Handbuch der mikroskopie [1 ed.]

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Handbuch der Mikroskopie Herausgeber:

Dr. rer. nat. Hermann Beyer Wissenschaftlicher Mitarbeiter im VEB Carl Zeiss JENA

2., stark bearbeitete Auflage mit 493 Bildern und 45 Tafeln

I II II II 11111111 11111 1 11111 0

,

\�,

.,,

00000s 40060 .-::a

I

I

I

"

700 r--· 80 60 50 4 01---f-- -t30

Q2 Q3 Q4Q5

+---+-

w

2

3 4 5

70

20 30 40 50

Bild 2.23. Grafische Darstellung der Akkommodationstiefe von der Mikroskopvergrößerung (Ordinate) Die Geraden sind für die Akkommodationsbreite

Ia

700

zoo )!ffi 500

7000

nach GI. (2.64) in Abhängigkeit

l, 2, 4 und 8 Dioptrien gezeichnet, sie gelten ferner für

11 =

I.

Ist die Brechzahl II im Objektraum 9= 1, so ist die aus der grafischen Darstellung entnommene Akkommodationstiefe

noch mit n zu multiplizieren

55

2.4. Wellenoptische und aberrationsbehaftete Abbildung

sammenhang zwischen Akkommodationstiefe 1,.,

die Schärfentiefe bei der mikroskopiscl1en Ab­

VMikr und dem in dpt an­

bildung durch Iw mit genügender Genauigkeit

Mikroskopvergrößerung

gegebenen Akkommodationsbereich grafisch dar­

angegeben wird, wenn man im Bereich der förder­

gestellt.

lichen Vergrößerung bleibt und die Akkommo­

Der

Akkommodationsbereich

mit den Sehweiten nelle Sehweite) und

1v� w;

=

=

beträgt

250 mm (konventio­

dation des Auges ausgeschaltet ist. Ohne diese Ein­

(Fernpunkt eines

schränkungen ist für die Bestimmung der Schär­

oo

rechtsichtigen Auges) 4 dpt, denn 1/w� - 1Jw;

J /0,25 breite

m

- 0

als

=

4 dpt.

Die

=

Akkommodations­

Akkommodationsbereich

fentiefe lges bei der mikroskopischen Abbildung die Gleichung

zwischen

(2.65a)

Fernpunkt un d kürzestmöglicher Naheinstellung ist altersbedingt und verringert sich beim ge­

anzuwenden, die allgemein gültig ist. Sie lautet

sunden menschlichen Auge nach den Angaben

ausführlich

in Tafel 2.4.

n?,

11

+0 15--

'

--

2A2

Tafel 2.4. Akkommodationsbreite in Abhängigkeit vom Lebensalter

+62 500

J0

Alter in Jahren

20

30

40

50

60

AVMikr

__!._ l

-

V�ikr

(

1 - -

IV�

1

-

w

;

)

(2.65 b)

'

wobei die Terme für fw, lg, 13 nach den GIn. (2.61),

Akkommodationsbreite in dpt (Durchschnitt) 12

10

8

6

2

1,4

(2.63 c), (2.64) eingesetzt sind. Der letzte Term für die Akkommodationstiefe spielt nur bei subjek­ tiver mikroskopischer Beobachtung eine Rolle

Bei Tiefenmessungen durch Scharfeinsteilungen

und kann überdies durch besondere Maßnahmen

mit dem Mikroskop muß darauf geachtet werden,

unwirksam gemacht werden. Die ersten beiden

daß die wellenoptisch bzw. geometrisch-optisch

Terme geben die Schärfentiefe bei der mikro­

bedingte Schärfentiefe nicht durch den Einfluß

skopischen Abbildung an, wenn die Akkommo­

der Akkommodation des Auges, d. h. durch die

dation des Auges ausgeschaltet ist (z. B. bei der

Akkommodationstiefe, vergrößert wird, was eine

mikrofotografischen Abbildung). Sie wird unter

größere Einstellungenauigkeit und damit eine

der Abkürzung

größere Meßungenauigkeit zur Folge hätte. Die Wirkung unterschiedlicher Akkommodation muß bei solchen Beobachtungen dadurch ausgeschaltet

Im

=

11

(

A

tm

zusammengefaßt:

0,15 +�

z

M•kr

2A

).

(2.66)

VMikr

werden, daß in der Brennebene des Okulars eine

Anstelle der Mikroskopvergrößerung

Strichmarkierung angeordnet wird, die gleich­

der Abbildungsmaßstab M des Endbilds einge­

zeitig mit dem Objektdetail scharf gesehen wer­

setzt werden. Da in GI. (2.66) als Zahlenfaktor

kann

den muß. Die Einstellung auf die Strichmarkie­

u'

rung

Berechnung ebenfalls in Millimeter ausgedrückt

zwingt

das Auge zu einem

Akkommodationszustand,

der

bestimmten

während

der

=

0,15 mm eingeht, müssen

A

und

tm

bei der

werden.

Messungen erhalten bleibt.

Für},

Ist eine Festlegung auf einen bestimmten Akkom­

kommenden numeriseben Aperturen ist die Schär­

=

0,55 ltm und eine Anzahl von häufig vor­

modationszustand nicht gegeben, so nimmt die

fentiefe Im - oder genauer die Größe

Akkommodationstiefe

Bild 2.24 i n Abhängigkeit von der Mikroskop­

mit

Mikroskopvergrößerung

kleiner

rasch

zu.

werdender Bei

einem

vergrößerung

bzw.

vom

tm/n

-

im

Abbildungsmaßstab

Akkommodationsbereich von 4 dpt beträgt die

grafisch dargestellt.

durch

Die gestrichelten Teile der Kurven enden bei

bei

Akkommodation bedingte Schärfentiefe

1000facher

Mikroskopvergrößerung

nur

0,25 ,um, während sie bei lOOfacher Mikroskop­

VMikr

=

100

A

bzw.

VMikr

=

2000A. Grafische

Darstellungen in der Literatur, die den Zusam­

vergrößerung 25 ,um und bei lOfacher Mikroskop­

menhang

vergrößerung einen Wert von 2,5 mm erreicht

Apertur und Vergrößerung so zeigen, daß die

(s. Bild 2.23).

Kombinierte Gleichung für die Schä1j"entie.fe

zwischen

Schärfentiefe,

numerischer

Schärfentiefe bei jeder beliebigen Apertur bis hin zu den kleinsten Vergrößerungen angegeben wird, sind irreführend. In der Praxis wird man sich bei

Bei der Erläuterung der GI. (2.61) für die wellen­

einer gegebenen numerischen Apertur des Objek­

optische Schärfentiefe Iw wurde festgestellt, daß

tivs nicht beliebig weit von dem Bereich der för-

2. Optisches System des Mikroskops

56

derliehen Vergrößerung entfernen. In den Kurven

verringerung im Zentrum des Beugungsscheib­

kommt deutlich zum Ausdruck, daß

chens nicht mehr zutreffen, weil eine solche nicht

zu einer gegebenen numerischen Apertur, mit der

mehr wahrgenommen wird. Der Kern der räum­

im Bild

2.24

die Kurven bezeichnet sind, ein begrenzter Schär­

lichen Beugungsfigur, d. h. der geometrisch-opti­

fentiefebereich gehört. Bleibt man im Bereich

sche Bildpunkt, kann unter diesen Umständen

der förderlichen Vergrößerung, so schwankt die

weiter von der Auffangebene entfernt sein, ehe

Schärfentiefe f111 nur innerhalb enger Grenzen.

der entstehende Unschärfekreis als störend wahr­

Die kombinierte Gleichung läßt sich folgender­

genommen wird. Die Schärfentiefe wird somit

maßen erklären, wobei wir uns auf GI.

be­

größer als die wellenoptisch bestimmte und vor­

schränken können, da die Akkommodationstiefe

nehmlich durch den geometrisch-optischen Term

im vorhergehenden Abschnitt erklärt ist. Unge­

beherrscht.

(2.66)

fähr an der unteren Grenze der förderlichen Ver­

Berek

größerung, bei der alle aufgelösten Objektstruk­

der der Perzeptionsbreite des Auges Rechnung

turen gerade deutlich und bequem erkennbar sind,

trägt. Anstelle

werden beide Terme gleich groß, d. h., fg und somit wird die Schärfentiefe

tm

=

i-tw,

gleich der

wellenoptischen Schärfentiefe fw. Nimmt die Ver­ größerung ab, so wächst der zweite Term im Ver­ gleich zu dem konstant bleibenden ersten Term

bezeichnet

den

zweiten Term als den,

' u

= 0,15 mm wird in der von Berek [13] angegebenen kombinierten Gleichung ' u = 0,35 mm verwendet, so daß man größere

Schärfentiefen erhält.

SchäJfentiefe bei lupenfotografischer Abbildung

an und bestimmt somit die Schärfentiefe. Bei

Bei der Berechnung der Schärfentiefe für die lu­

Vergrößerungen weit unterhalb der förderlichen

penfotografische Abbildung ist es üblich, von der

Vergrößerung wird das einem Objektpunkt zu­

geometrisch-optischen Schärfentiefe auszugehen.

geordnete

Das ist nach den Erläuterungen zur kombinierten

Beugungsscheibchen so

klein abge­

bildet, daß die Überlegungen in den Abschnitten

GI.

2.4.2.1. und 2.4.2.2. über die zulässige Intensitäts-

der unteren Grenze der förderlichen Vergröße-

�

J

��!���@��� -

(2.66)

dann berechtigt, wenn man unterhalb

700 80 60 sor---:--,, ,--r+t-"- ---'4 oc-------, :--+--,-+3 Of-----11--t-f--t-+-t-f , 20'f----+--+-++++_j__- .!__ _j_ -'-'-!!

-

Bild 2.24. Grafische Darstellung der Schäljentiefe bei der mikroskopischen Abbildung in Abhängigkeit von der Mikroskopvergrößerung bzw. vom Abbildungsmaßstab (Ordinate) und für häufig vorkommende numerische Aperturen (Kurvenparameter} Als Abszisse ist !111/n nach GI. (2.66) für A = 550 nm angegeben. Um die Schärfentiefe 1111 zu erhalten, ist der abgelesene Abszissenwert noch mit der Brechzahln im Objektraum zu multiplizieren. Bei Durchlichtpräparaten ist für 11 die Brech­

zahl des Objekts oder des Einbettungsmittels zu wählen (s. Bild Trockensysteme 11 =

J,

2.14).

Bei unbedeckten Auflichtpräparaten gilt für

bei Immersionssystemen ist 11 die Brechzahl der J mmersionsftüssigkeit. - Der ausgezogene

Teil der Kurven gibt den Bereich der förderlichen Vergrößerung an. Der senkrechte Strich in jeder Kurve gibt den Wert der wellenoptischen Schärfentiefe Iwan.- Soll die Wirkung der Akkommodation auf die Schärfentiefe berück­

sichtigt werden, ist die aus Bild 2.23 zu entnehmende Akkommodationstiefe zu addieren

2.4.

Tafel

Wellenoptische und aberrationsbehaftete Abbildung

57

Schäljentiefe in mm bei lupenfotografischen Aufnahmen

2.5.

Abb.-Maßstab

Öffnungsverhältnis I:I,6

I:2,5

I:3,5

I :4,5

1 :I 2:1 3:1 4: 1 5:1 7:1 10:1 15: 1 20:1 30:1 40:1 50:1

0,96 0,36 0,2I 0,15 0,12 0,078 0,053 0,034 0,025 0,017 0,012 0,010

1,5 0,56 0,33 0,23 0,18 0,12 0,083 0,053 0,039 0,026 0,019 0,015

2,1 0,79 0,47 0,33 0,25 O,I7 0,12 0,075 0,055 0,036 0,027 0,021

2,7 I,O 0,60 0,42 0,32 0,22 O,I5 0,096 0,071 0,047 0,035 0,028

M

I:8

I:6,3

4,8 1,8 1,1 0,75 0,58 0,39 0,26 0,17 0,13 0,083 0,061 0,049

3,8 1,4 0,84 0,59 0,45 0,3I 0,21 0,13 0,10 0,065 0,048 0,039

1:16

I:11 6,6 2,5 1,5 1,0 0,79 0,54 0,36 0,24 0,27 0,11 0,085 0,067

9,6 3,6 2,I 1,5 1,2 0,78 0,53 0,34 0,25 0,17 0,12 0,098

rung bleibt. Andernfalls wäre es angebracht, die

Bei offener Blende der lupenfotografischen Ob­

kombinierte Gleichung zu verwenden.

jektive (z. B. Objektive

Die geometrisch-optische Schärfentiefe ist gege­

oder in der Gebrauchsanleitung angegebene Öff­

ben durch GI. (2.63a)

nungsverhältnis beim Gebrauch der Tafel zu wäh­

fg =

' nu

u

mit

AM

,

M)

ist das aufgravierte

len. Bei Abblendung ist zu beachten, daß sich das

= 0,15 mm.

Öffnungsverhältnis

proportional

zum

Durch­

messer der Irisblende verkleinert.

Lupenfotografische Objektive sind wie Fotoobjek­ tive durch Brennweite und Öffnungsverhältnis ge­ kennzeichnet. Die wirksame numerische Apertur

2.4.3.

Monochromatische Abbildungsfehler

richtet sich nach dem gewählten Durchmesser der

Bei der in der Praxis üblichen Abbildung von Ob­

Öffnungsblende

jektpunkten

und

dem

Abbildungsmaßstab

der einstufigen Abbildung. Nach GJ. (2.48 a) er­ hält man

t= g

-2nu'

1 -M

Q

oder mit

u

'

1

1

M

(

1

1+

,

1

I MI

Öffnungs­

läßt sich eine punktförmige Strahlenvereinigung (2.67 a)

nicht erreichen. In einer Auffangebene, die recht­ winklig zur optischen Achse des abbildenden op­

= 0,15 mm und

ts=0,3 Q

unterschiedlichem

strahlen zur optischen Achse geneigt verlaufen,

( --) IMI 1+

mit

winkel und durch Strahlenbündel, deren Haupt­

)

n=

tischen Systems am Ort des entstehenden Bilds angeordnet ist, entstehen anstelle von Bildpunk­ (2.67b)

in mm.

ten Zerstreuungsfiguren, die man als Punktdia­ gramm (eng!. spot diagram) darstellen kann, wenn

Das ÖffnungsverhältnisQ= 2h/f' ist dem Durch­

man die Durchstoßpunkte einer möglichst gro­

messer der Öffnungsblende proportional.

ßen Anzahl von Strahlen eines Strahlenbündels

In Tafel 2.5 ist nach GJ. (2.67b) die Schärfentiefe

durch die Auffangebene markiert. Da diese Er­

bei

scheinungen als Abweichungen von der idealen

lupenfotografischen

Aufnahmen

für

eine

Reihe von Öffnungsverhältnissen und Abbildungs­

punktförmigen Abbildung des Gaußsehen Raums

maßstäben angegeben.

aufgefaßt werden können, bezeichnet man sie als

Bemerkung: In der Fotografie ist es üblich, den

Abbildungsfehler oder als Bildfehler.

zulässigen Unschärfekreis nach dem Bildformat

Man

zu bestimmen.

dungsfehler, die bei brechenden Flächen bei ein­

Es gilt, daß der Durchmesser

des zulässigen Unschärfekreises der

Bilddiagonale betragen

9 x 12-Format beträgt 15 cm und somit

u

'

'

u

etwa 1/1000

kann.

Bei

die Bilddiagonale

= 0,15

mm.

einem etwa

Dies stimmt

unterscheidet

monochromatische

Abbil­

farbigem Licht und bei spiegelnden Flächen un­ abhängig von der Wellenlänge auftreten, und Farbfehler bzw. chromatische Abbildungsfehler, die

durch

die

Wellenlängenabhängigkeit

der

mit der Festlegung für den Unschärfekreis über­

Brechzahl des Linsenmaterials bedingt sind. Be­

ein.

trachtet man den Abbildungsvorgang wellenop-

58

2. Optisches System des Mikroskops

tisch, so kommen Abbildungsfehler dadurch zum Ausdruck, daß die von einem leuchtenden Punkt entstehende Beugungsfigur gegenüber der idealen Airyschen

Beugungsfigur

verändert

erscheint.

Dabei kann die Rotationssymmetrie der Beu­ gungsfigur erhalten bleiben und sich nur die Licht­ verteilung ändern. Das trifft bei der Abbildung mit einer ringförmigen Pupille (s. Abschn. 2.4.1.2.) und bei der Defokussierung (s. Abschn. sowie beim Öffnungsfehler

2.4.2.1.)

Die Beugungs­

zu.

�� Objekt-

Einfrlf/s-

Austrifis­

ebene

pupille

pupille

Bild 2.25. Zur Erläuterung der Queraberrationen

figuren von Objektpunkten, die größeren Abstand von der optischen Achse haben, sind nicht mehr

Geometrisch-optisch werden die Abbildungsfeh­

rotationssymmetrisch, sondern zeigen nur noch

ler entweder als Queraberrationen oder als Längs­

Symmetrie zu einer Ebene (Asymmetriefehler,

aberrationen dargestellt. Im Bild

Koma) bzw. zu zwei aufeinander rechtwinklig

Queraberration so dargestellt, daß in der Objekt­

2.25

wird die

stehenden Ebenen (Astigmatismus). Ihre Licht­

ebene ein außeraxialer Objektpunkt B mit den

verteilung ist kompliziert. Hinzu kommt, daß der

Koordinaten x

optimale Bildort eines außeraxialen Objektpunkts

in der

=

0 und y

Bildebene

der

=

OB gegeben ist, dem

Gaußsehe Bildpunkt B'

meist vor oder hinter der Bildebene liegt, die durch

mit denKoordinatenx'

den "Bildpunkt" des axialen Objektpunkts hin­

entspricht,

durchgeht. Dieser Abbildungsfehler tritt als Bild­

ist. Die Ebene, die durch das Objekt OB und

wobei

=

O undy'

M der

=

O'B'

=

yM

Abbildungsmaßstab

feldwölbung in Erscheinung. Den nichtrotations­

die optische Achse bestimmt ist, im Bild

symmetrischen

Objekt­

die durch die y-Achse und die z-Achse bestimmte

punkten, die einen größeren Abstand von der

Ebene, heißt Meridionalebene. In ihr verlaufende

optischen Achse haben,

Strahlen

Beugungsfiguren

von

können rotationssym­

werden

Meridionalstrahlen

2.25 also

genannt.

metrische Anteile des Defokussierungsfehlers und

Strahlen, die nicht in der Meridionalebene ver­

auch des Öffnungsfehlers überlagert sein.

laufen, heißen windschiefe Strahlen. Ein solcher

Im folgenden wird vorausgesetzt, daß das optische

von B ausgehender windschiefer Strahl wird im

System zentriert ist, d. h., daß die Krümmungs­

Bild 2.25 gezeigt. Er zielt nach einem Punkt P

mittelpunkte der optischen Flächen sämtlich auf der optischen Achse liegen. Dann kann man fünf

der Eintrittspupille mit den Koordinaten xp, Yr· Nach Durchgang durch das nicht dargestellte

typische Abbildungsfehler unterscheiden:

optische System geht er im Bildraum durch den Punkt P' der Austrittspupille mit denKoordinaten

Öffnungsfehler

x�,

Koma

y�

und durchstößt die Bildebene im Punkt B',

der von dem Gaußsehen Bildpunkt B' um die

Astigmatismus

Strecke B'lJ' abweicht, die als Queraberration be­

Bildfeldwölbung

zeichnet wird. Es ist üblich, die Queraberration in

Verzeichnung.

die meridionale Komponente Lly' und eine dazu

Die Grundlage für diese Einteilung bildet die

rechtwinklige Komponente Llx' zu zerlegen. Sie

Bildfehlertheorie 3. Ordnung, die man nach dem

ist die sagittale Komponente der Queraberration.

Mathematiker Seidel auch als Seidelsehe Bild­

Bei Meridionalstrahlen verschwindet die sagittale

fehlertheorie bezeichnet. Sie beruht darauf, daß

Komponente, und es bleibt nur eine meridionale

in den Gleichungen die exakt gültigen trigono­

Queraberration bestehen.

metrischen Funktionen, wie sin x, cos x usw., die

Längsaberrationen werden in Lichtrichtung bzw.

bei der Brechung und der Spiegelung eine Rolle

in Richtung der optischen Achse gemessen. Eine

spielen, durch ihre Reihenentwicklungen bis zur

3. Ordnung angenähert dargestellt werden: sin x � x-

x3

3!'

COS X�

1-

x2 --

2

.

Die Einteilung nach Abbildungsfehlern kann auch dann beibehalten werden, wenn bei der Abbil­ dung durch ein optisches System Abbildungsfeh­

Bild 2.26. Längsaberration Lls'

ler höherer Ordnung zu berücksichtigen sind.

und ihr Zusammenhang mit der Queraberration Lly'

2.4. Wellenoptische und aberrat ionsbehaftete Abbildung

59

Längsaberration ist z.B. der Abstand des Schnitt­

figur die größte Helligkeit herrscht. Bei einem Öff­

punkts eines Strahls mit der optischen Achse von

nungsfehler nach Bild 2.27 (Öffnungsfehler 3. Ord­

der Bildebene. Bild

nung oder primäre sphärische Aberration)

2.26 ist zu entnehmen, daß Lls' und der Quer­

zwischen der Längsaberration

aberration Lly' ein Zusammenhang besteht. Für diesen gilt die einfache Beziehung

Lly'

=

-

Lis' tan CJ',

(2.68)

günstigste

b'

O,SLis,;,.x vom Gaußsehen Bildpunkt entfernt,

=

Einstellebene

um

liegt

die

die Strecke

d. h. in der Mitte zwischen dem Bildpunkt des Randstrahls und dem Gaußsehen Bildpunkt Falls die Schnittweite eines Öffnungsstrahls

s'

die für die Umrechnung der Längsaberrationen

kleiner als die Schnittweite des paraxialen Strahls

des Öffnungsfehlers in Queraberrationen benutzt

ist, d.h. im Falls'
c

ß

>

Einfallsrichtung des Lichts steht. Ihre Achsen

mit den Achsen

entsprechen den Brechzahlen und bestimmen

Einfallsrichtungen x und

gleichzeitig

die

Schwingungsrichtungen

dieser

c,,.

6.74 sind die geometrischen Verhältnisse

11"'

und ny maßgebend. Für die z gilt das entsprechend

der Schnittellipsen yz und xy. Zu jeder Richtung kann man auch hier eine dazu senkrecht liegende

l

Schnittellipse konstruieren, in der

die

beiden

Hauptachsen die Brechzahlen der beiden sich in der angegebenen Richtung fortpflanzenden Wel­ len darstellen und gleichzeitig ihre Schwingungs­ richtungen festlegen. Die im Bild

6.74 in der Zeichenebene liegende (yz) hat z.B. eine in ihr liegende

Symmetrieebene

V

Strahlenrichtung As;

die der

Strahlenrichtung

parallele Tangente an die in der Zeichenebene liegende Schnittellipse berührt diese in R. Die Schnittellipse durch R und AA' steht senkrecht auf der zu As gehörigen Richtung der Wellen­ l Bild 6. 7 3. Indikatrix eines einachsigen Kristalls mit Wellennormale und zugehöriger Schnittellipse (nach Kleber)

normalen

Aw.

Die

beiden

Hauptachsen

der

schraffierten Ellipse entsprechen den Brechzahlen n"' und n;. (wobei 11� einem zwischen 11" und ny ge­ legenen Wert entspricht) und ihre Richtungen

6.1. Durchlichtmikroskopie

197

den Schwingungsrichtungen der beiden Kompo­

Achsen der Indikatrix parallel zu den Kristall­

nenten.

achsen; bei monoklinen Kristallen liegt nur eine

In einem dreiachsigen Ellipsoid gibt es zwei

Achse der Indikatrix parallel mit der y-Achse, und

Schnittebenen, in denen die Ellipse zu einem

bei triklinen Kristallen gibt es keine Beziehungen

Kreis entartet. In ihnen entsprechen die beiden

zwischen den Achsen der Indikatrix und den

Brechzahlen der Größe np. Die dazugehörigen

Kristallachsen. Fresnel [185] hat eine Konstruk­

Wellennormalenrichtungen bezeichnet man als

tion angegeben, nach der es möglich ist, mit dem

optische Achsen oder Binormalen. Sie werden

stereografischen Netz für eine beliebige Wellen­

ebenfalls als Achsen der optischen Isotropie an­

richtung die beiden Schwingungsrichtungen zu

gesehen, obwohl keine von ihnen vollständig einer

bestimmen.

solchen genügt.

Wegen Vorhandenseins zweier

Doppelbrechung Das Maß der Doppelbrechung ist durch den

1

As

Unterschied der beiden Brechzahlen im Kristall gegeben. Bei einachsigen Kristallen bezeichnet man die Differenz der Hauptbrechzahlen (nli- nw) als Hauptdoppelbrechung. Bei zweiachsigen Kristallen,

die drei

Hauptbrechzahlen haben,

unterscheidet man drei Hauptdoppelbrechungen

(ny -

n0),

(ny - n"'), (np - n"').

Für beliebige andere Richtungen liegen die Werte der Doppelbrechung zwischen den Extremwerten. Die Untersuchung der Doppelbrechung wurde zu einem ausgezeichneten diagnostischen Verfahren ausgearbeitet. Sie spielt auch auf verschiedenen Gebieten der organischen Welt eine Rolle. Man

r'

kennt in der Biologie und Medizin ebenfalls

Bild 6.74. Indikatrix zweiachsiger Kristalle mit

Strukturen

zugehöriger Schnittellipse x, y, z Achsen des dreiachsigen Ellipsoids; As Strahl­

richtung; Aw Richtung der zugehörigen Wellennormalen; 11",

np n1,,

verschiedener

Brechzahl

und

hat

Verfahren zu ihrer Bestimmung ausgearbeitet,

Hauptbrechzahlen

z.B. die Einbettungsmethode oder Imbibitions­ methode (s. Abschn. 6.1.4.4.). In biologischen Strukturen tritt z. B. auch Doppel­ brechung auf, weru1 die einzelnen Komponenten

Richtungen spricht man von optisch zweiachsigen

nicht doppelbrechend sind, aber unterschiedliche

Kristallen. Die Ebene, in der die beiden Achsen

Brechzahlen

liegen,

diesem Fall von der Formdoppelbrechung, weil

bezeichnet man

als Achsenebene.

Der

n1

und

n2

haben. Man spricht in

Winkel zwischen den beiden Achsenrichtungen ist

sie wesentlich von der Form der Komponenten

der Achsenwinkel 2 V. Der Zusammenhang dieses

abhängt. Nach einer von Wiener 1912 aufgestell­

Winkels mit den Hauptbrechzahlen eines Kristalls

ten Theorie von den Mischkörpern wird ent­

läßt sich wie folgt darstellen:

sprechend seinem Aufb

(n�

bzw.

Interferenzfarben zeigen, haben

optisches Dreh vermögen. Die Ursache liegt darin,

ist ein Auftreten von Farben erst in der

daß derartige Kristalle in Richtung der optischen

2. oder folgenden Ordnung charakteristisch, die

Achse doppelbrechend sind, wobei die Schwin­

allerdings der l. Ordnung der normalen Folge

gungsebene des austretenden Lichts noch ge­

-

n�)viol

entsprechen.Dadurch erscheinen stumpfe Farben;

dreht ist. Für verschiedene Wellenlängen ergeben

violettgraue, bräunliche und fahlgraue Farbtöne

sich verschiedene Drehwinkel, für rotes Licht ist

sind zu beobachten. Bei bestimmten Mineralen,

er kleiner als für die folgenden Wellenlängen bis

8H20)

zum violetten Teil des Spektrums. Diese Erschei­

wie Apophylliten (KCa4 [(F (Si4010)2]

(Bild 6.81 a), entarten sie in helle schmutzigweiße

nung nennt man Rotationsdispersion. Man unter­

Töne. Ein bekanntes Beispiel eines Minerals mit

scheidet eine Rechtsdrehung von einer Links­

unternormalen

Farben

ist

der

Klinochlor

{ (MgAI3) [(OHh l AlSi3010] Mg3 (OH)6 } , Pennirr { Mg5 (Mg, Al) [(OH)8, (Al, SihJ

auch 010

}

ist hier zu nennen (Bild 6.81 b). Bei komplizierten Zusammenhängen

in

den

drehung. Demgemäß unterscheidet man rechts­ drehende Kristalle, z.B. Rechtsquarz, von links­ drehenden, z.B. Linksquarz. Der Betrag der Drehung ist von der Dicke der

Dispersionserschei­

Kristallplatte abhängig. Unter dem spezifischen

nungen der Doppelbrechung, wenn im sichtbaren

Drehvermögen versteht man den Drehwinkel,

Spektrum die Doppelbrechung für eine bestimmte

den eine 1 mm dicke Platte hervorruft. Man be­

Wellenlänge gleich Null wird, treten sog. anomale

zieht das Drehvermögen auf bestimmte Weilen­

Farbfolgen auf,z.B. beim Vesuvian (Ca10 (MgFeh

längen. Wird der Analysator bei Verwendung

Al4 [(OH)4/(Si04)5/(Si207)7]) (Bild 6.8l c).

weißen Lichts kontinuierlich in einer Richtung

Ehringhaus hat diese Erscheinungen quantitativ

gedreht, so werden nebeneinander bestimmte

untersucht. Er konnte zeigen, daß der Kehrwert

Farben

der relativen Dispersion

Farben addieren sich zu Mischfarben derart, wie

(n

N=

(n"

-

)

n"' F

-

-

n

-

Die

hindurchgelassenen

die Interferenzfarben an einem QuarzkeiL Die

)

o o

(n"

ausgelöscht.

auftretenden

)

llcx c

Farben

verlaufen

bei

gleichem

Drehungssinn von Rot über Gelb, Grün und

ein leicht bestimmbares Charakteristikum für die

Blau zu Violett. Das Achsenbild solcher Kristalle

Dispersion der Doppelbrechung ist. Von beson­

(Bild 6.82) zeigt ebenfalls Isogyren und Jsochro­

derem Interesse sind die Dispersionserscheinun­

maten, nur sind erstere innerhalb der l.Ordnung

gen in den Achsenbildern optisch zweiachsiger

stark geschwächt oder bei dicken Platten ganz

Kristalle. Sie treten aus Symmetriegründen nur

unterbrochen, wobei der innerste Ring in der

bei den rhombischen, monoklinen und triklinen

eben angefi.ihrten Farbfolge farbig erscheint. Legt

Kristallen auf. Das Studium ihrer Abhängigkeit

man gleich dicke Achsenplatten aufeinander (eine

von der Wellenlänge

A.

kann im Polarisations­

mikroskop bei indirekter Betrachtung an den be­ sprochenen Interferenzbildern vorgenommen wer­ den. Im rhombischen System z.B. äußert sich die Dispersion in den verschiedenen Werten

des

Achsenwinkels 2 V (im Kristall gemessen) für violettes werden v

�

r

v

oder rotes Licht r. In der Literatur

die

Tatsachen

durch die Abkürzung

gekennzeichnet. Ist der Wert von 2 V für

violettes Licht größer, so ist

am

Achsenaustritt

eine rote Farbe zu beobachten. Im anderen Fall zeigen die hyperbelförmigen Hauptisogyren in der Diagonalstellung rote und

blaue Säume.

Weitere Einzelheiten können [185] oder [I 96] ent­ nommen werden.

Drehende und absorbierende Kristalle Kristalle, die wie der Quarz in Platten senkrecht zur optischen Achse geschnitten zwischen ge-

Bild 6.82. Ac!tseninleiferenzbild vom Quarz im weißen Licht (dicke Plalle senkrecht zur optischen Achse) Das farbige Mittelfeld ist auf die Rotationsdispersion des Quarzes zurliekzuführen

6. Mikroskopierue1jahren und ihre Anwendung

204

Absorptionskomponente und nach Drehen der Schwingungsrichtung des Polarisators oder des Objekts um 90° die andere Absorptionskompo­ nente. In einem senkrecht dazu orientiertenSchnitt kann

die

dritte

Absorptionskomponente

be­

obachtet werden. Von den sechs möglichen Fällen sind je zwei gleich, wie im Bild 6.84 am Cordierit (nach Tschermack) ersichtlich ist. Trennt man diese Absorptionen nicht voneinander, etwa durch Anwendung eines Polarisators, so treten Misch­ farben, wie Graugrün, Gelb und Indigoblau, auf. Mit einer Haidingersehen Lupe beobachtet man die Farben nebeneinanderliegend, und mit dem

Bild 6.83. Airysche Spiralen, erzeugt durch Übereinanderlegen von rechts- und linksdrehenden Quarzplatten zwischen gekreuzten Polaren

Polarisationsmikroskop beobachtet man sie hin­ tereinander. In

Bestimmungstafeln

werden

diesbezügliche

Hinweise aufgenommen. Bei zunehmender Ab­ rechtsdrehende und eine linksdrehende), so ent­ stehen die "Airyschen Spiralen" (Bild 6.83). Bei durchsichtigen

und

schwach

absorbierenden

Kristallen werden sowohl im direkten als auch im

sorption bis zur Undurchsichtigkeit in Dünn­ schliffdicke müssen

die Objekte im

polarisationsmikroskop

6.1.4.3.

Störungen hervorgerufen, auch wenn das Mineral

Durchlichtpolarisationsmikroskop

druck der Eigenabsorption ist bei anisotropen Körpern richtungsabhängig. Diese Erscheinung bezeichnet

man

als

Pleochroismus.

Turmalin

(Na Fe3 Al6 [(OH)l+ 3 (B03h Si60 18]) und Cor­

I

I

dierit (Mg = dj). (n�

-

n�)

sei noch

trammel in Fadenkreuzmitte gebracht wird. In

Soll z. B. die Dicke einer Quarzplatte, die parallel

dieser Stellung heben sich Gangunterschiede im

zur optischen Achse aus einem Kristall heraus­

Objekt und in der Platte auf. Der Kippwinkel für

geschnitten wurde, nach dieser Methode bestimmt

den Meßstreifen wird einmal bei einem Skalen­

werden, so ergibt sich zunächst die Doppel­

wert über 90° und durch Zurückdrehen der Meß­

brechung des Quarzes zu 0,00911 für). = 589 nm.

trammel unter 90° ermittelt (wegen der symme­

Nach Auflegen auf den Drehtisch und Orientie­

trischen Lage der Interferenzstreifen). Der tat­

rung in die Subtraktionsstellung werden die bei­

sächliche Kippwinkel berechnet sich daraus als

den folgenden Kippwinkel abgelesen:

halber Wert der Differenz der beiden Ablesungen.

a= 114,62°

Aus der dem Kompensator beigegebenen Punk­

b= 65,60°

tionstafel oder einer Eichkurve kam1 dann der Wert des Gangunterschieds entnommen werden. Bei Interpolation zwischen den einzelnen Wellen­

a-b= 49,02°

längen in den Funktionstafeln müssen Disper­

.

sionsformeln verwendet werden. Voraussetzung

I=--=

für einwandfreie Messungen mit dem Meßkom­

a-b 2

24,51

o

pensator ist die korrekte Einstellung des Dunkel­

Das entspricht lt. Funktionstafel einem Gang­

streifens bei beschränkter Beleuchtungsapertur.

unterschied von 11 806 nm (= 0,011806 mm).

215

6.1. Durchlichtmikroskopie

Durch Einsetzen in

�

df}" (n ;

=

0,011806

d=

d

R;;.>

---,-.,... .,....,=

0,00911

- n

�)

wird

gegangen werden. Auch aus dieser sind Doppel­ brechungswerte zu entnehmen, weil sie die Zu­ ordnung der Größen

1,2959

d, ny

-

na

und R enthält.

Nimmt man den Fall an, daß ein Kristall bei einer

1,296 mm .

Schliffdicke von

1. Ordnung

(R

=

0,03 mm das

Rot der

551 nm) zeigt, so errichtet man

Die Dicke der Platte beträgt 1,296 mm. Ermittelt

bei dem Abszissenwert 551 nm eine Ordinate bis

man ihre

Dicke mit dem Mikroskop (s. Ab­

zur Höhe des Wertes 0,03 und bemerkt dann, daß

sehn. 6.1.4.4.), so kann nach Messung des Gang­

sich in diesem Farbbereich zwei Radialstrahlen

unterschieds R(;.> aus dieser Gleichung auch die

befinden, die, bis zum oberen Rand verfolgt, auf

Doppelbrechung ermittelt werden.

Doppelbrechung von 0,018 bis 0,019

Da bei diesem Beispiel eine orientiert zur opti­

Andererseits ist es möglich, umgekehrt bei be­

stoßen.

schen Achse geschliffene

Quarzplatte gewählt

kannten Doppelbrechungen, die in einem Schliff

wurde,

um

bestimmter

handelt

es

sich

Doppelbrechungswert

(ny

-

einen

)

n . "'

extremen

In diesem Zu­

Dicke

auftreten,

die

Interferenz­

farben zu bestimmen.

sammenhang soll nochmals auf die im Bild 6.89

Schließlich besteht noch die Möglichkeit, bei

dargestellte Tafel der Interferenzfarbfolge ein-

einer

bestimmten

Schliffdicke und

Farbe den

Gangunterschied bzw. die Doppelbrechung abzu­

Bild 6.95. Kompensation des Gangunterschieds eines Kristalls im Dünnschliff mit dem Meßkompensator nach Ehringhaus im direkten Strahlengang (weißes Licltt) Objekt: Norit von Bande (Olivin) M 32:1

schätzen.

Die

hänge gehen auf

Michel-Levy

hier

besprochenen

Mal/ard zurück

Zusammen­

und werden von

in einer Farbtafel übersichtlich dar­

gestellt. Imbibitionsmethode Die Imbibitionsmethode wurde vonAmbronn [183] zum

Nachweis

der

Formdoppelbrechung

ent­

wickelt. Sie beruht darauf, das Präparat mit ge­ eigneten Flüssigkeiten mit schrittweise steigender Brechzahl zu durchtränken, bis die Brechzahlen von fester Substanz und Imbibitionsmittel ab­ geglichen sind. Die zu diesen Etappen gehörigen Doppelbrechungen werden über den Gangunter­ schied mit Kompensatoren gemessen und in ein Koordinatensystem eingetragen, dessen Abszissen die Werte der ansteigenden Brechzahlen der Imbi­ a) P + zentraler Olivinkristall erscheint grün-blau;

bitionsflüssigkeiten enthalten und dessen Ordinaten die gemessenen Gangunterschiede oder die Doppel­

b) P + und Ehringhaus-Kompensator in Subtraktions­

brechung darstellen (s. Bild 6.75). Als Meßergeb­

stellung:

nisse treten positive und negative Werte auf. Bei

Kompensation des Gangunterschieds an der

dunklen Kompensationsfarbe zu erkennen. Die Inter­ ferenzfarben der übrigen Kristalle ändern sich je nach Orientierung

der Eintragung wirkt dieAbszissenachse als Grenz­ linie der Isotropie. Voraussetzung für derartige Messungen ist, daß diese an einem Objektstück bzw. nur an solchen Stücken des Präparats durch­ geführt werden, deren Ausgangszustand gleich

ist (gleicher Gangunterschied!). Außerdem soll die Imbibitionsfli.issigkeit das zu untersuchende Material nicht angreifen oder ändern (z.B. Quel­ len) und sich auch aus dem Präparat wieder rest­ los entfernen lassen. Die nacheinander benutzten Flüssigkeiten sollen sich auch gut mischen lassen. Mit Wasser mischbare Mittel werden bevorzugt. Das Durchtränken des Präparats ist zeitintensiv. Die Verwendung eines Thermostaten soll die Imbibition beschleunigen.

Grundsätzlich kann

6. Mikroskopiervetfahren und ihre Anwendung

216

das Verfahren auf einem Objektträger durch­

p

geführt werden; dieser wird dann in Küvetten, die mit Imbibitionsmitteln angefüllt sind, behandelt. Die Brechzahlen der verwendeten Flüssigkeiten müssen vorher nach bekannten Methoden (s.

A

Abschn. 6.1.4.4.) bestimmt worden sein. Auslöschungsschiefen und ihre Bestimmung Ein Kristall zeigt beim Drehen auf dem Objekt­ tisch zwischen gekreuzten Polaren

4 X Hell- und 4 x Dunkelstellung. In der Dunkelstellung stim­ men die Schwingungsrichtungen im Kristall mit denen vom Polarisator bzw. Analysator überein. Die Lagen der Schwingungsrichtung bzw. der

Bild 6.96. Definition eines Auslöschungswinkels

a

P Schwingungsrichtung des Polarisators; A Schwingungsrichtung des Analysators; a Auslöschungsschiefe in Bezug auf die Kante des

Kristalls und die angedeutete Spaltbarkeit

Auslöschungsrichtung in einem Kristall sind von der Lage der Indikatrix im Kristall abhängig. Es besteht also auch umgekehrt die Möglichkeit, aus der

Lage

der

Auslöschungsrichtung

auf

Lichtquellen. Auch ist die Dispersion von Einfluß,

die

d. h., für verschiedene Wellenlängen findet man

Orientierung der Indikatrix in einem Kristall

verschiedene Auslöschungswinkel. Die Schwin­

Rückschlüsse zu ziehen. Es ist dazu erforderlich,

gungsrichtungen der Polare müssen den Fäden

die Auslöschungsrichtungen in Bezug auf be­

des Fadenkreuzes sehr genau parallel liegen. Auf

stimmte Richtungen im Kristall, wie Kristall­

die vorteilhafte Verwendung von Halbschatten­

kanten, Spaltrisse, Zwillings- oder Verwachsungs­

vorrichtungen kann hier nur hingewiesen werden.

ebenen, zu bestimmen. Das ist für die Charakteri­

Einzelheiten dazu müssen physikalischer Spezial­

sierung des Untersuchungsmaterials von großer

literatur entnommen werden.

Bedeutung.

Unter

Auslöschungswinkel

oder

Auslöschungsschiefe wird dabei die winkelmäßige Lage einer Schwingungsrichtung gegenüber einem kristallografischen

Bezugselement

verstanden.

Man unterscheidet eine Reihe von Standard fällen, je nachdem, wie die Schwingungsrichtungen zu

Messungen bzw. Bestimmungen im indirekten Strahlengang Bestimmung des optischen Charakters Auf den Charakter der Interferenzbilder im in­

den gewählten Bezugsrichtungen liegen. Bei der

direkten (konoskopischen) Strahlengang ist be­

geraden Auslöschung liegen beide Richtungen

reits im Abschn. 6.1.4.2.

parallel zueinander, bei der symmetrischen Aus­

In diesem Abschnitt soll dargestellt werden, wie

löschung ist die Lage zweier kristallografischer

derartige Interferenzbilder für die Beurteilung

hingewiesen

worden.

Bezugsrichtungen zur Schwingungsrichtung sym­

von Kristallen auszunutzen sind. Man spricht

metrisch, und bei schiefer Auslöschung bilden

von der Bestimmung des optischen Charakters

kristallografische und Schwingungsrichtung einen

und versteht darunter die Feststellung, ob ein

von 0 oder 90° verschiedenen Winkel miteinander.

Kristall einachsig oder zweiachsig und ob er

Den Auslöschungswinkel ermittelt man durch

optisch positiv oder negativ ist. Nachdem das

Drehen des Objekttisches von der Auslöschungs­

Objekt eingestellt wurde, wird die Bertrand-Linse

lage des Kristalls (Ablesung

eingeschaltet und die Beleuchtungsapertur durch

a1) bis zur Parallel­

stellung der kristallografischen Bezugsrichtung

Zuschalten der Frontlinse des Kondensors erhöht.

mit dem vertikalen Arm des Fadenkreuz.es (Ab­

Das Interferenzbild (Achsenbild) des Kristalls wird

lesung

a2). Dessen Lage entspricht der Schwin­

seinerseits mit der Bertrand-Linse fokussiert. Um

gungsrichtung des vom Polarisator kommenden

einen Überblick über die beim Zuschalten der

Lichts. Mit Hilfe eines Kompensators wird die

Kompensatoren auftretenden Erscheinungen zu

der Auslöschungslage entsprechende Richtung

erhalten, werden als Beispiele Kristallquerschnitte

n � bzw. n� bestimmt. Ein Beispiel ist im Bild 6.96 a die schiefe Aus­

dargestellt, in dem der Winkel

bestimmter optischer Orientierung ausgewählt. Die unveränderten Achsenbilder ein- und zweiachsi­

löschung in Bezug auf die Kristallkante und die

ger Kristalle wurden bereits im Bild

Spaltbarkeit darstellt. Bei solchen Messungen ist

gestellt.

6.80 dar­

eine Beschränkung der Beleuchtungsapertur zu

Im Bild

empfehlen; das bedingt die Verwendung starker

bilder positiver und negativer einachsiger und

6.97 findet man die veränderten Achsen­

6.1. Durclzlichtmikroskopie

zweiachsiger Kristalle nach Zuschalten der Kom­

217

skop gemessen werden kann. Man unterscheidet

pensatoren (Rot I und

.A./4). Dazu wurden bei ein­

den wahren Achsenwinkel im Kristall von dem

achsigen

senkrecht

scheinbaren in Luft gemessenen. Die Zusammen­

Kristallen

zur

optischen

Achse orientiert geschliffene und bei zweiachsigen

hänge sind im Bild 6.98 dargestellt. Die Achsen­

Kristallen senkrecht zur spitzen Bisektrix ge­

ebene liegt in der Zeichenebene; daher ist der

schliffene Kristallplatten in Diagonal- und Nor­

Sinus des halben wahren Achsenwinkels mit der

malstellung verwendet.

Brechzahl nß zu multiplizieren, um den schein­

Die

Einschiebrichtung

der Kompensatoren und die optische Orientie­

baren Achsenwinkel E zu erhalten nß sin V=

rung sind vermerkt sowie, ob der Kristall positiv

sin E.

oder negativ ist. In der ersten Zeile sind die

Objektivbrennebene ist proportional zum Sinus

Achsenbilder ohne Mitwirkung von Kompensato­

des Winkels, den das zugehörige Parallelstrahl­

Der Mittenabstand eines Punkts in der

ren zu finden. In der zweiten Zeile ist die Ein­

bi.indel im Objektraum mit der Mikroskopachse

wirkung des Kompensators (Rot

einschließt.

I) und in der

dritten Zeile die Veränderung der Interferenz­

Er ist durch die Brennweite des Objektivs und den

figuren

entsprechenden Winkel

beim

Einschieben

des

Kompensators

u

nach GI. d

=

jsin

u

(Grau) vermerkt. Es ist zu beobachten, daß bei

gegeben. Bei eingeschalteter Bertrand-Linse be­

positiven Kristallen im I. und III. Quadranten ein

trachtet man das Achseninterferenzbild in der

Steigen der I�erferenzfarben nach Blau eintritt, wenn der Kompensator (Rot

I) verwendet wird.

Zwischenbildebene des Mikroskops, wo es, und damit auch d, um einen Faktor vergrößert er­ u =

Außerdem erscheint die Isogyre in der Farbe

scheint. Mit

Rot I. Bei negativen Kristallen treten diese Er­

Größe 1/hf = K wird als Mallardsche Konstante

scheinungen in den benachbarten Quadranten

bezeichnet. Der in der Zwischenbildebene ge­

D = dh ergibt sich sin

D/hf Die

auf. Bei Verwendung des Kompensators (Grau)

messene Mittenabstand ist mit K zu multiplizie­

beobachtet man im II. und IV. Quadranten und

ren, um den Sinus des im Objektraum zugeord­

bei negativen Kristallen in den benachbarten

neten Winkels zu erhalten. Mit

Quadranten Kompensationspunkte. Die Verhält­

daraus der scheinbare AchsenwinkeL Es besteht

nisse bei zweiachsig positiven Kristallen sind in

also zunächst die Aufgabe, die Mallardsche Kon­

u =

E ergibt sich

der Diagonalstellung, die von zweiachsig negativen

stante für verschiedene Objektiv-Okular-Kom­

in der Normalstellung dargestellt. In der Normal­

binationen festzulegen. Dazu benötigt man eine

stellung sind die beiden Isogyrenäste zu einem

senkrecht

Kreuz verschmolzen, das bei Anwendung des

Platte eines zweiachsigen Kristalls, für die also

zur

spitzen

Bisektrix

geschnittene.

Kompensators (Rot I) in der roten Farbe des

die beiden Achsenaustritte im Bildfeld zu be­

Kompensators erscheint. In der Diagonalstellung

obachten sind. Je größer dieser Winkel zwischen

liegt die Achsenebene in der Richtung SW-NO

den Achsenaustritten ist, um so höher muß die

und in der Normalstellung verläuft sie horizontal

Apertur des zur Messung verwendeten Objektivs

0-W. DieFarbänderungen im Bereich der Achsen­

sein. Es werden hierzu nicht zu dünne Platten aus­

austritte sind ebenfalls charakteristisch und sinn­

gewählt,

gemäß zu deuten.

scharf ausgebildet sind. Man kann in der Diago­

Messung des Achsenwinkels Der Achsenwinkel bei zweiachsigen Kristallen ist

damit

nalstellung

die

Hauptisogyren

(45°-Stellung)

oder

möglichst

auch

in

der

Normalstellung (Kreuzstellung) messen und be­ nutzt zur Messung eine Okularmeßplatte oder ein

ein ausgezeiclmetes Charakteristikum von kristal­

Meßschraubenokular,

lisierter Materie, das mit dem Polarisationsmikro-

Objektmeßplatte ausgewertet wurden. Die Zu­

die

vorher

mit

einer

ordnung Länge- Winkel erfolgt unter Zugrunde­ legung bekannter Achsenwinkel, die vorher mit einem Achsenwinkelapparat festgestellt wurden. Auch eines der bekannten Apertomeier nach Abbe oder Metz eignet sich für solche Winkel­ bestimmungen. Es bietet den Vorteil, daß kon­ tinuierlich veränderliche Winkel zur Messung zur I!

I

II

1/

II

Verfügung stehen. Die mikroskopische Methode der Achsenwinkel­

Bild 6.98. Zusammenhang zwischen V und E, dem

bestimmung hat gewisse Grenzen, die die Ge­

wahren und scheinbaren E Achsenwinkel

nauigkeit beeinflussen. Da die sog. Objektiv-

218

6. Mikroskopierve1jahren und ihre Anwendung

Kristall

einachsig positiv

ohne Kompen­ sator

}. (Rot I)

?./4

einachsig negativ

6.1. Durchlichtmikroskopie

Normalstellung zweiachsig negativ

219

Diagonalstellung zweiachsig negativ

Bild 6.97. Achsenbilder ein- rmd zweiachsiger Kristalle ohne und unter Mitwirkung von Kompensatoren Ä (Rot 1) und Ä/4 (Grau 1) Einschieberichtung des Kompensators: (SO-NW, optische Orientierung der Schwingungsrichtung des verwendeten Kompensators

ny

(SW- NO).

Die typischen Kompensationsstreifen und -punkte, die Additionsfarben an den Isogyren und Isochromaten sowie das charakteristische Wandern der Isochromaten sind skizzenhaft dargestellt.

220

6. MikroskopierveJfahren und ihre Anwendung

brennebene in Wirklichkeit eine besonders nach

Dimensionen zu ermitteln. Sie gestattet ebenfalls

dem Rande

Aussagen über die Lage der Indikatrix zu mar­

zu

stärker gekrümmte Fläche ist,

die in ihr liegenden Bildpunkte beim Messen je­

kanten kristallografischen Richtungen, wie Spalt­

doch auf eine Ebene projiziert sind, werden die

rissen, Kristallkanten und Zwillingsgrenzen, fest­

Abweichungen vom wahren Winkelwert nach

zuhalten. Es ist nicht möglich, hier einen um­

dem Rande des Bildfelds zu groß, d.h., die

fassenden

Mallardsche

Arten des nutzbaren Einsatzes zu geben, man

Konstante ist

keine solche.

Bei

Überblick

über

die

verschiedenen

modernen Objektivkonstruktionen ist dieser Feh­

kann nur das Grundsätzliche der Methode dar­

ler jedoch gering, so daß die Bestimmung des

stellen.

Achsenwinkels mit einer für die Praxis genügen­ den Genauigkeit auszuführen ist.

Instrumenteller Aufbau des U-Tisches

Grundsätzlich ist der beschriebenen Methode eine

Je nach mechanischer Ausführung unterscheidet

Grenze gesetzt, da keine größeren Winkel ge­

man zwei- und mehrachsige Drehtische.

messen werden können, als es die Apertur des be­

werden für die grundsätzlichen Ausführungen

Wir

nutzten Objektivs zuläßt. Auch muß die Apertur

den vierachsigen U-Tisch auswählen und einige

des Kondensors so auskorrigiert sein, daß die

ergänzende Bemerkungen zum fünfachsigen hin­

volle Öffnung des Objektivs ausgeleuchtet ist.

zufügen.

Man verwendet daher für solche Messungen

Dreh-

aplanatisch-achromatisch

eme kardanische Anordnung ermöglicht. Dabei

korrigierte

Konden­

und

Kippbewegungen

werden

durch

soren. Achsenwinkelmessungen an Schnitten, die nicht senkrecht zur spitzen Bisektrix, aber senk­ recht zur Ebene der optischen Achsen getroffen sind, können mit der beschriebenen, jedoch ge­ ringfügig

modifizierten

Methode noch durch­

geführt werden. Achsenwinkelbestimmungen an Schnitten normal zu den Bisektrizen bei beliebig großem Achsenwinkel oder normal nß sind über Gangunterschiedsmessungen im Interferenzbild möglich [185]. Bild 6.99. Bezeichnungsschema

V-Tisch-Methoden Die nutzbare Verwendung von Universaldreh­ tisehen

zusammen

mit

einem

Polarisations­

mikroskop geht auf E. V. Fedorow [185] zurück. Obwohl diese Methode nicht alle wünschens­

der Dreh- und Kippachsen nach Berek am V-Tisch A1, A3, A5 vertikale

Drehachsen; A2, A4 horizontale

Kippachsen; A1 bis A4 Achsen am U-Tisch; A5 Dreh­ achse des Mikroskoptisches Index von innen nach außen am U-Tisch steigend

werten kristall-optischen Methoden durchzufüh­ ren gestattet, also keine "Universalmethode" dar­

liegen die Achsen in der Ausgangsstellung senk­

stellt, hat sie doch viele kristalloptische Unter­

recht

suchungsarten wesentlich ergänzt und fruchtbar

Bild 6.99

zur

oder

in

der

gezeigt wird.

Tischebene,

wie

im

Die Bezeichnung der

erweitert. Sie ist aus der praktischen Polarisations­

Achsen wurde nach Berek gewählt. Das hat hin­

mikroskopie nicht mehr fortzudenken, vor allem,

sichtlich der Systematik den Vorteil, daß die Be­

nachdem Schumann [200] die ergänzende Methode

tätigung einer Achse mit höherem Index die Lage

der Drehkonoskopie bekanntgab.

aller vorhergehenden Achsen mit kleinerem Index

Im

Prinzip

beruht die U-Tischmethode darauf, daß mit einer

ändert, die mit höherem Index jedoch nicht. Die

im Raum drehbaren Vorrichtung in Form eines

Achsen mit ungeradem Index stehen senkrecht

Drehtisches, der früher mit dem Mikroskop fest

und die mit geradem Index horizontal. Außer der

verbunden war und heute als Zusatzeinrichtung

Berekschen

zum Polarisationsmikroskop gebaut wird, die

anderer Autoren, auf die hier nur hingewiesen

Bezeichnungsweise

gibt

es

solche

Möglichkeit geschaffen ist, ein Mineralkorn nach

werden kann [185].

verschiedenen Richtungen zu durchmustern. Hier­

Im Bild 6.100 ist der vierachsige Drehtisch aus

durch wird es möglich, bei direkter und indirek­

der Jenaer Fertigung auf dem Mikroskoptisch

ter Beobachtung die Orientierung der Indikatrix

des AMPLIVAL pol d dargestellt.

und mit Doppelbrechungsmessungen und Im­

Mit einer Grundplatte 1 wird der U-Tisch auf

mersionsmethoden auch ihre Form und ihre

dem Mikroskoptisch mit Befestigungsschrauben 4

6.1. Durclilichtmikroskopie

221

bezeichnet. Die Kippwinkel a4 nach vorn und nach hinten sind an einer Meßtrammel eben­ falls mit einem Nonius auf 0,1° abzulesen. Diese sitzt

nach Aufsetzen

des

U-Tisches auf den

Mikroskoptisch zur rechten Hand des Beobach­ ters. Die Drehachse A5 stellt die Drehachse des Mikroskoptisches dar. Sie verläuft der optischen Achse des Polarisationsmikroskops parallel und ist erforderlich, um den U-Tisch in die Diagonal­ stellung zu bringen. Moderne Tische eines Polari­ sationsmikroskops

haben

deshalb

eine

45°­

Rastung. In der Ausgangsstellung des U-Tisches verlaufen die Vertikalachsen A1,

A3

und A5

untereinander parallel, die Horizontalachsen A2 und A4 rechtwinklig zu diesen und untereinander. Außer A1 sind alle Achsen mit entsprechenden Klemmschrauben 4, 7und I 0 in jederStellung arre­ tierbar. Das untereTeil der erforderlichen durch­ sichtigenSegmente(es werden zu dem U-TischSeg­ mentpaare mit drei verschiedenenn0- Werten gelie­ fert:n0

=

1,516;n0

=

1,556;n0

=

1,648)wird im

Mittelteil des U-Tisches in ein Ringlager ein­ gehängt, das Präparat auf ihm mit Immersions­ flüssigkeit entsprechender Brechzahl blasenfrei in optische Verbindung gebracht.

Das obere

Segment 9 wird ebenfalls mit Immersionsflüssig­ keit versehen und dann über dem Präparat mit einer Befestigungsschraube im Mittelteil befestigt. Aus Gründen der Beweglichkeit des U-Tisches werden die oberen Segmente oft kleiner gehalten; Bi fd 6.1 00. Vierachsiger U- Tisch auf dem Drehtisch des AMPLIVALpof d

1 Grundplatte des U-Tisches; 2 Arretierungsschraube für die Zentrierung; 3 Zentriervorrichtung für den U-Tisch; 4 Befestigungsschraube für den U-Tisch auf dem Mikro­ skoptisch; 5 Gradteilung für A3-Achse; 6 Gradteilung für A2-Achse; 7 Arretierung für A4-Achse; 8 Gradteilung für A4-Achse; 9 oberes Segment mit Halterung; 10 Arretie­ rungsschraube für A2-Achse YEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

das beeinflußt die Meßgenauigkeit, die aber auch dann noch für die Meßpraxis ausreichend ist. Die zum U-Tisch empfohlenen Objektive sind für die Verwendung mit den Segmenten besonders kor­ rigiert und als solche mit S gekennzeichnet. Die stärkeren Objektive haben zur Beschränkung der Beobachtungsapertur

Irisblenden.

Wegen

der

höheren Objektlage müssen die Schnittweite des Kondensors und seine Apertur besonders berech­ net sein, um für den direkten und den indirekten Strahlengang volle Ausleuchtung zu garantieren.

befestigt. Das Gestell, das die Achsen trägt, ist

Die

auf einer Grundplatte zentrierbar angeordnet.

Schnittpunkt der Achsen liegen muß, erfolgt mit

Die Achse A1 (Bilder 6.99 und 6.100) ist die

einer besonderen Vorrichtung.

Höhenverstellung des

Präparats,

das im

innere Vertikalachse; der ihr zugeordnete Teil­

Nachdem der U-Tisch auf dem Drehtisch des

kreis ist auf 1° ablesbar. Die Kippung um die

Polarisationsmikroskops montiert ist, muß er

Horizontalachse A2 wird auf einem dem Beob­

justiert werden. Dazu gehört vor allem zunächst

achter zugewandten Zylinderstück 6 mit einer

die Justierung der Objektive und des U-Tisches

Gradteilung und einem Nonius abgelesen (Ab­

zur Achse des Drehtisches.

lesegenauigkeit 0,5°). Die Drehung um die zweite

Im einzelnen hält man sich hierbei an die Justier­

Vertikalachse A3 wird an dem äußeren Tisch­

vorschriften,

ring 5 ebenfalls an einer Gradteilung zusammen

U-Tische aufgestellt und empfohlen werden.

mit einem Nonius auf 0,1° abgelesen. Die Hori­

Bei indirekten Beobachtungen müssen Objektive

zontalachse A4 wird häufig auch als Kontrollachse

höherer Apertur, z.B. 30/0,60 S, verwendet wer-

die von den Herstellern solcher

6. Mikroskopiervel:fahren und ihre Anwendung

222

den; dazu ist eine entsprechende Beleuchtungs­

tionen würde hier zu weit führen. Ihre Hand­

apertur einzustellen.

habung ist aus Spezialliteratur [197] [205] zu ent­

Weichen die Brechzahlen des zu untersuchenden

nehmen.

Materials von denen der zur Verfügung stehenden

Auch einachsige Kristalle können mit dem U­

Glassegmente ab(> 0,1), so müssen die Winkel­

Tisch vermessen werden. Man muß dabei be­

ablesungen am U-Tisch korrigiert werden. Hierzu

achten,

sind besondere Verfahren entwickelt worden.

Symmetrieachse der Indikatrix darstellt und daß

Meist benutzt man zur Korrektion der Winkel

jede durch diese verlaufende Ebene eine Symme­

daß

die

optische

Achse

immer

eine

Nomogramme. Sie liegen vor nach Angaben von

trieebene ist. Das heißt, für eine eingestellte Rich­

E. V.Fedorow und von E.Tröger [196] [197].

tung bleibt eine Richtung beim Kippen um A4

Das Prinzip der Anwendung des U-Tisches be­

immer erhalten, woraus folgt, daß cx2

ruht darauf, an Kristallen die optischen Symme­

Diese Methode wurde besonders zur Bestim­

trieebenen aufzusuchen und den Charakter der

mung der Zwillingsgesetze an Feldspaten und zur

=

0 ist.

darauf senkrecht stehenden Hauptschwingungs­

Ermittlung des Chemismus der Plagioklase ent­

richtung zu bestimmen. Dabei wird so vorgegan­

wickelt. Dabei werden auch Spaltflächen und

gen, daß zunächst das Präparat durch Drehen

Zwillingsverwachsungsebenen eingemessen. Die

um A1

in die Auslöschungsstellung gebracht

Meßergebnisse werden auch hier in stereografi­

wird. Eine folgende Kippung um A4 nach vorn oder hinten stellt fest, ob Aufhellung erfolgt oder

sche Projektionen übertragen und können mit Nomogrammen, die auf Fedorow, Nikitin u. a.

nicht. Erfolgt Aufhellung, so liegt eine optische

zurückgehen, ausgewertet werden. Spezielle U­

Symmetrieebene nicht normal zu A4. Die Dunkel­

Tischmethoden gestatten die Messung von Gang­

stellung wird durch ein Kippen um A2 nach links

unterschieden in einer bestimmten Richtung, die

oder rechts wieder hergestellt. Erneutes Kippen

Ermittlung von 2 V aus Gangunterschiedsmessun­

um A4 gibt Auskunft, ob die erlangte Dunkel­

gen, Bestimmung der drei Hauptdoppelbrechun­

stellung erhalten bleibt; wenn nicht, muß durch

gen und der Schliffdicke aus der bekannten Dop­

erneutes Drehen um A1, wobei A4 auf Null ein­

pelbrechung

gestellt ist, weiterkorrigiert werden. Dieser Pro­

Pleochroismus und der Absorption zweiachsiger

zeß wird fortgesetzt,

des

Quarzes,

Bestimmung

des

bis die Dunkelheit bei

Kristalle u.a. Die Untersuchung der Pyroxene

Drehung der Kippachse A4 erhalten bleibt. Jetzt

und Amphibole u.a. Mineralgruppen nach ähn­

steht fest, daß eine optische Symmetrieebene

lichen Methoden steckt erst in den Anfängen.

normal zur Achse A4 steht, d.h., in der Richtung

Noch einige Worte über den fünfachsigen U­

A4liegt eine Hauptschwingungsrichtung (

Tisch. Er wurde im Jahre 1929 durch Ernmons

metrieachse). Azimut cx1

=

Sym­

und Kippwinkel cx2

[187] eingeführt.

Die fünfte Achse liegt hori­

dieser Symmetrieebene werden an den entspre­

zontal und senkrecht zur A2 und wird gemäß

chenden Teilkreisen abgelesen, wobei zu unter­

der Berek-Nomenklatur zweckmäßig als A; be­

scheiden ist, ob A2 nach links oder nach rechts

zeichnet. Sie liegt also ebenfalls der Richtung

gekippt wurde. Daran anschließend wird der

der

Charakter

optischen

der

eingestellten

Symmetrieebene

(Normale zur Symmetrieebene) mit Hilfe von

A4-Achse parallel. Nach Einstellung der Indikatrix

auf

einem

fünfachsigen

Drehtisch wird die A;-Achse durch Drehen um

Kompensatoren nach früher beschriebenen Me­

A3 in eine Ebene gebracht, die senkrecht zu A4

thoden in der 45°-Stellung bestimmt (s. Ab­

und A2 liegt. Wenn dann A4 bis zur größten

sehn. 6.1.4.2.).

Symmetrie­

Helligkeit gekippt wird, kann durch Kippung um

ebene die optische Achsenebene, so liegt bei zwei­

Ist

die

eingestellte

A; die Dunkelstellung wiederhergestellt werden.

achsigen Kristallen n

in der Richtung A4• Tritt ß beim Kippen um A4 zweimalige Verdunklung

Dann liegt bereits die zweite Symmetrieebene parallel zum Vertikalfaden im Fadenkreuzokular.

ein, so kann der Achsenwinkel 2 V gemessen

Ihre Vermessung kann also sofort in der bekann­

werden. Tritt beim Kippen um A4 keine Ver­

ten Art erfolgen. Nach diesem Verfahren ist die

dunklung ein, so liegt in der Richtung A4 ny oder

Anfertigung

nrx. Auf die gleiche Weise wird die Bestimmung

nicht mehr erforderlich, weil bei zweiachsigen

der

zweiten

Symmetrieebene

einer

stereografischen

Projektion

vorgenommen.

Kristallen alle Parameter so ermittelt werden

Durch Eintragen der Meßergebnisse in ein stereo­

können, wenn es die Schnittlage des Präparats

grafisches Netz kann die Lage der dritten Symme­

überhaupt erlaubt.

trieebene konstruktiv ermittelt werden. Die Be­

Es wäre noch zu erwähnen, daß durch Leitz und

schreibung der Durchführung solcher Projek-

Winkel-Zeiss Zusatzeinrichtungen zum U-Tisch

6.1. Durc!tlic!ttmikroskopie

223

gebaut wurden, die eine Erwärmung des Präparats

Nach der Stokessehen Regel ist die zu beobach­

(meistens körnig) ermöglichten, um, nach einem

tende emittierte Fluoreszenzstrahlung stets länger­

der beschriebenen Immersionsverfahren für die

wellig als die Erregerstrahlung. Dadurch ist es

Brechzahlbestimmung, die Brechzahlen für orien­

möglich,

tierte Lagen des Präparats zu bestimmen.

durch Farbfilter zu trennen.

Anregungs-

und

Emissionsstrahlung

6.1.5.2.

6.1.5.

Aufbau des Fluoreszenzmikroskops

Fluoreszenzmikroskopie

Die Leistungsfähigkeit eines Fluoreszenzmikro­

von Dr. rer. nat.Ludwig Otto

skops wird durch die Eigenschaften seiner wesent­

Neubearbeitung von

lichen Baugruppen, der Anregungslichtquelle, der

Dipi.-Phys. Gerhard Börner

Filter und der Optikausrüstung bestimmt (Bil­ der 6.101 bis 6.103). Die optimale Lichtquelle der

6.1.5.1.

Fluoreszenzmikroskopie muß im Spektrum, das

Allgemeine Betrachtungen

die Absorptionsgebiete aller verwendeten Fluoro­

Der zur Fluoreszenz führende physikalische Vor­

chrome umfaßt, eine ausreichend hohe Leucht­

gang ist eine intramolekulare Energieumsetzung,

dichte haben. Im Emissionsgebiet der Fluoro­

die durch Einwirkung energiereicher Strahlen auf

chrome darf dagegen praktisch keine Energie

bestimmte Substanzen induziert wird. Der Ge­

mehr ausgestrahlt werden. Es ist denkbar, daß

samtkomplex

\V ird

als Lumineszenz bezeichnet

diese Forderungen von einem durchstimmbaren

und nach zeitlichen und energetischen Gesichts­ punkten gegliedert.

Von Lumineszenz spricht

man, wenn geeignete Substanzen - Festkörper, Flüssigkeiten oder Gase - bei Anregung mit energiereicher Strahlung eine Eigenstrahlung aus­ senden, deren Wellenlänge größer ist als die der Anregungsstrahlung. Von den Arten der Lumi­ neszenz mit unterschiedlichem Modus der Ener­ gieumsetzung, z. B. Thermo-, Chemo-, Elektro-, Fotolumineszenz usw., interessiert für die Fluo­ reszenzmikroskopie die Fotolumineszenz, d. h. die Anregung durch Lichtstrahlen.

Die Zeit­

spanne zwischen Anregung und Emission ist da­ von abhängig, wie schnell die Leuchtelektronen des Molekülverbands die Energieniveaus wech­ seln. Geschieht dies innerhalb einer Zeitspanne von 10-9 bis 10-7 s, spricht man von Fluores­ zenz. Länger andauerndes Nachleuchten gilt als Phosphoreszenz. Da in der Mikroskopie fast ausschließlich Fluo­ reszenzerscheinungen

beobachtet

werden

und

auch beim gemeinsamen Auftreten von Fluo�

2

und Phosphoreszenz in einem Objekt die Fluores­ zenz das wesentliche Diagnosemittel ist, hat man die Bezeichnung Lumineszenzmikroskopie ver­ lassen

und

ist

3

I

zur Bezeichnung Fluoreszenz­

mikroskopie übergegangen. Einige Präparate haben

von

sich aus die Eigen­

schaft zu fluoreszieren; sie zeigen Primärfiuores­ zenz. Die meisten Präparate müssen jedoch erst mit bestimmten Farbstoffen - Fluoroehromen behandelt werden und zeigen danach bei ent­ sprechender Bestrahlung sog. zenz.

Sekundärfiuores­

Bild 6.10 I. Schema eines Fluo reszenzmikro skops mit Anregung im Durchlicht-Hellfeld-Strah/engang

1

2 Lichtquelle; 3 Kollektor; 4 Leuchtfeld­ 5 Erregerfilter; 6 Umlenkspiegel; 7 Apertur­ blende; 8 Kondensor; 90bj ekt; JOObj ektiv; 11 Zwischen­ bildebene; 12 Okular; 13 Sperrfilter Hilfsspiegel;

blende;

224

6. lvlikroskopierve!j'a/zren und ihre Anwendung

Farbstofflaser erfüllt werden können [210] [234].

mit einer Quecksilberlinie zusammenfällt, oder in

Die z. Z. verwendeten Lichtquellen stellen einen

der Fluorometrie,

von den technischen Möglichkeiten diktierten

schaften nützlich sind, werden z.T. Xenon-Höchst­

Kompromiß

dar.

Für

Fluoreszenzforschungs­

wo ihre guten Brenneigen­

drucklampen eingesetzt.

mikroskope und für quantitative Untersuchungen

Hochleistungsfluoreszenzmikroskope

(Fluorometrie)

einer Quecksilber-Höchstdrucklampe vom Typ

werden

aus Intensitätsgründen

nur Gasentladungslampen,

meist

Quecksilber­

Höchstdrucklampen, verwendet. Ausschlaggebend

sind

mit

HBO 200 o. ä. ausgerüstet. Bei Beurteilung der Leistung der HBO-Typen darf man nicht allein von

der

Lampenleistungsaufnahme

ausgehen.

Die Intensität der mit der HBO 200 erzeugten Fluoreszenzbilder ergibt gegenüber der HBO 50 9

i. allg. nur den Faktor 2 und nicht 4, wie man aufgrund

des

Verhältnisses der

Leistungsauf­

nahme vermuten könnte. Entscheidend ist die Intensität im eigentlich interessierenden kurz­ welligen Bereich und inwieweit bei Köhlerscher Beleuchtung das Lichtquellenbild die Eintritts­ pupille der Beleuchtungsoptik ausleuchtet. Lam­ pen noch höherer Leistungsaufnahme bringen

��-{ ::�-{

keine Steigerung der Helligkeit der Fluoreszenz­ bilder. Die Erklärung ist darin zu suchen, daß eine gewisse Menge anregungsfähiger Substanz, wie sie im mikroskopischen Präparat vorliegt, nur ein bestimmtes Maß an zugeführter Energie in Fluoreszenzlicht umsetzen kann.

Wenn dieses

Maß für das gesamte Sehfeld erreicht ist, geht weiter zugeführte Energie gleicher Wellenlänge

Bild 6.102. Schema eines Fluoreszenzmikroskops mit Anregung im Auflicht-Hellfeldstrahlengang und gleichzeitigem Durchlicht-Phasenkontrast

1 Leuchtfeldblende; 2 Kollektor; 3 Lichtwurflampe; 4 Hilfsspiegel; 5 Anregungslichtquelle; 6 Kollektor; 7 Leuchtfeldblende; 8 Erregerfilter; 9 Okular; 10 Zwischenbildebene; 11 Sperrfilter; 12 Teilerspiegel; 13 Phasenring; 14 Objektiv; 15 Objekt; 16 Kondensor; 17 Ringblende; 18 Grünfilter; 19 Umlenkelement

für diese Wahl ist die Tatsache, daß die dem kontinuierlichen Untergrundspektrum überlager­ ten charakteristischen Quecksilberlinien bei },

=

313, 334, 365, 405, 435 und 546 nm in Anregungs­ bzw. Absorptionsgebieten vieler Fluorochrome liegen [242]. Die Intensität des tageslichtähnlichen kontinuierlichen Spektrums von Xenon-Höchst­ drucklampen (z. B. XBO 75, XBO 101, XBO 150) erreicht bei weitem nicht die Intensitätsmaxima der Quecksilberlinien. Nur bei Verwendung von Fluorochromen, deren Anregungsbereich nicht

Bild 6.103. Schema eines Fluoreszenzmikroskops mit Anregung im Durchlicht-Dunkelfeldstrahlengang

1 Hilfsspiegel; 2 Lichtquelle; 3 Kollektor; 4 Leuchlfeld­ blende; 5 Erregerfilter; 6 Umlenkspiegel; 7 Kardioidkon­ densor;

8 Objekt; 9 Objektiv; 10 Aperturblende; 11

Sperrillter; 12 Zwischenbildebene; I 3 Okular

6.1. Durchlichtmikroskopie

unverändert durch das Präparat hindurch, ohne

225

Interferenzfilter hinzugekommen. Hier erfolgt die

die Helligkeit des Fluoreszenzbilds zu steigern.

Selektion der Anregungswellenlängen, indem die

Vor allem aus Preisgründen werden seit einiger

unerwünschten

Zeit bei Routineuntersuchungen Halogenlampen

durch Interferenz ausgelöscht werden. Mit Hilfe

Anteile

des

Lampenspektrums

mit einer Leistung von 100 W eingesetzt. Sie haben

der Kurzpaßfilter können hohe Forderungen in

im Ultraviolett und Violett keine bzw. nur sehr

bezug auf Durchlässigkeit, Kantensteilheit und

geringe Strahlungsanteile, weshalb auch nur die

gute Sperrung im Fußpunkt verwirklicht werden.

Anregung bestimmter Fluorochrome möglich ist.

Die zweite für fluoreszenzmikroskopische Zwecke

Die Intensität der Gesamtstrahlung verhält sich

unentbehrliche Filtergruppe sind die Sperrfilter,

zu

Quecksilber-Höchstdrucklampen

in der Literatur auch als Okularsperrfilter be­

Relativ zur Anregungs­

zeichnet. Sie haben die Aufgabe, die im Objekt

der

von

etwa wie

1 : 10 [222].

strahlung ist die Stärke der Fluoreszenzstrahlung

nicht in Fluoreszenzstrahlung umgesetzte An­

sehr gering. Die Ausbeute beträgt zwischen

regungsstrahlung abzufiltern,

1,0

damit diese

das

Da das menschliche Auge aber in der

Fluoreszenzlicht nicht überstrahlt und im Auge

Lage ist, Fluoreszeozintensitäten wahrzunehmen,

des Beobachters auch keine Schutzfluoreszenz

und

0,1 %.

,die durch die Umsetzung von nur eingestrahlten

0,0002%

der

Anregungsenergie hervorgerufen

werden, ist eine Beobachtung trotzdem möglich.

hervorruft.

Die

Sperrfilter

müssen

deshalb

zwischen Objekt und Empfänger der Fluoreszenz­ strahlung angeordnet werden.

Die Filteranlag� ist eine weitere grundlegend wich­

Die technische Lösung in den ersten Jahrzehnten

tige Baugruppe

der Fluoreszenzmikroskopie, die Sperrfilter durch

jedes Fluoreszenzmikroskops.

Man versteht darunter seine Ausrüstung mit

Aufsteckfassungen über den Okularen zu be­

Anregungs-,

festigen, ist verlassen worden. Es haben sich be­

Dämpfungs-,

Konversions-

und

Sperrfiltern und die mechanische Unterbringung

stimmte

dieser Filter im Strahlengang. Sinngemäß sind

gebildet, so daß sich die feste Lagerung der Sperr­

Standardfilterkombinationen

heraus­

auch die Teilerspiegel bei Auflichtkondensoren

filter in einer Wechselvorrichtung anbietet. Zwar

zur Filteranlage zu rechnen.

verlangt die mit dieser Konstruktion verbundene

Die Bezeichnungen aller im folgenden genannten

Anbringung der Filter zwischen Objektiv und

auf Filtergläser, mit

Okular eine höhere Güte des Farbglases, seiner

denen die Geräte des VEB Carl Zeiss JENA aus­

Oberflächenbearbeitung und der Flächenparalle­

gerüstet

praktischem

lität, doch macht die Realisierung dieser Forde­

Ergebnis können natürlich auch Filter anderer

rungen der modernen Optiktechnologie keine so

Glasfilter

beziehen werden.

sich Mit

gleichem

Hersteller verwendet werden, wenn sie gleichen

großen Schwierigkeiten mehr, daß der Konstruk­

oder ähnlichen Durchlässigkeitsverlauf zeigen.

teur auf die Bedienungsvorteile verzichten müßte,

Die Anregungsfilter, die jene Wellenlängen aus

die der Einbau einer Sperrfilterwechselvorrich­

dem Emissionsspektrum der Lampe aussondern,

tung dem Benutzer bietet. Der Einbau von Sperr­

die für das gewünschte Anregungsverfahren er­

filtern in das Objektiv, der gelegentlich versucht

forderlich sind, finden zwischen Kollektor und

wurde, hat sich aus optischen und methodischen

Kondensor Platz. Abgesehen von ganz speziellen

Gründen nicht bewährt.

Routinefluoreszenzmikroskopen muß die Wechsel­

Außer den aus sog. Anlaufgläsern bestehenden Sperrfiltern werden auch Interferenzfi lter und so­

barkeit aller Filter gewährleistet sein. Weitere Forderungen sind ihre unmißverständliche Kenn­

gar Beobachtungsmonochromatoren verwendet,

zeichnung und eine Anordnung im Gerät, die zu

da erst dieser Mehraufwand bei manchen fluores­

keinen Schäden durch die Wärmestrahlung der

zenzmikroskopischen Problemen zu befriedigen­

Lampe Anlaß gibt.

den Ergebnissen führt.

Die Hersteller erfüllen diese Bedingung durch

Für die Fluoreszenzanregung im auffallenden

Wärmehärtung der Filter, durch Anordnung der

Licht ist ein Planglasilluminator nötig, der Inter­

Filter

ferenzfilterschichten trägt. Diese bewirken eine

in

angemessener

Entfernung

von

der

Wärme­

vorwiegende Reflexion der kurzwelligen Erreger­

schutzgläsern, die die Ausbeute an Amegungs­

strahlung, die längerwellige Fluoreszenzstrahlung

Lampe

oder

durch

Einführung

von

strahlung nicht wesentlich schmälern.

wird dagegen bevorzugt hindurchgelassen. Solche

Zu den konventionellen Glasfi.ltern, deren selek­

di- oder polychromatische Spektralteiler (Teiler­

tierende Wirkung auf dem Absorptionsvermögen

spiegel) unterstützen bei genauer Abstimmung auf

verschiedener Metallionen beruht, sind in den letzten Jahren die als Kurzpaßfilter wirkenden

die zugeordneten Erreger- und Sperrfilter diese in

15

Beyer, Mikroskopie

ihrer Wirkung [240]. Ebenso wie die Filter müs-

226

6.

Mikroskopierue1/ahren und ihre AniVendung

sen die Teilerspiegel zur Anpassung an die jeweils gewählte Fluorochromierung wechselbar sein. An die Mikroskopoptik stellt die Fluoreszenz­ mikroskopie bestimmte Anforderungen, deren Beachtung die Ergebnisse merklich verbessern kann. Die Beleuchtungsoptik soll eine möglichst hohe Durchlässigkeit im Bereich der Anregungs­ strahlung und der Kondensor eine möglichst hohe Apertur aufweisen. Beide Forderungen zielen auf hohe Anregungsintensität Mit der Apertur des Kondensors steigt die Beleuchtungsstärke, d. h. die auf das Objekt konzentrierte Anregungs­ energie. Die Fluoreszenzmikroskopie unterschei­ det sich bezüglich des Zusammenwirkens von Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang grundsätzlich von anderen Mikroskopierverfah­ ren. Der Beleuchtungsstrahlengang trägt nur mittelbar zur Abbildung des Objekts bei, weil er zur Aussendung von Objektstrahlung anregt. Hierdurch wird das fluoreszenzfähige Objekt zum Selbstleuchter; es gelten also die Gesetzmäßig­ keilen für die Abbildung selbstleuchtender Ob­ jekte (s. Abschn. 3.). Große Aperturen sind in der Fluoreszenzmikro­ skopie besonders wegen ihrer hohen Lichtstärke für die abbildende Optik von Bedeutung. Bei gleicher Maßstabszahl erweisen sich Objektive mit höherer Apertur als besser geeignet, weshalb Apochromate als die besten Objektive für die Fluoreszenzmikroskopie anzusehen sind. Die gute Farbkorrektion und besondere Bildqualität dieser Objektive verbessern die Abbildungs­ verhältnisse weiterhin. Als wenig geeignet für reine Fluoreszenzmikro­ skopie erweisen sich die Phasenkontrastobjektive infolge der Beeinflussung der Abbildung durch den eingebauten Phaseming. Beim Kombinations­ beleuchtungsverfahren Phasenkontrast-Fluores­ zenz wird dieser Nachteil zugunsten anderer schwerer wiegender Vorteile in Kauf genommen. Über die Methodik der Fluoreszenzmikroskopie wird später noch zu sprechen sein. 6.1.5.3. Technik der Fluoreszenzmikroskopie

Die verschiedenen Anregungsformen der Fluores­ zenzmikroskopie kann man nach der Art der Führung der Anregungsstrahlung und nach den benutzten Filtern unterscheiden und einteilen. Durch- und Auflichtanregung im Hellfeldstrahlen­ gang sind die verbreitetsten Methoden der Fluoreszenzmikroskopie (Bild 6.101 und Bild 6.102). Moderne leistungsfähige Forschungs­ mikroskope haben beide Möglichkeiten.

Während für spezielle Aufgaben auch Durch­ lichtamegung im Dunkelfeldstrahlengang ver­ wendet wird (Bild 6.103), hat die Auflicht­ Dunkelfeldbeleuchtung geringere Bedeutung, da hierbei der Vorteil der Dunkelfeldanregung nicht so stark wirksam wird. Er besteht darin, daß das meiste nicht absorbierte Erregerlicht auch nicht abgelenkt wird und am Objektiv vorbeigeht, deshalb einen dunklen Bilduntergrund schafft und so die Filter in ihrer Wirkung unterstützt. Die Wahl zwischen der Anregung im Durchlicht­ oder Auflichthellfeld richtet sich nach den Unter­ suchungsobjekten, den verwendeten Fluoro­ ehromen und nach dem nötigen Objektiv. So ist z.B. für opake Objekte Auflichtanregung erfor­ derlich, und auch bei Fluorochromen, die bevor-. zugt an der Oberfläche des behandelten Werk­ stoffs reagieren, ist diese Art der Strahlenführung günstig. Von ausschlaggebender Bedeutung für die Hellig­ keit des Fluoreszenzbilds ist die Auswahl des Objektivs bzw. seiner numerischen Apertur. Denn während bei Durchlichtanregung die Be­ strahlungsstärke der Anregungsstrahlung fast konstant bleibt (vgl. Abschn.6.1.1.3.), wächst sie bei Auflichtanregung unter Zugrundelegung üblicher Konstruktionsprinzipien mit dem Qua­ drat der numerischen Apertur des Objektivs. Mit Objektiven großen Abbildungsmaßstabs und hoher numerischer Apertur sind daher bei Auf­ lichtanregung hellere Bilder als bei Durchficht­ anregung zu erwarten.

Breitband- und Schmalbandanregung Bei Verwendung von Glasfiltern großer Halb­ wertsbreite ( ;:;; 100 nm) spricht man von Breit­ bandanregung. Sie ist überall dort möglich, wo Absorptions- und Emissionsmaximum des ver­ wendeten Fluorochrom genügend weit ausein­ ander liegen, so daß noch eine Trennung mit den relativ flachkantigen Glasfiltern möglich ist. Die Fluorochrome Acriflavin, Auramin und Euchry­ sin sind Anwendungsbeispiele. Liegen Absorptions- und Emissionsmaxima je­ doch eng benachbart(� 50 nm), so ist eine exakte Trennung von Anregungs- und Fluoreszenz­ strahlung nur möglich, wenn auch erregerseilig sehr steile Kantenfilter (Kurzpaßfilter) verwendet werden. Wie bereits erwähnt, handelt es sich hierbei um spezielle Vielschichteninterferenzfilter, die in den letzten Jahren für die Fluoreszenzmikroskopie entwickelt wurden. Ihre geringere Halbwerts­ breite gegenüber Glasfiltern hat in dem Zusam-

6.1. Durchlichtmikroskopie

menhang den Begriff Schmalbandanregung her­

227

nahmen des Geräte- oder Glasherstellers vor dem

vorgebracht. Der genau festgelegte und relativ

Zerspringen bewahrt werden.

schmale Durchlaßbereich der Kurzpaßfilter für

Viele Objekte der Fluoreszenzmikroskopie ver­

die Schmalbandanregung erklärt auch ihre opti­

lieren unter Wirkung langwelligen Ultravioletts

male Eignung für meist nur ein Fluorochrom.

ihre Fluoreszenzintensität, sie bleichen aus. Diese

Für spezifische fluoreszenzmikroskopische Nach­

Erscheinung tritt besonders bei den

weisverfahren lohnt jedoch der Aufwand in jedem

auf, für die ultraviolette Strahlung zur Fluores­

Objekten

Fall. So sind u. a. für folgende Fluorochrome

zenzanregung nicht erforderlich ist, so daß man

schon spezielle Kurzpaßfilter entwickelt worden:

in diesen Fällen durch Verwendung eines ultra­

Fluoresceinisothiocyanat

(FITC),

violettundurchlässigen Filters Abhilfe schaffen

Rhodaminisothiocyanat

(TRITC),

Tetramethyl­ zum

kann. Derartige Filter bewähren sich auch bei

Nachweis immunologischer Reaktionen], Quina­

der Untersuchung vitalfluorochromierter Objekte,

crine

mustard

die langwelliges Ultraviolett schlecht vertragen.

sowie

zum

[beide

(Chromosomenuntersuchungen)

Nachweis primär

fluoreszierender

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, gibt der VEB Carl Zeiss JENA seinen Filtersätzen einen

biogener Amine.

241

Filter G

gute Zuordnung der Erreger- zu den Sperrfiltern

sperrt langwelliges Ultraviolett bis zurWellenlänge

wichtig, wobei im Fall der Auflichtanregung auch

A

der spektrale T�ilerspiegel in diese Abstimmung

Beobachtungszeit für ultraviolettempfindliche und

=

von

2 mm

Bei der Schmalbandanregung ist eine besonders

Dicke bei. Dieses Glas

375 nm und verlängert damit die mögliche

einbezogen wer 8en muß.

supravitale Objekte beträchtlich bzw. schiebt den

Ungünstig ist einerseits ein zu großer Abstand

Beginn von Veränderungen im Objekt hinaus, die

der sperrenden Kanten von Erreger- und Sperr­

durch

filtern,

werden. Da das Ultraviolettsperrfilter die Gesamt­

da dann zuviel Anregungsenergie ver­

das langwellige

Ultraviolett

verursacht

schenkt wird. Andererseits läßt ein zu starkes

anregungsenergie herabsetzt, kann die Einführung

Überlappen der Filtertransmissionen den Unter­

des Filters eine gewisse Herabsetzung der Fluores­

grund unerwünscht hell erscheinen. Als Richt­

zenzhelligkeit verursachen. Ob man diese Hellig­

wert gilt, daß das Produkt der Durchlässigkeilen

keitseinbuße im Interesse einer längeren stö­

von Erreger- und Sperrfiltern am Schnittpunkt

rungsfreien Beobachtungszeit oder zur Vermei­

ihrer

dung von Strahlungsschäden in Kauf nehmen

0,01%

Durchlässigkeilskurven

zwischen

0

und

kann, hängt vom Untersuchungsvorhaben ab.

liegen soll.

Unter Umständen müssen mehrere Erregerfilter

Vielen Filtersätzen für Fluoreszenzmikroskopie

miteinander kombiniert werden, um den Bereich

werden Dämpfungs-, Neutralfilter, Rauch- oder

der Anregungsstrahlung einzuengen (z. B. B + G

241

224

zur Blauanregung) oder um in einem

Graugläser als Blendschutz beigegeben. Sie haben in

der

Fluoreszenzmikroskopie

selbst

kaum

anderen Bereich noch vorhandene Durchlässig­

praktische Bedeutung, es sei denn, es interessiert,

keilen zu unterdrücken. So haben z.B. die Ultra­

wie manche

violettgläser, die bei Anregung mit Schwerpunkt

hängigkeit von der Intensität der Anregung mit

um A

unterschiedlichen

= 365 nm verwendet werden,

einen zweiten

Durchlässigkeilsbereich im Rot. Diese hindurch­

Objekte,

z. B.

Kristalle,

Fluoreszenzfarben

in Ab­

reagieren.

Sonst haben diese Filter nur Bedeutung bei der

gelassene Strahlung ist im Verhältnis zur Fluores­

Prüfung des Strahlengangs der Fluoreszenzein­

zenz-Strahlung so intensiv, daß die Rotfärbung

richtung oder beim Einsatz der Fluoreszenz­

des Sehfelds erheblich stört und eine fotografische

einrichtung

oder fotometrische Bildauswertung gänzlich in

Arbeiten

für

Frage gestellt wird. Es ist also in der Praxis er­

Eigenarten

forderlich, Ultraviolettgläser mit passenden rot­

Linienspektrum,

andere

müssen der

inhomogener

Wechselstromliebtbogen

B

werden.

BG

38

der Glaswerke Schott, Mainz,

Bei

die

solchen

besonderen

Quecksilberdampflampen,

sperrenden Gläsern zu kombinieren, z. B. mit

226 oder

Zwecke.

allerdings

usw.,

wie

Leuchtkörper, berücksichtigt

oder mit Gläsern entsprechender Eigenschaften

Die gebräuchlichsten Sperrfilter sind

anderer Hersteller. Stets sollte die Dicke dieser

gläser mit besonderen Eigenschaften, sog. Kan­ Ihre

Durchlässigkeit

muß

Anlauf­

Zusatzgläser so gering wie möglich sein, um den

tenfilter.

unvermeidlichen Lichtverlust niedrig zu halten.

regungsbereich praktisch Null sein und oberhalb

im

An­

Die rotsperrenden Filter, die sich infolge ihrer

davon, im Emissionsbereich, möglichst steil an­

beträchtlichen Infrarotabsorption stark erwär­

steigen (Bild

men, müssen durch entsprechende Schutzmaß-

Fluoreszenzmikroskope gehören mehrere Sperr-

6.104).

Zur Ausrüstung moderner

6. Mikroskopierve1jahren und ihre Anwendung

228

filter für die unterschiedlichen Anregungsverfah­

U204 U205

ren.

!t;OIJ

/\

8223 82211

h!lJO

Als Sperrfilter für die UV-Anregung dient u. a. ein Glas vom Typ G 245, dessen Durchlässigkeit im Bereich von 400 bis 500 nm von 0 auf 90 % ansteigt. Man kann mit diesem Sperrfilter die bei UV-Anregung entstehende blaue Fluoreszenz beobachten. Bei Blau- und Blauviolettanregung

Kf/190

benutzt man u. a. die Orangegläser G 249 oder G 247, deren

Durchlässigkeit im Bereich von

520 nm bzw. 500 bis 550 nm von 0 auf über 90 % ansteigt. Verwendet werden diese Gläser z.B. für die Beobachtung der charakteristisch apfelgrünen

&CO

JCJ \'

Fluoreszenz FITC-markierter Immunpräparate. Leider haben die für Orangegläser verwendeten Glassorten Eigenfluoreszenz, wenn sie mit lang­

Kf'560

welligem Ultraviolett bestrahlt werden. Es ent­ steht so der Eindruck eines orangeroten Schleiers über dem Bild, der den Farbkontrast beeinträch­ tigt. Um diesen Fehler zu beseitigen, kann man entweder im Anregungsstrahlengang ein UV­ 600

J!XJ

Sperrfilter einfügen

oder aber vor das fluores­

zierende Sperrfilter ein ultraviolettundurchlässi­

6241

ges Glas bringen, das jedoch die Fluoreszenz­

1500

JOO

strahlung durchlassen muß. Da sich diese Be­ dingungen mit den Forderungen decken, die an ein Sperrfilter für UV-Anregung gestellt werden,

8226 8227

ist der VEB Carl Zeiss JENA dazu übergegangen, vor

jedem Sperrfilter

für

Blauanregung

eine

G 245-Scheibe mit 1 mm Dicke anzuordnen, die die .JOO

Eigenfluoreszenz

der

Orangegläser unter­

drückt.

500

4!XJ

Zur Beobachtung der mit grünem Licht angereg­

62115

ten 300

400

700 800

i500

Rotfluoreszenz

keit erst bei A

621;7

ein

Filterglas

vom

=

590 nm beginnt. Tafel 6.4. ent­

hält in der Fluoreszenzmikroskopie gebräuchliche

1600

JOO

kann

Typ 0 261 eingesetzt werden, dessen Durchlässig­

Filter und -kombinationen und ihr Einsatzgebiet

6249 JOO

ltOO

800

6.1.5.4.

1600

Geräte zur Fluoreszenzmikroskopie FluoreszenzmikroskopischeUntersuchungen kön­

0267

nen mit üblichen Labor-, Arbeits- oder Routine­ mikroskopen durchgeführt werden, wenn diese eine Fokussiereinrichtung für den Kondensor und einen Mikroskopierspiegel haben. Mit Apo­ 500

nm

chromaten,

Fluoreszenzleuchte

und

Filtersatz

wird ein solches Gerät zum vollwertigen Fluores­ Bild 6.104. Durchlässigkeitskurven von Filternfür die Fluoreszenzmikroskopie Erregerfilter:

U 204, U 205, B 223, B 224, KP 490,

KP 560; UV-Schutzfilter: G 241; Sperrfilter: G 245, G 247, G 249 0 261; Rotsperrfilter: B 226, B227

zenzmikroskop. Wünschenswert ist weiterhin eine Wechselmöglichkeit

für

den

Tubus,

um

bei

Objekten, deren Fluoreszenzhelligkeit für bin­ okulare Beobachtung zu schwach ist, auf einen monokularen Tubus ausweichen zu können. Da der binokulare Tubus die Lichtenergie zu

6.1. Durchlichtmikroskopie

229

Tafel 6.4. Gebräuchliche Filter und-kombinationen der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsart

Erregerfilter

Sperrfilter

Ultraviolett

U 204 + B226

G 245

Untersuchung von Primärfluoreszenzen.

(Breitband)

U 205 + B 226

Blauviolett

U 205 + B223

G245 + G247

Untersuchung von Zellen, Kernen, Bakterien,

B 224

G 245 + G 249

Viren u. a. mitAcridinorange,Auramin, Euchrysin,

Einsatzgebiet

Darstellung biogener Amine

Tetracyclin usw. Blau

B 224 + G 241

Chromosomendarstellung mit Quinacrine

(Breitband)

mustard

Blau

KP 490

(Schmalband)

evtl. + B 226

Grün

KP 560

G 245 + G 247

Immunfluoreszenz mit FITC

0261

Immunfluoreszenz mit TRITC

(Schmal band)

etwa

auf die beiden Okularstutzen verteilt,

Einrichtungen

können

können in der Fluoreszenzmikroskopie Situatio­

untersatz

geeigneter

nen eintreten,

magazin bestehen, oder es sind spezielleAuflicht­

50%

bilder unter de

q ei

denen die Helligkeit der Teil­

J Grenzwert für das Dämmerungs­

mit

aus einem Leuchte

Durchlicht­ und

Filter­

kondensoren mit Wechselmöglichkeit für Filter

sehen sinkt und so eine einwandfreie Beobachtung

und Teilerspiegel (Bild

von Einzelheiten nicht mehr möglich ist. Hier

Weit schwieriger werden die Bedingungen, wenn

6.105 und 6.106).

kann man durch Benutzung eines monokularen

außer Anregung im Durchlicht auch noch An­

Tubus weiterkommen, der die Intensitäten der

regung

Teilbilder des binokularen Tubus gewissermaßen

oder Mischlichtanregung angestrebt werden. Der

im

Auflicht,

Kombinationsmethoden

addiert. Di � meisten bedeutenden Mikroskop­

hierfür erforderliche technische Aufwand ist mit

hersteller bieten neben den zur Komplettierung

konventionellen Mikroskopstativen und Zusatz­

vorhandener Ausrüstungen erforderlichen Gerä­

geräten nicht mehr optimal zu bewältigen, und es

ten besondere Fluoreszenzmikroskope oder Ein­

entstehen umfangreiche Spezialgeräte, die man

richtungen für Fluoreszenzmikroskopie an. Diese

als Universalfluoreszenzmikroskope bezeichnen

Bild 6.1 05. Fluoreszenzmikroskop ERGA VAL fl für

Bild 6.1 06. Fluoreszenz-Auflichteinrichtung

Durchlichtanregung

DIALUX

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Firma E.Leitz GmbH, Wetzlar, Werkfoto

am

6. Mikroskopiervelfahren und ihre Anwendung

230

Bild 6.1 07. Universelles Fluoreszenzmikroskop

Bild 6.108. MPV 2 in Ausrüstun g

FLUGVALfür Auflicht-und Durchlichtanregung

für Mikro-Fluorometrie

sowie Kombinationsbeleuchtungsvetfahren,

Firma E.Leitz GmbH, Wetzlar, Werkfoto

Mikrofotografie und Mikroskopfotometrie VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

könnte (Bild 6.107). Derartige Geräte sind neben

Anregung im auffallenden Licht im Hellfeld­

der Fluoreszenzleuchte noch mit einer Mikro­

strahlengang

skopierleuchte mit Glühlampe, Vertikalillumina­

Kombination von Durch- und Auflichtanregung

tor für Fluoreszenzmikroskopie und technischen

im Hellfeldstrahlengang

Hilfsmitteln zur simultanen oder alternierenden

Kombination von Dunkelfeld und Fluoreszenz

Kombination verschiedener Beleuchtungsverfah­

im Durchlicht

ren

ausgerüstet.

Zum

forschungsmikroskope

Teil sind mit

Fluoreszenz­

Einrichtungen

für

Kombination von Durchlichtdunkelfeld mit Auf­ ! ichtfl.uoreszenz

quantitative Auswertung ausgestattet, z. B. Foto­

Kombination von Phasenkontrast und Fluores­

metereinrichtungen zur Messung von Fluores­

zenz im Durchlicht

zenzlichtintensitäten.

Diese,

auch als Fluoro­

Kombination von Durchlichtphasenkontrast mit

meter bezeichneten Geräte bieten die Möglich­

Auflichtfluoreszenz

keit zum Anschluß von Registrier- und Speicher­

Kombination von qualitativer Polarisation mit

einheiten (Bild 6.108). Folgende Untersuchungs­

Fluoreszenz im Durchlicht

möglichkeiten sind denkbar und mit mehr oder

Kombination von qualitativer Durchlichtpolari­

weniger Aufwand durchführbar:

sation mit Auflichtfluoreszenz

6.1.5.5. Fluoreszenz- und Kombinationsverfahren

Hellfeldbeleuchtung im Durchlicht Dunkelfeldbeleuchtung im Durchlicht Phasenkontrast im Durchlicht

Anregung im durchfallenden Licht im Hellfeld­

qualitative Polarisation im Durchlicht

strahlengang

Dieser überraschend breite Einsatzbereich wird

Anregung im durchfallenden Licht im Dunkel­

durch das Vorhandensein verschiedener Leuch­

feldstrahlengang

ten und einer sinnvollen Kombination von ganz-

6.1. Durchlichtmikroskopie

231

und teilreflektierenden Spiegeln (Bild 6.109) be­

zur Differenzierung von Treponema-Stämmen be­

wirkt. Ihre Anordnung erfolgt so, daß an den

währt, die sich durch serologische Reaktionen

Stellen, in denen ein Beleuchtungsstrahlengang

unterscheiden. Sie erfordert bei der Arbeit im

allein seine Richtung ändert, Oberflächenspiegel

Bereich der Immersionsvergrößerungen ein Ob­

verwendet werden, und an den Stellen, in denen

j ektiv

sich zwei Strahlengänge kreuzen oder vereinigen,

erreichen. Das Verfahren läßt sich auch an einer

teilreflektierende die

gleichzeitig

Schichten eingeführt werden, Wellenlängenbereiche

trennen.

Man erreicht so maximale Energieausbeute im

mit Irisblende, um den Dunkelfeldeffekt zu

aus Mikroskop und Leuchte zusammengestellten Ausrüstung durchführen, doch lohnt der Versuch kaum ohne eine Anregungslichtquelle HBO 200.

Anregungsstrahlengang und zugleich eine Licht­

Das zweite Verfahren benutzt zwar auch den

filterwirkung.

der

Dunkelfeldkondensor zur Fluoreszenzanregung,

Strahlengänge läßt sich so die Fluoreszenzanre­

führt die Anregungsstrahlung aber über einen

Bei

geeigneter

Anordnung

gung im Auflicht mit einer ganzen Reihe von

bevorzugt im kurzwelligen Spektralbereich reflek­

Durchlichtbeleuchtungsverfahren

tierenden

kombinieren,

Teilerspiegel und überlagert diesem

ohne daß man andere als serienmäßige Zusatz­

Strahlengang von unten her einen Dunkelfeld­

einheiten, wie Phasenkontrasteinrichtung, Dun­

strahlengang unter Benutzung einer Glühlampe.

kelfeldkondensor oder Polarisationseimichtung,

Gegenüber dem erstbeschriebenen Verfahren ge­

benötigt. Komplizierter wird der Aufbau, wenn

winnt man so die Vorteile der Kombination auch

die Forderung besteht, Fluoreszenzamegung im

mit Ultraviolettanregung, der Möglichkeit, die

Durchlichtstri:'ihlengang mit anderen Durchlicht­

Dunkelfeldobjekte mit Farbfiltern gegenüber den

beleuchtungsverfahren zu kombinieren.

Fluoreszenzobjekten zu kontrastieren, und der

Die Kombination mit Dunkelfeld ist auf zweierlei

besseren Ausleuchtung im Dunkelfeld, denn die

Weise zu realisieren: mit der Fluoreszenzleuchte

inhomogene Strahlungsquelle HBO 200 ist als

allein, indem man Fluoreszenz im Dunkelfeld­

Lichtquelle für Dunkelfeld nicht ideal.

Durchlichtstrahlengang anregt. Dieses Verfahren

Die Kombination mit dem Phasenkontrastverfah­

wird

ren ist ebenfalls auf zweierlei Art möglich:

zur

Unterdrückung

störender

diffuser

Fluoreszenz im Untergrund serologischer Präpa­

Die erste Art ist die Durchführung des Fluores­

rate empfohlen. Durch Ausschalten des Sperr­

zenzverfahrens durch Auflichtamegung und des

filters kann man dem Fluoreszenzbild ein Dunkel­

Phasenkontrastverfahrens mit einer serienmäßi­

feldbild in der Farbe der Anregungsstrahlung

gen Eimichtung im Durchlicht Voraussetzung

überlagern, wenn man Blauviolett- oder Blau­

ist

anregung benutzt. Diese Methode hat sich z. B.

Durchlichtbeleuchtung

ein

Mikroskopstativ,

an

mit

dem

einer

gleichzeitig eingebauten

Bild 6.109. Schema eines universell einsetzbaren Fluor­ eszenzmikroskops FLUGVAL

VEB Carl Zeiss JENA

232

6. MikroskopierveJfahren und ihre Anwendung

Lichtquelle, einer Ansteckleuchte oder einer üblichen Mikroskopierleuchte und Auflicht mit einem Vertikalilluminator, der als Umlenk- und Strahlenteilungselement einen Teilerspiegel ent­ hält, möglich sind. Für die Fluoreszenzanregung bildet man den Spiegel so aus, daß er die An­ regungsstrahlung reflektiert und das Fluoreszenz­ licht durchläßt Ein typischer Vertreter dieser Geräteart ist der Opak-Illuminator OI-17 des Werkes LOMO, Leningrad. Da dieser Illumina­ tor auf den Tubusträger aufgesetzt wird, gestattet er die Verwendung des serienmäßigen Objektiv­ revolvers. Eine andere technische Lösung wird im Bild 6.106 gezeigt. Hier wurde der Opak-Illumina­ tor eingebaut. Diese Bauart hat den Vorteil be­ quemer und dauerhafter Justierung durch den Benutzer. Die eben beschriebene Anordnung er­ laubt sowohl die Beobachtung fluoreszierender Objektdetails als auch nichtfluoreszierender Phasenstrukturen, die eine Erweiterung der Aus­ sage über das mikroskopische Bild ermöglichen. Bedingung ist, daß die Helligkeit des Phasenkon­ trastbilds der desFiuoreszenzbilds,z. B.durch einen Regeltransformator angepaßt werden kann. Die alternative Anwendung von Fluoreszenz­ anregung im Auflicht und Phasenkontrast im Durchlicht hat große Bedeutung in der Fluoro­ metrie erlangt. Die Intensitätsabnahme vieler fluoreszierender Objekte sofort ab Beginn der Bestrahlung behaftet jede Messung mit einem nicht unbedeutenden Fehler. Die oft vorhandene Möglichkeit, bei Glühlampenlicht im Phasen­ kontrast die zu messende Objektstelle auszu­ wählen und erst unmittelbar bei Meßbeginn mit der Objektanregung einzusetzen, ermöglicht auch das Fotometrieren schnell ausbleichender Präparate. Die zweite Art ist die Durchführung von Fluores­ zenz- und Phasenkontrastverfahren, beide im durchfallenden Licht mit einer oder zwei Licht­ quellen. Beide Varianten erfordern eine spezi­ fische Ausbildung des Phasenkontrastkonden­ sors, bei der die Ringblende aus Erregerfilterglas oder -folie hergestellt wird. Das Einsatzgebiet dieser Geräte ist jedoch sehr begrenzt und hat daher auch kaum Bedeutung erlangt. Die wesentlich seltener erforderliche Kombina­ tion Polarisation-Fluoreszenz [218] ist mit einer gemeinsamen Lichtquelle ganz unmöglich, weil beide Teilverfahren im Hellfeldstrahlengang arbeiten und deshalb das Sperrfilter das mit An­ regungsstrahlung entworfene Polarisationsbild auslöscht und bei Weglassen des Sperrfilters das Fluoreszenzbild stark überstrahlt wird. Ab-

gesehen davon, ist die kurzwellige Erregerstrah­ lung den handelsüblichen Filterpolarisatoren keineswegs zuträglich. Die Kombination Polari­ sation-Fluoreszenz ist demnach nur unter Auf­ ! ichtfluoreszenzanregung realisierbar. 6.1.5.6. Mikroskopzubehör und Präpariertechnik

Zur Präpariertechnik für die Fluoreszenzmikro­ skopie sind gegenüber Abschn. 6.1.9. nur einige ergänzende Bemerkungen erforderlich. Auch an das konventionelle Mikroskopzubehör, wie Ob­ jektträger, Objektkammern, Deckgläser, Ein­ bettungsmittel, Immersionsflüssigkeit u. a., wer­ den in der Fluoreszenzmikroskopie keine anderen Anforderungen gestellt als bei sonst üblichen Mikroskopierverfahren. Lediglich die Forderung nach Freiheit von Eigenfluoreszenz muß hier zu­ sätzlich erhoben werden. Sie ist im allgemeinen bei Objektträgern und Deckgläsern erfüllt. Die Prüfung auf Eigenfluoreszenz ist einfach. Man mikroskopiert die Gläser unter dem Fluoreszenzmikroskop. Um die Einstellebene zu markieren, legt man ein paar fluoreszierende Kristallstäubchen, wie Anthrazen, Zinkoxid, Quecksilberchlorür, oder in Fluorochromlösung getauchte Fließpapierfasern auf den Objektträger. Man kann auch einen Strich mit rotem Fettstift anbringen, der gewöhnlich tiefrot fluoresziert. Diese Objekte sollen möglichst klein sein und in möglichst großen Abständen liegen, damit ihre relativ intensive Fluoreszenz nicht die erfahrungs­ gemäß schwache Eigenfluoreszenz der Gläser überstrahlt. Es ist auch anzuraten, bereits be­ nutzte und zur Wiederverwendung gereinigte Gläser vor der Benutzung in der Fluoreszenz­ mikroskopie auf die beschriebene Weise zu prü­ fen, ob die Reinigung gründlich genug vorgenom­ nen wurde oder ob noch verbliebene Rückstände Fluoreszenz verursachen. Da geringe Substanz­ mengen u. U. starke Fluoreszenz zeigen, können derartige Rückstände bei weiteren Untersuchun­ gen stören. Analog kann man das Fluoreszenzverhalten':von Einbettungsmittel, Einschlußmasse und Immer­ sionsflüssigkeit testen. Für lebende und tote, aber nicht konservierte Objekte eignet sich Wasser bzw. die Kulturflüssigkeit, soweit nicht einzelne Komponenten oder Stoffwechselprodukte fluores­ zieren. Zwingt die Methodik, Objekte in einem solchen Substrat zu untersuchen, kann man nur versuchen, durch UV-Sperrfilter oder Anregung im Dunkelfeld- oder Auflichtstrahlengang die Untergrundfluoreszenz herabzusetzen.

6.1. Durchlichtmikroskopie

233

Für die Konservierung werden überall wäßrige

die Leuchtkraft der Präparate merklich nachläßt

Formollösung, Formalindämpfe, Formolalkohol

und der in das umgebende Medium übergetretene

und Carnoy-Gemisch empfohlen

[225].

Als un­

brauchbar gelten dagegen alle quecksilber- und

Farbstoff eine Untergrundfluoreszenz hervorruft, die den Kontrast stark beeinträchtigt.

eisenhaltigen Fixiermittel, weil sie die Fluores­

Der Einsatz von fluoreszenzfreiem Immersionsöl

zenzeigenschaften der Objekte unkontrollierbar

als Einschlußmittel kann nicht ohne Einschrän­

beeinflussen. Wenn Eigenfluoreszenz beobachtet

kung empfohlen werden, weil derartige Flüssig­

werden soll, müssen außerdem noch alle anderen

keiten Substanzen enthalten, die u. U. Fluora­

Schwermetallsalze und die Pikrinsäure vermieden

chromierungen angreifen.

werden. Die Lösungen der Fluoreszenzfarbstoffe

Zum Herstellen von Dauerpräparaten kommen

die

Kanada- und Neutralbalsam und deren Derivate

chemischen Eigenschaften der Substanzen, sehr

sowie Glyzeringelatine wegen erheblicher Eigen­

empfindlich gegen Schwankungen des pH-Werts.

fluoreszenz nicht in Frage.

oder

Fluorochrome

sind,

bedingt

durch

Unachtsamkeit in dieser Hinsicht kann zu Über­

Sehr

raschungen hinsichtlich der beabsichtigten Farb­

fluoreszenzfreien Schnelleinschlußmittel für Mi­

effekte und der Haltbarkeit der Präparate führen.

kroskope,

Von großer Bedeutung vor allem für das Ge­

(n

=

gut geeignet sind die neu z.B.

1,491) und

Entellan

(n

=

entwickelten

1,501),

Eukitt

Caedax. Die damit angefertigten

lingen physiologisch-chemischer, histochemischer

Präparate sind schon nach einigen Minuten soweit

und verwandter Experimente kann die Beachtung

ausgehärtet, daß sie 'ohne Bedenken mikrosko­

der Absorp t1ons- und Emissionseigenschaften der benutzten Fluorochrome,

Fluoreszenzindikato­

piert werden können. Fluorochromierte Präparate sind bei sorgfältiger

ren, Reagenzien u.a. sein. Als theoretische Hilfs­

Behandlung

mittel sei auf die in der Literatur veröffentlichten

dunkel) oft monatelang haltbar.

Tafeln,

Kurven und Vorschriften hingewiesen

[219] [226] [242].

ten Lösungen über längere Zeit gegenüber der kurzzeitigen Färbung mit höherkonzentrierten

Aufbewahrung

(kühl

und

Allgemeine Hinweise zur Präparier- und Färbe­ technik gibt

Der Behandlung der Objekte mit stark verdünn­

und

[225] und [243].

6.1.5.7. Einsatzgebiete der Fluoreszenzmikroskopie

Lösungen ist der Vorzug zu geben. Diese Regel

In der Entwicklung ihrer wissenschaftlichen Be­

gilt sowohl für die Vitalfluorochromierung als

deutung

auch für die Behandlung fixierter Objekte.

ähnliches Schicksal erfahren wie z.B. das Phasen­

hat

die

Fluoreszenzmikroskopie

ein

Wesentlich für die Erzielung kontrastreicher Bil­

kontrastverfahren. Zuerst zögernd, dann in immer

der ist die restlose Entfernung allen überschüssi­

lebhafterem Tempo vollzog sich die Einführung;

gen Farbstoffs aus den Präparaten. Die Fluores­

es folgte die Periode der Erprobung der Methode

zenzmikroskopie ist in diesem Punkt empfind­

auf allen möglichen mikroskopischen Arbeits­

licher als die Hellfeldmikroskopie. Da Fluoro­

gebieten mit der beinahe obligaten Erscheinung,

chrome in wesentlich geringeren Konzentrationen

daß in der Begeisterung über das Neue über das

als Diachrome zufriedenstellende Wirkung zei­

Ziel hinausgeschossen und von der

gen, stören auch wesentlich geringere Restmengen

etwas gefordert wurde, was sie nicht bringen

Methode

im Objekt. Darum ist dem Auswaschen nach der

konnte. So haben sich die Hoffnungen, die man

eigentlichen Fluorochromierung große Sorgfalt

in die Möglichkeit setzte, mit einzelnen Fluoro­

zu widmen. Da Alkohol, vor allem in der Kon­

ehromen Mehrfachfärbungen zu erzielen

zentration

und die Erwartung, mit dem Acridinorange­

70%,

Fluorochrome stark extrahiert,

[225],

kann gegebenenfalls auch die Technik der Über­

verfahren eine ganz einfache Technik zur Unter­

färbung und nachfolgenden Differenzierung be­

scheidung lebender und toter Zellen in der Hand

nutzt werden.

zu haben, nicht im anfänglich erhofften Ausmaß

Fixiertes und konserviertes Material läßt sich

erfüllt

[248].

Auch in der Geschwulstforschung

außer in Wasser auch in fluoreszenzfreiem Glyze­

[211]

rin oder Paraffinöl beobachten. Es genügt, wenn

nisse offenbar hinter den Erwartungen zurück­

und Tuberkulosediagnose sind die Ergeb­

[208].

sie der Güteklasse DAB VII entsprechen. Paraffin­

geblieben

öl kann natürlich bei der Untersuchung fettlös­

in der Hämatologie zu entwickeln

Ähnlich scheint sich die Situation

licher Substanzen nicht verwendet werden. Es hat

Unzweifelhaften Gewinn jedoch hat die Fluores­

[217] [233].

auch die unangenehme Eigenschaft, auf die Dauer

zenzmethodik für jede Art von Vitalmikroskopie

manche

gebracht. Die hohe Effektivität der Vitalfluoro-

Fluorochrome zu extrahieren, so daß

234

6. Mikroskopierve1/ahren und ihre Anwendung

Bild 6.110. Ruhende und

Bild 6.112.

keimende Sporen

von Anobaena variablis

Polyomyelitis-Viren auf FL-Zellen

FTTC-Technik im Auflicht.

M 200:1

Primärfluoreszenz durch Blauanregung. M200: 1 / Durchlicht

Bild 6.111.

Menschliche Chromosomen in der

Bild 6.113.

Keimende Pollen auf Narbe

Methaphase mit hellleuchtenden Y-Chromosomen

von Weideröschen

Quinaerine mustard mit Blauanregung. M800:

Anilin blau-Färbung mit Blauanregung

1/Auflicht

M 50: 1 Durchlicht

/

chrome, allen voran das Acridinorange, und ihre

Routinemethoden in Laboratorien Eingang ge­

überraschend gute Verträglichkeit sichern aller

funden und sind entscheidend für die Diagnose

Voraussicht nach diesem Verfahren ein dauern­

solcher

des Arbeitsfeld

[247]. Von ähnlicher Bedeutung

Pocken, Herpes, Polio, Syphilis usw., geworden

für biochemische Untersuchungen scheinen man­ cheindikatorsubstanzen unter denFluorochromen

[214] [215] [216] [221] [223] [224] [229] [235] [236] [250]. Fluoreszenzmikroskopische Methoden

zu sein. Es gibt umfangreiche Listen von Indika­

werden

toren für praktisch alle pH-Bereiche, z. B.

Identifikation von Chromosomen und deren Ab­

[225].

Erkrankungen,. wie

angewandt in der

Masern, Tollwut,

Humangenetik zur

Zum umfangreichsten und wichtigsten Anwen­

errationen

dungsgebiet

In der Physiologie werden auf fluoreszenzmikro­

der

fluoreszenzmikroskopischen

Nachweisverfahren ist die

Mikrobiologie von

Zelle und Gewebe geworden Hilfe

spezieller

[249] [252]. Mit

Fluorochromierungen

können

Strukturen und Substanzen nachgewiesen und

[213] [239] [253].

skopischem Wege biogene Amine nachgewiesen

[220] [241], und die Ophthalmologie bedient sich [228].

ihrer beim Auffinden von Netzhautschäden

Anwendungsgebiete im weitesten Sinne bilden

lokalisiert werden. Größte Bedeutung hat hierbei

Mineralogie und Geologie

die Immufluoreszenz erlangt, die auf der Dar­

dungsbeispiele geben die Bilder

[237] [238]. Anwen­ 6.110 bis 6.113.

stellung der serologischen Antigen - Antikör­

Mit Verlagerung der Einsatzgebiete der Fluores­

per- Reaktion beruht. Zahlreiche Methoden der

zenzmikroskopie in Untersuchungen, die sowohl

Fluoreszenz-Antikörpertechnik haben schon als

qualitative als auch quantitative Aussagen for-

6.1. Durchlichtmikroskopie

235

dern, gewinnt die fotometrische Messung immer

violetten

größere Bedeutung [219]. Über die Ermittlung

langen zunehmende Bedeutung. Die Bedeutung

(UV) Spektralbereich üblich und er­

von Fluoreszenzlichtintensitäten können Stoff­

der Mikroskopie mit unsichtbaren Strahlen hat

mengen

ab­

mehrere Gründe. Ein wesentlicher Grund be­

laufende und abgelaufene biochemische Prozesse

steht darin, daß viele wichtige Substanzen, aus

bestimmt

wahrgenommen

(DNS,

Proteine)

oder

und lokalisiert werden

[208]

denen mikroskopische Objekte bestehen, in be­ stimmten nicht sichtbaren Spektralgebieten selek­

[212] [232] [244]. oder

tive Absorptionen zeigen, während sie im sicht­

Fluorametrie bildet die Grundlage für eine voll­

baren Gebiet vollständig durchlässig sind oder in

Die

Fluoreszenzmikroskop-Fotometrie

automatische Messung, Registrierung und stati­

manchen Fällen zu stark absorbieren. Je nach

stische

fluoreszenzmikrosko­

dem Absorptionsverhalten der Objekte ist dann

pischen Präparaten. Sie stellt für den Mediziner

die UV-Mikroskopie oder die IR-Mikroskopie

Auswertung

von

und Biologen ein wichtiges Hilfsmittel für For­

oder auch die Röntgenmikroskopie das angemes­

schung und Routineuntersuchungen dar.

sene mikroskopische Verfahren, wenn es darauf

Eine Schwierigkeit ist z. Z. noch das Ausbleichen

ankommt, die Objekte ohne künstliche Eingriffe

der Präparate unter dem Einfluß der Erreger­

(z. B.

strahlung,

Kontrastierungsverfahren,

wodurch jede

Messung mit einem

Färbemethoden)

zu

untersuchen

wie

und

Phasenkontrast­

ader Interferenzkontrastverfahren, zu vermeiden,

Fehler behaftet ist [245]. Ein anderes Problem ist die Schaffung eines Fluor­

bei denen die Kontraste nicht aufgrund von

eszenzstandards, der es ermöglicht, unabhängig

spezifischen Absorptionen der Substanzen, son­

von der verwendeten Apparatur und den sich z. T.

dern aufgrund von Brechzahl- oder Gangunter­

stark unterscheidenden Chargen der Fluorochrome

schieden entstehen. Die Absorption beim Durch­

bzw.

fluoreszenzmarkierten Eiweiße stets mit­

tritt von Strahlung durch Materie hat unter­

einander vergleichbare reproduzierbare Ergeb­

schiedliche Ursachen. Im Gebiet der Röntgen­

nisse zu erzielen [227 ] [230] [246] [251 ].

strahlen ist die

Die Mikrofotografie wird wegen der geringen

Durch Absorption von Lichtquanten ergeben

Helligkeit der Fluoreszenzbilder vorwiegend im

sich energetische Änderungen in den inneren

Kleinbildformat durchgeführt. Aus dem gleichen

Schalen der Elektronenhülle des Atoms. Im Ge­

Absorption elementspezifisch.

Grund ist auch erklärlich, weshalb die Benutzung

biet des ultravioletten, sichtbaren und infraroten

von Belichtungsautomaten in der Fluoreszenz­

Spektralbereichs absorbieren die Moleküle, wo­

mikroskopie gelegentlich Schwierigkeiten bereitet.

bei durch Absorption von Lichtquanten ener­

Weitere

getische Änderungen in dem äußeren Elektronen­

Besonderheiten sind der Dunkelfeld­

charakter der Fluoreszenzbilder, der in manchen

system, d. h. in den Zuständen der Valenzelek­

Fällen die Verwendung von Belichtungsmeßein­

tronen eines Moleküls und in der Rotations- und

richtungen erschwert, und die spektrale Zusam­

Schwingungsenergie der Moleküle auftreten. Ein

mensetzung des Fluoreszenzlichts, die für Farb­

weiterer Grund für die Mikroskopie mit unsicht­

aufnahmen in der Regel Tageslichtmaterial ver­

baren Strahlen im IR-Bereich bildet das Emis­

langt [231]. Da für die fotografische Dokumen­

sionsverhalten von Stoffen, das z. B. zur Tempera­

tation in der Fluoreszenzmikroskopie sonst die

turmessung mikroskopisch kleiner Bereiche ge­

gleichen Bedingungen gelten wie für die meisten

nutzt wird.

anderen Beobachtungsverfahren, sei für diesen

Der sichtbare und die unsichtbaren Spektral­

Komplex auf den Abschn. 8. verwiesen.

bereiche werden durch die Angabe von Wellen­ längen gegeneinander abgegrenzt. Die Grenzen des sichtbaren oder visuellen Spektralbereichs

6.1.6.

(VIS) sind

Mikroskopie mit unsichtbaren Strahlen

durch die

lichkeitskurve

von Dr. rer. nat. Horst Riesenberg

spektrale

des Auges,

Hellempfind­

die sog.

V;.-Kurve

(Bild 6.114 und Tafel6.5), bedingt und werden mit etwa 400 und 760 nm angegeben. Inner­

6.1.6.1.

halb dieses Bereichs nimmt das (Durchschnitts-)

Einführung

Auge Strahlung wahr und bewertet ein energie­

Obwohl die Mikroskopie im sichtbaren Spektral­

gleiches Spektrum hinsichtlich der empfundenen

bereich

Hellig] 25 p,m.

Objekts

0 wird durch em

0� mit hoher Bestrahlungsstärke abgebildet, wo­ durch das ultraviolette Bild kontrastrichtig in ein helles, sichtbares Bild umgewandelt wird. Durch ein nachgeordnetes Mikroskop mit relativ hoher Apertur wird das Fluoreszenzbild wieder ver­

6.1.6.2.

größert abgebildet, so daß es in der förderlichen

UV-Mikroskopie

Vergrößerung erscheint, jedoch mit einem wesent­

Zum Erzeugen von UV-Strahlung für die UV­

lich größeren Durchmesser der Austrittspupille,

Mikroskopie sind verschiedene Strahlungsquellen

als es sonst bei der förderlichen Vergrößerung

gebräuchlich, z. B. die im Abschn. 5. beschriebe­

üblich ist. Die Austrittspupille ist der Augenpu­

nen Xenon-Höchstdrucklampen und die Queck­

pille beim Beobachten des UV-Bilds angepaßt.

silber-Höchstdrucklampen.

Ein

Die Deuteriumlam­

pen haben für.Untersuchungen im UV eine sehr günstige

l

spek rale

Emissionsverteilung,

liegt ihre Strahldichte bei der

der

mit

dem

Fluoreszenzschirm

verbundenes

Prisma beseitigt die Strahlung aus dem Strahlen­

doch

gang, die nicht zur Fluoreszenzbildwandlung bei­

260 nm noch unterhalb

trägt und deshalb unerwünscht ist, z. B. sichtbares

höhere

Licht aus Filterfehlern, sichtbares Streulicht aus

Leistung und Wasserkühlung konnte die Strahl­

Höchstdrucklampen.

Durch

Monochromatoren und langwellige UV-Strah-

dichte der Deuteriumlampen verbessert werden. Zur spektralen Zerlegung der von den Strah­ lungsquellen emittierten Strahlung dienen Mono­ chromatoren oder Filter.

Als Filter kommen

Filtersysteme in Betracht, die aus Filtergläsern, Flüssigkeitsfiltern oder UV-Interferenzfiltern be­ stehen

[291] [314] [336] [354] [360] [373]. Die

abbildende

Optik

muß

UV-durchlässig

sein.

Außer Spiegeln können Quarzglas, Flußspat und Lithiumfluorid verwendet werden. Als Mikro­ skopobjektive sind UV-VIS-apochromatische und UV-VIS-achromatische

Objektive

geeignet

(s.

Abschn. 2.5.3.). Um das UV-Bild im Mikroskop sichtbar zu ma­ chen, ist eine Bildwandlung erforderlich. Die einfachste Art der Bildwandlung ist mit einem fluoreszierenden Glasplättchen möglich, auf das das UV-Bild fokussiert und durch Fluoreszenz in sichtbares Licht umgewandelt wird. Ein spe­ zieller UV-Sucher mit Fluoreszenzbildwandlung, der das aus dem Monochromator stammende störende Streulicht aus dem Strahlengang durch ein Prisma entfernte, wurde von Köhler eingeführt, der auch das erste UV-Mikroskop entwickelte

[296]. Das Prinzip der Fluoreszenzbildwandlung konnte durch Entwicklung eines speziellen UV­ Tubus wesentlich verbessert werden, in dem das ultraviolette Bild durch eine lichtoptische Ver­ stärkung erheblich heller erscheint und dabei

Bild 6.116. Optikschema

zum

UV-Mikroskop

links: spezieller UV-Tubus mit lichtstarker Fluoreszenz­ bildwandlung; rechts: Phasenkontraststrahlengang, Ringblenden bei

Störungen durch Streulicht wie beim Köhlersehen

Phasenringe bei P'"

UV-Sucher vermieden werden. Das Optikschema

VEB Carl Zeiss

JENA

I',

6.

238

MikroskopierveJfalzren und ihre Anwendung

Jung. Ein Komafehler, der durch das mit dem Flu­

aus einer definierten Bildmitte (

oreszenzschirm verbundene Prisma entsteht, wird

mitte) und aus dem (visuellen) Schärfenbereich.

durch geeignete Wahl des nachfolgenden Prismas

Darüber hinaus ist es vorteilhaft, wenn auch im

Meßblenden­

=

kompensiert. Man erhält im Vergleich zu bisher

UV-Beleuchtungsstrahlengang keine Manipula­

bekannten Fluoreszenzbildwandlern ein helles und

tion für das Phasenkontrastverfahren erforderlich

kontrastreiches UV-Bild, das außerdem ohne Ge­

wird, wie Ein- und Ausschalten von Ringblenden,

fahr einer Augenschädigung beobachtet werden

so daß ein normaler UV-Kondensor verwendet

kann.

werden kann.

Bedeutend aufwendiger sind elektronische Bild­ wandler

[276] [279] [284],

Hochspannungsgerät

die zum Betrieb ein

erfordern.

Das

UV-Bild

Der Strahlengang für ein Phasenkontrastverfah­ ren in der UV-Mikroskopie, dessen Ringblenden P und

Phasenringe P"'

außerhalb

des

UV­

wird auf die Fotokatode des Bildwandlers ab­

Strahlengangs in einem

gebildet, aus der durch die auftretenden Photonen

geordnet sind, so daß normale UV-Kondensoren

Elektronen ausgelöst werden. Diese werden durch

und normale UV-Objektive verwendet werden

VIS-Strahlengang

an­

6.116

ein Hochspannungsfeld beschleunigt und elek­

können, wird in dem Optikschema Bild

tronenoptisch auf einen Leuchtschirm abgebildet,

zeigt. P' und P" sind Zwischenbilder der Ring­

ge­

wobei ein sichtbares Bild entsteht.

blende in der Eintrittspupille des Kondensors

Neben der Sichtbarmachung des UV-Bilds durch

und in der Austrittspupille des Objektivs. Die

einen Fluoreszenzbildwandler oder einen elektro­

Beobachtung der Pupille und damit die Zentrie­

nischen Bildwandler, die einen raschen Überblick

rung von Ringblende und Phasenring sind bei ein­

über die Absorptionsstruktur des Präparats ge­

geschobener Bertrand-Linse möglich.

währleisten und zur genauen Einstellung der ge­

Die Fluoreszenzbildwandlung und das Phasen­

wünschten Präparatstelle dienen - die Schärfen­

kontrastverfahren

einstellung ist aufgrund der geringeren Einstell­

(Bild

toleranz im ultravioletten Licht genauer als im

des VEB Carl Zeiss JENA

sichtbaren Licht (s. Abschn.

2.4.2.)

, ist es in der

-

6.116)

nach

dem

Optikschema

wurden durch das UV-Mikroskop

[334] [336] realisiert. 0�1

Das vom Objektiv erzeugte Zwischenbild

UV-Mikroskopie wesentlich, die vorbereitenden

dient zur objektiven Verwertung des UV-Bilds,

mikroskopischen Arbeiten, wie das Aufsuchen

z.B.

und Einstellen von Präparatstellen, im sichtbaren

Im Fall der Fotografie erfolgt eine Nachvergröße­

zur

UV-Fotografie oder UV-Fotometrie.

6,3:1

Licht durchzuführen, um das Präparat nicht un­

rung im Maßstab

nötig der Strahlenbelastung durch die energie­

eingebautes Spiegelprojektiv.

reichere UV-Strahlung auszusetzen und um be­

scher Fotometrie sind lichtelektrische Fotometrie

quemer arbeiten zu können. Da die in der UV­

und Fluoreszenzfotometrie möglich.

Mikroskopie interessierenden Präparate im sicht­

Weitere

baren

schnitt

Spektralbereich

typische

Phasenobjekte

durch ein in der Kamera

UV-Mikroskope

6.1.7.

Neben fotografi­

werden

im

Ab­

beschrieben.

enthalten, die im Hellfeld mangels absorbieren­

Viele biologische Objekte sind ohne Anfärbung

der Strukturen nahezu unsichtbar bleiben, wird

im Hellfeld praktisch unsichtbar, weil die wich­

zur Kontrastbildung das Dunkelfeld- und das

tigsten Stoffe biologischer Objekte, die Nuklein­

Phasenkontrastverfahren angewendet. Bei Ver­

säuren und Proteine,

wendung eines Spiegelkondensors kann dessen

nicht oder nur unbedeutend absorbieren. Durch

ii11

sichtbaren Spektrum

Zentralabschattung zur Erzeugung von Dunkel­

das Phasenkontrastverfahren entsteht von einem

feld in Verbindung mit solchen Mikroskopobjek­

solchen ungefärbten Präparat ein Bild mit unter­

tiven genutzt werden, deren numerische Apertur

schiedlichem

kleiner ist als die innere Apertur des Kondensors.

unterschiedliche

Das Phasenkontrastverfahren ist in der

gleicher Dicke- auf unterschiedliche Brechzahlen

UV­

Hell-Dunkel-Kontrast,

der

Gangunterschiede oder -

auf bei

Mikroskopie dann optimal gelöst, wenn keine

der

speziellen

führen ist. Im ultravioletten Licht geeigneter

Phasenkontrastobjektive

mit

ein­

vorhandenen

Objektstrukturen

zurückzu­

gebauten Phasenringen erforderlich sind, sondern

Wellenlänge erhält man von demselben ungefärb­

normale UV-Objektive verwendet werden kön­

ten Präparat ein Absorptionsbild, bei dem die im

nen, damit die Nachteile vermieden werden, die

Präparat

mit einem Objektivwechsel beim Übergang von

selektive Absorption der sie aufbauenden Stoffe

der Phasenkontrastbeobachtung zur UV-Beob­

in Erscheinung treten. Dies führt dazu, daß der

enthaltenen

Objektstrukturen

durch

achtung bzw. UV-Fotometrie verbunden sind,

Bildcharakter des UV-Absorptionsbilds von dem

B. das Auswandern eingestellter Präparatdetails

des Phasenkontrastbilds recht verschieden sein

z.

6.1. Durcldichtmikroskopie

239

die ursprüngliche Absicht von Köhler [296] [297] bei der Einführung der UV-Mikroskopie darin bestand, durch die kleinere Wellenlänge im UV eine höhere Auflösung zu erreichen. Das Auf­ lösungsvermögen steigt auf das Doppelte, wenn man von 550 (grünes Licht) zu 275 nm übergeht; oder: Der Durchmesser des zentralen Beugungs­ scheibchens schrumpft auf die Hälfte zusammen (s. Abschn. 2.4.1.1.). Der Bereich der förderlichen Vergrößerung müßte hiernach auf das 1000- bis 2000fache der numerischen Apertur festgelegt werden; doch kann man mit der Vergrößerung selbstverständlich auch unterhalb dieses Bereichs a) UV-Aufnahme bei 263 nm,

bleiben. Hin und wieder kann die gesteigerte Auf­

Abb.-Maßstab des Negativs 400: 1;

lösung eine Rolle spielen. 6.1.6.3. Infrarotmikroskopie Während für die UV-Mikroskopie vor allem die Gebiete interessant sind, die im sichtbaren Spek­ tralbereich praktisch völlig durchlässig sind und deshalb erst durch selektive Absorption im ultra­ violetten Licht in ihrer Struktur in Erscheinung treten, hat es die Infrarotmikroskopie vor allem mit solchen Objekten zu tun, die im sichtbaren Spektralbereich nahezu völlig undurchlässig sind und bei denen es die Infrarotstrahlung infolge des größeren

b) Phasenkontrastbild mit Strichmarkierung, wie es im

"Durchdringungsvermögens"

erlaubt,

Struktureinzelheiten darzustellen. Für Infrarot­

VIS-Einblick erscheint.

strahlung sind bis zu einem gewissen Grad kalk­

Bild 6.117. Zungenmuskulatur der Maus

wisse Pigmente, wie Melanin durchlässig.

Glyzerineinbettung, aufgenommen mit Spiegelobjektiv

Das

63/0,65 (s. Tafel2.12)

mikroskope,

haltige Stoffe, das Chitin der Insekten und ge­

und UV-Mikroskop des VEB Carl Zeiss JENA Der unterschiedliche Informationsgehalt ist bei diesem Präparat auffallend

Wellenlängengebiet

bekannter

Infrarot­

die zur Abbildung strukturierter

Objekte dienen, wird durch die spektrale Emp­ findlichkeit der Bildempfänger begrenzt. Foto­ grafische

Schichten

werden

durch

besondere

Sensibilisatoren für das nahe Infrarot bis etwa kann, wenn auch öfters einander entsprechende

1,3 [tm empfindlich. Die spektrale Empfindlich­

Strukturen im Kontrast Analogien zeigen (Bil­

keit von Infrarotfotokatoden elektronischer Bild­

der 6.117a und b). Der Unterschied der spektra­

wandler reicht ebenfalls nur bis etwa 1,3 ttm. Ihre

len Abhängigkeit der Absorption von Objekt­

Wirkungsweise ist die gleiche, wie sie im Ab­

details wird zu deren Substanzidentifikation ver­

schnitt6.1.6.2. beschrieben wurde [276] [279] [284].

wendet (qualitative Mikrospektralanalyse). Bei

Ein Festkörperbildwandler, dessen Empfindlich­

bekannter Substanz führt die Ausmessung des

keit bei tiefen Temperaturen bis etwa 6 [tm reicht,

Absorptionsbilds bzw. von abgegrenzten Struk­

beruht auf der Kopplung eines Fotohalbleiters

turen des Bilds (z. B. von Zellkernen) zur Mengen­

mit einer elektrolumineszierenden Schicht [277].

bestimmung der Substanz (Mikrofotometrie). Die

Bei Begrenzung auf das nahe Infrarot können für

Ausmessung

kann

Infrarotmikroskope gewöhnliche Glühlampen als

zum Bestimmen der Trockenmasse benutzt wer­

Strahlungsquellen verwendet werden. Durch ein

von

Phasenkontrastbildern

den, die stoffunspezifisch ist.

Infrarotfilter wird das sichtbare Licht absorbiert wichtiger

und das infrarote durchgelassen. Als Objektive

Stoffe für die UV-Mikroskopie von vorrangiger

sind entweder normale Objektive oder Spiegel­

Bedeutung ist, soll nicht unerwähnt bleiben, daß

objektive (s. Abschn. 2.5.3.) üblich.

Obwohl

die

selektive

Absorption

240

6 Mikmskopiervetfahren und ihre AniVendung .

.

Bei einem japanischen Infrarotmikroskop der Firma Nippon Electric Co. [324] wird ein mit Infrarotstrahlung beleuchtetes Objekt durch ein gewöhnliches Mikroskop vergrößert abgebildet und auf die Fotokatode eines mit 16 kV betrie­ benen

elektronischen

Bildwandlers

fokussiert.

Das auf dem Leuchtschirm des Bildwandlers ent­ stehende sichtbare Bild kann direkt betrachtet oder mit einer Kamera auf einem gewöhnlichen Film fotografiert werden. In der

Infrarotspektralfotometrie werden gele­

gentlich mikroskopische Abbildungssysteme ver­ wendet, um Mikroproben zu untersuchen [257] [258]. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um Un­

Die

zu

messenden

Mikroskop

Objektstellen

vergrößert

auf

werden

einen

im

geeigneten

Strahlungsempfänger abgebildet, dessen Größe entsprechend der Meßftäche des Objekts und des Abbildungsmaßstabs des Mikroskops

zu

wählen

ist. Es werden vornehmlich thermische Strah­ lungsempfänger,

wie

Vakuumthermoelemente

oder Bolometer, verwendet. Strahlungsempfänger auf fotoelektrischer Grundlage vom Typ InSb erfordern in den interessierenden Wellenlängen­ bereichen

eine

Kühlung,

Stickstoff,

und

sind

z. B.

deshalb

mit

flüssigem

wesentlich

auf­

wendiger. Von der DAW- Forschungsstelle für Meßtechnik

tersuchungen an mikroskopisch strukturierten 0b­

und Automatisierung (FMA) wurde ein Mikro­

engeren Sinne nicht als Infrarotmikroskope be­

Baueinheiten des VEB Carl Zeiss JENA ent­

jekten. Deshalb werden solche Einrichtungen im

zeiclmet. Eine besondere Art von Infrarotmikroskopen [295] [299] [300], die die Emission infraroter Strahlung zur Temperaturmessung kleiner Be­ reiche nutzen, werden auch als Mikropyrometer bezeichnet. Ihre Hauptanwendung ist die Be­ stimmung von Temperaturprofilen von mikro­ elektronischen Schaltkreisen

[281]

[286]

[308]

[328] [348] [356] [361], wobei es darauf ankommt, unzulässige Erwärmungen festzustellen, die ent­ weder Änderungen in der Schaltungstopologie erfordern oder in der routinemäßigen Fertigungs­ überwachung auf Fertigungsmängel aufmerksam machen. Ferner sind Temperaturmessungen an Chemiefasern

und

ähnlichen

Objekten

von

mikroskopisch kleinen Dimensionen möglich. Die Objekte sind im Sinne der mikroskopischen Ab­

pyrometer (Bild 6.118) unter Verwendung von wickelt

[300]. Das auf

einem

mit

Feinmeß­

schrauben verstellbaren Kreuztisch angeordnete Objekt wird wahlweise mit dem Spiegelobjektiv 20/0,45 oder 40/0,65 auf die Empfängerfläche eines Vakuumthermoelements oder Bolometers [299] abgebildet. Das Eintrittsfenster des Strah­

lungsempfängers besteht aus Kaliumbromid (KBr) und ist entweder planparallel oder als Linse mit zweifacher

ML

=

Verkleinerung

(Abbildungsmaßstab

0,5) ausgebildet. Mit den Spiegelobjektiven

und der KBr-Linse ergibt sich im Meßstrahlen­ gang der Abbildungsmaßstab 10:1 bzw. 20 :I.

Die Breite der Empfängerfläche kann für Vakuum­

thermoelemente (VTh) zwischen 0,3 und 3 mm und für Bolometer zwischen 0,15 und 4 mm variie­ ren. Im visuellen Einblick des Mikropyrometers

bildung Selbstleuchter. Die optische Auflösung liegt bei dem in Frage kommenden Temperaturbereich zwischen 30 und 300°C in der Größenordnung von 10 ,um und die thermische Auflösung, d.h. die kleinste noch meßbare Temperaturdifferenz, in der Größen­ ordnung von Zehntelgrad. Für IR-Strahlung von A

=

10 ,um, die dem Ener­

giemaximum bei 30°C entspricht, beträgt nach der GI. (2.54) im Abschn. 2.4.1.1. der kleinste noch auflösbare Abstand bzw. der Durchmesser des zentralen Beugungsscheibchens in der Objekt­ ebene

A

=

13 fWl

bei einer

numerischen

0,45 und 9 ,um bei A

=

Apertur

0,65 (numerische

Aperturen der Spiegelobjektive vom katoptrischen Typ nach Tafel 2.13, S. 85). Die kleinste meß­ technisch verwertbare Objektgröße ist aufgrund der Beugungsstruktur bei der Abbildung etwas größer als der kleinste auflösbare Abstand an­ zunehmen.

Bild 6.118. MikropyrometerMP 2 Institut für Meßtechnik und Automatisierung Institutsfoto

DA W,

241

6.1. Durchlichtmikroskopie ist das thermisch ausmeßbare Feld markiert. Es

sprunghaft

dient zum Aufsuchen und Einstellen der Objekt­

Röntgenstrahlungsquanten

ansteigt,

wenn

(E

die =

Energie

der

hv = hc/A) gleich

stelle. Die Beleuchtung der Meßobjekte erfolgt

oder größer wird als die Bindungsenergie von

über Lichtleitkabel im Auflicht Die vom Objekt

Elektronen in der K-Schale, den L-Schalen, M­

durch einen

Schalen usw. der betreffenden Elemente und so­

Chopper, der zwischen Objektiv und Strahlungs­

mit ausreicht, um diese Elektronen aus dem

empfänger angeordnet ist, in Wechsellicht ver­

Atomverband

wandelt, das verstärkungstechnisch zur

Diese

emittierte Infrarotstrahlung

wird

Meß­

zu

entfernen [256] [306] [318].

wellenlängenabhängigen

selektiven

Ab­

anzeige benutzt wird. Als Registriergerät eignet

sorptionsstellen heißen Absorptionskanten. So­

sich der Kompensationsschreiber des VEB Carl

wohl auf der kurzwelligen als auch auf der lang­

Zeiss JENA, der überdies eine Kopplung zwi­

welligen Seite der Absorptionskante gilt für den

schen

Absorptionskoeffizienten die Näherungsgleichung

Tischvorschub

und

Antriebsrolle

des

Schreibers ermöglicht.

fl = cz4J,3,

6.1.6.4.

wobei die Konstante C auf beiden Seiten der Ab­

Röntgenmikroskopie Unter

sorptionskante verschiedene Werte hat.

Röntgenmikroskopie versteht

Untersuchung

mikroskopischer

Röntgenstrahlen.

Das

Ziel

man

Diese

Gleichung besagt, daß die Absorption sowohl mit

mit

größer werdender Wellenlänge). als auch mit zu­

einerseits

nehmender Ordnungszahl Z der Elemente rasch

Objekte

besteht

die

darin, das �uflösungsvermögen gegenüber dem

zunimmt. Bei biologisch-medizinischen Anwen­

Lichtmikroskop aufgrund der kleineren Wellen­

dungen handelt es sich meist um Stoffe, die aus

länge zu steigern, und andererseits, das gänzlich

Elementen niedriger Ordnungszahl bestehen. Da­

andere Absorptionsverhalten der Substanzen bei

mit mikroskopische Präparate von geringer Dicke

Durchstrahlung

mit

Röntgenstrahlen

auszu­

nutzen.

(einige Mikrometer) noch genügend stark absor­ bieren, müssen die Röntgenwellenlängen verhält­

Wie bereits erwähnt, sind die selektiven Absorp­

nismäßig groß sein, wenn keine speziellen Kon­

tionen im Röntgengebiet elementspezifisch und

trastmittel verwendet werden sollen. Die K-Ab­

erlauben im Prinzip den Nachweis bestimmter

sorptionskanten wichtiger Zellbestandteile(Sauer­

Die

stoff bei 2,3 nm, Stickstoff bei 3,1 nm, Kohlenstoff

Schwächung der Röntgenstrahlen beim Durch­

bei 4,4 nm) ergeben günstigen Kontrast oder auf­

gang durch einen Stoff genügt dem Lambert­

schlußreiche Kontrastunterschiede erst beiWellen­

schen Gesetz

längen von der Größenordnung 1,0 nm.

Elemente

(/j

=

im

mikroskopischen

Präparat.

Knochengewebe kann bei kleinerer Wellenlänge

oder

thermischen

Behandlung,

wenn man vor und nach der Behandlung die relative Mikroeindruckhärte ermittelt. Von der Härtebestimmung mit Prüfkräften über

lgF

2 zu.

tgHV

98,1 N ist man gewöhnt, daß sich bei Eindring­ körpern in Pyramidenform, unabhängig von der Eindringtiefe und damit von der Prüfkraft, geo­ metrisch ähnlicheEindrückeergeben. Hier gilt also der Ähnlichkeitssatz, den

Kick aufgestellt hat,

F= a1d2, wobei die Konstantea1 von dem zu untersuchen­

lgd

tgd Bild 6.216. Mcyer- und Härtegerade

den Material und von der Form des Eindring­ körpers abhängt. Damit wird die Härte von der Prüfkraft unabhängig. Doch gilt dieser Satz nicht

Im allgemeinen stellt aber das logarithmierte

für den gesamten Bereich der in der Technik ver­

Potenzgesetz eine Kurve dar. Nach

wendeten Prüfkräfte. Bei kleinen Prüfkräften, wie

Bückte [490] [491] lassen sich alle experimentell bestimmten

sie in der Mikroeindruckhärte üblich sind, kann

lg F/lgd-Kurven auf zwei

man den Kicksehen Satz nur als eine erste, sehr

6.217) zurückführen. Für einphasige homogene

grobe Näherung bezeichnen.

Legierungen mit ungestörtem Gitter erhält man

Grundformen

(Bild

Auflichtmikroskopie

6.2. die Form a), während sich für Legierungen mit heterogenem Gefüge oder mit gestörtem Gitter die Form b) ergibt. Zu letzteren gehören Aus­

700 p

scheidungen, Feinkorn, Seigerungen und Span­ nungsfelder.

f--�r--r-r- · 1-·- -

Aus dem Gesagten ist zu entnehmen, daß man bei

f--

der Bestimmung der Mikrohärte weder aus der er­ mittelten Mikrohärte auf die Makrohärte schlie­ ßen noch über den gewählten Prüfkraftbereich hinaus extrapolieren kann, wenn der Verlauf der

70

--

8//L

-

rl

/n=Z,74

!

i

iA .:J:- I I ! I I I I ,I II I 70000 I

--H,r

N/mm2

lg F/lg d-Kurve nicht bekannt ist.

/..

lgf

I

A'-

';;vl C::l

I

lgd

oj

I

I I

I 1,;1

1 : 1

Mikrofotografie

einstufige Vergrößerung

Lupenaufnahme

zweistufige Vergrößerung

Mikroaufnahme

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

350

einstufig vergrößerndes optisches System erzielt

Gerätetyp wird dann als Vertikalkamera bezeich­

wird;

net. Im Normalfall wird das Mikroskop bei me­ chanischer Trennung von Mikroskop und Kamera

Mikroaujiwhme

unter dieser aufgestellt. Die Balgenkamera kann

fotografische Aufnahme mit einem Negativ-Ab­

neben

bildungsmaßstab > 1 : 1, bei der dieser durch ein

nahmen benutzt werden. Das Hauptaufnahme­

zweistufig vergrößerndes optisches System- durch

format ist 9 cm

Mikroaufnahmen x

auch

für

Lupenauf­

12 cm.

das zusammengesetzte Mikroskop- erzielt wird.

8.2.3.3. Kameramikroskop

8.2.2. Aufnahmeformate der Mikrofotografie

Spezielle,

für

die

Mikrofotografie

bestimmte

Mikroskope werden als Kameramikroskope be­ Ein weiteres Kennzeichen fotografischer Auf­

zeichnet.

nahmen ist das AufnahmeformaL Für die Mikro­

Mikroskop und Kamera führt zu einem hohen Be­

fotografie sind dabei von Bedeutung

dienungskomfort.

Kleinbildformat

24 mm

X

36 mm(24/36)

Mittelformat

65 mm

X

90mm(6,5/9)

Großformat

90mm

X

120mm (9/12)

Großformat

130mm

x

180mm(13/18).

Die konstruktive Verschmelzung von

Kleinbild-Kameramikroskope weisen eine kon­ stante optische Kameralänge auf, Großformat­ Kameramikroskope werden dagegen meist mit variabler Kameralänge können

ausgeführt.

Schließlich

unter gewissen Voraussetzungen

auch

Zur vollständigen Bezeichnung einer Aufnahme

durch Fotoansätze ergänzte Mikroskope dieser

können die Begriffe Kleinbild-Lupenaufnahrne,

Klasse zugeordnet werden.

Kleinbild-Mikroaufnahme, Mittelformat-Lupen­ aufnahme, Mittelformat-Mikroaufnahrne, Groß­ format-Lupenaufnahme

und

Großformat-Mi­

kroaufnahme dienen, mit denen eine mikrofoto­

8.2.4.

Mikrofotografie mit der Aufsetzkamera

grafische Aufnahme dann eindeutig gekennzeich­ Die Aufsetzkamera kann als die universellste und

net ist.

am vielseitigsten verwendbare mikrofotografische Einrichtung

8.2.3.

angesehen

werden.

Wegen

ihrer

Geräte zur Mikrofotografie Nach den Kriterien optische Kameralänge und Art der Verbindung von Mikroskop und Kamera können die Geräte zur Mikrofotografie in drei Klassen eingeteilt werden.

8.2.3.1. Aufsetzkamera Eine mikrofotografische Aufsetzkamera ist durch ihre relativ

geringe,

aber konstante

optische

Kameralänge, ihr optisches Einstellsystem und ihre Verwendbarkeit an praktisch allen Mikro­ skopen bei fester Verbindung von Mikroskop und Kamera gekennzeichnet. format ist 24 mm

x

Das Hauptaufnahme­

36 mm.

8.2.3.2. Balgenkamera Bestimmendes Kennzeichen ist die variable op­ tische

Kameralänge.

Die optische Achse

Kamera ist meist senkrecht

angeordnet.

der Der

Bild 8.2. Dreiteilung der Aufsetzkamera in Mikroskopanpassung - Gm n dkörper - Kameraansatz (v. u. n. o.)

kompakten Bauweise kann sie auf jedes Mikro­

skop aufgesetzt und damit für jedes Beleuchtungs­

o'

und Abbildungsverfahren der Mikroskopie ein­

gesetzt werden.

Ihre Universalität verdankt die Aufsetzkamera ihrer mechanischen Ausbildung, die in der Regel

auf einer Dreiteilung der einzelnen Bauelemente

beruht (Bild 8.2).

Die mechanische Verbindung von mikrofoto­

grafischer Einrichtung und Mikroskop wird mit

einer Tubusklemme oder einem Fototubus vor­

genommen. Zur Einstellung des Bilds ist die Auf­

T

setzkamera mit einem optischen Einstellsystem versehen, das im Grundkörper untergebracht ist.

Der Grundkörper der Aufsetzkamera übernimmt

darüber hinaus oft noch weitere Funktionen, z. B.

bei

der

Durchführung

einer

Ok

lichtelektrischen

Messung oder einer automatischen Regelung der

Belichtungszeit.

Das AuM� hmeformat wird durch den Kamera­

ansatz bestimmt.

0 Bild 8.3. Optisches Einstellsystem der Zeiss-Aafsetzkamera mf

8.2.4.1. Optisches Einstellsystem der Aufsetzkamera

Die prinzipielle Funktion des optischen Einstell­

systems der Aufsetzkamera ist im Bild 8.3 dar­

gestellt. Durch das Okularsystem Ok wird das

mikroskopische Zwischenbild, das hier - wie bei allen mikroskopischen Bildwiedergabeverfahren­ als Objekt 0 angesehen werden kann, in die Bild­

ebene 0' der Aufsetzkamera abgebildet. Ein Strah­

lenteiler T lenkt ständig einen Teil des Lichts in das optische Einstellsystem.

Bild 8.4 Einstellscheibe der mf

Anstelle des Strahlenteilers kann auch ein ein­ schaltbares Umlenkprisma verwendet werden.

Durch ein Linsensystem Li wird das der Bildebene

der Kamera entsprechende Bild 0' der Beobach­

tungsseite nach 0" zurückverlegt. Am Ort 0"

befindet sich eine Klarglasscheibe mit der Format­

figur (Bilder 8.4, 8.5 und 8. 7). Mit einem auf eine eventuelle Fehlsichtigkeit des Beobachters ein­

stellbarenOkular wird-wie imBild8.5 links ersicht­ lich- das Bild 0" betrachtet und zusammen mit der Formatfigur gesehen. 0' und 0" sind optisch

zueinander konjugiert. Das hat zur Folge, daß das Bild in der Bildebene der Aufsetzkamera dann

zwangsläufig scharf ist, wenn das Mikroskop bei Beobachtung durch das optische Einstellsystem

auf 0" eingestellt wird. Diese Konjugation bleibt auch beim Wechsel des Kameraansatzes erhalten,

wenn die Mittelformat- und Großformat-Kamera­

ansätze dieses Typs der Aufsetzkamera entspre­

chende Bildversetzungslinsen haben rechts).

(1 1,

Bild 8.5,

Bild 8.5. Optisches Schema der Zeiss-Aufsetzkamera mf 1 nifTubus; 2 mf-Projektiv; 3 mf-Grundkörper; 4 mf-Kameraansatz; 5 Umlenkelement; 6 Hilfsobjektiv; 7 Einstellscheibe; 8 Einstellokular; 9 Auge; 10 nif-Kameraansatz; 11 Bildversetzungslinse

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

352

probe und Belichtungszeitmessung ermittelt oder

8.2.4.2.

durch eine Belichtungsautomatik gesteuert werden.

Umstellung des Mikroskops­ Okulare und Projektive

Belichtungsprobe

Sollen Mikroskopokulare zur Mikrofotografie mit

Bei der Belichtungsprobe wird das Objekt mit

einer Aufsetzkamera benutzt werden, so ist zu

einer Reihe von im Verhältnis 1 : 2 gestuften

beachten,

Belichtungszeiten aufgenommen. Bei Mittelfor­

daß

sphärischen

dabei

Fehlers

zur

bei

Vermeidung

der

eines

Umstellung

des

mataufnahmen benutzt man dazu die Teilung

Mikroskops von der visuellen Beobachtung zur

auf dem Kassettenschieber (s. Abschn. 8.2.5.3.).

Mikrofotografie das Okular vom Zwischenbild

Bei Kleinbildaufnahmen kann der Zeitaufwand

abgehoben werden muß (s. Abschn. 8.1.2.). Das

für die Entwicklung und Auswertung der Belich­

kann durch eine Tubusverlängerung nach GI. (8.2)

tungsprobe dadurch umgangen werden, das man

erreicht werden. Bei einer optischen Kamera­

jede Aufnahme mit einer Belichtungsreihe auf­

länge von 125 mm, wie sie bei einer Aufsetz­

nimmt

kamera überwiegend zur Anwendung kommt,

richtig belichtete Aufnahme auswählt.

nimmt diese Tubusverlängerung die in Tafel 8.2 zusammengestellten Werte an. Tafel 8.2. Tubusverlängerung bei VerJ\Iendung von Mikroskopokularen zur Mikrofotografie bei einer optischen Kameralänge von k

=

VOkular 5x

6,3x

Sx

lüx

Llt

12,5

8

5

mm

20

beim

Negativ/Positivprozeß

die

Belichtungszeitmessung

Die aus der allgemeinen Fotografie bekannten Verfahren

der

lichtelektrischen

Messung

der

Belichtungszeit Jassen sich auch auf die Mikro­

125 mm

fotografie übertragen. Die Messung sollte dabei

12,5x 3

und

16x

20x

2

in der Bildebene der mikrofotografischen Ein­ richtung vorgenommen werden. Im Prinzip kann dazu bei der Mikrofotografie mit der Aufsetz­ kamera der Kameraansatz abgenommen und durch

Vom VEB Carl Zeiss JENA wurden zur Vermei­

ein in der Bildebene liegendes Selensperrschicht­

dung dieser Tubusverlängerung für die Aufsetz­

element ersetzt werden. Bei der praktischen Aus­

kamera

"mf"

spezielle

Systeme

herausge­

führung (Bild 8.6) wird das Fotoelement in einer

bracht, die für die Kameralänge der Aufsetz­

zur Bildebene optisch konjugierten Ebene ange­

kamera korrigiert sind und die iiu·er Aufgabe -

ordnet (Bilder 8.7 und 8.8). Der vom Fotoelement

der Projektion des Zwischenbilds als reelles Bild

gelieferte Strom wird mit einem Galvanometer

in die Bildebene der Aufsetzkamera-entsprechend

entsprechender Empfindlichkeit gemessen. Aus

als ruf-Projektive bezeichnet werden. Zur sicheren

der Anzeige kann die zugehörige Belichtungszeit

Unterscheidung von den Mikroskopokularen wer­

einer Eichkurve entnommen werden. Es ist ein

den die ruf-Projektive nicht mit iiu·er Lupenver­

Vorteil dieses Verfalu·ens, daß der Schwarzschild­

größerung, sondern mit dem Abbildungsmaßstab

Exponent des Fotomaterials in die Eichkurve ein-

gekennzeiclmet. Diese Angabe ist auf k

=

125m m

bezogen.

Bild 8.6. Belichtungszeitmessung an der Aufsetzkamera

8.2.4.3. Bestimmung der Belichtungszeit

Die Vielzahl der Beleuchtungs- und Abbildungs­ verfahren der

Mikroskopie einerseits und die

unterschiedlichen Transmissions-bzw. Reflexions­ eigenschaften

der

mikroskopischen

Objekte

andererseits haben zur Folge, daß die in der Bildebene

einer

mikrofotografischen

Aufsetz­

kamera auftretenden Beleuchtungsstärken erheb­ lich voneinander abweichen. Aus dem Hellig­ keitseindruck des mikroskopischen Bilds kann nur mit großer Unsicherheit auf die zu erwartende Belichtungszeit geschlossen werden. Beim Arbeiten mit der Aufsetzkamera kann die Belichtungszeit nach den Methoden Belichtungs-

8.2. Mikrofotografie

geht. Die Methode erfordert

aber ein

353

relativ

hochempfindliches Meßinstrument. Durch

den Einsatz von

modernen eine

Fotowiderständen

Taschenbelichtungsmessern

beträchtliche

111

wurde

Empfindlichkeitssteigerung

erzielt. Das kommt der Verwendung derartiger Belichtungsmesser in der Mikrofotografie ent­ gegen. Der zu diesem Zweck in ein "Meßauge" eingebaute an

den

Fotowiderstand Grundkörper

kann

einer

u. a.

auch

Aufsetzkamera

angesetzt (Bild 8.9) oder in diesen eingebaut Bild 8. 7. Optische Elemente eines mf-Cmndkörpers

werden.

mit Belichtungszeitmessung

modifikation

1 Umlenkprisma für Beobachtung; 2 optischer Ausgleich für Fotografie; 3 Umlenkprisma für Belichtungszeitmes­ sung; 4 Hilfslinse; 5 Fotoelement; 6 Hilfsobjektiv; 7 Zugstange zur Einstellung von 1, 2 und 3; 8 Einstell­ scheibe; 9 Einstellokular

Funktion einer Eichwertskale.

Bei einer solchen erhält

die

Wird eine Aufsetzkamera nur für ein Aufnahme­ des Meßergebnisses auf den Verschluß automati-

Bild 8.9. Modifikation eines Taschenbelichtungsmessers zur Belichtungszeitmessung bei mikrofotografischen Aufnahmen Belichtungsmesser MICROSIX-L, Firma E. Leitz, Wetzlar, Werkfoto

Beyer. Mikroskopie

die

format ausgelegt, kann die manuelle Übertragung

Bild 8.8. Schema der mf-Belichtungszeitmessung

23

Belichtungsmesser­

Blendenwertskaie

354

8. Ve1jahren zur Wiedergabemikroskopischer Bilder

schaltung der Automatik auf die sog.

Punkt­

messung, die erforderlich wird, wenn zur Steue­ rung der Belichtung das gesamte Sehfeld oder ein außerhalb des Aufnahmeformats liegender Bild­ anteil benutzt wird. Die Lichtübertragungvon der Aufsetzkamera zum Lichtfühler erfolgt über ein Lichtleitkabel. Im Bild 8.12 wird ein Geräteaufbau zur Kleinbild­ Mikrofotografie mit Belichtungsautomatik ge-

Bild 8.10. Reichert-Fotoalllomatik auf Mikroskop ZETOPAN Firma C. Reichert, Wien, Werkfoto

siert werden. Allerdings sind dann Korrekturen für den Schwarzschild-Effekt erforderlich. Ein solches

Gerät ist die

Bild 8.11. Optisches Schema der Zeiss-Belichtungsautomatik mf

·

matic

Reichert-Fotoautomatik

(Bild 8.10). Vor der Aufnahme wird die Belich­

Bild 8.12. Geräteaufbau zur Anfertigung

tungszeit gemessen, das Meßergebnis wird als

von Kleinbild-Mikroaufnahmenmit automatischer

Belichtungszeit angezeigt und auf den Verschluß

Steuerung der Belichtungszeit

übertragen.

Forschungsmikroskop AMPLIVAL

mit Wechseltubus

und Belichtungsautomatik mf matic ·

Belichtungsautomatik

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Für eine vollautomatische Steuerung der Belich­ tungszeit sind bei der Mikrofotografie mit einer Aufsetzkamera spezielle elektromagnetische Ver­ schlüsse

erforderlich. Ein solcher Verschluß · wurde z. B. von /I/gen [548] angegeben und wird

in der Belichtungsautomatik des VEB Carl Zeiss JENA angewendet, deren schematischen Aufbau Bild 8.11 zeigt. Der Verschluß ist oberhalb des Strahlenteilers für das

optische

Einstellsystem

angeordnet.

Zur

Steuerung der Belichtung ist oberhalb des Ver­ schlusses ein weiterer Strahlenteiler angeordnet, der während der Belichtung einen Teil des Lichts zum Lichtfühler der Automatik lenkt. Zur Steuerung der Belichtungszeit wird ein zen­ traler Bildausschnitt herangezogen und die Be­ lichtung so auf die bildwichtigen Details zuge­ schnitten. Diese Maßnahme erübrigt eine Um-

8.2. Mikrofotografie

355

zeigt. Das Schaltgerät dieser Belichtungsautoma­

ausgegangen werden, daß innerhalb eines Belich­

tik ist mit einer Anzeige des bereits abgelaufenen

tungszeitenbereichs von etwa 1 : 100 die durch den

bzw. des noch bevorstehenden Anteils der Be­

Schwarzschild-Effekt bedingte Belichtungszeitver­

lichtungszeit

die

längerung unerheblich ist. Innerhalb der einzelnen

Belichtungs­

Beleuchtungsverfahren der Mikroskopie streuen

ausgerüstet

-

eine

Anzeige,

besonders beim Auftreten langer

die Belichtungszeiten mikrofotografischer Auf­

zeiten von Vorteil ist. Die Farbenempfindlichkeit des Lichtfühlers einer

nahmen selten über diesen Umfang hinaus, so daß

Belichtungsautomatik weicht meist von der eines

eine für das zutreffende Beleuchtungsverfahren

panchromatischen Fotomaterials ab.

durchgeführte

Man kann das durch ein vor dem Lichtfühler an­

weiteren Korrekturen mehr erfordert.

geordnetes Lichtfilter zwar verbessern, eine voll­ ständige Angleichung ist aber in den seltensten Fällen

möglich.

mikrofotografische

Erfordern

Automatikeichung

dann

keine

8.2.4.4. Aufnahmeformat

Aufnahmen ein strenges Blau- oder Rotfilter,

Ein weiteres typisches

dann sollte man mit einer Stoppulu· die Schaltzeit

kamera ist die leicht zu bewerkstelligende Vari­

Merkmal der Aufsetz­

der Automatik ohne dieses Filter messen und

ation des Aufnahmeformats. Zwar herrscht das

danach mit Filter eine dessen Verlängerungsfaktor

Kleinbildformat 24 mm

entsprechende

eine Reihe von Gründen dazu geführt, die Auf­

Zeit

durch

Handsteuerung

der

36 mm vor, doch hat

x

setzkamera auch für die Mittel- und Großformat­

Automatik belichten. Auch ist eine Belichtungsautomatik nicht in der

mikrofotografie einzurichten. Dem kommt die ge­

Lage, die durch den Schwarzschild-Effekt bedingte

nannte Dreiteilung in der mechanischen Ausbil­

Verlängerung der Belichtungszeit bei lichtschwa­

dung der Aufsetzkamera entgegen- der Ü bergang

chen mikroskopischen Beleuchtungsverfah1·en zu

von einem Aufnahmeformat zum anderen geschieht

kompensieren. Ein einfaches Hilfsmittel besteht

durch Auswechselung des Kameraansatzes.

darin, die Belichtungsautomatik stets unter An­

Die Variationsbreite einer Aufsetzkamera hin­

wendung

mikroskopischen

sichtlich ihrer Ausbaufähigkeit für die verschie­

Beleuchtungsverfahrens zu eichen. Es kann davon

denen Aufnahmeverfahren zeigt Bild 8.13. Inner-

des

vorgesehenen

Bild 8.1 3. Kameraansätze der Aufsetzkamera

Zmf-Kameraansätze und -Adapter VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

r Jx

3,5x

3,5x

,... �,

l "'IID" ;J 6

1

.-.1 ..: .

7

3 · -'- ·· - --- --- ·· { -�

I·.::J

356

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

halb des als Beispiel gewählten Baukastensystems der

mikrofotografischen

Einrichtung

mf

des

VEB Carl Zeiss JENA stehen Kameraansätze für Kleinbildaufnahmen mit manuellem

1 oder

Glieder PAufsetzkarnera und PKarneraansatz. In GI. (8.4) eingesetzt, ergibt sich dann MNegativ

mit automatischem Filmtransport 2, für Klein­ bildaufnahmen auf Fotoplatte 6,5 cm

x

=

MObjektiv VokularPAufsetzkamcraPKameraansatz

·

(8.5)

9 cm 3,

9 cm 4, für

Das mag auf den ersten Blick umständlich und

12 cm 6sowie Ad­

unbequem erscheinen. Wenn - wie im Fall der

apter für Polaroidkassetten 5 bzw. -filmhalter 7

Zeiss-Aufsetzkamera mf- das Okularsystem des

für Mittelformataufnahmen 6,5 cm Großformataufnahmen9cm

x

x

zur Wahl. Darüber hinaus können noch handels­

Mikroskops nicht nur auf die Kameralänge der

übliche Kleinbildkameras durch ein entsprechen­

Aufsetzkamera optisch korrigiert, sondern dar­

des Ansetzstück in das System dieser Aufsetz­

über hinaus noch mit

kamera einbezogen werden.

zeiclmet ist, den es in Verbindung mit der Auf­

Durch den Einbau entsprechender Bildverset­

setzkamera ergibt, wenn also

zungslinsen

(11, Bild 8.5) in die Mittel-und Groß­

format-Kameraansätze

bzw.

-Adapter

wurde

erreicht, daß stets ein dem Kleinbildformat ent­

Mrrojektiv

=

dem Maßstab

gekenn­

(8.6)

VokuiarPAufsetzkamera

ist, wird aus GI. (8.5)

sprechender Bildausschnitt erfaßt wird. Auf diese Weise hat die Formatfigur (Bild 8.4) im optischen Einstellsystem für

der Aufsetz­

Beim Arbeiten mit mf-Projektiven ist die Angabe

kamera Gültigkeit. Auch bedarf es beim Wechsel

alle Formate

eines nach GI. (8.7) errechneten Abbildungsmaß­

des Aufnahmeformats - gleichen Endbild-Ab­

stabs für die mikrofotografische Praxis ausrei­

bildungsmaßstab vorausgesetzt - keiner Verän­

chend genau. Werden Okulare in Verbindung

derung der Objektiv-Projektiv-Kombination.

mit

der Aufsetzkamera

benutzt,

dann liefert

GI. (8.5) deshalb nur einen Näherungswert, weil

8.2.4.5.

PAufsetzkarnera

Abbildungsmaßstab der Aufnahme Der Abbildungsmaßstab des Negativs einer mikro­ fotografischen Aufnahme kann nach MNegativ

=

VMikroskop

wegen der mechanischen Ausbil­

dung der Aufsetzkamera für jedes Okular einen

anderen Wert annimmt, wenn die Aufsetzkamera "nach Vorschrift" mit der Tubusklenm1e so mit dem Mikroskop verbunden wird, daß

k

(8.3)

250

Tubus­

klemmenoberkante und Okulardeckel auf gleiche Höhe kommen. Ist in diesen Fällen eine gerraue

berechnet werden, wobei k/250 als Kamerafaktor

Angabe des

p bezeichnet wird. GI. (8.3) kann deshalb auch

muß eine Messung des Abbildungsmaßstabs in

MNegativ

=

Mobjektiv VokularP

(8.4)

Abbildungsmaßstabs

erforderlich,

der Bildebene des Kameraansatzes vorgenommen werden (s. Abschnitt 8.2.5.4.).

geschrieben werden.

Die für die Erreclmung des Abbildungsmaßstabs

Bei einer Aufsetzkamera, deren Kameraansätze

einer Aufnahme mit der Aufsetzkamera mf des

gewechselt werden können, empfiehlt sich eine

VEB Carl Zeiss JENA geltenden Beziehungen

Zerlegung des Kamerafaktors p in die beiden

sind in Tafel 8.3 zusammengestellt.

Tafel 8.3. Die Abbildungsmaßstäbe der mfAufselzkamera des VEB Carl Zeiss JENA

Kameraansa t z

24 mm

x 36mm

6,5 cm x 9 cm

p 3f'

X

4f'

4"

x

1x 2,5

X

3x

9 cm x 12cm und P

PKamcraansatz

5"

3,5

X

Okula rsystem

Formel für die Errechnung des Negativ-Abbildungsmaßstabs

Okular

MNcg = Mob; Vok

Projektiv

MNcg =Mob; MProj

0,5

Okular

MNcg =Mob; Vok

Projektiv

MNcg = Mob; MProj

2,5

Okular

MNcg =Mob; Vok

1,5

Projektiv

MNeg =Mobj MProj

Okular

MNcg = Mob; Vok

Projektiv

Mr;.cg =Mob; MProj

1,25

3 1,75 3,5

Wegen des kleinen Aufnahmeformats muß bei der Mikrofotografie mit einer Aufsetzkamera stets davon ausgegangen werden, daß das Negativ der im

Aufnahme

fotografischen

Negativ/Positiv­

prozeß nochmals vergrößert wird. Diese nach­ folgende Vergrößerung muß bereits bei der Wahl des Abbildungsmaßstabs der

oder

Kleinbild-

Mittelformataufnahme berücksichtigt werden. So wie bei der visuellen mikroskopischen Beob­ achtung die Wahl der Vergrößerung des Mikro­ skops der Regel der "förderlichen Vergrößerung" genügen muß, gilt diese Regel auch für dieBetrach­ tung des Endbilds eines mikroskopischen Bildwie­ dergabeverfahrens. Während das mikroskopische Bild bei visueller Beobachtung stets als in der Bezugssehweite liegend angenommen wird, kann das Endbild eines mikroskopischen Bildwieder­ gabeverfahrens durchaus aus einer anderen meist größeren - Entfernung betrachtet werden. Die Betrachtungsentfernung muß bei der Wahl des Abbildungsmaßstabs für das Endbild berück­ sichtigt werden.

Für den "förderlichen Abbil­

dungsmaßstab"des Endbilds gilt die Beziehung

500AObj

1V

250

�

Mrörderlich

� 1000Aobj

1V

250

;

(8.8) w

=

Betrachtungsabstand des Endbilds in

mm.

Wird ein Mikrofotogramm aus der Bezugsseh­ weite

250 mm betrachtet,

die "förderliche Vergrößerung" und den "förder­

w/25 0

den Wert 1 an­

nimmt. In diesem Fall gilt

500 Aobj �

Mrörderl ich

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

dann sind die Werte für

lichen Abbildungsmaßstab" zahlenmäßig gleich, weil dann der Quotient

Bild 8.14. Geräteaufbau zur Lupenfotografie mit Teilen der Aufsetzkamera mf

� 1000 Aobj

·

(8.9)

sehen Beleuchtungsverfahrens insofern ab, als die Leuchtfeldblende nicht in das Präparat, sondern in die Öffnungsblende des Lupenobjektivs abge­ bildet wird.

8.2.4.6. Lupenfotografie mit der Aufsetzkamera

Die einstufig vergrößerte Abbildung des Objekts

Aufnahme,

aufgenommen

System der Brennweite abstand des Bilds

lupenfotografi­

einer

Abbildungsmaßstab

Der schen

k

f bei

mit

einem

einem Brennpunkt­

der optischen Kamera­

-

länge-, kann nach der Gleichung

wird vor allem für Übersichtsdarstellungen ang(­ wendet. Zur Kleinbild- und Mittelformat-Lupen­

MNcgativ

=

(8.10)

k/f

fotografie können die Kameraansätze einer Auf­ setzkamera dann verwendet werden, wenn einmal

überschlagsmäßig errechnet werden.

die Aufsetzkamera nach dem Dreiteilungsprinzip

Bei

(Bild

8.2)

aufgebaut ist und zum anderen die Ver­

Lupenaufnahmen

ist

eine

lichtelektrische

Bestimmung der Belichtungszeit in der Weise

bindung der einzelnen Bauteile mit der gleichen

möglich, daßman einFotoelement in dieBildebene

Wechselvorrichtung erfolgt, die auch zum Auf­

der Einrichtung bringt.

setzen der Beobachtungstuben auf das Mikroskop

Fotostrom kann die Belichtungszeit über eine

zur Anwendung gelangt (Bild

8.14).

Aus dem gemessenen

Eichkurve ermittelt werden.

Zur Beleuchtung des Objekts sind Lupenkonden­

Eine vollautomatische Regelung der Belichtungs­

soren, zur Abbildung lupenfotografische Objektive

zeit erfordert bei einstufig vergrößerter Abbildung

erforderlich. Die Beleuchtung des Objekts weicht

eine spezielle, nur für diese Aufnahmen verwend­

bei Lupenaufnahmen von der Regel des Köhler-

bare Anordnung mit einem kaum vertretbaren

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

358

länge.

Überwiegend

sind

Balgenkameras

für

mikrofotografische Zwecke auf das Großformat

9 cm

x

12 cm oder 4"

x

5" ausgelegt, wobei

die vertikale Anordnung vorherrscht. Der Aufbau einer Balgenkamera für die Mikro­ fotografie wird im Bild 8.16 am Beispiel der mikrofotografischen Einrichtung st des VEB Carl Zeiss JENA gezeigt. Grundsätzlich ist es möglich, die im Mikroskop­ fuß

vieler

Lichtquelle

Durchlichtmikroskope auch

zur

eingebaute

Großformat-Mikrofoto­

grafie einzusetzen. Das führt aber

zu

Schwierig­

keiten bei der Einstellung des Bilds und Belichtungszeiten.

zu

langen

Deshalb werden zur

Groß­

formatmikrofotografie stärkere Lichtquellen be­ vorzugt.

8.2.5.1. Einstellung des Bilds Die Einstellung des Bilds erfolgt bei der Balgen­ kamera auf einer Einstellscheibe in der Bildebene der

mikrofotografischen

Einrichtung.

Zur

Bild 8.16. Balgenkamera für Großformat-Mikroaufnahmen ERGA VAL-st Bild 8.15. Geräteaufbau zur Mikrofotografie

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Aufnahme von Übersichtsbildern mit Planachromat

1/0,03,

Mikroskop ERGAVAL, Aufsetzkamera mf

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Aufwand.

Zur

automatischen

Steuerung

der

Belichtungszeit bei Übersichtsaufnahmen wird deshalb eine zweistufig vergrößernde Anordnung bevorzugt und als Objektiv ein Mikroskopobjek­ tiv der Maßstabszahl 1 benutzt. Dieses ermöglicht denEinsatzeiner mikrofotografischenBelichtungs­ automatik ohne Änderungen des Geräts auch zur vollautomatischen Regelung der Belichtungs­ zeit bei den Abbildungsmaßstäben, die gemeinhin als der Lupenfotografie vorbehalten angesehen werden. Unter diesem Aspekt verliert die ein­ stufig .vergrößernde Abbildung des Objekts mit lupenfotografischen Objektiven bei Kleinbild- und Mittelformataufnahmen

dann

an

Bedeutung,

wenn es allein um die Anfertigung von Über­ sichtsbildern geht (Bild 8.15).

8.2.5. Mikrofotografie mit der Balgenkamera Das wesentliche Kennzeichen der Balgenkamera ist die Veränderlichkeit der optischen Kamera-

Er-

8.2. Mikrofotografie

359

Jeichterung dieser Einstellung - vor allem bei großen Kameralängen - werden die mikrofoto­ grafischen

Balgenkameras mit einem

Spiegel­

reflexaufsatz ausgerüstet. Für diejeder mikrofoto­

.L 100

grafischen Aufnahme vorausgehende visuelle Ein­ stellung des Mikroskops dienen spezielle Foto­ tuben.

8.2.5.2.

iI

Umstellung des Mikroskops

'

�

i �

1 10

!

1 2

1

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,&,

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\ !l)

1 ß

1

1

1

2

4

8

15

30

1

2

4

8

15

30

I

�

lls

II _

� ·a;

�!::l

w�

II

so11s

ZurMikrofotografie werden an der Balgenkamera die

üblichen Mikroskopokulare

benutzt. Bei

kurzen Kameralängen und schwachen Okularen

ist eine Tubusverlängerung nach GI. (8.2) (Ab­

schnitt 8.1.2.) erforderlich, deren Werte Tafel 8.4 entnommen werden können.

Bild 8.17. Teilung auf dem Kassellenschieber zur Anfertigung einer Belichtungsprobe

Tafel 8.4. Tubusverlängerung in 111111 bei Verwendung von Mikroskopokularen zur Mikrofotografie mit einer Balgenkamera

k\ Vokula r ;\

6,3 X

200mm 400mm

8 4

600mm

2,5

8

lOx

12,5x

5

3

2

2,5

1,5

1

1,5

1

0,5

X

16x

20x

0,5 0,5

8.2.5.3.

Bestimmung der Belichtungszeit Die Bestimmung der Belichtungszeit erfolgt beim Arbeiten mit einer mikrofotografischen Balgen­ kamera nach den gleichen Methoden wie bei der Aufsetzkamera: Probebelichtung-lichtelektrische

Bild 8.18. Beispiel einer Belichtungsprobe mit dem Kassellenschieber (Negativ)

Messung- Belichtungsautomatik. Tafel 8.5. Einzel- und Streifenbelichtungszeiten

Belichtungsprobe Eine Belichtungsprobe kann im einfachsten Fall mit der zur Balgenkamera gehörenden Platten­ kassette angefertigt werden, deren Kassettenschie­ ber dazu mit einer Teilung (Bild 8.17) versehen ist. Die Probe wird so ausgeführt, daß zunächst der

Kassettenschieber so weit herausgezogen wird, daß die gesamte Teilung sichtbar ist. Die Mittelfelder

der Teilung geben die zu jedem Teilstreifen der Belichtungsprobe

auszuführende

Einzelbelich­

tungszeit an. Als erstes wird das gesamte Negativ mit 1 oder 1/100 s belichtet. Diese Entscheidung

in Sekunden bei der Belichtungsprobe mit dem Kassettenschieber

Streifen-Nr.

I

1I

Ill

1. Belichtung

IV

V

VI

Vll

2. Belichtung

1

I

I

I

1

3. Belichtung

2

2

2

2

2

4

4

4

4

4. Belichtung 5. Beli�htung

8

8

15

6. Belichtung

7. Belichtung

8

15 30

kann nach dem Helligkeitseindruck des Bilds re­ lativ leicht getroffen werden.

Streifen­

Dann wird der Kassettenschieber um eine Streifen-

belichtungszeit

breite bis zum nächsten Teilstrich eingeschoben

in s

2

4

8

15

30

60

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

360

und die erste Belichtungszeit wiederholt. Vom folgenden Streifen an wird die Belichtungszeit dann jeweils verdoppelt. Im Bild

8.18 ist eine nach diesem Verfahren ange­

fertigte Belichtungsprobe dargestellt. Das Zu­ standekommen der Streifenbelichtungszeiten für die Erstbelichtungszeit 1 s ist in Tafel

8.5 er­

sichtlich. Eine nach der vorstehend beschriebenen Methode durchgeführte Belichtungsprobe setzt voraus, daß sich die Objektstruktur annähernd gleichmäßig über das gesamte Bildfeld verteilt.

Belichtungszeitmessung Die lichtelektrische Messung der Belichtungszeit mit

einer

mikrofotografischen

Balgenkamera

wird gelegentlich mit einer Okularfotozelle vor­ genommen, die auf der Beobachtungsseite des Fototubus - etwa in der Zwischenbildebene des Mikroskops - angeordnet wird. Aus dem Meß­ wert kann auf die erforderliche Belichtungszeit ge­ schlossen werden, indem die Ablesung mit einem von der Okularvergrößerung auf der Fotoseite und der Kameralänge abhängigen Faktor um­ gewandelt wird. Bei genügend hellen Bildern kann die Bildhellig­ keit mit einem ausreichend empfindlichen Belich­ tungsmesser auf der Einstellscheibe gemessen wer­ den. Man erhält über einen empirisch zu bestim­

Bild 8.19. Möglichkeiten der Anordnung des Lichtfiihlers fiir eine Belichtungsautomatik ' an der Balgenkamera ·

menden Umwandlungsfaktor brauchbare Ergeb­ Objektantei!' zugrunde, der für die Aufnahme

nisse.

nicht verwendet wird.

Belichtungsautomatik

Beide Arten einer Belichtungsautomatik für die

Jede vollautomatische Regelung der Belichtungs­

mikrofotografische Balgenkamera sind ausgeführt

zeit erfordert den gleichzeitigen Lichteinfall auf

worden.

Fotoschicht und Lichtfühler.

Die st-Belichtungsautomatik des VEB Carl Zeiss

Bei der Balgen­

kamera stehen für die Lichtführung zum Licht­

JENA arbeitet nach dem ersten, die Belichtungs­

fühler zwei Wege zur Wahl, die im Bild

automatik

8.19

für

die Balgenkamera

schematisch dargestellt sind.

Wetzlar (BRD) (Bild

Man kann einmal einen Teil des Lichts in der

Verfahren.

von

Leitz,

8.20) benutzt das zweite

Form zum Lichtfühler abzweigen, daß man - wie bei der Aufsetzkamera - oberhalb des Okulars

8.2.5.4.

einen Strahlenteiler einbaut, zum anderen kann

Abbildungsmaßstab der Aufnahme

der Lichtfühler in der Bildebene außerhalb des Bildformats angeordnet werden.

Errechnung des Abbildungsmaßstabs

Vorteil,

Auch beim Arbeiten mit einer Balgenkamera

zur Belichtungssteuerung einen zentralen Bild­

kann der Abbildungsmaßstab des Negativs der

Das erstgenannte

Verfahren

hat

den

ausschnitt zu verwenden. Dabei muß aber wegen

mikrofotografischen Aufnahme nach GI.

des konstanten Abstands des Lichtfühlers und

errechnet werden. Die Balgenkamera ist dazu

(8.3)

der variablen Kameralänge eine Korrektur der

meist mit einem Bandmaß zum Messen der op­

Automatik auf die Kameralänge vorgenommen

tischen Kameralänge

werden.

Hinsichtlich der Genauigkeit der so ermittelten

Das zweite Verfahren erfordert diese Korrektur

Werte muß beachtet werden, daß die auf den

nicht, legt der Belichtungssteuerung aber einen

Mikroskopobjektiven und -okularen angegebe-

k versehen.

8.2. Mikrofotografie

gemessen

wird,

ebenfalls

361

vom genauen Wert

abweicht.

Bestimmung des Abbildungsmaßstabs durch Messung des Objekt/Bildabstands Als Objekt/Bildabstand wird in diesem Fall die Entfernung der Bildebene der mikrofotografischen Einrichtung vom Objekttisch des Mikroskops ver­ standen. Dieser Abstand kann mit einem auf den Objekttisch des Mikroskops gestellten Maßstab ohne Veränderung der Einstellung der Einrich­ tung gemessen werden. Der Abbildungsmaßstab kann auch in Abhängigkeit vom Objekt/Bildab­ stand in der im Bild 8.21 gezeigten Weise für den zur Mikrofotografie benutzten Objektivsatz in Verbindung mit einem oder mehreren Okularen grafisch dargestellt werden. Mit einer solchen Dar­ stellung kann nicht nur der Abbildungsmaßstab der Aufnahme in einer für die Praxis ausreichen­ den Genauigkeit bestimmt, sondern darüber hin­ aus auch die mikrofotografische Einrichtung vor der Aufnahme

auf einen

gewünschten Abbil­

dungsmaßstab eingestellt werden. In die Darstellung der Abhängigkeit des Abbil­ dungsmaßstabs vom außerdem

noch

Objekt/Bildabstand kann

der Bereich

des "förderlichen

Abbildungsmaßstabs" für eine aus der Bezugsseh­ weite

vorgenommene Bildbetrachtung

des

im

Bild 8.20. Leitz-Belichtungsautomatik für die Balgenkamera

Kontaktverfahren gewonnenen Positivbilds ein­

Firma E.Leitz, Wetzlar, Werkfoto

gezeichnet werden (Bereich zwischen den gestri­ chelten Linien im Bild 8.21).

nen Werte der Objektiv-Maßstabszahl und der angegebenen

Die gerraue Bestimmung des Abbildungsmaßstabs

5% abweichen können und daß ferner

geschieht durch eine Messung desBilds derTeilung

Okular-Lupenvergrößerung Wert um±

Messung des Abbildungsmaßstabs

vom

die Messung der optischen Kameralänge, wenn

einer Objektmeßplatte auf der Einstellscheibe in

sie- wie in der Praxis üblich- vom Okulardeckel

der Bildebene der mikrofotografischen Einrich-

J,Z/0,70 6,3/0,76 70/0,25 20/0,40 700 ,---,.-----,.-· ----ik----"

40/0,65

700/1,25

cm

90

t

�

80 1---L.._

_ _

70

I

Bild 8.21 Ermilllung des Abbildungsmaß­ stabs einer mikrofotografischen Aujiwhme mit Hilfe des Objekt/ Bildabstands für Zeiss-Pian­ achromate und Okular PK JOx

50

M--

8. Ve1/ahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

362

tung (Bild meßplatte

8.22). Bei Verwendung einer Objekt0,01, bei der die Strecke 1 mm in 100

Teile unterteilt ist, ist MNegativ = wenn

a

(100 a): 1,

(8.11)

der in der Bildebene gemessene Abstand

zweier Teilstriche, und MNegativ= wenn

b

(8.12)

(100 bjn) : 1 ,

über

Teilstrichen in der Bildebene ge­

n

messen wurde

(a

und

b in mm).

a

i

I

I I

I

I

IIII

I

Bild 8.22 Messung des Abbildungs­ maßstabs in der

b

Bildebene

Hinsichtlich des "förderlichen Abbildungsmaß­ stabs" gelten die im Abschn.

8.2.4.5.

gemachten

Ausführungen auch für die Großformat-Mikro­ fotografie.

Bild 8.23. Balgenkamerafiir Kleinbildaufnahmen mit stufenlos veränderlichem Abbildungsmaßstab Mikroskop

8.2.5.5.

LABOVAL 2 und lHAGEE-Vielzweckgerät

mit Kleinbildkamera EXAKTA YAREX

Balgenkamera für Kleinbildaufnahmen

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Bei der Anfertigung von Kleinbild-Mikroauf­ nahmen besteht oft der Wunsch, mit stufenlos veränderlichem Abbildungsmaßstab zu arbeiten. Das läßt sich, zwar recht aufwendig, durch die

8.2.5.6. Lupenfotografie mit der Balgenkamera

Verwendung eines pankratischen Projektivs er­

Mikrofotografische

reichen. Eine dieser Forderung genügende Ein­

auch für die Großformat-Lupenfotografie ein­

richtung kann aber auch aus dem Kleinbild­

gerichtet (Bild

Kamerazubehör aufgebaut werden, wenn für die

Durchlicht-Lupenfotografie geeigneten Objekti­

Kamera ein Reproduktionsgestell und dazu ein

ven M des VEB Carl Zeiss JENA Abbildungsmaß­

Balgen-Naheinstellgerät zur

stäbe von

Spiegelreflexeinstellung

der

Verfügung stehen. Kamera

ist

zur

Balgenkameras

8.24).

10: 1

bis

sind

meist

Man erreicht mit den zur

63 : 1.

Der Abbildungsmaßstabeinerlupenfotografischen

bequemen und sicheren Einstellung des Bilds zu

Aufnahme kann nach

bevorzugen (Bild 8.23). Mit dem gezeigten Aufbau

mäßig errechnet werden. In der Praxis wird man

GI.

(8.10)

überschlags­

werden optische Kameralängen von 100 bis 270 mm

den Abbildungsmaßstab der Aufnahn1e indessen

erreicht. Mit dem gleichen Geräteaufbau können

in der Bildebene messen.

auch Kleinbild-Lupenaufnahmen angefertigt wer­

Diese Messung basiert auf der Gleichung

den. In beiden Fällen gestattet die Verwendung einer

Kleinbildkamera

mit

Innenbelichtungs­

messung - ausreichende Helligkeit des mikro­

Bildgröße y' M=-= Objektgröße y

(8.13)

skopischen Bilds vorausgesetzt - die Durchfüh­

Auch bei der Lupenfotografie mit der Balgen­

rung des Verfahrens einer Belichtungszeitmessung.

kamera kann die Bestimmung des Abbildungs-

8.2. Mikrofotografie

363

prinzip zu einem Fotomikroskop ausgebaut wer­ den kann. Grundsätzlich erfüllen beide Bauformen ihren Zweck. Die Baukastenform hat den Vorteil, ein beliebiges Mikroskop zu einem beliebigen Zeit­ punkt

in

ein

Fotomikroskop umwandeln

zu

können. Das Spezialmikroskop kann dagegen in geschlossener Bauart und mit größerem Bedie­ nungskomfort ausgeführt werden. Nach

dem

Aufnahmeformat

kann

in

beiden

Gruppen schließlich noch zwischen Kleinbild-und Großformat-Kameramikroskopen unterschieden werden.

8.2.6.1. Kleinbild-Kameramikroskop in geschlossener Bauart Von

der

gerätetechnischen Konzeption

eines

Kleinbild-Kameramikroskops wird erwartet, daß neben dem raschen und bequemen Wechsel des Mikroskopierverfahrens die Wahl des Bildaus­ schnitts sicher erfolgen und dabei der Abbildungs­ maßstab ohne Umbau des Geräts variiert werden kann. Ständige

Aufnahmebereitschaft,

tungsautomatik

und

automatischer

Belich­

Filmtrans­

port sollen es dem Mikroskopiker ferner ermög­ lichen, sich während seiner Tätigkeit voll auf die mikroskopische Untersuchung konzentrieren zu Bild 8.24. Balgenkamera für Großformal-Lupenaufnahmen LABO VAL-s! VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

können

-, die fotografische Registrierung

muß ohne Ablenkung durch fotografische Ar­ beitsgänge möglich sein.

maßstabs durch Messen des Objekt/Bildabstands

Bild 8.25. Kleinbild-Kamemmikroskop

vorgenommen werden.

FOTOMIKROSKOP li

Die Balgenkamera kann darüber hinaus auch

Firma Opton, Feintechnik GmbH, Oberkochen

ohne

Werkfoto

Mikroskop zur Lupenfotografie benutzt

werden. In diesem Fall werden Objektiv und Ver­ schluß in dieKamerafrontplatteeingesetzt.So sind auch längerbrennweitige lupenfotografische Ob­ jektive (z.B. f = 60 bis 120 mm) verwendbar. Zur Beleuchtung des Objekts dienen dann Großfeld­ beleuchtungseinrichtungen für Durchlicht oder spezielle Beleuchtungseinrichtungen für Auflicht.

8.2.6. Mikrofotografie mit einem Kameramikroskop Ein Kameramikroskop kann auf zwei Arten auf­ gebaut werden. Einmal als Spezialgerät - als Fotomikroskop

-,

das die mikrofotografische

Kamera enthält. Zum anderen sind eine Reihe von Fotoaufsätzen für Mikroskope bekannt geworden, mit denen ein Mikroskop nach dem Baukasten-

des

Untersuchungsergebnisses in allen seinen Phasen

-,

364

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

Der älteste Vertreter eines Kleinbild-Kamera­ mikroskops

in

geschlossener Bauart

ist

das

MIKROPHOT des VEB R athenower Optische Werke. Dieses Gerät ist durch eine eingebaute Kleinbildkassette gekennzeichnet. Zum Zeitpunkt seines Erscheinens existierte eine mikrofotogra­ fische Belichtungsautomatik noch nicht. Den gleichen Grundaufbau -mitBelichtungsauto­ matik- zeigt das FOTOMI K R OSKOP der Firma Opton Feintechnik, Oberkochen (BRD), (Bild 8.25). Die beiden Geräte sind durch feste Projektiv-AbbiJdungsmaßstäbe gekennzeichnet.

Bild 8.26. Fotomikroskop DOCUVAL

Beim Fotomikroskop DOCUVAL des VEB

YEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Carl Zeiss JENA (Bild 8.26) ist mit Hilfe eines eingebauten pankratischen Projektivs eine stufen­ lose Veränderung des Abbildungsmaßstabs mög­

ansatzes aus dem System der Aufsetzkamera

lich.

(s. Abschn. 8.2.4.4.) auf den an diesem Fotomi­

Innerhalb seiner Geräteklasse nimmt dasD 0 CU­

kroskop vorhandenen "Zweitausgang" auch für

VAL - was seine Ergänzungsmöglichkeiten zur

die Mittel- und Großformat-Mikrofotografie aus­

Mikrofotografie angeht - insofern eine Sonder­

gebaut werden kann (Bild

stellung ein, als es durch Aufsetzen eines Kamera-

Konjugation mit dem binokularen Einstelltubus

Bild 8.27. Wechselmöglichkeit des Aujiwhmeformats an1 Fotomikroskop DOCU VAL

YEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

..

\

\

3,5x 1

u ......

�OCUVA< 0

. '

•

' 1!!1

•

8.27). Die optische

8. 2. Mikrofotografie

365

sowie der zur Fotografie gewählte Bildausschnitt bleiben dabei unabhängig vom gewählten Auf­ nahmeformat erhalten. Darüber hinaus ermög­ licht der Zweitausgang den Ausbau des Foto­ mikroskops zur

Fernsehmikroskopie und

zur

Mikroprojektion- in beiden Fällen mit der Mög­ lichkeit einer schnellen mikrofotografischen Re­ gistrierung des demonstrierten Objekts mit Hilfe der eingebauten Kleinbildkamera. 8.2.6.2. Großformat-Kameramikroskop in geschlossener Bauart

Die ältesten Vertreter sind das ULTRAPHOT von Carl Zeiss JENA und das PANPHOT von Leitz, Wetzlar (BRD); bei beiden Geräten er­ folgt die Variation des Abbildungsmaßstabs bei vorgegebenem

Objektiv

durch

Änderung

der

Okularvergrößerung und der optischen Kamera­ länge.

Von Opton

Feintechnik,

Oberkochen

(BRD), wird als Vertreter dieser Geräteklasse das ULTRAPHOT -II (Bild 8.28) gefertigt, bei dem die Kameralänge mit einem eingebauten Spiegel­ wagen geändert wird. Eine bedeutende Rolle spielen Kameramikro­ skope seit langem in der Auflichtmikroskopie.

Bild 8.28. Großformat-Kameramikroskop

Bild 8.29. Großformat-Kameramikroskop NEOPHOT 2 VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

ULTRAPHOT !I

Stellvertretend für ein solchesGerät stellt Bild 8.29

Firma Opton, Feintechnik GmbH, überkochen,

das NEOPHOT 2 des VEB Carl Zeiss JENA

Werkfoto

dar. In das Gerät ist eine Belichtungsautomatik eingebaut. DieÄnderungdes Abbildungsmaßstabs erfolgt mit einem in das Mikroskop eingebauten optischen Vergrößerungswechsler, mit dem bei einer Grundkameralänge von 250 mm die in der Metallografie standardisierten Abbildungsmaß­ stäbe erreicht werden. Eine zusätzliche mechani­ sche Verstellmöglichkeit der Kameralänge er­ laubt sowohl die exakte Einstellung eines vor­ gegebenen Abbildungsmaßstabs Einstellung

der

zwischen

den

als

auch

die

Stufen

des

Vergrößerungswechslers liegenden Maßstäbe. 8.2.6.3. Kleinbild-Kameramikroskop in Baukastenform

Durch Aufsetzen von weitgehend automatisierten Fotoaufsätzen

auf

ein

Mikroskop

entstehen

Geräte, die die Funktion eines Kameramikro­ skops übernehmen können. Einen ersten Schritt in dieser Richtung stellt die Automatisierung von Belichtung und Filmtransport dar, wie er sich bereits mit Bauteilen der Aufsetzkamera erreichen läßt (Bild 8.30). Gegenüber der Aufsetzkamera mit ihrem monokularen Einstellsystem weisen

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

366

..

•

' ? 0 ..

•

Bild 8.31. Kleinbild-Kameramikroskop in Baukastenform Mikroskop ORTHOPLAN mit automatischer Aufsetz­ kamera ORTHOMAT Firma

Bild 8.32. Großformat-Kameramikroskop

Bild 8.30. Meluformat-Kameramikroskop in

in Baukastenform

Baukastenform

Mikroskop ORTHOPLAN mit Balgenkamera und

Mikroskop ERGAVAL

Lampenhaus

mit automatischer Aufsetzkamera mf

·

matic

Kameramikroskope in Baukastenform einen bin­ okularen Einblick auf. Dabei kann die Konju­ gation der beiden Zwischenbildebenen auf der Einblick- und der Fotoseite zur Scharfeinstellung des Bilds genutzt werden. Zur Beurteilung des Formatausschnitts sind dann spezielle Bildfeld­ okulare mit Formatfiguren erforderlich. Geräte sind z.B.

Der­

der ORTHOMA T

(Bild 8.3 I) und dieFotoautomatik vonWild, Heer­ brugg, Schweiz. Während das erste Gerät aus­ schließlich für die Kleinbild-Mikrofotografie aus­ gelegt ist, erlaubt das zweite die wahlweise An­ wendung verschiedener Aufnahmeformate.

8.2.6.4. Großformat-Kameramikroskop in Baukastenform Ähnlich wie durch Aufsetzen eines Kleinbild­ Fotoaufsatzes

auf

ein

serienmäßig

gefertigtes

Mikroskop ein GerätmitdervollenFunktion eines Kameramikroskops entsteht, kann diese Bauform auch auf die Großformat-Mikrofotografie aus­ gedehnt werden. Diese Möglichkeit besteht für das ORTHOPLAN von Leitz, Wetzlar (BRD), und ist im Bild

8.32 dargestellt.

500

Firma E. Leitz, Wetzlar, Werkfoto

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

artige

E. Leitz, Wetzlar, Werkfoto

8.2. Mikrofotografie

Die

angesetzte Balgenkamera kann mit einer

367

Lichtempfindlichkeit

Belichtungsautomatik ausgerüstet werden. Dem

Die Bestimmung der Lichtempfindlichkeit eines

größeren Lichtbedarf

Fotomaterials wird nach unterschiedlichen Ver­

der

Großformat-Mikro­

fotografie wird durch eine Hochleistungs-Mikro­

fahren vorgenommen. In Tafel 8.6 wird ein Ver­

skopierleuchte entsprochen.

gleich der beiden gebräuchlichsten Empfindlich­ keitsangaben nach DIN und ASA gezeigt.

8.2.6.5.

Dabei wird doppelte Lichtempfindlichkeit durch

Handhabung eines Kameramikroskops

Zuwachs der DIN-Zahl um

Was die Handhabung eines Kameramikroskops

Faktor 2

hinsichtlich der für die Mikrofotografie maßge­

bracht.

benden Dinge angeht, so Jassen sich die Verhält­ nisse einer Aufsetzkamera oder einer Balgenka­

x

+ 3 bzw. durch

der ASA-Zahl zum Ausdruck ge­

Farbenempfindlichkeit

mera auch auf ein Kameramikroskop übertragen

Die Farbenempfindlichkeit eines Schwarzweißma­

und gelten hier sinngemäß.

terials sagt aus, in welchem Strahlungsbereich Schwärzung erzielt werden kann. Bei allen Foto­ schichten ist zunächst einmal eine UV- und Blau­

8.2.7.

empfindlichkeit von etwa 200 bis 500 nm vorhan­

Fotografische Seite der Mikrofotografie

den. Die zur Kennzeichnung der Farbenempfind­

Der Erfolg einer mikrofotografischen Bildwieder­

lichkeit üblichen Handelsbezeichnungen und die

gabe hängt von der richtigen Handhabung des

daraus erkennbare Farbenempfindlichkeit sind in

Mikroskops und einer sicheren Beherrschung des

Tafel 8.7 vereinfacht zusammengestellt.

fotografischen Prozesses ab. Nachfolgend sollen

Die Angaben sind als Hinweis für die bei der Ver­

die für die Mikrofotografie wesentlichen Dinge

arbeitung des Materials zulässige Dunkelkammer­

der Fotografie kurz umrissen werden.

beleuchtung zu verstehen.

Genauere Auskunft

über die Farbenempfindlichkeit geben die relative

8.2.7.1.

spektrale

Grundzüge der Schwarzweißfotografie

Empfindlichkeit sowie das Spektra­

gramm (Bild 8.33).

Ein Fotomaterial wird durch die Angabe seiner

Die relative spektrale Empfindlichkeit gestattet

Haupteigenschaften charakterisiert. Diese sind:

Aussagen darüber, in welchem Strahlungsbereich

Tafel 8.6. Vergleich der Lichtempfindlichkeitsangaben nach DIN und ASA DIN ASA DIN ASA DIN ASA

10

11 10

12 12

13

8 22

23

24

125

160

200

25 250

16

14 20

15 25

16 32

17

26

27

28

29

320

400

500

39 6400

40 8000

34

35

36

37

38

2000

2500

3200

4000

5000

18 50

19 64

20

21

80

100

30 800

31 1000

32 1250

33

640 41 10 000

42 12 500

43 16000

40

1600

Tafel 8. 7. Angaben der Farbenempfindlichkeil eines Fotomalerials Kennzeichnung

Empfindlichkeilsbereich

Empfindlichkeit für die Farben

nm

Unsensibilisiert

200 ... 500

UV, Violett und Blau

Orthochromatisch

UV, Violett, Blau, Grün und Gelb

Panchromatisch

200 ... 600 200 ... 700

UV, Violett, Blau, Grün, Gelb und Rot

Infrarotempfindlich

400 ... 500

UV, Violett, Blau sowie

700 ... 11001)

Infrarot

1) Die Empfindlichkeilsgrenze im langwelligen Bereich ist verschieden und vom benutzten Sensibilisator abhängig.

8. Ve1jahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder

368

J

�

�

I

FU2 2

t

s

"

M01

7-

IgEl�

2

3

.

Belichtungsumfang

I

4

�

5

� -i

Bild 8.34. Schwärzungskurve

500

�00

600

700

mm

ßOO

umfang und damit auf den Belichtungsspielraum

Bild 8.33. Spektragranune verschieden sensibilisierter

zu.

Fotoschichten bei Belichtung mit Kunstlicht (3200 K)

Projiziert man die den geradlinigen Teil der

unsensibilisiert: ORWO-FU 2;

auf die Abszisse, dann kann dort der Helligkeits­

orthochromatisch: ORWO-MO I;

Schwärzungskurve begrenzenden PunkteBund C

umfang abgelesen werden, den das Material bei

panchromatisch: ORWO-NP 15; IR-empfindlich: ORWO-IR 750

Entwicklung zu diesem Gamma-Wert tonwert­

VEB Filmfabrik Welfen

richtig wiedergeben kann. Dieser Wert kann aus den zugehörigen Belichtungswerten auch zahlen­ mäßig als "Belichtungsumfang" angegeben wer­

eine Schwärzung erzielt werden kann, und geht

den.

dabei von einem energiegleichen Spektrum aus.

Aus dem Belichtungsumfang kann auf den Belich­

Die effektive spektrale Empfindlichkeit geht von

tungsspielraum des für den Aufnahmegegenstand

einer definierten Beleuchtung (meist Kunstlicht

3200

K oder Tageslicht

5500

K) aus und ermög­

bekannten oder vorgegebenen Helligkeitsumfangs geschlossen werden.

licht über das sog. Spektragramm des Fotomate­

Der

rials eine Aussage über den bei dieser Beleuchtungs­

Schicht ist in starkem Maße von der Gradation

Belichtungsumfang

einer

fotografischen

art wirksamen Strahlungsbereich.

abhängig (Bild

Gradation

werden, daß der Belichtungsumfang einer hart

8.35). Ganz allgemein kann

gesagt

arbeitenden Schicht (BU11) kleiner und der einer

Zur Angabe der Gradation wird die Schwärzungs­ kurve

des

Fotomaterials

Schwärzungskurve (Bild

herangezogen.

8.34)

Die

zeigt die Schwär­

s

zung in Abhängigkeit von der Belichtung. Nur im geradlinigen Teil der Kurve ist die Schwärzung der Belichtung proportional. Die Neigung des

I ,weich' J 1 werden als "hart", mit

y < I als "weich" arbeitend bezeichnet.

Der geradlinige Teil der Schwärzungskurve ist

BUh BUn

OHU>--
® 2

oder

migi i.Auswerf8fJJ!_bmsse Anwendllflj!fl

feslgesle!!les Freigms

mehr benochbarte

Beginn

in es

e

b)

im Db'ekf

Material usw.

Zälliung,

ßroßen - und einfache Forman alyse an getrennt liegenden Objekten unter giinsti­

vorhergellende --

'

m

Beainn ein s Ob­ jekts. Der okfu­

Einige benachbtJrl Punkte in Z oder mehr

e

benachbarte

Zeilen

/!8J-�,

� �

�

Analyse von Pulvertetlehen

gen Bedtngungen htn­

e • om

c)

Stereologische Analyse von Me/ollen, po!'(fsem

Linearanalyse

Ende eines Ob ·ekls

Jrl

Obiek/s

Pun kte der aleichen Zeile

�

� �

meh'18:1--0/ rere

größere Punktgruppen über Zeilen

/t�*

elle Punkt ist Kon­ turpunkt

�

@]

Punktgruppe liegt am obe­

ren Rand eines

Objekts

0

Punktgruppe

linken

Rand e�nes Objekts

sichtliclt Punkt ist kein Konturpunkt und liegt im lneren des Ob'ekts

z 8 rod10le Anordnung von ßrouwertgrodtenten 1m Bild betm ßrodtentenftltervedllh­ ren [!1}

L

Kron/rast usw

Der aktuelle

A n a lyse kugeliger

Erkennung und Aus­ wertung komplizierter St rukturen, auch ein fa ­ cher J'trokluren tlfller

erschwerten gen

Objekte

mit wechseln­

dem Kontrast, mäßigem 1/ntergrund und Berührungen

ungleich­

Bedingun­

.

·)orouwer'itsoltnte Teslpunld

erfoßl keinen rodialen Orouwerlgrodienlen

Bild 9.23. Schematisierte Beispiele zur zeilengeführten Bildverarbeiu t ng ..., Richtung der Abarbeitung; //////// Objekt;

L Objektpunkt; 0 Untergrund;* aktuelle Bildpunkte

Anzahl und Anordnung von Nachbarpunkten des

Ein steuerbarer Abtaster erhöht die Flexibilität

aktuellen Bildpunkts. So erhält man aus dem ur­

der Bildverarbeitung in mehrfacher Hinsicht. Da­

sprünglichen Bild Punktmengen, die in enger

mit läßt sich z. B. durch Variation der Meßdauer

Beziehung zu stereologischen Kenngrößen des

für den Grauwert einer Bildzelle das unterschied­

Untersuchungsgegenstands stehen.

liche

Ist für die Lösung einer Bildanalyseaufgabe die

hellen Bildbereichen ausgleichen.

Signal/Rausch-Verhältnis

in

verschieden

Kenntnis des gesamten Verlaufs des Umrisses der

Grundsätzlich können die geschilderten Auswert­

Objekte

verfahren ebenso durch speziell entwickelte, fest­

nötig

(z. B.

bei

Chromosomen),

so

empfiehlt sich statt der zeilenweisen Verarbeitung

verdrahtete

des Bilds die sog. Konturfolgung (Bild 9.24).

schnitt 9.5.2.2.) wie durch Universalrechner reali­

elektronische Schaltungen (s. Ab­

Dabei sucht der Automat so lange zeilenweise, bis

siert werden [622]. Der Vorzug der Spezialrechner

er ein Objekt gefunden hat. Die Verarbeitung folgt

liegt in ihrer hohen Arbeitsgeschwindigkeit Sie

dann der Kontur des Objekts. Wenn die gesamte

sind jedoch nur eingeschränkt programmierbar.

Kontur abgefahren und registriert ist, wird die

Universalrechner

Suche nach weiteren Objekten fortgesetzt [614].

Software-Programme optimal an das Anwendungs­

Durch diese Methode kann Speicherplatz im

problem anpassen. Auch nach der Anschaffung

lassen

sich

durch

geeignete

Automaten gespart werden. Der Vorteil entsteht

der Apparatur können neu auftretende Aufgaben

allerdings nur dann, wenn die Konturfolgung

durch neue Programme gelöst werden. Bildana-

bereits bei der Abtastung einsetzt, d. h., wenn der Abtaster das Bild nicht zeilenweise abrastert, son­ dern die Abtastsonde selbst der Kontur folgt und deren Koordinaten ermittelt. Die objektfreien Präparatstellen werden überhaupt nicht gemessen. Dazu muß ein Abtaster vorhanden sein, bei dem die Position der Abtastsonde vom Auswertauto­ maten frei gesteuert werden kann. Zusätzlich wird eine sehr hohe Reproduzierbarkeit der Posi­ tionierung und der Grauwertmessung verlangt.

--· Bild 9.24. Kontwfolgung

9.5. Automatische Bildanalyse

417

(z. B.

Ein- und Ausgabe erlaubt die visuelle Kontrolle

Chromosomenuntersuchung) ist im wesentlichen

des Auswertevorgangs sowie korrigierende Ein­

lyse

mit

höherem

Kompliziertheilsgrad

dem Universalrechner vorbehalten.

Vorteilhaft

ist oft eine Kombination beider Konstruktions­

griffe.

Das ist

wichtig,

da die gegenwärtigen

Verfahren der automatischen Bildanalyse viele

prinzipien.

Störeinflüsse nicht fehlerlos bewältigen. So kö1men

Fast alle handelsüblichen Automaten zur Bild­

etwa atypische Objekte oder Präparierfehler von

analyse enthalten außer optischen Mitteln zur

der Auswertung ausgeschlossen werden. Auch die

Objektbeobachtung einen elektronischen Bild­

Einstellung der optimalen Schwellwerte für die

schirm, auf dem der abgetastete Präparateaus­

Objektdetektion wird mit Hilfe eines Bildschirms

schnitt dargestellt werden kann (Bild 9.25). Außer

bequemer.

der Wiedergabe des grauwertähnlichen Bilds (wie

Trotz erstaunlicher Leistungen in einigen Fällen

beim

gewöhnlichen

TV-Mikroskop,

s.

Ab­

[615]

[636]

kann

der

Entwicklungsstand

der

schnitt8.5.) können auf dem Bildschirm Flächen,

automatischen Bildanalyse gegenwärtig noch nicht

Linien und Punkte, die für den gerade laufenden

befriedigen.

Auswertprozeß charakteristisch sind, durch Hell­

Die Schwäche der Automaten besteht hauptsäch­

tastung hervorgehoben werden.

lich darin, daß sie bei Abweichungen der Prä­ parate von idealisierten Bedingungen (Kratzer, Staub, unvollkommene Ausbildung der Objekt­

Obje!lt

merkmale [Bilder 6.232 u. optische

wechselnde

6.234],

Abbildungseigenschaften

[Bild 3.15],

Überlagerung störender Strukturen usw.) die ge­ gebene Ausnahmesituation nicht selbständig er­ kennen und zweckmäßig reagieren. 9.5.1.4. Nutzen der automatischen Bildanalyse für die praktische Mikroskopie

Erhöhte Genauigkeit

Bei visuell durchgeführter Bildauswertung, z. B. Teilchenzählung oder Trefferanalyse, schwankt die von verschiedenen Beobachtern erzielte Ge­ nauigkeit infolge unterschiedlicher Sehtüchtigkeit, Sorgfalt oder Auslegung des Einstellkriteriums. Bild 9.25. Blockschema eines Bildanalyseautomaten

Auch bei demselben Beobachter differieren die

mit Display

Genauigkeiten in Abhängigkeit vom Grad der

GW Grau wert; K Steuerkommandos; H Helltastung von Bildelementen; LG Lichtgriffeleingabe; BS Bildschirmgerät

Konzentration bzw. Ermüdung. Die entstehenden Fehler sind sowohl systematischer als auch stati­ stischer Natur (vgl. Abschnitte 9.2.3., 9.3.1.4., 9.3.2.4.). Dagegen hängen die durch Automaten

Beispiel: Nach der Ermittlung der Kontur eines

erhaltenen Analysenergebnisse vom Bearbeiter

Objekts gibt der Automat die Konturlinie gra­

nur wenig ab.

fisch aus.

Die Reproduzierbarkeil

Umgekehrt kann der Bearbeiter mit einem Licht­

automatische Teilchenzählung z. B. können die

griffel auf dem Bildschirm Objekte oder beliebige

Zählfehler auf 2 bis 3

Punkte antasten. Dabei erfaßt der Auswertauto­

(vgl. Abschn. 9.3.1.4.).

mat die Koordinaten des angetasteten Punkts und modifiziert die Auswertung entsprechend. Welche

%

wird

erhöht.

Durch

herabgedrückt werden

Verbesserte Arbeitsbedingungen

Lichtgriffelein­

Die Durchführung visueller Bildanalysemethodeu

gabe hat, hängt natürlich vom gerade benutzten

weist i. allg. einen geringen Anteil geistig schöpfe­

Wirkung

im

Einzelfall

eine

Auswertprogramm ab.

rischer

Beispiel: Ein Objekt, das den angetasteten Punkt

hohen Anforderungen an Konzentration und

enthält, wird nicht ausgewertet.

Sehleistung. Für Routinebearbeiter müssen wegen

Ein Bildschirm mit Möglichkeiten der grafischen

der

'1.7

Beyer, Mikroskopie

Arbeitsgänge

damit

gegebenen

auf

in

Verbindung

körperlichen

mit

Belastung

9. Messen und Zählen mit dem Mikroskop

418

Kurzarbeit und besondere Arbeitspausen vorge­ werden.

sehen

Durch

Bildanalyseautomaten

des Analyseergebnisses können praktisch nur aus­ nahmsweise durch höheren Aufwand im Auswert­

wird die Tätigkeit für den Bearbeiter weniger er­

algorithmus beseitigt werden. Die Präparation

müdend und zumutbar.

muß dem Automaten entgegenkommen. Das bedeutet z. B. für Auflichtpräparate: Kratzer

Mehr Information

und Reliefbildung sind zu vermeiden. Bei Ab­

Automaten versetzen den Lage,

zahlreiche

Untersucher in die

quantitative

Merkmale

tastern mit automatischer Präparatverschiebung

von

dürfen z. B. Schliffe nur innerhalb der Schärfen­

arith­

tiefe von der Ebene abweichen, es sei denn, es

metisch zu kombinieren und statistisch zu ver­

steht eine automatische Fokussiereirrrichtung zur

Bildstrukturen gleichzeitig zu sammeln,

arbeiten. An jedem Objekt eines Bilds können

Verfügung. Für Teilchenpräparate oder zytolo­

z.B. Fläche, Länge der Kontur, maximale Sehne,

gische Ausstriche muß man fordern, daß die

Grauwertstreuung usw. zahlenmäßig bestimmt

interessierenden Objekte nicht zusammengeballt

werden, eine sonst praktisch kaum durchführbare

sind. Das wird in einigen Fällen durch chemische

Aufgabe. Durch geeignete rechnerische Merkmal­

Behandlung und Ultraschalleinwirkung erreicht.

auswertung kann ein Automat u. U. in einer dem

Gewebedünnschnitte müssen zur automatischen

visuellen Anschein nach homogenen Zellpopu­

Auswertung

lation

gefärbte oder geätzte

verschiedene

Zellklassen

unterscheiden

[652].

gleichmäßig

dick sein. Künstlich

Präparate dürfen

keine

Schwankungen der Farbintensität aufweisen. Die chemischen Färbe- und Ätzreaktionen sind so

Schnelleres Messen und Auswerten

auszuwählen, daß sich der Grauwert der zu unter­

Vergleicht man die fürdiegleichen Untersuchungs­

suchenden Objekte maximal von dem anderer

aufgaben von einem Menschen und von einem

Objekte abhebt [596] [618] [623]. Um diese For­

automatischen Bildanalysator benötigten Zeiten,

derungen zu erfüllen, ist es mitunter nötig, kon­

so ergibt sich im Durchschnitt für den Automaten

ventionelle Präparationsrezepte zu verlassen und

eine

eigens für die automatische Auswertung zweck­

beachtliche

gibt für

die

Karyogramms

Überlegenheit. Ledley

automatische

20 s

an.

Aufstellung

[614] eines

Manuell durchgeführt

mäßige Verfahren und Vorrichtungen zu entwik­ keln.

beansprucht diese Arbeit mehrere Stunden. Je

So liefert die Firma Corning Glass Works zu

nach Lage der Dinge bewegt sich der Zeitgewinn

ihrem Differentialblutbild-Automaten LARC ein

zwischen dem 10- bis 1 OOOfachen.

Präpariergerät, in

Man kann die Faustregel aufstellen, daß die auto­

eine gleichmäßige Schicht von Blutzellen erzeugt

dem durch Zentrifugalkraft

matische Bildverarbeitungsmaschine überall dort

wird, wobei beschädigte und überlagerte Zellen

dem Menschen überlegen ist, wo die Objektdefini­

sehr selten vorkommen.

tion relativ klar liegt und die Analyse überwiegend

Dieser Auffassung wird allerdings von einigen

die quantitative Bestimmung geometrischer, foto­

Autoren widersprochen [652]. In der Tat sind

metrischer und statistischer Kenngrößen enthält.

gerade Arbeitsstellen mit routinemäßiger Bild­

Der Mensch ist im Vorteil, sobald die Problematik

diagnostik an der Beibehaltung einmal eingeführ­

der Objektdefinition im Vordergrund steht. Zu­

ter

sammenfassende Darstellungen aus dem Gebiet

wegen der Vergleichbarkeit mit Archivmaterial

Präparationsmethoden

interessiert,

schon

der automatischen Bildanalyse geben [580] [610]

und mit anderen Labors. In Stahlwerken

[613] [615] [622] [636] [638].

es

üblich,

die Proben zur

gerade so weit zu

9.5.1.5. Bemerkungen zur Präparation für automatische Bildanalyse

für

den

Menschen

polieren,

ist

Ausgangskontrolle daß die Prüfung

durchführbar

wird,

d.h.,

relativ grobe Mängel am Schliff sind zugelas­ sen. Es ist jedoch grundsätzlich günstiger, den

Zunächst bleibt alles im Abschn. 9.4. Gesagte

Aufwand zur Bildanalyse auf alle Stufen des

gültig. Durch die Automatisierung der Bildaus­

Prozesses gleichmäßig zu verteilen: Präparation -

wertung erhält jedoch die Präparationsproblema­

Abtastung- Auswertelogik- Nachverarbeitung.

tik

Jedenfalls müssen für die automatische Bildverar­

einige

spezifische

Akzente. Grundsätzlich

bereiten alle Störungen im Präparat (Schmutzteil­

beitung die Präparationsbedingungen konstant

chen, ungleichmäßige Färbung, Zusammenballung

und reproduzierbar sein. Die Forderungen der

von Objekten) der automatischen Auswertung

Bildanalyseautomaten an die Präparation werden

Schwierigkeiten. Die dabei entstehenden Fehler

am besten durch Präparierautomaten zu erfüllen

9.5. Automatische Bildanalyse

sein, bei denen Qualität und Quantität der erzeug­ ten Präparate den Leistungen des Verarbeitungs­ systems angepaßt sind [624]. 9.5.2. Geräte zur automatischen Bildanalyse

Die ersten industriellen Entwicklungen, in denen Bildanalyseaufgaben automatisiert wurden, be­ trafen die Probleme der Teilchenzählung und der Gefügeanalyse in Gestalt der Linearanalyse. Bei einigen Teilchenzählgeräten wurden speziell ge­ formte Abtastblenden verwendet, um bereitswäh­ rend der Abtastung Elementaraussagen über die Teilchengröße o. a. Merkmale zu gewinnen [592] [601] [610]. Diese Geräte besaßen in der Regel eine fest ver­ drahtete Auswertelektronik. Sie benutzten oft eine eigene, nur für das betreffende Verfahren gültige Korngrößendefinition. Neben der mechanischen Abtastung (Objektscanning [592] [601]) spielte schon früh das Flying-spot-Verfahren mit Kato­ denstrahlröhre eine wichtige Rolle [582]. In den 60er Jahren wurden Katodenstrahlabtaster die bevorzugten Bildeingabegeräte für die Analyse auf großen Rechenanlagen [614] [622]. Ein der­ artiges sehr leistungsfähiges System, CYDAC (CYtophotometric DAta Conversion), wurde von der Firma Airborne Instruments Laboratory, USA entwickelt [622]. Abgetastet werden mikro­ skopische Originalpräparate. Der Rasterpunkt­ abstand (Auflösungsvermögen) beträgt minimal 0,25 flm, die Punktfolgefrequenz 6 kHz. Die fotometrische Genauigkeit wird mit 1% ange­ geben. Die Bildmatrix kann auf Magnetband zwischengespeichert oder unmittelbar in einen IBM 7040 eingegeben werden. Das System wurde auf Leukozyten und Chromosomen angewandt. Ein anderes Gerät zur Analyse von Blutzellen ist das CELLSCAN -System der Firma Perkin Eimer, US A [608]. Es hat einen mechanischen Mikroskopabtaster. Er ist nach dem Bildscanning­ prinzip aufgebaut und arbeitet mit zwei schwin­ genden Spiegeln, deren Drehachsen zueinander senkrecht liegen, so daßeine zweidimensionale Ab­ tastung erreicht wird. Die Verarbeitung· erfolgt zunächst in einem fest verdrahteten Rechner, wo­ bei ausnahmsweise ein hexagonales Raster zu­ grunde liegt. Die damit gewonnenen Merkmale werden anschließend in einem frei programmier­ baren Rechner einem automatischen Klassi­ fizierungsprozeß unterworfen. Das Gerätesystem hat eine automatische Präparatverschiebung sowie eine automatische Fokussierung.

419

Aus der Vielzahl weiterer Geräte zur automati­ schen Bildverarbeitung sollen im folgenden zwei herausgegriffen und gerrauer beschrieben werden. 9.5.2.1.

Der automatische Gefügeanalysator EPIQUANT

Wie schon bemerkt, gehörten Linearanalysatoren zu den ersten halb- [590] oder vollautomatischen [585] Bildanalysegeräten. Das EPIQUANT des VEB Carl Zeiss JENA ist ein moderner Ver­ treter dieser Gruppe [59 I]. Seine bevorzugten Ein­ satzgebiete sind die stereologische Untersuchung von Metallen, Keramik und biologischen Ge­ weben. Das EPIQUANT besteht aus einem Mikroskop­ objektabtaster und einer fest verdrahteten elek­ tronischen VerarbeitungseinheiL Der Abtaster ist nach dem Objektscanningprinzip aufgebaut (vgl. Abschn. 9.5.1.2.). Ein stark vereinfachtes Schema des optischen Strahlengangs ist im Bild 9.26 enthalten. Eine Ansicht des gesamten Systemsist imBild 9.27 dargestellt. DasMikroskop selbst gehört zum Le ChatelierschenBautyp und ist in erster Linie für Auflichtbeleuchtung eingerich­ tet(s. Abschn. 4.5.1.). Es erlaubt dieBeobachtungs­ verfahren Hellfeld, Dunkelfeld, Polarisation und Interferenzkontrast. Zur Beleuchtung wird eine stabilisierte Halogenlampe von 100 W verwendet, um bei der Messung ein gutes Signal/Rausch-Ver­ hältnis zu erreichen. In der Beleuchtungseinrich­ tung befindet sich eine kleine Vorblende wähl­ barer Größe, die in die Objektebene abgebildet wird. Sie bewirkt eine Herabsetzung des Streu­ lichts und dient damit der Verbesserung der foto­ metrischen Genauigkeit (vgl. Abschn. 6.2.5.2.). Das vom Objekt reflektierte Licht gelangt durchs Objektiv und über weitere Abbildungsschritte zur Bildebene. Dort befindet sich die kreisförmige Meßblende MB. Es stehen verschieden große Meßblenden zur Verfügung, um das Abtast­ auflösungsvermögen den unterschiedlichen Ob­ jekten und Meßaufgaben anpassen zu können. Dies geschieht außerdem durch die Wahl des im Meßstrahlengang wirksamen Abbildungsmaß­ stabs. Der kleinste Meßblendendurchmesser be­ trägt auf die Objektebene bezogen 0,2 fLm. In dieser Größenordnung liegt auch das höchste Auflösungsvermögen des Geräts. Die Meßblende kann gemeinsam mit dem Bild des Objekts beob­ achtet werden. Dadurch hat der Bearbeiter stets die Kontrolle über ihre momentane Lage im Gefügebild. Das ist z.B. für die Schwellwertein­ stellung an kleinen Objekten wichtig. Deshalb sind beim .,.:EPIQUANT die Meßblenden als

420

9. Messen und Zählen mit dem Mikroskop

Spiegel ausgeführt, die in der Mitte eine kleine durchlässige

Stelle

haben.

Das

durchgehende

0,25 [LID. Da mit dem Gerät ausschließlich linear­ analytische Kenngrößen gemessen werden, findet

Licht dient zur Grauwertmessung, das reflektierte

keine

Licht gelangt zur visuellen Beobachtung.

Bilds statt, z.B. im Bild 9.17, sondern das Objekt

lückenlose

quadratische Rasterung des

Der Objekttisch wird mit elektrischen Schritt­

wird längs 25 geraden Linien verschoben (vgl.

motoren angetrieben. Die Schrittgröße beträgt

Bild 9.23 a), die in mäanderförmiger Ordnung auf-

y

�·-

Bild 9.26. EPIQUANT, Blockschema Lq Lichtquelle;

MB

Meßblende;

VB Yorblende; Ov BE Bildebene

Objektiv;

PI

Planglasilluminator;

K

Kleinbildkamera; Sausschaltbarer Spiegel;

Bild 9.27. EPIQUANT, Ansicht

[In

der Mitte der Abtaster mit dem Mikroskop.

I VEB

Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Rechts die Auswerteinheit

421

9.5. Automatische Bildanalyse

einander folgen. Das EPIQUANT verfügt über

kann außerdem die statistische Verteilung der in

eine große Auswahl von Festprogrammen zur

dessen

Tischsteuerung, mit deren Hilfe die 25 Linien in

(d5, S. 405) automatisch aufgenommen werden.

ihrer Länge variiert und auf verschieden große

Die Registrierung erfolgt in 13 Größenklassen, die

Körnern

durchlaufenen

Sehnenlängen

� gestuft sind.

quadratische Meßfelder verteilt werden können.

geometrisch mit dem Modul

So läßt sich die Länge L der Meßlinie der ge­

DieAuswahl und Zusammenstellung der verschie­

wünschten statistischen Sicherheit und der Korn­

denen fest verdrahteten Grundfunktionen der

größe des Untersuchungsmaterials anpassen. Die

Auswertelektronik besorgt der

Bewegungsgeschwindigkeit

Hilfe entsprechender Schalter. Die Resultate eines

des

Scanningtischs

können

an

Bearbeiter mit

muß dem Lichtangebot angepaßt werden, das

Programmlaufs

u. a. durch das Reflexionsvermögen des Objekts,

abgelesen oder auf einem Meßwertdrucker aus­

einem

Ziffernfeld

die Größe der Meßblende und den Abbildungs­

gegeben werden. DerAnschluß einesED V-gerech­

maßstab

ten Lochstreifenstarrzers ist ebenfalls möglich.

bestimmt

wird. Sie ist maximal auf

1 mm/s einstellbar.

Als Anwendungsbeispiel ist im Bild 9.28 ein An­

Die Messung des durch die Meßblende tretenden

schliff von Grauguß mit Kugelgraphit dargestellt.

Lichtstroms geschieht mit einem Sekundärelek­

Dieses Präparat wurde auf dem EPIQUANT

tronenvervielfacher mit nachfolgendem Verstär­

vermessen. Die Gesamtlänge der Meßlinie betrug

ker. Letzterer�befindet sich, wie auch die folgen­

20 cm. Davon entfallen 10,8 % auf Graphit. Es

den Geräteteile, in der elektronischen Verarbei­

wurden 11"

tungseinheiL Zur Identifizierung des gerade ab­

Verteilung der Schnittlängen ist im Bild 9.29

getasteten Objekts wird das

verstärkte Signal

einem Schwellwertdiskriminator zugeleitet (vgl.

=

608 Graphitpartikel geschnitten. Die

wiedergegeben. Die Meßdauer betrug 40 s. Aus den vom EPIQUANT gelieferten Grund­

Abschnitt9.5.1.3.). Er hat fünfeinstellbare Schwel­

größen können nun zahlreiche weitere stereo­

len und erlaubt die gleichzeitige automatische Er­

logische Parameter berechnet werden,

kennung und Verarbeitung dreier Bestandteile des

mittlere Sehnenlänge (dHeyn, S. 409), spezifische

so die

Präparats, die sich genügend im Reflexionsver­

Oberflächen (S. 409), mittlere freie Weglänge[598],

mögen unterscheiden.

Proximität (S. 409) usw. Die Sehnenlängenver­

Die Gewinnung der linearanalytischen Daten

teilung kann unter bestimmten Voraussetzungen

wird durch eine Folge von Taktimpulsen ver­

in eine räumliche Durchmesserverteilung umge­

mittelt. Diese Impulse sind mit den Schritten der

rechnet werden (s. S. 409). Die Formeln dazu

Motoren am Scanningtisch synchron. Um z. B.

sind sehr einfach [572]. Ein besonders wichtiges

eines

Kennzeichen von Gefügen ist ihre Gerichtetheit.

festzustellen,

Bei vielen Materialien, z. B. Walzgut, sind die

die Länge L"' des in der Komponente Präparats

zurückgelegten

Weges

IX

verfährt der Automat folgendermaßen: Beim Ein­

Körner mehr oder weniger gestreckt und parallel

tritt der Meßblende in die Komponente

zu einer Vorzugsrichtung angeordnet. Die Zähl­

IX

öffnet

der Diskriminator ein elektrisches Tor. Das bleibt

werte für

solange geöffnet, wie die Komponente

schieden sein, je nachdem die Meßlinien parallel

IX

vorliegt.

11"

usw. werden in solchen Fällen ver­

Es läßt die eintreffenden Taktimpulse zu dem der

oder senkrecht zur Vorzugsrichtung verlaufen.

Komponente IX zugeordneten Zähler passieren.Am

Setzt man die Zählwerte ins Verhältnis, so erhält

Ende der

man eine Maßzahl für die Anisotropie (auch

Messung gibt der

Zählerstand die

gesuchte Länge L" in Vielfachen des Impulsab­

Umformgrad) des Materials. Derartige Messungen

stands an. Unter dem Impulsabstand versteht

sind am EPIQUANT sehr erleichtert, da mit

man dabei den zwischen zwei Taktimpulsen zu­

einem

rückgelegten Weg. In ähnlicher Weise gewinnt das

Scanningtisches in bezug auf das Präparat um 90°

Knopfdruck

die

Zeilenrichtung

des

Gerät alle wichtigen Grundgrößen der Linear­

geschwenkt werden kann, ohne die übrigen Be­

analyse, nämlich: Die im Präparat zurückgelegte

stimmungsgrößen des Mäandermusters zu ändern

Gesamtstrecke L; die davon auf verschiedene

oder das Präparat selbst zu drehen.

Gefügebestandteile entfallenden Anteile L", Lp,

Schließlich sei noch auf eine sehr nützliche Be­

Ly; die Anzahlen n", nß, ny der Korngrenzen oder

triebsart des EPIQUANT hingewiesen, bei der

diese Streckenanteile L" usw. im allgemeinen in

stimmten

viele kleinere Abschnitte zerlegen; sowie die im

getroffen wird. Der Scanningtisch verschiebt das

Abschn. 9.3.3.3. definierten Sequenzzahlen 11""'

Präparat mit mäßiger Geschwindigkeit. Dabei

n"ß' usw. Für einen der drei Gefügebestandteile

blickt der Bearbeiter ins Mikroskop. Stellt er

anderer Trennlinien

und Zwischenräume, die

die Entscheidung über das Vorliegen einer be­ Komponente vom Bearbeiter selbst

9. Messen und Zählen mit dem Mikroskop

422

fest, daß die Meßblende in die Komponente /X des

9.5.2.2.

Präparats eintritt, so drückt er die entsprechende

Der automatische Bildanalysator QUANTIMET

Taste eines Steuerpultes. Die Auswertlogik ver­ arbeitet die Tastensignale genauso wie die Dis­

Das von der Firma IMANCO in

kriminatorensignale beim vollautomatischen Be­

England,

trieb. Auf diese Weise werden auch sämtliche oben

das bekannteste

hergestellte

Melbourne,

QUANTIMET

ist

z.

Z.

Gerät zur vollautomatischen,

genannten Grundgrößen der Linearanalyse auto­

mikroskopischen Bildanalyse. Die neueste Ver­

matisch registriert. Die halbautomatische Arbeits­

sion, QUANTIMET 720, hat eine beachtliche

weise

Leistungsfähigkeit erreicht.

ermöglicht

die

schnelle

und

bequeme

QUANTIMET

Linearanalyse bei Präparaten, derenBestandteile

Der Abtaster des

sich durch ihren Grauwert nicht eindeutig unter­

dem Bildscanningprinzip

scheiden, oder bei sonstiger ungenügender oder

schnitt 9.5.1.2., Bild 9.20).

720 ist nach

aufgebaut

(vgl.

Ab­

Dementsprechend kann die Abtasteinheit außer

komplizierter Objektdefinition.

an Mikroskope u. a. auch an ein Epidiaskop, an Dia- oder Filmprojektoren sowie an ein Gerät zur

.••. t!. :,

_ _ --

·

Beobachtung von Petrischalen angesetzt werden. Die Rolle des Bildempfängers übernimmt beim

.

QUANTIMET 720 eine Fernsehkamera, die mit Vidicon

, .

oder

Plumbikon

ausgerüstet

werden

kann. Da die Detailauflösung und die Grauwert­ genauigkeit normaler

Fernsehkameras für die

quantitative Bildauswertung nicht ausreichen, hat

i'

der Hersteller des QUANTIMET eine eigene, verbesserte Kamera entwickelt. Sie benötigt für die Abtastung eines Bilds 0,1 s im Gegensatz zu 1/50 s beim normalen Fernsehen. Um die stets vorhandenen

Ungleichmäßigkeiten

empfindlichkeit auf Bild 9.28. Grauguß mit Kugelgraphit M

=

verschiedenen

der

Licht­

Stellen

der

Signalplatte von Kameraröhren zu verkleinern,

100: I

werden die am Röhrenausgang erhaltenen Grau­ werte

erst

über einen sog.

shading corrector

geleitet. Dieser muß mit dem ObjektfreienStrahlen­ gang geeicht werden, bevor die eigentliche Mes­ sung beginnt. So wird schließlich eine recht gute, gleichmäßige

Grauwertgenauigkeit

Unterschied

zum

QUANTIMET

EPIQUANT

eine lückenlose,

erzielt. findet

Im beim

rechtwinklige

Rasterung des Bilds statt. Der Rasterpunktab­ stand

kann

durch

einfachen

Vergrößerungs­

wechsel bequem variiert und auch wesentlich

I)

Bild 9.29. Sehnenschnillverteilung

kleiner als das mikroskopische Auflösungsver­

der Graphitkugeln aus Bild 9.28

interessierenden Objekts basiert beim QUANTI­

mögen gemacht werden. Die Feststellung eines MET

auf

dem Schwellwertkriterium (s. Ab­

schnitt 9.5.1.3.). Allerdings läßt sich das Gerät mit einem sog. auto detector ausrüsten, der die Fehler des SchweBwertverfahrens reduziert. Zur Korrek-

1285,8 4 8

11 16 22

J2

45

I

64

o'.r

-

90

L__

128

9.5. Automatische Bildanalyse

423

Bild 9.30. QUANT/MET 72 IMANCO Werkfoto

tur des Schweltwerts zieht der

2 D-auto detector

die 24 nächsten Nachbarn des aktuell abgetasteten

automatisch nach der Größe und nach bestimm­ ten Formkriterien klassifiziert werden.

Rasterelements heran sowie den örtlich vorhan­

Die verschiedenen Auswertfunktionen des Geräts

denen Weißpegel

[644] (vgl. a. Abschn. 9.5.1.3.).

sind in zahlreichen Bausteinen lokalisiert, die der

Das nunmehr vollständig digitalisierte Bild kann

Anwender sich nach Wunsch zusammenstellen

zur

in

kann. Während einer Bildabtastung können im­

einen Universalrechner eingelesen werden, z. B.

mer nur wenige Auswertfunktionen gleichzeitig

PDP

ablaufen. Es ist möglich, daß mehrere verschiedene

Verarbeitung

mit

Softwaremethoden

11. Typisch für das QUANTIMET ist

jedoch die Verarbeitung in einem eigenen, fest­

Funktionen automatisch nacheinander durchge­

verdrahteten Bildanalysecomputer. Dieser nutzt

führt werden. Um ihre Reihenfolge und Parameter

die hohe Abtastgeschwindigkeit

festzulegen, müssen Kontaktstifte in ein Pro­

der

Fernseh­

kamera voll aus. Sofort nach der Abtastung stehen

grammierfeld eingeschraubt werden. Das System

die errechneten Resultate zur Verfügung.

Die

enthält schließlich einen Bilddisplay mit Licht­

mathematische Analyse der Bildstruktur erfolgt

griffel. In Verbindung mit einem Imageeditor

zeilengeführt und berücksichtigt mehrere benach­

können darauf außer dem Originalbild zahlreiche

barte Punkte in benachbarten Zeilen (Bild 9.23 b).

Zusatzinformationen

Dergestalt lassen sich außer stereologischenKenn­

strukturen angezeigt werden.

sowie

veränderte

Bild­

größen des Gesamtbilds auch solche Merkmale

Auf die Schilderung weiterer interessanter Eigen­

gewinnen, die sich auf individuelle Objekte im

schaften und Zusatzgeräte des QUANTIMET 720

Bild beziehen, also Anzahl, Flächengröße, Um­

wird aus Platzgründen verzichtet. Eine mögliche

fang usw. einzelner Teilchen. Die Objekte können

Ausbaustufe ist im Bild

9.30 dargestellt.

10.

Mikroskopie unter besonderen Temperatur- und Umweltbedingungen von Dipi.-Phys. Manfred Neuperl

Bei der Beobachtung von Objekten mit dem

den, während Heiz- und Kühltische diesen vor

Mikroskop interessiert in den meisten Fällen

allem hinsichtlich der Lage der Objektebene und

deren Verhalten, Struktur o.ä. unter normalen

der Wechselbarkeit gleichen. Demgegenüber wird

Umweltbedingungen, d.h., Temperatur, Luft­

die Zusatzbezeichnung

feuchtigkeit, Druck und Atmosphäre entsprechen

fügt, wenn das Präparat in der Heiz- oder Kühl­

-

Kammer

-

dann ange­

den am Einsatzort des Geräts vorliegenden Wer­

einrichtung innerhalb eines gegen die Umwelt

ten. Häufig will man jedoch auch unter Bedin­

abgeschlossenen Volumens angeordnet ist. Ehe

gungen arbeiten, denen ein mikroskopisches Ob­

auf das Instrumentarium der Hoch- und Tier­

jekt während seiner Existenz oder im Verlauf

temperaturmikroskopie eingegangen wird, sollen

bestimmter Prozesse unterliegt. Unter den verän­

zunächst in zwei einführendenAbschnittenFragen

derbaren Parametern spielt die Temperatur die

der Temperaturmessung und der Energieübertra­

wichtigste Rolle; weiterhin sind die Art der Gas­

gung angeschnitten werden.

sphäre, der Druck und die Luftfeuchtigkeit im Objektraum als solche zu werten. Es ist das Ziel

10.1.1.

dieser Darlegungen, dem Leser einen Überblick

Temperaturbestimmung

über das gesamte Gebiet und die Aufbauprin­ zipien

typischer

Geräte

und Versuchseinrich­

[654] [655] [656] [681] [698] [723] [761] Die Temperatur ist eine der fundamentalen Grö­

tungen zu vermitteln.

ßen gebräuchlicher Maßsysteme. Sie ist eine thermodynamische Zustandsgröße und charakterisiert den Wärmezustand eines Körpers.

10.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

Der direkten

Messung

entzieht sie sich und

wird als Ursache anderer, meßbarer Wirkungen

Hoch- und tieftemperaturmikroskopische Unter­

nachgewiesen. Grundlage derTemperaturmessung

suchungsmethoden dienen der Erforschung oder

ist die empirisch bestätigte Tatsache, daß es zwi­

Prüfung des Verhaltens mikroskopischer Objekte

schen unterschiedlichen, thermischen Zuständen

bei Erhitzung und Abkühlung unter dem Mikro­

eine eindimensionale Ordnung gibt, die z. B. durch

skop. Grenzfälle der Hoch- und Tieftemperatur­

eine Temperat urskale widergespiegelt werden kann.

mikroskopie sind jene Verfahren, bei denen Ob­

Deren Festlegung und Kalibrierung gehen von

jekte aus Biologie und Medizin bei Temperaturen

reproduzierbaren Wärmezuständen - den durch

beobachtet werden, die nur wenig ober- oder

Gesetze und internationale Verträge verankerten

unterhalb der Raumtemperatur am Einsatzort des

Festpunkten

Mikroskops liegen. Im Bild 10.1 ist eine Zusam­

skale- aus [761]. Die bekannteste Art der Skalen­

menstellung der bei hoch- und tieftemperatur­

teilung stammt von Celsius, während in angel­

der

Internationalen Temperatur­

mikroskopischen Untersuchungen gebräuchlichen

sächsischen Ländern noch heute die Temperatur­

Gerätetypen

findet fünf

skale nach Fahrenheit im Gebrauch ist.Aufgrund

größere Anwendungsbereiche, wobei sieben in

theoretischer, thermodynamischer Betrachtungen

wiedergegeben. Man

Aufbau und Arbeitsweise erheblich unterschied­

modifizierte Lord Kelvin die Celsiusskale. Der

liche Gerätegruppen benutzt werden. Zur gewähl­

Nullpunkt dieser sog. absoluten, thermodyna­

ten Terminologie sind noch einige Bemerkungen

mischen Temperaturskale fällt mit dem absoluten

anzufügen. Als

Temperiereinrichtungen werden

Nullpunkt

(- 273,15°C)

zusammen.

Man

be­

Bauformen bezeichnet, in die man entweder Teile

zeichnet neuerdings die Einheit dieser thermo­

des Mikroskops einbaut oder die auf handels­

dynamischen Temperaturskale mit dem Symbol K

übliche Mikroskop-Objekttische aufgesetzt wer-

(Kelvin) ohne Gradangabe.

1 0.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

425

Anwendungsgebiete und Gerätetypen für hoch- und tieftemperaturmikroskopische Untersuchungen

I Untersuchungen

Thermomikro­

Durchlichtmikroskopie

an Objekten

analytische

bis zu hohen bzw. tiefen

und -Tieftemperatur­

aus Biologie

Verfahren (Kofler)

Temperaturen

Metallographie

Oberflächen-Hoch­

und M edizin

Untersuchung des Verhaltens fester Stoffe bei Erhitzung

I

und Abkühlung mit geringer Vergrößerung

I

I

Temperatur-

Erweiterter

bereich

Temperatur­

beiderseits der

Bereich

Humanten1peratur

I

i;\

Temperierein­

Heiz- und

Heiz- und

Hoch- und

Hoch- und

Universell

Spezielle

richtungen für

Kühltische

Kühl-

Tieftempera-

Tieftempera-

einsetzbare

Hoch-

Arbeits- und

für Arbeits-

kammern für

turkammern

turkammern

Spezial-

tempera-

Forschungs­

und

Arbeits- und

für Arbeits-

für

mikroskope

turmi-

mikroskope

Forschungs-

Forschungs-

und

Forschungs-

mit Spitzen-

kroskope

mikroskope

mikroskope

Forschungs-

Metall-

Ieistungen

horizon-

mikroskope

mikroskope

taler Bauart

Bild 10.1 Anwendungsbereiche und Gerätetypen für hoch- und tieftemperaturmikroskopische Untersuchungen

halb an sich eme Vorzugsstellung einnehmen

10.1.1.1.

müßten [675].

Temperaturmeßmittel

Mechanische Berührungsthermometer haben im

Die für die praktische Thermometrie eingesetzten

allgemeinen eine zu große Wärmekapazität, um

Temperaturmeßmittel

exakte Temperaturmessungen an mikroskopischen

mit ihren Anwendungs­

bereichen sind im Bild 10.2 wiedergegeben, wobei

Objekten vornehmen zu kö1men.

die Pfeile Hinweise auf die in Einzelfällen genutz­

Widerstandsthermometer bestehen aus dem Meß­

ten Temperaturgebiete geben [761].

widerstand und einer entsprechenden Anzeigeein­

Durch die Besonderheiten des Aufbaus hoch- und

richtung. Während noch vor etwa einem Jahr­

tieftemperaturmikroskopischer Einrichtungen ist

zehnt vorwiegend Platin- oder Nickeldrähte den

von vornherein zu erwarten, daß nur einige der

relativ großflächigen Meßfühler bildeten, ist es in

angefülwten Meßmittel für die Temperaturmes­

den letzten Jahren gelungen, für technische Mes­

sung in Frage kommen.

Vorbedingung ist in

sungen ausreichend alterungsbeständige Halb­

erster Linie, daß der Meßfühler klein ist und eine

leitermeßfühler geringer Größe zu entwickeln.

geringe Wärmekapazität (s. Abschn. 10.1.2.) hat,

Für Temperaturmessungen am mikroskopischen

um zu gewährleisten, daß das vorliegende Tem­

Objekt sind die

peraturfeld durch den Meßfühler möglichst wenig

thermometern trotzdem noch zu groß; man ver­

Meßfühler von Widerstands­

geändert wird [681] [693] [761]. Dieser Forderung

wendet sie jedoch zuweilen, um aus der Tempera­

entsprechen in erster Linie elektrische Berührungs­

turbestimmung in Objektnähe auf die Objekt­

thermometer (Widerstandsthermometer, Thermo­

temperatur selbst zu schließen.

elemente); sie werden deshalb in der Hoch- und

Die Herstellung nahezu beliebig kleiner Meß­

Tieftemperaturmikroskopievorwiegendeingesetzt.

fühler

Selten kommen Strahlungspyrometer zur Anwen­

Widerstandsthermometer ermöglichen auch

dung, obwohl sie berührungslos messen und des-

eine Fernübertragung des Meßwerts. Als Thermo-

gelingt

bei Thermoelementen. Wie die sie

10. Jvlikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

426

Bild 10.2

Gebräuchliche Temperaturmeßmittel

Gasthermometer

und ihre Anwendungsbereiche

[761]

Flüssigkeits­ thermometer

3000°C). Die

art Verwendung, wodurch dieMikroskopierleuchte

untere Temperaturgrenze liegt in der Nähe des

außerhalb des aus transparentem Plast bestehen­

Siedepunkts von Stickstoff.

den Wärmeschranks liegt. Auch binokularer Ein­

In der Übersicht im Bild 10.1 ist an letzter Stelle

blicktubus und fotografische Einrichtung ragen

eine Gruppe mikroskopischer Geräte aufgeführt,

aus dem Schrank heraus. Die Bedienelemente des

mit denen bei sehr geringer Vergrößerung das

Mikroskops sind über Drehstangen und -gelenke

Schmelz- oder Umwandlungsverhalten von Stof�

aus dem Wärmeschrank herausgeführt. Die Be­

fen (z. B. feste Brennstoffe, keramische Rohstoffe

heizung des Innenraums erfolgt mit Warmluft, die

und Gläser) untersucht wird. Der Temperatur­

von einem Thermostaten zugefülu·t wird.

bereich dieser Geräte, die in handelsüblichen Ein­

Temperiereinrichtungen dieser Art habenden Vor­

richtungen meist von horizontaler Bauart sind,

teil eines weitgehend konstanten Temperaturfelds in der Objektebene. Sie sind thermisch träger als

reicht von Raumtemperatur bis 1 800°C.

entsprechende Heiztische, worauf besonders Engel

10.1.3.1.

und Zerbst [685] in einer Untersuchung hinweisen.

Temperiereinrichtungen - Heiz- und Kühltische

Die mit Wärmeschränken erreichbaren Tempe­

In diese Gerätegruppe fallen zwei Arten von

raturen dürften sich nicht wesentlich über + 37°C

Zusatzeinheiten für Mikroskope: einerseits Tem­

steigern lassen, weil dann die Gefahr einer nach­

periereinrichtungen, mit denen man lediglich ein

teiligen Beeinflussung der Abbildungsgüte der

sehr schmales Temperaturintervall- vornehmlich

Optiksysteme besteht. Einsclu·änkungen ergeben

beiderseits der Humantemperatur von + 37°C

sich

gelegen - beherrscht, zum anderen Heiz- und

mikroskopischer

Kühltische mit erweitertem Temperaturbereich,

Mikromanipulatoren- in Wärmesclu·änken selu·

dessen Grenzen etwa bei

erschwert ist.

-

30 bis

-

20°C und

+ 60 bis + 80°C liegen. Für

weiterhin

dadurch,

daß die Anwendung

Zusatzeinrichtungen

-

z. B. ·

Als Beispiele elektrisch betriebener Mikroskop­

Temperiereinrichtungen

kennt

man

zwei

heiztische seien hier die auf den Objekttisch han­

Bauprinzipien. Entweder bringt man das gesamte

delsüblicher

Mikroskop in einen Wärmeschrank bzw. eine

SPERMOTHERM und BIOTHERM der Firma

Mikroskope

aufsetzbaren

Typen

Klimakammer, deren Innentemperatur man regu­

C. Reichert, Wien, erwälmt.

liert,

Während der in Zusammenarbeit mit Kot/er und

oder

man versieht das Mikroskop

mit

einem Spezialtisch, der z. B. nach dem Durchfluß-

j

·,.

Ja!mel

[705]

( Warming Chamber Equipmen!), Modell MWC, zum Mikroskop

�---

28

Beyer, Mikro�kopie

SPERMOTHERM

Bild 10.12. Wärmeschrank

� I I

""..,

•

entstandene

·--+

\ .

MiC-3Bifür bakteriologische und zytologische Untersuchungen bei +Jrc

Union Optical Co., Ltd., Tokyo, Werkfoto

434

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

speziell für Spermauntersuchungen bei+ 37°C be­ stimmt ist, kann man mit dem unter Mitwirkung von Stoc/dnger entwickelten BIOTHERM [676] Temperaturen von + 35 bis 40°C erzielen. Im Bild 10.13 wird dieser Heizzusatz mit dem zuge­ hörigen Berührungsthermometer, das mit einer Tischfeder auf den Objektträger geklemmt wird, und dem Regeltransformator gezeigt. Gleichwertig nach dem Durchflußprinzip und mit elektrischer Heizung arbeitet ein von Halle und Ristau [695] [696] beschriebener Heiztisch. Um Bild 10.13. Biologische Heizplatte BIOTHERM mit Thermometer und Regeltran�formator Firma C. Reicher!, Optische Werke. Wien, Werkfoto

bei

hoher

mikroskopischer

Vergrößerung

die

störende Wärmeableitung über das dann nahe dem Präparat liegende Mikroskopobjektiv zu ver­ mindern, setzt man über dieses eine hohle, zylin­ drische Hülse, die ebenfalls beheizt wird und da­ mit das Objektiv auf eine Temperatur bringt, die der des untersuchten Präparats nahekommt Die Temperaturmessung erfolgt thermoelektrisch und in unmittelbarer Nähe des Objekts. Die Tempe­ raturkonstanz des Heiztisches erreicht Werte von ± 0,2 °C und weniger. Die Einrichtung, die man bei entsprechender Betriebsweise des Thermo­ staten auch zur Objektkühlung verwenden kann, ist wie ein Objekttisch mit dem Mikroskop zu koppeln. Während die bislang beschriebenen Wärmeschrän­ ke und Heiztische, die als Beispiele aus einer Viel­ zahl bekannt gewordener Konstruktionen heraus­ gegriffen

wurden,

schon

wegen

der

geringen

Breite des Bereichs einstellbarer Arbeitstempera­ turen

fast ausschließlich

für

biologische

und

medizinische Untersuchungen benutzt werden, Bild 10.14. Heiz- und Kühltisch 80 nach Eisenberg

bieten Heiz- und Kühltische mit erweitertem Tem­

mit automatischer Thermoregulierung

peraturbereich zusätzlich eine Reihe ergänzender

Firma E.Leitz, Wetzlar, Werkfoto

Anwendungsmöglichkeiten.

Bild 10.15. Heiz- und Kühltisch -20°C bis +80°C

am Mikroskop ERGA VAL VEB Carl Zeiss, JENA, Werkfoto

1 0.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

435

Als typische Vertreter dieser Gruppe von Zusatz­

Thermoelement

einheiten für Arbeits- und Forschungsmikroskope

kann mit einer Schutzhaube abgedeckt werden,

sind der Heiz- und Kühltisch 80 [672] der Firma

die

E.Leitz, Wetzlar, und der Heiz- und Kühltisch

Innenraum bewirkt und andererseits beim Kühlen

einerseits

enthält. einen

Die

Tischoberfläche

Temperaturausgleich

-20 bis+ 80°C des VEB Carl Zeiss JENA anzu­

durch die Spülung mit trockenen Gasen

sehen, auf die im folgenden kurz eingegangen

Betauen

bzw.

im das

Bereifen

des

Präparats irrfolge

des

der

Luft

wird.

Kondensation

Die häufig verwendete, indirekte Widerstands­

Wasserdampfs verhindert. Im Bild I 0.15 ist außer­

heizung (Bild 10.4, Variante

in

enthaltenen

b) und die Kühlung

dem das als Stromquelle für die Peltierbatterie

mit Wasser bzw. Kohlendioxid (Bild 10.10 a) sind

dienende Vorschaltgerät erkennbar. Die Tem­

in dem auf Anregung von

peraturkonstanz ist im wesentlichen nur von der

Eisenberg entwickelten

Heiz- und Kühltisch 80 (Bild 10.14) [672] ver­

Konstanz der Netzeingangsspannung am Vor­

wirklicht, dessen Grenztemperaturen - 20 und

schaltgerät und in geringerem Maße von der des

+ 80°C betragen.

optimalen Wasserflusses durch den Energieaus­

Er ist wie ein normaler Objekttisch an handels­

tauscher

übliche Mikroskope anbringbar und mit einem Bi­

Dauerbetrieb arbeitet.

metall- Thermoregulator ausgerüstet, der auf eine

Bei den

bestimmte Grenzstromstärke (entsprechend der

Kühleinrichtungen

gewünschten Objekttemperatur) eingestellt wer­

darauf angewiesen, daß sich bei Verwendung der

abhängig,

da

die

Peltierbatterie

vorstehend beschriebenen ist

man

in

im

Heiz- und

hohem

Maße

den kann. Das zur Temperatureinstellung vor­

auch bei Raumtemperatur benutzten Optiksysteme

gesehene Glasthermometer ist längs des Umfangs

andere mikroskopische Zusatzeinheiten- Feucht­

in den Heiz- und Kühltisch eingelassen; für ge­

kammer,

nauere

zubehör,

Temperaturmessungen

Zusatzthermometer

auf

kann

man

den Objektträger

ein auf­

Mikromanipulatoren, mikrofotografische

matografische

Einrichtung

Polarisations­

und

mikrokine­

- einsetzen

lassen.

setzen. Um das Präparat gegen Luftbewegungen

Auch die zum Rüstzeug des

abzuschirmen, kann eine Temperaturausgleichs­

zählenden Beobachtungsverfahren (Dunkelfeld,

Mikroskopikers

kammer aufgelegt werden, die man auf Bild 10.14 erkennt. Beim Kühlen wird sie von einer mit trockenem Stickstoff durchströmten Kammer er­ setzt, die außerdem eine Betauung bzw. Bereifung des Objektträgers, Deckglases oder des Präparats selbst verhindert. Die Objektkühlung kann mit Wasser oder Kohlensäure vorgenommen wer­ den.

Einsatzgebiete für Temperiereinrichtungen sowie Heiz- und Kühltische für Untersuchungen in Biologie und Medizin

Temperaturverhalten mikroskopischer Objekte (lebende Objekte, tote Materie)

Der Heiz- und Kühltisch -20 bis + 80°C des

Lebenduntersuchungen engythermer Objekte

VEB Carl Zeiss JENA [740] ist demgegenüber

(Gewebekulturen, Bakterien, Pilze, Protisten, Blut,

auf dem Prinzip der thermoelektrischen Heizung

Liquor, Aszites)

und Kühlung aufgebaut (Bild 10.11), wodurch die

Spermauntersuchungen (Tierzucht)

Umschaltung zwischen Heizung und Kühlung

Medizinische Mikrobiologie (Blut, Bakterien,

lediglich durch Betätigung eines Schalters ermög­ licht wird. Im Bild 10.15 ist die wie ein drehbarer Objekt­ tisch aufgebaute ERGA VAL des

Zusatzeinrichtung VEB Carl

am

Stativ

Zeiss JENA dar­

Protisten) Kältekonservierung toter und lebender Zellen Brechzahlbestimmung nach der T- oder },-T-Methode Umwandlung des optischen Charakters

gestellt. Das Heiz- und Kühlelement bilden zehn

(Spannungszustände, Modifikationsänderungen,

in

Dehydratisierungsvorgänge)

Ringform

hintereinandergeschaltete

Halb­

leiter-Peltierelemente, deren Kupferverbindungs­

Verfolgung von Lösungsvorgängen (Niederschläge,

brücken den Energietransport vom und zum

Peptisation)

Objekt sowie zum wasserdurchflossenen Energie­ austauscher vermitteln. Der Heiz- und Kühltisch ist mit einem Objektführer ausgerüstet, der eine Objektverschiebung von 20 mm

x

20 mm er­

Quellvorgänge an Fasern, Textilien, Leder Aufklärung von Waschprozessen (Gewebe aus natürlichen und synthetischen Fasern)

laubt. In diesen läßt sich ein Meßobjektträger ein­

Bild 10.16. Einsatzbereiche der im Absclm.10.1.3.1.

setzen,

beschriebenen Heiz- und Kühleinrichtungen

der

ein

in

Präparatnähe eingekittetes

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

436

Phasenkontrast, Interferenzkontrast, Polarisation,

tische mit erweitertem Temperaturbereich betrifft

Fluoreszenz) sollten durchführbar sein. Diese Ge­

die Bestimmung der Brechzahl durchsichtiger,

sichtspunkte bestimmen den realen Wert einer

fester Medien nach dem Immersionsverfahren

solchen Zusatzeinrichtung.

[185]. Man kann entweder mit der Temperatur­

Mit der im Bild 10.16 wiedergegebenen Übersicht

oder

werden die aus der Literatur bekannt gewordenen,

(s. Abschnitte 6.1.2. und 6.1.4.).

der

Doppelvariationsmethode

arbeiten

wesentlichen Anwendungskomplexe der beschrie­

Bei anderen Untersuchungen mit Heiz- und Kühl­

benen Heiz- und Kühltische systematisch zu­

tischen der beschriebenen Art sind polarisations­

sammengefaßt. Der Einsatz der Temperierein­

optische Hilfsmittel vonnöten, wenn man nämlich

richtungen und Heiztische mit schmalem, beider­

Änderungen des optischen Charakters des die

seits der Humantemperatur von+ 37°C gelegenem

mikroskopischen Objekte durchdringenden Lichts

Temperaturbereich erstreckt sich fast ausnahms­

sicher feststellen will. So gelingt z. B. der Nachweis

los auf Untersuchungen an lebenden Objekten

von

aller Art. Zusammenfassend ist festzustellen, daß

Spannungszuständen

es zur Gewinnung von Erkenntnissen über die

scheinungen in Kristalliten. Zuweilen kann man

Modifikationsänderungen und

(Polymorphie),

Dehydratisierungser­

Faktoren, die die Lebensfunktionen mehr oder

diese Fragen auch ohne Untersuchung im polari­

weniger intensiv beeinflussen, unumgänglich ist,

sierten Licht klären, wenn nämlich bei Umwand­

das Verhaiten der individuellenEiementarbereiche

lungen Änderungen der Dimensionen der kristal­

pflanzlicher und tierischer Lebensformen unter

lografischen Elementarzelle auftreten, wodurch

Bedingungen zu beobachten, die ihre Lebens­

der vordem klar durchsichtige Körper trübe wird,

fähigkeit garantieren [757]. Dabei kann es sich

weil die beim Zerfall in kleine Bereiche erzeugten

um Zellen [756], Gewebekulturen (Explantate),

Spalte und Risse das Licht diffus streuen. Solche

lebensnotwendige oder krankheitserregende Bak­

Phänomene können auch durch aus dem Kristall­

terien, Pilze, niedere Organismen (Protisten) oder

verband aus tretendes Kristallwasser hervorgerufen

Körperflüssigkeiten (Blut, Liquor) handeln, die in

werden.

vielen Fällen als engytherme (nur in einem sehr

Der Temperaturbereich von Heiz- und Kühl­

begrenzten Temperaturintervall beständige) Ob­

tischen dieser Art erlaubt außerdem die Beobach­

jekte anzusprechen sind. Von Interesse sind so­

tung

wohl Probleme des gesunden als auch die des

kolloidalen

von

Lösungsvorgängen Niederschlägen,

an

die

festen

und

Untersuchung

kranken oder sich krankhaft verändernden Indi­

von Quellvorgängen an Fasern, Textilgeweben

viduums. Diese Fragen treten z.B. auch bei Organ­

und Lederstoffen bei Behandlung mit Wasser

verpflanzungen auf. Von erheblicher Bedeutung

oder anderen flüssigen Medien sowie die Aufklä­

sind Spermauntersuchungen [705], die bei der

rung von Waschvorgängen.

künstlichen Besamung in der Tierzucht die Grund­ lage einer erfolgreichen Anwendung des Ver­ fahrens bilden. Demgegenüber

interessiert

beim

Einsatz

von

Heiz- und Kühltischen mit erweitertem Tempera­

10.1.3.2. Heiz- und Kühlkammern für mittlere Temperaturbereiche [275] [575] [682] [712] [731]

turbereich in erster Linie die Abhängigkeit der

Unter dem Begriff "Chemische Mikroskopie" ver­

Lebensfunktionen von der Temperatur. So wird

steht man die Anwendung mikroskopischer Unter­

die

Erforschung

philer

der

Lebensfähigkeit

(wärmebeständiger)

bzw.

thermo­

suchungsverfahren auf die chemische Analysen­

psychrophiler

technik [575] [682] [712] [731]. Das Mikroskop

(kältebeständiger) niederer Lebewesen in Ab­

bietet sich als Hilfsmittel für

hängigkeit von der Umwelttemperatur ermöglicht.

mische Untersuchungen an, z. B. bei der Beobach­

Die von den Normalwerten abweichenden Tem­

tung von Niederschlägen oder Kristallwachstums­

qualitative

che­

peraturverhältnisse können die Lebensfunktionen

erscheinungen. Entscheidende Impulse im Hin­

irrfolge z. T. gegenläufiger Wirkungen stimulieren

blick auf die Gewinnung quantitativer Aussagen

oder hemmen.

empfing die chemische Mikroskopie durch einen

Wachstumsvorgänge und Zell­

teilung sind häufig in unterschiedlicher Weise

Verfahrenskomplex, den man als Thermo-Mikro­

temperaturabhängig [757]. Die Kältekonservie­

analyse bezeichnet hat und dessen Entwicklung

rung lebender und toter

untrennbar mit den Namen L. und A. Kofters und

Zellen sind weitere

Gegenstände dieser Studien.

denen ihrer Schüler verbunden ist [712]; weiterhin

Eine andere umfangreiche Gruppe von Unter­

hat die Forschergruppe um McCrone in den USA

suchungen unter Verwendung der Heiz- und Kühl-

entscheidende Beiträge hierzu geleistet [731].

I 0.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

437

Über erste Anwendungen von Heiz- und Kühl­

Kühlkammer für Versuche unterhalb Raumtem­

einrichtungen am Mikroskop wird schon in der

peratur. Ein besonderes Heiztischstativ vervoll­

zweiten Hälfte des vorigen Jahrhunderts berich­

ständigt die Einrichtung, und man erreicht so eine

tet. Mit diesen gasbeheizten Objekttischen wurden

maximale Vergrößerung von 200x, wobei Beob­

vor allem Probleme der Kristallisation organischer

achtungen im Hellfeld und mit polarisiertem

und anorganischer Stoffe untersucht. Sehr bald

Licht

ging man zur elektrischen Widerstandsheizung

dient ebenfalls ein Glasthermometer, dessen An­

möglich

sind.

Zur

Temperaturmessung

über (Bilder 10.4 b und c), die man auch heute

zeige über eine am Heiztischokular angeordnete

noch in den meisten handelsüblichen und Ver­

Schiebeprismenvorrichtung in das Bildfeld ein­

Der

gespiegelt wird. Damit ist bei fotografischen Auf­

Temperaturbereich moderner Heiz- und Kühl­

nahmen neben dem Objekt auch die jeweils ange­

kammern erstreckt sich von etwa- 50 bis+ 350°C,

zeigte Temperatur registrierbar.

suchseinrichtungen anwendet [673]

[759].

zuweilen weichen die Grenzwerte etwas davon ab.

Einen ähnlichen Aufbau wie das soeben beschrie­

Temperaturen unterhalb der der Umgebung er­

bene Gerät hat auch das Spezialmikroskop mit

reicht man entweder mit besonderen Kühlkam­

Mikroheiztisch BOETIUS

mern (Bild 10.10 a), die neben der Heizspirale

Dresden [670].

des

VEB Analytik,

angeordnet sind und im Kühlfall von entspann­ tem Kohlen

d�o xid

durchströmt

werden,

oder

man benutzt neben dem Heiztisch noch einen besonderen Kühltisch, der auf die gleiche Art ge­ kühlt wird. Eine Spezialeinrichtung für die Ther­ mo-Mikroanalyse ist das in Zusammenarbeit mit dem Forscherehepaar skop

Kof!er entstandene Mikro­

THERMOPAN

der

Firma

C.R eichert,

Wien, mitMikroheiz- und Mikrokühltisch [677]. Letzterer ist zusätzlich mit einer Heizspirale aus­ gestattet, wodurch Untersuchungen im Tempe­ raturbereich zwischen -50 und + 80°C ermög­ licht werden. Zur Temperaturmessung dient ein Glasthermometer, und man beobachtet bei 100oder 160facher Vergrößerung. Betauung bzw. Bereifung des Glasabschlußfensters und Objekts im Kühlfall durch kondensierten Wasserdampf wird dadurch unterbunden, daß man einen Teil des zur Abkühlung benutzten, trockenen Kohlen­ dioxids durch die Präparatkammer leitet. Das gleiche bewirkt eine auf das Objektiv gesteckte Schwammgummihülse an der

Außenseite des

Glassichtfensters. Man kann außer im Hellfeld auch im polarisierten Licht und im Phasenkon­ trast beobachten, und an das Mikroskop lassen

Bild 10.17. l\lfikroskopheiztisch 350 mit Heiztischstativ und Einrichtung

für direkte Firma

Temperaturablesung im

sich eine mikrofotografische Einrichtung, ver­ schiedene Leuchten und ein Mikroprojektions­ zusatz

anbringen.

möglichkeiten

bietet

Zusätzliche

Anwendungs­ 6

ein zum Mikroheiztisch

'

(Temperaturbereich + 30 bis 350°C) verfügbarer Vakuumsublimationsblock nach

Kof!er.

erzielt werden können [673].

·-- ·

Z

Ht

111 :::

; 1-�1__l_l,

I

I

iii

--

tion der Versuchsergebnisse ist der Mikroskop­ mit dem Temperaturen zwischen- 20und+ 350°C

u
leitung; 6 Stroman­ schluß; 7 Kühlwasseranschlüsse; 8 Thermoelement; 9 Schraubkalotte; 10 Kugelschalentisch mit Haftmagne­ ten; 11 Bodenplatte; 12 Vakuumanschluß

einem Objektiv mit etwa

10 cm Arbeitsabstand

fanden 0/son, Brixner und Smith tine bemerkens­ werte Lösung

[742].

Sie

benutzten einen im

Deckelteil der Vakuumkammer befestigten ellip­ tischen Spiegel, in dess:!n einem Brennpunkt sich

Firma E. Leitz, Wetzlar, Werkfoto

die Probe l:efindet. Im anderen, außerhalb der Kammer,

[720] [721] [733] mit dieser Gerätekombination gewonnen wurde. Die Hochtemperaturkammer besteht aus dem am Mikroskoptisch zu befestigen­

entsteht das Zwischenbild. Die Ver­

größerung nimmt bei einer Objektivapertur von

0,47 Werte zwischen 30 x und 600 x an; man 2500°C. Durch eine Boh-

erhitzt das Obj:kt bis

den Unterteil und dem Oberteil; beide sind zur Durchflußwasserkühlung führt. Der im Bild

doppelwandig

ausge­

10.23 am Unterteil rechts sicht­

bare Stutzen dient der Verbindung zum Hoch­ vakuumaggregat =

( Grenzvakuum

1

·

w- 5 Torr

lmPa); außerdem ist von dort die bereits mehr­

fach angeführte

Wechselfenstervorrichtung

zu

betätigen. Die Probe ist zylindrisch mit einer Ein­ drehung zur Auflage auf einem Quarzring; zudem ist seitlich ein Schlitz zurAufnahmedes Thermo­ elements einzusägen. Ein zweiter, im Bild

10.23

links erkeru1barer Stutzen dient der Anbringung eines Sichtglases zur Probenbeobachtung, eines Vakuummeßkopfes oder anderer zusätzlicher Bau­ elemente. Das Oberteil trägt die wassergekühlten Elektroden, deren eine durchbohrt ist, so daß man über ein

angesetztes Ventil die Kammer mit

Schutzgas spülen oder die Probe schndl abkühlen kann. Diese ist von Heizbändern aus hochschmel-

Bild 10.23. Schnellregelheizkammer VACVTHERM Firma C. Reichcrt, Optische Werke, Wien, \Verkfoto

445

10.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

Bild 10.24 Hochtemperaturmikroskop HM-4 mit Zusatzgerät für Folienheizung

Union Optical Co., Tokyo, Werkfoto

rung des Ellipsenspiegels wird die Probe beleuch­

und mikrokinematografische Registrierung sind

tet.

möglich. Die Bedampfung des Vakuumkammer­

Während die bislang beschriebenen Hochtempe­

Sichtfensters wird durch eine exzentrisch ange­

raturkammern der eingangs des Abschnitts klassi­

ordnete, drehbare Quarzglasscheibe verhindert.

fizierten Gruppe 1 angehören, ist das Hochtempe­

Als Zusatzeinheit ist die bereits erwähnte Ein­

raturmikroskop

richtung für die Heizung durch Folien aus hoch­

Modell

HM-4

der

Union

Optical Co., Tokyo (Bild 10.24), zur Gruppe der

schmelzenden

Metallen

Spezialmikroskope

standsheizung

(bis

für

Hochtemperaturmikro­

skopie zu rechnen [679] [760].

oder

1850 °C)

direkter

Wider­

anzufügen.

Zur

Stromversorgung dient ein spezielles Netzgerät

Das Gerät ist in Normalausführung für Tempera­

(links im Bild 10.24). Man kann die Vakuum­

turen bis 1500°C ausgelegt. Zahlreiche Zusatz­

kammer weiterhin durch eine Schmelzpunktein­

einheiten zum Gerät garantieren einen breiten

richtung ersetzen, die mit den im folgenden Ab­

Anwendungsbereich.

schnitt beschriebenen Hochtemperaturmikrosko­

Durch

den

Einbau

Hochvakuumaggregats (Grenzvakuum 2 Torr

=

·

des w-s

2,5 mPa) und der Stromversorgung im

Instrumententisch hat das Mikroskop einen ge­

pen

vergleichbar

elektronisches

Grenzwertschalter

schlossenen Aufbau. Im Arbeitspult sind Meß­

Fernsehanpassung

instrumente und

baugruppen.

Bedienelemente

übersichtlich

ist.

Durchlichteimichtung,

Temperatur-Registriergerät für

die

sind

Heizung

weitere

mit

und eine

Ergänzungs­

untergebracht. Außer im Hochvakuum kannman

Durch drei weitere Zusatzeinheiten zum Hoch­

die Probe auch im Schutzgasstrom erhitzen und

temperaturmikroskop HM-4 entstehen Geräte,

abkühlen. Für die Heizung der Präparate hat

die der Gruppe 3 der Klassifikation entsprechen

man eine interessante Lösung gefunden; es lassen

[679] [704] [772].

sich verschiedene Heizelemente in eine Halterung

Man ersetzt dabei das Unterteil der Vakuum­

einsetzen, die die im Bild 10.4 a, b und e gezeigten

kammer und erhält so die Möglichkeit, die Probe

Prinzipien verwirklichen. Dadurch sind Zylinder­

unter Druck-, Zug- und Biegebelastung zu beob­

undBlechproben ebenso zu untersuchen wie solche,

achten. Die Druckbelastung der Objekte

die lediglich einen Anschliff haben. Die mikro­

x

3 mm

x

(3 mm

10 mm) bis 2 00 kp (::::: 2kN) erzeugt

skopische Ausrüstung gestattet Hellfeldbeobach­

man durch Federn, die mit Schraubelementen zu­

tung mit Vergrößerungen zwischen 50 x und 250 x ;

sammengepreßt werden. Druckanzeiger und ein

/0,10

Feinzeiger zum Bestimmen der Probenlänge auf

/0,25 zum Einsatz. Fotografische

0,01 mm vervollständigen die Einrichtung. Die bis

es komm�n zwei Spezialobjektive HM 5 und LD 10

x

x

446

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

1500°C zu erhitzende Probe liegt zwischen zwei

kammer, in der die Probe mit einer Spannmutter

Heizelementen mit Beobachtungsöffnung wie in

relativ hoch belastet werden kann. Die Kraft­

einem Muffelofen. Ein ähnlich ausgeführtes, zwei­

messung erfolgt mit Dehnungsmeßstreifen, die

tes

Temperaturbestimmung mit einem auf der Probe

Vakuumkammer-Unterteil gestattet zusätz­

lich zur Druckbelastung noch die Beanspruchung

angepunkteten Thermoelement.

auf Biegung. Untersuchungen bei Zugbelastung

Während die beiden letztgenannten Einrichtungen

ermöglicht das dritte Vakuumkammer-Unterted

an Mikroskopen umgekehrter Bauart zu benutzen

einschließlich

Belastungsvorrich­

sind, ist die von Reinacher [747] entworfene ein­

tung. Massestücke dienen als Last, die in Stufen

fache Heizkammer für lvlikrozeitstandversuche an

ansetzbarer

verändert werden karm,

in der Regel jedoch

während eines Versuchs konstant ist. Die Kraft

Metallbändern für aufrechte Mikroskope vor­ gesehen.

greift über Zugseile und eine Rollenvorrichtung

Feltham [688] beschreibt eine Zusatz-Vakuum­

an der Probeneinspannung an.

Die Maximal­

kammer zu einem kommerziellen Tensometer,

spannung der doppel-T-förmigen Probe wird mit

wobei die auf maximal 700 °C erhitzbare, band­

11,5 kp/mm2

(� 115 N / mm2) angegeben [772].

Das Heizelement ist wie im Fall der Druckbe­ lastung ausgeführt. Die

oder stabförmige Probe bei bis zu 500facher Ver­ größerung betrachtet werden kann. Kasen, Fore!,

erzielbare Höchsttem­

Taggart und Polanis [710] entwickelten eine um­

peratur beträgt ebenfalls 1500°C. Die Objekt­

fangreiche Apparatur für die Hochtemperatur­

dehnung wird mit Feinanzeigern auf 0, 01

mm

mikroskopie zugbeanspruchter Objekte, die mit

V ACUTHERM

standsheizung (Höchsttemperatur 1 1 00°C) durch­

abgelesen. Die

Hochtemperaturkammer

hydraulischen

modifizierte Thorsen [767] zur Untersuchung der

Mitteln

und

indirekter

Wider­

geführt wird.

Warmrißbildung in Schweißnähten.

Man arbeitet mit konstanter oder kontinuierlich

Kireimer und Ripling [711] berichten über die

steigender Kraft. Die Dehnungsgeschwindigkeiten

Konstruktion einer Mikroskop-Hochtemperatur-

betragen

2,5

·

10-s

bis 2 5 ,

·

10-2

mm/s.

Es

Bild 10.25 Hochtemperatur­ mikroskop IMASCH-5S-65 (Ausrüstung fiir Zug­ belastung der Proben) 1 Vakuurnkammer; 2 Bedienelernente der Heizung;

3 Spannungsanzeiger; 4 Temperatur­ schreiber;

5 Vakuummeter; 6 Mikroskop; 7, 8, 9, 10, 11 Bela­ stungseinrichtung mit Massestücken; 12 Vorvakuumpumpe;

13 Belastungs­ einrichtung mit kontinuierlich steigender Last ; 14 Kühlwasser­ anschlüsse

447

10.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

Bild 10.26 Hochtemperatur­ mikroskop 1MASCH-5S-65 Blick in die geöffnete Vakuumkammer 1 Probe; 2 Thermoelement; 3, 4, 5, 6 Proben­ befestigung ;

7, 8, 9, 10, 11 Ver­ bindungen zur Tensometer- und Belastungseinrichtung; 12, 13, 14, 15 Strom­ zuführungen; 16, 17 Thermopaar­ Anschweißvorrichtung

:S

werden mehrere Thermoelemente an die Probe

den

angeschweißt, um einerseits den sich einstellenden

schen 0,12 und 0,42 eingesetzt. Einen Blick in die

14 mm und numerischen Aperturen zwi­

zum

Kammer vermittelt Bild 10.26. Das zur Tempe­

anderen den Heizstrom zu steuern. Belastung und

raturbestimmung benutzte Thermopaar ist an die

Temperaturgradienten

zu

erfassen

und

Laständerung werden mit Dehnungsmeßstreifen

Probe angeschweißt; dessen Anzeige wird mit

registriert; ebenso die Probendehnung in Abhän­

einem Schreiber registriert und steuert gleich­

gigkeit von Temperatur und Zeit. Fotografische

zeitig einen Zweipunktregler für die Heizstrom­

und Laufbildregistrierung im Hellfeld und polari­

stärke. Mikrofotografische und mikrokinemato­

sierten Licht sind möglich.

grafische

Maßgebenden Einfluß auf die Entwicklung der

Gerät.

Einrichtungen

vervollständigen

das

Hochtemperaturmikroskopie hatten und haben

Im Gegensatz zur Apparatur

die Arbeiten, die im Moskauer Institut für Ma­

liegen die Mittenachsen der Vakuumkammern bei

schinenkunde von Losinski [724] und Mitarbeitern

den Einrichtungen IMASCH-SM und IMASCH-8 ebenso

horizontal wie

IMASCH-SS-65

ausgeführt wurden. Die im Werk für Feinmeß­

[724]

geräte, Frunse, gefertigte Einrichtung IMASCH­

Die Probe wird mit Gewichtskräften auf Zug

SS-65 [727] ist für die direkte Beobachtung von

beansprucht(� 60 kp/mm2

Proben unter Zugbelastung bis zu Temperaturen

maltemperatur 1100 °C). IMASCH -8 bietet dabei

�

das Mikroskop.

600 N/mm2; Maxi­

von 1500°C bestimmt.

die Möglichkeit, neben der lichtmikroskopischen

Im Bild 10.25 wird die Anlage in der Ausrüstung

Beobachtung mit Hilfe einer Feinfokus-Röntgen­

für abstufbare, gleichbleibende Belastung mit Ge­

röhre Strukturanalysen nach der Rückstrahlungs­

wichtskräften bis 500 kp( � SkN) gezeigt. DieProbe

methode von Sachs durchführen zu können.

hatDoppei-T-Profil und wirddurch direktenStrom­

In den Leningrader Optischen Werken wurde aus

durchgang erhitzt. Mit einer zweiten Vorrichtung

dem Gerätetyp IMASCH-5M das vom Prinzip

Jassen sich Proben mit variablen Geschwindigkei­

her ähnliche Hochtemperaturmikroskop UVM-1

ten zwischen 0,03 und 4200 mm/h dehnen. Zur

[724] entwickelt, bei dem die Vakuumkammer in

Kraftbestimmung dienen

Dehnungsmeßstreifen

einem Rahmen ähnlich dem handelsüblicher Zer­

in einer Brückenschaltung. Die Dehnung selbst

reißmaschinen angeordnet ist. Das Mikroskop ge­

wird mit einem Feinzeiger und Mikrohärteein­

stattet auch Beobachtungen im Dunkelfeld. Maxi­

drücken, die vor dem Versuch auf der Proben­

mal kann man bis 3 000 kp

oberfläche angebracht wurden, bestimmt. Man

die

beobachtet mit einem Mikroskop aufrechten Typs.

allerdings nur

Es werden vier Linsenobjektive mit Arbeitsabstän-

chen Prototyp ausgehenden Institutsentwicklung

höchste

einstellbare I 100 °C.

�

30 kN belasten;

Temperatur Bei einer

beträgt

vom

glei­

448

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

IMASCH-18 [728] verwendet man ein ähnliches Mikroskop UVT-1 mit langbrennweitiger Optik; es ist bis zu Temperaturen über 3000 °C benutzbar. Oberhalb 2100°C ersetzt man die thermoelek­ trische Temperaturmessung durch die pyrome­ trische. Zur Beleuchtung dient bis 2100°C eine spezielle

Hochleistungs-Gasentladungsleuchte,

bei höheren Temperaturen bildet man das Objekt im Eigenlicht ab. Die Untersuchung von Objekten bei Wechselbie­ gebeanspruchung ist mit der vonLosinski und Ro­ manow [725] entwickelten Einrichtung IMASCH10 möglich. Die in einer Vakuumkammer ein­ seitig eingespannte Probe (1 mm

x

20 mm

x

90 mm) wird am freienEnde über eine Exzenter­ anordnung mit maximal 3000 Lastwechseln

je

Minute beansprucht. Man arbeitet mit indirekter Wiclerstandsheizung underreichtmaximal1200°C. Als Lichtquelle dient eine Impulsleuchte, die synchron zur Biegewechselvorrichtung gezündet wird. Die mikroskopische Beobachtung wird bei Vergrößerungen bis 200fach vorgenommen. Thermische

die

Wechselbeanspruchung,

einer

mechanischen vergleichbar ist, führte Losinski

Bild 10.27. Tieftemperaturmikroskopische Einrichtung

[724] mit einer anderen Apparaturvariante im

mit Fastax-High Speed Camera

Vakuum oder unter Schutzgas durch.

Firma C. Reichert, Wien, Werkfoto

Als mechanische Belastung erhitzter Proben mit meßbarer Wirkung ist bei hochtemperaturmikro­ skopischen Untersuchungen auch die Härtebe­ anzusprechen.

und

pri.ifer der Nippon Kogalm K. K., Tokyo, finden,

Miro­

dessenBelastungsstufen(50, 100, 300p::::0 :: ,5; I; 3N)

tworski entwickelten auf der Basis der IMASCH­

schon in das Gebiet der Kleinlasthärte hinüber­

stimmung

Losinski

Serie den Gerätetyp IMASCH-9 [726] für die

reichen. Die zylindrische Probe kann bis 1450 °C

Bestimmung der Mikrohärte und des Verhaltens

im Vakuum erhitzt werden. Die mikroskopische

unterZugbelastung(� 60 kp/mm2::::::: 600N / mm2)

Vergrößerung beträgt 100

im Vakuum bis 1300°C. Die Belastung des Ein­

x

bzw. 300

x.

Man hat auch versucht, von der bloßen, gleichsam

dringkörpers variiert zwischen 2 und 50 p ::::::: 2

qualitativen

und 50· 10-2 N.

rungen an der Objektoberfläche zu meßbaren

Das Mikrohärte-Prüfgerät ist

Beobachtung

von

Gefügeände­

so konstruiert, daß man entweder die interessie­

und

rende Stelle der Flachprobe beobachten oder dort

gelangen.

einen Mikrohärteeindruck ausführen kann. Dieser

So

Wechsel wird mit einem Drehkonus im Deckelteil

Gabler [658] das Hochtemperaturmikroskop mit

damit

quantitativen

kombinierten

Informationen

Brandstaetter,

zu

Mitsehe und

der Vakuumkammer vorgenommen, der zur Mit­

einer Magnetsonde. Dicht! und Jeglitsch [667]

tenachse der Kammer exzentrisch angeordnet ist.

berichten über die Kopplung von Hochtempera­

Als Eindringkörper verwendet man Diamant und

turmikroskopie

synthetischen Saphir

in Molybdänhalterungen.

Kulmburg, Gabler und Kamtheuer [720] schließ­

Oberhalb 900°C ist Diamant nicht mehr sicher

lich steigerten den Bedienungskomfort des Rei­

und

Differentialthermoanalyse.

einsatzfähig, weil in vielen Fällen der Kohlen­

chert-Hochtemperaturmikroskops durch Zusatz­

stoff unter Karbidbildung in das Objekt abdif­

einrichtungen

fundiert.

einspiegelung in das Bildfeld) und wiesen damit

Saphir-Eindringkörper

benutzten die

( Heizstromsteuerung, Temperatur­

Autoren bis 1300°C. Die Ausmessung der Härte­

Wege für die zukünftige Geräteentwicklung.

eindrücke geschieht während der Versuche, so

In den letzten Jahren wurde die Mikroskopie

daß Einflüsse durch

auch

Oberflächendiffusion o. ä.

für

Untersuchungen

des

Verhaltens

von

vermieden werden.Erwähnung soll an dieser Stelle

Werkstoffen

noch der handelsübliche Hochtemperatur-Härte-

zogen. Dabei koppelte man vielfach die Einrich-

bei

tiefen

Temperaturen herange­

I 0.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

449

werden

können.

gefunden

tungen für Hoch- und Tieftemperaturmikrosko­

Informationsgehalt

pie. Nach [734] ersetzt man hierzu das Oberteil der

Dies entspricht wohl dem Übergang dieser Unter­

bereits mehrfach erwähnten Heizkammer VA CU­

suchungsmethoden aus der Sphäre der reinen in

THERM durch einen doppelwandigen Kühlein­

die der augewandten Grundlagenforschung und T.

schon in die der betrieblichen Routine­

satz, in dem die Probe direkten Kontakt mit dem

z.

Kühlmedium hat. Damit man den Abkühlungs­

prüfung. Eine weitere Ursache für diesen Wandel

vorgang regulieren kann, ist der Kühleinsatz noch

dürfte auch darin zu suchen sein, daß im Hoch­

mit einer elektrischen Heizung ausgestattet. Im

temperaturmikroskop nur die Oberfläche des Ob­

Bild 10.27 wird diese tieftemperaturmikroskopi­

jekts, nicht aber dessen Inneres überschaubar ist.

sche Einrichtung gezeigt; gleichzeitig ist eine

Man muß stets sehr gerrau prüfen, ob die auf­

Laufbildkamera mit hoher Bildfrequenz (Fastax­

tretenden Oberflächeneffekte für die im Proben­

High Speed Camera, maximal 8000 Bilder/s) ange­

inneren ablaufenden Prozesse repräsentativ sind.

setzt. Zur Beleuchtung benutzt man eine über­

Untersuchungen in dieser Richtung, die gleich­

lastbare Hochleistungs-Xenonlampe.

zeitig die Grenzen der Hoch- und Tieftemperatur­

Demgegenüber vereinigte Cech [662 ] Hoch- und

mikroskopie abstecken, sind vor allem an der

Tieftemperaturkammer in einer Konstruktion, so

Montanistischen Hochschule

daß das Objekt unmittelbar von hohen bis zu tiefen

Mitsehe und Jeglitsch [733] durchgeführt worden.

Temperaturen t}ntersucht werden kann.

In erster Linie sind folgende Punkte zu beachten:

Die Übersicht

iin

Bild 10.28 stellt einen Versuch

in

Leoben

von

1. Änderung der Probenzusammensetzung an der

dar, die umfangreicherrArbeiten auf diesem Sektor

Oberfläche. Sie kann durch sog. Auflegieren

der Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie zu­

erfolgen, indem z. B. aus dem Heizelement ab­

sammenzufassen. Man kann z. Z. zum Stand der

dampfende Metallatome in das Kristallgitter

Entwicklung dieses Fachgebietes sagen, daß die

der Probe eindiffundieren. Tritt dies in stär­

Gefügeumwandlungen

kerem Maße auf, kann sogar der zunächst vor­

gegenüber den Verfahren etwas zurückgetreten

liegende Legierungstyp verändert werden. Um­

ist, mit denen quantitative Aussagen mit hohem

gekehrt kann sich durch selektive Verdampfung

bloße Beobachtung von

einzelner Komponenten die Zusammensetzung Einsatzbereiche von Einrichtungen für die Oberflächen-, Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie Untersuchungen des Sinter-, Schmelz- und Erstar­ rungsverhaltens

an der Probenoberfläche ändern (Ablegieren). In dieser Richtung wirkt z. B. die Entkohlung der

Oberflächen speziell bei Eisenwerkstoffen

durch den Restsauerstoff des Vakuums bzw. Schutzgases. 2. Störungen der ablaufenden Vorgänge durch die

Thermische Ätzung, Anlaufvorgänge durch selektive

das Objekt umgebende Gassphäre können in

Oxydation

mannigfacher Weise eintreten. Kritisch dürfte

Feststellung und Beobachtung von Gefügeumwand­ lungen (subjektive Beobachtung, fotografische Regi­ strierung, Mikrokinematografie, Magnetsonde, DTA) Untersuchung von Zustandsdiagrammen Grenzflächen- und Diffusionsprozesse Untersuchung des Kornwachstums, der Rekristalli­ sation sowie von Ausscheidungs-, Lösungs- und Ent­ mischungsvorgängen Veränderung der Festigkeitswerte in Abhängigkeit von

dabei die Bildung von Oxiden bzw. Suboxiden durch den Restsauerstoff des Schutzgases oder im Vakuum sein (s. Abschn. 10.2.).

3. Eine dritte Gruppe von Phänomenen, die die Oberflächenvorgänge beeinflussen, leitet sich davon ab, daß an der Oberfläche eines Ob­ jekts grundsätzlich andere Verhältnisse herr­ schen als in dessen Innerem. So laufen mit Volumenzunahme

verbundene Umwandlun­

gen an der Oberfläche schneller ab als im Probeninnern, solche unter Volumenvermin­

der Temperatur (Zug-, Druck- und Biegebelastung,

derung entsprechend langsamer. Durch ener­

Mikrohärte, Wechselbeanspruchung)

getische Unterschiede herrschen an der Pro­

Vorgänge im Gefüge bei konstanter und veränder­

benaberfläche andere Keimbildungsbedingun­

licher mechanischer Belastung

gen als im Innern, wozu noch die

Wirkung

adsorbierter Schichten kommen kann. Auch Bild 10.28. Einsatzbereiche der im Abschn.l0. 1.3.4.

bei Diffusionsvorgängen können sich Verschie­

beschriebenen hoch- und

bungen dadurch ergeben, daß sich Oberflächen­

tieftemperaturmikroskopischen Einrichtungen

und Volumendiffusion stark unterscheiden.

29

Beyer, Mikroskopie

450

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

d) 5 min/500°C

a) 10 sj1350°C

,,

I

e) 8 min/500 oc

c) 3 min/500 oc

f) 10 min/500°C

Bild 10.29. Bildung des Zwischenstufengefüges Bainil beim Abkühlen eines NiCrMo-Stahls ( Hochtemperaturmikroskop HM-4 der Union Optical Co., Tokyo; Vakuum; 320: I)

Eine der wesentlichen Erscheinungen, die die

mit minimaler, freier Energie im Korngrenzenbe­

Beobachtung der Veränderungen in Präparaten

reich bezeichnen, der vor allem über die Ober­

im Hochtemperaturmikroskop ermöglicht, ist die

flächendiffusion vor sich geht. Das Schliff bild er­

thermische Atzung, worunter man das Sichtbar­

hitzter Proben sowie Kornwachstum [718] [754],

werden der Korngrenzen in Form eines Ober­

Rekristallisation [700] und Gefügeumwandlungen

flächemeliefs an der Schliffoberfläche beim Er­

sind so (besonders bei Dunkelfeldbeobachtung)

hitzen versteht [706] [733]. Man kann dies als den

[722] [724] [729] [733] [752] gut im Mikroskop

Bildungsmechanismus von Gleichgewichtsflächen

verfolgen [71 8] [724] [733]. Ausscheidungs- und

zu

1 0.1.

Lösungsprozesse [737] sowie Gefügeumwandlun­

451

Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

in den hochtemperaturmikroskopisch geprüften

gen, die mit Volumenänderungen der kristallo­

Proben einen aussagekräftigen Durchschnitt über

grafischen Elementarzelle verbunden sind und

das in der betrieblichen Praxis in großen Mengen

dadurch ein Oberflächenrelief erzeugen, lassen

verwendete

sich im mikroskopischen Bild besonders gut mit

dieser Zielsetzung ist sogleich eine weitere For­

Phasen- oder Interferenzkontrast sowie im Dun­

derung

kelfeld nachweisen. Als Beispiel ist im Bild 10.29

Bauart abzuleiten, und zwar die nach einer Doku­

an

Material

voraussetzen

muß.

Hochtemperaturmikroskope

Aus dieser

die isotherme Umwandlung eines NiCrMo-Stahls

mentation mit hohem InformationsgehalL Aus

wiedergegeben, und zwar die Bildung des Zwi­

diesem Grund gehört eine fotografische Einrich­

schenstufengefüges Bainit, das ein Gemenge von

tung stets zum Lieferumfang der Geräte. Außer

Ferrit und Zementit ist und mit seinem nadligen

der Abbildung der Probe strebt man an, zumin­

Aussehen dem Martensit ähnelt, jedoch geringere

dest die Temperaturanzeige gleichzeitig mit zu

Härte als dieser hat. Die Bainitbildung ist in der

registrieren.

Technik von erheblicher Bedeutung; man kann

Nach ersten Arbeiten von Nacken

sie als Vergütungsvorgang ansehen.

Endeil [686] erhielt dieser Zweig der Hochtempe­

Die Untersuchung des Schmelz- und Erstarrungs­

raturmikroskopie neue Impulse, als man mit des

[736]

und

verhaltens ist einerseits von besonderer Bedeutung

Routineuntersuchungen

für die Aufstellung von Zustandsdiagrammen,

haltens technisch genutzter, fester Brennstoffe

Ascheschmelzver­

zum anderen kann sie bei der Aufklärung von

begann. Deren Eigenschaften werden sowohl von

Schadensfällen

der enthaltenen organischen Kohlensubstanz als

(Warmbrüchigkeit durch

Auf­

schmelzen einzelner Gefügekomponenten) wert­

auch von den mineralischen Bestandteilen be­

volle Dienste leisten [707] [719]. Der Beobach­

stimmt.

tung sind auch Diffusions- und Grenzflächenvor­

dustrieller Aggregate ist jedoch vorwiegend das

Für den kontinuierlichen Betrieb in­

gänge zugänglich, die z. B. das Sinterverhalten von

Verhalten der mineralischen Rückstände (Asche,

Stoffen beeinflussen. Hier eröffnen sich weitere

Schlacke) von Interesse [762] [763].

Anwendungsgebiete der Hochtemperaturmikro­

Bevor auf die Anwendungsgebiete der Hochtem­

skopie für Untersuchungen an keramischen und

peraturmikroskope

pulvermetallurgisch

Werkstoffen

Längsachse eingegangen wird, soll zunächst der

[735] [768].

Aufbau eines typischen Geräts, des Hochtempe­

Mit der Untersuchung von Objekten unter Zug­

raturmikroskops MHO 2 des VEB Carl Zeiss

hergestellten

mit

horizontal

liegender

Druck- oder anderer mechanischer Belastung hat

JENA (Bild 10.30), beschrieben werden [738].

ein wichtiger Einsatzbereich Eingang in die hoch­

Es ist mit seinen Baugruppen - Grundkörper mit

und tieftemperaturmikroskopische Praxis gefun­

Betrachtungsmikroskop und fotografischer Ein­

den [724] [749], wodurch die Prüfmethoden der

richtung, Horizontalofen und Leuchte- auf einer

Oberflächen-Hoch- und

-Tieftemperaturmikro ­

Schiene für optische Bänke aufgebaut. Die elek­

skopie einen festen Platz in der metallkundliehen

trischen Zusatzaggregate für Ofenheizung und

Werkstoffprüfung errungen haben. 10.1.3.5. Hochtemperaturmikroskope mit horizontalliegender Längsachse [689] [692] Die

letzte

Beleuchtung sind in zwei Vorschaltgeräten unter­ gebracht. Das Mikroskop hat eine feste ZuOJ.·d­

Gruppe

nung Okular-Objektiv; Vergrößerung (12,5 25

x bis x) und Abbildungsmaßstab (4 : 1 bis 8 :I)

werden durch Betätigen eines Vierfach-Vergröße­

hochtemperaturmikrosko­

rungswechsels verändert. Man kann mit Durch­

pischer Geräte ist in erster Linie für die Unter­

licht- oder Auflichtbeleuchtung arbeiten. Da die

suchung des Verhaltens anorganischer Stoffe bei

mit einer Handpresse aus den Brennstoffrück­

Erhitzung und Abkühlung bestimmt. Als Proben

ständen

kommen feste Stoffe - kompakte Stücke, in

sichtig sind, beobachtet man häufig nur deren

angefertigten

Probekörper

undurch­

bestimmte Form gepreßte Pulver - zum Einsatz.

Schattenbild und stellt an den mit einer Netz­

Es ist eine Eigenart dieser Gerätegruppe, daß man

teilung im Okular verfolgbaren Größenänderun­

mit relativ geringen Vergrößerungen arbeitet, weil

gen den Verlauf von Reaktionen fest. Bei foto­

man die Proben gern als Ganzes betrachten möch­

grafischer Dokumentation ist die Einspiegelung

te und des weiteren daran interessiert ist, aus den

der Temperaturanzeige in das Bildfeld von beson­

Untersuchungen Schlüsse auf die Arbeitsweise

derem Wert. Weiterhin sind bis 1000°C orientie­

großtechnischer Anlagen (Heizkraftwerke, kera­

rende

mische Werke, Glaswerke) zu ziehen und somit

durchführbar.

polarisationsoptische

Untersuchungen

452

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

Bild 10.30 Hochtemperatttrmikroskop MH02

VEB Carl Zeiss JENA, Werkfoto

Der im

Bild 10.30

durch

Schutzbleche

ver­

deckte Horizontalofen 1 600°C ist ein Rohrofen

Anwendungsgebiete der Hochtemperaturmikroskope mit horizontal liegender Längsachse

(Bild 10.4 a), in den dasauf einemKeramik-Objekt­ träger befindliche Objekt mit dem Präparatwagen eingefahren wird. Das Thermoelement liegt in der Nähe des Objekts, ohne dieses zu berühren. Das Ofeninnere wird mit Sichtfenstern aus geschmol­ zenem Quarz verschlossen. Am Ofen sind Zu­ leitungs- und Ableitungsrohre für Gase vorge­ sehen, so daß man in gewünschter Gassphäre

Untersuchung des Sinter-, Erweichungs- und Schmelz­ verhaltens fester Stoffe (Brennstoffrückstände, Schlak­ ken, keramische Rohstoffe, reine Stoffe, Verbin­ dungen) Thermisches Verhalten von Kristalliten, kompakten Stücken, Einschlüssen

(z.B. reduzierend) arbeiten kann. Die Maximal­

Bestimmung des Verbrennungs- und Blähverhaltens

temperatur des Ofens beträgt 1 600°C. Das Er­

von Kohle

hitzungsmikroskop der Firma E. Leitz, Wetzlar, [671] kann jedoch auch mit Horizontalöfen aus­ gerüstet werden, die maximai1750°C erreichen. Im Bild 10.31 sind die wesentlichen Anwendungen von Hochtemperaturmikroskopen dieser Geräte­ klasse zusammengefaßt. In erster Linie setzt man sie für Untersuchungen des Sinter-, Erweichungs­

Feststellung von Gefüge- und Modifikationsände­ rungen Untersuchungen auf Feuerfestigkeit und Beständig­ keit keramischer Werkstoffe gegen Chemikalien und Schlacken Bestimmung des Benetzungsverhaltens (Randwinkel­

und Schmelzverhaltens vorwiegend anorganischer

messungen)

Stoffe nach standardisierten Prüfverfahren ein

Schwindungs- und Dehnungsverhalten keramischer

[692] [730]. Hierzu muß man einige neue Begriffe definieren. Reine Stoffe schmelzen so, daß bei einer bestimmten Temperatur - der Schmelz­

Stoffe Bestimmung des Druckerweichungsverhaltens

temperatur- der Übergang vom kristallinen in den

Spannungsverhalten von Verschmelzungen

schmelzflüssigen Zustand erfolgt. Gemische hin­

Untersuchung schmelzender Glasgemenge (reale und

gegen schmelzen innerhalb eines mehr oder weni­ ger ausgedehnten Temperaturintervalls; und da die mit Hochtemperaturmikroskopen dieses Typs untersuchten

Objekte

häufig

Gemische

aus

mehreren Komponenten sind, hat man versucht, unter Berücksichtigung der beim Schmelzen von Proben mit vorgeschriebenen Abmessungen tat­ sächlich beobachtbaren Phänomene bestimmte, reproduzierbare Temperaturwerte zu definieren, und zwar u. a. [692] [745] [762] [763]: Sinte1punkt

Modellschmelzen) Aufklärung von Entglasungserscheinungen Bestimmung der Zähigkeitstemperatur von Gläsern Untersuchung von Zustandsdiagrammen Bild 10.31. Einsatzbereiche der im Abschn.10.1.3.5. beschriebenen Hochtemperaturmikroskope

Erweichungspunkt Temperatur, bei der sich scharfe Kanten und

Temperatur, bei der der Probekörper seine Form

hervorstehende Spitzen des Probekörpers runden

ändert (Höhehabnahme), ohne daß sich scharfe

oder in stärkerem Maße Bläherscheinungen auf­

Konturen runden;

treten;

10.1. Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie

453

Halbkugelpunkt

Andere, ebenso definierte Begriffe, auf die nicht

Temperatur, bei der der Probekörper zur Halb­

näher eingegangen werden kann, betreffen den

kugel bzw. zu einem halbkugelförmigen Gebilde

Schwindungs-,

zusammengeschmolzen ist; auchals Schmelzpunkt

reich sowie den Randwinkel zwischen Probe und

Erweichungs-

und

Schmelzbe­

Unterlage [692] [746] [763]. Im Bild 10.32 wird

des Gemisches bezeichnet;

als Beispiel das fast modellmäßige Schmelzver­

Fließpunkt

halten an einer Braunkohlenasche demonstriert.

Temperatur, bei der der schmelzende Körper auf

Selbstverständlich

-} der

Schmelzvorgänge in natura so eindeutig.

ursprünglichen Höhe zusammengeschmol­

hineswegs

alle

An Kohleproben nimmt man auch Untersuchun-

zen ist.

Bild 10.32. Schmelzvorgang

verlaufen

än

einer Braunkohlenasche [738]

Raumtempera!vr

7735°C Sintern

7355 oc Flie/Jpunkt

454

10. Mikroskopie unter besonderen Temperaturbedingungen

gen vor, die Aufschlüsse über das Verbrennungs­ und Blähverhalten geben [755]. Deren Bedeutung mag man daran erkennen, daß es z. B. Kohlen­ sorten gibt, die durch Gasabgabe bei nur 1 00 K Temperaturerhöhung eine Volumenzunahme um etwa t des Anfangswerts erfahren! Außer der nach standardisierten Prüfverfahren vorzunehmenden Bestimmung des Schwindungs­ und Dehnungsverhaltens keramischer Rohstoffe interessiert auch deren Benetzungsverhalten gegen­ über Schlacken, Schmelzen und Chemikalien. Je kleiner der Randwinkel- das ist der am Schatten­ bild im Berührungspunkt Schmelze-Unterlage meßbare Winkel der Probenoberfläche gegen die Unterlage (in Richtung zur Probe gemessen) wird, desto größer ist die Gefahr einer Reaktion zwischen Objekt und Unterlage [692] [746]. Die Feuetfestigkeit keramischer Baustoffe gegen­ über Flußmitteln und Schlacken ermittelt man durch Herstellung von Proben aus Gemischen des keramischen Rohstoffs mit dem betreffenden Flußmittel bzw. der jeweiligen Schlacke. Deren Erweichungspunkt, den man als Maß für die Feuerfestigkeit ansehen kann, bestimmt man dann im Hochtemperaturmikroskop. In wie starkem Maße dabei die Feuerfestigkeit abnehmen kann, wird im Bild 1 0.33 gezeigt. So bewirkt eine Beimengung von 30% MnO zu einer Schamotte eine Erniedrigung des Erweichungspunkts um etwa 500 K! Ein weiteres Einsatzgebiet des Hoch­ temperaturmikroskops in diesem Industriezweig ist die Bestimmung des Schmelzverhaltens der in Brennöfen als Temperaturindikatoren dienenden Segerkegelmassen [692]. Nur kurz soll an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß man auch bestrebt war, Zustands-

1300 MnO

7200 0

10

20 30 40 50%60 Oxi dbeimengung

Bild 10.33. Wirkung verschiedener Flußmittel auf die FeueJfestigkeit (Enveichungspunkt) eiher reinen Schamotte mit 30% A/203 [692]

diagramme

metallischer und anderer Systeme hochtemperaturmikroskopisch zu untersuchen [692]. Dem lag der Gedanke zugrunde, Korrela­ tionen zwischen Erweichungspunkt und Solidus­ kurve sowie Halbkugel- oder Fließpunkt und Liquiduskurve zu finden. Man erhielt technisch verwertbare Resultate. Es war aber auch zu er­ kennen, daß die integralen Aussagen in manchen Fällen nicht den erforderlichen Voraussetzungen an die Genauigkeit solcher Studien genügen. Auch eine weitere Anwendung der Hochtempera­ turmikroskope horizontaler Bauart soll hier nur kurz gestreift werden. Für die Verhüttung von Erzen, den Einsatz keramischer Baustoffe und die Verwendung fester Brennstoffe ist deren ther­ misches Verhalten unter Druckbelastung von er­ heblichemlnteresse. Zu diesem Zweck wurde von der Firma E. Leitz, Wetzlar, ein Zusatzofen für die Untersuchung des Druckerweichungsverhaltens zum Erhitzungsmikroskop entwickelt [701 ]. Durch Hinzunahme weiterer Bauelemente lassen sich Hochtemperaturmikroskope des vorliegenden Typs auch für quantitative polarisationsoptische Untersuchungen ausrüsten [684]. Dabei interessiert die Änderung des Verhaltens durchsichtiger, kristallirrer Stoffe im polarisierten Licht, die häufig Struktur- und Modifikationsänderungen ankündigt. Die Aufklärung von Entglasungs­ erscheinungen durch Kristallisation und Unter­ suchungen des Spannungsverhaltens von Glas­ Glas- oder Glas-Metall-Verbindungen sind wei­ tere Einsatzmöglichkeiten so ausgeführter Hoch­ temperaturmikroskope. Beispiele für diese Ge­ rätegruppe sind die Ausstattungen IIA-P und III-P des Erhitzungsmikroskops von E. Leitz, Wetzlar, (Bild 1 0.34). Man erkennt auch hier die Aufgliederung Durch­ lichtleuchte - Horizontalofen - Betrachtungs­ mikroskop mit Einrichtung für fotografische Re­ gistrierung. Zusätzlich sind jedoch die synchrone Drehung von Polarisator und Analysator sowie die Verwendung von Kompensatoren (Berek­ Kompensator 0 bis 4?., Senarmont-Methode 0 bis 1 },), wobei im Bildfeld neben der Tem­ peraturanzeige auch die Stellungen von Kom­ pensator und Analysator abgelesen werden können. Der im Bild 1 0.34 sichtbare Ofen mit erweitertem Ofenraum gestattet die spannungs­ optische Untersuchung auch größerer Ein- und Verschmelzungen; die Maximaltemperatur des Ofens beträgt 800°C. Für glasherstellende und -verarbeitende Betriebe ist ':!in hochtemperaturmikroskopisches Unter­ suchungsverfahren einsetzbar, das Rückschlüsse

10.2. Mikroskopie bei Über- und Unterdruck

45 5

Bild 10.34 Erhitzungsmikroskop, Ausstattang Ill-P

Firma E. Leitz, Wetzlar, Werkfoto

auf die Viskosität und damit die optimalen Ver­

Griffin-Telin-Heiztischmikroskop (Griffin & Ge­

arbeitungsbedingungen von Gläsern zuläßt. Zu

orge, Großbritannien), das die Kombination eines

diesem Zweck wurde der Begriff Zähigkeitstempe­

waagerecht montierten,

ratur geprägt, womit man die Temperatur be­

skops mit einer auf dem Objekttisch aufgesetzten

zeichnet, bei ds,r sich ein belasteter, unter definier­ ten Bedingungen erwärmterGlasfaden um 1 mm/

element dient gleichzeitig als Probenauflage, Heiz­

min längt.

element und Meßfühler. Das Gerät wurde bisher

Im VEB Carl Zeiss JENA wurde hierzu nach

für die Untersuchung keramischer Stoffe und

petrologischen Mikro­

Heizzelle ist. Das in dieser angeordnete Thermo­

Vorstellungen von Rothe [751] ein Ofen zur Be­

Schlacken eingesetzt; die erzielbare Maximal­

stimmung der Zähigkeitstemperatur Tz1 ( Belastung 1 p/mm2 �10mNfmm2) zum Hochtemperaturmi­

temperatur beträgt 1800 °C. Die förderliche Ver­

kroskop MH02 entwickelt.

im polarisierten Licht ist möglich; auch kann man

Zur Erforschung des Schmelzvorgangs an Glä­

die Heizzelle mit Schutzgas spülen [694].

größerung erreicht Werte bis 170

x

. DasArbeiten

sern wurde das Hochtemperaturmikroskop von Buss et. al. benutzt [770].

WesentlichenEinfluß auf das Ergebnis hochtempe­

10.2.

raturmikroskopischer Untersuchungen haben die

Mikroskopie bei Über- und Unterdruck

jeweiligen Arbeitsbedingungen,

sowie in spezieller Gassphäre

z.

B.

die Ofen­

raum-Gassphäre, weil die in der Probe vor sich gehenden Reaktionen unterschiedlich ablaufen,

Bereits in den Abschnitten 10.1.3.2., 10.1.3.3. und

je nachdem, ob sich diese in oxydierender, redu­

10.1.3.4. wurden hochtemperaturmikroskopische

zierender oder inerter Gassphäre befindet. Wei­

Eimichtungen besprochen, in denen man mit Un­

terhin sindAufheiz- undAbkühlungsgeschwindig­

terdruck bis etwa1

keit des Ofens

Schutzgassphäre arbeitet. Auf diese Weise soll der

von

Einfluß auf die Resultate,

·

w-s Torr

(

=

1 mPa) oder in

die Gleichgewichtseinstel­

Sauerstoffpartialdruck im Kammerinnern redu­

lung im Objekt bei langsam ablaufenden Pro­

ziert werden, um der hohen Affinität erhitzter,

weil hiervon

u. U.

zessen abhängt. So sollte man stets quasistationäre

mikroskopischer

Verhältnisse im Ofenraum anstreben, wobei die

begegnen,

die

Objekte die

zum

Sauerstoff

Beobachtung

zu

ablaufender

erforderliche Zeit maßgeblich von der Viskosität

Prozesse durch Oxidbildung beeinträchtigt oder

des schmelzflüssigen Probenmaterials begrenzt

gar verhindert. Sauerstoffpartialdrücke von 10-4

wird.

Auch Probengröße und -masse können

bis w-s Torr (10 bis 1mPa) führen zwar auch

(z. B. bei Randwinkelmessungen) die Resultate

zu dünnen Oxidschichten, die aber im allgemeinen

der

die

noch nicht stören, wenn man von einigen Aus­

Probekörper aus pulverförmigem Material, so ist

nahmen (Aluminium, Titan, Uran, Zirkon) ab­

auch von dessen Körnung ein Einfluß zu erwarten,

sieht. Bei Untersuchungen

weil hiervon die Größe der reaktionsfähi�en

muß man Ultrahochvakuum (10-8bis10-9Torr

Untersuchungen

ändern.

Preßt

man

Grenzflächen abhängt [692].

=

an solchen Stoffen

1 bis 0,1 pPa) oder weitgehend sauerstofffreie

Zum Abschluß dieses Abschnitts soll noch auf ein

Schutzgase benutzen. Im Feinvakuumbereich ar­

Gerät hingewiesen werden, das von der Form­

beitende Zusätze zu Heizkammern für die che­

gebung der bisher angeführten Hochtemperatur­

mische Mikroskopie erleichtern das Studium von

mikroskope abweicht. Es handelt sich

Sublimationsprozessen.

um

das

456

10. Mikroskopie unter besonderen Temperafllrbedingungen

Untersuchungen in Überdruckkammem zu Mikro­

suchten Conroy und Robertson [664] in einer

skopen werden dann erforderlich, wenn leicht­

Hochtemperaturkammer. In einer ähnlichen Ein­

flüchtige oder unter Normaldruck zersetzliehe

richtung setzte Hasson [697] Metalloberflächen

Substanzen als Proben vorliegen.

der korrodierenden Wirkung gasförmiger, ätzen­

Dies können z. B. Metalle sein, die bei hohen

der Stoffe aus und versuchte so, Werkstofffragen

Temperaturen zu starker Verdampfung neigen

zu lösen, die in kernphysikalischen Anlagen auf­

(Molybdän; Legierungsbestandteile,

treten.

tiv abdampfen),

die

selek­

oder auch zersetzliche, orga­

nische Verbindungen. Aus diesem Grund sind einigeHochtemperaturkammern(VACUTHERM,

10.3.

IM AS CH-Serie) für das Arbeiten mit Überdruck

Mikroskopie unter besonderen Bedingungen

ausgelegt.Joebstl und Dix [708] setzten eine Hoch­

hinsichtlich Luftfeuchtigkeit

druckkammer (maximal 100 kbar) ein, um die Polymorphie von Aziden sowie deren Kornwachs­

Die Mehrzahl mikroskopischer Objekte bei Unter­

tum und Zersetzung bis 250°C zu verfolgen.

suchungen in Biologie und Medizin stellt Forde­

[699] benutzten

rungen hinsichtlich des Feuchtigkeitsgehalts der

eine Tieftemperatur-Überdruckkammer (Grenz­

sie umgebenden Gassphäre. Einerseits handelt es

Heymer, Niegel und Seimeider

2,5 N /mm2), um

sich dabei um Individuen, die nur im Wasser

Paraffinkristallstrukturen bei der Entparaffinie­

existieren können; und um die beim Arbeiten

werte

-40 °C; 25 kp/cm2

�

rung vonSchmierölen mit Flüssigpropan studieren

unter dem Mikroskop meist geringen Flüssigkeits­

zu können.Die Konstruktion derartiger Kammern

mengen vor dem Verdunsten zu bewahren, muß

unterscheidet sich von der üblicher Hoch- und

die sie umgebende Luft in starkem Maße mit

Tieftemperaturkammern

Feuchtigkeit angereichert sein. Zum anderen ist

im

wesentlichen

nur

durch die Gewährleistung der erforderlichen Be­

hohe Luftfeuchtigkeit auch bei solchen Präparaten

lastbarkeit; neue Gesichtspunkte treten hierbei

(Gewebeexplantate, Bakterien- und Pilzkulturen)

nicht auf.

vonnöten,

Nicht ganz so eng wie bei den Unter- und Über­

behalten,

druckkammern ist bei den Einrichtungen fiir die

schützt werden. In den meisten Fällen kann man

die ihre

Lebensfähigkeit nur dann

wenn sie vor dem Austrocknen

ge­

Mikroskopie in spezieller Gassphäre die Bindung

dies durch die Benutzung von Feuchtkammem

an die Hoch- und Tieftemperaturtechnik.

erzielen.

So gibt es z.B. in der Biologie Probleme, die die

Diese haben ein flaches Gehäuse aus Metall, Glas

Beeinflussung der Lebensfunktionen von Klein­

oder Kunststoff. Die im mikroskopischen Strah­

lebewesen bei normaler Umgebungstemperatur

lengang liegenden Teile bestehen aus Glas. Durch

in bestimmter Gassphäre enthalten. Von Inter­

Anbringen auffüllbarer Wasserrinnen [741], Ein­

esse ist ferner der Ablauf chemischer Reaktionen

legen

unter speziellen Bedingungen an die Umgebungs­

poröser Keramikteile, die man während der Ver­

von flüssigkeitsgetränktem Zellstoff oder

Gassphäre. Man arbeitet dann meist in Klima­

suche durch Auftropfen von Wasser tränkt, er­

schränken (s.Abschnitte 10.1.3.1. und 10.3.), die

reicht man die erforderliche Luftfeuchtigkeit im

die gesamte mikroskopische Einrichtung (außer

Kammerinnern. Feuchtkammern befestigt man

dem Einblicktubus, der fotografischenEinrichtung

am bewegbaren Objekttisch oder koppelt sie mit

und den Bedienelementen der

einem Objektführer. Zum Einführen der für die

Mikroskopme­

chanik) aufnehmen und in denen außer der Gas­

Mikromanipulation

sphäre die Luftfeuchtigkeit und zuweilen auch die

sind spezielle Muffen und Schlauchdichtungen

Temperatur geregelt werden können.Über solche

vorgesehen.

erforderlichen

Werkzeuge

Untersuchungen an Sauerstoff- und feuchtigkeits­

Für Präparate, die neben der Forderung an eine

empfindlichen oder giftigen bzw. giftige Dämpfe

hohe Luftfeuchtigkeit noch weitere an die Tempera­

absondernden Stoffen berichteten Crisler, Hecht­

tur verbinden, kann man die Bauprinzipien von

Crisler und Brinkman

[665] [666].

Das Verhalten nichtbeständiger,

Feuchtkammern mit denen der im Abschn.l 0.1. 3 .1. anorganischer

beschriebenen

Temperiereinrichtungen

verei­

Salze studierten Emons, Halme und Seyfarth in

nigen.

einer kombinierten

Solche Kammern, die mit elektrischer Wider­

Präparier-Mikroskopierbox

[683].

standsheizung (Bild 10.4 b und c) oder nach Art

Die Wirkung der Gassphäre auf die mikrosko­

der Durchflußküvetten (Bild 10.5) arbeiten, sind

pischen Objekte bei Glasschmelzprozessen unter-

seit Jahrzehnten bekannt [744].

10.3. Mikroskopie unter besonderen Bedingungen

Ein anderer Weg,

die geforderte hohe

Luft­

457

Unschärfe im mikroskopischen Bild nach sich

feuchtigkeit und (zusätzlich) gewünschte Tempe­

zieht.

raturen beim Mikroskopieren zu erreichen, führt

Klimaschränke benutzt man auch dann, wenn

zu Klimaschränken, die im Aufbau den im Ab­

Untersuchungen in trockener Atmosphäre erfor­

schnitt IO.I. 3 .I. beschriebenen Wärmeschränken

derlich sind, z. B. in der chemischen Mikroskopie

10.12) gleichen. Dies ist z. B. bei der mikro­

beim Vorliegen hygroskopischer oder feuchtig­

kinematografischenRegistrierungvonWachstums­

(Bild

keitsempfindlicher Substanzen. Man entzieht der

prozessen und anderen Vorgängen an Kulturen

Atmosphäre die Feuchtigkeit durch Trockenmittel

auf Nährböden von Bedeutung, weil man über

oder Molekularsiebe.

einen längeren Zeitraum mit Zeitraffung arbeitet

Vielfach sind solche Einrichtungen auch für das

undjede Änderung der Luftfeuchtigkeit Quellung

Arbeiten in gewünschter Gassphäre verwendbar

oder Schrumpfung des Nährbodens und damit

(s. Abschn. I0.2.).

Ausblick auf die zukünftige Entwicklung

11.

der Lichtmikroskopie von Dr. rer. nat. Hermann Beyerund Dipl.-Phys. Bemhard Gröbler

Das Lichtmikroskop hat im Verlauf seiner fast

Mikroskopfotometrie an mikroskopischen Objek­

400jährigen Geschichte einen beachtlichen Lei­

ten Dicken,

stungsstand erreicht, doch ein Abschluß seiner

gemessen. Die Abhängigkeit der Absorption von

Brechzahlen

und

Absorptionen

Entwicklung ist heute noch nicht abzusehen. Das

der Wellenlänge führte zur Mikrospektralfoto­

Entwicklungstempo war in den verschiedenen

metrie.

Etappen sehr unterschiedlich.

Nach der Erfin­

Da im Verlauf der technisch-wissenschaftlichen

dung des Mikroskops folgte ein Jahrhundert der

Entwicklung die Menge des zu untersuchenden

ersten bedeutenden Erfolge einzelner Mikrosko­

Materials stark angewachsen ist und in vielen

piker, dem sich ein Jahrhundert der Stagnation

Fällen vom gleichen Material stets eine größere

anschloß, bis man gelernt hatte, achromatische

Anzahl Proben untersucht werden müssen, um zu

Linsensysteme herzustellen.

gesicherten statistischen Aussagen zu gelangen,

Ein

gewisser

Ab­

schluß wurde durch die Schaffung der homogenen

wird eine stärkere Mechanisierung und Automati­

Immersion und der Apochromate erreicht. Etwa

sierung, vor allem der quantitativen mikrosko­

50 Jahre später wurden der Mikroskopie lebender

pischen Untersuchungen, nicht nur wünschens­

Präparate

durch

das

Phasenkontrastverfahren

wert, sondern in Zukunft zu einer unabdingbaren

neue Perspektiven eröffnet.

Forderung. Diese wird noch durch die Tatsache

Man kann wohl mit ziemlicher Sicherheit anneh­

erhärtet, daß es in den meistenFällen nicht genügt,

men, daß die visuelle mikroskopische Beobach­

nur einen Parameter, etwa die Größe bzw. Grö­

tung auch in 100 bis 200 Jahren noch ihre Exi­

ßenverteilung bestimmter mikroskopischer Bild­

stenzberechtigung haben wird. Das gilt besonders

elemente, wie biologische Zellen oder Zellkerne

für die belebte Natur; denn der Blick in die Werk­

im Dünnschnitt oder Ausstrich, zu bestimmen.

statt des Lebens kann niemals vollständig durch

Zur Gewinnung einer sicheren Aussage sind viel­

Meßdaten und ihre Auswertung in einem Elektro­

fach verschiedene Parameter, z.B. Größe, Form,

nenrechner ersetzt werden. Allerdings ist anzu­

Häufigkeit, Orientierung, Brechzahl, Reflexions­

nehmen, daß in verstärktem Maße der Einblick ins

vermögen und Durchlässigkeit, miteinander zu

Okular vom Bildschirm abgelöst wird,auf dem das

kombinieren.

mikroskopische Bild genügend stark vergrößert

gungen gemacht, um z. B. durch Kombination

Es werden z. Z.

große Anstren­

erscheint.

der aus der Vermessung von Einzelzellen erhalte­

Obwohl das Messen, Zählen und Vergleichen

nen Parameter eine Früherkennung des Krebses

schon frühzeitig in die mikroskopische Praxis ein­

zu ermöglichen. Die dafür erforderlichen Mes­

geführt worden ist, handelte es sich doch über­

sungen sowie die sinnvolle Weiterverarbeitung

wiegend um qualitative mikroskopische Unter­

der gewonnenen Meßwerte sind zwar nach den

suchungen, um aus Form und Anzahl bestimmter

bisher üblichen Methoden prinzipiell möglich,

Objekte und Objektstrukturen auf die Eigen­

doch, vor allem wegen des zu hohen Zeitauf­

schaften

wands, praktisch nicht durchführbar.

der

organischen

und

anorganischen

Materie zu schließen. Erst allmählich hat die

Schon heute sind einige Ansatzpunkte vorhanden,

quantitative

um mikroskopische Untersuchungen dieser Art

Mikroskopie

immer

stärker

an

Bedeutung gewonnen und drängt heute nach

immer stärker zu mechanisieren und zu automati­

ständiger Erweiterung und Vervollkommnung.

sieren. Es werden vor allem geometrische, inter­

Zunächst war es die Polarisationsmikroskopie, die

ferometrische oder fotometrische Meßgrößen er­

sich

bei der

Untersuchung

doppelbrechenden

mittelt und anschließend nach einem vorbestimm­

Materials im polarisierten Licht gerrauer Gang­

ten Programm in einer Datenverarbeitungsanlage

unterschiedsmessungeil bediente. Später wurden

ausgewertet.

im Bereich der Interferenzmikroskopie und der

kann Bestandteil des Geräts sein; dann läßt sie sich

Diese

Datenverarbeitungsanlage

11.

Ausblick auf die zukünftige Entwicklung der Lichtmikroskopie

für den speziellen Anwendungszweck relativ ein­

459

ralien auch für andere technische Kunstprodukte,

fach bauen. Im anderen Fall werden die Meß­

wie Kunstfasern u. dgl. Wegen der damit verbun­

größen auf einem geeigneten Speicher (z.B. Loch­

denen Vorteile wird man in vielen Fällen die mit

streifen oder Magnetband) registriert, und die

der größeren Wellenlängeverbundene verminderte

Auswertung erfolgt in einer der vielseitig an­

Auflösung in Kauf nehmen.

wendbaren

Datenverarbeitungs­

Auch die Röntgenstrahlung ist schon zur Ver­

anlagen, wie sie mehr und mehr zur Anwendung

wendung in der Mikroskopie vorgeschlagen und

elektronischen

kommen.

auch in einigen Fällen dafür nutzbar gemacht wor­

Die verstärkte Anwendung der modernen Elek­

den. Sie kann ebenfalls viele Substanzen fast unge­

tronik wird sicher aus den vorgenannten Gründen

hindertdurchdringen. Da ihre Wellenlängewesent­

ein wesentlicher Faktor in der zukünftigen Mikro­

lich kleiner als die der sichtbaren Strahlung ist,

skopentwicklung sein. Die Miniaturisierung der

läßt ihre Anwendung eine wesentlich höhere Auf­

elektronischen Bauelemente. und

lösung erwarten. Die Röntgenstrahlen werden im

Schaltungen,

z.B. in Form der Mikroelektronik, wird anderer­

Gegensatz

seits eine stärkere Anwendung des Mikroskops

Atmosphäre nicht oder kaum absorbiert. Hoch­

zu

den

Elektronenstrahlen

in

der

in dieser Arbeitsrichtung erfordern.

vakuum ist also im Objektraum nicht erforderlich.

In der Perspektive wird auch die Mikroskopie

Leider

unter Verwendung besonderer Strahlenarten, sei

schwierig aus ihrer Richtung ablenken, also auch

es im sichtbaren oder unsichtbaren Spektralbe­

schwierig fokussieren. Aus diesem Grund ist bis­

lassen

sich

Röntgenstrahlen nur

sehr

reich, weiter an Bedeutung gewinnen. Von den

her nur die Röntgenschattenmikroskopie prak­

mikroskopischen

unsichtbaren

tisch durchgeführt worden. Eine Feinfokusrönt­

Spektralbereich hat sich bisher, wegen der wesent­

genröhre wird in der Nähe des zu untersuchenden

Verfahren

im

lichen Erhöhung des Auflösungsvermögens, vor

Präparats angeordnet

allem die Elektronenmikroskopie in stärkerem

divergierenden

und

letzteres von

Maße durchsetzen können. Durch die sehr kurze

strahlt, so daß auf einem Fluoreszenzschirm ein

Röntgenstrahlenbündel

dem

durch­

Wellenlänge der verwendeten Elektronenstrahlen

Röntgenschattenbild sichtbar

kann

kann. Die Auflösung des Lichtmikroskops wird

das

Auflösungsvermögen

etwa

auf

das

gemacht werden

lOOfache gegenüber dem Lichtmikroskop gestei­

dabei allerdings nicht erreicht. Es existieren bis

gert werden.Doch muß man, wegen der Absorption

jetzt noch keine abbildenden

der Elektronen in der Atmosphäre, stets im Hoch­

Qualität auch nur annähernd als für die Röntgen­

vakuum arbeiten. Die Untersuchung lebender

mikroskopie ausreichend angesehen werden kann.

Systeme,

deren

Objekte ist kaum möglich. Das sind die wesent­

Es läßt sich über die Perspektive der Röntgen­

lichen

mikroskopie nur schwer eine Prognose stellen.

Gründe, weshalb die Lichtmikroskopie

kaum jemals von der Elektronenmikroskopie ver­

Zu den vorher erwähnten besonderen Strahlen­

drängt werden kann. Innerhalb des vom Licht­

arten gehört auch die Laserstrahlung, die sich

mikroskop erreichbaren Auflösungsvermögens ist

durch besonders gute zeitliche und räumliche

es

dem Elektronenmikroskop eindeutig über­

Kohärenz auszeichnet. Sie wird sicher noch eine

legen.

besondere Bedeutung für die Mikroskopie, z.B.

Die Mikroskopie mit Strahlenarten, die sich an

im Rahmen der Holografie, erlangen.

den sichtbaren Spektralbereich anschließen, d. h.

Unter Holografie

im ultravioletten und infraroten Spektralbereich,

ges Bildaufzeichnungsverfahren, bei dem kohä­

[774] versteht man ein neuarti­

kann für Substanzuntersuchungen an organischer

rentes (Laser-) Licht benutzt wird und das ohne

und anorganischer Materie große Bedeutung er­

Linsenoptik arbeitet. Kurz gesagt, basiert es auf

langen. Die wesentlichen optischen Elemente zur

der Erzeugung von Zweistrahlinterferenzen zwi­

Realisierung der Mikroskopie in diesen Spektral­

schen den vom Gegenstand beeinflußten Licht­

bereichen sind schon entwickelt worden. Auch

wellen und einer Referenzwelle. Die fotografische

Untersuchungen

dieser Art,

Zytologie mit ultraviolettem

besonders in der Licht,

sind,

wie

Aufnahme dieses Interferenzmusters ist das Holo­ gramm. Bei erneuter Durchstrahlung des Holo­

bereits aus Abschn. 6.1.6. hervorgeht, schon über

gramms mit kohärentem Licht entsteht durch

Jahrzehnte durchgeführt worden. Die IR-Mikro­

Beugung ein Bild des Gegenstands. Dieses Bild

skopie wird mit der Weiterentwicklung der Halb­

hat alle räumlichen und perspektivischen Eigen­

leitertechnik an Bedeutung gewinnen, weil viele

schaften,

Halbleiter im infraroten Spektralbereich durch­

Gegenstands vom Ort des Hologramms aus wahr­

ässig sind. Das gilt neben verschiedenen Mine-

nehmbar sind. Je nach Wahl der geometrischen

die

beim

normalen Betrachten

des

11. Ausblick auf die zukünftige Entwicklung der Lichtmikroskopie

460

Anordnung bei Aufnahme und Reproduktion des

Einrichtung bleiben. Stellt manjedoch von dem

Hologramms kann man beliebigeAbbildungsmaß­

Raumgebiet, in dem sich die Objekte aufhalten,

stäbe erhalten. Dieses und andere Verfahren der

ein Momenthologramm (lmpulslaser) her, so

sog.

kann man bei der Reproduktion in Ruhe ein

kohärenten

Optik

eröffnen

unabsehbare

Möglichkeiten für das optische Instrumentarium

stehendes Bild des Raums durchmustern und

der Zukunft.

die Objekte finden. Auf diese Weise wurden

Zur Zeit finden diese Verfahren in der Mikrosko­

natürliche Nebel, Sprays, Hydrosole u. ä. er­

pie jedoch nur zögernd Eingang [773]. Es werden

folgreich untersucht [775].

vor allem

zwei Aspekte

der Holografie stark

beachtet. 1. Eine 1

:

holografische Abbildung

Wie schon im Abschn. 1. anband der historischen Entwicklung gezeigt werden konnte, sind der

im

Maßstab

1 ist aberrationsfrei und läßtsehr große Ding­

Mikroskopie,

sowohl durch

Forderungen

der

Praxis als auch aufgrund vertiefter theoretischer

felder zu, bei numerischen Aperturen bis nahe

Erkenntnisse und erweiterter technischer Möglich­

an Eins. Dies wird in der Kopiertechnologie

keiten, mehrfach neue, erweiterte Perspektiven

für Mikroschaltkreise genutzt, wobei ziemlich

eröffnet worden.

große Flächen mit hoher Auflösung abzubilden

Außer den in diesem Abschnitt schon erwähnten

sind. 2. Ein Hologramm speichert ein scharfes Bild

Möglichkeiten ist zu erwarten, daß im Verlauf der Weiterentwicklung von Wissenschaftund Technik,

vom gesamten Raum. Schnell bewegte Objekte,

besonders der Entdeckung neuer physikalischer

z. B. Pantoffeltierchen, kann man unter not­

Effekte, auch der Mikroskopie weitere Impulse

malen Umständen nicht fotografieren, weil sie

zu

nicht in der Einstellebene der fotografischen

ihres Anwendungsbereiches geliefert werden.

ihrer

Vervollkommnung

und

Erweiterung

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