Mikrobiologie der Cellulose [Reprint 2021 ed.] 9783112578124, 9783112578117

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A. A. I M S C H E N E Z K I

M i k r o b i o l o g i e der C e l l u l o s e

ALEXANDER A. IMSCHENEZKI

Mikrobiologie der Cellulose Vom Autor neu bearbeitet In deutscher Sprache herausgegeben von Dr. H E L M U T

KÖßLITZ

Mit 121 Abbildungen im Text und auf 38 Tafeln und 66

Tabellen

A K A D E M I E - V E R L A G • B E R L I N 1959

A . A . IlMmeHeijKHÖ MHKpOÖHOJIOrHH AeJIJIJ0J103M Erschienen im Verlag der Akademie der Wissenschaften der UdSSR Moskau 1953 Übersetzung aus dem Russischen v o n Rudolf Wittwer

Die Herausgabe dieses Werkes wurde vom K u l t u r f o n d s der Deutsehen Demokratischen Republik gefördert

Erschienen im Akademie-Verlag G m b H , Berlin W 8, Mohrenstraße 39 Copyright 1959 b y Akademie-Verlag G m b H , Berlin Alle R e c h t e vorbehalten Lizenz-Nr. 202 • 100/701/59 Gesamtherstellung: Druckhaus „Maxim Gorki", Altenburg Bestell- u n d Verlagsnummer: 5293 P r i n t e d in Germany E S 18 G l

VORWORT Zu den Disziplinen der Mikrobiologie, die für die verschiedensten Spezialgebiete von Interesse sind, gehört zweifellos auch die Mikrobiologie der Cellulose. Die Zersetzung der Cellulose durch Mikroorganismen ist einmal für den Biogeochemiker interessant, da dies der umfangreichste Prozeß ist, der mit dem Kreislauf des Kohlenstoffs in der Natur verbunden ist. Von gleicher Wichtigkeit ist sie aber auch für den Agronomen und Bodenkundler im Zusammenhang mit dem Problem der Humusbildung, die mehr oder weniger von der Zersetzung pflanzlicher Rückstände abhängt. Diese Prozesse hängen direkt mit der Entstehung einer festen Bodenstruktur zusammen. Zum anderen muß den Biochemiker die Hydrolyse eines derart beständigen Stoffes, wie ihn die Cellulose darstellt, mit Hilfe der von Mikroorganismen gebildeten aktiven Cellulasen interessieren. Für die Cellulose als Rohstoff der Zukunft und die in letzter Zeit besonders intensiv entwickelte Hydrolysenindustrie wird die Notwendigkeit der Verwendung von Fermentpräparaten für die Hydrolyse der Cellulose immer deutlicher. Andererseits hat die ausgedehnte Verwendung von cellulosehaltigen Werkstoffen in Wirtschaft und Technik die Biologen und Chemiker bereits seit längerer Zeit vor die volkswirtschaftlich wichtige Aufgabe gestellt, Maßnahmen auszuarbeiten, um diese Stoffe vor der zerstörenden Wirkung der Mikroorganismen zu schützen. Seit einer Reihe von Jahren sind vom Verfasser Untersuchungen über die Biologie der aeroben und anaeroben Cellulosebakterien durchgeführt sowie die Ursachen für die Zerstörung der cellulosehaltigen Stoffe aufgeklärt worden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse, z. T. bisher unveröffentlicht, bilden den Hauptinhalt der vorliegenden Monographie. Sie enthält Angaben über Morphologie, Systematik und Physiologie der aeroben und anaeroben Cellulosebakterien und deren Verbreitung in der Natur. Ferner wird das Problem der Symbiose von Cellulosebakterien mit niederen und höheren Organismen besprochen und die praktische Bedeutung der Cellulosebakterien behandelt. Dadurch, daß einige andere nicht unmittelbar mit der Mikrobiologie zusammenhängende Wissensgebiete, wie die Entomologie, die Viehzucht, die Technik usw., gestreift werden mußten, war es dem Verfasser nicht möglich, lediglich seine eigenen Arbeiten zur Grundlage zu machen. Es ist somit notwendig geworden, das Buch durch einige vorwiegend nach Literaturangaben geschriebene Abschnitte zu ergänzen. Dies betrifft in erster Linie die Rolle der Cellulosebakterien bei der Verdauung der Cellulose im Magen-Darm-Kanal von Wiederkäuern und die Symbiose von Cellulosebakterien mit Insekten. Am Schluß des Buches ist eine ausführliche Literaturzusammenstellung über die Mikrobiologie der Cellulose angeführt,

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Vorwort

In das vorliegende Werk sind ausschließlich Angaben über die zu den Bakterien, Myxobakterien und Actinomyceten gehörenden Cellulosebakterien aufgenommen worden. Die mit dem Abbau der Cellulose durch Pilze zusammenhängenden Fragen werden nur kurz gestreift. Auf diesem Gebiet hat der Verfasser kaum eigene Arbeiten durchgeführt, und die vorhandenen Veröffentlichungen sind bereits so zahlreich, daß sie als selbständiges Gebiet, die Mycologie der Cellulose, behandelt werden können. Naturgemäß besitzt eine Bevorzugung der nur mit der Zersetzung der Cellulose zusammenhängenden mikrobiologischen Prozesse einen etwas künstlichen Charakter. Meist handelt es sich um die Zersetzung von Pflanzenresten, die nicht nur aus Cellulose bestehen, sondern auch Pectinstoffe, Hemicellulosen, Lignin u. a. m. enthalten. Sämtliche derartigen Vorgänge lassen sich jedoch nicht in einer einzigen Monographie zusammenfassen; deshalb zog es der Verfasser vor, einige Fragen, die mit der Zersetzung der Cellulose zusammenhängen, ausführlicher zu behandeln. Eine Ubersicht der Arbeiten auf dem Gebiet der Mikrobiologie der Cellulose ist sehr aufschlußreich, da in diesem Bereich von russischen und sowjetischen Mikrobiologen bedeutende Ergebnisse erzielt werden konnten. Die klassischen Arbeiten von W. L. OMELJANSKI und S. N. WLNOGRADSKL erfüllen jeden sowjetischen Mikrobiologen mit Stolz. Diese Forschungen, die zielweisend für die weitere Entwicklung unserer Vorstellungen über die Rolle der Mikroorganismen bei der Cellulosezersetzung sind, haben allgemeine Anerkennung gefunden. A. A. IMSCHENEZKI

INHALTSVERZEICHNIS Seite

Vorwort Einleitung

V 1 I. A e r o b e C e l l u l o s e b a k t e r i e n

A. Untersuchungsmethoden 1. Chemie der Cellulose 2. Cellulose für Nährmedien 3. Nährmedien 4. Herstellung von Anreicherungskulturen 5. Bestimmung der Menge an aeroben Cellulosebakterien in natürlichen Substraten 6. Isolierung von Reinkulturen 7. Bestimmung der Bakterienmenge 8. Bestimmung der Aktivität einer Kultur 9. Mikroskopische Technik B. Morphologie und Systematik

9 10 13 18 23 28 29 35 36 43 47

1. Verwertung der Cellulose als Kohlenstoff- und Energiequelle durch Mikroorganismen 47 2. Mykobakterien (Myxobacterialea) 50 3. Sporenlose Bakterien 80 4. Vibrionen 87 5. Sporenbildende Bakterien 93 6. Actinomyceten und Mycobakterien (Actinomycetales) 100 C.Physiologie 1. Kohlenstoffernährung 2. Mineralische Ernährung 3. Stickstoffernährung 4. Vitaminbedarf

112 112 130 131 136

D. Einwirkung äußerer Faktoren

139

1. 2. 3. 4. 5.

Die Temperatur Das Licht Der Feuchtigkeitsgehalt des Substrats Die Belüftung Die Acidität des Mediums

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung 1. 2. 3. 4.

139 142 142 143 145 146

Oxydationstheorie 146 Die Oxydation der Hydrolysenprodukte der Cellulose 157 Die Synthese des Bakterienschleims 159 Die Beziehungen zwischen bakterieller Cellulosezersetzung und Humusbildung 162

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Inhaltsverzeichnis

II. A n a e r o b e C e l l u l o s e b a k t e r i e n A. Methodik 1. Nährmedien 2. Die Herstellung der Anreicherungskulturen 3. Die Isolierung der Reinkulturen

Seite 164 164 169 169

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien 1. Morphologie 2. Physiologie a) Kohlenhydratbedarf b) Stickstoffernährung c) Vitaminbedarf 3. Der Einfluß äußerer Faktoren a) Die Temperatur b) Die Acidität des Mediums c) Das Verhalten gegenüber Sauerstoff 4. Die Biochemie der Cellulosegärung a) Die Hydrolyse der Cellulose b) Gärungsprodukte c) Die Bildung des Methans d) Die Vergärung der Glucose 5. Die Systematik der thermophilen anaeroben Cellulosebakterien

178 178 186 186 188 189 191 191 192 194 199 200 203 210 212 215

G. Mesophile Cellulosebakterien 1. Sporenbildende Bakterien a) Morphologie b) Cytologie c) Kultivierungsmerkmale d) Die Büdung des Methans e) Systematik 2. Kokkenähnliche Formen 3. Sporenlose Bakterien 4. Physiologie a) Das Verhalten gegenüber verschiedenen Kohlenstoffquellen b) Stickstoffernährung c) Vitaminbedarf d) Der Bedarf an Mineralsalzen e) Äußere Faktoren a) Temperatur ß) Acidität des Mediums •y) Das Verhalten gegenüber Sauerstoff f) Die Produkte der mesophilen Cellulosegärung . a) Hydrolyse der Cellulose ß) Gärungsprodukte

217 217 219 224 225 233 236 238 242 244 244 246 248 250 250 250 252 253 255 255 262

III. Die V e r b r e i t u n g der C e l l u l o s e b a k t e r i e n 1. Geographische Verbreitung 265 2. Die quantitative Bestimmung der Cellulosebakterien 267 A. Der Boden 270 1. Die Bedeutung des Celluloseabbaus im Boden 270 2. Faktoren, die den Gehalt des Bodens an Cellulosebakterien beeinflussen . . . 272 3. Der Gehalt verschiedener Böden an Cellulosebakterien 278 4. Die Artenzusammensetzung der im Boden vorhandenen Bakterien 280 5. Die Cellulosebakterien als Kriterium für die Kultivierung des Bodens . . . . 282

Inhaltsverzeichnis

IX Seite

B. Das Vorkommen der Cellulosebakterien im Süßwasser und im Salzwasser . . . . 1. Allgemeine Bemerkungen 2. Die Seen 3. Die Ozeane und Meere 4. Die Artenzusammensetzung der Cellulosebakterien 5. Die Halophilie

283 283 285 286 287 288

C. Die Böden der Gewässer 1. Die Zusammensetzung der Böden und die in ihnen enthaltene Cellulosemenge. 2. Die in den Seeböden vorhandene Menge an Cellulosebakterien 3. Die Verteilung der Cellulosebakterien in vertikaler Richtung 4. Der Anteil der verschiedenen Arten im Schlamm der Gewässer 5. Das Wachstum an wassertechnischen Anlagen 6. Das Vorkommen in Schlammvulkanen

289 289 290 292 293 293 294

D. Das Vorkommen in Dung und Torf

295

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen . . . . . . . . . 1. Die Cellulosegärung als symbiotischer Prozeß . . a) Die Wirkungsweise der begleitenden Mikroflora b) Die Verwertung der Produkte der Cellulosegärung durch die Begleitbakterien 2. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit stickstoffbindenden Bakterien . . . a) Bemerkungen zur Methodik b) Die Zersetzungsprodukte der Cellulose als Energiequelle für die Stickstoffbakterien c) Die gleichzeitige Kultivierung von Cellulose-und Stickstoffbakterien . . a) Untersuchungen mit aeroben Cellulosebakterien aa) Die Vermehrung der Stickstofifbakterien ßß) Die Fixierung des Stickstoffs ß) Versuche mit anaeroben Cellulosebakterien d) Metabiose oder Symbiose? e) Die Fixierung des Stickstoffs im Boden als Funktion der Cellulosezersetzung. f) Biostickstoffdüngung 3. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Mikroorganismen 4. Die Cellulosebakterien als Symbionten der Wirbellosen a) Methodik b) Protozoen c) Mollusken d) Krebse e) Insekten

298 298 300 306 308 309

F. Die Cellulosebakterien im Verdauungstrakt der Tiere und des Menschen 1. Der Cellulosegehalt des Futters 2. Das Fehlen von Cellulase in den Sekreten der Verdauungsdrüsen 3. Die Existenzbedingungen der Bakterien im Pansen a) Protozoen b) Cellulosebakterien c) Die Zersetzungsprodukte der Cellulose und ihre physiologische Bedeutung . d) Das Eiweiß der Mikroorganismen 4. Die Beziehungen zwischen der Mikroflora und der Cellulosezersetzung im Blinddarm der Pferde, Nagetiere und anderer tierischer Organismen 5. Die Vorbehandlung des Futters 6. Die Verdauung der Cellulose im menschlichen Organismus

310 313 313 313 320 326 329 334 335 339 341 342 345 348 349 350 357 358 360 360 361 363 370 373 375 376 377

X

Inhaltsverzeichnis

IV. D i e p r a k t i s c h e B e d e u t u n g d e r c e l l u l o s e z e r s e t z e n d e n

Mikroorganismen Seite

A. Die thermophile Gärung der Cellulose 381 1. Die Geschwindigkeit biochemischer Prozesse bei höheren Temperaturen . . . 381 2. Die Rohstoffe 382 3. Die verwendbaren Kulturen 383 4. Die Nährmedien 384 5. Die Neutralisation 385 6. Der Anteil an vergorener Cellulose 386 7. Die Bildung von Alkohol 387 8. Die Bilduhg von Säuren 389 9. Die Belüftung 390 10. Der Einfluß von Metallen 391 11. Die Vergärung von Holz 392 12. „Cellulose-Gas" 394 B. Die Zerstörung cellulosehaltiger Industrieerzeugnisse 1. Die wirtschaftliche Bedeutung 2. Textilerzeugnisse 3. Material zur Isolierung von Kabeln und Leitungen 4. Fischnetze, Seile und ähnliche Materialien 5. Die Beständigkeit der aus verschiedenen Pflanzen gewonnenen Fasern . . . . 6. Papier, Pappe und ähnliche Materialien 7. Die Zerstörung pflanzlicher Zellwände

395 395 395 397 398 400 400 402

C. Die Bestimmung der Resistenz von Cellulosematerialien

402

D. Die Methoden zur Konservierung von Cellulosematerialien

407

Literaturverzeichnis

412

Autorenregister

443

Sachverzeichnis

448

EINLEITUNG Von allen organischen Kohlenstoffverbindungen ist die Cellulose am weitesten verbreitet. Jährlich bilden die höheren Pflanzen große Mengen von Cellulose. Dieser synthetische Prozeß ist so bedeutend, daß er im Vergleich zur Synthese anderer Stoffe zweifellos den ersten Platz einnimmt. Die Fähigkeit, Cellulose zu synthetisieren, besitzen in der Hauptsache die höheren Pflanzen. Niedere Pflanzen bilden im allgemeinen keine Cellulose; ihre Zellwände bestehen aus anderen Stoffen, z. B. aus Hemicellulosen, Pectin u. a. m. Eine Ausnahme bilden einige Bakterien, unter denen insbesondere das Essigsäurebakterium Bacterium xylinum hervorzuheben ist, das erhebliche Mengen an Cellulose bildet. Wie sich aus neueren Untersuchungen über die Struktur und das physikochemische Verhalten ergeben hat, sind die Eigenschaften dieser Cellulose die gleichen wie die der in höheren Pflanzen gebildeten. In theoretischer Hinsicht ist die Tatsache interessant, daß bei den Bakterien die Ablagerung der Cellulose außerhalb der Zelle erfolgt, und zwar im Falle der Essigsäurebakterien in Form eines massiven, schleimigen Films. Man muß jedoch die Möglichkeit einer Diffusion von niedermolekularen löslichen Cellulosevorstufen durch die Zellwand in den Kreis der Betrachtungen einbeziehen; die weitere Polymerisation dieser Vorstufen würde dann bereits außerhalb der Zelle stattfinden. Die von den niederen Pflanzen erzeugte Cellulosemenge ist derart gering, daß sie in keiner Weise mit der im Holz oder in den anderen Zellwänden höherer Pflanzen enthaltenen Menge verglichen werden kann. Im Gegensatz zu den Mikroorganismen, die die Cellulose aus organischen Verbindungen aufbauen, steht den höheren Pflanzen zur Synthese der Cellulose nur eine einzige Kohlenstoffquelle zur Verfügung, nämlich die in der Atmosphäre vorhandene Kohlensäure. Mittels der Photosynthese können die Pflanzen die Energie des Sonnenlichtes ausnutzen und die verschiedensten kohlenstoffhaltigen Verbindungen synthetisieren, darunter an erster Stelle die Cellulose. Die Angaben der verschiedenen Autoren über die Kohlensäuremenge der Atmosphäre stimmen nicht überein. Der Wirklichkeit am nächsten dürfte die Menge von 110 Billionen Kilogramm kommen. Über die Dauer des Zeitraumes, in dem dieser Kohlensäurevorrat der Atmosphäre durch die Assimilation erschöpft sein würde, gibt es zahlreiche theoretische Berechnungen. Auch hier stimmen die von den verschiedenen Autoren angegebenen Zahlen nicht überein. Ohne näher auf diese Frage einzugehen, da ihre Behandlung außerhalb der gestellten Aufgabe liegt, sei erwähnt, daß einige einen Zeitraum von zwei Jahren, andere dagegen einen solchen von 35 Jalyen angeben, in dem der Kohlensäurevorrat der Atmosphäre verbraucht sein 1

Imschenezki, Mikrobiologie

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Einleitung

würde. Die größere Wahrscheinlichkeit besitzen wohl die Angaben mit kürzeren Zeiten. Einer der hervorragendsten Kenner der Photosynthese, K. A. TlMIRJASEW, hat angenommen, daß eine Menge, die der gesamten in der Atmosphäre enthaltenen Kohlensäure entspricht, in weniger als vier Jahren von den Pflanzen assimiliert wird. Jedenfalls besteht kein Zweifel darüber, daß die Kohlensäuremenge in der Atmosphäre relativ klein ist und daß dieser Vorrat bei gleichbleibender Intensität der Photosynthese, wie sie heute beobachtet wird, nicht lange reichen würde. Etwa die Hälfte der zur Verfügung stehenden Kohlensäure wird zum Aufbau von Holz benutzt, d. h. etwa 50% des von den Pflanzen assimilierten Kohlenstoffs wird in Form von Holz gebunden. Diese Angaben geben nun Aufschluß darüber, warum sich der Forschergeist bereits seit hundert Jahren mit der Frage beschäftigt, auf welche Weise dieser Kohlenstoff der Atmosphäre wieder als C0 2 zugeführt wird. Schon im vorigen Jahrhundert wurde festgestellt, daß die durch die Lebenstätigkeit der Organismen auf der Erde, d. h. durch die Atmung der Pflanzen, Tiere und Menschen, in die Atmosphäre gelangende Kohlensäuremenge verschwindend klein ist im Vergleich zu der während der Photosynthese assimilierten. Weder die vulkanische Tätigkeit, bei der geringe Mengen Kohlensäure in die Luft entweichen, noch die Bildung von Kohlensäure durch die Verbrennung erheblicher Mengen von Brennstoffen in der Industrie ändern irgend etwas an dieser Bilanz. Durch alle aufgeführten Vorgänge werden nicht mehr als 10% der wieder in die Atmosphäre gelangenden Kohlensäure gebildet. Bereits lange, bevor man die Fähigkeit der Mikroorganismen zur Zersetzung der Cellulose erkannt hatte, wurde festgestellt, daß der Boden in irgendeiner Weise lebt, daß er atmet und viel Kohlensäure abgibt. Die Atmung des „Bodens" liefert die fehlenden 90% der in die Atmosphäre zurückkehrenden Kohlensäure. Ein Viertel dieser Kohlensäuremenge stammt aus der Atmung der Wurzeln, die restlichen drei Viertel sind auf die Tätigkeit der Mikroflora des Bodens zurückzuführen. Die Zersetzung der Cellulose und ihre Oxydation zu Kohlensäure erfolgt im wesentlichen durch Mikroorganismen. Sie spielen die Hauptrolle in dem großartigen Prozeß der Zersetzung von Pflanzenresten, der zur Auffüllung des Kohlensäurevorrates in der Atmosphäre führt. In diesem Vorgang ist die größte Kohlensäurequelle zu sehen, die nach einem bildlichen Vergleich von S. P. KoSTYTSCHEW „das Betriebskapital des atmosphärischen Kohlenstoffs" darstellt. Man muß sich einmal die Massen an Pflanzenresten vorstellen, die alljährlich beim Absterben von einjährigen Pflanzen in den Boden gelangen, die in den Wäldern als Streu herabfallen und die in den Gewässern beim Absterben von Wasserpflanzen zu Boden sinken, um eine Vorstellung von der Größe dieses Prozesses zu erhalten. Die Zersetzung der in größter Menge vorhandenen Kohlenstoffverbindung, der Cellulose, findet in einem derartigen Ausmaß statt, daß man diesen Prozeß mit Recht als den Hauptbestandteil des Kohlenstoffkr'eislaufes bezeichnen kann. Am Zustandekommen dieses Kreislaufes auf der Erdoberfläche sind sowohl Mikroben als auch geologische Faktoren beteiligt. Bezeichnet man die Photosynthese der höheren

Einleitung

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Pflanzen als den grundlegenden Vorgang, der mit der Aufnahme von Kohlensäure verbunden ist (die heterotrophen und chemosynthetischen Mikroorganismen verbrauchen nur sehr wenig Kohlensäure), so ist die Oxydation der Cellulose durch Mikroorganismen zu C0 2 für den Kohlenstoffkreislauf nicht weniger wichtig, da auf diese Weise die zur Photosynthese benötigte Menge an Kohlensäure der Atmosphäre wieder zugeführt wird. Die größte Bedeutung besitzt dabei die Zersetzung der Cellulose durch Mikroorganismen. Diese Umwandlungen sind jedoch nicht nur für den Kohlenstoffkreislauf von Wichtigkeit. Obwohl das Problem der Humusbildung nicht erwähnt worden ist, kann kein Zweifel darüber herrschen, daß die Zersetzung der Cellulose im Boden mehr oder weniger mit der Humusentstehung und möglicherweise auch mit der Ausbildung der Bodenstruktur zusammenhängt. Deshalb hat die Zersetzung der Cellulose durch Mikroorganismen auch stets eine entsprechende Beachtung der Bodenkundler und Agrochemiker gefunden. Schließlich muß noch erwähnt werden, daß die Cellulose einer der am häufigsten vom Menschen benutzten Stoffe ist. Papier, Textilien, Fischfanggeräte, Baumaterialien usw. werden leicht von Mikroorganismen zerstört, wodurch große wirtschaftliche Verluste entstehen. Eine der wichtigsten praktischen Aufgaben der heutigen Mikrobiologie und Technik besteht also darin, die cellulosehaltigen Stoffe vor einem biologischen Angriff zu schützen. Beim Betrachten dieser Gesichtspunkte wird verständlich, warum W. L. OMELJANSKI die Zerstörung der Cellulose durch Mikroorganismen „beinahe den großartigsten unter allen natürlichen Vorgängen" nannte. Es wurde bereits erwähnt, daß die Synthese der Cellulose im wesentlichen von höheren Pflanzen durchgeführt wird. Andererseits ist ihre Zerstörung bzw. der Abbau mit der Tätigkeit niederer pflanzlicher Organismen verbunden. Die höheren Pflanzen enthalten im allgemeinen keine Fermente, die zur Zersetzung von Cellulose befähigt sind. Die gegen die verschiedensten physikalischen und chemischen Angriffe ungewöhnlich beständige Cellulose wird relativ leicht unter dem Einfluß des Ferments Cellulase hydrolysiert, so daß lediglich solche Zellen an der Zersetzung der Cellulose beteiligt sein können, die zur Bildung dieses Ferments befähigt sind. Naturgemäß konnte das Vermögen zur Cellulasebildung nur dann entstehen, wenn der Organismus an der Ausnutzung der Cellulose als Kohlenstoff- oder Energiequelle interessiert war. Von der Anwesenheit des einen oder anderen Fermentes hängen die ökologischen Eigenarten des Organismus ab, d. h. die Ansprüche, die er an das Medium stellt. Anscheinend haben die meisten niederen Organismen erst spät die Fähigkeit zur Bildung von Cellulase und zur Zersetzung der Cellulose erlangt, nachdem sich bereits die Pflanzen entwickelt hatten, deren Zellwände aus Cellulose bestehen. Die Verbreitung der Cellulase in der Tier- und Pflanzenwelt ist sehr eigenartig. Die höheren Tiere und der Mensch sind nicht in der Lage, Cellulase zu erzeugen. Sie ist weder im Blut noch in der Lymphe noch im Sekret der verschiedenen Drüsen der Tiere und des Menschen enthalten. Besonders auffällig ist auch das Fehlen der Cellulase bei den Wiederkäuern, deren Hauptnahrungsmittel sehr viel Cellulose enthalten. i*

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Einleitung

Daß trotzdem eine gute Ausnutzung dieser Nahrung erfolgt, ist auf die intensive Vermehrung der cellulosezersetzenden Mikroorganismen in ihrem Darm zurückzuführen. Diese Frage wird jedoch in dem Abschnitt über die Symbiose von Cellulosebakterien mit höheren und niederen Tieren und Pflanzen ausführlicher behandelt. Aber auch bei den niederen Lebewesen kommt die Cellulase relativ selten vor. Der Nachweis der Befähigung zur Cellulasebildung bei den verschiedenen Wirbellosen ist sehr schwer zu führen, da sich im Darm dieser Organismen häufig symbiotische Bakterien ansiedeln, die Cellulase erzeugen. Die in dieser Richtung von den Zoologen durchgeführten Arbeiten enthalten nicht immer sehr überzeugende Angaben, da die Möglichkeit nicht ausgeschlossen ist, daß die Verdauung der Cellulose über spezielle, im Darm der Tiere lebende Mikroorganismen erfolgt, die die Cellulose hydrolysieren. Daraus folgt, daß die Tiere nur diese Abbauprodukte verwerten können. In vielen Fällen konnte jedoch der Nachweis geführt werden, daß einige niedere Tiere das Ferment Cellulase erzeugen. Wie zu erwarten, tritt die Cellulase bei Lebewesen auf, die sich von Holz, Blättern und Nadeln ernähren, d. h. von Stoffen, die erhebliche Mengen Cellulose enthalten. So wurde festgestellt, daß im Darm der Mollusken Teredo und Bankia Cellulase vorhanden ist, die im Schleim des Verdauungstraktes dieser Tiere erzeugt wird. Die Notwendigkeit der Anwesenheit eines hydrolysierenden Ferments beim Holzwurm läßt sich leicht durch seine Lebensweise erklären: Holz ist seine einzige Nahrung. Sehr eingehend ist ein im Darm der Weinbergschnecke anwesendes, die Cellulose hydrolysierendes Ferment untersucht worden. Bei den verschiedenen Protisten dagegen ist die Cellulase sehr verbreitet. Es sind bereits viele Beobachtungen gemacht worden, die die Tatsache bestätigen, daß viele einzellige Organismen die Befähigung zur Cellulosezersetzung besitzen. Einige von ihnen, z. B. Vampyrella, lösen die Zellwände von Wasserpflanzen auf und nehmen den Zellinhalt als Nahrung auf. Viel häufiger leben die Protisten jedoch im Darm von holzfressenden Insekten oder in deren Larven. So ist z. B. eine ganze Reihe von Protisten aus dem Darm von Termiten, aus den Larven verschiedener Käfer usw. isoliert worden. Aus Reinkulturen derartiger Protisten kann man Enzympräparate gewinnen, die eine Hydrolyse der Cellulose bewirken. Darin ist wohl der beste Beweis für die Fähigkeit dieser Einzeller zur Bildung von Cellulase zu erblicken. Im Zusammenhang mit den Pflanzen ist bereits erwähnt worden, daß die höheren Pflanzen keine Cellulase bilden können. Allerdings gibt es Hinweise, daß die Samen einer Reihe von Pflanzen beim Keimen einen Stoff erzeugen, der die Samenschale hydrolysiert. In den meisten Fällen handelt es sich dabei jedoch um die Hydrolyse verschiedener Hemicellulosen und nicht um die der Cellulose. Obwohl einerseits die völlige Ablehnung der Cellulasebildung in keimenden Samen jeder Grundlage entbehrt, ist dieser Vorgang andererseits doch längst nicht so verbreitet, und das Ferment besitzt keine große Aktivität. Daneben gibt es aber hinreichend viele niedere Pflanzen, die Cellulase bilden. Es sei hier auf die verschiedensten Pilze, Actinomyceten und Bakterien aufmerksam

Einleitung

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gemacht, die Holz und Cellulose abbauen. Die bereits erwähnten Protisten und Wirbellosen spielen natürlich eine unbedeutendere Rolle bei der Cellulosezersetzung als die Pilze, Actinomyceten und Bakterien. Die im Erdboden vorhandenen Bakterien und Pilze sind die Hauptursachen für die Hydrolyse der Cellulose und die anschließende Oxydation der Abbauprodukte zu Kohlensäure und damit für die Zuführung von großen Mengen der letzteren in die Atmosphäre. Bereits lange, bevor die Mikrobiologie als Wissenschaft entstanden war, kannten die Agronomen die Tätigkeit der Mikroorganismen. In alten Handbüchern der Bodenkunde sind Hinweise auf die zur Zersetzung der Cellulose im Boden notwendigen Vorbedingungen zu finden. Daraus ist zu ersehen, daß sich der Mensch in seiner praktischen Tätigkeit schon lange um die Regulierung des Zersetzungevorgangs der Cellulose bemüht hat, um die Ergiebigkeit des Bodens zu steigern. "*" Die Mikrobiologie der Cellulose als Wissenschaft ist jedoch nicht aus der Erforschung der Cellulosezersetzung im Boden unter aeroben Bedingungen entstanden, sondern ist in ihrem Ursprung mit der Aufklärung der anaeroben Zersetzung verbunden. Der Grund hierfür liegt offenbar darin, daß in der zweiten Hälfte des vorigen Jahrhunderts die mannigfaltigen Gärungsprozesse die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler besonders auf sich zogen. Im Zusammenhang mit den Arbeiten von L. PASTEUR haben sich viele Forscher mit der Zersetzung der verschiedensten organischen Stoffe unter anaeroben Bedingungen beschäftigt. Als erster hat POPOW 1875 Untersuchungen über die anaerobe Zersetzung der Cellulose durchgeführt. Er brachte Schlamm und' Filtrierpapier in einen Zylinder mit einem flüssigen Nährmedium und beobachtete eine allmähliche Zersetzung der Cellulose unter Gasbildung. Die Bedeutung dieser Arbeit liegt darin, daß in ihr zum erstenmal die Möglichkeit einer biologischen Zersetzung der Cellulose bewiesen worden ist. Diese Tatsache ist allgemein anerkannt worden. Der Priorität POPOWS bezüglich der Entdeckung des anaeroben Celluloseabbaus wurde ein Aufsatz von I. L. RABOTNOWA (1949) gewidmet. Ende des vorigen Jahrhunderts verbreitete sich die Auffassung von S. N. WiNOGRADSKI (1952) über die ökologische Bedeutung der elektiven Nährmedien. Optimale Bedingungen für die Entwicklung der Funktionen eines bestimmten Mikroorganismus hat WlNOGRADSKI bekanntlich durch entsprechende Zusammensetzung des Nährmediums erreicht, womit er das Wachstum anderer Mikroorganismen begrenzte und die Entwicklung des in Betracht kommenden Erregers förderte. Die glänzenden Untersuchungen WlNOGRADSKls über die Stickstoffbakterien haben die Richtigkeit seiner Arbeitshypothese erwiesen. Sein Schüler OMELIANSKI (1895, 1897, 1902, 1904) bzw. OMELJANSKI (1901) machte diese Hypothese später zur Grundlage seiner Untersuchungen und benutzte als erster elektive Nährmedien zur Herstellung von Kulturen anaerober Cellulosebakterien. Zu diesem Zweck verwendete er Nährmedien, die keine andere Kohlenstoffquelle als Cellulose enthielten. OMELJANSKI beimpfte einen Zylinder, der neben einem Filtrierpapierstreifen synthetisches Nährmedium enthielt, mit Flußschlamm und beobachtete eine Gärung der Cellulose. Auf diese Weise erhielt er elektive Kulturen eines anaeroben sporenbildenden Stäbchens, das die Cellulose zersetzt hatte.

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Einleitung

Das Medium von OMELJANSKI wird allgemein benutzt, und seine inzwischen klassisch gewordenen Arbeiten werden in allen in den verschiedensten Sprachen erschienenen Handbüchern der Mikrobiologie beschrieben. Zwanzig Jahre nach Veröffentlichung der Arbeiten von OMELJANSKI erschien eine Reihe von Untersuchungsergebnissen, in denen über die Isolierung einer großen Anzahl von Bakterien berichtet wurde, die Cellulose unter aeroben Bedingungen zersetzen (KELLERMAN und McBETH, 1912;

KELLERMAN, McBETH,

SCALES

und SMITH, 1913/14). Diese Autoren benutzten erstmalig Cellulose-Agar zur Herstellung der Kulturen. Sie sind der Ansicht, daß dieses Nährsubstrat ein elektives Medium für aerobe Cellulosebakterien darstellt. Vorstehend zitierte Arbeiten lösten später eine lebhafte Diskussion aus, da sich bei der Prüfung der beschriebenen Mikroorganismen auf ihre Befähigung zur Cellulosezersetzung ergeben hatte, daß dieses Polysaccharid nicht zerstört wird. Möglicherweise hängen diese Widersprüche mit der Isolierung der Kulturen auf Cellulose-Agar zusammen, das nämlich gefällte, also veränderte Cellulose enthält, so daß eine Auswahl von Formen erfolgt, die gegenüber normaler Cellulose weniger aktiv sind. Diese Erklärung wird zum Teil dadurch bestätigt, daß z. B. Hydratcellulose von Cellulase leicht zerstört wird. Andererseits sind Hinweise dafür vorhanden, daß einige Formen von Cellulosebakterien die Cellulose aus dem Grunde nicht angreifen können, weil sie für ihre Entwicklung und ihr Wachstum statt des erforderlichen organischen Stickstoffs nur anorganisch gebundenen zur Verfügung hatten. Enthält das Nährmedium organischen Stickstoff, so sind sie durchaus in der Lage, Cellulose abzubauen. Zweifellos gehören jedoch viele in diesen Untersuchungen beschriebene Formen nicht zu den Cellulosebakterien. Wenn einige von ihnen auch Cellulose zersetzt haben, so sind sie doch nicht mit den Formen identisch, die später wiederholt von den verschiedensten Forschern isoliert worden sind und die, wie spätere Arbeiten ergeben haben, zu den in der Natur weitverbreiteten Cellulosebakterien gehören. Der nächste Abschnitt in der Entwicklung unserer Vorstellungen über die cellulosezersetzenden Mikroorganismen ist ebenfalls mit Untersuchungen von WlNOGRADSKl (1952) verbunden, in denen elektive Medien zur Isolierung aerober Cellulosebakterien verwendet wurden. Er benutzte Platten aus Kieselsäuregel mit aufgelegten Rundfiltern und ein nur Mineralsalze enthaltendes Nährmedium. Auf diese Weise konnte WlNOGRADSKl eine ganze Reihe von Organismen mit vielen neuen Formen isolieren. Ausführlich ist von ihm die Biologie der cellulosezersetzenden Vibrionen und Cytophagen untersucht worden. Der Autor hat sich ferner Vorstellungen über den Chemismus des Celluloseabbaus gemacht. Mit Hilfe der von OMELIANSKI (1895, 1897,1902,1904), OMELJANSKI (1901) und WlNOGRADSKl (1952) zur Isolierung von aeroben und anaeroben Cellulosebakterien vorgeschlagenen elektiven Nährmedien haben viele Mikrobiologen versucht, die Rolle der Cellulosebakterien im Kohlenstoffkreislauf aufzuklären und ihre Verbreitung zu erforschen. Durch die Arbeiten sowjetischer Mikrobiologen ist die weite Verbreitung sowohl der aeroben als auch der anaeroben Cellulosebakterien in der Natur, insbesondere auch im Boden der Arktis und auf dem Grunde von Meeren

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und anderen Gewässern, festgestellt worden. Sie kommen ebenfalls im Wasser der verschiedenen Meere vor [ISSATSCHENKO (1914), MALIJANZ (1933), KRISS (1945)].

Mehrere Böden der Sowjetunion haben TEPLJAKOWA (1950), SLAWNINA (1938) und PRONINA (1952) untersucht.

Unsere Kenntnisse über die Biologie der Erreger der Cellulosezersetzung, insbesondere über ihre Physiologie und Biochemie, waren jedoch noch sehr unvollkommen, da die Methoden zur Züchtung von Cellulosebakterien in Reinkultur noch kaum ausgearbeitet waren. Infolgedessen ist auch der Chemismus der aeroben und anaeroben Cellulosezersetzung nur sehr unzulänglich erforscht worden. Die Aufklärung eines Spezialfalles der Cellulosezersetzung in Mischkultur hat wenig zu unseren Kenntnissen über den Stoffwechsel der Cellulosebakterien beigetragen. Die nächste Entwicklungsstufe in der Geschichte der Mikrobiologie der Cellulose ist mit der Erforschung der systematischen Stellung der häufigsten Cellulosebakterien verbunden. Nach Untersuchungen von IMSCHENEZKI und SOLNZEWA (1936, 1937) können auch Myxobakterien Cellulose unter aeroben Bedingungen zersetzen. Durch Ausarbeitung entsprechender Methoden gelang es, Reinkulturen zu züchten und die systematischen Beziehungen festzulegen. Es konnte ferner nachgewiesen werden, daß die Cellulosemyxobakterien die gleichen biologischen Eigenschaften besitzen wie die Vertreter der Reihe Myxobacteriales. Sie unterscheiden sich von diesen nur durch ihre Befähigung zur Cellulosezersetzung. Weiter konnte festgestellt werden, daß viele Bakterien, deren systematische Stellung noch ungeklärt war, wie z. B. Gytophaga, tatsächlich den Myxobakterien angehören. Diese Beobachtungen sind später von KRZEMXENIEWSKA und KRZEMIENIEWSKI (1937), KRZEMIENIEWSKI

(1937), MISCHUSTIN (1938),

STANIER

(1942), FÄHRAEUS (1941/42, 1944/45), HARMSEN (1946) und anderen bestätigt und ergänzt worden. Mit zunehmender Verbesserung der Methoden zur Isolierung von Reinkulturen der Cellulosebakterien haben sich auch unsere Kenntnisse über die Biochemie der Cellulosezersetzung vermehrt. Nach Angaben von IMSCHENEZKI (1938, 1939, 1940) findet in Reinkulturen von anaeroben, thermophilen Cellulosebakterien eine intensive Hydrolyse der Cellulose statt, wobei erhebliche Mengen von Glucose auftreten. Die Anwesenheit von Glucose dient als Beweis für die Reinheit der Kultur, da jene in Mischkulturen von den begleitenden Mikroorganismen ständig verbraucht wird. Dabei werden die Produkte der Cellulosehydrolyse unter Bildung von verschiedenen Säuren und Alkohol vergoren. Wesentlich schwieriger war der Nachweis der Cellulosehydrolyse in Kulturen aerober Cellulosebakterien zu bringen. Aber auch hier wurde die Anzahl der Beobachtungen immer größer, nach denen die Zersetzung der Cellulose unter aeroben Bedingungen ebenso mit einer Hydrolyse beginnt wie unter anaeroben' Verhältnissen. Neben der Anwesenheit von Glucose und Cellobiose in den Kulturen der aeroben Bakterien wiesen auch die Ergebnisse anderer Untersuchungen auf einen derartigen Verlauf der Cellulosezersetzung hin. Zum Beispiel wurden zur Verzuckerung der Cellulose zellfreie Fermentpräparate aus aeroben Cellulosebakterien benutzt (FÄHRAEUS, 1944/45, 1946).

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Einleitung

Die Untersuchungen über die Biochemie des Celluloseabbaus sind jedoch noch nicht abgeschlossen, und es gibt noch viele Fragen, die einer Klärung bedürfen. Aber auch die bereits vorhandenen Resultate ermöglichen jetzt bessere Erklärungen für einige Erscheinungen, deren Wesen früher nicht ganz klar war. Insbesondere trifft das für die Symbiose zu, die zwischen den Cellulosebakterien einerseits und den verschiedensten Mikroorganismen, aber auch höheren und niederen Tieren und Pflanzen andererseits beobachtet wird. Diese symbiotischen Beziehungen waren zwar bekannt, aber erst nach der Züchtung von Reinkulturen der aeroben und anaeroben Cellulosebakterien und der Erforschung der einzelnen Stufen des biochemischen Celluloseabbaus wurde es möglich, den der Symbiose zugrunde liegenden Mechanismus zu erkennen. Die ältere Vorstellung von der Existenz metabiotischer Beziehungen zwischen den Cellulosebakterien und anderen Mikroben wird allmählich durch eine neuere verdrängt, nach der diese Beziehungen den Charakter einer echten, auf gegenseitigem Nutzen begründeten Symbiose besitzen. Derartige Beziehungen kommen bei den Mikroben nicht weniger häufig vor als z. B. die Erscheinung des Antagonismus. Die letztere fällt aber stärker ins Auge und ist der Untersuchung leichter zugänglich als die symbiotischen Beziehungen, zu deren Aufklärung eine genaue Kenntnis der Physiologie der einzelnen Symbiosepartner erforderlich ist.

I. AEROBE CELLULOSEBAKTERIEN A. Untersuchungsmethoden Etwas schematisch lassen sich, die Erreger der verschiedenen mikrobiologischen Umwandlungen organischer Stoffe in zwei Gruppen einteilen. Zur ersten Gruppe gehören die Bakterien, die für die Hydrolyse der Stärke, den Abbau von Eiweiß; die Zersetzung von Harnstoff usw. verantwortlich sind. Sie lassen sich leicht in Reinkulturen züchten. Die zweite Gruppe vereinigt die Bakterien, deren Reinzüchtung stets als eine der schwierigsten Aufgaben der Mikrobiologie angesehen worden ist. Dazu gehören die Stickstoff-, Schwefel- und Cellulosebakterien. Die Bedeutung der Verfahren, mit deren Hilfe man zunächst angereicherte und schließlich Reinkulturen von Cellulosebakterien züchten kann, darf keineswegs unterschätzt werden. Inder Geschichte der Cellulosebakterien lassen sich viele Beispiele dafür anführen, daß die Anwendung unvollkommener Verfahren die Forscher zu Trugschlüssen verleitet hat. Widersprüche hinsichtlich einiger physiologischer Besonderheiten der Cellulosebakterien, die sich im Laufe der Jahre ergeben hatten, klärten sich sofort auf, wenn methodische Fehler abgestellt wurden. Aus einer Übersicht über die Literatur sowie aus eigenen Versuchen kann geschlossen werden, daß die genaue und vollständige Bestimmung der biologischen Eigenschaften von Mikroorganismen, die aus dem Boden oder anderen natürlichen Substraten isoliert wurden, mit der Untersuchungsmethodik steht und fällt. Gewöhnlich arbeitet jeder Forscher nach irgendeinem besonderen Verfahren zur Isolierung der Bakterien, womit er natürlich nur eine bestimmte Gruppe von Cellulosebakterien isolieren kann. In ökologischer Hinsicht sind die celluloseangreifenden Myxo- und Mykobakterien sehr unterschiedlich. Dasselbe gilt auch für die entsprechenden sporenbildenden Bazillen und die Vibrionen. Bei Verwendung nur eines Nährmediums und nur unter ganz bestimmten Züchtungsbedingungen besteht die Möglichkeit, daß sich vorwiegend eine der verschiedenen Gruppen entwickelt. Bei Verwendung von Kieselsäuregel mit Filtrierpapier — eine Methode, die WlNOGRADSKI (1952) vorgeschlagen hat — ist im allgemeinen die Kultivierung der celluloseangreifenden sporenbildenden Bazillen und Mycobakterien schlecht möglich. Diese Mikroorganismen können jedoch mit Hilfe von Cellulose-Agar aus dem Boden isoliert werden. Am Ende dieser kurzen Vorbemerkungen sei nochmals auf die Bedeutung der Untersuchungsmethodik bei der Erforschung der Mikrobiologie der Cellulose hingewiesen.

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I. Aerobe Cellulosebakterien 1. Chemie der Cellulose

In den letzten Jahren sind beachtliche Ergebnisse in der Erforschung der hochpolymeren Verbindungen, darunter auch auf dem Gebiet der Cellulose, erzielt worden. Unsere Kenntnisse über den Aufbau, das Molekulargewicht und die Darstellungsverfahren von Celluloseverbindungen sind durch viele neue Angaben erweitert worden. Diese verdanken wir der Anwendung subtiler Untersuchungsmethoden: Elektronenmikroskopie, Verwendung von Ultrazentrifugen usw. Eine ausführliche Darstellung der neuesten Ergebnisse der Cellulosechemie findet s i c h i n d e n M o n o g r a p h i e n v o n SCHORYGIN (1939), ROGOWIN ( 1 9 4 5 ) , H E S S ( 1 9 2 8 )

u. a. Trotzdem ist es zweckmäßig, hier einige Tatsachen aus diesem Forschungsgebiet anzuführen, da sie zum Verständnis der mit der Zersetzung der Cellulose durch Mikroben zusammenhängenden Fragen erforderlich sind. Zunächst muß der Aufbau der Cellulose im Hinblick auf die Zellengröße der Cellulosebakterien betrachtet werden. Als Struktureinheit der Cellulose ist die Fibrille anzusehen, die etwa 80 bis 150 A breit ist. Wie sich aus neuesten elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergeben hat, beträgt die Breite des Cellulosemoleküls 4,5 A. Dieses Molekül besteht aus Glucoseresten, die in Form einer Kette angeordnet sind. Die untere Grenze für die Anzahl der Glucosereste im Cellulosemolekül liegt bei etwa 100 bis 200. Einige Autoren lehnen die Auffassung einer ununterbrochenen Kette ab und nehmen an, daß nach jeweils 25 bis 30 Glucoseresten Störstellen vorhanden sind. Naturgemäß kann man mit Hilfe optischer Methoden lediglich die Breite der Fibrillen bestimmen; ihre Länge beträgt 10 bis 15000 Ä. Natürliche Cellulosefasern (Baumwolle, Faserpflanzen) liegen in Form von Fibrillenbündeln vor, die alle gleichmäßig in der Faserlängsrichtung orientiert sind. Dagegen ist dieser Ordnungsgrad in verholzten pflanzlichen Zellwänden sehr unvollkommen. Heute besteht kein Zweifel darüber, daß die Makromoleküle der Cellulose eine bestimmte Anzahl Carboxylgruppen enthalten. In der Baumwollcellulose entfällt auf etwa 600 Glucosereste eine Carboxylgruppe. Bisweilen werden Cellulosen verschiedener Herkunft durch die Anzahl der im Molekül vorhandenen Carboxylgruppen charakterisiert. So enthält z. B. Cellulose aus Kiefernholz 11, Cellulose aus Weizenstroh dagegen nur 9 Carboxylgruppen im Molekül. Die elementare Struktureinheit ist nicht das individuelle kettenförmige Cellulosemolekül, sondern das als Fibrille bezeichnete Molekülbündel, dessen Breite um ein vielfaches geringer ist als die Breite der Bakterienzellen. Daraus folgt, daß jede Bakterienzelle, z. B. ein auf der Cellulosefaser lebender Vibrio, dicht an den einzelnen Fibrillen anliegt und auf diese durch die ausgeschiedenen Fermente einwirkt. Eine noch engere Wechselwirkung zwischen den Fibrillen und den Zellen der Mikroorganismen ist bei anderen Mikroben, z. B. den Actinomyceten, vorhanden. Das Mycel der Actinomyceten ist manchmal so klein, daß es der Breite des Cellulose-

A. Untersuchungsmethoden

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moleküls gleichkommt. Folglich ist in diesem Falle ein besonders enger Eontakt zwischen der Cellulose und der Myceloberfläche gegeben. Lediglich Baumwollcellulose stellt ein reines „Glucosepolysaccharid" dar; die meisten anderen Pflanzen enthalten zwar auch eine der Baumwolle entsprechende Cellulose, die jedoch stets mit kurzkettigen Stoffen verbunden ist. Dazu gehören in erster Linie die Hemicellulosen, insbesondere Xylan, das in Mengen bis zu 25% vorkommt; bei den Angiospermen findet sich außerdem Mannan. Die Ketten dieser Verbindungen sind in der gleichen Richtung wie die der Cellulose orientiert; sie sind jedoch wesentlich kürzer als letztere. Die Hemicellulosen werden durch verdünnte Säuren leicht hydrolysiert und lassen sich mit Alkalien extrahieren. Filtrierpapier besteht aus Holzcellulose, die in der eben erwähnten Weise behandelt worden ist; es kann deshalb kaum als typische Cellulose angesprochen werden. Die Anwesenheit von Hemicellulosen erklärt die Tatsache, daß viele eng spezialisierte Cellulosebakterien nicht nur Cellulase produzieren, sondern auch Fermente, die Hemicellulosen angreifen. Es ist allgemein bekannt, daß die Gewebe junger Pflanzen leichter von den Mikroorganismen angegriffen werden als solche von älteren. Man könnte geneigt sein, diese Tatsache durch einen anderen Aufbau der Cellulose in den jungen Pflanzen zu erklären. Auf röntgenographischem Wege findet man aber, daß selbst in den jüngsten Fasern bezüglich der Cellulose das gleiche Strukturprinzip herrscht wie in den älteren. Die leichtere Zersetzbarkeit der Gewebe junger Pflanzen unter natürlichen Bedingungen kann auch nicht damit erklärt werden, daß die Bildung der Cellulose durch schrittweise Eondensation erfolgt, da man niemals, auch nicht in den jüngsten Geweben, niedermolekulare Oligosaccharide gefunden hat. Die gesamten Versuchsergebnisse der organischen Chemie beweisen, daß die Cellulose durch Polymerisation entsteht. Die Analyse junger Pflanzengewebe zeigt, daß sie bis zu 60% an Pectinstoffen und nur 5 bis 7% Cellulose enthalten. Wenn das Wachstum beendet ist, sinkt der Anteil an Pectinstoffen auf 6 bis 8%. Im Zusammenhang damit ist die Ansicht geäußert worden, daß die Synthese der Cellulose mit einer Reduktion der Carboxylgruppen der Polyuronsäuren verbunden ist. In diesem Falle wäre das Pectin als Primärprodukt zu betrachten; die Cellulose würde sich dann erst auf Grund sekundärer Prozesse bilden. Ferner bilden die Pectinstoffe mit der Cellulose keinen Eomplex, sondern liegen in Form von Salzen vor. Die größere Beständigkeit älterer Zellwände hängt offenbar mit der Bildung erheblicher Mengen an Lignin zusammen, dessen Anwesenheit nach heutiger Auffassung die Zersetzung der Cellulose durch Cellulosebakterien mehr oder weniger erschwert. Für den Mikrobiologen, der die Zersetzung der Cellulose durch Mikroorganismen untersucht, ist die Hydrolyse der Cellulose von großem Interesse. Wie aus dem Folgenden hervorgeht, bewirken alle Cellulosemikroorganismen eine Hydrolyse. Dieser Vorgang ist sowohl für die Aufklärung der zwischen den Mikroben existierenden symbiotiscben Beziehungen als auch für die Bildung praktisch verwendbarer Produkte bei der Cellulosegärung von großer Bedeutung. Bekanntlich besitzt die Cellulose keine reduzierenden Eigenschaften, was entweder auf die große Eettenlänge oder eine Modifizierung der Endgruppen, z. B. durch

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Oxydation zu Carboxylgruppen, zurückzuführen ist. Bei der Hydrolyse der Cellulose entstellen „hydrolytische Fragmente", d. h. Cellodextrine, die noch relativ schlecht erforscht sind. Die Kettenlänge der Cellulose kann sich bereits durch eine relativ milde Behandlung ändern; der Bruch der Kette erfolgt an den Störstellen. Nach heutiger Auffassung besteht die Cellulose nicht aus einzelnen Kristalliten oder Micellen, die definierte Oberflächen und bestimmte Abmessungen besitzen. Viele Forscher nehmen an, daß die Cellulose bei normaler Temperatur in amorphem Zustand vorliegt. Einige weisen jedoch darauf hin, daß sich die native Cellulose nicht im Gleichgewichtszustand befindet, d. h. geordnet bzw. kristallin ist. Gewöhnlich findet man in Präparaten sowohl von umgefällter als auch von nativer Cellulose einen unterschiedlichen Orientierungsgrad der Makromoleküle, d. h. es existieren kristalline (orientierte) und amorphe Bereiche. Die physikalisch-mechanischen Eigenschaften der Cellulosefasern hängen natürlich vom Orientierungsgrad der Moleküle ab. In gewöhnlicher Baumwollcellulose beträgt allerdings der amorphe Anteil nicht mehr als 1 bis 2%. Untersuchungen über die Hydrolyse der Cellulose mittels Mineralsäuren haben Resultate geliefert, die für- die Biochemie und Mikrobiologie der Cellulose sehr interessant sind. So wurde z. B. gezeigt, daß bei Behandlung der Cellulose mit Salzsäure bei 100° C in einigen Fällen das Polysaccharid nicht vollständig zu Glucose hydrolysiert wird, sondern ein weißes Pulver zurückbleibt. Daraus folgt, daß nur eine bestimmte Menge der Cellulose eine Hydrolyse erleidet, denn das resultierende Pulver zeigt das Röntgendiagramm der ursprünglichen Cellulose. Es besteht also offenbar aus unveränderter Cellulose. Theoretisch läßt sich diese Erscheinung folgendermaßen erklären: Der amorphe (nichtorientierte) und infolgedessen leichter angreifbare Anteil wird hydrolysiert, während der kristalline (orientierte) Teil entweder nicht vollständig oder nur sehr langsam abgebaut wird. Nach Ansicht von ROGOWIN (1945) ist diese Deutung jedoch nicht richtig, da man kaum annehmen kann, daß der kristalline Anteil, der die gleiche chemische Zusammensetzung wie der amorphe besitzt und der für die hydrolysierenden Agenzien ebenfalls zugänglich ist, nicht hydrolysiert wird, d. h. beständiger ist. Nach ROGOWIN ist eine gewisse Anzahl von Bindungen anzunehmen, die leichter als die /9-glucosidischen Bindungen hydrolysiert werden. Die in der Mikrobiologie erhaltenen Resultate stimmen mit den zitierten Beobachtungen vollkommen überein. So wird z. B. die Hydrolyse der Cellulose durch thermophile anaerobe Bakterien in der Weise geleitet, daß sich im Nährmedium erhebliche Mengen von Glucose ansammeln. Ein Teil der Cellulose jedoch, der von den Bakterien nicht angegriffen worden ist, bleibt unverändert zurück und besitzt noch völlig die ursprüngliche Struktur. Die Hydrolyse durch Säuren und Fermente bewirkt die gleichen Veränderungen an der Cellulose. Die mit der Hydrolyse der Cellulose und mit der chemischen Natur ihrer Derivate zusammenhängenden Fragen besitzen enge Beziehungen zur Methodik der Herstellung von Nährmedien für Cellulosebakterien. Im folgenden Abschnitt werden

A Untersuchungsmethoden

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die Verfahren zur Herstellung von Nährsubstraten ausführlich beschrieben. Deshalb soll hier noch kurz auf diejenigen chemischen Veränderungen hingewiesen werden, die die Cellulose bei der Herstellung von Nährmedien für Cellulosebakterien erleidet. Bei Verwendung von flüssigen Nährmedien oder Medien mit Kieselsäuregel und Filtrierpapier liegen relativ reine Cellulosepräparate vor, die kaum verändert und nachträglich nicht verunreinigt wurden. Zur Herstellung von Cellulose-Agar wird die Cellulose bei den verschiedenen Verfahren unterschiedlich behandelt. Bisweilen wird sie durch Naßverreiben im Mörser zerkleinert. In dem so entstandenen Brei liegt die Cellulose unverändert vor. Man kann sie andererseits auch in einer Kolloidmühle mahlen, um die Kristallstruktur, die Größe und Form der Teilchen und andere Eigenschaften zu ändern. Auf diese Weise erhält man ein Cellulosepräparät, das aus einzelnen Fibrillen von etwa 100 bis 150 Ä Breite besteht. Bei einer derartigen mechanischen Behandlung wird Hydratcellulose gebildet, d. h. ein höherer Gleichgewichtszustand der Cellulose erreicht. Diese Veränderungen dürfen nicht als Folge einer Hydrolyse oder Oxydation angesehen werden, sie sind lediglich das Ergebnis einer mechanischen, zum Zerbrechen der Makromoleküle führenden Einwirkung. Daraus folgt, daß sich eine mechanisch behandelte Cellulose von der Form, wie sie z. B. im Filtrierpapier vorliegt, wesentlich unterscheidet. Eines der brauchbarsten Verfahren zur Herstellung einer homogenen Cellulosemasse, wie sie für Cellulose-Agar benötigt wird, besteht in der Auflösung der Cellulose in Kupferoxydammoniak und anschließendem Ausfällen. Dadurch erhält man eine umgefällte Cellulose mit veränderter Struktur. Die durch die Einwirkung des Reagenses entstehende Hydratcellulose ist weniger beständig als die native Cellulose; es ändert sich das Verhältnis zwischen kristallinem und amorphem Anteil. Zum Beispiel enthält aus Kupferoxydammoniak umgefällte Baumwollcellulose etwa 7,4% amorphe Anteile gegenüber 1 bis 2% in nativer Cellulose. Ferner kann man auch Cellulose in Schwefelsäure lösen und anschließend mit Wasser ausfällen. Die hierbei erhaltene Form der Cellulose ist die Hydrocellulose. Diese kann aber durch Hydrolysen' produkte verunreinigt sein, auch wenn man sorgfältig arbeitet, insbesondere beim Auswaschen der gefällten Cellulose. Bei Verwendung eines derartigen Präparates für Nährmedien ist somit das Prinzip der Elektivität nicht mehr gegeben. Wie aus dem oben gesagten hervorgeht, ist jede chemische und zu einem gewissen Grade auch mechanische Behandlung der Cellulose mit Veränderungen verbunden, die die Resistenz gegenüber einem Angriff der Bakterien herabsetzt. Dieser Umstand wird von den Mikrobiologen nicht immer genügend beachtet, so daß häufig Mikroorganismen auf Cellulose-Agar isoliert werden, die in Wirklichkeit die Cellulose gar nicht angreifen. 2. Cellulose für Nährmedien Zur Isolierung von Cellulosebakterien verwendet man Cellulose, die hinsichtlich ihres physikalischen Zustandes, ihrer Herkunft und anderer Faktoren sehr unterschiedlich sein kann.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

a) P a p i e r und Gewebe Weitaus am häufigsten wird Filtrierpapier benutzt. Als erster hat OMELIANSKI (1895,1897) Filtrierpapierstückchen zur Züchtung von anaeroben Cellulosebakterien in seinem inzwischen viel verwendeten elektiven Nährmedium angewandt. Gewöhnlich arbeitet man mit Papier in Form von aschefreien Rundfiltern oder Streifen. Besser entwickeln sich die Bakterien jedoch auf Filtrierpapierbogen als auf aschefreien Filtern. Dies hängt jedoch nicht mit dem Fehlen von Aschebestandteilen zusammen, da die Zugabe von Papierasche keine Verbesserung der Entwicklung auf aschefreien Filtern bewirkt. Die geringere Eignung dieser Filter für das Bakterien Wachstum ist wahrscheinlich auf die Behandlung während des Herstellungsprozesses zurückzuführen. Wie sich aus Versuchen von IMSCHENEZKI ergeben hat, färben sich selbst die besten Sorten von Filtrierpapier mit Jod blau. Diese Färbung hängt anscheinend mit der Anwesenheit von Amyloid im Papier zusammen. Zur Entfernung dieser Verunreinigung behandelt man das Papier mit schwacher Essigsäure und anschließend mit schwacher Sodalösung. Nach dem Trocknen kann es dann wie üblich verwendet werden. Filtrierpapier enthält oft toxische Verunreinigungen, die der Entwicklung der Cellulosebakterien hinderlich sein können. Man kann sich vom Vorhandensein derartiger Giftstoffe auf folgende Weise überzeugen. Legt man auf den in einer Petrischale befindlichen Agar-Agar-Nährboden ein Rundfilter von 9 cm Durchmesser und impft die Papieroberfläche mit einer Kultur von Cytophaga, so entwickelt sich diese meist nicht. Vermindert man jedoch die Papiermenge und damit auch den Gehalt an giftigen Verunreinigungen durch Verwendung von schmalen Papierstreifen, d. h. wird die Papiermenge auf ein Fünftel bis ein Zehntel reduziert, so wachsen die Cellulosebakterien ausgezeichnet. Zur Entfernung der schädlichen Verunreinigungen empfiehlt es sich, das Papier entweder mit schwacher Alkalilösung oder mit der gewöhnlich zur Züchtung von Cellulosebakterien benutzten Nährlösung zu behandeln. In letzterem Falle gibt man je Gramm Filtrierpapier 100 ml der Nährflüssigkeit und behandelt eine halbe Stunde im Autoklaven bei 120° C. Anschließend wird das Papier mit Wasser gewaschen und bei 50° C getrocknet. Die Natur der im Papier vorhandenen toxischen Verunreinigungen ist bisher noch nicht bekannt. Man nimmt an, daß einige Papiersorten Spuren von Flußsäure enthalten, die von der Fabrikation her im Papier verblieben sind und auf die Cellulosebakterien giftig wirken. Nach Beobachtungen von IMSCHENEZKI ist Zigarettenpapier für die Züchtung von Cellulosebakterien sehr gut geeignet. Die Wachstumsgeschwindigkeit liegt ziemlich hoch, und das Papier wird schnell völlig zerstört. Für die Kultivierung weniger geeignet ist bearbeitetes Papier, z. B. Pergament, das nur sehr langsam zersetzt wird. In letzter Zeit ist auch Watte in steigendem Maße verwendet worden. Gegenüber dem Filtrierpapier besitzt sie einige Vorteile. Zum Beispiel sinkt sie in einem flüssigen Medium nicht nach unten, sondern bleibt gewissermaßen suspendiert, wodurch die Kultivierung von aeroben Cellulosebakterien erleichtert wird.

A. Untersuchungsmethoden

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Hygroskopische Watte ist ein fast reines Cellulosepräparat, sie enthält etwa 98 bis 99,5% a-Cellulose. Baumwollwatte besteht aus 85 bis 90% a-Cellulose, der Rest setzt sich aus Pentosanen, Pectinstoffen, Wachs usw. zusammen. Es sind jedoch Hinweise darauf vorhanden, daß einige Cellulosebakterien, z. B. Vibrio, sich auf Baumwollwatte (ungereinigt) gut entwickeln, auf hygroskopischer (gereinigter) Watte aber überhaupt nicht wachsen. Über die Ursachen dieser Erscheinung ist noch nichts bekannt. Man kann nur vermuten, daß in der gereinigten Watte im Gegensatz zur ungereinigten gewisse notwendige Mikroelemente und Vitamine fehlen. Sehr erfolgreich läßt sich die Cellulose auch in Form von Baumwoll- oder Leinengewebe verwenden. Man benutzt zu diesem Zweck Perkai, Nansok, Chiffon, Batist, Baumwoll- oder Leinentücher, aber auch andere Gewebe sind brauchbar. S. N. WlNOGRADSKI (1952) empfiehlt die Anwendung von Geweben besonders dann, wenn weitere chemische Untersuchungen über den Zersetzungsprozeß der Cellulose erforderlich sind, insbesondere wenn die von den Bakterien zerstörte Cellulosemenge bestimmt werden soll. Es ist allerdings sorgfältig darauf zu achten, daß das Gewebe keine Verunreinigungen enthält, z. B. Stärke, die mit der Schlichte in den Stoff hineingelangt. Aus diesem Grunde muß das Gewebe vor dem Gebrauch entweder auf fermentativem Wege oder durch saure Hydrolyse vollständig entschlichtet werden. In der Literatur findet sich ein Hinweis, wonach sich die Mikroorganismen hinsichtlich ihrer Fermentaktivität gegenüber Cellulose verschiedenen Ursprungs unterschiedlich verhalten, so z. B. gegenüber Carboxymethylcellulose, aus 85%iger Phosphorsäure ausgefällter Cellulose, Watte usw. Aber auch bei ein und derselben Organismengruppe ist die Fermentaktivität nicht immer die gleiche; sie hängt vielmehr von den jeweiligen Kultivierungsbedingungen ab (REESE und GLLLIGAN, 1954). Die Verwendung von Cellophan zum Studium der Entwicklung von Cellulosebakterien, ein Cellulosepräparat, das KRZEMIENIEWSKA (1933) vorgeschlagen hat, erwies sich als sehr günstig. Geringer Stärkegehalt, Durchsichtigkeit und Befähigung zur Aufnahme des Nährmediums sind die Vorteile bei der Kultivierung von Cellulosebakterien auf Cellophanfolien. Allerdings sind nicht alle Cellophansorten gleich gut für die Bakterienentwicklung geeignet. In der Literatur wird ein Fall beschrieben, in dem sich selbst nach neun Tagen noch keine Entwicklung einer Kultur von Sporocytophaga zeigte, während in Parallelversuchen mit Filtrierpapier bereits nach drei Tagen ein Wachstum zu beobachten war. Auf den verschiedenen Cellophansorten begannen die Bakterien am dritten, fünften, siebenten bzw. neunten Tag zu wachsen. Verschiedene von IMSCHENEZKI benutzte Cellophanproben besaßen keinerlei hemmenden Einfluß auf die Entwicklung der Cellulosebakterien. b) Cellulose aus p f l a n z l i c h e n M a t e r i a l i e n Bisweilen beschränkt man sich nicht auf die Verwendung von Baumwollcellulose, da die Baumwolle keine charakteristische Pflanze der gemäßigten Zone ist. Deshalb

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I. Aerobe Cellulosebakterien

isoliert man die Cellulose aus den verschiedensten Pflanzen und kultiviert auf ihr die Bakterien. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, daß durch die aggressive chemische Behandlung des pflanzlichen Rohmaterials bei der Isolierung der Cellulose diese derart verändert wird, daß ihre vorher vorhandenen spezifischen Eigenschaften modifiziert werden. Die Entwicklung der Bakterien auf den aus den verschiedensten Pflanzen isolierten Cellulosen verläuft ebenso wie auf Baumwollcellulose. Die Isolierung von Polysacchariden aus pflanzlichem Material ist manchmal auch aus anderen Gründen erforderlich. Aus aeroben Cellulosebakterien erhaltene Fermentpräparate greifen z. B. gereinigte Watte oder Filtrierpapier gar nicht oder nur sehr wenig an, während die auf diese Weise isolierte Cellulase das aus dem Isländischen Moos (Cetraria islandica) dargestellte Lichenin schnell zersetzt. Im Gegensatz zu Baumwollcellulose wird Lichenin durch Fermentpräparate leicht hydrolysiert, weshalb dieses Polysaccharid zur Erforschung der Bakteriencellulase sehr gut geeignet ist. c) C e l l u l o s e i n n a t ü r l i c h e n

Substraten

Im Verlaufe der Entwicklung der ökologischen Mikrobiologie wird immer häufiger darauf hingewiesen, daß die Zersetzung von reinen Cellulosepräparaten oder Watte nicht den Verhältnissen entspricht, unter denen ein Angriff der Cellulosebakterien in der Natur erfolgt. Diese Kritik ist durchaus berechtigt, obwohl es andererseits notwendig und wichtig ist, die Fähigkeit der Bakterien zur Cellulosezersetzung zunächst durch entsprechende Versuche auf Filtrierpapier oder Watte festzustellen. Die weitere Forschung muß dann aber die so erhaltenen Angaben über die Physiologie der Bakterien dahingehend vervollständigen, wieweit der untersuchte Organismus die Fähigkeit besitzt, pfianzliche Zellwände und andere natürliche Cellulose enthaltende Substrate zu zersetzen. Da reine Cellulose in der Natur nicht vorkommt, bestehen die Bedenken der Ökologen gegenüber der physiologischen Methodik zu Recht. Die der Zerstörung unterliegenden pflanzlichen Zellwände enthalten neben der Cellulose noch viele andere Stoffe: Pectin, Pentosane, Lignin usw. Di» verschiedenen Cellulosebakterien verhalten sich diesen Stoffen gegenüber keineswegs gleichartig. Deswegen variiert die Fähigkeit der verschiedenen Mikroben sehr stark, Pflanzenreste unter natürlichen Bedingungen zu zersetzen. Um diese Befähigung festzustellen, züchtet man Cellulosebakterien z. B. auf Stroh (Haferund Roggenstroh), Flachs, trockenen Blättern verschiedener Pflanzen, Waldstreu usw. Durch eine entsprechende chemische Behandlung werden aus dem Rohmaterial Lignin, Pentosane oder andere Stoffe entfernt, und anschließend wird festgestellt, in welcher Weise sich diese chemischen Eingriffe auf die Fähigkeit der Cellulosebakterien auswirken, die übrigbleibende Cellulose zu zersetzen. All diese Probleme beziehen sich jedoch nur. auf die von höheren Pflanzen aufgebaute Cellulose. Bei den niederen Pflanzen, darunter auch den Bakterien, ist die Fähigkeit, Cellulose synthetisch aufzubauen, nicht sehr verbreitet. Es steht jedoch fest, daß das Essigsäurebakterium Bacterium xylinum eine Cellulose bildet, die

A. Untersuchungsmethoden

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bezüglich ihrer Eigenschaft der in höheren Pflanzen vorhandenen sehr nahekommt.. In der Literatur ist des öfteren vorgeschlagen worden, zur Kultivierung von aeroben Cellulosebakterien Häutchen von Bacterium xylinum zu benutzen. Man hat sich deshalb in letzter Zeit intensiv mit der Biosynthese der Cellulose durch Acetobacter xylinum, (Bacterium xylinum) beschäftigt. So haben z. B. SCHRAMM und HESTRIN ( 1 9 5 4 ) festgestellt, daß die Menge an gebildeter Cellulose in (besser: auf) einem ruhenden Medium größer ist als in einem bewegten. Dies hängt offenbar damit zusammen, daß an der Oberfläche eines ruhenden Nährsubstrats der Partialdruck des Sauerstoffs höher ist, was sich auf die Cellulosesynthese günstig auswirkt. Bestätigt wird dies insbesondere auch dadurch, daß die Bildung der Cellulosehäutchen vorzugsweise in den oberen Schichten des Mediums stattfindet. Interessanterweise verlieren die Organismen von Acetobacter xylinum bei längerer Kultivierung unter Luftmangel die Fähigkeit zur Bildung von Cellulose. Sie benötigen gewissermaßen dieses Cellulosehäutchen nicht mehr, das den Bakterien praktisch die Entwicklung an der Flüssigkeitsoberfläche ermöglicht, wo die Versorgung mit Sauerstoff am besten ist. SKOPEK (1955) beschäftigte sich mit der Frage, aus welchen Stoffen Acetobacter xylinum die Cellulose aufbaut. Es zeigte sich, daß mehrere Stoffe in Betracht kommen: d-Glucose, d-Mannit, d-Fructose und Glycerin. Als Zwischenprodukte treten Ketohexofuranosen, Dioxyaceton sowie Polymerisationsprodukte vom Aldoltypus auf. Sehr interessant sind in diesem Zusammenhang Arbeiten von Forschern, die sich zur Aufklärung der Cellulosesynthese durch Acetobacter xylinum radioaktiver Kohlenstoffverbindungen bedienen. So fanden z. B. HESTRIN und SCHRAMM ( 1 9 5 4 ) , die mit 14C-haltiger Glucose arbeiteten, daß die Aktivität der erhaltenen Cellulose nur 78 bis 88% der zugesetzten Aktivität beträgt. Nach ihren Üntersuchungen erfolgt die Bildung der Cellulose nur in Gegenwart von Glucose und Sauerstoff und bei PH-Werten zwischen 5 und 7; die Bildungsgeschwindigkeit beträgt 0,1 bis 0,25 (xMol je mg und Stunde. Durch diese Angaben wird obige Feststellung bestätigt, daß die von Acetobacter xylinum synthetisierte Cellulose in ihrer Struktur der in den Zellwänden grüner Pflanzen ähnlich ist. Entsprechende Untersuchungen mit markiertem Mannit sind von MINOR, GREATHOUSE, SHIRK, SCHWARTZ und HARRIS (1954) durchgeführt worden. Die Autoren

unterwarfen die erhaltene Cellulose einer Totalhydrolyse und bestimmten die Radioaktivität der einzelnen Kohlenstoffatome der dabei gewonnenen Glucose. Sie fanden, daß 84 bis 96% der Aktivität auf die Kohlenstoffatome 1 und 6 entfallen und der Rest sich auf die C-Atome 2 und 5 verteilt. Diese Angaben über die Verteilung der markierten Kohlenstoffatome bestätigen die Hypothese einer bakteriellen Cellulosesynthese auf dem Wege der direkten Polymerisation. Die Anwesenheit von Äthylalkohol im Medium erhöht die Ausbeute an Cellulose ünd deren Gehalt an 14C, hat aber keinen Einfluß auf die Verteilung der markierten Kohlenstoffatome. 2

Imschenezki, Mikrobiologie

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Zur Herstellung derartiger Häutchen züchtet man die Bakterien unter Zusatz von Alkohol auf Bierwürze. Auf der Oberfläche des Mediums bildet sich bald eine dicke Haut. Nach sorgfältigem Auswaschen kann diese dann zu Kultivierungszwecken für Cellulosebakterien verwendet werden. Die Bakterien wachsen auf der Haut sehr gut und zerstören sie schnell (BROZKAJA, 1941). Das Häutchen kann aber auch einer Vorbehandlung mit schwachem Bromwasser und 0,4%igem Ammoniak unterworfen werden. Man erhält dann eine weiße, halb durchsichtige Cellulosefolie (Abb. 1), deren Röntgendiagramm das gleiche ist wie das der Baumwollcellulose (Abb. 2). d) M o d i f i z i e r t e Cellulose Die Faserstruktur der Cellulose verhindert die Herstellung eines homogenen dichten Nährmediums, das zur Züchtung von aeroben Cellulosebakterien und deren Kolonien geeignet ist. Deshalb hat man bereits zu Beginn dieses Jahrhunderts vorgeschlagen, gelöste und wieder ausgefällte Cellulose zu verwenden. Die auf diese Weise erhaltenen Hydro- oder Hydratcellulosen werden dann den festen oder flüssigen Nährmedien zugesetzt. Zur Gewinnung derartiger Cellulosepräparate ist eine Reihe von Verfahren bekannt, über die später noch berichtet wird. Hier soll nur darauf hingewiesen werden, daß die Verwendung von umgefällter Cellulose gewisse Vorzüge, aber auch Nachteile besitzt. Dichte Nährmedien, insbesondere Cellulose-Agar, ermöglichen die Züchtung von Cellulosebakterien ohne Begrenzung ihrer Entwicklung durch das Vorhandensein einzelner Cellulosefasern. Andererseits besitzt umgefällte Cellulose stark veränderte chemische und physikochemische Eigenschaften. Sicher findet während der Präparation von Hydrocellulose eine teilweise Hydrolyse der Cellulose zu löslichen Kohlenhydraten, aber auch eine Bildung von Cellodextrinen statt. Dadurch wird in irgendeiner Weise auch die Entwicklung anderer Bakterien begünstigt, d. h. die Elektivität des Mediums wird mehr oder weniger aufgehoben. Diese Tatsachen werden auch dadurch bestätigt, daß Hydrat- und Hydrocellulose von Bakteriencellulase leichter angegriffen werden. Der fermentative Abbau dieser Cellulosepräparate erfolgt leichter und rascher als der unveränderter Cellulose. Nach Literaturangaben wird aus Kupferoxydammoniak gefällte Cellulose von Cellulase leicht hydrolysiert, wobei etwa 96% der Cellulose in Glucose umgewandelt werden. Native Cellulose wird durch das Ferment kaum hydrolysiert, und man findet nur Spuren von Glucose. Diese Erscheinungen wurden bereits oben in dem Abschnitt über die Chemie der Cellulose erwähnt. In der Natur kommt keine umgefällte Cellulose vor, deshalb ist die Verwendung von weitgehend veränderter Cellulose auch vom ökologischen Gesichtspunkt her unzweckmäßig. 3. Nährmedien a) F l ü s s i g e Medien Flüssige Nährmedien sind in großer Zahl und unterschiedlicher Zusammensetzung von vielen Autoren vorgeschlagen worden. Alle enthalten Mineralsalze, eine im

Tafel 1

Abb. 1. Von Bact. xylinum

gebildete Cellulosefolie, gereinigt.

Abb. 2. Röntgendiagramm der von Bact. xylinum

gebildeten Cellulose

A. Untersuchungsmethoden

19

allgemeinen anorganische Stickstoffquelle und als einzige Kohlenstoffquelle Cellulose. Als Vorbild für alle Nährlösungen diente das von OMELIANSKL(1897) bzw. OMELJANSKI (1899) für anaerobe Bakterien voregschlagene elektive Medium. Die Zusammensetzung einiger dieser Medien soll hier angeführt werden. Nach OMELJANSKI (NH 4 ) 2 S0 4 K2HP04

10 g 1,0 g

MgS0 4 NaCl dest. Wasser

0,5 g Spuren 1000 ml

Nach WAKSMAN und CAREY (NH^HPO, MgS0 4 FeS04 KCl dest. Wasser

2,5 g 0,5 g 0,01 g 0,5 g 1000 ml

Nach STAPP und BoRTELS Lösung A NaN0 3 0,5 g K2HP04 0,25 g MgS04-7H20 0,1 g Leitungswasser 1000 ml pn-Wert der Lösung A 7,6 Lösung S (NH 4 ) 2 S0 4 0,5 g KH2P04 0,25 g MgS04.7H20 0,1 g mit H 2 S 0 4 angesäuertes Leitungswasser (pH 6,0) 1000 ml

Nach HUTCHINSON und CLAYTON KH2P04 1,0 g CaCl2 0,1 g MgS04-7H20 0,3 g NaCl 0,1 g FeCl s 0,01g NaNOg 2,5 g dest. Wasser 1000 ml Nach WlNOGRADSKI konzentrierte Salzlösung KH2P04 MgS0 4 NaCl FeS04 MnS0 4 dest. Wasser

1,0 g 0,5 g 0,5 g 0,01 g 0,01 g 200 ml

Zur Befeuchtung des in der Petrischale auf dem Gel ausgebreiteten Rundfilters von 10 cm Durchmesser mischt man: konz. Salzlösung 2 ml CaC0 3 0,02 g 0,036 g KNO s 10 ml dest. Wasser 6 Tropfen 2%ige Kalilauge pn-Wert der verdünnten Lösung 7,2

Jede der oben angeführten Nährlösungen läßt sich auch durch Zugabe von 0,7 bis 1 % Agar-Agar verfestigen. Die Frage, ob die Zusammensetzung der Nährlösungen theoretisch begründet ist, wird später, in dem Abschnitt über die Physiologie der aeroben Cellulosebakterien, erörtert werden. b) F e s t e M e d i e n Kiesdsäuregd Eine große Verbreitung hat die von WlNOGRADSKI (1952) vorgeschlagene Methode gefunden. Sie besteht darin, daß Filtrierpapier auf Kieselsäuregel aufgelegt

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I. Aerobe Cellulosebakterien

und mit einer entsprechenden Nährlösung befeuchtet wird. Zur Herstellung des Kieselsäuregels sind viele "Verfahren bekannt. Im folgenden wird ein Verfahren beschrieben, das von IMSCHENEZKI bei seinen Untersuchungen benutzt worden ist und gute Resultate liefert. Zunächst mischt man gleiche Volumina Salzsäure (d 1,1) und Wasserglas (d 1,06) miteinander, wobei man das Wasserglas in die Salzsäure gießt, nicht umgekehrt. Nach dem Vermischen gießt man die Flüssigkeit in Petrischalen und läßt eine halbe Stunde oder länger stehen, bis das in der Schale befindliche Gel beim leichten Schütteln mit der Hand nicht mehr vibriert. Danach wird das Gel in der Schale drei bis vier Tage in fließendem Leitungswasser gewaschen. Das Auswaschen ist dann genügend, wenn die Reaktion mit Silbernitrat nicht mehr Chloridionen anzeigt, als im Leitungswasser vorhanden sind. Nach dem Waschen werden die Schalen mit dem Gel 20 Min. im Autoklaven bei 110° C sterilisiert. Von speziellen Arbeiten, die sich mit der Verwendung von Kieselsäuregel zur Kultivierung von Cellulosebakterien befassen, sind die von BOJANOWSKY (1925) und WAKSMAN und CAREY (1926) zu nennen.

CeUulose-Agar Zum Nähragar setzt man 1% einer auf irgendeine Weise umgefällten Cellulose zu. Nähragar ist eine der oben beschriebenen Nährlösungen, die mit Agar-Agar verfestigt ist. Ohne näher auf die verschiedenen Verfahren zur Darstellung von regenerierter Cellulose einzugehen, seien an dieser Stelle zwei Methoden beschrieben: die Behandlung mit Schwefelsäure und mit Kupferoxydammoniak. Andere, weniger benutzte Verfahren verwenden Zinkchlorid, Natronlauge u. a. m. In einen 2 1 fassenden Erlenmeyerkolben gibt man 60 ml destilliertes Wasser und fügt vorsichtig 100 ml konzentrierte Schwefelsäure zu. Nach Abkühlen der Flüssigkeit auf 60 bis 65° C gibt man 5 g mit Wasser angefeuchtetes Filtrierpapier zu. Nun wird der Kolben so lange geschüttelt, bis das Papier sich in einzelne Fasern aufgelöst hat. Dann gießt man schnell Wasser in den Kolben, um eine vollständige Auflösung der Fasern zu vermeiden. Die Cellulose setzt sich in Form feiner Fasern ab, die dekantiert oder durch ein Faltenfilter abfiltriert werden. Bei der Filtration laufen nur die ersten 200 bis 300 ml Flüssigkeit rasch durch, danach verlangsamt sich die Filtration beträchtlich. Das gewonnene Cellulosepräparat wird mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis das Filtrat mit BaCl 2 keine Reaktion mehr gibt. WlNOGRADSKl weist darauf hin, daß die Cellulosefasern die Säure nur schwer wieder abgeben und empfiehlt daher, zunächst mit l%iger Sodalösung und danach mit heißem Wasser bis zum Verschwinden der alkalischen Reaktion zu waschen. Ferner muß ein Klebenbleiben der Fasern am Filter auf jeden Fall vermieden werden. Daher ist es notwendig, entweder die Flüssigkeit zu schütteln oder aber den Niederschlag vorsichtig mit einem Pinsel abzuheben. Nach beendeter Filtration wird das Filter durchlöchert und der Niederschlag in einen Kolben gespült, in den dann die erforderlichen Salze und 0,8 bis 1% Agar-Agar zugegeben werden.

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Die Darstellung von regenerierter Cellulose aus Kupferoxydammoniaklösung geht auf folgendem Wege vor sich. Zunächst vermischt man 10 Teile Ammoniak (d 0,90) mit 3 Teilen Wasser. Zu 11 des verdünnten Ammoniaks gibt man nun Kupfercarbonat im Überschuß, schüttelt gut, läßt über Nacht absitzen und dekantiert die überstehende Lösung. Dieser werden nun 15 Teile Filtrierpapier zugefügt, danach wird bis zur Auflösung des Papiers geschüttelt, mit Wasser auf 101 aufgefüllt und allmählich verdünnte Salzsäure (1:5) zugegeben, bis die Cellulose vollständig ausgefallen ist. Der Niederschlag wird mit Salzsäure und darauf mit Wasser bis zum Verschwinden der Chlorreaktion gewaschen. Zur Herstellung des Nährbodens verwendet man eine wäßrige Suspension mit 1% Cellulose, der die benötigten Salze und, falls erforderlich, organischer Stickstoff und Vitamine zugesetzt werden. Gute Ergebnisse erhält man auch mit Cellulose-Agar, das nicht aus regenerierter, sondern aus unveränderter Cellulose hergestellt wurde. Zu diesem Zweck zerreißt man Filtrierpapier in sehr kleine Stückchen, was man am besten dadurch erreicht, daß man vom Rande eines Stückes Filtrierpapier mit Hilfe eines Skalpells und des Daumens kleine Stückchen abzupft. Danach verreibt man die Stückchen längere Zeit in der Reibschale mit wenig heißem Wasser, bis man einen vollständig homogenen Brei erhält. Zu diesem gibt man dann die benötigten Salze, die erforderliche Menge Wasser und 0,8 bis 1% Agar-Agar. Die Zerkleinerung des Filtrierpapiers oder der Baumwollfasern kann auch mittels einer Kolloidmühle vorgenommen werden. Für Baumwolle empfiehlt sich jedoch hierbei eine 24stündige Vorbehandlung mit Salzsäure (270 ml konz. HCl und 300 ml Wasser). Die zerkleinerte Cellulose wird der Agar enthaltenden Nährlösung in Mengen von 1,2% (Baumwolle) oder 0,6% (Filtrierpapier) zugesetzt. Beim Arbeiten mit Cellulose-Agar kann es vorkommen, daß die Bakterien kein Wachstum zeigen. In den meisten Fällen rührt diese Erscheinung von einer etwas zu hohen Agar-Agar-Konzentration des Nährmediums her. Für Cellulosebakterien ist ein Medium mit 2% Agar-Agar zu fest, wodurch ihre Beweglichkeit verhindert wird, d. h. die Bakterien besitzen keine Bewegungsfreiheit, u m neue Cellulosegebiete erreichen zu können. Infolge der Immobilisierung hört die Vermehrung der Zellen auf und es bilden sich keine Kolonien aus. Zur Vermeidung dieses Dilemmas wendet man Agar-Agar nur in geringeren Konzentrationen an, etwa um 0,7 bis 0,8%. In einem derartigen Medium sind Cellulosebakterien genügend beweglich, während für fremde Bakterien die Viskosität bereits zu groß ist. Medien mit Cellodextrinen Bei der Hydrolyse der Cellulose bilden sich Dextrine, die von den Cellulosebakterien gut verwertet werden können. Stärkehaltige Medien Häufig werden Nährböden benutzt, die eine der oben angeführten Nährlösungen, z. B. die von HUTCHINSON, sowie 2% lösliche Stärke und 1% Agar-Agar enthalten.

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Zu diesem Zweck läßt sich auch gewöhnliches Kartoffel-Agar verwenden, das durch Kochen von Kartoffeln in Wasser und Zusatz von Agar erhalten wird (20 g Kartoffeln auf 100 ml Wasser). Stärke- und Kartoffelnährböden finden Verwendung zur Züchtung von Bakterien, die nicht nur Cellulose, sondern auch die Hydrolysenprodukte der Stärke verwerten. Glucosehaltige Medien Früher wurde angenommen, daß sich die spezialisierten Cellulosebakterien auf glucosehaltigen Nährböden nicht entwickeln können. Später hat man jedoch gefunden, daß selbst hochspezialisierte Formen wie Cytophaga und Sporocytophaga auf glucosehaltigen Nährböden gut wachsen. Eine ausführlichere Behandlung dieser Verhältnisse erfolgt in dem Abschnitt über die „toxische Wirkung" der Glucose. Gewöhnlich arbeitet man mit einer der erwähnten Nährlösungen, der man an Stelle der Cellulose 0,5% Glucose zusetzt. Es empfiehlt sich jedoch, die Glucose nicht durch Hitze, sondern etwa mittels Filtration durch ein Bakterienfilter zu sterilisieren. Andere Medien Neben den bereits erwähnten Nährböden werden zur Erforschung der aeroben Cellulosebakterien häufig auch andere Nährmedien benutzt. Die Zusammensetzung einiger derartiger Substrate wird im folgenden Abschnitt gegeben. Bezüglich allgemein benutzter Nährböden, wie Most-Agar, Peptonböden, Nährböden zur Erforschung der Denitrifizierungsfähigkeit usw., findet man ausführliche Angaben in praktischen Handbüchern der Mikrobiologie. c) Die Q u a l i t ä t d e s A g a r - A g a r Agar-Agar enthält häufig Verunreinigungen, die die Entwicklung von aeroben Cellulosebakterien hemmen. Eine Agar-Konzentration von 1,5% zeigt eine stark ausgeprägte Hemmwirkung auf das Wachstum einiger Cytophaga-FoTmen. Von der Anwesenheit schädlicher Verunreinigungen kann man sich leicht überzeugen, indem man Bakterien auf Nährböden mit verschiedenen Agar-Konzentrationen züchtet. Je höher der Gehalt an Agar ist, um so stärker wird die Entwicklung der Bakterien verzögert. Die gleiche Wachstumshemmung beobachtet man auch, wenn die Bakterien auf Filtrierpapier gezüchtet werden, das sich auf einem Nährboden mit hoher Agar-Konzentration befindet. Folglich ist die Vermutung nicht zutreffend, daß die Wachstumshemmung durch die Erhöhung der Viskosität des Mediums hervorgerufen wird. Die schädlichen Stoffe diffundieren aus dem Agar in die Nährlösung, mit der das Filter befeuchtet ist. Aus diesem Grund muß das Agar-Agar vor dem Gebrauch sorgfältig mit kaltem Wasser gewaschen werden. Bisweilen wird empfohlen, nach beendetem Waschen den gewöhnlich im Wasser vorhandenen Bakterien auf der Agar-Oberfläche eine Entwicklung zu ermöglichen, um die letzten Reste der Verunreinigungen zu entfernen. Nach den Erfahrungen von IMSCHENEZKI ist diese Prozedur überflüssig.

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4. Herstellung von Anreicherungskulturen a) K u l t i v i e r u n g a u f der O b e r f l ä c h e f e u c h t e r Cellulose Zur Kultivierung kann man mehrere Verfahren benutzen. Am häufigsten arbeitet man nach der von WlNOGRADSKI vorgeschlagenen Methode oder einer ihrer Modifikationen. Bei dieser Methode wird ein Rundfilter auf die Oberfläche eines feuchten, für die Bakterienernährung indifferenten Stoffes gelegt. WlNOGRADSKI verwendete zu diesem Zweck Kieselsäuregel, auf dessen Oberfläche er Filtrierpapier in Form von Rundfiltern oder aus Cellulose bestehende Gewebestücke legte, die mit Nährlösung getränkt waren. Die ursprüngliche Methode von WlNOGRADSKI ist etwas kompliziert, da man jedesmal zwei Lösungen in den zur Befeuchtung einer Petrischale erforderlichen Mengen vermischen muß. Einfacher ist es, die Nährlösung mit den entsprechenden Salzmengen auf einmal herzustellen und damit die sterilen Schalen mit Gel und Rundfilter zu befeuchten. Die mit dem Gel und dem Papier beschickten Schalen müssen leicht getrocknet werden, damit das Papier nach Zugabe der Nährflüssigkeit nicht zu feucht wird. An Stelle von Kieselsäuregel läßt sich auch nährstoffreies Agar verwenden. Letzteres erhält man aus sorgfältig gewaschenem Agar-Agar, das man in Konzentrationen von etwa 1,5 bis 2% zu destilliertem Wasser zusetzt. Die Züchtung von Cellulosebakterien auf Filtrierpapier, das sich auf der Oberfläche des nährstofffreien Agars befindet, gelingt ebenso gut wie bei Verwendung von Kieselsäuregel. Ferner kann man als Ersatz für das Gel oder das Agar Quarzsand in dünner Schicht, Glasperlen, feuchte Watte, Gipsplättchen oder Platten aus porösem keramischen Material verwenden. Alle diese Methoden liefern jedoch schlechtere Resultate, als sie bei Verwendung von Kieselsäuregel oder Agar erhalten werden. Das auf der Oberfläche des Gels befindliche Rundfilter wird mit der Nährlösung (nach WlNOGRADSKI oder HUTCHINSON) befeuchtet. Danach beimpft man das Papier mit kleinen Erdklümpchen, bei einem Filterdurchmesser von 10 cm mit etwa 25 Stück. Einige Autoren empfehlen, auf die Oberfläche des Gels, Agars oder der Gipsplatte umgefällte Cellulose aufzubringen und diese gleichmäßig zu verteilen. Diese Modifikation besitzt jedoch vor der Verwendung von Filtrierpapier keine Vorteile. Die so präparierten Schalen werden nun im Thermostaten bei 25 bis 30° C bebrütet. Nach drei bis fünf Tagen zeigen sich rings um die Erdklümpchen schmale gefärbte konzentrische Zonen, die den Beginn des Wachstums der Cellulosebakterien anzeigen. Diese Zonen breiten sich immer mehr aus, und nach etwa sieben bis zehn Tagen sind einige Erdkrümel von sehr charakteristisch aussehenden Bereichen umgeben. Meistens sind diese Wachstumszonen gefärbt. Es erscheinen die verschiedensten Farbnuancen: eigelb, nußgelb, orange, rosa, grün, gelbgrün usw. In einigen Fällen ist die Oberfläche der Zonen glänzend und schleimig, in anderen zwar feucht, aber nicht schleimig. Die Ränder der Zonen sind um so größer, je diffuser sie verlaufen. Für die auf Filtrierpapier wachsenden Cellulosebakterien sind die Form der Areale, ihre Färbung, Oberfläche sowie die Beschaffenheit der Ränder sehr charakteristische

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Kennzeichen. Im allgemeinen ist einer bestimmten Farbe eine Form von Mikroorganismen zugeordnet. Andererseits darf jedoch die Bedeutung dieser Kennzeichen nicht überschätzt werden. Es kann auch vorkommen, daß die Bereiche von der Entwicklung zweier verschiedener Cellulosebakterien herrühren, die eine unterschiedliche Färbung hervorrufen, das eine z. B. eine gelbe, das andere eine grüne. So hat man beispielsweise in einem orangefarbenen Gebiet eine ganze Reihe von Mikroben entdeckt, darunter die beiden Cellulosebakterien Vibrio und Cytophaga. Viel seltener hängt die Farbänderung mit der Entwicklung fremder Bakterien zusammen, die sich als Begleitbakterien in den älteren, zentralen Bereichen des durch die Cellulosebakterien gebildeten Areals entwickeln. Es gibt aber auch einige Cellulosebakterien, die keinen Farbstoff erzeugen. Deshalb darf aus dem Fehlen einer gefärbten Zone rings um die Bodenpartikel nicht ohne weiteres auf die Abwesenheit von Cellulosebakterien geschlossen werden. In diesem Fall muß die Oberfläche des Papiers sorgfältig untersucht werden. An den Stellen, an denen sie rauher, lockerer oder glänzender erscheint, haben sich sehr wahrscheinlich Cellulosebakterien entwickelt, die kein Pigment erzeugen. In derartigen Fällen ist auch die Beobachtung der Kultur im durchfallenden Licht erfolgreich. Die Bezirke, an denen infolge der Entwicklung von Cellulosebakterien eine Zersetzung der Cellulose stattgefunden hat, sind stärker durchscheinend. Normalerweise zeigen die mittels Erdklümpchen erhaltenen Kulturen nach zehn bis zwölf Tagen ein sehr charakteristisches Aussehen. Es finden sich gelbe, glänzende Gebiete in verschiedenen Farbtönungen, die von Cytophaga oder Sporocytophaga hervorgerufen wurden, weniger schleimige und nicht scharf begrenzte gelbliche Areale von Vibrionen sowie noch andere Bereiche. Außerdem sind in der Umgebung einiger Bodenpartikel farblose Zersetzungszonen sichtbar. Selbstverständlich entwickeln sich in der Zersetzungszone der Cellulose auch viele andere Mikroorganismen. Gewöhnlich beobachtet man eine Symbiose einer Cellulosebakterienart mit drei bis vier, seltener mehr fremden Bakterienformen. Vielen Protisten dienen die aeroben Cellulosebakterien als Nahrung. Deshalb findet man in diesen Kulturen auch Amöben, die sich von den Bakterienzellen ernähren. Bei der Kultivierung, möglicherweise auch unter den in der Natur herrschenden metabiotischen Verhältnissen, erfolgt eine eigentümliche Auswahl der Cellulosebakterienbegleiter. Im allgemeinen sind es bewegliche oder unbewegliche, aber meist keine sporen- und pigmentbildende stabförmige Bakterien. Zur weiteren Kultivierung der aeroben Cellulosebakterien überträgt man diese aus der gefärbten Zone. Dabei ist es erforderlich, die Bakterien, die übergeimpft werden sollen, vom äußersten Rand des Areals zu nehmen. Mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen hat man nämlich festgestellt, daß die Entwicklung der Cellulosebakterien auf der Papieroberfläche in dem noch nicht gefärbten Bezirk in einigem Abstand vom Rande der Farbzone vor sich geht. Lediglich die älteren Bereiche zeigen die für die vorliegende Bakterienform charakteristische Färbung. Entnimmt man eine geringe Menge an Papier von der Peripherie der gefärbten Zone, das äußerlich ungefärbt und unverändert erscheint, so kann man sich leicht davon überzeugen, daß es bereits Cellulosebakterien, aber nur wenige Fremd-

Tafel 2

Abb. 3. Papiersektoren zur gleichzeitigen Züchtung von vier verschiedenen Bakterienformen in einer Petrischale

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bakterien enthält. Es gelingt auf diese Weise, nach zwei bis drei Passagen die Anzahl dieser Begleitbakterien auf ein Mindestmaß zu verringern. Zur Übertragung benutzt man wieder Petrischalen mit Kieselsäuregel und Rundfilter. Um die Anzahl der benötigten Kulturgefäße zu verkleinern, kann man nach einem Vorschlag von WlNOGRADSKI ( 1 9 5 2 ) Schalen benutzen, die jeweils nicht ein ganzes, sondern ein in vier Sektoren aufgeteiltes Rundfilter enthalten, dessen Teile durch unbedecktes Kieselsäuregel voneinander getrennt sind. Die Abbildung 3 gibt eine derartige Anordnung wieder. Auf diese Weise lassen sich verschiedene Kulturen in einer Schale züchten. b) Z ü c h t u n g auf C e l l u l o s e - A g a r Die verschiedenen im Boden oder anderen Material lebenden Cellulosebakterien können auch auf Cellulose-Agar gezüchtet werden. Die Verwendung von Cellulose-Agar gestattet den Nachweis der Existenz einer großen Anzahl der verschiedensten Mikroorganismen im Boden, die zur Zersetzung von Cellulose befähigt sind. Mit Hilfe von Cellulose-Agar lassen sich Kulturen von celluloseangreifenden Mycobakterien und sporenbildenden Bakterien erhalten. Ver-

Abb. 4. •Lokalisierung der Cellulosezersetzung an den Stellen der Entwicklung aerober Cellulosebakterien (Schale mit Cellulose-Agar im durchfallenden Licht)

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wendet man dagegen Kieselsäuregel und Rundfilter, so können sich diese Formen gewöhnlich nicht entwickeln. Die Anwendung von Cellulose-Agar besitzt jedoch auch einige Nachteile. Es wirkt weniger elektiv, und je nach der Herstellungsart des Mediums können sich fremde, die Cellulose nicht angreifende Bakterien in mehr oder weniger großer Menge ebenfalls entwickeln. Naturgemäß ist ihre Anwesenheit unerwünscht, denn sie erschweren die Reinzüchtung der Cellulosebakterien. Zur Herstellung der Kulturen impft man im allgemeinen das Medium mit einigen Bodenproben und überträgt dann cellulosezersetzende Bakterien aus den transparenten Zonen in der Umgebung der Kolonien (Abb. 4) auf neues Cellulose-Agar oder ein flüssiges Medium mit Cellulose. c) Z ü c h t u n g auf Cellulose im f l ü s s i g e n Medium Die Züchtung der aeroben Cellulosebakterien erfolgt häufig auch in einem flüssigen, Cellulose enthaltenden Medium. Gewöhnlich werden dazu Erlenmeyerkolben mit eingesetztem konischen Faltenfilter be. nutzt, dessen Spitze nach oben zeigt (Abb. 5). Der Kolben wird 1 bis 1,5 cm hoch mit Nährlösung (nach WINOGRADSKI, HUTCHINSON oder

anderen) gefüllt und mit dem zu untersuchenden Material (Boden, Wasser, pflanzliche Rohstoffe usw.) beimpft. Nach zehn- bis zwölftägigem Stehen bei 25 bis 30° C beginnt sich das Papier in der Höhe des Flüssigkeitsspiegels zu zersetzen. Dabei bildet sich ein rings um das Filter verlaufender gefärbter Streifen. Manchmal erfolgt auch eine Zersetzung in der Weise, daß das Filter in sich zusammenfällt, wobei kein Farbstoff auftritt. An Stelle von Faltenfiltern kann man auch Papierstreifen verwenden. Das Papier wird dabei so eingelegt, daß die Streifenmitte in die Flüssigkeit eintaucht und die beiden Enden an der Kolbenwandung anliegen. Die Entwicklung der Abb. 5. Kolben mit Nährlösung Cellulosebakterien erfolgt auch hier in Höhe des und Faltenfilter zur KultivieFlüssigkeitsspiegels. rung aerober Cellulosebakterien Mit Hilfe einer gebogenen Nadel läßt sich etwas halbzerstörte Cellulose mit Bakterien entnehmen und zur weiteren Reinzüchtung übertragen. Zur Untersuchung einer größeren Anzahl von Bodenproben können an Stelle der Erlenmeyerkolben auch Reagenzgläser verwendet werden. Man füllt diese zu einem Drittel mit Nährlösung und läßt einen Papierstreifen derart eintauchen, daß noch mindestens ein Drittel des Streifens aus der Flüssigkeit herausragt. Gewöhnlich verwendet man Streifen von 6 cm Länge und 1 cm Breite. Die Anordnung ist in Abb. 6 wiedergegeben. Dieses Verfahren ist allgemein zur Züchtung

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von Cellulosebakterien sehr geeignet, da die Art der Farbstoffbildung und damit die Färbung des Papiers sowie die Form der Zerstörungen des Papiers für die verschiedenen aeroben Cellulosebakterien außerordentlich charakteristisch sind. In einigen Fällen wurden Kulturen aerober Cellulosebakterien in der Weise hergestellt, daß man das entsprechende Ausgangsmaterial in einen Kolben einbrachte, in welchem Papierstückchen oder -streifen vollständig von einer Nährlösung bedeckt wurden. Dieses Verfahren ist jedoch nicht zu empfehlen, weil dabei für das Wachstum aerober Bakterien ungünstige Bedingungen auftreten. Außerdem entstehen infolge der Entwicklung der Begleitbakterien Verhältnisse in dem Medium, unter denen nicht nur die fakultativen, sondern auch die stark anaeroben Bakterien gedeihen. In diesen Fällen beobachtet man eine langsame anaerobe Zersetzung der Cellulose unter Gasbildung bei gleichzeitiger schwacher Entwicklung der aeroben Bakterien. Aus den genannten Gründen ist deshalb dieses Verfahren abzulehnen. d) Z e r s e t z u n g d e r C e l l u l o s e im B o d e n Eine der ältesten und bis heute noch Bedeutung besitzenden "Methoden zur Gewinnung angereicherter Kulturen beruht auf dem Einbringen größerer Cellulosemengen in den Boden. Das Verfahren ist in zwei Varianten bekannt. Die erste besteht darin, daß man in eine KoCHsche Schale eine Schicht von 1,5 bis 2,5 cm Erde einfüllt, diese etwas festdrückt und bis zu 60% des Sättigungswertes anfeuchtet. Auf die so entstandene Oberfläche legt man dann ein Bundfilter oder ein anderes Stück Filtrierpapier. Nach Befeuchten des Papiers mit wenig Wasser fügt man weitere Erde in lockerer, dünner Schicht zu. Besser ist es jedoch, das Papier nicht vollständig zu bedecken, sondern nur mit verschieden großen Erdklümpchen zu bestreuen. Die so präparierte Schale wird nun bei 25 bis 30° C bebrütet, wobei darauf zu achten ist, daß das Papier nicht austrocknet. Nach 12 bis 15 Tagen entfernt man die auf dem Papier befindliche Erde. Auf dem Bundfilter erkennt man dann verschiedenfarbige Bereiche oder infolge der Entwicklung aerober Cellulosebakterien bisweilen auch Löcher. Diese halbzerstörte Cellulose mit ihren Bakterien kann als Ausgangsmaterial für weitere Kulturen oder zur Keinzüchtung dienen.

glas mit Nährlösung und eingetauchtem Papierstreifen

Die zweite Variante beruht darauf, daß man größere Mengen Filtrierpapier in die Erde einbringt und nach dessen vollständiger Zersetzung den mit Cellulosebakterien angereicherten Boden als Ausgangsmaterial für weitere Untersuchungen benutzt. Dazu verfährt man folgendermaßen: dünne Streifen Filtrierpapier werden in Blumentöpfen mit Erde oder im Sommer in den Ackerboden eingetragen. Das Verfahren besitzt den Vorteil, daß sich unter diesen Verhältnissen die verschiedensten im Boden vorhandenen Cellulosebakterien entwickeln können.

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In beiden Verfahren ist die Versorgung der Cellulosebakterien mit Stickstoff von großer Bedeutung. Deshalb kann man den Zersetzungsprozeß der Cellulose durch geringe Befeuchtung des Bodens mit Nährlösung beschleunigen. e) A u f b e w a h r e n e l e k t i v e r K u l t u r e n Die in der beschriebenen Weise erhaltenen elektiven Kulturen aerober Cellulosebakterien können längere Zeit unter Laboratoriumsbedingungen weitergezüchtet werden, ohne daß ihre Aktivität hinsichtlich der Cellulosezersetzung nachläßt. Bei der Anwendung elektiver Medien braucht man nicht zu befürchten, daß die Cellulosebakterien von den im Boden ebenfalls vorhandenen Saprophyten überwuchert werden. Die angereicherten Kulturen können mittels einer der oben beschriebenen Methoden weiterkultiviert werden. Zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Kulturen müssen diese mindestens zweimal wöchentlich übergeimpft werden. Ferner muß darauf geachtet werden, daß die Oberfläche der Cellulose niemals austrocknet. Zu diesem Zweck hält man die Schalen mit den Kulturen am besten auf Porzellanuntersätzen in Aquarien, deren Böden mit Wasser bedeckt sind und die mit Glasplatten verschlossen werden, so daß die Luft stets mit Feuchtigkeit gesättigt ist. Die Aquarien selbst werden im Dunkeln bei einer relativ niedrigen Temperatur von 12 bis 15° C aufbewahrt. 5. Bestimmung der Menge an aeroben Cellulosebakterien in natürlichen Substraten Die quantitative Bestimmung der Cellulosebakterien im Boden oder in anderen natürlichen Substraten ist eine diffizile Aufgabe, deren Lösung erheblich schwieriger ist als bei anderen Mikroorganismen. Diese Schwierigkeiten lassen sich dadurch erklären, daß sich auf einer Papieroberfläche keine isolierten Kolonien entwickeln. Andererseits wächst auf Cellulose-Agar anscheinend nur ein Teil der in dem zu untersuchenden Material vorhandenen Cellulosebakterien. Außerdem wird die Bestimmung durch die sich ebenfalls entwickelnden fremden Bakterien gestört. Zur quantitativen Bestimmung der Bakterienzellen können zwei Methoden herangezogen werden. Die erste beruht auf dem Prinzip der successiven Verdünnung. Dazu werden aus Bodenproben oder anderem Untersuchungsmaterial abgestufte Verdünnungsreihen hergestellt. Für die Kultivierung von Cellulosebakterien präparierte Eeagenzgläser werden dann mit je 0,1 ml dieser verdünnten Lösungen beimpft. Das Auftreten von Flecken auf dem Papierstreifen und dessen Zerstörung zeigen die Anwesenheit von Cellulosebakterien an. Auf diese Weise kann man den Titer der Cellulosebakterien festlegen, d. h. man kann die Verdünnung ermitteln, bei der gerade noch ein Wachstum der Bakterien beobachtet wird. Dieses Verfahren ist naturgemäß nicht genau, da das Impfmaterial erhebliche Bakterienmengen enthalten muß, um ein Wachstum im Beagenzglas zu ermöglichen. Die so erhaltenen Werte liegen demgemäß niedriger als dem tatsächlichen Gehalt des Untersuchungsmaterials an aeroben Cellulosebakterien entspricht. Das zweite Verfahren benutzt die Methode der Kultivierung auf Cellulose-Agar, wobei dieses Medium mit den verschiedenen oben beschriebenen Verdünnungen beimpft wird. Die Kulturen werden bei 25 bis 30° C gehalten, und nach 12 bis

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15 Tagen werden die von hellen Zonen umgebenen Kolonien ausgezählt, wobei man annimmt, daß diese von Cellulosebakterien gebildet wurden. Kolonien, die keine hellen Ränder besitzen, bleiben dabei unberücksichtigt. 6. Isolierung von Reinkulturen In der Entwicklung der ökologischen Mikrobiologie kann manchmal eine falsche Einschätzung der Bedeutung von Reinkulturen beobachtet werden. Gewöhnlich wird hervorgehoben, daß die Mikroorganismen in der Natur unter Bedingungen leben, die die Existenz von Reinkulturen ausschließen. Daher wird der ökologischen Mikrobiologie die Aufgabe gestellt, die aus mehreren Mikroorganismen bestehenden Komplexe zu untersuchen. Ohne die hervorragende Bedeutung solcher Erscheinungen, wie Metabiose, Symbiose, Antagonismus usw., ableugnen und die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung natürlicher Verhältnisse bestreiten zu wollen, darf nicht vergessen werden, daß jede physiologische Erforschung der Mikroorganismen nur mit Hilfe von Reinkulturen durchgeführt werden kann. Viele Arbeiten über Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen enthalten nur deshalb falsche Schlußfolgerungen, weil die Autoren nicht mit Reinkulturen gearbeitet haben. So fanden z. B. HUTCHINSON und CLAYTON (1918/19) in Kulturen des von ihnen beschriebenen Cellulosebakteriums Spirochaeta cytophaga (Sporocytophaga) Butter säure. Diese Beobachtung konnte jedoch nicht bestätigt werden. Die einzige Erklärung für die Diskrepanz ist darin zu suchen, daß die Kulturen von Spirochaeta cytophaga durch Buttersäurebakterien verunreinigt waren. Ebenfalls auf das Fehlen einer Reinkultur ist die Beschreibung der sehr eigenartigen Entwicklungsgeschichte des von BOKOR (1930) isolierten Cellulosebakteriums Sporocytophaga zurückzuführen. Der ungewöhnliche Entwicklungszyklus dieses Mikroorganismus läßt sich leicht dadurch erklären, daß es sich hierbei um eine Mischkultur aus einem Proactinomyceten und dem Myxobakterium Cytophaga handelte. Es gibt noch viele Beispiele für derartige fehlerhafte Schlußfolgerungen, die alle darauf beruhen, daß keine Reinkulturen zur Verfügung stehen. Die Reinzüchtung aerober Cellulosebakterien ist für den Experimentator stets mit großen Schwierigkeiten verbunden. Nur wenigen Forschern gelang es z. B., Reinkulturen der zu den Myxobakterien (Sporocytophaga) gehörenden aeroben Cellulosebakterien anzulegen. In der UdSSR haben IMSCHENEZKI und SoLNZEWA (1936) erstmalig eine Reinkultur von Sporocytophaga erhalten. Durch Verbesserung der Arbeitstechnik konnten später auch andere Autoren Reinkulturen züchten. a) I s o l i e r u n g auf f e s t e n N ä h r m e d i e n Unabhängig von der Zusammensetzung des zur Kultivierung verwendeten Nährmediums entwickeln sich die Cellulosebakterien je nach ihrer systematischen Stellung in verschiedener Weise. Die Vibrionen und nicht sporenbildenden cellulosezersetzenden stäbchenförmigen Bakterien treten zusammen mit fremden Bakterien

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auf. Die Myxobakterien wachsen langsamer, weshalb sich zunächst die Kolonien der Begleitbakterien bilden und erst später die der Cellulosebakterien in Erscheinung treten. a) Kulturen auf Kieselsäuregel mit aufgelegtem Rundfilter Die Reinzüchtung von Bakterien durch Überimpfen aus Kulturen, die auf Filtrierpapier gewachsen sind, gelingt gewöhnlich nicht. In sehr seltenen Fällen erhält man durch Übertragung vom Rand eines durch die Entwicklung von Cellulosebakterien neu entstandenen Bereichs eine Reinkultur. Eine erfolgreiche Isolierung von Reinkulturen mit Hilfe dieses Verfahrens ist jedoch Glücksache. Somit können durch Übertragung auf Medien mit Filtrierpapier lediglich Roh- aber keine Reinkulturen erhalten werden. ß) Kulturen auf Cdlulose-Agar Die Übertragung von Bakterien aus Rohkulturen auf Cellulose-Agar ermöglicht die Isolierung von Kolonien der Cellulosebakterien. Durch mehrmaliges Überimpfen von isolierten Bakterien auf frischen Nährboden gelingt schließlich die Herstellung von Reinkulturen. Die Vorteile, des Cellulose-Agar zur Reinzüchtung von Kulturen sind folgende: a) Auf Cellulose-Agar ist die Entwicklung der Cellulosebakterien aus den verschiedensten Gruppen, unabhängig von ihrer systematischen Stellung, möglich. b) Das Auftreten von transparenten Zonen in der Umgebung der Kolonien beweist die cellulosezersetzende Aktivität der vorliegenden Kultur. c) Bei der Reinzüchtung wird die Art des Nährmediums nicht verändert; jede Übertragung erfolgt wieder auf das gleiche Medium, in dem die Kolonien gewachsen sind. Diese Methode besitzt aber auch einige Nachteile. Die Entwicklung der verschiedenen Formen erfolgt auf Cellulose-Agar mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Infolge des mitunter schwachen Wachstums von Fremdbakterien, die mit den Cellulosebakterien vergesellschaftet sind, wird die Reinzüchtung letzterer erschwert. Es ist deshalb notwendig, die Schalen von Zeit zu Zeit bei schwacher Vergrößerung unter dem Mikroskop zu beobachten, um nicht Gefahr zu laufen, das Isolierungsverfahren vorzeitig abzubrechen. Wie aus einer Mitteilung von VOETS u n d VAN HOVE (1953) hervorgeht, ist es

unmöglich, aerobe Cellulosebakterien mittels Übertragungen auf Rundfiltern reinzuzüchten. Selbst nach 10 Passagen ist es nicht gelungen, eine Anreicherungskultur von ihren Begleitbakterien zu befreien. Dagegen war eine Reinzüchtung auf Agar mit 0,2% gefällter Cellulose, Nährsalzen sowie 0,1% Dungextrakt möglich. Unter diesen Bedingungen bildeten sich auf dem festen Medium Zonen hydrolysierter Cellulose, aus denen durch Überimpfen Reinkulturen der Cellulosebakterien erhalten werden konnten. Auf dem angegebenen Medium mit Dungextrakt vertragen die aeroben Cellulosebakterien sowohl längere Aufbewahrungszeiten als auch Passagen, ohne ihre Aktivität zu verlieren.

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y) Züchtung auf stärkehaltigem Medium Unter den Cellulosebakterien gibt es eine Reihe von Formen, die nicht nur auf Cellulosemedien, sondern auch auf stärkehaltigen Substraten gut gedeihen. Dazu gehören u. a. einige Myxobakterien (Sorangium) und Vibrionen (Vibrio). Zu ihrer Isolierung impft man ein Stärkemedium (vgl. S. 21) mit einer Anreicherungskultur. Ist nun in der als Übeitragungsmaterial dienenden teilweise zerstörten Cellulose eine größere Anzahl von Zellen einer Art vorhanden, so erhält man auf Stärkemedien bei einem bestimmten Verdünnungsgrad der Bakteriensuspension fast reine Kulturen von Vibrionen oder Myxobakterien. Nach mehreren Übertragungen auf frisches Nährsubstrat prüft man die Reinheit der Kultur.. Dieses Prüfverfahren wird später näher beschrieben. 8) Züchtung auf glucosehaltigem Medium Neuere Untersuchungen (STANIER, 1942; HARMSEN, 1946) über die Physiologie der aeroben Cellulosebakterien haben ergeben, daß diese Bakterien sich auch auf glucosehaltigen Medien entwickeln können. Das dabei verwendete Substrat enthält 0,5 bis 1% Glucose und 0,7 bis 0,8% Agar-Agar. Nach STANIER sind die früher bei den Versuchen zur Kultivierung von Cytophaga und Sporocytophaga auf glucosehaltigem Medium aufgetretenen Schwierigkeiten darauf zurückzuführen, daß die Glucose zusammen mit dem Nährmedium heiß sterilisiert worden ist. Dabei erfolgt eine Zersetzung der Glucose unter Bildung giftiger Stoffe. Sterilisiert man dagegen die Glucose durch Filtration, so erhält man ein Nährsubstrat, auf dem die Myxobakterien ausgezeichnet gedeihen. Andererseits konnte HARMSEN (1946) Sporocytophaga auch auf heiß sterilisierter Glucoselösung zum Wachsen bringen. Diese Frage soll in dem Abschnitt über die Physiologie der aeroben Cellulosebakterien ausführlicher behandelt werden. Es ist jedoch auf jeden Fall zu empfehlen, bei der Herstellung des Nährmediums die Glucoselösung mittels Filtration durch ein Bakterienfilter gesondert zu sterilisieren. Auf Glucose-Agar können sich fast alle aeroben Cellulosebakterien entwickeln, ausgenommen die obligat Cellulose beanspruchenden Formen. Dabei muß jedoch festgestellt werden, ob diese bezüglich der Cellulose tatsächlich obligat sind. b) E r h i t z e n d e r K u l t u r e n Für einige aerobe Cellulosebakterien ist die Bildung von Ruhestadien charakteristisch. So gibt es z. B. in der Gattung Sporocytophaga (Myxobacteriales) Mikrocysten und bei den Bazillen Sporen. Die Mikrocysten sind gegenüber höheren Temperaturen etwas beständiger als die vegetativen Zellen. Die Begleitbakterien aber, die die Kultur verunreinigen und. zu den nicht sporenbildenden Formen gehören, können durch die Einwirkung höherer Temperaturen abgetötet werden. Auf dieser Basis haben IMSCHENEZKI und SOLNZEWA (1937) eine einfache Methode zur Isolierung von Reinkulturen vorgeschlagen. Diese besteht darin, daß man Bakterien aus den Anreicherungskulturen in Reagenzgläser mit Wasser überführt und durch sorgfältiges Verreiben homogene Zellsuspensionen herstellt. Durch Erhitzen

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der Gläser mit den Zellsuspensionen auf verschiedene Temperaturen und nachfolgendes Uberimpfen auf frische Nährböden wird die Beständigkeit der Mikrocysten festgestellt. Man besitzt damit die Möglichkeit, durch Erwärmen derartiger Zellaufschwemmungen bis dicht unter die kritische Temperatur die vegetativen Bakterienstadien unter Erhaltung der Lebensfähigkeit der Mikrocysten abzutöten. Eine so behandelte Suspension kann dann als Impfmaterial zur Herstellung von Reinkulturen dienen. Auf diese Weise konnten die erwähnten Autoren Reinkulturen von Sporocytophaga myxococcoides und 8p. ellipsospora erhalten. c) Z ü c h t u n g v o n s o g e n a n n t e n „ s t e r i l e n " A g a r - B l ö c k c h e n Zur Isolierung von Reinkulturen aerober Cellulosebakterien benutzt man bisweilen eine Methode, die schon WlNOGRADSKI zur Kultivierung nitrifizierender Bakterien verwendet hat. Nach dieser Methode stellt man zunächst eine Rohkultur auf einem festen Nährsubstrat her, das für die Entwicklung der Begleitbakterien günstiger ist als für das Wachstum der Hauptorganismen. Meist wird für diesen Zweck Fleischbrühe-Agar verwendet. Nach dem Auftreten von Kolonien der Fremdbakterien schneidet man mit Hilfe eines keimfreien Skalpells „sterile" Bereiche des Nährbodens aus, auf denen keine Kolonien sichtbar sind. Diese Blöckchen werden dann mit sterilem Wasser ausgewaschen, und die so erhaltene Flüssigkeit könnte zum Impfen eines für Cellulosebakterien geeigneten Nährbodens benutzt werden. Jedoch hat sich das Verfahren nicht bewährt, da es auf diese Weise nicht gelingt, Reinkulturen zu erhalten. d) I s o l i e r u n g d u r c h A u s w a s c h e n i n f i z i e r t e r Cellulose Da sich die aeroben Cellulosebakterien auf der Oberfläche von Cellulosefasern ansiedeln und diese allmählich zerstören, somit also während ihrer ganzen Entwicklung in engem Kontakt mit der Cellulosefaser stehen, hat man an die Möglichkeit gedacht, eine Reinzüchtung von Cellulosebakterien mittels Auswaschen von halbzerstörten Fasern durchzuführen. Jedoch hat sich die Hoffnung, Reinkulturen von Cellulosebakterien durch mehrmaliges Auswaschen von halbzerstörten Fasern mit sterilem Wasser zu erhalten, nicht erfüllt. Wahrscheinlich haften die Begleitbakterien infolge des von den Cellulosebakterien erzeugten Schleimes ziemlich fest auf dem Substrat und können durch Auswaschen nicht vollständig entfernt werden. e) I s o l i e r u n g durch s u c c e s s i v e V e r d ü n n u n g Die Darstellung von Reinkulturen aerober Cellulosebakterien wurde auch nach der Methode der successiven Verdünnung von Anreicherungskulturen versucht. Zu diesem Zweck wurde flüssiges cellulosehaltiges Nährmedium in Reagenzgläsern mit Zellsuspensionen verschiedener Konzentration aus Anreicherungskulturen beimpft und festgestellt, bei welcher Konzentration das Wachstum der Cellulosebakterien noch gefördert, das der Fremdbakterien aber gehemmt wird.

A. Untersuchungsmethoden

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Die Reinzüchtung von Kulturen nach dieser Methode gelingt im allgemeinen nicht. Bei zu hohen Konzentrationen entwickeln sich Mischkulturen, bei stärkeren Verdünnungen wachsen die Cellulosebakterien nicht. Wahrscheinlich beruhen diese Mißerfolge darauf, daß es sehr schwierig ist, eine gleichmäßige Bakteriensuspension zu erhalten, da diese Mikroorganismen mit den Cellulosefragmenten in enger Berührung stehen und durch den Schleim mehr oder weniger miteinander verklebt sind. Ein anderer Grund für das Mißlingen dieses Verfahrens ist wohl darin zu suchen, daß die Cellulosebakterien nur dann wachsen können, wenn sie in ausreichender Menge auf das Nährmedium gelangen. Dabei entwickeln sich im allgemeinen natürlich auch Fremdbakterien. Es ist jedoch möglich, wie in einem späteren Kapitel erörtert wird, eine geringere Anzahl von Zellen zum Wachstum zu bringen, indem man nämlich die Zusammensetzung des Nährmediums unter besonderer Berücksichtigung seines Vitamingehalts ändert. f) E n t w i c k l u n g einer K u l t u r aus einer i s o l i e r t e n Zelle Versuche zur Kultivierung von Bakterien aus einer Mutterzelle sind bereits mehrmals unternommen worden. So hat z. B. FÄHRAEUS (1944/45) aus einer Kultur von Sporocytophaga mit Hilfe eines Mikromanipulators 50 Zellen isoliert, von denen jedoch keine einzige Wachstum zeigte. Auch von anderen Autoren durchgeführte ähnliche Versuche blieben erfolglos. Diese Mißerfolge sind offenbar auf die oben bereits erwähnten Gründe zurückzuführen. Im Gegensatz zu den gewöhnlichen Saprophyten, bei denen eine Züchtung aus einer isolierten Zelle relativ leicht möglich ist, gehören die Cellulosebakterien zu den Organismen, die sich als Einzelzelle nur sehr schwer vermehren können. Da sich unter den Cellulosebakterien aber auch viele Vertreter der Mykobakterien befinden, sei hier auf die Arbeiten von SOLNZEWA (1940) hingewiesen, in denen über die Kultivierung von Myxobakterien aus einer isolierten Zelle berichtet wird. Wenn sich diese Untersuchungen auch mit Formen befassen, die keine Cellulose angreifen, so beweisen sie doch, daß ein relativ kleiner Teil von einzelnen Zellen der Myxobakterien beim Einbringen in das Nährmedium zum Wachstum und zur Vermehrung befähigt ist. Von den 19 Zellen, die SOLNZEWA isolierte, vermehrte sich allerdings nur eine einzige. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, daß die weitere Erforschung der Physiologie der aeroben Cellulosebakterien Ergebnisse liefert, mit deren Hilfe man, etwa durch Änderung der Zusammensetzung der Nährmedien und der Wachstumsbedingungen, Kulturen aus einzelnen Zellen anlegen kann. g) B e u r t e i l u n g der verschiedenen V e r f a h r e n Ein Vergleich der verschiedenen Methoden zur Reinzüchtung von aeroben Cellulosebakterien ergibt, daß im wesentlichen nur zwei Verfahren mit Erfolg angewendet werden können. Das erste beruht auf dem Prinzip der Selektion; durch mehrmaliges Übertragen der Bakterien auf frisches Nährmedium, wobei als Substrat Stärke-, Cellulose- oder Glucose-Agar Verwendung findet, wird eine schrittweise 3

Imschenezki, Mikrobiologie

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Reinigung der Kulturen erzielt. Die andere Methode macht von der Möglichkeit Gebrauch, durch Erhitzen der Kulturen die vegetativen Formen der Bakterien zu zerstören und die am Leben bleibenden Dauerformen dann auf frisches Medium überzuimpfen. Das Verfahren ist jedoch nur bei Formen anwendbar, die Mikrocysten oder Sporen bilden. Ferner ist es dann angebracht, wenn die Reinzüchtung auf festen Nährmedien nicht möglich ist. Alle anderen oben aufgeführten Verfahren sind in den seltensten Fällen brauchbar. Für die Isolierung von Reinkulturen ergibt sich also folgendes Schema. Zunächst stellt man eine Anreicherungskultur auf Kieselsäuregel und Filtrierpapier in Petrischalen oder in flüssigen, cellulosehaltigen Medien her. Dann wird die infizierte Cellulose mit den anhaftenden Bakterien auf frisches festes Nährmedium übergeimpft. Auf mikroskopischem Wege läßt sich dabei feststellen, welche Cellulosebakterien vorherrschend sind. Dadurch wird der spätere morphologische Vergleich zwischen den auf festem Medium wachsenden und den in den Anreicherungskulturen vorhandenen Formen erleichtert. Um festzustellen, ob eine Kultur zur Zersetzung von Cellulose befähigt ist, muß man die auf festen Medien erhaltenen Kolonien nicht nur auf Substrate gleicher Zusammensetzung überimpfen, sondern auch auf Filtrierpapier in flüssigem Medium. Auf diese Weise kann man zusammen mit der Reinzüchtung auch die Fähigkeit der Kultur zur Zersetzung von Cellulose überprüfen. Die cellulosezersetzenden Vibrionen lassen sich leicht auf stärkehaltigem Medium in Petrischalen reinzüchten. Viele Myxobakterien (Sorangium, Promyxobacterium) können in der gleichen Weise rein erhalten werden. Zur Isolierung von Sporocytophaga verwendet man das Selektionsverfahren auf Cellulose- oder Glucose-Agar oder die Methode der partiellen Erhitzung unter Erhaltung der Lebensfähigkeit der Mikrocysten. h) P r ü f u n g der K u l t u r auf R e i n h e i t An eine isolierte Kultur sind bezüglich ihrer Reinheit sehr hohe Anforderungen zu stellen. Infolgedessen ist eine entsprechende Prüfung auf Reinheit unbedingt erforderlich. Man impft zu diesem Zweck mehrere feste Nährböden unterschiedlicher Zusammensetzung mit der zu prüfenden Kultur und untersucht die Morphologie der Kolonien, die Besonderheiten des Wachstums auf den verschiedenen Medien, die Art der Cellulosezerstörung usw. Die überwiegende Mehrzahl der aeroben Cellulosebakterien, insbesondere alle Myxobakterien, gedeihen im allgemeinen auf Fleischbrühe nicht. Dagegen wachsen die Begleitbakterien auf diesem Substrat meist gut. Die Kultivierung auf Fleischbrühe ist aus diesem Grund ein ausgezeichnetes Kriterium für die Reinheit einer Kultur. Zur Reinheitsprüfung kann auch die mikroskopische Beobachtung ungefärbter und gefärbter Präparate aus verschieden alten Kulturen herangezogen werden. Im allgemeinen kommen die Begleitbakterien erst nach den aeroben Cellulosebakterien zur Entwicklung, d. h. wenn bereits eine merkliche Zerstörung der Cellulose eingesetzt hat. Bei der Untersuchung einer jungen Kultur findet man deshalb mitunter keine Fremdbakterien, weil ihre Anzahl noch zu gering ist. Es ist somit praktisch,

A. Untersuchungsmethoden

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mit der Prüfung der Kulturen erst nach einem Wachstum von 15 bis 20 Tagen zu beginnen. Die meisten Cellulosebakterien lassen sich auf Grund ihrer morphologischen Merkmale leicht von den gewöhnlich die Kultur verunreinigenden nicht sporenbildenden Bakterien unterscheiden. i) K u l t i v i e r u n g u n d A u f b e w a h r e n der R e i n k u l t u r e n Die isolierten Reinkulturen müssen in Reagenzgläsern mit Papierstreifen und flüssigem Medium gezüchtet werden. Gute Resultate erhält man auch, wenn man Reagenzgläser mit einer schräg erstarrten Nähragarschicht benutzt, die mit einem Papierstreifen bedeckt ist. Auf diesem Papierstreifen gedeihen die Reinkulturen ausgezeichnet. Der einzige Nachteil des Verfahrens besteht darin, daß der sterile Papierstreifen nach dem Sterilisieren der Nährlösung gesondert in das Glas eingebracht werden muß. Diese Manipulation erfordert sehr viel Sorgfalt. Ferner kann man die Reinkulturen auf schräg erstarrten Schichten von Cellulose-, Stärke- oder Glucose-Agar kultivieren. Eine Aufbewahrung in Petrischalen ist dagegen nicht angebracht, da leicht eine Infektion durch Fremdbakterien erfolgen kann. Ältere Kulturen von Cellulosebakterien, insbesondere von Vibrionen und Myxobakterien, lysieren leicht und sterben dann ab. Daher müssen sie im allgemeinen mindestens zweimal im Monat auf frisches Nährsubstrat übertragen werden. Um die Haltbarkeit der Kulturen zu erhöhen, soll man sie nach fünf- bis sechstägigem Aufenthalt im Thermostaten von 25 bis 30° C bei einer etwas tieferen Temperatur, etwa zwischen 10 und 15° C, aufbewahren. Auch die Methode der lyophilen Trocknung von Kulturen ist für die Konservierung von Cellulosebakterien sehr brauchbar. Nach dieser Trocknung werden die Gläser mit den Kulturen im Kühlschrank bei —5° C gehalten. 7. Bestimmung der Bakterienmenge Die Bestimmung der Anzahl aerober Cellulosebakterien in einer Kultur ist erheblich schwieriger als die Auszählung anderer Bakterien. Dies trifft vor allem auf Kulturen zu, die auf Filtrierpapier gezüchtet wurden. Hier sind nämlich die Bakterienzellen sehr eng mit den Cellulosefasern verbunden, und ihre vollständige Ablösung von der Faser ist außerordentlich schwierig. Viel einfacher ist die Bestimmung in Kulturen, die auf Medien mit löslichen Kohlenhydraten, z. B. Glucose, kultiviert wurden. Gewöhnlich erfolgt die Bestimmung nach der vollständigen oder weitgehenden Zerstörung der Cellulose. Zu diesem Zweck filtriert man die Kulturflüssigkeit durch Baumwollgewebe und bestimmt im Filtrat die Anzahl der Zellen. Die Auszählung der lebenden Zellen erfolgt in Zählkammern bei entsprechender Vergrößerung. In Paralleluntersuchungen werden die Zellen in gefärbten Präparaten gezählt, indem man ein bestimmtes Volumen der Kulturflüssigkeit auf eine begrenzte Fläche, meist 4 cm2, des Meßglases bringt. In älteren Kulturen begegnet man neben sehr vielen degenerierten auch bereits abgestorbenen Zellen, die sich aufzulösen beginnen. Diese werden bei der Auszählung ebenfalls mit erfaßt, weshalb es richtiger ist, die Untersuchungen an jüngeren Kulturen durchzuführen. Hierbei sind einerseits 3*

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I. Aerobe Cellulosebakterien

die direkte Bestimmung der in der Kammer vorhandenen Zellen, andererseits die Verfahren von WLNOGRADSKL oder DREIER-KOROLEW genauer als die Berechnung der sich auf Cellulose-Agar entwickelnden Bakterienmenge oder die Methode der Auszählung nach vorheriger Verdünnung des Mediums. Ein Kriterium für die Intensität des Bakterienwachstums in der Kultur ist die Erhöhung des Gehaltes an organisch gebundenem Stickstoff und Phosphor. Die Zunahme der Stickstoff- und Phosphormenge ist der Entwicklung der aeroben Cellulosebakterien direkt proportional. 8. Bestimmung der Aktivität einer Kultur a) Nachweis der B e f ä h i g u n g zur Cellulosezersetzung Nach Herstellung der Reinkultur eines aeroben Cellulosebakteriums muß zunächst untersucht werden, ob diese Kultur wirklich in der Lage ist, Cellulose zu zersetzen; denn die Fähigkeit, sich auf Filtrierpapier entwickeln zu können, ist kein Zeichen dafür, daß die Cellulose tatsächlich angegriffen wird. Auf der Oberfläche von feuchtem Filtrierpapier wachsen nämlich häufig die verschiedenartigsten Mikroorganismen. Diese zersetzen die Cellulose nicht, sie gedeihen vielmehr auf Kosten der im Papier enthaltenen Verunreinigungen und der im Leitungswasser oder in der Laborluft vorhandenen Stoffe. Aus diesem Grunde beweist die Tatsache der Entwicklung von Mikroorganismen auf Cellulose noch nicht, daß sie zur Verwertung von Cellulose als Kohlenstoffquelle fähig sind. Ebensowenig überzeugend sind auch Untersuchungen an Wurzel- oder Knollengeweben (Kartoffeln, Karotten, Eüben usw.). Die Zerstörung der pflanzlichen Zellwände kann nicht nur von Cellulosebakterien sondern auch von anderen Mikroorganismen herrühren, z. B. solchen, die Pectinstoffe vergären. Bekanntlich können pectinzersetzende Bakterien (z. B. Bacillus fdsineus) die Zellwände von Kartoffelknollen zerstören, wobei die in den Zellen enthaltene Stärke frei wird. Cellulose wird jedoch von Bac. fdsineus nicht angegriffen. Man darf somit zur Klärung der Frage, ob ein bestimmter Mikroorganismus zur Zersetzung von Cellulose befähigt ist, keine natürlichen Substrate benutzen, sondern muß nach Möglichkeit Cellulose in reiner Form verwenden. In der Praxis kultiviert man auf hygroskopischer Watte oder Filtrierpapier, das durch die oben erwähnte Behandlung von den geringen noch vorhandenen Verunreinigungen befreit wurde. Bevor jedoch die isolierten Bakterien den cellulosezerstörenden Mikroorganismen zugeordnet werden können, muß noch ihre Aktivität bestimmt werden, d. h. man muß auf quantitativem Wege den durch die vorliegende Form hervorgerufenen Zerstörungsgrad der Cellulose feststellen. In der Literatur wurden Bakterien beschrieben, die nach einigen Wochen nicht mehr als 2 bis 3 % der Cellulose zersetzt hatten. Eine derart geringe Aktivität, die durchaus innerhalb der bei Cellulosebestimmungen üblichen Fehlergrenze liegen kann, berechtigt nicht zu der Annahme, daß das Bakterium tatsächlich Cellulose zersetzt.

A. Untersuchungsmethoden

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b) Q u a n t i t a t i v e B e s t i m m u n g d e r B e f ä h i g u n g z u r C e l l u l o s e z e r s e t z u n g a) Züchtungsmethoden Bei der Kultivierung von Cellulosebakterien muß vor allem für optimale Lebensbedingungen gesorgt werden, unter denen also eine maximale Cellulosemenge in möglichst kurzer Zeit zerstört wird. Die Bakterien lassen sich auf Filtrierpapier kultivieren, das zuvor getrocknet und gewogen und danach auf Kieselsäuregel oder nährstofffreies Agar in Petrischalen gelegt wird. WlNOGRADSKI empfiehlt auch Baumwollgewebe als Substrat. Zur Züchtung impft man das Papier oder Gewebe mit einer großen Anzahl von Zellen, um eine möglichst gleichmäßige Entwicklung der Bakterien auf der gesamten Celluloseoberfläche zu erreichen. Nach entsprechender Kulturdauer, bei 25 bis 30° C löst man die restliche, unzerstörte Cellulose samt Schleim und Bakterien von dem Gel ab und bestimmt die Cellulose nach einem der weiter unten beschriebenen Verfahren. Zur Aktivitätsbestimmung können auch Kulturen in Kolben mit flüssigem Nährmedium und Faltenfiltern benutzt werden. Um eine schnellere Zerstörung der Cellulose zu erreichen, empfiehlt es sich, an Stelle konischer Filter die in der Abb. 7 dargestellte Anordnung zu verwenden. Gute Resultate erhält man auch bei folgender Arbeitsweise. Man bedeckt den Boden eines Kolbens mit verschieden langen Glasröhrchen, so daß Abb. 7. Kolben zur Züchtung aerober Cellusie eine gleichmäßige Schicht bilden, losebakterien. Am Boden des Kolbens befindet auf die ein gewogenes Rundfilter gelegt sich eine dünne Schicht der Nährlösung mit wird. Dazu muß aber bemerkt werden, ziehharmonikaför mig gefaltetem Filtrierpapier daß die Entwicklung der Cellulosebakterien selbst dann nur relativ langsam erfolgt, wenn das flüssige Medium das Papier nicht bedeckt, sondern nur befeuchtet. In noch stärkerem Maße ist diese Erscheinung auch bei Faltenfiltern zu beobachten. Daher ist jetzt die früher häufig angewandte Kultivierung in stehenden Kolben durch bessere Züchtungsverfahren ersetzt worden. Besonders hervorzuheben ist dabei die Kultivierung von Cellulosebakterien in Kolben mit flüssigem Medium und Cellulose unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung.

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Abb. 33. Zellen der Art S. cellulosum

lang und 0,4 ¡i, breit; ihre Größenabmessungen schwanken je nach den Kultivierungsbedingungen und der Zusammensetzung der Nährlösung. Die jungen vegetativen Zellen vermehren sich durch Einschnürung. Diese Teilungsart führt dazu, daß die Tochterzellen an dem einen Ende spitz, am anderen aber abgerundet sind; sie besitzen somit entweder eine lanzettförmige Gestalt oder die Form eines in die Länge gezogenen Tropfens (Abb. 36). Die neu entstandenen Myxobakterien zeigen sowohl in der Längsrichtung als auch senkrecht zu ihr lebhafte Bewegungen. Häufig haften die Bakterien mit ihrem einen Ende an irgendeiner festen Oberfläche, z. B. am Deckglas, und führen mit dem anderen Ende schwingende, pendelartige Bewegungen aus. In einem vom Deckglas flachgedrückten Tropfen oder bei Kultivierung im hängenden Tropfen hört die Beweglichkeit sehr rasch auf, während sie bei Züchtung in flüssigen Nährmedien mehrere Tage erhalten bleibt. Die Beweglichkeit der Zellen kann nicht allein durch die Quellung des von ihnen ausgeschiedenen Schleimes erklärt werden, da sich die Bakterien sowohl vorwärts bewegen als auch krümmen können. Deshalb trifft man in den Präparaten häufig bogenförmig ge-

B. Morphologie und Systematik

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krümmte Formen an. Die Bakterienzellen bleiben auch nach ihrer Teilung dicht beieinander, wodurch die Pseudoplasmodien oder Schwarmstadien entstehen, die für diese Gruppe von Mikroorganismen so charakteristisch sind. Durch die Anwesenheit von Schleim verkleben die Zellen miteinander, wodurch große Bakterienansammlungen entstehen, in denen die Zellen ihre Beweglichkeit bereits verloren haben. Diese Bakterienfelder verändern sich in folgender Weise. Die vegetativen Zellen werden kürzer und dicker und gehen allmählich in kleine Stäbchen von 1,5 bis 2 ¡JL Länge und 0,3 [i. Breite über. Gleichzeitig sammeln sich in

Abb. 34. Band einer Kolonie der Art S. celhilomm. Deutlich läßt sich die schrittweise Bildung der Fruchtkörper aus kleinen Cysten erkennen

diesen Pseudoplasmodien die Bakterien an bestimmten Stellen, was schließlich zur Entstehung kleiner, aus verkürzten Myxobakterien bestehenden Zellhaufen führt. Einige dieser kurzen Zellen vereinigen sich und bilden kleine polygonale Cysten von 1,6 bis 3,2 [A Durchmesser. Sie besitzen keine feste Membran. Die in ihnen befindlichen Zellen sind jedoch ziemlich dicht gepackt. Bringt man die Cysten in einen Wassertropfen, so fallen sie nicht auseinander, sondern behalten ihre Gestalt bei. Die kleinen Sekundärcysten besitzen bereits die Gestalt der späteren Fruchtkörper. Die Cysten vereinigen sich unter Bildung von Agglomeraten, die sich wiederum zusammenlagern und noch größere Gebilde von runder Form ergeben. Der gesamte Prozeß der Fruchtkörperentstehung ist an Riesenkolonien sehr gut mikroskopisch zu beobachten. Wenn man vom Band einer Kolonie langsam der Mitte zuschreitet, kann man alle Zwischenformen finden. In den äußersten Randbezirken sind keine Cysten vorhanden, sondern nur junge Zellen. In einigem Abstand vom Rand sind bereits kleine Cysten und Cystenansammlungen zu erkennen. Im mittleren

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Bereich, sieht man schließlich runde oder ovale, aus vielen Cysten bestehende Fruchtkörper. Die Verhältnisse werden in der Abbildung 34 veranschaulicht. Die von S. cellulosum gebildeten Fruchtkörper besitzen einen Durchmesser von 400 bis 500 [i und eine rostbraune Farbe (Abb. 35). Die Fruchtkörper sind ungestielt und sitzen direkt auf einer eingetrockneten Schleimschicht. Obgleich sie von keiner Membran umgeben sind, liegen die Cysten derart dicht beieinander, daß man z. B. einzelne Fruchtkörper mit Hilfe einer Nadel isolieren kann, ohne daß sie auseinanderfallen.

Abb. 35. Einzelne Fruchtkörper der Art 8. cellulosum aus den zentralen Bereichen einer Riesenkolonie auf Stärke-Agar

Wie die Zellen aller Myxobakterien, besitzen auch die Zellen von S. ceUvlosum ein schwach lichtbrechendes Protoplasma von mattgrauer Färbung. Da auch keine feste Zellwand vorhanden ist, sind sie im ungefärbten Zustand schlechter zu erkennen als die Zellen echter Bakterien. Die Zugehörigkeit zu den Myxobakterien äußert sich auch in der schwierigen Anfärbbarkeit der Zellen. Mit einer einprozentigen Fuchsinlösung lassen sich die Zellen glänzendrot anfärben. Im Zentrum der Zellen von 8. cellulosum befindet sich ein kugelförmiger Chromatinkern mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,4 y.. Dieser Einschluß ist basophil und kann mit Methylenblau, Gentianaviolett oder Eisenhämatoxylin nach HEIDENHAIN angefärbt werden. Bevor sich die Zellen durch Einschnürung vermehren, teilt sich der Kern ebenfalls durch Einschnürung. Einige Zeit nach der Kernteilung sehen die beiden nebeneinanderliegenden Kerne wie eine 8 aus. Der Teilung der Kernsubstanz folgt die Zellteilung, indem sich der mittlere Teil der Zelle zunächst einbuchtet und allmählich durchschnürt. Wie aus der Abbildung 36 zu entnehmen ist,

B. Morphologie und Systematik

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enthalten die durch die Teilung entstandenen spitzen Enden der Tochterzellen je einen Tochterkern, der im Laufe der Zeit langsam in die Mitte der Zelle wandert. Nach der Entwicklungsgeschichte ist dieses Myxobakterium als neue SorangiumArt zu betrachten. Es wurde als 8. cellulosum nov. sp. beschrieben. W a c h s t u m a u f c e l l u l o s e h a l t i g e n M e d i e n . Die Zellen von S. cellulosum vermehren sich ausgezeichnet auf Filtrierpapier, das mit HUTCHlNSONscher Lösung getränkt ist. Bereits 24 Stunden nach dem Impfen tritt auf dem halb in die Flüssigkeit tauchenden Streifen in Höhe des Flüssigkeitsspiegels eine gelbliche Zone auf. Gleichzeitig kann man eine geringe Trübung der Flüssigkeit beobachten. Das Papier ist an der Angriffsstelle bald so stark zerstört, daß ein leichtes Schütteln

Abb. 36. Verschiedene Teilungsstadien des Chromatinkerns einer Zelle der Art S. cellulosum

des Beagenzglases genügt, um den Papierstreifen zu zerreißen. Zur raschen Zersetzung der Cellulose ist der freie Zutritt von Luft unbedingt erforderlich. Jedoch wird das am Boden des Glases befindliche Papier ebenfalls angegriffen, wenn auch der Abbau erheblich langsamer verläuft. Beim Impfen von feuchtem Filtrierpapier auf Kieselsäuregel entstehen hell- bis dunkelgelbe Flecken mit einer feuchten Oberfläche; in der Mitte sind sie dunkler gefärbt. Die Flecken sind unscharf begrenzt und erzeugen nie Fruchtkörper. Dies ist ein wesentliches Merkmal des Formenkreises S. cellulosum zum Unterschied von den Bassen der Art S. compositum. Die Entwicklung von Kulturen oder Kolonien auf Stärke-Agar verläuft nicht anders als die auf Papier. Auch auf Cellophan ist ein gutes Wachstum möglich. Das Cellophan wird dabei getrübt, und auf seiner Oberfläche entstehen zerstörte Bezirke mit diffusen Umrissen. Die Verwendung von Cellophan zur Züchtung der Bakterien ermöglicht ein direktes Studium der Beweglichkeitsverhältnisse und der Vermehrung bei Sorangium, da die Cellophanstückchen infolge ihrer Durchsichtigkeit unmittelbar zwischen Objektträger und Deckglas gebracht werden können. Untersucht man Proben aus den gefärbten Zonen des Filtrierpapiers auf Kieselsäuregel, so findet man im Anfangsstadium der Cellulosezerstörung auf den Fasern nur einzelne Bakterienzellen (Abb. 37). Die Bakterien vermehren sich aber intensiv

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I. Aerobe Celluloaebakterien

und dringen allmählich immer tiefer in die Fasern ein. Die Zellen von S. cdlulosu/m sind wesentlich kürzer als die von Sporocytophaga. Deshalb siedeln sie sich nicht nur längs der Faser an, wie es für Sporocytophaga typisch ist, sondern die Längsachse der Bakterien kann mit der Faserachse die verschiedensten Winkel bilden. Trotz der intensiven Entwicklung der Bakterien auf dem Papier erfolgt niemals eine vollständige Auflösung der einzelnen Fasern; zerstört werden in der Hauptsache deren äußere Schichten. Man findet deshalb auch im mittleren Bereich einer Kolonie, in der die Zerstörung der Cellulose am weitesten fortgeschritten ist, immer nur halbzerstörte Fasern.

Abb. 37. Zellen der Art S. cellulosum auf Cellulosefasern

Bei 8. cellvlosum bleibt die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung auch nach wiederholtem Uberimpfen auf frisches Stärke-Agar erhalten. Auch durch längeren Aufenthalt der Bakterien auf cellulosehaltigen Medien unter Laboratoriumsbedingungen wird die Intensität der cellulosezersetzenden Fermente nicht vermindert. W a c h s t u m a u f v e r s c h i e d e n e n Medien. S.cdlulosum ist im ernährungsphysiologischen Sinne keine eng spezialisierte Art. Das Bakterium gedeiht nicht nur auf Cellulosemedien, sondern auch auf Stärke-Agar ganz ausgezeichnet. Nach Strichimpfung eines derartigen Substrats erscheint sehr rasch ein gelber, glänzender, stark faltiger Belag von schleimiger Konsistenz, der nach und nach eine rostbraune Farbe annimmt. Die gelbbraunen Kolonien sind rund und mit einem wulstförmigen Ring umgeben, der von kleineren, konzentrisch angeordneten Kanälen durchzogen wird; das Zentrum ist kraterförmig vertieft (Abb. 38). Eine derartige Riesenkolonie auf Stärke-Agar erreicht in 15 Tagen einen Durchmesser von 11 mm und besteht aus drei kontinuierlich ineinander übergehende

B. Morphologie und Systematik

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Zonen. Die Randzone besitzt die Form eines glatten gelben Reifens mit stark gezacktem Rand. In Richtung zum Mittelpunkt der Kolonie steigt sie an und geht in einen dunkelbraunen Wall mit unebener, warziger Oberfläche über. Daran anschließend beginnt die kraterförmige Vertiefung, die den gesamten mittleren Raum der Kolonie einnimmt. Je mehr man sich dem Mittelpunkt nähert, um so glänzender wird die Färbung, und die braunen Farbtöne werden durch gelbe abgelöst (Abb. 38).

Abb. 38. Riesenkolonie der Art S. cellulosum auf Stärke-Agar, a — Gesamtansicht; b — schematischer Querschnitt; die Fruchtkörperanhäufungen sind deutlich zu erkennen

Der aus der Substratebene herausragende braune Wall besteht aus zahlreichen in der Entwicklung befindlichen Fruchtkörpern. In den mittleren, älteren Bereichen der Kolonie findet man in verhältnismäßig geringer Zahl reife Fruchtkörper. Ein derartiger Aufbau der Kolonie beruht auf dem gesetzmäßigen Entwicklungszyklus des Myxobakteriums. Die Anordnung der Cysten und Fruchtkörper ist in der schematischen Abbildung 38b wiedergegeben. Die Entwicklung der Myxobakterien auf Stärke-Agar verursacht eine Hydrolyse der Stärke. Nach Behandlung des Mediums mit LuGOLscher Lösung erhält man rings um die Kolonie eine breite ungefärbte Zone. In Schrägkulturen auf Stärke-Agar gibt das gesamte Nährsubstrat, mit Ausnahme der höchsten Stellen, an denen kein Wachstum vorhanden ist, eine negative Jodreaktion auf Stärke.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Die Bildung des gelben Farbstoffs kann unterbleiben. Eine längere Züchtung auf HuTCHlNSONschem Medium mit Cellulose führte zum vollständigen Verlust der Fähigkeit, gefärbte Kolonien zu bilden. Diese Varietät (Leukorasse) erwies sich jedoch als ziemlich unbeständig, da nach mehrmaliger Übertragung auf frisches Stärke-Agar die Kultur wieder ihre gewohnte Farbe zeigte. S. cellulosum gedeiht ausgezeichnet auf HuTCHINSONscher Nährlösung unter Zusatz von etwa 0,5% verschiedener Kohlenhydrate (Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Dextrine). Der Beginn des Bakterienwachstums macht sich in einer gleichmäßigen Trübung der Flüssigkeit bemerkbar. Nach einiger Zeit bildet sich auf der Oberfläche der Nährlösung eine lockere, braune, ziemlich dicke Schleimhaut, die leicht zu Boden sinken kann; an ihrer Stelle wird jedoch sofort eine neue gebildet. Das Bakterienwachstum in der Flüssigkeit wird von der Bildung eines Pigments begleitet, das die Lösung braun färbt. In der Abbildung 39 ist rechts ein Reagenzglas mit einer Kultur von S. cellulosum in einer 0,5% Glucose enthaltenden Nährlösung abgebildet. Links ist zum Vergleich ein entsprechender Blindversuch ohne Glucose dargestellt. Abb. 39. S. cellulosum auf Nährlösung mit PRONINA führte Untersuchungen einem Zusatz von 0,5% Glucose. Im rechts abgebildeten Röhrchen ist deutlich die über die Biologie der mit 8. cellulosum intensive Bildung eines braunen Farbstoffs verwandten Myxobakterien durch. Dazu erkennen (links Kontrollversuch) bei gelang es, die für die Zersetzung der in den Papierfabriken hergestellten Papiermasse verantwortlichen Organismen zu isolieren. Diese gelangten hauptsächlich mit dem in den Werken benutzten Flußwasser in die Papiermasse. Im Leitungswasser sind sie dagegen in geringerer Menge vorhanden. Von den Bakterien aus der Papiermasse und dem Wasser konnte PRONINA auf cellulosehaltigen Medien eine ganze Reihe von Anreicherungskulturen herstellen, wobei auch einige Cellulosemyxobakterien isoliert wurden. Zur darauf folgenden Reinzüchtung wurde als Substrat Stärke-Agar verwendet. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen wieder die Tatsache, daß man bei derartigen Isolierungsversuchen gewöhnlich die Formen erhält, die sich auf dem benutzten Medium am besten entwickeln können. Alle Kulturen wuchsen auf dem Stärke-Agar ausgezeichnet und

B. Morphologie und Systematik

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bewirkten eine Hydrolyse der Stärke. Aber auch Cellulose wurde von ihnen intensiv zersetzt. Die Untersuchungen von PRONINA haben folgende Resultate ergeben. Zehn verschiedene zur Gattung Sorangium gehörende Myxobakterien wurden in Reinkultur isoliert. Einige von ihnen waren der bereits beschriebenen Art S. cellulosum sehr ähnlich, andere unterschieden sich von ihr in einer Reihe von Merkmalen. Die Arten wurden nicht im einzelnen beschrieben, aber die Gruppe ist insgesamt recht ausführlich charakterisiert worden. Die vegetativen Zellen von Sorangium besitzen eine Dicke von 0,5 bis 1 (X, während ihre Länge bei den verschiedenen Arten von 2,7 bis 4,3 [x schwankt. In morphologischer Hinsicht können die vegetativen Zellen in zwei Gruppen eingeteilt werden. In der ersten Gruppe sind Zellen mit abgerundeten Enden enthalten, in der zweiten sind die Zellenden etwas zugespitzt. Jedoch wurde keine einzige Form isoliert, deren vegetative Zellen stark zugespitzte Enden, d. h. die für Cytophaga und Sporocytophaga charakteristische Nadelform, besaßen. Nach einiger Zeit verkürzen sich die vegetativen Zellen und verwandeln sich in Mikrocysten. Wenn z. B. die Stäbchen einer zwei Tage alten Kultur eine Länge von 3,4 bis 4,3 ¡x und eine Breite von 0,4 bis 1 [x besitzen, so beträgt in einer zwölf Tage alten Kultur die Länge 2 [X und die Breite 0,7 bis 1 fx. In einigen Fällen erfolgt gleichzeitig mit der Verkürzung der Zellen eine Verdickung; bisweilen werden sie gleichzeitig auch dünner oder behalten ihre Breite unverändert bei. Die Zellen aller isolierten Sorangium-Vormen besitzen einen Kern, der sich mit basischen Farbstoffen gut anfärben läßt. Dadurch unterscheiden sie sich besonders von den gewöhnlichen Bakterien. Im hängenden Tropfen zeigen die SorangiumZellen eine aktive Beweglichkeit. Junge, lange Zellen können eine schlängelnde Bewegung ausführen, wodurch sie in gewisser Weise den Spirillen ähnlich sind. Diese Eigenschaft besitzen jedoch nur lebende Zellen, während in fixierten und gefärbten Präparaten allenfalls noch gekrümmte Stäbchen sichtbar sind. In älteren Kulturen fehlen auch diese. In älteren Kulturen ist die schlängelnde Bewegung der Zellen weniger deutlich ausgeprägt. Die Enden führen jedoch weiterhin Schwingungen aus. Eine besonders intensive Bewegung beobachtet man dann, wenn die Zellen sich in einem engen Kontakt mit einer festen Oberfläche, z. B. von Agar, Glas, Papier usw., befinden. Andererseits läßt sich in einem nicht vom Deckglas bedeckten Tropfen auf dem Objektträger bei 600facher Vergrößerung eine gewisse Beweglichkeit der Bakterien beobachten, die nicht nur in den oberen Schichten, sondern auch im Innern des Tropfens sichtbar ist. Auf einem festen Medium, z. B. einer Agaroberfläche, kann man eine Vorwärtsbewegung des gesamten Randes der Kolonie bereits zehn Minuten nach dem Impfen erkennen. Eine derartige frontale Bewegung ist für die Myxobakterien sehr charakteristisch. Irgendwelche Geißeln sind bei isolierten und nach LÖFFLER angefärbten Myxobakterien nicht zu entdecken. Alle Sorangium-Formen bilden auf Stärke-Agar Fruchtkörper, auf Cellulose dagegen nicht. In Kolonien auf Stärke-Agar entstehen Sekundärcysten von 4 bis 6 (x Durchmesser, was ein typisches Merkmal für den Formenkreis von S. cellulosum ist.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Bei den verschiedenen Arten sind die Sekundärcysten von unterschiedlicher Größe, z. B.: Länge 33 ¡JL, Breite 29 (JL; Länge 6.7 fx, Breite 6,7 ¡x; Länge 20 ¡x, Breite 16,7 (x. Am häufigsten kommen jedoch Cysten mit einem Durchmesser von 4 bis 6 ¡x vor. Die Fruchtkörper besitzen runde, eiförmige oder ovale Gestalt und bestehen aus einer Anhäufung von Cysten. Ihre Abmessungen schwanken ebenfalls stark, z. B.: Länge 13 ¡x, Breite 13 (x ; Länge 20 [x, Breite 20 (x; Länge 50 [x, Breite 20 (x; Länge 140 ¡x, Breite 100 (x; Länge 260 jx, Breite 180 ¡x; Länge 420 (x, Breite 300 [x. PRONINA schlägt vor, die Begriffe primäre und sekundäre Cysten fallen zu lassen und die sekundären Cysten als Cysten und ihre Ansammlungen als Fruchtkörper zu bezeichnen. Anwendbar ist dieser Vorschlag offenbar nur für solche SorangiumFormen, die keine derartig hoch organisierten Fruchtkörper wie S. compositum besitzen. Unter den isolierten Cellulosemyxobakterien befand sich kein einziger Vertreter der Gattung Archangium. In einigen grünen oder braunen Kulturen befanden sich jedoch an der Oberfläche des Substrats Kolonien aus zahlreichen schleifen- oder röhrchenförmigen Zellen, die sich allmählich in der Längsrichtung verdrehten. Diese Art des Wachstums erinnert an Archangium. Später entstanden aus den Röhrchen jedoch eiförmige Fruchtkörper, was darauf hinzuweisen scheint, daß eine scharfe Grenze zwischen Sorangium und Archangium nicht besteht. Andererseits darf nicht außer acht gelassen werden, daß Sorangium bei der Züchtung unter Laboratoriumsbedingungen mitunter die Fähigkeit zur Ausbildung von Cysten verliert. In diesem Zustand können sie leicht für Archangium-Voimen gehalten werden. Wie bereits erwähnt, bilden die verschiedenen Sorangium-Formen bei ihrer Entwicklung auf Filtrierpapier die mannigfaltigsten Pigmente. Dagegen konnten auf Papier nie Fruchtkörper beobachtet werden. Unter den gebildeten Pigmenten findet man solche von hellgelber, gelber, grüner, rosa, hellorange oder brauner Farbe. Einige Formen bewirken aber auch keine Färbung des Papiers. Die orangefarbenen und gelben Pigmente gehören zweifellos zu den Carotinoiden. Mit zunehmendem Alter der Kultur verblassen die Farben, was bei den Carotinoiden auf eine Oxydation, bei den grünen und blauen Farbstoffen auf eine Reduktion zurückzuführen ist. Findet in dem Medium gleichzeitig mit der Cellulosezersetzung eine Denitrifizierung statt, so beobachtet man infolge der Alkalisierung des Mediums das Auftreten von grauen Farbtönen, die durch Oxydation nach Bot umschlagen können. Im allgemeinen bewirkt die Züchtung bei höheren Temperaturen und verringerter Feuchtigkeit eine verstärkte Farbstoffabsonderung. Von den festen, cellulosefreien Medien hat sich zur Kultivierung der verschiedenen Sorangium-T?ormen, wie bereits erwähnt, am besten Stärke-Agar bewährt, auf dem sich am häufigsten die verschieden gelb oder braun gefärbten Kolonien entwickeln. Seltener werden hellgrüne Kolonien gebildet. Das Aussehen der Kolonien wird zu einem gewissen Grade von der Intensität der Schleimbildung bestimmt. Einige Formen bilden reichlich Schleim, andere dagegen wesentlich weniger. Manchmal ist die Schleimbildung derart intensiv, daß die Kolonien von einer schleimigen, transparenten Hülle umgeben sind (Abb. 40).

T a f e l 14

Abb. 40. Schleimbildende Sorangium,-Kolonie

auf Stärke-Agar

Abb. 41. Schleimbildende Sorangium-Kolonien auf Stärke-Agar. Die Kolonien wurden mit Jodlösung behandelt und lassen in ihrer Umgebung ungefärbte Zonen abgebauter Stärke erkennen

B. Morphologie und Systematik

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Die Gestalt der Kolonien und die Anordnung der Fruchtkörper hängt wesentlich davon ab, ob sich die Mykobakterien auf der festen Oberfläche des Mediums aktiv fortbewegen können. Da sich der Eand der Kolonie stets vorwärts bewegt, sind die Fruchtkörper meist über die gesamte Oberfläche verteilt. Untersucht man derartige Kolonien im durchfallenden Licht, so sind einzelne Fruchtkörper als Punkte sichtbar. Die gezackten Ränder, die aus einzelnen Auswüchsen bestehen (Wimperrand), sind ebenfalls auf die Fähigkeit der Bakterien zur aktiven Fortbewegung zurückzuführen. Die Anordnung der Fruchtkörper in der Kolonie ändert sich mit zunehmendem Alter. Durch Eintrocknen des Schleims in den älteren Kolonien findet eine Wanderung der Cysten zur Mitte hin statt. Formen, die einen sehr dünnflüssigen Schleim erzeugen, können sich auf der Agaroberfläche rasch bewegen und breiten sich gleichmäßig auf dem Substrat aus. Wird dagegen ein mehr viskoser Schleim ausgeschieden, so nehmen die Kolonien eine kuppeiförmige Gestalt an. Der Durchmesser derartiger Kolonien schwankt zwischen 1 und 10 mm. Ihre Oberfläche ist je nach der Schleimbildung matt oder glänzend, die Ränder sind verschwommen. Die Fruchtkörper sind entweder in konzentrischen Ringen angeordnet oder in der Mitte der Kolonie angehäuft. Kolonien auf Stärke-Agar sind von einer breiten Hydrolysenzone der Stärke umgeben, die nach Behandlung mit Jod als ungefärbter Ring deutlich sichtbar ist (Abb. 41). Besondere Beachtung verdient die Fähigkeit der Bakterien, sich nicht nur auf der Agaroberfläche zu entwickeln, sondern auch in das Innere des Substrats vorzudringen. In der Literatur wird diese Erscheinung auf verschiedene Weise erklärt. Einige nehmen an, daß das mehr oder weniger tiefe Eindringen der Kolonien von der Zähigkeit des Mediums abhängt, da dieser Vorgang bei einer höheren Agar-AgarKonzentration (1 bis 1,5%) zum Stillstand kommt. Andere führen zur Erklärung an, daß die Zellen rein mechanisch infolge ihrer Schwere einsinken. Noch andere führen das Hineinwachsen in das Agar auf den erhöhten Wasserbedarf an den Stellen der Bakterienentwicklung zurück. Die Entwässerung dieser Stellen bewirkt dann die Senkung der Kolonien. Zweifellos hängt diese Erscheinung nicht mit einer Verflüssigung des Agars zusammen, da sie auch auf Kieselsäuregel mit regenerierter Cellulose zu beobachten ist. Wie PRONINA feststellte, treten bei Sorangium häufig Kolonien auf, die in das Stärke-Agar hineinwachsen. Dies könnte damit erklärt werden, daß durch die Wirkung der Bakterienamylase ein Abbau der Stärke erfolgt und somit die Abstände der Agarmicellen vergrößert werden; in die so entstandenen Zwischenräume dringen dann die Bakterien ein. Folglich ist nicht die Festigkeit des Agars von ausschlaggebender Bedeutung, sondern die Existenz hinreichend großer Zwischenräume zwischen den Micellen. Gewöhnlich werden auch die osmotischen Eigenschaften des Mediums und die Rolle des von den Kolloiden und gelösten Stoffen gebundenen Wassers nicht genügend berücksichtigt. Erhöht man nämlich den Peptongehalt des Mediums, d. h. bindet man das Wasser an Kolloide, so wachsen die Kolonien nicht mehr in das Substrat hinein. PRONINA ist der Ansicht, daß die

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Kolonien nicht passiv absinken, sondern aktiv in die tieferen Schichten des Mediums vordringen. Zur Probenentnahme muß man deshalb die oberen Agarschichten entfernen. Wenn zu wenig freies Wasser vorhanden ist, verringert sich selbstverständlich auch die Beweglichkeit der Bakterien. Im gleichen Sinne wirkt eine zu große Festigkeit des Agars. Anscheinend gehören die in das Substrat hineinwachsenden Formen zu denen, die sich auch unter ungenügender Luftzufuhr entwickeln können. Die Arbeiten von PRONINA sind nur als Beginn des Studiums der großen Zahl von Mykobakterien zu betrachten, die in der Natur sehr verbreitet und an der Zersetzung der Cellulose wesentlich beteiligt sind. Die nächsten Aufgaben bestehen darin, ausführlichere Untersuchungen über die Systematik und die Ernährungsphysiologie durchzuführen. Auf Grund der bisherigen Arbeiten kann jedoch über die Biologie der Sorangium-Gruppe bereits folgendes gesagt werden: 1. Die Vertreter dieser Gruppe besitzen relativ wenig Ähnlichkeit mit den in Monographien und Bestimmungsbüchern beschriebenen klassischen Myxobakterien. In ihrem Wachstum und in der Tatsache, daß sie auf einem Cellulosesubstrat keine Fruchtkörper bilden, erinnern sie stark an gewöhnliche sporenlose Bakterien. 2. Die Anzahl der zur Gruppe S. cellulosum gehörenden Arten ist zweifellos größer als die Anzahl der anderen cellulosezersetzenden Myxobakterien. Spezialisierte Formen, die ähnlich wie Cytophaga und Sporocytophaga ausschließlich Cellulose angreifen, gibt es unter ihnen nicht. Die Vertreter der Gruppe Sorangium gehören zu den Polyphagen; es ist deshalb nicht ausgeschlossen, daß sie die Cellulose erst dann angreifen, wenn andere Nahrungs- und Energiequellen fehlen. 3. An der Zugehörigkeit dieser Organismen zu den Myxobakterien besteht kein Zweifel. Dafür sprechen die Morphologie der Zellen, die Zellteilung durch Einschnürung, die Existenz eines Zellkernes, die charakteristische schlängelnde Beweglichkeit, das Fehlen von Geißeln, die Verkürzung der Zellen während des Entwicklungszyklus, die Bildung von Mikrocysten, die Entstehung sekundärer Cysten durch Zusammenlagerung einzelner Mikrocysten, die Bildung von Fruchtkörpern auf cellulosefreien Substraten, die charakteristische Struktur der Kolonien, die Fähigkeit des Randes der Kolonie zur Vorwärtsbewegung, das Kriechen auf einem festen Medium und zahlreiche weitere Merkmale. 4. Sämtliche eben aufgezählten Kennzeichen müssen bei allen sporenlosen Cellulosebakterien genau überprüft und daraufhin deren systematische Stellung neu festgelegt werden. Denn es ist sehr wahrscheinlich, daß einige als sporenlose Erreger der Cellulosezersetzung beschriebene Cdlulomonas-, Pseudobaderium-, Pseudomonas- und andere Formen in Wirklichkeit den Gruppen S. cellulosum oder Promyxohacterium angehören, d. h. Myxobakterien sind, die auf Cellulose keine Fruchtkörper bilden und in ihrer äußeren Form schwer von den gewöhnlichen sporenlosen Bakterien zu unterscheiden sind. 3. Sporenlose Bakterien Die Arbeiten von OMELJANSKI über die Herstellung von Anreicherungskulturen haben allgemeine Beachtung gefunden. Nach seinen Arbeitsvorschriften konnten

B. Morphologie und Systematik

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Anreicherungskulturen anaerober Cellulosebakterien in den verschiedensten Ländern erhalten werden. Die erste Reinzüchtung aerober Cellulosebakterien ist ebenfalls mit dem Studium der anaeroben Kulturen von OMELJANSKI verbunden. KELLERMAN und MCBETH (1912) konnten Kulturen aus dem Laboratorium von OMELJANSKI auf Cellulose-Agar weiterzüchten. Dabei gelang es ihnen, aus einer Kultur von Wasserstoffbakterien zwei aerobe Cellulosebakterien und fünf Begleitbakterien zu isolieren. Ferner konnten aus einer Kultur von Methanbakterien ein aerobes Cellulosebakterium und zwei Begleitbakterien erhalten werden. Nachdem aus anderen Quellen Reinkulturen von noch elf weiteren aeroben Cellulosebakterien angelegt werden konnten, wurden die Ergebnisse mit einer Beschreibung dieser Organismen veröffentlicht. Als Kriterium für die cellulosezersetzende Aktivität der beschriebenen Bakterien benutzten die Autoren das Auftreten eines transparenten Hofes rings um die Kolonien, der von einer Hydrolyse der Cellulose herrührt. OMELIANSKY (1913) hat jedoch darauf hingewiesen, daß die hellen Zonen auch durch die Auflösung des im Medium vorhandenen Calciumcarbonats durch die sich bildenden Säuren hervorgerufen werden können. Diese Meinungsverschiedenheit ist lange Zeit ausführlich diskutiert worden. LÖHNIS u n d LOCHHEAD ( 1 9 1 3 ) modifizierten die M e t h o d i k v o n KELLERMAN,

indem sie die Cellulosekonzentration im Agar von 1% auf % bis % % Cellulose herabsetzten und statt Ammoniumsulfat Natriumnitrat zugaben. Bei der Züchtung aerober Cellulosebakterien auf einem derartigen Agar erhielten sie ebenfalls Zonen hydrolysierter Cellulose. Diese blieben auch nach einer Behandlung des Substrats mit Salzsäure erhalten. Folglich können sie nicht mit einer Auflösung des Calciumcarbonats zusammenhängen, sondern sind auf eine Diffusion der cellulosezersetzenden Enzyme zurückzuführen. PRINGSHEIM (1912) jedoch, der einige Kulturen von LÖHNIS und Mitarbeitern (Bad. find, Bact. flavigenum, Bact. redum u. a.) untersuchte, konnte die Fähigkeit der Bakterien zur Zersetzung von Cellulose nicht bestätigen. Er nahm an, daß die Organismen ein Endoenzym produzieren und demzufolge theoretisch keine Hydrolysenzone existieren kann. Eine ähnliche ablehnende Haltung zur Frage der Cellulosezersetzung nahm auch CHÄRPENTIER (1920, 1921) ein. Im Laufe der nächsten 40 Jahre sind die von KELLERMAN und MCBETH (1912), KELLERMAN, MCBETH, SCALES u n d SMITH ( 1 9 1 3 / 1 4 ) isolierten K u l t u r e n häufig

Gegenstand von Untersuchungen gewesen. Dabei stellte sich heraus, daß einige der Bakterien in Nährböden mit mineralischem Stickstoff die Cellulose nicht zersetzten, während dieselben Bakterien in Substraten mit organisch gebundenem Stickstoff dazu durchaus in der Lage waren [BRADLEY (1923), BRADLEY und RETTGER (1927), SKINNER ( 1 9 2 9 ) sowie SNIESZKO ( 1 9 2 9 ) ] .

Diese Untersuchungen scheinen die Ergebnisse von KELLERMAN und Mitarbeitern (1912, 1913/14) zu bestätigen. Gleichzeitig unterstreichen sie nochmals die Richtigkeit der allgemeinen theoretischen Überlegungen, von denen WLNOGRADSKI (1952) u n d OMELIANSKI (1895, 1 9 0 2 ) bzw. OMELJANSKI ( 1 8 9 9 ) ausgingen, als sie für die

Kultivierung der aeroben und anaeroben Cellulosebakterien elektive Medien vorschlugen. In diesem Zusammenhang wäre noch zu bemerken, daß OMELJANSKI 6

Imschenezki, Mikrobiologie

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I. Aerobe Cellulosebakterien

niemals behauptet hat, seine Kulturen seien rein. Sie stellten lediglich Anreicherungen dar; die in ihnen enthaltenen sporenbildenden Bakterien waren jedoch spezifische Erreger der Cellulosegärung. In den vergangenen 50 Jahren sind die Resultate von OMELJANSKI von zahlreichen Autoren des öfteren bestätigt worden. Dabei wurden Anreicherungs-, bisweilen auch Reinkulturen der gleichen sporenbildenden Form erhalten, die auch OMELJANSKI isoliert hatte. KELLERMAN und MCBETH (1912) versuchten, die Erreger der aeroben Cellulosezersetzung aus Kulturen ausgesprochen anaerober cellulosevergärender Bakterien zu isolieren. Da dieses Vorgehen den Vorstellungen von der Ökologie der Mikroorganismen widerspricht, ist es nicht verwunderlich, daß es den Autoren kein einziges Mal gelungen ist, echte engspezialisierte Bakterienformen zu isolieren, die die Cellulose unter aeroben Bedingungen zersetzen. Somit ist es also nur nach den Verfahren von WLNOGRADSKI und OMELJANSKI möglich, aerobe cellulosezersetzende echte Bakterien und Myxobakterien zu isolieren. Viele von KELLERMAN und MCBETH erhaltene Formen, die von BERGEY unter der Bezeichnung Cellulomonas zusammengefaßt wurden, gedeihen auf gewöhnlichen Substraten ausgezeichnet und, was die Hauptsache ist, zersetzen die Cellulose nur schwach. Offenbar spielen sie in der Natur bei der Cellulosezersetzung im Vergleich zu den obligaten Celluloseformen nur eine untergeordnete Rolle. Diese Annahme wird besonders durch ihr vereinzeltes Vorkommen im Boden bestätigt, in dem sie viel seltener anzutreffen sind als die Myxobakterien. Dabei ist allerdings zu bemerken, daß die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung früher mit Hilfe von Cellulose-Agar festgestellt wurde, das durch den Gehalt an umgefällter Cellulose in seinen Eigenschaften stark von den natürlichen Bedingungen abweicht. Es ist kaum zu rechtfertigen, eine Form zu den Cellulosebakterien zu rechnen, nur weil sie auf Cellulose-Agar eine Hydrolysenzone hervorruft. Vielmehr muß man zur Untersuchung Cellulosematerial heranziehen, das in keiner Weise chemisch vorbehandelt ist. Seit der Entdeckung des Erregers der Cellulosegärung durch OMELJANSKI (1901) sind viele Jahre vergangen, in denen Reinkulturen aerober Cellulosebakterien in den verschiedensten Laboratorien angelegt worden sind. Wie bereits erwähnt, haben KELLERMAN und andere ( 1 9 1 2 , 1 9 1 3 / 1 4 ) unter Verwendung von Cellulose-Agar eine große Anzahl cellulosezerstörender nichtsporenbildender Bakterien isoliert. Dazu gehörten auch Formen mit peritrichial angeordneten Geißeln. Nach den damals gültigen systematischen Regeln wurden diese Formen unter der Bezeichnung Bacillus zusammengefaßt. Später wurden Bakterien aufgefunden, die eine oder mehrere Geißeln am Ende der Zelle besaßen und folglich zu Pseudomonas zählten. Schließlich wurden viele unbewegliche Formen ohne Geißeln als Bacterium bezeichnet. Obwohl viele dieser Organismen in der Natur die Cellulose angreifen, sind sie doch bis heute noch nicht als „klassische" Cellulosebakterien anerkannt worden. Bezeichnenderweise ist seit dem Erscheinen der Arbeiten von KELLERMAN und MCBETH (1912) und KELLERMAN, MCBETH, SCALES und SMITH (1913/14) nur eine geringe Anzahl von Publikationen über ähnliche Formen erschienen. Die meisten Arbeiten enthalten Beschreibungen von eng spezialisierten Cellulosezerstörern, wie

B. Morphologie und Systematik

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sie die Mykobakterien und Vibrionen darstellen [WLNOGRADSKI (1952), STAPP und BORTELS (1934), HARMSEN (1946), IMSCHENEZKI und SOLNZEWA (1936, 1937)]. Die Befähigung der von KELLERMAN beschriebenen Formen zur Cellulosezersetzung veranlaßte BERGEY (1936) dazu, in der Familie Bacteriaceae einen besonderen Zweig der Celluiomonadaceae aufzustellen. Dieser Zweig enthielt nur eine Gattung, CeUulomonas, der alle von KELLERMAN und anderen amerikanischen Autoren beschriebenen cellulosezersetzenden Bakterien zugeordnet wurden. Diese Klassifizierung hat sich später als unbegründet herausgestellt, so daß der Zweig der Cellulomonadaceae in der 5. Auflage des gleichen Bestimmungsbuches (1939) beseitigt worden ist. Die früher zu CeUulomonas gehörenden Formen mit Geißeln an den Enden der Zellen wurden der Gattung Pseudomonas zugeordnet, während die Mikroorganismen mit unbeweglichen Zellen jetzt zur Gattung Bacterium gehören. Die 5. Auflage des Bestimmungsbuches führt zwar die Gattung CeUulomonas noch an, sie enthält jedoch nur noch 18 Arten, deren Zellen peritrichial angeordnete Geißeln aufweisen. Trotzdem hat auch das Verbleiben der Gattung CeUulomonas in der darauffolgenden 6. Auflage Widersprüche hervorgerufen, weshalb KRASSILNIKOW (1949) in seinem „Bestimmungsbuch der Bakterien und Actinomyceten" die strittige Gattung nicht mehr anführt. Die zuvor in ihr enthaltenen Arten wurden den Pseudobakterien und Chromobakterien zugeordnet. Es dürfte sich hier erübrigen, eine Charakteristik der einzelnen Formen zu geben, da diese in den gebräuchlichen Bestimmungsbüchern zu finden sind. Anschließend sollen die einzelnen Arten deshalb nur aufgezählt und kurze morphologisch-physiologische Hinweise gegeben werden, die die ganze Gruppe betreffen. 1916 hat MCBETH folgende 31 sporenlose Arten beschrieben: Bacillus albidus, Bac. almus, Bac. autogenes, Bac. bibulus, Bac. biazoteus, Bac. caesius, Bac. cellaseus, Bac. concitatus, Bac. desidiosus, Bac. galbus, Bac. gelidus, Bac. gilvus, Bac. ingis, Bac. pusilus, Bac. rossicus, Bac. svbattms, Bacterium acidulum, Bact. castigatum, Bact. fimi, Bact. flavigenum, Bact. idoneum, Bact. liguatum, Bact. lucrosum, Bact. udum, Pseudomonas arguta, Ps. effusa, Ps. minuscula, Ps. mira, Ps. perlurida, Ps. subcreta, Ps. tralucida. In den folgenden Jahren sind nur relativ wenige cellulosezersetzende sporenlose Formen beschrieben worden. KALNINS (1929/31, 1931) isolierte die Arten Bact. bosporum und Bact. protozoides, HOROWITZ-WLASSOWA (1935/36) die Art Bact. cdlulosolyticum flavum. Einige Kulturen wurden von JENSEN (1940) und von DUBOS (1928) angelegt. Beide Autoren benutzten jedoch für die von ihnen erhaltenen Stämme nur Buchstabenbezeichnungen. FÜLLER und NORMAN (1943) beschrieben drei Pseudomonasa.Tten recht ausführlich: Ps. ephemerocyanea, Ps. lasia, Ps. erythra; ferner wird noch die Art Achromobacter picrum erwähnt. Abgesehen von der Art CeUulomonas flava (SACK, 1924), deren Fähigkeit zur Cellulosezersetzung stark angezweifelt wird, enthält die Aufstellung alle in der Literatur als cellulosezersetzende Formen beschriebenen Arten. Wie aus dieser Zusammenstellung hervorgeht, wurden außer den von KELLERMAN und McBETH (1912) und KELLERMAN, McBETH, SCALES und SMITH (1913/14) 8*

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I. Aerobe Cellulosebakterien

beschriebenen Formen nur relativ wenige cellulosezersetzende sporenlose Bakterien aufgefunden. Möglicherweise hängt diese Erscheinung damit zusammen, daß man früher zu den sporenlosen Bakterien fälschlicherweise auch die Vertreter anderer Gruppen von Cellulosebakterien, z. B. die Mykobakterien, gerechnet hat. Ausführlicher wird weiter unten davon die Rede sein. Alle sporenlosen Bakterien besitzen viele gemeinsame morphologische Besonderheiten. Es handelt sich um kleine Stäbchen mit abgerundeten Enden, die meist gramnegativ sind und weder Ketten noch "Verzweigungen bilden. Sie sind 0,9 bis 2,8 [I, lang und 0,4 bis 0,7 (JL breit. Man findet unter ihnen sowohl Formen mit ein bis drei polar angeordneten Geißeln als auch peritrichial begeißelte Arten. Einige Bakterien sind vollkommen unbeweglich; von den 31 von McBETH beschriebenen Formen waren 22 beweglich. Einige Arten der Gattung Pseudomonas sind schwach gekrümmt; man kann sie dann vielleicht den Vibrionen zuordnen. Nach NORMAN und FÜLLER (1942) besteht der Unterschied zwischen Cellulomonas und Cellfalcicula darin, daß letztere Gattung Zellen mit spitzen Enden aufweist. Dies dürfte jedoch kaum zutreffen, da viele Merkmale, die bereits im Abschnitt über die Myxobakterien erwähnt wurden, ohne Zweifel als Beweis dafür angesehen werden können, daß Cellfalcicula zu den Myxobakterien gehört. Die sporenlosen Bakterien zersetzen die Cellulose langsamer als die spezialisierten Myxobakterien. Filtrierpapier, das in eine Nährlösung eintaucht, wird von ihnen in Höhe des Flüssigkeitsspiegels zerstört; an dieser Stelle zerreißt dann das Papier. Niemals jedoch verwandeln die sporenlosen Bakterien das Papier in eine dünne, schleimige Schicht unter völliger Zerstörung der Cellulosefasern wie die spezialisierten Myxobakterien. Sehr viele sporenlose, cellulosezersetzende Bakterien bilden Farbstoffe. Das angegriffene Papier zeigt deshalb gelbe und braune, seltener rötliche oder blauviolette Färbungen. Die Zerstörung der Cellulose durch die sporenlosen Bakterien erfolgt verhältnismäßig langsam. Nach 15 Tagen sind erst etwa 11 bis 16% der Cellulose abgebaut (BRADLEY und RETTGER, 1927). Durch quantitative Bestimmung der in alten Kulturen noch verbliebenen Cellulose wurde festgestellt, daß Bact. liquatum, Bact. flavigenum und Bact. gelidum auf peptonhaltigen Medien etwa 42 bis 50% der Cellulose zersetzen (SKINNER, 1929). Auf ein den sporenlosen Cellulosebakterien eigentümliches Charakteristikum, das bei den Myxobakterien fehlt, sei noch hingewiesen. Mehrfach ist in der Literatur darüber berichtet worden, daß die sporenlosen Bakterien bei mehrmaligem Übertragen und längerem Verweilen auf gewöhnlichen Nährböden die Fähigkeit zur Zersetzung der Cellulose verlieren (BRADLEY und RETTGER, 1927; PRINGSHEIM, 1912). Bringt man eine derartige Kultur jedoch auf ein Medium mit organisch gebundenem Stickstoff, so erlangt sie die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung bald wieder zurück. Die Vertreter der beschriebenen Bakteriengruppe können auch auf cellulosefreien Nährböden wachsen. Es existieren unter ihnen keine spezialisierten Formen, die allein auf Cellulose als Kohlenhydratquelle angewiesen sind.

B. Morphologie und Systematik

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2 8 der von MCBETH, SCALES und SMITH (1914) beschriebenen 31 A r t e n wachsen

auf Fleischbrühe, 18 auf Fleischbrühe-Agar und 17 auf Fleischbrühe-Gelatine. 26 Kulturen röteten Lackmus, und viele Arten konnten auf Kartoffeln gezüchtet werden. 10 Arten bildeten auf festen Medien Kolonien mit gelber Farbe. Das Wachstum auf Fleischbrühe-Agar vollzieht sich mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Manchmal erreichen die Kolonien nach 15 Tagen bereits einen Durchmesser von 5 bis 10 mm. Sie besitzen glatte Ränder und sind bisweilen farblos, meist aber gelb gefärbt. Einige Arten bilden auf Fleischbrühe eine Bakterienhaut und erzeugen in der Flüssigkeit einen Niederschlag. Andere trüben die Flüssigkeit zunächst nur und geben erst dann einen Niederschlag; in diesem Fall wird keine Haut gebildet. Die meisten Formen verflüssigen Gelatine und bewirken eine Rötung, aber keine Gerinnung von Milch. Auf Stärke-Agar oder Kartoffeln gedeihen sie ausgezeichnet. Schwefelwasserstoff und Indol entstehen durch die Tätigkeit dieser Bakterien nicht. Bei der Entwicklung auf Cellulosesubstraten hydrolysieren die Bakterien das Polysaccharid und zersetzen seine Abbauprodukte. Reduzierende Stoffe trifft man in der Kultur gewöhnlich nicht an. Bei geringer Luftzufuhr wird die Cellulose nur langsam zersetzt, wobei sich im Medium Glucose anreichert (KALNINS, 1929/31; J E N S E N , 1940).

Die sporenlosen Cellulosebakterien gedeihen auch auf Medien mit verschiedenen Kohlenhydraten und Alkoholen gut. Im allgemeinen enthalten die Bakterien Amylase und können infolgedessen Stärke hydrolysieren. Glucose, Maltose, Saccharose, Lactose, Arabinose, Xylose, Glycerin, Dextrin, Stärke, Mannit, in einigen Fällen auch Aesculin und Salicin werden von ihnen gewöhnlich zersetzt. Inulin wird dagegen meist nicht angegriffen. Untersuchungen über den Chemismus der Cellulosezersetzung durch die sporenlosen Bakterien sind nicht durchgeführt worden; desgleichen fehlen eingehende Analysen der bei der Zersetzung der verschiedenen Kohlenhydrate entstehenden Produkte. Von den cellulosezersetzenden Myxobakterien und Vibrionen unterscheiden sich die sporenlosen Bakterien durch den deutlich ausgeprägten Bedarf an organisch gebundenem Stickstoff. So zeigt z. B. nach JENSEN der typischste Vertreter dieser Gruppe, Cellulomonas biazotea, auf Medien mit Ammoniumnitrat oder -sulfat, Glycin oder Asparagin keine Entwicklung; er zersetzt die Cellulose nur bei Gegenwart von Pepton oder Hefeextrakt. BRADLEY und RETTGER (1927) weisen darauf hin, daß eine Entwicklung dieser Bakterien auch auf nitrathaltigen Medien möglich ist. Die Zersetzung der Cellulose erfolgt jedoch erheblich schneller, wenn gleichzeitig Caseinhydrolysat oder Fleischextrakt zugesetzt werden. Bei Züchtung der Bakterien auf diesen Medien bleibt ihre Fähigkeit zur Cellulosezersetzung erhalten. Offenbar unterscheiden sich die einzelnen Vertreter dieser Gruppe bezüglich ihres Stickstoffbedarfs voneinander. So haben z. B. ITANO und ARAKAWA (1931/33) ge-

zeigt, daß die Cellulose bei Abwesenheit organisch gebundenen Stickstoffs überhaupt nicht zersetzt wird. Die entsprechenden Bakterien müssen deshalb auf Nährböden gezüchtet werden, die Caseinhydrolysat, Hefeextrakt oder Pepton enthalten.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Andererseits gehören nach MCBETH, SCALES und SMITH (1913, 1914) auch Nitrate,

Ammoniumsalze sowie Asparagin zu den von den Bakterien verwertbaren Stickstoffverbindungen. Die Frage, ob der positive Einfluß von Eiweißhydrolysaten oder verschiedenen Extrakten auf die Zuführung von organisch gebundenem Stickstoff zurückzuführen ist oder auf Vitamine, die in diesen Stoffen enthalten sind, ist noch ungeklärt. Die Hinweise darauf, daß eine Cellulosezersetzung in Medien mit ausschließlich anorganisch gebundenem Stickstoff bisweilen nicht stattfindet, was für Mykobakterien und Vibrionen auf jeden Fall eine ungewöhnliche Erscheinung ist, dürfen jedoch nicht ignoriert werden^ Die sporenlosen Cellulosebakterien gehören zu den aeroben oder fakultativ anaeroben Formen. Ausführlichere Angaben in dieser Richtung sind in der Literatur jedoch nicht zu finden. Eine Zersetzung der Cellulose durch sporenlose Bakterien ist nur bei neutraler oder schwach saurer Reaktion des Mediums möglich. Bei Cdlulomonas biazotea z. B. liegt der Aktivitätsbereich zwischen p H 5,7 und 6,4; bei p H 5,2 wurde eine Wirkung erst am 30. Tag beobachtet (JENSEN, 1940). Von 17 untersuchten Kulturen zersetzten 5 die Cellulose bei p H 6,2; alle Kulturen aber waren bei p H 7,4 a k t i v (BRADLEY und RETTGER, 1927).

Alle sporenlosen Cellulosebakterien gehören zu den mesophilen Bakterien. Ihr Temperaturoptimum liegt bei 28 bis 37° C, bei 15° C ist das Wachstum nur gering. In systematischer Hinsicht ist die Gruppe der sporenlosen Cellulosebakterien recht uneinheitlich. So enthält sie z. B. Gattungen wie Baderium, Pseudomonas, Chromobacter, Achromobacter und andere. Wahrscheinlich müssen einige cellulosezersetzende Organismen, die heute noch zu den sporenlosen Bakterien gerechnet werden, später einmal anderen systematischen Gruppen zugeordnet werden. Eine derartige Umstellung ist beispielsweise bei Cellulomonas fimi durchgeführt worden, das in der Tat ein Mycobakterium ist und nach den Untersuchungen JENSENS in der neuen Ausgabe von BERGEYs Manual of Determinative Bacteridlogy den Actinomyceten zugezählt wird. Desgleichen gehört der seinerzeit als Bac. ferrugineus beschriebene Organismus nicht zu den sporenlosen Bakterien, sondern stellt eine Art der Gattung Sporocytophaga dar. In den Beschreibungen einiger angeblich sporenloser Cellulosebakterien lassen sich viele Merkmale finden, wie Größe und Gestalt der Zellen, Beweglichkeit, Erzeugung von Schleim und häufige Bildung verschiedener Pigmente, die es sehr wahrscheinlich machen, daß diese Mikroorganismen den Myxobakterien angehören. Naturgemäß handelt es sich hierbei nicht um Formen, die typische und wohlbekannte Fruchtkörper ausbilden, sondern eher um solche, die mit der Art Sorangium cetlulosum verwandt sind. Vergleicht man die zu 8. cellulosum gehörenden Myxobakterien mit den sporenlosen Cellulosebakterien hinsichtlich ihrer Physiologie und der bei ihrer Züchtung zu beachtenden Kultivierungsbedingungen, so stimmen sie in vielem überein. Die Existenz von Geißeln ist bei den sporenlosen Cellulosebakterien schwer festzustellen. Der Nachweis derartiger Plasmafortsätze bedarf in jedem Einzelfall einer genauen Untersuchung, da beispielsweise der von den Myxobakterienzellen ge-

B. Morphologie und Systematik

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bildete Schleim zu einzelnen Fäden eintrocknen und so Geißeln vortäuschen kann. Nur ausführliche Untersuchungen der morphologischen und physiologischen Eigenschaften von Kulturen wiederholt reingezüchteter sporenloser Cellulosebakterien sowie ein Vergleich mit den Myxobakterien können eine endgültige Klärung ihrer systematischen Stellung herbeiführen. Solange noch keine neueren Ergebnisse vorliegen, muß diese Gruppe beibehalten werden, obwohl vieles gegen eine systematische Selbständigkeit der sporenlosen Bakterien spricht. Ihre wesentlichen Merkmale sind folgende: 1. Die sporenlosen Cellulosebakterien besitzen gerade, stäbchenförmige Zellen mit runden Enden und von geringer Länge. Es sind monotrichial und peritrichial begeißelte und unbewegliche Formen bekannt. Sie kommen im Boden vor, sind gramnegativ und bilden keine Sporen. 2. Die Vertreter dieser Gruppe greifen die Cellulose relativ langsam an. Engspezialisierte Formen, die die Cellulose anderen Kohlenhydraten vorziehen, sind nicht bekannt. 3. Im allgemeinen entwickeln sich die sporenlosen Cellulosebakterien auf Fleischbrühe* Agar und -Gelatine, Stärke-Agar, Kartoffeln und Milch. In den meisten Fällen wird ein gelbes Pigment erzeugt; seltener treten andere Farbstoffe auf. 4. Die Bakterien zersetzen verschiedene Mono- und Disaccharide, Stärke, einige Alkohole und Cellulose unter Säurebildung. Von vielen Formen wird die Cellulose in einem Medium, das nur anorganischen Stickstoff enthält, nicht angegriffen. Dagegen beobachtet man in Substraten mit Caseinhydrolysat, Pepton oder Hefeextrakt eine intensive Zerstörung des Polysaccharids. 5. Die einzelnen Bakterienarten und -rassen unterscheiden sich voneinander in verschiedenen morphologischen und physiologischen Eigenschaften. Es gibt bewegliche und unbewegliche Formen, einige Bakterien können Farbstoffe oder Ammoniak bilden, andere sind in der Lage, Lackmuslösung rot zu färben, wieder andere können Gelatine verflüssigen usw. 6. Zur einwandfreien systematischen Einordnung der sporenlosen Cellulosebakterien ist ein Vergleich mit den fruchtkörperlosen Myxobakterien in morphologischer und physiologischer Hinsicht erforderlich. Es ist sehr wahrscheinlich, daß unter den sporenlosen Cellulosebakterien Formen existieren, die in Wirklichkeit zu den Myxobakterien gehören. 4. Vibrionen Typische cellulosezersetzende Vibrionen wurden von WlNOGRADSKI in der besonderen Gattung Cellvibrio zusammengefaßt. Wie früher bereits festgestellt wurde, ist die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung bei den verschiedensten Mikroorganismen vorhanden. Infolgedessen ist die Abtrennung einer besonderen Gattung auf Grund von physiologischen Merkmalen unzweckmäßig. Deshalb werden hier alle früher als CeUvibrio bezeichneten Mikroorganismen als Vertreter der Gattung Vibrio geführt.

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I. Aerobe Cellulosebakterien a) M o r p h o l o g i e

Die cellulosezersetzenden Vibrionen besitzen die gleiche charakteristische Morphologie der Zellen wie die übrigen Vibrionen, einschließlich der pathogenen Formen. Diese Bakterien stellen bogenförmig gekrümmte Stäbchen mit abgerundeten Enden dar; sie sind 2 bis 4,5 ¡I lang und 0,3 bis 0,5 ¡J. breit (Abb. 42). Wenn das Bakterium seine maximale Länge erreicht hat, erfolgt die Teilung der Zellen, wobei die entstehenden Tochterzellen noch eine Zeitlang miteinander verbunden bleiben (Abb. 42 a). Mitunter sind die beiden neuen aneinanderhängenden Zellen nach verschiedenen Seiten gekrümmt, so daß S-förmige Gebilde entstehen. Die Vibrionen sind beweglich und besitzen am Ende der Zelle eine Geißel, die zwei- bis dreimal so lang ist wie die Zelle (Abb. 42b). Charakteristisch für die Vibrionen ist ihre Beweglichkeit im hängenden Tropfen („tanzende Kommas"). Die Geißeln können mittels der üblichen Färbemethoden gut angefärbt werden. Die Vibrionen bilden im allgemeinen weder Sporen noch irgendwelche anderen Ruhestadien. Die Frage, ob es eine Gattung Sporovibrio gibt oder nicht, soll in dem Abschnitt über die sporenbildenden Bakterien erörtert werden. Mit zunehmendem Alter der Kultur werden die Zellen der Vibrionen immer kleiner; diese Größenabnahme kann bisweilen recht erhebliche Ausmaße annehmen. Die mit einer derartigen Autolyse verbundene Alterung der Vibrionen ist besonders auf festen Medien eine derart häufige Erscheinung, daß man ziemlich regelmäßig bereits einige Tage nach dem Impfen in der Kultur blasse, schlecht anfärbbare Zellen erkennen kann, die auch nach dem Überimpfen auf einen frischen Nährboden kein Wachstum mehr zeigen. Die gramnegativen Vibrionen lassen sich mit den verschiedensten Farbstoffen wesentlich besser anfärben als die Myxobakterien. Die bei den letzteren leicht nachweisbaren Chromatinkerne sind in den Vibrionen niemals enthalten. Dagegen findet man beim Anfärben an den Zellenden gewisse Polkörper, die aber nur eine auch bei sporenlosen Bakterien vorhandene innerzellulare Struktur darstellen. b) W a c h s t u m auf der Cellulose Kulturen auf Papierstreifen im Reagenzglas mit HüTCHINSONscher Nährlösung zeigen nach 24stündigem Stehen bei 28° C eine leichte Trübung der Flüssigkeit. Nach weiteren 24 Stunden ist das Papier in Höhe des Flüssigkeitsspiegels zerstört. Durch leichtes Schütteln des Glases können die beiden Papierenden voneinander getrennt werden. Abbildung 43 gibt zwei derartige Versuche wieder; im linken Reagenzglas befindet sich zum Vergleich sterile, nicht beimpfte Lösung. Die Entwicklung der Vibrionen auf dem Cellulosematerial erfolgt außerordentlich rasch. Je nach der Vibrionenart bleibt das Papier entweder farblos oder es färbt sich im Bereich der Zerstörungszone gelb, gelbgrün oder andersfarbig. Die Zerstörung der Cellulose verläuft bei Vibrio gänzlich anders als bei Cytophaga oder Sporocytophaga. In Vibrionenkulturen werden die Papierstreifen gewissermaßen in der Höhe des Flüssigkeitsspiegels durchgeschnitten: sie werden maceriert. Da die

T a f e l 15

Abb.'42. Schwach gekrümmte Zellen der Art Vibrio vulgaris, a — in Teilung begriffene Zellen; b — Zellen mit einer Geißel

Abb. 43. Kulturen der Art Vibrio vulgaris auf Papierstreifen (links: unbeimpftes Röhrchen)

B. Morphologie und Systematik

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Beweglichkeit der Vibrionen nicht wie die der Mykobakterien von einer Schleimbildung abhängt, wird in den Kulturen kaum Schleim erzeugt, und das Papier verwandelt sich nicht in eine transparente schleimige Folie wie in den Kulturen von Gytophaga und Sporocytophaga. Wenn man das Glas mit dem Papierstreifen etwas schüttelt, findet man in der Flüssigkeit viele feine Cellulosefäserchen; auch diese Erscheinung ist bei der Entwicklung der Myxobakterien nicht zu beobachten. In Kolben, die flüssige Nährlösung und Faltenfilter als Cellulosesubstrat enthalten, erfolgt ebenfalls eine energische Zersetzung der Cellulose. Die Entwicklung der Vibrionen bewirkt ein rasches Zusammenfallen und Absinken des Filters. Bereits nach drei Tagen verwandelt sich das gesamte Papier in eine lockere, farblose oder schwach gelbe Masse von einzelnen Faserbruchstücken. Abbildung 44 veranschaulicht diesen allmählichen Zersetzungsvorgang. Typisch ist auch die Entwicklung der Vibrionen auf der Oberfläche von Filtrierpapier, das sich auf einer Kieselsäuregelschicht befindet. Die Vibrionen überziehen das Papier sehr rasch und bedecken es bald in seiner gesamten Ausdehnung mit vielen Kolonien. WlNOGRADSKI hebt diese Erscheinung besonders hervor. So wurde z. B. die Bildung einer Riesenkolonie beobachtet, die innerhalb von zwei Tagen die gesamte Filterfläche von 150 mm Durchmesser bedeckte, was von eiiier ungewöhnlich raschen Verbreitung der Zellen über die Papieroberfläche zeugt. Die Vibrionen entwickeln auf Papier trockene, unscharf begrenzte, sich rasch ausbreitende Kolonien; man beobachtet hierbei niemals derart scharfe Konturen, wie sie für Sporocytophaga-Kulturen charakteristisch sind. Wie aus den oben erörterten Merkmalen hervorgeht, handelt es sich bei der Zerstörung der Cellulose durch Arten der Gattung Vibrio um einen völlig anderen Typ der Cellulosezersetzung, als wir ihn bis jetzt kennengelernt haben. In Vibrionenkulturen beobachtet man keine Auflösung der Cellulose, sondern nur deren Maceration, wogegen die Gattungen Gytophaga, Sporocytophaga und andere Myxobakterien wesentlich mehr Cellulose zersetzen und diese vollständig auflösen. Auf Cellulose-Agar bilden die Vibrionen kleine runde, transparente Kolonien mit glatter Oberfläche und makroskopisch glatten Rändern. Bei Vibrio vulgaris sind die Kolonien pigmentlos, bei anderen dagegen in den verschiedensten gelben oder anderen Farbtönen gefärbt. Die Größe der Kolonien übersteigt im allgemeinen 1 mm nicht. Bei schwacher Vergrößerung zeigen sie eine feinkörnige Struktur, wobei das Zentrum ausgeprägter erscheint als die Peripherie; die Ränder sind fein gezackt. c) W a c h s t u m auf anderen Medien Die Cellulosevibrionen unterscheiden sich von den cellulosezersetzenden Myxobakterien vor allem dadurch, daß sie auch auf cellulosefreien Medien gut und rasch wachsen. Die Reinzüchtung von Fi&no-Kulturen bereitet deshalb keine besonderen Schwierigkeiten. Eine besonders gute Entwicklung ist auf stärkehaltigen Medien (Stärke- oder Kartoffel-Agar) zu beobachten. Nach Strichimpfung von Stärke-Agar mit einem Vibrio- Stamm entsteht bereits nach vier Tagen rings um die Kolonien, die sich allmählich vereinigen, eine breite,

B. Morphologie und Systematik

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durch J o d nicht mehr blaugefärbte Zone. Diese intensive Hydrolyse der Stärke weist auf eine aktive Amylaseabscheidung in das Medium hin. Gutes Wachstum findet auf Agar-Agar mit HüTCHINSONscher Nährlösung bei Zusatz folgender Zucker statt: Glucose, Lävulose, Maltose, Saccharose, Arabinose und Dextrine. Hinsichtlich ihrer Ansprüche an die im Medium enthaltenen Kohlenhydrate kann man die Vibrionen, wie auch einige Mykobakterien, zu den fakultativen Cellulosebakterien rechnen, da sie sich auch auf cellulosefreien Substraten sehr gut entwickeln. Nach Angaben von STAPP und BoRTELS (1934) wachsen die Vibrionen auf mit Soda neutralisiertem Bierwürze-, Möhren- oder KartofFel-Agar nur schlecht. Der fakultative Charakter dieser Gruppe von Cellulosebakterien wird von den genannten Autoren ebenfalls bestätigt. Sie stellten fest, daß die Vibrionen die Cellulose bei Gegenwart von Stärke nicht angreifen, da sie die letztere als Kohlenstoffquelle vorziehen. Nach Beobachtungen von IMSCHENEZKI findet auf Fleischbrühe-Agar und -Gelatine, Bierwürze-Agar, Kartoffeln, Möhren und Milch keine sofortige Entwicklung statt. So vermehren sich z. B. die Vibrionen unmittelbar nach der Isolierung einer Reinkultur nicht auf Fleischbrühe-Agar. Nach einem Monat jedoch haben sie diese Fähigkeit erlangt und bilden kleine runde, farblose Kolonien mit glatten Rändern. Das Wachstum auf Fleischbrühe ist schwach; Bakterienfilme werden dabei nicht gebildet. Feste Nährmedien sind nur dann als Substrat geeignet, wenn sie genügend freies Wasser enthalten; wenn sie auch nur geringfügig eingetrocknet sind, entwickeln sich die Vibrionen nicht. Aus diesem Grunde findet auch auf Medien mit mehr als 1 % Agar-Agar nur ein geringes Wachstum statt. Bei einer Agarkonzentration von 1 % ist bereits eine bessere Entwicklung der Vibrionen zu verzeichnen; am besten gedeihen sie bei einem Gehalt von 0,7 bis 0 , 8 % Agar. Vibrionenkulturen auf festen Medien (z. B . Stärke-Agar) müssen häufig auf frisches Nährsubstrat übergeimpft werden, da bereits neun Tage alte Kulturen, nicht mehr übertragungsfähig sind und nach diesem Zeitpunkt angelegte Tochterkulturen kein Wachstum zeigen. d) D,ie m i k r o s k o p i s c h e B e o b a c h t u n g des W a c h s t u m s a u f C e l l u l o s e Bei der mikroskopischen Betrachtung einzelner Cellulosefasern aus infiziertem Filtrierpapier fällt besonders die intensive Vermehrung der Vibrionen auf der Faseroberfläche auf. Die gesamte Papieroberfläche ist von den leicht gekrümmten Zellen bedeckt, die sich lebhaft durch Teilung sehr rasch vermehren und den Rand der Faser erreichen. Im Gegensatz zu Sporocytophaga zerstören sie aber nicht die tiefer gelegenen Bereiche der Faser, sondern beschränken sich auf die Zersetzung der äußersten Schichten (Abb. 45). Die bei den Myxobakterien verbreitet auftretende Erscheinung der Heteromorphose, d. h. der Ersatz von Cellulosefasern durch Bakterienzellen, und die ebenfalls bei Myxobakterien gewöhnlich sichtbaren Schleimfäden sind selbst in alten Vibrionenkulturen nicht zu finden. Die mikroskopische Beobachtung bestätigt die äußeren Merkmale des Vibrionenwachstums

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I. Aerobe Cellulosebakterien

vollkommen : es findet keine vollständige Zerstörung und Auflösung der Faser statt, sondern nur deren rasche Maceration. Zwei Vibrionenarten wurden eingehender untersucht. Sie unterscheiden sich voneinander niir dadurch, daß sie das zersetzte Papier verschiedenartig färben. Die eine Art, Vibrio vulgaris, bildet kein Pigment, so daß das angegriffene Papier weiß bleibt. Eine Isolierung dieser Art wurde von WLNOGRADSKL (1952), STAPP und BORTELS (1934), IMSCHENEZKI und SOLNZEWA (1936),

SLAWNINA ( 1 9 3 8 ) und

JENSEN (1940) durchgeführt. Anscheinend ist sie mit dem von DÜBOS (1928) beschriebenen Bakterium ,,Co" identisch. Nach WlNOGRADSKl kann die farblose Art auf Medien bestimmter Zusammensetzung bisweilen ein schwach gelbliches Pigment erzeugen. IMSCHENEZKI hat dagegen niemals eine derartige Farbstoffbildung beobachten können. Die zweite Art, Vibrio fulvus, unterscheidet sich von der ersten durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung eines gelben Pigments. Sehr wahrscheinlich ist sie mit dem bereits erwähnten Bakterium „Co" von DUBOS und der Art Oellvibrio ochraceus von WlNOGRADSKl identisch. Die cellulosezersetzenden Vibrionen sind sehr verbreitet; sie wurden in den Böden der verschiedensten Länder gefunden. Von Vibrio vulgaris konnten Reinkulturen in der Sowjetunion, in Deutschland, Amerika, Frankreich und Polen angelegt werden. IMSCHENEZKI und Mitarbeiter

B. Morphologie und Systematik

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isolierten den Organismus aus Bodenproben der Moskauer Gegend und vom linken Wolgaufer. Nach STAPP und BORTELS (1934) kommen die Vibrionen im Waldboden relativ selten vor. Die Verbreitung der verschiedenen Arten und Rassen ist anscheinend sehr ungleichmäßig. So beobachtete z. B. IMSCHENEZKI in Vibrionenkulturen aus Bodenproben vom linken Wolgaufer Zersetzungszonen auf dem Papier, die grün gefärbt waren. Aus dem Moskauer Gebiet konnten jedoch derartige Vibrionenformen nicht reingezüchtet werden. e) U n e c h t e V i b r i o n e n WlNOGRADSKI hat in seinen Arbeiten zwei Vibrionen beschrieben: Cellvibrio ochraceus und C. flavescens. Die erste Art besitzt morphologische Eigenschaften, die völlig den oben für die Vibrionen beschriebenen entsprechen; ferner läßt sie sich in derselben Weise kultivieren. Im Gegensatz dazu gehört C.flavescensoffenbar nicht zu den Vibrionen, sondern zu den Myxobakterien. Für diese systematische Umgruppierung sind folgende Gründe anzuführen. Die vegetativen Zellen dieser Bakterienart sind, wie aus einer Mikrophotographie von WlNOGRADSKI (1952, Tafel 8, Abb. 10) hervorgeht, länger als die Zellen der Vibrionen. Sie besitzen spitze Enden, sind nur wenig schraubenförmig gedreht und teilen sich durch Einschnürung der Mutterzelle. Ihre Morphologie entspricht also vollständig derjenigen der Myxobakterien. Ferner lassen sich in den Zellen Chromatinkerne nachweisen, was beim Anfärben von Vibrionen niemals der Fall ist. Ferner sind nach der angeführten Mikrophotographie in den Kulturen kugelförmige Gebilde zu erkennen, die nichts anderes als Mikrocysten darstellen. Außerdem wird in diesen Bakterienkulturen Schleim erzeugt. Nach Ansicht iMSCHENEZKls sind einige Merkmale vorhanden, die auf Cytophaga zutreffen. Ohne das Vorhandensein einer Beinkultur ist^eine schlüssige Beweisführung für die systematische Stellung der betreffenden Bakterien jedoch nicht möglich. Immerhin ist es sehr wahrscheinlich, daß es sich in diesem Fall nicht um die Kultur von Vibrionen handelt, sondern um die eines Myxobakteriums aus dem Formenkreis Sporocytophaga oder einer ähnlichen Gattung. 5. Sporenbildende Bakterien Die Zersetzung der Cellulose unter anaeroben Bedingungen wird in der Hauptsache durch sporenbildende anaerobe Bakterien bewirkt. Im Gegensatz dazu sind diese Bakterien an der Cellulosezersetzung unter aeroben Bedingungen im allgemeinen nicht beteiligt. In den letzten 50 Jahren ist nur eine sehr geringe Anzahl von Bazillen isoliert worden, die die Cellulose unter aeroben Bedingungen angreifen. Im Verlaufe seiner umfangreichen Arbeiten über die aerobe Cellulosezersetzung konnte WlNOGRADSKI kein einziges Mal sporenbildende Bakterien entdecken. Er hebt diesen Umstand in seinen Veröffentlichungen sogar besonders hervor. Aber auch viele andere Autoren konnten unter den von ihnen isolierten cellulosezersetzenden Bakterien keine Bazillen finden. IMSCHENEZKI und Mitarbeitern ist es

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I. Aerobe Cellulosebakterien

ebenfalls kein einziges Mal gelungen, eine cellulosezersetzende, sporenbildende Form zu isolieren. Das Fehlen sporenbildender Formen wurde mitunter auf die angewandte Untersuc hungstechnik zurückgeführt, da nämlich die sporenbildenden Bakterien weder in flüssigen Medien mit Filtrierpapierstreifen noch auf Filtrierpapier mit einer Kieselsäuregelunterlage gedeihen. Die Benutzung anderer Kultivierungsverfahren, insbesondere die Verwendung von Cellulose-Agar, veränderte jedoch die Sachlage auch nicht, so daß die sich mit dieser Frage beschäftigenden Forscher ebenfalls zu der Überzeugung kamen, daß sporenbildende Cellulosebakterien im Boden sehr viel seltener anzutreffen sind als Myxobakterien oder Vibrionen (HARMSEN, 1946). Unter 36 von KELLERMAN und Mitarbeitern (1912, 1913/14) sowie von McBETH

und Mitarbeitern (1913) kultivierten und beschriebenen aeroben Cellulosebakterien fanden sich nur fünf sporenbildende Arten: Bac. amylolyticus,

Bac. cytaseus,

Bac.

festinus, Bac. imminutus, Bact.paludosum. HOROWITZ-WLASSOWA (1935/36) isolierte aus einer Anreicherungskultur auf OMELjANSKlschem Medium die Arten Bact. terminalis (4004) und Bact. similityphosus (4075). Eine dritte Art wurde von ihr neu beschrieben: Bact. cellulölyticiis (3598). Weitere cellulosezersetzende, sporenbildende Bakterien wurden von KALNINS (1931) (Bact. latvianus), SlMOLA (1931) (Cellulobacittusmyxogenes und Bac. mucosus), ZAREMBSKA (1936) (Cellulobacittus varsaviensis) und FÜLLER und NORMAN (1943)

(Bac. aporrhoeus) entdeckt und isoliert. Viele sporenbildende Formen sind auch nur unter einer Nummer oder einer Typenbezeichnung beschrieben worden (JENSEN, 1940; HARMSEN, 1946), z. B. „klostridialer Typ", „langer Typ" usw. Aus der Aufzählung geht hervor, daß die Anzahl der sporenbildenden Arten nicht sehr groß ist. Sie haben auch keine allzu große Beachtung gefunden, da sämtliche Formen keine ausgesprochenen Cellulosebakterien darstellen; diese Mikroorganismen gedeihen vielmehr auch ausgezeichnet auf allgemein üblichen Laboratoriumsnährböden. In morphologischer Hinsicht kann man drei verschiedene Typen cellulosezersetzender aerober Bazillen unterscheiden. Am häufigsten begegnet man Arten, die bei der Sporenbildung eine spindelförmige Gestalt annehmen. Die vegetativen Zellen sind gerade, 1,5 bis 2,6 ¡x lange und 0,6 bis 1 [i. breite Stäbchen mit abgerundeten Enden. Sie sind gewöhnlich gramnegativ, beweglich und besitzen peritrichial angeordnete Geißeln. Die Spore befindet sich in der Mitte der spindelförmigen Zelle oder ist subterminal angeordnet. Gewöhnlich ist sie oval gestaltet und besitzt eine Länge von 1,2 bis 2 fx und eine Breite von 0,7 bis 1 fx. Die Zellen enthalten keine Granulöse und färben sich aus diesem Grunde mit Jod nicht blaugrau an. Zu den klostridialen Arten gehören Cettulobacillus myxogenes von SlMOLA (1931), C. varsaviensis von ZAREMBSKA (1936), Bac. 43, Bac. O von JENSEN (1940) und eine Beihe anderer von HARMSEN beschriebenen Formen. Die Abmessungen der vegetativen Zellen und der Sporen sind bei den einzelnen zu dieser Gruppe gehörenden Formen geringen Schwankungen unterworfen. Klostridiale Bazillen sind wesentlich häufiger als die anderen Cellulosebazillen.

B. Morphologie und Systematik

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Die zweite Gruppe vereinigt Formen mit sehr dünnen, langen, beweglichen Zellen. Sie besitzen relativ wenige peritrichial angeordnete Geißeln. Die terminal oder subterminal gelagerte Spore ist oval oder rund. Die zu dieser Gruppe gehörenden Bakterien wurden von HARMSEN (1946) in dem von ihm geprägten Ordnungsbegriff „langer T y p " zusammengefaßt. Nach seiner Ansicht besitzt dieser .Typ eine große Ähnlichkeit mit den Bazillen von OMELIANSKI (1895, 1897, 1902) bzw. OMELJANSKI (1901), während die Vertreter des klostridialen T y p s den von KHOUVINE (1923, 1934) u n d von V. MEYER (1935)

isolierten Bazillen nahestehen sollen. Dies kann jedoch kaum stimmen, da es sich bei den Kulturen von KHOUVINE, wie weiter unten berichtet wird, um ähnliche Bazillen handelt, wie sie auch von OMELJANSKI isoliert wurden. Die dem „langen T y p " angehörenden Bazillen kommen in der Natur seltener vor als die cellulosezersetzenden klostridialen Arten. Noch seltener begegnet man aber den Vertretern des „ T y p s mit langen Sporen" (HARMSEN, 1946). Die vegetativen Zellen dieser Arten ändern ihre Gestalt bei der Sporenbildung nicht. Im Zentrum der Zelle entstehen große, lange, ovale Sporen. Dabei werden weder klostridiale noch plektridiale Formen gebildet. In der Literatur erscheinen bisweilen Berichte über verschiedene saprophytische, aerobe sporenbildende Bakterien, die mehr oder weniger intensiv Cellulose zersetzen sollen. Eine spezielle Überprüfung der Befähigung von Bac. mesentericus und Bac. subtilis zur CellulosezerSetzung hat jedoch ein negatives Resultat erbracht (THAYSEN u n d B U N K E R , 1926).

Auch von HARMSEN durchgeführte Untersuchungen über die Physiologie einiger Bazillen, wie Bac. subtilis, Bac. mesentericus, Bac. vulgatus, Bac. mycoides, haben bestätigt, daß diese Mikroorganismen keine Cellulose zerstören können. Bisweilen werden auch Bac. polymyxa und Bac. macerans zu den Cellulosebakterien gerechnet, die in Wirklichkeit jedoch die Cellulose ebenfalls nicht angreifen (FÜLLER und NORMAN, 1943). E s finden sich also unter diesen aeroben sporenbildenden Bakterien keine Arten oder Rassen, die Cellulose zersetzen können. Aus einer Reihe von Untersuchungen, in denen über die Isolierung cellulosezersetzender aerober Bazillen berichtet wird, ist zu entnehmen, daß es aber tatsächlich Bazillenarten gibt, die die Cellulose zersetzen. IMSCHENEZKI dagegen nimmt auf Grund eigener Versuche an, daß die aeroben Cellulosebakterien, z. B . Myxobakterien oder Vibrionen, mitunter von sporenbildenden aeroben Arten begleitet sind, wodurch ohne weiteres der Eindruck erweckt werden kann, daß die sporenbildenden Bakterien in der Lage sind, die Cellulose zu zersetzen. Wie folgendes Beispiel zeigt, ist diese Situation nicht immer leicht zu erkennen. HARMSEN (1946) beobachtete in Kulturen aerober cellulosezersetzender. Bazillen stets zwei verschiedene Zelltypen, größere Zellen von 2 bis 8 [i, Länge und 0,5 bis 1 [i, Breite und kleinere, dünne Zellen von 1 bis 3 (j. Länge und 0,2 bis 0,3 ¡x Breite. Zunächst war der Autor der Ansicht, daß es sich hier um eine Verunreinigung der Kultur durch sporenlose Formen handelt, die für den Abbau der Cellulose verantwortlich sind. Diese Möglichkeit konnte er aber wieder ausschließen, weil die Kulturen nach zehnminutigem Erhitzen auf 100° C die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung

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I. Aerobe Cellulosebakterien

nicht verloren hatten und ein „Dimorphismus" nach wie vor zu beobachten war. Außerdem waren auch in einer Einzellenkultur nach BURRI keine Änderungen der morphologischen und physiologischen Eigenschaften zu erkennen. Trotzdem bestehen bei näherer Betrachtung der Angaben von HARMSEN immer noch Zweifel darüber, ob er überhaupt eine Reinkultur von Bazillen vor sich hatte. Eine besondere Beachtung verdient die Frage, ob es schraubenförmig gewundene, aerobe, cellulosezersetzende Bazillen gibt. Derartige Formen sind beschrieben worden. Sie besitzen meist Zellen von 2 bis 6 (x Länge und 0,3 bis 0,6 ¡x Breite, bilden an Spirillen erinnernde Fäden bis zu 20 ¡j. Länge und erzeugen Sporen. Deshalb sind sie der von STARKEY (1938) aufgestellten Gattung Sporovibrio zugeordnet worden. Dieser Auffassung von HARMSEN kann man nicht ohne weiteres zustimmen, da die Existenz von Sporovibrio selbst noch nicht bewiesen ist. STARKEY fand in den Zellen von Schwefelbakterien kleine lichtbrechende Körperchen, konnte aber keine überzeugenden Beweise dafür liefern, daß diese Körperchen tatsächlich Sporen sind. Insbesondere fehlt in seinen Arbeiten der Nachweis, daß diese Körper zur Keimung befähigt sind. Weder das Verhalten beim Anfärben noch die Beständigkeit bei hohen Temperaturen können als direkte Beweise gelten, da thermophile Vibrionenrassen bekannt sind, die hohe Temperaturen ohne Bildung von Sporen ausgezeichnet vertragen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Einordnung der gekrümmten sporenbildenden cellulosezersetzenden Arten in den Formenkreis der sporenbildenden Vibrionen ohne ausreichende Begründung geschehen ist. HARMSEN (1946) hat in seiner Monographie einige Zellen dieser sogenannten Sporovibrionen abgebildet, zwischen denen jedoch auch Zellen von typisch plektridialer Gestalt zu sehen sind, die am Zellende eine reife Spore tragen. Die cellulosezersetzenden aeroben Bazillen gedeihen ausgezeichnet auf CelluloseAgar, auf dem sie schleimige Kolonien mit verdickten Rändern bilden. Die Kolonien sind von einer deutlich sichtbaren Hydrolysenzone umgeben. Wenn die zur Kultivierung benutzte Agarschicht etwas dicker ist, zeigen die Kolonien des klostridialen Typs eine linsenförmige Gestalt. Die zu dem „langen Typ" gehörigen Bazillen bilden auf Cellulose-Agar runde, flockige, an Blumenkohl erinnernde Kolonien, die ebenfalls von einer breiten Zersetzungszone umgeben sind. Das Auftreten von Abbauzonen rings um die Kolonien der Bazillen ist mehrfach festgestellt worden. Nach einigen Autoren (KELLERMAN U. MCBETH, 1912) sind diese Bereiche 0,5 bis 1 mm breit, andere (FÜLLER) berichten, daß nach zehn Tagen rings um die gewölbte, weiße Kolonie ein 2 bis 3 mm breiter Ring entstanden ist. Im allgemeinen bewirken die aeroben Bazillen, die auf Filtrierpapierstreifen in Nährlösung kultiviert werden, eine Zerstörung des Papiers in Höhe des Flüssigkeitsspiegels ohne Verfärbung. Einige Arten, z. B. jBac. oporrAoe««, bilden aber auch einen gelben Farbstoff (FÜLLER u. NORMAN, 1943). Durch quantitative Cellulosebestimmungen wurde festgestellt, daß etwa 17 bis 53% Cellulose von den Bazillen zerstört werden.' Die Bazillen des klostridialen Typs greifen die Cellulose wesentlich intensiver an als die Vertreter des „langen Typs", d. h. die plektridialen Formen. Andererseits

B. Morphologie und Systematik

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zersetzen alle Bazillen die Cellulose in geringerem Maße als die Mykobakterien. Die Mikrofibrillen, d. h. die gegen chemische Einwirkungen beständigste Cellulose, werden von ihnen nur sehr langsam abgebaut. Dagegen bewirken sie eine lOOprozentige Zerstörung von umgefällter oder fein zerkleinerter Cellulose im Gemisch mit A g a r - A g a r (HARMSEN, 1 9 4 6 ) .

Unter den auf Cellulose wachsenden aeroben Bazillen finden sich keine spezialisierten Formen; alle gedeihen auch auf den anderen gewöhnlich verwendeten Nährböden. Allerdings wird von einigen Forschern ihr relativ langsames Wachstum auf diesen Nährböden hervorgehoben, was als ein Beweis für ihre Spezialisierung angesehen wird. Auf Fleischbrühe-Agar bilden die aeroben Bazillen meist farblose Kolonien. Ein gutes Wachstum zeigen sie im allgemeinen aber auch auf Stärke-Agar, Fleischbrühe und Fleischbrühe-Gelatine, die dabei häufig'verflüssigt wird. Die verschiedenen Arten unterscheiden sich voneinander dadurch, daß einige Lackmus rot färben, andere Indol bilden, wieder andere weitere Eigenschaften besitzen. Häufig erzeugen die Bazillen auf Stärke-Agar einen schleimigen, weißen, mitunter auch transparenten Belag. Bei einigen Formen, insbesondere bei Bac. aporrhoeus wurde eine interessante Erscheinung beobachtet. Die gesamte Kolonie bewegte sich gleichmäßig in einer Richtung auf der Oberfläche des Stärke-Agars und legte in zwei Stunden einen Weg von etwa 3 mm zurück. Von allen Forschern wurde festgestellt, daß die aeroben Cellulosebazillen die Fähigkeit zur Hydrolyse von Stärke besitzen, d. h. aktive Amylase enthalten. Die Bildung von Zersetzungszonen bei der Entwicklung der Bazillen auf CelluloseAgar weist auf eine Hydrolyse der Cellulose hin. Ein weiterer Beweis dafür ist die von SLMOLA (1931) gefundene Anwesenheit von Cellobiose und Glucose in der Kulturflüssigkeit von Cellulobacillus myxogenes. Auch andere Autoren (JENSEN, 1940; ZAREMBSKA, 1936) haben Mono- oder Oligosaccharide in Kulturen aerober Cellulosebazillen gefunden. Die aeroben sporenbildenden Formen zersetzen aber nicht nur Cellulose, sondern verwerten auch verschiedene lösliche Kohlenhydrate ausgezeichnet. Diese von KELLERMAN und MCBETH stammenden Angaben konnten jedoch nicht in jedem Falle bestätigt werden (JENSEN, 1940). Nach Beobachtungen von FÜLLER zersetzen die Bazillen Glucose, Maltose, Galactose, Xylose, Arabinose, Saccharose, nicht aber Lactose. Beim Abbau von Cellulose durch Cellulobacillus myxogenes werden etwa 10% der zerstörten Cellulose zu Ameisen- und Essigsäure oxydiert. Außerdem lassen sich noch Spuren von Alkohol und Milchsäure finden. Bei der Oxydation der meisten Zucker durch den gleichen Bacillus entstehen Kohlensäure, Ameisensäure, Alkohol und nicht näher identifizierte Polyoxysäuren. Die säurebildenden Bazillen bewirken nur eine relativ schwach« Ansäuerung der Kulturflüssigkeit. In Medien mit Cellulose sinkt der p H -Wert auf 5,5, in zuckerhaltigen Lösungen auf 4,5 bis 5 (HARMSEN, 1946). Bezüglich des Stickstoffbedarfs stellen die verschiedenen Arten und Varietäten unterschiedliche Ansprüche an die Stickstoffquellen. Einige Autoren (FÜLLER u. 7 Imschenezki, Mikrobiologie

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I. Aerobe Cellulosebakterien

NORMAN, 1943) berichten über die Zersetzung von Cellulose in Medien, die Nitrat, Ammoniumsalze, Pepton oder Hefeextrakt enthielten. Aus diesem Angaben geht hervor, daß die Cellulosebazillen in der Lage sind, anorganischen Stickstoff zu verwerten (SLMOLA, 1931). Im Gegensatz dazu stehen Beobachtungen von JENSEN (1940), nach denen eine Entwicklung der sporenbildenden Formen auf Medien mit Ammoniumsulfat oder Asparagin sehr schwach ist, auf nitrathaltigen Nährböden überhaupt nicht stattfindet und nur auf Substraten mit Hefeextrakt eine intensive Zersetzung der Cellulose erfolgt. Anscheinend können die Bazillen organisch gebundenen Stickstoff in jeder Form verwerten. Die schwache Entwicklung bei Verwendung von Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle hängt möglicherweise mit einer Steigerung der Acidität des Mediums zusammen, auf die bereits hingewiesen wurde. Einige sporenbildende Cellulosebakterien vermögen die Cellulose noch bei einem pH-Wert von 5 zu zersetzen; meist ist zur Entwicklung aber ein weniger saures Substrat erforderlich. Als untere Grenze gilt im allgemeinen ein pH-Wert von 6 bis 6,5. Andererseits vertragen die Bazillen aber ebenso gut auch ein alkalisches Medium; sie vermehren sich noch bei p H 8,5, mitunter sogar bei p H 9. Nicht alle Cellulosebazillen sind streng aerob; es gibt auch Formen, die sich unter anaeroben Bedingungen entwickeln. An der Existenz von fakultativ anaeroben Cellulosebazillen besteht kein Zweifel. Aus diesem Grunde können die Cellulosebazillen, wie übrigens auch die cellulosezersetzenden Actinomyceten, als Formen betrachtet werden, die gewissermaßen die Merkmale der aeroben und anaeroben Cellulosebakterien in sich vereinigen. HARMSEN (1946) beobachtete die Entwicklung der Cellulosebazillen bei verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken. Er untersuchte den Einfluß des Sauerstoffdruckes im Bereich von 150 bis 10,2 mm sowie die Auswirkungen streng anaerober Bedingungen. Dabei ergab sich, daß bei einem Druck von 22 mm die Vertreter des klostridialen Typs bereits keine Entwicklung mehr zeigen, während die zum „langen Typ" gehörenden, d. h. plektridialen Formen selbst noch unter ausgesprochen anaeroben Bedingungen weiterwachsen. Dies bestätigt nochmals die Unmöglichkeit, eine strenge Trennung der aeroben von den anaeroben Mikroorganismen durchzuführen. Die Cellulosebazillen gehören zu den mesophilen Formen. Bei 15° C entwickeln sie sich nur schwach. Ein optimales Wachstum zeigen sie zwischen 28 und 30° C nach HARMSEN, 2 8 u n d 3 3 ° C n a c h M C B E T H ( 1 9 1 6 ) , 2 8 u n d 3 7 ° C n a c h J E N S E N ( 1 9 4 0 )

und 22 bis 35° C nach FÜLLER.

Die Hitzeresistenz der Cellulosebazillensporen ist je nach Bakterienart eine unterschiedliche. Einige Formen vertragen nur ein 2minutiges Erhitzen auf 98 bis 100° C; bei länger anhaltender Hitzeeinwirkung (20 Minuten) gehen sie zugrunde. Dagegen sind die Vertreter der plektridialen Formen gegenüber einer 30- bis 45minutigen Erhitzung auf 98 bis 100° C beständig. Das Austrocknen der Sporen beeinträchtigt die Lebensfähigkeit derselben nur sehr wenig. Sporen von Kulturen, die zwei Jahre im Exsikkator gehalten wurden, sind voll keimungsfähig (HARMSEN, 1946). Die aeroben Cellulosebazillen kommen im Boden, im Mist sowie im Süß- und Salzwasserschlamm vor. Nach Angaben von HARMSEN trifft man sie viel seltener

B. Morphologie und Systematik

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an als die Myxobakterien und Vibrionen. Dennoch ist es ihm gelungen, in allen untersuchten Proben aus dem Boden und vom Grunde der Gewässer Cellulosebazillen nachzuweisen. Um festzustellen, inwieweit die Mikroorganismen auf die Cellulose als Kohlenstoffquelle spezialisiert sind, bestimmt man die Intensität des Celluloseabbaus in Gegenwart von Glucose. Dabei wurde gefunden, daß sich die verschiedenen Formen nicht gleichartig verhalten. Einige setzen auf Cellulose-Agar mit einem Zusatz von 3% Glucose das Wachstum fort, während andere in diesem Falle keine Entwicklung mehr zeigen. Durch quantitative Bestimmung der zerstörten Cellulose wurde festgestellt, daß die Bazillen des sogenannten „langen Typs" bei einem Zusatz von 1% Glucose nur etwa 6,5% der Cellulose zerstören gegenüber 23% ohne Glucosezusatz. Völlig anders verhalten sich dagegen die Vertreter des klostridialen Typs. Von diesen Formen werden normalerweise etwa 5 % der Cellulose abgebaut; bei Glucosezusatz (1%) findet aber überhaupt kein Abbau der Cellulose mehr statt. Auf diese Weise läßt sich also zeigen, daß einige Formen auch nach Glucosezusatz die Cellulose weiterhin als Ernährungsbasis benutzen. Zusammenfassend läßt sich über die Cellulosebazillen folgendes sagen: 1. Die klostridialen Formen der Cellulosebazillen sind häufiger anzutreffen als die Vertreter des plektridialen Typs. Die Existenz von celluloseangreifenden Sporovibrionen ist noch umstritten. 2. Die aeroben Bazillen zersetzen die Cellulose langsamer als die Myxobakterien und Vibrionen. Der Abbau beginnt mit einer Hydrolyse der Cellulose. 3. Zur Kultivierung cellulosezersetzender aerober Bazillen sind außer den cellulosehaltigen Substraten auch Stärke- und Fleischbrühe-Agar, Fleischbrühe, Fleischbrühe-Gelatine und andere allgemein übliche Nährmedien geeignet. 4. Die Zersetzung der Cellulose durch Bazillen verläuft unter Bildung geringer Säuremengen. Bei gleichzeitiger Anwesenheit löslicher Mono- oder Disaccharide werden diese Zucker zu organischen Säuren oxydiert. 5. Bezüglich der verschiedenen Stickstoffquellen verhalten sich die Vertreter dieser Gruppe unterschiedlich. Einige von ihnen können anorganisch gebundenen Stickstoff verwerten, andere hingegen vermögen ihn nur aus organischen Verbindungen aufzunehmen. Der Vitaminbedarf der Cellulosebazillen ist noch nicht untersucht worden. 6. Die Gruppe der sporenbildenden Bakterien enthält sowohl aerobe als auch fakultativ anaerobe Formen. Sie fungieren somit, ähnlich wie die Actinomyceten, als Bindeglied zwischen den aeroben und anaeroben Cellulosebakterien. 7. Cellulosezersetzende Bazillen kommen im Boden erheblich seltener vor als die „klassischen" Erreger der aeroben Cellulosezersetzung, die Myxobakterien und Vibrionen. Spezialisierte Formen, die vorzugsweise die Cellulose verwerten, fehlen. Diese Tatsache und die geringe Verbreitung derartiger Mikroorganismen in der Natur führten zu der Annahme, daß sie bei der Zersetzung der Cellulose nur eine untergeordnete Rolle spielen. 7*

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I. Aerobe Cellulosebakterien 6. Actinomyceten und Mycobakterien ( Actinomycetales )

Als erster erkannte der russische Forscher KRAINSKI (1913) bzw. KRAINSKY(1914) die Fähigkeit der Actinomyceten, Cellulose zu zersetzen. Er konnte zwei Actinomycetenarten in Reinkultur züchten; eine der beiden Arten bildete auf Filtrierpapier charakteristische schwarze Kolonien. Diese Untersuchungen haben allgemeine Anerkennung gefunden und bilden die Grundlage für jegliches Studium der Cellulosezersetzung durch Actinomyceten. Leider wurde der Cellulosezerstörung durch die verschiedenen Vertreter der Actinomycetales in der Folgezeit sehr wenig Beachtung geschenkt. Es existiert nur eine relativ geringe Anzahl von Arbeiten, in denen über das Cellulosezersetzungsvermögen von Reinkulturen der Actinomyceten und Mycobakterien berichtet wird. Überdies besitzen diese Arbeiten vorzugsweise beschreibenden Charakter und betrachten das Problem vom morphologischen Gesichtspunkt her. Dagegen liegen keine Untersuchungen über die Biochemie der Cellulosezersetzung durch die Actinomyceten vor. Es erhebt sich zunächst die Frage, weshalb der Zersetzungsprozeß der Cellulose durch die aeroben Cellulosebakterien wesentlich ausführlicher untersucht worden ist als der Celluloseabbau durch die Mycobakterien und Actinomyceten, obwohl die letzteren in der Natur ungewöhnlich häufig vorkommen und gerade dort in großer Menge zu finden sind, wo pflanzliche Überreste vorhanden sind. Diese Vernachlässigung der Actinomyceten besitzt mehrere Ursachen. 1. In der Reihe der Actinomycetales fehlen spezialisierte Formen, wie sie bei den aeroben Cellulosebakterien vorhanden sind. Naturgemäß haben die Mikroorganismen, die nicht nur die Cellulose, sondern auch andere Kohlenstoffquellen verwerten können, geringere Beachtung gefunden als die engspezialisierten Celluloseformen. 2. Die Proactinomyceten, Actinomyceten und ähnlichen Formen lassen sich auf den üblichen Nährböden zur Reinzüchtung von Cellulosemikroorganismen nicht isolieren. So gedeihen z. B. auf feuchtem Filtrierpapier mit einer Kieselsäuregelunterlage vorzugsweise nur Myxobakterien und Vibrionen. Offenbar wird das Wachstum der Actinomyceten durch den hohen Feuchtigkeitsgehalt behindert. 3. Die Actinomyceten entwickeln sich wesentlich langsamer als die anderen cellulosezersetzenden Mikroorganismen. Deshalb werden die Actinomyceten häufig von fremden Bakterien überwuchert. Auch können sie von den Beobachtern übersehen werden, weil ihre Kolonien später in Erscheinung treten. Andererseits ist jedoch zu bemerken, daß die Fähigkeit der Actinomyceten- und MicromonosporaArten zur Zersetzung der Cellulose wohlbekannt ist, daß aber nur wenige Ergebnisse von Untersuchungen über die cellulosezersetzenden Mycobakterien und Proactinomyceten vorliegen. Wir wollen die Besprechung der Actinomycetales mit einer Betrachtung der Mycobakterien beginnen, wobei jedoch nur die mit der Zersetzung der Cellulose unmittelbar zusammenhängenden Fragen ausführlicher erörtert werden sollen. Eine allgemeine Charakteristik der Actinomyceten erübrigt sich hier, da ausführliche

B. Morphologie und Systematik

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Beschreibungen der morphologischen, physiologischen und systematischen Merkmale in einer Reihe von Monographien enthalten sind (KRASSILNIKOW, 1938, 1949; L I E S K E , 1 9 2 1 ; JENSEN, 1930, 1932).

a) Mycobakterien Die Mycobakterien sind im Boden und im Schlamm der Gewässer sehr verbreitet. Cellulosezersetzende Formen kommen scheinbar nur selten vor. KRASSILNIKOW (1938) bemerkt dazu, daß er unter den Mycobakterien und Mycokokken niemals Stämme beobachtet hat, die sich auf Cellulose entwickeln können. Möglicherweise beruhen die negativen Ergebnisse KRASSILNIKOWS darauf, daß er nur gut belüftete Substrate untersuchte. Es wird nämlich an einigen Stellen darauf hingewiesen, daß die Cellulosemycobakterien vorzugsweise im Süßwasserschlamm vorkommen. Kultiviert man Proben aus sauerstoffarmem Süßwasserschlamm auf Cellulose-Agar, so gehören etwa 3% aller sich entwickelnden Mikroorganismen zu den Mycobakterien. Die cellulosezersetzenden Mycobakterien sind dünne Stäbchen von 1,5 bis 3 [J. Länge und 0,2 JA Breite. In Kulturen, deren Bakterien in lebhafter Vermehrung begriffen sind, findet man häufig Stäbchen, die in einem gewissen Winkel aneinanderliegen. Seltener beobachtet man dagegen sich verzweigende Formen. Im hängenden Tropfen bilden die Mycobakterien ein dünnes rudimentäres Mycel, dessen Abmessungen etwas größer sind als bei den gewöhnlichen, sich verzweigenden Bakterien (HARMSEN, 1946).

Die von JENSEN (1940) als „Cor-3, Cor-Va und Cor-Vb" beschriebenen cellulosezersetzenden Mycobakterien sind kleine, dünne, unbewegliche, oft gekrümmte Stäbchen von unregelmäßiger Gestalt; Länge 1 bis 4 ¡x, Breite 0,4 bis 0,6 [x. Sie sind grampositiv. Es gibt aber auch bewegliche Formen unter den Cellulosemycobakterien. Dazu gehören z. B. der Stamm Va von JENSEN und von HARMSEN reingezüchtete Arten. Letzterer berichtet im Zusammenhang mit der Kultivierung derartiger Formen, daß in der Kultur nur eine geringe Anzahl von beweglichen Zellen vorhanden war. Die von HARMSEN beobachteten Mycobakterien erinnern mehr an die von TOPPING (1937/38) beschriebenen Formen als an die von GRAY und THORNTON (1928) untersuchte Gattung Mycoplana. In älteren Kulturen treten auch kürzere Stäbchen und Kokken auf. Demzufolge besitzen die cellulosezersetzenden Formen den gleichen Entwicklungszyklus wie die übrigen Mycobakterien. Bei der Zersetzung der Cellulose in der Natur spielen die Mycobakterien eine geringere Rolle als die ausgesprochenen Cellulosebakterien. Einige Gattungen sind jedoch sehr aktiv; Mycobakterien aus Komposterde, die auf angefeuchtetem Filtrierpapier gezüchtet wurden, zersetzen z. B. 60% der Cellulose. Mehrmalige Übertragungen auf Substrate, die als einzige Kohlenstoffquelle Cellulose enthalten, bewirken kein Nachlassen der cellulosezersetzenden Aktivität. Die Mycobakterien bilden auf Filtrierpapier farblose oder hellgelbe Zersetzungszonen. Der Charakter der Cellulosezersetzung ist der gleiche wie bei den Vibrionen; auf der Papieroberfläche bildet sich niemals ein stärkerer Bakterienrasen. Auf Grund dieses äußeren Merkmals kann man die Mycobakterien sofort von den entsprechenden Kulturen der Proactinomyceten und Actinomyceten unterscheiden.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Die Mycobakterien wachsen auf der Cellulose schneller und zersetzen diese intensiver als die Proactinomyceten. Auf Cellulose-Agär entstehen runde, stark hervortretende farblose oder gelbe Kolonien mit nichtgewölbter, ebener Oberfläche. Wenn diese in das Innere des Agars hineinwachsen, werden sie weißlich und nehmen eine linsenförmige Gestalt an. Ihr Durchmesser übersteigt selten 1 mm. Im Umkreis der Kolonien entstehen 1,5 bis 2 mm breite Zersetzungszonen. Auf cellulosefreien Nährböden wachsen die Mycobakterien schneller als auf cellulosehaltigen Substraten. Gutes Wachstum zeigen sie z. B . bei Verwendung von Fleischbrühe-Agar, auf dem runde, schleimige, transparente Kolonien entstehen, die sich andererseits langsamer entwickeln als solche echter Bakterien. Bei Benutzung von Fleischbrühe als Nährmedium bildet sich am Boden des Kulturgefäßes ein weißer Niederschlag aus; auf Kartoffeln beobachtet man einen gelben Belag. Aber auch verschiedene lösliche Kohlenhydrate und Stärke können von den Cellulosemycobakterien ausgezeichnet verwertet werden. Mono- und Disaccharide werden dabei zu Säuren oxydiert, Stärke wird unter gleichzeitiger Hydrolyse abgebaut. Bei der Züchtung auf Filtrierpapierstreifen findet das Wachstum nicht nur in Höhe des Flüssigkeitsspiegels statt, sondern auch in den submersen Bereichen. Die Mycobakterien besitzen demnach die Fähigkeit, Cellulose unter relativ anaeroben Bedingungen zu zersetzen. Man kann sie deshalb zu den fakultativ anaeroben Mikroorganismen rechnen. In dieser Beziehung unterscheiden sie sich deutlich von den übrigen aeroben Cellulosebakterien, die, wie bereits erwähnt, ausgesprochen aerobe Organismen darstellen. Die Fähigkeit, sich auch unter anaeroben Bedingungen zu vermehren, entspricht völlig ihrem natürlichen Standortvorkommen: vorzugsweise im Boden von Gewässern. Eine strenge Einteilung der Cellulosebakterien in aerobe und anaerobe Formen ist deshalb kaum möglich, weil es fakultativ anaerobe Organismen wie die Mycobakterien gibt, die als Bindeglied zwischen den beiden Gruppen fungieren. Die Mycobakterien sind bekanntlich häufig mit echten Bakterien verwechselt worden. Sehr wahrscheinlich gehören einige sporenbildende Cellulosebakterien doch zu den Mycobakterien. Nach JENSENS Ansicht trifft dies besonders für Cettvlomonas fimi zu, das dem von ihm beschriebenen Cor-3 sehr ähnlich ist. Die Frage der Beweglichkeit der Cellulosemycobakterien ist noch umstritten. Einige Autoren, z. B . KRASSILNIKOW (1938), lehnen die Existenz beweglicher Formen ab, wogegen andere Forscher (JENSEN, 1940; HARMSEN, 1946) Arten beschreiben, die eine aktive Beweglichkeit besitzen. b) P r o a c t i n o m y c e t e n Im Gegensatz zu den Mycobakterien ist bei den Proactinomyceten die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung weit verbreitet. E s gibt eine ganze Reihe von Formen, die auf Cellulose gedeihen. So isolierte z. B. KRASSILNIKOW mehr als 20 verschiedene Stämme, die auf Cellulose wachsen konnten. Dabei wurde das Papier trotz der Bildung eines dicken Bakterienrasens nur schwach angegriffen. Selbst nach einer Kultivierungsdauer von zwei Monaten war noch keine Zerstörung der Faserstruktur festzustellen.

B. Morphologie und Systematik

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Im Gegensatz zu KRASSILNIKOW fand J E N S E N ( 1 9 3 2 ) unter den von ihm isolierten Proactinomyceten keinen einzigen celluloseaktiven Stamm. Die Proactinomyceten kommen vorzugsweise in schlecht belüfteten Substraten vor, z. B. in kompakten Böden, im Schlamm von Bächen, in Komposthaufen und anderen Ansammlungen in Zersetzung begriffener organischer Substanz. Im normal belüfteten Boden fehlen sie gewöhnlich. Aus diesem Grunde dürfen sie auch nicht als autochtone Formen betrachtet werden. Junge Kolonien bestehen aus verzweigten Mycelen, ähnlich denen der Actinomyceten. Yom Zentrum der Kolonie ausgehend beginnt aber bald eine Segmentierung des Mycels in einzelne Abschnitte, woraus schließlich eine Masse kurzer Stäbchen und Kokken resultiert. In älteren Kulturen weicht die Morphologie der einzelnen Elemente schon weitgehend von den Bauprinzipien der Actinomyceten ab, und die Ähnlichkeit der Proactinomyceten mit den Bakterien ist in diesem Stadium bereits stark ausgeprägt. Die Dicke der Mycelfäden beträgt 0,15 ¡x. Da die Fäden vor der Teilung nicht dicker werden, besitzen die entstandenen bakterienähnlichen Elemente in der Kultur den gleichen Durchmesser. Nach HARMSEN befinden sich unter den kurzen Stäbchen bewegliche Elemente mit monotrich, lophotrich oder peritrich angeordneten Geißeln. Eine derartige Beweglichkeit zeigt jedoch nur ein bestimmter Prozentsatz der Zellen; diese sind anscheinend mit der Gattung Mycoplana verwandt. Allerdings bedürfen die Angaben HARMSENs nach Ansicht IMSCHENEZKIS einer Nachprüfung. Die cellulosezersetzenden Proactinomycetenarten unterscheiden sich voneinander durch die Bildung verschiedener Farbstoffe, durch die Stärke des Mycels und dessen Morphologie. Bisweilen erinnert dieses an die Mycele der Actinomyceten, in anderen Fällen besteht es aus stärkeren, unregelmäßig verdrehten Fäden, ähnlich den Mycelfäden der Micromonospora-Arten. Alle diese Angaben sind jedoch Ergebnisse von Kultivierungsversuchen auf Cellulose-Agar und beziehen sich deshalb nur auf Proactinomyceten, die auf diesem Substrat gezüchtet wurden. Einige Formen, z. B. Proactinomyces actinoides, Pr. fructiferi, entwickeln sich nur langsam. Ein gutes Wachstum auf Cellulose zeigt dagegen Pr. cytophagus. Diese Art wurde seinerzeit von BOKOR (1930) als Mycococcus cytophagus beschrieben. Es handelte sich aber um eine Mischkultur, in der auch Proactinomyceten enthalten waren. Wahrscheinlich gehört auch die von MERKER (1912) als Micrococcus melanocydus beschriebene Form zu den Proactinomyceten. Pr. cytophagus bildet auf Filtrierpapier einen dicken schneeweißen Rasen, der aus faden-, stäbchen- und kokkenförmigen Zellen besteht. Die Oberfläche dieses Rasens ist von einem zarten Flaum aus kurzen, geraden Fruchtkörpern bedeckt, die später in kurze stäbchenförmige Sporen zerfallen. Auf den verschiedenen Nährböden zeigt diese Proactinomycetenart ein Wachstum, das dem der Bakterien ähnlich ist. Die Kolonien sind hügelig, von pastenartiger Konsistenz, glänzend oder matt, aber stets unbehaart. Anfangs sind einige haarartige Fäden vorhanden, die später aber in Stäbchen und Kokken zerfallen. Gelatine wird von Pr. cytophagus nicht verflüssigt; dagegen wird Milch schwach peptonisiert, wobei aber kein Gerinnen eintritt. Stärke wird hydrolysiert, Saccharose invertiert

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I. Aerobe Cellulosebakterien

und Nitrate werden reduziert. Pr. cytophagus wird als Varietät von Pr. albicans betrachtet. Die Kolonien der Celluloseproactinomyceten entwickeln sich nur langsam und werden deshalb im allgemeinen übersehen. Bei der Kultivierung auf Cellulose-Agar wird die Hydrolysenzone der Cellulose erst spät sichtbar. Die Proactinomycetenansammlungen erinnern an kleine Kolonien von Bac. mycoides, da ihre Ränder ebenfalls durch zahlreiche Auswüchse fein gezähnt sind. In einem späteren Entwicklungsstadium besitzen sie eine gewisse Ähnlichkeit mit den Kolonien farbloser oder hellgelber Actinomyceten. Da jedoch fast nie ein Luftmycel ausgebildet wird, kann man sie leicht von den typischen Actinomyceten unterscheiden. c) G a t t u n g

Micromonospora

Nach JENSEN (1930, 1932) gehören etwa 8%, nach HARMSEN (1946) etwa 2% aller isolierten Actinomyceten der Gattung Micromonospora an. Die Micromonospora-Arten verursachen einen intensiven Abbau der Cellulose. KRASSILNIKOW (1949) führt eine Reihe von Formen an, die auf Cellulose gut gedeihen, z. B. Micromonospora globosa, M. chalceae, M. elongata, M. bicolor. 1930 isolierte JENSEN eine Reihe von Micromonospora-Arten; dabei fand er einige Formen, die Cellulose aktiv zersetzen. Alle von HARMSEN isolierten Arten entwickelten sich auf Cellulose-Agar nur langsam und bildeten kleine, brüchige Mycele mit kurzen Verzweigungen, auf denen einzelne runde Sporen sichtbar waren; freiliegende Sporen sammelten sich und bildeten kleine Sporenhäufchen. Ein Luftmycel fehlte, und auch die Sporen konnten nur im Substrat entdeckt werden. Die reifen Sporen besaßen einen breiten, hellen Streifen, aus dem gewöhnlich der Keim hervortritt. Die Kolonien waren meist braun oder hellgrau gefärbt. Im Habitus ähneln sie sehr den Bakterienkolonien. Deshalb kann man die systematische Stellung dieser Mikroorganismen nur mit Hilfe des Mikroskops bestimmen. Bei einigen Stämmen bildet sich rings um die Kolonie eine breite Hydrolysenzone aus. Infolge der gegenseitigen Durchdringung von Papier und Mycel ist es sehr schwierig, die genaue Menge an zerstörter Cellulose festzustellen. In einigen Fällen wurde z. B. ein Celluloseverlust von 35 Gew.-% gefunden; dieser Wert dürfte jedoch in Wirklichkeit höher liegen. Die Gattung Micromonospora besitzt, wie auch die anderen Gruppen der Actinomycetales, keine engspezialisierten cellulosezersetzenden Formen; die verschiedenen Arten gedeihen ebenso gut auch auf Medien mit löslichen Kohlenhydraten. Die Zugabe von 2% Glucose zum Cellulose-Agar vermindert jedoch nicht die cellulolytische Wirksamkeit der Strahlenpilze. Besondere Beachtung verdient eine Micromonospora-Form, die HUNGATE (1946) aus dem Darm der Termitenart Amitermes minimus isolieren konnte. Sie erzeugt eine große Anzahl kugeliger Sporen mit einem Durchmesser von 0,8 [x, die einzeln an kurzen Verzweigungen des Mycels sitzen (Abb. 46). Im Zusammenhang mit den bei Kultivierungsversuchen zu beachtenden Sauerstoffverhältnissen ist die Beobachtung von Wichtigkeit, daß die Kolonien nicht auf den dünnen Agar-Schichten wachsen, die beim Erstarren des flüssigen Cellulose-Agars an den Wänden des Reagenzglases entstanden sind, sondern sich nur im Innern des Nährbodens entwickeln. Diese

T a f e l 16

Abb. 46. Sporenbildung bei Micromonospora propionici

Abb. 47. Kolonien der Art M. propionici auf Cellulose-Agar. Das Auftreten von Ringen bei der Sporenbildung ist deutlich zu erkennen

Abb. 48. Schwarze ringförmige Kolonien der Art Actinomyces melanocyelvs auf Filtrierpapier

B. Morphologie und Systematik

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Tatsache bestätigt wiederum die Fähigkeit der Actinomyceten, die Cellulose unter anaeroben Bedingungen zu zersetzen. Die Entwicklungsgeschichte der Kolonien ist sehr eigenartig. Zunächst erscheint im Cellulose-Agar eine transparente Zone. In diesem Bereich entsteht eine Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 1 mm, deren Zentrum transparent bleibt, während sich ein weißes, undurchsichtiges Wachstumsareal ringförmig im Agar ausbreitet. An diesen Wachstumsring schließt sich zentrifugal eine Hydrolysenzone an (Abb. 47). Das eigenartige Wachstum kann nicht mit einem Absterben und der Auflösung des Koloniezentrums zusammenhängen, da in glucosehaltigen Medien die Kolonien die übliche runde Gestalt und einen einheitlichen homogenen Aufbau besitzen. Vielmehr ist eine derartige Ausbreitung auf der Oberfläche des Cellulose-Agars wohl so zu deuten, daß der Mikroorganismus bestrebt ist, neue Flächen des Cellulose-Agars zu erreichen. Bei einer mikroskopischen Untersuchung des Darminhalts der Termite gelang es nicht, Micromonospora-Arten oder ähnliche Mikroorganismen zu entdecken. Auch das langsame Wachstum der Micromonospora-Formen könnte zu der Annahme führen, daß sie bei der Verdauung der Cellulose im Darm nur eine untergeordnete Rolle spielen. Diese Vermutung kann jedoch kaum zutreffen, da es gelungen ist, aus dem Darminhalt einer einzigen Termite 500 Micromonospora-TLo\om.va. zu isolieren. Derselbe Autor konnte früher eine Micromonospora-Form aus einer Kultur von Einzellern erhalten, die aus dem Pansen von Wiederkäuern stammte. Offenbar sind also die Micromonospora-Axten in der Natur verbreitet und an der Zersetzung der Cellulose weitgehend beteiligt. TEPLJAKOWA (1950) untersuchte beispielsweise cellulosezersetzende Mikroorganismen aus dem Boden der Provinz Kasachstan und konnte dabei eine Kultur von M. vulgaris isolieren, die in der Lage war-, Filtrierpapier zu zerstören; dieser Abbau ging aber sehr langsam vonstatten und fand nur in bestimmten Bereichen statt. Diese Micromonospora-Art bildete auf dem Papier transparente Bereiche und verwandelte das Substrat in eine gelartige, schleimige Masse. Diese Zerstörungsform ist bei den Actinomyceten gewöhnlich nicht zu finden, so daß einer derartigen Beobachtung eine gewisse Bedeutung zukommen würde, wenn es sich überhaupt um eine Reinkultur gehandelt hat. d) A c t i n o m y c e t e n Als erster war KRAINSKI (1913) bzw. KRAINSKY (1914) in der Lage, aus dem Boden Reinkulturen von Actinomyceten zu isolieren; ferner konnte er ihre Fähig.keit zur Zersetzung der Cellulose nachweisen. Später wurde diese Fähigkeit einiger Actinomycetenarten auch von anderen Forschern erkannt. Es erschienen zahlreiche Berichte, in denen auf die weite Verbreitung der Actinomyceten in der Natur hingewiesen wird; sie treten meist dort auf, wo Pflanzenreste verwesen, im Stroh, Heu, Kompost usw. Eine große Rolle spielen sie auch bei der Zersetzung der Wurzeln im Boden, beim Abbau der organischen Substanz auf dem Boden von Gewässern usw. Diese Organismengruppe besitzt eine ganze Reihe von biologischen Merkmalen, die sie deutlich von den übrigen Bakterien unterscheiden, die ebenfalls ah der Umwandlung der organischen Materie beteiligt sind.

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I. Aerobe Cellulosebakterien

Die Actinomyceten entwickeln sich wesentlich langsamer als die Bakterien. Ihr langes dünnes verzweigtes Mycel kann sich dem Substrat außerordentlich gut anpassen. Die Mycelfäden umschlingen die Teilchen des zu zersetzenden Stoffes — speziell die celluloseenthaltenden Pflanzenreste •—• sehr eng und fest. Die Zersetzung durch Actinomyceten stellt offenbar die Schlußphase der Mineralisierung des organischen Materials dar. Unter den Actinomyceten ist die Fähigkeit weit verbreitet, verschiedene antibiotische Stoffe zu erzeugen; dadurch sind sie in der Lage, sich im Kampf ums Dasein zu behaupten und ihre langsame Entwicklung gewissermaßen zu kompensieren. Trotz des Reichtums an Actinomycetenformen, die zur Cellulosezersetzung befähigt sind (im „Bestimmungsbuch der Bakterien und Actinomyceten" von KRASSILNIKOW sind etwa 60 Celluloseactinomyceten angeführt), ist die von ihnen verursachte Zerstörung der Cellulose nicht so ausführlich erforscht worden wie der Celluloseabbau durch die echten Bakterien. Diese geringe Beachtung der Actinomyceten läßt sich zum Teil dadurch erklären, daß es unter ihnen keine engspezialisierten Formen gibt; alle entwickeln sich erheblich besser auf Medien mit löslichen Kohlenhydraten als auf cellulosehaltigen Nährböden. Die Einteilung der Celluloseactinomyceten kann nach den verschiedensten Gesichtspunkten erfolgen. Es ist deshalb kaum angebracht, hier auf die Besonderheiten ihres Wachstums, die Art der Kolonienbildung, den mikroskopischen Aufbau und die Entwicklungsgeschichte einzugehen, da alle diese Fragen in einer Reihe von Monographien und Lehrbüchern über die Morphologie und Systematik ausführlich behandelt werden. Es sollen deshalb nur kurz zwei von KRAINSKI (1913) bzw. KRAINSKY (1914) isolierte Actinomycetenarten besprochen werden. Diese beiden Arten besitzen ein gewisses historisches Interesse, da bei ihnen erstmalig die Fähigkeit der Actinomyceten zur Cellulosezersetzung nachgewiesen wurde. Ferner treten beide Formen am häufigsten als Erreger der Cellulosezersetzung auf. In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, daß GORBUNOW (1946, 1949) beim Studium der Cellulosezersetzung im Wolgadelta aus Pflanzenüberresten die zwei bereits früher von KRAINSKI beschriebenen Arten isolieren konnte. KRAINSKI schildert den Entwicklungsverlauf der ersten Art, Actinomyces mdcrnocyclus, in folgender Weise. Nach der Beimpfung des Filtrierpapiers entstehen innerhalb von vier bis fünf Tagen auf dem Papier rosafarbene Flecken, die allmählich schwarz werden und sich mit einer Schicht von Aerosporen bedecken. Charakteristisch für A. melanocyclus ist die Bildung konzentrischer, abwechselnd heller und dunkler gefärbter Ringe auf dem Filtrierpapier (Abb. 48); diese Eigenart kommt auch in der . Bezeichnung „melanocyclus" zum Ausdruck. Ein derartiges Erscheinungsbild findet man nicht nur auf Filtrierpapier, sondern auch auf anderen Medien. A. melanocyclus entwickelt sich auf Filtrierpapier, das in ein flüssiges Medium eintaucht, in Höhe des Flüssigkeitsspiegels, wodurch das Papier schwarz gefärbt wird und seine Struktur verliert. In älteren Kulturen wird das Papier im Zentrum der Kolonie und in den dunkler gefärbten ringförmigen Zonen durchscheinend. Mit der Entwicklung der Actinomyceten ist eine erhebliche Zersetzung des Papiers verbunden, das bei Berührung sehr leicht zerfällt. Bei der mikroskopischen Unter-

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suchung beobachtet man dünne Mycele, deren verzweigte Fäden die Papierfasern eng umschlingen. Einzelne Mycelstränge verlaufen häufig in Richtung der Fasern. Zwischen diesen Fasern findet man Anhäufungen runder Sporen, deren Durchmesser 0,8 bis 1,5 (x beträgt und die meist einzeln liegen; seltener bilden sie Ketten. Die Sporen lassen sich leicht von der Cellulose entfernen. Deshalb erinnert das mikroskopische Bild einer solchen Kultur stark an eine Reinkultur kokkenförmiger Bakterien. Auf Glucose-Agar mit einem Zusatz von Ammoniumsalzen bildet A. mdanocyclus am zweiten Kulturtage rosafarbene Kolonien, die sich nach vier bis fünf Tagen mit schwarzen Aerosporen bedecken. Auf Fleischbrühe mit einem Zusatz von 1% Glucose ist das Wachstum schlechter; auf Fleischbrühe-Agar entstehen keine Aerosporen. Fleischbrühe-Gelatine wird durch das Wachstum der Actinomyceten verflüssigt. Die zweite Art, die vonKRAINSKI als A.albosporeus beschrieben wurde, bildet auf Filtrierpapier in flüssigem Nährmedium einen kreideähnlichen Belag. Nach einer Woche färbt sich zunächst das Papier, schließlich auch die Flüssigkeit rosa. Auf Fleischbrühe-Agar mit einem Zusatz von Glucose entstehen runde Kolonien, die in das Medium hineinwachsen und von einer Schicht weißer Sporen bedeckt sind. Das im Verlauf der weiteren Entwicklung ausgeschiedene rosafarbene Pigment diffundiert auch in das Medium hinein. Auf Fleischbrühe-Agar ohne Glucosezusatz werden keine Sporen erzeugt. Fleischbrühe-Gelatine wird verflüssigt. Die Sporen von A. alboroseus besitzen die Gestalt kurzer Stäbchen mit einer Länge von 1,5 bis 2 JA und einer Breite von 1 (x. Sie treten entweder einzeln auf oder bilden Zweier- oder Dreiergruppen. Diese Art unterscheidet sich von A. melanocyclus auch dadurch, daß ihre Mycelfäden länger sind und daß der von ihr gebildete Farbstoff wasserlöslich ist, wogegen das schwarze Pigment von A. mdanocyclus nicht leicht zu isolieren ist und selbst beim Kochen mit Lauge nur teilweise in Lösung geht. 1914 konnte KRAINSKY aus einer bei 30° C bebrüteten Rohkultur eine weitere cellulosezersetzende Form erhalten, die er A. cellulosae nannte. Ferner prüfte er die Arten A. diastaticus, A. roseus, A. griseus, A. erythrochromogenes und andere Formen auf ihre Fähigkeit zur Cellulosezersetzung. Fast alle angeführten Arten bilden auf Filtrierpapier Luftmycele, die violett, rosa oder andersartig gefärbt sind. Einige gedeihen auf Filtrierpapier überhaupt nicht (z. B. A. erythrochromogenes), während andere nur ein geringes Wachstum zeigen. KRAINSKI weist darauf hin, daß Cellulose-Agar zur Prüfung der Actinomyceten auf ihre Fähigkeit zur Cellulosezersetzung wenig geeignet ist, da diese sich bereits auf reinem Agar ausgezeichnet entwickeln. Sie sind also durchaus in der Lage, auch Agar-Agar als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten. Irgendeine Gesetzmäßigkeit in der Verteilung der cellulosezersetzenden Eigenschaften läßt sich bei den Actinomyceten nicht erkennen. Die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung kommt bei den verschiedensten Arten vor. Man kann jedoch eine gewisse Einteilung in der Weise vornehmen, daß man die cellulosezersetzenden Formen in einer Gruppe zusammenfaßt.

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In ähnlicher Weise versuchte HARMSEN (1946) ein System der Actinomyceten aufzustellen. Er isolierte eine große Anzahl von Formen und verteilte sie auf drei Gruppen, A, B und C. Die Gruppe A enthält ihrerseits wieder vier Untergruppen: Untergruppe 1, 2, 5 und 6. Zur ersten Untergruppe gehören typische Actinomyceten mit kräftigem Luftmycel. Sie erzeugen kugelige Sporen, die sich auf spiralig gewundenen Carpophoren bilden und in ihrer Gesamtheit eine weiße Schicht ergeben. Das Trägermycel ist gut entwickelt, stark verzweigt und besitzt ein schnelles Wachstum. Es besteht aus 0,4 [i dicken Fäden. Die Vertreter dieser Untergruppe sind meist farblos und besitzen einen typischen Erdgeruch. Die zweite Untergruppe unterscheidet sich von der ersten lediglich dadurch, daß sie Actinomyceten enthält, deren Mycel im Substrat nur schwach entwickelt ist und deren einzelne Fäden sehr dünn (0,2 fx) und lang sind. Die Angehörigen dieser Untergruppe bilden ovale längliche Sporen, die auf kurzen, geraden Carpophoren entstehen. Nach einem von WAKSMAN aufgestellten System sind die Vertreter der ersten und zweiten Untergruppe der Sektion albo-flavus zuzuordnen. Zur Gruppe A gehören aber auch die Vertreter der fünften Untergruppe. Diese besitzen ein rasch wachsendes, stark verzweigtes Substratmycel, das aus sehr dünnen (0,15 ¡x) Hyphen besteht. Die Kolonien erscheinen flockenartig, ein Luftmycel ist nur schwach entwickelt. Desgleichen findet eine Bildung von Sporen, die eine runde bis längliche Gestalt aufweisen, nur in geringem Umfang statt. Zu dieser Untergruppe gehören Arten, die orange, braune, graue oder violette Farbstoffe erzeugen und denen der oben erwähnte erdige Geruch fehlt. Die Vertreter der sechsten Untergruppe unterscheiden sich von denen der fünften in relativ wenigen Merkmalen. Nach WAKSMAN gehören z. B. folgende Arten zur fünften und sechsten Untergruppe: A. salmonicolor, A. asteroides, A. fradii u. a. Somit sind die fünfte und sechste Untergruppe HARMSENs mit der von WAKSMAN aufgestellten Sektion fradii-asteroides identisch. Für die Actinomyceten der Gruppe B sind das rasche Wachstum und die Bildung eines ausgeprägten Substratmycels, das aus sehr dünnen Fäden besteht, charakteristisch. Die grau gefärbten Kolonien sind nicht scharf abgegrenzt und besitzen Auswüchse, die in das Substrat eindringen. Sporen bilden sich sowohl an den Hyphen des Substrat- als auch an denen des Luftmycels. Sie besitzen zunächst zylindrische Gestalt, runden sich dann aber etwas ab. Da das Luftmycel nur schwach entwickelt ist, bilden sich die Sporen hauptsächlich im Substrat. Nach WAKSMAN gehören in die Gruppe B Arten wie A. diastaticus und A- lipmanii. In den Kolonien der Gruppe C entstehen Sporen von länglicher Gestalt, die auf langen geraden Carpophoren sitzen und in ihrer Gesamtheit einen kreideähnlichen Belag bilden. Das langfädige Mycel wächst rasch und ist weiß oder hellbraun gefärbt. Die Gruppe C enthält Arten, die nach der WAKSMANschen Systematik in die Gruppe albo-luteus gehören. Die Vertreter der Gruppen B und C gehören nach ÜARMSEN ZU den Formen, die celluloseenthaltende Stoife am aktivsten angreifen.

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Obige Ausführungen unterstützen die bereits früher erwähnte, weit verbreitete Ansicht, daß die verschiedenen Actinomyceten infolge ihrer Affinität zur Cellulose als Kohlenstoff- und Energiequelle in der Lage sind, Cellulose zu zersetzen. Die Intensität des Celluloseabbaus schwankt bei den verschiedenen Formen sehr stark. KRASSILNIKOW gibt folgende Bewertung einiger Actinomycetenarten bezüglich ihres Celluloseabbauvermögens nach einem Fünfpunktesystem: A. coelicolor 5, A. sulfureus 5, A. aureus 5, A. cellulosae 5, A. verne 5, A. glaucus 5, A. Candidus 5, A. chromogenus 5, A. hygroscopicus 4, A. griseoflavus 4, A. ochroleucus 4, A. loidensis 4, A. viridans 4, A. albidus 4, A. griseolus 4, A. diastaticus 4. A. thermofuscus 3. A. xanthostromus 3, A. flavochromogenes 2, A. bovis 2, A. sampsonii 2. Außer diesen Arten besitzen viele andere Formen ebenfalls die Fähigkeit, Cellulose zu zersetzen, wenn auch bei ihnen diese Eigenschaft weniger ausgeprägt ist. Nach KRASSILNIKOW (1949) bilden die Celluloseactinomyceten hauptsächlich blaue, violette, rote, graugrüne oder dunkelgraue Kolonien. Von großem theoretischen Interesse ist die Tatsache, daß bei vielen Actinomycetenarten Varietäten auftreten, die sich gegenüber der Cellulose als Kohlenstoffquelle sehr unterschiedlich verhalten. So besitzt z . B . A. longisporus sowohl die Stämme 50 und 145, die Cellulose nicht angreifen, als auch den Stamm 317, der die Cellulose aktiv zersetzt. Bei A. griseus greifen die Stämme 70 und 78 die Cellulose ebenfalls nicht an, während die Stämme 20 und 855 sehr celluloseaktiv sind. Der Stamm 238 von A. arcmaticus besitzt deutlich ausgeprägte cellulosezersetzende Eigenschaften, während der Stamm 102 derselben Art in dieser Beziehung nicht aktiv ist. Vier Stämme von A. longisporus ruber griffen Cellulose nicht an, wogegen zwei Stämme sehr aktiv waren. Die Anzahl der Beispiele ließe sich noch beliebig vermehren, die angeführten genügen jedoch für die Feststellung, daß die Fähigkeit zum Abbau der Cellulose nicht immer ein Artmerkmal ist und daß sich verschiedene Stämme der gleichen Art in dieser Beziehung unterschiedlich verhalten. Für die Systematik besitzt dieses Merkmal also nur einen relativen Wert. Bei derartigen Beobachtungen taucht die Frage auf, ob es auch in anderen Bakterienreihen Arten mit mehreren Stämmen gibt, die sich voneinander nur durch die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung unterscheiden. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß nach Angaben von IMSCHENEZKI die zur Reihe Myxobacteriales gehörenden typischen fruchtkörperbildenden Myxokokken Cellulose nicht angreifen. Dagegen konnte PRONINA (1952) unlängst eine Myxokokkenkultur isolieren, die Cellulose zersetzt. Es ist daher durchaus möglich, daß auch unter den Myxobakterien und echten Bakterien Arten vorkommen, die aus Cellulose- und Nichtcellulosestämmen bestehen. Der Abbau der Cellulose verläuft bei den cellulosezersetzenden Actinomyceten ganz anders als bei den eigentlichen Cellulosebakterien. Filtrierpapier wird gewöhnlich nicht durchscheinend, d. h. es verwandelt sich nicht in eine dünne, transparente, schleimige Folie, wie sie z. B. bei der Einwirkung von Myxobakterien entsteht. Die Faserstruktur des Papiers bleibt normalerweise erhalten. Ein derartiges Wachstum ohne sichtbare Zerstörung der Cellulose ist sehr merkwürdig. Nachdem KRASSIL-

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I. Aerobe Cellulosebakterien

NIKOW (1938) festgestellt hatte, daß das Papier durch die Actinomycetenentwicklung nicht zerstört wird, erörterte er die Frage, welche Stoffe dann als Kohlenstoffquelle für die Entwicklung der Mikroorganismen in Betracht kommen: Da das zu seinen Untersuchungen benutzte Papier stärkefrei war und auch alle übrigen Bestandteile durch mehrfache Extraktion mit Wasser herausgewaschen waren, konnten irgendwelche Verunreinigungen des Papiers nicht zur Erklärung des Wachstums herangezogen werden. Wenn die Entwicklung der Organismen von der Stärke oder von anderen fremden Bestandteilen des Papiers abhängig wäre, so müßten alle Actinomycetenarten und -stamme in der Lage sein, sich auf Filtrierpapier zu entwickeln, was aber nicht der Fall ist. Einen besonderen Platz in der Erforschung des Celluloseabbaus durch Mikroorganismen nehmen die Arbeiten von LlESKE (1921) ein, der unter den von ihm isolierten und untersuchten Actinomycetenarten keine einzige finden konnte, die Cellulose angreift. Alle Arten zeigten nur ein sehr spärliches Wachstum auf Substraten, die als einzige Kohlenstoffquelle chemisch reine Cellulose enthielten. Es gelang ihm ferner auch nicht, bei den Actinomyceten Cellulase nachzuweisen oder zu isolieren. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß die negativen Ergebnisse LlESKEs auf das Fehlen von anderen für das Wachstum notwendigen Stoffen im benutzten Medium zurückzuführen sind. Zu ähnlichen Schlüssen gelangte auch TEPLJAKOWA (1950), die auf Grund von Untersuchungen über den Gehalt der Böden Kasachstans an Cellulosemikroorganismen zu der Überzeugung kam, daß die Actinomyceten beim Abbau der Cellulose im Boden nur eine verhältnismäßig untergeordnete Rolle spielen. Allerdings konnte TEPLJAKOWA eine Art, A. globisporus, isolieren, die Filtrierpapier zerstörte, wobei dieses allmählich durchscheinend wurde und sich in einen schleimigen Stoff verwandelte. Diese Beobachtung steht jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen anderer Autoren. Die Cellulose wird von verschiedenen Actinomyceten zersetzt. Eine Art, A. melanocyclus, sowie die sehr nahe verwandte oder sogar identische Art, A. melanogenes, sind besonders interessant, weil sie eine deutliche, sogar mit bloßem Auge sichtbare Zerstörung der Cellulose bewirken. Bereits KRAINSKI (1913) bzw. KRAINSKY (1914) stellte fest, daß diese Arten bei Strichimpfung rinnenartige Vertiefungen im Papier hervorrufen, die gewissermaßen in das Papier hineinwachsen. Derartige Erscheinungen sprechen für eine intensive Zersetzung der Cellulose. Ferner sind diese Arten auch deswegen von besonderem Interesse, weil sie außerordentlich weit verbreitet sind und besonders in den Böden von Gewässern oder in Pflanzenresten, die im Wasser faulen, vorkommen. RüBENTSCHIK (1930, 1948) konnte beide Arten häufig aus Gewässern isolieren (Kujalnizki-Liman, Bodenablagerungen salziger Gewässer der Ukrainischen SSR usw.). Einige Stämme dieser Arten haben sich im Laufe der Zeit den hohen Salzkonzentrationen ganz ausgezeichnet angepaßt. Derartige halophile Formen entwickeln sich gut auf Medien mit einem Gehalt von 17% Natriumchlorid. Die Affinität verschiedener Actinomyceten zur Cellulose ist von WAKSMAN (1919) untersucht worden. Zur Kultivierung benutzte er CzAPEKsches Nährmedium, in das

B. Morphologie und Systematik

111

Filtrierpapierstreifen eintauchten oder das mit 0,5% umgefällter Cellulose versetzt war. Es wurden 27 Actinomycetenarten geprüft, von denen 20 reguläre binomiale Artnamen besaßen, während die restlichen 7 nur mit Nummern versehen waren. Die erhaltenen Resultate lassen sich folgendermaßen zusammenfassen. 1. Die Actinomyceten entwickeln sich auf Filtrieipapier einerseits und auf Medien mit umgefällter Cellulose andererseits mit unterschiedlicher Intensität. 2. Von den untersuchten Arten zeigten sieben auf Filtrierpapier überhaupt kein Wachstum. Auch die anderen Actinomyceten entwickelten sich nur schwach; nach dem Fünfpunktesystem erhielten sie die Bewertungen 1 oder 2, höchstens 3. Auf Papier unterblieb die Bildung von Luftmycelen, und auch auf regenerierter Cellulose konnte eine schwache Entwicklung dieser Mycelform nur in zwei Fällen beobachtet werden. 3. Auf Filtrierpapier wurden runde, auf Regeneratcellulose meist flockenförmige, seltener runde Kolonien gebildet. 4. Mit zunehmender Entwicklung der Actinomyceten wird das Medium schwach alkalisch (pH 7,2 bis 7,7). Des weiteren untersuchte WAKSMAN die Entwicklung der 27 Actinomycetenarten auf vier verschiedenen cellulosehaltigen Medien. Dieselbe Art wurde gleichzeitig auf Cellulose-Agar und auf Filtrierpapier nach KRAINSKI, ferner in CzAPEKscher Nährlösung kultiviert, in die entweder Filtrierpapierstreifen eintauchten oder die mit regenerierter Cellulose versetzt war. Etliche Actinomycetenarten entwickelten sich auf allen Substraten vorzüglich. Cellulose-Agar wurde später nicht mehr benutzt, da einige Arten die Fähigkeit besitzen, Agar-Agar als Kohlenstoffquelle zu benutzen und somit ein eventuelles unterschiedliches Wachstum auf Filtrierpapier bzw. Cellulose-Agar damit erklärt werden kann, daß der Organismus nicht die Cellulose, sondern das Agar-Agar verwertet; auf dieses Problem hat bereits KRAINSKI hingewiesen. Selten sind die Kolonien von einer Hydrolysenzone des Cellulose-Agars umgeben. Bei der Entwicklung von A. verne, A. ezfoliatus u. a. auf Filtrierpapier in flüssigem Medium entstehen auf der Papieroberfläche zunächst kleine weiße Kolonien, die sich später ablösen und entweder auf der Flüssigkeit schwimmen oder zu Boden sinken. Einige Arten bilden schwarze Zonen auf dem Papier; sie sind offenbar mit der Art A. mdanocydus verwandt. Dies trifft besonders für die Kultur Nr. 120 zu. Von den 27 untersuchten Arten zeigte A. verne überhaupt kein Wachstum auf Cellulose-Agar. Aber auch die meisten anderen Organismen entwickelten sich nur mäßig, lediglich A. aureus erzielte fünf und A. 215 vier Punkte. Drei Punkte erreichten Arten wie A. albidus, A. bobili, A. exfoliatus. Bei A.. violaceus, A. ezfoliatus und A. bobili wurden schmale Hydrolysenzonen in der Umgebung der Kolonien beobachtet. In flüssigem Nährmedium suspendierte Cellulose konnte in zehn Fällen nicht als Substrat benutzt werden, da die Kulturen auf diesem Nährboden kein Wachstum zeigten. Bei Verwendung der gleichen Nährlösung, die lediglich an Stelle der suspendierten Cellulose Filtrierpapierstreifen enthielt, betrug die Anzahl der nicht zur Entwicklung gelangenden Arten nur noch sechs. Eine Kultivierung nach der Methode von KRAINSKI verminderte diese Anzahl auf drei.

112

I. Aerobe Cellulosebakterien

Somit hat sich das Verfahren von KRAINSKI als das brauchbarste erwiesen. Die untersuchten Actinomyceten entwickelten sich nicht nur oberhalb des Flüssigkeitsspiegels, sondern häufig auch auf dem submersen Teil des Papierstreifens. Sie können also, wie auch die anderen Actinomycetenarten, die Cellulose unter relativ anaeroben Bedingungen zersetzen. Die optimale Entwicklungstemperatur liegt zwischen 24 und 30° C, es sind aber auch thermophile Formen bekannt, die sogar noch bei 60° C auf der Cellulose wachsen können. Zum Schluß dieses Abschnitts sollen die gewonnenen Erkenntnisse über die Zersetzung der Cellulose durch verschiedene Actinomyceten noch einmal kurz zusammengefaßt werden. 1. Cellulosezerstörende Arten gibt es bei den Mycobakterien, Proactinomyceten, Actinomyceten und in der Gattung Micromonospora. Die Mycobakterien sind in dieser Hinsicht noch wenig untersucht worden; möglicherweise handelt es sich nur um einzelne Rassen oder Stämme, die in der Lage sind, Cellulose anzugreifen. 2. Alle Angehörigen der Reihe Actinomycetales wachsen relativ langsam. Aus diesem Grunde bewirken sie au

Zersetzte Cellulose

Versuchsansatz (aerob)

in g

in %

Ö SP •8 a «S-s

m 0 60 60JS Ö ö a .2 r® -H ^ s « •60^ S S,—,

ing

in %

Zersetzte Cellulose

S 60

M o Ha

90 90 91 92 91 91 91 92

1,676 1,735 1,810 1,750 1,740 1,779 1,779 1,792

0,147 0,065 0,219 0,145 0,122 0,137 0,152 0,159

8,7 3,7 12,1 8,2 7,0 7.7 8,5 8.8

14.0 6,0 18,0 5.4 3.5 10,8 15.1 4,5

1,713 1,731 1.728 1.729 1,807 1,861 1,727 1,816

0,283 0,162 0,532 0,282 0,304 0,304 0,292 0,159

16,5 9,3 30.7 16,3 16.8 16,3 16,9 8,7

0 0 0 0 0 0 0 0

Mittelwert:

1,757

0,143

8,0

9,6

1,764

0,289

16,4

0

6/1 6/3 7/8 8/7 10/10 10/7 10/4 11/1

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

153

IMSCHENEZKI (1938) und Mitarbeiter führten entsprechende Versuche mit Rundfiltern auf Glasröhrchen in HüTCHlNSONscher Nährlösung durch (vgl. S. 39 und Abb. 9). Als Versuchsobjekte dienten die Arten Sporocytophaga myxococcoides und Vibrio vulgaris, die bei 25 °C kultiviert wurden. Nach zwölftägiger (Sporocytophaga) bzw. elftägiger (Vibrio) Entwicklung unter aeroben Bedingungen wurden die als Kolbenverschluß dienenden Wattestopfen abgeschnitten, die Kolbenöffnungen mit Paraffin überzogen und bei der gleichen Temperatur weiterkultiviert. Nach dreimonatiger Kultivierungsdauer wurden der Zuckergehalt nach BERTRAND und der Celluloseverlust bestimmt. Die dabei erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 11 und 12 zusammengestellt. Zur Kontrolle wurde in einem Teil der Kolben der Celluloseverlust vor dem luftdichten Verschließen der Kolben ermittelt. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit zog IMSCHENEZKI folgende Schlüsse: 1. Beschränkt man die Luftzufuhr, so reichern sich in den Vibrio vulgär isKulturen erhebliche Zuckermengen an. So entstanden z. B. bei der Zersetzung von 143 mg Cellulose 9,6 mg Zucker (Durchschnittswert von acht Ansätzen). Es ist aber nicht richtig, diesen Zucker auf eine Cellulosemenge von 143 mg zu beziehen, da während der aeroben Entwicklung der Vibrionen in den ersten neun Tagen bereits 87 mg Cellulose zerstört wurden. In Vergleichsansätzen ohne Luftabschluß konnten keine Zucker in der Kulturflüssigkeit nachgewiesen werden. 2. Versuche mit Sporocytophaga myxococcoides unter gleichen Bedingungen ergaben keine wesentliche Anreicherung von Zuckern in den Kulturen. Spuren von reduzierenden Stoffen waren jedoch in allen Fällen nachweisbar. Damit konnte erstmalig die Anwesenheit von Zuckern in Sporocytophaga-liultuTeTi bewiesen werden; es sei daran erinnert, daß Sporocytophaga ein Organismus ist, auf den Glucose außerordentlich toxisch wirkt. Infolge der geringen vorhandenen Zuckermengen konnte eine Identifizierung der Glucose als Osazon, wie es bei den Vibrionen möglich war, nicht durchgeführt werden. Diese Arbeiten wurden durch die Resultate einer gemeinsamen Kultivierung von Cellulosebakterien mit anderen Mikroorganismen, z. B. Azotobacter, Hefen u. a. m., vollkommen bestätigt. Obwohl die mit der Symbiose zusammenhängenden Fragen in einem besonderen Abschnitt ausführlicher behandelt werden, soll hier nicht unerwähnt bleiben, daß die Entwicklung der Hefekulturen, die nur lösliche Kohlenhydrate assimilieren können, ebenfalls für das Auftreten von Zucker bei der Cellulosezersetzung durch aerobe Bakterien spricht. Offenbar schwankt die Fähigkeit der Bakterien zur Ansammlung von Hydrolysenprodukten der Cellulose bei den verschiedenen Rassen beträchtlich selbst innerhalb der gleichen Art. In den Versuchen iMSCHENEZKls erfolgte die Anreicherung löslicher Kohlenhydrate in der Lösung nur bei erschwertem Zutritt des Sauerstoffs. Durch diesen Sauerstoffmangel wurde zwar die Entwicklung der Bakterien gehemmt, nicht aber die Wirksamkeit der Cellulase. Wie bereits erwähnt, ist der Nachweis reduzierender Stoffe in Kulturen, deren Entwicklung nicht behindert wurde, fast nie gelungen. Dies hängt anscheinend mit den besonderen Eigenschaften der einzelnen Stämme zusammen. Allerdings konnte FÄHRAEUS (1944/45) die Bildung relativ hoher Glucosemengen im flüssigen Medium

154

I. Aerobe Cellulosebakterien

einer normal entwickelten Sporocytophaga - Kultur beobachten. Nach seinen Angaben enthielt die Kulturflüssigkeit bis zu 0,25% Glucose, die er mit Hilfe üblicher biochemischer Methoden identifizierte. Die Anwesenheit von Glucose im Medium spricht gegen eine Oxydation der Cellulose und ist eine der wichtigsten Stützen für die Hydrolysentheorie der Cellulosezersetzung. In allen Versuchen wurde die Einwirkung sich vermehrender Bakterienzellen auf die Cellulose untersucht. Andererseits dürfte aber auch ein Studium der von den Cellulosebakterien gebildeten hydrolytischen Fermente von besonderem Interesse sein. Ihre Existenz unterstreicht ebenfalls die Möglichkeit einer primären Hydrolyse der Cellulose. d) D i e C e l l u l a s e d e r a e r o b e n B a k t e r i e n Die von den aeroben Cellulosebakterien gebildete Cellulase war bereits zu einer Zeit bekannt, als eine vertiefte Forschung auf dem Gebiete der Fermente noch nicht möglich war. Als erstes festes Medium zur Isolierung von Cellulosebakterien diente CelluloseAgar. Die auf diesem Medium wachsenden Kolonien waren von einem transparenten Ring umgeben, der häufig auch als enzymatische Zone bezeichnet wurde. Man nahm an, daß die von den Bakterienzellen gebildeten Fermente ausgeschieden werden und eine Hydrolyse der Cellulose hervorrufen. Dadurch bildet sich in der Umgebung der Kolonie ein heller Band, der dem Bereich der Celluloseauflösung entspricht. OMELIANSKY (1913) wies jedoch bereits darauf hin, daß bei der Entwicklung von Fremdbakterien auf Cellulose-Agar die Bildung derartiger Ränder nicht von einer Zersetzung der Cellulose herrührt, sondern durch die Auflösung der im Nährmedium vorhandenen Salze und des Calciumcarbonats bewirkt wird, die für die Undurchsichtigkeit des Substrats verantwortlich sind. Andererseits besteht wohl kein Zweifel darüber, daß durch Diffusion der Cellulase und nachfolgende Hydrolyse der Cellulose in der Umgebung der Kolonien eine durchsichtige Zone entsteht (Abb. 87). Diese Beobachtung trifft jedoch nur für Medien mit regenerierter Cellulose zu, die offenbar durch die Bakterienfermente leichter hydrolysieit wird als unveränderte Cellulose. Im letzteren Falle können die Bakterien nur dann eine Zersetzung hervorrufen, wenn sie mit der Faser direkten Kontakt besitzen. Benutzt man als Nährboden gemahlenes Filtrierpapier, dessen Faserstruktur vollständig erhalten ist, so besteht eigentlich kein Grund dafür, von sichtbaren enzymatischen Zonen zu sprechen, da transparente Zonen lediglich infolge einer direkten „Vernichtung" der Faser durch die sich auf ihr ansiedelnden Bakterien entstehen können (vgl. Abb. 4). Von besonderem theoretischen Interesse sind die Beziehungen zwischen den Fermenten und der Zelle. Die inzwischen allgemein eingeführte Einteilung der Fermente in Exo- und Endoenzyme macht es notwendig, über die Stellung der Cellulase im System der Fermente zu entscheiden. In der Kulturflüssigkeit läßt sie sich gewöhnlich nicht nachweisen. IMSCHENEZKI führte in dieser Richtung einige Versuche durch mit dem Ergebnis, daß die Kulturfiltrate der Cellulosebakterien an Filtrierpapier oder Watte keine Hydrolyse hervorrufen. Diese Tatsache stimmt gut mit der Beobachtung überein, daß ein Angriff der Cellulosebakterien auf die Cellulose

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

155

nur dann erfolgt, wenn sie sich in unmittelbarem Kontakt mit der Faser befinden. Die Kulturflüssigkeit enthält demnach keine aktive Cellulase. Andererseits kann die Zersetzung der Cellulose, d. h. ihre Hydrolyse, nur extrazellulär stattfinden. In diesem Falle ist es wohl notwendig, einen Kompromiß zu schließen insofern, als die Zelle zwar Cellulase ausscheidet, die aber mit den äußeren Schichten der Zellwand oder dem die Zelle bedeckenden Schleim in enger Verbindung bleibt. Möglicherweise ist sie auch adsorptiv gebunden und wirkt unmittelbar von der Zellwand aus auf die Cellulose ein. Wahrscheinlich ist zur Hydrolyse der Cellulose die Bildung einer „Mikrozone" in der Umgebung der Zelle notwendig, die gewissermaßen aus sehr aktiver Cellulase besteht. Naturgemäß kann eine derartige Zone nur direkt an der Bakterienmembran entstehen. Die Menge des in die weitere Umgebung gelangenden hydrolytischen Fermentes ist für eine Hydrolyse nicht mehr ausreichend. Wenn diese Ausführungen auch nur einen hypothetischen Charakter besitzen, so werden sie doch durch gewisse Beobachtungen bestätigt. Beispielsweise zeigen die Myxobakterien die Fähigkeit, auch andere recht beständige Stoffe, wie Chitin, zu zersetzen. Diese Substanz wird jedoch nur bei direkter Berührung der Bakterienzellen mit dem chitinhaltigen Substrat (Krebspanzer, Pilze u. a. m.) angegriffen. Die von den Myxobakterien hervorgerufene Auflösung der Zellen verschiedener Bakterien und Pilze ist ebenfalls nur bei engem Kontakt zwischen den Zellen möglich. Die Bakteriencellulase ist also zweifellos ein Exoferment, das jedoch im Gegensatz zu anderen Hydrolasen wesentlich stärker an die Zelle gebunden bleibt. Die Cellulase diffundiert nur in sehr geringem Maße in die Umgebung. In der Kultur befindliche Cellulosefasern werden also nicht hydrolysiert, wenn sieh auf ihrer Oberfläche keine Bakterien angesiedelt haben. Durch diese Eigenschaft unterscheidet sich die Cellulase wesentlich von der Bakterienamylase, die im Medium stets in größeren Mengen auftritt. Obwohl das Problem des Celluloseabbaus dahingehend entschieden werden konnte, daß dieser nicht oxydativ erfolgt, wird der Ausdruck „Oxydation" hin und wieder immer noch angewendet. So behaupten z. B. PORTER, WEISER und GRAY (1955), daß die hohe Aktivität von Mischkulturen der Cellulosebakterien auf die Wirksamkeit von proteolytischen Fermenten zurückzuführen ist, die von den begleitenden Mikroorganismen produziert werden. Es wurde festgestellt, daß Organismen der Art Cdlvlomonas flavizena nicht in der Lage sind, Cellulose zu oxydieren, wenn das Kulturmedium außer Cellulose noch Glucose enthält. Durch Behandlung mit Trypsin konnte die Fähigkeit zur Oxydation der Glucose in beiden Fällen verstärkt wérden, während sich das Verhalten gegenüber der Cellulose nicht änderte. Durch eine Trypsinbehandlung zerstörter Zellen jedoch konnte das Vermögen zur Oxydation dér Cellulose erheblich gesteigert werden. Die gleiche Erscheinung tritt auch bei Kultivierung in sacchárosehaltigen Medien auf. Experimentelle Untersuchungen über die Cellulase der aeroben Cellulosebakterien sind nur in geringem Umfang durchgeführt und erst aus jüngster Zeit bekannt geworden. Entsprechende Versuche mit anaeroben Mikroorganismen sind jedoch bereits früher angestellt worden. '

I. Aerobe Cellulosebakterïen

156

Als erster war SlMOLA (1931) in der Lage, mit filtrierten Kulturflüssigkeiten der Art Cellulobacittus myxogenes Cellulose zu hydrolysieren und die Abbauprodukte zu isolieren. Erst erheblich später untersuchte FÄHRAEUS (1944/45, 1946) dieses Problem eingehend, indem er enzymatisch wirksame Präparate aus getrockneten Zellen der Gattung Sporocytophaga herstellte. Durch Einwirkung derartiger Präparate auf Cellulose konnte er Glucose in quantitativer Ausbeute erhalten. Seine Erfolge lassen sich im wesentlichen dadurch erklären, daß er nicht die sonst zur Kultivierung der Cellulosebakterien üblichen Materialien, wie Filtrierpapier oder Watte, benutzte, die nach seinen Angaben von dem Ferment kaum angegriffen werden, sondern leichter hydrolysierbare Stoffe verwendete, wie Lichenin (aus Isländischem Moos) oder Cellophan, die wesentlich besser verzuckert werden. Obwohl in diesen Versuchen die Cellulose zu Glucose hydrolysiert wurde, sind sie doch nicht ganz einwandfrei, da als Ausgangsprodukt getrocknete Bakterienzellen dienten. So bestand z. B . durchaus die Möglichkeit, daß die Hydrolyse durch die Lebenstätigkeit der Zellen und nicht durch ein außerhalb derselben wirksames Ferment hervorgerufen wurde. Wichtiger sind deshalb die Arbeiten, in denen Versuche zur Hydrolyse der Cellulose mit zellfreien Filtraten beschrieben werden. Durch Extraktion getrockneter vegetativer Sporocytophaga-Zellen mit einer Pufferlösung stellte FÄHRAEUS eine cellulaseenthaltende Flüssigkeit her. Auch nach Filtration durch ein Bakterienfilter blieb das Filtrat celluloseaktiv. Mit Hilfe eines derartigen Filtrates konnte er Lichenin und Cellophan zu Glucose hydrolysieren. Diese Beobachtung stimmt vollkommen mit früheren Untersuchungen überein, in denen über das Auftreten von Zuckern in Sporocytophaga-Kulturen berichtet wird. Im Zusammenhang mit der Bildung von Glucose unter dem Einfluß von Fermentpräparaten liegt die Vermutung nahe, daß bei diesem Vorgang zwei Fermente, Cellulase und Cellobiase, wirksam sind. E s kann heute als gesichert gelten, daß die Cellobiase, im Gegensatz zur Cellulase, zu den spezifischen Oligosaccharasen gehört. Die beiden Fermente zeigen gegenüber Substraten mit verschiedenen Molekülgrößen unterschiedliche Aktivitäten, wie aus den Angaben der Tabelle 13 zu entnehmen ist. Tabelle 13 Wirkung der Cellulase auf verschiedene Kohlenhydrate (Hydrolysengrad in ml n/60 Jodlösung) Substrat Hydrocellulose Cellodextrin. Cellohexaose Cellotetraose Cellotriose . Cellobiose. .

Polysaccharase (Cellulase)

Oligosaccharase (Cellobiase)

0,55 2,57 2,98 0,10 0,50

0,10

0,0

0,20 5,35 3,50 2,70 2,90

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

157

Aus der Tabelle geht hervor, daß Cellobiose von der Cellulase überhaupt nicht angegriffen wird, während diese ihrererseits gegenüber der Hydrocellulose außerordentlich aktiv ist. Im Gegensatz dazu wirkt die Cellobiase auf Hydrocellulose fast gar nicht ein; Oligosaccharide dagegen zersetzt sie sehr aktiv. Die Aktivität der Cellobiase ist dem Molekulargewicht umgekehrt proportional. Obwohl diese Angaben nicht Bakterien, sondern aus Aspergillus oryzae, gewonnene Pilzfermente betreffen, so besteht wohl kein Zweifel darüber, daß die Cellulase und Cellobiase aus Bakterien ebenfalls zwei vollkommen verschiedene Fermente sind. Nach FÄHRAEUS (1944/45) bildet Sporocytophaga Cellobiase; durch Einwirkung eines Fermentpräparates auf Cellobiose erhielt der Autor Glucose. Zur ausführlicheren Charakterisierung dieser beiden Fermente sind weitere Untersuchungen erforderlich. 2. Die Oxydation der Hydrolysenprodukte der Cellulose Im vorigen Abschnitt wurde bereits darüber berichtet, daß die Cellulose unter Mitwirkung der Bakteriencellulase und -cellobiase in Glucose umgewandelt wird. Die Frage nach dem weiteren Abbau der Glucose läßt sich nur dann beantworten, wenn man einerseits die verschiedenen Zersetzungsprodukte zu identifizieren versucht und andererseits Kultivierungsversuche mit Cellulosebakterien durchführt, in denen die Cellulose durch Glucose als Substrat ersetzt wird. Alle bisher in dieser Richtung unternommenen Arbeiten haben im wesentlichen die gleichen Resultate ergeben. Bis heute konnte man keinerlei Zersetzungsprodukte finden, die aus einem Abbau der Glucose durch Sporocytophaga oder Vibrio stammen. Die Kulturflüssigkeiten enthalten keine flüchtigen oder nicht flüchtigen organischen Säuren, Alkohole, Aldehyde oder ähnliche Verbindungen (WLNOGRADSKI, 1952). HUTCHINSON und CLAYTON (1918/19) stellten dagegen fest, daß sich bei der Zersetzung der Cellulose durch Sporocytophaga (Spirochaeta cytophaga) Buttersäure bildet. Anscheinend handelte es sich hierbei aber nicht um eine Reinkultur, da das Auftreten der Säure später nicht mehr bestätigt werden konnte. Nach FÄHRAEUS (1944/45) bilden sich bei der Entwicklung der SporocytophagaArten auf glucosehaltigem Medium geringe Mengen nicht identifizierter organischer Säuren. Möglicherweise handelt es sich hierbei um besondere Bakterienrassen, die einen anderen Stoffwechsel besitzen als die früher untersuchten Stämme. "Wahrscheinlicher ist jedoch die Annahme, daß die verwendete hohe Glucosekonzentration, die in keiner Weise den ökologischen Verhältnissen entspricht, da sie beim Abbau der Cellulose normalerweise nicht auftritt, ungewöhnliche Bedingungen schafft. Die Oxydation der Glucose erfolgt somit langsamer, wodurch die Bildung der Säuren ermöglich wird. Beim Wachstum der Gattung Sporocytophaga auf Cellulose stellt man häufig einen charakteristischen sauren Geruch fest, der von der- Bildung flüchtiger Stoffe herrührt. Eine Isolierung dieser Bestandteile ist jedoch bisher nicht gelungen. Aus den obigen Darlegungen geht also hervor, daß es bis jetzt nicht möglich war, organische Säuren oder Alkohole in den Kulturen aufzufinden. Dies betrifft aber im wesentlichen nur die typischsten und häufigsten Cellulosebakterien, d. h. die Myxo-

158

I. Aerobe Cellulosebakterien

bakteriell und Vibrionen. Zwar bilden einige Vertreter dieser Gruppen, insbesondere etliche Mykobakterien, organische Säuren (JENSEN, 1940). Diese Säurebildner gehören jedoch ausschließlich zu den fakultativ anaeroben Formen. Die „klassischen" aeroben Cellulosebakterien andererseits oxydieren die Hydrolysenprodukte vollständig zu Kohlendioxyd und Wasser. Naturgemäß ist die quantitative Bestimmung des bei der Bakterienkultivierung auf festen Nährmedien gebildeten Kohlen- / dioxyds kaum möglich. Man arbeitet deshalb vorzugsweise mit flüssigen, cellulosehaltigen Medien, durch die C02-freie Luft oder Sauerstoff geleitet wird. Mittels dieser Versuchsanordnung bereitet die Bestimmung des Kohlendioxyds keinerlei Schwierigkeiten mehr: das mit der Luft entweichende C0 2 wird in Barytlauge aufgefangen. Tabelle 14 enthält einige Versuchsergebnisse iMSCHENEZKls. Beispielsweise werden aus 1,13 g Cellulose in drei Tagen 94 mg Kohlendioxyd gebildet. T a b e l l e 14 Zersetzung der Cellulose und Bildung von C0 2 durch Vibrio vulgaris (Kultivierungsdauer drei Tage) Ursprüngliches Cellulosegewicht in g

Zersetzungsgrad der Cellulose in %

Bildung von C0 2 ing

1,646 1,131 1,130 1,576

6 6 15 9

0,110 0,057 0,094 0,097

Bei gleicher Versuchsmethodik scheidet Sporocytophaga in der Zeiteinheit erheblich weniger C0 2 ab; in vier Tagen entstehen z. B. nur 50 mg Kohlendioxyd. Auch in der Literatur wird auf die bedeutenden Kohlendioxydmengen hingewiesen, die bei der Zersetzung der Cellulose durch aerobe Bakterien gebildet werden. Leider existieren bis jetzt noch keine Arbeiten, in denen eine Kqhlenstoffbilanz der Cellulosezersetzung aufgestellt worden ist. Die Verwendung von Filtrierpapier als Substrat macht eine derartige Rechnung praktisch unmöglich, da die Bakterienzellen so fest an den Fasern haften, daß ihre vollständige Entfernung äußerst schwierig ist. In diesem Falle würde nämlich der Kohlenstoffgehalt der unzerstörten Cellulose durch die Anwesenheit des Bakterienkohlenstoffs viel zu hoch erscheinen. Dieses Dilemma kann weitgehend vermieden werden, wenn man die Kultivierung bis zur völligen Zerstörung der Cellulose fortsetzt. Auch die Verwendung von regenerierter Cellulose ist vorteilhaft, da sie keine Faserstruktur besitzt und leichter zersetzt wird. Obwohl keine quantitativen Angaben bezüglich der Kohlenstoffbilanz bekannt sind, ist doch aus den vielen Kultivierungsversuchen ersichtlich, daß die Menge des bei diesem Prozeß entstehenden Kohlendioxyds ungewöhnlich groß ist. Dieser Vorgang ist insofern von weittragender Bedeutung, als er eine Hauptquelle für die Auffüllung des Kohlendioxydvorrats der Atmosphäre darstellt, der sich durch die

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

159

Lebenstätigkeit der Pflanzen ständig verringern würde. Das Ausmaß der aeroben Cellulosezersetzung und die im Boden herrschende Dominanz dieses Prozesses über den anaeroben Abbau weisen darauf hin, daß die Oxydation der Hydrolysenprodukte der Cellulose zu Kohlendioxyd und Wasser ein wesentlicher Bestandteil des Kohlenstoffkreislaufs in der Natur ist. Über den Chemismus der Cellulosezersetzung durch die Actinomyceten liegen fast gar keine Untersuchungsergebnisse vor. Schon früh beobachtete KRAINSKI (1913) bzw. KRAINSKY (1914) in der Umgebung einiger Actinomycetenkulturen auf cellulosehaltigem Kieselsäuregel die Bildung durchsichtiger Celluloseabbauzonen. In diesen Bereichen fand der Autor jedoch stets Hyphen der Actinomyceten, so daß er nicht entscheiden konnte, ob die durch den Abbau hervorgerufene Durchsichtigkeit auf der Wirkung diffundierender Fermente beruht, oder ob sie von einem direkten Angriff der Hyphen auf die Cellulose herrührt. Derartige klare und eindeutige Resultate, wie sie aus Arbeiten über die Verzuckerungsfähigkeit aerober und anaerober Bakterien bekannt sind, fehlen hier vollständig. JENSEN (1940) konnte in drei Kulturen cellulosezersetzender Mycobakterien keine reduzierenden Stoffe nachweisen. Dies hängt möglicherweise damit zusammen, daß die von ihm untersuchten Mycobakterien eine Vergärung der Hydrolysenprodukte unter Bildung organischer Säuren bewirkten. Lediglich in einer Kultur konnten nach einem Zusatz von Toluol geringe Mengen reduzierender Stoffe gefunden werden. In einer alten Micromonospora-Kultur konnte gleichfalls die Anwesenheit von Glucose festgestellt werden. Gewöhnlich ist die Zersetzung der Cellulose durch Micromonospora mit der Bildung von Propion- und Essigsäure (Verhältnis 1,4 : 2) sowie von Kohlendioxyd verbunden. Wasserstoff, Ameisensäure, höhere Fettsäuren sowie neutrale Gärungsprodukte fehlen völlig. In der Kohlenstoffbilanz konnten nur 70% des eingesetzten Kohlenstoffs wiedergefunden werden (HüNGATE, 1946). Die langsame Entwicklung der Actinomyceten erschwert offenbar den Nachweis von Hydrolysenprodukten der Cellulose im Medium. Der Chemismus der Cellulosezersetzung durch die Actinomyceten kann nur durch weitere intensive Forschungsarbeit aufgeklärt werden. 3. Die Synthese des Bakterienschleims In dem ersten Bericht über die neue Art Spirochaeta cytophaga (Sporocytophaga) wurde der Schleimbildung in den entsprechenden Kulturen keinerlei Beachtung geschenkt. Später erst wurde der bei Cytophaga oder Sporocytophaga auftretende Schleim näher untersucht. Beim aeroben Abbau der Cellulose wird neben dem Kohlendioxyd nur Schleim gebildet. Als erster wies WlNOGRADSKl darauf hin, daß dieser Schleim ein Oxydationsprodukt der Cellulose, d. h. Oxycellulose darstellt. Eine ausführliche Besprechung seines Standpunktes ist bereits weiter oben erfolgt. Im Widerspruch zur Ansicht WlNOGRADSKls stand die Tatsache, daß die Schleimbildung nur bei den zur Reihe der Myxobakterien gehörenden Cellulosebakterien beobachtet wurde, für die eine Schleimerzeugung sehr charakteristisch ist.

160

I. Aerobe Cellulosebakterien

Viele Cellulosebakterien, z.B. die Vibrionen und sporenlosen Bakterien, bilden fast keinen Schleim, während die Myxobakteriengattungen Cytophaga und Sporocytophaga auf Cellulose viel Schleim produzieren. Dieser Umstand hat die Aufmerksamkeit vieler Forscher auf sich gezogen. Auf Grund von Versuchsergebnissen vermuteten I M S C H E N E Z K I und S O L N Z E W A (1936), daß dieser Schleimstoff kein Oxydationsprodukt der Cellulose darstellt. Seine Bildung hängt nicht mit der Umwandlung der Cellulose in ein „organisches Gel" ( W L N O G R A D S K L ) zusammen, sondern er wird von den Bakterien in Form eines Sois ausgeschieden und anschließend erst in eine gelförmige Masse umgewandelt. Das Auftreten eines weißen organischen Kolloids ist also nicht die Folge eines Abbaus der Cellulose, sondern beruht auf der synthetisierenden Tätigkeit der Cytophaga-Zelien, die den Schleim in großer Menge hervorbringen. Die Schleimbildung kann ebensowenig mit Umwandlungen der Cellulose zusammenhängen, wie z. B. die Schleimausscheidung in Kulturen der Art Leuconostoc mesenterioides mit einer direkten Umwandlung des Kohlenhydrates zum Membranstoff dieses Organismus etwas zu tun hat. Eine eingehendere chemische Untersuchung des Schleims wurde von I M S C H E N E Z K I und Mitarbeitern jedoch nicht durchgeführt. Sie stellten lediglich seine Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln fest, untersuchten sein Verhalten gegenüber verschiedenen Chemikalien usw. Alle dabei erhaltenen Resultate widersprechen nicht den Vorstellungen I M S C H E N E Z K I S . Andererseits reichen sie jedoch nicht aus, um endgültig entscheiden zu können, ob der in den Kulturen der Cellulosebakterien auftretende Schleim ein von diesen synthetisiertes Produkt darstellt. Hinsichtlich der Schleimbildung ist noch zu bemerken, daß zwischen den Myxobakterien und anderen Mikroorganismen gewisse funktionelle Unterschiede existieren. Erstere scheiden den Schleim an einem Ende der Zelle aus und bewegen sich auf diese Weise vorwärts. Folglich dient der Schleim der Cellulosemyxobakterien zu ihrer Fortbewegung. Im Gegensatz dazu erfüllt der Schleim der Scheidenmikroorganismen oder Zooglöen ganz andere Aufgaben, die keinesfalls mit der Beweglichkeit zusammenhängen. Die Richtigkeit obiger Anschauungen wird durch die Arbeiten von F Ä H R A E U S (1944/45) überzeugend bewiesen. Er beobachtete eine Schleimbildung bei der Kultivierung der Gattung Sporocytophaga auf einem Medium, das an Stelle der Cellulose Glucose enthielt. Die Zusammensetzung dieses Schleims unterschied sich in keiner Weise von dem Aufbau des bei der Entwicklung auf Cellulose entstehenden Abscheidungsproduktes. Damit kann die Annahme, daß es sich bei dem Schleim um ein Oxydationsprodukt der Cellulose selbst handelt, nicht mehr aufrechterhalten werden. Anschließend soll eine kurze Charakteristik des Schleims gegeben werden. Er besitzt je nach der Art des Mikroorganismus ein unterschiedliches Aussehen. Beispielsweise ist der Cytophaga- oder Sporocytophaga-Schleim je nach dem gleichzeitig gebildeten Pigment gelb, orange oder rosa gefärbt. Die Menge des produzierten Schleimes ist ebenfalls bei den verschiedenen Cellulosebakterien beträchtlichen Schwankungen unterworfen; Sporocytophaga und Cytophaga bilden sehr viel Schleim.

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

161

So konnte z. B. aus Cytophaga-Kulturen bei einem Einsatz von 10 g Cellulose in 11 Nährlösung 1 g Schleim erhalten werden (WALKER u. WARREN, 1938). Wesentlich weniger Schleim wird durch die zur Gattung Sorangium gehörenden Mykobakterien gebildet. Der Schleim ist in Wasser leicht quellbar, aber unlöslich. In heißer Sodalösung oder Natronlauge ist er leicht löslich. Beim Neutralisieren der alkalischen Lösung erhält man eine opaleszierende Flüssigkeit, aus der durch Ansäuern der Schleim als Niederschlag abgeschieden werden kann. Die Reinigung des Schleimes erfolgt durch mehrtägiges Dialysieren mit Hilfe von Membranen aus Cellophan oder anderen Folien. Die von einigen Autoren empfohlene weitere Reinigung und Trocknung des Schleimes mit Alkohol erübrigt sich in den meisten Fällen. Der in Wasser dispergierte Schleim läßt sich leicht mit alkoholischer Tanninlösung bzw. mit gesättigten Ammoniumsulfat-, Bariumhydroxyd-, Bleiacetatlösungen usw. ausfällen. Es gelang, verschiedene Salze des Schleims, z. B. das Bariumsalz, darzustellen, die jedoch nichts wesentlich neues zur Charakterisierung des Schleimes beitragen. Die von WALKER und WARREN (1938) durchgeführte Elementaranalyse des von Cytophaga produzierten Schleims ergab folgende Werte: C 33,3%; H 6%; 0 60%. Das Molekulargewicht betrug 1107. Der Schleim besitzt keine reduzierenden Eigenschaften. Wie oben bereits erwähnt wurde, enthält er Uronsäuregruppen. Dieser Befund ist insofern plausibel, als einige der von Bakterien synthetisch aufgebauten Polysaccharide ebenfalls Uronsäuren enthalten. Nach FORSYTH und WEBLEY (1949) sind etwa 76% aller im Boden vorkommenden Bakterien Schleimbildner. Unter ihnen finden sich sowohl sporenbildende als auch kurze, sporenlose Bakterien. Die Zusammensetzung des Schleimes ist kleinen Schwankungen unterworfen; am häufigsten findet man jedoch bei der Hydrolyse Glucose und eine Uronsäure. Die gleiche Säure konnte ebenfalls im Kapselschleim der Gattungen Azotobacter, Pneumococcus u. a. nachgewiesen werden. Obwohl keiner dieser Mikroorganismen in der Lage'ist, auf Cellulose zu gedeihen, erzeugen sie jedoch alle einen Schleim, der sich prinzipiell nicht von dem der cellulosezersetzenden Myxobakterien unterscheidet. In Parallelversuchen wurde Sporocytopkaga myzococcoides sowohl auf Medien mit Cellulose als auch auf glucosehaltigen Substraten gezüchtet, wobei die verbrauchte Glucose ständig in der Weise ergänzt wurde, daß ihre Konzentration 0,25% nicht überstieg. Nach 14tägiger Kultivierungsdauer wurde der Schleim durch Ansäuern ausgefällt, abzentrifugiert, mit Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Bestimmung der verbrauchten Cellulose bzw. Glucose ergab, daß die Schleimbildung 14,6% der Cellulose bzw. 19,2% der Glucose betrug. Unabhängig von der Art des Substrats enthält der Schleim in jedem Falle Uronsäuren. FÄHRAEUS (1944/45) fand bei Versuchen mit Glucose im gebildeten Schleim einen Uronsäuregehalt von 1,9%, während LOIZJANSKAJA (1937) bei Anwesenheit von Cellulose 2% Uronsäuren feststellte. Die gefundenen Uronsäurewerte stimmen fast vollständig überein, obwohl die Nährmedien verschiedene Kohlenstoffquellen enthielten. 11

Imschenezki, Mikrobiologie

162

I. Aerobe Cellulosebakterien

Es darf deshalb als weitgehend gesichert angesehen werden, daß der bei der Zersetzung der Cellulose gebildete Schleim ein synthetisches Produkt der Cellulosebakterien darstellt und sich in keiner Weise von dem Schleim anderer, Cellulose nicht zersetzender Bakterien unterscheidet. Ferner ist auch die Art des Substrates nicht ausschlaggebend für den Charakter des gebildeten Schleimes, wie am Beispiel der cellulose- bzw. glucosehaltigen Medien gezeigt werden konnte. Somit dürfte wohl kein Zweifel mehr darüber bestehen, daß der Schleim ein Produkt der Bakterienzellen ist und nicht, wie früher angenommen wurde, ein Oxydationsprodukt der Cellulose darstellt. Wie die Kohlenstoffbilanz zeigt, wird der größte Teil des Kohlenstoffs bei der Cellulosezersetzung als Kohlendioxyd frei. Der Restkohlenstoff wird in dem von den Bakterien synthetisierten Schleim, in den Bakterienzellen selbst und möglicherweise noch in Spuren schwer nachweisbarer, in der Kulturflüssigkeit vorhandener organischer Stoffe festgelegt. Ein weiteres kohlenstoffhaltiges Stoffwechselprodukt der Bakterien, das sich in der Kultur gesetzmäßig anreichert, ist der Farbstoff der aeroben Cellulosebakterien, über dessen Eigenschaften bisher nur wenig bekannt ist. Obwohl er nur in verschwindend geringen Mengen gebildet wird und keine große Bedeutung in der Kohlenstoffbilanz besitzen kann, darf er doch nicht unberücksichtigt bleiben. Dieser Farbstoff gehört mit großer Wahrscheinlichkeit zu den Carotinoiden und unterscheidet sich prinzipiell nicht von den Farbstoffen der anderen Myxobakterien. Die roten, orangefarbenen, grünen oder gelbgrünen Pigmente der cellulosezersetzenden Bakterien sind noch nicht näher untersucht worden. Lediglich über den von Sporocytophaga gebildeten Farbstoff liegen einige Angaben vor. Zur Gewinnung des Pigments wird die Kulturflüssigkeit im Vakuum auf ein Zehntel ihres ursprünglichen Volumens eingeengt, mit Alkali versetzt, filtriert, mit Salzsäure angesäuert und mit Äther ausgeschüttelt. Nach dem Abdampfen des Äthers erhält man einen dunkelbraunen, zähflüssigen Rückstand mit saurer Reaktion und eigenartigem, beißendem Geruch. In Wasser ist er unlöslich, in allen üblichen organischen Lösungsmitteln dagegen leicht löslich. Mit Alkalien ergibt die Masse eine kolloide Lösung, die geringe Mengen höherer Fettsäuren enthält. Trotz zahlreicher Versuche ist es bisher nicht gelungen, den Farbstoff in kristallisierter Form zu erhalten. Vermutlich handelt es sich um eine ungesättigte aliphatische Säure mit relativ niedrigem Molekulargewicht. Die leichte Oxydierbarkeit durch Permanganat sowie die Bildung von Jodoform bei der Behandlung mit Jod und Alkali unterstützen die Annahme, daß der Farbstoff den Charakter eines Carotinoids besitzt. 4. Die Beziehungen zwischen bakterieller Cellulosezersetzung und Humusbildung An der Lösung des Humusproblems sind die Vertreter der verschiedensten wissenschaftlichen Disziplinen beteiligt, wobei das Problem selbst zu einem der schwierigsten gehört. Eine besondere Beachtung unter den Theorien über die Humusbildung verdient die Cellulosetheorie, nach der die Entstehung des Humus unmittelbar mit einer Zersetzung der Cellulose zusammenhängt.

E. Der Chemismus der Cellulosezersetzung

163

Es gehört nicht zu den Aufgaben dieses Buches, die der erwähnten Theorie zugrunde liegenden theoretischen Ansichten und Ergebnisse der chemischen Forschungen zu behandeln. Ausführliche Darstellungen finden sich in den entsprechenden Monographien und speziellen Publikationen (WlLJAMS, 1948/51; WAKSMAN, 1927; TjURIN, 1937, 1951; KONONOWA, 1951). Hier sollen deshalb nur die mit der Mikrobiologie der Cellulose zusammenhängenden Fragen kurz gestreift werden. Bereits WlNOGRADSKl (1952) vermutete, daß die bei der Zersetzung der Cellulose entstehende schleimige Masse ein humusähnlicher Stoff ist. Auf Grund der physikalischen, physikochemischen und biologischen Eigenschaften des „organischen Gels" brachte er dieses in unmittelbare Beziehung zur Humusbildung. Im übrigen wird die Schleimsubstanz von anderen Mikroorganismen kaum angegriffen. Die fehlende dunkle Farbe hinderte WlNOGRADSKl nicht daran, die fragliche Substanz den Huminstoffen zuzurechnen. Er wies darauf hin, daß dunkel gefärbte Produkte in geringer Konzentration befähigt sind, größere Mengen des „organischen Gels" entsprechend anzufärben, in ähnlicher Weise, wie ein beliebiger Stoff durch einen Tropfen Tusche dunkel gefärbt werden kann. Eine gewisse Bestätigung fand diese Theorie in den Arbeiten KONONOWAs (1949), die bei der Kultivierung von Myxobakterien auf verschiedenen pflanzlichen Uberresten eine organische Substanz erhielt, die in ihrer Zusammensetzung den Huminstoffen sehr nahe kam. Diese Untersuchungen sind auch insofern interessant, als hierbei statt reiner Cellulose abgestorbene Pflanzenteile als Substrat benutzt wurden. Die Versuchsbedingungen waren den natürlichen Gegebenheiten weitgehend angepaßt, womit eine Möglichkeit geschaffen war, das Mitwirken der Myxobakterien an der Zersetzung pflanzlicher Zellwände zu beurteilen. KONONOWA gelangte auf diese Weise zu der Ansicht, daß bei der Zersetzung der Cellulose durch Myxobakterien eine dem natürlichen Humus sehr ähnliche Substanz gebildet wird. Die Bildung eines gelartigen Schleimes ist aber noch in anderer Hinsicht von Interesse. Zweifellos besitzt die Anhäufung von Bakterienschleim im Boden einen großen Einfluß auf dessen physikalische Eigenschaften. Die Ausscheidungsprodukte der Bakterien spielen sicher eine große Rolle bei der Entstehung einer festen Bodenstruktur. In dieser Beziehung kommt den Bakterien eine größere Bedeutung zu als den Pilzen. Sehr wahrscheinlich ermöglicht der Bakterienschleim die Entstehung umfangreicherer Bodenpartikel sowie deren größere Beständigkeit, und deshalb ist gerade die Schleimbildung durch die aeroben Cellulosebakterien von besonderem theoretischen und praktischen Interesse. Offenbar stellt die Cellulose die größte Kohlenstoffquelle des Bodens dar, so daß der Hauptanteil der Schleimbildung auf die aeroben Cellulosebakterien entfällt. Es darf als sicher angenommen werden, daß der günstige Einfluß des Grasanbaues auf die Bodenstruktur in erheblichem Maße auf die Zersetzung der ausgedehnten älteren Wurzelsysteme und anderer, hauptsächlich aus Cellulose bestehender Pflanzenreste zurückzuführen ist.

Ii*

II. ANAEROBE CELLULOSEBAKTERIEN Ende des vorigen Jahrhunderts begann der russische Forscher W. L. OMELJANSKI, sich mit der Biologie der anaeroben Cellulosebakterien zu beschäftigen. Eine ganze Reihe von Fragen, die mit der Morphologie, Physiologie und Ökologie der cellulosevergärenden Bakterien zusammenhängen, blieben jedoch noch ungeklärt. 1936 griff IMSCHENEZKI das Problem auf, mit dem Ziel, eine Methode zur Reinzüchtung anaerober Bakterien auszuarbeiten und mit Hilfe dieser Technik ihre Physiologie zu studieren. Die Untersuchungen beschränkten sich im allgemeinen auf die thermophilen Cellulosebakterien, weil diese Organismen schneller wachsen als die mesophilen Formen, wodurch die Bewertung der verschiedenen Versuche zur Reinzüchtung wesentlich erleichtert wurde. Andererseits ist eine rasche Zersetzung der Cellulose zur Erforschung des ebenfalls noch wenig bekannten Biochemismus der Cellulosegärung sehr geeignet. Die größte Schwierigkeit beim Studium der anaeroben Cellulosebakterien besteht in der Herstellung von Reinkulturen. Eine kritische Durchsicht der Literatur der letzten 50 Jahre führt zu dem Ergebnis, daß lediglich drei bis vier Autoren einwandfreie Reinkulturen anaerober, thermophiler Cellulosebakterien erhalten haben. Läßt man die Berichte über derartige „Reinkulturen" unberücksichtigt, in denen unter ausgeprochen anaeroben Bedingungen auf der Flüssigkeitsoberfläche ein Film e n t s t a n d e n w a r (VLLJOEN, F R E D U. P E T E R S O N , 1926), s o h a b e n l e d i g l i c h K H O U V I N E

sowie ENEBO in eindeutiger Weise Reinkulturen isolieren können. Im Zusammenhang damit verdient die bei der Untersuchung der anaeroben Cellulosebakterien benutzte Methodik besondere Beachtung. Liegen nämlich Mischkulturen vor, die irrtümlich für reine angesehen werden, so kann leicht der Fall eintreten, daß die anaeroben Bakterien über die aeroben dominieren bzw. die Buttersäurebakterien eine Gärfähigkeit der Cellulose- oder Pectinbakterien vortäuschen (ROTMISTROW, 1952). A. Methodik Für die Untersuchungen anaerober Cellulosebakterien benutzt man als Substrat gewöhnlich Filtrierpapier, seltener Watte oder Cellophan. Im übrigen sei auf den Abschnitt über die Kultivierungsmethodik der aeroben Cellulosebakterien hingewiesen (S. 13ff.). 1. Nährmedien a) F l ü s s i g e Medien Zur Isolierung der anaeroben Cellulosebakterien benutzte OMELIANSKI (1895, 1897, 1902, 1904) bzw. OMELJANSKI (1901) bekanntlich ein später allgemein an-

A. Methodik

165

erkanntes elektives Nährmedium. Es handelt sich insofern um ein ausgesprochen elektives Medium, als das darin enthaltene Filtrierpapier die einzige Kohlenstoffund Energiequelle darstellt. IMSCHENEZKI (1939) stellte s p ä t e r fest, d a ß bei d e r Be-

• i-n ¿kz

impfung des OMELjANSKIschen Mediums mit anaeroben Cellulosebakterien häufig kein Wachstum der Bakterien stattfindet. Fügt man jedoch dem Medium Eiweiß oder andere organische Substanzen zu, so erfolgt eine normale Bakterienentwicklung und Vergärung der Cellulose. Die elektiven Medien tragen demzufolge einen künstlichen Charakter, der keineswegs den in der Natur herrschenden Bedingungen entspricht. In derartigen Nährböden dominiert zwar der spezielle Mikroorganismus, was jedoch nicht bedeutet, daß er für seine Entwicklung stets optimale Bedingungen vorfindet. Die enge Spezialisierung des Mediums, die durch die Notwendigkeit bedingt ist, das Wachstum fremder Mikroben zu beschränken, kann dazu führen, daß die elektiven Medien auch für den spezialisierten Organismus keineswegs mehr vollwertig sind.

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fsa^ Abb. 54. Kultivierungsversuche mit Pferdedung in verschiedenen Nährmedien für anaerobe Cellulosebakterien. a — in O M E L j A N S K i s c h e m Medium unter aeroben Bedingungen; b — im Medium VL unter anaeroben Bedingungen; hier findet eine vollständige Zerstörung der Cellulose durch thermophile Bakterien statt; c — in O M E L j A N S K i s c h e m Medium unter anaeroben Bedingungen

166

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Das fehlende Wachstum im OMELJANSKlschen Medium kann nicht mit einem ungenügenden Sauerstoffausschluß zusammenhängen, da die Züchtungsversuche unter streng anaeroben Bedingungen durchgeführt wurden (Entfernung der Luft aus dem Substrat und anschließendes Zuschmelzen der Reagenzgläser). Abbildung 54 zeigt die Ergebnisse entsprechender Versuche. OMELjANSKisches Medium in Reagenzgläsern wurde mit bakterienhaltigem Material (Boden, Dung oder Schlamm) in bestimmten Verdünnungen beimpft. Dabei konnte weder unter gewöhnlichen (a) noch unter ausgesprochen anaeroben (c) Bedingungen ein Wachstum der Cellulosebakterien beobachtet werden. Die beiden mittleren Gläser (b) enthielten das gleiche Impfmaterial, aber ein anderes Nährmedium (VL), dessen Zusammensetzung weiter unten angeführt ist. In Gegenwart dieser Nährlösung wurde die gesamte Cellulose vergoren, wobei sie sich in eine amorphe, am Boden absetzende Masse verwandelte. Bei dem anschließenden Studium des physiologischen Verhaltens der Reinkulturen wurde festgestellt, daß die anaeroben Cellulosebakterien sich in Nährböden mit anorganischem Stickstoff, insbesondere in dem OMELJANSKlschen Medium nicht vermehren. Ihre Entwicklung ist in diesen Fällen nur dann möglich, wenn sich die mit dem Impfmaterial eingebrachten Fremdbakterien derartig ausgebreitet haben, daß in dem Medium ausreichende Mengen an Eiweiß, Eiweißabbauprodukten und vielleicht auch Vitaminen vorhanden sind. Später setzte IMSCHENEZKI (1949) diese Versuche fort und konnte dabei seine früheren Beobachtungen vollkommen bestätigen. Insbesondere stellte sich heraus, daß die im Boden, auf dem Grunde der Gewässer, im Dung usw. vorkommenden thermophilen, aber auch mesophilen anaeroben Cellulosebakterien wesentlich besser in eiweißhaltigen als in streng elektiven Nährmedien gedeihen. Auf Grund dieser Ergebnisse prägte IMSCHENEZKI den Begriff des „optimalen" Mediums, worunter Medien zu verstehen sind, in denen das Elektionsprinzip bis zu einem gewissen Grade durchbrochen wird. Derartige Medien enthalten Stoffe, die nicht nur den Erregern des spezifischen Prozesses, sondern auch fremden Mikroorganismen eine Entwicklung ermöglichen. Zur Veranschaulichung der Verhältnisse möge die Abbildung 55 dienen. Wie aus Parallelversuchen mit elektiven bzw. optimalen Medien hervorgeht, entwickeln sich die Cellulosebakterien im optimalen Medium, das in diesem Falle aus gleichen Teilen Fleischbrühe-Pepton und Wasser, Filtrierpapierstückchen und Calciumcarbonat besteht, in erheblich größerer Verdünnung als im elektiven Medium. Der von IMSCHENEZKI festgestellte günstige Einfluß von Fleischbrühe-PeptonZusätzen zum Medium auf das Wachstum der anaeroben Cellulosebakterien wurde später auch von anderen Autoren bestätigt. SHUKOWA (1956) fand anläßlich ihrer Untersuchungen über die Verteilung der Cellulosebakterien in Neuland-Böden, daß sich mittels der von IMSCHENEZKI vorgeschlagenen optimalen Medien wesentlich mehr anaerobe Cellulosebakterien nachweisen lassen als bei Verwendung der früher benutzten synthetischen Nährsubstrate. Zum Nachweis anaerober Cellulosebakterien ist es deshalb unvorteilhaft, elektive Medien zu verwenden, da man bei der Benutzung optimaler Medien etwa 100- bis

T a f e l 17

167

A. Methodik

lOOOmal mehr Bakterienzellen entdecken kann. Die elektiven Medien verlieren aber keineswegs an Bedeutung. Wenn ein Versuch darauf abzielt, Kulturen mit einer minimalen Anzahl von Fremdbaktsrien zu erhalten, wird es nach wie vor zweckmäßig sein, elektive Medien zu verwenden. Ist die Untersuchung aber auf eine quantitative Bestimmung der anaeroben Cellulosebakterien gerichtet, so sind optimale Medien durchaus angebrachter. Neben Fleischbrühe-Pepton finden auch Nährlösungen Verwendung, die Leberextrakte, Fäkalienextrakte, Hefeautolysate oder andere Stoffe enthalten. Anschließend wird die Zusammensetzung einiger Nährlösungen gebracht, die zur Isolierung oder Kultivierung anaerober Cellulosebakterien dienen können. Nährmedien für anaerobe Cellulosebakterien n a c h OMELJANSKI 2

nach OMELJANSKI 1

K2HP04 MgS0 4 (NH 4 ) 2 S0 4 od. (NH 4 ) 2 HP0 4 bzw. NH 4 H 2 P0 4 NaCl CaC0 3 Filtrierpapierstreifen dest. Wasser

1,0 g 0,5 g 1,0 g Spuren

1000

ml

(für Anreicherungskulturen) 0,5 g 0,5 g 1,0 g ljOg 2,0 g 1000 ml

n a c h MEYER

(für Reinkulturen) K 2 HPO 4 NaCl MgS0 4 (NH 4 ) 2 S0 4 Pepton Liebigs Fleischextrakt dest. Wasser

1,0 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 2,0 g 30,0 g 1000 ml

Medium V

nach KHOUVINE K2HP04 NaHgPO NaCl Pepton CaC0 3 Leitungswasser

K2HP04 MgS0 4 NaCl (NH 4 ) 2 S0 4 CaC0 3 Filtrierpapier Leitungswasser

lg lg 2g 2g lg lg 1000 ml

(für Anreicherungskulturen) NaNH 4 HP0 4 • 4 1 ^ 0 1,5 g KH 2 P0 4 0,5 g K2HP04 0,5 g MgS0 4 0,4 g NaCl 0,1g MnS0 4 1 1 Tropfen einer l%igen F e S 0 4 J Lösung Pepton 5,0 g Filtrierpapier 15,0 g CaC0 3 2,0 g Leitungswasser 1000 ml (pH 7,0 bis 7,4)

1 Aus dem Original geht nicht hervor, ob ein- oder zweibasisches Phosphat verwendet wird; ebenso ist die Menge an CaCOa nicht angegeben. 2 Häufigste Modifikation.

168

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Medium YL (für Reinkulturen)

n a c h IMSCHENEZKI

(für Roh- und Reinkulturen) Fleischbrühe-Pepton Leitungswasser CaCOj Filtrierpapier

500 ml 500 ml 2g 15 g

Zu 750 ml des Mediums V gibt man 250 ml eines lOprozentigen Fäkalienextraktes n a c h CLAUSEN

(für Roh- und Reinkulturen) Fleischwasser 1000 ml (3 Teile Wasser, 1 Teil Fleisch) Kalbsleber 500 g Pepton 10 g NaCl 5g Asparagin 5g CaC0 3 10 g Cellulose (ehem. rein) 3g pH-Wert des Mediums . 7,4 b) F e s t e N ä h r m e d i e n Als festes Nährmedium verwendet man Cellulose-Agar, dessen Herstellung bereits beschrieben wurde (vgl. S.20f.). Brauchbar ist außerdem einAgar-Gel mit Zusätzen von Stärke, Fleisch-Pepton, Fleisch-Pepton-Cellulose, Fleisch-Pepton-Leber, Cellulose oder Gemüse; auch andere, allgemein bekannte Medien können als Nährboden dienen. Ausgehend von der Ökologie der Cellulosemikroorganismen, benutzte IMSCHENEZKI als Medium bisweilen Filtrate alter Anreicherungskulturen, denen AgarAgar zugesetzt wurde. Das Medium wird in Petrischalen gegossen und in einem Metallexsikkator mit Hilfe einer ölpumpe sorgfältig entlüftet. Wie der Autor hervorhebt, sind andere Verfahren zur Herstellung anaerober Verhältnisse weniger zuverlässig; insbesondere erzielt man mit Glasexsikkatoren schlechtere Resultate. Auch Reagenzgläser, die das verflüssigte Nährmedium in großer Schichtdicke enthalten, sowie PASTEURpipetten sind für die Kultivierung anaerober Bakterien geeignet. IMSCHENEZKI benutzte diese Verfahren häufig, allerdings nicht zur Isolierung der Cellulosebakterien, sondern hauptsächlich zur Untersuchung der Begleitorganismen. Besonders wichtig bei der Erforschung der anaeroben Cellulosebakterien ist die Sterilisierung der Medien. In erster Linie betrifft dies die thermophilen Formen. Die in üblicher Weise, d. h. 20 min bei 121° C, sterilisierten Medien lassen sich in einem Raum von 25° C gewöhnlich weiterhin steril halten. Bei 50 bis 60° C jedoch beginnen die gleichen Medien häufig zu keimen (JEGOROWA, 1940). Offenbar enthält das Agar Sporen thermophiler Bakterien, die während der Sterilisierung nicht abgetötet werden und sich erst bei höherer Temperatur entwickeln. Diese Erscheinung ist derart häufig, daß selbst Reinkulturen anaerober Cellulosebakterien durch die Verwendung mangelhaft sterilisierter Medien verunreinigt

A. Methodik

169

werden können. Auf einer ungenügenden Keimfreiheit des Nährsubstrats beruhte wohl auch das von ROTMISTROW beobachtete Auftreten neuer, in ihrer äußeren Gestalt atypischer Mikrobenformen in Kulturen von Cellulosebakterien. Zur Vermeidung jeglicher Verunreinigung empfiehlt es sich daher, die Medien entweder bei hoher Temperatur (2 Atm) oder zweimal zu sterilisieren. IMSCHENEZKI benutzte in seinen Arbeiten gewöhnlich letzteres Verfahren. 2. Die Herstellung der Anreicherungskulturen Eine Reinzüchtung anaerober Cellulosebakterien kann nur von Anreicherungskulturen ausgehen. Letztere erhält man in folgender Weise. Ein Kolben wird mit einem der oben angeführten flüssigen Nährmedien bis zur Mitte des Kolbenhalses gefüllt und mit einem Wattestopfen zum ungehinderten Entweichen der Gase verschlossen. Der Luftabschluß mit Mandelöl oder einem anderen Öl ist unzweckmäßig, da sich in den Kulturen Fremdbakterien entwickeln, die das Redoxpotential des Mediums verhältnismäßig rasch herabsetzen und für das Wachstum der Cellulosebakterien ungünstige Verhältnisse schaffen. Nach der Sterilisation wird die Kulturflüssigkeit mit entsprechendem Bakterienmaterial beimpft. Beabsichtigt man die Anreicherung thermophiler Formen, so werden die Kulturen bei 60° C aufbewahrt; mesophile Arten dagegen wachsen am besten in einem Temperaturbereich von 30 bis 35° C. Als geeignete Nährlösungen kommen folgende Medien in Betracht: OMELJANSKIsches Medium, Medium V und Fleischbrühe-Pepton mit Cellulose. In den Anreicherungskulturen der thermophilen Cellulosebakterien setzt bereits nach zwei bis drei Tagen eine intensive Gärung ein. Auf der Flüssigkeitsoberfläche bildet sich Schaum, der von aufsteigenden Gasbläschen herrührt. Das Papier wird weich und schleimig, nimmt eine gelbe oder orange Färbung an, und seine Ränder erhalten ein zerfressenes Aussehen. Allmählich wandelt es sich zu einer lockeren amorphen Masse um. Nach mehreren Passagen erhält man eine aktive, stark angereicherte Kultur thermophiler Cellulosebakterien. Ganz anders liegen die Verhältnisse bei der Anreicherung der mesophilen Formen. Die Entwicklung erfolgt in diesem Falle erheblich langsamer, wodurch auch die Geschwindigkeit der Cellulosegärung entsprechend herabgesetzt wird. Für die Zerstörung der Cellulose ist nach OMELJANSKI eine Kultivierungsdauer von 40 bis 50 Tagen erforderlich. Gasbläschen treten nur vereinzelt auf, bisweilen sind sie erst beim Schütteln des Kulturgefäßes sichtbar; Schaum entsteht nicht. Im Papier bilden sich allmählich feine Löcher, es wird schleimig, weich, schlaff und löst sich schließlich auf. Während dieses Zersetzungsprozesses bleibt es entweder farblos oder färbt sich gelb. 3. Die Isolierung der Reinkulturen In den letzten 50 Jahren sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Reinkulturen beschrieben worden. Ausgehend von iMSCHENEZKIs eigenen Versuchen, lassen, sich alle vorgeschlagenen Methoden in einer bestimmten Weise systematisch ordnen. Es folgt eine kurze Betrachtung aller bekannten Verfahren.

170

II. Anaerobe Cellulosebakterien a) D i e Züchtung auf f e s t e n Medien

Nach einer vor 20 bis 30 Jahren weitverbreiteten Ansicht bilden die anaeroben Cellulosebakterien auf der Oberfläche eines festen Nährmediums entweder überhaupt keine Kolonien oder nur in sehr geringer Anzahl. Als Beispiel seien die Versuche OMELIANSKIs (1895,1902) bzw. OMELJANSKls (1899) zur Züchtung der Methan- und Wasserstoffbakterien auf festen Nährböden angeführt, die sämtlich erfolglos blieben. Später stellte sich jedoch heraus, daß auch die anaeroben Celluloseformen auf den verschiedensten Substraten Kolonien bilden können. Ausführlicher soll auf diese widersprechenden Ergebnisse erst bei der Diskussion der Kultivierungsmerkmale eingegangen werden. Allerdings führt das einfache Beimpfen des in einer Schale befindlichen festen Mediums mit einer Anreicherungskultur meist nicht zu einer Reinkultur. Die Anreicherungskulturen enthalten nämlich stets Begleitbakterien in größerer Menge, die sich rascher und intensiver entwickeln als die anaeroben Cellulosearten, so daß deren Kolonien überwuchert werden. Eine andere Schwierigkeit bei der Reinzüchtung in Petrischalen besteht darin, daß die Schalen unter streng anaeroben Bedingungen gehalten werden müssen, da sich sonst die anaeroben Bakterien nicht entwickeln. Unter diesen Umständen zeigen die in der Rohkultur stets vorhandenen Begleitbakterien zwar kein Wachstum, jedoch können sich einzelne Zellen aerober Bakterien gerade an den Stellen befinden, an denen die Kolonien der anaeroben Bakterien entstehen, so daß bei einer Übertragung in ein flüssiges Medium eine Mischkultur resultiert. Nach einem anderen Verfahren beimpft man verflüssigtes Cellulose- oder Kartoffel-Agar mit der Rohkultur und überführt anschließend das Substrat in Reagenzgläser oder saugt es in PASTEURpipetten ein. Wenn die Entwicklung der Bakterien genügend weit fortgeschritten ist, stößt man die Agarsäulen aus, isoliert die Kolonien mit einem sterilen Skalpell und beimpft mit ihnen ein flüssiges Nährmedium. 1926 berichteten VlLJOEN, FRED und PETERSON, daß es ihnen gelungen ist, eine neue Art, Clostridium thermoceUum, zu isolieren, indem sie aus der Kultur die Gasbläschen mit dem umgebenden Cellulose-Agar ausschnitten und überimpften. Wie aus der Beschreibung hervorgeht, war jedoch die Kultur nicht rein. Nach Beobachtungen iMSCHENEZKls gelingt es nicht, auf diese Weise Reinkulturen zu isolieren, da im Agar stets eine große Anzahl von Begleitbakterien vorhanden ist, die zusammen mit der anaeroben Kolonie übertragen werden. Wie IMSCHENEZKI betont, ist diese Schlußfolgerung das Resultat einer großen Anzahl von Versuchen. Etwas später veröffentlichte CLAUSEN (1931) eine Untersuchung über die Züchtung von Cellulosebakterien mit endständigen Sporen. Bei einer Nachprüfung dieser Angaben beobachtete V. MEYER (1935) ebenfalls die Bildung isolierter Kolonien auf festen Medien, die jedoch nicht immer zur anaeroben Zersetzung der Cellulose befähigt waren. Wurden zur Weiterzüchtung Fleischbrühe-Pepton-Medien benutzt, so fand keine Cellulosegärung mehr statt. MEYER erklärt diese Erscheinung damit, daß die Cellulosebakterien bei der Kultivierung auf gewöhnlichen Medien in die Saprophytenform übergehen und demgemäß die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung ver-

A. Methodik

171

lieren. Zu ähnlichen Folgerungen ist auch ROTMISTROW (1939, 1940) gelangt. Denkbar ist allerdings auch eine andere, wesentlich einfachere Erklärung. Möglicherweise wurden die bei diesen Versuchen beobachteten Kolonien aus Begleitbakterien gebildet, unter denen sich auch einzelne Zellen der Cellulosebakterien befinden. Nach der Übertragung auf Fleischbrühe-Pepton-Medien entwickeln sich die Cellulosebakterien nicht mehr, so daß schließlich Reinkulturen der celluloseinaktiven, anaeroben Begleitbakterien erhalten werden, in denen keinerlei Celluloseformen mehr auftreten. b) Die V e r d ü n n u n g s m e t h o d e Vom theoretischen Standpunkt aus besteht kein Zweifel darüber, daß die Anzahl der Cellulosebakterien in einer Anreicherungskultur sehr groß ist. Man könnte also erwarten, daß beim Impfen mit Material aus verschieden verdünnten Bakteriensuspensionen in einigen Fällen Kulturen gewonnen werden, die nur cellulosevergärende Bakterien enthalten. Irgendwelche Erfolge sind jedoch mit dieser Methode in keinem Falle erzielt worden (OMELJANSKI, 1901; OMELIANSKI, 1902; TETRAULT, 1 9 3 0 ; KHOUVINE, 1923).

c) Die Z ü c h t u n g a u s einer Zelle (Einzellenkultur) Sogar bei der Übertragung einer einzelnen Zelle, die einer Reinkultur entnommen ist, erfolgt nicht immer eine Entwicklung. Diese Erscheinung ist von den verschiedensten Bakterienarten her bekannt. Noch schwieriger gestaltet sich die Herstellung von Reinkulturen aus einer Zelle, die einer Mischkultur, wie sie die Anreicherungskulturen vorstellen, entnommen wird. Man kann sich bei der Reinzüchtung nicht nach der Morphologie der Zellen richten, da unter den Begleitbakterien ebenfalls Formen mit terminalen Sporen vorkommen, d. h. Formen, die den Cellulosearten ähnlich sind. Leider gibt es noch keine experimentellen Untersuchungen darüber, unter welchen Bedingungen die Vermehrung einer einzelnen Zelle der anaeroben Cellulosebakterien möglich ist. Es kommt häufig vor, daß bei den Übertragungen der Reinkulturen kein Wachstum mehr stattfindet, wenn die Impfmenge zu klein wird. Alle Versuche zur Herstellung von Einzellenkulturen sind bisher fehlgeschlagen. TETRAULT (1930) führte 1 0 4 Versuche zur Bakterienkultivierung aus einer einzelnen Zelle durch; dabei fand in 100 Fällen überhaupt keine Entwicklung statt und in den restlichen 4 Ansätzen beobachtete er nur eine Vermehrung der celluloseinaktiven Begleitbakterien. d) D a s E r h i t z e n der K u l t u r Seit langem ist bekannt, daß die anaeroben Cellulosebakterien Sporen bilden. Es müßte also möglich sein, durch Erhitzen der Kultur und damit durch Abtöten aller sporenloser Begleitbakterien eine Reinkultur der Cellulosebakterien zu erhalten. Versuche in dieser Richtung sind häufig unternommen worden. So erhitzte z. B. OMELJANSKI eine Kultur 20 bis 25 min auf 90° C, konnte jedoch auf diesem Wege auch keine Reinkultur erhalten. Ebenso erfolglos blieben die Versuche anderer Autoren ( W E R N E R , 1 9 2 6 ; TETRAULT, 1930).

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Das Fehlschlagen, der Versuche ist insofern verständlich, als die Mischkulturen stets sporogene Begleitbakterien enthalten, die eine Erhitzung ebenfalls überstehen. Wendet man noch höhere Temperaturen oder eine längere Erhitzungsdauer an, so werden auch die Cellulosebakterien abgetötet. Nach OMELJANSKI (1899) bzw. OMELIANSKI (1902) wird eine Modifikation der Hitzesterilisation als „fraktionierte Erhitzung" bezeichnet, die aus einem wiederholten Erwärmen der Kultur auf höhere Temperaturen besteht. So erhitzte OMELJANSKI beispielsweise eine Mischkultur, die auf einem synthetischen Medium oder auf Fleischbrühe gewachsen war, 15 min lang auf 75° C und wiederholte das Verfahren nach 24 Stunden. Zwischen den beiden Erwärmungen wurde die Kultur unter anaeroben Bedingungen (Vakuum) bei 34 bis 35° C gehalten. Aber auch auf diesem Wege gelang es OMELJANSKI nicht, die Kultur von den Begleitbakterien zu befreien. ÖNIESZKO (1937) schlug ebenfalls ein Verfahren zur Reinzüchtung thermophiler Cellulosebakterien vor, das sich jedoch prinzipiell nicht von dem OMELJANSKIschen unterscheidet. ÖNIESZKO ging von der Tatsache aus, daß die Ernährungsphysiologie der Begleitbakterien eine andere ist als die der Cellulosebakterien. Letztere zeigen in Fleischbrühe-Pepton-Medien ohne Cellulose kein Wachstum, während die Sporen der Begleitbakterien in dieser Nährlösung auskeimen. ÖNIESZKO führte deshalb die weitere Züchtung der Rohkultur in Reagenzgläsern mit Fleischbrühe durch und hielt die Kulturen 3 Tage lang bei 60° C. Während dieser Zeit wurden die Reagenzgläser alle 4 bis 5 Stunden jeweils 10 bis 15 min auf 100° C erhitzt, danach die Bakteriensuspensionen im Verhältnis 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000 verdünnt und 1 ml jeder Verdünnung zum Impfen eines flüssigen, cellulosehaltigen Mediums benutzt. Zu jedem Ansatz mußten außerdem noch 1 bis 2 ml einer konzentrierten Hefesuspension zugegeben werden, da andernfalls keine Entwicklung der Cellulosebakterien erfolgte. Möglicherweise setzt die Hefe das Redoxpotential des Mediums herab und bewirkt eine Anreicherung der Lösung mit organischem Stickstoff und Vitaminen. Auf dem 2. Internationalen Mikrobiologenkongreß berichtete ÖNIESZKO über eine weitere Modifikation des Hitzeverfahrens zur Isolierung thermophiler Cellulosebakterien, die sich von der ursprünglichen Methode lediglich insofern unterscheidet, als die Züchtung in Kolben mit Fleischbrühe vorgenommen wird, durch die man sterile Luft leitet. Diese Verfahrenstechnik beschleunigt das Keimen der Sporen und die Entwicklung der Begleitbakterien. Das Abtöten der letzteren durch Erhitzen der Kultur und die weiteren Passagen werden genau wie bei dem ursprünglichen Verfahren durchgeführt. Beide Methoden ÖNlESZKOs können jedoch nicht als sichere Standardisolierungen empfohlen werden, da mit dieser Technik im wesentlichen nur das Ziel verfolgt wird, die aeroben Begleitbakterien auszuschließen. Neben den aeroben Bakterien sind aber in Rohkulturen der thermophilen Cellulosebakterien meist auch anaerobe, celluloseinaktive Bakterien vorhanden, wovon man sich leicht überzeugen kann. E s ist evident, daß eine Entfernung der letzteren nicht möglich ist, da sich die Sporen der anaeroben Bazillen beim Durchleiten der Luft nicht entwickeln. PERWOSWANSKI und ROMANOWITSCH (1937) erhielten bei einer Nachprüfung der ÖNIESZKOschen Verfahren (1932) nur negative Ergebnisse.

A. Methodik

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e) D i e K u l t i v i e r u n g „ s t e r i l e r " A g a r - B l ö c k c h e n Diese Methode beruht auf der Tatsache, daß sich bei der Kultivierung der Cellulosebakterien in Schalen mit Fleischbrühe-Pepton-Agar nur Kolonien der Begleitbakterien entwickeln. Die Sporen der Cellulosebakterien befinden sich dagegen auch an den Stellen der Agaroberfläche, die von Kolonien frei sind. Zur Übertragung dieser Sporen auf ein cellulosehaltiges Medium bestehen nun zwei Möglichkeiten. WERNER (1926) ging bei seinen Versuchen zur Isolierung einer mesophilen Art aus dem Darm des Käfers Potosia cwprea Fbr. in der Weise vor, daß er aus einer Anreicherungskultur zunächst die zerstörte Cellulose in eine Petrischale mit Fleischbrühe-Pepton-Agar überführte. Das Material wird ausgestrichen, und mit dem gleichen Spatel können noch drei weitere Schalen beimpft werden. Die nach der Bebrütung entstandenen Kolonien einschließlich des Substratagars werden mit Hilfe eines sterilen Skalpells ausgeschnitten und die verbliebenen Kulturen erneut in den Thermostaten eingestellt. Als Kriterium für die völlige Beseitigung der Begleitbakterien dient das Fehlen jeglichen Wachstums in der Kultur. Anschließend werden die Cellulosebakterien mittels eines Wattetampons von der Oberfläche des „sterilen" Agars abgehoben und zusammen mit dem Wattebausch in ein flüssiges, cellulosehaltiges Nährmedium übertragen. Das zweite Verfahren ist einfacher. Hierbei werden nicht die Agarstücke mit den Kolonien, sondern die dazwischenliegenden „sterilen" Bereiche ausgeschnitten und weiter kultiviert. Die zweite Methode benutzten u. a. V. MEYER (1935) und TETRAULT (1930). Man kann zwar auf diese Weise bisweilen tatsächlich Reinkulturen der Cellulosebakterien erhalten, absolut sicher ist die Methode aber ebenfalls nicht. In einem festen Medium sind die Bedingungen zur Entwicklung der Begleitbakterien nicht immer gleich günstig. Es kann durchaus vorkommen, daß sich an der Oberfläche sogenannter „steriler" Bereiche noch lebensfähige Zellen der Begleitbakterien im latenten Zustand befinden. Bei der Übertragung in ein flüssiges Medium setzt dann wieder eine Vermehrung dieser Zellen ein. Der Hauptnachteil der Methode besteht jedoch darin, daß, bedingt durch den hohen Artenbestand einer Mischkultur, eine einmalige Trennung mittels des beschriebenen Verfahrens nicht sehr wirkungsvoll ist. Erfolgt die Impfung unter aeroben Bedingungen, so werden sich auf den „sterilen" Bereichen des Agars nicht nur die anaeroben Celluloseformen, sondern auch andere anaerobe Bakterien befinden. Letztere gelangen dann zusammen mit den ersteren in das flüssige Medium. Wird andererseits im Vakuum kultiviert, so entstehen für die aeroben Mikroorganismen ungünstige Verhältnisse. Ihre Zellen sind dann ebenfalls an den freien Stellen der Agaroberfläche zu finden. In beiden Fällen erhält man nach der Übertragung des Impfmaterials aus den „sterilen" Bereichen keine Reinkulturen. Wenn doch einmal eine Reinkultur entstehen sollte, so dürfte es sich nur um einen Zufallstreffer handeln. Im allgemeinen ist das Verfahren nicht zu empfehlen. f) D i e m e c h a n i s c h e A b t r e n n u n g d e r B e g l e i t b a k t e r i e n Eine einfache Methode zur Herstellung von Reinkulturen der Cellulosebakterien stammt von KHOUVINE. Man entnimmt der Rohkultür kleine' Anteile des halb

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

zerstörten und gelb gefärbten Filtrierpapiers und wäscht diese nacheinander in drei Petrischalen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung. Anschließend beimpft man mit dem gewaschenen Material ein flüssiges, cellulosehaltiges Nährmedium. IMSCHENEZKI konnte mit dieser Methode allerdings ebenfalls keine Reinkulturen erhalten. Anscheinend gelingt es nicht, beim Waschen a l l e an den Cellulosefasern haftenden Zellen der Begleitbakterien zu entfernen. Ferner machte KHOUVINE den Vorschlag, dem Medium Fäkalienextrakt zuzusetzen, der die Entwicklung der Cellulosebakterien fördert, was auch IMSCHENEZKI festgestellt hatte. Die negativen Resultate, die IMSCHENEZKI und Mitarbeiter bei der Nachprüfung aller Verfahren zur Gewinnung von Reinkulturen der anaeroben Cellulosebakterien erhalten hatten, veranlaßten die genannten Autoren, ihre eigenen Bemühungen auf diesem Gebiet fortzusetzen. Aus zahlreichen Versuchen geht hervor, daß die meisten Methoden zur Herstellung der Reinkulturen, wie bereits erwähnt, unbrauchbar sind. Auf Grund der dabei gesammelten Erfahrungen gelang es IMSCHENEZKI und Mitarbeitern jedoch, Verfahren auszuarbeiten, mit denen die Isolierung der Reinkulturen einwandfrei möglich ist. Aus den Anreicherungskulturen überträgt man Anteile des halbzerstörten Filtrierpapiers in Reagenzgläser mit dem Medium VL. Danach zieht man den oberen Teil des Reagenzglases in der Flamme aus, entfernt die Luft und schmilzt zu. Die Kulturen werden bei 60° C aufbewahrt. Das Wesen der Methode besteht nun in einem mehrmaligen Übertragen der Kulturen unter streng anaeroben Bedingungen. Bevor das Impfmaterial auf frisches Nährsubstrat übergeführt wird, wäscht man es mit sterilem Leitungswasser gründlich aus. Durch den Waschprozeß findet eine Beseitigung der oberflächlich anhaftenden Begleitbakterien statt, die in der anschließenden Kultivierung unter streng anaeroben, für die Entwicklung der aeroben Begleitbakterien extrem ungünstigen Verhältnissen vervollständigt wird. Es muß jedoch darauf hingewiesen werden, daß Erfolg oder Mißerfolg im wesentlichen von dem Charakter, d. h. der Zusammensetzung der Anreicherungskultur abhängen. Sind als Begleitbakterien nur aerobe Formen vorhanden, so gelingt es unter den angegebenen Bedingungen verhältnismäßig leicht, Reinkulturen zu erhalten. Wenn deshalb nicht die Notwendigkeit besteht, eine Reinkultur aus einer bestimmten Anreicherungskultur zu isolieren, so empfiehlt es sich, diese Rohkultur auf Fleischbrühe-Pepton- oder Kartoffel-Agar mit großer Schichtdicke überzuimpfen und nur solche Kulturen zur Weiterzüchtung zu benutzen, die frei von anaeroben Begleitformen sind. Wenn diese Voraussetzung erfüllt ist, kann man nach der angegebenen Vorschrift rasch Reinkulturen erhalten. Dazu genügen z. B. bereits drei bis vier Passagen unter anaeroben Bedingungen. Die Reinzüchtung der Cellulosebakterien aus Mischkulturen, die sowohl aerobe als auch anaerobe Begleitbakterien enthalten, ist schwieriger. In diesem Falle wird nach folgendem Schema verfahren: Zur Abtötung der asporogenen Formen erhitzt man die Rohkultur für 20 min auf 100° C. Dann werden die aeroben Begleitbakterien entfernt, wozu Übertragungen unter streng anaeroben Verhältnissen notwendig sind. Gewöhnlich reichen drei bis vier Passagen aus. Anschließend wird das Impf-

A. Methodik

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material auf Fleischbrühe-Pepton-Agar übertragen. Ist in der Umgebung der Papierstückchen auf dem Agar kein Wachstum sichtbar, so ist die Kultur vollständig frei von aeroben sporenbildenden Bakterien. Danach überträgt man die „sterilen" Papierstückchen in Reagenzgläser mit dem Medium VL. Die Kultur enthält nun neben den anaeroben Celluloseformen nur noch anaerobe sporenbildende Begleitbakterien. Um auch die letzteren noch zu entfernen, erhitzt man die Kultur 10 min lang auf 100° C, wodurch alle vegetativen Zellen, sowohl der Cellulose- als auch der Begleitbakterien, abgetötet werden. Danach werden die Reagenzgläser so lange geschüttelt, bis sich die Cellulose gleichmäßig verteilt hat, und dann bringt man je 0,5 ml der Suspension auf verflüssigtes Fleischbrühe-Pepton-Agar, das sich in hoher Schicht in engen Reagenzgläsern befindet. Das Agar wird vor der Sterilisation filtriert und muß vollkommen klar sein. Aus der Kultur stellt man nun verschiedene Verdünnungen her (1 : 10, 1 :100, 1 : 1000) und beimpft jeweils drei Reagenzgläser sowohl mit den Verdünnungen als auch mit der unverdünnten Kultur. Nach 24stündigem Stehen bei 60° C werden die Gläser ausgewählt, in denen sich keine Kolonien der anaeroben Begleitbakterien gebildet haben. Durch leichtes Erwärmen der Gläser werden die Agar-Säulen ausgestoßen und in sterile Petrischalen übergeführt. Nun schneidet man mit einem durch die Flamme gezogenen Skalpell aus dem mittleren Drittel der Säule eine dünne Agar-Scheibe heraus und überträgt sie in ein Reagenzglas mit flüssigem Medium. Die Gläser werden anschließend sorgfältig evakuiert. Mit jeder Säule beimpft man zweckmäßigerweise zwei bis drei Kultivierungsröhrchen, die dann gewöhnlich für etwa vier bis fünf Tage sich selbst überlassen werden. Diejenigen Gläser, in denen nach dieser Zeit eine Gärung der Cellulose sichtbar geworden ist, werden geöffnet, und nach einer der weiter unten beschriebenen Methoden wird die Reinheit der Kultur geprüft. g) Die R e i n h e i t s p r ü f u n g e i n e r K u l t u r Unter den verschiedenen Mikroorganismen nehmen die anaeroben Cellulosebakterien insofern eine „Sonderstellung" ein, als die überwiegende Mehrzahl der Untersuchungen über die Mikrobiologie des Celluloseabbaus mit unreinen Kulturen durchgeführt worden ist. Für die Physiologie der Mikroben besitzen diese Arbeiten keinerlei wissenschaftlichen Wert, weil sich die „Physiologie" der Cellulosebakterien je nach der Art der Begleitflora ändert. Einige Autoren besitzen nun einen etwas eigenartigen Begriff von der Reinheit einer Kultur. Bisweilen spricht man sogar von einem unterschiedlichen Reinheitsgrad. So beschreiben z. B. SARLES, FRED und PETERSON (1931/32) „eine Kultur mit hohem Reinheitsgrad". Hierzu muß bemerkt werden, daß eine Kultur keinen Reinheitsgrad besitzen kann; entweder sie ist rein, oder sie ist mit Begleitbakterien verunreinigt. Die Schwierigkeiten bei der Herstellung einer Reinkultur führen manche Autoren zu der Annahme einer obligaten Symbiose, d. h. sie behaupten, daß sich die anaeroben Cellulosebakterien in einer Reinkultur nur dann entwickeln können, wenn gleichzeitig eine Vermehrung der Begleitbakterien erfolgt. Diese Auffassung rührt sicher von einem Mißverständnis her, da Reinkulturen in Medien, die für die Entwicklung der Cellulosebakterien geeignet sind, ausgezeichnet gedeihen. Häufig wird

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

behauptet, eine Kultur sei rein, ohne daß irgendwelche Reinheitsbeweise gegeben werden. Naturgemäß muß man in diesen Fällen immer daran zweifeln, ob die Autoren wirkliche Reinkulturen zur Verfügung hatten. Die Ansichten über die Physiologie der anaeroben Cellulosebakterien, ihren Entwicklungszyklus usw. gehen bei den verschiedenen Forschern deswegen weit auseinander, weil meist mit Mischkulturen statt mit Reinkulturen gearbeitet wurde. Es ist somit unbedingt notwendig, ausführlicher auf die Beweise für die Reinheit einer Kultur einzugehen. Es gibt mehrere Möglichkeiten für die Prüfung der Reinheit einer Kultur, die anschließend aufgezählt werden sollen. 1. Die anaeroben Cellulosebakterien zeigen auf den gewöhnlichen Laboratoriumsmedien kein Wachstum. Eine Entwicklung von Mikroorganismen auf FleischbrühePepton mit oder ohne Agar zeugt deshalb stets von einer Verunreinigung der Kultur durch Fremdbakterien. Als Nährlösung ist Milch besonders geeignet, in der die begleitenden Saprophyten ausgezeichnet gedeihen, während die Celluloseformen keinerlei Wachstum aufweisen. Es ist also notwendig, die Kultur durch Züchtung auf den üblichen Laboratoriumsmedien, zu denen außer den oben genannten noch Most, flüssige Medien mit Kartoffelschnitzeln und Kartoffel-Agar gehören, auf ihre Reinheit zu prüfen. Ein fehlendes Wachstum auf diesen Medien beweist, daß die vorliegende Kultur keine aeroben Begleitbakterien enthält. Der Beweis ist jedoch nicht ausreichend für die Behauptung, daß die Kultur nur a,naerobe Cellulosebakterien enthält. Häufig beschränken sich die Autoren auf diese Reinheitsprüfung und vergessen dabei, daß in Kulturen der Cellulosebakterien auch andere anaerobe, celluloseinaktive Formen vorkommen können. Es ist deshalb stets erforderlich, eine Kultivierung auch auf Fleischbrühe-Pepton-Agar in hochgefüllten Reagenzgläsern durchzuführen, wobei als Substrat das Medium nach KlTT-TAROZZl oder andere cellulosefreie Medien für anaerobe Bakterien verwendet werden. Daneben ist es zweckmäßig, Kultivierungsproben sowohl in Reagenzgläsern mit Fleischbrühe-Pepton als auch in Schalen mit Fleischbrühe-Pepton-Agar durchzuführen. Die Schalen bzw. Gläser werden dabei unter streng anaeroben Bedingungen, d. h. im Exsikkator, gehalten. Nur für den Fall, daß weder unter aeroben noch unter anaeroben Verhältnissen ein Wachstum sichtbar ist, darf man annehmen, daß die Kultur frei von Begleitbäkterien ist. 2. Die Cellulosebakterien benötigen für ihre Entwicklung vollwertige Medien; in rein synthetischen, cellulosehaltigen Nährböden findet deshalb gewöhnlich kein Wachstum statt. Beobachtet man trotzdem eine rasche Entwicklung der Celluloseformen, so kann man mit Sicherheit annehmen, daß sich zunächst Fremdbakterien angesiedelt und das Substrat so verändert haben, daß günstigere Bedingungen für das Wachstum der anaeroben Cellulosebakterien entstanden sind. Ausführlicher soll auf diese Frage in dem Abschnitt über die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen eingegangen werden. 3. Die. anaeroben Cellulosebakterien haften an den Cellulosefasern. Da diese gewöhnlich am Boden des Kulturgefäßes liegen, sind alle Zellen der Cellulosebakterien in den untersten Schichten der Nährlösung konzentriert, so daß die überstehende Flüssigkeit klar sein muß. Findet man jedoch bei der mikroskopischen

A. Methodik

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Untersuchung der Flüssigkeit eine größere Anzahl von Bakterienzellen, so weist diese Beobachtung auf eine Verunreinigung der Kultur durch Fremdbakterien hin. 4. Da die anaeroben Cellulosebakterien unmittelbar an der Faser haften, findet man deren Zellen bei der mikroskopischen Untersuchung der befallenen Cellulosefasern. Die cellulosevergärenden Bakterien besitzen typische morphologische Merkmale. Es sind sehr dünne, lange Stäbchen mit einer schwach ovalgekrümmten endständigen Spore. Ausführlicher wird ihre Morphologie weiter unten beschrieben. Die Gestalt derartiger plektridialer Formen ist sehr charakteristisch. Man kann deshalb auch bei nur geringer Erfahrung unter dem Mikroskop leicht die Anwesenheit fremder Bakterienformen feststellen. In den meisten Fällen handelt es sich dabei um sporenbildende Bakterien, die häufig ebenfalls terminale Sporen bilden. Die celluloseinaktiven Bazillen sind meist raketenförmig gestaltet oder besitzen die Form kurzer, dicker Stäbchen mit ovalen oder länglichen Sporen. Ihre Zellen sind wesentlich kürzer, dicker und plumper als die Zellen der Celluloseformen und können in der Kulturflüssigkeit in größerer Anzahl nachgewiesen werden. Auf den Cellulosefasern kommen sie dagegen nicht vor. Abbildung 91 zeigt einige sporenbildende celluloseinaktive Begleitbakterien aus einer Anreicherungskultur. 5. Wie weiter unten mitgeteilt wird, sind die anaeroben Cellulosebakterien gramnegativ, die meisten Begleitbakterien dagegen grampositiv. Mit Hilfe der mikroskopischen Beobachtung gramgefärbter Präparate läßt sich also ebenfalls entscheiden, ob eine Reinkultur vorliegt oder ob außer den Cellulosebakterien noch Fremdbakterien anwesend sind. 6. Nach Behandlung mit LüGOLscher Lösung nehmen die Zellen der anaeroben Cellulosebakterien (sowohl im lebenden Zustand als auch in fixierter Form) eine einheitliche glänzend gelbe Färbung an, während die Begleitformen, unter denen bisweilen Buttersäure- oder Pectinbakterien vorkommen, eine positive ßeaktion auf Glycogen oder Amylose geben, d. h. entweder über die ganze Zelle oder nur in einzelnen Bereichen bläulichgrau oder braun gefärbt sind. 7. Unter den Begleitbakterien treten häufig eiweißzersetzende Formen auf. In diesen Fällen haben die Kulturen, besonders wenn sie eiweißhaltiges Substrat enthalten, einen unangenehmen fauligen Geruch. Eine Eeinkultur anaerober Cellulosebakterien dagegen besitzt keinen derartigen Geruch, unabhängig von der Zusammensetzung des Mediums. Anaerobe Cellulosebakterien haben einen leicht sauren, nicht deutlich ausgeprägten Geruch. 8. Sulfate werden von den anaeroben Cellulosebakterien nicht reduziert; auch bilden sie auf eiweißhaltigen Nährmedien keinen Schwefelwasserstoff. Das Auftreten schwarzer Flecken auf dem Papier oder schwarzgefärbter Bereiche im Medium hängt mit der Entstehung von Eisensulfid zusammen. Schwefelwasserstoffgeruch und Bildung von Eisensulfid dienen also als Beweis dafür, daß in dem Medium (gewöhnlich MgS0 4 enthaltend) eine Reduktion des Sulfats durch Fremdbakterien stattgefunden hat. Besonders häufig begegnet man den desulfurierenden Formen in Proben aus den Böden der Gewässer, aus dem Seewasser usw. 12 Imschenezki, Mikrobiologie

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

9. Die Zerstörung der Cellulose durch, anaerobe Bakterien beginnt mit einer Hydrolyse des Polysaccharids. Dieser Prozeß wird später in dem Abschnitt über die Biochemie der '-Cellulosegärung behandelt. Es ist evident, daß die im Medium entstehenden und sich ansammelnden Glucose- und Cellobiosemengen von den Fremdbakterien verwertet werden. Die Anwesenheit reduzierender Substanzen im Medium kann also als Beweis für die Reinheit der Kultur angesehen werden. In Mischkulturen fehlen reduzierende Substanzen entweder vollständig, oder sie sind nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Dies betrifft jedoch nur die Kulturen thermophiler Cellulosebakterien, da in diesem Falle die Hydrolyse der Cellulose rasch erfolgt und sich größere Mengen reduzierender Stoffe im Medium ansammeln. Die mesophilen Bakterien verwerten die sich bildenden Kohlenhydrate im Maße ihrer Entstehung. Folglich können hier bei langsamer Zersetzung der Cellulose auch in Reinkulturen reduzierende Substanzen fehlen. Die Anwesenheit löslicher Kohlenhydrate im Medium ist jedenfalls ein sehr wertvolles Kennzeichen für die Reinheit einer Kultur. Wie aus der Literatur hervorgeht, haben die meisten Autoren, die sich mit der Physiologie der thermophilen Cellulosebakterien beschäftigten, eine rasche Zersetzung der Cellulose und das Auftreten organischer Säuren, aber keiner reduzierenden Substanzen beobachtet. IMSCHENEZKI dagegen fand in Reinkulturen eine Anhäufung von Zuckern in sehr großen Mengen. Somit deuten die erwähnten Literaturangaben darauf hin, daß die Kulturen neben den Celluloseformen auch noch andere Bakterien enthielten, die in der Lage waren, reduzierende Substanzen unter Bildung verschiedener Gärungsprodukte zu verwerten. Naturgemäß kann als endgültiger Beweis für die Reinheit einer Kultur nur das Übereinstimmen der Resultate aller oben aufgezählten Prüfungen angesehen werden. Außer diesen Prüfungsverfahren ist weiterhin noch eine längere Beobachtung der Kultur angebracht. Wenn in Zukunft bei allen Arbeiten mit anaeroben Cellulosebakterien der Beweis für die Reinheit der Kultur erbracht wird, kann man leicht in jedem einzelnen Falle den Wert und die Glaubwürdigkeit der Angaben über die Morphologie und besonders über die Physiologie der cellulosevergärenden Bakterien beurteilen. B . Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien 1. Morphologie Die Morphologie der thermophilen anaeroben Cellulosebakterien kann am besten untersucht werden, wenn man Faserproben aus verschieden alten Kulturen unter dem Mikroskop beobachtet. Die Methode des hängenden Tropfens erscheint deshalb ungeeignet, weil es schwierig ist, gleichzeitig eine gute Sichtbarkeit, streng anaerobe Verhältnisse und eine ausreichend hohe Temperatur zu erhalten. Man muß sich daher auf die Untersuchung der Zellen aus Kulturen in flüssigen Medien beschränken oder auf Kolonien zurückgreifen, die sich unter anaeroben Bedingungen an der Oberfläche eines festen Mediums gebildet haben. In cellulosehaltigen Nährlösungen besitzen die jungen vegetativen Zellen die Gestalt dünner gerader oder leicht bogenförmig gekrümmter Stäbchen mit ab-

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

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gerundeten Enden; nach IMSCHENEZKI sind sie 3 bis 4 fx lang und 0,4 bis 0,5 (J. b r e i t (Abb. 56 und 57), n a c h M C B E E ( 1 9 4 7 , 1 9 4 8 , 1 9 5 0 ) 2,5 bis 3,5 [Z lang und 0 , 6 bis

0,7 FI, breit. Mit zunehmendem Alter der Kultur werden die Stäbchen immer länger, und auch die stärker gekrümmten Formen werden häufiger; junge Zellen sind dagegen meist gerade. Die Behauptung von MCBEE, daß die thermophilen anaeroben Cellulosebakterien Ketten bilden, konnte von IMSCHENEZKI nicht bestätigt werden. Allerdings sind sie häufig paarweise hintereinander gelagert, da die Zellen nach der Teilung zusammenbleiben. In Ausnahmefällen kann man auch drei bis vier aneinanderhängende Zellen beobachten; typische Ketten kommen jedoch nicht vor. In alten Kulturen begegnet man fadenförmigen, 30 bis 40 (X langen Gebilden mit einer Verzweigung oder mit mehreren Ästen (Abb. 58). Anscheinend handelt es sich hierbei um besondere Formen, die durch den ungünstigen Einfluß desMediums entstanden sind, dessen Zusammensetzung sich während des Gärprozesses laufend ändert. Mit zunehmendem Alter der Kultur lassen sich an den Bakterien folgende Veränderungen beobachten : Zunächst strecken sie sich und werden dabei etwas dünner. Dann wird an einem Ende der Zelle eine kleine Verdickung sichtbar, das erste Anzeichen für die beginnende Abb. 56. Entwicklungszyklus der anaeroben thermophilen Cellulosebakterien Sporenbildung. Zu diesem Zeitpunkt strecken sich die Zellen stark in die Länge und erreichen 9 bis 15, mitunter sogar 20 ¡J,. Die terminale Schwellung vergrößert sich allmählich und verwandelt sich in eine 1,5 fx lange und 1,3 ¡x breite birnenförmige Prospore. Dieses Entwicklungsstadium der thermophilen Bakterien wird in den Abbildungen 56 und 59 veranschaulicht. Im weiteren Verlauf der Sporenbildung werden die Prosporen zusammengedrückt, nehmen ein glänzendes Aussehen an, umgeben sich mit einer Membran und verwandeln sich schließlich in die Sporen (Abb. 56 und 60). Die reifen Sporen besitzen eine runde oder ovale Gestalt mit einem Durchmesser von 1,4 bis 1,7 |x. Durch das Zusammendrücken der Prospore während der Reifung liegt die Spore frei in der terminalen Verdickung der vegetativen Zelle, d. h. die Spore befindet sich gewissermaßen in einer Tasche.

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Mitunter entstehen aus einer Reihe sporentragender Zellen Ansammlungen (vgl. Abb. 61). In der nächsten Phase des Entwicklungszyklus erfolgt die Trennung der Spore von der Mutterzelle. Die alten vegetativen Zellen werden dünner, durchsichtiger und lassen sich schlecht anfärben. Sie erinnern in ihrem Aussehen an die von der Autolyse der Bakterien bekannten Gebilde. Gleichzeitig verkürzen sich die Zellen immer mehr und werden schließlich völlig resorbiert. Die einzelnen Stadien dieses relativ rasch ablaufenden Prozesses sind in der Abbildung 56 wiedergegeben. Bringt man pasteurisiertes Impfmaterial auf ein frisches Nährmedium, so beginnt sofort eine polare Keimung der Sporen. Eingehender ist dieser Prozeß von IMSCHENEZKI nicht untersucht worden. Da die Sporenbildung bei den Cellulosebakterien stets terminal erfolgt, kann man auf diese Weise die Celluloseformen von den thermophilen Begleitbazillen unterscheiden, da deren Sporen auch an den verschiedensten anderen Stellen des Zellkörpers gebildet werden können. Die anaeroben Cellulosebakterien enthalten dagegen niemals zentral oder subterminal gelegene Sporen. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß die Bezeichnung Clostridium völlig unangebracht ist, da die Cellulosebakterien in keiner Weise mit einer Spindel vergleichbar sind. Bisweilen kann die Sporenbildung auch am Ende einer gekrümmten Zelle stattfinden, wie aus Abbildung 62 hervorgeht. In älteren Kulturen treten häufig auch Riesenformen von birnen-, keulenähnlicher oder anderer Gestalt auf (Abb. 63). Mit dem beschriebenen Entwicklungszyklus ist der Abbau der Cellulose in ganz bestimmter Weise verknüpft. So befinden sich die jungen und folglich kürzeren vegetativen Zellen meist ungeordnet auf den Cellulosefasern; nur einige sind in der Längsrichtung der Faser orientiert (vgl. Abb. 67). In älteren Kulturen ordnen sich die gestreckten, jungen plektridialen Formen mit kleinen Verdickungen am Zellende im allgemeinen längs der Faserachse oder etwas schräg dazu an. Die Zellen tauchen gewissermaßen in das Fasergewebe ein, sie dringen durch die entstehenden Schädigungen in das Faserinnere vor. Mit fortschreitender Entwicklung begegnet man immer mehr reifen Plektridien, bei denen die Verdickungen an den Zellenden bereits stärker ausgeprägt sind. Infolge der zunehmenden Verdickung, die einen längeren Aufenthalt der Zelle in der Faser aus räumlichen Gründen behindert, trifft man in diesem Stadium kaum noch sporentragende Zellen in der Faser an. Die sporenhaltigen Zellen fallen von der Faser ab und gelangen in die Flüssigkeit. Mitunter lösen sich nur di e Enden der plektridialen Formen ab, die reife Sporen besitzen. Das andere Ende der Zelle bleibt an der Faser haften. Auf diese Weise kommen sehr häufig beschriebene mikroskopische Bilder zustande, in denen Fasern wiedergegeben sind, die wie mit Keulen „gespickt" aussehen. Dabei handelt es sich um reife plektridiale sporentragende Formen, die den Zusammenhang mit der Faser noch nicht aufgegeben haben. Bis zur Bildung der Sporen wird bereits ein erheblicher Teil der Cellulose zerstört, so daß man die Sporen leicht in der Restcellulose auffinden kann. Vorstehende Ausführungen betreffen jedoch nur Kulturen in flüssigen, cellulosehaltigen Medien.

T a f e l 18 Abb. 57. Junge Zellen thermophiler Cellulosebakterien

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Abb. 58. Fadenförmige Zellen in einer Kultur thermophiler Cellulosebakterien

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Abb. 59. Zellen thermophiler Cellulosebakterien in verschiedenen Stadien der Sporenbildung

Abb. 60. Langgestreckte Zellen thermophiler Cellulosebakterien zu Beginn der Sporenbildung

Abb. 61. Anhäufung von Sporen thermophiler Cellulosebakterien

Abb. 62. Langes, gekrümmtes, thermophiles Cellulosebakterium mit Spore

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Abb. 64. Ungleichmäßige Zellteilung bei thermophilen Cellulosebakterien

T a f e l 21

Abb. 65. Zersetzung des von Bact. xylinum gebildeten Cellulosehäutchens unter streng anaeroben Bedingungen; links — Kontrollversuch; rechts — völlige Vergärung innerhalb von 72 Stunden

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

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Der Entwicklungszyklus der thermophilen Cellulosebakterien im flüssigen Medium ist grundsätzlich derselbe wie der auf einem festen Substrat. Im Gegensatz zu dem Verhalten in flüssigen Medien zeigen die Bakterien auf festen Substraten eine geringere Schwellung des einen Zellendes, die Stäbchen sind dünner, und in den Kolonien findet eine reichliche Sporenbildung statt. In diesem Zusammenhang dürfte die Angabe von MCBEE (1950) kaum zutreffen, daß in flüssigen Kulturen nur wenige Sporen gebildet werden. Nach IMSCHENEZKI entwickeln sich sogar sehr viele Sporen, die allerdings nicht in den Cellulosefasern lokalisiert sind. Zwischen der Menge an gebildeten Sporen und der Intensität der Cellulosezersetzung besteht eine lineare Abhängigkeit. Je schlechter sich die Bakterien entwickeln, desto langsamer wird die Cellulose angegriffen und desto weniger Sporen treten in der Kultur auf. Es ist demnach auch möglich, daß die von MCBEE benutzten Nährmedien qualitativ schlechter waren als die von IMSCHENEZKI verwendeten. Dadurch ließe sich die von MCBEE beobachtete Verringerung der Sporenbildung erklären. Die Zellen der thermophilen Bakterien sind in allen Entwicklungsstadien gramnegativ. Dieses Verhalten kann als ein relativ sicheres Kennzeichen für derartige Bakterien angesehen werden. Dagegen lassen sie sich durch verschiedene basische Farbstoffe (Methylenblau, Methylviolett, Fuchsin, Safranin, Hämatoxylin u. a. m.) ausgezeichnet anfärben. Sie enthalten, wie bereits erwähnt, kein Glykogen und keine Amylose, werden also durch Jod nur strohgelb gefärbt. Vom theoretischen Standpunkt aus ist die Tatsache sehr interessant, daß die Zellen der anaeroben Cellulosebakterien keine Lipoproteinkörper enthalten, die für die aeroben sporenbildenden Bakterien so charakteristisch sind. Daraufhin untersuchte IMSCHENEZKI verschiedene anaerobe Bakterien auf ihren Lipoidgehalt und fand, daß alle obligaten anaeroben Arten kein Fett enthalten. Funktionsmorphologisch besitzen also die anaeroben Bakterien ebenfalls ein spezifisches Merkmal, durch das sie sich von den aeroben Bazillen unterscheiden (IMSENECKI, 1945). Bei der Sporenbildung treten die gleichen cytologischen Veränderungen auf wie bei allen anderen sporenbildenden Bakterien. Das in jungen vegetativen Zellen vorhandene Chromatin ist vollkommen diffus verteilt. Die Konzentrierung der Kernsubstanz an einem Zellende, die zur Bildung eines kleinen chromophilen Kernes führt, ist das erste Anzeichen für den Beginn der Sporenentstehung. Die ständig größer werdenden Kerne wandeln sich in die chromophilen Prosporen um, werden zusammengedrückt und schließlich mit einer festen Membran umgeben. Wenn dieses Stadium erreicht ist, lassen sie sich nicht mehr stärker anfärben. Der schnelle Ablauf der Lebensprozesse ist für alle thermophilen Bakterien, also auch für die thermophilen Celluloseformen, charakteristisch. Somit ist es verständlich, daß man in relativ jungen Kulturen bereits alte, degenerierte Zellen antrifft. Durch die rasche Alterung wird der Zellinhalt körnig, und in den Zellen findet man mehrere große, dunkelgefärbte Kerne. Ein derartiges Verhalten des Protoplasmas ist für die aus älteren Kulturen stammenden Zellen der thermophilen Bakterien sehr kennzeichnend. Unter dem Einfluß der eigenen Stoffwechselprodukte, d. h. bei langanhaltender Selbstvergiftung,

182

II. Anaerobe Cellulosebakterien

die für Laboratoriumskulturen typisch ist, entstehen in den Kulturen der thermophilen Bakterien häufig Involutionsformen. Es handelt sich um birnenförmige oder kugelige, glänzend anfärbbare Zellgebilde, die entfernt an Amöben erinnern. In der Abbildung 63 sind einige Involutions- oder Kiesenzellen dargestellt, wie sie in den Kulturen der Cellulosebakterien vorkommen. Bei der Kultivierung auf festen Medien gelingt es bisweilen, eine unter den Bakterien weitverbreitete und als „ungleichmäßige Teilung" (IMSCHENEZKI, 1939, 1940) bezeichnete Erscheinung zu beobachten. Die Zellen teilen sich in zwei verschieden große Tochterzellen, wobei die Scheidewand in unmittelbarer Nähe des einen der beiden Zellenden entsteht. Es bilden sich also durch Abschnürung kleine kugelige Zellen von kokkenähnlichem Aussehen. Zur Veranschaulichung dieser Verhältnisse dient die Abbildung 64. Derartige kokkenförmige Gebilde, die in Kulturen der Cellulosebakterien vorkommen, sind also keine Verunreinigungen durch irgendwelche Fremdbakterien. a) K u l t i v i e r u n g s m e r k m a l e a) Das Wachstum in flüssigen Medien Die Entwicklung der thermophilen Bakterien in cellulosehaltigen Medien ist mit sehr charakteristischen Veränderungen des Milieus verbunden. Impft man ein flüssiges Medium mit jungen, drei bis vier Tage alten Kulturen, so setzt die Gärung nach etwa 24 Stunden ein. Vom Boden des Gefäßes beginnen dann Bläschen aufzusteigen, die Gasentwicklung verstärkt sich im Laufe der Zeit, das Papier wird schlaff, leicht schleimig und allmählich gelb. Am dritten Tage entsteht auf der Flüssigkeitsoberfläche ein Schaum, der noch unvergorene Cellulosereste enthält. Verläuft die Gärung normal, so färben sich die Filtrierpapierstückchen mit zunehmender Zerstörung eigelb oder orange. Ist keine Verfärbung des Papiers zu beobachten, so findet gewöhnlich auch nur eine langsame Gärung statt. Fast ebenso verhalten sich Kulturen in Reagenzgläsern. In diesem Falle jedoch schwimmen die Cellulosereste wegen der hohen Flüssigkeitsschicht selten an der Oberfläche. Gewöhnlich verbleiben sie dann am Boden und werden durch das Bakterienpigment gefärbt. Nach vier bis fünf Tagen kommt die Gärung fast zum Erliegen. Am Boden des Gefäßes sammelt sich ein geringer, lockerer, orangegelber Niederschlag an, der aus Bakterienzellen und unzerstörten Celluloseresten besteht. In evakuierten Reagenzgläsern verläuft die Gärung schneller, wobei sich der Boden mit einer dünnen Schicht des gelben Niederschlages bedeckt. Ganz ausgezeichnet vergären die thermophilen Bakterien Cellulose, die von Bakterien synthetisiert worden ist. Abbildung 65 zeigt die Vergärung mehrerer, von Bact. xylinum gebildeter Cellulosefolien. Bei der mikroskopischen Untersuchung eines derartigen Präparates sind sowohl die Zellen der Essigsäurebakterien als auch die typischen plektridialen Formen der anaeroben Cellulosebakterien sichtbar (Abb. 66). Zerstörtes Filtrierpapier enthält in den ersten Zersetzungsphasen auf der Faseroberfläche nur die stäbchenartigen vegetativen Zellen der thermophilen Bakterien

T a f e l 22

Abb. 66. Reife plektridiale Formen thermophiler Cellulosebakterien auf einem von Baet. xylinum synthetisierten Cellulosehäutchen

T a f e l 23

Abb. 67. Thermophile Cellulosebakterien auf Fasern

T a f e l 24

Abb. 68. Ersatz einer Faser durch ein Geflecht thermophiler Cellulosebakterien

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

183

(Abb. 67). Erst später treten plektridiale Formen mit Sporen auf. Bisweilen erfolgt die Vermehrung der Bakterien derart intensiv, daß die Cellulosefasern völlig verschwinden und gewissermaßen durch ein aus Bakterienzellen bestehendes Geflecht ersetzt werden (Abb. 68). In flüssigen, glucosehaltigen Medien wird das Monosaccharid von den Cellulosebakterien unter Gasbildung vergoren. Im Gegensatz zu den cellulosehaltigen Medien sind die Bakterienzellen in diesem Falle auch innerhalb der Kulturflüssigkeit selbst nachweisbar. Besonders intensiv verläuft die Gärung in evakuierten Reagenzgläsern. Der von der Gasentstehung herrührende Überdruck wird dadurch beseitigt, daß man von Zeit zu Zeit das Röhrchen öffnet und dann wieder zuschmilzt. ß) Das Wachstum auf festen Medien Kultiviert man Cellulosebakterien auf Cellulose-Agar in Röhrchen, so wird ebenfalls die im Agar enthaltene Cellulose vergoren. Mit zunehmender Gasentwicklung entstehen zunächst Blasen und Sprünge im Agar. Hat sich genügend Gas angesammelt, so zerreißt die Säule, wie aus der Abbildung 69 hervorgeht. Ähnlich entwickeln sich die Cellulosebakterien auch auf Cellulose-Agar in PASTEUR-Pipetten oder VlGNAL-VEYONRöhrchen. Entnimmt man aus der Mitte einer derartigen Agar-Säule mit Hilfe einer Rasierklinge eine dünne Folie, so kann man im Mikroskop längs der Cellulosefasern ein Geflecht aus Cellulosebakterien erkennen. IMSCHENEZKI und Mitarbeiter benutzten z. T. Cellulose-Agar, dessen Celluloseanteil aus zerriebenem Filtrierpapier bestand. Bei Verwendung dieses Mediums ließen sich im Innern des Agars keine individuellen Kolonien nachweisen. Die Bakterien siedelten sich stets nur auf den Cellulosefasern an, und ihre Vermehrung fand auch nur in diesen Bereichen statt. In einem Nährboden, der Agar und regenerierte Cellulose enthielt, stellte

Abb. 69. Kultur thermophiler Cellulosebakterien in Cellulose-Agar. Das Medium ist durch die bei der Gärung entstehenden Gase zerrissen

184

II. Anaerobe Cellulosebakterien

MCBEE das Auftreten wurmförmiger, weißlicher Kolonien mit ebenen, glatten Konturen fest; die Kolonien erreichen einen Durchmesser von 1 bis 2, in älteren Kulturen sogar von 5 mm. In der Umgebung derartiger Kolonien befinden sich durchsichtige Zonen, die ihre Entstehung anscheinend einer Hydrolyse der Cellulose verdanken.

Abb. 70. Aus vegetativen Zellen und einigen reifen Sporen bestehende Mikrokolonie thermophiler Cellulosebakterien im Innern von Cellulose-Agar

Impft man Fleischbrühe-Pepton-Agar, Most-Agar, Kartoffel-Agar u. a. mit Reinkulturen der Cellulosebakterien, so findet kein Wachstum statt. Wie IMSCHENEZKI bereits früher bemerkte, stellen die anaeroben thermophilen Bakterien besondere Anforderungen an die Zusammensetzung der Nährmedien. Insbesondere wurde gefunden, daß ihre Entwicklung durch Stoffwechselprodukte anderer Bakterien stimuliert wird. In diesem Zusammenhang sind Versuche zur Kultivierung thermophiler Bakterien auf Medien mit Stoffwechselprodukten der in Mischkulturen vorkommenden Begleitbakterien angestellt worden. Zu diesem Zweck wurden Filtrate der Mischkulturen einem Fleischbrühe-Pepton-Agar zugesetzt. Eine Beimpfung derartiger Medien mit Reinkulturen führte in jedem Falle zur Bildung von Kolonien.

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien Diese Kolonien waren sehr klein, ihr Durchmesser schwankte zwischen 30 und 250 ¡X. Sie bestanden aus Ansammlungen von Stäbchen und freien Sporen (Abb. 70). Größere Kolonien konnten in derartigen Medien nicht beobachtet werden. Längere Zeit hindurch war es nicht möglich, auf der Oberfläche fester Medien Kolonien zu erhalten. Auch mit einem Zusatz von Fäkalienextrakt, Stärke, Hefeautolysat, organischem Stickstoff und Vitaminen konnte kein Wachstum erzielt werden. Später jedoch gelang IMSCHENEZKI die Kultivierung auf einem festen Medium folgender Zusammensetzung: gleiche Teile des Nährmediums V und einer Kartoffelabkochung wurden mit 2 % Agar-Agar versetzt. Dieses Substrat wurde in Petrischalen ausgegossen und mit jungen Kultuten beimpft, die in Reagenzgläsern auf einer cellulosehaltigen Nähtlösung gezüchtet waren. Die Schalen wurden sofort in einem Metallexsikkator sorgfältig evakuiert. Die thermophilen Bakterien entwickeln sich rasch, und man kann deshalb bereits 24 Stunden nach dem Beimpfen das Auftreten von Kolonien an der Oberfläche des Mediums beobachten. Die Kolonien sind klein, Abb. 71. Kolonien thermophiler Cellulosegewölbt, glänzend und durchsichtig; bakterien auf Kartoffel-Agar sie ähneln kleinen Tröpfchen (Abb. 71). Die Untersuchung der Kolonien gestaltete sich folgendermaßen: Zunächst wurden sie 5 min lang der Einwirkung von Formalindämpfen ausgesetzt und danach mit schwacher Fuchsinlösung übergössen, wobei sie sich rot färbten. Nach dieser Fixierung konnten sie leicht als Ganzes von der Oberfläche des Agars abgehoben werden. Durch Einbetten in Kanadabalsam erhielt man schließlich beständige Präparate. Die Kolonien, deren Ränder gezackt sind, bestehen aus einem Geflecht von Zellen mit vielen plektridialen sporentragenden Formen. Als Beispiel möge die in der Abbildung 72 A b b 7 2 K o I o n i e t h e r m o p h i l e r Cellulosewiedergegebene Kolonie dienen. bakterien

186

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Größere Kolonien konnten bisher in keinem Falle erhalten werden. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß bei noch besserer Zusammensetzung des Mediums größere isolierte Oberflächenkolonien gebildet werden. Erst durch weitere Forschungen über den Vitaminbedarf dieser Mikroben wird es möglich sein, ein wissenschaftlich begründetes Substrat herzustellen, das den thermophilen Bakterien ein optimales Wachstum unter anaeroben Verhältnissen erlaubt.

2. Physiologie a) K o h l e n h y d r a t b e d a r f Naturgemäß kann den Angaben über die Vergärung verschiedener Kohlenhydrate durch Mischkulturen kein wissenschaftlicher Wert beigemessen werden, da in diesen Fällen je nach der Art der Begleitbakterien auch die Art der vergorenen Kohlenhydrate eine andere ist. IMSCHENEZKI fand, daß Cellulose in verschiedener Form und cellulosehaltige Materialien von Reinkulturen thermophiler Bakterien ausgezeichnet vergoren werden. Jedoch werden nicht alle Cellulosematerialien und Cellulosederivate mit der gleichen Leichtigkeit und Schnelligkeit angegriffen. Am raschesten zerstört werden Filtrier- und Zigarettenpapier, Watte, Karton, Pergament, Baumwolle, Bastfasern (Flachs, Hanf usw.), Nadelholzzellstoff, Leinen- und Baumwollgewebe. Nach dreibis viertägiger Kultivierungsdauer ist von den genannten Stoffen nur noch eine amorphe Masse übrig; während der Zersetzung reichert sich im Medium Glucose an. Cellophanstückchen wurden in Kulturen thermophiler Cellulosebakterien nicht zerstört, sie behielten ihre ursprüngliche Form bei; desgleichen erfolgte keine sichtbare Gasentwicklung. Auf Grund dieser Beobachtung nahm TOMODA (1932) an, daß Cellophan überhaupt nicht vergoren wird. Dies dürfte jedoch nicht ganz zutreffen, da nach der Kultivierung auf den Cellophanstückchen, wie IMSCHENEZKI fand, gelbe Flecken, Schädigungen und Vertiefungen sichtbar sind, in denen sich Cellulosebakterien nachweisen lassen. Ein weiterer Beweis für die Fähigkeit der Bakterien, sich auf Cellophan zu entwickeln, ist die Anwesenheit von reduzierenden Substanzen in der Kulturflüssigkeit. Zwischen der Zersetzung des Cellophans und dem Abbau anderer Cellulosepräparate besteht also lediglich ein allerdings sehr großer quantitativer Unterschied. Da sich die aeroben Cellulosebakterien auf den gleichen Cellophanproben ausgezeichnet entwickeln, können für das langsame Wachstum der anaeroben Bakterien keinerlei giftige Bestandteile des Cellophans verantwortlich gemacht werden. Außer den obengenannten Stoffen werden noch verschiedene andere, cellulosehaltige Pflanzenmaterialien (Rübenpreßrückstände, Roggen- und Weizenstroh, Heu, Maisstrünke usw.) von den thermophilen Bakterien vergoren. Dagegen sind einige Cellulosederivate, insbesondere die Celluloseester (Nitrat, Acetat) nicht angreifbar. Zur Prüfung der Vergärbarkeit verschiedener Kohlenhydrate durch die thermophilen Cellulosebakterien wurden entsprechende Versuche mit dem Medium VL unter Zusatz der Kohlenhydrate durchgeführt. Die dabei erhaltenen Resultate sind in der Tabelle 15 zusammengestellt.

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

187

T a b e l l e 15

Kohlenhydrat

Glucose . . Lävulose . Mannose . Galactose . Raffinose . Maltose . . Saccharose

. . . . . . .

. . . . . . .

+ —

— — —

+ +

PH am Anfang

am Ende

7,6 7,2 7,6 7,5 7,5 7,6 7,6

7,0 7,2 7,6 7,5 7,5 7,0 7,2

Gärung

Gärung

Die Vergärung von Kohlenhydraten durch Beinkulturen thermophiler Cellulosebakterien

Kohlenhydrat

Lactose . Xylose . Arabinose Dextrin . Stärke . Glycogen Inulin .

. . . . . . .

. . . . . . .

. . . . . . .

— — — —

PH am Anfang

am Ende

7,4 7,0 7,2 7,4 7,3 7,5 7,3

7,4 7,0 7,2 7,4 7,3 7,5 7,3

"Wie aus der Tabelle ersichtlich, ist, werden Glucose, Maltose und Saccharose vergoren ; dagegen findet keine Zersetzung der anderen Mono-, Di- und Polysaccharide statt. Eine Gärung der Glucose war durchaus zu erwarten, da ein anderer Weg zur Verwertung der Cellulose als der über die bei der Hydrolyse gebildete Glucose nicht g u t d e n k b a r i s t . I n diesem Z u s a m m e n h a n g erscheinen die v o n M C B E E (1950) er-

haltenen Resultate sehr zweifelhaft. Nach MCBEE sollen die thermophilen Bakterien viele Kohlenhydrate vergären, nicht aber die Glucose. Offenbar beruht diese Behauptung auf einem Irrtum. Theoretisch ist es nicht vorstellbar, daß es thermophile Cellulosebakterien geben soll, die nicht in der Lage sind, die Hydrolysenprodukte der Cellulose zu vergären. Dagegen besaßen alle von IMSCHENEZKI untersuchten Kulturen die Fähigkeit zur Vergärung der Glucose. Es muß deshalb angenommen werden, daß die von MCBEE erhaltenen negativen Ergebnisse dadurch zustande kamen, daß ein in seiner Zusammensetzung minderwertigeres Medium verwendet wurde. Der Autor benutzte nämlich Medien mit mineralischem Stickstoff, die ferner wahrscheinlich zu geringe Mengen an Vitaminen oder zu wenig Hefewasser enthielten. Die Angaben iMSCHENEZKls über die Vergärung der Glucose durch thermophile Cellulosebakterien wurden von SoETERS (1936) ebenfalls bestätigt. Letzterer weist jedoch auf ein nicht unwesentliches Detail in der Sterilisiermethodik hin. Wenn nämlich Nährlösung und Glucoselösung getrennt sterilisiert und danach erst zusammengegeben werden, wird die Glucose durch die thermophilen Bakterien nicht vergoren. Enthält die Nährlösung andererseits bereits vor der Sterilisation Glucose und Fäkalienextrakt, so findet eine Gärung statt. Eine Erklärung für diese Erscheinung wird von dem Autor nicht gegeben. Betrachtet man aber ähnliche Untersuchungen mit aeroben Cellulosebakterien, so kann man annehmen, daß bei der St3rilisation einer glucosehaltigen Nährlösung keine Karamelisierung der Glucose oder die Bildung irgendwelcher, für die Cellulosebakterien schädlichen Produkte stattfindet. In den Versuchen IMSCHENEZKls wurde die Glucose stets vergoren, ein Ausbleiben der Gärung konnte nie beobachtet werden. Da die Sterilisation immer nach dem Glucosezusatz zum Nährmedium erfolgte, bestehen zwischen diesen Beobachtungen und den SOETERSschen Versuchen keine unmittelbaren Beziehungen.

I I . Anaerobe Cellulosebakterien

188

b) S t i c k s t o f f e r n ä h r u n g Zur Prüfung der thermophilen Cellulosebakterien auf ihre Fälligkeit zur Assimilation verschiedener Stickstoffverbindungen wurden Kulturen in Medium V ohne Natriumammoniumphosphat und Pepton angelegt, dem man die jeweiligen Stickstoffverbindungen zusetzte. Der Gehalt an Calciumcarbonat und Cellulose war der übliche. Als Impfmaterial dienten halbzerstörte Cellulosestückchen aus Kulturen, die in dem Medium VL gewachsen waren. Die Kultivierung erfolgte in evakuierten Reagenzgläsern. Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 16 zusammengestellt.

T a b e l l e 16 Die Entwicklung thermophiler Cellulosebakterien in Gegenwart verschiedener Stickstoffquellen

Stickstoffverbindung

Natriumnilrat Ammoniumphosphat(tert.) Glykokoll Alanin Leucin Asparagin Histidin Arginin Harnstoff Pepton Eialbumin Globulin Edestin Casein zehnprozentige Kartoffelabkochung. . . zehnprozentiger Fäkalienextrakt . . . zehnprozentiger Pferdemistextrakt Leber-, Nieren- oder Gehirnproben . . . . Fleischbrühe mit Pepton Fleischbrühe mit Pepton und 1% Asparagin Zeichenerklärung:

Menge in Prozent 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0

Gärung der Cellulose nach Tagen 1

2

3

Bemerkungen

4

5

— —

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

— —

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

+

+

+

+

—

—

—

—

—

—

—

—

— '

—

—

+

+

50,0

+

+

++

25,0

+ +++ +++ ++ +

25,0

—

+

+

—

+

++ + ++ +

+ +++ +++ ++

'

schwache Cellulosezersetzung Gärung am vierten Tag beendet Gärung am vierten Tag beendet

25,0

—

—

—

—

—

25,0

—

+

+

+

+

+ schwache Gärung + + normale Gärung + + + starke Gärung — keine Gärung

schwache Cellulosezersetzung

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

189

Aus den Angaben lassen sich folgende Schlüsse ziehen: 1. In Medien mit mineralischem Stickstoff, Aminosäuren oder Pepton zeigen die Bakterien keine Entwicklung. Ebenfalls sehr schwach ist das Wachstum bei Anwesenheit von Albumin und Casein. 2. Eine intensive Gärung der Cellulose setzt dann ein, wenn man dem Medium komplizierte Stickstoffverbindungen bzw. -komplexe zusetzt, wie sie z. B. im Fäkalienextrakt oder in Teilen tierischer Organe vorkommen. Die stürmische Gärung, die nach Zugabe von Fleischbrühe-Pepton, Fäkalienextrakt oder tierischen Organteilen beobachtet wird, beruht auf der Zufuhr der erforderlichen Stickstoffverbindungen. Diese Umstände deuten darauf hin, daß eine Vergärung der Cellulose nur bei Anwesenheit von organisch gebundenem Stickstoff möglich ist. Einen sehr günstigen Einfluß auf die Vermehrung der Bakterien scheint auch ein Komplex von Aminosäuren zu besitzen, wie er bei der Hydrolyse des Eiweißes entsteht; dafür spricht die gute Wirksamkeit von Hefeautolysaten. In diesem Zusammenhang ist ferner zu bemerken, daß die Gärung bei Anwesenheit von Fäkalienextrakt wesentlich energischer stattfindet als bei Zusatz eines Extraktes aus dem Darminhalt der Pferde, der für die thermophilen Bakterien ein natürliches Nährsubstrat darstellt. Diese Tatsache kann wahrscheinlich mit dem höheren Stickstoffgehalt des Fäkalienextraktes erklärt werden. Die Fähigkeit der thermophilen Cellulosebakterien, bei einer Symbiose mit anderen Bakterien auch in Medien zu wachsen, die nur anorganischen Stickstoff enthalten, ist ebenfalls ein Beweis dafür, daß die Stoffwechselprodukte der Symbionten den Celluloseformen als Stickstoffquelle dienen können. Im Verlaufe der Entwicklung auf eiweißhaltigen Medien (z. B. Fleischbrühe mit Cellulose) bilden die thermophilen Bakterien weder Ammoniak noch Schwefelwasserstoff. Desgleichen tritt auch keine Exoprotease in Erscheinung. Cellulosehaltige Gelatine wird nicht verflüssigt, und Nitrate werden nicht reduziert. Auf das Fehlen einer Nitratreduktion hat bereits MCBEE hingewiesen. c) V i t a m i n b e d a r f Die Verwertung der verschiedenen Formen des Stickstoffs durch die Bakterien hängt eng mit dem Einfluß der Vitamine auf das Bakterienwachstum zusammen. Die angeführten Versuche über den Stickstoffbedarf der thermophilen Cellulosebakterien sind in den Jahren 1937 bis 1939 durchgeführt worden, zu einer Zeit also, als über die Rolle der Vitamine bei der Ernährung der Mikroben noch wenig bekannt war. Da die Entwicklung der thermophilen Bakterien bei Zugabe verschiedener Extrakte besonders intensiv erfolgt, liegt die Vermutung nahe, daß auf diese Weise den Bakterien verschiedene zusätzliche Ernährungselemente geboten werden. IMSCHENEZKI und Mitarbeiter nahmen damals an, daß der Wert der Extrakte nicht nur auf dem Stickstoffgehalt als solchem beruht, sondern auch auf der Anwesenheit fertiger Vitamine und anderer komplizierter Stickstoffverbindungen. In den Arbeiten der letzten zwölf Jahre konnte gezeigt werden, daß viele Mikroorganismen, die vordem den Eiweißverwertern zugerechnet wurden, auch in der Lage

190

II. Anaerobe Cellulosebakterien

sind, inMedien mit anorganischem Stickstoff (Ammoniumsalze) zu gedeihen, allerdings nur bei Zugabe verschiedener Vitamine. Dies betrifft sowohl aerobe als auch anaerobe Mikroben, darunter verschiedene Gärungserreger. MCBEE führte seine Untersuchungen über die Ernährungsphysiologie der thermophilen Cellulosebakterien wesentlich später durch, ihm standen also bereits die verschiedensten Vitaminpräparate zur Verfügung. Nach seinen Angaben entwickeln sich die thermophilen Cellulosebakterien ausgezeichnet in cellulosehaltigen Medien, die in 10 ml Nährlösung folgende Vitaminmengen enthalten: 2 y Aneurinhydrochlorid, 2 y ßiboflavin, 2 y Calciumpanthotenat, 2 y Adermin und 0,02 y Biotin. Fehlt auch nur eines dieser Vitamine, so ist eine Entwicklung der Mikroben nicht mehr möglich. Die Wachstumsgeschwindigkeit war in diesem Substrat die gleiche wie die in einer mineralischen Nährlösung mit 0,05% Hefeextrakt. Nach MCBEE wird Cellulose in Mengen bis zu 0,1%, bezogen auf das Medium, in 24 bis 36 Stunden vollständig vergoren. Zusätze größerer Mengen an Hefeextrakt, Serum, Pflanzenpreßsaft oder Extrakten aus Bodenproben oder Dung zeigen keine stimulierenden Wirkungen auf das Bakterienwachstum. In Medien, die keinerlei Zusätze enthalten, hört das Wachstum nach zwei bis drei Passagen auf. Zur Prüfung des Einflusses, den eine bestimmte Menge des Zusatzes auf die Gärung der Cellulose ausübt, stellte IMSCHENEZKI Versuche an, in denen die Nährlösungen bezüglich des Stimulans verschieden stark konzentriert waren. Dabei zeigte sich, daß kleinere Mengen an Hefeautolysaten oder Hefewasser keine stimulierende Wirkung besitzen. Erst bei höheren Konzentrationen war eine Vergärung der Cellulose durch die anaeroben Bakterien zu erkennen. In den Extrakten sind also entweder nicht alle Vitamine vorhanden, odeT die Vitaminmengen sind derart gering, daß für eine sichtbare stimulierende Wirkung erheblich mehr Hefeautolysat erforderlich ist. Andererseits wäre es noch denkbar, daß für eine normale Entwicklung der Mikroben neben den Vitaminen auch einige Aminosäuren oder deren Derivate benötigt werden. Gegen diese Vermutung sprechen allerdings die Angaben von MCBEE, nach denen die thermophilen Cellulosebakterien bei Anwesenheit von Vitaminen in Medien wachsen können, die als einzige Stickstoffquelle Ammoniumsalze enthalten. Eine endgültige Aussage über dieses Problem ist jedoch noch nicht möglich, da einige der von MCBEE festgestellten physiologischen Eigenschaften derart ungewöhnlich sind, daß man an der Eignung seiner Nährmedien für Zwecke der Kultivierung anaerober Bakterien zweifeln kann. Es sei an dieser Stelle nochmals darauf hingewiesen, daß keine seiner Kulturen in der Lage war, Glucose zu vergären. Diese Beobachtung ist um so merkwürdiger, als eine Vergärung der Cellulose ohne vorherige Hydrolyse höchst unwahrscheinlich ist. Im Gegensatz zu IMSCHENEZKI und auch zu KHOUVINE (1923, 1934) fand MCBEE ferner unter den Gärungsprodukten keine Buttersäure. Als besonders schwerwiegend ist schließlich der Umstand anzusehen, daß MCBEE in den Kulturflüssigkeiten niemals die Ansammlung reduzierender Substanzen festgestellt hat, während IMSCHENEZKI stets größere Zuckermengen nachweisen konnte.

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

191

Somit ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß, daß die thermophilen Bakterien zu ihrem Wachstum nicht nur eine Reihe von Vitaminen, sondern auch mehrere Aminosäuren benötigen, wie sie in den verschiedensten Extrakten oder Hydrolysaten vorkommen. Eine intensive Entwicklung findet anscheinend nur dann statt, wenn neben den Vitaminen auch anderer organisch gebundener Stickstoff vorhanden ist. Naturgemäß kann eine endgültige Beantwortung der Frage nach dem Stickstoffbedarf erst dann erfolgen, wenn die Ernährungsphysiologie dieser Gruppe von Mikroorganismen eingehender erforscht ist. Nach wie vor ist ferner das Problem von großem Interesse, welche Wirkstoffe die thermophilen Cellulosebakterien benötigen. So fand z. B. IsiMARU (1954) anläßlich von Untersuchungen über den Einfluß von verschiedenen Extrakten aus natürlichen Materialien, von Vitaminen und Wuchsstoffen auf die thermophilen Cellulosebakterien die größte Wirksamkeit bei einem Extrakt aus Buchweizen (Fagopyrum vulgare), sowie bei Rutin und Vitamin P. Bezüglich der anderen physiologischen Eigenschaften sei an dieser Stelle lediglich bemerkt, daß IMSCHENEZKI und Mitarbeiter niemals eine Reduktion der Sulfate beobachten konnten. Tritt also Schwefelwasserstoff auf, so kann er nur durch Begleitbakterien gebildet worden sein. MCBEE weist ebenfalls auf das Pehlen dieser Erscheinung hin. Nach seinen Angaben findet auch keine Bildung von Acetylmethyl-Carbinol statt. 3. Der Einfluß äußerer Faktoren a) T e m p e r a t u r Auf Grund langjähriger Erfahrungen lassen sich die thermophilen Bakterien hinsichtlich ihres Temperaturverhaltens in zwei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe bilden die stenothermen Bakterien, die sich nur bei höheren Temperaturen entwickeln, bei niedrigeren (30 bis 37° C) dagegen keine Vermehrung zeigen. Zur zweiten Gruppe gehören die ävrithermen Bakterien, die sich sowohl bei höheren als auch bei niederen Temperaturen vermehren (IMSCHENEZKI, 1944). Diese Unterteilung lehnt sich an die bereits seit längerem in der Hydrobiologie bei Wasserpflanzen und Tieren eingeführte Terminologie an. Über die Zweckmäßigkeit der Einteilung bestehen keine Zweifel, in jüngster Zeit ist sie auch von anderen Autoren übernommen worden ( G Ä U G H R A N , 1 9 4 7 ) . Die thermophilen Cellulosebakterien gehören alle der ersten Gruppe, den stenothermen Bakterien, an. Nach Beobachtungen iMSCHENEZKls vermehren sie sich bei 33° C nicht mehr] Optimales Wachstum zeigen sie bei etwa 60 bis 65° C, während bei 80° C wieder keine Entwicklung mehr stattfindet. Kultiviert man zuvor auf 65° C gehaltene Bakterien bei Zimmertemperatur, so läßt sich ein rasches Absinken der Intensität der Cellulosegärung beobachten. Enthält eine derartige Kultur noch unzersetzte Cellulose, so kann man die Gärung durch Erwärmen auf 60° C erneut in Gang bringen, unabhängig von der Einwirkungsdauer der Zimmertemperatur. Auf

192

II. Anaerobe Cellulosebakterien

diese Weise lassen sich Kulturen verschiedenen Alters herstellen, wie sie zur Erforschung der verschiedenen Entwicklungsstadien benötigt werden. MCBEE gibt als Temperaturoptimum 60 bis 68° C an. Bei dieser Temperatur soll im Laufe der Zeit eine gewisse Inaktivierung der Cellulase erfolgen. Andererseits soll nach zehnmonatigem Stehen auch bei 30° C eine geringe Abnahme der Cellulosemenge zu verzeichnen sein. Für diese Beobachtung gibt es zwei Erklärungsmöglichkeiten. Entweder reagiert die Cellulase sehr langsam, was bei niedrigen Temperaturen durchaus im Bereich des möglichen liegt, oder die Entwicklungsgeschwindigkeit der Bakterien selbst ist außerordentlich gering. Aus der Literatur (HANSEN, 1933) sind Beispiele dafür bekannt, daß einige thermophile celluloseinaktive Bakterien in der Lage sind, sich bei relativ niedrigen Temperaturen langsam zu vermehren. Diese Beobachtung kann jedoch nichts an der Tatsache ändern, daß die Cellulosebakterien zu den echten thermophilen Organismen gehören. (Vergleiche a b e r EOTMISTROW.)

IMSCHENEZKI und Mitarbeiter stellten ferner Untersuchungen über die Beständigkeit der Cellulosebakteriensporen bei höheren Temperaturen an. Zu diesem Zweck wurden Kulturen in Reagenzgläsern verschieden lange in einem Heizbad, das aus gesättigter Kaliümcarbonatlösung bestand, einer Temperatur, von 115° C ausgesetzt. Anschließend an dieErhitzung wurde das Material in frischesMedium (VL) übertragen. Die Gläser mit den neuen Kulturen wurden wie üblich mit der Ölpumpe evakuiert. Aus den Versuchen geht hervor, daß die Sporen der thermophilen Cellulosebakterien außerordentlich beständig sind; sie vertragen ohne weiteres ein 10- bis 12minütiges Erhitzen auf 115° C. Erst nach löminütiger Hitzeeinwirkung gehen sie zugrunde. Die Sporen der mesophilen Cellulosebakterien sind erheblich weniger resistent. So werden z. B. nach OMELJANSKI die Sporen der celluloseaktiven Wasserstoffbakterien bereits nach 10 min bei 100° C abgetötet. b) D i e A c i d i t ä t des Mediums Zur Neutralisation der bei der Cellulosegärung entstehenden Säuren versetzt man bekanntlich das Medium mit Calcium- oder Ammoniumcarbonat oder mit anderen Salzen. In diesem Zusammenhang ist nun die Frage aufgetaucht, ob eine Gärung der Cellulose auch ohne derartige Zusätze möglich ist. Tatsächlich konnte in einem Versuch mit dem Medium VL ohne Calciumcarbonat eine Gärung der Cellulose beobachtet werden. Naturgemäß beeinflußt das Fehlen des Calciumcarbonats die Menge der bei der Gärung entstehenden Gase. Über die Änderungen der p H -Werte des Mediums informiert die Tabelle 17. Demnach hemmt also die gebildete Säure die Entwicklung der Bakterien. Ohne Zusatz eines Neutralisationsmittels setzt die Cellulosegärung später ein, verläuft langsamer, und die Cellulose verwandelt sich nicht in eine amorphe Masse. Bereits aus diesen Angaben geht hervor, daß die thermophilen Cellulosebakterien gegenüber Säuren recht empfindlich sind. Zur Abgrenzung des p H -Bereiches, in dem die Entwicklung der Reinkulturen möglich ist, wurden Versuche mit dem Medium VL durchgeführt, das an Stelle des

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

193

Calciumcarbonats verschiedene Mengen an zehnprozentiger Kalilauge oder zehnprozentiger Salzsäure enthielt. Die dabei gewonnenen Eesultate sind aus der Tabelle 18 zu entnehmen. Tabellen Änderungen des pn-Wertes bei der Cellulosegärung in Medium VL ohne CaC03 (pH 7,4) und mit 2 % CaCOs (pH 7,4) Gärung der Cellulose PH-Wert

Tage

Versuchsnummer 1

2

dés Mediums 4

3

5

6

+ + + + +

+ + + + +

8

10

+ + + +

+ + + +

erste Versuchsreihe 1 2 2 4 5

—

—

—

—

—

—

— —

—

+

+ + + + +

—

-

+

6,2 6,3 6,2 6,2 6,4

zweite Versuchsreihe 2 1 2 3 4 mit 2 % CaC03

4

—

—

—

— — —

•

++

6

5

+ + + + +++

.

+

+ + + +++

Gärung beendet

6,2 6,1 6,1 6,0 7,0

T a b e l l e 18 Einfluß des p H -Wertes auf die Entwicklung der thermophilen Cellulosebakterien Gärung der Cellulose p H -Wert des Mediums

Zeichenerklärung für Tab. 17 u. 18: 13

Imschenezki, Mikrobiologie

2

3

4

5

1 1 1+ + + + 1 1 I I 1

6,2 6,4 6,6 7,2 7,4 7.6 7,8 8,0 8,2 8,4 9,1 9.7

Tage

+ +++ +++ ++ + + + + +

+ + ++ +++ ++ ++ + + + +

+ + + ++ ++ + + + +

+ schwache Gärung + + normale Gärung

+ + + starke Gärung — keine Gärung

194

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Kurz zusammengefaßt ergibt sich folgendes Bild: 1. Der optimale p H -Bereich für die Vermehrung der anaeroben Cellulosebakterien liegt zwischen 7,4 und 7,6. 2. Die isolierten Bakterien sind acidophob; bei einem pn-Wert von 6,2 bis 6,6 entwickeln sie sich nicht mehr. 3. Die Gärung der Cellulose ist noch in einem stark alkalischen Bereich (pn 9,7) möglich. MCBEE fand in seinen Untersuchungen etwas andere Werte. So konnte er.noch zwischen p H 6,4 und 7,4 eine Gärung beobachten. Oberhalb pn 7,6 und unterhalb PH 6 fand kein Wachstum mehr statt. Nach MCBEE besitzen calciumcarbonathaltige Medien einen etwas höheren p H -Wert, als er für die Entwicklung der Cellulosebakterien erforderlich ist. Die geringfügigen Abweichungen zwischen den Ergebnissen von MCBEE und IMSCHENEZKI lassen sich durch die unterschiedliche Zusammensetzung der benutzten Nährmedien erklären. Das Verhalten gegenüber dem p H -Wert hängt anscheinend mit der Ökologie dieser Mikroorganismen zusammen. Am häufigsten findet man sie nämlich in warmen Dunghaufen, in denen viel Ammoniak gebildet wird, oder sie treten in anderen Anhäufungen organischer Materie auf. Infolge der Anpassung an eine alkalische Reaktion sind somit Formen entstanden, die sich nur bei relativ hohen p H -Weiten entwickeln können. Unter gewöhnlichen Kultivierungsbedingungen, d. h. in calciumcarbonathaltigem Medium VL mit einem p H -Wert von 7,4, ist während der Gärung ein leichtes Absinken des pn-Wertes zu beobachten. Die Beziehungen zwischen dem pH-Wert und dem Alter der Kulturen sind in der Tabelle 19 enthalten. T a b e l l e 19 Änderung des p H -Wertes von Kulturen thermophiler Cellulosebakterien mit zunehmendem Alter (Medium VL mit CaC03) Alter der Kultur in Tagen

PH

9

6,8

11

6,9

13 18

7,0 6,8

20

6,8

38

6,8

61

7,2

Zusammenfassend kann man feststellen, daß in neutralen und alkalischen Medien eine gute Entwicklung der thermophilen Cellulosebakterien möglich ist, während in sauren Medien kein Wachstum stattfindet. c) D a s V e r h a l t e n g e g e n ü b e r S a u e r s t o f f Die thermophilen Cellulosebakterien gehören zu den obligaten anaeroben Mikroorganismen. Eine Vermehrung findet sogar dann nicht statt, wenn man die Kulti-

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

195

vierung in Reagenzgläsern durchführt, die mit Nährmedium relativ hoch gefällt sind. Dies bedeutet, daß für die Cellulosebakterien stärker anaerobe Bedingungen notwendig sind als z. B. für Bac. amylobacter oder Granulobacter pectinovorum, die in der beschriebenen Weise kultiviert werden können. Somit besteht kein Zweifel darüber, daß für die Entwicklung der thermophilen Cellulosebakterien eine strenge Anaerobiose erforderlich ist. Auch in Kolben kultivierte Bakterien, deren Nährmedium mit einer ausreichenden Schicht von Yaselinöl bedeckt ist, bewirken keine Gärung der Cellulose, obwohl ein hinsichtlich der Zusammensetzung optimales Nährsubstrat verwendet wurde.

Abb. 73. Schematische Abbildung einer Apparatur zur Bestimmung des Redoxpotentials in Kulturen anaerober Bakterien

196

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Zur Bestimmung des für die Entwicklung der Cellulosebakterien notwendigen Redoxpotentials konstruierte BOJARSKAJA (1939) eine Apparatur, mit der es möglich ist, das Redoxpotential des Mediums bis zum Beginn der sichtbaren Cellulosegärung zu bestimmen. Es ist evident, daß Potentialbestimmungen in einer gärenden Flüssigkeit zwecklos sind, weil durch den dabei entstehenden Wasserstoff das Redoxpotential stark herabgesetzt wird. In diesem Falle erhält man Werte, die keinesfalls dem Redoxpotential entsprechen, das bis zum Beginn der Bakterienvermehrung in der Nährlösung herrschte. Ein derartiger Fehler ist z. B. ROTMISTROW unterlaufen, der Potentialbestimmungen in gärenden Kulturen durch-

Tabelle 20 Bestimmung des Redoxpotentials in einer Reinkultur thermophiler Cellulosebakterien (Medium VL, Vakuum 5 mm Hg) Versuchstemperatur °C

16

60

16

60

Kultivierungsdauer

PH

Eh

Erste Versuchsreihe Vor dem Evakuieren

7,3

0,424

29,2

0,296 0,162 0,134 0,122

24,8 20,2 19,2 18,8

Nach dem Evakuieren : nach 1 Stunde „ 18 Stunden „ 2 2 „ „ 2 5 „ Aufenthalt im Brutschrank: nach 24 Stunden „ 4 2 „

H

-0,370

1,5 Gär ung Medium H2 -gesättigt

Nach beendeter Gärung

7,0

Zweite Versuchsreihe Vor dem Evakuieren

7,5

Nach dem Evakuieren: nach 1 Stunde ,, 2 Stunden „ 2 2 „ 2 6 „ 6 8 „ „ 7 5 „ Aufenthalt im Brutschrank: nach 23 Stunden „ 4 1 „ Nach beendeter Gärung

r

0,470

31.2

0,350 0,308 0,088 0,050 -0,080 -0,086

17.0 25.6 18,0 16.7 12.3 12.1

3,2 Gär ung Medium H ¡¡-gesättigt

—0,340

7,2

197

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

führte. Der von BOJARSKAJA konstruierte Apparat besteht aus einem Zylinder, der mit dem Nährmedium gefüllt, mit Impfmaterial beschickt und zugeschmolzen wird. Mit Hilfe der in die Flüssigkeit eintauchenden Elektroden kann man die Änderung des Redoxpotentials im Medium als Funktion der Zeit verfolgen. In Abbildung 73 ist eine Skizze der Apparatur wiedergegeben. Ausführlichere Angaben sind der Originalarbeit zu entnehmen. Die Ergebnisse einer Versuchsreihe sind in der Tabelle 20 und als graphische Darstellung in der Abbildung 74 enthalten. mV

0

1

S

10

IS

20

25

30

3S

4-0

4-S h

SO

Abb. 74. Änderungen des Redoxpotentials in einer Kultur thermophiler Cellulosebakterien (Vakuum)

Zunächst liegt der r H -Wert z. B. zwischen r H 25 und 27; durch das Evakuieren und die Lebenstätigkeit der Bakterien sinkt er auf r H 17 bis 18 ab. Dieser Punkt fällt mit dem Beginn der Gärung zusammen. Bekanntlich ermöglicht die Herabsetzung des Eedoxpotentials eine Entwicklung der anaeroben Bakterien auch dann, wenn die Schichthöhe des Nährmediums nur gering ist. Man kann dieses anaerobe Milieu durch Zusatz von 0,02% Natriumglykolat oder 0,01% Natriumsulfid zum Medium erreichen. Das Medium muß in jedem Falle ein so niedriges Redoxpotential besitzen, daß Methylenblau oder Resazurin reduziert werden. Infolge der strengen Anaerobiose der thermophilen Cellulosebakterien ist es auch sehr schwierig, Kolonien dieser Organismen auf Agar in Petrischalen zu züchten. Die geringste Undichtigkeit an der Pumpe oder dem Exsikkator führt bereits zu einer Sistierung des Wachstums der Kolonien. Die Senkung des Redoxpotentials kann aber auch durch gleichzeitige Mitkultivierung von fakultativ anaeroben oder aeroben Bakterien erreicht werden. Die

198

II. Anaerobe Cellulosebakterien

letzteren entziehen während ihrer Entwicklung dem Medium Sauerstoff und setzen dadurch das Redoxpotential so weit herab, daß die anaeroben Cellulosebakterien eine Entwicklungsmöglichkeit erhalten. Die Ergebnisse von Versuchen über die von Bact. coli bewirkte Herabsetzung des Redoxpotentials sind in der Tabelle 21 enthalten. T a b e l l e 21 Änderung des Redoxpotentials im Medium nach Vorkultivierung mit Bact. coli (Medium VL) Versuchsbedingungen

Dauer der TempeKultivierung ratur Tage in °C

Eh

PH

r

H

Gärung der Cellulose

Erste Versuchsreihe Reinkultur von Cellulosebakterien Beimpfung mit Bact. coli . . Nach erneutem Einstellen in den Brutschrank . . . .

4 2

60 37

2

60

0,368 0,104

7,0 7,0

26,8 17,5

— —

+

Zweite Versuchsreihe Reinkultur von Cellulosebakterien Beimpfung mit Bact. coli . . Nach erneutem Einstellen in den Brutschrank

9 2

60 37

2

60

0,362 0,007

7,6 7,4

26,1 15,0

— —

+

Die thermophilen Cellulosebakterien wachsen und vergären die Cellulose also erst dann, wenn der r H -Wert 17,5 erreicht und unterschritten hat. Die Werte der Tabelle 21 stimmen mit denen, die nach dem Verfahren von BOJARSKAJA erhalten wurden, vollständig überein. Das Verfahren, eine Potentialänderung des Mediums durch simultane Kultivierung anderer Mikroorganismen herbeizuführen, wurde von verschiedenen Autoren (SNIESZKO, 1933; SOETERS, 1936) sowohl bei thermophilen als auch bei mesophilen Cellulosebakterien angewandt. Jedoch ist diese Methode in ihrem "Wirkungsmechanismus nicht immer richtig erkannt worden. So nimmt z. B. SOETERS an, daß der günstige Einfluß des Bact. coli nicht auf eine Verringerung des Redoxpotentials zurückzuführen ist, weil bei einer Herabsetzung des Redoxpotentials durch Platinmohr, Cystein, Glutathion oder andere reduzierende Substanzen eine Nährlösung resultierte, in der sich die Cellulosebakterien zwar entwickelten, aber wesentlich schlechter wuchsen als in Mischkulturen mit dem Darmbakterium. Da Versuche mit einem Zellextrakt aus Bact. coli ebenfalls ausgezeichnete Resultate ergaben, folgerte man, daß der günstige Einfluß des Darmbakteriums auf eine Anreicherung des Mediums mit komplizierten, für die Entwicklung der Cellulosebakterien notwendigen organischen Verbindungen zurückzuführen ist. Dieser Schluß

B. Thermophile, sporenbildende Cellulösebakterien

199

ist aber nur dann gerechtfertigt, wenn die für die Entwicklung thermophiler Cellulösebakterien notwendigen Verbindungen im Medium fehlen. In diesen Fällen ist die Anwesenheit von Bact. coli als Stickstoff- und Vitaminlieferant tatsächlich erforderlich. IMSCHENEZKI benutzte für alle seine Versuche einen sehr hochwertigen Nährboden, nämlich das Medium VL, in dem die Gärung sofort nach der Evakuierung des Kulturgefäßes einsetzt. Es ist somit nicht notwendig, zur Erklärung der Coli- Wirkung eine Anreicherung des Mediums an irgendwelchen Stoffen heranzuziehen. Selbst wenn eine derartige Anreicherung stattfinden sollte, so wäre sie im Falle des Mediums VL überflüssig, und die einzige Wirkung besteht folglich in einer Herabsetzung des Redoxpotentials. Im Zusammenhang mit der Anaerobiose der Cellulösebakterien soll noch der Vorschlag

(LANGWELL,

1932;

PERWOSWANSKI U. TsCHELZOWA,

1935,

1936;

ROTMISTROW, 1939, 1940) erwähnt werden, Luft durch die Kulturen thermophiler Cellulösebakterien zu leiten. Durch eine derartige Maßnahme wird naturgemäß die Entwicklung einer Reinkultur unterbrochen und möglicherweise eine Abtötung der vegetativen Zellen erzielt. Das Verfahren wurde zur Steigerung der Alkoholausbeuten vorgeschlagen und bei der Züchtung von Anreicherungskulturen verwendet, die definitionsgemäß aus mehreren Organismen bestehen. Es ist anzunehmen, daß durch die Belüftung die Vermehrung der alkoholproduzierenden Begleitbakterien stimuliert oder daß die Gärungsrichtung im allgemeinen durch Erhöhung des Redoxpotentials geändert wird. Direkte Beziehungen zur Physiologie der Cellulösebakterien im Sinne einer verstärkten Entwicklung dieser Organismen bestehen jedenfalls nicht. Für die Verbreitung der thermophilen Cellulösebakterien ist die Tatsache von gewisser Bedeutung, daß ihre Sporen auch bei Luftzutritt längere Zeit hindurch im ausgetrockneten Zustande lebensfähig bleiben. Beispielsweise bewirkten 18 Tage lang an der Luft aufbewahrte Sporen bei der Übertragung auf frisches Nährmedium eine Gärung der Cellulose. Weder der Luftsauerstoff noch das Eintrocknen vernichteten die Sporen der anaeroben Cellulösebakterien. 4. Die Biochemie der Cellulosegärung Normalerweise geht man bei der Erforschung der Cellulosegärung von der Annahme aus, daß dieser Prozeß in Teilschritten verläuft. Das Auftreten flüchtiger Säuren und die Bildung des Alkohols im Medium sind nur nach der Entstehung löslicher Kohlenhydrate und deren anschließender Vergärung durch die Cellulösebakterien möglich. Der Gärprozeß muß demnach aus zwei Phasen bestehen; in der ersten erfolgt die Hydrolyse der Cellulose, und in der zweiten werden die dabei gebildeten Produkte vergoren. Betrachtet man die Eigenschaften der thermophilen Bakterien, so müßte es möglich sein, die Anwesenheit von Hydrolysenprodukten der Cellulose im Medium auch ohne Anwendung von Mitteln festzustellen, die zwar eine Bakterienvermehrung verhindern, die Wirksamkeit der Cellulase jedoch nicht hemmen (z. B. Antiseptika). Tatsächlich konnten infolge der raschen Entwicklung der Kultur Bedingungen

200

II. Anaerobe Cellulosebakterien

hergestellt werden, bei denen zwar ein erheblicher Teil der Cellulose hydrolysiert, der entstandene Zucker jedoch noch nicht abgebaut wird. Die Verwendung hoher oder niedriger Temperaturen sowie der früher häufig benutzten Antiseptika erübrigte sich auf diese Weise. Dank der Schnelligkeit des Prozesses war es möglich, eine ausreichende Cellulosemenge zu zersetzen, wodurch genügend Hydrolysenprodukte gebildet wurden. a) D i e H y d r o l y s e der C e l l u l o s e Die Versuche zur Hydrolyse der Cellulose mit Hilfe einer Reinkultur anaerober Bakterien wurden folgendermaßen durchgeführt: 300 ml fassende Rundkolben wurden mit je 250 ml Nährlösung VL und einer genau abgewogenen Cellulosemenge gefüllt. Der Cellulosezusatz betrug etwa 2 % des Gewichtes der Nährlösung, der p H Wert des Mediums lag bei 7,4. Nach Sterilisation und Impfung mit 25 ml einer alten Kultur wurde auf die Oberfläche des Mediums steriles Vaselinöl in 1 cm hoher Schicht aufgebracht. Die Kultivierungstemperatur bewegte sich um 60° C. Nach einer bestimmten Zeit (von 4 bis 17 Tagen) wurde das Vaselinöl entfernt, eine kleinere Menge der Kulturflüssigkeit abfiltriert und darin der Zuckergehalt nach BERTRAND bestimmt. Danach brachte man das im Kolben noch vorhandene ungelöste Calciumcarbonat durch Salzsäure in Lösung und filtrieTte den gesamten Kolbeninhalt. Die dabei zurückbleibende Cellulose wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und gewogen. Auf diese Weise ließ sich der Anteil der zerstörten Cellulose bestimmen. Die aus zwei Versuchsreihen erhaltenen Werte sind in der Tabelle 22 zusammengestellt. Aus den Resultaten dieser Versuche lassen sich folgende Schlüsse ziehen: 1. Da die Kulturflüssigkeit stets Zucker enthält, unabhängig vom Alter der Kultur, müssen die thermophilen Bakterien eine Hydrolyse der Cellulose bewirken. Tabelle 22 Die Anreicherung von Kulturen thermophiler Cellulosebakterien mit Zucker Versuchsdauer (Tage) . .

4

4

8

8

12

13

16

17

Versuchsnummer

1

5

2

6

7

3

8

4

5,33

5,24

5,33

5,23

5,27

5,33

5,25

5,33

1,17

0,30

1,60

1,66

2,29

2,05

2,51

1,91

21,95

5,72

30,01

31,74

43,47

38,46

47,81

35,83

0,47

0,19

0,85

0,77

1,56

1,53

1,19

1,09

0,17

0,07

0,31

0,28

0,42

0,41

0,45

0,41

40,17

63,33

53,12

46,38

68,12

74,63

47,41

57,07

. . . .

Eingewogene Cellulosemenge (g) Zersetzte Cellulosemenge (g) Zersetzte Cellulosemenge (Prozent) Im Medium enthaltene Zuckermenge (g) . . . Im Medium enthaltene Zuckermenge (Prozent) Verhältnis von Zucker zu abgebauter Cellulose (Prozent)

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

201

2. Die Menge an zerstörter Cellulose ist der Menge an gebildetem Zucker direkt proportional. 3. Da der gebildete Zucker in den verschiedenen Versuchen nicht mit der gleichen Geschwindigkeit vergoren wird, schwankt das Verhältnis von Zucker zur zerstörten Cellulose in ziemlich weiten Grenzen; in der Lösung wurden 40,17 bis 74,63% der zerstörten Cellulose als Glucose wiedergefunden. Die Anwesenheit der Glucose im Kulturfiltrat konnte durch Bildung des Osazons nachgewiesen werden. Das Glucosazon zeigte einen Schmelzpunkt von 204 bis 205° C. In diesen Untersuchungen konnte zum erstenmal gezeigt werden, daß ein wesentlicher Teil der zerstörten Cellulose unter optimalen Kultivierungsbedingungen als Zucker im Medium wiederauftritt. Die Menge an Hydrolysenprodukten ist in Wirklichkeit etwas höher als die Versuche angeben, da bei der Zuckerbestimmung nach BERTRAND nicht die gesamte Cellobiose erfaßt wird. Die Tatsache der Zuckeransammlung im Medium ist jedenfalls von grundsätzlicher Bedeutung. Sie wurde später durch die Arbeiten ENEBOs vollauf bestätigt. Bei den thermophilen Bakterien ist die Fähigkeit zur Hydrolyse deutlicher ausgeprägt als die Fähigkeit zur Vergärung der Hydrolysenprodukte. Es ist nicht anzunehmen, daß die Glucose hemmend auf die Gärfähigkeit der Bakterien einwirkt, da die thermophilen Bakterien, wie weiter unten ausgeführt wird, sogar in der Lage sind, Glucose auch in noch höheren Konzentrationen zu vergären, als sie bei der Zersetzung der Cellulose auftreten. Nach IMSCHENEZKI gibt es eine ganze Reihe von Faktoren, die einen Einfluß auf die Menge der Hydrolysenprodukte ausüben. Enthält das Medium nur sehr wenig Cellulose, so wird der entstehende Zucker sofort zu den verschiedensten Produkten vergoren. In diesem Falle lassen sich demnach keine reduzierenden Substanzen im Medium nachweisen; diese Erscheinung dürfte im allgemeinen bei einem Zusatz von nur 0,1 bis 0,2% Cellulose auftreten. IMSCHENEZKI benutzte dagegen einen Cellulosezusatz von 2%. Ferner bewirken alle Faktoren, die eine Verzögerung der Bakterienentwicklung hervorrufen, gleichzeitig auch eine Verminderung der reduzierenden Substanzen im Medium. Dabei läßt sich der gleiche Effekt beobachten wie bei Anwesenheit zu geringer Cellulosemengen, nämlich der, daß Bildung und Vergärung der Hydrolysenprodukte sich im Gleichgewicht befinden. Obwohl größere Mengen T a b e l l e 23 Verringerung des Zuckergehaltes im Medium bei langsamer Gärung Versuchsdauer (Tage) Eingewogene Cellulosemenge (g) . . . Zersetzte Cellulosemenge (g) Zersetzte Cellulosemenge (Prozent) . . I m Medium enthaltene Zuckermenge (g) I m Medium enthaltene Zuckermenge (Prozent) Verhältnis von Zucker zu abgebauter Cellulose (Prozent)

12

16

5,10 1,45 28,55 0,28

5,11 1,25 24,56 0,29

0,10

0,11

19,64

23,83

202

II. Anaerobe Cellulosebakterien

an Cellulose zur Verfügung stehen, können sich infolge der langsameren Zerstörung doch nur geringere Mengen an Hydrolysenprodukten bilden. In diesem Zusammenhang sei auf die Angaben der Tabelle 23 verwiesen. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß sich bei einer „schwachen" Gärung nicht nur der Anteil an zerstörter Cellulose, sondern auch das Verhältnis von Zucker zu abgebauter Cellulose verringert. Ein Vergleich der Tabellen 22 und 23 zeigt, daß bei einer intensiven Gärung 47,41 bis 74,63% der abgebauten Cellulose als Zucker in der Lösung erscheinen, während bei einer langsamen Gärung in der gleichen Zeit nur 19,64 bis 23,83% der zerstörten Cellulose als Glucose gefunden wurden. Im letzteren Falle wird die Glucose anscheinend unmittelbar nach ihrer Bildung vergoren. Für die langsame Entwicklung der Cellulosebakterien kann eine Keihe von Gründen maßgeblich sein: mangelhafte Anaerobiose, minderwertiges Nährmedium, Anwesenheit toxischer Verunreinigungen, schlecht vergärbare Cellulosematerialien usw. Ein Hauptgrund für das Fehlen der Zucker im Medium ist häufig darin zu erblicken, daß die Kultur neben den Cellulosebakterien noch eine Art oder mehrere Formen von Begleitbakterien enthält. Es ist evident, daß derartige Fremdbakterien die gebildete Glucose und Cellobiose rasch unter Umwandlung in die verschiedensten Gärungsprodukte assimilieren, so daß sich im Medium keine Zucker mehr nachweisen lassen. Diese Angaben wurden von ENEBO in vollem Umfang bestätigt, der anläßlich der Reinzüchtung thermophiler Bakterien fand, daß von 1 g zerstörter Cellulose 0,355 g Glucose im Medium wieder erscheinen. Er erhielt also etwa 35% an reduzierenden Substanzen, d. h. fast halb so viel wie IMSCHENEZKI und Mitarbeiter. Auf Grund der vorerwähnten Tatsachen ist es schwer verständlich, weshalb MCBEE bei der Untersuchung einiger Stämme thermophiler Cellulosebakterien in den Kulturflüssigkeiten keinerlei reduzierende Stoffe gefunden hat. In einer zusammenfassenden Arbeit wird über diesen Punkt nichts ausgesagt. Während IMSCHENEZKI und Mitarbeiter bis zu 75% der Cellulose in Form ihrer Hydrolysenprodukte wiederfanden, fehlen Cellobiose und Glucose in den Kulturflüssigkeiten MCBEES vollständig. Es ist nicht anzunehmen, daß sich diese Zucker infolge methodischer Mängel des Untersuchungsverfahrens dem Nachweis entzogen haben, weil nämlich die Kohlenstoffmenge der Gärungsprodukte bei einigen Stämmen streng mit dem ursprünglich in der Cellulose vorhandenen Kohlenstoff übereinstimmt. Unvergorener Zucker ist demzufolge nicht vorhanden. Diese Tatsache kann dreierlei Ursachen haben. Zum ersten es ist möglich, daß der von MCBEE benutzte Nährboden unzureichend war, so daß die Hydrolyse langsam erfolgte und die gebildeten Zucker sofort zu Alkohol und Säuren vergoren wurden. Zum anderen war die eingesetzte Cellulosemenge relativ klein, so daß auch aus diesem Grunde alle entstandenen Zucker sofort abgebaut wurden. Drittens schließlich enthielten alle Kulturen schwer nachweisbare Begleitbakterien, die für ein sofortiges Verschwinden der gebildeten Glucose sorgten. Alle von IMSCHENEZKI unternommenen Versuche, aus Kulturfiltraten Fermente zu isolieren, die zur Hydrolyse der Cellulose befähigt sind, waren erfolglos. Anscheinend trifft hier das gleiche zu wie bei den aeroben Cellulosebakterien. Die Bakterien besitzen in ihrer Umgebung eine aktive Zone mit hoher Cellulasekonzentration, wobei

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

203

die Cellulase jedoch fest an der Bakterienzelle haftet. Eine vollständige Hydrolyse der Cellulose erfolgt deshalb nur an den Stellen, an denen sich Bakterienzellen befinden. Irgendwelche Intermediärprodukte treten nicht auf; in physikochemischer Hinsicht konnten keine Unterschiede zwischen der Restcellulose im Medium und unbehandelter Cellulose gefunden werden. Die Bestimmung des a-, ß- und y-Cellulosegehaltes, der Kupferzahl sowie der Viskosität von Restcellulose ergibt die gleichen Werte wie die einer völlig unbehandelten Cellulose (TOMODA, 1932). Die Wirkung der Bakterien ist also örtlich begrenzt; sie hydrolysieren nur die Faserbereiche, auf denen sie sich befinden. Die Kulturflüssigkeit selbst bewirkt keine Verzuckerung, folglich enthält sie auch keine Cellulase. Unter der Einwirkung der Cellulosebakterien zerfallen die Fasern in einzelne Bruchstücke. Diese besitzen spitze Enden und können leicht in dem amorphen Niederschlag nachgewiesen werden, der sich am Boden eines Kulturkolbens ansammelt. b) G ä r u n g s p r o d u k t e Bevor IMSCHENEZKI 1939 seine Arbeiten über die Physiologie der thermophilen Cellulosebakterien durchführte, waren die aus der Literatur bekannten Angaben über die Produkte der thermophilen Cellulosegärung lediglich durch physiologische Untersuchungen an elektiven Kulturen erhalten worden. Naturgemäß bewirkt die Metabiose in derartigen Kulturen eine Bildung von sekundären Produkten, die keineswegs für die Cellulosebakterien charakteristisch sind, oder eine Ausbeuteerhöhung der normalen Gärungsprodukte. Schlüssige biochemische Resultate lassen sich aber nur mit Reinkulturen erzielen. IMSCHENEZKI und Mitarbeiter führten Versuche unter optimalen Entwicklungsbedingungen durch mit dem Ziel, eine maximale Vergärung der Cellulose in kürzester Zeit zu erreichen. Rundkolben mit je 275 ml Medium VL und 2% Cellulose wurden beimpft und bei 60° C aufbewahrt. Gewöhnlich setzte die Gärung der Cellulose bereits am Tage nach der Impfung unter Gasentwicklung ein. Die Bestimmung der Gärungsprodukte und der zerstörten Cellulose erfolgte nach sechs Tagen. Tabelle 24 enthält die aus drei derartigen Versuchsreihen erhaltenen Resultate (Vers. Nr. 52 bis 54). Bei der Betrachtung dieser Ergebnisse fällt vor allem auf, daß während einer Vergärung der Cellulose durch Reinkulturen Alkohol entweder überhaupt nicht oder nur in Spuren gebildet wird. Bemerkenswert ist ferner auch der hohe Anteil an zerstörter Cellulose; er betragt für sechs Tage bis zu 58,6%. Die nächste Versuchsreihe (Tab. 24, Nr. 49 u. 49a) wurde unter Verwendung eines eiweißhaltigen Mediums (AFP) durchgeführt, das aus Fleischbrühe-Pepton, Cellulose und 1% Asparagin besteht. Ferner wurden noch Versuche (Nr. 51, 51a) angestellt, in denen man als Substrat das Medium V mit einem Zusatz von 25 bzw. 50% AFP benutzte. Die Analysen wurden ebenfalls nach sechs Tagen durchgeführt. Bei den letzten Versuchen (49 — 51) wird stets Alkohol gebildet, allerdings in relativ geringen Mengen. Dieser Umstand ist insofern von Bedeutung, als daraus hervorgeht, daß die Zusammensetzung des Mediums auf die Alkoholausbeute bei der Vergärung der Cellulose durch Reinkulturen einen gewissen Einfluß ausübt. So

204

II. Anaerobe Cellulosebakterien

T a b e l l e 24 Bildung von Alkohol und flüchtigen Säuren in Reinkulturen thermophiler Cellulosebakterien (6 Tage alte Kulturen) Medien VL

AFP

V+50% V+25% AFP AFP

Versuchsnummer

Eingewogene Cellulosemenge (g) Zersetzte Cellulosemenge(g) Zersetzte Cellulosemenge (Prozent) Gebildete Alkoholmenge(g) Gebildete Alkoholmenge (Prozent) Gebildete Alkoholmenge (in Prozent, auf vergorene Cellulose berechnet) Gebildete Säuremenge (g) Gebildete Säuremenge (Prozent) Gebildete Säuremenge (in Prozent, auf vergorene Cellulose berechnet) . .

52

53

5,29 1,62 30,62 0 0

54

49

49 a

51

51a

5,36 1,41

5,34 1,75

5,28 2,12

5,24 1,73

5,26 2,69

5,25 3,08

26,35 0,01

32,77 Spuren

40,2 33,0 0,17 0,17

51,14 0,01

58,67 0,2

0,004

—

0,06

0,06

0,004

0,074

0,28

0,3.'S

0,36

8,02 0,33

9,83 0,30

0,37 0,37

6,49 0,47

0,10

0,12

0,13

0,12

0,11

0,14

0,17

17,28

23,40

20,57

15,57

17,34

14,50

15,26

—

—

tritt Alkohol bei Verwendung des Mediums VL überhaupt nicht oder nur in Spuren auf, während in Fleischbrühemedien stets Alkohol entsteht. Der Gehalt an flüchtigen Säuren ist bei allen Versuchen etwa der gleiche; er schwankt zwischen 14,5 und 23,4% der Menge an zerstörter Cellulose. Für genauere Angaben über die Physiologie der thermophilen Cellulosebakterien wurde eine Bilanz aller sich in Reinkulturen bildenden Produkte aufgestellt, wodurch ein einwandfreier Nachweis über den Verbleib des Kohlenstoffs geführt werden konnte. Für die Versuche wurden Reinkulturen im Medium VL mit genauen Einwaagen an chemisch reinem Calciumcarbonat und reiner Cellulose benutzt. Nach acht Tagen erfolgte die Bestimmung der abgebauten Cellulose sowie der im Medium angesammelten Zucker und Säuren (Essig-, Ameisen-, Butter- und Milchsäure). Daneben wurde die während der Gärung entstehende Kohlensäure ebenfalls quantitativ bestimmt. Zu diesem Zweck ermittelte man einmal die gesamte, während der Gärung gebildete Kohlensäure aus dem abgeschiedenen Gas, und zum andern den in Lösung verbliebenen Anteil des Kohlendioxyds. Zur Bestimmung des letzteren werden 100 ml der Kulturflüssigkeit in einen mit Gasableitungsrohr versehenen Kolben übergeführt und erwärmt; das ausgetriebene C0 2 wird dann in Barytlauge aufgefangen. Aus den

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

205

beiden Einzelbestimmungen ergibt sich additiv die Gesamtmenge der entstandenen Kohlensäure. Um jedoch die unmittelbar während der Gärung gebildete Kohlensäuremenge festzustellen, muß von der obigen Summe die durch Neutralisation des Calciumcarbonats mittels Säuren freigemachte Kohlensäure abgezogen werden. Zur Bestimmung des unverbrauchten Calciumcarbonats werden 50 ml der sorgfältig durchgeschüttelten, Calciumcarbonat und Cellulose enthaltenden Kultur in einen Erlenmeyerkolben übergeführt, der anschließend mit einem dreifach durchbohrten Stopfen verschlossen wird. Durch die Bohrungen führen ein Trichter und zwei Glasrohre, wie aus der schematischen Abbildung 75 (a) ersichtlich ist. Der Trichter wird

Abb. 75. Apparatur zur Bestimmung des Kohlendioxyds, das bei der Behandlung einer calciumcarbonathaltigen Kulturflüssigkeit mit Salzsäure frei wird

mit dreiprozentiger Salzsäure gefüllt, und durch die Apparatur läßt man mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe Luft hindurchströmen, aus der zuvor das Kohlendioxyd mittels 50%iger Kalilauge (b) entfernt wurde. Zur Kontrolle auf C0 2 -Freiheit dient ein zusätzliches Absorptionsgefäß mit Barytlauge (c). Damit die Luft wirklich nur in einer Richtung strömen kann, wurde zwischen den Erlenmeyerkolben und das Kontrollgefäß noch ein Spezialventil (d) eingesetzt. Nach Regulierung des Luftstroms läßt man die Salzsäure langsam in den Erlenmeyerkolben tropfen. Zur Entfernung der Feuchtigkeit wird der Luftstrom zunächst durch eine Waschflasche mit Schwefelsäure (e) und dann erst durch zwei Kaliapparate (f und f') geleitet, in denen die Absorption der gebildeten Kohlensäure stattfindet. Zur Kontrolle einer vollständigen Absorption dient ein nachgeschaltetes Absorptionsgefäß mit Barytlauge (g). Als Schutz gegen ein Zurücksteigen des Wassers aus der Wasserstrahlpumpe ist die Sicherheitsflasche h zwischengeschaltet. Die Säurezugabe wird so lange fortgesetzt, bis sich das im Kolben befindliche Calciumcarbonat restlos gelöst hat. Anschließend wird der Kolbeninhalt bis zum Sieden erhitzt und durch dasselbe Filter filtriert, das zur Bestimmung des Celluloserückstandes benutzt worden war. Wie bereits erwähnt, treten als Hauptprodukt bei der anaeroben Cellulosegärung lösliche Kohlenhydrate auf, was durch die Angaben der Tabelle 25 in vollem Umfange bestätigt wird.

206

II. Anaerobe Cellulosebakterien Tabelle 25 Die Kohlenstoff bilanz der Cellulosegärung Eingesetzte Stoffe

Menge ing

Gärungsprodukte in g

Kohlenstoff ing

Eingewogene Cellulosemenge. Zerstörte Cellulosemenge . . Eingewogenes Calciumcarbonat Gelöstes Calciumcarbonat . .

11,6792 6,2224

Zucker 3,3120 Alkohol 0 0,9864 Essigsäure Buttersäure . . . . 0,1230 Ameisensäure . . . . 0,0960 0,3840 Milchsäure Kohlendioxyd . . . 0,4626

1,3248 0 0,3945 0,0670 0,250 0,1536 0,1261

Kohlenstoffgehalt der vergorenen Cellulose . . .

11,5232 0,7432

2,7655 100%

Kohlenstoffgehalt der Gärungsprodukte.

—

2,0910 75,61%

Im vorliegenden Falle entstehen aus 6,2224 g Cellulose 3,3120g Zucker, d. h. über 5 0 % der zerstörten Cellulose finden sich als Glucose im Medium wieder. Eine Alkoholbildung konnte auch in diesem Falle nicht festgestellt werden, während Säuren immer entstehen. Die Essigsäuremenge beträgt gewöhnlich das drei- bis achtfache der Buttersäure, wogegen Ameisensäure und Milchsäure nur in kleinen Mengen auftreten. Die Bestimmung der Gesamtkohlensäure nach dem oben beschriebenen Verfahren Abb. 76. Die bei der Zersetzung von 6,222 g Cellulose ergab 0,7896 g C0 2 . Nach Abdurch thermophile Bakterien entstehenden Produkte zug der durch Neutralisation a — Zucker; b — Essigsäure; c — Buttersäure; des CaC0 3 gebildeten Kohlend — Ameisensäure; e — Milchsäure; / — Kohlensäur emenge von 0,3270 g verdioxyd bleiben 0,4626 g reiner Gärungskohlensäure, die aus 6,2224 g Cellulose entstanden sind. Zur besseren Veranschaulichung sind die Mengenverhältnisse der Gärungsprodukte in der Abbildung 76 schematisch dargestellt. Bei der Aufstellung der Kohlenstoffbilanz ergibt sich, daß 75,61% des ursprünglich in der vergorenen Cellulose enthaltenen Kohlenstoffs in den Gärungsprodukten wiedergefunden werden. In einem anderen, hier nicht näher angeführten analogen

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

207

Versuch betrug dieser Anteil 70,20%. Im Zusammenhang mit diesen Untersuchungen ist ein Vergleich mit den von K H O U V I N E (1923) bei der mesophilen Vergärung der Cellulose erhaltenen Resultaten interessant. Auf Grund quantitativer Bestimmungen der Gärungsprodukte stellte die Autorin die in der Tabelle 26 wiedergegebene Kohlenstoffbilanz auf. Tabelle 26 Die Kohlenstoffbilanz der Cellulosegärung (nach

KHOUVINE)

Gärungsprodukte in g Zerstörte Cellulose gefunden: Essigsäure Buttersäure Äthylalkohol C0 2 H2 . . . . Pigment

. . .

Kohlenstoff ing

1,012

0,400

0,275 0,033 0,082 0,1827 0,0085 0,0135

0,110 0,018 0,0428 0,0498

0,5947 58,76%

0,2206 55,15%

— —

KHOUVINE konnte 4 5 % des ursprünglich vorhandenen Kohlenstoffs nicht mehr wiederfinden. Bei der weiteren Untersuchung konnten in dem Medium noch Hydrolysenprodukte der Cellulose nachgewiesen werden, deren Menge jedoch sehr gering war. Der durch die Bilanz entdeckte Kohlenstoffverlust war jedoch bei weitem größer als die den Kohlenhydraten entsprechende Kohlenstoffmenge. In den Kulturen der mesophilen Cellulosebakterien treten erheblich weniger Zucker auf als in denen der thermophilen Arten. Obwohl IMSCHENEZKI in seinen Versuchen 75,61% des eingesetzten Kohlenstoffs wiederfand, und obwohl dieser Wert höher liegt als der von KHOUVINE gefundene, so sind doch irgendwelche Produkte nicht erfaßt worden, deren Kohlenstoffgehalt 24,39% ausmacht. Derartige Kohlenstoffverluste können zweierlei Ursachen haben. Einmal bleibt der in den Zellen der Cellulosebakterien enthaltene Kohlenstoff unberücksichtigt, zum anderen entziehen sich einige Stoffwechselprodukte dem Nachweis und der Bestimmung. Im einzelnen handelt es sich dabei um Kohlenhydrate, die mit Hilfe der BERTRANDschen Methode nicht erfaßt werden, ferner um das orangefarbige Bakterienpigment, um Aldehyde, insbesondere Acetaldehyd und möglicherweise auch um andere, in sehr geringen Mengen auftretende Gärungsprodukte. Als später auch andere Autoren die Physiologie der Reinkulturen thermophiler Cellulosebakterien untersuchten, ergab sich, daß alle Kulturen ziemlich ähnliche Eigenschaften besaßen. In jedem Falle traten bei ihnen organische Säuren und Alkohol auf.

208

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Von Interesse sind in diesem Zusammenhang Angaben MCBEES über die Mengen an Gärungsprodukten, die er bei vergleichenden Untersuchungen an sechs Kulturen thermophiler Cellulosebakterien erhielt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 27 wiedergegeben. T a b e l l e 27 Produkte der thermophilen Cellulosegärung Kulturen

Eingesetzte Cellulose (mg) . . Kohlenstoff (mg)

651

CT

TT

60,0 2,22

104,4 3,85

110,5 4,1

157

EB

TET

88,5 3,28

107,5 3,98

110,5 4,1

51 47 13 07 27 16 1,81 55

59 56 21 10 47 08 2,25 57

Gärungsprodukte (mg) Wasserstoff Kohlendioxyd Äthylalkohol Ameisensäure Essigsäure Milchsäure Kohlenstoff (mg) Kohlenstoff (Prozent)

. . . .

44 56 35 04 17 21 2,27 102

26 29 20 10 37 31 2,46 64

44 43 21 04 22 22 2,99 49

51 56 20 10 44 19 2,51 61

Aus den Versuchsdaten der Tabelle ist zu ersehen, daß sich sämtliche von ihm untersuchten Kulturen ungewöhnlich ähnlich verhalten. In allen Fällen entstehen die gleichen Produkte, nämlich Alkohol, Essigsäure, Ameisensäure und Milchsäure. Sie unterscheiden sich lediglich durch die Anwesenheit anderer, nicht näher untersuchter Produkte. Die Kohlenstoffbilanz ergibt in einem Versuch sogar 102%, d. h. etwas mehr als theoretisch möglich wäre. Bei den anderen Kulturen bewegt sich die Kohlenstoffbilanz allerdings um wesentlich niedrigere Werte; 49—64% des eingesetzten Kohlenstoffs wurden wiedergefunden. MCBEE teilte die angeführten Kulturen trotz ihres ähnlichen Verhaltens in drei Gruppen ein. Zur ersten Gruppe gehören die Kulturen (651), bei denen die Kohlenstoffbilanz keinerlei Verluste aufweist. Charakteristisch für die zweite Gruppe (157, EB, TET) ist die Erscheinung, daß etwa 40 bis 50% des Kohlenstoffs in Stoffen enthalten sind, deren Keduktionspotential größer ist als das der Cellulose. Die Kohlenstoffbilanz der dritten Gruppe (CT, TT) liegt etwa in der gleichen Höhe wie die der zweiten, jedoch ist der Oxydationsgrad gleich dem der Kohlenhydrate. Wie bereits erwähnt, fehlen in den Kulturen von MCBEE die Hydrolysenprodukte der Cellulose vollständig, während sie in den Versuchen iMSCHENEZKls 50% der vergorenen Cellulose ausmachen. Nicht uninteressant ist auch das Auftreten der Buttersäure. IMSCHENEZKI fand stets geringe Mengen dieser Fettsäure; ungefähr in der gleichen Menge entsteht Ameisensäure, während das achtfache an Essigsäure gebildet wird. Andere Autoren (MCBEE, 1948, 1950; ENEBO, 1948) konnten dagegen bei ihren Untersuchungen keine Buttersäure nachweisen. Für die unterschiedlichen Ergebnisse sind anscheinend

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

209

die gleichen. Gründe maßgebend wie f ü r das Fehlen der Zucker in einigen Kulturen (MCBEE, 1948,1950). Die Buttersäure wird offenbar nur bei Verwendung von Medien bestimmter Zusammensetzung gebildet. Dies trifft wahrscheinlich auch für den von IMSCHENEZKI verwendeten Nährboden VL zu, der für die Entwicklung der thermophilen Cellulosebakterien optimale Bedingungen schafft. Die von anderen Autoren benutzten mineralischen Medien sind für die Gärung der Cellulose weniger geeignet. Bei der Verwendung kompliziert zusammengesetzter Nährsubstrate wurde ebenfalls Buttersäure in der Kulturflüssigkeit gefunden (SOETERS, 1936).

Bezüglich der Alkoholbildung scheinen die in den Versuchen iMSCHENEZKIs herrschenden Bedingungen ungünstiger gewesen zu sein als in den Kulturen von MCBEE. Nach IMSCHENEZKI werden in Reinkulturen etwa 8,02 bis 9,83% Alkohol gebildet, während in Anreicherungskulturen wesentlich mehr entsteht. Dieses Problem soll jedoch weiter unten noch ausführlicher behandelt werden. Die thermophilen Cellulosebakterien scheiden ein orangefarbenes Pigment ab, das die Cellulose langsam anfärbt. Je intensiver die Entwicklung der Bakterien erfolgt, 2C 6 H 10 O 5 + 2H20 + 4 H 3 P 0 4 4C 3 H S 0 2 (H 2 P0 4 ) + 4 H 2 0 4H 2 CH 2 (H 2 P0 4 ) • CHOH • COOH 2CH 2 (H 2 P0 4 ) • CHOH • COOH + 2CH 2 (H 2 P0 4 )CH0H • CH2OH 2 CHJCO • COOH + 2 H 3 P 0 4

+ 4H-

+ 4H

+ 4H-

2CHSCHO + 2 C 0 2

-

4H

2CH 3 CHOH • COOH

2CH 3 CH 2 OH

2CH 3 CHO + 2 H C O O H +H2O CHJCHOH • CH2CHO

2 CH 2 (H 2 P0 4 )CH0H • CHO 2 C 0 2 + 2H 2

CH 3 CH 2 0H + CH3COOH CH 3 CH 2 CH 2 C00H 14 Imschenezki, Mikrobiologie

CH4 + C0 2

I

210

II. Anaerobe Cellulosebakterien

desto deutlicher wird die Färbung. Spezielle Untersuchungen über die Natur dieses Farbstoffes sind nicht bekannt. In Analogie zu dem für die mesophilen Cellulosebakterien charakteristischen Farbstoff kann jedoch angenommen werden, daß es sich hier ebenfalls um ein Carotinoid handelt. Für Untersuchungen über den Chemismus der Gärung sind die thermophilen Cellulosebakterien wenig geeignet, weil sie sich nur schwer rein züchten lassen, komplizierte Nährmedien benötigen und unter streng anaeroben Bedingungen kultiviert werden müssen. Es ist somit verständlich, weshalb es bis heute noch kein definitives Reaktionsschema für die Bildung von Alkohol und Säuren bei der thermophilen Cellulosegärung gibt. Man kann aber annehmen, daß die Cellulosebakterien die Cellulose in derselben Weise vergären wie die Glucose. Ebenso wahrscheinlich ist es auch, daß die Cellulosebakterien die gleichen Gärungsprodukte bilden wie die anderen, zuckervergärenden anaeroben Bakterien. An Hand einer Bilanz der Zwischenprodukte wurde festgestellt, daß die Verhältnisse in vollem Umfang denen entsprechen, die bei der Vergärung der Zucker durch andere Bakterien, z. B. Bact. coli, zu beobachten sind. PERWOSWANSKI undTsCHELZOWA (1936) haben auf Grund

dieses Versuchsmaterials ein vorläufiges Schema für die Cellulosegärung aufgestellt (s. S. 209). Dieses Schema besitzt naturgemäß lediglich einen relativen Wert, weil die dafür benutzten Daten aus Gärungsversuchen stammen, die mit Mischkulturen durchgeführt wurden. So ist insbesondere die Bildung von Methan bei Reinkulturen nicht beobachtet worden. Interessant ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, daß bei der Gärung relativ wenig Kohlendioxyd entsteht. Auf Grund theoretischer Berechnungen müßte mehr C0 2 zu erwarten sein. PERWOSWANSKI und TSCHELZOWA vermuteten deshalb, daß ein derartiger C02-Verlust auf die mögliche Bildung von Alkohol und Säuren zurückzuführen ist, wie dies z. B. in Kulturen von Bact. typhosum oder anderer Bakterien nach folgendem Schema beobachtet wurde: C6H10O6 + H 2 0 -> 2 CH3COCH(OH)2 2 CH3COCH(OH)2 2 HCOOH + 2 CH3CHO 2 CHjCHO + H 2 0 CH3CH2OH + CH3COOH C6H10O6 + 2 H 2 0

CH3CH2OH + CHsCOOH + 2 HCOOH

In letzter Zeit ist jedoch für die geringe Kohlendioxydbildung auch eine andere Erklärung gefunden worden. Man hat nämlich festgestellt, daß mit einer Verringerung der Wasserstoffabscheidung eine verstärkte Bildung von Essigsäure verbunden ist. VlRTANEN (1946) nimmt deshalb an, daß bei der Vergärung von Holzmehl durch Cellulosebakterien Essigsäure nach der Gleichung 4 H2 + 2 C0 2 = CH3COOH + 2 H 2 0 entsteht. Wird in die Kultur zusätzlich Kohlendioxyd eingeleitet, so wird auch dieses in Essigsäure umgewandelt. c) Die Bildung des Methans Bereits in seinen ersten Arbeiten stellte POPOW fest, daß bei dem Abbau der Cellulose durch Mikroben, insbesondere an den Stellen einer größeren Celluloseakkumu-

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

211

lation, erhebliche Mengen an Methan entstehen. Nachdem OMELJANSKI Ende des vorigen Jahrhunderts den spezifischen Erreger der Methangärung der Cellulose entdeckt hatte, aber auch auf Grund anderer in den letzten 40 Jahren durchgeführter Arbeiten, verbreitete sich die Meinung, daß Methan bei der bakteriellen Zersetzung der Cellulose durch Cellulosebakterien entsteht. Allmählich stellte sich jedoch heraus, daß Methan nicht bei der Zersetzung der Cellulose durch Bakterienreinkulturen, sondern durch eine eigenartige Zönose der Mikroorganismen gebildet wird. Ferner wurde bekannt, daß viele Bakterien in der Lage sind, Salze organischer Säuren unter Bildung von Methan zu vergären, oder dieses Gas auf einem anderen Wege zu erzeugen. Andererseits zeigte es sich, daß bei der Celhilosegärung mit Hilfe thermophiler oder mesophiler Cellulosebakterien kein Methan entsteht. Zur endgültigen Klärung dieser Frage waren jedoch noch vergleichende Untersuchungen der sowohl durch Misch- als auch durch Reinkulturen gebildeten gasförmigen Gärungsprodukte der Cellulose erforderlich. IMSCHENEZKI und Mitarbeiter führten deshalb folgende Versuche durch. Kolben mit Medium V und Filtrierpapier wurden mit Pferdedung geimpft und für fünf bis sechs Tage bei 60° C gehalten. Während dieser Zeit fand eine intensive Gärung der Cellulose unter Gasentwicklung statt. Nach zwei bis drei Passagen übertrug man die Kulturen in cellulosehaltiges Medium YL. Die Kolben wurden dann mit Stopfen verschlossen, durch die je ein Gasableitungsrohr hindurchführte. Das dabei aufgefangene Gas wurde in üblicher Weise gasanalytisch untersucht. Die sowohl an Misch- als auch an Beinkulturen gewonnenen Resultate sind in der Tabelle 28 zusammengestellt. T a b e l l e 28 Zusammensetzung der bei einer thermophilen Cellulosegärung durch Anreicherungsund Beinkulturen gebildeten Gase Gefundene Gasmenge in ccm

Bestandteil C02

02. H*

CO CH 4 n2.

Beinkultur

Anreicherungskultur 32,6 5,2 2,3 0 34,8 25,1

25,0 6,3 32,4 0 1,2 35,1

63,5 1,0 2,0 0 7,8 25,7

31,2 2,7 56,6 0 0 9,5

31,8 5,2 44,4 0 0 18,6

Faßt man diese Ergebnisse kurz zusammen, so läßt sich folgendes sagen: 1. Bei der Vergärung der Cellulose mit Mischkulturen entsteht Methan. 2. Unter den gasförmigen Produkten, die bei der Gärung mit Reinkulturen auftreten, fehlt Methan vollständig. 3. Im wesentlichen werden bei der Vergärung der Cellulose durch Reinkulturen lediglich Kohlendioxyd und Wasserstoff gebildet, wobei letzterer mengenmäßig überwiegt. 14«

212

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Die gebildete Methanmenge schwankt bei den verschiedenen Versuchen in ziemlich weiten Grenzen. Wahrscheinlich hängt diese Erscheinung damit zusammen, daß bei Versuchsbeginn nicht von einer bestimmten Anreicherungskultur ausgegangen wurde, sondern von unterschiedlichen Stückchen Pferdedung. Dieser Umstand war jedoch für die beschriebenen Versuche bedeutungslos, da es sich hier nur darum handelte, eine Methanentwicklung qualitativ festzustellen. Der Ursprung des ebenfalls aufgefundenen Sauerstoffs und Stickstoffs läßt sich ohne weiteres folgendermaßen erklären: Die im Kolben und dem relativ langen Gasableitungsrohr zu Versuchsbeginn vorhandene Luft wird durch die bei der Gärung entstehenden Gase allmählich verdrängt und gelangt somit in das zu analysierende Gasgemisch. Eine derartige Gegenüberstellung der Zusammensetzung des durch Rein- und Mischkulturen erhaltenen Gases wurde erstmalig von IMSCHENEZKI durchgeführt. Damit ist die Behauptung bewiesen, daß Methan bei der Cellulosegärung stets in sekundären Prozessen gebildet wird. Die OMELJANSKlschen Kulturen enthielten wahrscheinlich neben den Celluloseformen auch noch andere, methanbildende Bakterien. Für diese Mikroben ist die Bezeichnung „methanbildende" Bakterien richtiger als „methanoxydierende" Bakterien. Letzterer Name sollte den tatsächlich methanoxydierenden autotrophen Organismen vorbehalten bleiben. Die Abwesenheit von Methan unter den gasförmigen Gärungsprodukten haben auch andere Autoren an Reinkulturen mesophiler (CLAUSEN, 1931; KHOÜVINE, 1923, 1934) und thermophiler (MCBEE, 1948, 1950) Cellulosebakterien festgestellt. Demgegenüber stehen Angaben aus der neueren Literatur, nach denen bei der Cellulosegärung doch Methan gebildet werden soll. Alle diese Arbeiten sind jedoch mit Mischkulturen durchgeführt worden, so daß nach wie vor eine sekundäre Herkunft des Methans angenommen werden muß. Eingehender soll die Frage der sogenannten Methangärung der Cellulose im Abschnitt über die Physiologie der mesophilen Cellulosebakterien erörtert werden. Es kann aber hier schon festgestellt werden, daß die durch die Tätigkeit der thermophilen anaeroben Cellulosebakterien gebildeten gasförmigen Produkte stets nur aus Wasserstoff und Kohlendioxyd bestehen. Reinkulturen bilden unter keinen Umständen Methan. Leider ist diese Tatsache in einer Reihe moderner Lehrbücher der Mikrobiologie noch nicht entsprechend berücksichtigt worden. In diesen wird immer noch von einer Methanbildung bei der Cellulosegärung gesprochen. d) Die Vergärung der Glucose Wie bereits mehrfach erwähnt wurde, beginnt die Gärung der Cellulose mit einer Hydrolyse des Polysaccharids. J e günstiger die Entwicklungsbedingungen für die Bakterien sind, desto rascher verläuft dieser Prozeß. Von theoretischem Interesse ist deshalb die Frage, inwieweit eine Reinkultur von Cellulosebakterien in der Lage ist, die Hydrolysenprodukte, insbesondere die Glucose, zu vergären. Zu diesem Zwecke sind nachstehend beschriebene Versuche durchgeführt worden. 250 ml-Rundkolben mit 160 ml Medium VL, das an Stelle der Cellulose 2% Glucose enthielt, wurden dreimal bei 100°C sterilisiert und dann mit je 16 ml einer jungen, dreitägigen Kultur beimpft, die im gleichen Medium gezüchtet worden war.

213

B. Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

Nach kräftigem Durchschütteln wurde die Hälfte (80 ml) jeder Kultur in große, weite, oben etwas ausgezogene Reagenzgläser übergeführt, die darauf evakuiert, zugeschmolzen und bei 60° C aufbewahrt wurden. Der Rest des Kolbeninhaltes diente für Kontrollanalysen (Bestimmung von Zucker, Alkohol und flüchtigen Säuren). Diese Blindwerte sind später bei der Auswertung der Versuche zu berücksichtigen. Nach zehn Tagen wurden die Ansätze geöffnet und die Kulturen zunächst mit Hilfe von Fleischbrühe-Pepton auf Reinheit geprüft. Wenn auf diesem Medium kein Wachstum zu beobachten ist, so handelt es sich bei der vorliegenden Kultur um eine Reinkultur. Glucose wird weniger intensiv vergoren als Cellulose; deshalb konnte eine Gasentwicklung nur in den ersten drei Tagen beobachtet werden. Aus dieser Tatsache ist zu ersehen, daß auch in vorliegendem Falle, wie bei einigen anderen bakteriellen' Gärungen, unmittelbar durch Bakterieneinwirkung gebildete Hydrolysenprodukte besser vergoren werden als künstlich zugesetzte Stoffe. Die Resultate dieser Versuche sind in der Tabelle 29 wiedergegeben. Wie die Tabelle zeigt, vergären die thermophilen Cellulosebakterien die Glucose stets unter Entwicklung von Alkohol und Säuren. Im Laufe von zehn Tagen werden jedoch nur 13,1 bis 22,3% der Glucose abgebaut, wogegen bei Verwendung von Cellulose als Substrat bereits nach sechs Tagen 58% der eingesetzten Cellulose zerstört sind. T a b e l l e 29 Vergärung von Glucose durch Reinkulturen thermophiler Cellulosebakterien Versuchsnummer 1

2

ohne Bakt. mit Bakt. ohne Bakt. mit Bakt. Glucosegehalt des Mediums (g) ... . Menge an vergorener Glucose (g) . . Menge an vergorener Glucose (Prozent) Alkoholgehalt (g) Alkoholgehalt (Prozent) Alkoholgehalt (in Prozent der vergorenen Glucose) Säuregehalt (g) Säuregehalt (Prozent) Säuregehalt (in Prozent der vergorenen Glucose)

1,630

—

1,652

0,0099 0,012

0,214 13,1 0,0640 0,080

0,0063 0,007

0,028 0,035

25,3 0,109 0,137

0,023 0,029

— —

38,1

— —

—

—

—

0,369 22,3 0,0406 0,050 9,2 0,292 0,365 72,8

Im Zusammenhäng mit der Aufstellung einer Kohlenstoffbilanz wurde bereits erwähnt, daß bei einer derartig raschen Vergärung der Cellulose stets eine Ansammlung von Zuckern im Medium stattfindet; dabei werden mehr als 50% des ursprünglich in der zerstörten Cellulose vorhandenen Kohlenstoffs in Form löslicher Kohlenhydrate wiedergefunden. Die restlichen Hydrolysenprodukte wurden von den Bakterien bereits abgebaut.

214

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Bei der Vergärung der Glucose entstellt Alkohol in Mengen von 25 bis 28% der abgebauten Glucose. Demzufolge bildet sich beim Abbau der Glucose durch die Bakterien mehr Alkohol als bei der Zerstörung der Celluloge. Wie aus der Tabelle 29 hervorgeht, beträgt die Gesamtmenge an Abbauprodukten (Alkohol + Säuren) 63,4 bis 82,0% der vergorenen Glucose. Der Rest blieb bei der Analyse unberücksichtigt; insbesondere erfolgte keine quantitative Bestimmung der gasförmigen Produkte. Bei der Vergärung der Cellulose durch Reinkulturen werden dagegen nur 27,17% der umgesetzten Cellulose zu Alkohol und Säuren oxydiert. Bei der Zersetzung der Glucose durch Cellulosebakterien entstehen also die gleichen Produkte wie bei der Vergärung der Cellulose. Der Prozeß des anaeroben Abbaues der Cellulose verläuft demniach in zwei Stufen. In der ersten wird die Cellulose hydrolytisch gespalten, und in der zweiten findet die Vergärung der gebildeten Hydrolysenprodukte statt. Aus den Versuchen zum anaeroben Abbau der Glucose geht hervor, daß in der zweiten Stufe des Gärprozesses die gleichen Produkte entstehen, unabhängig davon, ob die Glucose durch die Wirkung der Bakteriencellulase entstanden ist oder künstlich zugesetzt wurde. a) D e r E i n f l u ß der G l u c o s e a u f die Gärung der Cellulose Die Beantwortung der Frage, ob die Glucose einen Einfluß auf die Cellulosegärung ausübt,.war angesichts der Fähigkeit der anaeroben Cellulosebakterien zur Glucosegärung außerordentlich wichtig. Es wurden daher zunächst orientierende Versuche unternommen. In Reagenzgläsern befindliches cellulosehaltiges Medium VL wurde mit verschiedenen Mengen an Glucose (0,5; 1 und 2%) versetzt und mit einer Reinkultur beimpft. Es zeigte sich, daß die Gärung der Cellulose in allen Fällen genauso verlief wie im Blindversuch, d. h. ohne Glucosezusatz. Die Gärung der Cellulose wird also durch Glucose nicht gehemmt. Eine andere Frage ist die, ob die zugesetzte Glucose ebenfalls abgebaut wird. Dabei bestehen theoretisch drei Möglichkeiten: 1. die Bakterien zersetzen die Cellulose und vergären nur die dabei entstandene Glucose; 2. zunächst wird die zugesetzte Glucose abgebaut und erst dann die Cellulose angegriffen ; 3. sowohl der Abbau der Glucose als auch die Zerstörung der Cellulose finden gleichzeitig statt. Zur Klärung dieser Frage wurden Versuche durchgeführt, in denen das Medium neben Cellulose auch Glucose enthielt. Unmittelbar vor dem Einbringen des Impfmaterials bestimmte man die im Medium vorhandene Glucose nach BERTRAND und führte dann Zuckerbestimmungen in Kulturen verschiedenen Alters durch. Über die erhaltenen Ergebnisse orientiert die Tabelle 30. Es zeigt sich dabei, daß die Bakterien trotz der Anwesenheit der Glucose im Medium mit der Zersetzung der Cellulose beginnen und die vorhandene Glucose nicht verwerten. In dieser Hinsicht sind die Cellulosebakterien außerordentlich

B, Thermophile, sporenbildende Cellulosebakterien

215

T a b e l l e 30 Die Vergärung der Cellulose in Gegenwart von Glucose Glucosegehalt des Mediums in Prozent

Dauer der Gärung in Stunden

Glucosegehalt der Kultur in Prozent

Cellulosegärung

0,234 0,234 0,234 0,234 0,251 0 251 0,251 0,251

24 24 48 48 48 48 72 72

0,212 0,227 0,230 0,224 0,235 0,236 0,113 0,110

+ + + + + + + +

spezialisiert, so daß man in der cellulolytischen Wirksamkeit ihre Hauptfunktion erblicken kann. Im Verlauf der Kultivierung müßte der Glucosegehalt des Mediums infolge der Hydrolyse der Cellulose ansteigen. Dies ist jedoch, nicht der Fall. Die Bakterien bauen später sowohl die Hydrolysenprodukte als auch die zugesetzte Glucose ab. Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden hat sich die Gesamtmenge an Glucose bereits erheblich verringert. 5. Die Systematik der thermophilen anaeroben Cellulosebakterien Die Mikroorganismen passen sich den verschiedensten Umweltbedingungen an. Da diese in der Natur sehr mannigfaltig sind, ist es nicht verwunderlich, daß ein und dieselbe Art in Form verschiedener ökologischer Rassen existieren kann. Dieser Umstand wird von den Systematikern nicht immer genügend beachtet. Oft werden einzelne ökologische Rassen ohne ausreichende Begründung als selbständige Arten angesehen. Grundlage für derartige Einordnungen sind gewöhnlich ökologischphysiologische Merkmale wie Osmophilie, Acidophilie oder Thermophilie der Bakterien, d. h. Eigenschaften, die durch Anpassung der Mikroben an diese oder jene Lebensbedingungen entstanden sind. Ferner besteht auch dann kein Grund für die Aufstellung einer besonderen Art, wenn sich die eine oder andere Rasse einer, gut bekannten Art an neue Umweltbedingungen angepaßt hat. Die Versuche, unter den desulfurierenden Bakterien thermophile und mesophile Arten aufzufinden, verliefen deshalb negativ, weil alle thermophilen Formen nur Rassen der gleichen mesophilen Art darstellen. Ein ausgezeichnetes Beispiel für eine derartige ökologische Wandlungsfähigkeit ist die von BROZKAJA (1947) festgestellte Existenz einer thermophilen Rasse der Art Bac. mycoides, die in allen übrigen Merkmalen mit den mesophilen Rassen dieser Art übereinstimmte. Es gibt noch mehrere derartige Beispiele, die alle beweisen, daß die thermophilen Formen lediglich ökologische Rassen der mesophilen Art darstellen. Vorstehende Erörterungen treffen in vollem Umfang auch für die Cellulosebakterien

216

II. Anaerobe Cellulosebakterien

zu. Hinsichtlich der Morphologie, Physiologie und Entwicklungsgeschichte sind sich die thermophilen und mesophilen Cellulosebakterien außerordentlich ähnlich. Aus diesem Grunde besteht auch keine Veranlassung dazu, die thermophilen anaeroben Cellulosebakterien als besondere Arten anzusehen. In der Literatur wurden viele cellulosezersetzende thermophile Bakterien beschrieben, z. B. Clostridium thermocellum, C. cellobioparus, Terminosporus thermocellulolyticus, Bac. cellulosae dissolvens, ein von ÖNIESZKO isolierter, aber nicht näher bezeichneter Bacillus, u. a. m. Nach den Beschreibungen sind alle diese Bakterien miteinander identisch und müssen demnach einer einzigen Art zugeordnet werden. Vergleicht man die Eigenschaften der mesophilen und thermophilen anaeroben Bakterien, so fällt auf, daß sie einander außerordentlich ähnlich sind. IMSCHENEZKI macht daher den Vorschlag, alle anaeroben Cellulosebakterien in einer einzigen Art zusammenzufassen und sie zu Ehren des russischen Mikrobiologen W. L. OMELJANSKI als Bacillus omelianskii zu bezeichnen. Diese Vereinfachung in der Systematik der anaeroben Bakterien wurde schon früher von V. M E Y E R vorgeschlagen und kann hier nur voll und ganz unterstützt werden. Zur genaueren Bezeichnung der thermophilen Formen, d. h. zur Charakterisierung des positiven Verhaltens der gegebenen Rasse gegenüber höheren Temperaturen, muß es dann folgendermaßen heißen: Bac. omdianskii var. thermophilus. Die Notwendigkeit, alle anaeroben Cellulosebakterien in einer einzigen Art zusammenzufassen, ist schon früher erkannt worden. In sämtlichen Arbeiten werden als dominierende Form die charakteristischen, dünnen, schwach gekrümmten Stäbchen mit abgerundeten oder ovalen endständigen Sporen beschrieben. Die Spore befindet sich stets an einem Ende des Stäbchens, worauf die nicht sehr glücklich gewählte Bezeichnung Terminosporus zurückzuführen ist. Die endständige Anordnung der Sporen ist ein außerordentlich sicheres Merkmal für die anaeroben Cellulosebakterien, wovon man sich leicht durch einen Vergleich zwischen der Entwicklungsgeschichte der Art Oranulobacter pectinovorum (IMSCHENEZKI, 1 9 3 4 ) und der Morphologie der anaeroben Cellulosebakterien überzeugen kann. Dieser Umstand ist insofern von Bedeutung, als viele Autoren (VLLJOEN, F R E D U. PETERSON, 1 9 2 6 ; TETRAULT, 1 9 3 0 ; M C B E E , 1 9 4 8 , 1 9 5 0 ) die Bezeichnung Clostridium für die anaeroben Cellulosebakterien anwenden. Diese Bezeichnung trifft aber in keiner Weise zu, da bei der Sporenbildung im Falle der plektridialen anaeroben Cellulosebakterien niemals spindelartige Formen auftreten. Diese Frage soll im Abschnitt über die Systematik der.mesophilen Cellulosebakterien nochmals berührt werden. Die Annahme, daß in der Natur nur mesophile und nur thermophile Formen der Cellulosebakterien existieren, die einen mit einer niedrigen, die anderen mit einer hohen optimalen Entwicklungstemperatur, hat sich als falsch erwiesen. Tatsächlich gibt es unzählige Zwischenformen, und die Behauptung ist keineswegs übertrieben, daß in der Natur Bakterien mit den verschiedensten optimalen Entwicklungstemperaturen zwischen 25 und 65° C vorkommen. Auf Grund vieler Merkmale ist die vorliegende Art klar von anderen anaeroben kohlenhydratvergärenden Bakterien abgegrenzt. Sie unterscheidet sich auch deut-

C. Mesophile Cellulosebakterien

217

lieh von der gesamten Gruppe der Aceton-Buttersäurebakterien insofern, als sie nicht in der Lage ist, Stärke zu vergären. Die Cellulosebakterien werden durch Jod nicht blau gefärbt, sie besitzen eine andere Morphologie und vergären Cellulose, wozu die Vertreter der ersteren Gruppe nicht befähigt sind. C. Mesophile Cellulosebakterien 1. Sporenbildende Bakterien Fast in allen Arbeiten über die Biologie der mesophilen anaeroben Cellulosebakterien wird behauptet, daß die Erreger der Cellulosegärung zu der Gruppe der sporenbildenden Bakterien gehören. IMSCHENEZKI kommt auf Grund seiner eigenen Arbeiten ebenfalls zu der Ansicht, daß bei der Herstellung von Anreicherungskulturen im allgemeinen nur die Bakterien mit endständigen Sporen zur Vermehrung befähigt sind. Die benutzten Methoden sind jedoch insofern nicht ganz einwandfrei, als nämlich nur Arten wachsen können, die den gegebenen Verhältnissen angepaßt sind. Es erhebt sich natürlich die Frage, ob die Gärungsprodukte der Cellulose nicht die Entwicklung anderer Formen behindern, die sonst ebenfalls in der Lage wären, Cellulose zu zersetzen, jedoch eine andere Physiologie besitzen. Eine Abgrenzung der verschiedenen Cellulosebakterienformen in einer flüssigen Anreicherungskultur ist unmöglich. Ebenso ist eine mengenmäßige Bestimmung der anaeroben Formen auf festen Nährmedien derart schwierig, daß dieses Verfahren nicht benutzt wird. Es ist deshalb nicht ausgeschlossen, daß in der Natur neben den klassischen Erregern der Cellulosegärung, den sporenbildenden Bakterien mit endständigen Sporen, auch andere Formen vorkommen, die sich der Untersuchung infolge der unzulänglichen Methoden bisher entzogen haben. Nur so läßt sich das in letzter Zeit beobachtete Auftreten sporenloser celluloseaktiver, anaerober Bakterienund sogar Kokkenformen erklären. Zweifellos wird man durch weitere Untersuchungen entscheiden können, ob unter den Mikrokokken und Streptokokken auch anaerobe Formen existieren. Obwohl diese Literaturangaben nicht unberücksichtigt bleiben dürfen, sind doch die typischsten und häufigsten Formen die' von OMELIANSKI (1895, 1897, 1902, 1904) bzw. OMELJANSKI (1901) beschriebenen Bakterien. In der Geschichte jedes beliebigen wissenschaftlichen Problems hat es eine Periode gegeben, die der sogenannten klassischen, stets neue Gedankengänge bringenden Forschung voranging. So war es ganz natürlich, daß die biologische Zersetzung eines in der Natur derart häufigen Stoffes, wie ihn die Cellulose darstellt, für die Biologen und Chemiker in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts kein besonders interessantes Gebiet war. Anläßlich ihrer Beobachtungen über die Zersetzung der verschiedensten pflanzlichen Gewebe fiel ihnen unter anderem auch auf, daß die Zellwand zerstört wird und mit Bakterienzellen bedeckt ist. Selbstverständlich können an der Maceration der Pflanzengewebe die in physiologischer Hinsicht verschiedensten Bakterien beteiligt sein. Es ist deshalb nicht verwunderlich, daß sich die Aufmerksamkeit der ersten Forscher denjenigen Formen zuwandte, die bereits bekannt waren.

218

II. Anaerobe Cellulosebakterien

1865 fand T R É C U L (1865, 1867), daß an der Maceration Bazillen mitwirken, deren Zellen durch Jod blau gefärbt werden. Er nahm an, daß mehrere Arten dieser Bazillen existieren, die er in der Gattung Amylobacter zusammenfaßte. Im Laufe der nächsten 35 Jahre nahm man an, daß die Erreger der Cellulosegärung den AmylobacterFormen ähnlich sind. Diese-Ansicht wurde vor allem von VAN TLEGHEM (1877,1879), HOPPE-SEYLER (1883, 1886) und a n d e r e n v e r t r e t e n .

Bereits 1891 wurden die Untersuchungen HOPPE-SEYLERs von dem russischen Wissenschaftler D. I. IWANOWSKI (1891) im Zusammenhang mit der Tätigkeit der Mikroorganismen im Boden einer Kritik unterzogen. Letzterer behauptete, daß Amylobacter nicht als Erreger der Methangärung der Cellulose in Betracht kommen kann, da es nicht angängig ist, nur von äußeren Ähnlichkeiten ohne Berücksichtigung der Gärungsprodukte auszugehen. Nach seiner Meinung war für die Gärung der Cellulose ein besonderer Mikroorganismus verantwortlich, dessen Entdeckung der Zukunft überlassen bleiben mußte. Bekanntlich hat dann OMELJANSKI diese Aufgabe gelöst. Er begann bereits 1894 mit seinen Arbeiten über die anaerobe Zersetzung der Cellulose. Mit Hilfe der von WlNOGRADSKI vorgeschlagenen elektiven Medien, die als einzige Kohlenstoffquelle Cellulose enthalten, gelang es OMELJANSKI, die bis dahin verbreitete Vorstellung zu widerlegen, daß der Erreger der anaeroben Cellulosezersetzung zur Gattung Amylobacter gehöre. Er konnte die Existenz spezialisierter und in der Natur weitverbreiteter cellulosezersetzender Bakterien beweisen. In einer Reihe von Arbeiten, die zwischen 1895 und 1902 veröffentlicht wurden, legte er die Ergebnisse seiner Untersuchungen vor, aus denen die Existenz sporenbildender cellulosevergärender Bakterien einwandfrei hervorgeht. Seit dem Erscheinen der ersten Arbeiten OMELJANSKls sind 60 Jahre vergangen. In dieser Zeit konnten fast alle sich mit der Cellulosegärung beschäftigenden Forscher Kulturen sporenbildender Bakterien anlegen, die mit den von OMELJANSKI beschriebenen identisch oder ihnen zumindest ähnlich sind. Die Bedeutung seiner Arbeiten kann nicht hoch genug eingeschätzt werden, insbesondere wenn man berücksichtigt, daß die Arbeiten in einer Zeit durchgeführt wurden, in der das Problem der Cellulosezersetzung eben erst begann, aktuell zu werden. Das Auffinden des Erregers der Cellulosegärung ist neben der Entdeckung der nitrifizierenden Bakterien und des Bacillus der Flachsröste eines der Hauptverdienste des russischen Mikrobiologen. Die meisten der in den letzten 50 Jahren isolierten und in der Literatur beschriebenen Kulturen enthalten sporenbildende Bakterien, deren Sporen stets terminal angeordnet sind. Zweifellos sind besonders diese Organismen als die typischen klassischen Erreger der Cellulosegärung anzusprechen, und gerade sie sind in der Natur außergewöhnlich stark verbreitet. Diese Tatsache ist häufig angezweifelt worden, insbesondere von HuNGATE, der im Verdauungstrakt der Wiederkäuer sporenbildende Cellulosébakterien nur sehr selten fand, statt dessen aber cellulosezersetzende sporenlose Bakterien und Kokken in großer Zahl nachweisen konnte. Der Lebensraum der sporenbildenden Formen wäre somit nur der Boden. HUNGATE weist ferner darauf hin, daß bei der Isolierung der Cellulosebakterien gewöhnlich mit Anreiche-

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rungskulturen gearbeitet wird, in denen alle anderen Cellulosebakterien außer den sporenbildenden durch die Abbauprodukte der Cellulose unterdrückt werden. Durch mehrmaliges Übertragen derartiger Anreicherungskulturen werden die sporenlosen und kokkenförmigen Bakterien allmählich verdrängt, so daß sich schließlich nur noch sporenbildende Formen neben den normalen Begleitbakterien vorfinden. Nach H Ü N G A T E wird diese Möglichkeit besonders dadurch bestätigt, daß man bei der direkten Kultivierung von natürlichem Impfmaterial auf festen cellulosehaltigen Medien nicht nur sporenbildende, sondern auch andere Celluloseformen beobachten kann. Obwohl die Möglichkeit einer Cellulosezersetzung auch durch andere, nicht sporenbildende Formen keineswegs bestritten wird, muß man jedoch aus allen Arbeiten über die anaerobe Cellulosezersetzung die Überzeugung gewinnen, daß in der Hauptsache für diesen Gärungsprozeß doch nur die von O M E L J A N S K I beschriebenen oder verwandte Formen in Betracht kommen. Als Beweis können die mittels des Verdünnungsverfahrens durchgeführten Züchtungsversuche dienen, ferner mikroskopische Untersuchungen an Filtrierpapier, das im Festlandboden oder im Boden der Gewässer eingegraben war, sowie an Pflanzengeweben, die einen natürlichen Zersetzungsprozeß durchgemacht hatten. Auch füjr den Verdauungstrakt der Wiederkäuer konnte diese Auffassung in letzter Zeit von L O M O W A (1951) bestätigt werden. Es besteht also kein Grund dafür, die entscheidende Rolle der plektridialen Formen, wie sie seinerzeit von OMELJANSKI beschrieben wurden, abzulehnen. Sie sind tatsächlich die klassischen Erreger der Cellulosegärung. a) Morphologie a) Vegetative Zellen Die Angaben aller Forscher, die sich mit der Morphologie der anaeroben Cellulosebakterien beschäftigt haben, stimmen dahingehend überein, daß deren vegetative Zellen die Gestalt dünner, langer, häufig bogenförmig gekrümmter Stäbchen besitzen. Im folgenden werden die Abmessungen einiger Bakterienformen gegeben. Junge Stadien des Erregers der Wasserstoffgärung der Cellulose: Länge 4,8 JJI; Breite 0,3 bis 0,4 ¡j. (OMELJANSKI, 1899). Ältere Stadien des gleichen Bakteriums: Länge 10 bis 15 ¡x. Erreger der Methangärung: Länge 4 fx; Breite 0,2 [i (Abb. 97a). Junge Zellen von Clostridium cdlobioparus: Länge 3,5 ¡x ; Breite 0,3 bis 0,4 ¡x (HilNGATE, 1944, 1946). Bakterien aus einer Kultur in flüssigem Medium: Länge 2,6 (x; Breite 0,5 ¡x (COWLES und RETTGER, 1931). Vegetative Zellen (ohne nähere Angaben): Länge schwankt je nach dem Alter von 2,5 bis 12,5 (J. (KHOUVINE, 1923, 1934). Bacillus cellulosam fermentans: Länge 1,5 bis 5 ¡x; Breite 0,5 bis 0,7 ¡JL (WERNER, 1926). Nicht näher bezeichnete vegetative Zellen: Länge 10 bis 15 ¡x '(Mittelwert 11,3 |x); Breite 0,5 bis 0,7 fx (häufigster Wert 0,5 |x) (CLAUSEN, 1931). Die Angaben von CLAUSEN sind sehr überzeugend, da sechs Rassen der gleichen Art untersucht wurden. Vegetative Zellen: Länge 4,7 jx; Breite 0,3 bis 0,4 [x (RuBENTSCHIK). In den meisten Untersuchungen wurde also gefunden, daß es sich bei den mesophilen Cellulosebakterien um dünne Stäbchen von 6 bis 10 [x Länge und 0,3 bis 0,4 ¡x

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Breite handelt. Die Angaben über die Größe der Bakterien sind deshalb hier so ausführlich wiedergegeben worden, weil sich die mesophilen Cellulosebakterien einmal durch dieses Merkmal von den Buttersäurebakterien unterscheiden, zum anderen, weil die gleiche Größe der von den verschiedenen Autoren beschriebenen Organismen die Unmöglichkeit bestätigt, sie verschiedenen Arten zuzuordnen. In Kulturen der anaeroben Cellulosebakterien findet man häufig paarweise angeordnete Stäbchen; Ketten werden jedoch nie gebildet (OMELIANSKI, 1902; COWLES u. RETTGER, 1931; KHOÜVINE, 1923, 1934). Bisweilen begegnet man auch langgestreckten oder aufgeblähten Formen. Offenbar handelt es sich dabei um Formen, die durch Vergiftung mit eigenen Stoffwechselprodukten entstehen. ß) Sporenbildung Schon OMELIANSKI (1895, 1902) bzw. OMELJANSKI (1899) hat auf die Verlängerung der vegetativen Zellen in älteren Kulturen anaerober Cellulosebakterien hingewiesen. Wenn die ursprüngliche Länge z. B. 4 bis 8 ¡i, beträgt, so erreicht sie in späteren Stadien 10 bis 15 ¡i.. Darin ist das erste Anzeichen für den Beginn der Sporenbildung zu erblicken. Bei allen in der Literatur beschriebenen plektridialen Formen erfolgt die Entstehung der Sporen in annähernd der gleichen Weise: Nach ihrer Streckung verbreitert sich die Zelle an einem Ende keulenförmig (Abb. 77 b, 78). Diese Aufblähung wird allmählich größer und es entsteht eine große, runde oder ovale Prospore (Abb. 79). Danach verkleinert sie sich wieder, wird zusammengepreßt und verwandelt sich in eine reife, von einer Membran umgebene, glänzende Spore (Abb. 80). Alle Stadien der Sporenbildung lassen sich mit Hilfe des Mikroskops an lebenden Zellen aus verschieden alten Kulturen beobachten. Eine direkte Verfolgung des Prozesses ist leider nicht möglich, da die Cellulosebakterien im Gegensatz zu anderen anaeroben Bakterien streng anaerob wachsen und es gewöhnlich nicht gelingt, im hängenden Tropfen entsprechende Bedingungen zu schaffen. Ein etwas anderes Bild erhält man bei der Beobachtung gefärbter Präparate. Das erste Anzeichen für den Beginn der Sporenbildung ist in diesem Falle das Auftreten eines kleinen, runden, intensiv gefärbten Kernes. Die chromophile Prospore wird allmählich größer, bis sie sich in die reife Spore umwandelt. Danach gelingt es nicht mehr, eine Ansammlung von Kernsubstanz durch Farbstoffe sichtbar zu machen. Die Beobachtungen aller Forscher stimmen dahingehend überein, daß die Spore stets am äußersten Ende der Zelle gelegen ist. Niemals wurde eine Anordnung gefunden, in der die Spore etwas weiter vom Ende entfernt ist. Ferner sind in keinem Fille Sporen entdeckt worden, die an ihrer Spitze eine kleine Ausstülpung besitzen, entsprechend dem Ende der vegetativen Zelle. Derartige Ausstülpungen, die einer Helmspitze ähnlich sehen, kommen nur bei subterminal gelegenen Sporen vor, und zwar stets bei den verschiedensten in der Natur auftretenden plektridialen Nichtcelluloseformen. Einige dieser Arten können als Begleitbakterien der Cellulosebakterien in Anreicherungskulturen gefunden werden. Demzufolge enthalten also die anaeroben Cellulosebakterien niemals subterminal oder zentral gelegene Sporen. Wichtig für die Unterscheidung der Bakterien ist ferner die Tatsache, daß die vegetative Zelle bei der Sporenbildung sich nur in die Länge streckt, keinesfalls aber in

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Abb. 77 a. Junge Zellen des Erregers der Methangärung der Cellulose

Abb. 77 b. Bildung der Sporen von Bac. cellulosae methanicus

Abb. 78. Beinkultur von Bac. omelianskii in Cellulose-Leberbrühe Abb. 79. Anaerobe mesophile Cellulosebakterien Abb. 80. Reife Sporen von Bac. cellulosae methanicus Abb. 81. Spindelförmige Zellen von Amylobacter navícula in Cellulose-Leberbrühe Abb. 82. Durch mesophile Cellulosebakterien zerstörte Filtrierpapierstreifen Abb. 83. Oberflächenkolonie von Bac. omelianskii Agar

auf asparaginhaltigem Fleischbrühe-

Abb. 84. Zerstörung der Cellulose-Agarplatten durch Amylobacter navícula. Hechts das gleiche Medium ohne Cellulose

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ihrem mittleren Teil breiter wird, d. h. keine spindelförmige Gestalt annimmt. Dieses ist ein außerordentlicli sicheres Merkmal für die Trennung der Cellulosebakterien von den ebenfalls häufig in Anreicherungskulturen vorkommenden Buttersäurebakterien. Die Frage nach der Gestalt der Sporen ist recht schwierig zu beantworten. Nach O M E L J A N S K I sind die Sporen des Bacillus der Wasserstoff- und Methangärung stets rund. Die Sporen der Wasserstoffbakterien besitzen aber einen Durchmesser von 1,5 ¡x, während die der Methanbakterien nur 1 fx dick sind. Später wurden in der Literatur ebenfalls Cellulosebakterien beschrieben, die in morphologischer Hinsicht den von O M E L J A N S K I entdeckten verwandt sind, d. h. sie besitzen gleichfalls kugelige Sporen. So konnte z. B. R Ü B E N T S C H I K aus dem Kujalnizki-Liman eine plektridiale Celluloseform mit 1 ¡x dicken, runden Sporen isolieren. Der von H ü N G A T E (1944, 1947) als Clostridium, cellobioparus beschriebene Organismus bildete ebenfalls sphärische, endständige Sporen von 0,9 fi Durchmesser. Ähnliche Formen fand auch V. M E Y E R , der sie daraufhin als „keulenförmige" Bakterien bezeichnete. C L A U S E N (1931) züchtete aus einer Anreicherungskultur den Erreger der Methangärung in Reinkultur und stellte fest, daß er den Wasserstoffbakterien verwandt ist. Bei dieser Gelegenheit beobachtete er ferner, daß stets nur runde, terminal angeordnete Sporen von 1 ¡x Durchmesser entstehen. Hinsichtlich der Anordnung und Morphologie der Sporen stimmen also die Angaben aller zitierten Autoren überein. Demnach befindet sich die Spore stets am Ende des Stäbchens; sie ist rund und ihr Durchmesser beträgt höchstens 1 bis 1,5 (x. Neben diesen Formen gibt es in der Natur aber noch andere Arten oder Rassen, die auch endständige Sporen bilden; diese sind jedoch nicht rund, sondern oval und besitzen etwas größere Abmessungen. Als Beispiel für diese Organismengruppe kann der von K H O U V I N E isolierte und als Bac. cellulosae dissolvens bezeichnete Organismus angeführt werden. Seine Sporen sind oval mit einer kleinen Achse von 2 ¡x und einer großen von 2,5 jx. Bazillen mit ovalen Sporen wurden ferner auch von S L M A K O W A beschrieben. Das Achsenverhältnis betrug in diesem Falle 1 : 1,5 bis 1 :1,7 (x. Ein ähnliches Achsenverhältnis ist auch von W E R N E R beobachtet worden. Infolgedessen muß es zwei verschiedene Typen von Cellulosebakterien geben. Der eine erzeugt kleine runde Sporen, der andere größere ovale. Trotz dieser Ergebnisse scheint es notwendig zu sein, durch weitere Untersuchungen die Richtigkeit der Befunde zu erhärten. Zur Begründung eines derartigen Vorgehens lassen sich folgende Punkte anführen: 1. Von einer Bakterienform mit runden Sporen kann man sicher nur dann sprechen, wenn in der Kultur tatsächlich keine ovalen Sporen nachweisbar sind. Einige Veröffentlichungen enthalten nämlich Abbildungen, in denen sowohl runde als auch ovale Sporen sichtbar sind. Da eine ovale Spore von oben betrachtet eine runde vortäuschen kann, kommt dem Nachweis einer, wenn auch nur geringen Anzahl ovaler Sporen eine gewisse Bedeutung zu. 2. Zur Untersuchung der Sporengestalt werden häufig nur gefärbte Präparate herangezogen. Dabei kann dem Beobachter leicht ein Irrtum unterlaufen insofern,

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

als bei einem Organismus mit ovalen Sporen mitunter die jungen gefärbten Prosporen tatsächlich eine vollkommen runde Gestalt besitzen. Dies ist vielleicht auch ein Grund für die Annahme, daß kugelige Sporen gebildet werden. Eine andere mögliche Fehlerquelle ist die Tatsache, daß die Sporen der anaeroben Cellulosebakterien im Gegensatz zu denen vieler anderer Bazillen ohne eine besondere Beize leicht angefärbt werden. Dabei färben sich in erster Linie die Randgebiete der Spore, während die mittleren Bereiche, die meist von runder Form sind, den Farbstoff so gut wie gar nicht aufnehmen. Diese ungefärbten Bezirke können dann fälschlicherweise als runde Sporen angesehen werden. 3. In einigen Kulturen finden sich sowohl runde als auch ovale Sporen. Als typisches Beispiel sei hier eine von WERNER (1926) isolierte Kultur angeführt. Es ist also keineswegs immer leicht zu entscheiden, ob die vorliegende Kultur einer Form angehört, die ovale oder kugelige Sporen bildet. 4. Einen gewissen Einfluß auf die Größe und die Gestalt der Sporen üben auch die Zusammensetzung des Nährmediums und die Kultivierungsbedingungen aus. Wie IMSCHENEZKI und Mitarbeiter beobachteten, sind die Sporen der anaeroben Cellulosebakterien in flüssigen Medien stets größer als auf festen Substraten. Mitunter verbreitert sich auch das in flüssigen Medien oft vorhandene keulenartige Ende der Zelle, in der die Spore liegt, und quillt, wobei die Spore ihre Lage ändert und verschoben wird. Da in diesem Falle nur eines der Ellipsoidenden sichtbar ist, kann leicht der Eindruck entstehen, daß es sich um eine kugelige Spore handelt. Der Einfluß der Züchtungsbedingungen auf die Sporengröße tritt besonders deutlich in den Arbeiten CLAUSENS hervor. Er fand nämlich, daß sich der Sporendurchmesser je nach der Zusammensetzung des Mediums bis zum l,5fachen seines normalen Wertes vergrößern kann. Zur endgültigen Klärung des Problems der Sporengestalt müßten also noch vergleichende Untersuchungen an den unterschiedlichen Stämmen der verschiedenen Autoren durchgeführt werden. Aber schon heute besteht an der Existenz der seltener vorkommenden Varietät mit ovalen Sporen kein Zweifel mehr. Im Zusammenhang mit der Systematik der anaeroben Cellulosebakterien soll dieses Problem nochmals erörtert werden. Nach Ausbildung der fertigen Sporen findet man in der Kultur noch einige Zeit lang reife plektridiale Formen, danach lösen sich die vegetativen Zellen allmählich auf, und die Sporen werden frei. Ein Vergleich zwischen den einzelnen Phasen der ontogenetischen Entwicklung einerseits und den verschiedenen Stadien der Cellulosezerstörung andererseits ergibt folgendes Bild: Im Anfang der Zersetzung ist die Cellulo"sefaser von jungen Zellen bedeckt. Etwas später findet man bereits junge plektridiale Formen mit erheblich verbreiterten Zellenenden. Die für diese Bakterienart so charakteristischen reifen Plektridien lassen sich in den Fasern nicht erkennen. Das sporenhaltige Ende der Zelle ist gewöhnlich von der FaseT abgewandt, wählend sich das andere Ende innig mit der Faser verbindet, wie aus der Abbildung 79 hervorgeht. Freie Sporen treten im allgemeinen nicht innerhalb der Fasern auf, sie fallen heraus und lassen sich unter den amorphen Zerfallsprodukten am Boden des Kultivierungsgefäßes nachweisen.

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Bezüglich der Physiologie der Sporenbildung wurde gefunden, daß alle f ü r eine optimale Bakterienentwicklung notwendigen Faktoren auch f ü r die Sporenentstehung verantwortlich sind. Insbesondere werden nach einer raschen Vermehrung der Bakterienzellen und entsprechend intensiven Cellulosezersetzung sehr viele Sporen erzeugt. Bei einer langsamen Gärung der Cellulose werden in der Kultur auch nur wenig Sporen gebildet. Ist ein Medium f ü r die Bakterienentwicklung schlecht geeignet, so läßt sich die Degeneration der Kultur unter anderem an der successiven Verringerung der Sporenanzahl während der weiteren Passagen erkennen. In Nährmedien, denen die für eine normale Entwicklung erforderlichen Vitamine und Stickstoffverbindungen fehlen, tritt eine fortschreitende Verlangsamung der Sporenbildung ein. Diese Beobachtungen erklären auch die Ergebnisse COWLES' und RETTGERs (1931), nach denen in Reinkulturen der Cellulosebakterien weniger Sporen vorkommen als in Mischkulturen. Infolge des Fehlens bestimmter vitaminerzeugender Begleitbakterien herrschen nämlich in den Reinkulturen ungünstigere Bedingungen für die Entwicklung der Mikroorganismen. Auch nach IMSCHENEZKI erfolgt die Sporenbildung in Anreicherungskulturen wesentlich intensiver. Eine besondere Stellung unter den anaeroben Cellulosebakterien nimmt der von CLAUSEN isolierte Organismus Amylobacter navicula ein. Es handelt sich hierbei um eine typisch klostridiale Form, die während der Sporenbildung die Gestalt einer Spindel annimmt (Abb. 81). Ihre Sporen sind zylindrisch mit einer Länge von 1,8 bis 2 (i und einer Breite von 1 [x. Die Sporenbildung erfolgt sowohl in flüssigen als auch auf festen Medien gleich gut. Plektridiale Formen treten niemals auf. y) Beweglichkeit Die Frage, ob die Zellen der anaeroben Cellulosebakterien beweglich sind, läßt sich nur schwer beantworten. Die lebenden Zellen sind bei mikroskopischer Beobachtung gewöhnlich unbeweglich. Die Annahme, daß im hängenden Tropfen die Beweglichkeit infolge des Eindiffundierens von Sauerstoff verlorengeht, ist ziemlich unwahrscheinlich, da andere anaerobe Organismen, wie z. B. die Buttersäurebakterien, unter den gleichen Bedingungen ihre Beweglichkeit beibehalten. Offenbar gehören die Cellulosebakterien zu den relativ unbeweglichen Formen. Vom teleologischen Standpunkt aus könnte man eine derartige Unbeweglichkeit insofern „erklären", als die Organismen auf Grund ihrer ökologischen Eigenart, d. h. infolge der „Notwendigkeit", unbeweglich auf der Faseroberfläche zu verbleiben, die aktive Beweglichkeit im Laufe ihrer Entwicklungsgeschichte eingebüßt haben. Ein „Bedürfnis" zu rascher Ortsveränderung in der Flüssigkeit besteht nicht, da die von ihnen gebildete Cellulase nicht in das Medium diffundiert, sondern nur dort wirksam ist, wo sich die Zellen befinden, d. h. also auf der Faseroberfläche. Nach Beobachtungen von CLAUSEN sowie von R. MEYER sind die jungen Zellen beweglich. Beim Eintritt in das Stadium der Sporenbildung werden sie weniger beweglich, und die reifen Plektridien «schließlich sind stets unbeweglich. Da vielfach nur letztere untersucht wurden, kamen einige Autoren (COWLES u. RETTGER, 1931; KHOUVINE, 1923, 1934) zu dem Schluß, daß die Cellulosebakterien überhaupt unbeweglich sind.

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Geißeln konnten auch, durch Anfärbung nach den verschiedensten Verfahren meist nicht nachgewiesen werden (CLAUSEN, 1931; KHOUVINE, 1923, 1934). WERNER (1926) fand dagegen unter Benutzung der PÖPPLERschen Methode bei den von ihm isolierten Bakterien peritrich angeordnete Geißeln. HÜNGATE (1944, 1947) stellte ebenfalls die Anwesenheit von ein bis vier Geißeln an verschiedenen Stellen der Zellenoberfläche fest. Möglicherweise hat der Autor aber lediglich die aus mehreren Geißeln bestehenden „Zotten" angefärbt, so daß die Anzahl der vorhandenen Geißeln noch größer ist. Nach HÜNGATE bewegen sich die anaeroben Cellulosebakterien auf spiralenförmigen Bahnen vorwärts, d. h. ihre Zellen führen außer der Tfanslation noch Drehbewegungen um ihre Längsachse aus. Der genannte Autor hat die Beweglichkeit der Cellulosebakterien mit dem Verhalten der Vibrionen verglichen, was jedoch kaum zutreffen dürfte. Die jungen Zellen der klostridialen Celluloseform, Amybbacter navicula, sind nach CLAUSEN (1931) beweglich. Sowie die Zellen aber in das Stadium der Sporenbildung eintreten, anschwellen und Reservestoffe ablagern, verschwindet die Beweglichkeit. b) C y t o l o g i e Nach OMELIANSKI (1902) geben die Zellen der anaeroben Cellulosebakterien mit Jod niemals eine rotbraune oder blaue Färbung. Darin unterscheiden sie sich deutlich von den Buttersäurebakterien. Später wurde diese Beobachtung auch von allen anderen Autoren bestätigt. Demnach enthalten die anaeroben Cellulosebakterien weder Glycogen noch Jogen oder Amylose. Lediglich CLAUSEN (1931) fand bei Anwendung von Jod eine weinrote Färbung, die aber möglicherweise auf die Benutzung einer zu starken Jodlösung zurückzuführen ist. Ähnlich allen anderen streng anaeroben Bakterien enthalten auch die Celluloseformen keine sichtbaren Fetttröpfchen. Ihr Protoplasma ist völlig homogen und frei von glänzenden Lipoproteinkörpern; Metatjhromatin fehlt ebenfalls. Als einziger veröffentlichte R. MEYER (1938,1942) eine ausführliche Arbeit über die Lokalisation und die optischen Eigenschaften von Metachromatinkernen in den Zellen der Cellulosebakterien. Andere Forscher haben derartige Kerne nicht gefunden. Da die MEYERschen Kulturen zweifellos verunreinigt waren, dürfte dieser Beobachtung keine große Bedeutung zukommen. Dagegen verdient eine weitere Angabe desselben Autors einige Beachtung. Er fand nämlich, daß die Zellen der anaeroben Cellulosebakterien im Dunkelfeld durch das von ihnen gebildete Pigment orange gefärbt sind. Durch dieses Merkmal unterscheiden sie sich von den ebenfalls im Präparat vorhandenen Zellen der Art Bac. mycoides. Die Zellen der mesophilen Cellulosebakterien sind im allgemeinen gramnegativ (KHOUVINE, 1 9 2 3 , 1 9 3 4 ; COWLES u . RETTGER, 1 9 3 1 ; WERNER, 1 9 2 6 ; HUNGATE,

1944, 1947). Lediglich CLAUSEN berichtet darüber, daß er in einer von ihm untersuchten Kultur junge Zellen gefunden hat, die grampositiv waren. Mit zunehmendem Alter nimmt allerdings auch hier die Anfärbbarkeit nach GRAM ab. Die anaeroben Cellulosebakterien lassen sich im Gegensatz zu den aeroben mit basischen Farbstoffen, wie Methylenblau, Fuchsin u. a. ausgezeichnet anfärben.

C. Mesophile Cellulosebakterien

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In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß die einzige klostridiale Form, Amylobacter navicida, sich auch in cytologischer Hinsicht vollkommen anders verhält. In stärkehaltigen Nährmedien geben die Zellen mit Jod eine Blaufärbung. Entweder enthalten sie einzelne Kerne oder Kernansammlungen, die mit Jod eine Blaufärbung zeigen, oder die gesamte Zelle färbt sich diffus. Die mikroskopische Beobachtung liefert demnach das gleiche "Bild wie im Falle von Bac. amylobacter. Aber auch auf anderen Medien kultivierte Zellen der A r t A. navicula lassen sich mit Jod rotbraun oder blau anfärben. c) K u l t i v i e r u n g s m e r k m a l e a) Das Wachstum in flüssigen Medien In flüssigen cellulosehaltigen Substraten setzt die Gärung nach Ablauf einer bestimmten Inkubationszeit ein. Die Dauer dieser Periode ist von vielen Faktoren abhängig. Große Bedeutung kommt in diesem Zusammenhange der Menge des Impfmaterials zu. Impft man beispielsweise das Nährmedium mit einem Tropfen Impfmaterial, so beginnt die Gärung erst nach einem Zeitraum von drei bis vier Wochen (KHOUVINE). Wird dagegen die fünffache Menge angewandt, so setzt die Gärung bereits nach zwei bis drei Tagen ein. Diese Erscheinung hängt erstens zweifellos mit einer rascheren Herabsetzung des Redoxpotentials, zweitens mit der Zuführung von Vitaminen und Stickstoffverbindungen durch das Impfmaterial zusammen. Es ist bekannt, daß die Inkubationszeit mit zunehmender Anpassung des Mediums an die Bedürfnisse der Bakterien kürzer wird. Zur Verringerung der Inkubationszeit ist ferner die Einhaltung einer optimalen Temperatur und streng anaerober Bedingungen erforderlich. IMSCHENEZKI fand etwas längere Inkubationszeiten: in Anreicherungskulturen gewöhnlich vier bis sechs Tage, in Reinkulturen bei Verwendung optimaler Medien drei bis vier Tage. Nach WERNER beträgt die Inkubationszeit drei bis neun Tage; der Autor weist jedoch darauf hin, daß sich diese Inkubationszeit mitunter bis auf 50 Tage ausdehnen kann. Bei der Gärung werden nur relativ kleine Gasmengen gebildet. Der Prozeß verläuft bei den mesophilen Formen wesentlich langsamer als bei den thermophilen Cellulosebakterien. Letztere bilden auf der Flüssigkeitsoberfläche rasch eine Schaumkappe, die aus Gasblasen und zersetzten Celluloseresten besteht. I m Falle der mesophilen Gärung entsteht gewöhnlich keine derartige Kappe, und die Cellulosereste bleiben am Boden des Gefäßes zurück. Das angegriffene Filtrierpapier wird schleimig und nimmt eine gelbe, orange oder graugelbe Farbe an. Bei sehr langsamer Zersetzung kann die Pigmentbildung mitunter auch fehlen; das Papier erscheint in diesem Fall spitzenartig durchbrochen. Die Abbildung 82 zeigt derartige Streifen, wie sie seinerzeit von OMELJANSKI erhalten wurden. Für die Zersetzungsgeschwindigkeit der Cellulose ist in erster Linie die Zusammensetzung des Nährmediums verantwortlich. So verläuft die Gärung in synthetischen Medien sehr langsam, auch wenn die Cellulosezerstörer in Symbiose mit anderen Mikroorganismen kultiviert wurden. Nach OMELJANSKI. zersetzt der Bacillus der Wasserstoffgärung in der außergewöhnlich langen Zeit von fünf bis sieben Monaten 15 Imschenezki, Mikrobiologie

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

nur 79,4 bis 84% der Cellulose. Sechs Passagen in sieben Monaten sind erforderlich, um eine Zerstörung von 96,24% zu erzielen. Dagegen verläuft der Celluloseabbau bei Verwendung optimaler Nährmedien, die organisch gebundenen Stickstoff und Vitamine enthalten, wesentlich rascher. So zersetzte beispielsweise eine Reinkultur der Art Bac. cellulosae dissolvens innerhalb von sechs Tagen die gesamte Cellulose und verwandelte sie in eine „pulverförmige'' amorphe Masse (KHOUVINE, 1923, 1934). Nach IMSCHENEZKI vermehren sich die anaeroben Cellulosebakterien in kompliziert zusammengesetzten Nährmedien ausgezeichnet. Ein schneller Abbau der Cellulose findet in folgenden Substraten statt: Fleischbrühe-Pepton, Medien mit Fäkalienextrakt, Fleischbrühe mit Asparagin, Hefewasser usw. In folgenden cellulosefreien Medien fand KHOUVINE (1923, 1934) kein Wachstum der mesophilen Cellulosebakterien: Fleischbrühe-Pepton mit und ohne Glucosezusatz, Hühnerbrühe, Leberbrühe, Fleischbrühe-Pepton-Gelatine, geronnenes Blutserum, Milch. Die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen blieb bei einer Kultivierung auf derartigen Substraten jedoch erhalten, was sich durch entsprechende Impfversuche nachweisen ließ. Im Gegensatz zu anderen Autoren konnte KHOUVINE in einem aus Fleischbrühe-Pepton-Cellulose oder Leberbrühe-Cellulose bestehenden Medium kein ständiges Wachstum der Cellulosebakterien erhalten. Bei Verwendung von cellulose- bzw. glucosehaltigem Fleischbrühe-Pepton setzte zwar eine Gärung ein, die j edoch während mehrerer Passagen immer schwächer wurde, was auf eine Degeneration der Kultur z u r ü c k z u f ü h r e n ist. In OMELJANSKlschem Medium mit Zusätzen von Pepton oder Ammoniumsulfat fand überhaupt keine Entwicklung statt. Ausgezeichnet entwickeln sich die anaeroben Cellulosebakterien in asparaginhaltiger Fleischbrühe mit Cellulose oder in cellulosehaltiger Leberbrühe (CLAUSEN, 1931). COWLES und RETTGER (1931) berichten, daß in cellulosehaltiger Fleischbrühe

mit Peptonzusatz ein gutes Wachstum möglich ist; die Cellulose wird in diesen Fällen innerhalb von drei bis fünf Tagen zerstört. Zur Züchtung der mesophilen Cellulosebakterien wurden also lediglich eiweißhaltige Medien verwendet. Eine Ausnahme bilden einige Untersuchungen von WERNER (1926), der eine langsame Vergärung der Cellulose in synthetischem OMELJANSKlschen Medium beobachtete. Verschiedene Anzeichen, auf die noch näher einzugehen ist, sprechen dafür, daß eine Mischkultur vorlag und nur aus diesem Grunde eine Entwicklung auf dem mineralischen Medium möglich war. Alle vorstehenden Ausführungen gelten nur für die Reinkulturen der Cellulosebakterien, da sich die letzteren im Falle einer Symbiose mit anderen Bakterien auch in relativ primitiven Nährmedien entwickeln können. Als Beispiel sei hier eine Beobachtung von COWLES und RETTGER (1931) angeführt, die nur dann ein Wachstum auf synthetischen Medien erhielten, wenn gleichzeitig das Impfmaterial auch Zellen von Bact. aerogenes enthielt. Wird an Stelle des mineralischen Substrats ein anderes Nährmedium (Fleischbrühe-Pepton mit Cellulose) benutzt, so entwickelt sich dieselbe Reinkultur ganz ausgezeichnet. Wie bereits erwähnt, siedeln sich die Cellulosebakterien auf der Oberfläche der Cellulosefasern an. Die Flüssigkeit oberhalb der Papierstückchen bleibt deshalb stets klar. Beobachtet man trotzdem eine Trübung, so kann dieses Zeichen als ein sicherer

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Beweis für die Anwesenheit von Fremdbakterien gewertet werden. Erst gegen Ende des Gärprozesses entsteht am Boden des Gefäßes eine Trübung, die von den amorphen Überresten der zerstörten Cellulose hervorgerufen wird. Weniger spezialisierte Celluloseformen verhalten sich gegenüber den verschiedenen flüssigen Nährmedien ganz anders. So gedeiht z. B. Amylobacter navicula nicht nur in cellulosehaltiger Leberbrühe ausgezeichnet, wobei eine stürmische Gärung hervorgerufen wird, sondern auch auf einem aus Roggen zubereiteten Substrat, ferner auf Kartoffelstücken, die mit Wasser übergössen sind, sowie in einem mineralischen Medium mit 0,2% Glucose und 0,3 bis 0,5% chemisch reiner Cellulose (CLAUSEN, 1931). Bei Verwendung des letzteren Mediums tritt nach etwa 24 Stunden die bekannte Schaumkappe auf. Amylobacter navicula unterscheidet sich von den spezialisierten Celluloseformen durch seine Fähigkeit, in stärkehaltigen Medien zu wachsen und die Stärke zu zersetzen. Von Amylobacter navicula befallenes Filtrierpapier wird durch Jod hellrot angefärbt. Diese Erscheinung beruht auf einer Anfärbung der in großer Anzahl vorhandenen Bakterienzellen, wodurch der Eindruck entsteht, daß auch das Papier so gefärbt ist. ß) Das Wachstum auf festen Nährmedien Vor 50 Jahren gelang es OMELJANSKI erstmalig, anaerobe Cellulosebakterien auf der Oberfläche fester Nährmedien zu züchten. Bei Versuchen zur Kultivierung von Bakteriensuspensionen auf Kartoffelscheiben beobachtete er das Auftreten kleiner, fast durchsichtiger, tropfenförmiger Kolonien, die ohne Lupe nur schwer erkennbar waren. Es handelte sich um Kolonien von Cellulosebazillen, die nach dem mikroskopischen Befund Degenerationserscheinungen zeigten. Diese äußerten sich in der Bildung von Involutionsformen, verbunden mit einem Zerfall der Zellen und dem Verlust der Fähigkeit zur Sporenerzeugung. Nach OMELJANSKI zeugt auch noch folgender Umstand von dem krankhaften Zustand der Bakterien. Übertragungen der Bazillen aus einer derartigen Kolonie in ein flüssiges Medium waren stets erfolglos. Eine eventuell einsetzende Gärung verlief mit nur mäßiger Intensität und hörte bald auf. Offenbar war das zu diesen Versuchen benutzte Medium für die Entwicklung der Reinkulturen ungeeignet; die Organismen waren nicht in der Lage, sich zu vermehren und die Cellulose anzugreifen. Indem CLAUSEN (1931) keine rein synthetischen Nährböden mehr benutzte und unter streng anaeroben Bedingungen arbeitete, gelang es ihm, isolierte Kulturen anaerober Cellulosebakterien auf festen Medien zu erhalten. Dabei darf das Impfmaterial allerdings nicht auf die Agar-Oberfläche aufgebracht werden, weil in diesem Falle nur dort eine Entwicklung der Cellulosebakterien zu beobachten ist, wo sich auch Begleitbakterien befinden. Infolge der Neigung der anaeroben Cellulosebakterien zur Symbiose bilden sich auf der Oberfläche des Mediums in erster Linie Mischkolonien aus. CLAUSEN empfahl daher, das Impfmaterial in das verflüssigte Nährmedium einzubringen und dieses dann erst in Schalen auszugießen. Bei Verwendung dieser Methodik entstehen nicht nur im Innern des Agars, sondern auch in den oberen Schichten und sogar an der Oberfläche des Substrates isolierte Kolonien 15*

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

der Cellulosebakterien. Um einzelne, besonders gut ausgebildete Kolonien zu erhalten, muß man das im Laufe der Zeit gebildete Kondenswasser entfernen, was man am besten durch Einstellen der Schalen in einen Exsikkator über Calciumchlorid erreicht. Eine weitere, für die Entwicklung der Bakterien ungünstige Erscheinung besteht darin, daß sich während der Evakuierung die Agar-Platte etwas hebt und so vom Boden der Schale absteht. Um dies zu verhindern, schneidet man die Platte mit einem sterilen Skalpell kreuzförmig ein. Unter Beachtung streng anaerober Verhältnisse findet auf asparaginhaltigem Fleischbrühe-Agar, das sich als bestes Medium erwiesen hat, eine ausgezeichnete Entwicklung der Cellulosebakterienkolonien statt. Ebenfalls gute Resultate wurden auf Fleischbrühe-Agar mit Kartoffel- oder Gemüsezusätzen erhalten. Die zur Herstellung des Substrats benutzte Fleischbrühe wurde zuvor durch Saprophytenkulturen „verdaut". Nach CLAUSEN soll man dem Medium weder Calciumcarbonat noch Cellulose zusetzen, weil dadurch das Substrat undurchsichtiger und damit das Aufsuchen und das Studium der Kolonien erschwert wird. Ferner treten bei Anwesenheit von Calciumcarbonat Gasblasen und Risse im Agar auf, die von den während der Cellulosegärung gebildeten Gasen herrühren. Die Kolonien im Innern des Agars besitzen einen Durchmesser von etwa 1 cm, sind von weißlich-grauer Farbe und erinnern an kleine Wattekugeln. Von einem dichteren Zentrum gehen feine und feinste Fäden aus, die anscheinend aus Bakterienschnüren bestehen und der ganzen Kolonie ein lockeres Aussehen verleihen. Eine Vorstellung von den an der Oberfläche befindlichen Kolonien vermittelt die Abbildung 83. Ein ähnliches Aussehen zeigen auch die Kolonien aus den inneren Bereichen des Substrats. Desgleichen haben COWLES und RETTGER (1931) Kolonien mesophiler Cellulosebakterien auf festen Medien erhalten. Das von ihnen benutzte Medium enthielt Fleischbrühe-Pepton mit Dextrin- und Cysteinzusätzen. Vier Tage nach der Beimpfung traten im Vakuum oder in einer Wasserstoffatmosphäre zunächst kleine, kugelige Kolonien mit glatter Oberfläche auf, die allmählich bis zu 0,5 mm Durchmesser anwuchsen und in ihrer Gestalt ebenfalls an Tropfen erinnerten. Der Rand der Kolonien war schwefelgelb gefärbt. Nach der Übertragung in ein flüssiges, cellulosehaltiges Medium konnte eine Gärung der Cellulose beobachtet werden. Relativ leicht konnte auch HUNGATE (1944, 1947) Kolonien im Innern eines festen Mediums erhalten. Er stellte außerdem fest, daß die Form der Kolonien je nach der Art der verschiedenen Cellulosebakterien eine unterschiedliche ist. So wurden z. B. bei direkter Beimpfung eines Cellulose-Hefe-Agars mit Bodenproben büschelartige Kolonien beobachtet. In der Umgebung dieser Kolonien entstand allmählich eine durchsichtige Zone von hydrolysierter Cellulose. In Cellulose-Agar bildet Clostridium cellobioparus Kolonien von unregelmäßiger Gestalt; in zweiprozentigem Glucose-Agar dagegen entstehen sehr dichte, linsenförmige Kolonien. In einem etwas späteren Entwicklungsstadium treten sekundäre linsenförmige Kolonien auf, die gegenüber den primären etwas schräg gelagert sind. Aus dem vorangehenden ist wohl zu ersehen, daß die Aufgabe der Isolierung von Kulturen anaerober Cellulosebakterien auf festen Medien gelöst ist. In den älteren

C. Mesophile Cellulosebakterien

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Arbeiten wurde anscheinend nicht genügend auf die Einhaltung streng anaerober Bedingungen und auf die Verwendung geeigneter Nährmedien geachtet. Mit der Verbesserung der mikrobiologischen Arbeitsmethoden gelang es im Laufe der Zeit, isolierte Kulturen einiger Mikroben auf festen Medien zu erhalten, ein Erfolg, der bis dahin für unmöglich gehalten wurde. Es handelt sich hierbei um die nitrifizierenden Bakterien, die aeroben Celluloseformen der Gattung SporocytopJiaga und die mesophilen anaeroben Cellulosebakterien. Lediglich KHOUVINE konnte auf verschiedenen festen Medien keine Kolonien erhalten. Nach Ansicht der Forscherin ist dies darauf zurückzuführen, daß die Cellulosebakterien sich nur auf den Fasern ansiedeln. Dieser Erklärung kann man jedoch nicht ohne weiteres zustimmen. Mitunter sollen einige Cellulosebakterien auf festen Medien ein ungewöhnliches Wachstum zeigen. In den Versuchen W E R N E R S beispielsweise entwickelten sich die Bakterien nicht in Fleischbrühe-Pepton-Agar, während in hochgeschichtetem Cellulose-Agar ein normales Wachstum einsetzte. Bei einer Temperatur von 27° C entstanden nach fünf bis sieben Tagen Gasblasen, darauf zeigten sich grauschwarze Punkte, bis schließlich das ganze Medium infolge Schwefelwasserstofferzeugung schwarz wurde. Auf Cellulose-Agar in Petrischalen bildeten sich ebenfalls Kolonien, die jedoch nach einer Übertragung in OMELJANSKlsches Medium keine Vermehrung mehr zeigten. Die WERNERschen Ergebnisse weichen stark von denen anderer Autoren ab. Anscheinend enthielt seine Kultur sulfatreduzierende Begleitbakterien. Folgende Beobachtungen KHOUVINEs und SOETERS' (1935, 1936) müssen noch bestätigt werden: Die Autoren fanden eine Anpassung der mesophilen Cellulosebakterien an verschiedene Existenzbedingungen. Zunächst entwickelte sich die Kultur lediglich in einem Medium, das Glucose und Fäkalienextrakt enthielt. Später zeigte sich auch ein Wachstum in glucosehaltigem Peptonwasser unter anaeroben, danach sogar unter aeroben Verhältnissen. Schließlich entwickelten sich die Bakterien auch in reinem Peptonwasser und in Agar-Schrägkulturen unter aeroben Bedingungen. Die Kultur bestand aus dicken, kurzen, sporenbildenden Bakterien. Das schnelle Anpassungsvermögen und die während der Züchtungsversuche beobachteten außergewöhnlichen morphologischen Veränderungen der Bazillen lassen es als notwendig erscheinen, diese Angaben durch Untersuchungen von dritter Seite nachzuprüfen. Die nicht spezialisierten Celluloseformen, wie Amylobacter navicvla, zeigen auf den verschiedensten festen Nährmedien eine ausgezeichnete Entwicklung. Bei 37° C bilden sich nach fünf bis sechs Tagen Kolonien im Innern von Kartoffel-, Gemüseoder BREDEMANNschem D-Agar. Im auffallenden Licht sind die Kolonien gelblichweiß, im durchfallenden Licht erscheinen sie dunkelbraun; sie besitzen eine linsenförmige Gestalt mit scharf begrenzten Bändern. Bei Verwendung von D-Agar als Substrat findet keine Gasentwicklung statt. Fügt man jedoch dem Medium chemisch reine Cellulose zu, so beginnt eine Gaserzeugung. Die Kultur nimmt dann die in der Abbildung 84 wiedergegebene Form an. A. navicula gedeiht ausgezeichnet in Kartoffel-Agar; zwei bis fünf Tage nach der Beimpfung treten Sporen auf. Eine gute Entwicklung findet auch in synthetischen Medien statt, die Ammoniumsulfat, Glucose und Cellulose enthalten. In Fleisch-

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

brühe-Pepton- sowie Fleischbrühe-Asparagin-Agar mit oder ohne Glucosezusatz ist entweder überhaupt kein Wachstum oder nur eine atypische Entwicklung zu beobachten. Ein sehr brauchbares Medium für A. navicula ist Gemüse-Agar, auf dem drei Tage nach der Beimpfung typische Oberflächenkolonien von bräunlicher Farbe und mit glänzender Außenseite erscheinen, die etwas plastisch hervortreten, sowie klebrig und fadenziehend sind. Gelatine wird von dem Mikroorganismus nicht verflüssigt (CLAUSEN, 1931). Hinsichtlich der Art des Wachstums steht A. navicula den Buttersäurebakterien näher als den Cellulosebakterien. Wie bereits früher erwähnt wurde, entstehen in den Kulturen einiger sporenbildender Bakterien geringe Mengen an Bernsteinsäure. HüNGATE konnte auch eine asporogene Art, Bacteroides succinogenes, isolieren, die bei der Vergärung der Cellulose erhebliche Mengen an Bernsteinsäure erzeugt. Als Medium diente bei diesen Versuchen eine aus Ochsenpa-nsen erhaltene Flüssigkeit. Folglich enthielt das sterile Medium bereits geringe Mengen organischer Säuren, die vor dem Versuch bestimmt und als Blindwert von der nach der Vergärung erhaltenen "Säure abgezogen werden müssen (Tab. 31). Tabelle 31 Die bei der Vergärung der Cellulose durch Bacteroides succinogenes entstehenden Produkte Kontrolle Differenz Versuch 1 Kontrolle Differenz Versuch 2 1 2 co 2 Ameisensäure . . . Essigsäure . . . . Propionsäure . . . Buttersäure.... Milchsäure . . . . Bernsteinsäure . . Cellulose (als Glucose) . .

0,31 Spuren 0,92 0,20 0,136

0,435 Spuren 0,64 0,173 0,120

+ 0,28 + 0,027 + 0,016 —

—

0,458

-0,125

keine

0,458 0,554

0,216 Spuren 1,08 0,212 —

keine 0,501

0,364 keine 0,872 0,186 0,070 keine 0,077

-0,148 + 0,208 + 0,026 —

+ 0,424 -0,531

In biochemischer Hinsicht etwas eigenartig ist der von CLAUSEN (1931) als Amylobacter navicula beschriebene Organismus. Ausführlichere Angaben über die bei der Vergärung der Cellulose entstehenden Produkte sind in der Arbeit nicht enthalten. Der Autor weist lediglich darauf hin, daß sich in der Kultur Milchsäure und höhere Fettsäuren anreichern, wogegen Buttersäure fehlt. Dies stellte auch WERNER fest, der einen ähnlichen Organismus nur auf Grund mikroskopischer Beobachtungen der zersetzten Cellulose beschrieben hatte. Infolge des Fehlens genauerer Einzelheiten ist es nicht möglich, eine eventuell vorhandene genetische Verwandtschaft mit den Buttersäurebakterien zu erkennen. Morphologie und Kultivierungsmerkmale weisen darauf hin, daß A. navicula dem Bac. amylobacter nahe steht. E s war jedoch bis jetzt noch nicht möglich, das Problem der Buttersäureentstehung bei der Vergärung der Kohlenhydrate zu klären. Bei dem Abbau der Cellulose bildet A. navicula viel Propionsäure.

C. Mesophile Cellulosebakterien

231

Es zeigt sich also, daß die anaeroben Cellulosebakterien in biochemischer Hinsicht eine ziemlich einheitliche Gruppe bilden. Die Gärung verläuft bei den mesophilen Formen ebenso wie bei den thermophilen Rassen in zwei Stufen. Zunächst wird die Cellulose zu den entsprechenden Cellodextrinen hydrolysiert, die dann in der zweiten Stufe zu Cellobiose und Glucose abgebaut und vergoren werden. Die Cellulosebakterien sind in der Lage, Glucose, möglicherweise auch Cellobiose zu vergären, wobei Alkohol und organische Säuren gebildet werden. Bezüglich des Chemismus der Gärung selbst sind die anaeroben Cellulosebakterien ein schwieriges Untersuchungsobjekt. Irgendwelche speziellen Arbeiten in dieser Richtung sind nicht bekannt. Es ist jedoch anzunehmen, daß die Entstehung der Essig-, Ameisen- und Milchsäure in der gleichen Weise erfolgt wie in den Kulturen anderer anaerober Bakterien, die ebenfalls Glucose unter Bildung dieser Produkte vergären. Die oben erwähnten Stoffe entstehen bei der Vergärung der Cellulose durch Reinkulturen der Cellulosebakterien. Allerdings können sich unter natürlichen Verhältnissen, d. h. bei Gegenwart der Vertreter aus den unterschiedlichen physiologischen Gruppen der an einer Cellulosezersetzung beteiligten Bakterien auch verschiedene andere Produkte bilden. Theoretisch ist es durchaus denkbar, daß der entstehende Alkohol zu Essigsäure oxydiert wird. Die Tatsache, daß bei der Cellulosezersetzung in der Natur Bernsteinsäure selten in größeren Mengen in Erscheinung tritt, läßt vermuten, daß diese durch Decarboxylierung in Propionsäure übergeht. Letztere kann aber auch durch Reduktion der Milchsäure entstehen. Die Möglichkeit einer Reduktion der verschiedenen Produkte ist durch die Anwesenheit von molekularem Wasserstoff gegeben; auch bei Gegenwart von Alkohol oder Ameisensäure, die ebenfalls Wasserstoff liefern, kann eine Reduktion stattfinden. Bei der Cellulosezersetzung durch Mischkulturen unter natürlichen Verhältnissen, z. B. im Darm von Wiederkäuern, treten große Mengen an Propionsäure auf; aber auch Methan wird gebildet. Die Mengen an Bernstein- und Milchsäure sind in.diesem Falle gewöhnlich geringer als beim Celluloseabbau durch Reinkulturen. Damit sind selbstverständlich noch nicht alle Möglichkeiten ausgeschöpft, die den Vertretern der verschiedenen physiologischen Gruppen in einem Medium zur Verfügung stehen, in dem gleichzeitig auch anaerobe Cellulosebakterien wirksam sind. Die dabei stattfindenden Prozesse können in ihrer Art sehr vielfältig sein und zu den unterschiedlichsten Produkten führen. Wie bereits erwähnt wurde, färbt sich die Cellulose bei der Entwicklung anaerober Cellulosebakterien gelb oder orange. Gewöhnlich ist die Färbung um so kräftiger, je intensiver die Gärung verläuft. Bei langsamer Zersetzung der Cellulose wird das Papier entweder überhaupt nicht oder nur blaßgelb gefärbt. Wie KHOUVINE (1923, 1934) fand, ist der Farbstoff in Alkohol, Schwefelkohlenstoff, Benzol und Aceton löslich. Er konnte auch von der Forscherin isoliert werden; insgesamt erhielt sie 13 mg des Farbstoffs. Eine alkoholische Lösung des Pigments wird durch Schwefelsäure leuchtend rot gefärbt, während Ammoniak oder LUGOLsche Lösung keine Farbänderung hervorrufen. Chloroform dagegen bewirkt einen Umschlag nach dunkelbraun.

232

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Eine ausführlichere Untersuchung des Farbstoffs ist von R. MEYER durchgeführt worden. Nach seinen Beobachtungen verhalten sich die verschiedenen Bakterienstämme hinsichtlich des Färbevermögens durchaus nicht alle gleich. Im Anfang der Gärung ist die Färbung gewöhnlich kräftig, während sie im weiteren Verlaufe des Prozesses immer graustichiger wird. Der gebildete Farbstoff wird in den Kapillaren der Cellulosefasern abgelagert. Durch Einwirkung von verdünnter Salzsäure geht die Farbe zunächst in ein schmutziges Bot über; später schlägt sie in schmutziggrün um. Der Farbstoff löst sich in Äthanol und Methanol, weniger in n-Propanol. In Isopropanol, Amylalkohol, Petroläther, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol und Benzylalkohol ist er unlöslich. Wie R. MEYER (1934T, 1938, 1942) fand, entfärbt sich das von den anaeroben Cellulosebakterien gebildete Pigment am Licht. Eine alkoholische Lösung des Farbstoffs absorbiert einen großen Teil des sichtbaren Spektrums, insbesondere im blauen, violetten und langwelligen UV-Gebiet. Eine Absorptionsbande liegt bei 214,5 mjx. Leider stammen die Angaben MEYERS über den Charakter des Farbstoffes und seine Löslichkeit aus Untersuchungen an Anreicherungskulturen und besitzen deshalb nur einen relativen "Wert. Nach Ansicht der auf diesem Arbeitsgebiet tätigen Forscher gehört der Farbstoff zu den Carotinoiden. Obwohl er nur in geringen Mengen gebildet wird, darf er als kohlenstoffhaltiges, bei der Cellulosezersetzung entstehendes Produkt doch nicht vernachlässigt werden. Die Kohlenstoffbilanz wird ferner auch von der Fähigkeit der Cellulosebakterien zur Fixierung der Kohlensäure beeinflußt. So finden sich in der Literatur Hinweise (HüNGATE, 1944, 1947), nach denen in Kulturen der Cellulosebakterien, deren Nährlösungen erhebliche Mengen an C0 2 enthalten (z. B. bicarboriathaltige Medien, durch die außerdem noch zur Verbesserung der anaeroben Bedingungen C0 2 durchgeleitet wird), bei der Gärung wesentlich weniger Kohlensäure frei wird als normalerweise entsteht. Auf Grund analoger Beobachtungen an anderen heterotrophen Mikroorganismen wird deshalb angenommen, daß die Verringerung der während der Gärung frei werdenden Kohlensäuremenge im vorliegenden Falle auf eine Fixierung zurückzuführen ist. Zweifellos verdienen diese Angaben eine entsprechende Beachtung. Andererseits sollte eine endgültige Beantwortung dieser Frage noch so lange hinausgeschoben werden, bis es möglich ist, durch Untersuchungen mit markiertem Kohlenstoff die Richtigkeit der auf anderem Wege gefundenen Ergebnisse zu bestätigen oder sie zu verwerfen, um so mehr, als für das erwähnte Phänomen noch weitere Erklärungsmöglichkeiten vorhanden sind. Die Kulturen der Cellulosebakterien besitzen keinen unangenehmen Geruch. Das Auftreten eines skatolähnlichen oder irgendeines anderen Verwesungsgeruchs zeugt meist davon, daß die Kultur nicht nur aus einer Bakterienart besteht. Eine Reinkultur zeigt dagegen stets ein angenehmes Aroma, das offenbar durch die Bildung irgendwelcher Äther oder Ester bedingt ist. R . MEYER fand einen weißwein- oder ananasähnlichen Geruch. Durch Extraktion mit Äther gelang es MEYER, aromatische Substanzen zu isolieren, die nach Abdampfen des Äthers einen starken

C. Mesophile Cellulosebakterien

233

hyazinthenähnlichen Geruch zeigten. Anscheinend ist die Entstehung verschiedener aromatischer Substanzen in Kulturen anaerober, sporenbildender Bakterien eine häufige Erscheinung. In diesem Zusammenhang sei auf den in Bac. felsineusKulturen auftretenden Geruch verwiesen. Im Rahmen einer weiteren Untersuchung der entstandenen Gärungsprodukte wurde kein 2,3-Butylenglykol gefunden (HüNGATE, 1944, 1947; KHOUVINE, 1923, 1934). Fast alle Forscher stimmen ferner dahingehend überein, daß in Reinkulturen anaerober Cellulosebakterien keine Reduktion der Sulfate stattfindet. Diese Feststellung schließt aber nicht die Möglichkeit aus, daß sich in Anreicherungskulturen Schwefelwasserstoff aus den Sulfaten bilden kann. Im Gegenteil, die Desulfurierung ist eine sehr häufige Erscheinung, mit der man in Anreicherungskulturen stets rechnen muß. Die Reduktion der Sulfate ist jedoch ausschließlich auf die desulfurierenden Begleitbakterien zurückzuführen. Eine ausführlichere Betrachtung dieser Frage findet sich weiter unten im Abschnitt über die Symbiose der anaeroben Cellulosebakterien mit anderen Mikroorganismen. Eine Ausnahme bilden auch hier wieder die Befunde WERNERS (1926), in dessen Arbeit über die Bildung von Schwefelwasserstoff in Kulturen anaerober Cellulosebakterien berichtet wird. Impft man Cellulose-Agar mit einer derartigen Kultur, so entstehen zunächst schwarze Punkte im Agar; nach und nach wird dieses durch Bildung von Eisensulfid ganz schwarz. Vom theoretischen Standpunkt aus ist die Möglichkeit der Reduktion von Sulfaten durch Cellulosebakterien nicht ohne weiteres abzulehnen, da die lange vorherrschende Ansicht, nach der nur die Vibrionen in der Lage sind, Sulfate zu reduzieren, neuerdings revidiert werden mußte. So fand man z. B. echte Bakterien, die auf gewöhnlichen Nährmedien gedeihen und dabei Sulfate reduzieren (STURM, 1950). Ferner wurde festgestellt, daß die pectinvergärenden Bakterien ebenfalls die Fähigkeit zur Reduktion von Sulfaten besitzen (ALEXEJEW, 1952). Dieser Umstand ist für das vorliegende Problem insofern von Interesse, als es sich dabei auch um anaerobe, sporenbildende Formen handelt, die gleichfalls Kohlenhydrate verwerten. Zu einer endgültigen Entscheidung der Frage, ob die anaeroben Cellulosebakterien Sulfate reduzieren oder ob sie dazu nicht in der Lage sind, reichen die bisherigen Daten jedoch nicht aus. Die Angaben WERNERS müßten nochmals nachgeprüft werden, da er anscheinend, wie bereits früher erwähnt, nicht mit Reinkulturen gearbeitet hat. d) D i e B i l d u n g des M e t h a n s Nachdem POPOW vor 75 Jahren festgestellt hatte, daß bei der Zersetzung der Cellulose Methan entstehen kann, haben sich viele Forscher der Theorie einer biologischen Genese des Methans angeschlossen. Insbesondere beobachtete auch HOPPE-SEYLER (1886) das Auftreten von Methan bei der Cellulosezersetzung. Ausführlicher befaßte sich jedoch erst OMELJANSKI (1901) bzw. OMELIANSKI (1902) mit diesem Problem. Nach einem Vorschlag WlNOGRADSKls verwendete er zur Isolierung der anaeroben Cellulosebakterien elektive Nährmedien. Er erhielt dabei Anreicherungskulturen, in denen erhebliche Mengen an Methan gebildet

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

wurden. Das bei der Gärung frei werdende Gas enthielt 40% Wasserstoff und 60% Methan. Durch Erwärmen der Kultur wurde der Charakter der Gärung verändert: Methan entstand nicht mehr, sondern nur noch Wasserstoff und Kohlendioxyd. Als OMELJANSKI gegen Ende des vorigen Jahrhunderts seine Versuche durchführte, war noch keine Methode zur Reinzüchtung der anaeroben Cellulosebakterien bekannt. Ebenso mangelhaft waren auch die Kenntnisse über die Ernährungsphysiologie der anaeroben Bakterien. Alle diese Faktoren wirkten erschwerend auf die Herstellung von Reinkulturen. Erst 30 bis 40 Jahre später, als die Herstellung von Reinkulturen und eine genaue Analyse der Gärungsprodukte möglich waren, konnte festgestellt werden, daß anaerobe Cellulosebakterien in Reinkultur kein Methan bilden. Für Anreicherungskulturen dagegen ist die Richtigkeit der OMELJANSKIschen Beobachtungen mehrfach bestätigt worden (CLAUSEN, 1931, PRINGSHEIM, 1912, IMSCHENEZKI, 1940). Ebenso wurde auch die Tatsache bestätigt, daß eine derartige Kultur beim Erwärmen die Fähigkeit zur Bildung von Methan verliert. Bereits OMELJANSKI (1899, 1901) selbst hat darauf hingewiesen, daß der Erreger der Methangärung der Cellulose dem Bakterium der Wasserstoffgärung ungewöhnlich ähnlich ist. Der einzige Unterschied zwischen beiden Formen bestand lediglich in der Größe der Sporen. Die Sporen des ersteren besaßen einen Durchmesser von 1 [X, die des letzteren waren 1,5 FI dick. Nach CLAUSEN (1931) ist aber die Sporengröße in diesem Falle kein zuverlässiges Unterscheidungskriterium, da sie bei den anaeroben Cellulosebakterien je nach der Zusammensetzung des Mediums und nach den Züchtungsbedingungen in gewissen Grenzen schwanken kann. CLAUSEN isolierte die Cellulosebakterien einmal aus einer methanbildenden und zum anderen aus einer wasserstoffbildenden Anreicherungskultur Und konnte auf diese Weise das Verhalten der beiden Reinkulturen miteinander vergleichen. Das bei der Zersetzung der Cellulose entstehende Gas setzte sich in beiden Fällen stets nur aus Wasserstoff und Kohlendioxyd zusammen; es bestand aus 33,1% Wasserstoff und 42,6% Kohlendioxyd, Methan konnte niemals nachgewiesen werden. In den Arbeiten KHOÜVINES (1923, 1934) wird folgender Versuch beschrieben: 1 g Cellulose in 100 ml Nährlösung wurde innerhalb von 10 Tagen vergoren. Während dieser Zeit entwickelten sich 26,4 ml Gas, das aus 47,4% COa, 48,33% H 2 und 4,6% N2 (aus der Luft) bestand. In einem anderen Versuch wurden 290 ml Gas aufgefangen, die bei der Vergärung von 3 g Cellulose in 300 ml Nährlösung entstanden waren. Dem Ansatz wurde vorher 0,6 g Calciumcarbonat zugesetzt, wodurch der Köhlendioxydanteil des Gases erheblich größer war als im ersten Versuch. Die Gasanalyse ergab 56,1% C0 2 , 36,11% H 2 und 7,7% N2. Auch bei diesen Versuchen trat niemals Methan auf. COWLES und RETTGER (1931) stellten ebenfalls diesbezügliche Untersuchungen an. Innerhalb von 6 Tagen wurden z. B. 0,432 g der eingesetzten Cellulosemenge von 1,180 g vergoren und dabei 133 ml Gas aufgefangen, das aus 75% H 2 u n d 25% C0 2 bestand; Methan fehlte ebenfalls. Mit diesen Analysen sind die bisher bekannt gewordenen Angaben über die Zusammensetzung des bei der Vergärung der Cellulose durch mesophile Bakterien entstehenden Gases erschöpft. Sie beweisen jedoch eindeutig, daß Methan bei der

C. Mesophile Cellulosebakterien

235 •

Zersetzung der Cellulose nicht gebildet wird und sein Auftreten stets nur auf die Wirksamkeit anderer Bakterien zurückzuführen ist. Diese Erkenntnis steht in völliger Übereinstimmung mit den von IMSCHENEZKI erhaltenen Resultaten über die Zusammensetzung des bei der thermophilen Cellulosegärung gebildeten Gases. Wie bereits erwähnt, wurden Vergleichsanalysen der von Anreicherungs- und Reinkulturen gebildeten Gase durchgeführt. Im ersten Falle konnte stets Methan nachgewiesen werden, während es im letzteren fehlte. Man könnte allerdings noch vermuten, daß die Lebensbedingungen für die Cellulosebakterien in Mischkulturen andere sind als in Reinkulturen, so daß die Mikroorganismen in Mischkulturen zur Bildung von Methan befähigt sind. Diese Erklärung ist jedoch zu künstlich und wenig plausibel, nachdem die Mikrobiologie und Biochemie der Methanbildung zu einem wesentlichen Teil aufgeklärt ist (BARKER, 1936; SCHNELLEN, 1947). Demnach sind mehrere Wege möglich, auf denen die Methanbildung in Mischkulturen stattfinden kann. Einmal können Begleitformen vorhanden sein, die Salze organischer Säuren vergären und dabei Methan bilden. Zum anderen können Bakterien existieren, die aktive Hydrogenase erzeugen und deshalb in der Lage sind, aus den im Überfluß vorhandenen Gasen, d. h. aus Wasserstoff und Kohlendioxyd, Methan zu bilden. Schließlich kann das Methan auch durch die Zersetzung der im Medium vorhandenen Aminosäuren entstehen. Diese Bildungsart ist allerdings weniger wahrscheinlich, weil die in Anreicherungskulturen entwickelte Methanmenge etwas zu groß ist, um ihre Entstehung auf diese Weise erklären zu können. Anreicherungskulturen enthalten durchaus nicht in jedem Falle Begleitbakterien, die zur Methanbildung befähigt sind. Wie IMSCHENEZKI fand, besteht häufig das aus Anreicherungskulturen entweichende Gas zunächst nur aus Wasserstoff und Kohlendioxyd. Ähnliche Angaben sind auch in der übrigen Literatur zu finden. In Versuchen WERNERS entstanden z. B. bei der Vergärung von 1,485 g Cellulose in 51 Tagen 412,2 ml Gas. Obwohl es sich um eine Anreicherungskultur handelte, enthielt das Gas kein Methan, sondern bestand nur aus 67,3% C0 2 , 29,1% H 2 und 3,6% N 2 . Daneben findet man aber auch Angaben, nach denen bei der sogenannten Methangärung der Cellulose bis zu 60% Methan entstehen (PRINGSHEIM, 1912). Im Falle der reinen Wasserstoffgärung wurden neben Wasserstoff und Kohlensäure aber auch geringe Mengen von Methan nachgewiesen. Anscheinend sind für die Methanbildung in Anreicherungskulturen verschiedene Bakterien verantwortlich, die sich durch ihre Aktivität und Thermoresistenz voneinander unterscheiden. Somit ist es möglich, daß auch nach einer Hitzebehandlung der Kulturen einige Bakterienrassen ihre Fähigkeit zur Bildung von Methan aus den verschiedenen Gärungsprodukten der Cellulose nicht verlieren. Die Menge des aus Anreicherungskulturen entweichenden Methans ist starken Schwankungen unterworfen. Sehr wahrscheinlich besaßen die methanbildenden Bakterien in den Kulturen OMELJANSKls eine geringere Widerstandskraft gegenüber höheren Temperaturen als die Sporen der anaeroben Cellulosebakterien. Beim Erhitzen von Anreicherungskulturen, welches Verfahren zur Isolierung des Bacillus der Wasserstoffgärung empfohlen wird, gehen die methanbildenden Bakterien zugrunde. In der Kultur verbleiben lediglich die Cellulose-

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

bakterien und einige Begleitformen, die bei der Cellulosezersetzung nur Wasserstoff und Kohlendioxyd bilden. Das Verhältnis von Wasserstoff zu KoMendioxyd in dem aus Reinkulturen stammenden Gasgemisch, kann ebenfalls erheblich schwanken. Nach CLAUSEN (1931) beträgt das Verhältnis von Kohlendioxyd zu Wasserstoff 1,5 : 1, nach COWLES und RETTGER (1931) 1 : 3, nach KHOUVINE etwa 1 : 1. Wenn man die entstehende Kohlensäure genau bestimmen will, so müssen die Versuche ohne Calciumcarbonatzusatz durchgeführt werden, oder die durch Neutralisation des CaC03 gebildete Kohlensäure ist gesondert zu ermitteln und von der Gesamtkohlensäure abzuziehen. Leider sind keine Arbeiten bekannt, in denen diese Gesichtspunkte berücksichtigt wurden. Zusammenfassend läßt sich also sagen, daß die in der zweiten Hälfte des vorigen Jahrhunderts entstandene Vorstellung von der Bildung eines „Cellulosegases" bei der Zersetzung pflanzlicher Überreste, die sich etwa 60 bis 70 Jahre lang gehalten hat, nicht bestätigt werden konnte. Bei dem Abbau der Cellulose selbst entsteht kein Methan. Dagegen treten aber andere Produkte in großer Menge auf, die den verschiedensten Begleitbakterien zur Methanbildung dienen können. Insbesondere aus diesem Grunde werden bei der Zersetzung der Cellulose in natürlicher Umgebung stets große Mengen an Methan gebildet. Das Entweichen von „Sumpfgas" aus Gewässern, an deren Boden Cellulose zersetzt wird, bestätigt ebenfalls die Annahme, daß die Zersetzung der Cellulose ein symbiotischer Prozeß ist, an dem Vertreter der verschiedensten physiologischen Mikrobengruppen beteiligt sind. Zerlegt man eine methanbildende Aiireicherungskultur in ihre Komponenten, so muß man schließlich durch entsprechende Kombination zu einer Kultur gelangen, die nur aus zwei Organismen besteht und ebenfalls Methan bildet. Dieses Ziel kann man erreichen durch Vereinigung der Reinkultur eines methanbildenden Bakteriums mit der Reinkultur eines Cellulosebakteriums. e) S y s t e m a t i k Infolge der Anpassung an die Cellulose als Kohlenstoff- und Energiequelle ist die Fähigkeit zur Zersetzung dieses Polysaccharids bei den verschiedensten Mikroorganismen vorhanden. Unter den aeroben Bakterien ist diese Fähigkeit außerordentlich verbreitet; sie ist in vielen systematischen Gruppen anzutreffen. Im Gegensatz dazu ist diese Funktion bei den anaeroben Bakterien weniger stark ausgeprägt. Es könnte allerdings durchaus möglich sein, daß einige der in der Natur vorkommenden anaeroben Cellulosebakterien auf Grund methodischer Schwierigkeiten bisher noch nicht als solche erkannt worden sind. In diesem Falle wäre jeder Versuch einer Systematik der anaeroben Cellulosebakterien mit Unzulänglichkeiten behaftet. Es ist jedoch andererseits kaum denkbar, daß häufiger vorkommende Formen im Laufe der letzten 60 Jahre den Forschern unbekannt geblieben sind. Anaerobe cellulosezersetzende Kokken wurden bisher nur im Pansen von Wiederkäuern nachgewiesen. Sporenlose Bakterien kommen ebenfalls im Verdauungstrakt grasfressender Tiere sowie im Schlamm von Klärbecken und in geringen Mengen im Boden vor. Die typischsten und verbreitetsten Formen sind jedoch sporenbildende

C. Mesophile Cellulosebakterien

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Bakterien, denen man im Erdboden, im Boden der Gewässer und im Wasser selbst begegnet. Zu dieser Gruppe gehört die nicht spezialisierte Form Amylobacternavicvla, die eng mit Bac. amylobacter verwandt ist. Die Gruppe der spezialisierten Celluloseformen enthält sporenbildende anaerobe Bakterien mit folgenden Merkmalen: Sie bilden nur endständige Sporen, zersetzen keine Stärke, vergären Cellulose und lassen sich durch Jod nicht blau färben. Auf Grund einer geringen Krümmung der Stäbchen und der Schrauben- und Rotationsbewegung um die Längsachse vermutete HüNGATE (1944, 1947), daß diese Organismen der Gattung Sporovibrio verwandt sind. Da die Existenz sporenbildender Vibrionen noch nicht exakt bewiesen ist, kann man aber einen unbekannten Organismus nicht ohne weiteres dieser Gruppe zuordnen. In dem neuen Bestimmungsbuch KRASSILNlKOWs (1949) ist diese Gattung auch nicht aufgeführt. Um zu beweisen, daß die Vibrionen Sporen bilden, genügt es nicht, ihre Existenz durch Erhitzen von Schrägkulturen oder durch mikroskopische Beobachtung gefärbter Präparate festzustellen, sondern man muß den Beweis antreten, daß es sich bei den in den Zellen vorhandenen glänzenden Körpern tatsächlich um Sporen handelt. Der Beweis ist aber identisch mit dem Nachweis einer Keimfähigkeit dieser Körperchen; dieser Nachweis ist bis jetzt leider noch nicht erbracht worden. Es ist ebenfalls nicht gerechtfertigt, die anaeroben Cellulosebakterien mit endständigen Sporen nur auf Grund der schwachen Krümmung der Zellen irgendeiner anderen Gattung als Bacillus oder Plectridium zuzuordnen. Einige Autoren haben Formen unter verschiedenen Bezeichnungen beschrieben, z. B . Clostridium

cdlobioparus,

Bac.cdlulosam

fermentans

usw., die den von OMEL-

JANSKI aufgefundenen ungewöhnlich ähnlich, möglicherweise mit ihnen sogar identisch sind. Das Problem der Sporenform ist noch nicht endgültig geklärt. In diesem Zusammenhang ist aber zu erwähnen, daß zur Stammart Bac. omdianskii nur Organismen mit kugeligen Sporen gerechnet werden. Bei Formen, die in der Kultur vorherrschend ovale Sporen bilden, ist es wohl zweckmäßiger, von einer selbständigen Varietät zu sprechen und diese mit Bac. omdianskii var. ovalisporus zu bezeichnen. Neben dieser Abart haben I M S C H E N E Z K I und Mitarbeiter, wie bereits früher erwähnt, noch eine thermophile Varietät, Bac. omdianskii var. thermophilus gefunden. Die bei der Einwirkung der beiden Varietäten auf die Cellulose entstehenden Gärungsprodukte sind hinsichtlich ihrer qualitativen und quantitativen Zusammensetzung einander sehr ähnlich. Auf Grund ihrer biochemischen Eigenschaften besteht deshalb keine Veranlassung zur Aufspaltung dieser Art in kleinere Einheiten. Einige Autoren, z. B. H Ü N G A T E , wollen das unterschiedliche Verhalten der anaeroben Cellulosebakterien gegenüber den Stickstoff- und Vitaminquellen als Grundlage einer detaillierteren Systematik benutzen. Eine derartige Systematik der Mikroben dürfte wohl kaum angebracht sein. Es ist bereits weiter oben darüber berichtet worden, daß die anaeroben Cellulosebakterien je nach ihrer Herkunft, d. h. je nach dem natürlichen Substrat, aus dem sie isoliert wurden, unterschiedliche Bedürfnisse an zusätzlichen Nahrungselementen aufweisen und demzufolge auch unterschiedliche Forderungen an die Zusammensetzung des Nährmediums stellen.

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Naturgemäß wird die Eigenart der Stickstoff- und Vitaminernährung einer bestimmten Mikrobengruppe, insbesondere der Cellulosebakterien, durch ökologische Momente bestimmt. Somit erscheint es ganz folgerichtig, wenn die bereits vorhandenen Versuche zur Aufstellung einer neuen Systematik einiger Bereiche der Mikroorganismen, z. B. der Hefen, unter Zugrundelegung des Vitaminbedarfs eine durchaus begründete Ablehnung erfahren haben, da derartige ökologisch-physiologische Eigenschaften innerhalb einer Art von Basse zu Basse schwanken können. E s existieren bereits Angaben darüber, daß die anaeroben Organismen aus Abwässern oder Klärbecken, d. h. also dort, wo große Mengen an Eiweiß, Eiweißabbauprodukten und Vitaminen auftreten, sehr hohe Anforderungen an die Zusammensetzung des Nährmediums stellen. In synthetischen Medien gedeihen sie nur bei Anwesenheit relativ großer Mengen der verschiedensten Vitamine (JERUSSALIMSKI, N., NERONOWA, N. und JARYGTNA, N., 1952).

Es folgt nun die Beschreibung der Art Bac. omdianskii. Die vegetativen Zellen besitzen eine Breite von 0,3 bis 0,4 fx und eine Länge von 4 bis 12 \L und sind beweglich. Die stets endständigen Sporen stellen Kugeln dar mit einem Durchmesser von 1 bis 1,5 [X. Der Bazillus vergärt Cellulose und deren Hydrolysenprodukte unter Bildung organischer Säuren und Alkohol. An gasförmigen Produkten entstehen C0 2 und H 2 , wogegen CH4 stets fehlt. Die Bazillen sind gramnegativ. Die Prüfung mit Jod auf Glycogen, Amylose und Jogen verläuft ebenfalls negativ. Die beste Entwicklung findet zwischen 33 und 37° C statt. In eiweißhaltigen Cellulosemedien gedeihen sie ausgezeichnet, in synthetischen Nährböden ohne Vitamine dagegen nicht. Für ein normales Wachstum ist die Anwesenheit von Vitaminen und offenbar auch von anderen organischen Stickstoffverbindungen notwendig. Die Bazillen gedeihen ferner nur unter streng anaeroben Bedingungen. Sie treten auf im Pansen und Darm von Wiederkäuern, im Erdboden, im Boden von Süß- und Salzgewässern, im Wasser und in Ansammlungen faulender Pflanzenreste. Somit sind sie in der Natur sehr verbreitet. Die Charakteristik der Varietät Bac. omelianskii var. ovalisporus ist die gleiche wie die der Hauptart. Die Sporen besitzen jedoch eine ovale Form mit den Abmessungen 2 X 2,5 [X. Die Frage, ob es möglich oder notwendig ist, diese „große Art" in mehrere kleinere, selbständige deutlich voneinander abgegrenzte Arten aufzuteilen, kann erst nach weiteren Untersuchungen beantwortet werden. Heute sind die Kenntnisse über die anaeroben Cellulosebakterien noch längst nicht so vollständig, daß dieser Überfluß an Arten, wie wir ihm in der Literatur begegnen, gerechtfertigt wäre. Viele Arten kommen lediglich in der Weise zustande, daß die Autoren ihre neugezüchteten Beinkulturen nicht sorgfältig genug mit bereits früher isolierten Stämmen vergleichen und deshalb für eine neue Art halten und als solche beschreiben. 2. Kokkenähnliche Formen Unter den im Erdboden vorkommenden Cellulosebakterien findet man gewöhnlich keine Vertreter der Familie Goccaceae. WLNOGRADSKL konnte unter den verschiedenen von ihm isolierten Mikroorganismen nicht eine einzige cellulosezersetzende

C. Mesophile Cellulosebakterien

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Kokkenform entdecken. Auch IMSCHENEZKI und Mitarbeitern ist es niemals gelungen, eine auf Cellulose gedeihende Mikrokokken- oder Streptokokkenkultur zu isolieren. Ähnlich liegen die Verhältnisse auch in Untersuchungen anderer Autoren. Trotzdem gibt es in der Literatur Hinweise auf cellulosezersetzende kokkenartige Formen; mitunter beruhen diese aber auf falschen Beobachtungen. So beschreibt MERKER (1912) Z. B. eine Art Micrococcus cytophagus, die eine Zerstörung der Wasserpflanze Elodea bewirken soll. Aus der Beschreibung und den Abbildungen geht jedoch zweifelsfrei hervor, daß es sich hier um das Myxobakterium Sporocytophaga myxococcoides handelt, dessen kugelartige Mikrocysten fälschlicherweise für Kokken gehalten wurden. Aber auch anderen Autoren (BAKER, 1931, 1933, BAKER und MARTIN, 1937, 1938) ist der gleiche Fehler unterlaufen. Ferner ist auch die Möglichkeit nicht ausgeschlossen, daß einige cellulosezersetzende Mycobakterien irrtümlich für Mikrokokken angesehen wurden. Bis heute ist es nicht gelungen, aus dem Boden oder aus Gewässern zur Familie Coccaceae gehörende Bakterien zu isolieren, bei denen die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung einwandfrei festgestellt werden konnte. Anders verhält es sich jedoch mit dem Magen-Darm-Kanal der verschiedenen Tiere und des Menschen. In diesem Milieu findet man zahlreiche Kokkenformen, die sich hier ausgezeichnet vermehren und Cellulose sehr intensiv angreifen. Als erster unter suchte HENNEBERG (1922) auf mikroskopischemWege die morphologischen Veränderungen der Cellulose bei ihrer Zersetzung im menschlichen Darm. Er fand dabei, daß sich die verschiedenen, durch Fermente und Mikroorganismen bereits halbverdauten Pflanzenteilchen durch die Art der Zerstörungen unterscheiden, die auf die hydrolytische Wirkung der Cellulase zurückzuführen sind. So konnte man Vertiefungen und Löcher von unterschiedlicher Größe und Form feststellen. Bei der Behandlung entsprechender Präparate mit Jod wurde gefunden, daß sich an den Rändern der Löcher kokkenähnliche Zellen verschiedener Größe angesiedelt hatten. An Hand der Größe der Zellen und auf Grund ihres Verhaltens gegenüber Jod nimmt der Autor an, daß im Darm folgende Mikrokokkenarten vorkommen: Micrococcus pustulatus, M.ruminantium,M .pygmaeus, sowie eine Streptokokkenart, von ihm als Streptococcus jodophilus bezeichnet, Der Autor hat jedoch nicht den Versuch unternommen, Reinkulturen dieser Organismen herzustellen. Seine Arbeiten sind deshalb mit Zurückhaltung aufgenommen worden, da es außerordentlich schwierig ist, lediglich auf Grund mikroskopischer Beobachtungen eine neue Art aufzustellen, ganz zu schweigen von deren physiologischen Eigenschaften. In ähnlicher Weise ist auch eine Untersuchung von BAKER und MARTIN (1937) über die Mikroflora des Blinddarms von Meerschweinchen durchgeführt worden. Zur Färbung der Präparate wurden die Methoden nach GLEMSA, mit Karbolfuchsin, Eisenhämatoxylin nach HEIDENHAIN und andere benutzt. Die Autoren fanden bei der mikroskopischen Beobachtung Kokken, die pich auf zerstörten Pflanzenresten befanden. Einige der Mikrokokken waren etwas größer, ca. 0,36 bis 1 X 0,36 bis 1,3 [x, und erinnerten an die von HENNEBERG beschriebene Art M. ruminantium. Andere, kleinere Formen gehörten der Art M. pygmaeus an und waren 0,36 bis 0,54 X 0,36 bis 0,9 fi. groß.

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Die auf die Einwirkung der Kokken auf die pflanzlichen Zellwände zurückzuführenden Löcher erreichten Abmessungen von 3,1 ¡m Länge und 1 ¡x Breite. Bei der Behandlung mit Jod geben die Streptokokken eine positive Reaktion auf Amylodextrin. Die Autoren weisen auf die Schwierigkeiten hin, die bei dem Versuch auftreten, eine klare Abgrenzung der Mikrokokken von dem bei der Entwicklung von Sporocytophaga myxococcoides auftretenden Kugelstadium zu erreichen. Nach den angeführten Zeichnungen sind in einigen Fällen tatsächlich Mikrocysten von Sporocytophaga für Kokken gehalten worden. Andererseits besteht kein Zweifel darüber, daß es den Autoren gelungen ist, echte, insbesondere kettenbildende Kokkenformen nachzuweisen. In analogen Untersuchungen des Blinddarminhaltes von Kaninchen fanden dieselben Autoren Riesenzellen von Streptokokken, die entweder paarweise oder in kurzen, aus vier bis acht Zellen bestehenden Ketten angeordnet waren. Der Durchmesser der Zellen betrug 0,9 bis 3,2 [i. Nach IMSCHENEZKI ist jedoch die Zugehörigkeit dieser Organismen zu den Bakterien noch zweifelhaft. Mit Jod lassen sich die Streptokokken entweder gleichmäßig oder nur in einzelnen Bereichen blau oder blauviolett anfärben. Sie finden sich auf den Pflanzenresten in großer Anzahl, und zwar dort, wo eine Zerstörung stattgefunden hat, z. B. in der Nähe der Löcher. In morphologischer Hinsicht sind die Streptokokken identisch mit den von BAKER im Blinddarm von Meerschweinchen aufgefundenen Biesenkokken. Die gefundene Streptokokkenart erhielt den Namen Jodococaus intestinalis. Neben dieser Art kommen im zersetzten Sklerenchym noch kleinere Kokken mit einem Durchmesser von 0,43 bis 0,45 [j. in großer Zahl vor, die durch Jod ebenfalls blau gefärbt werden. Durch die Arbeiten HENNEBERGs (1922), sowie BAKERS und MARTINS (1937, 1938) wurde somit die Existenz cellulosezersetzender Kokken im Darm der Menschen und der Tiere festgestellt. HüNGATE (1944,1947) konnte diese Beobachtungen später mit Hilfe mikrobiologischer Methoden bestätigen. Aus dem Panseninhalt einer Kuh bzw. eines jungen Ochsens gelang es ihm, vier Streptokokkenstämme in Reinkultur zu züchten. Der Durchmesser war in allen Fällen der gleiche; er betrug 1{a (Abb. 85). Die jungen Zellen enthalten Glykogen und geben mit Jod die entsprechende Farbreaktion. Die Streptokokken entwickeln sich in cellulosehaltigen Nährmedien mit Hefeextrakt, wobei gleichzeitig ein gelber Farbstoff gebildet wird. Einige Stämme zersetzen die Cellulose derart intensiv, daß in Cellulose-Agar bereits am zweiten Tage nach der Beimpfung in der Umgebung der Kolonien Hydrolysenzonen auftreten. Einer der Stämme konnte Cellobiose, aber keine Glucose vergären, während ein anderer wieder in der Lage war, Glucose, aber keine Cellobiose abzubauen. Durch Züchtung auf einem festen Nährmedium gelang nach mehreren Passagen die Herstellung von Reinkulturen. Die Kolonien sind farblos und besitzen das Aussehen kleiner Büschel. Die Kokken kommen entweder einzeln oder paarweise vor oder sind in kürzeren oder längeren Ketten angeordnet. Mit Jod lassen sie sich anfärben. Nach IMSCHENEZKI sind diese Organismen mit dem von SlJPESTElN (1948) als Rvminobacter parvum beschriebenen Bakterium identisch. Nach sieben bis acht Passagen haben die Streptokokken die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung

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eingebüßt. HüNGATE nimmt an, daß für den Celluloseabbau im Verdauungstrakt der Wiederkäuer in der Hauptsache die Streptokokken verantwortlich sind. Als Beweis führt er die Tatsache an, daß ihre Anzahl im Panseninhalt etwa 1 Million pro Milliliter beträgt und daß sie die Cellulose sehr rasch abbauen können. So werden z. B. in einem flüssigen Medium bei 38° C innerhalb von 16 Tagen 0,1% der vorhandenen Cellulose zerstört. Aus dem gleichen Ausgangsmaterial konnte HUNGATE noch zwei weitere Kokkenstämme isolieren, die gelbe, linsenförmige Kolonien bilden. Nach einiger Zeit entstehen sekundäre Scheiben, die in einem gewissen Winkel zu den primären Kolonien angeordnet sind. Die jungen Zellen der gelben Formen sind jodophil und grampositiv. Sie treten einzeln auf oder bilden kürzere, mitunter auch längere, aus 16 bis 24 Zellen bestehende Ketten. Der Durchmesser der Zelle beträgt 0,7 bis 1 (i. Wahrscheinlich sind sie identisch mit der Art Ruminobacter flavescens. HUNGATE ist der Ansicht, daß im Pansen der Wiederkäuer besonders günstige Bedingungen zur Zersetzung der Cellulose durch Mikroben herrschen, und zwar nicht nur bezüglich des Mediums, sondern auch hinsichtlich der symbiotischen Beziehungen zu anderen Formen. Angesichts dieser Verhältnisse dominieren im Pansen die sporenlosen Formen, weil hier keine Notwendigkeit zur Bildung von Sporen besteht. In den Arbeiten ÜUNGATEs werden erstmalig nicht nur mikroskopische Beobachtungen des Darminhaltes pflanzenfressender Tiere mitgeteilt, sondern auch Angaben zur Physiologie der Kokkenreinkulturen gemacht. Eine Nachprüfung der Ergebnisse dürfte aber auf jeden Fall zweckmäßig sein, da einige Umstände zumindest eigenartig erscheinen. So ist z. B. nicht recht einzusehen, weshalb die Kulturen nach mehreren Passagen die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung verloren haben sollen, wenn man insbesondere berücksichtigt, daß optimale Nährmedien mit Pansenflüssigkeit benutzt wurden. Störend wirkt ferner der Umstand, daß in der Beschreibung der gelben Kokkenform auf die Existenz von Stäbchen hingewiesen wird. Es ist schwierig zu entscheiden, ob die isolierte Kokkenform zu den Mycobakterien gehört, in deren Kolonien Kokken neben Stäbchen vorkommen, oder ob es sich um cellulosezersetzende Stäbchen und begleitende Kokken handelt. Irgendwelche Reinheitsbeweise für die Kultur wurden leider auch nicht gegeben. Bezüglich der Reinzüchtung mittels Übertragungen auf feste Nährmedien ist IMSCHENEZKI auf Grund eigener Versuche der Ansicht, daß auf diese Weise häufig auch nur wieder Mischkulturen erhalten werden. Dabei verbleiben die Cellulosebakterien noch eine Zeitlang zusammen mit den Begleitformen in gemeinsamen Kolonien und zeigen auf Grund der Symbiose eine gute Entwicklung. Allmählich werden die Cellulosebakterien j edoch ausgesiebt, und die Kultur verliert damit ihre Fähigkeit zur Cellulosevergärung. Die Möglichkeit einer Cellulosezerstörung unter anaeroben Bedingungen durch Kokkenformen soll damit nicht bestritten werden, jedoch fehlen bis jetzt jedwede systematischen und ausführlichen Beschreibungen der Organismen sowie überzeugende Beweise für die Reinheit der Kulturen. Andererseits geht aus dem oben gesagten klar hervor, daß der Verdauungstrakt der pflanzenfressenden Tiere besondere Gruppen von Cellulosebakterien beherbergt, die weder in Gewässern noch im Boden vorkommen. 16 Imschenezkl, Mikrobiologie

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Außer den bereits genannten Formen werden in der Literatur noch die Arten Cellubcoccus albus ( S A C K , 1924) sowie Micrococcusmotchutcowskii ( S E R B I N O W , 1927) angeführt. In diesen beiden Fällen muß jedoch die Fähigkeit der Mikroorganismen zur Cellulosezersetzung auf Grund einiger besonderer Eigenschaften bezweifelt werden. 3. Sporenlose Bakterien Viele sporenlose Bakterien, die Cellulose unter aeroben Bedingungen zersetzen, gehören zu den fakultativ anaeroben Formen, die sich also auch unter relativ anaeroben Verhältnissen entwickeln können. Im allgemeinen rechnet man dazu einige Mycobakterien, verschiedene ehemals in der Gattung Cellulomonas zusammengefaßte Arten sowie einige sporenlose Formen. Möglicherweise gehören zu den fakultativ anaeroben, celluloseaktiven Mikroorganismen auch eine Reihe von Actinomyceten, unter denen bekanntlich Arten existieren, die auch unter anaeroben Verhältnissen wachsen und sich vermehren. Alle diese Organismen wurden bereits im Abschnitt über die aeroben Cellulosebakterien beschrieben. Ausgesprochen anaerobe sporenlose Bakterien waren bis jetzt noch nicht bekannt. Erst H u N G A T E konnte aus dem Panseninhalt, aus dem Schlamm der Kläranlagen sowie aus dem Boden sporenlose mesophile cellulosezersctzende Bakterien isolieren. Die Kulturen dieser Organismen erwiesen sich als äußerst anspruchsvoll hinsichtlich der Zusammensetzung des Nährmediums. So gediehen die im Ochsenpansen vorkommenden Bakterien nur dann gut, wenn dem aus Cellulose-Agar mit Pansenflüssigkeit bestehenden Nährmedium noch 1% Blutserum zugesetzt oder wenn zur Kultivierung ein flüssiges Medium mit 30% Pansenflüssigkeit, 0,5% Cellulose, anorganischen Salzen und Bicarbonat benutzt wurde. Diese Bakterien besitzen die Gestalt kleiner, leicht gekrümmter Stäbchen von 1,0 bis 2,0 ¡i, Länge und 0,3 bis 0,4 fi, Breite. Die Zellen sind im lebenden ungefärbten Zustand schlecht sichtbar und erzeugen keine Sporen. In älteren Kulturen treten große runde oder ovale Zellen auf, die offenbar Altersformen darstellen. Diese Bakterienart unterscheidet sich von anderen anaeroben Formen dadurch, daß sie in der Lage ist, sich auf Cellulose-Agar zu entwickeln. Eigentliche Kolonien, die von einer Hydrolysenzone umgeben sind, entstehen in diesem Medium nicht. Die Zellen verteilen sich im Substrat in Form einer dünnen „Schicht" an der Grenze zwischen der zersetzten und unzersetzten Cellulose. Diese Feststellung ist jedoch nicht gleichbedeutend damit, daß die Zellen keine Exocellulase erzeugen. In jungen Kulturen gibt es sehr wohl Kolonien, die von einer kleinen enzymatischen Hydrolysenzone umgeben sind. Bezüglich der Systematik ist H U N G A T E der Ansicht, daß einige Eigenschaften auf die Verwandtschaft mit den Myxobacteriales hinweisen. Ungefärbt sind die Zellen schlecht sichtbar. In alten Kulturen entstehen Körper von unregelmäßig runder oder ovaler Gestalt. Im Agar verteilen sich die Bakterienzellen schließlich in der gleichen Weise wie die Cytophaga-Yoimen. Da der Autor jedoch keine krümmende Bewegung feststellen konnte, hielt er die Zugehörigkeit zu den Myxobakterien für ausgeschlossen und ordnete sie der Gattung Bacteroides zu. Leider fehlt jedoch die nähere Beschreibung einer Reihe von Eigenschaften, die für die Aufklärung der verwandtschaftlichen

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Beziehungen mit den Myxobakterien von Interesse sein dürften. Auf Grund der Beschreibung muß man nämlich annehmen, daß die vorliegende Form den letzteren zuzurechnen ist. Die allgemeine Bedeutung dieser Beobachtung für die Mikrobiologie ist jedenfalls von HüNGATE unterschätzt worden. Unter den Myxobakterien ist bis heute keine einzige anaerobe Art bekannt geworden. Sollte aber doch eine derartige existieren, so wäre diese Tatsache von erheblichem theoretischen Interesse. Sie würde die oft geäußerte Vermutung unterstützen, daß innerhalb jeder Reihe oder Familie die Möglichkeit zur Anpassung an verschiedene Bedingungen besteht. Das Auftreten nicht nur aerober, sondern auch anaerober Celluloseformen unter den Myxobakterien würde in diesem Falle die Anpassungsfähigkeit illustrieren. Bei der Zersetzung der Cellulose durch die erwähnte Bakterienart bilden sich größere Mengen an Bernsteinsäure. Deshalb wurde für das Bakterium die Bezeichnung Bacteroides succinogenes gewählt. Infolge der Entwicklung im tierischen Organismus paßte sich die Art relativ hohen Temperaturen an; die für das Wachstum günstigste Temperatur liegt zwischen 38 und 42° C. Eine rasche Entwicklung wurde auch bei 44° C beobachtet; bei 48° C war kein Wachstum mehr festzustellen, und bei 23 °C erfolgte die Vermehrung nur sehr langsam. Diese Angaben verdienen schon insofern Beachtung, als die Myxobakterien im allgemeinen oberhalb 36° C überhaupt nicht mehr gedeihen. Es dürfte sich hier also nicht u m die gleichen Arten handeln, die im Boden vorkommen, sondern um solche, die sich den im Darm der Warmblüter herrschenden Bedingungen angepaßt haben. Die Kulturen von B. succinogenes erfordern häufige Passagen, da sie beim Altern mitunter zugrunde gehen, eine Eigenschaft, die sie ebenfalls mit den Myxobakterien teilen.. Züchtungsversuche haben ergeben, daß sie in bezug auf das Medium äußerst anspruchsvoll sind. Weder in peptonhaltigen Substraten noch in solchen mit Malz, Hefeextrakt, Maisextrakt oder Schrot, wie sie in der Alkoholfabrikation anfallen, ist ein Wachstum festzustellen. Gute Resultate erhält man mit blutserumhaltigen Medien, die zuvor der Einwirkung von gramnegativen celluloseinaktiven Bakterien aus dem Pansen ausgesetzt wurden. Offenbar ist auch hier die gesamte Mikroflora des Pansens für die günstigen Entwicklungsmöglichkeiten von B. succinogenes bestimmend. Letzterer ist ferner in der Lage, neben Cellulose auch Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke und Trehalose zu vergären, nicht dagegen andere Mono-, Di- und Polysaccharide sowie Hemicellulosen verschiedener Herkunft. Die bei der Vergärung der Cellulose entstehenden Produkte sollen weiter unten im Abschnitt über die Physiologie besprochen werden. Hydrolysenprodukte der Cellulose konnten im Medium jedenfalls nicht nachgewiesen werden. HUNGATE konnte aus dem Panseninhalt noch weitere, ebenfalls Cellulose unter anaeroben Bedingungen zersetzende sporenlose Bakterien isolieren, deren Aktivität allerdings geringer war als die von B. succinogenes. Von der letzteren Art unterschieden sie sich unter anderem dadurch, daß bei der Vergärung der Cellulose keine Bernsteinsäure, sondern Buttersäure und Milchsäure gebildet werden. In morphologischer Hinsicht ähneln sie den Vibrionen, ohne jedoch deren Beweglichkeit zu besitzen (Abb. 86). Andere aus Klärschlamm erhaltene Bakterien erzeugen offenbar aktive Cellulase, da die Kolonien von hellen Hydrolysenzonen umgeben sind 16*

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

(Abb. 87). Die Zellen dieser Stämme besitzen die Form leicht gekrümmter Stäbchen, sie sind gramnegativ, beweglich und zeigen mitunter etwas angeschwollene Bereiche. In Medien mit verschieden hohen Konzentrationen an Hefeextrakt wird die Cellulose proportional der Hefemenge immer langsamer vergoren; bei 0,4% Hefezusatz hört die Gärung ganz auf. In alten Kulturen lassen sich reduzierende Substanzen nachweisen. Unter den Gärungsprodukten wurden Äthanol und Essigsäure gefunden, andere Säuren fehlten. Die von H Ü N G A T E erhaltenen Resultate sind zweifellos äußerst wichtig. Allerdings müßten sie noch einer sorgfältigen Nachprüfung unterzogen werden, da keinerlei Reinheitsbeweise gegeben werden. Das von dem Autor benutzte Züchtungsverfahren garantiert keineswegs die Abwesenheit von Begleitbakterien. Darauf deutet auch die Mannigfaltigkeit der Gärungsprodukte hin. Weiterhin ist nicht ausgeschlossen, daß in einigen Fällen Kulturen sporenbildender Bakterien vorlagen, die unter den gegebenen Verhältnissen keine Sporen erzeugten. Möglicherweise handelt es sich auch um sporenlose Rassen der Cellulosebazillen. Insbesondere stimmt nach den angeführten Mikrophotographien die Morphologie der sporenlosen, aus Klärschlamm isolierten Bakterien mit derjenigen sporenbildender Formen überein. Ausführlichere Angaben über die Morphologie und Physiologie der von H Ü N G A T E isolierten Formen fehlen leider, so daß die systematische Einordnung wesentlich erschwert wird. Andererseits muß natürlich stets mit der möglichen Existenz sporenloser anaerober Cellulosebakterien gerechnet werden. Da diese hinsichtlich des Mediums anscheinend sehr anspruchsvoll sind, so dürften auch zu ihrer Züchtung besondere Verfahren erforderlich sein. 4. Physiologie a) D a s V e r h a l t e n g e g e n ü b e r v e r s c h i e d e n e n K o h l e n s t o f f q u e l l e n Die Fähigkeit der Cellulosebakterien, verschiedene Stoffe als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten, prüft man gewöhnlich durch Kultivierung der Mikroorganismen in flüssigen Medien, deren organische Bestandteile von Fall zu Fall geändert werden. Durch Beobachtung der Zellenvermehrung und des Gärungsbeginnes kann man auf die Eignung der verschiedenen Stoffe schließen. Eine derartige Methode besitzt allerdings einen etwas primitiven Charakter, da sich z. B. eine geringe Vermehrung der Zellen in undurchsichtigen Medien nicht immer feststellen läßt. Ebenso wird bei einer langsamen und schwachen Gärung keine sichtbare Gasentwicklung stattfinden.1 Als sichere Beweise können deshalb nur die Ergebnisse solcher Versuche angesehen werden, in denen erstens eine Auszählung der Zellen vorgenommen wird und zweitens sowohl die entstandenen Gärungsprodukte als auch die zu Beginn und am Ende vorhandene kohlenstoffhaltige Substanz quantitativ bestimmt werden. Es ist ziemlich schwierig, die verschiedenen auf diesem Gebiete durchgeführten Untersuchungen auf einen Nenner zu bringen. Angaben, nach denen die CelluloseIm Falle der thermophilen Cellulosegärung reicht die beschriebene Methode aus, da hier die Gärung stürmisch und unter starker Gasentwicklung verläuft. 1

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bakterien die verschiedenartigsten Kohlenstoffverbindungen vergären, rufen bei dem kritischen Beobachter unbedingt Zweifel an der Reinheit der benutzten Kulturen hervor. Andererseits können die hinsichtlich gewisser Substanzen erhaltenen negativen Ergebnisse darauf zurückgeführt werden, daß die verwendeten Medien für die Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien nicht die optimale Zusammensetzung besitzen. Aus den meisten Arbeiten geht hervor, daß verschiedene Kohlenhydrate und Alkohole von den anaeroben Cellulosebakterien nicht vergoren werden. So berichtet z. B. KHOUVINE (1923, 1934), daß ein von ihr kultiviertes anaerobes Bakterium

bei Zusatz von Arabinose, Xylose, Glucose, Lävulose, Saccharose, Galactose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Mannit, Dulcit, Inulin oder löslicher Stärke zum Medium sich nicht entwickelte. Ähnliche Ergebnisse erhielt auch WERNER (1926) bei Zusatz folgender Substanzen: Glucose, Galactose, Fructose, Saccharose, Lactose, Maltose, Inulin, Dextrin, lösliche Stärke, Glykogen und Mannit. COWLES und KETTGER (1931) fanden keine Gärung bei Zusatz von Glucose, Lävulose, Mannit, Lactose, Maltose, Saccharose, Melicitose, Raffinose, Inulin, Sorbit oder Gummi arabicum. Die gleichen Bakterienarten vergoren jedoch Araban (bei pn 6,2), Xylan (Ph 5,2) und Dextrin (pH 5,6) unter Bildung von Säuren. Im Falle von Stärke wurde ebenfalls ein Abbau beobachtet, der aber nur sehr schwach und unspezifisch war und wahrscheinlich auf eine Hydrolyse der Stärke bei der Sterilisation zurückzuführen ist. Zu gänzlich anderen Schlußfolgerungen gelangte HuNGATE (1944, 1947) bei entsprechenden Untersuchungen an Clostridium cdlobioparus. Dieser Organismus verhält sich den verschiedenen Kohlenhydraten gegenüber sehr unterschiedlich. Eine gute Gärung beobachtete der Autor bei einem Zusatz von Glucose, Fructose, Xylose, Arabinose, Mannose, Cellobiose, Melicitose oder Maltose. Wesentlich schwächer verlief die Gärung im Falle der Saccharose, Lactose, Raffinose, Galactose, des Mannits oder Dextrins; mitunter setzte auch gar keine Gärung ein. Melicitose, Trehalose, Rhamnose, Salicin, Inulin, Glycerin und lösliche Stärke konnten in keinem Falle vergoren werden. Die angeführten Resultate beziehen sich sämtlich auf diejenigen Cellulosebakterien, die endständige Sporen bilden und in diesem Buch als Bac. omdianskii beschrieben wurden. Nach der Analyse dieser Angaben muß folgendes festgestellt werden: 1. Völlig unverständlich ist es, weshalb die anaeroben Cellulosebakterien nach den Beobachtungen einiger Autoren nicht in der Lage sind, Glucose zu vergären. Man kann sich nur schwer vorstellen, «daß die Glucose, die in den Kulturen sicher durch Hydrolyse der Cellulose entsteht, in Substanz nicht vergoren wird. Für diese Merkwürdigkeit gibt es nur zwei Erklärungsmöglichkeiten: a) die Cellulosebakterien greifen die bei der Hydrolyse der Cellulose entstehende Glucose leichter an als künstlich zugesetzten Traubenzucker; b) die herrschenden Kultivierungsbedingungen waren für eine Vergärung der Kohlenhydrate, darunter auch der Glucose, nicht günstig. 2. Möglicherweise unterscheiden sich die verschiedenen Cellulosebakterien voneinander durch ihre Fähigkeit zur Vergärung der Zucker. Eine endgültige Ent-

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Scheidung dieser Frage ist jedoch heute noch nicht möglich. Unter Berücksichtigung der ökologischen Besonderheiten dieser Mikroorganismen kann angenommen werden, daß die „klassischen" anaeroben Cellulosebakterien außer Cellulose, Glucose und Cellobiose auch die bei der Hydrolyse der Pentosane entstehenden Kohlenhydrate, Arabinose und Xylose, vergären. 3. Von allen Autoren wird übereinstimmend festgestellt, daß Stärke überhaupt nicht angegriffen wird. Darin äußert sich unter anderem die Spezifität dieser Bakteriengruppe. 4. Bisweilen werden vom gleichen Autor, bei Verwendung des gleichen Nährmediums, aber verschiedener Bakterienrassen, unterschiedliche Resultate erhalten. So fand HUNGATE (1944, 1947), wie bereits oben erwähnt, daß Clostridium cellobioparus die verschiedensten Kohlenhydrate und Alkohole vergärt. Durch eine andere Bakterienform (Stamm E) werden aber außer Glucose, Cellobiose, Arabinose und Xylose keine anderen kohlenstoffhaltigen Verbindungen vergoren. Eine sehr eigenartige Stellung nimmt A. navicula ein. Dieser Organismus gehört zu den „Polyphagen" und vermehrt sich in Hefewasser mit einem Zusatz von 2 % der verschiedenen Substanzen. Während Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Raffinose, Lävulose, Galactose, Stärke, Mannit, Salicin, Glycerin vergoren werden, greift der Organismus Calciumlactat nicht an. Es handelt sich hier anscheinend um keine ausgesprochene Celluloseform. Aus den angeführten Beobachtungen geht hervor, daß die Reaktion der Cellulosebakterien gegenüber den verschiedenen Kohlenstoffquellen noch einer eingehenden Untersuchung bedarf. Durch Veränderung der Nährmedien, Verwendung verschiedener Vitamine und Einhaltung streng anaerober Bedingungen kann man gegebenenfalls eine Unterscheidung der Cellulosebakterien hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber den verschiedenen Kohlenhydraten erreichen. Aber schon jetzt ist die Existenz zweier Gruppen zu erkennen. Der einen gehören die eng spezialisierten Formen an, die neben Cellulose, Glucose, Cellobiose gegebenenfalls nur noch Xylose, Arabinose und Mannose vergären. Vom Evolutions- und ökologischen Standpunkt aus ist das Vorhandensein einer derartigen Gruppe völlig berechtigt. Zur zweiten Gruppe gehören alle diejenigen Formen, die zur Vergärung der verschiedensten Kohlenhydrate und Alkohole befähigt sind. Wenn durch weitere Untersuchungen bestätigt werden kann, daß Reinkulturen der Cellulosebakterien tatsächlich eine derart „breite" Gärfähigkeit aufweisen, so ist an der Existenz von wenig spezialisierten Celluloseformen nicht mehr zu zweifeln. Aus der Erfahrung über die Mineralisierung der im Boden vorhandenen organischen Verbindungen gewinnt man jedoch die Uberzeugung, daß die erste, spezialisierte Gruppe die dominierende Rolle in der Natur spielt. b) S t i c k s t o f f e r n ä h r u n g Systematische Untersuchungen über den Stickstoffbedarf der anaeroben Cellulosebakterien sind nicht bekannt. Der Grund dafür liegt in der Tatsache, daß die Reinzüchtung und weitere Kultivierung in derart kompliziert zusammengesetzten

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Medien erfolgt, wie sie z. B. Fleischbrühe-Pepton oder Substrate mit verschiedenen Extrakten und Autolysaten darstellen. Alle Autoren stimmen dahingehend überein, daß die anaeroben Cellulosebakterien sich ausgezeichnet bei Anwesenheit von organisch gebundenem Stickstoff entwickeln. Die bisherigen Vorstellungen über den Stickstoffbedarf der Mikroorganismen wurden jedoch durch die neuen Erkenntnisse über den Einfluß der Vitamine auf das Bakterienwachstum wesentlich verändert. Die Zahl der Mikroorganismen, die nur bei Gegenwart von Eiweiß oder Aminosäurekomplexen eine Entwicklung zeigten, verringerte sich allmählich. Ferner wurde festgestellt, daß einige pathogene, aber auch nichtpathogene Formen in der Lage sind, ihren Stickstoffbedarf aus anorganischen Quellen zu decken (Ammoniumsalze), wenn dem Medium verschiedene Vitamine zugesetzt werden. Ausführlicher hat sich J E R U S S A L I M S K I (1949) mit dieser Frage beschäftigt. Alle an aeroben Bakterien gewonnenen Ergebnisse treffen anscheinend auch auf die anaeroben Cellulosebakterien zu. HuNGATE gelang z. B. ihre Züchtung in mineralischen Medien. Als einzige Stickstoffquelle diente Ammoniumsulfat; allerdings erwies sich ein Zusatz von Biotin als erforderlich. Einige physiologische Merkmale seiner Kultur, insbesondere das Fehlen einer größeren Menge an reduzierenden Stoffen in der Kulturflüssigkeit, weisen darauf hin, daß alle derartig zusammengesetzten Nährmedien nicht als optimal anzusprechen sind. Dadurch wird schließlich nur die wohlbekannte Auffassung bestätigt, daß vollsynthetische Nährmedien schlechter sind als natürliche Substrate, selbst dann, wenn sie den gesamten, für die gegebene Mikrobenform erforderlichen Vitaminkomplex enthalten. Die Angaben über die Verwertung des Eiweißes durch die anaeroben Cellulosebakterien sind einander sehr widersprechend. C L A U S E N erwähnt, daß die Cellulosebakterien während ihrer Entwicklung auf asparaginhaltiger Fleischbrühe-PeptonGelatine dieses Medium abbauen. Andere Autoren konnten bei den anaeroben Cellulosebakterien keine Exoprotease nachweisen. Etwas unerwartet ist die Feststellung C L A U S E N S , daß Bac. omelianskii in der Lage ist, Milch zu peptonisieren, da diese Eigenschaft vom ökologischen Standpunkt aus nur schwer zu erklären ist. Bei dem erwähnten Versuch wurden folgende Zahlen erhalten: Gesamtstickstoff 2 , 9 5 % ; Caseinstickstoff 0 , 9 3 % ; Albuminstickstoff 0 , 3 6 % . Ein Blindversuch ergab: Gesamtstickstoff 3,2%; Caseinstickstoff 2,7%; Albuminstickstoff 0,4%. In 100 ml Milch wurde vor dem Versuch ein Aminostickstoffgehalt von 2 0 , 3 3 5 mg gefunden. Nach einer Parallelzüchtung von sechs verschiedenen Bac. omelianskii-St'ámmen betrug der Aminostickstoffgehalt zwischen 2 5 , 2 1 9 und 5 6 , 6 5 1 mg. Das Casein wird infolgedessen nicht bis zum Ammoniak, sondern nur bis zu Aminosäuren abgebaut. Die gleiche proteolytische Fähigkeit besaß auch eine andere von C L A U S E N untersuchte Kultur, nämlich Amylobacter navícula. Bereits 24 Stunden nach der Beimpfung wurde in der Milch eine starke Gasentwicklung beobachtet. Die Milch zersetzte sich, die Molke wurde hell, und das Gerinnsel ballte sich zusammen; ein Geruch nach Buttersäure trat nicht auf. Dagegen konnten geringe Mengen Essig-, Ameisen- und hauptsächlich Propionsäure nachgewiesen werden. Weder Bac. omelianskii noch A. navícula zersetzen ein hirnhaltiges Medium; ferner bilden sie weder Indol noch Ammoniak, noch reduzieren sie Nitrate.

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Aus den zur Verfügung stehenden Zahlen geht also hervor, daß die anaeroben Cellulosebakterien Stickstoff entweder in Form von Eiweiß oder von Aminosäurekomplexen benötigen. Es ist jedoch auch möglich, daß die Wirksamkeit von Zusätzen wie Fleischbrühe-Pepton, verschiedenen Extrakten, Autolysaten usw. auf die darin enthaltenen Vitamine zurückzuführen ist. Auf diese Frage soll weiter unten noch ausführlicher eingegangen werden. Es ist durchaus anzunehmen, daß der Bedarf der verschiedenen Cellulosebakterien an Stickstoff und Vitaminen ein unterschiedlicher ist. Darauf ist wahrscheinlich auch die Beobachtung einiger Autoren zurückzuführen, daß in Reinkulturen eine, wenn auch schwache Entwicklung ebenfalls auf rein mineralischen Medien auftritt (CLAUSEN, 1931). Andere dagegen fanden auf derartigen Substraten niemals ein Wachstum der Bakterien (KHOUVINE, 1923,1934; IMSCHENEZKI, 1938,1940). Von besonderem Interesse sind einige VeTsuche CLAUSENS (1931) über die Fixierung des Stickstoffs durch die Cellulosebakterien. Für die Versuche wurde eine Kultur von A. navicula in einem fast stickstofffreien mineralischen Medium benutzt, dem auf 1000 ml Lösung 1 g Glucose und 3 g Cellulose zugesetzt waren. Der Stickstoffgehalt des Mediums betrug 0,03%. Nach 20 Tagen war er bereits auf etwa den zehnfachen Wert, nämlich 0,31%, angestiegen. An Hand einer einfachen Berechnung läßt sich jedoch nachweisen, daß dem Autor methodische Fehler unterlaufen sein müssen. Auf 4 g Kohlenhydrate (d. h. 1 g Glucose + 3 g Cellulose) wurden 2,8 g Stickstoff fixiert (3,1g N2 in 1000 ml der Kulturflüssigkeit abzüglich 300 mg ursprünglich vorhandenen Stickstoffs). Folglich haben die Bakterien je Gramm Kohlenhydrat 700 mg Stickstoff fixiert. Da aber in 20 Tagen sicher nicht die gesamte Cellulose zerstört worden ist, dürfte der angegebene Wert zu hoch sein. Letzterer liegt sogar um ein geringes höher als die bei den aktivsten Stämmen stickstofffixierender Bakterien aus der Gruppe der Buttersäurebakterien beobachteten Werte. Vom theoretischen Standpunkt aus besteht keine Veranlassung, an der Fähigkeit der anaeroben Cellulosebakterien zur Stickstoffixierung zu zweifeln, da diese Eigenschaft unter denjenigen Bakterien, die Kohlenhydrate unter anaeroben Bedingungen zersetzen, sehr häufig anzutreffen ist (McCOY, HlGBYundFRED, 1928/29). Wahrscheinlich sind also auch die anaeroben Cellulosebakterien in der Lage, Stickstoff zubinden. Zu einem einwandfreien Beweis bedarf es jedoch noch überzeugenderer Versuche. Trotz der hohen Anforderungen, die von den anaeroben Cellulosebakterien an die Zusammensetzung des Nährmediums gestellt werden, sind diese Organismen jedoch typische Saprophyten. Wie festgestellt werden konnte, wirken sie weder auf Mäuse (WERNER, 1926; CLAUSEN, 1931) noch auf Meerschweinchen (KHOUVINE, 1923,

1934) pathogen.

c) V i t a m i n b e d a r f Bei dem Studium des Verhaltens der anaeroben Cellulosebakterien gegenüber den verschiedenen Stickstoffquellen darf nicht übersehen werden, daß die verschiedenartigsten Extrakte und Hydrolysate nicht nur organische Stickstoffverbindungen, sondern auch viele Vitamine enthalten. Es ist deshalb mehrfach versucht worden, die Frage zu beantworten, ob der günstige Einfluß dieser Zusätze auf die Vitamine

C. Mesophile Cellulosebakterien

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oder auf die Stickstoffverbindungen zurückgeführt werden kann. Die Versuche wurden jedoch zu einer Zeit durchgeführt, als man über den Bedarf der Mikroorganismen an diesen Substanzen erst sehr wenig wußte. Andererseits verwandte man damals Vitaminreinpräparate im Laboratorium noch nicht in dem Maße, wie es heute üblich ist. E s wurden die verschiedensten Extrakte benutzt, deren Zusammensetzung und Vitamingehalt man noch nicht genügend kannte, so daß irgendwelche Folgerungen nicht möglich waren. Anläßlich von Untersuchungen über die Ernährungsphysiologie des Bac. cellulosae dissolvens beobachtete K H O U V I N E ( 1 9 2 3 , 1 9 3 4 ) , daß die Gärung im Verlauf von mehreren Passagen in cellulosehaltigem Fleischbrühe-Pepton allmählich schwächer wurde und statt des orangefarbenen Pigments ein blaßgelber Farbstoff auftrat. Die Bakterienzellen wurden dünner und länger und die Anzahl der Sporen verringerte sich sprunghaft. Nach sieben Passagen hörte die Sporenbildung gänzlich auf; die Kultur war degeneriert. Verwendet man dagegen ein Medium, das Fäkalienextrakt enthält, so bewahrt die Kultur selbst nach 30 Passagen ihre volle Aktivität. Die Sporenbildung bleibt hier ebenfalls normal. Zusätze von Vitamin B zeigten keinerlei Wirksamkeit. Das gleiche traf auch für das Filtrat einer J/wcor-Kultur zu, die in MEYERschem Medium mit 5% Saccharose gezüchtet worden war. Aus diesen Ergebnissen folgert K H Ö U V I N E , daß die Wirksamkeit des Fäkalienextraktes nicht auf eventuell darin vorhandene Vitamine zurückzuführen ist. Die geringe Wirkung des Filtrates einer auf Fleischbrühe-Pepton gezüchteten Mucor-Kultur dürfte keine Bedeutung besitzen, da die Fleischbrühe selbst schon einen schwach stimulierenden Einfluß besitzt. Für die Wirkung des Fäkalienextraktes sind demnach gewisse Stickstoffverbindungen verantwortlich, die für die Entwicklung der Cellulosebakterien notwendig sind. K H O U V I N E versuchte ferner, die Natur der wirksamen Substanzen aufzuklären. Dabei stellte sich heraus, daß ein alkoholischer Fäkalienextrakt die gleiche Wirksamkeit besitzt wie ein wäßriger. Das wirksame Prinzip muß in Alkohol also ebenfalls löslich sein. Andererseits sind Peptone und Salze in Alkohol unlöslich. Ferner zeigte es sich, daß ein Extrakt, der nicht durch Oxydation an der Luft braun gefärbt war, eine schwächere Wirkung aufwies. Skatol konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen war in einem Falle eine schwach positive Reaktion auf Hydrobilirubin festzustellen. Gallensäuren und Gallenfarbstoffe waren nicht vorhanden, wohl aber Cholesterin, das aber keine Wirksamkeit zeigte. Nach Ansicht K H O Ü V I N E S kommt als wirksames Prinzip nur der braune Farbstoff in Betracht. Während des Gärprozesses wird die Flüssigkeit allmählich klar, wobei sich am Boden ein brauner Niederschlag ansammelt. Dieser löst sich in zehnprozentiger Salzsäure, nicht dagegen in Alkohol und Äther. Eine Lösung des Problems mit Hilfe derartiger Untersuchungen ist natürlich nicht möglich. Schwer zu erklärende Resultate hat R. M E Y E R ( 1 9 3 8 , 1 9 4 2 ) erhalten. Er fand, daß ein Extrakt aus Maiskeimen die Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien günstig beeinflußt. Die gleiche Wirkung zeigte auch Vitamin D. Diese Angabe ruft jedoch insofern einige Zweifel hervor, als die Mikroben dieses Vitamin gewöhnlich nicht benötigen. Extrakte aus alten Kulturen von Cellulosebakterien und Mais-

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

wurzeln wirkten nur in geringem Maße wachstumsfördernd. Als völlig unwirksam erwiesen sich B-Vitamine, Apfelsinensaft, Boden - und Hefeextrakte. Nach V. MEYER (1935) zeigen verschiedene Extrakte, darunter auch Hefeauszüge, keinen Einfluß auf die Bakterienentwicklung. Ziemlich eingehend hat sich auch HuNGATE (1947) mit dieser Frage befaßt. Die von ihm aus dem Boden isolierten sporenbildenden Cellulosebakterien (Stamm E) wuchsen nicht auf Medien mit Hefeextrakt, entwickelten sich dagegen gut auf mineralischen Medien, die Pansenflüssigkeit, Proteospepton, Heu oder FleischbrühePepton enthielten. Schwächer als vorstehende Zusätze wirkten Treberrückstände, Malz und Trypton. Keine Entwicklung fand bei Zugabe von Hefe- oder Maisextrakten statt. Die gleichen negativen Ergebnisse wurden auch mit Calciumpanthotenat, Folsäure und Heuextrakt erzielt. Ein Zusatz von Biotin zum Nährsubstrat erwies sich dagegen als äußerst wirksam: die Bakterien entwickelten sich ausgezeichnet in einem Medium, das außer Biotin nur noch anorganischen Stickstoff enthielt. HUNGATE gelang ferner noch eine sehr wesentliche Beobachtung. In einem flüssigen Medium zeigten die Bakterien keinerlei Entwicklung. Verfestigte man jedoch die Nährlösung mit Agar-Agar, so fand eine normale Vermehrung statt.. Diese Erscheinung kann mit der Tatsache erklärt werden, daß Agar-Agar gewöhnlich etwas Biotin enthält. Aus den wenigen Angaben geht hervor, daß eine systematische Untersuchung über den Vitaminbedarf der anaeroben Cellulosebakterien bislang noch nicht durchgeführt worden ist. Offenbar ist die Anwesenheit mehrerer Vitamine erforderlich, wofür die Vermehrung in mineralischen Medien bei Gegenwart von Biotin spricht. Da diese Untersuchungen erst einen Anfang in der Erforschung des Vitaminbedarfs darstellen, sind noch weitere umfassende physiologische Versuche mit reinen Vitaminpräparaten notwendig, um die Frage des Stickstoff- und Vitaminbedarfs der anaeroben Cellulosebakterien endgültig zu klären. d) D e r B e d a r f a n M i n e r a l s a l z e n Zur Kultivierung der anaeroben Cellulosebakterien benutzt man gewöhnlich ziemlich kompliziert zusammengesetzte Medien. Untersuchungen über den Einfluß der Einzelbestandteile des Nährsubstrats auf das Bakterienwachstum sind deshalb kaum durchführbar. Die in der Literatur vorhandenen, vereinzelten Angaben über den Bedarf an dem einen oder anderen Element haben deshalb nur einen relativen Wert. Im Grunde genommen besitzen nur solche Versuche einen gewissen Aussagewert, in denen die Bakterienentwicklung auf mineralischen Medien bei Gegenwart geringer Vitaminmengen untersucht wird. Im Falle des Biotins enthielt das Medium Kalium, Natrium, Magnesium, Schwefel, Chlor und Phosphor. Speziellere Arbeiten in dieser Richtung fehlen jedoch noch. e) Ä u ß e r e F a k t o r e n a) Temperatur Literaturangaben zufolge verhalten sich die mesophilen anaeroben Cellulosebakterien hinsichtlich des für die Lebenstätigkeit notwendigen Temperaturbereiches

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ziemlich gleichartig. Schon OMÉLJANSKI (1899) stellte fest, daß die für die Entwicklung der Wasserstoffbakterien geeignetste Temperatur zwischen 34 und 36° C liegt; Methanbakterien gären am besten bei 35 bis 37° C. Nach WERNER (1926) beträgt das Temperaturoptimum für die von ihm untersuchte Kultur 33 bis 37° C mit einem Minimum bei 21° C und einem Maximum bei 39° C. Anscheinend kann der Bereich des Temperaturoptimums unter sehr günstigen Wachstumsverhältnissen auch etwas schwanken. So beobachtete WERNER z. B. in Mischkulturen eine Zersetzung der Cellulose schon bei 13° C, d. h. also bei einer Temperatur, die um 8° C niedriger liegt als die für Reinkulturen erforderliche Mindesttemperatur. Ähnliche Zahlen gibt auch CLAUSEN (1931) an. Danach liegt das Minimum bei 25°C, das Optimum zwischen 37 und 42° C und das Maximum bei 50° C. Clostridium cellobioparus entwickelt sich nach HUNGATE (1944, 1947) bei 38° C normal, bei 25° C dagegen nur geringfügig, und unterhalb 18° C sowie oberhalb 45° C hört jegliches Wachstum auf. Neben den typischen mesophilen Formen können unter den anaeroben Cellulosebakterien auch Übergangsformen zwischen den mesophilen und thermophilen Rassen vorkommen. So zeigte z. B. der mehrfach erwähnte Stamm E ein relativ hohes Temperaturoptimum, zwischen 37 und 45° C, während bei 26° C nur noch eine sehr geringe Entwicklung und unterhalb von 25° C sowie oberhalb von 50° C überhaupt kein Wachstum mehr zu beobachten war (HUNGATE, 1947). KHOUVINE (1923,1934) konnte ebenfalls die Existenz derartiger Übergangsformen bestätigen. Bac. cellulosae dissolvens besitzt bei 28° C eine Inkubationszeit von 3 Wochen, während diese zwischen 35 und 51° C nur 2 bis 3 Tage beträgt. Unterhalb von 22° C und oberhalb von 57 bis 62° C findet keine Entwicklung mehr statt. IMSCHENEZKI beobachtete gelegentlich der Herstellung von Anreicherungskulturen des öfteren, daß in der Natur zwischen den mesophilen und den thermophilen Bakterien alle möglichen Übergangsformen existieren. Letzten Endes wird das Temperaturverhalten durch die während der Herstellung der Anreicherungskultur herrschende Temperatur diktiert. Die mesophilen Bakterien stellen demzufolge keine einheitliche Gruppe dar; ihr Temperaturverhalten kann ein sehr unterschiedliches sein. Dies ist ganz natürlich, da das Temperaturoptimum der Cellulosebakterien von ihren Lebensbedingungen abhängt, die ebenfalls sehr verschieden sein können. Meistens entwickelten sich die Formen am besten bei der Temperatur, die während der Herstellung der Anreicherungskultur geherrscht hat. Dies dürfte der Grund dafür sein, daß die gefundenen Organismen häufig ein Temperaturoptimum zwischen 32 und 36° C besitzen. Ebenso starken Schwankungen ist auch die Beständigkeit der Cellulosebakterien gegenüber hohen Temperaturen unterworfen. Die von OMELJANSKI (1899) bzw. OMELIANSKI (1902) als Erreger der Wasserstoffgärung beschriebene Kultur war relativ unbeständig; bereits nach einem Aufenthalt von 7 bis 10 Minuten bei 100° C ging sie zugrunde. Zur Zerstörung der Aktivität bei niedrigeren Temperaturen waren etwas längere Zeiten erforderlich: bei 60° C bis 80 Minuten, bei 70° C bis 120 Minuten, bei 80 bis 90° C bis 25 Minuten und bei 96° C bis 20 Minuten. Deshalb empfahl OMELJANSKI zur Entfernung anderer Mikro-

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Organismen eine 20 bis 25 Minuten andauernde Erhitzung der Kultur auf 90° C. Nach Beobachtungen HUNGATES (1947) ist Clostridium ceUobioparus ziemlich thermostabil; die Sporen überdauern sogar ein 12stündiges Erhitzen auf 85° C. Andere in der Literatur beschriebene anaerobe Cellulosebakterien sind ebenfalls relativ hitzebeständig. So berichtet z. B. KHOUVINE (1923,1934), daß die Bakterien ein 45 bis 50 Minuten andauerndes Erhitzen auf 100° C ohne Schaden vertragen. CLAUSEN (1931) beschreibt eine Kultur, die ihre Lebensfähigkeit nach einem Erwärmen auf 100° C während 90 Minuten noch nicht eingebüßt hat. Obwohl die Sporen der mesophilen Cellulosebakterien gegenüber höheren Temperaturen ziemlich resistent sein können, lassen sie sich in dieser Hinsicht doch nicht mit den Sporen der thermophilen Cellulosebakterien vergleichen. Alle vorstehend gemachten Angaben beziehen sich jedoch nur auf die plektridialen Bakterienformen. Die Sporen der von CLAUSEN als A. navicula beschriebenen Art sind dagegen wesentlich weniger thermoresistent. Bei 100° C wurden sie in 5 Minuten, bei 75° C in 15 Minuten und bei 90° C in 3 Minuten abgetötet. Ein längeres Einwirken von Temperaturen, die zwar oberhalb des Optimums liegen, aber noch nicht unbedingt tödlich wirken, führt ebenfalls zum allmählichen Absterben der Kultur. So zeigte beispielsweise eine Kultur von Bac. cellulosae dissolvens nach 12tägiger Aufbewahrung bei 67° C und darauf folgender erneuter Kultivierung bei 37° C kein Wachstum mehr (KHOUVINE). Die Beständigkeit der Cellulosebakteriensporen ist somit, wie auch zu erwarten war, eine sehr unterschiedliche, weil die Zersetzung der Cellulose unter natürlichen Verhältnissen ebenfalls bei verschiedenen Temperaturbedingungen stattfindet. • ß) Acidität des Mediums Von allen Bearbeitern der mesophilen Cellulosebakterien wird übereinstimmend festgestellt, daß diese Organismen eine saure Reaktion des Mediums sehr schlecht vertragen. Eine gute Entwicklung findet nur ^>ei neutraler oder alkalischer Reaktion statt. Enthält das Medium keine Zusätze von Calciumcarbonat oder sonstigen neutralisierend wirkenden Stoffen, so hört die Gärung infolge der sich ansammelnden Säuren gewöhnlich bald auf. COWLES und RETTGER (1931) fanden z. B., daß unterhalb eines p H -Wertes von 5,6 keine Gärung mehr erfolgt. Nach WERNER (1926) verläuft die Gärung ohne Zusatz von Calciumcarbonat entweder sehr langsam, oder es findet überhaupt keine Zersetzung statt. Ein ursprünglich vorhandener pn-Wert von 7,1 bis 7,2 sinkt im Verlauf der Gärung langsam auf 6,1 bis 6,5 ab. Bei pn 5,6 bis 6 hört die anaerobe Zersetzung ganz auf. Während bei einem p H von 8,3 die Gärung normal verläuft, wirkt ein weiteres Ansteigen des pH-Wertes ungünstig und führt ebenfalls zu einer Sistierung des Celluloseabbaues. Der hemmende Einfluß der Säuren zeigte sich besonders deutlich in einem von KHOUVINE (1923, 1934) beobachteten Fall. In einem Medium ohne Calciumcarbonatzusatz wurde etwa nur ein Viertel der im Kontrollversuch mit CaC03 zerstörten Cellulose abgebaut. Durch eine schwach saure Reaktion des Substrats wird die Zersetzung der Cellulose nicht behindert. Beträgt z. B. die Acidität des Mediums 1 ml 0,1 n NaOH/lO ml Lösung, so hört die Gärung nicht auf (KHOUVINE). In einem alkalischen Medium (48 mgNaOH/lOOml)

C. Mesophile Cellulosebakterien

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entwickelte sich eine Kultur von Bac. cellulosae dissolvens mit der gleichen Intensität wie in einem neutralen Nährboden. Nach CLAUSEN (1931) liegt der optimale p H -Wert für Bac. omelianslcii zwischen 7 und 7,4, der Toleranzbereich erstreckt sich von p H 6 bis 8,4. Amylobacter navicvla besitzt ein Entwicklungsoptimum bei p H 7,4 bis 7,6 und einen Toleranzbereich von 6,2 bis 8,4. Etwas empfindlicher gegenüber Alkali ist die von HUNGATE (1947) beschriebene Art C. cellobioparus, die verschiedene Kohlenhydrate wohl bei pn Werten zwischen 6 und 7, aber nicht mehr bei p H 8, vergären konnte. Interessante Ergebnisse erhielten KAUFFMANN und TOUSSAINT (1953) im Verlaufe von Untersuchungen über die Verbreitung der anaeroben Cellulosebakterien in Kulturböden Frankreichs (p H 7,2) und Französisch-Westafrikas (p H 5,5). Zur Züchtung wurde die Nährlösung nach WlNOGRADSKI unter Zusatz von Ammoniumsulfat bzw. von Nitraten als Stickstoffquelle verwendet. Drei Versuchsreihen, bei denen der p H -Wert durch Calciumcarbonat auf 7,2 gebracht war und eine vierte durch Zugabe von Calciumchlorid auf p H 5,5 eingestellte Reihe wurden beimpft und für zwei Monate bei 29° gehalten. Zum T eil waren die Kulturen durch Evakuieren entlüftet, zum Teil mittels Pyrogallol vom Sauerstoff befreit. Bei diesen Versuchen wurden etwas ungewöhnliche Ergebnisse erzielt. Die Zerstörung der Cellulose und die damit verbundene G.asabscheidung verliefen im Falle der afrikanischen Bodenproben in sauren Medien ohne Pufferzusatz intensiver als in alkalischen Substraten mit Pufferzusatz. Dieser Umstand verdient insofern besondere Beachtung, als die überwiegende Mehrheit der anaeroben Cellulosebakterien sich bei hohen PH-Werten ausgezeichnet entwickelt, während bei pH-Werten unter 7 im allgemeinen nur ein sehr schwaches Wachstum erfolgt. Daraus kann man schließen, daß in sauren Böden säuretolerante ökotypen der anaeroben Cellulosebakterien vorherrschen. Die Fähigkeit der Cellulosebakterien zur Entwicklung in Nährböden mit schwach saurer Reaktion ermöglicht ihre Züchtung auf festen Substraten, die keinen Zusatz an Calciumcarbonat enthalten. Durch Verwendung von calciumcarbonatfreiem Nähragar wird die Isolierung kleiner Kolonien aus dem Innern des Agars erleichtert, da andernfalls in einem calciumcarbonathaltigen Medium infolge des entstehenden Kohlendioxyds Risse, Sprünge oder Blasen auftreten, wodurch die Züchtung sehr erschwert wird. Die Kultivierung in flüssigen Medien kann naturgemäß dann angewandt werden, wenn eine maximale Zersetzung der Cellulose erreicht werden soll. In diesen Fällen setzt man CaC03 oder andere neutralisierend wirkende Stoffe zu, oder man arbeitet gegebenenfalls auch mit Pufferlösungen. Dabei ist zu beachten, daß die Kulturen von Zeit zu Zeit durch einfaches Drehen der Kolben durchgemischt werden. Vorstehende Ausführungen zeigen, daß die Cellulosebakterien acidophob und bis zu einem gewissen Grade alkalophil sind. Dieses Verhalten läßt sich leicht durch eine Anpassung an die unter natürlichen Verhältnissen vorkommenden pH-Werte erklären. y) Das Verhalten gegenüber Sauerstoff Die Cellulosebakterien sind ausgesprochen anaerobe Organismen. Dies geht deutlich aus ihrem Verhalten gegenüber Sauerstoff hervor. So kann man z. B. die Gärung

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

einer Kultur unmittelbar verzögern oder sogar unterbrechen, wenn man sie der Luft aussetzt. Durch Verringerung des Redoxpotentials des Mediums kann die Entwicklung der Bakterien und die Zersetzung der Cellulose erneut in Gang gebracht werden. Alle Forscher, die sich mit der Physiologie der Cellulosebakterien beschäftigt haben, stimmen dahingehend überein, daß diese Mikroben streng anaerobe Organismen sind. CLAUSEN (1931) führt die von ihm bei der Isolierung der Reinkulturen erzielten Erfolge darauf zurück, daß er zur Herstellung wirklich anaerober Bedingungen eine verbesserte Methodik benutzt hat. Durch Einhalten einer strengen A.naerobiose gelang es IMSCHENEZKI sogar, Cellulosebakterien auf festen Nährmedien zu züchten. Leider existieren jedoch bis jetzt keine Arbeiten, die sich mit der Bestimmung des Redoxpotentials in den entsprechenden Kulturen beschäftigen. Ausführlichere Angaben über das Ausmaß der Anaerobiose bei den Cellulosebakterien sind deshalb nicht vorhanden; man beschränkte sich lediglich auf einige methodische Hinweise. Nach HüNGATE (1944, 1947) reicht z. B. die Belüftung von flüssigen Kulturen mit einem aus Stickstoff und 5% Kohlendioxyd bestehenden Gasgemisch mitunter nicht aus. Erst nach Zugabe von Natriumsulfid oder Natriumthioglycolat waren wirklich anaerobe Bedingungen vorhanden. Zum Studium des diesbezüglichen Verhaltens von Bac. cellulosae dissolvens unternahm KHOUVINE folgenden Versuch. Das Nährmedium (5 ml) wurde zunächst eine halbe Stunde lang ausgekocht, dann beimpft und darauf bis zu verschiedenen Restdrücken evakuiert. Während bei einem Druck von 2,5 bis 7 mm eine gute Entwicklung zu verzeichnen war, fand bei 12 mm keine Vermehrung der Bakterien statt. In einer Stickstoff-, "Wasserstoff- oder Kohlendioxydatmosphäre verlief das Bakterienwachstum dagegen normal. Aus diesen Angaben läßt sich ersehen, daß die mesophilen Cellulosebakterien zu ihrer Entwicklung ein anaerobes Milieu benötigen. Dieses Verhalten ist insofern verständlich, als sie in der Natur immer dort vorkommen, wo freier Sauerstoff fehlt und anaerobe Bedingungen herrschen (Pansen, Böden von Gewässern, Schlamm von Kläranlagen usw.). In diesen natürlichen Substraten findet man gewöhnlich keine fakultativen Anaerobier, sondern nur die ausgesprochen anaeroben Cellulosebakterien. Die Redoxpotentiale dieser Medien liegen stets relativ niedrig. Vom theoretischen Standpunkt aus ist es verständlich, daß der Fermentkomplex der streng anaeroben Bakterien im Gegensatz zu den fakultativen Formen weniger kompliziert zusammengesetzt ist, weil die Lebensbedingungen stets gleich bleiben. Bei den letzteren Organismen muß er umfangreicher sein, da diese infolge ihres „Amphibiencharakters" sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Verhältnissen leben müssen. Wenn man von den Lebensbedingungen der anaeroben Cellulosebakterien in der Natur spricht, darf man nicht vergessen, daß auch die Tätigkeit aerober Formen zur Herstellung anaerober Verhältnisse beiträgt, wovon man sich leicht an Hand eines Versuches überzeugen kann. Dazu braucht man nur ein cellulosehaltiges Medium in dünner Schicht erst mit anaeroben Cellulosebakterien und anschließend mit aeroben Saprophyten zu beimpfen. Letztere bewirken durch ihre Entwicklung eine derart

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Abb. 85. Kokkenartige Cellulosebakterien aus dem Inhalt des Fansens

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Abb. 86. Aus dem Pansen isolierte sporenlose Cellulosebakterien

Abb. 87. Hydrolysenzonen auf Cellulose-Agar in der Umgebung sporenloser, aus dem Pansen isolierter Cellulosebakterien

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rasche Senkung des Redoxpotentials, daß sich die anaeroben Formen trotz der geringen Schichtdicke entwickeln und die Cellulose angreifen. f) Die P r o d u k t e der mesophilen Cellulosegärung a) Hydrolyse der Cellulose aa) Der Beweis für die Existenz der Cellulase Die ersten Untersuchungen über die Gärung der Cellulose wurden zu einer Zeit unternommen, als man sich intensiv mit der Erforschung der Zersetzung verschiedener organischer Stoffe unter anaeroben Bedingungen beschäftigte. Erst viel später wurden die unter anaeroben Verhältnissen stattfindenden Oxydationsprozesse studiert. Möglicherweise hängt diese Entwicklung mit dem Auffinden der Anaerobiose durch PASTEUR zusammen; diese Entdeckung hat auch später außerordentlich befruchtend auf das Studium der verschiedensten Gärungsprozesse gewirkt. In Analogie zur Buttersäuregärung erschien es sehr wahrscheinlich, daß die Hydrolysenprodukte der Stärke bzw. der Cellulose der Gärung unterworfen werden. Die Anwesenheit der Amylase in den Bakterienzellen wurde früher entdeckt als die der Cellulase. Das Problem der Hydrolyse der Cellulose blieb lange Zeit hindurch ungelöst. In diesem Zusammenhang wurde die Theorie des oxydativen Celluloseabbaues entwickelt. Mit Ausnahme von R. MEYER (1934, 1938, 1942) befaßte sich jedoch in der Folgezeit niemand mit der Möglichkeit einer Celluloseoxydation unter anaeroben Bedingungen. Letzterer versuchte, den in Kulturkolben herrschenden Druck zu messen. Dabei wurde in den ersten Gärungsstadien ein starker Sauerstoffverbrauch gefunden. Bis zum Auftreten der primären Gasbläschen sinkt der Druck ständig ab. MEYER nahm deshalb an, daß die Cellulosegärung in zwei Stufen verläuft. Zunächst soll eine Oxydation stattfinden, charakterisiert durch einen starken Sauerstoffverbrauch, und in der zweiten Stufe soll dann die Hydrolyse der Cellulose erfolgen. Im Hinblick auf diese Hypothese ist zu bemerken, daß einige Eigenschaften der MEYERschen Kulturen dafür sprechen, daß es sich um keine Reinkulturen handelte. Bei der Nachprüfung der MEYERschen Angaben konnte IMSCHENEZKI die erwähnte Erscheinung bestätigen, jedoch nur im Falle von Mischkulturen, wobei der Sauerstoffverbrauch auf die Lebenstätigkeit der Begleitbakterien zurückzuführen ist. In Reinkulturen läßt sich kein anfänglicher Druckabfall beobachten. Die Annahme MEYERS, daß der anaerobe Celluloseabbau mit einer Oxydation der Cellulose beginnt, ist deshalb als nicht zutreffend anzusehen. Bereits von den ersten Autoren, die sich mit der Cellulosegärung befaßten, ist der außerordentlich langsame Abbau der Cellulose hervorgehoben worden. In den Versuchen OMELIANSKIs (1897, 1902) bzw. OMELJANSKls (1899) waren Monate dazu erforderlich, was wahrscheinlich auf die für die Cellulosebakterien ungeeigneten Nährmedien zurückzuführen ist. Aber auch später, als die Zusammensetzung der Nährmedien erheblich verbessert werden konnte, waren immerhin noch einige Wochen notwendig, um die Cellulose vollständig zu zersetzen. Die langsame Gärung ist auch der Grund dafür, weshalb sich die Produkte der Cellulosehydrolyse im Medium nicht in derartigen Mengen ansammeln, wie im Falle

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

der thermophilen Cellulosegärung. Die entstandenen, löslichen Kohlenhydrate werden im Maße ihrer Bildung vergoren, und ihr Nachweis ist deshalb in einer normalen Kultur sehr schwierig. Es gibt jedoch viele Verfahren, mit deren Hilfe es möglich ist, die Existenz der Cellulase und die Hydrolyse der Cellulose zu beweisen. Am einfachsten gelingt der Nachweis durch Züchtung der Cellulosebakterien in hochgeschichtetem CelluloseAgar. Es muß lediglich darauf geachtet werden, daß die Cellulose sorgfältig vermählen ist, damit das Medium möglichst homogen und durchsichtig wird. Bei der Entwicklung der Bakterienkolonien diffundiert dann die von den Zellen gebildete Cellulase in das Medium und hydrolysiert dort die Cellulose, wodurch sich rings um die Kolonien breite, helle Hydrolysenzonen bilden. In einigen Fällen entstehen derartige Zonen frühzeitig, in anderen erst später. Dadurch findet auch die Angabe CLAUSENS ihre Erklärung, daß er in der Umgebung der Kolonien keine Hydrolysenzonen beobachten konnte. HÜNGATE (1944, 1947) fand bei seinen Untersuchungen, daß die Bildung der Hydrolysenzone erst relativ spät einsetzt. Verantwortlich für die negativen Resultate CLAUSENS ist folglich nur der Umstand, daß die Versuche nicht langfristig genug durchgeführt wurden. Der Durchmesser der Zonen beträgt gewöhnlich das fünf- bis zehnfache des Durchmessers der Kolonien. Zur Veranschaulichung dieser Verhältnisse diene die Abbildung 87. In alten Agar-Kulturen kann man nach Hydrolyse der gesamten Cellulose die Mono- und Disaccharide quantitativ bestimmen. Weitaus am häufigsten geht man zum Nachweis der Cellulosehydrolyse von Kulturen in flüssiger Nährlösung aus und versucht, die Gärung der Cellulose in irgendeiner Weise zu unterbrechen und die Vermehrung der Bakterien zu hemmen. So stellte HÜNGATE Z. B. nach beendeter Gärung die Kulturen in den Thermostaten. Nach seinen Beobachtungen ist die Unterbrechung der Gärung auf eine Zunahme der Acidität des calciumcarbonatfreien Mediums zurückzuführen. Dadurch wird die weitere Entwicklung der Bakterien gehemmt unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Cellulasewirksamkeit. Nach längerer Zeit lassen sich in derartigen Kulturen reduzierende Stoffe nachweisen. Bei einem anderen Verfahren ändert man die Temperaturbedingungen dergestalt, daß die Kultur Temperaturen ausgesetzt wird, die oberhalb der für die Bakterienentwicklung maximal verträglichen Grenze liegen. Die Cellulase behält auch unter diesen Umständen ihre Wirksamkeit bei und hydrolysiert die Cellulose nach wie vor. Insbesondere erzielte PRINGSHE.IM (1912) mit diesem Verfahren gute Resultate. Letzterer hat ferner noch eine andere Methode vorgeschlagen, bei der dem flüssigen Medium verschiedene Antiseptika zugesetzt werden. Dabei traten jedoch große Schwierigkeiten auf insofern, als viele der von PRINGSHEIM benutzten Stoffe keine Unterbrechung der Gärung bewirkten, sondern nur die Entwicklung der Cellulosebakterien erheblich verzögerten. Es handelte sich dabei um Toluol, Chloroform, Thymol, Guajakol, o-Kresol, Amylalkohol und Phenol. Aber auch die Durchleitung von Äther- oder Chloroformdämpfen durch die gärende Kultur zeitigte nicht den gewünschten Erfolg. Gute Resultate erhielt der Autor lediglich durch Zusatz von 1 g Jodoform in 50 ml Aceton oder durch Sättigung

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der Kultur mit Chlorpikrin, das nach Ansicht PRINGSHEIMS die Fermentwirkung nicht beeinträchtigt, gleichzeitig aber eine ausgeprägte antiseptische Wirkung besitzt. Im letzteren Falle zeigte sich, daß selbst eine zehntägige Einwirkung von Chlorpikrin noch nicht zur Abtötung der Bakterienzellen ausreichte, so daß die Einwirkungsdauer wesentlich erhöht werden mußte. Die mit Chlorpikrin behandelten Kulturen wurden zentrifugiert, der Rückstand mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert und erneut durch Zentrifugieren abgetrennt. Darauf wurde versucht, in der dekantierten Lösung nach Zusatz von Cellulose und Toluol Cellulase nachzuweisen. Dieser Versuch verlief negativ, d. h. die Cellulose wurde nicht hydrolysiert. PRINGSHEIM folgerte daraus, daß die Zellen keine hydrolytischen Fermente an das Medium abgeben und daß demzufolge die Cellulase ein Endoferment ist. Dieser Schluß ist insofern kaum berechtigt, als die Zersetzung der Cellulose stets außerhalb der Bakterienzellen erfolgt. Trotz der stürmischen Entwicklung der Enzymologie in den letzten Jahren konnten bis heute noch keine Cellulasepräparate aus Kulturen anaerober Cellulosebakterien isoliert werden. Ebenfalls ist bis jetzt noch nicht bewiesen, daß zellfreie Kulturfiltrate zur Hydrolyse von Cellulose befähigt sind. Es besteht aber kein> Zweifel darüber, daß die bekannten Cellulasepräparate, insbesondere die der thermophilen Bakterien, sehr aktiv sind. Sie wirken j edenfalls viel rascher als entsprechende, aus Pilzen gewonnene Präparate. PRINGSHEIM (1912) nahm seinerzeit an, daß der Versuch zwecklos ist, durch Verreiben der Bakterienzellen einen Zellsaft herzustellen, weil die Zellen zu klein dazu sind. In der modernen Biochemie ist das jedoch keine Hinderung mehr. Es ist bereits gelungen, aus den Zellen aerober Cellulosebakterien mehr oder weniger reine, zellfreie Cellulasepräparate zu erhalten. Inzwischen sind auch Verfahren ausgearbeitet worden, die eine rasche und genaue quantitative Bestimmung der bei der mikrobiellen Hydrolyse der Cellulose gebildeten löslichen Kohlenhydrate gestatten. Neuere Bestimmungsmethoden für die Cellodextrine sind dagegen in die mikrobiologische Praxis noch nicht eingeführt worden. Die Bestimmung der Glucose und Cellobiose, die unmittelbar bei der Hydrolyse entstehen, bereitet keine Schwierigkeiten. Gewöhnlich verfährt man nach folgendem Schema: Die im Kulturfiltrat vorhandenen Zucker werden als Osazone isoliert und deren Schmelzpunkte und Elementarzusammensetzung mit den entsprechenden Daten authentischer Proben verglichen. Danach setzt man dem Kulturfiltrat überschüssige Hefe zur Vergärung der Glucose zu. Da die Cellobiose unter diesen Bedingungen nicht vergoren wird, findet eine Gärung nur bei Anwesenheit von Glucose statt. Eine weitere Probe des Filtrates wird einer enzymatischen oder einer sauren Hydrolyse unterworfen und anschließend ebenfalls vergoren. Durch Zuckerbestimmungen vor und nach der Hydrolyse lassen sich die vorhandenen Kohlenhydrate quantitativ erfassen. Enthielt die Kulturflüssigkeit Cellobiose, so nimmt der Gehalt an reduzierender Substanz nach der Hydrolyse um 34% zu. Dies ist bekanntlich darauf zurückzuführen, daß durch die Zuckerbestimmung vor der Hydrolyse nicht die gesamte Cellobiose erfaßt wird. 17

Imschenezki, Mikrobiologie

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II. Anaerobe Cellulosebakterien

Ferner muß der durch den Abbau entstandene Celluloseverlust quantitativ ermittelt und mit den entsprechenden Zuckergehalten der Kulturflüssigkeit in Beziehung gesetzt werden. Berücksichtigt man noch die bei der Gärung gebildete Kohlensäure, so läßt sich eine ziemlich genaue Kohlenstoffbilanz aufstellen. Anschließend folgen einige bei den mesophilen Bakterien erhaltene Resultate. PRINGSHEIM fand bei seinen Versuchen (Zusatz von Antiseptika), daß die Kulturflüssigkeit Glucose und Cellobiose enthält. Im einzelnen erhielt er bei der Vergärung von 15 g Cellulose durch eine sogenannte denitrifizierende Kultur 0,04 g Glucosazon mit einem Schmelzpunkt von 205° C. Nach Vergärung der Glucose wurde die Kulturflüssigkeit mit Aceton und Phenylhydrazinhydrochlorid versetzt und das entstandene Osazon der Cellobiose, F. 165° C, isoliert. Von 18 g eingesetzter Cellulose erhielt er 0,35 g Cellobiosazon. Methanbakterien bildeten aus 3 g Cellulose 0,6 g Glucosazon, Wasserstoffbakterien erzeugten aus 20 g Cellulose 0,2 g Cellobiosazon. Bei der Vergärung von 15 g Cellulose durch thermophile Cellulosebakterien in einem mineralischen Medium mit Calciumcarbonat betrug die Glucosazonausbeute 0,36 g (F. 205° C). In einem analogen Versuch mit der gleichen Kultur wurden aus 61 Kulturflüssigkeit am Tage nach dem Thymolzusatz 0,3 g Glucosazon und 0,5 g Cellobiosazon erhalten. Nach PRINGSHEIM liegt die günstigste Temperatur für die Wirksamkeit der Cellobiase bei 46° C. Die Versuche PRINGSHElMs sind seinerzeit von großer Bedeutung gewesen, weil sie die Aufmerksamkeit der Forscher auf die Hydrolyse der Cellulose durch anaerobe Bakterien gelenkt haben. Einer späteren Kritik konnten die Angaben PRINGSHElMs jedoch nicht standhalten, weil sie sich in verschiedener Weise erklären lassen: 1. Der Autor führt keinen Beweis dafür an, daß die von ihm gefundenen reduzierenden Substanzen nicht schon vor der Zugabe des Antiseptikums in der Kultur vorhanden waren. So ist es durchaus bekannt, daß in Kulturen thermophiler Cellulosebakterien, die er benutzte, mitunter auch in Kulturen mesophiler Bakterien, durch die Lebenstätigkeit der sich vermehrenden Zellen reduzierende Substanzen ohne Zusatz eines Antiseptikums vorhanden sind. 2. Bei allen Untersuchungen hatte PRINGSHEIM keine Reinkulturen zur Verfügung. Wie IMSCHENEZKI auf Grund eigener Erfahrungen annimmt, enthalten Mischkulturen bisweilen gleichzeitig mesophile und thermophile Rassen anaerober Cellulosebakterien. Durch die relativ hohe Kultivierungstemperatur wurden günstige Bedingungen für die Entwicklung der thermophilen Organismen geschaffen, so daß die Verzuckerung der Cellulose auf deren Lebenstätigkeit zurückgeführt werden kann. 3. In Mischkulturen können sich aber auch noch andere Bakterien befinden, die ebenfalls Cellobiase produzieren. Aus den Versuchen PRINGSHElMs kann deshalb auch nicht gefolgert werden, daß die Hydrolyse der Cellobiose speziell durch die Cellulosebakterien bewirkt wird. Die Fähigkeit zur Hydrolyse der Cellobiose, d. h. zur Erzeugung von Cellobiase besitzen auch einige andere, celluloseinaktive Bakterien. 4. Der Autor hat zu seinen Versuchen keine zellfreien Kulturfiltrate benutzt. E s ist deshalb nicht ausgeschlossen, daß die Bakterienzellen auch nach Zugabe der

C. Mesophile Callulosebakterien

259

Antiseptika weiterhin wirksam waren. PRINGSHEIM bemerkt selbst, daß die Unterbrechung der Gärung, d. h. die vollständige Unterdrückung der anaeroben Bakterien, nur schwer zu bewerkstelligen war. Dabei diente ihm als Kriterium für die Ausschaltung der Bakterien das äußere Aussehen der Kultur, d. h. ein sehr unsicheres Merkmal. Es ist deshalb auch möglich, daß sogar die geeignetsten Antiseptika keine vollständige Ausschaltung der Bakterientätigkeit bewirkten und daß die in der Flüssigkeit nachgewiesenen Zucker nicht durch die Wirksamkeit des Fermentes selbst entstanden sind, sondern dadurch, daß die Fähigkeit der Bakterien zur Hydrolyse weniger gehemmt war als ihre Fähigkeit zur Vergärung der Hydrolysenprodukte. Die Versuche PRlNGSHEIMs beweisen also keineswegs die Möglichkeit einer rein fermentativen, außerhalb der Bakterienzelle stattfindenden Hydrolyse der Cellulose. Zu etwas anderen Resultaten gelangte HUNGATE (1944, 1947), der, wie bereits erwähnt, die Unterbrechung der Gärung nicht durch Zusatz von Antiseptika, sondern durch die langsam ansteigende Acidität des Mediums bewirkte. Der Autor konnte eine Kohlenstoffbilanz aufstellen. Die eingesetzte Cellulosemenge betrug 2,582 g, wovon 1,883 g zerstört wurden. In parallelen Ansätzen wurde festgestellt, daß bei der Vergärung der gleichen Cellulosemenge 0,462 g Cellulose auf die Bildung der Gärungsprodukte, d. h. Säuren, Alkohol und Kohlendioxyd entfallen. Zieht man diese Menge von der Gesamtmenge an zerstörter Cellulose ab, so verbleiben noch 1,421 g, die in Form löslicher Kohlenhydrate vorliegen. Theoretisch müßten also 1,5 g Cellobiose vorhanden sein, tatsächlich gefunden wurden 1,464 g. Anschließend wurden sowohl eine bestimmte Menge Kulturflüssigkeit als auch eine ihr entsprechende Menge einer reinen Cellobioselösung enzymatisch (Emulsin) hydrolysiert und mittels Hefe vergoren. Quantitative Bestimmungen des entstandenen Kohlendioxyds ergaben im Falle der Kulturflüssigkeit eine Ausbeute von 8,16 ml und im Falle der reinen Cellobioselösung eine solche von 5,44 ml COa. HUNGATE (1947) schließt daraus, daß bei der Hydrolyse der Cellulose durch anaerobe Bakterien nur Cellobiose, aber keine Glucose gebildet wird. Als Begründung führt er an, daß ohne Hydrolyse der Kulturflüssigkeit bei deren Vergärung mit Hefe kein Kohlendioxyd entsteht. Ferner entspricht die gravimetrisch ermittelte Cellobiosazonmenge dem festgestellten Gehalt der Kultur an reduzierenden Substanzen. Es ist nicht ganz leicht, vorstehende Ergebnisse und deren Folgerungen zu begreifen, da die Cellulosebakterien zweifellos nicht nur Cellulase, sondern auch Cellobiase erzeugen. HUNGATEs Angaben lassen sich vielleicht in der Weise erklären, daß die Wirksamkeit der Cellobiase infolge ungünstiger Bedingungen nicht zur Entfaltung kommen konnte. Es ist somit anzunehmen, daß in Kulturen, in denen die Gärung infolge steigender Acidität des Mediums unterbrochen wurde, ein günstiges Milieu lediglich für die Wirksamkeit der Cellulase vorhanden ist. Dies geht auch aus den Angaben HüNGATEs hervor, der feststellte, daß das Optimum der Cellulaseaktivität bei einem p H -Wert von 5,5 liegt; Minimum p H 4,4, schwache Hydrolyse p H 4,9, normale Hydrolyse p H 6 bis 6,5, schwache Hydrolyse Ph 7,0, Maximum p H 7,5. Es ist nicht ausgeschlossen, daß für die Cellobiase andere pn-Bedingungen erforderlich sind und sich aus diesem Grunde in der Kultur nur Uellobiose 17»

260

II. Anaerobe Cellulosebakterien

aber keine Glucose ansammelt. Die Richtigkeit derartiger Vorstellungen geht daraus hervor, daß ÜUNGATE selbst im Falle eines anderen sporenbildenden Cellulosebakteriums (Stamm E) in alten Agar-Kulturen die Ansammlung reduzierender Stoffe nachweisen konnte. Nach entsprechender Hydrolyse erhöhte sich der Gehalt an reduzierender Substanz. Die Cellobiose wurde dadurch zu Glucose abgebaut, und letztere konnte anschließend mit Hefe vergoren werden. In der Kulturflüssigkeit ließen sich aber auch vor der Hydrolyse vergärbare Zucker nachweisen, die also nur aus Glucose bestehen konnten. Auf diese Weise wird bestätigt, daß die anaeroben Cellulosebakterien sowohl Cellulase als auch Cellobiase hervorbringen. Die Frage nach der fermentativen Hydrolyse der Cellulose wird durch die Arbeiten HuNGATEs allerdings auch nicht beantwortet, da er Kulturen, aber keine zellfreien Filtrate untersuchte. Wahrscheinlich wird bei der von ihm angewandten Temperatur die hydrolytische Funktion der Bakterien weniger gehemmt als ihre Fähigkeit zur Vermehrung. Unter diesen Verhältnissen findet in den Kulturen eine Ansammlung löslicher Kohlenhydrate statt. Es ist durchaus anzunehmen, daß die in gewöhnlichen Kulturen, d. h. in Kulturen, deren Gärung nicht künstlich unterbrochen wurde, infolge einer langsamen Gärung entstehenden geringen Mengen an Cellobiose und Glucose im Maße ihrer Bildung verbraucht werden. So fand z. B. KHOUVINE im Falle kleiner Proben aus den Kulturflüssigkeiten keine reduzierenden Substanzen. Zur Aufstellung der Kohlenstoffbilanz wurde eine sorgfältige Bestimmung der Zwischenprodukte vorgenommen. Dabei konnte in 11 Kulturflüssigkeit nur 1 mg Zucker nachgewiesen werden. KHOUVINE nimmt daher sehr richtig an, daß in den Kulturen zwar Zucker gebildet werden, daß diese aber auch gleich wieder weiter vergoren werden. Die Verwertung der Hydrolysenprodukte der Cellulose bildet die Grundlage für die Existenz nicht nur der Cellulosebakterien selbst, sondern auch anderer, in der Kultur ebenfalls vorhandener Mikroorganismen. HUNGATE kultivierte z. B. gleichzeitig sporenbildende Cellulosebakterien (Stamm D) aus Schlammproben zusammen mit der Hefeart Saccharomyces cerevisiae auf hefeextrakthaltigem Cellulose-Agar. Zur Kontrolle wurde der Cellulosebakterienstamm allein auf dem gleichen Medium kultiviert. Im Laufe von zwei Jahren wurde sowohl in der Mischkultur als auch in der Reinkultur die gesamte vorhandene Cellulose vollständig hydrolysiert. Eine Analyse der beiden Kulturen ergab, daß die Reinkultur reduzierende Substanzen enthielt ; in der Mischkultur konnten keine Hydrolysenprodukte nachgewiesen werden, weil sie durch die Hefe inzwischen vergoren waren. Die Bakterien sind jedoch' nur in der Lage, relativ kleine Cellulosemengen zu hydrolysieren. Beträgt der Cellulosegehalt des Mediums 0,05%, so wird das Polysaccharid leicht hydrolysiert. Bei höheren Konzentrationen verläuft der Abbau nur sehr langsam, und trotz langer Versuchszeiten bleibt ein erheblicher Teil der Cellulose unangegriffen (HUNGATE, 1947). Die mesophilen anaeroben Cellulosebakterien bilden also Cellulase und Cellobiase. Durch die Wirksamkeit dieser beiden Fermente wird die Cellulose hydrolysiert, wobei Cellobiose und Glucose in Lösung gehen. Infolge der langsamen Entwicklung der mesophilen Bakterien werden diese Hydrolysenprodukte unmittelbar, nach ihrer

C. Mesophile Cellulosebakterien

261

Entstehung auch schon vergoren, weshalb im Gegensatz zu den thermophilen Formen bei den mesophilen Bakterien in der Kulturflüssigkeit keine größeren Mengen dieser beiden Zucker gespeichert werden. Über den Abbau der Cellulose durch zellfreie Cellulasepräparate aus anaeroben Bakterienkulturen liegen noch keine endgültigen Ergebnisse vor. Hier befindet sich ein weiterer Ansatzpunkt für die zukünftige Forschung. ßß) Die morphologischen Veränderungen an der Cellulose während ihrer Hydrolyse durch Bakterien In den umfangreichen Arbeiten OMELIANSKls (1897, 1902, 1904) bzw. OMELJANSKIs (1899, 1901) war bereits ein Zusammenhang zwischen der biochemischen Aktivität der Bakterienzellen und den während des Abbaues in der Cellulose stattfindenden morphologischen Veränderungen ersichtlich. OMELJANSKI konnte schon damals zeigen, daß die Cellulose nur an den Stellen abgebaut wird, an denen sich die Cellulosebakterien in Form kleiner Kolonien angesiedelt haben (Filtrierpapier). Abbildung 82 zeigt Filtrierpapierstreifen, in denen durch die Bakterientätigkeit verschieden große Löcher entstanden sind. Durch die Wirkung der Bakteriencellulase treten auf der Papieroberfläche zunächst Vertiefungen auf, die später in feine, nadelstichartige und schließlich größere Löcher übergehen. Allmählich bilden sich auf dem ganzen Papier immer mehr Löcher, die sich ständig erweitern, so daß der Streifen das Aussehen eines durchbrochenen Gewebes annimmt. Eine weitere, sehr interessante Beobachtung OMELJANSKls zeigt, daß die Cellulosefasern durch Bakterienzellen ersetzt werden. Infolge des Absterbens der letzteren entsteht ein aus den Zellen aufgebautes Geflecht, das äußerlich die Form der ursprünglichen Faser besitzt. OMELJANSKI bezeichnete diese Erscheinung als „Pseudomorphose". Auch später konnte in allen mikroskopischen Untersuchungen über den Abbau der Cellulose durch anaerobe Bakterien die Beobachtung bestätigt werden, daß die Zersetzung nur bei einem unmittelbaren Kontakt der Bakterien mit den Cellulosefasern stattfindet. Die Zellen erzeugen Cellulase, die jedoch nicht in das Medium übergeht, sondern sich in der äußersten Schicht der Zellwand befindet. Nur so läßt sich die Tatsache erklären, daß erstens die in der näheren Umgebung befindlichen Cellulosebereiche nicht hydrolysiert werden und daß zweitens die Zellen gewissermaßen in die Faser hineinwachsen. Diese Feststellung schließt natürlich nicht die Möglichkeit aus, daß doch vielleicht eine Diffusion des Fermentes in das umgebende Medium stattfindet. Nur ist wahrscheinlich die Fermentkonzentration an der Zelloberfläche sehr viel höher als in der weiteren Umgebung der Kolonie, so daß die Kulturflüssigkeit selbst keine hydrolytische Wirkung aufweist. Ein Beweis für die tatsächliche Diffusion der Cellulase in das Medium sind die Hydrolysenzonen, die sich bei der Züchtung der Bakterien auf Cellulose-Agar in einem erheblichen Abstand von den eigentlichen Kolonien bilden. Diese Erscheinung wurde bereits oben behandelt. Unter dem Einfluß der Cellulase erfolgt die Umwandlung der Cellulose in lösliche Produkte, wodurch die Bakterien in die Faser eindringen können. Dies ist die Er-

262

II. Anaerobe Cellulosebakterien

klärung dafür, daß bei der Zersetzung cellulosehaltiger Pflanzenmaterialien (Gemüsestückchen, Blätter usw.) im Darm des Menschen und der Tiere auf der Oberfläche der Substrate häufig Vertiefungen, Risse usw. beobachtet werden. Alle diese Veränderungen werden von den Cellulosebakterien bewirkt, die sich auf der Oberfläche der Materialien vermehren. Das Eindringen der Bakterien in die Fasersubstanz erklärt auch die Tatsache, daß beim Auswaschen halbzerstörter Cellulose alle Fremdbakterien leicht entfernt werden können, während die tief eingedrungenen Cellulosebakterien nicht auszuwaschen sind. Vom ökologischen Standpunkt aus ist die Lokalisierung der Bakterienzellen sehr interessant. Es besteht eine enge Abhängigkeit zwischen dem Feinbau der Cellulose und der Anordnung der Zellen. Letztere ordnen sich stets in Richtung der Fibrillenlängsachse an. Mitunter verlaufen diese Fibrillen nicht nur längs der Faserachse, sondern auch schräg zu ihr. In diesem Falle lagern sich die Zellen ebenfalls in der gleichen Richtung an, d. h. unter einem bestimmten Winkel zur Faserachse. Man kann daher annehmen, daß diese Lokalisation der Zellen keine zufällige ist, sondern mit der Anpassung des Organismus an die Strukturbesonderheiten der Cellulosefaser zusammenhängt. Bekanntlich bestehen die fadenförmigen Makromoleküle der Cellulose aus 100 bis 1000 Glucoseresten und erreichen eine Länge von etwa 1 ¡x, wie sich aus röntgenographischen Daten ergeben hat. Die Länge der Cellulosekette ist also mit der Größe der Bakterienzelle durchaus vergleichbar. Die natürliche Cellulosefaser besteht allerdings nicht nur aus reinen Celluloseketten, sondern auch aus Makromolekülen mit anderen Eigenschaften; schließlich enthält die Faser noch inkrustierende Stoffe (Lignin, mineralische Bestandteile). Durch die Einwirkung der Bakterienfermente wird die Faser aufgelockert und zerfällt in kleinere Teilstückchen. In nicht angegriffenen Bereichen bleibt sie dagegen unverändert. Dies ist deutlich in den amorphen Celluloseresten zu erkennen, die sich am Boden des Gefäßes abgesetzt haben. In den runden oder rhombenförmigen Löchern kann man unter dem Mikroskop einzelne, vom Rand her hereinragende, zugespitzte Fasern beobachten. ß) Gärungsprodukte aa) Säuren und Alkohol Trotz der etwas unterschiedlichen Morphologie der sporenbildenden anaeroben Cellulosebakterien sind sie in physiologischer Hinsicht kaum voneinander zu unterscheiden. Naturgemäß kommen für physiologische und biochemische Untersuchungen nur von Reinkulturen hervorgerufene Gärungen in Betracht. In Mischkulturen können die entstehenden Produkte derart mannigfaltig sein, und ihre Mengen können je nach der Art der Mikroflora schwanken, daß ihre Behandlung hier überhaupt nicht in Betracht kommt. Die ausführlichsten Angaben über die bei der mesophilen Cellulösegärang auftretenden Produkte stammen von KHOUVINE. In einer Kultur des Bac. cellulosae

263

C. Mesophile Cellulosebakterien

dissolvens wurden innerhalb von 22 Tagen 750 mg, das sind 17,9% der Cellulose, abgebaut. Dabei entstanden folgende Produkte: 23 mg Kohlendioxyd, 10 mg Wasserstoff, 20 mg Alkohol sowie 80 mg organische Säuren (Butter- und Essigsäure). In einem anderen Versuch wurden 3 g Cellulose in 300 ml Medium mit 0,6 g Calciumcarbonat vergoren. Innerhalb von 19 Tagen wurden 1,012 g Cellulose abgebaut und folgende Reaktionsprodukte festgestellt: 275 mg Essigsäure, 33 mg Buttersäure, 82 mg Alkohol, 182,7 mg Kohlendioxyd, 8,5 mg Wasserstoff sowie 13,5 mg Farbstoff. Diese Angaben wurden bereits früher in der Tabelle 26 gebracht. Da KHOUVINE (1923, 1934) nur 55,15% des ursprünglich vorhandenen Kohlenstoffs wiederfand, wurden die Versuche wiederholt und dabei die Kulturflüssigkeiten sorgfältiger untersucht. Es konnten darin zwar noch geringe Mengen an Zucker und Milchsäure nachgewiesen werden, das Defizit in der Kohlenstoffbilanz wurde dadurch aber in keiner Weise gedeckt. Uber die Natur der nicht aufgefundenen Stoffe ist bisher nichts bekannt geworden. Von theoretischer Bedeutung war die Entscheidung der Frage, ob die Cellulosebakterien bei der Vergärung der Glucose die gleichen Produkte bilden wie bei dem Abbau der Cellulose. Die Ergebnisse eines in dieser Richtung angestellten Versuches über die Vergärung der Glucose durch eine Kultur von Clostridium cellobioparus sind in der Tabelle 32 zusammengefaßt ( H Ü N G A T E ) . T a b e l l e 32 Die bei der Vergärung von Glucose und Cellulose durch C. cellobioparus entstehenden Produkte

Kohlenstoff in Prozent

3,33 3,33 15,15 17,1

Kohlenstoffgehalt der Gärungsprodukte in mg

. . . .

Alkohol

mg Glucose . mg Glucose . mg Glucose . mg Cellulose

Milchsäure

100 100 455 462

0,29 0,49 0,97 0,65

0,03 0,55 0,38

0,22 0,22 0,55 0,98

2,03 2,22 10,66 12,44

60 67 70 73

Gärungsprodukte (in mmol)

co2 0,28 0,32 2,36 3,43

H2

Essigsäure

Substrat

Ameisensäure

1 2 3 4

Kohlenstoffgehalt des Substrats (mg)

Versuchsnummer

(nach HUNGATE)

0,55 0,51 0,53 0,44 2,98 229 4,17 263

Wie aus der Tabelle hervorgeht, werden bei dem anaeroben Abbau der Glucose neben Kohlendioxyd und Wasserstoff ebenfalls Ameisen-, Essig-, Milchsäure sowie Alkohol gebildet. Aus der Kohlenstoffbilanz ergibt sich, daß zwischen 60 und 73% des ursprünglich vorhandenen Kohlenstoffs wiedergefunden wurden. Unter den Säuren steht die Essigsäure mengenmäßig an erster Stelle. Die Ausbeute an Ameisensäure beträgt nur etwa ein Drittel bis ein Viertel der Essigsäuremenge; Milchsäure wird noch weniger gebildet. Alkohol fällt ebenfalls nur in geringen Mengen an. In einer weiteren Arbeit untersuchte H Ü N G A T E die Gärungsprodukte, die bei der Einwirkung anderer sporenbildender Cellulosebakterien auf ein cellulosehaltiges

264

II. Anaerobe Cellulosebakterien

Substrat entstehen. Nach der Zersetzung von 760 mg Cellulose durch den Stamm C fand er: 97 mg Essigsäure, 79 mg Alkohol und 4 mg Milchsäure. In einem zweiten Versuch wurden 730 mg Cellulose zersetzt und dabei 131 mg .Essigsäure, 83 mg Alkohol sowie 8 mg Milchsäure gefunden. Etwas andere Ergebnisse wurden mit dem Stamm E erhalten. Durch Vergärung von 0,43 mg Cellulose entstanden 0,57 g Kohlendioxyd, 0,78 g Wasserstoff, 0,07 g Alkohol, 0,48 g Essigsäure, 0,10 g Milchsäure und 0,21 g Bernsteinsäure. Zusammenfassend läßt sich also sagen, daß bei der Vergärung der Cellulose durch sporenbildende Cellulosebakterien verschiedene organische Säuren sowie Alkohol gebildet werden. Die von den verschiedenen Autoren isolierten Bakterienkulturen erzeugten in qualitativer Hinsicht alle die gleichen Gärungsprodukte. Eine besondere Beachtung verdient das Problem der Butter- und Bernsteinsäureentstehung. KHOUVINE berichtet, daß wesentlich weniger Buttersäure gebildet wird als Essigsäure. Auf acht Gewichtsteile (11,8 Volumenteile) Essigsäure entfällt nur ein Gewichts- bzw. Volumenteil Buttersäure. Sowohl an der Reinheit der Kultur als auch an der Existenz der Buttersäure können keine Zweifel bestehen. So fiel z. B. die AGULONsche Reaktion auf Buttersäure positiv aus; ferner konnten die entsprechenden Bariumsalze isoliert und identifiziert werden. Andererseits gelang es CLAUSEN (1931) und HUNGATE (1947) nicht, in ihren Versuchen Buttersäure nachzuweisen. Über diese Frage ist jedoch schon im Zusammenhang mit Untersuchungen iMSCHENEZKIs über die thermophilen Cellulosebakterien gesprochen worden. Letzterer konnte zeigen, daß bei der Cellulosegärung stets geringe Mengen an Buttersäure auftreten. Ihre Bildung in den genannten Fällen hängt anscheinend damit zusammen, daß sowohl KHOUVINE als auch IMSCHENEZKI Nährmedien mit Fäkalienextrakt verwendeten, wodurch für die Entstehung der Buttersäure günstige Bedingungen geschaffen waren. CLAUSEN und HuNGATE benutzten Nährmedien anderer Zusammensetzung. Um diese Frage jedoch endgültig klären zu können, bedarf es noch weiterer Untersuchungen.

III. DIE VERBREITUNG DER CELLULOSEBAKTERIEN 1. Geographische Verbreitung Unsere Kenntnisse über die Verbreitung sowohl der höheren als auch der niederen Pflanzen zeigen, daß die geographischen Verhältnisse mit zunehmender Vereinfachung der Organisation der pflanzlichen Organismen eine immer geringere Rolle spielen. Die Geographie der höheren Pflanzen ist eine Disziplin, die auf einem großen Tatsachenmaterial über die Verbreitung der verschiedenen Gewächse auf der Erdoberfläche aufgebaut ist. Für die Verbreitung der Sporenpflanzen spielt der geographische Faktor jedoch bereits eine geringere Rolle. Bezüglich der Pilze kann man allerdings mit Recht von der Mycogeographie als einer Wissenschaft sprechen, weil es bestimmte Pilzgruppen gibt, die für die Tropen oder andere Zonen charakteristisch sind. Dagegen kann die Geographie der Bakterien keinen Anspruch auf Selbständigkeit erheben, da in diesem Falle ökologische Momente eine größere Rolle für die Verbreitung spielen als geographische. Bekanntlich kann man einigen wohlbekannten Bakterienarten in der ganzen Welt begegnen, z. B. Bac. mycoides, Bac. subtilis und anderen. Unter den höheren Pflanzen dürfte es dagegen nicht eine einzige Art geben, die sowohl am Äquator als auch am nördlichen Polarkreis vorkommt. Die geringe Größe der Mikroben, ihre physiologischen Besonderheiten und besonders ihre Fähigkeit, Energiestoffwechsel und Nährstoffbedarf den unterschiedlichsten Bedingungen anzupassen, sind die Ursachen dafür, daß an demselben geographischen Punkt die gleiche Mikrobenart in Form verschiedener ökologischer Rassen existieren kann, die sich deutlich voneinander unterscheiden. Die Ökologie rangiert also vor der Geographie, weil die durch klimatische oder sonstige Faktoren bedingten, in verschiedenen geographischen Zonen bei der gleichen Art auftretenden Veränderungen weniger deutlich ausgeprägt sind als die auf ökologischer Basis am gleichen geographischen Punkt auftretenden Eigenschaften. Dazu ein Beispiel. Nach MlSCHUSTIN (1947) liegt sowohl das Temperaturoptimum als auch das -maximum bei den südlichen Rassen von Bac. mycoides um 2 bis 3° C höher als bei den nördlichen. Von der gleichen Art fand BROZKAJA (1947) in Kläranlagen Moskaus noch eine thermophile Rasse, deren Temperaturoptimum um 20° C höher lag. Diese Ausführungen treffen selbstverständlich auch für die Cellulosebakterien zu. Der Hauptsatz der MlTSCHURlNschen Biologie über die Einheit von Organismus und Umwelt wird durch die biologischen Besonderheiten der Cellulosebakterien bestätigt. Die Entstehung der letzteren war erst dann möglich, als die höheren Pflanzen in der Lage waren, Cellulose zu synthetisieren. Derselbe Faktor war auch später für

266

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

ihre Verbreitung in der Natur maßgebend, d. h. sie kommen überall dort vor, wo Cellulose vorhanden ist. Aerobe und anaerobe Cellulosebakterien kommen vor im Erdboden, im Boden der Gewässer, im Wasser der Flüsse, Seen, Meere und Ozeane, ferner in Anhäufungen pflanzlicher Materialien (Torf, Heu, Hanf usw.), im Darm von Insekten und Säugetieren, im Dung usw. Ihr Vorkommen ist an Substrate gebunden, in denen die Möglichkeit zur Cellulosezersetzung gegeben ist. Von dem geringen Einfluß des geographischen Faktors auf die Verbreitung der Cellulosebakterien zeugen folgende Angaben. Cellulosebakterien wurden gefunden: auf den Inseln des Nördlichen Eismeeres (ISSATSCHENKO, 1914; KASANSKI, 1932), in der Wüste (FEHER, 1946), im Nördlichen Eismeer (KRISS, 1945), in den Salzseen Armeniens (PANOSJAN, 1948), unter 80° nördlicher Breite im Boden (ISSATSCHENKO und SLMAKOWA, 1934) und in den verschiedensten Böden Australiens (JENSEN, 1940).

Trägt man die Fundorte auf einer Erdkarte ein, so erhält man eine Vorstellung von der außerordentlichen Verbreitung der Cellulosebakterien. Man fand sie in jedem Land und an jedem Ort, wo man nur nach ihnen gesucht hat. Sehr interessant ist die Tatsache, daß man an den verschiedensten geographischen Punkten stets die gleichen Bakterienarten angetroffen hat. Sporocytophaga myxococcoides wurde in den verschiedensten Ländern und unter den verschiedensten geographischen Breiten nachgewiesen. Man kann diese Art mit vollem Recht als das am häufigsten vorkommende aerobe Cellulosebakterium bezeichnen. Als weiteres Beispiel für die außerordentliche Verbreitung der Cellulosebakterien kann die 1936 von IMSCHENEZKI und SOLNZEWA beschriebene Art 8p. eUipsospora dienen. Diese Art wurde zuerst in Moskau aus dem Treibhausboden isoliert; bald darauf berichtete JENSEN (1940) von dem Auftreten des Mikroorganismus in Australien, später wurde er von GORBUNOW (1946, 1949) im Wolgadelta nachgewiesen. Sehr verbreitet sind ferner auch die verschiedenen cellulosezersetzenden Vibrionen. Vorstehende Ausführungen sollen jedoch nicht den Gedanken erwecken, daß diese Arten unter veränderten ökologischen Bedingungen nicht auch wesentliche Veränderungen erleiden und den neuen Bedingungen besser angepaßte ökologische Rassen hervorbringen können. So sind z. B. Cellulosebakterien bekannt, die sich in kochsalzfreien Medien nicht entwickeln, sogenannte halophile Rassen. Ferner gibt es Formen, die relativ hohe Konzentrationen an Jod oder Bor im Medium ohne weiteres vertragen usw. Die erwähnten ökologischen Faktoren können für das Vorkommen der Cellulosebakterien ausschlaggebend sein. So entwickeln sich z. B. die thermophilen anaeroben Bakterien in den warmen Anhäufungen organischer Substanz (Torf, Dung) der nördlichen Länder sehr intensiv und wesentlich besser als im Boden der tropischen Gebiete. Durch ökologische Faktoren läßt sich ebenfalls die Tatsache erklären, daß gut kultivierte, dunghaltige Böden im Norden reicher an thermophilen Cellulosebakterien sind als die tropischen Böden mit geringerem Gehalt an organischen Düngemitteln.

2. Die quantitative Bestimmung der Cellulosebakterien

267

2. Die quantitative Bestimmung der Cellulosebakterien Durch die klassischen Arbeiten WlNOGRADSKls und OMELJANSKls haben die elektiven Nährmedien Eingang in die mikrobiologische Praxis gefunden. Ihr Wesen besteht darin, daß man mit Hilfe der Zusammensetzung des Mediums geeignete Bedingungen zur Entwicklung einer einzigen Mikrobenart mit bestimmten physiologischen Eigenschaften schaffen kann. So ermöglichten z. B. stickstofffreie Medien die Entwicklung von Bakterien, die den erforderlichen Stickstoff aus der Luft entnehmen. Ammoniakhaltige Medien ohne organische Kohlenstoffverbindungen wurden zur Züchtung von nitrifizierenden Bakterien benutzt. Medien schließlich, die als einzige Kohlenstoffquelle Cellulose enthielten, verwendete man zur Herstellung von Anreicherungskulturen der Cellulosebakterien. Elektive Medien ermöglichten die Reinkultur vieler neuer Bakterienformen und eine Entscheidung prinzipieller Fragen über die Biologie der Mikroorganismen. Bezüglich der Voraussetzungen für die Herstellung und Anwendung elektiver Medien hat sich WlNOGRADSKI (1952) folgendermaßen geäußert: „In einer elektiven Kultur sind für eine gegebene Art insofern günstige Bedingungen zu ihrer Entwicklung vorhanden, als die Begleitbakterien am Wachstum gehindert werden." Infolge der stürmischen Entwicklung von Physiologie und Biochemie der Mikroorganismen und auf Grund neuer Erkenntnisse hinsichtlich des Stickstoff- und Vitaminbedarfs der Bakterien wurde es notwendig, das Problem der elektiven Medien zu überprüfen. Ein weiterer Grund für eine derartige Überprüfung ist dadurch gegeben, daß viele Bakterien in elektiven Medien nur in geringen Mengen auftreten. Somit liegt der Verdacht nahe, daß die verwendeten elektiven Medien nicht optimal wirksam sind. In erster Linie trifft das auch für die Cellulosebakterien zu. Obwohl die Cellulose in der Natur außerordentlich verbreitet ist, hat man im Erdboden, im Boden der Gewässer und in anderen natürlichen Substraten anaerobe Cellulosebakterien nur in sehr geringer Menge gefunden. Betrachtet man die Angaben verschiedener Autoren über das Vorkommen der Cellulosebakterien in See-, Fluß- und Meeresböden, so muß man feststellen, daß nur relativ kleine Mengen gefunden wurden, obwohl reichlich Cellulose vorhanden war. Erst durch ein eingehendes Studium der Ernährungsphysiologie der anaeroben Cellulosebakterien war eine Lösung dieses Problems möglich. Wie IMSCHENEZKI an Hand entsprechender Untersuchungen festgestellt hat, benötigen die anaeroben Cellulosebakterien zu ihrer Entwicklung komplizierte organische Stickstoffverbindungen (Eiweiß und Aminosäurekomplexe) sowie Vitamine. Diese Beobachtungen dienten als Grundlage für die im folgenden beschriebenen Versuche. Verschiedene Mengen an Erd- und Seebodenproben wurden einmal in OMELJANSKIschem Medium (in hohen Reagenzgläsern, in die zuvor etwas Filtrierpapier eingebracht wurde) und zum anderen in einem Medium kultiviert, dem 30% Fleischbrühe-Pepton zugesetzt wurden und das im folgenden als optimales OMELJANSKIsches Medium bezeichnet werden soll. Eine Versuchsreihe wurde bei 30° C durchgeführt, eine andere zum Nachweis der thermophilen Cellulosebakterien bei 60° C. Vergleicht man beide Versuchsreihen miteinander, so fällt ohne weiteres die stürmische Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien in den Gläsern mit

268

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

optimalem Medium auf (vgl. Abb. 55). Auf diese Weise findet man etwa lOOmal mehr Bakterien als mit dem normalerweise benutzten Verfahren. Diese Beobachtung verdient besonders hervorgehoben zu werden, weil sie im Gegensatz zu allen hier angeführten Literaturangaben über den Gehalt der Erd- und Seeböden an anaeroben Cellulosebakterien wesentlich höhere Zahlen liefert. Die Ergebnisse der Versuche sind in der Tabelle 33 zusammengestellt. Die Tatsache, daß IMSCHENEZKI rein zahlenmäßig erheblich mehr mesophile und thermophile Cellulosebakterien im Boden und Schlamm gefunden hat, ist nur auf die Verwendung des sogenannten optimalen Mediums zurückzuführen. Die von IMSCHENEZKI an Hand seiner Versuche gewonnenen Vorstellungen lassen sich durch nachstehende Punkte wiedergeben. 1. Als Erklärung dafür, daß die anaeroben Cellulosebakterien gewöhnlich in relativ geringen Mengen angetroffen werden, ist die Verwendung von Nährmedien ohne organischen Stickstoff und ohne Vitamine anzusehen, weil derartige Medien zur Vermehrung der Cellulosebakterien ungeeignet sind. Benutzt man dagegen optimal zusammengesetzte Nährsubstrate, so lassen sich die letzteren auch noch dort nachweisen, wo sie mit Hilfe der üblichen Verfahren nicht gefunden werden konnten. 2. Die beste Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien ist dann gewährleistet, wenn man von dem Prinzip der Elektivität abgeht. Dies ist dann der Fall, wenn dem Medium Eiweißstoffe zugesetzt werden, weil jetzt nicht nur die Cellulose, sondern auch die Eiweißstoffe als Kohlenstofflieferanten dienen können. Dadurch ist natürlich auch anderen Mikroorganismen eine Entwicklungsmöglichkeit gegeben. Das Wachstum derartiger Fremdorganismen stört allerdings die Entwicklung der Cellulosebakterien in keiner Weise, womit wieder einmal gezeigt wird, daß metabiotische Beziehungen zwischen verschiedenen Mikroorganismen sehr häufig vorkommen. 3. Die elektiven Nährmedien verlieren durch die angeführten Versuche jedoch nicht an Bedeutung. Zur Herstellung der Anreicherungskulturen, ohne die eine Reinzüchtung nicht möglich ist, sind sie nach wie vor brauchbar. Die optimalen Medien dagegen besitzen auf anderen Anwendungsgebieten Vorteile, so z. B. in den Fällen, in denen es darum geht, die Anzahl der vorhandenen Bakterien zu bestimmen. Nach Veröffentlichung der entsprechenden Arbeit iMSCHENEZKIs fand dieser Literaturangaben, die sich nunmehr anders erklären ließen. So untersuchten z. B . STAPP und BORTELS (1934) Waldboden (Nadelstreu) und verwendeten dazu elektive Medien mineralischer Zusammensetzung. Zunächst konnten sie keine Anreicherungskultur anaerober Cellulosebakterien erhalten. Erst nach einem Zusatz von Pepton zum Medium war eine Entwicklung der Cellulosebakterien zu beobachten. Desgleichen fand auch OMELJANSKI (1917) keine Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien in Proben aus Seeböden, wenn zu ihrer Kultivierung ein synthetisches Medium mit Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle benutzt wurde. In einem normalerweise zur Züchtung von desulfurierenden Bakterien verwendeten Medium, das Natriumlactat und Filtrierpapier enthielt, konnte dagegen ein Wachstum der Cellulosebakterien mit entsprechendem Abbau der Cellulose beobachtet werden. Die

2. Die quantitative Bestimmung der Cellulosebakterien

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ti ® Q • .2 "ö ® ® • ® , ® 1 n p •n •S ti « bo"" 8 .SB S ® * a ¡i 9(9 §a M •31 . ® a a® a l l-9 '.2 S ja -• Wirbellose -*• Fische. Die Produktivität der Gewässer läßt sich also erhöhen, wenn man cellulosereiche Pflanzenmaterialien einbringt. Spezielle Untersuchungen über das Vorkommen der Cellulosebakterien in Flußund Leitungswasser sind von PRONINA (1952) durchgeführt worden. Den Anlaß zu dieser Arbeit gab die Notwendigkeit, Erfahrungen über den mikrobiellen Abbau der Cellulose in Papierfabriken zu sammeln. Zur quantitativen Bestimmung der Cellulosebakterien befeuchtete man Papierscheiben in Petrischalen mit den Wasserproben; nach entsprechender Kultivierungsdauer wurden dann die gebildeten Farbflecken ausgezählt. Zur Untersuchung gelangten Flußwasser aus der Kama, Industrieabwasser sowie Leitungswasser. Die Analysen wurden jeweils im März, Mai und Juni durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 38 a zusammengefaßt. Außerdem wurden noch Analysen des Wassers aus verschiedenen Bereichen der Kama durchgeführt, und zwar im Frühjahr während des Hochwassers und im Sommer (Tabelle 38 b). Das Leitungswasser. enthält somit erheblich weniger Bakterien als dfis Flußwasser. Das aus den Papierfabriken stammende Abwasser enthält andererseits mehr Bakterien als das Flußwasser, d. h. das letztere reichert sich mit Cellulosebakterien an. Während der Hochwasserzeit nimmt die Bakterienmenge im Flußwasser zu und ist im Mai höher als im Juni. Im Wolgadelta, das große Mengen an Pflanzenmaterial enthält, ist die Anzahl der Cellulosebakterien während der Hochwasserzeit, d. h. von Mai bis Juni, ebenfalls wesentlich erhöht.

B. Das Voikommen der Cellulosebakterien im Süßwasser und im Salzwasser

285

T a b e l l e 38a

Anzahl der Zerstörungszonen Herkunft der Wasserprobe

März

Mai

Juni

36 26 9

52 166 8

14 16 10

Flußwasser der Kama . . Industriewasser Leitungswasser

T a b e l l e 38b Anzahl der Zerstörungszonen Herkunft der Wasserprobe

Mai

Juni

Wasseroberfläche in Ufernähe . . . . Wasseroberfläche in einiger Entfernung vom Ufer Wassertiefe I m Wassertiefe 3 m

52

14

118 28 10

12 6 2

Die Intensität der Cellulosezersetzung und folglich auch, die Cellulosebakterienmenge ist in fließenden Gewässern größer als in verschilften Kanälen oder in Schilfdickichten, in denen nur eine geringe Strömung herrscht. GORBUNOW (1946, 1949) fand in 1 g Sparganium oder Schilf Mengen von ein bis zehn Millionen Bakterien. Wurde an den gleichen Stellen und unter den gleichen Bedingungen Filtrierpapier in das Wasser eingebracht, so siedelten sich auf der Cellulose die gleichen Bakterienmengen an. Beim Durchtritt des Wassers durch die Kiemen der Fische bleiben die Cellulosebakterien in den Kiemen zurück. MOSSEWITSCH (1944) fand bei seinen Untersuchungen über die Fische und das Wasser von Ob und Irtysch aerobe Cellulosebakterien sowohl in den Kiemen als auch im Körperschleim von Trüschen. Anaerobe Bakterien konnten nicht nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung heißer Quellen (Chodsha-Obi-Garm) fand RODINA (1945) keine Cellulosebakterien. 2. Die Seen Die Seen der Sowjetunion sind wiederholt von den Mikrobiologen untersucht worden, wobei auch die Cellulosebakterien berücksichtigt wurden. Meist wurde jedoch nicht das Wasser selbst, sondern der Seeboden studiert. Bei der Untersuchung der Mikroflora des Beloje-Sees und des Glubokoje-Sees fand KUSNEZOW (1934) in 1ml Wasser bis zu 600 Cellulosebakterien. Meist schwankt deren Menge jedoch zwischen 0,2 und 10 Individuen pro Milliliter Flüssigkeit. Im Frühjahr (Mai) enthielt das Seewasser gewöhnlich keine Cellulosebakterien. Die höchste Zahl trat in den Monaten August und September auf. Zwischen der Cellulosebakterienmenge und dem Nitratgehalt des Wassers existiert eine direkte Abhängigkeit: mit zunehmendem Nitratgehalt des Wassers vergrößert sich auch

286

I I I . Die Verbreitung der Cellulosebakterien

die Anzahl der Cellulosebakterien. Diese Hypothese konnte beispielsweise am Wasser des Glubokoje-Sees verifiziert werden. Das Wasser des Beloje-Sees enthielt nur wenig Nitrate, so daß dementsprechend auch die Cellulosebakterien nur in geringer Anzahl vorhanden waren. KUBENTSCHIK und GoiCHERMAN (1939) fanden bei ihren Untersuchungen der Slawjansker Seen in dem sehr salzhaltigen Wasser und in den Wasserpflanzen verschiedene Cytophaga-Arten, die rosa oder gelbe Pigmente bildeten. Der Abbau der Cellulose erfolgte in dem Wasser dieser Seen nur langsam. Ein in das Wasser getauchter Bindfaden war noch nach 127 Tagen völlig intakt; ein Seil wurde nur innerhalb der biogenen Zone zerstört. Diese geringe Aktivität der Cellulosebakterien ist wohl einmal auf die niedrige Temperatur (4,5 bis 5,2° C) und zum anderen auf den relativ hohen Salzgehalt (3,9° B.) des Wassers zurückzuführen. 3. Die Ozeane und Meere Die Ozeane und Meere enthalten viel weniger organische Substanz als das Süßwasser. Es ist daher durchaus verständlich, weshalb man bei der Analyse des Meereswassers so selten auf Cellulosebakterien stößt. Der Versuch, aus einem einzigen Milliliter Meerwasser Cellulosebakterien auf elektiven Medien zu kultivieren und damit deren Existenz im Wasser nachzuweisen, verläuft gewöhnlich negativ. Nach ZOBELL (1946) sind dazu mindestens 10 bis 100 ml erforderlich. Die Ursache für die Unmöglichkeit des Nachweises von Cellulosebakterien in kleinsten Flüssigkeitsmengen kann aber auch darin bestehen, daß die auf das Nährmedium gelangenden vereinzelten Bakterienzellen sich nicht weiter entwickeln (Unmöglichkeit der „Einzellenkultur"). Für den Fall der anaeroben Bakterien trifft diese Erklärung sogar sicher zu. In den zwischen der Wrangelinsel und der Beringstraße gelegenen Meeresteilen konnte KRISS (1945) sowohl aerobe als auch anaerobe Cellulosebakterien nachweisen. Die verschiedensten aeroben Cellulosebakterien fand BAVENDAMM (1932) im Wasser und im Schlamm des die Bahamainseln umgebenden Meeres. Die Anwesenheit anaerober Cellulosebakterien konnte der Autor niemals beobachten. Die Zersetzung der in den Mangrovedickichten auftretenden Cellulosemengen wird in der Hauptsache ebenfalls von aeroben Bakterien bewerkstelligt. Neun Proben aus dem Boden und zwölf von der Wasseroberfläche des KujalnizkiL i m a n s enthielten aerobe Cellulosebakterien (RUBENTSCHIK und

GoiCHERMAN,

1935). In den Proben des Liman-Bodens wurden ferner auch anaerobe Formen gefunden. Wie bereits erwähnt, ist das Vorkommen der Cellulosebakterien im Wasser an das Vorhandensein cellulosehaltiger organischer Substanz gebunden. Man findet sie deshalb auch an den Stellen, an denen Holz zerstört wird, d. h. in den verschiedenen Hafenanlagen, in Holzschiffen sowie in anderen Cellulosematerialien (Netze, Seile, Tauwerk usw.). Nicht alle im Meer lebenden Wasserpflanzen enthalten viel Cellulose. In den meisten Fällen schwankt ihr Cellulosegehalt zwischen 2 und 17%. Die Fähigkeit der Cellulosebakterien zur Zerstörung einer Wasserpflanze hängt jedoch nicht nur von

B. Das Vorkommen der Cellulosebakterien im Süßwasser und im Salzwasser

287

ihrer Cellulosemenge, sondern auch von ihrem Stickstoffgehalt ab. So enthält beispielsweise der Meersalat, Ulva lactuca, 6,2% Cellulose und 2,56% Stickstoff; deshalb kann diese Grünalge im Wasser rasch abgebaut werden. Fucus vesiculosus enthält neben 4,3% Cellulose lediglich 1,01% Stickstoff, so daß diese Pflanze im Wasser nur langsam angegriffen wird. Um so leichter erfolgt dagegen ein Abbau im Bodenschlamm, der bekanntlich mehr Stickstoff in einer für die Cellulosebakterien geeigneten Form besitzt. Im Meerwasser selbst kommen also Cellulosebakterien sehr selten vor. Ihre Hauptmenge befindet sich im Boden der Gewässer, auf der Oberfläche befallener Wasserpflanzen und im cellulosehaltigen Flankton. Spezielle Arbeiten über das Vorkommen der Cellulosebakterien in verschiedenen Meerestiefen sind nicht bekannt. 4. Die Artenzasammensetzung der Cellulosebakterien Ebenso wie im Falle der Bodenbakterien haben sich die meisten Forscher bei mikrobiologischen Untersuchungen des Wassers darauf beschränkt, lediglich die Anwesenheit von Cellulosebakterien festzustellen. Gewöhnlich weiß man deshalb nur, daß irgendeine Wasserprobe in der Lage ist, Cellulose zu zerstören. Reinkulturen sind im allgemeinen nicht hergestellt worden. Deshalb besteht bis jetzt auch keine Möglichkeit dafür, irgend etwas endgültiges über die Verteilung der verschiedenen Cellulosebakterienarten in den Gewässern aussagen zu können. Einige Anhaltspunkte sind lediglich den Beschreibungen der Anreicherungskulturen zu entnehmen. Es handelt sich dabei meistens um Schlußfolgerungen, die aus den Veränderungen (Auftreten von verschieden gefärbten Flecken, Art und Geschwindigkeit des Celluloseabbaus usw.) des Filtrierpapiers gezogen werden. Im Verlaufe von Untersuchungen über den Abbau der in Wasserpflanzen enthaltenen Cellulose entdeckte GORBUNOW (1946, 1949) im Wolgadelta eine sehr mannigfaltige und artenreiche Mikroflora. Es gelang ihm, aus dem Wasser 34 Kulturen aerober Cellulosebakterien anzulegen. Von diesen enthielten 23 Sporocytophaga myxococcoides, was aus dem Erscheinen der typischen, glänzend gelben Flecken auf dem Filtrierpapier gefolgert wurde. Zwei weitere Kulturen zeichneten sich durch die Bildung orangefarbener Flecken aus und wurden deshalb Sp. ellipsospora zugeschrieben. Ferner erhielt der Autor zwei Cytophaga-TLxdturen, von denen eine kein Pigment bildete, die andere dagegen einen rosa Farbstoff erzeugte. Außerdem isolierte er eine Myxobakterienkultur, die Fruchtkörper ausbildete und mit der von IMSCHENEZKI und SoLNZEWA (1936) beschriebenen Art identisch war, sowie schließlich vier Vibrionenkulturen, die eine Cellulosezersetzung ohne Farbstoffbildung bewirkten. Hinsichtlich der mengenmäßigen Verteilung nehmen also im Süßwasser die Myxobakterien den ersten Platz ein, die Vibrionen folgen erst in einigem Abstand. Aus dem Wasser der Slawjansker Seen konnten RuBENTSCHlK und GoiCHERMAN (1939) Anreicherungskulturen der Gattung Cytophaga erhalten, die auf dem Filtrierpapier gelbe, rosa oder orangefarbene Flecken erzeugten. Ferner trat eine CeUfvlckula-Kultur in Erscheinung.

288

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

Für die Ermittlung der artmäßigen Zusammensetzung der Cellulosebakterien ist ein von N. 6 . CHOLODNI vorgeschlagenes und etwas abgeändertes Verfahren sehr brauchbar: man bringt Filtrierpapier oder ein cellulosehaltiges Gewebe in das zu untersuchende Wasser ein und verfolgt die Zerstörung des Materials. Derartige Untersuchungen ha,t z. B. STURM (1928) durchgeführt und dabei gefunden, daß ein Abbau des Cellulosematerials im Wasser des Kolomnosees innerhalb von 9 bis 30 Tagen stattfindet. Das Gewebe bedeckt sich dabei mit leuchtenden, eigelben Flecken, die auf die Anwesenheit der Gattung Cytophaga schließen lassen. Mitunter treten auch rosafarbene Flecken auf. Bei der anschließenden mikroskopischen Untersuchung konnten an diesen Stellen Vertreter der Gattung Cyt&phaga, entdeckt werden. Die erwähnten Versuche bestätigen ebenfalls die außerordentliche Häufigkeit dieser Organismengruppe. In den glänzendgelben Flecken wurden kleine sporenlose Stäbchen, aber auch sporenbildende Bakterien mit ovalen endstänfligen Sporen gefunden. WAKSMAN und CAREY (1926) sowie andere Autoren weisen darauf hin, daß in Anreicherungskulturen der Cellulosebakterien verschiedene Protozoen in großer Anzahl auftreten, z. B. Flagellaten, Ciliaten und Amöben, die sich von den Bakterien ernähren. Die im Meerwasser vorhandenen Cellulosebakterien bilden bei der Zerstörung des Filtrierpapiers auf dessen Oberfläche orangefarbene, gelbe, braune oder rote Flecken. Es sind jedoch auch Fälle bekannt, in denen der Abbau ohne Farbstoffbildung erfolgt. Nach WAKSMAN, CAREY und REUSZER (1933) und anderen Autoren gehören die im Meerwasser aufgefundenen aeroben Cellulosebakterien den Gattungen Cytophaga und Cellfalcicwla an. Es dürfte wohl kein Zweifel mehr darüber bestehen, daß die vorherrschenden Formen Myxobakterien sind, denn die Gattung Gellfalcicula gehört sicher auch dieser Bakterienreihe an. Aus dem Meerwasser lassen sich häufig Bakterien isolieren, deren Kulturen sowohl Cellulose als auch Agar-Agar zersetzen können. Tatsächlich sind auch einige Cellulosebakterien bekannt, die Agar-Agar abbauen. In den meisten Fällen dürfte die Zersetzung des Agar-Agars aber darauf zurückzuführen sein, daß sich in der Kultur neben den Cellulosebakterien auch besondere, Agar-Agar angreifende Formen entwickeln, die in ihrer Mehrzahl ebenfalls den Myxobakterien angehören. Die eigentliche Zersetzung des Agar-Agars darf aber keinesfalls mit einem rein mechanischen Eindringen der Kolonien verwechselt werden, das häufig bei der Züchtung von Myxobakterien auf einem festen Medium beobachtet wird. Hier findet keine Verflüssigung des Agars statt, sondern offenbar nur eine Entwässerung der unter den Kolonien befindlichen Agarschichten. 5. Die Halophilie Bekanntlich haben sich die im Salzwasser lebenden Mikroorganismen derart gut an die hohe Salzkonzentration angepaßt, daß sie in salzlosen Medien nicht mehr leben können. Neben diesen ausgesprochen halophilen Formen gibt es aber auch sogenannte halotolerante Formen, die sowohl in salzhaltigen als auch in salzfreien Medien gedeihen. Da die Cellulosebakterien in dieser Beziehung ebenfalls keine Aus-

B. Das Vorkommen der Cellulosebakterien im Süßwasser und im Salzwasser

289

nähme machen, fand z. B. ISSATSCHENKO (1920) anläßlich von Untersuchungen über die Mikroflora des Sakskoje-Sees, daß der Celluloseabbau durch celluloseaktive Mikroben dieses Gewässers bei einer Kochsalzkonzentration von 2% besser erfolgt als in kochsalzfreien Medien. Die vorliegenden Cellulosebakterien vertrugen höhere Kochsalzkonzentrationen jedoch schlechter; bereits bei 4% NaCl verlangsamte sich die Zersetzungsgeschwindigkeit. Etwas später entdeckte ISSATSCHENKO (1927) im Tumbukanskoje-See ebenfalls aerobe und anaerobe Cellulosebakterien, die sich bei einer Kochsalzkonzentration von 2 bis 4% gut entwickelten. Zahlreiche Arbeiten über die halophilen Cellulosebakterien sind von RUBENTSCHIK veröffentlicht worden (1928,1931,1933,1948). Letzterer stellte fest, daß die im Salzwasser lebenden halotoleranten Formen bei höherem Salzgehalt des Wassers die Cellulose langsamer abbauen als in salzarmem Wasser. Bei einem Kochsalzgehalt des Mediums von 5% zersetzten sie die Cellulose z. B. innerhalb von 12 Tagen, bei 15% NaCl dagegen erst innerhalb von 34 bis 44 Tagen. Mit zunehmendem Salzgehalt nimmt also die Zersetzungsgeschwindigkeit der Cellulose ab. Das Maximum wird bei einem Salzgehalt von 5% erreicht. Am geringsten ist die Zersetzung der Cellulose durch halophile Formen in salzfreien Medien. Andererseits ist noch bei Salzkonzentrationen bis zu 17% ein Abbau möglich. Nach RUBENTSCHIK und GOICHERMAN (1937) enthält das Wasser des Golopristanskoje-Sees keine halophilen, sondern nur halotolerante Cellulosebakterien. Die letzteren entwickeln sich in Medien, die mit Leitungswasser hergestellt wurden, besser als in solchen, die Wasser des Herkunftsees enthalten. Im Wasser des Kujalnizki-Limans findet man dagegen sowohl halotolerante als auch halophile Formen. Mitunter ist die Anpassung an hohe Salzkonzentrationen derart ausgeprägt, daß besondere ökologische Rassen entstehen, die nur bei den entsprechenden, hohen Salzgehalten gedeihen können. Als Beispiel sei die von RUBENTSCHIK beschriebene Art Gytophaga halophila erwähnt. Von analogen Erscheinungen bei den desulfurierenden Bakterien ausgehend, ist aber anzunehmen, daß es sich dabei um keine selbständigen Arten, sondern nur um verschiedene Rassen einer bereits bekannten Art handelt. Die gleiche Art kann folglich in Form mehrerer Rassen existieren, unter denen natürlich auch halophile Varietäten vorkommen. Diese Ansicht wird z. B. auch von TEPLJAKOWA (1950) vertreten, die halophile Formen der Cellulosevibrionen in Salzseen aufgefunden hat. Halophile anaerobe Cellulosebakterien konnten von RUBENTSCHIK im Odessaer Liman nicht nachgewiesen werden. C. Die Böden der Gewässer 1. Die Zusammensetzung der Böden und die in ihnen enthaltene Cellulosemenge Im Zusammenhang mit dem Studium des Lebens im Wasser hat man dem Boden der Gewässer stets besondere Aufmerksamkeit gewidmet, weil die biologischen Prozesse dort besonders aktiv verlaufen. Der bekannte russische Geochemiker WERNADSKI (1940) sagt über die Bedeutung dieser Prozesse: „Die Bodenschicht der 19 Imschenezki, Mikrobiologie

290

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

Gewässer ist stets ein Gebiet intensiver chemischer Arbeit des Lebens. In erster Linie werden dort Mikroorganismen, die Bakterien, konzentriert, die eine sehr hohe, vielleicht die höchste geochemische Energie besitzen. Der Boden besteht aus zwei Schichten, von denen die obere, nur einige Millimeter starke Zone noch im Einflußbereich des freien Sauerstoffs liegt. In ihr finden intensive biochemische Oxydationsprozesse unter Bildung von Nitraten und Sulfaten statt. Sie trennt die Gesamtheit der am Boden konzentrierten Lebewesen von der unbekannten Biosphäre des anaeroben Bodenschlamms ab. Die zweite, darunter befindliche Schicht ist erheblich stärker und wimmelt von anaeroben Bakterien. Die in ihr ablaufenden chemischen Vorgänge sind Reduktionsprozesse." In Schlammproben aus den verschiedensten Seeböden findet man stets einen relativ hohen Cellulosegehalt. KUSNEZOW (1934) bestimmte z. B. im Schlamm des Beloje-Sees den Cellulosegehalt in 5 cm Tiefe mit 6,44%, in 25 bis 40 cm Tiefe mit 4,92% (bezogen auf Trockensubstanz). Im Schlamm der Moskauer Seen fand ÜHARTULARI (1939) in einer Tiefe von 3 m 2,25% Cellulose, in 5 m Tiefe immer noch 1,85%. Der Schlamm enthält demnach relativ viel Cellulose, deren Menge mit zunehmender Tiefe oft nur sehr langsam abnimmt. So konnte z. B. im Schlamm des TschernojeSees noch in 5 m Tiefe ein Cellulosegehalt von 6,21% bestimmt werden. Der Schlamm des Glubokoje-Sees enthielt nur 2,23% Cellulose, während der Cellulosegehalt im Schlamm des Swjatoje-Sees sogar 10,88% erreichte. Zusammenfassend läßt sich also sagen, daß in den Böden der Gewässer für die Cellulosebakterien durchaus die Möglichkeit gegeben ist, sich intensiv zu vermehren. 2. Die in den Seeböden vorhandene Menge an Cellulosebakterien Über die Mikrobiologie des Süßwasser- und Salzwasserbodens existiert bereits eine umfassende Literatur. Von sowjetischer Seite haben sich besonders RUBENTSCHIK und Mitarbeiter mit der Mikroflora der verschiedensten Seen beschäftigt (RUBENTSCHIK, 1 9 4 8 ; RUBENTSCHIK U. GOICHERMAN, 1935, 1937, 1939, 1940). D i e d a b e i

gewonnenen Ergebnisse sind in den Tabellen 39 und 40 zusammengestellt. Der Bodenschlamm enthält demnach erhebliche Mengen an Cellulosebakterien; in 1 g findet man mitunter bis zu mehreren hunderttausend Individuen. Die Menge der Cellulosebakterien hängt aber auch von der Art des Bodenschlamms ab. So enthält z. B. 1 g Schwarzschlamm bis zu tausend Zellen, wogegen ein sandiger Seeboden nicht mehr als zehn Bakterien je g beherbergt. Nach SALIMOWSKAJA-RODINA (1938) verlaufen die anaeroben Prozesse im Seeschlamm energischer als die aeroben. So wurden z. B. wesentlich mehr anaerobe Stickstoff- und Cellulosebakterien gefunden als aerobe Cellulosemikroben. Besonders intensiv vermehren sich die Cellulosebakterien dort, wo die Zersetzung der Uferpflanzen stattfindet. Wie schon früher erwähnt, fand GORBUNOW (1946, 1949) in 1 g zersetztem Schilf Mengen von ein bis zehn Millionen Cellulosebakterien. Eine maximale Entwicklung konnte in den Monaten April bis August festgestellt werden, während die Anzahl der Cellulosebakterien in den übrigen Monaten wesentlich

C. Die Böden der Gewässer

291

T a b e l l e 39 Aktivität der anaeroben Cellulosebakterien in verschiedenen Salzgewässern Aktivität (Bewertung nach dem Fünfpunktesystem)

Gewässer Kujalnizki-Liman . . . . Molotschni-Liman . . . . Golopristanskoje-See . . Slawjansker-Seen . . . .

0-4 2 2 2-3

T a b e l l e 40 Aktivität der anaeroben Cellulosebakterien bei Impfversuchen mit Schlammablagerungen aus dem Kujalnizki-Liman

Herkunft der Probe

Schwarzer Schlamm . . . Grauschwarzer Schlamm . Grauer Schlamm . . . . Sandablagerungen....

Aktivität (Bewertung nach dem Fünfpunktesystem) Wasser des Limans

Leitungswasser

0-2 0-1 0-1 0-1

1-3 2-3 1-2 2-3

geringer ist. K O P P und LIMBERG ( 1 9 4 5 ) bestätigen anläßlich von Untersuchungen über die Mikroflora des Schlamms der Seen Kasachstans ebenfalls, daß der Celluloseabbau im Sommer energischer erfolgt als im Winter. Bezüglich der Bakterienmengen geben die genannten Autoren an, daß die Zellen noch bei Verdünnungen des Schlamms von 10~3 und 10 -4 nachweisbar sind. R A S U M O W S K A J A und S J A B L I K O W A ( 1 9 4 5 ) entdeckten sowohl aerobe als auch anaerobe Cellulosebakterien sogar noch bei einer Schlammverdünnung von 1 : 10. Sie untersuchten ferner verschiedene Schlammproben auf ihre Fähigkeit, Wasserpflanzen zu zersetzen. Wie zu erwarten, fand eine Zersetzung hur bei den Proben statt, in denen die Anwesenheit von Cellulosebakterien nachgewiesen war. STURM ( 1 9 2 8 ) stellte fest, daß de. Faulschlamm des Beloje-Sees reich an anaeroben Cellulosebakterien ist. Züchtungsversuche mit Schlammproben aus dem Beloje- und Samro-See ergaben erst nach einer Inkubationszeit von zwei Monaten eine Zerstörung des Filtrierpapiers. Bei mikroskopischer Untersuchung des befallenen Papiers wurden Formen beobachtet, die den von OMELJANSKI beschriebenen Bakterien entsprechen. Es handelt sich dabei um dünne, schwach gekrümmte Stäbchen mit endständigen, kugelförmigen Sporen. Eine Schlammprobe aus dem SamroSee verursachte selbst nach einer Inkubationszeit von acht Monaten noch keine Zerstörung des Papiers. Diese negativen Ergebnisse sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß zu den Versuchen OMELJANSKIsches Medium benutzt wurde, das, wie 19»

292

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

bereits erwähnt, zur Züchtung anaerober Bakterien ungeeignet ist. Bis zu einem gewissen Grade beruhen auch die Resultate KuSNEZOWs auf der Verwendung dieses Mediums, der bei einer Kultivierung des Schlamms aus dem Trostenewskoje-See nach 20 Tagen noch keine Zersetzung des Papiers fand. Schlammproben aus dem Glubokoje-See führten innerhalb von 30 Tagen, aus dem Beloje-See bereits innerhalb von 7 Tagen zu einer Zersetzung der Cellulose. Aus den Untersuchungen SALIMOWSKAjA-RODINAs (1938) über die Mikroflora der im Kreise Toksowsk gelegenen Seen geht hervor, daß der Schlamm stets anaerobe Cellulosebakterien enthält, während aerobe Formen nur selten angetroffen werden. B e i analogen Versuchen von TUTAJEWA und MOLOSSOWA (1946) k o n n t e n i m

Schlamm des Tagarskoje-Sees keine anaeroben Cellulosebakterien nachgewiesen werden, selbst nicht bei Anwendung von 0,5 g Schlamm. Aerobe Cellulosebakterien wurden zwar aufgefunden, jedoch nur bei Verwendung relativ geringer Verdünnungen. Im Boden der Salzgewässer lassen sich aerobe und anaerobe Cellulosebakterien im allgemeinen leicht feststellen. So fand z. B. MALIJANZ (1933) im Boden des Kaspischen Meeres in jedem Falle Cellulosebakterien. Auch GLNSBURG-KARAGITSCHEWA, PRJANISCHNIKOW und RODIONOWA (1934) stellten im Boden des Kaspischen Meeres bei Wassertiefen von 177 bis 1920 m die Anwesenheit aerober und anaerober Cellulosebakterien fest. Nach ZOBELL (1946) lassen sich in 1 g Meeresboden stets Cellulosebakterien nachweisen. Mit Hilfe des Verdünnungsverfahrens wurden bis zu tausend Bakterien je Gramm gefunden. In Wassertiefen von 505, 780 und 1322 m konnten im Meeresboden ebenfalls Cellulosebakterien festgestellt werden. Im Asowschen Meer, den Buchten von Taman und Tugan sowie im AchtanisowskiLiman fand MESSINEWA (1948) ebenfalls erhebliche Mengen anaerober Cellulosebakterien; auf 1 g Schlamm entfielen bis zu 9900 Individuen. 3. Die Verteilung der Cellulosebakterien in vertikaler Richtung Die anaeroben Cellulosebakterien finden im Boden der Gewässer für ihre Entwicklung ausgezeichnete Bedingungen vor. Dabei treten sie gewöhnlich in den tieferen Schichten des Schlamms häufiger als in den oberen Zonen auf. So weist z. B. MESSINEWA darauf hin, daß ihre Anzahl bei 0,5 cm geringer ist als in einer Tiefe von 30 bis 40 cm. Dagegen nimmt die Menge der aeroben Bakterien mit zunehmender Tiefe ab. Bei 50 cm fand man z. B. noch 690 Vibrionen, bei 1660 cm in einem Falle nur 18, in einem anderen 21 Vertreter dieser Gruppe. Ähnliche Verhältnisse stellten auch RuBENTSCHIK und GOICHERMAN (1935) fest. In 180 cm Schlammtiefe konnten sie keine aeroben Cellulosebakterien mehr entdecken, während die oberen Schichten Vertreter der Gattung Cytophaga sowie Actinomyceten enthielten. Es sind aber auch Ausnahmen von dieser allgemeinen Regel bekannt geworden. So hat MESSINEWA (1948) z. B. noch in einer Schlammtiefe von 195 cm erhebliche Mengen an Sporocytophaga-Zellen aufgefunden.

C. Die Böden der Gewässer

293

4. Der Apteil der verschiedenen Arten im Sehlamm der Gewässer Mit zunehmender Entwicklung der Systematik der Cellulosebakterien hat sich auch die Artcharakteristik der aufgefundenen Formen verändert. Bevor die Fähigkeit der Mykobakterien zur Cellulosezersetzung erkannt war, wurden in der Mikroflora der Gewässer häufig Vertreter der Art Bac. ferrugineus entdeckt. Als Beispiel seien OMELJANSKI ( 1 9 1 7 ) , der diese Art im Schlamm des Kolomenskoje- und BelojeSees fand, und MALIJANZ ( 1 9 3 3 ) angeführt. Letzterer isolierte den genannten Organismus aus dem Boden des Kaspischen Meeres. Später entdeckte man jedoch überwiegend Myxobakterien, womit es sehr wahrscheinlich wurde, daß Bac. ferrugineus ebenfalls zu dieser Mikrobengruppe gehört. MESSINEWA stellte fest, daß in den Gewässerböden hauptsächlich cellulosezer-setzende Organismen der Gattungen Gytophaga und Vibrio vorkommen. In der Mikroflora des Faulschlammes sind nach STURM ( 1 9 2 8 ) Sjtorocytophaga {Spirochaeta cytophaga), sporenbildende Bakterien sowie kokkenartige Formen sehr verbreitet. Anscheinend sind in diesem Falle die Mikrocysten der Sporocytophaga-ZeMen fälschlich für Kokken gehalten worden, da cellulosezersetzende Kokken überhaupt nicht oder doch nur sehr selten vorkommen. In den erwähnten Arbeiten konnten denitrifizierende, cellulosezersetzende Bakterien nicht aufgefunden werden. Dies ist ein weiterer Beweis dafür, daß es eine derartige physiologische Gruppe nicht gibt. Auch thermophile Cellulosebakterien wurden im Schlamm nicht nachgewiesen. An Hand der von den verschiedenen Autoren gegebenen Beschreibungen läßt sich zusammenfassend sagen, daß unter den aeroben Cellulosebakterien in der Hauptsache verschiedene Formen der Gattungen Sporocytophaga, Gytophaga, Sorangium und andere Myxobakterien im Schlammboden der Gewässer vorkommen. In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, daß OMELIANSKI ( 1 8 9 5 , 1 8 9 7 ) bzw. OMELJANSKI ( 1 8 9 9 ) als erster aus dem Schlamm des Flusses Malaja Newka anaerobe Cellulosebakterien isolieren konnte. Alle später aufgefundenen Formen gehören anscheinend derselben Art an oder sind ihr zumindest sehr ähnlich. 5. Das Wachstum an wassertechnischen Anlagen An den unterhalb der Wasserlinie gelegenen Teilen von Wasserbauten findet infolge des starken Bewuchses mit Algen und anderen Pflanzen stets eine Anhäufung erheblicher Mengen organischer Substanz statt; darunterfindetsich auch immer etwas Cellulose. Ein derartiger Bewuchs ist für die Praxis schon deshalb nicht bedeutungslos, weil er eine der Ursachen für die Korrosion des Betons darstellt. In diesem Zusammenhang ist der Entwicklung von Mikroorganismen, die durch Bildung von Säuren zur Auflösung des Betons beitragen, besondere Beachtung zu schenken. Wie sich z. B. aus Versuchen von BOJARSKAJA ( 1 9 4 0 ) ergeben hat, bewirken die durch entsprechende Bakterien gebildeten Säuren — Buttersäure, salpetrige Säure, Salpetersäure — eine allmähliche Auflösung des Betons. Da die Algen jedoch erheblich weniger Cellulose enthalten als die höheren Pflanzen, findet man Cellulosebakterien nur dann vor, wenn der Bewuchs größere Ausmaße an-

294

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

genommen hat. So konnte man z. B. im Bewuchs von Betonklötzen je Quadratmeter Oberfläche in drei Fällen keine Cellulosebakterien nachweisen; nur in einem Falle wurden etwa 100 Zellen aerober Bakterien gefunden. Diese Angaben beziehen sich auf Untersuchungen, die im Frühjahr durchgeführt worden sind. Im Herbst wurden dagegen an den gleichen Klötzen 200 bis 11000 Bakterienje Quadratmeter festgestellt (KRISS U. RUKINA, 1941). Diese Beobachtung kann man in der Weise erklären, daß sich die Algen im Laufe des Sommers gewaltig vermehrt haben und dementsprechend auch die Anzahl der Cellulosebakterien zugenommen hat. Dabei ist die in Höhe des Wasserspiegels vorhandene Menge der celluloseaktiven Mikroben größer als in einer Tiefe von 12 cm. V o n IMSCHENEZKI, TROFIMOW, RussAKOWA u n d BROZKAJA (1941) d u r c h g e -

führte Untersuchungen an Wasserbauten des Moskau-Wolga-Kanals haben ergeben, daß der Bewuchs sowohl aerobe als auch anaerobe Cellulosebakterien enthält. J e stärker der Bewuchs ist, desto größer ist auch die Anzahl der Cellulosebakterien. In einigen Fällen konnten sie noch bei einer Verdünnung von 1 : 1000 nächgewiesen werden. 6. Das Vorkommen in Schlammvulkanen Aus der mikrobiologischen Untersuchung vulkanischer Schlammassen haben sich für die Ökologie der Mikroorganismen wertvolle Hinweise ergeben. Naturgemäß ist der Vulkanschlamm für die Entwicklung aerober Arten kein geeignetes Substrat. Dies geht auch aus Arbeiten von TAUSSON, WESSELOW, ALESCHINA und GOLDIN (1933) hervor. Die genannten Autoren untersuchten Schlammvulkane auf der Tamanhalbinsel und fanden in Vulkanen mit größeren Kraterdurchmessern weder desulfurierende noch cellulosezersetzende anaerobe Bakterien. Wenn allerdings die Krater nicht trichterförmig ausgebildet waren oder der Schlamm eine festere Konsistenz besaß, so konnten anaerobe Cellulosebakterien nachgewiesen werden. Dabei traten die letzteren jedoch erst in einer Tiefe von 10 bis 70 cm auf. MESSINEWA (1948) beobachtete im Schlamm des Vulkans „Achtanisowskoje Blewako" ebenfalls keine aeroben Cellulosebakterien, dagegen aber in 200 cm Tiefe anaerobe Formen mit hoher Celluloseaktivität. Im Zusammenhang mit der Mikroflora des Vulkanschlamms wird stets die Frage gestellt, ob der Schlamm das natürliche Substrat der jeweiligen Mikroorganismen darstellt, oder ob diese von außen her nur zufällig dorthin gelangt sind. Interessant sind Versuche RuBENTSCHIKs und GoiCHERMANs (1941), die sie zur Klärung dieser Frage angestellt hatten. Wie die Autoren feststellten, enthielt der von ihnen untersuchte Schlamm Jod und Bor. Sie benutzten deshalb zur Isolierung der Bakterien Nährmedien mit Zusätzen von Borsäure und Kaliumjodid. Dabei stellte sich heraus, daß normale Bodenbakterien nur bei Anwesenheit relativ geringer Mengen an H 3 B 0 3 und K J wachsen konnten, während die Schlammbakterien wesentlich höhere Konzentrationen vertrugen. Im einzelnen entwickelten sich die letzteren noch bei einem Gehalt des Mediums von 100 mg/1 Kaliumjodid bzw. 400 mg/1 Borsäure. Für die'normalen, im Boden vorkommenden aeroben Cellulosebakterien betrug die maximal verträgliche Konzentration jeweils nur etwa 50 mg/1.

D. Das Vorkommen in Dung und Torf

295

Dies scheint ein Beweis für die Auffassung zu sein, daß es sich bei den im Vulkanschlamm gefundenen Cellulosebakterien um autochthone Formen handelt. Die anaeroben Cellulosebakterien des Vulkanschlamms besitzen häufig die Fähigkeit zur Reduktion von Sulfaten. Da die letzteren aber auch in cellulosefreien Medien reduziert werden, enthält der Schlamm neben den Celluloseformen auch dasulfurierende Bakterien. Beobachtet man in entsprechenden Kulturen der Cellulosebakterien keine Reduktion, so tritt diese auch in cellulosefreien Medien nicht auf, d. h. es konnte keine Entwicklung von desulfurierenden Bakterien beobachtet werden (TAUSSON, WESSELOW, ALESCHINA und GOLDIN, 1933). Diese Beobachtungen zeigen erneut, daß das Auftreten von Schwefelwasserstoff in Kulturen anaerober Cellulosebakterien stets mit der Entwicklung einer entsprechenden Begleitflora verbunden ist. Gewöhnlich handelt es sich dabei um desulfurierende Bakterien, die das Sulfat mit Hilfe der bei der Cellulosegärung frei werdenden Energie reduzieren. D. Das Vorkommen in Dung und Torf Von allen natürlichen Substraten bietet der Dung den Cellulosebakterien die besten Entwicklungsmöglichkeiten. Er enthält ausreichende Stickstoffmengen in geeigneter Form. Dieser Umstand ist besonders wichtig, weil ein Mangel an Stickstoff für die Entwicklung der Cellulosebakterien ein sehr hemmender Faktor sein kann. Zur Zersetzung von 35 g Cellulose wird 1 g Stickstoff in leicht aufnehmbarer Form benötigt. Dung enthält neben 24% Cellulose etwa 0,5% Stickstoff. Das Verhältnis dieser beiden Komponenten zueinander muß als außergewöhnlich günstig bezeichnet werden. Außerdem kommen im Dung noch große Mengen anderer Bakterien vor, die mit ihren abgestorbenen Zellen ebenfalls verschiedene stickstoffhaltige Verbindungen sowie Vitamine liefern. Letztere sind für die Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien von besonderer Bedeutung. Verantwortlich für die Menge der vorhandenen Cellulosebakterien, aber auch für deren Zerfallsgeschwindigkeit, sind in erster Linie die Temperatur und die Belüftung des Dungs. Das beste Verfahren zur quantitativen Bestimmung der aeroben Cellulosebakterien im Dung ist nach Ansicht STEPANOWAs (1935) die Kultivierung auf Filtrierpapier mit Kieselsäuregelunterlage. Daneben werden auch verschiedene flüssige Medien mit Filtrierpapier benutzt oder das Verfahren von CHRISTENSEN angewendet, bei dem man die in Petrischalen befindliche Dungprobe mit Filtrierpapier bedeckt. Alle drei Methoden führen hinsichtlich der artmäßigen Zusammensetzung der isolierten Mikroorganismen zu annähernd gleichen Resultaten. Weniger ausgearbeitet sind die Verfahren zur quantitativen Bestimmung der anaeroben Cellulosebakterien. Obwohl das Problem schon des öfteren erörtert worden ist, muß diese Frage noch einmal angeschnitten werden, weil durch die Verwendung ungeeigneter Medien leicht falsche Vorstellungen .über die Menge der im Substrat vorhandenen anaeroben Celluloseformen erhalten werden. Als Kuriosum sei erwähnt, daß einige Autoren zur Isolierung anaerober Cellulosebakterien Medien mit einem hohen Gehalt an löslichen Kohlenhydraten benutzten. Natürlich konnte in einem derartigen Milieu keine Entwicklung der Cellulosebakterien stattfinden. Auch vom ökologischen Standpunkt aus begründete Medien

296

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

geben nicht immer die besten Resultate. So verwendete z. B . STEPANOWA (1935) einen Nährboden, der mineralische Salze und Dungextrakte enthielt. IMSCHENEZKI ist der Meinung, daß sich sowohl thermophile als auch mesophile anaerobe Cellulosebakterien in derartigen Medien schlechter entwickeln als in solchen mit Eiweiß und verschiedenen Extrakten (Fleischbrühe-Pepton, Fäkalienextrakt, Leberextrakt usw.). Die Tatsache, daß meistens nur relativ niedrige Werte für den Gehalt des Dungs an anaeroben Cellulosebakterien angegeben werden, ist im wesentlichen auf die Verwendung ungeeigneter Nährmedien zurückzuführen. Mit der Änderung der Bakterienmenge im Dung als Funktion der Lagerungsart haben sich STEPANOWA (1935) und GOETERS (1929) ziemlich eingehend beschäftigt. Nach diesen Ergebnissen erhöht sich die Zahl der aeroben Cellulosebakterien bei der Lagerung in Haufen von etwa 1,5 auf 500 Tausend Zellen j e Gramm. Mit zunehmender Erwärmung beginnen die aeroben Formen im allgemeinen abzusterben. Andererseits findet in einem Dung, der zunächst sechs Tage bei 60° C und anschließend wieder bei 20° C gehalten wurde, eine Zunahme der aeroben Cellulosebakterien statt. Betrug beispielsweise die ursprüngliche Menge 500 Individuen je Gramm, so wurden nach dieser Behandlung bis zu 7,5 Tausend Zellen bestimmt. GOETERS stellte dagegen fest, daß die aeroben Formen bei 60° C vollständig zugrunde gehen. STEPANOWA fand allerdings unter den gleichen Bedingungen noch lebende aerobe Cellulosebakterien. Bei einer Nachprüfung unter Laboratoriumsverhältnissen stellte sich dagegen heraus, daß Organismen der Art Sporocytophaga myxococcoides Temperaturen von 60° C nicht mehr vertragen können. Wahrscheinlich herrschen im Dung Verhältnisse, die eine gewisse Resistenz der Bakterien gegenüber höheren Temperaturen bewirken. Wie sich aus entsprechenden Versuchen ergeben hat, bleiben die Vertreter der Gattung Sporocytophaga unter anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30° C höchstens zwölf Tage am Leben. Wird dagegen der Partialdruck des Sauerstoffs geringfügig erhöht, so findet eine, wenn auch nur sehr langsame Entwicklung statt. Die im Dung am häufigsten vorkommende aerobe Celluloseform ist nach STEPANOWA 8p. myxococcoides, deren Menge je Gramm etwa 20 Tausend Zellen erreicht. Daneben wurden aber auch Vertreter der Gattungen Vibrio, Gellfalcicula sowie der Art Bact. fimi gefunden. Besonders intensiv entwickeln sich die Sp. myxococcoidesZellen dann, wenn der Dung in Haufen gelagert wird. Bewahrt man aber den Dung in bedeckten Behältern oder in Gruben auf, so nimmt die Zahl der aeroben Formen infolge der Eigenerwärmung des Substrats um etwa 90% ab. Für die mesophilen anaeroben Cellulosebakterien stellt der Dung einen hervorragenden Nährboden dar, aus dem schon viele Bakterien isoliert werden konnten. E s sei in diesem Zusammenhang nur auf die Arbeiten OMELIANSKls (1895, 1897, 1902) bzw. OMELJANSKI (1899, 1901), CLAUSENS (1931) sowie COWLES und RETTGERs (1931) verwiesen. Wie STEPANOWA (1935) fand, enthält der Dung stets anaerobe Cellulosebakterien. Infolge der Verwendung ungeeigneter Nährmedien liegen die von ihr angegebenen Zahlen jedoch zu niedrig. Wird der Dung zwei Monate lang bei normaler Temperatur gelagert, so erhöht sich die Zahl der anaeroben Cellulosebakterien von 2 bis 4 auf

D. Das Vorkommen in Dung und Torf

297

80 bis 100 Tausend; in abgedeckten Gruben oder Behältern vermehren sie sich so intensiv, daß aus 600 bis 800 Zellen 100 bis 200 Tausend entstehen. Auch bei der Lagerung in Haufen wurden Mengen von 200 Tausend erreicht. In der Hauptsache handelte es sich dabei um Formen vom Typ des OMELJANSKlschen Bakteriums; oft wurde aber auch die von KHOUVINE (1923, 1934) beschriebene Art Bac. cellulosae dissclvens gefunden, die ein genügend breites Temperaturintervall (35 bis 51° C) für ihr Wachstum aufweist. Wie aus den Ausführungen hervorgeht, hat STEPANOWA bei ihren Arbeiten stets eine Erhöhung der Bakterienzahl beobachten können. Deshalb sind die von GOETERS (1929) erhaltenen negativen Resultate um so weniger verständlich. Unter Benutzung des LoCHHEADschen Nährmediums, das Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und etwas Fleischextrakt enthält, fand der Autor, daß die Menge der anaeroben Cellulosebakterien nach einer vierwöchigen Lagerung bei 20° C unverändert geblieben ist und etwa 10 Tausend Individuen je Gramm beträgt. Ferner beobachtete er eine Abnahme der Bakterienzahl nach sechstägiger Erwärmung auf 60° C und anschließender Lagerung bei 0° C, 40° C oder 60° C. Etwas unwahrscheinlich klingt auch seine Angabe, daß sich die Zahl der anaeroben Cellulosebakterien bei einer zweimonatigen Lagerung des Dunges im Sommer nicht erhöhte, sondern im Gegenteil verringerte, nämlich von 7,5 auf 5 Tausend Zellen. Durch ein viertägiges Erhitzen auf 80° C werden sowohl die anaeroben als auch die aeroben Cellulosebakterien abgetötet (GOETERS). Der Luftzutritt spielt für die Menge der anaeroben Cellulosebakterien eine wesentliche Rolle. In einem fest gepackten Dung sind etwa zehnmal mehr Bakterien enthalten als in einem lockeren Haufen. Diese Feststellung widerspricht natürlich nicht der Tatsache, daß sich die anaeroben Formen auch in den obersten Lagen entwickeln, nur erfolgt ihre Vermehrung an der Oberfläche des Substrats nicht so intensiv wie im Inneren desselben. I m Gegensatz dazu können die aeroben Cellulosebakterien unter anaeroben Bedingungen nicht wachsen. Mit zunehmender Tiefe nimmt deshalb ihre Zahl gewöhnlich rasch ab. Die Temperatur im Inneren des Dungs, besonders bei der Lagerung in abgedeckten Gruben, erreicht häufig 60° C, so daß man in diesem Fall große Mengen thermophiler Formen vorfindet. Nach STEPANOWA nimmt deren Zahl von 200 Zellen bis auf 100 Tausend Individuen zu. Wichtig ist die Feststellung, daß auch bei einer Lagerung des Dungs in der Kälte die Anzahl der thermophilen Bakterien ebenfalls etwas ansteigt. Dies hängt offenbar damit zusammen, daß auch schon eine geringfügige Erwärmung für deren Vermehrung ausreichend ist. Die Erwärmung des Dungs auf höhere Temperaturen bewirkt eine leichte Zunahme des Gehalts an mesophilen anaeroben Cellulosebakterien. Die Tätigkeit der aeroben Formen wird dagegen stark eingeschränkt oder manchmal sogar völlig unterbunden. Im Gegensatz dazu können die Actinomyceten ihre abbauende Tätigkeit fortsetzen, weil es unter ihnen auch thermophile Rassen gibt. Wie STEPANOWA bemerkt, besitzen die Actinomyceten ebenfalls die Fähigkeit, Cellulose unter anaeroben Bedingungen zu zersetzen. Demzufolge können sie sich auch im Innern des Dungs entwickeln.

298

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

Unter den. im Dung bei 25 bis 28° C wachsenden und sich vermehrenden Actinomyceten findet man am häufigsten die Arten Actinomyces roseus, A. cellulosae, A. melanocyclus und A.melanos'poreus. Im Vergleich zu den normalen Varietäten kommen die thermophilen Actinomycetenrassen im Dung jedoch relativ selten vor. STEPANOWA (1935) gelangte bei der quantitativen Bestimmung der sich bei 35° C entwickelnden Actinomyceten zu folgenden Ergebnissen. Bei einer Lagerung in der Kälte ändert sich ihre Zahl entweder nicht oder erreicht höchstens 250 Zellen. In gedeckten Gruben steigt ihre Menge von 750 bis 5000 auf 50 bis 75 Tausend an. In freiliegenden Haufen war einmal eine Zunahme von 5 auf 25 Tausend, in einem anderen Falle von 75 auf 750 Tausend zu verzeichnen. An dem im Dung stattfindenden Celluloseabbau sind also Vertreter der aeroben Cellulosebakterien, der meso- und thermophilen anaeroben Cellulosebakterien, der Actinomyceten sowie verschiedener Pilze beteiligt; letztere bedürfen in diesem Zusammenhang einer besonderen Betrachtung. Zweifellos läßt sich der Prozeß des Celluloseabbaus durch eine Veränderung der Dungzusammensetzung in jeder beliebigen Richtung lenken. Mit Hilfe entsprechender mikrobiologischer Untersuchungen kann man daher auch rationellere Lagerungsmöglichkeiten auffinden. Torf enthält normalerweise nur relativ geringe Mengen an Cellulosebakterien. Ist er jedoch in Haufen mit großer Schichtdicke gelagert und besitzt er einen ausreichenden Feuchtigkeitsgehalt, so kann man eine intensive Entwicklung der Mikroorganismen, darunter auch der Cellulosebakterien beobachten. Nach Beobachtungen von DlANOWA (1954) erreicht die Menge an Actinomyceten im torfbürtigen Kompost am Ende des Kompostierungsprozesses ihr Maximum. Mit zunehmender Akkumulation leicht löslicher Stickstoffverbindungen steigt auch die Anzahl der aeroben celluloseaktiven Mikroorganismen an. Eine besondere Bedeutung kommt den im Torf enthaltenen thermophilen Cellulosebakterien zu, die im hochgestapelten Torf an dem Prozeß der Thermogenese beteiligt sind und die Selbstentzündung der Haufen verursachen können. Von praktischem Interesse wäre eine „Veredelung" des Torfs durch Anreicherung mit Kohlenstoff. Dieses Problem ist jedoch sehr kompliziert, weil durch die Tätigkeit der Cellulosebakterien leicht zersetzbare kohlenstoffhaltige Abbauprodukte entstehen, die ihrerseits sogar unter anaeroben Bedingungen weiter zersetzt werden. Auch in Heu- und Strohhaufen finden sich häufig Cellulosebakterien, die ein Verfaulen des Materials bewirken. Die Menge der dabei beobachteten Bakterien ist starken Schwankungen unterworfen und hängt von der Temperatur und der Feuchtigkeit des Materials ab. E . Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen 1. Die Cellulosegärung als symbiotischer Prozeß Reinkulturen von Mikroorganismen gibt es nur in Laboratorien und den entsprechenden Industriebetrieben. Unter natürlichen Verhältnissen werden alle biochemischen Prozesse durch das Zusammenwirken verschiedener Bakterien bewerk-

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

299

stelligt. Dies ist einer der wesentlichen Gründe für die rasche und vollständige Umwandlung der organischen Stoffe. Die zwischen den Mikroorganismen vorhandenen Beziehungen besitzen für die Ökologen schon seit längerer Zeit ein außerordentliches Interesse. Die Mikrobiologen operierten früher häufig mit dem Begriff der Metabiose, d. i. die bei der Zersetzung eines organischen Stoffes durch eine Bakterienart gebildeten Produkte werden von einem anderen Mikroorganismus verwertet. Mit Zunahme der Kenntnisse über die Physiologie der Mikroben und die zwischen den verschiedenen Arten existierenden Beziehungen stellte es sich jedoch heraus, daß letztere nicht metabiotischer, sondern symbiotischer Natur sind. Die Erscheinung der Zusammenarbeit und gegenseitigen Hilfe ist in der Welt der Mikroben viel häufiger verbreitet als die Erscheinung des Antagonismus. Dem Antagonismus wird gegenwärtig nur deshalb mehr Aufmerksamkeit gewidmet als der Symbiose, weil er für das Studium der Antibiotika ein praktisches Interesse besitzt. Beim Celluloseabbau unter anaeroben Bedingungen entstehen hauptsächlich Cellobiose und Glucose, ferner verschiedene Säuren und Alkohole. E s ist also nur natürlich, daß diese Produkte den verschiedenartigsten Mikrobenformen als Nahrungs- und Energiequelle dienen. Die am häufigsten vorkommende Kohlenstoffverbindung, die Cellulose, liefert bei der Hydrolyse Zucker (Glucose), der in freier Form sonst in der Natur nur relativ selten zu finden ist (Früchte, Beeren). Gerade die Glucose wird aber von sehr vielen Mikroorganismen besonders leicht verwertet. Die Hydrolyse der Cellulose und der Stärke durch entsprechende Mikroben liefert also erhebliche Glucosemengen, die wieder anderen Bakterienarten zugute kommen. Nur so ist eine Erklärung für die unter den Mikroben weit verbreitete Fähigkeit zur Glucoseverwertung möglich. Die von den anaeroben Cellulosebakterien durch Vergärung der Cellulose gebildeten Produkte können den Angehörigen der verschiedensten physiologischen Gruppen als Nahrungsquelle dienen. In dieser Weise werden die sehr häufig zu beobachtenden Symbiosen zwischen den Cellulosebakterien einerseits und den denitrifizierenden, desulfurierenden, methanbildenden und anderen Bakterien andererseits verständlich. Der Charakter der Begleitorganismen hängt in gewisser Weise von einigen biologischen Besonderheiten der Cellulosebakterien ab. So findet man z. B . in Kulturen thermophiler Cellulosebakterien stets nur sporenbildende Begleitbakterien, weil die meisten thermophilen Bakterien zu den sporenbildenden Formen gehören. Bei den mesophilen Cellulosebakterien können dagegen sowohl sporenbildende als auch sporenlose Arten als Begleiter vorkommen. IMSCHENEZKI fand bei seinen Untersuchungen in Anreicherungskulturen thermophiler Cellulosebakterien im Medium V außer den Celluloseformen noch drei andere Bakterienarten, und zwar zwei aerobe und eine anaeTobe. Die isolierten aeroben Begleitbakterien entwickelten sich auf den gewöhnlichen Nährmedien nur schlecht und zeigten bei entsprechenden Übertragungen nicht immer ein Wachstum. Auf die anaerobe Art soll hier nicht näher eingegangen werden, da die anaeroben Begleitbakterien bei der Cellulosevergärung, wie später dargelegt wird, keine so

300

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

große Rolle spielen wie die aeroben Formen. Naturgemäß trifft diese Feststellung dann nicht zu, wenn die Anreicherungskultur unter ausgesprochen anaeroben Bedingungen gehalten wird. Von den beiden aeroben Arten stellt die erstere bewegliche Stäbchen dar, die zentral oder subterminal angeordnete Sporen erzeugen und grampositiv sind. Die Stäbchen bilden Kolonien mit glatter Oberfläche und von glänzender, grauweißer Farbe, deren Ränder gezackte Konturen aufweisen (Abb. 88b). Die Cellulose wird von diesen Bakterien nicht angegriffen. Sie können dagegen Glucose, Saccharose, Lactose, Dextrin, Stärke, Natriumacetat und Äthylalkohol verwerten. Impft man Agar mit einem Stückchen Filtrierpapier aus der. Anreicherungskultur, so bedeckt sich die Agaroberfläche rasch mit Kolonien der zweiten Axt (Abb. 89). Die isolierten Kolonien zeigen eine matte graugelbe Farbe und ein sternförmiges Aussehen (Abb. 90). Bei Strichimpfung auf Agar erscheint ein grauweißer Belag mit gezackten Rändern (Abb. 88a). Bezüglich der verwertbaren Kohlenstoffquellen verhält sich diese Art gleich der vorigen. Häufig findet man in Anreicherungskulturen thermophiler Cellulosebakterien auch Begleitbakterien mit endständigen Sporen. IMSCHENEZKI beobachtete derartige plektridiale Formen in einer von ROTMISTROW hergestellten Kultur. Sie können leicht mit den Cellulosebakterien verwechselt werden, denen sie in gewisser Abb. 88. Das Wachstum der BegleitorganisWeise ähnlich sind (Abb. 91). men thermophiler Cellulosebakterien bei Die erwähnte Anreicherungskultur Strichimpfung, a — Begleitform Nr. 2 ; b — Begleitform Nr. 1 enthielt also eine Cellulosebakterienart sowie zwei aerobe Begleitformen und einen anaeroben Begleiter; diese celluloseinaktiven Arten entwickelten sich in symbiotischer Form zusammen mit der Celluloseform. a) D i e W i r k u n g s w e i s e der b e g l e i t e n d e n M i k r o f l o r a Durch Zerlegung einer Anreicherungskultur thermophiler Cellulosebakterien in die darin vorhandenen Arten erhält man die Möglichkeit, den Einfluß der einzelnen

T a f e l 28

Abb. 89. Die Entwicklung aerober Begleitbakterien auf einem festen Medium nach Impfung mit Papierstückchen aus einer Anreicherungskultur thermophiler Cellulosebakterien

T a f e l 29

Abb. 90. Einzelne sternförmige Kolonien der Begleitform Nr. 2

1

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wi*• *

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Y

V •

Abb. 91. Sporenbildende Begleitformen der thermophilen Cellulosebakterien. Die plektridialen Formen weisen eine gewisse Ähnlichkeit mit den thermophilen Celluloseorganismen auf

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

301

Begleitarten auf die Cellulosegärung zu studieren. Entsprechende Versuche wurden in hohen Reagenzgläsern mit Medium V und Filtrierpapier durchgeführt. Zunächst beimpfte man das Medium mit einer Reinkultur thermophiler Cellulosebakterien, und anschließend wurden die Begleitbakterien einzeln oder in verschiedenen Kombinationen zugegeben. Die Kulturen wurden jeweils bei 60° C gehalten. Uber die dabei erhaltenen Ergebnisse unterrichtet die Tabelle 41. Aus den Angaben dieser Tabelle kann man folgende Schlüsse ziehen: 1. Auf dem Medium V entwickeln sich keine Reinkulturen der Cellulosebakterien. Auch in Anwesenheit der anaeroben Begleitformen findet auf diesem Medium kein Wachstum der celluloseaktiven Mikroorganismen und kein Abbau der Cellulose statt. 2. In Symbiose mit den aeroben Formen wird die Cellulose unabhängig von der jeweiligen Art des Cellulosebakteriums stets vergoren. Man vergleiche hierzu die in der Abbildung 92 wiedergegebenen Versuche. T a b e l l e 41 Cellulosegärung unter symbiotischen Bedingungen Komponenten des symbiotischen Systems Cellulosebakterien in Reinkultur . Cellulosebakterien + Bj + B2 + B3 » + Bj + Ba . . „ + B2 + B 3 . . » + B 2 + Bj . . » + Bi + B 2 + B $

Gärung . .

+ + —

. . . .

. . . .

+ + + +

Erklärung: B, = aerobe Begleitform Nr. 1 B2 = aerobe Begleitform Nr. 2 Ba = anaerobe Begleitform Nr. 3

Von großer Wichtigkeit ist aber noch folgende Feststellung. Das Medium V sowie . auch andere mehr oder weniger einfach zusammengesetzte Nährböden werden häufig zur Herstellung von Reinkulturen anaerober Cellulosebakterien benutzt. Aus den oben erwähnten Versuchen geht aber deutlich hervor, daß Reinkulturen auf diesem Wege nicht gewonnen werden können. Findet trotzdem eine Gärung der Cellulose statt, so ist das ein Zeichen für die Verunreinigung der Kultur mit celluloseinaktiven Begleitbakterien. Unter diesen besonderen Bedingungen können sich die Cellulosebakterien nur in Symbiose mit anderen, celluloseinaktiven Arten entwickeln. Man kann diese Erscheinung nicht einfach mit einer Senkung des Redoxpotentials durch die Begleitbakterien erklären, da auch unter ausgesprochen anaeroben Bedingungen (Vakuum) bei Abwesenheit der Begleitflora kein Wachstum der Celluloseformen erfolgt. Da. gegen wird die Rolle der Symbionten verständlich, wenn man einige physiologische Besonderheiten in der Ernährung der Cellulosebakterien berücksichtigt.

302

III. Die Verbreitung der Celhilosebakterien

Die thermophilen Celhilosebakterien bewirken dann keine Zersetzung der Cellulose, wenn das Medium den für die Entwicklung der Celluloseorganismen notwendigen Stickstoff nur in Form anorganischer Verbindungen, Aminosäuren oder Pepton enthält. Es lag deshalb die Vermutung nahe, daß die Begleitbakterien dazu befähigt sind, den in dieser Form vorliegenden Stickstoff zu assimilieren, damit

Abb. 92. Die Entwicklung thermophiler Celhilosebakterien in Symbiose mit Begleitbakterien. a — Reinkultur ohne Begleitbakterien; kein Wachstum; b — Cellulosebakterien in Symbiose mit der Begleitform Nr. 1 ; c — Cellulosebakterien in Symbiose mit der Begleitform Nr. 2 ; d — Cellulosebakterien in Symbiose mit einer anaeroben Begleitform; kein Wachstum

körpereigene Substanz einschließlich Vitamine usw. aufzubauen und so das Medium mit dem für die Cellulosebakterien notwendigen organischen Stickstoff, eventuell auch mit Vitaminen, anzureichern. Zur Prüfung dieser Annahme wurden folgende Versuche angestellt. Zunächst beimpfte man mit der Begleitart B2 eine Beihe von

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

303

Petrischalen, die Fleischbrühe-Pepton-Agar enthielten. Die gebildeten Kolonien wurden anschließend gesammelt, gewaschen, zentrifugiert und getrocknet. Die auf diese Weise erhaltene Substanz setzte man dem Medium V zu, das weder Pepton noch Natrium-Ammoniumphosphat als Stickstoffquelle enthielt. Der so vorbereitete Nährboden wurde schließlich unter Einhaltung streng anaerober Bedingungen mit einer Reinkultur thermophiler Cellulosebakterien beimpft. Bereits am Tage nach der Impfung erfolgte in allen Reagenzgläsern eine stürmische Gärung der Cellulose. Damit war also bewiesen, daß die getrockneten Zellen der Begleitbakterien den Cellulosebakterien als Stickstoff- und Vitaminquelle dienen können. Es handelt sich dabei keineswegs um eine spezifische Wirkung bestimmter Bakterien. Den gleichen Effekt kann man auch mit anderen getrockneten Bakterienzellen erreichen (Sarcina lutea, Bac. mycoides, Bad. herbicola). In allen Versuchen begann sofort nach dem Zusatz des Zellmaterials eine intensive Gärung der Cellulose. Die Entwicklung anaerober Cellulosebakterien in Medien mit mineralischem Stickstoff oder Pepton ist demnach nur unter den Bedingungen einer Symbiose mit anderen Bakterien möglich, die den in dieser Form vorhandenen Stickstoff assimilieren können. Voraussetzung für eine Cellulosegärung ist also stets die Entwicklung von Begleitbakterien. Offenbar entstehen durch die Lebenstätigkeit der Begleitmikroflora optimale Bedingungen für die Entwicklung der Cellulosebakterien, denn der Celluloseabbau in Mischkulturen erfolgt viel intensiver als der in Reinkulturen. Eine Ausnahme bilden gewisse Begleitbakterien, die einen fluoreszierenden Farbstoff hervorbringen, der seinerseits auf die Entwicklung der Cellulosebakterien einen hemmenden Einfluß ausübt. Das Nährmedium wird in diesen Fällen meist grünlich, mitunter auch etwas bläulich gefärbt. Die Cellulosegärung verläuft in derartigen Kulturen weniger gut. Der günstige Einfluß des Zellenmaterials auf die Entwicklung der Cellulosebakterien ist schließlich nicht nur auf die bei der Autolyse der Bakterienzellen entstehenden Aminosäuren zurückzuführen, sondern auch auf die frei werdenden Vitamine, die auf diese Weise ebenfalls in das Medium gelangen. Als die erwähnten Untersuchungen durchgeführt wurden, standen noch keine reinen Vitaminpräparate zur Verfügung, so daß die Wirkung der Vitamine auf das Bakterienwachstum nur mit Hilfe der seinerzeit bekannten unzulänglichen Methode studiert werden konnte. Zunächst wurden also beide aeroben Begleitbakterien hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Wirkstofferzeugung mit Hilfe der üblichen Methodik (Haferkoleoptile) geprüft. Dabei wurde gefunden, daß beide Arten keine Wachstumsstimulatoren vom Auxintyp besitzen. Ferner versuchte man, eventuell vorhandene Vitamine der B-Gruppe in den Bakterienzellen nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurden Versuche mit Saccharomyces cerevisiae in synthetischem Nährmedium nach BOAS durchgeführt. In einer Versuchsreihe erhielt das Medium einen Zusatz von 0,05% getrockneten Zellmaterials der beiden Begleitbakterien und gleichzeitig eine bestimmte Menge lebender Hefezellen; in einer anderen Reihe wurden an Stelle der getrockneten Bakterienzellen 0,05% getrockneter Hefe und wiederum lebende Hefe eingebracht. Nach zwei Tagen wurden die Zellen der lebenden Hefe ausgezählt. Da die Entwicklung der Hefe in

304

I I I . Die Verbreitung der Cellulosebakterien

beiden .Nährlösungen annähernd gleichmäßig erfolgte, enthalten also die Begleitbakterien Vitamine des B-Komplexes. Auf Grund dieser Ergebnisse verbreitete sich die Ansicht, daß die thermophilen Cellulosebakterien in dem peptonhaltigen Medium lediglich deshalb nicht wachsen können, weil die notwendigen Vitamine fehlen. Da diese offenbar in den Zellen der Begleitbakterien vorhanden sind, ist also die Entwicklung der Cellulosebakterien im Rahmen einer Symbiose möglich. Zur Nachprüfung dieser Ergebnisse wurden Kultivierungsversuche mit Cellulosebakterien in dem üblichen, peptonhaltigen Nährmedium unter Zusatz von 0,005% Zellenmaterial der Begleitbakterien durchgeführt. Trotz einer zusätzlichen VitaminB-Gabe erfolgte keine Vergärung der Cellulose. Durch weitere Zusätze von 0,01 bis 0,5% Hefeextrakt konnte kein Wachstum der Bakterien erzielt werden. Alle Versuche wurden unter streng anaeroben Bedingungen (Vakuum) durchgeführt. Es ist daher völlig ausgeschlossen, daß mangelhafte anaerobe Verhältnisse für das fehlende Wachstum verantwortlich sind. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß bei Verwendung optimaler Medien die Cellulosegärung stets sofort einsetzt. Die Rolle der Vitamine in der Ernährung der anaeroben Bakterien ist bereits früher erörtert worden (vgl. S. 189ff.). Nach MCBEE (1950) sind die thermophilen Cellulosebakterien durchaus in der Lage, sich in Medien mit mineralischem Stickstoff (Ammoniumsalze) zu entwickeln, wenn verschiedene Vitamine zur Nährlösung zugesetzt werden. Es ist deshalb nicht ausgeschlossen, daß die negativen Ergebnisse IMSCHENEZKls darauf beruhen, daß die getrockneten Zellen oder der Hefeextrakt nicht alle für die Entwicklung der Cellulosebakterien notwendigen Vitamine enthielten. Diese Frage bedarf jedoch noch einer eingehenden Uberprüfung, weil die von MCBEE beschriebenen Gärungen einen etwas anderen Charakter aufweisen als die von IMSCHENEZKI und Mitarbeitern normalerweise beobachteten. MCBEE fand z. B. keine Hydrolysenprodukte der Cellulose, d. h. Cellobiose und Glucose, die nach IMSCHENEZKI bei einer Vergärung in optimalen Medien stets in größeren Mengen auftreten. Aber auch aus Versuchen SOETERS' (1936) geht hervor, daß die Begleitbakterien eine Anreicherung des Mediums mit Stoffen bewirken, die für die Entwicklung der Cellulosebakterien unbedingt erforderlich sind. SOETERS untersuchte z. B. den Einfluß getrockneter Bact. coii-Zellen sowie daraus erhaltener Autolysate auf das Wachstum der Cellulosebakterien. Die beobachtete günstige Wirkung des Darmbakteriums führte der Autor ebenfalls auf die Bildung irgendwelcher, das Wachstum der Cellulosebakterien stimulierender Stoffe zurück. Sicher verändern also die Begleitbakterien die Zusammensetzung des Substrats und erleichtern damit die Entwicklung der Cellulosebakterien. Wie aus folgendem Versuch hervorgeht, ist dieses aber nicht der einzige günstige Einfluß der Begleitmikroflora auf das Wachstum der Cellulosemikroben. Zur Kultivierung der Bakterien verwendete man einen optimalen Nährboden, z. B. das Medium VL, dem Fäkalienextrakt oder Stückchen tierischer Organe zugesetzt wurden. In einem derartigen Medium, das sich in hoher Schicht in Reagenzgläsern befand, entwickelten sich keine Reinkulturen der Cellulosebakterien, während

305

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

Anreicherungskulturen unter den gleichen Bedingungen lebhaftes Wachstum, zeigten und eine intensive Gärung der Cellulose verursachten. In diesem Falle besteht die Wirkung der Begleitbakterien in einer Senkung des Redoxpotentials, denn da das Medium bereits ausreichende Mengen an organisch gebundenem Stickstoff und Vitaminen enthält, kann eine weitere Anreicherung des Substrats mit diesen Stoffen zu keiner wesentlichen Steigerung des Wachstums der Cellulosebakterien führen. Zum Beweis der Richtigkeit dieser Annahme wurde folgende Versuchsreihe durchgeführt: Zunächst kultivierte man das Begleitbakterium B a in hohen Reagenzgläsern, die mit den Medien V und VL gefüllt waren. Nachdem in bestimmten Zeitabständen das Redoxpotential der Kulturen gemessen worden war, wurden die Kulturen des Begleitbakteriums schließlich noch mit Cellulosebakterien beimpft. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der Tabelle 42 enthalten. T a b e l l e 42 Änderung des Redoxpotentials während des Wachstums der Begleitbakterien Medium V

Versuchsdauer Erste Versuchsreihe 24 Stunden 48 Stunden Zweite Versuchsreihe 24 Stunden 48 Stunden Impfung mit Cellulosebakterien

Medium VL

PH

Eh

TH

PH

Eh

7,3 7,3

0,329 0,165

26,0 20,3

7,7 7,5

0,263 0,211

24,1 22,4

7,3 7,2

0,316 0,223

25,5 22,2

8,5 8,5

0,202 0,189

24,0 23,5

Gärungsbeginn am dritten Tag nach der Beimpfung

Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, bewirken die Begleitbakterien tatsächlich eine Senkung des Redoxpotentials. Auf diese Weise werden Bedingungen geschaffen, unter denen eine Vermehrung der Cellulosebakterien üiöglich ist. Naturgemäß können anaerobe Verhältnisse auch von beliebigen anderen aeroben Organismen hervorgerufen werden, sofern sie in der Lage sind, sich in dem jeweiligen Medium zu entwickeln. Werden z. B. Kulturen anaerober Cellulosebakterien mit aeroben Formen aus der Luft verunreinigt, setzt meistens bald danach eine Gärung der Cellulose ein. Mit einer Senkung des Redoxpotentials durch die Begleitbakterien kann auch die Beobachtung erklärt werden, daß mitunter die als streng anaerobe Organismen bekannten Cellulosebakterien auch in Nährböden geringer Schichthöhe wachsen. Sofern die aeroben Formen günstige Verhältnisse für die Entwicklung der anaeroben Cellulosebakterien schaffen, genügen bereits Schichthöhen von 4 bis 5 cm. Andererseits entwickeln sich die letzteren auch in sehr hoch geschichteten Substraten nur dann, wenn wirklich anaerobe Bedingungen vorhanden sind (Vakuum, Zusätze reduzierender Stoffe usw.). Erfolgt also unter gewöhnlichen Verhältnissen, d. h. in flüssigen Nährmedien, eine Vergärung der Cellulose, so liegt meistens eine Mischkultur vor. 20 Imschenezki, Mikrobiologie

306

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

b) Die V e r w e r t u n g der P r o d u k t e d e r C e l l u l o s e g ä r u n g d u r c h die Begleitbakterien Nachdem im vorigen Abschnitt über den günstigen Einfluß der Begleitbakterien auf die Entwicklung der Cellulosebakterien berichtet wurde, soll nun die Verwertung der Gärungsprodukte durch die Begleitbakterien behandelt werden. Man kann sich leicht davon überzeugen, daß eine derartige Verwertung tatsächlich stattfindet, wenn man die einerseits von Reinkulturen und andererseits von Mischkulturen gebildeten Mengen an Alkohol und Säuren miteinander vergleicht. Die Ergebnisse entsprechender Versuche sind in den Tabellen 43 und 44 zusammengestellt. T a b e l l e 43 Vergärung von Cellulose mit einer thermophilen Mischkultur Versuchsdauer 6 Tage

12 Tage

18 Tage

Versuchsnummer 1 Eingesetzte Cellulosemenge (g) Zerstörte Cellulosemenge (g) Zerstörte Cellulosemenge (Prozent) Gefundene Alkoholmenge (g) Gefundene Alkoholmenge (Prozent) Gefundene Alkoholmenge (in Prozent der zerstörten Cellulose) Gefundene Säurenmenge (g) Gefundene Säurenmenge (Prozent) Gefundene Säurenmenge (in Prozent der zerstörten Cellulose)

la

lb

2

2a

2b

3

3a

3b

5,2601 5,2462 5,3291 5,2540 5,2520 5,4278 5,2351 5,2660 5,4741 0,9517 1,0640 1,5071 2,4258 1,9480 3,0598 2,8943 4,000 3,6945 18,1

20,3

28,2

46,2

38,0

56,4

55,20 75,9

67,5

0,28

0,30

0,33

0,53

0,53

0,35

0,61

0,77

0,38

0,10

0,11

0,12

0,20

0,20

0,13

0,23

0,29

0,15

29,5

28,2

21,9

21,8

26,5

11,4

21,0

19,3

10,2

0,33

0,33

0,6.

0,58

0,56

0,77

0,74

0,80

0,90

0,12

0,12

0,22

0,22

0,21

0,29

0,28

0,30

0,36

34,7

31,0

39,8

23,9

28,0

25,2

25,60 20,0

24,4

Wie die Tabellen zeigen, steigt der Säuregehalt in Mischkulturen rascher an als in Reinkulturen. Diese Tatsache läßt sich nur so erklären, daß die Begleitbakterien einen Teil der Produkte des Celluloseabbaus gleichzeitig mit den Cellulosebakterien oxydieren, wobei organische Säuren entstehen. Dies ist eine der Hauptursachen dafür, daß in Mischkulturen keine reduzierenden Substanzen gefunden werden, einfach deshalb, weil die Zahl der sie verwertenden Bakterien in den Mischkulturen größer ist als in den Reinkulturen.

E . Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

307

Zur experimentellen Bestätigung dieser Theorie isolierte IMSCHENEZKI zunächst die Begleitbakterien in Reinkultur und impfte mit diesen darauf Reinkulturen thermophiler Cellulosebakterien. Als Kontrolle dienten Reinkulturen der Cellulosemikroben ohne Zusatz der Begleitformen. Über die dabei erhaltenen Ergebnisse g i b t die Tabelle 45 Auskunft. T a b e l l e 44 Bildung von Alkohol u n d Säuren bei der Vergärung von Cellulose mit celluloseaktiven Bakterien in Beinkultur Medium VL

Medium V

Medium V Medium V + 50% + 25% AFP APP.

Versuchsnummer

Eingesetzte Cellulosemenge (g) Zerstörte Cellulosemenge (g) Zerstörte Cellulosemenge (Prozent) Gefundene Alkoholmenge (g) • • • Gefundene Alkoholmenge (Prozent) Gefundene Alkoholmenge (in Prozent der zerstörten Cellulose) . . . Gefundene Säurenmenge(g) Gefundene Säurenmenge (Prozent) Gefundene Säurenmenge(in Prozent der zerstörten Cellulose)

52

53

54

49

49a

51

51a

5,29

5,36

5,34

5,28

5,24

5,26

5,25

1,62

1,41

1,75

2,12

1,73

2,69

3,08

30,62

26,35

51,14

58,67

0

32,77 42,2

0,01 Spuren 0,004

0

-

33,0

0,17

0,17

0,01

0,2

0,06

0,06

0,004

0,074

0,28

0,33

0,36

8,02 0,33

9,83 0,30

0,37 0,37

6,49 0,47

0,10

0,12

0,13

0,12

0,11

0,14

0,17

17,28

23,40

20,57

15,57

17,34

14,50

15,26

—

—

T a b e l l e 45 Einfluß der Begleitflora auf die Menge der gebildeten Zucker und Säuren in einer K u l t u r thermophiler Cellulosebakterien Zucker (Prozent) Versuchsnummer

vor der Beimpfung mit den Begleitorganismen

14 18 22 28 45 46

0,51 0,59 0,62 0,43 0,26 0,40

20*

flüchtige Säuren (Prozent)

fünf Tage nach der vor der Beimpfung f ü n f Tage nach der Beimpfung mit Beimpfung mit mit den Begleitden Begleitden Begleitorganismen organismen organismen 0,40 0,27 0,42 0 0 - 0

0,21 0,14 0,15 0,23 0,43 0,35

0,44 0,29 0,22 0,30 0,51 0,42

308

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

Aus den Angaben der Tabelle ist ersichtlich, daß durch die Entwicklung der Begleitbakterien das Auftreten reduzierender Substanzen verhindert und gleichzeitig die Menge an organischen Säuren erhöht wird. Wesentlich komplizierter liegen die Verhältnisse hinsichtlich der Alkoholbildung durch die Begleitbakterien. Man könnte vermuten, daß es unter den letzteren Mikroben auch Arten gibt, die eine Vergärung der Celluloseabbauprodukte zu Alkohol bewirken. Unter den vier, von IMSCHENEZKI hergestellten Kulturen wurde jedoch nicht eine einzige gefunden, bei deren Zusatz zu Reinkulturen der Cellulosebakterien eine Erhöhung der Alkoholausbeute zu beobachten war. Diese Feststellung schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, daß doch ein indirekter Einfluß auf die Alkoholbildung vorhanden ist. So wurden z. B. in Kulturen, die Bact. coli als Begleitform enthielten, stets größere Alkoholmengen gefunden. Anscheinend wirkt eine veränderte Zusammensetzung des Substrats, insbesondere dessen Anreicherung mit Zerfallsprodukten der Zellen des Darmbakteriums, wie sie bei einer Kultivierungstemperatur von 60° C an Stelle der normalen 37° C auftreten, in der Weise auf die Physiologie der thermophilen Cellulosebakterien ein, daß sie mehr Alkohol erzeugen. Wahrscheinlich spielt aber auch die von den Begleitbakterien hervorgerufene Senkung des Redoxpotentials dabei eine gewisse Rolle. Schließlich besteht immer noch die Möglichkeit, daß in der Natur Arten vorkommen, die zur alkoholischen Gärung auf Kosten der Celluloseabbauprodukte befähigt sind. Es ist bisher jedoch noch nicht gelungen, derartige Formen zu isolieren. Somit sind die in Mischkulturen beobachteten höheren Alkoholausbeuten auf zwei Ursachen zurückzuführen. Einmal kann die Entwicklung von alkoholerzeugenden Bakterien dafür verantwortlich sein, zum anderen muß man die Möglichkeit in Betracht ziehen, daß durch Veränderungen des Nährmediums die Cellulosebakterien zu einer stärkeren Alkoholbildung angeregt werden. Die Gärungsprodukte der Cellulose können aber auch von methanbildenden Bakterien verwertet werden, die häufig ebenfalls in Anreicherungskulturen vorhanden sind. Darauf beruht letzten Endes auch die Methanbildung in Anreicherungskulturen. Die vorstehend angeführten Tatsachen zeigen, daß die Begleitbakterien einerseits einer* günstigen Einfluß auf die Entwicklung der Cellulosebakterien ausüben, andererseits aber auch erhebliche Mengen an Gärungsprodukten als Nahrung für sich selbst verbrauchen. Die Zersetzung der Cellulose in der Natur muß deshalb auf jeden Fall als symbiotischer Prozeß aufgefaßt werden. 2. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit stickstoffbindenden Bakterien Symbiotische Beziehungen zu den Cellulosebakterien können die verschiedensten Mikrobengruppen aufweisen. Ein besonderes Interesse beanspruchen jedoch die Verhältnisse zwischen den Cellulosebakterien einerseits und den verschiedenen stickstoffbindenden Bakterien andererseits. Der Grund dafür liegt darin, daß die Cellulose oder ihre Zersetzungsprodukte die hauptsächlichsten Energiequellen für die verschiedenen im Boden vorhandenen Mikroorganismen, darunter auch der Stickstoffsammler, darstellt. Deshalb hat man sich schon sehr früh mit der Möglichkeit einer

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

309

Stickstoffixierung auf Kosten der durch die Cellulosezersetzung frei werdenden Energie beschäftigt. Für die Landwirtschaft ist dieses Problem von besonderer Bedeutung, weil, wie schon seit langem bekannt ist, durch das Einbringen von Cellulose in den Boden dessen Stickstoffgehalt schließlich zunimmt. Dies ist der Hauptgrund dafür, daß die Symbiose der Cellulosebakterien mit den stickstoffbindenden Organismen in der mikrobiologischen Literatur ziemlich eingehend bearbeitet Worden ist. a) B e m e r k u n g e n z u r M e t h o d i k Das Problem der Verwertung von Celluloseabbauprodukten durch die Stickstoffbakterien läßt sich nur mit Hilfe von Reinkulturen der einen wie der anderen JDrganismenkategorie lösen. Positive Ergebnisse sind in jedem Falle als Beweis zu. werten, da die im Laboratorium vorhandenen Bedingungen oft nicht den für die Stickstoffixierung erforderlichen entsprechen und negative Resultate somit meist nicht zwingend sind. Zieht man dagegen Mischkulturen zur Untersuchung heran, so können durch die Begleitbakterien sekundäre Produkte gebildet werden, die sowohl von den Cellulose- als auch von den Stickstoffbakterien verwertet werden. Dann ist aber durchaus die Möglichkeit gegeben, daß die Frage nach den Beziehungen der beiden Bakteriengruppen zueinander falsch beantwortet wird. Von großer Bedeutung für die experimentellen Arbeiten ist ferner auch die Reinheit der benutzten Cellulose. Filtrierpapier z. B. enthält häufig kohlenstoffhaltige Verunreinigungen, die den Stickstoffbakterien als Nahrungs- und Energiequelle dienen können. Man behandelt deshalb zweckmäßig das Papier mit einer gesättigten Calciumchloridlösung, der einige Tropfen Essigsäure zugesetzt werden. Nachdem das Papier in dieser Lösung gekocht worden ist, wird es mehrere Male mit destilliertem Wasser ausgewaschen. In einem Medium, das als einzige Kohlenstoffquelle derart behandeltes Papier enthält, entwickelt sich Azotobacter wesentlich schwächer als in einem Substrat mit unbehandeltem Papier. Wie jedoch aus den weiteren Ausführungen hervorgeht, ist auch die schwache Entwicklung des Bakteriums auf die nach der Behandlung immer noch verbliebenen Beimengungen des Papiers zurückzuführen. An Stelle des Filtrierpapiers haben IMSCHENEZKI und Mitarbeiter auch Cellophan benutzt. Selbstverständlich muß bei den Züchtungsversuchen die in den Kontrollansätzen (die keine Cellulosebakterien enthalten) zu Beginn und am Schluß des Experiments vorhandene Menge an Stickstoffbakterien berücksichtigt werden. Die am Ende des Versuchs in den Kontrollansätzen vorhandene Zellenanzahl ist jeweils von der Zahl der in den Versuchsansätzen vorhandenen Stickstoffbakterien abzuziehen. Ferner ist noch darauf hinzuweisen, daß die Cellulose selbst stets etwas Stickstoff enthält. So findet man z. B. in Rundfiltern von 5,5 cm Durchmesser bis zu 0,032 mg Stickstoff. Gewöhnliches Filtrierpapier enthält noch wesentlich mehr Stickstoff. Folglich muß auch hier der Stickstoffblindwert des Papiers bei der Auswertung der Versuche berücksichtigt werden. Gewöhnlich kultiviert man die Cellulose- und die Stickstoffbakterien zusammen in einem cellulosehaltigen Medium. Danach ermittelt man die Anzahl der Stickstoffbakterien durch Auszählen oder mittels der Ver-

310

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

dünnungsmethode. Bei einer derartigen gemeinsamen Kultivierung können die Stickstoffbakterien die Produkte der aeroben oder anaeroben Cellulosezersetzung unmittelbar nach ihrer Entstehung in der Kultur verwerten. Um die Eignung bereits gebildeter Zersetzungsprodukte als Energiequelle für die Stickstoffbakterien zu erforschen, setzt man verschieden alten Reinkulturen der Cellulosebakterien Kulturen der Stickstoffbakterien zu. In methodischer Hinsicht am schwersten ist die Bestimmung der stickstoff- und kohlenstoffhaltigen Verbindungen (außer der Cellulose) im Medium. Da sich die Cellulosebakterien in einem stickstofffreien Medium nicht entwickeln, muß man also eine geringe Menge an Stickstoffverbindungen zusetzen, wodurch eine Fixierung des freien Stickstoffs durch die Stickstoffbakterien stark eingeschränkt ist. Setzt man z. B. 1950 ml Nährmedium eine 12,5 mg Stickstoff entsprechende Menge Ammoniumchlorid zu, so werden noch 11,5 mg N2 durch Azotobacter aufgenommen. Bei Zusatz der doppelten Menge, entsprechend 25 mg N2, werden nur noch 4 mg freien Stickstoffs fixiert. Erhöht man den Zusatz nochmals um das Doppelte, d. h. auf 50 mg N 2 , so wird überhaupt kein freier Stickstoff mehr gebunden. In Kontrollversuchen, d. h. in einem stickstofffreien Medium, wurden 18 mg N 2 fixiert (TUORILA, 1928). Deshalb muß also zunächst stets vor dem eigentlichen Versuch diejenige Stickstoffmenge ermittelt werden, bei der eine Entwicklung der Cellulosebakterien möglich ist, ohne daß die Stickstoffbakterien in ihrer Tätigkeit behindert werden. Bisweilen wird behauptet, daß bezüglich der Kohlenstoffquelle ähnliche Verhältnisse herrschen. Die gleichzeitige Kultivierung der beiden Bakteriengruppen müßte demnach in einem Medium vorgenommen werden, das außer der Cellulose noch lösliche Kohlenhydrate wie Glucose, Mannit usw. enthält. E s wird ferner an einigen Stellen darauf hingewiesen, daß die Stickstoffbakterien nur dann intensiv wachsen und Stickstoff aufnehmen können, wenn sie zunächst die Möglichkeit erhalten, sich auf Kosten geringer Mengen löslicher Kohlenhydrate zu vermehren. Die zum Beweis dieser Auffassung angeführten Argumente sind jedoch wenig überzeugend. b) D i e Z e r s e t z u n g s p r o d u k t e der C e l l u l o s e a l s E n e r g i e q u e l l e f ü r die S t i c k s t off bakterien Bevor auf die Symbiose selbst zwischen den Stickstoff -und den Cellulosebakterien eingegangen wird, soll zunächst untersucht werden, welche Zersetzungsprodukte der Cellulose für die Stickstoffbakterien als Energiequelle in Betracht kommen. In der gesamten Literatur findet man keinerlei Hinweise auf eine mögliche Fähigkeit von Azotobacter, Cellulose selbst abzubauen. Auch bei Kultivierungsversuchen auf Rundfiltern, die einer Kieselsäuregelschicht auflagen und mit einem für Cellulosebakterien üblichen Medium getränkt waren, konnte in keinem Falle eine Entwicklung von Azotobacter beobachtet werden. In Kolben mit kegelförmig gefalteten Filtern oder mit Cellophanstückchen zeigte eine Reinkultur nur sehr geringes Wachstum; diese Erscheinung wurde weiter oben bereits besprochen. Ganz analoge Resultate sollen später erörtert werden. Offenbar enthalten sowohl das Fitrierpapier als auch das Cellophan Beimengungen, die von der Nährlösung aufgelöst werden und

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

311

so den Stickstoffbakterien eine, wenn auch nur geringfügige Entwicklung ermöglichen. Zur Prüfung der Frage, ob bei dem Wachstum einer ^zotoftocicr-Reinkultur in einem cellulosehaltigen Medium eine Stickstoffaufnahme erfolgt, wurden Stickstoffbestimmungen sowohl in einem nicht beimpften als auch in einem bakterienhaltigen Medium durchgeführt. Dabei fand man in einem Falle einen Stickstoffgehalt von 3,08 mg, der sich am Ende des Versuchs auf 3,20 und 3,82 mg erhöht hatte. Bei der Kultivierung der gleichen Reinkultur in einem mannithaltigen Medium wurde eine Stickstoffaufnahme von 5 bis 6 mg je Gramm Mannit festgestellt. Es kann deshalb als gesichert gelten, daß die Cellulose selbst nicht als Energiequelle für die Stickstofffixierung durch Azotobacter in Betracht kommt ( T Ü O R I L A , 1 9 2 8 ) . Anaerobe stickstoffbindende Bakterien greifen die Cellulose ebenfalls nicht an, wie von P R I N G S H E I M ( 1 9 0 9 ) bei der Untersuchung der Art Clostridium americanum gefunden wurde. IMSCHENEZKI hat auch bei den Buttersäurebakterien niemals die Fähigkeit zur Cellulosezersetzung festgestellt. Für die von einigen Forschern aufgestellte Hypothese, daß nämlich die Cellulosebakterien zwei Funktionen besitzen, Stickstoffaufnahme und Cellulosezersetzung, gibt es bisher noch keine glaubwürdigen Beweise. Sehr interessant ist das Verhalten von Azotobacter gegenüber den primären Produkten der enzymatischen Cellulosehydrolyse, den Cellodextrinen. Experimentelle Untersuchungen in dieser Richtung sind nicht bekannt. Aus theoretischen Erwägungen heraus dürfte jedoch anzunehmen sein, daß diese Produkte ebenfalls nicht angegriffen werden. Wesentlich schwerer ist die Frage nach dem Verhalten von Azotobacter gegenüber der beim bakteriellen Abbau der Cellulose gebildeten Cellobiose zu beantworten. Letztere entsteht in den Kulturen der Cellulosebakterien durch die Wirkung des Ferments Cellulase; theoretisch könnte die Cellobiose den Stickstoffbakterien als Energiequelle dienen. Von I M S C H E N E Z K I durchgeführte Versuche mit reinen Cellobiosepräparaten haben jedoch gezeigt, daß eine Entwicklung in Medien, die als ausschließliche Kohlenstoffquelle Cellobiose enthalten, nicht stattfindet. Auch Versuche zur Züchtung der Art Azotobacter chroococcum auf AsHBYschem Medium, das lediglich 0,5% Cellobiose enthält, führten zu keinem Erfolg. In den beiden Versuchsreihen wurde einmal das cellobiosehaltige Medium normal bei 110° C sterilisiert, zum anderen wurde die Cellobioselösung gesondert durch ein Bakterienfilter gesaugt, um eine mögliche Hydrolyse bei der Erhitzung zu vermeiden. Unabhängig von der Art des Sterilisierungsverfahrens war in keinem Falle eine Entwicklung der Bakterien zu beobachten. Ähnliche Resultate hat auch B U C K S T E E G ( 1 9 3 6 / 3 7 ) erhalten. Nach Feststellungen des Autors genügte es schon, entsprechende Fremdbakterien zuzusetzen, die zum hydrolytischen Abbau der Cellulose befähigt waren, um eine Entwicklung und Stickstoffaufnahme der Stickstoffbakterien zu erzielen. Dieser Umstand ist offenbar auf die dabei gebildete Glucose zurückzuführen. Mit dem Problem der Cellobioseverwertung durch Azotobacter befaßt sich auch eine spezielle Arbeit, die K O C H und S E Y D E L ( 1 9 1 2 ) durchführten. In einem Medium mit

312

III. D i e Verbreitung der Cellulosebakterien

2 % Cellobiose konnte sich eine Reinkultur von Azotobacter nicht entwickeln. Eine Mischkultur dagegen zeigte ein entsprechendes Wachstum, wobei je Gramm Cellobiose 10,7 mg Stickstoff aufgenommen wurden. Möglicherweise ist dies eine Erklärung für die Beobachtung, daß in Mischkulturen von Stickstoff- und Cellulosebakterien mitunter eine Fixierung des Stickstoffs stattfindet, die im Falle von Reinkulturen jedoch niemals festgestellt wurde. I n der Literatur finden sich auch noch andersartige Hinweise. So führt z. B. GEORGE unter den von Azotobacter verwertbaren Kohlenhydraten Cellobiose an. Auch RlPPEL (1927/33) beobachtete eine ähnliche Erscheinung. Die positiven Ergebnisse in diesen Fällen beruhen wahrscheinlich darauf, daß bei der Sterilisation des Mediums eine partielle Hydrolyse der Cellobiose stattgefunden hat und die dabei entstandene Glucose den Bakterien als Energiequelle zur Verfügung stand. Schließlich besteht aber auch die Möglichkeit, daß die verschiedenen Azotobacter- Stämme ein unterschiedliches Verhalten gegenüber der Cellobiose aufweisen. IMSCHENEZKI konnte jedoch bei den verschiedensten Stämmen keinen Abbau der Cellobiose beobachten. Vorstehende Ausführungen lassen es als ganz natürlich erscheinen, daß die durch die Tätigkeit der Cellobiase gebildete Glucose von den Stickstoffbakterien leicht verwertet wird. Je aktiver demnach die Cellobiase der Cellulosebakterien ist und je schneller infolgedessen die Hydrolyse der Cellobiose zu Glucose erfolgt, desto rascher werden auch geeignete Bedingungen für die Entwicklung der aeroben Stickstoffbakterien geschaffen. Bei der aeroben Cellulosezersetzung durch die am häufigsten vorkommenden Myxobakterien und Vibrionen findet im allgemeinen keine Bildung von Alkohol und organischen Säuren statt. Einige Cellulosebakterien jedoch, wahrscheinlich handelt es sich hier um fakultativ anaerobe Formen, erzeugen sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Säuren. So konnte z. B. JENSEN bei der Cellulosezersetzung durch Corynebakterien die Entstehung von Ameisen-, Essig- und Milchsäure nächweisen. Nach JENSEN müssen daneben jedoch noch andere, nicht näher identifizierte kohlenstoffhaltige Zersetzungsprodukte vorhanden sein, die von den Stickstoffbakterien ausgenutzt werden. Beim anaeroben Abbau der Cellulose bilden sich dagegen stets verschiedene Säuren und lösliche Kohlenhydrate. I » zahlreichen Arbeiten über das ernährungsphysiologische Verhalten von Azotobacter sowie auch in den Arbeiten WlNOGRADSKls war festgestellt worden, daß diese Gattung zu den „polyphagen" Formen zählt, die leicht die verschiedenartigsten organischen Verbindungen verwerten. Es überrascht deshalb nicht, daß sowohl der in Kulturen anaerober Cellulosebakterien entstehende Alkohol als auch die verschiedenen organischen Säuren für die Stickstoffbakterien eine ausgezeichnete Energiequelle darstellen. Als Energiespender für die aerober. Stickstoffbakterien kommen die Hydrolysenprodukte der Cellulose und die verschiedensten in den Kulturen der Cellulosebakterien gebildeten Gärungsprodukte in Betracht. Besondere Beachtung verdient in diesem Zusammenhang auch der sich in den Kulturen aerober Cellulosebakterien anhäufende Schleim. A n anderer Stelle (S.159ff.)

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

313

wurde bereits darüber berichtet, daß es sich dabei um kein Umwandlungsprodukt der Cellulose handelt, sondern um einen von den Cellulosebakterien synthetisch aufgebauten Stoff. In zahlreichen Versuchen konnte von IMSCHENEZKI der Nachweis erbracht werden, daß auf diesem Schleim keine Entwicklung der Stickstoffbakterien stattfindet, daß er von den letzteren demzufolge auch nicht als Kohlenstoffquelle ausgenutzt werden kann. Das gleiche gilt auch für die aus den Zellen der Cellulosebakterien entstehenden Zerfallsprodukte. c) Die g l e i c h z e i t i g e K u l t i v i e r u n g v o n Cellulose- u n d Stickstoffbakterien a) Untersuchungen mit aeroben Cellulosebakterien aa) Die Vermehrung der Stickstoffbakterien Bei der Untersuchung symbiotischer Kulturen war die besondere Aufmerksamkeit stets vornehmlich auf die Fixierung des Stickstoffs gerichtet; deshalb gibt es nur sehr wenige Untersuchungen über die Vermehrung der Stickstoffbakterien. Neben anderen hat KALNINS Versuche zur gleichzeitigen Kultivierung von Cellulose- und Stickstoffbakterien durchgeführt. Es muß als glücklicher Umstand angesehen werden, daß er gerade diejenigen Cellulosebakterien auswählte, bei deren Entwicklung ausreichende Mengen an Hydrolysenprodukten der Cellulose entstehen. Im Reagenzglas mit flüssigem Medium wuchs Azotobacter unter diesen Bedingungen ausgezeichnet und bildete ein Häutchen und einen Ring. Eine Entwicklung konnte jedoch nur dann beobachtet werden, wenn das Medium Nitrate, Ammoniumsulfat oder Pepton enthielt. Ohne diese Zusätze erfolgte weder eine Zersetzung der Cellulose noch eine Vermehrung der Stickstoffbakterien. Ganz andere Resultate erhielt BUCKSTEEG (1936/37), der mit Reinkulturen von Sporocytophaga myxococcoides (Gytophaga globulosa) und einer Azotobacter-Art arbeitete. Der Autor benutzte für seine Versuche stickstofffreie mineralische Nährmedien mit Cellulose. Wie zu erwarten war, entwickelten sich auf diesem Substrat weder die Cellulosebakterien noch die Stickstoffbakterien. Nach Zusatz von 0,01, 0,05 bzw. 0,1% Glucose erfolgte ein entsprechendes Wachstum. Die Stickstoffaufnahme stieg dabei proportional der zugesetzten Glucosemenge an. In einer weiteren Versuchsreihe wurde an Stelle der Glucose 0,02% Natriumnitrat zur Nährlösung zugesetzt. Nach vier Wochen konnte eine schwache Entwicklung der Cellulosebakterien nachgewiesen werden, während die Stickstoffbakterien überhaupt nicht wuchsen; der Stickstoffgehalt war sowohl im Versuch als auch im Kontrollansatz der gleiche geblieben. Ein gleichzeitiger Zusatz geringer Mengen an Glucose und Nitrat bewirkte zwar eine schwache Entwicklung beider Bakterienarten, führte jedoch zu keiner Fixierung des Stickstoffs. Schließlich setzte der Autor noch folgende Versuchsreihen an. Im Medium enthaltene Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen: 1. 1% Glucose, 2. 1% Glucose und 2% Cellulose, 3. 2% Cellulose und 0,2% Natriumnitrat, 4.0,1% Glucose und 0,02% Natriumnitrat, 5. 0,1% Glucose, 0,02% Natriumnitrat und 2% Cellulose. In den beiden letzten Versuchsreihen wurde das Nährsubstrat gleichzeitig mit Reinkulturen

314

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien

von Sporocytophaga und Azotobacter geimpft. Nach Beendigung der Versuche wurden quantitative Bestimmungen der Zucker, des Natriumnitrats und des Stickstoffs durchgeführt. In allen Fällen konnte BUCKSTEEG keine Vermehrung der Stickstoffbakterien und auch keine Stickstoffixierung beobachten. Er sprach deshalb die Vermutung aus, daß die fehlende Entwicklung der Stickstoffbakterien möglicherweise mit einer antagonistischen Wirkung der Cellulosebakterien zusammenhängt. Deshalb versuchte er auch, eine bereits in voller Entwicklung befindliche Reinkultur von Cellulosebakterien durch Sterilisation abzutöten und diese Kultur danach erst mit Stickstoffbakterien zu beimpfen. Aber auch in diesem Falle entwickelten sich die letzteren nicht. Folglich besitzen also die Cellulosebakterien auch keinen antagonistischen Einfluß auf das Wachstum der Stickstoffbakterien; diesen fehlten einfach die entsprechenden Energiequellen in der Kultur. IMSCHENEZKI benutzte zu seinen Versuchen folgende Methodik: Rundfilter wurden auf Kieselsäuregel in Petrischalen ausgelegt, mit HüTCHlNSONscher Nährlösung befeuchtet und teils gemeinsam mit Reinkulturen von Sporocytophaga myxococcoides und Azotobacter chroococcum, teils getrennt mit der einen oder anderen Bakterienart beimpft. Die Kultivierungstemperatur betrug 25° C. Zur quantitativen Bestimmung der Stickstoffbakterien wurde das Papier von dem Gel abgehoben und sorgfältig in einer Reibeschale mit Wasser verrieben. Die gleichen Versuche führte IMSCHENEZKI noch in Kolben mit kegelförmig gefalteten Filtern durch. Auf der Papieroberfläche erschienen fünf bis sechs Tage nach der Beimpfung gelbe, sich rasch vergrößernde Flecken, die allmählich die gesamte Papieroberfläche bedeckten. Bereits nach einer 48stündigen Kultivierungsdauer ließ sich mikroskopisch die Entwicklung von Azotobacter chroococcum nachweisen. Besonders intensiv findet sie an den Stellen statt, an denen die Cellulosefasern am stärksten angegriffen sind. Die Zersetzung der Cellulose erfolgt stufenweise. Die Stickstoffbakterien sammeln sich dort an, wo die Zerstörung der Cellulose zuvor begonnen hat (Abb. 93). Je weiter die Zerstörung fortschreitet, desto mehr Zellen der Stickstoffbakterien befinden sich in der Umgebung der zerstörten Cellulosebereiche (Abb. 94). Aus dem Verhalten der Stickstoffbakterien und aus dem reichlichen Vorhandensein in Teilung begriffener Zellen kann man schließen, daß in dem vorliegenden Falle für die Vermehrung der stickstoffbindenden Mikroben günstige Verhältnisse herrschen. In Symbiose mit den Cellulosebakterien treten die gleichen feinen Strukturmerkmale auf, wie in Reinkulturen bei Gegenwart von Mannit oder Glucose. Häufig sieht man im Mikroskop Bereiche mit vielen sich teilenden Zellen (Abb. 95). Aber auch mit bloßem Auge kann man sich von der Vermehrung der Stickstoffbakterien überzeugen. Bei fortgeschrittener Zerstörung des Papiers sieht man bisweilen auf der Oberfläche der glänzenden gelben Flecken die typischen runden, etwa 1 mm großen durchsichtigen Kolonien der Azotobacter-Art. Sehr bequem läßt sich auch die gleichzeitige Entwicklung der beiden Organismen auf der Oberfläche von Cellophanstückchen verfolgen, die mit einem für Cellulosebakterien gebräuchlichen Medium befeuchtet sind. Während des Wachstums der Sporocytophaga-Zellen bilden sich auf der Oberfläche Vertiefungen, in denen sich rasch auch die Stickstoffbäkterien vermehren. Infolge Anhäufung der Bakterien-

T a f e l 30

Abb. 93. Zellen der Gattung Azotobacter in der Umgebung von Cellulosefasern, die durch Sporocytophaga teilweise zerstört wurden

Abb. 94. Ansammlung von Azotobacter-Zellen in der Nähe zerstörter Cellulosefasern

T a f e l 31

Abb. 95. Die Vermehrung von Azotobacter chroococcum in Symbiose mit 8p. myxococcoides

E. Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

315

Zellen beider Gruppen verschleimt bald die gesamte Cellophanoberfläche. Unter dem Mikroskop sind danach sowohl die großen Zellen der Azotobacter-Art als auch die kleineren kugelförmigen Mikrocysten der Gattung Sporocytophaga zu erkennen, die aus den vegetativen Zellen entstanden sind (Abb. 96).

Abb. 96. Mikrocysten von 8p. myxococcoides und kugelförmige Zellen von Az. chroococcum in einer zehn Tage alten Mischkultur auf Cellophan Die Auszählung der vorhandenen Stickstoffbakterienzellen wurde an den in Kolben gezüchteten Mischkulturen vorgenommen. Dabei führte man die Bestimmung in einigen Kolben bereits am 6. Kulturtage, in anderen dagegen erst am 15. Kulturtage durch (Tab. 46). Am 6. Tage wurden in 1 ml Kulturflüssigkeit 13,5 Millionen Azotobacter-Zellen. gezählt. Bei weiterer intensiver Vermehrung waren es am 15. Tage bereits 30 Millionen Zellen. Da aber der Celluloseabbau in den JParallelversuchen nicht immer mit der

316

I I I . Die Verbreitung der Cellulosebakterien

gleichen Geschwindigkeit verläuft, schwankt auch die Anzahl der Stickstoffbakterien in ziemlich weiten Grenzen. Schließlich wurden die Stickstoffbakterien in den Mischkulturen ausgezählt, die auf Cellophan oder Filtrierpapier in Kolben gewachsen waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 47 zusammengestellt. T a b e l l e 46 Anzahl der Azotobacter chroococcum-ZeWen in Mischkulturen mit Sp. myxococcoides Auszählung)

(direkte

Versuchsnummer

Versuchsdauer Tage

Zellen in 1 ml Medium

Versuchsnummer

Versuchsdauer Tage

Zellen in 1 ml Medium

1 2 3 4

6 6 6 6

4999750 35569650 8285300 5428300

5 6 7 8 9

15 15 15 15 15

9142400 32712650 10285200 15284900 83567250

. . . .

13570750

Mittelwert

Mittelwert

30198480

. . . .

T a b e l l e 47 Die Vermehrung der Az. chroococcum-Zieften in Symbiose mit Sp.

myxococcoides

Anzahl der Stickstoffbakterien in 1 ml Nährmedium (in Millionen) Substrat: Cellophan Versuchsnummer

8 Tage alte Kultur

16 Tage alte Kultur Versuch

Kontrolle

21 21 22 22 24

147,5 570,0 92,5 505,0 349,5

295,0 1460,0 48,5 180,0 908,0 83,0 31,4 1362,0 186,0 34,0 296,5 197,5 80,5 194,0 89,0

Mittelwert

332,9

124,2

844,1

Versuchsnummer

Kontrolle

Versuch

1

Substrat : Filtrierpapier

120,8

17 17 18 18 20 20 Mittelwert

8 Tage alte Kultur

16 Tage alte Kultur

Versuch

Kontrolle

Versuch

Kontrolle

I I 173,5 116,0 X 470,0

I i 17,0 37,0 55,0 51,0

106,0 266,0 502,5

89,0 347,0 303,0

936,0

130,0

253,2

36,3

452,6

217,3

Infolge der zu großen Menge an Impfmaterial konnte keine Auszählung mehr vorgenommen werden.

Zusammenfassend läßt sich folgendes sagen: 1. In Symbiose mit Cellulosebakterien gedeihen die Stickstoffbakterien ausgezeichnet. Ihre Menge übertrifft die Bakterienanzahl in den Blindversuchen um das Siebenfache. 2. Die Stickstoffbakterien entwickeln sich auf Cellophan besser als auf Filtrierpapier.

T a f e l 32

Abb. 97 a. Mischkultur von 8p. myxococcoides und^lz. chroococcum aufASHBYschem Medium

Abb. 97 b. Reinkultur von Az. chroococcum auf dem gleichen Medium

Abb. 98 a. Mischkultur von 8p. myxococcoides und Az. chroococcum

Abb. 98 b. Reinkultur von Az. chroococcum

E . Die Symbiose der Cellulosebakterien mit anderen Organismen

317

3. In den Kontrollansätzen, die keine Cellulosebakterien enthalten, findet stets eine schwache Entwicklung der Stickstoffbakterien statt, die wahrscheinlich auf die im Papier vorhandenen Beimengungen zurückzuführen ist. Impft man in Petrischalen befindliches ASHBYsches Medium mit gleichen Mengen der Versuchs- und Kontrollansätze, so erhält man eine deutlich unterschiedene Entwicklung. Diese ist in den Abbildungen 97 und 98 wiedergegeben, die das Wachstum der Stickstoffbakterien in Symbiose mit Cellulosebakterien ausgezeichnet illustrieren. Wie lassen sich nun die negativen Resultate BuCKSTEEGs erklären? Man kann erstens annehmen, daß der von ihm verwendete Sp. myxococcoides-St&m.m kaum Cellobiase erzeugte. Deshalb enthielt die Kultur auch keine Glucose und die Stickstoffbakterien waren nicht in der Lage, sich zu vermehren. Voraussetzung für die Stichhaltigkeit dieser Erklärung ist die Annahme, daß Cellobiose von den Stickstoffbakterien nicht verwertet wird. Zweitens besteht die Möglichkeit, daß der Autor dem Medium zu geringe Mengen an Stickstoffverbindungen zugesetzt hat, so daß die Cellulosebakterien sich nicht genügend intensiv entwickeln konnten. Den Stickstoffbakterien standen folglich auch nur unzulängliche Energiequellen (Celluloseabbauprodukte) zur Verfügung. Tatsächlich ist der Unterschied des Stickstoffgehalts der Nährlösungen zwischen seinen Versuchen und denen iMSCHENEZKls sehr erheblich. Während BUCKSTEEG ein Medium mit 0,02% Natriumnitrat verwendete, hatte IMSCHENEZKI dem Nährsubstrat die zehnfache Nitratmenge zugesetzt. Den Einfluß verschiedener Stickstoffmengen auf die Entwicklung von Mischkulturen der Cellulose- und Stickstoffbakterien hat STUZER (1945) untersucht. Für die Versuche wurde als Celluloseorganismus Vibrio (Cellvibrio) vulgaris benutzt, der für diese Zwecke sehr brauchbar ist, weil sich in seinen Kulturen die Hydrolysenprödukte der Cellulose relativ leicht ansammeln. Die verwendeten Nährmedien, die Phosphate, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Calciumcarbonat enthielten, unterschieden sich voneinander lediglich durch ihre Gehalte an Nitrat und Saccharose. Die näheren Angaben über die Zusammensetzung des jeweiligen Mediums und über die erhaltenen Ergebnisse sind der Tabelle 48 zu entnehmen. Im ersten und zweiten Medium fand infolge der Anwesenheit von Saccharose zunächst eine Vermehrung der Stickstoffbakterien statt. Erst später begann die Zersetzung der Cellulose, wobei ihre Abbauprodukte den Stickstoffbakterien als zusätzliche Kohlenstoffquelle dienten. Die Anzahl der stickstoffbindenden Mikroben erhöhte sich also im Laufe der Zeit ständig. Im dritten Medium, das keinen Stickstoff, wohl aber Saccharose enthielt, fand innerhalb von zwei Monaten keine Zersetzung der Cellulose statt. Erst nachdem der gesamte Zucker von den Stickstoffbakterien verbraucht war, begann ein Abbau des Papiers und eine erneute Vermehrung der Stickstoffbakterien. Im vierten Medium, das sowohl Stickstoff als auch Zucker enthielt, setzte sofort nach der Beimpfung auch eine Zersetzung der Cellulose ein. Die Entwicklung der Stickstoffbakterien erfolgte dabei auf Kosten des zugesetzten Zuckers und der entstandenen Celluloseabbauprodukte.

318

III. Die Verbreitung der Cellulosebakterien «5 eo

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4,4 0,4 7,2 68,6 85,2 92,9

45,8 40,9 40,9 7,1 7,6 7,1

8,8 18,6 18,6 84,6 96,6 84,6

T a b e l l e 63 Die Zerstörung von Baumwollgespinsten durch Mischkulturen thermophiler Cellulosebakterien (Versuchsdauer 96 Stunden) Versuchsnummer 1 2 3 4 5 6

Festigkeit (g)

Behandlung der Probe konserviert nicht konserviert. . . »

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vor dem Versuch

nach dem Versuch

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3703 3970 3992 1190 172 153

Festigkeitsverlust in Prozent 2,5 2,7 2,1 72,3 96,0 96,5

T a f e l 38

Abb. 119. Rechts: Die Zerstörung eines Gewebes durch thermophile Cellulosebakterien innerhalb von drei Tagen. Links: Aussehen des Gewebes vor dem Versuch

Abb. 120. Mit Kupfernaphthenat getränktes Papier bleibt unangegriffen, während sich auf unbehandeltem Papier Pilze ansiedeln

D. Die Methoden zur Konservierung von Celluloeematerialien

407

Nach Ablauf der entsprechenden Versuchsdauer wird das Material herausgenommen, gewaschen und auf seine Restfestigkeit hin geprüft. Wie aus den Angaben der Tabelle 62 hervorgeht, kann man mit Hilfe dieses Verfahrens ausgezeichnet übereinstimmende Resultate erhalten. In der Praxis ist es jedoch bequemer, von vornherein mit einer Anreicherungskultur thermophiler Cellulosebakterien zu arbeiten, weil man in diesem Falle nicht erst eine Impfung mit Fremdbakterien vorzunehmen braucht. Das Potential des Mediums wird durch die sich gut entwickelnden Begleitbakterien schon ausreichend gesenkt. Die Verwendung von Anreicherungskulturen stellt also eine Vereinfachung des Arbeitsganges dar. Auch kann in diesem Falle der Versuch sofort bei 60° C durchgeführt werden. Damit das Untersuchungsmaterial nicht auf der Oberfläche der Flüssigkeit schwimmt, wird es zweckmäßig mit Glasstopfen beschwert. Mit Hilfe dieses Verfahrens können natürlich auch konservierte Proben untersucht werden. Die Güte des jeweiligen Konservierungsmittels läßt sich an Hand der anschließend durchgeführten Festigkeitsuntersuchungen beurteilen. Um eine wirksamere Kontrolle zu ermöglichen, empfiehlt es sich, das Material zuvor einige Tage in fließendem Wasser aufzubewahren. Dabei wird das Konservierungsmittel mehr oder weniger ausgewaschen. Wenn der konservierte Stoff nach dieser Behandlung von den Bakterien immer noch nicht angegriffen wird, so ist anzunehmen, daß er unter feuchten Bedingungen ebenfalls beständig bleibt. Wie aus der Tabelle 63 hervorgeht, lassen sich derartige Versuche sowohl mit Änreicherungskulturen als auch mit Reinkulturen durchführen; die erforderlichen Kultivierungszeiten sind in beiden Fällen die gleichen. Die vorgeschlagene Methode ist auch für die Untersuchung der Wirksamkeit von Konservierungsmitteln geeignet, die in der Kabelindustrie für Isoliermaterialien Verwendung finden. Besonders be' quem ist sie für orientierende Versuche bei der Auswahl eines Konservierungsmittels. Zur endgültigen Beurteilung müssen selbstverständlich noch Versuche unter natürlichen Bedingungen durchgeführt werden. D. Die Methoden zur Konservierung von Cellulosematerialien Unmittelbar nach dem Auftreten der Bastfasern als Gebrauchsmaterial entstand auch schon die Notwendigkeit, ihre Haltbarkeit zu verlängern. Bereits in uralten Zeiten haben die Fischer ihre Netze mit verschiedenen Stoffen imprägniert, um sie haltbarer zu machen. Man kannte auch schon verschiedene Verfahren, die im wesentlichen auf der Verwendung von Harzen, Teer usw. beruhten. Heute stellt die Konservierung von Cellulosematerialien einen besonderen Zweig der chemischen Technologie dar. Es ist unmöglich, an dieser Stelle alle Konservierungsmittel aufzuzählen; auch sollen hier nicht die Voraussetzungen zu ihrer Herstellung behandelt werden. Die Konservierungsmittel müssen den verschiedensten Anforderungen genügen. Einige Eigenschaften müssen jedoch bei allen Mitteln in gleichem Maße vorhanden sein, unabhängig vom Orte ihres Einsatzes. Sie müssen z. B . alle nicht nur baktericid, sondern auch fungicid wirksam sein. Ferner dürfen sie weder die Cellulose angreifen noch die Biegsamkeit und Elastizität des

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schwaches Wachstum kein Wachstum

Lebensdauer der Cellulosematerialien läßt sich mit Hilfe von Konservierungsmitteln jedenfalls beträchtlich, erhöhen. In der Abbildung 121 sind zwei Netzproben wiedergegeben, die der Einwirkung aerober Cellulosebakterien ausgesetzt waren. Während die linke, unbehandelte Probe zerstört wurde, blieb das rechte, mit einem Antiseptikum behandelte Netz unangegriffen (RAWITSCH-STSCHERBO und IWANOWA, 1938). Materialien, die der Einwirkung von Wasser ausgesetzt sind, werden häufig auch in der Weise konserviert, daß man auf den Fasern unlösliche Kupferkomplexe ausfällt. Dies läßt sich auf verschiedenen Wegen erreichen. Man behandelt z. B. das Material zunächst mit einer Lösung von Kupfersalzen und taucht es anschließend in eine Tanninlösung. Dadurch scheidet sich unlösliches Kupfertannat auf der Faser ab. Häufig werden auch andere organische Kupferverbindungen verwendet, z. B. CuNaphthenat, Cu-Oleat usw. Auch gemahlenes Kupferoxyd, das man entsprechend auf die Faser aufträgt, soll ebenfalls eine stark baktericide Wirkung besitzen. Nach IMSCHENEZKI wirken die oft zur Konservierung benutzten Produkte aus den Rückständen der Erdöldestillation (GOUDRON) überhaupt nicht auf die Bakterien ein, während Steinkohlenteer sich in dieser Beziehung ausgezeichnet verhält. Angaben hierüber finden sich in der Tabelle 66. Um die Wirksamkeit der verschiedenen Konservierungsverfahren zu beurteilen, benutzt man die im vorigen Abschnitt beschriebenen Untersuchungsmethoden.

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D. Die Methoden zur Konservierung von Cellulosematerialien

LITERATURVERZEICHNIS I m Original sind zwei Literaturverzeichnisse vorhanden. Das eine enthält Arbeiten russischer Autoren, die teils in russischen Zeitschriften mit kyrillischen Schriftzeichen, teils in nichtrussischen Zeitschriften mit nichtkyrillischen Schriftzeichen erschienen sind. Folglich sind auch die Namen der Autoren in den Originalarbeiten teils mit kyrillischen, teils mit nichtkyrillischeh Zeichen geschrieben. IMSCHENEZKI hat nun aber die Namen aller russischen Autoren mit kyrillischen Zeichen geschrieben, unabhängig davon, ob in den Originalarbelten ebenso verfahren wurde. Dies f ü h r t zu Schwierigkeiten bei der Transkription. Beispielsweise wird der Name UeHKOBCKHÖmit Zenkowski transkribiert, während in der Originalarbeit Gienkowski steht, oder TopoBim = Gorowiz, im Original aber Horowitz. Da wir nun der Meinung sind, daß der über der Originalarbeit stehende Name nicht verändert werden darf, haben wir diesen jeweils an die erste Stelle gesetzt; dahinter folgt in Klammern der von IMSCHENEZKI angegebene Name in kyrillischen Zeichen und dessen Transkribierung. Das zweite Verzeichnis des Originals enthält in üblicher Weise die Arbeiten der nichtrussischen Autoren in lateinischen Schriftzeichen. Beide Verzeichnisse würden in der Übersetzung zu einem Literaturverzeichnis zusammengezogen. Transkribiert wurde nach STEINITZ in „Der große Duden", VEB Bibliographisches Institut, Leipzig 1957, mit einigen Abweichungen: statt seht haben wir st gesetzt (z. B. bei IÜTypM = Sturm, I l i r y i i e p = Stuzer), statt ch steht h (z. B. bei IIlTeftHxays = Steinhaus). Die Zeitschriftentitel wurden nach „Periodica Chimica", Verzeichnis der im Chemischen Zentralblatt referierten Zeitschriften mit den entsprechenden genormten Titelabkürzungen, Akademie-Verlag Berlin und Verlag Chemie GmbH. Weinheim-Bergstraße, 1952, abgekürzt. Die Abkürzungen von Zeitschriftentiteln, die in dieser Sammlung nicht enthalten sind, wurden analog nach den üblichen Hegeln gebildet, wobei die Eindeutigkeit und Verständlichkeit vor der Kürze rangieren. Die Zeitschriftentitel russischer Arbeiten in kyrillischen Zeichen werden zwecks Vermeidung von Verwechslungen in ungekürzter Form gebracht. Einige der im Literaturverzeichnis aufgeführten Arbeiten sind im Text des Originals nicht ausdrücklich erwähnt (mit Namen und Jahreszahl), obwohl sie in dem Werk offensichtlich verarbeitet wurden; jedoch ist die nachträgliche Zuordnung der betreffenden Arbelten zu den Textstellen sehr schwierig und nicht eindeutig, deshalb wurde darauf verzichtet. Andererseits sind aber auch diese Arbeiten so wertvoll und wichtig, daß sie im Literaturverzeichnis beibehalten wurden; sie sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Im übrigen wurden bis auf wenige Ausnahmen(Unzugänglichkeit der betreffenden Zeitschrift) alle Zeitschriftenangaben auf Vollständigkeit und nichtigkeit überprüft bzw. ergänzt oder berichtigt. Der Herausgeber

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AUTORENREGISTER Namen, denen keine Seitenzahl folgt, sind Im Text des Originals und somit auch im Text der Übersetzung nicht erwähnt; sie erscheinen nur im Literaturverzeichnis.

Afferni, E. Aleschina, W. 294f. Alexandre)wa, I. Alexejew, W. 233 Ankeramit, P. 365 Arakawa, 8. 85 Arnaudi, Ch. Aschner, M. Bachman, N. Baker, F. 239f., 364, 376 Balows, A. Barker, H. A. 235, 394 Barsha, J . Bartholomew, W. V. Bavendamm, W. 286 Beckwith, T. D. 354 Beebe, J . M. Beijerinck, M. W. Beljajewa, M. 394 Bender, R. Bentley, O. 365 Bergey 49, 65, 82 f., 86 Bierry, H. 350 Billard, G. Birjusowa, W. 283 Blaxall, F. R. Bojanowsky, R. 20, 131 Bojarskaja, B. 196ff., 293 Bokor, R. 29, 103, 115 Bortels, H. 19, 58, 61, 83, 91 ff., 113,118,125, 136, 140, 268, Tabellen 1, 7, 9, 10 Boswell, J . G. 149 Boynton, L. C. 349 Bradley, L. A. 81, 84ff., 140 Brozkaja, S. 18, 215, 265, 294 Buchner, P. 350, 352 Bucksteeg, W. 311, 313f., 317, 324f. Bunker, H. J . 95 Bykowa, N. 386f., 389f. Campbell, W. G. 351 Carey, C. 19 f., 283, 288

Carpenter, P. Chait, S.. Chalmers, C. H. 125,133 Charpentier, C. A. G. 81 Chartulari, Je. 290 Choukévitch, J . 376 Christensen, H. R. 270, 275, 295 Christensen, L. M. 384f., 388 Cienkowski, L. 345 Clausen,P. 168, 170, 212, 219,221ff.,226ff., 230, 234, 236, 247,248,251 ff., 256, 264,296 Clayton, J . 19, 29, 45f., 50, 54,112,133,157, 321, Tabellen 1, 7, 9 , 1 0 Cleveland, L. R. 346f., 354 Cohn, R. Coolhaas, C. Cordon, T. C. Cowles, Ph. B. 219f., 223f., 226, 228, 234, 236, 245, 252, 296 Curtis, R. E. Czerwinska, E. 401 Dabin, B. 281 van Delden, A. Dementjew, K. 275 Dianowa, K. 298 Dickman, A. 355 Distaso, A. Dogel, W. 348, 361 f., 374 Dore, W. 349 Dubos, R. J . 83, 92, 113, 273f., Tab. 9 Enebo, L. 164, 201 f., 208 Epstein, A. Evans, R. E. 371 Fâhraeus, G. 7, 33, 113, 117f., 139,144, 153, 156 f., 160 f. Falck, R. 351 Fedorow, M. 335 Feher, D. 266, 279 Felsz-Karnicka, H.

444

Autorenregister

Flehmig, T. Forsyth, W. G. C. 161 Fred, E. B. 164, 170, 175, 216, 248 Fuller, J . E. Fuller, W. H. 55, 83f., 94ff., 121, 126, 128, Tab. 9 Fulmer, E. L. 384f., 388 Gall, L. S. 366 f. Gaughran, E. R. 191 von Geseher, N. Gilligan, W. 15 Ginsburg-Karagitschewa, T. 292 Goeters, W. 296f. Goicherman, D. 286 f., 289 f., 292, 294 Goldin, M. 294f. Gopal, Chandra Das-Gupta Gorbunow, K. 106, 138, 266, 284f.,287, 290 Goresline, H. E. 123 Gorjunowa, S. Gorowiz, L. Gosmann, W. 378 Gran, H. H. 123 Grassmann, W. Gray, P. H. H. 101, 125, 133, Tab. 9 Gray, W. 155 Greathouse, G- A. 17 Groenewege, J . 145 Gutgisser, A. H. Haberlandt, G. 364 Hamilton, W. B. 331 Hansen, P. A. 192 Harington, Ch. R. 349 Harmsen, G. W. 7, 31, 83, 94fl., 101 ff., 108, 120, 122, 132, 136£f., 270, 274 Harris, M. 17 Hastings, E. 374 Henneberg, W. 239 f., 364, 367, 377 f. Hess, K. 10 Hestrin, S. 17 Heukelekian, H. Heukelekian, O. 274 Hibbert, EL Higby, W. M. 248 Hirschberg, N. 378 f. von Hösslin, H. 375 Hofmeister 360 Hollande, A.-Ch. Hoppe-Seyler, F. 218, 233 Horowitz-Wlassowa, L. M. 83, 94 van Hove, Y. K. 30 Hulpoi, N. Humfeld, H.

Hungate, R. E. 104, 138, 159, 218 f., 221, 224, 228, 230,232f.,237,240ff.,250ff.,256, 259f., 263f., 366f., 372, 377 Hunt, C. 365 Hutohings, I. J . Hutchinson, H. B. 19, 21, 23, 26,29,45f., 50, 54, 65, 69, 73,76,88,91,112,116,133,144, 153, 157, 270, 314, 321, 340, Tabellen, 1, 7, 9, 10 Illing, H. 348 Imschenezki, A.A. 7,14f.,15, 20, 22, 29, 31, 39, 41, 45f„ 50,53,55, 58f.,62, 65, 68f.,83, 91 ff., 95,103,109,113.115,127 f., 130,133, 135 f., 140 ff., 151, 153f., 158, 160, 164ff„ 168ff, 174, 178ff, 189ff, 194, 199, 201 ff, 207ff.,211 f., 216f., 222 f., 225f., 234 f., 237, 239ff.,248, 251, 254f.,258, 264, 266ff,270, 281, 283, 287, 294, 296, 299f., 304,307ff., 311 ff., 317, 319, 326f., 330, 332, 336, 340, 367f., 372, 378f., 381 ff., 391, 393, 396ff., 402, 405, 409f, Tabellen 1, 7, 9, 10. Imsenecki s. Imschenezki Isotalo, A. Isimaru, K. 191, 382 Issatschenko, B. 7, 266, 289 Itano, A. 85 van Iterson, C. 145 Iwanowski, D. I. 218 Iwanowa, S. 398f., 410 Jahn, E. 50, 55, 65 Jarygina, N. 238 Jegorowa, A. 168 Jegunow, M. Jelkina, O. 280 Jennison, M. W. Jensen, H. L. 83, 85f., 92, 94, 97f., lOlff., 113, 121, 133, 138, 144, 158f.,266, 273, 281, 312, 322ff., 331, 338, Tabellen 7, 9 Jerussalimski, N. 238, 247 Johnson, R. 365 Jones, L. H. Jonge, C. M. Judowicz, Z. Kadota 399 Kalnins, A. 83, 85, 94, 135, 281, 313 Kanunnikowa. S. Karrer, P. 348 Kasanski, A. 266 Kauffmann, J . 253 Kellerman, K. F. 6, 81 ff., 94, 96 f.

Autorenregister Khouvine, Y. 95, 164, 167, 171,173f., 190, 207, 212,219ff.,223fl.,229,231,233f.,236, 245,248f., 251 f., 254,260, 262ff., 297,366, 372,379 ' Khouvine-Delaunay, Y. Kimball, N. Kitts, W. D. 364, 372 Kiuru, V. 393 Koeh, A. 311, 334 Kochanskaja, Je. Koistinen, O. 393 Kokurina, N. Kölker, I. Kononowa, M. 163 Kopp, F. 291 Korolew, M. 382, 387 Koschtojanz, Ch. 362, 374f. Kostytschew, S. P. 2 Kozlowska, D. 401 Krainski, A. 41 f., 100,105fl., 110ff., 129 f., 159 Krainsky s. Krainski Krassilnikow, N. 54, 83, 101 fi, 106, 109, 237 Kriss, A. 7, 54, 266, 283, 286, 294 Kroulik, A. de Kruyff, E. 140 Krzemieniewska, H. 7, 15, 46, 50, 54f., 57, 62, 66ff., 128,135, 141, 143, 146, Tabellen 1, 7, 9, 10 Krzemieniewski, S. 7, 50, 55, 67f., 128,135, 141,143,146 Kusjurina, L. Kusnezow, N. 341, 357 Kusnezow, S. 285, 290, 292 Kusnezowa, S. Langwell, H. 199, 384f., 3880. Lehmann, K. B. van der Lek, J . B. 124 Lesser, E. J . 375 Lichtenstein, St. Lieske, R. 42, 101, 110 Limberg, E. 291 Litwinow, M. 54 Lochhead, G. 81 Löhnis, F. 81 Lötsch, E. Loginowa, L. 382, 385ff., 389 f. Loizjanskaja, M. O. 147f., 161 Lomowa, N. 219, 367ff., 373 Loosli, J . K. 366 f. Lundestad, J . 124 Lindin, H. Lymn, A. Lyssenko, T. D. 47

445

Macfadyen, A. Madhok, M. R. Magnus von Merkatz, A. Makrinow, I. A. 335ff. Malijanz, A. 7, 292 f. Mangold, E. 359 Mansour, K. 348 Mansour-Bek, J . J . 348 Mario, F. Marten, E. A. Martin, R. 239f., 376 McBee, R. H. 179, 181, 184, 187,189ff., 194, 202, 208f., 212, 216, 304, 364 McBeth, J . G. 6, 81 ff., 94, 96ff., 321 McCoy, E. 248 Merker, E. 103, 239, 283 Messinewa, M. 292fi. Metschnikow 376 Meyer, R. 223f., 232, 249, 255 Meyer, V. 95, 167, 170, 173, 216, 221, 250 Michaelis, M. Miller, R. C. 349 Minor, F. W. 17 Mischustin, Je. 7, 67, 265, 282 f. Mistschenko, P. Mitscherlich Mitschurin, I. 47, 265 Molosso wa, S. 292 Mossewitsch, M. 285 Müller, W. 351 ff. Mütterlein, C. Murray, H. C. Neronowa, N. 238 Neuberg, C. Neumann, R. O. Nikkilä, O. E. Norman, A. G. 55, 83f., 94ff., 98,121, 126, 128 Oechsner de Coninck, W. Olson, F. R. 392 f. Omelianski, V. (bzw. W.) s. Omeljanski Omeliansky s. Omeljanski Omeljanski, W. L. 3, 5f., 14, 19, 80ff., 94f., 154, 164ff., 169ff, 192, 210, 212, 216ff., 224ff„ 229, 233ff., 237,251,255,261,267ff., 291, 293, 296f., 365f., 368, 376f., 400 Otani, Y. Owsjannikowa, K. 394 Paine, F. S. Panosjan, A. 266, 277, 280 Parkin, E. A. 353 Pasteur, L. 5, 255

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Autorenregister

Perlin, A. S. Perwoswanski, W. 172,199, 210, 382, 384f., 387, 389fE. Peterson, W. H. 164,170,175, 216, 392 Piatt, D. Pochon, J . 344, 355f., 366, 369f., 372, 376 Poijarvi, J . Popow, L. 5, 210, 233 Popowa, S. 399 Porter, F. 165 Pr6vot, A.-R. Primm Pringsheim, H. 81, 84, 234f., 256£f., 311, 328f. Prjanischnikow, N. 292 Pronina, N. 7, 67, 69, 76ft., 109, 113, 123, 128, 132, 141ff.,277, 284, 401, 409, Tab. 1 Rabotnowa, I. L. 5 Rasumowskaja, S. 291 Rawitsch, B. Rawitsch-Stscherbo, J u . 398f., 410 Reese, E. T. 15 van der Reis 378 Remy, B. Rettger, L. F. 81,84ff.,140,219f.,223f.,226, 228, 234, 236, 245, 252, 296 Reuszer, H. W. 283, 288 Rippel, A. 312 Ripper, W. 351 ff. Rodina, A. 285 Rodionowa, K. 292 Rogers, R. E. Rogowin, S. 10, 12 Roine, P. Rokizkaja, A. Romanowitsch, T. 172 Rose, E. J . 354 Rotmistrow, M. 164,169, 171, 192,196,199, 300, 382, 385, 388f., 391 Rubentschik, L. 110, 219, 221, 280, 286f., 289f., 292, 294, 332f. Rukina, Je. 283, 294 Rumjanzewa, L. Russakowa, G. 294 Sacharow, N. 281 Sack, J . 83, 242 Sadurska, I. 401 Salesskaja, M. 382, 384, 387, 389f. Salimowskaja-Rodina, A. 290, 292 Sanborn, J . R. 331 Sandholzer, L. A. Sarciron, R.

Sarles, W. B. 175 Sawjalow, W. Scales, F. M. 6, 81ff., 85f. Scharoiko, K. 382, 385, 388f., 391 Scheunert, A. 360, 375 Schieblich, M. Schmidt, E. W. 337 f. Schnellen, Ch. 235, 394 Schorygin, P. 10 Schramm, M. 17 Schwartz, A. M. 17 Schwartz, W. Scott, S. W. Semenowa, L. 382, 385 Sen, H. K. van Senus Serbinow, I. K. 242 Sergejewa, N. 281 Seydel, S. 311 Sherrard, E. C. 392 Shirk, H. G. 17 Shukowa, R. 166 Sijpestein, A. 240 Simakowa, T. 221, 266, 270 Simola, P. E. 94, 97 f., 156 Siu, R. G. H. Sjablikowa, O. 291 Skinner, C. E. 81, 84, 274f, 331. Skopek, J . 17 Slawnina, G. 7, 92, 272, 278, 282, Tabellen 9, 10 Smith, N. R. 6, 81 ff., 85 f. Smith, R. L. 364 Snieszko, S. 81, 172, 198, 216 Söhngen, N. L. Soeters, K. 187, 198, 209, 229, 304 Solnzewa, L. 7, 29, 31, 33, 50f., 53,55,58, 65, 69, 83, 92, 113, 128, 136, 151, 160, 266, 287, 358, Tabellen 1, 7, 9, 10 Sorokin, A. 276, 280, 283 Stadler, R. Stanier, R. Y. 7, 31, 50, 55, 59,115ff., 121, 123f., Tabellen 1, 7, 9 Stapp, C. 19, 58, 61, 83, 91ff., 113,118, 125, 136, 140, 268, Tabellen 1, 7, 9, 10 Stark, C. N. 366 f. Starkey, R. L. 96 Steinhaus, E. 357 Stepanowa, M. 295 ff. Stephenson, M. Stewart, J . Stohmann, F. Stschepkina, T. Stscherbakowa, I.

Autorenregister Sturm, L. 233, 288, 291, 293 Stuzer, Ju. 317, 319, 330, 332 Swetsphnikow, I. Talalajew, Je. 277 Tappeiner, H. Tausson, W. 279, 294f. Tenney, F. G. Tepljakowa, S. 7, 105, 110, 132, 273f., 276, 278f., 281, 289 Tetrault, P. A. 171, 173, 216 Thaysen, A. Ch. 95 Thompson, W. S. Thornton, H. G. 101 ran Tieghem, Ph. 218 Timirjasew, K. A. 2 Tittsler, R. P. Tjurin, 1.163 Tomoda, Y. 186, 203 Topping, L. E. 101 T6th, G. Toussaint, P. 253 Trager, W. 345f. Trecul, A. 218 Trofimow, A. 294 Troizkaja-Aleschina, W. Tschelzowa, Ju. 199, 210, 382, 385ff. Tschilikin 402 Tuorila, P. 310f„ 324, 334 Tutajewa, A. 292

447

Viljoen, J . W. 164,170, 216 Vintika, I. 333 Virtanen, A. I. 210, 392, 393 Yoets, J . P. 30

Underkofler, L. A. 364, 372 TJwarow, B. 350

Wackenhut, A. M. Wagner, R. P. Wakengut, A. Waksman, S. A. 19f., 42, 108, 110f., 122, 129f., 133, 163, 274f., 283, 288 Waledinski, I. Walker, E. 113 148f., 161 Warren, F. L. 113, 148 f., 161 Webber, H. H. Webley, D. M. 161 Wehmer, C. Weis, W. L. Weiser, H. 155 Wernadski, W. I. 271, 289 Werner, E. 171, 173,219,221f.,224ff.,229f., 233, 235, 245, 248, 251 f., 356 Wesselow, I. 294f. Wheeler, H. G. Wiljams, W. R. 163 Windisch Winogradski, S. N. 5f.,9, 15,19f.,23,25f., 32,36f.,45f.,50, 53f.,56f.,64,81ff.,87, 89, 92f., 113, 121, 128, 135, 147, 150f„ 157, 159f„ 163, 218, 233, 238, 253, 267, 312 Winogradsky s. Winogradski Woodman, H. E. 371 Wosnjakowskaja, Ju. 278, 333

Vanecko, S. 365 Vartiovaara, A. Veldhuis, M. K. 384f., 388f., 392

Zarembska, R. 94, 97 Zechmeister, L. Zobell, C. 286, 292

SACHVERZEICHNIS Abutilon avicennae 400 Abwässer 270, 284, 394 Acetamid 133 14 C-Acetat 371 Acetatseide s. Celluloseacetat Acetobacter xylinum s. Bacterium xylinum, Aceton 231, 383, 388 Acetonbuttersäurebakterien 217 Acetylcellulose s. Celluloseacetat Acetylmethylcarbinol 191 Achromobacter 48, 86 — picrum 83, Tab. 9 Acidität 42, 52, 86, 97 f., 111, 132,146ff, 187, 192ff., 252f., 256, 259, 273f., 276, 280, 305, 331, 361, 366, 368, 372, 385ff. Acidophilic 215 Ackerboden s. Erdboden Acrostalagmus cinnabarinus Taf. 37 Actinomyces 48 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

albidus 109, 111 albosporeus 107, 129, .138, 284 albus 133 aromaticus 109 asteroides 108, 133 aureus 109, 111, 133 bobili 111 bovis 109 Candidus 109 cellulosae 107, 109, 130, 298 chromogenus 109 coelicolor 109 diastaticus 107 ff erythrochromogenes 107 exfoliatus 111, 133 flavochromogenes 109 fradii 108, 133 glaucus 109 globisporus 110, 121 griseoflavus 109 griseolus 109 griseus 107, 109, 133 hygroscopicus 109 lipmanii 108 loidensis 109 longisporus 109, 132

Actinomyces melanocycltts 106f., 110f., 129, 138, 284, 298, Taf. 16 — melanogenes 110 — melanosporeus 298 — ochroleucus 109 — reticulus ruber 133 — roseus 107, 298 — salmonicolor 108 — sampsonii 109 — sulfureus 109 — thermofuscus 109 — verne 109, 111, 133 — violaceus 111 — violaceus-ruber 130 — viridans 109 — viridochromogenus 130, 133 — xanthostromus 109 Actinomycetales, Actinomyceten 47ff., 86, 98ff.,lOOff, 120ff., 132,137,159, 242, 270, 274,279,292,297 f., 344,367f., 377, 396ff., —, Kultivierung 41 Adaption 131 Adenin 365 Adermin 139, 190, 374 Äquator 265 Aerosporen 106 f. Äsculin 85 Äther 249, 256 Äthylenoxyd 401 Ä t h y l n i t r a t 133 Ävritherme Bakterien 191 Affinität zu Farbstoffen 46 Agar-Agar 19ff., 22, 42, 77, 91, 107, 111, 122 f., 250, 288, 300 — Filme 43, 45, 56, 104 — Hydrolyse 122 — Konzentration im Nährmedium 21, 31, 81, 91, 142, 185 — Micellen 79 —, nährstofifreies 23, 37 — Reinigung 22 — Verflüssigung 79, 12211., 125 — Viskosität 122 Agarbakterien 123ff. AGULHONsche Reaktion auf Buttersäure 264

Sachverzeichnis Ahornzellstoff s. Zellstoff Aktivitätsbestimmung 36 Alanin 132, 134, 188 Albumine 188f., 247, 270 Aldehyde 40, 157, 207 Algen 272, 279, 283, 287, 293f., 398 Alginsäure 124 Alkohole, Alkoholbildung (speziell Äthanol) 7, 40, 44, 87, 97, 157, 199,202fl., 231 ff., 238, 244, 249, 259, 262ff„ 299f., 306ff., 312,326,338f., 356f., 370,373,382,384f„ 387f., 393f. Alkoholfänger 388 Alkoholgewinnung 199 Allesfresser 358 Alma-Ata 276 Alterung, Altersformen 181, 242 Aluminium 391 f — -nitrat 408 — -oxyd 346 — -salze 391 — -sulfat 391 Ameisenhaufen 356 Ameisensäure 97, 159, 204ff.,230f.,247,263, 312, 357, 371, 373, 389f., 394 p-Aminobenzoesäure 365 Aminosäuren 132,134,136,189ff, 235, 247f., 267, 302f., 333 Amitermes minimus 104 Ammoniak 87, 189, 194, 231, 247, 333, 337, 373, 386 Ammonifizierung 380 Ammonium —-carbonat 132, 192, 386 --Chlorid 310, 335, 384 — -nitrat 85 — •phosphat 188, 384, 386 — -salze 86, 98,107,132f., 138,190, 247, 304, 369 — -sulfat 81, 85, 98,125,132ff., 146,161,226, 229, 247, 253, 273ff., 313, 321, 355 — -tartrat 133 Amoeba verrucosa 345 Amöben 24, 44, 182, 288 Amphibien 358 „Amphibiencharakter" der fakultativen Anaerobier 254 Amylalkohol 232, 256 Amylase 79, 85, 91, 97, 121, 125, 155, 255 Amylobacter 218 — navicula 223ff., 237,246ff., 252 f., Taf. 26 Amyloid 14 Amylose 177, 181, 224, 238 Aneurin 139, 190, 334, 374

449

Anilinfarben 46 Annelida 341 Anobiidae, Anobiiden 350, 353 Anobium punctatum 353 Anreicherungskulturen 9, 23ff.,34, 44, 76, 80, 82, 94,168,169ff., 209,212,217 f., 220, 223, 232ff., 251,268,287 f., 299f., 305,308, 324f., 328, 334,338, 355, 364f.,368, 371, 383, 392ff., 407 Antagonismus 8, 29, 299, 314 Antibiotika 106, 299 Antiseptika 152,199 f., 256ff., 344,372,398ff., 409f. Apfelsinensaft 250 Apparat — zur Bestimmung der Cellulosezersetzungsprodukte 38 — zur Bestimmung des Kohlendioxyds 205 — zur Bestimmung des Redoxpotentials 114, 195 ff. — zur Prüfung der Beständigkeit von Cellulosematerialien 403ff. Araban 245 Arabinose 85, 91, 97,113f.,121f.,124f.,133, 187, 245f. Archangiaceae 53 Archangium 65, 78 Archive 401 Arginin 188 Arktis 6 Armenien 266, 269, 280 Artenzusammensetzung 280ff., 287 f., 298, 371 Asellus 284 Asowsches Meer 292 Asparagin 85f.,98,132ff., 188, 203, 226, 228, 230, 247 Asparaginsäure 132, 134 Aspergillus 379 — ceUuhsum 363 — fumigatus 130 — oryzae 157 Atmung — des Bodens 2, 271 — der Mikroben 2, 401 f. — der Wurzeln 2 Auflösungsstadien s. Autolyse Australien 266 Autochtone Formen 103, 295 Autographien 400 Autolyse, Autolysate 35, 46, 57, 88, 180, 303f., 333 Auxine 303 Auxoautotrophe Organismen 334

450

Sachverzeichnis

Azotobacter 153, 161, 273, 309ff., 318ff., Taf. 30 — beijerinckii 323 — chroococcum 311, 314fi.,321, 323,326ff., 337, Tafeln 31, 32 — indicum 323 — vinelandii 323, 332 Bacillus 48 f, 82, 237 — aVbidus 83 — almus 83 — amylobacter 195, 225, 230, 237 — amylolyticus 94 — aporrhoeus 94, 96f., Tab. 9 — aurogenes 83 — biazoteus 83, 145 — bibulus 83 — caesius 83 — cellaseus 83 — cellulosae dissolvens 216, 221, 226, 249, 251 ff., 262, 297 — cellulosae methanicus Tafeln 25, 26 — ceUulosam fermentans 219, 237, 866 — coli 406 — concitatus 83 — cytaseus 94 — desiduosus 83 — felsineus 36,233* — ferrugineus 86, 293 — festinus 94 — 0 94,331 — galbus 83 — gelaticus 123 — gelidus 83 — gilvus 83 — imminutus 94 — ingis 83 — latvianus 94 — macerans 95 — mesentericus 95, 381 — methanigenes omelianskii 378 , Entwicklungscyclus 378 — mucosus 94 — mycoides 95, 104, 215, 224, 265, 303 — omelianskii 216, 237,288,247,253,378f., Taf. 26 — omelianskii var. ovalisporus 237, 288 — omelianskii var. thermophilus 216, 237 — polymyxa 95 — pusilus 83 — rossicus 83 — subalbus 83 — subtilis 95, 265 — vulgatus 95

Bacillus — 43 94, 331, Tab. 7 Bacteriaceae 83 Bacterium 48f., 82f., 86 — acidulum 83 — aerogenes 226 — bosporum 83 — castigatimi 83 — ceUulolyticus (3598) 94 — cellulosolyticum flavum 83 — „Co" 92, 331 — coli 198 f., 210, 304, 308 — fimi 81, 83, 296 — flavigenum 81, 83 f. — gelidum 84 — herbicola 303 — idoneum 83 — J. Dubos 331 — liquatum 83 f. — lucrosum 83 — paludosum 94 — protozoides 83, 135 — B 331 — radicicola 320 — redum 81 — similityphosus (4075) 94 — terminalis (4004) 94 — typhosum 210 — udum 83 — xylinum 1, 16f.,64, 182,379, Tafelnl, 8, 9, 21, 22 Bacteroides 242 — succinogenes 230, 243 Bahamainseln 286 Baktericide 407 Bakteriencellulose 1, 16f., 379 —, ßöntgendiagramm 18 —, Vergärung durch anaerobe Cellulosebakterien 182 —, Zersetzung durch aerobe Cellulosebakterien 64 Bakterienfilter, Bakterienfiltration 22, 31, 156, 311, 344, 375 Bakterienhaut 85, 332, 379 Bakterienmenge 35, 276f., 290ff., 364, 367 f. Bakterienschleim 32f.,51,56, 58,63ff.,86ff., 93, 96, 102, 105, 110, 144, 147fi.,155, 159ff., 279f., 312 f. —.Herauslösen aus dem Substrat 40 — und Beweglichkeit 160 Bakterienschnttre 228 Bankia 4 — setacea 349

Sachverzeichnis Barium — -carbonat 408 —salze 409 — -sulfat 408 Barytlauge 158,161, 205 Bast, Bastfasern 186, 337, 395,397,400, 407 Batist 15 Bauindustrie 3, 395 Baumwollcellulose 11, 15, 343, 348 Baumwolle 10, 186, 343, 395 Baumwollgewebe 15, 37, 186, 396ff,.403,406 Beeren 299, 339 Begleitbakterien 24, 32, 34, 81, 136f.,140, 155, 166ff., 184, 186, 191, 202, 220, 223, 227, 233, 235f., 241, 243, 255,262,267 f., 295, 299ff.,311, 322, 345, 365, 384, 390, 394, 402, 407 Belüftung 143, 199, 272ff„ 295, 297, 323, 33511., 890f. Bentoniten 284 Benzol 231 f. Benzylalkohol 232 Beringstraße 286 BERKEFELD-Filter 375, 378

Bernsteinsäure 230f., 243, 264, 371, 373 Bernsteinsäureamid 133 Beton s. Korrosion Beweglichkeit der Bakterien 21,43ff.,51, 56, 59, 66, 70f., 77,79ff., 94,97,101 fi., 223f., 237, 362 Bewetterungsversuche 396 Biegsamkeit 407 Bienen 357 Bindfaden 286 Biomasse 361, 373 Biostickstoffdüngung 335ff. Biotin 139, 190, 247, 250, 365 Biovolumen s. Biomasse Biozönose 211, 276 Birkenholz s. Holz Birkenteer s. Teer Blätter 4,16, 262, 271 f., 343 Blättermagen 368 f., 372ff. Blei 391 —-acetat 161 — c a r b o n a t 408 — -chlorid 408 — -nitrat 408 —salze 409 — -sulfat 408 Blinddarm 239f., 349, 356, 358, 360, 368, 375ff. Blindsäcke des Insektendarms 352 Bodenbearbeitung 272, 282 29

Imschenezki, Mikrobiologie

451

Bodenbildung s. Bodenstruktur Bodenextrakt 138, 190, 250 Bodenrassen der Cellulosebakterien 369f. Bodenstruktur 3, 163, 271 Bodenverbesserung 334 Böden, alkalische 273f. —, kultivierte 397, 402 —, saure 273f. Bohnen-Agar 320 Boote s. Holzschiffe Bor 266, 294 Borax 410 Borsäure 294 Bostrychidae 353 Brachland 282 B R E D E M A N N s c h e s D-Agar 229 Brenztraubensäure 371, 373 B R O W N s c h e Molekularbewegung 44 Bruchbelastung 405 Buchweizenextrakt 191 Bücher 400f., 409 Butanol 383, 388 Butschlia 361 Buttersäure 29, 157, 190, 204ff„ 230, 243, 247, 263, 293, 356f.,371, 373,383,389f., 393 f. Buttersäurebakterien, Buttersäuregärung 29, 164, 177, 220ff., 230, 248, 255, 311 2.3-Butylenglycol 233 Cadmium 131 Calcium 130, 275 - - c a r b o n a t 81, 130, 132, 154, 166, 188, 192ff., 204ff., 228, 234, 236, 252f,. 258, 263, 271 ff., 317,321, 323, 332,335,337 f., 384ff. — -chlorid 228, 253, 366 — l a c t a t s. Milchsäure — p a n t h o t e n a t s. Panthotensäure —phosphat 385f. Calotermes minor 354 Carbamid 133 Carbonatböden 277, 279 Carboxylgruppen lOff., 147 f. Carboxymethyl cellulose 15, 364 Carotinoide 78, 142, 162, 210, 232 Carpophore 108 Casein 188f., 247 — -hydrolysat, 85, 87 Cellfalcicvla 49, 56, 84, 281, 287 f., 296 — viridis 281 f. Cellobiase 156f., 258, 260, 312, 317, 346 Cellobiosazon 258f

452

Sachverzeichnis

Cellobiose 7,52,97,116,121,124f., 152,156f., 178,201 f., 231,240,245f., 257ff., 299,304, 311 f., 317, 325, 339, 346, 357, 367, 372 - , Hydrolyse 258, 312, 325 Cellodextrine 12,18, 21,152,156, 231, 311 Cellohexaose 156 Cellophan 15, 45, 56, 61, 64, 73, 117, 126, 149, 156, 161, 164, 186,309f.,314ff.,320, 383 —, Verunreinigungen 310 Cellotetraose 156 Cellotriose 156 Cellulase 3 f . , l l , 16, 18, 47, 63, 74, 81, 110, 119, 153,164ff.,192,199, 202 f., 214, 239, 242f.,256ff.,342,346, 349, 364,372f.,377, 402 Diffusion 261 — in niederen Organismen 4 — in Samen 4 —, Ökologie der Fermentbildung 3, 47 —, Verbreitung, Vorkommen 3f.,341 ff., 372, 375 —, zellfreie Fermentpräparate 7, 257, 261, 376 Cellvlobacülus 49, 132 — myxogenes 94, 97, 156 — varsaviensis 94 CeUulococcu8 49 — albus 242 Cellulomonadaceae 83 Cellulomonas 49, 80, 82ff., 132,242, 281, 324 — biazotea 85 f., 322f., Tab. 7 — fimi 86, 102 — flava 83 — flavigena 155 — folia 331 — subcreta 331 Cellulose - , ot-, ß-, y- 15, 150, 203, 353 —, amorphe 12 —, anaerobe Zersetzung s. Cellulosegärung —, Bestimmung 36, 96, 99,104, 128, 135 —, Bestimmung (gravimetrisch) 40, 129 —, Bestimmung in Actinomycetenkulturen 43, 129 —, Bestimmung nach K i s e l und Semiganowski40 —, Biosynthese 17 —, Chemie lOff. - , Hydrolyse 7, 11 f., 18,63, 66, 81, 97, 99, 115, 119, 147, 149ff., 154ff., 178, 187, 199,200ff.,212, 215, 245, 255ff.,299,311, 339, 343ff., 372f., 376 — in Bakterien s. Bakteriencellulose

Cellulose — in jungen Pflanzen 11 —, Isolierung 16 —, kristalline 12 —, Micellarstruktur 149 —, Molekül 10, 262 —, Orientierungsgrad 12 —.regenerierte 21, 111, 126, 154, 183, 343 —, Röntgendiagramm 12, 262 —, Viskosität 203 Celluloseabbau - , Abbauprodukte 40, 370ff. —, Chemie 6, 8, 146ff. — im Boden 27 f. — in Gegenwart anderer Kohlenhydrate 99, 113ff., 118 Celluloseabbau — in Mischkultur 7 —, Intensität 109, 181, 191 — in verholzten Zellwänden 11 - , Hemmung 119f., 126, 134f. —, morphologische Veränderungen der Faser 62f., 239, 261 f., 364, 377 — und Stickstoffbedarf 41, 135, 275 —, zeitlicher Ablauf 44 Celluloseacetat 186, 383, 397ff. Cellulose-Agar 6, 9, 13,18,20f., 25f., 28,30, 33ff.,42, 63, 81 f., 89, 94, 96,101 ff., 111, 120,137 f., 143,154,168,170,183 f., 228f, 233, 240, 242, 256, 260f., 270 Cellulosebakterien —, aerobe 9ff. - , Aktivität 28,127ff. —, anaerobe 164ff. —, Cytologie 224f. —, Entwicklungscyclus 43, 216 - , fakultative 125, 128, 132, 143 - , Kohlenstoffernährung 112ff., 186f. —, Kultivierungsmerkmale 182ff., 225ff. - , mesophile 130, 164, 166, 169, 178, 192, 212, 215f., 217ff., 225 - , Morphologie 47ff., 219ff. - , obligate 125, 129, 134 - , Physiologie 112ÉE., 186ff., 216, 244ff. —, quantitative Bestimmung 267ff.,273,295 - , sporenbildende 178ff., 217ff. , Entwicklungscyclus 179 f. —, sporenlose 217, 242ff. —, Stoffwechsel 7 - , Systematik 7, 47ff., 215ff., 236ff. - , thermophile 130,140,164,166,169,172, 178£f., 192, 212, 215f., 225 - , Thermoresistenz 141, 235, 252, 296 —, Trockenresistenz 399

Sachverzeichnis Cellulosebakterien —, tropische Formen 140 —, Verbreitung, Vorkommen 6f., 265ff. - , Vitaminbedarf 33, 99,136ff., 186,189ff., 199, 248ff., 267, 328 Cellulosegärung 5, 102, 112, 164, 182, 231, 881 fl. —, Biochemie 199ff. —, Geschwindigkeit 381 f. —, thermophile 210, 381 —, Wirkung von Metallen 391 f. „Cellulosegas" 236, 394 Cellulosegehalt des Bodens 272 — der Faser 126 Cellulosenitrat 186, 396 Cellulosezersetzende Bakterienrassen 109 Cellvibrio 49, 87, 131, 284, 318f., 330, 333, 399 — flavescens 93 — fulvus Tab. 7 — halophilus 280 — ochraceus 92f., 121 — vulgaris 281, 317, Tab. 7 — winogradshii 280 Cerambycidae, Cerambyciden 350, 353 Cerambyx cerdo 352f. Cetraria islandica 156 Chaetomium kunzeanum 403 Chiffon 15 China-Blau-Aurin 331 Chironomiden 284 Chitin 124, 155 Chlor 250, 410 Chlorkalk 410 p-Chlor-m-kresol 401 Chloroform 231 f., 256 Chlorophyll 362 Chlorpikrin 257 Chlorwasser s. Chlor Chlorzinkjod 337, 343 Cholesterin 249 Chondromyces 55 — aurantiacus 55 Chromatin 46, 51, 56ff., 72, 88, 93, 181 Chromobacter 48 f., 86 Chromobakterien 83 Ciliaten 288, 374 Clostridium 180, 216, 329, 378 — americanum 311, 328f. — cellobioparus 216, 219, 221, 228, 237, 245f., 251 ff., 263, 367, 369f. — medium, 378 — nothnageli 378 — pastorianum 336 29'

453

Clostridium — pygmaeum 378 — the.rmoce.Uum 170, 216 — zuntzii 378 Coccaceae 49, 238f. Coelenterata 341 Colpoddla pugnax 345 Conidien 400 Cor 3 101 f. Cor 7a 101 Cor Vb 101 Corynebaeterium Tabellen 7, 9 Corynebakterien 312, 322ff., 331, 338 Cossus cossus 342, 351, 353 Cryptocerus punctulatus 345 Cutin 358 Cystein 115f., 144, 198, 228 Cysten 44f., 52f„ 65ff., 71 f., 75, 78f. —, primäre 65ff., 78 —, sekundäre 65fl., 77ff. —, Thermoresistenz 141 Cystophore 67 Cystrocera globosa 353 Cytasen 360 Cytophaga 7, 14, 22, 24, 29, 31,46,48f.,53ff., 563., 59, 62ff.,77, 80, 88f.,93, 113, 121, 124,129ff., 136ff., 15911.,242,280ff .,286ff., 292 f., 319, 330, 333, 399, Taf. 2 — anularis Tab. 7 — aurantiaca 281 — diffluens 124, Tab. 9 — globulosa 313 — haloflava 399 — halophila 289 — hutchinsoni 55, 116, 134, 281 f., Tabellen — — — —

krzemieniewskae 124, Tab. 9 myxococcoides 54 rosea 399 rubra 116,123, Tabellen 1, 7, 9

Darm 105,173,189,231, 238ff.,243,262,266, 341ff.,372ff. Darmepithel 353 Darmextrakt s. Darm Darmrassen der Cellulosebakterien 354, 357, 369 f. Darmsaft s. Darm Datteln 343, 348, 350, 354 Debaryomyces tyrocola 340 Denitrifizierung, Denitrifizierende Bakterien 78, 145, 299, 339, 380f. Desinfektion 401

454

Sachverzeichnis

Desulfurierung, Desulfurierende Bakterien 177, 294, 299, 340 Dextrine 76, 85, 91, 114, 187, 228, 243, 245, 300 Dialyse 161 Dickdarm 356, 360, 365, 375, 377 f. Dimethylcarbaminsäure (Zinksalz) 401 Dimorphismus 96 Dioxyaceton 17 Diplodinium 361 Disaccharide 99,102,121,187, 243, 256 Dixippus 342 Dokumente 400f., 409 Dörens parallelopipedus 353 Dünger s. Dung Dünndarm 360, 365, 368 f., 377 f. Dulcit 245 Dung, Dungextrakt 30, 55, 68, 98, 136, 138, 166, 188, 190, 194, 211 f., 266, 269, 273, 282 f., 295fi., 334f., 339, 376, 402 Edestin 188 Eialbumin s. Albumine Eichenzellstoff s. Zellstoff Eichhörnchen 375 Eindringen der Kolonien in das Substrat 79, 122f., 288 Einhufer 356 Einzellenkultur 33, 171, 286 — n a c h BURRI 96

Einzeller s. Protozoen Eisen 130 f., 391 — -Chlorid 384 Eisenhämatoxylin 46 — n a c h HEIDENHAIN 72, 239

Eisensalze 323, 332, 391 Eisensulfat 391 Eisensulfid 177, 233 Eiweiße 166, 238, 247 f., 267 f., 270,275, 296, 332ff., 363, 369, 873f., 376f. Eiweißabbauprodukte 166, 189, 238, 333, 369 Eiweißbakterien 9, 177 Eiweißhydrolysate 86 Elastizität 407 Elektive Kulturen 5, 28, 166, 203 Elektive Nährmedien s. Nährmedien Elektivitätsprinzip 13, 18, 26, 166, 268 Elektroindustrie 395 Elektronenmikroskop 10, 46 f. Elephanten 375 Elfenbeinpalme s. Phytelephas Elodea 239, 283 Emulsin 259

Endgruppen im Cellulosemolekül 11 Endoenzyme 81, 154, 257 Endosperm 343, 348, 350 Endosporen 59 Entodinium 361 Eosin 151 Erdboden 69, 219, 236ff., 242, 266ff., 270ff., 277, 334, 377, 396, 402 Erdöl s. Konservierungsmittel Ergine 137 Ernteerträge 275, 334ff. Erythrocyten 361 Erythrosin 46 Espenholz s. Holz Essigsäure, Essigsäurebildung 97, 122, 159, 204, 206ff., 230f.,244,247,263f.,300,312, 339, 356f., 371, 373, 380, 389f., 393 Essigsäurebakterien 1, 64, 182 Eubacteriales 46, 48, 399 Exkremente 68, 342, 348ff., 375ff., 383 Exocellulase s. Cellulase Exoenzyme 132, 154 f. Exoprotease s. Proteolytische Permente Exsikkatoren 168, 185, 228 Extracelluläre Prozesse 150, 155 Fäkalienextrakt 167, 174, 185, 187ff., 226, 229, 249, 264, 296, 304, 344, 355, 366,379 Färbung — mit basischen Farbstoffen 60, 77, 147, 151, 181, 224 — mit sauren Farbstoffen 151 — n a c h GIEMSA 46, 67, 239 — n a c h GRAM 87 f., 94, 101, 177, 181, 224, 238, 241, 243F., 300, 3 5 5

— n a c h LÖFFLER 46, 77 — n a c h ROMANOWSKY- GIEMSA 4 6

— n a c h ZETTNOW 46

Fäulnisbakterien 276 Faltenfilter 26, 37, 89, 127, 310, 314 Farbstoffe, Farbstoffbildung 23f , 52, 56ff., 63ff., 74ff., 84ff., 92f., 101 f., 106ff., 144, 160,162,169,182,207 ff., 224 f., 231 f., 240, 263, 280, 286ff„ 303, 355, 378 —, Spektrum 232 Faulschlamm 291, 293 Feldversuche 334 Felsgestein 271, 278 Fermentierapparate 383 —, Material 391 Fermentpräparate 7, 349 —, zellfreie 156 Festigkeit, Festigkeitsabnahme von Geweben 403, 407

Sachverzeichnis Fette, Fettbildung, Fettröpfchen 67, 181, 224, 371, 373, 377 Feuchtigkeit 28, 142, 274, 276, 298, 336, 396f., 401 FEULGEN-Reaktion 66 Fibrillen, Fibrillenbündel 10, 13, 262 Filtrierpapier 5, 9, 11, 13f.,19fl.,23,30,36f., 40, 84,106ff., 127,164,166,183,186, 219, 225, 227, 261, 270f.,275, 287 f., 291, 309, 316, 320, 322f., 340, 343, 347, 349, 353, 353, 366, 384, 387, 392 —, Reinigung 14, 309 - , Verunreinigungen 14,110,133,309f.,317 Fische 284, 358 Fischfanggeräte 3, 144, 286, 380,395,398f., 402, 407, 409 Fischmehl 364 Fixierung, Fixierungsgemische 45 — n a c h CARNOY 46 — n a c h CHAMPY 46

Flachs 16, 126, 186, 400 Flachsröste 218 Flachmoortorfs. Torf F l a g e l l a t e n 288, 345FF.

Flechten 271, 278 Fleischbrühe-Pepton 34, 85, 97, 99,102,107, 166£f., 188f., 203f., 213, 226, 228, 247ff., 267, 269, 296, 368 Fleischbrühe-Pepton-Agar 32, 42, 85, 87, 91, 97, 99, 102, 107, 125, 168, 173ff., 184, 228ff., 303 Fleischbrühe-Pepton-Cellulose-Agar 168 Fleischbrühe-Pepton-Gelatine 85, 87, 91, 97, 99, 107, 226, 247 Fleischbrühe-Pepton-Leber-Agar 168 Fleischextrakt 85, 138f., 297 Fleischkombinate 270 Fleischwasserextrakt s. Fleischextrakt Flüsse s. Flußwasser Flußsäure 14 Flußwasser 76, 266 f., 283ff. Folsäure 139, 250 Forfícula 342 Formalin 44, 46, 185, 401, 410 Fraktionierte Erhitzung 172 Frankreich, Französisch-Westafrika 253 Fruchtfleisch 402 Fruchtfolge 282 Fruchtkörper 43f., 52ff., 62, 65ff., 86f., 103, 143, 287 —, Hitzeresistenz 141 Früchte 299, 339 Fructose 17, 113f., 123, 187, 245f. F r ü h j a h r 276, 294

455

Fuchsin 46, 66, 72, 151, 181, 185, 224 Fucus vesiculosus 287 Fungicide 407, 409 Furfurol 148 Furfurolbestimmung nach KRÖBER-TOLLENS 148

Futterhefen 392 Gärkammern des Insektendarms 862f. Gärungsgeschwindigkeit 387, 389, 391, 394 Gärungsprodukte 7, 203ff., 218, 234, 237, 244, 255ff.,262ff.,306ff.,312, 326f.,357, 376, 383ff., 390ff. Galactose 76, 97, 113f., 122ff, 187, 245f. Gallenfarbstoffe 249 Gallensäuren 249 Gartenerde s. Erdboden Gasentwicklung 183,186, 203, 211, 213, 225, 229, 244, 247, 370, 375 Gefäßbündel 337 Gehirnextrakt 188 Geißeln 44, 46, 51, 56,77, 80, 82 f., 86,88, 94, 224, 346 Geißeltierchen s. Flagellaten Gelatine 230 - , Verflüssigung 85, 87, 97, 103, 107, 189 Oemiastoma 342 Gemüse 168, 228, 262, 378 Gemüse-Agar 229 f. Gentianaviolett 46, 72,151 Geographie der Bakterien 265f. Gerste 359 Gerstenstroh s. Stroh Geruch 232 f. Gewässerböden 112, 177, 219, 254, 266ff., 285, 287, 289ff., 360 Gewebe 14 f., 288, 380, 395 —, Reinigung 15 Gipsplättchen 23 Glas 77 Glasexsikkatoren s. Exsikkatoren Glasspatel 43 Globuline 188 Glucosazon 201, 258 Glucose 7, 12, 17, 22, 52, 64, 76, 85, 91, 97, 99, 104ff.,113ff.,147,149,152ff., 178,183, 186f., 190, 201 f., 206, 210, 212ff., 226ff., 240ff., 257ff., 280,299f., 304,310ff., 325ff., 346ff., 365, 367, 371 f., 390, 401 14 C-Glucose 17 Glucose-Agar 31, 33ff., 64, 107, 228 Glucose —, Darstellung aus Cellophan 117 — g ä r u n g 212 ff.

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Sachverzeichnis

Glucose, Konzentration im Nährmedium 31, 157 —, Reinigung 117 Glucosereste 10 Glucose, „toxische" Wirkung 22,115£F.,147, Glucuronsäure 148 LI 53 Glutathion 144, 198 Glycerin 17, 85, 121, 245f., 401 Glycin 85, 132f., 188 Glycogen 177, 181,187, 224, 238, 240, 245 Glycol 197 Glykokoll s. Glycin Goudron 410 f. GRANsche Probe 123 Granulierung 56 Gramdobacter pectinovorum 195, 216 —, Entwicklungscyclus 216 Granulöse 94 Gras 358f. Grauerdeböden 278f., 281 Grimmdarm 368 Grünalgen s. Algen Gründüngung 275, 321, 334, 339 Gruppenanalyse, mikrobiologische 280 Grusien 269 Guajacol 256 Guanin 365 Gummi arabicum 245 Hämatoxylin 66, 181 Hämoglobin 270 Hängender Tropfen 43f., 61, 77, 88,101, 178, 220, 223, 361 Hafenanlagen 286, 349 Hafer 359 Haferkoleoptile 303 Halophile Rassen 110, 266, 288f. Halophilie 288 f. Halotolerante Rassen 288f. Hammel 359 f., 365f. Handschriften 401 Hanf 126, 186, 266, 382, 400 Harnextrakt 138 Harnstoff 132, 134f., 188, 364, 373 f. Harnstoffbakterien 9, 48, 336 Harze 407 Hefeautolysat 132, 136, 167, 185, 189f., 270 Hefeextrakt 85, 87, 98, 124, 133,138f., 187, 190, 226, 240, 244, 246, 250, 260, 304, 322 f., 338, 365 f. Hefen, Hefeartige Organismen 153, 172, 238, 257, 259f., 303, 345, 352, 357, 374, 376, 379 Heilschlamm 380

Helix pomatia 4, 342f., 348f., 353 HemiceUulasen 4, 11 Hemiceilulosen 1, 11, 243, 272, 337, 339, 342f., 345,349f.,362f.,365,384,386, 393, 398 Herbst 276, 294 Heteromorphose 64, 91 Heu, Heuextrakt 105, 130, 139, 186, 250, 266, 298, 359, 365, 375 Heuschrecken 342 Histidin 188 Holz 2, 4, 10, 55, 149, 210, 286, 337,341 ff., 362, 377, 383f., 392ff., 395, 400, 402 Holzhydrolyse 392 Holzpilze s. Pilze Holzschädlinge 341, 345, 350 Holzschiffe 286, 349 Holzvergärung 3920. Holzverwertung s. Holz Holzwurm 4 Homarus 350 Hühner 359, 375 Hühnerbrühe 226 Huftiere 358 Huminstoffe 163, 275ff., 337 Humus, Humusbildung 3,162 f. Hunde 359 Hundswolle 399 Hydra 398 Hydratcellulose 6,13,18, 42 Hydrazinsulfat 133 Hydrobilirubin 249 Hydrobiologie 191 Hydrocellulose 13, 18, 156 f. Hydrogenase 235, 394 Hydrolysenindustrie 392 Hydrolysenprodukte 40, 48, 115, 119, 121, 135, 147, 150, 161ff., 187, 199AE., 208, 212£f.,238, 243, 255,258, 304,312 f., 317, 323, 326, 338ff., 344, 372 f. Hydrolysentheorie der Cellulosezersetzung 154 Hydrolysenzonen 26, 30, 63, 67, 81,96,104f., 111, 119f., 120, 125, 154, 159, 184, 202, 228, 240, 242f., 256, 261, 355 Hydroxylaminsulfat 133 Hylecoetus 350 Hypermastigina 346 Hyposulfit 115f. Imagines 353 Impfen 110, 129, 360 — mittels Erdklümpchen 23, 324 — mittels Injektion 125

Sachverzeichnis Impfmenge 171, 225 Indol 85, 97 Industrieabwässer s. Abwässer Inkubationszeit 225, 251, 291, 354, 356, 365 Insekten 266, 341 ff., 850ff., 356f. Inulin, Inulinacetat 85, 121, 124, 187, 245, 397 Involutionsformen 182, 227 Ipidae 350 Irtysch 285 Isländisches Moos s. Cetraria islandica Isoliermaterial für Kabel 395,397 f., 407,409 Isopropanol 232 Isotomys speciosus 353 Jahreszeit 276 Java 140 Jod 266, 294 Jodococcus intestinalis 240 Jodoform 162, 256 Jodreaktion auf Stärke 75, 79, 91 Jodtinktur 354 Jogen 224, 238 Jute 126, 400 „Jutehülle" 397 Käfer 4,173, 356 ' Käferlarven s. Larven Kaliapparat 205 Kalilauge 193, 205 Kalium 130, 250, 275f. —bicarbonat 386 —bichromat 408 —carbonat 386 — -ehlorid 384 — -jodid 294 - - n i t r a t 131, 146, 318 —permanganat 408 — -phosphat 271, 275f., 297, 366, 384 Kaltblüter 357 f. Kama 284f. Kanadabalsam 185 Kanäle 285, 294 Kaninchen 240, 358ff., 375 Kaninchenlosung s. Exkremente Kapselschleim 161 Karamelisierung der Zucker 116f., 187 Karbolerythrosin 46 Karbolfuchsin 46, 239 Karotten 36 Karpfen 284 Kartoffel-Agar 22, 89, 91,170,174,176,184f., 229 Kartoffeln, Kartoffelextrakt 36, 85, 87, 91, 102, 138, 176, 185, 188, 227f., 359

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Kartoffelpreßrückstände 382, 384, 387ff. Karton 186, 395 Kasachstan 105, 110, 279, 281, 291 Kaspisches Meer 292 f. Kastanienbraune Böden 276, 279 Kenaf 382 Keramische Kerzen 39 Keramische Platten 23 Kernapparat 46 Ketohexofuranosen 17 Kettenbildung bei Bakterien 84, 107, 179, 220, 240 f., Kiefernholz s. Holz Kiefernzellstoff s. Zellstoff Kiemen 285 Kieselsäuregel-Filtrierpapier 6, 9, 13,19f., 23,25f., 30, 34, 37, 42, 54, 63, 65, 67, 69, 73, 79, 89, 94, 100, 112, 122, 127, 129, 131, 135, 142 f., 151, 159, 270, 295, 310, 314, 323, 330, 332, 336, 355 Kläranlagen 265, 380, 394 Kleber 365 „Klostridialer Typ" sporenbildender Bakterien 9411. Klostridien, klostridiale Formen 94ff., 180, 216, 223ff., 378 Knöllchenbakterien 319 f. Kochsalz 280 —, Konzentration im Nährmedium 280, 289 KocHsche Schalen 27 Körnerfresser 358 Kohlendioxyd 97, 150, 158f., 162, 206ff., 230ff., 253f., 258f., 263f., 270ff., 284, 340f., 370ff, 391, 394 —, Abgase der Industrie 2 —, Bestimmung 41, 158, 204f. —, Bestimmung nach L e f e v r e - T o l l e n s 148 —, Bildung durch vulkanische Tätigkeit 2 —, Menge in der Atmosphäre 1 f. Kohlenoxyd 211, 370 Kohlenstoffbilanz 158f., 162, 204ff., 232, 258ff. Kohlenstoffkreislauf 2 f., 6, 158 f., 271, 283, 382 Kohlrabi 378 Kokken 50, 54, 57, 101, 103, 107,217f.,236, 238ff., 293, 364, 367, 369, 376f., 388 Kokosfasern 400 Kokosnüsse 402 Kolloide 79 Kolloidmühle 21 Kombinierte Kulturen 384

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Sachverzeichnis

Kompost, Kompostextrakt 101, 103, 105, 130, 138f., 298, 334 Koniferennadeln s. Nadelstreu Konservierung, Konservierungsmittel 398f., 401, 405, 407 ff. Korkböden 277 Korrosion des Betons 293 — von Metallröhren 380 Kot s. Exkremente Krebse, Krebspanzer 155, 341, 849f. Kreosot 409 Kresol 256, 411 Kristallinität, Kristallite 12, 397 Krater 294 Krummdarm 368 Kugelmühle 392 Kulturfiltrate 154, 257f., 260, 323 f. Kunstseide 396 Kunststoffe 398 Kupfer 131, 391 — -Chlorid 408 —komplexe, unlösliche 410 —naphthenat 409 —-oleat 410 — o x y d 410 Kupferoxydammoniak 13, 18, 20 f. Kupfersalze 391, 409f. Kupferseide 396 Kupfersulfat 408, 410 Kupfertannat 410 Kupferzahl 203 Labmagen 365, 368, 372ff. Lackmus 85, 87, 97 Lactose 85, 97, 114, 121 f., 133, 187, 245f., 300, 329 Lävulose s. Fructose Lamellicornia 350 „Langer T y p " sporenbildender Bakterien 94 ff. Larven 4, 342, 345f., 350ff. Laubstreu 16, 49, 268, 272 Leberbrühe 226f. Leberextrakt 138, 167, 188, 296 Leerdarm 368 Leidyopais 346 Leinengewebe 15, 186, 395f.,399f.,406,409 Leitungswasser 130,141, 284f.,289,366, 384 Leontodon taraxacum 343 Leptura 353 Leucin 132, 188 Leuconostoc mesenterioides 160 Leukorassen 76,142 Lichenin 16, 156

Licht 142, 396 Lignin 11, 16, 126, 262, 272,342,349,358f., 377, 392 f., 399ff. Lignocellulose 279 Limane 110, 221, 286, 289, 291 f. Lipoide 181, 373 Lipoproteinkörper 181, 224 Lößböden 281 Lophotriche Begeißelung 103 Luftmycel 42, 104,107 f., 111 LuGOLsche Lösung 75, 123, 177, 231 Lupen 43 Lupine 348, 359 Luzerne, Luzernewurzeln 279, 282, 359, 365 Lyctidae 353 Lyctus 351 Lyophile Trocknung 35 Lysierende Zellen s. Autolyse Maceration 88ff., 124, 217f. Macrotoma palmata 353 Mäuse 248 Magen 341, 345, 348f., 363ff. Magen-Darm-Kanal 358, 365, 367 Magenfisteln 365 Magensaft s. Magen Magnesium 130, 250, 275 —-carbonat 385f., 388 — -chlorid 384 — s u l f a t 129, 177, 275, 297, 317, 323, 337, 366, 384 Mais 186, 282, 382f., 386ff. Maisextrakt 243, 249 f. Maisstrünke s. Mais Maja 350 Malonsäure 122 Maltose 76, 85, 91, 97, 113f.,122, 124, 133, 187, 24311, 374 Malz, Malzextrakt 138, 243, 250 Mandelöl 169 Mangan 131 Mangroven 286 Mannan 11, 121 Mannit 17, 85, 114,120f., 124, 245f.,310f., 314, 319, 321 ff., 329, 336, 401 "C-Mannit 17 Mannose 121, 125, 187, 245f. Mastdarm 368 Maultiere 375 Meere s. Meerwasser Meerschweinchen 239f., 248, 375f. Meerwasser 110, 266f.,283ff.,286ff.,396,402 Melasse 365f. Melicitose 245

Sachverzeichnis Metabiose 8, 24, 29, 203, 268, 299, 329ff. Metachromatin 224 Metallexsikkatoren s. Exsikkatoren Methan, Methanbildung 210ff., 218, 231, 233ff., 238, 308, 370, 373, 383, 394 Methanbakterien, Methangärung 81, 170, 211 f.,219,221, 234£f.,251, 258, 299, 308, 328f., 340 Methanol 232 Methionin 374 Methoxylgruppen 148 Methylenblau 46, 66, 72, 151, 181, 197, 224 Methylpentosen 123 Methylviolett 181 Methylzahl 149 Miastor 342 Micellen 12 Micrococcus 48 — cytophagus 239 — melanocyclus 103 — motchutcowskii 242 — pustulatus 239, 377 — pygmaeus 239, 377 — ruminantium 239, 367, 377 Micromonospora 41, 48, 50, 100,103,104f., 112, 138f., 159, 367 — bicolor 104 — chalceae 104, Taf. 35 — elongata 104 — globosa 104 — propionici 138, 367, Taf. 16 — vulgaris 105, 121, 132, 138 Micromonospora, Entwicklungscyclus 105 Microspira agarliquefaciens 124f., 133 Mikrobereiche 120, 155 Mikrocysten 31, 34, 45,50ff.,77, 80, 93,115, 141,143ff., 239 f., 315, 355, 406 —, Hitzeresistenz 32, 141 —, Keimung 60 f. —, Membran 61 f. Mikroelemente 15, 130, 325 Mikroflbrillen 97 Mikroflora, jodophile 377 Mikroheiztisch 43 Mikroklima 401 Mikrokokken 57, 217, 239, 355, 364, 369 Mikrokolonien 184 Mikromanipulator 33 Mikroskopische Präparate —, gefärbte 45f., 220 —»ungefärbte 43f. Mikroskopische Technik 43 Milch 85, 87, 91, 103, 176, 226, 247

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Milchsäure 97, 122, 204, 206, 208,230f., 243, 246, 263f., 268,312, 339, 357, 371, 373. 383, 389 f., 394 Milchsäurebakterien, Milchsäuregärung 48, 380 Mineralisierung organischer Substanz 106, 339f. Mischkulturen 29, 33, 37, 103, 136, 140, 155, 164,170ff.,176,178,184, 186, 198, 211 f., 223, 226, 231, 235, 241, 251, 255, 258, 260, 262, 271, 303, 305fi., 312, 315ff., 320ff., 330ff., 339, 356, 383ff., Mist s. Dung Mitteldarm 343, 356 Möhren 91 Möhren-Agar 91 Moldau 281 Molke 247 Mollusken 4, 341 ff., 348 f., 354, 357 Molybdänsalze 323, 332 „Monophage" Organismen 48 Monosaccharide 97, 99, 102, 121 f., 187,243, 256 Monotriche Begeißelung 49, 87, 103 Moose 278, 337 f., 382 Moskau, Moskauer Gebiet 93, 265f.,269,290 Most 176 Most-Agar 22, 184 Mucor 249, 379 Mycetocysten 350, 352 Mycobakterien 47, 50, 86, lOOff., 120f., 133, 239, 241 f. —, Kultivierung 41 —, Verbreitung 101 Mycobacterium 48, Tabellen 7, 9 Mycococcus cytophagus 103 Mycogeographie 265 Myco plana 101, 103 Myzöbacteriales, Myxobakterien 7, 31,47fi., 50ff., 850., 109, 113, 117, 120ff., 128ff., 136,242 f., 270,276,279ff., 287 f., 293,312, 323,325,329,334, 348, 355, 367, 369, 410 —, cellulosezersetzende 5fjfi. —, Entwicklungscyclus 52 —, Fruchtkörper 43 f. —, unechte 52, 57 Myxococcaceae 53 f. —, Entwicklungscyclus 55 Myxococcus 59, 284 Myxokokken s. Myxococcaceae Nadelholz s. Holz Nadelstreu 4, 16, 49, 268, 272, 356 Nährhefen 392

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Sachverzeichnis

Nährmedien 12f., 18ff., 129 - , elektive 5f.,14, 19, 81, 165fi.,218, 233, 267 f., 286 - , feste 19ff., 29, 34, 58,158,168,170,181 ff., 227ff. , osmotische Eigenschaften 79 - , flüssige 13,18ff.,26, 34,37,58,111 ff., 158, 169, 173f.,180ff., 250, 270, 295, 305, 356 , mit Durchleiten von Luft bzw. Sauerstoff 39 —, für Actinomyceten 41 — mit Carboxymethylcellulose 364 — mit Cellodextrinen 21 — mit Glucose 22, 31 — mit Kochsalz 280 — mit Melasse 366 — mit Pepton 22, 84, 124; 304 — mit Stärke 21, 31, 34, 89,142, 225 - , optimale 166, 226, 241, 247, 267f., 304, 344, 355 — zur Erforschung der Denitrifizierungsfähigkeit 22 Nährmedium nach A S H B Y 3 1 1 , 3 1 7 , 3 2 6 — nach B O A S 3 0 3 — nach C L A U S E N 1 6 8 — nach C Z A P E K llOf. — nach H U T C H I N S O N und C L A Y T O N 1 9 , 21, 26, 65, 69, 73, 76, 88, 91, 144, 153, 270, 314, 340 — nach I M S C H E N E Z K I 1 6 8 , 3 6 8 — n a c h KHOUVINE 167, 366

— — — —

nach K I T T - T A R O Z Z I 1 7 6 nach L A N G W E L L 3 8 4 nach M E Y E R 1 6 7 , 2 4 9 nach O M E L J A N S K I 6, 14, 19, 94,164ff., 167, 169, 226, 229, 267, 269, 291,365ff., 376 — nach P E R W O S W A N S K I et. al. 3 8 4 — nach S T A P P und B O R T E L S 1 9 — nach V E L D H U I S , C H R I S T E N S E N und FULMER 384

— nach W A K S M A N und C A R E Y 1 9 — nach W I N O G R A D S K I 1 9 , 2 6 , 2 5 3 — V 167, 169, 185, 188, 203, 211, 299, 301, 303, 305, — VL 166, 168, 174f., 186, 188, 192, 194, 198ff., 203f., 209, 211 ff., 304f. Nagetiere 356, 358, 360, 375 f. Nahrungskette in Gewässern 284 Nansok 15 Naphthole 409 Natrium 250 — a c e t a t s. Essigsälire —ammoniumphosphat 133, 188, 303

Natrium —-bicarbonat 361, 366, 386 — -carbonat 366, 386 — -chlorid 110,129, 297, 317, 323, 366 — -fluorid 372, 408 — -lactat s. Milchsäure - - n i t r a t 81, 125, 131, 146, 188, 313f.,317, 321, 325 — p h o s p h a t 384 — -sulfid 197, 254 — -sulfit 408 —thioglycolat s. Thioglycol — -thiosulfat 408 Nemathelminthes 341 Nematoden 44 Netze s. Fischfanggeräte Netzmagen 368f., 371 f. Neulandböden 166 Neutralisation 137,192, 205 f., 885f. Nierenextrakt 188 Nigerdelta 281 Nikotinsäure 139, 374 Nitrate 85f.,98, 132f.,145, 253, 270f.,275, 285f., 313, 317, 324, 331, 334, 337 Nitratreduktion 42,104,131 ff., 145,189, 247 Nitrite 131 ff, 145 Nitrocellulose s. Cellulosenitrat Nördliches Eismeer 266 Ob 285 Obligate Symbiose s. Symbiose Ochsen s. Binder Ökologie der Bakterien 16, 18, 29,82,119ff., 168, 194, 215, 246,262,265ff., 278,294f., 299, 339 — der Celluloseverdauung 358 Ökologische Bassen, ökotypen 253, 341 ölteer s. Teer Oligochaeten 284 Oligonitrophilie 133 Oligosaccharasen 156 Oligosaccharide 11, 97, 150, 157 OMELjANSKische B a k t e r i e n 366, 377

Optimale Medien s. Nährmedien Optische Ebene 44 „Organisches Gel" 160,163 Osazone 257 Osmiumsäure 45 Osmoderma, eremita 353 Osmophilie 215 Osmotischer Druck 115,119 Oxalsäure 122 Oxycellulose 147ff., 151,159,399 Oxydationsprozesse 290

Sachverzeichnis Oxydationstheorie der Cellulosezersetzung 1463., 155, 255 Oxymirus 352 — cwrsor 353 Ozeane 266, 283, 286ff. Paläontologie 48 Palisadenanordnung von Bakterien 64 Pamir 279 Pansen, Pansenextrakt, Pansenflüssigkeit 105,112, 230, 236, 238,240ff.,250,254fi., 860fl„ 372ff. Pantothensäure 139, 190, 250, 374 Paramaecium caudatum 374 Paranüsse 348 Parenchym 337 Papierfabriken 284 —, Waschwasser in 401 Papiermasse 69, 76, 360, 401, 409 Pappe 395, 400f. Paraffinabdichtung 40, 135, 153 Paspalum dilatatum 338 PASTEURpipetten 43, 168, 170, 183 Pectin 1,11,15 f.,36, 126, 148, 272, 337, 343, 345, 363, 384, 386, 393fi., 398f. Pectinbakterien 36, 164, 177, 233 Pectinsäure 148 Pénicillium 379 Pentosan 15f., 126,149, 246, 358, 393f. Pentosen 123, 126, 148ff. PEPPLERsche Methode für Geißelfärbungen 224 Pepton 22, 84fi., 98, 124,131fl., 166,188f., 226, 229, 243,249f., 268,302f.,313, 322, 375, 388 Pergamentpapier 14, 149, 186 Peritriche Begeißelung 49,82ff., 87,94f., 103, 224 Perkai 15 Petroläther 232 Pferde 358ff., 375f. Pferdemist s. Dung Pflanzenpreßsaft 190 PH-Wert s. Acidität Phenol 44, 256, 409ff. Phosphate 317, 323, 337, 361, 384 Phosphor 36,130, 250, 276f. Photosynthese lf., 284 Phycomyces-Test 139 Phytelephas 343 — tnacrocarpa 348, 350 Phytoplankton s. Plankton Pilze 149, 155, 270ff.,282f.,298, 336,339f., 349f., 367, 369, 395fi., 409

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Plankton 123 f., 283, 287 Plasmolyse 51 Platinmohr 198 Platyhdminthes 341 Plectridien, plectridiale Formen 50, 95ff., 177, 180ff.,216, 220S., 252,300, 356, 378 Plectridium 237, 356 — ceMulolyticum 366 Pneumococcus 161 Podangium erectum 55 Podsolboden 273, 277 f. Polare Begeißelung 84 Polarkreis 265 Polkörper 88 Polyangiaceae 53 Polyangium 55 — cellulosum 55, 65 Polyglucuronsäure 147 f. Polymastigina 346 Polyoxysäuren 97 Polyphage Organismen 48, 80,121,125, 246, 312 Polysaccharide 187, 243 Polyuronide, Polyuronsäuren 11, 149 Polyvinylverbindungen 398 Porifera 341 Potosia cuprea Fbr. 173, 356 Präpariernadeln 43 Proactinomyces 48, 138 — actinoides 103 — albicans 104 — cytophagus 103 f. — frudiferi 103 Proactinomyceten 47, lOOfi., 102,132 —, Kultivierung 41 —, Vorkommen 103 Promyxobacteriaceae 53, 55, 56 Promyxobacterium 34, 46, 48, 53, 56, 80,121, 142 n-Propanol 232 Propionsäure 159, 230f., 247,357, 371, 373, 394 Prosporen 179, 181, 220, 222 Proteasen s. proteolytische Fermente Proteine s. Eiweiße Proteolyse, proteolytische Fermente 155, 189, 247, 332, 381 Proteospepton 250 Proteus vulgaris 51 Protozoen, Protisten 24, 288, 341 f., 345fi., 354 f., 360, 861fi., 373£f., 398 Protozoenextrakte 366 Pseudobacterium 80 Pseudobakterien 83

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Sachverzeichnis

Pseudomonas 44, 48f., 80, 82ff., 121 — arguta 83 — droebachense 124 — effusa 83 — ephemerocyanea 83, 126, Tab. 9 — erythra 83, 126, Tab. 9 — gelatica — iridescens 124 — lasia 83, Tab. 9 — minuscula 83 — mira 83 — perlurida 83 — subcreta 83 — tralucida 83 Pseudomorphose 261 Pseudoplasmodien 46, 66, 71 Pseudosaccharomyceten 352 Pufferung 253, 343 Pyridoxin s. Adermin Pyrogallol 253 Quarzlampe 142 Quarzsand 23 Quecksilber — -nitrat 408 —salze 409 — -sulfat 408 Quellen 285 Quellung des Rohmaterials bei technischen Gärungen 386 Quetschpräparate 362

Reinkulturen — durch Erhitzen der Anreicherungskulturen 171 — durch Auswaschen der infizierten Cellulose 32, 173f. —, Isolierung 29 ff. — nach I M S C H E N E Z K I 1 7 4 — von Actinomyceten 42 Reisfelder 280, 282 f. Reisstroh s. Stroh Resazurin 197 Restfestigkeit 407 Reticalotermes hes-peris 354 Reticulitermes 346 Rhagium 353 — bifasciatum 353 — mordax 353 — sycophante 356 Rhamnose 245 Rhizosphäre 278 Rhombenzellen 60 Riboflavin 139, 190, 333, 374 Riesenkolonien 71, 74f., 89 Riesenzellen 56, 180, 182, 240 Rinde 271 f. Rinder 359, 364, 366 f., 371 Roggen, Roggenbrot 227, 359 Roggenkleie 358 Roggenstroh s. Stroh Rohcellulose 358 Rüben 36, 359 Rübenpreßrückstände 186, 382, 384, 386ff. „Rückstoßbewegung" 51 Ruhestadien 31, 45, 54ff., 88, 140 Ruminobacter — flavescens 241 — parvum 240 Rutin 191

Radieschen 378 Räumliche Verteilung der Bakterien in der Faser 44 Raffinose 113f., 187, 245f. Ramie 382 Ratten 374 „Reaktive" Formen 57 Redoxpotential, r H -Wert 114ff., 137, 144, 169, 172, 195ff.,225, 254f.,301,305, 308, Saccharomyces 379 340, 344, 366, 391, 406 f. — cerevisiae 260, 303, 340, Taf. 34 Reduktionsprozesse 290 Saccharose 76, 85, 91, 97,103, U 3 f . , 121 f., Reinheitsprüfungen von Bakterienkulturen 124, 155, 187, 245f., 300,317f., 329, 338, 31,34,175ff., 213,241, 243 393, 401 Reinkulturen 7f., 9, 55, 76f., 81 f., 92f., 96, ' Sägemehl 346, 349, 392 100, 105, 123, 127, 136, 157, 164, 166, Säugetiere 266 168,169ff.,176,184,186f.,192,199f.,203f., Säurefuchsin 151, 347 207, 209ff., 223ff., 231 fi., 246, 248, 251, Säuren, organische 7, 40, 81, 87, 99, 102, 255, 258, 260, 262, 268, 280f., 287, 298, 124, 146, 157f., 178, 192, 199, 202, 204, 301, 303f., 306ff., 319, 322ff„ 329ff., 335, 207, 210ff., 230, 235, 238, 252, 259, 262, 340,344,355,362,364,370ff., 377ff., 383 f., 271,280,299,306ff., 312,323,326 f., 338ff., 387, 393, 397, 402f., 406f. 356, 361, 370, 373, 382ff., 389f. —, Aufbewahrung, AufbewahrungstempeSafranin 181 raturen 35 Sahara 279

Sachverzeichnis Salat 343, 353, 378 Salicin 85, 245f. Salicylsäureanilid 401 Salpetersäure 293 Salpetrige Säure 293 Salzböden 269, 277, 279 f. Salzsäure 193 Salzseen 266, 286 Salzwasser s. Meerwasser Samen 350, 360 Sand, Sandböden 278ff. Saprophyten 28, 33, 95, 170, 176, 228, 248, 254, 272 Sargassomeer 283 Sarcina 48 - lutea 303 „Satelliten"kolonien 137 Sauerstoff 211 f., 223, 253, 255, 290, 370 Sauerstoffdonator 149 Sauerstofipartialdruck 98, 254, 296, 346 Sauerstoffverhältnisse 49f., 104f., 127 f., 135, 140, 143ff., 153, 194ff., 258ff., 361, 391 Schaben 342, 345 Schafe s. Hammel Schaum 169, 182, 225, 227 Scheidenmikroorganismen 160 Scheidewand 51, 182 Schieferteer s. Teer Schiffswurm s. Teredo Schildkröten 357, 359 Schilf 285, 290 Schlamm 69, 103, 166, 260, 268, 269, 287, 290ff., 334, 399 - des Salzwassers 98, 101, 238, 286, 290, 292 - des Süßwassers 98, 101, 238, 290 - von Klärbecken 236, 242, 243f., 254 Schlammvulkane 294f. Schleimdrüsen 360 Schlichte 15 Schmetterlingsraupen s. Larven Schnecken 349, 354 Schrägkulturen 35, 124, 229, 237 Schrot 243 Schüttelkulturen 37f., 128 Schutzmaßnahmen gegen biologische Cellulosezerstörung 3, 395 Schutzreaktion bei Cellulosemikroben 119 Schwarmbildung, Schwarmstadium 45, 51, 66, 71 Schwarzerdeboden 120, 277ff. Schwarzes Meer 349 Schwefel 130, 250 Schwefelbakterien 9, 96, 268

463

Schwefelkohlenstoff 231 Schwefelwasserstoff 85, 177, 189, 191, 229, 233, 295, 370, 373, 380 Schweine 359f., 375 Scolytidae 353 Seen 266f., 285f., 402 Segeltuch 409 Segmentierung bei Proactinomyceten 103 Seide 399 Seile s. Taue SEITZ-Filter 117 Selbstentzündung 298 Selbstvergiftung 181, 220, 363 Selektionsprinzip 33 Serum 190, 226, 242f. Silber — -nitrat 408 — -sulfat 408 Simultankultivierung aerober und anaerober Bakterien 197 f. Sirex phantoma 351 Skatol 232, 249 Sklerenchym 240 Sommer 276, 294 Sonnenlicht s. Licht Sorangiaceae 53, 55, 65 Sorangium 31, 34, 48f., 55, 65, 77ff., 113, 121 ff., 125, 128, 131 ff., 135, 138,141 ff., 161, 284, 293, 401, 409, Tafeln 12, 14 — cellvlosum 55, 65, 69ff, 77, 80, 86, Tabellen 1, 9 , Morphologie und Entwicklungscyclus 70 , Wachstum auf Cellulose 73 , Wachstum auf verschiedenen Medien 74 — compositum 65ff.,73,78, 146, Tabellen 1, 7, 9, Tafeln 11, 13 , Entwicklungscyclus 66 , Morphologie 66 , Wachstum auf Cellulose 67 — nigrescens 68 — nigrum 68 — spumosv/m 68 Sorbit 245 Sori 67 Sparganium 285 Spargel 378 Speichel 361, 366, 375 Speicheldrüsen 345 Sphagnum 337 Spinatextrakt 138 Spirillen 96 Spirochaeta 54, 59

464

Sachverzeichnis

Spirockaeta — cytophaga 29, 45, 571., 147ff., 157, 159, 293, 321 Spirochäten 346ff., 355 Sporen, Sporenbildung 31, 34, 45, 52f.,87f., 94ff., 103f., 107 f., 168,170ff.,177,179ff., 183, 185, 199, 216f., 220ff., 227, 234ff„ 241, 244f., 249,288, 291, 300, 356, 365, 368, 376, 378, 400f. - , Hitzeresistenz 98, 141, 192, 252, 283 —, Keimung 96, 180, 237 — -membran 59, 220 —, Trockenresistenz 98 Sporocytophaga 15, 22, 24, 29, 31, 33 f., 45, 48ff., 53ff., 57 f., 69ff., 66, 74, 77, 80, 86, 88f, 91, 93,113,115ff, 121,129,131,133, 135, 138f., 141 ff., 153ff., 229, 240, 273, 276, 281, 292, 293,296,314f., 319,321ff., 326, 331 ff., 338,355, 399, Tafeln 6, 9, 10, 30 —, Entwicklungsgeschichte 59 — eUipsospora 32, 55, 59ff., 114,127,143f., 266, 287, Tabellen 1, 7, 9, 10, Tafeln 5, 6,7 — myxococcoides 32, 55, 58, 59ff., 112ff., 116, 118fi.,123, 126 f., 133 f., 139,140ff., 153, 161, 239f., 266, 287, 296, 313ff., 320f., 324,330ff., 340,369, 399, 403, 408, 411, Tabellen 1, 7, 9, 10, Tafeln 4, 5, 7, 8, 9, 10, 31, 32 Sporovibrio 88, 96, 237 Spurenelemente s. Mikroelemente Stachybotris aUernans 403 Stärke 21, 31, 36, 87,102,112ff., 121ff., 133, 138, 185, 187, 217, 227, 237, 243,245f., 300, 329, 341 ff., 348, 350, 353,360ff.,372, 376ff., 382, 384, 388, 390, 393, 395, 401 Stärke-Agar 33, 35, 68, 70,73ff.,85, 87, 89, 91, 97, 99,168, 344 Stärkehydrolyse 75, 77, 79, 85,91,97,102 f., 245, 255, 299, 339, 381 Stärkekleister 390 Staub 396, 400 Steinkohlenteer s. Teer Stengel 271, 343 Stenotherme Bakterien 191 „Sterile" Agar-Blöckchen 32, 173 Sterilisation durch Hitze22,31,115ff., 168f., 172, 187, 311 f. — durch Filtration 22, 31, 116, 311 Stickstoff 211 f., 234f., 254, 274, 275f., 287, 295, 298, 370 Stickstoffanreicherung des Bodens 320 Stickstoffbakterien 9, 290, 308ff.

Stickstoffbedarf der Bakterien 6, 28,85,97 f., 267 Stickstoffbedarf und Cellulosezersetzung 41 Stickstoffbestimmung 311, 314 Stickstoffbilanz 335 Stickstoffixierung 248, 267, 309ff., 320ff. Stickstoffkreislauf 382 Stickstoff, mineralischer 81, 87, 98f., 135, 166, 187, 189f., 276, 302, 304, 369 : 373, 384 -.organischer 36, 81, 84ff., 98f., 132, 137, 172, 185, 189, 191, 199, 223,225f., 237 f., 247ff., 302ff., 340, 366, 370, 375, 395 Stickstoffverhältnisse 364 Störstellen im Cellulosemolekül 10, 12 Stoffdichte 386 Streblomastix 346 Streptococcus 48 — jodophilua 239, 367 f. Streptokokken 57, 217, 239ff., 364, 369. Strichimpfung s. Impfen Stroh 10, 16, 105, 186, 273, 275, 298, 321, 333, 335, 337 f., 340,358ff., 364, 377, 382, 394 Strohzellstoff s. Zellstoff Stuhlgang s. Exkremente Successive Verdünnung 28, 32, 171 f., 219, 273, 281, 292, 310, 365ff. Süßwasser s. Flußwasser Sulfatbildung 290 Sulfatreduktion 177, 191, 229, 233, 295, 380 Sulfitzellstoff s. Zellstoff Sumpfböden 277 „Sumpfgas" 236 Symbiose 29, 136, 153, 298ff., 329ff. —, obligate 175, 365 — von aeroben mit anaeroben Mikroorganismen 304f. — von Cellulosebakterien mit Hefen 340 — von Cellulosebakterien mit anderen Mikroorganismen 11, 24, 140,145,175 f., 189, 225ff„ 233, 241, 271, 299 — von Cellulosebakterien mit Pflanzen 4, 8 — von Cellulosebakterien mit stickstoffbindenden Bakterien 308ff. — von Cellulosebakterien mit Tieren 4, 8 Tamanhalbinsel 294 Tannin 410f. Tannipus 284 „Tanzende Kommas" 88 Tau, Taubildung 279 Taue, Tauwerk 144, 286, 395, 398f.,400,409

Sachverzeichnis Teer 407, 409ff. Temperatur, Temperaturbereich 28, 52, 86, 96, 98, 112, 139ff., 169, 191 f., 200, 203, 211, 213, 216, 229, 238,243, 250ff.,26ö, 276, 283, 295ff.,308,314, 323, 325, 337, 341, 346, 356, 358, 361, 367, 372, 382, 388, 396, 406 Temperaturkonstanz 43 Temperaturverhalten s. Temperatur Teredo 4, 342, 349, 354 — navalia 342, 349 — norvegica 349 Terminosporus 216 — thermocellulolyticus 216 Termiten 4, 104f., 345ff., 350, 354f., 357 Termopsis 346, 355 — angusticollia 345 Testobjekte für den Cellulasenachweis 343 Tetrachlorkohlenstoff 232 Textilien 3, 396ff., 402 Textilprüfung 396 Thermogenese 298 Thermophilie 215 Thioglycol 254 Thymol 256, 258, 372 Tipula oleracea 356 Tipvlidae 350 Toluol 159, 256f., 325, 343f., 372 Torf 69, 130, 266, 275f., 296ff., 321, 333, 335f. —, bioazotierter 336f. Torfböden 277 Torfhydrolyse 337 f. Torfveredlung 298 Torulopsis 352 — rufvia 340 — utilis 340, Taf. 34 Transparente Zonen s. Hydrolysenzonen Treberrückstände 250 Trehalose 243, 245 Treibhausböden 266, 269 Trichoderma koningii 130 — lignorum 403, 408, 411 Trichomonas 346 — termopaidia 345 Trichonympha 346 — campanula 347, 362 Tropaeolum 343 Tropen 265f., 398, 402 Trüschen 285 Trypsin 155 Trypton 250 Tuberkelbazillus 47

465

„Typ mit langen Sporen" bei sporenbildenden Bakterien 95 Tyrosin 133 Übergangsformen erster Ordnung 59, 64 — zweiter Ordnung 59, 60, 64 Ukraine 110 Ultraviolettes Licht 142 Ultrazentrifuge 10 Ulva lactuca 287 „Ungleichmäßige Teilung" 182 Uracil 365 Uronsäuren 148 f., 151,161 Vampyrella 4 — pendula 345 — apirogyrae 345 Vaselinöl 195, 200, 366, 391 Verdaulichkeit der Cellulose 359 — des Futters 376f. Verdauung 105, 342fi., 353fi. Verdauungsdrüsen 360 Verdauungssaft s. Verdauung Verdauungstrakt 218f.,236, 239, 241,341 f., 3 4 5 , 363f., 3 5 6 , 857fi., 3 5 9 , 3 6 5 , 367FF., 3 7 2 1 1 . , 377ff. Verdünnungsmethode s. Successive Verdünnung Verfahren nach C H O L O D N Y 2 8 8 — nach C H R I S T E N S E N 270, 275, 295 — nach D O K U T S C H A J E W - W I L J A M S 2 7 1 — nach D R E I E R - K O R O L E W 3 6 — nach W I N O G R A D S K I 3 6 — zur Anreicherung organischer Säuren 390 — zur Prüfung der Beständigkeit von Cellulosematerialien 402 ff. Verstaubung s. Staub Verzweigungen 84, 101 ff., 179 Vibrio 10, 15, 24, 31, 48 f., 87 ff., 113, 131, 142, 153, 157, 283, 293, 296, 319, 322, 324 — agarliquefaciens 124 — amylocella Tab. 9 — beijerinckii 123 — fulvus 92, 134, Tabellen 1, 9, 10 — fuscus 124 — granii 124 — ochraceus 408, 411 — vulgaria 89, 92, 127, 134, 152f., 158,317, 403, 408, 411, Tabellen 1, 9, 10, Taf. 15 Vibrionen 44, 47, 50, 83ff., 87ff., 94f„ 99ff., 113f., 120S., 128, 131ff., 224, 233, 237, 243, 266, 270£f., 276, 279ff.,287,292,312, 325, 331

466

Sachverzeichnis

Vibrionen —, Morphologie 88 —, sporenbildende 237 —, thermophile 96 —, unechte 93 —, Wachstum auf Cellulose 88 —, Wachstum auf anderen Medien 89 Viersektorenmethode nach W I N O G R A D S K I 25 VIGNAL-VEYON-Röhrchen 183

Viskoseseide 396f. Viskosität 203 Vitamine 15, 86, 99, 186ff., 166, 172, 185, 187, 189ff., 223, 225f., 237f., 246ff., 267, 270,295,302ff., 328, 333f., 340, 348, 352, 366, 369 f., 374, 376 B-Vitamine 249f, 303f., 366 Vitamin B12 365 D-Vitamine 249 Vitamin P 191 Vögel 358 Vorkultivierung 406 Vormagen 368 Wachs 15 Wachstumszonen 23 Waldböden 93, 279 WARBURG-Apparatur 116, 365

Warmblüter 47, 243 Wasser 69, 266, 377 —, freies 80, 91 —, gebundenes 79 Wasserfestigkeit 409 Wasserglas 20 Wassermangel 142 Wasserpest s. Elodea Wasserpflanzen 283, 286f., 291, 345 Wasserstoff 159, 196, 207ff., 231, 234ff,254, 263 f., 370, 373, 394 Wasserstoffbakterien 81, 170, 192, 219, 221, 225, 234f., 251, 258, 329, 370, 394 Wasserstrahlpumpen 205 Wassertechnische Anlagen 293 f. Watte 14f.,16,23, 36, 40,154,156,164, 186, 333 Weinbergschnecke s. Helix pomatia Weinsäure 122 Weizen, Weizenkörner 282, 402 Weizenstroh s. Stroh Wiederkäuer 105, 112, 218f., 231, 236ff., 354ff„ 364ff., 372ff., 383

Wimperrand 79 Winter 291 Wirbellose 284, 841ff„ 354, 356, 374 Wirbeltiere 354, 360 Wirkungsgruppen von Fermenten 131 Wolgadelta 106, 266, 284, 287 Wolgaufer 54, 65, 93 Wrangelinseln 286 Wuchsstoffe 191, 303, 356 Würmer 342 Würze-Agar 91, 340 Wüstenboden 266, 272 Wurzelzersetzung 36, 105,163, 271, 278, 320 Xanthin 365 Xanthogenat 42 Xerophile Organismen 274 Xestobium 351 — rufovillosum 351 Xylan 11, 121, 245 Xylosazon 148 Xylose 85, 97, 113, 114, 121, 124, 125, 187, 245f., 372 Xylotrupes bajulus 351, 353 Ysotricha 361 Zählkammern 35 Zellkern 46, 51, 57, 60, 66, 77, 80,181, 225 Zellstoff 186, 359, 383 f., 392, 409 Zellteilung 45, 51, 57, 314 — durch Einschnürung 51, 57, 70,72,80,93 Zell wand 126, 163, 240, 272, 337, 343, 345, 348, 350, 377 — der Myxobakterien 51, 56 —, verholzte 10 —Zerstörung 402 —Zusammensetzung bei niederen Pflanzen 1 Zeltleinen s. Leinengewebe Zerstörung von Industrieerzeugnissen 395 ff. — von Kabelisolierungen 897 f. Zigarettenpapier 14, 186 Zinkchlorid 20, 42 Zinn 391 f. Zönose s. Biozönose Zooglöen 160 „Zotten" 224 Zuckerbestimmung 257, 345 — nach B E R T R A N D 41, 153, 200f.,207,214 — nach H A G E D O R N - J E N S E N 3 4 3 Zwölffingerdarm 368f., 373