Lehrbuch der Biochemie [2., aktualisierte & erweiterte Auflage] 9783527326679

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"Donald Voet, Judith G. Voet

®WILEY-VCH

und Charlotte W. Pratt

Lehrbuch der Biochemie Übersetzungsherausgeber: Annette G. Beck-Sickinger und Ulrich Hahn

Zweite, aktualisierte und erweiterte Auflage

Gebräuchliche biochemische Abkürzungen

AMP ATCase ATP BChl

bp BPG BPheo BEN @ CaM CAM cAMP

CAP CDK cDNA

CDP CE Chl CM CMP

Adenin Aminoacyl-tRNA-Synthetase Acyl-CoA: Cholesterin-Acyltransferase Acylcarrier-Protein Adenosin-Desaminase Adenosindiphosphat acquired immunodeficiency syndrome ö-Aminolävulinsäure Adenosinmonophosphat Aspartattranscarbamoylase Adenosintriphosphat Bakteriochlorophyll Basenpaar p-2,3-Bisphosphoglycerat Bakteriophaeophytin bovine pancreatic trypsin inhibitor Cytosin Calmodulin crassulacean acid metabolism cyclo-AMP catabolite gene activator protein Cyclin-abhängige Proteinkinase komplementäre DNA Cytidindiphosphat Kapillarelektrophorese Chlorophyll Carboxymethyl Cytidinmonophosphat

ER ESI ETF FAD FADH, FADHFBP FBPase

Fd FH fMet FMN F1P F2,6P F6P

Glutamatdehydrogenase

CoA oder

CoASH CoQ

coX GBS RP,

Coenzym A Coenzym Q (Ubichinon) Cyclooxygenase Carbamoylphosphat-Synthetase Cytidintriphosphat Dalton desoxy 1,2-Diacylglycerin Dicyclohexylcarbodiimid didesoxy 2',3’-Didesoxy-Nucleosidtriphosphat Diethylaminoethyl Dihydroxyacetonphosphat Dihydrofolat Dihydrofolat-Reduktase Desoxyribonucleinsäure 2,4-Dinitrophenol

2'-Desoxy-Nucleosidtriphosphat Elongationsfaktor enzyme-linked immunosorbent assay Elektronenmikroskopie electromotive force Erythrose-4-phosphat

endoplasmatisches Reticulum Elektrosprayionisierung Elektronen übertragendes Flavoprotein Flavinadenindinucleotid (oxidiert) Flavinadenindinucleotid (reduziert) Flavinadenindinucleotid (Radikal) Fructose-1,6-bisphosphat Fructose-1,6-bisphosphatase Ferredoxin familiäre Hypercholesterinämie N-Formylmethionin Flavinmononucleotid Fructose-1-phosphat Fructose-2,6-bisphosphat Fructose-6-phosphat Guanin y-Aminobuttersäure Galactose N-Acetylgalactosamin Glycerinaldehyd-3-phosphat Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase

GTP

GSSG Hb HDL HIV

HMG-CoA hn RNA HPLC

Hsp HTH HAyl

Hyp IDL IF IgG IMP IP; IPTG IR

Guanosindiphosphat Glucose N-Acetylglucosamin Guanosinmonophosphat Glucose-1-phosphat Glucose-6-phosphat Glucose-6-phosphatdehydrogenase Glycosylphosphatidylinositol Glutathion general transcription factor Guanosintriphosphat Glutathiondisulfid Hämoglobin high density lipoprotein human immunodeficiency virus ß-Hydroxy-ß-methylglutaryl-CoA heterogene nucleäre RNA high-performance liquid chromatography (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie) Hitzeschock-Protein helix-turn-helix 5-Hydroxylysin 4-Hydroxyprolin intermediate density lipoprotein Initiationsfaktor Immunglobulin G Inosinmonophosphat Inositol-1,4,5-triphosphat Isopropylthiogalactosid Infrarot

Il

Gebräuchliche biochemische Abkürzungen

NeuNAc NMN NMR nt

NTP OEC OMP ORF P oder p PAGE PBG PC PCNA PCR PDB PDBid PDI PDB PE PEP PEPCK PFG PFK 2PG 3PG PGI PGK PGM Pheo

P; PIC PIP, PK PKA PKB PKU

Insertionssequenz iron-sulfur protein Kilobasenpaar Kilodalton Michaelis-Konstante Lactatdehydrogenase low density lipoprotein light harvesting complex matrix-assisted desorptin-ionization Mannose Myoglobin messenger RNA N-Acetylmuraminsäure Nicotinamidadenindinucleotid (oxidiert) Nicotinamidadenindinucleotid (reduziert) Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (oxidiert) Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (reduziert) N-Acetyl-Glucosamin N-Acetylmuraminsäure N-Acetylneuraminsäure Nucleosiddiposphat Nucleotidexcisionsreparatur N-Acetylneuraminsäure Nicotinamidmononucleotid nuclear magnetic resonance Nucleotid Nucleosidtriphosphat oxygen evolving center Orotidinmonophosphat offenes Leseraster Phosphat Polyacrylamid-Gelelektrophorese Porphobilinogen Plastocyanin proliferating cell nuclear antigen polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) Protein Data Bank PDB Identifikationscode Proteindisulfid-Isomerase Protein Data Bank Phosphatidylethanolamin Phosphoenolpyruvat PEP-Carboxykinase Pulsfeldgelelektrophorese Phosphofructokinase 2-Phosphoglycerat 3-Phosphoglycerat Phosphoglucose-Isomerase Phosphoglycerat-Kinase Phosphoglycerat-Mutase Phaeophytin Orthophosphat, anorganisches Phosphat Präinitiationskomplex Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat Pyruvatkinase Proteinkinase A Proteinkinase B Phenylketonurie

Pyridoxal-5’-phosphat protonmotive force Pyridoxamin-5’-phosphat Purinnucleotid-Phosphorylase DNA-Polymerase Pyrophosphat 5-Phosphoribosyl-a-pyrophosphat Photosystem Protein-Tyrosinkinase Protein-Tyrosin-Phosphatase Ubichinon (CoQ)

Ubichinol ribo raues endoplasmatisches Reticulum Release-Faktor (Freisetzungsfaktor) oder replikative Form Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus Radioimmunoassay Ribonucleinsäure RNA-Interferenz ribosomale RNA Reverse Transkriptase Rezeptor-Tyrosinkinase

Ribulose-1,5-bisphosphat Svedberg-Einheit S-Adenosylmethionin severe combined immunodeficiency disease sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) small nuclear RNA (kleine nucleäre RNA)

small ribonuclear protein (kleines Ribonucleoprotein) Superoxiddismutase soluble NSF attachmet protein SNAP-Rezeptor Sedoheptulose-7-phosphat signal recognition particle Einzelstrang-Bindeprotein signal transducer and activator of transcription Thymin TBP-assoziierter Faktor TATA-Box-Bindeprotein tricarboxylic acid (Tricarbonsäure) Tetrahydrofolat Triosephosphat-Isomerase Trinitrobenzolsulfonsäure Thiaminpyrophosphat Transfer-RNA Thymidintriphosphat Uracil Uridindiphosphat UDP-Glucose Uridinmonophosphat Uridintriphosphat Ultraviolett very low density lipoprotein maximale Geschwindigkeit Xanthosinmonophosphat Xylulose-5-phosphat yeast artificial chromosome Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe (Yeast)

DonaldJ. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Lehrbuch der Biochemie

Lehrbücher bei Wiley-VCH

Krauss, G.

Biochemistry of Signal Transduction and Regulation 2008 ISBN: 978-3-527-31397-6

Cotterill, R.

Biophysik Eine Einführung 2008 ISBN: 978-3-527-40686-9

Garratt, R. C., Orengo, C. A.

The Protein Chart 2008 ISBN: 978-3-527-31963-3

Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P.

Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie 2005 ISBN: 978-3-527-31160-6

Whitford, D.

Proteins Structure and Function 2005 ISBN: 978-0-471-49894-0

Pingoud, A., Urbanke, C., Hoggett, J., Jeltsch, A.

Biochemical Methods A Concise Guide for Students and Researchers 2002 ISBN: 978-3-527-30299-4

Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Lehrbuch der Biochemie

Zweite, aktualisierte und erweiterte Auflage Übersetzung herausgegeben von Annette G. Beck-Sickinger und Ulrich Hahn

Übersetzt von Bärbel Häcker, Otmar Asperger, Regula von Eggelkraut-Gottanka, Norman

Koglin, Ulrike Krauss, Michael

Langer, Maria Ludewig,

Michael Richter

WILEYVCH

WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA

Donald Voet University of Pennsylvania Judith G. Voet Swarthmore College

Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für

Charlotte W. Pratt Seattle Pacific University

die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung

Tiel der Originalausgabe:

der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese

Fundamentals of Biochemistry Life at the Molecular Level/Third edition

detaillierte bibliografische Daten sind im Internet

Bibliografische Information

Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;

über abrufbar.

Copyright © 2008 John Wiley & Sons, Inc. © 2010 WILEY-VCH

Verlag GmbH

& Co. KGaA,

All rights reserved.

Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany

Authorized translation from the English language edition published by John Wiley & Sons, Inc.

Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten.

Kein Teil dieses

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Professor Dr. Annette G. Beck-Sickinger

- reproduziert oder in eine von Maschinen, ins-

Universität Leipzig Institut für Biochemie

besondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in

Talstraße 33 04103 Leipzig

diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme,

Professor Dr. Ulrich Hahn Universität Hamburg Biochemie und Molekularbiologie Martin-Luther-King-Platz 6 20146 Hamburg

dass diese von jedermann frei benutzt werden

dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. Printed in the Federal Republic of Germany

1. Auflage 2002 2., aktualisierte und erweiterte Auflage 2010

Gedruckt auf säurefreiem Papier.

ISBN: 978-3-527-32667-9

Satz Hagedorn Kommunikation, Viernheim

Druck und Bindung Himmer AG, Augsburg Umschlaggestaltung Formgeber, Eppelheim

Die Autoren

Die Autoren

Donald Voet erhielt den B.S. in Chemie am California Institute of Technology, den Ph.D. in Chemie an der Harvard University bei William Lipscomb und arbeitete nach der Promotion am Biology Department des MIT mit Alexander Rich. Nach Fertigstellung dieser Forschungsarbeiten wurde er an die University of Pennsylvania berufen, wo er in den vergangenen 39 Jahren eine Vielzahl biochemischer Kurse gab und auch allgemeine Chemie lehrte. Sein Hauptforschungsgebiet ist die Röntgenstrukturanalyse von Biomolekülen. Er war Gastdozent an der Oxford University, der University of California in San Diego und am Weizmann Institute of Science in Israel. Zusammen mit Judith G. Voet ist er CoChefredakteur der Zeitschrift Biochemistry and Molecular Biology Education. Er ist Mitglied des Education Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Seine Hobbies sind Rucksacktouren, Tauchen, Skifahren, Reisen, Photographieren und das Schreiben biochemischer Lehrbücher. Judith („Judy“) Voet erhielt den B.S. in Chemie am Antioch College und den Ph.D. in Biochemie an der Brandeis University bei Robert H. Abeles. Sie arbeitete nach der Promotion an der University of Pennsylvania, am Haverford College und am Fox Chase Cancer Center. Zu ihrem Hauptforschungsgebiet gehören enzymatische Reaktionsmechanismen und enzymatische Hemmung. Sie lehrte Biochemie an der University of Delaware, bevor sie an das Swarthmore College wechselte. Sie lehrte dort 26 Jahre lang und erhielt die James H. Hammons Professur für Chemie und Biochemie bevor sie ein „permanentes Forschungsfreisemester“ antrat. Sie war Gastdozent an der Oxford University, an der University of California in San Diego, an der University of Pennsylvania und am Weizmann Institute of Science in Israel. Sie ist Co-Chefredakteurin der Zeitschrift Biochemistry and Molecular Biology Education. Sie war Mitglied des Education and Professional Development Committee der American Society for Biochemistry and Molecular Biology und des Education Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Ihre Hobbies sind Wandern, Rucksacktouren, Tauchen und Stepptanz.

Charlotte Pratt erhielt den B.S. in Biologie an der Universität von Notre Dame und den Ph.D. in Biochemie an der Duke University unter der Anleitung von Salvatore Pizzo. Obwohl sie ursprünglich vorhatte Meeresbiologin zu werden, entdeckte sie, dass die Biochemie die vielversprechendsten Antworten auf viele Fragen zu biologischen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und zu den molekularen Grundlagen für Gesundheit und Krankheiten beim Menschen bot. Nach der Promotion forschte sie am Center for Thrombosis and Hemostasis an der University of North Carolina in Chapel Hill. Sie lehrte an der University of Washington und lehrt z. Zt. an der Seattle Pacific University. Darüberhinaus hat sie mehrere biochemische Lehrbücher mitgestaltet. Sie ist Mitautorin von Essential Biochemistry und von früheren Auflagen von Fundamentals of Biochemistry.

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Vorwort der Autoren

In den letzten Jahren waren enorme Fortschritte in der Biochemie, insbesondere auf den Gebieten der Strukturbiologie und der Bioinformatik zu beobachten. Vor diesem Hintergrund haben wir uns‘gefragt, was Studenten der modernen Biochemie wirklich wissen müssen und wie wir, als Autoren, ihnen dabei helfen können dieses Wissen zu erwerben. Wir kamen zu dem Schluss, dass es wichtiger denn je ist, eine solide biochemische Grundlage mit dem entsprechenden chemischen Hintergrundwissen zu vermitteln, um die Studenten auf die wissenschaftlichen Herausforderungen der Zukunft vorzubereiten. Mit diesem Ziel haben wir den Inhalt des Lehrbuch der Biochemie überarbeitet, uns auf die grundlegenden Prinzipien konzentriert, dem Text den letzten Schliff verliehen und die Didaktik innerhalb des gesamten Buchs weiter verbessert, damt es für die Studenten noch besser zugänglich wird. Gleichzeitig haben wir neues Material hinzugefügt und es so in den bestehenden Inhalt eingefügt, dass die Studenten die neue Information im Kontext aufnehmen können. Wir glauben, dass Studenten am besten mit einem Lehrbuch gedient ist, das umfassend ist, verständlich geschrieben ist, und das Hintergrundwissen zu einem biochemischen Verständnis des menschlichen Organismus liefert.

Neue Inhalte Die neueste Auflage des Lehrbuch der Biochemie enthält wichtige Änderungen und wurde inhaltlich auf den neuesten Stand gebracht. Zu diesen Änderungen gehören: © Das neue Kapitel 13, Biochemische Signale, beschäftigt sich mit der Rolle von Hormonen, Rezeptoren, G-Proteinen, sekundären Botenstoffen und an-

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°

deren Aspekten der inter- und intrazellulären Kommunikation. Diesen Themen ein eigenes Kapitel zu widmen erlaubt eine umfassendere Behandlung dieses sich schnell verändernden Fachgebiets, das u. a. für das Verständnis von Prozessen des Stoffwechselkontrolle oder der Entstehung von Tumoren entscheidend ist. Kapitel 14 (Einführung in den Stoffwechsel) enthält eine neue Einführung zu Vitaminen, Mineralien und Makronährstoffen als Teil einer systemischen Betrachtung des menschlichen Stoffwechsels. Die detaillierte Behandlung der DNA-Chip-Technologie und deren Anwendung spiegelt die rasante Entwicklung auf diesem Gebiet wider. Ein neu aufgenommener Abschnitt über die Systembiologie behandelt die Felder der Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik und beschreibt einige der dort zum Einsatz kommenden modernen Methoden. P/O-Verhältnisse wurden in allen Stoffwechsel-Kapiteln auf den neuesten Stand gebracht, so dass jedes Elektronenpaar aus NADH nun 2,5 ATP anstatt 3 ATP entspricht, im Einklang mit neuesten Forschungsergebnissen. Kapitel 22 (Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation) wurde umfangreich überarbeitet, um neueste Erkenntnisse über den humanen Stoffwechsel berücksichtigen, mit einem neuen Abschnitt zur Stoffwechsel-Homöostase und zur Regulierung von Appetit und Körpergewicht beim Menschen. Neue Abschnitte zur CAMP-abhängigen Proteinkinase, zu Adiponectin und verwandten Hormonen zeigen die jüngst entdeckte Biochemie, die hinter dieser Stoffwechselregulierung steckt. An vielen weiteren Stellen wurde neues Material aufgenommen, um die Fortschritte in vielen Gebieten der Biochemie zu dokumentieren. So gibt es z. B. neue Erkenntnisse über die Analyse von genetischen Fingerabdrü-

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Vorwort der Autoren

cken mithilfe von STR-Stellen, über bakterielle Biofilme, virale Membranfu-

sion, Struktur und Funktionen von Ionenkanälen und ABC-Transportern, Chromatinstruktur, zu Faktoren der Transkriptionsinitiation und zur posttranskriptionalen Modifikation von Proteinen. Wir haben besondere Sorgfalt auf die Didaktik der Texte verwandt und uns bemüht, durch zahlreiche kleine Verbesserungen und Ergänzungen den Studenten das Lernen mit dem Buch zu erleichtern: ® Viele Makromolekülstrukturen wurden um neu entdeckte Details erweitert, und mehr als 100 Abbildungen wurden auf den neusten Stand gebracht. ® Durchgehend werden nun Übersichtsabbildungen zum Stoffwechsel eingesetzt, um die physiologische Funktion der verschiedenen Stoffwechselwege zu zeigen. ® Beiden Exkursen wurde die Reihe „Berühmte Biochemiker“ neu aufgenommen, die die wissenschaftliche Bedeutung der Arbeiten von 23 herausragenden Biochemikern zum Gegenstand hat. Diese Exkurse vermitteln ein besseres Verständnis davon, wie Fortschritte in der Forschung zustande kommen und zeigen auch die menschliche Seite der Biochemie. ® Am Ende eines jeden Unterkapitels finden sich jetzt Verständnisfragen zum vorangegangenen Text, die eine rasche Lernkontrolle ermöglichen. ® Mehr als 50 neue Aufgaben mit den dazugehörigen Lösungen wurden am Kapitelende hinzugefügt, um den Studenten ausreichend Gelegenheit zu geben, ihr Wissen anzuwenden. ® Neue Übersichtsabbildungen fassen komplexe Stoffwechselwege und deren Wechselbeziehungen zusammen.

Aufbau des Lehrbuchs Wie in der ersten Auflage beginnt das Buch mit zwei einleitenden Kapiteln über den Ursprung des Lebens, Evolution, Thermodynamik, die Eigenschaften von Wasser und die Säure-Base-Chemie. Nucleotide und Nucleinsäuren werden in Kapitel 3 behandelt. Das Verständnis der Strukturen und Funktionen dieser Moleküle ist eine Voraussetzung für die nachfolgende Beschreibung von Evolution und Stoffwechsel der Proteine. In vier weiteren Kapiteln (Kapitel 4 bis 7) werden die Aminosäurechemie, Methoden zur Analyse von Proteinstruktur und -sequenz, Sekundär- bis Quartärstruktur von Proteinen, Proteinfaltung und -stabilität sowie Struktur-Wirkungs-Beziehungen in Hämoglobin, Muskelproteinen und Antikörpern erklärt. Kapitel 8 (Kohlenhydrate), Kapitel 9 (Lipide) und Kapitel 10 (Membrantransport) komplettieren diesen Teil zu den Biomolekülen. Die nächsten drei Kapitel beschäftigen sich mit Proteinen in Aktion und führen die Studenten zuerst in den enzymatische Katalyse ein (Kapitel 11) und lotsen sie dann durch die Diskussion der Enzymkinetik, Hemmung und Regulation (Kapitel 12). All diese Themen werden in Kapitel 13 noch vertieft, welches die Komponenten der biochemischen Signalwege beschreibt. Die Stoffwechselwege werden in den nächsten Kapiteln behandelt. Dieser Teil beginnt mit einem einleitenden Kapitel (Kapitel 14), das einen Überblick über Stoffwechselwege, Thermodynamik von „energiereichen“ Verbindungen und Redoxchemie liefert. Zentrale Stoffwechselwege werden im Detail dargestellt (z. B. Glykolyse, Glykogenstoffwechsel und Citratcyclus in den Kapiteln 15 bis 17). Dabei sollen die Studenten lernen, wie Enzyme einzelne Reaktionen katalysieren und zusammenwirken, um komplizierte biochemische Aufgaben zu erfüllen. Kapitel 18 (Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung) und 19 (Photosynthese) vervollständigen die Betrachtung des Energiestoffwechsels. Nicht alle Stoffwechselwege werden im Detail behandelt, darunter viele, die mit Lipiden (Kapitel 20), Aminosäuren (Kapitel 21) und Nucleotiden (Kapitel 23) in Verbindung stehen. Statt dessen werden ausgewählte enzymatische Reak-

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Vorwort der Autoren

tionen herausgegriffen, die aufgrund ihrer interessanten Chemie oder ihrer regulatorischen Funktion von Bedeutung sind. Kapitel 22 befasst sich mit der metabolischen Spezialisierung von Organen und der Regulation des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Mit Kapitel 24 beginnend, das sich mit der Struktur der DNA und ihrer Wechselwirkung mit Proteinen befasst, beschreiben die letzten fünf Kapitel die Biochemie von Nucleinsäuren. Die Kapitel 25 bis 27 behandelt die Prozesse der Replikation, Transkription und Translation. Besonderes Augenmerk gilt hier den molekularen Mechanismen der RNA- und Proteinmoleküle, die diese Prozesse ausführen. Kapitel 28 schließlich beschäftigt sich mit einer Vielzahl von Mechanismen zur Regulation der Genexpression, einschließlich des HistonCodes und der Rolle der Transkriptionsfaktoren, ihrer Rolle bei der Enstehung von Krebs und bei der Embryonalentwicklung.

Lernhilfen Viele Lernhilfen, die schon in der ersten Auflage des Lehrbuch der Biochemie zum Einsatz kamen, wurden beibehalten: ®e Die Kapitel sind zur leichten Orientierung in nummerierte Abschnitte untergliedert. Wichtige Sätze sind durch Kursivdruck hervorgehoben. Wichtige Begriffe sind fett gedruckt. Am Ende eines jeden Kapitels befindet sich eine Liste der wichtigsten Begriffe. Im Anhang befindet sich ein umfassendes Glossar mit über 1200 Begriffen. Für viele Stoffwechselprozesse existieren Übersichtsabbildungen. © Überall im Text zeigen a die Details zu enzymatischen Reaktionmechanismen. © Es gibt zu thermodynamischen und anderen Berechnungen zahlreiche Rechenbeispiele. ° Inder Abbildungslegende ist der PDB-Identifikationsschlüssel für jede Molekülstruktur angegeben, so dass Studenten sie aus dem Internet herunter laden und die Strukturen selbst untersuchen können. ° 88 Exkurse beleuchten wissenswerte Aspekte zur medizinischen Bedeutung, zu modernen Techniken oder zu historischen Perspektiven. ° Am Ende eines jeden Kapitels steht eine nummerierte Zusammenfassung. ° Am Kapitelende befindet sich eine umfangreiche Liste von Aufgaben (mit den kompletten Lösungen im Anhang). ° Zu jedem Kapitel gibt es eine Literaturliste, ausgewählt nach Relevanz und Verständlichkeit. Soweit wie möglich ist neben den meist englischsprachigen Originalarbeiten auch deutschsprachige Literatur berücksichtigt.

D. Voet, J. G. Voet, C. W. Pratt

Übersetzer

Übersetzer

Kap. 1: Otmar Asperger und Bärbel Häcker Kap. 2: Michael Langer Kap. 3: Michael Richter und Bärbel Häcker Kap. 4 und 5: Norman Koglin und Bärbel Häcker Kap. 6 und 7: Ulrike Krauss und Bärbel Häcker Kap. 8: Regula von Eggelkraut-Gottanka und Bärbel Häcker Kap. 9 und 10: Maria Ludewig und Bärbel Häcker Kap. 11 und 12: Ulrike Krauss und Bärbel Häcker Kap. 13 Bärbel Häcker Kap. 14, 15 und 16: Regula von Eggelkraut-Gottanka und Bärbel Häcker Kap. 17 und 18: Otmar Asperger und Bärbel Häcker Kap. 19 und 20: Maria Ludewig und Bärbel Häcker Kap. 21 und 22: Norman Koglin und Bärbel Häcker Kap. 23: Michael Richter und Bärbel Häcker Kap. 24 und 25: Michael Langer und Bärbel Häcker Kap. 26 und 27: Michael Richter und Bärbel Häcker Kap 28: Michael Langer und Bärbel Häcker Glossar: Otmar Asperger und Claudia Horstmann

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Danksagung An der Entstehung dieses Lehrbuchs wirkten viele Personen mit, von denen wir die Folgenden besonders erwähnen möchten: Laura lerardi hat aus Texten, Abbildungen und Tabellen die Seiten des Buchs komponiert, Suzanne Ingrao, unser Production Coordinator, hat die gesamte Herstellung koordiniert, Madelyn Lesure war verantwortlich für die Typographie und das Titelbild, Kevin Molloy, unser Acquisitions Editor, hat das Projekt bis zu seinem Weggang organisiert, Petra Recter, Associate Publisher, lotste uns zur Publikation. Hilary Newman und Elyse Rieder suchten und verwalteten unzählige Bilder für das Buch, Connie Parks, unsere Copy-Editorin, hat dem Manuskript den letzten Schliff gegeben und viele Fehler eliminiert. Sandra Dumas war unser Production Editor bei Wiley, Sigmund Melinowski war für die Abbildungen verantwortlich und wurde von Joan Kalkut und Elizabeth Morales unterstützt. Amanda Wainer leitete die Marketingkampagne. Besonderer Dank gilt Geraldine Osnato und Aly Rentrop, unseren Projekt Editors für die Bewältigung des vielen Zusatzmaterialien, sowie unserem Media Editor Tom Kulesa, der Medienressourcen, Webseite und WileyPLUS-Version wesentlich weiterentwickelte und verbesserte. Unser Dank gilt auch Ann Shinnar für ihre sorgfältige Durchsicht der Testaufgaben. Die Atomkoordinaten vieler Proteine und Nucleinsäuren, deren Abbildungen im Buch enthalten sind, stammen aus der Protein Data Bank des Research Collaboratory for Structural Bioinformatics. Die Molekülgrafiken wurden mit den Programmen RIBBONS (von Mike Carson), GRASP (von Anthony Nicholls, Kim Sharp und Barry Honig) und PyMOL (von Warren DeLano) erstellt. Die interaktiven Computergrafiken auf der zu diesem Lehrbuch gehörenden Webseite wurden entweder als Jmol-Bilder oder als Kinemages erstellt. Jmol ist ein frei zugängliches, interaktives Programm zur dreidimensionalen Bearbeitung von Molekülen. Es basiert auf dem Programm RasMol von Roger Sayle, das großzügigerweise öffentlich zugänglich gemacht wurde. Die Jmol-Bilder in den Interactive Exercises wurden von Stephen Rouse erstellt. Die Kinemages werden über das Programm KiNG angezeigt, das von David C. Richardson geschrieben und großzügigerweise zur Verfügung gestellt wurde. Das Programm PREKIN, das DV und JGV bei der Erstellung der Kinemages verwendet haben, stammt ebenfalls von ihm. KiNG (Kinemage, Next Generation) ist ein interaktives System für die dreidimensionale Vektordarstellungen, das mit Windows, Mac OS X und Linux/Unix-Systemen betrieben werden kann. Die Internet Resources und die Student Printed Resources wurden von den folgenden Personen vorbereitet: ® Bioinformatics Exercises: Paul Craig, Rochester Institute of Technology, Rochester, New York. ® Online Homework Exercises und Classroom Response Questions: Rachel Milner und Adrienne Wright, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada. ® Online Self-Study Quizzes: Steven Vik, Southern Methodist University, Dallas, Texas.

®

Case Studies: Kathleen Cornely, Providence College, Providence, Rhode Island. Student Companion: Akif Uzman, University of Houston-Downtown, Houston, Texas. Test Bank: Marilee Benore-Parsons, University of Michigan-Dearborn, Dearborn, Michigan und Robert Kane, Baylor University, Waco, Texas.

Wir danken natürlich auch den zahlreichen Kollegen, die uns mit wertvollen Ratschlägen weitergeholfen haben. Zu unseren Beratern gehören: Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt en ar ee Fer

N en EEE

Danksagung ALABAMA Michael E. Friedman, Auburn University CALIFORNIA Marjorie A. Bates, University of California Los Angeles Lukas Buehler, University of California San Diego Charles E. Bowen, California Polytechnic University Richard Calendar, University of California Berkeley Gopal Iyer, University of California Los Angeles Carla Koehler, University of California Los Angeles Michael A. Marletta, University of California Berkeley Douglas McAbee, California State University Long Beach Angelika Niema, Keck Graduate Institute Tim Osborne, University of California Irvine Stanley M. Parsons, University of California Santa Barbara Leigh Plesniak, University of San Diego Christian K. Roberts, University of California Los Angeles Pam Stacks, San Jose State University Koni Stone, California State University Stanislaus Leon Yengoyan, San Jose State University

FLORIDA Fazal Ahmad, University of Miami School of Medicine Peggy R. Borum, University of Florida Gainesville Glenn Cunningham, University of Central Florida Frans Huijing, University of Miami School of Medicine Robley J. Light, Florida State University

David J. Merkler, University of South Florida Tampa Thomas L. Selby, University of Central Florida GEORGIA Giovanni Gadda, Georgia State University Stephan Quirk, Georgia Institute of Technology ILLINOIS Jeffrey A. Frick, Illinois Wesleyan University Lowell P. Hager, University of Illinois Urbana-Champaign Robert MacDonald, Northwestern University Stephen Meredith, University of Chicago Ken Olsen, Loyola University Phoebe A. Rice, University of Chicago Gary Spedding, Butler University INDIANA

Thomas Goyne, Valparaiso University Ann L. Kirchlmaier, Purdue University West Lafayette

IOWA Donald Beitz, Iowa State University LaRhee Henderson, Drake University KANSAS

Lawrence C. Davis, Kansas State University

Michael Keck, Emporia State University KENTUCKY

Steven R. Ellis, University of Louisville Stefan Paula, Northern Kentucky University LOUISIANA

Marion L. Carroll, Xavier University of Louisiana Jim D. Karam, Tulane University Health Sciences Center

Eric R.Taylor, University of Louisiana at Lafayette Candace Timpte, University of New Orleans William C.Wimley, Tulane University Health Sciences Center MAINE

Gale Rhodes, University of Southern Maine MARYLAND

Bonnie Diehl, Johns Hopkins University J. Norman Hansen, University of Maryland Jason D. Kahn, University of Maryland College Park Tom Stanton, University of Maryland Shady Grove MASSACHUSETTS Robert D. Lynch, University of Massachusetts Lowell

Lynmarie K.Thompson, University of Massachusetts Adele Wolfson, Wellesley College Michael B.Yaffe, Massachusetts Institute of Technology

MICHIGAN Kenneth Balazovich, University of Michigan Ann Arbor Deborah Heyl-Clegg, Eastern Michigan University Michael LaFontaine, Ferris State University Kathleen V. Nolta, University of Michigan Robert Stach, University of Michigan Flint Marty Thompson, Michigan Technical University MISSISSIPPI

Jeffrey Evans, University of Southern Mississippi Kenneth O.Willeford, Mississippi State University Robert P.Wilson, Mississippi State University MISSOURI

Mark E. Martin, University of Missouri Columbia William T. Morgan, University of Missouri Kansas City Michael R. Nichols, University of Missouri St Louis Peter Tipton, University of Missouri Columbia MONTANA

Larry L. Jackson, Montana State University Martin Teintze, Montana State University NEBRASKA

Ruma Banerjee, University of Nebraska Frank A. Kovack, University of Nebraska NEVADA

Bryan Spangelo, University of Nevada Las Vegas NEW HAMPSHIRE

Anita S. Kline, University of New Hampshire NEW JERSEY

Cathy Yang, Rowan University NEW MEXICO

James Hageman, New Mexico State University NEW YORK

Jacquelyn Fetrow, University of Albany Burt Goldberg, New York University

Martin Horowitz, New York Medical College Terry Platt, University of Rochester Raghu Sarma, State University of New York at Stony Brook Scott Severance, Canisius College Ann E. Shinnar, Touro College Burton Tropp, Queens College CUNY Joseph T.Warden, Rensselaer Polytechnic Institute NORTH

CAROLINA

Arno L. Greenleaf, Duke University OHIO

Caroline Breitenberger, The Ohio State University Susan C. Evans, Ohio University Dave Mascotti, John Carroll University Gary E. Means, Ohio State University Daniel Smith, University of Akron John Turchi, Wright State University OKLAHOMA

Paul F. Cook, University of Oklahoma Kenneth Weed, Oral Roberts University PENNSYLVANIA Michael Borenstein, Temple University

David J. Edwards, University of Pittsburgh Jan Feng, Temple University Diane W. Husic, East Stroudsburg University Teh-hui Kao, Pennsylvania State University Laura Mitchell, St. Joseph’s University Allen T. Phillips, Pennsylvania State University Philip A. Rea, University of Pennsylvania Michael Sypes, Pennsylvania State University George Tuszynski, Temple University Joan Wasilewski, The University of Scranton Michelle W.Wien, Saint Joseph’s University Bruce Wightman, Muhlenberg College Michael Wilson, Temple University RHODE

ISLAND

Kathleen Cornely, Providence College Mary Louise Greeley, Salve Regina University Kimberly Mowry, Brown University

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Danksagung

SOUTH CAROLINA Jessup M. Shivley, Clemson University Kerry Smith, Clemson University Takita Felder Sumter, Winthrop University SOUTH DAKOTA Joel E. Houglum, South Dakota State University Daniel Cervantes Laurean, South Dakota State University TENNESSEE

Scott Champney, East Tennessee State University Paul C. Kline, Middle Tennessee State University Gerald Stuffs, Vanderbilt University Jubran M.Wakim, Middle Tennessee State University TEXAS Helen Cronenberger, University of Texas Sarı Antonio Joseph Eichberg, University of Houston George E. Fox, University of Houston Edward D. Harris, Texas AXM University

David W. Hoffman, University of Texas at Austin Bob Kane, Baylor University Barrie Kitto, University of Texas at Austin

W.E. Kurtin, Trinity University

Glen B. Legge, University of Houston Robert Renthal, University of Texas Sarı Antonio Linda J. Roman, University of Texas San Antonio Rick Russell, University of Texas Austin Jane Torrie, Tarrant County College Northwest Akıf Uzman, University of Houston-Downtown Steven B.Vik, Southern Methodist University Linette M.Watkins, Soutkwest Texas State University William Widger, University of Houston Ryland E.Young, Texas AXM University

UTAH Scott A. Ensign, Utah State University Steven W. Graves, Brigham Young University

VIRGINIA } Robert F. Diegelmann, Virginia Commonwealth University William M. Grogan, Virginia Commonwealth University Jeff Kushner, James Madison University WASHINGTON \ Ronald Brosemer, Washington State University Michael D. Grisweld, Washington State University Christine M. Smith, University of Puget Sound Steve Sylvester, Washington State University Vancouver David C.Teller, University of Washington WEST VIRGINIA

Giri R. Sura, West Virginia State University WISCONSIN

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Lisa C. Kroutil, University of Wisconsin River Falls AUSTRALIA

Graham Parslow, University of Melbourne

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Online-Unterstützung und Zusatzmaterial für Studenten und Dozenten e-Learning mit WileyPLUS WileyPLUS verbindet den kompletten Buchtext mit zahlreichen weiteren Lehrund Lerninhalten auf einer intuitiv zu bedienenden Benutzeroberfläche, die in allen gängigen Webbrowsern dargestellt werden kann. WileyPLUS bietet alle nötigen Funktionalitäten, um einen kompletten Kurs mit Online-Unterstützung durchzuführen, Hausaufgaben und Klausuren eingeschlossen. Das alles kann WileyPLUS: ® Rund-um-die-Uhr-Zugriff auf den kompletten Buchinhalt im htmi-Format, unter Einbindung des gesamten Zusatzmaterials ® Flexible Zusammenstellung der Lerninhalte und Ergänzung mit eigenem Zusatzmaterial ® Hilfe beim Erstellen multimedialer Präsentationen für die Vorlesung, oder als Ergänzung dazu ® Kommunikation mit den Kursteilnehmern ® Austausch von Materialien mit anderen Dozenten ® Hausaufgaben und Klausuren, die in beliebiger Art aus den Testaufgaben zusammengestellt werden und von den Studenten online bearbeitet werden können. Da die richtigen Lösungen zu allen Fragen hinterlegt sind, können Aufgaben automatisch von WileyPLUS bewertet und die Ergebnisse im Gradebook gespeichert werden. ® Analyse des individuellen und kollektiven Lernfortschritts durch statistische Auswertung der Zahl der benötigten Lösungsversuche sowie der Inanspruchnahme von Hilfen. Auf diese Weise kann der Dozent sofort erkennen, welche Fragestellungen für die Mehrheit der Kursteilnehmer schwer zu lösen waren und kann diese Themen im weiteren Verlauf des Kurses gezielt ansprechen. Der Zugang zu dieser e-Learning-Plattform ist bei Abnahme von Klassensätzen in der Regel im Preis des gedruckten Buches inbegriffen. Weitere Informationen unter [email protected].

Interaktive Elemente und Übungen für Studenten in WileyPLUS: In der WileyPLUS-Umgebung können die Studenten nicht nur auf den gesamten Buchtext, sondern auch auf alle im Buch aufgeführten interaktiven Zusatzmaterialien zugreifen - und das alles ganz einfach per Mausklick. Zu diesem (nur in englischer Sprache verfügbaren) Zusatzmaterial gehören: e 30 Guided Explorations: Animationen mit Bild und Ton, die wichtige Konzepte vertiefen. e 59 Interactive Exercises: Molekülstrukturen, die als 3D-Modelle angezeigt und manipuliert werden können. e 55 Kinemages: Dreidimensionale Strukturen von Proteinen und Nucdeinsäuren, die auf verschiedene Weise dargestellt werden können und so Besonderheiten der Strukturen leichter erkennen lassen. e 69 Animated Figures: Abbildungen aus dem Buch, die teilweise animiert sind, um die dargestellten Prozesse besser begreiflich zu machen. e 33 Case Studies: Problemstellungen aus der biochemischen Forschung, die auf realen Daten aufbauen und es ermöglichen, das Gelernte praktisch anzuwenden.

XIV

_ Online-Unterstützung und Zusatzmaterial für Studenten und Dozenten

e

5 Bioinformatics Exercises: Aufgabensammlungen zum Umgang mit diversen Datenbanken, mit Beispieldaten und Anleitung.

Eine komplette Liste der Zusatzmaterialien ist im Abschnitt Zusatzmaterial im Internet weiter unten zu finden.

Dozentenmaterial in WileyPLUS. In der WileyPLUS-Umgebung können Dozenten auf umfangreiches Zusatzmaterial zurückgreifen, aber auch eigene Materialien einbauen und für den Kurs nutzen. Folgende Materialien stehen zur Verfügung: ® Alle Abbildungen des Buches im jpeg-Format, zum Einbau in eigene Präsentationen. ® Mehr als 1.300 deutschsprachige Testaufgaben (ca. 50 zu jedem Kapitel), in den vier Kategorien Multiple Choice, Lückentext, Aufsatz und Numerisch. Jede Testaufgabe ist einem Oberthema zugeordnet, mit dem entsprechenden Textabschnitt verknüpft und nach Schwierigkeitsgrad kategorisiert. Die vorhandenen Testaufgaben können jederzeit durch selbst formulierte Aufgaben ergänzt werden. ®e Fragen während der Vorlesung („Clicker-Fragen”) zu den meisten Kapiteln. Wenn die Kursräume entsprechend ausgerüstet sind, können diese interaktiven Fragen zu Beginn oder am Ende einer Unterrichtseinheit dazu genutzt werden, das Vorwissen bzw. den Lernerfolg der Studenten zu überprüfen oder eine Diskussion in Gang zu bringen. Die Fragen sind so gestellt, dass häufig auftretende Missverständnisse erkannt und so noch während der Vorlesung ausgeräumt werden können.

Zusatzmaterial im Internet Die Webseite zu diesem Buch (www.wiley.com/college/voet) enthält die nachfolgend aufgeführten Zusatzmaterialien (in englischer Sprache), um das Lernen mit dem Buch zu erleichtern. Die Materialien sind jeweils bestimmten Abbildungen oder Abschnitten des Textes zugeordnet. An der entsprechenden Stelle wird im Text durch ein rotes Symbol (6%) oder durch einen Hinweis in der Randspalte auf das Zusatzmaterial verwiesen.

Online-Unterstützung und Zusatzmaterial für Studenten und Dozenten

Kapitel 2

Wasser

Animated Figure 2.17: Titration curves for acetic acid, phosphate, and ammonia Animated Figure 2.18: Titration of polyprotic acid Case Study 1: Acute Aspirin Overdose: Relationship to the Blood Buffering

Kapitel 3

Nucleotide und Nucleinsäuren

Guided Exploration 1: Overview of transcription and translation Guided Exploration 2: DNA sequence determination by the chainterminator method Guided Exploration 3: PCR and site-directed mutagenesis Interactive Exercise 1 (Abb 3.6): Three-dimensional structure of DNA Animated Figure 3.26: Construction of a recombinant DNA molecule Animated Figure 3.27: Cloning with bacteriophage A Animated Figure 3.30: Site-directed mutagenesis Kinemage 2-1 (Abb. 3.6): Structure of DNA Kinemage 2-2 (Abb. 3.8): Watson-Crick base pairs Bioinformatics Exercise: Databases for the Storage and “Mining” of Genome Sequences

Kapitel 5

Proteine: Primärstruktur

Guided Exploration 4: Protein sequence determination Guided Exploration 5: Protein evolution Animated Figure 5.3: Enzyme-linked immunosorbent assay Animated Figure 5.6: Ion exchange chromatography Animated Figure 5.7: Gel filtration chromatography Animated Figure 5.15: Edman degradation Animated Figure 5.18: Generating overlapping fragments to determine the amino acid sequence of a polypeptide Case Study 2: Histidine-Proline-rich Glycoprotein as a Plasma pH Sensor Bioinformatics Exercise: Using Databases to Compare and Identify Related Protein Sequences

Kapitel 6

Dreidimensionale Struktur von Proteinen

Guided Exploration Guided Exploration Guided Exploration Interactive Exercise dehydrogenase

Animated Animated Animated Animated

Figure Figure Figure Figure

6: Stable helices in proteins: the a-helix 7: Hydrogen bonding in ß-sheets 8. Secondary structures in proteins 2 (Abb. 6.31): Glyceraldehyde-3-phosphate

6.7: The a-helix 6.9: B-sheets 6.34: Symmetry in oligomeric proteins 6.42:Mechanism of protein disulfide isomerase

Kinemage 3-1 (Abb. 6.2, 6.4, 6.5): The peptide group Kinemage 3-2 (Abb. 6.7): The a-helix Kinemage 3-3 (Abb.6.9, 6.10, 6.11): B-sheets Kinemage 3-4 (Abb. 6.14): Reverse turns Kinemage 4-1, 4-2 (Abb. 6.15): Coiled coils Kinemage 4-3, 4-4 (Abb. 6.18): Collagen Kinemage 5 (Abb. 6.27, 6.32): Cytochrome c Case Study 4: The Structure of Insulin Case Study 5: Characterization of Subtilisin from the AntarcticPsychrophile BacillusTA41 Case Study 6: A Collection of Collagen Cases Bioinformatics Exercise: Visualizing Three-Dimensional Protein Structures

Kapitel 7

Proteinfunktion

Interactive Exercise 3 (Abb. 7.38): Structure of a mouse antibody Animated Figure 7.6: Oxygen-binding curve of hemoglobin

XV

Animated Figure 7.8: Movements of heme and F helix in hemoglobin Animated Figure 7.11: The Bohr effect Animated Figure 7.13: Effect of BPG and CO2on hemoglobin Animated Figure 7.32: Mechanism of force generation in muscle Kinemage 6-1 (Abb. 7.1, 7.3): Myoglobin structure Kinemage 6-2, 6-3 (Abb. 7.5): Hemoglobin structure Kinemage 6-3 (Abb. 7-14): BPG binding to hemoglobin Abb. 7.8 Kinemage 6-5 (Abb. 7.9): Changes at «1-ß2/a2-P1 interfaces in hemoglobin Case Study 8: Hemoglobin, the Oxygen Carrier Case Study 9: Allosteric Interactions in Crocodile Hemoglobin Case Study 10:The Biological Roles of Nitric Oxide

Kapitel 8

Kohlenhydrate

Kinemage 7-1 (Abb. 8.4, 8.5): D-Glucopyranose, a and ß anomers Kinemage 7-2 (Abschnitt 8.2A): Sucrose Kinemage 7-3 (Abb. 8.12): Hyaluronate Kinemage 7-4 (Abb. 8.19): Structure of a complex carbohydrate Kapitel 9 Lipide Guided Exploration 9: Membrane structure and the fluid mosaic model Interactive Exercise 4 (Abb. 9.6): Model of phospholipase A2and glycerophospholipid Animated Figure 9.35: Secretory pathway

Kinemage 8-1 (Abb. 9.22): Bacteriorhodopsin Kinemage 8-3 (Abb. 9.23): OmpF porin

Kapitel 10 Membrantransport Interactive Exercise 5 (Abb. 10.5): The K*-channel selectivity filter Animated Figure 10.13: Model for glucose transport Case Study 3: Carbonic Anhydrase II Deficiency Case Study 14: Shavings from the Carpenter’s Bench: The Biological Role of the Insulin C-peptide Case Study 17: A Possible Mechanism for Blindness Associated with Diabetes: Na+-Dependent Glucose Uptake by Retinal Cells

Kapitel 11

Enzymatische Katalyse

Guided Exploration Interactive Exercise Interactive Exercise Interactive Exercise

10: The catalytic mechanism of serine proteases 6 (Abb. 11.9): Pancreatic RNase S 7 (Abb. 11.13): Carbonic anhydrase 8 (Abb. 11.17): Hen egg white lysozyme Animated Figure 11.15: Effect of preferential transition state binding Animated Figure 11.18: Chair and half-chair conformations Kinemage 9 (Abb. 11.17, 11.19, 11.21): Hen egg white lysozyme-catalytic mechanism Kinemage 10-1 (Abb. 11.25, 11.31): Structural overview of a trypsin/inhibitor complex Kinemage 10-2 (Abb. 11.28): Evolutionary comparisons of proteases Kinemage 10-3 (Abb. 11.30): A transition state analog bound to chymotrypsin Case Study 11: Nonenzymatic Deamidization of Asparagine and Glutamine Residues in Proteins

Kapitel 12

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Guided Exploration 11: Michaelis-Menten kinetics, Lineweaver-Burk plots, and enzyme inhibition Interactive Exercise 9 (Exkurs 12.4): HIV protease

Animated Figure 12.2: Progress curve for an enzyme-catalyzed reaction Animated Figure 12.3: Plot of initial velocity versus substrate concentration

Animated Figure 12.4: Double-reciprocal (Lineweaver-Burk) plot Animated Figure 12.7: Lineweaver-Burk plot of competitive inhibition

XVi

_Online-Unterstützung und Zusatzmaterial für Studenten und Dozenten

Animated Figure 12.8: Lineweaver-Burk plot of uncompetitive inhibition Animated Figure 12.9: Lineweaver-Burk plot of mixed inhibition Animated Figure 12.10: Plot of vo versus [aspartate] for ATCase Kinemage 11-1 (Abb. 12.12, 12.13): Structure of ATCase Kinemage 11-2 (Abb. 12.13): Conformational changes in ATCase Kinemage 14-1 (Abb. 12.14): Glycogen phosphorylase Kinemage 14-2 und 14-3 (Abb. 12.15): Conformational changes in glycogen phosphorylase Case Study 7: A Storage Protein from Seeds of Brassica nigrals a Serine Protease Inhibitor Case Study 12: Production of Methanol in Ripening Fruit Case Study 13: Inhibition of Alcohol Dehydrogenase Case Study 15: Site-Directed Mutagenesis of Creatine Kinease Case Study 19: Purification of Rat Kidney Sphingosine Kinease Bioinformatics Exercise: Enzyme Inhibitors and Rational Drug Design

Kapitel 13

Biochemische Signale

Guided Exploration kinase system Guided Exploration system Interactive Exercise hormone (hGH) Interactive Exercise

12: Hormone signaling by the receptor tyrosine 13: Hormone signaling by the adenylate cyclase

10 (Abb. 13.3): X-ray structure of human growth 11 (Abb. 13.5): Tyrosine kinase domain of insulin

Kapitel 16

Guided Exploration 15: Control of glycogen metabolism Animated Figure 16.1: Overview of glucose metabolism Animated Figure 16.13: Major phosphorylation and dephosphorylation systems in glycogen metabolism Animated Figure 16.15: Comparison of gluconeogenesis and glycolysis Animated Figure 16.20: Transport of PEP and oxaloacetate from mitochondrion to cytosol Animated Figure 16.27: Pathway for dolichol-PP-oligosaccharide synthesis Case Study 22: Carrier--Mediated Uptake of Lactate in Rat Hepatocytes Case Study 26: The Role of Specific Amino Acids in the Peptide Hormone Glucagon in Receptor Binding and Signal Transduction

Kapitel 17_

Interactive Exercise 12 (Abb. 13.19): A heterotrimeric G protein Interactive Exercise 13 (Abb. 13.21): C subunit of protein kinase A

Animated Animated Kinemage Kinemage Kinemage

Figure 13.7: The Ras signaling cascade Figure 13.24: The phosphoinositide signaling system 15 (Abb. 13.21): cAMP-dependent protein kinase (PKA) 16-1 (Abb. 13.27): The structure of calmodulin 16-2 (Abb. 13.28): Calmodulin complex with target polypeptide

Kapitel 14

Einführung in den Stoffwechsel

Interactive Exercise 14 (Abb. 14.9): Conformational changes in E. coli adenylate kinase Case Study 16: Allosteric Regulation of ATCase Bioinformatics Exercise: Metabolic Enzymes, Microarrays, and Proteomics

Kapitel15

Glucose-Katabolismus

Guided Exploration 14: Glycolysis overview Interactive Exercise 15 (Abb. 15.2): Conformational changes in yeast hexokinase Interactive Exercise 16 (Abb. 15.6): Yeast TIM in complex with 2-phosphoglycolate Interactive Exercise 17 (Abb. 15.19): TPP binding to pyruvate decarboxylase Animated Figure 15.1: Overview of glycolysis Animated Figure 15.5: Mechanism of aldolase Animated Figure 15.9: Mechanism of GAPDH Animated Figure 15.23: PFK activity versus F6P conceritration Kinemage 12-1, 12-2 (Abb. 15.6): Triose phosphate isomerase Kinemage 13-1 (Abb. 15.22): Phosphofructokinase Kinemage 13-2 (Abb. 15.24): Allosteric changes in phosphofructokinase Case Study 18: Purification of Phosphofructokinase 1-C Case Study 20: NAD*-dependent Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase from Thermoproteus tenax

Citratcyclus

Guided Exploration 16: Citric acid cycle overview Interactive Exercise 18 (Abb. 17.9): Conformational changes in citrate synthase Animated Figure 17.1: Overview of oxidative fuel metabolism Animated Figure 17.2: Reactions of the citric acid cycle Animated Figure 17.16: Regulation of the citric acid cycle Animated Figure 17.17: Amphibolic functions of the citric acid cycle Case Study 21: Characterization of Pyruvate Carboxylase from Methanobacterium thermoautotrophicum

Kapitel 18

receptor

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Guided Exploration 17: Electron transport and oxidative phosphorylation overview Guided Exploration 18: The Q cycle

Guided Exploration 19: FIFO-ATP synthase and the binding change mechanism R Interactive Exercise 19 (Abb. 18.14): Complex III Interactive Exercise 20 (Abb. 18.16): Cytochrome cresidues involved in intermolecular complex formation Interactive Exercise 21 (Abb. 18.17): Bovine heart cyctochrome coxidase Interactive Exercise 22 (Abb. 18.22): F1-ATP synthase Animated Figure 18.8: The mitochondrial electron transport chain Animated Figure 18.20: Coupling of electron transport and ATP synthesis Animated Figure 18.24: The binding change mechanism of ATP synthesis Animated Figure 18.29: Coordinated control of glycolysis and the citric acid cycle Kinemage 5 (Abb. 18.16): Cytochrome c Case Study 24: Uncoupling Proteins in Plants Case Study 27: Regulation of Sugar and Alcohol Metabolism in Saccharomyces cerevisiae Case Study 33: Modification of Subunit cfrom Bovine Mitochondrial ATPase

Kapitel 19

Photosynthese

Guided Exploration 20: Two-center photosynthesis (Z-scheme) overview Interactive Exercise 23 (Abb. 19.5): Light-harvesting complex LH-2 Interactive Exercise 24 (Abb. 19.8): Rb. sphaeroides reaction center Interactive Exercise 25 (Abb. 19.22): Ferredoxin Interactive Exercise 26 (Abb. 19.23): Ferredoxin-NADP* reductase Animated Figure 19.6: Electronic states of chlorophyll Animated Figure 19.26: The Calvin cycle Animated Figure 19.28: Mechanism of RuBP carboxylase Kinemage 8-2 (Abb. 19.8, 19.9): Photosynthetic reaction center

Online-Unterstützung und Zusatzmaterial für Studenten und Dozenten

Kapitel 20

Lipidstoffwechsel

XVıl

Interactive Exercise 27 (Abb. 20.13): Active site of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase Interactive Exercise 28 (Abb. 20.18): X-Ray structure of methylmalonylCoA mutase Animated Figure 20.8: Receptor-mediated endocytosis Animated Figure 20.12: B-oxidation pathway of fatty acyl-CoA Animated Figure 20.23: Comparison of fatty acid ß-oxidation and fatty acid biosynthesis Animated Figure 20.26: Reaction sequence for biosynthesis of fatty acids Case Study 23: The Role of Uncoupling Proteins in Obesity

Animated Figure 24.20: Example of DNA melting curve Kinemage 17-1, 17-4, 17-5, 17-6 (Abb. 24.2): Structures of A, B, and Z DNAs Kinemage 17-2 (Abb. 24.1): Watson-Crick base pairs Kinemage 17-3 (Abb. 24.7): Nucleotide sugar conformations Kinemage 18-1 (Abb. 24.30): EcoRI endonuclease in complex with DNA Kinemage 18-2 (Abb. 24.31): EcoRV endonuclease in complex with DNA Kinemage 19 (Abb. 24.32): 434 phage repressor in complex with DNA Kinemage 20 (Abb. 24.37): GCN4 leucine zipper motif Case Study 31: Hyperactive Dnase I Variants: A Treatment for Cystic Fibrosis

Kapitel 21

Kapitel 25

Interactive Interactive synthase Interactive Animated Animated

Aminosäuremetabolismus

Exercise 29 (Abb. 21.1): Ubiquitin Exercise 30 (Abb. 21.35): The bifunctional enzyme tryptophan

Exercise 31 (Abb. 21.41): A. vinelandii nitrogenase Figure 21.8: Mechanism of PLP-dependent transamination Figure 21.9: The urea cycle

Kapitel 22

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Interactive Exercise 32 (Abb. 22.13): Human leptin Animated Figure 22.6: The Cori cycle Animated Figure 22.7: The glucose-alanine cycle Animated Figure 22.8: GLUTA4 activity Case Study 25: Glycogen Storage Diseases Case Study 28: The Bacterium Helicobacter pylori and Peptic Ulcers Case Study 30: Phenylketonuria

Kapitel 23 _ _Nucleotidmetabolismus Interactive Interactive Interactive Animated Animated Animated Animated

Exercise 33 Exercise 34 Exercise 35 Figure 23.1: Figure 23.4: Figure 23.5: Figure 23.8:

Kapitel 24

(Abb. 23.9): E coli ribonucleotide reductase (Abb. 23.17): Human dihydrofolate reductase (Abb. 23.20): Murine adenosine deaminase Metabolic pathway for de novobiosynthesis of IMP Control of purine biosynthesis pathway The de novosynthesis of UMP Regulation of pyrimidine biosynthesis

Struktur von Nucleinsäuren

Guided Exploration Guided Exploration Guided Exploration Guided Exploration Interactive Exercise Interactive Exercise Interactive Exercise Interactive Exercise complex with target

21: DNA structures 22: DNA supercoiling 23: Transcription factor-DNA interactions 24: Nucleosome structure 36 (Abb. 24.4): An RNA-DNA helix 37 (Abb. 24.16): Yeast topoisomerase II 38 (Abb. 24.26): A hammerhead ribozyme 39 (Abb. 24.32): A portion of phage 434 repressor in DNA

Interactive Exercise 40 (Abb. 24.33): E. coli trp repressor-operator complex

Interactive Exercise 41 complex Interactive Exercise 42 in complex with DNA Interactive Exercise 43 complex with DNA Interactive Exercise 44

(Abb. 24.34): E. coli met repressor-operator

(Abb. 24.35): A three-zinc finger segment of Zif268 (Abb. 24.36): GAL4 DNA-binding domain in (Abb. 24.38): GCN4 bZIP region in complex with

DNA

Interactive Exercise 45 (Abb. 24.39): Max binding to DNA Animated Figure 24.19: UV absorbance spectra of native and heatdenatured DNA

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Guided Exploration 25: The replication of DNA in E. coli Interactive Exercise 46 (Abb. 25.10): E. coli DNA Pol I Klenow fragment with double-helical DNA Interactive Exercise 47 (Abb. 25.19): E. coli Tus in complex with Ter-containing DNA Interactive Exercise 48 (Abb. 25.20): Structure of PCNA Interactive Exercise 49 (Exkurs 25.2): HIV reverse transcriptase Animated Figure 25.1: Meselson and Stahl experiment Animated Figure 25.36: Holliday model of general recombination Case Study 32: Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Activity and Cell Growth

Kapitel26

Transkription und RNA-Prozessierung

Interactive Exercise 50 (Abb. 26.12): RNA polymerase II Interactive Exercise 51 (Abb. 26.16): TATA-binding protein in complex with TATA box Interactive Exercise 52 8 (Abb. 26.30): Self-splicing group I intron from Tetrahymena

Kapitel 27_

Proteinbiosynthese

Guided Exploration 26: The structure of tRNA Guided Exploration 27: The structures of aminoacyl-tRNA synthetases and their interactions with tRNAs Guided Exploration 28: Translational initiation Guided Exploration 29: Translational elongation Interactive Exercise 53 (Abb. 27.17): Ribosomal subunits in complex with three tRNAs and an mRNA Interactive Exercise 54 (Abb. 27.29):. Elongation factor EF-Tu in its complexes with GDP and GMPPNP Kinemage 21-1 (Abb. 27.5): Structure of yeast tRNA”"* Kinemage 21-2 (Abb. 27.4): Modified bases in tRNAs Kinemage 22 (Abb. 27.8): Structure of GInRS-tRNAC""-ATP Case Study 29: Pseudovitamin D Deficiency

Kapitel 28

Regulation der Genexpression

Guided Exploration 30: he regulation of gene expression by the lacrepressor system Interactive Exercise 55 (Abb. 28.13): CAP-cAMP dimer in complex with DNA

Interactive Exercise 56 (Abb. 28.33): domain in complex with DNA Interactive Exercise 57 (Abb. 28.41): Interactive Exercise 58 (Abb. 28.42): in complex with its target DNA Interactive Exercise 59 (Abb. 28.53): complex with its target DNA

Glucocorticoid receptor DNA-binding Cdk2 phosphorylated at Thr 160 DNA-binding domain of human p53 Engrailed protein homeodomain in

xVvıl

Inhaltsübersicht

Teill

Einführung

1

Kapitel 1 Leben

2

Kapitel 2 Wasser

24

Teil I Biomoleküle

43

Kapitel 3 Nucleotide und Nucleinsäuren Kapitel 4 Aminosäuren

44

84

Kapitel 5 Proteine: Primärstruktur

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Kapitel 17

Citratcyclus

Kapitel 18

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Kapitel 19

Photosynthese

Kapitel 20

Lipidstoffwechsel

Kapitel 21

Aminosäuremetabolismus

Kapitel 22

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation 852

104

612

692

730 792

Kapitel 6 Dreidimensionale Struktur von Proteinen Teil V Genexpression und Replikation Kapitel

7 Proteinfunktion

Kapitel8

Kohlenhydrate

Kapitel 9

Lipide

Kapitel 10

Teil III Enzyme Kapitel 11

Kapitel 23

Nucleotidmetabolismus

Kapitel 24

Struktur von Nucleinsäuren

Kapitel 25

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination 960

Kapitel 26

Transkription und RNA-Prozessierung

Kapitel 27

Proteinbiosynthese

Kapitel 28

Regulation der Genexpression

916

270 322

351

Enzymatische Katalyse

352

Biochemische Signale

438

Teil VI Anhänge Glossar

Teil IV Metabolismus Kapitel 14

38384

240

1052

Kapitel 12_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation Kapitel 13

883

196

Membrantransport

483

Kapitel15 Glucose-Katabolismus

484

Verlag GmbH

1170

Sachregister

524

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH ISBN: 978-3-527-326679

1169

Lösungen zu den Aufgaben

Einführung in den Stoffwechsel

& Co. KGaA, Weinheim

574

Kapitel 16

1240

1202

1104

1010

646

XIX

Inhaltsverzeichnis

Teill

Einführung

Kapitel 1 Leben

1

3

2

4

1

Der Ursprung des Lebens 3 A Die präbiotische Welt 4 B Chemische Evolution 4 2 Zelluläre Strukturen 6 A Die Entstehung des Stoffwechsels 7 B Prokaryoten und Eukaryoten 8 C Grundtypen der Organismen 10 D Wie entwickeln sich Organismen weiter? 11 3 Thermodynamik 13 A Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik: Die Energie bleibt erhalten 13 B Der Zweite Hauptsatz der Thermodynamik: Die Entropie nimmt ständig zu 15 C Freie Enthalpie 16 D Chemische Gleichgewichte und der Standardzustand E Leben unterliegt den Gesetzen der Thermodynamik Exkurs 1.1 Berühmte Biochemiker Lynn Margulis und die Endosymbiontentheorie 12 Exkurs 1.2 Biochemie im Fokus Biochemische Konventionen 14 Kapitel 2 Wasser 1

2

A

lonisation von Wasser

Sequenzieren von Nucleinsäuren

A B C

A B C D

Klonierungstechniken 67 Genombibliotheken 70 DNA-Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion 74 Anwendungen der rekombinanten DNA-Technologie

Exkurs 3.1

Francis Collins und das Gen für cystische Fibrose Exkurs 3.2

Kapitel 4 Aminosäuren

84

Berühmte Biochemiker

William C. Rose und die Entdeckung von Threonin Exkurs 4.2

96

Biochemie im Fokus

Grün fluoreszierendes Protein

40

1

43

Kapitel 3 Nucleotide und Nucleinsäuren

Struktur und Funktion von Nucleotiden Struktur von Nucleinsäuren 49

44

46

Nucleinsäuren sind Polymere aus Nucleotiden Die Doppelhelix 50 Einzelsträngige Nucleinsäuren 354

49

3

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH TEDAT.

0792 ._3.EI7

29ILL7

O0

Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

86

Biochemie im Fokus

Das RS-System Exkurs 4.3

2

A B C

73

Aminosäurestrukturen 85 A Allgemeine Eigenschaften 87 B Peptidbindungen 87 C Einteilung und Charakteristika 87 D Säure-Base-Eigenschaften 92 E Einige Worte zur Nomenklatur 93 Stereochemie 94 Aminosäurederivate 97 A Aminosäurederivate in Proteinen 97 B Biologisch aktive Aminosäuren 99

Exkurs 4.1

35

64

Biochemie im Fokus

Genetischer Fingerabdruck

1

76

Berühmte Biochemiker

Kapitel 5 Proteine: Primärstruktur

1 2

57

Restriktionsendonucleasen 57 Elektrophorese und Restriktionskartierung 59 Sequenzieren mit der Kettenabbruchmethode 60

34

B Die Chemie der Säuren und Basen GuPuflfer» 37 Exkurs 2.1 Biochemie im Organismus Das Puffersystem des Blutplasmas

Teil II Biomoleküle

54

D Ganze Genome sind sequenziert 63 E Sequenzen, Mutation und Evolution 66 Rekombinante DNA-Technologie 67

24

Physikalische Eigenschaften von Wasser 26 A Struktur von Wasser 26 B Wasser als Lösungsmittel 28 C Der hydrophobe Effekt 30 D Osmose und Diffusion 32 Chemische Eigenschaften von Wasser 34

Überblick über die Funktionen von Nucleinsäuren A DNA trägt die genetische Information 54 B Gene regeln die Proteinbiosynthese 55

98

104

Diversität von Polypeptiden 106 Proteinreinigung 108 A Zur Proteinreinigung ist eine Strategie nötig 108 B Löslichkeit von Proteinen 112 C Chromatographie 112 D Elektrophorese von Proteinen 116 Proteinsequenzierung 118 A Vorbereitende Schritte 121 B Edman-Abbau 123 C Massenspektrometrie zur Bestimmung der Molekülmasse von Peptiden 124 D Rekonstruieren der Proteinsequenz 127

xx

Inhaltsverzeichnis

3

4

Evolution von Proteinen 130 A Evolution der Proteinsequenz 130 B Proteine entwickelten sich weiter durch Verdopplung von Genen oder Gensegmenten 131 Exkurs 5.1 Berühmte Biochemiker Frederick Sanger und die Proteinsequenzierung 119

Kapitel 6 Dreidimensionale Struktur von Proteinen

Antikörper 229 A Antikörperstruktur 229 B Antigen-Antikörper-Bindung

Biochemie im Überblick

Exkurs 7.2

Weitere sauerstofftransportierende Proteine Berühmte Biochemiker Max Perutz und die Bestimmung der Hämoglobinstruktur

142

Exkurs 7.3

1

Sekundärstruktur 144 A Die Peptidgruppe 144 B Reguläre Sekundärstrukturen: a-Helix und ß-Faltblatt 147 C Fibrilläre Proteine 152 D Nicht repetitive Proteinstruktur 156 Tertiärstruktur 158 A Die meisten Proteinstrukturen werden mithilfe der Röntgenkristallographie oder Kernspinresonanz bestimmt 159 B Die Anordnung der Seitenketten variiert mit der Polarität 164 C Tertiärstrukturen enthalten Kombinationen von Sekundärsstrukturen 165 D Proteinfamilien 167 E Die Strukturbioinformatik liefert die Mittel zur Speicherung, Visualisierung und zum Vergleich von Proteinstrukturinformationen 169 3 Quartärstruktur und Symmetrie 173 A Kräfte, die Proteinstrukturen stabilisieren 175 B Proteindenaturierung und -renaturierung 178 4 Proteinfaltungsmechanismen 180 A Proteinfaltungsmechanismen 180 B Molekulare Chaperone 183 C Manche Krankheiten werden durch fehlgefaltete Proteine hervorgerufen 187 Exkurs 6.1 Berühmte Biochemiker Linus Pauling und die Strukturbiochemie 148 Exkurs 6.2 Biochemie im Organismus Kollagenerkrankungen 154 Exkurs 6.3 Biochemie im Fokus Thermostabile Proteine 178 Exkurs 6.4 Biochemie im Fokus Proteinstrukturvoraussage und Proteindesign 182 Kapitel 7 Proteinfunktion

1

2

196

Myoglobin 198 A Struktur des Myoglobins 198 B Struktur des Hämoglobins 201 C Sauerstoffbindung an Hämoglobin 204 D Mechanismus der kooperativen Bindung von Sauerstoff 206 E Abnormale Hämoglobinformen 214 Muskelbewegung 217 A Struktur quergestreifter Muskulatur 217 B Mechanismus der Muskelkontraktion 226 C In Nicht-Muskelzellen bildet Actin Mikrofilamente

227

231

Exkurs 7.1

Exkurs 7.4 Exkurs 7.5

1

2

203

Biochemie im Organismus Höhenanpassung 211 Berühmte Biochemiker Hugh Huxley und das Gleitfilamentmodell Biochemie im Fokus Monoklonale Antikörper 233

Kapitel 8 Kohlenhydrate

222

240

Monosaccharide 242 A Einteilung der Monosaccharide B Zuckerderivate 246 Polysaccharide

202

242

249

A Disaccharide 249 B Struktur-Polysaccharide: Cellulose und Chitin C Speicher-Polysaccharide: Stärke und Glykogen D Glykosaminoglykane 255 3 Giykoproteine 257 A Proteoglykane 258 B Die Bakterienzellwand 259 C Funktionen der Oligosaccharide 264 Exkurs 8.1 Biochemie im Organismus Lactoseintoleranz 250 Exkurs 8.2 Biochemie im Fokus Künstliche Süßstoffe 251 Exkurs 8.3 Biochemie im Organismus Peptidoglykanspezifische Antibiotika 261 Kapitel 9 Lipide 270 Fettsäuren 272 Triacylglycerine

252 253

274 Glycerophospholipide 275 Sphingolipide 278 Steroide 280 Andere Lipide 283 1 Lipiddoppelschichten 286 Ursache der Bildung von Doppelschichten 286 Beweglichkeit der Lipide 287 Integrale Membranproteine 289 Lipidgebundene Proteine 294 DIE> Periphere Membranproteine GO, Finke (ae ee) 295 2 Membranstruktur und -aufbau 296 Das Flüssig-Mosaik-Modell 296 Die Erythrocytenmembran 299 Asymmetrie der Lipide 300 Der Sekretionsweg 304 Intrazelluläre Vesikel transportieren Proteine 308 Se ke) (A lo) el a Fusion von Vesikeln 313

Inhaltsverzeichnis

Exkurs 9.1

Biochemie im Organismus Lungen-Surfactant 276

Exkurs 9.2

Berühmte Biochemiker

Serin-Proteasen 378 A Das aktive Zentrum 378 B Katalysemechanismus 383 C Zymogene 388 Exkurs 11.1 Biochemie im Fokus ' Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert

5

Richard Henderson und die Struktur von

Exkurs 9.3

Kapitel 10 1

Bacteriorhodopsin 292 Biochemie im Organismus Tetanus- und Botulinustoxin greifen spezifisch SNARE-Proteine an 315

Membrantransport

Exkurs 11.2

Exkurs 11.3

322

Thermodynamik des Transports 323 A Ionophore transportieren Ionen durch Membranen B Porine enthalten ß-Fässer 326 C lIonenkanäle sind hochselektiv 327 D Aquaporine ermöglichen den Wassertransport durch die Membran 335 E Transportproteine wechseln zwischen zwei Konformationen 336 Aktiver Transport 339 A (Na'-K*)-ATPase 340

B Ca’*-ATPase C D

341

Kapitel 12_

1

345

Biochemie im Fokus

Kryoelektronenmikroskopische Struktur eines Gap Junction-Membrankanals 337 Exkurs 10.2

Exkurs 11.4

325

2

ABC-Transporter 343 lIonengradientgetriebener aktiver Transport

“Exkurs 10.1

3

Unterschied zwischen vermitteltem und nicht Exkurs 10.3

4

338

Biochemie im Fokus

Die Wirkung der Herzglykoside

342

D

1

2 3

Allgemeine Eigenschaften von Enzymen A Nomenklatur von Enzymen 355

Exkurs 354

B Substratspezifität 355 C Cofaktoren und Coenzyme 357 Aktivierungsenergie und Reaktionsverlauf 359 Katalysemechanismen 361 A Säure-Base-Katalyse 361 B Kovalente Katalyse 364 C Metallionenkatalyse 366 D Katalyse durch Nachbargruppen- und Orientierungseffekte 367 Katalyse durch Stabilisierung des ri

Übergangszustands 4

352

Lysozym

A B

Enzymstruktur 370 Katalysemechanismus

Exkurs Exkurs

Die Bioverfügbarkeit eines Arzneistoffes hängt davon ab,

Kinetik und Übergangszustandstheorie

Kapitel 13 1

Hormone

A

B

374

404

wie er resorbiert und im Körper transportiert wird Klinische Prüfungen geben Aufschluss über Wirksamkeit und Sicherheit 429 An Arzneimittelnebenwirkungen sind häufig die Cytochrome P450 beteiligt 431 12.1 Biochemie im Fokus Isotopenmarkierung 398 12.2 Berühmte Biochemiker J.B.S. Haldane und die Enzymaktivität 402 12.3 Biochemie im Fokus

Exkurs 12.4

368

370

394

Allosterische Kontrolle durch Bindung an einer anderen Stelle als dem aktiven Zentrum 419 B Kontrolle durch Protein-Phosphorylierung 423 Arzneistoffentwicklung (Drug Design) 427 A Die Arzneistoffentwicklung bedient sich verschiedener Techniken 427

351

Enzymatische Katalyse

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Enzymhemmung 409 A Kompetitive Hemmung 410 B Unkompetitive Hemmung 414 C Gemischte Hemmung 415 Regulation der Enzymaktivität 419

C

Kapitel 11

Untersuchung enzymatischer Abläufe durch Röntgenkristallographie 372 Biochemie im Organismus Nemengifte 379 Biochemie im Organismus Die Blutgerinnungskaskade 389

Reaktionskinetik 396 A Chemische Kinetik 396 B Enzymkinetik 399 C Analyse kinetischer Daten D Bisubstratreaktionen 407

B

Teil III Enzyme

364

Biochemie im Überblick

A

Biochemie im Fokus

vermitteltem Transport

xx

C

429

406

Biochemie im Organismus HIV-Enzyminhibitoren 416

Biochemische Signale

438

440

Die Hormone der Pankreasinselzellen steuern den Brennstoffmetabolismus 441 Adrenalin und Noradrenalin bereiten den Körper auf eine Reaktion vor 443 Steroidhormone regulieren vielfältige Stoffwechselund Sexualvorgänge 444

Inhaltsverzeichnis

xx

D 2

Das Wachstumshormon bindet an Rezeptoren im Muskel, Knochen und Knorpel 446

Rezeptor-Tyrosinkinasen 448 A Rezeptor-Tyrosinkinasen übermitteln Signale durch die Zellmembran 448

Kinasekaskaden geben Signale an den Zellkern C D 3

weiter 451 Manche Rezeptoren sind mit Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen verknüpft 456 Proteinphosphatasen sind selber Signalproteine

Heterotrimere G-Proteine

460

463

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren enthalten sieben Transmembranhelices 464 B Heterotrimere G-Proteine dissoziieren bei Aktivierung 465 @ Die Adenylat-Cyclase synthetisiert CAMP, um die Proteinkinase A zu aktivieren 467 D Phosphodiesterasen begrenzen die Aktivität des Second Messengers 469 4 Der Phosphatidylinositolweg 472 A Bei Bindung des Liganden werden im Cytoplasma die Second Messenger IP, und Ca”* freigesetzt 472 Calmodulin ist ein durch Ca?*-Ionen aktivierter Schalter 473 @ DAG ist ein fettlöslicher Second Messenger, der die Proteinkinase C aktiviert 475 D Nachwort: Komplexe Systeme haben emergente Eigenschaften 476 Berühmte Biochemiker Exkurs 13.1 Rosalyn Yalow und der Radioimmunoassay (RIA) 442 Biochemie im Fokus Exkurs 13.2 Die Rezeptor-Ligandenbindung ist messbar 449 Biochemie im Organismus Exkurs 13.3 Onkogene und Krebs 456 Exkurs 13.4 Biochemie im Organismus Arzneistoffe und Toxine, die die Signaltransduktion in der Zelle beeinflussen 470 A

Exkurs 13.5

3

1

Glucose-Katabolismus

524

Übersicht über die Glykolyse 527 Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse 529 Hexokinase: Verbrauch des ersten ATP 529 Glucosephosphat-Isomerase 531 Aldolase 533 Triosephosphat-Isomerase 534 Hon®» Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase: Bildung des ersten energiereichen Zwischenprodukts 538 Phosphoglycerat-Kinase: Produktion des ersten ATP 539 Phosphoglycerat-Mutase 541 Enolase: Bildung des zweiten energiereichen Zwischenprodukts 542 I Pyruvat-Kinase: Produktion des zweiten ATP 544

3

Gärung: Der anaerobe Weg des Pyruvats 546 A Milchsäuregärung 547 B Alkoholische Gärung 548 € Die Energiebilanz der Gärung 551 Kontrolle der Glykolyse 552 A Phosphofructokinase: Das Schlüsselenzym für die Kontrolle der Glykolyse im Muskel 553 B Substratkreislauf 555 Stoffwechsel von anderen Hexosen als Glucose

A B @

484 6

497

500

1 2

483

Allgemeine Einführung in den Stoffwechsel 486 A Ernährungsstrategien 486 B Vitamine und Mineralien unterstützen Stoffwechselreaktionen 487 @ Stoffwechselwege 488 D Thermodynamische Betrachtungen 493 E Kontrolle des Stoffwechselflusses 496 Energiereiche Verbindungen 497 A ATP und Phosphorylgruppenübertragungen Gekoppelte Reaktionen 500 Weitere phosphorylierte Verbindungen 503 SH@aaS Thioester 506

Die Nernst’sche Gleichung 509 Messung von Redoxpotentialen 510

Kapitel 15

478

Einführung in den Stoffwechsel

B @

ATP und AG

5

Kapitel 14

507

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung von Stoffwechselvorgängen - 513 513 A Nachweis von Stoffwechselvorgängen Stoffwechselwege werden durch gezielte Störungen B aufgeklärt 515 @ Systembiologie befasst sich mit der Untersuchung des Stoffwechsels 516 Biochemie im Organismus Exkurs 14.1 Oxidationszustände des Kohlenstoffs 490 Exkurs 14.2 Biochemie im Fokus Die Kartierung von Stoffwechselwegen 491 Berühmte Biochemiker Exkurs 14.3 Fritz Lipmann und „energiereiche“ Verbindungen 498 Biochemie im Fokus Exkurs 14.4

4

Teil IV Metabolismus

507

NAD* und FAD

4

Biochemie im Organismus Milzbrand

Reduktions- und Oxidationsreaktionen

A

Fructose

558

558

Galactose

560

Mannose

562

Der Pentosephosphatweg 563 A Stufe 1: Oxidation unter Bildung von NADPH und Ribulose-5-phosphat 564 Stufe 2: Isomerisierung und Epimerisierung von Ribulose-5-phosphat 565 Stufe 3: Reaktionen zur Knüpfung und Spaltung

von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen 566 Kontrollmechanismen des Pentosephosphatwegs

571

Inhaltsverzeichnis

Exkurs 15.1

Berühmte Biochemiker Otto Warburg und seine Untersuchungen des Stoffwechsels 526 Biochemie im Fokus Synthese von 2,3-Bisphosphoglycerat in Erythrocyten und dessen Einfluss auf die Sauerstofftransportkapazität des Bluts 543 Biochemie im Fokus Glykolytische ATP-Produktion im Muskel 552 Biochemie im Organismus Mangel an Glucose- 6-phosphat-Dehydrogenase 570

Exkurs 15.2

Exkurs 15.3

Exkurs 15.4

5

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen 634 A Stoffwechselwege, die Intermediate des Citratcyclus verbrauchen 635 B Reaktionen, die Intermediate des Citratcyclus auffüllen 636 C Der Glyoxylatcyclus und der Citratcyclus haben einige Schritte gemeinsam 639 Exkurs 17.1 Berühmte Biochemiker Hans Krebs und der Citratcyclus 616 Exkurs 17.2 Biochemie im Organismus Arsenvergiftung 623 Exkurs 17.3

Kapitel 16

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

574

1

Gilykogenabbau 576 A Giykogen-Phosphorylase 578 B Gilykogen-Entzweigungsenzym 581 C Phosphoglucomutase 582 2 Giykogensynthese 585 A UDP-Glucose-Pyrophosphorylase 585 B Gilykogen-Synthase 586 C Glykogen-Verzweigungsenzym 588 3 Kontrolle des Glykogenstoffwechsels 590 A Direkte allosterische Kontrolle von Glykogen-Phosphorylase und Glykogen-Synthase 590 B Kovalente Modifikation der Glykogen-Phosphorylase und der Glykogen-Synthase 591 C Hormonelle Einflüsse auf den Glykogenstoffwechsel 596 4 Giluconeogenese 598 A Vom Pyruvat zum Phosphoenolpyruvat 599 B Hydrolytische Reaktionen 603 C Regulation der Gluconeogenese 603 5 Andere Biosynthesewege für Kohlenhydrate 605 Exkurs 16.1 Berühmte Biochemiker Carl und Gerty Cori und der Glucosestoffwechsel 578 Exkurs 16.2 Biochemie im Organismus Glykogenspeicherkrankheiten 583

Exkurs 16.3

Biochemie im Überblick

Exkurs 16.4

Optimierung der Glykogenstruktur Biochemie im Fokus Lactosesynthese 606

Kapitel 13

2

Elektronentransport

Überblick

Synthese von Acetyl-Coenzym A 617 A Der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex Die Enzyme des Citratcyclus 622 Citrat-Synthase 622

3

3> Komplex III transportiert Protonen lee) (mi a) za

3

über den Q-Cyclus 664 F Komplex IV (Cytochrom c-Oxidase) Oxidative Phosphorylierung 670 A Die chemiosmotische Theorie 671 B ATP-Synthase 673 C

Der P/O-Quotient

4

667

681

D Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung 682 4 Kontrolle der ATP-Bildung 683 A Kontrolle der oxidativen Phosphorylierung 683 B Physiologische Konsequenzen des aeroben Stoffwechsels 686 Exkurs 18.1 Biochemie im Fokus Cytochrome sind elektronenübertragende Exkurs 18.2

Hämproteine 662 Berühmte Biochemiker Peter Mitchell und die chemiosmotische Theorie

Exkurs 18.4

614

NAD*-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 626 a-Ketoglutarat-Dehydrogenase 626 Succinyl-CoA-Synthetase 627 629 p= Fumarase ee Oo Io) al Regulation des Citratcyclus 630 A Die geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme des Citratcyclus 632

648

652

Thermodynamik des Elektronentransports 652 Die Reaktionsfolge des Elektronentransports 653 Komplex I (NADH:Coenzym Q-Oxidoreduktase) 657 Komplex II (Succinat:Coenzym Q-Oxidoreduktase) 661

612

1

638

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Das Mitochondrion 649 A Struktur der Mitochondrien 649 B Mitochondriale Transportsysteme

589

2

Biochemie im Fokus Die Evolution des Citrateyclus

1

Exkurs 18.3 Kapitel17_ Citratcyclus

XXI

617 Exkurs 18.5

Biochemie im Überblick Bakterieller Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung 674 Biochemie im Fokus Braunes Fettgewebe erzeugt Wärme durch Entkopplung 684 Biochemie im Organismus Sauerstoffverarmung bei Herzinfarkt und Schlaganfall 687

672

646

Inhaltsverzeichnis

XXIV Kapitel 19 1

Photosynthese

Chloroplasten

Kapitel 21

692

1

694

A B C D

Aufbau der Chloroplasten 694 Lichtabsorbierende Pigmente 695 Wechselwirkung von Licht und Materie 699 Elektronentransport in photosynthetisch aktiven Bakterien 700 E Elektronentransport mit zwei Zentren 703 F Photophosphorylierung 712 Die Dunkelreaktion 715 A Der Calvin-Cyclus 715 B Die Produkte des Calvin-Cyclus werden in Stärke, Saccharose und Cellulose umgewandelt 720 C Kontrolle des Calvin-Cyclus 721 D Photorespiration 723 Biochemie im Fokus Exkurs 19.1 Die Trennung von PSI und PSII 713 Kapitel 20 1

Lipidstoffwechsel

Verdauung und Resorption Transport von Lipiden 735

732

732

Fettsäureoxidation 740 Aktivierung der Fettsäuren 741 Transport durch die Mitochondrienmembran ß-Oxidation 743 Oxidation ungesättigter Fettsäuren 745

Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren ß-Oxidation 754

742

748

SJEODBTIE.> TEE Peroxisomale

Ketonkörper 753 Fettsäurebiosynthese

756

A

Transport von mitochondrialem Acetyl-CoA in das Cytosol 757 Acetyl-CoA-Carboxylase 758 Fettsäure-Synthase 759 Elongasen und Desaturasen 764 KIESE@EEI Synthese von Triacylglycerinen 765 Regulation des Fettsäurestoffwechsels 768 Synthese von Membranlipiden 770 A Glycerophospholipide 771 B Sphingolipide 774 C Cy,0-Fettsäuren sind die Vorstufen der Prostaglandine Cholesterinstoffwechsel 779 A Cholesterinbiosynthese 779 B HMG-CoA-Reduktase kontrolliert die Syntheserate von Cholesterin 783 C Ein anomaler Cholesterintransport führt zu Atherosklerose 786 Exkurs 20.1

Exkurs 20.2

776

1

Biochemie im Überblick Dorothy Crowfoot Hodgkin und die Struktur von Vitamin B,;

Exkurs 20.3 Exkurs 20.4

750

Biochemie im Fokus Triclosan: ein Hemmstoff der Fettsäure-Synthese Biochemie im Organismus Sphingolipidabbau- und Lipidspeicherkrankheiten

764 778

794

798

B Oxidative Desaminierung 802 3 Der Harnstoffeyclus 803 A Reaktionen des Harnstoffcyclus 804 B Regulation des Harnstoffeyclus 807 _ 4 Aminosäureabbau 807 A Alanin, Cystein, Glycin, Serin und Threonin werden zu Pyruvat abgebaut 808 B Asparagin und Aspartat werden zu Oxalacetat abgebaut 811 C Arginin, Glutamat, Glutamin, Histidin und Prolin werden zu o-Ketoglutarat abgebaut 812 D Isoleucin, Methionin und Valin werden zu Succinyl-CoA abgebaut 812 E Leucin und Lysin werden zu Acetoacetat und/oder Acetyl-CoA abgebaut 819 F Tryptophan wird zu Alanin und Acetoacetat abgebaut 820 G Phenylalanin und Tyrosin werden zu Fumarat und Acetoacetat abgebaut 821 5 Aminosäurebiosynthese 824 A Biosynthese der nicht essentiellen Aminosäuren 824 B. Biosynthese der essentiellen Aminosäuren 831 6 Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels 835 A Hämbiosynthese und -abbau 835 B Biosynthese physiologisch aktiver Amine 840 C Stickstoffmonoxid 841 7 Stickstofffixierung 842 A Nitrogenase reduziert N, zu NH, 842 B Fixierter Stickstoff wird zu biologischen Molekülen assimiliert 846 Exkurs 21.1 Biochemie im Organismus Homocystein, ein Krankheitsmarker 814 Exkurs 21.2 Biochemie im Organismus Phenylketonurie und Alkaptonurie sind Folgen von Defekten beim Phenylalaninabbau 822 Exkurs 21.3 Biochemie im Organismus Die Porphyrien 837 Kapitel 22

Biochemie im Organismus Vitamin-B}3-Mangel 748

792

Intrazellulärer Proteinabbau 793 A Iysosomaler Abbau 794 B Ubiquitin markiert Proteine für den Abbau C Das Proteasom entfaltet und hydrolysiert ubiquitinierte Polypeptide 796 Aminosäuredesaminierung 798

A Transaminierung

730

Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden

A B

2

Aminosäuremetabolismus

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation 852

Spezialisierung von Organen 854 A Gehirn 855 B Muskel 856 C Fettgewebe 858 D Leber 858 E Die Niere filtert Abfallprodukte aus dem Blut und hält dessen pH konstant 860 F Stoffwechselcyclen zwischen Organen 860

Inhaltsverzeichnis

2

Hormonelle Kontrolle des Metabolismus der Energieträger im Körper

3

Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht A Die AMP-abhängige Proteinkinase ist der Brennstoffmesser der Zelle 868 B Adiponectin reguliert die AMPK-Aktivität C Leptin ist ein Sättigungshormon 870 D

2

862

867 3

A B

869 4

Ghrelin und PYY;_;, fungieren als kurzzeitige

Appetitregulatoren 871 Der Energieverbrauch kann durch die adaptive Thermogenese gesteuert werden Störungen im Energiestoffwechsel 873 E

4

A B

Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren A Denaturierung und Renaturierung 934 B Basenpaarung 935 C Struktur der RNA 936 Fraktionierung von Nucleinsäuren 940

872

5

Hungern 873 Diabetes mellitus

875 C Fettleibigkeit (Obesitas) 879 Exkurs 22.1 Berühmte Biochemiker Frederick Banting und Charles Best: Die Entdeckung von Insulin 876

DNA-Protein-Wechselwirkungen 943 A Restriktionsendonucleasen 944 B Motive der prokaryotischen Transkriptionskontrolle C Eukaryotische Transkriptionsfaktoren 947 Eukaryotische Chromosomenstruktur 950

Nucleotidmetabolismus

884

Synthese von Purinribonucleotiden 886 A Synthese von Inosinmonophosphat 887 B Synthese von Adenosin- und Guanosinribonucleotiden 890 C Regulation der Biosynthese von Purinnucleotiden D Rückgewinnung von Purinen 892 2 Synthese von Pyrimidinribonucleotiden 893 A Synthese von UTP und CTP 895 B Regulation der Biosynthese von Pyrimidinnucleotiden 899 3 Bildung von Desoxyribonucleotiden 897 A Synthese von Desoxyribonucleotiden 897 B Bildung von Thymin 902 4 Nucleotidabbau 905 A Katabolismus der Purine 905 B Stoffwechsel der Harnsäure 909 C Katabolismus der Pyrimidine 910 Exkurs 23.1 Biochemie im Organismus Hemmstoffe der Thymidylat-Synthase in der Tumortherapie 906 Exkurs 23.2 Berühmte Biochemiker Gertrude Elion und Purinderivate 912

1

Struktur von Nucleinsäuren

Die DNA-Helix

A B C D

939

883

1 2

1

Kapitel 24

944

A Histone 951 B Nucleosomen 952 C Chromatin bildet hochgeordnete Strukturen 954 Exkurs 24.1 Berühmte Biochemiker Rosalind Franklin und die Struktur der DNA 920 Exkurs 24.2 Biochemie im Organismus Inhibitoren der Topoisomerasen Il als Antibiotika und Zytostatika 933 Exkurs 24.3 Biochemie im Fokus

Kapitel 25

Kapitel 233

934

Chromatographie 940 Elektrophorese 941

Die RNA-Welt

Teil V Genexpression und Replikation

XXV

891

3

4

5

918

Geometrie der DNA 918 Flexibilität der DNA 924 Superspiralisierte DNA 926 Topoisomerasen kontrollieren die DNA-Superspiralisierung 928

DNA-Replikation: Ein Überblick 962 DNA-Replikation in Prokaryoten 965 A DNA-Polymerasen 965 B Für die Initiation der Replikation sind eine Helicase und eine Primase erforderlich 970 C Synthese von Leit- und Folgestrang 972 D Termination der Replikation 975 E Genauigkeit der Replikation 976 Eukaryotische DNA-Replikation 976 A Eukaryoten verwenden verschiedene DNA-Polymerasen 977 B Die Replikation der eukaryotischen DNA beginnt an mehreren Startpunkten 980 C Telomere und Telomerasen 981 DNA-Schäden und Mutationen 983 A Chemische Mutagenese 984 B Carcinogene 987 DNA-Reparatur

A B

916

6

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination 960

988

Manche Schäden können direkt repariert werden 988 Die Basen-Excisionsreparatur erfordert eine Glykosylase 989 C Die Nucleotid-Excisionsreparatur schneidet einen Abschnitt eines DNA-Strangs aus 990 D Fehlpaarungsreparatur korrigiert Replikationsfehler 992 E Manche DNA-Reparaturmechanismen führen Fehler ein 988 Rekombination 994 A Der Mechanismus der allgemeinen Rekombination 994 B DNA kann durch Rekombination repariert werden 999 C Transposition 1002

XXVI Exkurs 25.1 Exkurs 25.2 Exkurs 25.3 Exkurs 25.4 Exkurs 25.5

Inhaltsverzeichnis Berühmte Biochemiker Arthur Kornberg und die DNA-Polymerase | 966 Biochemie im Fokus Reverse Transkriptase 978 Biochemie im Organismus Telomerase, Alterung und Krebs 983 Biochemie im Fokus DNA-Methylierung 986 Biochemie im Fokus Wieso kommt

Kapitel 26 1

Uracil nicht in DNA vor?

Transkription und RNA-Prozessierung

RNA-Polymerase

989

1010

1012

A Enzymstruktur 1012 1012 B Matrizenbindung C Kettenverlängerung 1015 D Kettentermination 1018 Transkription in Eukaryoten 1020 1020 A Eukaryotische RNA-Polymerasen B Jede Polymerase erkennt einen anderen Promotortyp 1026 C Transkriptionsfaktoren 1028 Posttranskriptionale Prozessierung 1032 A Prozessierung von Messenger-RNA 1032 B Prozessierung ribosomaler RNA 1043 C Prozessierung von Transfer--RNA 1046 Biochemie im Fokus Exkurs 26.1 Kollisionen zwischen der DNA-Polymerase Exkurs 26.2 Exkurs 26.3

und der RNA-Polymerase 1017 Biochemie im Organismus Inhibitoren der Transkription 1022 Berühmte Biochemiker Richard Roberts, Phillip Sharp und die Entdeckung der Introns

1036

Kapitel 27 _Proteinbiosynthese 1

1052

Der genetische Code 1054 A Codons sind Tripletts,

die sequentiell gelesen werden 1054 B Die Entschlüsselung des genetischen Codes 1055 C Die Natur des genetischen Codes 1057 Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung 1060 A Struktur der tRNA 1060 B Aminoacyl-tRNA-Synthetasen 1062 C Codon-Anticodon-Wechselwirkungen 1067 Ribosomen 1068 A Das prokaryotische Ribosom besteht aus zwei Untereinheiten 1070 B Das eukaryotische Ribosom ist größer und komplexer aufgebaut 1075 Translation 1076 A Ketteninitiation 1078 B Das Ribosom dechiffriert die mRNA, katalysiert die Bildung der Peptidbindung und geht dann zum nächsten Codon weiter 1083 C Freisetzungsfaktoren beenden die Translation 1092

Posttranslationale Modifikation (PTM) 1095 A Ribosomenassoziierte Chaperone unterstützen die Proteinfaltung 1096 B Neu synthetisierte Proteine können kovalent modifiziert werden 1097 Biochemie im Fokus Exkurs 27.1 Evolution des genetischen Codes 1059 Biochemie im Fokus Exkurs 27.2 Erweiterung des genetischen Codes 1069 Biochemie im Organismus Exkurs 27.3 Auswirkungen von Antibiotika auf die Proteinbiosynthese 1092

5

Kapitel 23

Regulation der Genexpression

1104

Organisation des Genoms 1105 A Anzahl der Gene 1106 B Gencluster 1109 I C Eukaryotische Genome haben repetitive Sequenzen Regulation der prokaryotischen Genexpression 1114 A Der lac-Repressor 1114 1118 B Katabolitrepression: Ein Beispiel für Genaktivierung C Attenuierung 1120 D Riboswitches 1122 Regulation der eukaryotischen Genexpression 1123 A Chromatinstruktur und Genexpression 1125 B Eukaryoten enthalten mehrere Iranskriptionsaktivatoren 1135 C Posttranskriptionale Kontrollmechanismen 1141 D Antikörpervielfalt entsteht durch somatische Rekombination und Hypermutation 1146 Zellcyclus, Krebs und Apoptose 1149 A Der Zellcyclus ist streng reglementiert 1149 B Tumorsuppressoren verhindern Krebs 1151 C Apoptose 1155 D Molekulare Grundlagen der Entwicklung 1158 Exkurs 28.1 Biochemie im Organismus Krankheiten durch Trinucleotidwiederholungen 1112, Exkurs 28.2 Biochemie im Fokus Die Inaktivierung des X-Chromosoms 1124 Exkurs 28.3 Biochemie im Fokus Nonsense-vermittelter RNA-Abbau 1143

1

Teil VI Anhänge

Glossar

1169

1170

Lösungen zu den Aufgaben Sachregister

1240

1202

Die frühe Erde, ein winziger Fleck in einer Galaxis, enthielt einfache anorganische Moleküle, aus denen die ersten biologischen Makromoleküle hervorgingen. Diese erwarben wiederum die Fähigkeit, sich selbst zu organisieren und sich selbst zu vervielfältigen. Dabei wurden schließlich zelluläre Lebensformen ausgebildet. [© Lynette Cook/Photo Researchers.]

Leben Die Biochemie ist, wortwörtlich, die Lehre von der Chemie des Lebens. Obwohl sie in andere Disziplinen wie Zellbiologie, Genetik, Immunologie, Mikrobiologie, Pharmakologie und Physiologie hineinreicht, befasst sich Biochemie im Wesentlichen mit einer begrenzten Anzahl von Fragestellungen. Hierzu gehören: 1. Wie sehen die chemischen und dreidimensionalen Strukturen von Biomolekülen aus? Wie reagieren Biomoleküle miteinander? Wie werden Biomoleküle durch die Zelle synthetisiert und abgebaut? Wie wird Energie durch die Zelle gespeichert und genutzt? a Wie sehen die Mechanismen für die Organisation von Biomolekülen und die Koordination ihrer Aktivitäten aus? = Wie wird genetische Information gespeichert, übertragen und umgesetzt? Um die Struktur und Wirkung von Systemen aufzuzeigen, die den menschlichen Sinnen nicht direkt zugänglich sind, greift die Biochemie, wie auch andere moderne Wissenschaften, auf ausgeklügelte Forschungsinstrumente zurück. Zusätzlich zum Rüstzeug des Chemikers für Trennung, quantitative Erfassung und andere Analysen biologischen Materials nutzen Biochemiker die einzigartigen biologischen Aspekte ihres Forschungsgegenstandes, indem sie die Evolutionsgeschichte von Organismen, von Stoffwechselwegen und auch einzelnen Molekülen untersuchen. Neben ihrer offenkundigen Bedeutung für die menschliche Gesundheit deckt die Biochemie die Arbeitsweisen der Natur auf und ermöglicht uns auf diese Weise, das einzigartige und geheimnisvolle Phänomen, das wir Leben nennen, zu verstehen und zu schätzen. In diesem einführenden Kapitel wollen wir einige grundlegende Prinzipien der Chemie und der Biologie betrachten, die sozusagen den Kontext für die Biochemie liefern. Dazu gehören der Ursprung des Lebens, die Grundtypen lebender Zellen und eine Einführung in die Thermodynamik. Alle diese Themen werden wir im weiteren Verlauf des Buches wiederholt antreffen.

1

Der Ursprung des Lebens

Alle Organismen weisen bestimmte gemeinsame biochemische Merkmale auf: zum Beispiel die Art und Weise wie Erbinformationen verschlüsselt sind und exprimiert werden und auf welche Weise Biomoleküle synthetisiert oder zur Energiegewinnung abgebaut werden. Die zugrundeliegende genetische und biochemische Einheitlichkeit heutiger Organismen lässt vermuten, dass sie von einem einzigen Vorläufer abstammen. Es wird wohl niemals möglich sein, den Ursprung des Lebens auf der Erde mit letzter Gewissheit aufzuklären. Dank paläontologischer Forschung und experimentellen Erkenntnissen sind wir heute jedoch in der Lage, die Entstehung des Lebens mit wissenschaftlichen Begriffen zu beschreiben. Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

Leben e Der Ursprung des Lebens e Zelluläre Strukturen

e Thermodynamik

4

Leben

Tab. 1.1

Chemische Elemente im menschlichen

Körper”.

A.

Die präbiotische Welt

1

Element

Trocken-

masse (%)

In Spuren vorhandene Elemente

ne]

@

61,7

B

N

11,0

F

(6)

98

Si

H

5

V

Ca

5,0

Cr

B

3,3

Mn

K

1,3

Fe

S

1,0

Co

ei

0,7

Cu

Na

0,7

Zn

Mg

0,3

Se Mo Sn

I

* Berechnet nach Frieden, E., Sci. Am . 227 (1), 54-55 (1972).

Lebende Materie besteht aus einer relativ kleinen Anzahl von Elementen (Tab. 1.1). C, N, 0,H, Ca, P, K und S umfassen ungefähr 98 % der Trockenmasse von Lebewesen (die meisten Organismen bestehen zu nahezu 70 % aus Wasser). Der Rest besteht aus Elementen, die nur in Spuren vorhanden sind. Dazu gehören B, F, Al, Si, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni,-Cu, Zn, As, Se, Br, Mo, Cd,

Das älteste bekannte, fossile Beweisstück für Leben ist ungefähr 3,5 Milliarden

Jahre alt (Abb. 1.1). Die vorangehende präbiotische Ära, die mit der Bildung der Erde vor ca. 4,6 Milliarden Jahren begann, hinterließ keine direkten Zeugnisse. Aber Wissenschaftler können chemische Reaktionen der Art, die möglicherweise in dieser Periode von einer Milliarde Jahren zu lebenden Organismen führten, experimentell nachvollziehen. Die Atmosphäre der frühen Erde bestand wahrscheinlich aus H,O, N,, CO, und kleineren Mengen an CH,, NH;,, SO, sowie möglicherweise H,. In den

1930er Jahren stellten Alexander Oparin and J. B. S. Haldane unabhängig voneinander die These auf, dass Moleküle der Ur-Atmosphäre, verursacht durch die ultraviolette Strahlung der Sonne oder durch Blitzentladungen, unter Bildung einfacher organischer (kohlenstoffhaltiger) Verbindungen miteinander reagierten. Stanley Miller und Harold Urey reproduzierten 1953 solch einen Reaktionsablauf, indem sie eine Mischung von H,O, CH,, NH; und H; eine Woche lang elektrischen Entladungen aussetzten. Die sich daraus ergebende Lösung enthielt wasserlösliche organische Verbindungen, darunter mehrere Aminosäuren (die Bausteine der Proteine) und andere biochemisch bedeutsame Substanzen. Die Grundannahmen hinter dem Experiment von Miller und Urey, vor allem die Zusammensetzung des von Ihnen verwendeten Gasgemischs, wurden von anderen Wissenschaftlern in Frage gestellt, die den Ursprung des Lebens an einem ganz anderen Ort vermuten nämlich im Dunkeln und unter Wasser. Hydrothermale Quellen am Ozeanboden, die bis zu 400 °C heiße Lösungen von Metallsulfiden ausstoßen (Abb. 1.2), könnten die richtigen Rahmenbedingungen für die Bildung von Aminosäuren aus Bestandteilen des Meerwassers geliefert haben. Unabhängig von ihrem Urspung waren diese frühen organischen Moleküle die Vorläufer für die enorme Vielfalt von Biomolekülen, die es heute auf der Erde gibt. Je nach ihrem Aufbau und ihrer chemischen Reaktivität lassen sich diese Biomoleküle in Bezug auf ihre funktionellen Gruppen (die reaktiven Stellen im Molekül) und ihre Bindungsarten klassifizieren. Dabei verwendet die Biochemie dieselben Begriffe wie sie auch in der Organischen Chemie gebräuchlich sind. Einige der häufig vorkommenden funktionellen Gruppen und Bindungsarten sind in Tabelle 1.2 dargestellt.

B.

Abb. 1.1

Mikrofossil filamentbildender Bakterienzellen. Dieses Fossil (im unteren Teil schematisch) stammt von einem etwa 3400 Millionen Jahre alten Felsen aus Westaustralien. [Mit freundlicher Genehmigung von J. William Schopf, UCLA.]

Iund W, wenn

auch nicht alle Organismen jedes dieser Elemente benötigen.

Chemische

Evolution

Selbst bei reichlich vorhandenem Ausgangsmaterial, das sich in Gezeitenprielen oder flachen Seen angehäuft haben könnte, entstand Leben nicht unmittelbar. Während einer Periode chemischer Evolution kondensierten kleine Moleküle unter Bildung komplexerer Substanzen oder sie reagierten linear zu Polymeren sich wiederholender Einheiten. In einer Kondensationsreaktion wird Wasser abgespalten. Die Geschwindigkeit, mit der einfache Verbindungen kondensieren um ein stabiles Polymer zu bilden, muss deshalb größer sein als die Geschwindigkeit der Hydrolyse (Spaltung durch Addition von Wasser; Abb. 1.3). Im präbiotischen Milieu könnten Mineralien, wie z.B. Tonerde, die Polymerisationsreaktionen katalysiert und die Reaktionsprodukte von der wässrigen Phase getrennt haben. Bestimmend für Größe und Zusammensetzung der präbiotischen

Der Ursprung des Lebens Tab. 1.2

5

Funktionelle Gruppen und Bindungsarten in der Biochemie.

u Zu

Bezeichnung

Struktur

u

Fr

Funktionelle Gruppe oder Bindung

WEBER EEE EEE EEE

Amin?

RNH, oder RNH, R,NH oder R,NH, R;N oder R,NH

+| |

—N_\_

oder —N—

Alkohol

ROH

Thiol

RSH

-SH

Ether

ROR

—-O- (Etherbindung)

-OH (Hydroxylgruppe)

OÖ

Aldehyd

— C — (Carbonylgruppe)

O

O

RZGER

= e— (Carbonlygruppe)

O

Carbonsäure?

(Sulfhydrylgruppe)

(6)

RG Keton

(Aminogruppe)

(6)

oder

R2-&

OH

—= \— OH (Carboxylgruppe) oder (6) —C—0O

O

(Carboxylatgruppe)

O

Ester

Abb. 1.2 Eine hydrothermale Quelle. Solche Strukturen am Grunde der Tiefsee werden auch als Schwarze Raucher (Black Smoker) be-

Rz .— (Esterbindung)

ae

O

Rz h— (Acylgruppe)‘

zeichnet, da das im austretenden heißen Wasser

O

O

|

Thioester

re

— C —S—

(Thioesterbindung)

Institution.]

| R— C— (Acylgruppe)‘ O

(©)

>

Amid

R—C-—NH,

—@ —_n

gelöste Metallsulfid beim Kontakt mit dem sehr viel kälteren Seewasser in Form dichter schwarzer Wolken präzipitiert. [© J. Edmond. Mit freundlicher Genehmigung der Woods Hole Ocenanographic

(6)

(Amidogruppe)

]

ER

R—0—OH

OÖ RE

+

| R— C— (Acylgruppe)‘

NER

H

NR

(6) R-—E@ZNR,

Kondensation

Imin (Schiff’sche

R=NH oder R=NN;

Base)”

R=NR

Disulfid

R-5-S-R

Phosphatester?

en

IC=N—

gruppe)

oder R=NHR

-S-S-

\ I

—P—O

©;

Diphosphatester?

|

R—O—P—O—P—O°

(6)

—

|

7

pP 0

| oO

Phosphatdiester”

ne

! (6)

pP 07 (Phosphoan: | hydridgruppe)

OH OÖ

|

ai

H,0

| R=CZZNHZR;

OH

6) |

NE

(Phosphorylgruppe)

|

OH

H>0

(Disulfidbindung)

|

—

Hydrolyse

oder Se=NZ (Imino-

— 0 —P — O0 — (Phosphodiesterbindung) 0|

® R steht für eine beliebige kohlenstoffhaltige Gruppe. Jedes R kann für eine unterschiedliche Gruppe stehen. 5 Diese Gruppen sind unter physiologischen Bedingungen ionisiert und tragen eine Ladung. ° Nur wenn nicht an einen Kohlenstoff gebunden.

Abb. 1.3 Reaktion einer Carbonsäure mit einem Amin. Während der Kondensation wird Wasser abgespalten. In der Rückreaktion - Hydrolyse — erfolgt unter Spaltung der Amidbindung eine Addition von Wasser. Kondensationsreaktionen sind in lebenden Systemen nicht ohne weiteres umkehrbar.

6

Leben

Abb. 1.4 Assoziation komplementärer Moleküle. Die positiv geladene Aminogruppe geht eine elektrostatische Wechselwirkung mit der negativ geladenen Carboxylatgruppe ein.

Makromoleküle dürften die Verfügbarkeit der niedermolekularen Ausgangsmaterialien, die Effizienz, mit der diese verknüpft werden konnten, und die eigene Resistenz gegenüber Abbau gewesen sein. Die Kombination verschiedener funktioneller Gruppen in einem einzigen großen Molekül erhöht offensichtlich die chemische Vielseitigkeit dieses Moleküles, wodurch chemische Leistungen weit über das Vermögen einfacherer Moleküle hinaus durchführbar werden. (Dieses Gesetz von der Herausbildung neuer Qualitäten kann auch folgendermaßen formuliert werden: „Das Ganze ist mehr als die Summe seiner Teile“.) Einzeln vorliegende Makromoleküle mit komplementären Anordnungen der funktionellen Gruppen können miteinander assoziieren (Abb. 1.4), was zu noch komplexeren molekularen Aggregaten mit einem noch größeren Spektrum an funktionellen Fähigkeiten führt. Spezifische Paarungen zwischen komplementären funktionellen Gruppen sorgen dafür, dass der eine Partner des Paares die Art und Orientierung des anderen Partners festlegen kann. Eine derartige Komplementarität ermöglicht dem Makromolekül sich zu replizieren, d.h. sich selbst zu kopieren, indem es das Zu-

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Geben Sie einen Überblick über die Hauptstadien der chemischen Evolution. 2. Kennen Sie alle funktionellen

Gruppen und Bindungsarten in Tabelle 1.2? 3. Beschreiben Sie, was bei einer Kondensationsreaktion und

bei einer Hydrolysereaktion geschieht.

sammenfügen eines neuen Moleküles aus kleineren komplementären Einheiten steuert. Die Replikation eines einfachen Polymeres mit intramolekularer Komplementarität ist in Abbildung 1.5 veranschaulicht. Ein ähnliches Phänomen ist für die Funktion der DNA von zentraler Bedeutung. Dort legt die Basensequenz des einen Stranges (z.B. A-C-G-T) absolut die Sequenz der Basen im anderen Strang, mit dem er gepaart ist (T-G-C-A), fest. Bei Replikation der DNA trennen sich die beiden Stränge und steuern jeweils die Synthese komplementärer Tochterstränge. Komplementarität ist ebenfalls die Basis für die Transkription von DNA in RNA und für die Translation der RNA-Information bei der Proteinbiosynthese. Ein kritischer Zeitpunkt in der chemischen Evolution war der Übergang von Systemen zufällig entstandener Moleküle zu Systemen, in welchen die Moleküle organisiert vorlagen und sich spezifisch replizierten. Sobald Makromoleküle die Fähigkeit zur Selbstvermehrung erwarben, wurden im Ur-Milieu diejenigen Moleküle angereichert, die am besten geeignet waren zu überleben und sich zu vermehren. Die ersten Replikationssysteme waren ohne Zweifel gegenüber Tochtermolekülen, die nur teilweise komplementär zu ihren Eltern waren, etwas nachlässig. Mit der Zeit wird die natürliche Selektion aber diejenigen Moleküle begünstigt haben, die genauere Kopien von sich produzierten.

2

Zelluläre Strukturen

Systeme von der Art, wie sie bisher beschrieben wurden, mussten mit all den anderen Komponenten des „Ur-Teiches“ um die verfügbaren Ressourcen kämpfen. Wechselnde Milieubedingungen werden ebenfalls das Überleben eines sich selbst replizierenden Systemes beeinflusst haben. Selektionsvorteile dürften einem System erwachsen sein, das durch irgendeine Art von Begrenzung abgetrennt und geschützt wurde. Wie diese Begrenzungen erstmalig entstanden und auch aus welchem Material sie gebildet wurden, ist unbekannt. Eine der Theo-

er

LUEALLLL]

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2

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Abb. 1.5 Replikation durch Komplementarität. In diesem einfachen Fall dient ein Polymer als Matrize für das Zusammenfügen eines komplementären Moleküles. Letzteres ist, bedingt durch die intramolekulare Komplement arität eine exakte Kopie des Originals.

Zelluläre Strukturen

rien besteht darin, dass sich Membranvesikel (mit Flüssigkeit gefüllte Beutelchen) an selbstreplizierende Systeme zunächst anlagerten und dann diese einschlossen. Diese Vesikel könnten die ersten Zellen geworden sein.

A.

Die Entstehung des Stoffwechsels

Die Vorteile einer Kompartimentierung sind vielfältig. Zusätzlich zum Schutz vor ungünstigen Umwelteinwirkungen ist ein abgeschlossenes System in der Lage, hohe lokale Konzentrationen von Bestandteilen aufrecht zu erhalten, welche andernfalls auseinander diffundieren würden. Höher konzentrierte Stoffe können schneller miteinander reagieren, was zu einer erhöhten Effizienz bei Polymerisationen und anderen chemischen Reaktionen führt. Ein von Membranen umschlossenes Kompartiment, das seine Inhaltstoffe nach außen abschirmt, wird sich mit der Zeit in seiner Zusammensetzung immer mehr von der Umgebung unterscheiden. Hochentwickelte Zellen enthalten in hohen Konzentrationen Ionen, kleine Moleküle und große Molekülaggregate, die außerhalb der Zelle - wenn überhaupt - nur in Spuren gefunden werden. Zum Beispiel kommen in der Escherichia coli- Zelle Millionen von Molekülen vor, die etwa 3000 bis 6000 chemisch unterschiedliche Verbindungen umfassen (Abb. 1.6). Eine typische tierische Zelle kann 100.000 verschiedene Arten von Molekülen enthalten.

Ribosom

Proteine

&3 14

Lipopolysaccharid

Lipoprotein

“= —

Abb. 1.6 Querschnitt durch eine E. coli-Zelle. Die rechte Seite der Abbildung zeigt die mehrschichtige Zellwand und die Membran. Das Cytoplasma im mittleren Bereich der Zeichnung ist mit Ribosomen ausgefüllt, die Proteine synthetisieren. Die linke Seite der

Zeichnung enthält ein dichtes Knäuel von DNA. Diese Zeichnung ent-

Peptidoglycan

spricht einer millionenfachen Vergrößerung: Es sind nur die größten In einer lebenden we Makromoleküle und MSIchllae on ate ı und Wasser ausgefüllt ss ist der verbleibende Sa mit En (die Wassermoleküle hätten ungefähr die Größe des Punktes am Ende

dieses Satzes). [Nach einer Zeichnung von David Goodsell, UCLA.]

8

Leben

Die ersten Zellen waren bei der Versorgung mit Zellbausteinen völlig von der Umgebung abhängig. Als die „präbiotische Suppe“ an einigen der essentiellen Verbindungen verarmte, begünstigte die natürliche Selektion Organismen, die Mechanismen zur Synthese der erforderlichen Verbindungen aus einfacheren, aber reichlicher vorhandenen Vorstufen entwickelt hatten. Die ersten Stoffwechselreaktionen könnten Metalle oder Tonerde, herangeholt aus dem anorganischen Umfeld, als Katalysatoren genutzt haben (ein Katalysator ist ein Stoff, der eine chemische Reaktion beschleunigt, ohne selbst verändert zu werden). In der Tat stehen Metallionen auch in den jetzigen Zellen noch im Mittelpunkt vieler chemischer Reaktionen. Einige Katalysatoren könnten auch aus polymeren Molekülen, welche die geeigneten funktionellen Gruppen enthielten, entstanden sein. Biosynthetische Reaktionen erfordern generell die Zufuhr von Energie. Folglich benötigten auch die ersten zellulären Reaktionen eine Energiequelle. Die anzunehmende Verarmung an bereits in der präbiotischen Umwelt vorhandenen energiereichen Stoffen dürfte die Entwicklung energieproduzierender Stoffwechselwege gefördert haben. Zum Beispiel entwickelte sich die Photosynthese, welche eine praktisch nicht versiegende Energiequelle - die Sonne - nutzt, relativ früh. Jedoch stellte die Anreicherung von O,, das durch Photosynthese aus H,O freigesetzt wurde (die heutige Atmosphäre besteht zu 21 % aus O,), auch eine zunehmende Bedrohung für die Organismen dar, die an eine sauerstoffarme Atmosphäre angepasst waren. Eine weitere Verfeinerung des Stoffwechsels könnte den Organismen letztendlich nicht nur dabei geholfen haben, oxidative Schädigungen zu verhindern, sondern O, sogar für einen oxidativen Stoffwechsel zu nutzen, der gegenüber dem anaeroben Metabolismus eine viel effizientere Form des Energiestoffwechsels darstellt. Überreste aus diesen uralten Lebensformen können auch heute noch im anaeroben Stoffwechsel einiger jetzt lebender Organismen gefunden werden. Ur-Organismen, die innerhalb eines geschützten Kompartiments metabolische Strategien zur Synthese von Biomolekülen, zur kontrollierten Speicherung und Nutzung von Energie als auch Zur Replikation entwickelten, waren in der Lage, in immer mehr Lebensräume vorzudringen. Eine Adaptation der Zellen an unterschiedliche äußere Bedingungen führte letztendlich zu der heutigen Artenvielfalt. Die Spezialisierung individueller Zellen machte es auch möglich, dass Gruppen unterschiedlicher Zellen in mehrzelligen Organismen zusammenarbeiten.

B.

Prokaryoten und Eukaryoten

Alle gegenwärtigen Organismen basieren auf der gleichen morphologischen Einheit, der Zelle. Es gibt zwei Hauptklassen von Zellen: die Eukaryoten (griech.: eu, gut oder wahr und karyon, Kern oder Nuss), welche einen membranumgebenen Zellkern aufweisen, in dem ihre DNA eingeschlossen ist, und die Prokaryoten (griech.: pro, vor), welche keinen Zellkern haben. Prokaryoten umfassen verschiedene Typen von Bakterien, haben relativ einfache Strukturen und sind ohne Ausnahme Einzeller (wobei sie aber Filamente und Kolonien eigenständiger Zellen bilden können).

Eukaryoten, welche sowohl

Viel- als auch

Einzeller sein

können, sind bedeutend komplexer strukturiert als Prokaryoten. (Viren sind viel einfachere Einheiten als Zellen und werden nicht zu den Lebewesen gezählt, weil ihnen der Stoffwechselapparat für eine Reproduktion außerhalb ihrer Wirtszellen fehlt.) Prokaryoten sind die zahlreichsten und am weitesten verbreiteten Organismen auf der Erde. Wegen ihres variantenreichen und oft äußerst anpassungsfähigen Stoffwechsels können sie vielfältigste Habitate besiedeln. Prokaryoten haben eine Größe von 1 bis 10 um und kommen in einer von drei morphologischen Grundformen vor (Abb. 1.7): kugelförmig (Coccen), stäbchenförmig (Bacillen) und helical gewunden (Spirillen). Abgesehen von der Zellmembran,

Zelluläre Strukturen

welche in den meisten Fällen von einer schützenden Zellwand umgeben ist, haben Prokaryoten keine weiteren intrazellulären Membranen. Dennoch ist das prokaryotische Cytoplasma (Zellinhalt) keineswegs homogen. Es wird angenommen, dass unterschiedliche metabolische Funktionen in unterschiedlichen Regionen des Cytoplasmas ausgeführt werden (Abb. 1.6). Der am besten charakterisierte Prokaryot ist Escherichia coli, ein stäbchenförmiges Bakterium

Spirillum Spirochäte

Anabaena (Ein Cyanobakterium)

von 2 um X 1 um, das den Säugerdickdarm besiedelt. Eukaryotische Zellen haben üblicherweise einen Durchmesser von 10 bis 100 um und somit ein tausend- bis millionenfach größeres Volumen als typische Prokaryoten. Aber es ist nicht die Größe, sondern das Vorkommen membra-

numschlossener Organellen, welches die eukaryotischen Zellen vor allem auszeichnet (Abb. 1.8). Eukaryotische Zellen besitzen neben dem Zellkern ein endoplasmatisches Reticulum. Dieses ist ein Syntheseort für viele Zellkomponenten, von denen einige anschließend im Golgi-Apparat weiter modifiziert werden. In fast allen Eukaryoten findet der oxidative Stoffwechsel in den Mitochondrien statt. Photosynthetisierende Zellen enthalten Chloroplasten. Andere Organellen, wie Lysosomen und Peroxisomen zeichnen sich durch noch stärker spezialisierte Funktionen aus. Vakuolen haben im allgemeinen Speicherfunktionen und kommen vor allem in Pflanzenzellen vor. Das Cytosol (Cytoplasma ohne seine mit Membranen umgebenen Organellen) wird durch das Cytoskelett strukturiert. Dieses ist ein ausgedehntes Fasergeflecht und verleiht der Zelle ihre Gestalt sowie die Fähigkeit sich zu bewegen.

Escherichia coli Großer Bacillus

@) Staphylococcus

= Rickettsia

Drei Arten von Mycoplasma

a————10 um ——— |

Abb. 1.7 Maßstabsgerechte Darstellung verschiedener prokaryotischer Zellen.

Kernmembran

Centriolen

Zellkern

GolgiApparat

Nucleolus Chromatin

Vakuole

Endoplasmatische® Reticulum Mitochondrion

Lysosom

Zellmembran

Raues endoplasmatisches Reticulum

Glattes endoplasmatisches Reticulum

Abb. 1.8 Schematische Darstellung einer typischen tierischen Zelle sowie elektronenmikroskopische Aufnahmen ihrer Organellen. Zu den von Membranen umgebenen Organellen gehören Zellkern, endoplasmatisches Reticulum, Lysosom, Peroxisom (nicht dargestellt),

Mitochondrion, Vakuole und Golgi-Apparat. Der Zellkern enthält Chromatin (ein Komplex aus DNA und Protein) und den Nucleolus (Syntheseort für Ribosomen). Während das raue endoplasmatische Reticulum mit Ribosomen übersät ist, enthält das glatte keine davon. Die Anordnung des

Cytoskelettes wird durch das Centriolenpaar unterstützt. Eine typische Pflanzenzelle unterscheidet sich vor allem durch das Vorhandensein von Chloroplasten im Cytosol und die Existenz einer äußeren Zellwand. [Zellkern: Tektoff-RM; CNRI/Photo Reseachers; raues endoplasmatisches Reticulum und Golgi-Apparat: Secchi-Lecaque/Roussel-UCLAF/CNRI/ Photo Reseachers; glattes endoplasmatisches Reticulum: David M. Phillips/Visuals Unlimited; Mitochondrion: CNRI/Photo Reseachers; Lysosom: Biophoto Associates/Photo Reseachers.]

9

10

Leben

Die verschiedenen Organellen, durch welche eukaryotische Zellen in Kompar-

timente aufgeteilt werden, verkörpern ein Ausmaß an Komplexität, das prokaryotischen Zellen weitgehend fehlt. Dennoch sind Prokaryoten in vielerlei Hinsicht effizienter als Eukaryoten. Prokaryoten nutzen die Vorteile von Einfachheit und Miniaturisierung. Ihre hohen Wachstumsraten erlauben ihnen, auch ökologische Nischen zu besiedeln, in denen drastische Schwankungen an verfügbaren Nährstoffen vorkommen. Andererseits haben die Eukaryoten mit ihrer Komplexität, auf Grund derer sie zwar langsamer wachsen aber größer werden als Prokaryoten, in einer stabilen Umgebung und bei begrenzten Ressourcen ihrerseits Wettbewerbsvorteile. Insoweit wäre es irreführend, Prokaryoten im Vergleich zu Eukaryoten als entwicklungsgeschichtlich primitiv einzuschätzen. Beide Typen von Organismen sind an ihre jeweiligen Daseinsformen gut angepasst.

C.

Grundtypen der Organismen

Alle Prokaryoten auf Grund ihres fehlenden Zellkerns in einen einzigen Topf zu werfen, verschleiert ihre metabolische Vielfalt und somit die Geschichte ihrer Evolution. Umgekehrt verdeckt die beträchtliche morphologische Diversität eukaryotischer Organismen (man denke nur an die anatomischen Unterschiede zwischen, sagen wir einer Amöbe, einer Eiche und dem Menschen) ihrerseits deren prinzipielle Ähnlichkeit auf dem zellulären Niveau. Traditionelle taxonomische Schemata (Taxonomie ist die Wissenschaft von der biologischen Klassifikation), welche auf einer makroskopischen Morphologie beruhen, haben sich für die Beschreibung der tatsächlichen Verwandtschaft zwischen Organismen, wie sie durch die Evolutionsgeschichte (Phylogenie) aufgedeckt wurde, als nicht adäquat erwiesen. Biologische Klassifikationsschemata, die auf Reproduktions- oder Entwicklungsabläufen aufbauen, spiegeln die Evolutionsgeschichte viel genauer wider als solche, die nur auf der Morphologie adulter Organismen beruhen. Am sichersten werden phylogenetische Beziehungen aber durch den Vergleich polymerer Moleküle — RNA, DNA oder Proteine — aus verschiedenen Organismen abgeleitet. Zum Beispiel führten RNA-Analysen Carl Woese dazu, alle Organismen drei Domänen zuzuordnen (Abb. 1.9). Die Archaea (auch als Archaebakterien bekannt) sind eine Gruppe von Prokaryoten, die mit anderen Prokaryoten (den Bacteria, manchmal auch Eubakterien genannt) nicht enger verwandt sind als beide Gruppen mit den Eukaryoten (Eukarya). Zu den Archaea gehören auch einige ungewöhnliche Organismen: die Methanogenen (produzieren CH,), die Halobakterien (überleben in konzentrierten Salzlaken) und bestimmte Thermophile (bevölkern heiße Quellen). Das genetische Material, von dem einiges mehr ÄhnEukarya Tiere Archaea

Pilze

Bacteria

Schleimpilze

Halophile Purpurbakterien

Abb, 1.9 Phylogenetischer Stammbaum mit den drei Organismen-Domänen. Die Verzweigungen veranschaulichen die divergente Entwicklung ausgehend von

Cyanobakterien

einem gemeinsamen Vorläufer. Die Archaea sind

Flavobakterien

Prokaryoten, ähnlich den Bacteria, aber besitzen

einige Merkmale von Eukaryoten. [Nach Wheelis, M. L., Kandler, ©., und Woese, C. R., Proc. Natl.

Acad. Sci. 89, 2931 (1992).]

Gram-Positive

Methanococcus Thermoproteus

Pflanzen Ciliaten

Flagellaten Mikrosporidien

Zelluläre Strukturen

lichkeit mit dem von Eukaryoten als dem von Bakterien hat, beweist, dass die

Archaea nicht einfach ungewöhnliche Bakterien sind. Die Divergenz der drei Organismentypen wird durch das Verzweigungsmuster in Woeses Evolutionsschema deutlich angezeigt (jede Verzweigungsstelle stellt einen jeweils gemeinsamen Vorläufer dar). Das Drei-Domänen-Schema zeigt außerdem, dass Tiere, Pflanzen und Pilze nur einen kleinen Teil aller Lebensformen ausmachen. Solche phylogenetischen Stammbäume ergänzen die fossilen Befunde, welche nur ein flickenhaftes Zeugnis des Lebens vor ungefähr 600 Millionen Jahren liefern (Vielzeller tauchten vor ungefähr 700-900 Millionen Jahren auf). Es ist unwahrscheinlich, dass Eukaryoten von einem hoch entwickelten Prokaryoten abstammen, da zwischen Bacteria und Eukarya fundamentale Unterschiede bestehen. Der erste Eukaryot scheint vielmehr das Ergebnis einer Assoziation von archaebakteriellen und eubakteriellen Zellen zu sein. Das genetische Material der Eukaryoten enthält Strukturen, die vermutlich archaebakteriellen Ursprungs sind. Zudem ähneln die Mitochondrien und Chloroplasten eukaryotischer Zellen in Größe und Form Bakterien, und beide Organellen verfügen über ein eigenes Genom und eine eigene Proteinsynthese. Die wahrscheinlichste Erklärung dafür, nämlich dass Mitochondrien und Chloroplasten das Resultat einer Symbiose zwischen frei lebenden Bakterien und primitiven Eukaryoten sind, wurde zuerst von Lynn Margulis formuliert (Exkurs 1.1). In der Tat kennt man einige Eukaryoten ohne eigene Mitochondrien oder Chloroplasten, die permanent durch symbiontisch in ihnen lebende Bakterien besiedelt sind.

D.

Wie entwickeln sich Organismen weiter?

Der Mechanismus der präbiotischen Evolution durch natürliche Selektion setzt sich bei der Evolution der Organismen fort. Richard Dawkins hat die Evolution mit einem blinden Uhrmacher verglichen. Dieser ist in der Lage, rein zufällig ein kompliziertes Produkt zustande zu bringen. Solch ein Bild kann aber nicht die riesige Zeitspanne und die in kleinsten Schritten auf Basis von Versuch und Irrtum ablaufenden Verfahren vermitteln, aus denen komplexe Organismen hervorgehen. Geringfügige Mutationen (Veränderungen im genetischen Material eines Individuums) resultieren aus zufälligen physikalischen Schädigungen der DNA oder aus zufälligen inhärenten Fehlern während des Replikationsprozesses. Eine Mutation, welche die Überlebenschancen eines Individuums erhöht, verstärkt die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutation an die nächste Generation weitergegeben wird. Während vorteilhafte Mutationen dazu neigen, sich schnell in einer Population auszubreiten, tendieren schädliche Mutationen dazu, mit dem Organismus, der sie trägt, auszusterben. Obwohl bereits um 1860 Charles Darwin die natürliche Selektion als Evolutionstheorie formulierte, wurde sie erst in letzter Zeit experimentell nachvollzo-

gen. Die gemeinsame Betrachtung von experimentellen Ergebnissen, molekularer Information und Fossilienfunden veranschaulicht wichtige — oft auch missverstandene — Prinzipien der Evolution: 1. Evolution ist nicht auf ein bestimmtes Ziel gerichtet. Sie erfolgt durch zufällige Veränderungen, welche die Fähigkeit eines Organismus, sich unter den vorherrschenden Bedingungen zu vermehren, beeinflussen kann. Wenn sich die Bedingungen ändern, kann es einem Organismus, der an seine Umgebung gut angepasst ist, besser oder schlechter gehen. 2. Evolution benötigt ein gewisses Maß an inhärenter Ungenauigkeit, die es Organismen erlaubt, sich an unvorhergesehene Veränderungen anzupassen. Dies ist ein Grund, warum genetisch homogene Populationen (z. B. gewisse Getreidesorten) gegenüber einem einzigen Schädling (z.B. einem Insekt) so empfindlich sind. Eine stärker heterogene Population hat mehr Möglichkeiten, einer Bedrohung zu widerstehen und sich zu regenerieren.

71

12

Leben

Exkurs 1.1

Berühmte Biochemiker

Lynn Margulis und die Endosymbiontentheorie Zusammenschluss von Zellen - und deren genetischem Material - den Margulis postuliert hatte. Nichtsdestotrotz beharrte die forsche.Lynn Margulis darauf, und als sie 1981 ihr Buch „Symbiosis in Cell Evolution“ veröffentlichte, stand ein

großer Teil der Biologen hinter ihr. Zwei wichtige Postulate aus Margulis‘ Theorie sind inzwischen nahezu allgemein akzeptiert: Mitochondrien sind Lynn Margulis (1938-)

Nachfahren

Lynn Margulis wuchs in Chicago auf. Mit 16 Jahren immatrikulierte sie sich an der Universität von Chicago und wollte Schriftstellerin werden. Ihr Interesse an der Biologie wurde durch eine obligate naturwissenschaftliche Lehrveranstaltung geweckt, für die sie Gregor Mendels Berichte über seine genetischen Experimente mit Erbsen las. Margulis setze ihr Studium an der Universität von Wisconsin in Madison und der Universität von Kalifornien in Berkeley fort, wo sie im Jahre 1963 den Doktortitel erhielt. Nach sorgfältiger Betrachtung der Zellstrukturen stellte sie die Hypothese auf, dass sich eukaryotische Zellen durch eine Reihe von sogenannten endosymbiontischen Ereignissen entwickelten, an denen verschiedene Prokaryoten beteiligt waren. Der Begriff endo (griechisch: innerhalb) zeigt an, dass eine Zelle innerhalb einer anderen

„haust“.

Damals

(1967)

wurde

diese Vorstellung

für unmöglich gehalten, aber inzwischen sind viele von Margulis‘ Ideen allgemein akzeptiert. Bereits 1927 hatte Ivan Wallin die Endosymbiose als Ursache für die Entstehung der Mitochondrien postuliert. Ihm war die Ähnlichkeit zwischen Mitochondrien und Bakterien hinsichtlich ‚Größe, Form und cytologischer Anfärbung aufgefallen. Wallins Hypothese wurde als zu unwahrscheinlich abgetan und ignoriert, bis Lynn Margulis sie wieder aufgriff. In den 1960er-Jahren wusste man mittlerweile sehr viel mehr über Mitochondrien (und Chloroplasten), so auch, dass sie DNA enthalten und sich durch Teilung vermehren. Margulis konzentrierte sich nicht nur auf den Ursprung einzelner Organellen, sondern war bestrebt, den Ursprung der gesamten eukaryotischen Zelle zu erklären, zu der auch Centriolen, ein weiterer bakterieller Überrest, gehören. Ihre Veröf-

fentlichung „On the Origin of Mitosing cells“ („Über den Ursprung sich teilender Zellen“) wurde zunächst von mehreren Fachzeitschriften abgelehnt, bevor sie schlieflich vom Journal of Theoretical Biology angenommen wurde. Die Vorstellung, dass eine komplexe eukaryotische Zelle aus einer Vereinigung von gegenseitig abhängigen prokaryotischen Zellen entstanden sein könnte, war mit der vorherrschenden Ansicht unvereinbar, dass die Evolution eine Reihe kleiner Schritte darstellt.

Die Evolutionstheorie jener Zeit hatte keinen Platz für den

von

sauerstoffverbrauchenden

Bakterien,

und

Chloroplasten waren ursprünglich Photosynthese treibende Bakterien. Die Vorstellung, dass das eukaryotische Cytosol das Überbleibsel

Biologen

einer Archaeazelle

allerdings

noch

ist, wird von

in Frage gestellt.

manchen

Margulis

ist

dabei, Beweise für eine vierte Vorstellung zu sammeln, näm-

lich die, dass Cilien und Flagellen (Geißeln) und manche sensorischen Strukturen wie zum Beispiel die lichtempfindlichen Zellen des Auges die Nachfahren von frei lebenden Bakterien, den Spirochäten, sind. Margulis hatte ursprünglich prophezeit, dass man

Organellen wie z.B. Mitochondrien

isolieren

und kultivieren könne. Dies ist nicht eingetreten. Es gibt jedoch hinreichende Beweise für den Transfer von genetischem Material zwischen Organellen und dem Zellkern, was mit Margulis‘ Endosymbiontentheorie im Einklang steht. Heutige Evolutionstheorien berücksichtigen neben kleinen zufälligen Mutationen als Auslöser für Veränderungen in der Tat die Verschiebung von genetischem Material zwischen Organismen, so wie es von Margulis vorhergesagt wurde. Möglicherweise in Erweiterung ihrer Arbeit über die bakterielle Endosymbiose erkannte Margulis, dass die Wechselwirkungen zwischen vielen verschiedenen Organismentypen sowie ihre Wechselwirkungen mit ihrer Umwelt ein einziges, sich selbst regulierendes System bilden. Diese Vorstellung entspricht der von James Lovelock vorgeschlagenen GaiaHypothese, welche die gesamte Erde als eine lebende Einheit ansieht (Gaia war in der griechischen Mythologie die Erde in Göttergestalt). Margulis widerstrebt es jedoch, diese moderne Gaia zu mythologisieren. Sie besteht darauf, allein wissenschaftliche Werkzeuge und Beweisführungen einzusetzen, um die Wahrheit herauszufinden und ärgert sich über die allgemeine Ansicht, dass der Mensch den Mittelpunkt des Lebens auf der Erde bildet. Margulis ist der Auffassung, dass das Überleben der Menschheit von unserem Miteinander mit Bakterien abhängt, die Abfälle wiederverwerten, Was-

ser reinigen und Sauerstoff erzeugen können und mit denen wir uns über Milliarden von Jahren - manchmal endosymbiontisch — gemeinsam entwickelt haben. Sagan, L., On the origin of mitosing cells.J. Theor. Biol. 14, 255-274 (1967).

Thermodynamik

3. Evolution ist durch ihre eigene Vorgeschichte determiniert. Neue Strukturen und Stoffwechselfunktionen entstehen aus bereits bestehenden Elementen. Zum Beispiel tauchten Insektenflügel nicht plötzlich auf, sondern entwickelten sich wahrscheinlich in abgestufter Weise aus kleinen wärmeaustauschenden Strukturen. 4. Evolution dauert an, obgleich nicht ausschließlich in Richtung Komplexität. Eine anthropozentrische Sicht stellt menschliche Wesen als den Gipfel eines evolutionären Planes dar. Aber ein kurzer Blick auf die Vielfalt des Lebens zeigt, dass auch einfacher strukturierte Arten nicht ausgestorben sind und nicht aufgehört haben, sich weiterzuentwickeln.

3

Thermodynamik

Die Kennzeichen lebender Organismen — Bewegung, Wachstum, Vermehrung — erfordern eine nahezu gleichbleibende Zufuhr von Energie. Selbst in Ruhe setzen Organismen einen erheblichen Teil ihres biochemischen Apparates für die Gewinnung und den Verbrauch von Energie ein. Die Lehre von der Energie und ihrer Wirkung auf die Materie sind Gegenstand der Thermodynamik (griech.: therme, Wärme; dynamis, Kraft). Obwohl lebende Systeme einige praktische Herausforderungen an die thermodynamische Analyse mit sich bringen, folgt Leben den Gesetzen der Thermodynamik. Eine thermodynamische Betrachtung ist zum einen wichtig für eine quantitative Beschreibung eines Prozesses (z.B. einer biochemischen Reaktion), zum anderen für die Voraussage, ob der Prozess überhaupt spontan ablaufen kann. Wir werden nun zunächst die Hauptsätze der Thermodynamik rekapitulieren. Dann wenden wir uns der Freien Enthalpie und ihrer Bedeutung für die Beschreibung chemischer Reaktionen zu. Abschließend werden wir uns ansehen, wie lebende Systeme mit den thermodynamischen Gesetzmäfßigkeiten zurecht kommen.

A.

Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik: Die Energie bleibt erhalten

In der Thermodynamik wird ein System als der aktuell interessierende Teil des Universums definiert, wie z.B. ein Reaktionsgefäß oder ein Organismus; der Rest des Universums gilt als Umgebung. Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik sagt aus, dass Energie (U) erhalten bleibt ; sie kann weder erschaffen noch vernichtet werden. Die Energieänderung eines Systemes ist als Differenz zwischen der Wärme (g), die von einem System aus der Umgebung aufgenommen wird, und der Arbeit (w), die von dem System gegenüber der Umgebung geleistet wird, definiert. AU

=

Uanfang —

Upnde = g-Ww

(1.1)

Während Arbeit (definiert als Kraft mal dem unter ihrer Einwirkung beschrittenen Weg) mit einer zielgerichteten Bewegung verbunden ist, reflektiert Wärme ungeordnete molekulare Bewegung. Kraft kann viele unterschiedliche Formen annehmen. Hierzu gehören die von einer Masse auf eine andere ausgeübte Gravitationskraft, die Expansionskraft eines Gases, die von einer Feder oder einer Muskelfaser ausgeübte Torsionskraft, die elektrische Kraft zwischen Ladungen und die dissipativen Kräfte bei Reibung und Viskosität. Energie kann auf verschiedene Weise dazu verwendet werden, Arbeit zu verrichten. Je nach Art der geleisteten Arbeit spricht man daher auch von mechanischer Energie, elektrischer Energie oder chemischer Energie. Alle diese Energieformen sind für biologische Systeme von Bedeutung.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 %

Welche Rolle spielt die Kompartimentierung für die Chemie der Zelle? Nennen Sie die wichtigsten Unterschiede zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Wie stehen die drei Grundtypen der Organismen zueinander in Beziehung? Erklären Sie den Prozess der Evolution durch natürliche Auslese.

13

14

Leben

Die meisten biologischen Vorgänge laufen bei konstantem Druck ab. Unter solchen Bedingungen ist die Arbeit, die durch die Expansion eines Gases (Druck-Volumen-Arbeit) geleistet wird, PAV. Darauf aufbauend, ist es vorteilhaft, eine neue thermodynamische Größe, die Enthalpie (griech.: enthalpein, erwärmen), abgekürzt H, zu definieren: (1.2)

H=U+rPV Dann ist bei konstantem Druck

= AU + PAV=qp -w+ AH

(1.3)

PAV

wobei gp als die Wärme bei konstantem Druck definiert ist. Jetzt, nur Druck-Volumen-Arbeit zulassend (andere Arten von Arbeit sind bei chemischen Reaktionen gewöhnlich zu vernachlässigen), ist

AH = qp - PAV + PAV=

(1.4)

Wie wir sehen, entspricht unter diesen Bedingungen jede Enthalpieänderung der Freisetzung, oder Aufnahme, von Wärme. Darüber hinaus sind bei den meisten biochemischen Reaktionen die Volumenänderungen unbedeutend, so dass die Unterschiede zwischen AU und AH zu vernachlässigen sind. Enthalpie wird ähnlich wie Energie, Wärme und Arbeit in Joule-Einheiten angegeben (einige häufig verwendete Einheiten, biochemische Konstanten und Umrechnungsfaktoren sind im Exkurs 1.2 wiedergegeben).

Exkurs 1.2

Biochemie im Fokus

2

2

-

2+,

p4 x

ir‘ Br: 5ni P

Er

Biochemische Konventionen Die moderne Biochemie verwendet für verschiedene thermo-

Präfixe von Maßeinheiten

dynamische und andere Messungen generell Syst&me-International-Einheiten (SI-Einheiten) inklusive der Einheiten Meter (m), Kilogramm (kg) und Sekunde (s) sowie der daraus abgeleiteten Einheiten. Die folgende Tabelle führt häufig

Mega (M) Kilo (k) Milli (m) Mikro (u) Nano (n) Pico (p) Femto (f) Atto (a)

verwendete

biochemische

Einheiten,

einige nützliche

Kon-

stanten und ein paar Umrechnungsfaktoren auf. In diesem Text werden die molekularen Massen von Partikeln durchgehend in der Einheit Dalton (D), die als 1/12 der

Masse eines "’C-Atoms definiert ist, angegeben (1000 D = 1 Kilodalton, kD). Biochemiker verwenden auch den Begriff Molekulargewicht, eine dimensionslose Größe, die als das Verhältnis der Partikelmasse zu 1/12 der Masse eines

'?C-Atoms definiert ist und mit dem Symbol M, (für relative Molmasse) bezeichnet wird.

10° 10° 10° 10% 10% 10"? 1058 107°

Konstanten

Avogadro-Zahl (N) Coulomb (C)

6,0221 x 10°” Moleküle -mol" ”

Faraday-Konstante (7)

6,241 X 10'° Elektronenladungen 96.485 C- mol”

bzw. 96.485 ]-V' mol" Allgemeine

Einheiten

Energie, Wärme

Joule ())

kg-m?: s” oder C V

Elektrisches Potential

Volt (V)

en

8,3145 J)- K' . mol"

Gaskonstante (R)

Boltzmann-Konstante (ks) 1,3807 x 10°” J-K' (R/N) Planck’sches 6162614x51 07 5] 5 Wirkungsquantum

Umrechnungsfaktoren Angström (Ä)

102m

Kalorie (cal) Kelvin (K)

4,184 ] Grad Celsius (°C) + 273,15

Pascal (Pa)

10° bar bzw. 9,86923 x 10° atm

Thermodynamik

Die Thermodynamik ist sehr nützlich, um die Spontaneität eines Vorganges anzuzeigen. Ein spontaner Vorgang erfolgt ohne zusätzliche Energiezufuhr zum System von außerhalb. Thermodynamische Spontaneität hat hingegen nichts damit zu tun, wie schnell ein Vorgang geschieht. Ob ein Prozess spontan verläuft, geht jedoch nicht allein aus dem Ersten Hauptsatz der Thermodynamik hervor. Betrachten Sie einen Vorgang, bei dem zwei Objekte unterschiedlicher Temperatur zusammengebracht werden. Wärme fließt spontan von dem wärmeren zu dem kühleren Objekt, niemals umgekehrt. Jedoch würden beide Vorgänge mit dem Ersten Hauptsatz der Thermodynamik übereinstimmen, da die Gesamtenergie der beiden Objekte sich nicht ändert. Deshalb wird ein zusätzliches Kriterium für Spontaneität benötigt.

B.

Der Zweite Hauptsatz der Thermodynamik: Die Entropie nimmt ständig zu

Entsprechend dem Zweiten Hauptsatz der Thermodynamik sind spontane Vorgänge durch den Übergang von Ordnung zu Unordnung gekennzeichnet. Unordnung ist in diesem Zusammenhang als die Anzahl energetisch äquivalenter Möglichkeiten, W in der die Komponenten eines Systemes angeordnet werden können, definiert. Um dieses Konzept zu veranschaulichen, soll ein System betrachtet werden, das aus zwei Kolben gleicher Volumina besteht, von denen der eine Moleküle eines idealen Gases enthält (Abb. 1.10). Wenn der die beiden Kolben verbindende Hahn offen ist, liegen die Moleküle ungeordnet, aber zu gleichen Teilen auf die beiden Kolben verteilt vor. Dass in jedem Kolben die gleiche Anzahl von Gasmolekülen vorkommt, ist nicht die Folge irgendeines, die Fortbewegung bestimmenden Gesetzes, sondern beruht darauf, dass die Wahrscheinlichkeiten für alle anderen Arten der Molekülverteilung über alle Maße gering sind. So ist die Wahrscheinlichkeit, dass alle Moleküle in diesem System von allein in den linken Kolben strömen (die Ausgangssituation) unendlich klein, obwohl die Energie und Enthalpie dieser Anordnung genau die gleiche ist, wie die der gleichmäßig verteilten Moleküle. Das Ausmaß der Zufälligkeit eines Systemes wird durch seine Entropie (griech.: en, in und trope, zugewendet), abgekürzt S, angegeben:

S=k in W

(1,5)

wobei k, die Boltzmann-Konstante ist. Entropie hat die Dimension J K’' (die absolute Temperatur, in Kelvin-Einheiten, tritt als Faktor auf, weil die Entropie mit der Temperatur variiert; z.B. nimmt die Unordnung eines Systemes mit dem Anstieg seiner Temperatur zu). Die wahrscheinlichste Anordnung eines Systemes ist diejenige, die zu höchsten Werten von W und folglich von S führt. Somit muss, wenn ein — wie in Abbildung 1.10 gezeigter — spontaner Vorgang Gesamtänderungen der Energie und Enthalpie (AU und AH) von Null hat, seine Entropieänderung (AS) größer als Null sein. Dies bedeutet, dass die Zahl äquivalenter Anordnungsmöglichkeiten des Endzustandes größer als die des Ausgangszustandes sein muss. Weiterhin gilt, da ASsystem + ASumgebung = ASuUniversum > 0

dass alle ablaufenden Vorgänge die Entropie - d.h. die Unordnung versums erhöhen. Bei chemischen und biologischen Systemen ist es in der Praxis wenn nicht sogar unmöglich, die Entropie eines Systemes durch aller äquivalenten Anordnungsmöglichkeiten seiner Komponenten men (W). Es gibt jedoch für die bei biologischen Systemen typischen,

(1.6)

- des Unischwierig, Auszählen zu bestimunter kon-

Abb. 1.10 Zufallsverteilung von Gasmolekülen. Bei (a) besetzt ein Gas nur den linken von zwei gleich großen Kolben. Wenn der Hahn geöffnet wird (b), diffundieren die Gasmoleküle zwischen den Kolben hin und her und sind letztendlich zwischen beiden Kolben gleich verteilt.

15

16

Leben

Enstanten Temperaturbedingungen ablaufenden, spontanen Vorgänge für die tropie eine äquivalente Formel: ASS q T

(1.7)

Nach dieser Formel kann die bei einem Vorgang auftretende Entropieänderung durch Wärmemessungen experimentell bestimmt werden.

C.

Freie Enthalpie

Allein die Kenntnis der Entropieänderung eines Systems reicht nicht aus, um die Spontaneität eines Vorgangs vorauszusagen. Zum Beispiel reagieren 2 Mol H, und 1 Mol O,, wenn sie angezündet werden, unter Bildung von 2 Mol H,O. Zwei Wassermoleküle, bei denen jeweils drei Atome zusammengelagert sind, haben aber einen höheren Ordnungsgrad als die drei zweiatomigen Moleküle, aus denen sie hervorgingen. Was ist also das thermodynamische Kriterium für einen spontanen Vorgang? Die Gleichungen 1.4 und 1.7 zeigen, dass bei konstantem Druck und Tempera-

As

AH

=

(1.8)

AH-TAS=0

(1.9)

Somit ist

Dies ist das wahre Kriterium für Spontaneität, wie es 1878 durch J. Willard Gibbs formuliert wurde. Er definierte die Gibbs’sche Freie Energie (G, heute als Freie Enthalpie definiert; im englischen Sprachgebrauch aber sehr oft als „Freie Energie“ bezeichnet) als Tab. 1.3 Veränderung der Spontaneität einer Reaktion (Vorzeichen von AG) mit den Vorzeichen von AH und AS. AH

AS

G=H-TS

(1.10)

Folglich ist für spontane Vorgänge bei konstanter Temperatur und konstantem Druck:

AG = AH - TAS

Die Reaktion ist sowohl seitens der Enthalpie (exotherm) als auch entropisch begünstigt. Sie läuft bei allen Temperaturen spontan (exergon) ab. Seitens der Enthalpie ist die Reaktion begünstigt, die Entropie wirkt aber dem entgegen. Sie läuft nur bei Temperaturen niedriger als T= AH /AS spontan ab.

Die Reaktion ist seitens der Enthalpie gehindert (endotherm), aber entropisch begünstigt. Sie läuft nur bei Temperaturen oberhalb T= AH /AS spontan ab.

Die Reaktion ist sowohl seitens Enthalpie als auch Entropie gehindert (endergon). Sie läuft bei keiner Temperatur spontan ab.

AG=AH-TAS 0) und werden endergon genannt. Ihnen muss Freie Enthalpie zugeführt werden. Wenn ein Vorgang exergon ist, dann ist die Rückreaktion endergon oder umgekehrt. Bei Vorgängen im Gleichgewicht, also solchen, bei denen Hin- und Rückreaktion genau ausgeglichen sind, ist AG = 0. In den meisten Fällen können für Freie Enthalpie, Enthalpie und Entropie nur die Veränderungen (AG, AH und AS), aber nicht die Absolutwerte gemessen werden. Ein Vorgang, der mit einem Anstieg der Enthalpie (AH > 0) verbunden ist (was dem Vorgang entgegenwirkt), kann dennoch spontan ablaufen, wenn die Entropieänderung ausreichend positiv ist (AS > 0; Tab. 1.3). Umgekehrt kann ein Vorgang, der mit einer Abnahme der Entropie einhergeht (AS < 0), dann ablaufen, wenn die Änderung seiner Enthalpie ausreichend negativ ist (AH < 0). Man sollte sich aber immer dessen bewusst sein, dass ein stark negativer Wert von AG keine Gewähr dafür ist, dass ein Vorgang - wie z.B. eine chemische Reaktion — mit einer messbaren Geschwindigkeit abläuft. Die Geschwindigkeit hängt vom genauen Mechanismus der Reaktion ab, der in keiner Abhängigkeit zu AG steht.

Thermodynamik

Freie Enthalpie wie auch Energie, Enthalpie und Entropie sind Zustandsfunktionen. Mit anderen Worten, ihre Werte hängen nur von dem aktuellen Zustand oder den Eigenschaften eines Systemes ab, aber nicht davon, wie das System diesen Zustand erreicht hat. Deswegen können thermodynamische Messungen in einer Weise durchgeführt werden, bei der nur die Ausgangs- und Endzustände berücksichtigt werden und alle schrittweisen Änderungen von Enthalpie und Entropie, die zwischendurch erfolgen, nicht mit einbezogen werden. Zum Beispiel ist es bei einem lebenden Organismus wegen zahlreicher anderer gleichzeitig ablaufender, chemischer Reaktionen nicht möglich, die Änderung der Energie für die Reaktion von Glucose mit O, direkt zu messen. Da aber AG nur von den Anfangs- und Endzuständen abhängt, kann die Verbrennung der Glucose unter Verwendung der gleichen Ausgangs- (Glucose und O,) und Endstoffe (CO, und H,O), die auch in vivo erhalten werden, in jeder geeigneten Apparatur analysiert werden.

D.

Chemische Gleichgewichte und der Standardzustand

Die Entropie (Unordnung) einer Substanz steigt mit ihrem Volumen an. Zum Beispiel erreicht eine Ansammlung von Gasmolekülen ihren höchsten Entropiewert, wenn diese allen verfügbaren Raum belegen. In ähnlicher Weise werden gelöste Moleküle gleichförmig im gesamten Volumen der Lösung verteilt. So gesehen ist Entropie eine Funktion der Konzentration. Wenn die Entropie mit der Konzentration variiert, gilt dies auch für die Freie Enthalpie. Damit hängt die Freie Enthalpie einer chemischen Reaktion von der Konzentration sowohl ihrer Reaktanten als auch ihrer Produkte ab. Dieses Phänomen hat große Bedeutung, weil viele biochemische Reaktionen in Abhängigkeit von den relativen Konzentrationen ihrer Reaktanten und Produkte in beide Richtungen laufen. Gleichgewichtskonstanten und AG stehen miteinander in Beziehung Die Beziehung zwischen der Konzentration und der Freien Enthalpie einer Ver-

bindung A ist annäherungsweise

Gı-G, = RTin[A]

(1.12)

wobei G, als die partielle molare Freie Enthalpie oder als chemisches Potential von A bezeichnet wird (der Balken zeigt an, dass es sich um eine auf ein Mol bezogene Größe handelt). G4 ist die partielle molare Freie Enthalpie von A im Standardzustand, R die allgemeine Gaskonstante und [A] die molare Konzentration von A. Weil Freie Enthalpien additive Größen sind, stellen Änderungen der Freien Reaktionsenthalpie die Summe der Freien Enthalpien der Produkte abzüglich der der Ausgangsstoffe dar. Für die allgemeine Reaktion aA +bB=cC + dD

ist die Änderung der Freien Enthalpie AG

= CGc ar dGp

= aGa

= bGs

(1.13)

und

NET.

ia

jelbG,

(1.14)

Einsetzen dieser Beziehung in Gleichung 1.12 ergibt: c

AG=AG°®

+ RTIn

ns

d

(1.15)

17

18

Leben

Rechenbeispiel 1.1 TE IN TEE ZUBE ESEBESIEI

Die Änderung in der Freien Standardenthal-

pie für eine Reaktion beträgt -15 kj-mol. Welche Gleichgewichtskonstante hat diese Reaktion? Da AG° bekannt ist, kann K., nach

Gleichung 1.17 berechnet werden. Setzen wir als Standardtemperatur 25 °C (298 K) ein, so ergibt sich: Baal Ka

g (15.000 J,mol.) (8,314 J-K--mol.ı) (298 K)

eq

Re

ee?

Keg= 426

wobei AG? die Änderung der Freien Reaktionsenthalpie ist, wenn alleAusgangs-

stoffe und Produkte im Standardzustand vorliegen (siehe unten). Die Gleichung für die Änderung der Freien Reaktionsenthalpie besteht somit aus zwei Teilen: (1) Einem konstanten Term, dessen Wert nur von der Art der ablaufenden Reaktion abhängt, und (2) einem variablen Teil, der von den Konzentrationen der Reaktionspartner, der Stöchiometrie der Reaktion und der Temperatur abhängt. Für eine Reaktion im Gleichgewicht, bei der es auf Grund gleicher Änderun-

gen der Freien Enthalpien von Hin- und Rückreaktion keine Nettoänderung gibt, wird AG = 0 und aus Gleichung 1.15 wird:

(1.16)

[AG° =-RTIn K,,| K.. ist die allgemein bekannte Gleichgewichtskonstante der Reaktion:

_ [SlealDiea _ „-scırr

© TAlealBles

(1.17)

Der Index „eq“ gibt an, dass es sich um Konzentrationen der Reaktionspartner im Gleichgewichtszustand handelt (dies geht meistens schon aus dem Kontext der geschilderten Reaktion hervor, so dass Gleichgewichtskonzentrationen gewöhnlich ohne diesen Index angegeben werden). Die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion kann somit aus Werten der Freien Standardenthalpien berechnet werden und umgekehrt (siehe das Rechenbeispiel 1.1). K hängt von der Temperatur ab

Wie die Gleichgewichtskonstante sich mit der Temperatur ändert, ist durch Einsetzen von Gleichung 1.11 in Gleichung 1.15 und anschließendes Umformen ersichtlich: -AH° InReg =

er

/1 (z)Er

NSS R

(1.18)

wobei H° und S° Standardenthalpie und -entropie sind. Gleichung 1.18 hat die Form einer Geradengleichung: y = mx + b. Durch eine Auftragung nach van’ Hoff von In K,, gegen 1/T können aus den Messungen von Gleichgewichtskonstanten bei zwei (oder mehreren) unterschiedlichen Temperaturen die Werte von AH? und AS? (und folglich von AG°) bestimmt werden. Diese Methode ist meistens leichter durchführbar als die direkte kalorimetrische Messung von AH° und AS? (bei der die Reaktionswärme, q,, gemessen wird). In der Biochemie übliche Festlegungen für Standardzustände Um Änderungen der Freien Enthalpie für verschiedene Reaktionen zu vergleichen, ist es erforderlich, auf einen Standardzustand bezogene AG-Werte anzugeben (ähnlich wie die Höhe geographischer Orte auf die Höhe des Meeresspiegels bezogen sind, die willkürlich gleich Null gesetzt wird). Nach der in der physikalischen Chemie verwendeten Festlegung befindet sich ein gelöster Stoff im Standardzustand, wenn die Temperatur 25 °C, der Druck 101,325 kPa und seine Aktivität 1 betragen (die Aktivität eines Stoffes ist eine korrigierte Konzentrationsangabe, die sein nichtideales Verhalten bei Konzentrationen höher als die einer unendlichen Verdünnung berücksichtigt). Gewöhnlich sind bei den meisten biochemischen Reaktionen die Konzentrationen der Reaktionspartner so niedrig (in der Größenordnung von millimolar oder niedriger), dass ihre Aktivitätswerte sehr nahe bei den Werten der molaren Konzentrationen liegen. Da weiterhin biochemische Reaktionen bei nahezu neutralen pH-Werten ablaufen, haben Biochemiker eine etwas veränderte Festlegung für den Standardzustand getroffen:

Thermodynamik

1. Der Aktivität von reinem Wasser wird ein Wert von 1 zugewiesen, obgleich die Konzentration 55,5 M ist. Bei Reaktionen, die in verdünnten Lösungen mit Wasser als einem Reaktionspartner ablaufen, vereinfacht dieses Vorgehen den Ausdruck für die Freie Enthalpie, da der [H,O]-Term weggelassen werden kann. 2. Der Wasserstoffionen-Aktivität wird ein Wert von 1 zugewiesen, wenn der physiologisch relevante pH von 7 vorliegt. Damit ist der biochemische Standardzustand durch einen pH-Wert von 7,0 charakterisiert (neutraler pH bei dem [H*] = 10°” M) und nicht wie der physikochemische Standardzustand durch den pH-Wert 0 ([H*] = 1 M), bei dem viele biologische Substanzen

nicht stabil sind. 3. Der Standardzustand einer Substanz, die ein Säure-Base-Verhalten zeigt, ist als Summe der Konzentrationen ihrer natürlichen, bei pH 7 als Gemisch vorkommenden Arten von Ionen definiert. Im Gegensatz dazu beziehen sich physikochemische Festlegungen auf reine Stoffe, unabhängig davon, ob sie bei pH 0 wirklich vorkommen. Der Vorteil der biochemischen Festlegung ist, dass die Gesamtkonzentration einer Verbindung mit mehreren lonisationszuständen, wie es auf die meisten Biomoleküle zutrifft, meistens leichter zu messen ist, als die ihrer einzelnen Ionenspezies. Da die Ionenzusammensetzung einer Säure oder Base jedoch mit dem pH-Wert variiert, gelten die Freien Standardenthalpien, die gemäß der biochemischen Konvention berechnet werden, nur für pH 7. Nach der Biochemie-Konvention werden die Änderungen der Freien Standardreaktionsenthalpien üblicherweise durch AG°’ symbolisiert, um sie von den physikochemischen Änderungen der Freien Standardenthalpie, AG°, zu unterscheiden. Wenn bei einer Reaktion weder H,O, H*, noch eine ionisierbare Spezies beteiligt sind, dann ist AG?’ = AG°.

E.

Leben unterliegt den Gesetzen der Thermodynamik

Es gab eine Zeit, da glaubten Biologen, dass Leben, mit seiner ihm eigenen Komplexität und Ordnung, sich den Gesetzen der Thermodynamik entzieht. Jedoch bestätigen sorgfältige Messungen an lebenden Tieren die durch den Ersten Hauptsatz vorausgesagte Erhaltung von Energie. Offensichtlich ist eine experimentelle Beweisführung für den Zweiten Hauptsatz praktisch nicht durchführbar, da dies eine Zerlegung eines Organismus in seine molekularen Komponenten erfordert, was zu seinem unwiderruflichen Tod führen würde. Dass die En-

tropie lebender Materie geringer ist als die der Bestandteile, aus denen sie sich zusammensetzt, kann somit nur behauptet werden. Leben ist deshalb möglich, weil ein System für den Preis einer zunehmenden Unordnung seiner Umgebung in einen Zustand größerer Ordnung übergehen kann (Gl. 1.6). Lebende Organismen bringen Ordnung hervor, indem sie die Ordnung der von ihnen verbrauchten (abgebauten) Nährstoffe erniedrigen. Damit ist der Entropiegehalt von Nahrung ebenso bedeutsam wie ihr Enthalpiegehalt. Lebende Organismen sind offene Systeme

Die klassische Thermodynamik lässt sich in erste Linie auf reversible Prozesse in abgeschlossenen und geschlossenen Systemen anwenden. Erstere können weder Materie noch Energie, letztere nur Energie mit der Umgebung austauschen. Ein isoliertes System nähert sich zwangsläufig einem Gleichgewichtszustand. Wenn zum Beispiel seine Reaktanten im Überschuss vorliegen, wird die Hinreaktion so lange schneller als die Rückreaktion ablaufen, bis das Gleichgewicht erreicht ist (AG = 0). An diesem Punkt halten sich Hin- und Rückreaktion genau die Waage. Im Gegensatz dazu können offene Systeme, welche mit ihrer

19

20

Leben

Abb. 1.11 Energiefluss in der Biosphäre. Pflanzen verwenden die Strahlungsenergie der Sonne, um aus CO, und H,O Kohlenhydrate zu synthetisieren. Pflanzen oder die Tiere, die sich

von diesen ernähren, machen letztendlich beim Stoffwechsel der Kohlenhydrate die in ihnen gespeicherte Freie Enthalpie verfügbar, wobei CO, und H,O wieder an die Umgebung abgegeben werden.

Umgebung sowohl Materie als auch Energie austauschen, nie in einem solchen Gleichgewicht sein, solange dieser Austausch andauert. Lebende Systeme, die Nahrung aufnehmen, Abfallprodukte ausscheiden, Arbeit leisten und Wärme erzeugen, sind offene Systeme und können daher nie im Gleichgewicht sein. Sie nehmen kontinuierlich Nährstoffe hoher Enthalpie und niedriger Entropie auf, die sie zu Abfallprodukten niedriger Enthalpie und hoher Entropie umwandeln. Die bei diesen Prozessen freigesetzte Freie Enthalpie ermöglicht die zellulären Aktivitäten, die den für Leben charakteristischen hohen Ordnungs-

zustand herstellen. Wird dieser Prozess unterbrochen, dann geht das System letztendlich in ein Gleichgewicht über, das für Lebewesen den Tod bedeutet. Ein Beispiel für den Energiefluss in einem offenen System ist in Abbildung 1.11 bildlich dargestellt. Durch Photosynthese wandeln Pflanzen Strahlungsenergie der Sonne, der primären Energiequelle für das Leben auf der Erde, in die chemische Energie von Kohlenhydraten und anderen organischen Stoffen um. Die Pflanzen oder die Tiere, die diese fressen, metabolisieren diese Substanzen, um

damit Energie für Leistungen wie die Synthese von

Biomolekülen,

zelluläre Bewegungsvorgänge und die Aufrechterhaltung intrazellulärer Ionenkonzentrationen bereitzustellen. Lebewesen halten ein Fließgleichgewicht aufrecht Auch in einem System, das sich nicht im Gleichgewicht befindet, unterliegt der Fluss von Materie und Energie den Gesetzen der Thermodynamik. Zum Beispiel bewegen sich Stoffe von Stellen hoher zu denen niedriger Konzentration. Auf diese Weise nimmt Blut in den Lungen O, auf- das dort ausreichend vorhanden ist - und setzt es in den Geweben frei. Dort ist O, nur in geringen Konzentrationen vorhanden. Lebende Systeme sind dadurch charakterisiert, dass sie sich in einem Fließgleichgewicht (engl.: steady state) befinden. Dies bedeutet, dass alle Flüsse in dem System konstant sind, so dass das System sich nicht mit der Zeit ändert. Der Energiefluss in der Biosphäre (Abb. 1.11) stellt ein Beispiel für solch ein System dar. Geringe Störungen des Fließgleichgewichtes verursachen Veränderungen bei den Flüssen, die das Fließgleichgewicht dann wieder herstellen. In allen lebenden Systemen ist der Energiefluss ausschließlich „bergab“ gerichtet (AG < 0). Hinzu kommt, dass natürlichen Vorgängen ein dissipativer Charakter innewohnt, so dass die Ausbeute an Freier Enthalpie bei einem biochemischen Vorgang nie dem maximalen Wert entspricht und somit immer etwas Energie an die Umgebung verloren geht.

Zusammenfassung Biochemische Reaktionen werden durch Enzyme katalysiert Potentiell können nahezu alle molekularen Komponenten eines Organismus miteinander reagieren. Viele dieser Reaktionen sind thermodynamisch begünstigt (spontan). Doch tatsächlich laufen nur ein Bruchteil aller möglichen Reaktionen in einem Organismus in wahrnehmbarem Ausmaß ab. Die Geschwindigkeit einer einzelnen Reaktion hängt nicht nur von der Differenz der Freien Enthalpie zwischen Ausgangs- und Endzustand ab, sondern auch von dem konkreten Reaktionsablauf, durch den die Reaktanten in Produkte umgewandelt werden. Lebende Organismen nutzen dabei Katalysatoren, d.h. Substanzen, welche die Geschwindigkeit erhöhen, mit der sich eine Reaktion dem Gleichgewicht nähert, ohne dass das AG der Reaktion beeinflusst wird. Biologische Katalysatoren werden als Enzyme, die in den meisten Fällen Proteine sind, bezeichnet. Enzyme beschleunigen biochemische Reaktionen durch physische Wechselwirkung mit den Reaktanten und Produkten und führen dadurch zu einem günstigeren Reaktionsweg für deren gegenseitige Umwandlung. Indem Enzyme die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die Reaktanten miteinander produktive Wechselwirkungen eingehen, beschleunigen sie die Reaktionen. Reaktionen mit positiven AG-Werten können auch durch Enzyme nicht ermöglicht werden. Der Energiefluss wird in jeder Zelle durch eine Fülle von Enzymen vermittelt. Wenn Enthalpie aufgenommen, gespeichert oder auch zur Durchführung zellulärer Arbeit verwendet wird, kann sie dabei auf andere Moleküle übertragen werden. Von daher ist man geneigt, Freie Enthalpie als etwas anzusehen, das in einer chemischen Bindung konserviert ist. Aber chemische Energie kann entsprechend dem Bedarf der Organismen und in Abhängigkeit von der biochemischen Maschinerie, mit der sie durch die Evolution ausgestattet wurden, auch in Wärme, elektrische Arbeit oder in mechanische Arbeit transformiert werden.

Zusammenfassung 1. Zum Ursprung des Lebens wird ein Modell vorgeschlagen, nach dem Organismen letztendlich aus einfachen organischen Molekülen hervorgingen. Durch Polymerisation bildeten diese komplexere Moleküle, die in der Lage waren, sich selbst zu replizieren. 2. Kompartimentierung führte zu Zellen, die Stoffwechselreaktionen zur Synthese von Biomolekülen und zur Bereitstellung von Energie entwickelten. 3. Zellen sind durchweg entweder prokaryotischer oder eukaryotischer Natur. Eukaryotische Zellen enthalten eine Vielfalt membranumschlossener Organellen. 4. Auf der Basis phylogenetischer Beweisführung werden Organismen in drei große Domänen eingeteilt: Archaea, Bacteria und Eukarya. 5. Die Evolution der Arten erfolgt durch natürliche Auslese. 6. Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik (Energie bleibt erhalten) und der Zweite Hauptsatz (Spontane Vorgänge steigern die Unordnung des Universums) gelten auch für biochemische Prozesse. Die Spontaneität eines Vorgangs wird durch die Änderung der Freien Enthalpie (AG = AH - TAS) bestimmt: Bei spontanen Reaktionen ist AG < 0 und bei nichtspontanen ist NGE=20:

7. Die Gleichgewichtskonstante und die Änderung der Freien Standardenthalpie eines Prozesses stehen miteinander in Beziehung. 8. Lebende Organismen sind offene Systeme, die ein Fließgleichgewicht aufrecht erhalten.

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1; Erklären Sie den Ersten und Zweiten Hauptsatz der Thermo-

dynamik.

Wie hängt die Änderung der Freien Enthalpie eines Vorganges von seiner Enthalpie- und Entropieänderung ab? Wann läuft ein Vorgang spontan ab? In welchem Zusammenhang stehen die Gleichgewichtskonstante einer chemischen Reaktion und ihre Freie Enthalpieänderung? Wie kann Leben trotz des Zweiten Hauptsatzes der Thermodynamik bestehen?

2]

22

Leben

Verbindun i Gruppe le Bindung Polymer Kondensationsreaktion Hydrolyse Replikation Vesikel Kompartimentierung Katalysator Eukaryot Prokaryot Virus Zellkern Organelle

Cytoplasma ci Golgi-Apparat Mitochondrion Chloroplast Lysosom Peroxisom Vakuole Cytosol Cytoskelett Taxonomie Phylogenie Archaea Bacteria Eukarya

Reticulum

kp spontaner Vorgang _ exergon endergon Gleichgewicht Zustandsfunktion

Methanogene Halobakterien Thermophile Symbiose Mutation Thermodynamik ' System Umgebung U q 9 w H W S

Ga GL Standardzustand Gleichgewichtskonstante abgeschlossenes System geschlossenes System offenes System Fließgleichgewicht Enzym

Aufgaben 1. Identifizieren Sie die funktionellen Gruppen im abgebildeten Molekül.

6. Nimmt Entropie bei den folgenden Prozessen zu oder ab? (a) N, + 3H)

(b)

2NH;3

1 E5N

HZN

——

C-NEG

+

1,07

000777

CH,CH7

|

DB

CH

B

Harnstoff

:

( _

Wassers machen es zu einem ausgezeichneten Lösungsmittel für polare und ionische Substanzen, die als hydrophil (griech.: hydro, Wasser; philos, liebend) bezeichnet werden. Dagegen sind apolare Substanzen quasi unlöslich in Wasser („Öl und Wasser mische nicht!“) und werden dementsprechend als hydrophob (griech.: phobos, Angst) bezeichnet. Apolare Substanzen sind jedoch in apolaren Lösungsmitteln wie CCl, und Hexan löslich. Dies kann man mit dem Grundsatz „Gleiches löst sich in Gleichem“ zusammenfassen. Wieso lösen sich Salze in Wasser? Polare Lösungsmittel wie Wasser schirmen die Anziehungskräfte zwischen entgegengesetzt geladenen Ionen ab und dadurch können die Ionen voneinander getrennt werden (in apolaren Lösungsmitteln dagegen ziehen sich entgegengesetzt geladene Ionen so stark an, dass sie sich zu einem Festkörper vereinigen). Ein in einem polaren Lösungsmittel gelöstes Ion zieht die jeweils entgegengesetzt geladenen Pole der Lösungsmitteldipole an (Abb. 2.6). Dadurch wird das gelöste Ion von mehreren konzentrisch angeordneten Hüllen aus gerichteten Lösungsmittelmolekülen umgeben. Solche Ionen nennt man solvatisiert oder, wenn Wasser als Lösungsmittel fungiert, hydratisiert. Die Wassermoleküle der Hydrathülle sind verglichen mit den Wassermolekülen in der reinen Wasserphase weniger mobil. In der Wasserphase ist die für das Lösen einer Wasserstoffbrücke benötigte Energie verschwindend gering, da sich meist gleichzeitig eine neue Wasserstoffbrücke ausbildet. Dies gilt nicht für die stärker geordneten Wassermoleküle der Hydrathülle. Die Solvatisierungsenergie kann auch bei chemischen Reaktionen eine Rolle spielen, denn eine reagierende Gruppe muss zunächst das sie umgebende Hydratationswasser abstreifen, um

Abb. 2.6

Solvatisierung von lonen.

nahe genug an den Reaktionspartner heranzukommen.

Die Dipole der umgebenden Wassermoleküle sind

Ungeladene polare Moleküle können auf Grund ihrer Bindungsdipole ebenso in wässrigen Lösungen löslich sein wie ionische Substanzen. Die Löslichkeit von

gemäß der Ladung des lones angeordnet. Nur eine Schicht der Hydrathülle ist gezeigt.

30

Wasser

(a) 0)

(b) (0)

x

H

R

“

TEN

QH2..O

Y

/

B ji H

(c)

R

. o=e

SH

H

R

6)

(d)

0Z

H

H

|

ee

H

:

ö

R—C

H,

/

U:

?

SE

r

No

P:

R—N’—H-:--0 H|i H

ö

no

| oO

on

Abb. 2.7 Wasserstoffbrücken-Bindung über funktionelle Gruppen. Wasser bildet Wasserstoffbrücken mit (a) Hydroxylgruppen, (b) Ketogruppen, (c) Carboxylgruppen und (d) Ammoniumionen aus.

polaren und ionischen Substanzen wird durch funktionelle Gruppen erhöht, wie beispielsweise Hydroxyl- (OH), Carbonyl- (C=O), Carboxyl- (COOH) und Amino(NH3) gruppen, welche wie in Abbildung 2.7 dargestellt Wasserstoffbrücken-Bindungen ausbilden können. Tatsächlich enthalten wasserlösliche Biomoleküle wie Proteine, Nucleinsäuren und Zucker eine große Zahl solcher funktioneller Gruppen. Dagegen fehlen solche Wasserstoffbrückendonatoren und -akzeptoren in apolaren Substanzen.

C.

Der hydrophobe Effekt

Bei Zugabe einer apolaren Substanz zu einer wässrigen Lösung wird diese vom Wasser nicht gelöst, sondern vielmehr ausgeschlossen. Das Bestreben des Wassers, seinen Kontakt mit hydrophoben Molekülen so gering wie möglich zu halten, nennt man den hydrophoben Effekt. Viele große Moleküle und molekulare Verbände wie Proteine und Membranen bilden ihre Form auf Grund dieses hydrophoben Effektes aus. Betrachten wir einmal die Thermodynamik des Transfers von apolaren Molekülen von einem wässrigen in ein apolares Lösungsmittel. Die Änderung der freien Energie ist stets negativ, was zeigt, dass ein solcher Transfer ein spontaner Prozess ist (Tab. 2.2). Interessanterweise sind diese Prozesse entweder endotherm (AH ist positiv) oder athermisch (AH = 0), d.h. es ist vom Standpunkt der Enthalpie aus gesehen nahezu gleich günstig, apolare Moleküle in Wasser oder in einem apolaren Medium zu lösen. Jedoch ist die Änderung in der Entropie (ausgedrückt durch -TAS) stets groß und negativ. Deshalb ist der Transfer eines Kohlenwasserstoffs aus einem wässrigen in ein apolares Medium durch die Entropie getrieben, d.h. die Änderung der freien Energie wird hauptsächlich durch die Entropie bewirkt. Entropie oder „Unordnung“ ist ein Maß für die Ordnung eines Systems (Abschnitt 1.3B). Wenn die Entropie beim Verlassen eines apolaren Moleküls aus dem Wasser zunimmt, muss umgekehrt die Entropie abnehmen, wenn das Molekül ins Wasser eintritt. Diese Entropieabnahme bei der Solvatisierung eines apolaren Moleküls in Wasser ist eine experimentelle Beobachtung, keine theoretische Schlussfolgerung. Die auftretenden Entropieänderungen sind zu groß, als dass sie lediglich die Konformationsänderungen der Kohlenwasserstoffe widerspiegeln könnten. Daher müssen die Entropieänderungen maßgeblich durch eine Umorientierung des Wassers bewirkt werden. Was ist die Triebfeder für diese Umorientierung?

Tab. 2.2 Thermodynamische Änderungen beim Transfer von Kohlenwasserstoffen aus Wasser in apolare Lösungsmittel bei 25 °C.

Prozess

AH (kJ-mol')

-TAS (kJ-mol)

AG (kJ- mol")

CH, in H,O = CH, in Benzol

117

2726

-10,9

CHyin H,O = CH, in CCl,

10,5

226

21241

GH, in H,O = C,H, in Benzol

9,2

es

-15,9

GH, in H,O = C,H, in Benzol

6,7

18,8

—12,1

GH, inH,O = C,H, in Benzol

0,8

- 88

- 80

Benzol in H,O = flüssiges Benzol?

0,0

-17,2

-17,2

Toluol in H,O = flüssiges Toluol®

0,0

—20,0

-20,0

pen eh

Abb. 2.8 Orientierung von Wassermolekülen rings um eine gelöste apolare Substanz. Um die Anzahl an Wasserstoffbrücken-Bindungen zu maximieren, bilden Wassermoleküle einen Käfig

um die gelöste Substanz. Schwarze Linien zeigen Wasserstoffbrücken-Bindungen an.

eines

estehetenn uns>Seren

* gemessen bei 18 °C Quelle: Kauzmann, W., Adv. Protein Chem. 14, 39 (1959).

ernennen

N

5

Physikalische Eigenschaften von Wasser

Das komplexe Netzwerk aus Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den Molekülen in flüssigem Wasser wird durch das Eindringen einer apolaren Gruppe zerstört. Da eine apolare Gruppe weder als Donator noch als Akzeptor an Wasserstoffbrücken-Bindungen teilnehmen kann, können die Wassermoleküle an der Grenzschicht zur polaren Gruppe keine normalen Wasserstoffbrücken-Bindungen ausbilden. Um den Verlust an Wasserstoffbrücken-Bindungsenergie wett zu machen, orientieren sich die Wassermoleküle an der Grenzfläche so, dass sie ein Netzwerk aus Wasserstoffbrücken bilden, welches das hydrophobe Volumen ausschließt (Abb. 2.8). Diese Umorientierung stellt eine größere Ordnung der Wasserstruktur dar, denn die Anzahl der möglichen Wasserstoffbrücken-Bindungen um eine apolare Gruppe herum ist geringer als wenn nur freie Wassermoleküle vorhanden wären. Unglücklicherweise hat bislang die komplexe Grundstruktur von flüssigem Wasser eine detaillierte Beschreibung dieser Umorientierung nicht zugelassen. Ein Modell schlägt vor, dass Wasser eine Art Käfig aus Wasserstoffbrücken-Bindungen um die apolaren Gruppen bildet, ähnlich wie in der Struktur des Eises. Die Wassermoleküle der Käfige sind tetraedrisch durch Wasserstoffbrücken-Bindungen an andere Wassermoleküle gebunden. Diese Umorientierung der Moleküle erstreckt sich in mehreren Schichten über die erste Hydratationshülle des apolaren gelösten Stoffes hinaus. Die ungünstige freie Hydratationsenergie einer apolaren Substanz, welche durch die Umorientierung der umgebenden Wassermoleküle verursacht wird, hat letztendlich den Effekt, dass die apolare Substanz aus der wässrigen Phase ausgeschlossen wird. Das rührt daher, dass die Oberfläche einer Kavität mit mehreren apolaren Molekülen geringer ist als die Gesamtoberfläche der Kavitäten, die einzeln vorliegende Moleküle erzeugen würden (Abb. 2.9). Die Aggregation von apolaren Gruppen in Wasser minimiert die Oberfläche der entstehenden Kavität und damit auch den Entropieverlust des ganzen Systemes. Die apolaren Gruppen werden quasi aus der wässrigen Phase herausgedrängt.

31

Abb. 2.9 Aggregation unpolarer Moleküle in Wasser. (a) Die Hydratation dispers verteilter unpolarer Moleküle (braun) verringert die Entropie des Systems, denn die Wassermoleküle in der Hydrat-

hülle (dunkelblau) stehen nur eingeschränkt für die Bildung von Wasserstoffbrücken zur Verfügung. (b) Nach Aggregation der unpolaren Moleküle erhöht sich die Entropie, denn für die Hydrathülle des Aggregats sind weniger Wassermoleküle nötig als für die Hydrathüllen der Einzelmoleküle. Dieser Entropiegewinn ist der Grund für die spontane Aggregation upolarer Substanzen in Wasser.

Amphiphile Verbindungen bilden Micellen und Doppelschichten aus

Die meisten Biomoleküle haben sowohl polare (oder ionische) als auch apolare Bereiche. Sie sind damit hydrophil und hydrophob zugleich. Solche Moleküle, wie z.B. Fettsäuren (Seifen; Abb. 2.10), werden als amphiphil oder amphipathisch bezeichnet (griech.: amphi, beides; pathos, Leidenschaft). Wie treten amphiphile Substanzen mit Wasser in Wechselwirkung? Wasser ist bestrebt, die hydrophilen Anteile eines Amphiphils zu hydratisieren, es versucht jedoch gleichzeitig, die hydrophoben Regionen des gelösten Moleküls zu meiden. Aus diesem Grund bilden Amphiphile bevorzugt geordnete Aggregate. Solche Aggregate können die Form von Micellen (kugelförmige Gebilde aus mehreren tausend amphiphilen Molekülen) einnehmen. Dabei sind die hydrophilen Gruppen an der Oberfläche der Kugel angeordnet, wo sie mit dem wässrigen Lösungsmittel interagieren können. Die hydrophoben Gruppen hingegen füllen das Kugelinnere aus, wo sie das Lösungsmittel möglichst meiden können (Abb. 2.11a). Das in Abbildung 2.11a dargestellte Modell ist allerdings stark vereinfacht. Im Inneren der idealisiert dargestellten Micelle wäre gar nicht genug Platz für alle hydrophoben Gruppen. In der Realität sind die Micellen sehr viel weniger geordnet (6)

l

CH,CH,CH,CH,CH;CH,CH,CH,CH;CH,CH5CH;CH;CH,CH, — C— 0° Palmitat

(C 1 „Ha ‚C00’)

eek | CH3CH,CH;CH3CH;CH;CH;CH,

— C — [6 =

Oleat

i CH;CH3>CH;CH3;CH;CH3;CH;

(C47H33C00)

C a (02

Abb. 2.10 Fettsäureanionen (Seifen). Palmitat und Oleat sind amphiphile Verbindungen. Sie tragen sowohl eine polare Carboxylgruppe als auch eine lange apolare Kohlenwasserstoffkette.

32

Wasser

Abb. 2.11 Strukturen von Micellen und Lipiddoppelschichten. In wässriger Lösung sind die polaren Kopfgruppen amphiphiler Moleküle hydratisiert, während die apolaren Schwänze durch Wasserausschluss aggregieren. Eine Micelle (a) ist ein kugelartiges Aggregat, eine Doppelschicht (b) ist ein ausgestrecktes planares Aggregat. Die Doppelschicht kann eine geschlossene Kugel (ein sog. Vesikel) ausbilden, welche eine wässrige Phase einschließt.

(b) Doppelschicht

(a) Micelle polare

„Kopf“gruppen

„Schwanz“

H,O

(Abb. 2.12). Nichtsdestoweniger sind die unpolaren Gruppen überwiegend im Inneren der Micelle zu finden, während die polaren Gruppen an der Oberfläche liegen. Alternativ können sich Amphiphile auch in Form von Doppelschichten (engl.: bilayer) oder Vesikeln anordnen, in denen sich die polaren Gruppen in Richtung auf die wässrige Phase ausrichten (Abb. 2.11b). In beiden Fällen werden die Aggregate durch den hydrophoben Effekt, d.h. das Bestreben des Wassers, hydrophobe Gruppen auszuschließen, stabilisiert. Die Auswirkungen des hydrophoben Effektes werden oft als hydrophobe Kräfte oder hydrophobe „Bindungen“ bezeichnet. Der Begriff „Bindung“ impliziert jedoch eine diskrete und gerichtete Beziehung zwischen zwei Partnern. Der hydrophobe Effekt wirkt indirekt und ungerichtet auf apolare Gruppen. Obwohl man bei einer Gruppe von apolaren Molekülen in einer wässrigen Umgebung von einer gegenseitigen Anziehung sprechen könnte, ist deren Ausschluss aus der wässrigen Phase in erster Linie durch die Entropie der umgebenden Wassermoleküle bedingt und nicht durch „hydrophobe Kräfte“ zwischen den apolaren Molekülen. Es treten zwar Dispersionkräfte (London-Kräfte) zwischen den unpolaren Gruppen auf, diese sind jedoch vergleichsweise gering.

D.

Abb. 2.12

Modell einer Micelle.

Gezeigt ist ein raumfüllendes, am Computer

berechnetes Modell einer Micelle aus zwanzig Molekülen Octylglucosid (eine unpolare Kette aus acht Kohlenstoffen mit einem Zucker als polare Kopfgruppe). Die polaren Sauerstoffe der Glucosidgruppen sind rot dargestellt, die Kohlenstoffe sind grau. Der Übersichtlichkeit halber sind die Wasserstoffe nicht dargestellt. Aus Computersimulationen weiß man, dass solche Micellen eine

unregelmäßige Struktur besitzen, die zudem einer raschen Fluktuation unterliegt - ganz anders als das idealisierte, völlig symmetrische Modell in Abb. 2.11a. Die Kopfgruppen können nur einen Teil der Micellenoberfläche abdecken, so dass immer auch

ein Teil der hydrophoben „Schwänze“ in Kontakt mit dem Lösungsmittel steht. [Mit freundlicher Genehmigung von Michael Garavito und Shelagh Ferguson-Miller, Michigan State University.]

Osmose und Diffusion

Die Flüssigkeit in den Zellen und die umgebende Flüssigkeit in vielzelligen Organismen ist voller gelöster Substanzen, angefangen von kleinen anorganischen Ionen bis hin zu großen molekularen Aggregaten. Die Menge an „freiem“ Wasser, in welchem sich diese Stoffe bewegen, umfasst daher lediglich einen Teil des gesamten vorhandenen Wassers, da jedes gelöste Molekül von einer vergleichsweise unbeweglichen Hülle aus Wassermolekülen umgeben ist, dem sogenannten Hydratationswasser. Zusätzlich beeinflusst die Konzentration des gelösten Stoffes die kolligativen Eigenschaften des Wassers. Das sind physikalische Eigenschaften, die maßgeblich von der Konzentration und nicht von den chemischen Eigenschaften der gelösten Substanzen abhängen. Beispielsweise bewirken gelöste Stoffe eine Gefrierpunktserniedrigung, indem sie die Kristallisation von Wassermolekülen erschweren, oder sie bewirken eine Siedepunktserhöhung, indem sie dem Über-

tritt der Moleküle von der Lösung in die Gasphase entgegenwirken. Der osmotische Druck hängt ebenfalls von der Konzentration des gelösten Stoffes ab. Wenn eine Lösung und reines Wasser durch eine semipermeable Membran (die den Durchgang von Wassermolekülen, aber nicht von gelösten Stoffen erlaubt) getrennt sind, so versucht das Wasser auf die Seite der Lösung zu fließen, um die Konzentration des gelösten Stoffes auf beiden Seiten der Membran auszugleichen. Osmose ist die Lösungsmittelbewegung vom Ort hoher Konzentration (in diesem Falle vom reinen Wasser) zum Ort niedrigerer Konzentration (Wasser mit gelöstem Stoff). Der osmotische Druck einer Lösung ist derjenige Druck, der aufgewendet werden muss, um das Einfließen von Was-

Physikalische Eigenschaften von Wasser (a)

(b)

(e)

Druck

33

Abb. 2.13 Osmotischer Druck. (a) Eine wasserdurchlässige Membran trennt eine mit konzentrierter Lösung gefüllte Röhre von reinem Wasser. (b) Da Wasser durch Osmose eindringt, steigt der Pegel im Rohr. (c) Der Druck, der notwendig ist um den Influx zu verhindern,

entspricht dem osmotischen Druck. Er beträgt für eine 1 M Lösung 2270 kPa.

konzentrierte

Lösung Wasser

semipermeable Membran

ser zu verhindern. Er ist der Konzentration des gelösten Stoffes proportional (Abb. 2.13). Für eine 1 M Lösung beträgt der osmotische Druck 2270 kPa. Wie wirkt sich der osmotische Druck auf lebende Zellen aus, die im Prinzip lediglich semipermeable Beutel mit wässrigen Lösungen sind? Viele tierische Zellen minimieren den osmotischen Zufluss von Wasser, indem sie sich mit einer Lösung ähnlichen osmotischen Druckes umgeben, so dass kein Nettofluss von Wasser stattfindet. Ohne diese Vorkehrungen würden die relativ instabilen Membranen tierischer Zellen dem Druck nicht standhalten können. Die meisten Pflanzen und Bakterien hingegen umgeben ihre Zellen mit einer starren Zellwand, die dem innerhalb der Zelle erzeugten osmotischen Druck standhalten kann. Wenn eine wässrige Lösung und reines Wasser durch eine Membran getrennt sind, welche permeabel für Wasser und gelösten Stoff ist, dann tritt gelöster Stoff aus der Lösung aus, während Wasser einfließt. Die Moleküle bewegen sich dabei ungerichtet, sie diffundieren so lange, bis die Konzentration des gelösten Stoffes auf beiden Seiten der Membran die gleiche ist. Zu diesem Zeitpunkt hat sich ein Gleichgewicht eingestellt, es tritt kein Nettofluss mehr von Wasser oder gelöstem Stoff auf (obwohl sich die einzelnen Moleküle nach wie vor durch die Membran hindurch bewegen). Das Bestreben von gelösten Substanzen, von einem Ort hoher Konzentration zu einem mit niedriger Konzentration (d. h. entlang eines Konzentrationsgefälles) zu diffundieren, ist thermodynamisch günstig, da es eine Zunahme der Entropie darstellt. Diffusion von gelösten Substanzen kommt bei der Technik der Dialyse zur Anwendung. Dabei wird ausgenutzt, dass Stoffe, die kleiner als die Porengröße der Dialysemembran sind, frei permeieren können, bis sich zwischen der Probe und dem Vorratsgefäß ein Gleichgewicht eingestellt hat (Abb. 2.14). (a)

Beginn der Dialyse

(b) Im Gleichgewichtszustand

Dialysemembran

Lösungsmittel

konzentrierte

Lösung

Abb. 2.14 Dialyse. (a) Eine konzentrierte Lösung wird durch eine Dialysemembran (dargestellt als Schlauch, der an beiden Ende verknotet ist) von einem großen Lösungsmittelvolumen getrennt. Nur kleine Moleküle können durch die Membran diffundieren. (b) Im Gleichgewichtszustand ist die Konzentration an kleinen Molekülen innen und außen dieselbe, wohingegen die großen Moleküle sämtlich innerhalb der Membran verbleiben.

34

Wasser

Verständnisfragen zu Abschnitt1 1. Vergleichen Sie die Wasserstoffbrücken-Bindung in Eis und in flüssigem Wasser. 2. Beschreiben Sie die chemische Natur und relative Stärke von kovalenten Bindungen, ionischen Wechselwirkungen und van-der-Waals-Kräften. 3. Erklären Sie, warum sich polare Substanzen im Gegensatz zu apolaren in Wasser lösen. 4. Beschreiben Sie den Beitrag der Entropie beim hydrophoben Effekt. 5. Wieso bilden Amphiphile im Wasser Micellen aus? 6. Wie unterscheidet sich Osmose von Diffusion? Welcher dieser Prozesse tritt bei der Dialyse auf?

Die größeren Moleküle jedoch können die Membran nicht passieren und bleiben wo sie sind. Die Dialyse ist vor allem nützlich zur Abtrennung von großen Molekülen wie Proteinen und Nucleinsäuren von kleineren gelösten Substanzen.

Da die kleinen, löslichen

Partikel frei zwischen

der Probe und

dem umgebenden Medium diffundieren können, kann die Dialyse mehrmals wiederholt werden, um z.B. das Probenmedium ersetzen.

2

durch eine andere Lösung zu ;

Chemische Eigenschaften von Wasser

Wasser ist nicht nur eine passive Komponente der Zelle oder der extrazellulären Umgebung. Wasser bestimmt auf Grund seiner physikalischen Eigenschaften die Löslichkeiten anderer Substanzen. Ähnlich bestimmen die chemischen Eigenschaften des Wassers das Verhalten anderer Moleküle in Lösung.

A.

lonisation von Wasser

Wasser ist ein neutrales Molekül mit einer leichten Tendenz Gewöhnlich wird diese Ionisation als

zur lonisation.

H0:=:H"#ı0Hr

ausgedrückt. In Wahrheit existiert aber kein freies Proton (H*) in Lösung. Das Proton ist vielmehr mit einem Wassermolekül zu einem Hydroniumion (H;0*) assoziiert. Die Assoziation von einem Proton mit einer Gruppe von Wassermolekülen führt auch zu Strukturen mit den Formeln H,O}, H,O3 usw. Der

Einfachheit halber werden wir diese Ionen alle als H* darstellen. Das zweite Produkt der Ionisierung von Wasser ist das Hydroxidion, OH. Das Proton eines einzelnen Hydroniumiones kann schnell von einem Wassermolekül zum nächsten springen (Abb. 2.15). Deshalb ist die Beweglichkeit von H'- und OH"-Ionen sehr viel größer als die anderer Ionen. Protonensprünge sind auch die Ursache dafür, dass Säure-Base-Reaktionen zu den schnellsten Reaktionen in wässrigen Lösungen zählen. Die Ionisation von Wasser wird durch eine Gleichgewichtsgleichung ausgedrückt, in der die Konzentration der Ausgangssubstanz in den Nenner und die Konzentrationen der dissoziierten Produkte in den Zähler gesetzt werden:

«_ [H*JIOH7] [0]

Protonen-

N

“

u

_— sprünge

H N

oT

&,@)

K ist die Dissoziationskonstante (hier und generell in diesem Buch werden Einheiten in eckigen Klammern dazu verwendet, die molare Konzentration anzugeben). Da die Konzentration von undissoziiertem H,O ([H,O]) sehr viel größer ist als die seiner Dissoziationsprodukte, kann erstere als konstant angesehen und mit K zusammengefasst werden. Dann kann die Ionisation von Wasser folgendermaßen beschrieben werden:

K, = [H*[OH] Abb. 2.15

Protonensprünge. Protonensprünge finden sehr viel schneller statt als andere molekulare Bewegungen, wodurch die beobachtete hohe Mobilität von Hydronium- und Hydroxidionen in wässriger Lösung zu Stande kommt.

(2.1)

(2.2)

K,, die Ionisationskonstante von Wasser, beträgt 10°'* M? bei 25 °C. Da die Konzentration von H* und OH” in reinem Wasser gleich sein muss,

folgt [H'] = [OH] = (K,)'* = 10” M. Gemäß Gleichung 2.2 sind [H*] und

[OH] reziprok miteinander verknüpft. Wenn [H*] größer als 10°” M ist, muss [OH] dementsprechend kleiner sein, und umgekehrt. Lösungen mit [H*] = 10°” M werden als neutral, solche mit [H*] > 10” M als sauer und jene mit [H*] < 10” M als basisch bezeichnet. Die meisten physiologischen Lösungen

Chemische Eigenschaften von Wasser neutral

35

Abb. 2.16 Beziehung zwischen pH und Konzentration von H*- bzw. OH”-Ionen in Wasser. Da das Produkt von [H*] und [OH] konstant ist (10°'* M?), verhalten sich beide zueinander reziprok. Lösungen mit einem Überschuss an H*-lonen sind sauer (pH < 7), solche mit einem Überschuss an OH-lonen basisch (pH > 7). Wenn [H*] = [OH] = 10” M, ist die Lösung neutral (pH = 7). Man beachte die logarithmische Skala der lonenkonzentration.

basisch

102

m

lonenkonzentration (M) 10-12

Tab. 2.3

haben Hydroniumkonzentrationen nahe dem Neutralwert. So ist menschliches Blut mit [H*] von 4,0 x 10° M schwach basisch. Die absoluten Werte für [H*] sind in den meisten Flüssigkeiten sehr niedrig und damit unpraktisch in der Handhabung. Eine wesentlich praktischere Größe wurde im Jahre 1909 durch Sporen Sorensen mit dem Begriff des pH-Wertes eingeführt:

pH = - log [H*]

(2.3)

Je größer der pH ist, umso kleiner ist die H*-Konzentration und umgekehrt (Abb. 2.16). Der pH-Wert von reinem Wasser liegt bei 7,0, während saure Lösungen durch einen pH < 7,0 und basische Lösungen durch einen pH > 7,0 gekennzeichnet sind (siehe das Rechenbeispiel 2.1). Man beachte, dass sich Lösungen, die um eine pH-Einheit differieren, in [H*] um den Faktor 10 unterscheiden. Die pH-Werte einiger bekannter Flüssigkeiten sind in Tabelle 2.3 aufgelistet.

B.

pH-Werte einiger bekannter Flüssigkeiten.

Substanz

pH

1 M NaOH

14

Haushalts-Ammoniak

12

Meerwasser

8

Blut

Ze

Milch

7

Speichel

6,6

Tomatensaft

Auf

Essig

3

Magensaft

15

1M

0

HCl

Die Chemie der Säuren und Basen

Die von Wasser abgeleiteten H*- und OH’-Ionen sind elementar für die biochemischen Reaktionen, die wir im späteren Verlauf in diesem Buch antreffen werden. Biomoleküle wie Proteine und Nucleinsäuren tragen eine Vielzahl funktioneller Gruppen wie Carboxyl- oder Aminogruppen, die wiederum SäureBase-Reaktionen eingehen können. Diese Moleküle beeinflussen den pH der umgebenden wässrigen Lösung. Im Gegenzug beeinflusst der pH der Umgebung ihre Strukturen und Reaktivitäten. Ein Verständnis der Säure-Base-Chemie ist deshalb essentiell, um die Funktionen vieler Biomoleküle zu verstehen.

Eine Säure kann ein Proton abgeben Gemäß einer Definition, die 1923 von Johannes Bronsted und Thomas

Lowry

formuliert wurde, vermag eine Säure ein Proton abzugeben und eine Base ein Proton aufzunehmen. Eine Säure-Base-Reaktion kann nach der Bronsted-Lowry-Definition geschrieben werden als HA + H,O = H30*+ A°

Eine Säure (HA) reagiert mit einer Base (H,O) unter Bildung der zur Säure konjugierten Base (A’) und der zur Base konjugierten Säure (H,O*). Demnach ist

Rechenbeispiel 2.1 Ve

PT

Er

EEE

EEE

EFT

Welcher pH stellt sich ein, wenn 1,0 x 10* Mol H* (in der Form von HCI) zu einem Liter reinen Wassers dazugegeben werden? Reines Wasser hat einen pH von 7,0;

d.h. seine Protonenkonzentration [H*] beträgt 10°” M. Die Konzentration der zugefügten H*-Ionen beträgt 10°* M; die Konzentration der im Wasser vorhandenen H*-Ionen ist dem gegenüber vernachlässigbar. Die Protonenkonzentration der Lösung

beträgt demnach 10°* M. Der pH-Wert ist der negative dekadische Logarithmus der Protonenkonzentration, also

PH = -log[H*] = -log(1,0 x 10%) = 4.

36

Wasser

das Acetation (CH,COO") die konjugierte Base der Essigsäure (CH;COOH) und das Ammoniumion (NH}) die konjugierte Säure des Ammoniaks (NH,). Die Säure-Base-Reaktion wird in der Regel mit HA = H* + A’ abgekürzt, womit die Beteiligung von Wasser stillschweigend eingeschlossen wird. Für eine basische Substanz schreibt man analog HB* = H" + B. Die Stärke einer Säure wird durch ihre Dissoziationskonstante bestimmt Die Gleichgewichtskonstante für eine Säure-Base-Reaktion wird durch eine Dissoziationskonstante ausgedrückt, bei der die Konzentrationen der „Reaktanten“ in den Nenner und die Konzentrationen der „Produkte“ in den Zähler gesetzt werden:

= E

(2.4)

[HAJ[ARO] In verdünnten Lösungen ist die Wasserkonzentration im Wesentlichen immer gleich und liegt bei 55,5 M (1.000 g- L/18,015 g- mol’ = 55,5 M). Bezieht man diesen Wert als Konstante in die Dissoziationskonstante ein, erhält man:

K, = KIH20] = [H30*][A7] =

(2.5)

Der Einfachheit halber soll im weiteren Verlauf der Index „a“ jedoch weggelassen werden. Dissoziationskonstanten einiger gebräuchlicher Säuren sind in Tabelle 2.4 aufgelistet. Da die Säuredissoziationskonstanten, ähnlich wie die [H*]-Werte, sehr unpraktisch sind, werden sie analog zu Gleichung 2.3 in pK-Werte umgerechnet: pK = -logK

(2.6)

Säuren lassen sich anhand ihrer relativen Stärke klassifizieren, d.h. auf Grund ihrer Fähigkeit, Protonen auf Wassermoleküle zu übertragen. Die Säuren aus Tabelle 2.4 werden als schwache Säuren bezeichnet, da sie in wässriger Lösung nur teilweise ionisiert vorliegen (K < 1). Viele der sogenannten Mineralsäuren, beispielsweise HCIO,, HNO; und HCl, werden dagegen als starke Säuren bezeichnet (K>> 1). Da starke Säuren ihre Protonen umgehend auf H,O übertragen, ist H30" die stärkste Säure, die in wässriger Lösung stabil ist. Entsprechend kann es in wässrigen Systemen auch keine stärkere Base als OH geben. Praktisch alle Reaktionen in biologischen Systemen laufen unter Mitwirkung von H30* (bzw. OH’) und schwachen Säuren (bzw. deren konjugierten Basen) ab. Die relativen Konzentrationen von Säuren und Basen bestimmen den pH-Wert einer Lösung

Die Beziehung zwischen dem pH-Wert einer Lösung und der Konzentration einer Säure und ihrer konjugierten Base kann durch die Umformulierung von Gleichung 2.5 abgeleitet werden:

[H30*] =

[HA] a Ss

(2.7)

Nimmt man den negativen dekadischen Logarithmus beider Terme (und setzt pH = -log [H*] bzw. -log [H;0*]; Gl. 2.3), erhält man pH = - logK + log

[A]

[HA]

129)

Substituiert man -log K durch pK (Gl. 2.6), ergibt sich E =pK + log ss

[HA]

(2.9)

Chemische Eigenschaften von Wasser Tab. 2.4

Dissoziationskonstanten und pK-Werte einiger Säuren bei 25 °C.

Bm

TEE

TO EEE

— —— Z——————n.—

Säure

K

Oxalsäure

SIR

10

1,27 (pKı)

H,PO,

2082@105

2,15 (pK,)

Ameisensäure

178 2107°

3,75

Bernsteinsäure

417% 10”

4,21 (pKı)

Oxalat

537 x 10°

4,27 (pK,)

Essigsäure

1.74,x.107

4,76

Succinat

2,29 x 10°

5,64 (pK;)

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)

8,13 x 107

6,09

H,CO,

4,47 x 107

6,35 (pKı)*

Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)

1,74 x 107

6,76

H,PO;

15102102

6,82 (pK;)

3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)

085°

102

7,15

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N‘-2-ethansulfonsäure

3,39 x 10°

7,47

Tris(hydroxymethyl)Jaminomethan (Tris)

832210?

8,08

NH;

50622210:

0000.95

Glycin

1,66 X 107°

9,78

HCO;

4,68 x 10"!

Piperidin

a

HPO?

4,17 x 10"

(HEPES)

pK

a

10,33 (pK,) 5 62

12,38 (pK,)

Quelle: Dawson, R. M. C., Elliott, D. C., Elliott, W. H., und Jones, K. M., Data for Biochemical Research (3. Aufl.), S. 424-425, Oxford Science Publications (1986); Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolyy, T. N., Izawa, S., und Singh, R. M. M., Biochemistry 5, S. 467 (1966). * für die Gesamtreaktion CO, + H,O = H,CO, = H* + HCO;, vgl. Exkurs 2.1

Diese Beziehung wird Henderson-Hasselbalch-Gleichung genannt. Sind die molaren Konzentrationen einer Säure (HA) und ihrer konjugierten Base (A7) gleich, so ist log ([A’J/[HA]) = 0, und der pH der Lösung entspricht dem pK der Säure. Die Henderson-Hasselbalch-Gleichung ist beispielsweise sehr hilfreich, um den pH einer Lösung auszurechnen, wenn die Mengen an schwacher Säure und ihrer konjugierten Base bekannt sind (siehe das Rechenbeispiel 2.2). Die Gleichung ist jedoch nicht anwendbar bei starken Säuren und Basen, da sie nicht direkt das Ionisationsgleichgewicht des Wassers ausdrückt. Eine 1 M Lösung einer starken Säure hat z.B. einen pH von 0 und eine 1 M Lösung einer starken Base den pH 14.

Rechenbeispiel 2.2 EEE TE FETTE IDEE

Berechnen Sie den pH einer Lösung von 2 L Gesamtvolumen, die 10 mLeiner5M _ Essigsäure und 10 mL einer 1 M Natrium-

acetatlösung enthält. Berechnen Sie zunächst die Konzentrationen der Säure und die der konjugierten Base in mol pro Liter. Essigsäure:

(0,01 L)(5 M)/(2 L) = 0,025 M Natriumacetat:

(0,01 L)(1 M)/(2 L) = 0,005 M

Setzen Sie nun die Konzentration der Säure und die der konjugierten Base in die Henderson-Hasselbalch-Gleichung ein. Den pK für Essigsäure entnimmt man aus

G:

37

Puffer

Tabelle 2.4. pH = pK + log([Acetat]/[Essigsäure])

Bei Zugabe von 0,001 mL 1 M Salzsäure zu 1 L reinem Wasser fällt der pH von 7 auf 5, d.h. die Konzentration von H* steigt um das Hundertfache. Solch ein großer pH-Sprung wäre für die meisten biologischen Systeme kritisch, da schon eine geringe pH-Änderung Struktur und Funktion biologischer Moleküle dramatisch beeinflussen kann. Die Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Wertes

pH = 4,76 + log([0,005]/[0,025]) pH = 4,76 - 0,7 pH = 4,06

EEE EEE ENTE EEE TIEFEN

38

Wasser

Abb. 2.17 Titrationskurven von Essigsäure, Phosphat und Ammoniak. Am Startpunkt dominiert die Säureform. Bei Zugabe einer starken Base (z.B. NaOH) wird die Säure zur konjugierten Base. Am Wendepunkt der

Startpunkt

Endpunkt

Wendepunkt (pH=pK )

Titration, für den die Bedingung pH = pKgilt, sind

die Konzentrationen von Säure und konjugierter

Base gleich. Im Bereich des Titrationsendpunktes, an dem die Äquivalente an zugesetzter starker Base

jenen an vorgelegter Säure entsprechen (Äquiva-

lenzpunkt), herrscht ein großer Überschuss an konjugierter Base. Die farbig unterlegten Flächen zeigen die pH-Bereiche an, in denen die jeweiligen Lösungen effektive Pufferwirkung besitzen. 62 siehe Animated Figure.

Rechenbeispiel 2.3 FETT

FIFINENNSSITTTEE

Berechnen Sie den pH in einem Liter einer Lösung, die 0,1 M Ameisensäure und 0,1 M

Formiat enthält, jeweils vor und nach Zugabe von 1 mL einer 5 M NaOH-Lösung. Wie groß

wäre demgegenüber die pH-Veränderung bei Zugabe der Natronlauge zu I L reinen Wassers?

Nach Tabelle 2.4 beträgt der pK von Ameisensäure 3,75. Da [Ameisensäure]

= [Formiat], reduziert sich der Term log([A’]/[HA]) in der Henderson-Hasselbalch-Gleichung auf Null. Daher gilt: pH = pK = 3,75. Da die Volumenänderung nach Zugabe von 1 mL Natronlauge vernachlässigbar ist, errechnet sich [NaOH] als

022015025.

(0,001 L)(5 M)/(1 L) = 0,005 M.

Als starke Base dissoziiert NaOH vollständig in Lösung, und [OH] = [NaOH] = 0,005 M. Die OH”-Ionen reagieren mit Ameisensäure

und bilden Formiat und Wasser. Dadurch verringert sich die Konzentration der Ameisensäure um 0,005 M, während die

des Formiats um denselben Betrag steigt.

Die Konzentration der Ameisensäure beträgt also nun 0,1 M - 0,005 M = 0,095 M; die des Formiats beträgt 0,1 M + 0,005 M=0,105 M.

Setzt man diese Werte in die Henderson-

Hasselbalch-Gleichung ein, so ergibt sich: pH = pK + log([Formiat]/[Ameisensäure])

pH = 3,75 + log(0,105/0,095) pH = 3,75 + 0,04

pH = 3,79

Ohne die Pufferung durch die Ameisensäure wird der neue pH-Wert allein durch das Dissoziationsgleichgewicht des Wassers bestimmt:

K, = [H’JIOH ]= 10" [H*]= 10""*/ [OH ]=10"*/0,005=2 x 10"?M

pH = -log[H*] = -log(2 X 10?) = 11,7 VTErETEEETTT NN ITS TEEN

085.0742,.

0,522.

0:65,

0772201552.

01

925150

Dissoziierte H*-Ionen/Molekül

ist damit essentiell für lebende Systeme. Um die hierfür von der Natur entwickelten Mechanismen verständlich zu machen, soll zunächst die Titration einer schwachen Säure mit einer starken Base betrachtet werden. In Abbildung 2.17 sind die Änderungen der pH-Werte von Essigsäure, Dihydrogenphosphat und Ammonium bei der Titration mit OH” wiedergegeben. Solche Titrationskurven können experimentell oder rechnerisch anhand der Henderson-Hasselbalch-Gleichung erstellt werden (siehe das Rechenbeispiel 2.3). Wenn OH’ mit HA reagiert, entstehen A’ und Wasser: HA +0OH’=A"+H30. Folgende Einzelheiten der Titrationskurven in Abbildung 2.17 sind zu beachten:

1. Alle Kurven zeigen einen ähnlichen Verlauf, sind jedoch entlang der pHAchse in der Vertikalen verschoben. 2. Der pH-Wert am Wendepunkt jeder Titrationskurve hat die gleiche Größe wie der pK-Wert der entsprechenden Säure. An diesem Punkt gilt [HA] =

[AT].

3. Die Steigung aller Kurven verläuft in der Nähe der Wendepunkte wesentlich flacher als im Anfangs- und Endbereich der Titration. Dementsprechend ist der pH-Wert der Lösung für die Bedingung [HA]>[A'] vergleichsweise unempfindlich gegenüber der Zugabe starker Säuren oder Basen. Ein solches, allgemein als Säure-Base-Puffer bezeichnetes System, hält den pH-Wert dadurch konstant, dass kleine Zugaben von H* oder OH” durch A” oder HA abgefangen werden, ohne dass es im Bereich der Pufferwirkung zu großen Änderungen

des Wertes für log ([A’]/[HA]) kommt.

Chemische Eigenschaften von Wasser Startpunkt

1. Äquivalenzpunkt

2. Äquivalenz3. Äquivalenzpunkt punkt 3. Wendepunkt [HPO7

14

= [PO}]

Abb. 2.18 Titrationskurve einer mehrprotonigen Säure. Die Äquivalenzpunkte für die ersten beiden Dissoziationsstufen befinden sich jeweils im

|

steilsten Teil der Titrationskurve von H;PO,. Der pH am Wendepunkt jeder Stufe entspricht dem pK der entsprechenden lonisation.

12

6% siehe Animated Figure.

10

2. Wendepunkt

[H3POz ]=[HPO%]

|

pH

1. Wendepunkt [Hz3PO,]

=

[Ha PO;

|

0,5

]

1,0

14.39

2,0

25

3,0

Dissoziierte H*-Ionen/Molekül

Verbindungen, die mehr als einmal ionisiert werden können, wie z.B. H;PO, und H,CO;, nennt man mehrprotonige Säuren. Die Titrationskurven solcher

Verbindungen sind komplexer als diejenigen der einprotonigen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure. Eine mehrprotonige Säure besitzt mehrere pK-Werte, jeweils einen für jeden lonisierungsschritt (Abb. 2.18). H;PO, besitzt drei unterschiedliche Dissoziationskonstanten, da die ionische Ladung, welche aus der Abgabe des ersten Protons resultiert, eine weitere Protonendissoziation inhibiert. Dadurch erhöhen sich die pK-Werte für die Abgabe des zweiten und dritten Protons. Entsprechend besitzen Moleküle mit mehreren ionisierbaren Gruppen jeweils unterschiedliche pK-Werte für jede Gruppe. Deshalb besitzt die Titrationskurve eines Biomoleküls mit zahlreichen ionisierbaren Gruppen und pKWerten in der Regel keine deutlichen Plateaus. Biologische Flüssigkeiten, seien sie nun intra- oder extrazellulär, sind stark gepuffert. So wird z.B. der pH des Blutes eines gesunden Menschen auf einem Wert nahe bei 7,4 gehalten (vgl. Exkurs 2.1). Eine besondere Rolle spielen dabei in den meisten biologischen Flüssigkeiten Phosphat- und Carbonationen, da deren pK-Werte in diesem Bereich liegen (Tab. 2.4). Weiterhin tragen viele Biomoleküle wie Proteine, Nucleinsäuren und Lipide ebenso wie zahlreiche anorganische Moleküle eine Vielzahl von Säure-Base-Gruppen, die im Bereich des physiologischen pH-Wertes wirksame Puffereigenschaften haben. Vor dem 20. Jahrhundert wurde der Tatsache wenig Rechung getragen, dass sich die Eigenschaften biologischer Moleküle durch den pH des umgebenden Mediums stark ändern. Viele der frühen biochemischen Experimente wurden ohne pHKontrolle durchgeführt, weshalb die Reproduzierbarkeit oft zu wünschen übrig ließ. Heutzutage werden biochemische Präparationen standardmäßig gepuffert, um sie den natürlichen Bedingungen weitgehend anzunähern. Viele synthetische Pufferverbindungen wurden entwickelt. Tabelle 2.4 zeigt einige

39

40

Wasser

Das Puffersystem des Blutplasmas Bicarbonat ist das wichtigste Puffersystem im menschlichen Blut. Andere Puffersubstanzen, wie Proteine und organische

Säuren, sind dagegen in weit geringerer Konzentration vorhanden. Die Pufferkapazität hängt im Wesentlichen von zwei Gleichgewichten ab: (1) dem Gleichgewicht zwischen im Blut gasförmig gelöstem CO, und der nach folgendem Reaktionsschema entstehenden

c9,+. 0

Kohlensäure,

H,CO,

und (2) dem Gleichgewicht zwischen Kohlensäure und Bicarbonat, welches durch die Abspaltung von einem

steht:

H" ent-

H,CO, = H* + HCO;5

Der Gesamt-pK für beide Reaktionen

beträgt 6,35 (die

weitere Dissoziation von HCO; zu CO3', pK = 10,33, ist bei

physiologischem pH irrelevant). Wenn der pH des Blutplasmas auf Grund metabolischer H*-Produktion

sinkt, verschiebt

sich das Gleichgewicht

in

Richtung zu mehr Kohlensäure. Gleichzeitig zerfällt die Kohlensäure in Wasser und (gelöstes) CO,, welches dann in den Lungen als gasförmiges CO, abgeatmet wird. Im Gegensatz dazu entsteht mehr HCO3, wenn der pH des Blutplasmas steigt. Die Atmung wird so reguliert, dass vermehrt CO, durch die Lungen ins Blut eingeführt und zu Kohlensäure umgewandelt werden kann. Auf diese Weise kann eine annä-

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Was entsteht bei der Dissoziation von Wasser? Wie ist der Ky definiert? Beschreiben Sie, wie man den

pH-Wert aus der H*- oder OH”Konzentration berechnen kann.

Definieren Sie die Begriffe Säure und Base. Welche Abhängigkeit besteht zwischen der Stärke einer

Säure und ihrem pK? Wofür kann die Henderson-

hernd konstante Protonenkonzentration aufrechterhalten werden. Störungen dieses Puffersystemes können zur sogenannten Acidose, bei der der pH bis auf 7,1 absinken kann, oder zur Alkalose führen, bei der der pH bis auf 7,6 steigen kann. Änderungen von 0,05 pH-Einheiten um den „normalen“ Wert

von 7,4 sind jedoch problemlos. Ostruktive Lungenerkrankungen können beispielsweise eine sogenannte respiratorische Acidose verursachen, da das CO, nicht mehr abgeatmet werden kann. Eine Hyperventilation dagegen beschleunigt dessen Abatmen und eine respiratorische Alkalose ist die Folge. Eine metabolische Acidose kann durch eine Überproduktion von organischen Säuren aus Nahrungsvorstufen oder durch einen plötzlichen Anstieg der Milchsäurekonzentration beim Sport entstehen. Störungen im Säure-Base-Haushalt werden am besten durch Bekämpfen der verantwortlichen physiologischen Probleme behandelt. Bei einer Acidose wird meistens NaHCO, intravenös verabreicht. Eine Alkalose ist jedoch etwas schwieriger zu behandeln. Metabolische Alkalosen sprechen manchmal auf KCI oder NaCl an, da das zusätzliche CI” die H*-Sekretion der Nieren vermindert. Respiratorische Alkalosen können durch Einatmen von mit CO, angereicherter Luft behandelt werden.

davon. Die Pufferkapazität (Fähigkeit zur Konstanthaltung des pH-Wertes bei Zugabe von Säuren oder Basen) dieser schwachen Säuren ist jeweils maximal, wenn pH = pK. In der Praxis bedeutet das, dass eine schwache Säure eine relativ gute Pufferkapazität innerhalb einer pH-Einheit um ihren pK-Wert aufweist. Dieser Bereich ist in Abbildung 2.17 farbig unterlegt. Oberhalb dieses Bereiches, wenn das Verhältnis [AJ/[HA] > 10 ist, ändert sich der pH der Lösung bei Zugabe einer starken Base sehr rasch. Ebenso geht die Pufferwirkung verloren, wenn der pH-Wert den pK-Wert durch Zugabe einer starken Säure um mehr als eine Einheit unterschreitet. In der Laborpraxis wählt man die passenden Puffersubstanzen anhand des gewünschten pH-Wertes der Lösung aus. Typischerweise wird zunächst die freie Säure und ein leicht lösliches Salz der Säure etwa äquimolar in Lösung gebracht, und anschließend wird der pH durch Titration mit einer starken Säure oder Base eingestellt, während der pH mit Hilfe eines pH-Meters überprüft wird.

Hasselbalch-Gleichung verwendet werden? ua

Können Sie aus dem Kopf eine Titrationkurve für eine ein- und eine zweiprotonige Säure zeichnen? Wie heißen die charakteristischen Punkte auf der Kurve? Welche Merkmale muss eine

Pufferlösung haben, um ihren Zweck erfüllen zu können?

Zusammenfassung

—

1. Wasser ist essentiell für alle lebenden Organismen. 2. Wassermoleküle können Wasserstoffbrücken ausbilden. Dabei können die zwei Wasserstoffatome als Donatoren und die zwei ungepaarten Elektronenpaare als Akzeptoren fungieren. 3. Flüssiges Wasser stellt ein unregelmäßiges Netzwerk aus Wassermolekülen dar, wobei jedes Molekül bis zu vier Wasserstoffbrücken-Bindungen zu benachbarten Molekülen ausbildet.

Aufgaben

Hydrophile Substanzen wie Ionen und polare Moleküle lösen sich leicht in Wasser. Der hydrophobe Effekt ist das Bestreben des Wassers, seinen Kontakt zu

apolaren Verbindungen zu minimieren. Wassermoleküle wandern von Orten hoher zu Orten niedriger Konzentration durch Osmose. Gelöste Substanzen wandern von Orten hoher zu Orten niedriger Konzentration durch Diffusion. Wasser ionisiert zu H* (Hydroniumion, H30*) und OH”. Die Konzentration an H* in einer Lösung wird durch den pH-Wert ausgedrückt; in sauren Lösungen ist pH < 7, in basischen ist pH > 7 und in neutralen ist pH = 7. Säuren können Protonen abgeben und Basen Protonen aufnehmen. Die Stärke einer Säure wird durch ihren pK ausgedrückt. 10. Die Henderson-Hasselbalch-Gleichung setzt den pH einer Lösung in Bezug zu den Konzentrationen an gelöster Säure und konjugierter Base. KR Pufferlösungen können pH-Änderungen ungefähr innerhalb einer pH-Einheit um den pK der Komponenten abpuffern.

Wichtige Begriffe polar Wasserstoffbrücken-Bindung van-der-Waals-Abstand van-der-Waals-Kräfte London-Dispersionskräfte hydrophil hydrophob Solvatation

Hydratationswasser kolligative Eigenschaften Osmose osmotischer Druck Diffusion Dialyse Hydroniumion Protonensprung

Hydratation hydrophober Effekt amphiphil amphipathisch Micelle Doppelschicht

Dissoziationskonstante Ky

Säure Base

konjugierte Säure konjugierte Base pK

schwache Säure starke Säure Henderson-Hasselbalch-Gleichung Titrationskurve Puffer mehrprotonige Säure Pufferkapazität

neutrale Lösung saure Lösung basische Lösung pH

Aufgaben IE Benennen Sie die möglichen Waserstoffbrückendonatoren

und -akzeptoren in den folgenden Molekülen:

(a)

[6)

en

1

6

b)

|

nn 3 N:

N

ni

S

N

NH

3

Oo

s

5|

(ce)

=

COO”T

|

—&C=OH, OH

|

NHt

nn

>1

In seltenen Fällen kann auch eine C-H-Gruppe eine Wasserstoffbrücke ausbilden. Erklären Sie, warum dies leichter möglich ist, wenn das C-Atom ein benachbartes N-Atom hat.

3. Ordnen Sie folgende Verbindungen in der Reihenfolge ihrer Wasserlöslichkeit: (a)

(b)

H;C —

CH

OÖ

CHE

0)

|

H;C—C—NH;

(c) (d) (e)

0 H3C y, CHs a

CH;

OÖ

|

H,C—CH,— CH 4. Wo würden sich die folgenden Substanzen verteilen, in Wasser oder in Micellen aus Palmitinsäure?

(a) *H,N-CH,-COO’, (b) *HZN-(CH;)1-COO", (c) H3C-(CH,)1-COO".

41

42

Wasser

5. Erklären Sie, warum die Wassertropfen auf dem Lack eines frisch gewaschenen und gewachsten Autos nahezu ideale Kugelform besitzen. Warum bilden sich solche perlförmigen Wassertröpfchen auf der Windschutzscheibe nicht? 6. Was geschieht, wenn ein Dialyseschlauch mit reinem Wasser in einen Becher mit Salzwasser gehängt wird? Was würde passieren, wenn die Dialysemembran für Wasser, aber nicht für gelöste Substanzen durchlässig wäre? 7. Zeichnen Sie die Strukturen der konjugierten Basen der folgenden Säuren:

(@) C00” CH

®

COOH H—-C-H

al C0OH

©

N

000 H-C—H NH}

8. Geben Sie für (a) Ammoniak und (b) Phosphorsäure diejenige ionische Form an, welche jeweils bei pH 4, 8 und 11 vorherrscht. 9. Berechnen Sie den pH einer Lösung aus 200 mL Wasser und 50 mL 1 mM HCl. 10. Berechnen Sie den pH von 1 L einer Lösung mit folgender Zusammensetzung

(a) 10 mL5 M NaOH,

(b) 10 mL 100 mM Glycin und 20 mL 5 M HC], (cl) 10 mL2M Essigsäure und 5 g Natriumacetat

14. Wie viele Gramm Natriumsuccinat (Molgewicht 140 g- mol‘) und Dinatriumsuccinat (Molgewicht 162 g: mol!) müssen zu 1 L Wasser gegeben werden, um einen pH von 6,0 und eine Konzentration von

50 mM zu erhalten? 15. Schätzen Sie das Volumen an 5 M NaOH ab, das zu 100 mL einer 100 mM Phosphorsäure gegeben werden muss, um den pH von 4 auf 9 zu bringen. 16. (a) Wäre Phosphor- oder Bernsteinsäure der bessere Puffer bei pH 5? (b) Wäre Ammoniak oder Piperidin der bessere Puffer bei pH 9? (c) Wäre HEPES oder Tris der bessere Puffer bei pH 7,5? 17. Für die Proteinaufreinigung bei 4 °C wird eine Pufferlösung mit einem pH von 7,5 benötigt. Sie haben sich für einen Tris-Puffer (pK 8,08, AH? = 50 kJ - mol"') entschieden und eine 0,01 M Pufferlösung angesetzt, die bei 25 °C den gewünschten pH von 7,5 aufweist. Nachdem Sie den Puffer für die Proteinreinigung auf 4 °C abgekühlt haben, prüfen Sie nochmals den pH. Der pH hat sich beim Abkühlen jedoch auf 8,1 erhöht. Was ist die Erklärung für diese pH-Änderung? Wie können Sie sie vermeiden? 18. Glycin-Hydrochlorid (CIH;N’CH,COOH) ist eine diprotonige Säure mit einer Carboxylat- und einer Ammoniumgruppe. Diese zu den Aminosäuren gehörende Substanz wird häufig für biochemische Pufferlösungen verwendet. (a) Welches Proton dissoziiert bei niedrigem pH, das Proton der Carboxylatgruppe oder das der Ammoniumgruppe? (b) Schreiben Sie die Gleichgewichtsreaktionen für die Dissoziation des ersten und zweiten Protons von Glycin-Hydrochlorid auf. (c) Eine Lösung mit 0,01 M undissoziiertem GlycinHydrochlorid und 0,02 M der einfach dissoziierten Form hat einen pH von 2,65. Berechnen Sie den pK für diese Dissoziation. (d) Zeichnen Sie analog zu Abbildung 2.18 die Titrationskurve von Glycin-Hydrochlorid.

(Molgewicht 82 g mol"). 11. Berechnen Sie die Änderung in der freien Enthalpie bei der Dissoziation von HEPES (unter Standardbedingungen). 12.50 mL 2,0 M K,HPO, und 25 mL 2,0 M KH,PO, werden

mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 mL verdünnt. Welchen pH besitzt diese Lösung? 13. Berechnen Sie den pK einer unbekannten

Säure HA,

ausgehend von der Beobachtung, dass eine Lösung mit 0,1 M HA und 0,2 M A’ einen pH von 6,5 aufweist.

Literatur

———

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 1 Acute Aspirin Overdose: Relationship to the Blood Buffering System The carbonic acid-bicarbonate buffering system responds to an overdose of aspirin.

ee

Finney, J.L., Water? What's so special about it? Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 29, 1145-1163 (2004). [Enthält eine Diskussion über Wasserstrukturen, Wasserstoffbrücken und welche Bedeutung diese für biologische Systeme besitzen.) Fuhrhop, J.-H., Wang, T., Sieben Moleküle: Die chemischen Elemente

und das Leben, Kapitel 1, Wiley-VCH (2008). [Enthält eine Einführung

in die Wasserstruktur und die Wasserkreisläufe in der Natur.] Gerstein, M. and Levitt, M., Simulating water and the molecules of life,

Sci. Am. 279(11), 101-105 (1998). [Eine Beschreibung der Wasserstruktur und der Wechselwirkung von Wasser mit anderen Molekülen.) Good, N.E., Winget, G.D., Winter, W,, Connolly, T.N., Izaa, S., and Singh,

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Me ee eeee

467-477 (1966). [Eine klassische Beschreibung der Verwendung von Pufferlösungen.] Jeffrey, G.A. and Saenger, W., Hydrogen Bonding in Biological Structures, Kapitel 1, 2 und 21, Springer (1994). [Eine Übersicht zur Chemie der Wasserstoffbrücken und ihrer Bedeutung für die Molekülstruktur.] Segel, I.H., Biochemical Calculations (2nd ed.), Kapitel 1, Wiley (1976). [Eine Beschreibung von Säure-Base-Gleichgewichten auf Master-Niveau, mit Übungsaufgaben.) Tanford, C., The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes (2nd ed.), Kapitel 5 und 6, Wiley (1980). [Beschreibt die Strukturen von Wasser und von Micellen.)

TEIL II Biomoleküle

Die beiden Nucleotidketten der DNA bilden einen Doppelstrang, der sich um eine zentrale Achse windet, welche hier als heller

Strahl dargestellt ist. Ein kompletter Satz an genetischer Information besteht aus nur vier Arten von Bausteinen. Die Sequenz,

in der diese Monomere miteinander verknüpft sind, bildet eine Form der biologischen Information, die effizient abgelesen und sicher kopiert werden kann. [Illustration von Irving Geis,

© The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.]

Nucleotide und Nucleinsäuren Nucleotide und Nucleinsäuren

Elektronisches Zusatzmaterial

e Struktur und Funktion von Nucleotiden

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 1 Guided Exploration 2 Guided Exploration 3

e Struktur von

von Nucleinsäuren e Sequenzieren von Nucleinsäuren

Interactive Exercise ] Animated Figure 3-26

© Rekombinante DNA-Technologie

Animated Figure 3-27 Animated Figure 3-30 Kinemage Exercise 2-1 Kinemage Exercise 2-2 Bioinformatics Exercises

Trotz offensichtlicher Unterschiede in der Lebensweise und in ihrem makroskopischen Aussehen gibt es auf der molekularen Ebene erstaunliche Gemeinsamkeiten zwischen den Organismen. Zelluläre Strukturen und Stoffwechselvorgänge greifen auf ein gemeinsames Repertoire aus Molekülen zurück. Dazu zählen Aminosäuren, Kohlenhydrate, Lipide, Nucleotide und deren polymere Formen. Wir beginnen unsere Betrachtung der Biomoleküle mit den Nucleotiden und ihren polymeren Formen, den Nucleinsäuren. Nucleotide spielen eine zentrale Rolle bei vielen biochemischen Prozessen. Sie kommen bei Redoxreaktionen, beim Energietransfer, in biochemischen Signalwegen und als Partner in Biosyntheseraktionen zum Einsatz. Die Nucleinsäuren sind für das Speichern und Ablesen von genetischer Information notwendig. Nucleotide haben außerdem strukturbildende und katalytische Eigenschaften. Keine andere Stoffklasse liefert eine solche Vielfalt an Funktionen, die essentiell für das Leben sind. Evolutionsforscher vermuten, dass erst das Auftreten von Nucleotiden die Evolution von Organismen ermöglicht hat, die in der Lage waren, Energie aus ihrer Umwelt aufzunehmen und zu speichern, und die sich zudem selbst vervielfältigen konnten. Obwohl das Wissen über die chemischen und biologischen Details der frühen Lebensformen Gegenstand von Spekulationen ist, so ist doch unbestritten, dass das Leben, wie wir es kennen, unzertrennlich mit der Chemie der

Nucleinsäuren verbunden ist. Im Rahmen dieses Kapitels soll zunächst die Struktur der Nucleotide und der Nucleinsäuren, RNA und DNA, untersucht werden. Wir werden sehen, wie ge-

netische Information, in Form einer Sequenz von Nucleotiden, in den Molekülen gespeichert, abgelesen und schließlich in Protein übersetzt Da die Struktur und Funktion von Zellen letztlich von ihrer genetischen mation abhängen, kann die Nucleotidsequenz wichtige Erkenntnisse über Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim BEHTER

Nucleinsäuren

© Überblick über die Funktionen

DNAwird. InforEvolu-

Nucleotide und Nucleinsäuren

46

end tion, Stoffwechsel oder die Entstehung von Krankheiten liefern. Abschließ

werden wir einige der Techniken kennenlernen, mit denen man DNA im Labor manipulieren kann. In späteren Kapiteln wird die Rolle von Nucleotiden und Nucleinsäuren bei Stoffwechselvorgängen noch eingehender dargestellt werden. In Kapitel 24 finden sich weitere Informationen zur Nucleinsäurestruktur und der „Verpackung“ der DNA in den Zellen. Die Kapitel 25 bis 28 behandeln dann die Funktionen von Nucleinsäuren bei der Speicherung und Expression genetischer Information.

Struktur und Funktion von Nucleotiden

1

Nucleotide sind ubiquitäre Moleküle mit einer beträchtlichen strukturellen Vielfalt. In Organismen kommen acht häufig verwendete Nucleotide vor; jedes besteht aus einer Stickstoffbase, die N-glykosidisch an einen Zucker gebunden ist, welcher zudem mindestens eine Phosphatgruppe trägt. Die Stickstoffbasen der Nucleotide sind heterocyclische planare aromatische Verbindungen, meist Derivate von Purin oder von Pyrimidin (obwohl sie in vivo nicht ausgehend von diesen Verbindungen synthetisiert werden). N 2 3

6

N

R| N

IN

N

9 ® N \

2 1

4

| N

H

Purin

Pyrimidin

Die wichtigsten Purinbasen sind Adenin (A) und Guanin (G), bei den Pyrimidinbasen sind es Cytosin (C), Uracil (U) und Thymin (T). Die Purinbasen binden über das N9-Atom an das C1’-Atom eines Zuckers, der fünf Kohlenstoffatome besitzt (eine Pentose); bei den Pyrimidinbasen erfolgt die Bindung über das N1-Atom (Tab. 3.1). In Ribonucleotiden ist die Pentose Ribose, in Desoxyribonucleotiden (kurz Desoxynucleotiden), den Bausteinen der DNA, 2'-Desoxyribose. In diesem Falle fehlt die OH-Gruppe in 2’-Position (beachte: apostrophierte Ziffern stehen für Atome des Riboserestes, nicht apostrophierte Ziffern beziehen sich auf die Atome der Stickstoffbase). 5’ HO—CH, OH

O

NH

OH

OH

Ribonucleotide

Ribose (6) Base

=)

0,PO—CH, _O Ku BEER HJ 5

H

H

OREH Desoxyribonucleotide Abb. 3.1

OH

Chemische Strukturen von

(a) Ribonucleotiden und (b) Desoxyribonucleotiden. Die Purin- oder Pyrimidinbase ist an das C1’-Atom der Pentose gebunden, welche mindestens eine

Phosphatgruppe (rot) trägt.

OH

5 HO—CH,

O0

HE

OH

H

OH} Deoxyribose

Die Phosphatgruppe kann an das C3’- oder an das C5’-Atom einer Pentose gebunden sein und so ihr 3’-Nucleotid bzw. das 5’-Nucleotid bilden (Abb. 3a). Fehlt die Phosphatgruppe, bezeichnet man die Verbindung als Nucleosid. Ein 5'-Nucleotid kann man daher auch als Nucleosid-5’-phosphat bezeichnen. Die am häufigsten vorkommenden Nucleotide tragen eine bis drei Phosphatgruppen an der C5’-Position und werden entsprechend als Nucleosidmonophosphate, -diphosphate und -triphosphate bezeichnet. Die Strukturen, Namen und Abkürzungen der bekannten Basen, Nucleoside und Nucleotide sind in Tabelle 3.1 angegeben. Ribonucleotide sind Bestandteile der RNA (Ribonucleinsäure), Desoxynucleotide die der DNA (Desoxyribonucleinsäure). Adenin, Guanin und Cytosin kommen sowohl als Ribonucleotide als auch als Desoxyribonucleotide vor (das entspricht also sechs der wichtigsten

Struktur und Funktion von Nucleotiden Tab. 3.1

Namen und Abkürzungen der Nucleinsäurebasen, Nucleoside und Nucleotide.

Formel der Base

NH»

nZ

| \ N

N

H

N

| N

ANQ

Base (X = H)

Nucleosid (X = Ribose‘)

Nucleotid® (X = Ribosephosphat‘)

Adenin

Adenosin

Adenylsäure

Ade

Ado

Adenosinmonophosphat

A

A

AMP

Guanin

Guanosin

Guanylsäure

Gua

Guo

Guanosinmonophosphat

G

G

GMP

Cytosin

Cytidin

Cytidylsäure

Cyt

Cyd

Cytidinmonophosphat

@

C

CMP

Uracil

Uridin

Uridylsäure

Ura

Urd

Uridinmonophosphat

U

U

UMP

Thymin

Desoxythymidin

Desoxythymidylsäure

dThd

Desoxythymidinmonophosphat

dT

dTMP

X NH> |

N” >

| X

HL N

|

e

| X O

H IN

|

On

CH

Se, 2

dX * Das Vorkommen einer 2'-Desoxyribose anstelle einer Ribose, wie in der DNA, wird durch die Präfixe „Desoxy“ oder „d“ angegeben. So ist z. B. das Desoxyadenosin oder dA das Desoxynucleosid von Adenin. Bei thyminhaltigen Resten, die in RNA nur selten vorkommen, ist dieses Präfix überflüssig und kann wegfallen. Die Anwesenheit einer Riboseeinheit kann durch das Präfix „Ribo“ oder „r“ hervorgehoben werden. Das Ribonucleotid des Thymins ist demnach Ribothymidin oder rT. ’ Die Position der Phosphatgruppe in einem Nucleotid kann noch genauer angegeben werden, z. B. als 3’-AMP und 5'-GMP.

Nucleotide). Uracil hingegen liegt ausschließlich als Ribonucleotid und Thymin hauptsächlich als Desoxyribonucleotid vor. Freie Nucleotide sind als anionische Verbindungen in Zellen meist mit Mg’* als Gegenion assoziiert. Nucleotide haben eine wichtige Funktion im Stoffwechsel Der größte Anteil an Nucleotiden in einer Zelle liegt in polymerer Form vor, entweder als DNA oder als RNA, deren primäre Funktionen das Speichern und der Transfer von genetischer Information sind. Darüber hinaus nehmen freie Nucleotide und ihre Derivate aber auch an einer Vielzahl von metabolischen Prozessen teil, die nicht zu Abläufen des genetischen Apparates gehören. Das vielleicht bekannteste Nucleotid ist Adenosintriphosphat (ATP), bestehend aus Adenin, Ribose und einer Triphosphatgruppe. ATP wird oft irrtümlicherweise als Energiespeichermolekül beschrieben. Bezeichnungen wie Energie-

47

48

Nucleotide und Nucleinsäuren

träger oder Energieübermittler sind für diese Verbindung präziser. Die Photosynthese oder der Abbau (Katabolismus) von Nahrungsstoffen, wie 2. B. Kohlenhydraten und Fettsäuren, führt zur Synthese von ATP aus Adenosindiphosphat

(ADP):

Adenosin

NH,

NH,

A

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(6) I

Oz

Oz

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I

O7

O7

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Der

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I

1. Zeichnen Sie die prinzipiellen Strukturen eines Ribonucleotids und eines Desoxyribonucleotids. 2. Beschreiben Sie die Unterschiede zwischen einem Ribonucleotid

und einem Desoxyribonucleotid.

Sy

N

+

o H

OH

H0

Es

Oz

H OH

Adenosindiphosphat (ADP)

Verständnisfragen zu Abschnitt 1

N

re

H OH

wi )

n”

AN

OH

Adenosintriphosphat (ATP)

ATP ist in der Zelle vorhanden, um Energie für Biosynthesen, den Ionentransport und die Zellbewegung bereitzustellen. Die Energie aus ATP wird dadurch genutzt, dass eine Phosphatgruppe (oder alle beide) auf ein anderes Molekül übertragen wird. Dieser Prozess ist am Beispiel der Rückreaktion oben gezeigt; es handelt sich dort um die Hydrolyse von ATP zu ADP. (Wir werden in späteren Kapiteln sehen, dass die Umwandlung von ATP und ADP nicht ohne weiteres reversibel ist, und dass eine freie Phosphatgruppe selten direkt von ATP abgegeben wird). Der Grad der Beteiligung von ATP an den zellulären Aktivitäten wird aus Berechnungen deutlich, die zeigen, dass trotz einer vergleichsweise geringen intrazellulären ATP-Konzentration (ca. 5 mM), die Menge des durchschnittlich pro Tag umgesetzten ATP beim Menschen dem eigenen Körpergewicht entspricht. Nucleotidderivate spielen bei vielen verschiedenen biochemischen Prozessen eine Rolle. Zum Beispiel erfolgt die Synthese von Stärke in Pflanzen durch eine wiederholte Addition von Glucoseresten, die von ADP-Glucosemolekülen bereitgestellt werden (Abb. 3.2). Andere Nucleotidderivate tragen funktionelle Gruppen, die an Redoxreaktionen beteiligt sind. Beispiele dafür werden wir in späteren Kapiteln antreffen. Die funktionelle Gruppe bzw. das zu übertragende Molekül ist in der Regel über eine Mono- oder Diphosphatgruppe mit dem Nucleosid verbunden.

Glucose

ADP

(8

nn

N

NH;

CH,OH H

H

3

OH HI

HO

n” H

oO

I

o

I

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OH

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N

oO

(Om

HH

H

H

HO Abb, 3.2

”

OH

ADP-Glucose.

Bei diesem Nucleotidderivat ist die Glucose (blau) über zwei Phosphatgruppen (rot) an Adenosin (schwarz) gebunden.

Struktur von Nucleinsäuren

2

49

Struktur von Nucleinsäuren

Nucleotide können zu linearen Polymeren verknüpft sein, die uns als RNA und

DNA bekannt sind. Im Folgenden werden die grundlegenden Eigenschaften dieser Nucleinsäuren beschrieben. Die Strukturen von Nucleinsäuren werden noch

einmal detailliert in Kapitel 24 behandelt.

A.

Nucleinsäuren sind Polymere aus Nucleotiden

Die Nucleinsäuren bestehen aus Ketten von Nucleotiden, deren Phosphatreste die 3'- und 5’-Position der aufeinander folgenden Riboseeinheiten verbinden (Abb. 3.3). Die Phosphatgruppen der Polynucleotide sind Diester der Phosphorsäure und liegen demnach bei physiologischem pH als Polyanionen vor. Die Bindung zwischen einzelnen Nucleotiden ist als Phosphodiesterbindung bekannt und wird deshalb so bezeichnet, weil die Phosphatgruppe mit zwei Ribo(a)

(b)

5,

al

5%

Abb. 3.3 Chemische Struktur einer Nucleinsäure. (a) Das Tetranucleotid Adenyl-3’,5’-uridyl-3’,5’-cytidyl-3’,5’- guanyl-3’-phosphat. Die Nummerierung der Zuckeratome erfolgt mit dem Strichindex, um

| a4

ag.

107=P—0-CH;

o

sie von den Atompositionen der Stickstoffbasen zu unterscheiden. Konventionsgemäß werden Polynucleotidsequenzen mit ihrem 5’-Ende nach links und ihrem 3’-Ende nach rechts geschrieben. Wenn man sie also von links nach rechts liest, bedeutet dies, dass die Phosphodiesterbindung benachbarte Ribosereste in 5’—3’-Richtung verbindet. Die obige Sequenz kann folgendermaßen abgekürzt werden: ApUpCpGp oder nur AUCGp (wobei ein „p“ am rechten Ende eines Nucleosidsymboles eine 3’-Phosphorylgruppe anzeigt). Das entsprechende Desoxytetranucleotid, bei dem die 2’-OH-

Gruppe durch H und Uracil (U) durch Thymin (T) ersetzt ist, lautet abgekürzt d(ApTpCpGp) oder d(ATCGp). (b) Schematische Darstellung von AUCGp. Eine vertikale Linie bedeutet hier einen

Riboserest, die angehängte Base wird durch den jeweiligen Ein-Buchstaben-Code angedeutet und die diagonale Verbindung (wahlweise mit einem „Pp“) stellt die Phosphodiesterbindung dar. Die Nummerierung der Ribosereste, die hier an-

gedeutet ist, wird normalerweise weggelassen. Die gleichwertige Darstellung des Desoxynucleotids würde sich lediglich durch das Fehlen der 2’-OH-Gruppen und den Ersatz von U durch T unterscheiden.

50

Nucleotide und Nucleinsäuren

seeinheiten verestert ist. Jedes Nucleotid, das in ein Polynucleotid eingebaut ist, wird als Nucleotidrest bezeichnet. Der endständige Rest, dessen C5’-Atom nicht an ein weiteres Nucleotid gebunden ist wird 5’-Ende genannt. Den endständigen Rest, dessen C3’-Atom nicht an ein weiteres Nucleotid gebunden ist, nennt man 3’.Ende. Man ist übereingekommen, beim Aufschreiben einer Nucleotidsequenz

immer am 3’-Ende zu beginnen. Die Eigenschaften solch eines Polymeres, wie z.B. einer Nucleinsäure, können sich sehr von den Eigenschaften einzelner Segmente oder den Monomeren vor der Polymerisierung unterscheiden. So wie die Größe des Polymeres in der Reihenfolge Dimer, Trimer, Tetramer, usw. bis hin zu sogenannten Oligomeren (griech.: oligos, wenig) zunimmt, können sich die physikalischen Eigenschaften, wie die Ladung und die Löslichkeit, ändern. Zusätzlich besitzt ein Polymer, das aus nicht identischen Resten besteht, Eigenschaften, die seine Monomere nicht haben, denn

es trägt Information in Form der Sequenz seiner Bausteine. Die Basenzusammensetzung der DNA

Obwohl es für RNA-Moleküle offenbar keine Regeln gibt, welche die typische Nucleotidzusammensetzung bestimmen, besitzt die DNA immer eine gleiche Anzahl an Adenin- und Thyminresten (A = T) sowie eine gleiche Anzahl an Guanin- und Cytosinresten (G = C). Diese Beziehungen, die als Chargaff-Regeln bekannt sind, wurden in den späten 1940ern von Erwin Chargaff entdeckt, der die ersten aussagekräftigen Methoden für die Analyse des DNA-Aufbaues entwickelte. Die Basenzusammensetzung der DNA unterscheidet sich sehr zwischen den verschiedenen Organismen. Sie reicht von ca. 25 bis 75 % (G + C)-Gehalt in unterschiedlichen Arten von Bakterien. Dennoch ist sie mehr oder weniger konstant zwischen verwandten Arten. In Säugetieren reicht der (G + C)-Gehalt z.B. von 39 bis 46 %. Die grundlegende Bedeutung der Chargaff-Regeln wurde damals nicht sofort erkannt, aber wir wissen heute, dass die doppelsträngige Form der DNA die strukturelle Basis für diese Regeln ist.

B.

Die Doppelhelix

Die Bestimmung der DNA-Struktur durch James Watson und Francis Crick im Jahre 1953 wird oft als Grundstein der modernen Molekularbiologie bezeichnet. Die Watson-Crick-Struktur der DNA lieferte nicht nur ein Modell für das zentrale Molekül des Lebens, es klärte zusätzlich den molekularen Mechanismus der Vererbung auf. Watsons und Cricks Ausführungen, die zu den größten wissenschaftlichen Errungenschaften zählen, basierten teilweise auf zwei Hinweisen zusätzlich zu den Chargaff-Regeln; den korrekten tautomeren Formen der Basen und den ersten Hinweisen darauf, dass die DNA ein helicales Molekül ist. Die Purin- und Pyrimidinbasen der Nucleinsäuren können in verschiedenen tautomeren Formen vorliegen (Tautomere sind Isomere, die sich nur in der Position der Wasserstoffatome unterscheiden; Abb. 3.4). Die Röntgenkristallstruktur (engl.: X-ray structure) und die Kernspinresonanz (NMR) sowie weitere spektroskopische Untersuchungen haben inzwischen eindeutig bestätigt, dass die Nucleinsäurebasen überwiegend in der keto-tautomeren Form vorliegen (Abb. 3.3). Dies entsprach jedoch im Jahre 1953 nicht der allgemeinen Lehrmeinung. Die Erkenntnisse über die vorherrschenden tautomeren Formen stammten von Jerry Donohue, einem Kollegen von Watson und Crick, der zudem ein Experte für Röntgenstrukturanalytik kleiner organischer Moleküle war. Der Beweis, dass die DNA ein helicales Molekül bildet, wurde anhand eines von Rosalind Franklin aufgenommenen Röntgenbeugungsbildes einer DNAFaser erbracht (Abb. 3.5). Dieses Foto ermöglichte es dem ausgebildeten Röntgenkristallographen Crick, herzuleiten, (a) dass DNA ein helicales Molekül ist

Struktur von Nucleinsäuren (a)

H

0 H

Yy“

[6)

N

H

Abb. 3.4 Tautomere Formen von Nucleinsäurebasen. Hier sind die tautomeren Formen von (a) Thymin und (b) Guanin gezeigt. Bei Cytosin und Adenin können ähnliche Verschiebungen von Wasserstoffatomen vorliegen.

Fo

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H

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R

R

Thymin

Thymin

(Keto- oder Lactamform)

(Enol- oder Lactimform)

(6)

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51

H

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N

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5 N>> N

Sy

R

R

Guanin

Guanin

(Keto- oder Lactamform)

(Enol- oder Lactimform)

und (b) dass ihre planaren, aromatischen Basen Stapel bilden, die parallel zur Helixachse verlaufen. Die wenigen strukturellen Informationen boten zusammen mit den ChargaffRegeln nur eine ungefähre Vorstellung von der DNA-Struktur. Watsons und Cricks Modell ergab sich hauptsächlich aus ihren Überlegungen und Modellbaustudien. Als das Watson-Crick-Modell schließlich veröffentlicht worden war, wurde es wegen seiner verblüffenden Einfachheit, verbunden mit seiner offensichtlichen biologischen Relevanz, rasch von der Fachwelt akzeptiert. Spätere Forschungsarbeiten haben die prinzipielle Richtigkeit des Watson-Crick-Modelles bestätigt, wenngleich es in einigen Details korrigiert wurde. Das Watson-Crick-Modell besitzt folgende bedeutende Eigenschaften: 1. Zwei Polynucleotidketten winden sich um eine gemeinsame Achse und bilden eine Doppelhelix aus (Abb. 3.6). 2. Die beiden Stränge der DNA sind antiparallel (sie verlaufen in entgegengesetzten Richtungen) und jeder bildet eine rechtsgängige Helix. (Der Unterschied zwischen einer rechts- und linksgängigen Helix ist in Abb. 3.7 er-

klärt.) 3. Die Basen liegen im Inneren der Helix und das Zucker-Phosphat-Gerüst verläuft an der Peripherie. Somit wird die Abstoßung zwischen den geladenen Phosphatgruppen minimiert. Auf der Oberfläche der Doppelhelix befinden sich zwei Arten von Furchen mit unterschiedlicher Ausdehnung: die große und die kleine Furche. 4. Jede Base ist über Wasserstoffbrückenbindungen mit einer Base im gegenüberliegenden Strang verbunden und bildet ein planares Basenpaar. In der Watson-Crick-Struktur können nur zwei unterschiedliche Arten von Basenpaaren auftreten. Jeder Adeninrest muss mit einem Thyminrest gepaart sein und umgekehrt, und ebenfalls muss jeder Guaninrest mit einem Cyto-

sinrest gepaart sein und umgekehrt (Abb. 3.8). Auf Grund dieser Wechselwirkungen über Wasserstoffbrückenbindungen, einem Phänomen, das als komplementäre Basenpaarung bezeichnet wird, ergibt sich die spezifische Assoziation der zwei Ketten zur Doppelhelix. Die Watson-Crick-Struktur kann jede beliebige Basensequenz in einem Polynucleotidstrang beinhalten, solange der gegenüberliegende Strang die dazu komplementäre Basensequenz besitzt. Dies entspricht ganz klar den Chargaff-Regeln.

Abb. 3.5 Röntgenbeugungsbild einer vertikal orientierten DNA-Faser.

Das Photo wurde von Rosalind Franklin aufgenommen und war der Schlüssel zur Aufklärung der Watson-Crick-Struktur. Die zentrale X-förmige Struktur zeigt an, dass es sich um eine Helix han-

delt, wohingegen die dunklen Bögen am oberen und unteren Bildrand den Abstand der gestapelten Basen angeben (340 pm). [Mit freundlicher Genehmigung von Maurice Wilkins, King’s College, London.]

Nucleotide und Nucleinsäuren

52

Abb. 3.6 Dreidimensionale Struktur der DNA. Die sich wiederholende Helix basiert auf der Struktur des selbstkomplementären Dodecameres d(CGCGAATTCGCG), welche von Richard Dickersen und Horace Drew bestimmt wurde. Die Blickrichtung auf dieses Kugel-Stab-Modell verläuft senkrecht zur Helixachse. Das gewundene Zuckerphosphatrückgrat (blau und grün) bildet die Außenhülle des Moleküls. Die Basen (rot) formen über Wasserstoffbrückenbindungen verbundene Basenpaare, die sich im Innern befinden. Wasserstoffatome wurden in der Abbildung, der Übersicht zuliebe, weggelassen. Beide Stränge verlaufen in entgegengesetzten Richtungen. [Illustration von Irving Geis, © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute] 6% siehe Interactive Exercise und Kinemage

kleine Furche

Exercise 2.1.

Furche

Linksgängig

Rechtsgängig

Abb. 3.7

Abbildung von links- und rechtsgängigen Helices. Wenn der Daumen die Richtung anzeigt in welcher die Helix ansteigt, beschreibt die Krümmung der Finger in jedem Fall die Drehrichtung, mit der sich die Helix windet. Es ist zu beachten, dass die

Händigkeit erhalten bleibt, selbst wenn die Helices auf den Kopf gestellt werden.

Aber wichtiger noch ist Folgendes: Sie legt nahe, dass jeder DNA-Strang als Vorlage (Matrize) für die Synthese seines komplementären Stranges dienen kann und zeigt damit, dass die Erbinformation in der Basensequenz jedes Stranges kodiert ist. Die meisten DNA-Moleküle sind groß Die meisten DNA-Moleküle sind aufgrund ihrer Funktion als Speicher der genetischen Information einer Zelle relativ groß. Natürlich kann das Genom eines Organismus, d.h. die gesamte DNA darin, auf mehrere Chromosomen (griech.:

chromos, Farbe; soma, Körper) verteilt sein, von denen jedes aus einem N.

DNA-Molekül besteht. Dabei ist zu beachten, dass viele Lebewesen diploid sind;

Struktur von Nucleinsäuren ZuckerphosphatRückgrat

Komplementäre Basenpaarung

ZuckerphosphatRückgrat

re

Sy

Desoxyribose

das bedeutet, dass sie zwei äquivalente Sätze an jedem Elternteil einen. Der einfache (haploide) also lediglich der Hälfte der Gesamt-DNA. Der 46 Chromosomen pro Zelle, entsprechend einem

Chromosomen enthalten, von Chromosomensatz entspricht Mensch besitzt beispielsweise haploiden Chromosomensatz

von 23.

Wegen ihrer großen Längen werden DNA-Moleküle durch die Anzahl ihrer Basenpaare (bp) oder Tausenden von Basenpaaren (Kilobasenpaare oder kb) beschrieben. Obwohl einzelne DNA-Moleküle lang und relativ starr sind, sind sie nicht völlig rigide. Wir werden in Kapitel 24 sehen, dass die DNA-Doppelhelix Verdrillungen (engl.: coils) und Schlaufen (engl.: loops) bildet, wenn sie in Zellen verpackt ist. Darüber hinaus kann die DNA in Abhängigkeit von ihrer Nucleotidsequenz leicht unterschiedliche helicale Konformationen annehmen. Schließlich kann sich die DNA in Gegenwart von anderen zellulären Bestandteilen stark verdrehen oder die beiden Stränge können sich teilweise entwinden.

Abb. 3.8 Komplementäre DNA-Stränge. Zwei Polynucleotidketten assoziieren durch Basenpaarung und bilden eine Doppelhelix.

A paart mit Tund G mit C durch Bildung spezifischer Wasserstoffbrückenbindungen. 6% siehe Kinemage Exercise 2.2.

53

54

Nucleotide und Nucleinsäuren

C. _ Einzelsträngige Nucleinsäuren Einzelsträngige DNA ist selten und kommt meistens als Erbmaterial bei bestimmten Viren vor. Im Gegensatz dazu liegt RNA, die üblicherweise eher kompakte Strukturen ausbildet als lange und lose Ketten, überwiegend in Einzelsträngen vor (doppelsträngige RNA ist das Erbmaterial bestimmter Viren). Ein RNA-Strang, welcher mit einem DNA-Strang bis auf die Anwesenheit der 2’OH-Gruppe und die Substitution von Thymin durch Uracil identisch ist, kann Basenpaare mit komplementären RNA- oder DNA-Strängen ausbilden.

Wie erwartet paart A mit U (oder Tin DNA) und G mit C. Die Basenpaarung

Abb. 3.9 Bildung einer Haarnadelstruktur. Die Basenpaarung zwischen zwei komplementären Sequenzen innerhalb eines RNA-Stranges erlaubt dem Polynucleotid eine intramolekulare Schleifenbildung.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Beschreiben Sie die Struktur der

DNA-Doppelhelix.

geschieht oft intramolekular und führt so zu Haarnadelstrukturen (engl.: stemand-loop structures; Abb. 3.9). Komplexere Strukturen entstehen, wenn die Schlaufen miteinander in Wechselwirkung treten. Die möglichen Strukturen, die von einzelsträngiger RNA eingenommen werden können, liefern einen zusätzlichen Beweis dafür, dass die RNA mehr Funktionen besitzt als nur das Speichern und Weitergeben von genetischer Information. Zahlreiche Untersuchungen haben ergeben, dass bestimmte RNA-Moleküle kleine organische Moleküle spezifisch binden und dass sie Reaktionen katalysieren können, in welche diese Moleküle involviert sind. Diese Erkenntnisse stützen grundsätzlich die verschiedenen Theorien, dass ursprünglich, d.h. in der sogenannten RNA-Welt, viele Prozesse, die für das Leben essentiell sind, durch die chemische Vielseitigkeit von kleinen Polynucleotiden ermöglicht wurden. Wir werden die Struktur und Funktion von RNA in Abschnitt 24.2C noch eingehender kennen lernen.

2. Nennen Sie die Unterschiede zwischen den Strukturen von DNA und RNA.

3

Überblick über die Funktionen von Nucleinsäuren

DNA ist in Zellen und vielen Viren der Träger der genetischen Information. Es vergingen 75 Jahre von dem Zeitpunkt an, zu dem Gregor Mendel seine Vererbungsgesetze entdeckt hatte, bis zu dem Augenblick, zu dem die biologische Bedeutung der DNA aufgeklärt wurde. Auch heute sind viele Details hinsichtlich der Expression der genetischen Information und deren Weitergabe an folgende Generationen noch nicht geklärt. Mendel kam durch seine Arbeiten mit Erbsenpflanzen zu dem Schluss, dass eine individuelle Pflanze ein Paar an Faktoren enthält (die heute Gene genannt werden), von dem jeweils die Hälfte von jedem Elternteil vererbt wird. Mendels Vererbungslehre, die 1866 veröffentlicht wurde, stieß bei den damaligen Wissenschaftlern auf völlige Nichtachtung, da ihr Wissen über Anatomie und Physiologie hierfür keine Basis bot. Letztendlich wurde dann doch angenommen, dass Gene Teile der Chromosomen sind und der Fortschritt in der Genforschung beschleunigte sich enorm.

A.

DNA trägt die genetische Information

Bis in die 1940er Jahre wurde allgemein angenommen, dass Gene aus einem Protein bestehen, weil bis dahin Proteine die einzigen biochemischen Einheiten waren, die komplex genug dafür erschienen, um als Erbmaterial zu dienen. Von Nucleinsäuren, die zuerst 1869 von Friedrich Miescher isoliert worden waren,

nahm man an, dass sie aus sich monoton wiederholenden Nucleotidsequenzen bestehen und demnach keine geeigneten Kandidaten für Moleküle waren, die genetische Information weitergeben konnten.

Überblick über die Funktionen von Nucleinsäuren

55

Abb. 3.10 Transformierte Pneumococcen. Die großen Kolonien sind virulente Pneumococcen, die durch die

Transformation von nicht pathogenen Pneumococcen (kleinere Kolonien) mit aus dem virulenten Stamm isolierter DNA entstanden sind. Damit konnte gezeigt werden, dass diese DNA ein Gen enthielt, das im nicht

pathogenen Stamm fehlte. [Avery, ©. T., MacLeod, C. M., und McCarty, M.,

J. Exp. Med. 79, 153 (1944). © Rockefeller University Press.]

Erst durch die Ergebnisse von Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty konnte gezeigt werden, dass DNA genetische Information trägt. Ihre Experimente, die sie 1944 abschlossen, zeigten, dass DNA - und nicht etwa ein Protein —, welche aus einem virulenten (pathogenen) Stamm des Bakteriums Diplococcus pneumoniae isoliert worden war, einen nicht pathogenen Stamm des Organismus in einen virulenten Stamm transformierte (bleibend veränderte; Abb. 3.10). Averys Entdeckung wurde anfänglich mit Skepsis betrachtet, aber sie beeinflusste Erwin Chargaff, dessen Regeln schließlich zu neuartigen Struktur- und Funktionsmodellen der DNA führten (Abschnitt 3.2A). Der Aufbau der DNA als Doppelstrang bzw. Duplex ermöglicht ihre Replikation. Wenn sich eine Zelle teilt, dient jeder DNA-Strang als Vorlage für den Aufbau seines komplementären Stranges (Abb. 3.11). Damit ist gewährleistet, dass jede Tochterzelle ein vollständiges DNA-Molekül erhält (oder einen Satz an DNA-Molekülen in Organismen, deren Genom aus mehr als einem Chromosom besteht). Jedes DNA-Molekül besteht aus einem elterlichen Strang und einem Tochterstrang. Die Tochterstränge werden durch stufenweise Polymerisierung von Nucleotiden synthetisiert, die spezifisch mit den Basen des elterlichen Stranges paaren. Der Mechanismus der Replikation in der Zelle ist, obwohl er schnell abläuft, äußerst komplex. Wie wir in Kapitel 25 sehen werden, ist eine Vielzahl von Enzymen nötig, um eine große Genauigkeit und hohe Effizienz zu gewährleisten.

B.

Gene regeln die Proteinbiosynthese

Es dauerte einige Zeit, um die Frage zu beantworten, wie die Nucleotidsequenzen die Eigenschaften eines Organismus kontrollieren. Durch Experimente mit dem Schimmelpilz Neurospora crassa in den 1940er Jahren fanden George Beadle und Edward Tatum, dass es einen spezifischen Zusammenhang zwischen Genen und Enzymen gibt, die sogenannte Ein-Gen-Ein-Enzym-Theorie. Beadle und Tatum zeigten, dass mutierte Arten von Neurospora, die durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen entstanden, für ihr Wachstum zusätzliche Nährstoffe benötigten. Mutmaßlich fehlten den Abkömmlingen der strahlungsgeschädigten Zellen bestimmte Enzyme, die zur Synthese dieser Nährstoffe nötig waren. Das Bindeglied zwischen DNA und Enzymen (von denen fast alle Proteine sind) ist die RNA. DNA steuert ihre eigene Replikation sowie die Transkription, um RNA mit komplementärer Sequenz zu bilden. Die Basensequenz der RNA wird dann in die korrespondierende Sequenz von Aminosäuren translatiert, um ein Protein zu bilden (Abb. 3.12). Dieser Prozess wurde als sogenanntes zentrales Dogma der Molekularbiologie im Jahr 1958 von Crick erstmals formuliert (Abb. 3.13). So wie die Tochterstränge der DNA aus freien Desoxynucleotiden synthetisiert werden, die mit den Basen der elterlichen DNA paaren, werden die RNA-Stränge

Abb. 3.11 Replikation der DNA. Jeder elterliche Strang der DNA (rot) dient als Vorlage für die Synthese des komplementären Tochterstranges (grün). Dadurch sind die resultierenden doppelsträngigen Moleküle identisch.

56

Nucleotide und Nucleinsäuren DNA

5’— A-G-A-G-G-T-G-C-T—

Replikation

3

3’— T-C-T-C-C-A-C0-G-A—5 % —

/ mRNA

5'— A-G-A-G-G-U-G-C-U — 3’

tRNAs

3°

Protein

Abb. 3.12

U-C-U

C-C-A

C-G-A

Arginin

Glycin

Alanin

Transkription

‚ /

Translation

NA.

um

j PLOTEIN

5

-Arginin-Glycin-Alanin-

Abb. 3.13 Das zentrale Dogma der Molekularbiologie. Die durchgezogenen Pfeile symbolisieren den Fluss der genetischen Information, wie er in allen Zellen abläuft. DNA steuert ihre eigene Replikation und wird in RNA transkribiert. RNA wird in Protein translatiert. In einigen Organismen kann die Information auch noch in anderen Richtungen fließen. Dies wird durch die unterbrochenen Pfeile angedeutet.

Transkription und Translation.

Ein DNA-Strang steuert die Synthese von BotenRNA (mRNA von engl.: messenger, Bote). Die

Basensequenz der transkribierten RNA ist komplementär zu der des DNA-Stranges. Die Information wird translatiert, wenn Transfer-RNA-(tRNA-)Moleküle sich mit der mRNA durch komplementäre Basenpaarung zusammenlagern. Jede tRNA trägt eine bestimmte Aminosäure. Diese Aminosäuren werden kovalent miteinander verknüpft, um

ein Protein zu bilden. Auf diese Weise bestimmt die Basensequenz der DNA die Sequenz der Aminosäuren

in einem Protein.

6% siehe Guided Exploration 1: Overview of Transcription and Translation.

aus freien Ribonucleotiden synthetisiert, die mit den komplementären Basen des DNA-Strangs eines Gens paaren. (Die Transkription wird in Kap. 26 ausführlicher beschrieben.) Die RNA, die zu einem Protein kodierenden Gen gehört, wird als Messenger-RNA (engl. für Boten-RNA) oder mRNA bezeichnet. Sie wandert zum Ribosom, einer Zellorganelle, die selbst größtenteils aus RNA aufgebaut ist (ribosomale RNA oder rRNA). Am Ribosom paart jedes Triplett der mRNA mit drei komplementären Nucleotiden in einem kleinen RNA-Molekül, der Transfer--RNA oder tRNA (Abb. 3.14). An jedes tRNA-Molekül ist eine bestimmte Aminosäure gebunden. Das Ribosom katalysiert die Verknüpfung der Aminosäuren, welche die monomeren Einheiten der Proteine sind. (Die Synthese von Proteinen wird in Kap. 27 detailliert beschrieben.) Die Aminosäuren werden an die wachsende Proteinkette entsprechend der Reihenfolge angefügt, in der das tRNA-Molekül an die mRNA bindet. Da die Nucleotidsequenz der mRNA wiederum die Nucleotidsequenz des Gens widerspiegelt, dirigiert die DNA die Synthese von Proteinen. Folglich können sich auch Veränderungen (Mutationen) des genetischen Materials eines Organismus in Proteinen mit veränderten Strukturen und Funktionen widerspiegeln. Mithilfe der in den folgenden Abschnitten beschriebenen Techniken kann die Gesamtheit aller in der DNA codierten Erbinformation für einen bestimmten Organismus, sein Genom, zusammengetragen werden. Die Untersuchung des Genoms, seiner Größe, Organisation und der darin enthaltenen Gene, wird auch als Genomik bezeichnet. In Analogie dazu nennt man die Untersuchung der Genexpression auch Transkriptomik. Ihr Forschungsgegenstand ist die Gesamtheit der mRNA-Moleküle (auch als Transkriptom bezeichnet), die unter den jeweiligen Bedingungen von der DNA transkribiert werden. Entsprechend bezeichnet Proteomik die Untersuchung der Gesamtheit der Proteine eines Organismus, seines Proteoms. Zwar verändert sich das Genom eines Organismus wachsende Proteinkette

NH$

NH3

OH

NH;

Rest

Abb. 3.14 Translation. tRNA-Moleküle, die mit ihrer entsprechenden

Transfer-

RNA

Aminosäure beladen sind, binden an Trinucleo-

tideinheiten (Tripletts) der mRNA. Ribosomen ermöglichen die Anlagerung von tRNA an mRNA und katalysieren die Verknüpfung von Aminosäuren, um eine Polypeptidkette zu synthetisieren. Wenn

eine neue Aminosäure

5 3

Boten-RNA

hinzugefügt wird,

wird das vorhergehende tRNA-Molekül entfernt,

und das Ribosom bewegt sich entlang der mRNA weiter.

Aminosäure-

Richtung der Ribosomenbewegung entlang der mRNA

Sequenzieren von Nucleinsäuren

im Laufe des Lebens im Grunde nicht, jedoch können sich seine Transkriptome und Proteome in Abhängigkeit von untersuchtem Gewebe, Entwicklungszustand oder äußerer Umwelt wesentlich unterscheiden.

4

Bei den ersten Bemühungen, RNA zu sequenzieren, wurden unspezifische Enzyme eingesetzt, um relativ kleine Fragmente zu generieren, deren Nucleotidzusammensetzung dann durch eine partielle Spaltung mit einem Enzym bestimmt wurde, das selektiv Nucleotide von einem der beiden Enden entfernte (Abb. 3.15). Die Sequenzierung der RNA auf diese Art und Weise war mühsam und Zeit raubend. Robert Holley benötigte sieben Jahre, bis er mit diesen Methoden die Sequenz eines tRNA-Moleküls aus 76 Resten bestimmt hatte. Nach 1975 wurde ein deutlicher Fortschritt in der Technik der Nucleinsäuresequenzierung gemacht. Dies wurde durch die Entdeckung von Enzymen erreicht, die DNA an spezifischen Stellen spalten können, und durch die Entwicklung schneller Sequenzierungstechniken für DNA. Das Aufkommen der modernen molekularbiologischen Klonierungstechniken (Abschnitt 3.5) ermöglichte außerdem die Gewinnung ausreichender Mengen an DNA für die Sequenzierung. Diese Klonierungstechniken sind deshalb so wichtig, weil die meisten DNA-Sequenzen normalerweise nur als einzelne Kopie im Genom vorliegen.

A.

Verständnisfrage zu Abschnitt 3 1. Fassen Sie das zentrale Dogma der Molekularbiologie zusammen.

_Sequenzieren von Nucleinsäuren

Vieles vom gegenwärtigen Verständnis bezüglich der Struktur und Funktion von Proteinen stammt aus Informationen, die nicht direkt aus Proteinen selbst, sondern indirekt aus ihren Genen erhalten wurden. Die Fähigkeit, die Nucleotidsequenz von Nucleinsäuren zu bestimmen, hat es ermöglicht, die Aminosäuresequenz der kodierten Proteine sowie auch in einem gewissen Umfang deren Strukturen und Funktionen abzuleiten. Die Sequenzierung von Nucleinsäuren ergab außerdem Informationen bezüglich der Regulation von Genen. Teile von Genen, die aber nicht in RNA transkribiert werden, können trotzdem einen Einfluss darauf haben, wie oft ein Gen exprimiert, d.h. transkribiert und translatiert wird. Darüber hinaus haben Bemühungen, Sequenzen in bisher nicht kartierten Bereichen der DNA aufzuklären, zu der Entdeckung neuer Gene und neuer regulatorischer Elemente geführt. Hält man eine Nucleinsäuresequenz erst einmal in Händen, kann sie vervielfältigt, modifiziert und exprimiert werden. Dies ermöglicht die Untersuchung von Proteinen, die sonst nicht in ausreichenden Mengen erhalten werden könnten. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Nucleinsäuren sequenziert werden und welche Informationen die Sequenzen liefern können. Im darauf folgenden Abschnitt wird die Manipulation von isolierten Nucleinsäuresequenzen für vielfältige Anwendungen diskutiert. Die generelle Strategie für die Sequenzierung eines Polymeres aus nicht identischen Einheiten ist folgende: 1. Spalten des Polymeres in bestimmte Fragmente, die klein genug sind, um vollständig sequenziert zu werden. 2. Bestimmen der Bausteinsequenz in jedem Fragment. 3. Bestimmen der Reihenfolge der Fragmente im ursprünglichen Polymer durch Wiederholen der vorangegangenen Schritte, indem eine Degradationsmethode gewählt wird, die einen Satz an Fragmenten liefert, welche die Schnittpunkte aus dem ersten Schritt überlappen.

Restriktionsendonucleasen

Viele Bakterien können der Infektion durch Bakteriophagen (Viren, die spezifisch Bakterien infizieren) widerstehen, weil sie ein wirksames Restriktionsmodifikationssystem besitzen. Ein Bakterium modifiziert bestimmte Nucleinsäuren

57

GCACUUGA SchlangengiftPhosphodiesterase GCACUUGA GCACUUG GCACUU GCACU GCAC GCA GC

+ Mononucleotide

Abb. 3.15 Bestimmung der Sequenz eines Oligonucleotids. Das Oligonucleotid wurde teilweise mit Phospho-

diesterase aus Schlangengift gespalten, welche die Phosphodiesterbindungen zwischen den Nucleotiden spaltet. Das Enzym beginnt mit der Spaltung am 3’-Ende des Oligonucleotids. Es entsteht eine Mischung aus Fragmenten aller Längen, die dann getrennt werden können. Der Vergleich der Basenzusammensetzung von Paaren, die sich nur um ein Nucleotid unterscheiden, ermöglicht die Identifizierung des 3’-terminalen Nucleotids des jeweils größeren Fragmentes. Die Analyse jedes Fragmentpaares ergibt die Sequenz des ursprünglichen Oligonucleotids.

58

Nucleotide und Nucleinsäuren

in definierten Bereichen seiner eigenen DNA durch den Einbau einer Methylgruppe (-CH;). Diese Reaktion wird durch eine Modifikationsmethyltransferase katalysiert. Eine Restriktionsendonuclease, welche die gleiche Nucleotidsequenz erkennt wie die Methyltransferase, spaltet jede DNA, die nicht an mindestens einem der beiden Stränge modifiziert wurde. (Eine Endonuclease spaltet eine Nucleinsäure innerhalb eines Polynucleotidstranges, eine Exonuclease spaltet eine Nucleinsäure, indem sie einen der terminalen Reste entfernt.) Das Restrik-

tionssystem zerstört fremde (Phagen-)DNA, die eine Erkennungsstelle besitzt, welche nicht durch Methylierung modifiziert wurde. Die Wirts-DNA ist zur Hälfte methyliert, denn auch wenn

ein Tochterstrang

immer

mindestens

Tab. 3.2

Erkennungs- und Restriktionsschnittstellen einiger Typ-Il-Restriktionsenzyme.

bis kurz nach Beendigung seiner Synthese nicht methyliert vorliegt, ist doch der Elternstrang, mit dem er paart, schon modifiziert und schützt somit beide Stränge der DNA vor der Spaltung durch Restriktionsenzyme. Typ-II-Restriktionsendonucleasen sind hilfreiche molekularbiologische Werkzeuge. Diese Enzyme schneiden DNA innerhalb einer Sequenz von vier bis acht Basen, die durch die dazugehörige Modifikationsmethyltransferase erkannt wird (Typ-I- und Typ-III-Restriktionsendonucleasen schneiden DNA nicht direkt innerhalb ihrer Erkennungssequenzen). Mittlerweile sind über 3000 Typ-II-Restriktionsenzyme mit mehr als 200 verschiedenen Erkennungssequenzen charakterisiert worden. Einige der am häufigsten verwendeten Restriktionsenzyme sind in Tabelle 3.2 aufgelistet. Ein bakterielles Restriktionsenzym wird folgender-

8

Enzym

Erkennungssequenz”

Mikroorganismus

Alul

AGJC+T

Arthrobacter luteus

BamHI

GIGATCHC

Bacillus amyloliquefaciens H

Bgll

GCCNNNNNINGGC

Bacillus globigii

Bell!

ALGATCT

Bacillus globigii

EcoRI

GJAA*TTC

Escherichia coli RY13

EcoRII

LET NET

Escherichia coli R245

EcoRV

GA*TLATC

Escherichia coli J62 pLG74

Haell

RGCGCIY

Haemophilus aegyptius

Haelll

GGICHC

Haemophilus aegyptius

Hindlll

A*LAGCTT

Haemophilus influenzae R,

Hpall

EICKEG

Haemophilus parainfluenzae

Mspl

EITES

Moraxella-Spezies

PstlI

CTGCA*G

Providencia stuartii 164

Pvull

CAGIC#TG

Proteus vulgaris

Sall

GITCEAC

Streptomyces albus G

Tagl

TICGA*

Thermus aquaticus

Xhol

CITCGAG

Xanthomonas holcicola

Die Erkennungssequenz ist abgekürzt; nur ein Strang, in 5’-3’-Richtung gelesen, ist angegeben. Die Schnittstelle ist durch einen Pfeil (J) gekennzeichnet, und die modifiziert e Base soweit bekannt, ist mit einem Sternchen markiert (A* steht für N°-Methyladenin und C* für 5-Methylcytosin). R, Yund N stehen entsprechend entweder für ein Purinnucleotid ein Pyrimidinnucleotid oder jedes beliebige Nucleotid. [Quelle: Roberts, R. J., und Mat D., REBASE-the restriction enzyme database, http:/ [rebase.neb.com.)

Sequenzieren von Nucleinsäuren (a)

EcoRI

| Schnittstelle

(b)

®

EcoRV

59

Abb. 3.16 Restriktionsschnittstellen. Die Erkennungssequenzen für Typ-Il-Restriktionsendonucleasen sind palindromische Sequenzen mit einer zweizähligen Symmetrieachse. (a) Erkennungssequenz für EcoRl, das DNA-Fragmente mit „klebrigen“ Enden (engl.: sticky ends) liefert. (b) Erkennungssequenz für EcoRV, das Fragmente mit „glatten“ Enden (engl.: blunt ends) liefert.

zweizählige Symmetrieachse

maßen benannt: Der erste Buchstabe ist der Anfangsbuchstabe des Gattungsnamens, darauf folgen die beiden ersten Buchstaben der Art und dann der Serotyp oder die Stammbezeichnung. Falls das Bakterium mehr als einen Typ an Restriktionsenzymen besitzt, wird dem Namen zusätzlich eine römische Ziffer angefügt. Zum Beispiel findet manEcoRI in dem E. coli-Stamm RY13. Interessanterweise erkennen und spalten die meisten Typ-II-Restriktionsendonucleasen an palindromischen DNA-Sequenzen. Ein Palindrom ist ein Wort oder eine Phrase, die sich vorwärts wie rückwärts gleich lesen lässt. Zwei Beispiele sind „Otto“ und „Ein Esel lese nie“. In einem palindromischen DNA-Abschnitt ist die Nucleotidsequenz in jedem Strang gleich und das Segment besitzt eine zweizählige Symmetrieachse (Abb. 3.16). Die meisten Restriktionsenzyme schneiden beide Stränge der DNA versetzt und erzeugen so DNA-Fragmente mit komplementären Einzelstrangüberhängen. Restriktionsfragmente mit solchen klebrigen Enden (engl.: sticky ends) können sich durch Basenpaarung mit anderen Fragmenten assoziieren, die durch dasselbe Restriktionsenzym entstanden sind. Einige Restriktionsendonucleasen spalten die beiden DNA-Stränge an der Symmetrieachse und produzieren dadurch Fragmente mit komplett basengepaarten glatten Enden (engl.: blunt ends). Kathode

B.

Elektrophorese und Restriktionskartierung

Die Inkubation einer DNA mit einer Restriktionsendonuclease ergibt eine Reihe von Fragmenten, die ihrer Größe nach getrennt werden können. Für eine solche Trennung wird üblicherweise die Gelelektrophorese angewendet. Das Prinzip beruht dabei darauf, dass sich ein geladenes Molekül in einem elektrischen Feld bewegt und zwar mit einer Geschwindigkeit, die proportional zu seiner Gesamtladungsdichte, Größe und Form ist. Für Moleküle einer relativ homogenen Zusammensetzung (wie Nucleinsäuren) sind die Form und die Ladungsdichte konstant, so dass die Geschwindigkeit vor allem von der Größe abhängt. Die Elektrophorese wird in einer gelartigen Matrix durchgeführt. Diese besteht meist aus Agarose (Kohlenhydratpolymere, die ein loses Maschenwerk bilden) oder aus Polyacrylamid (ein etwas starreres, quervernetztes synthetisches Polymer). Das Gel wird im Allgemeinen zwischen zwei Glas- oder Kunststoffplatten gegossen (Abb. 3.17) oder es wird als dünne Schicht auf eine ebene Fläche aufgebracht. Die Proben mit den zu trennenden Molekülen werden an einem Ende des Geles aufgetragen und bewegen sich dann, unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes, durch die Poren der Matrix. Kleinere Moleküle bewegen sich schneller durch das Gel und legen deshalb in einer bestimmten Zeit eine größere Strecke zurück. Nach der Elektrophorese können die getrennten Moleküle im Gel durch geeignete Techniken sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch einen Farbstoff, der spezifisch an die DNA bindet, oder mittels radioaktiver Markierung. Je nach

Probenkammern

Erabe

Plastikrahmen

Abb. 3.17 Gelelektrophoreseapparatur. Die Proben werden in Taschen oben im Gel aufgetragen und wandern während der Elektrophorese in parallelen Bahnen. Negativ geladene Moleküle wie DNA wandern in Folge eines angelegten elektrischen Feldes durch die Gelmatrix zur Anode. Weil sich kleine Moleküle schneller bewegen als große, werden die Moleküle jeder Probe nach ihrer Größe getrennt. Nach der Elektrophorese können die getrennten Moleküle durch Färbung, Fluores-

zenz oder radiographische Techniken sichtbar gemacht werden.

Nucleotide und Nucleinsäuren

60

Größe und Färbemethode des Geles können mittels der Gelelektrophorese Proben getrennt und detektiert werden, die weniger als ein Nanogramm Material enthalten. Außerdem können verschiedene Proben gleichzeitig in einem Elektrophoreselauf analysiert werden. Zum Beispiel können die Fragmente, die durch die Spaltung einer DNA-Probe mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, nebeneinander sichtbar gemacht werden (Abb. 3.18). Die Größe der verschiedenen Fragmente kann dann durch den Vergleich ihrer elektrophoretischen Mobilität mit der von Fragmenten bekannter Größe bestimmt werden.

AEBACADFEZEIGERN |

C.

_ Sequenzieren mit der Kettenabbruchmethode

Die heute am häufigsten eingesetzte Technik der DNA-Sequenzierung ist die von Frederick Sanger entwickelte Kettenabbruchmethode. In einem ersten Schritt müssen dazu einzelne Polynucleotidstränge in der Probe erzeugt werden. Komplementäre Stränge können durch Erhitzen getrennt werden, wobei die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen aufgebrochen werden. Als Nächstes werden Polynucleotidfragmente gebildet, welche an Positionen abbrechen, die jeweils einem der vier Nucleotide entsprechen. Die Fragmente werden schließlich getrennt und bestimmt. Für die Kettenabbruchmethode wird DNA-Polymerase verwendet Bei der Kettenabbruchmethode (auch Didesoxymethode genannt) verwendet man ein E. coli Enzym, um komplementäre Kopien der zu sequenzierenden Einzelstrang-DNA herzustellen. Das Enzym ist ein Fragment der DNA-Polymerase I, eines der Enzyme, die an der Replikation der bakteriellen DNA (Abschnitt 24.2A) beteiligt sind. Indem sie einen einzelnen DNA-Strang als Vorlage (Matrize) verwendet, baut die DNA-Polymerase in 5’—3’ Richtung die vier Nucleosidtriphosphate (dNTPs), dATP, dCIP, dGTP und dTTP so ein, dass eine komplementäre Polynucleotidkette entsteht (Abb. 3.19). Die DNA-Polymerase I kann aufeinander folgende Desoxynucleotide nur an das 3'-Ende der Polynucleotidkette addieren. Das bedeutet, dass die Replikation durch die Anwesenheit eines kurzen Polynucleotids (eines Primers) initiiert werden muss, der komplementär zum 3’-Ende der Matrizen-DNA ist und das 5’Ende des neuen Stranges bildet. Der Primer lagert sich über Basenpaarung an den Vorlagestrang an und die Nucleotide werden nacheinander an das 3’-Ende

Abb. 3.18 Elektrophoretogramm einer Restriktionsspaltung. Das Plasmid pAgK34 wurde mit (A) BamHl,

(B) Psti, (C) Bglil, (D) Haelll, (E) Hincli, (F) Sacl, (G) Xbal und (H) Hpal gespalten. Bahn | enthält

DNA des Bakteriophagen A, die mit Hindlll gespalten wurde und als Standard dient, da die

Gröfe dieser Fragmente bekannt ist. Die Restriktionsfragmente in jeder Bahn wurden vor einem dunklen Hintergrund durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. [Aus: Slota, J. E., und Farrand, S. F. Plasmid 8, 180, (1982). © 1982 Academic Press.]

Matrize

3’

..5

erone p

2

DNA-

al

Polymerase I

i

GET

\ \\

P

Ö

ee >

0 Cr

5

en

T

PP; OH PPP 5

Abb. 3.19

Primer

3’

+

FOH+etec.

OH

PPP

dCTP

dTTP

Funktionsweise der DNA-Polymerase I.

Mit dem Einzelstrang als Vorlage verlängert das Enzym den Primer durch schrittweise Addition komplementärer Nucleotide. Dazukommende Nuc-

leotide paaren mit den Basen des Vorlagestranges und werden in 5’—3’-

pP

P

p

P

+

has + PPP

ü Richtung dem wachsenden Polynucleotidstrang hinzugefügt. Die polymerasekatalysierte Reaktion erfordert, dass am wachsenden Strang eine freie 3’OH-Gruppe vorhanden ist. Bei jeder Nucleotidaddition wird ein Molekül

Pyrophosphat (P,0F, PP,) freigesetzt.

Sequenzieren von Nucleinsäuren

61

des Primers addiert. In den meisten Fällen ist die zu sequenzierende DNA ein Restriktionsfragment, d.h. sie beginnt und sie endet mit einer Restriktionsschnittstelle. Der Primer kann dann ein kurzes DNA-Segment mit der Sequenz dieser Restriktionsschnittstelle sein. Die DNA-Synthese bricht nach bestimmten Basen ab

Bei der Kettenabbruchtechnik (Abb. 3.20), wird die zu sequenzierende DNA mit DNA-Polymerase I, einem geeigneten Primer und den vier dNTP-Substraten für die Polymerisierungsreaktion inkubiert. Der Reaktionsansatz beinhaltet eine markierte Komponente; dies ist entweder eines der dNTP-Substrate oder der Primer. Die Markierung, die ein radioaktives Isotop (z.B. ””P) oder eine fluoreszierende Gruppe sein kann, erlaubt es, die bei der Polymerisierung entstandenen Produkte hinterher leicht zu bestimmen. Die Schlüsselkomponente der Reaktionsmischung ist eine kleine Menge 2’, 3'-Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP),

EI

6% siehe Guided Exploration 2: DNA Sequence Determination by the

Chain-Terminator Method.

Fi

2,3 -Didesoxynucleosidtriphosphat

dem die 3’-OH-Gruppe der Desoxynucleotide fehlt. Wenn das Didesoxyanalogon anstelle des normalen Nucieotids in das wachsende Polynucleotid eingebaut wird, ist

die Kettenverlängerung beendet, weil die Addition des nächsten Nucleotids eine freie Matrize: Primer:

dATP dETp dGTP aTTP

3’ —— — a

+ ddATP

CCA CCATCGTTGA

CCGGTAGCAACT nn

dATP dCTP dGTP dTTP

GGC GGCC GGCCATC

+ ddCTP

———

dATP dCTP dGTP dTTP

5

+ ddGTP

GGCCATCG GGCCATCGTTG

dATP genE dGTP dTTP

+ ddTTP

GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT

Abb. 3.20 DNA-Sequenzierung mit der Kettenabbruch-(Didesoxy-)Methode. Jede der vier Reaktionsmischungen enthält die zu sequenzierende Einzelstrang-DNA (Matrize), einen Primer, die vier Desoxynucleotidtriphosphatverbindungen (dATP etc.) und eines der vier Didesoxynucleosidtriphosphate (ddATP etc.). Die Verlängerung des Primers mit Hilfe der DNA-Polymerase

Eye

&

ergibt DNA-Ketten, die mit einem

Didesoxynuc-

Sequenz ist komplementär

leotid enden. Eine Gelelektrophorese der Frag-

zur Matrizen-DNA

mente der vier Reaktionsmischungen auf parallelen

Bahnen führt zu einer Reihe von Polynucleotidketten, deren terminale 3’-Gruppen bekannt sind. Die Sequenz, die man erhält, indem man vom kleinsten ee ahiaNe eeO1 a

bis zum größten Fragment „liest“ (d. h. auf dem Gel von unten nach oben), ist zur Sequenz der Matrizen-DNA komplementär.

62

Nucleotide und Nucleinsäuren

Abb. 3.21 Autoradiogramm eines Sequenzierungsgels. Die Positionen der mit der Kettenabbruchmethode hergestellten radioaktiven Fragmente, wurden nach der Elektrophorese durch Auflegen eines Röntgenfilmes auf das Gel sichtbar gemacht. Der ersten Beladung des Gels folgte nach 90 min eine zweite (4 Bahnen rechts), um die Sequenzen der kleineren Fragmente zu erhalten. Die abgeleitete Sequenz von 140 Nucleotiden ist an den Seiten angegeben.

AG

AGCT

80

c

140

acA TInA”

OrCr DC

TaIE, in

T ALLA

ion An An Ara.

Cru ES

Go

und Burdon, R. H. (Hrsg.), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 10, S. 82,

Au

°C

90 N aM

A

C79q

T GA

C

G.& Co

(®

Ar

Ar

A

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OA

CT

Tı (€

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Ac

[Aus: Hindley, J., DNA Sequeneing, in Work, T. S.,

Elsevier (1983) mit freundlicher Genehmigung.]

OT

TTT

T C

a

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c

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08

A Ten

A [6

Bi

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wi

(6) A

A

G

T

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c

ae G

p

3'-OH-Gruppe erfordert. Mit einer nur geringen Menge an ddNTPs wird eine Reihe von verkürzten Ketten gebildet, von denen jede mit einem Didesoxyanalogon an einer der Positionen endet, die von der entsprechenden Base eingenommen wird. Bei Sequenzierungen im Labormaßstab erzeugt man vier Reaktionsmischungen, jede mit einem anderen ddNTP und trennt die Reaktionsprodukte mittels Gelelektrophorese auf parallelen Bahnen. Die Länge der entstandenen vorzeitig abbrechenden Ketten zeigt die Position an, an der das Didesoxynucleotid eingebaut wurde. Auf diese Weise kann die Sequenz des replizierten Stranges direkt vom Gel abgelesen werden (Abb. 3.21). Die Auflösung des Geles muss so gut sein, dass Bruchstücke getrennt werden können, die sich in ihrer Länge nur um ein Nucleotid unterscheiden. Man kann zwei verschiedene Gele mit unterschiedlich langen Laufzeiten benutzen, um die Sequenz von bis zu 800 DNABasen zu erhalten. Es ist zu beachten, dass die Sequenz, die man mit der Kettenabbruchmethode erhält, komplementär zu dem DNA-Strang ist, der sequenziert wird. Automatisches Sequenzieren

Sequenzierungen im großen Maßstab lassen sich durch Automatisierung beschleunigen. Bei einer Variante der Kettenabbruchmethode ist jeder Primer, den man für die vier Kettenverlängerungsreaktionen benutzt, mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt. Man lässt diese Reaktionsmischungen einzeln reagieren, vereinigt sie dann und trennt sie elektrophoretisch auf einer einzigen Bahn. Die terminale Base eines jeden Fragmentes wird durch die charakteristische Fluoreszenz seines Primers identifiziert (Abb. 3.22). Die Fehlerquote bei dieser Art des Nachweises liegt im Bereich von einem Prozent. In den am weitesten entwickelten Systemen ist das Sequenziergel - anstelle der früher gebräuchlichen Platten-Gelkammer - in Kapillarröhrchen enthalten, von denen bis zu 96 in einem Array zusammengefasst sind. Probenvorbereitung und -auftragung werden von einem Roboter ausgeführt. Die Elektrophorese und Datenanalyse erfolgt voll automatisiert. Diese Systeme können gleichzeitig 96 DNA-Proben mit durchschnittlich etwa 600 Basen sequenzieren, wobei eine Se-

quenzierung jeweils ungefähr 2,5 Stunden dauert. Somit kann pro Tag die Sequenz von bis zu 550.000 Basen ermittelt werden - alles erfordert nur etwa

Sequenzieren von Nucleinsäuren LTSTSEILGOSEGECHE GOGGTGENAGO TCCAGCT I EGT TCC Ei A AGT GAGGGTT AAT TTICGAGCTTRAC GT A, A A CAT SATONT AGCTGTTT

63 (

Mi! ua MMMLEMIININUMITINN IM BETGTGAAATETTATECGETE

AC BEISRL di

AACAT Eh GAGOCGGAAGC AT AAAGTGTAAAGC C Tan

a1Se C TASTNaET

han! INni InhMEINLIMIUINUN IN

15 Minuten menschliche Aufmerksamkeit. Zum Vergleich: ein geübter Laborant kann unter Zuhilfenahme der oben beschriebenen manuellen Methoden nur etwa 25.000 Basen pro Jahr sequenzieren. Die Sequenzierung des 3,2 Milliarden Basenpaare umfassenden menschlichen Genoms erforderte Hunderte solch hochentwickelter Sequenziersysteme. Nucleotidsequenzen sind in Datenbanken gespeichert Die Ergebnisse der großen und kleinen Sequenzierungsprojekte werden üblicherweise in Online-Datenbanken hinterlegt, wie z.B. bei GenBank (siehe die Bioinformatics Exercises). Bis Anfang 2009 wurden auf diese Weise mehr als 190 Milliarden Nucleotide in mehr als 110 Millionen Sequenzen aufgezeichnet. Die Nucleinsäuresequenzierung wurde derart zur Routine, dass die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins (Abschnitt 5.3) weit mehr Zeit in Anspruch nimmt als die Ermittlung der Basensequenz seines entsprechenden Gens. Die Sequenzierung von Nucleinsäuren ist in der Tat von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von Genen, deren Produkte bislang noch

nicht

identifiziert

wurden.

Wenn

das

Gen

sequenziert

werden

kann,

lässt sich die voraussichtliche Funktion des Genprodukts (z.B. Proteins) vorhersagen, wenn die Produkte von Genen ähnlicher Sequenzen bereits beschrieben sind (Exkurs 3.1).

D.

Ganze Genome sind sequenziert

Die Möglichkeit von Basensequenzierung im großen Maßstab hat den Traum von der Sequenzierung ganzer Genome wahr werden lassen. Die hauptsächliche technische Hürde bei der Sequenzierung der gesamten genomischen DNA eines Lebewesens ist jedoch nicht die eigentliche Sequenzierung. Die Schwierigkeit ist vielmehr, die vielen einzelnen sequenzierten Abschnitte (je nach Genomgröße einige zehntausend bis einige Millionen) zu zusammenhängenden Blöcken zusammenzusetzen und ihnen auf den Chromosomen die richtigen Positionen zuzuweisen. Um dies zu bewerkstelligen, waren die Entwicklung automatisierter Sequenzierprotokolle und mathematisch hoch komplexer Computeralgorithmen erforderlich. Die erste vollständig bestimmte Genomsequenz war die des Bakteriums Haemophilus influenzae, die 1995 Craig Venter vermeldete.

die Sequenzen von 1000 Genomen

Bis Mitte 2009 waren

aus Pro- und Eukaryoten bekannt, ein-

schließlich des Humangenoms, der Genome von menschlichen Krankheitserregern, von Pflanzen und Labororganismen (Tab. 3.3). Weitaus mehr Genomse-

quenzen werden zur Zeit noch ermittelt. Die Bestimmung der rund 3,2 Milliarden Nucleotide des menschlichen Genoms war ein gewaltiges Unternehmen, an dem Hunderte von Wissenschaftlern beteiligt waren. Diese arbeiteten in zwei Gruppen, von denen eine von Venter,

SZEOT,

LM

Abb. 3.22 Automatische DNA-Sequenzierung. Bei dieser Variante des Sequenzierens ist jeder Primer der vier Reaktionsmischungen mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff markiert. Die vier Reaktionsmischungen wurden vereinigt und durch eine Elektrophorese getrennt. Jede der vier farbigen Kurvenverläufe gibt daher das Elektrophoresemuster der Fragmente wieder, die eines der Didesoxynucleotide enthalten. Grün, Rot, Schwarz und Blau entsprechen den Fragmenten, die mit ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP enden.

Die terminale 3’-Base jedes Oligonucleotids wird durch die Fluoreszenz seiner Bande auf dem Gel identifiziert. Dieser Teil des Computerausdruckes entspricht den Nucleotiden 100-290 des sequenzierten DNA-Segments. [Mit freundlicher Genehmigung von Mark Adams, J. Craig Venter Institute, Rockville, Maryland.]

64

Nucleotide und Nucleinsäuren

. symptomlos waren (mit einem von Familienangehörigen,die des Gens). So konnnormalen und einem defekten Exemplar ten er und seine Mitarbeiter den Gendefekt, der cystische Fibrose verursacht, auf dem langen Arm von Chromosom 7 lokalisieren. Sie grenzten allmählich einen DNA-Abschnitt ein, der bei einer Reihe von Säugetieren vorzukommen schien, was vermuten ließ, dass ein lebenswichtiges Gen

darin enthalten war. 1989 wurde das defekte Gen für cystiFrancis S. Collins (1950-)

sche Fibrose schließlich

In der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts hat man die molekularen Grundlagen mehrerer menschlicher Krankheiten verstanden. So stellte sich beispielsweise heraus, dass die Sichelzellanämie (Abschnitt 7.1E) durch ein anomales Protein, das

Sichelzellhämoglobin,

verursacht

wird.

Untersu-

chungen des Sichelzellhämoglobins offenbarten schließlich den zugrunde liegenden genetischen Defekt, eine Mutation in einem Hämoglobin-Gen. Demzufolge schien es möglich zu sein, auch andere Krankheiten auf defekte Gene zurückzu-

führen. Aber bei vielen genetischen Krankheiten - sogar bei denjenigen, deren Symptome gut beschrieben waren - hatte man bislang kein fehlerhaftes Protein identifiziert. Eine derartige Krankheit war die cystische Fibrose, die hauptsächlich

durch die Absonderung eines dicken Schleims charakterisiert ist, der die Atemwege

verstopft und

Bakterien

ein ideales

Wachstumsmillieu bietet. Cystische Fibrose ist die häufigste Erbkrankheit bei Nord- und Mitteleuropäern; in Deutschland

ist eines von 2500 Neugeborenen davon betroffen. Die Krankheit führt meist im frühen Erwachsenenalter zum Tod, weil

die Lunge irreversibel geschädigt wird. Man hoffte, wenn man den molekularen Defekt der cystischen Fibrose herausfinden würde, dann ließe sich die Krankheit besser verstehen und man könnte auch wirksamere Therapien entwerfen.

Dies war die Ausgangslage für Francis Collins, der seine Laufbahn mit einer Promotion in physikalischer Chemie begann, sich aber dann an der medizinischen Fakultät immatrikulierte, um an der molekularbiologischen Revolution teilhaben zu können. Als Mediziner entwickelte Collins Methoden, um große DNA-Stücke zu analysieren und sich an die darin enthaltenen Gene heranzutasten. Dazu gehörte auch das Gen, dessen Mutation die cystische Fibrose verursacht. Collins analysierte die DNA von Personen, die an der Krank-

heit litten (sie besaßen zwei Kopien des defekten Gens) und

identifiziert. Collins

hatte gezeigt,

dass es möglich ist, einen Gendefekt selbst in Abwesenheit anderer molekularer Informationen zu identifizieren. Als man das defekte Gen für cystische Fibrose gewissermaßen in Händen hielt, war es ein relativ einfacher Vorgang, die mutmaßliche Struktur und Funktion des davon codierten Proteins herzuleiten. Dieses erwies sich als ein ATP-regulierter Chloridkanal der Zellmembran (siehe Abschnitt 10.3C). Bei normaler

Funktion

trägt dieses

Protein

dazu

bei, die

lonenzusammensetzung und Viskosität der extrazellulären Sekrete zu regulieren. Diese Entdeckung ermöglichte es nicht zuletzt, Tests zu entwickeln, mit denen man Träger des Gendefekts, der zu cystischer Fibrose führt, ermitteln kann, sodass diese sich einer genetischen Beratung unterzie-

hen können. Parallel zu

seiner Suche

nach

dem

Gen

für cystische

Fibrose und weiteren Krankheits-Genen, wie denen für Neurofibromatose und Morbus Huntington, machte sich Collins

stets Gedanken über die ethische Bewertung dieser neuen Wissenschaft Molekulargenetik. Collins war immer ein strenger Verfechter des Schutzes genetischer Daten. Gleichzeitig erkannte er den möglichen therapeutischen Nutzen derartiger Informationen. In seiner Amtszeit als Direktor des Humangenomprojekts sorgte er dafür, dass alle Ergebnisse frei für alle und unverzüglich zugänglich gemacht wurden, sowohl für die Forscher wie für die Patienten, die von neuen moleku-

largenetisch inspirierten Therapien profitieren könnten.

Riordan, J.R., Rommens, J.M. Kerem, B.-S., Alon, N., Rozmahel, R., Grzelczak, Z., Zielensky, ., Lok, S., Plavsic, N., Chou, ).-L. Drumm, M.L., lannuzzi, M.C., Collins, F.S., und Tsui, L.-C., Identification of the cystic

fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA, Science 245, 1066-1073

(1 989).

die andere von Francis Collins (Exkurs 3.1), Eric Lander und John Sulston geleitet wurde. Nach mehr als zehn Jahren intensiver Bemühungen wurde Anfang 2001 der „Rohentwurf“ der menschlichen Genomsequenz veröffentlicht. Die „endgültige“ Fertigstellung wurde Mitte 2003 verkündet. Diese überwältigende Leistung verspricht sowohl das Verständnis wie auch die Arbeitsweise der Biochemie und der Medizin grundlegend zu verändern, auch wenn wahrscheinlich noch viele Jahre weiterer Anstrengungen erforderlich sein werden, bevor die ganze Tragweite dieses Informationszuwachses verstanden ist. Nichtsdestotrotz lassen sich zahlreiche wichtige Schlüsse bereits jetzt ziehen. Dazu gehören:

Sequenzieren von Nucleinsäuren Tab. 3.3

Einige bislang sequenzierte Genome.

nn

Organismus DIENEN TER

nn

Genomgröße

Chromosomen

ei

Mycoplasma genitalium (Parasit beim Menschen)

Anzahl der

580

1

Rickettsia prowazekii (vermutlich mit Mitochondrien verwandt)

1.112

1

Haemophilus influenzae (Krankheitserreger beim Menschen)

1.830

1

Escherichia coli (menschlicher Symbiont) -

4.639

1

Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)

11.700

16

Plasmodium falciparum (einzelliger Parasit, Erreger der Malaria)

30.000

14

Caenorhabditis elegans (Nematode)

97.000

6

Arabidopsis thaliana (zweikeimblättrige Pflanze)

117.000

5

Drosophila melanogaster (Taufliege)

137.000

4

Oryza sativa (Reis)

390.000

12

Danio rerio (Zebrafisch)

1.700.000

25

Gallus gallus (Huhn)

1.200.000

40

Mus musculus (Maus)

2.500.000

20

Etwa die Hälfte des menschlichen Genoms besteht aus repetitiven (sich wiederholenden) Sequenzen verschiedener Art. Bis zu 60 % des Genoms wird in RNA transkribiert. Nur 1,1 bis 1,4 % des Genoms (rund 2 % der transkribierten RNA) codieren Proteine. Das menschliche Genom scheint nur etwa 23.000 Protein-codierende Gene zu enthalten. Diese zum Teil prognostizierten Gene werden auch als offene Leseraster (ORFs, von engl. open reading frames) bezeichnet. Ursprünglich waren 50.000 bis 140.000 Protein-codierende Gene vorhergesagt worden. Zum Vergleich: Die Hefe hat rund 6.000 ORFs, Drosophila etwa 13.000, C. elegans ungefähr 18.000 und Arabidopsis rund 26.000 — obgleich sich diese Zahlen höchst wahrscheinlich ändern werden, wenn sich unsere Fähigkeit, ORFs zu erkennen, verbessert. Nur ein kleiner Bruchteil der menschlichen Proteine ist für Wirbeltiere einzigartig; die meisten kommen auch bei anderen, wenn nicht sogar allen

Lebensformen vor. Zwei zufällig ausgewählte menschliche Genome weisen im Durchschnitt einen Unterschied je 1250 Nucleotide auf; d.h. zwei beliebige Menschen sind zu über 99,9 % genetisch identisch. Die offensichtlich höhere Komplexität von Menschen (Wirbeltieren) im Vergleich zu Wirbellosen geht wahrscheinlich nicht auf die unwesentlich größere Anzahl an ORFs bei den Wirbeltieren zurück. Vielmehr scheint es so zu sein, dass die Proteine der Wirbeltiere an sich komplexer sind als jene der Wirbellosen. Vertebraten-Proteine haben mehr Domänen (Module) als Evertebraten-Proteine. Diese Module werden häufiger durch alternatives Gen-Spleißen selektiv exprimiert (ein Phänomen, bei dem ein bestimmtes Gentranskript auf verschiedene Weise bearbeitet werden kann, sodass sich bei der Translation unterschied-

liche Proteine ergeben; Abschnitt 26.3A). Somit codieren viele Wirbeltiergene mehrere verschiedene, aber dennoch ähnliche Proteine.

65

66

Nucleotide und Nucleinsäuren

E.

Sequenzen, Mutation und Evolution

Das vielleicht wertvollste Ergebnis der Nucleinsäuresequenzierungstechnologie ist die Information, die sie über Mechanismen der Evolution liefert. Auf Grund der chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA, wie ihrer regulären dreidimensionalen Form und des eleganten Replikationsvorganges, kann der Eindruck entstehen, dass die genetische Information relativ statisch ist. Tatsächlich ist die DNA ein dynamisches Molekül, das Veränderungen unterliegt, die wiederum die genetische Information verändern. Zum Beispiel entstehen durch falsche Basenpaarungen (engl.: mismatches) während der DNA-Replikation Fehler in den Tochtersträngen, die als Punktmutationen bezeichnet werden. Mutationen ergeben sich auch auf Grund von Schädigungen der DNA durch Chemikalien oder durch Strahlung. Noch ausgedehntere Veränderungen der genetischen Information werden durch fehlerhafte Rekombination (Austausch der DNA zwischen Chromosomen) oder einer Transposition von Genen von einem Chromosom auf ein anderes verursacht. In einigen Fällen kann ein Gen auch von einem Organismus auf einen anderen übertragen werden. All diese Veränderungen der DNA liefern das Rohmaterial für die natürliche Selektion. Wenn ein mutiertes Gen transkribiert wird und die Boten-RNA anschließend translatiert wird, kann das dabei entstehende Protein Eigenschaften haben, die dem Individuum den einen oder anderen Vorteil bringen. Da eine nützliche Veränderung von Generation zu Generation weitergegeben wird, wird sie ein Teil des artenspezifischen Genoms. Während sich eine Art entwickelt, ereignen sich selbstverständlich viele Veränderungen, nicht alle vollziehen sich einfach und schrittweise. Phylogenetische Beziehungen können durch den Sequenzvergleich von gleichen Genen in verschiedenen Organismen erhalten werden. Die Anzahl der Unterschiede in der Nucleotidsequenz zweier gleichartiger Gene stimmt ungefähr mit dem Grad der evolutionären Divergenz ihrer Träger überein. Die Neueinteilung von Prokaryoten in Archaea und Bakterien (Abschnitt 1.3A) auf Grund des Vergleiches von rRNA-Sequenzen, die in allen Organismen vorkommen, illustriert die große Bedeutung der Sequenzanalyse. Die Nucleinsäuresequenzierung zeigt zudem, dass Arten mit großen Unterschieden im Phänotyp (d.h. der äußeren Erscheinung) auf molekularer Ebene sehr nahe verwandt sein können. Beispielsweise besitzen Mensch und Schimpanse eine zu 98-99 % identische DNA-Sequenz. Auch die Studien über Mais und seinen Vorläufer Teosint haben gezeigt, dass sich die Pflanzen nur in einer Hand voll Genen unterscheiden, die für die Entwicklung des Samenkornes verantwortlich sind (Teosintkörner sind von einer ungenießbaren Schale umhüllt; Abb. 3.23).

Abb. 3.23 Mais und Teosint. Trotz der großen Unterschiede im Phänotyp — Mais (unten) besitzt Hunderte leicht zu kauender Körner,

Teosint (oben) dagegen nur ein paar harte, ungenießbare — unterscheiden sich die Pflanzen nur in ein paar Genen. Der Vorläufer von Mais ist vermutlich eine mutierte Form des Teosintes,

bei der die Körner exponierter angeordnet waren. John Doebley/Visuals Unlimited.)

PT

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Rekombinante DNA-Technologie

Kleine Mutationen der DNA sind wahrscheinlich für relativ große evolutionäre Sprünge verantwortlich. Das erscheint nicht so überraschend, wenn man die Struktur der genetischen Information betrachtet. Eine Mutation in einem Genabschnitt, der eine RNA kodiert, kann die Bindung zellulärer Faktoren beeinflussen, welche die Effizienz der Translation steuern. Auch eine minimale Änderung der Gene könnte einen kompletten Entwicklungsprozess unterbrechen, was zum Auftreten einer neuen Art führt. Ungeachtet der hohen Wahrscheinlichkeit, dass die meisten Veränderungen zu einer verminderten individuellen Vitalität oder zu Veränderungen der Fortpflanzungsfähigkeit führen, ist die Anzahl der plötzlichen Veränderungen genetischer Information im Einklang mit fossilen Funden. Es waren ironischerweise die Diskontinuitäten in den fossilen Funden, die wahrscheinlich teilweise auf rasche genetische Veränderungen zurückzuführen sind, auf die sich die Annahmen von Charles Darwins Theorie der Evolution durch natürliche Selektion stützten.

5

Rekombinante DNA-Technologie

Zusammen mit der Sequenzierung von Nucleinsäuren haben die Techniken zur Manipulation von DNA in vitro und in vivo (im Reagenzglas und im lebenden System) zu großen Fortschritten in der Biochemie, Zellbiologie und Genetik geführt. In vielen Fällen hat es die Klonierungstechnik (engl.: recombinant DNA technology) ermöglicht, bestimmte DNA-Sequenzen zu reinigen und sie für Untersuchungen in ausreichenden Mengen herzustellen. Betrachten wir z.B. das Problem, ein 1000 bp langes Stück chromosomaler DNA von E. coli isolieren zu wollen. 10 L einer Bakterienkultur, die zu einer Dichte von ca. 10'° Zellen pro mL gewachsen ist, enthalten nur rund 0,1 mg der gewünschten DNA. Diese DNA-Menge wäre zwar ausreichend, ist aber mit den klassischen Reinigungsmethoden fast unmöglich von der übrigen DNA zu trennen (Abschnitte 5.2 und 24.3). Erst die rekombinanten DNA-Techniken, auch molekulare Klonierung (engl.: molecular cloning) oder Gentechnik (engl.: genetic engineering) genannt, machen die Isolierung, Amplifikation und Modifikation bestimmter DNASequenzen möglich.

A.

Klonierungstechniken

Um ein DNA-Segment zu erhalten und zu amplifizieren, wendet man folgende Vorgehensweise an: 1. Ein DNA-Fragment der gewünschten Größe wird mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten und danach isoliert. 2. Das DNA-Fragment wird in ein anderes DNA-Molekül, einen sogenannten Vektor, eingebaut, der Sequenzen enthält, die seine eigene Replikation ermöglichen. 3. Der Vektor mit dem eingefügten DNA-Fragment wird in Zellen eingeführt, in denen er vermehrt werden soll. 4. Zellen, welche die gewünschte DNA enthalten, werden identifiziert und

selektiert. Klonieren bedeutet die Produktion von vielen identischen Organismen, die von

einem einzigen Vorläufer abstammen. In unserem Falle ist der Klon diejenige Zellkolonie, die den Vektor enthält, welcher das gewünschte Fragment trägt. In einem passenden Wirtsorganismus, wie z.B. E. coli oder Hefe, können große Mengen der eingefügten DNA produziert werden. Klonierte DNA kann leicht gereinigt und sequenziert werden (Abschnitt 3.4). Der Wirtsorganismus kann auch große Mengen an RNA und Protein synthetisieren, wenn das klonierte Gen von den entsprechenden regulatorischen

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Erklären Sie die Arbeitsweise des Restriktionsmodifikationssystems.

2. Beschreiben Sie den Ablauf der Kettenabbruchmethode zur Sequenzierung von DNA.

3. Wie groß ist der Anteil des Humangenoms, der transkribiert bzw. translatiert wird? 4. Wie kann eine Mutation in der DNA zur Evolution des Organismus beitragen?

67

68

Nucleotide und Nucleinsäuren

Sequenzen für die RNA- und Proteinbiosynthese flankiert wird. Damit liefert das Klonieren Material (Nucleinsäuren und Proteine) für weiterführende Untersuchungen und bietet Möglichkeiten, die Genexpression unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Klonierungsvektoren

Eine Vielzahl von kleinen, sich selbst replizierenden DNA-Molekülen wird als Klonierungsvektoren verwendet. Plasmide sind ringförmige DNA-Moleküle mit einer Größe von 1 bis 200 kb, die man in Bakterien- oder Hefezellen findet. Plasmide können als „molekulare Parasiten“ angesehen werden, jedoch nützen

sie in vielen Fällen ihrem Wirt, weil sie Funktionen vermitteln, die dem Wirtsorganismus fehlen, wie z.B. die Resistenz gegenüber Antibiotika. Einige Arten von Plasmiden liegen nur in wenigen Kopien in einer Zelle vor und replizieren sich auch nur, wenn das bakterielle Chromosom vervielfältigt wird. Die Plasmide, die für das Klonieren verwendet werden, liegen meist in Hunderten von Kopien pro Zelle vor und können unter gegebenen Bedingungen dazu gebracht werden, sich zu replizieren, bis die Zelle zwei bis dreitausend Kopien enthält (was ungefähr der Hälfte der gesamten DNA der Zelle entspricht). Die Plasmide, die für den Gebrauch im Labor konstruiert wurden, sind relativ klein, replizieren leicht, tragen Gene, welche die Resistenz gegenüber einem oder mehreren Antibiotika vermitteln, und enthalten eine Reihe von Restriktionsschnittstellen, an denen fremde DNA eingefügt werden kann. Plasmidvektoren können zur Klonierung von DNA-Segmenten bis zu einer Länge von ca. 10 kb verwendet werden. Das abgebildete Plasmid pUC18 (pUC steht für plasmid universal cloning) aus E. coli (Abb. 3.24) ist ein typischer Klonierungsvektor. Der Bakteriophage A (Abb. 3.25) ist ein weiterer Klonierungsvektor, der DNAEinfügungen bis zu einer Größe von 20 kb aufnehmen kann. Das mittlere Drittel des 48,5 kb großen Phagengenoms wird für die Infektion nicht benötigt und kann deshalb durch fremde DNA mit ähnlicher Größe ersetzt werden. Die entstehenden Rekombinanten oder Chimären (benannt nach der Bestie aus der griechischen Mythologie, die den Kopf eines Löwen, einen Ziegenkörper und einen Schlangenschwanz besaß) werden in Phagenpartikel gepackt und können dann in die Wirtszelle überführt werden. Ein Vorteil von Phagenvektoren als molekularbiologischen Werkzeugen ist, dass hier die rekombinante DNA in großen Mengen produziert und leicht gereinigt werden kann. Retroviren, die Insek-

Ndel, HgiEll Aatll

Eco0109

Narl | Bgll Mstl Pvul ee pyüll

AetoMinter

pUC18

(2.69 kb) Abb. 3.24 Das Plasmid pUC18. Dieses zirkuläre Plasmid enthält zahlreiche Restriktionsschnittstellen, darunter 13 nur einmal

vorkommende Schnittstellen in der sogenannten Polylinker-Region. Das amp"-Gen verleiht Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin. Die Gene lacZ und lacl codieren das Enzym ß-Galactosidase sowie einen dazugehörigen Transkriptionsfaktor (siehe Abschnitt 28.2A).

HgiEII

Rekombinante DNA-Technologie

69

tenzellen infizieren können, werden auf analoge Weise für das Klonieren in Insektenzellen benutzt. DNA-Fragmente die weit größer sind, bis hin zu einigen Hundert Kilobasenpaaren, können in künstlichen Bakterienchromosomen (engl.: bacterial artificial chromosomes, BACs) oder künstlichen Hefechromosomen (engl.: yeast artificial chromosomes, YACs) kloniert werden. YACs sind lineare DNA-Moleküle, die alle chromosomalen Strukturen besitzen, die für die normale Replikation und Verteilung auf die Tochterzellen während der Teilung von Hefezellen nötig sind. BACs, die in E. coli-Zellen repliziert werden, sind von großen ringförmigen Plasmiden abgeleitet, die normalerweise nur in einer einzigen Kopie in der Zelle vorliegen, ähnlich wie das eigentliche Bakterienchromosom. Ligation Ein DNA-Fragment, das kloniert werden soll, wird häufig durch den Einsatz von

Restriktionsendonucleasen erhalten. Die meisten Restriktionsenzyme schneiden doppelsträngige DNA, so dass „klebrige Enden“ entstehen (Abschnitt 3.4A). Wie Janet Mertz und Ron Davis erstmals 1972 zeigen konnten, ist es somit möglich, dass ein Restriktionsfragment an einer Schnittstelle des Klonierungsvektors eingefügt werden kann, welcher mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde (Abb. 3.26). Die komplementären Enden der beiden DNAs bilden Basenpaare (sie lagern sich zusammen), und das Zuckerphosphat-Rückgrat wird jeweils durch ein Enzym kovalent ligiert (verbunden), das als DNA-Ligase bezeichnet wird (eine von Bakteriophagen produzierte Ligase, die man zur Verbindung von Restriktionsfragmenten mit glatten Enden einsetzt). Ein großer Vorteil des Einsatzes von Restriktionsendonucleasen beim Konstruieren einer Chimäre besteht darin, dass das eingefügte DNA-Fragment mit demselben Restriktionsenzym später wieder aus dem klonierten Vektor präzise herausgeschnitten werden kann. Transformation und Selektion Die Transformation einer bakteriellen Wirtszelle mit einem chimären Plasmid wurde erstmals 1973 von Herbert Boyer und Stanley Cohen gezeigt. Ein Wirtsbakterium kann ein Plasmid aufnehmen, wenn man beide zusammengibt, das Plasmid verbleibt allerdings nur mit einer Wahrscheinlichkeit von etwa 0,1 % dauerhaft in der Wirtszelle (Transformation). Jedoch kann sich eine einzelne transformierte Zelle unendlich vervielfältigen und große Mengen der rekombinanten DNA produzieren. Die Bakterienzellen werden meist auf Agarplatten ausplattiert. Man lässt sie nur bis zu einer solchen Dichte wachsen, dass einzelne Kolonien, die jeweils auf eine einzige Zelle zurückgehen, noch erkennbar sind. Es ist entscheidend, nur die Zellen zu selektieren, die transformiert sind und das richtige Vektorkonstrukt enthalten. Im Falle der Plasmidtransformation kann die Selektion durch den Einsatz von Antibiotika oder chromogenen (färbenden) Substraten erzielt werden. So codiert das im Plasmid pUC18 (Abb. 3.24) enthal-

=

Abb. 3.25

Bakteriophage A.

Während einer Phageninfektion wird die DNA, die im „Phagenkopf“ enthalten ist, in die Bakte-

rienzelle geschleust, wo sie ca. 100-mal repliziert und so verpackt wird, dass neue Phagennachkommen entstehen. [Elektronenmikroskopische Aufnahme mit freundlicher Genehmigung von A. F. Howatson. Aus: Lewin, B., Gene Expression, Band 3,

Abb. 5.23, Wiley (1977).]

Abb. 3.26 Kontruktion eines rekombinanten DNA-Moleküls. Der Klonierungsvektor und die Fremd-DNA, werden mit demselben Restriktionsenzym geschnitten. Die „klebrigen Enden“ des Vektors und der Fremd-DNA-Fragmente lagern sich zusammen und werden kovalent durch eine DNA-Ligase verbunden. Es entsteht eine chimäre DNA,

die einen Teil der fremden DNA als Insert enthält. 2% siehe Animated Figure.

Fremd-DNA

Restriktions-

Klonie-

rungsvektor

klasse

C,

Anlagerung des Fremd-DNA-Fragments an den Klonierungsvektor und Ligation —

chimäre

DNA

70

Nucleotide und Nucleinsäuren

Lage, das farblose tene lacZ-Gen das Enzym ß-Galactosidase. Dieses ist in der ndeln. umzuwa ff Substrat X-gal durch Spaltung in einen blauen Farbsto Cl HOCH3s HO

ne

ommo H

OHzEH H

N H

H

H

OH

5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-gal) (farblos)

H,O

H

B-Galactosidase

OH

ß-D-Galactose

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl (blau)

Sind die E. coli-Zellen mit dem unmodifizierten pUC18 transformiert worden, bilden sie blaue Kolonien. Im Gegensatz dazu bilden Bakterien, in deren Plasmid an der Polylinker-Region eine fremde DNA eingefügt wurde, farblose Kolonien. Durch die DNA-Insertion wird nämlich das lacZ-Gen unterbrochen, und es wird keine aktive ß-Galactosidase gebildet. Bakterien, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, sind ebenfalls farblos, da ihnen die ß-Galactosidase fehlt. Dadurch dass auf dem Plasmid das Ampicillin-Resistenzgen amp" enthalten ist, können diese Zellen durch die Zugabe des Antibiotikums Ampicillin zum Kulturmedium selektiv entfernt werden. Erfolgreich transformierte Bakterienzellen können so dadurch identifiziert werden, dass Sie in einem ampicillinhaltigen Medium farblose Kolonien ausbilden. Gene wie amp" werden auch als Selektionsmarker bezeichnet. Genetisch veränderte Varianten des Bakteriophagen A enthalten Restriktionsschnittstellen, die das entbehrliche mittlere Drittel des Phagengenoms flankieren. Dieser Teil der Sequenz kann durch Fremd-DNA ersetzt werden. Die chimäre DNA wird nur dann in Phagenpartikel verpackt, wenn ihre Länge zwischen 75 % und 105 % des 48,5 kb langen A-Wildtypgenoms liegt (Abb. 3.27). Folglich können sich A-Phagenvektoren, bei denen die Aufnahme von FremdDNA fehlgeschlagen ist, nicht fortpflanzen, weil sie zu kurz sind, um infektiöse Phagenpartikel zu bilden. Die Produktion von infektiösen Phagenpartikeln führt in diesem Fall nicht zu einer Bakterienkolonie, sondern zu einem Plaque, einer Region von Iysierten Bakterienzellen auf einer Kulturplatte, die einen „Rasen“ aus Wirtsbakterien enthält. Die rekombinante und nun stark amplifizierte DNA kann anschließend aus den Phagen in dem Plaque isoliert werden.

B.

Genombibliotheken

Zum Klonieren eines bestimmten DNA-Fragmentes muss dieses zunächst in re-

lativ reiner Form gewonnen werden. Den Umfang dieser Aufgabe kann man ermessen, wenn man bedenkt, dass z.B. ein 1-kb-Fragment menschlicher DNA nur 0,000031 % des menschlichen Genoms repräsentiert, das aus 3,2 Milliarden bp besteht. Natürlich erfordert die Identifizierung eines speziellen DNA-Frag-

Rekombinante DNA-Technologie

71

Nicht benötigt für Lytische Infektion

a Y

Infektiöser A-Phage, der ein Fragment

|

Fremd-DNA enthält

!

!

Schneiden mit Hilfe von Restriktionsenzymen und Trennung der

in vitro Verpackung

’

Fragmente

N

—

+

___—

36 kb

Verbleibende A-DNA enthält Gene, die für die Infektion benötigt werden, aber sie ist zu klein, um verpackt zu werden

De und Ligation

8

| IIRTITZZ

chimäre

DNA

een

»15-kb großes Fragment Fremd-DNA

mentes, dass man Einiges über seine Nucleotidsequenz oder sein Proteinprodukt weiß. In der Praxis ist es meist schwierig, ein bestimmtes Gen eines Organismus zu identifizieren und es dann zu klonieren. Leichter ist es, das gesamte Genom des Organismus als DNA-Fragmente zu klonieren und danach die Klone zu identifizieren, welche Sequenzen enthalten, die von Interesse sind. Shotgun-Klonierung Der Satz aller klonierten Fragmente wird als Genombibliothek bezeichnet. Genombibliotheken werden durch ein Verfahren erstellt, das man ShotgunKlonierung nennt. Die chromosomale DNA des Organismus wird isoliert, zu Fragmenten klonierbarer Größe geschnitten und diese in einen Klonierungsvektor eingefügt. Die DNA wird normalerweise eher durch eine partielle als durch eine erschöpfende Restriktionsspaltung fragmentiert, so dass die Genombipbliothek intakte Vertreter aller Gene des Organismus enthält, einschließlich der Gene, die Restriktionsschnittstellen tragen. DNA kann in Lösung auch durch schnelles Rühren fragmentiert (geschert) werden.

Angesichts der enormen Größe eines Genoms gegenüber der eines Gens gelten für die Methode des Shotgun-Klonierens die Wahrscheinlichkeitsgesetze. Die Zahl der zufällig gebildeten Fragmente, die kloniert werden müssen, um mit hoher Wahrscheinlichkeit zu gewährleisten, dass eine gewünschte Sequenz wenigstens einmal in der Genombibliothek vertreten ist, wird wie folgt berechnet: Die Wahrscheinlichkeit P, dass ein Satz von N Klonen ein Fragment enthält, das einen Anteil f (in bp) des Organismusgenoms ausmacht, ist:

P=1-(1-f)"

(3.1)

Daraus folgt N = log(1 - P)/log(1-f)

(3.2)

Für die Wahrscheinlichkeit P= 0,99 und Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 10 kb ist N= 2116 bezogen auf das 4600 kb große E. coli-Genom und 63.000 bezogen auf das 137.000 kb große Drosophila-Genom. Die Erstellung von Genombibliotheken mithilfe von BACs oder YACs reduziert, wegen der so zugänglichen großen Fragmentlängen, weitgehend den erforderlichen Aufwand, ein gegebenes Gensegment aus einem großen Genom zu erhalten. Nachdem ein BAC- oder YAC-Klon mit der gesuchten DNA identifiziert wurde (siehe unten), kann dessen DNA weiter fragmentiert und noch einmal kloniert werden,

Abb. 3.27 Klonierung mit dem Bakteriophagen A. Die Entfernung eines nicht essentiellen Teiles des Phagengenoms erlaubt das Einsetzen eines Seg-

ments fremder DNA. Die chimäre DNA kann nur dann in ein infektiöses Phagenteilchen eingebaut werden, wenn das DNA-Insert die passende Größe besitzt. 6%, siehe Animated Figure.

72

Nucleotide und Nucleinsäuren

um so schließlich die gesuchte DNA zu isolieren. Diesen Vorgang nennt man Subklonierung. cDNA-Bibliotheken

Eine Alternative zur Genombibliothek ist eine DNA-Bibliothek, welche nur diejenigen Sequenzen enthält, die in einem bestimmten Zelltyp exprimiert werden. Eine solche cDNA-Bibliothek erhält man, indem die gesamten mRNAs der Zelle

isoliert und in DNA umgeschrieben werden. Letzteres geschieht mithilfe des Enzyms reverse Transkriptase, einer speziellen DNA-Polymerase, die DNA nach einer RNA-Vorlage synthetisieren kann (Exkurs 25.2). Die so entstandene komplementäre DNA (cDNA, von engl. complementary DNA) kann wie genomische DNA in Klonierungsvektoren eingebaut werden. Screening

Abb. 3.28 Kolonie-(in situ-)Hybridisierung. Kolonien werden von der Stammplatte durch Replika-Plattierung übertragen. Klone, welche die gewünschte DNA enthalten, werden anhand ihrer Fähigkeit, bestimmte molekulare Sonden zu binden, identifiziert. Hier wird das Bindungsvermögen

Wenn man die erforderliche Zahl an Klonen einmal erhalten hat, muss die Genombibliothek auf die Anwesenheit des gewünschten Gens durchgesehen werden. Das kann durch ein Verfahren geschehen, das Kolonie- oder in situ-Hybridisierung genannt wird (lat.: in situ, am Platz, an Ort und Stelle; Abb. 3.28). Die klonierten Hefe- und Bakterienkolonien oder Phagen-Plaques, die getestet werden sollen, werden durch Replika-Plattierung von der Stammplatte auf einen Nitrocellulosefilter übertragen (Replika-Plattierung wird auch angewandt, um Kolonien auf Platten mit verschiedenen Nährböden zu übertragen). Danach wird das Filterpapier mit NaOH behandelt, wobei Zellen oder Phagen Iysiert werden und die DNA in Einzelstränge getrennt wird, welche bevorzugt an die Nitrocellulose binden. Das Filterpapier wird daraufhin getrocknet, um die DNA am Ort zu fixieren und mit einer markierten molekularen Sonde inkubiert. Die Sonde ist ein kurzes DNA- oder RNA-Segment, dessen Sequenz komplementär zu einer gesuchten DNA ist. Nachdem ungebundene Sondenmoleküle weggewaschen wurden, wird die Anwesenheit der gebundenen Sonde auf der Nitrocellulose mit einem Verfahren nachgewiesen, das sich für die benutzte Markierung eignet (z.B. Bestrahlung eines Röntgenfilmes bei einer radioaktiven Sonde, ein Verfahren, das auch als Autoradiographie bekannt ist, oder die Belichtung mit einer passenden Wellenlänge, bei der Verwendung einer fluoreszenzmarkierten Sonde). Nur solche Kolonien oder Plaques, die das gewünschte Gen enthalten, binden die Sonde und werden nachgewiesen. Die entsprechenden Klone können dann von der Stammplatte entnommen werden. Mit dieser Technik kann eine Bibliothek des menschlichen Genoms von ca. 1 Million Klonen schnell auf die Anwesenheit eines speziellen Gens hin durchsucht werden. Eine Sonde für ein Gen auszuwählen, dessen Sequenz unbekannt ist, erfordert einiges an Kunstfertigkeit. Man kann dazu die mRNA benutzen, falls sie

durch das Auflegen eines Röntgenfilmes auf das getrocknete Filterpapier bestimmt. Da die Kolonien auf der Stammplatte und dem Filter die gleiche örtliche Verteilung haben, lassen sich positive Kolonien leicht wiederfinden.

Stempel

Behandeln mit Lauge und Trocknen

Anlagerung der markierten > Sonde, Waschen und Trocknen

Autoradiographie und Vergleich mit der Stammplatte =

Autoradiographie Film Kolonien, die durch die @ Sonde iden-

tifiziertN

Kolonien, die auf der Stammplatte gewachsen sind

Der Samt wird auf die Stammplatte gepresst und danach auf den

Nitrocellulosefilter übertragen

wurden

Filter-gebundene DNA

Die radioaktive Sonde hybridisiert mit ihrer komplementären DNA

Schwärzung zeigt die Kolonien, welche die gewünschte DNA tra

Rekombinante DNA-Technologie

Genetischer Fingerabdruck Die forensische Untersuchung der DNA macht sich die Variationen oder Polymorphismen der DNA-Sequenz zunutze, die zwischen den einzelnen Personen auftreten. Viele genetische Polymorphismen haben keine Auswirkung auf eine Funktion, weil sie in DNA-Bereichen auftreten, die viele Wiederholungen enthalten, in denen sich aber keine Gene befinden. Wenn sie allerdings in der Nähe eines „Krankheits-Gens“ liegen, können sie dazu verwendet werden, dieses Gen aufzu-

spüren und zu identifizieren. Moderne DNA-FingerprintingMethoden untersuchen diese nicht codierenden repetitiven DNA-Sequenzen

in Proben, die zuvor mithilfe der PCR ver-

vielfältigt wurden. Hintereinander liegende, in einer Orientierung ausgerichtete DNA-Sequenzwiederholungen, so genannte tandem repeats, kommen über das ganze menschliche Genom verteilt vor und umfassen auch die kurzen Sequenzwiederholungen (short tandem repeats, STR); diese enthalten eine unterschiedliche Anzahl sich wiederholender Abschnitte mit zwei bis sieben Basenpaaren. Die für die Forensik relevanten STR-Stellen sind Wiederholungen aus vier Nucleotiden. Die Anzahl der Wiederholungen schwankt zwischen einzelnen

Die amplifizierten Produkte werden mithilfe einer Elektrophorese getrennt und durch eine Fluoreszenz-Markierung (Tag) an ihren Primern nachgewiesen. Die STR-Allele sind kurz (< 500 bp), so dass auch DNA-Fragmente leicht unterschieden werden

können, die sich nur in einer einzigen Wieder-

holung aus vier Basen unterscheiden. Die Allele für jede STR-Stelle werden im Allgemeinen mit der Anzahl der vorhandenen Wiederholungseinheiten bezeichnet. Die für die Forensik verwendeten STR-Stellen weisen in der Regel zwischen 7 und 30 verschiedene Allele auf. In dem hier dargestellten Beispiel zeigt die obere Spur die Fluoreszenz des Elektropherogramms der Referenzstandards (bestehend aus allen Allelen mit einer Länge zwischen 13 und 23 Wiederholungen). Die untere Spur repräsentiert die untersuchte Probe, die zwei Allele enthält, eines mit 16 und

eines mit 13 Sequenzwiederholungen. Mithilfe geeigneter Primer, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, lassen sich sogar mehrere STR-Stellen gleichzeitig analysieren. Wiederholungseinheit

Personen, selbst bei Ange-

hörigen derselben Familie. Jedes solche Segment an einer bestimmten Stelle im Genom bezeichnet man als Allel. Allele können sich hinsichtlich der Zahl ihrer STR-Wiederholungen unterscheiden. Jedes Individuum besitzt zwei Allele, je eines von jedem Elternteil. Da der erste Schritt bei der Fingerprint-Methode eine PCR ist, genügt eine winzige DNA-Menge (ungefähr Ing) als Ausgangsmaterial. Der DNA-Bereich, der die STR enthält, wird bei der PCR vervielfältigt. Die hierbei verwendeten

Primer

sind zu den

Sequenzwiederholungen

sich nicht wiederholenden,

flankierenden

Sequenzen

mentär.

Berka hr 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Fluoreszenz

Größe

die

komple-

Die

Wahrscheinlichkeit,

dass

zwei

Personen

übereinstim-

mende genetische Fingerabdrücke haben, hängt von der Anzahl der untersuchten STR-Stellen sowie von der Anzahl der Allele an jeder Stelle ab. Wenn beispielsweise ein Allelpaar an einer Stelle mit einer Häufigkeit von 10 % (1/10) in der Bevölkerung vorkommt und das andere Allelpaar an einer zweiten Stelle mit einer Häufigkeit von 5 % (1/20), dann ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Fingerprints von zwei Personen an beiden Stellen übereinstimmen, 1 zu 200 (1/10x1/ 20; die Wahrscheinlichkeiten von unabhängigen Ereignissen sind zu multiplizieren). Wenn man viele STR-Stellen untersucht, wird die Wahrscheinlichkeit für eine zufällige Übereinstimmung zweier Fingerprints verschwindend gering.

73

74

Nucleotide und Nucleinsäuren

in solcher Menge produziert wird, dass man sie isolieren kann. Falls die Amino-

säuresequenz des Proteines bekannt ist, das von dem gesuchten Gen kodiert wird, kann die Sonde auch ein Gemisch aus verschiedenen synthetischen Oligonucleotiden sein, die komplementär zu einem Segment der abgeleiteten Gensequenz sind. Mehrere mit Erbkrankheiten assoziierte Gene wurden dadurch gefunden, dass man Sonden für genetische Marker - in der Regel repetitive DNA-

Sequenzen - einsetzte, von denen aus genetischen Studien bekannt war, dass sie

in der Nähe des gesuchten Gens liegen.

C. 6% siehe Guided Eploration 3: PCR and Site-Directed Mutagenesis.

DNA-Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion

Obwohl die Klonierungstechniken für die moderne biochemische Forschung unverzichtbar sind, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), oft eine schnellere und bequemere Methode, um eine spezielle DNA zu amplifizieren. Wie Kary Mullis 1985 gezeigt hat, können damit Segmente bis zu 6 kb amplifiziert werden. Bei der PCR wird eine DNA-Probe in Einzelstränge getrennt und mit DNA-PoIymerase, dNTPs und zwei Oligonucleotid-Primern inkubiert, deren Sequenzen das gewünschte DNA-Segment flankieren. Die Primer steuern die DNA-Polymerase so, dass sie komplementäre Stränge der gewünschten DNA synthetisiert (Abb. 3.29). Die mehrfache Wiederholung dieses Vorganges, bei dem sich jedes Mal die Menge der gewünschten DNA verdoppelt, amplifiziert die Ziel-DNA exponentiell, ausgehend von einer einzigen Genkopie. Bei jedem Cyclus werden die zwei Stränge der doppelsträngigen DNA durch Erhitzen getrennt, danach lagern sich die Primer an ihre komplementären DNA-Segmente an. Die DNA-Polymerase synthetisiert dann die komplementären Stränge. Mit einer hitzestabilen DNA-Polymerase wie der Tag-Polymerase aus Thermus aquaticus, einem Bakterium, das in 75 °C heißen Quellen lebt, benötigt man nicht nach jedem Erhitzen neues Enzym (hohe Temperaturen inaktivieren die meisten Enzyme). In Anwesenheit ausreichender Mengen Primer und dNTPs wird die PCR daher einfach nur durch cyclisches Variieren der Temperatur durchgeführt. Zwanzig Cyclen der PCR vermehren die Menge der gewünschten Sequenz

etwa millionenfach (ca. 2°°) mit großer Spezifität. Tatsächlich kann eine PCR eine gewünschte DNA amplifizieren, die in einer Probe von 10° Zellen nur einmal vorkommt. Diese Methode kann daher ohne vorherige Reinigung der DNA benutzt werden. Die amplifizierte DNA kann danach sequenziert oder kloniert werden. Die Amplifizierung durch PCR wird für zahlreiche Anwendungen eingesetzt. In der Medizin wird diese Methode unter anderem dazu verwendet, Infektionen zu diagnostizieren und Krebs verursachende Mutationen aufzuspüren. In der Rechtsmedizin kann die DNA aus einem einzigen Haar oder einem einzigen Spermium so weit vervielfältigt werden, dass dessen Besitzer ermittelt werden kann (siehe Exkurs 3.2). Für die früher verwendete Blutgruppenanalyse benötigte man noch einen geldstückgroßen Blutfleck. Eine PCR-Analyse kann dagegen bereits mit einer stecknadelkopfgroßen Probe aus Blut oder aus einer anderen Körperflüssigkeit durchgeführt werden. Die Gerichte haben die DNASequenz mittlerweile als eine dem Fingerabdruck gleichwertige Möglichkeit zur Identifzierung von Personen anerkannt. Die Chance, dass zwei Personen zu-

fällig die gleiche DNA-Sequenz besitzen, liegt bei Analyse hinreichend langer Sequenzen bei unter eins zu einer Million. Es sind sogar Fälle dokumentiert, in denen die PCR-Analyse einen Justizirrtum korrigieren und so zur Rehabilitierung von unschuldig Verurteilten beitragen konnte, zum Teil noch viele Jahre nachdem die Spuren am Tatort gesichert worden waren.

Rekombinante DNA-Technologie Bo... Z’...

gr 5

Abb. 3.29 Die Polymerasekettenreaktion (PCR). Bei jedem Cyclus werden die Stränge der DNA-Doppelhelix durch Erhitzen getrennt, daraufhin wird die Reaktionsmischung abgekühlt, um den Primern zu ermöglichen, sich an ihre komplementären

durch

Sequenzen anzulagern. Danach verlängert die DNA-Polymerase die

ursprüngliche doppelsträngige Ziel-DNA

’

Eu

+ BE

rn

en |

;

Primer. Die Zahl der Stränge mit „einheitlicher Länge“ verdoppelt sich nach dem zweiten Cyclus mit jedem weiteren Cyclus. Durch die Wahl spezifischer Primer kann das Gen millionenfach amplifiziert werden.

Anlagstung den'Prifier *

BE 5 +

5

ir

1. Cyclus

eg

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Verlängern mit DNA-Polymerase

2

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N

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BE

+ BEE

.

3

Er >= Stränge mit variabler Länge ang? — — ———

——

— ————

nn : 1

5’

Trennen der Stränge durch

| Erhitzen, Kühlen und

Anlagerung weiterer Primer 5

...

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—

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2. Cyclus

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Verlängern der Primer mit DNA-Polymerase

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Stränge mit einheitlichen Längen .

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—

75

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)

76

Nucleotide und Nucleinsäuren

D.

Anwendungen der rekombinanten DNA-Technologie

Die Fähigkeit, Gene in vitro zu manipulieren, erlaubt es, Gene gezielt zu verändern. Diese können zur biotechnologischen Erzeugung von Proteinen mit verbesserten funktionellen Eigenschaften oder zur Korrektur von genetischen Defekten eingesetzt werden. Proteinproduktion

Die Produktion von großen Mengen seltener oder neuartiger Proteine ist nur für bakterielle Proteine relativ einfach: Ein kloniertes Gen muss in einen Expressionsvektor, ein Plasmid, eingefügt werden, der richtig angeordnete Kontrollsequenzen für die Transkription und die Translation enthält. Der Anteil eines so hergestellten Proteins am Gesamtprotein des Wirtsorganismus kann bis zu 30 % ausmachen. Solche genetisch veränderten Organismen werden als Überproduzenten bezeichnet (engl.: overproducers). Bakterienzellen sondern oft solche in großen Mengen anfallenden, für das Bakterium nutzlosen und möglicherweise toxischen Proteine als unlösliche Einschlüsse (engl.: inclusion bodies) aus. In diesen Fällen müssen zur Gewinnung des gewünschten Proteins kompliziertere Reinigungsmethoden als für lösliche oder sekretierte Proteine eingesetzt werden. Bakterienzellen können eukaryotische Proteine nur dann produzieren, wenn die rekombinante DNA, welche die proteinkodierende Sequenz enthält, auch die Kontrollsequenzen für die bakterielle Transkription und Translation beinhaltet. Bei der Synthese von eukaryotischen Proteinen in Bakterien ergeben sich weitere Probleme. Eukaryotische Gene haben beispielsweise Bereiche von Nucleotiden (Introns), die zwar transkribiert, aber vor der Translation aus der mRNA herausgeschnitten werden (Abschnitt 26.3A). Bakterien fehlt die Maschinerie, um Introns herauszuschneiden. Zusätzlich werden viele eukaryotische Proteine posttranslational durch die Addition von Kohlenhydraten oder durch andere Reaktionen modifiziert. Diese Probleme können überwunden werden, indem man Expressionsvektoren benutzt, die sich in eukaryotischen Wirtszellen fortpflanzen, wie Hefe, kultivierte Insekten- oder andere Tierzellen. In Tabelle 3.4 sind die rekombinanten Proteine aufgelistet, die für den medizinischen oder landwirtschaftlichen Gebrauch produziert wurden. Oftmals kann eine Reinigung dieser Proteine direkt aus den tierischen oder menschlichen Geweben aus ethischen oder praktischen Gründen nicht durchgeführt werden. Expressionssysteme ermöglichen die effiziente Produktion von Proteinen im Großmaßstab und minimieren das Risiko der Kontamination durch Viren oder andere Pathogene aus Gewebeproben. Tab. 3.4

Einige Proteine, die gentechnisch erzeugt werden.

Protein

Verwendungszweck

Humaninsulin

Behandlung von Diabetes

menschliches Wachstumshormon

Behandlung von endokrinen Störungen

Erythropoietin

Stimulation der Produktion von roten Blutkörperchen

kolonienstimulierender Faktor

Produktion und Aktivierung weißer Blutkörperchen

Koagulationsfaktoren IX und X

Behandlung von Blutgerinnungskrankheiten

Gewebeplasminogenaktivator

Lyse von Blutgerinnseln bei Herzinfarkt und Schlaganfall

Rinderwachstumshormon

Steigerung der Milchproduktion bei Kühen

Hepatitis B-Oberflächenantigen

Impfung gegen Hepatitis B

(Hämophilie)

Rekombinante DNA-Technologie

77

Ortsgerichtete Mutagenese

Nachdem man ein Gen isoliert hat, ist es möglich, dessen Nucleotidsequenz und damit auch die Aminosäuresequenz des kodierten Proteines zu verändern. Die ortsgerichtete Mutagenese, eine Technik, die von Michael Smith entwickelt wurde, ahmt den natürlichen Prozess der Evolution nach und erlaubt Vorhersagen über die strukturelle und funktionelle Rolle einzelner Aminosäuren in einem Protein, das im Labor exakt untersucht werden soll. Um Gene spezifisch durch ortsgerichtete Mutagenese zu verändern, werden synthetische Oligonucleotide eingesetzt. Ein Oligonucleotid, dessen Sequenz mit der des betrachteten Gens — außer bei den gewünschten Basenänderungen - identisch ist, wird als Primer für die Replikation mit DNA-Polymerase I eingesetzt. Der Primer hybridisiert mit der entsprechenden Wildtypsequenz (natürlich vorkommende Sequenz) auch dann, wenn einige Basen falsch miteinander paaren. Die Verlängerung des Primers durch DNA-Polymerase I führt zu dem gewünschten veränderten Gen (Abb. 3.30). Das veränderte Gen kann dann in einen geeigneten Vektor eingefügt werden. Primer mit geeigneten Änderungen in der Basensequenz können auch dazu benutzt werden, um mutierte Gene mit Hilfe der PCR herzustellen. Transgene Organismen

Für viele Zwecke ist es besser, gleich einen ganzen Organismus durch genetische Veränderung mafßzuschneidern. Multizelluläre Organismen, die das Gen eines anderen Organismus exprimieren, nennt man transgen, und das transplantierte fremde Gen wird als Transgen bezeichnet. Um zu erreichen, dass eine solche Veränderung dauerhaft bleibt und vererbt wird, muss ein Transgen stabil in die Keimzellen eines Organismus integriert werden. Bei Mäusen erreicht man dies durch Mikroinjektion von klonierter DNA, welche die veränderten Charakteristika enthält, in fertile Eizellen. Anschließend werden diese in den Uterus eines Ammentieres implantiert. Ein 3 TCG

c

GT

VAN

VBER

5

AGCTTCAGAGGTACA

CATGT

AGTC

1. Ein chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das die gewünschten Veränderungen in der Basensequenz enthält,

lagert sich

die DNA an, en das zu ändernde en enthält.

g'

5’

u

an

Gen, das verändert werden soll

fehlgepaarter

e 27

Primer

zen,® C GES

—_ 5’

GT TEENS

>

=H

2. der teilweise fehlgepaarte

dATP + dCTP +

(engl.: mismatched) Primer wird dann durch die DNA-Polymerase verlängert. So entsteht ac das veränderte ZEN

dGTP + dTTP

GT Zn

5’

CATGT

Gen.

Abb. 3.30

5°

3

verändertes Gen

Ortsgerichtete Mutagenese.

Das veränderte Gen kann in einen geeigneten

Klonierungsvektor eingefügt werden. Es kann dann vervielfältigt, exprimiert oder zur Erzeugung von mutierten Organismen verwendet werden. 6% siehe Animated Figure.

78

Nucleotide und Nucleinsäuren

weithin bekanntes Beispiel ist die transgene Maus, deren Genom zusätzliche Kopien des Gens für das Wachstumshormon enthält (Abb. 3.31). Es werden außerdem transgene Nutztiere entwickelt. Idealerweise können die Gene dieser Tiere so zugeschnitten werden, dass die Tiere schneller wachsen

und dabei weniger Nahrung verbrauchen oder gegenüber bestimmten Krankheiten resistent sind. Einige transgene Nutztiere sind so verändert worden, dass sie medizinisch verwendbare Proteine in ihre Milch sekretieren. Der Gewinn solch einer Substanz aus Milch ist im Vergleich zur Produktion dieser Substanz in Bakterienzellen viel kostengünstiger. Einer der weltweit erfolgreichsten transgenen Organismen ist Mais, der genetisch so verändert wurde, dass er ein Protein bildet, das für pflanzenfressende

Abb. 3.31 Transgene Maus. Die große Maus auf der linken Seite entstand aus einer durch Mikroinjektion von DNA befruchteten

Eizelle. Die injizierte DNA enthielt das Gen für das Wachstumshormon der Ratten. Die Maus auf der linken Seite ist fast doppelt so schwer wie ihr normales Geschwister desselben Wurfes rechts. [Mit freundlicher Genehmigung von Ralph L. Brinster, School of Veterinary Medicine,

University of Pennsylvania.]

Insekten giftig ist, für Wirbeltiere jedoch harmlos. Das Gift wird vom Bodenbakterium Bacillus thuringensis gebildet. Man hat das Toxin-Gen in das Mais-Genom inseriert, um der Pflanze Schutz gegenüber dem Maiszünsler zu verleihen, einem wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenschädling, der einen Großteil seines Lebenscyclus innerhalb des Maispflanze verbringt, wo er für chemische Insektizide weitgehend unerreichbar ist. Der Anbau von sogenanntem Bt-Mais, der besonders in den USA großflächig angepflanzt wird, hat den Einsatz dieser giftigen Insektizide enorm verringert. Auch zur Verbesserung der Ernährung hat man transgene Pflanzen geschaffen. So entwickelten beispielsweise Forscher einen Reis mit fremden Genen, die Enzyme codieren, die für die ß-Carotin-Synthese (ein orangefarbenes Pigment, das die Vorstufe von Vitamin A ist) verantwortlich sind; oder mit einem Gen für das Eisen-Speicherprotein Ferritin. Der genetisch veränderte Reis, der auch „goldener Reis“ heißt (Abb. 3.32), soll helfen, Vitamin-A-Mangel (von dem weltweit 400 Millionen Menschen betroffen sind) sowie Eisenmangel (an dem schätzungsweise 30 % der Weltbevölkerung leiden) zu lindern. Andere transgene Pflanzen sind frosttolerante Erdbeeren und langsam reifende Tomaten.

‘

Gegenwärtig herrscht, insbesondere in Europa, in weiten Kreisen der Bevölkerung die Meinung vor, dass die unkontrollierte Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen (GVOs) sowie daraus hergestellte Lebensmittel (GVOLebensmittel) gefährlich sein könnten. So ist z.B. in mehreren europäischen Ländern, darunter Deutschland, der freie Anbau von Bt-Mais verboten. Umfangreiche wissenschaftliche Studien sowie die mittlerweile beträchtliche Erfahrung

Abb. 3.32 Goldener Reis. Links ist der Wildtyp-Reis zu sehen. Die Reiskörner rechts wurden gentechnisch so verändert, dass sie dreimal soviel Eisen speichern und außerdem ß-Carotin bilden können, wodurch sie gelb erscheinen (mit freundlicher Genehmigung von Ingo Potrykus).

Zusammenfassung

mit dem Konsum von GVO-Lebensmitteln in Nordamerika haben jedoch keinerlei schädliche Auswirkungen erkennen lassen. Transgene Organismen haben unser Verständnis von der Genexpression stark erweitert. Tiere, die mit einem defekten Gen „konstruiert“ wurden, oder denen ein komplettes Gen fehlt (man spricht dann von einem sogenannten GenKnockout), dienen als experimentelle Modelle für menschliche Krankheiten. Gentherapie

Unter Gentherapie versteht man den Transfer von neuem genetischen Material in Zellen, um einen therapeutischen Effekt zu erreichen. Obwohl die potentiellen Vorteile dieser bis heute rudimentär entwickelten Technologie enorm sind, müssen dazu zahlreiche Hindernisse überwunden werden. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass die für die Genübertragung eingesetzten Vektoren, RNA-haltige Retroviren, eine manchmal tödlich verlaufende Immunantwort in den Patienten hervorrufen können. Die bis dato einzige erfolgreiche Gentherapie am Menschen wird an Kindern durchgeführt, die unter dem SCID-Syndrom (engl.: severe combined immunodeficiency disease) leiden. Diese Kinder müssen normalerweise ein Leben lang in einer sterilen Umgebung leben, um der Gefahr möglicherweise tödlich verlaufender Infektionen vorzubeugen. In der Variante X1 wird SCID durch einen Gendefekt beim Cytokinrezeptor yc hervorgerufen, ohne den das Immunsystem nicht funktionieren kann. Ein Teil des Knochenmarks der SCID-X1Patienten, welches die Stammzellen der weißen Blutkörperchen enthält, wird entnommen und nach Inkubation mit einem Vektor, der das Gen für einen funktionalen Cytokinrezeptor yc trägt, wieder implantiert. Die nun vorhandenen transgenen Knochenmarkszellen ermöglichen eine normale Funktion des Immunsystems. Da sich der virale Vektor ungerichtet in das Genom einbaut, besteht jedoch die Gefahr, dass abhängig von der Position des TIransgens im Genom die Expression anderer Gene verändert wird. Dies kann ein Auslöser für eine Krebserkrankung sein. Es sind mindestens zwei Fälle beschrieben, in denen die Gentherapie bei SCID-X1-Patienten zu Leukämie, einer Krebserkrankung der weißen Blutzellen, geführt hat.

Zusammenfassung 1. Nucleotide bestehen aus einer Purin- oder Pyrimidinbase, die an eine Ribose gebunden ist. Die Ribose trägt mindestens eine Phosphatgruppe. RNA ist aus Ribonucleotiden aufgebaut, DNA aus Desoxyribonucleotiden (die eine 2’-Desoxyribose enthalten). 2. In der DNA bilden zwei antiparallele Ketten aus Nucleotiden, die durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind, eine Doppelhelix. Dabei paaren Basen aus gegenüberliegenden Strängen wie folgt: A mit Tund G mit C. > Einzelsträngige Nucleinsäuren können Haarnadelstrukturen ausbilden. 4. DNA trägt die genetische Information in ihrer Nucleotidsequenz. Wenn die DNA repliziert wird, dient jeder Strang als Vorlage für die Synthese eines komplementären Stranges. 5. Nach dem zentralen Dogma der Molekularbiologie wird der DNA-Strang eines Gens in mRNA transkribiert. Die RNA wird dann translatiert; dabei entsteht ein Protein, durch die schrittweise Addition von Aminosäuren

die an tRNA-Moleküle gebunden sind, welche mit der mRNA am Ribosom Basenpaare ausbilden. 6. Restriktionsendonucleasen, die bestimmte Sequenzen auf der DNA erkennen, werden dazu eingesetzt, DNA-Moleküle spezifisch zu spalten. 7. Die Gelelektrophorese wird angewendet, um DNA-Fragmente zu trennen und um deren Größe zu bestimmen.

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 Ir Welche Funktion haben der

Vektor und die DNA-Ligase beim Klonieren von DNA? Erklären Sie, auf welche Weise man Zellen selektiert, die rekombinante DNA enthalten. Was ist eine DNA-Bibliothek? Wie kann man sie benutzen, um ein bestimmtes Gen zu finden? Beschreiben Sie den Ablauf bei

der Amplifizierung eines DNAAbschnitts mithilfe der PCR.

Wie kann man durch ortsgerichtete Mutagenese ein Bakterium dazu bringen, ein verändertes Protein zu produzieren? Was ist Gentherapie, und wie unterscheidet sie sich von der

Erzeugung eines transgenen Organismus?

79

80

Nucleotide und Nucleinsäuren

8. Bei der DNA-Sequenzierung mit der Kettenabbruchmethode wird die Nucleotidsequenz einer DNA durch enzymatische Synthese der komplementären Polynucleotide bestimmt, die mit einem Didesoxyanalogon eines der vier Nucleotide aufhören. Die entstandenen Polynucleotidfragmente werden durch Elektrophorese getrennt, um die Originalsequenz zu rekonstruieren.

9. Mutationen und andere Veränderungen der DNA bilden die Basis für die Evolution der Organismen. 10. Beim Klonieren wird ein Fragment fremder DNA in einen Vektor eingefügt, um es in einer Wirtszelle zu amplifizieren. Transformierte Zellen können durch selektierbare Marker identifiziert werden. 11. Genombibliotheken beinhalten die gesamte DNA eines Organismus. Klone, die bestimmte DNA-Fragmente beherbergen, werden in ScreeningProzessen identifiziert.

12. Mit der Polymerasekettenreaktion können ausgewählte DNA-Sequenzen vervielfältigt werden. 13. Rekombinante DNA-Methoden werden zur Produktion von Wildtyp- oder selektiv mutierten Proteinen in Zellen oder ganzen Organismen eingesetzt.

Wichtige Begriffe Nucleinsäure Nucleotid Nucleosid

mRNA

Ligation

rRNA tRNA

RNA DNA

Ribosom Genomik

Polynucleotid Phosphodiesterbindung Nucleotidrest 5’-Ende 3’-Ende

Transkriptomik

selektierbarer Marker Plaque Genombibliothek Shotgun-Klonierung reverse Iranskriptase

Monomer Dimer Trimer Tetramer

Oligomer Chargaff-Regeln Tautomer

Proteomik Genexpression Bakteriophage Modifikationsmethyltransferase Endonuclease Restriktionsendonuclease Exonuclease Palindrom

klebrige Enden glatte Enden Gelelektrophorese

Doppelhelix antiparallel große Furche kleine Furche komplementäre Basenpaarung

Kettenabbruchmethode Primer dNTP ddNTP

Genom

alternatives Spleißen

Chromosom diploid haploid

Punktmutation Rekombination Traiısposition

ORF

bp

Phänotyp

kb Haarnadelstruktur

rekombinante DNA Klonieren Klon Vektor Plasmid BACs, künstliche Bakterienchromosomen YACs, künstliche Hefechromosomen

Gen

Transformation Replikation Transkription Translation zentrales Dogma der Molekularbiologie Anlagern

cDNA Screening

Kolonie-(in situ-) Hybridisierung Replika-Plattierung Autoradiographie BER Polymorphismus genetischer Fingerabdruck STR

Allel Expressionsvektor

Überproduzent Intron

ortsgerichtete Mutagenese Wildtyp transgener Organismus Iransgen Gen-Knockout Gentherapie

Aufgaben

81

Aufgaben a

1. Kinasen sind Enzyme, die Phosphorylgruppen eines Nucleosidtriphosphates übertragen. Welche der folgenden Reaktionen sind kinasekatalysierte Reaktionen? (a) ATP + GDP — ADP + GTP (b) ATP + GMP — AMP + GTP (c) ADP + CMP — AMP + CDP (d) AMP + ATP— 2 ADP

Ein diploider Organismus, bestehend aus einem haploiden, 45.000 kb großen Genom, enthält zu 21 % G-Reste. Berechnen Sie die Anzahl der A-, C-, G- und T-Reste in der DNA jeder Zelle in diesem Organismus. Ein DNA-Segment aus 20 Basenpaaren enthält 7 Guaninreste. Wie viele Adeninreste und wie viele Uracilreste enthält es? Zeichnen Sie die tautomeren Formen von (a) Adenin und (b) Cytosin. Das Adeninderivat Hypoxanthin kann sowohl mit Cytosin als auch mit Adenin eine Basenpaarung eingehen. Zeichnen die die Strukturen dieser Basenpaare. [6) u

es ” H

Hypoxanthin

Erklären Sie, warum die Trennung der DNA-Stränge durch pH-Werte > 11 erleichtert wird.

. Wie viele verschiedene Aminosäuren könnten theoretisch durch Nucleinsäuren kodiert werden, die vier verschiedene Nucleotide enthalten, falls (a) jedes Nucleotid eine Aminosäure kodieren würde, (b) aufeinander folgende Sequenzen von zwei Nucleotiden eine Aminosäure kodieren würden, (c) aufeinander folgende Sequenzen von drei Nucleotiden eine Aminosäure kodieren würden, (d) aufeinander folgende Sequenzen von vier Nucleotiden eine Aminosäure kodieren würden? . Die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Taql ist TICGA. Welche Produkte entstehen bei der Reaktion von Tagl mit der gezeigten DNA-Sequenz? 5’-ACGTCGAATC-3' 3’-TGCAGCTTAG-5’

Identifizieren Sie, unter Berücksichtigung der Daten aus Tabelle 3.2, die Restriktionsenzyme, die (a) glatte Enden erzeugen, (b) identische Sequenzen erkennen und schneiden (sog. Isoschizomere), (c) identische klebrige Enden produzieren.

10. Beschreiben Sie das Ergebnis der Sequenzierung mittels der Kettenabbruchmethode, (a) falls zu wenige ddNTPs zugegen sind, (b) falls zu viele ddNTPs zugefügt wurden, (c) falls zu wenige Primer vorliegen, (d) falls zu viele Primer vorliegen. M: Berechnen Sie die Anzahl der Klone, die benötigt werden, um ein bestimmtes 5 kb großes Fragment von C. elegans mit der Wahrscheinlichkeit von 0,99 zu erhalten (Tab. 3.3). 122 Beschreiben Sie wie man rekombinante Klone selektiert, wenn die Fremd-DNA in die Polylinker-Region von pUC18 eingefügt und dann in E. coli eingeschleust wurde. 13. Beschreiben Sie das mögliche Ergebnis einer PCR, bei der (a) einer der Primer versehentlich weggelassen wurde, (b) einer der Primer an mehreren Stellen komplementär zu der Ausgangs-DNA ist, (c) ein Einzelstrangbruch in der zu vervielfältigenden DNA-Sequenz vorhanden ist, die nur als eine Kopie im Ansatz vorliegt, (d) ein Doppelstrangbruch in der zu vervielfältigenden DNA-Sequenz vorhanden ist, die nur als eine Kopie im Ansatz vorliegt. 14. Notieren Sie die Sequenz der zwei Primer aus je

12 Nucleotiden, die man benutzen könnte, um das folgende DNA-Segment mittels der PCR zu vervielfältigen. ATAGGCATAGGCCCATATGGCATAAGGCTTTATAA TATGCGATAGGCGCTGGTCAG

15. (a) Wieso ist die genomische DNA-Bibliothek eines Organismus größer als seine cDNA-Bibliothek? (b) Warum unterscheiden sich die cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben desselben Organismus? 16. Ein Blutfleck vom Tatort eines Verbrechens, sowie Blutproben von vier Verdächtigen wurden mittels PCR analysiert. Dabei wurden fluoreszierende Primer für die STRLoci D3S1358, vWA und FGA verwendet. Die erhaltenen Electrophoretrogramme sind unten gezeigt. Die unter jedem Peak angezeigten Nummern geben das Allel (oben) und die Höhe des Peaks in relativen Einheiten (unten) an. (a) Warum erscheint an manchen Loci nur ein einziges Allel, obwohl jeweils zwei Kopien, und damit zwei Allele, für jedes Gen vorhanden sind? (b) Von welchem der Verdächtigem stammt vermutlich der Blutfleck am Tatort? (c) Hätte man den Verdächtigen auch durch die Analyse eines einzigen Locus herausfinden können? (d) Was lässt sich über die Menge an DNA in der Probe 1 im Vergleich zur Probe 4 aussagen?

82

Nucleotide und Nucleinsäuren und Krane, D.E., [Aus Thompson, W.C., Ford, S., Doom, T., Raymer, M., 0381358

vwA

nt Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of acompete (2003).] 16-25 27, n Champio The defensive review,

Blutfleck

Probe 1

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Probe 2

Probe 3

Probe 4

Bioinformatics Exercises 1. Finding Databases. Locate databases for genome sequences and explore the meaning of terms related to them. 2. The Institute for Genomic Research. Explore a prokaryotic genome and find listings for eukaryotic genomes. 3. Analyzing a DNA sequence. Given a DNA sequence, identify its open reading frame and translate it into a protein sequence.

4. Sequence Homology. Perform a BLAST search for homologs of a protein sequence. 5. Plasmids and Cloning. Predict the sizes of the fragments produced by the action of various restriction enzymes on plasmids.

Literatur Struktur und Funktion von Nucleinsäuren Bloomfield, V. A., Crothers, D. M. und Tinoco, I., Jr., Nucleic Acids.

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Thieffry, D., Forty years under the central dogma, Trends Biochem. Sci. 23, 312-316 (1998). [Ein Abriss von Ursprung, Verbreitung und Kritik an der Vorstellung, dass Nucleinsäuren Träger der genetischen Information sind.] Watson, J. D., und Crick, F. H. C., Molecular structure of nucleic acids,

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Neben den bekannten Geschmacksempfindungen süß, sauer, salzig und bitter gibt es noch die Geschmacksempfindung Umami (abgeleitet vom japanischen Begriff für herzhaft). Diese wird durch Mononatriumglutamat hervorgerufen, eine Aminosäure, die oft als Geschmacks-

verstärker verwendet wird. [© Jackson Vereen/Foodpix/Picture Arts Co.]

Aminosäuren Als Wissenschaftler am Anfang des 19. Jahrhunderts ihre Aufmerksamkeit der Ernährung zuwandten, entdeckten sie schnell, dass stickstoffhaltige Naturprodukte für das Überleben von Tieren essentiell waren. Für diese Stoffklasse prägte der holländische Chemiker G.]J. Mulder 1839 den Begriff Protein (griech.: proteios, grundlegend). Obwohl die ersten Aminosäuren bereits 1830 isoliert wurden, hatten die physiologischen Chemiker jener Zeit noch nicht erkannt, dass Proteine aus noch kleineren Komponenten - den Aminosäuren aufgebaut sind. So wurde zunächst für viele Jahre angenommen, dass bestimmte Substanzen aus Pflanzen - einschließlich der Proteine - als Ganzes in tierische Gewebe eingebaut werden. Dieses Missverständnis konnte erst beseitigt werden, als der Verdauungsprozess verstanden wurde. Nachdem klar war, dass mit der Nahrung aufgenommene Proteine in kleinere, aminosäurehaltige Verbindungen abgebaut werden, widmeten die Wissenschaftler ihre Aufmerksamkeit dem Nährwert dieser Verbindungen (Exkurs 4.1). Ernährungsstudien mit Tieren zeigten, dass die Aminosäurezusammensetzung eines Proteins dessen Nährwert ausmacht. Bestimmten Getreideproteinen fehlt z.B. die Aminosäure Lysin. Tiere, denen nur dieses Futter und damit kein Lysin zugeführt wurde, wiesen Defizite im Wachstum auf. Als schließlich im Jahre 1925 die Strukturen aller 20 Standard-Aminosäuren aufgeklärt waren, war inzwischen die relative Bedeutung der verschiedenen Aminosäuren in den Proteinen für die Ernährung eingehend dokumentiert. Die heutige Aminosäure- und Proteinforschung hat jenen grundlegenden Experimenten aus dem 19. Jahrhundert viel zu verdanken. Wir wissen heute, warum stickstoffhaltige Aminosäuren essentiell für das Leben sind und dass sie die Bausteine der Proteine sind. Die zentrale Rolle der Aminosäuren in der Biochemie ist vielleicht nicht allzu überraschend: Von mehreren Aminosäuren wird angenommen, dass sie zu den organischen Verbindungen gehörten, die bereits früh in der Erdgeschichte entstanden sind (Abschnitt 1.1A). Aminosäuren als ursprüngliche, allgegenwärtige und vielseitig verwendbare Moleküle wurden von der Evolution für zahlreiche Zwecke in lebenden Systemen verwen-

det. Wir beginnen dieses Kapitel mit der Betrachtung der Strukturen, der chemischen Eigenschaften und der Stereochemie von Standard-Aminosäuren und enden mit einer kurzen Übersicht über Strukturen und Funktionen einiger verwandter Verbindungen.

1

_Aminosäurestrukturen

Die Untersuchung einer großen Zahl von Proteinen aus einer Vielfalt von Organismen hat gezeigt, dass alle Proteine aus 20 “Standard“-Aminosäuren aufgebaut sind. Nicht jedes Protein enthält alle Aminosäuren, aber die Mehrzahl der Proteine enthält die meisten, wenn nicht sogar alle der 20 proteinogenen Aminosäuren.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH

Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

Aminosäuren

«e Aminosäurestrukturen o Stereochemie « Aminosäurederivate

86

Aminosäuren

Exkurs 4.1

Berühmte Biochemiker

William C. Rose und die Entdeckung von Threonin

William C. Rose (1887-1985)

Die Aminosäuren zu ermitteln, aus denen Proteine aufgebaut sind, war eine wissenschaftliche Herausforderung, die sich

bei Untersuchungen zur Tierernährung ergab. Zu Beginn des zwanzigsten Jahrhunderts erkannten physiologische Chemiker (den Begriff Biochemiker kannte man damals noch nicht), dass nicht alle Nahrungsmittel eine ausreichende Ernährung boten. Ratten beispielsweise, denen man als einzige Stickstoffquelle das Maisprotein Zein verfütterte, wuchsen nicht, solange man nicht auch Tryptophan und Lysin ihrer Nahrung zusetzte. In dieser Zeit stammten die Kenntnisse über den Stoffwechsel hauptsächlich aus Studien, in denen die Abhängigkeit zwischen der Aufnahme bestimmter Substanzen mit der Nahrung und den Ausscheidungsprodukten im Urin der Versuchstiere bzw. der menschlichen Probanden untersucht wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche standen im Einklang mit der Vorstellung, dass Verbindungen in begrenztem Umfang in andere Verbindungen überführt werden

können,

aber offensichtlich

waren

die Nährstoffe

nicht vollständig gegeneinander austauschbar. An der Universität von Illinois führte William C. Rose Ernährungsstudien durch, mit denen er die Stoffwechselbeziehungen von stickstoffhaltigen Verbindungen entschlüsseln wollte. Unter anderem konnten seine Untersuchungen zum Zusammenhang von Wachstum und Ernährung bei Ratten zeigen, dass Purine und Pyrimidine von Aminosäuren abgeleitet sind, aber dass andererseits diese Verbindungen die Aminosäuren in der Nahrung nicht ersetzen können. Um die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die Ernährung zu untersuchen, hydrolysierte Rose Proteine zunächst bis zu den einzelnen Aminosäuren und entfernte danach selektiv bestimmte Aminosäuren. In einem seiner ersten Experimente entfernte er Arginin und Histidin aus dem HydroIysat des Milchproteins Casein. Fütterte man Ratten mit dieser Zubereitung, so verloren sie solange an Gewicht, bis die Aminosäure Histidin wieder der Nahrung zugesetzt wurde. Die Zugabe von Arginin hingegen konnte den Mangel nicht wieder

ausgleichen. Diese Ergebnisse spornten Rose dazu an, die Bedeutung aller Aminosäuren zu untersuchen. Mit seinen Experimenten konnte er zeigen, dass Cystein, Histidin und Tryptophan nicht durch andere Aminosäuren ersetzt werden können. Anstelle von Zubereitungen auf der Grundlage hydrolysierter Proteine verwendete Rose schließlich Mischungen aus einzeln gereinigten Aminosäuren. Dreizehn der 19 damals bekannten Aminosäuren konnte man reinigen, die anderen sechs synthetisieren. Verfütterte man aber Ratten die 19 Aminosäuren als einzige Nahrungsstickstoffquelle, so verloren sie dennoch an Gewicht. Eine mögliche Erklärung dafür war, dass das Mischungsverhältnis der Aminosäuren nicht optimal war. Dennoch folgerte Rose, dass es eine weitere, noch unbekannte essenzielle Aminosäure geben musste, die in natürlich

vorkommenden Proteinen sowie in deren Hydrolysaten enthalten war, jedoch in seiner Aminosäurenmischung fehlte. Nach mehrjährigen Anstrengungen konnte Rose die fehlende Aminosäure reinigen und identifizieren. In einer 1935 veröffentlichten Arbeit zeigte er, dass der Zusatz dieser Aminosäure zu den anderen 19 das Wachstum der Ratten ermöglichte. Damit war die zwanzigste und letzte Aminosäure, das Threonin, entdeckt worden. Weitere Experimente, die sich über die nächsten 20 Jahre erstreckten, zeigten,-dass zehn der 20 in Proteinen vorkomm-

enden Aminosäuren notwendig,

für die Ernährung der Ratten lebens-

also essenziell,

sind. Entfernt man

eine dieser

Aminosäuren, so verursacht dies Wachstumsstörungen und schließlich den Tod der Versuchstiere. Die anderen zehn Aminosäuren

betrachtete

man

als „entbehrlich“,

da Tiere

sie in ausreichenden Mengen selbst synthetisieren können. Rose ermittelte in der Folge die für den Menschen essenziellen Aminosäuren, dabei dienten ihm seine Studenten als Probanden.

Nachdem

man wusste, welche Aminosäuren

für die menschliche Ernährung erforderlich sind - und in welchen Mengen - war es nun möglich, den Nährwert der verschiedenen Arten von Nahrungsproteinen zu beurteilen. Nicht zuletzt trugen Roses Befunde zur Entwicklung optimaler Rezepturen für eine intravenöse Ernährung bei.

McCoy, R.H., Meyer, C.E., Rose, W.C., Feeding experiments with mixtures

of highly purified amino acids. VIII. Isolation and identification of anew essential amino acid,J. Biol. Chem. 112, 283-302 (1935). [Diese Arbeit ist frei zugänglich unter http://www.jbc.org.]

Alle Standard-Aminosäuren gehören zur Gruppe der a-Aminosäuren. Sie besitzen eine primäre Aminogruppe (-NH,) und eine Carboxylgruppe (-COOH) als Substituenten am gleichen Kohlenstoffatom (dem «-Kohlenstoff: Abb. 4.1). Die einzige Ausnahme bildet die Aminosäure Prolin. Obwohl Prolin anstelle einer primären eine sekundäre Aminogruppe (-NH-) enthält, wird auch diese Aminosäure zu den a-Aminosäuren gezählt. Die 20 Standard-Aminosäuren unterscheiden sich in der Struktur ihrer Seitenketten (R-Gruppen).

Aminosäurestrukturen

In Tabelle 4.1 sind die Namen und die kompletten chemischen Strukturen der 20 Standard-Aminosäuren aufgeführt.

A.

R H;N Se COOH H

Allgemeine Eigenschaften

Die Amino- und Carboxylgruppen von Aminosäuren ionisieren sehr leicht. Die PK-Werte der a-Carboxylgruppen (in Tab. 4.1 als pK, wiedergegeben) liegen in einem engen Bereich um 2,2, während die pK-Werte der a-Aminogruppen (PR) alle nahe bei 9,4 liegen. Bei einem physiologischen pH-Wert (ca. 7,4) liegen die Aminogruppen protoniert und die Carboxylgruppen in Form ihrer konjugierten Base (als Carboxylat) vor (Abb. 4.2). Eine Aminosäure hat demnach sowohl Säure- als auch als Baseeigenschaften. In Tabelle 4.1 sind außerdem die pKWerte der Seitenketten aufgeführt, die ionisierbare Gruppen enthalten (pK}). Moleküle wie Aminosäuren, die geladene Gruppen mit entgegengesetzter Polarität aufweisen, werden als Zwitterionen oder dipolare Ionen bezeichnet. Der zwitterionische Charakter der a-Aminosäuren wurde durch verschiedene Methoden, wie spektroskopische Messungen und Röntgenkristallstrukturanalysen, nachgewiesen. Aminosäuren sind wie andere ionische Verbindungen in polaren Lösungsmitteln besser löslich als in unpolaren. Wie wir noch sehen werden, beeinflussen die ionischen Eigenschaften der Seitenketten die physikalischen und chemischen Eigenschaften der freien Aminosäuren und der Aminosäuren in

87

Abb. 4.1 Allgemeine Struktur einer «-Aminosäure. Anhand der R-Gruppen werden die 20 StandardAminosäuren unterschieden.

R +

H,N—C— C00H Abb. 4.2 Eine zwitterionische Aminosäure. Bei einem physiologischen pH-Wert ist die Aminogruppe protoniert und die Carboxylgruppe deprotoniert.

Proteinen.

B.

Peptidbindungen

Aminosäuren können polymerisieren und dabei Ketten bilden. Dieser Prozess kann als Kondensationsreaktion (Elimination eines Wassermoleküles) betrachtet werden, wie in Abbildung 4.3 gezeigt ist. Die entstandene CO-NH-Verknüpfung ist eine Amidbindung und wird als Peptidbindung bezeichnet. Polymere, zusammengesetzt aus zwei, drei, einigen (3-10) oder vielen Aminosäuren, werden entsprechend als Di-, Tri-, Oligo- und Polypeptide bezeichnet. Vereinfacht werden diese Verbindungen oft auch nur „Peptide“ genannt. Nachdem die einzelnen Aminosäuren (die monomeren Einheiten) in ein Peptid eingebaut wurden, werden sie als Aminosäurereste bezeichnet. Polypeptide sind lineare Polymere, d.h. jeder Aminosäurerest ist an zwei Peptidbindungen beteiligt. Dabei sind die Aminosäuren in einer „Kopf-Schwanz-Anordnung“ miteinander verbunden und bilden keine verzweigten Ketten. Die Reste an den beiden Enden eines Peptides sind jeweils nur an einer Peptidbindung beteiligt. Der Rest mit der freien Aminogruppe (per Definition der am weitesten links befindliche Aminosäurerest, wie in Abb. 4.3 gezeigt) wird als Aminoterminus oder N-Terminus bezeichnet. Der Rest mit der freien Carboxylgruppe (ganz rechts stehend) wird Carboxyterminus oder C-Terminus genannt. Proteine sind Moleküle, die aus einer oder mehreren Polypeptidketten bestehen. Wie wir in den folgenden Kapiteln noch sehen werden, bewirken Variationen in der Länge und der Aminosäuresequenz von Polypeptiden die außergewöhnliche

Vielfalt von Form und biologischer Funktion der Proteine.

C.

Einteilung und Charakteristika

Der Einteilung der 20 Standard-Aminosäuren nach der Polarität ihrer Seitenketten hat sich als die nützlichste Form erwiesen. Diesem allgemeinen Einteilungsschema folgend gibt es drei Haupttypen von Aminosäuren: (1) solche mit unpolaren Seitenketten, (2) solche mit ungeladenen aber polaren und (3) solche mit geladenen polaren Seitenketten.

Rı

es

EN

(6)

7

H

Rs

(6)

er

ar

ee

HOMaOT

m

Eur

H>0

RO |

EisN

Ra

09

I

Menge CZ OzN —0ZE

H

Dr

H

Abb. 4.3 Kondensationsreaktion von zwei Aminosäuren.

Unter Eliminierung eines Wassermoleküles entsteht aus zwei Aminosäuren ein Dipeptid. Die so entstandene Peptidbindung ist rot dargestellt. Der Aminosäurerest mit der freien Aminogruppe wird als N-Terminus und der Rest mit einer freien Carboxylgruppe als C-Terminus eines Peptides bezeichnet.

88

Aminosäuren

Tab. 4.1

Strukturformeln und Abkürzungen der „Standard“-Aminosäuren, ihre durchschnittliche Häufigkeit in Proteinen

und die pK-Werte ihrer ionisierbaren Gruppen. Name, Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Code

Durchschnittliche Häufigkeit in Proteinen (%)°

-pk, pKı 0-NH3 1 0-COOH“

57,0

MR

2,35

9,78

all

7,8

2,35

9,87

99,1

6,6

229

9,74

122

9,1

2,33

9,74

113,2

5,3

2,32

9,76

1,

2

213

9,28

97,1’

5,2

1,95

10,64

147,2

349

2,20

9,31

Masse des Restes (DM?

Strukturformel?

Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten Glycin

COOT

Gly

"

|

NH Alanin

COOH

Ala

|

NHZ Valin

COOz

Val

A

V

Hz

| @zCH x

Leucin

COOT

Leu

1

CH;

£

CS

|

£

H—&

Isoleucin

lb

SE

COOZZECER

Ile

*

| NHZ Methionin

005

Met M

H

| a

u

NHZ

Brom Pro D

% H, coo % ach, j

NcH H,

Phenylalanin Phe

«O0 |

i

|

NHzZ TIryptophan

Trp

coo”

|

;

186,2

1,4

2,46

|

9,41

en) PKR Seitenkette” Aak

Aminosäurestrukturen Tab. 4.1

89

Fortsetzung

Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten

=

“org

S

87,1

6,8

2,19

9,21

101,1

5,9

2,09

9,10

114,1

4,3

2,14

8,72

128,1

4,3

2

9,13

163,2

3:2

2,20

9,21

103,1

1,9

1,92

10,70

128,2

5,9

2,16

9,06

10,54 (e-NH})

156,2

5,1

1,82

8,99

12,48 (Guanidino-)

137,1

2,3

1,80

9,33

6,04 (Imidazol-)

all

558

199

9,90

3,90 (B-COOH)

H=C—-CH,—-OBR

Nur;

Threonin

OO

Thr

|

T

H6T—

CC»

Kar Asparagin’

ie

ka

COOE

an

©

H= = CH er NHF

Glutamin?

NH,

cOO-

ni

oO

H= eh GR a, 2 NHFZ

Tyrosin

NH,

003

=

Fi .-O)-

10,46 (Phenol-)

OH

-

Cystein

CHIRTE

=

8,37 (Sulfhydryl-)

ut, Si

Aminosäuren mit geladenen polaren Seitenketten

E00,

Lysin Lys

NHFZ Arginin Ar R ü

NH,

cOoO” | Er er

le

N

NHF Histidin? His

=

Asparaginsäure” Asp

/

NH3 CO07 |

+, NH?

H-C— 4] | NH3

OST |

H—-C-CH-C

NH+

N H

(6) Va

DZ

90 Tab. 4.1

Aminosäuren Fortsetzung

LT Strukturformel®?

Name,

Drei-Buchstaben- und

e®0z |

Glutaminsäure® Glu

mit C-Atomen

(6) a

|

in grüner, O-Atomen

a-NH

Seitenkette

2,10°

9,47

4,07 (y-COOH)

129,1

6,3

© Berechnet auf Grundlage einer Datenbank bestehend aus 300.688 Aminosäureresten nicht verwandter Proteine, zusammengestellt von Doolittle, R. F. in Fasman, G. D. (Hrsg.), Predictions of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press (1989). d Daten von Dawson, R. M. C., Elliott, D. C., Elliott. W. H., und Jones,

K. M., Data for Biochemical Research (3. Aufl.), S. 1-31, Oxford Science Publications (1986). ° Der Drei- bzw. Ein-Buchstaben-Code für Asparagin oder Asparaginsäure ist Asx bzw. B; für Glutamin oder Glutaminsäure wird Glx bzw. Z verwendet. Die Abkürzung für eine undefinierte Aminosäure ist Xaa bzw. X. f Sowohl die neutrale als auch die protonierte Form der Histidinseitenkette sind bei pH 7,0 vorhanden, da der pKx-Wert nahe bei 7,0 liegt.

Die Seitenketten der unpolaren Aminosäuren sind vielfältig in Gestalt und Größe Neun Aminosäuren werden zu den Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten gezählt. Die dreidimensionale Gestalt einiger dieser Aminosäuren ist in Abbildung 4.4 wiedergegeben. Glycin hat die kleinstmögliche Seitenkette, ein H-Atom. Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin besitzen aliphatische Kohlenwasserstoffseitenketten, deren Größe von einer Methylgruppe für Alanin bis zu den isomeren Butylgruppen für Leucin und Isoleucin reicht. Methionin trägt eine Thioethergruppierung in der Seitenkette. Diese Seitenkette ähnelt in vielen physikalischen Eigenschaften denen einer n-Butylgruppe, da Kohlenstoff und Schwefel ähnliche Elektronegativitätswerte aufweisen und die Größe eines S-Atomes in etwa der Größe einer Methylengruppe entspricht. Prolin trägt als Seitenkette eine cyclische Pyrrolidinstruktur. Phenylalanin (mit einem Phenylring) und Tryptophan (mit seiner Indolgruppe) enthalten aromatische Seitenketten, die durch ihre Größe und durch ihre unpolaren Eigenschaften gekennzeichnet sind.

in roter,

N-Atomen in blauer und H-Atomen in weißer Farbe.

Alanin

>

0-COOH?!

Proteinen (%)“

Masse einer Peptidgruppe, von der Masse der Aminosäurereste zu

Abb. 4.4 Modelle einiger Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten. Die Kugel-Stab-Modelle sind transparent mit den zugehörigen raumfüllenden Modellen unterlegt. Die Modelle sind hier für drei Aminosäuren wiedergegeben: Alanin, Isoleucin und Phenylalanin. Alle Modelle sind im gleichen Maßstab dargestellt

PKR

pKı

Häufigkeit in

° Die hier abgebildete ionisierte Form der Aminosäuren ist die, welche bei pH 7,0 (mit Ausnahme der Histidinseitenkette’) vorherrscht. Für die Berechnung der Aminosäuremasse wurde jedoch die neutrale Form verwendet. Die C,-Atome (außer Glycin) sowie die mit einem Stern gekennzeichneten Atome sind chirale Zentren, deren Konfiguration gemäß der Fischer-Projektion dargestellt wird. Für die Heterocyclen wurde die Standardnummerierung für organische Systeme verwendet. P Angegeben sind die Molmassen für die ungeladene Form der Aminosäurereste. Für die molekulare Masse der zugehörigen Aminosäuren sind 18,0 D, die molekulare Masse von H,O, zu addieren. Zur Ermittlung der molekularen Masse einer Seitenkette sind 56,0 D, die subtrahieren.

}

Durchschnittliche

&

Ein-Buchstaben-Code

-pk,

Masse des

Restes (D)?

Isoleuein

Phenylalanin

Aminosäurestrukturen

91

| = 0

NH

| ag

|

24 ae

NH

c=O

|

|

Cysteinrest y

101

H,0

Cystei ysteinres t

|

|

e—O Serin

NH

Glutamin

Abb. 4.5 Modelle einiger Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten: Serin und Glutamin. Die Atome sind farblich wie in Abb. 4.4 gekennzeichnet. Bemerkenswert ist hier das Vorhandensein von elektronegativen Atomen in den Seitenketten.

Ungeladene polare Seitenketten besitzen Hydroxyl-, Amid- oder Thiolgruppen Zu den Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten werden im Allge-

Abb. 4.6 Über eine Disulfidbindung verbundene Cysteinseitenketten. Die Disulfidbindung entsteht, wenn zwei

Thiolgruppen oxidativ verknüpft werden.

meinen sechs Aminosäuren gezählt (Tab. 4.1 und Abb. 4.5). Serin und Threonin enthalten eine Hydroxylgruppe. Tyrosin weist eine phenolische Seitenkette auf und ist damit wie Phenylalanin und Tryptophan aromatisch. Asparagin und Glutamin enthalten eine Amidgruppe in ihrer Seitenkette. Cystein ist die einzige Aminosäure mit einer Thiolgruppe in der Seitenkette und kann mit einer weiteren Cysteinseitenkette (Abb. 4.6) durch Oxidation der beiden Thiolgruppen eine Disulfidbindung ausbilden. Geladene polare Seitenketten besitzen eine positive oder negative Ladung Fünf Aminosäuren besitzen geladene Seitenketten (Tab. 4.1 und Abb. 4.7). Die Seitenketten der basischen Aminosäuren sind bei physiologischen pH-Werten positiv geladen. Dazu gehören Lysin mit einer Butylammoniumseitenkette, Arginin mit einer Guanidinogruppe und Histidin mit einem Imidazolring. Von den 20 a-Aminosäuren ionisiert nur Histidin, mit einem pKz von 6,04 innerhalb des physiologischen pH-Bereiches. Dementsprechend kommen in Proteinen sowohl die neutrale als auch die positiv geladene Form vor. Tatsächlich ist die Protonierung-Deprotonierung von Histidinseitenketten charakteristisch für viele enzymatische Reaktionsmechanismen. Die Seitenketten der sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure sind bei einem pH-Wert über 3 negativ geladen. In ihrem geladenen Zustand werden sie oft auch wie ihre Salze als Aspartat und Glutamat bezeichnet. Asparagin und Glutamin sind jeweils die Seitenkettenamide von Asparagin-

säure und Glutaminsäure. Die Einteilung der 20 Aminosäuren in die drei verschiedenen Gruppen ist teilweise etwas willkürlich. So könnten z.B. die kleineren Aminosäuren wie Glycin und Alanin oder Tryptophan mit dem heterocyclischen Ring genauso als ungeladene polare Aminosäuren betrachtet werden. Ebenso könnten Tyrosin und Cystein mit ihren besonders bei höheren pH-Werten ionisierbaren Seitenketten auch zu den Aminosäuren mit geladenen polaren Seitenketten gezählt werden. Tatsächlich kommt in vielen Enzymen die deprotonierte Seitenkette von Cystein

(die das Thiolatanion S” enthält) vor und ist aktiv an chemischen Reaktionen beteiligt. Die Einordnung einer einzelnen Aminosäure in die eine oder andere Gruppe spiegelt jedoch nicht nur die Eigenschaften der isolierten Aminosäure wider, sondern auch deren Verhalten als Teil eines Polypeptides. Die Strukturen der meisten Polypeptide hängen von dem Bestreben polarer und ionischer Seitenketten ab, solvatisiert zu werden, und von dem Bestreben unpolarer Seitenket-

Lysin

Abb. 4.7 Modelle einiger Aminosäuren mit geladenen polaren Seitenketten. Aspartat und Lysin. Die farbliche Kennzeichnung der Atome entspricht der in Abb. 4.4.

92

Aminosäuren

ten, eher miteinander als mit Wasser zu interagieren. Diese Eigenschaft der Polypeptide ist eine Folge des sogenannten hydrophoben Effekts (Abschnitt 2.10). Wie wir noch sehen werden, sind die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Aminosäureseitenketten auch Maß gebend für die chemische Reaktivität eines Polypeptides. Es ist empfehlenswert, sich die Strukturen der 20 Aminosäuren einzuprägen. So kann am .besten abgeschätzt werden, wie sich die einzelnen Aminosäuren in ihrer Polarität, Acidität, Aromatizität, Größe, konformativen Flexibilität, in der Möglichkeit zur Quervernetzung und zur Ausbil-

dung von Wasserstoffbrücken sowie in ihrer Reaktivität unterscheiden.

D.

Säure-Base-Eigenschaften

Die a-Aminosäuren tragen zwei, bzw. diejenigen mit ionisierbaren Seitenketten drei Säure-Base-Gruppen. Bei niedrigen pH-Werten sind diese Gruppen vollständig protoniert und bei hohen pH-Werten liegen sie nicht protoniert vor. Bei intermediären pH-Werten sind die Säuregruppen meist nicht protoniert und die basischen Gruppen meist protoniert. Dementsprechend, liegt die Aminosäure Glycin bei einem pH-Wert unter 2,35 (dem pK-Wert seiner Carboxylgruppe) überwiegend in der 'H,;,NCH,COOH-Form vor. Bei einem pH-Wert über 2,35 ist die Carboxylgruppe meistens ionisiert, die Aminogruppe dagegen ist meistens noch protoniert (*H,NCH,COO”). Über pH 9,78 (dem pK-Wert der Aminogruppe) dominiert die H,NCH,COO-Form. Daraus folgt, dass Aminosäuren in wässriger Lösung fast nie die neutrale Form einnehmen. Der pH-Wert, an dem ein Molekül keine Nettoladung aufweist, wird als der isoelektrische Punkt (pI) bezeichnet. Der p!I von a-Aminosäuren kann mit hoher Genauigkeit nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung wie folgt berechnet werden:

pI = S(pK, + PK) Dabei sind K; und K; die Dissoziationskonstanten für die beiden Ionisations-

schritte unter Einbeziehung der neutralen Form. Für Monoamino- und Monocarbonsäuren wie Glycin, werden K; und K; durch K, und K, repräsentiert. Dagegen sind K; und K; für Asparaginsäure und Glutaminsäure K, und Ks; für Arginin, Histidin und Lysin gelten hingegen Kz und Kı. Die Aminosäurereste im Inneren einer Polypeptidkette besitzen an den a-Kohlenstoffatomen natürlich keine ionisierbaren freien Amino- und Carboxylgruppen (diese Gruppen sind über Peptidbindungen miteinander verknüpft; Abb. 4.3). Weiterhin können die pK-Werte aller ionisierbaren Gruppen, inklusive der N- und C-Termini, von den in Tabelle 4.1 angegebenen Werten für freie Aminosäuren abweichen. Die pK-Werte von a-Carboxylgruppen in nicht gefalteten Proteinen schwanken zwischen 3,5 und 4,0, während die pK-Werte für a-Aminogruppen zwischen 7,5 und 8,5 liegen. In freien Aminosäuren sind die pK-Werte wegen des Elektronen-ziehenden Charakters der benachbarten Carboxylatgruppe höher, was wiederum die Deprotonierung der Ammoniumgruppe erschwert. In der dreidimensionalen Struktur einer gefalteten Polypeptidkette können polare Seitenketten dicht nebeneinander liegen. Durch die resultierenden elektrostatischen Interaktionen zwischen diesen räumlich benachbarten Gruppen können sich deren pK-Werte um einige pH-Einheiten gegenüber den Werten der freien Aminosäuren verschieben. Aus diesem Grund ist der pl eines Polypeptids, der durch die pK-Werte seiner vielen ionisierbaren Gruppen bestimmt ist, nicht ohne weiteres vorauszusagen. Er muss üblicherweise experimentell bestimmt werden.

93

Aminosäurestrukturen

E.

Einige Worte zur Nomenklatur

Die aus drei Buchstaben bestehenden Abkürzungen für die 20 Standard-Aminosäuren, dargestellt in Tabelle 4.1, sind in der biochemischen Literatur weit verbreitet. Die meisten dieser Abkürzungen sind den ersten drei Buchstaben des Namens der jeweiligen Aminosäure entnommen und werden ausgesprochen wie sie geschrieben werden. Das Kürzel Glx steht für Glu oder Gln, entsprechend steht Asx für Asp oder Asn. Diese zweideutige Schreibweise entstammt der Laborerfahrung: Asn und GlIn werden leicht unter den sauren oder basischen Bedingungen, die für ihre Freisetzung aus Proteinen eingesetzt werden (Abschnitt 5.3A), zu Asp bzw. Glu hydrolysiert. Ohne besondere Vorkehrungen ist es dann nicht mehr möglich zu entscheiden, ob ein detektiertes Glu ursprünglich ein Glu oder Gln war. Entsprechendes gilt für Asp und Asn. Die Ein-Buchstaben-Symbole für die Aminosäuren sind ebenfalls in Tabelle 4.1 angegeben. Diese kompaktere Schreibweise wird oft beim Vergleich von Aminosäuresequenzen mehrerer ähnlicher Proteine genutzt. Dabei entspricht der Ein-Buchstaben-Code in der Regel dem ersten Buchstaben des Aminosäurenamens. Bei mehreren Aminosäuren mit demselben Anfangsbuchstaben gilt dies für die jeweils am häufigsten vorkommende Aminosäure. Die Benennung von Aminosäureresten in Polypeptiden erfolgt durch Ersetzen des Suffixes -in im Aminosäurenamen durch -yl. Die Sequenz einer Polypeptidkette wird immer mit dem N-Terminus beginnend mit den Namen der Reste beschrieben; die Aminosäure am C-Terminus wird mit dem Namen der ursprünglichen Aminosäure bezeichnet. Nach dieser Regel wird das unten dargestellte Peptid als Alanyltyrosylaspartylglycin bezeichnet.

OH

Huf,

H -.

HH

FIRE

Bl Aa

|In MER |Me

—

Tyrr

1. Beschreiben Sie die allgemeine Struktur einer Aminosäure. 2. Identifizieren Sie Peptidbindungen, Aminosäureseitenketten und die N- und C-Termini eines Polypeptids. 3. Zeichnen Sie die Strukturen der 20 Standard-Aminosäuren und fügen Sie deren Ein- und DreiBuchstabenabkürzungen an. 4.

Klassifizieren Sie die 20 Standard-Aminosäuren nach Polarität, Struktur, Art der

funktionellen Gruppen und Säure-Base-Eigenschaften. 5. Warum haben die ionisierbaren Gruppen von freien Aminosäuren einen anderen pK-Wert

als die ionisierbaren Gruppen von Aminosäureresten in

Polypeptiden?

OÖ

Sm co0-

Dass.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1

—

Asp

Mh omg: —

ge

eng ee

BC,

HC,

Be,

Hı0,

HsC;

co0o°

0,

NH;

Gly

Solche Namen sind für Polypeptidketten, die aus mehreren Resten bestehen, offensichtlich unpraktisch. Bei Verwendung des Drei-Buchstaben-Codes kann das Tetrapeptid ebenso als Ala-Tyr-Asp-Gly und unter Verwendung der Ein-Buchstaben-Symbole als AYDG geschrieben werden. Die verschiedenen Atome der Aminosäureseitenketten werden oft sequenziell nach dem griechischen Alphabet benannt. Dabei wird mit dem Kohlenstoffatom begonnen, welches sich in Nachbarschaft zur peptidischen Carbonylgruppe befindet. Deshalb wird, wie in Abbildung 4.8 gezeigt, die Aminogruppe der LysSeitenkette als --Aminogruppe und die Carboxylgruppe der Glu-Seitenkette als y-Carboxylgruppe bezeichnet. Leider ist dieses Bezeichnungssystem für einige Aminosäuren mehrdeutig. Daher werden alternativ die Standard-Nomenklaturschemata für organische Moleküle verwandt (und sind in Tab. 4.1 für die heterocyclischen Seitenketten mit angegeben).

oO

Lys Abb. 4.8

Glu

Griechische Nomenklatur für

Aminosäuren.

Die Kohlenstoffatome sind mit aufeinander

folgenden Buchstaben des griechischen Alphabetes bezeichnet, beginnend mit dem C-Atom

der Carboxylgruppe.

neben

94

Aminosäuren Drehbarer Analysator

Abb. 4.9 Schematische Darstellung eines Polarimeters. Dieses Gerät wird zum Messen der optischen Drehung benutzt.

Fixierte Gradskala

Probenhalter Die Polarisationsebene

Fixierter Polarisator Lichtquelle

ee di H—C--F ! F--C—H Br

2

des austretenden Lichtes ist nicht gleich der des eintretenden Lichtes Befindet sich eine optisch aktive Substanz gelöst im Probenrohr, erfolgt eine Drehung der Ebene des polarisierten Lichtes

Stereochemie

Br

Spiegelebene

Abb. 4.10 Die zwei Enantiomere von Fluorchlorbrommethan. Die vier Substituenten sind tetrahedral um das zentrale Kohlenstoffatom angeordnet. Eine gepunktete Linie zeigt an, dass sich der betreffende Substituent hinter der Papierebene befindet. Bei einer keilförmigen Linie liegt der Substituent oberhalb, bei einer dünnen

Linie in der Papier-

ebene. Die zu den beiden Enantiomeren gehörende Spiegelebene ist als vertikale gestrichelte Linie gezeichnet.

Mit Ausnahme von Glycin sind alle aus Polypeptiden gewonnenen Aminosäuren optisch aktiv, d.h. sie drehen die Ebene von polarisiertem Licht. Die Richtung und der Drehwinkel können mit einem Gerät gemessen werden, das Polarimeter genannt wird (Abb. 4.9). Optisch aktive Moleküle sind asymmetrisch. Dies bedeutet, dass sie nicht mit ihrem Spiegelbild zur Deckung gebracht werden können. In gleicher Weise verhalten sich unsere Hände: Eine linke Hand kann nicht mit ihrem Spiegelbild — einer rechten Hand - zur Deckung gebracht werden. Diese Situation ist für Substanzen charakteristisch, die ein tetrahedrales Atom, z.B. ein Kohlenstoffatom mit vier unterschiedlichen Substituenten, enthalten. Zwei solcher Moleküle sind in Abbildung 4.10 dargestellt. Sie können nicht übereinander gelegt werden, da sie sich wie Bild und Spiegelbild verhalten. Die zentralen Atome in solchen Molekülen stellen ein asymmetrisches oder chirales Zentrum dar. Sie besitzen, anders ausgedrückt, die Eigenschaft der Chiralität (griech.: cheir, Hand). Die C,-Atome der Aminosäuren (mit Ausnahme von Glycin) sind asymmetrische Zentren. Glycin, welches zwei H-Atome an seinem C,-Atom besitzt,

kann mit seinem Spiegelbild zur Deckung gebracht werden und ist demzufolge optisch inaktiv. Neben den Aminosäuren enthalten viele weitere biologische Moleküle ein oder mehrere chirale Zentren. Chirale Zentren erzeugen Enantiomere

Moleküle, deren Spiegelbilder miteinander nicht zur Deckung gebracht werden können, werden als Enantiomere bezeichnet. Enantiomere Moleküle sind mit den meisten Techniken physikalisch und chemisch nicht zu unterscheiden. Nur wenn sie asymmetrisch untersucht werden, z. B. mit linear polarisiertem Licht oder mit Reaktanten, die ebenfalls chirale Zentren enthalten, können sie unterschieden

oder unterschiedlich behandelt Leider gibt es keine klare und dem Ausmaß oder der Lichtes dreht. So dreht aus

werden. Beziehung zwischen der Struktur eines Moleküles Richtung, in welche es die Ebene des polarisierten Proteinen isoliertes Leucin polarisiertes Licht um

10,4° nach links, während

Arginin polarisiertes

Licht um

12,5° nach rechts

dreht. (Die Enantiomere dieser beiden Verbindungen drehen polarisiertes Licht um den gleichen Betrag, aber in die entgegengesetzte Richtung.) Eine Verbindung, die polarisiertes Licht nach rechts dreht, erhält das Präfix (+), eine linksdrehende das Präfix (-). Es ist bisher nicht möglich, die optische Drehung aus der Struktur vorherzusagen. Umgekehrt kann die absolute Konfiguration (räumliche Anordnung) von chemischen Gruppen um ein chirales Zentrum aus den optischen Rotationsmessungen nicht abgeleitet werden.

Stereochemie

Die Fischer-Konvention beschreibt die Konfiguration von asymmetrischen Zentren Biochemiker

benutzen

im Allgemeinen

die Fischer-Konvention,

um

die ver-

schiedenen Formen von chiralen Molekülen zu beschreiben. In diesem System wird die Konfiguration von Gruppen um ein asymmetrisches Zentrum mit der vom Glycerinaldehyd verglichen, ein Molekül mit einem chiralen Zentrum. Bereits im Jahr 1891 hatte Emil Fischer für die beiden räumlichen Isomere (Stereoisomere) von Glycerinaldehyd vorgeschlagen, sie mit p-Glycerinaldehyd und ı-Glycerinaldehyd zu benennen (Abb. 4.11). Der vorangestellte kleingeschriebene Großbuchstabe ı oder p gibt an, um welches Enantiomer es sich handelt. Fischer legte willkürlich fest, dass (-)-Glycerinaldehyd mit dem Präfix ı. (griech.: levo, links) und (+)-Glycerinaldehyd mit dem Präfix o (griech.: dextro, rechts) bezeichnet wird. Er ordnete dabei die Präfixe den in Abbildung 4.11 gezeigten Strukturen zu, ohne zu wissen, ob die Struktur links und die Struktur rechts wirklich linksdrehend bzw. rechtsdrehend waren. Erst im Jahr 1949 konnte durch Experimente bestätigt werden, dass Fischers Vermutung tatsächlich richtig war. Fischer schlug ebenfalls eine allgemeine Kurzschreibweise für molekulare Konfigurationen an asymmetrischen Zentren vor. Diese wurde als FischerProjektion bekannt und ist ebenfalls in Abbildung 4.11 dargestellt. Nach der Fischer-Konvention verlaufen horizontal gezeichnete Bindungen oberhalb der Papierebene und vertikal gezeichnete Bindungen unterhalb der Papierebene. Des Weiteren ist die längste Kohlenstoffkette vertikal eingezeichnet und das C-Atom mit der höchsten Oxidationsstufe oben angeordnet. Ist dabei die funktionelle Gruppe des chiralen Zentrums, das am weitesten vom C-Atom mit der höchsten Oxidationsstufe entfernt ist, rechts angeordnet, so liegt die DForm vor, zeigt sie nach links, liegt die L-Form vor. Die Konfiguration von Gruppen um ein beliebiges chirales Zentrum kann mit der Konfiguration von Glycerinaldehyd in Verbindung gebracht werden, indem diese Gruppen chemisch in jene von Glycerinaldehyd umgewandelt werden. Bei den a-Aminosäuren entsprechen die Amino-, Carboxyl- und R-Gruppe der Hydroxyl-, Aldehyd- und CH,OH-Gruppe vom Glycerinaldehyd.

CHO i HO—C—H CH,OH L-Glycerinaldehyd

coo H,N—C—H R 2

L-«-Aminosäure

Mit anderen Worten, ı-Glycerinaldehyd und ı-a-Aminosäuren haben die gleiche relative Konfiguration. Alle aus Proteinen gewonnenen Aminosäuren besitzen die stereochemische 1-Konfiguration; d.h. sie haben alle die gleiche relative Konfiguration um ihre C,-Atome. Natürlich gibt die Kennzeichnung von Aminosäuren mit L oder p keinen Hinweis auf ihre Fähigkeit, die Ebene des polarisierten Lichtes zu drehen: Viele 1-Aminosäuren sind rechtsdrehend. Das Fischer-System hat jedoch einige Unzulänglichkeiten, besonders bei Molekülen mit mehreren asymmetrischen Zentren. Jedes asymmetrische Zentrum

kann zwei mögliche Konfigurationen haben. So besitzt ein Molekül mit n chiralen Zentren 2" mögliche verschiedene Stereoisomere. Threonin und Isoleucin z.B. haben beide zwei chirale Kohlenstoffatome und demzufolge jeweils vier Stereoisomere oder zwei Paare von Enantiomeren

[die Enantiomere

(Spiegel-

bilder) der ı-Formen sind die p-Formen]. Für die meisten Zwecke erlaubt das Fischer-System eine ausreichende Beschreibung von biologischen Molekülen. Ein genaueres Nomenklatursystem wird gelegentlich ebenfalls von Biochemikern verwendet (siehe Exkurs 4.2).

95

Geometrische Formeln

CHO

|

CHO

HO—C—H

H-C—oH

CH,OH

CH,OH

FischerProjektion

CHO

CHO

mr

DEe

CH,OH

|

CH,OH

Spiegelebene

L-Glycerinaldehyd

D-Glycerinaldehyd

Abb. 4,11 Die Fischer-Konvention. Die beiden Enantiomere des Glycerinaldehydes sind als geometrische Formeln (oben) und in der Fischer-Projektion (unten) gezeigt. Bei der FischerProjektion stellen horizontale Linien Bindungen dar, die auf den Betrachter zu nach vorn weisen,

und vertikale Linien repräsentieren Bindungen, die vom Betrachter weg nach hinten weisen (in einigen Fischer-Projektionen ist das zentrale chirale Kohlenstoffatom nicht extra gezeigt).

96

Aminosäuren

Das RS-System Robert Cahr, Christopher Ingold und Vladimir Prelog entwickelten im Jahr 1956 ein System zur eindeutigen Beschreibung der Konfigurationen von Molekülen mit mehr als einem asymmetrischen Zentrum. Bei dem Cahn-Ingold-Prelog- oder RS-System werden die vier Gruppen um ein chirales Zentrum

nach einem spezifischen, wenn auch willkürlichen,

Prioritätsschema geordnet: Atome mit einer höheren Ordnungszahl werden höher eingestuft als solche mit einer kleineren Ordnungszahl (z.B. hat -OH eine höhere Priorität als -CH,). Wenn die ersten Atome der Substituenten identisch sind, wird die Priorität ermittelt, indem das nachfolgende Atom, ausgehend vom chiralen Zentrum, betrachtet wird (z.B. hat -CH,OH Vorrang vor -CH;). Die Priorität einiger

wichtiger funktioneller Gruppen ist SH > OH > NH,> COOH

> CHO > CH,OH > C;H5; >

CH>H. Die Gruppen werden in der Reihenfolge ihrer Priorität mit den Buchstaben W, X, Y, Z bezeichnet, so dass

W>X>Y

> Z ist. Um die Konfiguration des chiralen Zentrums zu ermitteln, wird es von dem asymmetrischen Zentrum aus in Richtung der Z-Gruppe (geringste Priorität) betrachtet. Verläuft die Reihenfolge der Gruppen W— X — Y im Uhrzeigersinn, so wird die Konfiguration mit R bezeichnet (lat.: rectus, rechts). Ist die Reihenfolge der Gruppen W > X — Y entgegen dem Uhrzeigersinn, wird die Konfiguration mit einem S (lat.: sinistrus, links) bezeichnet.

ı-Glycerinaldehyd wird auch als (S)-Glycerinaldehyd bezeichnet, da die drei mit höchster Priorität eingestuften Gruppen entgegen dem Uhrzeigersinn angeordnet sind, wenn das H-Atom (gestrichelte Linie) hinter dem chiralen C-Atom (gro$er Kreis) positioniert ist.

CHO \

CHO

HO—C—H

=

CH,0H L-Glycerinaldehyd

(X) 5%

E)-Hm CH,OHy (S)-Glycerinaldehyd

Alle L-Aminosäuren in Proteinen sind (S)-Aminosäuren mit Ausnahme von Cystein, welches als (R)-Cystein bezeichnet wird, weil das S-Atom

in der Seitenkette deren Priorität er-

höht. Andere eng verwandte Verbindungen mit der gleichen Kennzeichnung durch die pı-Konvention nach Fischer können nach dem RS-System unterschiedliche Bezeichnungen haben. Besonders hilfreich ist das RS-System bei der Beschreibung der Chiralitäten von Verbindungen mit mehreren asymmetrischen Zentren. So kann ı-Threonin auch als (2S,3R)-Threonin bezeichnet werden.

Chirale Moleküle bilden die Grundlage des Lebens Bei der normalen chemischen Synthese eines chiralen Moleküles entsteht ein

racemisches Gemisch (enthält beide Enantiomere zu gleichen Teilen). Um ein enantiomerenreines Produkt zu erhalten, muss ein chiraler Prozess angewandt werden. Eine der auffallendsten Eigenschaften des Lebens ist die Synthese von optisch aktiven Molekülen. Biosynthetische Prozesse erzeugen nahezu reine Stereoisomere. Die Tatsache, dass alle Aminosäuren in Proteinen die ı-Konfiguration aufweisen, ist nur ein Beispiel für dieses Phänomen. Da die meisten biologischen Moleküle chiral sind, bindet oder reagiert ein Molekül, welches nur in einer enantiomeren Form vorhanden ist, nur mit einem Enantiomer einer anderen Verbindung. Ein Protein aus L-Aminosäuren beispielsweise, das mit einer bestimmten ı-Aminosäure reagiert, reagiert nicht ohne weiteres mit der p-Form dieser Aminosäure. Ein im übrigen identisches synthetisches Protein aus D-Aminosäuren reagiert ohne weiteres nur mit der entsprechenden p-Aminosäure. D-Aminosäuren sind Bestandteile von einigen relativ kleinen ( , i

j

nichtinvasiv unter dem Fluoreszenzmikroskop messen. Das grün fluoreszierende Protein besteht aus einer Kette von 238 Aminosäuren. Die lichtemittierende Gruppe ist ein

—NH- CH —E——N— CH C— Fluorophor des grün fluoreszierenden Proteins

Derivat von

Die Cyclisierung zwischen Ser und Gly läuft wahrscheinlich rasch ab, die Oxidation der Tyr-Seitenkette (durch O,) ist vermutlich der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Erzeugung des Fluorophors. Gentechnisch veränderte GFP-Varianten zeigen z.B. eine erhöhte Fluoreszenzintensität, eine pH-abhängige Fluoreszenz oder eine Verschiebung der Wellenlänge des emittierten Lichts und damit andere Farben. Damit ist es möglich, gleichzeitig die Expression von mehreren verschiedenen Genen zu beobachten.

drei aufeinander

folgenden

Aminosäuren:

Ser,

Tyr und Gly. Nach der Synthese des Proteins cyclisieren und oxidieren diese drei Aminosäuren spontan. Der Carbonyl-Kohlenstoff von Ser geht dabei eine kovalente Bindung mit dem Amino-Stickstoff des Gly ein. Dabei wird Wasser abgespalten und die C,-C;-Bindung im Tyr wird zu einer Doppelbindung oxidiert. Die so entstandene Struktur enthält ein System konjugierter Doppelbindungen, welches für die Fluoreszenzeigenschaften des Proteins verantwortlich ist.

allen Fällen resultieren diese Aminosäuren aus einer spezifischen Modifikation eines Aminosäurerestes, nachdem die Polypeptidkette synthetisiert wurde. Zu den Aminosäuremodifikationen gehört die einfache Addition von kleinen chemischen Gruppen an bestimmte Aminosäureseitenketten: Hydroxylierung, Methylierung, Acetylierung, Carboxylierung und Phosphorylierung. Auch größere Gruppen, dazu zählen auch Lipide und Kohlenhydratpolymere, werden mit bestimmten Aminosäureresten verknüpft. Kompliziertere chemische Modifikationen werden ebenso an einigen Aminosäureresten gefunden. Die freien Amino- und Carboxylgruppen an den N- und C-Termini eines Polypeptides können ebenfalls chemisch modifiziert werden. In vielen Fällen sind diese Modifikationen zwar wichtig aber nicht essentiell für die Funktion eines Proteins. In einigen Fällen bilden einzelne Aminosäure-Seitenketten zusammen eine neue Struktur (Exkurs 4.3).

Aminosäurederivate

Grün fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten als Sonden in der Zellbiologie. Linkes Bild: Zellen, die mit dem Rezeptorprotein Y1 (als Fusionsprotein mit dem rot fluoreszierenden Protein) und dem Rezeptorprotein Y2 (als Fusionsprotein mit dem grün fluoreszierenden Protein) transfiziert wurden. Die Rezeptoren gehören zur Klasse der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (s. Kap. 13) und sind in der Membran der Zelle lokalisiert. Rechtes Bild: Nach Stimulation mit dem Y2-spezifischen Liganden werden nur die Y2-Rezeptoren (grün) internalisiert, die YI-Rezeptoren (rot) bleiben in der Membran. Rezeptorsubtyp-spezifische Wege können so aufgeklärt werden. [© 2009 Annette G. Beck-Sickinger, Universität Leipzig.]

[© 1999 Steven Haddock und Trevor Rivers/Monterey Bay Aquarium Research Institute, Monterey, Kalifornien.]

Biologisch aktive Aminosäuren Die 20 Standard-Aminosäuren erfahren eine verblüffende Zahl von chemischen Transformationen zu anderen Aminosäuren und verwandten Verbindungen als Teil ihrer normalen zellulären Synthese und ihres Abbaues. In einigen Fällen haben die Intermediate des Aminosäuremetabolismus Funktionen, die außerhalb ihrer unmittelbaren Verwendung als Vorstufen oder Abbauprodukte der 20 Standard-Aminosäuren liegen. Außerdem werden viele Aminosäuren nicht nur als späterer Bestandteil von Polypeptiden, sondern auch für eigenständige Funktionen benötigt. Wie wir noch sehen werden, benutzen viele Organismen bestimmte Aminosäuren, um Stickstoff in Form von Aminogruppen zu transportieren (Abschnitt 21.2A). Aminosäuren können ebenfalls als metabolischer Treibstoff oxidiert werden, um Energie bereitzustellen (Abschnitt 21.4). Oft fungieren Aminosäuren und ihre Derivate darüber hinaus als chemische Boten für die Kommunikation zwischen Zellen (Abb. 4.15). Glycin, y-Aminobuttersäure (GABA; ein Decarboxylierungsprodukt von Glutamat) und Dopamin (ein Tyrosinderivat) sind Neurotransmitter. Dies sind Substanzen, die von Nervenzellen freigesetzt werden, um das Verhalten der sie umgebenden Zellen zu beeinflussen. Histamin (ein Decarboxylierungsprodukt von Histidin) ist ein potenter lokaler Mediator allergischer Reaktionen. Thyroxin (ein anderes Tyrosinderivat) ist ein iodhaltiges Schilddrüsenhormon, das allgemein den Metabolismus von Vertebraten stimuliert.

HO

Einige biologisch aktive Aminosäurederivate.

Die verbleibenden Teile der ursprünglichen Aminosäuren

sind schwarz und rot, zusätzliche

Gruppen blau dargestellt. I

I

HO = H3N CH,

y-Aminobuttersäure (GABA)

+ H;N a

Histamin

H;N —CH— 000° +

CH>

H3N er CH,

Dopamin

Thyroxin

99

100

Aminosäuren

Verständnisfragen zu Abschnitt3 1. Nennen Sie einige kovalente Modifikationen von Aminosäuren in Proteinen.

2. Nennen Sie einige Funktionen von Aminosäurederivaten.

Viele kurzkettige Peptide üben wichtige physiologische Funktionen aus, sie wirken als Hormone oder auf andere Weise als Regulatoren. Ein beinahe allgegenwärtiges Tripeptid namens Glutathion (abgekürzt GSH) spielt im Zellstoffwechsel eine wichtige Rolle. Bei Glutathion handelt es sich um ein Glu-CysGly-Peptid, in dem die y-Carboxylatgruppe der Glutamat-Seitenkette mit der Aminogruppe des Cys-Restes eine Isopeptidbindung ausbildet (im Gegensatz zur herkömmlichen Peptidbindung zwischen dem a-Carboxylat und der a-Aminogruppe zweier Aminosäuren). Zwei solche Tripeptide bilden nach Oxidation ihrer SH-Gruppen ein Dimer, das über eine Disulfidbrücke verknüpft ist, das so genannte Glutathiondisulfid (GSSG): |

CT NH

2 HN-CH- CH, CH, COO-

(6) |

CH OZNHT CH CO0OCH, SH

Glutathion (GSH) (y-Glutamylcysteinylglycin)

20, H,O

+

|

|

H,N—CH—CH,—CH,—C—NH—CH—C—-NH—CH,—CO0OCO0OCH, S Ss

H,N—CH— CH, CH, COO-

6) NH

CH, O CH

NH CH,—COO-

Glutathiondisulfid (GSSG)

Oxidierende Verbindungen, die Zellstrukturen durch die Reaktion mit Glutathion inaktiviert:

schädigen

könnten,

werden

2 GSH + Xogidier> GSSG + X reduziert

GSH muss dann in einer separaten Reduktionsreaktion wieder aus GSSG regeneriert werden.

Zusammenfassung

EE SEEN E SELL GREEN

0...

1. Bei neutralem pH ist die Aminogruppe einer Aminosäure protoniert und die Carboxylgruppe deprotoniert. 2. Proteine sind Polymere aus Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.

3. Die 20 Standard-Aminosäuren können als nicht polar (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp), als ungeladen polar (Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys) und als geladen (Lys, Arg, His, Asp, Glu) klassifiziert werden. 4. Die pK-Werte ionisierbarer Gruppen von Aminosäuren werden durch benachbarte Gruppen beeinflusst und können sich ändern, wenn die Aminosäure Bestandteil eines Polypeptids ist. 5. Aminosäuren sind chirale Moleküle. In Proteinen werden nur t-Aminosäuren gefunden (einige bakterielle Peptide enthalten D-Aminosäuren).

Aufgaben

101

6. Aminosäuren können kovalent modifiziert werden, nachdem sie in ein

Polypeptid eingebaut wurden. 7. Einzelne Aminosäuren und ihre Derivate haben spezielle physiologische Funktionen.

Wichtige Begriffe Protein a-Aminosäure a-Kohlenstoffatom

Rest

Stereoisomere

N-Terminus

linksdrehend rechtsdrehend Fischer-Projektion racemisches Gemisch Cahn-Ingold-Prelog- (RS-) System Peptidase

C-Terminus

R-Gruppe Zwitterion

pl

Kondensationsreaktion

Polarität chirales Zentrum Chiralität

optische Aktivität

Peptidbindung Dipeptid Tripeptid Oligopeptid Polypeptid

Neurotransmitter

Isopeptidbindung

Enantiomer

absolute Konfiguration Fischer-Konvention

Aufgaben ik: Identifizieren Sie die Aminosäuren, die sich durch eine

einzige Methylengruppe voneinander unterscheiden. Die 20 Standardaminosäuren sind a-Aminosäuren. In der Natur kommen auch bestimmte ß-Aminosäuren vor. Zeichnen Sie die Struktur von ß-Alanin (3-Amino-npropionat). Identifizieren Sie Wasserstoffbrückenbindungs-Donatorund -Akzeptorgruppen in Asparagin. Zeichnen Sie das Dipeptid Asp-His bei pH 7,0. Berechnen Sie die Zahl der möglichen Pentapeptide, die jeweils einen Ala-, Gly-, His-, Lys- und Val-Rest enthalten. Bestimmen Sie die Nettoladung der vorherrschenden Form von Asp bei

(a) pH 1,0,

(b) pH 3,0, (c) pH 6,0 und

10. Zeichnen Sie die vier Stereoisomere von Threonin. Bl. Die zwei C,-H-Atome von Glycin werden als prochiral bezeichnet, weil das C, chiral wird, wenn eines der beiden

H-Atome durch eine andere Gruppe ersetzt wird. Zeichnen Sie die Fischer-Projektion von Gly und kennzeichnen Sie dasjenige H-Atom, welches durch CH; ersetzt werden muss, um p-Ala zu erhalten. 19% Das von Bakterien produzierte Antibiotikum Gramicidin A bildet in Zellmembranen Kanäle, die die freie Diffusion von Na*- und K*-Ionen erlauben, wodurch die Zelle getötet wird. Dieses Peptid besteht aus einer Sequenz von D- und ı-Aminosäuren. Die Sequenz eines Abschnitts aus fünf Aminosäuren in Gramicidin A ist R-Gly-ı-Ala-p-Leu-r-Alap-Val-R‘. Vervollständigen Sie die Fischer-Projektion unten, indem Sie die richtige Gruppe an jede vertikale Bindung hinzufügen.

(d) pH 11,0.

Berechnen Sie den p! von (a) Ala, (b) His und (c) Glu. Die Aminosäure Tyrosin löst sich kaum in Wasser. Wäre ein nur aus Tyr-Resten bestehendes Polypeptid, Poly(Tyr), besser oder schlechter löslich, wenn man unterstellt, dass die Konzentration der Tyr-Gruppen in der Probe konstant bleibt? Kreisen Sie in den folgenden Verbindungen jeweils den chiralen Kohlenstoff ein: SG

(6)

oO 07 N

3. EN

SE °

H—-C--CH; H—@G=H

H=-C—H n

|

a

et a.

L

C

er

o

ae

4

3 2

a cn

© EN

0006

des RS-Systems. 14. Manche Aminosäuren werden synthetisiert, indem die Ketogruppe (C=O) einer organischen Säure, einer so ge-

nannten a-Ketosäure, durch eine Aminogruppe (C-NH;) ersetzt wird. Ermitteln Sie die Aminosäuren, die auf diese Weise aus den nachfolgenden a-Ketosäuren gebildet werden können: coO07

02

| OH

13, Benennen Sie Isoleucin (wie in Tab. 4.1 gezeigt) mit Hilfe

o

4

c007

0-0 CM, 6=0 600ab

102

Aminosäuren

15. Identifizieren Sie die Aminosäure, aus welcher die folgenden Verbindungen synthetisiert wurden: “

De

'

CH,—C—NH—CH—CO— (b)

NHF

(c)

S—CH3 |

CH

ICH

04

|

nn

6 |

HC

16. Zeichnen Sie das Peptid ATLDAK. (a) Berechnen Sie seinen ungefähren pl. (b) Bestimmen Sie die Nettoladung bei pH 7,0. 17. Das Protein Insulin besteht aus zwei Polypeptiden, die als A- und B-Kette bezeichnet werden. Insulin aus verschiewert denen Organismen wurde isoliert und sequenziert. Menschliches Insulin und Enten-Insulin haben mit Ausnahme der unten gezeigten sechs Aminosäurereste die gleiche Aminosäuresequenz. Ist der pI von menschlichem Insulin niedriger oder höher als der des Enten-Insulin?

CH; Aminosäurerest

NH _CH.CO.

U —NHTZCH 007

AB

A9

AO

Mensch

Thr

Ser

Ile

Ente

Glu

Asn

Pro

_ Bl

B2

B27

Phe

Val

Thr

Ala

Ala

Ser

Literatur

Tr, en Barrett, G. C. und University Press einer Diskussion über analytische

Elmore, D. T., Amino Acids and Peptides, Cambridge (2001). [Enthält die Strukturen von Aminosäuren mit ihrer chemischen Reaktivitäten und Informationen Eigenschaften]

Lamzin, V. S., Dauter, Z. und Wilson, K. S., How nature deals with ste-

reoisomers, Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 830-836 (1995). [Es werden aus

D-Aminosäuren synthetisierte Proteine diskutiert.]

SE

Sewald, N. und Jakubke, H.-D., Peptides - Chemistry and Biology (2. Aufl.), Wiley-VCH (2009). Solomons, T. W. G., Organic Chemistry (9. Aufl.), Kap. 5, Wiley (2008). [Eine Diskussion der Chiralität. Die meisten anderen Lehrbücher der organischen Chemie enthalten ähnlichen Lehrstoff.]

| |

jr -

ee

Be

Pr

a:

Fa

er

N.

j

a

rn BE

u

Die große Vielfalt in Struktur und Funktion der Proteine reflektiert die astronomischen Variationsmöglichkeiten in den Sequenzen der beteiligten Aminosäuren - es gibt weit mehr mögliche Aminosäuresequenzen als Sterne im Weltall. Wie kann eine solche Diversität im Labor erfasst werden und was verrät sie über die evolutionären Zusammenhänge innerhalb der Proteine? [© John Chumack/Photo Researchers.]

Proteine: Primärstruktur Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 4 Guided Exploration 5 Animated Figure 5-3 Animated Figure 5-6 Animated Figure 5-7 Animated Figure 5-15 Animated Figure 5-18 Case Study 2 Bioinformatics Exercises

Proteine befinden sich im Zentrum der Aktivität biologischer Prozesse. Nahezu alle molekularen Transformationen, die den zellulären Metabolismus definieren, werden von Proteinkatalysatoren vermittelt. Proteine erfüllen auch regulatorische Aufgaben, überwachen die extrazellulären und intrazellulären Bedingungen und geben Informationen an andere zelluläre Komponenten weiter. Außerdem sind Proteine wichtige strukturelle Bausteine von Zellen. Daneben gibt es Proteine, die andere Moleküle transportieren, und Proteine, die mechanische und elektrochemische Kräfte erzeugen. Eine komplette Liste aller bekannten Proteinfunktionen würde mehrere Tausend Einträge enthalten. Eine solche Liste würde jedoch noch nicht die Tausende von Proteinen berücksichtigen, deren Funktionen bislang nicht vollständig charakterisiert wurden oder — wie in vielen Fällen - noch komplett unbekannt sind. Einer der Schlüssel, um die Funktion eines Proteins zu enträtseln, ist das Verständnis seiner Struktur. Wie die anderen wichtigen biologischen Makromoleküle, die Nucleinsäuren (Abschnitt 3.2) und die Polysaccharide (Abschnitt 8.2), sind Proteine aus kleineren Einheiten zusammengesetzte Polymere. Im Gegen-

satz zu vielen Nucleinsäuren haben Proteine keine einheitlichen und regelmäßigen Strukturen. Dies liegt zum Teil daran, dass die 20 verschiedenen Aminosäurereste, aus denen Proteine bestehen, sehr verschiedene chemische und physikalische Eigenschaften haben (Abschnitt 4.1C). Die Aminosäuresequenz, d.h. die Reihenfolge, in der die Aminosäuren aneinandergereiht sind, kann entweder direkt, wie in diesem Kaptel beschrieben, oder indirekt über DNA-Sequenzierung (Abschnitt 3.4) analysiert werden. Mit dem Wissen, wie diese Aminosäuren aneinander gereiht sind, können wir versuchen, die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Proteinen, ihre Verwandtschaft mit anderen Proteinen und letztendlich ihre Wirkmechanismen in lebenden Organismen zu verstehen. Nach einer kurzen Einführung zur Vielfalt der Proteinstrukturen werden wir Methoden zur Reinigung und Analyse von Proteinen kennenlernen. Wir werden Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

Proteine: Primärstruktur

® Diversität von Polypeptiden ® Proteinreinigung ® Proteinsequenzierung

® Evolution von Proteinen

106

Proteine: Primärstruktur S

A-Kette

Ss

|

|

-Glu Giy-Ile- Val-Glu-Gln-Cys-Cys- Ala=Ser- Val -Cys-Ser-Leu- TyrGin-Leu 5

£

Nn—

B-Kette

Asn-Iyr "Oye= Ann

10

un

Ss

Ss|

}

Leu -Tyr-Leu = Val-Oye-GlyGlu = Arg -Gly=Phe= Phe-Val = Asn-Gin- His-Leu-Cys- Gly- Ser-His= Leu - Val- Glu = Ala; 15 10 5

Abb. 5.1

Die Primärstruktur von Rinderinsulin.

Zu beachten sind die Disulfidbindungen innerhalb einer Kette und zwischen den beiden Ketten.

a

Be...

Fr Tyr-Thr-Pro-Lys

betrachten, auf welche Weise Aminosäuresequenzen bestimmt werden und welche Informationen diese über Funktion und Evolution von Proteinen liefern.

1

Diversität von Polypeptiden

Wie alle polymeren Moleküle können Proteine über ihre Organisationsstufen, in diesem Fall ihre Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen beschrieben werden. Die Primärstruktur eines Proteins ist die Aminosäuresequenz der Peptidkette oder -ketten, wenn das Protein aus mehr als einem Polypeptid besteht. Ein Beispiel für eine Aminosäuresequenz ist in Abbildung 5.1 wiedergegeben. Jeder Rest ist mit dem nachfolgenden über eine Peptidbindung verbunden (Abb. 4.3). Höhere Stufen der Proteinstruktur wie Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur beziehen sich auf die dreidimensionale Gestalt gefalteter Polypeptidketten und werden in dem nachfolgenden Kapitel beschrieben. Proteine werden in vivo durch die schrittweise Polymerisierung von Aminosäuren, in der Reihenfolge, die durch die Nucleotidsequenz eines Genes vorgegeben wurde, synthetisiert. Die direkte Übereinstimmung zwischen einem linearen Polymer (DNA) und einem anderen (einem Polypeptid) zeigt die elegante Einfachheit lebender Systeme und ermöglicht uns, Informationen über ein Polymer auf ein anderes zu übertragen. Die theoretischen Möglichkeiten für Polypeptide sind unbegrenzt

Mit 20 verschiedenen Möglichkeiten für jeden Aminosäurerest in einer Polypeptidkette ist es offensichtlich, dass eine astronomische Zahl verschiedener Proteinmoleküle verwirklicht werden kann. Für ein Protein mit n Resten ergeben sich 20" mögliche Sequenzen. So besteht z.B. ein relativ kleines Proteinmolekül aus einer einzelnen Polypeptidkette mit ca. 100 Resten. Dies entspricht 20! 1,27 x 10'°° möglichen Polypeptidketten dieser Länge, eine Zahl, die weitaus größer ist als die geschätzte Zahl der Atome im Universum (9 x 10°). Es ist klar, dass die Natur nur einen winzigen Teil der theoretischen Möglichkeiten verwirklicht hat - einen Teil, der trotzdem eine astronomisch große Zahl verschiedener Polypeptide repräsentiert. Natürlich auftretende Polypeptide sind in ihrer Größe und Zusammensetzung limitiert Im Allgemeinen bestehen Proteine aus mindestens 40 Resten. Kleinere Polypep-

tide werden einfach Peptide genannt. Die größte bekannte Polypeptidkette ist das aus 34.350 Resten bestehende Titin, ein gigantisches Protein (3816 kD), das bei der Anordnung sich wiederholender Muskelfaserstrukturen hilft (Abschnitt 7.2A). Der weitaus größte Teil der Polypeptide enthält zwischen 100 und 1000 Reste (Tab. 5.1). Multiproteinkomplexe enthalten mehrere identische und/oder nicht identische Ketten, die Untereinheiten genannt werden. Einige Proteine werden als einzelne Polypeptide synthetisiert, die später in zwei oder mehr miteinander verbundene Ketten gespalten werden. Insulin ist solch ein Protein (Abb. 5.1). Der Größenbereich, in dem die meisten Polypeptide liegen, reflektiert möglicherweise die Optimierung von verschiedenen biochemischen Prozessen:

Diversität von Polypeptiden Tab. 5.1 Zusammensetzungen einiger Proteine. ee EEE EEE EEE

Protein

SE BEER 150 BE

Aminosäurereste

Untereinheiten

ER

Molekulare Masse (D)

(ee nn

Proteaseinhibitor III (Melone)

30

1

3.427

Cytochrom c (Mensch)

104

1

11.617

Ribonuclease H (E. coli)

153

1

16.951

Interferon-y (Kaninchen)

288

2

33.842

Chorismat-Mutase (Bacillus subtilis)

381

3

43.551

Triosephosphat-Isomerase (E. coli)

510

2

53.944

Hämoglobin (Mensch)

574

E

61.986

RNA-Polymerase (Bacteriophage T7)

883

1

98.885

Nucleosiddiphosphat-Kinase (Dictyostelium discoideum)

930

6

100.764

Pyruvat-Decarboxylase (Hefe)

2.252

4

245.456

Glutamin-Synthetase (E. coli)

5.616

12

621.264

34.350

1

3.816.188

Titin (Mensch)

1. 40 Reste scheinen nahe dem Minimum für eine Polypeptidkette zu sein, um sich in eine diskrete und stabile Form zu falten, welche die Ausübung einer bestimmten Funktion erlaubt. 2. Polypeptide mit mehreren Hundert Resten können an die Grenzen der Leistungsfähigkeit der Proteinsynthesemaschinerie stoßen. Je länger das Polypeptid (und je länger seine entsprechende mRNA und sein Gen) desto größer ist die Wahrscheinlichkeit. dass Fehler während der Transkription und Translation auftreten. Zusätzlich zu diesen Einschränkungen in der Größe unterliegen Polypeptide noch wesentlich stärkeren Einschränkungen hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung. Die 20 Standard-Aminosäuren erscheinen nicht mit der gleichen Häufigkeit in Proteinen (in Tab. 4.1 ist die durchschnittliche Häufigkeit für jeden Aminosäurerest angegeben). Die häufigsten Aminosäuren in Proteinen sind z.B. Leu, Ala, Gly, Ser, Val und Glu; die seltensten sind Trp, Cys, Met und His. Da jeder Aminosäurerest charakteristische chemische und physikalische Merkmale aufweist, beeinflusst sein Auftreten an einer bestimmten Position im Protein die Eigenschaften dieses Proteins. Wie wir noch sehen werden, ist die dreidimensionale Gestalt einer gefalteten Polypeptidkette das Ergebnis von intramolekularen Kräften zwischen den verschiedenen Resten. Im Allgemeinen ordnen sich die hydrophoben Reste eines Proteins für Wasser nicht zugänglich in seinem Inneren an, während seine hydrophilen Seitenketten dazu neigen, die Oberfläche eines Proteins einzunehmen. Die Charakteristika jedes individuellen Proteins hängen daher eher von seiner Aminosäuresequenz als von seiner Aminosäurezusammensetzung ab. In gleicher Weise sind das Wort „Tablette“ und sein Anagramm „Teeblatt“ ziemlich unterschiedlich, obwohl sie dieselbe Buchstabenzusammensetzung aufweisen. Außerdem bestehen viele Proteine nicht nur aus Aminosäureresten. Sie können Komplexe mit Metallionen wie Zn’* und Ca’* bilden, kovalent oder nicht kovalent bestimmte kleine organische Moleküle binden oder sie können auch kovalent durch posttranslationales Anfügen von Gruppen, wie Phosphat und Kohlenhydraten, modifiziert werden.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 Il, Erklären Sie, warum Polypeptide

so unterschiedliche Sequenzen haben. Welche Faktoren limitieren die Größe und die Zusammensetzung von Polypeptiden?

107

108

Proteine: Primärstruktur

2

Proteinreinigung

Glücklicherweise erleichtert es die Variation der Polypeptide in Größe und chemischer Zusammensetzung, Methoden zur Trennung der Proteine voneinander und von anderen biologischen Molekülen zu entwickeln. Die Reinigung ist ein fast obligatorischer Schritt bei der Untersuchung von Makromolekülen, aber sie ist nicht unbedingt einfach. Häufig muss eine Substanz, die weniger als 0,1% des Trockengewichtes eines Gewebes ausmacht, auf ca. 98% Reinheit gebracht werden. Von den meisten Synthesechemikern würden Reinigungsprobleme dieser Größenordnung als unzumutbar schwierig angesehen werden! In den folgenden Abschnitten wird ein Überblick über einige der gebräuchlichsten Techniken für die Reinigung und für die grundlegende Charakterisierung von Proteinen gegeben. Die meisten dieser Techniken können, zum Teil in leicht abgewandelter Form, auch für Nucleinsäuren und andere Arten biologischer Moleküle angewandt werden.

A.

Abb. 5.2 Einschlusskörper. Ein genetisch veränderter Organismus, der große Mengen eines fremden

Proteins produziert,

lagert dieses in Einschlusskörpern. (engl.: inclusion bodies) ab. Diese elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt einen Einschlusskörper des Proteins Prochymosin in einer E. coli-Zelle. [Mit freundlicher Genehmigung von Teruhiko Beppu, Nikon University, Japan.]

Zur Proteinreinigung ist eine Strategie nötig

Die Aufgabe, ein Protein zu reinigen, das nur in winzigen Mengen vorliegt, war früher so schwierig, dass viele der zuerst charakterisierten Proteine nur deshalb genauer untersucht werden konnten, weil sie reichlich vorhanden und leicht zu isolieren waren. Hämoglobin z.B., welches rund ein Drittel des Gewichtes von roten Blutzellen ausmacht, zählt historisch gesehen zu den am umfassendsten untersuchten Proteinen. Da die meisten Enzyme, welche die grundlegenden metabolischen Prozesse vermitteln oder an der Expression und Weitergabe der genetischen Information beteiligt sind, in allen Spezies gleich sind, kann ein zu untersuchendes Protein häufig aus einer einfach zugänglichen Quelle gewonnen werden, z.B. aus dem Gewebe von Haustieren oder aus leicht zu kultivierenden Mikroorganismen wie E. coli und Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe). Die Entwicklung der molekularen Klonierungstechniken (Abschnitt 3.5) ermöglicht es, nahezu jedes für ein Protein codierende Gen aus seinem ursprünglichen Organismus zu isolieren, es gegebenenfalls spezifisch zu verändern (engl.: genetically engineered) und in einem Mikroorganismus in großen Mengen zu exprimieren. Das rekombinante Protein kann dabei bis zu 40% des gesamten Zellproteins eines Mikroorganismus ausmachen (Abb. 5.2). Dieser hohe Proteingehalt macht es sehr viel leichter, das rekombinante Protein zu isolieren als dasjenige aus dem ursprünglichen Organismus (in dem es in verschwindend geringen Mengen vorkommt). Der erste Schritt bei der Isolierung eines Proteins oder anderer biologischer Moleküle besteht darin, es aus der Zelle freizusetzen.und in Lösung zu bringen. Viele Zellen müssen zunächst auf mechanischem Wege aufgerissen (Iysiert) werden, damit sie ihren Inhalt freisetzen. Zur Lyse von Zellen werden diese

meist in irgendeiner Art zerkleinert. Anschließend werden größere unlösliche Partikel durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Wenn das gesuchte Protein fest mit der Lipidmembran assoziiert ist, kann ein Detergens oder ein organisches Lösungsmittel eingesetzt werden, um das Protein aus der Membran herauszulösen. Stabilisierung von Proteinen

Wurde das Protein einmal aus seiner natürlichen Umgebung entfernt, ist es Agenzien ausgesetzt, die es irreversibel schädigen können. Diese Einflüsse müssen auf allen Stufen des Reinigungsprozesses sorgfältig kontrolliert werden. Die folgenden Faktoren sollten berücksichtigt werden:

Proteinreinigung

1. pH. Biologisches Material wird routinemäßig in Pufferlösungen gelöst, die effektiv den pH-Bereich puffern, in dem die Proben stabil sind (Puffer werden im Abschnitt 2.2C beschrieben). Geschieht dies nicht, kann es zur Denaturierung (Aufbrechen der Struktur), wenn nicht sogar zum chemischen Abbau der Probe kommen. 2. Temperatur. Die thermische Stabilität von Proteinen ist unterschiedlich. Manche Proteine können bei niedrigen Temperaturen denaturieren; die meisten Proteine denaturieren bei hohen Temperaturen, einige nur ein paar Grad über ihrer nativen Umgebungstemperatur. Die Proteinreinigung wird daher normalerweise bei Temperaturen nahe 0°C durchgeführt. 3. Gegenwart abbauender Enzyme. Wenn Gewebe zerstört wird, um das interessierende Molekül zu gewinnen, werden gleichzeitig abbauende Enzyme freigesetzt. Zu diesen gehören Nucleasen (Enzyme, die Nucleinsäuren abbauen) und Proteasen (Enzyme, die Peptidbindungen von Proteinen spalten). Abbauende Enzyme können inhibiert werden, indem der pH oder die Temperatur auf Werte eingestellt werden, die diese inaktivieren (vorausgesetzt, dies beeinflusst das interessierende Protein nicht nachteilig), oder indem Verbindungen zugesetzt werden, die spezifisch ihre Wirkung blockieren. 4. Adsorption an Oberflächen. Viele Proteine werden beim Kontakt mit der Luft-Wasser-Grenzfläche oder mit Glas- bzw. Plastikoberflächen denaturiert. Darum sollten Proteinlösungen relativ konzentriert gehalten und so behandelt werden, dass eine Schaumbildung minimiert wird. 5. Lagerung der Proben. Alle oben aufgeführten Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn eine gereinigte Proteinprobe stabil gehalten werden soll. Außerdem müssen Prozesse wie langsame Oxidation und mikrobielle Kontamination verhindert werden. Proteinlösungen werden manchmal in einer Stickstoff- oder Argonatmosphäre gelagert (anstatt unter Luft, die ca. 21% O, enthält) und bei -70°C oder bei -196 °C (der Temperatur von flüssigem Stickstoff) gefroren. Nachweis von Proteinen Die Reinigung einer Substanz setzt eine Methode zu deren quantitativem Nachweis voraus. Demzufolge muss ein Test (engl.: assay) entwickelt werden, der spezifisch für das Zielprotein, hochsensitiv und einfach zu handhaben ist (besonders, wenn er auf jeder Stufe eines Reinigungsprozesses wiederholt werden muss).

Zu den unkompliziertesten Protein-Assays gehören jene für Enzyme, die Reaktionen mit leicht nachweisbaren Produkten katalysieren, da die Geschwindigkeit der Produktbildung proportional zu der Menge des vorhandenen Enzymes ist. Reagenzien mit gefärbten oder fluoreszierenden Spaltprodukten wurden speziell für diesen Zweck entwickelt. Wenn keine solche Substanz für das zu untersuchende Protein verfügbar ist, kann das Produkt einer enzymatischen Reaktion auch durch die Wirkung eines zweiten Enzymes in eine leicht quantifizierbare Substanz umgewandelt werden. Dies wird als gekoppelte enzymatische Reaktion bezeichnet. Proteine, die keine Enzyme sind, können durch ihre Fähigkeit nachgewiesen werden, Substanzen spezifisch zu binden oder beobachtbare biologische Effekte zu erzeugen. Immunchemische Verfahren gehören zu den empfindlichsten Untersuchungstechniken. Bei Immunoassays werden Antikörper eingesetzt. Dies sind Proteine, die durch das Immunsystem eines Tieres als Antwort auf das Eindringen einer fremden Substanz (eines Antigens) produziert werden. Aus dem Blutserum eines immunisierten Tieres oder aus Kulturen von unsterblichen antikörperproduzierenden Zellen können Antikörper isoliert werden, die spezifisch an das ursprüngliche Proteinantigen binden. In einer komplexen Mischung kann ein Protein durch Bindung an seinen entsprechenden Antikörper nachgewiesen werden. Mit einer Technik, bekannt als

109

110

Proteine: Primärstruktur 1 Immobilisieren des ersten Antikörpers auf einem

festen Träger E'ster

Antikörper

2 Inkubation mit einer Protein

Abb. 5.3 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA). (1) Ein Antikörper gegen das zu untersuchende Protein wird auf einer inerten Fläche z.B. aus Polystyrol immobilisiert. (2) Die zu untersuchende Lösung wird zu der mit Antikörpern beschichteten Oberfläche gegeben. Der Antikörper bindet das zu untersuchende Protein, andere Proteine werden durch Waschen entfernt. (3) Der Protein-Antikörper-Komplex reagiert mit einem zweiten proteinspezifischen Antikörper, an den ein Enzym befestigt ist. (4) Die Bindung des zweiten Antikörper-Enzym-Komplexes kann gemessen werden, indem die Aktivität des Enzymes nachgewiesen wird. Die Menge des umgesetzten Substrates zeigt die Menge

des vorhandenen Proteins an. 6% siehe Animated Figures.

haltigen Probe Protein

3 Zugabe eines zweiten Antikörpers, der mit einem Defektionsenzym kovalent verbunden ist 4 Waschen und Nachweis |des Enzyms

Radioimmunoassay (RIA), wird das Protein indirekt nachgewiesen, indem man es mit einer radioaktiv markierten Standardsubstanz um die Bindung an einen Antikörper konkurrieren lässt. Eine andere Technik, der enzymgekoppelte Immunnachweis (ELISA, von engl.: enzyme linked immunosorbent assay), hat viele Varianten, von denen eine in Abbildung 5.3 veranschaulicht ist. Proteinkonzentrationen können spektroskopisch bestimmt werden

Die Konzentration einer gelösten Substanz kann man häufig mittels Absorptionsspektroskopie messen. Für Lösungen Licht-absorbierender Stoffe gilt das Lambert-Beer’sche Gesetz: A= log— = ecl

40.000 20.000 10.000 5.000 2.000 1.000 500 200 100 50 20 10 200

220

jajeei 240 260

| 280

300

J 320

X (nm)

Abb. 5.4 Die UV-Absorptionsspektren von Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Hier ist das molare Absorptionsvermögen (e, wenn c in mol L-1 ausgedrückt wird) für jede aromatische Aminosäure auf einer logarithmischen Skala dargestellt. [Nach Wetlaufer, D.B., Adv. Prot. Chem. 7, 310 (1962).]

Ö-1)

Dabei ist A die Absorption des gelösten Stoffes (manchmal auch als optische Dichte bezeichnet), I, die Intensität des einfallenden Lichts bei einer bestimmten Wellenlänge A, I die Intensität des austretenden Lichtes bei derselben Wellenlänge, e das Absorptionsvermögen (auch als Extinktionskoeffizient bezeichnet) des gelösten Stoffes bei der Wellenlänge A, c dessen Konzentration und 1 der Weg (in Zentimetern), den das Licht zurücklegt. Der Wert von & ändert sich mit A. Trägt man A oder g gegen A auf, so erhält man das Absorptionsspektrum des gelösten Stoffes. Ist & bekannt, lässt sich mit obiger Formel die Konzentration einer gelösten Substanz spektroskopisch ermitteln. Polypeptide absorbieren stark im Spektralbereich des ultravioletten Lichts (UV-Bereich; A = 200 bis 400 nm), hauptsächlich deshalb, weil ihre aromatischen Seitenketten (hauptsächlich diejenigen von Trp und Tyr) in diesem Spektralbereich besonders hohe Extinktionskoeffizienten besitzen (Abb. 5.4). Im Bereich des sichtbaren Lichts (A = 400 bis 800nm) absorbieren Polypeptide dagegen nicht, deshalb sind sie farblos. Wenn aber ein Protein ein Chromophor besitzt, das im sichtbaren Bereich des Spektrums absorbiert, kann dessen spezifische Absorption dazu verwendet werden, die Konzentration des Proteins selbst in einer Mischung mit anderen Proteinen zu bestimmen. Um die Reinigung eines Proteins zu verfolgen, ist es wichtig, die Gesamtmenge des Proteins nach jedem Reinigungsschritt zu bestimmen. Mit der Absorptionsspektroskopie bei 280nm kann man dies auf bequeme Weise bewerkstelligen. Da jedoch viele andere Substanzen (wie z.B. Nucleinsäuren), ebenfalls UV-Licht absorbieren, und da der Anteil der lichtabsorbierenden aromatischen Reste zwischen den Proteinen schwankt, erlauben die spektroskopischen Messungen im UV-Bereich nur angenäherte Schätzungen der tatsächlichen Proteinmenge, obwohl man damit theoretisch die Menge eines reinen Proteins mit bekanntem molaren Absorptionsvermögen exakt feststellen könnte. Zudem sind spektroskopische Methoden für Proteine nicht besonders empfindlich; sie können minimal 50 bis 100 ug Protein pro Milliliter erfassen. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, hat man mehrere alternative Techniken zur Bestimmung der Proteinkonzentration entwickelt. Im Bradford-Assay z.B. verursacht die Bindung von Coomassie Brilliant Blue

Proteinreinigung

70,8

soz

NH

OC,H, Coomassie Brilliant Blue

an ein Protein in saurer Lösung, dass sich das Absorptionsmaximum des Farbstoffs von 465nm nach 595nm verschiebt. Somit stellt die Absorption bei 595nm in einem Bradford-Assay ein direktes Maß für die vorhandene Proteinmenge dar. Außerdem ist der Bradford-Assay hoch empfindlich, er kann sogar lug Protein pro Milliliter detektieren. Trennungstechniken Proteine werden über Fraktionierungsverfahren gereinigt. In einer Folge unab-

hängiger Schritte werden die verschiedenen physikochemischen Eigenschaften des zu untersuchenden Proteins ausgenutzt, um es schrittweise von anderen Substanzen zu trennen. Die Absicht dabei ist nicht unbedingt, den Verlust des

gewünschten Proteins zu minimieren, sondern vielmehr, andere Komponenten der Mischung selektiv zu eliminieren, so dass nur die gesuchte Substanz zurückbleibt. Eine über mehrere Schritte verlaufende Proteinreinigung kann gleichermaßen als Kunst wie als Wissenschaft betrachtet werden. Während ein empirischer Ansatz bei der Auswahl der Reinigungsschritte zum Erfolg führen kann, erleichtert die Kenntnis einiger Fakten über das Zielprotein (oder die abzutrennenden Proteine) die Auswahl der Trennungstechniken. Die Charakteristika von Proteinen und anderen Biomolekülen, die den verschiedenen Trennungstechniken zu Grunde liegen, sind Löslichkeit, ionische Ladung, Molekülgröße und Bindungsspezifität für andere biologische Moleküle. Nachfolgend sind einige Trennungstechniken und die charakteristischen Größen, von denen sie abhängen, gegenübergestellt. Charakteristikum

Verfahren

Ladung

Ionenaustauschchromatographie Elektrophorese

Polarität

hydrophobe Interaktionschromatographie

Größe

Gelfiltrationschromatographie SDS-PAGE

Bindungsspezifität

Affinitätschromatographie

111

112

Proteine: Primärstruktur

(a)

B.

Zielprotein

Abb. 5.5 Fraktionierung durch Aussalzen. (a) Ein gut lösliches Salz, oft Ammoniumsulfat, wird zu der Lösung mit Makromolekülen bis zu einer Konzentration gerade unterhalb des Präzipitationspunktes des zu untersuchenden Proteins zugegeben. (b) Nach Zentrifugation werden die unerwünschten ausgefallenen Proteine (rote Kugeln) verworfen. Die Salzkonzentration im Überstand wird so weit erhöht, dass das gewünschte Protein (grüne Kugeln) ausfällt. (c) Nach einer zweiten Zentrifugation wird das Protein als Präzipitat erhalten und der Überstand verworfen.

Löslichkeit von Proteinen

Da ein Protein eine Vielzahl geladener Gruppen enthält, hängt seine Löslichkeit von der Konzentration an gelösten Salzen, dem pH und der Temperatur ab. Einige oder alle dieser Variablen können gezielt verändert werden, um bestimmte Proteine selektiv auszufällen, während andere gelöst bleiben. Die Löslichkeit eines Proteins erhöht sich bei geringen Ionenkonzentrationen, sobald Salz hinzu gegeben wird - ein Phänomen, das Einsalzen (engl.: salting in) genannt wird. Die zusätzlichen Ionen schirmen die zahlreichen ionischen Ladungen eines Proteins ab und schwächen dadurch die anziehenden Kräfte zwischen einzelnen Proteinmolekülen (solche Kräfte können zur Aggregation und Ausfällung führen). Wenn weiteres Salz zugegeben wird, nimmt die Löslichkeit des Proteins wieder ab. Dieser Aussalz- (engl.: salting out) Effekt ist primär das Resultat der Konkurrenz zwischen den zugegebenen Salzionen und anderen gelösten Bestandteilen um die Lösungsmittelmoleküle. Bei sehr hohen Salzkonzentrationen wird so viel Lösungsmittel zur Solvatisierung der zugegebenen Ionen benötigt, dass ein signifikant geringerer Teil zum Lösen anderer Substanzen, einschließlich der Proteine, zur Verfügung steht. Da verschiedene Proteine meist bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen ausgefällt werden, ist das Aussalzen die Basis für eines der am häufigsten eingesetzten Proteinreinigungsverfahren. Wenn man die Salzkonzentration einer Lösung, die verschiedene Proteine enthält, auf einen Wert gerade unterhalb des Präzipitationspunktes des zu reinigenden Proteins einstellt, können so bereits viele unerwünschte Proteine aus der Lösung entfernt werden (Abb. 5.5). Anschließend wird, nachdem die gefällten Proteine durch Filtration oder Zent-

Tab. 5.2

Isoelektrische Punkte einiger Proteine.

Protein

pl

Pepsin

zZ)

Ovalbumin (Huhn)

4,6

Serumalbumin (Mensch)

4,9

Tropomyosin

5

Insulin (Rind)

5,4

Fibrinogen (Mensch)

5,8

y-Globulin (Mensch)

6,6

Kollagen

6,6

Myoglobin (Pferd)

7,0

Hämoglobin (Mensch)

7,1

Ribonuclease A (Rind)

9,4

Cytochrom c (Pferd)

10,6

Histon (Rind)

10,8

Lysozym (Huhn)

11,0

Salmin (Lachs)

12

rifugation entfernt wurden, die Salzkonzentration der verbleibenden Lösung so weit erhöht, bis das gewünschte Protein ausgefällt wird. Mit diesem Verfahren ist eine deutliche Aufreinigung und Konzentrierung großer Proteinmengen möglich. Ammoniumsulfat, (NH,),SO,, ist wegen seiner hohen Löslichkeit (3,9 M in Wasser bei 0°C) das am häufigsten eingesetzte Reagenz, um Proteine auszusalzen, da es die Herstellung von Lösungen mit hoher Ionenstärke ermöglicht. Der pH der Lösung sollte nahe dem isoelektrischen Punkt (pl) des gewünschten Proteins eingestellt sein, da die Löslichkeit eines Proteins ohne Nettoladung am geringsten ist. Die pl-Werte einiger Proteine sind in Tabelle 5.2 aufgelistet.

C.

Chromatographie

Der Vorgang der Chromatographie (griech.: chroma, Farbe; graphein, schreiben) wurde 1903 von Mikhail Tswett entdeckt, als er gelöste Pflanzenpigmente mit Hilfe fester Adsorbenzien voneinander trennte. Bei den meisten Chromatographievorgängen werden heutzutage die zu fraktionierenden Substanzmischungen in einer Flüssigkeit (der mobilen Phase) gelöst und durch eine Säule geschickt, die eine durchlässige feste Matrix (die stationäre Phase) enthält. Während die gelösten Bestandteile durch die Säule fließen, interagieren sie mit der stationären Phase und werden verlangsamt. Der Grad der Verlangsamung ist von den Eigenschaften jedes gelösten Bestandteiles abhängig. Wenn die Säule lang genug ist, können Substanzen mit unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten getrennt werden. Die für die Proteinreinigung am besten geeigneten Chromatographieverfahren werden nach der Art der Interaktion zwischen Protein und stationärer Phase eingeteilt. Eine der frühesten Chromatographietechniken nutzte Filterpapierstreifen als stationäre Phase — ein Prozess, der Papierchromatographie genannt wurde. Die heutige Säulenchromatographie benutzt Derivate von Zellulose, Agarose oder Dextran (allesamt Kohlenhydratpolymere) oder Derivate von synthetischen

Proteinreinigung

Substanzen wie quervernetztes Polyacrylamid oder Silicate. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, engl.: high-performance liquid chromatography) benutzt automatisierte Systeme mit präziser Probenauftragung, mit kontrollierten Flussraten bei hohem Druck (bis zu 340 bar bzw. 34 MPa) und mit einer Online-Probendetektion. Als chromatographische Matrix werden speziell gefertigte Glas- oder Plastikkügelchen mit Durchmessern von 3 bis 300 um verwendet, die mit einer Schicht aus chromatographischem Material überzogen sind. Dies verbessert wesentlich die Geschwindigkeit, Auflösung und Reproduzierbarkeit der Trennung. Letzteres ist insbesondere dann wichtig, wenn die chromatographische Trennung mehrere Male wiederholt oder eher für analytische als für präparative Zwecke eingesetzt werden soll. lonenaustauschchromatographie Bei der Ionenaustauschchromatographie binden geladene Moleküle an entgegengesetzt geladene Gruppen, die an einer Matrix immobilisiert sind. Anionen binden an kationische Gruppen der Anionenaustauscher. Kationen binden an anionische Gruppen der Kationenaustauscher. Der vermutlich am häufigsten eingesetzte Anionenaustauscher besteht aus einer Matrix, die mit Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen versehen wurde. Die am häufigsten genutzte Matrix für Kationenaustauscher enthält Carboxymethyl (CM)-Gruppen.

DEAE: Matrix-CH,-CH,-NH(CH,CH,)} CM: Matrix-CH,-COO" Proteine und andere Polyelektrolyte (polyionische Polymere), die positive und negative Ladungen aufweisen, können in Abhängigkeit von ihrer Nettoladung sowohl an Kationen- als auch an Anionenaustauscher binden. Die Bindungsaffinität eines bestimmten Proteins ist von der Gegenwart anderer Ionen, die mit dem Protein um die Bindung am Ionenaustauscher konkurrieren und von dem pH der Lösung, der die Nettoladung des Proteins beeinflusst, abhängig. Die zu trennenden Proteine werden in einem Puffer mit geeignetem pH und geeigneter Salzkonzentration gelöst und auf eine Säule aufgetragen, die den Ionenaustauscher enthält. Die Säule wird anschließend mit dem Puffer gewaschen (Abb. 5.6). Während die Säule gewaschen wird, wandern Proteine mit relativ niedrigen Affinitäten zu dem Ionenaustauscher schneller durch die Säule als Proteine, die mit höherer Affinität binden. Der Waschpuffer wird nach dem Säulendurchlauf in einer Serie von Fraktionen aufgefangen. Proteine, die sehr fest an den Ionenaustauscher binden, können eluiert (von der Säule gewaschen) werden, indem ein Puffer (Eluent) mit einer höheren Salzkonzentration und einem pH verwendet wird, der die Affinität, mit der die Matrix das Protein bindet, reduziert. Der Proteingehalt des Eluats der Säule kann durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt werden. Die eluierten Fraktionen können auch durch spezifischere Tests direkt auf das gewünschte Protein hin untersucht werden. Hydrophobe Chromatographie

Hydrophobe Interaktionen zwischen Proteinen und der chromatographischen Matrix können für die Proteinreinigung ausgenutzt werden. Bei der hydrophoben Chromatographie ist das Matrixmaterial geringfügig mit Octyl- oder Phenylgruppen substituiert. Nicht polare Gruppen an der Oberfläche von Proteinen „interagieren“ mit den hydrophoben Gruppen, d.h. beide werden vom Kontakt mit dem polaren Lösungsmittel ausgeschlossen. Als Eluent wird typischerweise ein wässriger Puffer mit abnehmender Salzkonzentration (hydrophobe Effekte werden durch Erhöhung der Ionenstärken verstärkt), mit steigenden Detergenskonzentrationen (Detergenzien stören hydrophobe Interaktionen) oder mit veränderlichem pH eingesetzt.

113

114

Proteine: Primärstruktur (a)

(d)

(b)

Elutionspuffer mit hohem Salzgehalt

Elutions- — puffer mit geringem Salzgehalt

wenig Salz

viel Salz

Protein-Konzentration

Probenmischung Chromatographie- _

säule Fraktionsnummer oder Elutionsvolumen

7 Sequenziell gesammelte Fraktionen

Abb. 5.6 lonenaustauschchromatographie. Der braun gefärbte Bereich im Inneren der Säulen stellt den Ionenaustauscher dar und die farbigen Banden repräsentieren Proteine. (a) Ein in einem

kleinen Puffervolumen gelöstes Proteingemisch wird oben auf die Säulenmatrix aufgetragen. (b) Während die Elution fortschreitet, werden die Proteine als Ergebnis ihrer unterschiedlichen Affinität zu dem Austauscher in diskrete Banden aufgetrennt. In dieser Darstellung hat das erste Protein (rot) die Säule passiert und wurde als separate Fraktion isoliert. Die anderen Proteine

verbleiben nahe am Auftragungsort. (c) Die Salzkonzentration des Eluenten wird nun erhöht,

um die verbliebenen Proteine zu eluieren. (d) Elutionsdiagramm des Proteingemisches. 62% siehe Animated Figures.

Gelfiltrationschromatographie

Bei der Gelfiltrationschromatographie (auch Ausschluss- oder Molekularsiebchromatographie genannt) werden die Moleküle nach ihrer Größe und Form getrennt. Die stationäre Phase besteht aus Gelkügelchen, die Poren enthalten. Die

Größe dieser Poren liegt in einem relativ engen Bereich. Die Porengröße wird typischerweise durch den Grad der Quervernetzung zwischen den Polymeren des Gelmateriales bestimmt. Wenn eine wässrige Lösung mit Molekülen verschiedener Größen durch eine Säule mit solchen „Molekularsieben“ fließt, werden die Moleküle, die zu groß sind, um die Poren zu passieren, von dem Lösungsmittelvolumen in den Gelkügelchen ausgeschlossen. Diese großen Moleküle durchqueren die Säule schneller als kleine Moleküle, welche die Poren passieren können (Abb. 5.7). Weil die Porengrößen im Gel leicht streuen, können mehrere unterschiedlich große Moleküle mit Hilfe der Gelfiltration getrennt werden. Größere Moleküle mit Zugang zu weniger Poren werden früher eluiert (d.h. mit einem geringeren Volumen des Eluenten) als kleinere Moleküle, die Zugang zu dem größeren Volumen im Inneren des Geles haben. Für eine bestimmte Porengröße besteht innerhalb des Größenbereiches der zu trennenden Moleküle ein linearer Zusammenhang zwischen dem relativen Elutionsvolumen einer Substanz und ihrer molekularen Masse (vorausgesetzt die Moleküle haben ähnliche Formen). Wenn eine Gelfiltrationssäule mit einigen Proteinen kalibriert wurde, deren molekulare Massen bekannt sind, kann die Masse eines unbekannten Proteins relativ einfach aus seiner Elutionsposition abgeschätzt werden.

Proteinreinigung

(b)

(c)

(d)

115

(e)

Lösungsmittel

az»

2» Gelkügelchen

matrix

Substanzmenge

Gel-

Kleine Moleküle

kügelchen

Soße

Elutionsvolumen

Moleküle

Affinitätschromatographie Ein wichtiges Charakteristikum vieler Proteine ist ihre Fähigkeit, spezielle Moleküle fest aber nicht kovalent zu binden. Diese Eigenschaft kann zur Reinigung solcher Proteine durch Affinitätschromatographie genutzt werden (Abb. 5.8). Bei dieser Technik wird ein Molekül (ein Ligand), welches das interessierende Protein spezifisch bindet, kovalent an eine inerte Matrix angeheftet. Wenn eine Lösung, die das gewünschte Protein enthält, über dieses chromatographische Material fließt, bindet das Protein an den immobilisierten Liganden, während andere Substanzen mit dem Puffer durch die Säule gewaschen werden. Das gewünschte Protein kann anschließend in hoch reiner Form erhalten werden, indem es durch Änderung der Elutionsbedingungen von der Matrix freigesetzt wird. Die große Stärke der Affinitätschromatographie liegt in ihrer Fähigkeit, die oft einzigartigen biochemischen Eigenschaften des gewünschten Proteins zu nutzen anstelle der kleinen Unterschiede in den physikochemischen Eigenschaften der Proteine, die bei anderen Chromatographiemethoden ausgenutzt werden. Dementsprechend ist die Trennleistung der Affinitätschromatographie oft größer als die von anderen Chromatographietechniken. Affinitätschromatographiesäulen können durch chemisches Kuppeln kleiner Moleküle oder Proteine an eine chromatographische Matrix hergestellt werden. Bei der Immunoaffinitätschromatographie wird ein Antikörper an die Matrix gebunden, um das Protein zu reinigen, gegen das dieser Antikörper gerichtet ist. In allen Fällen muss der Ligand eine ausreichende Affinität zu dem interessierenden Protein aufweisen. Sie darf jedoch nicht zu hoch sein, damit bei der nachfolgenden Freisetzung des Proteins dieses nicht denaturiert wird. Das gebundene Protein kann durch Waschen der Säule mit einer Lösung eluiert werden, die eine hohe Konzentration des freien Liganden enthält oder sich in pH oder Ionenstärke von der zum Aufbringen auf die Säule eingesetzten Lösung unterscheidet.

Abb. 5.7 Gelfiltrationschromatographie. (a) Ein Gelkügelchen besteht aus einer Gelmatrix (gewellte Linien), die einen inneren Lösungsmittelraum umschließt. Kleine Moleküle (rote Punkte) können frei in den inneren Raum des Gelkügelchens eintreten. Große Moleküle (blaue Punkte) können die Gelporen nicht durchdringen. (b) Die Probenlösung wird am oberen Ende der Säule aufgetragen (die Gelkügelchen sind als braune Kugeln dargestellt). (c) Die kleinen Moleküle können in das Gel eindringen und wandern folglich langsamer durch die Säule als die großen Moleküle, die vom Gel ausgeschlossen werden. (d) Die großen Moleküle werden zuerst eluiert und in Fraktionen gesammelt. Kleine Moleküle erfordern ein größeres Lösungsmittelvolumen zur Elution. (e) Das Elutionsdiagramm oder Chromatogramm zeigt die vollständige Trennung der zwei Komponenten an. 6% siehe Animated Figures.

116

Proteine: Primärstruktur

Sn

9 N

|

feste Matrix Spezifische Bindung eines Moleküls an einen Matrix gebundenen Liganden Matrix gebundener Ligand Makromoleküle mit unterschiedlichen Ligandenbindungsstellen

In der Metallchelataffinitätschromatographie wird ein divalentes Metallion, wie z.B. Zn?* oder Ni?* so an die chromatographische Matrix gebunden, dass Proteine, die Metall-chelierende Gruppen (z. B. mehrere His-Seitenketten) besitzen, zurückgehalten werden. Mithilfe rekombinanter DNA-Techniken (Abschnitt 3.5) kann ein aus sechs aufeinander folgenden His-Resten bestehendes Segment, das auch als His-Tag bezeichnet wird, am N- oder C-Terminus des zu isolierenden Polypeptids angebracht werden. So entsteht eine künstliche Bindungsstelle für Metallionen. Mit Hilfe dieser Bindungsstelle kann dann das rekombinante Protein über Metallchelatchromatographie gereinigt werden. Nachdem das Protein, üblicherweise durch Ändern des pH-Wertes, von der Säule eluiert wurde, kann das His-Tag mit spezifischen Proteasen, die die (His);-Sequenz vom Rest des Proteins abspalten, wieder entfernt werden.

D.

Elektrophorese von Proteinen

Elektrophorese, die Wanderung von Ionen in einem elektrischen Feld, wurde in

Abschnitt 3.4B erklärt. Hier beschreiben wir ihre Anwendung zur Reinigung und Analyse von Proteinen.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abb. 5.83 Affinitätschromatographie. Ein Ligand (gelb) wurde durch kovalente Bindung an der chromatographischen Matrix immobilisiert. Die ausgeschnittenen Quadrate, Halbkreise und

Dreiecke stellen Ligandenbindungsstellen von Makromolekülen dar. Nur bestimmte Moleküle (orange Kreise) binden spezifisch an den Liganden. Die anderen Bestandteile werden durch die Säule gewaschen.

Die Elektrophorese von Proteinen wird typischerweise in Agarose- oder Polyacrylamidgelen mit charakteristischer Porengröße durchgeführt. Die molekularen Trennungen basieren demnach sowohl auf Siebeffekten als auch auf Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität. Die Elektrophorese unterscheidet sich jedoch von der Gelfiltration darin, dass die elektrophoretische Mobilität von kleinen Molekülen bei gleicher Ladungsdichte größer ist als die Mobilität von großen Molekülen. Der pH des Geles ist hoch genug (meist um pH 9), dass nahezu alle Proteine eine negative Ladung tragen und sich in Richtung der Anode bewegen, sobald ein elektrisches Feld angelegt wird. Moleküle mit gleicher Größe und Ladung bewegen sich als eine Bande durch das Gel. Nach der Elektrophorese können die getrennten Banden durch eine geeignete Methode sichtbar gemacht werden, wie z.B. Färben des Gels in einer Lösung eines Farbstoffs, der fest an das Protein bindet (z.B. Coomassie Brilliant Blue). Bei einer präparativen Gelelektrophorese werden die Proteine anschließend direkt aus dem Gel eluiert, üblicherweise ohne vorherige Färbung. Wenn die Proteine in einer Probe radioaktiv markiert sind, kann das Gel getrocknet und auf einen Röntgenfilm gelegt werden. Nach einer gewissen Zeit (die in Abhängigkeit von der Strahlungsintensität von einigen Minuten bis zu vielen Wochen reichen kann) wird der Film entwickelt und das erhaltene Autoradiogramm zeigt dann die Positionen der radioaktiven Bestandteile durch Schwärzungen des Filmes an. Wenn ein Antikörper für das gewünschte Protein vorhanden ist, kann er dazu benutzt werden, dieses im Gel in Gegenwart von vielen anderen Proteinen spezifisch nachzuweisen - ein Vorgang der Immunoblotting oder Westernblotting genannt wird und der dem ELISA-Verfahren ähnelt (Abb. 5.3). Abhängig von der Dimension des Gels und der verwendeten Nachweistechnik können selbst Proben, die weniger als ein Nanogramm Protein enthalten, mit Hilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt und nachgewiesen werden. SDS-PAGE

Bei einer Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wird das Detergens Natriumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecyl sulfate, SDS)

[CH3 - (CH3)},-CH2-0-5SO;]Na* zum Denaturieren der Proteine benutzt. Amphiphile Moleküle (Abschnitt 2.1C) wie SDS stören die hydrophoben Interaktionen, die normalerweise Proteine sta-

Proteinreinigung Abb. 5.9

SDS-PAGE.

Proben des Überstandes (links) und der Membranfraktionen (rechts) einer Präparation des Bakteriums Salmonella typhimurium wurden einer Elektrophorese in parallelen Bahnen eines 35 cm langen und 0,8 mm dicken Polyacrylamidstreifens unterzogen. Die mit MW bezeichnete Bahn enthält Markerproteine. [Mit freundlicher Genehmigung von Giovanna F. Ames, University of California at Berkeley.]

Überstäinde

a2 ®

117

Membranen

Bralwlsnseris]

ERS

MW

en u

Richtung der

Wanderung

bilisieren. In Gegenwart von SDS nehmen Proteine eine stäbchenförmige Gestalt an. Weiterhin binden die meisten Proteine SDS in einem Verhältnis von 1,4 g SDS pro g Protein (ca. ein SDS-Molekül pro zwei Aminosäurereste). Die große negative Ladung, die das SDS auf das Protein überträgt, überdeckt die natürliche Ladung des Proteins. Das Ergebnis ist, dass mit SDS behandelte Proteine alle eine vergleichbare Form und ein ähnliches Ladung-zu-Masse-Verhältnis aufweisen. SDS-PAGE trennt also Proteine mittels eines Gelfiltrationseffektes, d.h. auf Grund der molekularen Masse. In Abbildung 5.9 ist ein Beispiel für die Trennschärfe und Reproduzierbarkeit der SDS-PAGE gezeigt. Durch die SDS-PAGE können die molekularen Massen von Proteinen routinemäßig auf 5 bis 10% genau angegeben werden. Die relative Mobilität von Proteinen in solchen Gelen ist linear vom Logarithmus ihrer molekularen Massen abhängig (Abb. 5.10). In der Praxis wird die molekulare Masse eines Proteins bestimmt, indem es zusammen mit einigen „Marker“-Proteinen mit bekannter molekularer Masse (die im Größenbereich des interessierenden Proteins liegt) einer Elektrophorese unterworfen wird. Weil SDS nicht kovalente Interaktionen zwischen Polypeptiden zerstört, können über die SDS-PAGE nur die molekularen Massen der Untereinheiten von Multikomponentenproteinen bestimmt werden. Ob Untereinheiten über Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, kann dadurch überprüft werden, dass Proben für eine SDS-PAGE einmal in Gegenwart und einmal in Abwesenheit eines reduzierenden Agens wie 2Mercaptoethanol (HS-CH,-CH,-OH), das diese Bindungen bricht, vorbereitet werden (Abschnitt 5.3A). Kapillarelektrophorese

Obwohl die Gelelektrophorese in ihren verschiedenen Ausführungen bei der Trennung von geladenen Molekülen sehr effektiv ist, kann sie bis zu einigen Stunden dauern. Sie ist zudem schwierig zu quantifizieren und zu automatisieren. Diese Nachteile werden durch den Einsatz der Kapillarelektrophorese (engl.: capillary electrophoresis, CE) größtenteils vermieden. Bei dieser Technik wird die Elektrophorese in sehr dünnen Kapillarröhrchen durchgeführt (20 bis 75 um innerer Durchmesser). Solche engen Kapillaren leiten die Wärme sehr schnell ab

40 30

und erlauben dadurch die Verwendung von sehr starken elektrischen Feldern,

welche die Trennungszeiten auf wenige Minuten reduzieren. Die CE-Techniken haben eine extrem hohe Auflösung und können in gleicher Weise wie eine HPLC automatisiert werden, d.h. mit automatischer Probennahme und Online-Probendetektion. Da bei der CE nur kleine Probenmengen getrennt werden können, ist sie in ihrer Anwendung auf analytische Fragestellungen beschränkt.

(kD) Masse Molekulare

20

Die zweidimensionale Elektrophorese löst komplexe Proteinmischungen auf

Ein Protein hat geladene Gruppen beider Polaritäten und besitzt einen sogenannten isoelektrischen Punkt pI. Das ist der pH-Wert, bei dem seine Nettoladung null ist und es sich im elektrischen Feld nicht bewegt. Wird eine Proteinmischung in einer Lösung oder auf einem Gel in einem stabilen pH-Gradienten — mit einem kontinuierlichen pH-Anstieg von der Anode zur Kathode — elektrophoretisch getrennt, dann wandert jedes Protein zu der Stelle im pH-Gradienten, die seinem pl entspricht. Sobald ein Proteinmolekül von dieser Position weg diffundiert und in den Bereich eines anderen pH-Werts kommt, weist es eine elektrische Ladung auf, und die resultierenden elektrophoretischen Kräfte bringen es wieder an seine, dem isoelektrischen Punkt entsprechende Position zurück. Jedes Protein

10

a

ee

le

Relative Beweglichkeit

Abb. 5.10 Logarithmischer Zusammenhang zwischen der molekularen Masse eines Proteins und seiner elektrophoretischen Beweglichkeit in einer SDS-PAGE.

Dargestellt sind die Massen von 37 Proteinen, die zwischen 11 und 70 kD liegen. [Nach Weber, K.,

und Osborn, M.,J. Biol. Chem. 244, 4406 (1969).]

118

Proteine: Primärstruktur

Abb. 5.11

Zweidimensionale Gelelektrophorese.

In diesem Beispiel wurden E. coli-Proteine, die

mit '*C-Aminosäuren markiert waren, mittels der isoelektrischen Fokussierung (horizontal) und anschließend durch SDS-PAGE (vertikal) getrennt. In dem hier gezeigten Autoradiogramm sind mehr als 1000 Flecken aufgelöst. [Mit freundlicher Genehmigung von Patrick O’Farrell; University of California at San Francisco.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Welche Umgebungsbedingungen müssen während der Reinigung eines Proteins überwacht werden? 2.

wird dabei in einer scharfen Bande um seinen p/ fokussiert, weshalb man diese Art der Elektrophorese auch als isoelektrische Fokussierung (IEF) bezeichnet. Die IEF lässt sich mit der SDS-PAGE zu einer äußerst leistungsfähigen Trenntechnik, der zweidimensionalen (2D-) Gelelektrophorese, kombinieren. Zunächst wird eine Proteinprobe in einer Laufrichtung per isolektrischer Fokussierung getrennt, danach unterzieht man die so getrennten Proteine im rechten Winkel zur ersten Laufrichtung einer SDS-PAGE. Das Verfahren erzeugt eine Reihe von Punkten, von denen jeder ein Protein repräsentiert (Abb. 5.11). In einem einzigen zweidimensionalen Elektropherogramm lassen sich so bis zu 5000 Proteine darstellen.

Beschreiben Sie, wie ein Protein

mit Hilfe eines Tests oder mittels Absorptionsspektroskopie quantifiziert werden kann.

Die zweidimensionale

Gelelektrophorese ist ein wertvolles Werkzeug in der

Proteomik, einem Forschungsgebiet, das sich mit der Katalogisierung aller von einer Zelle zu einem definierten Zeitpunkt synthetisierten Proteine befasst. Dies schliesst deren Quantifizierung, Lokalisierung, sofern subzelluläre Struktu-

3. Erklären Sie, wie der Aussalz-

ren analysiert werden, und Modifikationen ein. Im angefärbten 2D-Gel kann

Effekt in der Proteinfraktionierung verwendet wird. 4. Beschreiben Sie die Grundlagen der Trennung von Proteinen durch Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Affinitätschromatographie. 5. Beschreiben Sie das Verfahren

man die einzelnen Proteinflecken mit einem Skalpell ausschneiden, entfärben und das Protein aus dem Gelstückchen eluieren, um es zu identifizieren und/ oder zu charakterisieren, zumeist mit Hilfe der Massenspektrometrie (Abschnitt 5.3D). Hat man 2D-Elektropherogramme gescannt und digitalisiert, so kann man sie mit Hilfe des Computers analysieren und z.B. Abweichungen in den Positionen und Intensitäten der Proteinflecken zwischen verschieden Proben erkennen, die man aus verschiedenen Geweben oder unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen gewonnen hat. Inzwischen sind zahlreiche 2DReferenz-Gele in frei zugänglichen Datenbanken über das Internet verfügbar (siehe http://us.expasy.org/ch2d/). Diese Datenbanken enthalten Referenzabbildungen von 2D-Proteingelen einer Vielzahl von Organsimen und Geweben, auf denen viele Punkte bereits analysiert und bestimmten Proteinen zugeordnet sind. Ihre Verwendung ist in der bioinformatics exercise 5-4 (www.wiley.com/ college/voet) dargestellt.

der Gelelektrophorese, der SDS-PAGE und der

2D-Gelelektrophorese.

3 6% siehe Guided Exploration 4: Protein Sequence Determination.

Proteinsequenzierung

Wenn erst einmal eine reine Proteinprobe vorliegt, kann sie für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden. Wenn aber das Protein vorher noch nicht charakterisiert wurde, ist der nächste Schritt oft die Bestimmung seiner Aminosäuresequenz. Die erste bekannte Proteinsequenz war die von Rinder-Insulin. Sie wurde 1953 von Frederick Sanger bestimmt. Damit wurde definitiv bestätigt, dass Proteine definierte kovalente Strukturen aufweisen (Exkurs 5.1). Seitdem

Proteinsequenzierung

BE

119

Bl Berühmte Biochemiker

Frederick Sanger und die Proteinsequenzierung Frederick Sanger (1918-)

ziert werden. Sanger stellte fest, dass manche

Früher glaubten viele Biochemiker, dass Proteine

amorphe

„Kolloide“

verschie-

dener Größe, Form und Zusammensetzung seien. Erst als es in den 1940erJahren möglich wurde, die Aminosäurezusammensetzung

eines

Proteins

zu

bestimmen, wurde diese Auffassung weitgehend aufgegeben. Diese Analysen konnten zwar die genaue Anzahl für alle in einem Protein enthaltenen Aminosäuren liefern, sagten jedoch nichts darüber aus, in welcher Reihenfolge die Aminosäuren verbunden waren. Tatsächlich fragten sich Skeptiker immer noch, ob Proteine überhaupt eindeutige Sequenzen hätten. Eine plausible Theorie lautete, dass Proteine eine Mischung ähnlicher, aus kürzeren Stücken zusammengesetz-

ter Moleküle darstellten. Manche Untersuchungen gingen so weit, dass sie Regeln formulierten, welche die relativen Stö-

chiometrien und die Abstände der verschiedenen Aminosäuren in Proteinen beschreiben sollten. In den 1940er-Jahren verbesserte sich die Genauigkeit der Aminosäurenanalyse infolge der Entwicklung von Chromatographietechniken für die Trennung der Aminosäuren und der Verwendung des Reagens’ Ninhydrin. Dieses bildet mit Aminosäuren

farbige Addukte, die man für eine quantitative

Bestimmung nutzen kann (frühere Methoden verwendeten schwerfällige biologische Tests). Frederick Sanger, der 1943 an

der

Proteinsequenzierung

zu

arbeiten

begann,

nutzte

diese neuen Techniken ebenso wie die klassische organische Chemie. Sangers ursprüngliche Intention war es nicht, ein Protein zu sequenzieren; seine ersten Experimente zielten da-

rauf ab, eine bessere Methode zur Messung freier Aminogruppen zu entwickeln, wie z.B. der Aminogruppen, die den N-Terminus von Polypeptiden bilden. Sanger

verwendete

das

Reagens

2,4-Dinitrofluorbenzol,

das an den endständigen Aminogruppen ein gelbes Dinitrophenyl-(DNP-)Derivat bildet, ohne dabei irgendeine Peptidbindung aufzubrechen. NO,

DNP-Amino-

säurenderivate während der Hydrolyse instabil waren, deshalb musste dieser Schritt abgekürzt werden. Bei seinen vergleichenden Untersuchungen von langen und kurzen Hydrolysezeiten konnte Sanger zusätzliche gelbe Flecken beobachten, die Dipeptiden oder anderen kleinen Peptiden mit intakten Peptidbindungen entsprachen. Diese Dipeptide konnte er isolieren und so die zweite Aminosäure in der Proteinsequenz

bestimmen.

Sangers Genius war es, dass er

erkannte, dass mit dieser Methode die Aminosäuresequenz

kompletter Proteine bestimmt werden konnte, indem man die Sequenzen von sich überlappenden kleinen Peptiden unvollständig hydrolysierter Proteine bestimmte. Um dieses Grundprinzip in eine verlässliche Labormethode zur Proteinsequenzierung zu überführen, war ein enormes Maß an Arbeit erforderlich. Als erstes Untersuchungsobjekt wählte Sanger Insulin, weil es eines der kleinsten

bekannten

Pro-

teine war. Insulin enthält 51 Aminosäuren in zwei Polypeptidketten (A und B genannt). 195] war die Sequenz der 30 Aminosäuren in der B-Kette ermittelt, und zwei Jahre später auch die Sequenz der A-Kette (21 Aminosäuren). Da die beiden Ketten über Disulfidbrücken verbunden sind, war Sanger auch

bestrebt,

die

optimale

Methode

Brücken zu spalten und dann’deren

zu

finden,

diese

Position im intakten

Protein zu ermitteln; dieses Ziel erreichte er 1955. Diese bahnbrechenden Arbeiten, die insgesamt mehr als

ein Jahrzehnt in Anspruch genommen hatten, und bei denen Sanger sein Fachwissen in der organischen Chemie (die Spaltungs- und Derivatisierungsreaktionen) mit der Entwicklung analytischer Methoden für die Trennung und Identifizierung der Reaktionsprodukte

verband,

brachten

ihm im

Jahre 1958 seinen ersten Nobelpreis ein (er bekam 1980 einen zweiten Nobelpreis für seine Erfindung der Kettenabbruchmethode bei der Nucleinsäuresequenzierung; siehe Abschnitt 3.4C). Die Bedeutung von Sangers Leistung und Weitblick

wird

dadurch

unterstrichen,

dass

seine

Herang-

ehensweise an die Sequenzierung von Polypeptiden und Nucleinsäuren auch ein halbes Jahrhundert später immer noch weit verbreitet ist. Die Veröffentlichung der Aminosäuresequenz von Insulin im Jahre 1955 überzeugte die letzten Zweifler davon, dass jedes Protein eine einzigartige Aminosäuresequenz besitzt.

NO,

NO,

12 3

NO,

* 2,4-Dinitrofluor-

RK

CH

|

e=0O

1E }

HF

ig

R}

|

cr

one

Ü Polypeptid

DNP-Polypeptid

benzol (DNFB)

Wird das Protein anschließend hydrolysiert, d.h. werden all seine Peptidbindungen aufgebrochen, dann behält nach chromatographischer Trennung des Hydrolysats die N-terminale Aminosäure die DNP-Markierung und kann dadurch identifi-

Sangers Arbeit beflügelte auch die Diskussion über die Existenz eines genetischen Codes, dem Bindeglied zwischen der Aminosäuresequenz eines Proteins und einer Nucleotidsequenz in der DNA - eines Moleküls, dessen Struktur 1953 gerade erst aufgeklärt worden war. Sanger, F., Sequences, sequences, sequences. Annu. Rev. Biochem. 57,

1-28 (1988). [Eine wissenschaftliche Autobiographie, die einen Eindruck von den frühen Schwierigkeiten der Proteinsequenzierung vermittelt.] Sanger F., Thompson E.O.P., Kitai, R., The amide groups of insulin.

Biochem. J. 59, 509-518 (1955).

120

Proteine: Primärstruktur

wurden viele Proteine sequenziert und die Sequenzen von vielen weiteren Proteinen wurden aus ihren DNA-Sequenzen abgeleitet. Die Aminosäuresequenzen

Hunderttausender Polypeptide sind bis heute bekannt. Solch eine Information ist aus den folgenden Gründen nützlich: 1. Die Kenntnis der Aminosäuresequenz eines Proteins ist die Voraussetzung für die Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur und ist wichtig für das Verständnis seiner molekularen Wirkmechanismen. 2. Sequenzvergleiche innerhalb analoger Proteine verschiedener Spezies geben Einblicke in die Proteinfunktion und zeigen evolutionäre Zusammenhänge zwischen den Proteinen und den Organismen auf, die sie synthetisieren. 3. Viele vererbbare Krankheiten werden durch Mutationen hervorgerufen, die zu einem Aminosäureaustausch in einem Protein führen. Die Analyse der Aminosäuresequenz kann bei der Entwicklung eines diagnostischen Testes und der effektiven Therapie helfen. Die Bestimmung der Insulinsequenz mit ihren 51 Resten (Abb. 5.1) nahm ca. 10 Jahre in Anspruch. Dabei wurden ca. 100 g Protein benötigt. Die Verfahren

Protein aus zwei Ketten

(über Disulfidbrücken

Slzmele)

verbunden)

| 1. Reduktion der

Disulfidbrücken

+

u

hen

Sa

2.a chemische oder enzymatische Spaltung, Entstehung definierter

2.b alternative Spaltung erzeugt unterschiedliche

Bruchstücke

Bruchstücke

3.a Sequenzbestimmung

3.b Sequenzbestimmung

der Bruchstücke

der Bruchstücke

TDI

SGE

CY

CF

FCYK

HNYCFR

KTDI

HNY

GVAGRF

RSGE

GVAGR

4. Rekonstruktion der Ursprungssequenz aus den überlappenden Sequenzen der Bruchstücke

GVAGRFCYKTDI

HNYCFRSGE

5. erneute Spaltung ohne vorherige Reduktion der Disulfidbrücken ermöglicht die Bestimmung der verbrückten Cysteinreste

GVAGRFCYKTDI

Abb. 5.12

Proteinsequenzierung HNYCFRSGE

Proteinsequenzierung

für die Bestimmung der Primärstruktur wurden seitdem derart verfeinert und automatisiert, dass die meisten Proteine heutzutage innerhalb weniger Tage automatisch sequenziert werden können. Dazu werden nur wenige Mikrogramm Material benötigt. Polypeptide mit bis zu 25 Resten können mit Hilfe der Massenspektrometrie sequenziert werden. Bei dieser Technik werden die Massen von ionisierten Peptidfragmenten direkt bestimmt. Die grundlegende Vorgehensweise zur Proteinsequenzierung ist jedoch ähnlich dem Verfahren, das von Sanger entwickelt wurde. Kurz gesagt, das Protein muss in ausreichend kleine Fragmente zerlegt werden, die anschließend individuell sequenziert werden. Die Primärstruktur des intakten Proteins wird dann aus den Sequenzen überlappender Fragmente wieder zusammengesetzt (Abb. 5.12). Wie wir in Abschnitt 3.4C gesehen haben, wird ein analoges Verfahren auch zur DNA-Sequenzierung verwendet.

A.

Vorbereitende Schritte

Die vollständige Aminosäuresequenz eines Proteins beinhaltet die Sequenzen jeder seiner Untereinheiten. Sofern Untereinheiten vorhanden sind, müssen diese vor Beginn der Sequenzierung identifiziert und isoliert werden. Die Endgruppenanalyse gibt die Anzahl der verschiedenen Untereinheiten an

Jede Polypeptidkette (wenn sie nicht chemisch blockiert ist) hat einen N-terminalen und einen C-terminalen Rest. Durch Identifizierung dieser Endgruppen kann die Anzahl der chemisch unterschiedlichen Polypeptide innerhalb eines Proteins ermittelt werden. So enthält z.B. Insulin die N-terminalen Reste Gly und Phe in den gleichen Mengen, was darauf hindeutet, dass es zwei nicht identische Polypeptidketten in der gleichen Anzahl enthält. Der N-Terminus eines Polypeptids kann durch mehrere Methoden bestimmt werden. Die fluoreszierende Verbindung 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonylchlorid (Dansylchlorid) reagiert mit primären Aminen, so dass dansylierte Polypeptide erhalten werden (Abb. 5.13). Durch saure Hydrolyse werden die modifizierten N-terminalen Reste freigesetzt, die dann chromatographisch getrennt und durch ihre intensive gelbe Fluoreszenz identifiziert werden können. Der N-terminale Rest kann ebenso durch den ersten Schritt des Edman-Abbaus (Abschnitt 5.3C) identifiziert werden. Bei diesem Verfahren werden die Aminosäuren schrittweise einzeln vom N-Terminus des Polypeptids her freigesetzt. Disulfidbindungen zwischen und innerhalb von Polypeptiden werden gespalten Disulfidbindungen zwischen Cys-Resten müssen gespalten werden, um Poly-

peptidketten — die über ein Disulfid verbunden sind — zu trennen und um die durchgängige Linearität der Polypeptidketten sicherzustellen. Dies ist notwendig, damit auch die Reste in Polypeptiden, die über viele Disulfidbindungen „verknotet“ sind, für alle bei der Sequenzierung verwendeten Enzyme und Rea-

genzien erreichbar sind. Disulfidbindungen können durch 2-Mercaptoethanol oder ein anderes Mercaptan (Verbindungen, die eine SH-Gruppe besitzen) reduktiv gespalten werden:

2

hielt

—NH-CH—C— u.

CH,

CH,

SH

|

+

S

2HSCH,CHHOH

——-

CH NIE Cystin

SCH,CH,OH SCH,CH,OH

.;

|

CH (

1

eu

N

CH,

Be

Gdligi:

...

2-Mercaptoethanol

—

O

|

NH—CH—C—

Cystein

...

121

122 Abb. 5.13

Proteine: Primärstruktur

Die Reaktion von Dansylchlorid mit primären Aminogruppen wird für die Endgruppenanalyse

4

N

0

ER CH—C H,N—CH—-C—NH

+

OO

By

0

R,

N(CH3)3

Dansylchlorid-Reaktion.

genutzt.

0 cl Polypeptid

1-Dimethylaminonaphthyl5-sulfonylchlorid (Dansylchlorid) Base

HC]

tn!

bl

ushneri: nl

| NH—CH—C—NH—CH— C—-NH—-CH—-C-— Dansyliertes Polypeptid

H,O

Hr

N(CH3)o

ie |

|

NH—CH—C-OH

+

+

h

HsN—CH—-COOH

Dansylierte Aminosäure (fluoreszierend)

+

+

;

H;N-CH-COOH

+

Freie Aminosäuren

Die erhaltenen freien Sulfhydrylgruppen werden anschließend alkyliert, üblicherweise durch Behandlung mit Iodessigsäure, um die Neubildung von Disulfidbindungen durch Oxidation mit O, zu vermeiden:

Cys—CH,—SH Cystein

+

ICH,C00O”

——>

Iodoacetat

Cys—CH,—S—CHzC0O

+

HI

S-Carboxymethylcystein

(CM-Cys)

B.

Spaltung von Polypeptiden

Polypeptide, die größer als 40 bis 100 Reste sind, können nicht direkt sequenziert werden und müssen deshalb entweder enzymatisch oder chemisch in spezifische Fragmente gespalten werden, die für eine Sequenzierung klein genug sind. Verschiedene Endopeptidasen (Enzyme, welche die Hydrolyse interner Peptidbindungen katalysieren) können für die Fragmentierung der Polypeptide genutzt werden. Diese Enzyme weisen, wie die Exopeptidasen, bestimmte Anforderungen an die Reste auf, die die zu spaltende Peptidbindung umgeben (Tab. 5.3). Das Verdauungsenzym Trypsin besitzt die höchste Spezifität und ist deshalb das wertvollste Instrument im Arsenal der Peptidasen, die für die Fragmentierung von Polypeptiden benutzt werden. Es spaltet Peptidbindungen an der C-terminalen Seite (in Richtung des Carboxyterminus) der positiv geladenen Reste Arg und Lys, wenn der nachfolgende Rest kein Pro ist.

Proteinsequenzierung Tab. 5.3 Spezifität verschiedener Endopeptidasen. Be EEE FREE ELBE BD DsEel 1E

BEI

Ri

EEE

1370

IE

er

nauerchrz.Ores-NH

Enzym

Herkunft

zz TIrypsin

ee Rinderpankreas

R4

law

123

EEE

(©)

|

sch CC

zu spaltende Peptidbindung Spezifität

REIS

EEE

PETE

EEE

DB

Anmerkungen

BEER 1VDE:

R..ı = positiv geladene Reste: Arg, Lys; R, # Pro

hochspezifisch spaltet langsamer bei R,_, = Asn, His, Met, Leu

Chymotrypsin

Rinderpankreas

R,_., = sperrige hydrophobe Reste: Phe, Trp, Tyr; R, # Pro

Elastase

Rinderpankreas

R.., = kleine neutrale Reste: Ala, Gly, Ser, Val; R, # Pro

Thermolysin

Bacillus thermoproteolyticus

R. = Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val; R,, # Pro

spaltet gelegentlich bei R, = Ala, Asp, His, Thr, hitzestabil

Pepsin

Rindermagenschleimhaut

R„ = Leu, Phe, Trp, Tyr; R,_, # Pro

ebenso andere; relativ unspezifisch; pH-Optimum = 2

Endopeptidase V8

Staphylococcus aureus

R,_., = Glu

-

+

en

Lys

ns

go

(or Arg)

CH,

Ge

CH;

CH; |

+

1020{brabsatabin A

-NH—CH— C—NH—CH—C—

CH,

H,O

:

„+

Bam

Jeder Aminosäurenrest außer Pro

Die anderen in Tabelle 5.3 aufgeführten Endopeptidasen weisen eine geringere Seitenkettenspezifität als Trypsin auf und es werden oft Serien von Peptidfragmenten mit überlappenden Sequenzen erhalten. Durch limitierte Proteolyse, d.h. durch Einstellen der Reaktionsbedingungen und durch kurze Reaktionszeiten, kann auch mit diesen weniger spezifischen Endopeptidasen ein Satz diskreter, nicht überlappender Fragmente erhalten werden. Verschiedene chemische Reagenzien bewirken eine Spaltung der Peptidbindung an bestimmten Resten. Das Nützlichste von diesen ist Cyanbromid (CNBr), das an der C-terminalen Seite von Met-Resten spaltet (Abb. 5.14).

C.

Edman-Abbau

Nachdem die durch spezifische Spaltungsreaktionen gebildeten Peptidfragmente isoliert wurden, kann deren Aminosäuresequenz bestimmt werden. Dies wird üblicherweise durch wiederholte Cyclen des Edman-Abbaues erreicht. Bei dieser Reaktion (benannt nach ihrem Erfinder, Pehr Edman) reagiert Phenylisothiocyanat (PITC) mit der N-terminalen Aminogruppe eines Polypeptids unter leicht alkalischen Bedingungen zum Phenylthiocarbamoyl (PTC)-Addukt (Abb. 5.15). Dieses Produkt wird anschließend mit wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt,

die den N-terminalen

io

-NH—-CH—C-07 + HBN—CH-C—-.-

trypsin

m

Rest als Thiazolinonderivat

abspaltet,

die anderen Peptidbindungen jedoch nicht hydrolysiert. Beim Edman-Abbau

124

Proteine: Primärstruktur

IGE 1=N

|

CH

CH, NEL

Br

”

Cyan-

| CHIIH

bromid

|

:NH— ne — 1A

R >

OÖ Bra

De

& —Cc=N

oe

e Ni

wird somit der N-terminale Aminosäurerest freigesetzt, die verbleibende Polypeptidkette aber intakt gelassen. Die Thiazolinon-Aminosäure wird selektiv mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und durch Behandlung mit wässriger Säure in das stabilere Phenylthiohydantoin (PTH)-Derivat umgewandelt. Diese PTH-Aminosäure kann später chromatographisch identifiziert werden. Es ist also möglich, die Aminosäuresequenz einer Polypeptidkette vom NTerminus fortschreitend durch wiederholte Cyclen des Edman-Abbaues und durch Identifizierung der nach jedem Cyclus neu freigesetzten PTH-Aminosäure zu bestimmen. Die Technik des Edman-Abbaues wurde so weit automatisiert und perfektioniert, dass sie rasch und mit geringem Materialeinsatz durchgeführt werden kann. Das erste automatische Gerät, Sequenator genannt, wurde von Edman und Geoffrey Begg entwickelt. Bei den moderneren Instrumenten wird die Peptidprobe auf einem Glasfaserfilter getrocknet. Anschließend werden in einem Argonstrom exakt dosierte Reagenzien in programmierten Intervallen als Dämpfe freigesetzt. Bis zu 100 Reste können identifiziert werden, bevor kumulative Effekte durch unvollständige Reaktionen, Nebenreaktionen und Peptidverluste eine weitere Aminosäureidentifizierung unzuverlässig werden lassen. Weil weniger als ein Picomol einer PTH-Aminosäure nachgewiesen und identifiziert werden kann, kann die Sequenzanalyse selbst von 5 bis 10 pmol eines Peptids durchgeführt werden (das ist weniger als 0,1 ug — eine unsichtbar kleine Menge).

D.

H,0

Peptidylhomoserinlacton

| ||

Abb. 5.14 Cyanbromidspaltung eines Polypeptids. CNBr reagiert spezifisch mit Met-Resten und führt zur Spaltung der Peptidbindung an deren C-terminalen Seite. Der neu entstandene C-terminale Rest bildet eine cyclische Struktur, die als Peptidylhomoserinlacton bezeichnet wird.

_Massenspektrometrie zur Bestimmung der Molekülmasse von Peptiden

Die Massenspektrometrie ist heute eine der wichtigsten Techniken für die Charakterisierung und Sequenzierung von Polypeptiden. Sie vermag sehr exakt das Masse-Ladungs-Verhältnis m/z von Ionen in der Gasphase zu bestimmen (wobei m die Masse des Ions und z seine Ladung ist). Bis Mitte der 1980er Jahre konnten Makromoleküle wie Proteine und Nucleinsäuren nicht mit Hilfe der Massenspektrometrie untersucht werden. Dies lag daran, dass Makromoleküle während des ersten Schrittes der klassischen massenspektrometrischen Analysemethoden, der Erzeugung von Ionen in der Gasphase durch thermische Verdampfung und nachfolgende Ionisierung durch Elektronenbeschuss, weitest gehend zerstört werden. Neuere Techniken haben dieses Problem jedoch lösen können. Bei der Elektrosprayionisierung (ESI) z.B. wird eine Lösung mit dem zu bestimmenden Protein aus einer engen, unter hoher Spannung (4000 V) stehenden Kapillare gesprüht. Dabei bilden sich feine, stark geladene Tröpfchen, aus denen das Lösungsmittel rasch verdunstet (Abb. 5.160). Dieser Vorgang erzeugt eine Wolke aus makromolekularen Gasphase-Ionen, die normalerweise eine Ionenladung im Bereich von +0,5 bis +2 pro Kilodalton aufweisen. Die Ladungen stammen aus der Protonierung basischer Seitenketten wie z.B. Arg und Lys. Diese Ionen werden in das Massenspektrometer geleitet, das ihre m/z-Werte mit einer Abweichung von weniger als 0,01 % misst (Abb. 5.16b). Wenn z des Peptidions bekannt ist, kann die Massenspektrometrie dessen Molekülmasse mit weit größerer Genauigkeit ermitteln als irgendeine andere Methode. Kurze Polypeptide aus weniger als 25 Aminosäuren können sogar mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie direkt sequenziert werden. Wie der Name andeutet, sind hierbei zwei Massenspektrometer in Reihe geschaltet (Abb. 5.17). Das erste Massenpektrometer dient dazu, einzelne Peptidionen aus der Probe zu isolieren. Das ausgewählte Peptidion wird dann in eine Kollisionszelle gelenkt, wo es mit chemisch trägen Atomen

wie Helium

zusammenstößt.

Die

dabei auf das Peptidion übertragene Energie bewirkt, dass es an einer seiner Peptidbindungen bricht, wodurch aus jedem Peptidion ein oder zwei geladene

OiSe

Proteinsequenzierung

a

n

EN0—C -NH—-CH—H-C—NH-CH—-0—

Phenylisothiocyanat

.-.- =

Polypeptid

(PITC)

|onRO De ran 2 116Daum Dale

Se

Bas TR

en

Ss

ae

...

PTC-Polypeptid F3CCOOH (wasserfrei)

Rı N

04

(0)

nn \ x

r

ei PT BNScH Cm +

S

ER er

Um seinen N-terminalen Rest

verkürztes ursprüngliches Polypeptid

Thiazolinon-Derivat

I"

PTH-Aminosäure

Fragmente entstehen. Die Molekülmasse der auf diese Weise erzeugten Fragment-Ionen wird dann mit dem zweiten Massenspektrometer bestimmt. Der Vergleich der Molekülmassen von zunehmend größeren Bruchstücken erlaubt die Ermittlung der Zunahme der Molekülmasse und damit die Identifizierung der aufeinander folgenden Aminosäurereste. Auf diese Weise kann die Sequenz eines ganzen Polypeptids aufgeklärt werden. Eine gewisse Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Massenspektrometrie nicht die isomeren Aminosäuren Ile und

Leu unterscheiden

kann, weil sie exakt die gleiche Masse

besitzen,

und dass sie nicht immer zuverlässig zwischen Gln und Iys unterscheiden kann, weil deren Molekülmassen nur um 0,036 D differieren. Der Einsatz von Computern beim Massenvergleich hat die für die Sequenzierung eines kurzen Polypeptids erforderliche Zeit auf nur einige wenige Minuten reduziert. Zum Vergleich: ein Cyclus des Edman-Abbaus dauert unter Umständen eine Stunde. Weiter verbessert wurde die Zuverlässigkeit dieses Prozesses durch die Möglichkeit zum computerisierten Vergleich des Massenspektrums mit den Spektren der Peptide bekannter Sequenzen, die in Datenbanken verfügbar sind. Die Massenspektrometrie kann auch dazu verwendet werden, Peptide mit chemisch blockierten N-Termini zu sequenzieren (was den Edman-Abbau

125

Abb. 5.15 Edman-Abbau. Die Reaktion läuft in drei Stufen ab, von denen jede unterschiedliche Reaktionsbedingungen erfordert. Die Aminosäurereste können auf diese Weise sequenziell vom N-Terminus eines Polypeptids her kontrolliert und schrittweise freigesetzt werden. 6% siehe Animated Figures.

126

Proteine: Primärstruktur

(a)

N

Proben-

' Kapillare 6, —

lösung

mug u

|

:

a

=. wi,

/

? :

Abb. 5.16

atmosphärischer

geringes

Druck

Vakuum

Massendetektor

Be F 40%

_ k

+ +4

ru +

Elektrosprayionisierungsmassen-

spektrometrie (ESI-MS).

en

= \

mIz

ee,

Detektor

:

ESI-Massenspektrum

re

hohes Vakuum

Ss

(b)

100

(a) N,-Trockengas beschleunigt die Verdampfung des Lösungsmittels aus geladenen Tröpfchen, die

+17 998,4

+20

das analysierte Protein enthalten; zurück bleiben

Gasphase-Ionen, deren Ladung auf die Protonierung von Arg- und Lys-Resten zurückzuführen ist. Dann ermittelt das Massenspektrometer das Verhältnis der Masse zur Ladung dieser Ionen. Das

80

sich ergebende Massenspektrum besteht aus einer

60

848,7

+14

+16 nz

Reihe von Peaks. Die dazugehörigen Ionen unterscheiden sich jeweils um eine einzige lonenladung und um die Masse eines Protons. [Nach Fitzgerald, M.C. und Siuzdak, G., Chem. Biol. 3, 708 (1996).]

+12 1414,0

40

(b) Das ESI-Massenspektrum von Apomyoglobin (Myoglobin, dem sein Häm-Eisen-Komplex fehlt) des Pferdeherzens. Für die meisten Peaks sind die

Häufigkeit Relative

gemessenen m/z-Quotienten und die abgeleiteten

20

-

Es

1542,3 +23

Ladungen angegeben. Die Daten in diesem Spektrum erlauben die Berechnung der Masse des Urprungsproteins (siehe Rechenbeispiel 5.1). [Nach Yates, J. R., Methods Enzymol. 271, 353

li

(1996).]

600

138,1 ee

.

er; 1696,3

|

Laub

800

Na

1000

1200

1400

: N af

1600

a Miles

1800

2000

mI/z

MS-1

Kollisionszelle

lonenquelle

Abb. 5.17. Tandemmassenspektrometrie bei der Peptidsequenzierung. Die zur Elektrosprayionisierung (ES!) verwendete lonenquelle erzeugt verschiedene Peptid-Ionen, die mit P,, P, usw. bezeichnet sind. Diese Peptide werden entsprechend ihrer m/z-Werte vom ersten Massenspektrometer (MS-1) getrennt; eines davon (hier P;) wird in die Kollisionszelle geleitet, wo es mit Heliumatomen zusammenstößt. Dabei zerbricht das Peptid in Fragmente (F,, F, usw.), die zur Bestimmung ihrer m/z-Werte in das zweite Massenspektrometer (MS-2) gelenkt werden. [Nach Biemann, K., und Scoble, H.A., Science 237,

992 (1987)]

Proteinsequenzierung

verhindert) sowie dazu, verschiedene andere posttranslationale Modifikationen, wie das Vorhandensein von Phosphat- oder Kohlenhydratgruppen, zu charakterisieren.

E.

Rekonstruieren der Proteinsequenz

Nachdem die einzelnen Peptidfragmente sequenziert worden sind, muss ihre Reihenfolge in dem ursprünglichen Polypeptid ermittelt werden. Dies erreicht man durch eine zweite Proteinspaltungsrunde mit einem Reagens anderer Spezifität und anschließendem Vergleich der Aminosäuresequenzen überlappender Peptidfragmente (Abb. 5.18). Der letzte Schritt einer Aminosäuresequenzanalyse ist die Bestimmung der Positionen eventuell vorhandener Disulfidbindungen. Dies kann durch die Spaltung einer Proteinprobe erreicht werden, bei der die Disulfidbindungen intakt bleiben. Dabei werden Paare von Peptidfragmenten erhalten, von denen jedes einen Cys-Rest enthält, die über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Nachdem ein disulfidverbrücktes Polypeptidfragment isoliert wurde, wird die Disulfidbindung gespalten, alkyliert (Abschnitt 5.3A) und die Sequenz der beiden Peptide bestimmt (Abb. 5.19). Die verschiedenen Paare solcher Polypeptidfragmente werden durch Vergleich ihrer Sequenzen mit der des Proteins identifiziert. Auf diese Weise wird die Lage der Disulfidbindungen ermittelt.

127

Rechenbeispiel 5.1 Ein ESI-Massenspektrum wie das von Apomyoglobin (Abb. 5.165) enthält eine Reihe von Peaks, die jeweils dem m/z-Quotienten eines (M + nH)"*-Ions entsprechen. Bei zwei aufeinanderfolgenden Peaks in diesem Massenspektrum betragen die m/z-Quotienten 1414,0 und 1542,3. Wie groß ist die Molekülmasse des ursprünglichen Apomyoglobins? Wie hoch ist die gemessene Masse im Vergleich zum in Tabelle 5.] angegebenen Wert, und wie groß sind die Ladungen der Ionen, die diese Peaks ergeben? Der erste Peak (p} = 1414,0) stammt von einem lon mit Ladung z und Masse M + z, wobei M die Molekülmasse des ursprünglichen Proteins bezeichnet. Der direkt benachbarte Peak (p, = 1542,3) muss auf ein lon zurückgehen, das ein Proton weniger hat, also die Ladung z - 1 trägt und die Masse M + z- 1 besitzt. Die m/z-Quotienten für diese Ionen, pı und p,, sind damit durch die folgenden Ausdrücke gegeben:

pı= (M + z)/z Sequenzen werden in Datenbanken hinterlegt Wenn die Aminosäurensequenz eines Proteins bestimmt wurde, wird diese Information üblicherweise in einer öffentlichen Datenbank hinterlegt. Sowohl Protein- als auch DNA-Sequenzdatenbanken sind über das Internet zugänglich (Tabelle 5.4). Elektronische Verknüpfungen zwischen den Datenbanken ermöglichen eine rasche Aktualisierung und eine Überkreuzprüfung der Sequenzin-

formation. Die meisten Sequenzdatenbanken verwenden ähnliche Formate. Betrachten wir als Beispiel die kommentierte (annotierte) Protein-Sequenzdatenbank namens UniProt. Ein Sequenzeintrag in UniProt beginnt mit der ID-Kennziffer des Proteins in der Form X_Y, wobei X ein Kürzel für den Proteinnamen ist (z.B. CYC für Cytochrom c und HBA für die a-Kette von Hämoglobin); bei Y handelt es sich um einen fünfbuchstabigen Identifikationsschlüssel, der die biologische Herkunft des Proteins angibt: Die ersten drei Buchstaben stammen von der Gattung und die nächsten zwei von der Art [z.B. CANFA für Canis familiaris (Hund)]. Für viele Organismen ist Y selbsterklärend (z.B. BOVIN oder ECOLI).

p= (M +z -1)/(z-]).

Diese beiden linearen Gleichungen lassen sich leicht lösen. Man löst zunächst die erste

Gleichung nach M auf.

M = z(pı -1) Dann setzt man dieses Ergebnis in die zweite Gleichung ein und löst nach z bzw. M auf.

2

PL

A

ze

zul

iz

z2p, -p, = zp, -1 Zn

(pr, -

Y/(p, - pı)

M = (p, - (pi - D/(p - Pi) Setzt man für pl und p2 die entsprechenden Werte ein, erhält man

M = (1542,3 - 1)(1414,0 - 1)/ (1542,3 — 1414,0) = 16.975 D

CNBrFragmente zz

>

+

>

CNBr

+

>

CNBr

Dieser Wert liegt nur 0,14% über dem für Pferde-Apomyoglobin in Tabelle 5.1 angegebenen Wert von 16.951 D.

Für die Ladung von Ion 1 gilt

Phe—Trp

Trypsin-

ME cıy— na

BLU

Trypsin

Fragmente —+

— Pro — MEEAsp— aly— A

|

+

Die Ionenladung von lon 2 ist somit

| —

Es

>

Abb. 5.18 Erzeugung überlappender Fragmente für die Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids. In diesem Beispiel werden zwei Sätze überlappender Peptidfragmente erzeugt, zunächst durch Verwendung von Trypsin, zur Spaltung des Polypeptids nach allen Arg- und Lys-Resten, und in einer getrennten Reaktion durch Verwendung von CNBr zur Spaltung nach allen

Met-Resten. 6% siehe Animated Figures.

z = (1542,3 — 1)/(1542,3 — 1414,0) = 12 12-1=11

Trypsin

| >

cys—Ala— Gin

128

Proteine: Primärstruktur

Abb. 5.19

Bestimmung der Lage von Disulfidbindungen. Bei dieser Methode werden über ein Disulfid verbundene Fragmente eines Proteins reduziert und getrennt sequenziert, um die Lage der Disulfidbindungen des intakten Proteins zu identifizieren.

SS

Polypeptidfragment mit Disulfidbindung

Reduktion des Disulfids und Blockierung mit Jodacetat

er

-S—CH,C0O; + "0,CCH,—S—

EN Trennung und Sequenzierung der Polypeptide

Dem schließt sich ein Zugriffsschlüssel an, der von der Datenbank festgelegt wird und auch dann noch eine Identifikation ermöglicht, wenn die ID-Kennziffer geändert werden muss (siehe z.B. Abb. 5.20). Der Eintrag enthält weiterhin das Datum, an dem die Sequenz in der Datenbank hinterlegt wurde, eine Angabe, wann sie zuletzt verändert und kommentiert wurde, eine Liste mit ent-

sprechenden Referenzen (die mit der Literaturdatenbank PubMed verlinkt sind), eine Beschreibung des Proteins und seine Einträge in Datenbanken. Eine Liste mit Besonderheiten beschreibt Bereiche oder Stellen im Protein, die von Interesse sind wie z.B. Disulfidbrücken, posttranslationale Modifikationen, Bindungsstellen und ggf. strittige Punkte, die in verschiedenen Referenzen unterschiedlich dargestellt sind. Der Eintrag endet mit der Anzahl der Aminosäuren des Polypeptids, seinem Molekulargewicht und schließlich seiner Sequenz, die mit Hilfe des Einbuchstaben-Codes angegeben ist. Mittels geeigneter Software (die häufig auf den Webseiten der Datenbanken kostenlos erhältlich ist) kann ein Forscher die Datenbank durchsuchen, um beispielsweise in verschiedenen Organismen Proteine mit ähnlichen Sequenzen zu finden. Schon die Sequenz eines kurzen Peptidbruchstücks ist unter Umständen ausreichend, um das Ursprungsprotein oder zumindest sein Pendant bei einer anderen Spezies aus der Datenbank „herauszufischen‘“.

Tab. 5.4

Internetadressen für die wichtigsten Protein- und DNA-Sequenz-Datenbanken.

Datenbanken mit Proteinsequenzen ES GEEBEOMEEEEREEREREEREBEEE SE HE EEBRE VERN a a a An ExPASy Proteomics Server: http://expasy.org/ Protein Information Resource (PIR): http:/ [pir.georgetown.edu/

Protein Research Foundation (PRF): http://www.prf.or.jp/ UniProt: http://www.uniprot.org/

Datenbanken mit Gensequenzen GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/

European Bioinformatics Institute (EBI): http://www.ebi.ac.uk

DBGET/Integrated Database Retrieval System: http:/ /www.genome.jp/

nun.

Proteinsequenzierung

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Sjt1e]o/e]awADleYei@lsıT=nle:]ufo]a)

UniProtKB Entry

Niceprot View | SRS View

u

A

EERDERTNT

ENTRY INFORMATION ENTRY NAME

RSN HUMAN

ACCESSION NUMBERS

Q9HD89; Q540D9

Integraded into Swiss-Prot on

2001-09-26

Sequence was last modified on

2001-03-01 (Sequence version1)

Annotatons were last modified on

2006-10-03

(Entry

version 42)

NAME AND ORIGIN OF THE PROTEIN PROTEIN NAME

Resistin precursor

Cysteine-rich secreted protein FIZZ3 Adipose tissue-specific secretory factor Synonyms

ADSF C/EBP-epsilon-regulated mycloid-specific secreted cysteine-rich protein Cysteine-rich secreted protein A 12-alpha-like 2

Name: RETN

GENE NAME

Synonym: FIZZ3; HXCP1; RSTN ORF name: UNQ407/PRO1199

SOURCE ORGANISM

Homo sapiens

TAXONOMY

9606 [NCBI, NEWT]

LINEAGE

ID

Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Eitjeroa; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo

Abb. 5.20

Der Anfang eines Eintrags bei UniProt.

Dieser Eintrag gehört zum Protein Resistin, das

Der Wert einer Aminosäuresequenz ist nicht geringer, nur weil die Nucleotid-

vom Fettgewebe gebildet wird und vermutlich bei

sequenz des entsprechenden Gens bereits bekannt ist. Die Proteinsequenz lie-

Entzündungen und eventuell bei Diabetes eine

fert zusätzliche Informationen über die Proteinstruktur (siehe Abschnitt 3.4).

Rolle spielt (Abschnitt 22.4B). Der vollständige

So kann beispielsweise nur die direkte Proteinsequenzierung die Lage von Disulfidbrücken in Proteinen aufklären. Außerdem werden viele Proteine im Anschluss an ihre Synthese modifiziert. Manchmal werden bestimmte Aminosäuren ausgeschnitten, damit das „reife“ Protein entsteht. Das in Abb. 5.1 gezeigte Insulin ist hierfür ein gutes Beispiel, denn es wird zunächst als ein Polypeptid mit 84 Aminosäuren synthetisiert, danach aber proteolytisch gespalten, wodurch die aktive Form aus zwei Ketten entsteht. Die Seitenketten der Aminosäuren werden unter Umständen ebenfalls modifiziert, indem u. a. Kohlenhydrate, Phosphatgruppen oder Acetylgruppen angefügt werden. Obwohl einige dieser Modifikationen bei charakteristischen Aminosäuresequenzen auftreten und somit anhand der Nucleotidsequenzen vorhersagbar sind, kann nur die tatsächliche Proteinsequenzierung bestätigen, ob und wo sie im reifen Protein vorkommen.

Eintrag enthält noch weitere Informationen und Referenzen sowie die Sequenz des Proteins. [Nach http://www.pir.uniprot.org/.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Fassen Sie kurz die Schritte zusammen, die an der Sequenzierung eines Proteins beteiligt sind. 2. Warum ist es wichtig, die N-terminalen Reste eines Proteins zu identifizieren? 3. Welche Vorteile besitzt die Massenspektrometrie gegenüber dem Edman-Abbau beim Sequenzieren von Peptiden? 4. Welche verschiedenen Informationen kann man aus

einer Proteinsequenzdatenbank erhalten?

130

Proteine: Primärstruktur

4 62 siehe Guided Exploration 5: Protein Evolution.

Evolution von Proteinen

Das genetische Material eines Organismus bestimmt die Aminosäuresequenzen aller seiner Proteine. Veränderungen in den Genen durch zufällige Mutationen verändern oft die Primärstruktur eines Proteins. Eine Mutation in einem Protein wird nur vererbt, wenn sie irgendwie die Wahrscheinlichkeit erhöht oder wenigstens nicht verringert, dass ihr Träger für die Fortpflanzung überleben wird. Viele Mutationen sind nachteilig oder erzeugen letale Effekte und sterben somit schnell aus. In seltenen Fällen tritt eine Mutation auf, welche die Fitness ihres Trägers verbessert. Dies ist die Kernaussage der Evolution durch natürliche Selektion.

A.

Evolution der Proteinsequenz

Die Primärstrukturen homologer Proteine aus verwandten Spezies sind einander sehr ähnlich. Im Folgenden soll auf Cytochrom c, ein Protein, das in nahezu allen Eukaryoten gefunden wird, näher eingegangen werden. Cytochrom c ist Bestandteil des mitochondrialen Elektronentransportsystemes (Abschnitt 18.2), von dem man annimmt, dass es seine heutige Form vor 1,5 bis 2 Milliarden Jahren angenommen hat, als die Organismen die Fähigkeit zur Atmung entwickelten. Emanuel Margoliash, Emil Smith und andere haben die Cytochrom c-Aminosäuresequenzen aus über 100 eukaryotischen Spezies untersucht, von der einfachen Hefe bis zum Menschen. Cytochrom c besteht bei allen Spezies aus einer einzigen Polypeptidkette, die 104 bis 112 Reste enthalten kann. Die Sequenzen von 38 dieser Proteine sind in Tabelle 5.5 aufgeführt. Um Ähnlichkeiten zwischen den homologen Resten zu verdeutlichen, wurden hierzu die Reste farblich nach ihren physikalischen Eigenschaften codiert. Ein Überblick über die angeordneten Sequenzen (unterste Zeile in Tab. 5.5) zeigt, dass an 38 Positionen (23 Positionen bei dem vollständigen Satz aus über 100 Sequenzen) dieselbe Aminosäure in allen Spezies erscheint. Die meisten der übrigen Positionen werden bei unterschiedlichen Organismen durch chemisch ähnliche Reste eingenommen. An nur acht Positionen können in der Sequenz sechs oder mehr verschiedene Reste vorkommen. Nach der Evolutionstheorie haben sich verwandte Spezies aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt. Demzufolge müssen sich die Gene, die jedes ihrer Proteine bestimmen, ebenso aus dem entsprechenden Gen des Vorfahren entwickelt haben. Die Sequenz des ursprünglichen Cytochrom c ist nur indirekt durch die Untersuchung der Sequenzen von noch vorhandenen Proteinen zugänglich. Cytochrom c ist ein evolutionär konservatives Protein, d.h. seine Sequenz unterliegt nur geringen evolutionären Veränderungen.

Sequenzvergleiche liefern Informationen zur Proteinstruktur und -funktion Im Allgemeinen zeigen Vergleiche der Primärstrukturen homologer Proteine (evolutionär verwandter Proteine), welche der Reste in einem Protein für seine Funktion essentiell sind, welche nicht so bedeutend sind und welche nur in geringem Maße eine spezifische Funktion haben. Wird z. B. derselbe Rest an einer bestimmten Position

in der Aminosäuresequenz in einer Reihe von verwandten Proteinen vorgefun-

den, deutet dies darauf hin, dass die chemischen oder strukturellen Eigenschaf-

ten dieses sogenannten invarianten Restes für wichtige Funktionen des Proteins die einzig passenden sind. Andere Aminosäurepositionen besitzen weniger stringente Seitenkettenanforderungen und können deshalb durch Reste mit ähnlichen Charakteristika besetzt werden (z.B. Asp oder Glu, Ser oder Thr etc.). Solche Positionen bezeichnet man als konservativ substituiert. Andere Positionen können viele verschiedene Aminosäurereste tolerieren. Dies zeigt an,

Evolution von Proteinen

dass die funktionellen Anforderungen an diese Position eher unspezifisch sind. Solch eine Position wird hypervariabel genannt. Warum ist Cytochrom c - ein altes und wichtiges Protein - nicht in allen Spezies identisch? Selbst ein Protein, das gut an seine Funktion angepasst ist, d.h. ein Protein, das keinen physiologischen Verbesserungen mehr unterliegt, entwickelt sich trotzdem weiter. Die zufällige Natur der Mutationsprozesse wird im Laufe der Zeit solch ein Protein in einer Weise verändern, die seine Funktion nicht signifikant beeinflusst, ein Prozess, der neutrale Drift genannt wird. Schädliche Mutationen werden dagegen durch die natürliche Selektion schnell verworfen. Hypervariable Reste sind offenbar ein bevorzugter Ort der neutralen Drift. Entwicklung phylogenetischer Stammbäume Aus dem Vergleich der Aminosäuresequenzen homologer Proteine können weitreichende Schlussfolgerungen über evolutionäre Zusammenhänge gezogen werden. Der einfachste Weg für die Abschätzung evolutionärer Divergenz besteht darin, die Zahl der unterschiedlichen Aminosäuren zwischen Proteinen zu bestimmen. Die Daten in Tabelle 5.5 zeigen z. B., dass Cytochrom c der Primaten eher dem anderer Säuger als dem von Insekten ähnelt (8-12 Unterschiede zwischen Säugern gegenüber 26-31 Unterschieden zwischen Säugern und Insekten). In ähnlicher Weise unterscheidet sich das Cytochrom c der Pilze genauso stark von dem der Säuger (45-51 Unterschiede) wie es sich von dem der Insekten (41-47) oder höheren Pflanzen (47-54) unterscheidet. Die Rangfolge dieser Divergenzen entspricht größtenteils der von der klassischen Taxonomie erwarteten. Die Sequenzen der homologen Proteine können durch einen Computer analysiert werden, um einen phylogenetischen Stammbaum zu entwerfen. Ein solches Schaubild zeigt die verwandschaftlichen Beziehungen zwischen den Organismen, die das Protein enthalten. Der phylogenetische Stammbaum für Cytochrom c ist in Abbildung 5.21 skizziert. Ähnliche Stammbäume wurden auch für andere Proteine abgeleitet. Jeder Verzweigungspunkt des Baumes repräsentiert den für alle von ihm ausgehenden Organismen angenommenen gemeinsamen Vorfahren. Die Abstände zwischen den Verzweigungspunkten entsprechen der Zahl der Aminosäureunterschiede pro 100 Reste des untersuchten Proteins. Solche Bäume geben ein besseres quantitatives Maß für den Grad der Verwandtschaft verschiedener Spezies als es die makroskopische Taxonomie liefern kann. Aus der Abbildung geht hervor, dass bezogen auf das Cytochrom c die evolutionären Abstände aller modernen Arten zu dem untersten Punkt, dem frühesten gemeinsamen Vorfahren, der dieses Protein synthetisieren konnte, nahezu gleich sind. Folglich repräsentieren „niedere“ Organismen keine Lebensformen, die frühzeitig in der Geschichte auftraten und aufgehört haben, sich weiterzuentwickeln. Das Cytochrom c aller in Abbildung 5.21 aufgeführten Spezies — ob „primitiv“ oder „fortgeschritten“ - hat sich in gleichem Umfang weiterentwickelt.

B.

Proteine entwickelten sich weiter durch Verdopplung von Genen oder Gensegmenten

Margaret Dayhoff leistete zu Beginn der 1960er-Jahre Pionierarbeit bei der Beschreibung der Proteinevolution und Schaffung von Datenbanken für verwandte Proteine. Seither hat man infolge der direkten Protein- oder DNA-Sequenzierungsprojekte ungefähr eine Million Proteinsequenzen katalogisiert. Dies führte zur Entwicklung von mathematisch hoch entwickelten Computeralgorithmen, mit deren Hilfe man Sequenzübereinstimmungen identifizieren kann. Diese Suchprotokolle können Gemeinsamkeiten selbst zwischen Proteinen aufdecken, die sich so weit entwickelt haben, dass ihre Aminosäuresequenzen zu weniger als 20% identisch sind und sie mehrere Insertionen und/oder Deletionen verschiedener Länge erfahren haben. Die Verwendung solcher Sequenz-Align-

131

132

Proteine: Primärstruktur

Tab. 5.5

Aminosäuresequenzen von Cytochrom c aus 38 Spezies‘. 1

=g

5

10

15

_20

_

25

30

u,

Mensch, Schimpanse Rhesusaffe Pferd Esel

Säugetiere

Kuh, Schwein, Schaf Hund Kaninchen Kalifornischer Grauwal

Känguruh

Andere Wirbeltiere

Huhn, Truthahn Taube Stockente Schnappschildkröte Klapperschlange Ochsenfrosch Thunfisch Hundshai

o|Ir oo 9009090090. 0

080 ©» 02 €. 8 ©

Samia cynthia (Seidenspinner) Tabakschwärmer Schraubenwurmfliege Drosophila (Fruchtfliege) Insekten

Pilze

=

Bäckerhefe Candida krusei (eine Hefe) Neurospora crassa (ein Schimmelpilz) Weizenkeim Buchweizensaat

©

Sonnenblumensaat

5 X © e :© TE

Mungbohne Blumenkohl Kürbis Sesamsaat Rizinussamen Baumwollsaat

Schönmalvensaat Anzahl verschiedener Aminosäuren

080 80 0 09 92929009009

Wal

13,5 5.54

[

3.3 4.1 ,4.352.2.3 101,10 1.409204 102737 2210410189

2

Ale

1USEE 3537 oe

ment-Programme, die allgemein zugänglich sind, ist in den bioinformatics exercises 3-1 und 5-2 aufgezeigt (www.wiley.com/college/voet). Die Untersuchung einer großen Anzahl von Proteinen zeigte, dass es sich bei den in der Evolution konservierten Sequenzen häufig um Abschnitte handelt, die etwa 40 bis 200 Aminosäuren umfassen und als Domänen bezeichnet werden. Ursprünglich bezog sich dieser Ausdruck auf einen Teil einer einzelnen Proteinstruktur, aber inzwischen hat man den Begriff auf die entsprechende Aminosäuresequenz ausgeweitet. Wie wir in Abschnitt 6.2D noch sehen werden, sind Strukturähnlichkeiten zwischen zwei Domänen unter Umständen selbst dann noch erkennbar, wenn die Sequenzen nur einige wenige gemeinsame Aminosäuren haben. Die Proteindomänen lassen sich in schätzungsweise 1000-1400 verschiedene Familien eingruppieren. Dabei gehören die Hälfte aller bekannten Domänen zu nur 200 Familien, d.h. die meisten Proteinfamilien haben nur einige weniger Vertreter. 10 bis 20% der Proteine lassen sich keiner Familie zuordnen, sie

scheinen diesbezüglich einzigartig zu sein. Es ist aber durchaus denkbar, dass ihre Familienzugehörigkeit nur nicht mehr aufgrund starker Sequenzabweichungen zu erkennen ist. Domänen, die zu über 40% übereinstimmende Sequenzen haben, besitzen gewöhnlich die gleiche Funktion; haben die Domänen weniger als 25% Sequenzübereinstimmung, dann erfüllen sie in der Regel unterschiedliche Aufgaben.

Evolution von Proteinen

Hydrophil, sauer:

[o]Asp

[e] Glu

Hydrophil, basisch:

IH] His

[«] Lys

Polar:

[8] Asn oderAsp

[@|Giy

[N] Asn

Elsr

Hrhr

W| Trp

Tyr

[A] Ala

[e] Cys

[Fl Phe

Ile

Hydrophob:

[R]Arg

133

u TrimethylLys

Gln

Gin oder Glu It] Leu

M]ıme PlPrr Mva * Die Aminosäuren wurden auf Grund der Polarität ihrer Seitenketten

Quelle: Nach Dickerson, R.E., Sci. Am. 226(4); 58-72 (1972),

farblich unterlegt, so dass ein invarianter oder konservativ substituierter

mit Korrekturen von Dickerson, R.E., und Timkovich, R.

Rest leicht durch ein senkrecht verlaufendes Farbband erkannt werden kann. Der Buchstabe a am Beginn einer Kette zeigt an, dass die N-terminale Aminosäure acetyliert ist: ein h zeigt an, dass keine Acetylgruppe vorhanden ist.

in Boyer, P.D. /(Hrsg.), The Enzymes (3. Aufl.), Band 11, S. 421-422, Academic Press (1975). Tabelle: Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.

Proteinfamilien entstehen durch Genduplikation

Dass Proteine mit ähnlichen Sequenzen ähnliche Funktionen rascht nicht; solche Proteine haben sich gewöhnlich aus einem Vorgängermolekül entwickelt. Homologe Proteine, welche in Spezies vorkommen und die gleiche Funktion haben, bezeichnet log (z.B. die in Tabelle 5.5 gezeigten Cytochrom c-Varianten).

erfüllen, übergemeinsamen verschiedenen man als ortho-

134

Proteine: Primärstruktur

B Pierd Kuh, he Schwein, °\

Schnapp

E al

Amphibien 2

EN

a

Seidenspinner ın

jo

o

.@ Karpfen7 6,5 1 z

/ Schraubenwurm- &/am

fee

5

Thunfisch

‚Ochsenfrosch__

“Insekten

Reptiien.

77 —

12

/

Bonito

Fische

a

——Hundshai __Neunauge

Phylogenetischer Stammbaum von Cytochrom c. Jeder Verzweigungspunkt symbolisiert einen gemeinsamen Ur-Organismus für die Spezies, die über ihn miteinander verbunden sind.

Die Zahl neben jeder Verzweigung zeigt die berechnete Anzahl der Unterschiede pro 100 Reste zwischen den Cytochrom c-Varianten der angrenzenden Verzweigungen oder Spezies. [Nach Dayhoff, M.O., Park, C.M., und McLaughlin,

P.). in Dayhoff, M.O. (Hrsg.), Atlas of Protein Sequence and Structure, S. 8, National Biomedical

Research Foundation (1972).]

Innerhalb einer biologischen Art entstehen ähnliche Proteine durch Genduplikation, ein anomales genetisches Rekombinationsereignis, bei dem ein Chromosom eines Chromosomenpaars beide Exemplare des ursprünglichen Gens erhält (die genetische Rekombination wird im Abschnitt 25.6 erörtert). Nach der Duplikation können die Sequenzen mit der Zeit durch Mutationen divergieren. Die Genduplikation ist ein wichtiger Mechanismus für die Entstehung neuer Proteine, denn ein Exemplar des Gens kann durch die natürliche Selektion eine neue Funktion entwickeln, während sein unverändertes Gegenstück weiterhin für die Codierung des ursprünglichen Proteins sorgt. Zwei Gene, die sich unabhängig voneinander aus einem Duplikationsereignis entwickelnt haben, nennt man paralog. Bei Prokaryoten sind etwa 60% der Proteindomänen durch Duplikation entstanden; bei vielen Eukaryoten sind es sogar rund 90% und beim Menschen etwa 98%. Die Globinfamilie liefert ein eindrucksvolles Beispiel für Evolution durch Genduplikation. Hämoglobin, das Sauerstoff von den Lungen (bzw. den Kiemen oder der Haut) zu den Geweben transportiert, ist ein Tetramer, in welchem die Untereinheiten als a,ß,-Komplex zusammengesetzt sind (d.h. zwei a-Polypeptide und zwei ß-Polypeptide). Die Sequenzen der a- und ß-Untereinheiten sind untereinander und im Vergleich zur Sequenz des Proteins Myoglobin ähnlich, das die Diffusion von Sauerstoff durch das Muskelgewebe erleichtert (Hämoglobin und Myoglobin werden in Kapitel 7 näher diskutiert). Das ur-

Evolution von Proteinen

sprüngliche Globin besaß möglicherweise die Funktion eines einfachen Sauerstoffspeicherproteins. Nach einer Duplikation konnte sich eines der Globine zu einer monomeren Hämoglobin a-Kette entwickeln. Aus der Duplikation der a-Kette ging dann die ß-Kette hervor. Andere Mitglieder der Globinfamilie enthalten die ß-ähnliche y-Kette, die im fötalen Hämoglobin als ein a,y,-Tetramer vorkommt.Die ß-ähnliche &-Kette sowie die a-ähnliche C-Kette treten zusammen in einem frühen Stadium der Embryogenese als &,£,-Hämoglobin auf. Pri-

135 Myoglobin

maten besitzen zusätzlich ein vor relativ kurzer Zeit dupliziertes Globin, die ß-

ähnliche ö-Kette, die als geringer Bestandteil (ca. 1%) des adulten Hämoglobins vorkommt. Obwohl das ,ö,-Hämoglobin noch keine bekannte eigenständige Funktion aufweist, könnte es in Zukunft eine solche entwickeln. Der Stammbaum von Mitgliedern der Globinfamilie ist in Abbildung 5.22 dargestellt. Das menschliche Genom enthält außerdem die Relikte von Globingenen, die nicht exprimiert werden. Diese Pseudogene können als Sackgassen der Proteinevolution angesehen werden. Ein dupliziertes und deshalb zunächst überflüssiges Gen hat daher nur eine begrenzte Zeit zur Verfügung, um eine neue Funktion zu entwickeln, die seinem Wirt einen Selektionsvorteil liefert, bevor es durch Mutation inaktiviert wird, d.h. zu einem Pseudogen wird.

Ur-Globin

Abb. 5.22 Stammbaum der Globin-Familie. Jeder Verzweigungspunkt repräsentiert ein Genduplikationsereignis. Das Protein Myoglobin besteht aus einer Kette. Die mit griechischen Buchstaben bezeichneten Globine sind Untereinheiten der Hämoglobine.

Proteine entwickeln sich mit charakteristischer Geschwindigkeit

Die Unterschiede in den Proteinsequenzen zwischen den verschiedenen Spezies können gegen die durch Fossilienfunde bestimmte Zeit aufgetragen werden, zu der die Spezies begannen, sich divergent zu entwickeln. Die graphische Darstellung für ein gegebenes Protein verläuft im Wesentlichen linear. Dies zeigt an, dass sich die Mutationen über geologische Zeiträume betrachtet mit konstanter Geschwindigkeit anhäufen. Dagegen variieren die Evolutionsgeschwindigkeiten zwischen den einzelnen Proteinen (Abb. 5.23). Dies bedeutet nicht, dass sich die Mutationsraten der DNAs, die diese Proteine bestimmen, unterscheiden, sondern vielmehr, dass die Geschwindigkeit, mit der Mutationen in Proteinen akzeptiert werden, davon abhängt, in welchem Ausmaß Aminosäureänderungen die Funktion eines Proteins beeinflussen. Histon H4, ein Protein, das DNA in Eukaryoten bindet (Abschnitt 24.5A), gehört, wie in Abbildung 5.23 dargestellt, zu den am stärksten konservierten Proteinen. Die Histone H4 von Erbsen und Rindern, zwei Spezies, die sich vor 1,2 Milliarden Jahren voneinander getrennt haben, unterscheiden sich nur durch zwei konservative Änderungen in ihren 102 Resten. Es ist offensichtlich, dass Histon H4 für die Verpackung von DNA in den Zellen so wichtig ist, dass es gegenüber jeglichen Mutationen 140 ®

17)

£

= 120 =

2

S

© =

&

Fibrinopeptide

100

Q

3

ES) E ©

Se

Hämoglobin

60 -

:© [%)

[o)

E

&

40

Cytochromc

©

ge)

E20 ©

=

Histon H4

. Die Strukturen von Proteinen hat man hauptsächlich durch Röntgenkristallographie und NMR-Spektroskopie bestimmt. 6. Die unpolaren Seitenketten globulärer Proteine befinden sich gewöhnlich im Inneren eines Proteins, während die polaren Seitenketten seine Oberfläche ausmachen. Proteinstrukturen können anhand ihrer Motive, Sekundärstrukturen,

Topologie oder ihres Domänenaufbaus eingeteilt werden. Strukturelemente sind eher evolutionär konserviert als Aminosäuresequenzen. 8. Das Gebiet der Strukturbioinformatik befasst sich mit der Speicherung, Visualisierung, Analyse und dem Vergleich von Makromolekülstrukturen. 9. Die einzelnen Einheiten von Proteinen, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, sind in der Regel symmetrisch angeordnet.

Wichtige Begriffe 10. Native Proteinstrukturen sind nur geringfügig stabiler als ihre denaturierten Formen. Der hydrophobe Effekt ist ein wichtiger Faktor für die Stabilität eines Proieins. Wasserstoffbrückenbindungen und Ionenpaare tragen meist wenig zur Stabilität der Proteine bei. 11. Untersuchungen zur Proteindenaturierung und Renaturierung zeigen, dass die Primärstruktur eines Proteins seine dreidimensionale Struktur bestimmt. 12. Proteine falten sich in mehreren Schritten in ihre nativen Konformationen, wobei sich kleine Strukturelemente zu größeren Strukturen zusammenlagern. 13. Molekulare Chaperone erleichtern die Proteinfaltung in vivo, indem sie in einem ATP-verbrauchenden Vorgang ein Polypeptid wiederholt binden und freilassen und eine isolierte Mikroumgebung schaffen, in der sich das Polypeptid falten kann. 14. Die Amyloidosen wie Morbus Alzheimer und die transmissiblen spongiformen Encephalopathien (TSEs) sind Krankheiten, die durch Proteinfehlfaltung verursacht werden.

Wichtige Begriffe Sekundärstruktur Tertiärstruktur Quartärstruktur Peptidgruppe trans-Konformation cis-Konformation Rückgrat Torsionswinkel (Diederwinkel) ® Y Ramachandran-Diagramm a-Helix regelmäßige Sekundärstruktur Ganghöhe antiparalleles ß-Faltblatt paralleles ß-Faltblatt Topologie Kehre (ß-Schleife)

Röntgenkristallographie Beugungsmuster Elektronendichteverteilung Konturenkarte NMR Supersekundärstruktur (Motiv) Paß-Motiv ß-Haarnadel (engl.: -hairpin) aa-Motiv ß-Fass a/ß-Fass Domäne Dinucleotid-Bindungsfaltung (Rossmann-Faltung) Strukturbioinformatik Oligomer

Faserprotein

cyclische Symmetrie diedrische Symmetrie Hydrophobizität Ionenpaar (Salzbrücke) Zinkfinger “Atmen“ von Proteinen Kooperativität chaotropes Agens

globuläres Protein Superhelix Zufallsknäuel (engl.: random coil) Denaturierung

native Struktur ß-Beule

Helix-capping

Protomer Rotationssymmetrie

Renaturierung hydrophober Kollaps „Molten globule“ „Homology modeling“ „Ihreading“ ab initio molekulares Chaperon Hitzeschock-Protein Chaperonin ATPase Amyloid Morbus Alzheimer Transmissible spongiforme Encephalopathien (TSEs) Kreutzfeld-Jacob-Krankheit Prion

193

194

Dreidimensionale Struktur von Proteinen

1: Zeichnen Sie eine cis-Peptidbindung, und bestimmen Sie

die Gruppen, bei denen es zu sterischen Interferenzen kommt. Helices können durch die Formel n,, beschrieben werden, wobei n die Zahl der Reste pro Helixwindung angibt und m die Anzahl der Atome, einschließlich Wasserstoff, in dem von der Wasserstoffbrücke geschlossenen Ring. (a) Wie lautet die Formel für eine a-Helix? (b) Ist die 3,.-Helix steiler oder flacher als die a-Helix? Berechnen Sie die Länge (in nm) eines 100-AminosäureSegmentes der a-Keratinsuperhelix. In Polypeptiden, die Superhelices bilden, sind gewöhnlich an der ersten und vierten Position in den aus sieben Resten bestehenden Wiederholungseinheiten hydrophobe Reste zu finden. (a) Warum kommen in den restlichen fünf Positionen gewöhnlich polare oder geladene Reste vor? (b) Warum ist die Sequenz Ile-Gln-Glu-Val-Glu-Arg-Asp in einer Superhelix wahrscheinlicher als die Sequenz Trp-Gln-Glu-Tyr-Glu-Arg-Asp? Globuläre Proteine sind normalerweise aus mehreren Sekundärstrukturschichten aufgebaut, mit einem hydrophoben Kern und einer hydrophilen Oberfläche. Gilt dies auch für ein Faserprotein wie a-Keratin? Der Verdauungstrakt der Larve der Kleidermotte besitzt ein stark reduzierendes Milieu. Warum ist das für die Larve von Vorteil? Beschreiben Sie die Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Kollagen. Erklären Sie, warum Gelatine, die zumeist aus Kollagen besteht, gegenüber anderen Proteinarten einen geringeren Nährwert hat. Kann ein natives Protein völlig irregulär sein, d.h. ohne a-Helices, ß-Faltblätter oder andere repetitive Sekundärstrukturen? 10. (a) Findet man eher Trp oder Gln an der Oberfläche eines Proteins? (b) Was ist weniger wahrscheinlich im Inneren eines Proteins, Ser oder Val? (c) Wird man eher Leu oder Ile mitten in einer a-Helix finden? (d) Ist Cys oder Ser häufiger in einem ß-Faltblatt zu finden? 11. Welche Arten der Rotationssymmetrie sind bei einem Protein möglich, das (a) vier oder (b) sechs identische Untereinheiten hat?

12: Sie führen eine ortsgerichtete Mutagenese durch, um

Vorhersagen zu überprüfen, welche Reste für die Funktion eines Proteins essenziell sind. Bei welchem der unten aufgeführten Paare an Aminosäurensubstitutionen würde Sie erwarten, dass die Proteinstruktur am meisten gestört

113,

14.

15.

16.

1%

18 .

wird? (a) Val wird durch Ala oder Phe ersetzt. (b) Lys wird durch Asp oder Arg ersetzt. (c) Gln wird durch Glu oder Asn ersetzt. (d) Pro wird durch His oder Gly ersetzt. Die zufällige Verknüpfung von Aminosäuren erzeugt in der Regel ein unlösliches Polypeptid, obwohl ein natürlich vorkommendes Polypeptid gleicher Länge gewöhnlich löslich ist. Erklären Sie dies! Können alle denaturierten Proteine spontan renaturieren, ausreichende Zeit vorausgesetzt? Welche intra- und intermolekularen Bindungen bzw. Wechselwirkungen werden aufgebrochen, welche werden erhalten, wenn Kollagen zur Gelatineproduktion erhitzt wird? Unter physiologischen Bedingungen nimmt Polylysin eine zufällige Knäuelkonformation ein. Unter welchen Bedingungen könnte es eine a-Helix bilden? Auf den ersten Blick erscheinen Proteine sehr groß im Vergleich zu den Molekülen, die sie binden. Aber was bedeutet in diesem Zusammenhang groß? Berechnen Sie das Volumenverhältnis eines Hämoglobinmoleküles (65 kD) zu den vier O,-Molekülen, die es bindet, und das Verhältnis des Volumens eines typischen Büros (4 X 4X 3 m) zu einem typischen Angestellten (70 kg), der darin arbeitet. Nehmen Sie dabei an, dass sich das Molvolumen von Hämoglobin und O, im selben Verhältnis zu ihren Molmassen verhält und dass der Angestellte eine Dichte von 1,0 gcm”” hat. Vergleichen Sie die Ergebnisse. Entspricht das Ergebnis Ihren Erwartungen? Welches der folgenden Polypeptide bildet am ehesten eine a-Helix? Bei welchem ist die Wahrscheinlichkeit eines ß-Faltblattes am geringsten? CRAGNRKIVLETY

SEDNFGAPKSILW QKASVEMAVRNSG 19% Die röntgenkristallographische Analyse eines Proteins

verrät oft nicht die Positionen der allerersten und/oder allerletzten Reste einer Polypeptidkette. Erklären Sie dies.

Literatur

195

Elektronisches Zusatzmaterial auf

www.wiley.com/college/voet Case Study 4 The Structure of Insulin The primary structure of insulin is examined, and the sequences of various animal insulins are compared. Case Study 5 Chracterization of Subtilisin from the Antarctic Psychrophile Bacillus TA41 The structural features involved in protein adaptation to cold-temperatures are explored. Case Study 6 A Collection of Collagen Cases Factors important in the stability of collagen are examined.

Bioinformatics Exercises 1. Obtaining Structural Information. Compare different secondary structure predictions for a given protein sequence, then inspect its X-ray crystallographic structure. 2. Exploring the Protein Data Bank. Learn how to locate and download specific protein structure files, sequences, and images. Explore additional educational resources such as Molecule of the Month and links to additional structural biology resources. 3. Using JMol and PyMol. Examine a protein structure file and use basic molecular modeling programs to visualize the protein and highlight selected features. 4. Protein families. Identify homologous proteins in other structural databases.

Literatur Allgemeines

Faltung und Stabilisierung

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Die Struktur eines Proteins bestimmt seine

biologische Funktion; ob es ein kleines Molekül bindet oder mit einem anderen,

großen Molekül interagiert. Die Sauerstoffbindungsstelle des Myoglobins ist z.B. so strukturiert, dass O, gut binden oder aber, wie in der obigen Abbildung, vollständig vom Protein abdissoziieren kann. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.]

Proteinfunktion Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 3

Animated Animated Animated Animated Animated

Figure Figure Figure Figure Figure

Kinemage 6-1 Kinemage 6-2, 6-3 Kinemage 6-3 Kinemage 6-4 Kinemage 6-5 Case Study 8 Case Study 9 Case Study 10

Die zwei vorhergehenden Kapitel haben zwar die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Proteinen in aller Breite beschrieben, ihre physiologischen Funktionen aber nur am Rande gestreift. Trotzdem dürfte es nicht überraschen, dass die strukturelle Komplexität und Vielfalt der Proteine die Bewältigung einer enormen Anzahl verschiedener, spezifischer biologischer Aufgaben ermöglicht. So sind z.B. die Enzymkatalysatoren praktisch aller Stoffwechselreaktionen Proteine (Enzyme werden ausführlich in den Kap. 11 und 12 besprochen). Genetische Information bliebe in der DNA eingeschlossen, wären Proteine nicht an der Decodierung und Übermittlung dieser Information beteiligt. Bemerkenswerterweise arbeiten die Proteine, die in Aufbau, Unterstützung, Er-

kennung, Transport und Umwandlung zellulärer Kompartimente involviert sind, mit unglaublicher Geschwindigkeit und Genauigkeit und unterliegen in vielen Fällen zahlreichen Regulationsmechanismen. Die spezialisierten Proteinfunktionen, angefangen von den Faserproteinen in Abschnitt 6.1C bis zu den präzise regulierten Stoffwechselenzymen, die in späteren Kapiteln besprochen werden, können alle so gesehen werden, dass Proteine an andere Komponenten lebender Systeme binden und mit diesen interagieren. Wir werden Proteine kennen lernen, die kleine Moleküle binden; Proteine, die mit anderen Proteinen interagieren, und Proteine, die wesentlich größere Einheiten binden, wie z.B. Nucleinsäuren. In diesem Kapitel konzentrieren wir uns auf vier von vielen möglichen Proteintypen, die relativ gut untersucht sind. Diese vier Beispiele - Myoglobin, Hämoglobin, Myosin und Actin der Muskeln sowie Antikörper - sind aus mehreren Gründen von besonderer BedeuLehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

ISBN: 978-3-527-32667-9

® Muskelbewegung e Antikörper

7-6 7-8 7-11 7-13 7-32

Copyright © 2010 WILEY-VCH

Proteinfunktion e Myoglobin

Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

198

Proteinfunktion

tung. Untersuchungen dieser Proteine lieferten die Basis für einige der bedeutendsten Fortschritte in der Biochemie. Ihre ordnungsgemäße Funktion ist von entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit, und nicht zuletzt sind sie wertvolle Beispiele für zahlreiche Proteine, die in späteren Kapiteln bei der Besprechung von Stoffwechsel und der Organisation genetischer Information untersucht werden.

1

Myoglobin

Wir beginnen unsere Untersuchungen zur Proteinfunktion mit zwei Proteinen,

Abb. 7.1

Struktur des Pottwal-Myoglobins.

Dieses 153 Aminosäuren

lange, monomere

Protein

besteht aus acht a-Helices, von A bis H bezeichnet,

die durch kurze Polypeptidsegmente verbunden sind (die letzte Hälfte des ursprünglich als EF-Ecke vermuteten Abschnitts stellte sich als kurze Helix heraus, die als F’-Helix bezeichnet wird). Die Hämgruppe ist rot dargestellt. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/ Howard Hughes Medical Institute.] 6% siehe Kinemage Exercise 6-1.

die reversibel molekularen Sauerstoff (O,) binden. Myoglobin, das erste Protein, dessen Struktur mittels Röntgenkristallographie bestimmt wurde, ist ein kleines Protein mit relativ einfachem Sauerstoffbindungsverhalten. Hämoglobin, ein Tetramer aus myoglobinähnlichen Polypeptiden, ist ein komplexeres Protein. Es fungiert als spezialisiertes System zur Verteilung von Sauerstoff im Körper. Die Effizienz, mit der Hämoglobin O, bindet und abgibt, erinnert an die Spezifität und Effizienz eines Stoffwechselenzyms. Es lohnt sich, die Struktur und die Wirkungsweise von Hämoglobin zu untersuchen, denn viele der Prinzipien, die der Bindung von O, an Hämoglobin zugrunde liegen, gelten auch für die Kontrolle von enzymatischer Aktivität.

A.

Struktur des Myoglobins

Myoglobin ist ein kleines intrazelluläres Protein, das in Muskeln von Wirbeltieren vorkommt. Seine Röntgenstruktur, die 1959 von John Kendrew bestimmt wurde, zeigte, dass die meisten der 153 Reste des Myoglobins in acht a-Helices angeordnet sind (die traditionell von A bis H bezeichnet werden) und ein globuläres Protein mit ungefähren Abmessungen von 4,4 X 4,4 X 2,5 nm bilden (Abb. 7.1). Prosthetische Gruppe des Myoglobins

Myoglobin, andere Mitglieder der Proteinfamilie der Globine (Abschnitt 5.4B) sowie einige weitere Proteine, wie Cytochrom c (Abschnitte 5.4A und 6.2D), enthalten eine einzelne Hämgruppe (Abb. 7.2). Das Häm ist fest in einer hydropho-

Abb. 7.2 Die Hämgruppe. Die vier N-Atome des Porphyrinrings (dessen Pyrrolringe als A-D benannt sind) sind als Liganden des zentralen Fe(Il)-Atoms dargestellt. Häm ist ein konjugiertes System, d.h. alle Fe-N-Bindungen sind äquivalent. Das Fe(ll)-Atom bindet zusätzlich eine His-Seitenkette und, falls anwesend, O,. Die

sechs Liganden sind an den Ecken eines Oktaeders angeordnet. Das Fe-lon befindet sich im Zentrum (oktaedrische Geometrie).

Myoglobin

ben Tasche zwischen den Helices E und F des Myoglobins gebunden. Das heterocyclische Ringsystem des Häm ist ein Porphyrinderivat, das aus vier Pyrrolringen (mit A-D markiert) besteht, die über Methylenbrücken verbunden sind (andere Porphyrine unterscheiden sich in den Substituenten der Ringe A-D). Das Fe(II)-Atom wird von den vier Stickstoffatomen des Porphyrins und einem NAtom einer Histidinseitenkette (die in einer Myoglobin- und Hämoglobin-eigenen Nomenklatur als His F8 bezeichnet wird, da es sich um den achten Rest der Helix F handelt) im Zentrum des Hämmboleküls koordiniert. Ein Sauerstoffmolekül (O,) kann die Position des sechsten Liganden am Eisenatom einnehmen. His E7 (der siebte Rest der Helix E) bildet eine Wasserstoffbrücke zum O, mit einer Geometrie wie in Abbildung 7.3 dargestellt. Zwei hydrophobe Seitenketten auf der O,-bindenden Seite des Häm, Val E11 und Phe CD1 (der erste Rest im Segment zwischen den Helices C und D), fixieren das Häm an seinem Platz. Diese Seitenketten schwingen vermutlich zur Seite, wenn das Protein „atmet“ (Abschnitt 6.4A), wodurch O, binden und wieder abdissoziieren kann. Bei Kontakt mit Sauerstoff wird das Fe(II)-Atom von isoliertem Häm irreversibel zu Fe(IIl) oxidiert, einer Form, die nicht in der Lage ist, O, zu binden. Der Proteinanteil des Myoglobins (und des Hämoglobins, das vier Hämgruppen in vier Globinketten enthält) verhindert diese Oxidation und ermöglicht die reversible Bindung von O, an die Hämgruppe. Die Oxygenierung verändert die Elektronenkonfiguration im Fe(Il)-Häm-Komplex, gut erkennbar am Farbwechsel von dunklem Purpur (die Farbe des Hämoglobins in venösem Blut) zu leuchtendem Scharlachrot (der Farbe von Hämoglobin in arteriellem Blut). Unter bestimmten Bedingungen wird das Fe(II) in Myoglobin oder Hämoglobin zu Fe(III) oxidert, was zur Bildung von Metmyoglobin bzw. Methämoglobin führt; diese Proteine sind für die Braunfärbung von altem Fleisch und geronnenem Blut verantwortlich. Außer O, können noch bestimmte weitere kleine Moleküle wie CO, NO und H,S an Hämgruppen in Proteinen binden. Da diese anderen Komponenten mit einer wesentlich höheren Affinität als O, binden, wirken sie toxisch. So hat z.B. CO eine 200fach größere Affinität zu Hämoglobin als O;.

Funktion des Myoglobins Obwohl Myoglobin ursprünglich nur für ein sauerstoffspeicherndes Protein gehalten wurde, ist heute offensichtlich, dass seine physiologische Hauptaufgabe die Erleichterung des Sauerstofftransports in der Muskulatur (in Belastungssituationen das am schnellsten O, verbrauchende Gewebe) ist. Die Geschwindigkeit, mit der O, aus den Kapillaren ins Gewebe diffundieren kann, wird von seiner geringen Löslichkeit in wässrigen Lösungen begrenzt (ca. 10°* M in Blut). Myoglobin erhöht die effektive Löslichkeit von O, in der Muskulatur, indem es als eine Art „molekulares Schaufelrad“ fungiert, um die O,-Diffusionsrate zu steigern. Die Funktion von Myoglobin als Sauerstoffspeicher ist wahrscheinlich nur bei Wassersäugern wie Robben und Walen von Bedeutung, deren Myoglobinkonzentrationen in der Muskulatur ungefähr 10-mal höher sind als bei Landsäugern (dies ist ein Grund, warum Kendrew für seine röntgenkristallographischen Untersuchungen das Pottwal-Myoglobin auswählte). Nichtsdestotrotz sind Mäuse, bei denen das Gen für Myoglobin „ausgeschaltet“ wurde, scheinbar normal, obwohl ihre Muskeln eine hellere Farbe aufweisen als die von Wildtyp-Mäusen. Dieses Experiment legt nahe, dass Myoglobin unter normalen metabolischen Bedingungen von den Muskeln nicht benötigt wird. Im Gegensatz dazu könnte das Neuroglobin, ein erst kürzlich entdecktes myoglobinähnliches Protein im Gehirn, eine essentielle Funktion bei der Erhöhung der O,-Konzentration im Nervengewebe ausübern. Nervengewebe ist metabolisch äußerst aktiv und hat einen entsprechend hohen Sauerstoffbedarf. So verbraucht das menschliche Gehirn rund 20% des gesamten Sauerstoffs, obwohl sein Anteil an der Körpermasse le-

diglich 2% beträgt.

199

His E7

Val Ell

J

Phe CD1 0,

‘

-

x

His F8

Abb. 7.3 Der Hämkomplex im Myoglobin. Die obere Zeichnung zeigt ein Kalottenmodell, H-Atome sind nicht dargestellt. Die untere Abbildung zeigt das entsprechende Skelettmodell, wobei die gestrichelte Linie die Wasserstoffbrückenbindung zwischen His E7 und dem gebundenen O, symbolisiert. [Nach einer Röntgenstruktur von Simon Phillips, MRC Laboratory of Molecular

Biology, Cambridge. PDBid 1MBO.] 6% siehe Kinemage Exercise 6-1.

200

Proteinfunktion

Sauerstoffbindungskurve von Myoglobin

eine einfache Die reversible Bindung von O, an Myoglobin (Mb) kann durch Gleichgewichtsreaktion beschrieben werden: Mb + O0, = MbO;

mit einer Dissoziationskonstanten

K- [Mb] [O2]

|

Mbo;]

K:

(7.1)

Man beachte, dass Biochemiker Gleichgewichte normalerweise mit Dissoziationskonstanten beschreiben, während Chemiker die reziproken Assoziationskonstanten bevorzugen. Die O,-Beladung von Myoglobin lässt sich durch seinen Sättigungsgrad Yo, beschreiben, der den Anteil der mit O, besetzten O,-Bindungsstellen angibt:

. Ne]

[MbO3]

[02] Mo B 0

272

Die O,-Konzentration wird üblicherweise durch den Partialdruck pO, (Sauerstoffpartialdruck) ausgedrückt. Gleichung 7.2 kann daher umgeformt werden in

po

Yo, Ir

(7.3)

K + pO;

{6}

5

10

15

20

25

30

PO; (torr)

Abb. 7.4 Sauerstoffbindungskurve von Myoglobin. Myoglobin ist bei einem Sauerstoffpartialdruck (pO;) von 2,8 torr (3,7 hPa) zur Hälfte mit O, gesättigt. Die hyperbolische Form der Bindungskurve von Myoglobin ist typisch für die einfache Bindung eines kleinen Moleküls an ein Protein.

Diese Gleichung beschreibt eine Hyperbel und ist formal mit den Gleichungen identisch, die die Bindung eines Hormons an seinen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder die Bindung eines kleinen Substratmoleküls an das aktive Zentrum eines Enzyms beschreiben. Diese hyperbolische Funktion ist in Abbildung 7.4 graphisch dargestellt. Bei niedrigem pO, bindet nur sehr wenig O, an Myoglobin (Yo, ist sehr gering). Mit steigendem pO, bindet mehr O, an Myoglobin. Bei hohem pO, sind praktisch alle O,-Bindungsstellen besetzt; das Myoglobin ist mit O, gesättigt. Die Steigung der Hyperbel für einen einfachen Bindungsvorgang, wie die Bindung von O, an Myoglobin, wird größer, wenn K abnimmt. Bei pO, = K ist Myoglobin zur Hälfte mit Sauerstoff gesättigt. Mathematisch wird dies anschaulich, wenn man in Gleichung 7.3 K durch pO, ersetzt. Somit kann K als der Wert für pO, bestimmt werden, bei dem Y = 0,5 (Abb. 7.4). Sinnvollerweise wird K als ps, definiert, der O,-Partialdruck, bei dem Myoglobin zu 50% gesättigt ist. Der p;, für Myoglobin beträgt 2,8 torr (3,7 hPa). Im physiologischen pO,-Bereich im Blut (100 torr (133 hPa) in arteriellem Blut und 30 torr (40 hPa) in venösem Blut) ist Myoglobin fast vollständig mit O, gesättigt; z.B. ist Yo,= 0,97 bei 100 torr und 0,91 bei 30 torr. Infolgedessen sorgt Myoglobin für einen effizienten Sauerstofftransport von den Kapillaren zu den Muskelzellen. Myoglobin besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einer Hämgruppe und hat dementsprechend eine einzige Sauerstoffbindungsstelle. Es ist ein wertvolles Modell für andere ligandenbindende Proteine. Auch Proteine mit mehreren Bindungsstellen für dasselbe kleine Molekül, oder denselben Liganden, zeigen hyperbolische Bindungskurven (vergleichbar der des Myoglobins), wenn die Liganden unabhängig voneinander mit den jeweiligen Bindungsstellen interagieren. Wenn die Affinität eines Liganden zu seinem bindenden Protein nicht bekannt ist, kann diese durch die Bestimmung einer Bindungskurve wie

in Abbildung 7.4 ermittelt werden.

Myoglobin

B.

201

Struktur des Hämoglobins

Hämoglobin, das intrazelluläre Protein, das roten Blutzellen ihre Farbe verleiht,

ist eines der am besten charakterisierten Proteine und war gleichzeitig eines der ersten Proteine, für das eine spezifische physiologische Funktion angenommen wurde (Sauerstofftransport). Hämoglobin ist jedoch keinesfalls nur ein simpler Sauerstoffspeicher; es handelt sich vielmehr um ein hochentwickeltes Transportsystem, das unter unterschiedlichsten Bedingungen genau die benötigte Sauerstoffmenge in die Gewebe bringt. Alle Tiere, die auf Grund ihres Körperdurchmessers zu groß sind (> 1 mm), um ihre Gewebe durch einfache Diffusion ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen, haben Kreislaufsysteme, die Hämoglobin oder ein Protein mit vergleichbarer Funktion enthalten (siehe Exkurs 7.1). Das Hämoglobin der Säugetiere ist, wie in Abbildung 6.33 dargestellt, ein tetrameres Protein mit der Quartärstruktur aß, (ein Dimer aus aß-Protomeren). Die a- und ß-Untereinheiten sind strukturell und entwicklungsgeschichtlich untereinander und mit Myoglobin verwandt. Die Struktur des Hämoglobins wurde von Max Perutz, dem Vater der Röntgenkristallographie, bestimmt (siehe Exkurs 7.2). Nur etwa 18% der Aminosäurereste des Myoglobins sind mit der a- bzw. ßUntereinheit des Hämoglobins identisch, trotzdem weisen die Tertiärstrukturen der drei Polypeptide eine verblüffend große Ähnlichkeit auf (die Bezeichnung der Hämoglobinuntereinheiten entspricht der Nummerierung der Myoglobinhelices, obwohl der a-Kette die D-Helix fehlt). Die aß-Protomere des Hämoglobins haben eine zweizählige Rotationsachse (d.h. eine Drehung um 180° bringt die Protomere zur Deckung). Zusätzlich haben die strukturell sehr ähnlichen aund ß-Untereinheiten eine annähernd zweizählige Symmetrie (Pseudosymmetrie), deren Achse rechtwinklig zur exakten zweizähligen Rotationsachse steht. Hämoglobin zeigt also exakte C,- und pseudo-D,-Symmetrie (Abschnitt 6.3; Objekte mit D,-Symmetrie haben die Rotationssymmetrie eines Tetraeders). Die Abmessungen des gesamten Hämoglobinmoleküls betragen 6,4 X 5,5 X 5,0 nm. Wenn Sauerstoff bindet, ändert sich die Struktur des gesamten Hämoglobintetramers, so dass sich die Strukturen von Desoxyhämoglobin (Abb. 7.5a) und Oxyhämoglobin (Abb. 7.5b) deutlich voneinander unterscheiden. In beiden Formen haben die a- und ß-Untereinheiten ausgeprägten Kontakt: Am a,-ß}-Kontakt (und an seinem entsprechenden a,-ß,-Äquivalent) sind 35 Aminosäuren be-

Abb. 7.5 Hämoglobinstruktur. (a) Desoxyhämoglobin und (b) Oxyhämoglobin. Das a,ß}-Protomer kann über eine zweizählige Symmetrieachse, die rechtwinklig zur Seitenansicht

verläuft (durch die Linse symbolisiert), mit dem @,ß,-Protomer zur Deckung gebracht werden. Die Oxygenierung verkürzt den Abstand zwischen den ß-Ketten (vgl. die Länge der Pfeile mit den Doppelspitzen) und verschiebt die Kontaktstellen @-ß, und a,-ß} der Untereinheiten (einige der relevanten Seitenketten sind schwarz markiert). Die großen grauen Pfeile in (b) zeigen die Molekülbewegungen während der Oxygenierung. [I!lustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.] 6% siehe Kinemage Exercise 6-2 und 6.3.

(b)

a

%

202

Proteinfunktion

Weitere sauerstofftransportierende Proteine Das Vorkommen von O, in der Erdatmosphäre und seine Nutzung bei der Verbrennung von Nahrungssubstanzen führten zur Entwicklung verschiedener Mechanismen für die Speicherung und den Transport von Sauerstoff in Organismen. Bei kleinen Organismen wird der Sauerstoffbedarf durch Diffusion gedeckt. Da jedoch die Diffusionsgeschwin-

sind ihre Sauerstoffbindungsstellen einander äußerst ähnlich. Sie bestehen aus zwei Kupferatomen, von denen jedes drei His-Reste bindet.

digkeit mit dem Quadrat der Diffusionsstrecke abnimmt, be-

nötigen Organismen mit einer Dicke von mehr als 1 mm ein Kreislaufsystern und steigern die begrenzte Löslichkeit von O, in Wasser mittels spezifischer O,-Transportproteine. Viele wirbellose Tiere, sogar manche Pflanzen und Bakterien, enthalten O,-bindende Proteine, die auf Häm basieren.

Hämoglobine aus einzelnen und mehreren Untereinheiten kommen sowohl intrazellulär als auch als extrazelluläre Bestandteile von Blut und anderen Körperflüssigkeiten vor. Das sporadische Vorkommen von hämoglobinähnlichen Proteinen bei Bakterien unterstreicht die Wahrscheinlichkeit eines ein- oder mehrmaligen Gentransfers von Tieren auf Bakterien im Laufe der Evolution. Bei einigen Leguminosen sorgen die sogenannten Leghämoglobine für die O,-Versorgung der stickstofffixierenden Bakterien in den Wurzelknöllchen. Die Chlorocruorine mancher Anneliden (z.B. Regenwürmer) enthalten ein Porphyrinderivat, das sich geringfügig von dem des Hämoglobins unterscheidet und für die grüne Farbe der Chlorocruorine verantwortlich ist. Hämocyanin und Hämerythrin (beide enthalten keine Hämgruppen) sind zwei weitere O,-bindende Proteine, die nur bei Invertebraten vorkommen. Hämerythrin, das nur bei einigen Arten von marinen Würmern vorkommt, ist ein intrazelluläres Protein mit einer Untereinheitenmasse von ca. 13 kD.:Es enthält zwei Fe-Atome, die an His und saure Reste assoziiert sind. Es ist im oxygenierten Zustand violett bis rosa und farblos, wenn es deoxygeniert vorliegt. Hämocyanin,

das ausschließlich

extrazellulär vorkommt,

transportiert O, in Mollusken und Arthropoden. Die Hämocyanine der Mollusken und Arthropoden sind multimere Proteine, die sich auf allen Strukturebenen, von der Primär- bis zur Quartärstruktur, voneinander unterscheiden. Dennoch

Fiese [Abbildung nach einer Röntgenstruktur von Wim Hol, University of Washington School of Medicine. PDBid 10XY.]

In diesem Modell der Sauerstoffbindungsstelle vom Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus sind Kohlenstoff grau, Stickstoff blau, Sauerstoff rot und Kupfer

violett dargestellt. Der sonst farblose Komplex wird blau, wenn er O, bindet. ' Hämocyanin

muss

in hoher Konzentration vorliegen, um

Sauerstoff effektiv transportieren zu können. Die Hämolymphe von Kraken (eine dem Blut äquivalente extrazelluläre Flüssigkeit) z.B. enthält ungefähr 100 mg/mL Hämocyanin. Um den osmotischen Druck bei einer solch hohen Proteinkonzentration zu kontrollieren bildet das Hämocyanin bei einigen Spezies multimere Strukturen mit Massen von 9 x 10° D. Hämocyanin ist oft das vorherrschende extrazelluläre Protein und könnte daher zusätzliche Funktion als Puffer gegen pH-Veränderungen und osmotische Schwankungen besitzen. Bei einigen Invertebraten kann Hämocyanin z.B. während Metamorphose oder Häutung als Nahrungsreserve dienen.

teiligt, am a,-ß,- (und a,-ß,-) Kontakt 19 Reste. Hauptverantwortlich dafür sind hydrophobe Wechselwirkungen, es kommen aber auch zahlreiche Wasserstoffbrücken und einige Ionenpaare vor. Jedoch kommt es zwischen den a,-Q;und ß,-ß,-Paaren bestenfalls zu sehr schwachen Wechselwirkungen, da diese durch einen ca. 2 nm breiten, 5 nm langen, lösungsmittelgefüllten Kanal getrennt sind, der parallel zur exakt zweizähligen Rotationsachse des Hämoglobins verläuft (Abb. 7.5). Durch die Bindung von Sauerstoff verschiebt sich der a,-ß,- (und a,-ß}-) Kontakt, was eine Änderung der Quartärstruktur zur Folge hat. Während der Oxygenierung dreht sich ein aß-Dimer um ca. 15° gegen das andere (graue Pfeile in Abb. 7.5b); dies verkürzt den Abstand zwischen den ß-Untereinheiten und verengt den lösungsmittelgefüllten Kanal im Zentrum des Hämoglobins

Myoglobin

203

een:

Exkurs 7.2 Berühmte Biochemiker Max Perutz und die Bestimmung der Hämoglobinstruktur im Protein binden, ohne dessen Struktur wesentlich zu stö-

ren (was die Positionen aller übrigen Reflexe verändern würde). Wenn sich dabei die Intensitäten der Reflexe messbar verändern,

dann

könnten

diese

Unterschiede

die fehlende

Information zur Bestimmung der Phasen liefern. Bangend und dann jubelnd beobachtete Perutz, dass Hg-dotierte Hämoglobinkristalle in der Tat Reflexe mit messbaren Intensitätsänderungen ergeben, aber keine Positionsänderungen auftraten. Es dauerte noch weitere fünf Jahre, bis er die drei-

Max Perutz (1914-2002)

Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen ist heutzutage so gang und gäbe, dass die Schwierigkeiten, denen sich die ersten Proteinkristallographen ausgesetzt sahen, schwer nachzuvollziehen

sind. Max Perutz war

auf diesem Gebiet einer der Pioniere. Er verbrachte viele Jahre damit, die Struktur von Hämoglobin bei atomarer Auflösung zu bestimmen und nutzte dann diese Information zur Erklärung der physiologischen Funktion dieses Proteins. Im Jahre 1934, zwei Jahre bevor Perutz mit seiner Doktorarbeit in Cambridge begann, hatten J.D. Bernal und Dorothy Crowfoot Hodgkin einen Kristall des Proteins Pepsin mit einem Röntgenstrahl bestrahlt und ein Beugungsmuster erhalten. Perutz machte das gleiche Experiment mit Hämoglobin. Er hatte dieses Protein ausgewählt, weil es in großer Menge vorkommt, leicht kristallisierte und seine physiologische Bedeutung bekannt war. Hämoglobinkristalle ergaben Beugungsmuster

mit

Tausenden

von

Beugungsmaxima

(Reflexe genannt). Diese kommen durch die Röntgenstrahlstreuung von Tausenden von Atomen in jedem Proteinmolekül zustande. Bis dahin hatte man die Röntgenkristallographie zur Strukturbestimmung von Molekülen verwendet, die nur etwa 40 Atome besafen. Zur Bestimmung der atomaren Struktur von Hämoglobin erschien die Methode somit aussichtslos. Nichtsdestotrotz nahm Perutz die Herausforderung an und verbrachte den Rest seiner langen Berufslaufbahn mit der Untersuchung von Hämoglobin. Bei der Röntgenkristallographie kann man die Intensitäten und Positionen der Reflexe leicht bestimmen, aber die Werte ihrer Phasen

(die relativen

Positionen

der Wellenmaxima),

die für die Bildrekonstruktion genauso wichtig sind wie die Wellenamplitude, lassen sich nicht direkt messen. Für die Bestimmung der Phasenwerte kleiner Moleküle waren zwar Computermethoden entwickelt worden, aber praktikable Methoden zur Lösung dieses so genannten Phasenproblems für solch komplexe Moleküle wie Proteine schienen völlig un-

dimensionale Struktur von Hämoglobin bei niedriger Auflösung (0,55 nm) erhielt - und erst 1968, etwa 30 Jahre, nachdem er sein Projekt begonnen hatte, bestimmte er die Hämoglobinstruktur mit nahezu atomarer (0,28 nm) Auflösung. Inzwischen verwendete Perutz‘ Kollege, John Kendrew, die Methode des isomorphen Ersatzes, um die Struktur von Myoglobin aufzuklären, das im Vergleich zu Hämoglobin kleiner und einfacher ist. Für ihre bahnbrechenden Arbeiten erhielten Perutz und Kendrew 1962 den Nobelpreis für Chemie. Für Perutz war die Struktur des Hämoglobins nur ein Teilziel auf dem Weg zum besseren Verständnis der Funktion dieses Proteins. Aus Funktionsuntersuchungen war beispielsweise bekannt, dass die vier Sauerstoffbindungsstellen des Hämoglobins

miteinander

wechselwirken,

was

zur

Hypo-

these führte, dass sie in räumlicher Nähe stünden. Die von

Perutz ermittelte Struktur zeigte jedoch, dass die Bindungsstellen in tiefen und weit voneinander getrennten Taschen liegen. Perutz konnte zudem zeigen, dass in Abwesenheit von Sauerstoff hergestellte Hämoglobinkristalle brachen, wenn sie mit Luft in Berührung kamen (das Ergebnis einer starken Konformationsänderung

im

Protein,

wie

man

inzwischen

weiß), was ein faszinierendes Ergebnis war. Obwohl sich auch viele andere Forscher Hämoglobin zuwandten, war Perutz der führende Kopf bei der Erklärung des Bindungsverhaltens zwischen molekularem Sauerstoff und Proteinen. Er versuchte zudem

intensiv, die Korrelation zwischen

Funk-

tionsstörungen und Strukturveränderungen in Hämoglobinvarianten aufzudecken. Perutz‘ bahnbrechende Arbeit zur Röntgenkristallographie von Proteinen ebnete den Weg für weitere Untersuchungen. So wurde beispielsweise die erste Röntgenstruktur eines Enzyms, Lysozym, 1965 bestimmt. Die mehr als 50.000 Makromolekülstrukturen,

die seither bestimmt

wurden,

sind indi-

rekt Perutz zu verdanken. Denn er ist ganz bewusst eine „nicht lösbare“ Aufgabe angegangen und hat nicht aufgegeben, bis seine Ergebnisse gut genug waren, um biologische Phänomene erklären zu können.

erreichbar zu sein. 1952 erkannte Perutz, dass die Methode

des isomorphen Ersatzes das Phasenproblem bei Hämoglobin lösen könnte. Bei dieser Methode muss ein elektronen-

Perutz, M.F., Rossmann,

reiches

synthesis at 5.5 Ä resolution, obtained by X-ray analysis. Nature 185,

Schwermetallatom,

wie z.B.

ein

Hg’*-Ion

(dessen

Elektronen die Röntgenstrahlen streuen), an definierte Stellen

M.G., Cullis, A. F., Muirhead, H., Will, G.,

North, A.C.T., Structure of haemoglobin: A three-dimensional 416-422

(1960).

Fourier

204

Proteinfunktion

(Abb. 7.5). Einige Atome in den a,-ß,- und u-ß1-Kontaktebenen werden um bis zu 0,6 nm verschoben (die Oxygenierung verändert die Quartärstruktur so stark, dass Kristalle von Desoxyhämoglobin an der Luft zerspringen). Diese strukturelle Umlagerung ist ein entscheidender Faktor für das Sauerstoffbindungsverhalten des Hämoglobins.

1,00 Myoglobin

0,80

"Hämoglobin 0,60

in Vollblut

C. 0,20 Venöser Druck

0

20

40

Arterieller Druck

60 pO,3 (torr)

80

100

120

Abb. 7.6 Sauerstoffbindungskurve des Hämoglobins. Hämoglobin ist in Vollblut bei einem Druck von 26 torr (34,6 hPa) zur Hälfte mit Sauerstoff gesättigt. Die Normalwerte (Meereshöhe) für arteriellen und venösen pO, beim Menschen sind eingezeichnet (der atmosphärische pO, auf Meereshöhe beträgt 150-160 torr (200-212,8 hPa)). Die O,-Bindungskurve für Myoglobin ist zum Vergleich ebenfalls eingezeichnet. Die gestrichelte Linie ist eine hyperbolische O,-Bindungskurve mit demselben p;, wie Hämoglobin.

6% siehe Animated Figures.

Sauerstoffbindung an Hämoglobin

Der ps, von Hämoglobin beträgt 26 torr (34,6 hPa, d.h. die Hälfte aller O,-Bindungsstellen des Hämoglobins sind bei einem Sauerstoffpartialdruck von 26 torr besetzt) und ist damit fast zehnmal größer als der ps, von Myoglobin. Hämoglobin weist auch keine myoglobinähnliche hyperbolische Sauerstoffbindungskurve auf. Stattdessen lässt sich die O,-Bindung an Hämoglobin durch eine sigmoide (S-förmige) Kurve beschreiben (Abb. 7.6). Auf diese Weise kann das Blut wesentlich mehr O, in die Gewebe abgeben, als wenn Hämoglobin eine hyperbolische Bindungskurve bei demselben p;, aufwiese (gestrichelte Linie in Abb. 7.6). Beispielsweise ist Hämoglobin bei arteriellem Sauerstoffdruck beinahe vollständig mit O, gesättigt (Yo,= 0,95 bei 100 torr (133 hPa)), bei venösem Druck allerdings nur etwa zur Hälfte (Yo,= 0,55 bei 30 torr (40 hPa)). Diese Differenz der Sauerstoffsättigung - in Höhe von 0,40 - ist ein Maß für die Fähigkeit des Hämoglobins,

O, von

der Lunge zu den Geweben zu transportieren; sie würde bei einer hyperbolischen Bindungskurve, wie der des Hämoglobins, nur 0,25 betragen. Unabhängig vom jeweiligen Bindungssystem ist eine sigmoide Kurve stets ein Zeichen für eine kooperative Interaktion der Bindungsstellen. Das bedeutet, dass die Bindung eines Liganden an eine Bindungsstelle die Bindung weiterer Liganden an andere Bindungsstellen beeinflusst. Bei Hämoglobin erhöht die Bindung von O, an eine Untereinheit die O,-Affinität der übrigen Untereinheiten. Die anfängliche Steigung der Sauerstoffbindungskurve (Abb. 7.6) ist gering, solange die einzelnen Hämoglobinuntereinheiten unabhängig voneinander um das erste O,-Molekül konkurrieren. Hat jedoch ein O,-Molekül an eine Untereinheit gebunden, erhöht sich die O,-Bindungsaffinität der anderen Hämoglobinuntereinheiten. Dadurch erklärt sich die zunehmende Steigung im mittleren Abschnitt der sigmoiden Kurve. Die Hill-Gleichung beschreibt die O,-Bindungskurve von Hämoglobin Der erste Versuch, die sigmoide O,-Dissoziationskurve des Hämoglobins zu analysieren, stammt von Archibald Hill aus dem Jahre 1910. Hill nahm an, dass Hämoglobin (Hb) n Moleküle O, in einem einzigen Schritt bindet,

Hb + n 0, — Hb(0,), d.h. mit unendlicher Kooperativität. Daher gilt, in Analogie zur Ableitung der Gleichung 7.3,

vl 073

(pO2)” (Pso)" + (pO2)"

(7.4)

die als Hill-Gleichung bekannt ist. Sie beschreibt den Sättigungsgrad des Hämoglobins als Funktion von pO,. Eine unendliche O,-Bindungskooperativität, wie Hill sie annahm, ist physikalisch unmöglich, so kann n jedoch als nicht integraler Parameter für den Grad der Kooperativität zwischen den interagierenden Untereinheiten angenommen werden statt für die Anzahl der Untereinheiten, die im selben Schritt O, binden. Die Hill-Gleichung ist damit ein hilfreiches, empirisches Anpassungsverfahren, kann aber nicht zur Identifizierung eines bestimmten Modells der Ligandenbindung herangezogen werden.

Myoglobin

205

Der Wert für den Hill-Koeffizienten n steigt mit dem Grad der Kooperativität einer Reaktion an und beschreibt damit in vereinfachender Form die Ligandenbindung. Für n = 1 beschreibt Gleichung 7.4 eine hyperbolische Kurve wie Gleichung 7.3 für Myoglobin; diese O,-Bindungsreaktion wird als nicht kooperativ bezeichnet. Eine Reaktion mit n > 1 ist positiv kooperativ, weil die Bindung von O, die Afhnität des Hämoglobins für eine weitere O,-Bindung erhöht (für n = 4, der Zahl der O,-Bindungsstellen des Hämoglobins, ist die Kooperativität als unendlich gesetzt). Entsprechend wird eine Reaktion mit n < 1 als negativ kooperativ bezeichnet, da eine Bindung von O, die Affinität des Hämoglobins für eine nachfolgende O,-Bindung vermindern würde. Der Hill-Koeffizient n und der Wert für ps, durch die die Hämoglobinsättigungskurve am besten beschrieben wird, können durch Umformen von Gleichung 7.4 graphisch bestimmt werden:

Yo, - PO)" 1-. Yo, .. (Pso)”

285 (75)

Durch Logarithmieren beider Seiten erhält man eine lineare Gleichung: I

%n )= 1 Bo:

nlogpO; - nlogpso

(7.6)

Bei der linearen Auftragung von log [Yo,/(1-Yo,)] gegen log pO,, der sogenannten Hill-Auftragung, ist der Hill-Koeffizient n die Steigung und log ps, der Abszissenabschnitt (die lineare Gleichung y = mx + b beschreibt eine Gerade mit der Steigung m und dem x-Achsenabschnitt -b/m). In Abbildung 7.7 ist die Hill-Auftragung für Myoglobin und Hämoglobin dargestellt. Für Myoglobin ergibt die Auftragung wie erwartet eine Gerade mit der Steigung 1. Auch wenn die O,-Bindung an Hämoglobin nicht in einem Schritt verläuft, wie bei der Ableitung der Hill-Gleichung angenommen, ist die Hill-Auftragung für Werte von Yo, zwischen 0,1 und 0,9 linear. Die Steigung, der HillKoeffizient n, ist maximal für pO;= ps [Yo,/(1-Yo,) = 1]. Für normales humanes Hämoglobin liegt der Hill-Koeffizient zwischen 2,8 und 3,0; d.h. die Sauerstoffbindung des Hämoglobins ist hoch, aber nicht unendlich kooperativ. Viele ano-

100

0,99

zuletzt

telßlate[el-ie

10

&

y

0,9

102) Hämoglobin Steigung =3,0

Yo,

0,5 Yo,

1- Yo,

01

Myoglobin Steigung=1

&

Pso des ersten

h

gebundenen

ü

41 01

0,

0,01 0,01

0,1

10

di

pO; (torr)

100

0,01 1000

Abb. 7.7 Hill-Kurven für Myoglobin und gereinigtes Hämoglobin. Man beachte die doppelt-logarithmische Darstellung. Für pOz= Pso ist Yo,/(I-Yo,) = 1.

206

Proteinfunktion

male Hämoglobine haben kleinere Hill-Koeffizienten (Abschnitt 7.1E). Daran sieht man, dass die Kooperativität geringer als bei normalem Hämoglobin ist. Bei Yo, nahe Null, wenn nur wenige Hämoglobinmoleküle ein einzelnes O,Molekül gebunden haben, nimmt die Hill-Kurve eine Steigung von 1 an (Abb. 7.7, untere Asymptote), da die Hämoglobinuntereinheiten (wie Myoglobin) unabhängig voneinander um O, konkurrieren. Bei Yo,-Werten nahe Eins, wenn mindestens drei der vier O,-Bindungsstellen des Hämoglobins besetzt sind, ist die Steigung der Hill-Kurve ebenfalls 1 (Abb. 7.7, obere Asymptote), da die wenigen unbesetzten Bindungsstellen auf verschiedenen Molekülen liegen und daher O, unabhängig voneinander binden. Extrapoliert man die untere Asymptote in Abbildung 7.7 auf die Abszisse, erhält man (siehe Gl. 7.6) einen ps, von 30 torr (40 hPa) für die Bindung des ersten O,-Moleküls an Hämoglobin. Entsprechend erhält man bei der Extrapolation der oberen Asymptote einen ps, von 0,3 torr (0,4 hPa) für die Bindung des vierten O,-Moleküls an Hämoglobin. Folglich bindet das vierte O,-Molekül mit 100fach höherer Affinität an Hämoglobin als das erste. Wie wir im Folgenden sehen werden, ist dieser Unterschied vollständig auf den Einfluss der Globinkette auf die O,-Affinität des Häms zurückzuführen.

D.

Mechanismus der kooperativen Bindung von Sauerstoff

Die beobachtete Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin bedeutet, dass eine Hämgruppe mit gebundenem Liganden Einfluss ausübt auf die Ligandenbindungsaffinität einer anderen, freien Hämgruppe. Der Abstand zwischen den Hämgruppen ist mit 2,5 bis 3,7 nm jedoch zu groß für eine direkte Wechselwirkung der Hämgruppen. Stattdessen wird die Information über die O,-Bindung an einer Hämgruppe mechanisch über Proteinbewegungen an die anderen Hämgruppen übertragen. Diese Bewegungen sind für die unterschiedlichen Quartärstrukturen von Oxy- und Desoxyhämoglobin verantwortlich (siehe

Abb. 7.5).

Hämoglobin hat zwei Konformationszustände Auf der Grundlage der Röntgenstrukturen von Oxy- und Desoxyhämoglobin formulierte Perutz einen Mechanismus für die Oxygenierung von Hämoglobin. Nach dem Perutz-Mechanismus besitzt Hämoglobin zwei stabile Konformationszustände, den T-Zustand (Konformation von Desoxyhämoglobin) und den R-Zustand (Konformation von Oxyhämoglobin). Die Konformationen aller vier Untereinheiten im T-Zustand des Hämoglobins unterscheiden sich von denen des R-Zustands. Die Sauerstoffbindung löst eine Reihe koordinierter Bewegungen aus, die einen Übergang vom T- zum R-Zustand innerhalb weniger Mikrosekunden bewirken: 1. Im T-Zustand befindet sich das Fe(II) ca. 60 pm außerhalb der Hämebene, weil sich die Porphyringruppe in der Art einer „pyramidalen Kuppel“ in Richtung des His F8 (Abb. 7.8) wölbt. Die Bindung von O, ändert die Elektronenkonfiguration der Hämgruppe. Dadurch verkürzen sich die FeNporphyrin Bindungen um ca. 10. pm und die Wölbung der Porphyringruppe verflacht sich. Folglich wandert das Fe(II) beim T>R-Übergang ins Zentrum der Hämebene.

2. Das Fe(Il) zieht das kovalent gebundene His F8 mit sich. Allerdings würde

es bei einer direkten Verschiebung der His F8-Gruppe um 60 pm zur Hämebene zur Kollision mit der Hämgruppe kommen. Um dies zu vermeiden kippt die F-Helix und bewegt sich um ca. 100 pm versetzt zur Hämebene. 3. Die Veränderungen in der Tertiärstruktur sind mit einer Verschiebung der vier Untereinheiten des Hämoglobins verbunden. Der größte Unterschied beim TR-Übergang resultiert aus Bewegungen der Reste an den O1-ß>und a,-ß}-Kontaktflächen. Im T-Zustand steht His FG4(97) der ß-Kette (der

Myoglobin Helix F

Abb. 7.8

207

Bewegungen von Häm und F-Helix

beim T>R-Übergang des Hämoglobins. Im T-Zustand (blau) steht das Fe-Ion 60 pm oberhalb der Porphyrin-„Kuppel“. Beim Übergang in die R-Form (rot) wandert das Fe-Ion in die Ebene des nun planaren Porphyrinrings. So kann es O, stärker binden, dabei werden das His F8 und die

F-Helix mitgezogen. 6% siehe Kinemage Exercise 6-4 und Animated Figures.

vierte Rest im Verbindungsstück zwischen den F- und G-Helices und insgesamt die 97. Aminosäure) in Kontakt mit Thr C6(41) in der a-Kette (dem sechsten Rest der C-Helix und Position 41 der Gesamtkette; Abb. 7.9a). Im R-Zustand dagegen besteht der Kontakt zwischen His FG4 und Thr C3(38), das eine Windung der a-Helix zurückversetzt ist (Abb. 7.9b). In beiden Konformationen passen die Untereinheiten exakt wie Druckknöpfe zusammen. Eine Zwischenposition ist unwahrscheinlich, da der Abstand zwischen His FG4 und Thr C6 zu gering wäre. 4. Die C-terminalen Reste jeder Untereinheit (Arg 141la und His 146ß) bilden im T-Zustand stabilisierende Ionenpaare, sowohl innerhalb der Untereinheiten als auch zwischen ihnen (Abb. 7.10). Die Konformationsverschiebung beim T—R-Übergang führt zum Bruch dieser Ionenpaarbindungen, angetrieben von der Bindungsenergie der Fe-O,-Bindungen. Das entscheidende Charakteristikum des Hämoglobin-T—R-Übergangs ist, dass die Untereinheiten so eng verwoben sind, dass größere Veränderungen der Tertiärstruktur einer Untereinheit immer Auswirkungen auf die Quartärstruktur des gesamten tetrameren Proteins haben. Hämoglobin hat nur zwei Quartärstrukturformen,

den T- und R-Zustand. Die Kontaktstellen zwischen den Untereinheiten (siehe Abb. 7.9) fungieren als binärer Schalter, der nur zwei stabile Positionen der Untereinheiten relativ zueinander zulässt. Der T>R-Übergang muss simultan sowohl an der a,-ß,- als auch der a,-ß,-Kontaktstelle erfolgen, da die a,-ßbzw. a,-ß,-Kontakte nicht flexibel sind. Einzelne Untereinheiten oder Dimere können ihre Konformation nicht unabhängig voneinander verändern. Nun können wir also die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin anhand der Struktur erklären. Die O,-Affinität von Hämoglobin im T-Zustand ist gering, hauptsächlich wegen der um 10 pm längeren Fe-O-Bindung im Vergleich zum R-Zustand (d.h. die blaue Struktur in Abb. 7.8). Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass nach der Bindung von mindestens einem O,-Molekül an jedem aß-Dimer die C-terminalen Ionenpaarbindungen aufgebrochen werden. Dadurch „schnappt“ das Protein in den R-Zustand. Dabei nehmen alle Untereinheiten simultan die R-Konformation ein, egal ob sie O, gebunden haben oder nicht. Untereinheiten in der R-Form ohne Ligand haben eine erhöhte Sauerstoffaffinität, da sie bereits die O,-bindende Konformation einnehmen. Dies erklärt die hohe O,-Affinität von fast vollständig gesättigtem Hämoglobin.

208

Proteinfunktion

Asn G4 (102)

Asp G1 (94)

I

un

23

Thr c3 38

=

u

Thr C3 38

Oxygenierung nn

>

Asp G1 (99)

Thr 66.41

Thr 66.41

Pro CD2.44

Pro CD2.44

Tyr C7

(42)

(a) T-Form (Desoxy)

(6b) R-Form (Oxy)

Abb. 7.9 Veränderungen am o,-ß,-Kontakt während des T>R-Übergangs bei Hämoglobin. (a) Der T-Zustand und (b) der R-Zustand. In den oberen Abbildungen ist die C-Helix als violettes Band dargestellt. Die Reste, die den a]C-ß,FG-Kontakt bilden sind als Kugel-und-Stab-Form dargestellt und entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt (Kohlenstoff grün, Stickstoff blau und Sauerstoff rot). Die Umrisse ihrer van-der-Waals-Oberflächen sind mit farbigen Punkten dargestellt. Die unteren Zeichnungen sind die entsprechenden schematischen Diagramme des a,Cß,FG-Kontakts. Beim TR-Übergang bewegt sich die ß,FG-Region entlang der a,C-Helix ohne stabilen Übergangszustand (beachten Sie, wie in beiden Konformationen die Knöpfe, die von den Seitenketten des His 97ß und des Asp 99ß gebildet werden, in die Vertiefungen auf der C-Helix, die von den Seitenketten von Thr 380, Thr 41a und Pro 44a gebildet werden, passen). Die Untereinheiten sind in den zwei Quärtarstrukturen über verschiedene Wasserstoffbrücken ver-

bunden. Abb. 7.5 zeigt einen anderen Blick auf diese Wechselwirkungen. [Nach einer Röntgenstruktur von Giulio Fermi, Max Perutz und Boaz Shaanan, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge. PDBids (a) 2HHB und (b) IHHO.] 6% siehe Kinemage Exercise 6-5.

Myoglobin (a) a-Ketten

55

0,

209

(b) B-Ketten

Val

Lys

Lys

N-terminal

B,

x

- ..-

C-terminal

.

C-terminal

Val

Val

Val

Tyr

Asp

&,

Asp

—

B,

Kohlendioxidtransport und Bohr-Effekt

Durch die Konformationsänderungen des Hämoglobins bei der Bindung von O, verringern sich die pK-Werte verschiedener Gruppen, darunter auch die der Nterminalen Aminogruppe der a-Untereinheiten und der C-terminalen HisGruppe der ß-Untereinheiten (siehe Abb. 7.10). Im T-Zustand sind diese positiv geladenen, acidischen Gruppen an Salzbrücken beteiligt, wodurch ihr pK-Wert zunimmt (sie werden basischer). Derartige Wechselwirkungen finden im R-Zustand nicht statt. Hämoglobin gibt also unter physiologischen Bedingungen für jedes gebundene O, ca. 0,6 Protonen ab. Umgekehrt stimuliert ein steigender pH-Wert (d.h. ein Abfangen der Protonen) die O,-Bindung an Hämoglobin bei niedrigerem Sauerstoffpartialdruck (Abb. 7.11). Dieses als Bohr-Effekt bezeichnete Phänomen wurde erstmals 1904 von Christian Bohr (dem Vater des Physikers Niels Bohr) beobachtet. Der Bohr-Effekt spielt eine wichtige Rolle beim Transport von O, von der Lunge zu den O,-verbrauchenden Geweben und beim Rücktransport des bei der Atmung entstehenden CO, zur Lunge (Abb. 7.12). Das in den Geweben bei der Atmung entstehende CO, diffundiert aus den Geweben zu den Kapillaren. Das gelöste CO, bildet nur äußerst langsam Hydrogencarbonat (HCO;):

Abb. 7.10 Netzwerk aus lonenpaaren und Wasserstoffbrücken in Desoxyhämoglobin. Diese Bindungen zwischen den zwei letzten Resten der (a) «-Ketten und (b) ß-Ketten, werden beim T-R-Übergang aufgebrochen. Zwei Gruppen, die im R-Zustand partiell deprotoniert werden (Teil des Bohr-Effekts), sind durch weiße Pluszeichen

markiert. [Illustration von Irving Geis. © The Irving

Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.]

1,0

CO; + HBO =H*

+ HCO;z 0,8

In den Erythrocyten (rote Blutkörperchen; griech.: erythros, rot; kytos, Hohlgefäß) katalysiert jedoch die Carboanhydrase diese Reaktion. Entsprechend wird der größte Teil des CO, im Blut als Hydrogencarbonat transportiert (in Abwesenheit von Carboanhydrase würden sich im Blut CO,-Bläschen bilden). In den Kapillaren ist pO, niedrig; die bei der Hydrogencarbonatbildung freigesetzten Protonen werden von Hämoglobin aufgenommen, wobei sich die Ionenpaare des T-Zustands bilden. Dabei wird vermehrt O, freigesetzt. Die Protonenaufnahme fördert darüber hinaus durch eine vermehrte Hydrogencarbonatbildung den CO,-Transport. Umgekehrt führt die O,-Bindung an Hämoglobin in den Lungen (dort ist pO, hoch) zum Aufbrechen der Ionenpaare im T-Zustand. Der R-Zustand wird unter Freisetzung der Bohr-Protonen eingenommen. Die Protonen reagieren mit Hydrogencarbonat und CO, wird abgeatmet. Diese Reaktionen sind so genau aufeinander abgestimmt, dass sich der pH-Wert des Bluts kaum verändert (siehe Exkurs 2.1).

0,4

(2

7

el

Em

ale)

ae)

ale

pO; (torr)

Abb. 7.11 Der Bohr-Effekt. Die O,-Affinität des Hämoglobins nimmt mit steigendem pH zu. Die gestrichelte Linie markiert den pO, in O,-verbrauchender Muskulatur. [Nach Benesch, R.E., und Benesch, R., Adv. Protein

Chem. 28, 212 (1974).] &% siehe Animated Figures.

210

Proteinfunktion

Abb. 7.12 Die Rolle von Hämoglobin und Myoglobin beim Transport von O, von den Lungen zu den O,-verbrauchenden Geweben und von CO; (als HCO;) vom Gewebe zurück zu den Lungen. In den Lungen wird Sauerstoff bei hohem pO, eingeatmet und bindet an Hämoglobin im Blut. O; wird in die Gewebe transportiert, wo es bei nied-

rigem pO, von Hb abdissoziiert und in die Gewebe diffundiert. Dort oxidiert es Stoffwechselprodukte zu CO, und H,O. Im rasch arbeitenden Muskelgewebe bindet O, zuerst an Myoglobin (höhere O,Affinität als Hämoglobin). Dadurch kann mehr O, aus den Kapillaren ins Gewebe diffundieren, d.h. die Löslichkeit ist erhöht. Hb und CO, (überwiegend als HCOz) werden zu den Lungen zurück transportiert, wo CO, abgeatmet wird.

pOs = 100 Torr

Über den Bohr-Effekt kann zusätzlicher Sauerstoff in stark beanspruchte Muskulatur gebracht werden, wo der pO,< 20 torr (26,6 hPa) betragen kann. Dort entsteht Milchsäure (Abschnitt 15.3A) so schnell, dass der pH-Wert des Bluts in diesen Muskeln von 7,4 auf 7,2 fallen kann. Bei einem pO, von 20 torr setzt Hämoglobin bei pH 7,2 ca. 10% mehr O, frei als bei pH 7,4 (Abb. 7.11). CO, beeinflusst die O,-Bindung an Hämoglobin auch durch eine reversible Anlagerung an die N-terminalen Aminogruppen der Plasmaproteine unter Bildung von Carbamaten: R-

NH,

+ C0,

=R-

NH - COO’ + H*

Im T-Zustand (DesoxyHb) bindet Hämoglobin mehr CO, in Form von Carbamat als in der R-Form (OxyHb). Bei hoher CO,-Konzentration, wie in den Kapillaren, ist die T-Form bevorzugt; die Desoxygenierung von Hämoglobin wird stimuliert. Die bei der Carbamatbildung frei werdenden Protonen fördern eine weitere O,Freisetzung über den Bohr-Effekt. Obwohl der Unterschied der CO,-Bindung zwischen Oxy- und Desoxyhämoglobin nur ca. 5% des Gesamt-CO,-Gehalts im Blut beträgt, wird dennoch die Hälfte des transportierten CO, über diesen Mechanismus gebunden, weil nur ca. 10% des Gesamt-CO, im Blut pro Cyclus über die Lunge abgeatmet werden.

gereinigtes Hb

Bisphosphoglycerat bindet an Desoxyhämoglobin

Hoch gereinigtes Hämoglobin hat eine höhere O,-Affinität als Hämoglobin im Voliblut (Abb. 7.13). Auf Grund dieser Beobachtung ging Joseph Barcroft bereits 1921 davon aus, dass außer CO, noch eine weitere Substanz die O,-Bindung an Hämoglobin beeinflussen muss. Dabei handelt es sich um v-2,3-Bisphosphoglycerat (BPG).

E00 C H-C--oroR HC ro"

u

oo

©

2

©

0

©

m

PO; (torr)

Abb. 7.13 Der Einfluss von BPG und CO, auf die O,-Bindungskurve von Hämoglobin. Gereinigtes Hämoglobin (links) hat eine höhere O,-Affinität als Vollblut (rote Kume). Die Zugabe von BPG oder CO, (oder von beidem) verschiebt die Kurve nach rechts (erniedrigt die O,-Affinität von Hämoglobin). [Nach Kilmartin, J.V. und

Rossi-Bernardi, L., Physiol. Rev. 53, 884 (1973).] e% siehe Animated Figures.

D-2,3-Bisphosphoglycerat (BPG)

BPG bindet fest an Desoxyhämoglobin, aber nur schwach an Oxyhämoglobin. In Erythrocyten von Säugetieren senkt daher BPG die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin durch eine Stabilisierung der Desoxykonformation. Bei anderen Vertebraten haben verschiedene phosphorylierte Substanzen denselben Effekt. BPG hat eine unverzichtbare physiologische Funktion: Bei einem pO, von ca.

100 torr (133 hPa) ist Hämoglobin in arteriellem Blut zu 95% mit O, gesättigt, in venösem Blut (pO; ca. 30 torr = 40 hPa) allerdings nur zu 55% (Abb. 7.6). Das

Myoglobin

211

Höhenanpassung Der atmosphärische

Druck sinkt mit steigender Höhe, so-

dass der Sauerstoffpartialdruck in der Atmosphäre bei 3000 m nur rund 110 Torr beträgt, das entspricht 70% des Drucks auf Meereshöhe. Um auch in großer Höhe im Körper eine normale Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, ist eine Vielzahl von physiologischen Anpassungen erforderlich. Ein Sauerstoffpartialdruck von 85 Torr oder weniger würde ohne Adaptation zu Störungen der Hirnfunktion führen. Die Höhenanpassung ist ein komplexer Vorgang, der unter anderem eine Zunahme der Erythrocyten und der Hämoglobinmenge pro Erythrocyt mit sich bringt. Es dauert normalerweise mehrere Wochen, bis eine Akklimatisierung erreicht ist. Aber wer sich schon einmal in großer Höhe aufgehalten hat, weiß, dass bereits nach einem Tag eine bemerkenswerte

Anpassung erfolgt. Dafür ist der rasche Anstieg der Synthese von BPG (p-2,3-bisphosphoglycerat) von rund 4 mM auf rund 8 mM in den Erythrocyten verantwortlich. Trägt man Yo, gegen pO, auf, erkennt man den Effekt dieser Zunahme des BPG-Spiegels in den Erythrocyten (BPG kann die Erythrocytenmembran nicht passieren): Die O,-Bindungskurve von Hämoglobin auf Meereshöhe (schwarze Kurve) verschiebt sich in großen Höhen zu einer Bindungskurve geringerer Affinität (rote Kume). Auf Meereshöhe beträgt der Unterschied zwischen dem arteriellen und venösen pO, 70 Torr (100 Torr — 30 Torr), so dass Hämoglobin 38% seines gebundenen Sauerstoffs wieder abgeben kann. Fällt jedoch der arterielle pO, auf 55 Torr, wie dies in einer Höhe von 4500 m der Fall ist, dann kann Hämoglobin nur 30% seines gebundenen Sauerstoffs abgeben. Die Höhenanpassung führt dazu, dass Hämoglobin in der Lunge zwar weniger O, binden kann, bewirkt aber gleichzeitig einen überproportionalen Anstieg der im Gewebe freigesetzten O,-Menge. Insgesamt ermöglicht diese Anpassung, dass Hämoglobin mit einer

nahezu

normalen

Effizienz

arbeitet,

indem

können somit keine Proteine synthetisieren). Durch eine veränderte BPG-Konzentration kann überdies die Sauerstoffversorgung feiner reguliert werden als durch eine veränderte Atemfrequenz. Bei Hyperventilation, eine weitere frühe Reaktion auf große Höhen, kann es zur respiratorischen Alkalose

kommen (Exkurs 2.1). In diesem Zusammenhang ist auch interessant, dass die Bewohner hoch gelegener Regionen wie der Anden und des Himalaya im Vergleich zu Flachlandbewohnern eine höhere Lungenkapazität sowie höhere Hämoglobinspiegel aufweisen. Häufig haben sie auch eine vergrößerte rechte Herzkammer (was das erhöhte Herzzeitvolumen widerspiegelt). Im Gegensatz zu den Mechanismen bei der menschlichen Anpassung an große Höhen besitzen die meisten Säugetiere, die in großen Höhen leben (z.B. das Lama), ein genetisch verändertes Hämoglobin mit einer höheren O,-Bindungsaffinität als ihre „Vettern“ auf Meereshöhe. Somit kann sowohl

die Erhöhung als auch die Senkung des p;, von Hämoglobin für eine Höhenanpassung sorgen. Arterieller

Arterieller

Venöser

pO, auf

pO, auf

PO»

4500 m

Meereshöhe

Y

'

Y

es 37%

seines gebundenen O; liefert. Man beobachtet eine Zunahme der BPG-Konzentration auch bei Personen, die aufgrund einer Erkrankung eine mangelnde Oxigenierung des Blutes (Hypoxie) aufwiesen, wie z.B. bei verschiedenen Anämien und Herz-Lungen-Insuffizienzen. Die BPG-Konzentration in Erythrocyten kann schneller angepasst werden als neues Hämoglobin synthetisiert werden kann (Exkurs 15.2; Erythrocyten haben keinen Zellkern und

0

heißt, Hämoglobin gibt bei der Passage durch die Kapillaren ca. 40% des gebundenen O, ab. Ohne BPG könnte nur ein kleiner Teil davon freigesetzt werden, da

dabei die O,-Affinität von Hämoglobin steigen würde und die O,-Bindungskurve deutlich zu niedrigeren pO,-Werten verschoben würde (Abb. 7.13, links). BPG spielt aber auch bei der Höhenanpassung eine wichtige Rolle (siehe Exkurs 7.3). nn Röntgenstruktur eines BPG-Desoxyhämoglobin-Komplex zeigt, dass BPG in der zentralen Tasche des Desoxyhämoglobins bindet (Abb. 7.14). Die Abstände der anionischen Gruppen des BPG liegen im Bereich von Wasserstoff-

20

40 60 pO; (torr)

80

100

212

Proteinfunktion

Abb. 7.14 Bindung von BPG an Desoxyhämoglobin. BPG (rot) bindet in der zentralen Tasche des Hämoglobins. BPG, das unter physiologischen Bedingungen fünf anionische Gruppen hat, ist von acht kationischen Gruppen (blau) der beiden B-Untereinheiten umgeben. Im R-Zustand ist die zentrale Tasche zu eng; BPG kann nicht mehr binden. Die lonenpaare und Wasserstoffbrückenbindungen, die den T-Zustand (Abb. 7.10b) stabilisieren, sind unten rechts eingezeichnet. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.] 6% siehe Kinemage Exercise 6-3.

brücken und Ionenpaarbindungen zu den N-terminalen Aminogruppen der beiden ß-Untereinheiten. Der T>R-Übergang bringt die beiden ß-H-Helices näher zusammen. Dadurch verengt sich die zentrale Tasche (vgl. Abb. 7.5a und 7.5b) und BPG wird herausgedrängt. Der Abstand der ß-N-terminalen Aminogruppen vergrößert sich von 1,6 auf 2,0 nm, damit sind auch keine Wasserstoffbrückenbindungen zu den Phosphatgruppen des BPG mehr möglich. BPG stabilisiert also die T-Konformation des Hämoglobins durch eine Quervernetzung seiner ß-Untereinheiten. Dies verschiebt das Gleichgewicht T = R zur T-Form hin und senkt die O,-Affinität von Hämoglobin. Fetales Hämoglobin hat eine niedrige BPG-Affinität

Die Bindungseigenschaften von BPG tragen auch zur Sauerstoffversorgung eines Fötus bei. Ein Fötus wird über die Plazenta vom mütterlichen Kreislauf mit Sauerstoff versorgt. Die BPG-Konzentration in den Erythrocyten ist beim Erwachsenen und beim Fötus gleich, aber BPG bindet fester an das Hämoglobin eines Erwachsenen als an fetales Hämoglobin. Die höhere O,-Affinität von fetalem Hämoglobin erleichtert so den O,-Transfer zum Fötus. Fetales Hämoglobin besteht aus den Untereinheiten a,y,, wobei die y-Untereinheit eine Variante der ß-Kette ist (Abschnitt 5.4B). Bei der ß-Kette des Erwachsenen sitzt an Position 143 ein kationisches His, während das fetale Hämoglobin dort ein ungeladenes Ser hat. Durch das fehlende His kommen einige der Wechselwirkungen, die den BPG-Desoxyhämoglobin-Komplex stabilisieren, nicht zustande (Abb. 7.14).

Myoglobin Allosterische Proteine

Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ist ein klassisches Modell für das Verhalten vieler anderer Proteine (einschließlich bestimmter Enzyme), die aus mehreren Untereinheiten bestehen und kleine Moleküle binden. Manchmal führt die Bindung eines Liganden an eine Bindungsstelle zu einer höheren Affinität anderer Bindungsstellen desselben Proteins (wie z.B. bei der O,-Bindung an Hämoglobin). In anderen Fällen erniedrigt die Bindung eines Liganden die Affinität der anderen Bindungsstellen (z.B. reduziert BPG die O,-Affinität des Hämoglobins). Derartige Effekte resultieren aus allosterischen Wechselwirkungen (griech.: allos, der andere; stereos, fest, Abstand). Zu allosterischen Effekten, bei denen die Bindung eines Liganden an einer Bindungsstelle die Bindung eines weiteren Liganden an einer anderen Bindungsstelle beeinflusst, kommt es durch Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten oligomerer Proteine. Der T—R-Übergang der Hämoglobinuntereinheiten erklärt die unterschiedliche O,-Affinität von Oxy- und Desoxyhämoglobin. Andere Proteine zeigen ähnliche Konformationsverschiebungen, wenngleich die molekularen Grundlagen dieser Phänome noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Zwei Modelle einer kooperativen Ligandenbindung haben größte Beachtung gefunden. Das Symmetriemodell der Allosterie, das 1965 von Jacques Monod, Jeffries Wyman und Jean-Pierre Changeux aufgestellt wurde, geht von folgenden Voraussetzungen aus:

1. Ein allosterisches Protein ist ein Oligomer von zueinander symmetrischen Untereinheiten (obwohl die a- und ß-Untereinheiten des Hämoglobins nur pseudosymmetrisch sind). 2. Jedes Protomer kann in zwei Konformationszuständen auftreten, die als R und T bezeichnet werden; diese Zustände stehen miteinander im Gleichgewicht. 3. Der Ligand kann in jeder Konformation an eine Untereinheit binden. Der Konformationsübergang ändert lediglich die Affınität zum Liganden. 4. Die molekulare Symmetrie des Proteins bleibt bei der Konformationsänderung erhalten. Die Untereinheiten müssen daher ihre Konformation in einer konzertierten Aktion verändern; mit anderen Worten, es gibt keine Oligomere, die gleichzeitig R- und T-Untereinheiten enthalten. Das Symmetriemodell für ein tetrameres (bindendes) Protein ist in Abbildung 7.15 dargestellt. Wenn ein Ligand fester an ein Protomer im R-Zustand bindet als an ein Protomer im T-Zustand, wird die Bindung des Liganden den T>RÜbergang fördern und dabei die Affinität der unbesetzten Untereinheiten für den Liganden erhöhen. Allerdings fällt es schwer zu glauben, dass die Symmetrie der Oligomere in allen Proteinen unverändert erhalten bleibt. Das heißt, der T>R-Übergang würde in allen Untereinheiten gleichzeitig erfolgen, unabhängig von der Zahl gebundener Liganden. Außerdem kann das Symmetriemodell nur eine positive Kooperativität erklären, dabei zeigen einige Proteine eine negative Kooperativität. Als Alternative schlug Daniel Koshland das sequentielle Modell der Allosterie vor. Nach diesem Modell verursacht die Bindung eines Liganden eine Konformationsänderung der Untereinheit, an die der Ligand bindet. Der Einfluss dieser Konformationsänderung auf die benachbarten Untereinheiten bewirkt die kooperativen Wechselwirkungen. Die Konformationsveränderungen erfolgen sequentiell mit zunehmender Besetzung der Bindungsstellen (Abb. 7.16). Die Ligandenbindungsaffinität einer Untereinheit variiert mit ihrer Konformation.

Untereinheiten des T-Zustands

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>

213

Untereinheiten des R-Zustands

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(02)

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\ Abb. 7.15 Symmetriemodell der Allosterie. Quadrate und Kreise symbolisieren T- bzw. R-Zustand eines tetrameren Proteins. T- und R-Zustand sind im Gleichgewicht unabhängig von der Anzahl gebundener Liganden (symbolisiert durch S). Das Modell erlaubt keine Kombination von T- und R-Zustand im selben Protein, alle

Untereinheiten müssen entweder im T- oder R-Zustand vorliegen.

Abb. 7.16 Sequentielles Modell der Allosterie. Die Bindung von Liganden induziert zunehmend Konformationsänderungen der Untereinheiten, wobei die Untereinheiten mit gebundenem Liganden die gröftten Veränderungen erfahren. Im Gegensatz zum Symmetriemodell bleibt hier die Symmetrie des oligomeren Proteins nicht erhalten.

214

Proteinfunktion

Sie kann im Vergleich zu den Untereinheiten im Protein ohne gebundene Lganden höher oder niedriger sein. Daher können Proteine nach dem sequentiellen Modell der Allosterie positive oder negative Kooperativität aufweisen. Bei sehr fester Kopplung der Untereinheiten erfolgt die Konformationsänderung simultan, so dass das Oligomer seine Symmetrie beibehält (wie im Symmetriemodell). Daher kann das Symmetriemodell auch als Extremfall des allgemeineren sequentiellen Modells gesehen werden. Die Sauerstoffbindung an Hämoglobin weist Merkmale beider Modelle auf. Der T-R-Übergang erfolgt in allen vier Untereinheiten konzertiert, entspricht also dem Symmetriemodell. Aber die Bindung eines Liganden verursacht kleine Anderungen in der Tertiärstruktur, wie vom sequentiellen Modell vorhergesagt. Diese kleinen Konformationsänderungen sind zweifellos für die Auslösung des TORÜbergangs verantwortlich. Die Komplexität von Ligand-Protein-Wechselwirkungen bei Hämoglobin und anderen Proteinen scheint also eine sehr feine Regulation der Bindungsprozesse zu erlauben, je nach den Bedürfnissen eines Organismus bei wechselnden inneren und äußeren Bedingungen. Allosterischen Effekten werden wir auch bei der Besprechung der Enzyme in Kapitel 12 begegnen.

E.

Abnormale Hämoglobinformen

Vor der Einführung rekombinanter DNA-Techniken boten Hämoglobinmutanten eine einzigartige Möglichkeit, Struktur-Wirkungs-Beziehungen in Proteinen zu untersuchen. Lange Jahre nämlich war Hämoglobin das einzige Protein bekannter Struktur mit einer großen Anzahl gut untersuchter, natürlicher Varianten. Die Untersuchungen von Patienten sowie Routine-Elektrophoreseuntersuchungen menschlicher Blutproben führten zur Entdeckung von rund 500 Hämoglobinvarianten, von denen >90% auf den Austausch einer einzelnen Aminosäure in einer Globinkette zurückzuführen waren. Tatsächlich sind ca. 5% der Weltbevölkerung Träger erblicher Hämoglobinvarianten. Nicht alle Hämoglobinvarianten verursachen klinische Symptome, aber einige anomale Hämoglobinmoleküle sind tatsächlich für schwere Krankheiten verantwortlich (natürlich auftretende tödliche Hämoglobinvarianten können ja nicht beobachtet werden). In Tabelle 7.1 sind einige dieser Hämoglobinvarianten aufgelistet. Mutationen, die eine Destabilisierung der Tertiär- oder Quartärstruktur von Hämoglobin hervorrufen, verändern die O,-Bindungsaffinität (ps,) und reduzieren die Kooperativität (Hill-Koeffizient). Zudem werden diese instabilen Hämoglobine von den Erythrocyten abgebaut und deren Abbauprodukte verursachen oft die Lyse der Erythrocyten. Eine daraus resultierende hämolytische Anämie (Anämie bedeutet den Verlust roter Blutkörperchen) beeinträchtigt den O,-Iransport in die Gewebe. Bestimmte Mutationen an der O,-Bindungsstelle der a- oder der ß-Kette begünstigen eine Oxidation von Fe(lI) zu Fe(IlI), Methämoglobin entsteht. Träger dieser Mutation entwickeln auf Grund des Methämoglobins im arteriellen Blut eine Cyanose (bläuliche Hautfarbe). Die Kooperativität dieser Hämoglobine ist geringer und besitzt einen

Hill-Koeffizienten von

ca. 1,2 (im Vergleich zum

theoretisch möglichen Maximalwert von 2, denn nur zwei der Methämoglobinuntereinheiten können Sauerstoff binden).

Bei Mutationen, die zu erhöhter O,-Affinität führen, werden vermehrt Erythrocyten gebildet, um die reduzierte Sauerstoffabgabe in den Geweben zu kom-

pensieren. Diese an Polyzythämie leidenden Patienten sind meist an einer Gesichtsrötung zu erkennen.

Sichelzellanämie Klinisch schwerwiegende Mutationen treten nur selten auf. Allerdings tragen

ca. 10% der Afroamerikaner und ca. 25% der Farbigen in Afrika eine einzige Kopie (sind heterozygot bezüglich) des Gens für Sichelzellhämoglobin

Myoglobin

215

Tab. 7.1 Hämoglobinvarianten. EEE EN FE rue sn Te Effekt Name® Mutation ze E ee EE Hammersmith Phe CD1(42)ß > Ser Schwächung der Hämbindung

Bristol

Val E11(67) > Asp

Schwächung der Hämbindung

Bibba

Leu H19(136)« > Pro

Aufbrechen der H-Helix

Savannah

Gly B6(24)ß — Val

Aufbrechen der B-E-Helix-Kontaktstelle

Philly

Tyr C1(35)« — Phe

Bruch der Wasserstoffbrücken an der a,-ßı-Kontaktstelle

Boston

His E7(58)a — Tyr

Förderung der Methämoglobinbildung

Milwaukee

Val E11(67)ß

Förderung der Methämoglobinbildung

Iwate

His F8(87)a — Tyr

Förderung der Methämoglobinbildung

Yakima

Asp G1(99)ß > His

Bruch einer den T-Zustand stabilisierenden Wasserstoffbrücke

Kansas

Asn G4(102)ß — Thr

> Glu

Bruch einer den R-Zustand stabilisierenden Wasserstoffbrücke

* Hämoglobinvarianten werden üblicherweise nach dem Ort ihrer Entdeckung benannt (z.B. Hämoglobin Boston).

(Hämoglobin S). Individuen, die zwei Kopien des Gens für Hämoglobin S tragen (homozygot sind), leiden an Sichelzellanämie, einer schmerzhaften und oft tödlich verlaufenden Erkrankung. Unlösliche Desoxyhämoglobinfilamente verursachen eine Deformation der Erythrocyten (Abb. 7.17), die starren, sichelförmigen Zellen können in den Kapillaren verklumpen. Bei einem Sichelzellschub kommt es in manchen Geweben zu einer kompletten Blockade des Blutflusses, was zum Absterben des Gewebes führt. Zusätzlich verursacht die Anfälligkeit gegenüber mechanischer Beanspruchung eine hämolytische Anämie. Heterozygote Träger mit einem Hämoglobin S-Anteil bis ca. 40% am Gesamt-Hämoglobin können gewöhnlich ein normales Leben führen, obwohl ihre Erythrocyten eine kürzere Halbwertszeit haben. 1945 stellte Linus Pauling die Theorie auf, dass Sichelzellanämie die Folge einer Mutation im Hämoglobin ist. 1949 zeigte er, dass diese Hämoglobinmutante eine geringere negative ionische Ladung besitzt als das normale Hämoglobin von Erwachsenen. Dies war der erste Beleg dafür, dass einer Krankheit eine Veränderung der molekularen Struktur eines Proteins zu Grunde liegen kann. Da Sichelzellanämie vererbbar ist, musste ein defektes Gen für das anomale Protein verantwortlich sein. Dennoch wurde erst 1956 der molekulare Defekt im Sichelzell-Hämoglobin identifiziert. Damals zeigte Vernon Ingram, dass Hämoglobin S an der sechsten Position der ß-Ketten Val anstelle von Glu enthält. Zum ersten Mal konnte damit nachgewiesen werden, dass eine Erbkrankheit auf den Austausch einer spezifischen Aminosäure innerhalb eines Proteins zurückzuführen war. Die Röntgenstruktur von Desoxyhämoglobin S zeigte, dass eine ausgetauschte Val-Seitenkette von Hämoglobin S in die hydrophobe Tasche an der Oberfläche der B-Untereinheit eines weiteren Hämoglobin-Moleküls bindet (Abb. 7.18). Dieser intermolekulare Kontakt ermöglicht die Bildung linearer Hämoglobin-S-Polymere. Aggregate aus 14 Strängen, die sich umeinander winden, bilden Fasern mit einem Durchmesser von ca. 22 nm. Die Fasern erstrecken sich über die gesamte Länge der Erythrocyten (Abb. 7.19). Die hydrophobe Tasche an der P-Untereinheit, die bei Oxyhämoglobin nicht auftritt, ist zu klein, um die Glu-Seitenkette von normalem Hämoglobin aufzunehmen. Folglich können weder norma-

Abb. 7.17 Elektronenmikroskopische Aufnahmen humaner Erythrocyten. (a) Normale Erythrocyten sind biegsame, bikonkave Scheiben, die bei der Passage durch die Kapillaren ein leichtes Verbiegen tolerieren (viele Kapillaren haben einen kleineren Durchmesser als Erythrocyten). [David M. Phillips/Visuals Unlimited.] (b) Bei Sichelzellanämie sind die Erythrocten länglich und starr und können Kapillaren nicht leicht passieren. [Bill Longcore/Photo Researchers, Inc.]

216

Proteinfunktion Abb. 7.19 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Hämoglobin-S-Fasern, die aus einem zerstörten Erythrocyten austreten.

[Mit freundlicher Genehmigung von Robert Josephs, University of Chicago.]

(a)

les Hämoglobin noch Oxyhämoglobin S polymerisieren. In der Tat dissoziieren Hämoglobin-S-Fasern bei der Oxygenierung so rasch, dass sie in arteriellem Blut nicht nachweisbar sind. Die Gefahr der Faserbildung und einer Unterbrechung des Blutflusses ist bei der Desoxygenierung während der Passage durch die Kapillaren am größten. Die Polymerisation der Hämoglobin-S-Moleküle ist konzentrations- und zeitabhängig. Dies erklärt, warum eine Blockade der Blutzufuhr nur sporadisch auftritt (ein sogenannter Schub bei der Sichelzellanämie). Interessanterweise haben viele homozygote Hämoglobin-S-Träger nur eine milde Form der Sichelzellanämie, weil sie relativ viel fetales Hämoglobin produzieren, das y-Ketten anstelle der defekten ß-Ketten enthält. Durch die erhöhte Konzentration an fetalem Hämoglobin wird das Hämoglobin S verdünnt, und die Wahrscheinlichkeit einer Aggregation während der 10-20 s, die ein Erythrocyt von den peripheren Geweben bis zur Reoxygenierung in der Lunge unterwegs ist, sinkt. Durch die Gabe von Hydroxyharnstoff, (0) ESNZE6CZENEHZZOH Hydroxyharnstoff

(b) Abb. 7.18 Struktur einer Desoxyhämoglobin-SFaser. (a) Anordnung von Desoxyhämoglobin-S-Molekülen in einer Faser. Die Darstellung zeigt je drei Untereinheiten eines Desoxyhämoglobin-S-Moleküls. (b) Die Seitenkette der Variation Val 6 in der ß>-Kette eines Hämoglobin-S-Moleküls (gelber

Punkt in (a)) bindet in die hydrophobe Tasche der Bı-Untereinheit eines benachbarten Hämoglobin-SMoleküls. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.]

der ersten und bisher einzigen effektiven Behandlung von Sichelzellanämie, lassen sich die Symptome der Sichelzellanämie lindern, da der Anteil der Zellen, die fetales Hämoglobin enthalten, erhöht wird. Der Wirkmechanismus von Hydroxyharnstoff ist unbekannt. Hämoglobin S schützt vor Malaria Vor der Einführung moderner palliativer Therapien überlebten Sichelzellanämie-Patienten selten bis zur Geschlechtsreife. Trotzdem führte die natürliche Selektion nicht zur Auslöschung der Hämoglobin-S-Variante. Heterozygote Träger dieser Mutation sind nämlich resistenter gegenüber Malaria, einer oft letalen Infektion. Von den 2,5 Milliarden Menschen, die in Malariagebieten leben, zeigen 100 Millionen klinische Symptome und rund 1 Million, meistens kleine Kinder, sterben pro Jahr an Malaria. Malaria wird unter anderem von Plasmodium falciparum verursacht, einem durch Moskitos übertragenen Protozoen, der den größten Teil seines 48 h dauernden Lebenscyclus in Erythrocyten verbringt. Infizierte Erythrocyten bleiben an Kapillarwänden kleben.

Dies kann zum

Tod führen,

wenn der Blutfluss zu einem lebenswichtigen Organ behindert wird. Regionen in Äquatorialafrika, in denen Malaria eine Haupttodesursache ist, überlagern sich mit den Gegenden, wo das Sichelzellgen vorkommt (Abb. 7.20). Daraus kann man schließen, dass das Sichelzellgen Malariaresistenz verleiht. Wie kommt es dazu? Die Infektion mit Plasmodien lässt den Erythrocyten-pH um ca. 0,4 Einheiten sinken. Der niedrigere pH-Wert begünstigt über den Bohr-Effekt die Desoxyhämoglobinbildung. Dadurch erhöht sich die Wahr-

Muskelbewegung

217

Abb. 7.20 Übereinstimmung zwischen Malaria und dem Sichelzellgen. Die blauen Flächen kennzeichnen Regionen, in denen Malaria häufig verbreitet ist oder war. Die pink-farbenen Bereiche stellt die Verteilung des Hämoglobin S-Gens dar. Beachten Sie die Überlappung (violett) der Verteilungen.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 AR Malaria

EEE sicheizeil-Gen EEE] überlappendes Gebiet

scheinlichkeit, dass Hämoglobin-S-enthaltende Erythrocyten zerfallen. Schadhafte Erythrocyten werden normalerweise von der Milz aus dem Kreislauf entfernt. In der frühen Phase einer Malariainfektion ermöglichen die von den Parasiten verursachten Schäden wahrscheinlich eine bevorzugte Entfernung infizierter Erythrocyten durch die Milz. In späteren Stadien der Infektion, wenn die infizierten Erythrocyten an den Kapillarwänden haften (vermutlich um einer Entfernung durch die Milz zu entgehen), kann eine lyse zu einer mechanischen Zerstörung der Parasiten führen. Folglich haben heterozygote Hämoglobin-S-Träger in Malariagebieten einen adaptiven Vorteil: Die Wahrscheinlichkeit, dass sie das Erwachsenenalter erreichen, ist bei ihnen höher als bei Homozygoten für normales Hämoglobin. Daher steigt in Malariaregionen der Bevölkerungsanteil der heterozygoten Träger des Sichelzellgens so lange, bis der Reproduktionsvorteil durch den entsprechend zunehmenden Anteil der Homozygoten (die ohne moderne medizinische Therapie bereits in der Kindheit sterben) aufgewogen wird.

2

1. Beschreiben Sie das Sauerstoffbindungs-Verhalten von Myoglobin hinsichtlich pO, und K. Wie ist K definiert? 2. Erklären Sie die strukturellen Grundlagen für die kooperative Bindung von O, an Hämoglobin. 3. Beschreiben Sie die Funktion von Myoglobin und Hämoglobin beim Transport von Sauerstoff von der Lunge zum peripheren Gewebe. 4. Worin liegt die physiologische Relevanz des Bohr-Effekts und von BPG? 5. Erklären Sie, wie Mutationen die Sauerstoffaffinität und die Kooperativiät von Hämoglobin erhöhen oder senken können. Wie kann der Körper diese Veränderungen kompensieren?

_Muskelbewegung

Eines der eindrucksvollsten Merkmale von Lebewesen ist sicherlich deren Fähigkeit, sich koordiniert zu bewegen. Bewegungsphänomene gibt es auf allen strukturellen Ebenen, sie umfassen so verschiedenartige gerichtete Prozesse wie die Trennung replizierter Chromosomen während der Zellteilung, die Schlagbewegungen von Geißeln und Cilien sowie die Muskelkontraktion. Dieser Abschnitt

beschäftigt sich mit den strukturellen und chemischen Grundlagen von Bewegungsvorgängen in quergestreifter Muskulatur, eines der am besten untersuchten Bewegungssysteme.

|

j u

A.

Struktur quergestreifter Muskulatur

Die willkürlich bewegbaren Muskeln, zu denen die Skelettmuskeln gehören, sehen im Lichtmikroskop quergestreift aus (Abb. 7.21). Diese Muskeln bestehen aus langen, vielkernigen Zellen (den Muskelfasern), die parallele Bündel aus

2

ij

Mikroskopaufnahme einer Muskelfaser im Längsschnitt.

Abb. 7.21

Die Querstreifung mit den dunklen A- und hellen I-Banden ist deutlich zu erkennen. ]J-.C. Revy, CNRI/Photo Researchers.]

218

Proteinfunktion

(b) Muskelfaser-

bündel

(ce) Einzelne Muskelfaser

(d) Myofibrilie

Abb. 7.22 Aufbau der Skelettmuskulatur. Ein Muskel (a) besteht aus Muskelfaserbündeln (b); jede Muskelfaser ist eine langgestreckte, dünne Zelle mit vielen Kernen (c), die sich über die gesamte Länge des Muskels erstrecken kann. Muskelfasern enthalten Bündel aus Myofibrillen (d), die aus abwechselnd angeordneten dicken und dünnen Filamenten bestehen.

Abb. 7.23 Anatomie der Myofibrillen. Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt einen Ausschnitt aus drei Myofibrillen, die durch horizontale Zwischenräume getrennt sind. Die Schemazeichnung zeigt die wichtigsten Merkmale der Myofibrillen: Die helle I-Bande enthält nur dünne Filamente; die dunkle H-Zone im Zentrum

der A-Bande enthält nur dicke Filamente, während

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in den äußeren, noch dunkleren Bereichen der

A-Bande dicke und dünne Filamente überlappen. An der Z-Scheibe sind die dünnen Filamente verankert und die M-Scheibe entsteht durch Verdickungen im Zentrum der dicken Filamente. Die Funktionseinheit der Myofibrillen, das Sarko-

mer, ist der Bereich zwischen zwei aufeinander folgenden Z-Scheiben. [Mit freundlicher Genehmigung von Hugh Huxley, Brandeis University.]

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Querschnitt

Muskelbewegung (a)

219

(b)

Abb. 7.24 Kontraktion der Myofibrillen. (a) Elektronenmikroskopische Aufzeichnungen, die

Myofibrillen (griech.: myos, Muskel; Abb. 7.22) enthalten. Im Elektronenmikroskop erkennt man, dass die Bandenstruktur vieler Myofibrillen, die auf derselben Höhe liegen, für die Querstreifung verantwortlich ist. Die Banden kommen durch alternierende Bereiche höherer und geringerer Elektronendichte zustande und werden als A- bzw. I-Banden bezeichnet (Abb. 7.23). Das Sarkomer (griech.: sarkos, Fleisch), die Wiederholungseinheit der Myofibrillen, ist von Z-Scheiben begrenzt, die in der Mitte der I-Banden liegen. Im Zentrum der A-Bande befindet sich die H-Zone, in deren Mitte wiederum die M-Scheibe liegt. Die A-Bande enthält dicke Filamente mit einem Durchmesser von 15 nm, die I-Bande dünne Filamente mit einem Durchmesser von 7 nm. Ein kontrahierter Muskel kann bis zu einem Drittel kürzer sein als im vollständig gestreckten Zustand. Die Kontraktion ist Folge einer Verkürzung der Sarkomere, indem sich die Länge der I-Bande und der H-Zone verringert (Abb. 7.24a). Diese Beobachtungen von Hugh Huxley aus dem Jahr 1954 (siehe Exkurs 7.4) lassen sich durch das Gleitfasermodell erklären, nach dem ineinander greifende dicke und dünne Filamente aneinander vorbeigleiten (Abb. 7.24b). Dementsprechend werden die Muskeln während einer Kontraktion kürzer und, da sich deren Gesamtvolumen nicht ändert, auch dicker. Dicke Filamente bestehen hauptsächlich aus Myosin

Die dicken Filamente bestehen bei Vertebraten beinahe ausschließlich aus einem einzigen Protein, dem Myosin. Es setzt sich aus sechs Polypeptidketten zusammen: zwei schweren Ketten mit je 220 kD und zwei Paaren unterschiedlich leichter Ketten, den so genannten essentiellen und regulatorischen leichten Kette (ELC und RLC), mit einer je nach Herkunft zwischen 15 und 22 kD schwankenden Molekülmasse. Ivan Rayment und Hazel Holden bestimmten die Röntgenstruktur der N-terminalen Hälfte der schweren Myosinkette, des so genannten Myosinkopfes. Diese bildet ein langgestrecktes (5,5 X 16,5 nm) globuläres Köpfchen. Je eine Untereinheit von ELC und RLC binden an das Köpfchen (Abb. 7.25a). Die C-terminalen Hälften der schweren Kette bilden einen langen, fibrillären a-helicalen

Schwanz;

je zwei dieser a-Helices bilden

eine linksgängige Superspirale. Myosin besteht also aus einem 160 nm langen, stäbchenförmigen Segment mit zwei globulären Köpfchen (Abb. 7.25b). Die Aminosäuresequenz im a-helicalen Schwanz von Myosin ist typisch für Helices wie z.B. in Keratin (Abschnitt 6.1C): Sie enthält eine pseudo-Wiederholungseinheit aus sieben Aminosäuren, a-b-c-d-e-fg, wobei an den Positionen a und d unpolare Reste überwiegen.

den Kontraktionsverlauf von Myofibrillen darstellen. Die I-Bande und H-Zone verkürzen sich bei der Kontraktion, während sich die Länge der dicken und dünnen Filamente nicht verändert. (b) Schematische Darstellung ineinander greifender Gruppen dicker und dünner Filamente, die aneinander vorbeigleiten. [Mit freundlicher Genehmigung von Hugh Huxley, Brandeis University.]

220

Proteinfunktion Abb. 7.25

Struktur von Myosin.

(a) Bänderdiagramm des Myosinkopfes aus Hühnermuskel. Die 25-, 50- und 20-kD-Segmente

(a)

der schweren Kette sind grün, rot, bzw. blau. Die essenziellen und regulatorischen leichten Ketten, ELC und RLC, sind violett und gelb. An verschiedenen Stellen sind die Aminosäurenummern angegeben; zu den Nummern der RLC und ELC wurde noch 2000 bzw. 3000 addiert,

um sie von der schweren Kette unterscheiden zu können. Ein Sulfat-lon in Kalottenform (rot) ist in der Nähe der Stelle gebunden, an der sich die drei Segmente der schweren Kette treffen. Dort besetzt es die Bindungsstelle der a-Phosphatgruppe von ATP. Ein an RLC gebundenes Ca’*-Ion ist durch eine graue Kugel (unten links) dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Ivan Rayment und Hazel Holden, University of Wisconsin. PDBid 2MYS]. (b) Diagramm des Myosinmoleküls. Es besteht aus zwei identischen schweren Ketten (grün und orange), die jeweils ein N-terminales globuläres Köpfchen und einen a-helicalen Schwanz haben. Zwischen dem Köpfchen und dem Schwanz ist der Hebelarm, der sich mit den beiden Typen von leichten Ketten verbindet (hellblau und lavendel). Die Schwänze winden sich umeinander und bilden eine . 160 nm lange parallele Superspirale.

NH} Schwere

Kette

Br —

Abb. 7.26 Struktur eines dicken (a) Die elektronenmikroskopische die Myosinköpfchen, die aus dem herausragen. [Nach Trinick, J. und

Filaments. Aufnahme zeigt dicken Filament Elliott, A.,J.Mol.

Biol. 131, 135 (1977).] (b) Ein dickes Filament besteht aus mehreren Hundert Myosinmolekülen in einer gestaffelten Anordnung, so dass die globulären Köpfchen nach außen ragen.

Leichte Kette

Unter physiologischen Bedingungen lagern sich mehrere Hundert Myosinmo -

leküle zu einem dicken Filament zusammen. Die stäbchenförmigen Schwänze bilden eine regelmäßige, versetzte Anordnung, bei der die globulären Köpfchen an beiden Enden seitlich herausragen (Abb. 7.26). Diese Myosinköpfchen sorgen in intakten Myofibrillen für die Quervernetzung mit den dünnen Filament en Das Myosinköpfchen ist eine ATPase (ein ATP hydrolysierendes Enzym) u einer 1,3 nm tiefen, V-förmigen Tasche als ATP-Bindungsstelle.

Muskelbewegung

221

Abb, 7.27 Röntgenstruktur von Actin aus Kaninchenmuskel. Die vier Domänen des Proteins sind türkis,

magentarot, orange und gelb angefärbt; die N- und C-Termini sind gekennzeichnet. Ein nicht hydrolysierbares ATP-Analogon, Adenosin-5‘-(ß,y-imido) triphosphat, das hier als Stabmodell gezeichnet ist und dessen Atome entsprechend eingefärbt sind (C grün, N blau, O rot und P gold), bindet am Boden eines tiefen Spalts zwischen den Domänen. Das Ca?*-Ion ist durch eine hellgrüne Kugel dargestellt. [Nach der Röntgenstruktur von Roberto Dominguez, Boston Biomedical Research Institute,

Watertown, Massachusetts. PDBid INWK.]

Dünne Filamente bestehen hauptsächlich aus Actin

Dünne Filamente bestehen hauptsächlich aus Actinpolymeren. Actin ist das häufigste cytosolische Protein in Eukaryoten (es macht ungefähr 20% des Proteinanteils in Muskelzellen aus und bis zu 15% des Proteins in Nicht-Muskelzellen). In seiner Monomerform bezeichnet man dieses aus 375 Aminosäuren bestehende Protein als G-Actin (G steht für globulär); wenn es polymerisiert, nennt man es F-Actin (F steht für fibrillär). Jede Actinuntereinheit hat Bindungsstellen für ATP und ein Ca?*- oder Mg?*-Ion, die sich in einem tiefen Spalt befinden (Abb. 7.27). Für die Polymerisation von Actin ist die Hydrolyse von ATP zu ADP und Pi nicht erforderlich, sie findet anschließend statt (Abschnitt 7.2C). Die faserige Beschaffenheit von F-Actin und seine unterschiedlichen Faserlängen haben die Gewinnung von Kristallen in einer für die röntgenkristallographische Analyse hinreichenden Qualität verhindert. Infolgedessen beruht unser augenblickliches Verständnis der atomaren Struktur von F-Actin auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen (Abb. 7.28a). Außerdem hat man Modelle mit geringer Auflösung herangezogen, die auf Röntgenuntersuchungen ausgerichteter F-Actin-Gele basieren. In diese wurden hoch aufgelöste Atommodelle von GActin eingepasst (Abb. 7.28b). Diese Modelle zeigen, dass das Actinpolymer eine Doppelstranghelix ist, deren Untereinheiten jeweils vier andere Untereinheiten berühren. Jede Untereinheit hat die gleiche Kopf-an-Schwanz-Ausrichtung (d.h. alle Nucleotidbindungsstellen sind in Abb. 7.28b nach oben geöffnet).

Abb. 7.28 Struktur des Actinfilaments. (a) Kryoelektronenmikroskopische Darstellung. Die Tropomyosinbindungsstellen (siehe dazu die nachfolgende Abbildung) sind blau dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Daniel Safer, University of Pennsylvania und Ronald Milligan, The Scripps Research Institute, La Jolla, California.] (b) Im Modell wurde die Röntgenstruktur des Actinmonomers an die per Röntgenfaserbeugung ermittelte Struktur von F-Actin angepasst. Die Actinmonomere sind als Kalottenmodell gezeigt, wobei blau, rot und weiß sich abwechseln; jeder Aminosäurerest

ist als eine

Kugel dargestellt. Das ganz unten gezeigte Monomer ist genau so ausgerichtet wie in Abbildung 7.27. Die Aminosäuren, von denen man aus Crosslinking-Untersuchungen weiß, dass sie die Myosinbindungsstelle bilden, sind grün dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Wolfgang Kabsch und Kenneth Holmes, Max-Planck-Institut für medizinische Forschung, Heidelberg.]

222

Proteinfunktion

_ Exkurs 7.4 Berühmte Biochemiker Hugh Huxley und das Gleitfilamentmodell bewegte sich das Cytoplasma von Muskelzellen wie das einer Amöbe. Andere Theorien postulierten, dass Muskel-

Hugh Huxley (1924-)

Die Muskelbewegung hat Wissenschaftler seit Hunderten oder sogar Tausenden von Jahren fasziniert. 1682 wurde erstmals eine Muskelfaser

im

Detail

betrachtet,

wobei

Antoni van Leeuwenhoeks frühes Mikroskop ein Muster aus dünnen Längsfasern offenbarte. In der Neuzeit hat die Muskelforschung zwei Ansätze verfolgt: Zum einen kann ein Muskel als ein energieübertragendes System untersucht werden, in dem Stoffwechselenergie erzeugt und verbraucht wird. Dieser Forschungsansatz bekam

in den 1930er-Jahren

einen enormen

Schub,

als man entdeckte, dass ATP die Energiequelle für die Muskelkontraktion darstellt. Beim zweiten Ansatz wird der Muskel als mechanisches System angesehen, d.h. seine Streben und Hebel werden analysiert. Schließlich hat ein molekularer Ansatz die mechanischen und energetischen Aspekte der Muskelforschung zusammengeführt. Dies wurde durch die Erkenntnisse von Hugh Huxley ermöglicht. Die molekulare Beschreibung des Muskels erfolgte nicht über Nacht. Im Jahre 1859 isolierte Willi Kühne eine proteinartige Substanz aus dem Muskelgewebe, die er „Myosin“ nannte (die höchstwahrscheinlich eine Mischung verschiedener Proteine darstellte). Da die Substanz jedoch zur Verklumpung neigte, war sie kein so beliebtes Untersuchungsobjekt wie die löslicheren Proteine, zu denen z.B. das Hämoglobin zählte. Ein wichtiger Durchbruch in der Muskelchemie gelang 1941. Damals zeigte der ungarische Biochemiker Albert Szent-Györgyi, dass sich aus dem Muskel mithilfe einer hochkonzentrierten Salzlösung zwei Proteinarten extrahieren ließen (Szent-Györgyi leistete auch einen Beitrag zur Aufklärung des Citratcyklus, Exkurs 17.1). Eine 20-minütige Ex-

fasern Wasser aufnehmen und abgeben oder andere Fasern elektrostatisch abstoßen und anziehen. Linus Pauling hatte kurz zuvor die a-Helix- und ß-Faltblattstruktur entdeckt (Exkurs 6.1) und spekulierte nun, dass Myosin seine Länge verändern

dadurch

könnte, dass es zwischen

zwei

Protein-

konformationen hin und herwechselte. Mit seinem Gleitfilamentmodell formulierte Huxley eine elegante — und wie sich zeigen sollte, korrekte — Erklärung für die Muskelkontraktion. 1948 begann Huxley seine Doktorarbeit an der Universität Cambridge in England, im Labor von John Kendrew (der zehn Jahre später die erste Röntgenstruktur eines Proteins, nämlich die von Myosin, bestimmte; Abschnitt 7.1A). Huxley führte Röntgenuntersuchungen an Froschmuskelfasern durch und konnte nachweisen, dass sich das Röntgenbeugungsmuster mit dem physiologischen Zustand des Muskels ändert. Des Weiteren zeigte er, dass der Muskel zwei Reihen

paralleler

Fasern

enthält,

und

dass

diese

Fasern

über viele Querbrücken verknüpft sind. Diese Beobachtungen waren Anstoß für die weitere Forschung, die er 1953 und 1954 am MIT (Massachusetts Institute of Technology, Boston) betrieb. Er schloss sich mit der Britin Jean Hanson zusammen,

die ebenfalls am

MIT arbeitete.

Hanson

nutzte

ihre Kenntnisse der Muskelphysiologie und ihre Expertise in der Phasenkontrastmikroskopie. Mit dieser Technik konnte man das Bandmuster von Muskelfasern sichtbar machen. Huxley und Hanson untersuchten Muskelfasern von Kaninchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und mafßen die exakte Breite der A- und I-Banden in Sarkomeren (Abb. 7.23). In einem Experiment extrahierten sie Myosin aus der Muskelfaser und bemerkten, dass dadurch die dunkle A-Bande verschwunden war, woraus sie folgerten,

Myosin B bezeichnet, heutzutage Actomyosin genannt. Bald schon wurde klar, dass Myosin B eine Mischung aus zwei

dass die A-Bande aus Myosin besteht. Wenn sie sowohl Actin als auch Myosin extrahierten, ging die gesamte erkennbare Struktur verloren. Daraus schlossen sie, dass Actin auf der ganzen Länge des Sarkomers vorkommt. Fügten Huxley und Hanson ihren Präparationen ATP hinzu, kontrahierte der Muskel langsam, und sie konnten die Verkürzung der I-Bande messen. Die A-Bande behielt eine

Proteinen

konstante

traktion ergab ein Protein, das er als Myosin A bezeichnete,

das aber heute nur Myosin heißt. Erfolgte die Extraktion über Nacht, so erhielt er ein zweites

Protein, von

ist, nämlich aus Myosin und einem

Protein, das man

Actin

nannte.

Die weiteren

ihm als

unbekannten Arbeiten

zeig-

ten, dass sich Actomyosinfäden in Gegenwart von ATP auf etwa 10% ihrer ursprünglichen Länge verkürzten. Da in Gegenwart von ATP weder Actin noch Myosin alleine kontrahieren, musste die Kontraktion durch das Zusammenspiel beider zustande kommen. Es dauerte jedoch noch ein weiteres Jahrzehnt,

bis ein realistisches

Modell für das Zusam-

menwirken von Myosin und Actin entwickelt war. Um

die Muskelkontraktion

zu erklären,

hatte

man

eine

Reihe von Theorien aufgestellt. Nach einer dieser Theorien

Länge, wurde jedoch dunkler.

Durch

Ziehen

am

Deckglas ließ sich eine Muskelfaser unter dem Mikroskop ebenfalls ausdehnen. Wenn

der Muskel „entspannte“, dann

wurde die I-Bande breiter und die A-Bande weniger dicht. Die Messungen wurden an Muskelfasern durchgeführt, die sich auf 60% ihrer ursprünglichen Länge verkürzt bzw. auf 120% ihrer Ursprungslänge gedehnt hatten. Das Entscheidende am Gleitfilamentmodell, das Huxley erstmalig beschrieb und nachfolgend verfeinerte, war die Annahme, dass einzelne Moleküle (bzw. die aus Ihnen gebil-

deten und im Mikroskop sichtbaren Fasern) nicht schrumpf-

Muskelbewegung

ten oder sich ausdehnten, sondern aneinander vorbeiglitten. Während der Kontraktion werden die Actinfilamente (dünne Filamente) der I-Bande in die A-Bande hineingezogen, die aus unbeweglichen myosinhaltigen Filamenten (dicken Filamente) besteht. Während der Dehnung ziehen sich die Actinfilamente aus der A-Bande zurück. Zu ähnlichen Schlüssen kam das Team von Andrew Huxley (kein Verwandter von Hugh) und Rolf Niedergerke, die die Kontraktion lebender Froschmuskelfasern untersuchten. Beide Gruppen veröffentlichten ihre Arbeiten nebeneinander in ein und demselben Heft der Zeitschrift Nature im Jahre 1954. Hugh Huxley ergänzte sein Gleitfilamentmodell um weitere Details. Er zeigte z.B., dass Myosin mit Actinfasern

Quer-

brücken ausbildet. Diese Brücken sind jedoch asymmetrisch, sie zeigen in den beiden Sarkomerhälften in entgegengesetzte Richtungen. Diese Anordnung ermöglicht es Myosin, die dünnen Filamente gegeneinander, zur Sarkomermitte hin zu ziehen (Abb. 7.24). Zur gleichen Zeit, als Huxley den Mechanismus der Muskelkontraktion beschrieb, klärten Watson und Crick die

223

DNA-Struktur auf, und Max Perutz gelang der entscheidende Durchbruch bei der Verwendung von Schwermetallatomen, um das Phasenproblem bei seinen Röntgenuntersuchungen von Hämoglobin zu lösen (Exkurs 7.2). Zusammengenommen zeigten diese drei Entdeckungen ein enormes Potential zur molekularen

Beschreibung biologischer Phänomene, die

noch heute von großer Bedeutung sind. Die nachfolgenden Untersuchungen der Muskelkontraktion wurden mithilfe der Elektronenmikroskopie, Röntgenkristallographie und Enzymologie durchgeführt, um die Feinheiten des Gleitfilament-

modells aufzuklären. Dazu zählten die Struktur des MyosinHebelarms, die Zusammensetzung des dünnen Filaments und die genaue Rolle von ATP bei der Auslösung der Konformationsänderungen, welche die mechanische Kraft erzeugen.

Huxley, H.E., Hanson, J., Changes in the cross-striations of muscle

during contraction and stretch and their structural interpretation, Nature

173, 973-976 (1954).

Damit hat die zusammengesetzte Faser eine eindeutige Polarität. Das Ende der Faser, in dessen Richtung sich die Nucleotidbindungsstelle öffnet, nennt man das (-)-Ende, das andere Ende heift (+)-Ende. Die (+)-Enden der dünnen Filamente binden an die Z-Scheibe (Abb. 7.23). Jedes F-Actinmonomer im Muskel kann ein einzelnes Myosinköpfchen binden (Abb. 7.29), wahrscheinlich über eine Ionenpaarbindung und die Assoziation hydrophober Bereiche auf jedem Protein. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die an das F-Actinfilament gebundenen Myosinköpfchen alle gleich ausgerichtet sind (Abb. 7.30). Sie lassen auch erkennen, dass in dünnen Filamenten, die immer noch mit der Z-Scheibe verbunden sind, alle Myosinköpfchen von der Z-Scheibe wegzeigen. Tropomyosin und Troponin sind die Bestandteile der dünnen Filamente

Myosin und Actin, die Hauptbestandteile des Muskels, machen 60 bis 70% bzw. 20 bis 25% des gesamten Muskelproteins aus. Darüber hinaus sind zwei Proteinkomponenten der dünnen Filamente besonders häufig vertreten: 1. Tropomyosin, ein Homodimer, dessen beide aus 284 Aminosäuren bestehenden a-helicalen Untereinheiten sich umeinander winden und eine parallele Superspirale bilden. Diese erstreckt sich nahezu über die gesamte 400-nmLänge des Moleküls (Abb. 6.15b zeigt einen Teil davon). Viele dieser stäbchenförmigen Proteine sind Kopf-an-Schwanz zusammengefügt und bilden so einen Strang, welcher entlang der Furchen der F-Actin-Helix verläuft. Dabei kommt jedes Tropomyosinmolekül mit sieben nachfolgenden Actinuntereinheiten in Berührung (Abb. 7.30). Troponin, ein Heteromer aus drei Untereinheiten: TnC, ein Ca°*-bindendes Protein, TnI, das an Actin bindet, und TnT, ein längliches Molekül, das an die Kopf-Schwanz-Kontaktstelle von Tropomyosin bindet. Die Röntgenstruktur von Troponin im Komplex mit vier Ca°'-Ionen (Abb. 7.31), die von Robert Fletterick bestimmt wurde, zeigt, dass TnI den leichten Myosinketten stark ähnelt. Sie zeigt auch, dass in diesem Ca’*-aktivierten Zustand das inhibitorische Segment von TnI an die starre zentrale Helix von TnC bindet.

Wie wir weiter unten sehen werden, reguliert der Tropomyosin-Troponin-Komplex die Muskelkontraktion, indem er den Zugang der Myosinköpfchen zu deren Bindungsstellen an der Actinfaser kontrolliert.

224

Proteinfunktion

Abb. 7.29 Modell der Myosin-ActinWechselwirkung. Röntgenstrukturen von Actin und vom Myosinkopf, sowie elektronenmikroskopische Aufnahmen ihres Komplexes sind die Grundlage für die Konstruktion dieses Kalottenmodells. Das Actinfilament befindet sich oben. Die globulären Bereiche des Myosinkopfes sind rot und grün, sein a-helicaler Hebelarm ist blau und die leichten Ketten sind gelb und pinkfarben. Der superspiralisierte Schwanz ist nicht gezeigt. Eine ATP-Bindungsstelle sitzt in einem Spalt in der roten Domäne des Myosinkopfes. In einer Myofibrille hat jedes Actinmonomer die Möglichkeit, einen Myosinkopfzu binden. Aus dem dicken Filament ragen zahlreiche Myosinköpfe. [Mit freundlicher Genehmigung von Ivan Rayment und Hazel Holden, University of Wisconsin.)

In

nn

Abb. 7.30 Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme eines mit Myosinköpfen bestückten dünnen Filaments bei einer Auflösung von unter 2,5 nm. F-Actin ist rot, Tropomyosin blau, die Domäne

mit

dem Myosinmotor gelb, die essenzielle leichte Kette grün. Das helicale Filament hat eine Ganghöhe (Steigung pro Umdrehung) von 37 nm. [Mit freundlicher Genehmigung von Ronald Milligan, The Scripps Research Institute, La Jolla, California.

Abb. 7.31

Röntgenstruktur von Troponin aus dem Skelettmuskel des Huhns.

TnC ist rot, Tnl blau und TnT goldfarben. Die vier Ca°*-Ionen, die von TnC gebunden sind

sind als türkisfarbene Kugeln dargestellt. [Nach einer Röntgenstruktur von Robert Fletterick University of California at San Francisco. PDBid IYTZ.]

Muskelbewegung Der Muskel enthält zahlreiche kleine Proteine, die seine Funktion modulieren

Es gibt neben den oben genannten noch viele andere Muskelproteine. Diese bilden die Z-Scheibe und die M-Scheibe und kontrollieren die Anordnung der dicken und dünnen Filamente. Ein Beispiel dafür ist a-Actinin, ein stäbchenförmi-

ges homodimeres Protein. Es ist mit F-Actinfilamenten quervernetzt und liegt im Innern der Z-Scheibe. Man vermutet deshalb, dass es für die Anheftung der entgegengesetzt ausgerichteten dünnen Filamente an die Z-Scheibe sorgt. Ein außergewöhnliches Muskelprotein ist Titin. Es bestitzt die längste Polypeptidkette (34.350 Aminosäuren) unter allen bekannten Proteinen und besteht aus etwa 300 sich wiederholenden globulären Domänen. Drei bis sechs Titinmoleküle verbinden sich mit jedem dicken Filament, das sich über die Strecke von 1 um zwischen M- und Z-Scheibe erstreckt. Man vermutet, dass Titin als

molekulares „Spanngummi“ fungiert, um das dicke Filament in der Mitte des Sarkomers zu halten: Wenn sich während der Muskelkontraktion das Sarkomer verkürzt, dann verdichtet sich Titin. Wenn sich aber der Muskel entspannt, dann

verhindert Titin eine Ausdehnung des Sarkomers über seine ursprüngliche Länge hinaus. Auch Nebulin ist ein extrem großes, hauptsächlich a-helicales Protein (6669 Aminosäuren). Es ist mit dem dünnen Filament assoziiert. Man nimmt an, dass es die Länge des dünnen Filaments vorgibt, indem es als Vorlage für die Actinpolymerisation dient. Diese Länge wird durch Tropomodulin konstant gehalten, welches das (-)-Ende des dünnen Filaments bedeckt (das Ende, das nicht mit der Z-Scheibe verbunden ist). Dabei verhindert es die weitere Polymerisation und Depolymerisation von Actin. CapZ (auch ß-Actinin genannt) ist ein mit a-Actinin verbundenes Heterodimer, das entsprechend das (+)-Ende von F-Actin kaschiert. Die M-Scheibe (Abb. 7.23) entsteht aus der lokalen Vergrößerung der dicken Filamente.

Zwei Proteine, die in der M-Scheibe vorkommen,

Myomensin und

M-Protein, binden an Titin und werden vermutlich in das dicke Filament genauso wie das Myosin-Bindeprotein C eingebaut. Die Duchenne Muskeldystrophie (DMD) und die weniger schwerwiegende Becker-Muskeldystrophie (BMD) sind beide geschlechtsgekoppelte Muskelschwundkrankheiten. Bei der DMD, die im Alter von zwei bis fünf Jahren einsetzt, übersteigt die Muskeldegeneration die Muskelregeneration. Dies verursacht Muskelschwäche und führt schließlich aufgrund von Atembeschwerden und Herzversagen im Alter von etwa 25 Jahren zum Tod. BMD beginnt im Alter von fünf bis zehn Jahren. Die Muskeldegeneration hat einen insgesamt langsameren Verlauf, sodass die davon Betroffenen länger leben (bis hin zum Erreichen einer normalen Lebensdauer) als Personen mit DMD. Das Gen, das bei DMD und BMD involviert ist, codiert ein Protein aus 3685 Aminosäuren namens Dystrophin. Dystrophin kommt im Muskelgewebe mit einem Anteil von 0,002% vor. In den Muskeln von Personen mit DMD lässt sich aber gewöhnlich kein Dystrophin nachweisen. Bei an BMD Erkrankten hat Dystrophin eine andere Größe als bei Gesunden. Offenbar werden die Dystrophine von Personen mit DMD rasch abgebaut, wohingegen sie bei Personen mit BMD noch partiell funktional sind. Dystrophin gehört zu einer Familie von flexiblen stäbchenförmigen Proteinen, zu denen auch andere Actin-bindende Bestandteile des Cytoskeletts gehören. Dystrophin interagiert auf der Innenseite der Plasmamembran der Muskelzelle mit einem Transmembran-Glykoprotein-Komplex. Dort unterstützt es die Verankerung von F-Actin an der extrazellulären Matrix und verhindert somit, dass die Plasmamembran durch die mechanische Belastung der Muskelkontraktion zerreißt. Obwohl solche kleinen Risse bei Muskelzellen nicht ungewöhnlich sind, kommen sie sehr viel häufiger bei dystrophen Zellen vor. Dies führt zu einem rascheren Absterben der Zellen.

225

226

Proteinfunktion

B.

Abb. 7.32 Mechanismus der Krafterzeugung im Muskel. Das Myosinköpfchen „wandert“ in einem

gerichteten, cyclischen, durch ATP-Hydrolyse getriebenen Prozess am dünnen Actinfilament entlang. Es ist nur ein Myosinköpfchen dargestellt. Das Actinmonomer, an welches

das Myosinköpfchen zu Beginn des Cyclus gebunden war, ist zur besseren Übersicht

dunkel gefärbt. [Nach Rayment, |., und

Mechanismus der Muskelkontraktion

Um die Beschreibung der Muskelkontraktion zu vervollständigen, müssen wir bestimmen, wie die ATP-Hydrolyse an das Gleitfasermodell gekoppelt ist. Wenn das Gleitfasermodell korrekt ist, dann ist es unmöglich für eine Myosin-Querverbindung, während der Muskelkontraktion immer mit dem gleichen Punkt des dünnen Filaments verbunden zu bleiben. Vielmehr muss jede ActinMyosin-Querverbindung wiederholt gelöst und an einer Bindungsstelle am dünnen Filament weiter in Richtung Z-Scheibe neu geknüpft werden. Das legt wiederum nahe, dass die Muskelspannung durch die Interaktion von Myosin-Querverbindungen und dünnen Filamenten erzeugt wird. Die für die Kontraktion erforderliche Kraft stammt aus der ATP-Hydrolyse. Somit ist Myosin ein Motorprotein,

Holden, H.M., Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 949

(1993).] 6% siehe Animated Figures. Z-Scheipe

&—

—-

M-Scheibe SWS (

LEN,

\

Dünnes Filament

1

m

6

ADP-Freisetzung

Ze ————

öffnet sich; Myosinköpfchen setzt Actin frei

ee

Dickes Filament

ATP bindet an ein Myosinköpfchen; Actin-Bindungsstelle

=

ADP

2

5

Kraftschlag

Verschluss des aktiven Zentrums; nachfolgend ATP-Hydrolyse, die die „Spannung“ des Myosinköpfchens auslöst

Übergangszustand

———.,—A.,—__ — nn > —————C————ue u —— ——— ————

4

Freisetzung von P; führt zu einer starken Bindung des Myosinköpfchens an Actin

3

Schwache Bindung des Myosinköpfchens an Actin

Muskelbewegung

227

das die chemische Energie der ATP-Hydrolyse in die mechanische Energie der Bewegung umwandelt. Edwin Taylor formulierte ein Modell für die myosinvermittelte ATP-Hydrolyse, das nach Strukturuntersuchungen von Ivan Rayment, Hazel Holden und Ronald Milligan wie folgt angepasst wurde (Abb. 7.32): 1. ATP bindet an ein Myosinköpfchen; dadurch öffnet sich die Actinbindungsstelle und das gebundene Actin wird freigesetzt. 2. ATP wird im aktiven Zentrum eingeschlossen. Durch die ATP-Hydrolyse wird das Myosinköpfchen „aufgerichtet“, d.h. es nimmt seine „energiereiche“ Konformation ein, in der es rechtwinklig zum dicken Filament steht. 3. Das Myosinköpfchen bindet schwach an ein Actinmonomer mit einer geringeren Distanz zur Z-Scheibe als das Monomer, an das es bisher gebunden war. 4. Myosin setzt P; frei; die daraus resultierende Konformationsverschiebung erhöht die Affinität des Myosins für Actin. 5. Der Übergangszustand wird sofort vom „Kraftschlag“ gefolgt, einer weiteren Konformationsänderung, die den C-terminalen Schwanz des Myosinköpfchens um etwa 6 nm näher an die Z-Scheibe bringt, relativ zur Actinbindungsstelle an seinem Köpfchen. Dadurch wird das dünne Filament um diese Distanz näher zur M-Scheibe gezogen. 6. ADP wird freigesetzt, der Cyclus ist beendet. Da der Reaktionscyclus verschiedene Schritte umfasst, von denen einige irreversible sind (z. B. die ATP-Hydrolyse und die Freisetzung von P;), ist der gesamte Cyclus unidirektional. Die ungefähr 500 Myosinköpfchen eines dicken Filaments durchlaufen diesen Cyclus asynchron, jedes bis zu fünfmal pro Sekunde während einer starken Muskelkontraktion. Die Myosinköpfchen „wandern“ oder „rudern“ dabei bei gleichzeitiger Muskelkontraktion an den dünnen Filamenten entlang Richtung Z-Scheibe. Obwohl Myosin ein Dimer ist, arbeiten die beiden Myosinköpfchen unabhängig voneinander. Kontrolle der Muskelkontraktion Hochgereinigtes Actin und Myosin können unabhängig von der Ca’*-Konzentration kontrahieren, aber in Präparaten, die intakte dünne Filamente enthalten, findet eine Kontraktion wegen der regulatorischen Wirkungsweise des Troponin C (Abb. 7.31) nur in Gegenwart von Ca°* statt. Die Stimulation einer Myofibrille durch einen Nervenimpuls führt zu einem Ca’*-Einstrom aus dem sarkoplasmatischen Reticulum (ein System flacher Vesikel, die vom endoplasmatischen Reticulum abstammen). Als Folge steigt die intrazelluläre Ca’*-Konzentration von ca. 107 auf ca. 10° M. Die erhöhte Calciumkonzentration führt zu einer Konformationsänderung des Troponin-ITropomyosin-Komplexes. Durch diese Bewegung werden die Bindungsstellen für die Myosinköpfchen an den Actinfilamenten zugänglich (Abb. 7.33). Bei einer niedrigen Ca’*-Konzentration in den Myofibrillen (Ca?* wird durch eine spezifische, ATP-abhängige Proteinpumpe zurück in das sarkoplasmatische Reticulum gepumpt; Abschnitt 10.3B) nimmt der Troponin-Tropomyosin-Komplex seine Ruhekonformation ein; Myosin kann nicht mehr an Actin binden und der Muskel entspannt sich.

G;

In Nicht-Muskelzellen bildet Actin Mikrofilamente

Actin und Myosin kommen zwar vor allem in Muskelzellen vor, jedoch auch in anderem Gewebe. Actin ist allgegenwärtig und in der Regel das häufigste cytoplasmatische Protein in Eukaryotenzellen. Es macht normalerweise 5 bis 10% ihres gesamten Proteins aus. In Nicht-Muskelzellen bildet Actin Fasern mit einem Durchmesser von etwa 7 nm. Man bezeichnet diese Fasern als Mikrofilamente. Diese lassen sich mittels Immunfluoreszenzmikroskopie darstellen (dabei verwendet man einen fluoreszenzmarkierten Actin-bindenden Antikör-

Abb. 7.33 Lage von Tropomyosin auf dem dünnen Filament in Ab- und Anwesenheit von Ca?*.

Hier handelt es sich um eine Überlagerung von kryoelektronenmikroskopischen Bildern. Das F-Actin-Filament ist golden, Tropomyosin in Abwesenheit von Ca?* rot, in Gegenwart von Ca?* grün. [Nach Xu, C., Craig, R., Tobacman,

L.,

Horowitz, R. und Lehman, W.,J. Mol. Biol. 77,

985-992 (1999).)

228

Proteinfunktion

per, um das Actin „anzufärben“). Bei Nicht-Muskelzellen spielt Actin für viele Abläufe in der Zelle eine lebenswichtige Rolle. Dazu zählen Änderungen der Zellform, die Zellteilung, die Endocytose und der Organellentransport. Das „Treadmilling“ der Mikrofilamente kann eine Bewegung erzeugen

Abb. 7.34

Actinmikrofilamente.

Die Mikrofilamente in einem Fibroblasten, der auf der Oberfläche einer Kulturschale sitzt, sind mit-

hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Dazu wurde ein fluroreszenzmarkierter Antikörper gegen Actin verwendet. Sobald sich die Zelle zu bewegen beginnt, werden die Filamente abgebaut. [Mit freundlicher Genehmigung von

Victor Small, Österreichische Akademie der Wissenschaften, Salzburg.]

ATP-G-Actin (G-Actin: globuläres Actin) bindet an beide Enden eines F-Actin-Filaments (F-Actin: fibrilläres Aktin), es hat jedoch zum (+)-Ende eine größere Affinität (und dieses daher seinen Namen erhalten). Durch die Polymerisierung werden die F-Actin-Untereinheiten aktiviert und hydrolysieren ihr gebundenes ATP zu ADP und Pi. Anschließend dissoziiert Pi ab. Durch die sich daraus ergebende Konformationsänderung sinkt die Affinität der ADP-F-Actin-Untereinheit zu ihrer benachbarten Untereinheit. Dabei veräuft die von F-Actin katalysierte ATP-Hydrolyse langsamer als die Actinpolymerisation, und das an FActin gebundene Nucleotid steht nicht im Austausch mit den Nucleotiden in der umgebenden Lösung, da seine Nucleotidbindungsstelle durch die umgebenden Actin-Untereinheiten blockiert ist. Infolgedessen treten die neu angefügten und damit vorwiegend ATP-haltigen Actin-Untereinheiten im Wesentlichen an dessen (+)-Ende auf. Das (-)-Ende besteht hingegen hauptsächlich aus nicht eben erst polymerisierten und damit vorwiegend ADP-haltigen Untereinheiten. Weil die ADP-haltigen Actinuntereinheiten eine geringere Affinität zum F-Actin haben, kommt es am (-)-Ende des Polymers zu einem Nettoverlust von ActinUntereinheiten. Ein Fließgleichgewicht (bei dem die Mikrofilamente ein konstante Länge beibehalten) liegt dann vor, wenn die Rate, mit der Untereinheiten an das (+)-Ende angefügt werden, der Rate der Ablösung von Untereinheiten am (-)-Ende entspricht. In der Summe wandern Untereinheiten, die an das (+)-Ende angefügt wurden, in Richtung (-)-Ende und lösen sich dort ab. Diesen Vorgang nennt man Treadmilling oder Tretmühleneffekt (von engl.: treadmill, Tretmühle, Abb. 7.35). Somit kann man bei einem fluoreszenzmarkierten Actinmonomer sehen, dass es vom (+)-Ende des Mikrofilaments in Richtung (-)-Ende wandert. Treadmilling wird durch die Freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse getrieben, und ist damit nicht im Gleichgewicht. Das gerichtete Wachstum der Actinfilamente übt auf die Plasmamembran eine Kraft aus, die es der Zelle ermöglicht, ihr Cytoplasma in eine bestimmte Richtung auszudehnen. Ist die cytoplasmatische Ausstülpung fest am Untergrund verankert, kann die Zelle diesen Adhäsionspunkt zur gerichteten Bewegung nutzen.

Damit die Zelle jedoch in dieser Weise kriechen kann, muss der hintere Zellsaum die Kontakte mit der Oberfläche lösen, während am vorderen Saum neue Kontakte gebildet werden (Abb. 7.36). Da der Vorrat an G-Actin begrenzt ist, muss außerdem während der fortschreitenden Mikrofilamentpolymerisation a Do ® a

Abb. 7.35 Treadmilling bei Mikrofilamenten. Im Fleifgleichgewicht binden fortwährend Actinmonomere am (+)-Ende des Filaments (links). Vom (-)-Ende (rechts) lösen sich mit der gleichen Geschwindigkeit Actinmonomere wiederum ab. Dabei behält das Filament eine konstante Länge, während seine Monomere von links nach rechts durch das Filament wandern.

(+)-Ende

Antikörper

229

am vorderen Saum irgendwo anders in der Zelle eine Depolymerisation stattfinden. Die Geschwindigkeit der Actindepolymerisierung und erneuten Polymerisierung wird in vivo von einer Vielzahl actinbindender Proteine moduliert. Die durch Actin vermittelte Zellfortbewegung, die auch Amöboidbewegung genannt wird, ist der primitivste Mechanismus der Zellbewegung. Nichtsdestotrotz verwenden praktisch alle Eukaryotenzellen eine derartige Form - auch wenn dabei manchmal nur eine kleine Region nahe der Zelloberfläche beteiligt ist. Bei Zellen wie den neutrophilen Granulocyten, einer Form weißer Blutkörperchen, sind ausgedehntere Mikrofilament-Umgestaltungen für die Funktion essentiell. Diese Zellen müssen oft weite Entfernungen bis zum Infektionsoder Entzündungsort zurücklegen.

3

Antikörper

Alle Lebewesen kommen ständig mit andereren Organismen in Kontakt, darunter sind auch krankheitsauslösende Mikroorganismen und Viren. In höheren Tieren werden solche Pathogene, denen es gelingt, die physikalische Barriere der Haut und Schleimhäute (die erste Verteidigungslinie) zu durchbrechen, vom Immunsystem als fremd erkannt und zerstört. Man unterscheidet zwei Arten der Immunität: 1. Die zelluläre Immunität richtet sich gegen virusinfizierte Zellen, Pilze, Parasiten und fremdes Gewebe. Sie wird von T-Lymphocyten oder T-Zellen vermittelt; der Name bezieht sich auf ihre Herkuft aus dem Thymus. 2. Die humorale Immunität (lat.: humor, Flüssigkeit) bietet einen sehr wirksamen Schutz vor bakteriellen Infektionen und extrazellulär auftretenden Viren. Sie wird von einer enormen Vielfalt ähnlicher Proteine getragen, die als Antikörper oder Immunglobuline bezeichnet werden. Antikörper werden von den B-Lymphocyten oder B-Zellen produziert, die bei Säugetieren im Knochenmark (engl.: bone marrow) heranreifen. Die folgenden Abschnitte konzentrieren sich auf die Struktur und Funktion von Antikörpern. Eine Immunantwort wird oft durch das Auftreten eines fremden Makromoleküls ausgelöst; bei diesen Antigenen handelt es sich häufig um Proteine oder Kohlenhydrate. B-Zellen präsentieren Immunglobuline auf ihren Oberflächen. Trifft eine B-Zelle auf ein Antigen, das an ihr spezifisches Immunglobulin gebunden hat, nimmt sie den Antigen-Antikörper-Komplex auf, baut ihn ab und präsentiert die Antigenfragmente auf ihrer Zelloberfläche. T-Zellen stimulieren dann die Proliferation der B-Zelle. Die meisten Zellen der Folgegenerationen der BZelle zirkulieren im Körper und sezernieren große Mengen des antigenspezifischen Antikörpers. Diese Antikörper können dann weitere Antigenmoleküle binden, die dadurch für einen Abbau durch andere Komponenten des Immunsystems markiert werden. Die meisten B-Zellen überleben zwar nur wenige Tage, sofern sie nicht durch ihr jeweiliges Antigen stimuliert werden, jedoch können einige wenige B-Gedächtniszellen ihr spezifisches Antigen selbst nach mehreren Wochen oder Jahren noch erkennen und eine schnellere und umfassendere Immunantwort auslösen (dies wird als sekundäre Immunantwort bezeichnet) als B-Zellen, die zum allerersten Mal auf ihr entsprechendes Antigen treffen (Abb. 7.37).

A.

Antikörperstruktur

Die Immunglobuline (Ig) bilden eine verwandte, aber unglaublich diverse Proteingruppe. Alle Immunglobuline bestehen aus mindestens vier Untereinheiten: zwei identischen leichten Ketten (L) von ca. 23 kD und zwei identischen schwe-

Abb. 7.36 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer kriechenden Zelle. Der vordere Saum einer Zelle (links) erscheint gekräuselt; dort hat sich die Zelle von der Oberfläche abgelöst und ist dabei, sich auszudehnen.

Der

hintere Saum oder der Schwanz der Zelle (rechts) haftet immer noch an der Oberfläche und wird allmählich in Richtung Vordersaum gezogen. Die Geschwindigkeit der Actinpolymerisation ist am vorderen Saum am größten. [© David Phillips/ Visuals Unlimited.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Erklären Sie, in welchem

Bezug die Struktur von Myosin zu dessen Funktion als

Motorprotein steht. 2. Zeichnen Sie ein Diagramm der Komponenten eines Sarkomers. 3. Erläutern Sie die molekularen

Grundlagen des Gleitfasermodells bei der Muskelkontraktion. 4. Erklären Sie den Prozess des „Ireadmilling“ in einem Mikrofilament. 5. Wie unterscheidet sich ein Mikrofilament vom dünnen Filament in einer Mikrofibrille?

230

Proteinfunktion Tab. 7.2

4 |. | 1° Antigen A 2

2° Antigen A+ 1° Antigen B

Klasse a

Antikörper gegen A

102

101

Antikörper gegen B

Y l

10° Antikörperkonzentration (willkürliche Einheiten)

0)

U

ee

ee!

ee

IE2EEE

Schwere Kette

Leichte Kette

Untereinheitenstruktur

_Molare Masse (kD)

——

r———————————————————————

IgA

a

x oder A

(0%,)„J* oder (0%,).)”

360-720

IgD

[)

x oder A

ö,x, oder 8,X,

160

IgE

€

x oder A

&3K) au Ei,

190

IgG’

y

x oder X »

Yık, oder Yakz

150

IgM

u

x oder A

(UK,)5J oder (UA,)5]

950

3542956

Tage

Abb. 7.37 Primäre und sekundäre Immunantwort. Das Auftreten Antigen A-spezifischer Antikörper im Blut nach primärer Immunisierung an Tag 0 und sekundärer Immunisierung an Tag 28. Die Zugabe von Antigen B bei der zweiten Immunisierung zeigt

das spezifische immunologische Gedächtnis für Antigen A. Die sekundäre Immunantwort auf Antigen A (dargestellt als Antikörperkonzentration) ist sowohl schneller als auch stärker als die primäre.

Abb. 7.38 Röntgenstruktur eines Maus-Antikörpers gegen Hunde-Lymphom (ein Krebstyp, gegen den dieser Antikörper therapeutisch gut

einsetzbar ist). Der Antikörper ist in Bandform dargestellt, die schweren Ketten sind gold und türkis, beide leichten Ketten sind magenta eingefärbt. Seine beiden identischen Kohlenhydratketten sind im Kalottenmodell gezeichnet. Kohlenstoff ist grün, Stickstoff blau und Sauerstoff rot dargestellt. Die Antigenbindungsstellen sind an den Enden der beiden annähernd horizontalen Fab-Arme lokalisiert, die

durch die Assoziation der leichten Ketten mit den schweren Ketten gebildet werden. [Basierend auf der Röntgenstruktur von Alexander McPherson, University of California at Irvine. PDBid 1IGT.] 6% siehe Interactive Exercises.

Immunglobulinklassen des Menschen.

® n=1,2 oder 3.

’ Es gibt vier IgG-Unterklassen, IgG1, IgG2, 1gG3 und IgG4, die sich in ihren y-Ketten unterscheiden. ;

ren Ketten (H) von 53 bis 75 kD. Diese Untereinheiten assoziieren über Disulfidbindungen und nicht kovalente Wechselwirkungen zu einem Y-förmigen, symmetrischen Molekül der Formel (LH), (Abb. 7.38). Die fünf Immunglobulinklassen unterscheiden sich im Typ ihrer schweren Kette und in einigen Fällen in der Struktur ihrer Untereinheiten (Tab. 7.2). Zum Beispiel besteht IgM aus fünf Y-förmigen Molekülen, die um eine zentrale J-Untereinheit angeordnet sind; IgA tritt als Monomer, Dimer oder Trimer auf. Die verschiedenen Immunglobulinklassen haben auch unterschiedliche physiologische Funktionen. IgM ist das erste Immunglobulin, das als Antwort auf ein Antigen sezerniert wird und am effektivsten gegen Mikroorganismen. IgG ist das häufigste Immunglobulin und zu gleichen Teilen im Blut und in extravaskulärer Flüssigkeit vorhanden. IgA kommt hauptsächlich im Intestinaltrakt vor und verhindert die Anhaftung von Pathogenen an epitheliale (äußere) Oberflächen durch eine Anlagerung an die antigenen Strukturen. IgE, das normalerweise in geringer Konzentration im Blut vorliegt, schützt vor Parasiten und spielt eine Rolle bei allergischen Reaktionen. Die Funktion von IgD, das ebenfalls nur in geringen Konzentrationen vorkommt, ist nicht bekannt. Bei der Besprechung der Struktur von Antikörpern werden wir uns im Folgenden auf IgG konzentrieren. IgG kann durch das Enzym Papain proteolytisch in drei ca. 50 kD-Fragmente gespalten werden: zwei identische Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment. Die Fab-Fragmente bilden die „Arme“ des Y-förmigen Antikörpers und bestehen

Antikörper Antigen-

VL

leichte

Antigen-

Bindungsstelle

Bindungsstelle

Yu

4) GleNAc ß (1—-4) GleNAc — Manc (13)

Bei einigen Glykoproteinen erfolgt nur eine kurze Prozessierung, woraus „Man-

nose-reiche“ Oligosaccharide resultieren. Eine ausgedehnte Prozessierung andever Glykoproteine generiert große Oligosaccharide, die verschiedenartige Zuckerreste enthalten. Die Oligosaccharide in N-verknüpften Glykoproteinen sind enorm vielfältig. Tatsächlich können sogar Glykoproteine mit gleicher Polypeptidkette beachtenswerte Mikroheterogenität aufweisen, vermutlich infolge unvollständiger Glykosylierung und fehlender absoluter Spezifität bei einem Teil der Glykosidasen und Glykosyltransferasen.

Glykoproteine

Ein 14 Reste langes Oligosaccharid ist an Asn des Polypeptids gebunden.

® W & % ®

N-Acetyl-Glucosamin (GleNAc) Mannose Galactose Glucose Sialinsäure Polypeptid

@ 1-Fucose

Abb. 8.19 Synthese der N-verknüpften Oligosaccharide. Nach Anfügen eines (Mannose),(Glucose); (GIcNAc),-Oligosaccharids werden einzelne Monosaccharide, katalysiert durch Glykosidasen, abgespalten und andere Monosaccharide, katalysiert durch Glykosyltransferasen, angefügt. Das Kern-Pentasaccharid kommt in allen N-verknüpften Oligosacchariden vor. [Nach R. Kornfeld und S. Kornfeld, Annu. Rev. Biochem. 54, 640 (1985).] 6% siehe Kinemage Exercise 7-4.

Durch die Abspaltung von Monosaccharideinheiten wird ein (Mannose)z(GIcNAc),-Oligosaccharid gebildet. Diese (Mannose)z(GlcNAc)„-Grundsequenz findet sich in allen N-verknüpften Oligosacchariden.

Weiteres Abspalten und

Anfügen anderer Zucker ergibt eine Vielfalt an N-verknüpften Oligosacchariden.

Kern-

Oligosaccharid

O-verknüpfte Oligosaccharide Die häufigste O-glykosidische Verknüpfung in Oligosacchariden beinhaltet als Kernstruktur das Disaccharid ß-Galactosyl-(1>3)-a-N-Acetyl-Galactosamin, das an die OH-Gruppe eines Ser oder Thr gebunden ist. R=H

ee HO

H ge H

oder CH;

0-(6) H

O0 en—cH NHCOCH;

B-Galactosyl-(1—-3)-a-N. -Acetyl-Galactosaminyl-Ser/Thr

Galactose, Mannose und Xylose bilden seltener O-Glykoside mit Ser oder Thr.

Galactose kann ebenfalls O-glykosidische Bindungen mit 5-Hydroxylysylresten des Kollagens eingehen (Abschnitt 6.1C). O-verknüpfte Oligosaccharide unter-

263

264

Kohlenhydrate

scheiden sich in ihrer Größe. So sind einzelne Galactosereste im Kollagen bis hin zu Ketten von 1000 Disaccharideinheiten in Proteoglykanen möglich. O-verknüpfte Oligosaccharide werden im Golgi-Apparat synthetisiert. Monosaccharideinheiten werden fortlaufend an eine vollständige Polypeptidkette angefügt. Die Synthese beginnt mit dem Transfer von GalNAc auf einen ‚ser oder Thr-Rest im Polypeptid. N-verknüpfte Oligosacharide werden auf einen Asn-Rest in einer spezifischen Aminosäuresequenz übertragen. Für O-glykosyliertes Ser- oder Thr ist keine Konsensussequenz bekannt. Die Glykosylierungsposition dagegen wird allein durch die Sekundär- oder Tertiärstruktur des Polypeptids bestimmt. Die O-Glykosylierung wird über das schrittweise Anfügen von Zuckern mit Hilfe der entsprechenden Glykosyltransferasen fortgesetzt. Eine genauere Erörterung der Energetik und Enzymologie der Oligosaccharidsynthese erfolgt in Abschnitt 16.5.

D.

Funktionen der Oligosaccharide

Ein einzelnes Protein kann mehrere N- und O-verknüpfte Oligosaccharidketten enthalten, verschiedene Moleküle des gleichen Glykoproteins können sich jedoch in der Sequenz, der Position und der Anzahl der kovalent gebundenen Kohlenhydrate unterscheiden (die verschiedenen Formen eines Glykoproteins werden als Glykoformen bezeichnet). Diese Heterogenität macht es schwierig, den Oligosaccharidketten eine bestimmte biologische Funktion zuzuweisen. So scheinen einige Glykoproteine, die in Zellen synthetisiert werden, denen besondere Prozessierungsenzyme für Oligosaccharide fehlen, trotz abnormer oder fehlender Glykosylierung, normal ihre Aufgaben erfüllen zu können. In anderen Fällen kann die Glykosylierung durchaus die Struktur, Stabilität oder Aktivität eines Proteins beeinflussen. Strukturelle Effekte von Oligosacchariden

Oligosaccharide werden in der Regel an Sequenzen im Protein gebunden, die sich an der Oberfläche von Schleifen (engl.: loops) und Biegungen (engl.: turns) befinden. Durch ihre Hydrophilie zeigen Zuckerreste eher von der Proteinoberfläche weg. Da Kohlenhydratketten oft konformativ beweglich sind, können Oligosaccharide, die an das Protein gebunden sind, zeitweise Volumina beachtlicher Größe einnehmen (Abb. 8.20). So kann ein Oligosaccharid die gesamte Oberfläche eines Proteins bedecken, möglicherweise um die Aktivität des Proteins zu steuern oder dieses vor Proteolyse zu schützen. Darüber hinaus beeinflussen einige Oligosaccharide die Proteinstruktur, indem sie die konformationelle Flexibilität der gebundenen Polypeptidketten einschränken. Da N-verknüpfte Oligosaccharide während der Proteinsynthese angefügt werden, kann das Anfügen eines Oligosaccharids helfen, die Proteinfaltung zu steuern. Weiterhin kann das Oligosaccharid dazu führen, dass die korrekt gefaltete Konformation eines Polypeptids durch Einschränkung der Flexibilität des Polypeptidrückgrates stabilisiert wird. Insbesondere O-verknüpfte Oligosaccharide, die oft in stark glykosylierten Proteinsegmenten gehäuft vorkommen, können einer Polypeptidkette eine starrere und gestrecktere Struktur verleihen. Oligosaccharide vermitteln Erkennungsvorgänge Abb. 8.20 Modell der Oligosaccharid-Dynamik. Gezeigt sind in überlagerten „Schnappschüssen“ die erlaubten Konformationen eines (GIcNAc), (Mannose);_-Oligosaccharids (gelb), das an ein pankreatisches Enzym vom

Rind, Ribonuclease B

(violett), gebunden ist. [Mit freundlicher Genehmigung von Raymond Dwek, Oxford University.]

Die vielfältigen Möglichkeiten, mit denen sich Kohlenhydrate zusammenfügen und vernetzen können, verleihen ihnen das Potential, sogar mehr biologische Informationen zu tragen als Nucleinsäuren oder Proteine ähnlicher Größe. Zum Beispiel können zwei verschiedene Nucleotide nur zwei unterschiedliche Dinucleotide bilden, wohingegen zwei verschiedene Hexosen jedoch 36 mögliche Kombinationen ergeben (obwohl nicht alle in der Natur wirklich vorkommen).

Glykoproteine

265

Den ersten Anhaltspunkt dafür, dass einzelne Kombinationen von Kohlenhyd-

raten in die interzelluläre Kommunikation involviert sein könnten, erbrachte die

Entdeckung, dass alle Zellen von einer Zuckerhülle umgeben sind. Die Zucker liegen in Form von Glykokonjugaten, wie den Glykoproteinen oder den Glykolipiden vor. Die Oligosaccharide der Glykokonjugate bilden in einigen Zellen eine diffuse, bis zu 140 nm dicke Schicht, die Glykocalyx genannt wird (Abb. 8.21). Weiterhin zeigt das Vorhandensein von Lectinen (Proteinen, die Kohlenhydrate binden), dass Kohlenhydrate an der Zelloberfläche Aufgaben in der Zellerkennung wahrnehmen. Lectine kommen überall in der Natur vor und finden sich häufig an der Oberfläche von Zellen. Sie sind ausgesprochen spezifisch: Sie können einzelne Monosaccharide in besonderen Verbrückungen zu anderen Zuckerresten eines Oligosaccharids erkennen (eine Eigenschaft, die Lectine zu geeigneten labortechnischen Werkzeugen macht, um Glykoproteine und Oligosaccharide zu isolieren). Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen werden sehr stark von Wasserstoffbrückenbindungen (oft wirken ganze Wassermoleküle verbrückend) und van-der-Waals-Interaktionen hydrophober Zucker mit aromatischen Seitenketten der Proteine geprägt (Abb. 8.22). Sogenannte Selectine vermitteln die Bindung von Leukocyten (zirkulierende weiße Blutzellen) an die Oberfläche von Endothelzellen (die Zellen, die die Blutgefäße auskleiden). Leukocyten produzieren auf ihrer Oberfläche kontinuierlich Selectine; Endothelzellen ihrerseits produzieren eigene Selectine als Antwort auf einen Gewebeschaden durch Infektionen oder mechanische Verletzungen. Die Selectine erkennen Oligosaccharide auf Glykoproteinen der Zelloberfläche und binden spezifisch daran. Die gegenseitige Selectin-Oligosaccharid-Erkennung zwischen Leukocyten und Endothelzellen erlaubt es den Endothelzellen, die zirkulierenden Leukocyten „herauszufischen“. Diese wandern dann an den Endothelzellen vorbei ins Gewebe ein, um eine Infektionen zu bekämpfen oder um beschädigtes Gewebe zu reparieren. Auch viele andere Zell-Zell-Erkennungsphänomene werden durch Oligosaccharide vermittelt. Zum Beispiel erkennen als Teil der Bindungs- und Aktivierungsvorgänge während der Befruchtung Proteine auf der Oberfläche von Säugetierspermien GlcNAc oder Galactosereste auf den Glykoproteinen der Eizelle. Viele Viren, Bakterien und eukaryotische Parasiten dringen in die Zielzellen ein, indem sie zuerst an Kohlenhydrate der Zelloberfläche binden. Oligosaccharide als antigene Determinanten Die Kohlenhydrate an der Zelloberfläche gehören zu den am besten charakterisierten immunchemischen Markern. Zum Beispiel sind ABO-Blutgruppenantigene Oligosaccharidbestandteile von Glykolipiden an der Oberfläche der Zellen

eines Individuums (nicht nur der roten Blutkörperchen). Individuen mit TypA-Zellen haben A-Antigene an ihren Zelloberflächen und tragen Anti-B-Antikörper im Blut. Solche mit Typ-B-Zellen haben B-Antigene und Anti-A-Antikörper und solche mit Typ-AB-Zellen sowohl A- als auch B-Antigene und weder AntiA- noch Anti-B-Antikörper. Typ-O-Individuen, die keines dieser Antigene haben, tragen dafür Anti-A- und Anti-B-Antikörper im Blut. Bei der Transfusion von Typ-A-Blut in ein Typ-B-Individuum kommt es infolgedessen zu einer AntiA-Antikörper/A-Antigen-Reaktion. Die Erythrocyten des übertragenen Blutes agglutinieren (verklumpen) und verursachen dadurch oft eine lebensbedrohliche Verstopfung von Blutgefäßen. In Tabelle 8.1 sind die Oligosaccharide aufgelistet, die in den A-, B- und H-Antigenen vorkommen (Typ-O-Individuen besitzen das H-Antigen). Diese befinden sich an den nicht reduzierenden Enden der Oligosaccharidbausteine der Glykolipide. Das H-Antigen ist das Vorläuferoligosaccharid der A- und B-Antigene. Typ-A-Individuen besitzen eine 303-Aminosäuren-lange Glykosyltransferase, die spezifisch einen GalNAc-Rest an das Ende des H-Antigens anfügt. In TypB-Individuen knüpft ein ebensolches Enzym, das sich nur in vier Aminosäuren vom Enzym der Typ-A-Individuen unterscheidet, stattdessen einen Galactoserest an das Ende des Antigens. In Typ-O-Individuen ist dieses Enzym inaktiv, da dessen Synthese nach 115 Aminosäuren beendet wird.

Abb. 8.21 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Erythrocytenoberfläche. Die (bis zu 140 nm) dicke Kohlenhydrathülle, die sogenannte Glykocalyx, besteht aus dicht gepackten Oligosacchariden, die an die Proteine und

Lipide der Zelloberfläche gebunden sind. [Mit freundlicher Genehmigung von Harrison Latta,

UCLA]

Arg70

Abb. 8.22 Bindung eines Kohlenhydrats an ein Lectin. Menschliches Galectin-2 bindet ß-Galactoside,

wie Lactose, vornehmlich über ihren Galactoserest. Die Galactose- und Glucosereste sind grün (mit rot markierten O-Atomen) und die Lectin- Aminosäureseitenketten blau dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Seitenketten und Zuckerresten sind als gelbe, gestrichelte Linien eingezeichnet. [Mit freundlicher Genehmigung von Hakon Leffler, Lund University, PDBid IHLC.]

266

Kohlenhydrate

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Beschreiben Sie die allgemeine

Tab. 8.1 Strukturen der A-, B- und H-Antigendeterminanten in Erythrocyten. EEE Er R BRENNE Antigen” Typ

Galß(1>4GleNAc:

H

12

Struktur von Proteoglykanen,

Peptidoglykanen und glykosylierten Proteinen. 2. Nennen Sie die wichtigsten biologischen Funktionen von Proteoglykanen und Peptidoglykanen. 3. Erklären Sie den Unterschied zwischen N- und O-verknüpften Oligosacchariden. 4. Wie sind Oligosaccharide an der biologischen Erkennung beteiligt?

L-Fuca GalNAca(1—>3)Galß(1>4GleNAc-

-

Iı2

L-Fuca Gala(1—3)Galß(1>HGleNAc:

hı2 L-Fuca % Gal, Galactose; GalcNAc, N-Acetyl-Galactosamin; GlcNAc, N-Acetyl-Glucosamin; L-Fuc, L-Fucose

Zusammenfassung 1. Monosaccharide, die einfachsten Kohlenhydrate, werden in Aldosen und

Ketosen eingeteilt. Die cyclischen Halbacetal- und Halbketalformen der Monosaccharide sind in ihrer Konformation variabel, das anomere C-Atom hat dagegen entweder a- oder B-Konfiguration. .

Zu den Monosaccharidderivaten gehören die Aldonsäuren, Uronsäuren,

Alditole, Desoxyzucker, Aminozucker sowie a- und ß-Glykoside. Polysaccharide bestehen aus glykosidisch verbundenen Monosacchariden. Cellulose und Chitin sind Polysaccharide, deren ß(1—4)-Bindungen ihnen eine starre und ausgedehnte Struktur verleihen. Die Speicher-Polysaccharide Stärke und Glykogen bestehen aus a-glykosidisch verbundenen Glucoseeinheiten. Glykosaminoglykane sind nicht verzweigte Polysaccharide, die Uronsäure und häufig sulfatierte Aminozucker enthalten. Proteoglykane sind ausgesprochen große Moleküle, die aus Hyaluronsäure aufgebaut sind, an die Kernproteine gebunden sind, die wiederum zahlreiche gebundenen Glykosaminoglykane und Oligosaccharide tragen. Bakterienzellwände bestehen aus Peptidoglykan, einem Netzwerk aus Polysaccharid- und Polypeptidketten. 10. Glykosylierte Proteine können sowohl N-verknüpfte (an Asn gebundene) als auch O-verknüpfte (an Ser oder Thr gebundene) Oligosaccharide enthalten. Verschiedene Moleküle eines Glykoproteins können sich in Sequenz und Position der Oligosaccharide unterscheiden. 11 . Oligosaccharide spielen eine wichtige Rolle für die Proteinstruktur und in der Zelloberflächenerkennung.

Aufgaben

267

Wichtige Begriffe

a Kohlenhydrate Monosaccharid Polysaccharid

Aminozucker Glykoprotein Glykolipid

Aldose

a-Glykosid

Ketose Epimer Halbacetal Halbketal Haworth-Projektion Pyranose Furanose anomerer Kohlenstoff a-Anomer

P-Glykosid glykosidische Bindung reduzierender Zucker Glykan Homopolysaccharid Heteropolysaccharid Oligosaccharid Exoglykosidase Endoglykosidase

N-verknüpftes Oligosaccharid O-verknüpftes Oligosaccharid grampositiv gramnegativ Peptidoglykan Glykosylierung Oligosaccharidprozessierung Glykoform Glykokonjugat

B-Anomer Aldonsäure Uronsäure Alditol Desoxyzucker

Disaccharid Stärke

Lectin Leukocyt ABO-Blutgruppenantigene

Biofilm Mikroheterogenität Glykomik

Proteoglykan

Glykogen Wachstumsfaktor Glykosaminoglykan

Aufgaben 1. Wie viele Stereoisomere sind bei

Wie viele verschiedene Disaccharide einer p-Glykopyranose sind möglich? Der künstliche Süßstoff Sucralose ist ein Derivat der

(a) einer Ketopentose, (b) einer Ketohexose und (c) einer Ketoheptose möglich?

2. Welche der folgenden Zuckerpaare sind Epimere: (a) D-Sorbose und D-Psicose (b) D-Sorbose und D-Fructose

Saccharose mit der formalen Bezeichnung 1,6-Dichlor-1,6-

10.

(c) D-Fructose und 1-Fructose (d) D-Arabinose und v-Ribose

(e) p-Ribose und v-Ribulose 3. Der Saccharoseersatzstoff Tagatose (Abb. 8.2) wird durch Hydrolyse von Lactose und die anschließende chemische Umwandlung einer der beiden entstehenden Aldosen zu einer Ketose erzeugt. Aus welchem Teil der Lactose wird Tagatose erzeugt? 4. Zeichnen Sie die Furanose- und die Pyranoseform der p-Ribose. 5. Sind (a) D-Glucitol, (b) p-Galactitol und (c) p-Glycerin optisch aktiv? 6. Zeichnen Sie die Fischer-Projektion der ı-Fucose. Von welcher ı-Hexose ist 1-Fucose die Desoxyform? 7. (a) Leiten Sie die Struktur des Disaccharids Trehalose aus folgenden Informationen ab: Die vollständige Hydrolyse ergibt nur p-Glucose; es wird durch eine a-Glykosidase, nicht jedoch von einer ß-Glykosidase hydrolysiert; es reduziert Cu’* nicht zu Cu". (b) Viele Pflanzen und Wirbellose synthetisieren große Mengen Trehalose, wenn sie von Austrocknung bedroht sind, denn dieser Zucker ermöglicht ihnen, bei anhaltender Trockenheit zu überleben. Welche Eigenschaften des Trehalosemoleküls prädestinieren es für die Funktion als Wasserersatz?

11. 12%

13: 14.

15:

16.

didesoxy-ß-D-fructofuranosyl-4-chlor-4-desoxy-a-D-galactopyranosid. Zeichnen Sie die Struktur des Moleküls. Wie viele reduzierende Enden sind in einem Glykogenmolekül enthalten, das 10.000 Reste und jede zehnte Einheit eine Verzweigung enthält? Ist Amylose oder eher Amylopectin eine Langzeitspeicherform der Polysaccharide in Pflanzen? Mit „Nutrazeutika“ werden Stoffe bezeichnet, denen man eine gesundheitsfördernde Wirkung zuschreibt und die eine Zwischenstellung zwischen Nahrungsmittel und Arzneimittel einnehmen. Warum könnte jemand, der an Arthrose leidet, versucht sein, das Nutrazeutikum Glucosamin zu konsumieren? Berechnen Sie die Nettoladung eines Chondroitin-4-sulfatmoleküls, das 100 Disaccharideinheiten enthält. Den Kern eines Pectinmoleküles bildet ein Polymer aus a(1—4)-verknüpften p-Galacturonatresten. Zeichen Sie einen der Reste. Zeichnen Sie die Struktur des Blutgruppenantigens beim 0-Typ (das H-Antigen, in Tabelle 8.1 beschrieben). Glykogen wird mit Dimethylsulfat behandelt, wodurch an jede freie OH-Gruppe eine Methylgruppe angefügt wird. Als nächstes wird das Molekül hydrolysiert, um alle glykosidischen Bindungen zwischen Glucoseresten aufzubrechen. Die Reaktionsprodukte werden dann chemisch analysiert. (a) Wie viele verschiedene Arten methylierter Glucosemoleküle erhält man? (b) Zeichen Sie die Struktur des Moleküls, das am häufigsten vorkommt.

268

Kohlenhydrate

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Etzler, M. E., Essentials of Glycobiology (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2008).

Aufgrund ihrer Hydrophobizität mischen sich Lipide nicht frei mit der wässrigen Phase. Einige haben die Fähigkeit, in wässriger Umgebung molekulare Doppelschichten auszubilden. Membranen, die aus einer

Lipiddoppelschicht und den darin eingebetteten Proteinen bestehen, umgeben das Cytoplasma von allen Zellen und ermöglichen die Ausbildung von abgetrennten metabolischen Kompartimenten innerhalb der Zellen [© ISM/Phototake.]

Lipide EEE

Zr

EEE

TREE EEE

ERSTE NLETTREEEEIET)

Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 9 Interactive Exercise 4 Animated Figure 9-35 Kinemage Exercise 8-1 Kinemage Exercise 8-3

Lipide (griech.: lipos, Fett) sind die vierte wichtige Gruppe von Molekülen, die in allen Zellen vorkommen. Anders als Nucleinsäuren, Proteine und Polysaccharide sind Lipide keine Polymere. Jedoch aggregieren sie, und in diesem Zustand kommen sie ihrer wichtigsten Funktion, der Ausbildung der strukturellen Matrix biologischer Membranen, nach. Lipide zeigen eine viel größere strukturelle Vielfalt als die anderen Klassen von Biomolekülen. Unter dem Begriff Lipide wird gewissermaßen eine Ansammlung von Substanzen zusammengefasst, denen nur gemeinsam ist, dass sie stark hydrophob und schwer wasserlöslich sind. Wegen ihrer Hydrophobizität erfordert die Analyse von Lipiden größere Anstrengungen als Untersuchungen an Molekülen, die sich besser in Wasser lösen (und daher leichter zu hand-

haben sind). Viele der interessantesten Funktionen von Lipiden sind erst ab Mitte der 1980er Jahre bekannt geworden. Im Allgemeinen erfüllen Lipide drei biologische Funktionen (obwohl bestimmten Lipiden in einigen Zellen anscheinend mehr als eine Aufgabe zukommt): 1. Lipidmoleküle sind in Form von Lipiddoppelschichten zusammen mit Proteinen essentielle Bestandteile biologischer Membranen. 2. Die in Lipiden enthaltenen Kohlenwasserstoffketten dienen als Energiespeicher. 3. An vielen intra- und interzellulären Signalübertragungen sind Lipidmoleküle beteiligt. In diesem Kapitel werden die Strukturen und physikalischen Eigenschaften der häufigsten Lipidtypen beleuchtet. Im Anschluss beschäftigen wir uns mit den Eigenschaften der Lipiddoppelschicht und den Proteinen, die sich darin befinden. Schließlich untersuchen wir die geläufigen Membranstrukturmodelle. Das anschließende Kapitel befasst sich mit dem Phänomen des Membrantransports. Die Beteiligung von Lipiden an der intrazellulären Signalübertragung wird in Abschnitt 13.4 diskutiert.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copvrieht © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Lipide e Klassifizierung der Lipide ® Lipiddoppelschichten © Membranproteine © Membranstruktur und -aufbau

272

Lipide

1

Klassifizierung der Lipide

Lipide sind Substanzen biologischer Herkunft, die in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform und Methanol, löslich sind und daher leicht durch Extraktion mit orga-

nischen Lösungsmitteln von anderen biologischen Materialien getrennt werden können. Fette, Öle, einige Vitamine sowie die meisten Membranbestandteile (außer den Proteinbestandteilen) sind Lipide. In diesem Abschnitt werden die Strukturen und physikalischen Eigenschaften der wichtigsten Lipidklassen diskutiert.

A.

Fettsäuren

Fettsäuren sind Carbonsäuren mit langkettigen Kohlenwasserstoffresten (Abb. 9.1). Sie sind - gewöhnlich in veresterter Form — Hauptbestandteil der verschiedenen Lipide, die in diesem Kapitel beschrieben werden. Die häufigsten biologischen Fettsäuren sind in Tabelle 9.1 aufgeführt. In höheren Pflanzen und Tieren sind Fettsäurereste der C,s- und C}jg-Gruppe vorherrschend: Palmitin-, Öl-, Linol- und Stearinsäuren. Fettsäuren mit weniger als 14 oder mehr als 20 Kohlenstoffatomen sind ungewöhnlich. Die meisten Fettsäuren haben eine gerade Anzahl von Kohlenstoffatomen, da sie bei der Biosynthese durch Verknüpfen von C,-Einheiten entstehen (Abschnitt 20.4). Mehr als die Hälfte der Fettsäurereste pflanzlicher und tierischer Lipide sind ungesättigt (enthalten Doppelbindungen), häufig auch mehrfach ungesättigt (enthalten zwei oder mehr Doppelbindungen). Fettsäuren aus Bakterien sind selten mehrfach ungesättigt, aber häufig verzweigt, hydroxyliert oder enthalten Cyclopropanringe. O

OH

N/

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OH

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2

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ne Struk rukturformeln

ini A einiger C},-Fettsäuren.

H\, 4

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Yı

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Abb. 9.9.1

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CH, CHs

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CH; \ ICH;

CH 182223

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Stearinsäure

Ölsäure

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HZ, CH

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CH

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]

Yilıs

CH

2

3CH ne Se

>:

CH, „

ısCH 3

Die Doppelbindungen liegen alle in cis-Konfigura-

tion vor.

Linolsäure

co-Linolensäure

Klassifizierung der Lipfide Tab. 9.1

273

Allgemeine biologische Fettsäuren.

Symbol? ——— Tivialname

Systematische Name

Gesättigte Fettsäuren

T

12:0

Laurinsäure

Dodecansäure

CH;(CH3;)], COOH

44,2,

14:0

Myristinsäure

Tetradecansäure

CH;(CH,) ;COOH

DD,

16:0

Palmitinsäure

Hexadecansäure

CH;(CH3,)] „COOH

63,1

18:0

Stearinsäure

Octadecansäure

CH;(CH;)];, COOH

69,6

20:0

Arachidinsäure

Eicosansäure

CH;(CH3,)]s COOH

77

22:0

Behensäure

Docosansäure

CH;(CH,);, COOH

81,5

24:0

Lignocerinsäure

Tetracosansäure

CH;(CH,)„COOH

88

Ungesättigte Fettsäuren (alle Doppelbindungen haben cis-Konfiguration) 16:1n-7

Palmitoleinsäure

9-Hexadecensäure

CH;(CH,);CH=CH(CH,),COOH

—0,5

18:1n-9

Ölsäure

9-Octadecensäure

CH; (CH,),‚CH=CH(CH,),COOH

12

18:2n-6

Linolsäure

9,12-Octadecadiensäure

CH;(CH,)„(CH=CHCH;3),(CH,),COOH

-5

18:3n-3

a-Linolensäure

9,12,15-Octadecatriensäure

CH;CH;(CH=CHCH;3);(CH3;),COOH

-11

18:3n-6

y-Linolensäure

6,9,12-Octadecatriensäure

CH;(CH;)4„(CH=CHCH3);(CH,);COOH

-11

20:4n-6

Arachidonsäure

5,8,11,14-Eicosatetraensäure

CH;(CH,)4(CH=CHCH;3)4(CH;),COOH

49,5

20:5n-3

EPA

5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure

CH;CH,(CH=CHCH;3);(CH;),

22:6n-3

DHA

4,7,10,13,16,19-Docohexensäure

CH;CH,(CH=CHCH;3),CH,COOH

24:1n-9

Nervonsäure

15-Ietracosensäure

CH;(CH,);CH=CH(CH3)]3,COOH

COOH

54 44 39

* Anzahl der Kohlenstoffatome: Anzahl der Doppelbindungen. Für ungesättigte Fettsäuren bezeichnet „n-x“ die Position der letzten Doppelbindung in der Fettsäure, wobei n die Anzahl der C-Atome ist und x die Position des letzten an einer Doppelbindung beteiligten C-Atoms, gezählt vom Methylende (w) angibt. Quelle: LipidBank (www.lipidbank.jp).

Tabelle 9.1 zeigt, dass die erste Doppelbindung einer ungesättigten Fettsäure gewöhnlich zwischen deren C9- und C10-Atom auftritt, vom Carboxylkohlenstoffatom aus gezählt. Diese Bindung wird A’- oder 9-Doppelbindung genannt. In mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind die Doppelbindungen häufig durch eine Methylengruppe voneinander getrennt (z.B. -CH=CH-CH,-CH=CH-) und somit nicht konjugiert (wie in -CH=CH-CH=CH-). Zwei wichtige Klassen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren werden als w-3 oder w-6 Fettsäuren bezeichnet, gemäß einer Nomenklatur, die vom Methyl-Ende (w) der Kette her beginnend das Kohlenstoffatom der letzten Doppelbindung benennt. «-Linolensäure und Linolsäure (Abb. 9.1) sind Beispiele für solche Fettsäuren. Gesättigte Fettsäuren (die vollständig reduziert d.h. mit Wasserstoff „gesättigt“ sind) sind sehr flexible Moleküle, die eine Vielzahl von Konformationen einnehmen können, da jede ihrer C-C-Bindungen relativ frei rotieren kann. Trotzdem ist die vollständig gestreckte Konformation, bei der sich die benachbarten Methylengruppen am wenigsten sterisch behindern, ihre energetisch begünstigte Konformation. Die Schmelzpunkte (T,.) gesättigter Fettsäuren steigen wie bei den meisten Substanzen mit ihrem Molekulargewicht (Tab. 9.1). Die Doppelbindungen der Fettsäuren liegen fast immer in cis-Konfiguration vor (Abb. 9.1). Dies führt zu einem starren 30 °-Knick in der Kohlenwasserstoffkette. Deshalb lagern sich ungesättigte Fettsäuren weniger dicht aneinander als gesättigte Fettsäuren. Die verringerten van-der-Waals-Kräfte ungesättigter Fettsäuren

274

Lipide

der bewirken eine Erniedrigung ihres Schmelzpunkts mit zunehmender Anzahl Fettsäure die Lipiden, von Fluidität) (die mögen Doppelbindungen. Das Fließver n. Fettsäure den in n indunge Doppelb der Anzahl der reste enthalten, steigt mit Dieses Phänomen hat, wie noch zu sehen sein wird, bedeutende Folgen für die biologischen Membranen.

B.

_Triacylglycerine

Die in Pflanzen und Tieren vorkommenden Fette und Öle bestehen zum größten Teil aus einer Mischung von Triacylglycerinen (auch Triglyceride genannt). Diese unpolaren, wasserunlöslichen Verbindungen sind Fettsäuretriester von Glycerin:

n

IcH,—0—C—.Rı o

5 CH,

Abb. 9.2 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Adipocyten. Jede Fettzelle enthält ein Fetttröpfchen, das fast die ganze Zelle ausfüllt. [© Fred E. Hossler/Visuals Unlimited.]

ICH,

|

—2CH

—=; 2CHs

|

6) ) O = 0G206 CH,

CH,

CH,

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CH

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CHE

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CH, » CH, (sCHs

5 CH5

—

OH

| 2CH—OH

CH

SCH;

SCH

-OH

Glycerin

O- CR (6) 0-0

|

Triacylglycerin

Triacylglycerine dienen in Tieren als Energiespeicher und sind deshalb deren umfangreichste Lipidklasse, obwohl sie nicht Bestandteile der Zellmembranen sind. Triacylglycerine unterscheiden sich in Art und Anordnung ihrer drei Fettsäurereste. Die meisten Triacylglycerine enthalten zwei oder drei verschiedene Fettsäurereste und werden nach deren Position am Glyceringerüst benannt, wie z.B. 1-Palmitoleoyl-2-linoloyl-3-stearoylglycerin (links). Fette und Öle (die sich nur dadurch unterscheiden, dass Fette bei Raumtemperatur fest und Öle flüssig sind) sind komplexe Mischungen von Triacylglycerinen, deren Fettsäurezusammensetzung variiert, je nachdem aus welchem Organismus sie stammen. Pflanzliche Öle sind gewöhnlich reicher an ungesättigten Fettsäuren als tierische Fette, wie die niedrigeren Schmelzpunkte von Ölen andeuten. Triacylglycerine dienen als Energiereserven

Fette sind sehr effektive Speicher von Stoffwechselenergie. Da Fette niedriger oxidiert sind als Kohlenhydrate oder Proteine, liefern sie bei vollständiger Oxidation sehr viel mehr Energie je Masseneinheit. Zudem werden Fette, da sie unpolar sind, ohne Hydrathülle gespeichert, wohingegen z.B. Glykogen (Abschnitt 8.2C) unter physiologischen Bedingungen etwa das Doppelte seines Gewichtes an Wasser bindet. Fette liefern daher etwa das Sechsfache an Stoffwechselenergie im Verhältnis zur gleichen Masse hydratisierten Glykogens. In Tieren sind Adipocyten (Fettzellen; Abb. 9.2) auf die Synthese und die Speicherung von Triacylglycerinen spezialisiert. Während andere Zelltypen nur einige kleine Fetttröpfchen im Cytosol enthalten (dispergieren), können Adipocyten fast vollständig mit Fetttröpfchen gefüllt sein. Fettgewebe tritt am stärksten in der Unterhaut und der Bauchhöhle auf. Der Fettanteil eines durchschnittlichen Menschen (21% für Männer, 26% für Frauen) ermöglicht, eine Hungerzeit von zwei bis drei Monaten zu überleben. Im Gegensatz dazu liefert der Glykogenvorrat des Körpers, der als Kurzzeit-Energiespeicher dient, dem Körper Energie für weniger als einen Tag. Das Unterhautfettgewebe dient auch als Temperaturschutz. Dies ist besonders für gleichwarme wasserlebende Tiere wie Wale, Seehunde, Gänse und Pinguine von Bedeutung, die ständig niedrigen Wassertemperaturen ausgesetzt sind.

1-Palmitoleoyl-2-linoloyl3-stearoylglycerin

Klassifizierung der Lipfide

275

(a)

€. _ Gilycerophospholipide Glycerophospholipide (oder Phosphoglyceride) sind die Lipidhauptbestandteile biologischer Membranen. Sie bestehen aus Glycerin-3-phosphat (als Rückgrat), dessen C1- und C2-Stellen mit Fettsäuren verestert sind. Zusätzlich ist die Phosphatgruppe mit einer anderen Gruppe X verbunden (Abb. 9.3). Glycerophospholipide sind daher amphiphile Moleküle mit unpolaren aliphatischen (Kohlenwasserstoff-) „Schwänzen“ und polaren Phosphat-X-,Köpfen “. Die einfachsten Glycerophospholipide, in denen X = H ist, sind Phosphatidsäuren. Sie kommen in biologischen Membranen nur in geringen Mengen vor. In Glycerophospholipiden, die normalerweise in biologischen Membranen vorkommen, stammen die Kopfgruppen von polaren Alkoholen (Tab. 9.2). Ge-

HO-—2C—H

N

SCH, —0-— |== OH OH Glycerin-3-phosphat

(b)

sättigte C},- oder C}3-Fettsäuren treten gewöhnlich an der C1-Stelle der Glycero-

phospholipide auf und die C2-Stelle C,.-Fettsäure besetzt. Die einzelnen Fettsäureresten benannt (siehe z.B. zwei Palmitoylketten enthält, ist ein tants (siehe Exkurs 9.1).

ist häufig durch eine ungesättigte Cıs- bis Glycerophospholipide sind nach diesen Abb. 9.4). Ein Glycerophospholipid, das wichtiger Bestandteil des Lungen-Surfac-

Phospholipasen hydrolysieren Glycerophospholipide Die chemische Struktur von Glycerophospholipiden - einschließlich der Fettsäureketten und Kopfgruppen — kann über die Produkte der von Phospholipasen katalysierten Hydrolyse bestimmt werden. So spaltet z.B. Phospholipase A, hydrolytisch den Rest am C2-Kohlenstoff ab; das Produkt ist ein Lysophospholipid

(Abb. 9.5). Lysophospholipide sind, wie ihr Name andeutet, starke Detergentien,

Tab. 9.2

Glycerophospholipid

Abb. 9.3 Struktur von Glycerophospholipiden. (a) Das Rückgrat, ı-Glycerin-3-phosphat. (b) Allgemeine Formel von Glycerophospholipiden. R, und R, sind die langkettigen Kohlenwasser-

stoffschwänze der Fettsäuren und X wird von einem polaren Alkohol abgeleitet (siehe Tab. 9.2). Man erkennt, dass Glycerin-3-phosphate und Glycerophospholipide chirale Verbindungen sind.

Häufige Klassen von Glycerophospholipiden. Das Grundgerüst ist in Abb. 9.3 dargestellt.

Name von X-OH

Formel von —X

Name des Phospholipids

Wasser Ethanolamin

—H -CH,CH,NH3

Phosphatidsäure Phosphatidylethanolamin Phosphatidxlcholin (Lecithin) Phospahtidylserin

Cholin

Serin

-CH,CH3,N(CH;)3

-CH,CH(NH})COO”

myo-Inositol

HO

OH

H

H H

Glycerin

Phosphatlinositol

H

OH Phospahtidylglycerin

-CH,CH(OH)CH,OH

OÖ

Phosphatidylglycerin

UI

ANDER (0) o

o

\

@El = Oz @—R 4

Diphosphatidylglycerin (Cardiolipin)

Lungen-Surfactant Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ist das wichtigste Lipid des Lungen-Surfactants — jener Mischung aus Proteinen und Lipiden, die für eine normale Funktion der Lunge essentiell ist. Die Oberfläche der Zellen, die die Alveolen bilden

(kleine Lufträume der Lunge), ist mit Surfactant überzogen, das die Oberflächenspannung der Alveolen herabsetzt. Lungen-Surfactant besteht zu 80-90% seines Gewichts aus Phospholipiden, wobei Phosphatidylcholin (meistens vom Dipalmitoyltyp) 70-80% dieser Phospholipide ausmacht. Die Palmitoylketten von DPPC sind meist ganz ausgestreckt und ohne Knicke, da sie vollständig gesättigt sind. Das erlaubt eine enge Packung der DPPC-Moleküle, die einschichtig angeordnet sind. Ihre unpolaren Schwänze ragen in den Luftraum und ihre polaren Köpfe weisen zu den Alveolarzellen. Wenn die Luft aus der Lunge entweicht, schrumpfen Oberfläche und Volumen der Alveolen. Ein vollständiges Zusammenfallen des Alveolarraums wird durch das SurfacAbb. 9.4 Das Glycerophospholipid 1-Stearoyl-2-oleoyl-3-phosphatidylcholin. (a) Strukturformel als Fischer-Projektion. (b) Raumfüllendes Modell mit H weiß, C grün,

(a)

tant verhindert, da dessen eng gepackte DPPC-Moleküle ein Zusammendrücken verhindern. Einen zusammengefallenen Luftraum neu zu eröffnen erforderte viel mehr Kraft als einen bestehenden auszudehnen. Lungen-Surfactant wird ständig von den Alveolarzellen gebildet, sekretiert und wieder zurückgewonnen. Da bis kurz vor der Geburt die Bildung von Surfactant niedrig ist, besteht bei Frühgeburten die Gefahr des sogenannten Atemnot-Syndroms, der Schwierigkeit zu atmen, weil die Alveolen zusam-

mengefallen sind. Das Syndrom kann durch Einführen eines exogenen Surfactants in die Lunge behandelt werden. Der vergleichbare Zustand bei Erwachsenen (Erwachsenen-Atemnot-Syndrom) ist durch ungenügende Mengen Surfactants gekennzeichnet, meistens als Folge einer Lungenverletzung. Dieser Zustand kann ebenfalls durch exogenes Surfactant behandelt werden.

CH; | I;C-N= CH; |

(b)

CH;

N blau, O rot und P orange. Man beachte, wie

die ungesättigte Oleoylkette (links) im Vergleich zur gesättigten Stearoylkette geknickt ist. [Grafik erzeugt mit Koordinaten von Richard Venable und Richard Pastor, NIH, Bethesda.]

DIE

=0 H

N ze

ms

o

O

c=0

C=O

|

1-Stearoyl-2-oleoyl-3-phosphatidylcholin

die die Zellmembranen zerstören und somit die Zellen lysieren. Bienen- und Schlangengifte enthalten sehr viel Phospholipase A,. Andere Klassen von Phospholipasen hydrolysieren Glycerophospholipide an anderen Positionen, wie in Abbildung 9.5 gezeigt ist. Enzyme, die Lipide umsetzen, faszinieren Biochemiker, da diese Enzyme Zugang zu Bereichen der Lipide erhalten müssen, die in einer nicht wässrigen Umgebung verborgen liegen. Phospholipasen A,, die am besten verstandenen lipidspezifischen Enzyme, sind verhältnismäßig kleine Proteine (ca. 14 kD mit ca.

Klassifizierung der Lipide Phospholipase A,

l

9

-C—R,

Phospholipase C

H,O

|

OÖ | OR; B

R,—C—OH

277

Abb. 9.5 Wirkung von Phospholipasen. Phospholipase A, spaltet hydrolytisch den C2-Fettsäurerest am Triacylglycerin ab, so dass das entsprechende Lysophospholipid entsteht. Die Bindungen, die von anderen Klassen von Phospholipasen hydrolysiert werden, sind gekennzeichnet. Diese werden nach ihrer Spezifität eingeteilt.

Phospholipase D

Phospholipid

Lysophospholipid

125 Aminosäuren). Die Röntgenkristallstruktur der Phospholipase A, aus dem Gift der Kobra zeigt, wie das Enzym ein Glycerophospholipid bindet: Die polare Kopfgruppe des Glycerophospholipids passt in das aktive Zentrum des Enzyms. Die hydrophoben Schwänze, die über das aktive Zentrum hinausragen, interagieren mit einigen aromatischen Resten (Abb. 9.6). Lipasen, die bestimmte Triacylglycerine und Membranlipide spalten, katalysieren deren Abbau in vivo. Häufig sind die Hydrolyseprodukte nicht für den weiteren Abbau bestimmt, sondern dienen als intra- und extrazelluläre Signalmoleküle. Zum Beispiel regt Lysophosphatidsäure (1-Acylglycerin-3-phosphat), die auf Grund ihrer kleinen Kopfgruppe (einer unsubstituierten Phosphatgruppe) keine ausgeprägten Detergenseigenschaften hat, während der Wundheilung das Zellwachstum an. Sie entsteht durch Hydrolyse von Membranlipiden in Blutplättchen (Thrombocyten) und beschädigten Zellen. 1,2-Diacylglycerin, welches durch die Aktivität von Phospholipase C aus Membranlipiden entsteht, ist ein intrazelluläres Signalmolekül, das Proteinkinasen aktiviert (Abschnitt 13.4,

Kinasen katalysieren ATP-abhängige Phosphatübertragungen). Plasmalogene enthalten eine Etherbindung

Plasmalogene sind Glycerophospholipide, bei denen der C1-Substituent nicht über eine Esterbindung mit der Glycerineinheit verbunden ist, sondern über eine a,ß-ungesättigte Etherbindung (cis-konfigurierte Doppelbindung).

©)

CH 6=0 CHR h ein Vertreter der Plasmalogene

Ethanolamin, Cholin und Serin (Tab. 9.2) sind die häufigsten Plasmalogen-Kopfgruppen. Über die Funktionen der meisten Plasmalogene ist noch nicht viel bekannt. Da die Vinylether-Gruppe leicht oxidiert wird, reagieren Plasmalogene vermutlich mit freien Sauerstoffradikalen, die als Nebenprodukte des normalen Stoffwechsels auftreten. Sie verhindern dadurch, dass andere Bestandteile der Zelle durch freie Radikale geschädigt werden.

Abb. 9.6 Modell der Phospholipase A, mit einem Glycerophospholipid. Dargestellt ist die Röntgenkristallstruktur des Enzyms aus dem Gift der Kobra mit einem raumfüllenden Modell von Dimyristoylphosphatidylethanolamin in seinem aktiven Zentrum. Die Struktur des Lipids wurde durch NMR-Untersuchungen ermittelt. Ein Ca?*-Ion im aktiven Zentrum ist magenta dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Edward A. Dennis, University of California at San Diego.] 6%, siehe Interactive Exercises.

278

Lipide

Abb. 9.7 Ein Sphingomyelin. (a) Strukturformel. (b) Raumfüllendes Modell

(a) [

mit H weiß, C grün, N blau, O rot und P orange.

CH;

I+

CH; — N— CH;

[Grafik erzeugt mit Koordinaten von Richard Venable und Richard Pastor, NIH,

ir

Bethesda.! PhosphocholinKopfgruppe

CH; |

j

O= |— Om Lu

0)

|

ke

|

(&Eb— \

'—H

ba

Tue

®O_E

ng

Palmitat-

er

(OH (OH |

CH;

CH;

ein typisches Sphingomyelin

Sphingolipide Sphingolipide sind ebenfalls Hauptbestandteile der Zellmembran. Da Ihre Funktion in der Zelle anfangs rätselhaft war, wurden sie nach der Sphinx benannt. Die meisten von ihnen sind Derivate des C,s-Aminoalkohols Sphingosin, dessen Doppelbindung in trans-Konfiguration vorliegt. Die N-Acyl-Fettsäurederivate von Sphingosin sind als Ceramide bekannt.

OHH lan)

OH

OHH

OH

EEKO—E—E IE

H;N*

Tu

in (6)=

Ce, “one Fettsäure-

Sphingosin

Abb. 9.8 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Nervenfasern mit Myelinscheide. Dieser Blick auf den Querschnitt der Fasern zeigt,

wie die Membranen die Nervenaxone spiralförmig umhüllen. Die Myelinscheide kann 10 bis 15 Schichten dick sein, dabei macht sie ihr hoher

Myelingehalt zu einem elektrischen Isolator. [Mit freundlicher Genehmigung von Cedric S. Raine, Albert Einstein College of Medicine.]

in a

Duo

ein Vertreter der Ceramide

Ceramide sind die Ausgangsverbindungen für die weit verbreitete Gruppe der Sphingolipide: 1. Sphingomyeline, die häufigsten Sphingolipide, sind Ceramide, die entweder eine Phosphocholin- (Abb. 9.7) oder eine Phosphoethanolamin-Kopfgruppe tragen; sie können auch als Sphingophospholipide klassifiziert werden. Sie machen üblicherweise 10 bis 20% der Plasmamembranlipide aus. Obwohl Sphingomyeline sich chemisch von Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin unterscheiden, sind ihre Konformationen und Ladungsverteilungen recht ähnlich (vgl. dazu Abb. 9.4 und 9.7). Die Membranmyelinscheide, die viele Axone der Nervenzellen umgibt und sie dadurch elektrisch isoliert, ist besonders reich an Sphingomyelinen (Abb. 9.8). Cerebroside sind Ceramide, die als Kopfgruppe einen einzelnen Zuckerrest tragen. Auf Grund dessen werden diese Lipide Glykosphingolipide genannt, wobei Galactocerebroside und Glucocerebroside am häufigsten vorkommen. Cerebroside besitzen im Gegensatz zu Phospholipiden keine Phosphatgruppen und sind daher nicht ionisch.

Klassifizierung der Lipide

(a

Em

De

279

=

_ Gm

. Gus

N-AcetylD-Galactose

D-Galactosamin

D-Galactose

D-Glucose

CH;,0H

CH;>0OH

CH;0OH

CH;0OH

HO

H HNOH H

OÖ

HH OH

HO

(6)

H >

Sam H H (6)

(0)

N HH

0)

A OH

Hu

H

OH

I

(6) H

NH-—- C—CH,

"H

OH (6)

|

CH3

f

Im H

Ne

Ti

(6)ar OH

H

N-Acetylneuraminidat

alu (a)

iR

T

s

ce

CH;

CH;

Stearin-

Sphingo-

säure

sin

3. Ganglioside sind die strukturell kompliziertesten Glykosphingolipide. Diese Ceramide tragen Oligosaccharide, die mindestens einen Sialinsäurerest enthalten. Die Strukturen der Ganglioside Gy, Gm; und Gy;, drei der über sechzig bekannten, sind in Abbildung 9.9 wiedergegeben. Ganglioside sind in erster Linie Bestandteile der Zelloberflächenmembranen und machen einen erheblichen Teil (6%) der Lipide des Gehirns aus.

Ganglioside sind von erheblicher physiologischer und medizinischer Bedeutung. Ihre komplexen Kohlenhydratkopfgruppen, die aus der Zellmembranoberfläche herausragen, dienen als spezifische Rezeptoren für bestimmte Glykoproteinhormone der Hypophyse, die eine Reihe wichtiger physiologischer Funktionen regulieren. Außerdem sind Ganglioside Rezeptoren für bestimmte bakterielle Proteingifte, wie das Choleratoxin. Es gibt deutliche Hinweise dafür, dass Ganglioside spezifische Faktoren der Zell-Zell-Erkennung sind. Ihnen kommt wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei Wachstum und Differenzierung von Geweben, aber auch bei der Krebsentstehung zu. Störungen im Abbau von Gangliosiden sind Ursache für mehrere angeborene Krankheiten, die zur Speicherung von Sphingolipiden führen, wie der Tay-Sachs-Erkrankung. Diese äußert sich in einem anhaltenden, zum Tode führenden, neurologischen Verfall in der frühen Kindheit. Aus Sphingolipiden gehen, wie auch aus den Glycerophospholipiden, kleinere Lipide hervor, die bestimmte Signalwirkungen besitzen. Sphingomyelin scheint, ebenso wie die Ceramidanteile der komplexeren Sphingolipide, die Aktivität von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen (Enzyme, die Phosphatgruppen an Proteinen abspalten) spezifisch zu verändern. Diese Enzyme sind an der Regulierung von Zellwachstum und -differenzierung beteiligt.

b)

Abb. 9.9 Ganglioside. (a) Strukturformel der Ganglioside Gy, Gy2 und Gus. Dem Gangliosid Gy; fehlt im Vergleich zu Gy der terminale p-Galactoserest, dem Gangliosid Gy;

zudem noch der N-Acetyl-D-Galactosaminrest. Andere Ganglioside haben unterschiedliche Oligosaccharid-Kopfgruppen. (b) Raumfüllendes Modell von Gy] mit H weiß, C grün, N blau und © rot.

[Grafik erzeugt mit Koordinaten von Richard Venable und Richard Pastor, NIH, Bethesda.]

230

Lipide

Abb. 9.10 Cholesterin. (a) Strukturformel mit der Standardnummerierung. (b) Raumfüllendes Modell mit H weiß, C grün und O rot. [Grafik erzeugt mit Koordinaten von Richard

(a) "CH

20H

Venable und Richard Pastor, NIH, Bethesda.]

°C,

CH, CH, CH, CH

CH3

op,

HO

(d)

Cholesterin

E.

Steroide

Steroide sind meist eukaryotischer Herkunft und (chemisch gesehen) Derivate von 1,2-Cyclopentanoperhydrophenanthren,

Cyclopentanoperhydrophenanthren

einer Verbindung, die aus vier kondensierten, nicht polaren Ringen (markiert mit A-D) besteht. Das beinahe in Verruf geratene Cholesterin ist das häufigste Steroid in Tieren und der Klasse der Sterole zuzurechnen, da es am C3 eine OHGruppe trägt (Abb. 9.10). Cholesterin ist ein Hauptbestandteil tierischer Membranen, der üblicherweise 30 bis 40% aller Plasmamembranlipide ausmacht. Seine polare OH-Gruppe verleiht ihm einen leicht amphiphilen Charakter und sein kondensiertes Ringsystem eine größere Starrheit als sie andere Membranlipide haben. Cholesterin kann auch mit langkettigen Fettsäuren verestert sein, wodurch Cholesterinester entstehen, wie z.B. Cholesterinstearat: H3C

CH3 CH3 CH3 CH3

ı ei (CH3)1s zer CH;

Cholesterinstearat

Pflanzen enthalten wenig Cholesterin, synthetisieren aber andere Sterole. Hefen und Pilze synthetisieren ebenfalls Sterole, die sich von Cholesterin durch ihre aliphatischen Seitenketten und die Anzahl an Doppelbindungen unterscheiden. Prokaryoten enthalten, wenn überhaupt, nur sehr wenig Sterol. In Säugetieren ist Cholesterin die Ausgangsverbindung der Steroidhormone, einer Verbindungsklasse, die eine Vielzahl verschiedener physiologischer Funk-

Klassifizierung der Lipfide Abb. 9.11

OH H3C H3C

(6) Cortisol (Hydrocortison) (ein Vertreter der Glucocorticoide)

Testosteron (ein typisches Androgen)

CH>30H

HO

| HC

c=0

OH

a

H3C

(6) Aldosteron (ein Vertreter der Mineralocorticoide)

[=

HO B-Östradiol (ein typisches Östrogen)

tionen reguliert. Die Strukturen einiger Steroidhormone sind in Abbildung 9.11 dargestellt. Steroidhormone werden nach den physiologischen Antworten, die sie hervorrufen, eingeteilt: 1. Glucocorticoide, wie Cortisol (eine C,,-Verbindung), beeinflussen den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden und viele andere Lebensfunktionen, einschließlich der Entzündungsreaktionen und der Fähigkeit, mit Stress umzugehen. 2. Aldosterone und andere Mineralocorticoide regulieren die Ausscheidung von Salz und Wasser durch die Nieren. 3. Androgene und Östrogene beeinflussen die sexuelle Entwicklung und Funktion. Der Prototyp der Androgene (der männlichen Sexualhormone) ist Testosteron, eine C}9-Verbindung, während ß-Östradiol, eine C,g,-Komponente, ein Östrogen (weibliches Sexualhormon) ist. Glucocorticoide und Mineralocorticoide werden von der Rinde (Cortex) der Nebenniere synthetisiert. In Hoden und Eierstöcken (und in geringerem Ausmaß auch von der Nebennierenrinde) werden sowohl Androgene als auch Östrogene (die weiblichen Sexualhormone) gebildet (jedoch herrschen Androgene in den Hoden und Östrogene in den Eierstöcken vor). Da Steroidhormone wasserunlöslich sind, werden sie an Proteine gebunden, um über das Blut zu ihren Zielorganen transportiert zu werden. Eine verminderte Funktion der Nebennierenrinde, sei sie durch Erkrankungen oder durch eine Verletzung entstanden, ist die Ursache der Addison-Krankheit. Diese ist durch Hypoglykämie (verringerter Glucosegehalt im Blut), Muskelschwäche, Na*-Verlust, erhöhte K*-Konzentration, verminderte Herztätigkeit und stark erhöhte Stressempfindlichkeit gekennzeichnet. Werden bei den Patienten nicht die Spiegel der Glucocorticoide und Mineralocorticoide medikamentös eingestellt, siechen sie langsam dahin und sterben schließlich ohne auffällige Schmerzen und Leiden. Umgekehrt führt adrenocorticale Hyperfunktion, die oft durch einen Tumor der Nebennierenrinde hervorgerufen wird, zum Cushing-Syndrom, das sich durch Erschöpfung, Hyperglykämie (erhöhte Glucose-

281

Einige Vertreter der Steroidhormone.

282

Lipide

konzentration im Blut), Ödeme (Wassereinlagerungen) und eine Neuverteilung des Körperfettes, resultierend im charakteristischen „Mondgesicht“, äußert.

Vitamin D reguliert den Ca?*-Stoffwechsel

Die verschiedenen Formen von Vitamin D, die echte Hormone sind, sind Ste-

roidderivate, deren Ring B zwischen den C-Atomen C9 und C10 geöffnet ist. R H3C UVStrahlung

HO

HO R=X R=Y

H;C

R s

H3C spontan

z

H>C

HO R=X R=Y

7-Dehydrocholesterin Ergosterol

n Vitamin D, (Cholecalciferol Vitamin D, (Ergocalciferol)

ae Vitamin D, (Ergocalciferol) entsteht in der Haut von Tieren durch eine nicht enzymatische Reaktion, bei der das Pflanzensterol Ergosterol (ein häufiger Milchzusatzstoff) durch die photolytische Wirkung von UV-Licht modifiziert wird. Analog wird das nahe verwandte Vitamin D; (Cholecalciferol) aus 7-Dehydrocholesterin photolysiert (deshalb sagt man, dass Sonnenlicht Vitamin D bilde). Vitamin D, und D, sind inaktiv. Ihre aktiven Formen entstehen durch enzymatische Hydroxylierung (Addition einer OH-Gruppe) in der Leber (am C25) und in der Niere (am C1), so dass 1a,25-Dihydroxycholecalciferol entsteht.

H;C

HO 1@,25-Dihydroxycholecalciferol

Aktives Vitamin D erhöht die Ca’*-Konzentration im Blutserum, indem es im Darm die Aufnahme des in der Nahrung enthaltenen Ca’* steigert. Dadurch wird die Einlagerung von Ca’ in Knochen und Zähne gefördert. Vitamin-DMangel führt bei Kindern zu Rachitis, einer Krankheit, die durch gehemmtes Wachstum und verkrümmte Beine (wegen ungenügender Mineralisierung der Knochen) gekennzeichnet ist. Obwohl Rachitis erstmals 1645 beschrieben wurde, konnte erst im frühen 20. Jahrhundert nachgewiesen werden, dass tierische Fette, besonders Lebertran (Öle der Fischleber) diese Mangelerkrankung verhindern können. Rachitis kann auch dadurch vorgebeugt werden, dass Kin-

Klassifizierung der Lipide

der unabhängig von ihrer Ernährung dem Sonnenlicht oder nur ultraviolettem Licht im Wellenlängenbereich von 230 bis 313 nm ausgesetzt werden. Da Vitamin D wasserunlöslich ist, kann es sich im Fettgewebe anreichern; bei starker Aufnahme von Vitamin D über längere Zeit kommt es zu einer VitaminD-Vergiftung. Dabei führt die anhaltend hohe Ca?*-Konzentration im Blutplasma zu einer krankhaften Verkalkung der weichen Gewebe und zur Bildung von Nierensteinen, die Nierenversagen verursachen können. Es wird vermutet,

dass die Pigmentierung der Haut eine Vitamin-D-Vergiftung verhindert, indem sie die intensive Sonneneinstrahlung filtert. Dies würde die Beobachtung erklären, dass die Intensität der Hautpigmentierung bei der einheimischen Bevölkerung mit zunehmender Äquatornähe zunimmt.

F.

Andere Lipide

Zusätzlich zu den gut untersuchten Lipiden, die in großen Mengen in Zellmembranen vorkommen, synthetisieren viele Organismen andere Verbindungen, die keine Membranbestandteile sind, aber gemäß ihrer physikalischen Eigenschaften den Lipiden zugerechnet werden. Lipide kommen z.B. in der Wachsschicht von Pflanzen vor. Hier schützen sie die Zellen vor dem Austrocknen, indem sie eine wasserundurchlässige Schicht bilden. Isoprenoide sind aus C,-Einheiten aufgebaut

Zu den Verbindungen, die keine Strukturbestandteile von Membranen sind obwohl sie in der Lipiddoppelschicht löslich sind — gehören die Isoprenoide. Diese bestehen aus C;-Einheiten mit dem Kohlenstoffskelett des Isoprens.

H,C

=

C

er Isopren

Das Isoprenoid Ubichinon (auch unter Coenzym Q bekannt) z.B. wird in der Mitochondrienmembran reversibel reduziert und oxidiert. Seine Aktivität wird in Abschnitt 18.2C ausführlicher beschrieben. Bei Säugetieren besteht Ubichinon aus zehn Isoprenoideinheiten. [6) H;CO

CH;

H;CO o

CH3 | (CH, -CH=C CH), Isoprenoideinheiten

H

Coenzyme @ (Co) oder Ubichinon

Das Pflanzenreich ist reich an Isoprenoiden, die als Pigmente, Signalmoleküle (Hormone und Pheromone) sowie Abwehrstoffe dienen. Man hat inzwischen mehr als 25.000 Isoprenoide (auch als Terpenoide bezeichnet) beschrieben, die meist aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien stammen. Im Verlauf der Evolution hat der Wirbeltierstoffwechsel verschiedene dieser Verbindungen für andere Aufgaben „zweckentfremdet“. Einige dieser Verbindungen (z.B. Vitamin D) bezeichnet man als fettlösliche Vitamine (Vitamine sind organische Substanzen, die der tierische Organismus in kleinen Mengen benötigt und, da er sie nicht selbst herstellen kann, mit der Nahrung aufnehmen muss). Vitamin A oder Retinol stammt hauptsächlich aus Pflanzen genauso wie das ß-Carotin, ein rotes Pigment, das sowohl in grünem Gemüse als auch in Karotten (nach denen es benannt ist) und Tomaten vorkommt (Abschnitt 19.1B).

283

284

Lipide

IE

DIN

x= CH50H

Retinol (Vitamin A)

XE=ICEI®

Retinal

Retinol wird zu seinem entsprechenden Aldehyd, dem Retinal, oxidiert. Retinal fungiert bei geringer Lichtstärke als primärer Photorezeptor des Auges. Licht bewirkt eine Isomerisierung des Retinals. Über einen komplexen Signalweg führt dies schließlich zu einer Erregung des Sehnervs (siehe Abschnitt 13.3A). Ein Mangel an Vitamin A kann zu Blindheit führen. Retinsäure besitzt hormonartige Eigenschaften, da sie an nucleäre Rezeptoren bindet und die Gewebereparatur stimuliert. Sie wird zur Behandlung von starker Akne und Hautgeschwüren verwendet, aber auch kosmetisch zur Faltenbeseitigung. Vitamin K ist ein von Pflanzen (Phyllochinon) und Bakterien (Menachinon) synthetisiertes Lipid: O

R

N (0)

R=

I

R= 3

7

Phyllochinon

Menachinon

(Vitamin K,)

(Vitamin K;)

Etwa die Hälfte des täglichen menschlichen Bedarfs wird durch Darmbakterien gedeckt. Vitamin K ist an der Carboxylierung von Glutamatresten einiger Proteine beteiligt, die für die Blutgerinnung von Bedeutung sind (der Name Vitamin K rührt von dem Begriff Koagulation her). Vitamin-K-Mangel verhindert diese Carboxylierung, und da das sich ergebende Gerinnungsprotein inaktiv ist, hat dies übermäßige Blutungen zur Folge. Besonders Früh- und Neugeborene sind hiervon betroffen. Die heute übliche Vitamin-K-Prophylaxe hat das Risiko drastisch gesenkt. Verbindungen, die die Vitamin-K-Funktion beeinträchtigen, sind wirksame Bestandteile mancher Rattengifte, Substanzen, welche die Vitamin-K-Synthese hemmen, werden in der Medizin als Therapeutika zur „Blutver-

dünnung“ und Vorbeugung von Blutgerinselbildung eingesetzt. Vitamin E ist eigentlich eine Gruppe von Verbindungen, deren häufigster Vertreter o-Tocopherol ist:

HO

a-Tocopherol (Vitamin E)

Klassifizierung der Lipfide

285

Dieses stark hydrophobe Molekül wird in die Zellmembran eingebaut, wo es als Antioxidans wirkt und oxidative Schäden an Membranproteinen und -lipiden verhindert. Ein Vitamin-E-Mangel ruft verschiedene unspezifische Symptome hervor, weshalb er schwer festzustellen ist. Die Beliebtheit von Vitamin-E-Zusätzen zu Kosmetika und Nahrungsmitteln beruht auf der Annahme, dass Vitamin E die Zellen vor Oxidationsschäden schützt und somit auch die Alterserscheinungen verringert. Eicosanoide werden aus Arachidonsäure gebildet

Andere, weniger häufige Lipide werden aus Membranlipiden gebildet. Prostaglandine (siehe z.B. Abb. 9.12) wurden in den 1930er Jahren von Ulf von Euler entdeckt, der davon ausging, dass sie von der Vorsteherdrüse (Prostata) gebildet würden. Prostaglandine und die verwandten Verbindungen - Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene- werden unter dem Begriff Eicosanoide zusammengefasst, da sie alle C,.-Verbindungen sind (griech.: eikosi, zwanzig). Eicosanoide wirken in sehr niedrigen Konzentrationen und sind an der Entstehung von Schmerz und Fieber sowie der Regulierung des Blutdrucks, der Blutgerinnung und der Fortpflanzung beteiligt. Anders als Hormone werden Eicosanoide nicht durch das Blut zu ihren Wirkorten transportiert, sondern wirken meist lokal, nahe den Zellen, die sie produzieren. Tatsächlich zerfallen die meisten Eicosanoide innerhalb von Sekunden oder Minuten, was ihre Wirkung auf nahe gelegene Gewebe begrenzt. Die Synthese von Eicosanoiden wird in Abschnitt 20.6C diskutiert. Im menschlichen Organismus ist der wichtigste Vorläufer der Eicosanoide die Arachidonsäure, eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit vier Doppelbindungen (Tab. 9.1). Arachidonat ist in Zellmembranen als C2-Ester von Phos-

er

=

Abb. 9.12 Eicosanoide. Arachidonat ist die Vorstufe der Prostaglandine (PG), Prostacycline und Thromboxane (Tx), der Lipoxine (LX) und der Leukotriene. Obwohl nur ein Beispiel von jedem Eicosanoidtyp gezeigt ist, hat jeder Typ eine ganze Reihe physiologisch bedeutsamer Derivate, die durch Buchstaben und Indices

bezeichnet sind (z.B. PGH, für Prostaglandin H,).

OH FI

COOH

rege

OH

COOH

=—)-

LTB,

Arachidonsäure

(ein Vertreter der Leukotriene)

PGH;-Synthase

———

HO

(Aspirin hemmt)

OH

COOH

DIE

—

COOH FREE

Or

OH

15-LXA,

ST

(ein Vertreter der Lipoxine)

OH COOH H

?

PGH,

£

HO

/

HO a x

E

OH

(6)

[6)

COOH ern

een Zu OH

COOH

LG

TxB 2

(ein Vertreter der Thromboxane)

6-Oxo-PGF;« nen

(ein Vertreter der Prostacycline)

HO

ae

7

OH PGF3«

(ein Vertreter der Prostaglandine)

286

Lipide

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Wie unterscheiden sich Lipide von den drei anderen Hauptklassen von Biomolekülen? 2. Wie beeinflussen ungesättigte Bindungen die physikalischen Eigenschaften von Fettsäuren oder Membranlipiden, mit denen diese verestert sind? 3. Vergleichen Sie die Strukturen und physikalischen Eigenschaften von Triacylglycerinen, Glycerophospholipiden und Sphingolipiden. 4. Fassen Sie die Funktionen von Steroiden und Eicosanoiden zusammen.

phatidylinositol (Tab. 9.2) und anderen Phospholipiden gespeichert. Der Fettsäurerest wird durch Phospholipase A, (Abb. 9.5) freigesetzt. Die einzelnen Produkte des Arachidonsäure-Stoffwechsels sind gewebeabhängig. Zum Beispiel bilden Blutplättchen (Thrombocyten) meist ausschließlich Thromboxane. Endothelzellen, die die Wände von Blutgefäßen auskleiden, synthetisieren hingegen vorwiegend Prostaglandine. Interessanterweise regen Thromboxane die Vasokonstriktion und Blutplättchenaggregation an (der einleitende Schritt bei der Blutgerinnung), während Prostaglandine die gegenteilige Wirkung hervorrufen. Somit wirken die beiden Substanzen entgegengesetzt, um eine Balance im kardiovaskulären System aufrechtzuerhalten.

2

In lebenden Organismen sind Lipide selten als freie Moleküle zu finden. Sie sind vielmehr mit anderen Molekülen, meist mit anderen Lipiden, assoziiert. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Lipide sich zusammenlagern, um Micellen und Doppelschichten zu bilden. Es werden die physikalischen Eigenschaften von Lipiddoppelschichten dargestellt, da diese Aggregate die strukturelle Grundlage biologischer Membranen sind.

A.

Abb. 9.13 Aggregate von Lipiden mit einem einzelnen Schwanz. Die spitz zulaufenden van-der-Waals-Hüllen dieser Lipide (a) ermöglichen ihnen, sich effizient zusammenzulagern und kugelige Micellen zu bilden (b). Der Durchmesser dieser Micellen ist abhängig von der Länge der Schwänze. Kugelige Micellen, die aus deutlich mehr Lipiden als der idealen Anzahl gebildet werden (c), besäßen ein ungünstiges, mit Wasser gefülltes Inneres (blau). Solche Micellen könnten sich abflachen, um das hohle

Innere zusammenfallen zu lassen. In diesen elliptischen Micellen bilden sich aber auch wassergefüllte Hohlräume (d).

(a)

van-der-WaalsHülle

(b)

Lipiddoppelschichten

Ursache der Bildung von Doppelschichten

In wässrigen Lösungen bilden amphiphile Moleküle, wie Seifen oder Detergentien, Micellen (kugelförmige Aggregate, deren Kohlenwasserstoffgruppen vom Kontakt mit Wasser ausgeschlossen sind; Abschnitt 2.1C). Diese molekulare Anordnung verhindert den ungünstigen Kontakt zwischen Wassermolekülen und den hydrophoben Schwänzen der amphiphilen Verbindungen, ermöglicht aber trotzdem die Solvatisierung der polaren Kopfgruppen. Die ungefähre Größe und Form einer Micelle kann aus geometrischen Überlegungen abgeleitet werden. Amphiphile Verbindungen mit einem einzelnen Schwanz, wie etwa Seifenanionen, bilden kugelige oder elliptische Micellen, da sie eine spitz zulaufende Form haben (ihre hydratisierten Kopfgruppen sind breiter als ihre Schwänze; Abb. 9.13a,b). Die Anzahl der Moleküle in einer solchen Micelle ist abhängig von der amphiphilen Verbindung. Für viele Substanzen liegt sie in der Größenordnung von mehreren Hundert. Bei zu wenigen Lipidmolekülen wäre das hydrophobe Innere einer Micelle der Wasserumgebung ausgesetzt. Dagegen entstünde bei zu vielen Molekülen in einer Micelle ein energetisch ungünstiger hohler Innenraum (Abb. 9.13c). Natürlich könnte sich eine große Micelle abflachen, um eine solche hohle Mitte zu verhindern. Die an den abgeflachten Oberflächen verringerte Krümmung würde jedoch ebenfalls zu Hohlräumen führen (Abb. 9.13d).

Lipiddoppelschichtten

Amphiphile Verbindungen, wie Glycerophospholipide und Sphingolipide, haben durch ihre zwei Kohlenwasserstoffschwänze einen annähernd rechteckigen Querschnitt (Abb. 9.14a). Die sterischen Anforderungen solcher Moleküle ergeben beim Packen große diskusförmige Micellen (Abb. 9.145), die auch als ausgedehnte bimolekulare Blätter aufgefasst werden können. Diese Lipiddoppelschichten sind etwa 6 nm dick, wie elektronenmikroskopische Untersuchungen und Röntgenbeugungsmuster ergaben. Dies entspricht einer Größe, die für mehr oder weniger vollständig gestreckte Kohlenwasserstoffschwänze zu erwarten ist. Eine Suspension von Phospholipiden (Glycerophospholipiden oder Sphingo-

myelinen) kann Liposomen bilden - geschlossene, sich selbst abschließende, lösungsmittelgefüllte Vesikel, die nur durch eine einzelne Doppelschicht begrenzt werden (Abb. 9.15). Sie haben gewöhnlich einen Durchmesser von einigen Zehn Nanometern und sind in einer gegebenen Präparation von ziemlich einheitlicher Größe. Haben sich Liposomen einmal gebildet, sind sie recht stabil und können durch Gelfiltrationschromatographie, Dialyse oder Zentrifugation gereinigt werden. Deshalb können Liposomen, deren inneres Milieu sich von der umgebenden Lösung unterschiedet, leicht präpariert werden. Liposomen dienen als Modell für biologische Membranen und werden vielleicht in Zukunft als Iransportsysteme für Medikamente dienen können, da sie von vielen Zellen durch Verschmelzen mit der Zellmembran aufgenommen werden.

B.

(a)

287

(b)

Abb. 9.14 Bildung einer Lipiddoppelschicht durch Phospholipide. Die zylindrischen van-der-Waals-Hüllen dieser Lipide (a) bewirken, dass sie ausgedehnte diskusförmige Micellen bilden (b), die besser als Lipiddoppelschichten bezeichnet werden.

Beweglichkeit der Lipide

Der Durchtritt eines Lipidmoleküls durch eine Doppelschicht (Abb. 9.160), ein Vorgang, der als Transversaldiffusion oder Flip-Flop bezeichnet wird, ist ein äußerst seltenes Ereignis. Die Ursache dafür ist, dass für einen Flip-Flop die hydratisierte, polare Kopfgruppe des Lipids die innere, wasserfreie Kohlenwasserstoffzone der Doppelschicht durchqueren müsste. Die Flip-Flop-Geschwindigkeiten von Phospholipiden entsprechen Halbwertszeiten von einigen Tagen oder mehr. Im Gegensatz zu ihren niedrigen Flip-Flop-Geschwindigkeiten haben Lipide eine sehr hohe Beweglichkeit innerhalb einer Lage der Doppelschicht (Lateraldiffusion; Abb. 9.16b). Es wurde geschätzt, dass Lipide in Membranen in ungefähr 1 s die Strecke von 1 um diffundieren können. Dies entspricht der Länge einer Bakterienzelle. Auf Grund der Beweglichkeit der Lipide kann die Lipiddoppelschicht als eine zweidimensionale Flüssigkeit angesehen werden. Das Innere von Lipiddoppelschichten ist wegen der Drehung um die C-CBindungen der Lipidschwänze in ständiger Bewegung. Verschiedene physikalische Messungen vermitteln den Eindruck, dass das Innere der Doppelschichten die Viskosität eines leichten Maschinenöls besitzt. Diese Eigenschaft des Doppelschichtinneren steht in Einklang mit Molekül-Dynamik-Simulationen. Dabei werden aus Kalkulationen der Kräfte, die auf Atome wirken, deren zeitabhängige Positionen bestimmt (Abb. 9.17). Die Viskosität der Doppelschicht steigt erheblich mit zunehmender Nähe zu den Lipidkopfgruppen, deren Rotation begrenzt ist und deren laterale Beweglichkeit mehr durch Wechselwirkungen mit anderen polaren oder geladenen Kopfgruppen bedingt ist. Die äußeren Oberflächen der Lipiddoppelschichten werden natürlich von einigen Schichten geordneter Wassermoleküle flankiert. Es ist zu beachten, dass die hydrophoben Schwänze der Lipide, wie sie in Abbildung 9.17 dargestellt sind, nicht so starr angeordnet sind, wie es in Abbildung 9.16 erscheinen mag. So überrascht es nicht, dass sich die Lipidschwänze abwinkeln und ineinander schieben. Eine typische biologische Membran enthält viele verschiedene Lipidmoleküle, von denen einige unterschiedlich lange Schwänze besitzen oder durch das Auftreten von Doppelbindungen abgeknickt sind. Unter physiologischen Bedingungen füllen sehr bewegliche Ketten alle Lücken aus, die sich im Inneren der Doppelschicht zwischen den Lipiden bilden können.

Abb. 9.15

Elektronenmikroskopische Aufnahme

eines Liposoms.

Seine Wand besteht, wie das angefügte Schema verdeutlicht, aus einer Lipiddoppelschicht. [Mit freundlicher Genehmigung von Walther Stoeckenius, University of California at San Francisco.]

(a) Transversaldiffusion (Flip-Flop)

a

Ar: N

———

j

(b) Lateraldiffusion

nn

u

schnell

\ bis

R

Abb. 9.16 Diffusion eines Phospholipids in einer Lipiddoppelschicht. (a) Transversaldiffusion (Flip-Flop) ist definiert als der Übergang eines Phospholipids von der einen Lage der Doppelschicht auf die andere. (b) Lateraldiffusion ist definiert als der paarweise Austausch benachbarter Phospholipidmoleküle innerhalb derselben Lage der Doppelschicht.

288

Lipide

Abb. 9.17 _Modell (Schnappschuss) einer Lipiddoppelschicht zu einem bestimmten Zeitpunkt. Die Konformationen der Dipalmitoylphosphatidylcholin-Moleküle in einer Doppelschicht, die von Wasser umgeben ist, wurden am Computer

berechnet. Die Atome sind farbig gekennzeichnet: Ketten- und Glycerin-C grau (mit der Ausnahme des C der terminalen Methylgruppe gelb), Ester-O rot, Phosphat-P und -O grün, Cholin-C und -N helles violett, Wassermoleküle sind als durchscheinende blaue Kugeln dargestellt (die in der Nähe der Doppelschicht erscheinen dunkler, da sie mit den Atomen der Kopfgruppen überlappen). Die Wasserstoffatome der Lipide sind nicht dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Richard Pastor und Richard Venable, NIH, Bethesda.]

Das in Abbildung 9.17 dargestellte Modell einer Lipiddoppelschicht verdeutlicht, dass die Phospholipide nicht genau parallel ausgerichtet sind, sondern sich bis zu einem gewissen Grad auf und ab bewegen. Dies geschieht genauso in natürlichen Membranen, die eine Vielzahl an verschiedenen Lipid-Kopfgruppen enthalten. Die polare äußere Oberfläche der Doppelschicht reicht von den Kopfgruppen bis zu den Carbonylgruppen der Ester- und Amidbindungen, über die die Fettsäuren gebunden sind. Folglich können Wassermoleküle bis zu einer Tiefe von 1,5 nm in die Lipiddoppelschicht eindringen und meiden nur den zentralen ca. 3 nm breiten Kohlenwasserstoffkern. Das Fließvermögen (die Fluidität) einer Lipiddoppelschicht hängt von der Temperatur ab

Abb. 9.18 Phasenübergang in einer Lipiddoppelschicht. (a) Oberhalb der Übergangstemperatur sind sowohl die Lipidmoleküle als Ganzes als auch ihre unpolaren Schwänze innerhalb einer Lage der Doppelschicht sehr beweglich. (b) Unterhalb der Übergangstemperatur haben die Lipidmoleküle eine viel regelmäfßigere Anordnung, so dass sich

ein gelartiger Feststoff bildet. [Nach Robertson, R.N., The Lively Membranes, S. 69-70, Cambridge

University Press (1983).] (a) oberhalb der Übergangstemperatur

Wird eine Lipiddoppelschicht unter eine bestimmte Übergangstemperatur abgekühlt, durchläuft sie eine Art Phasenübergang. Da sie dabei ihre Fluidität verliert, wird sie zu einem gelartigen Feststoff (Abb. 9.18). Oberhalb der Übergangstemperatur befinden die sehr beweglichen Lipide sich in einem Zustand, der als flüssiger Kristall bezeichnet wird, da die Lipide in einigen Richtungen geordnet sind, in anderen hingegen nicht. Die Doppelschicht ist im Gelzustand wegen der zunehmenden Steifheit der Kohlenwasserstoffschwänze bei niedrigeren Temperaturen dicker als im Zustand des flüssigen Kristalls. Die Übergangstemperatur einer Doppelschicht erhöht sich mit der Kettenlänge und dem Sättigungsgrad ihrer Fettsäurebestandteile aus demselben Grund, aus dem die Schmelzpunkte von Fettsäuren durch diese Eigenschaften steigen. Die Übergangstemperaturen der meisten biologischen Membranen liegen im Bereich von 10 bis (b)

unterhalb der Übergangstemperatur

Membranproteine

40°C. Bakterien und wechselwarme Tiere wie Fische verändern (durch Lipidsynthese und -abbau) die Fettsäurezusammensetzung ihrer Membranlipide in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur, um einen gleichmäßigen Zustand der Membranfluidität aufrechtzuerhalten. Somit ist die Fluidität biologischer Membranen eine ihrer bedeutenden physikalischen Eigenschaften. Cholesterin bildet allein keine Doppelschichten, jedoch verringert es die Fluidität von Membranen, weil sein steifes Steroidringsystem die Bewegungen der Fettsäureseitenketten anderer Membranlipide behindert. Außerdem erweitert es den Temperaturbereich des Phasenüberganges, weil Cholesterin die Kristallisation von Fettsäureseitenketten verhindert, indem es sich zwischen sie lagert. Daher dient Cholesterin als eine Art „Membran-Weichmacher“.

3

_Membranproteine

Biologische Membranen bestehen aus Proteinen und Lipiden. Die Art der Lipidund Proteinkomponenten und das Verhältnis von Protein zu Lipid variiert je nach Art der Membran. Zum Beispiel besitzen die lipidreichen Myelinscheiden, die bestimmte Nervenaxone umhüllen und isolieren (Abb. 9.8), ein ProteinLipid-Verhältnis von 0,23. Dagegen weist die proteinreiche innere Mitochondrienmembran, die an vielen chemischen Reaktionen beteiligt ist, ein ProteinLipid-Verhältnis von 3,2 auf. Eukaryotische Plasmamembranen bestehen typischerweise zu etwa 50% aus Proteinen. Membranproteine katalysieren eine Reihe chemischer Reaktionen, vermitteln den Fluss von Nährstoffen und Abbauprodukten durch die Membran und sind an der Weitergabe von Informationen aus der extrazellulären Umgebung an verschiedene intrazelluläre Kompartimente beteiligt. Solche Proteine erfüllen ihre Funktion in Verbindung mit der Lipiddoppelschicht. Sie müssen daher in einem gewissen Umfang mit dem hydrophoben Kern und/oder mit der polaren Oberfläche der Doppelschicht in Wechselwirkung treten. In diesem Kapitel werden die Strukturen einiger Membranproteine untersucht, die nach ihrer Art der Wechselwirkung mit der Membran eingeteilt werden.

A.

Integrale Membranproteine

Integrale oder intrinsische Proteine (Abb. 9.19) sind durch hydrophobe Wechselwirkungen fest an die Membran gebunden und können von ihr nur durch Reagenzien getrennt werden, welche die Membranen zerstören. Detergentien wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, (engl.: sodium dodecyl sulfate (SDS); Abschnitt 5.2D) lösen Membranproteine heraus, indem sie die Membranlipide, die normalerweise die Proteine umgeben, ersetzen. Die hydrophoben Teile der Lösungsmittelmoleküle umhüllen die hydrophoben Regionen des Proteins, und die polaren Kopfgruppen machen den Lösungsmittel-Protein-Komplex wasserlöslich. Chaotrope Reagenzien, wie z.B. das Guanidiniumion oder Harnstoff (Abschnitt 6.4B) zerstören die Wasserstruktur. Dadurch reduzieren sie den hydrophoben Effekt, die wichtigste Triebkraft zur Stabilisierung des Komplexes aus Protein und Membranlipiden. Einige integrale Proteine binden so hartnäckig an Lipide, dass sie nur unter denaturierenden Bedingungen von diesen getrennt werden können. Sind sie einmal in Lösung gebracht, können integrale Membranproteine durch viele der Methoden gereinigt werden, die in Abschnitt 5.2 besprochen wurden. Integrale Proteine neigen dazu, in wässrigen Lösungen zu aggregieren und zu präzipitieren, wenn sie nicht durch Detergentien oder wassermischbare organische Lösungsmittel wie Butanol oder Glycerin gelöst werden.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Warum bilden Glycerophospholipide Doppelschichten, Fettsäuren aber nicht? 2. Erklären Sie, warum die Lateral-

diffusion von Membranlipiden schneller abläuft als die Transversaldiffusion. 3. Welche Faktoren beeinflussen

die Fluidität einer Lipiddoppelschicht?

289

290

Lipide Innenseite der Zelle

Abb. 9.19 Struktur des integralen Membranproteins Aquaporin-0 (AQPO) in Assoziation mit Lipiden. Das Protein wird durch sein Oberflächendiagramm dargestellt. Es ist entsprechend seiner Ladung gefärbt (rot negativ, blau positiv und weiß ungeladen). Fest gebundene Dimyristoylphosphatidylcholin-Moleküle sind in raumfüllender Darstellung (Kalottenmodell) mit O rot, P orange und C grau abgebildet. Beachten Sie, wie sich die Lipid-

schwänze eng an der unpolaren Oberfläche des Proteins ausrichten und diese dadurch solvatisieren. Die Anordnung der zwei Lipidmolekülreihen mit Phosphat-Phosphat-Abständen von etwa 3,5 nm entspricht der Dimension einer Lipiddoppelschicht. [Mit freundlicher Genehmigung von Anthony Lee, University of Southampton, Southampton. Nach einer elektronenkristallographischen Struktur von Stephen Harrison und Thomas Walz, Harvard Medical School.]

Außenseite der Zelie

Integrale Proteine sind asymmetrisch orientierte amphiphile Verbindungen

Integrale Proteine sind amphiphile Verbindungen. Das Proteinsegment, das in dem unpolaren Inneren einer Membran verankert ist, hat überwiegend hydrophobe Oberflächenreste, wohingegen solche Teile, die in die wässrige Umgebung ragen, stark mit polaren Resten überzogen sind. Dies wurde durch Oberflächenmarkierung gezeigt, einer Technik, bei der Verbindungen eingesetzt werden, die mit den Membranproteinen reagieren, aber nicht in die Membranen eindringen können. So bindet z.B. die extrazelluläre Domäne eines integralen Proteins an spezifische Antikörper, aber seine cytoplasmatische Domäne bindet sie nur, wenn die Membran aufgebrochen wurde. Proteinspezifische Reagenzien, welche die Membran nicht passieren können und eine Fluoreszenz- oder radioaktive Markierung tragen, sind ebenfalls geeignet. Alternativ können Proteasen eingesetzt werden, die nur den Teil eines integralen Proteins spalten, der dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, um den Teil des Proteins zu bestimmen, der in die Membran eingetaucht ist. Durch diese Technik wurde z.B. entdeckt, dass Glykophorin A, ein Membranprotein der roten Blutkörperchen (Erythrocyten), drei Domänen hat (Abb. 9.20): (1) eine außen gelegene N-terminale Domäne, die aus 72 Aminosäuren besteht und 16 Kohlenhydratketten trägt, (2) eine 19 Aminosäuren lange Sequenz, die fast ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren besteht und die Erythrocytenzellmembran durchspannt und (3) eine cytoplasmatische C-terminale Domäne aus 40 Aminosäuren mit vielen polaren und geladenen Resten. Somit ist Glykophorin A ein Transmembran(TM-)protein, was bedeutet, dass es die Membran vollständig durchspannt. Studien an einer Vielzahl biologischer Membranen haben ergeben, dass biologische Membranen so aufgebaut sind, dass ein bestimmtes Membranprotein nur an einer bestimmten Seite der Membran lokalisiert ist, oder im Fall eines Transmembranproteins nur in eine Richtung orientiert ist. Die Membran ist somit asymmetrisch. Jedoch ist kein Protein bekannt, das vollständig in der Membran verborgen ist. Das heißt, alle membranassoziierten Proteine sind wenigstens zu einem Teil der wässrigen Umgebung ausgesetzt. Transmembranproteine enthalten «-Helices

Eine Polypeptidkette muss, um die Lipiddoppelschicht zu durchdringen oder zu durchspannen, hydrophobe Seitenkette besitzen, die mit den Lipidschwänzen in Kontakt treten und sie muss ihre polaren Rückgratgruppen abschirmen. Die zweite Bedingung wird durch Bildung einer Sekundärstruktur erreicht, die alle Möglichkeiten des Polypeptidrückgrats zur Bildung von Wasserstoffbrücken-

Membranproteine außen

Doppelschicht

©: ©:

291

innen

@ @

®:

Gal -ßB (1 —— 23 NeuNAc -&

3) - GalNAc - & - Ser/Thr ba

NeuNAc-a

bindungen berücksichtigt. Daher bestehen alle bekannten TM-Segmente von integralen Membranproteinen entweder aus a-Helices oder aus ß-Fässern. Die 19 Reste umfassende Transmembrandomäne von Glykophorin A bildet z.B. höchstwahrscheinlich eine a-Helix. Dass Glykophorin A eine einzelne Transmembranhelix besitzt, kann durch Berechnung der Änderung der Freien Enthalpie vorhergesagt werden, die mit der Überführung des a-helicalen Polypeptidsegments aus dem unpolaren Inneren einer Membran in Wasser einher geht (Abb. 9.21). Zudem können die hydrophoben Polypeptidsegmente anhand

eines Hydrophobizitätsindexes (wie in Tab. 6.3 aufgeführt) bestimmt werden. Methoden, mit denen sich die Position einer TM a-Helix vorhersagen lassen sind nützlich, da integrale Membranproteine schwer kristallisieren und daher

Abb. 9.20 Giykophorin A menschlicher Erythrocyten. Das Protein trägt 15 O-glykosidisch verknüpfte Oligosaccharide (grüne Quadrate) und eines, das N-glykosidisch an seine extrazelluläre Domäne gebunden ist (dunkelgrünes Sechseck). Die häufigste Sequenz der O-glykosidisch verbundenen Oligosaccharide ist im Kasten gezeigt (NeuNAc = N-AcetyIneuraminsäure). Der Transmembranteil des Proteins (braun und violett) besteht aus 19 aufeinander folgenden, vorwiegend hydrophoben Aminosäuren. Sein C-terminaler Teil, der an der

cytoplasmatischen Seite der Membran lokalisiert ist, ist reich an anionischen (rosa) und kationischen (blau) Resten. Es gibt zwei typische genetische Varianten von Glykophorin A: Glykophorin A” hat Ser und Gly an den Stellen 1 und 5, Glykophorin AN dagegen Leu und Glu. [Nach Marchesi, \.T., Semin. Hematol. 16, 8 (1979).]

relativ wenige Röntgenstrukturen bestimmt werden konnten. Lage der vorhergesagten

+200

Transmembran-

helix JaKWO)

a

VE

85 kJ : mol Ausschlusslinie —

-100

-200 (0) 20 40 60 80 100 120 Übergangs Enthalpie Freie mol-!) des (kJ Wasser zu erste Aminosäure eines 20 Reste langen Abschnittes

Abb. 9.21 Identifizierung der Transmembrandomäne von Glykophorin A. Die berechnete Änderung der Freien Enthalpie beim Übergang von 20 Aminosäuren langen a-helicalen Abschnitten aus dem Inneren einer Membran in Wasser ist gegen die Position der ersten Aminosäure des Abschnitts aufgetragen. Maxima von mehr als +85 kJ: mol’ weisen auf eine Transmembranhelix hin. [Nach Engelman, D.M., Steitz, T.A. und Goldman, A., Annu. Rev.

Biophys. Chem. 15, 343 (1986).]

Richard Henderson und die Struktur von Bacteriorhodopsin der Röntgenkristallographie auf die zweidimensionalen

Kris-

talle des Bacteriorhodopsins an. Dazu maß er die Brechungsintensitäten, die vom Elektronenstrahl eines Elektronenmikroskops erzeugt wurden, der auf einen Purpurmembran-

bereich auftrat (wie der Wellen-Teilchen-Dualismus darlegt, besitzen Elektronen genauso wie alle Teilchen \Wellenlängeneigenschaften. Die Wellenlänge % = h/mv, wobei h das Planck’sche Wirkungsquantum ist, m die Teilchenmasse und v die Geschwindigkeit). Es erwies sich als notwendig, anstatt eines Röntgenstrahls einen Elektronenstrahl zu verwen-

Richard Henderson (1945-)

den, weil nur das Elektronenmikroskop

Richard Henderson hat wie eine Reihe anderer Pioniere der Strukturbiologie seine Laufbahn als Physiker begonnen. Er richtete

seine Aufmerksamkeit

auf Membranproteine,

weil

sie bei Stoffwechsel-, Transport- und Signalprozessen von Bedeutung sind. Globuläre Proteine sind in wässrigen Lösungen löslich und lassen sich aus diesen in der Regel auskristallisieren. Im Gegensatz dazu aggregieren (verklumpen) integrale Membranproteine in wässriger Lösung; man kann sie nur in Gegenwart

eines geeigneten

Detergens

in Lösung

halten. Solche solubilisierten Proteine kristallisieren jedoch so gut wie nie in einer für die Röntgenanalyse geeigneten Weise. Als Henderson seine Untersuchungen begann, gab es niemanden, der diese Technik beherrschte. Um trotz dieser Einschränkungen die Struktur von Membranproteinen untersuchen zu können, adaptierte Henderson die Elektronenkristallographie für Makromoleküle und arbeitete mit dem Membranprotein Bacteriorhodopsin. Bacteriorhodopsin wurde 1967 entdeckt und kurze Zeit später als Protonenpumpe beschrieben. Das Protein wird von halophilen Archaea wie Halobacterium salinarum (früher H. halobium genannt) synthetisiert. Außer Bacteriorhodopsin gehören zu den archaealen Rhodopsinen auch Chloridionenpumpen und sensorische Proteine. Auch in Eubakterien und einzelligen Eukaryoten hat man ähnliche Proteine gefunden. Dass Bacteriorhodopsin für die Forschung attraktiv ist, hat mehrere Gründe: Es ist relativ klein (248 Aminosäuren), stabil und — was am wichtigsten ist - es hat die ungewöhnliche Neigung, geordnete zweidimensionale Anordnungen in der Bakterienzellmembran zu bilden. Bei H. salinarum bilden diese Anordnungen

bis zu 0,5 um

große

Bereiche

in der

Membran. Aufgrund ihrer Farbe, die durch das an das Protein gebundene Retinalmolekül zustande kommt, bezeichnet man

sie als Purpurmembranen.

Jede Purpurmembran,

Grunde ein zweidimensionaler

die im

Kristall ist, besteht zu 75%

aus Bacteriorhodopsin und zu 25% aus Lipid. Zu der Zeit, als Henderson

chungen

bei Bacteriorhodopsin

etwa einem

mit seinen

begann,

Strukturuntersu-

waren

erst von

Dutzend verschiedener globulärer Proteine die

Röntgenstrukturen veröffentlicht. Henderson, der mit Nigel Unwin zusammenarbeitete, wendete die Grundgedanken

Elektronen-

seinen

strahl auf die mikroskopisch kleine Purpurmembran fokussieren konnte. Dabei durften allerdings nur sehr geringe Elektronenstrahlintensitäten verwendet werden, weil andern-

falls die sich ergebende

Strahlenschädigung

die Purpur-

membran zerstört hätte. Um Beugungsmuster mit einem ausreichend hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu bekommen,

mussten folglich Beugungsmuster von etwa hundert oder mehr Purpurmembranproben gemittelt werden. Durch ihre Arbeit an den Grenzen der damals vorhandenen Technologie konnten Henderson und Unwin 1975 ein Strukturmodel für Bacteriorhodopsin mit niedriger Auflösung veröffentlichen. Dies war der erste Einblick in die Struktur eines integralen Membranproteins. Seine sieben Transmembranhelices waren deutlich als Säulen in der Elektronendichtekarte zu erkennen; sie standen

nahezu

senkrecht zur Membran-

ebene. Um solche dreidimensionale Beugungsdaten zu bekommen, muss ein zweidimensionaler Kristall systematisch im Elektronenstrahl gekippt werden. Mechanische Beschränkungen verhinderten, dass die Probe in dem für eine volle

dreidimensionale Datenreihe erforderlichen Maß gekippt werden konnte. Daneben gab es noch andere technische Schwierigkeiten, deshalb erhielten die beiden Forscher ein Modell,

das in der Membranebene

eine Auflösung

hatte, senkrecht dazu aber nur 1,4 nm.

von

In diesem

0,7 nm Modell

ließen sich die Polypeptidschleifen, welche die sieben Helices verbinden, nicht erkennen; genauso wenig waren das mit dem Protein verknüpfte Retinalmolekül oder irgendeine Aminosäure-Seitenkette zu sehen. Während der folgenden 15 Jahre ermöglichten es Henderson technische Fortschritte in der Elektronenmikroskopie - z.B. die Verwendung besserer Elektronenquellen und das Kühlen mit flüssigem Helium zur Verringerung der Strahlenschäden an der Probe - die Auflösung der Bacteriorhodopsinstruktur

auf 0,35

nm

in der

Schleifen sichtbar, welche die Transmembranhelices

verbin-

Membranebene und I nm senkrecht dazu zu verbessern. Die sich nun ergebende Elektronendichtekarte offenbarte klar die Positionen mehrerer voluminöser aromatischer Reste und des gebundenen Retinals. Zudem waren nun die den. Somit war die Elektronenkristallographie zu einem nützlichen Werkzeug geworden, um die Strukturen einer Vielzahl

Membranproteine von Proteinen zu bestimmen. Dies gilt sowohl für Proteine, die zweidimensionale Anordnungen bilden, als auch für solche, die sehr dünne dreidimensionale Kristalle bilden.

Hendersons bahnbrechende Arbeit über Bacteriorhodopsin leistete einen fruchtbaren Beitrag zu den zunehmenden biochemischen, genetischen, spektroskopischen und strukturellen Untersuchungen von Bacteriorhodopsin. Durch Kristallisieren des Proteins in einer Lipidmatrix hat man kürzlich hochaufgelöste Röntgenstrukturen von dreidimensionalen Bacteriorhodopsinkristallen erhalten. Zusammen mit Hendersons vorausgegangenen Arbeiten haben diese Struktur-

293

informationen zu einem detaillierten Verständnis des Mechanismus der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin geführt. Henderson, R., Unwin, P.N., Three-dimensional

model of purple

membrane obtained by electron microscopy, Nature 257, 28-32 (1975). Henderson, R., Baldwin, J.M., Ceska, T.A., Zemlin, F., Beckmann,

E., Downing, K.H., Model for the structure of bacteriorhodopsin based on

high-resolution electron cryo-microscopy. J. Mol. Biol. 213, 899-929

(1990).

Nigel Unwin und Richard Henderson nutzten Elektronenkristallographie (Exkurs 9.2), um die Struktur des integralen Membranproteins Bacteriorhodopsin zu bestimmen. Dieses aus 247 Aminosäuren bestehende homotrimere Protein, das aus dem halophilen (salzliebenden) Archaebakterium Halobacterium salinarum isoliert wurde (es wächst am besten in 4,3 M NaCl), ist eine lichtgetriebene Protonenpumpe: Es baut ein Protonenkonzentrationsgefälle auf, das die ATPSynthese durch einen Mechanismus antreibt, der in Abschnitt 18.3B diskutiert wird. Die lichtabsorbierende Gruppe des Proteins ist ein kovalent gebundenes Retinal (Abschnitt 9.1F). Den größten Teil des Bacteriorhodopsins bildet ein Bündel von sieben, etwa 25 Aminosäuren langen, a-helicalen Zylindern, die die Lipiddoppelschicht fast senkrecht zu deren Ebene durchspannen (Abb. 9.22). Wie erwartet sind die Aminosäurereste, welche in Kontakt mit den Lipidschwänzen stehen, stark hydrophob. Die einzelnen membrandurchspannenden Helices sind über hydrophile Schleifen verschiedener Länge in Kopf-anSchwanz-Ausrichtung verbunden. Diese Anordnung bringt die geladenen Reste des Proteins, die nahe an der Oberfläche der Membran liegen, in Kontakt mit der wässrigen Umgebung. Wie in Abschnitt 6.4A deutlich wurde, sind hydrophobe Interaktionen die vorherrschenden Kräfte, die die dreidimensionalen Strukturen wasserlöslicher, globulärer Proteine stabilisieren. Was stabilisiert jedoch die Strukturen der Transmembranregionen integraler Membranproteine, die in unpolare Umgebungen eingetaucht sind? Eine Analyse der Strukturen integraler Proteine zeigt, dass die Hydrophobizität ihrer innenliegenden Reste mit der von wasserlöslichen Proteinen vergleichbar ist. Jedoch sind die der Membran ausgesetzten Reste dieser Proteine im Durchschnitt noch hydrophober als ihre innenliegenden Reste. So ist der Unterschied zwischen integralen und wasserlöslichen Proteinen nur hauchdünn: Ihr Inneres ist gleich, aber die Polarität ihrer Oberflächen entspricht der Polarität ihrer Umgebung. Membranproteine enthalten membrandurchspannende ß-Fässer Ein Proteinbereich, der in das unpolare Innere einer Membran eintaucht, muss so gefaltet sein, dass die Ausbildung der Wasserstoffbrücken seines Polypeptidrückgrates nicht behindert wird. Eine a-Helix erfüllt diese Bedingung. Ebenso gilt dies bei einem antiparallelen ß-Faltblatt, das zu einem Zylinder zusammenrollt ist (ein ß-Fass; Abschnitt 6.2C). Membrandurchspannende ß-Fässer mit bekannter Struktur bestehen aus 8 bis 22 Strängen. Es muss immer eine geradzahlige Anzahl von Strängen vorliegen, damit sich eine durchgängig antiparallele, in sich geschlossene Faltblattstruktur ausbilden kann. Solche ß-Strukturen kommen in Porinen vor. Dies sind Proteine, die in den äußeren Membranen gramnegativer Bakterien einen Kanal bilden (Abschnitt 8.3B). Die äußere Membran schützt das Bakterium vor seiner Umgebung, während die Porine den Eintritt kleiner, polarer, gelöster Substanzen, zu denen auch

die wichtigsten Nahrungsstoffe zählen, ermöglichen. Porine kommen auch in Eukaryoten in der äußeren Membran von Mitochondrien und Chloroplasten

Abb. 9.22 Struktur von Bacteriorhodopsin. Das Protein ist in Bänderform gezeigt, von innerhalb der Membranebene aus gesehen. Es ist in der Reihenfolge der Spektralfarben angefärbt, beginnend beim N-Terminus (blau) bis hin zum C-Terminus (rot). Sein kovalent gebundenes Retinal ist in Kugel-Stab-Form (magenta) gezeigt. [Nach der Röntgenstruktur von Nikolaus Grigorieff und Richard Henderson,

MRC

Laboratory of

Molecular Biology, Cambridge. PDBid 2BRD.]

6% siehe Kinemage Exercises 8-1.

Abb. 9.23 Röntgenstruktur des E. coli OmpF-Porins. (a) Eine Bänderdarstellung des 16-strängigen Monomers. Es ist in der Reihenfolge der Spektralfarben angefärbt, beginnend beim N-Terminus (blau) bis hin zum C-Terminus (rot). (b) Das C,-Rückgrat des Trimers, aus einem Winkel von etwa 30° zu seiner dreifachen Symmetrieachse gesehen, der die Pore durch jede der Untereinheiten erkennen lässt. (c) Ein raumfüllendes Modell des Trimers, senkrecht zu seiner dreifachen Achse (vertikale grüne Linie) gesehen. N-Atome sind blau, O-Atome rot und C-Atome gelb, außer denen in den Seitenketten aromatischer Reste, die weiß sind. Die aromatischen Gruppen scheinen ein etwa 2,7 nm hohes hydrophobes Band zu begrenzen (Maßstab links), welches in den unpolaren Teil der äußeren bakteriellen Membran eintaucht (mit der Zellaußenseite in (a) und (c) jeweils oben). [Teil (a) nach einer Röntgenstruktur und (b) und (c) mit freundlicher Genehmigung von Tilman Schirmer und Johan Jansonius, Universität Basel. PDBid 1OPF.] 6% siehe Kinemage Exercises 8-3.

vor. Diese Entdeckung steht in Einklang mit der Theorie, dass diese Organellen von freilebenden Bakterien abstammen (Abschnitt 1.2C). Bakterielle Porine sind Monomere oder Trimere aus identischen 30 bis 50 kD großen Untereinheiten. Röntgenkristallographische Untersuchungen zeigen, dass jede Porinuntereinheit im Wesentlichen aus einem mindestens 16-strängigen, antiparallen ß-Fass besteht, das einen für das Lösungsmittel zugänglichen zentralen Kanal mit einer Länge von etwa 5,5 nm und einem Durchmesser von mindestens 0,7 nm bildet (Abb. 9.23). Wie erwartet sind die Seitenketten an den Oberflächen, an denen das Protein der Membran ausgesetzt ist, unpolar. Sie bilden ein etwa 2,7 nm hohes, hydrophobes Band, welches das Trimer umschließt (Abb. 9.23c). Dieses Band wird von polareren aromatischen Seitenketten (Tab. 6.3) flankiert, die Kontaktflächen für die Kopfgruppen der Lipiddoppelschicht darstellen (Abb. 9.23c). Dahingegen sind die Seitenketten an den Oberflächen, an denen das Protein dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, polar, einschließlich der Reste, die die Wände des wässrigen Kanals auskleiden. Mögliche Mechanismen,

die eine Selektion der gelösten Substanzen durch die Porine ermöglichen, werden in Abschnitt 10.2B diskutiert.

B.

Lipidgebundene Proteine

Einige membranassoziierte Proteine enthalten kovalent gebundene Lipide, über die das Protein in der Membran verankert wird. Über solche gebundenen Lipide können Wechselwirkungen zwischen zwei lipidmodifizierten Proteinen vermittelt werden. Des Weiteren kann die Lipidgruppe, wie jede andere modifizierte Gruppe, die Struktur und Aktivität eines Proteins beeinflussen. Lipidgebundene Proteine treten in drei verschiedenen Formen auf: als prenylierte Proteine, als fettsäureacylierte Proteine und als Proteine mit Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker. Ein einzelnes Protein kann mehr als eine kovalent gebundene Lipidgruppe tragen. Prenylierte Proteine haben kovalent gebundene Lipide, die aus Isopreneinheiten bestehen (Isopren ist eine C,-Verbindung, siehe Abschnitt 9.1F). Die häufigsten Isoprenoidgruppen sind die C];-Farnesyl- und C,,-Geranylgeranylreste:

CH, 5

CH,

CH

® wesen

Farnesylrest

CH

Hs:

or el

CH;

Geranylgeranylrest

OR

CH;

Membranproteine

Die häufigste Prenylierungsstelle in Proteinen ist das C-terminale Tetrapeptid C-X-X-Y, wobei C Cys entspricht und X oft eine aliphatische Aminosäure ist. Der Rest Y ist für die Art der Prenylierung verantwortlich: Proteine werden farnesyliert, wenn Y Ala, Met oder Ser ist, und geranylgeranyliert, wenn Yein Leu ist. In beiden Fällen ist die Prenylgruppe enzymatisch über eine Thioetherbindung an das Cystein-Schwefelatom gebunden. Das X-X-Y Tripeptid wird dann proteolytisch abgeschnitten und die exponierte Carboxylgruppe des neuen C-Terminus mit einer Methylgruppe verestert. So entsteht ein C-Terminus mit der Struktur:

Ss et

4

| CH>

| Protein 3

CH A MioOa

|

| (6)

Es gibt zwei Arten von Fettsäuren, die an Membranproteine gebunden sein können, Myristinsäure und Palmitinsäure. Myristinsäure, eine selten vorkommende, gesättigte C},-Fettsäure, wird über eine Amidbindung an die oAminogruppe des N-terminalen Glycinrestes an ein Protein angehängt. Die Myristoylierung ist stabil: Die Fettsäure-Acylgruppe bleibt an das Protein während dessen gesamter Lebenszeit gebunden. Myristoylierte Proteine sind in einer Reihe subzellulärer Kompartimente lokalisiert, einschließlich des Cytosols, des endoplasmatischen Reticulums, der Plasmamembran und des Zellkerns. Bei der Palmitoylierung wird die gesättigte C,;-Fettsäure Palmitinsäure über eine Thioesterbindung an einen spezifischen Cysteinrest gekoppelt. Palmitoylierte Proteine sind beinahe ausschließlich an der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran zu finden, wo sie an vielen Prozessen der transmembranen Signalübertragung beteiligt sind. Die Palmitoylgruppe kann durch PalmitoylThioesterase wieder entfernt werden. Dies deutet darauf hin, dass reversible Palmitoylierung die Assoziierung des Proteins mit der Plasmamembran reguliert und dadurch die Signalübertragung beeinflussen kann. Proteine mit Glykosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) kommen in allen Eukaryoten vor. Besonders reichlich sind sie jedoch in einigen parasitischen Protozoen verbreitet, die relativ wenige Transmembranproteine enthalten. Proteine mit GPI-Anker sind wie Glykoproteine und Glykolipide nur an der äußeren Oberfläche der Plasmamembran zu finden. Die Grundstruktur des GPI-Ankers ist ein Phosphatidylinositol (Tab. 9.2), das glykosidisch an ein lineares Tetrasaccharid gebunden ist, welches aus drei Mannoseresten und einem Glucosaminrest besteht (Abb. 9.24). Die Mannose am nicht reduzierenden Ende dieser Verbindung bildet eine Phosphodiesterbindung mit einem Phosphoethanolaminrest, der über eine Amidbindung an die Cterminale Carboxylgruppe des Proteins gekoppelt ist. Das zentrale Tetrasaccharid trägt meist eine Vielzahl von Zuckerresten, die je nach Protein variieren. Auch die Fettsäurereste der Phosphatidylinositolgruppe sind sehr vielfältig.

C. _ Periphere Membranproteine Periphere oder extrinsische Proteine können, anders als integrale Membranproteine oder lipidgebundene Proteine, von ihren Membranen durch relativ milde Verfahren abgetrennt werden, welche die Membran intakt lassen. Die Trennung kann z.B. mit Hilfe einer Salzlösung mit großer Ionenstärke oder eines Wechsels des pH-Werts erfolgen. Periphere Proteine enthalten keine Lipidbestand-

295

296

Lipide oO

Abb. 9.24 Die Grundstruktur der GPI-Anker von Proteinen. Rı und R, stehen für Fettsäurereste, die je nach Protein verschieden sind. Das Tetrasaccharid kann mit einer Vielzahl

I

Protein —C on

NH

| CH,

verschiedener Zuckerreste verknüpft sein, die ebenfalls variieren.

|

CH,

|

Phospho-

(0)

ethanolamin

| 20-2

0 |

zentrales Tetrasaccharid

0

& |

Man

al,2

al,6

— > Man ——>

al,4

Man ———

H

o -

Sn

o

|

meao-cH

a.1,6

HO

Di

H

f He=- 0 — CR,

I

H

0O—-P -0--CH

Or u

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Erklären Sie die Unterschiede zwischen integralen und peripheren Membranproteinen. 2. Welche zwei Typen von Sekundärstrukturen kommen in Transmembranproteinen vor? 3. Beschreiben Sie die kovalenten Modifizierungen von Proteinen durch Lipide.

| 0

OL A

a

a

5

Phosphatidylinositol

teile. Sind sie einmal gereinigt, verhalten sie sich wie wasserlösliche Proteine. So assoziieren sie ausschließlich durch elektrostatische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen mit Membranoberflächen — höchstwahrscheinlich mit integralen Proteinen. Cytochrom c (Abschnitte 5.4A, 6.2D und 18.2E) ist ein Beispiel für ein peripheres Membranprotein, das mit der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran assoziiert ist. Bei physiologischem pH-Wert ist Cytochrom c positiv geladen und kann mit negativ geladenen Phospholipiden, wie Phosphatidylserin und Phosphatidylglycerin in Wechselwirkung

treten.

4 6% siehe Guided Exploration 9: Membrane structure and the fluid mosaic model.

Membranstruktur und -aufbau

Früher nahm man an, die Membran bestünde aus einer Lipiddoppelschicht, die zwischen zwei Schichten ungefalteter Polypeptide eingebettet ist. Dieses Schichtenmodell, das schon aus thermodynamischen

Gründen unwahrscheinlich ist,

wurde durch elektronenmikroskopische Aufnahmen von Membranen und durch andere experimentelle Methoden widerlegt. Neuere Studien haben Einblicke in die Feinstruktur von Membranen, einschließlich ihrer überraschend hohen Heterogenität, gegeben. In diesem Abschnitt betrachten wir die Anordnung der Membranproteine und -lipide und untersuchen einige der Mechanismen, mit denen diese Komponenten sich innerhalb der Zelle bewegen.

A.

Das Flüssig-Mosaik-Modell

Die nachgewiesene Fluidität künstlicher Lipiddoppelschichten (Abschnitt 9.2B ) lässt vermuten, dass biologische Membranen ähnliche Eigenschaften besitzen. Dieser Gedanke wurde 1972 von S. Jonathan Singer und Garth Nicolson in ihrer allgemeinen Theorie zur Membranstruktur vorgeschlagen und ist als das Flüssig-MosaikModell (engl.: fluid mosaic model) bekannt. Bei diesem Modell stellt man sich die integralen Membranproteine als „Eisberge“ vor, die in einem zweidimensiona-

Membranstruktur und -aufbau

297

len Lipid-„Meer“ in einer zufälligen oder mosaikartigen Verteilung treiben (Abb. 9.25). Ein Schlüsselelement dieses Modells ist, dass integrale Proteine lateral in

der Lipidmatrix diffundieren können, es sei denn, dass ihre Bewegung durch die Assoziation mit anderen Zellbestandteilen beeinträchtigt wird. Dieses Modell einer beweglichen Membran konnte die früheren experimentellen Ergebnisse von Michael Edidin erklären, der Zellen aus Zellkulturen miteinander verschmelzen ließ und die Vermischung ihrer unterschiedlich markierten Zelloberflächenproteine beobachtete (Abb. 9.26). Die Diffusionsgeschwindigkeit von Proteinen in Membranen kann durch Fluoreszenzmessungen, genauer durch Bestimmung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach Bleichen [engl.: fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)], ermittelt werden. Ein Fluorophor (eine fluoreszierende Gruppe) wird in einer immobilisierten Zelle oder einem künstlichen Membransystem spezifisch an einen Membranbestandteil gebunden. Ein intensiver Laserpuls, der auf eine sehr kleine Fläche fokussiert ist (etwa 3 um?), zerstört (bleicht) an dieser Stelle den Fluorophor (Abb. 9.27). Die Geschwindigkeit, mit der die gebleichte Fläche ihre Fluoreszenz regeneriert (ein Vorgang, der im Fluoreszenzmikroskop verfolgt werden kann), steht für die Geschwindigkeit, mit der gebleichte (farblose) und ungebleichte (farbige) fluorophormarkierte Moleküle lateral in diesen und aus diesem gebleichten Bereich diffundieren. FRAP-Messungen zeigen, dass sich Membranproteine in ihren lateralen Diffusionsgeschwindigkeiten unterscheiden. Etwa 30 bis 90% dieser Proteine sind frei beweglich. Sie diffundieren mit Geschwindigkeiten, die nur etwa eine Größenordnung geringer ist als die von den viel kleineren Lipiden. Sie können die Strecke von 20 um - das entspricht der Länge einer eukaryotischen Zelle

- in einer Stunde diffundieren. Andere Proteine diffundieren langsamer und einige sind auf Grund submembranär gebundener Cytoskelettelemente quasi un:

beweglich.

Glykolipid

Abb. 9.25 De

Schematische Darstellung der er:

Die integralen Proteine (rot) sind in eine Doppelschicht eingebettet, die sich aus Phospholipiden (blaue Kopfgruppen verbunden mit beweglichen Schwänzen) und Cholesterin (gelb) zusammensetzt. Die Kohlenhydratteile (grüne und gelbe Kügelchen) der Glykoproteine und Glykolipide kommen nur auf der äußeren Seite der Membran vor.

integrales Protein

Oligosaccharid

€

aan» NELLE

Eu

®

»

1

%

‘

Phospholipid

Cholesterin

U

hydrophobe a-Helix

298

Lipide

Abb. 9.26 Verschmelzen von Zellen aus Mäusen und Menschen. Die Mikrophotographien (in den quadratischen Kästen) wurden mit Rot- oder Grünfiltern aufgenommen. [Immunfluoreszenz-Mikrophotographien mit freundlicher Genehmigung von Michael Edidin,

The Johns Hopkins University.]

Zelle (Mensch)

Zelle (Maus)

1. Die Zellober-

flächenproteine von Zellen aus Zellkulturen von Mäusen und Menschen werden

mit grün- und rotfloureszierenden Verbindungen markiert. Sendai-Virus

2. Die beiden Zelltypen wurden durch Behandlung

mit Sendai-Virus fusioniert, um eine Hybridzelle zu erhalten.

Fusion

3. Direkt nach dem Verschmelzen sind die Maus- und

Menschenproteine getrennt.

»40 min

Abb. 9.27 Die Technik der Fluoreszenzregenerierung nach Bleichen mit Licht. (a) Ein intensiver Laserpuls bleicht die fluoreszierenden Marker (grün) auf einer kleinen Fläche einer immobilisierten Zelle, die fluorophormarkierte Membranbestandteile hat. (b) Die Fluoreszenz des gebleichten Bereichs regeneriert sich, da die gebleichten Moleküle seitlich aus der Fläche herausdiffundieren und intakte fluoreszierende Moleküle hineindiffundieren. (c) Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzregenerierung hängt von der Diffusionsgeschwindigkeit der markierten Moleküle ab. (a)

4. Nach 40 min bei 37°C haben sich die grünen und roten Markierungen vollständig vermischt.

(€)

Ausbleichen

Regenerieren KT

Intensität der Fluoreszenz

Zeit

Membranstruktur und -aufbau

B.

Die Erythrocytenmembran

Bei Untersuchungen der Membranstruktur und -zusammensetzung werden oft Erythrocytenmembranen verwendet, da sie verhältnismäßig einfach gebaut, gut verfügbar und leicht zu präparieren sind. Ein ausgereifter Säugererythrocyt besitzt keine Organellen mehr und vollzieht nur wenige Stoffwechselprozesse — im Grunde genommen ist er ein mit Hämoglobin gefüllter Membransack. Erythrocytenmembranen können durch osmotische Iyse gewonnen werden, die bewirkt, dass der Zellinhalt heraustritt. Die so gewonnenen Membranen werden als Erythrocyten-Geister (engl.: ghosts) bezeichnet, da sie sich unter physiologischen Bedingungen wieder schließen und farblose Zellhüllen bilden, die ihre ursprüngliche Gestalt annehmen, aber frei von Cytoplasma sind. Die bikonkave diskusartige Form der Erythrocyten (Abb. 7.17a) gewährleistet die schnelle Diffusion von O, an die Hämoglobinmoleküle im Inneren des Erythrocyten, da keines weiter als 1 um von der Zelloberfläche entfernt ist. Allerdings nehmen „Wulst“ und „Delle“ eines Erythrocyten keine feste Position auf der Zellmembran ein. Das kann gezeigt werden, indem ein rotes Blutkörperchen mit einem kleinen Teil seiner Oberfläche auf einem Objektträger verankert und die Zelle veranlasst wird, sich lateral in einem schwachen Flüssigkeitsstrom fortzubewegen. Ein Punkt, der ursprünglich auf dem Wulst des Erythrocyten lag, wandert allmählich über die Delle weg zum gegenüberliegenden Wulst der Zelle hin. Offensichtlich rollt die Membran um die Zelle herum, während ihre Form erhalten bleibt, ähnlich der Kette eines Kettenfahrzeugs. Diese bemerkenswerte mechanische Eigenschaft der Erythrocytenmembran beruht auf dem Vorhandensein eines submembranen Netzwerks aus Proteinen, das als Membran-„Skelett“ wirkt. Das Fließvermögen und die Beweglichkeit, die sein Membranskelett einem Erythrocyten verleiht, haben entscheidende physiologische Konsequenzen. Eine Aufschlämmung fester Bestandteile von der Größe und Konzentration roter Blutkörperchen im Blut hat ungefähr die gleichen Fließeigenschaften wie Sand. Damit Blut überhaupt fließen kann, d.h. die roten Blutkörperchen sich durch die Blutkapillaren zwängen, obwohl die Kapillaren einen kleineren Durchmesser haben als die Erythrocyten, müssen die Erythrocytenmembranen mit ihrem Membranskelett Flüssigkeitscharakter haben und leicht zu verformen sein. Etwa 75% des Erythrocytenmembranskeletts besteht aus dem Protein Spectrin (von engl. spectre, Gespenst, weil es zuerst in Erythrocyten-Geistern entdeckt wurde). Es setzt sich aus zwei ähnlichen Polypeptidketten zusammen, der im SDS-Gel erscheinenden Bande 1 (a-Untereinheit, 280 kD) und der Bande 2 (ß-Untereinheit, 246 kD). Beide Untereinheiten bestehen aus sich wiederholenden, 106 Aminosäuren langen Segmenten, die sich wahrscheinlich in dreisträngige, a-helicale Superhelices falten (Abb. 9.28). Diese riesigen Polypeptide sind locker ineinander verflochten, so dass sie ein bewegliches, wurmförmiges aßDimer bilden, das ungefähr 100 nm lang ist. Zwei solcher Heterodimere lagern sich wiederum Kopf an Kopf zusammen und bilden ein (aß),-Tetramer. Spectrin ist ein Homolog von Dystrophin, dem Muskelprotein, das bei muskulärer Dystrophie defekt ist (Abschnitt 7.2A). Es gibt etwa 100.000 Spectrintetramere pro Erythrocyt. Sie sind an beiden Enden durch Bindung an andere Proteinen des Cytoskeletts quervernetzt. So entsteht ein dichtes und unregelmäßiges Maschenwerk aus Proteinen, das unter der Erythrocytenplasmamembran liegt (Abb. 9.29). Ein Defekt in der Spectrinsynthese oder ein Spectrinmangel führt zur erblichen Sphärocytose, bei der die Erythrocyten kugelig (sphäroide) und relativ zerbrechlich und starr sind. Individuen mit dieser Erkrankung leiden aufgrund der Lyse der Erythrocyten und weil die Milz sphärolytische Zellen entfernt (eine Funktion, die normalerweise dazu dient, gealterte und deswegen unflexible Erythrocyten am

299

300

Lipide

(a)

C-Terminus

R17

Helix B

Abb. 9.28

Struktur von Spectrin. (a) Struktur eines aß-Dimers. Beide antiparallelen Polypeptide enthalten sich mehrfach wiederholende 106 Aminosäuren lange Segmente, die wahr-

scheinlich tripelhelicale Bündel bilden, welche über

nicht helicale Abschnitte beweglich miteinander verbunden sind. Zwei solcher Heterodimere lagern sich Kopfan Kopf zusammen und bilden ein (aß)>Heterotetramer. [Nach Speicher, D.W. und Marchesi, V., Nature 311, 177 (1984).]

(b) Röntgenstruktur von zwei aufeinanderfolgenden Wiederholungen von a-Spectrin aus dem Gehirn von Hühnern. Jedes dieser 106 Aminosäuren langen Segmente besteht aus einem tripelhelicalen Bündel, in dem die C-terminale Helix des ersten

Wiederholungssegments (rot) über ein 5 Aminosäuren langes helicales Verbindungssegment (grün) mit der N-terminalen Helix des zweiten Wiederholungssegments (blau) verbunden ist. Die Helices innerhalb eines jeden tripelhelicalen Bündels wickeln sich ein einer leichten linksgängigen Superspirale umeinander. [Mit freundlicher Genehmigung von Alfonso Mondragön, Northwestern University. PDBid ICUN.]

Ende ihrer etwa 120-tägigen

Lebenszeit aus dem

Blut herauszufiltern)

an

Anämie. Spectrin assoziiert auch mit einem 1880 Aminosäuren umfassenden Mono-

mer, das als Ankyrin bekannt ist. Es assoziiert seinerseits mit einem Anionenkanalprotein. Durch diese Verknüpfungen ist das Membranskelett in der Membran verankert. Immunchemische Studien haben die Existenz von Spectrin- und Ankyrin-ähnlichen Proteinen in vielen Geweben nachgewiesen. Das 798-Aminosäuren-Segment am N-terminalen Ende von Ankyrin besteht fast ausschließlich aus 24 Tandemwiederholungen mit etwa 33 Resten, auch bekannt als Ankyrinwiederholungen (engl.: ankyrin repeats), die auch in vielen anderen Proteinen vorkommen (Abb. 9.30). Jede Ankyrinwiederholung besteht aus zwei kurzen (8 oder 9 Aminosäuren) antiparallelen a-Helices, gefolgt von einer langen Schlaufe. Diese Strukturen sind in einem rechtsgängigen helicalen Stapel angeordnet. In ihrer Gesamtheit bilden sie eine langgestreckte konkave Oberfläche, die vermutlich die Bindung von verschiedenen integralen Proteinen ermöglicht, Spectrin eingeschlossen. Die Wechselwirkung von Membrankomponenten mit dem darunter liegenden Gerüst erklärt, warum integrale Membranproteine eine unterschiedliche Mobilität innerhalb der Membran besitzen: Einige integrale Membranproteine sind fest an Elemente des Cytoskeletts gebunden oder sie sind in den Zwischenräumen gefangen, die durch diese „Zäune“ entstehen. Andere Membranproteine sind vielleicht in der Lage, sich durch Lücken oder „Tore“ zwischen den Bestandteilen des Cytoskeletts zu zwängen, wohingegen wieder andere Proteine frei diffundieren können, ohne mit dem Cytoskelett zu interagieren (Abb. 9.31). Gestützt wird dieses Tor-und-Zaun-Modell durch die Erkenntnis, dass eine teilweise Zerstörung des Cytoskeletts eine freiere Diffusion der Proteine zur Folge hat.

C. _ Asymmetrie der Lipide Die Lipid- und Proteinkomponenten von Membranen kommen auf den beiden Seiten biologischer Membranen nicht in den gleichen Verhältnissen vor. So sind z.B. Membranglykoproteine und -glykolipide stets so orientiert, dass ihre Kohlenhydratteile an der Zellaußenseite liegen. Die Verteilung bestimmter Lipide auf die innere und äußere Schicht einer Membran kann mit Hilfe von Phospholipasen ermittelt werden (Abschnitt 9.1C). Phospholipasen können Membranen nicht durchqueren, so dass nur die Phospholipide der äußeren Oberflächen intakter Zellen für die Hydrolyse durch diese Enzyme zugänglich sind. Solche Untersuchungen haben gezeigt, dass die meisten Lipide asymmetrisch in biologischen Membranen verteilt sind (z.B. Abb. 9.32). Wie entsteht diese Asymmetrie? In Eukaryoten sind die Enzyme der Membranlipidbiosynthese meistens integ-

rale Membranproteine des endoplasmatischen Reticulums (ER, die ausgedehnten, miteinander verbundenen Membranvesikel, die einen großen Teil des Cytosols ausmachen; Abb. 1.8). In Prokaryoten werden Lipide in der Zellmembran synthetisiert, d.h. die Membranlipide werden vor Ort hergestellt. Eugene Kennedy und James Rothman konnten durch selektive Markierung beweisen, dass dieses in Bakterien der Fall ist. Sie gaben wachsenden Bakterien einen einminü-

tigen ”°PO2 -Puls, um nur die Phosphatgruppen der neu synthetisierten Phos-

Membranstruktur und -aufbau

301

Abb. 9.29 Das Membranskelett menschlicher Erythrocyten. (a) Ein elektronenmikroskopisches Bild des Membranskeletts eines Erythrocyten, das zu einer Fläche gedehnt wurde, die neun- bis zehnmal gröfßser ist als die der nativen

Membran. Das Dehnen ermöglichte klare Aufnahmen des Membranskeletts. Dieses ist im nativen Zustand so dicht gepackt und unregelmäßig gewunden, dass es schwer ist, einzelne Moleküle darzustellen und herauszufinden, wie sie miteinander verbunden

sind. Bemerkenswert ist das vorwiegend hexagonale Netzwerk, das aus Spectrintetrameren besteht, die über Verzweigungen vernetzt sind, die Aktin und Bande 4.1-Protein

enthalten. [Mit freundlicher Genehmigung von T.). Byers und D. Branton, Visualization of the protein associations in the erythrocyte membrane skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6153-6157 (1985).] (b) Ein Modell des Erythrocytenmembranskeletts. Der sogenannte verzweigte Komplex, der in dieser Zeichnung vergrößert dargestellt ist, enthält Aktin, Tropomyosin (Abschnitt 7.2) und Bande 4.1-Protein sowie andere Proteine. [Nach Goodman, S.R., Krebs, K.E., Whitfield, C. F., Riederer, B.M. und Zagen, |.S., CRC

Crit. Rev. Biochem. 23, 196 (1988).]

(a)

Aktin Tropomyosin

Bande 4.1

Ankyrin Bande 4.2

z

Anionenkanal

@lykophorin A

pholipide radioaktiv zu markieren. Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), eine Substanz, die die Membran nicht passieren kann und sich mit Phosphatidylethanolamin (PE; Abb. 9.33) verbindet, wurde gleich im Anschluss der Zellsuspension zugegeben. Die Analyse der daraus entstandenen, doppelt markierten Membranen zeigte, dass keines der TNBS-markierten PE radioaktiv markiert war. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass neu gebildetes PE an der cytoplasmatischen Seite der Membran synthetisiert wird (Abb. 9.34, oben rechts). Lässt man jedoch drei Minuten zwischen dem PO, -Puls und der Zugabe von TNBS

vergehen,

so ist etwa die Hälfte des ”P-markierten

PE auch mit

TNBS markiert (Abb. 9.34, unten rechts). Diese Beobachtung zeigt, dass die Flip-Flop-Geschwindigkeit von PE in der Bakterienmembran etwa 100.000fach größer ist als in Doppelschichten, die nur aus Phospholipiden bestehen (wo die Flip-Flop-Prozesse Halbwertszeiten von vielen Tagen haben). Wie gelangen die Phospholipide, die auf der einen Seite der Membran synthe-

Abb. 9.30 Röntgenstruktur der humanen Ankyrinwiederholungen 13 bis 24. Die einzelnen Wiederholungen sind in der Reihen-

tisiert werden, so schnell auf die andere Seite? Der Flip-Flop von Phospholipiden

University of Texas Southwestern Medical Center,

scheint über zwei Wege verwirklicht zu werden:

folge den speliraltansen darsestchh Wiederholung 13 ist rot und Wiederholung 24 ist violett. [Mit freundlicher Genehmigung von Peter Michaely,

Dallas. PDBid IN11.]

302

Lipide Lipiddoppelschicht

Abb. 9.31

Ein Modell, das die unterschiedliche

Beweglichkeit der Membranproteine verdeutlicht. 40

50

Protein A, welches in enger Beziehung mit dem

skelett wandert. Die Diffusion einiger Membranproteine wird nicht durch das Cytoskelett

10

[0]

30

20

40

50

Anteil am Gesamt-Phospholipid in mol %

darunter liegenden Cytoskelett steht, ist unbeweglich. Protein B kann sich innerhalb der Grenzen des „Zauns“ (in einem Feld) frei drehen. Protein C diffundiert, indem es durch die „Tore“ im Cyto-

10

20

30

Abb. 9.32 Asymmetrische Verteilung der Membranphospholipide in der menschlichen Erythrocytenmembran. Der Phospholipidgehalt ist in mol % ausgedrückt. [Nach Rothman, J.E. und Lenard, J., Science 194, 1744 (1977).

beeinflusst. [Nach Edidin, M., Trends in Cell Biol. 2,

378 (1992).]

? ?

Ci ee O—

Rome Case: O— m

&—

NO, R,

in

CH0

r

oe

aa NH;

O;N

NO,

o-

Ss03

Phosphatidylethanolamin (PE)

Trinitrobenzolsulfon-

j

säure (TNBS) H,SO; NO,

N 2

CHs, a

GO

R5==&-0_CH

CO

Abb. 9.33

G Dar: R}

7

ee O0 o-

OsN

CH,

NO,

CHR NH

Die Reaktion von TNBS mit Phosphatidylethanolamin.

1. Membranen enthalten Proteine, die Flippasen genannt werden und den FlipFlop bestimmter Phospholipide katalysieren. Diese Proteine bewirken, dass die Verteilung der von ihnen gebundenen Phospholipide über die Doppelschicht ausgeglichen wird, d.h. es werden Phospholipide von der Seite der Doppelschicht mit der höheren Konzentration des Phospholipids zur gegenüberliegenden Seite transportiert. Solch ein Vorgang ist, wie wir in Abschnitt 10.1 sehen werden, eine Form der erleichterten Diffusion. 2. Membranen enthalten Proteine, die als Phospholipid-Translokasen bezeichnet werden und bestimmte Phospholipide mittels eines ATP-getriebenen Prozesses durch die Doppelschicht transportieren. Diese Proteine können bestimmte Phospholipide von der Seite der Doppelschicht mit der niedrigeren Konzentration des Phospholipids, zur gegenüberliegenden Seite trans-

Membranstruktur und -aufbau

LLZ,

LTZ,

SW

Wa. =

303

FE

u

En SD Inkubation a, SS S 7 ASS I. radioaktivem AR Sy ea

Lt&j\ IS

Ahganhat

Gr&RIS

er

kabel mit

| 3 min

SUR PRTD

TERN

Inkubation

mit TNBS

portieren und bauen dabei eine Phospholipidverteilung entgegen des Gleichgewichts auf. Solch ein Vorgang ist, wie in Abschnitt 10.3 besprochen wird, eine Form des aktiven Transports. Die beobachtete Verteilung der Phospholipide über die Membran (z. B. Abb. 9.32) ergibt sich offensichtlich aus der Orientierung der Enzyme, welche die Phospholipide synthetisieren. Hinzu kommen die gegenläufigen Tendenzen der beiden Phospholipid-Transportproteine: Die ATP-abhängigen Phospholipid-Translokasen bewirken eine asymmetrische Verteilung der Phospholipide, welche die Flippasen im Gegenzug wieder ausgleichen. Wie wichtig diese Lipidtransportsysteme sind, macht die Beobachtung deutlich, dass die Anwesenheit von Phosphatidylserin an den Außenseiten vieler Zellen die Blutgerinnung auslöst (d.h. es ist ein Zeichen für Gewebeschädigung). Bei Erythrocyten markiert es die Zellen, die aus dem Blut entfernt werden sollen. In allen Zellen werden neue Membranen durch Erweiterung der bestehenden Membranen gebildet. In eukaryotischen Zellen werden Lipide, die an der cytoplasmatischen Seite des ER synthetisiert wurden, durch Vesikel zu anderen Teilen der Zelle transportiert. Diese Vesikel werden vom ER abgeschnürt und verschmelzen mit anderen zellulären Membranen. Auf diesem Wege werden auch Membranproteine transportiert. Lipidflöße sind Membransubdomänen Lipide und Proteine in Membranen können je nach Lage auf der Zelloberfläche verschieden angeordnet sein. Die Plasmamembranen vieler Eukaryotenzellen besitzen zwei oder mehr charakteristische Domänen, die unterschiedliche Funktionen haben.

So hat beispielsweise

die Plasmamembran

von

Epithelzellen

(Zellen,

die Körperhöhlen auskleiden und freie Oberflächen bedecken) eine apikale Domäne und eine basolaterale Domäne. Die apikale Domäne zeigt zum Lumen (Innern) des Hohlraums und hat häufig eine spezielle Aufgabe (z.B. die Nährstoffresorption in den Bürstensaumzellen des Darms). Die basolaterale Domäne bedeckt die übrige Zelloberfläche. Diese beiden Domänen mischen sich nicht, und sie sind aus unterschiedlichen Lipiden und Proteinen aufgebaut.

Abb. 9.34 Die Lokalisierung der Lipidsynthese in einer Bakterienmembran. Neu synthetisiertes PE wurde durch einen einminütigen ””PO; -Puls markiert (orange Kopfgruppen). Das PE an der Zelloberfläche wurde unabhängig davon durch eine Behandlung mit TNBS markiert, einer Verbindung, welche die

Membran nicht durchqueren kann. Wurde die TNBS-Markierung (purpurne Kreise) direkt

nach dem °”P-Puls durchgeführt, war keines der ?2P.markierten PE auch mit TNBS markiert (oben rechts). Dies zeigt, dass das PE an der cytoplasmatischen Seite der Membran gebildet wird. Lagen jedoch nur wenige Minuten zwischen den beiden Markierungsvorgängen, war ein großer Teil des TNBS-markierten PE in der Außenseite der Membran auch °”P-markiert (unten rechts).

304

Lipide

Weiterhin existieren auf einer Zelle Hunderte verschiedener Lipide und Proteine, die innerhalb einer bestimmten Plasmamembrandomäne nicht homogen verteilt sind. Sie bilden oft definierte Bereiche, sogenannte Mikrodomänen, in denen bestimmte Lipide und Proteine angereichert sind. Verantwortlich hierfür können spezifische Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen und bestimmten Membranlipidtypen sein. Zweiwertige Metallionen, insbesondere Ca?*, verursachen unter Umständen die Gruppierung dieser Lipide. Diese Ionen binden an negativ geladene Kopfgruppen von Lipiden wie z.B. an die von Phosphatidylserin. Ein Mikrodomänentyp, die Lipidflöße (engl.: lipid rafts), scheinen aus dicht gepackten Glykosphingolipiden (die nur in der äußeren Lage der Plasmamembran vorkommen) und Cholesterin zu bestehen. Von sich aus können Glykosphingolipide keine Doppelschicht bilden, weil ihre voluminösen Kopfgruppen keine dazu notwendige dichte Packung ihrer vorwiegend gesättigten hydrophoben Schwänze erlauben. Umgekehrt bildet Cholesterin aufgrund seiner sehr kleinen Kopfgruppe allein keine Doppelschicht aus. Man nimmt daher an, dass die Glykosphingolipide in Lipidflößen über schwache Wechselwirkungen zwischen ihren Kohlehydratköpfen zusammengehalten werden, und dass die Lücken zwischen ihren Schwänzen durch Cholesterin ausgefüllt werden. Wegen der dichten Packung ihrer Lipidbestandteile und der langen, gesättigten Sphingolipidschwänze zeigen Sphingolipid-Cholesterin-Flöße eine beinahe kristalline, sehr viel stärker geordnete Struktur als andere Membranbereiche. Sie sind dadurch auch widerstandsfähiger gegenüber der Solubilisierung durch Detergentien. Die Flöße können innerhalb der Membran seitwärts diffundieren. Bestimmte Proteine reichern sich bevorzugt in den Flößen an; dazu zählen viele GPI-verknüpfte Proteine und einige der Proteine, die an der Signalübertragung durch die Membran beteiligt sind (Kap. 13). Dies lässt vermuten, dass Lipidflöße, die wahrscheinlich in allen Zelltypen vorkommen, als Ankerpunkte für den Aufbau komplexer intrazellulärer Signalsysteme fungieren. Mehrere Viren wie z.B. Grippeviren, das Masern-, Ebola- und HI-Virus binden die Zellmembran bevorzugt an Lipidflößen oder binden an Proteine, die in Lipidflößen angereichert sind. Daher wird vermutet, dass Viren vor allem über Lipidfloßdomänen in nicht infizierte Zellen gelangen und sich in infizierten Zellen auch in diesen Bereichen abknospen. Allerdings muss angemerkt werden, dass Lipidflöße hoch dynamische Strukturen sind, die mit ihrer umgebenden Membran rasch sowohl Proteine als auch Lipide austauschen. Der Grund dafür liegt in den schwachen und daher kurzlebigen Wechselwirkungen zwischen den Membranbestandteilen. Caveolen (vom lat.: cava, Höhle) sind kolbenförmige Einstülpungen der Plasmamembran mit einem Durchmesser von etwa 75 nm. Es handelt sich um spezialisierte Formen von Lipidflößen, die mit rund 21-kD großen integralen Membranproteinen namens Caveoline verknüpft sind. Caveolen kommen hauptsächlich auf Muskel- und Epithelzellen vor. Sie sind an der Endocytose (Internalisierung von rezeptorgebundenen Liganden; Abschnitt 20.1B) und an der Signalübermittlung zwischen Zellen beteiligt.

D.

Der Sekretionsweg

Im Gegensatz zu Membranlipiden ändern Membranproteine ihre Orientierung in der Membran nicht mehr, nachdem sie einmal synthetisiert wurden. Membranproteine werden wie alle anderen Proteine an den Ribosomen mittels einer Messenger-RNA-Vorlage synthetisiert (die Translation wird in Kap. 27 behandelt). Die Polypeptidkette wächst von ihrem N-Terminus in Richtung ihres C-Terminus, indem schrittweise Aminosäuren angefügt werden. Translatierende Ribosomen können frei im Cytosol vorkommen oder an das ER gebunden sein und bilden dann das raue endoplasmatische Reticulum (rER, so bezeichnet, weil

Membranstruktur und -aufbau

305

die gebundenen Ribosomen ihm ein knotiges Aussehen verleihen; Abb. 1.8). Die freien Ribosomen synthetisieren hauptsächlich lösliche und mitochondriale Proteine, die membrangebundenen Ribosomen fertigen hingegen Transmembranproteine sowie Proteine, die für die Sekretion, die Verwendung im ER und zum Einlagern in Lysosomen vorgesehen sind (Abb. 1.8; Lysosomen sind Membranvesikel, die eine ganze Reihe hydrolytischer Enzyme enthalten; diese Enzyme bauen Zellbestandteile ab und recyceln sie). Die letztgenannten Proteine erscheinen zunächst im ER. Ein großer Teil der neu synthetisierten Proteine gelangt zunächst in das ER Woher weiß die Zelle, welche Proteine für das rER bestimmt sind? Und wie gelangen diese großen, relativ polaren Moleküle durch die ER-Membran? Diese Vorgänge spielen sich über den Sekretionsweg ab, den Günter Blobel, Cesar Milstein und David Sabatini um 1975 erstmals beschrieben haben. Rund 25% der verschiedenen Proteintypen, die von Zellen synthetisiert werden, sind integrale Membranproteine, und viele weitere Proteine werden sezerniert. Daher müssen etwa 40% der verschiedenen Proteintypen, die eine Zelle synthetisiert, den Sekretionsweg oder einen vergleichbaren Proteintransportweg durchlaufen. Im Folgenden wird der Sekretionsweg dargestellt, der in Abbildung 9.35 skizziert ist: 1. Alle sezernierten, ER- und lysosomalen Proteine sowie zahlreiche Transmembranproteine werden mit N-terminalen, 13 bis 36 Aminosäuren langen, Signalpeptiden synthetisiert. Diese Signalpeptide bestehen aus einer zwischen 6 und 15 Aminosäuren langen hydrophoben Kernsequenz, die von einigen hydrophilen Aminosäureresten flankiert wird. Zu diesen hydrophilen Resten gehört gewöhnlich mindestens eine basische Aminosäure in der Nähe des NTerminus (Abb. 9.36). Ansonsten haben die Signalpeptide wenig Sequenzähnlichkeit. Vieles deutet jedoch darauf hin, dass sie alle in unpolaren Umgebungen a-Helices ausbilden. 2. Das Signalpeptid ragt erst aus der Ribosomenoberfläche heraus, wenn etwa 40 Aminosäuren sythetisiert wurden. Zu diesem Zeitpunkt bindet das Signalerkennungspartikel (SRP, von engl.: signal recognition particle), ein 325-kDKomplex aus sechs verschiedenen Polypeptiden und einem 300 Nucleotide

Abb. 9.35 Ribosomale Synthese, Einbau in die Membran und anfängliche Glykosylierung eines integralen Proteins auf dem Sekretionsweg. Die Einzelheiten sind im Text beschrieben. 6% siehe Animated Figures.

Lumen %*

. \: Br

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z

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die Haut, so entspannen sich die kleinen Muskeln, die Falten

verursachen; infolgedessen etwa drei Monate.

nähert, dann ziehen sich die

©

verschwinden

diese Falten für

das SNARE-

1 Andock-Mechanismus: Wenn sich ca09999o das Vesikel seiner Zielmembran ©

1 ah! of

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die ihr Substrat,

Protein, an einer bestimmten Stelle schneidet (siehe Abb. 9.44). Die Spaltung von SNARE verhindert, dass sich der Fusionskomplex bildet und bringt dadurch die Exocytose der synaptischen Vesikel zum Erliegen. Die schwere Kette von TeTx bindet spezifisch an inhibitorische Neuronen. Der damit einher gehende Kontrollverlust der Nervenimpulsstärke ist für die spastische Lähmung verantwortlich, die für Tetanus typisch ist. Die schweren Ketten der BoNTs binden stattdessen an Motoneuronen (die Muskeln innervieren) und verursachen somit die schlaffe Lähmung, die für Botulismus charakteristisch ist. Die Verabreichung einer genau dosierten Menge Botulinustoxin („Botox“) ist zur Linderung bestimmter chronischer Muskelkrämpfe von medizinischem Nutzen. Zudem wird dieses Nervengift kosmetisch eingesetzt: Injiziert man es in

&

2 Hemifusion: Während der Andockvorgang fortschreitet, verursacht die zunehmende Krümmung

und seitliche Spannung, ”

&

%o

[e)

dass die Schichten der Doppelschicht fusionieren.

SNARES von ihren N-Termini

-

aus zusammen, wodurch die

©

Dabei kommen die inneren

beiden Membranen zuein-

°

Schichten der Membran miteinander in Kontakt.

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® 3 Die beiden Schichten der Doppelmembran,

ursprünglich am weitesten voneinander entfernt waren, » fusionieren nun undbilen > eine neue Doppelschicht.. EEG

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5 Die Fusionspore weitet sich aus,

wenn sich die jetzt fusionierte Membran entspannt.

Abb. 9.45

4 Bildung der Fusionspore: Die andauernde, durch die SNARE ausgelöste laterale Spannung führt zum Aufreißen der Membran und zur Bildung einer Fusionspore.

Modell zur SNARE-vermittelten Vesikelfusion.

Hier sind R-SNARE und Q-SNARE durch rote und blaue Schlangen schematisch dargestellt

[Nach einer Zeichnung von Chen, Y.A. und Scheller, R.H.;

Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 98 (2001).]

9-=0

316

Lipide

seinen infektiösen Inhalt, die Nucleinsäure, im Cytoplasma der Zelle absetzen. Solche viralen Membranfusionen laufen ebenfalls proteinvermittelt ab, die Mechanismen unterscheiden sich aber von denen der gerade beschriebenen Vesikelfusion. Am Beispiel des Grippevirus soll nun gezeigt werden, wie die virale Membranfusion vermittelt wird (andere membranumhüllte Viren verwenden ähnliche Systeme). Diese Membranfusion verläuft in drei Phasen: 1. Das Virus erkennt die Wirtszelle. 2. Die virale Maschinerie zur Membranfusion wird aktiviert. 3. Die virale Membran fusioniert.mit der Wirtszellmembran, sodass das virale Genom ins Cytoplasma der Wirtzelle freigesetzt wird. Das wichtigste integrale Protein der Membran, die das Grippevirus umhüllt, heißt Hämagglutinin (HA); die Bezeichnung stammt daher, dass das Protein Erythrocyten zum Verklumpen (Agglutination) bringt. HA ist ein so genanntes virales Fusionsprotein, das über die Bindung an spezifische Glykoproteine der Zelloberfläche eine Infektion der Wirtszelle durch das Virus vermittelt. Diese Glykoproteine (Glykophorin A in Erythrocyten; Abschnitt 9.3A) haben an ihren Kohlenhydratgruppen endständige N-Acetylneuraminsäurereste (Sialinsäure; Abb. 8.6). HA wird als Homotrimer mit Untereinheiten aus 550 Amino-

säuren synthetisiert, die jeweils über eine einzelne Transmembranhelix in der Membran verankert sind (Aminosäurereste 524-540). Arginin 329 von HA wird jedoch nach der Translation von Proteasen der Wirtszelle ausgeschnitten.

Abb. 9.46 Röntgenstruktur des InfluenzaHämagglutinins. (a) Bänderdiagramm des BHA-Monomers. HAI ist grün, HA2 türkis. (b) Bänderdiagramm des BHA-Trimers. Jede HAl- und HA2-Kette ist in einer anderen Farbe dargestellt. Die Ausrichtung der grünen HAI- und der türkisfarbenen HA2-Kette ist die gleiche wie in Teil a. [Nach einer Röntgenstruktur von John Skehel, National Institute for Medical Research, London und Don Wiley, Harvard University. PDBid AHMG]

Membranstruktur und -aufbau

Es entstehen so zwei Peptide, HAl1 und HA2, die über eine Disulfidbrücke verbunden bleiben. Nachdem ein Virus an die Plasmamembran seiner Wirtszelle gebunden hat, wird es durch Einstülpen der Membran in die Zelle aufgenommen. Diesen Vorgang nennt man rezeptorvermittelte Endocytose (Abschnitt 20.1B); er ähnelt oberflächlich betrachtet der umgekehrten Fusion eines Vesikels mit einer Membran (Abb. 9.40). Das dabei entstehende intrazelluläre Vesikel, das an seiner

317

Rezeptorbindungsstellen

Innenfläche das Virus gebunden hat, fusioniert mit einem Vesikel, einem so

genannten Endosom. Das Endosom hat im Innern einen pH-Wert von etwa 5. Der Abfall im pH-Wert löst eine Konformationsänderung im HA aus, bei der sich das N-terminale Ende von HA2 in die Endosomenmembran der Wirtszelle einbaut. HA2, ein hydrophobes, aus etwa 24 Aminosäuren bestehendes Peptid, wird auch als Fusionspeptid bezeichnet. Durch die Membraninsertion des Fusionspeptids wird die Endosomenmembran fest mit der Virusmembran verbunden und auf die Fusion vorbereitet. Unser Wissen darüber, wie HA die Fusion der viralen und der Wirtszellmembran vermittelt, basiert größtenteils auf Röntgenstrukturuntersuchungen von Don Wiley und John Skehel. Der hydrophobe Membrananker von HA beeinträchtigt seine Kristallisation. Entfernt man jedoch proteolytisch die Transmembranhelix von HA, so erhält man ein kristallisierbares Protein namens BHA. Dessen Röntgenstruktur zeigt einen globulären Bereich, der auf einem langen faserigen Stiel sitzt und aus der Oberfläche der Virusmembran ragt (Abb. 9.46a). Der globuläre Bereich enthält die Sialinsäure-Bindungstasche, wohingegen der faserige Stiel eine ungewöhnliche, 7,6 nm lange Helix (mit 53 Aminosäuren und 14 Windungen) umfasst. Die alles bestimmende Wechselwirkung, die die trimere Struktur von BHA stabilisiert, ist eine dreisträngige Superspirale aus den langen a-Helices jedes ihrer Monomere (Abb. 9.46b). Seltsamerweise sind die Fusionspeptide von BHA in seinem hydrophoben Innern verborgen, etwa 10 nm entfernt von den Sialinsäure-Bindungsstellen (diese liegen im Bild oben auf dem Protein). Im Endosom erfährt HA eine drastische Konformationsänderung (Abb. 9.47), die mithilfe der Röntgenstruktur eines Teils von BHA, TBHA2 genannt, aufgeklärt wurde. TBHA2 besteht aus der langen Helix von BHA und einigen ihrer flankierenden Bereiche. Bei dieser Konformationsänderung bewegen sich Segment A und B am N-Terminus von TBHA2 (die roten und orangefarbenen Segmente in Abb. 9.47) wie ein Klappmesser. Die Bewegung beträgt rund 10 nm, dabei dehnt sich der obere Teil der langen Helix um etwa 10 Helixwindungen in Richtung Endosomenmembran. Dadurch wird das Fusionspeptid um mindestens 10 nm über seine Position im BHA-Protein verschoben. Bei TBHA2 fehlt das Fusionspeptid, das sich aber über den N-Terminus an der Spitze von Segment A hinaus erstrecken würde. Das ermöglicht es dem Protein, in die Wirtsmembran einzutauchen. Gleichzeitig verkürzt sich die lange Helix an der Unterseite durch analoge Verschiebungen der Segmente D und E (grün und blau in Abb. 9.47). Diese Konformationsänderungen spielen sich gleichzeitig in mehreren benachbarten HA-Molekülen in der Virusmembran ab. Sie ziehen die Viren- und die Wirtsmembran zusammen, sodass deren Fusion ähnlich wie bei den SNARE-Komplexen erleichtert wird.

Abb. 9.47 Schematischer Vergleich der Strukturen von BHA und TBHA2. Diese Zeichnung zeigt die Lage und Höhe der verschiedenen Strukturelemente von TBHA2 auf der viralen Membranoberfläche, einmal im

HA-Trimer (links) und zum anderen in seiner Form bei niedrigem pH-Wert (rechts). In der Form bei niedrigem pH-Wert ragt das Fusionspeptid deutlich über die Rezeptorbindungsköpfe hinaus, wo es sich vermutlich selbst in die Endosomenmembran einbauen kann.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Beschreiben Sie das FlüssigMosaik-Modell. 2. Erklären Sie, wie das Membranskelett die Verteilung der Membranproteine beeinflusst. 3. Welche Funktionen haben Flippasen und Phospholipidtranslokasen? 4. Beschreiben Sie die Struktur eines Lipidfloßes. 5. Zählen Sie die Schritte des Sekretionsweges auf, einschließlich der Funktion des Translokationskomplexes. 6. Beschreiben Sie wie ein Membranprotein, ein sezerniertes Protein und ein lysosomales Protein vom rER zu ihrem

endgültigen Bestimmungsort transportiert werden. 7. Beschreiben Sie, wie SNAREs und virale Fusionsproteine wie das Hämagglutinin spezifische Membranen nahe aneinander bringen und ihre Fusion auslösen.

318

Lipide

Zusammenfassung ZUSAMMEN 2.

u,

Er BE

1° Lipide sind eine Gruppe strukturell vielfältiger Moleküle, die in organischen

Lösungsmitteln löslich sind und im Gegensatz zu anderen wichtigen Gruppen biologischer Moleküle keine Polymere bilden. Fettsäuren sind Carbonsäuren, deren Kettenlänge und Anzahl ungesättigter Bindungen variiert. Fettzellen (Adipocyten) und andere Zellen enthalten Vorräte an Triacylglycerinen — Glycerinderivate, die mit drei Fettsäuren verestert sind. Glycerophospholipide sind amphipathische Moleküle, die zwei Fettsäureketten und eine polare Kopfgruppe enthalten. Die Sphingolipide umfassen Sphingomyeline, Cerebroside und Ganglioside. Cholesterin, Steroidhormone und Vitamin D basieren auf einer Vier-Ringe-

Struktur.

10.

kl,

112, 15%

14.

15.

16.

Die Arachidonsäurederivate Prostaglandine, Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene sind Signalmoleküle, denen unterschiedliche physiologische Aufgaben zukommen. Glycerophospholipide und Sphingolipide bilden Doppelschichten, in denen ihre unpolaren Schwänze miteinander assoziieren und ihre polaren Kopfgruppen der wässrigen Umgebung ausgesetzt sind. Die Transversaldiffusion eines Lipids durch eine Doppelschicht ist sehr langsam, innerhalb einer Lage einer Doppelschicht diffundieren Lipide dagegen schnell. Die Fluidität der Doppelschicht ändert sich mit der Temperatur, der Kettenlänge und dem Sättigungsgrad ihrer Fettsäurebestandteile. Zu den Proteinen biologischer Membranen gehören integrale (intrinsische) Proteine, die eine oder mehrere Transmembran-o-Helices oder ein ß-Fass enthalten. In allen Fällen ist die der Membran ausgesetzte Seite des Proteins hydrophob. Andere membranassoziierte Proteine können über Isoprenoid-, Fettsäureoder Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Gruppen in der Membran verankert sein. Periphere (extrinsische) Proteine sind locker mit der Membranoberfläche verbunden. Das Flüssig-Mosaik-Modell der Membranstruktur erklärt die laterale Diffusion von Membranproteinen und Lipiden. Die Anordnung der Membranproteine kann von ihrer Wechselwirkung mit dem darunter liegenden Proteinskelett abhängig sein wie z.B. in roten Blutkörperchen. Membranproteine und -lipide sind in den beiden Schichten asymmetrisch verteilt und können Domänen wie z.B. Lipidflöße bilden. Transmembran- (TM-), sekretorische und lysosomale Proteine werden mithilfe des Sekretionswegs synthetisiert. Ein Signalpeptid lenkt eine wachsende Polypeptidkette über eine Proteinpore durch die rER-Membran. Dieser sogenannte Translokationskomplex dient auch dazu, TM-Proteine in die rER-Membran einzubauen. Umhüllte Vesikel (engl.: coated vesicles) transportieren Proteine, die in die Membran eingebettet sind oder sich im Lumen befinden, vom ER zum

Golgi-Apparat. Dort werden sie prozessiert und zu anderen Membranen weitertransportiert. Die Proteinhülle dieser Vesikel besteht oft aus Clathrin, das polyedrische Käfige bildet, oder aus COPI oder COPII, die amorph erscheinende Hüllen bilden. 17. Die Fusion der Vesikel mit Membranen verläuft über einen komplexen

Vorgang, an dem SNARES beteiligt sind. Diese bilden Vier-Helix-Bündel, die zwei Membranen zusammenbringen, was wiederum die Membranfusion einleitet. 18. Virale Fusionsproteine vermitteln die Fusion der membranumhüllten Viren wie z.B. des Grippevirus mit Zellmembranen des Wirts, sodass die virale Nucleinsäure in das Cytoplasma des Wirts freigesetzt wird.

Aufgaben

Wichtige Begriffe De Bee Lipid Fettsäure

Sättigung Triacylglycerin Fette Öle Adipocyt Glycerophospholipid Phosphatidsäure Phospholipase Lysophospholipid Plasmalogen Sphingolipid Ceramid Sphingomyelin Cerebrosid Gangliosid Steroid Sterol Glucocorticoid

a

ecke

an ame

Mineralocorticoid Androgen Östrogen Isoprenoid

319

dr armesah an tu bunten Flüssig-Mosaik-Modell Fluoreszenzregenerierung nach Bleichen

mit Licht (FRAP)

Vitamin

Prostaglandin Eicosanoid Lipiddoppelschicht Liposom Transversaldiffusion Lateraldiffusion Übergangstemperatur integrales (intrinsisches) Protein Transmembran-(TM-)Protein Elektronenkristallographie Prenylierung Myristoylierung Palmitoylierung Protein mit GPI-Anker Peripheres (extrinsisches) Protein

Tor- und Zaun-Modell Flippase Lipidfloß Endocytose Sekretionsweg Signalpeptid Signalerkennungspartikel (SRP) SRP-Rezeptor (SR) Translokationskomplex umhüllte Vesikel (engl.: coated vesicles) Clathrin Exocytose SNARE membranumhülltes Virus Hämagglutinin virales Fusionsprotein

Aufgaben 12 Hat trans-Ölsäure einen höheren oder niedrigeren

Schmelzpunkt als cis-Ölsäure? Erklären Sie die Antwort. Wie viele verschiedene Triacylglycerine können mit den Fettsäuren, die in Abbildung 9.1 gezeigt sind, gebildet werden? Welches Triacylglycerin liefert bei der Oxidation mehr Energie: eines mit drei Linolensäureresten oder eines mit drei Stearinsäureresten? Zeichnen Sie die Struktur eines Glycerophospholipids, das eine gesättigte C,,-Fettsäuregruppe an Position 1, eine

einfach gesättigte C}s-Fettsäuregruppe an Position 2 und eine Ethanolaminkopfgruppe hat. Welche Produkte entstehen, wenn 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3phosphatidylserin durch (a) Phospholipase A,, (b) Phospholipase A,, (c) Phospholipase C, (d) Phospholipase D hydrolysiert wird? Welche der in Tabelle 9.2 aufgeführten Glycerophospholipidkopfgruppen kann Wasserstoffbrücken bilden? Ragt die Phosphatidylglycerin-„Kopfgruppe“ von Cardiolipin (Tab. 9.2) aus einer Lipiddoppelschicht so wie die Kopfgruppen anderer Glycerophospholipide heraus? Bei manchen Autoimmunerkrankungen bilden die Betroffenen Antikörper, die gegen Zellbestandteile wie DNA und Phospholipide gerichtet sind. Manche der Antikörper reagieren sowohl mit DNA als auch mit Phospholipiden. Welche strukturelle Grundlage hat diese Kreuzreaktion? Die meisten Hormone, wie z.B. Peptidhormone, üben ihre Wirkung durch Bindung an Zelloberflächenrezeptoren aus. Steroidhormone erreichen dies jedoch durch Bindung an cytosolische Rezeptoren. Wie ist das möglich?

10. Tiere können keine Linolsäure (eine Vorstufe der Arachi-

ill:

12% 11.

14.

15:

16.

donsäure) synthetisieren und müssen diese essentielle Fettsäure deshalb aus ihrer Nahrung gewinnen. Erklären Sie, warum in Zellkulturen gehaltene Tierzellen in Abwesenheit von Linolsäure überleben können. Warum können Triacylglycerine keine wesentlichen Bestandteile von Lipiddoppelschichten sein? Warum wäre eine Doppelschicht, die nur Ganglioside enthält, nicht stabil? Werden Bakterien, die bei 20°C wachsen und auf 30°C erwärmt werden, eher Membranlipide mit (a) mehr gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und (b) kurzkettigen oder langkettigen Fettsäuren synthetisieren? Erklären Sie die Antwort. (a) Wie viele Windungen einer a-Helix sind notwendig, um eine Lipiddoppelschicht (ca. 3 nm dick) zu durchspannen? (b) Was ist die Mindestanzahl an Aminosäuren dafür? (c) Warum enthalten die meisten Transmembranhelices mehr als die Mindestanzahl an Aminosäuren? Der Abstand zwischen den C,-Kohlenstoffen in einem ß-Faltblatt ist ungefähr 0,35 nm. Kann ein einzelnes 9 Aminosäuren langes Segment mit ß-Faltblattkonformation als Transmembranbereich eines integralen Membranproteins dienen? Werden die folgenden Lipidproben eher der inneren oder äußeren Lage der eukaryotischen Zellmembran entsprechen? (a) 20% Phosphatidylcholin, 15% Phosphatidylserin, 65% andere Lipide. (b) 35% Phosphatidylcholin, 15% Ganglioside, 5% Cholesterin 45% andere Lipide.

320

Lipide

17. Beschreiben Sie das Markierungsmuster an Glykophorin A, wenn ein Reagens zur Markierung von Proteinen, das die Membran nicht passieren kann, zugegeben wird zu (a) einer Präparation solubilisierter Erythrocytenproteine, (b) intakten Erythrocyten-Geistern, (c) Erythrocyten-Geistern, die anfangs durchlässig sind, aber dann sofort verschlossen und in eine Lösung überführt werden, die das proteinmarkierende Reagens nicht enthält.

18. Welche Auswirkung wird eine Mutation an einer Signalpeptidase haben, wenn sie deren Spezifität so einengt, dass sie nur noch zwischen zwei Leu-Resten spaltet? 19. Erklären Sie, warum ein Arzneistoff, der den Abbau eines SNARE-Komplexes beeinträchtigt, die Neurotransmission blockieren würde.

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säitılidss masgen!

reiesira2nis .

=

ic

Die Impermeabilität zellulärer Membranen, einschließlich der von Neuronen,

von denen eines hier im Bild gezeigt ist, ermöglichen die Ausbildung eines Membranpotentials. Dieses Potential ändert sich, wenn bestimmte Membranproteine den Fluss von lonen in die Zelle hinein oder aus der Zelle heraus zulassen. [David Becker/Photo Researchers.]

Membrantransport Membrantransport

Elektronisches Zusatzmaterial

© Thermodynamik des Transports

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 5

e Passiv vermittelter Transport

e Aktiver Transport

Animated Figure 10-13 Case Study 3 Case Study 14 Case Study 17 EEE GETESTET EEE TETERETT HET LET SET EEE

TEE ETECTEIETTEN

Zellen sind von ihrer Umgebung durch Plasmamembranen abgetrennt. Eukaryotische Zellen sind zusätzlich durch intrazelluläre Membranen in Kompartmente aufgeteilt. Diese Membranen bilden die Grenzen und die internen Strukturen der verschiedenen Zellorganellen. Biologische Membranen stellen beachtliche Barrieren für ionische und polare Substanzen dar, sodass solche Substanzen die Membranen nur mit Hilfe spezifischer Transportproteine durchqueren können. Solche Proteine vermitteln transmembrane Bewegungen sowohl von

Ionen, wie z.B. Na*, K*, Ca?* und CT’, als auch von Stoffwechselverbindungen, wie z.B. Pyruvat, Aminosäuren, Zuckern, Nucleotiden und sogar von Wasser. Transportproteine sind auch für alle biologischen elektrochemischen Phänomene verantwortlich wie z.B. für Neurotransmission. Die Mechanismen für den Transport von größeren Verbindungen wie Proteinen und makromolekularen Aggregaten durch Membranen (z.B. Endocytose) sind komplizierter. Wir beginnen unsere Diskussion über den Membrantransport mit einer Betrachtung der Thermodynamik dieses Vorgangs. Anschließend werden die Strukturen und die Mechanismen einiger Membrantransportsysteme untersucht.

1

Thermodynamik des Transports

Die Diffusion einer Substanz zwischen zwei Seiten einer Membran

A(außen) = A(innen) ähnelt thermodynamisch einer chemischen Reaktion. In Abschnitt 1.4D wurde gezeigt, das sich die Freie Enthalpie eines gelösten Stoffes A mit dessen Konzentration ändert:

GbR

EIn]A]

(10.1)

wobei Gy das chemische Potential (die partielle molare Freie Enthalpie) von A (der Querstrich steht für Menge pro Mol) und G, sein chemisches Potential Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Crnvricht &© 2010 WITEY.VCH Verlao GmbH & Co. KGaA, Weinheim

324

_Membrantransport

Rechenbeispiel 10.1 SIITTEREN

Zeigen Sie, dass AG. ac

der Kette ein Proton wieder frei wird.). Aquaporin unterbricht jedoch diese Kette, indem die NH,-Gruppen der Seitenketten von zwei hoch konservierten Asn-Resten mit einem Wassermolekül im Zentrum der Pore Wasserstoffbrücken ausbilden (Abb. 10.12). Obwohl dieses zentrale Wassermolekül nach wie vor den benachbarten Wassermolekülen in der Kette Wasserstoffbrücken zur Verfügung stellen könnte, kann es selbst keine Wasserstoffbrücke mehr von diesen annehmen, geschweige denn die Wassermoleküle neu ausrichten. Dadurch wird der „Protonenleitungsdraht“ durchtrennt.

Pr‘ x

1

E. _ Transportproteine wechseln zwischen zwei Konformationen & —zr

e*

PR A)

2 MR » u

intrazellulär

Abb. 10.12 Schematische Zeichnung einer wasserleitenden Pore von Aquaporin AQP]. Die Pore ist innerhalb der Membran gezeigt, die extrazelluläre Seite befindet sich oben. Bezeichnet sind die Positionen der Aminosäuren, die dafür verantwortlich sind, dass keine Protonen, andere

Ionen und kleine gelöste Stoffe passieren können. [Mit freundlicher Genehmigung von Peter Agre, The Johns Hopkins School of Medicine.)

Bisher haben wir die Strukturen und Funktionen von Membranproteinen untersucht, die einen porenartigen Durchlass für kleine Moleküle, Ionen oder Wasser bilden. Andere Membranproteine, die Connexine, bilden ebenfalls solche permanenten Kanäle in Form von Gap junctions zwischen den Zellen (siehe Exkurs 10.1). Aber viele andere Proteine, die den Transport durch eine Membran vermitteln, besitzen keine permanente, die Doppelschicht durchspannende Pore. Stattdessen durchlaufen diese Proteine Konformationsänderungen, um Stoffe von der einen Seite der Membran zur anderen zu bringen. Der Glucosetransporter aus Erythrocyten (auch bekannt als GLUTI) ist ein solches Protein. Biochemische Untersuchungen weisen darauf hin, dass GLUT1 auf beiden Seiten der Membran Bindungsstellen für Glucose besitzt. John Barnett zeigte, dass das Anhängen einer Propylgruppe an das C1 der Glucose die Bindung an der äußeren Oberfläche der Membran verhindert. Wird aber am C6 eine Propylgruppe angehängt, wird die Bindung an der inneren Oberfläche verhindert. Er schlug deshalb vor, dass dieses Transmembranprotein zwei unterschiedliche Konformatio-

Nr

Glucose

Bindung

rierung

\

Dissoziation

Abb. 10.13 Modell für den Glucosetransport. Das Transportprotein wechselt zwischen zwei sich gegenseitig ausschließenden Konformationen. Glucose bindet auf einer Seite der Membran und wird auf der anderen freigesetzt, nachdem das Protein seine Konformation geändert hat. Das Glucosemolekül (rot) ist nicht maßstabsgerecht gezeichnet. [Nach Baldwin, S.A. und Lienhard, G.E., Trends in Biochem. Sci. 6, 210 (1981).]

6% siehe Animated Figures.

nen einnehmen kann: Eine, in der die Glucosebindungsstelle zur äußeren Zelloberfläche weist und Kontakt mit dem O1 hat, O6 aber frei lässt. Bei der anderen Konformation ist die Glucosebindungsstelle der Oberfläche der Zellinnenseite zugewandt und setzt O6-Kontakt voraus, lässt O1 aber unberührt.-Der Transport verläuft offensichtlich folgendermaßen (Abb. 10.13): 1. Glucose bindet auf einer Seite der Membran an das Protein. 2. Eine Konformationsänderung schließt die erste Bindungsstelle und legt die Bindungsstelle auf der anderen Seite der Membran frei (Transport). 3. Glucose dissoziiert vom Protein ab. 4. Der Transportkreislauf wird dadurch vervollständigt, dass GLUT1 leer, d.h. ohne gebundene Glucose zurück in seine Ausgangskonformation gebracht wird (Regenerierung). Dieser Transportkreislauf kann in beide Richtungen ablaufen, abhängig von den relativen Konzentrationen von intrazellulärer und extrazellulärer Glucose. Der Glucosetransporter bietet ein Mittel, die Glucosekonzentration über die Erythrocytenmembran auszugleichen, ohne zugleich für kleine Moleküle oder Ionen durchlässig zu sein (wie es bei Transport durch einen ständig geöffneten Kanal wie Porin der Fall sein könnte). Alle bekannten Transportproteine scheinen asymmetrisch in der Membran sitzende Transmembranproteine zu sein, die zwischen zwei Konformationen wechseln, in wel-

chen die Ligandenbindungsstellen abwechselnd auf den gegenüberliegenden Seiten der Membran zugänglich sind. Ein solcher Mechanismus ist analog dem allosterischen T— R-Übergang von Proteinen, wie z.B. Hämoglobin (Abschnitt 7.1B). Tatsächlich haben Transportproteine und ligandenbindende Proteine, wie Myoglobin und Hämoglobin, viele ähnliche Eigenschaften (siehe Exkurs 10.2% Biochemische Analysen deuten darauf hin, dass GLUT1 12 membrandurchspannende a-Helices besitzt und wahrscheinlich in Form eines Tetramers in der Membran vorliegt. Dieses Protein gehört zu einer großen Familie von Trans-

Passiv vermittelter Transport

Exkurs 10.1

337

Biochemie im Fokus

Kryoelektronenmikroskopische Struktur eines Gap Junction-Membrankanals Die meisten eukaryotischen Zellen stehen mit ihren Nachbarzellen sowohl im Stoffwechsel- als auch im physischen Kontakt. Dieser Kontakt kommt über röhrenförmige Gebilde zustande, die so genannten Gap Junctions (offener Zellkontakt;

engl.: gap = Lücke). Diese Komplexe verbinden einzelne Bereiche von benachbarten Plasmamembranen, ähnlich wie Hohlnieten zwei Stoffbahnen aneinander heften. Ein Gap Junction besteht aus zwei gegenüberliegenden in der Plasmamembran einbetteten Proteinkomplexen. Kleine Moleküle und lonen, aber

keine

Makromoleküle,

können

über

den

zentralen

Kanal des Gap Junction von einer Zelle zur anderen gelangen. Cytoplasma

der Zelle heraus sowie in ihre Mitochondrien und ins endoplasmatische Reticulum hinein pumpen (Abschnitt 10.3B). Ca?* strömt in lecke oder stoffwechselgeschwächte

lonen,

Aminosäuren, n; Zucker, . Nucleotide ® Proteine, Nucleinsäuren

Diese

interzellulären

Röhren

sind so verbreitet,

dass viele

dass

sich

ihren

mit

Molekülmassen

zwischen

25

und

50 kD.

Manche Connexone sind aus zwei oder mehr Connexinarten aufgebaut, und die Gap Junctions, die zwei Zellen verbinden, können aus zwei unterschiedlichen Connexontypen bestehen. Diese daraus entstehenden unterschiedlichen Typen von Gap-Junctions sind vermutlich unterschiedlich selektiv für die Stoffe, die sie durchlassen. Die kryoelektronenmikroskopisch bestimmte Struktur eines Gap Junction-Kanals

Organe im Ganzen komplett permeabel sind. Gap Junctions sind somit wichtige Kommunikationskanäle zwischen benachbarten Zellen. Die synchronisierte Kontraktion des Herzmuskels z.B. kommt durch den lonenfluss durch Gap Junctions zustande, weshalb Gap Junctions auch als elektrische Synapsen bezeichnet werden. Weiter dienen Gap Junctions als Kanal für einige Stoffe, die das embryonale Wachstum steuern.

bewirkt dadurch,

tion-Kanal besteht aus zwei sechseckigen Connexinringen, den so genannten Connexonen. Jeweils ein Ring stammt von jeder angrenzenden Plasmamembran. Jeder tierische Organismus produziert zahlreiche genetisch verschiedene

Anordnung, Zellzwischenraum

und

Gap Junctions sind aus einer einzigen Sorte Proteinuntereinheiten aufgebaut, dem Connexin. Ein einzelner Gap Junc-

Connexine,

Cytoplasma

Zellen zurück

die Gap Junctions schließen und diese Zellen von Nachbarzellen abgeschottet werden.

des Herzens

mit einem

zeigt eine symmetrische

Durchmesser

von

rund 7,0 nm

und

einer Länge von etwa 15,0 nm. Sie umschlief%t einen zentralen Kanal, dessen Durchmesser zwischen ca. 4,0 nm am Ein-

gang und rund 1,5 nm im Innern schwankt. Die Transmembrananteile des Gap Junction-Kanals enthalten jeweils 24 elektronendichte Stäbchen, die in sechseckiger Symmetrie angeordnet sind und sich senkrecht zur Membranebene erstrecken.

Gap Junctions von Säugetieren haben einen inneren Durchmesser von 1,6 bis 2,0 nm. Dies hat Werner Loewenstein dadurch gezeigt, dass er verschieden große fluoreszierende Moleküle in einzelne Zellen mikroinjizierte und mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtete, ob die fluoreszierende

Sonde in die Nachbarzelle gelangte. Die Moleküle und lonen, die durch Gap Junctions von Zelle zu Zelle frei passieren können,

dürfen

maximal

eine Molekülmasse

von

rund

1000 D aufweisen. Makromoleküle wie Proteine und Nucleinsäuren können eine Zelle auf diesem Weg also nicht verlassen. Der Durchmesser eines Gap-Junction-Kanals wird über die Ca?*-Konzentration und über den pH reguliert: Die Kanäle sind ganz geöffnet, wenn der Ca?'-Spiegel unter 10 M liegt, sie verengen sich, wenn die Ca?*-Konzentration ansteigt, bis sie sich

bei über

5X 10°

M

schließen.

Man

nimmt

an,

dass dieses Steuerungssystem die miteinander verbundenen Zellen vor der Ausbreitung von Schäden schützt. Eine einzige tote oder geschädigte Zelle könnte sonst zum Absterben einer ganzen Gruppe von Zellen führen. Zellen haben im Allgemeinen eine sehr geringe cytosolische Ca”*-Konzentration (unter 10°” M). Dies erreichen sie, indem sie aktiv Ca? aus

Im Bild ist die Elektronendichte bei zwei verschiedenen Schwellenwerten durch die flächigen und die netzförmigen Konturen (in Gold) dargestellt, während die weißen Kästen die Lage der Zellmembranen aufzeigen. [Kryoelektronenmikroskopische Struktur mit freundlicher Genehmigung vom Mark Yeager, The Scripps Research Institute, La Jolla.]

338

Membrantransport

portern, deren Strukturen noch nicht so gut charakterisiert wurden wie die von Kanalproteinen. Die kryoelektronenmikroskopische Struktur mit einer Auflösung von 0,65 nm eines bakteriellen Oxalat-Transporters, genannt OxIT, zeigt, dass seine 12 transmembranen Helices rund um einen zentralen Hohlraum angeordnet sind, der vermutlich eine Substratbindungsstelle darstellt (Abb. 10.14). Das Protein weist einen hohen Grad an Symmetrie zwischen seiner cytoplasmatischen und seiner extrazellulären Hälfte auf. Das steht damit im Einklang, dass das Protein sowohl Substanzen in die Zelle hinein als auch aus der Zelle heraus transportieren kann. Die in Abb. 10.14 dargestellte Struktur entspricht einer intermediären Konformation, die weder von der cytoplasmatischen noch von der extrazellulären Membranseite aus für Substrat zugänglich ist. Einige Transporter können mehr als ein Substrat transportieren. Der bak-

terielle Oxalat-Transporter z.B. transportiert Oxalat in die Zelle hinein und Formiat aus der Zelle heraus.

\

Unterschied zwischen vermitteltem und nicht vermitteltem Transport Glucose und viele andere Verbindungen können durch einen nicht vermittelten Vorgang in Zellen gelangen. Dabei diffundieren sie langsam in die Zellen, mit einer Geschwindigkeit, die ihrer Membranlöslichkeit und der Konzentrationsdifferenz zwischen beiden Seiten der Membran proportional ist. Dies ist ein linearer Vorgang: Der Fluss (Transportgeschwindigkeit je Flächeneinheit) einer Verbindung durch eine Membran steigt mit der Größe des Konzentrationsgefälles (der Differenz zwischen seiner Konzentration innerhalb und außerhalb der Zelle). Bewegt sich dieselbe Verbindung, z.B. Glucose, mittels eines Transportproteins durch die Membran, ist sein Fluss nicht länger linear. Das ist eines von vier Kriterien, in denen sich vermittelter und nicht vermittel-

ter Transport unterscheiden: 1. Geschwindigkeit und Spezifität. Die Löslichkeiten der chemisch ähnlichen Zucker o-Glucose und p-Mannitol in einer synthetischen Lipiddoppelschicht sind gleich. Jedoch ist die Geschwindigkeit, mit der Glucose die Erythrocytenmembran

durchquert,

vier

Größenordnungen

höher als die von o-Mannitol. Die Erythrocytenmembran muss deshalb ein System haben, das Glucose transportiert und das o-Glucose von p-Mannitol unterscheiden kann. 2. Sättigung. Die Geschwindigkeit des Glucosetransports in ein rotes Blutkörperchen erhöht sich nicht unbegrenzt mit einer steigenden externen Glucosekonzentration: Die Geschwindigkeit nähert sich allmählich einem Maximum. Diese Beobachtung ist der Beweis, dass eine bestimmte Anzahl an Stellen auf derMembran am Transport der Glucose beteiligt ist. Bei hoher Glucosekonzentration sind die transportierenden Elemente gesättigt, so wie Myoglobin bei hohem pO, mit O, gesättigt ist (Abb. 7.4). Wie zu erwarten, ergibt die graphische Darstellung des Glucoseflusses gegen die Glucosekonzentration eine

hyperbolische Kurve. Der nicht vermittelte Glucosefluss steigt linear mit der Glucosekonzentration, würde sich aber bei dem Maßstab der obigen Graphik nicht wesentlich von der Abszisse abheben. 3. Kompetition. Die obige Kurve verschiebt sich in Gegenwart einer Verbindung, die mit Glucose um die Bindung am Transporter konkurriert, nach rechts — z.B. hat 6-OBenzyl-o-galactose diese Wirkung. Kompetition tritt bei nicht vermittelten

Transport

nicht auf, weil bei diesem

kein Transportprotein beteiligt ist. 4. Inaktivierung. Reagenzien, die Proteine chemisch verändern und daher ihre Funktion beeinflussen können, sind in der Lage, den schnellen und sättigbaren Glucosefluss

in die roten Blutkörperchen auszuschalten. Die Empfindlichkeit des Glucosetransportsystems der roten Blutkörperchen gegenüber proteinverändernden Reagenzien ist ein weiterer Beweis dafür, dass es sich bei diesem Transportsystem um ein Protein handelt.

eo N

oO

Er 5

FR

We fo)

®

2508 cr = =

0

0

2

4

6

8

10

[Glucose] (mM)

[Graphik basiert auf Daten von Stein, W.D., Movement of Molecules across Membranes, S. 134, Academic Press (1967)]

Aktiver Transport

339

Abb. 10.14 Kryoelektronenmikroskopische Struktur des Oxalat-Transporters OxIT von Oxalobacter formigenes. Zwölf a-Helices wurden in der Elektronendichtedarstellung, die eine Auflösung von 0,65 nm hat, angepasst. Die grünen Helices sind fast senkrecht zur Membranebene, gelbe Helices enthalte eine Schlaufe und violette Helices sind sowohl gebogen als auch gekrümmt, um zur Elektronendichte zu passen. Segmente, die die Helices verbinden, sind nicht aufgelöst. [Mit freundlicher Genehmigung von Sriram Subramaniam, NIH, Bethesda, Maryland.]

"00C-COO-

H-COO>

Oxalat

Formiat

Einige Transportproteine transportieren mehr als ein Molekül gleichzeitig. Daher teilt man den vermittelten Transport nach der Stöchiometrie des Transune ein (Abb. 10.15): Bei einem Uniport wird jeweils ein einzelnes Ion oder Molekül transportiert. Der Erythrocyten-Glucosetransporter ist ein Uniport-System. 2. Bei einem Symport werden verschiedene Ionen oder Moleküle zugleich und in derselben Richtung transportiert. 3. Bei einem Antiport werden verschiedene Ionen oder Moleküle zugleich, aber in entgegengesetzte Richtungen transportiert.

3

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Nennen Sie Gemeinsamkeiten

und Unterschiede von Ionophoren, Porinen, Ionenkanälen und den Transportproteinen für passiv vermittelten Transport. Erklären Sie, wie und warum Ionenkanäle als Tore wirken. Beschreiben Sie den Mechanis-

Aktiver Transport

Passiv vermittelnde Transporter, einschließlich Porine, Ionentunnel und Proteine wie GLUTI erleichtern die Bewegung von Substanzen über die Membran hinweg entsprechend ihrer relativen Konzentration auf den beiden Seiten der Membran. Da die Glucosekonzentration im Blutplasma (etwa 5 mM) normalerweise höher als im Zellinneren ist, transportiert GLUT1 normalerweise Glucose in die Erythrocyten, wo die Glucose als Energielieferant benötigt wird. Viele Verbindungen sind jedoch auf einer Membranseite in geringeren Konzentrationen verfügbar, als sie auf der anderen Seite benötigt werden. Solche Stoffe müssen aktiv und selektiv entgegen ihres Konzentrationsgefälles durch die Membran transportiert werden. Aktiver Transport ist ein endergoner Vorgang, der in den meisten Fällen mit Hydrolyse von ATP verbunden ist. Es wurden verschiedene Familien von ATPabhängigen Transportern identifiziert: 1. P-Typ ATPasen werden beim Transport von Kationen, wie z.B. Na’, K' und Ca’* über die Membran phosphoryliert.

2. F-Typ ATPasen sind Protonen-transportierende Komplexe, die in Mitochond-

mus von Uniport-, Symport- und Antiport-Iransportprozessen,

indem Sie dieselbe Terminologie wie bei allosterischen Proteinen verwenden.

AlauBen)

tisieren, wie wir in Abschnitt 18.3 sehen werden.

3. V-Typ ATPasen ähneln den F-Typ ATPasen und kommen in Pflanzenvakuolen und in sauren Vesikeln, wie in den Lysosomen von Tieren vor. 4. A-Typ ATPasen transportieren Anionen über die Membranen. 5. ABC-Transporter sind nach ihrer ATP-bindenden Kassette (engl.: cassette) benannt und transportieren eine Vielzahl von Substanzen, einschließlich Ionen, kleine Metaboliten und Arzneimittelmoleküle).

En

es

en)

Binnen) Symport

en

der durch einen anderen

Mechanismus

entstanden

ist, wie z.B.

a Antiport

In diesem Abschnitt untersuchen wir zwei P-Typ ATPasen und einen ABCTransporter. Diese Proteine führen einen primär aktiven Transport durch. Bei sekundär aktivem Transport wird die Freie Enthalpie eines elektrochemischen Gradienten,

A (innen) Uniport

rienmembranen oder in bakteriellen Membranen lokalisiert sind. Anstatt die freie Enthalpie von ATP zu nutzen, um Protonen gegen ihren Gradienten zu pumpen, funktionieren diese Proteine entgegengesetzt, um ATP zu synthe-

Abb. 10.15 Uniport-, Symportund Antiport-Transportsysteme.

340

_Membrantransport Bindungsstellen für kardiotonische Steroide

Kohlenhydrate

durch eine Ionen-pumpende ATPase, genutzt, um neutrale Moleküle entgegen ihres Konzentrationsgefälles zu transportieren.

A.

ATPBindungsstellen

Abb. 10.16

(Na*-K*)-ATPase.

Das Schema zeigt die vermutete dimere Struktur

des Transporters und dessen Orientierung in der Zellmembran. Herzstärkende (kardiotonische) Steroide - zu denen die Herzglykoside (Exkurs 10.3) gehören - binden an die äußere Seite des Transporters, wodurch sie den Transport verhindern.

(Na*-K*)-ATPase

Eines der am gründlichsten untersuchten Systeme des aktiven Transports ist die (Na*-K*)-ATPase in der Plasmamembran höherer Eukaryoten, die als erstes von Jens Skou charakterisiert wurde. Dieses Membranprotein besteht aus zwei Arten von Untereinheiten: einer nicht glykosylierten 110-kD-a-Untereinheit, die die katalytische Aktivität des Enzyms und die Ionenbindungsstellen trägt, und einer 55-kD-ß-Untereinheit, ein Glykoprotein, dessen Funktion man nicht kennt. Sequenzanalysen lassen vermuten, dass die a-Untereinheit acht a-helicale Transmembranbereiche enthält, sowie zwei große cytoplasmatische Domänen. Die ß-Untereinheit hat eine einzige Transmembranhelix und eine große extrazelluläre Domäne. Das Protein bildet in vivo ein (aß),-Tetramer (Abb. 10.16). Die (Na*-K*)-ATPase wird oft (Na*-K*)-Ionenpumpe genannt, weil sie Na* aus der Zelle heraus und K* hinein befördert, bei gleichzeitiger Hydrolyse von intrazellulärem ATP. Die Gesamtstöchiometrie dieser Reaktion ist 3Na* (innen) + 2K* (außen) + ATP + H2O = 3Na* (außen) + 2K* (innen)

+ADP +P;

Die (Na*-K*)-ATPase ist ein Antiporter, der eine Ladungstrennung über die Membran bewirkt, da für zwei positive Ladungen, die in die Zelle hereingebracht werden, drei positive diese verlassen. Durch das Ausschleusen von Na" sind tierische Zellen befähigt, ihren Wassergehalt osmotisch zu kontrollieren. Ohne funktionstüchtige (Na*-K' )-ATPasen, die eine niedrige Natriumkonzentration im Zellinneren aufrechterhalten, würde Wasser in solchen Mengen osmotisch in die Zelle einströmen, dass tierische Zellen, die keine Zellwand besitzen, aufquellen und platzen würden. Der elektrochemische Gradient, den die (Na*-K*)-ATPase erzeugt, ist auch die Grundlage für die elektrische Erregbarkeit der Nervenzellen (Abschnitt 10.2C). Tatsächlich verwenden Zellen einen großen Teil des ATP, das sie erzeugen (bis zu 70% in Nervenzellen), um die cytosolischen Na*- und K*Konzentrationen, die sie für eine normale Funktion benötigen, aufrechtzuerhalten. Das Schlüsselprinzip der (Na’-K*)-ATPase ist die Phosphorylierung eines spezifischen Asp-Restes des Transportproteins. ATP phosphoryliert das TransporterAsp nur in Gegenwart von Na’, wohingegen der Aspartylphosphatrest

Aspartylphosphatrest

nur in Gegenwart von K* hydrolysiert wird. Das macht es wahrscheinlich, dass die (Na“-K')-ATPase zwei Konformationszustände (E, und E, genannt) einnimmt, mit unterschiedlichen Strukturen, unterschiedlichen katalytischen Aktivitäten und unterschiedlichen Ligandenspezifitäten. Man geht davon aus, dass das Protein auf folgende Weise arbeitet (Abb. 10.17): 1. Der Transporter bindet im E,-Zustand drei Na*-Ionen in der Zelle und dann ATP, sodass ein E,- ATP-3Na*-Komplex entsteht. 2. Durch ATP-Hydrolyse entsteht ADP und ein „energiereiches“ Aspartylphosphat-Zwischenprodukt E-P-3Na* (hier steht „—“ für eine „energiereiche“ Bindung).

Aktiver Transport ATP

Mg?’*

E, +3Na+ Mi

ADP Eı » ATP- 3Na*+

1. ATP-Bindung

Mg’* Eı-P «3Nat 2. Bildung eines „energie-

3Na*” (innen) 2K* (innen)

reichen“ Aspartylphosphat-Zwischener.

produkts

außen

3Na* (außen)

5. Phosphat-

E, * a

Hydrolyse

ar ne EP BE

PRi

4. K*-Bindung

dns as Nr E&-P

H,O

3. Dieses „energiereiche“ Zwischenprodukt nimmt eine „energiearme“ Konformation, E,-P-3Na*, ein und setzt die gebundenen Na*-Ionen außerhalb der Zelle frei. 4.

E,-P bindet zwei K*-Ionen außerhalb der Zelle, wodurch ein E,-P-2K*-

Komplex entsteht. 5. Durch die Hydrolyse der Phosphatgruppe entsteht E,-2K*. 6. E,-2K* ändert seine Konformation, setzt die beiden gebundenen K*-Ionen in der Zelle frei und nimmt erneut drei Na*-Ionen auf, wodurch der Kreislauf geschlossen wird. Jeder der genannten Reaktionsschritte für sich genommen ist reversibel. Unter normalen physiologischen Verhältnissen läuft der Kreislauf, wie in Abbildung 10.17 gezeigt, trotzdem nur im Uhrzeigersinn ab, weil die ATP-Hydrolyse und der Ionentransport gerichtete (unidirektionelle), miteinander verbundene Vorgänge sind. Die gerichtete Natur des Reaktionskreislaufs leitet sich aus der Abfolge exergoner und endergoner Schritte ab. Zu den exergonen Schritten gehören die ATP-Hydrolysen (Schritte 1 und 2 und Schritt 5), wogegen die Schritte, bei denen Ionen transportiert werden (Schritte 3 und 4 und Schritt 6), endergon sind. So kann keine der Reaktionen vollständig ablaufen, wenn es die anderen nicht auch tun. Die Untersuchung der (Na*-K*)-ATPase wurde durch den Einsatz von bestimmten Glykosiden, die den Transporter inhibieren (siehe Exkurs 10.3), wesentlich erleichtert.

B.

Ca’*-ATPase

Ein vorübergehender Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration löst eine Vielzahl von Reaktionen in Zellen aus, einschließlich der Muskelkontraktion (Abschnitt 7.2B), des Glykogenabbaus und der Ausschüttung von Neurotransmittern (Abschnitt 16.3). Zudem ist Ca’* ein wichtiger Aktivator des oxidativen Stoffwechsels (Abschnitt 18.4). Die Calciumionenkonzentration im Cytosol (etwa 0,1 uM) ist um vier Größenordnungen niedriger als im extrazellulären Raum (etwa 1500 uM, intrazelluläres Ca’* würde sich bei höherer Konzentration mit Phosphat verbinden und Ca,(PO,), bilden, das eine maximale Löslichkeit von nur 65 uM besitzt). Dieses starke Konzentrationsgefälle wird durch den aktiven Transport von Ca”* durch die Zellmembran und das endoplasmatische Reticulum (im Muskel das sarkoplasmatische Reticulum) von einer Ca’*-ATPase (Ca’*-Ionenpumpe) aufrecht-

2K* (außen)

Abb. 10.17 Schematische Darstellung des aktiven Transports von Na* und K* durch die (Na*-K*)-ATPase.

341

342

__Membrantransport

Exkurs 10.3. Biochemie im Fokus . Die Wirkung der Herzglykoside Die Herzglykoside sind natürlich vorkommende Verbindungen, die die Stärke der Herzmuskelkontraktion erhöhen. So wurde

z.B. Digitalis, ein Extrakt aus

den

Blättern

des

luläre Na*-Konzentration steigt dadurch an und stimuliert das (Na*-Ca?*)-Antiportsystem des Herzens, das Na* aus der Zelle heraus und Ca’* hinein pumpt. Die gestiegene

Ca?*-Konzentration im Cytosol erhöht die Ca’*-Konzentration

roten Fingerhutes, der eine Mischung von Herzglykosiden, einschließlich Digitoxin (Digitalin, siehe Abb. unten) enthält, Jahrhunderte lang zur Behandlung von kongestiver (d.h. zu Blutstauungen führender) Insuffizienz des Herzens verwendet. Das Herzglykosid Strophantin (Ouabain, gesprochen

im sarkoplasmatischen Reticulum. Somit ruft die Ausschüttung von Ca”*, die eine Muskelkontraktion auslösen soll (Abschnitt 7.3C), einen größeren Anstieg der Ca?*-Konzentration

WabeYn), ein Produkt des ostafrikanischen

Herzmuskelkontraktion verstärkt wird. Es wurde inzwischen entdeckt, dass Strophantin, von dem man ursprünglich an-

Ouabio-Baums,

wurde lange als Pfeilgift verwendet. Diese beiden Steroide, die heute noch zu den am häufigsten verordneten Herzmedikamenten zählen, inhibie-

ren die (Na*-K*)-ATPase, indem sie sehr fest an einen außen liegenden Teil des Proteins binden (Abb. 10.16), sodass Schritt 5 in Abbildung 10.17 blockiert wird. Die intrazel-

Digitoxin (Digitalin)

im Cytosol hervor als gewöhnlich, wodurch die Intensität der

nahm, dass es nur von

Pflanzen gebildet würde,

in Tieren

als Hormon vorkommt. Es wird von der Nebennierenrinde ausgeschüttet und reguliert die zelluläre Na*-Konzentration sowie allgemein das Gleichgewicht von Wasser und Salzen im Körper.

Ouabain

erhalten. Diese transportiert Ca’* im Austausch gegen zwei oder drei Protonen aus dem Cytosol heraus, wobei ATP verbraucht wird. Der Mechanismus der

Ca’*-ATPase (Abb. 10.18) ähnelt dem der (Na*-K*)-ATPase (Abb. 10.17).

Chikashi Toyoshima bestimmte die Röntgenstrukturen der Ca’*-ATPase aus dem sarkoplasmatischen Reticulum des Kaninchenmuskels in der E}- und E,-

Konformation. Deren überlagerten Röntgenstrukturen sind in Abbildung 10.19 dargestellt. Zwei Ca?*-Ionen binden im Innern eines Bündels aus zehn Transmembranhelices. Drei weitere Domänen bilden eine große Struktur auf der cytoplasmatischen Membranseite. Die Unterschiede zwischen der Komponente, die Ca’* gebunden hat (E,), und der Ca?*-freien (E,) Variante zeigen, dass der Transporter während des Reaktionscyclus’ erhebliche Konformationsänderungen erfährt, insbesondere in den cytoplasmatischen Domänen, aber auch in der Ca**-transportierenden Membrandomäne. Durch diese weitreichenden Veränderungen wird offensichtlich die Kommunikation zwischen den Ca?*-Bindungsstellen und der etwa 8 nm entfernten ATP-Bindungsstelle vermittelt.

Aktiver Transport

ATP E+ 2Ca?t

ADP

an

Abb. 10.18

E- P +» 2Ca?*+

1. ATP-Bindung und Bildung eines „energiereichen“ Zwischenprodukts

343

Schema für den aktiven Ca’*-Transport

durch die Ca?*-ATPase. In dieser Darstellung steht „innen“ für das Cytosol und „außen“ für die Außenseite der Zelle, bezogen

auf die Ca’*-ATPase der Plasmamembran. Im Falle der Ca?*-ATPase des endoplasmatischen (oder sarkoplasmatischen) Reticulums bezeichnet „außen“ deren Lumina.

3. PhosphatHydrolyse

€.

_ABC-Transporter

Wenn Krebszellen nicht mehr auf Chemotherapeutika ansprechen, dann geht dies häufig auf eine Überproduktion eines bestimmten Membranproteins zurück: des so genannten P-Glykoproteins. Es gehört zu der Klasse der ABC-Transporter und pumpt eine Vielzahl amphiphiler Stoffe - einschließlich zahlreicher Arzneistoffe — aus der Zelle. Deshalb heißt diese Proteinfamilie auch MultidrugResistance-Transporter (MDR-Transporter). Bei Bakterien tragen ähnliche Proteine zu deren Antibiotikaresistenz bei. Die ABC-Transporter pumpen Ionen, Zucker, Aminosäuren und andere polare und unpolare Substanzen. Sie setzen sich aus vier Bausteinen zusammen: zwei hoch konservierten cytoplasmatischen Nucleotidbindedomänen und zwei Transmembrandomänen, die normalerweise jeweils sechs Transmembranhelices enthalten. Bei Bakterien liegen diese vier Domänen auf zwei oder vier getrennten Polypeptiden, in Eukaryoten hingegen enthält ein einzelnes Polypeptid alle vier Domänen. Bakterielle ABC-Transporter vermitteln die Aufnahme und den Ausstrom einer Reihe von Substanzen. Die eukaryotischen Pendants arbeiten hingegen nur als Exporteure, die Material aus der Zelle oder in intrazelluläre Kompartimente wie das endoplasmatische Reticulum transportieren. Die Röntgenstruktur des bakteriellen ABC-Iransporters SAV1866 zeigt eine größe Ähnlichkeit zum menschlichen P-Glykoprotein. Somit liefert sie wertvolle Hinweise darauf, wie die ABC-Transporter arbeiten. Die beiden identischen Untereinheiten von Sav1866 sind eng miteinander verflochten. Jeweils drei Helices jeder Untereinheit bilden einen der beiden Arme der V-förmigen Transmembrandomäne (Abb. 10.200). Die zwei ATP-Bindungsstellen sitzen an der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten der nucleotidbindenden Domänen. Konformationsänderungen infolge der ATP-Bindung und -Hydrolyse in diesem Teil des Proteins scheinen über kleine Bewegungen der zwei kurzen intrazellulären, parallel zur Membran ausgerichteten Helices (ICL; Abb. 10.20b) zu den Transmembrandomänen übertragen zu werden. Diese so genannten Kopplungshelices wechselwirken mit der nucleotidbindenden Domäne der gegenüberliegenden Untereinheit. Dadurch können sich die beiden Untereinheiten des Transporters gemeinsam bewegen. Im nucleotidbindenden Zustand in Abbildung 10.20 umschließen die Transmembrandomänen einen Hohlraum, der zum äußeren Blatt der Doppelschicht und zum Extrazellulärraum hin geöffnet ist. Die ATP-Hydrolyse löst vermutlich eine Konformationsänderung aus, die den Hohlraum dem Cytosol und der inne-

Abb. 10.19

Röntgenstrukturen der Ca?*-ATPase,

mit und ohne gebundenes Ca?*. Die Ca?*-freie Variante, E,, ist grün und die Variante, die Ca** gebunden hat, E,Ca”*, ist violett

dargestellt. Diese Proteine sind an ihren Transmembrandomänen übereinander gelagert, sodass gezeigt wird, wie sie entlang/parallel zur Membran lokalisiert sind, wobei die cytosolische Seite oben

ist. Zehn Transmembranhelices bilden die M-

(für Membran) Domäne. ATP bindet an die N(für nucleotidbindende) Domäne. Der Asp-Rest, der während des Reaktionscyclus phosphoryliert wird, sitzt auf der P- (für Phosphorylierung) Domäne. Die A- (für Auslöser) Domäne hat ihren Namen daher, dass sie an der Übermittlung von

wichtigen Konformationsänderungen beteiligt ist. Die gestrichelten Linien markieren die Ausrichtung einer Helix in der N-Domäne in den beiden Konformationen, die horizontalen Linien skizzieren

die Membran. [Mit freundlicher Genehmigung von Chikashi Toyoshima, Universität Tokyo. PDBids 1SU4 und 1IWO.]

344

_Membrantransport

Abb. 10.20

Röntgenstruktur des ABC-Transporters

SAV1866 aus Staphylococcus aureus.

(a)

(a) Bänderdiagramm des homodimeren Proteins, in dem die Untereinheiten gelb-grün und smaragdgrün gefärbt sind. Das Protein ist parallel zur Membran angeordnet, seine extrazelluläre Seite ist

oben. Markiert sind die Transmembrandomänen (TMDs), die nucleotidbindenden

Domänen

(NBDs) und die intrazellulären Schleifen (ICLs). Die graue Box gibt die ungefähre Lage der Lipiddoppelschicht an. (b) Das gleiche Modell, aber um 90° um seine vertikale Achse gedreht. Die gebundenen ATP-Moleküle sind als Kugel-Stab-Modelle gezeichnet. Die Transmembranhelices der smaragdgrünen Untereinheit sind nummeriert, und mehrere extrazelluläre (ECL) und intrazelluläre Schleifen (ICL) sind markiert. [Mit freundlicher Genehmigung von Kaspar Locher, ETH Zürich.

cytoplasmatisch

PDBid 2HYD.]

ren Membranschicht aussetzt. Somit ermöglicht eine ATP-getriebene Konformationsänderung, dass der Transporter ein Molekül aus dem Zellinneren oder der inneren Membranschicht bindet und es außerhalb der Zelle oder in die äußere Membranschicht wieder freisetzt (somit würde der Transporter als eine Flippase für fettlösliche Substanzen funktionieren). In seiner nach außen zeigenden Konformation ist der Hohlraum vorwiegend mit polaren und geladenen Resten ausgekleidet, welche die Freisetzung hydrophober Substanzen, zu denen viele Arzneistoffe zählen, begünstigen. CFTR ist ein ABC-Transporter

Nur einer von den tausenden ABC-Transportern, die man kennt, ist keine Pumpe, sondern ein Ionenkanal: der sogenannte CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Dieses aus 1480 Aminosäuren bestehende Protein ist bei Patienten mit der Erbkrankheit cystische Fibrose defekt (Exkurs 3.1). Im offenen Zustand ermöglicht der CFTR den Strom von Chloridionen entsprechend ihres Konzentrationsgefälles. Wenn ATP an die beiden nucleotidbindenden Domänen des CFTR bindet, öffnet sich der Kanal. Wird ein ATP hydrolysiert, so schließt sich der Kanal wieder (das andere ATP-Molekül wird nicht gespalten). Der CFTR-Kanal kann sich jedoch nur öffnen, wenn seine Regulatordomäne (die innerhalb der ABC-Transporter einmalig ist) zuvor phosphoryliert wurde. Auf diese Weise wird der Ionenstrom durch die Membran reguliert. Da der CFTR keine hohe Spezifität für CI-Ionen zeigt, ist zu vermuten, dass der Kanal keinen Auswahlfilter hat wie z.B. der K*-Kanal KcsA (Abschnitt 10.2C). Um die elektrische Neutralität aufrechtzuerhalten, wird der vom CFTR vermittelte Ausstrom von Chlorid vom Ausstrom positiv geladener Ionen - hauptsächlich Na*- begleitet. Die transportierten Ionen werden osmotisch von Wasser begleitet, wodurch der Wassergehalt und damit die Fluidität in den Sekreten der Luftwege, des Darmtrakts sowie in den Gängen der Bauchspeicheldrüse, der Hoden und der Schweifßdrüsen reguliert wird. Obwohl über 1000 Mutationen des CFTR beschrieben sind, fehlt bei etwa 70% der Fälle von cystischer Fibrose

Aktiver Transport

345

Phe 508 des CFTR. Diese CFTR-Mutante ist zwar funktionsfähig; da sie aber nicht korrekt gefaltet ist, wird sie wieder abgebaut, noch bevor sie in die Plasmamembran eingebaut werden kann. Personen, die homozygot für den defekten oder fehlenden CFTR sind (Heterozygote zeigen keine Symptome), haben in vielen der oben genannten Organe Probleme, besonders bedrohlich sind die Symptome in der Lunge. Die Ursache hierfür ist, dass sich durch den verminderten CI’-Export der Schleim verdickt und nicht mehr so einfach abgehustet werden kann. Da die Lungen normalerweise Fremdkörper wie Bakterien hauptsächlich durch den Schleimfluss entfernen, leiden an cystischer Fibrose Erkrankte an chronischen Lungeninfektionen. Die Lunge wird dadurch im Laufe der Zeit stark geschädigt, sodass die Betroffenen eine deutlich verringerte Lebenserwartung haben.

D.

lonengradient-getriebener aktiver Transport

Systeme wie die (Na'-K’)-ATPase bauen einen elektrochemischen Gradienten über eine Membran auf. Die Freie Enthalpie, die in einem elektrochemischen Gradienten gespeichert ist (Gl. 10.3), kann genutzt werden, um damit verschiedenste endergone, physiologische Prozesse anzutreiben. Zum Beispiel nehmen Zellen des Darmepithels Glucose aus der Nahrung durch einen Na*-abhängigen Symport auf (Abb. 10.21). Die direkte Energiequelle für diesen „Bergauftransport“ ist der Na*-Gradient. Dieser Vorgang ist ein Beispiel für einen sekundär aktiven Transport, weil der Na*-Gradient in diesen Zellen durch die (Na'-K')ATPase aufrechterhalten wird. Das Na*-Glucose-Transportsystem konzentriert Glucose in der Zelle. Glucose geht dann durch einen passiv vermittelten Glucose-Uniport in die Blutkapillaren über (dieser Transporter ähnelt GLUT]; Abb. 10.13). Glucose verstärkt die Na*-Aufnahme im Körper, was eine stärkere Wasserresorption nach sich zieht. Dies ist der Grund, weshalb Patienten, die wegen Durchfalls an Salz- und Wasserverlust leiden, Glucose verabreicht wird. Lactose-Permease benötigt einen Protonengradienten

Gram-negative Bakterien wie E. coli enthalten mehrere aktive Transportsysteme zur Aufnahme von Zuckern. Ein ausführlich untersuchtes Beispiel ist die Lactose-Permease (auch bekannt als Galactosid-Permease). Sie nutzt den Protonengradienten der Bakterienzellmembran, um H* und Lactose gemeinsam zu transportieren. Der Protonengradient wird im Stoffwechsel durch oxidative Prozesse in einer ähnlichen Weise wie in Mitochondrien (Abschnitt 18.2) gebildet. (In diesen (b) Darmzotte

(a) Dünndarm

Abb. 10.21 Glucosetransport im Darmepithel. Die bürstenartigen Darmzotten, die den Dünndarm auskleiden, vergrößern stark dessen Oberfläche

(a) und unterstützen dadurch die Aufnahme von Nährstoffen. Die Bürstensaumzellen, welche die Darmzotten bilden (b), konzentrieren im Symport mit Na* Glucose aus dem Darmlumen (c). Dieser Vorgang wird durch die (Na'-K*)-ATPase getrieben, die auf der Kapillarseite der Zellen

lokalisiert ist und die Aufrechterhaltung einer niedrigen intrazellulären Na*-Konzentration bewirkt. Die Glucose wird über ein separates,

passiv vermittelndes Uniport-System

(ähnlich dem GLUTI) in das Blut abgegeben.

(c) Glucosetransport

Na*-Glucose-Symport

Säulenepithel

Glucose-Uniport

an“ Glucose

DB

Glucose —

Na*

zu den Kapillaren

ads

intestinales Lumen

IN

intestinale —# Schleimhautfalte

Darmschleimhaut

E; =

Na*

goneaDadF 3

> (

>

I |

K+

Kapillaren

HM,

Bürstensa

(Na*-K*)-ATPase

346

Membrantransport

Abb. 10.22 Schematisch Darstellung vom Cotransport von H* und Lactose durch die Lactose-Permease in E. coli.

H* bindet zuerst außerhalb der Zelle an E-2, gefolgt von Lactose. Beide werden innerhalb der Zelle von E-1 freigesetzt. E-2 muss sowohl Lactose als auch H* binden, um die Konformation zu E-1 zu wechseln, wobei es diese Substanzen in die

Zelle transportiert. E-] wechselt die Konformation zu E-2, wenn weder Lactose noch H* gebunden sind, womit der Kreislauf geschlossen wird.

Bindung

E-2.H*

io

E-2 + H*. Lactose

E-1-H*

Freisetzung Lactose

E-1 »« H*. Lactose

wird mit der erzeugten elektrochemischen Potentialdifferenz hauptsächlich die ATP-Synthese angetrieben.) Lactose-Permease ist ein aus 417 Aminosäuren bestehendes Monomer. Sie besteht wie GLUT1 und der Oxalat-Transporter (Abschnitt 10.2E), mit dem sie entfernt verwandt ist, im wesentlichen aus 12 Transmembranhelices,

deren N-

und C-Termini sich im Cytoplasma befinden. Ähnlich wie die (Na*-K*)-ATPase besitzt sie zwei Hauptkonformationen (Abb. 10.22): 1. E-1, welche eine Lactosebindungsstelle mit niedriger Affinität besitzt, die zur Zellinnenseite weist. 2. E-2, welche eine Lactosebindungsstelle mit hoher Affinität besitzt, die der

Zellaußenseite zugewandt ist.

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Unterscheiden Sie zwischen passiv vermitteltem Transport, aktivem Transport und sekundär aktivem Transport. 2. Erklären Sie, warum die (Na*-K’)-ATPase und die Ca”*-ATPase den Transport nur in eine Richtung ausführen. 3. Erklären Sie, inwiefern ein Multidrug-Resistance-ABC-Transporter wie eine Flippase arbeitet.

Ronald Kaback zeigte, dass E-1 und E-2 nur ineinander übergehen können, wenn ihre H'- und Lactosebindungsstellen entweder beide besetzt oder beide leer sind. Dies verhindert den unkontrollierten Abbau des H*-Gradienten ohne Cotransport von Lactose in die Zelle. Es verhindert ebenfalls einen Transport von Lactose aus der Zelle heraus, weil das einen Cotransport von H* entgegen seines Konzentrationsgefälles erfordern würde. Die Röntgenstruktur von Lactose-Permease, komplexiert mit einem fest bindenden Lactoseanalog, die von Kaback und So Iwata aufgeklärt wurde, zeigt, dass dieses Protein aus zwei strukturell ähnlichen und zweifach symmetrisch positionierten Domänen besteht, die jeweils sechs transmembrane Helices enthalten (Abb. 10.23). Ein großer innen liegender hydrophiler Hohlraum ist zur cytoplasmatischen Seite der Membran hin offen (Abb. 10.23b). Diese Struktur ist der E-1-Zustand des Proteins. Das Lactoseanalog ist im Hohlraum an einer Stelle gebunden, die von beiden Seiten der Membran annähernd gleich weit entfernt ist. Das steht mit dem Modell im Einklang, dass die Lactose-Bindungsstelle abwechselnd von jeder Seite der Membran zugänglich ist (z.B. Abb. 10.13). Arg, His, Glu und Tyr-Reste, die Mutationsstudien zufolge mit der Protonentranslokation in Verbindung gebracht werden, befinden sich in der Nähe der Lactosebindungsstelle.

Zusammenfassung

347

Periplasma

(a)

Zusammenfassung 1: Der vermittelte und nicht vermittelte Transport einer Substanz durch eine

Membran wird durch die chemische Potentialdifferenz dieser Substanz getrieben. Ionophore erleichtern die Diffusion von Ionen, indem sie ein Ion binden, mit ihm durch die Membran diffundieren und es dann freisetzen; oder indem sie einen Kanal bilden. Porine bilden ß-Fass-Strukturen um einen zentralen Kanal, der für Anionen, Kationen oder bestimmte kleine Moleküle selektiv ist. Ionenkanäle vermitteln Membranpotentialänderungen, indem sie den schnellen und spontanen Transport von Ionen gestatten. Ionenkanäle sind hoch selektiv für gelöste Stoffe und öffnen und schließen sich (Torsteuerung) als Reaktion auf zahlreiche Stimuli. Nervenimpulse verwenden Ionenkanäle. Aquaporine enthalten Kanäle, die eine rasche Diffusion von Wasser, aber nicht von Protonen durch die Membran gestatten. Transportproteine wie GLUT1 wechseln zwischen zwei Konformationen, sodass die Ligandenbindungsstelle abwechselnd jeweils von der einen oder anderen Seite der Membran zugänglich ist. Aktiver Transport wird in den meisten Fällen durch ATP-Hydrolyse getrieben. Bei der (Na*-K*)-ATPase und der Ca”*-ATPase sind ATP-Hydrolyse und Ionentransport miteinander gekoppelt und gerichtet. ABC-Transporter nutzen die ATP-Hydrolyse, um Konformationsänderungen auszulösen, die Substanzen einschließlich amphiphiler Moleküle von einer Membranseite zur anderen befördern. Beim sekundär aktiven Transport treibt ein Ionengradient, der von einer ATPase aufrechterhalten wird, den Transport einer anderen Substanz. So wird beispielsweise der Transport von Lactose in eine Zelle durch die Lactose-Permease durch den Cotransport von H* angetrieben.

Abb. 10.23 Röntgenstruktur der Lactose-Permease aus E.coli. (a) Bänderdiagramm von der Membran, so dargestellt, dass die cytoplasmatische Seite oben ist. Die 12 transmembranen Helices sind in der Reihenfolge der Spektralfarben angefärbt, beginnend beim N-Terminus (violett) bis hin zum C-Terminus (rosa). Das gebundene Lactoseanalog

ist mit schwarzen Kugeln dargestellt. (b) Oberflächenmodell dagestellt wie Teil a. Es wurden aber die zwei Helices, die dem Betrachter in Teil a am nächsten sind, entfernt,

um die Lactose-Bindungsstelle erkennen zu können. Die Oberfläche ist entsprechend ihres

elektrostatischen geladene Flächen Flächen sind rot [Mit freundlicher

Potentials gefärbt. Positiv sind blau, negativ geladene und neutrale Flächen sind weiß. Genehmigung von

H. Ronald Kaback, UCLA. PDBid 1PV7.]

348

Membrantransport

Wichtige Begriffe Aquaporin

Tormechanismus

chemisches Potential A elektrochemisches Potential nicht vermittelter Transport vermittelter Transport

mechanosensitiver Kanal ligandengesteuerter Kanal signalgesteuerter Kanal spannungsgesteuerter Kanal Depolarisierung Repolarisierung Aktionspotential

passiv vermittelter Transport

aktiver Transport Ionophor

Gap junction (offener Zellkontakt) Uniport Symport Antiport primär aktiver Transport

sekundär aktiver Transport ABC-Iransporter

Aufgaben

ng)

ee

Il, Geben Sie an, ob die folgenden Verbindungen eine

Membran eher durch nicht vermittelten oder vermittelten Transport durchqueren werden: (a) Ethanol, (b) Glycin, (c) Cholesterin,

(d) ATP.

Ordnen Sie die folgenden Verbindungen nach der Diffusionsgeschwindigkeit durch die Membran: A. Acetamid B. Butyramid C. Harnstoff

I

Kenn,

CH, Z CH) "CB

A. Acetamid

Die Einwanderungsgeschwindigkeit (Flux) einer Substanz X in Zellen wurde bei verschiedenen Konzentrationen von X gemessen und der folgende Graph erstellt. (a) Legt diese Information nahe, dass die Wanderung von X in Zellen durch ein Transportprotein vermittelt wird? (b) Welches zusätzliche Experiment würden Sie durchführen, um zu beweisen, dass ein Transportprotein beteiligt ist oder nicht beteiligt ist?

\C-NE,

B. Butyramid

Flux

n H,N—

(& —NH3

C. Harnstoff

Berechnen Sie die Änderung der Freien Enthalpie für den Glucoseeintritt in Zellen, wenn die extrazelluläre Konzentration bei 5 mM und die intrazelluläre Konzentration bei 3 mM liegt. (a) Berechnen Sie die chemische Potentialdifferenz, wenn bei 37°C die intrazelluläre [Na*] = 10 mM und die extrazelluläre [Na'] = 15 mM beträgt. (b) Wie groß wäre das elektrochemische Potential, wenn das Membranpotential bei -60 mV (innen negativ) läge? Berechnen Sie für die Aufgabe im Rechenbeispiel 10.1 AG bei 37°C, wenn das Membranpotential (a) -50 mV (Cytosol negativ) und (b) +150 mV beträgt. In welchem Fall ist die Ca”*-Bewegung in der markierten Richtung thermodynamisch günstig? Was geschieht mit dem K*-Transport durch Valinomycin, wenn die Membran unter ihre Übergangstemperatur abgekühlt wird? Wie lange würden 100 Moleküle Valinomycin benötigen, um genügend K* zu transportieren, damit sich die Konzentration in einem roten Blutkörperchen mit einem Volumen von 100 um’ um 10 mM ändert? (Nehmen Sie an, dass Valinomycin kein Kalium aus der Zelle heraustransportiert — was es in der Realität natürlich tun würde und dass die Valinomycinmoleküle jederzeit mit K* gesättigt sind.)

X Wenn die ATP-Versorgung in der Zelle, wie in Abbildung 10.21c gezeigt, plötzlich aufhörte, würde die intrazelluläre Glucosekonzentration ansteigen, absinken oder gleich bleiben? 10. Endothelzellen und Pericyten in der Retina (Netzhaut) des Auges haben unterschiedliche Mechanismen für die Aufnahme von Glucose. Die Abbildung unten zeigt die Geschwindigkeit der Glucoseaufnahme für jeden Zelltyp in Gegenwart steigender Natriummengen. Was sagen

diese Ergebnisse über die Glucosetransporter beider Zelltypen aus?

Endothelzellen

Pericyten

Glucoseaufnahme der Geschwindigkeit

[Na*]

Literatur

11. Die unten gezeigte Verbindung ist der antiparasitäre Wirkstoff Miltefosin. o

| CH; et (CHa)15 Zn (0)= Ze GH,

349

(c) Wie würde der Na*-Strom durch den Ionenkanal das Membranpotential verändern? 14. Zellen in der Magenwand von Säugern sezernieren HCl mit einer Konzentration von 0,15 M. Die sezernierten

—

CH, —N

(CH)

Miltefosin

(a) Ist diese Verbindung ein Glycerophospholipid? (b) Wie durchquert Miltefosin vermutlich die Zellmembran des Parasiten? (cl) In welchem Teil der Zelle wird sich der Wirkstoff anreichern? Erklären Sie Ihre Antwort. (d) Miltefosin bindet an ein Protein, das auch Sphingolipide und Glycerophospholipide bindet. Welches Merkmal, das all diesen Verbindungen gemeinsam ist, wird vom Protein erkannt? Das Protein bindet keine Triacylglycerine. 12. Bei Eukaryoten werden Ribosomen (Masse ca. 4 X 10° D) innerhalb des Zellkerns zusammengebaut, der von einer

Doppelmembran umgeben ist. Die Proteinsynthese spielt sich im Cytosol ab. (a) Könnte ein Protein, das einem Porin oder dem Glucosetransporter ähnelt, für den Transport der Ribosomen ins Cytoplasma verantwortlich sein? Geben Sie eine Erklärung. (b) Wäre für den Transport eines Ribosoms vom Zellkern zum Cytoplasma Freie Enthalpie erforderlich? Warum oder warum nicht? 13. Neben Neuronen erfahren auch Muskelzellen aufgrund der Aktivität des Acetylcholinrezeptors eine Depolarisierung, wenn auch geringer und langsamer als diejenige in einer Nervenzelle. (a) Der Acetylcholinrezeptor ist auch ein torgesteuerter Ionenkanal. Was löst das Öffnen und Schließen des Tors aus? (b) Der Acetylcholinrezeptor/Ionenkanal ist spezifisch für Na*-Ionen. Würden Na*'-Ionen ein- oder ausströmen? Warum?

Protonen, die aus der intrazellulären Hydratisierung von

CO, durch Carboanhydrase stammen, werden durch einen (H"-K")-ATPase-Antiport herausgepumpt. Auch ein K*-CTCotransporter ist erforderlich, um den Gesamttransportvorgang abzuschließen. (a) Berechnen Sie den pH-Wert des sezernierten HCl. Wie ist dieser im Vergleich zum cytosolischen

pH-Wert (7,4)?

(b) Formulieren Sie die Reaktion, die von der Carboanhydrase katalysiert wird. (c) Zeichnen Sie ein Diagramm, um zu zeigen, wie die Wirkung beider Transportproteine die Sekretion von HCl zur Folge hat. 15. Warum würde die Überexprimierung eines MDR-Transporters in einer Krebszelle die Behandlung des Krebses erschweren?

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 3 Carbonic Anhydrase II Definciency Carbonic anhydrase plays a role in normal bone tissue formation Case Study 14 Shavings from the Carpenter’s Bench: The Biological Tole of the Insulin C-peptide Recent experiments indicate that the insulin C-Peptide, which is removed on conversion of proinsulin to insulin, may have biological activity in its own right. Case Study 17 A Possible Mechanism for Blindness Associated with Diabetes: Na*-Dependent Glucose Uptake by Retinal Cells Glucose transport into cells can influence collagen synthesis, which causes the basement membrane thickening associated with diabetic retinopathy.

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TEIL IN Enzyme

Wie diese Akrobaten agieren Enzyme mit hoher Geschwindigkeit und großer Präzision, wenn sie auf ein Substrat einwirken, um eine chemische

Umwandlung zu erleichtern. [David Madison/Stone/Getty Images.]

Enzymatische Katalyse EEE

ET

TEL ET TEERNSTENTEWEELT

IEE DELETE

Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 10

Interactive Exercise 6

Reaktionsverlauf

Interactive Exercise 7

© Katalysemechanismen

Interactive Exercise 8

® Lysozym

Animated Figure 10-15

» Serinproteasen

Animated Figure 10-18 Kinemage 9 Kinemage 10-1 Kinemage 10-2 Kinemage 10-3 Case Study 11

Lebende Systeme werden durch eine enorme Vielfalt biochemischer Reaktionen geformt. Die meisten dieser Reaktionen werden durch eine Reihe erstaunlicher biologischer Katalysatoren vermittelt, die als Enzyme bezeichnet werden. Die Wurzeln der Enzymologie, der Lehre von den Enzymen, reichen bis in die Anfangstage der Biochemie zurück. Beide Disziplinen entwickelten sich aus Untersuchungen zur Gärung (Fermentation) und Verdauung im 19. Jahrhundert. Da es anfangs nicht möglich war, die meisten biochemischen Reaktionen im Labor zu reproduzieren, nahmen Louis Pasteur und andere an, dass lebenden Systemen eine „Lebenskraft“ innewohnt, die es ihnen erlaubt, den für unbelebte Ma-

terie geltenden Naturgesetzen zu entgehen. Andere Forscher, allen voran Justus von Liebig, glaubten jedoch, dass biologische Reaktionen durch die Aktivität chemischer Substanzen, die damals als „Fermente“ bekannt waren, zustande kommen. Tatsächlich wurde der Name „Enzym“ (griech.: en, in; zyme, Hefe) 1878 geprägt, um zu unterstreichen, dass etwas in der Hefe, und nicht Hefe selbst, Fermentationsreaktionen katalysiert. Eduard Buchner konnte schließlich zeigen, dass ein zellfreier Hefeextrakt tatsächlich die Synthese von Ethanol aus Glucose (alkoholische Gärung; Abschnitt 15.3B) durchführen konnte: C;H120%

+2

CH;CH;,0OH

+2

CO;

Diese chemische Umwandlung erfolgt in zwölf enzymkatalysierten Stufen. Die chemische Zusammensetzung von Enzymen war bis 1926 nicht genau bekannt. Dann gelang es James Sumner, Schwertbohnen-Urease (katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff zu NH, und CO,) zu kristallisieren und zu zeigen, dass diese Kristalle aus Protein bestehen. In der Folge durchgeführte enzymologische Untersuchungen haben bestätigt, dass die weitaus meisten Enzyme Proteine sind. Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

Enzymatische Katalyse ine Eigenschaften Ei e Allgemeine von Enzymen e Aktivierungsenergie und

354

_Enzymatische Katalyse

Bestimmte Arten von RNA-Molekülen, die auch als Ribozyme bekannt sind, besitzen enzymatische Aktivität. Zu ihnen gehört die ribosomale RNA, die die Bildung von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren katalysiert. Tatsächlich wurden in Laborexperimenten Ribozyme hergestellt, die Reaktionen katalysieren können, die den Reaktionen ähneln, die für die Replikation von DNA, die Transkription von DNA in RNA und das Anheften von Aminosäuren an Transfer-RNA benötigt werden. Dies Entdeckungen passen zur Vorstellung einer präzellulären Welt, in der die RNA-Moleküle die wichtigsten Katalysatoren der Biochemie waren. Die heutigen RNA-Katalysatoren sind vermutlich Überbleibsel aus dieser früheren „RNA-Welt“. Proteine haben RNA als zelluläre Katalysatoren weit in den Schatten gestellt, vermutlich weil sie über eine größere chemische Vielseitigkeit verfügen. Während Nucleinsäuren Polymere aus nur vier Typen von chemisch recht ähnlichen monomeren Einheiten sind, haben Proteine 20 Typen von Aminosäuren mit einer größeren Vielfalt von funktionellen Gruppen zur Verfügung. Dieses Kapitel beschäftigt sich mit einer der zentralen Fragen der Biochemie: Wie arbeiten Enzyme? Wir werden sehen, dass Enzyme die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen erhöhen, indem sie die Energiebarriere, die Reaktanten und Produkte trennt, herabsetzen. Enzyme arbeiten nach unterschiedlichen Mechanismen, die von der Anordnung der funktionellen Gruppen im aktiven Zentrum des Enzyms abhängen (an diesem ist seine katalytische Aktivität lokalisiert). Dieses Kapitel beschreibt diese Reaktionen und Beispiele, die zeigen, wie Enzyme verschiedene Mechanismen kombinieren, um biologische Reaktionen zu katalysieren. Das darauf folgende Kapitel befasst sich mit Untersuchungen zur Enzymkinetik, den Studien zur Geschwindigkeit, mit der solche Reaktionen ablaufen.

1

Allgemeine Eigenschaften von Enzymen

Obwohl Enzyme denselben Naturgesetzen unterliegen, die das Verhalten anderer Substanzen bestimmen, zeigte die biochemische Forschung seit Pasteurs Zeiten, dass sich Enzyme in einigen wichtigen Punkten von üblichen chemischen Katalysatoren unterscheiden: 1. Höhere Reaktionsgeschwindigkeiten. Die Geschwindigkeiten enzymatisch katalysierter Reaktionen sind in der Regel 10°- bis 10'*-mal größer als die entsprechender nicht katalysierter Reaktionen (Tab. 11.1) und um mindestens einige Größenordnungen höher als die entsprechender chemisch katalysierter Reaktionen. 2. Mildere Reaktionsbedingungen. Enzymatisch katalysierte Reaktionen laufen unter relativ milden Bedingungen ab: Temperaturen unter 100°C, Atmosphärendruck und fast neutrale pH-Werte. Im Gegensatz dazu erfordert Tab. 11.1

Katalytische Stärke einiger Enzyme.

Enzym

Nicht enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit (s')

Enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit (s"')

Geschwindigkeitserhöhung

Carboanhydrase

13x10

1.x10-

7,7. 210°

Chorismat-Mutase

26

50

1,9210.

Triosephosphat-Isomerase

4,3 x 107°

4300

1,0 x 10°

Carboxypeptidase A

3,0.% 107°

578

79710,

AMP-Nucleosidase

1.0 21023

60

6,0 x 10"

Staphylococcen-Nuclease

22108

95

56x10

Nach: Radzicka, A., und Wolfenden, R., Science 267, 91 (1995).

Allgemeine Eigenschaften von Enzymen

355

eine effektive chemische Katalyse oft erhöhte Temperaturen und Drücke sowie extreme pH-Werte.

3. Größere Reaktionsspezifität. Enzyme sind hinsichtlich der Identität ihrer Substrate (Reaktanten) und Produkte wesentlich spezifischer als chemische Katalysatoren, d.h. bei enzymatischen Reaktionen treten nur selten Nebenprodukte auf. 4. Regulationsmöglichkeit. Die katalytische Aktivität vieler Enzyme ist abhängig von der Konzentration von Nicht-Substrat-Substanzen. Zu den Mechanismen dieser Regulationsprozesse gehören die allosterische Kontrolle, kovalente Modifikation von Enzymen sowie die Änderung der synthetisierten Enzymmenge.

A.

Nomenklatur von Enzymen

Bevor wir uns näher mit den spezifischen Eigenschaften der Enzyme beschäftigen, zuerst ein Wort zur Nomenklatur. Enzyme werden im Allgemeinen durch Anhängen der Endung -ase an das Enzymsubstrat oder die Beschreibung der katalysierten Reaktion benannt. Folglich katalysiert die Urease die Hydrolyse von Harnstoff (Urea) und die Alkoholdehydrogenase die Oxidation von Alkoholen zu den entsprechenden Aldehyden. Da es anfangs keine systematischen Regeln zur Benennung von Enzymen gab, kam es manchmal vor, dass zwei unterschiedliche Namen dasselbe Enzym bezeichneten oder, im umgekehrten Falle, derselbe Name für zwei verschiedene Enzyme gebraucht wurde. Auch erhielten viele Enzyme wie z.B. die Katalase (katalysiert den Zerfall von H,O, in H,O und O,) Namen, die keinerlei Hinweise zu ihrer Funktion geben. Um diese Verwechslungen auszuräumen und um eine rationale Benennung der schnell wachsenden Anzahl neu entdeckter Enzyme zu gewährleisten, führte die „International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)“ ein Schema zur systematischen funktionellen Klassifizierung und Nomenklatur von Enzymen ein. Enzyme werden nach der Natur der chemischen Reaktion, die sie katalysieren, eingeteilt und benannt. Es gibt sechs Hauptklassen enzymatischer Reaktionen (Tab. 11.2), die weiter in Unterklassen (und noch weiter) unterteilt werden können. Jedes Enzym erhält zwei Namen und eine vierstellige Klassifikationsnummer. Das Synonym eines Enzyms ist hilfreich für den täglichen Gebrauch und ist oft der ehemals übliche Trivialname. Der systematische Name wird benutzt,

wenn Unklarheiten vermieden werden sollen. Dem/n Namen der Substrat/e folgt die Reaktionsbezeichnung nach der Hauptgruppeneinteilung des Enzyms mit der Endung -ase. So lautet z.B. der systematische Name der Aconitase (Abschnitt 17.3B) Aconitat-Hydratase mit der Klassifikationsnummer EC 4.2.1.3 („EC“

steht

für „Enzyme

Commission“

und

die

Zahlen

bedeuten

Klasse,

Gruppe, Untergruppe und die willkürlich zugewiesene Seriennummer innerhalb der Untergruppe des Enzyms). Für unsere Zwecke sind die Synonymnamen der Enzyme ausreichend. In verschiedenen über das Internet zugänglichen Datenbanken werden aber in zunehmenden Maße die EC-Klassifikationsnummern verwendet (Exkurs 14.2). Die systematischen Namen und EC-Klassifizierungsnummern findet man im Internet (http://www.expasy.org/enzmye/).

B.

_Substratspezifität

Substrate und andere Moleküle binden an Enzyme durch dieselben nicht kovalenten Kräfte, die auch die Konformationen der Proteine bestimmen (Abschnitt 6.4A). In beiden Fällen handelt es sich um van-der-Waals-, elektrostatische, Was-

serstoffbrücken- und hydrophobe Wechselwirkungen. Im Allgemeinen besteht eine Substratbindungsstelle aus einer Vertiefung oder Spalte an der Oberfläche

Tab. 11.2 Enzymklassifizierung nach dem Reaktionstyp. Einteilung

Art der katalysierten Reaktion

1. Oxido-

Oxidations-Reduktions-

reduktasen

Reaktionen

2. Transferasen

Übertragung funktioneller Gruppen

3. Hydrolasen

Hydrolysereaktionen

4. Lyasen

Eliminierung von Gruppen unter Ausbildung von Doppelbindungen

5. Isomerasen

Isomerisierungen

6. Ligasen

mit ATP-Hydrolyse gekoppelte Knüpfung von Bindungen

356

Enzymatische Katalyse

eines Enzyms, deren Form zum Substrat komplementär ist (geometrische Komplementarität). Außerdem sind die Aminosäurereste in der Bindungsstelle so angeordnet, dass es zu spezifischen Wechselwirkungen mit dem Substrat kommt (elektronische Komplementarität; Abb. 11.1). Moleküle, die sich in Form oder Verteilung ihrer funktionellen Gruppen vom Substrat unterscheiden, können nicht wirkungsvoll bzw. produktiv an das Enzym binden. Röntgenstrukturuntersuchungen zeigen, dass die Substratbindungsstellen der meisten Enzyme größtenteils vorgeformt sind, es aber trotzdem während der Substratbindung zu Konformationsänderungen kommt. Dieses Phänomen wird als „induced fit“ bezeichnet (engl. für „induzierte Passform“). Die Komplementarität zwischen Enzymen und ihren Substraten ist Grundlage des „SchlüsselSchloss-Modells“, das Emil Fischer 1894 als erster postulierte. Wie wir im Weiteren noch sehen werden, ist eine spezifische Bindung notwendig, aber nicht ausreichend, für eine wirksame Katalyse. : Enzyme sind stereospezifisch

Sowohl bei der Bindung chiraler Substanzen als auch bei der Katalyse ihrer Reaktionen sind Enzyme hochspezifisch. Diese Stereospezifität entsteht dadurch, dass die bereits von Natur aus chiralen Enzyme (Proteine bestehen nur aus 1-Aminosäuren) asymmetrische aktive Zentren ausbilden. Das Enzym Aconitase zum Beispiel katalysiert die Umwandlung von Citrat und Isocitrat im Citratcyclus (Abschnitt 17.3B): Abb. 11.1 Ein Enzym-Substrat-Komplex. Die geometrische und physikalische Komplementarität beruhen auf nicht kovalenten Kräften. Ein h in einem braunen Kreis bedeutet hydrophobe Gruppe und gestrichelte Linien stehen für Wasserstoffbrücken.

(0/0103

cs

|

OH2 HO_-CC007 |

CR c00” Citrat

CH, 7—

Aconitase

7

7H—-C—C007z |

EO_— ogl cC00° Isocitrat

Citrat ist ein prochirales Molekül, d.h. es kann durch die Substitution einer seiner zwei Carboxymethyl (-CH,COO’°)-Gruppen chiral werden (Chiralität wird in Abschnitt 4.2 diskutiert). Diese Gruppen sind chemisch äquivalent, besetzen aber relativ zu ihren OH- und COO-Gruppen verschiedene Positionen (vergleichbar mit dem menschlichen Körper, der bilateral symmetrisch ist, aber eine unterschiedliche rechte und linke Seite besitzt). Die Aconitase kann deshalb zwischen ihnen unterscheiden, da Citrat asymmetrisch mit der Oberfläche des Enzyms in Wechselwirkung tritt, indem es an drei Punkten bindet (Abb. 11.2). Da es nur eine produktive Art für Citrat gibt an das Enzym zu binden, reagiert nur eine der -CH,COO"-Gruppen und es entsteht Isocitrat. Die Stereospezifität der Aconitase ist keineswegs unüblich. Beinahe alle Enzyme, die an chiralen Reaktionen beteiligt sind, arbeiten absolut stereospezifisch. Enzyme unterscheiden sich hinsichtlich ihrer geometrischen Spezifität Angesichts der Komplementarität der Bindungsstelle eines Enzyms zum Substrat ist die Stereospezifität der Enzyme nicht sonderlich überraschend. Eine Substanz falscher Chiralität wird nicht in die Bindungsstelle des Enzyms passen, so wie eben eine rechte Hand

Abb. 11.2 Stereospezifität bei der Substratbindung. Die spezifische Bindung eines prochiralen Moleküls wie Citrat an das aktive Zentrum erlaubt es dem Enzym, zwischen prochiralen Gruppen zu unterscheiden.

nicht in einen linken Handschuh

passt.

Zusätzlich zu ihrer Stereospezifität sind die meisten Enzyme auch sehr selektiv bezüglich der Strukturen der chemischen Gruppen ihrer Substrate. Tatsächlich ist eine solche geometrische Spezifität zwingender erforderlich als Stereospezi-

fität.

Enzyme unterscheiden sich erheblich im Grad ihrer geometrischen Spezifität. Einige wenige Enzyme sind absolut spezifisch für eine einzige Verbindung. Die meisten Enzyme katalysieren jedoch die Reaktionen einer kleinen Gruppe verwandter Verbindungen wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz. Die Alko-

Allgemeine Eigenschaften von Enzymen

hol-Dehydrogenase zum Beispiel katalysiert die Oxidation von Ethanol (CH;CH;OH) zu Acetaldehyd (CH,CHO) schneller als sie Methanol (CH,OH) zu Formaldehyd (H,CO) oder Isopropanol [(CH;), CHOH] zu Aceton [(CH;),CO] oxidiert, obwohl sich Methanol und Isopropanol von Ethanol nur um eine CH,-Gruppe unterscheiden. Einige Enzyme, insbesondere Verdauungsenzyme, tolerieren eine so große Bandbreite an Substraten, dass ihre geometrische Spezifität besser als Präferenz bezeichnet werden sollte. Manche Enzyme sind nicht einmal für den Reaktionstyp spezifisch, den sie katalysieren. Chymotrypsin katalysiert z.B. neben der Hydrolyse von Peptidbindungen auch die Hydrolyse von Esterbindungen. O REIZE NHRMF

Chymotrypsin EHE

I ROOT

+

+ HLNR

Peptid

[6)

RC

Re

Ester

Chymotrypsin

OÖ |

RC--O5..-44HOR:

nt

Diese Eigenschaft erleichtert die Messung der Chymotrypsinaktivität durch den Einsatz kleiner synthetischer Ester als Substrate. Eine derartige Toleranz ist allerdings eher die Ausnahme als die Regel. Die meisten intrazellulären Enzyme katalysieren in vivo eine bestimmte Reaktion eines spezifischen Substrats.

C.

_ Cofaktoren und Coenzyme

Die funktionellen Gruppen von Enzymproteinen können Säure-Base-Reaktionen katalysieren, kovalente Bindungen öffnen und schließen und an elektrostatischen Wechselwirkungen beteiligt sein. Für die Katalyse von Reduktions-Oxidations-(Redox-)Reaktionen und vieler Arten von Gruppenübertragungsprozessen

sind sie allerdings weniger geeignet. Enzyme können zwar solche Reaktionen katalysieren, benötigen dazu aber kleine Moleküle als Cofaktoren, die sozusagen als „chemische Zähne“ der Enzyme fungieren (Abb. 11.3). Cofaktoren können Metallionen sein, wie z.B. Cu?*, Fe’* oder Zn”*. Die essentielle Natur dieser Cofaktoren erklärt, warum Organismen diese Spurenelemente mit der Nahrung aufnehmen müssen. Es erklärt aber auch teilweise die Toxizität gewisser Schwermetalle. Beispielsweise können Cd’”* und Hg”* das Zn”* (alle stehen in derselben Gruppe im Periodensystem der Elemente) im aktiven Zentrum bestimmter Enzyme ersetzen, einschließlich der RNA-Polymerase, und dadurch diese Enzyme inaktivieren. Cofaktoren können auch kleine organische Moleküle sein, die dann als Coenzyme bezeichnet werden. Einige Cofaktoren sind nur vorübergehend mit einem bestimmten Enzymmolekül assoziiert, so dass sie als Cosubstrate fungie-

Abb. 11.3

Cofaktortypen

357

358

_Enzymatische Katalyse

Nicotinamid

D-Ribose

j|

Reduzierte Form

Oxidierte Form

oO l

C

LIES

DR

NH, + 2[41 >

O I

en

neh

NH, + H*

Abb. 11.4 Strukturen und Reaktionen von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD*) und Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP*). Ihre reduzierten Formen sind NADH und NADPH. Diese

Adenosin

Substanzen, die kollektiv als Nicotinamid-Coenzyme oder

x=H

Nicotinamidadenindinucleotid (NAD*)

X=PO?

Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP*)

Pyridinnucleotide (Nicotinamid ist ein Pyridinderivat) bezeichnet werden, fungieren als intrazelluläre Elektronenüberträger. Ihre Reduktion (Addition von Elektronen) entspricht formal der Übertragung von zwei Wasserstoffatomen (H-) oder eines Hydridions und eines Protons (H:”+ H*). Man beachte, dass nur der Nicotinamidring an der Reaktion teilnimmt.

ren. Nicotinamidadenindinucleotid (NAD*) und Nicotinamidadenindnucleotidphosphat (NADP*) sind Beispiele für Cosubstrate (Abb. 11.4). NAD" z.B. ist das obligatorische Oxidationsmittel in der durch Alkohol-Dehydrogenase (ADH)-katalysierten Reaktion:

CH;CH;OH Ethanol

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Durch welche Eigenschaften unterscheiden sich Enzyme von anderen Katalysatoren? 2. Welche Faktoren beeinflussen die Substratspezifität eines Enzyms? 3. Warum sind für einige enzymatische Reaktionen Cofaktoren notwendig? 4. Welche Beziehung besteht zwischen Cofaktoren, Coenzymen, Cosubstraten und prosthetischen Gruppen?

+ NAD

ADH

——

il

CH;CH

+ NADH

+ H*

Acetaldehyd

Das Produkt NADH dissoziiert vom Enzym und kann nachfolgend in einer unabhängigen enzymatischen Reaktion wieder oxidiert werden. Andere Cofaktoren, auch als prosthetische Gruppen bekannt, sind permanent, oft durch kovalente Bindungen, mit ihrem Protein assoziiert. Eine prosthetische Hämgruppe (Abb. 7.2) ist z.B. fest an die als Cytochrome bekannten Proteine (Abb. 6.32 und Exkurs 18.1) gebunden. Die Bindung erfolgt über umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen in Kombination mit kovalenten Bindungen zwischen dem Häm und spezifischen Proteinseitenketten. Ein katalytisch aktiver Enzym-Cofaktor-Komplex wird als Holoenzym bezeichnet. Das katalytisch inaktive Protein ohne den Cofaktor des Holoenzyms nennt man Apoenzym; also: Apoenzym (inaktiv) + Cofaktor = Holoenzym (aktiv) Coenzyme müssen regeneriert werden

Coenzyme werden durch die enzymatischen Reaktionen, an denen sie beteiligt sind, chemisch verändert. Um den katalytischen Cyclus zu vollenden muss das Coenzym in seinen Ausgangszustand zurückkehren. Bei prosthetischen Gruppen erfolgt die Regeneration in einer getrennten Phase der enzymatischen Reaktionssequenz. Die Regeneration vorübergehend gebundener Coenzyme (Cosubstrate) wie NAD" kann jedoch auch von einem anderen Enzym katalysiert werden.

Aktivierungsenergie und Reaktionsverlauf

2

359

Aktivierungsenergie und Reaktionsverlauf

Die Theorie des Übergangszustands, die hauptsächlich von Henry Eyring in den 1930er Jahren entwickelt wurde, trug viel zu unserem Verständnis bei, wie Enzyme Reaktionen katalysieren. Betrachten wir eine bimolekulare Reaktion dreier Atome, wie z.B. bei der Reaktion eines Wasserstoffatoms mit diatomarem Wasserstoff (H,) zu einem neuen H,-Molekül und einem anderen H-Atom: B—H,#+ H.>H, + H,—;

Bei dieser Reaktion muss

sich H. so an das diatomare Molekül H,—H,

an-

nähern, dass an irgendeinem Punkt der Reaktion ein energiereicher Komplex H,: + H3: - » He entsteht. In diesem Komplex bricht die kovalente H,—H;Bindung gerade auf, während die Hz—H--Bindung gerade entsteht. Der Punkt der höchsten Freien Enthalpie wird als Übergangszustand des Systems

bezeichnet. Die Reaktanten nähern sich einander gewöhnlich entlang des Wegs der geringsten Freien Enthalpie, ihrer sogenannten Reaktionskoordinate. Die Auftragung der Freien Enthalpie gegen die Reaktionskoordinate wird als Übergangszustands- oder Reaktionskoordinatendiagramm bezeichnet (Abb. 11.5). Reaktanten und Produkte befinden sich im Zustand der geringsten Freien Enthalpie, während der Übergangszustand dem höchsten Punkt des Diagramms entspricht. Bei der Reaktion H + H, haben Reaktanten und Produkte dieselbe Freie Enthalpie (Abb. 11.5a). Sind am Reaktionssystem verschiedene Atome beteiligt, wie bei der Reaktion

AzB>X->P+Q mit den Reaktanten A und B, den Produkten P und Q und dem Symbol für den Übergangszustand X', dann ist das Übergangszustandsdiagramm nicht mehr symmetrisch, da ein Unterschied in der Freien Enthalpie zwischen Reaktanten und Produkten besteht (Abb. 11.5b). In beiden Fällen wird AG‘, die Differenz der Freien Enthalpie zwischen Übergangszustand und Reaktanten, als Freie Aktivierungsenthalpie bezeichnet. Der Übergangszustand wird in 10° bis 10”'* s durchlaufen, so dass seine Konzentration in einem Reaktionssystem gering ist. Daher wird der Zerfall des Übergangszustands in die Produkte (oder zurück zu den Reaktanten) als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Gesamtreaktion postuliert. Thermodynamische Betrachtungen zeigen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit propor-

Abb. 11.5 Übergangszustandsdiagramm. (a) Die Reaktion H + H,. Reaktanten und Produkte entsprechen den niederenergetischen Zuständen. Der Punkt der höchsten Freien Enthalpie ist der

Übergangszustand, bei dem die Reaktanten teilweise in die Produkte umgewandelt sind. AG) ist die Freie Aktivierungsenthalpie, die Energie-

differenz zwischen Reaktanten und Übergangszustand X. (b) Übergangszustandsdiagramm für die Reaktion A+ B— P +Q. Diese Reaktion läuft spontan ab, d.h. AGpeaktion < O0 (die Freie Enthalpie von P + Q ist geringer als die Freie Enthalpie von A + B).

(b)

(a)

/\

re

er Es,

Reaktion

als

ee P+Q

Reaktionskoordinate

Reaktionskoordinate

360

Enzymatische Katalyse

tional zu e?*RT ist, wobei R die allgemeine Gaskonstante und T die absolute

Temperatur sind. Folglich gilt, je größer der Wert für AG‘, desto geringer die Reaktionsgeschwindigkeit. Je größer AG nämlich wird, desto kleiner wird die Zahl der

At

Reaktanten-Moleküle,

die über ausreichend thermische

Energie verfügen, um

die Freie Enthalpie des Übergangszustands zu erreichen. Chemische Reaktionen verlaufen im Allgemeinen über mehrere Stufen. Bei einer zweistufigen Reaktion wie z.B. A—IP A

>|

> P

Reaktionskoordinate

Abb. 11.6 Übergangszustandsdiagramm einer zweistufigen Reaktion. Bei der blauen Kurve ist der erste Schritt der

Reaktion (A— I — P) geschwindigkeitsbestimmend,

bei der Reaktion der roten Kurve

der zweite Schritt.

wobei I ein Intermediat der Reaktion darstellt, gibt es zwei Übergangszustände und zwei Aktivierungsenergiebarrieren. Das Übergangszustandsdiagramm zeigt die relativen Geschwindigkeiten der beiden Reaktionsschritte (Abb. 11.6). Ist die Aktivierungsenergie des ersten Schritts größer als die des zweiten, dann verläuft der erste Reaktionsschritt langsamer als der zweite. Umgekehrt ist die zweite Reaktionsstufe langsamer als die erste, wenn die Aktivierungsenergie der zweiten Stufe größer ist. Bei einer mehrstufigen Reaktion wirkt der Schritt mit der höchsten Freien Enthalpie des Übergangszustands als „Flaschenhals“ und wird daher als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Reaktion bezeichnet. Katalysatoren verringern AG'

nicht katalysiert

MAG, (Verringerung von

AG*® durch den Katalysator)

Katalysatoren erniedrigen die Freie Enthalpie des Übergangszustands der katalysierten Reaktion (Abb. 11.7). Die Differenz der AG'-Werte zwischen katalysierter und nicht katalysierter Reaktion, AAG,.,, kennzeichnet die Effizienz des Katalysators. Die Geschwindigkeitserhöhung (Verhältnis der Geschwindigkeiten von kataly-

sierter und unkatalysierter Reaktion) ergibt sich nach e!**"®YRT, Folglich erforkatalysiert

A+B==P+Q Reaktionskoordinate

Abb. 11.7 Einfluss eines Katalysators auf das Übergangszustandsdiagramm einer Reaktion.

Hier gilt AAGL4= AGypar - ACka

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Zeichnen Sie Übergangszustandsdiagramme und benennen Sie deren verschiedene Abschnitte für eine Reaktion mit und ohne einen Katalysator. 2. Welche Beziehung besteht zwischen AG und AG’?

dert eine zehnfache Geschwindigkeitserhöhung nur ein AAG,., von 5,71 kJ - mol”', also weniger als die Hälfte der Energie einer typischen Wasserstoffbrückenbindung. Zu einer millionenfachen Beschleunigung kommt es bei AAGya> 34 kJ - mol’', was nur einem kleinen Teil der Energie der meisten kovalenten Bindungen entspricht. Theoretisch kann also durch die reaktiven Gruppen im aktiven Zentrum von Enzymen eine enorme katalytische Effizienz erreicht werden. Wie diese Gruppen auf atomarer Ebene arbeiten ist Thema eines großen Teils dieses und folgender Kapitel.

Man beachte hierbei, dass ein Katalysator die Energiebarriere um denselben Betrag sowohl für die Hin- als auch für die Rückreaktion senkt (Abb. 11.7), und folglich Hin- und Rückreaktionen gleichermaßen beschleunigt. Ein Katalysator kann zwar die Umwandlung der Reaktanten (Edukte) in die Produkte (oder Produkte zurück zu den Edukten) beschleunigen, aber die Wahrscheinlichkeit, ob die Reaktion in die eine oder die andere Richtung verläuft, hängt nur von der Energiedifferenz zwischen Reaktanten und Produkten ab. Wenn AGpeaktion < 0 ist, verläuft die Reaktion spontan von den Edukten zu den Produkten, ist AGpeaktion > 0, läuft die Rückreaktion ab. Ein Enzym kann AG psaktion nicht verändern, es kann lediglich AG'verringern. Dann stellt sich das Reaktionsgleichgewicht (in dem Hin- und Rückreaktion gleich schnell ablaufen) schneller ein als ohne Katalysator. Die tatsächliche Geschwindigkeit, mit der die Edukte in die Produkte umgewandelt werden, wird später im Abschnitt Enzymkinetik besprochen (Abschnitt 12.1).

Katalysemechanismen

3

_Katalysemechanismen

Enzyme erreichen ihre enorme Reaktionsbeschleunigung mittels derselben Mechanismen wie chemische Katalysatoren. Enzyme wurden einfach durch die Evolution weiter optimiert. Enzyme verringern, wie andere Katalysatoren auch,

die Freie Enthalpie des Übergangszustands (AG'), d.h. sie stabilisieren den Über-

gangszustand der katalysierten Reaktion. Die Spezifität der Substratbindung in Kombination mit der Anordnung der katalytischen Gruppen macht Enzyme zu derart effektiven Katalysatoren. Allerdings erfolgt die Einteilung in substratbindende Gruppen und katalytische Gruppen etwas willkürlich. Durch einen Vergleich mit entsprechenden nicht enzymatischen Reaktionen von Modellverbindungen kann man viel über enzymatische Reaktionsmechanismen lernen. Bei beiden Reaktionstypen kann man sich einer Pfeildarstellung bedienen, um die Verschiebung der Elektronenpaare während der Reaktion zu beschreiben. Die Bewegung eines Elektronenpaares (kann sowohl ein freies Elektronenpaar sein als auch ein Paar, das eine kovalente Bindung bildet) wird durch einen gebogenen Pfeil symbolisiert, der vom Elektronenpaar ausgehend auf das elektronenarme Atom zeigt, von dem das Elektronenpaar angezogen wird. Die Bildung eines Imins (Schiff’sche Base) beispielsweise, eine biochemisch bedeutsame Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd oder Keton, stellt sich folgendermaßen dar:

B

Ri,

R Amin

R'

oe

ö

—

Aldehyd oder Keton

BT

a

H

R’

Ht+

N ®

CarbinolaminIntermediat

Te

H,O

HR Imin (Schiff’sche Base)

Im ersten Reaktionsschritt lagert sich das freie Elektronenpaar des Amins an das elektronenarme Carbonyl-C-Atom an, während ein Elektronenpaar der C=ODoppelbindung auf das Sauerstoffatom übertragen wird. Im zweiten Schritt bindet das freie Elektronenpaar des N-Atoms an das elektronenarme C-Atom unter Abspaltung von Wasser. Während der gesamten Reaktionssequenz erfüllt das System die chemischen Bindungsregeln: So gibt es z.B. nie fünf Bindungen an einem C-Atom oder zwei Bindungen an einem H-Atom. Enzymatische Katalysemechanismen lassen sich wie folgt klassifizieren: Säure-Base-Katalyse Kovalente Katalyse Metallionenkatalyse Nachbargruppen- und Orientierungseffekte SA Stabilisierung des Übergangszustandskomplexes

A.

Säure-Base-Katalyse

Bei der allgemeinen Säurekatalyse erniedrigt ein partieller Protonentransfer von einer Säure die Freie Enthalpie des Übergangszustands einer Reaktion. So läuft z.B. eine nicht katalysierte Keto-Enol-Tautomerisierung auf Grund der hohen Energie (Freien Enthalpie) des carbanionoiden Übergangszustands (Abb. 11.80; der Übergangszustand steht in eckigen Klammern, um seine Instabilität zu symbolisieren) relativ langsam ab. Die Protonierung des Sauerstoffatoms (Abb. 11.8b) reduziert jedoch den Carbanioncharakter des Übergangszustands und beschleunigt dadurch die Reaktion.

361

362

_Enzymatische Katalyse

Abb. 11.8 Mechanismus der Keto-Enol-Tautomerie. (a) Nicht katalysiert. (b) Allgemeine Säurekatalyse. (c) Allgemeine Basekatalyse. H-A steht für die Säure, B für die Base.

| 0=09|

Hei —

| |

—

1

(€)

R

R ln

| c=o*-Ht-A° 4 CH3

Con

CH3-

|:

+

HB

I

A

2

H—A

iee

n

Hi

C—Oo—H+ | m CH

1

\|

en

C70-H

CH,

e

R N c=0+ | CC

——

en

@;

(b)

R

R

R (a)

Enol

Übergangszustand

Keto

Bö+

H,O + OH

ICom H+

I

CH,

+ H

H?

I— +B Bt

Eine Reaktion kann auch durch eine allgemeine Basekatalyse stimuliert werden, wenn sich ihre Geschwindigkeit durch eine teilweise Deprotonierung erhöht (z.B. Abb. 11.8c). Einige Reaktionen können gleichzeitig beiden Prozessen unterliegen, dabei handelt es sich um konzertierte Säure-Base-katalysierte Reaktionen. Viele biochemische Reaktionen sind säure- und/oder basekatalysiert. Die Seitenketten der Aminosäuren Asp, Glu, His, Cys, Tyr und Lys haben pK-Werte im oder nahe des physiologischen pH-Bereichs (Tab. 4.1), wodurch sie als Säureund/oder Basekatalysatoren fungieren können. Tatsächlich macht die Fähigkeit der Enzyme, mehrere katalytische Gruppen um ihre Substrate anzuordnen, die konzertierte Säure-Base-Katalyse zu einem verbreiteten enzymatischen Mechanismus. Die katalytische Aktivität dieser Enzyme ist pH-abhängig, da der pH-Wert den Protonierungszustand der Seitenketten im aktiven Zentrum beeinflusst (siehe Exkurs 11.1). Die RNase A-Reaktion

Abb. 11.9 Röntgenstruktur von RNase S aus Rinderpankreas. Das Dinucleosidphosphonat UpcA (rot), ein nicht hydrolysierbares Substratanalogon, ist im aktiven

Zentrum gebunden. RNase S ist eine katalytisch aktive Form der RNase A, bei der die Peptidbindung zwischen den Resten 20 und 21 hydrolysiert ist. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.] 6% siehe Interactive Exercises.

Ribonuclease (RNase) A aus Rinderpankreas ist ein gutes Beispiel für die enzymatische Säure-Base-Katalyse. Dieses Verdauungsenzym (Abb. 11.9) wird vom Pankreas (Bauchspeicheldrüse) in den Zwölffingerdarm (Duodenum) sezerniert, wo es RNA zu Mono-, Di- oder längeren Nucleotiden hydrolysiert. Die Isolierung von 2’,3'-cyclischen Nucleotiden aus einer RNase-A-Spaltung von RNA zeigt, dass 2’,3'-cyclische Nucleotide Intermediate der RNase-A-Reaktion sein müssen (Abb. 11.10). Die pH-Abhängigkeit der Geschwindigkeit der RNase-A-Reaktion deutet auf die Beteiligung zweier ionisierbarer Reste mit pK-Werten von 5,4 und 6,4. Diese Information zeigt zusammen mit den Ergebnissen aus chemischer Derivatisierung und Röntgenstrukturuntersuchungen, dass RNase A zwei essentielle His-Reste besitzt, His 12 und His 119, die gemeinsam als allgemeine Säure-Base-Katalysatoren fungieren. Offensichtlich läuft die RNase-AReaktion in zwei Stufen ab (Abb. 11.10):

Katalysemechanismen

2',3'-cyclisches Nucleotid

j

BIRD

Abb. 11.10 RNase-A-Mechanismus. Die von boviner pankreatischer RNase A katalysierte RNA-Hydrolyse verläuft in zwei Stufen mit der Bildung eines 2’,3’-cyclischen Nucleotids als Zwischenprodukt.

1. His 12 zieht als Base ein Proton von einer 2’-OH-Gruppe der RNA ab und

erleichtert dadurch den nucleophilen Angriff auf das benachbarte Phosphoratom. His 119 unterstützt als Säure den Bruch der Bindung durch eine Protonierung der Abgangsgruppe. 2. Das 2’,3’-cyclische Intermediat wird hydrolysiert; dies ist im Wesentlichen eine Umkehrung des ersten Schritts, bei der Wasser die Abgangsgruppe ersetzt. So wirken His 12 als Säure und His 119 als Base, um am Ende hydrolysiertte RNA und das Enzym im Ausgangszustand zu erhalten.

mcHae0

363

364

_Enzymatische Katalyse

Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert ren pK-Wert). Darüber hinaus kann die pH-abhängige Geschwindigkeitsabnahme einer enzymatischen Reaktion auch eher von der Denaturierung des Enzyms herrühren als von einer Protonierung oder Deprotonierung spezifischer katalytischer Reste. Durch die Substitution einer bestimmten Aminosäure durch ortsgerichtete Mutagenese oder den Vergleich evolutionär entstandener Enzymvarianten lassen sich die Reste, die an der Substratbindung oder Katalyse beteiligt sind, zuverlässiger bestimmen.

Die meisten Proteine sind nur innerhalb eines kleinen pHBereichs aktiv, typischerweise zwischen pH 5 und 9. Der pH-Wert beeinflusst mehrere Faktoren: (1) die Substratbindung an das Enzym, (2) den lonisierungsgrad der an der katalytischen Aktivität des Enzyms beteiligten Aminosäurereste, (3) die lonisierung des Substrats und (4) Veränderungen der Proteinstruktur (normalerweise nur in extremen pH-Bereichen von Bedeutung). Die Geschwindigkeiten vieler enzymatischer Reaktionen

zeigen als Funktion des pH-Werts eine glockenförmige Kurve. Die pH-Abhängigkeit der Geschwindigkeit einer durch Fumarase (Abschnitt 17.3G) katalysierten Reaktion zeigt folgenden Verlauf: Solche Kurven spiegeln den lonisierungszustand bestimmter Aminosäurereste wider, die für eine enzymatische Aktivi-

tät eine spezifische lonisierung aufweisen müssen. Die beobachteten pK-Werte (die Wendepunkte der Kurve) liefern oft wertvolle Hinweise, welche Aminosäuren für die enzymatische Aktivität essentiell sind. So deutet z.B. ein pK von ca. 4 auf die Bedeutung eines Asp oder Glu für das Enzym hin. Ebenso weist ein pK von ca. 6 oder ca. 10 auf die Beteiligung von His bzw. Lys. Allerdings kann der pK-Wert einer bestimmten Säure-Base-Gruppe in Abhängigkeit von seiner Mikroumgebung um bis zu mehrere pH-Einheiten von seinem erwarteten Wert abweichen (z.B. würde ein Asp-Rest in unpolarer Umgebung oder benachbart zu einem anderen Asp-Rest Protonen stärker als normal binden und hätte daher einen höhe-

B.

Geschwindigkeit

0

5

6

T

8

I

pH

[Abbildung nach Tanford, C., Physical Chemistry of Macromolecules,

S. 647, Wiley (1961).]

N

Kovalente Katalyse

Bei der kovalenten Katalyse wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch die vorübergehende Bildung einer kovalenten Katalysator-Substrat-Bindung erhöht. Normalerweise entsteht diese kovalente Bindung durch die Reaktion einer nucleophilen Gruppe am Katalysator mit einer elektrophilen Gruppe des Substrats. Daher wird diese Form der Katalyse oft auch als nucleophile Katalyse bezeichnet. Die Decarboxylierung von Acetoacetat, die chemisch durch primäre Amine katalysiert wird, ist ein Beispiel für einen derartigen Prozess (Abb. 11.11). Im ersten Schritt dieser Reaktion greift das Amin, ein Nucleophil, die Carbonylgruppe des Acetoacetats an und bildet eine Schiff’sche Base (Iminbindung). H

an —N—+

c0=0

Ihn‘ >=

N—C-—-OH

I =

—_n=cC

=

(EN

H (i :B

N HA

Schiff’sche Base R (Imin)

Das protonierte N-Atom des kovalenten Zwischenprodukts fungiert dann als Elektronenfalle (Abb. 11.11, unten) und verringert dadurch den energiereichen Enolatcharakter des Übergangszustands. Die Bildung und der Zerfall der Schiff’schen Base verlaufen relativ schnell, so dass dies nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion ist.

Katalysemechanismen

OB

Seen

re

co

EIN

— &—=CH,

-C

en

Acetoacetat

Mas

Rena

|

CH;

Enolat

—C— CH;

Aceton

RNH;

OH”

Abb. 11.11 Decarboxylierung von Acetoacetat. Der nicht katalysierte Reaktionsmechanismus ist oben dargestellt, unten der Mechanismus einer durch primäre Amine katalysierten Reaktion.

un

oLbn,

365

RNH, OH

Re N

CO,

a,

GC

CHE

Ray N

S x(0)

CH;

H+

See N

\

|

—C=CH;

CH;

—C—

CH;

Schiff'sche Base

(Imin)

Die kovalente Katalyse kann theoretisch in drei Schritte aufgeteilt werden: 1. Die nucleophile Reaktion zwischen Katalysator und Substrat, die zur Bildung einer kovalenten Bindung führt. 2. Die Entfernung der Elektronen aus dem Reaktionszentrum durch den nun elektrophilen Katalysator. 3. Die Eliminierung des Katalysators, notwendigerweise die Umkehrreaktion des ersten Schritts. Die Nucleophilie einer Substanz hängt eng mit ihrer Basizität zusammen. In der Tat ähnelt der Mechanismus der nucleophilen Katalyse einer Basenkatalyse, abgesehen davon, dass der Katalysator das Substrat nucleophil angreift, um eine kovalente Bindung zu bilden, anstatt ein Proton vom Substrat abzuziehen. Biologisch wichtige Nucleophile sind negativ geladen oder haben freie Elektronenpaare, die leicht kovalente Bindungen mit elektronenarmen Zentren (Abb. 11.12a) ausbilden können. Elektrophile enthalten im Gegensatz dazu positiv geladene Gruppen, eine unvollständige Valenzelektronenschale oder ein elektronegatives

Abb. 11.12 Biologisch wichtige nucleophile und elektrophile Gruppen. (a) Nucleophile Gruppen wie Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Amino- und Imidazolgruppen sind in ihrer basischen Form Nucleophile. (b) Elektrophile Gruppen enthalten ein elektronenarmes Atom (rot).

Atom (Abb. 11.125).

Bei der kovalenten Katalyse gilt: Je stabiler die kovalente Bindung ist, desto schwieriger ist ihr Zerfall in den letzten Reaktionsschritten. Ein guter kovalenter Katalysa-

(a) Nucleophile

() Electrophile H'

ROH a

RSH

Ba

Hydroxylgruppe

—

Sulfhydrylgruppe

M R

.

Metallionen

x c=O

Carbonyl-C-Atom

+ C=NH-—

Kationisches Imin (Schiff’sche Base)

au

R’

Aminogruppe

RN

nt

Protonen

R —— HN\

. ONE

EB Tees

Imidazol man

e

r

366

Enzymatische Katalyse

tor muss daher scheinbar gegensätzliche Eigenschaften in sich vereinen: hohe Nucleophilie und die Fähigkeit, eine gute Abgangsgruppe zu bilden (d.h. die Umkehrung des bindungsbildenden Schritts muss leicht möglich sein). Leicht polarisierbare Gruppen (d.h. solche mit sehr beweglichen Elektronen), wie Imidazol- oder Thiolgruppen, haben diese Eigenschaften und eignen sich daher gut als kovalente Katalysatoren. Zu solchen funktionellen Gruppen gehören in Proteinen die e-Aminogruppe von Lys, die Imidazolgruppe von His, die Thiolgruppe von Cys, die Carboxylgruppe von Asp und die Hydroxylgruppe von Ser. Zusätzlich wirken einige Coenzyme, insbesondere Thiaminpyrophosphat (Abschnitt 15.3B) und Pyridoxalphosphat (Abschnitt 21.2A) in Assoziation mit ihren Apoenzymen als kovalente Katalysatoren. Enzyme arbeiten häufig nach kovalenten Katalysemechanismen, dafür spricht die große Vielfalt kovalent gebundener Enzym-Substrat-Übergangskomplexe, die bisher isoliert wurden.

(a)

C. _ Metallionenkatalyse

VL

—\Thr 199 zig 106

\ \

meistens Übergangsmetalle wie Fe’*, Fe’*, Cu”*, Zn”*, Mn?* oder Co’*. Diese Glu 117

(6)

Im

I

Im—Zn

CN =

In

H

=:

|

a

oO

T So

Im

o HL

a

er

a

°

I 1

2

Im—Zn’*- 2 +

Im

H

+

400

H

0

Im = Imidazol

Abb. 11.13

Beinahe ein Drittel aller bekannten Enzyme erfordern die Anwesenheit von Metallionen für eine katalytische Aktivität. Zu dieser Enzymgruppe gehören die Metalloenzyme, die fest gebundene Metallionen als Cofaktoren enthalten,

für die Katalyse essentiellen Metallionen unterscheiden sich von Ionen wie Na*, K* oder Ca?*, die oft eher von struktureller als von katalytischer Bedeutung für Enzyme sind. Ionen wie Mg’' und Zn°* können entweder strukturelle oder katalytische Funktion haben. Metallionen sind hauptsächlich auf drei Arten an katalytischen Prozessen beteiligt: 1. Bindung an Substrate, um diese in eine für die Reaktion geeignete Konformation zu bringen. 2. Reversible Änderungen des Oxidationszustands der Metallionen vermitteln Reduktions-Oxidations- (Redox-) Reaktionen. 3. Elektrostatische Stabilisierung oder Abschirmung negativer Ladungen. Bei vielen von Metallionen katalysierten Reaktionen fungiert das Metallion ähnlich wie ein Proton, um eine negative Ladung zu neutralisieren. Metallionen sind aber häufig viel effektivere Katalysatoren als Protonen, da Metallionen bei neutralem pH in hohen Konzentrationen vorliegen und Ladungen > +1 haben können. Die Ladung eines Metallions macht zudem seine koordinativ gebundenen Wassermoleküle acider als freies H,O. Damit können diese als nucleophile OH-Ionen agieren, selbst bei saurem pH. Ein hervorragendes Beispiel dieses Phänomens ist der Katalysemechanismus der Carboanhydrase (Exkurs 2.1), einem weit verbreiteten Enzym, das folgende Reaktion katalysiert:

CO, + H,O == HCO; + H*

Die Rolle von Zn?* in der

Carboanhydrase. (a) Das aktive Zentrum des humanen Enzyms. In der Röntgenstruktur ist das Zn’*-Ion mit drei Imidazolgruppen und einem Wassermolekül koordiniert. Der Pfeil zeigt in Richtung der Öffnung der Tasche mit dem aktiven Zentrum. [Nach Sheridan, R.P. und Allen, L.C.,

J. Am. Chem. Soc. 103, 1545 (1981).] 6% siehe Interactive Exercises. (b) Die von der Carboanhydrase katalysierte Reaktion. Im steht für die His-Imidazolgruppe.

Die Carboanhydrase enthält ein essentielles Zn’*-Ion. Die Röntgenstruktur des Enzyms zeigt, dass sich das Zn’*-Ion am Grund einer 1,5 nm tiefen Spalte des aktiven Zentrums befindet, wo es tetraedrisch mit drei im Laufe der Evolution unveränderten His-Seitenketten und einem H,O-Molekül koordiniert ist (Abb. 11.13a). Das Zn’*-polarisierte H,O ionisiert und es entsteht OH”, das das enzymgebundene CO, nucleophil angreift, so dass sich HCO7 bildet (Abb. 11.13b). Das in dieser Reaktion erzeugte Proton wird durch Basenkatalyse, die durch einen vierten His-Rest

(His 64) erleichtert wird, zur Enzymoberfläche

transportiert. Das katalytische Zentrum des Enzyms wird dann durch Bindung eines weiteren H,O-Moleküls an das Zn°*-Ion regeneriert.

Katalysemechanismen

D.

Katalyse durch Nachbargruppen- und Orientierungseffekte

Obwohl die katalytischen Mechanismen der Enzyme denen organischer Modellreaktionen ähneln, sind sie doch weit wirkungsvoller. Diese hohe Effizienz beruht auf den spezifischen physikalischen Eigenschaften des aktiven Zentrums der Enzyme, die die entsprechenden chemischen Reaktionen katalysieren. Den größten Einfluss haben Nachbargruppen und Orientierung: Die Reaktanten müssen in der richtigen räumlichen Anordnung zueinander stehen, damit eine Reaktion ablaufen kann. Nehmen wir hierfür die bimolekulare Reaktion von Imidazol mit p-Nitrophenylacetat als Beispiel.

ı/

/

Er 0 Yo. y N.

p-Nitrophenylacetat

Wi

NH

n|

CH

© \

+

N

NH

0 a8. p-Nitrophenolat

N-Acetylimidazolium

Imidazol

Den Fortschritt der Reaktion kann man bequem anhand des Auftretens des intensiv gelben p-Nitrophenolations verfolgen. Die entsprechende intramolekulare Reaktion

verläuft ca. 24-mal schneller. Ist also der Imidazolkatalysator kovalent an den Reaktanten gebunden, wirkt er 24-mal stärker als frei in Lösung. Diese Reaktionsbeschleunigung resultiert sowohl aus Nachbargruppen- als auch aus Orientierungseffekten. Allein durch die Bindung ihrer Substrate fördern Enzyme die von ihnen katalysierten Reaktionen auf dreierlei Art: 1. Enzyme bringen Substrate mit ihren katalytischen Gruppen in Kontakt und bei Reaktionen mit mehr als einem Substrat diese auch untereinander. Aller-

dings lassen einfache Modellrechnungen darauf schließen, dass solche Nachbargruppeneffekte allein die Reaktionsgeschwindigkeit höchstens um den Faktor 5 steigern können. 2. Enzyme binden ihre Substrate in der für die Reaktion richtigen Ausrichtung. Moleküle sind nicht in allen Richtungen gleich reaktiv. Vielmehr reagieren sie bevorzugt, wenn sie die geeignete relative Orientierung zueinander haben. So greift z.B. bei einer Sy2-Reaktion (bimolekulare nucleophile Substitution) das Nucleophil aus der der Abgangsgruppe entgegengesetzten Richtung an (Rückseitenangriff, Abb. 11.14). Nähern sich reagierende Atome auf Bahnen, die nur um 10° von diesem Optimum abweichen, wird die Aktivität deutlich reduziert. Man schätzt, dass optimal ausgerichtete Substrate die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor von bis zu 100 steigern können. Enzyme richten, wie wir noch sehen werden, ihre Substrate und katalytischen Grup-

pen so aus, dass eine optimale Reaktivität erzielt wird. 3. Geladene Gruppen können dabei helfen, den Übergangszustand der Reaktion zu stabilisieren - ein Phänomen, das man elektrostatische Katalyse

367

368

_Enzymatische Katalyse

Abb. 11.14 Die Geometrie einer S,2-Reaktion. (1) das angreifende Nucleophil, Y", muss sich dem

tetraedrisch koordinierten und daher sp’-hybridisierten C-Atom aus der Richtung nähern, die der Bindung mit der abgehenden Gruppe X gegenüber liegt. Im Übergangszustand der Reaktion wird das C-Atom trigonal bipyramidal koordiniert und daher sp?-p-hybridisiert, wobei das p-Orbital (blau) partielle Bindungen mit X und Y bildet. Die drei sp?-Orbitale bilden Bindungen zu den drei anderen Substituenten des C-Atoms (R, R’und R”) aus, die ihre Positionen in die Ebene senkrecht zur X-C-Y-Achse (gebogene Pfeile) verlagert haben. Jede Abweichung von dieser optimalen Geometrie würde die Freie Enthalpie des Übergangszustands, AG’, erhöhen und somit die Geschwindigkeit der

Reaktion senken. (2) Der Übergangszustand zerfällt schließlich in die Produkte, in denen R, R’ und R”

ihre Position relativ zum C-Atom umgekehrt haben. C ist zu sp” rehybridisiert, und X” ist freigesetzt.

sp?-p-Hybridisierung am Kohlenstoff

nennt. Darüberhinaus kann die Ladungsverteilung um das aktive Zentrum des Enzyms herum polare Substrate zu ihrer Bindungsstelle leiten. 4. Enzyme schränken die Translations- und Rotationsbewegungen ihrer Substrate und katalytischen Gruppen ein. Dies ist ein wichtiger Aspekt der Katalyse, da sich die reagierenden Gruppen im Übergangszustand kaum gegeneinander bewegen. Tatsächlich lassen Experimente mit Modellsubstanzen vermuten, dass dieser Effekt die Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 10’fach erhöhen kann! Das Zusammenbringen der Substrate und der katalytischen Gruppen für eine optimale Reaktivität erhöht die Ordnung und führt daher zu einem erheblichen Entropieverlust. Die Freie Enthalpie, die benötigt wird, um diesen Entropieverlust auszugleichen, wird von der Bindungsenergie des/der Substrate(s) geliefert und trägt zu einem erniedrigten AAG bei.

E.

Katalyse durch Stabilisierung des Übergangszustands

Die durch Enzyme bewirkten Geschwindigkeitssteigerungen sind oft größer als es sich mit den bisher besprochenen Katalysemechanismen vernünftig erklären ließe. Allerdings haben wir einen der wichtigsten Mechanismen der enzymatischen Katalyse noch nicht behandelt: Ein Enzym kann den Übergangszustand der katalysierten Reaktion mit höherer Affinität binden als die Substrate oder Produkte. Zusammen mit den bisher beschriebenen Katalysemechanismen erklärt die bevorzugte Bindung des Übergangszustands die beobachteten Reaktionsgeschwindigkeiten enzymatisch katalysierter Reaktionen. Ursprünglich stellte man sich die Bindung des Übergangszustands so vor, dass Enzyme ihre Substrate mechanisch in die Geometrie des Übergangszustands hineinzwängen können, weil die Substrate in ihrer normalen Konformation nicht genau in die Bindungsstellen passen. Solche sterischen Spannungen ermöglichen nämlich viele organische Reaktionen. Beispielsweise ist die Geschwindigkeit der Reaktion R

R

CH,OH

u

H

eg

———

OO

Fe

R’

X_Sterische Hinderung

C

R

!

Katalysemechanismen

315-mal höher, wenn R=CH, anstatt H ist, wegen der größeren sterischen Abstoßung zwischen der CH;- und den reagierenden Gruppen. Der gespannte Reaktant ähnelt dem Übergangszustand der Reaktion viel mehr als der entsprechende nicht gespannte Reaktant. Daher entwickelten zuerst Linus Pauling und später Richard Wolfenden und Gustav Lienhard folgende Vorstellung: Enzyme, die bevorzugt die Struktur des Übergangszustands binden, erhöhen dessen Konzentration und steigern dadurch proportional die Reaktionsgeschwindigkeit. Je fester ein Enzym den Übergangszustand seiner Reaktion im Verhältnis zum Substrat bindet, desto höher ist die Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion relativ zur nicht katalysierten Reaktion. Dies bedeutet, dass die Katalyse aus der bevorzugten Bindung und damit Stabilisierung des Übergangszustands relativ zum Substrat resultiert (Abb. 11.15). In anderen Worten, die Differenz der Freien Enthalpie zwischen einem Enzym-Substrat-Komplex (ES) und einem Enzym-Übergangszustands-Komplex (ES') ist geringer als die zwischen S und S' in einer unkatalysierten Reaktion. Wie wir in Abschnitt 11.2 gesehen haben, ist die Geschwindigkeitserhöhung einer katalysierten Reaktion durch et? RT gegeben, wobei AAG,,, die Differenz zwischen AG der nicht katalysierten (AG,) und der katalysierten (AG;) Reaktionen ist. Eine Geschwindigkeitserhöhung um den Faktor 10° erfordert eine 10°fach höhere Bindungsaffinität des Enzyms zum Übergangszustandskomplex als zum Substrat. Dies entspricht einer Stabilisierung um 34,2 k] - mol”! bei 25°C, was ungefähr der Freien Enthalpie von zwei Wasserstoffbrückenbindungen entspricht. Folglich sollte die enzymatische Bindung eines Übergangszustands durch zwei Wasserstoffbrücken, die sich nicht bilden können, wenn zuerst das Substrat an das Enzym bindet, zu einer Geschwindigkeitssteigerung von ca. 10° führen, und zwar allein auf Grund dieses Effekts. Es wird allgemein beobachtet, dass ein Enzym schwache Substrate, die niedrige Reaktionsgeschwindigkeiten haben, ebenso gut oder sogar besser bindet als gute Substrate mit hohen Reaktionsgeschwindigkeiten. Ein gutes Substrat bindet also nicht notwendigerweise im Grundzustand mit hoher Affinität an sein Enzym, dafür aber nach der Aktivierung im Übergangszustand. Übergangszustandsanaloga sind Enzyminhibitoren Wenn ein Enzym bevorzugt den Übergangszustand bindet, kann man davon ausge-

hen, dass Übergangszustandsanaloga, stabile Moleküle, die dem Übergangszustand geometrisch und von der Elektronenverteilung her ähneln, starke Enzyminhibitoren sind. So läuft z.B. die von der Prolin-Racemase aus Clostridium sticklandii katalysierte Reaktion vermutlich über einen planaren Übergangszustand ab:

co0O74

[

»

H

‘c00-

|

ER

H

H

H ,

L-Prolin

EL

HL

[ Je==C007

H"

p-Prolin

planarer

Übergangszustand

Prolin-Racemase wird durch die planaren Prolinanaloga Pyrrol-2-carboxylat und A-1-Pyrrolin-2-carboxylat gehemmt,

\

&

Pyrrol-2-carboxylat

N

}|

A-1-Pyrrolin-2-carboxylat

br

369

gi

Reaktionskoordinate

Abb. 11.15

Effekt der Stabilisierung des Übergangszustands. Reaktionskoordinaten für eine hypothetische, enzymatisch katalysierte Reaktion mit einem einzigen Substrat (blau) und für die entsprechende nicht katalysierte Reaktion (rot). AG, ist die Freie Aktivierungsenthalpie der nicht enzymatischen Reaktion und AG; der enzymatisch katalysierten Reaktion. Die kleinen Täler bei der Reaktionskoordinate der enzymatisch katalysierten Reaktion resultieren aus der Bindung von Substrat und Produkt an das Enzym. &% siehe Animated Figures.

Enzymatische Katalyse

370

die beide mit 160-fach höherer Affinität als Prolin an das Enzym binden. Man hält diese Substanzen daher für Übergangszustandsanaloga der Prolin-Racemasereaktion. Hunderte von Übergangszustandsanaloga verschiedener Enzyme sind mittlerweile bekannt. Einige sind natürlich vorkommende Antibiotika. Andere wurden für mechanistische Untersuchungen bestimmter Enzyme oder als spezifische Enzyminhibitoren für den Einsatz in Medizin und Landwirtschaft entwickelt. In der Tat hat sich die Theorie, dass Enzyme die Übergangszustände mit höherer Affınität als die Substrate binden, als Grundlage für die rationale Entwicklung von Medikamenten basierend auf dem Verständnis von spezifischen Enzym-Reaktionsmechanismen erwiesen (Abschnitt 12.4).

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 d. Beschreiben Sie, wie funktionelle

Gruppen als Säure- und Basekatalysatoren wirken können. Erklären Sie, wie Nucleophile als kovalente Katalysatoren wirken. Nennen Sie die verschiedenen Möglichkeiten, wie Metallionen an der Katalyse beteiligt sein können. Welche Rolle spielen Nähe und Orientierung bei der enzymatischen Katalyse? Warum ist es unwahrscheinlich, dass nicht-enzymatische Katalysatoren durch die Stabilisierung des Überganszustands funktionieren?

4

Lysozym

Im verbleibenden Teil dieses Kapitels befassen wir uns mit den Katalysemechanismen einiger gut charakterisierter Enzyme. Dabei werden wir sehen, wie die Enzyme die katalytischen Prinzipien anwenden, die in den bisherigen Abschnitten beschrieben wurden. Lysozym ist ein Enzym, das bakterielle Zellwände zerstört. Es hydrolysiert die glykosidischen ß(1—4)-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (NAM oder MurNAc) und N-Acetylglucosamin (NAG oder GlcNAc) der Peptidoglykane in bakteriellen Zellwänden (Abb. 11.16 und Abschnitt 8.3B). Ebenso hydrolysiert es ß(1—4)-gebundenes Poly(NAG) (Chitin; Abschnitt 8.2B), ein Zellwandbestandteil der meisten Pilze und die Hauptkomponente des Exoskeletts von Insekten und Krustentieren. Lysozym ist in den Zellen und Sekreten von Vertebraten weit verbreitet. Es kann bakterizid wirken oder zur Beseitigung von Bakterien, die auf andere Weise abgetötet wurden, beitragen. Lysozym aus Hühnereiweiß (HEW) ist die am besten untersuchte Lysozymspezies und eines der mechanistisch am besten verstandenen Enzyme. Es ist ein relativ kleines Protein (14,3 kD), dessen einzige Polypeptidkette aus 129 Aminosäuren besteht und in sich durch vier Disulfidbindungen quervernetzt ist. Lysozym hydrolysiert seine Substrate im Vergleich zur nicht katalysierten

Reaktion mit einer rund 10°fach höheren Geschwindigkeit.

A.

Enzymstruktur

Die Röntgenstruktur von HEW-Lysozym, die 1965 von David Phillips aufgeklärt werden konnte, zeigt, dass das Protein eine ellipsoide Form mit den Abmessungen 3X 3 x 4,5 nm hat (Abb. 11.17). Sein charakteristischstes Merkmal ist eine tiefe Spalte, die Substratbindungsstelle, die quer über eine Seite des Moleküls verläuft. Die Aufklärung des Wirkmechanismus eines Enzyms setzt Kenntnisse über die Struktur des Enzym-Substrat-Komplexes voraus. Selbst wenn die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren durch chemische und physikalische Metho-

Abb. 11.16 Schnittstelle des Lysozyms. Das Enzym schneidet nach einer B(I—4)-Bindung in der alternierenden NAG-NAM-Polysaccharidkomponente bakterieller Zellwände.

Lysozym- '

eCH,0OH H

s

ON

CH,OH

5

Spaltstelle x

H

CH,OH H

H

OR

CH,OH Ö

OH

ES

H

a

Nu H

H

3

/

Ö

CH,CHCOO” NAG

NAM

CH,;CHCOO” NAG

NAM

Lysozym

371

Abb. 11.17 Röntgenstruktur des Lysozyms aus Hühnereiweiß im Komplex mit (NAG);. Das Protein ist als transparente Oberfläche dargestellt mit seinem Peptidrückgrat in Schlangenform, das in den Spektralfarben, von blau an seinem N-terminalen Ende bis rot an seinem C-Terminus,

eingefärbt ist. Das (NAG),, das mit seinen Zuckerringen, bezeichnet mit A an seinem nicht-

reduzierenden Ende bis hin zu F am reduzierenden Ende, in Stabform gezeichnet ist, bindet in einer

tiefen Spalte an der Enzymoberfläche. Die Ringe A, B und C (die entsprechend ihrer Atomtypen mit C grün, N blau und O rot gefärbt sind) sind in der Röntgenstruktur des Komplexes von (NAG); mit Lysozym sichtbar. Die Positionen der Ringe D, E und F (C-Atome sind türkis) wurden aus Modellen abgeleitet. Die Seitenketten der Aminosäuren des aktiven Zentrums von Lysozym, Glu 35 und Asp 52,

die als Kalottenmodelle gezeichnet sind (C-Atome sind gelb), katalysieren die Hydrolyse der glykosidischen Bindung zwischen den Ringen D und E. [Nach einer Röntgenstruktur von David Phillips, Oxford University. PDBid THEW.] 62 siehe Interactive Exercises und Kinemage Exercise 9.

den identifiziert sind, muss ihre dreidimensionale Anordnung relativ zum Substrat sowie zueinander bekannt sein, um zu verstehen, wie das Enzym funktioniert. Ein Enzym bindet seine „guten“ Substrate nämlich nur vorübergehend, bevor es eine Reaktion katalysiert und die Produkte freisetzt. Das meiste Wissen über Enzym-Substrat-Komplexe stammt aus Röntgenstrukturuntersuchungen von Enzymen in Komplexen mit Inhibitoren oder “schlechten“ Substraten, die einen Tag oder länger fest an das Enzym gebunden sind, um das Röntgenbeugungsmuster eines Proteinkristalls aufnehmen zu können (aber siehe Exkurs 11.1). Phillips’ Röntgenstruktur von Lysozym umfasst das Trisaccharid (NAG);, das nur langsam von Lysozym hydrolysiert wird. Das Enzym katalysiert aber effizient die Hydrolyse von Substraten, die mindestens sechs Saccharideinheiten enthalten, so dass Phillips anhand von Modellen untersuchte, wie ein größeres Substrat an das Enzym binden könnte. Die Spalte des aktiven Zentrums des Lysozyms ist lang genug für ein hexameres Oligosaccharid (dessen Einheiten in Abb. 11.17 mit A bis F bezeichnet sind). Der vierte Rest (D) scheint jedoch nicht an das Enzym binden zu können, da seine C6- und O6-Atome zu nahe an den Proteinseitenketten und am Rest C liegen. Dieser sterischen Hinderung kann durch den Übergang des Glucoserings aus seiner normalen Sessel- zur Halbsesselkonformation ausgewichen werden (Abb. 11.18). Bei dieser Drehung, die die Atome C1, C2, C5 und O5 von Rest D in eine Ebene bringt, bewegt sich die C6-Gruppe aus ihrer normalen äquatorialen Stellung in eine axiale Position; dort hat sie keine engen Kontakte und kann eine Wasserstoffbrücke zur Rückgrat-Carbonylgruppe des Gin 57 ausbilden. In weiteren Untersuchungen entdeckte Phillips, dass die Reste E und F offensichtlich ohne Verzerrung und

Abb. 11.18 Sessel- und Halbsesselkonformationen. Hexoseringe nehmen normalerweise die Sesselkonformation ein. Es wird jedoch postuliert, dass die Bindung durch Lysozym den D-Ring in die Halbsesselkonformation zwingt, in der die

Atome C1, C2, C5 und O5 in einer Ebene liegen. Sessel-Konformation

Halbsessel-Konformation

6% siehe Animated Figures.

372

_ Enzymatische Katalyse

Untersuchung enzymatischer Abläufe durch Röntgenkristallographie Die atomaren Umlagerungen während der Katalyse sind in gewissem Maße durch die Röntgenkristallographie zugänglich. Da die Proteinkristalle überwiegend aus Lösungsmittel bestehen,

bleiben

nicht nur die nativen

Proteinstrukturen

im kristallinen Zustand erhalten, sondern häufig sind auch ihre katalytischen Funktionen noch intakt. Substrate können durch Lösungsmittelkanäle im Kristall zum aktiven Zentrum des Enzyms diffundieren. Ein Enzym bindet jedoch seine Substrate nur vorübergehend, vor der Katalyse einer Reaktion und der Freisetzung der Produkte. Daher wären die chemischen Umwandlungen während einer enzymatischen Reaktion nur als „vorher — nachher“-Schnappschüsse zugänglich, d.h. von der Struktur des Enzyms ohne Substrate und, in einigen Fällen, der Struktur des Enzyms mit seinen locker gebundenen Produkten. Über verschiedene Ansätze wurde versucht, dieses Problem zu lösen.

Von Komplexen aus Enzymen mit langsam reagierenden Substraten können die Röntgenstrukturen bestimmt werden. Dabei muss das Substrat während der Zeit, die für die Mes-

sung der Röntgenbeugungsintensitäten des Kristalls erforderlich ist (ein Tag oder sogar länger), stabil an das Enzym gebunden bleiben. Als Alternative kann ein nicht reagierendes Substratanalogon eingesetzt werden, d.h. das Molekül bindet vergleichbar einem Substrat, wird aber nicht umgesetzt.

Allerdings liefert dieser Ansatz keine vollständige Aufklärung, da einige der molekularen Interaktionen, die Voraussetzung für eine Katalyse sind, fehlen oder verzerrt sind. Trotzdem erlauben

diese

Daten,

zusammen

mit der Kenntnis

nicht

enzymatischer Reaktionsmechanismen, die Ableitung des enzymatischen Reaktionsmechanismus mit hinreichender Genauigkeit, Tatsächlich wurde der größte Teil unserer gegenwärtigen Kenntnis der Strukturen von Enzym-Substrat-Wechselwirkungen mit Hilfe dieser Technik gewonnen. Enzymatische Reaktionen sind, wie alle chemischen

Reak-

tionen, temperaturabhängig. Daher kann die Kühlung eines

kristallisierten Enzyms die Geschwindigkeit, mit der es mit einem herandiffundierenden Substrat reagiert, erheblich verlangsamen. So kann beispielsweise die Kühlung eines Kristalls auf weniger als 40 K die Reaktionszeit von weniger als einer Mikrosekunde auf Stunden oder sogar Tage verlängern — lange genug, um eine Serie von Röntgenbeugungsmustern aufzunehmen. Ein anderer Ansatz, der erfolgreich bei der Untersuchung atomarer Vorgänge an der Hämgruppe des Myoglobins angewandt wurde, löst gleich zwei Probleme, die bei der Analyse schneller biochemischer Abläufe auftreten. Zuerst wird ein „Schnappschuss“ eines aktiven Enzyms mit einer kurzen Belichtungszeit aufgenommen, analog zur herkömmlichen Photographie. Dementsprechend muss eine sehr intensive Strahlung eingesetzt werden, in diesem Fall ein Röntgenstrahl, der von einem Synchrotron erzeugt wird (ein spezieller Teilchenbeschleuniger, in dem Elektronen auf einer Kreisbahn beinahe bis auf Lichtgeschwindigkeit beschleunigt werden und dabei starke Röntgenstrahlung emittieren). Diese Strahlung ist um mehrere Größenordnungen intensiver als durch herkömmliche Generatoren erzeugte Röntgenstrahlung. Des Weiteren müssen sämtliche Moleküle im Kristall gleichzeitig aktiv sein; ansonsten sind die Aufnahmen „verschwommen“.

Bei der Untersuchung der Dissoziation von CO von Myoglobin (CO bindet an :Myoglobin in derselben Art wie O,, allerdings wesentlich fester) wurden die Moleküle durch einen wenige Nanosekunden dauernden Laserblitz zur Dissoziation vom Häm gebracht. Die darauf folgenden molekularen Bewegungen, die letztendlich zur Wiederanlagerung des CO an Myoglobin führen, wurden in Intervallen von Mikrobis Millisekunden aufgezeichnet. Mit einigen Anpassungen kann diese — experimentell aufwändige — Technik vielleicht helfen, die Wirkung von Enzymen zu dokumentieren,

deren

katalytische Cyclen innerhalb von Nanosekunden abgeschlossen sind.

unter Ausbildung von Wasserstoffbrücken und van-der-Waals-Kontakten an das Enzym binden. Einige der Wasserstoffbrücken, über die die sechs SubstratZuckerreste an das Enzym binden, sind in Abbildung 11.19 dargestellt. Im natürlichen Substrat des Enzyms ist jeder zweite Rest ein NAM. Am Modell zeigte sich jedoch, dass eine Lactylseitenkette nicht in die Bindungsstellen der Reste C oder E eingepasst werden kann. Folglich müssen die NAM-Reste, wie in Abb. 11.19 dargestellt, über die Bindungsstellen B, D und F an das Enzym binden. Außerdem muss, da Lysozym (NAG), zwischen den Resten D und E hydrolysiert, es die glykosidische Bindung in seinem natürliche Substrat zwischen dem NAM-Rest an der Bindungsstelle D und den NAG-Rest an der Bindungsstelle E spalten. Die von Lysozym gespaltene Bindung wurde identifiziert, indem man die lysozymkatalysierte Hydrolyse von (NAG); in H}%?O durchführte. Das entstandene Produkt trug das '®O am C1-Atom seines neuen reduzierenden Endes. Die Bin-

dungsspaltung findet also zwischen C1 und dem Brückensauerstoff O1 statt:

Lysozym

D-Ring in Halbsessel-

N

Konformation

Gin

Ba

I

ii 57

-:0 Asp 52 -- Lysozym spaltet

ur. Ho

Gln wG

Na

57

Asn

CH,OH

O

y Wu35

. Hs KW

re Q

NAG OÖ

Glu\ 35 /

/Phe Riga

DE 0.

er CH;

IN

NC

H,C

ea

HsN

F

N

NAM

|

0) H;N

H

Fi

Bags H;N H

Asn

EN 37

NH

Are 114

Abb. 11.19 Wechselwirkungen des Lysozyms mit seinem Substrat. Blickrichtung ist in die Bindungsspalte hinein, wobei die dicker gezeichneten Kanten der Zuckerringe nach außen zeigen und die helleren zum Grund der Enzymspalte. Nach einer Abbildung von Irving Geis (Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/ Howard Hughes Medical Institute.). 6% siehe Kinemage Excercise 9.

373

374

_Enzymatische Katalyse CH,0H ——O®

SS

HZ

\ =

SCH

NAc

H

10-|Lysozym

o, "OH H/| NAc

H ERE

| HO

CH,0H

OH H

Die Reaktion läuft außerdem unter Beibehaltung der Konfiguration ab, d.h. das D-Ring-Produkt bleibt ein ß-Anomer.

B.

OR’

OR’

| H-C-0-F

+

+H">H

| R

I

Acetal

R’

18

rn

R’OH

Y

nn

un (6)

a |

H

EN




da cc

R

H

>

_ Katalysemechanismus

Die von Lysozym katalysierte Reaktion, die Hydrolyse eines Glykosids, stellt die Umwandlung eines Acetals in ein Halbacetal dar. Die nicht enzymatische Acetalhydrolyse ist eine säurekatalysierte Reaktion, bei der nach Protonierung eines Sauerstoffatoms im Reaktanten seine C-O-Bindung gespalten wird (Abb. 11.20). Dies führt zur Bildung eines resonanzstabilisierten Carbokations, eines sogenannten Oxoniumions. Um eine Resonanzstabilisierung zu erreichen, müssen die R- und R’-Gruppen des Oxoniumions in einer Ebene mit seinen C-, O- und H-Atomen liegen. Dann lagert das Oxoniumion Wasser an und es entstehen das Halbacetal und der regenerierte Säurekatalysator. Bei der Suche nach den katalytisch aktiven Gruppen eines acetalhydrolysierenden Enzyms muss man daher nach einem potentiellen Säurekatalysator sowie.einer Gruppe, die dazu noch ein Oxoniumion-Intermediat stabilisieren kann, Ausschau halten. Glu 35 und Asp 52 sind die katalytisch aktiven Reste in Lysozym

R

resonanzstabilisiertes Carbokation (Oxoniumion)

H,0 ze in Y

OR’ HCC R Halbacetal

Abb. 11.20 Mechanismus der nicht enzymatischen, säurekatalysierten Hydrolyse eines Acetals zu einem Halbacetal. Die Reaktion umfasst die Protonierung eines O-Atoms des Acetals und die anschließende Spaltung seiner C-O-Bindung; es entsteht ein

Alkohol (R’OH) und ein resonanzstabilisiertes Carbokation (Oxoniumion). Durch Bindung eines Wassermoleküls an das Oxoniumion entsteht das Halbacetal und der H*-Katalysator wird regeneriert. Man beachte, dass die C-, O-, H-, R- und R’-Atome

des Oxoniumions alle in derselben Ebene liegen.

Die einzigen funktionellen Gruppen in der unmittelbaren Umgebung des aktiven Zentrums von Lysozym, die die erforderlichen katalytischen Eigenschaften aufweisen, sind die Seitenketten von Glu 35 und Asp 52. Diese Seitenketten, die auf beiden Seiten der zu spaltenden Glykosidbindung angeordnet sind (Abb. 11.17), haben ausgesprochen unterschiedliche Umgebungen. Asp 52 ist von mehreren konservierten polaren Aminosäureresten umgeben, mit denen es ein komplexes Netzwerk aus Wasserstoffbrücken ausbildet. Asp 52 sollte daher einen „normalen“ pK-Wert besitzen. Es sollte im Bereich von pH 3 bis 8 (in diesem Bereich ist Lysozym katalytisch aktiv) nicht protoniert und demzufolge negativ geladen sein. Asp 52 könnte somit ein Oxoniumion elektrostatisch stabilisieren. Im Gegensatz dazu liegt die Carboxylgruppe von Glu 35 in einer vorwiegend unpolaren Tasche, wodurch sie selbst bei für Carboxylgruppen ungewöhnlich hohen pH-Werten protoniert bleibt. Dieser Aminosäurerest kann deshalb als ein Säurekatalysator fungieren. Untersuchungen mithilfe proteinmodifizierender Reagenzien und ortsgerichteter Mutagenese (d.h. ein Austausch von Asp 52 gegen Asn und von Glu 35 gegen GIn) haben bestätigt, dass diese beiden Aminosäuren für die Katalyse wichtig sind. Der katalytische Mechanismus von Lysozym spielt sich folgendermaßen ab

(Abb. 11.21):

1. Das Enzym lagert sich durch Bindung an eine Hexasaccharideinheit an die Bakterienzellwand an. Bei diesem Prozess wird der D-Rest in die Halbsesselkonformation gezwungen.

Lysozym

CH, Er CHs — Glu35

l

375

“ CH; — Glu35

Polysaccharidsubstrat

Be 1 Bindung

allgemeine Säure-

allgemeine Basenkatalyse

katalyse

CH, — CH, —Glu35

HOCH; Di

ie

OR

H

H

R

L. —H

| H,— CH, — Glu35

3 kovalente Katalyse

4

>

Wasserbindung

H,O — Asp52

kovalentes Zwischenprodukt

Glu 35 überträgt sein Proton auf das O1-Atom, das an den D- und den ERing gebunden ist. Dabei wird die C1-O1-Bindung gespalten (allgemeine Säurekatalyse). Dieser Schritt erzeugt im D-Ring einen Übergangszustand mit resonanzstabilisiertem Oxoniumion. Dessen Bildung wird durch die erzwungene Halbsesselkonformation begünstigt (Katalyse durch die bevorzugte Bindung des Übergangszustands). Das positiv geladene Oxoniumion wird durch die nahegelegene negativ geladene Asp-52-Carboxylatgruppe stabilisiert (elektrostatische Katalyse). Das den E-Ring enthaltende Produkt wird freigesetzt.

Abb. 11.21 Reaktionsmechanismus von Lysozym. Glu 35 fungiert als Säurekatalysator und Asp 52 als kovalenter Katalysator. Es sind nur der D- und

E-Ring des Substrats gezeigt. R stellt die N-Acetylgruppe an C2 dar, R' die CH;CHCOO”-Gruppe an C3. Der Übergangszustand mit dem resonanzstabilisierten Oxoniumion zwingt C1, C2, C5 und

O5 in eine koplanare Orientierung (schattiert). Dies erzeugt eine Halbsesselkonformation. Am Schritt 5 ist ein Oxoniumion-Übergangszustand beteiligt, der hier nicht dargestellt ist.

6% siehe Kinemage Excercise 9.

376

_Enzymatische Katalyse

Abb. 11.22 Hemmung von Lysozym durch ein Übergangszustands-Analogon. Das ö-Lacton-Analogon von (NAG); (links) ähnelt dem Übergangszustand der Lysozymreaktion (rechts). Man beachte, dass die Atome Cl, C2, C5

und O5 in jeder Struktur koplanar sind (durch Schattierung angedeutet), dies steht im Einklang mit der Halbsesselkonformation des Hexoserings.

NHCOCH; H (NAG)z ö-Lacton-Analogon von (NAG),

NHCOCH3

H

RE

CH; l CH co007

Übergangszustand der Lysozymreaktion

3. Die Carboxylatgruppe von Asp 52 greift den jetzt elektronenarmen C1 des D-Rings nucleophil an, dadurch bildet sich ein kovalentes Glykosyl-EnzymZwischenprodukt (kovalente Katalyse). 4. Wasser ersetzt den E-Ring im aktiven Zentrum. 5. Die Hydrolyse der kovalenten Bindung mithilfe von Glu 35 (allgemeine Basenkatalyse), die einen weiteren Oxoniumion-Übergangszustand einschließt, regeneriert die Gruppen des aktiven Zentrums. Das Enzym entlässt dann das den D-Ring enthaltende Produkt und der Katalysecyclus ist abgeschlossen. Der in Abbildung 11.21 skizzierte zweifache Verdrängungsmechanismus erlaubt dem hinzukommenden Wasser, dass es an derselben Seite des D-Rests positioniert wird, wie der E-Rest, den es ersetzt. Infolgedessen wird die Konfiguration des D-Rests beibehalten. Eine Substitutionsreaktion, bei der Wasser direkt die abgehende Gruppe ersetzt, würde zu einer Inversion der Konfiguration am C1 des D-Rings zwischen dem Substrat und dem Produkt führen. Dies wird aber nicht beobachtet. Die Bedeutung der Spannung bei der Katalyse

Viele strukturelle und mechanistische Untersuchungen an Lysozym haben sich auf die Rolle der katalytischen Spannung konzentriert. Die Röntgenstruktur von Lysozym im Komplex mit NAM-NAG-NAM zeigt, dass das Trisaccharid wie vorhergesagt an die B-, C- und D-Bindungsstellen von Lysozym bindet. Dabei ist NAM in der D-Position in die Halbsesselkonformation verdreht. Diese erzwungene Konformation wird durch eine starke Wasserstoffbrücke zwischen dem 06 im D-Ring und dem NH von Val 109 im Rückgrat stabilisiert (wie im Modell vorhergesagt; Abb. 11.19). Wenn mutationsbedingt Val 109 durch Pro ersetzt ist, das seinerseits keine NH-Gruppe aufweist, um eine solche Wasserstoffbrücke auszubilden, wird das Enzym inaktiviert. In Abschnitt 11.3E wurde erläutert, wie ein Enzym eine Reaktion katalysieren kann, indem es bevorzugt den Übergangszustand bindet. Es hat dann eine stärkere Bindungsaffinität für einen Inhibitor, welcher der Raumstruktur des Übergangszustands stark ähnelt (ein sogenanntes Übergangszustands-Analogon), als für sein Substrat. Das ö-Lacton-Analogon von (NAG), (Abb. 11.22), das fest an Lysozym bindet, ist ein solches Übergangszustands-Analogon für Lysozym, denn der Lactonring dieser Verbindung hat eine Halbsesselkonformation, die räumlich dem hypothetischen Oxoniumion-Übergangszustand des D-Rings im Substrat ähnelt. Röntgenstrukturuntersuchungen bestätigen, dass dieser Inhibitor so an Lysozym bindet, dass der Lactonring die D-Bindungsstelle in einer halbsesselartigen Konformation besetzt. Trotz des oben Gesagten gibt es Zweifel an der Bedeutung der Substratverformung für die Lysozymkatalyse. Tatsächlich fanden Nathan Sharon und David Chipman, dass der NAG-Lacton-Inhibitor (Abb. 11.22) lediglich mit einer um 9,2 kJ - mol" höheren Affinität an die D-Stelle bindet als NAG. Wie in Abschnitt 11.2 erklärt,

entspricht dieser Wert höchstens einer ca. 40fachen Beschleunigung der Lyso-

Lysozym

377

zymreaktion. Dies lässt vermuten, dass die Verformung im D-Ring nicht wesentlich zu der beobachteten ca. 10°fachen Reaktionsbeschleunigung beiträgt. Diese unerwartet kleine Änderung der Freien Enthalpie lässt sich jedoch durch die Beobachtung erklären, dass ein nicht verformter NAD-Ring in die D-Stelle des Lysozyms eingepasst werden kann, wie sie in der Röntgenstruktur des Komplexes mit NAM-NAG-NAM auftritt. Die sperrige Lactylseitenkette von NAM verhindert dagegen, dass es auf ebensolche Weise an die D-Stelle binden kann. Massenspektrometrie und Röntgenkristallographie liefern den Nachweis zur kovalenten Katalyse Die Existenz eines kovalent gebundenen Reaktionszwischenprodukts beim Lysozym war nur schwer nachzuweisen. Die Lebensdauer eines Glykosyloxoniumions in Wasser beträgt etwa 10°” s. Damit ein solch instabiles Zwischenprodukt

experimentell beobachtbar wird, muss seine Bildungsgeschwindigkeit gegenüber seiner Abbaugeschwindigkeit signifikant erhöht werden. Um dies zu erreichen, hat Stephen Withers drei Phänomene genutzt. 1. Wenn die Reaktion über einen Oxoniumion-Übergangszustand abliefe, dann sollte dieser bei der Substitution von F (dem elektronegativsten Element) am C2 des D-Rings durch dessen elektronenziehenden Effekt langsamer gebildet werden. 2. Wenn nach gezielter Mutation anstatt Glu in der Kettenposition 35 Gln vorkäme (E35Q), dann verschwände der allgemeine Säurekatalysator. Der Oxoniumion-Übergangszustand würde dadurch langsamer umgesetzt. 3. Baute man ein zusätzliches F-Atom am C1 des D-Rings ein, dann beschleunigte sich die Bildung des Zwischenprodukts, weil dieses F eine gute Abgangsgruppe wäre, ohne dass eine allgemeine Säurekatalyse nötig wäre. Wenn alle drei dieser Veränderungen vorgenommen würden, dann sollte die Bildungsgeschwindigkeit des postulierten kovalenten Zwischenprodukts im Verhältnis zu seiner Abbaugeschwindigkeit zunehmen und dieses sollte sich anreichern. Um dies zu überprüfen hat Withers E35Q HEW-Lysozym (HEW = Hühnereiweiß) mit NAG-ß(1—4)-2-desoxy-2fluor-B-p-glucopyranosylfluorid (NAG2FGIcF) inkubiert:

CH,0OH H

HO

OÖ

KSOHeH

H

CH,OH H

ONE

0 OH H H NHCOCH HF NAG2FGIcF

H

Die Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS; Abschnitt 5.3D) dieses Reaktionsgemisches zeigte bei 14.683 D einen scharfen Peak. Dies stand im Einklang mit der Bildung des vorgeschlagenen kovalenten Zwischenprodukts [Lysozym hat eine Molekülmasse von 14.314 D und die Molekülmasse der NAG-B(1—4)-2-desoxy-2-fluor-B-D-glucopyranosylfluorid-Gruppe beträgt 369 D]. Die Röntgenstruktur dieses kovalenten Komplexes offenbart eine etwa 140 pm lange kovalente Bindung zwischen dem C1 des D-Rings und einem O von Asp 52 einer Seitenkette (Abb. 11.23). Der D-Ring nimmt eine unverzerrte Sesselkonformation an, was zeigt, dass es sich um ein stabiles Reaktionszwischenprodukt handelt und nicht um ein Analogon des Übergangszustands. Die Überlagerung dieses kovalenten Komplexes mit dem oben beschriebenen Komplex aus NAM-NAG-NAM und Wildtyp-HEW-Lysozym lässt erkennen, wie sich diese kovalente Bindung ausbildet (Abb. 11.23). Der 320 pm-Abstand zwischen dem C1 des D-Rings und dem O von Asp 52 im NAM-NAG-NAM-Komplex ver-

kürzt sich auf etwa 140 pm im kovalenten Komplex, wenn sich der D-Ring aus der Halbsessel- zur Sesselkonformation entspannt und die Asp 52-Seitenkette sich um etwa 45° um ihre C,-C;-Bindung dreht.

Abb. 11.23 Position des D-Rings während der Katalyse durch Lysozym. Gezeigt ist die Position des C- und D-Rings vom Substrat und vom katalytischen Asp 52; dazu wurden die Röntgenstrukturen des kovalenten Komplexes aus E35Q-Lysozym und -NAG2FGIcF (© grün, N blau, O rot und F magentarot) und des nichtkovalenten Komplexes aus Lysozym und einem NAM-NAG-NAM-Substrat

(C gelb, N blau

und O rot) überlagert. Man beachte, dass sich die

kovalente Bindung zwischen Asp 52 und dem C] des D-Rings bildet, wenn sich der D-Ring im nichtkovalenten Komplex von der verzerrten Halbsessel- in die nicht verzerrte Sesselkonformation entspannt und die Seitenkette von Asp 52 sich um etwa 45° um ihre C,-C;-Bindung dreht. [Nach Röntgenstrukturen von David Vocadlo und Stephen Withers, University of British Columbia, Vancouver und Michael James, University of Alberta, Edmonton.

PDBid IH6M.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Worin liegt die Bedeutung der Konformation im D-Ring eines

Lysozymsubstrats? 2. Beschreiben Sie den katalytischen Mechanismus der Lysozymreaktion.

378

_Enzymatische Katalyse

5

Serinproteasen

Unser nächstes Beispiel für enzymatische Mechanismen ist eine mannigfaltige, weit verbreitete Gruppe proteolytischer Enzyme, die Serinproteasen. Sie werden so bezeichnet, weil sie einen gemeinsamen Katalysemechanismus besitzen, dessen Kennzeichen ein besonders reaktiver Ser:Rest ist. Zu den Serinproteasen gehören Verdauungsenzyme von Prokaryoten und Eukaryoten, daneben aber auch stärker spezialisierte Enzyme, die an Entwicklungsprozessen, Blutgerinnung, Entzündungen und zahlreichen anderen Vorgängen beteiligt sind. In diesem Abschnitt konzentrieren wir uns auf einige der am besten untersuchten Serinproteasen: Chymotrypsin, Trypsin und Elastase.

A. CH(CH;); oO (Aktives Ser) —CH,;,0OH

+

F—-P=O

(0) CH(CH3); Diisopropylfluorophosphat (DIPF)

CH(CH;),

0

(Aktives Ser) — CH, —-O eAN=0O

0

ass ‘DIP-Enzym

+

HF

Das aktive Zentrum

Chymotrypsin, Trypsin und Elastase sind Verdauungsenzyme, die vom Pankreas synthetisiert und ins Duodenum (Zwölffingerdarm) sezerniert werden. Alle drei katalysieren die Hydrolyse von Peptid-(Amid-)bindungen, allerdings mit unterschiedlichen Spezifitäten bezüglich der Seitenketten, die die zu spaltende Bindung flankieren. Chymotrypsin spaltet spezifisch nach großen hydrophoben Resten, Trypsin ist spezifisch für positiv geladene Reste und Elastase für kleine, neutrale Reste (Tab. 5.3). Zusammen bilden sie eine „schlagkräftige Verdauungsmannschaft“. Die katalytisch wichtigen Gruppen des Chymotrypsins hat man durch chemische Markierungsexperimente identifiziert. Ein diagnostischer Test auf das Vorhandensein eines aktiven Ser in Serinproteasen ist dessen Reaktion mit Diisopropylfluorophosphat (engl.: diisopropylphosphofluoridate, DIPF), da dabei das Enzym irreversibel inaktiviert wird (links). Andere Ser-Reste, auch im selben Protein, reagieren nicht mit DIPF. DIPF reagiert nur mit Ser 195 in Chymotrypsin, womit gezeigt ist, dass es sich bei diesem Rest um das Ser im aktiven Zentrum des Enzyms handelt. Diese Spezifität macht DIPF und verwandte Verbindungen extrem toxisch (siehe Exkurs 11.2). Ein zweiter katalytisch wichtiger Rest, His 57, wurde durch Affinitätsmarkierung entdeckt. Bei dieser Technik bindet ein Substratanalogon mit einer reaktiven Gruppe spezifisch an das aktive Zentrum des Enzyms und reagiert dort unter Ausbildung einer stabilen kovalenten Bindung mit einer nahe gelegenen reaktiven Gruppe (diese reaktiven Substratanaloga werden deshalb als „trojanische Pferde“ der Biochemie bezeichnet). Die affinitätsmarkierten Gruppen können dann anschließend identifiziert werden. Chymotrypsin bindet spezifisch Tosyl-ı-phenylalaninchlormethylketon (TPCK) auf Grund seiner Ähnlichkeit mit einem Phe-Rest (einem von Chymotrypsin bevorzugten Substratrest). Die Chlormethylketogruppe des am aktiven Zentrum gebundenen TPCK ist ein starkes Alkylierungsmittel; sie reagiert nur mit His 57 (Abb. 11.24) und inaktiviert dadurch das Enzym. Trypsin, das basische Reste bevorzugt, wird in gleicher Weise durch Tosyl-ı-lysinchlormethylketon inaktiviert.

nt

\vataan NH—CH—C—CH;0l | (0)

Tosyl-L-lysinchlormethylketon

Serinproteasen

379

Nervengifte Die Entdeckung, dass organische Phosphatverbindungen wie DIPF starke Nervengifte sind, führte zu derem Einsatz als Enzyminhibitoren. Die Neurotoxizität von DIPF wird durch die Hemmung der Acetylcholinesterase verursacht, eines Enzyms, das die Hydrolyse von Acetylcholin katalysiert.

4

O-CH,CH, 0-1

nl

O—CH;CH; Parathion

|

(CH3);N— CH, — CH5

06

(0) —CH;3

+

H,0

CH;z

Acetylcholin

et OÖ

|Arstyichlinesterase

+ +

+

O—CH;

Malathion

"

Se

ee

een

ER

(CH3)3„ N—-CH,—CH,—-OH

O—CH;

H

Cholin

Die Esteraseaktivität der Acetylcholinesterase erfordert, wie bei Chymotrypsin (Abschnitt 11.1B), einen reaktiven Ser-Rest. Acetylcholin ist ein Neurotransmitter: Es überträgt Nervenimpulse über bestimmte Arten von Synapsen (Kontaktstellen zwischen Nervenzellen). Die Acetylcholinesterase baut normalerweise Acetylcholin im synaptischen Spalt ab, so dass der Nervenimpuls nur ungefähr eine Millisekunde andauert. Die Inaktivierung der Acetylcholinesterase verhindert die Hydrolyse des Neurotransmitters. Dadurch bleibt der Acetylcholinrezeptor, ein Na’ /K*-Kanal, länger als normal geöffnet,

was den regulären Ablauf von Nervenimpulsen beeinflusst. DIPF ist für Menschen so toxisch (der Tod tritt durch Atemlähmung ein), dass es militärisch als Nervengift eingesetzt wurde. Verwandte Verbindungen wie Parathion und Malathion sind nützliche Insektizide, da sie für Insekten wesent-

Neurotoxine wie DIPF und Sarin (das 1995 traurige Berühmtheit durch seinen terroristischen Einsatz in einer U-Bahn in Tokio erlangte) werden durch das Enzym Paraoxonase inaktiviert.

9

F

CH, Sarın

Dieses Enzym tritt in zwei Isoformen (eine mit Arg, die andere mit Gin in Position 192) unterschiedlicher Aktivität auf. Verschiedene Individuen produzieren stark unterschiedliche Mengen dieses Enzyms. Diese Faktoren sind vermutlich für die großen beobachteten Sensitivitätsunterschiede der Individuen gegenüber Nervengiften verantwortlich.

lich giftiger sind als für Säugetiere.

Chymotrypsin

Chymotrypsin

CH

uf

j 2

NN His 57

ı

o +

md

Il im oI

CH, 0 | Il CH—C—CH,C1

Tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon (TPCK)

HCI m).

CH 7x 5

N|

Az

ae R Abb. 11.24 Reaktion von TPCK mit His 57 des Chymotrypsins.

380

_ Enzymatische Katalyse

B.

_Röntgenstrukturen

Chymotrypsin, Trypsin und Elastase sind auffallend homolog in ihrer Struktur: Die Primärstrukturen dieser rund 240 Reste langen Enzyme sind zu ca. 40% identisch (zum Vergleich: Die a- und ß-Ketten des menschlichen Hämoglobins haben eine 44 %ige Sequenzübereinstimmung). Außerdem besitzen alle diese Enzyme ein reaktives Ser und ein katalytisch essentielles His. Es kam daher nicht überraschend, dass sich auch ihre Röntgenstrukturen als nah miteinander verwandt erwiesen haben. Die Struktur von Rinder-Chymotrypsin wurde 1967 von David Blow aufgeklärt. Es folgten die Bestimmung der Struktur des Rinder-Trypsins (Abb. 11.25) durch Robert Stroud und Richard Dickerson sowie der Schweine-Elastase durch David Shotton und Herman Watson. Jedes dieser Proteine ist in zwei Domänen gefaltet, wobei beide ausgedehnte Bereiche mit antiparallelen ß-Faltblättern in einer zylinderförmigen Anordnung besitzen, aber nur wenige helicale Abschnitte enthalten. Um die Struktur dieser drei Enzyme besser vergleichen zu können, verwenden wir im Folgenden für alle dieselbe Nummerierung der Aminosäurereste, nämlich die des Rinder-Chymotrypsinogens, der 245 Reste langen Vorstufe des Chymotrypsins (Abschnitt 11.5D). Bei allen drei Strukturen sind die katalytisch essentiellen Reste His 57 und Ser 195 in der Substratbindungsstelle des Enzyms lokalisiert (im Zentrum der Abb. 11.25). Die Röntgenstrukturen zeigen außerdem, dass Asp 102, das bei allen Serinproteasen vorkommt, in einer nahe gelegenen, für Lösungsmittel un-

Abb. 11.25 Röntgenstruktur des Rinder-Trypsins im kovalenten Komplex mit seinem Inhibitor Leupeptin. Das Protein ist als transparente Oberfläche

dargestellt mit seinem Peptidrückgrat in Schlangenform, das in den Spektralfarben, von

blau an seinem N-terminalen Ende bis rot an seinem C-Terminus, eingefärbt ist. Die Seitenketten der katalytischen Triade Ser 195, His 57 und Asp

102 sind in Kugel-und-Stab-Form gezeichnet und entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt (C grün, N blau, © rot). Schwarze gestrichelte Linien stehen für Wasserstoffbrückenbindungen. Leupeptin (Acetyl-Leu-Leu-Arg, wobei die terminale Carboxylgruppe durch -CHO ersetzt ist) ist in Stabform gezeichnet (C türkis, N blau, © rot), seine Arg-

Seitenkette besetzt die Spezifitätstasche des Enzyms (magentafarbiges Netz). [Nach einer Röntgenstruktur von Daniel Koshland, |r.,

University of California, Berkeley. PDBid 2AGI.] 6% siehe Kinemage Exercise 10.1.

Serinproteasen

Katalytische Triade

Gly 193

381

Abb. 11.26 Die Aminosäuren des aktiven Zentrums von Chymotrypsin. Die Blickrichtung entspricht ungefähr der von Abb. 11.23. Die katalytische Triade besteht aus Ser 195, His 57 und Asp 102. [Nach Blow, D.M. und Steitz, T. A.; Annu. Rev. Biochem. 39, 86 (1970).]

zugänglichen Tasche verborgen ist. Diese drei invarianten Reste bilden eine durch Wasserstoffbrücken stabilisierte Anordnung, die als katalytische Triade bezeichnet wird (Abb. 11.25 und 11.26). zu spaltende Bindung

Die Substratspezifitäten lassen sich nur teilweise strukturell erklären Die Röntgenstrukturen der drei oben besprochenen Enzyme liefern die Grundlage für das Verständnis ihrer unterschiedlichen Substratspezifitäten (Abb. 11.27): 1. Chymotrypsin spaltet bevorzugt an der Carbonylgruppe der Aminosäurereste von Phe, Trp oder Tyr. Die sperrigen aromatischen Seitenketten passen perfekt in die hydrophobe Tasche in der Nähe der katalytisch aktiven Gruppen. 2. Bei Trypsin liegt ein anionischer Asp-Rest (anstelle von Ser 189 in Chymotrypsin) an der Rückseite der Bindungstasche. Die kationischen Seitenketten der für Trypsinspaltungen bevorzugten Reste Arg und Lys können daher mit diesem Asp-Rest Ionenpaare bilden. Die weiteren Aminosäuren der Bindungstasche des Chymotrypsins sind im Trypsin erhalten, so dass die sper-

zu spaltende Bindung

Ser 189 Chymotrypsin

rigen Seitenketten von Arg und Lys dort untergebracht werden können. 3. Elastase heißt so, weil sie das sonst praktisch unverdauliche, Ala-, Gly- und Val-reiche Protein Elastin (ein Hauptbestandteil des Bindegewebes) schnell hydrolysieren kann. Die Bindungstasche der Elastase wird größtenteils von den Seitenketten eines Val- und eines Tyr-Rests ausgefüllt. Diese Aminosäuren ersetzen zwei Gly-Reste, die im Chymotrypsin und Trypsin die Bindungstasche säumen. Folglich spaltet Elastase, deren Substratbindungstasche eher einer Senke gleicht, Peptidbindungen spezifisch nach kleinen, neutralen Resten, insbesondere nach Ala. Dagegen hydrolysieren Chymotrypsin und Trypsin solche Peptidbindungen extrem langsam, da diese kleinen Substrate für eine wirksame Katalyse auf der Enzymoberfläche nicht hinreichend immobilisiert werden können. Trotz des eben Gesagten ändert Trypsin nach dem Austausch von Asp 189 gegen Ser mittels ortsgerichteter Mutagenese (Abschnitt 3.5D) nicht seine Spezifität zu der des Chymotrypsins. Es entsteht lediglich eine schwach aktive, unspezifische Protease. Die Substitution zusätzlicher Reste in der Spezifitätstasche des Trypsins mit denjenigen des Chymotrypsins führt ebenfalls nicht zu einer bedeutenden Steigerung dieser katalytischen Aktivität. Trypsin wird jedoch ein ungefähr vergleichbar aktives Chymotrypsin-ähnliches Enzym, wenn zwei Schleifen an der Oberfläche, die die Wände der Bindungstasche verbinden (Reste 185-188 und 221-225), ebenfalls durch Chymotrypsinreste ersetzt werden. Diese Schleifen, die bei allen diesen Proteinen konserviert sind, sind offensichtlich nicht für

die Substratbindung an sich, sondern für die korrekte Ausrichtung der zu spaltenden Bindung notwendig. Diese Ergebnisse unterstreichen einen bedeutenden Punkt, den es bei „genetic engineering“-Experimenten zu beachten gilt:

Elastase

Abb. 11.27 Spezifitätstaschen von drei Serinproteasen. Die Seitenketten von wichtigen Aminosäuren,

die die Größe und Natur der Spezifitätstasche bestimmen, sind zusammen mit einem repräsentativen Substrat für jedes Enzym abgebildet. Chymotrypsin spaltet bevorzugt Peptidbindungen nach großen hydrophoben Seitenketten, Trypsin bevorzugt nach Lys oder Arg und Elastase nach Ala, Gly oder Val. [Nach einer Zeichnung in Branden, C. und Tooze, J., Introduction to Protein Structure (2. Aufl.), Garland Publishing, S. 213 (1999).]

382

_Enzymatische Katalyse

Enzyme sind maßgeschneidert für ihre jeweilige Funktion, mutagene Eingriffe oft in unerwarteter Weise reagieren.

so dass sie auf

Die evolutionäre Verwandtschaft unter Serinproteasen

Wir wissen bereits, dass man an Homologien in der Sequenz und Struktur von Proteinen ihre evolutionären Verwandtschaften erkennen kann (Abschnitte 5.4 und 6.2D). Die großen strukturellen Ähnlichkeiten von Chymotrypsin, Trypsin und Elastase lassen vermuten, dass sich diese Proteine durch Genduplikationen aus einer

“Ur-Serinprotease“ und anschließende, divergierende Evolution der entstandenen Enzyme entwickelt haben. Die ausgedehnte strukturelle Ähnlichkeit dieser pankreatischen Enzyme zu bestimmten bakteriellen Proteasen lässt darauf schließen, dass das primordiale (ursprüngliche) Trypsingen vor der Trennung von Pro- und Eukaryoten entstand. Es sind mehrere Serinproteasen bekannt, deren Primär- und Tertiärstrukturen keinerlei erkennbare Übereinstimmungen untereinander oder mit Chymotrypsin aufweisen. Dennoch enthalten sie in ihren aktiven Zentren katalytische Triaden, die den Strukturen des Chymotrypsins stark ähneln. Es handelt sich dabei um Subtilisin, eine Endopeptidase, die ursprünglich aus Bacillus subtilis isoliert wurde, und Serincarboxypeptidase II aus Weizenkleie, eine Exopeptidase. Da sich die Reste des entsprechenden aktiven Zentrums der drei Arten von Serinproteasen in gänzlich unterschiedlichen Positionen der Aminosäuresequenzen befinden (Abb. 11.28), scheint es äußerst unwahrscheinlich, dass sie von einem gemeinsamen Vorläufer-Protein abstammen. Diese Enzyme sind offensichtlich ein bemerkenswertes Beispiel konvergenter Evolution: Die Natur hat somit auf mehreren unterschiedlichen Wegen denselben katalytischen Mechanismus gefunden.

Subtilisin

Serincarboxypeptidase Il

Chymotrypsin

NH#

NH#

NH3

\ Asp 32

I A

His 64

His 57 Abb. 11.28 Schematische Darstellung der relativen Positionen der katalytisch relevanten Aminosäuren im aktiven Zentrum dreier nicht verwandter Serinproteasen.

“ Be eu ——

Ser 146

Asp 102

Gly 127°

\

Die katalytischen Triaden bestehen bei Subtilisin,

Chymotrypsin und Serincarboxypeptidase II jeweils aus Ser, His und Asp. Die Peptidgerüste

von Ser 214, Trp 215 und Gly 216 in Chymotrypsin und ihre Gegenstückein Subtilisin sind an den Wechselwirkungen bei der Substratbindung

N

ser 221

_—

|

Asp 338

Ser 195 1 on

& His 397 |

BP

beteiligt. [Nach Robertus, J.D., Alden, R.A.,

ey

Birktoft, J.)., Kraut, J., Powers, J.C. und Wilcox,

216

P.E., Biochemistry 11, 2449 (1972). 6% siehe Kinemage Excercise 10-2.

c00°

COO-

Serinproteasen

C. _ Katalysemechanismus Auf der Grundlage vielfältiger Daten zur Chemie und Struktur ist folgender Katalysemechanismus für Serinproteasen formuliert worden, der hier am Beispiel des Chymotrypsins erläutert wird (Abb. 11.29), der aber für alle Serinproteasen und bestimmte andere hydrolytisch aktive Enzyme gleichermaßen gilt: 1. Nach der Substratbindung an Chymotrypsin greift das Ser 195 die Carbonylgruppe der zu spaltenden Peptidbindung nucleophil an. Es entsteht das tetraedrische Zwischenprodukt, das dem Übergangszustand der Reaktion ähnelt (kovalente Katalyse). Röntgenstrukturuntersuchungen zeigen, dass das Ser 195 an der für den nucleophilen Angriff idealen Position lokalisiert ist (d.h. die Katalyse erfolgt auch durch Nachbargruppen- und Orientierungseffekte). Bei diesem nucleophilen Angriff wird ein Proton auf den Imidazolring von His 57 übertragen, wodurch ein Imidazoliumion entsteht (allgemeine Basekatalyse). Dieser Vorgang wird durch den polarisierenden Effekt des nicht solvatisierten Carboxylations von Asp 102 unterstützt, das mit His 57 eine Wasserstoffbrücke ausbildet (elektrostatische Katalyse). Das tetraedrische Zwischenprodukt stellt einen wohldefinierten, wenn auch kurz-

2.

3.

4.

5.

lebigen Zwischenzustand dar. Wir werden sehen, dass ein wesentlicher Teil der katalytischen Effektivität des Chymotrypsins aus der bevorzugten Bindung seines Übergangszustands stammt (Katalyse durch Stabilisierung des Übergangszustands). Das tetraedrische Zwischenprodukt zerfällt unter Deprotonierung von N3 des His 57 in das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt (allgemeine Säurekatalyse). Dies wird durch den Polarisierungseffekt von Asp 102 und His 57 unterstützt (elektrostatische Katalyse). Die abgehende Aminogruppe (R’NH,, der neue N-Terminus der gespaltenen Polypeptidkette) löst sich vom Enzym ab und wird durch Wasser aus dem Lösungsmittel ersetzt. Das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt, das leicht hydrolytisch spaltbar ist, fügt durch Umkehr von Schritt 2 Wasser hinzu. Dadurch entsteht ein zweites tetraedrisches Zwischenprodukt. Die Umkehr von Schritt 1 führt zur Bildung des Carboxylatprodukts (der neue C-Terminus der gespaltenen Polypeptidkette) und zur Regenerierung zum aktiven Enzym. Dabei ist Wasser das angreifende Nucleophil und Ser 195 die Abgangsgruppe.

Serinproteasen binden bevorzugt den Übergangszustand

Detaillierte Vergleiche der Röntgenstrukturen mehrerer Serinprotease-InhibitorKomplexe haben die strukturellen Grundlagen ihrer Mechanismen aufgeklärt

(Abb. 11.30): 1. Die Konformationsverzerrung bei der Bildung des tetraedrischen Zwischenprodukts bewirkt, dass der nun anionische Carbonylsauerstoff des Peptidsubstrats tiefer in das aktive Zentrum eindringt und so eine bis dahin freie Position besetzen kann — das sogenannte Oxyanion-Loch. 2. Dort bildet er zwei Wasserstoffbrücken mit dem Enzym aus, die bei normaler trigonaler Konformation der Carbonylgruppe nicht auftreten könnten. Joseph Kraut berichtete als erster, dass die beiden enzymatischen H-Brückendonatoren analoge Positionen in Chymotrypsin und Subtilisin einnehmen. Er postulierte die Existenz des Oxyanion-Lochs, wobei er davon ausging, dass konvergierende Evolution zur Identität der aktiven Zentren in diesen nicht verwandten Enzymen führte. 3. Die tetraedrische Verzerrung erlaubt außerdem die Bildung einer sonst nicht bestehenden Wasserstoffbrücke zwischen dem Enzym und der Gerüst-NHGruppe des Rests vor der enzymatischen Spaltstelle.

6” siehe Guided Exploration 10:

The catalytic mechanism of serine proteases.

383

_Enzymatische Katalyse

384

n 02)

zn (OL

|

HzON

CHs

A

N. [6)

SH

Ser

Ze SE D 7Z En en

195

en ER

Par Pr

——NE

ar

CH

u
P. Diese bimolekulare Reaktion ist

eine Reaktion zweiter Ordnung, deren momentane Geschwindigkeit wie folgt beschrieben wird:

397

Rechenbeispiel 12.1 Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der

v‚-- AN = k[A]

(12.2)

In diesem Fall verhält sich die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zum Quadrat der Konzentration von A, und die Geschwindigkeitskonstante k einer Reaktion zweiter Ordnung hat die Einheit Ms, Die bimolekulare Reaktion A + B— P ist ebenfalls eine Reaktion zweiter Ordnung mit der momentanen Geschwindigkeit

aA] __ AB] _ N

(12.3)

Diese Reaktion wird als jeweils erste Ordnung in [A] und [B] bezeichnet (siehe Rechenbeispiel 12.1). Uni- und bimolekulare Reaktionen kommen häufig vor. Trimolekulare Reaktionen sind ungewöhnlich, da die simultane Kollision dreier Moleküle ein seltenes Ereignis ist. Reaktionen vierter und höherer Ordnung sind nicht bekannt.

Elementarreaktion X + Y — Z, wenn die

Probe 3 uM X und 5 uM Y enthält und k für

die Reaktion 400 M': s"' beträgt.

Verwenden Sie Gleichung 12.3 und stellen Sie sicher, dass alle Einheiten zueinander passen:

v = kXN] = (400 M"- s')(3 uM)(5 uM) = (400 M: s')(3 x 10°M) (5 X 10°°M) = 610° Ms" =6nM - s"

Geschwindigkeitsgleichungen Eine Geschwindigkeitsgleichung beschreibt den Verlauf einer Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit und kann von den Gleichungen, die die Momentangeschwindigkeiten beschreiben, abgeleitet werden. Eine Geschwindigkeitsgleichung erster Ordnung erhält man also durch Umformen von Gleichung 12.1:

A

[A]

a In[A] = —k dt

(12.4)

und durch Integrieren von [A]o, der Anfangskonzentration von A, bis [A], der Konzentration von A zum Zeitpunkt t:

(Al / dln [A] -+/ dt [Al 0

(12,5)

Dies führt zu

In[A] = In[A], -kt

(12.6)

In[Al,

oder durch Entlogarithmieren zu

[A] = [Ale

Steigung = -k

(12.7)

Gleichung 12.6 ist eine lineare Gleichung der Form y= mx + b und kann wie in Abbildung 12.1 dargestellt werden. Daher ergibt bei einer Reaktion erster Ordnung die Auftragung von In[A] gegen t eine Gerade mit der Steigung -k (dem negativen Wert der Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung) und dem Schnittpunkt mit der In[A]-Achse In[A]o. Für alle Reaktionen erster Ordnung gilt: Die Zeit, in der die Hälfte des ursprünglich vorhandenen Reaktanten abgebaut wird, die Halbwertszeit t,,,, ist konstant und

daher von der Ausgangskonzentration des Reaktanten unabhängig. Dies lässt sich leicht zeigen, indem man die Beziehung [A] = [Alo/2 bei t= t}, in Gleichung 12.6 einsetzt und dann umformt: [Alo/2\

_ _

ne) Fe

(12.8)

In[A]

0)

Zeit

Abb. 12.1 Graphische Darstellung einer Geschwindigkeitsgleichung erster Ordnung. Die Steigung der Geraden aus der Auftragung von In [A] gegen t ergibt die Geschwindigkeitskonstante k.

398

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Exkurs 12.1

Biochemie im Fokus

Isotopenmarkierung Im Labor ist es oft hilfreich, große oder kleine Moleküle so zu markieren, dass sie nach chromatographischen oder elektro-

phoretischen Trennungen oder in Bindungsstudien leicht zu detektieren sind. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden ist die Markierung mit einem radioaktiven Isotop, entweder anstelle eines natürlich vorkommenden Isotops oder in einer zusätzlich angehängten Gruppe. Derart markierte Moleküle können dann in Lösung oder in fester Form durch die Messung der vom Marker emittierten Radioaktivität detektiert werden. Diese Methode ist empfindlicher als spektroskopische Messungen und oft leichter durchführbar als aufwändigere Untersuchungen, die auf chemischen oder biologischen NMR-aktiven

Aktivitäten basieren. Metaboliten, die mit Isotopen, wie z.B. 13C, markiert sind, können

auch in lebenden Geweben mit NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden. Einige der am häufigsten in der Biochemie verwendeten radioaktiven Isotope (Radionuclide), ihre Halbwertszeiten und die Art der beim spontanen Zerfall der Atomkerne emittierten Radioaktivität sind nachfolgend aufgelistet. Plasmakonzentrationen menschlicher Koagulationsfaktoren.

Radionuclid

Halbwertszeit

Strahlungstyp*®

°’H

12 Jahre

ß

nie

5715 Jahre

ß

“Na

15 Stunden

ß

pP

14 Tage

ß

87 Tage

ß

OR

1,25 X 10° Jahre

ß

ea

163 Tage

ß

60 Tage

y

Ss

|

|

8 Tage

B, y

® ß-Partikel sind emittierte Elektronen und y-Strahlen sind emittierte Photonen.

Nucleinsäuren

können einfach durch das Anhängen eines

terminalen Nucleotids, das °P anstelle des normalen, nicht radioaktiven °'P enthält, markiert werden. Proteine lassen

sich durch chemischen oder enzymatischen Einbau von "I in einen Tyrosinrest markieren. In Untersuchungen zu Zellwachstum und -teilung wird oft die Aufnahme von ’H-Thymidin gemessen (Thymidin wird ausschließlich in DNA eingebaut). Die Proteinsynthese kann in ähnlicher Weise durch das Auftreten von °”S-Met in Proteinen verfolgt werden.

Natürlich hängt die Wahl einer bestimmten Isotopenmarkierung auch vom Zeitverlauf des Experiments und der Methode der Radioaktivitätsmessung ab. Die Empfindlichkeit eines Geiger-Müller-Zählers, der elektronisch die lonisierung eines Gases unter dem Einfluss der Strahlung misst, reicht nicht aus, um niederenergetische Strahler wie ?H und '*C zu detektieren. Diese Beschränkung umgeht man durch Flüssigszintillationsmessung. Bei dieser Technik gibt man

eine Substanz,

die ß-Strahlung emittiert,

in eine Flüssigkeit, die ein fluoreszierendes Molekül enthält. Die ß-Partikel regen den Fluorophor zur Emission von Licht optisch detektiert werden

an, das dann

kann.

Radioaktive

Substanzen, die y-Strahlung emittieren, werden mit Szintillationszählern bestimmt; dabei schlagen die y-Strahlen Elektronen aus einem Nal-Kristall im Zähler heraus. Diese Elektronen

induzieren

Fluoreszenz,

die dann

gemessen

wird. Bei

der Autoradiographie wird eine auf einem Papier oder in einem Agarose- bzw. Polyacrylamidgel immobilisierte radioaktive Substanz

detektiert,

indem

ein Röntgenfilm

auf die

Probe gelegt und nach ausreichender Inkubation entwickelt wird (dunkle Bereiche auf dem entwickelten Film zeigen Regionen an, die Radioaktivität ausgesetzt waren). Mit dünnen Gewebeschnitten kann man auch eine Mikroradiographie durchführen, indem man sie mit einer Schicht einer photographischen Emulsiorr bedeckt und die entwickelte Emulsion unter einem Mikroskop untersucht. Instrumente, die Radioaktivität in festen Proben elektronisch, ohne den Gebrauch

eines Films, messen, bieten den Vorteil digitalisierter Ergebnisse und mehrfacher Exposition (im Gegensatz zu einem Film, der nur einmal belichtet und entwickelt werden kann). Der Einsatz radioaktiver Isotope zur Markierung von Molekülen ist nicht ohne Nachteile. Zuerst und zu aller oberst steht die Gefahr beim Umgang mit potentiell mutagenem Material (die Strahlung kann DNA-Schäden verursachen). Darüber hinaus müssen radioaktive Labormaterialien (Proben ebenso wie Glaswaren) ordnungsgemäß entsorgt werden, da die resultierende

Kontamination

Fehler bei nach-

folgenden Radioaktivitätsmessungen verursachen oder eine Gefahr für die Gesundheit darstellen kann. Szintillationsflüssigkeit stellt ein besonderes Problem bei der Entsorgung dar, weil große Volumina erforderlich sind (sie besteht auch größtenteils aus organischen Lösungsmitteln). Die Tabelle verdeutlicht,

dass

zwar

kurzlebige

Radionuclide

(wie z.B.

”p, ®°S und "I ) einfach durch Aufbewahren des Materials,

bis die Radioaktivität auf nicht signifikante Werte zurückgegangen ist, entsorgt werden können, dass aber die sichere Entsorgung langlebiger Spezies (wie °H und '*C) Probleme bereitet, die in absehbarer Zeit nicht gelöst werden können. Dies ist einer der Gründe, warum Markierungstechniken auf der Basis chemischer Marker oder fluoreszierender Substanzen zunehmend populärer werden.

Reaktionskinetik

399

In diesem Autoradiogramm, hat eine radioaktive RNA-Probe mit spezifischen Stellen innerhalb des Drosophila-Chromosoms hybridisiert. Die schwarzen Punkte zeigen die Stellen, an denen radioaktiver Zerfall

stattgefunden hat. [Aus Loughney, K., Kreber, R. und Ganetzky, B., Cell 58, 1143 (1989), mit Erlaubnis von Cell Press.]

Also gilt In2

0,693

hın= TR

(12.9)

Instabile Substanzen, wie z.B. radioaktive Kerne, zerfallen in Reaktionen erster Ordnung (siehe Exkurs 12.1 und Rechenbeispiel 12.2). Bei einer Reaktion zweiter Ordnung mit einem Reaktantentyp, 2 A— P, unterscheidet sich die Veränderung von [A] mit der Zeit deutlich im Vergleich zu einer Reaktion erster Ordnung. Umformen von Gleichung 12.2 und Integrieren über dieselben Grenzen wie bei der Reaktion erster Ordnung führen zu [A] BfdA] Mn

t

ind pe «| dt

[Al

[Abo

Dr T IB sERrBurerzER

Der Zerfall eines hypothetischen Radioisotops hat eine Geschwindigkeit von 0,01 s'. Wie lange dauert es, bis die Hälfte

einer Probe von einem Gramm dieses

Isotops zerfallen ist?

(12.10)

so dass

hirz;,

Rechenbeispiel 12.2

(12.11)

Die Einheiten der Geschwindigkeitskonstante weisen auf einen Prozess erster Ordnung hin. Somit ist die Halbwertszeit konzentrationsunabhängig. Die Halbwertszeit des Isotops (die Halbwertszeit für seinen Zerfall) ist durch Gl. 12.9 gegeben:

Gleichung 12.11 ist eine lineare Gleichung bezüglich der Variablen 1/[A] und t. Die Halbwertszeit einer Reaktion zweiter Ordnung wird ausgedrückt als tı 2 = 1/k[A]o und ist damit, im Gegensatz zu einer Reaktion erster Ordnung, von der ursprünglichen Reaktantenkonzentration abhängig. Mit den Gleichungen 12.6 und 12.11 kann man eine Reaktion erster Ordnung von einer Reaktion zweiter Ordnung unterscheiden, indem man In[A] gegen t und 1/[A] gegen t aufträgt und bestimmt, welche der Darstellungen eine Gerade ergibt.

Um die Geschwindigkeitskonstante einer Reaktion zweiter Ordnung vom Typ A + B > P experimentell zu bestimmen, ist es oft hilfreich, die Konzentration eines Reaktanten relativ zum anderen zu erhöhen, z.B. [B] > [A]. Unter diesen Bedingungen verändert sich [B] nicht signifikant im Verlauf der Reaktion. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt daher nur von [A] ab, der Konzentration des Reaktanten, der nur in begrenzten Mengen vorhanden ist. Folglich scheint die Reaktion bezüglich A erster Ordnung zu sein und wird daher als eine Reaktion pseudo-erster Ordnung bezeichnet. Die Reaktion ist erster Ordnung bezüglich B für [A] > [B].

B.

Enzymkinetik

Enzyme katalysieren eine unglaubliche Vielfalt an Reaktionen mittels verschiedener Kombinationen von sechs katalytischen Grundmechanismen (Abschnitt 11.3). Einige Enzyme setzen nur ein einzelnes Substratmolekül um; andere

6” siehe Guided Exploration 11: Michaelis-Menten kinetics, Lineweaver-

Burk plots, and enzyme inhibition.

400

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

wirken auf zwei oder mehrere unterschiedliche Substratmoleküle, wobei die Reihenfolge der Bindung geordnet oder beliebig sein kann. Einige Enzyme bilden kovalente Zwischenkomplexe mit ihren Substraten aus, andere nicht. Und doch können alle Enzyme so untersucht werden, dass ihre Reaktionsgeschwindigkeiten ebenso wie ihre Gesamteffizienz quantifiziert werden können. Die Untersuchungen zur Enzymkinetik begannen 1902, als Adrian Brown die Hydrolysegeschwindigkeit der Saccharose, katalysiert durch das Hefe-Enzym ßFructofuranosidase, untersuchte: Saccharose

+

H;O

——> Glucose

+

Fructose

Brown zeigte: Wenn die Saccharosekonzentration wesentlich höher als die des Enzyms ist, wird die Reaktionsgeschwindigkeit unabhängig von der Saccharosekonzentration; d.h. die Geschwindigkeit ist in Bezug auf Saccharose nullter Ordnung. Er nahm daher an, dass die Gesamtreaktion aus zwei Elementarreaktionen besteht, bei denen das Substrat einen Komplex mit dem Enzym bildet, der dann in Produkte und Enzym zerfällt:

mean:

(12.12)

1

Hier symbolisieren E, S, ES und P Enzym, Substrat, Enzym-Substrat-Komplex bzw. Produkte. Wird also die Substratkonzentration hoch genug, um das Enzym vollständig in die ES-Form umzuwandeln, wird nach diesem Modell der zweite Reaktionsschritt geschwindigkeitsbestimmend und die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion unempfindlich gegenüber einer weiteren Erhöhung der Substratkonzentration. Jede der Elementarreaktionen der obigen Enzymreaktion wird durch eine Geschwindigkeitskonstante charakterisiert: k, und k_, sind die Geschwindigkeits-

konstanten der Hin- und Rückreaktion der Bildung des ES-Komplexes (der ersten Reaktion), und k, ist die Geschwindigkeitskonstante des Zerfalls von ES zu P (der zweiten Reaktion). Hierbei nehmen wir zur mathematischen Vereinfachung an, dass die zweite Reaktion irreversibel ist. Die Michaelis-Menten-Gleichung

Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion, wie sie in Gleichung 12.12 dargestellt ist, als eine Funktion der Substratkonzentration. In diesem kinetischen Schema ist die Bildung des Produkts aus ES ein Prozess erster Ordnung. Entsprechend kann die Geschwindigkeit der Produktbildung als das Produkt der Geschwindigkeitskonstanten dieser Reaktion und der Konzentration des unmittelbar vorausgehenden Zwischenprodukts ausgedrückt werden. Der allgemeine Ausdruck für die Geschwindigkeit von Reaktion 12.12 ist daher

d{P v= a = kılES]

(12.13)

Die Gesamtgeschwindigkeit der Produktion von ES ist die Differenz der Geschwindigkeiten

der Elementarreaktionen,

die zu seiner

Entstehung

führen,

und jenen, die zu seiner Dissoziation führen:

diES] =

klEIIS] = Kı[ES] - MılES]

(12.14)

Diese Gleichung lässt sich nicht ohne Vereinfachung integrieren. Es gibt hierfür zwei Möglichkeiten: 1. Annahme eines Gleichgewichts. 1913 nahmen Leonor Michaelis und Maud Menten, aufbauend auf Arbeiten von Victor Henri, an, dass k_ > k,, so dass sich beim ersten Reaktionsschritt ein Gleichgewicht einstellt.

Reaktionskinetik

k_

E][S

Ks = T N[ES]

(12.15)

Dabei ist K, die Dissoziationskonstante des ersten Schritts der Enzymreaktion. Mit dieser Annahme lässt sich Gleichung 12.14 integrieren. Obwohl diese Annahme nicht immer korrekt ist, wird in Anerkennung der Bedeutung dieser Pionierarbeit der Enzym-Substrat-Komplex, ES, als MichaelisKomplex bezeichnet. 2. Annahme eines Fließgleichgewichts (steady state). Abbildung 12.2 zeigt den Reaktionsverlauf der verschiedenen Teilnehmer von Reaktion 12.12 unter normalen physiologischen Bedingungen. Üblicherweise liegt nämlich das Substrat in großem Überschuss im Vergleich zum Enzym vor ([S] > [E)). Mit Ausnahme der Anfangsphase der Reaktion, die gewöhnlich nur wenige Millisekunden dauert, während E und S gemischt werden, bleibt [ES] annähernd konstant bis das Substrat nahezu aufgebraucht ist. Folglich muss die Geschwindigkeit der Bildung von ES fast während des gesamten Reaktionsverlaufs gleich der Geschwindigkeit seines Verbrauchs sein. Mit anderen Worten, ES bleibt in einem „steady state“ (Fließgleichgewicht) und [ES] kann als konstant angenommen werden:

d{ES]

F

Teile

(12.16)

Diese sogenannte steady-state-Annahme, eine Vereinfachung mit allgemeinerer Gültigkeit als die Annahme eines Gleichgewichts, wurde erstmals 1925 von G.E. Briggs und B.S. Haldane vorgeschlagen (Exkurs 12.2). Für den praktischen Gebrauch müssen die kinetischen Ausdrücke noch zu experimentell bestimmbaren Größen umformuliert werden. Die Größen [ES] und [E] sind im Allgemeinen nicht direkt messbar, jedoch lässt sich die Gesamt-Enzymkonzentration

(12.17)

[E}r = [E] + [ES]

gewöhnlich leicht bestimmen. Die Geschwindigkeitsgleichung der vollständigen Enzymreaktion lässt sich dann wie folgt ableiten: Die Kombination von Gleichung 12.14 mit der steady-state-Annahme (Gl. 12.16) ergibt

kılEIIS] = k-ılES] + ko[ES]

(12.18)

Durch Ersetzen von [E] = [E]r - [ES] und Umformen erhält man

([E]r = [ESS] =_ kı + ko

[ES]

kr

(12.19)

Die Michaelis-Konstante, Ky, ist definiert als

(12.20)

Betkı somit erhält man durch Umformen von Gleichung 12.19

KulES] = ([E]r = [ESDIS]

(12.21)

Aufgelöst nach [ES] ergibt dies

Be. Ka

(12.22)

+ [S]

Der Ausdruck für die Anfangsgeschwindigkeit (v,) der Reaktion, die Geschwin-

digkeit (Gl. 12.13) bei t = 0, wird daher

401

[Sol

Konzentration

[E]r = [E] + [ES]

[E]r

Abb. 12.2 Verlaufskurven einer einfachen Enzymreaktion. Mit Ausnahme der Anfangsphase der Reaktion (vor dem schattierten Block) sind die Steigungen der Verlaufskurven von [E] und [ES] nahe Null, und zwar solange [S] > [E] (innerhalb des schattierten Blocks). [Nach Segel, I.H., Enzyme Kinetics, S. 27, Wiley (1993).] 6% siehe Animated Figures.

402

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

| Exkurs 12.2

Berühmte Biochemiker

J.B.S. Haldane und die Enzymaktivität gen. Dieses Prinzip, die Annahme des sogenannten Fließgleichgewichts, liegt den modernen Theorien der Enzymaktivität zu Grunde. ! Auch ohne zu.wissen,

woraus

Enzyme

bestehen, erzielte

Haldane bedeutende Erkenntnisse. Er postulierte, dass ein Enzym eine Reaktion dadurch

J.B.S. Haldane (1392-1964) John Burdon Sanderson war der Sohn eines berühmten Physiologen und ein begnadeter Wissenschaftler und Schriftsteller. Er trug hauptsächlich dazu bei, die Mathematik auf Gebiete der Biologie, wie die Genetik und Enzymkinetik, anzuwenden. Als Naturwissenschaftler und ebenso als Philosoph kannte er die Entwicklungen in der Relativitätstheorie und Quantenmechanik. Er war von der praktischen Philosophie beeinflusst und der Ansicht, dass die Natur den Gesetzen der Logik und Arithmetik gehorche. Als Haldane

1930 sein Buch Enzymes veröffentlichte, war

die Vorstellung immer noch strittig, dass Enzyme Proteine seien und keine kleinen, von einem amorphen Protein (Kolloid) umgebenen Katalysatoren. Aber obwohl Strukturinformationen

fehlten,

hatten

Wissenschaftler

wie

Leonor

Michaelis und Maud Menten bereits die Prinzipien der Thermodynamik angewandt und einige Grundgleichungen der Enzymkinetik hergeleitet. Michaelis und Menten postulierten

katalysieren

könnte, dass es

das Substrat in eine erzwungene oder sich nicht im Gleichgewicht befindende Anordnung bringt. Diese Vorstellung war eine Weiterentwicklung von Emil Fischers früher SchlüsselSchloss-Theorie (und wurde später von Linus Pauling weiter ausgearbeitet). Haldanes Konzept der Deformation wurde erst gegen 1970 voll gewürdigt, nachdem die Röntgenstrukturen mehrerer Enzyme, einschlieflich Lysozym und Chymotrypsin (Kap. 11), untersucht worden waren.

Außer seinen enzymologischen Arbeiten brachte Haldane die Rolle der Gene bei der Vererbung zur Sprache und formulierte mathematische Schätzungen von Mutationsraten — viele Jahre bevor man die Beschaffenheit von Genen oder die DNA-Struktur kannte. Aber Haldane war nicht nur ein Theoretiker. Er war auch ein Experimentator, der oft an sich selbst unangenehme oder gefährliche Experimente vornahm. Er schluckte z.B. Natriumhydrogencarbonat und Ammoniumchlorid, um deren Auswirkung auf die Atemfrequenz zu untersuchen. Außerhalb des Labors war Haldane für seine Bemühungen bekannt, die Wissenschaft populär zu

1913, dass ein Enzym und sein Substrat während einer Reak-

machen.

tion mit einem Komplex aus Enzym und Substrat im Gleichgewicht sind. 1925 wandte Haldane ein, dass dies nicht streng gelte. Denn manche Enzym-Substrat-Komplexe dissoziieren nicht zum freien Enzym und Substrat zurück, sondern fahren praktisch fort, um das Produkt zu bilden. Wenn Enzym und Substrat gemischt werden, steigt zunächst die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes an. Nach einiger Zeit pendelt sich die Konzentration des Komplexes auf einem bestimmten Wert allerdings ein, weil er sich ständig bildet und wieder abgebaut wird, um das Produkt zu erzeu-

oder Wissenschaft und Zukunft, München 1925) kommentierte Haldane den Stand verschiedener Wissenschaftszweige um etwa 1924 und spekulierte über zukünftige Entwicklungen. Man könnte glauben, dass seine Gedanken und seine Persönlichkeit die Handlungen und Figuren in Science-Fiction-Werken verschiedener Schriftsteller inspiriert haben.

I0

2) a

In Daedalus,

or, Science and the Future

(Daedalus

Briggs, G.E., Haldane, J.B. S., A note on the kinetics of enzyme action,

Biochem.J. 19, 339 (1925).

= kı[ES] ==

klE]-IS] Ku + [5]

(12.23)

Sowohl [E}- als auch [S] sind experimentell bestimmbare Größen. Um die Bedingungen für die steady-state-Annahme zu erfüllen, muss die Konzentration des Substrats viel größer sein als die Konzentration des Enzyms. Das erlaubt jedem Enzymmolekül wiederholt ein Substratmolekül zu binden und es in das Produkt umzusetzen, so dass [ES] konstant ist. Der Bezug auf die Anfangsgeschwindigkeit (man misst die Geschwindigkeit, bevor ca. 10% des Substrats zum Produkt umgewandelt worden sind) minimiert den Einfluss komplizierender Faktoren wie den Beitrag von der Rück- oder Folgereaktionen, Hemmung des Enzyms durch das(die) Produkt(e) und fortschreitende Inaktivierung des Enzyms. (Deshalb kann auch die Geschwindigkeit der Rückreaktion in Gleichung 12.12 gleich Null angenommen werden.)

Reaktionskinetik

403

Abb. 12.3 Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit v, einer einfachen Enzymreaktion gegen die Substratkonzentration [S]. Die Punkte wurden bei Substratkonzentrationen zwischen 0,5 Ky, und 5 Ky in Intervallen von 0,5 Ky,

eingezeichnet. 62 siehe Animated Figures.

0

Ku

2Ky

3Ky

4AKy

5Ky

[S]

Die Maximalgeschwindigkeit einer Reaktion, V,„.., tritt bei hohen Substratkonzentrationen auf, wenn das Enzym vollständig mit Substrat gesättigt ist, d.h. wenn es vollständig in der ES-Form vorliegt:

Vnax = kalEhr

(12.24)

Kombiniert man die Gleichungen 12.22 und 12.23, erhält man

°

zunaeN Ku+ls]

12.25 ea

Diese Michaelis-Menten-Gleichung ist die Grundgleichung der Enzymkinetik. Sie beschreibt eine Hyperbel, wie in Abbildung 12.3 dargestellt. Die Sättigungsfunktion der Sauerstoffbindung an Myoglobin (Gl. 7.6) hat dieselbe mathematische Form. Bedeutung der Michaelis-Konstanten Die Michaelis-Konstante, K,, lässt sich auf einfache Weise definieren. Bei einer Substratkonzentration [S] = Ky ergibt Gleichung 12.25 vo= Vmax/2: Ku ist also die

Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist. Ein Enzym mit einem kleinen Ky-Wert erreicht also maximale katalytische Effizienz bei niedrigen Substratkonzentrationen. Der KyrWert ist einzigartig für jedes Enzym-Substrat-Paar: Verschiedene Substrate, die mit einem gegebenen Enzym reagieren, weisen unterschiedliche KyWerte auf. K, variiert stark mit der Natur von Enzym und Substrat (Tab. 12.1). Ky hängt auch von der Temperatur und dem pH-Wert ab. Die Michaelis-Konstante (Gl. 12.20) kann ausgedrückt werden als:

Ku

kı

+

k

Re k}

(12.26)

Da Ks die Dissoziationskonstante des Michaelis-Komplexes ist (Gl. 12.15), steigt mit fallendem K, die Substrataffinität des Enzyms. Ky ist daher auch ein Maß für die Substrataffinität eines Enzyms, vorausgesetzt k,/k, ist klein im Vergleich zu Ks, d.h. k, < k_,; somit verläuft die Reaktion ES > P langsamer als ES zurück in E und S zerfällt. kya/Km ist ein Maß für die katalytische Wirksamkeit Man kann die katalytische Konstante k,, eines Enzyms definieren als

Vmax Rkat —, [Er

(12.27)

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

404

Kur, ka und kya/Km-Werte für einige Enzyme und Substrate.

Tab. 12.1

u/

2 r | = Kae (s)

Enzym

Substrat

Ku (m)

Acetylcholin-Esterase

Acetylcholin

9,5:% 107

1,4% 10:

1,510

Carboanhydrase

GO>

22, 107

1,0.% 10°

8,3.x 107

HCO;

2,6% 102

4,0 x 10°

15.x°10°

Katalase

H)0,

25

102

1,0. x. 107

4.0. %,10°

Chymotrypsin

N-Acetylglycinethylester

4,4 92107

0

12%

N-Acetylvalinethylester

8,8 x 10”

1.7.%:10,2

1,9

N-Acetyltyrosinethylester

6,6 x 10*

19

Fumarat

5,0 x 10°

8,0 x 10?

D6.10-

Malat

2.5. 10,

9,0 x 10°

3,6 X 107

Harnstoff

25.1077

Toxe10%

4,0 x 10°

Fumarase

Urease

Rechenbeispiel 12.3 Eine enzymkatalysierte Reaktion hat eine Ky, von 1 mM und eine V,„., von 5 nM-s”. Wie groß ist die Reaktionsgeschwindigkeit

wenn die Substratkonzentration (a) 0,25 mM, (b) 1,5 mM oder (c) 10mM ist? Verwenden Sie die Michaelis-Menten-

Gleichung (Gl. 12.25):

(5 nM - s') (0,25 mM)

(2) = I mm) + (0,25 mM)

(5 nM - s')(1,5 mM) (1 mM) + (1,5 mM)

(b)

—5)—_

=3nM.S) (5 nM - s')(10 mM)

Il

=

(1 mM) + (10 mM) 50 1

Ms

z

=45nM -s

Beachten Sie: Wenn sich Einheiten im Zähler und im Nenner gegenseitig aufheben, ist es nicht nötig sie vorher in Standard-Einheiten umzuwandeln.

10

j

100

2,9 x 10°

Diese Größe wird auch als Wechselzahl (engl.: turnover number) bezeichnet, weil sie die Zahl der Umsetzungen angibt, die jedes aktive Zentrum pro Zeiteinheit katalysiert. Die Wechselzahlen für einige Enzyme sind in Tabelle 12.1 aufgeführt. Man beachte, dass diese Werte um über acht Größenordnungen variieren. Gleichung 12.24 zeigt, dass bei einem einfachen System wie einer Michaelis-Menten-Modellreaktion (Gl. 12.12) k,.= k, ist. Bei Enzymen mit komplizierteren Mechanismen (z.B. mehreren Substraten oder mehreren Zwischenprodukten) kann k,., eine Funktion verschiedener Geschwindigkeitskonstanten sein. Beachten Sie, dass k,., eine Konstante ist, während V,„,, von der Enzymkonzentration abhängt. V„., erhöht sich, wenn [E]- größer wird. Wenn [S] = K,, wird nur sehr wenig ES gebildet. Folglich gilt [E] = [E]r und Gleichung 12.23 reduziert sich zu einer Geschwindigkeitsgleichung zweiter Ordnung

vos2&) [E][S]>[kat (=) [EIIS]

(12.28)

Hier ist ky./Ky die scheinbare Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung der enzymatischen Reaktion; die Reaktionsgeschwindigkeit ändert sich direkt mit der Häufigkeit, mit der sich Enzym und Substrat in Lösung begegnen. Die Größe ky./ Km ist daher ein Maß für die katalytische Leistungsfähigkeit eines Enzyms (oft auch als Spezifitätskonstante bezeichnet). Es gibt eine obere Grenze für den Wert von k../Ky. Er kann nicht größer als k} sein; d.h. der Zerfall von ES in E + P kann nicht häufiger erfolgen als E und S zusammenstoßen und ES bilden. Die wirksamsten Enzyme haben k,,./Ku-Werte nahe der diffusionskontrollierten Grenze von 10° bis 10° M'- s!. Diese Enzyme katalysieren eine Reaktion also beinahe jedes Mal, wenn sie auf ein Substratmolekül treffen; sie haben praktisch katalytische Perfektion erreicht. In diesem Fall korrelieren Katalysegeschwindigkeit und Thermodynamik des Übergangszustands (siehe Exkurs 12.3).

C.

Analyse kinetischer Daten

Die Werte der Parameter der Michaelis-Menten-Gleichung (z.B. V,„., und Ku) können über verschiedene Methoden bestimmt werden. Bei sehr hohen Werten von [S] nähert sich die Anfangsgeschwindigkeit v, asymptotisch V., an (siehe Rechenbeispiel 12.3). In der Praxis ist es jedoch sehr schwierig, V,., direkt

Reaktionskinetik 1/v

405

Abb. 12.4

Doppelt-reziproke (Lineweaver-Burk-) Auftragung.

0

Die Fehlerbalken geben + 0,05 V,„„, an. Die

Steigung = Ky/ Vnax

Datenpunkte sind dieselben wie in Abb. 12.3. Man beachte den großen Einfluss kleiner Fehler bei niedrigen Substratkonzentrationen (1/[S] groß) und die Häufung von Datenpunkten bei großen Werten von [S]. 6% siehe Animated Figures.

[SI= 0,5 Ky

-1/Ky

0

1/[S] aus der Auftragung von v, gegen [S] (siehe Abb. 12.3) genau zu bestimmen. Selbst bei derart hohen Substratkonzentrationen wie [S] = 10 Ky ergibt Gleichung 12.25 für v, nur 91% von V,„.. so dass der Wert für V„., meist zu niedrig abgeschätzt wird. Eine bessere Methode zur Bestimmung der Werte von V„., und Ky wurde von

Hans Lineweaver und Dean Burk entwickelt. Sie bedient sich der reziproken Form der Michaelis-Menten-Gleichung (Gl. 12.25):

Rechenbeispiel 12.4 EEITTRETTEEIIEIIH

Bestimmen Sie Ky und V„., für ein Enzym

anhand folgender Daten:

[S] (mM)

vo (uM-s)

1

(er

Bau

IS.

Ä

12.29

Von

u

Diese Gleichung ist linear bezüglich 1/v, und 1/[S]. Trägt man diese Größen gegeneinander auf, erhält man die sogenannte Lineweaver-Burk- oder doppelt-reziproke Auftragung mit der Steigung Ky/ Va, dem Schnittpunkt mit der Ordinate 1/Vn., und dem extrapolierten Schnittpunkt mit der Abszisse -1/Ky (Abb. 12.4 und Rechenbeispiel 12.4). Wie aus Abbildung 12.3 ersichtlich, erhält man die besten Werte für kinetische Parameter in einem Messbereich von [S] von ca. 0,5 K, bis ca. 5 Ky. Ein Nachteil der Lineweaver-Burk-Auftragung liegt darin, dass sich die experimentell bestimmten Werte weiter links im Graphen häufen (Abb. 12.4). Außerdem führen bei geringen Substratkonzentrationen bereits kleine Messfehler bei v, zu großen Fehlern bei 1/v, und damit auch bei K,y, und Vax Es gibt noch verschiedene andere Auftragungsverfahren zur Bestimmung von Kuund V,„., aus kinetischen Daten, jedes mit seinen Vor- und Nachteilen. Heute werden kinetische Daten üblicherweise mit Computern analysiert, die mathematisch ausgereifte statistische Verfahren anwenden. Trotzdem sind LineweaverBurk-Auftragungen hilfreich zur graphischen Darstellung kinetischer Daten. Aus der „steady state“-Kinetik lässt sich der Reaktionsmechanismus nicht vollständig herleiten Obwohl die Analyse kinetischer Daten wertvolle Informationen über die Ge-

schwindigkeiten von Bildung und Zerfall von ES liefert, sind die Hinweise zur Struktur des ES spärlich. Eine enzymatische Reaktion kann also in Wirklichkeit über mehrere, mehr oder weniger stabile Zwischenprodukte ablaufen, wie 725 18%

Be

pn

IX

—

Er

ee

Er

DEE

25

2

4,0

£ 10

6,3 7,6

20

9,0

Wandeln Sie zunächst die Werte in die reziproke Form um (1/[S] mit der Einheit mM" und 1/v, in der Einheit uM - s). Tragen Sie dann 1/v, gegen 1/[S] auf. Die x- und y-Achsenabschnitte können abgeschätzt werden oder durch lineare Regression berechnet werden. Gemäß Gleichung 12.29 und Abbildung 12.4 ist der y-Achsenstand (Wert ca.

0,1 uM". s) äquivalent zu 1/Vy.,, also ist Vnau, der reziproke Wert des y-Achsenabschnitts, 10 uM-s’'. Der x-Achsenabschnitt, -0,33 mM, ist äquivalent zu -1/Ky,

so dass Ky (der negativ reziproke Wert des x-Achsenabschnitts) 3,0 mM beträgt.

406

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

e Exkurs 12.3 Biochemie im Fokus Kinetik und Übergangszustandstheorie Betrachten wir nun k’, die Geschwindigkeit, mit der X zer-

Wie verhält sich die Geschwindigkeit einer Reaktion zu ihrer Aktivierungsenergie (Abschnitt 11.2)? Betrachten wir eine

fällt. Die Struktur des Übergangszustands wird von einer Bindung zusammengehalten, die als so schwach angenommen wird, dass sie bei der ersten Erschütterung auseinander bricht. Daher wird k’ ausgedrückt als

bimolekulare Reaktion, die nach folgendem Schema abläuft:

A+B

K

mx

x

k'

—P+Q

k'’ = xv

Dabei steht X‘ für den Übergangszustand. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann ausgedrückt werden als

diP

j. r = k[AJ[B]= k’[X]

wobei v für die Vibrationsfrequenz der Bindung, die beim Zerfall von X" in die Produkte gebrochen wird, steht und x, der Übertragungskoeffizient, ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Zerfall von X° in Richtung der Produktbildung und nicht zurück zu den Reaktanten erfolgt. Für die meisten spontanen

(12.A)

wobei k die normale Geschwindigkeitskonstante der Elementarreaktion ist und k’ die Geschwindigkeitskonstante für den Zerfall von X’ in die Produkte. Trotz der Instabilität von X‘ nimmt man an, dass es in einem

schnellen

Gleichgewicht

mit den

Reaktanten

Reaktionen wird für x der Wert 1,0 angenommen (obwohl dieser Wert, der zwischen 0 und 1 liegen muss, kaum zuverläs-

sig berechnet werden kann).

steht;

Das Planck’sche Gesetz besagt, dass

d.h.

pl AI] +

- RTInk' = AG’

v=e/h

(12.B)

wobei K' eine Gleichgewichtskonstante ist. Diese Annahme der Übergangszustandstheorie erlaubt die dung der Hauptsätze der Thermodynamik auf die der Reaktionsgeschwindigkeiten. Die Gleichgewichtskonstante K° kann ausgedrückt als

(12.F)

wobei in diesem Falle e die durchschnittliche Schwingungsenergie ist, die zum Zerfall von X führt, und h (= 6,6261

x

zentrale AnwenTheorie

10°* J.s) die Planck-Konstante. Durch statistische Verfahren wissen wir, dass bei einer Temperatur Tdie klassische Energie eines Oszillators

werden

&=ksT

(12.G)

beträgt, mit der Boltzmann-Konstante kg (= 1,3807 x 10° J-K"') und kgT ist die eigentlich verfügbare thermische Energie. Die Kombination der Gleichungen 12.E bis 12.G ergibt

(12.C)

mit der absoluten Temperatur T und der Gaskonstanten R (8,3145 )J-K-mol"; diese Beziehung zwischen Gleich-

K=

gewichtskonstante und Freier Enthalpie wurde in Abschnitt 1.4D abgeleitet). Die Kombination der drei vorhergehenden Gleichungen ergibt

AK eacier [ae]

(12.E)

kgT h

Folglich erhält man durch die Kombination der Gleichungen 12.A, 12.D und 12-H die Formel für die Geschwindigkeitskonstante der Elementarreaktion:

(12.D) RE

Diese Gleichung zeigt, dass die Geschwindigkeit einer Reaktion nicht nur von der Konzentration der Reaktanten abhängt, sondern auch exponentiell mit AG’ abnimmt. Je größer also die Differenz zwischen der Freien Enthalpie des Übergangszustands und derjenigen der Reaktanten, d.h. je instabiler der Übergangszustand, desto langsamer verläuft die Reaktion.

krh

e-AG'/RT

Diese Gleichung verdeutlicht, dass bei steigender Temperatur, also bei vermehrt verfügbarer thermischer Energie, die den Reaktionskomplex über die Aktivierungsbarriere befördern kann, die Geschwindigkeit der Reaktion zunimmt.

oder einen weitaus komplexeren Verlauf haben wie z.B.

IN ES

5

EPZ ZI + SP

Reaktionskinetik

Leider lassen sich aus Steady-State-Messungen keine Rückschlüsse auf die Anzahl der Zwischenprodukte einer enzymkatalysierten Reaktion ziehen. Daher

kann man

solche Untersuchungen

mit einer „black box“ vergleichen, die ein

System aus Wasserleitungen mit einem Zu- und einem Abfluss enthält. "Black box"

Ein rePe

Aus

Im Steady-State, d.h. wenn sich die Leitungen mit Wasser gefüllt haben, kann man das Verhältnis zwischen Einlassdruck und Ausfluss messen. Solche Messungen sagen allerdings nichts über die genaue Konstruktion der Rohrleitungen, die Einlass und Abfluss verbinden, aus. Dies würde zusätzliche Information erfordern, z.B. durch Öffnen der Box, um den genauen Verlauf der Röhren zu verfolgen. In ähnlicher Weise können Steady-State-Messungen eine phänomenologische Beschreibung des Enzymverhaltens liefern, wobei die Natur der Zwischenprodukte aber unbestimmt bleibt. Die Existenz der Zwischenprodukte muss unabhängig davon nachgewiesen werden, z.B. über eine Identifizierung mittels spektroskopischer Methoden. Das vorangehend Gesagte betont ein zentrales Prinzip der Enzymologie: Die kinetische Analyse einer Reaktion, die sich im Fließgleichgewicht befindet, kann deren Mechanismus nicht aufklären. Denn so einfach, elegant oder rational ein postulierter Mechanismus auch sein mag, gibt es doch immer eine unendliche Anzahl alternativer Mechanismen, die genauso zu den kinetischen Daten passen würden. Meist stellt sich der einfachere und elegantere als der korrekte Mechanismus heraus, aber nicht immer. Sind jedoch kinetische Daten nicht mit einem gegebenen Mechanismus kompatibel, muss dieser verworfen werden. Obwohl daher die Kinetik nicht ohne bestätigende Daten (z.B. dem physikalischen Nachweis eines Zwischenprodukts) auskommt, ist die kinetische Analyse des Fließgleichgewichts einer Reaktion von großem Wert, weil man damit vorgeschlagene Mechanismen ausschließen kann. D.

Bisubstratreaktionen

Bisher haben wir uns mit einfachen Ein-Substrat-Reaktionen beschäftigt, die dem Michaelis-Menten-Modell folgen (Reaktion 12.12). Jedoch sind enzymatische Reaktionen, die mehrere Substrate erfordern und verschiedene Produkte liefern, weit mehr verbreitet. Tatsächlich machen Reaktionen, bei denen zwei

Substrate zu zwei Produkten umgesetzt werden, E A+BPpPr+rQ

rund 60% genannten

der bekannten biochemischen Reaktionen aus. Fast alle dieser soBisubstratreaktionen sind entweder Transferasereaktionen, bei

denen das Enzym die Übertragung einer spezifischen funktionellen Gruppe X von einem Substrat auf das andere katalysiert: E

P-xX+B = P+HB-X

407

408

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Abb. 12.5 Zwei Bisubstratreaktionen. (a) Bei der von Trypsin katalysierten PeptidhydroIyse wird die Peptidcarbonylgruppe mit ihrer anhängenden Polypeptidkette vom Peptid-N-Atom auf ein Wassermolekül übertragen. (b) Bei der Alkohol-Dehydrogenasereaktion wird formal ein Hydridion von Ethanol auf NAD* übertragen.

(@) (6)

Ö

I

Trypsin

I R,-C-NH-R,

+

>

H,0

RR)

0-0

E

> +

H;N—Ry

Polypeptid

(b) i

% ol

CH; -C-OH

+

NAD*+

ehydrogenase =

j CH; —-CH

+ NADH

| H

Ht

oder Redoxreaktionen, bei denen Reduktionsäquivalente zwischen den Substra-

ten übertragen werden. So wird z.B. bei der Hydrolyse «einer Peptidbindung durch Trypsin (Abschnitt 11.5) die Peptidcarbonylgruppe vom N-Atom des Peptids auf Wasser übertragen (Abb. 12.5a), während bei der Alkohol-Dehydroge-

nase-Reaktion (Abschnitt 11.1B) formal ein Hydridion von Ethanol auf NAD" übertragen wird (Abb. 12.5b). Obwohl Bisubstratreaktionen über eine große Anzahl verschiedener Mechanismen ablaufen könnten, beobachtet man im Allgemeinen nur wenige Typen. Sequentielle Reaktionen

Reaktionen, bei denen alle Substrate an das Enzym binden müssen, bevor eine Reaktion stattfinden und Produkte freigesetzt werden können, werden als sequentielle Reaktionen bezeichnet. Bei diesen Reaktionen wird die zu übertragende Gruppe X direkt von A (= P-X) auf B übertragen, was P und Q ergibt (= B-X). Solche Reaktionen werden folglich auch als Einzelverdrängungsreaktionen bezeichnet. Sequentielle Reaktionen lassen sich weiter unterteilen in solche Reaktionen,

bei denen die Substrate in einer strengen Reihenfolge an das Substrat binden — sie haben einen geordneten Mechanismus — und in jene ohne Präferenz für die Reihenfolge der Substratbindung - sie haben einen zufälligen Mechanismus. Beim geordneten Mechanismus ist die Bindung des ersten Substrats offensichtlich notwendig, damit das Enzym die Bindungsstelle für das zweite Substrat ausbilden kann. Beim zufälligen Mechanismus sind dagegen beide Bindungsstellen bereits am freien Enzym unabhängig voneinander verfügbar. Nach der von W. W. Cleland entwickelten Schreibweise werden die Substrate in der Reihenfolge ihrer Bindung an das Enzym mit A und B bezeichnet, Produkte in der Reihenfolge, mit der sie vom Enzym freigesetzt werden, mit Pund Q. Das Enzym wird durch eine horizontale Linie dargestellt, die aufeinanderfolgende Addition von Substraten und die Freisetzung von Produkten durch senkrechte Pfeile. Eine geordnete Bisubstratreaktion wird folgendermaßen dargestellt: |

E

BA

B

1%

EAB-EPO

Q

EO

EB

dabei werden A und B als Leit- bzw. Folgesubstrat bezeichnet. Viele NAD*und NADP"-benötigende Dehydrogenasen folgen einem geordneten Bisubstratmechanismus mit dem Coenzym als Leitsubstrat. Eine Bisubstratreaktion nach einem zufälligen Mechanismus wird wie folgt dargestellt:

Enzymhemmung

BE

EAB-EPQ

E

EB

ER

BR

Or

Einige Dehydrogenasen und Kinasen arbeiten nach solchen zufälligen Mechanismen. Ping-Pong-Reaktionen Gruppentransferreaktionen, bei denen ein oder mehrere Produkte freigesetzt werden, bevor alle Substrate gebunden haben, werden als Ping-Pong-Reaktionen bezeichnet. Die Ping-Pong-Bisubstratreaktion wird schematisch dargestellt durch

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 Er =

E| "

EA-FP

F

r Ber: FB-EQ

1®

Hierbei wird eine funktionelle Gruppe X des ersten Substrats A (= P-X) durch das Enzym vom Substrat verdrängt, was ein erstes Produkt P und eine stabile Enzymform F (= E-X) ergibt, in der X fest (häufig kovalent) an das Enzym gebunden ist (Ping). Im zweiten Reaktionsschritt wird X durch das zweite Substrat B vom Enzym verdrängt, dabei entsteht das zweite Produkt Q (= B-X) und die regenerierte, ursprüngliche Form des Enzyms E (Pong). Solche Reaktionen werden daher auch als Doppelverdrängungsreaktionen bezeichnet. Man beachte, dass sich bei Ping-Pong-Reaktionen die Substrate A und B niemals gleichzeitig in Kontakt mit dem Enzym befinden. Viele Enzyme, einschließlich Trypsin (dabei ist F das Acyl-Enzym-Intermediat; Abschnitt 11.5), Transaminasen und einiger Flavoenzyme, reagieren nach Ping-Pong-Mechanismen. Bisubstratmechanismen können durch kinetische Messungen unterschieden werden

Die Geschwindigkeitsgleichungen, die die vorangehenden Bisubstratmechanismen beschreiben, sind wesentlich komplizierter als die Gleichung für eine Ein-Substrat-Reaktion. Tatsächlich enthalten die Gleichungen für Bisubstratmechanismen (die über den Umfang dieses Buchs hinausgehen) bis zu vier kinetische Konstanten im Vergleich zu zweien (V„., und K,,) bei der Michaelis-Menten-Gleichung. Nichtsdestotrotz kann man durch kinetische Messungen im Fließgleichgewicht zwischen den verschiedenen Bisubstratmechanismen unterscheiden.

2

Enzymhemmung

Viele Substanzen beeinflussen die Aktivität eines Enzyms, indem sie so mit ihm in Wechselwirkung treten, dass die Substratbindung und/oder seine Wechselzahl beeinflusst werden. Substanzen, die die Aktivität eines Enzyms reduzieren, werden als Inhibitoren bezeichnet. Ein großer Teil des modernen pharmazeutischen Arsenals besteht aus Enzyminhibitoren. AIDS wird beispielsweise nahezu ausschließlich mit Arzneistoffen behandelt, die die Aktivität bestimmter viraler Enzyme hemmen. Inhibitoren wirken

über verschiedene Mechanismen. Irreversible Enzyminhibitoren, sogenannte Inaktivatoren, binden so fest an das Enzym, dass sie

1. Notieren Sie die Geschwindig-

keitsgleichungen für eine Reaktion erster Ordnung und eine Reaktion zweiter Ordnung. Was sind die Unterschiede zwischen Momentangeschwindigkeit, Anfangsgeschwindigkeit und maximaler Geschwindigkeit bei einer enzymatischen Reaktion? Leiten Sie die MichaelisMenten-Gleichung ab. Was sagen die Werte K,, und Krar/ Km über ein Enzym aus? Geben Sie die Lineweaver-Burk(doppelt-reziproke) Gleichung an

und beschreiben Sie die Charakteristika eines LineweaverBurk-Diagramms. Benutzen Sie die ClelandSchreibweise, um eine geordnete sowie eine zufällige sequentielle Reaktion und eine Ping-PongReaktion zu beschreiben.

409

410

Enzymkinetik, Hemmung

und Regulation

das aktive Zentrum des Enzyms permanent blockieren. Reagenzien, die spezifische Aminosäurereste chemisch modifizieren, können als Inaktivatoren wirken. Zum Beispiel sind die Verbindungen, die verwendet wurden, um die katalytischen Ser- und His-Reste von Serinproteasen zu identifizieren (Abschnitt 11.5A), Inaktivatoren dieser Enzyme.

Reversible Enzyminhibitoren verringern die Aktivität eines Enzyms, indem sie reversibel mit ihm in Wechselwirkung treten. Einige Enzyminhibitoren ähneln strukturell den Substraten des Enzyms, reagieren aber entweder überhaupt nicht oder sehr langsam. Diese Substanzen werden häufig eingesetzt, um zur Aufklärung des katalytischen Mechanismus die chemische und konformationelle Natur des aktiven Zentrums eines Enzyms zu untersuchen. Andere Inhibitoren beeinflussen die katalytische Aktivität eines Enzyms, ohne seine Substratbindung zu stören. Viele Inhibitoren vereinen beide Effekte. In diesem Abschnitt besprechen wir einige der einfachen Mechanismen der reversiblen Hemmung und ihre Effekte auf das kinetische Verhalten von Enzymen, die dem Michaelis-Menten-Modell folgen. Wie im vohergehenden Abschnitt werden wir unsere Analyse auf einem einfachen Reaktionsmodell mit einem Substrat aufbauen.

A.

Kompetitive Hemmung

Eine Substanz, die direkt mit dem normalen Substrat um die Substratbindestelle eines Enzyms konkurriert, bezeichnet man als kompetitiven Inhibitor. Ein solcher Inhibitor ähnelt dem Substrat gewöhnlich so weit, dass er spezifisch an das aktive Zentrum bindet. Er unterscheidet sich vom Substrat dadurch, dass er keine Reaktion eingeht. Die Succinat-Dehydrogenase, ein Enzym des Citratcyclus, das Succinat in Fumarat umwandelt (Abschnitt 17.3F), wird z. B. kompetitiv durch Malonat gehemmt, das strukturell dem Succinat ähnelt, aber nicht dehydriert werden kann. coo| 9

= Succinat-

Re

dehydrogenase

CH;

C

NE

coo

H

Succinat

cooIn

P

1

FEN

coo-

Fumarat

Succinatdehyd u SEINESEER FE

keine Umsetzung

cooMalonat

Die Wirksamkeit von Malonat als kompetitivem Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase legt nahe, dass die Substratbindungsstelle des Enzyms so angelegt ist, dass sie beide Carboxylgruppen des Substrats binden kann, vermutlich unter dem Einfluss zweier passend angeordneter positiv geladener Reste. Ähnliche Prinzipien sind für die Produktinhibition verantwortlich. Bei diesem Phänomen häuft sich ein Produkt der Reaktion, welches naturgemäß an das aktive Zentrum des Enzyms binden kann, an und konkurriert im nachfolgenden katalytischen Cyclus mit dem Substrat um die Bindung an das Enzym. Produktinhibition ist einer der Wege, auf dem die Zelle die Aktivität ihrer Enzyme kontrolliert (Abschnitt 12.3). Übergangszustandsanaloga sind besonders wirksame Inhibitoren, da eine effektive Katalyse von der Fähigkeit des Enzyms abhängt, an den Übergangs-

Enzymhemmung

zustand der Reaktion zu binden und ihn zu stabilisieren (Abschnitt 11.3E). Eine Verbindung, die den Übergangszustand nachahmt, kann diese Bindungswechselwirkungen besser ausnutzen als jedes Substratanalog. Adenosin-Deaminase z.B. setzt das Nucleosid Adenosin wie folgt zu Inosin um:

HN

H,N OH

cr

N

Ds

H,O

O0 N

|N

Sy

Ribose

NH;

N

| Ribose

Adenosin

N

S,

N

|

Ribose

Inosin

Der K, des Enzyms für das Substrat Adenosin beträgt 3 x 10° M. Das Produkt Inosin wirkt mit einer Inhibitionskonstante (K,, die Dissoziationskonstante für die Enzym-Inhibitor-Bindung; siehe unten) von 3 x 10°* M als Inhibitor der Reaktion. Ein Übergangszustandsanalog H

OH

LU) | Ribose 1,6-Dihydroinosin

hemmt die Reaktion mit einem K; von 1,5 X 10°* M. Der Grad der kompetitiven Hemmung variiert mit dem Teil des Enzyms, das an den Inhibitor bindet. Das allgemeine Modell für die kompetitive Hemmung ist im folgenden Reaktionsschema wiedergegeben:

kı

PETE SE ——ZuSe

ko

pr

k_ı +

I

|

EI

+

S

—>

keine Umsetzung

Hierbei wird angenommen, dass der Inhibitor I reversibel an das Enzym bindet, wobei sich folgendes schnelles Gleichgewicht einstellt

[EIN Kı = TEN

(12.30)

und EI, der Enzym-Inhibitor-Komplex, katalytisch inaktiv ist. Ein kompetitiver Inhibitor erniedrigt daher die Konzentration des freien, für die Substratbindung verfügbaren Enzyms. Die Michaelis-Menten-Gleichung für eine kompetitiv gehemmte Reaktion wird wie zuvor (Abschnitt 12.1B) abgeleitet, allerdings mit einem zusätzlichen Term für den Anteil von [E], der den Enzym-Inhibitor-Komplex EI bildet ([E]r = [E] + [ES] + [EI]). Die resultierende Gleichung o”=

_ VmaxlS]_ aKy

+ [S]

(12.31)

411

412

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

entspricht der Michaelis-Menten-Gleichung, modifiziert um den Faktor a, der wie folgt definiert ist

Be

(12.32)

Man beachte, dass a eine Funktion der Inhibitorkonzentration und seiner Affinität zum Enzym ist und niemals kleiner als 1 sein kann. Ein Vergleich der

Gleichungen 12.25 und 12.31 zeigt an, dass Ki = aKy, wobei Ky der scheinbare (apparente) Ky ist, d.h. der. Ky-Wert, der bestimmt werden würde, wenn die Anwesenheit des Inhibitors nicht bekannt wäre. Abbildung 12.6 zeigt die hyperbolische Auftragung von Gleichung 12.31 für verschiedene Werte von 0. Durch die Anwesenheit des Inhibitors erscheint die Substratkonzentration geringer, als sie tatsächlich ist (K,, erscheint fälschlich größer), eine Folge der Tatsache, dass sich die Bindung von I und S an das Enzym gegenseitig ausschließen. Andererseits wird bei steigender Substratkonzentration der Inhibitor durch das Substrat zunehmend verdrängt. Tatsächlich ist a der Faktor, um den [S] erhöht werden muss, um den Effekt, den die Anwesenheit des Inhibitors hat, auszugleichen. Wenn [S] gegen Unendlich geht, geht v, für jeden Wert von a (d.h. für jede Inhibitorkonzentration) gegen V ax. Somit beeinflusst der Inhibitor die Wechselzahl des Enzyms nicht. Die kompetitve Hemmung ist die Grundlage der Therapie einer Methanolvergiftung mit Ethanol. Methanol selbst ist nur schwach toxisch. Aber das Leberenzym Alkohol-Dehydrogenase wandelt Methanol in das hochgiftige Formaldehyd um, von dem bereits geringe Mengen zu Erblindung und Tod führen können. Ethanol konkurriert mit Methanol um die Bindung im aktiven Zentrum der Leber-Alkohol-Dehydrogenase und verlangsamt so die Formaldehydbildung aus Methanol (Ethanol wird zum rasch metabolisierten Acetaldehyd umgewandelt): n Jsl— n— OH

oO =

|

HZC_—H

H Methanol A

Formaldehyd (0)

I H Ethanol

Acetaldehyd

max

a = 1 (ohne Inhibitor)

Abb. 12.6 Auftragung von v, gegen [S] für eine Michaelis-Menten-Reaktion in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen eines kompetitiven Inhibitors.

1] nimmt

Enzymhemmung 1/v

413

Abb. 12.7

Lineweaver-Burk-Diagramm eines kompetitiv gehemmten Michaelis-Menten-Enzyms, wie es Abb. 12.6 beschreibt.

o

{I nimmt zu

Man beachte, dass alle Geraden die 1/v,-Achse bei

1/Vmax schneiden. Die verschiedenen Steigungen verdeutlichen den Effekt des Inhibitors auf Kjj. 6% siehe Animated Figures. a = 1 (ohne Inhibitor)

Steigung = aKy/ Vmax

Mi)

a='l+

Kı

Durch die Gabe von Ethanol wird ein großer Teil des harmlosen Methanols über den Urin ausgeschieden, bevor es zu Formaldehyd umgewandelt werden kann. Das gleiche Prinzip liegt der Verwendung von Ethanol zur Behandlung von Frostschutzmittelvergiftungen mit Ethylenglykol (HOCH,CH,OH) zugrunde. Frostschutzmittel (Ethylenglycol, HOCH,CH,OH) schmeckt süß und wird daher oft von Katzen und Hunden gefressen. K, lässt sich messen

Die Umformung von Gleichung 12.31 in die doppelt reziproke Form ergibt

en) nl. Vo

Vmax/

[S]|

Vmax

(12.33)

Die graphische Darstellung dieser Gleichung ergibt eine Gerade mit der Steigung AKy/Vna, dem 1/[S]-Schnittpunkt bei -1/aKy und einem 1/vy-Schnittpunkt bei 1/V„., (Abb. 12.7). Die doppelt-reziproken Kurven für einen Inhibitor bei verschiedenen Konzentrationen von I schneiden alle die 1/v,-Achse bei 1/V na” ein charakteristisches Kriterium für einen kompetitiven Inhibitor. Der K;-Wert eines kompetitiven Inhibitors kann aus der Auftragung von

Ki? = (1 + [I]/K))Ku gegen [I] bestimmt werden. Der Schnittpunkt mit der [I]Achse ist -K,. K; kann auch aus Gleichung 12.32 berechnet werden, wenn Kir = aKy bei einer bekannten [I] für ein Enzym mit bekanntem K, bestimmt wird (siehe Rechenbeispiel 12.5). Ein Vergleich der K,-Werte kompetitiver Inhibitoren mit unterschiedlichen Strukturen kann Hinweise auf die Bindungsei-

genschaften des aktiven Zentrums eines Enzyms und somit auch auf den Katalysemechanismus liefern. So könnte man z.B. zur Untersuchung der Bedeutung der verschiedenen Segmente eines ATP-Moleküls für die Bindung an das aktive Zentrum eines ATP-benötigenden Enzyms den K,-Wert z.B. für ADP, AMP, Ribose, Triphosphat etc. bestimmen. Da viele dieser ATP-Bausteine selbst

nicht durch das Enzym umgesetzt werden, stellen Inhibitionsstudien eine einfache Methode dar, ihre Bindung an das Enzym zu verfolgen.

Rechenbeispiel 12.5 BETT

TESTEN

TEE

Ein Enzym besitzt ein Ky, von 8 uM in Abwesenheit eines kompetitiven Inhibitors und ein Ki" von 12 uM in Gegenwart von 3 uM Inhibitor. Berechnen Sie K). Berechnen Sie zuerst den Wert von a, wenn

Km =8 uM und Kir = 12 uM: Kir = aKn

Du

Ka

Km

12 =

uM

add

8 uM

aA=1+—

a)

Kı

a-1 3 uM

el

=

1,5

414

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Triphosphat

Kompetitive Inhibitionsstudien werden auch eingesetzt, um die Affinität von Übergangszustandsanaloga für das aktive Zentrum eines Enzyms zu bestimmen (Abschnitt 11.3E). Die HIV-Proteaseinhibitoren (Exkurs 12.4) wurden beispielsweise so entwickelt, dass sie dem Übergangszustand dieses Enzyms ähneln und folglich mit hoher Affinität an das Enzym binden. Inhibitionsstudien liefern wichtige Daten für solche Arzneimittelentwicklungen, wie in Abschnitt 12.4 näher beschrieben wird.

B.

_Unkompetitive Hemmung

Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor direkt an den EnzymSubstrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym:

E+S

k SE

n —oP+E

— +

ESI

——>

keine Umsetzung

In diesem Fall hat der Schritt der Inhibitorbindung die Dissoziationskonstante Kat

lESIN]

(12.34)

Die Bindung des unkompetitiven Inhibitors, der dem Substrat nicht zu ähneln braucht, verzerrt vermutlich das aktive Zentrum, wodurch das Enzym katalytisch inaktiv wird. Die Michaelis-Menten-Gleichung für die unkompetitive Hemmung sowie die Gleichung deren doppelt-reziproken Auftragung sind in Tabelle 12.2 angegeben. Die Lineweaver-Burk-Auftragung ergibt eine Schar paralleler Geraden (Abb. 12.8) mit der Steigung Ky/Vnaw, den Schnittpunkten mit der 1/vg-Achse a’/Vpax und mit der 1/[S]-Achse von -a’/Ky. Man beachte, dass bei der unkompetitiven

Hemmung sowohl Kir = Ky/a’ als auch vi = Vnax/a’ vermindert sind, das Verhältnis K'y /vmax = Ku) Va, jedoch unverändert bleibt. Im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung kehrt Zugabe von Substrat die Wirkung eines unkompetitiven Inhibitors nicht um, da die Bindung des Substrats die Bindung des unkompetitiven Inhibitors nicht stört.

Enzymhemmung Tab. 12.2

Effekte von Inhibitoren auf die Parameter der Michaelis-Menten-Gleichung?.

nur

Art der Hemmung

Michaelis-Menten-Gleichung

Lineweaver-Burk-Gleichung

a

keine

_ _VmaxlS]

me

RR

RR ERTE R

Mine

IN Wen:

keiner

=

_Vmax[S] aKım + [S]

2 .0KmN Mr Val

+ Im Wan

erhöht Kir

unkompetitiv

=

_Vmax[S] _

lie

r ae

Ku + a’[S]

iedriot KyyK“PP und VePp a erniedrigt

Vo

gemischt (nicht kompetitiv)

v= —maxlS] _

ne

aKy + a’[S]

ee!

I

Kı

und

a

“

=1

v5

VmaxolS]

V max

A * Wer

erniedrigt V@PP ;Ki” kann erhöht oder erniedrigt sein

u)

K,

1/v,

MD nimmt zu

Abb. 12.8 Lineweaver-Burk-Diagramm eines Michaelis-Menten-Enzyms in Gegenwart eines unkompetitiven Inhibitors. Man beachte, dass alle Geraden die gleiche Steigung von Ky/Vma besitzen.

6% siehe Animated Figures.

a'= 1 (ohne Inhibitor)

Steigung = Ky/ V max

Pe

=

"Ai

+ m

=

K,

0

-a'/Ky

1/[S]

Ein unkompetitiver Inhibitor beeinflusst zwar die katalytische Funktion des Enzyms, nicht jedoch die Substratbindung. Bei Enzymen mit nur einem Substrat ist dies nur schwer vorstellbar. Tatsächlich spielt die unkompetitive Hemmung nur bei Enzymen mit mehreren Substraten eine Rolle.

C.

Gemischte Hemmung

Viele reversible Inhibitoren treten mit dem Enzym so in Wechselwirkung, dass sowohl die Substratbindung als auch die katalytische Aktivität beeinflusst wird. Mit anderen Worten, der Inhibitor bindet sowohl an das Enzym als auch an den Enzym-Substrat-Komplex. Daraus ergibt sich das folgende Schema:

kı

ka

E+S—EP+E +

-1

+

I

I

EI

ESI

——>

keine Umsetzung

9

—————————————————

kompetitiv

V max [S]

I

Effekt des Inhibitors |

Ku + [S]

er

415

416

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

HIV-Enzyminhibitoren Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) verursacht AIDS (engl.: acquired immunodeficiency syndrome) durch die Infektion und Zerstörung des Wirts-Immunsystems. In den ersten Stadien der Infektion heftet sich das HIV an eine Zielzelle an und injiziert sein genetisches Material (das aus RNA und nicht aus DNA besteht) in die Wirtszelle. Die virale RNA wird durch das virale Enzym reverse Transkriptase (Exkurs 25.2) in DNA transkribiert. Nach der Integration dieser DNA in das Wirtsgenom kann die Zelle mehr virale RNA sowie Proteine produzieren,

um

sie in neue virale Partikel zu packen. Die

sem Arzneistoff auf, wodurch AZT wirksam die virale Replikation hemmt. Weitere Nucleosidanaloga, die zur Behandlung einer HIV-Infektion eingesetzt werden, sind 2’,3’-Didesoxycy-

tidin (ddC, Zalcitabin) und 2’,3’-Didesoxyinosin (ddl, Didanosin; Inosinnucleotide werden metabolisch in Adenosin- oder

Guanosinnucleotide umgewandelt), die ebenfalls einen Kettenabbruch hervorrufen. Nicht nucleosidische Substanzen, wie Nevirapin,

binden

nicht im aktiven

reversen Transkriptase, sondern in Tasche irgendwo anders am Enzym.

meisten der viralen Proteine werden als Teil größerer Polypeptidvorstufen, die als Polyproteine bezeichnet werden, synthetisiert. Folglich ist eine proteolytische Prozessierung durch die viral kodierte HIV-Protease für die Freisetzung dieser viralen Proteine unabdingbar für die virale Reproduktion. Da immer noch kein wirksamer HIV-Impfstoff zur Verfügung

CH3

Zentrum

der

hydrophoben

einer

o

H ne x

RHN

NHR’ N o

(0)

zu spaltende Bindung

— Phe —Pro— ne

steht, führten die Anstrengungen zur Prävention und Behand-

lung von AIDS zur Entwicklung von Substanzen, die die HIVreverse Transkriptase und HIV-Protease hemmen. HOCH,

HOCH,

N

=

€

Mm EIS

Kı = 0,40 nM

H

HH 3'-Azido-3’-desoxythymidin (AZT; Zidovudin)

2',3'’-Didesoxycytidin (ddC, Zalcitabin)

N HOCH;

Hypoxanthin

N

NRn

N

®.

®.

Ritonavir

HH

on 2',3-Didesoxyinosin (ddl, Didanosin)

=0,015nM

N

Or

lnech:

H

Nevirapin

Verschiedene Inhibitoren der reversen Transkriptase wurden entwickelt. Die Urverbindung ist AZT (3’-Azido-3’-desoxy-

thymidin, Zidovudin), das nach der Aufnahme in den Zellen phosphoryliert und in die DNA-Ketten eingebaut wird, die von der reversen Transkriptase nach dem HIV-Templat synthetisiert werden. Da AZT keine 3'-OH-Gruppe besitzt, bewirkt es einen Kettenabbruch, vergleichbar den Didesoxynucleotiden, die zur DNA-Sequenzierung eingesetzt werden (Abschnitt 3.4C). Die meisten zellulären DNA-Polymerasen haben eine geringe Affinität zu phosphoryliertem AZT, die reverse Transkriptase weist jedoch eine hohe Affinität zu die-

Die HIV-Protease ist ein Homodimer, dessen Untereinheiten

aus 99 Aminosäureresten bestehen. Vom Mechanismus her gehört das Enzym zu den sogenannten Aspartat-Proteasen, einer

Familie

von

Proteasen,

zu

der auch

Pepsin

gehört

(die Protease im Magen, die bei niedrigem pH aktiv ist). Die Entwicklung von HIV-Proteaseinhibitoren basierte auf Vergleichen der aktiven Zentren der Aspartat-Proteasen. Die HIV-Protease spaltet eine Anzahl spezifischer Peptidbindungen, einschließlich der Phe-Pro- und Tyr-Pro-Peptidbindungen, in ihren physiologischen Substraten, den HIV-Proteinen. Inhibitoren auf der Grundlage dieser Sequenzen sollten daher selektiv die virale Protease hemmen. Die peptidomimetischen (peptidimitierenden) Wirkstoffe Ritonavir und Saquinavir enthalten Phenyl- und andere sperrige Gruppen, die im aktiven Zentrum der HIV-Protease binden. Vielleicht noch entscheidender ist, dass diese Substanzen die Geo-

Enzymhemmung

metrie des tetraedrischen Übergangszustands der katalysierten Reaktion aufweisen (rot). Das Peptidsubstrat des Enzyms ist zum Vergleich dargestellt. 6% siehe Interactive Exercises. Die Wirksamkeit der anti-HIV-Arzneistoffe ist, wie bei vie-

gehören: (1) die Verminderung der Wahrscheinlichkeit, dass ein Virusstamm

spontan

Resistenzen

gegen jede Substanz

der Kombination ausbilden wird und (2) die Reduzierung der Dosen und entsprechend der Nebenwirkungen der einzelnen Verbindungen.

len anderen Wirkstoffen auch, durch deren Nebenwirkungen limitiert. Trotz der Präferenz für virale Enzyme greifen anti-HIV-Wirkstoffe auch in normale zelluläre Prozesse ein. So kann z.B. die Hemmung der DNA-Synthese durch Inhibitoren der reversen Transkriptase in schnell teilenden Zellen, wie den Zel-

len des Knochenmarks, wo die Erythrocyten gebildet werden, zu schwerer Anämie führen. Weitere Nebenwirkungen sind Übelkeit, Nierensteine, Hautrötungen und Störungen im Fettmetabolismus. Nebenwirkungen sind speziell bei einer HIVInfektion unerwünscht, da die Arzneistoffe mehrmals täglich über viele Jahre, wenn nicht gar ein Leben lang, eingenommen werden müssen. Erworbene Resistenz gegenüber antiviralen Substanzen stellt ein großes Problem bei einer HIV-Infektion dar, weil die Fehleranfälligkeit der reversen Transkriptase eine schnelle Mutation der HI-Viren erlaubt. Mehr als 20 Mutationen im HIV-Genom werden bereits mit einer Arzneimittelresistenz in Zusammenhang gebracht. Bei der anti-HIV-Therapie scheint es unwahrscheinlich, dass sich ein einzelner Arzneistoff als die „Trumpfkarte“ herausstellen wird, zum Teil weil das HIV viele Zelltypen infiziert, hauptsächlich aber auf Grund seiner Fähigkeit, schnell

Resistenzen gegen jeden beliebigen Wirkstoff auszubilden. Die jüngsten außerordentlichen Erfolge der anti-HIV-Therapie basieren auf einer Kombinationstherapie, bei der mehrere verschiedene Wirkstoffe gleichzeitig eingesetzt werden. Diese Therapie bekämpft AIDS wirkungsvoll durch eine Verringerung der HI-Viruslast, in einigen Fällen sogar unter die Nachweisgrenze. Dadurch verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich eine resistente HIV-Variante entwickelt. Zu den Vorteilen des Einsatzes eines Inhibitor-„Cocktails“ aus Hemmern der reversen Transkriptase und der HIV-Protease

HIV-Partikel, das sich von einem Lymphocyt abschnürt. [© Chris Bjomberg/Photo Reserchers.]

Dieses Phänomen wird als gemischte Hemmung (oder alternativ, nicht kompetitive Hemmung) bezeichnet. Man nimmt an, dass ein gemischter Inhibitor an Enzymbereiche bindet, die sowohl an der Substratbindung als auch an der Katalyse

beteiligt sind. Metallionen z.B., die nicht direkt mit den Substraten um die Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms konkurrieren, wie das kompetitive Inhibitoren tun, können auch als gemischte Inhibitoren wirken. Die zwei Dissoziationskonstanten für die Inhibitorbindung

_ ei [EI]

_ [ESIN I

[EST]

417

(12.35)

sind nicht notwendigerweise äquivalent. Die Michaelis-Menten-Gleichung und die Lineweaver-Burk-Gleichung für die gemischte Hemmung sind in Tabelle 12.2 angegeben. Wie bei der unkompetitiven Hemmung werden die Werte von Ky und V„.. durch die Anwesenheit eines

Inhibitors beeinflusst. Die Bezeichnung gemischte Hemmung rührt von der Tatsache her, dass im Nenner der Michaelis-Menten-Gleichung, wie bei der kom-

418

_ Enzymkinetik, Hemmung und Regulation 1/v o

Abb. 12.9 Lineweaver-Burk-Diagramm eines Michaelis-Menten-Enzyms in Gegenwart eines

gemischten Inhibitors. Man beachte, dass sich die Geraden links der

1/vg-Achse schneiden. Die Koordinaten dieses Schnittpunkts sind in Klammern angegeben. Bei Kı= Kı’ ist a= a’ und die Geraden schneiden die 1/[S]-Achse bei -1/Ky,. 6” siehe Animated Figures.

DI) „nimmt zu

a V max

1-d (a-1)Ky

5

,_a-0 Gere

a = a’ = 1 (ohne Inhibitor)

rt VE LE

ee

“ä

Steigung = aKy/V max

m

G=1

= K,

petitivren Hemmung, der Faktor a mit Ky multipliziert und wie bei der unkom-

petitivren Hemmung der Faktor a’ mit [S] multipliziert wird. Somit gilt Kr = (a/a’)Ky und var = Vnax/@. Abhängig von den relativen Werten von a und a’(und daher von K; und K}’) steigt Kir (wie bei der kompetitiven Hemmung) oder sinkt. Wenn das Enzym und der Enzym-Substrat-Komplex I mit der gleichen Affinität binden, gilt

a=a’und der Kir -Wert unterscheidet sich nicht von Ky für die Reaktion in Ab-

Verständnisfragen zu ® Abschnitt 2 1. Wodurch unterscheidet sich ein Inhibitor von einem Inaktivator? 2. Beschreiben Sie die Wirkung von kompetitiven, unkompetitiven und gemischten Inhibitoren auf Ky und Va:

wesenheit des Inhibitors. In diesem Fall wird nur V,„., beeinflusst. Dies wird als rein nicht-kompetitive Hemmung bezeichnet. Die doppelt-reziproken Auftragungen der gemischten Hemmung ergeben Geraden mit der Steigung aKy/Vma, den Schnittpunkten a’/Vy., mit der 1/vg-Achse und -a’/aKy, mit der 1/[S]-Achse (Abb. 12.9). Die Geraden für verschiedene Inhibitorkonzentrationen schneiden sich links von der 1/vp-Achse. Bei der rein nicht-kompetitiven Hemmung schneiden die Geraden die 1/[S]-

Achse bei -1/Ky. Wie bei der nicht-kompetitiven Hemmung kehrt die Bindung von Substrat die Wirkung der gemischten Inhibition nicht um. Die Kinetik eines Enzym-Inaktivators (eines irreversiblen Inhibitors) ähnelt der eines rein nicht-kompetitiven Inhibitors, da der Inaktivator die Konzentration von funktionellem Enzym bei allen Substratkonzentrationen senkt. Folglich sinkt Va, und Ky bleibt unverändert. Die doppelt-reziproke Auftragung für irreversible Inaktivierung ähnelt daher der für rein nicht-kompetitive Hemmung (die Geraden schneiden sich auf der 1/[S]-Achse).

Regulation der Enzymaktivität

3

Regulation der Enzymaktivität

Ein Organismus muss die katalytischen Aktivitäten seiner Einzelenzyme so regulieren können, dass er seine zahlreichen Stoffwechselprozesse koordinieren, auf Veränderungen in seiner Umgebung reagieren, wachsen und sich differenzieren kann, und all dies in geordneter Weise. Es gibt zwei Wege, wie dies erreicht werden kann: 1. Kontrolle der Verfügbarkeit von Enzymen. Die Menge eines gegebenen Enzyms in einer Zelle hängt von der Geschwindigkeit seiner Synthese und seines Abbaus ab. Beide Geschwindigkeiten werden von der Zelle reguliert und unterliegen dramatischen Veränderungen innerhalb einer Zeitspanne von Minuten (bei Bakterien) bis Stunden (bei höheren Organismen). 2. Kontrolle der Enzymaktivität. Die katalytische Aktivität eines Enzyms kann direkt über Konformationsänderungen reguliert werden, die die Substratbindungsaffinität eines Enzyms beeinflussen. So wie die Sauerstoffaffinität des Hämoglobins durch die Bindung von Liganden wie O,, CO,, H* und BPG allosterisch reguliert wird (Abschnitt 7.1D), kann die Substratbindungsaffinität eines Enzyms in ähnlicher Weise mit der Bindung kleiner Moleküle, sogenannter allosterischer Effektoren, variieren. Allosterische Mechanismen kön-

nen große Änderungen der enzymatischen Aktivität bewirken. Die Aktivitäten mancher Enzyme werden auf ähnliche Weise durch kovalente Modifikation reguliert, gewöhnlich durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung spezifischer Ser-, Thr- oder Tyr-Reste. In den folgenden Abschnitten besprechen wir die Kontrolle der Enzymaktivät durch allosterische Wechselwirkungen und kovalente Modifizierung.

A.

Allosterische Kontrolie durch Bindung an einer anderen Stelle als dem aktiven Zentrum

In diesem Abschnitt werden wir die allosterische Kontrolle der enzymatischen Aktivität anhand eines Beispiels - der Aspartat-Transcarbamoylase (ATCase) aus E. coli - besprechen. In späteren Kapiteln werden wir weitere Beispiele der allosterischen Kontrolle kennenlernen. Die „Feedback“-Hemmung der ATCase reguliert die Pyrimidinsynthese Aspartat-Transcarbamoylase katalysiert die Bildung von N-Carbamoylaspartat aus Carbamoylphosphat und Aspartat: OS NH;

|

_00 CH;

+

|

©

«en

0% Nopor

Be

Aspartat

Carbamoylphosphat Aspartat-

transcarbamoylase

OS NH,

|

C

_00 en

CH;

|

(&

Dr END H“cooN-Carbamoylaspartat

600

+

H,PO,

_

419

420

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Diese Umsetzung ist der erste Reaktionsschritt, der allein der Pyrimidinbiosynthese dient (Abschnitt 23.2A). Das allosterische Verhalten der ATCase aus ohne allosterische Effektoren

(0)

10

20

30

40

[Aspartat] (mM)

Abb. 12.10 Auftragung von v, gegen [Aspartat] bei der ATCase-Reaktion. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde in Abwesenheit allosterischer Effektoren gemessen, in Gegenwart von 0,4 mM CTP (Inhibitor) und in Gegenwart von 2,0 mM ATP (Aktivator). [Nach Kantrowitz, E.R., Pastra-Landis, S.C., und Lipscomb, W.N.,

Trends Biochem. Sci. 5, 125 (1980).]

62% siehe Animated Figures.

E.coli haben John Gerhart und Howard Schachman untersucht. Sie konnten zeigen, dass beide Substrate kooperativ an das Enzym binden. Außerdem wird die ATCase allosterisch durch Cytidintriphosphat (CTP), ein Pyrimidinnucleotid, gehemmt, und durch Adenosintriphosphat (ATP), ein Purinnucleotid, allosterisch aktiviert. Die Auftragung von v, gegen [S] für die ATCase (Abb. 12.10) verläuft sigmoid, im Gegensatz zu einem hyperbolischen Verlauf bei Enzymen, die nach dem Michaelis-Menten-Modell arbeiten. Dies ist eine Folge der kooperativen Substratbindung (wir erinnern uns, dass die O,-Bindungskurve des Hämoglobins ebenfalls sigmoid ist; Abb. 7.6). Die allosterischen Effektoren der ATCase verschieben die gesamte Kurve nach rechts oder links: Bei einer gegebenen Substratkonzentration verringert CTP die Katalysegeschwindigkeit des Enzyms, während sie durch ATP erhöht wird. CTP, ein Produkt der Pyrimidinbiosynthese, ist ein Beispiel für einen Rückkopplungsinhibitor (engl.: feedback inhibitor), da es einen früheren Schritt seiner eigenen Biosynthese hemmt (Abb. 12.11). Wenn also der CTP-Spiegel hoch ist, bindet CTP an die ATCase und reduziert dadurch die Geschwindigkeit der CTP-Synthese. Umgekehrt dissoziiert CTP bei fallender zellulärer CTP-Konzentration von der ATCase ab und die CTP-Synthese wird beschleunigt. Die metabolische Bedeutung der ATCase-Aktivierung durch ATP liegt in der Koordinierung der Synthesegeschwindigkeiten für Purin- und Pyrimidinnucleotide, die bei der Nucleinsäurebiosynthese in ungefähr gleichen Mengen benötigt werden. Ist z.B. die ATP-Konzentration wesentlich höher als diejenige von CTP, wird ATCase zur Synthese von weiteren Pyrimidinnucleotiden aktiviert, bis die Konzentrationen von ATC und CTP annähernd gleich sind. Umgekehrt erlaubt die ATCase-Hemmung durch CTP den Ausgleich der ATP- und CTP-Konzentration bei der Purinbiosynthese, wenn die CTP-Konzentration höher als die von ATP ist.

Carbamoylphosphat + Aspartat

ATCase — >

N-Carbamoylaspartat |

Y

6 enzymatische

}

Reaktionsschritte

NH,

N“ (6)

l

(6)

l

(0)

Oz

02

Os

ee Abb. 12.11 Schematische Darstellung der Pyrimidinbiosynthese. Das Endprodukt CTP hemmt die ATCase, die den ersten Schritt der Biosynthese katalysiert.

l

Zen

|

HO Cytidintriphosphat (CTP)

OH

|

Regulation der Enzymaktivität

421

Allosterische Veränderungen beeinflussen die Substratbindungsstellen der ATCase Die E. coli-ATCase (300 kD) hat die Untereinheitenzusamensetzung cr, wobei c und r für die katalytischen bzw. regulatorischen Untereinheiten stehen. Die von

William Lipscomb aufgeklärte Röntgenstruktur der ATCase (Abb. 12.12) zeigte, dass die katalytischen Untereinheiten zwei Trimere (c;) bilden, die in einem Komplex mit drei regulatorischen Dimeren (r,) angeordnet sind. Jedes regulatorische Dimer verbindet zwei katalytische Untereinheiten in verschiedenen c;-Trimeren. Die isolierten katalytischen Trimere sind katalytisch aktiv (ihre maximale Katalysegeschwindigkeit ist größer als die von intakter ATCase), zeigen eine nicht kooperative (hyperbolische) Substratsättigungskurve und werden durch die Anwesenheit von ATP oder CTP nicht beeinflusst. Die isolierten regulatorischen Dimere binden zwar diese allosterischen Effektoren, sind aber enzymatisch nicht aktiv. Offensichtlich vermindern die regulatorischen Untereinheiten allosterisch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten im multimeren Enzymkomplex. Wie durch die Theorie der allosterischen Wechselwirkungen (Abschnitt 7.1D) vorhergesagt, interagiert ATP als Aktivator bevorzugt mit der ATCase in ihrem aktiven (R-) Zustand (mit hoher Substrataffinität), während der Inhibitor CTP vorzugsweise an das Enzym im inaktiven (T-) Zustand (mit niedriger Substrataf(a)

Abb. 12.12 Röntgenstruktur der ATCase aus E. coli. Die Polypeptidgerüste des Enzyms im T-Zustand gesehen (a) entlang der dreizähligen Symmetrieachse des Proteins und (b) entlang einer zweizähligen Symmetrieachse, rechtwinklig zur Ansicht in a. Die Polypeptidketten sind in Schlangenform dargestellt, eingebettet in ihre transparente molekulare Oberfläche. Die regulatorischen Dimere (gelb) verbinden das obere katalytische Trimer (rot) mit dem unteren katalytischen Trimer (blau). CTP ist als Kalottenmodell dargestellt und entsprechend der Atomtypen gefärbt (D grün, O rot, N blau und P orange) (c) Das Enzym im R-Zustand im Komplex mit PALA in derselben Ansicht wie in b. PALA (das an die c-Untereinheiten gebunden ist aber hier größtenteils verdeckt ist) ist als Kalottenmodell gezeichnet. Man beachte, wie sich die katalytischen Trimere, auf Grund der Rotation der regulatorischen Dimere beim R— T-Übergang, entlang der dreizähligen Symmetrieachse bewegen. [Nach einer Röntgenstruktur von William Lipscomb, Harvard University. PDBids 5AT] und 3ATC.]

6% siehe Kinemage Exercise 11.1.

422

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

on finität) bindet. In ähnlicher Weise bindet das nicht reaktive Bisubstratanalog (PALA) at -ı-aspart N-(Phosphonacetyl)

ıC—CH,—PO% I

\

H,N —C—O0-—PO3

NH

|

700€

—-CH:

CH--CO07

N-(Phosphonacetyl])-

L-aspartat (PALA)

NH3

S

+0

T0O0CZCH2 CH -—COO Carbamoylphosphat

a Aspartat

fest an die R-Form, nicht aber an die T-Form der ATCase.Röntgenstrukturen konnten für den ATCase-CTP-Komplex (T-Zustand) und den ATCase-PALA-Komplex (R-Zustand) bestimmt werden (in der Regel bilden nicht reaktive Substratanaloga, wie beispielsweise PALA, Komplexe mit einem Enzym, die Strukturuntersuchungen leichter zugänglich sind als Komplexe des Enzyms mit schnell reagierenden Substraten; Exkurs 11.2). Die Strukturuntersuchungen machen deutlich, dass beim T — R-Übergang die katalytischen Trimere des Enzyms entlang der molekularen dreizähligen Symmetrieachse um ca. 1,1 nm auseinanderdriften und sich zusätzlich auch bezüglich dieser Achse um 12° versetzt neu anordnen (Abb. 12.12b,c). Außerdem drehen sich die regulatorischen Dimere im Uhrzeigersinn um 15° um ihre zweizähligen Symmetrieachsen und entfernen sich entlang der dreizähligen Achse um ca. 0,4 nm voneinander. Solch umfangreiche quarternäre Verschiebungen erinnern an die Strukturänderungen des Hämoglobins (Abschnitt 7.1D). Jede katalytische ATCase-Untereinheit besteht aus einer CarbamoylphosphatBindungsdomäne und einer Aspartat-Bindungsdomäne. Die PALA-Bindung an das Enzym, die vermutlich die Bindung beider Substrate nachahmt, induziert eine Veränderung der Konformation. Dabei bewegen sich die beiden Domänen so aufeinander zu, dass die beiden gebundenen Substrate miteinander zum Produkt reagieren können (Abb. 12.13). Die konformationellen Verschiebungen einige Reste bewegen sich um bis zu 0,8 nm - in einer einzigen katalytischen Untereinheit lösen den T — R-Übergang der ATCase aus. Die ternären und quarternären Veränderungen der ATCase sind eng miteinander gekoppelt (d.h. ATCase folgt dem Symmetriemodell der Allosterie; Abschnitt 7.1D). Die Substratbindung an eine katalytische Untereinheit erhöht die Substrataffinität und die katalytische Aktivität der anderen fünf katalytischen Untereinheiten und erklärt so die kooperative Substratbindung des Enzyms. Die strukturelle Grundlage der Allosterie bei der ATCase

Die strukturellen Grundlagen der Effekte von CTP und ATP auf die ATCase-Aktivität sind teilweise aufgeklärt. Sowohl der Inhibitor CTP als auch der Aktivator ATP binden an derselben Stelle am äußeren Rand der regulatorischen Untereinheit, ca. 6 nm vom nächsten katalytischen Zentrum entfernt. CTP bindet bevorzugt im T-Zustand und erhöht so dessen Stabilität, während ATP bevorzugt im R-Zustand bindet und dadurch diesen stablisiert. Die Bindung von CTP und ATP an ihre weniger favorisierten Enzymzustände beeinflusst die Struktur des gesamten Enzyms. Die Bindung von CTP an ATCase im R-Zustand induziert eine Kontraktion im regulatorischen Dimer, die ein Zusammenrücken der katalytischen Trimere um 50 pm bewirkt (Annäherung an den T-Zustand, d.h. geringere Aktivität). Dies führt wiederum zu einer Reorientierung von Resten, die zum aktiven Zentrum des Enzyms gehö-

ren, dadurch erniedrigt sich seine katalytische Aktivität. ATP hat den entgegengesetzten Effekt, wenn es an das Enzym im T-Zustand bindet: Die katalytischen Irimere bewegen sich um 40 pm auseinander (Annäherung an den R-Zustand,

Regulation der Enzymaktivität

(a)

T-Zustand

(b)

(c)

=

423

R-Zustand

Katalytisches Monomer

Katalytisches Monomer

— d.h. höhere Aktivität), dabei wird die katalytische Aktivität des Enzyms durch eine Konformationsänderung des aktiven Zentrums erhöht. Allosterische Übergänge in anderen Enzymen ähneln denen bei Hämoglobin und ATCase Allosterische Enzyme sind in der Natur weit verbreitet und nehmen oft regulatorische Schlüsselpositionen in Stoffwechselwegen ein. Solche Enzyme sind symmetrische Proteine aus mindestens zwei Untereinheiten. In sämtlichen be-

kannten Fällen sorgen Veränderungen der Quartärstruktur für die Abstimmung von Bindung und katalytischen Effekten zwischen allen aktiven Zentren im Enzym. Bei den Verschiebungen in der Quartärstruktur handelt es sich überwiegend um Drehungen der Untereinheiten relativ zueinander. Sekundärstrukturen bleiben bei T — R-Übergängen weitestgehend erhalten, was vermutlich für die mechanische Übertragung von allosterischen Effekten im nm-Bereich wichtig ist.

B.

Kontrolle durch Protein-Phosphorylierung

Zusätzlich zu allosterischen Wechselwirkungen können viele Enzyme durch kovalente Modifikation kontrolliert werden. In Eukaryonten ist die bei weitem häufigste derartige Modifikation die Phosphorylierung und Dephosphorylierung (Anknüpfen und Entfernen einer Phosphoryl-Gruppe) von Hydroxyl-Gruppen von Ser-, Thr- oder Tyr-Resten.

Abb. 12.13 Schematische Darstellung der Konformationsveränderungen von Tertiär- und Quartärstruktur bei ATCase. Es sind zwei der sechs vertikal interagierenden katalytischen Untereinheiten der ATCase abgebildet. (a) Ohne gebundenes Substrat verbleibt das Protein im T-Zustand, da die Bewegungen,

die die zwei Domänen jeder Untereinheit zusammenbringen (grüne Pfeile), durch eine sterische Blockade (violetter Balken) zwischen den in Kontakt stehenden Aspartat-Bindungsdomänen verhindert werden. (b) Die Bindung von Carbamoylphosphat (CP) und nachfolgend Aspartat (Asp) an ihre jeweiligen Bindungsstellen veranlasst die Untereinheiten dazu, sich voneinander wegzubewegen und gegeneinander zu rotieren, was den T — R-Übergang ermöglicht. (c) Im R-Zustand kommen beide Domänen jeder Untereinheit so zusammen, dass die Reaktion ihrer jeweils gebundenen Substrate zum Produkt erleichtert wird. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.] 62 siehe Kinemage Execises 11.1 und 11.2.

424

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation ATP

ADP

Protein-Kinase

Be)

Bo: (inaktiv)

i

(aktiv)

Protein-Phosphatase

H,O Solche enzymatischen Modifikations-Demodifikationsprozesse, die von Enzymen, die als Protein-Kinasen und Protein-Phosphatasen bekannt sind, katalysiert werden, verändern die Aktivitäten der modifizierten Proteine. Tatsächlich werden etwa 30% der humanen Proteine, die kollektiv an fast allen biologischen Prozessen beteiligt sind, durch reversible Phosphorylierung kontrolliert. Ein Beispiel für ein solches Enzym, dessen Aktivität duch kovalente Modifikation kontrolliert wird, ist die Glykogen-Phosphorylase (oder einfach Phosphorylase), die die Phosphorolyse (Spaltung einer Bindung durch Substitution einer Phosphatgruppe) von Glykogen [das stärkeähnliche Polysaccharid, das hauptsächlich aus a(1-—>4)-verknüpften Glucoseresten besteht; Abschnitt 8.2C] katalysiert, wobei Glucose-1-Phosphat (G1P) entsteht: Glykogen + P;, =

Glykogen

(n Reste)

(n - | Reste)

+Gi1P

HOCH, H

HO

rel H OBzEH H

2]

OPOZ

OH

Glucose-1phosphat

(G1P)

Dies ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Stoffwechselweg des Abbaus von Glykogen, einem wichtigen Brennstofflieferanten für Stoffwechselaktivitäten (Abschnitt 16.1). Säugetiere exprimieren drei Isoenzyme (katalytisch und strukturell ähnliche aber genetisch unterschiedliche Enzyme vom selben Organismus; auch Isoformen genannt) der Glykogen-Phosphorylase: die des Muskels, die des Gehirns und die der Leber. Die Glykogen-Phosphorylase des Muskels, die wir hier besprechen, ist ein Dimer aus identischen Untereinheiten mit je 842 Resten. Sie

wird sowohl durch allosterische Wechselwirkungen als auch durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung reguliert. Die phosphoylierte Form des Enzyms, Phosphorylase a, ist am Ser 14 mit einer Phosphorylgruppe verestert. Die Dephosphoform wird als Phosphorylase b bezeichnet. Die von Robert Fletterick und Louise Johnson aufgeklärten Röntgenstrukturen von Phosphorylase a und Phosphorylase b sind ähnlich. Beide Strukturen haben eine große N-terminale Domäne (484 Reste, die größte bekannte Domäne) und

Regulation der Enzymaktivität

425

eine kleinere C-terminale Domäne (Abb. 12.14). Die N-terminale Domäne enthält die Phosphorylierungsstelle (Ser 14), die allosterische Effektorbindungsstelle, eine Glykogenbindungsstelle (als Glykogenspeicherstelle bezeichnet) und sämtliche Kontaktstellen zwischen den beiden Untereinheiten des Dimers. Das katalytische Zentrum liegt im Zentrum dieser Untereinheit. Phosphorylierung und Dephosphorylierung kann die enzymatische Aktivität ähnlich wie bei der allosterischen Kontrolle verändern Die Glykogen-Phosphorylase besitzt zwei Konformationszustände, den enzymatisch aktiven R-Zustand und den enzymatisch inaktiven T-Zustand (Abb. 12.15). Der T-Zustand des Enzyms ist inaktiv, da er ein verformtes aktives Zentrum und eine Oberflächenschleife (Reste 282-284) besitzt, die für das Substrat den Zugang zur Substrat-Bindungsstelle blockiert. Im Gegensatz dazu hat sich im R-Zustand des Enzyms die Seitenkette von Arg 569 so reorientiert, dass das Phosphation-Substrat und die 282-284-Schleife das aktive Zentrum nicht weiter blockieren und das Enzym das Substrat binden kann und effizient die Phosphorolyse von Glykogen katalysiert. Die Phosphorylierung von Ser 14 unterstützt den Konformationswechsel von Phosphorylase T ( inaktiv) zu R (aktiv). Darüber hinaus reagieren diese verschiedenen enzymatischen Formen auf verschiedene allosterische Effektoren (Abb. 12.16). Dementsprechend binden ATP und Glucose-6-Phosphat [G6P; in das das G1P-Produkt der Glykogen-Phosphorylasereaktion umgewandelt wird (Abschnitt 16.1C)] vorzugsweise an den T-Zustand der Phosphorylase b und inaktivieren dadurch das Enzym, während AMP vorzugsweise an den R-Zustand der Phosphorylase b bindet und diese dadurch aktiviert. Im Gegensatz dazu ist Glucose der einzige allosterische Effektor von Phosphorylase a. Sie bindet an den T-Zustand des Enzyms und inaktiviert das Enzym. Beachten Sie, dass ATP, G6P und Glucose bei geringer körperlicher Anstrengung, einem Zustand in dem Glykogenabbau überflüssig ist, im Muskel in relativ hohen Konzentrationen vorliegen. Im Gegensatz dazu liegt AMP im Muskel bei großer körperlicher Belastung, einem Zustand, in dem das G1P-Produkt der Phosphorylase-Reaktion dem Muskel hilft die Kontraktion anzutreiben, in relativ hohen Konzentrationen vor. Die Phosphatgruppe kann mit ihrer zweifach negativen Ladung (einer Eigenschaft, die natürlich vorkommende Aminosäurereste nicht besitzen) und ihrer kovalenten Bindung an ein Protein dramatische Konformationswechsel verursachen. In der Phosphorylase a bildet die Ser 14-Phosphatgruppe Ionenpaare mit zwei kationischen Arg-Seitenketten und verbindet dabei das aktive Zentrum, den Zwischenraum zwischen den Untereinheiten und die N-terminale Region. Letztere hat einen großen Konformationswechsel von seiner Position in den T-Zustand des Enzyms durchlaufen (Abb. 12.15). Diese Bindungswechselwirkungen führen dazu, dass die Turm-Helices der Glykogen-Phosphorylase (Abb. 12.14 und 12.15) sich neigen und voneinander getrennt werden, so dass sie vorteilhafter gepackt sind, was dann einen quaternären T>R-Übergang auslöst, der größtenteils aus einer relativen Drehung der zwei Untereinheiten um etwa 10° besteht. Daher wirkt die Ser 14-Phosphat-Gruppe als eine Art interner allosterischer Effektor, der das T= R-Gleichgewicht zugunsten des R-Zustands beeinflusst.

Protein-Kinase-Kaskaden Die Enzyme, die die Phosphorylierung und Dephosphorylierung der GlykogenPhosphorylase katalysieren, nennt man Phosphorylase-Kinase und Phosphoprotein-Phosphatase (Abb. 12.16). Die Aktivitäten der Letzteren sind selbst-kontrolliert, sowohl allosterisch als auch über Phosphorylierung/Dephosphorylierung. Daher besitzen, wie wir in Abschnitt 13.2 sehen werden, Sequenzen von Protein-Kinasen und Protein-Phosphatasen, die beide in Kaskaden verbunden sind (d.h. Protein-Kinase X phosphoryliert Protein-Kinase Y, die dann wiederum Protein-Kinase Z phosphoryliert), weitaus größere Kapazitäten zur Signalampli-

fikation (eine kleine stufenweise Veränderung der Effektorkonzentration verur-

(a)

(b)

Turm

N-terminale Domäne (Glykogenbindungssubdomäne

&

Glykogenspeicherstelle e Katalytisches Zen

Allosterisches Zentrum N-terminale Domäne (Kontaktbereichssubdomäne) C-terminale Domäne

Pyridoxalphosphat-Bindungsstelle

Abb. 12.14 Röntgenstruktur der GlykogenPhosphorylase aus Kaninchenmuskel. (a) Bänderdiagramm des Phosphorylase-a-Dimers mit Sicht entlang der zweizähligen Symmetrieachse des Moleküls. Die untere Untereinheit ist rot, die N-terminale und C-terminale Domäne der oberen Untereinheiten sind blau bzw. grün dargestellt. Die verschiedenen Liganden sind weiß. Die Phosphatgruppe in der Mitte jeder Untereinheit markiert das katalytische Zentrum des Enzyms. Maltoheptose (ein Glucoseheptamer) ist an jeder der Glykogenspeicherstellen gebunden und die allosterischen Effektorstellen sind an den AMP-Molekülen auf der Rückseite des Proteins erkennbar. [Mit freundlicher Genehmigung von Stephen Sprang, University of Texas Southwestern Medical Center.] (b) Vereinfachte Darstellung der Struktur von (a), welche dieverschiedenen Ligandenbindungsstellen des

Enzyms erkennen lässt. 6% siehe Kinemage Exercise 14.1.

426

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

T-Zustand

Konformationsänderungen in der Glykogen-Phosphorylase. Eine Untereinheit der dimeren Phosphorylase b ist links in Abwesenheit allosterischer Effektoren im T-Zustand und rechts im R-Zustand mit gebundenem AMP gezeigt. Diese Abbildung zeigt die untere Untereinheit (rot) aus der Sicht der blauen Untereinheit in Abb. 15.3. Die Turm-Helix ist blau, die N-terminale Helix cyan und die N-terminalen Reste, die ihre Konformation bei AMP-

Bindung ändern, sind grün markiert. Von den als raumfüllende Modelle dargestellten Gruppen ist Ser 14, die Phosphorylierungsstelle, hellgrün und AMP orange gefärbt, das PLP im aktiven Zentrum ist rot, die Seitenkette von Arg 569, die sich beim T>R-Übergang umorientiert und so mit dem Substratphosphat interagieren kann, ist cyan gezeichnet. Die Schleifenreste von Position 282 und 284, die im R-Zustand weitestgehend ungeordnet und daher nicht zu sehen sind, sind weiß und die beiden Phosphate im aktiven Zentrum

bzw. im R-Zustand

an der

Phosphorylierungsstelle Ser 14 (in der Phosphorylase b nicht vorhanden und nur für die Positionierung gezeigt) sind gelb markiert. [Röntgenstrukturkoordinaten mit freundlicher Genehmigung von Stephan Sprang, University of Texas Southwest Medical Center.] siehe Kinemage Exercises 14.2 und 14.3.

2ATP Die Kontrollmechanismen der Glykogen-Phosphorylase-Aktivität. Das Enzym kann die enzymatisch inaktive T-Konformation (oben) oder die katalytisch aktive R-Form

(unten) annehmen.

(inaktiv)

ee

Die Konformation von

Phosphorylase b wird durch Effektoren, wie AMP,

h

ATP und G6P, allosterisch kontrolliert. Unter

Press

o

physiologischen Bedingungen liegt sie überwiegend im T-Zustand vor. Im Gegensatz dazu reagiert die kovalent modifizierte Form des Enzyms, die Phosphorylase a (rechts), kaum auf diese Effektoren und liegt hauptsächlich im R-Zustand vor, aus-

|

genommen bei hohem Glucosespiegel. Unter normalen physiologischen Bedingungen wird die enzymatische Aktivität der Glykogen-Phosphorylase im Wesentlichen durch die Geschwindigkeit ihrer kovalenten Modifikation und deren Umkehrung

P

Kinase i

S

T-Zustand

2H,0

en

2

bestimmt. Es ist zu beachten, dass das Enzym nur

in der T-Form phosphoryliert und dephosphoryliert wird, so dass die Bindung an den Effektor die Häufigkeit dieser Modifikations-/Demodifikationsereignisse beeinflusst.

R-Zustand

(aktiv)

Phosphorylase b

Phosphorylase a

Arzneistoffentwicklung (Drug Design)

sacht eine größere stufenweise Veränderung der Enzymaktivität) und Flexibilität als Antwort auf eine größere Anzahl allosterischer Effektoren (die Aktivität jedes Proteins in der Kaskade kann durch verschiedene Effektoren beeinflusst werden) als dies ein einfaches allosterischen Enzym besitzt. Tatsächlich erlauben es gerade solche Kaskaden der Glykogen-Phosphorylase mit großer Empfindlichkeit auf die metabolischen Bedürfnisse des Organismus zu reagieren.

4

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Erklären Sie die strukturelle Grundlage für die kooperative Substratbindung und die allosterische Regulation bei der ATCase. 2. Beschreiben Sie wie Phosphorylierung und Dephosphorylierung die Aktivität der GlykogenPhosphorylase kontrollieren.

Arzneistoffentwicklung (Drug Design)

Die Verwendung von Heilmitteln zur Behandlung von Krankheiten hat eine lange Tradition. Die moderne, auf Naturwissenschaft basierende Pharmaindustrie ist allerdings ein Produkt des zwanzigsten Jahrhunderts (anstelle von Überlieferung und Aberglaube). Zu Beginn des zwanzigsten Jahrhunderts kannte man außer der Volksmedizin nur eine Handvoll Arzneistoffe. Dazu zählten Digitalis, ein herzanregendes Mittel aus dem Fingerhut (Exkurs 10.3); Chinin (Abb. 12.17) aus der Rinde und den Wurzeln des Chinarindenbaums (Cinchona), das zur Behandlung von Malaria diente und Quecksilber, mit dem man Syphilis behandelte — eine Therapie, die oft schlimmer war als die Krankheit selbst. Nahezu alle heute verwendeten Arzneistoffe wurden in den letzten drei Jahrzehnten entdeckt und entwickelt. Die Mehrzahl dieser Stoffe verändert die Aktivität eines Rezeptorproteins und erzielt auf diese Weise eine Wirkung. Enzyminhibitoren machen die zweitgrößte Arzneistoffklasse aus. Die Methoden der Enzymkinetik haben sich als außerordentlich wertvoll für die Bewertung von Arzneistoffkandidaten erwiesen.

A.

427

Die Arzneistoffentwicklung bedient sich verschiedener Techniken

Wie werden neue Arzneistoffe entdeckt? Bis in die 1990er Jahre hat man nahezu alle neuen Arzneistoffe dadurch entdeckt, dass man eine Vielzahl von Verbindungen überprüft hat. Dabei handelte es sich entweder um synthetische Verbindungen oder solche, die aus natürlichen Produkten stammen (oft Pflanzen, die in der Volksmedizin verwendet werden). Zur ersten Überprüfung gehört eine

N

>

I

00

CH=CH,

Beurteilung in-vitro, z.B. wie stark ein Arzneistoffkandidat an ein Enzym bindet.

Das Enzym muss natürlich mit der Krankheit zusammen hängen, um die es geht, d.h. man bestimmt zunächst die Kı-Werte potentieller Arzneistoffkandidaten. Wenn nach der ersten Überprüfung die Anzahl der Kandidaten eingegrenzt wurde, setzt man weitergehende Testsysteme ein, z.B. in Tierversuchen. Ein Arzneistoffkandidat, der die erwünschte Wirkung zeigt, heißt Leitverbindung (engl.: lead compound). Eine gute Leitverbindung bindet an ihr Zielprotein mit einer Dissoziationskonstante (für ein Enzym, eine Hemmkonstante) unter 1 uM. Eine solch hohe Affinität ist nötig, damit die weniger spezifische Bindung des Arzneistoffs an andere Moleküle im Körper möglichst gering ist. Weiterhin sollte gewährleistet sein, dass nur geringe Arzneistoffdosen eingenommen werden müssten. Eine Leitverbindung dient als Ausgangspunkt für die Entwicklung wirksamerer Verbindungen. Sogar kleine Veränderungen am Arzneistoffkandidaten können seine pharmakologischen Eigenschaften stark verändern. Die Substitution einer Methyl-, Chlor-, Hydroxyl- oder Benzylgruppe an verschiedenen Stellen der Leitverbindung kann somit unter Umständen deren Wirkung verbessern. Bei den meisten heutzutage verwendeten Arzneistoffen wurden üblicherweise 5.000 bis 10.000 verwandte Verbindungen synthetisiert und getestet. Die Arzneistoffforschung ist ein systematischer und iterativer Prozess, bei dem die vielversprechendsten Derivate der Leitverbindung als Ausgangspunkte für die nächste Derivatisierungs- und Testrunde dienen.

N

HO

Chinin

cl

NQ + NH

F

CH, — CH, — CH,

—N(C3H;),

CH3 Chloroquin

Abb. 12.17 Chinin und Chloroquin. Diese Verbindungen haben beide ein Chinolin-Ringsystem und sind wirksame Antimalariamittel. Der Parasit Plasmodium vermehrt sich innerhalb der roten Blutkörperchen. Er baut das Protein Hämoglobin ab, um damit seinen Nährstoffbedarf

zu decken. Bei diesem Vorgang wird Häm freigesetzt, das in seiner löslichen Form für den

Parasiten toxisch ist. Der Parasit sondert das Häm in kristalliner (ungiftiger) Form ab. Chinin und Chloroquin passieren die Zellmembran und hemmen die Häm-Kristallisation im Parasiten.

428

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation Strukturbasiertes Drug Design beschleunigt die Arzneistoffentwicklung Seit Mitte der 1980er Jahre hat die Bestimmung von Makromolekülstrukturen

mithilfe der Röntgenkristallographie und NMR (Abschnitt 6.2A) bahnbrechende Fortschritte erzielt; Geschwindigkeit und Genauigkeit verbesserten sich erheblich und ermöglichten so auch das strukturbasierte Drug Design. Dies ist ein Prozess, der zu einer enormen zahlenmäßigen Verringerung der zu synthetisierenden Verbindungen in einem Arzneistoffforschungsprogramm führte. Wie der Name vermuten lässt, verwendet das strukturbasierte Drug Design (auch rationales Drug Design genannt) die Struktur eines Rezeptors oder Enzyms im Komplex mit einem Arzneistoffkandidaten, um die Entwicklung wirksamerer Verbindungen zu erleichtern. Eine solche Struktur verrät z.B. die Positionen der Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren sowie die Hohlräume in der Bindungsstelle. In diese könnten unter Umständen Substituenten auf einem Arzneistoffkandidaten platziert werden, um dessen Bindungsaffinität zu erhöhen. Ergänzt werden diese direkten Visualisierungsmethoden gewöhnlich durch Tools des Moleküldesigns (molecular modeling). Dies beinhaltet die Berechnung der Konformation eines geplanten Derivats mit der geringsten Energie, quantenmechanische Berechnungen, die seine Ladungsverteilung ermitteln und untersuchen, wie es folglich mit dem Protein elektrostatisch wechselwirken würde. Außerdem werden in Andocksimulationen, bei denen ein Hemmstoffkandidat am Computer in die Bindungsstelle auf dem Rezeptor eingepasst wird, mögliche Wechselwirkungen analysiert. Für die Entwicklung der Analgetika (Schmerzstiller) Celebrex und Vioxx (Abschnitt 20.6C) und zur Entwicklung von Arzneistoffen gegen eine HIV-Infektion (Exkurs 12.4) wurde eine strukturbasierte Herangehensweise verwendet. Kombinatorische Chemie und das Hochdurchsatz-Screening sind nützliche Hilfsmittel bei der Arzneistoffentwicklung

Als die strukturbasierten Methoden entwickelt wurden, schien es, dass sie das vorherrschende Verfahren für die Arzneistoffforschung werden würden. Wenig später sind jedoch die Methoden der kombinatorischen Chemie aufgekommen. Mit ihnen lassen sich große Zahlen verwandter Verbindungen schnell und kostengünstig synthetisieren. In Kombination mit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Techniken (engl.: high-throughput screening, HTS) mithilfe von Robotern hat dies dazu geführt, dass das Pendel in der Arzneistoffforschung wieder umgeschlagen ist: Man synthetisiert wieder viele Verbindungen und testet deren Aktivität. Wenn eine Leitverbindung schrittweise aus mehreren Modulen synthetisiert wird, können die Substituenten auf jedem dieser Module parallel verändert werden und man erhält eine Bibliothek verwandter Verbindungen

(Abb. 12.18).

Man hat eine Vielzahl von Synthesetechniken entwickelt, die in einem einzigen Arbeitsablauf die kombinatorische Synthese Tausender verwandter Verbindungen ermöglichen. Um die Bedeutung einer hydrophoben Gruppe an einer bestimmten Position in einer Leitverbindung zu untersuchen, wären zu früheren Zeiten lediglich die Ethyl-, Propyl- und Benzyl-Derivate synthetisiert worden. Jetzt hingegen gestattet die kombinatorische Synthese, dass bis zu 100 unterschiedliche Gruppen an dieser Position eingeführt werden. Dies kann die mögliche Bandbreite des Substituenten weit effektiver gestalten und möglicherweise ein unerwartet aktives Derivat finden helfen.

Abb. 12.18 Kombinatorische Synthese von Arylidendiamiden. Wenn bei dieser Synthese für jede R-Gruppe zehn verschiedene Varianten verwendet werden, entstehen 1000 verschiedene Derivate.

o

10)

Arzneistoffentwicklung (Drug Design)

B.

Die Bioverfügbarkeit eines Arzneistoffes hängt davon ab, wie er resorbiert und im Körper transportiert wird

Die in vitro-Entwicklung eines wirksamen Arzneistoffkandidaten ist nur der erste Schritt im Entwicklungsprozess von Arzneimitteln. Neben der erwünschten Reaktion mit dem isolierten Zielprotein muss ein echter Arzneistoff in ausreichend hoher Konzentration in den Körper gelangen. So muss beispielsweise ein Arzneistoff, der oral verabreicht wird (der üblichste Weg), eine Reihe gewaltiger Hürden überwinden: (1) Der Arzneistoff muss unter den sehr sauren Bedingungen im Magen chemisch stabil sein und darf nicht von Verdauungsenzymen abgebaut werden. (2) Er muss aus dem Magen-Darm-Trakt in die Blutbahn resorbiert werden, d.h. er muss mehrere Zellmembranen durchqueren. (3) Er darf nicht zu fest an andere Stoffe im Körper binden (lipophile Substanzen z.B. werden von bestimmten Plasmaproteinen und dem Fettgewebe absorbiert). (4) Er muss die Derivatisierung durch ein Arsenal von Enzymen, insbesondere in der Leber, überstehen. Diese Enzyme entgiften Xenobiotika (fremde Verbindungen; man beachte, dass der Blutstrom aus dem Darm über die Pfortader (vena portae) direkt zur Leber führt, sodass die Leber alle über den Mund aufgenommen Stoffe verarbeitet, bevor sie den restlichen Körper erreichen). (5) Er darf nicht schnell wieder von der Niere ausgeschieden werden. (6) Er muss von den Kapillaren zum Zielgewebe gelangen. (7) Wenn er für das Gehirn bestimmt ist, muss er die Blut-Hirn-Schranke überwinden können, die den Durchtritt der meisten polaren Substanzen verhindert, und (8), wenn er für ein intrazelluläres Protein bestimmt ist, dann muss er die Plasmamembran und möglicherweise eine oder mehrere intrazelluläre Membranen durchqueren. Die Art und Weise, auf die ein Arzneistoff die oben aufgezählten Hindernisse überwindet, wird durch die Pharmakokinetik beschrieben. Somit hängt die Bioverfügbarkeit eines Arzneistoffs (das Ausmaß, in dem er seinen Wirkungsort erreicht, also in der systemischen Zirkulation zur Verfügung steht) sowohl von der verabreichten Dosis als auch von seiner Pharmakokinetik ab. Die wirksamsten Arzneistoffe sind gewöhnlich ein Kompromiss; sie sind weder zu lipophil noch zu hydrophil. Außerdem liegen ihre pK-Werte gewöhnlich im Bereich zwischen 6 und 8, sodass sie bei physiologischen pH-Werten leicht sowohl ihre ionisierte als auch ihre nicht ionisierte Form annehmen können. Dadurch ist es ihnen möglich, im nicht ionisierten Zustand die Zellmembranen zu durchqueren und im

ionisierten Zustand an ihr Zielprotein zu binden.

C.

Klinische Prüfungen geben Aufschluss über Wirksamkeit und Sicherheit

Vor allem anderen muss ein erfolgreicher Arzneistoff beim Menschen sicher und wirksam sein. Diese Eigenschaften werden zunächst an Tieren überprüft. Aber Menschen und Tiere reagieren oft ganz unterschiedlich auf einen Arzneistoff. Deshalb muss dieser letzten Endes in klinischen Prüfungen am Menschen getestet werden. In den Vereinigten Staaten von Amerika werden die klinischen Prüfungen von der Food and Drug Administration (FDA; Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln) überwacht. In Deutschland ist das Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) in Bonn für die Zulassung von neuen Arzneistoffen zuständig. Arzneimittelzulassungen bestehen aus drei zunehmend langwierigeren (und kostspieligeren) Phasen: Diese Phase dient in erster Linie dazu, die Sicherheit und UnbePhase I denklichkeit eines Arzneistoffkandidaten zu überprüfen, aber auch seinen Dosisbereich und die optimale Verabreichungsmethode (z.B. oral im Vergleich zur Injektion) und -häufigkeit zu ermitteln. Sie wird gewöhnlich mit einer kleinen Anzahl (20-100) normalen

429

430

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

gesunden Probanden an nur wenigen Prüfzentren durchgeführt. Besonderes Augenmerk wird auf das Auftreten schädlicher Nebenwirkungen gelegt. Wenn man von dem Arzneistoffkandidaten jedoch bereits weiß, dass er hoch giftig ist (z. B. Chemotherapeutika gegen Krebs), dann werden die Untersuchungen der Phase I bereits an Patienten durchgeführt, die an der Zielkrankheit leiden. In dieser Phase testet man an 100 bis 500 Probanden hauptsächlich, Phase II wie wirksam der Arzneistoff zur Behandlung der Zielkrankheit ist. Zudem wird der Dosisbereich verfeinert und der Arzneistoff auf mögliche Nebenwirkungen überprüft. Die Wirkungen des Arzneistoffkandidaten werden gewöhnlich mit Einfachblindstudien verifiziert. Bei dieser Vorgehensweise wissen die einzelnen Patienten nicht, ob sie den Arzneistoff erhalten oder eine Kontrollsubstanz. Gewöhnlich ist die Kontrollsubstanz ein Placebo (eine inaktive Substanz, die genauso aussieht, schmeckt, usw. wie der zu testende Arzneistoff). Bei lebensbedrohlichen Krankheiten muss die Kontrollsubstanz aus ethischen Gründen jedoch das beste zum Zeitpunkt der Studie verfügbare Medikament gegen diese Krankheit sein. In der Phase II scheiden viele Arzneimittel (ca. 70%) aus, da keine verbesserten Wirkungen im Vergleich zu etablierten Substanzen festgestellt werden. Dies ist für die Arzneistoffentwicklung besonders ungünstig, da bereits hohe Kosten entstanden sind. Phase III In dieser Phase überwacht man Nebenwirkungen, die durch Langzeitanwendungen hervorgerufen werden. Außerdem wird die Wirksamkeit an 1000 bis 5000 Patienten überprüft. Mithilfe der statistischen Analyse von sorgfältig entworfenen Doppelblindstudien wird der Arzneistoffkandidat im Vergleich mit Arzneistoffen der aktuellen Standardtherapie getestet. Bei diesen Studien weiß weder der Patient noch der Arzt, ob ein bestimmter Patient den Arzneistoff oder die Kontrollsubstanz erhalten hat. Die Testpersonen werden dabei nach dem Zufallsprinzip ausgewählt (Randomisierung). Dies wird gemacht, um Verfälschungen durch subjektive Beurteilungen der Forscher möglichst klein zu halten. Derzeit schaffen es nur 5 von 5000 Arzneistoffen in der präklinischen Phase bis zu den klinischen Prüfungen. Von diesen wird durchschnittlich nur einer letzen Endes für die klinische Verwendung zugelassen. Die Mehrzahl fällt bei den Prüfungen der Phase II durch. In den letzten Jahren betrug die Zeitabspanne der präklinischen Untersuchungen bei einer Arzneistoffentwicklung durchschnittlich etwa drei Jahre. Erfolgreiche klinische Prüfungen nehmen zusätzlich sieben bis zehn Jahre in Anspruch. Diese aufeinanderfolgenden Phasen sind zunehmend teurer, sodass es durchschnittlich 300 Millionen Euro kostet, bis ein Arzneimittel die Marktzulassung erhält. Der zeitraubendste und teuerste Aspekt eines Arzneimittelentwicklungsprogramms ist es, die seltenen Nebenwirkungen eines Arzneistoffkandidaten ausfindig zu machen. Nichtsdestotrotz ist es nicht ungewöhnlich, dass ein Medikament in den Verkauf gelangt und einige Monate oder Jahre später wieder vom Markt genommen wird, weil man festgestellt hat, dass es bei nur einer von 10.000 Personen unerwartete, lebensbedrohliche Nebenwirkungen verursacht hat (die Überwachung nach der Marktzulassung bezeichnet man als klinische Prüfungen der Phase IV). So hat beispielsweise die FDA im Jahre 1997 die Zulassung für den Appetitzügler Fenfluramin (Fen) zurückgezogen,

CH; CH,

ie NH—CH,—CH;

CH;

(_ om-o-m CF3 Fenfluramin

die Phentermin

Arzneistoffentwicklung (Drug Design)

431

den sie 1973 für Kurzzeitprogramme (wenige Wochen) zur Gewichtsreduktion zugelassen hatte. Fenfluramin wurde oft verordnet, häufig über längere Zeiträume und zusammen mit einem anderen Appetitzügler, Phentermin (Phen, 1959 zugelassen). Diese Kombination hieß Fen-Phen (die FDA hatte die beiden Arzneistoffe nicht in Kombination zugelassen, aber sobald ein Arzneistoff für

einen bestimmten Zweck zugelassen ist, kann ein Arzt ihn auch für andere Zwecke verordnen). Fenfluramin wurde auf Grund von über 100 Berichten über Herzklappenschäden vom Markt genommen. Diese traten bei Personen (zumeist Frauen) auf, die Fen-Phen durchschnittlich 12 Monate eingenommen hatten (Phentermin wurde nicht zurückgezogenen, weil es Beweise gab, dass für die Herzklappenschäden Fenfluramin verantwortlich war). Diese seltene Nebenwirkung war bei den klinischen Prüfungen mit Fenfluramin nicht beobachtet worden — auch deshalb, weil es sich dabei um eine derart ungewöhnliche Arzneimittelwirkung handelt, dass sie nicht gezielt untersucht worden war. In neuerer Zeit (2004) wurde das viel verschriebene Analgetikum Vioxx vom Markt genommen, weil es zuvor nicht erkannte Nebenwirkungen auf das Herz hatte. Hingegen blieb das eng verwandte Schmerzmittel Celebrex im Han-

del (Abschnitt 20.6C). D.

An Arzneimittelnebenwirkungen sind häufig die Cytochrome P450 beteiligt

Warum kann ein Arzneimittel, das von der Mehrheit der Patienten gut vertragen wird, für andere eine Gefahr darstellen? Die unterschiedlichen Reaktionen auf Arzneistoffe kommen durch die genetischen Unterschiede von Mensch zu Mensch zustande, aber auch durch deren unterschiedliche Krankheitszustände, andere eingenom-

mene Medikamente, das Alter, das Geschlecht und Umweltfaktoren. Ein anschauliches Beispiel für diese Phänomene sind die Cytochrome P450: Sie entgiften einen großen Teil der Xenobiotika und sind an der Stoffwechsel-Ausscheidung (Clearance) der meisten eingesetzten Arzneistoffe beteiligt. Die Cytochrome P450 bilden eine Superfamilie hämhaltiger Enzyme, die bei nahezu allen Lebewesen vorkommen - von den Bakterien bis zu den Säugetieren. Ihr Name stammt von dem typischen 450-nm-Peak in ihren Absorptionsspektren, der durch Komplexierung des Fe(II) der Häm-Gruppe mit Kohlenmonoxid hervor gerufen wird. „P“ steht dabei für Pigment. Das menschliche Genom codiert 57 Isoenzyme von Cytochrom P450, etwa ein Drittel davon kommt in der Leber vor. (Die P450-Isoenzyme werden mit den Buchstaben „CYP“ bezeichnet sowie einer Zahl, die für die Familie steht, dann folgt ein Großbuchstabe für die Unterfamilie und oft eine weitere Zahl; z.B. CYP2D6.) Diese Monooxygenasen (Abb. 12.19) sind bei Tieren in die Membran des endoplasmatischen Reticulums eingebettet und katalysieren Reaktionen des Typs RH + 9 +2H*

+2e

>ROH

+ H,O

Die Elektronen (e’) liefert NADPH, das diese durch Vermittlung des Enzyms NADPH-P450-Reductase auf die prosthetische Hämgruppe von Cytochrom P450 überträgt. RH steht für eine große Vielfalt gewöhnlich lipophiler Verbindungen, für die die verschiedenen Cytochrome P450 spezifisch sind. Zu ihnen zählen polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH, engl.: polycyclic aromatic hydrocarbons, dies sind häufig karzinogene (krebsauslösende) Verbindungen, die im Tabakrauch, gegrilltem Fleisch und anderen Pyrolyseprodukten vorkommen), polychlorierte Biphenyle (PCB, diese wurden als elektrische Isolatoren und als Weichmacher verwendet, sind weit verbreitet und ebenfalls karzinogen), Steroide (an deren Synthese Cytochrome P450 beteiligt sind) und viele verschiedene Arzneistofftypen. Die Xenobiotika werden dabei in eine wasserlöslichere Form überführt, was ihre Ausscheidung über die Niere ermöglicht. Zudem wer-

Abb. 12.19 Röntgenstruktur des menschlichen Cytochrom P450 CYP2C9 im Komplex mit dem Blutgerinnungshemmer Warfarin (Coumadin). Ausschnittsdiagramm vom aktiven Zentrum des Enzyms: Die Oberfläche des aktiven Zentrums ist violett gefärbt, sein Polypeptidrückgrat in Bänderform ist vom N-Terminus (blau) zum C-Terminus (rot) in der Abfolge der Spektralfarben markiert. Häm (mit der Schmalseite vorn), die Cys-Seitenkette, die das Fe-Atom des Häms koordiniert, und

das Warfarin sind in der Kugel-Stab-Form gezeigt. C ist grau, N blau, O rot, S gelb und Fe orangefarben. [Bild mit freundlicher Genehmigung von Astex Therapeutics Limited. PDBid 10C5.]

432

Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

den die neu erzeugten Hydroxylgruppen oft enzymatisch mit polaren Substanzen konjugiert (kovalent verknüpft), z.B. mit Glucuronsäure (Abschnitt 8.1C), Glycin, Sulfat und Acetat. Dadurch werden sie noch besser wasserlöslich. Die vielen Isoformen von Cytochrom P450 bei Tieren haben verschiedene Substratspezifitäten, allerdings ist die Spezifität eines jeden Cytochrom P450 eher breit und die Substratspezifitäten der verschiedenen Isoformen überlappen. Man nimmt an, dass sie als Reaktion auf die zahlreichen, unterschiedlichen Giftstoffe Andere produzieren. sind, die Pflanzen als Frassschutz entstanden Cytochrome P450 katalysieren dagegen spezifische Biosynthesereaktionen. Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln werden oft durch Cytochrome P450 vermittelt. Wenn ein Arzneistoff A beispielsweise von einem Cytochrom-P450Isoenzym verstoffwechselt wird oder ein P450-Isoenzym hemmt, das den Arzneistoff B verstoffwechselt, dann führt die gleichzeitige Verabreichung der Arzneistoffe A und B dazu, dass die Bioverfügbarkeit von Arzneistoff B zunimmt. Sie ist dann höher als wenn Arzneistoff B allein verabreicht worden wäre. Dieses Phänomen ist von besonderer Bedeutung, wenn der Arzneistoff B einen niedrigen therapeutischen Index hat (das Verhältnis der Arzneistoffdosis, die toxisch ist, zu der Dosis, welche die gewünschte Wirkung zeigt). Das Umgekehrte kommt ebenfalls oft vor: Arzneistoff A induziert die erhöhte Expression des Cytochrom-P450-Isooenzyms, von dem er und Arzneistoff B verstoffwechselt werden. Wenn man gleichzeitig Arzneistoff A und B verabreicht, nimmt die Bioverfügbarbeit von Arzneistoff B ab. Dieses Phänomen hat man erstmals bemerkt, als bestimmte Antibiotika die Wirkung oraler Kontrazeptiva aufhoben. Wenn der Arzneistoff B zudem zu einem giftigen Produkt verstoffwechselt wird, kann seine erhöhte Reaktionsrate zu Nebenwirkungen führen. Auch von Umweltgiften wie PAHs und PCBs ist bekannt, dass sie die Expression bestimmter Cytochrom-P450-Isoenzyme induzieren und dabei die Geschwindigkeit verändern, mit der bestimmte Arzneistoffe verstoffwechselt werden. Weiterhin kön-

nen solche Wirkungen bei Patienten mit Lebererkrankungen vorkommen sowie durch altersbedingte, geschlechtsbedingte und individuelle Unterschiede in der Leberphysiologie. Viele Cytochrome P450 sind vermutlich entstanden, um gefährliche Substanzen abzubauen und den Organismus zu entgiften und/oder der Beseitigung von Giftstoffen mitzuhelfen. Dennoch hat sich in manchen Fällen gezeigt, dass sie relativ harmlose Verbindungen zu giftigen Stoffen umwandeln. Ein Beispiel hierfür ist Paracetamol (in der engl. Literatur Acetaminophen; Abb. 12.20), ein viel verwendetes Analgetikum und Antipyretikum (fiebersenkendes Mittel). Es gilt als sehr sicheres Medikament, wenn es in therapeutischer Dosis eingenommen wird (1,2 g/Tag bei Erwachsenen); in hohen Dosen (>10 g) allerdings ist es stark giftig. Das liegt daran, dass bei therapeutischen Dosen 95% des vorhandenen Paracetamols an seiner OH-Gruppe enzymatisch zum entsprechenden Konjugat glucuronisiert oder sulfatiert und leicht ausgeschieden werden. Die verbleibenden 5% werden mithilfe von Cytochrom P450 (CYP2E1) zu N-Acetyl-pbenzochinonimin umgewandelt (Abb. 12.20), das dann mit Gluthathion umgesetzt wird (Abschnitt 4.3B). Wenn jedoch Paracetamol in großen Mengen genommen wird, ist der Glucuronisierungs- und Sulfatierungsweg gesättigt und damit wird der durch Cytochrom P450 vermittelte Weg zunehmend wichtiger. Wird das Glutathion in der Leber schneller verbraucht als wieder ersetzt, verbin-

det sich das reaktive N-Acetyl-p-benzochinonimin mit Sulfhydrylgruppen von Zellproteinen, was eine tödliche Lebertoxizität zur Folge hat. Viele P450-Cytochrome sind beim Menschen ungewöhnlich polymorph, d.h. es gibt in der Bevölkerung mehrere übliche Allele (Genvarianten) der Gene, die jedes der Enzyme codieren. Für die Cytochrome P450 hat man Allele beschrieben, die eine verminderte, erhöhte oder qualitativ veränderte Geschwindigkeit

des Arzneistoffmetabolismus bewirken. Die verschiedenen Allele sind zwischen ethnischen Gruppen sehr unterschiedlich verbreitet. Wahrscheinlich sind sie da-

Arzneistoffentwicklung (Drug Design)

=

(0)

an

l

I

ENIMROH: Be

433

P450 oh

N

cm

spontan Eng

m

—

Naval

H,O OH

Aergenenaitken (N-Acetyl-p-aminophenol) Glucuronid oder

Sulfat-Konjugat

coO _

allang

N-Acetyl-p-benzochinonimin

z

oO

CH

1

H3N—CH—CH,— CH, — C —NH—

jta8 N

CH—C —NH— CH,— COO-

Glutathion (y-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin)

ee NZ

6) och

|

cOODe nn m | I I H3N— CH—CH,— CH, — C—NH—CH—C—NH—CH,— C00Acetaminophen-Glutathion-Konjugat Abb. 12.20

durch entstanden, dass jede Gruppe mit den Giften in ihrer besonderen Nahrung zurechtkommen konnte. Der Polymorphismus bei einem bestimmten Cytochrom P450 verursacht, dass einzelne Personen bestimmte Arzneistoffe mit unterschiedlicher Geschwindigkeit abbauen. In Fällen beispielsweise, in denen eine Cytochrom-P450-Variante keine oder eine verminderte Aktivität besitzt, verursachen Standarddosen eines Arzneistoffs, den das Enzym normalerweise verstoffwechselt, dass die Biover-

fügbarkeit des Arzneistoffs eine toxische Konzentration erreicht. Wenn umgekehrt ein bestimmtes P450-Enzym eine erhöhte Aktivität hat (normalerweise dadurch, dass das entsprechende Gen dupliziert oder multipliziert wurde), müssen höhere Dosen des Arzneistoffs (der von dem Enzym abgebaut wird) als normalerweise verabreicht werden, um die erwünschte therapeutische Wirkung zu erhalten. Wenn aber der Arzneistoff zu einem giftigen Produkt verstoffwechselt wird, dann kann dies Nebenwirkungen mit sich bringen. Mehrere bekannte P450-Varianten haben eine veränderte Substratspezifität und bilden daher ungewöhnliche Metaboliten. Auch dies kann gefährliche Nebenwirkungen verursachen.

Die Erfahrung hat gezeigt, dass es keinen Arzneistoff gibt, der völlig ohne Nebenwirkungen ist. Wenn jedoch die Enzyme und ihre Varianten, die am Arzneistoffmetabolismus beteiligt sind, charakterisiert sind und schnelle und kostengünstige Methoden zur Genotypisierung entwickelt werden, wird es möglich, die Medikamententherapie auf die genetische Ausstattung einer Person zuzuschneiden, anstatt auf die gesamte Bevölkerung. Man spricht von individualisierter Therapie, dieses sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet bezeichnet man als Pharmakogenomik.

Abbau von Paracetamol

(Acetaminophen). Eine Überdosis Paracetamol führt zur Anhäufung des giftigen N-Acetyl-p-benzochinonimin.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 Il; Vergleichen Sie Struktur-basierte

Arzneistoffentwicklung und kombinatorische Chemie als

Werkzeuge für die Entwicklung von Arzneistoffkandidaten. Nennen Sie die Faktoren, die

die Bioverfügbarkeit eines Arzneistoffes beeinflussen. Erläutern Sie den Zweck der Phasen I bis III einer

klinischen Prüfung. Legen Sie dar, wie Arzneistoffe, die von der Mehrheit der Bevöl-

kerung gut toleriert werden, bei einzelnen Personen Neben-

wirkungen hervorrufen können.

434

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

Zusammenfassung nennen

1. Chemische Elementarreaktionen können nach erster, zweiter oder (selten) dritter Ordnung ablaufen. Für jeden Fall beschreibt eine Geschwindigkeitsgleichung den Fortschritt der Reaktion als Funktion der Zeit. 2. Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Beziehung zwischen Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion und Substratkonzentration im Fließgleichgewicht (engl.: steady state). 3. Bei der Substratkonzentration Ky ist die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal. Die Spezifitätskonstante k,./K gibt die katalytische Leistungsfähigkeit eines Enzyms an. 4. Kinetische Daten können in doppelt-reziproker Form aufgetragen werden, um Ky und V,„. zu bestimmen. 5. Bisubstratreaktionen unterteilt man in sequentielle (Einzel-Verdrängung) oder Ping-Pong-Reaktionen (Doppel-Verdrängung). Eine sequentielle Reaktion kann nach einem geordneten Mechanismus oder zufälllig ablaufen. 6. Reversible Inhibitoren reduzieren die Enzymaktivität durch Bindung an die Substratbindungsstelle (kompetitive Hemmung), an den Enzym-SubstratKomplex (unkompetitive Hemmung) oder an sowohl das Enzym als auch den Enzym-Substrat-Komplex (gemischte Hemmung). 7. Die Enzymaktivität kann durch allosterische Effektoren reguliert werden. 8. Die Aktivität der ATCase wird durch ATP erhöht und durch CTP erniedrigt; sie ändern die Konformation der katalytischen Zentren durch eine Stabilisierung der R- bzw. T-Zustände des Enzyms. 9. Die Enzymaktivität kann durch kovalente Modifikation, reguliert werden. 10. Die Enzymaktivität der Glykogen-Phosphorylase wird durch ihre Phosphorylierung/Dephosphorylierung reguliert sowie durch den Einfluss allosterischer Effektoren.

11. Ein Enzyminhibitor kann durch strukturbasierte und/oder kombinatorische Methoden zur Verwendung als Arzneistoff entwickelt werden. Er muss dann in klinischen Prüfungen auf seine Sicherheit und Wirksamkeit getestet werden. Arzneimittelnebenwirkungen oder Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln werden oft durch ein Cytochrom P450 vermittelt.

Wichtige Begriffe Elementarreaktion k v Reaktionsordnung Reaktion erster Ordnung Molekularität Reaktion zweiter Ordnung Geschwindigkeitsgleichung kn Reaktion pseudo-erster Ordnung Reaktion nullter Ordnung Radionuclid Autoradiographie ES-Komplex

k_ı k, Michaelis-Komplex Fließgleichgewicht (engl.: steady state) Annahme des Fließgleichgewichts

Enzymsättigung

Michaelis-Menten-Gleichung Kat

Wechselzahl kıa/ Km (Spezifitätskonstante)

diffusionskontrollierte Grenze Lineweaver-Burk-(doppelt- reziprokes) Diagramm sequentielle Reaktion Einzelverdrängungsreaktion geordneter Mechanismus zufälliger Mechanismus Ping-Pong-Reaktion Doppelverdrängungsreaktion Inhibitor Inaktivator kompetitive Hemmung Produkthemmung Übergangszustandsanalogon K

Ken

unkompetitive Hemmung

vorn, gemischte (nichtkompetitive) Hemmung allosterischer Effektor kovalente Modifikation Rückkopplungs-(feedback-) Hemmung Protein-Kinase Protein-Phosphatase Isozym (Isoform) Leitverbindung strukturbasierte (rationale) Arzneistoffentwicklung kombinatorische Chemie Xenobiotikum Pharmakokinetik Bioverfügbarkeit klinische Prüfung Cytochrom P450 Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln therapeutischer Index Pharmakogenomik

Aufgaben

435

Aufgaben en

1. Betrachten Sie die nichtenzymatische Grundreaktion AB. Wenn die Konzentration von A 20 mM ist, dann beträgt die in Form des Produkts B gemessene Reaktionsgeschwindigkeit 5 uM pro Minute. (a) Berechnen Sie für diese Reaktion die Geschwindigkeitskonstante. (b) Wie hoch ist die Molekularität der Reaktion? . Welche Menge des radioaktiven Isotops ””P (Halbwertszeit 14 Tage) ist von 10 umol bei t= O nach (a) 7 Tagen, (b) 14 Tagen, (c) 21 Tagen und

(d) 70 Tagen übrig? Die hypothetische Grundreaktion 2A — B + C hat eine Geschwindigkeitskonstante von 10° M!.s"!. Wie hoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit, wenn die Konzentration von A 10 mM beträgt? Bestimmen Sie für jede der beiden unten stehenden Reaktionen die Reaktionsordnung und berechnen Sie die Geschwindigkeitskonstante. Zeit (s)

digkeit zu berechnen, mit der das Produkt auftaucht als aus der Geschwindigkeit, mit der ein Substrat verschwindet. Bei welcher Konzentration von S (als Vielfaches von Ky ausgedrückt) wird vy = 0,95 Vnax? Bestimmen

Sie die Enzyme in Tabelle 12.1, deren kata-

lytische Wirksamkeit nahe des diffusionskontrollierten Limits liegt. Erklären Sie, warum die folgenden Datensätze aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm jeder für sich allein nicht geeignet sind, um Ky für eine enzymkatalysierte Reaktion zu bestimmen. Datensatz A

1/[S] (mM)

1/v, (uM:s)

0,5

2,4

1,0

2,6

1,5

2,9

2,0

3,1

1/[S] (mM)

1/v, (uM-s)

Reaktion A Reaktant (mM)

Reaktion B Reaktant (mM)

0

6,2

5,4

8

5,9

1

3,1

4,6

10

6,8

2

Ze

3,9

12

7,8

3

1,6

3,2

14

8,7

=

1,3

2,

5

el

2,3

10. Berechnen Sie Ky und V,„., aus den folgenden Daten:

Zeichen Sie in die unten stehenden Diagramme die für eine enzymatische Reaktion charakteristischen Kurvenverläufe ein.

[P]

[ES]

Zeit

Datensatz B

Zeit

Vo

[Elr 6. Erklären Sie, warum es gewöhnlich einfacher ist, die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms aus der Geschwin-

[5] (uM)

vo (mM-s")

0,1

0,34

0,2

0,53

0,4

0,74

0,8

0,91

1,6

1,04

11. Sie versuchen für ein Enzym die K,, zu bestimmen. Aufgrund einer Laborpanne haben Sie nur zwei verwendbare Datenpunkte:

[S] (uM)

v (uM-s”')

1

5

100

50

Verwenden Sie diese Daten, um einen Näherungswert für Ky zu berechnen. Ist dieser Wert bezogen auf den tatsächlichen Wert eher zu hoch oder zu niedrig geschätzt?

436

_Enzymkinetik, Hemmung und Regulation

12. Sie bestimmen die K,, indem Sie die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentrationen messen. Im Nachhinein bemerken Sie, dass das Substrat unter den von Ihnen gewählten experimentellen Bedingungen zur Präzipitation neigt. Wie beeinflusst dieser Umstand Ihre Bestimmung der Ky? 13. Sie möchten für ein Enzym, dessen K,, mit etwa 2 uM angenommen wird, die Geschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration messen. Die eingesetzte Enzymkonzentration beträgt 200 nM, und die Substratkonzentration reicht von 0,1 uM bis 10 uM. Was ist bei diesem experimentellen Ansatz falsch? Wie können Sie die Messung sinnvoller durchführen? 14. Ist es erforderlich, dass für die Berechnung der K, eines Enzyms aus Messungen der Reaktionsgeschwindigkeit diese in Konzentrationseinheiten pro Zeit (wie z.B. M-s’') ausgedrückt wird? 15. Muss [E]r bekannt sein, damit (a) Km (b) Vnax oder (©) Kr. bestimmt werden kann? 16. Für die Reaktion von Chymotrypsin mit N-Acetylvalinethylester beträgt Ky, 8,8 x 10°” M und für die Reaktion von Chymotrypsin mit N-Acetyltyrosinethylester beträgt

Ku 66410, M. (a) Welches Substrat hat die offensichtlich höhere Affinität zum Enzym? (b) Welches Substrat ergibt wahrscheinlich einen höheren

20. Schätzen Sie K, für einen kompetitiven Inhibitor ab, wenn für [I] = 5 mM eine apparente Ky bestimmt wird, die dreimal so groß ist wie die der ungehemmten Reaktion. 21. Bei einer enzymkatalysierten Reaktion ergibt die Anwesenheit von 5 nM eines reversiblen Inhibitors einen V..„Wert, der 80% des Werts in Abwesenheit eines Inhibitors beträgt. Der Ky-Wert ist unverändert. (a) Welche Art der Hemmung liegt wahrscheinlich vor? (b) Welcher Anteil der Enzymmoleküle hat den Inhibitor gebunden? (c) Berechnen Sie K, für diese Reaktion. 22. Wie würde die Zugabe von Diisopropylphosphofluoridat (DIPF; Abschnitt 11.5A) die apparente K,, und apparente Va, von Chymotrypsin beeinflussen? 23. Aufgrund vorausgehender Messungen vermuten Sie, dass eine Probe eines Enzyms einen irreversiblen Enzyminhibitor enthält. Sie entschließen sich dazu, die Probe um Faktor 100 zu verdünnen und messen die Enzymaktivität erneut. Was würden ihre Ergebnisse zeigen,

wenn der Inhibitor in der Probe (a) irreversibel oder (b) reversibel ist? 24. Enzym X und Enzym Y katalysieren dieselbe Reaktion und zeigen untenstehende v,-gegen-[S]-Kurven. Welches Enzym ist bei niedriger Substratkonzentration effektiver? Welches Enzym ist aktiver bei hoher Substratkonzentration?

Wert für Va? 17. Enzym A katalysiert die Reaktion S— P und hat eine K,, von 50 uM und eine V,.. von 100 nM-s'. Enzym B katalysiert die Reaktion S— Q und hat eine K,, von 5 mM und eine V„.„, von 120 nM-s’'. Wenn man

Enzym X

100 uM von S zu

einer Mischung gibt, die gleiche Mengen der Enzyme A und B enthält, welches Produkt wird dann nach einer Minute häufiger vorliegen: P oder Q? 18. Bei einer Bisubstratreaktion wird ein kleiner Teil des ersten Produkts P isotopenmarkiert (P“) und zu Enzym und erstem Substrat A zugegeben. B oder Q sind nicht anwesend. Wird A (= P-X) radioaktiv markiert sein (A”), wenn die Reaktion (a) einem Ping-Pong-Mechanismus oder (b) einem sequentiellen Mechanismus folgt? 19. Bestimmen Sie die Art der Hemmung einer enzymatischen Reaktion anhand der folgenden Daten, die in Abund Anwesenheit des Inhibitors (I) gemessen wurden. [SI] (mM)

v, (mM-min')

v, in Anwesenheit von | (mM - min”')

1

1,3

0,8

2

2,0

11,2

E

2,8

167,

8

3,6

DER,

12

4,0

2,4

Enzym Y

[S] 25. Sphingosin-1-phosphat (SPP) besitzt eine große Bedeutung für das zelluläre Überleben. Die Synthese von SPP aus Sphingosin und ATP wird durch das Enzym Sphingosin-Kinase katalysiert. Das Verständnis der Kinetik dieser Reaktion könnte bedeutsam für die Entwicklung neuer Medikamente zur Krebsbehandlung sein. Die Geschwindigkeit der Sphingosin-Kinasereaktion wurde in An- und Abwesenheit von threo-Sphingosin, einem Stereoisomer des Sphingosins, gemessen. Folgende Resultate wurden ermittelt.

Literatur DEE REEEEEFRREEETEE NEHEENEEEHEEEESEESIIESE 5... ©:7AEIS3

SERIE

SEE

[Sphingosin]

vo (mg- min")

(uM) x

vo (mg: min")

(ohne Inhibitor)

(mit threo-Sphingosin)

2,5

32,3

8,5

3,5

40

11,5

5

50,8

14,6

10

72

25,4

20

87,7

43,9

50

115,4

70,8

Zeichnen Sie ein Lineweaver-Burk-Diagramm, um folgende Fragen zu beantworten: (a) Wie sind die Werte für K, und V,„., in An- und Abwesenheit des Inhibitors? (b) Welche Art von Inhibitor ist threo-Sphingosin? Erklären Sie dies.

437

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 7_ A Storage Protein from Seeds of Brassica nigra Is a Serine Protease Inhibitor Purification of a novel seed storäge protein allows sequence analysis and determination of the protein’s secondary and tertiary structure Case Study 12 Production of Methanol in Ripening Fruit

The link between the production of methanol in ripening fruit and the activity of pectin methylesterase, the enzyme responsible for methanol production, is examined in wild-type and transgenic tomato fruit. Case Study 13 Inhibition of Alcohol Dehydrogenase The inhibition of the alcohol dehydrogenase by a formamide compound is examined. Case Study 15 Site-Directed Mutagenesis of Creatine Kinase Site-directed mutagenesis is used to create mutant creatine kinase enzymes so that the role of a single reactive cysteine in binding and catalysis can be assessed. Case Study 19 Purification of Rat Kidney Sphingosine Kinase The purification and kinetic analysis of an enzyme that produces a product important in cell survival is the focus of this study. Bioinformatics Exercises

Enzyme Inhibitors and Rational Drug Design 1. Dihydrofolate Reductase. Examine the structure of an enzyme with an inhibitor bound to it. 2. HIV Protease. Compare the structures of complexes containing HIV protease and an inhibitor. 3. Pharmacogenomics and Single Nucleotide Polymorphisms. Use online databases to find information on Cytochrome P450 polymorphisms.

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Eine Zelle braucht einen geeigneten Rezeptor, um chemische Signale anderer Zellen zu erkennen und auf sie zu reagieren.

[Grant V. Faint/Digital Vision/Getty Images]

Biochemische Signale a

TER

TEIL ASLISEL III

TEE

TINTEN

Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 12 Guided Exploration 13 Interactive Interactive Interactive Interactive

Exercise Exercise Exercise Exercise

10 11 12 13

Animated Figure 13.7 Animated Figure 13.24 Kinemage 15 Kinemage 16-1 Kinemage 16-2

Lebewesen koordinieren ihre Aktivitäten auf jeder Organisationstufe durch komplexe biochemische Signalsysteme. Interzelluläre Signale werden durch chemische Botenstoffe, die Hormone, und bei höheren Tieren durch neuronal übertragene elektrochemische Impulse vermittelt. Die intrazelluläre Kommunikation wird durch die Synthese oder Änderung einer großen Vielzahl verschiedener Substanzen aufrechterhalten. Diese sind oft feste Bestandteile der Prozesse, die sie steuern. In Kapitel 12 wurde gezeigt, dass Stoffwechselwege reguliert werden (Abschnitt 12.3). Dies geschieht beispielsweise mithilfe der Rückkopplung allosterischer Enzyme durch die Metaboliten dieser Stoffwechselwege oder durch die kovalente Modizifierung der Enzyme. In diesem Kapitel sollen die chemischen Signalstoffe betrachtet werden und es wird gezeigt, wie diese Moleküle Signale übermitteln können. Im Allgemeinen besteht jeder Signalweg aus einem Rezeptorprotein, das spezifisch ein Hormon oder einen Liganden bindet. Die Rezeptoren können in der Zelle lokalisiert sein oder als Membranproteine die Zellmembran durchspannen. Rezeptorproteine, die intrazellulär vorkommen, erkennen hydrophobe Hormone, welche die Membran selbst durchqueren (z. B. Steroidhormone, siehe Kapitel 28.3). Hydrophile und große Liganden binden an Transmembranrezeptoren. In diesem Fall folgt auf die Ligandenbindung eine Reihe von intrazellulären Reaktionen, zu denen die Synthese eines zweiten Botenstoffes, des Second Messengers, die Änderung der Konzentration von bestimmten Ionen und/oder durch Kinasen und Phosphatasen katalysierte chemische Veränderungen gehören können. Diese Wege beinhalten ofl Enzymkaskaden, bei denen aufeinander folgende, voneinander abhängende Ereignisse das Signal verstärken. Häufig ist die Aktivierung oder Deaktivierung von Transkriptionsfaktoren der letzte Schritt einer solchen Signalkaskade.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Biochemische Signale e Hormone

® Rezeptor-Tyrosinkinasen © Heterotrimere G-Proteine

® Der Phosphatidylinositolweg

440

Biochemische Signale

Zunächst sollen einige repräsentative Hormonsysteme beim Menschen und deren Funktion vorgestellt werden. Dann erörtern wir die drei wichtigsten Signalwege, auf denen interzelluläre Signale in intrazelluläre Signale umgewandelt werden (Transduktion): Solche, die (1) Rezeptor-Tyrosinkinasen aktivieren, (2) heterotrimere G-Proteine verwenden und (3) Phosphoinositid-Kaskaden einschließen. Die Neurotransmission und lIonenkanalaktivierung wird im Abschnitt 10.2C behandelt, die Signaltransduktion über Transkriptionsfaktoren

in Abschnitt 28.3.

1

f

Hormone

Bei den höheren Tieren synthetisieren endokrine Drüsen ohne Drüsengänge (Abb. 13.1) endokrine Hormone und setzen sie als Reaktion auf externe Reize in die Blutbahn frei. Mit dem Blut gelangen diese Hormone zu ihren Zielzellen (Abb. 13.2), in denen sie ihre Reaktion hervorrufen. Das endokrine System des

Menschen sezerniert eine breite Vielfalt von Hormonen. dem Körper unter anderem:

Hypothalamus Hypophyse Nebenschilddrüsen Schilddrüse

Nebennieren Pankreas Niere

Eierstöcke

Abb. 13.1 Die wichtigsten Drüsen des endokrinen Systems beim Menschen. Auch andere Gewebe wie der Darm sezernieren endokrine Hormone.

Diese ermöglichen

Hormone

44]

Abb. 13.2 Endokrine Signale. Die von endokrinen Zellen produzierten Hormone erreichen ihre Zielzellen über die Blutbahn. Nur Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren aufweisen, können auf die Hormone reagieren.

Hormonmoleküle

Endokrine Zellen

Blutstrom

Zielzellen

1. Die Aufrechterhaltung der Homöostase (Fließgleichgewicht; Insulin und Glucagon z.B. halten bei Hunger oder Sättigung den Blutglucosespiegel innerhalb fester Grenzen). 2. Auf eine Vielfalt externer Reize zu reagieren (z.B. die Vorbereitung auf „Flucht oder Kampf“ mithilfe von Adrenalin und Noradrenalin). 3. Verschiedenen Cyclen und Entwicklungsprogrammen zu folgen (z.B. regulieren die Geschlechtshormone die Geschlechtsdifferenzierung, die Reifung, den Menstruationscyclus und die Schwangerschaft). Die meisten Hormone gehören zu den Stoffklassen der Polypeptide, der Aminosäurenderivate oder der Steroide. Darüber hinaus können Lipide und Nucleinsäurederivate Signaltranduktionssysteme aktivieren, wenngleich wesentlich seltener. In jedem Fall reagieren aber nur diejenigen Zellen auf ein bestimmtes Hormon, die den spezifischen Rezeptor dafür besitzen - obwohl unter Umständen nahezu alle Zellen im Körper mit dem Hormon in Kontakt kommen. Hormonelle Botschaften sind somit spezifisch adressiert. Spezifische Hormone und deren Funktionen werden auch in vielen anderen Kapiteln erwähnt. In diesem Abschnitt sollen die Aktivitäten von Hormonen, die von einigen repräsentativen endokrinen Drüsen gebildet werden, ausführlicher beschrieben und deren Signaltransduktionswege exemplarisch dargestellt werden. Diese Drüsen sind nicht nur eine Ansammlung unabhängiger Sekretionsorgane,

sondern

bilden ein komplexes

und

stark ineinander

greifendes

Steuernetzwerk. Die Sekretion vieler Hormone wird durch Rückkopplung gesteuert. Die sezernierende Drüsenzelle reagiert dabei auf eine Änderung der Konzentration eines anderen Hormons, das als Folge der ersten Hormonfreisetzung ausgeschüttet wird. Man spricht vom Regelkreislauf der Hormonregulation. Die Konzentration der zirkulierenden Hormone misst man mit dem von Rosalyn Yalow (Exkurs 13.1) entwickelten Radioimmunoassay oder heutzutage mit den weiter entwickelten ELISA-Methoden (Abschnitt 5.2). A.

Die Hormone der Pankreasinselzellen steuern den Brennstoffmetabolismus

Das Pankreas ist ein großes Drüsenorgan. Sein größter Teil ist eine exokrine Drüse, die Verdauungsenzyme bildet, z.B. Trypsin, Chymotrypsin, RNase A, a-Amylase und Phospholipase A,. Diese Enzyme werden über den Pankreasgang in den Dünndarm sezerniert. Etwa 1 bis 2% des Pankreasgewebes bestehen aus verstreuten Zellgruppen, die man als Langerhans-Inseln bezeichnet. Sie stellen eine endokrine Drüse dar, deren Aufgabe es ist, die Energiehomöo-

442

_ Biochemische Signale

Exkurs 13.1

Berühmte Biochemiker

Rosalyn Yalow und der Radioimmunoassay (RIA) Abteilung und es begann eine 22-jährige Partnerschaft, die bis zu seinem Tod im Jahre 1972 anhielt. Bei ihren gemeinsamen Untersuchungen konzentrierten sich Yalow und. Berson auf die Anwendung von Isotopen für klinische Aufgaben wie z.B. Hormonuntersuchungen. Damals war Insulin das Hormon,

Rosalyn Yalow (1921-)

Diese war gewissermaßen

eine Pflicht-

lektüre für jede ehrgeizige Naturwissenschaftlerin. Rosalyn strebte damals eine Physikerlaufbahn an. Ihre Familie war zwar der Meinung, es sei praktischer, Grundschullehrerin zu werden, aber Rosalyn beharrte auf ihrem Entschluss.

Nach ihrem College-Abschluss im Jahre 1941 wurde Yalow eine Assistentenstelle mit Lehrtätigkeit in Physik von der Universität Illinois in Champaign-Urbana angeboten. Beim ersten Fakultätstreffen des Ingenieurs-Colleges stellte sie fest, dass sie die einzige Frau unter 400 Teilnehmern

war.

Der Dekan der Fakultät gratulierte ihr zu ihrer Leistung und sagte ihr, sie sei die erste Frau dort seit 1917. Die Einberu-

fung der jungen Männer zur Armee — noch bevor Amerika in den Zweiten Weltkrieg eintrat — hatte ihr den Zugang zur Promotion, ermöglicht.

Dort traf sie am

ersten

Tag Aron

Yalow, der ebenfalls gerade seine Arbeiten zur Dissertation

in Physik in Illinois aufnahm und später ihr Ehemann wurde. Im Januar 1945 erhielt Yalow ihren Promotionsabschluss in Kernphysik und kehrte zurück nach New York. Sie arbeitete beim Federal Telecommunications Laboratory und war die einzige Ingenieurin dort. 1946 ging sie an das Hunter-College zurück,

um

Physik

zu

unterrichten

—

aber

nicht

Frauen,

sondern Kriegsrückkehrer in einem Voringenieursprogramm.

Während dieser Zeit begann ihr Interesse an den medizinischen Aspekten von Radioisotopen. Sie ging im Dezember 1947 zur Bronx Veterans Administration (VA) als Teilzeitberaterin. Obwohl

sie bei Hunter

am

leichtesten

und erkannten, dass sie ein Werkzeug besaßen, mit dem es

Rosalyn Sussman Yalow kam am 19. Juli 1921 in New York City zur Welt. Keiner ihrer Eltern war in den Genuss einer Hochschulausbildung gekommen. Es bestand aber niemals ein Zweifel daran, dass ihre beiden Kinder das College schaffen würden. Als Rosalyn das Mädchen-College Hunter in New York (heute die City University of New York) besuchte, hatte Eve Curie gerade die Biographie ihrer Mutter, Madame Marie Curie, veröffentlicht.

das man

in hoch gereinigter Form bekommen konnte. Yalow und Berson untersuchten die Reaktion von Insulin mit Antikörpern

sogar in Vollzeit lehrte, ent-

wickelte sie den Radioisotopen-Service am VA-Krankenhaus und besorgte die notwendigen finanziellen Mittel. Zudem initiierte sie eine Vielzahl von Forschungsprojekten mit mehreren Ärzten. Im Januar 1950 entschloss sich Yalow, die Lehrtätigkeit ganz aufzugeben und bei der VA in Vollzeit zu arbeiten. In jenem Frühjahr kam Dr. Solomon A. Berson in diese

möglich war, in einer Mischung wie Blut die Insulinkonzentration zu messen. 1959 hatten sie eine praktische Methode entwickelt,

um

Insulin

im

menschlichen

Plasma

mengen-

mäßig bestimmen zu können: den Radioimmunoassay (RIA). Der RIA wird heute zur Messung von Hunderten von Substanzen eingesetzt, die von biologischem Interesse sind. Die Serumkonzentrationen von Insulin und anderen Hormonen sind extrem niedrig, im Allgemeinen liegen sie zwischen 10°’? und 10° M. Deshalb muss man sie oft indirekt messen. Beim RIA wird die unbekannte Konzentration eines Hormon

H bestimmt,

indem

man

misst, wie viel von der

Menge des radioaktiv markierten Hormons H* in Gegenwart von H an eine bestimmte Menge des Anti-H-Antikörpers bindet. Diese Konkurrenzreaktion lässt sich leicht eichen: Man erstellt eine Standardkurve, eine Eichkurve, bei der man

an den Antikörper gebundene

H*-Menge

gegen

die

bekannte

Konzentrationen von H aufträgt. Bestimmt man nun anschließend in der zu messenden Probe, wie viel-H* gebunden hat, so lässt sich die Konzentration von H aus der Eichkurve

ablesen. Weil Antikörper ihren Liganden spezifisch und mit hoher Affinität binden, ist der RIA sehr empfindlich und spezifisch. 1977 wurde Yalows Klinik in die Mount Sinai School of Medicine eingegliedert, und Yalow erhielt den Titel Distinguished Service Professor [eine Auszeichnung für besondere Verdienste]. Sie ist Mitglied in der Nationalen Akademie der Wissenschaften und hat zahlreiche Auszeichnungen und Ehrungen erhalten, u.a. 1977 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin (Berson war bereits gestorben, und konnte den

Preis nicht mehr mit ihr teilen) und 1988 die nationale Wissenschaftsmedaille [National Medal of Science; Diese Auszeichnung wird vom Präsidenten der USA verliehen]. „Die Begeisterung für das Lernen trennt die Jugend vom Alter“, sagte Rosalyn Yalow. „So lange man lernt, ist man nicht alt.“ Quellen: Größtenteils verkürzt aus Rosalyn Yalows Autobiographie, Les Prix Nobel. The Nobel Prizes 1977, Wilhem Odelberg (Ed.), Nobel Foundation, 1978. " Aus O, The Oprah Magazine, 1. Januar 2005.

Hormone

stase zu gewährleisten. Die Pankreasinseln enthalten drei Zelltypen, von denen jeder ein bestimmtes Polypeptidhormon sezerniert: 1. Die a-Zellen sezernieren Glucagon (29 Aminosäuren). 2. Die ß-Zellen sezernieren Insulin (51 Aminosäuren; Abb. 5.1). 3. Die ö-Zellen sezernieren Somatostatin (14 Aminosäuren).

Insulin wird als Reaktion auf einen hohen Blutglucosespiegel freigesetzt. Es hat hauptsächlich die Aufgabe, Muskel-, Leber- und Fettzellen dazu anzuregen, aus Glucose Glykogen, Protein und Fett zu synthetisieren und für die spätere Verwendung zu speichern (Abschnitt 22.2). Glucagon wird bei einem geringen Blutglucosespiegel sezerniert und hat die gegenteilige Wirkung: Es regt die Leber an, Glucose durch den Abbau von Glykogen freizusetzen (Glykogenolyse; Abschnitt 16.1) und aus Nichtkohlenhydrat-Vorstufen Glucose zu synthetisieren (Gluconeogenese; Abschnitt 16.4). Zudem aktiviert es das Fettgewebe, Fettsäuren durch Lipolyse freizusetzen. Somatostatin hemmt die Insulin- und Glucagonfreisetzung aus den jeweiligen Inselzellen. Neben den Pankreaszellen bildet auch der Hypothalamus Somatostatin, das durch zentrale Signale freigesetzt wird. Polypeptidhormone werden wie andere zur Sekretion bestimmte Proteine an den Ribosomen als Prohormone synthetisiert und im rauen endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat modifiziert, damit das reife Hormon entsteht. Hierbei spielen häufig proteolytische Spaltungen eine Rolle. Dann werden sie in sekretorische Granula verpackt und auf ein Signal hin durch Exocytose freigesetzt (Abschnitte 9.4D-F). Die stärksten physiologischen Stimuli für die Freisetzung von Insulin und Glucagon sind hohe bzw. niedrige Blutglucosespiegel, sodass die Inselzellen als die primären Glucosesensoren im Körper fungieren. Die Hormonfreisetzung wird aber auch durch das autonome (unwillkürliche) Nervensystem beeinflusst sowie durch Hormone, die vom MagenDarm-Trakt sezerniert werden.

B.

Adrenalin und Noradrenalin bereiten den Körper auf eine Reaktion vor

Die Nebennierendrüsen bestehen aus zwei unterschiedlichen Gewebetypen, der Medulla (Mark), einer Erweiterung des sympathischen Nervensystems (ein Teil des autonomen Nervensystems) und dem charakteristischeren Teil der Drüse, dem Cortex (Rinde). Zuerst befassen wir uns mit den Hormonen des Nebennierenmarks, den Katecholaminen. Die Hormone der Nebennierenrinde werden im darauf folgenden Abschnitt behandelt. Das Nebennierenmark synthetisiert zwei Katecholamine mit Hormonwirkung (primäre oder sekundäre Aminderivate des Katechols, 1,2-Dihydroxybenzol): Noradrenalin (in der engl. Literatur Norepinephrin) und sein Methylderivat Adrenalin (Epinephrin). Wie in Abschnitt 21.6B beschrieben, werden diese Hormone aus Tyrosin synthetisiert und in Granula gespeichert, bis sie mittels Exocytose freigesetzt werden. Diese Freisetzung wird vom sympathischen Nervensystem gesteuert. HO +

HO

F= CH

NED ZR

OH R=H

Noradrenalin (Norepinephrine)

R= CH,

Adrenalin (Epinephrine)

Die biologischen Wirkungen der Katecholamine werden durch zwei Klassen von Transmembranrezeptoren vermittelt, den «- und den ß-Adrenorezeptoren (auch als adrenerge Rezeptoren bezeichnet). Diese glykosylierten Transmembranpro-

443

444

Biochemische Signale

HO

Hz

+

HO

CH;

OH Isoproterenol

OH | O —CH, —CH CH,

+ NH,

FH; m

CH; Propranolol

H,C

a!

B)

ten Liganden bestimmt wurden, kann die Dissoziationskon-

stante anderer Liganden für die gleiche Ligandenbindungsstelle durch Untersuchung der kompetitiven Bindung ermittelt werden. Das Modell, das diese kompetitive Bindung beschreibt, ist analog zur kompetitiven Hemmung eines Michaelis-Menten-Enzyms (Abschnitt 12.2A).

KL R+ , ZR:L +

I

(13.3)

Wenn wir uns nun an die übliche Nomenklatur für die Rezeptorbindung halten, können wir statt [R-L] B (für den gebundenen Liganden) schreiben, statt [L] F (für den freien Liganden) und statt [R]} B„.... Dann wird Gleichung 13.3 zu B e

[L] Abb. 1 Bindung des Liganden an den Rezeptor. (a) Eine hyperbolische Kurve. (b) Ein Scatchard-Plot. Hier ist B = [R-L], F = [L] und B,.. = [Rh

Sobald die Parameter der Rezeptorbindung für einen konkre-

wobei Y der Anteil der besetzten Ligandenbindungsstellen ist. Gleichung 13.2 ergibt eine hyperbolische Kurve (Abb. 1a), in der K, als die Ligandenkonzentration definiert werden kann, bei der der Rezeptor die halbmaximale Ligandensättigung hat. K, und [R]- können zwar prinzipiell aus der Analyse einer hyperbolischen Darstellung wie in Abbildung 1a bestimmt werden, die Analyse aus einer linearen Gleichungsform ist aber üblicher. Gleichung 13.1 kann man umformen zu

[R-U _ (Rlr- IR-1)

[RL] [Rt 0,5

(13.4)

Kı

Trägt man B/F gegen B auf, so erhält man eine Gerade mit der Steigung -1/K,, deren Schnittpunkt mit der B-Achse Bunax Ist (Abb. 1b). Diese Darstellung bezeichnet man nach ihrem Erfinder als Scatchard-Plot. Dabei können sowohl B als auch F durch Filterbindungstests wie folgt bestimmt werden: Die meisten Rezeptoren sind unlösliche, membrangebundene Proteine und lassen sich deshalb von den löslichen freien Liganden durch Filtration oder Zentrifugation abtrennen (Rezeptoren, die solubilisiert wurden, können von freien Liganden durch Filtration getrennt werden, z.B. durch Nitro-

cellulose, da Proteine unspezifisch an Nitrocellulose binden). Wenn man nun radioaktiv markierte Liganden verwendet, lassen sich B und F ([R-L] und [L]) aus der Radioaktivität auf dem Filter bzw. dem Pellet und aus der in Lösung verbliebenen Radioaktivität bestimmen. Die Dissoziationsgeschwindigkeit von R-L ist im Allgemeinen so gering (Halbwertszeiten von Minuten bis Stunden), dass der Fehler unbedeutend

ist, wenn der Filter gewaschen wird, um den restlichen freien Liganden zu entfernen.

| R:-I+L —>

keine Bindung

Hier ist | der konkurrierende Ligand, dessen Dissoziationskonstante mit dem Rezeptor angegeben wird als

„ik

(13.5)

[R- 1]

Somit gilt in direkter Analogie mit der Ableitung der Gleichung, die die kompetitive Hemmung beschreibt:

[Rlr{E]

Rall-

(13.6)

Kı ( + d) + [L]

Die relativen Affinitäten eines Liganden und eines Inhibitors können

somit

bestimmt

werden,

indem

man

die

Glei-

chung 13.7 bei Anwesenheit des Inhibitors durch die Gleichung bei Abwesenheit des Inhibitors teilt: [R-LJ,

[Klı + IE]

[R-Lo

Kl + n) + [L]

(13.7)

Wenn dieses Verhältnis 0,5 beträgt (50% Hemmung), bezeichnet man die Konkurrenzkonzentration als [Iso] bzw. IC;, (inhibitory concentration 50%). Löst man bei der 50%igen Hemmung Gleichung 13.8 nach K, auf, so ergibt sich:

[so]

(13.8)

450

_ Biochemische Signale

(b)

(a) Abb. 13.5 Röntgenstruktur der TyrosinkinaseDomäne des Insulinrezeptors. (a) Die Tyrosinkinasedomäne ist in der bei Kinasen üblichen Orientierung gezeigt. Die N-terminale Domäne ist lavendelfarben, die C-terminale

Domäne türkis und die Aktivierungsschleife blau dargestellt. Ihre drei phosphorylierten Tyr-Seitenketten sind in der Kugel-Stab-Form gezeigt: C ist grün, N blau, © rot und P gelb. Das ATP-Analogon AMPPNP ist als Kalottenmodell gezeichnet. Das Substratpolypeptid ist orange (nur sechs seiner Aminosäuren

sind sichtbar); zu sehen ist sein

phosphorylierbarer Tyr-Rest, wobei C pink und O rot sind. (b) Hier sind die Polypeptidrückgrate der C-terminalen Domänen der Tyrosinkinasemodule des Insulinrezeptors in ihrer phosphorylierten und in der nicht phosphorylierten Form übereinandergelegt. Das phosphorylierte Protein ist grün, seine Aktivierungsschleife blau, das nicht phosphorylierte Protein ist gelb, seine Aktivierungsschleife rot. Der blaue Pfeil und die schwarze Achse zeigen die Rotation, die erforderlich ist, um die beiden

N-terminalen Domänen zur Deckung zu bringen. [Teil a nach einer Röntgenstruktur von Stevan Hubbard, New York University Medical School,

und Teil b mit dessen freundlicher Genehmigung. PDBids 1IR3 und 1IRK.] &% siehe Interactive Exercises.

die Enzymreaktion nicht ablaufen, die Bindungsstelle jedoch identifiziert werden kann. :

6) 6) Q | I I A "o-P-NH—P-0—-P CH, 3 6 oo un H H OH OH Adenosin-5’-(ß,y-imido)triphosphat

(AMPPNP)

Es ist zwischen den Proteindomänen gebunden. Seine y-Phosphatgruppe steht in enger Nachbarschaft zur OH-Gruppe der Zielaminosäure Tyrosin im aus 18 Aminosäuren bestehenden Substratpeptid, das ebenfalls an das Protein gebunden ist. Drei der Tyr-Reste der PTK, die allesamt in deren C-terminaler Domäne liegen, werden phosphoryliert. Der Vergleich dieser Röntgenstruktur mit derjenigen des nicht phosphorylierten und nicht komplexierten Proteins zeigt, dass sich die N-terminale Domäne der PTK bei Ligandenbindung und Phosphorylierung um 21° im Verhältnis zur C-terminalen Domäne dreht (Abb. 13.5b). Diese deutliche Konformationsänderung schließt den Spalt im aktiven Zentrum und positioniert vermutlich die für die Substratbindung und Katalyse entscheidenden Aminosäuren. Die drei Phospho-Iyr-Reste sitzen alle auf der sogenannten Aktivierungsschleife des Proteins. Die nicht phosphorylierte Aktivierungsschleife liegt im aktiven Zentrum der PTK, um zu verhindern, dass ATP und die Proteinsubstrate binden. Aber durch die Phosphorylierung ändert die Aktivierungsschleife ihre Konformation, sodass sie das aktive Zentrum nicht mehr verdeckt (Abb. 13.5). Stattdessen bildet sie einen Teil der Substraterkennungsstelle. Die PTK-Aktivität

Rezeptor-Tyrosinkinasen

451

des Insulinrezeptors steigt mit dem Phosphorylierungsgrad seiner drei autophosphorylierbaren Tyr-Reste an. Nahezu alle bekannten PTKs haben zwischen einem und drei autophosphorylierbare Tyr-Reste in ihren Aktivierungsschleifen. Diese nehmen in allen phosphorylierten PTKs mit bekannter Struktur eine ähnliche Konformation an. Zudem phosphorylieren viele aktivierte PTKs andere RTK zusätzlich auch an cytoplasmatischen Tyr-Resten außerhalb ihrer PTK-Domäne. Dass die PTKs spezifisch Tyr statt Ser oder Thr phosphorylieren, erklärt man sich folgendermaßen: Im Gegensatz zu Tyr sind die Ser- und Thr-Reste einfach zu kurz und reichen nicht bis ins aktive Zentrum.

B.

Kinasekaskaden geben Signale an den Zellkern weiter

Obwohl bestimmte autophosphorylierte RTKs ihre letztendlichen Zielproteine, z.B. andere Enzyme, direkt phosphorylieren und damit modulieren, gibt es auch solche, die dies nicht tun. Wie werden deren Zielproteine aktiviert? Die Antwort lautet: durch eine äußerst vielfältige und komplizierte Serie von miteinander verbundenen Signalwegen, die Proteininteraktionskaskaden und Phosphorylierungskaskaden beinhalten können. SH2-Domänen binden Phospho-Tyr-Reste Die wichtigsten Substrate der Insulinrezeptor-Tyrosinkinase sind die Insulinrezeptor-Substrate 1 und 2 (IRS-1 und IRS-2). Proteine, die einen Phospho-Tyr-

Rest enthalten, können mit einer anderen Klasse von Proteinen wechselwirken, die ein oder mehrere konservierte Module aus ca. 100 Aminosäuren enthalten. Diese Module bezeichnet man als Src--Homologie-2-(SH2-)Domänen [weil sie eine ähnliche Sequenz haben wie eine Domäne in dem Protein Src (wird als „sarc“ ausgesprochen)]. SH2-Domänen binden Phospho-Tyr-Reste mit hoher Affinität, aber sie binden nicht die weit häufigeren Phospho-Ser- und Phospho-ThrReste. Diese Spezifität lässt sich leicht erklären: Röntgenstrukturuntersuchungen zeigen, dass das phosphorylierte Tyr mit einem Arg am Boden einer tiefen Tasche in Wechselwirkung tritt (Abb. 13.6). Die Seitenketten von Ser und Thr sind für diese Wechselwirkung zu kurz.

+1 GLU

\

+2GLU

+3 ILE

Abb. 13.6 Röntgenstruktur der SH2-Domäne von Src. Ein Polypeptid aus 11 Aminosäuren hat an die SH2-Domäne gebunden. Es enthält das Tetrapeptidsegment Phospho-Tyr-Glu-Glu-Ile (das Zielmotiv) des Proteins. In diesem Ausschnitt ist die Proteinoberfläche durch rote Punkte dargestellt,

das Proteinrückgrat (pink) ist als Bändermodell, seine Seitenketten sind in der Stabform gezeigt. Das N-terminale, aus acht Aminosäuren bestehende Segment des gebundenen Polypeptids ist als Kalottenmodell gezeigt, sein Rückgrat ist gelb, seine Seitenketten sind grün und seine Phosphatgruppe ist weiß. [Mit freundlicher Genehmigung von John Kuriyan, The Rockefeller University.]

452

Biochemische Signale Proteine, die SH2-Domänen enthalten, können mit phosphorylierten IRS-Varianten und anderen Substraten wechselwirken. Sie weisen oft äußerst unterschiedliche Funktionen auf: Manche sind selbst wieder Kinasen, manche Phosphatasen und andere GTPasen, die man deshalb kurz als G-Proteine bezeichnet (Abschnitt 13.3B). Um es noch komplizierter zu machen: IRS-1 unterliegt der Ser-Phosphorylierung, was die Wirkungen der durch Insulin stimulierten Tyrosinphosphorylierung abschwächt. Das Signalnetzwerk ist somit wesentlich komplexer. Aktivierte RTKs aktivieren indirekt das G-Protein Ras Die molekulargenetische Analyse der Signalübertragung in einer Vielzahl entfernt verwandter Organismen brachte einen bemerkenswert konservierten Sig-

nalweg zum Vorschein, der solch lebensnotwendige Funktionen wie Zellwachstum und -differenzierung reguliert. Kurz gesagt: Wenn der Wachstumsfaktor an seine entsprechende RTK bindet, wird ein monomeres G-Protein (GTPase) namens Ras aktiviert. Dieses ist an der Innenseite der Plasmamembran durch Prenylierung verankert (Abschnitt 9.3B). Das aktivierte Ras kann das Signal weiterleiten und eine Kinasekaskade in Gang setzen. Diese übermittelt das Signal an den Transkriptionsapparat im Zellkern. SH3-Domänen binden prolinreiche Sequenzen

Bindet ein Wachstumsfaktor an seine RTK, dann phosphoryliert sich diese selbst und tritt mit einem SH2-haltigen Protein in Wechselwirkung (Abb. 13.7, links). Viele Proteine, die SH2-Domänen enthalten, haben auch eine oder mehrere nicht verwandte SH3-Domänen, die aus 50 bis 75 Aminosäuren aufgebaut sind. SH3-Domänen binden prolinreiche Sequenzen mit 9 oder 10 Aminosäureresten (Abb. 13.8). Sie können auch völlig unabhängig von SH2-Domänen auftreten. Beide Domänentypen vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Proteinen allgemein, vor allem aber zwischen Kinasen und Regulatorproteinen. Abbildung 13.7 zeigt eine Signalkaskade. Ein Säugerprotein aus 217 Aminosäuren namens Grb2 (Grb: engl. growth factor receptor bound protein 2; bzw. das analoge Sem-5 beim Nematoden Caenorhabditis elegans) besteht nahezu vollständig aus einer SH2-Domäne, die von zwei SH3-Domänen flankiert wird (Abb. 13.9). Grb2 bildet einen Komplex mit SOS (engl.: son of sevenless), einem Protein aus 1596 Aminosäuren. SOS enthält eine prolinreiche Sequenz, die spezifisch an SH3-Domänen bindet. Der Grb2-SOS-Komplex verbrückt die aktivierten RTKs und Ras. Durch die Bindung an SOS wird die Konformation des Ras-Proteins geändert, was Ras zum Austausch seines gebundenen GDP gegen GTP veranlasst. Ras bindet sowohl GTP als auch GDP fest und muss somit mit SOS wechselwirken, um die Nucleotide auszutauschen. SOS ist damit ein Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor, GEF). Die meisten G-Proteine benötigen einen entsprechenden GEF zur Aktivierung. Weil nur der Ras:GTP-Komplex das Signal von einer aktivierten RTK weiterleiten kann, wird Ras durch den Austausch von GDP gegen GTP aktiviert. Die Röntgenstruktur von Grb2 (Abb. 13.9) zeigt, dass seine SH2-Domäne mit seinen beiden SH3-Domänen flexibel verknüpft ist. Wie kann die Bindung eines solch biegsamen Adaptors (ein Verbindungstück ohne Enzymaktivität) an eine phosphorylierte RTK verursachen, dass SOS Ras aktiviert? Grb2 und SOS sind so fest miteinander assoziiert, dass sie in der Zelle praktisch ständig verbunden sind. Wenn also Grb2 an eine phosphorylierte RTK bindet, rekrutiert es SOS an der Innenseite der Plasmamembran. Dort verursacht die erhöhte lokale SOSKonzentration, dass SOS leichter an das membranverankerte Ras bindet, als GEF fungiert und den GDP/GTP-Austausch initiiert.

Rezeptor-Tyrosinkinassen Wachstumsfaktor

453

Abb. 13.7 Die Ras-Signalkaskade. Die Bindung eines Wachstumsfaktors an seine RTK induziert die Autophosphorylierung der cytosoli-

Extrazellulärer Raum

) Plasmamembran

schen RTK-Domäne. Grb2/Sem-5 bindet über seine SH2-Domäne an das resultierende Phospho-Tyrenthaltende Peptidsegment. Gleichzeitig bindet Grb2/Sem-5 über seine SH3-Domäne an prolinreiche Segmente von SOS. SOS wird dadurch aktiviert und das an Ras gebundene GDP wird gegen GTP ausgetauscht. Ras wird zur Bindung an Raf aktiviert. Dann phosphoryliert Raf, eine Ser/Thr-Kinase, in einer sogenannten Kinase-

SH2-

kaskade MEK; diese phosphoryliert wiederum

SH3-

Domäne Domäne |

Kinase-

A

kaskade

andere Effektoren

(GAPSs) andere Effektoren

MAPK, die dann in den Zellkern wandert, wo sie

Transkriptionsfaktoren wie Fos, Jun und Myc phosphoryliert. Auf diese Weise wird die Genexpression reguliert. Ras wird durch die Hydrolyse von GTP inaktiviert, dieser Prozess wird durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) beschleunigt. Die Kinasekaskade kehrt schließlich mithilfe der Aktivität von Proteinphosphatasen in ihren Ausgangszustand zurück (Abschnitt 13.2D). [Nach Egan, S.E. und Weinberg, R.A., Nature 365, 782 (1993).] 6% siehe Animated Figures.

Transkriptions-

faktoren Genexpression

DNA

Zellkern

GAPs beschleunigen die GTPase-Aktivitäten von G-Proteinen Ras ist ein Enzym, das die Hydrolyse seines gebunden GTP zu GDP + P; katalysiert. Dadurch wird es inaktiviert und kontrolliert die Stärke der Zellantwort auf

den Wachstumsfaktor. Das Signal wird somit intrinsisch abgeschaltet. Ras hydrolysiert von alleine nur zwei bis drei GTPs pro Minute - zu wenig, für eine leistungsfähige Signalübertragung und -abschaltung (damit ein Signal nicht nur ein einmaliger Schalter ist, muss es sowohl zum An- als auch zum Abschalten einen Mechanismus geben). Diese Erkenntnis führte zur Entdeckung des 120 kD GTPase-aktivierenden Proteins (GAP), namens RasGAP. Wenn dieses Protein an Ras:GTP gebunden hat, beschleunigt es die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse um den Faktor 10°. Die meisten anderen G-Proteine haben ebenfalls ein entsprechendes GAP.

Abb. 13.8 Röntgenstruktur der SH3-Domäne aus dem Protein Abl im Komplex mit seinem aus 10 Aminosäuren bestehenden, prolinreichen Polypeptid der Sequenz APTMPPPLPP. Die Oberflächen des Proteins ist türkis dargestellt,

das Peptid ist in der Stabform gezeigt, mit dem Prolin-Kohlenstoff magentarot, andere C-Atome sind grün, N blau, © rot und S gelb gefärbt. [Nach Röntgenstrukturen von Andrea Musacchio, European Molecular Biology Laboratory (EMBL),

Heidelberg. PDBid 1ABO.]

454

Biochemische Signale

Der Mechanismus, durch welchen RasGAP die GTPase-Aktivität von Ras aktiviert, wurde durch Röntgenstrukturen der aus 334 Aminosäuren bestehenden GTPase-aktivierenden Domäne von RasGAP (GAP334) aufgeklärt. Diese Domäne war an Ras gebunden, das im Komplex mit GDP und AlF; vorlag (Abb. 13.10). GAP334 interagiert mit Ras auf einer großen Fläche. AlF, hat eine dreieckige, planare Geometrie. Es bindet an Ras an der zu erwartenden Stelle der y-Phosphatgruppe von GTP, wobei das Al-Atom gegenüber einem gebundenen Wassermolekül liegt, das in der GTPase-Reaktion wahrscheinlich das angreifende Nucleophil ist. Da die Al-F- und die P-O-Bindung etwa gleich lang sind, ähnelt die Gruppierung GDP-AIF;-H,O dem erwarteten Übergangszustand der GTPase-Reaktion, bei dem AIF, die planare PO,-Gruppe imitiert. GAP334 bindet an Ras. Dabei ist die sogenannte Fingerschleife von GAP334 in das aktive Zentrum von Ras eingeschoben, sodass die Seitenkette von Arg 789 sowohl mit der ß-Phosphatgruppe des an Ras gebundenen GDP als auch mit AIF, interagiert (Abb. 13.10). In Ras:GTP wäre diese Argininseitenkette in einer optimalen Position, um die sich bildende negative Ladung im Übergangszustand der GTPase-Reaktion zu stabilisieren. Katalytisch wirksamere G-Proteine enthalten ebenfalls einen Arg-Rest, der an einer nahezu identischen Position sitzt.

SH3-C Abb. 13.9 Röntgenstruktur von Grb2. Seine SH2-Domäne (grün) ist mit seinen

flankierenden SH3-Domänen (türkis und über offenbar unstrukturierte und somit Verbindungsstücke aus vier Aminosäuren knüpft. [Nach einer Röntgenstruktur von

orange) flexible verArnaud

Ducruix, Universite de Paris-Sud, Gif sur Yvette.

PDBid IGRI.]

Eine Kinasekaskade beschließt den Signalweg

Der Signalweg nach der Ras-Aktivierung besteht aus einer linearen Kaskade von Proteinkinasen (Abb. 13.7, rechts). Die Ser/Thr-Kinase Raf, die durch direkte Interaktion mit Ras:GTP aktiviert wird, phosphoryliert eine weitere Kinase, die auch als MEK oder MAP-Kinase-Kinase bezeichnet wird. Dabei wird diese aktiviert. Die nun aktivierte MEK phosphoryliert eine Familie von Proteinen, die man mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPKs) oder auch extrazellulär signalregulierte Kinasen (ERKs) nennt. Für die volle Aktivität muss die MAPK sowohl an ihrem Thr- als auch Tyr-Rest in der Sequenz Thr-Glu-Tyr phosphoryliert werden. MEK (was für MAP-Kinase/ERK-Kinase aktivierende Kinase steht) katalysiert beide Phosphorylierungen. Sie ist somit sowohl eine Ser/Thr-Kinase als auch eine Tyr-Kinase. Die aktivierten MAP-Kinasen wandern vom Cytosol in den Zellkern, wo sie eine Vielzahl von Proteinen phosphorylieren, einschließlich Fos, Jun und Myc.

Ras-GDP: AlFz

Abb. 13.10 Röntgenstruktur des GAP334:Ras:GDP:AlF,;-Komplexes. Ras und GAP334 sind türkis bzw. magentarot, die Fingerschleife von GAP334 ist rot. GDP und AIF, sind als Kalottenmodell gezeigt; C ist grün, N blau, © rot, F hellgrün und Al hellblau. Die in der

Stabform gezeigte Seitenkette von Arg 789 streckt sich aus der Fingerschleife. Man beachte, wie sie sowohl mit AlF, als auch mit der ß-Phosphatgruppe von GDP in Wechselwirkung tritt. [Nach einer Röntgenstruktur von Alfred Wittinghofer, Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie,

Dortmund. PDBid 1 WQ1.]

GAP334

Rezeptor-Tyrosinkinasen

455

Diese Proteine sind Transkriptionsfaktoren (Proteine, die die Transkription ihrer Zielgene induzieren; Abschnitt 28.3B). In ihrer aktivierten Form stimulieren sie verschiedene Gene, um die Effekte auszulösen, die durch die extrazelluläre Bindung des Wachstumsfaktors „in Auftrag“ gegeben wurden, der die Signalkaskade initiiert hatte. Wenn Insulin den Ras-Signalweg aktiviert, nimmt die Proteinbiosynthese zu, was das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung unterstützt. Diese Reaktion ist konsistent mit der Funktion des Insulins als Signal für verfügbare Glucose. Verschiedene Proteine, die von Onkogenen codiert werden, greifen in solche Signalwege ein und können zu einem unkontrollierten Zellwachstum führen (siehe Exkurs 13.3). Der Nutzen einer Kinasekaskade ist, dass ein schwaches Signal innerhalb der Zelle mehrfach verstärkt werden kann. Außerdem kann die Phosphorylierung von mehr als einem Zielprotein gleichzeitig mehrere intrazelluläre Prozesse aktivieren. Im Fall des Insulins konnte gezeigt werden, dass das Signal die Änderungen des Vesikeltransports, eine veränderte Enzymaktivität und Genexpression vermittelt (Abschnitt 22.2). Gerüstproteine gruppieren und positionieren Proteinkinasen

Eukaryotische Zellen enthalten zahlreiche verschiedene MAPK-Signalkaskaden. Jede setzt sich aus einer typischen Reihe von Kinasen zusammen. Bei Säugetieren gibt es mindestens 12 MAP-Kinasen, 7 MAP-Kinase-Kinasen (MKKs) und 14 MAP-Kinase-Kinase-Kinasen (MKKKs; Abb. 13.11). Obwohl jede MAPK durch eine spezifische MKK aktiviert wird, kann eine bestimmte MKK durch mehr als eine MKKK aktiviert werden. Zudem werden unter Umständen mehrere Signalwege durch einen einzigen Rezeptortyp aktiviert. Wie verhindert dann eine Zelle einen nicht gewünschten „Cross-Talk“ (wörtlich: Überkreuzsprechen; gemeint ist hier das Überspringen der Aktivierung auf einen anderen Signalweg) zwischen eng verwandten Signalwegen? Eine Möglichkeit ist die Verwendung von Gerüstproteinen, die manche oder alle Proteinkinasen einer bestimmten Signalkaskade binden. Damit ist gewährleistet, dass die Proteinkinasen eines bestimmten Signalwegs bevorzugt miteinander interagieren, da sie bereits in extrazellulärer Reiz:

MKKK

Stress, Wachstumsfaktor, Differenzierungsfaktor

Wachstumsfaktor

sr

ae

Stress

Abb. 13.11 MAP-Kinase-Kaskaden in Säugerzellen. Jede MAP-Kinase-Kaskade besteht aus

Si

einer MKKK, einer MKK und einer

|

J MKK

ME, MERK?

MKK5

"4 MKKA, MKK7

N

MAPK. Zahlreiche äußere Reize können jeweils eine oder mehrere MKKKs

\

MKK3, MKK

e

aktivieren, die wiederum eine oder

mehrere MKKs aktivieren. Die MKKs sind im Allgemeinen spezifisch für ihre Ziel-MAPKs. Die aktivierten MAPKs phosphorylieren spezifische Transkriptionsfaktoren (z.B. ElIk-1, Ets-1, p53,

MAPK

NFAT4 und Max), die dann in den Zellkern wandern. Dort phosphorylieren sie zudem spezifische Kinasen

(z.B. p90'**, S6-Kinase und MAPKAPTranskriptionsfaktoren und

p90'°*, S6-Kinase, Sos, Phospholipase A,,

weitere Kinasen; EGF Rezeptor, Elk1, Ets1, " Sapla, c-Myc, Tal, STATS

MEF2C

En"

zelluläre Antwort:

Wachstum, Differenzierung

\

c-Jun, ATF-2, Elk-1, p53,

DPCA, NFAT4A

Wachstum, Differenzierung, Fortbestand, Apoptose

MAPKAP-Kinase, ATF-2,

Elk-1, Chop, Max, MEF2C

| Cytokinproduktion, Apoptose

Kinase). Die resultierenden aktivierten Transkriptionsfaktoren und Kinasen leiten dann eine zelluläre Antwort ein wie z.B. Wachstum,

Differenzierung

und Apoptose (programmierter Zelltod; Abschnitt 28.4C). [Nach Garrington, T.P. und Johnson, G.L.,

Curr. Opin. Cell Biol. 11, 212 (1999).

456

Biochemische Signale

Exkurs 13.3

Biochemie im Organismus

Onkogene und Krebs Wachstum und Differenzierung von Körperzellen werden normalerweise streng kontrolliert. Mit wenigen Ausnahmen (z.B. blutbildende Zeilen und Haarfollikelzellen) befinden sich die Zellen im ausgewachsenen Körper somit größtenteils im Ruhezustand. Allerdings gibt es eine Vielzahl von Ursachen, weshalb eine Zelle unkontrolliert proliferieren kann und einen Tumor bildet. Maligne Tumore (Krebs) wachsen invasiv und sind nahezu ausnahmslos lebensbedrohlich. Sie sind für 25% der Todesfälle in Deutschland (Stat. Bundesamt, 2007) verantwortlich. Zu den vielen Krebsursachen zählen Viren, die Onkogene (griechisch onkos, Masse oder Tumor) tragen. Das RousSarkom-Virus (RSV) beispielsweise, das in Hühnern die Bildung von Sarkomen (Bindegewebskrebs) auslöst, enthält vier Gene. Drei dieser Gene sind für die Virusreplikation unverzichtbar; das vierte dagegen, v-src (v steht für viral und src für Sarkom), ist ein Onkogen und induziert die Tumorbildung. Woher stammt v-src und wie funktioniert es? Hybridisierungsuntersuchungen von Michael Bishop und Harold Varmus führten 1976 zu einer bemerkenswerten Entdeckung: Nicht infizierte Hühnerzellen enthalten ein Gen, c-src (c steht

Eine

Mutation

des

c-ras-Gens,

bei

der- Gly 12

von

Ras

gegen Val ausgetauscht wird, verringert die GTPase-Aktivität, ohne dass die Fähigkeit zur Proteinphosphorylierung beeinträchtigt wäre. Dadurch verlängert sich die Zeit, während der Ras „eingeschaltet“ ist, und es kommt zur unkontrollier-

ten Zellproliferation. Die onkogenen Varianten von c-ras gehören tatsächlich zu denjenigen Onkogenen, die am häufigsten bei menschlichen Krebserkrankungen gefunden wurden. Bis heute hat man 50 Onkogene identifiziert. Die schädlichen Auswirkungen der Onkogen-Produkte entstehen dadurch, dass sie sich von den entsprechenden normalen Zell-

proteinen unterscheiden: Sie haben unter Umständen unterschiedliche Synthese- und/oder Abbaugeschwindigkeiten, sie

ist

haben eventuell veränderte Zellfunktionen oder sie widerset-

bei einer Vielzahl von Eukaryoten hoch konserviert ist. lässt vermuten, dass es sich um ein lebensnotwendiges handelt. Offenbar stammt das v-src ursprünglich aus Zelle und wurde von einem RSV-Vorfahren aufgenom-

zen sich der Kontrolle durch Zellregulationsmechanismen. Damit jedoch normale Zellen eine maligne Transformation erfahren (also zu Krebszellen werden), müssen mehrere unabhängige onkogene Ereignisse (durchschnittlich fünf) stattfinden. Dies spiegelt die Komplexität der zellulären Signalnetzwerke wider (Zellen reagieren auf zahlreiche Hormone, Wachstumsfaktoren und Transkriptionsfaktoren in sich teilweise überlappenden Signalwegen) und erklärt, warum mit zunehmendem Alter Krebs häufiger wird.

für zellulär, auf Englisch cellular), das zu v-src homolog

und Dies Gen einer

lären Pendants der Onkogene. Die viralen Gene v-fos und v-jun codieren Proteine, die mit ihren zellulären Pendants nahezu identisch sind, und sie imitieren deren Wirkungen auf Wirtszellen — aber auf unkontrollierte Weise. Onkogene müssen nicht unbedingt von Viren stammen. Tatsächlich werden nur wenige menschliche Krebsarten durch Viren verursacht. Stattdessen werden mutierte ProtoOnkogene zu Onkogenen und verursachen dann Krebs.

men, der keine Tumoren

bildete. Sowohl v-srce als auch c-src

codieren eine 60 kD Tyrosinkinase. Während die Aktivität von c-sre jedoch streng geregelt ist, unterliegt die v-src-Aktivität keiner solchen

Kontrolle. Wenn

v-src vorhanden

ist, ver-

bleibt die Wirtszelle in einem proliferativen Zustand. Da die Zellen bei einer RSV-Infektion dann nicht abgetötet werden, erhöht sich wahrscheinlich die virale Replikationsrate. Auch andere Onkogene sind auf ähnliche Weise mit Prozessen gekoppelt, die das Zellwachstum regulieren. Beispielsweise codiert das Onkogen v-erbB eine verkleinerte Variante des Rezeptors für den epidermalen Wachstumsfaktors (EGF). Dieser Rezeptor besitzt keine EGF bindende Domäne,

hat aber weiterhin seinen Transmembranabschnitt

und seine Tyrosinkinase-Domäne. Diese Kinase phosphoryliert ihre Zielproteine auch dann, wenn es kein extrazelluläres Signal gibt, was zur unkontrollierten Zellproliferation führt,

da der EGF-Rezeptor Wachstumssignale vermittelt. Das Onkogen

v-ras codiert ein 21-kD Protein, v-Ras, das

dem zellulären Ras ähnelt, aber GTP viel langsamer hydrolysiert und damit das Signal viel langsamer abschaltet. Dies hat Auswirkungen auf die Geschwindigkeit der Proteinphosphorylierung: Die Kinasen, die im Signalweg dem Protein Ras nachgelagert sind (downstream), werden länger und somit stärker aktiviert (Abb. 13.7). Die Transkriptionsfaktoren, die auf Ras-vermittelte Signale reagieren (z.B. Fos und Jun), werden ebenfalls von ProtoOnkogenen codiert; Proto-Onkogene sind die normalen zellu-

Die auf einer Röntgenaufnahme basierende Falschfarbendarstellung zeigt einen Axialschnitt durch den Bauchraum einer Person mit Leberkrebs. Die Leber ist die große rote Masse links im Bauch. Die hellen Flecken auf der Leber sind krebsartige Tumoren. In der unteren Bildmitte sieht man einen Wirbel (dunkelgrün). [Salisbury/Photo Researchers.]

Rezeptor-Tyrosinkinsen

457

räumlicher Nähe angeordnet sind. Zusätzlich kann ein Gerüstprotein die subzelluläre Lokalisierung der verknüpften Kinasen steuern. Das erste solche Gerüstprotein, Ste5p, hat man bei genetischen Untersuchungen einer MAP-Kinase-Kaskade in der Hefe entdeckt. Dieses Protein bindet die MKKK, MKK und MAPK, die Bestandteile dieses Signalwegs sind. Außerdem zeigte sich, dass in vivo der Signalweg inaktiviert wird, wenn das Gerüst fehlt. Offensichtlich reichen die Wechselwirkungen zwischen aufeinander folgenden Kinasen in dieser MAP-Kinase-Kaskade allein für die Signalweiterleitung nicht aus.

C. _ Manche Rezeptoren sind mit Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen verknüpft Es gibt weitere Zelloberflächenrezeptoren, die nicht im engeren Sinn zu den Rezeptor-Tyrosinkinasen gehören, die wir bis jetzt besprochen haben. Solche Rezeptoren phosphorylieren sich nicht selbst nach der Ligandenbindung. Dazu gehören die Rezeptoren für das Wachstumshormon (Abb. 13.3), für die Cytokine (Wachstumsfaktor-Proteine, die die Differenzierung, Proliferation und Aktivitäten zahlreicher Zelltypen regulieren, insbesondere von Blutzellen), für die Interferone (Wachstumsfaktor-Proteine, die die antivirale Abwehr anregen) und T-Zell-Rezeptoren (diese steuern die Proliferation von Immunzellen, der sogenannten T-Lymphocyten (T-Zellen); Abschnitt 7.3). Dennoch haben diese Rezeptoren in ihren Signalwegen viel gemeinsam mit den RTK. Die Bindung des Liganden führt auch bei diesen, sogenannten Tyrosinkinase-assoziierten Rezeptoren dazu, dass sie dimerisieren (und in manchen Fällen, trimerisieren), manchmal mit verschiedenen Untereinheiten. Dadurch werden Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen (NRTKs) assoziiert und aktiviert.

PTK (N-terminale

Die Struktur von Src verrät dessen autoinhibierenden Mechanismus Viele durch tyrosinkinase-assoziierte Rezeptoren aktivierte NRTKs gehören zu der Src-Familie. Sie enthält mindestens neun Mitglieder, einschließlich Src, Fyn und Lck. Die meisten dieser aus etwa 530 Aminosäuren bestehenden, durch Myristoylierung membranverankerten Proteine haben sowohl eine SH2als auch SH3-Domäne, und alle besitzen sie eine PTK-Domäne. Daher kann eine Src-verwandte Kinase unter Umständen auch durch Verknüpfung mit einer autophosphorylierten RTK aktiviert werden. Obwohl Src-verwandte Kinasen jeweils mit einem anderen Rezeptor verknüpft sind, phosphorylieren sie überlappende Gruppen von Zielproteinen. Dieses komplexe Netz aus Wechselwirkungen erklärt, warum verschiedene Liganden oft die gleichen Signalwege aktivieren. Vom N- zum C-Terminus betrachtet, besteht Src aus einer myristoylierten N-terminalen „einzigartigen“ Domäne, die bei den Vertretern der Src-Familie unterschiedlich ist, einer SH3-Domäne, einer SH2-Domäne, einer PTK-Domäne und einem kurzen C-terminalen Segment. Wird Tyr 416 in der Aktivierungsschleife der PTK phosphoryliert, so aktiviert dies Src. Findet die Phosphorylierung dagegen an Tyr 527 am C-terminalen Segment des Enzyms statt, so wird es inaktiviert. In vivo findet eine Phosphorylierung entweder an Tyr 416 oder an Tyr 527 statt, aber nicht an beiden. Die Dephosphorylierung von Tyr 527 oder die Bindung externer Liganden an die SH2- oder die SH3-Domäne aktiviert Src. Dieser Zustand wird dann durch die Autophosphorylierung von Tyr 416 aufrechterhalten. Wenn Tyr 527 phosphoryliert wird und keine Phosphopeptide zur Verfügung stehen, inaktivieren die SH2- und die SH3-Domäne von Src dessen

wobei die Aktivierungsschleife hellblau und das C-terminale Segment rot ist. AMPPNP ist als Kalottenmodell dargestellt und Y416 und pY527

PTK-Domäne,

als Kugel-Stab-Modell; bei beiden ist C grün,

d.h. Src hemmt sich selbst.

Die Röntgenstruktur von Src: AMPPNP, dem seine N-terminale Domäne fehlt und das an Tyr 527 phosphoryliert ist (pY), zeigt die molekulare Basis der SrcAutoinhibition (Abb. 13.12). Biochemische Untersuchungen haben gezeigt,

C

PTK (C-terminale Domäne

Abb. 13.12

Röntgenstruktur von Src:‘AMPPNP, dem seine N-terminale Domäne fehlt und das am Tyr 527 phosphoryliert ist. Das Protein ist so ausgerichtet, dass man seine PTK-Domäne in der für Kinasen üblichen Orientierung sieht (vergleichen Sie es mit Abb. 13.5a). Die SH3-Domäne

ist orange, die SH2-Domäne

magentarot; das Verbindungsstück, das die SH2Domäne mit der PTK-Domäne verknüpft, ist grün und hat die Aminosäurenummern

249 bis 253;

diese interagieren mit der SH3-Domäne (gelb). Die N-terminale Domäne des PTK-Moduls ist lavendelfarben, ihre C-terminale Domäne ist türkis,

N blau, © rot und P gelb. [Nach einer Röntgenstruktur von Michael Eck, Harvard Medical School,

PDBid 2SRC.]

458

_Biochemische Signale aktive Form

autoinhibierte Form

SrcAktivator

N-terminale PTK-Dömäne

Lys25 Glu 310

SH3-SH2Verbindungsstück

Substrat

Tyr 527 C-terminale

PTK-Dömäne

Abb. 13.13 Schematisches Modell der Src-Aktivierung. In ihrer autoinhibierten Form (links) bindet die SH2-Domäne (magentarot) an Phospho-Tyr 527, und die SH3-Domäne (orange) an ein innen liegendes prolinhaltiges Segment (gelb). Glu 310 bildet eine Salzbrücke zu Arg 385, die teilweise

helicale Aktivierungsschleife (blau) blockiert das aktive Zentrum, und Tyr 416 ist verborgen. In der aktiven Form (rechts) binden die SH2- und die SH3-Domäne an einen Src-Aktivator, Tyr 527 ist

dephosphonyliert, die Aktivierungsschleife hat ihre Konformation geändert, um Tyr 416 für die Phosphorylierung freizulegen; Glu 310 bildet eine Salzbrücke mit Lys 295, und Phospho-Tyr 416 bildet eine Salzbrücke mit Arg 385. Das Farbschema und der Blickwinkel entsprechen zum großen Teil denjenigen in Abbildung 13.12. [Nach Young, M.A., Gonfloni, F., Superti-Furga, G., Roux, B. und

Kuriyan, J., Cell 105, 116 (2001).)

dass die SH2-Domäne an Phospho-Tyr 527 in der Sequenz pYNP(G) bindet, aber nicht in der Sequenz pYEE(I), die typisch für hochaffine Scr-SH2-Zielpeptide ist. Obwohl die pYNP(G)-Sequenz ganz entsprechend der pYEE(I)-Sequenz in Abb. 13.6 an SH2 bindet, sind die nachfolgenden Aminosäurereste in der Röntgenstruktur kaum geordnet, und die SH2-Tasche, in die die Ile-Seitenkette von pYEE(I) bindet, ist zudem nicht besetzt. Offenbar bindet die Phospho-Tyr527-haltige Peptidsequenz an die SH2-Domäne von Src mit geringerer Affinität als dessen Zielpeptide. Die SH3-Domäne erkennt das Segment, das sie mit der N-terminalen Domäne des PTK-Moduls verbindet. Die Aminosäuren 249 bis 253 des Verbindungssegmentes binden auf ganz ähnliche Weise an die SH3-Domäne wie die prolinreichen Zielpeptide von SH3 (Abb. 13.8). Das einzige Prolin in diesem Abschnitt ist jedoch die Aminosäure 250. Die polare Seitenkette von GIn 253, die die Position des zweiten Prolins in der normalen Pro-X-X-Pro-Zielsequenz von SH3 besetzt, gelangt nicht in die hydrophobe Bindungstasche, die dieses zweite Prolin besetzen würde (Abb. 13.8) und somit weicht an diesem Punkt die Bindung des Peptids von demjenigen der prolinreichen Zielpeptide ab. Vermutlich ist diese Wechselwirkung auch schwächer als diejenige der SH3-Zielpeptide mit Src. Die SH2- und die SH3-Domäne von Src binden die PTK-Domäne auf der Seite, die ihrem aktiven Zentrum gegenüberliegt. Wie hemmt aber dann das in der in Abbildung 13.12 gezeigten Konformation vorliegende Protein die Aktivität der PTK? Die beiden Domänen des PTK-Moduls von Src sind größtenteils mit ihren Pendants in den PTK-Domänen phosphorylierter und daher aktivierter Proteinkinasen deckungsgleich (z.B. Abb. 13.5a). Die Src-Helix C (die einzige Helix in der N-terminalen Domäne der PTK) ist jedoch von der Grenzfläche zwischen der N-terminalen und C-terminalen Domäne im Verhältnis zu ihrer Position in anderen aktivierten Proteinkinasen verdrängt. Helix C enthält den konservierten Aminosäurerest Glu 310 (bei Verwendung der Src-Nummerierung), dieser ragt bei anderen aktivierten Proteinkinasen in den katalytischen

Spalt, wo er mit Lys 295 eine Salzbrücke bildet, einem wichtigen Liganden der a- und ß-Phosphatgruppe des Substrat-ATP. In der inaktiven Src-Kinase bildet Glu 310 eine alternative Salzbrücke mit Arg 385, und Lys 295 interagiert

Rezeptor-Tyrosinkinasen

stattdessen mit Asp 404. In der aktivierten Lck-Kinase bildet Arg 385 eine Salzbrücke mit Phospho-Tyr 416. Die vorangegangenen Strukturbeobachtungen deuten auf das folgende Szenarium für die Src-Aktivierung hin (Abb. 13.13): 1. Die Dephosphorylierung von Tyr 527 und/oder die Bindung der SH2- und/ oder SH3-Domäne an ihre Zielpeptide (zu denen SH2 und SH3 eine höhere Affinität haben als ihre inneren Src-Bindungsstellen) setzt diese Domänen von ihren PTK-gebundenen Positionen frei, die in Abbildung 13.12 gezeigt sind. Dadurch wird die konformative Spannung der PTK-Domäne abgebaut. Dies öffnet die Tasche im aktiven Zentrum der PTK, wobei die Struktur ihrer teilweise helicalen Aktivierungsschleife (die eine Blockierungsstelle in der Tasche des aktiven Zentrums besetzt; Abb. 13.12) gestört wird, sodass Tyr 416 für die Autophosphorylierung zugänglich wird. 2. Das resultierende Phospho-Tyr 416 bildet mit Arg 385 eine Salzbrücke, was sterisch eine Umstrukturierung der Aktivierungsschleife in ihre aktive, nicht blockierende Konformation erfordert. Dadurch zerreißt die Salzbrücke zwischen Glu 310 und Arg 385 und erlaubt der Helix C, ihre aktive Ausrichtung anzunehmen. Dies gestattet wiederum Glu 310, die katalytisch wichtige Salzbrücke mit Lys 295 auszubilden und dabei die PTK-Aktivität von Src zu aktivieren. PTKs sind Zielstrukturen vieler Antikrebsmedikamente Das Merkmal der chronischen myeloischen Leukämie (CML) ist eine bestimmte Chromosomentranslokation, bei der das sogenannte Philadelphia-Chromosom entsteht. In diesem ist das Abl-Gen (das die NRIK Abl codiert) mit dem BerGen fusioniert (das die Protein-Ser/Thr-Kinase BCR codiert). Der Abl-Anteil des sich ergebenden Bcr-Abl-Fusionsproteins ist konstitutiv aktiviert (d.h. permanent, ohne eine Regulierung) - wahrscheinlich, weil sein Bcr-Anteil oligomerisiert. Hämatopoetische Stammzellen (von denen alle Blutzellen abstammen), die das Philadelphia-Chromosom tragen, sind somit für die CML anfällig. Die Malignität erfordert allerdings mehrere unabhängige genetische Veränderungen (siehe Exkurs 13.3). Ohne Knochenmarkstransplantation (ein riskanter Eingriff, der für die meisten Personen nicht zur Verfügung steht, weil es keinen geeigneten Spender gibt), ist CML immer tödlich. Die durchschnittliche Überlebenszeit

beträgt rund sechs Jahre. Ein Hemmstoff für Abl könnte die Proliferation der CML-Zellen verhindern oder sie sogar abtöten. Ein wirksames Anti-CML-Mittel darf jedoch keine anderen Proteinkinasen hemmen, denn dies hätte sicher schwere Nebenwirkungen. Derivate von 2-Phenyl-aminopyrimidin binden mit außergewöhnlich hoher Affınität und Selektivität an Abl. Ein derartiges Derivat, Imatinib (Handelsname Gleevec in den USA, Glivec in Europa/Australien), wurde von Brian Druker und Nicholas Lydon entwickelt.

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Es hat zu einem Rückgang der Symptome bei über 90% der CML-Patienten geführt und geringe Nebenwirkungen. Dies wird dadurch erreicht, dass Glivec nicht mit anderen Proteinkinasen interagiert.

459

460

Biochemische Signale

Abl hat Ähnlichkeit mit Scr, allerdings fehlt dieser Kinase die C-terminale regulatorische Phosphorylierungsstelle (Abb. 13.12 und 13.13). John Kuriyan hat die Röntgenstruktur der PTK-Domäne von Abl im Komplex mit einer verkürzten Form von Glivec bestimmt (Abb. 13.14). Wie erwartet zeigt sie, dass der Arzneistoff an die ATP-Bindungsstelle von Abl bindet. Dabei nimmt Abl eine inaktive Konformation an, bei der seine nicht phosphorylierte Aktivierungsschleife eine autoinhibierende Konformation annimmt. Glivec war das erste von mehreren spezifischen Proteinkinasen hemmenden 2-Phenylaminopyrimidinderivaten, das von der US-amerikanischen Kontrollbehörde FDA zur klinischen Verwendung gegen bestimmte Krebsarten zugelassen wurde. Außerdem werden mehrere monoklonale Antikörper klinisch als Antikrebsmittel eingesetzt, die an bestimmte PTKs oder deren Liganden binden (z.B. Trastuzumab (Handelsname Herceptin), das gegen Brustkrebs wirksam ist, wenn eine Überproduktion der RTK namens HER2 vorliegt; Exkurs 7.5). Solche auf Rezeptoren gerichtete Therapien sind sehr vielversprechend für die Beherrschung, wenn nicht gar Heilung von Krebs, denn sie zielen speziell auf die anomalen Proteine ab, die die Krebserkrankungen verursachen. Im Gegensatz dazu töten die meisten derzeit verwendeten Chemotherapeutika wahllos alle sich schnell teilenden Zellen, so dass ihre Nebenwirkungen für den Organismus allgemein sehr belastend sind.

D. Abb. 13.14

Röntgenstruktur der PTK-Domäne von Abl im Komplex mit einem verkürzten Derivat von Glivec. Vom Protein ist die rechte Seite in der für Kinasen üblichen Orientierung gezeigt (z.B. Abb. 13.5a

Proteinphosphatasen sind selber Signalproteine

delfarben, seine C-terminale Domäne türkis und

Intrazelluläre Signale müssen wieder „abgeschaltet“ werden, wenn der Signalstoff seine Nachricht übermittelt hat. Nur so kann das System auch zukünftig Botschaften weiterleiten. Im Fall von Proteinkinasen werden deren Aktivitäten durch die Wirkung von Proteinphosphatasen aufgehoben. Die Proteinphosphatasen hydrolysieren die Phosphorylgruppen an Ser-, Thr- und Tyr-Seitenketten und beenden dadurch das Signal, das von der Kinase ausgelöst wurde. Obwohl

die Aktivierungsschleife hellblau. Das verkürzte,

den Proteinkinasen traditionsgemäß

und 13.12), seine N-terminale Domäne

ist laven-

als Kalottenmodell gezeigte Glivec besetzt die ATP-Bindungsstelle der PTK; C ist grün, N blau und

O rot. [Nach der Röntgenstruktur von John Kuriyan, The Rockefeller University. PDBid IFPU.]

mehr Aufmerksamkeit

geschenkt wurde,

produzieren Säugerzellen eine große Zahl an Proteinphosphatasen, deren Substratspezifitäten mit denjenigen der Kinasen vergleichbar sind. Protein-Tyrosin-Phosphatasen sind Proteine mit vielen Domänen

Die Enzyme, die Tyr-Reste dephosphorylieren, die Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), sind nicht nur einfache “housekeeping“-Enzyme (Enzyme, die die Grundfunktionen einer Zelle gewährleisten), sondern wichtige Elemente der Signaltransduktion. Diese Enzyme, von denen im menschlichen Genom 107 codiert sind, gehören vier Familien an. Jede Tyrosin-Phosphatase enthält mindestens eine konservierte Phosphatasedomäne aus etwa 240 Aminosäuren,

charakteristische Sequenz [(I/V)HCXAGXGR(S/T)G]

die die

mit 11 Aminosäuren ent-

hält. Dies ist das sogenannte CX;R-Motiv, das die katalytisch unbedingt notwendigen Cys- und Arg-Reste des Enzyms enthält. Während der Hydrolysereaktion wird die Phosphorylgruppe vom Tyrosylrest des Substratproteins auf das essenzielle Cys des Enzyms übertragen. Dabei bildet sich ein kovalentes Cys-Phosphat-Zwischenprodukt, das nachfolgend hydrolysiert wird. Manche Tyrosin-Phosphatasen sind ganz ähnlich wie die Rezeptor-Tyrosinkinasen aufgebaut, d.h. sie besitzen eine extrazelluläre

Domäne,

eine einzelne

Transmembranhelix und eine cytoplasmatische Domäne. Die cytoplasmatische Domäne besteht aus der katalytisch aktiven PTP-Domäne, auf die in den meisten Fällen eine zweite PTP-Domäne mit geringer oder keiner katalytischen Aktivität folgt. Diese inaktiven PTP-Domänen

sind trotzdem hoch konserviert, was

vermuten lässt, dass sie eine wichtige, wenn auch noch unbekannte Funktion haben. Biochemische und Strukturuntersuchungen zeigen, dass die ligandeninduzierte Dimerisierung einer rezeptorartigen PTP deren katalytische Aktivität verringert, wahrscheinlich indem ihre aktiven Zentren blockiert werden.

Rezeptor-Tyrosinkinasen

461

Eine zweite Gruppe von PTPs, intrazelluläre PTPs, enthalten nur eine TyrosinPhosphatase-Domäne. Diese Domäne ist von Proteininteraktionsdomänen wie den SH2-Domänen flankiert, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt

sind. Die als SHP-2 bekannte PTP (SH2-Domänen enthaltende Tyrosinphosphatase 2), die in allen Säugerzellen produziert wird, bindet an eine Vielzahl phosphorylierter (d.h. ligandenaktivierter) RTKs. Die Röntgenstruktur von SHP-2, der ihr C-terminales Segment fehlt, zeigt zwei SH2-Domänen, auf die eine Iyrosin-Phosphatase-Domäne folgt (Abb. 13.15). Die N-terminale SH2-Domäne (N-SH2) fungiert als Autoinhibitor, indem eine Proteinschleife (in Abb. 13.15 mit D’E markiert) in die 0,9 nm tiefe katalytische Tasche von PTP eingeschoben wird. Wenn die N-terminale SH2-Domäne eine Phospho-Tyr-Gruppe auf einem Substratprotein erkennt und bindet, ändert sich ihre Konformation. Dabei wird das katalytische Zentrum der PTP demaskiert, sodass die Phosphatase eine andere Phospho-Tyr-Gruppe auf dem Zielprotein hydrolysieren kann (aktivierte RTKs haben normalerweise mehrere phosphorylierte Tyr-Reste). Die Tasche im aktiven Zentrum der intrazellulären Tyrosin-Phosphatasen wie z.B. SHP-2 ist zu tief, um Phospho-Ser/Thr-Seitenketten zu spalten. Aber die Bindungstaschen im aktiven Zentrum einer dritten Gruppe von PTPs, den sogenannten Tyrosin-Phosphatasen mit zweifacher Spezifität, sind ausreichend flach, um sowohl Phospho-Tyr als auch Phospho-Ser/Thr-Reste zu binden und zu spalten.

Abb. 13.15 Röntgenstruktur der Protein-TyrosinPhosphatase SHP-2. Ihre N-SH2-Domäne ist goldfarben mit einer roten D’E-Schleife, ihre C-SH2-Domäne ist grün, und ihre PTP-Domäne ist türkis, mit einem blau dargestellten CX;R-Motiv aus 11 Aminosäuren.

Die Seiten-

kette des katalytisch unbedingt erforderlichen Cys-Rests ist in der Kugel-Stab-Form gezeigt, mit grünem C und gelbem S. [Nach einer Röntgenstruktur von Michael Eck und Steven Shoelson; Harvard Medical School. PDBid 2SHP.]

Die Virulenz der Beulenpest wird durch eine PTP verursacht

Bakterien haben üblicherweise keine PTKs und synthetisieren folglich auch keine Phospho-Tyr-Reste. Eine Ausnahme bilden Bakterien der Gattung Yersinia, insbesondere Yersinia pestis, die PIPs produzieren. Yersinia pestis ist der Erreger der Beulenpest (des von Flöhen übertragenen „Schwarzen Todes“. Die Pest war seit dem sechsten Jahrhundert für schätzungsweise 200 Millionen Tote verantwortlich, darunter etwa ein Drittel der Bevölkerung in Europa zwischen 1347 und 1350). Die PTP aus Y. pestis, YopH, ist u.a. für die Virulenz des Bakteriums verantwortlich. Sie ist katalytisch erheblich aktiver als die bekannten PTPs in Säugerzellen. Wenn nun Yersiria YopH in eine Zielzelle einbringt, werden die Phospho-Tyr-haltigen Proteine vollständig dephosphoryliert. Dies führt die Zelle in eine Katastrophe. Insbesondere das Immunystem wird dadurch lahmgelegt. Obwohl YopH und die PTPs von Säugern eine nur zu etwa 15% identische Sequenz besitzen, haben sie eine Reihe gleichbleibender Aminosäuren gemeinsam und weisen ähnliche Röntgenstrukturen auf. Dies lässt vermuten, dass ein Vorfahre von Yersinia ein PTP-Gen von einem Eukaryoten aufgenommen hat. Protein-Ser/Thr-Phosphatasen sind an zahlreichen Regulationsprozessen beteiligt Die Protein-Ser/Thr-Phosphatasen in Säugerzellen gehören zu zwei Proteinfamilien: Der PPP-Familie und der PPM-Familie. Diese beiden Familien sind weder miteinander noch mit den PTPs verwandt. Die Röntgenstrukturen haben ergeben, dass das katalytische Zentrum der Vertreter der PPP-Familie jeweils ein Fe’*- (oder möglicherweise ein Fe’*-) Ion und ein Zn°*- (oder eventuell ein Mn?*-) Ion besitzt. Dagegen enthält das katalytische Zentrum bei den Vertretern der PPM-Familie zwei Mn’*-Ionen. Diese zweikernigen (binuclearen) Metallionenzentren aktivieren nucleophil Wassermoleküle und dephosphorylieren die Substrate in einem einzigen Reaktionsschritt. Ein Mitglied der PPP-Familie, die Phosphoprotein-Phosphatase-1 (PP1), spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Glykogenstoffwechsels (Abschnitt 16.3B). Ein anderes Mitglied dieser Familie, PP2A, ist an vielfältigen Regulationsprozessen beteiligt. Dazu zählen solche, die den Stoffwechsel, die DNAReplikation, Transkription und Entwicklung steuern. PP2A ist ein Heterotrimer,

das aus einer zentralen (A-)Untereinheit besteht, die sowohl eine katalytische (C-) Untereinheit als auch eine regulatorische (B-) Untereinheit bindet. Die

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Wie erfolgt die Aktivierung einer RTK zur PTK? 2. Fassen Sie die Funktionen von SH2-Domänen, SH3-Domänen, Ras, GTP und Proteinkinasen

bei der Signalübertragung zwischen einer RTK und einem Transkriptionsfaktor zusammen. 3. Welchen Vorteil bietet die sequentielle Aktivierung mehrerer Kinasen in einem Signalweg? 4.

Wie beeinflussen SH2-Domänen,

SH3-Domänen und Tyr-Phosphorylierung die Aktivität einer PTK?

5. Erläutern Sie die Funktion von Phosphatasen. Warum bestehen diese Enzyme immer aus mehreren Domänen und/oder Untereinheiten?

462

Biochemische Signale

Abb. 13.16 Röntgenstruktur der Proteinphosphatase PP2A.

(a) Struktur einer isolierten zentralen (A-)Untereinheit. Die HEAT-Repeats sind hier in verschiedenen Farben dargestellt; sie bestehen jeweils aus zwei antiparallelen Helices, die über ein kurzes Verbindungsstück verknüpft sind. Sie sind übereinander gestapelt, wobei ihre sich einander ent-

sprechenden Helices nahezu parallel sind und eine etwa 10 nm lange rechtsgängige Superhelix (eine Helix aus Helices) in Hufeisenform bilden. [Mit freundlicher Genehmigung von Bostjan Kobe, St. Vincent’s Institute of Medical Research, Fitzroy.

Röntgenstruktur von David Barfold, University of Oxford. PDBid 1B3U.] (b) Struktur eines PP2AHeterotrimers. In dieser Ansicht ist die zentrale Untereinheit in etwa so ausgerichtet wie im Teil a. Hier sind die zentrale Untereinheit (A; 589 Aminosäuren) und die regulatorische (B; 449 Aminosäuren) Untereinheit in der Schlangenform gezeichnet; die Schlangen sind vom N-Terminus (blau) bis zum C-Terminus (rot) in der Reihenfolge der Spektralfarben dargestellt. Außerdem ist die A-Untereinheit in ihre transparente Moleküloberfläche eingebettet. Die katalytische (C; 309 Aminosäuren) Untereinheit (magentarot) ist in der Bänderform gezeigt. Man beachte die starke Strukturähnlichkeit zwischen der A- und B-Untereinheit. [Nach einer Röntgenstruktur von Yigong Shi, Princeton University. PDBid 2NPP.]

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Untereinheit (unterer Teil in Abb. 13.165) wird dabei nicht besetzt, was vermuten lässt, dass sie mit Substratproteinen wechselwirkt. Die katalytischen und die zentralen Untereinheiten der PP2A kommen beide in zwei Isoformen vor, von der regulatorischen Untereinheit gibt es sogar 16 Isoformen, die unterschiedlich kombiniert werden können. Daraus ergibt sich ein enormes Spektrum von Enzymen, die auf unterschiedliche Phosphoproteine an verschiedenen subzellulären Orten während unterschiedlicher Entwicklungsphasen zielen. Diese Komplexität ist eine Hauptursache dafür, warum wir nicht vollständig verstehen, wie PP2A seine verschiedenen Zellfunktionen ausführt, obwohl dieses Protein zwischen 0,3 und 1% der Zellproteine ausmacht. Zur PPP-Familie gehört auch Calcineurin (auch PP2B genannt), eine Ser/ThrPhosphatase, die durch Ca?* aktiviert wird. Calcineurin spielt eine wichtige Rolle bei der T-Zellproliferation. Arzneistoffe wie Cyclosporin A - ein Immunsuppressivum, das nach einer Organtransplantation verabreicht wird - hemmen Calcineurin.

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Die C-Untereinheit bindet an die konkave Oberfläche der A-Untereinheit entlang einer Kette aus konservierten, hydrophoben Seitenketten, die die HEAT-Repeats 11 bis 15 durchspannen. Die regulatorische Untereinheit interagiert auf ähnliche Weise mit den HEAT-Repeats 2 bis 8 der A-Untereinheit. Sie bindet außerdem über eine Kette, die ihre eigenen HEAT-artigen Repeats 6 bis 8 durch-

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A-Untereinheit angeordnet sind, obwohl sie keine Sequenzähnlichkeiten haben.

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A-Untereinheit besteht aus 15 unvollständigen Tandem-Repeats (gleichgerichteten Sequenzwiederholungen) einer Sequenz mit 39 Aminosäuren, die als HEATSequenz bezeichnet wird (der Name rührt daher, dass sie in dem Protein Huntingtin, in EF3, der A-Untereinheit von PP2A und in TOR1 vorkommt). Sie hat eine auffällige Struktur, bei der ihre HEAT-Repeats in einem hufeisenförmigen Solenoid angeordnet sind (Abb. 13.16a). Die Röntgenstruktur des PP2A-Holoenzyms (des vollständigen Enzyms; Abb. 13.165) lässt ganz unerwartet erkennen, dass auch seine regulatorische Untereinheit aus 8 HEAT-artigen Tandem-Repeats besteht, die wie diejenigen in der

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Heterotrimere G-Proteine

3

Heterotrimere G-Proteine

An der zweiten wichtigen Klasse von Signalübertragungswegen sind heterotrimere G-Proteine beteiligt. Diese Proteine gehören zur Superfamilie der regulatorischen GTPasen, die man kurz als G-Proteine bezeichnet. Wie bereits beschrieben, kommt ihr Name daher, dass diese Proteine, die die Guanin-Nucleotide GTP und GDP binden können, GTP zu GDP und P; hydrolysieren. Man unterschiedet monomere (oder kleine) G-Proteine und heterotrimere. Die monomeren G-Proteine sind für vielfältige Prozessen unbedingt notwendig. Dazu gehören die Signaltransduktion (z.B. Ras; Abschnitt 13.2B), der Vesikeltransport (Abschnitt 9.4E), das Wachstum der Actin-Mikrofilamente (Abschnitt 7.2C), die Translation (als ribosomale Hilfsfaktoren; Abschnitt 27.4) und das ProteinTargeting (als Bestandteile von Signalerkennungspartikeln (SRP) und des SRP-Rezeptors; Abschnitt 9.4D). Die vielen G-Proteine haben gemeinsame Strukturmotive, die für die Guanin-Nucleotid-Bindung und die GTP-Hydrolyse verantwortlich sind. Signaltransduktionswege, die heterotrimere G-Proteine beteiligen, benötigen zudem einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und ein Effektorenzym. Ein typisches Beispiel für den Aufbau solch einer Kaskade besteht aus folgenden Komponenten:

1. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Transmembranproteine, die ihren entsprechenden Liganden (z.B. ein Hormon) auf ihrer extrazellulären Seite binden, wodurch eine Konformationsänderung auf ihrer cytoplasmatischen Seite ausgelöst wird. 2. Heterotrimere G-Proteine, die in der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran verankert sind und aktiviert werden, wenn ein GPCR seine Konformation durch den gebundenen Liganden ändert. 3. Adenylat-Cyclase (AC), ein Transmembranenzym, das durch die G,-Untereinheit des aktivierten G-Proteins aktiviert (oder in manchen Fällen gehemmt) wird. Die aktivierte AC katalysiert die Synthese von cyclischem Adenosin-3‘-5‘°-Monophosphat (cyclisches 3‘,5°-AMP oder kurz cAMP) aus ATP.

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cAMP bindet wiederum an eine Vielzahl von Proteinen, sodass zahlreiche zelluläre Prozesse aktiviert werden. Wie Earl Sutherland als Erster gezeigt hat, ist cAMP ein sekundärer Botenstoff oder Second Messenger, d.h. es überträgt intrazellulär das Signal, das vom extrazellulären Liganden stammt. Welches sind die Mechanismen, durch die die Bindung des Liganden an einen extrazellulären Rezeptor die AC dazu veranlasst, im Cytosol CAMP zu synthetisieren? Bei der Klärung dieser Frage, werden wir sehen, dass das oben skizzierte Signalsystem stark vereinfacht dargestellt ist und das System durch seine große

463

464

_Biochemische Signale

Abb. 13.17 Allgemeine Struktur eines G-Proteingekoppelten Rezeptors (GPCR).

Komplexität sowohl in der Signalverstärkung als auch in der regulatorischen Flexibilität extrem leistungsfähig ist.

A. _ G-Protein-gekoppelte Rezeptoren enthalten sieben Transmembranhelices Zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören der Glucagonrezeptor, der ß-adrenerge Rezeptor (an den Adrenalin bindet; Abschnitt 13.1B) und viele andere Rezeptoren, die Peptid- und Proteinhormone, Aminosäurenderivate, Geruchsstoffe (Duftmoleküle) und Geschmacksstoffe, Eicosanoide (Abschnitt 9.1F) und weitere Moleküle binden. All diese Rezeptoren sind integrale Membranproteine mit sieben transmembranären a-Helices (Abb. 13.17), weshalb man diese Proteine auch Heptahelixrezeptoren oder 7TM-Rezeptoren nennt. Man schätzt, dass das Säugergenom über 1000 verschiedene GPCRs (> 4% seiner rund 23.000 Proteingene) enthält. Wie wichtig diese Rezeptoren sind, wird auch dadurch deutlich, dass etwa 60% der derzeit eingesetzten Arzneistoffe über GPCRs wirken. Der erste GPCR, dessen Struktur auf atomarer Ebene bestimmt wurde, ist Rhodopsin, das lichtempfindliche Protein in der Netzhaut, auch Sehpurpur genannt. Rhodopsin besteht aus dem 348 Aminosäuren großen Protein Opsin und dem kovalent daran geknüpften Chromophor Retinal (Abb. 13.18). Die Verknüpfung über eine Schiff’sche Base ist genau so wie in Bacteriorhodopsin (Abschnitt 9.3A), einem analog aufgebauten Protein, das jedoch eine Protonenpumpe und kein Rezeptor ist. Die Absorption eines Photons verursacht, dass das im Rhodopsin gebundene Retinal isomerisiert und von seinem Grundzustand, der 11-cis-Form, in die all-trans-Form übergeht. Diese Isomerisierung führt dazu, dass der Proteinteil, das Opsin, vorübergehend seine Konformation änAbb. 13.18 Röntgenstruktur von Rinderrhodopsin. Die Struktur ist parallel zur Membranebene betrachtet, wobei das Cytoplasma analog zu Abb. 13.17 unten ist. Das Protein ist mit seiner transparenten Moleküloberfläche wiedergegeben und die Polypeptidketten in Bänderform sind vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge der Spektralfarben gefärbt. Man beachte das Bündel aus sieben nahezu parallelen Transmembranhelices. Zwei der cytoplasmatischen Schleifen des Proteins sind teilweise ungeordnet und damit in der Röntgenstruktur nicht dargestellt, weshalb sie fragmentiert aussehen. Die prosthetische Gruppe des Proteins, Retinal (magentarot), ist als Kalottenmodell gezeigt, ebenso die beiden kovalent gebundenen Palmitoylgruppen (dunkelgrün) und die beiden N-glykosidischen Oligosaccharidgruppen (die Atome sind entsprechend gefärbt: C grün, N blau und O rot). [Nach einer Röntgenstruktur von Ronald Stenkamp, University of Washington. PDBid IHZX.]

dert, wodurch das assoziierte heterotrimere G-Protein, das im Fall des Sehvor-

gangs Transducin genannt wird, aktiviert wird. Die Transmembranhelices der GPCRs haben in etwa eine einheitliche Größe von 20 bis 27 Aminosäuren. Dies ist ausreichend um eine Lipiddoppelschicht zu durchspannen. Ihre N- und C-terminalen Segmente und die Schleifen zwischen ihren Transmembranhelices unterschieden sich jedoch deutlich in ihrer Länge. An diese Bereiche der Rezeptoren binden die Liganden (auf der extrazellulären Seite) und die heterotrimeren G-Proteine (auf der cytoplasmatischen Seite). Rhodopsin und viele andere Rezeptoren werden posttranslational noch modifiziert. In den extrazellulären Domänen findet man N-Glykosylierungen, die im Fall von Rhodopsin an zwei Positionen in den extrazellulären Schleifen platziert sind. Häufig ist zudem der C-Terminus durch eine Palmitoylierung an einem Cys in der Membran verankert. GPCRs funktionieren ganz ähnlich wie allosterische Proteine, z.B. wie Hämo-

globin (Abschnitt 7.1). Der Rezeptor kann ein extrazelluläres Signal ins Zellinnere weiterleiten, indem er zwischen zwei verschiedenen Konformationen wechselt: Eine aktive Rezeptorkonformation mit gebundenem Liganden und eine inaktive ohne Ligand. Dieses Modell der Rezeptorfunktion hat Ähnlichkeit mit der Arbeitsweise eines Membrantransportproteins (Abb. 10.13). Ligandengesteuerte Ionenkanäle, wie

Heterotrimere G-Proteine

465

der nikotinische Acetylcholinrezeptor sind membrangebundene Rezeptoren, die als Reaktion auf die Ligandenbindung analog den Transportproteinen von der offenen in die geschlossene Konformation wechseln und damit einen Ionenkanal öffnen. Dies führt zu einem Einstrom von z.B. Na*-Ionen in die Zelle. Rezeptoren können desensitiviert werden

Eine wichtige Fähigkeit biologischer Signalsysteme besteht darin, dass sie sich an lang anhaltende Stimuli anpassen können, indem sie ihre Reaktion abschwächen. Dieser Vorgang wird Desensitivierung genannt. Signalsysteme antworten dadurch vorrangig auf Veränderungen im Stimulierungsgrad statt auf die absolute Stärke des Reizes. Im Fall des ß-adrenergen Rezeptors führt eine lang andauernde Stimulierung mit Adrenalin zur Phosphorylierung eines oder mehrerer SerReste auf der cytoplasmatischen Seite des Rezeptors. Diese Phosphorylierung, die durch eine spezifische Kinase katalysiert wird und nur am Hormon-Rezeptor-Komplex und nicht am Rezeptor allein stattfindet, reduziert die Affinität des Rezeptors zu Adrenalin. Wenn der Adrenalinspiegel sinkt, wird der Rezeptor langsam dephosphoryliert und schließlich erreicht die Zelle wieder ihre ursprüngliche Empfindlichkeit für Adrenalin.

B.

Heterotrimere G-Proteine dissoziieren bei Aktivierung

Wie der Name vermuten lässt, bestehen heterotrimere G-Proteine aus drei Untereinheiten, einer a-, ßB- und y-Untereinheit (45, 37 bzw. 9 kD). Die Röntgenstrukturen der kompletten heterotrimeren G-Proteine wurden unabhängig voneinander von Alfred Gilman und Stephan Sprang (Abb. 13.19) sowie von Heidi Hamm und Paul Sigler untersucht. Die große als G. bezeichnete a-Untereinheit besteht aus zwei Domänen, die über zwei Polypeptidsegmente verbunden sind (Abb. 13.19a): (1) Eine stark konservierte GTPase-Domäne, die Ähnlichkeit mit derjenigen in monomeren G-Proteinen wie Ras hat und somit als Ras-ähnliche Domäne bezeichnet wird, und (2) eine helicale Domäne, die nur bei heterotrimeren G-Proteinen vorkommt. Die Ras-ähnliche Domäne enthält in einer tiefen Tasche die Guanin-Nucleotid-Bindungsstelle und ist mit der Membran über eine Myristoyl- oder Palmitoylgruppe oder über beide verankert. Dieser Lipidanker ist kovalent im N-terminalen Bereich der G,-Untereinheit gebunden. Die G;-Untereinheit besteht aus einer N-terminalen helicalen Domäne, auf die

Ras-ähnliche Domäne

Helicale Domäne

Abb. 13.19

Röntgenstruktur eines

heterotrimeren G-Proteins.

(a) Die G,-Untereinheit ist violett, die SwitchSegmente sind farbig hervorgehoben: Switch |, grün; Switch Il, blau; Switch III, rot. Ein gebun-

denes GDP ist als Kalottenmodell dargestellt, mit grünem C, blauem N, rotem O und gelbem P.

Das N-terminale Segment der G;-Untereinheit ist hellblau und jedes Blatt seines ß-Propellers hat eine andere Farbe. Die G,-Untereinheit ist goldfarben. Die Plasmamembran ist vermutlich in der Zeichnung oben, wie man aus den Positionen des

N-Terminus der G,„-Untereinheit und dem benach-

barten C-Terminus der G,-Untereinheit schließen kann. Beide Untereinheiten sind über einen Membrananker an der Plasmamembran orientiert und fixiert. Trotzdem ist die Ausrichtung des gesamten Proteins im Verhältnis zur Membran unbekannt. (b) Die Ansicht ist im Verhältnis zu der in Teil a um 90 ° um die horizontale Achse gedreht,

d.h. man schaut auf die Plasmamembran.

Das

Protein ist wie im Teil a gefärbt, mit der Ausnahme,

dass die G,-Untereinheit nun grau gefärbt ist. [Nach einer Röntgenstruktur von Alfred Gilman und Stephan Sprang, University of Texas Southwestern Medical Center. PDBid 1GP2.]

62% siehe Interactive Exercises.

466

Biochemische Signale

eine C-terminale Domäne folgt. Die C-terminale Domäne besteht aus sieben 4strängigen antiparallelen ß-Faltblättern, die wie die Flügel eines Propellers angeordnet sind - einem sogenannten ß-Propeller-Strukturmotiv (Abb. 13.195). Die G,-Untereinheit besteht hauptsächlich aus zwei helicalen Abschnitten, die über ein Polypeptid verbunden sind (Abb. 13.195). Sie ist in der Membran über eine Prenylierung ihres C-Terminus verankert und auf ihrer gesamten Länge hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen eng mit der G,-Untereinheit assoziiert. Die G,-Untereinheit bindet an die G,-Untereinheit mit solch hoher Affinität, dass die beiden nur unter Denaturierungsbedingungen dissoziieren. In der Folge werden wir diesen stabilen Komplex mit G,, bezeichnen. In seinem nicht aktivierten Zustand liegt ein heterotrimeres G-Protein in seinem heterotrimeren Zustand vor und seine G,-Untereinheit bindet GDP. Die Bindung dieses G,:GDP-G,,-Komplexes an seinen zugehörigen GPCR im Komplex mit dessen Liganden führt dazu, dass die G,-Untereinheit ihr gebundenes GDP gegen GTP austauscht. Somit fungiert der Ligand-GPCR-Komplex als der Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor (GEF) der G.-Untereinheit. Wenn GTP an die G,-Untereinheit gebunden ist, stabilisiert GTP über seine y-Phosphorylgruppe eine Konformationsänderung in drei sogenannten SwitchRegionen der G,-Untereinheit (Abb. 13.19a). Dies destabilisiert die Interaktion von G, mit G;,, weil die Bindung der y-Phosphatgruppe von GTP und die Bindung von G,, an G, sich gegenseitig ausschließen. Die y-Phosphorylgruppe bil-

det mit Seitenketten in den Switchregionen I und II Wasserstoffbrücken aus, sodass diese Bereiche nicht mehr mit den Schleifen und Kehren am Boden der ß-Propellerstruktur von G, wechselwirken können. Die Switchregionen I und II kommen in allen G-Proteinen mit bekannter Struktur in entsprechender Weise vor. Vergleicht man die Röntgenstrukturen des G.:GDP-G,,-Komplexes mit G,, allein, so zeigt sich, dass sich die Struktur von G,, durch die Bindung an G„:GDP nicht ändert. Dennoch ist sowohl G, als auch G,, in der Signaltransduktion aktiv. Beide durch die Aktivierung gebildeten Komponenten leiten das Signal, wenn auch auf unterschiedliche Art und Weise in der Zelle weiter, wie

im Folgenden ausgeführt wird. Die Wirkung der G-Proteinaktivierung ist nur von kurzer Dauer, weil G, als GTPase hydrolytisch das gebundene GTP zu GDP + P; spaltet - wenn auch mit einer relativ geringen Geschwindigkeit von 2 bis 3 min”. Die GTP-Hydrolyse führt dazu, dass die G,-Untereinheit, die nun wieder GDP gebunden hat,

sich mit G,, wieder zum inaktiven G.:GDP-G,,-Komplex zusammenlagert und das heterotrimere G-Protein bildet. Damit ist ein weiteres Mal gezeigt, wie wichtig es ist, dass ein Signal wieder abgeschaltet werden kann, damit das System zu einer erneuten Reaktion in der Lage ist. Heterotrimere G-Proteine aktivieren andere Proteine. Eine Säugerzelle enthält zahlreiche verschiedene heterotrimere G-Proteine, da es

20 verschiedene a-Untereinheiten, 6 verschiedene ß-Untereinheiten und 12 verschieden y-Untereinheiten gibt, die abhängig vom Zelltyp unterschiedlich kombiniert sein können. Diese Variabilität macht es möglich, dass verschiedene Zelltypen auf eine Vielzahl von Stimuli auf unterschiedliche Art und Weise reagieren. Eines der wichtigen Zielmoleküle des heterotrimeren G-Protein-Systems ist das Enzym Adenylat-Cyclase (AC; im nächsten Abschnitt ausführlicher beschrieben). Wenn sich zum Beispiel der G.:GTP-Komplex von G,, ablöst, kann er mit hoher Affinität an AC binden und dabei das Enzym aktivieren. Ein solches G,-Protein ist ein stimulierendes G-Protein, G,.. Andere G,-Proteine, die inhi-

bierenden G-Proteine, G;,, hemmen die AC-Aktivität. Die heterotrimeren Gund G;-Proteine unterscheiden sich in ihren a-Untereinheiten, können aber dennoch die gleiche ß- und y-Untereinheit enthalten. Wiederum andere hetero-

trimere G-Proteintypen leiten die Signale sowohl über ihre G,- wie über ihre G,-Untereinheit weiter. Diese stimulieren häufig die Öffnung von Ionenkanä-

Heterotrimere

G-Proteine

467

len, sind am Phosphatidylinositol-Signalsystem beteiligt (Abschnitt 13.14) und aktivieren Phosphodiesterasen und Proteinkinasen. Da eine einzige Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor nicht nur ein G-Protein aktivieren kann, dient dieser Schritt des Signaltransduktionswegs auch dazu, das ursprüngliche extrazelluläre Signal zu vervielfältigen. Da zudem verschiedene Ligand-Rezeptor-Komplexe das gleiche G-Protein aktivieren können, ist es möglich, dass verschiedene extrazelluläre Signale die gleiche Zellantwort hervorrufen.

€.

Die Adenylat-Cyclase synthetisiert CAMP, um die Proteinkinase A zu aktivieren

Säugetiere besitzen zehn verschiedene Isoformen der Adenylat-Cyclase. Diese werden gewebsspezifisch produziert und ihre Aktivität durch unterschiedliche Faktoren reguliert. Diese Transmembran-Glykoproteine von rund 120 kD sind modular aufgebaut. Sie bestehen jeweils aus einer kleinen N-terminalen Domäne (N). Auf diese folgen zwei sich wiederholende Einheiten, die aus einer Transmembrandomäne (M) und zwei sich anschließenden cytoplasmatischen Domänen (C) bestehen. Es entsteht somit die Abfolge NM,C,,C1»M;CaC» (Abb. 13.20). Die zu 40% identischen C,,- und C,,-Domänen lagern sich zusammen und bilden das katalytische Zentrum des Enzyms. C], und ebenso C,, und C,, binden hingegen Regulatormoleküle. G,. bindet zum Beispiel an C,,, um die AC zu aktivieren, und G;, interagiert mit C,,, um das Enzym zu hemmen. Ca”* und bestimmte Ser/Thr-Proteinkinasen sind andere Regulatoren der AC-Aktivität. Dadurch können Zellen ihren cCAMP-Spiegel an eine große Vielzahl von Reizen anpassen. Die Struktur der intakten, vollständigen Adenylat-Cylase ist nicht bekannt, aber Röntgenstrukturuntersuchungen der katalytischen Domänen zeigen, dass G,..GTP über die Switch-II-Region an den C,.:C,,-Komplex bindet. Diese Bindung verändert die Orientierung der C,,- und C,,-Domänen, damit ihre katalytischen Reste für die erfolgreiche Katalyse von ATP zu cAMP positioniert werden können. Wenn G,, sein gebundenes GTP hydrolysiert, wird die Switch-II-Region neu ausgerichtet, sodass sie nicht mehr an C,, binden kann, und die AdenylatCyclase kehrt zu ihrer inaktiven Konformation zurück.

6% siehe Guided Exploration 13:

Mechanisms of hormone signaling involving the adenylate cyclase system.

Abb. 13.20 Schemazeichnung einer typischen Säuger-Adenylat-Cyclase. Die M,- und M,-Domäne enthalten jeweils sechs Transmembranhelices. C,, und C,, bilden das

pseudosymmetrische katalytische Zentrum des Enzyms. Eingezeichnet sind diejenigen Domänen,

ATP

"CAMP + PP,

von denen bekannt ist, dass sie mit verschiedenen

Regulatorproteinen interagieren. [Nach Tesmer, J.). G. und Sprang, S.R., Curr. Opin. Struct. Biol. 8,

713 (1998).]

468

_Biochemische Signale Proteinkinase A wird durch Bindung von vier cAMP-Molekülen aktiviert

Bei cAMP handelt es sich um einen polaren, frei diffundierenden Second Messenger. In eukaryotischen Zellen ist sein Hauptzielenzym die Proteinkinase A (PKA; auch als CAMP-abhängige Proteinkinase oder cAPK bezeichnet). Dieses Enzym phosphoryliert spezifische Ser- und Thr-Reste zahlreicher Zellproteine, welche alle die spezifische Kinase-Erkennungs-Konsensussequenz Arg-Arg-XSer/Thr-Y enthalten. Dabei ist Ser/Thr die Phosphorylierungsstelle, X ein beliebiger kleiner Rest und Y ein großer hydrophober Rest. In Abwesenheit von cAMP ist PKA ein inaktives Heterotetramer aus zwei regulatorischen und zwei katalytischen Untereinheiten, R,C,. CAMP bindet an die regulatorischen Untereinheiten und führt somit zur Dissoziation in aktive katalytische Monomere:

R»C) + 4CAMP — 2C + Ry(cAMP), (inaktiv)

Abb. 13.21 Untereinheit Das Protein Orientierung

Röntgenstruktur der katalytischen (C-) der Maus-Proteinkinase A (PKA). ist in der für Kinasen üblichen und im Komplex mit ATP und einem

Peptidsegment von 20 Aminosäuren eines natür-

lich vorkommenden Proteinkinase-Inhibitors abgebildet. Die N-terminale Domäne ist rosa, die C-terminale Domäne türkis, und die Thr 197 ent-

haltende Aktivierungsschleife hellblau. Der Polypeptid-Inhibitor ist orange und seine PseudoZielsequenz Arg-Arg-Asn-Ala-lle ist magentarot (Ala, das die Aminosäure Ser oder Thr bei einem echten Substrat ersetzt, ist weiß). Das SubstratATP und die Phosphorylgruppe von Phospho-Thr197 sind als Kalottenmodell gezeigt; die Seitenketten des katalytisch essentiellen Arg 165, Asp 166 und Thr 197 sind in der Stabform dargestellt; die Farben sind entsprechend der Atomart gewählt (© grün, N blau, O rot und P gelb). Man beachte,

dass die Pseudo-Zielsequenz des Inhibitors dicht bei der y-Phosphatgruppe von ATP sitzt — derjenigen Gruppe, die das Enzym auf Ser oder Thr des Zielmoleküls überträgt. [Nach einer Röntgenstruktur von Susan Taylor und Janusz Sowadski, University of California at San Diego. PDBid 1ATP.] 6% siehe Interactive Exercises und Kinemage Exercise 15.

(aktiv)

Die intrazelluläre CAMP-Konzentration bestimmt somit den Anteil der PKA in der aktiven Form und damit die Geschwindigkeit, mit der diese ihr Substrat phosphoryliert. Die Röntgenstruktur der 350 Aminosäuren umfassenden katalytischen C-Untereinheit der Maus-PKA im Komplex mit ATP und einem aus 20 Aminosäuren bestehenden inhibitorischen Peptid wurde von Susan Taylor und Janusz Sowadski bestimmt und ist in Abbildung 13.21 gezeigt. Die C-Untereinheit ähnelt stark anderen Proteinkinasen mit bekannter Struktur (z.B. Abb. 13.5a und 13.12). In der PKA-Struktur ist die tiefe Tasche zwischen den Lappen durch ATP und durch ein Segment des inhibitorischen Peptids besetzt. Dieses Segment ähnelt der aus fünf Aminosäuren bestehenden Konsensussequenz für die Phosphorylierung - bis auf die Tatsache, dass Ser/Ihr durch Ala ersetzt ist. Thr 197 ist Teil der Aktivierungsschleife und muss für die maximale Aktivität phosphoryliert werden. Die Phosphorylgruppe am Thr 197 interagiert mit Arg 165, einem konservierten katalytischen Aminosäurerest, der an Asp 166 angrenzt — die katalytische Grundlage, die die Ziel-Hydroxylgruppen von Ser/Thr des Substratproteins zur Phosphorylierung aktiviert. Somit besteht die Aufgabe der Phosphorylgruppe am Thr 197 der PKA darin, die Aminosäuren des aktiven Zentrums korrekt auszurichten. Die regulatorische R-Untereinheit der Proteinkinase A hemmt kompetitiv deren C-Untereinheit. Die R-Untereinheit hat eine gut definierte Struktur mit zwei homologen cAMP-bindenden Domänen, A und B, sowie einem sogenannten autoinhibierenden Segment (Abb. 13.22). Das autoinhibierende Segment ähnelt dem Substrat der C-Untereinheit und bindet im inaktiven R,C,-Komplex an das

aktive Zentrum der C-Untereinheit (ebenso wie das inhibierende Peptid in Abb. 13.21), sodass die Substratbindung blockiert ist. Jede R-Untereinheit bindet kooperativ zwei CAMP-Moleküle. Fehlt der B-Domäne das gebundene cAMP, so maskiert sie die A-Domäne und verhindert dadurch, dass diese CAMP binden kann. Bindet jedoch cAMP an die B-Domäne, so kommt es zur Konformationsänderung, wodurch es der A-Domäne möglich wird, CAMP zu binden. Dies wiederum setzt die jetzt aktive C-Untereinheit vom Komplex frei. Ziel der PKA sind unter anderem Enzyme, die am Glykogenstoffwechsel beteiligt sind. Wenn beispielsweise Adrenalin an den ß-adrenergen Rezeptor einer Muskelzelle bindet, führt die aufeinander folgende Aktivierung eines heterotrimeren G-Proteins, der Adenylat-Cyclase und der PKA zur Aktivierung der Glykogen-Phosphorylase. Durch deren Aktivität entsteht Glucose-6-phosphat aus Glykogen, das nun für die Glykolyse bei einer „Flucht-oder-Kampf-Reaktion“ zur Verfügung steht (Abschnitt 16.3). Jeder Schritt eines Signaltransduktionswegs kann theoretisch reguliert werden. Damit spiegelt die Art und Stärke einer Zellantwort letztendlich die Anwesenheit und das Ausmaß der Aktivierung oder Hemmung aller vorausgegangenen Kompo-

Heterotrimere

G-Proteine

469

Abb. 13.22 Röntgenstruktur der regulatorischen (R-)Untereinheit der Rinderproteinkinase A (PKA) im Komplex mit cAMP. Die A-Domäne ist türkis, die B-Domäne orange. Die cAMP-Moleküle sind als Kalottenmodell

gezeigt und je nach Atomtyp gefärbt (C grün, N blau, O rot und P gelb). Der Bereich mit dem autoinhibitorischen Segment ist magentarot gefärbt. Die 91 N-terminalen Aminosäurereste der R-Untereinheit, die die Dimerisierung induzieren, fehlen in diesem Polypeptid. [Nach einer Röntgenstruktur von Susan Taylor, University of California at San Diego. PDBid 1RGS.]

nenten des Signalwegs wider. Der Adenylat-Cyclase-Signalweg kann z.B. durch die Ligandenaktivierung eines Rezeptors, der an ein inhibierendes G-Protein gekoppelt ist, blockiert oder eingeschränkt werden. Die Aktivität des Second Messengers cAMP kann durch die Wirkung von Phosphodiesterasen abgeschwächt werden, die CAMP zu AMP hydrolysieren (siehe unten). Außerdem werden von der PKA katalysierte Reaktionen von Ser/Thr-Phosphatasen umgekehrt (Abschnitt 13.2D). Einige dieser Eigenschaften des Adenylat-Cyclase-Signalwegs sind in Abbildung 13.23 dargestellt. Viele Arzneistoffe und Gifte wirken dadurch, dass sie Komponenten des Adenylat-Cyclase-Systems beeinflussen (Exkurs 13.4).

| Stimulations-

Inhibierendes

signal von außen

Signal von außen

DIN)

j

ET TIDAERNSDETERDIT

)

: BOSSE

/

Plasmamembran

Cytosol

H,0

I i

. Zu

Theophyllin, Theobromin

H,O

@ Ga: GDP

—#;

I

ei

APP,

Ce nn

Pertussisan

N

Protein

ZN

| ! Phosphodiesterase

\

4cAMP + RoC5 ——

PhosphoproteinShosphatase

R, : cAMP, + 2C

=.

ADP

F

a

Protein-®) (aktiv)

Abb. 13.23

Pi

(inaktiv)

®

4AMP +

& GTP

GDP

G,.: Eu

Adenylat-Cyclase-Signalsystem.

Die Bindung eines Hormons an einen stimulierenden Rezeptor R, (links) veranlasst diesen, ein heterotrimeres G-Protein G, zu binden. Diese Wechselwirkung führt dazu, dass die G,.-Untereinheit gebundenes GDP gegen GTP austauscht. Der G,.:GTP-Komplex dissoziiert von Gp, und stimuliert so lange die Adenylat-Cyclase (AC) welche die Umwandlung von ATP in cAMP katalysiert, bis das gebundene GTP zu GDP hydrolysiert wurde. Die Bindung eines Hormons an einen inhibierenden Rezeptor R; (rechts) löst eine nahezu identische Folge von Ereignissen aus,

bis auf die Tatsache, dass die Gegenwart des G,.:GTP-Komplexes die Adenylat-Cyclase inhibiert.

R,C, repräsentiert die Proteinkinase A (PKA), deren katalytische Untereinheit rauen ser ziation des regulatorischen Dimers R,:cAMP aktiviert wurde. Nun werden verschiedene zeluläre Proteine durch Phosphorylierung aktiviert. Die Stellen, an denen bestimmte Toxine angreifen, sind gekennzeichnet.

® Y Zellantwort

1n0

470

_ Biochemische Signale

Exkurs 13.4 Biochemie im Organismus Arzneistoffe und Toxine, die die Signaltransduktion in der Zelle beeinflussen Komplexe Prozesse wie das Adenylat-Cyclase-Signalsystem können durch eine Vielzahl von Wirkstoffen beeinflusst werden. Zum Beispiel sind die methylierten Purinderivate Coffein (Inhaltsstoff von Kaffee und Tee), Theophyllin (ein Asthmamittel) und Theobromin (in Kakao und Schokolade) Stimulanzien, weil sie die Adenosinrezeptoren (in Konkurrenz zum Adenosin) blockieren, die über inhibierende G-Proteine wirken. oO

R

/

x> N

N

oO

N

thels. Das gebundene Toxin gelangt möglicherweise über eine rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle, wo ein ca. 195 Reste großes Fragment seiner A-Untereinheit proteolytisch freigesetzt wird. Dieses Fragment katalysiert die Übertragung einer ADP-Riboseeinheit von NAD* auf eine spezifische Arg-Seitenkette von G,.. Das ADP-ribosylierte G,.:GTP kann zwar die Adenylat-Cyc-

lase aktivieren, aber es ist nicht mehr in der Lage das gebundene GTP zu hydrolysieren (Abb. 13.23). Somit wird das Signal nicht mehr abgeschaltet und das G,.:GTP bleibt aktiv. Als Konsequenz wird die Adenylat-Cyclase permanent aktiviert und der zelluläre CAMP-Spiegel steigt ca. 100fach. Darmzellen, die normalerweise

N

|

CHz R=CH3

X=CH;

Coffein (1,3,7-Trimethylxanthin)

R=H

X=CH;

Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin)

R=CH;3

X=H

Theobromin (1,7-Dimethylxanthin)

Zudem blockieren diese Substanzen Phosphodiesterasen, die cAMP abbauen. Die Inhibition und der Antagonismus der Adenosinrezeptoren führen zu einer deutlich erhöhten cAMP-Konzentration. Bestimmte bakterielle Toxine, die die heterotrimeren G-Proteine blockieren, sind tödliche Gifte. Das Toxin, das vom

Choleraerreger Vibrio cholerae freigesetzt wird, ruft einen massiven Flüssigkeitsverlust von über einem Liter pro Stunde durch Diarrhö hervor. Die Betroffenen sterben an Austrocknung, wenn ihre Wasser- und Salzverluste nicht umgehend ersetzt werden. Das Choleratoxin, ein 87 kD großes Protein, ist aus den Untereinheiten AB, zusammengesetzt und bindet über seine B-Untereinheiten an das Gangliosid Gy (Abb. 9.9) auf der Oberfläche von Zellen des Dünndarmepi-

fallerkrankung hervor, die ähnlich, aber nicht so schwer ist,

homologes

+ 23 O, —

16 CO,

Ernährung. Erklären Sie die Bedeutung, die Reaktionen für den Stoffwechsel haben, die nahe der Gleich-

+ 16 H,O

ist ein Vorgang, der sogar noch stärker exergon abläuft (AG°’ = -9781 kJ - mol"). Eine oxidative Stoffwechselreaktion verläuft schrittweise, wodurch die freigesetzte Freie Enthalpie bei jedem einzelnen exergonen Schritt des Gesamtprozesses in leichter zu bewältigenden Mengen wiedergewonnen werden kann.Diese „Energiepakete“ sind durch die Synthese einiger energiereicher Zwischenprodukte konserviert; sie ermöglichen durch ihren nachfolgenden exergonen Abbau endergone Vorgänge. Solche Zwischenprodukte bilden daher eine Art „Währung“ der Freien Enthalpie. Biochemische Reaktionen wie die Glucose- oder Fettsäureoxidation liefern Energie für andere, Energie verbrauchende Prozesse (Exkurs 14.3). Die Zelle verfügt über mehrere Formen von Energiespeichern. Dazu gehören phosphorylierte Verbindungen wie das Nucleotid ATP (der Hauptenergiespeicher der Zelle), Verbindungen mit Thioesterbindungen und reduzierte Coenzyme wie NADH. Jede dieser Verbindungen ist eine Quelle der Freien Enthalpie, die die Zelle auf verschiedene Arten nutzen kann, einschließlich der Synthese von ATP. Wir werden zunächst ATP untersuchen und danach die Eigenschaften der anderen Energiespeicher kennenlernen.

A.

Beschreiben Sie die Rolle von Vitaminen und Mineralien in der

gewichtslage bzw. weit entfernt davon ablaufen. Diskutieren Sie die Mechanismen, durch die der Fluss

durch einen Stoffwechselweg kontrolliert werden kann.

__ATP und Phosphorylgruppenübertragungen Phosphorsäure-

Das energiereiche Zwischenprodukt Adenosintriphosphat (ATP; Abb. 14.4), das in allen bekannten Lebensformen vorkommt, ist die am häufigsten verwendete energiereiche „Währung“ der Zelle. ATP besteht aus einer Adenosineinheit (Adenin + Ribose), an die über eine Phosphorsäureesterbindung eine Kette aus drei Phosphorylgruppen (-PO3") gebunden ist; letztere sind untereinander durch zwei Phosphorsäureanhydridbindungen verknüpft. Die biologische Bedeutung von ATP besteht in der großen Menge an Freier Enthalpie, die bei der Spaltung seiner Phosphorsäureanhydridbindungen freigesetzt wird. Entweder wird dabei eine Phosphorylgruppe auf eine andere Verbindung übertragen und ADP entsteht oder eine Nucleotidyl- (AMP-) Gruppe wird transferiert und Pyrophosphat (P,05°, PP;) wird frei. Ist der Akzeptor Wasser, wird der Vorgang als Hydrolyse bezeichnet:

NHs

esterbindung PhosphorsäureN anhydridbindungen hydridbind

pIN: DR h

x

P-—-0O—P--0—CH, sr alle: j

1

O

i

Er:

H

i SER

HO

OH

Adenosin

L

A ——,@

ATP

ABER

O =

ADB;

ATPEHI,OZSAMP

Abb. 14.4

+PP;

Bei den meisten biologischen Gruppenübertragungsreaktionen fungieren dere Moleküle, nicht Wasser, als Akzeptor. Da jedoch die Freie Enthalpie der Hydrolyse verschiedener Phosphorylverbindungen bekannt ist, lässt sich raus die Freie Enthalpie beim Transfer der Phosphorylgruppen auf andere

anbei daAk-

Die Struktur von ATP, die dessen

Beziehung zu ADP, AMP und Adenosin zeigt. Die Phosphorylgruppen werden, beginnend bei AMP, als die a-, ß- und y-Phosphate bezeichnet.

Man beachte den Unterschied zwischen Phosphorsäureester- und Phosphorsäureanhydridbindungen.

\

| )

498

Einführung in den Stoffwechsel

EExkurs. 143 ' Berühmte Biochemiker s Fritz Lipmann und „energiereiche“ Verbindungen lyse-Enthalpie (die Tilde — war sein Symbol für eine „energiereiche“ Bindung, und dieser „Schnörkel“ wird dafür auch heute noch verwendet). Lipmann beschrieb eine Art „Phos-

Fritz Albert Lipmann (1899-1986)

phatwährung“, in der die Photosynthese oder der Abbau von Nahrungsmolekülen „energiereiche“ Phosphate erzeugen, die zur Synthese von ATP führen. Das ATP kann wiederum die Energie für die mechanische Arbeit liefern, z.B. für die Muskelkontraktion oder biosynthetische Reaktionen an; treiben. Bis zu diesem Zeitpunkt (1941) beschränkte sich die Arbeit

Zu den vielen Naturwissenschaftlern, die in den 1930er-Jah-

von

ren aus Europa nach Amerika flohen, gehörte auch Fritz Lipmann - ein in Deutschland geborener Arzt, der sich der Biochemie zugewandt hatte. Während der ersten Hälfte des zwanzigsten Jahrhunderts waren Naturwissenschaftler hauptsächlich an den Strukturen und Zusammensetzungen biologischer Moleküle interessiert. Über die Biosynthese dieser Moleküle wusste man nicht viel. Lipmanns Beitrag auf die-

hauptsächlich auf ganze Tiere oder auf relativ intakte Gewebsschnitte. Lipmanns Ansichten zur Rolle des ATP befreiten die Forscher von ihren schwerfälligen und schwer reproduzierbaren experimentellen Systemen. Die Biochemiker konnten ihren zellfreien Präparationen einfach ATP zusetzen, um Biosyntheseprozesse wieder herzustellen. Lipmann war von der Entdeckung fasziniert, dass eine

sem Gebiet waren vor allem seine Erkenntnisse über „energiereiche“ Phosphate und andere „aktive“ Verbindungen.

Gruppe

Lipmann begann seine Forscherlaufbahn mit der Untersuchung von Kreatinphosphat, einer Verbindung, die für die Muskelkontraktion Energie bereitstellen kann. Wie viele seiner Zeitgenossen

war auch er verblüfft darüber, dass es

bei der Umwandlung von Glucose zu Lactat offenbar kein Bindeglied zwischen dieser phosphorylierten Verbindung und den bekannten Stoffwechselaktivitäten eines sich kontrahierenden Muskels gab. Ein Bindeglied wurde von Otto Warburg (Exkurs 15.1) entdeckt, der zeigen konnte, dass einer der Glykolyseschritte mit dem Einbau von anorganischem Phosphat einhergeht. Das sich ergebende Acylphosphat (1,3-Bisphosphoglycerat) kann dann mit ADP reagieren und es entsteht ATP. Lipmann fragte sich, ob sich auch andere phosphorylierte Verbindungen auf ähnliche Weise verhalten könnten. Weil die Reinigung solch instabiler (abbauanfälliger) Verbindungen aus ganzen Zellen nicht praktikabel war, synthetisierte Lipmann

sie selbst.

Er konnte

zeigen,

dass

Zellextrakte

synthetische Acylphosphate verwendeten, um ATP zu bilden. Lipmann postulierte weiter, dass Zellen zwei Klassen phosPhorylierter Verbindungen enthalten. Er nannte diese Klassen „energiearm“ und „energiereich“ und verstand darunter Ver-

bindungen mit geringer oder hoher negativer Freier Hydro-

Biochemikern,

mit zwei

die Biosynthesevorgänge

Kohlenstoffatomen,

untersuchten,

ein „aktives Acetat“,

als Vorstufe für die Synthese von Fettsäuren und Steroiden dient. War Acetylphosphat auch das „aktive Phosphat“? Es stellte sich heraus,

dass

dies

nicht der Fall ist. Dennoch

konnte Lipmann zeigen, dass die Addition einer Einheit mit zwei Kohlenstoffatomen an ein anderes Molekül (Acetylierung) Acetat, ATP und einen hitzestabilen Faktor aus Leberextrakten von Tauben

erforderte.

Er isolierte diesen

Faktor,

bestimmte seine Struktur und nannte ihn Coenzym A. Für diese bahnbrechende Entdeckung erhielt Lipmann 1953 den Nobelpreis für Physiologie und Medizin. Sogar nachdem

„energiereiche“ Thioester

(wie in Acetyl-

CoA) auf der biochemischen Bildfläche erschienen, blieb Lipmann ein entschiedener Verfechter der „energiereichen“ Phosphate. Er erkannte z.B., dass Carbamoylphosphat (H,N-COO-PO?‘) in Biosynthesereaktionen als ein „aktiver“ Carbamoylgruppen-Donator fungieren kann. Er trug auch dazu bei, unbekanntere Verbindungen — gemischte Anhydride zwischen Phosphat und Sulfat - als „aktive“ Sulfate zu iden-

tifizieren, die als Sulfatgruppen-Donatoren wirken können.

Kleinkauf, H., von Döhren, H. und Jaenicke, L. (Hrsg.), The Roots of

Modern Biochemistry. Fritz Lipmann’s Squiggle and its Consequences, Walter de Gruyter (1988).

Energiereiche Verbindungen

zeptoren berechnen, indem der Unterschied in der Freien Enthalpie bei der Hydrolyse von phosphoryliertem Donator bzw. Akzeptor bestimmt wird. Die AG°’-Werte für die Hydrolyse einiger phosphorylierter, biologisch relevanter Verbindungen sind in Tabelle 14.4 zusammengestellt. Häufig bezeichnet man ihre mit -1 multiplizierten Werte als Phosphorylgruppenübertragungspotentiale (angegeben als dimensionslose positive Zahl). Sie sind ein Maß für die Tendenz phosphorylierter Verbindungen, ihre Phosphorylgruppen auf Wasser zu übertragen. Zu beachten ist, dass ATP ein mittelgroßes Phosphorylgruppenübertragungspotential besitzt. Unter Standardbedingungen können die in Tabelle 14.4 oberhalb von ATP stehenden Verbindungen spontan eine Phosphotylgruppe auf ADP übertragen und dadurch ATP bilden, welches wiederum spontan eine Phosphorylgruppe auf die Hydrolyseprodukte (ROH-Form) der darunter stehenden Verbindungen weitergeben kann. Beachten Sie, dass eine vorteilhafte Änderung der Freien Enthalpie für eine Reaktion noch nichts darüber aussagt, wie schnell die Reaktion abläuft. Trotz ihres hohen Gruppenübertragungspotentials sind ATP und verwandte Phosphoryl-Verbindungen kinetisch stabil und reagieren mit keiner nennenswerten Geschwindigkeit, außer wenn sie durch ein entsprechendes Enzym dazu veranlasst werden. Zum Begriff der „Energie“ in energiereichen Verbindungen Bindungen, deren Hydrolyse mit stark negativen Werten für AG°’ einhergeht (normalerweise mehr als -25 kJ - mol”), werden häufig als „hochenergetisch“ oder energiereich bezeichnet und mit einer Schlangenlinie (-) symbolisiert.

So kann ATP als AR-P-P-P dargestellt werden; A, R und P stehen für Adenyl-, Ribosyl- bzw. Phosphorylgruppen. Allerdings unterscheidet sich die Phosphorsäureesterbindung zwischen der Adenosylgruppe des ATP und seiner a-Phosphorylgruppe in ihrem elektronischen Charakter nicht wesentlich von den sogenannten energiereichen Phosphorsäureanhydridbindungen zwischen den a-, B- und y-Phosphorylgruppen. An sich zeigt keine dieser Bindungen irgendwelche besonderen Eigenschaften, die Bezeichnung energiereich ist daher etwas irreführend (in jedem Fall sollte man sie nicht mit dem Begriff der „Bindungsenergie“ verwechseln, die als die Energie definiert ist, die für die direkte Spaltung, nicht jedoch für die Hydrolyse einer kovalenten Bindung erforderlich ist). Warum aber sind die Phosphorylgruppenübertragungsreaktionen des ATP so stark exergon? Einige Faktoren scheinen für den energiereichen Charakter der Phosphorsäureanhydridbindungen wie im ATP verantwortlich zu sein

499

Tab. 14.4 Freie Standardenthalpie der Phosphathydrolyse einiger biologisch relevanter Verbindungen.

Verbindung

AG”? (kJ: mol")

Phosphoenolpyruvat

-61,9

1,3-Bisphosphoglycerat

49,4

ATP (> AMP + PP)

-45,6

Acetylphosphat

43,1

Phosphocreatin

43,1

ATP (> ADP + P)

-30,5

Glucose-1-phosphat

-20,9

PP;

-19,2

Fructose-6-phosphat

-13,8

Glucose-6-phosphat

-13,8

Glycerin-3-phosphat

-9,2

Quelle: Jencks, W.P., in Fasman, G.D. (Hrsg.), Handbook of Biochemistry and Molecular Biology (3. Aufl.), Physical and Chemical Data, Band I, S. 296-304, CRC Press (1976).

(Abb. 14.5): 1. Die Resonanzstabilisierung einer Phosphorsäureanhydridbindung ist geringer als die ihrer Hydrolyseprodukte, da die beiden stark elektronenziehenden Phosphorylgruppen eines Phosphorsäureanhydrids um die n-Elektronen des Brückensauerstoffatoms konkurrieren müssen, während diese Konkurrenz bei den Hydrolyseprodukten fehlt. Mit anderen Worten: Ein Phosphorsäureanhydrid erfüllt die elektronischen Bedürfnisse der Phosphorylgruppen schlechter als seine Hydrolyseprodukte. 2. Von noch größerer Bedeutung ist vielleicht die destabilisierende Wirkung der elektrostatischen Abstoßung zwischen den geladenen Gruppen eines Phosphorsäureanhydrids im Vergleich zu denen seiner Hydrolyseprodukte. Im physiologischen pH-Bereich trägt ATP drei bis vier negative Ladungen, deren gegenseitige elektrostatische Abstoßung durch die ATP-Hydrolyse teil-

weise aufgehoben wird. 3, Ein weiterer destabilisierender Einfluss (der jedoch nur schwierig zu messen ist) ist die vergleichsweise zu seinen Hydrolyseprodukten geringe Solvatationsenergie eines Phosphorsäureanhydrids. Manche Schätzungen lassen darauf schließen, dass dieser Faktor den größten Teil der thermodynamischen Triebkraft für die Hydrolyse von Phosphorsäureanhydriden liefert.

= oO

oder

o

-0RT o= H,O

ae — 0

PIA,Ortes -0

N 0” 720 o-

Abb. 14.5 Resonanz- und elektrostatische Stabilisierung in einem Phosphorsäureanhydrid und seinen Hydrolyseprodukten. Die Konkurrenz um die Resonanz (vom zentralen O ausgehende gebogene Pfeile) und die gegenseitige Abstoßung der Ladungen (Zick-Zack-Linie) bei den Phosphorylgruppen eines Phosphorsäureanhydrids verringern dessen Stabilität gegenüber seinen Hydrolyseprodukten.

500

Einführung in den Stoffwechsel

ATP und AG Standardbedingungen, wie sie durch AG°’-Werte wiedergegeben werden, stellen sich in lebenden Organismen niemals ein. Zudem üben Stoffe, die in hohen Konzentrationen vor-

kommen und potentiell mit Substraten oder Produkten interagieren können, einen erheblichen Einfluss auf die AG-Werte

aus. Beispielsweise neutralisieren Mg?*-Ionen in Zellen zum Teil die negativen Ladungen der Phosphatgruppen des ATP und dessen Hydrolyseprodukte und mindern dadurch die elektrostatische Abstoßung, welche die ATP-Hydrolyse so exergon verlaufen lässt. In ähnlicher Weise führt auch eine Änderung des pH-Werts zu einem veränderten Ladungszustand phosphorylierter Verbindungen und damit gleichzeitig

zu einer Änderung der Freien Enthalpie. In einer Zelle variieren die Konzentrationen

vieler Ionen,

Coenzyme und Metabolite je nach Ort und Zeitpunkt der

Betrachtung. Oftmals beträgt der Unterschied mehrere Größenordnungen. Intrazelluläre ATP-Konzentrationen werden innerhalb einer engen Spanne aufrechterhalten, gewöhnlich 2-10 mM. Allerdings unterliegen die Konzentrationen an ADP und P; größeren Schwankungen. Betrachten wir eine typische Zelle mit [ATP] = 3,0 mM, [ADP] = 0,8 mM und [P|] = 4,0 mM. Wird Gleichung 14.1 angewendet, lässt sich die tatsächliche Freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse bei 37°C wie unten angegeben berechnen. Dieser Wert ist sogar größer als die Freie Standardenthalpie der ATP-Hydrolyse. Jedoch ist es schwierig, die Konzentrationen

von chemischen

Sub-

stanzen in einer Zelle oder Organelle exakt zu bestimmen. Die AG-Werte stellen daher für die meisten in- vivo-Reaktionen eher Schätzwerte dar. Der Einheitlichkeit wegen werden wir weitestgehend AG°’-Werte in diesem Buch verwenden.

AG = AG” + RT In (FE) [ATP] a

= -30,5 k) mol”! + (8,3145 )- K' mol!) (310 K) In ee (3,0 x 103 M) = -30,5 k] - mol'- 17,6 k) -mol”' = -48,1 kJ - mol"

=

Natürlich hängt die Änderung in der Freien Enthalpie einer jeden Reaktion, also auch die der Phosphorylgruppenübertragung von einer energiereichen Ver-

bindung, auch von den Konzentrationen an Reaktanten und Produkten ab (Gl. 14.1). Da ATP und seine Hydrolyseprodukte Ionen sind, haben darüber hinaus auch der pH-Wert und die Ionenstärke einen Einfluss auf AG (siehe Exkurs 14.4).

B.

Gekoppelte Reaktionen

Exergone Reaktionen energiereicher Verbindungen können mit endergonen Prozessen gekoppelt sein, um diese vollständig ablaufen zu lassen. Die thermodynamische Erklärung für die Kopplung eines exergonen an einen endergonen Vorgang gründet auf der Additivität von Freier Enthalpie. Betrachten wir die folgende zweistufige Reaktion:

(A BE— Ch Dies AG, BI DHE ZIEHE Ist AG, = 0, erfolgt Reaktion 1 nicht spontan. Ist jedoch AG, ausreichend exergon und damit AG, + AG, < 0, ist die Gleichgewichtskonzentration von D in

Reaktion 1 relativ klein, aber größer als in Reaktion 2. Da Reaktion 2 D zu den Produkten umsetzt, verläuft Reaktion 1 in Vorwärtsrichtung und füllt die Gleichgewichtskonzentration von D auf. Die stark exogene Reaktion 2 „treibt“ die endergone Reaktion 1 an bzw. „zieht“ sie. Die beiden Reaktionen werden als über ihr gemeinsames Zwischenprodukt D gekoppelt bezeichnet. Diese

Energiereiche Verbindungen

501

Kopplung der Reaktionen lässt sich auch durch Zusammenfassen von Reaktion 1 und 2 zur Gesamtreaktion ausdrücken: (1+2)

A+B+E==(C+F+G

AG3

wobei AG; = AG, + AG, < 0 ist. Ist die Gesamtreaktion exergon, läuft sie in Vor-

wärtsrichtung ab. Um diesen Vorgang zu illustrieren, betrachten wir zwei Beispiele von Phosphorylgruppenübertragungen. Der erste Schritt bei der Metabolisierung von Glucose ist die Umwandlung in Glucose-6-phosphat (Abschnitt 15.2A). Da die direkte Reaktion von Glucose und P; thermodynamisch ungünstig ist (AG°’ = +13,8 kJ] - mol’; Abb. 14.6a), ist sie in der Zelle mit der exergonen Spaltung von ATP (für die ATP-Hydrolyse gilt ein AG°’ = -30,5 kJ - mol”') gekoppelt. Daraus ergibt sich insgesamt eine thermodynamisch begünstige Gesamtreaktion (AG°’ = +13,8-30,5 = -16,7 k] - mol’). ATP kann auf ähnliche Weise zurückgewonnen werden (AG° = +30,5 kJ - mol”'), indem die Synthese aus ADP und P; mit der noch stärker exergonen Spaltung von Phosphoenolpyruvat (AG°’' =

-61,9 kJ] - mol”; Abb. 14.6b und Abschnitt 15.2J) verbunden ist. Beachten Sie, dass die in Abb. 14.6 dargestellten Halbreaktionen in Wirklichkeit am aktiven Zentrum eines Enzyms nicht so ablaufen wie beschrieben. Hexokinase, das Enzym, das die Bildung von Glucose-6-Phosphat katalysiert (Abb. 14.6a), katalysiert nicht die ATP-Hydrolyse, sondern es katalysiert die Übertragung einer Phosphoryl-Gruppe von ATP direkt auf Glucose. Ebenso fügt Pyruvat-Kinase, das Enzym, das die in Abb. 14.6b dargestellte Reaktion katalysiert, keine freie Phosphoryl-Gruppe an ADP, sondern überträgt eine Phosphoryl-Gruppe von Phosphoenolpyruvat auf ADP, um ATP zu bilden. Die Phosphorsäureanhydridhydrolyse treibt viele biochemische Prozesse Die Freie Enthalpie, die in den Phosphorsäureanhydridbindungen energiereicher Verbindungen wie ATP gespeichert liegt, kann eingesetzt werden, um

Reaktionen in Richtung des Gleichgewichtszustands ablaufen zu lassen. Dabei

vr

AG’ (kJ mol”")

Endergone

Halbreaktion 1

P;

Glucose

+

+13,8

H,O

+

——>

Glucose-6-P

ADP

+

P;

-30,5

ADP

+

Glucose-6-P

-16,7

Exergone

Halbreaktion 2

ATP

+

H,0

—

Gekoppelte Gesamtreaktion

ATP

+

Glucose

=>

e

Abb. 14.6 Einige gekoppelte Reaktionen unter Beteiligung von ATP.

er

n

_AG” (kJ: mol)

(b) cooEretgone ; Halbepäktion.d

IN nn E——

— / HER

Lan

—

—(— a

P: te

Sa) Re

Eyzuyal

ATP und Pyruvat. Jede Reaktion

in dem ATP hydrolysiert wird

Sr Be

phosphat und ADP. (b) Phosphorylierung von ADP durch Phosunter Bildung g von PY P hoenolpyruvat wurde zum besseren Verständnis in einen Phosphorylierungsschritt (Teilreaktion 1) und einen Schritt,

OPOZ

Elosphoensipyruyat

(a) Phosphorylierung von Glucose unter Bildung von Glucose-6-

+

ADP

;

P;,

=>

ATP

+

H,O

+30,5

legt. Beide 2 2), zerlegt. (Teilreaktion ilreaktion

za

Teilreaktionen verlaufen in der die GesamtreakRichtung, in der a 5 tion exergon ist (

Bee

/ c00

Gekoppelte Gesamtreaktion

CH,=C

\

rs +

ADP

=

| CH; —-C-C0O0O

u +

ATP

502

Einführung in den Stoffwechsel

müssen nicht unbedingt Phosphorylgruppen auf eine andere organische Verbindung übertragen werden. Zum Beispiel liefert die ATP-Hydrolyse (Phosphorylgruppenübertragung direkt auf H,O) die Freie Enthalpie für die Arbeit von molekularen Chaperonen (Abschnitt 6.5B), die Muskelkontraktion (Abschnitt 7.2B) und den aktiven Transmembranentransport (Abschnitt 10.3). Bei diesen Vorgängen unterliegen Proteine infolge der ATP-Bindung einer Änderung der Konformation.Die exergone Hydrolyse von ATP und die damit einhergehende Freisetzung von ADP und P; macht diese Änderung irreversibel und lässt die Prozesse in Vorwärtsrichtung ablaufen. Die Hydrolyse von GTP verläuft ähnlich und treibt einige Reaktionen der Signaltransduktion (Abschnitt 13.3B) und der Proteinbiosynthese (Abschnitt 27.4) an. Ist kein geeignetes Enzym zugegen, sind Phosphorsäureanhydridbindungen stabil. Das heißt sie hydrolysieren relativ langsam, obwohl eine große Menge Freier Enthalpie bei diesen Reaktionen frei wird. Begründet liegt das in der außergewöhnlich hohen Freien Aktivierungsenthalpie für diese Reaktion (A G'; Abschnitt 11.2). Daraus folgt, dass die ATP-Hydrolyse zwar thermodynamisch begünstigt, jedoch kinetisch gehemmt ist. Betrachtet man z.B. die Reaktion von Glucose mit ATP zu Glucose-6-phosphat (Abb. 14.60), so ist AG’ für die nicht enzymatische Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf Glucose größer als AG‘ der ATP-Hydrolyse, wodurch die Hydrolyse überwiegt (keine der Reaktionen läuft mit biologisch signifikanter Geschwindigkeit ab). Ist jedoch das Enzym Hexokinase anwesend (Abschnitt 15.2A), wird Glucose-6-phosphat weitaus schneller gebildet als ATP hydrolysiert. Durch den katalytischen Einfluss des Enzyms wird die Aktivierungsenergie der Phosphorylgruppenübertragung von ATP auf Glucose so stark herabgesetzt, dass sie kleiner wird als die Aktivierungsenergie für die Hydrolyse von ATP. Dieses Beispiel verdeutlicht, dass u. U. sogar eine thermodynamisch begünstigte Reaktion AG’ herabsetzt, um die Produktbildung zu erhöhen (Exkurs 12.3). Pyrophosphatase katalysiert weitere Spaltungen von Phosphorsäureanhydridbindungen Obwohl viele Reaktionen, an denen ATP beteiligt ist, ADP und-P; (Orthophosphatspaltung) liefern, ergeben andere AMP und PP; (Pyrophosphatspaltung).

Im letzteren Fall wird PP, schnell durch die Pyrophosphatase (anorganische Phosphatase) zu 2 P; hydrolysiert (AG°’ = -19,2 kJ] - mol"'). Die Pyrophosphatspaltung von ATP verbraucht in der Summe zwei energiereiche Phosphorsäureanhydridbindungen. Die Anlagerung der ersten Aminosäure an ein tRNA-Molekül bei der ribosomalen Proteinsynthese ist ein Beispiel für dieses Phänomen (Abb. 14.7 und Abschnitt 27.2B). Die zwei Schritte der Hauptreaktion sind gänzlich reversibel, da die Freie Enthalpie bei der Hydrolyse der gebildeten Bindungen vergleichbar ist mit der der ATP-Hydrolyse. Der quantitative Verlauf der Reaktion wird durch die irreversible Hydrolyse von PP, gewährleistet. Die Nucleinsäurebiosynthese aus Nucleosidtriphosphaten setzt ebenfalls PP; frei (Abschnitt 25.1 und 26.1). Die Freien Enthalpieänderungen dieser Reaktionen liegen nahe Null, wodurch die Kopplung an die Hydrolyse von PP; auch für die Nucleinsäurebiosynthese essentiell ist.

Energiereiche Verbindungen tRNA H

077

o

nr

(6) +

AMP=-P=-p

I

——

R—C—C-AMP

NEE, I Aminosäure

1a

N) I— —

Aminoacyl-Adenylat

BP

—

ER:

0)

el!

zZ RG

—C—tRNA

NHF

anorganische Pyrophosphatase

C.

AMP

NHF ATP

503

2P;

H,0

Weitere phosphorylierte Verbindungen

Aminoacyl-tRNA

Abb. 14.7 Pyrophosphatspaltung bei der Synthese einer Aminoacyl-tRNA. Im ersten Reaktionsschritt wird die Aminosäure

durch ATP adenyliert. Im zweiten Schritt ersetzt ein tRNA-Molekül das AMP und bildet eine AminoacyltRNA. Die stark exergone Hydrolyse von Pyrophosphat (AG?’ = -19,2 k)- mol”) treibt die Reaktion vorwärts.

Auch andere energiereiche Verbindungen als ATP sind essentiell für den Energiestoffwechsel, teilweise deswegen, weil sie einen relativ konstanten Spiegel an zellulärem ATP aufrechterhalten. ATP wird kontinuierlich hydrolysiert und regeneriert. Tatsächlich kann experimentell belegt werden, dass die metabolische Halb-

wertzeit von ATP-Molekülen, abhängig vom Zelltyp und dessen Stoffwechselaktivität, von Sekunden bis zu Minuten variieren kann. Der ATP-Vorrat von Gehirnzellen z.B. reicht nur für Sekunden (was teilweise für das schnelle Absterben von Hirngewebe bei Sauerstoffmangel verantwortlich ist). Durchschnittlich verbraucht und regeneriert ein Mensch in Ruhe ATP mit einer Geschwindigkeit von ca. 3 Mol (1,5 kg) pro Stunde, bei starker körperlicher Belastung sogar noch um eine Größenordnung rascher. So wie ATP endergone Reaktionen durch den exergonen Vorgang der Phosphorylgruppenübertragung und Phosphorsäureanhydridhydrolyse antreiben kann, kann ATP durch Kopplung seiner Bildung an einen noch stärker exergonen metabolischen Prozess zurückgewonnen werden. Wie Tabelle 14.4 zeigt, liegt ATP in der thermodynamischen Hierarchie der Phosphorylübertragungsagenzien auf einem mittleren Platz. ATP kann daher durch die direkte Übertragung einer Phosphorylgruppe von einer energiereichen Verbindung (wie z.B. Phosphoenolpyruvat; Abb. 14.6b und Abschnitt 15.2]J) auf ADP gebildet werden. Solch eine Reaktion wird als Substratkettenphosphorylierung bezeichnet. Andere Mechanismen generieren ATP indirekt, indem sie die Energie nützen, die im Protonenkonzentrationsgradienten über einer Membran gespeichert ist. Im oxidativen Stoffwechsel wird dieser Prozess als oxidative Phosphorylierung bezeichnet (Abschnitt 18.3), dagegen spricht man in der Photosynthese von Photophosphorylierung (Abschnitt 19.2D). Der Energiefluss von energiereichen Phosphatverbindungen auf ATP und von ATP auf energiearme Phosphatverbindungen ist in Abbildung 14.8 dargestellt. Diese Reaktionen werden durch Enzyme, sogenannte Kinasen, katalysiert, die Phosphorylgruppen von ATP auf andere Verbindungen und von phosphorylierten Verbindungen auf ADP übertragen. Wir werden diesen Vorgängen erneut bei der Betrachtung des Kohlenhydratstoffwechsels in Kapitel 15 und 16 begegnen.

e>

u

_ Phosphoenolpyruvat

ve 1,3-Bisphosphoglycerat

Phosphocreatin

Energiereiche Phosphatverbindungen

& fe) T

Energiearme

_20 | mol!) AG° (kJ Hydrolyse der . 0

\„

Phosphat-

ee

oo Glucose-6-phosphat Glycerin-3-phosphat

0

Abb. 14.8 Stellung von ATP in Relation zu energiereichen und energiearmen Phosphatverbindungen. Der Phosphorylgruppenfluss verläuft von energiereichen Phosphatdonatoren über das ATP-ADPSystem zu energiearmen Phosphatakzeptoren.

504

Einführung in den Stoffwechsel In Verbindungen, deren Übertragungspotential für Phosphorylgruppen gröRer ist als das von ATP, treten zusätzliche stabilisierende Effekte auf. Zum Beispiel wird die Hydrolyse von Acylphosphaten (gemischten Phosphorylcarbonylanhydriden) wie Acetylphosphat und 1,3-Bisphosphoglycerat,

6) | CH,—C-0OPOF

ii

h

03POCH,— CH— C — OPOF

Acetylphosphat

1,3-Bisphosphoglycerat

durch die gleichen Resonanz- und Solvatationseffekte angetrieben, die auch die Hydrolyse von Phosphorsäureanhydriden beeinflussen (Abb. 14.5). Diese Eigenschaften sind, wie es die Rangliste in Tabelle 14.4 widerspiegelt, bei Acylphosphaten stärker als bei Phosphorsäureanhydriden ausgeprägt. Im Gegensatz dazu weisen Verbindungen wie Glucose-6-phosphat und Glycerin-3-phosphat, CH,0PO2

Hi

NH

CH,OH

EN H

HO=C=H

OH

N

a-D-Glucose-6-phosphat

L-Glycerin-3-phosphat

die in Tabelle 14.4 unterhalb von ATP stehen, keine signifikant verschiedene Resonanzstabilisierung oder Ladungsverteilung im Vergleich zu ihren Hydrolyseprodukten auf. Deren Freie Enthalpie bei der Hydrolyse ist daher weitaus geringer als bei den oberhalb von ATP stehenden energiereichen Verbindungen. Das hohe Phosphorylgruppenübertragungspotential von Phosphoguanidinen, wie Phosphocreatin und Phosphoarginin, ergibt sich aus der ausgeprägten Konkurrenz um die Resonanz in der Guanidinogruppe, die sogar noch die der Phosphatgruppe von Phosphorsäureanhydriden übertrifft. + H>N

VArtl ei)

R=CH,—-CO3;

X=CH;

Phosphocreatin

NH} R=CH,

-CH,

- CH, —CH— C05; X=H

Phosphoarginin

Infolgedessen kann Phosphocreatin seine Phosphorylgruppe auf ADP übertragen und dabei ATP bilden. Phosphocreatin stellt einen energiereichen Speicher für die ATP-Bildung dar

Muskeln und Nervenzellen, Zellen mit hohem ATP-Umsatz, verwenden Phosphoguanidin, um für eine rasche Rückgewinnung von ATP zu sorgen. Bei Vertebraten wird Phosphocreatin durch die reversible Phosphorylierung von Creatin durch ATP synthetisiert, ein Vorgang, der von der Creatin-Kinase katalysiert wird:

ATP + Creatin =

Phosphocreatin + ADP

AG°’' = +12,6 kJ-mol"

Energiereiche Verbindungen

505

Zu beachten ist, dass diese Reaktion unter Standardbedingungen endergon verläuft. In der Zelle sind die Konzentrationen der Reaktanten und Produkte jedoch so, dass etwa ein Gleichgewicht vorliegt (AG — 0). Dementsprechend verläuft die Reaktion, wenn sich die Zelle im Ruhezustand befindet und [ATP] daher relativ hoch ist, unter Nettosynthese von Phosphocreatin, während sich das Gleichgewicht bei hoher Stoffwechselaktivität und niedrigem [ATP] so verschiebt, dass eine Nettosynthese von ATP aus Phosphocreatin und ADP erfolgt. Phosphocreatin fungiert dabei in Zellen, die Creatin-Kinase enthalten, als ATP-„Puffer“. Ein ruhender Vertebraten-Skelettmuskel besitzt in der Regel genügend Creatinphosphat, um den Bedarf an Freier Enthalpie für wenige Minuten zu decken (bei maximaler Anstrengung jedoch nur für einige Sekunden). In den Muskeln einiger Invertebraten (Wirbellose), z.B. bei Hummern, erfüllt Phosphoarginin diese Funktion. Diese Phosphoguanidine tragen die Sammelbezeichnung Phosphagene. Nucleosidtriphosphate sind frei ineinander umwandelbar Viele biosynthetische Prozesse, wie die Synthese von Proteinen und Nucleinsäuren, benötigen andere Nucleosidtriphosphate als ATP. Beispielsweise erfordert die RNA-Synthese neben ATP die Ribonucleotide CIP, GTP und UTP und die DNA-Synthese dCTP, dGTP, dTTP und dATP (Abschnitt 3.1). All diese Nucleosidtriphosphate (NTPs) werden aus ATP und dem entsprechenden Nucleosiddiphosphat (NDP) gebildet. Die Reaktion wird von einem Enzym mit geringer Spezifität, der Nucleosiddiphosphat-Kinase, katalysiert: ATP + NDP =

ADP + NTP

Die AG°'-Werte dieser Reaktionen liegen nahe 0, was auf Grund der Strukturähnlichkeiten zwischen den NTP-Molekülen erwartet werden kann. Angetrieben werden die Reaktionen durch den nachfolgenden Abbau und exergonen Verbrauch der NTPs. Andere Kinasen wandeln unter Verbrauch von ATP reversibel Nucleosidmonophosphate in die Diphosphate um. Eine dieser Phosphorylgruppenübertragungsreaktionen wird von der Adenylat-Kinase katalysiert: AMP

+ ATP ==

2 ADP

Dieses Enzym kommt in allen Geweben vor und hält dort die Gleichgewichtskonzentrationen der drei Nucleotide aufrecht. Akkumuliert AMP, wird es in ADP umgewandelt, das wiederum über die Substratkettenphosphorylierung, oxidative Phosphorylierung oder Photophosphorylierung für die Synthese von ATP zur Verfügung steht. Die umgekehrte Reaktion hilft, die zellulären Speicher von ATP wieder aufzufüllen, wenn schneller ATP-Verbrauch den ADP-Spiegel anhebt. Die von Georg Schulz aufgeklärte Röntgenkristallstruktur der Adenylat-Kinase verdeutlicht, dass bei der durch dieses Enzym katalysierten Reaktion zwei ca. 30 Reste große Domänen sich über den Substraten zusammenschließen (Abb. 14.9). Die Domänen binden dabei fest an die Substrate und hindern Wasser am Eintritt ins aktive Zentrum (es käme ansonsten zur Hydrolyse und nicht zur Phosphorylgruppenübertragung). Die Beweglichkeit einer dieser Domänen hängt vom Vorhandensein vier konservierter geladener Reste ab. Interaktionen zwischen diesen Resten und den gebundenen Substraten lösen offensichtlich die Umorientierung an der Substratbindungsstelle aus (Abb. 14.95). Ist die Adenylat-Kinasereaktion abgeschlossen, müssen die fest gebundenen Produkte schnell freigesetzt werden, um die katalytische Effizienz des Enzyms beizubehalten. Da die Reaktion energetisch neutral verläuft (die Nettoanzahl an Phosphorsäureanhydridbindungen ist unverändert), wird eine andere Quelle der Freien Enthalpie für die schnelle Produktfreisetzung benötigt. Der Vergleich

(b)

Abb. 14.9 Konformationsänderungen der Adenylat-Kinase bei Substratbindung. (a) Das Enzym ohne Substrat. (b) Das Enzym mit dem gebundenen Bisubstratanalogon ApsA. Das Ap;A ist als Kugel-Stab-Modell dargestellt (€ ist grün, N ist blau, O rot und P gelb). Einige der Proteinseitenketten, die an der Substratbindung beteiligt sind, sind in Stabform gezeichnet. Die pink und cyan markierten Bereiche unterliegen starken Konformationsänderungen bei der Ligandenbindung, wohingegen in den restlichen Proteinbereichen (gold), deren Ausrichtung in (a) und (b) dieselbe ist, die Konformation erhalten bleibt. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Georg Schulz, Institut für Organische Chemie und Biochemie, Freiburg. PDBids (a) 4AKE und (b) TAKE.] 6% siehe Interactive Exercises.

Einführung in den Stoffwechsel

506

der Röntgenkristallstruktur der ungebundenen Adenylat-Kinase und der Adenylat-Kinase im Komplex mit dem Bisubstratanalogon ApsA (AMP und ATP sind über eine fünfte Phosphatgruppe verbunden) zeigt, wie das Enzym die kinetische Blockade durch fest gebundene Substrate und Produkte umgeht: Wird Substrat gebunden, steigert ein vom aktiven Zentrum entfernter Teil des Proteins seine Beweglichkeit in der Kette und verbraucht dabei etwas von der Freien Enthalpie der Substratbindung. Der Proteinbereich „verfestigt sich“ wieder, sobald die Bindungsstelle geöffnet wird und die Produkte freigesetzt werden. Dieser Mechanismus

kann als „energetisches Gegengewicht“

angesehen werden,

das der Adenylat-Kinase eine hohe Reaktionsrate verleiht.

D.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 il, Warum ist ATP eine

energiereiche Verbindung? Beschreiben Sie die Möglichkeiten, wie eine exergone Reaktion einen endergonen Vorgang antreiben kann. .

Erklären Sie wie zelluläres ATP

regeneriert wird. Warum ist eine Thioesterbindung eine energiereiche Bindung?

Thioester

Die weite Verbreitung phosphorylierter Verbindungen im Stoffwechsel geht mit ihrem frühen evolutionären Ursprung einher. Phosphat ist (und war) jedoch knapp in der abiotischen Welt. Dies lässt vermuten, dass andere Molekülarten als energiereiche Verbindungen gedient haben, noch bevor sich Stoffwechselwege auf phosphorylierte Verbindungen spezialisiert haben. Ein Kandidat für eine primitive energiereiche Verbindung ist die Thioesterbindung, die sich auf Grund ihres Vorkommens in zentralen Stoffwechselwegen aller bekannten Organismen für diese Rolle anbietet. Bemerkenswerterweise ist die Thioesterbindung an der Substratkettenphosphorylierung beteiligt, einem ATP-erzeugenden Prozess, der unabhängig von der oxidativen Phosphorylierung abläuft und vermutlich auch vor ihr entstand. Die Thioesterbindung findet sich in Stoffwechselwegen als ein Zwischenprodukt (in Verbindung mit einem Cys-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms) und in Form von Acetyl-CoA (Abb. 14.10), dem gemeinsamen Produkt des Kohlenhydrat-, Fettsäure- und Aminosäurestoffwechsels. Coenzym A (CoASH oder CoA) besteht aus einer ß-Mercaptoethylamingruppe, die über eine Amidbindung an das Vitamin Pantothensäure geknüpft ist. Dieses ist wiederum an einen 3-Phosphoadenosinrest über eine Pyrophosphatbrücke gebunden. Die Acetylgruppe von Acetyl-CoA ist als Thioester an die Sulfhydrylgruppe von ß-Mercaptoethylamin gebunden. CoA dient dabei als Träger von Acetyl- und anderen Acylgruppen (das A von CoA steht für „Acetylierung“). Thioester können ebenfalls die Verknüpfungsart zwischen Acylketten und einer Phosphopantotheneinheit bilden, die über eine Ser-OH-Gruppe an ein Protein (Abschnitt 20.4C), statt an AMP wie im CoA, gebunden ist; dies ist sogar häufiger der Fall. Acetyl-CoA ist eine energiereiche Verbindung. Die Freie Enthalpie AG°’ für die Hydrolyse der Thioesterbindung von Acetyl-CoA beträgt -31,5 kJ - mol", ist also etwas stärker exergon (1 kJ - mol") als die ATP-Hydrolyse. Die Hydrolyse von Thioestern ist stärker exergon als die Hydrolyse gewöhnlicher Ester, da Thioester weniger resonanzstabilisiert sind. Diese Destabilisierung resultiert aus einem großen Atomradius des Schwefels, was die elektronische Überlappung von Kohlenstoff und Schwefel im Vergleich zu Kohlenstoff und Sauerstoff reduziert. Die Bildung einer Thioesterbindung in einem Stoffwechselzwischenprodukt konserviert einen Teil der Freien Enthalpie bei der Oxidation eines Stoffwechsel-„Brennstoffs“.

Diese

Freie

Enthalpie

kann

nun

eingesetzt

werden,

um

einen endergonen Prozess anzutreiben. Im Citratcyclus beispielsweise setzt die Spaltung einer Thioesterbindung (Succinyl-CoA) genügend Freie Enthalpie frei, um GTP aus GDP und P; (Abschnitt 17.3E) zu synthetisieren.

Reduktions- und Oxidationsreaktionen Acetylgruppe

Abb. 14.10 Die chemische Struktur von Acetyl-CoA. Die Thioesterbindung wird mit einem — symbolisiert, um sie als energiereiche Bindung auszuweisen. CoA trägt anstelle der Acetylgruppe ein Wasserstoffatom.

(To

S-C—cH, ß-Mercaptoethylamin-

|

Rest

Adenosin-3’-

phosphat PantothensäureRest

Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA)

3

Reduktions- und Oxidationsreaktionen

Bei der Oxidation von Stoffwechselbrennstoffen zu CO, werden die Elektronen

auf Moleküle übertragen, die in aeroben Organismen als Träger fungieren und letztendlich die Elektronen an molekularen Sauerstoff weitergeben. Der Vorgang des Elektronentransports führt zu einem transmembranären Protonenkonzentrationsgradienten, der die ATP-Synthese (oxidative Phosphorylierung; Abschnitt 18.3) treibt. Sogar bei obligaten Anaerobiern, die keine oxidative Phosphorylierung betreiben, ermöglicht die Oxidation von Substraten die ATP-Synthese. In der Tat erhalten Lebewesen den größten Teil ihrer Freien Enthalpie aus Reduktions-Oxidations-Reaktionen (auch als Redoxreaktionen bekannt). In diesem Abschnitt betrachten wir die tnermodynamischen Grundlagen für die Speicherung der Freien Enthalpie bei der Substratoxidation.

A.

507

NAD* und FAD

Zwei der am häufigsten vorkommenden Elektronenträgermoleküle sind die Nucleotidcoenzyme Nicotinamidadenindinucleotid (NAD") und Flavinadenindinucleotid (FAD). Im Nicotinamidanteil des NAD* (und dessen phosphorylierten Gegenstücks NADP*; Abb. 11.4) erfolgt die reversible Reduktion, wie in Abbildung 14.11 dargestellt, formal durch Übertragung eines Hydridions (H', ein Proton mit zwei Elektronen). Der schlussendliche Elektronenakzeptor in aeroben Organismen, O,, kann nur ungepaarte Elektronen aufnehmen. Das bedeutet, dass Elektronen einzeln nacheinander auf O, übertragen werden müssen.

Elektronen, die paarweise von Metaboliten abgespalten werden (z.B. bei der

508

Einführung in den Stoffwechsel

Abb. 14.11 Reduktion von NAD* zu NADH. R steht für die Ribose-pyrophosphoryl-adenosinEinheit des Coenzyms. Nur der Nicotinamidring ist von der Reduktion betroffen, die formal hier als Hydridionübertragung angegeben ist.

\

INH,

an

In N R

|

HH

l

INH,

a

a

N

N

NAD*

NADH

NH,

Abb. 14.12 Flavinadenindinucleotid (FAD). Adenosin (rot) ist über eine Pyrophosphorylgruppe (grün) an Riboflavin (schwarz) gebunden. Der

N”

Riboflavinanteil von FAD ist auch als Vitamin B,

Riboflavin

5

E

Il

|

| .I

|

| >

3

k

bekannt.

CH, -—0—P—0—P-—OCH, H—Ü&=OERibitol

H-—

Oz

O HH

5—OH

H—GCZOH | CHa

H;C

N

H3C

N

t Adenosin

a >:

NH

OÖ

Zwei-Elektronen-Reduktion von NAD'), müssen daher auf andere Trägermoleküle übertragen werden, die sowohl Zwei-Elektronen- als auch Ein-ElektronenRedoxreaktionen durchführen können. FAD (Abb. 14.12) ist ein solches Coenzym. Das konjugierte Ringsystem von FAD kann ein oder zwei Elektronen aufnehmen, wodurch das stabile Radikal (Semichinon) FADH- bzw. das vollständig reduzierte (Hydrochinon) FADH, gebildet wird (Abb. 14.13). Die mit der Reduktion verbundene Änderung des Ladungszustands im Ringsystem äußert sich in einer Farbänderung von leuchtend gelb (im FAD) nach blass gelb (in FADH;3). Die Aufgaben, die NAD* und FAD im Stoffwechsel übernehmen, erfordern, dass sie reversible Reduktionen eingehen und Elektronen aufnehmen können, diese an andere Elektronen-Trägermoleküle weiterreichen und dabei in den Ausgangsstatus zurückkehren, um an weiteren Cyclen von Oxidationsund Reduktionsreaktionen teilnehmen zu können. Der Mensch kann den Flavinanteil des FAD nicht selbst herstellen. Er muss daher mit der Nahrung aufgenommen werden, z.B. in Form des Riboflavins (Vitamin B,; Abb. 14.12). Dennoch kommt ein Riboflavinmangel beim Menschen relativ selten vor, z. T. deshalb, weil die prosthetische Gruppe des Flavins an sein Apoenzym fest bindet. Die Symptome eines Riboflavinmangels, der bei genereller Fehlernährung oder exotischen, einseitigen Diäten auftreten kann, sind eine entzündete Zunge, Läsionen der Mundschleimhaut sowie Dermatitis.

Reduktions- und Oxidationsreaktionen

B.

509

Die Nernst’sche Gleichung

Reduktions-Oxidations-Reaktionen ähneln anderen chemische Gruppen übertragenden Reaktionen, nur dass die übertragenen „Gruppen“ Elektronen sind, die von einem Elektronendonator (dem Reduktionsmittel) an einen Elektronenakzeptor (das Oxidationsmittel) abgegeben werden. So wird z.B. bei der Reaktion Fet+Ccu*

—

Fet+Cu*

Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD) (oxidierte bzw. Chinon-Form)

Cu” (das Reduktionsmittel) zu Cu?* oxidiert, während Fe’* (das Oxidationsmittel) zu Fe?* reduziert wird. Redoxreaktionen können in zwei Teilreaktionen oder Redoxpaare unterteilt werden:

Fe’* +e” =

Cu* ==

Fe?* (Reduktion)

Cu”* + e” (Oxidation) FADH:

(Radikal- bzw. Semichinon-Form)

Deren Summe ergibt die oben angegebene Gesamtreaktion. Diese beiden aufgeführten Teilreaktionen kommen im oxidativen Stoffwechsel bei der durch Cytochrom-c-Oxidase katalysierten Elektronenübertragung in den Mitochondrien (Abschnitt 18.2F) vor. Zu beachten ist, dass beide Teilreaktionen gleichzeitig ablaufen müssen, wenn Elektronen übertragen werden sollen. Die Elektronen bilden praktisch das gemeinsame Zwischenprodukt der beiden Teilreaktionen. Elektrochemische Zellen Eine Teilreaktion bestehi aus einem Elektronendonator und dem konjugierten Elektronenakzeptor. In der oben genannten Oxidationsteilreaktion ist Cu* der Elektronendonator, Cu’* der konjugierte Elektronenakzeptor. Zusammen bilden sie ein konjugiertes Redoxpaar, ein Analogon zum konjugierten Säure-Base-Paar (HA und A’; Abschnitt 2.2B). Ein wichtiger Unterschied zwischen Redoxpaaren und Säure-Base-Paaren ist jedoch, dass die beiden Teilreaktionen einer Redoxreaktion, von denen jede aus einem konjugierten Redoxpaar besteht, physikalisch voneinander getrennt werden können (elektrochemische Zelle) (Abb. 14.14). In einer elektrochemischen Zelle läuft jede Teilreaktion in einer separaten Halbzelle ab. Zwischen den Halbzellen fließen Elektronen als elektrischer Strom durch den Draht, der die beiden Elektroden verbindet. Um den Stromkreis zu schließen,

ist eine Salzbrücke nötig; sie bildet einen Kanal für die zur Aufrechterhaltung der Elektroneutralität nötige Ionenwanderung. Die Freie Enthalpie einer Redoxreaktion lässt sich besonders einfach durch Messung des Spannungsunterschieds zwischen ihren beiden Halbzellen bestimmen. Betrachten wir die allgemeine Redoxreaktion: Ay

+ Bed —

Ared + Dr

bei der n Elektronen pro Mol Reaktanten vom Reduktionsmittel (B,.a) auf das

Oxidationsmittel (A”*) übertragen werden. Die Freie Enthalpie dieser Reaktion lässt sich wie folgt ausdrücken: o el) np[Area][ Bi; AG = AÄG-PRT

14.4 (14.4)

Unter reversiblen Bedingungen gilt:

AG = -w' = wi

(14.5)

wobei w’ die drucklose Volumenarbeit ist. In diesem Fall ist w’ gleich der elektrischen Arbeit w,, die auf Grund der elektrischen Potentialdifferenz A&® für den

FADR; (reduzierte bzw. Hydrochinon-Form)

Abb. 14.13 Reduktion von FAD zu FADH.. R steht für die Ribitol-pyrophosphoryl-adenosinEinheit des Coenzyms. Das konjugierte Ringsystem

von FAD kann sowohl zwei aufeinander folgende Ein-Elektronen-Reduktionen als auch eine ZweiElektronen-Übertragung (die das Semichinonintermediat umgeht) eingehen.

510

_ Einführung in den Stoffwechsel

Transport von n Mol Elektronen erforderlich ist (die Einheit von ® ist Volt (V), der Anzahl an Joule (J), die an Arbeit aufgebracht werden muss, um eine Ladung von 1 Coulomb (C) zu transportieren). Diese beträgt nach den Gesetzen der Elektrostatik w. = NnFAE

(14.6)

wobei $, das Faraday, die elektrische Ladung von einem Mol Elektronen (1F=

96.494 C - mol"!= 96.494 ] - V!- mol!) und n die Anzahl Mole an übertragenen

Elektronen pro Mol umgesetzten Reaktanten entspricht. Durch Einsetzen von Gleichung 14.6 in Gleichung 14.5 erhält man somit

AG = -nFN&

(14.7)

Die Kombination von Gleichung 14.6 und 14.5 und analoge Substitution für AG? ergeben die Nernst’sche Gleichung:

A&-A®-—In(ee) nF

\[A0x l[Bres]

(14.8)

X

die erstmals 1881 von Walther Nernst aufgestellt wurde. &, das Redoxpotential, und A®%, die elektromotorische Kraft (EMK), können hier als der „Elektronendruck“ beschrieben werden, den die elektrochemische Zelle ausübt. Die Größe &° (das Redoxpotential, bei dem alle Komponenten im Standardzustand vorliegen) wird als Standardredoxpotential bezeichnet. Wenn mit diesen Standardzuständen biochemische Standardzustände (Abschnitt 1.3D) gemeint sind, wird &° durch 8°’ ersetzt. Zu beachten ist, dass ein positives A® in Gleichung 14.7 einem negativen AG entspricht. Mit anderen Worten: Ein positives A® zeigt eine spontane Reaktion an, die Arbeit verrichten kann.

C.

Messung von Redoxpotentialen

Wie Gleichung 14.7 zeigt, kann die Änderung der Freien Enthalpie bei einer Redoxreaktion durch einfaches Messen ihres Redoxpotentials mit einem Voltmeter bestimmt werden (Abb. 14.14). Infolgedessen werden Spannungsmessungen häufig angewendet, um die Abfolge der spontan ablaufenden Elektronenübertragungsreaktionen innerhalb eines Elektronentransportwegs (wie z.B. bei der oxidativen Phosphorylierung) zu bestimmen. Jede Redoxreaktion kann in ihre beiden Teilreaktionen aufgeteilt werden: Ar

Nenn

n+

en,

Bo

Abb. 14.14

Eine elektrochemische Zelle.

Die Halbzelle, in der die Oxidation

(hier: Cu'— Cu?*+ e‘) stattfindet, gibt die freigesetzten Elektronen über den Draht an die Halbzelle ab, in der die Reduktion

(hier: e° + Fe’'— Fe?*) abläuft. Die Elektroneutralität in den beiden Halbzellen wird durch die Wanderung von Ionen über die elektrolythaltige Salzbrücke gewährleistet.

+mer

=

Ar Bied

Reduktions- und Oxidationsreaktionen

Nach der Definition werden beide Teilreaktionen als Reduktion geschrieben. Diesen Teilreaktionen können gemäß der Nernst’schen Gleichung folgende Redoxpotentiale, &, und &,, zugewiesen werden:

NR!

KyN =®&

A

511

Rechenbeispiel 14.2 En TNEISETELTENIIEIESTICF FIN

Berechnen Sie AG°’ für die Oxidation von

[Area]

NADH durch FAD.

nF In (Ge

(14.9)

Fasst man die relevanten Teilreaktionen

zusammen, gilt:

BIO

&p = = 8% 8% --— — ) —— InIn | (B8

(14.10)

Berechnen Sie dann die elektromotorische Kraft (A®°’) aus dem Standardreduktionspotential aus Tabelle 14.5. Verwenden sie die folgenden Methoden.

Für die gesamte Redoxreaktion aus diesen zwei Teilreaktionen gilt: AE° = ©° - Akzeptor —&°-Donator

(14.11)

Für eine Reaktion mit A als Elektronenakzeptor und B als Elektronendonator ergibt sich demnach A®° = &°,- &°, und A& = &,- &;.

>=H;l)

A8°' = (-0,219 V) - (-0,315 V) = +0,096 Methode 2

ist die Teilreaktion die gleiche wie die

Biochemische Teilreaktionen sind von physiologischer Bedeutung Die Standardreduktionspotentiale (A®°’) einiger biochemisch relevanter Teilreaktionen sind in Tabelle 14.5 zusammengestellt. Die oxidierte Form eines Redoxpaares mit einem hohen positiven Standardreduktionspotential weist eine hohe Elektronenaffinität auf und ist daher ein guter Elektronenakzeptor (ein starkes Oxidationsmittel), während das konjugierte Reduktionsmittel einen schlechten Elektronendonator (ein schwaches Reduktionsmittel) darstellt. So ist z.B. O, in Tabelle 14.5 das stärkste Oxidationsmittel, während H,O, das seine Elektronen gut festhält, das schwächste Reduktionsmittel in der Tabelle ist. Das Gegenteil gilt für Teilreaktionen mit großen negativen Standardreduktionspotentialen. Da Elektronen spontan von niedrigen zu hohen Reduktionspotentialen fliesie unter

(e-Donator)

Schreiben Sie die Nettoreaktion als Summe der zwei relevanten Teilreaktionen. Für FAD

Dabei steht H* bei pH 0, 25°C und 10° kPa im Gleichgewicht mit gasförmigem Wasserstoff, H,(g), der Kontakt mit einer Pt-Elektrode hat. Dieser Halbzelle wird willkürlich ein Standardreduktionspotential & vonO V(1V=1]-C’) zugeordnet. Daraus ergibt sich für die Wasserstoffteilreaktion bei pH 7 ein Standardreduktionspotential &°’ von -0,421 V. Bei positivem A® ist AG negativ (Gl. 14.7) und zeigt somit einen spontanen Prozess an. Bei der Kombination zweier Teilreaktionen unter Standardbedingungen verläuft die Reaktion daher spontan in der Richtung, die der Reduktion des Redoxpaars mit dem positiveren Standardreduktionspotential entspricht. Mit anderen Worten: Je positiver das Standardreduktionspotential, desto höher die Elektronenaffinität der oxidierten Form. Daraus ergibt sich für die oxidierte Form eine umso größere Tendenz, Elektronen aufnehmen zu können und dadurch in die reduzierte Form überzugehen.

ßen, werden

= ©” (eAkzeptor) = ©°

Da FAD (8° = -0,219 V) der Elektronenakzeptor ist und NADH (8° = -0,315 V) der Elektronendonator ergibt sich

Redoxpotentiale müssen, wie Freie Enthalpien, bezogen auf einen willkürlichen Standard definiert werden. Nach Übereinkunft erfolgt dies bei Standardreduktionspotentialen bezogen auf die Wasserstoffteilreaktion: +2e"

Methode 1

Gemäß der Gleichung 14.11 ergibt sich: AE

Standardreduktionspotentiale werden verwendet, um Elektronenaffinitäten zu vergleichen

2 H*

NADH + FAD + H'— NAD*+ FADH,

Standardbedingungen

von den reduzierten

Produkten

einer beliebigen Teilreaktion in Tabelle 14.5 auf die oxidierten Reaktanten jeder beliebigen darüber stehenden Teilreaktion übertragen (siehe Rechenbeispiel 14.2). Die Geschwindigkeit kann hierbei allerdings unmessbar klein sein, falls kein geeignetes Enzym zugegen ist. Zu beachten ist, dass die Fe’*-Ionen der verschiedenen in Tabelle 14.5 aufgeführten Cytochrome deutlich unterschiedliche Redoxpotentiale haben. Das zeigt, dass die Proteinkomponenten von

reduktive Teilreaktion aus Tabelle 14.5 und ihr ©°’-Wert beträgt -0,219V. Für NADH, das eher oxidiert als reduziert wird, ist der

Teilreaktion die Umgekehrte zu der einen in Tabelle 14.5 und ihr &°’-Wert beträgt +0,315 V, dem Umgekehrten des Reduk-

tionspotentials, das in der Tabelle angegeben ist. Die zwei Teilreaktionen werden addiert

und ergeben die Netto-Oxidoreduktionsreaktion. Die &°’-Werte werden auch addiert:

NADH — NAD*+ H*+ 2”

&°'=-0,219 V &°'=40,315 V

NADH + FAD+H*—

&%°’=+0,096 V

FAD +2 H*+2e—>FADH, NAD*’+FADH,

Verwenden Sie dann Gleichung 14.7, um AG°’ zu berechnen. Da zwei Mol Elektronen übertragen werden pro Mol zu NAD" oxidiertem NADH, ist n=2

AG? = -nFAE®?'

AG?’ = -(2) (96.485 ) - V'-mol"')(0,096 V) = -18,5 k)- mol"

512

Einführung in den Stoffwechsel Tab. 14.5

Standardreduktionspotentiale einiger Teilreaktionen mit biochemischer Bedeutung.

Teilreaktion

OR

j

HIR2E—

NO; +2 H*+2e

;

RD

0,815

1,0

=NO;

Se Mm ch

0,42

+ H,O

\

Cytochrom a; (Fe’*) + e = Cytochrom a; (Fe)

0,295

O,(g)+2H’ +22. =H,0O, Cytochrom a (Fe) +C = Shop

0,385

0,29

a (Fe’*)

Cytochrom c (Fe?*) + € = Cytochrom c (Fe’*)

0,235

Cytochrom c, (Fe’*) + € = Cytochrom c, (Fe’*)

0,22

Cytochrom b (Fe’*) + € = Cytochrom b (Fe’*) (mitochondrial)

k

0,077

Ubichinon + 2 H* +2 e = Ubichinol

0,045

Fumarat + 2 H' + 2 e = Succinat”

0,031

FAD +2 H' +2 e = FADH, (in Flavoproteinen)

=0

Oxalacetat +2 H* +2 e = Malat

-0,166

Pyruvat

—0,185

+2 H* +2e = Lactat

Acetaldehyd + 2 H* + 2 e' = Ethanol

-0,197

FAD +2 H’ +2 e = FADH, (freies Enzym)

-0,219

Ss

0,23

2 He

2a

=Ehs

Liponsäure + 2 H* + 2 e' = Dihydroliponsäure

-0,29

NAD’ + H’ +2 e = NADH

—0,315

NADP* + H* +2 e = NADPH Cystindisulfid

;

+2 H’ +2 e = 2 Cystein

-0,320 0,340

Acetacetat + 2 H’ + 2 e = ß-Hydroxybutyrat

0,346

Hr us

-0,421

SO

oh, Hissolen — ISO-ESLTO

-0,515

Acetat + 3 H* +2 e° = Acetaldehyd + H,O

0,581

Quelle: Zum größten Teil aus Loach, P.A., in Fasman, G.D. (Hrsg.), Handbook of Biochemistry and Molecular Biology (3. Aufl.), Physical and Chemical Data, Band I, S. 123-130, CRC Press

(1976).

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 Il, Welche Rolle spielen reduzierte

Coenzyme im Stoffwechsel? Erklären sie die einzelnen Terme der Nernst’schen Gleichung. Wie verhält sich A® zu AG?

Redoxenzymen eine aktive Rolle bei Elektronenübertragungsreaktionen spielen, indem sie die Redoxpotentiale der an sie gebundenen redoxaktiven Zentren regulieren. Elektronenübertragungsreaktionen sind von großer biologischer Bedeutung. So werden z.B. in der mitochondrialen Elektronentransportkette (Abschnitt 18.2) Elektronen von NADH über eine Reihe von Elektronenakzeptoren (inklusive FAD und anderer in Tabelle 14.5 aufgeführter Verbindungen) mit steigendem Reduktionspotential auf O, übertragen. Die Synthese von ATP aus ADP und P; ist an diese Freie-Enthalpie-Kaskade gekoppelt. NADH fungiert dabei als energiereiches Coenzym der Elektronenübertragung. Die Oxidation eines NADH zu NAD* liefert genügend Freie Enthalpie, um drei ATP-Moleküle zu bilden. Das NAD* ist in vielen exergonen Oxidationen von Metaboliten der Elektronenakzeptor. Als Elektronendonator bei der ATP-Synthese erfüllt es in analoger Weise zum ATP (Abb. 14.8) eine cyclische Funktion als Überträger von Freier Enthalpie.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung von Stoffwechselvorgängen

4

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung von Stoffwechselvorgängen

Ein Stoffwechselweg kann von verschiedenen Seiten her betrachtet werden: 1. Anhand der Abfolge der Reaktionen, durch die bestimmte Nährstoffe in die Endprodukte umgewandelt werden, und deren Energetik bei diesen Umwandlungen. 2. Anhand des Mechanismus, durch den jedes Zwischenprodukt in das nachfolgende umgewandelt wird. Solch eine Untersuchung bedarf der Isolierung und Charakterisierung spezifischer Enzyme, die jede einzelne Reaktion katalysieren. 3. Anhand der Kontrollmechanismen, die den Metabolitenfluss innerhalb eines Stoffwechselwegs regulieren. Das beinhaltet den Informationsaustausch zwischen den Organen, um die metabolische Aktivität dem Bedarf im gesamten Organismus anzupassen.

Einen Stoffwechselweg auf all diesen Ebenen zu erfassen ist komplex und bedarf oft der Beteiligung vieler verschiedener Fachrichtungen. Die Grundzüge der wichtigsten Stoffwechselwege sind seit Jahrzehnten bekannt, dennoch bleibt in vielen Fällen die Enzymologie, die sich hinter vielen Schritten verbirgt, unklar. So sind die Mechanismen, die die Stoffwechselaktivität unter verschiedenen physiologischen Bedingungen regulieren, noch nicht gänzlich verstanden. Die Erweiterung des Wissens auf diesen Gebieten könnte darüber Aufschluss geben, wie die menschliche Gesundheit und die Heilung von Krankheiten verbessert werden können. Weitere Informationen können von bislang unerforschten Lebewesen, wie den kürzlich entdeckten „Extremophilen“, gewonnen werden. Sie lassen die Entdeckung neuer biologischer Bausteine und enzymatischer Prozesse erhoffen, die für eine umweltbewusste Produktion von Industriegütern, Lebensmitteln und Arzneimitteln genutzt werden können. Frühe Stoffwechseluntersuchungen verwendeten ganze Organismen, meist Hefe, aber auch Säugetiere. Beispielsweise fanden 1921 Frederick Banting und Charles Best die Rolle des Pankreas bei Diabetes heraus: Sie entfernten operativ dieses Organ aus Hunden und beobachteten, wie diese Tiere Diabetes entwickelten (Exkurs 22.1). Seither haben sich die Techniken, um Genaueres über Stoffwechselprozesse zu erfahren, stark verbessert, von Präparationen ganzer Organe und dünnen Gewebestücken bis hin zu Zellkulturen und isolierten Einzelorganellen. Die jüngsten Ansätze beinhalten die Identifizierung aktiver Gene und die Katalogisierung ihrer Proteinprodukte.

A.

Nachweis von Stoffwechselvorgängen

Ein Stoffwechselweg, bei dem eine Verbindung in eine andere umgewandelt wird, kann mit Hilfe eines spezifisch markierten Metaboliten verfolgt werden. Franz Knoop führte diese Technik im Jahre 1904 für die Untersuchung der Fettsäureoxidation ein. Er fütterte Hunde mit Fettsäuren, die chemisch mit Phenylgruppen markiert waren, und isolierte die phenylsubstituierten Endprodukte aus dem Harn der Hunde. Anhand der Unterschiede, die sich zeigten, je nachdem, ob das phenylsubstituierte Ausgangsmaterial eine gerade oder ungerade Anzahl an Kohlenstoffatomen enthielt, leitete Knoop ab, dass Fettsäuren in Einheiten zu je zwei Kohlenstoffen abgebaut werden (Abschnitt 20.2). Eine chemische Markierung hat den Nachteil, dass die chemischen Eigenschaften der markierten Metabolite sich von unmarkierten unterscheiden. Dieses Problem kann durch die Markierung mit Isotopen umgangen werden. Das Schicksal eines Isotops (markierten Atoms) in einem Metaboliten kann dadurch

513

514

Einführung in den Stoffwechsel

bei seiner Umsetzung in einem Stoffwechselweg mitverfolgt werden. Das Aufkommen der Isotopenmarkierung und der Markierungstechniken in den 1940er Jahren revolutionierte die Untersuchungen des Stoffwechsels. Zu einem besseren Verständnis von Stoffwechselvorgängen trugen schon die frühen Untersuchungen mit Isotopenmarkern bei, die David Shemin und David Rittenberg im Jahr 1945 durchführten. Sie konnten demonstrieren, dass sich die Stickstoffatome des Häm (Abb. 7.2) allein aus Glycin und nicht aus Ammoniumionen, Glutaminsäure, Prolin oder Leucin ableiten (Abschnitt 21.6A). Hierfür fütterten sie Ratten mit '"”N-markierten Nährstoffen, isolierten das Häm aus deren Blut und analysierten den Gehalt an "N. Nur wenn den Ratten [PN]Glycin gefüttert wurde, enthielt das Häm "N. Die gleiche Technik wurde mit dem radio-

aktiven Isotop '*C durchgeführt, um zu beweisen, dass der gesamte Kohlenstoffgehalt im Cholesterin sich von Acetyl-CoA ableitet (Abschnitt 20.7A). Radioaktive Isotope (Exkurs 12.1) sind praktisch nicht mehr wegzudenken, wenn der metabolische Ursprung komplexer Stoffwechselprodukte geklärt werden soll. Eine weitere Methode, um den Verbleib markierter Metabolite zu verfolgen, ist die Kernresonanzspektroskopie (engl.: nuclear magnetic resonance, NMR), die

spezifische Isotope wie 'H, '’C,

"N und °'P auf Grund ihres charakteristischen

Kernspins nachweist. Da sich das NMR-Spektrum einer bestimmten Kernart mit seiner unmittelbaren Umgebung ändert, ist es möglich, die Signale sogar in relativ komplexen Mischungen spezifischen Kernen zuzuordnen. Die Entwicklung von Magneten, die groß genug sind, um sie für Tiere und Menschen anzupassen und damit Spektren spezifischen Organen zuweisen zu können, hat es ermöglicht, nicht invasiv Stoffwechselvorgänge mit NMR-TIechniken zu erforschen. ?IP-NMR kann z.B. verwendet werden, um den Energiestoffwechsel im Muskel zu untersuchen, indem der Gehalt an phosphorylierten Verbindungen wie ATP, ADP und Phosphocreatin überwacht wird. Die Isotopenmarkierung spezifischer Kohlenstoffatome von Metaboliten mit "C (das nur zu 1,1% natürlich vorkommt) erlaubt es, den Stoffwechselprozess

Glucose und

(a)

Glykogen

—

CH,

a

Fl

C1 Glykogen

Abb. 14.15 Der Einbau von [1-"’C]Glucose in Glykogen, mittels lokaler in-vivo-'"’C-NMRSpektroskopie beobachtet. (a) NMR-Spektrum der natürlichen Verteilung von "C in der Leber der Ratte. Beachten Sie die Resonanz, die dem C1 des Glykogens entspricht. (b) Das ""C-NMR-Spektrum derselben Ratte ca. 5 min nach intravenöser Injektion von 100 mg

[1-"C]Glucose (90 %ig angereichert). Die Resonanz des C1-Atoms des a- wie auch des ß-Anomers der Glucose können eindeutig voneinander unterschieden werden, ebenso von der Resonanz des

C1-Atoms des Glykogens. (c) Das '’C-NMR-Spektrum der Leber derselben Ratte ca. 30 min nach der [1-'"C]JGlucoseinjektion. Die Cl-Resonanz der beiden Anomere a- und ß-Glucose ist wesentlich herabgesetzt, während die C1-Resonanz des Glykogens angestiegen ist. [Nach Reo, N.V,, Siegfried, B. A., und Acherman, J.). H.,J.Bio. Chem.

259, 13665 (1984)]

(e)

180

120

60

[®)

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung von Stoffwechselvorgängen

der markierten Atome durch "’C-NMR zu verfolgen. Abbildung 14.15 zeigt

die in vivo "C-NMR-Spektren einer Ratten-Leber vor und nach der Injektion von D-[1-'’C]Glucose. Man kann sehen, wie das °C in die Leber gelangt und in Glykogen (die Speicherform der Glucose; Abschnitt 16.2) eingebaut wird.

515

|

O)-0m-6-000NH} Phenylalanin

B. _ Stoffwechselwege werden durch gezielte Störungen aufgeklärt Viele Techniken, mit denen die Zwischenprodukte und Enzyme eines Stoffwechselwegs nachgewiesen werden sollen, stören hierfür in bestimmter Weise das System und prüfen dann, inwiefern die Aktivität des Stoffwechselwegs beeinträchtigt ist. Einen Stoffwechselweg kann man stören, indem man z.B. bestimmte Substanzen zufügt, die als Stoffwechselinhibitoren bezeichnet werden. Diese blockieren den Stoffwechselweg an bestimmten Stellen und sorgen somit dafür, dass sich die vorangehenden Zwischenprodukte anhäufen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um in der Hefe die Umwandlung von Glucose in Ethanol bei der Glykolyse nachzuweisen (Abschnitt 15.2). Um die Reihenfolge der ElektronenÜberträgermoleküle in der mitochondrialen Elektronentransportkette herzuleiten, wurden entsprechend Substanzen zugesetzt, welche die Elektronenübertragung an verschiedenen Stellen blockieren (Abschnitt 18.2B). Auch bei genetischen Defekten kommt es zu einer Anhäufung von Stoffwechselzwischenprodukten

Die Erkenntnis von Archibald Garrod zu Beginn des 20. Jahrhunderts, dass genetisch bedingte Krankheiten beim Menschen auf einem Mangel bestimmter Enzyme beruhen, hat gleichfalls dazu beigetragen, Stoffwechselwege aufzuklären. Werden beispielsweise mit der Nahrung Phenylalanin oder Tyrosin aufgenommen, so scheiden Personen, die eine ererbte, weitestgehend harmlose, als Alcaptonurie bezeichnete Erkrankung haben, im Gegensatz zu normalen Testpersonen Homogentisinsäure mit ihrem Urin aus (Exkurs 21.2). Menschen mit Alcaptonurie fehlt ein Leberenzym, das den Abbau von Homogentisinsäure katalysiert (Abb. 14.16).

h

HO oH H- c 2—

Fructose-

ap:

1,6-bisphosphat

(FBP)

Glycerinaldehyd3-phosphat

(GAP)

Zu beachten ist hierbei, dass sich mit diesem Reaktionsschritt des Stoffwechselwegs die Nummerierung der Kohlenstoffe ändert. Atome 1, 2 und 3 der Glucose entsprechen nun 3, 2 und 1 des DHAP, also in der umgekehrten Reihenfolge. Atome 4, 5 und 6 werden zu den Atomen 1, 2 und 3 des GAP. Reaktionsschritt 4 entspricht einer Aldolspaltung (Retro-Aldolkondensation), deren basenkatalysierter Mechanismus in Abbildung 15.4 gezeigt ist. Das Enolat-Zwischenprodukt ist auf Grund des elektronenziehenden Charakters des Carbonylsauerstoffatoms resonanzstabilisiert. Zu beachten ist, dass für die Aldolspaltung zwischen C3 und C4 des FBP ein Carbonylsauerstoffatom an C2 und eine Hydroxylgruppe an C4 erforderlich sind. Damit wird erkennbar, welche R

=o I

°— OH

R’

OH

HOH

Basenkatalyse

R

co

ee

> 0

R'

ne

Bindung

R

R

R

H—

Abb. 15.4 Der Mechanismus der basekatalysierten Aldolspaltung. Die Aldolkondensation erfolgt über den umgekehrten Mechanismus.

2:

ml C

2

Produkt 1

Enolat

00 Protonierung

Produkt 2

533

534

Glucose-Katabolismus

„Logik“ sich hinter Reaktion 2 der Glykolyse, der Isomerisierung von G6P zu F6P, verbirgt. Eine Aldolspaltung von G6P ergäbe Produkte mit ungleicher Länge der Kohlenstoffkette, während die Aldolspaltung von FBP zu zwei ineinander umwandelbaren C;-Verbindungen führt, die somit auf demselben Weg abgebaut werden können. Die Katalyse der Aldolspaltung lässt als Zwischenprodukt das durch bessere Elektronendelokalisierung stabilisierte Enolat entstehen. In Tieren und Pflanzen } verläuft die Reaktion wie folgt (Abb. 15.5): Schritt 1 Substratbindung. Schritt 2 Reaktion der FBP-Carbonylgruppe mit der e-Aminogruppe des Lys im aktiven Zentrum unter Bildung eines Iminiumkations, d.h. einer protonierten Schiff’schen Base. Schritt 3 Spaltung der C3-C4-Bindung unter Bildung eines Enamins und Freisetzung des GAP. Das Iminiumion ist eine stärker elektronenziehende Gruppe als das Sauerstoffatom der Carbonylgruppe, die in der Vorstufe vorlag. Die enzymkatalysierte Reaktion läuft leichter ab, weil das Enaminzwischenprodukt (Abb. 15.5, Schritt 3) stabiler ist als das entsprechende Enolatzwischenprodukt der basekatalysierten Aldolspaltung (Abb. 15.4, Schritt 2). Schritt 4 Protonierung des Enamins zu einem Iminiumkation. Schritt 5 Hydrolyse dieses Iminiumkations unter Freisetzung von DHAP, wobei das freie Enzym regeneriert wird.

E.

Triosephosphat-Isomerase

Nur eines der Produkte der Aldolspaltung, GAP, wird im weiteren Verlauf der Glykolyse abgebaut (Abb. 15.1). Jedoch sind DHAP und GAP, genau wie F6P und G6P, Ketose-Aldose-Isomere. DHAP und GAP werden durch eine Isomerisierungsreaktion über ein Endiol (oder-Endiolat) als Zwischenstufe ineinander umgewandelt. Die Triosephosphat-Isomerase (TIM oder TPI) katalysiert diesen Schritt in Reaktion 5 der Glykolyse, die letzte Reaktion von Stufe I.

H

N

H

0

|

H—C— OH |

H—C—0OH |

C=0

2 |

„CHzOPO3

„CH30POF"

Glycerinaldehyd3-phosphat (eine Aldose)

Dihydroxyacetonphosphat

a

2

(eine Ketose)

EndiolZwischenprodukt

Gestützt wird dieses Reaktionsschema durch Experimente mit den Analoga des Übergangszustands, Phosphoglykohydroxamat und 2-Phosphoglykolat. Die Strukturen dieser stabilen Verbindungen ähneln denjenigen der postulierten Endiol- bzw. Endiolatzwischenstufen:

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse

Abb. 15.5 Enzymmechanismus von Klasse-I-Aldolasen. Die Reaktion verläuft über (1) Bindung des Substrats, (2) Bildung einer Schiff’schen Base zwischen dem Lys-Rest im aktiven Zentrum und der Ketogruppe der offenkettigen Form von FBP, (3) Aldolspaltung, durch die ein Enaminzwischenprodukt des Enzyms und DHAP gebildet und GAP freigesetzt wird, (4) Tautomerisierung und Protonierung zur Iminform der Schiff’schen Base und (5) Hydrolyse der Schiff’schen Base unter Freisetzung von DHAP. g% siehe Animated Figures.

CH,OPOF ie | CH,OH Dihydroxyacetonphosphat

(Produkt 2) Fructose-1,6-bisphosphat

1

250

Hydrolyse der Schiff'schen Base

Freies Enzym

Substrat-

bindung

CH,OPOFT +

C=NH—

es

(CH5)4

| EO>— EZ

pro-R

Enzym -SubstratKomplex

Enzym -Produkt protonierte Schiff'sche Base

4

535

Bildung der protonierten Schiff'schen Bas

Tautomerisierung und Protonierung

H,O

CHLOERES Ta — (CH3)4

€

H— GregOH CH,0PO%EnaminZwischenprodukt

Enzym-Substrat-Komplex Glycerinaldehydmit protonierter Schiff'scher Base 3-phosphat

(Produkt 1)

536

Glucose-Katabolismus OH

N

|

N

= C a

Oz

| CH,0POF Phosphoglykohydroxamat

KESSTRRUR NS C Er CH,0POF Postuliertes Endiol-_ Zwischenprodukt

(0)S

>

n

CH,OPO27 2-Phosphoglykolat .

Enzyme katalysieren Reaktionen dadurch, dass sie den Übergangszustandskomplex besser binden als das Substrat (Abschnitt 11.3E). Tatsächlich ist die Bindung von Phosphoglykohydroxamat und 2-Phosphoglykolat an TIM 155- bzw. 100-mal stärker als diejenige von GAP oder DHAP. Glu 165 und His 95 wirken als allgemeine Säure bzw. Base

Mechanistische Betrachtungen lassen vermuten, dass die Umwandlung von GAP in das Endiolzwischenprodukt zum einen durch eine Base, die ein Proton von C2 des GAP abzieht, wie auch durch eine Säure katalysiert wird, die den Car-

bonylsauerstoff protoniert. Röntgenstrukturuntersuchungen verdeutlichen, dass die Seitenketten von Glu 165 optimal für die Abstraktion des C2-Protons von GAP ausgerichtet ist (Abb. 15.6). In der Tat ist die Carboxylgruppe bei mutagenem Austausch von Glu 165 gegen Asp zwar nur um 0,1 nm weiter vom Substrat entfernt als im Wildtyp-Enzym, die katalytische Aktivität von TIM ist dadurch jedoch 1000fach reduziert. Ähnlich zeigen Röntgenstrukturanalysen, dass His 95 über Wasserstoffbrücken gebunden ist und so optimal positioniert ist, um den Carbonylsauerstoff des GAP zu protonieren. Die positiv geladene Seitenkette von Lys 12 stabilisiert vermutlich über elektrostatische Wechselwirkungen den negativ geladenen Übergangszustand der Reaktion. Bei der Umwandlung des Endiolzwischenprodukts in DHAP entspricht Glu 165 einer allgemeinen Säure, die C1 protoniert, und His 95 einer allgemeinen Base, die das Proton von der OH-Gruppe abzieht und dabei diese katalytisch aktiven Gruppen in den ursprünglichen Protonierungszustand zurückversetzt. Eine flexible Schleife verschließt das aktive Zentrum Der Vergleich zwischen der Röntgenstruktur von TIM und deren Phosphoglykohydroxamat-Komplexes macht deutlich, dass eine konservierte, zehn Reste lange Schleife das aktive Zentrum wie eine Klappe verschließt, sobald das Substrat an TIM bindet. Diese Bewegung umfasst eine Kettenrückgratverschiebung um mehr als 0,7 nm (Abb. 15.6). Ein 4 Reste langer Abschnitt in dieser Schleife

Abb. 15.6 Ein Bänder-Diagramm der Hefe-TIM im Komplex mit seinem Übergangszustandanalogon 2-Phosphoglykolat. Eine einzelne Untereinheit dieses homodimeren

Enzyms wird ungefähr entlang der Achse des a/ß-Fasses betrachtet. Die flexible Schleife ist cyan,

die Seitenketten der für die Katalyse wichtigen Reste Lys, His und Glu sind violett, magenta bzw. rot dargestellt. Das 2-Phosphoglykolat ist als Kalottenmodell wiedergegeben und farbig entsprechend der Atomart markiert (©, grün; O, rot; P, gelb). [Nach der von Gregory Petsko, Brandeis University, bestimmten

Röntgenstruktur. PDBid 2YPI.] 2% siehe Interactive Exercises und Kinemage Exercises 12-1 und 12-2.

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse

ist über Wasserstoffbrückenbindungen mit der Phosphatgruppe des Substrats verbunden. Werden diese vier Reste durch Mutagenese entfernt, ist die Struktur des Proteins nicht signifikant verändert, die Substratbindung ist daher nicht wesentlich gestört. Die katalytische Leistung des mutierten Enzyms ist jedoch um den Faktor 10° verringert, das Enzym bindet nur noch schwach Phosphoglykohydroxamat. Offensichtlich stabilisiert die Struktur der geschlossenen Schleife bevorzugt den endiolähnlichen Übergangszustand des Substrats bei der enzymatischen Reaktion. Der Schleifenverschluss in der TIM-Reaktion ist ein bemerkenswertes Beispiel für die sogenannte stereoelektronische Kontrolle, die Enzyme in einer Reaktion ausüben können. In Lösung wird das Endiolzwischenprodukt vollständig durch Abspaltung des Phosphats an C3 zu der toxischen Verbindung Methylglyoxal abgebaut: (6)

HG

/ \

c=0O

H3;C

/

Methylglyoxal

An der Enzymoberfläche kommt es jedoch nicht zu dieser Reaktion, da die Phosphatgruppe durch die flexible Schleife in eine Stellung gebracht wird, welche die Phosphateliminierung verhindert. Im mutierten Enzym, das die flexible Schleife nicht enthält, kann das Endiol das aktive Zentrum verlassen: Ca. 85% des Endiolzwischenprodukts wird in Lösung freigesetzt, wo es rasch zu Methylglyoxal und P; abgebaut wird. Der Schleifenverschluss sorgt somit dafür, dass das Substrat effektiv in Produkt umgewandelt wird. a/ß-Fass-Enzyme könnten durch divergente Evolution entstanden sein

Bei TIM wurde erstmals eine a/ß-Fassstruktur beobachtet, die auch allgemein als TIM-Fass (engl.: TIM barrel) geläufig ist. Hierbei handelt es sich um einen Zylinder aus acht parallelen ß-Strängen, die von acht parallelen a-Helices umgeben sind (Abb. 6.30c). Dieses charakteristische strukturelle Motiv wurde seither in zahlreichen Proteinen gefunden; bei beinahe allen handelt es sich um Enzyme (inklusive der Enzyme für die Glykolyse Aldolase, Enolase und PyruvatKinase). Interessanterweise sind die aktiven Zentren aller bekannten a/ß-FassEnzyme am Fassrand lokalisiert, der die C-terminalen Enden der ß-Stränge enthält. Eine strukturell logische Erklärung hierfür gibt es nicht. Obwohl nur wenige dieser Proteine signifikante Sequenzähnlichkeiten aufweisen, wurde postuliert, dass alle von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen (divergente Evolution). Andererseits wird auch diskutiert, dass das a/ß-Fass eine stabile Anordnung ist, welche die Natur auf verschiedenen Wegen unabhängig voneinander entwickelt hat (konvergente Evolution). Triosephosphat-Isomerase ist ein perfektes Enzym

TIM hat, wie Jeremy Knowles gezeigt hat, im Bezug auf ihre Reaktion katalytische Perfektion erreicht, denn die Geschwindigkeit der bimolekularen Assoziation des Substrats an das Enzym ist allein diffusionskontrolliert. Dies bedeutet, dass die Bildung des Produkts praktisch ebenso rasch erfolgt, wie Enzym und Substrat in Lösung zusammenstoßen. Eine weitere Steigerung der katalytischen Effizienz von TIM würde daher zu keiner weiteren Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit führen. Da die gegenseitige Umwandlung von GAP und DHAP sehr effizient ist, sind die Konzentrationen beider Metabolite ständig im Gleichgewicht: K = [GAP]/

[DHAP] = 4,73 x 10°; d.h. im Gleichgewicht ist [DHAP] > [GAP]. Unter

den Bedingungen des Fließgleichgewichts, das in einer Zelle herrscht, wird je-

537

538

Glucose-Katabolismus

KaIEs

Phosphorylierung

doch GAP in den weiteren Reaktionsschritten der Glykolyse verbraucht. Da GAP auf diese Weise entzogen wird, muss mehr DHAP in GAP umgewandelt werden, um das Gleichgewichtsverhältnis aufrechtzuerhalten. Demnach werden beide Produkte der Aldolasereaktion über einen gemeinsamen Stoffwechselweg weiter umgesetzt. Zusammenfassung der bisherigen Schritte der Glykolyse Mit der Umwandlung der Glucose in zwei GAP ist die erste Stufe der Glykolyse

Isomerisierung

[Are |

Phosphorylierung

abgeschlossen (Abb. 15.7); bei diesem Prozess werden zwei Moleküle ATP verbraucht. Diese Investition an Energie wurde bis hierher noch nicht ausgeglichen, jedoch kann das energiearme GAP mit Hilfe einiger chemischer Kunstgriffe in energiereiche Verbindungen ungewandelt werden, deren Freie Enthalpie bei der Hydrolyse mit der Synthese von ATP in der zweiten Stufe der Glykolyse gekoppelt werden kann. i

a|

F. _ Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase: Bildung des ersten energiereichen Zwischenprodukts Spaltung

Abb. 15.7

Schematische Übersicht von der

ersten Stufe der Glykolyse. In dieser Reaktionsreihe wird eine Hexose

phosphoryliert, isomerisiert, erneut phosphoryliert und schließlich in zwei ineinander umwandelbare Triosephosphate gespalten. Zwei Moleküle ATP werden bei diesem Prozess verbraucht.

Reaktionsschritt 6 der Glykolyse verläuft über eine Oxidationsreaktion und eine Phosphorylierung von GAP durch NAD’ und P.. Er wird durch Glycerinaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; Abb. 6.31) katalysiert. Dies ist das erste Beispiel für einen chemischen Kunstgriff, auf den oben angespielt wurde. Bei dieser Reaktion treibt die Aldehydoxidation, eine exergone Reaktion, die Synthese des energiereichen Acylphosphats 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG) an. Man erinnere sich, dass es sich bei Acylphosphaten um Verbindungen mit hohem Übertragungspotential für Phosphorylgruppen handelt (Abschnitt 14.2C).

Op E50

OH

+

NAD*

+

P;

„CHzOPO5" Glycerinaldehyd-

3-phosphat (GAP) Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase (GAPDH)

OBEORG, ©

| ee

+

NADH

+

H*

„CHzOPO3" 1,3-Bisphosphoglycerat

(1,3-BPG)

Mechanistische Untersuchungen

Verschiedene enzymologische Schlüsselexperimente haben zur Aufklärung des GAPDH-Reaktionsmechanismus beigetragen: 1. GAPDH wird durch Alkylierung mit stöchiometrischen Mengen lodacetat inaktiviert. Im Hydrolysat des erhaltenen alkylierten Enzyms ist Carboxymethyleystein vorhanden (Abb. 15.80), was darauf schließen lässt, dass GAPDH eine Cys-Sulfhydrylgruppe im aktiven Zentrum trägt. 2. GAPDH überträgt °H quantitativvom C1 von GAP aufNAD* (Abb. 15.8b), was beweist, dass diese Reaktion über eine direkte Hydridübertragung verläuft.

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse

539

(a) HI

Enzym

— CH,—SH

+ ICH,COO

Enzym —CH,—S—CH,C00- as des

GAPDH

Cys im

Iodacetat

Ana Et \, —CH,—S—CH;COO- + Amino-

ere

C007

b

Proteins

aktiven Zentrum

a

Carboxymethylcystein

(b) oOSc 3SH Bin OH

(6)N H _OPO32 +

NAD*+

P;

sushi

| ECO]

+

|

CH,OPOF-

NAD°®H

CH5OPOF"

[1->H]GAP

1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG)

(c) 6)

O7

ga BZ

>07

Oz

|

+08

BR

|

CH,

O7

GAPDH

0ZZ

(6)

l

HOP 07

O2

+

Oz

a2 | 0—-P=O

©

l

Oz

CH;

Acetylphosphat

3. GAPDH katalysiert den Austausch von °P zwischen P; und Acetylphosphat, einem Analogon des Produkts (Abb. 15.8c). Derartige Isotopenaustauschreaktionen weisen auf ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt hin: Die Acetylgruppe geht einen kovalenten Komplex mit dem Enzym ein, ähnlich dem Acyl-Enzym-Zwischenprodukt beim Reaktionsmechanismus der Serin-Protease (Abschnitt 11.5C). David Trentham hat auf Grund dieser Erkenntnisse und der Ergebnisse kinetischer Untersuchungen einen Mechanismus für GAPDH postuliert (Abb. 15.9): Schritt 1 GAP bindet an das Enzym. Schritt 2_ Die essentielle Sulfhydrylgruppe, die als Nucleophil fungiert, greift die Aldehydgruppe an und bildet so ein Thiohalbacetal. Das Thiohalbacetal wird durch direkte Übertragung eines HydridSchritt 3 ions auf NAD* zu einem Acylthioester oxidiert. Dieses Zwischenprodukt, das isoliert werden konnte, besitzt eine hohe Freie Enthalpie bei der Hydrolyse. Die Energie der Aldehydoxidation wurde also nicht vergeudet, sondern durch die Synthese des Thioesters und die Reduktion von NAD* zu NADH konserviert. P; bindet an den Enzym-Thioester-NAD-Komplex. Schritt 4 Das Thioesterzwischenprodukt wird nucleophil von P; angegriffen. Schritt 5 Dabei wird das energiereiche gemischte Anhydrid 1,3-BPG gebildet. 1,3-BPG dissoziiert dann vom Enzym, NADH wird durch ein anderes NAD*-Molekül ersetzt und das freie Enzym so regeneriert.

G.

_Phosphoglycerat-Kinase: Produktion des ersten ATP

Beim Reaktionsschritt 7 der Glykolyse wird neben 3-Phosphoglycerat (3PG, siehe Formel rechts) auch erstmals ATP gebildet. Diese Reaktion wird durch Phosphoglycerat-Kinase (PGK) katalysiert. (Zu beachten ist, dass dieses Enzym als

Abb. 15.8

Reaktionen, mit deren Hilfe der

Enzymmechanismus von GAPDH aufgeklärt wurde. (a) Die Reaktion von lodacetat mit einem Cys-Rest des aktiven Zentrums. (b) Quantitative Übertragung des Tritiums vom Substrat auf NAD*. (c) Enzymkatalysierter °”P-Austausch von Phosphat auf Acetylphosphat.

Be

On

9

1 en

ar ADP

„CHz0PO3" 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG)

2 Me’z

Phosphoglycerat-

Kinase (PGK)

Ir =OE

„CHzOPO3 3-Phosphoglycerat

(3PG)

3 Au

540

Glucose-Katabolismus

Abb. 15.9 Enzymmechanismus der GAPDH. (1) GAP bindet ans Enzym. (2) Die Sulfhydrylgruppe im aktiven Zentrum bildet ein Thiohalbacetal mit dem Substrat. (3) NAD* oxidiert das Thiohalbacetal zum Thioester. (4) Das neugebildete NADH wird durch NAD" ersetzt. (5) P; greift den Thioester an, wobei das Acylphosphatprodukt,

|

_

ze as

Thiohemiacetal-

Zwischenprodukt

2 Thiol-

an

a.

1,3-BPG, entsteht und das a

ktive Enzym regeneriert wird.

6% siehe Animated Figures.

/ N> \

s—C

Enzym-SubstratKomplex

AcylthioesterZwischenprodukt

1 Substratbindung

GAP

5 Freisetzung des Produkts

NAD*

NADH

1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG)

„Kinase“ bezeichnet wird, da die umgekehrte Reaktion einer Phosphorylgruppenübertragung von ATP auf 3PG entspricht.) Die Struktur von PGK (Abb. 15.10) sieht auffällig zweilappig aus. Die Bindungsstelle für Mg”*-ADP liegt in einer der beiden Domänen und ist ca. 1 nm von der 1,3-BPG-Bindungsstelle, die in der anderen Domäne liegt, entfernt. Physikalische Messungen lassen darauf schließen, dass die beiden Domänen der PGK bei der Bindung des Substrats zusammenklappen, so dass die Substrate, wie bei der Hexokinase (Abschnitt 15.2A), in einer wasserfreien Umgebung miteinander reagieren können. Tatsächlich sieht die PGK der Hexokinase (Abb. 15.2) auffällig ähnlich, obwohl die Strukturen dieser Proteine nicht miteinander verwandt sind. Verknüpfung der GAPDH- mit den PGK-Reaktionen

Wie in Abschnitt 14.2B beschrieben, kann eine wenig begünstigte mit einer stark begünstigten Reaktion gekoppelt werden, so dass beide Reaktionen in Vorwärtsrichtung ablaufen. Im Fall des sechsten und siebten Reaktionsschritts der Glykolyse ist 1,3-BPG das gemeinsame Zwischenprodukt, dessen Verbrauch in der PGK-Reaktion die GAPDH-Reaktion vorwärts „zieht“. Die Energiebilanz der Gesamtreaktion kann wie folgt wiedergegeben werden:

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse

GAP + P,+ NAD* > 1,3-BPG + NADH 1,3-BPG + ADP — 3PG + ATP

541

AG?’ = 46,7 kJ: mol" AG? = -18,8 k] - mol"

GAP + P,+ NAD* + ADP — 3PG + NADH

+ AIP

AG°' = -121 kJ - mol"

Obwohl die GAPDH-Reaktion endergon verläuft, ermöglicht die stark exergone Natur der Phosphorylgruppenübertragung von 1,3-BPG auf ADP, dass die Gesamtsynthese von NADH und ATP aus GAP, P, NAD* und ADP begünstigt ist. Diese ATP-Synthese, an der kein Sauerstoff beteiligt ist, ist ein Beispiel für eine Substratkettenphosphorylierung. Die anschließende Oxidation des NADH, das aus dieser Reaktion stammt, durch O, liefert durch die oxidative Phosphorylierung zusätzlich ATP, wie wir in Abschnitt 18.3 sehen werden.

H.

Phosphoglycerat-Mutase

Bei Reaktionsschritt 8 der Glykolyse wird 3PG durch die PhosphoglyceratMutase (PGM) in 2-Phosphoglycerat (2PG) überführt: Or

Fh

C, |

OL

o

Phosphoglycerat-

H— Gr OH

Mutase (PGM)

r

Oz

C |

Haze I OPOS

Abb, 15.10 Kalottenmodell der Phosphoglycerat-Kinase aus Hefe. Die Substratbindungsstelle liegt am Grunde einer tiefen Spalte zwischen den beiden Domänen des Proteins. Diese Stelle ist durch das P-Atom des 3PG markiert (violett). Man vergleiche diese Struktur mit der von Hexokinase (Abb. 15.20). [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Herman Watson, University of Bristol. PDBid 3PCGK.]

H—C;-0H

nn OPOZ

| H

H 3-Phosphoglycerat

2-Phosphoglycerat (2PG)

(3PG)

Eine Mutase katalysiert die intramolekulare Übertragung einer funktionellen Gruppe von einer Position auf eine andere. Diese mehr oder weniger energetisch neutrale Reaktion ist zur Vorbereitung der nächsten Teilreaktion der Glykolyse notwendig, die eine energiereiche Phosphorylverbindung liefert. Auf den ersten Blick scheint es sich bei der durch die Phosphoglycerat-Mutase katalysierten Reaktion um eine einfache intramolekulare Phosphorylgruppenübertragung zu handeln. Dies ist jedoch nicht der Fall. Das Enzym trägt in seinem katalytischen Zentrum eine an His 8 gebundene Phosphorylgruppe.

Enzym— CH;

BR

I

Pr

EUR Phospho-His-Rest

Die Phosphorylgruppe wird auf das Substrat übertragen und ein BisphosphoZwischenprodukt gebildet. Dieses Zwischenprodukt phosphoryliert anschließend das Enzym, wobei das Produkt gebildet und das aktive Phosphoenzym wiederhergestellt wird. Die Röntgenstruktur des Enzyms verdeutlicht die Nähe von His 8 zum Substrat (Abb. 15.11). Die Katalyse durch Phosphoglycerat-Mutase läuft wie folgt ab (Abb. 15.12): 3PG bindet an das Phosphoenzym, in dem His 8 bereits phosSchritt 1 phoryliert vorliegt. Die Phosphorylgruppe des Enzyms wird auf das Substrat überSchritt 2 tragen, wodurch ein 2,3-Bisphosphoglycerat-Enzym-Komplex entsteht. 3& 4 Der Komplex zerfällt unter Bildung des Produkts 2PG und Schritte Regenerierung des Phosphoenzyms.

Abb. 15.11 Das aktive Zentrum der Phosphoglycerat-Mutase aus Hefe (Dephospho-Form). Das Substrat, 3PG, bindet in einer ionischen Tasche. His 8 liegt im aktiven Enzym phosphory-

liert vor. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von

Herman

Watson,

PDBid 3PGM.]

University of Bristol.

542

Glucose-Katabolismus

2PG 4 Freisetzung des FT

3PG

Phosphoenzym

1 Substratls

3PG-Phosphoenzym-

2PG:-Phosphoenzym-

Komplex

3 WESEN

Be.

u

> ER

Komplex

BAR,

des Enzyms

des Substrats

2,3-BPG:EnzymKomplex

Abb. 15.12 Der postulierte Reaktionsmechanismus für die Phosphoglycerat-Mutase. Die aktive Form des Enzyms enthält einen Phospho-His-Rest im aktiven Zentrum. (1) Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes. (2) Übertragung der enzymgebundenen Phosphorylgruppe auf das Substrat. (3) Rephosphorylierung des Enzyms durch die andere Phosphorylgruppe des Substrats. (4) Freisetzung des Produkts und Regenerierung des aktiven Phosphoenzyms.

»

Die ursprüngliche Phosphorylgruppe des 3PG erscheint daher schließlich am C2 des nächsten 3PG, das diese Reaktion eingeht. Gelegentlich kommt es vor, dass das in Schritt 2 gebildete 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG) vom Dephosphoenzym abdissoziiert und es in der inaktiven Form zurücklässt. 2,3-BPG muss daher immer in Spuren vorhanden sein, damit das aktive Phosphoenzym durch die Umkehrung der Reaktion regeneriert werden kann. 2,3-BPG bindet ebenfalls spezifisch Desoxyhämoglobin, wodurch dessen Sauerstoffaffinität abnimmt (Abschnitt 7.1D). Folglich benötigen Erythrocyten viel mehr 2,3-BPG (5 mM) als nur die winzigen Mengen, die für die Aktivierung der Phosphoglycerat-Mutase erforderlich sind (siehe Exkurs 15.2).

l.

Enolase: Bildung des zweiten energiereichen Zwischenprodukts

Im Reaktionsschritt 9 der Glykolyse wird 2PG durch die Enolase zu Phosphoenolpyruvat (PEP) dehydratisiert: OS

e.O, C |

na

oo

R.

El 1s on H 2-Phosphoglycerat

(2PG)

Enolase

——

O0 C |

mORO3

+

H,0

IH—(@ | H Phosphoenolpyruvat (PEP)

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse

543

Synthese von 2,3-Bisphosphoglycerat in Erythrocyten und dessen Einfluss auf die Sauerstofftransportkapazität des Bluts Die spezifische Bindung von 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3BPG) an Desoxyhämoglobin vermindert die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin (Abschnitt 7.2C). Erythrocyten führen die Synthese und den Abbau von 2,3 BPG auf einem Neben-

resultiert eine verringerte 2,3-BPG-Konzentration und eine erhöhte Sauerstoffaffinität des Hämoglobins (grüne Kurve). Umgekehrt nimmt bei einem Mangel an Pyruvat-Kinase (das Enzym, das die letzte Reaktion der Glykolyse katalysiert;

weg der Glykolyse durch.

Abb. 15.1), der die 2,3-BPG-Konzentration

Glycerinaldehyd3-phosphat

| | GAPDH 1,3-Bisphosphoglycerat

BisphosphoglyceratMutase

o

durch

Blockade

der letzten Reaktion ansteigen lässt, die Sauerstoffaffinität des Hämoglobins ab (blaue Kurve). Der Stoffwechsel von Erythrocyten ist daher physiologisch bedeutsam, auch wenn Erythrocyten keine Zellkerne oder andere Organellen und nur einen einfachen Stoffwechsel haben.

Oo, SQ ec“

100

ADP

PGK

ATP

De

P;

|

H0

|

CH>0PO3

3-Phosphoglycerat

| PGM

2,3-Bisphospho-

=

0P07

=

glycerat-

glycerat

Phosphatase

(2,3-BPG)

Dabei katalysiert Bisphosphoglycerat-Mutase die Übertragung einer Phosphorylgruppe vom C1- auf das C2-Atom Das so entstandene

en

2,3-Bisphospho-

2-Phosphoglycerat

des 1,3-BPG.

90

2,3-BPG wird durch die

2,3-Bisphosphoglycerat-Phosphatase zu 3PG hydrolysiert. 3PG geht nun weiter in den Glykolysestoffwechselweg ein. Der 2,3-BPG-Spiegel reguliert die Sauerstoffaffinität des Hämoglobins. Daher verändern ererbte Schäden in der Glykolyse von Erythrocyten die Sauerstoffbindungskapazität des Bluts, was in der Sauerstoffsättigungskurve des Hämoglobins sichtbar wird. Beispielsweise sind in Erythrocyten, welche einen Hexokinasemangel aufweisen, die Konzentrationen an Zwischenprodukten der Glykolyse gering (da die Hexokinase den ersten Reaktionsschritt der Glykolyse katalysiert). Daraus

Hexokinasedefizient m

=470 SI

=5.60 =

B

Normale

o = 50

Erythrocyten

r=

40

Di

) 30

== Pyruvatkinasedefizient

20 10 (0)

(6)

10

20

30

40

50

60

pO: (Torr)

[Sauerstoffsättigungskurve nach Delivoria-Papadopoulos, M., Oski, F.A:, und Gottlieb, A.., Science 165, 601 (1969).]

Als Voraussetzung für die Bindung des Substrats bildet das Enzym einen Komplex mit einem zweiwertigen Kation wie Mg’*. Fluoridionen inhibieren die Glykolyse, indem sie die Enolase blockieren (F* wurde als einer der Stoffwechselinhibitoren der Glykolyse bereits aufgeführt). Ist P; zugegen, hemmt F’ durch Bildung eines im aktiven Zentrum an Mg?”* gebundenen Komplexes die Substratbindung an Enolase. Das Substrat der Enolase, 2PG, sowie das durch Phosphoglycerat-Mutase umgesetzte 3PG reichern sich unter diesen Bedingungen an.

544

Glucose-Katabolismus

Pyruvat-Kinase: Produktion des zweiten ATP

].

Im zehnten und letzten Reaktionsschritt der Glykolyse wird die Freie Enthalpie der PEP-Hydrolyse durch die Pyruvat-Kinase (PK) an die Synthese von ATP gekoppelt; dabei wird Pyruvat gebildet.

C—-OPO®

+

l CH;

ADP

+

HY

Phosphoenolpyruvat

(PEP) Pyruvatkinase (PK)

Pyruvat

Katalysemechanismus der Pyruvat-Kinase

Die PK-Reaktion, die monovalente (K*) und divalente (Mg’*) Kationen benötigt, verläuft wie folgt (Abb. 15.13): Schritt 1 Ein ß-Phosphorylsauerstoffatom des ADP greift das PEP-Phosphoratom nucleophil an, wobei unter Verdrängung von Enolpyruvat ATP gebildet wird. Schritt 2 Enolpyruvat tautomerisiert zu Pyruvat. Die PK-Reaktion ist ausreichend exergon, um die ATP-Synthese zu ermöglichen (ein weiteres Beispiel für Substratkettenphosphorylierung). An dieser Stelle wird die „Logik“ der Enolasereaktion klar. Die Freie Standardenthalpie der Hydrolyse von 2PG beträgt nur AG°’ = -16 kJ - mol”', was als Triebkraft für die ATP-Synthese nicht ausreichen würde (AG°’ = 30,5 kJ - mol"'). Die Dehydratisierung von 2PG jedoch führt zur Bildung von PEP, einer energiereichen Verbindung, die zu

einer solchen Synthese in der Lage ist. Das hohe Phosphorylgruppenübertragungspotential von PEP spiegelt die große Menge an freigesetzter Freier Enthalpie bei der trachtet 15.14), als der

Abb. 15.13 Mechanismus der durch PyruvatKinase katalysierten Reaktion. (1) Nucleophiler Angriff eines B-Phosphorylsauerstoffatoms des ADP am Phosphoratom des PEP unter Bildung von ATP und Enolpyruvat und

Umwandlung des Produkts Enolpyruvat in dessen Ketotautomer wider. Beman die Hydrolyse von PEP als eine Zwei-Schritt-Reaktion (Abb. liefert der Tautomerisierungsschritt wesentlich mehr Freie Enthalpie Schritt der Phosphorylgruppenübertragung.

(2) Tautomerisierung des Enolpyruvats zu Pyruvat.

‚Mg*

-o

0

‚Mg“*

'o ö— 0”

Se

N K+----O

\

OO

+

o

Mg?*+

0

0O—-P—-0—-P—0—-

CH,

|

|

£

[0]

()

Phosphoenolpyruvat (PEP)

u

|

ADP

Adenossin

oO

———— > 1

OR

SIE GE

et Se

NW Ö

NER CH;

Enolpyruvat

2

| 2

7

OÖ

N) C—C

W oO

N CH;

Pyruvat

Die einzelnen Reaktionsschritte der Glykolyse Hydrolyse

AG?’ =-16 kJ-mol-!

|

6 O-POg

+ H;0 7"

HH

C—-0-—H + HPoZ en. Sy

545

Abb. 15.14 Hydrolyse von PEP. Die Reaktion ist in zwei Schritte unterteilt: Hydrolyse und Tautomerisierung. Der Gesamtbetrag von AG” ist deutlich größer als für die ATP-Synthese aus ADP und P,.

Phosphoenolpyruvat

cooTautomerisierung

AG” =-46kJ-mol!

Den

——

||

|

0 0=0

|

H— CH

C

|

Hui

H Pyruvat (Keto-Form)

Pyruvat (Enol-Form)

Gesamtreaktion

en

a

coo-

C907

rn C

a

Ve

Eee ACH

H

|

Bildung einer energiereichen Verbindung

H

Zusammenfassung von Stufe Il der Glykolyse Die Investition an Energie in Stufe I der Glykolyse (Verbrauch von 2 ATP) wird

in doppelter Ausbeute in Stufe II zurückgewonnen. Hierfür werden zwei phosphorylierte C,-Einheiten in zwei Pyruvat umgewandelt, ein Vorgang, der mit der Synthese von 4 Molekülen ATP gekoppelt ist (schematische Darstellung in

Substratkettenphosphorylierung

Abb. 15.15).

Die Gesamtbilanz der Glykolyse beläuft sich, wie wir bereits gesehen haben, auf Glucose

+ 2 NAD*

Umlagerung

+2 ADP +2 P;— 2 Pyruvat

+2 NADH

+2 AIP +2 H,O +4 H*

Betrachten wir jedes der drei Produkte der Glykolyse jeweils genauer: 1. ATP. Die anfängliche Investition von 2 Molekülen ATP in Stufe I der Glykolyse und die darauffolgende Rückgewinnung von 4 Molekülen ATP durch die Substratkettenphosphorylierung (jeweils 2 Moleküle pro GAP-Molekül, das Stufe II durchläuft) ergibt einen Nettogewinn von 2 ATP pro Molekül Glucose. In einigen Geweben und Organismen, für die Glucose den primären

Stoffwechselbrennstoff darstellt, deckt hauptsächlich das über die Glykolyse gebildete ATP den Energiebedarf der Zelle. Die parasitären Protozoen Trypanosoma und Leishmania (die für verschiedene Erkrankungen des Menschen verantwortlich sind, u.a. für die Schlafkrankheit und Leishmaniase) z.B. sind fast völlig auf die Glykolyse angewiesen. Einige der glykolytischen Enzyme in diesen Organismen unterscheiden sich in der Struktur von den entsprechenden Enzymen in Säugetieren. Das macht sie zu attraktiven Zielen für maßgeschneiderte Wirkstoffe gegen diese Krankheiten (Abschnitt 12.4). 2. NADH. Beim Abbau im Glykolysestoffwechselweg wird Glucose oxidiert, wodurch zwei NAD* zu zwei NADH reduziert werden. Wie in Abschnitt 13.3C beschrieben, stellen reduzierte Coenzyme wie NADH eine Quelle

Bildung einer energiereichen Verbindung

PEP| En

Substratketten-

EB]

phosphornylierung

Abb. 15.15 Schematische Übersicht von der zweiten Stufe der Glykolyse. Bei dieser Reaktionsfolge unterliegt GAP einer Phosphorylierung sowie einer Oxidation und anschließend einer molekularen Umordnung,

wodurch beide Phosphorylgruppen ausreichend Freie Enthalpie besitzen, um auf ADP übertragen zu werden und ATP bilden zu können. Zwei Moleküle GAP entstehen pro Molekül Glucose,

für Freie Enthalpie dar, die durch anschließende Oxidation zurückgewonnen

das in Stufe | eintritt, und werden in Pyruvat

werden kann. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen beim Vor-

umgewandelt.

546

Glucose-Katabolismus

gang des sogenannten Elektronentransports (Abschnitt 18.2) von reduzierten Coenzymen über eine Reihe von Elektronenträgermolekülen schließlich auf das Oxidationsmittel O, übertragen. Die Freie Enthalpie des Elektronentransports treibt die ATP-Synthese aus ADP (oxidative Phosphorylierung; Abschnitt 18.3) an. In aeroben Organismen dient diese Abfolge an Reaktionen

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Schreiben Sie die Reaktionen der Glykolyse auf, inklusive der Strukturformeln der Zwischenprodukte und der Bezeichnungen

auch

dazu,

oxidiertes

NAD*

zurückzugewinnen,

das an weiteren

durch

GAPDH katalysierten Cyclen teilnehmen kann. Unter anaeroben Bedingungen muss NADH anderweitig regeneriert werden, um’ den Glykolysestoffwechselweg mit NAD* zu versorgen (Abschnitt 15.3). Pyruvat. Die zwei Pyruvatmoleküle, die durch partielle Oxidation aus einem

der Enzyme, welche die

Reaktionen katalysieren. 2. Welche Verbindungen mit hohem PhosphatgruppenTransferpotential werden während der Glykolyse synthetisiert? 3. Was geschieht mit den Elektronen, die während der Glykolyse durch partielle Oxidation von Glucose erhalten werden?

Molekül Glucose entstehen, sind weiterhin in relativ wenig oxidiertem Zu-

stand. Unter aeroben Bedingungen erfolgt die vollständige Oxidation der Pyruvat-Kohlenstoffatome zu CO, im Citratcyclus (Kap. 17). Die bei diesem Vorgang freigesetzte Energie ermöglicht die Synthese von weitaus mehr ATP, als es die limitierte Oxidation von Glucose im Glykolysestoffwechsel erlaubt. Im anaeroben Stoffwechsel wird, wie wir im folgenden Abschnitt sehen werden, Pyruvat nur in geringem Maße abgebaut und stattdessen zur Rückgewinnung von NAD" eingesetzt.

3

Gärung: Der anaerobe Weg des Pyruvats

Die drei am häufigsten ablaufenden Abbauwege des Pyruvats, das in der Glykolyse entsteht, sind in Abbildung 15.16 wiedergegeben: il, Unter aeroben Bedingungen wird Pyruvat vollständig über den Citratcyclus zu CO, und H,O oxidiert.

Unter anaeroben Bedingungen muss Pyruvat in ein reduziertes Endprodukt umgewandelt werden, um das in der GAPDH-Reaktion anfallende NADH zu regenerieren. Das erfolgt auf zwei Wegen: (a) Unter anaeroben Bedingungen im Muskel wird Pyruvat zu Lactat reduziert. In diesem als Milchsäuregärung bezeichneten Prozess wird NAD" regeneriert. (Gärung bezeichnet generell einen anaerob ablaufenden biologischen Reaktionsweg). (b) In Hefe wird Pyruvat decarboxyliert; dabei werden CO, und Acetaldehyd gebildet. Acetaldehyd wird nun durch NADH reduziert, NAD* und Ethanol entstehen. Dieser Prozess wird als alkoholische Gärung bezeichnet.

Glykolyse

Abb. 15.16 Pyruvatabbau. Unter aeroben Bedingungen (linker Weg) wird das Pyruvatkohlenstoffatom über den Citratcyclus zu CO, oxidiert und die Elektronen werden vermutlich übertragen, um H,O in der oxidativen Phosphorylierung zu bilden. Unter anaeroben Bedingungen im Muskel wird Pyruvat reversibel in Lactat umgewandelt (mittlerer Weg), wohingegen es in Hefe zu CO, und Ethanol umgesetzt wird (rechter Weg).

oxidative Phosphorylierung

alkoholische

Citrateyclus

Milchsäure-

gärung

Gärung

Gärung: Der anaerobe Weg des Pyruvats

In der aeroben Glykolyse entspricht NADH einer energiereichen Verbindung, wohingegen in der anaeroben Glykolyse die Freie Enthalpie seiner Oxidation als Wärme abgegeben wird.

A.

Milchsäuregärung

Im Muskel katalysiert - vor allem wenn bei hoher Aktivität ein großer ATP-Bedarf besteht und die Sauerstoffversorgung knapp ist - Lactat-Dehydrogenase (LDH) die Reduktion von Pyruvat durch NADH unter Bildung von NAD* und Lactat (siehe Formel rechts). Diese Reaktion wird häufig als Reaktionsschritt 11 der Glykolyse zugeordnet. Die Lactat-Dehydrogenasereaktion ist vollständig reversibel, so dass die Konzentrationen an Pyruvat und Lactat im Gleichgewicht stehen. Im vorgeschlagenen Mechanismus für die Pyruvatreduktion durch LDH wird ein Hydridion stereospezifisch vom C4 des NADH auf das C2 des Pyruvats und gleichzeitig ein Proton auf den Imidazolring von His 195 übertragen.

R

a

Pyruvat

LactatDehydrogenase (LDH)

| NH,

SEN

| Arg 109

N

H,N° +" NH,

H;N = Gl :

NADH

E

ZELGNPS „Yr CH, a — His His 195 er

o“-No Pyruvat

\L-NH

NE

|

L-Lactat

Arg 171

ee Hr

NAD*+

CH3 |

H—C—0OH |

e 0°

®

No-

L-Lactat

Sowohl His 195 als auch Arg 171 interagieren elektrostatisch mit der Carboxylgruppe des Substrats und geben Pyruvat (oder Lactat in der Rückreaktion) die richtige Orientierung im aktiven Zentrum. Der Gesamtvorgang der anaeroben Glykolyse im Muskel kann wie folgt formuliert werden: Glucose

+2

ADP+2P;—>2Lactat

NADH

+2 ATP +2 H,0 +2 H?

Lactat entspricht einer Art Endprodukt des anaeroben Stoffwechsels der Glucose. Das Lactat kann entweder aus der Zelle heraustransportiert werden oder wieder zu Pyruvat umgewandelt werden. Ein Großteil des Lactats wird aus der Muskelzelle heraus und über das Blut zur Leber transportiert, wo es wieder zu Glucose umgesetzt wird (Abschnitt 22.1F).

547

548

Glucose-Katabolismus

o

o CH

NADH

o

1 |

me

— CC

co 2 CH; —C

Pyruvat\_ OÖ _ Decarboxylase

em

%

en

NAD

/

ee

AlkoholDehydrogenase

N H

| H

CH

Ethanol

Acetaldehyd

Pyruvat

SH

Die zwei Reaktionen der alkoholischen Gärung. (1) Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetaldehyd und (2) Reduktion von Acetaldehyd zu Ethanol durch NADH.

Abb. 15.18

Im Gegensatz zur weit verbreiteten Meinung ist es nicht etwa die Lactatanhäufung selbst, die im Muskel für die Muskelermüdung und den Muskelschmerz

[N Abb. 15.17 Eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Hefezellen. [Biophoto Associates Photo Researchers.]

(Muskelkater) verantwortlich ist, sondern die Akkumulation der durch die Glykolyse erzeugten Säure (Muskeln können ihre Arbeitsleistung auch bei hoher Lactatkonzentration aufrechterhalten, wenn der pH-Wert konstant gehalten wird).

B.

Alkoholische Gärung

In Hefe wird unter anaeroben Bedingungen NAD" für die Glykolyse in einem Prozess zurückgewonnen, der von alters her genutzt wird: Die Umwandlung von Pyruvat zu Ethanol und CO,. Ethanol ist für die berauschende Wirkung von Bier, Wein und Spirituosen verantwortlich, das gebildete CO, lässt Brotteig aufgehen. Hefe (Abb. 15.17) erzeugt Ethanol und CO, über zwei aufeinander folgende Reaktionen (Abb. 15.18): x 1. Die Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetaldehyd und CO,, die von der Pyruvat-Decarboxylase (ein Enzym, das bei Tieren nicht vorkommt) katalysiert wird. 2. Die Reduktion von Acetaldehyd zu Ethanol durch NADH, katalysiert durch die Alkohol-Dehydrogenase (Abschnitt 11.1C), wobei NAD* für die Verwendung in der GAPDH-Reaktion der Glykolyse regeneriert wird. TPP ist ein essentieller Cofaktor der Pyruvat-Decarboxylase Pyruvat-Decarboxylase enthält das Coenzym Thiaminpyrophosphat (TPP, auch als Thiamindiphosphat, ThDP, bezeichnet).

CH;

We —

0

m

EUER Se.

E

Ring

CH, CH,

8

H x

- Aminopyrimidin-

1

0 en

acıdes

Proton

ThiazoliumRing

TPP, das aus Thiamin (Vitamin B,) synthetisiert wird, bindet fest, aber nicht kovalent an Pyruvat-Decarboxylase (Abb. 15.19). Das Enzym verwendet TPP als Coenzym. Wenn die Decarboxylierung einer a-Ketocarbonsäure wie Pyruvat nicht katalysiert würde, wäre im Übergangszustand die Bildung einer negativen Ladung am Carbonylkohlenstoffatom notwendig, was einem instabilen Zustand entspräche:

Gärung: Der anaerobe Weg des Pyruvats

549

Abb. 15.19 TPP gebunden an PyruvatDecarboxylase aus Saccharomyces uvarum (Brauhefe). Das TPP und die Seitenkette von Glu 51 sind in Stabform gezeigt (C, grün; N, blau; O, rot; S, gelb und P, orange). TPP bindet in die Furche zwischen

den beiden Untereinheiten des Dimers (cyan und violett) und bildet Wasserstoffbrücken mit Glu 51 aus. [Nach einer Röntgenstruktur von William Furey und Martin Sax, Veterans Administration Medical Center and University of Pittsburgh. PDBid 1PYD.] 6% siehe Interactive Exercises.

oO

o 0—

ee)

NFi o R

X

E [6)

A

R

Dieser Übergangszustand kann durch Delokalisierung der negativen Ladung innerhalb einer geeigneten „Elektronensenke“ stabilisiert werden. Die Aminosäurereste der Proteine können diese Aufgabe nur sehr schlecht erfüllen, TPP

dagegen mit Leichtigkeit. Der „Arbeitsarm“ des TPP ist der Thiazoliumring. Dessen C2-Gruppe ist relativ stark acid, da das benachbarte positiv geladene quartäre Stickstoffatom das durch die Dissoziation des Protons gebildete Carbanion elektrostatisch stabilisiert. Dieses dipolare Carbanion (oder Ylid) ist die aktive Form des Coenzyms. Die Katalyse durch Pyruvat-Decarboxylase verläuft nach folgendem Mechanismus (Abb. 15.20): Schritt 1 Nucleophiler Angriff am Carbonylkohlenstoffatom des Pyruvats durch die Ylidform von TPP. Schritt 2_ Austritt des CO, unter Bildung eines resonanzstabilisierten Carbanionaddukts, in dem der Thiazoliumring des Coenzyms als Elektronensenke fungiert. Schritt 3 Protonierung des Carbanions. Schritt 4 Eliminierung des TPP-Ylids unter Bildung von Acetaldehyd und Regeneration des aktiven Enzyms. Dieser Mechanismus wurde durch Isolierung des Zwischenprodukts Hydroxyethylthiamin-pyrophosphat bestätigt. Beriberi ist eine Thiaminmangelkrankheit

Die Fähigkeit des TPP-Thiazoliumrings, sich an Carbonylgruppen zu addieren und als Elektronensenke zu fungieren, macht es zum häufigsten Coenzym bei Decarboxylierungen von a-Ketocarbonsäuren. Solche Reaktionen kommen in allen Organismen vor, nicht nur in Hefen. Infolgedessen muss Thiamin (Vitamin B,), das in Geweben der meisten Vertebraten weder synthetisiert noch in nennenswerter Menge gespeichert werden kann, mit der Nahrung aufgenommen werden. Ein Mangel an Thiamin führt beim Menschen zu einer lebensgefährdenden Erkrankung, der Beriberi (singhalesisch für Schwäche), bei der es zu neurologischen Ausfallerscheinungen kommt. Hierzu zählen

550

Glucose-Katabolismus

Abb. 15.20

=

I

02205

(1) Nucleophiler Angriff am Carbonylkohlenstoffatom des Pyruvats durch die Ylidform von TPP. (2) Austritt des CO, und Bildung eines resonanzstabilisierten Carbanions. (3) Protonierung des Carbanions und (4) Eliminierung des TPP-Ylids sowie Freisetzung des Produkts.

r

u

O

Reaktionsmechanismus der

Pyruvat-Decarboxylase.

1 2. 0-

CH3

N

CH3

WU

h Huc \ 5 S

R'

S

R' Hut

CH3

TPP

TPP (Ylid-Form)

Pyruvat

oO

=

7

+ H+

1 nucleophiler

u

Angriff

4 Produktfreisetzung

re

Acetaldehyd

; 2

R

A “ no

\N

CH3

| CH;

.

\

CH3

E

r

\er

n

as | S

a

IT

N

SR R

NT

R

CO;

Hydroxyethylthiamin-

pyrophosphat

2 CO„Austritt

3 Protonierung des Carbanions

H+

\

\NSSL.CH,

ar" 27

ER

/

HO

H;C

N

/

Y

N

R

i

resonanzstabilisiertes Carbanion

R

nn

HN

nr IN

Co

ll \

H

H

| 2

a CH3

NADH

una

Acetaldehyd

5-Cys

\ '"* N-His S-Cys

Hut

NAD*+

H ur

Ya

H

C

Hz(C

EN

OH

Ethanol

Schmerzen, Lähmungen und Atrophie (Muskelschwund) der Extremitäten und/ oder Störungen der Herzfunktion, in deren Folge Ödeme (Flüssigkeitsansammlungen in Geweben und Körperhöhlen) ausgebildet werden. Beriberi war besonders Ende des 18. Jahrhunderts und Anfang des 19. Jahrhunderts in den Ländern Asiens mit hohem Reiskonsum weit verbreitet, nachdem dort das maschinelle Polieren des Reises eingeführt wurde. Dabei wurden die groben, aber auch thiaminhaltigen äußeren Schichten des Reiskornes viel effektiver als früher entfernt (die zuvor verwendeten Polierverfahren waren weniger gründlich und ließen daher genug Thiamin auf den Körnern zurück). Wird der Reis vor dem Polieren kurz gekocht - ein Verfahren, das in Indien üblich ist und als Parboiling bezeichnet wird —, nehmen die Reiskörner Nährstoffe aus ihrer äußeren Schicht auf, und Beriberi tritt seltener auf. Als Thiaminmangel erst einmal als Ursache für Beriberi erkannt war, wurden Anreicherungsverfahren

eingeführt, so dass

diese Krankheit heute, außer in Folge von Hungersnöten, kein Problem mehr darstellt. Beriberi tritt aber gelegentlich bei chronischem Alkoholmissbrauch auf, bei dem vorrangig getrunken und nicht gegessen wird. Reduktion von Acetaldehyd und Regeneration von NAD* Die Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe (engl.: yeast alcohol dehydrogenase, YADH), das Enzym, das an in Ethanol umwandelt, ist ein Tetramer. Jede Untereinheit bindet ein Zn’*-Ion. Zn’* polarisiert die Carbonylgruppe des Acetaldehyds und stabilisiert so die sich im Übergangszustand der Reaktion aufbauende negative Ladung (siehe Formel links). Dies erleichtert die stereospezifische Übertragung eines Wasserstoffatoms von NADH auf Acetaldehyd.

Gärung: Der anaerobe Weg des Pyruvats

Bei Säugetieren hat die Alkohol-Dehydrogenase der Leber (LADH) die Aufgabe, sowohl den anaerob durch die körpereigene Darmflora produzierten als auch den von außen zugeführten Alkohol umzusetzen (die Richtung der ADH-Reaktion ist von der relativen Konzentration an Ethanol und Acetaldehyd abhängig). Die LADH der Säugetiere ist ein Dimer und weist zu YADH eine deutliche Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz auf. Jedes LADH-Monomer besitzt ein zweites Zn’*-Ion, das vermutlich eine strukturelle Funktion erfüllt.

C.

Die Energiebilanz der Gärung

Die Thermodynamik ermöglicht uns eine Bilanz der auftretenden Änderungen der Freien Enthalpie, nachdem wir den Gärungsvorgang in seine Einzelschritte zerlegt haben. Wir können somit berechnen, mit welcher Effizienz die Freie Enthalpie des Glucoseabbaus für die Synthese von ATP verwertet wird. Die Gesamtreaktion der Milchsäuregärung lautet:

Glucose — 2 Lactat + 2H*

AG°’ = -196 kJ] mol"

Für die alkoholische Gärung beläuft sich die Gesamtreaktion auf: Glucose

> 2 CO, + 2 Ethanol

AG? = -235 kJ-mol”"

Jede dieser Reaktionen ist an die Nettobildung von zwei Molekülen ATP gekoppelt, wofür AG?’ = +61 kJ - mol’ pro verbrauchter Glucose erforderlich sind. Dividiert man AG°' der ATP-Bildung durch das der Lactatbildung, so ergibt sich für die Milchsäuregärung eine „Effizienz“ von 31%; d.h. 31% der durch diesen Prozess freigesetzten Freien Enthalpie werden unter biochemischen Standardbedingungen in Form von ATP gespeichert. Der Rest geht als Wärme verloren, wodurch der Prozess irreversibel wird. Entsprechend hat die alkoholische Gärung unter biochemischen Standardbedingungen eine Effizienz von 26%. Unter physiologischen Bedingungen, bei denen andere Konzentrationen der Reaktanden und Produkte herrschen als unter Standardbedingungen, arbeiten diese Reaktionen allerdings mit einer Effizienz von über 50%. Im Vergleich zur oxidativen Phosphorylierung verbraucht die anaerobe Gärung Glucose in verschwenderischer Weise: Die Gärung liefert 2 Moleküle ATP pro Molekül Glucose, während deren vollständiger Abbau durch oxidative Phosphorylierung 32 Moleküle ATP ergibt (Abschnitt 18.3C). Dies entspricht der Beobachtung von Pasteur, dass Hefe bei anaerobem Wachstum wesentlich mehr Zucker verbraucht als bei aerobem Wachstum (sog. Pasteur-Effekt). Die ATP-Produktion kann bei der anaeroben Glykolyse jedoch bis zu 100-mal schneller erfolgen als bei der oxidativen Phosphorylierung. Infolgedessen wird ATP bei raschem Verbrauch in Geweben, wie z. B. dem Muskel, fast vollständig durch anaerobe GlykoIyse regeneriert. (Die Milchsäuregärung „verschwendet“ die Glucose nicht wirklich, da das so gebildete Lactat in der Leber wieder in Glucose umgewandelt wird; Abschnitt 22.1F). Bestimmte Muskeln sind für die schnelle Produktion von ATP durch die Glykolyse spezialisiert (siehe Exkurs 15.3).

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 il, Beschreiben sie die drei

möglichen Abbauwege von Pyruvat.

Vergleichen Sie den ATP-Ertrag und das Verhältnis der ATP-Produktion für anaeroben und aeroben Abbau von Glucose.

551

552

Glucose-Katabolismus

Glykolytische ATP-Produktion im Muskel Skelettmuskeln bestehen sowohl aus langsamen (Typ |) als auch aus schnellen (Typ II) Fasern. Schnelle Fasern sind so benannt, da sie in solchen Muskeln überwiegen, die zu kurz-

zeitigen schnellen Leistungssteigerungen in der Lage sind. Sie haben fast keine Mitochondrien (in denen die oxidative Phosphorylierung abläuft). Infolgedessen müssen sie fast die gesamte Menge ihres ATP über die anaerobe Glykolyse gewinnen, für die sie eine besonders große Kapazität besitzen. Muskeln, die sich langsam und stetig kontrahieren, enthalten dagegen vor allem langsame Fasern mit vielen Mitochondrien, die den größten Teil ihres ATP aus der oxidativen Phosphorylierung beziehen. Schnelle und langsame Fasern wurden ursprünglich als weiße und rote Fasern bezeichnet, da das ansonsten

aus schnellen Fasern. Allerdings ist die Farbe der Fasern kein zuverlässiger Indikator für die Physiologieder Muskeln. Beim Menschen sind die Muskeln von Sprintern relativ reich an schnellen Fasern, wogegen Langstreckenläufer einen größeren Anteil an langsamen Fasern aufweisen (obwohl die Muskeln die gleiche Farbe haben).

a

helle

Muskelgewebe bei einer Anreicherung mit Mitochondrien die für deren hämhaltige Cytochrome charakteristische rote Färbung annimmt. Ein bekanntes Beispiel sind die Flugmuskeln von Zugvögeln, wie Enten und Gänsen, die eine kontinuierliche Energieversorgung benötigen; sie sind reich an langsamen Fasern. Daher haben diese Vögel dunkles Brustfleisch. Dagegen bestehen die Flugmuskeln weniger ambitionierter Flieger, wie der Hühner und Truthähne, die diese nur für rasches Davon-

4

flattern, meist zur Flucht vor Gefahr, einsetzen, hauptsächlich

ER

Bin om

langsame Faser

schnelle Faser

[Fotos mit freundlicher Genehmigung von J.D. MacDougall, McMaster University.]

Kontrolle der Glykolyse

Unter den Bedingungen des Fließgleichgewichts läuft die Glykolyse kontinuierlich ab, jedoch muss der Ablauf der Glykolyse den Anforderungen des Organismus angepasst werden. Die Kontrollmechanismen von Stoffwechselwegen, wie der Glykolyse, werden häufig in drei Stufen aufgeklärt: 1. Identifizierung des (der) geschwindigkeitsbestimmenden Schritte(s) des Stoffwechselwegs. Eine Möglichkeit hierfür ist die Messung der in vitroAG-Werte aller am Stoffwechselweg beteiligten Reaktionen. Enzyme, die weit entfernt vom Gleichgewicht arbeiten, sind potentielle Kontrollpunkte (Abschnitt 14.1D). 2. Invitro-Identifizierung von allosterischen Modifikatoren derjenigen Enzyme, welche die geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionen katalysieren. Die Wirkmechanismen

dieser Verbindungen

werden

aus dem

Effekt, den sie

auf die Kinetik des Enzyms haben, abgeleitet. 3. Messung der in-vivo-Konzentrationen der postulierten Regulatoren unter verschiedenen Bedingungen, um festzustellen, ob die Konzentrationsveränderungen mit dem vorgeschlagenen Kontrollmechanismus in Einklang stehen.

Wir wollen nun die Thermodynamik der Glykolyse mit besonderem Augenmerk auf ihre Kontrollmechanismen betrachten (wir erinnern uns, dass verschiedene Gewebe die Glykolyse auf verschiedene Weise kontrollieren). In Tabelle 15.1 sind die Veränderung der Freien Enthalpie (AG°’) und die tatsächliche physiologische Veränderung der Freien Enthalpie (AG) für jede Reaktion der Glykolyse aufgeführt. Die Veränderung der Freien Enthalpie bei Reaktionen unter Standard-

Kontrolle der Glykolyse Tab. 15.1 Kur, ka und ku/Ku-Werte für einige Enzyme. a Lane an Fr ee BF a ee

Reaktion

ee.

see

Enzym

AG’ (kJ mol")

AG (kJ mol")

1

Hexokinase

—20,9

- 27,2

2

PGI

+ 2,2

A

PFK

-17,2

— 25,9

4

Aldolase

+22,8

=.5,9

5

TIM

+ 7,9

a)

GAPDH

8

PGM

9 10

+ PGK

Glucose

| | | | l l

| 13

&

6+7

553

| l | l | |

I j j

j I j

Pyruvat

16,7

—

11

+ 4,7

-

0,6

Enolase

- 3,2

-

2,4

PK

23,0

— 13,9

Berechnet nach Daten von Newsholme, E.A., und Start, C., Regulation in Metabolism, S. 97, Wiley (1973).

Abb. 15.21 Diagramm der Änderung der Freien Enthalpie in der Glykolyse. Dieses „Wasserfall“-Diagramm zeigt die Änderung

der Freien Enthalpie im Zuge der einzelnen glykolytischen Reaktionen im Herzmuskel (Tabelle 15.1). Die Reaktionen 1, 3 und 10 sind irreversibel. Die anderen Reaktionen befinden sich nahe dem Gleichgewicht und lassen einen Fluss in beiden Richtungen zu.

bedingungen kann sich drastisch von den tatsächlichen in-vivo-Werten unterscheiden. Nur drei Reaktionen — die durch Hexokinase, Phosphofructokinase und PyruvatKinase katalysiert werden — gehen unter physiologischen Bedingungen im Herzmuskel mit einer stark negativen Änderung der Freien Enthalpie einher (Abb. 15.21). Diese Reaktionen der Glykolyse, die fernab des Gleichgewichtszustands ablaufen, kommen als Kandidaten für Kontrollpunkte des Flusses in Frage. Die anderen Glykolysereaktionen arbeiten nahe dem Gleichgewicht: Die Geschwindigkeiten von Hinund Rückreaktion sind höher als der tatsächliche Fluss des Stoffwechselwegs. Infolgedessen sind diese Gleichgewichtsreaktionen sehr empfindlich gegenüber Veränderungen der Konzentrationen von Zwischenprodukten des Stoffwechselwegs und sorgen so dafür, dass alle Veränderungen des Flusses, die im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt auftreten, umgehend an alle Reaktionen des Stoffwechselwegs weitergegeben werden.

A.

Phosphofructokinase: Das Schlüsselenzym für die Kontrolle der Glykolyse im Muskel

In vitro-Untersuchungen der Enzyme Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvat-Kinase zeigen, dass jedes von ihnen durch eine Vielzahl von Molekülen kontrolliert wird. Dient jedoch Glykogen statt Glucose als G6P-Quelle für die Glykolyse, wie es im Skelettmuskel häufig der Fall ist, wird die Hexokinasereaktion umgangen (Abschnitt 16.1). Pyruvat-Kinase katalysiert die letzte Reaktion der Glykolyse und ist daher wahrscheinlich nicht der Hauptkontrollpunkt für die Regulierung des gesamten Stoffwechselflusses. Offensichtlich ist jedoch PFK, ein feinreguliertes Enzym, das weit entfernt vom Gleichgewicht arbeitet, im Muskel in der Regel der wichtigste Kontrollpunkt der Glykolyse. PFK (Abb. 15.22) ist ein tetrameres Enzym, das in zwei miteinander im Gleichgewicht stehenden Konformationszuständen, R (engl.: relaxed, entspannt) und T (engl.: tense, gespannt), auftritt. ATP ist für PFK sowohl Substrat als auch allosterischer Hemmstoff. Andere Verbindungen, einschließlich ADP, AMP und Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P) heben den inhibitorischen Effekt von ATP wieder auf und sind daher Aktivatoren. Jede Untereinheit besitzt zwei ATPBindungsstellen: eine Substratbindungsstelle und eine Inhibitorstelle. Die Substratbindungsstelle bindet ATP in beiden Konformationszuständen gleich gut, während die Inhibitorstelle ATP fast nur im T-Zustand bindet. Das zweite Sub-

Abb. 15.22

Die Röntgenstruktur der PFK aus E. coli. Zwei Untereinheiten des tetrameren Enzyms sind in Bänderform dargestellt. (Die anderen beiden Untereinheiten, die aus Gründen der Übersicht-

lichkeit weggelassen wurden, stehen mit den abgebildeten Untereinheiten über eine zweifache Rotation um die vertikale Achse in Verbindung). Jede Untereinheit ist mit ihren Substraten F6P (nahe dem Zentrum jeder Untereinheit) und Mg?*-ATP (rechts unten und links oben, die grünen

Kugeln stellen Mg’'dar) und daneben mit dem Aktivator Mg”'*-ADP (rechts oben und links unten, im hinteren Teil) assoziiert. Alle sind als Kalottenmodelle dargestellt und entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt (ADP C grün, FBP C türkis, N blau, O rot,

P orange und Mg violett). Beachten Sie die besondere Nähe der ß-Phosphatgruppe des ADP-Produkts zur Phosphorylgruppe in 1-Position des FBPs, der Gruppe die die PFK vom ATP auf F6P überträgt. [Nach einer Röntgenstruktur von Philip Evans, Cambridge University. PDBid 1PFK.]

6% siehe Kinemage Exercises 13-1.

554

Glucose-Katabolismus

ohne Inhibitoren (geringe [ATP])

1mM ATP + 0,1mM AMP

1mM

ATP

Phosphofructokinase-Aktivität

0)

Abb. 15.23

1,0 [Fructose-6-phosphat] mM

2,0

Korrelation der PFK-Enzymaktivität

mit der F6P-Konzentration.

Unter folgenden verschiedenen Bedingungen: blau, kein Inhibitor oder Aktivator ist vorhanden; grün, 1 mM ATP; und rot, 1 mM ATP + 0,1 mM AMP. [Nach Daten von Mansour, T. E., und Ahlfors, C. E.,J. Biol. Chem. 243, 2523-2533

62 siehe Animated Figures.

(1968).]

strat der PFK, F6P, wird bevorzugt vom R-Zustand gebunden. Folglich fungiert ATP bei hohen Konzentrationen als allosterischer Inhibitor, indem es an den TZustand bindet, dadurch das Gleichgewicht T = R zugunsten des T-Zustands verschiebt und somit die Affinität der PFK für F6P verringert (ähnlich der Verringerung der O,-Affinität von Hämoglobin durch 2,3-BPG; Abschnitt 7.1D). In einer graphischen Darstellung der Enzymaktivität von PFK gegen [F6P] bewirkt dies, dass die hyperbolische (nicht kooperative) Kurve der PFK-Aktivität bei hohen ATP-Konzentrationen in die für allosterische Enzyme charakteristische sigmoide (kooperative) Kurve übergeht (Abb. 15.23). Beispielsweise ist das Enzym bei einer F6P-Konzentration von etwa 0,5 mM (gestrichelte Linie in Abb. 15.23) maximal aktiv, doch fällt die Aktivität bei einer ATP-Konzentration von 1 mM auf 15% ihres Ausgangswerts, was einen beinahe 7fachen Rückgang bedeutet. (Der stärkste allosterische Effektor der PFK ist F2,6P. Die Rolle des F2,6P bei der Kontrolle der PFK-Aktivität wird in Abschnitt 16.4C näher betrachtet.) Strukturelle Basis für die Allosterie der Phosphofructokinase

Die Röntgenkristallstrukturen der PFK von mehreren Organismen sind sowohl für den R- als auch für den T-Zustand von Philip Evans bestimmt worden. Der R-Zustand von PFK wird durch die Bindung seines Substrats F6P stabilisiert. Im R-Zustand der PFK aus Bacillus stearothermophilus bildet die Seitenkette von Arg 162 ein Ionenpaar mit der Phosphorylgruppe eines am aktiven Zentrum einer anderen Untereinheit gebundenen F6P aus (Abb. 15.24). Arg 162 ist je-

Abb. 15.24 Allosterische Änderungen der PFK aus Bacillus stearothermophilus. Abschnitte im T-Zustand (blau) sind über den Abschnitten im R-Zustand (rot) gezeigt, die einer großen konformationellen Umordnung beim allosterischen T>R-Übergang unterliegen (durch die Pfeile angegeben). Die Reste des R-Zustands sind durch einen Apostroph markiert. Zu beachten ist,

dass im R-Zustand Arg 162 eine ionische Wechselwirkung mit F6P eingehen kann, wohingegen F6P im T-Zustand durch Glu 161 abgestoßen wird. Gebundene Liganden sind ebenfalls eingezeichnet: Der nicht physiologisch vorkommende Inhibitor 2Phosphoglykolat (PGC, ein PEP-Analogon) für den T-Zustand und das kooperativ gebundene Substrat F6P sowie der Aktivator ADP für den R-Zustand. [Nach Schirmer, T. und Evans, P.R., Nature 343, 142

(1990). PDBid 4PFK und-6PFK] @Q siehe Kinemage Exercises 13-2.

Kontrolle der Glykolyse

doch am Ende einer helicalen Biegung, die sich beim Übergang in den T-Zustand entwindet. Die positiv geladene Seitenkette von Arg 162 schwingt dabei weg und wird durch die negativ geladene Seitenkette von Glu 161 ersetzt. Die doppelt negativ geladene Phosphorylgruppe von F6P weist daher eine wesentlich geringere Affinität zum Enzym im T-Zustand auf. Die Entwindung dieser helicalen Biegung, die zwingend für den RT-Übergang ist, wird durch die Bindung des Aktivators ADP an die Effektorstelle des Enzyms verhindert. ATP kann somit an dieser Stelle nur binden, wenn die helicale Biegung entwunden vorliegt (T-Zustand). AMP hebt die ATP-Hemmung der PFK auf

Direkte allosterische Regulation der PFK durch ATP ist auf den ersten Blick ein ausreichender Kontrollmechanismus des glykolytischen Flusses. Ist [ATP] bei geringem Stoffwechselbedarf hoch, wird PFK gehemmt und der Fluss durch die Glykolyse ist gering. Ist umgekehrt [ATP] niedrig, so ist der Fluss durch den Stoffwechselweg hoch und ATP wird nachgebildet, um dessen Konzentration wieder aufzufüllen. Bei Betrachtung der verschiedenen physiologischen ATP-Konzentrationen zeigt sich jedoch, dass die Verhältnisse wesentlich komplexer sind. Der metabolische Fluss durch die Glykolyse kann um den Faktor 100 oder mehr variieren, je nachdem, wie der Stoffwechselbedarf für ATP ist. In vivo-Messungen von [ATP] bei verschiedenen Zuständen der Stoffwechselaktivität zeigen jedoch, dass [ATP] im Ruhezustand und bei starker Anstrengung sich nur um weniger als 10% voneinander unterscheiden. Es gibt jedoch keinen allosterischen Mechanismus, der einen 100fachen Anstieg des Flusses einer gleichgewichtsfernen Reaktion bei nur 10% höherer Effektorkonzentration erklären könnte. Ein oder mehrere weitere Mechanismen müssen für die Kontrolle des glykolytischen Flusses verantwortlich sein. Die Hemmung der PFK durch ATP wird durch AMP und ADP aufgehoben. Grund hierfür ist, dass AMP bevorzugt an den R-Zustand von PFK bindet. Enthält eine PFK-Lösung 1 mM ATP und 0,5 mM F6P, steigt die PFK-Aktivität bei einer Erhöhung der AMP-Konzentration auf 0,1 mM von 15% auf 50% der maximalen Aktivität, also um den Faktor 3 (Abb. 15.23). [ATP] nimmt beim Übergang aus dem Ruhezustand in einen Zustand hoher Aktivität nur um 10% ab, da es über zwei Enzyme gepuffert wird: Creatin-Kinase und Adenylat-Kinase (Abschnitt 14.2C). Die Adenylat-Kinase katalysiert die Reaktion 2 ADP = ATP + AMP

K=

[ATPJJAMP] _ [ADP?P

0,44

wodurch das ADP, das aus der ATP-Hydrolyse bei der Muskelkontraktion stammt, rasch wieder ins Gleichgewicht mit ATP und AMP gebracht wird. Im Muskel ist [ATP] ca. 50fach höher als [AMP] und ca. 10fach höher als [ADP]. Folglich kann durch die Adenylat-Kinasereaktion eine Änderung von [ATP] von beispielsweise 1 auf 0,9 mM, was einer 10%igen Abnahme entspricht, einen 100%igen Anstieg von [ADP] (von 0,1 auf 0,2 mM) und einen > 400%igen Anstieg an [AMP] (von 0,02 auf ca. 0,1 mM) bewirken. Ein Veränderung im Stoffwechsel, die bezogen auf die Abnahme an [ATP] zu gering ist, um die Hemmung der PFK aufzuheben, kann so von der Adenylat-Kinasereaktion verstärkt werden. Diese erhöht [AMP] um einen Betrag, der zu einem signifikanten Anstieg der PFK-Aktivität führt.

B.

Substratkreislauf

Der komplex regulierte, allosterische Mechanismus der PFK kann jedoch nur einen Teil der bis zu 100fachen Änderung im glykolytischen Fluss erklären. In Abschnitt 14.1D wurde erläutert, dass nur eine gleichgewichtsnahe Reaktion

555

556

Glucose-Katabolismus

einer größeren Änderung im Fluss unterliegen kann, weil bei ihr vr- v, = 0 ist (vrund v, sind die Reaktionsraten der Hin- bzw. der Rückreaktion) und a eine kleine Änderung in vs eine große anteilige Änderung in vr v, auslösen kann. Das gilt jedoch nicht für die PKF-Reaktion, da bei solch einer nicht im Gleichgewicht befindlichen gleichgewichtsfernen Reaktion v, vernachlässigbar ist. Dennoch können solche Gleichgewichtsbedingungen auf eine Nicht-Gleichgewichtsreaktion angewendet werden, wenn ein zweites Enzym (oder mehrere Enzyme) die Regenerierung der Substrate aus den Produkten auf eine thermodynamisch günstige Weise katalysiert. Dies kann wie folgt dargestellt werden:

Da zwei verschiedene Enzyme die Hinreaktion (f) und die Rückreaktion (r) katalysieren, können v; und v, unabhängig voneinander variieren und v, ist dann im Vergleich zu v; nicht weiter vernachlässigbar. Hierfür müssen die Hinreaktion (Bildung von FBP aus F6P) und die Rückreaktion (Abbau von FBP zu F6P) von unterschiedlichen Enzymen katalysiert werden, da sonst die Gesetze der Thermodynamik verletzt würden. Unter physiologischen Bedingungen ist die durch PFK katalysierte Reaktion F6P + ATP — FBP + ADP

stark exergon (AG = -25,9 kJ - mol"). Folglich weist die Rückreaktion eine vernachlässigbare Reaktionsrate im Vergleich zur Hinreaktion auf. Fructose-1,6Bisphosphatase (FBPase) jedoch, die in vielen Geweben von Säugetieren vorkommt (und die ein essentielles Enzym in der Gluconeogenese ist; Abschnitt 16.4B), katalysiert die exergone Hydrolyse von FBP (AG = -8,6.k] - mol’'): FBP

+ H,O

—F6P

+ P;

Zu beachten ist, dass die Kombination der Reaktionen, die durch PFK und FBPase katalysiert werden, netto in einer ATP-Hydrolyse resultiert:

ATIP + 770 — ADP Sp, Eine solche Gruppe von gegenläufigen Reaktionen (Abschnitt 14.1E) bezeichnet man als einen Substratkreislauf oder Substratcyclus, da ein Substrat über ein Zwischenprodukt wieder zum Ausgangssubstrat zurückreagiert und sich damit in einem Kreislauf befindet. Als diese Klasse von gekoppelten Reaktionen entdeckt wurde, wurde sie als Leerlaufcyclus bezeichnet, da sie im Endergebnis nur zu einem nutzlosen Verbrauch von ATP zu führen scheint. Eric Newsholme postulierte, dass Substratcyclen keineswegs „sinnlos“ sind, sondern stattdessen eine regulatorische Funktion besitzen. Insgesamt können die Einflüsse allosterischer Effektoren auf die gegenläufigen Reaktionen eines Substrat-

kreislaufs einen erheblich größeren Teileffekt auf den Fluss eines Stoffwechselwegs (vr= v,) ausüben, als es durch eine allosterische Regulation eines einzelnen Enzyms möglich wäre. Der allosterische Effektor F2,6P z.B. aktiviert die PFK-Reaktion, während er die FBPase-Reaktion inhibiert (dieser regulatorische Mechanismus

ist wichtig, um Glykolyse und Gluconeogenese in den Leberzellen im Gleichgewicht zu halten; Abschnitt 16.4C). Durch einen Substratcyclus wird nicht das Maximum eines Flusses durch

einen Stoffwechselweg erhöht, dafür aber das Minimum herabgesetzt. In gewis-

Kontrolle der Glykolyse (a)

(b)

I

G6P

F6P

F6P

P;

ATP

H,0

ADP

P;

ATP

H,0

ADP

FBP

FBP

GAP + DHAP

GAP + DHAP

Abb. 15.25 Substratkreislauf bei der Regulation der PFK. (a) Im Ruhezustand des Muskels sind beide Enzyme im F6P/FBP - Substratcyclus aktiv und der glykolytische Fluss ist gering. (b) Im aktiven Muskel steigt die-PFK-Aktivität an, während die FBPase-Aktivität abnimmt. Das führt zu einem dramatischen Anstieg im Fluss durch die PFK und daher insgesamt zu einem hohen glykolytischen Fluss.

sem Sinne wird dadurch das Substrat auf eine „Warteschleife“ geschickt. Im Falle der PFK/FBPase-Reaktion (Abb. 15.25) scheint der Substratkreislauf der energetische „Preis“ zu sein, den ein Muskel zahlen muss, um rasch aus dem Ruhezustand, bei dem v;- v, klein ist und der Substratcyclus mit maximaler Geschwindigkeit abläuft, in den Zustand mit hoher Daueraktivität (bei dem vs- v, groß ist) übergehen zu können. Die Rate des Substratkreislaufs kann jedoch selbst unter hormoneller oder neuronaler Kontrolle stehen, damit das Stoffwech-

selsystem unter Bedingungen, bei denen mit hoher Aktivität (Kampf oder Flucht) zu rechnen ist, exakt kontrolliert werden kann. Substratceyclen und andere Mechanismen, die die PFK-Aktivität in vivo kontrollieren, sind Teile eines übergeordneten Systems, das die gesamte zelluläre Stoffwechselaktivität reguliert. Weil die PFK das Kontrollenzym der Glykolyse ist, nahm man an, dass man den glykolytischen Fluss erhöhen könnte, wenn man die Expression der PFK steigern würde. Das ist jedoch nicht der Fall, denn die Aktivität der PFK wird letztlich unabhängig von ihrer Konzentration durch Faktoren reguliert, die den Bedarf der Zelle an Produkten, die durch die Glykolyse und alle anderen Stoffwechselwege zur Verfügung gestellt werden, widerspiegeln. Substratkreislauf, Thermogenese und Obesitas

Man nimmt an, dass viele Tiere und auch erwachsene Menschen den Hauptteil ihrer Körperwärme, besonders wenn es kalt ist, über Substratkreisläufe wie die des F6P in Muskeln und Leber erzeugen - ein Prozess, der als GrundumsatzThermogenese bezeichnet wird (die Muskelkontraktionen beim Zittern oder irgendeiner anderen Bewegung produzieren ebenfalls Wärme). Dieser Substratkreislauf wird durch Schilddrüsenhormone (die den Stoffwechsel in den meisten Geweben anregen) stimuliert. Gezeigt werden konnte dies am Beispiel von

Ratten, die ohne funktionstüchtige

Schilddrüse bei 5°C nicht überleben

konnten. Individuen, die an chronischer Obesitas (Fettleibigkeit) leiden, haben einen geringeren Stoffwechselumsatz. Verantwortlich hierfür ist zum Teil eine verringerte Rate an Grundumsatz-Thermogenese. Solche Individuen sind daher leicht kälteempfindlich. Tatsächlich können Tiere, die an genetisch bedingter Obesitas leiden, und fettleibige Menschen im Gegensatz zu normalen Individuen ihre Rate an Schilddrüsenhormonaktivierung bei Kälte nicht erhöhen.

557

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1: Welche glykolytischen Enzyme stellen potentielle Kontrollpunkte

dar? Beschreiben Sie den Regulationsmechanismus für die Aktivität der Phosphofructokinase. Worin besteht für den Stoffwechsel ein Vorteil durch einen Substrateyclus?

558

Glucose-Katabolismus

5

Stoffwechsel von anderen Hexosen als Glucose

Zusammen mit Glucose sind die Hexosen Fructose, Galactose und Mannose die bedeutendsten

„Brennstoffe“

im

Stoffwechsel.

Nach

der Verdauung

werden

diese Monosaccharide in den Blutkreislauf aufgenommen, der sie zu den verschiedenen Geweben transportiert. Fructose, Galactose und Mannose werden in glykolytische Zwischenprodukte umgewandelt, die nun in den Glykolysestoffwechselweg eingehen (Abb. 15.26).

A.

Fructose

Fructose ist eine wichtige Brennstoffquelle, wenn die Nahrung eine große Menge an Früchten oder Saccharose (einem Disaccharid aus Fructose und Glucose; Abschnitt 8.2A) enthält. Es gibt zwei Stoffwechselwege für den Fructoseabbau; einer wird im Muskel, der andere in der Leber beschritten. Diese Trennung

beruht darauf, dass diese Gewebe ein unterschiedliches Repertoire an Enzymen besitzen. Der Fructosestoffwechsel im Muskel unterscheidet sich nur wenig von dem der Glucose. Hexokinase (Abschnitt 15.2A), die Glucose in G6P umwandelt, phosphoryliert ebenfalls Fructose zu F6P (Abb. 15.27, links). Der Eintritt der Fructose in die Glykolyse erfolgt demnach über einen einzigen Reaktionsschritt. Die Leber enthält dagegen eine als Glucokinase bezeichnete Hexokinase, die eine geringe Bindungsaffinität zu Fructose und zu Hexosen (außer Glucose) hat (Abschnitt 22.1D). Der Fructosestoffwechsel in der Leber muss daher anders als im Muskel ablaufen. In der Tat erfolgt die Umwandlung der Fructose in der Leber über eine Reaktionsfolge, an der sieben Enzyme beteiligt sind (Abb. 15.27). ie Fructokinase katalysiert die Phosphorylierung von Fructose durch ATP am C1-Atom, wobei Fructose-1-phosphat entsteht. Weder die Hexokinase noch PFK sind in der Lage, Fructose-1-phosphat am C6-Atom zu phosphorylieren und das Zwischenprodukt der Glykolyse, FBP, zu bilden. 2. Bei Klasse-I-Aldolasen (Abschnitt 15.2D) sind mehrere Isoenzyme bekannt. Der Muskel enthält Typ-A-Aldolase, die für FBP spezifisch ist. Die Leber dagegen enhält Typ-B-Aldolase, für die auch Fructose-1-phosphat ein Substrat ist (Typ-B-Aldolase wird auch manchmal als Fructose1-phosphat-Aldolase bezeichnet). In der Leber unterliegt Fructose-1-phosphat einer Aldolspaltung: Fructose-1-phosphat = Dihydroxyacetonphosphat + Glycerinaldehyd 3: Über die direkte Phosphorylierung von Glycerinaldehyd durch ATP unter Einwirkung von Glycerinaldehyd-Kinase entsteht das Glykolysezwischen4.-7.

Abb. 15.26 Eintritt anderer Hexosen in die Glykolyse. Fructose (im Muskel) und Mannose werden in F6P, Leber-Fructose in GAP und Galactose in G6P

umgewandelt.

produkt GAP. Alternativ dazu wird Glycerinaldehyd in das Glykolysezwischenprodukt DHAP umgewandelt: Zunächst wird es, katalysiert durch die Alkohol-Dehydrogenase, NADH-abhängig zu Glycerin reduziert (Reaktion 4), unter Katalyse der Glycerin-Kinase zu Glycerin-3-phosphat phosphoryliert (Reaktion 5) und unter der Katalyse von Glycerinphosphat-Dehydrogenase NADH-abhängig zu DHAP reoxidiert (Reaktion 6). DHAP wird schließlich durch die Triosephosphat-Isomerase in GAP umgewandelt (Reaktion 2):

Die beiden Wege vom

Glycerinaldehyd zum

GAP haben dieselben „Nettokos-

ten“: Beide verbrauchen ATP; zudem wird NADH in Reaktion 4 oxidiert und in Reaktion 6 wieder reduziert. Der längere Weg dagegen liefert Glycerin-3phosphat, das (zusammen mit DHAP) als Glycerinrückgrat von Glycerophospholipiden und Triacylglycerinen fungieren kann (Abschnitt 20.6A)

Stoffwechsel von anderen Hexosen als Glucose

Leber

CH,0OPOF-

ADP

559

>

H—Cc= HOCH;

CH,0PO3-

Ho |Hl

> H

H

HO

H—-C—OH OH

ea

Ei \OH

HOCH

CH,0H

Fructose-1phosphat

Fructose-1-phosphat (offenkettige Form) Fructose-1-phosphatAldolase

NADH NAD+ ik

Br Bu

H— :=O „—-

u

ni -0 =0R

E

GlycerinaldehydKinase

er

u

3-phosphat

Isomerase

H—C—OH

Alkohol-

CH;OH

Dehydrogenase

2 Glycerin-

x

Glycerin

aldehyd

ATP

> Glycerin-

ir

7

Triosephosphat-

09H CH,0OH

CH,OPO?%Glycerinaldehyd-

bon

A

nern

Ns CH,OH

Glycerinphosphat-

|

Dehydrogenase

ar

6

CH,OPOS” NADH Dihydroxy-

CH,OH

NAD*

HC

OH

CH,0PO%-

aceton-

phosphat

Ist ein Überschuss an Fructose schädlich? Der Konsum von Fructose ist in den letzten Jahrzehnten in den Industrielän-

dern stark angestiegen. Zurückzuführen ist das zum größten Teil auf die Verwendung von Invertzuckersirup oder Isoglucose, die beide hoch konzentrierte Fructose enthalten, zum Süßen von alkoholfreien Getränken und anderen Lebensmitteln. Fructose ist süßer als Saccharose (Exkurs 8.2) und ist preiswerter herzustellen. Ein mögliches Risiko bei übermäßiger Fructoseaufnahme besteht darin, dass der Fructoseabbau in der Leber den PFK-katalysierten Schritt der Glykolyse umgeht und dadurch einen wichtigen Kontrollpunkt des Stoffwechsels umgeht. Dies bringt möglicherweise den Energiestoffwechsel soweit durcheinander, dass der glykolytische Fluss in Richtung Lipidsynthese umgeleitet wird, weil kein Bedarf mehr an ATP besteht. Stimmt diese Hypothese, dann

könnte ein Zusammenhang bestehen zwischen dem zunehmenden Konsum von Fructose und dem zunehmenden Auftreten von extremem Übergewicht besonders bei Kindern und Jugendlichen. Ganz anders liegen die Verhältnisse bei Menschen mit Fructoseunverträglichkeit. Diese wird durch einen Typ-B-Aldolase-Mangel hervorgerufen. In Abwesen-

Glycerin-3-phosphat

Abb. 15.27 Der Fructoseabbau. Im Muskel (links) wird die Umwandlung von Fructose in das Glykolysezwischenprodukt F6P über nur ein Enzym, die Hexokinase, katalysiert. In der Leber dagegen (rechts) sind sieben Enzyme an der Umwandlung in Zwischenprodukte der Glykolyse beteiligt: (1) Fructokinase, (2) Fructose-1phosphat-Aldolase, (3) Glycerinaldehyd-Kinase, (4) Alkohol-Dehydrogenase, (5) Glycerin-Kinase, (6) Glycerinphosphat-Dehydrogenase und (7) Triosephosphat-Isomerase.

560

Glucose-Katabolismus

heit von Aldolase kann sich genug Fructose-1-phosphat anhäufen, um den P:Speicher der Leber zu erschöpfen. Unter diesen Bedingungen sinkt [ATP], was zu einem Leberschaden führt. Außerdem hemmt eine erhöhte Fructose-1-phosphat-Konzentration sowohl die Glykogen-Phosphorylase (ein essentielles Enzym beim Abbau von Glykogen zu Glucose; Abschnitt 16.1A) als auch die Fructose1,6-bisphosphatase (ein essentielles Enzym der Gluconeogenese; Abschnitt 16.4B). Dadurch kommt es zu einer schweren Hypoglykämie (zu geringer Gehalt von Glucose im Blut), die lebensbedrohende Ausmaße annehmen kann. Die Krankheit scheint sich jedoch praktisch selbst zu kurieren: Personen mit einer Fructoseunverträglichkeit entwickeln rasch eine starke Abneigung gegenüber allem Süßen.

B.

Galactose

Galactose wird durch die Hydrolyse von Lactose (einem Disaccharid aus Galactose und Glucose; Abschnitt 8.2A) aus Milchprodukten aufgenommen. Galactose und Glucose (siehe Formel unten) sind Epimere, die sich nur in ihrer Konfiguration am C4-Atom unterscheiden. Obwohl die Hexokinase Glucose, Fructose und Mannose phosphorylieren kann, erkennt sie Galactose nicht. Ein Epimerisierungsschritt muss daher vor dem Eintritt der Galactose in die Glykolyse erfolgen. Diese Reaktion läuft nach der Umwandlung von Galactose in ihr Uridindiphosphatderivat ab (die Rolle des UDP-Zuckers und anderer Nucleotidylzucker wird im Detail in Abschnitt 15.4 erörtert). Der gesamte Stoffwechselweg, bei dem Galactose in ein Glykolysezwischenprodukt umgewandelt wird, umfasst vier Reaktionsschritte (Abb. 15.28): CH,0H H

CH,0H OH

H OH

HO

ONEH H OLE

H

HO

OH

H

OH

OH H

a-D-Glucose

OH

a-D-Galactose

1. Galactose wird am C1-Atom von Galactokinase durch ATP phosphoryliert. Galactose-1-phosphat-uridylyltransferase überträgt die Uridylylgruppe von UDP-Glucose auf Galactose-1-phosphat, wodurch Glucose-1-phosphat (G1P) und UDP-Galactose durch die reversible Spaltung der Pyrophosphorylbindung entstehen. 3. UDP-Galactose-4-Epimerase verwandelt UDP-Galactose zurück in die UDPGlucose. Dieses Enzym ist mit einem Molekül NAD* assoziiert, was darauf schließen lässt, dass die Reaktion über eine Oxidation und anschließende Reduktion des Hexose-C4-Atoms verläuft. CH,0H HO

CH,0H OH

H

H OHzEr H

H HO

OH

O—-UDP H

UDP-Galactose

OH

UDP-Glucose

N NADH

ZH

OHTEH

O—-UDP H

OX

Ke CH,0H

NADH

OH

Stoffwechsel von anderen Hexosen als Glucose CH;0H

Be

0

H

CH,0H

HO

CH,0H

(6)

H

OH H

e

H

Pu

Os

HO

OPOF

H

erreiche s

a

0

Uridin

UDP-Galactose-Epi 4-Epimerase

|3 NAD+

CH,OH OH

.

OH

H

HO Op 3

|

0

Galactose-1-phosphatidylyltransfera fü se uridylylt

CH,OH H

|

I

UDP-Glucose

|

i

(6)

|

er

HG Sehe

(6)

H

OH

H

OH

H

oO l

H

oO |

BE

H

Glucose-1-phosphat (G1P)

OH

OH

O7

Uridin

07

UDP-Galactose

4 || Phosphoglucomutase

CH,OPO3 E HO

OH H OHr

°H

H

OH

OH

Glucose-6-phosphat

(G6P)

Abb. 15.28 Der Galactoseabbau. Vier Enzyme sind an der Umwandlung von Galactose in Zwischenprodukte der Glykolyse beteiligt: (1) Galactokinase,

(2) Galactose-1-phosphat-uridylyltransferase, (3) UDP-Galactose-4-Epimerase und (4) Phosphoglucomutase.

4. G1P wird unter Einwirkung von Phosphoglucomutase (Abschnitt 16.1C) in das Glykolysezwischenprodukt G6P überführt. Galactosämie Galactosämie ist eine Erbkrankheit, die durch die Unfähigkeit zur Umwandlung von Galactose in Glucose charakterisiert ist. Zu ihren Symptomen zählen Entwicklungsstörungen, geistige Retardierung und — in manchen Fällen — Tod durch Leberschäden. Meist wird Galactosämie durch einen Mangel an Galactose-1-phosphat-uridylyltransferase ausgelöst, dem Enzym, das Reaktion 2 der Umwandlung katalysiert. Die Bildung von UDP-Galactose aus Galactose-1-phosphat wird somit verhindert, was zu einer Anhäufung toxischer Nebenprodukte führt. Zum Beispiel steigt bei zunehmender Galactosekonzentration im Blut die Galactosekonzentration in der Augenlinse ebenfalls an, wo dieser Zucker

zu Galactitol reduziert wird.

561

562

Glucose-Katabolismus

CH,OH Br 00H HO-C—H

HO—C—H

H-C—-OH emoH D-Galactitol

Dieser Zuckeralkohol ruft in der Linse schließlich Grauen Star (Linsentrübung) hervor. Galactosämie wird mit einer galactosefreien Diät behandelt. Mit Ausnahme der geistigen Retardierung lassen sich so sämtliche Krankheitssymptome beheben. Die für die Synthese von Glykoproteinen (Abschnitt 8.3C) und Glykolipiden (Abschnitt 9.1D) essentiellen Galactosyleinheiten können durch eine Umkehr der Epimerasereaktion aus Glucose synthetisiert werden. Für diese Synthesen ist daher keine Zufuhr von Galactose mit der Nahrung notwendig. C.

Mannose

Mannose, ein Abbauprodukt von Polysachariden und Glykoproteinen, ist das C2-Epimer von Glucose:

CH,OH

H

H OH

HO

oO H

H

H

HO

OH

CH,0OH H

OH HO

OH

Abschnitt

5

einen zweistufigen Prozess, ein (Abb. 15.29): 1. Hexokinase erkennt Mannose und wandelt sie in Mannose-6-phosphat um. 2. Phosphomannose-Isomerase überführt diese Aldose in das Glykolysezwi-

eintreten.

je

schenprodukt F6P; der Reaktionsmechanismus ähnelt dem der Phosphoglucose-Isomerase (Abschnitt 15.2B).

5

OH

ATP

HO

OH

x 2— De

_ADP

/

n

Hexokinase

HO

\ 1

H HO

a-D-Mannose

Mannose tritt in den Glykolysestoffwechselweg über die Umwandlung zu F6P,

1. Beschreiben Sie, wie Fructose, Galactose und Mannose in den Glykolysestoffwechselweg

A

De

a-D-Glucose

Verständnisfrage zu

OH

;

H H Mannose

Abb. 15.29 Der Mannoseabbau. Zwei Enzyme werden für die Umwandlung von Mannose in das Glykolysezwischenprodukt F6P benötigt: (1) Hexokinase und (2) Phosphomannose-Isomerase.

n

H OH

HO

OH

H H Mannose-6-phosphat

CH,OH

0,3POCH, g_

2 a

PhosphomannoseIsomerase

AM H

HO

HO

H

et

Fructose-6-phosphat (F6P)

Der Pentosephosphatweg

6

Der Pentosephosphatweg

ATP ist die „Energie-Währung“ der Zelle; seine exergone Spaltung ist mit vielen Zellfunktionen gekoppelt, die ansonsten endergon wären. Zellen haben jedoch noch eine zweite Währung: die Reduktionsäquivalente. Viele endergone Reaktionen, insbesondere die reduktiven Biosynthesen von Fettsäuren (Abschnitt 20.4) und von Cholesterin (Abschnitt 20.7A), sind zusätzlich zu ATP auch auf NADPH angewiesen. Trotz ihrer großen chemischen Ähnlichkeit sind NADPH und NADH in den Stoffwechselwegen im Allgemeinen nicht austauschbar. Während NADH die Freie Enthalpie, die bei der Oxidation von Metaboliten entsteht, für die ATP-Synthese (oxidative Phosphorylierung) einsetzt, macht NADPH die Freie Enthalpie der Metabolitenoxidation für reduktive Biosynthesen nutzbar. Diese Unterscheidung ist möglich, weil die Dehydrogenasen, die am oxidativen und reduktiven Stoffwechsel beteiligt sind, hochspezifisch für ihre jeweiligen Coenzyme sind. Tatsächlich halten Zellen normalerweise ein [NAD*]/[/NADH]-Verhältnis von ungefähr 1000 aufrecht, wodurch die Metabolitenoxidation begünstigt ist, während ihr [NADP*J/[/NADPH]-Verhältnis bei ca. 0,01 liegt, was die reduktive Biosynthese fördert. NADPH wird durch die Oxidation von Glucose- 6-phosphat über einen alternativen Weg der Glykolyse erzeugt, den Pentosephosphatweg (auch als Hexosemonophosphatweg bezeichnet; Abb. 15.30). Gewebe, die den Großteil der Lipidbiosynthese leisten (Leber, Milchdrüsen, Fettgewebe und Nebennierenrinde), enthalten große Mengen an Enzymen des Pentosephosphatwegs. So laufen etwa 30% der Glucoseoxidation in der Leber über den Pentosephosphatweg statt über die Glykolyse ab. Die Gesamtreaktion des Pentosephosphatwegs lautet 3 G6P + 6 NADP*

+3

H,O

=

6 NADPH +6 H* + 3 CO, + 2 F6P + GAP

Der Weg kann in drei Stufen eingeteilt werden: Schritt

1

Oxidative Reaktionen (Abb. 15.30, Reaktionen und Ribulose-5-phosphat (Ru5P) liefern. 3 G6P + 6 NADP*

Stufe 2

+ 3 Hz0 —> 6 NADPH

1-3), die NADPH

+ 6 H* + 3 CO, + 3 Ru5P

Isomerisierungs- und Epimerisierungsreaktionen (Abb. 15.30, Reaktionen 4 und 5), die Ru5P entweder in Ribose-5-phosphat (R5P) oder in Xylulose-5-phosphat (Xu5P) umwandeln. 3 Ru5P = R5P + 2 Xu5P

Eine Reihe von Reaktionen, die C-C-Bindungen spalten oder bilden (Abb. 15.30, Reaktionen 6-8), die zwei Moleküle Xu5P und ein Molekül R5P zu zwei Molekülen F6P und einem Molekül GAP umsetzen. Die Reaktionen der Stufen 2 und 3 sind vollständig reversibel, so dass die Produkte des Stoffwechselwegs je nach den Bedürfnissen der Zelle variieren können. Im folgenden Abschnitt werden die drei Stufen des Pentosephosphatwegs und dessen Kontrollmechanismen diskutiert. Stufe 3

563

564

Glucose-Katabolismus

A.

Abb. 15.30 Der Pentosephosphatweg. Die Anzahl der Linien in einem Pfeil gibt die Zahl

Stufe 1: Oxidation unter Bildung von NADPH und Ribulose-5-phosphat

der Moleküle an, die bei einem Durchlauf des

Stoffwechselwegs reagieren, wobei 3 Moleküle G6P in 3 Moleküle CO,, 2 Moleküle F6P und I Molekül GAP umgewandelt werden. Zur Vereinfachung sind die Zucker von Reaktion 3 an in ihrer linearen Form dargestellt. Das Kohlenstoffgerüst von R5P und die daraus abgeleiteten Atome sind rot eingezeichnet, die von Xu5P abgeleiteten grün. Die C,-Einheiten, die von der Transketolase übertragen werden, sind grün und die von der Transaldolase übertragenen C;-Einheiten türkis unterlegt.

G6P wird als der Startpunkt des Pentosephosphatwegs betrachtet. Dieses Stoffwechselprodukt kann sowohl durch Einwirkung von Hexokinase auf Glucose (Reaktion 1 der Glykolyse; Abschnitt 15.2A) als auch durch den Glykogenabbau (der G6P direkt produziert; Abschnitt 16.1) entstehen. Nur die ersten drei Reaktionen des Pentosephosphatwegs sind an der NADPH-Bildung beteiligt

(Abb. 15.30):

Dr u

NADPH + H*

CH,OPO H

HO

_ NADP* OH

O\_

H

oH

H H

H..

H

1

2

oO

{0)

H

OH

7,70

Glucose-6phosphat (G6P)

Be 0-OH H— 0-OH

Dh

OH

Lactonase

6-Phosphogluconat

H

En

u

6

=

>.

Transketolase

CH,0OPO3

3

Fe

1

H— 0200%

Ribulose-5-phosphat-

Sedoheptulose-7phosphat (S7P)

SELOR

ar

“

ee

c=0O

Ribulose-5-phosphat-

meh

Epimerase

|

5)

Xylulose-5phosphat (Xu5P)

|

N:

|

| D=C—0OH

HO—C—H

N

ne

Be

oH

ructose-6phosphat (F6P)

.

CH,OH

c=0O

EsCH,0PO3 2 :3

5

HO— hi65

CH>0PO;3

oa

09H

Isomerase

Ribose-5hosphat (R5P BE BRRENS

Y

ee He

Oo 4

7 |Transaldolase ransaladolase

HZ

Ribulose-5phosphat (Ru5P)

| CH>0PO3

YiOH:

(GAP)

5

a

CH;0PO3

Glycerinaldehyd3-phosphat

CH3OPOz

| HZ 60H

| H— nOH

Hz :— OH

ber 0-OH

a

|

Hze20H

or Ser H

R

CH,OPOF

CHOR |

H— 0-OH 6-Phosphogluconat-

H= 0 OH

6-Phosphogluconoö-lJacton

c=o

Ben

el 1El0 = 0-

6-Phosphc glucono-

H

Dehydrogenase

"ri 2

HO

Glucose6-phosphat-

OH

CH,O PO3

NADPH + CO,

Sr

H —(C—OH 5

A CH,0PO3 2 ri rose-4phosphat (E4P)

HOCH 8 Transketolase it7

OÖ Sa

De 7

\ H a’

= OH

CH,OPO3 2 Fructose-6phosphat

(F6P)

+

H

\ H=— N==OH

CHz0PO% Glycerinaldehydne

(GAP)

Der Pentosephosphatweg

565

1. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) katalysiert den Nettotransfer eines Hydridions vom C1-Atom des G6P auf NADP*, 6-Phosphoglucono-ölacton wird dabei gebildet. Hr

+

CH,OPO?” H

NADP

+

NADPH

SmOH

H OH

H

0

Glucose-6-phosphatH

H

CH,OPO? H

Dehydrogenase

(0)

H

OReHr HO

OH

H

G6P

OH

6-Phosphogluconoö-lacton

G6P, ein cyclisches Halbacetal einer Aldehydfunktion am C1-Atom, wird dadurch zu einem cyclischen Ester (Lacton) oxidiert. Das Enzym ist spezifisch für NADP* und wird durch NADPH stark gehemmt. 2. 6-Phosphogluconolactonase steigert die Geschwindigkeit der Hydrolyse von 6-Phosphoglucono-ö-lacton zu 6-Phosphogluconat (diese Reaktion läuft auch ohne Enzym mit signifikanter Geschwindigkeit ab). 3. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von 6-Phosphogluconat, einer ß-Hydroxysäure, zu Ru5P und CO, (Abb. 15.31). Diese Reaktion läuft vermutlich über die Bildung einer ß-Ketosäure als Zwischenprodukt ab. Die Ketogruppe erleichtert die Decarboxylierung, indem sie als Elektronensenke fungiert. Die Bildung von Ru5P schließt den oxidativen Teil des Pentosephosphatwegs ab. Dabei werden zwei Moleküle NADPH pro Molekül G6P erzeugt, das in den Stoffwechselweg eintritt.

B.

Stufe 2: Isomerisierung und Epimerisierung

von Ribulose-5-phosphat Ru5P wird durch Ribulose-5-phosphat-Isomerase (Abb. 15.30, Reaktion 4) in R5P bzw. durch Ribulose-5-phosphat-Epimerase (Abb. 15.30, Reaktion 5) in Xu5P überführt. Diese Isomerisierungs- und Epimerisierungsreaktionen laufen vermutlich wie die von der Triosephosphat-Isomerase katalysierte Reaktion (Abschnitt 15.2E) über ein Endiolzwischenprodukt ab.

o HZ 00H

eu N HOCH |

H—C—OH |

BC

04

n

N | INH,

12

R

NADPH +H

a

HZ

06H

J.

|

E36 | =40H HG —OH

CH,OPOF

CH,0POF 6-Phosphogluconat

| 6-PhosphogluconatDehydrogenase y.

0:

2 |

NADP*

Abb. 15.31 Die 6-PhosphogluconatDehydrogenasereaktion. Die Oxidation der OH-Gruppe führt zu einer leicht decarboxylierbaren ß-Ketosäure (wenngleich dieses postulierte Zwischenprodukt noch nicht isoliert werden konnte).

ß-KetosäureZwischenprodukt

H—C—OH CH,0POF Ru5P

566

Glucose-Katabolismus

Die relativen Mengen an R5P und Xu5P, die aus Ru5P gebildet werden, hängen von dem aktuellen Bedarf der Zelle ab. Beispielsweise ist R5P ein essentielles Vorläufermolekül in der Biosynthese von Nucleotiden (Kap. 23). Daher ist die RSP-Bildung in sich schnell teilenden Zellen, in denen die Rate der DNA-Synthese gesteigert ist, hoch (unter Umständen ist die gesamte Aktivität des Pentosephosphatwegs angehoben). Wird der Stoffwechselweg nur für die NADPH-Produktion genutzt, werden Xu5P und R5P im Verhältnis 2:1 gebildet, um anschließend in der dritten Stufe des Pentosephosphatwegs in Glykolysezwischenprodukte umgewandelt zu werden. Stufe 3 wird im folgenden Abschnitt erörtert.

C.

Stufe 3: Reaktionen zur Knüpfung und Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen

Wie wird ein Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen in einen Zucker mit 6 Kohlenstoffatomen, wie F6P, umgewandelt? Die Umordnung von Kohlenstoffatomen in der dritten Stufe des Pentosephosphatwegs ist einfacher nachzuvollziehen, wenn die Stöchiometrie des Stoffwechselwegs betrachtet wird. Drei G6P-Moleküle, die in den Stoffwechselweg eintreten, ergeben drei Ru5P-Moleküle in Stufe 1. Diese drei Pentosen werden dann zu einem R5P und zwei Xu5P umgesetzt (Abb. 15.30, Reaktionen 4 und 5). Die Umwandlung dieser drei C;-Zucker in zwei C,-Zucker und einen C;,-Zucker schließt einen beachtlichen „Jonglierakt“ ein, der von zwei Enzymen, der Transaldolase und der Transketolase katalysiert wird. Diese Enzyme weisen einen Reaktionsmechanismus auf, bei dem stabilisierte Carbanionen gebildet und an elektrophile Zentren von Aldehydgruppen addiert werden. Transketolase katalysiert die Übertragung von C,-Einheiten

Transketolase mit dem Cofaktor Thiaminpyrophosphat (TPP; Abschnitt 15.3B) katalysiert die Übertragung von einer-C,-Einheit von Xu5P auf R5P, wodurch GAP und Sedoheptulose-7-phosphat (S7P; Abb. 15.30, Reaktion 6) entstehen. Das Reaktionszwischenprodukt ist ein kovalent gebundenes Addukt zwischen Xu5P und TPP (Abb. 15.32) Die Röntgenstruktur des dimeren Enzyms zeigt, dass das TPP in einer tiefen Spalte zwischen den Untereinheiten bindet, so dass, genauso wie bei der Pyruvat-Decarboxylase (einem anderen TPP-abhängigen Enzym; Abb. 15.19), Reste beider Untereinheiten an der Bindung beteiligt sind. In der Tat sind die Strukturen beider Enzyme so ähnlich, dass sie wahrscheinlich von einem gemeinsamen Vorläufermolekül abstammen. Transaldolase katalysiert die Übertragung von C;-Einheiten

Transaldolase katalysiert die Übertragung von C;-Einheiten von S7P auf GAP:; dabei werden Erythrose-4-phosphat (E4P) und F6P (Abb. 15.30, Reaktion 7) gebildet. Die Reaktion erfolgt über eine Aldolspaltung (Abschnitt 15.2D), welche zunächst die Bildung einer Schiff’schen Base zwischen einer e-Aminogruppe eines essentiellen Lys-Rests und der Carbonylgruppe von S7P beinhaltet (Abb.

15.32).

Eine zweite Transketolasereaktion ergibt Glycerinaldehyd-3-phosphat und ein zweites Molekül Fructose-6-phosphat In einem zweiten Transketolase-Reaktionsschritt wird eine C,-Einheit von einem zweiten Molekül Xu5P auf E4P übertragen. Dabei wird GAP und ein weiteres

Molekül F6P gebildet (Abb. 15.30, Reaktion 8). Die dritte Stufe des Pentosephosphatwegs wandelt somit zwei Moleküle Xu5P und ein Molekül RSP in zwei Moleküle F6P und ein Molekül GAP um. Diese Kohlenstoffgerüst-Transformationen (Abb. 15.30, Reaktion 6-8) sind in Abbildung 15.34 zusammengefasst.

Der Pentosephosphatweg

er H;C

ar

N“

|

Abb. 15.32 Mechanismus der Transketolase. Transketolase (mit E wiedergegeben) verwendet als Coenzym TPP, um das bei der C2-C3-Bindungsspaltung von Xu5P gebildete Carbanion zu stabilisieren. Die Reaktion läuft wie folgt ab: (1) Das TPP-Ylid greift die Carbonylgruppe des Xu5P an. (2) Die C2-C3-Bindungsspaltung liefert GAP und enzymgebundenes 2-(1,2-Dihydroxyethyl)-TPP, ein resonanzstabilisiertes Carbanion. (3) Das C2-Carbanion greift das Aldehyd-C-Atom von R5P an und bildet ein S7P-TPP-Addukt. (4) TPP wird freigesetzt, durch diese Bindungsspaltung entstehen S7P und regeneriertes TPP-Enzym.

iR C 12

'NB,

| HO— ©—H

Thiamin-pyrophosphat (TPP)

Ylid-Form Hr

H—-C—OH

1

CH,0PO3

Xu5P

H;C

R

+

R=-Ny HO

5,8“ E ”— CH,0H

ulolc-u + SB

CH,OPO3

|

H—C—OH |

CH,OPO3 GAP

I

2

H;C

R’

7 H* (6)

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I

*

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H;C

HO

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CH,OH

HO ,

H

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CH>0H

2-(1,2-Dihydroxyethyl])-

| H— “—0OH

TPP

5

H—-0-0H

IN

H—C—OH | CH,OPOF R5P \f

H;C

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—

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az

.

E

CH,OH

Fre H-0-C—-CH,0H

c=o

| HO—C—H

H=C-0H | H-C-—OH H =. 02 :0H

| CH,OPOF

HO—C—H

s \

Hr C-0H H—C—OH HH60H

CH,OPO? S7P

567

r

568

_Glucose-Katabolismus

Abb. 15.33

Mechanismus der Transaldolase.

Transaldolase enthält einen essentiellen Lys-Rest,

der eine Aldolspaltungsreaktion wie folgt begünstigt: (1) Die e-Aminogruppe von Lys bildet eine Schiff’sche Base mit der Carbonylgruppe von S7P. (2) Ein in Form der Schiff’schen Base stabilisiertes Carbanion wird in einer Aldolspaltungsreaktion

‚CH50H

SER2)= Lys(CH3)4 Fr NH3

HO—C ®| H £ — OH H— C—OH °| H—C-0H

zwischen C3 und C4 gebildet, E4P wird dabei

eliminiert. (3) Das enzymgebundene, resonanzstabilisierte Carbanion wird an das Carbonyl-C-

|»

S7P

Atom von GAP addiert und bildet F6P, das über

OH

©

70:

1

eine Schiff’sche Base an das Enzym geknüpft ist. (4) Die Schiff’sche Base wird unter Regenerierung des aktiven Enzyms und Freisetzung von F6P hydrolysiert.

OH” e CH,OH + Lys(CH,),

Aal

—NH= T

HO cc—H

HC foiH H— i—0OH H— 5—0OH

HETRO

E=

CH,OPO2

H— S—0OH

2

H—C—OH E4P

CH,0POF

CH,OH

CH,OH 3Lys(CH3)4 mau NEE

Lys(CH), — NH —C

&

il

H— ;— OH GAP

CH,OPOF en

Bee BE

co

ae

ner

dr

+

Lys(CH,),, — NH=C

ea

BREI, Summe)

35

=

H—C—OH

30 #0,

Abb. 15.34 Zusammenfassung der Kohlenstoffgerüst-Neuordnung im Pentosephosphatweg. Eine Reihe von Reaktionen zur Knüpfung und Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen wandeln drei C;-Zucker in zwei C;- und einen

|

HO—C—H

CH,OPO?

oH- I CH,OH Lys(CH,),—NH,

+

a

C;-Zucker um. Die Zahlen in Klammern auf der

linken Seite geben die entsprechend nummerierte Reaktion in Abb. 15.30 an.

er

,

ee H—C—OH mn»

rsıtrTr

amd

| DS

H

Der Pentosephosphatweg

D.

569

Kontrollmechanismen des Pentosephosphatwegs

Die Hauptprodukte des Pentosephosphatwegs sind R5P und NADPH. Die Transaldolase- und Transketolasereaktionen überführen einen Überschuss von R5P in glykolytische Zwischenprodukte, wenn der Stoffwechselbedarf an NADPH den an R5P in der Nucleotidbiosynthese übersteigt. Das entstehende GAP und F6P kann in die Glykolyse und in die oxidative Phosphorylierung eingehen oder durch die Gluconeogenese (Abschnit 16.4) in Form von G6P wiederverwendet werden. Wird mehr R5P als NADPH benötigt, können F6P und GAP aus dem Glykolysestoffwechselweg bezogen werden und für die Synthese von R5P durch Umkehr der Transaldolase- und Transketolasereaktionen bereitgestellt werden. Das Zusammenspiel von Glykolyse und Pentosephosphatweg ist als Diagramm in Abbildung 15.35 dargestellt. Der Fluss durch den Pentosephosphatweg und damit auch die Geschwindigkeit der NADPH-Bildung wird durch die Rate der Glucose- 6-phosphat-Dehydrogenasereaktion (Abb. 15.30, Reaktion 1) kontrolliert. Die Aktivität dieses Enzyms, das den ersten geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Stoffwechselwegs (AG = -17,6 kJ - mol”) katalysiert, wird durch die NADPH-Konzentration reguliert (Regulation durch Verfügbarkeit an Substrat). Verbraucht die Zelle NADPH, steigt die NADP’-Konzentration an und damit auch die Geschwindigkeit der G6PD-Reaktion, wodurch die NADPH-Regeneration angeregt wird. In einigen Geweben unterliegt offensichtlich die Synthese von Enzymen ebenfalls hormoneller Kontrolle. Ein Mangel an G6PD ist der klinisch am häufigsten auftretende Defekt im Pentosephosphatweg (siehe Exkurs 15.4).

Verständnisfragen zu Abschnitt 6 1. Skizzieren Sie die einzelnen Reaktionen des Pentose-

phosphatwegs. 2. Wie ändert sich der Fluss durch

den Pentosephosphatweg als Antwort auf den Bedarf an

NADPH oder Ribose-5-phosphat?

Pentosephosphatweg

Glykolyse

> Abb. 15.35 Verbindung zwischen der Glykolyse und dem Pentosephosphatweg. Der Pentosephosphatweg, der mit dem in Stufe 2 der Glykolyse gebildeten G6P beginnt, generiert NADPH für den Einsatz in reduktiven Reaktionen und R5P für die Nucleotidbiosynthese. Überschuss an R5P wird in Glykolysezwischenprodukte über eine Reihe von Reaktionen umgewandelt, die ebenfalls in

umgekehrter Richtung ablaufen können, um R5P bei Bedarf zu gewinnen.

570

Glucose-Katabolismus

"Exkurs 15.4

Asa?

Biochemie im Organismus

E

.

=

we

2

ER

ash nemelinsigenenoll

a

>

Mangel an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Außer zur Biosynthese wird NADPH für mehrere reduzierende Prozesse benötigt. Zum Beispiel sind Erythrocyten auf große Mengen reduziertes Glutathion (GSH), ein Cyshaltiges Tripeptid, angewiesen.

Die Erythrocyten von Individuen, die einen Mangel an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) aufweisen, sind besonders empfindlich für oxidative Schädigung, obwohl klinische Symptome möglicherweise nicht auftreten. Dieser Enzymmangel, der häufig bei der afrikanischen, asiatischen

I HN-CH-CH,—CH,—C—NH—CH-C-NHCH,— 000° | CO0” CH,

chungen zur hämolytischen Anämie entdeckt. Hämolytische Anämie wird bei diesen Menschen durch die Gabe von be-

|

SH

Eine Hauptfunktion von GSH in Erythrocyten ist es, reduktiv H,O, und organische Hydroperoxide abzufangen. Diese reaktiven Sauerstoffspezies schädigen Hämoglobin irreversibel und können C-C-Bindungen in Phospholipidankern von Zellmembranen spalten. Die unkontrollierte Anhäufung von Peroxiden führt zur vorzeitigen Zelllyse. Peroxide lassen sich durch die von Glutathion-Peroxidase katalysierte Reaktion mit Glutathion eliminieren.

DIGSHELER- 00H

GSSG

+ ROH

+ H,O

GSSG entspricht oxidiertem Glutathion (zwei GSH-Moleküle sind über eine Disulfidbrücke zwischen ihren Sulfhydrylgruppen miteinander verknüpft). Reduziertes GSH wird anschließend durch die Reduktion von GSSG durch NADPH, katalysiert durch die Glutathion-Reduktase, wiedergewonnen.

GSSG

+ NADPH

+ H*

CH, | NH—CH—-CH5

N

H,CO

—

CH

— CH,

—

NH;

DI

4°:

Primagquin

Primaquin stimuliert die Peroxidbildung und steigert damit

Organische Hydroperoxide

GlutathionReduktase

stimmten Medikamenten induziert, wozu auch das Antimalariamittel Primaquin gehört, oder durch den Verzehr von Fava-

Bohnen (Saubohne, Vicia faba), einem Hauptnahrungsmittel im Mittleren Osten.

Glutathion (GSH) (y-L-Glutamyl-L-Cysteinylglycin)

GlutathionPeroxidase

und mediterranen Population vorkommt, wurde bei Untersu-

2GSH

+ NADP*

Ein ständiger Nachschub an NADPH ist für die Integrität der Erythrocyten äußerst wichtig.

den NADPH-Bedarf derartig, dass die mutierten Zellen ihn nicht mehr decken können. Gewisse toxische Glykoside, die

in kleinen Mengen in Fava-Bohnen vorkommen, haben den gleichen Effekt. Dies führt zum sogenannten Favismus. Der Hauptgrund für die niedrige enzymatische Aktivität in den betroffenen Zellen scheint eine gesteigerte Abbaugeschwindigkeit des mutierten Enzyms zu sein. Das erklärt, weshalb Patienten mit relativ milden Formen des G6PD-Mangels auf Primaquin zwar mit hämolytischer Anämie reagieren, sich aber trotz weiterer Primaquinbehandlung innerhalb einer Woche wieder erholen. Reife Erythrocyten haben keinen Zellkern und keine Proteinsynthese-Maschinerie und können deshalb keine neuen Enzymmoleküle synthetisieren, um die abgebauten zu ersetzen (sie können auch keine neuen Membrankomponenten synthetisieren, weshalb sie grundsätzlich so empfindlich gegen Membranschäden sind). Die anfängli-

2

u En

Zusammenfassung

che Primaquinbehandlung führt zur Lyse der „alten“ Erythrocyten, deren defekte G6PD zum Großteil abgebaut ist. Produkte dieser Lyse stimulieren die Bildung „junger“ Zellen, die mehr Enzym enthalten und deshalb besser mit der Primaquinbelastung zurechtkommen. Schätzungsweise gibt es rund 400 Millionen Menschen, die an G6PD-Mangel

Die Bedeutung von NADPH in anderen Zellen als den Erythrocyten konnte durch die Züchtung von Mäusen gezeigt werden, bei denen das G6PD-Gen

ausgeschaltet worden ist.

Alle Zellen dieser Tiere reagieren extrem empfindlich auf oxidativen Stress, obwohl sie weitere Mechanismen

zur Eli-

minierung reaktiver Sauerstoffspezies besitzen.

leiden, wodurch dieses Krankheitsbild die

häufigste Mangelerkrankung beim Menschen darstellt. Die starke Verbreitung von defekter G6PD in Malaria-Gebieten der Welt lässt vermuten, dass derartige Mutationen Resistenz gegen den Malariaparasiten Plasmodium falciparum verleihen. Tatsächlich scheinen Erythrocyten mit G6PD-Mangel ein weniger geeigneter Wirt für Plasmodien zu sein als normale Zellen. Wie die Sichelzellanämie (Abschnitt 7.1E) führt ein G6PD-Mangel zu einem Selektionsvorteil für Menschen, die in endemischen Malariagebieten leben. Erstaunlicherweise sind jedoch nur Frauen, die heterozygote Träger dieser X-chromosomal vererbten Krankheit sind, gegen Malaria resistent. Vermutlich können sich Plasmodien an das Leben in G6PD-defizienten Erythrocyten anpassen (die bei betroffenen Männern und bei für die Krankheit homozygoten Frauen ausschließlich auftreten). Offensichtlich kann sich aber der Parasit nicht an die Bedingungen in heterozygoten Frauen adaptieren, bei denen die eine Hälfte der Erythrocyten G6PD-defizient und die andere Hälfte normal ist.

571

”

[Foto von roten Blutzellen, mit intrazellulärem Plasmodium falciparum (der Malariaparasit). © Dr. Gopal Murti/Photo Researchers, Inc.]

Zusammenfassung T- Die Glykolyse ist eine Abfolge von zehn enzymkatalysierten Reaktionen, bei

denen ein Molekül Glucose in zwei Moleküle Pyruvat umgewandelt wird, unter Nettoproduktion von zwei ATP und der Reduktion von zwei NAD" zu zwei NADH.

In der ersten Stufe der Glykolyse wird Glucose durch Hexokinase phosphoryliert, durch Glucosephosphat-Isomerase (PGI) isomerisiert, erneut durch Phosphofructokinase (PFK) phosphoryliert und durch Aldolase schließlich in die Triosen Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) gespalten. Diese werden durch die Triosephosphat-Isomerase (TIM) ineinander umgewandelt. In der Summe werden bei den Reaktionen der Stufe I 2 ATP verbraucht.

In der zweiten Stufe der Glykolyse wird GAP oxidativ durch Glycerinaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) phosphoryliert, durch Phosphoglycerat-Kinase (PGK) dephosphoryliert, wobei ATP gebildet wird, durch Enolase dehydratisiert und durch Pyruvat-Kinase dephosphoryliert, um das zweite ATP und Pyruvat zu generieren. Diese Stufe produziert 4 ATP pro Molekül Glucose und sorgt damit für einen Nettogewinn von 2 Molekülen ATP pro Molekül Glucose.

Unter anaeroben Bedingungen wird Pyruvat reduziert, um NAD* für die Glykolyse bereitzustellen. Bei der Milchsäuregärung wird Pyruvat reversibel zu Lactat reduziert.

Bei der alkoholischen Gärung wird Pyruvat durch einen Thiaminpyrophosphat (TPP)-abhängigen Mechanismus decarboxyliert, der gebildete Acetaldehyd wird anschließend zu Ethanol reduziert.

572

Glucose-Katabolismus

Die Glykolysereaktionen, die durch Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvat-Kinase katalysiert werden, sind metabolisch irreversibel. Phosphofructokinase ist der Hauptkontrollpunkt des Flusses durch die Glykolyse. Eine allosterische Hemmung dieses Enzyms durch ATP kann

durch AMP und ADP aufgehoben werden, deren Konzentrationen wesent-

lich stärkeren Schwankungen unterliegen als die von ATP. Die gegenläufigen Reaktionen des Fructose-6-phosphat (F6P) /Fructose-1,6bisphosphat (FBP)-Cyclus erlauben große Änderungen im glykolytischen Fluss. \ Fructose, Galactose und Mannose werden enzymatisch in glykolytische Zwischenprodukte umgewandelt und dem Stoffwechsel so zur Verfügung gestellt. 10. Im Pentosephosphatweg wird Glucose-6-phosphat (G6P) oxidiert und decarboxyliert und dabei zwei Moleküle NADPH, CO, und Ribulose-5-phosphat (Ru5P) gebildet. al, Entsprechend des Bedarfs der Zelle kann Ribulose-5-phosphat zu Ribose-5phosphat (R5P) für die Nucleotidbiosynthese isomerisieren oder über Ribose-5-phosphat und Xylulose-5-phosphat (Xu5P) in Fructose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat umgewandelt werden, die erneut in den Glykolysestoffwechselweg eintreten können.

Wichtige Begriffe Glykolyse Pentosephosphatweg Aldolspaltung Endiolzwischenprodukt

katalytische Perfektion Mutase Milchsäuregärung alkoholische Gärung

TPP Pasteur-Effekt Substratkreislauf

Aufgaben 1. Welche der 10 Reaktionen der Glykolyse sind (a) Phosphorylierungen (b) Isomerisierungen, (c) Redoxreaktionen, (d) Dehydrierungen und (e) Spaltungen von Bindungen zwischen zwei Kohlenstoffatomen? Die Aldolasereaktion kann in umgekehrter Richtung als eine enzymatische Aldolkondensation erfolgen. Wie viele verschiedene Produkte könnten erhalten werden, wenn das Enzym nicht stereospezifisch wäre? Die bakterielle Aldolase bildet mit dem Substrat keine Schiff'sche Base. Stattdessen hat sie ein zweiwertiges Zn’*-Ion im aktiven Zentrum. Wie erleichtert dieses Ion die Aldolasereaktion?

Arsenat (AsO;),ein Strukturanalogon von Phosphat, kann in vielen Fällen Phosphat als Substrat ersetzen. Anders als die Phosphatester sind Arsenatester weder kinetisch noch thermodynamisch stabil, sondern hydrolysieren praktisch sofort. Notieren Sie die Gesamtgleichung für die Umwandlung von Glucose in Pyruvat in Anwesenheit von ATP, ADP, NAD" und entweder (a) Phosphat oder (b) Arsenat. (c) Warum ist Arsenat ein Gift?

5. Zeichnen Sie die Endiolzwischenprodukte der Ribulose-5phosphat-Isomerasereaktion (Ru5P > R5P) und der Ribulose-5-phosphat-Epimerasereaktion (Ru5P > Xu5P). 6. (a) Warum ist es möglich, dass sich die AG-Werte in Tabelle 15.1 von den AG°’-Werten unterscheiden? (b) Kann eine Reaktion, die einen AG°’-Wert von mindestens -30,5 kJ] - mol”' aufweist - also genug, um die

ATP-Synthese (AG°’' = 30,5 kJ - mol’) anzutreiben -, die Synthese von ATP auch in vivo ermöglichen, obwohl

ihr AG-Wert nur-10k] - mol” beträgt? Erklären Sie das. Für die Aldolasereaktion beträgt AG?’ = 22,8 kJ] - mol. In der Zelle liegt bei 37°C ein [DHAP]/[GAP]-Verhältnis von 5,5 vor. Berechnen Sie das Gleichgewichtsverhältnis

von [FBP]/[GAP], wenn [GAP] = 10°* M ist. Die Halbreaktionen, die an der Lactat-DehydrogenaseReaktion beteiligt sind und ihre Standardredoxpotentiale sind Pyruvat +2 H* +2 e — Lactat &° = -0,185 V NAD’ +2 H’ +2 e° — NADH

+ H*

8° = -0,315 V

Berechnen Sie AG bei pH 7,0 für die LDH-katalysierte Reaktion von Pyruvat unter folgenden Bedingungen: (a) [Lactat]/[Pyruvat] = 1 und [NAD*]/[NADH] = 1

(b) [Lactat]/[Pyruvat] = 160 und [NAD*]/[NADH] = 160 (c) [Lactat]/[Pyruvat] = 1000 und [NAD*]/[NADH] = 1000

(d) Erörtern Sie die Auswirkung der oben angegebenen Konzentrationsverhältnisse auf die Richtung der Reaktion.

Literatur

9. Obwohl die Pyruvat-Kinase nicht der Hauptregulationspunkt der Glykolyse ist, ist sie Gegenstand einer allosterischen Regulation. (a) Welche metabolische Bedeutung hat die Funktion der Pyruvat-Kinase für die Regulierung des glykolytischen Flusses? (b) Was ist der Vorteil der Aktivierung der Pyruvat-Kinase mit Fructose-1,6-bisphosphat? 10. Vergleichen Sie die ATP-Ausbeute von drei Molekülen Glucose, welche in die Glykolyse eintreten und in Pyruvat umgewandelt werden, mit drei Molekülen Glucose, die über den Pentosephosphatweg abgebaut werden. Nehmen Sie an, dass ihr Kohlenstoffgerüst (als zwei F6P und ein GAP) wieder in die Glykolyse eingebracht und zu Pyruvat umgesetzt wird. 11. Wo wird eine Markierung, wenn sie am C2-Atom des G6P angebracht wird, in den Produkten des Pentosephosphatwegs wieder auftreten? 12. (a) Geben Sie die Länge der Produkte der Transketolasereaktion an, wenn die beiden Substrate jeweils Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen sind. (b) Beschreiben Sie die Produkte der Reaktion, wenn die Substrate eine Aldose mit fünf Kohlenstoffatomen und eine Ketose mit sechs Kohlenstoffatomen sind. Spielt es eine Rolle, welches der Substrate zuerst an das Enzym bindet? 13. Erklären Sie, warum einige Gewebe die Atmung (gemessen als Produktion von CO,) auch in Anwesenheit von hohen Konzentrationen an Fluoridionen, welche die Glykolyse hemmen, fortsetzen können. 14. Das katalytische Verhalten der Phosphofructokinase-1 (PFK-1) der Leber und des Gehirns wurde in Anwesenheit von AMP, Phosphat und Fructose-2,6-bisphosphat untersucht. Die folgende Tabelle gibt die Konzentrationen jedes Effektors an, die für eine maximale Umsetzung erforderlich sind. Vergleichen Sie die Antwort der beiden Isoenzyme auf die drei Effektoren, und erörtern Sie die Auswirkungen, die die verschiedenen Antworten haben können.

PFK-1-Isoenzym

[Phosphat]

[AMP]

[F2,6P]

Leber

200 uM

10 uM

0,05 uM

Gehirn

350 uM

75 uM

4,5 uM

573

15. Einige Bakterien bauen Glucose über den Entner-Doudoroff-Weg ab, eine Glykolysevariante, bei der Glucose-6phosphat zu 6-Phosphogluconat (wie im Pentosephosphatweg) und dann zu 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat (KDPG) umgewandelt wird.

coo”

=0 H-0—H

H-6-0H H-0—0H CH,OPO2KDPG Als nächstes wirkt eine Aldose auf KDPG ein. (a) Zeichnen Sie die Strukturformeln der Produkte der KDPG-Aldolase-Reaktion. (b) Beschreiben Sie, wie diese Reaktionsprodukte von Glykolyseenzymen weiter verstoffwechselt werden. (c) Wie viel ATP entstehen, wenn Glucose auf dem EntnerDoudoroff-Weg zu Pyruvat metabolisiert wird? Wie viel ist dies im Vergleich zur ATP-Ausbeute bei der Glykolyse?

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 18 Purification of Phosphofructokinase 1-C The purification of the C isozyme of PFK-1 is presented and the kinetic properties of the purified enzyme are examined. Case Study 20° NAD*-Dependent Glyceraldehyde-3Phosphate Dehydrogenase from Thermoproteus tenax Glycolytic enzymes from T. tenax are regulated in an unusual manner.

Literatur nn

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Lindqvist, Y. und Schneider, G., Thiamin diphosphate dependent enzymes: transketolase, pyruvate oxidase and pyruvate decarboxylase, Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 896-901 (1993). Muirhead, H. und Watson, H., Glycolytic enzymes; from hexose to pyruvate, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 870-876 (1992). [Eine kurze Zusammenfassung der Strukturen der glykolytischen Enzyme.] Schirmer, T., und Evan, P.R., Structural basis of the allosteric behaviour of phosphofructokinase, Nature 343, 140-145 (1990). Scriver, C.R., Beaudet, A., Sly, W.S. und Valle, D. (Hrsg.), The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease (8. Aufl.), pp. 4517-4553, McGraw-Hill (2001). [Die Kapitel 70 und 72 beschreiben Erbkrankheiten des Fructose- und Galactosestoffwechsels. Kapitel 179 befasst sich mit dem G6PD-Mangel.]

Die Muskeln von Tieren enthalten Glykogen, eine Speicherform des Stoffwechselbrennstoffes Glucose. In lebenden Tieren wird die Balance zwischen Glykogensynthese und Glykogenabbau sorgfältig reguliert. Die Messung des Glykogengehalts in Hummern kann eingesetzt werden, um die Umweltbedingungen zu überwachen, denn bei unterernährten oder unter Stress stehenden Tieren sind die Giykogenspeicher erschöpft. [Andrew J. Martinez/Photo Researchers.]

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese u mn Al en A u

Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 15 Animated Figure 16-1 Animated Figure 16-13 Animated Figure 16-15 Animated Figure 16-20 Animated Figure 16-27 Case Study 22 Case Study 26

Glykogen (in Tieren, Pilzen und Bakterien) und Stärke (in Pflanzen) dienen der Speicherung von Glucose, um diese später im Stoffwechsel einzusetzen. In Tieren ist für Gewebe wie das Gehirn und die roten Blutkörperchen eine kontinuierliche Versorgung mit Glucose essentiell, da sie beinahe vollständig von Glucose als Energiequelle abhängen (andere Gewebe können darüber hinaus Fettsäuren zur Energiegewinnung oxidieren; Abschnitt 20.2). Die Freisetzung der Glucose aus Glykogenspeichern, in erster Linie der Leber, sorgt für eine konstante Versorgung aller Gewebe mit Glucose (die Konzentration im Blut beträgt rund 5 mM). Ist viel Glucose vorhanden, z.B. unmittelbar nach einer Mahlzeit, ist die Glykogensynthese beschleunigt. Die Speicherkapazität der Leber für Glykogen reicht jedoch nur aus, um für einen halben Tag die Glucoseversorgung des Gehirns zu gewährleisten. Beim Fasten wird der Glucosebedarf des Körpers über die Gluconeogenese (wörtlich: Glucose-Neuentstehung) aus Nicht-Kohlenhydrat-Vorläufermolekülen wie den Aminosäuren gedeckt. Es ist daher nicht überraschend, dass die Glucosesynthese, -speicherung, -freisetzung bzw. der Glucoseabbau durch die Glykolyse (Abschnitt 15.2) oder der Pentosephosphatweg (Abschnitt 15.6) feinregulierte Systeme sind und empfindlich auf die unmittelbaren und die Langzeit-Energiebedürfnisse des Organismus reagieren. Die Bedeutung von Glykogen für die Glucosespeicherung wird durch die Auswirkungen offensichtlich, die Mangelerscheinungen an Enzymen haben, die für die Freisetzung gespeicherter Glucose relevant sind. Die McArdle-Krankheit z.B. ist eine erbliche Glykogenspeicherkrankheit, die sich in schmerzhaften Muskelkrämpfen bei starker Anstrengung äußert. Bei Menschen mit dieser Krankheit fehlt dem Muskelgewebe ein Enzym, das für den Glykogenabbau zu freier Glucose benötigt wird. Glykogen wird zwar normal synthetisiert, kann jedoch keinen „Stoffwechselbrennstoff“ für die Glykolyse zur Verfügung stellen und somit nicht den Bedarf an ATP decken. Abbildung 16.1 fasst die Verwendung von Glucose im Stoffwechsel zusammen. Glucose-6-phosphat (G6P), eine Schlüsselverbindung des KohlenhydratLehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Crnvrioht © 2010 WILEY-VCH Verlao GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese © Glykogenabbau e Glykogensynthese ® Kontrolle des Glykogenstoffwechsels e Gluconeogenese e Andere Biosynthesewege für Kohlenhydrate

576

_Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Abb. 16.1 Übersicht über den Glucosestoffwechsel. Glucose-6-phosphat (G6P) wird durch Phosphorylierung freier Glucose, durch Glykogenabbau und durch die Gluconeogenese produziert. Es ist ebenfalls eine Vorstufe der Glykogensynthese und des Pentosephosphatwegs. Die Leber kann G6P zu Glucose hydrolysieren. Glucose wird über die Glykolyse zu Pyruvat metabolisiert, das weiter zu Acetyl-CoA für die Oxidation im Citratcyclus abgebaut wird. Lactat und Aminosäuren, die reversibel in Pyruvat umgewandelt werden können, sind Vorläufermoleküle der Gluconeogenese. 6% siehe Animated Figures.

are

Glykogensynthese l Pentosephosphatweg

a I, ee] —> Ders>

||

Ribose-5-

l Gluconeogenese

a Aminosäuren

\

| Taciat|

\ Citratcyclus

stoffwechsels, wird unter Beteiligung der Hexokinase aus freier Glucose erhalten (Abschnitt 15.2A) oder ist das Produkt des Glykogenabbaus bzw. der Gluconeogenese. G6P kann verschiedene weitere Verwendung finden: Es kann zur Synthese von Glykogen eingesetzt werden, über die Glykolyse abgebaut werden und dabei ATP und Kohlenstoffatome (als Acetyl-CoA) bereitstellen, die im Citratcyclus weiter oxidiert werden. Des Weiteren kann es über den Pentosephosphatweg NADPH und/oder Ribose-5-phosphat liefern. In der Leber kann G6P in Glucose umgewandelt werden, um so deren Transport zu anderen Geweben über den Blutstrom zu ermöglichen. Die gegenläufigen Vorgänge der Glykogensynthese und des Glykogenabbaus bzw. der Glykolyse und der Gluconeogenese werden reziprok reguliert; d.h. der eine Vorgang ist zum größten Teil „angeschaltet“, während der andere weitestgehend „aus“ ist. In diesem Kapitel untersuchen wir die enzymatischen Schritte des Glykogenstoffwechsels und der Gluconeogenese. Besonderes Augenmerk wird auf den Regulationsmechanismen liegen, die eine effiziente Arbeit gegenläufiger Stoffwechselwege sichern.

1

Giykogenabbau

Glykogen ist ein Polymer aus a(1—4)-verknüpften n-Glucoseeinheiten mit a(1—6)-verknüpften Verzweigungen nach jeweils 8 bis 14 Resten (Abb. 16.2 a,b und Abschnitt 8.2C). Glykogen liegt in intrazellulären Granula als globuläres Molekül mit 10 bis 40 nm Durchmesser vor. Diese Granula können bis zu 120.000 Glucoseeinheiten enthalten (Abb. 16.2c) und kommen besonders in Zellen mit erhöhtem Glykogenverbrauch vor: Muskel- (mit bis zu 1-2% Massenanteil an Glykogen) und Leberzellen (mit bis zu 10% Massenanteil an Glykogen; Abb. 8.11). Glykogengranula enthalten ebenfalls die Enzyme, welche die Glykogensynthese und den Glykogenabbau katalysieren, sowie viele der Proteine, die diese Prozesse regulieren. Die Mobilisierung von Glucoseeinheiten erfolgt über eine schrittweise Abtrennung, beginnend vom nicht reduzierenden Ende des Glykogens (Enden ohne C1-OH-Gruppe). Glykogen enthält nur ein reduzierendes Ende, dagegen weist jede Verzweigung ein nicht reduzierendes Ende auf. Die hochverzweigte Struktur

Glykogenabbau

577

(a)

CH,0H

CH,0H

OH

GE

CH>s0H

OH

H

=

OH

H

“

H

a(1—> 6)-Verknüpfung

reduzierendes Ende

nicht

reduzierende a Enden H

CH,0H A

CH,OH

5

H

2

H

(Ölak,

nl

Se

HO H

02

OH H

OH

ONEH ER

H

CHZOH

OH K

ONE

H

cf

H ee

H

OH

OH all —> 4)-

Verknüpfung

(b)

4

i

(€)

nichtreduzierendes Ende

Abb. 16.2 Glykogenstruktur. (a) Molekülformel. In Wirklichkeit sind die Ketten im Molekül mit ca. 12 Resten länger als gezeigt.

(b) Schematische Zeichnung zur Illustration der verzweigten Struktur. Zu beachten ist, dass das Molekül reduzierendes Ende

a Verzweigungspunkt

viele nicht reduzierende Enden, jedoch nur ein reduzierendes Ende hat. (c) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Glykogengranulums aus dem Rattenskelettmuskel. Jedes Granulum (mit a markiert) besteht aus mehreren globulären Glykogenmolekülen (ß) und assoziierten Proteinen. [Aus Calder, P.C., Int.J. Biochem. 23, 1339 (1991).

© Elsevier Science. Mit freundlicher Genehmigung.]

des Glykogens ermöglicht somit eine schnelle Mobilisierung von Glucose, indem gleichzeitig viele Glucoseeinheiten an den nicht reduzierenden Enden der Verzweigungen freigesetzt werden. Der Glykogenabbau, auch als Glykogenolyse bezeichnet, erfordert drei Enzyme: 1. Glykogen-Phosphorylase (oder einfach Phosphorylase) katalysiert die Phosphorolyse (Bindungsspaltung durch die Substitution mit einer Phosphatgruppe) von Glykogen zu Glucose-1-phosphat (G1P). Glykogen + P;, =

Glykogen + G1P

(n Reste)

(n -1 Reste)

Dieses Enzym kann nur solche Glucoseeinheiten freisetzen, die mindestens 5 Einheiten von einem Verzweigungspunkt entfernt liegen. 2. Das Glykogen-Entzweigungsenzym (engl.: glycogen debranching enzyme) beseitigt die Verzweigungen des Glykogens, wodurch weitere Glucoseeinheiten für die Glykogen-Phosphorylase zugänglich werden. 3. Phosphoglucomutase wandelt G1P in G6P um, das mehrere Richtungen im Stoffwechsel einschlagen kann (Abb. 16.1). Viele entscheidende Aspekte des Glykogenstoffwechsels wurden von der Gruppe von Carl und Gerty Cori entdeckt (Exkurs 16.1).

578

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Exkurs 16.1

Berühmte Biochemiker

Carl und Gerty Cori und der Glucosestoffwechsel den Enden der Glykogenketten Phosphat anstelle von Wasser. Aber noch erstaunlicher war, dass das Enzym auch die um-

gekehrte Reaktion katalysieren kann: die Verlängerung eines Glykogenpolymers durch Anfügen von Glucoseresten (genauer gesagt Glucose-1-phosphat). Zum ersten Mal konnte man ein großes biologisches Molekül in vitro synthetisieren. In den 1940er-Jahren lüfteten die Coris viele der Geheimnisse der Glykogen-Phosphorylase. Sie fanden beispielsweise heraus,

Carl F. Cori (1396-1984)

Gerty T. Cori (1896-1957)

Mit der Heirat von Carl und Gerty Cori im Jahre 1920 begann ihre lebenslange Zusammenarbeit. Die Coris hatten ihre Berufstätigkeit zwar in Österreich begonnen, flohen aber 1922 vor den wirtschaftlichen und sozialen Härten in Europa nach Buffalo im US-Bundesstaat New York. Später gingen sie an die Washington University School of Medicine in St. Louis, wo

Carl eine

Professur

der Pharmakologischen

Abteilung erhielt und danach einen Lehrstuhl der Biochemischen Abteilung. Obwohl sie bei den Forschungsarbeiten eine gleichwertige Partnerin war, blieb Gerty offiziell nur wissenschaftliche Mitarbeiterin. Die Coris richteten ihre Forschung in erster Linie auf den Glucose-Metabolismus. Eine ihrer ersten Entdeckungen war der Zusammenhang zwischen dem Glucose-Metabolismus im Muskel und dem Glykogenstoffwechsel in der Leber. Der „Cori-Cyclus“ (Abschnitt 22.1F) beschreibt, wie durch Glyko-

Iyse im aktiven Muskel gebildetes Lactat zur Leber transportiert wird, wo es dazu dient, Glucose zu synthetisieren, die

dann in der Leber bis zur Verwendung als Glykogen gespeichert wird. Nachdem die Coris den Transfer der Glucose zwischen den Organen im lebenden Tier beschrieben hatten, wandten sie sich dem Stoffwechsel der Glucose zu - insbesondere den Zwischenprodukten und Enzymen des Glucosestoffwechsels. 1936 entdeckten die Coris in einer Präparation eines zerkleinerten Froschmuskels Glucose in Form eines Phosphatesters (Cori-Ester genannt, heute als Glucose-1-phosphat bezeichnet). Sie führten den Cori-Ester auf die Aktivität einer Phosphorylase zurück (Glykogen-Phosphorylase). Dies war eine bemerkenswerte Entdeckung, denn das Enzym verwendet zur Abspaltung von Glucoseresten von den nicht reduzieren-

A.

dass das

Enzym

in zwei

Formen

vorkommt;

eine

Form benötigt als Aktivator AMP und eine Form ist ohne Anwesenheit eines allosterischen Aktivators aktiv. Obwohl man damals

nicht unmittelbar

erkannte,

dass

der Unterschied

zwischen den beiden Formen von der Anwesenheit eines kovalent gebundenen Phosphats abhing, war diese Arbeit die Grundlage für nachfolgende Forschungen über die Enzymregulation durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Carl und Gerty Cori beschrieben auch die Phosphoglucomutase, das Enzym, das Glucose-1-phosphat in Glucose-6phosphat umwandelt, welches in anderen Stoffwechselwegen des Glucose-Metabolismus umgesetzt wird. Mit der Zeit wurde das Cori-Labor zu einem Magneten für Wissenschaftler, die an der Reinigung und Charakterisierung weiterer Enzyme des Glucose-Metabolismus interessiert waren. Vielleicht wegen ihrer persönlichen Erfahrung von Benachteiligung und - speziell von Gerty — der fehlenden Chancengleichheit, legten die Coris Wert auf eine bunt gemischte Arbeitsgruppe, wie es für die Labors in jener Zeit nicht unbedingt typisch war. Im Jahre 1947 erhielten die Coris den Nobelpreis für Physiologie und Medizin. Einige ihrer jüngeren Mitarbeiter bekamen später selbst den Nobelpreis: Arthur Kornberg (siehe Exkurs 25.1), Severo Ochoa, Luis Leloir, Earl Sutherland, Christian de Duve und Edwin G. Krebs. Dies spiegelt möglicherweise die Arbeitsmoral, die breite Sicht der Wissenschaft und Medizin und die akribische Arbeitseinstellung wider, die ihnen von Carl und Gerty Cori eingeimpft wurden.

Cori, G.T., Colowick, S.P. und Cori, C. F., The activity of the phospho-

tylating enzyme in muscle extracts.J.Biol. Chem. 127, 771-782 (1939). Kornberg, A. Remembering our teachers.J. Biol. Chem. Reflections, www.jbc.org.

Giykogen-Phosphorylase

Glykogen-Phosphorylase ist ein Dimer, das aus identischen Untereinheiten mit je 842 Resten (97 kD) besteht und den kontrollierenden Schritt im Glykogenabbau katalysiert. Es wird sowohl durch allosterische Wechselwirkungen als auch durch kovalente Modifikation (Phosphorylierung und Dephosphorylierung) reguliert. Die phosphorylierte Form des Enzyms, Phosphorylase a, ist am Ser 14 mit einer Phosphorylgruppe verestert. Die Dephosphoform wird als Phosphory-

Glykogenabbau

lase b bezeichnet. Allosterische Inhibitoren der Phosphorylase (ATP, G6P und Glucose) und allosterische Aktivatoren (AMP) interagieren auf verschiedene Weise mit der phosphorylierten bzw. der dephosphorylierten Form des Enzyms, was eine äußerst empfindliche Regulation ermöglicht. Die Struktur der Glykogen-Phosphorylase sowie deren Regulation durch Phosphorylierung werden in Abschnitt 12.3B diskutiert. Ein ca. 3 nm langer Spalt auf der Oberfläche des Phosphorylasemonomers verbindet die Glykogenspeicherstelle mit dem aktiven Zentrum. In diesen Spalt passt eine vier- oder fünfgliedrige Kohlenhydratkette, er ist jedoch zu eng, um verzweigte Oligosaccharide aufzunehmen. Allein aus diesen physikalischen Gegebenheiten wird klar, weshalb die Phosphorylase keine Glucosereste abspalten kann, die näher als fünf Einheiten an einem Verzweigungspunkt liegen. Vermutlich steigert die Glykogenspeicherstelle die katalytische Leistung der Phosphorylase, indem sie die gleichzeitige Phosphorylierung mehrerer Glucosereste eines Glykogens ermöglicht, ohne dass zwischen den einzelnen Katalysecyclen eine vollständige Dissoziation und Reassoziation notwendig ist. Die Phosphorylase benötigt für ihre Aktivität den Cofaktor Pyridoxal-5’-phosphat (PLP, siehe Formel unten). Diese prosthetische Gruppe, ein Vitamin-B,-Derivat, ist kovalent an das Enzym als Schiff’sche Base (Imin) zwischen ihrer Aldehydgruppe und der e-Aminogruppe des Lys 680 des Enzyms gebunden. PLP kommt ebenfalls bei einer Vielzahl von Enzymen des Aminosäurestoffwechsels vor, bei denen das konjugierte Ringsystem des PLP katalytisch für die Delokalisierung von Elektronen sorgt (Abschnitt 21.2A und 21.4A). Bei der Phosphorylase ist jedoch nur die Phosphatgruppe an der Katalyse beteiligt, indem sie als allgemeiner Säure-Base-Katalysator wirkt. Die Phosphorolyse des Glykogens verläuft über einen zufälligen Mechanismus (ohne Präferenz für die Reihenfolge der Substratbindung; Abschnitt 12.1D), der einen ternären Enzym-P;,-Glykogenkomplex beinhaltet. Die C1-O1-Bindungsspaltung erfolgt, analog zur Lysozym katalysierten Reaktion, über ein Oxoniumion als Zwischenprodukt (Abschnitt 11.4B). Der Reaktionsmechanismus ist in. Abbildung 16.3 dargestellt und zeigt die Beteiligung der PLP-Phosphatgruppe an der Reaktion als allgemeiner Säure-Base-Katalysator.

0 ee

EIS 50 SH

Pyridoxal-5’-phosphat (PLP)

Konformationsänderungen in der Glykogen-Phosphorylase Die strukturellen Unterschiede zwischen der aktiven (R) und inaktiven (T) Konformation der Phosphorylase (Abb. 12.15) lassen sich mit dem Symmetriemodell der Allosterie relativ gut beschreiben (Abschnitt 7.1D). Der T-Zustand des En-

zyms weist ein verdecktes aktives Zentrum und damit eine geringe Affinität zu seinen Substraten auf, wohingegen im R-Zustand das aktive Zentrum des Enzyms zugänglich ist und eine hohe Affinität für Phosphat besitzt. AMP fördert die Konformationsänderung vom T (inaktiv)- zum R (aktiv)-Zustand der Phosphorylase, indem es im R-Zustand des Enzyms an dessen allosterische Effektorstelle bindet. Dieser Konformationswechsel führt zu einem verbesserten Zugang des Substrats zum aktiven Zentrum, da eine AminosäurenSchleife (282-284), die ansonsten das aktive Zentrum blockiert, verdrängt wird. Der Konformationswechsel führt auch dazu, dass die Arg569-Seitenkette, die im aktiven Zentrum neben der PLP- und der P;-Bindungsstelle liegt, so rotiert, dass die Affinität des Enzyms für das anionische Substrat P; zunimmt (Abb. 12.15).

579

580

_ Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

+ Glykogen

Nichtreduzierendes Ende

|

a(1—> 4)-Verknüpfung

HE

&)

Glykogen (n Glykosyleinheiten)

HO

OH|

a

H

CH,0OH

o

HO

(6) a-Verknüpfung mit Phosphat

en

3

Abb. 16.3 Reaktionsmechanismus der Glykogen-Phosphorylase. PL symbolisiert eine enzymgebundene Pyridoxalgruppe; BH* eine positiv geladene

2 Halbsessel-OxoniumionZwischenprodukt

Aminosäureseitenkette, wahrscheinlich

CH,0H / HO

| OH

CH,OH

HO 5

ee

DER (6) (6)2

|

(n-1 Glykosyleinheiten)

% HO

OH|

CH,OH

(6)

HO

)

Ö

Om

diejenige von Lys 568, die für die Aufrechterhaltung der elektrischen Neutralität von PLP notwendig ist. (1) Bildung eines ternären E - P; Glykogenkomplexes. (2) Bildung eines abgeschirmten Oxoniumionzwischenprodukts aus dem a-verknüpften, terminalen Glykosylrest. Sie verläuft mittels Säurekatalyse durch P,,

die durch die Protonenübertragung von PLP erleichtert wird. Das Oxoniumion nimmt die Halbsesselkonformation ein. (3) Reaktion von P; mit dem Oxoniumion

BH* Las

-

unter Beibehaltung der Konfiguration am C1, a-p-Glucose-]-phosphat wird gebildet. Das Glykogen, das nun einen Rest weniger als zu Beginn hat, geht erneut in Stufe 1 des Cyclus ein.

ATP bindet ebenfalls an die allosterische Effektorstelle, jedoch im T-Zustand, wodurch es die T>R-Konformationsänderung eher behindert als fördert. Der Grund liegt in der Anordnung der ß- und y-Phosphatgruppe des ATP. Sie erlaubt keine geeignete Anlagerung der Ribose- und der a-Phosphatgruppe, die sich bei der Konformationsänderung durch AMP ergibt.

Glykogenabbau

581

Phosphorylierung und Dephosphorylierung kann die Enzymaktivität auf eine Art und Weise verändern, die an eine allosterische Regulation erinnert. Die Phosphatgruppe hat eine doppelt negative Ladung (eine Eigenschaft, die bei natürlich vorkommenden Aminosäureresten nicht auftritt) und ihre kovalente Bindung an ein Protein kann eine dramatische Konformationsänderung auslösen. Bei der Phosphorylase verursacht die Phosphorylierung von Ser 14 eine Änderung der Tertiär- und der Quartärstruktur, da die Bewegung des N-terminalen Bereichs es dem Phospho-Ser ermöglicht, eine Ionenpaarbindung mit dem zweifach kationischen Arg-Rest einzugehen. Die Anwesenheit der Ser-14-Phosphatgruppe verursacht ähnliche Konformationsänderungen wie die Bindung von AMP, wodurch sich ebenfalls das TR-Gleichgewicht zugunsten des R-Zustands verschiebt. Das stimmt mit der Beobachtung überein, dass die Phosphorylase b für die Aktivität AMP benötigt, die a-Form jedoch ohne AMP aktiv ist. Wir werden auf die Regulationsmechanismen der Phosphorylaseaktivität erneut eingehen, wenn wir die Mechanismen diskutieren, die für ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Glykogensynthese und Glykogenabbau sorgen (Abschnitt 16.2).

B.

_ Gilykogen-Entzweigungsenzym

Die Phosphorolyse läuft so lange entlang eines Glykogenzweigs ab, bis der vierte oder fünfte Rest vor einem a(1—6)-Verzweigungspunkt erreicht ist, d.h. eine Art „Restverzweigung“ übrig bleibt. Das Glykogen-Entzweigungsenzym (engl.: glycogen debranching enzyme) agiert als «{(1—4)Transglykosylase (Glykosyltransferase), indem es eine a(1—4)-verknüpfte Trisaccharideinheit von einem Endzweig des Glykogens auf das nicht reduzierende Ende eines anderen Zweiges überträgt (Abb. 16.4). Durch diese Reaktion entsteht eine neue a(1—4)-Verknüpfung mit drei weiteren, der Phosphorylasereaktion zugänglichen Glucoseeinheiten. Die a(1—6)-Bindung, die den verbleibenden Glykosylrest des Zweigs mit der Hauptkette verknüpft, wird durch das gleiche Entzweigungsenzym hydroly-

Äußere Glykogenketten (nach Phosphorylaseangriff) GlykogenEntzweigungsenzym Abb. 16.4

.ei >

Eee Bir für weitere Phosphorolyse

zugänglich für

Hydrolyse

Die vom Entzweigungsenzym katalysierten Reaktionen. Das Enzym überträgt drei a(1—4)-verknüpfte Glucosereste von einem „Endzweig“ des Glykogens auf das nicht reduzierende Ende eines anderen Zweigs. Die a(I—6)-Bindung des am Verzweigungspunkt verbliebenen Rests wird durch erneuten Angriff des Entzweigungsenzyms hydrolysiert, wodurch freie Glucose entsteht. Der verlängerte Zweig wird durch die Glykogen-Phosphorylase abgebaut.

582

_ Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese siert (nicht phosphoryliert), wodurch Glucose und unverzweigtes Glykogen entstehen. Ungefähr 10% der Glykogenreste (die an den Verzweigungspunkten) werden daher als Glucose statt als G1P freigesetzt. Das Entzweigungsenzym besitzt demnach sowohl für die Transferasereaktion als auch für die a(1>6)-Glucosidasereaktion aktive Zentren. Zweifelsohne wird die Effizienz der Glykogenentzweigung dadurch gesteigert, dass das Enzym zwei voneinander unabhängige katalytische Aktivitäten aufweist. Die Maximalgeschwindigkeit der Glykogen--Phosphorylasereaktion ist wesentlich größer als die der Glykogen-Entzweigungsreaktion. Daher werden die äuRersten Zweige des Glykogens, die fast die Hälfte seiner Reste ausmachen, im Muskel bei einem hohen Glucosebedarf innerhalb von Sekunden abgebaut. Der anschließende, über diesen Punkt hinausgehende Glykogenabbau erfordert Entzweigung und läuft somit langsamer ab. Das ist einer der Gründe, weshalb ein Muskel seine maximale Anspannung nur für ein paar Sekunden aufrechterhalten kann.

€.

Phosphoglucomutase

Die Phosphorylase überführt die Glucoseeinheiten des Glykogens in G1P, das im Anschluss durch die Phosphoglucomutase in G6P umgewandelt wird. Die Phosphoglucomutasereaktion ähnelt der durch die Phosphoglycerat-Mutase katalysierten Reaktion (Abschnitt 15.2H). Eine Phosphorylgruppe wird vom aktiven Phosphoenzym auf G1P übertragen, wodurch Glucose-1,6-bisphosphat (G1,6P) entsteht; dieses phosphoryliert nun wiederum das Enzym und liefert so G6P (Abb. 16.5, diese gleichgewichtsnahe Reaktion läuft auch in umgekehrter Richtung ab). Ein wichtiger Unterschied zwischen diesem Enzym und der Phosphoglycerat-Mutase besteht darin, dass die Phosphorylgruppe in der Phosphoglucomutase kovalent an eine Ser-Hydroxylgruppe statt an ein Stickstoffatom des His-Imidazolrings gebunden ist. , Glucose-6-Phosphatase generiert Glucose in der Leber Das durch den Glykogenabbau gebildete G6P kann weiter in den Glykolysestoffwechselweg oder in den Pentosephosphatweg eingehen (zu beachten ist, dass die Glucose bereits phosphoryliert ist, wodurch die ATP-verbrauchende, von der Hexokinase katalysierte Phosphorylierung der Glucose umgangen wird). Darüber hinaus kann G6P in der Leber für andere Gewebe nutzbar gemacht werden. Da G6P die Zellmembran nicht passieren kann, wird es zunächst durch die Glucose-6-Phosphatase (G6Pase) hydrolysiert: G6P + H;50 — Glucose + P;

(Em]

Enzym

Ser

(6) I

|

CH,-0 ZPO

Ser

t

Ser

Oo II

|

CH,OH

CH5>—-0—P—0O-

a =

Abb. 16.5 Wirkungsmechanismus der Phosphoglucomutase. (1) Die OH-Gruppe am C6-Atom von G1P

greift das Phosphoenzym an und bildet so ein Dephosphoenzym-G1,6P-Zwischenprodukt. (2) Die Ser-OH-Gruppe des Dephosphoenzyms greift die Phosphorylgruppe am C1-Atom an, wodurch das Phosphoenzym unter Bildung von G6P regeneriert wird.

(0

HOCH, H

HO

== OH

H OH

SH

H

OH

Glucose-1l-

phosphat (G1P)

0;POCH, H

OPO?

=

HO

= O0

H OHA

3H

H

OH

Glucose-1,6bisphosphat (G1,6P)

°0;3POCH,

_H B

OPOF

6)

OH H (OFT H

OH

Glucose-6-

phosphat (G6P)

OH

Glykogenabbau

Obwohl G6P im Cytosol produziert wird, befindet sich die G6Pase in der Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER). Folglich muss G6P über eine G6P-Translocase in das ER transportiert werden, bevor es hydrolysiert werden kann. Die daraus entstehende Glucose und das P; werden dann über spezifische Transportproteine ins Cytosol zurück transportiert. Ein Defekt in einer der Komponenten dieses G6P-Hydrolysesystems führt zur Typ-I-Glykogenspeicherkrankheit (Exkurs 16.2). Glucose verlässt die Leberzelle mithilfe eines spezifischen Glucosetransporters, der GLUT2 genannt wird, und wird über den Blutkreislauf zu anderen Geweben transportiert. Muskeln und andere Gewebe besitzen keine G6Pase, können daher ihr G6P nicht abgeben und halten ihr G6P zurück.

Exkurs 16.2

583

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Nennen Sie die Quellen und Stoffwechselprodukte von G6P. 2. Inwiefern ist die Struktur des Glykogens an dessen Funktion im Stoffwechsel angepasst? 3. Beschreiben Sie den enzymatischen Abbau von Glykogen.

Biochemie im Organismus

Glykogenspeicherkrankheiten Glykogenspeicherkrankheiten sind Erbkrankheiten, die Auswirkungen auf den Glykogenstoffwechsel haben, indem es zur Synthese von abnormem Glykogen kommt, sowohl in Bezug auf dessen Menge als auch dessen Struktur. Untersu-

versorgt (um das glucosereiche Blut zunächst an periphere

chungen zu Gendefekten, die diesen Krankheiten (z.B. der McArdle-Krankheit) zu Grunde liegen, haben geholfen, die

Typ Il: &-1,4-Glucosidase-Mangel (Pompe-Krankheit)

Komplexität des Glykogenstoffwechsels aufzuklären. Umgekehrt folgen aus der biochemischen Charakterisierung der durch eine Erbkrankheit betroffenen Stoffwechselwege häufig nützliche Behandlungsstrategien. Die Tabelle auf der folgenden Seite führt die vorkommenden Enzymmangelerscheinungen in Verbindung mit der jeweiligen Art der Glykogenspeicherkrankheit auf. Glykogenspeicherkrankheiten, die vor allem die Leber betreffen, verursachen grundsätzlich Hepatomegalie (vergrößerte Leber) und Hypoglykämie (niedrigen Blutzuckerspiegel), während Glykogenspeicherkrankheiten in den Muskeln Muskelkrämpfe und Muskelschwäche auslösen. Beide Formen der Krankheit können zusätzlich kardiovaskuläre und renale Störungen zur Folge haben.

genspeicherkrankheit. Sie führt zu einer starken Akkumulation von normal aufgebautem Glykogen in den Lysosomen aller Zellen und hat - im Allgemeinen innerhalb des ersten Lebensjahres — den Tod durch Kreislaufkollaps zur Folge. Die a-1,4-Glucosidase kommt nicht in den Hauptwegen des Glykogenstoffwechsels vor. Sie tritt in den Lysosomen auf, wo ihre Aufgabe in der Hydrolyse von Maltose (einem Glucosedisaccharid), anderer linearer Oligosaccharide und der äußeren Zweige des Glykogens liegt, was freie Glucose ergibt. Dieser alternative Stoffwechselweg des Glykogens ist normalerweise mengenmäfßsig unbedeutend und seine physiologische Bedeutung ist bislang ungeklärt.

Typ I: Glucose-6-Phosphatase-Mangel (von-Gierke-Krankheit) Glucose-6-Phosphatase katalysiert den letzten Schritt, der in der Leber zur Ausschüttung von Glucose in den Blutstrom führt. Ein Mangel an diesem Enzym verursacht einen Anstieg der intrazellulären G6P-Konzentration. Dies führt zu einer starken Akkumulation von Glykogen in Leber und Nieren (man erinnere sich, dass G6P die Glykogen-Synthase aktiviert) und zur Unfähigkeit, die Blutglucosekonzentration als Reaktion auf Glucagon oder Adrenalin zu erhöhen. Die Symptome der Typ-I-Glykogenspeicherkrankheit sind u.a. schwere Hepatomegalie und Hypoglykämie sowie eine allgemeine Entwicklungsstörung. Die Behandlung der Krankheit umfasst eine medikamentöse Hemmung der Glucoseaufnahme durch die Leber (um den Blutglucosespiegel anzuheben), eine über Nacht angelegte, kontinuierliche Zufuhr von Nahrung über eine Magensonde (um wiederum den Blutglucosespiegel zu erhöhen), eine operative Verlegung der Pfortader, die normalerweise die Leber direkt vom Darm aus mit Nahrung

Gewebe

zu

leiten, bevor es die Leber erreicht),

und eine

Lebertransplantation.

a-1,4-Glucosidasemangel

ist die schwerste

bekannte Glyko-

Typ Ill: Amylo-1,6-Glucosidase-(Entzweigungsenzym-) Mangel (Cori-Krankheit)

Bei der Cori-Krankheit wird Glykogen mit abnormaler Struktur (sehr kurzen Außenketten) sowohl in der Leber als auch in den Muskeln akkumuliert, weil das Entzweigungsenzym fehlt und ein weiterer Abbau des Glykogens nicht erfolgen kann. Die resultierenden Hypoglycämiesymptome sind hier nicht so stark wie bei der von-Gierke-Krankheit (Typ |) ausgeprägt und können mit häufiger Nahrungszufuhr und einer proteinreichen Diät behandelt werden (um den Verlust an Aminosäuren, die in der Gluconeogenese verbraucht werden, wieder auszugleichen). Aus unbekannten Gründen verschwinden die Symptome der Cori-Krankheit häufig im Verlauf der Pubertät. Typ IV: Amylo-(1,4—1,6)-Transglykosylase(Verzweigungsenzym)-Mangel (Andersen-Krankheit) Die Andersen-Krankheit gehört ebenfalls zu einer der schweren Glykogenspeicherkrankheiten. Betroffene werden auf Grund einer Leberfunktionsstörung selten älter als 4 Jahre.

584

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Die Konzentration des Glykogens in der Leber ist nicht erhöht, aber die Struktur weist lange, unverzweigte Ketten auf, was die Löslichkeit des Glykogens herabsetzt. Die Leberfunktionsstörung wird vermutlich durch eine Immunreaktion ausgelöst, bei der das abnormale Glykogen als „Fremdkörper“ erkannt wird. Typ V: Muskel-Phosphorylase-Mangel (McArdle-Krankheit) Die Symptome der McArdle-Krankheit, schmerzhafte Muskelkrämpfe bei Anstrengung, treten typischerweise nicht vor Erreichen des Erwachsenenalters auf und können verhindert werden, indem anstrengende Tätigkeiten vermieden werden. Diese Krankheit betrifft nur den Glykogenstoffwechsel im Muskel und nicht den der Leber, die normale Mengen eines anderen Phosphorylase-Isoenzyms enthält. Typ VI: Leber-Phosphorylase-Mangel (Hers-Krankheit)

Patienten mit einem Mangel an Leber-Phosphorylase zeigen ähnliche Symptome wie bei der milden Form der Typ-I-Glykogenspeicherkrankheit. Die Hypoglykämie resultiert in diesen Fällen aus einer Unfähigkeit der Leber-Glykogen-Phosphorylase, auf den Bedarf an Glucose im Blutkreislaufzu reagieren. Typ VIl: Muskel-Phosphofructokinase-Mangel (Tarui-Krankheit)

Typ IX: Phosphorylase-Kinase-Mangel (autosomal vererbt) Der autosomal vererbte Phosphorylase-Kinase-Mangel resultiert aus einer Mutation

in einem der Gene, welche die ß-,

y- oder ö-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase kodieren. Da verschiedene Gewebe verschiedene Isoenzyme von Phosphorylase-Kinase enthalten, variieren Symptome und Schweregrad dieser Krankheit je nach betroffenem Organ. Techniken zur Identifizierung genetischer Veränderung sind daher verlässlicher

eine bestimmte zu können.

als die klinischen

Krankheitsbilder,

Glykogenspeicherkrankheit

um

diagnostizieren

Typ 0: Leber-Glykogen-Synthase-Mangel

Ein Mangel am Glykolyseenzym PFK in den Muskeln bewirkt eine abnormale Anreicherung der Glykolysemetabolite G6P und F6P. Hohe G6P-Konzentrationen steigern die Aktivität der Glykogen-Synthase und der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase (G6P befindet sich im Gleichgewicht

Typ VIll: Phosphorylase-Kinase-Mangel (X-chromosomal vererbt) Manche Menschen, die Symptome der Glykogenspeicherkrankheit vom Typ VI zeigen, haben normale Phosphorylaseenzyme, ihre Phosphorylase-Kinase ist jedoch inaktiv, was in ihrer Unfähigkeit zur Umwandlung von Phosphorylase a in Phosphorylase b resultiert. Die a-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase wird von einem Gen des X-Chromosoms kodiert, wodurch die Typ-VIll-Glykogenspeicherkrankheit an das X-Chromosom gekoppelt ist und nicht wie die anderen Glykogenspeicherkrankheiten autosomol rezessiv ist.

mit GIP, einem

Substrat für die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase), wodurch es zu einer Akkumulation von Glykogen im Muskel kommt. Andere Symptome ähneln denen des Muskel-Phosphorylasemangels (Typ V), da PFK-Mangel dazu führt, dass die GlykoIyse mit dem ATP-Bedarf der Muskelkontraktion nicht Schritt halten kann.

Leber-Glykogen-Synthase-Mangel stoffwechselkrankheit,

ist die einzige Glykogen-

bei der ein Mangel

und

kein

Über-

angebot an Glykogen vorliegt. Die Aktivität der Leber-Glykogen-Synthase bei Patienten mit dieser Typ-O-Krankheit ist extrem niedrig. Es kommt zur Hyperglykämie nach Mahlzeiten, während ansonsten hypoglykämische Zustände vorherrschen. Manche Menschen zeigen jedoch auch keine Symptome, was vermuten lässt, dass es eventuell mehrere Formen dieser autosomal rezessiven Erkrankung gibt.

Erbliche Glykogenspeicherkrankheiten

Typ Enyzmmangel Gewebe allgemeiner Name Glykogenstruktur ee EEISSSSEESEEEESESEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEE

|

Glucose-6-Phosphatase

Il

a-1,4-Glucosidase

Ill

Leber

von-Gierke-Krankheit

normal

alle Lysosomen

Pompe-Krankheit

normal

alle Organe

Cori-Krankheit

äußere Ketten fehlen oder sind

Amylo-(1,4—1,6)-Transglyko-

Leber, wahrschein-

Andersen-Krankheit

sehr lange, unverzweigte Ketten

sylase (Verzweigungsenzym)

lich alle Organe Muskel

McArdle-Krankheit

normal

Amylo-1,6-Glucosidase

(Entzweigungsenzym)

IV

V

_ Glykogen-Phosphorylase

VI

Glykogen-Phosphorylase

stark verkürzt

Leber

Hers-Krankheit

normal

VII

Phosphofructokinase

Muskel

Tarui-Krankheit

normal

VIII

Phosphorylase-Kinase

Leber

normal

IX

Phosphorylase-Kinase

alle Organe

X-chromosomal vererbter Phosphorylase-Kinase-Mangel

0

Glykogen-Synthase

Leber

normal

normal, Mangel nicht relevant

Glykogensynthese

2

585

_Giykogensynthese

Das AG°' der Glykogen-Phosphorylasereaktion beträgt +3,1 kJ - mol', unter physiologischen Bedingungen verläuft der Glykogenabbau jedoch exergon (AG = -5 bis -8 kJ - mol”). Die Synthese von Glykogen aus G1P ist demnach ohne Einbringen Freier Enthalpie unter physiologischen Bedingungen thermodynamisch benachteiligt. Auf Grund dessen müssen Glykogensynthese und Glykogenabbau in separaten Stoffwechselwegen ablaufen. Diese sich wiederholende Strategie des Stoffwechsels — dass biosynthetische und abbauende Stoffwechselwege verschieden sind - ist essentiell, wenn beide Stoffwechselwege unter ähnlichen physiologischen Bedingungen arbeiten müssen, was thermodynamisch nicht möglich ist, wenn ein Stoffwechselweg einfach nur die Umkehrreaktion des anderen ist. Die Entdeckung der Trennung von Synthese- und Abbauweg geht bei Glykogen jedoch nicht auf thermodynamische Betrachtungen, sondern auf die Aufklärung der McArdle-Krankheit zurück. Bei Menschen, die von dieser Krankheit betroffen sind, zeigt das Muskelgewebe keine Glykogen-Phosphorylaseaktivität; es kann daher kein Glykogen abbauen. Dennoch enthalten die Muskeln normales Glykogen in mäßig hoher Konzentration. Daraus lässt sich eindeutig schließen, dass die Glykogensynthese keine Glykogen-Phosphorylase benötigt. In diesem Abschnitt gehen wir auf die Enzyme ein, die an der Glykogensynthese beteiligt sind: UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, Glykogen-Synthase und Glykogen-Verzweigungsenzym. Die gegenläufigen Reaktionen der Glykogensynthese und des Glykogenabbaus sind in Abbildung 16.6 dargestellt.

A.

_ UDP-Glucose-Pyrophosphorylase

Da die direkte Umwandlung von G1P in Glykogen und P; unter physiologischen Bedingungen thermodynamisch ungünstig ist (positives AG), benötigt die Glykogensynthese einen exergonen Schritt. Das wird, wie Luis Leloir 1957 entdeckt hat, erreicht, indem G1P eine Reaktion mit Uridintriphosphat (UTP) eingeht, die durch UDP-Glucose-Pyrophosphorylase katalysiert wird (Abb. 16.7). Das Produkt dieser Reaktion, Uridin-diphosphat-glucose (UDP-Glucose oder UDPG), ist eine „aktivierte“ Verbindung, die eine Glucoseeinheit auf die wachsende Glykogenkette übertragen kann. Die Bildung von UDPG selbst hat ein AG°' = 0 (es ist eine Phosphorsäureanhydrid-Austauschreaktion), die nachfolgende exergone Hydrolyse von PP; durch das allgegenwärtige Enzym Pyrophosphatase (auch als anorganische Phosphatase bezeichnet) lässt die Gesamtreaktion exergon ablaufen: [Giykogen| ae Entzweigungsenzym

ES

UDP (rose Sys

PP;

Pyrophosphatase (anorganische Phosphatase)

> 2P;

ı

Glykogen-Phosphorylase UDP-Glucose-Pyrophosphorylase

engel

|

Abb. 16.6 Die gegenläufigen Stoffwechselwege der Synthese und des Abbaus von Glykogen. Der exergon verlaufende Glykogenabbau wird durch einen UTP-verbrauchenden Vorgang umgekehrt, wobei ein UDP-Glucose-Zwischenprodukt entsteht.

586

Gilykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Abb. 16.7 Die von UDP-Glucose-Phosphorylase katalysierte Reaktion. In dieser Phosphorsäureanhydrid-Austauschreaktion greift das Phosphorylsauerstoffatom von GIP das a-Phosphoratom des UTP an,

UDP-Glucose und PP; werden dabei gebildet. Das PP; wird umgehend von Pyrophosphatase hydrolysiert.

Pyrophosphatase

(anorganische Phosphatase)

PP,RL ——

2P, o

CH3OH

HO

ee

|

HO

UDP-Glucose (UDPG)

Gesamt

G1P + UIP= UDPG + PP, H,O + PP, > 2P,;

AG°' (kJ - mol!) 0 -19,2

GiP + UTP+H,0 > UDPG +2 P;

-19,2

Diese Reaktionsfolge ist ein Beispiel für die häufige biosynthetische Strategie der Spaltung eines Nucleosidtriphosphats unter Bildung von PP;. Die Freie Enthalpie der PP,-Hydrolyse steht nun zur Verfügung, um andere, thermodynamisch benachteiligte Reaktionen vollständig ablaufen zu lassen (Abschnitt 14.2B). Die fast vollständige Spaltung des PP, durch die stark exergone (irreversible) Pyrophosphatase-Reaktion verhindert, dass die Reaktionen, bei denen PP; gebildet wird, in umgekehrter Richtung ablaufen können.

B.

_ Glykogen-Synthase

Im nächsten Schritt der Glykogensynthese, der Glykogen-Synthasereaktion, wird die Glucoseeinheit des UDPG auf die C4-OH-Gruppe eines der nicht reduzierenden Enden von Glykogen übertragen, wobei eine a(1—4)-glykosidische Bindung entsteht. AG°’ für die Glykogen-Synthasereaktion UDPG + Glykogen (n Reste)

—

UDP + Glykogen (n + 1 Reste)

beträgt -13,4 k] - mol", was die gesamte Reaktion unter den gleichen Bedingungen spontan ablaufen lässt, die auch für den ebenfalls spontanen Glykogenabbau durch die Glykogen-Phosphorylase gelten. Die Glykogensynthese hat jedoch

Glykogensynthese

HO

CH,0H

HN

ee, E Ö (6)

HO

on

\7 )

a

OxoniumionZwischenprodukt

em

HO

Q

|

%

UDP-Glucose

an

CH,0OH

mer

10

CH,0H

€

CH,0H

HO

er

|

O

CH,OH

HO CH,0H

HO

Glykogen (n Reste)

Oo

EN

en ee SCH,OH E E +

HO

Glykogen (n + 1 Reste)

OH

o

Glykogen + G1P + UTP — Glykogen + UDP + 2P; (n + 1 Reste)

Somit wird ein Molekül UTP für jede in Glykogen eingebaute Glucoseeinheit in UDP gespalten. Das UTP wird über eine Phosphorylgruppenübertragung, die durch die Nucleosiddiphosphat-Kinase vermittelt wird, zurückerhalten (Abschnitt

14.2C):

=

UTP + ADP

Der UTP-Verbrauch entspricht damit energetisch einem ATP-Verbrauch. Die Übertragung einer Glucoseeinheit von UDPG auf eine wachsende Glykogenkette beinhaltet die Bildung eines Glykosyl-Oxoniumions, wobei UDP, eine gute Abgangsgruppe, abgespalten wird (Abb. 16.8). Gehemmt wird das Enzym durch 1,5-Gluconolacton,

CH,OH HO

...

OÖ

ihren Preis. Nimmt man die beiden ersten Reaktionen der Glykogensynthese zusammen, ergibt sich:

UDP +ATP

O—

Ben

HO

(n Reste)

6

O

OH

1,5-Gluconolacton

einem Analogon, das die Halbsesselgeometrie des Oxoniumions nachahmt. Das gleiche Analogon hemmt sowohl die Glykogen-Phosphorylase (Abschnitt 16.1A) als auch Lysozym (Abschnitt 11.4), da beide ähnliche Reaktionsmechanismen haben. Die Glykogen-Synthase des menschlichen Muskels ist ein Homotetramer aus Untereinheiten von je 737 Resten (das Leber-Isoenzym hat Untereinheiten aus

OH Abb. 16.8 Die von der Glykogen-Synthase katalysierte Reaktion. Diese Reaktion beinhaltet ein Glykosyl-Oxoniumion-Zwischenprodukt.

587

588

_ Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

703 Resten). Wie die Glykogen-Phosphorylase besitzt sie zwei enzymatisch ineinander überführbare Konformationen: In diesem Fall ist jedoch die phosphorylierte b-Form weniger aktiv, dagegen die nicht modifizierte (dephosphorylierte) a-Form aktiver. (Es gilt die Konvention, dass bei Enzymen, die kovalenten Modifikationen unterliegen, „a“ für die aktivere Form und „b“ für die weniger aktive Form steht.) Die Glykogen-Synthase steht unter allosterischer Kontrolle. Sie wird stark durch ATP, ADP und P; in physiologischen Konzentrationen gehemmt. Tatsächlich ist das phosphorylierte Enzym in vivo beinahe vollständig inaktiv. Das dephosphorylierte Enzym jedoch kann durch G6P aktiviert werden, wodurch die Glykogen-Synthase in der Zelle je nach vorhandener G6P-Konzentration und Menge an dephosphorylierter Form des Enzyms variabel aktiv ist. Die mechanistischen Einzelheiten der gegenseitigen Umwandlung von phosphorylierter und dephosphorylierter Form der Glykogen-Synthase sind komplex und bislang noch nicht so gut verstanden wie die der Glykogen-Phosphorylase (u.a. weil die Glykogen-Synthase mehrere Phosphorylierungsstellen hat). Wir werden die Regulation der Glykogen-Synthase in Abschnitt 16.3B näher erörtern. Glykogenin initiiert die Glykogensynthese Die Glykogen-Synthase kann nicht einfach zwei Glucoseeinheiten miteinander verbinden. Das Enzym kann nur eine bereits bestehende a(1—4)-verknüpfte Kette aus Glucosemolekülen (Glucankette) verlängern. Wie wird dann aber die Glykogensynthese in Gang gesetzt? Im ersten Schritt der Glykogensynthese kuppelt die Tyrosin-Glucosyltransferase einen Glucoserest an die OH-Gruppe von Tyr 194 eines 37 kD großen Proteins, des Glykogenins. Glykogenin verlän-

gert autokatalytisch die Glucankette um bis zu sieben zusätzliche Reste, die als UDPG bereitgestellt werden. Auf diese Weise wird ein „Starter“ (engl.: primer) gebildet. Erst an dieser Stelle greift die Glykogen-Synthase in die Glykogensynthese ein und verlängert den Starter. Die Analyse von Glykogengranula lässt vermuten, dass jedes Glykogenmolekül mit jeweils nur einem Molekül Glykogenin und Glykogen-Synthase assoziiert ist.

C.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Beschreiben Sie die enzymatische Synthese von Glykogen. 2. Warum müssen die gegenläufigen Stoffwechselwege der Biosynthese und des Abbaus sich in mindestens einem Enzym unterscheiden?

Giykogen-Verzweigungsenzym

Die Glykogen-Synthase katalysiert nur a(1—4)-Verknüpfungen, wodurch aAmylose entsteht. Die Verzweigung bei der Glykogenbildung geschieht durch ein anderes Enzym, die Amylo(1,4>1,6)-Transglykosylase (engl.: branching enzyme, Verzweigungsenzym), das keinesfalls dem Glykogen-Entzweigungsenzym (Abschnitt 16.1B) gleichgesetzt werden darf. Eine Verzweigung entsteht durch die Übertragung eines 7 Reste langen Abschnitts vom Ende einer Kette auf die C6-OH-Gruppe eines Glucoserests der gleichen oder einer anderen Glykogenkette (Abb. 16.9). Jeder übertragene Abschnitt muss aus einer Kette mit mindestens 11 Resten stammen und der neue Verzweigungspunkt muss wenigstens 4 Reste von anderen Verzweigungspunkten entfernt liegen. Das Verzweigungsmuster von Glykogen wurde im Laufe der Evolution optimiert, um eine effiziente Lagerung und Mobilisierung von Glucose zu gewährleisten (siehe Exkurs

16.3).

Glykogensynthese

589

Abb. 16.9 Die Verzweigung von Glykogen. Verzweigungen werden gebildet, indem ein sieben Reste langes Segment vom Ende einer a(1—4)-verknüpften Glucankette auf die C6-OH-Gruppe eines Glucoserests in derselben oder einer anderen Kette übertragen wird.

HO

a(1—>-4)-terminale Ketten von Glykogen

EDEL

LIKE v a“ Verzweigungsenzym

oa,

ger

DODDSDODDODDIDNDr Optimierung der Glykogenstruktur Die Aufgabe von Glykogen in tierischen Zellen besteht in der Speicherung des Stoffwechselbrennstoffs Glucose und bei Bedarf in dessen schneller Freisetzung. Glykogen muss ein Polymer sein, da Glucose selbst nicht ohne erheblichen Anstieg des intrazellulären osmotischen Drucks gespeichert werden könnte (Abschnitt 2.1D). Die Gesamtkonzentration an Glucoseresten, die in Form von Glykogen in einer Leberzelle gespeichert vorliegen, ist schätzungsweise 0,4 M. Die Konzentration an Glykogen dagegen erreicht nur einen Wert von ca. 10 nM. Dieser Unterschied verringert die osmotische Belastung beträchtlich. Um seine biologische Funktion wahrnehmen zu können, muss das Glykogenpolymer eine möglichst große Menge an Glucose in eine Speicherform mit möglichst geringem Volumen bringen und gleichzeitig sowohl für maximale Mengen an Glucose, die der Glykogen-Phosphorylase-Spaltung zugänglich sind, als auch für eine möglichst große Anzahl an nicht reduzierenden Enden sorgen (um dadurch eine hohe Geschwindigkeit für die Mobilisierung der Glucose zu gewährleisten). All diese Kriterien müssen durch Optimierung von gerade einmal zwei Variabeln erfüllt werden: Der Verzweigungsgrad und die Kettenlänge.

In einem Glykogenmolekül, das hier schematisch gezeigt ist,

|

|| | |

weisen die Glykogenketten, deren innerste Kette an Glykogenin (G) geknüpft ist, zwei Verzweigungen auf (die äußeren Ketten sind unverzweigt). Das gesamte Molekül ist ungefähr globulär und aus Verzweigungsebenen aufgebaut. Es gibt ca. 12 Verzweigungsebenen in reifem Glykogen (hier sind nur 4 gezeigt).

590

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Mit zwei Verzweigungen pro Kette entspricht die Anzahl an Ketten in einer Verzweigungsebene der doppelten Menge der vorhergehenden Verzweigungsebene und die äußeren Ebenen enthalten ungefähr die Hälfte der gesamten Anzahl an Glucoseresten (unabhängig von der Zahl der Verzweigungsebenen). Nimmt der Verzweigungsgrad auf z. B. drei Verzweigungen pro Kette zu, erhöht sich auch der Anteil an Resten in den äußeren Verzweigungsebenen, jedoch nimmt auch die Dichte der Glucosereste zu. Die maximal erreichbare Größe eines Glykogenmoleküls und die Anzahl an Glucoseresten, die es beherbergen kann, werden dadurch stark limitiert. Daraus ergibt sich ein optimaler Verzweigungsgrad von ungefähr 2 Verzweigungen pro Kette.

gen in Zellen (8-14) liegt. Man betrachte die beiden in der folgenden Abbildung vereinfacht dargestellten Glykogenmoleküle, welche alle die gleiche Anzahl an Glucoseresten

(durch dieselbe Gesamtlänge der Linien angedeutet) das gleiche Verzweigungsmuster aufweisen.

und

Das Molekül mit den kürzeren Ketten kann mehr Glucosereste in einem bestimmten Volumen unterbringen und hat mehr Stellen, an denen Phosphorylase angreifen kann. Vor der ersten Entzweigungsreaktion kann jedoch nur die Hälfte der Glucosemenge freigesetzt werden (Entzweigung läuft wesentlich langsamer als Phosphorolyse ab). In einem weniger dicht gepackten Molekül erzielen längere Ketten eine größere Zahl an Resten, die kontinuierlich von der Phosphorylase abgespalten werden können; es gibt dafür jedoch auch weniger Angriffsstellen. Dreizehn Reste sind offensichtlich ein Kompromiss, um möglichst viel Glucose in kürzester Zeit freizu-

2 Verzweigungen pro Keite

setzen.

Das ähnlich wie Glykogen aufgebaute Amylopectin (Abschnitt 8.2C) ist ein viel größeres Molekül und besitzt längere Ketten. Die Amylose dagegen ist gänzlich unverzweigt. Offensichtlich dient die pflanzliche Stärke nicht, wie Glykogen, der schnellen Mobilisierung von Stoffwechselbrennstoffen.

3 Verzweigungen pro Kette

Die mathematische Analyse der anderen Variable, der Kettenlänge, ergibt einen optimalen Wert von 13, der in guter Übereinstimmung mit der tatsächlichen Kettenlänge von Glyko-

3

[Abbildungen nach Melendez-Hevia, E., Waddell, T.G. und Shelton, E.D., Biochem.].295, 477-483

(1993).]

Kontrolle des Glykogenstoffwechsels

Laufen Glykogensynthese und Glykogenabbau gleichzeitig ab, resultiert daraus lediglich eine nutzlose UTP-Hydrolyse. Der Glykogenstoffwechsel muss daher den Bedürfnissen der Zelle angepasst sein. Die Regulation des Glykogenstoffwechsels beinhaltet sowohl eine allosterische als auch eine hormonelle Kontrolle, bei

der Enzyme, die den Stoffwechsel regulieren, kovalent modifiziert werden.

A.

Direkte allosterische Kontrolle von Glykogen-Phosphorylase und Glykogen-Synthase

Wie wir in Abschnitt 14.1E und 15.4B gesehen haben, ist der Nettofluss ] der Reaktanten durch einen Teilschritt eines Stoffwechselwegs gleich der Differenz der Geschwindigkeiten für die Hin- und Rückreaktion, v;und v, Der Fluss wird jedoch sehr stark von Substratkonzentrationen beeinflusst, wenn die Reaktion

das Gleichgewicht erreicht (v; = v,). Der Fluss durch eine gleichgewichtsnahe Reaktion ist daher praktisch unkontrollierbar. Eine genaue Kontrolle des Flusses durch einen Stoffwechselweg ist möglich, wenn einem Enzym, das weit entfernt vom

Kontrolle des Glykogenstoffwechsels

Gleichgewicht arbeitet, ein separat davon kontrolliertes Enzym entgegengesetzt wird. Dadurch verändern sich v; und v, unabhängig voneinander, v, kann größer oder kleiner als v; sein. Damit ist die Kontrolle sowohl der Reaktionsrate als auch der Reaktionsrichtung möglich. Genau diese Situation tritt im Glykogenstoffwechsel durch die gegenläufigen Reaktionen der Glykogen-Phosphorylase und der Glykogen-Synthase auf. Beide, Glykogen-Phosphorylase und Glykogen-Synthase, unterliegen allosterischer Kontrolle durch Effektoren, wie ATP, G6P und AMP. Die Muskel-Glykogen-Phosphorylase wird durch AMP aktiviert und durch ATP und G6P gehemmt. Die Glykogen-Synthase auf der anderen Seite wird durch G6P aktiviert. Das lässt vermuten, dass die Glykogen-Phosphorylase angeregt und die Glykogen-Synthase gehemmt wird, wenn ein hoher Bedarf an ATP besteht (geringe [ATP], geringe [G6P] und hohe [AMP]); der Glykogenabbau wird dadurch begünstigt. Umgekehrt wird die Glykogensynthese angetrieben, wenn [ATP] und

[G6P] hoch sind. In vivo wird dieses allosterische Schema von einem zusätzlichen Kontrollsystem überlagert, das auf kovalenter Modifikation basiert. Zum Beispiel ist Phosphorylase a sogar ohne AMP-Stimulierung (Abschnitt 16.1A) aktiv, die Glykogen-Synthase dagegen nahezu inaktiv (Abschnitt 16.2B), wenn sie nicht dephosphoryliert wird und G6P nicht zugegen ist. Kovalente Modifikationen (Phosphorylierung und Dephosphorylierung) der Glykogen-Phosphorylase und der Glykogen-Synthase stellen daher ein übergeordnetes Kontrollsystem dar, das die Ansprechempfindlichkeit dieser Enzyme auf allosterische Effektoren moduliert.

B.

_ Kovalente Modifikation der Glykogen-Phosphorylase und der Glykogen-Synthase

62 siehe Guided Exploration 15:

Control of Glycogen Metabolism. Die gegenseitige Umwandlung der a- und b-Formen von Glykogen-Synthase und Glykogen-Phosphorylase wird durch eine enzymkatalysierte Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung erreicht (Abschnitt 12.3B), die hormoneller Kontrolle unterliegt (Abschnitt 13.2). Enzymatisch ineinander überführbare Enzymsysteme können daher besser auf eine größere Zahl an Effektoren reagieren als einfache allosterisch kontrollierte Systeme. Darüber hinaus besitzt eine Reihe von Kinasen und Phosphatasen, die eine regulatorische Kaskade bilden, ein enormes Potential, auf verschiedene metabolische Signale zu reagieren, diese zu verstärken oder flexibel zu regulieren. Zu beachten ist, dass die Korrelation zwischen Phosphorylierung und Enzymaktivität sich von Enzym zu Enzym unterscheidet. Zum Beispiel wird die Glykogen-Phosphorylase durch Phosphorylierung (b — a) aktiviert, wohingegen die Glykogen-Synthase durch Phosphorylierung (a — b) inaktiviert wird. Umgekehrt inaktiviert Dephosphorylierung die Glykogen-Phosphorylase und aktiviert die Glykogen-Synthase. Glykogen-Phosphorylase wird durch Phosphorylierung aktiviert Die Kaskade, welche die enzymatische Umwandlung der Glykogen-Phosphorylase umfasst, enthält drei Enzyme (Abb. 16.10): 1. Phosphorylase-Kinase, die spezifisch Ser 14 der Glykogen-Phosphorylase b phosphoryliert. 2. Proteinkinase A (PKA, Abschnitt 13.3C), die Phosphorylase-Kinase phospho-

ryliert und dabei aktiviert. 3. Phosphoprotein-Phosphatase 1 (PP1; Abschnitt 13.2D), die sowohl Phosphorylase a als auch Phosphorylase-Kinase dephosphoryliert und dadurch inaktiviert.

Phosphorylase b reagiert empfindlich auf allosterische Effektoren, Phosphorylase a dagegen wesentlich weniger, wie in Abschnitt 12.3B gezeigt (Abb. 12.16). In ruhenden Zellen sind die Konzentrationen an ATP und G6P hoch

591

592 __ Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese Abb. 16.10 Das Glykogen-Phosphorylase-System. Die Umwandlung der Phosphorylase b (der weniger aktiven Form) in die Phosphorylase a (die aktivere Form) wird durch die von der PhosphorylaseKinase katalysierte Phosphorylierung erreicht. Die Phosphorylase-Kinase wird selbst durch Phosphorylierung durch die Proteinkinase A (PKA) aktiviert. Sowohl die Glykogen-Phosphorylase a als auch die Phosphorylase-Kinase werden durch die Phosphoprotein-Phosphatase 1 wieder dephosphoryliert.

Proteinkinase A

\ "DI=.

--— oo -—-—--

Rhosphoprotem Phosphatase 1

es

/

genug, um Phosphorylase b zu hemmen. Die Aktivität der Phosphorylase wird daher stark von der Menge an zur Verfügung stehendem Enzym in Form der Phosphorylase a bestimmt. Die Menge an phosphoryliertem Enzym im Fließgleichgewicht hängt von den relativen Aktivitäten der Phosphorylase-Kinase, PKA und PP1 ab. Erinnern Sie sich daran, dass PKA durch. cAMP aktiviert wird, einen sekundären Botenstoff (engl.: second messenger), der über die Adenylatcyclase durch Hormon-stimulierte Aktivierung eines heterotrimeren G-Proteins (Abschnitt 13.3C) gebildet wird. Betrachten wir nun die Faktoren, welche die Aktivitäten von Phosphorylase-Kinase und PP1 regulieren, bevor wir zu den Regulationsmechanismen der Glykogen-Synthaseaktivität zurückkehren. Phosphorylase-Kinase Abb. 16.11 Röntgenstruktur der y-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase aus Kaninchenmuskel im Komplex mit ATP und einem Heptapeptidanalog des natürlichen Substrats des Enzyms. Die N-terminale Domäne ist pink, die C-terminale Domäne cyan gefärbt. Die Aktivierungsschleife ist hellblau und das Heptapeptid ist orange, dessen zu phosphorylierender Rest (Ser) weiß. Das ATP ist als Kalottenmodell dargestellt und die Seitenketten der

für die Katalyse wichtigen Aminosäuren Arg 148, Asp 149 und Glu 182 sind in Stabform abgebildet. Alle sind entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt (© grün, N blau, O rot und P gelb). Beachten Sie die strukturellen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen diesem Protein und anderen Proteinkinasen, zum

Beispiel der C-Untereinheit der

Proteinkinase A (Abb. 13.22) und der Tyrosinkinase-domäne des Insulinrezeptors (Abb. 13.5). [Nach einer Röntgenstruktur von Louise Johnson, Oxford University. PDBid 2PHK.]

Phosphorylase-Kinase ist ein 1.300 kD großes Protein mit vier nicht identischen Untereinheiten a, ß, y und ö. Auf der y-Untereinheit ist das katalytische Zentrum lokalisiert, die anderen drei Untereinheiten übernehmen regulatorische Aufgaben. Phosphorylase-Kinase wird durch Ca” und durch die Phosphorylierung der a- und ß-Untereinheit maximal aktiviert. Die y-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase enthält eine 386 Reste große Kinasedomäne, die zu 36% mit der Sequenz der PKA C-Untereinheit (Abb. 13.22) übereinstimmt und eine ähnliche Struktur aufweist (Abb. 16.11). Die y-Untereinheit wird nicht wie einige andere Proteinkinasen phosphoryliert, da der Ser-, Thr- oder Tyr-Rest, der normalerweise für die Aktivierung dieser anderen Kinasen phosphoryliert wird, in der y-Untereinheit durch einen Glu-Rest ersetzt ist. Die negative Ladung von Glu imitiert die Anwesenheit einer Phosphatgruppe und interagiert mit dem konservierten Arg-Rest in der Nähe des aktiven Zentrums. Die katalytische Aktivität der y-Untereinheit wird jedoch gehemmt durch ihren C-terminalen Bereich, der an das aktive Zentrum bindet und dieses blockiert, vergleichbar der R-Untereinheit der Proteinkinase A, die die Aktivität

der C-Untereinheit blockiert. Ein inhibitorisches Segment in der ß-Untereinheit kann ebenfalls die Aktivität der y-Untereinheit blockieren.

Kontrolle des Glykogenstoffwechsels

Die Autoinhibierung der Phosphorylase-Kinase wird durch PKA-katalysierte Phosphorylierung sowohl der a- als auch der ß-Untereinheit aufgehoben. Die Phosphorylierung führt vermutlich dazu, dass das ß-Inhibitorsegment sich zur Seite bewegt (wie die Phosphorylierung der a-Untereinheit das Enzym reguliert ist nicht bekannt). Für eine maximale Aktivität der y-Untereinheit ist es erforderlich, dass Ca’* an die ö-Untereinheit bindet. Diese wird auch als Calmodulin (CaM) bezeichnet. CaM (Abschnitt 13.4B) tritt sowohl als unabhängiges Protein als auch, wie in diesem Fall, als Untereinheit von größeren Proteinen auf. Ca’*Konzentrationen von 10°” M reichen bereits aus, um die Phosphorylase-Kinase zu aktivieren. Sie bewirken einen Konformationswechsel in CaM, der dazu führt, dass es an das autoinhibitorische Segment der y-Untereinheit bindet und dieses aus dessen katalytischem Zentrum verdrängt. Die Umwandlung der Glykogen-Phosphorylase b in Glykogen-Phosphorylase a, katalysiert durch die Phosphorylase-Kinase, steigert die Rate des Glykogenabbaus. Die physiologische Bedeutung der Ca°*-Freisetzung für diese Aktivierung wird klar, wenn man bedenkt, dass auch die Muskelkontraktion durch einen vorübergehenden Anstieg der cytosolischen Ca’*-Konzentration ausgelöst wird (Abschnitt 7.2B). Die Abbaurate des Glykogens ist dadurch an das Ausmaß der Muskelkontraktion gekoppelt. Das ist entscheidend, da Glykogen die Glykolyse mit Stoffwechselbrennstoff versorgt, um das für die Muskelkontraktion notwendige ATP bereitzustellen. Da die Ca’*-Freisetzung in Antwort auf Nervenimpulse erfolgt, während die Phosphorylierung der Phosphorylase-Kinase letztlich hormonell gesteuert ist, wirken beide Signale in Muskelzellen synergistisch zusammen und stimulieren dadurch die Glykogenolyse. Phosphoprotein-Phosphatase 1 Viele über Phosphorylierung regulierte Enzyme stehen in einem dynamischen Gleichgewicht, das durch ein Wechselspiel von Phosphorylierung, katalysiert durch die entsprechende Kinase, und hydrolytischer Dephosphorylierung, katalysiert durch eine Phosphatase, aufrechterhalten wird. Phosphoprotein-Phosphatase 1 (PP1) spaltet die Phosphorylgruppen sowohl von Glykogen-Phosphorylase a und den a- und ß-Uniereinheiten der Phosphorylase-Kinase ab (Abb. 16.10), als auch von anderen Proteinen, die in den Glykogenstoffwechsel eingreifen (siehe unten). PP1 wird in Muskel- bzw. Lebergewebe unterschiedlich kontrolliert. Im Muskel ist die katalytische Untereinheit der PP1 (sie wird PPlc genannt) nur aktiv, wenn sie an Glykogen gebunden ist, vermittelt über die glykogenbindende Untereinheit Gy. Die Aktivität der PPlc und deren Affinität zur Gy-Untereinheit werden durch zwei separate Stellen in der Gy-Untereinheit kontrolliert, die phosphoryliert werden können (Abb. 16.12). Phosphorylierung an Stelle 1 durch eine insulinstimulierte Proteinkinase (ein Homologes der PKA und der y-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase) aktiviert PPlc, wohingegen Phosphorylierung von Stelle 2 durch PKA (die auch Stelle 1 phosphorylieren kann) PP1c vom Glykogen freisetzt. Im Cytosol kann sie jedoch an Glykogen gebundene Enzyme des Glykogenstoffwechsels nicht mehr dephosphorylieren. Im Cytosol wird Phosphoprotein-Phosphatase 1 ferner durch die Bindung des Proteins Phosphoprotein-Phosphatase-Inhibitor 1 gehemmt. Dieses Protein ist ein weiteres Beispiel für die Kontrolle durch kovalente Modifikation: Es wird ebenfalls durch PKA aktiviert und durch Phosphoprotein-Phosphatase 1 inaktiviert (Abb. 16.13, links unten). Die Konzentration an CAMP übernimmt daher die Kontrolle über die Menge an Enzym in phosphoryliertem Zustand, indem es nicht nur dessen Phosphorylierungsrate steigert, sondern auch die Umwandlungsrate in die dephosphorylierte Form herabsetzt. Im Fall der Glykogen-Phosphorylase sorgt eine erhöhte cAMP-Konzentration damit sowohl für eine Steigerung der Aktivitätsrate des Enzyms als auch für eine erniedrigte Deaktivierungsrate. In der Leber bindet PP1 auch an Glykogen, allerdings nicht direkt, sondern durch die Vermittlung einer Glykogen-bindenden Untereinheit, die G, genannt

593

594

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese Insulin I I

I

Y durch Insulin stimulierte Proteinkinase I

! ADP )

ATPN — > (aktiv)

Herabgesetzte Phosphornylierung führt zu gesteigerter Glykogensynthese

Adrenalin

———>-

ATP

(inaktiv)

Gesteigerte Phosphorylierung

führt zu gesteigertem Glykogenabbau

Abb. 16.12 Regulation der PhosphoproteinPhosphatase 1 im Muskel. Die antagonistischen Effekte von Insulin und Adrenalin auf den Glykogenstoffwechsel im Muskel ergeben sich durch deren Wirkungen auf die katalytische Untereinheit der PP1 (PPlc genannt) über die glykogenbindende Untereinheit Gy. Grüne Kreise und gestrichelte Pfeile zeigen eine Aktivierung an.

wird. Anders als Gy wird G, nicht durch reversible Phosphorylierung kontrolliert. Die Aktivität des PP1-G,-Komplexes wird durch dessen Bindung an Phosphorylase a kontrolliert. Beide Zustände der Phosphorylase a, R- und T-Zustand, interagieren stark mit PP1, aber nur im T-Zustand ist die Ser-14-Phosphorylgruppe der Hydrolyse zugänglich (im R-Zustand liegt die Ser-14-Phosphorylgruppe in dem Dimerverbindungsstück verdeckt; Abb. 12.15). Folglich unterdrückt Phosphorylase a, wenn sie in ihrem aktiven R-Zustand vorliegt, die Dephosphorylierungsaktivität der PP1. Unter solchen Bedingungen, bei denen Phosphorylase a in den T-Zustand übergeht (siehe unten), kann jedoch die PP1 die nun freiliegende Ser-14-Phosphorylgruppe hydrolysieren und überführt dadurch die Phosphorylase a in Phosphorylase b, die eine viel niedrigere Affinität zum PP1-G,-Komplex hat. Eine Auswirkung der Dephosphorylierung von Phosphorylase a ist daher die Aufhebung der Hemmung durch PP1. Da die Konzentration an Glykogen-Phosphorylase etwa 10-mal so groß ist wie die der PP1, erfolgt die Freisetzung erst dann, wenn mehr als 90% der Glykogen-Phosphorylase als Phosphorylase b vorliegen. Dies ist die Voraussetzung dafür, dass PP1 andere Proteine, einschließlich der Glykogen-Synthase, dephosphorylieren kann. Glucose ist ein allosterischer Inhibitor der Phosphorylase a (Abb. 12.16). Infolgedessen wird die Phosphorylase a, wenn die Konzentration an Glucose hoch

ist, in ihre T-Form umgewandelt, wobei sie selbst wie auch die Glykogen-Synthase dephosphoryliert werden. Glucose kommt daher eine wichtige Kontrollfunktion beim Glykogenstoffwechsel in der Leber zu. Glykogen-Synthase

Die Phosphorylase-Kinase, die die Glykogen-Phosphorylase aktiviert, phosphoryliert auch die Glykogen-Synthase und inaktiviert sie dadurch. Von sechs weiteren Proteinkinasen, einschließlich PKA, ist bekannt, dass sie zumindest teilweise die Glykogen-Synthase im menschlichen Muskel deaktivieren, indem sie einen oder mehrere der neun Ser-Reste in deren Untereinheiten phosphorylie-

Kontrolle des Glykogenstoffwechsels

+ Rx(cAMP),

595

PHOSPHORYLIERUNGS-

SYSTEM

[j j en

ATP

1

}

u

ne

-

|

(aßydy Phosphorylase-

\

r

——n

Kinase 5b

}

}

h N S

ATP

} ADP ne

; Glykogen-

Synthase b

e-

Phosphatase 1

(inaktiv) Jim me fm Mm JE Mm U AJM mA a AMA m dm

Phosphatase-

Inhibitor 15

DEPHOSPHORYLIERUNGSSYSTEM

ren (Abb. 16.13). Der Grund für dieses ausgefeilte Regulationssystem der Glyko-

Abb. 16.13

gen-Synthase ist bislang ungeklärt.

Dephosphorylierungssysteme, die den Glykogenstoffwechsel im Muskel regulieren. Aktivierte Enzyme sind grün und deaktivierte Enzyme violett gefärbt. Gestrichelte Pfeile zeigen

Das Gleichgewicht zwischen der Nettosynthese und dem Nettoabbau von Glykogen und die Geschwindigkeiten dieser beiden Prozesse hängt von den relativen Aktivitäten der Glykogen-Synthase und der Glykogen-Phosphorylase ab. Die Raten der de tienman und Dephosphorylierung dieser Enzymei kontrollie> ö ren maßgeblich die Glykogensynthese und den Glykogenabbau. Beide Vorgänge sind über die PKA und die Phosphorylase-Kinase miteinander verknüpft, welche

durch Phosphorylierung die Phosphorylase aktivieren und gleichzeitig die Glykogen-Synthase inaktivieren (Abb. 16.13). Sie sind ebenfalls über die PP1 gekoppelt, die in der Leber durch die Phosphorylase a gehemmt wird und dadurch nicht mehr in der Lage ist, die Glykogen-Synthase zu aktivieren (zu dephosphorylieren), bevor sie nicht Phosphorylase a (ebenfalls durch Dephosphorylierung) inaktiviert. Allerdings wird die Kontrolle durch kovalente Modifikation von der Kontrolle durch allosterische Effektoren überlagert. Dadurch hat z. B. die Verfügbarkeit des Substrats G6P (das die Glykogen-Synthase aktiviert) ebenfalls einen Einfluss auf die Geschwindigkeit des Einbaus von Glucoseeinheiten in Glyko-

Wichtige Phosphorylierungs- und

ns a a N (eeib) w. Dephosphornylierungsreaktion (violett) an. ED Siehe Animated Figures.

596

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

gen. Ein erblich bedingter Mangel an den fraglichen Enzymen kann die Feinkontrolle des Glykogenstoffwechsels stören und dadurch zu verschiedenen Krankheiten führen (siehe Exkurs 16.2).

C. _ Hormonelle Einflüsse auf den Glykogenstoffwechsel Der Glykogenstoffwechsel in der Leber wird durch die Polypeptidhormone Insulin (Abb. 5.1) und Glucagon, die entgegensetzte Wirkung haben, kontrolliert. Glucagon, +

H,N—His—Ser

Ser—Lys

—GlIn— Gly —

Thr— Phe— Thr — Ser

— Asp—Tyr— 10

— Tyr— Leu— Asp— Ser — Arg — Arg— Ala-- Gln— 20

Phe— Val—Gln Asp—

— Trp — Leu— Met— Asn— Thr—CO0 29 Glucagon

wird wie Insulin im Pankreas in Abhängigkeit von der Blutglucosekonzentration synthetisiert. In den Muskeln und verschiedenen Geweben erfolgt diese Kontrolle über Insulin und die Nebennieren-Hormone Adrenalin (Epinephrin) und Noradrenalin (Norepinephrin) (Abschnitt 13.1B). Diese Hormone beeinflussen den Stoffwechsel in ihren Zielgeweben, indem sie die kovalente Modifikation (Phosphorylierung) regulatorischer Enzyme stimulieren. Dazu binden sie an Transmembran-Rezeptoren auf der Zelloberfläche, wobei verschiedene Zelltypen verschiedene Rezeptoren aufweisen und daher auf verschiedene Hormone reagieren. Bindet ein Hormon an seinen Rezeptor, löst das innerhalb der Zelle die Freisetzung von sogenannten sekundären Botenstoffen (engl.: second messengers) aus, die intrazellulär als Überbringer (Mediatoren) der von außen erhaltenen hormonellen Botschaft fungieren. Verschiedene Rezeptoren setzen unterschiedliche

sekundäre

Botenstoffe

frei. Der erste

sekundäre

Botenstoff,

den

man entdeckt hat, war das in den 1950er Jahren von Earl Sutherland identifizierte CAMP. Das von intrazellulären Speichern ans Cytosol abgegebene Ca”*

ist ebenfalls ein häufiger sekundärer Botenstoff. Auf Rezeptoren und sekundäre Botenstoffe wird in Kapitel 13 näher eingegangen. Nimmt durch die hormonelle Stimulation die intrazelluläre cCAMP-Konzentration zu, erhöht sich die PKA-Aktivität und damit die Phosphorylierungsrate vieler Proteine, wohingegen die Dephosphorylierungsrate abnimmt. Auf Grund der Kaskadenstruktur der in Abbildung 16.13 aufgeführten regulatorischen Systeme führt eine kleine Veränderung in [CAMP] zu einer großen Veränderung des relativen Anteils der Enzyme in ihren phosphorylierten Formen. Wenn die Enzyme des Glykogenstoffwechsels zu einem großen Teil in ihren phosphorylierten Formen vorliegen, läuft der Stoffwechsel in Richtung des Glykogenabbaus ab, da die Glykogen-Phosphorylase aktiv und die Glykogen-Synthase inaktiv ist. Bei einer Abnahme der cAMP-Konzentration sinken die Phosphorylierungsgeschwindigkeiten, die Dephosphorylierungsgeschwindigkeiten nehmen zu und der relative Anteil der Enzyme in ihrer Dephosphoform steigt ebenfalls. Die daraus resultierende Aktivierung der Glykogen-Synthase und Hemmung der Glykogen-Phosphorylase bewirken eine Umkehr des Flusses in Richtung einer Nettosynthese von Glykogen. Glucagon bindet an einen Rezeptor auf Leberzellen, was intrazellulär zur Bildung von cAMP führt und für die Mobilisierung von Glucose aus gespeichertem Glykogen sorgt (Abb. 16.14). Glucagon wird vom Pankreas abgegeben, wenn die Konzentration der Glucose im Blut unter 5 mM sinkt, was bei einer Anstrengung oder mehrere Stunden nach der letzten Mahlzeit der Fall sein kann. Glucagon ist daher bedeutend für die Aufgabe der Leber, anderen Geweben, die primär von der Glykolyse abhängen, in ausreichender Menge Glucose zur Deckung

Kontrolle des Glykogenstoffwechsels Bauchspeiche

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597

Adrenalin

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Bauchspeicheldrüse

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Insulin-

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von deren Energiebedarf zur Verfügung zu stellen. Auf Muskelzellen hat Glucagon keine Wirkung, da diese keinen geeigneten Rezeptor besitzen. Adrenalin und Noradrenalin, die auch als „Kampf- und Flucht-“ Hormone bezeichnet werden, werden bei Stress von den Nebennieren ausgeschüttet und in den Blutkreislauf abgegeben. Es gibt zwei Arten von Rezeptoren für diese Hormone: Die ß-adrenergen Rezeptoren, die an das Adenylat-Cyclasesystem gekoppelt sind, und die a-adrenergen Rezeptoren, die intrazellulär [Ca’*] ansteigen lassen (Abschnitt 13.4A). Muskelzellen, die ß-adrenerge Rezeptoren aufweisen (Abb. 16.14), bauen in Antwort auf die Bindung von Adrenalin Glykogen für die anschließende Glykolyse ab, bilden dabei ATP und helfen den Muskeln, mit der Situation, welche zur Adrenalinausschüttung geführt hat, fertig zu werden. In Leberzellen löst Adrenalin direkte und indirekte Reaktionen aus. Adrenalin fördert die Freisetzung von Glucagon aus dem Pankreas. Die Bindung von Glucagon an seinen Rezeptor auf den Leberzellen steigert, wie oben beschrieben, den Glykogenabbau. Adrenalin bindet ebenfalls direkt an a- und ß-adrenerge Rezeptoren auf den Oberflächen der Leberzellen (Abb. 16.14). Die Bindung an den ß-adrenergen Rezeptor bewirkt eine höhere intrazelluläre [(AMP], was wiederum zu Glykogenabbau führt. Die Aktivierung des a-adrenergen Rezeptors lässt intrazellulär [Ca’*] ansteigen, das die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber cAMP erhöht (man erinnere sich, dass die Phosphorylase-Kinase, die die Glykogen-Phosphorylase aktiviert und die Glykogen-Synthase inaktiviert, nur vollständig aktiv ist, wenn sie in ihrer phosphorylierten Form vorliegt und [Ca’*] erhöht ist). Zusätzlich wird die Glykogen-Synthase durch Phosphorylierung, die von mehreren Ca?’*-abhängigen Proteinkinasen katalysiert wird, inaktiviert. Insulin und Adrenalin sind Antagonisten

Insulin wird vom Pankreas als Antwort auf einen hohen Blutglucosespiegel freigesetzt (z.B. direkt nach einer Mahlzeit). Hormonelle Stimulation durch Insulin steigert die Rate des Glucosetransports in den vielen Zellarten, die sowohl Insulinrezeptoren als auch Insulin-empfindliche Glucosetransporter, die als GLUT4 bezeichnet werden, auf ihrer Zelloberfläche tragen (z. B. Muskel- und Fettzellen, nicht jedoch Leber- und Gehirnzellen). Darüber hinaus nimmt [CAMP] ab und veranlasst dadurch den Glykogenstoffwechsel, von Glykogenabbau auf Glykogensynthese umzustellen (Abb. 16.14). Der Mechanismus der Insulinwirkung ist sehr komplex (Abschnitte 13.4D und 22.2), aber eines der Zielenzyme des In-

GLUT2 Glucosetransporter

Abb. 16.14 Hormonelle Kontrolle des Glykogenstoffwechsels. Adrenalin, das an ß-adrenerge Rezeptoren auf Leber- und Muskelzellen bindet, lässt intrazellulär

[CAMP] ansteigen, was den Glykogenabbau zu G6P fördert. G6P geht (im Muskel) in die Glykolyse ein oder wird (in der Leber) zu Glucose für den Export in den Blutkreislauf umgewandelt. Die Leber reagiert in ähnlicher Weise auf Glucagon. Adrenalin, das an a-adrenerge Rezeptoren auf Leberzellen bindet, führt zu einem erhöhten [Ca?*] im Cytosol, was ebenfalls den Glykogenabbau fördert. Ist der Blutglucosespiegel hoch, stimuliert Insulin die Glucoseaufnahme und die Glykogensynthese in Muskeln. Die Leber reagiert sowohl auf Insulin als auch direkt auf einen Anstieg von Glucose durch gesteigerte Glykogensynthese.

598

_Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Warum erlaubt ein Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungssystem eine empfindlichere Regulation eines Stoffwechselprozesses als ein einfaches allosterisches System? 2. Wie unterscheiden sich die Regulationsmechanismen des Glykogenstoffwechsels in Leber und Muskel?

sulins scheint PP1 zu sein. Wie in Abbildung 16.12 dargestellt, aktiviert Insulin die insulinstimulierte Proteinkinase im Muskel, die die Phosphorylierungsstelle 1 der G-Untereinheit der Glykogenbindungsstelle von PP1 phosphoryliert und damit dieses Protein aktiviert. Dieses Protein dephosphoryliert nun wiederum die Enzyme des Glykogenstoffwechsels. Die Speicherung der Glucose in Form des Glykogens wird so durch die Hemmung des Glykogenabbaus und die Anregung der Glykogensynthese gefördert. In der Leber stimuliert Insulin die Glykogensynthese durch die Hemmung der Glykogensynthase-Kinase 3ß: (GSK3ß: Abb. 13.31). Dies führt zu einer verminderten Phosphorylierung der Glykogen-Synthase und somit zu einem Anstieg ihrer Aktivität. Außerdem wird vermutet, dass Glucose selbst ein Botenstoff ist, der den Glykogenstoffwechsel beeinflusst. Glucose hemmt die Phosphorylase a, indem sie an den inaktiven T-Zustand des Enzyms bindet und das T = RGleichgewicht auf die Seite des T-Zustands verschiebt (Abb. 12.16). Diese Konformationsänderung macht Ser 14 der Dephosphorylierung zugänglich. Ein Anstieg der Glucosekonzentration fördert daher die Inaktivierung der GlykogenPhosphorylase a durch Umwandlung in Phosphorylase b. Die nachfolgende Freisetzung von Phosphoprotein-Phosphatase 1 aktiviert die Glykogen-Synthase. Die Leber kann somit bei einem großen Glucoseangebot den Überschuss als Glykogen speichern.

4

_Giluconeogenese

Wenn Glucose nicht in ausreichender Menge über die Nahrung verfügbar ist und die Glykogenvorräte in der Leber erschöpft sind, wird Glucose aus Vorläufermolekülen, die keine Kohlenhydrate sind, über den Weg der Gluconeogenese aufgebaut. Die Gluconeogenese stellt in der Tat beim Fasten einen beträchtlichen Teil der Glucosemenge bereit, selbst wenn die letzte Mahlzeit nur wenige Stunden zurückliegt. Die Gluconeogenese findet in der Leber und, in geringerem Ausmaß, in der Niere statt. Die Nicht-Kohlenhydrat-Vorstufen, die in Glucose umgewandelt werden können, sind die Glykolyseprodukte Lactat und Pyruvat, die Zwischenprodukte des Citratcyclus und das Kohlenstoffgerüst der meisten Aminosäuren. Zuerst müssen all diese Substanzen jedoch in das vier Kohlenstoffe umfassende Oxalacetat umgewandelt werden, OÖ OÖ j an

C—CH,—C—C

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Oxalacetat

das ein Zwischenprodukt des Citratcyclus ist (Abschnitt 17.1). Die einzigen Aminosäuren, die bei Tieren nicht zu Oxalacetat umgebaut werden können, sind

Leucin und Lysin, da bei deren Abbau Acetyl-CoA (Abschnitt 21.4E) entsteht, welches von Tieren nicht in Oxalacetat umgewandelt werden kann. Genauso wenig können Fettsäuren bei Tieren als Glucosevorstufen dienen, da die meisten Fettsäuren vollständig zu Acetyl-CoA abgebaut werden (Abschnitt 20.2). Beim Abbau von Fettsäuren wird hingegen ein großer Teil des ATP gebildet, das die Gluconeogenese antreibt. Der Einfachheit halber wird die Gluconeogenese als der Stoffwechselweg betrachtet, durch den Pyruvat in Glucose umgewandelt wird. Die meisten Reaktionen der Gluconeogenese sind Reaktionen der Glykolyse, die in umgekehrter Richtung ablaufen (Abb. 16.15). Die Glykolyseenzyme Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvat-Kinase katalysieren jedoch Vorgänge mit hoher negativer Freier Enthalpieänderung. Diese Vorgänge müssen daher in der Gluconeogenese durch Reaktionen ersetzt werden, welche die Glucosesynthese thermodynamisch begünstigen.

Gluconeogenese Glucose

Abb. 16.15 Vergleich der Stoffwechselwege von Gluconeogenese und Glykolyse. Die roten Pfeile stellen die Schritte dar, die jeweils

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A.

599

Vom Pyruvat zum Phosphoenolpyruvat

Beginnen wir bei der Betrachtung der für die Gluconeogenese spezifischen Reaktionen mit der Umwandlung von Pyruvat in Phosphoenolpyruvat (PEP). Da dieser Schritt der Umkehrung der hoch exergonen, durch die Pyruvat-Kinase katalysierten Reaktion (Abschnitt 15.2J) entspricht, wird Freie Enthalpie benötigt. Das wird erreicht, indem Pyruvat zunächst in Oxalacetat umgewandelt wird. Oxalacetat ist ein energiereiches Zwischenprodukt, dessen exergone Decarboxylierung die notwendige Freie Enthalpie für die PEP-Synthese liefert. An diesem Prozess sind zwei Enzyme beteiligt (Abb. 16.16): 1. Pyruvat-Carboxylase katalysiert die ATP-getriebene Bildung von Oxalacetat aus Pyruvat und HCO;. 2. PEP-Carboxykinase (PEPCK) wandelt Oxalacetat in einer Reaktion, die GTP als Phosphorylgruppendonator verwendet, in PEP um.

von verschiedenen Enzymen in beiden Stoffwechselwegen katalysiert werden. Die anderen sieben Reaktionsschritte der Gluconeogenese werden von Enzymen der Glykolyse in gleichgewichtsnahen Reaktionen katalysiert. 6% siehe Animated Figures.

600

Gilykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

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Pyruvat

Abb. 16,16 Die Umwandlung von Pyruvat in Phosphoenolpyruvat (PEP). Dieser Vorgang erfordert (1) die Pyruvat-Carboxylase für die Umwandlung von Pyruvat in Oxalacetat und (2) die PEP-Carboxykinase (PEPCK) für die Umwandlung von Oxalacetat in PEP.

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Phosphoenol(PEP) pyruvat

Die Pyruvat-Carboxylase trägt Biotin als prosthetische Gruppe

Die Pyruvat-Carboxylase ist ein tetrameres Protein aus vier identischen Untereinheiten, die jeweils aus etwa 1160 Aminosäuren bestehen. Jede dieser Untereinheiten besitzt ein Biotin als prosthetische Gruppe. Biotin (Abb. 16.17a) wirkt als CO,-Überträger, indem es mit seiner Ureidogruppe CO, als Carboxylsubstituenten reversibel bindet (Abb. 16.175). An das Enzym ist Biotin kovalent über einen Lys-Rest als Biocytinrest (alternativ auch als Biotinyliysin bezeichnet) gebunden (Abb. 16.17b). Das Biotinringsystem sitzt daher am Ende eines 1,4 nm langen beweglichen Arms. Biotin, das 1935 zunächst als Wachstumsfaktor in Hefe entdeckt wurde, ist ein für Menschen essentieller Nährstoff. Ein ernäh-

Abb. 16.17 Biotin und Carboxybiotinyl-Enzym. (a) Biotin besteht aus einem Imidazolinring, der

rungsbedingter Mangel ist jedoch selten, da Biotin in vielen Nahrungsmitteln vorkommt und darüberhinaus von Darmbakterien synthetisiert wird. Die Pyruvat-Carboxylasereaktion verläuft in zwei Phasen (Abb. 16.18): Phase I Die Spaltung von ATP zu ADP ermöglicht die Dehydrierung von Bicarbonat über die Zwischenstufe eines energiereichen Carboxyphosphats. Das dabei entstehende CO, reagiert mit Biotin in einer exergonen Reaktion. Die biotingebundene Carboxylgruppe ist daher im Vergleich zum Bicarbonat „aktiviert“ und kann auf andere Moleküle ohne weitere Zufuhr von Freier Enthalpie übertragen werden. Phase II Die aktivierte Carboxylgruppe wird in einem dreistufigen Prozess, der Oxalacetat liefert, vom: Carboxybiotin auf Pyruvat transferiert. Diese beiden Reaktionsschritte finden an verschiedenen Stellen desselben Enzyms statt, wobei der 1,4 nm lange Arm des Biocytins dem Weiterreichen des Biotinrings zwischen beiden Stellen dient. Oxalacetat ist sowohl eine Vorstufe der Gluconeogenese als auch ein Zwischenprodukt des Citratcyclus (Abschnitt 17.3). Wenn das Substrat des Citratcyclus, Acetyl-CoA, akkumuliert, aktiviert dieses allosterisch die Pyruvat-Carboxylase, wodurch die Menge an Oxalacetat ansteigt, die für den Citratcyclus zur Verfügung steht. Ist die Aktivität des Citratcyclus gering, geht Oxalacetat stattdessen in die Gluconeogenese ein.

in cis-Orientierung an einen mit einer Valerat-

seitenkette versehenen Tetrahydrothiophenring gebunden ist. Position 1, 2 und 3 bilden eine Ureidogruppe. (b) Biotin ist an Carboxylasen über eine Amidbindung zwischen seiner Valeryl-Carboxylgruppe und der e-Aminogruppe einer LysSeitenkette im Enzym kovalent gebunden. Das Carboxybiotinylenzym entsteht, wenn das N1-Atom der Ureidogruppe des Biotins carboxyliert wird.

w

PEP-Carboxykinase PEPCK, ein monomeres, aus etwa 610 Aminosäuren bestehendes Enzym, kata-

Iysiert die GTP-getriebene Decarboxylierung von Oxalacetat unter Bildung von PEP und GDP (Abb. 16.19). Zu beachten ist, dass das CO,, das Pyruvat zu Oxalacetat carboxyliert, bei der Entstehung von PEP wieder entfernt wird. Oxalacetat kann daher als „aktiviertes“ Pyruvat betrachtet werden, wobei CO, und Biotin die Aktivierung unter Verbrauch von ATP ermöglichen.

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Gluconeogenese Phase I

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Carboxybiotinyl-Enzym

Oxalacetat

Abb. 16.18 Der zweistufige Reaktionsmechanismus der Pyruvat-Carboxylase. Phase | umfasst eine Drei-Schritt-Reaktion, bei der Carboxyphosphat aus Bicarbonat und ATP gebildet wird und anschließend CO, entsteht, welches dann Biotin carboxyliert. Phase II umfasst eine Zwei-Schritt-Reaktion, bei der CO, im aktiven Zentrum unter Freisetzung des Biotinylenzyms entsteht. Dieses zieht ein Proton vom Pyruvat ab und generiert dabei Pyruvatenolat. Das Enolat wiederum greift CO, nucleophil an und wird zu Oxalacetat umgesetzt. [Nach Knowles, J.R., Annu. Rev. Biochem. 58, 217 (1989).]

Abb. 16.19

PEPCK-Reaktionsmechanismus.

Decarboxylierung von Oxalacetat (einer ß-Ketosäure) erzeugt ein resonanzstabilisiertes Enolatanion, dessen Sauerstoffatom die

y-Phosphorylgruppe von GTP unter Bildung von PEP und GDP angreift.

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Oxalacetat

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Phosphoenolpyruvat (PEP)

601

602

_Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese Die Gluconeogenese erfordert den Transport von Metaboliten zwischen Mitochondrien und Cytosol Die Bildung von Oxalacetat aus Pyruvat oder aus Zwischenprodukten des Citratcyclus erfolgt ausschließlich in den Mitochondrien, während sich die Enzyme, die PEP zu Glucose umwandeln, im Cytosol befinden. Die zelluläre Lokalisation von PEPCK ist von Spezies zu Spezies verschieden. In einigen Spezies ist sie mitochondrial, in anderen cytosolisch oder gar (wie beim Menschen) gleichmäBig auf beide Kompartimente verteilt. Damit die Gluconeogenese ablaufen kann, muss entweder Oxalacetat zur Umwandlung in PEP die Mitochondrien verlassen, oder das dort gebildete PEP muss ins Cytosol gelangen. PEP wird mittels spezifischer Transportproteine über die mitochondriale Membran transportiert. Für Oxalacetat gibt es jedoch kein solches Transportsystem. In Spezies mit cytosolisch lokalisierter PEPCK muss Oxalacetat daher zunächst entweder in Aspartat (Abb. 16.20, Weg 1) oder in Malat (Abb. 16.20, Weg 2) umgewandelt werden, für die mitochondriale Transportsysteme existieren.

Der Unterschied zwischen beiden Wegen betrifft den Transport von NADHReduktionsäquivalenten (beim Transport von Reduktionsäquivalenten werden die Elektronen und nicht die Elektronenträgermoleküle durch die Membran transportiert). Der Malat-Dehydrogenase-Weg (Weg 2) ermöglicht den Transport von Reduktionsäquivalenten vom Mitochondrion ins Cytosol, da mitochondriales NADH verbraucht und cytosolisches NADH produziert wird. Der AspartatAminotransferase-Weg (Weg 1) läuft ohne NADH ab. Cytosolisches NADH wird für die Gluconeogenese benötigt; deshalb ist in der Regel der Weg über Malat erforderlich. Wenn jedoch Lactat als Vorstufe für die Gluconeogenese

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Oxalacetat

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cC0O07

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Abb. 16.20 Transport von PEP und Oxalacetat aus dem Mitochondrion ins Cytosol. PEP wird direkt zwischen den Kompartimenten transportiert. Oxalacetat dagegen muss zunächst entweder durch die Aspartat-Aminotransferase in Aspartat (Weg 1) oder durch die Malat-Dehydrogenase in Malat (Weg 2) umgewandelt werden. Weg 2 beinhaltet die mitochondriale Oxidation von NADH und anschließende Reduktion von NAD* im Cytosol, wodurch zusätzlich NADH-Reduktionsäquivalente vom Mitochondrion ins Cytosol transferiert werden. 2 siehe Animated Figures.

Aminosäure AspartatAminotransferase

a-Ketosäure

a-Ketosäure

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> Gluconeogenese —-PE + P Ö“Sen

BER

Gluconeogenese

603

dient, wird bei dessen Oxidation zu Pyruvat cytosolisches NADH produziert, so dass beide Transportsysteme arbeiten können. Alle Reaktionen, die in Abbildung 16.20 angegeben sind, sind vollständig reversibel, wodurch bei geeigneten Bedingungen das Malat-Aspartat-Shuttle ebenfalls dazu benutzt werden kann, um NADH-Reduktionsäquivalente für den Elektronentransport und die oxidative Phosphorylierung in die Mitochondrien zu transportieren (Abschnitt 18.1B). In der Leber existiert eine Variante von Weg 1, in der Aspartat beim Eintritt ins Cytosol über den Harnstoff-Cyclus desaminiert wird, bevor es eine Reihe von Reaktionen durchläuft und in Oxalacetat umgewandelt wird (Abschnitt 21.3A).

B.

Hydrolytische Reaktionen

Der Weg von PEP zu Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) wird von den Enzymen der Glykolyse, lediglich in umkehrter Richtung, katalysiert. Die Reaktionen der GlykoIyse, die von der Phosphofructokinase (PFK) und der Hexokinase katalysiert werden, laufen in der Gluconeogenese jedoch endergon ab, weshalb diese Schritte durch andere, der Gluconeogenese eigene Enzyme erfolgen müssen. FBP wird durch die Fructose1,6-Bisphosphatase (FBPase) hydrolysiert. Das entstehende Fructose-6-phosphat (F6P) unterliegt einer Isomerisierung zu G6P, das nun durch die Glucose-6Phosphatase hydrolysiert wird, das gleiche Enzym, das auch aus Glykogen stammendes G6P in Glucose umwandelt (Abschnitt 16.1C) und nur in Leber und Niere vorkommt. Zu beachten ist, dass diese beiden hydrolytischen Reaktionen P; freisetzen und nicht die ATP — ADP-Vorgänge umkehren, die normalerweise an dieser Stelle des Glykolysestoffwechselwegs ablaufen. Die Nettoenergiekosten der Umwandlung von zwei Molekülen Pyruvat in ein Glucosemolekül über die Gluconeogenese betragen sechs ATP-Äquivalente: Jeweils zwei bei den durch die Pyruvat-Carboxylase, PEPCK, bzw. durch die Phosphoglycerat-Kinase katalysierten Schritten. Da über den Abbau von einem Glucosemolekül zu zwei Molekülen Pyruvat in der Glykolyse zwei ATP gewonnen werden (Abschnitt 15.1), belaufen sich die Energiekosten für den gesamten Cyclus, in dem Glucose zu Pyruvat umgewandelt und anschließend erneut synthetisiert wird, auf vier Äquivalente ATP. Solche Verluste an Freier Enthalpie sind der thermodynamische Preis für die unabhängige Regulation zweier Stoffwechselwege. Glucose wird zwar als Endpunkt des Gluconeogenesewegs angesehen, Zwischenprodukte des Stoffwechselwegs können jedoch auch für andere Zwecke abgezweigt werden, z.B. über die Transketolase- und Transaldolasereaktionen des Pentosephosphatwegs (Abschnitt 15.6C), aus denen Ribose-5-phosphat hervorgeht. Das G6P, das in der Gluconeogenese gebildet wird, muss nicht zwangsläufig die Hydrolyse zu Glucose eingehen, sondern kann stattdessen auch in G1P umgewandelt und in Glykogen eingebaut werden.

C.

Regulation der Gluconeogenese

Die gegenläufigen Stoffwechselwege der Gluconeogenese und der Glykolyse sowie der Synthese und des Abbaus von Glykogen laufen in vivo nicht gleichzeitig ab. Sie werden wechselseitig so reguliert, dass sie den Bedürfnissen des Organismus angepasst sind. Es stehen drei Substratcyclen und damit drei potentielle Regulationspunkte für den Fluss in Richtung Glykolyse bzw. Gluconeogenese zur Verfügung (Abb. 16.21).

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-5.1

-32.9

Hexokinase

Phosphatase

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PyruvatCarboxylase| + PEPCK

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|

) PFK

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|

Pyruvat-Kinase

za

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Abb. 16.21 Substratcyclen im Glucosestoffwechsel. Die gegenseitige Umwandlung von Glucose und G6P, von F6P und FBP sowie von PEP und Pyruvat wird durch unterschiedliche Enzyme für die Hinbzw. Rückreaktion katalysiert, wodurch alle Reaktionen exergon ablaufen (die AG-Werte für die Reaktionen in der Leber sind in kJ: mol” angegeben). [AG-Werte nach Newsholme, E.A. und Leech, A.R., Biochemistry for the Medical Sciences,

S. 448, Wiley (1983).

604

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese ATP

Leber-PFK-2

ADP

(Dephosphoenzym)

H HO SD H HO

H

HO

ß-D-Fructose-6-phosphat (F6P) Abb. 16.22 Bildung und Abbau von ß-o-Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P). Die enzymatischen Aktivitäten der Phosphofructokinase-2 (PFK-2) und der Fructose-Bisphosphatase-2 (FBPase-2) sind in verschiedenen Domänen desselben Proteinmoleküls lokalisiert. Die Dephosphonylierung des Leberenzyms aktiviert PFK-2, während

FBPase-2 inaktiviert wird.

H HO

B-D-Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P)

5 P;

Leber-FBPase-2 (Phosphoenzym)

CH,0H

H

H;O

Fructose-2,6-bisphosphat aktiviert die Phosphofructokinase und hemmt die Fructose1,6-Bisphosphatase

Der Nettofluss durch den Substratcyclus, der durch die gegenläufigen Katalysen von PFK und FPBase entsteht (beschrieben in Abschnitt 15.4B), wird von der Konzentration an verfügbarem Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P) bestimmt.

20,P—-OH,C

a

0,

H

0-—POF |

CH,OH HOZZH:

ß-D-Fructose-2,6-bisphosphat

(F2,6P)

Niedriger Blutglucosespiegel Y

Gesteigerte Glucagonausschüttung

B [cCAMP}Erhöhung uf

Gesteigerte Enzymphosphorylierung

Y Aktivierung von FBPase-2 und Inaktivierung von PFK-2 Y

[F2,6P}-Absenkung

Y Hemmung von PFK und Aktivierung von FBPase Y Gesteigerte Gluconeogenese

Abb. 16.23 Abfolge der Stoffwechselvorgänge in der Leber, die bei einem niedrigen Blutglucosespiegel die Gluconeogenese steigern.

F2,6P, das nicht als Zwischenprodukt der Glykolyse auftritt, ist ein außerordentlich wirksamer allosterischer Aktivator der PFK und ein Inhibitor der FBPase. Die Konzentration an F2,6P in den Zellen hängt von der Balance zwischen der Geschwindigkeit seiner Synthese und der seines Abbaus durch die Phosphofructokinase-2 (PFK-2) bzw. durch die Fructose-Bisphosphatase-2 (FBPase-2) ab (Abb. 16.22). Diese Enzymaktivitäten sind auf verschiedenen Domänen desselben, rund 100 kD großen, homodimeren Proteins lokalisiert. Das bifunktionelle Enzym wird durch eine Vielzahl an allosterischen Effektoren und über die Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch PKA und einer PhosphoproteinPhosphatase reguliert. Somit steht das Gleichgewicht zwischen Glykolyse und Gluconeogenese unter hormoneller Kontrolle. Ist z.B. [Glucose] niedrig, regt Glucagon die Bildung von cAMP in den Leberzellen an. Das wiederum aktiviert PKA, die ihrerseits PFK-2 und FBPase-2 phosphoryliert und dadurch aktiviert. Die F2,6P-Konzentration nimmt infolgedessen ab, was das Gleichgewicht zwischen der PFK- und der FBPase-Reaktion zugunsten der FBP-Synthese verschiebt und somit den Fluss in der Gluconeogenese erhöht (Abb. 16.23). Die gleichzeitig auftretende Zunahme der Gluconeogenese und des Glykogenabbaus ermöglicht es der Leber, Glucose in den Blutkreislauf abzugeben. Ist umgekehrt [Glucose] hoch, fällt der CAMP-Spiegel ab und der resultierende Anstieg von [F2,6P] fördert die Glykolyse. Im Muskel, in dem keine Gluconeogenese abläuft, arbeitet das F2,6P-Kontrollsystem auf Grund unterschiedlicher Isoenzyme der PFK-2 und FBPase-2 anders als in der Leber. Hormone, die den Glykogenabbau im Herzmuskel arıregen, führen zur Phosphorylierung an einer Stelle im bifunktionellen Enzym, die PFK-2 aktiviert anstatt hemmt. Der resultierende Anstieg von F2,6P lässt durch entsprechend gesteigerte Glykolyse den Glykogenabbau und die Glykolyse koordiniert ablaufen. Dem im Skelettmuskel vorkommenden Isoenzym fehlt dagegen eine Phosphorylierungsstelle. Es unterliegt damit nicht einer cCAMP-abhängigen Kontrolle.

Andere Biosynthesewege für Kohlenhydrate Andere allosterische Effektoren beeinflussen den Fluss durch die Gluconeogenese

Acetyl-CoA aktiviert zwar die Pyruvat-Carboxylase (Abschnitt 16.4A), für PEPCK, die gemeinsam mit der Pyruvat-Carboxylase die Pyruvat-Kinasereaktion umkehrt, gibt es jedoch keine bekannten allosterischen Effektoren. Die Pyruvat-Kinase wird dagegen in der Leber allosterisch durch Alanin, einer wichtigen Vorstufe der Gluconeogenese, gehemmt. Alanin wird durch die Übertragung seiner Aminogruppe auf eine a-Ketosäure in Pyruvat umgewandelt, wodurch eine neue Aminosäure und die a-Ketosäure Pyruvat entstehen. a-Keto- Amino-

‘ Be NH;

säure

säure

ee

IC

Alanin

\—C002

Pyruvat

Dieser Vorgang wird als Transaminierung (die in Abschnitt 21.2A erörtert wird) bezeichnet. Die Pyruvat-Kinase der Leber wird ebenfalls durch Phosphorylierung inaktiviert, was den Fluss durch die Gluconeogenese ansteigen lässt. Da Phosphorylierung gleichzeitig auch die Glykogen-Phosphorylase aktiviert, werden beide Stoffwechselwege, die Gluconeogenese und die Glykolyse, in Richtung von G6P gelenkt, das in Glucose umgewandelt und aus der Leber exportiert werden kann. Auch die Aktivität der Hexokinase (bzw. der Glucokinase, dem Leber-Isoenzym) wird, wie wir in Abschnitt 22.1D sehen werden, kontrolliert. Die Aktivität der Glucose-6-Phosphatase hängt dagegen nur von der Konzentration an verfügbarem Substrat ab und ist daher kein wichtiger Regulationspunkt. Langfristige Regulation des Glucosestoffwechsels geschieht nicht nur über allosterische Effektoren, sondern auch durch wechselnde Mengen an synthetisierten Enzymen. Pankreatische Hormone und solche der Nebennieren beeinflussen die Geschwindigkeit der Transkription und die Stabilität vieler mRNAs, die regulatorische Proteine des Glucosestoffwechsels kodieren. So fördern geringe Konzentrationen an Insulin oder hohe Konzentrationen an intrazellulärem cAMP die Transkription der Gene für PEPCK, FBPase sowie Glucose-6-Phosphatase und unterdrücken die Transkription der Gene für Glucokinase, PFK und für das bifunktionelle Enzym mit PFK-2/FBPase-2-Aktivität.

5

Andere Biosynthesewege für Kohlenhydrate

Die Leber ist auf Grund ihrer Masse und ihrer Stoffwechselmaschinerie das wichtigste Organ zur Aufrechterhaltung eines konstanten Blutglucosespiegels. Die über die Gluconeogenese erhaltene oder durch den Glykogenabbau freigesetzte Glucose wird von der Leber anderen Geweben als Energiequelle zur Verfügung gestellt. Glucose nimmt natürlich noch weitere Aufgaben in der Leber oder anderen Geweben wahr, z. B bei der Synthese von Lactose (siehe Exkurs

16.4). Nucleotidzucker ermöglichen die Bildung glykosidischer Bindungen Glucose und andere Monosaccharide

(wie Mannose,

N-Acetyl-Glucosamin,

Fu-

cose, Galactose, N-Acetylneuraminsäure und N-Acetyl-Galactosamin) kommen in Glykoproteinen und Glykolipiden vor. Die Bildung glykosidischer Bindungen, die Zucker untereinander und mit anderen Molekülen verknüpfen, erfordert unter physiologischen Bedingungen die Zufuhr von Freier Enthalpie (AG° = +16 kJ - mol"). Diese Freie Enthalpie wird, wie wir bei der Glykogensynthese gesehen haben (Abschnitt 16.2A), durch die Spaltung der Phosphatesterbindung eines Nucleotidzuckers gewonnen. Dabei wird PP; frei, dessen exergone Hydro-

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Beschreiben Sie die Reaktionen der Glucöoneogenese. 2. Warum ist das Malat-AspartatTransportsystem für die Gluconeogenese wichtig? 3. Beschreiben Sie die Rolle des Fructose-2,6-bisphosphats in der Regulation der Gluconeogenese.

605

606

Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

Lactosesynthese Verschiedene Disaccharide, wie die Lactose oder die Saccharose in Pflanzen, werden synthetisiert, um später dem Stoff-

wechsel als Energiequellen zu dienen. Lactose wird dabei besonders von jungen Säugetieren genutzt, die sie mit der Muttermilch aufnehmen.

Lactose oder Milchzucker wird in

den Milchdrüsen von der Lactose-Synthase gebildet. Bei die-

Beide Zuckereinheiten der Lactose leiten sich somit von Glucose ab. Lactose-Synthase besteht aus zwei Untereinheiten: die katalytische Untereinheit, 1. Galactosyltransferase, kommt in.vielen Geweben vor, wo sie die Reaktion zwischen UDP-Galactose und N-Acetyl-Glucosamin zu N-Acetyl-Lactosamin,

ser Reaktion ist UDP-Galactose der Donatorzucker, der durch Epimerisierung aus UDP-Glucose entsteht (Abb. 15.28). Der

Akzeptorzucker ist Glucose:

En

CH,OH

HO H

CH,OH Ki, H

OH

N OHzEH H

ee GHZ

O—UDP

oN—

OH

H

UDP-Galactose

HA

H

=

H/ o

OH S / OH OH

es N H

OH

H

9 H

yo

A

OH

H

H

OH

H

H

OH NHCCH;

|

[6]

einem Bestandteil vieler komplexer Oligosaccharide, kataIysiert.

2. a-Lactalbumin, ein Milchdrüsenprotein ohne katalytische Aktivität, verändert die Spezifität von Galactosyltransferase so, dass sie Glucose anstelle von N-Acetyl-Glucosamin als Akzeptor verwenden kann und Lactose statt NAcetyl-Lactosamin bildet. Die Synthese von a-Lactalbumin, dessen Sequenz zu rund 37% ähnlich der des Lysozyms ist (das ebenfalls an Reaktionen mit Zuckern beteiligt ist), wird durch hormonelle Veränderungen während der Geburt ausgelöst und fördert dabei die Lactosesynthese für die Milchproduktion.

CH,0OH % H

R

OH

N-Acetyl-Lactosamin

Glucose

CH,OH

H

on

OH

Taciose Syntlinse

HO

CH,OH

+ UDP

Lactose

[ß-Galactosyl-1—>4)-Glucose]

lyse die Reaktionen antreibt. Das Nucleosiddiphosphat am anomeren Kohlenstoffatom eines Zuckers ist eine gute Abgangsgruppe und erleichtert dadurch die Bildung einer glykosidischen Bindung an einen weiteren Zucker. Die Knüpfung dieser Bindung wird von einer Glykosyltransferase katalysiert (Abb. 16.24). In Säugetieren werden die meisten Glykosylgruppen in Form von UDP-Zuckern übertragen; allerdings sind Fucose und Mannose an GDP und Sialinsäure an CMP gekoppelt. In Pflanzen wird Stärke aus Glucoseeinheiten aufgebaut, die von ADP-Glucose stammen; die Synthese von Cellulose erfolgt über ADP-Glucose oder CDP-Glucose.

OH

%£

Y

N

7

B

1

emo

0

H H

OH ku,

N ——-

DonatorAucker

I

Be

Glykosyl-

transferase

Akzeptor-

a

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H

H

Zucker

OH

0:

z

O8

»

N

Bo ıphosphat

Y4 H

Oligosaccharid E|

Nucleosiddiphosphat Nucleotid-Zucker

Abb. 16.24

Rolle der Nucleotidzucker.

Diese Verbindungen sind die Glykosyldonatoren in der Oligosaccharidbiosynthese, die von Glykosyltransferasen katalysiert wird.

Andere Biosynthesewege für Kohlenhydrate O-verknüpfte Oligosaccharide werden posttranslational gebildet

Nucleotidzucker sind die Donatormoleküle bei der Synthese von O-verknüpften Oligosacchariden und bei der Prozessierung N-verknüpfter Oligosaccharide der Glykoproteine (Abschnitt 8.3C). O-verknüpfte Oligosaccharide werden im GolgiApparat über mehrfaches Anfügen von Monosaccharideinheiten an eine bestehende Polypeptidkette gebildet (Abb. 16.25). Die Synthese beginnt mit der Übertragung von N-Acetyl-Galactosamin (GalNAc) von UDP-GalNAc auf einen Seroder Thr-Rest im Polypeptid. Dieser Vorgang wird von der GalNAc-Transferase katalysiert. Man nimmt an, dass die Glykosylierungsstellen des Polypeptids von dessen Sekundär- oder Tertiärstruktur bestimmt werden. Die Glykosylierung wird durch ein schrittweises Anheften von Galactose, Sialinsäure, N-Acetyl-Glucosamin und Fucose durch die entsprechenden Glykosyltransferasen fortgesetzt.

S Ser

GalNAcTransferase

H-

ie|

CH, CH, -C=CH-

CH TUN

Isopreneinheit

Dolichol

je

ertil

OR CH, = CH, ) un | Oz Gesättigte a-Isopreneinheit =)

CH

0 —P— | (Or

O0—

— UDP— GalNAc UDP

Ser“ GalNAc

S

eUDP— Gal

N-verknüpfte Oligosaccharide werden an Dolichol-Trägern synthetisiert Die Synthese von N-verknüpften Oligosacchariden ist komplizierter als die der O-verknüpften Oligosaccharide. Zu Beginn der Synthese von N-verknüpften Oligosacchariden werden Zuckerreste nacheinander an einen Lipidträger, das Doli-

cholpyrophosphat, angefügt (Abb. 16.26). Dolichol ist ein langkettiges Polyisoprenol aus 17 bis 21 Isopreneinheiten bei Tieren und 14 bis 24 Einheiten bei Pilzen und Pflanzen. Es verankert das wachsende Oligosaccharid in der Membran des endoplasmatischen Reticulums, wo die ersten Glykosylierungsreaktionen stattfinden. Obwohl Nucleotidzucker die häufigsten Monosacchariddonatoren in der Glykosyltransferasereaktion sind, werden einige Mannose- und Glucosegruppen von den entsprechenden Dolichol-P-Derivaten auf die wachsenden DolicholPP-Oligosaccharide übertragen. Dolicholphosphat ist, wie auch ein Nucleosiddiphosphat, dazu in der Lage, einen Zuckerrest für die anschließende Übertragung zu „aktivieren“. Der Aufbau eines N-verknüpften Oligosaccharids beginnt, wie in Abschnitt 8.3C beschrieben, mit der Synthese eines aus (N-Acetyl-Glucosamin),(Mannose).(Glucose); aufgebauten Oligosaccharids. Dies erfolgt an einem Dolicholträger in einem 12-stufigen Prozess, der von einer Reihe spezifischer Glykosyltransferasen katalysiert wird (Abb. 16.27). Dabei ist zu beachten, dass einige dieser Reaktionen auf der luminalen Seite des endoplasmatischen Reticulums stattfinden, während andere auf der cytosolischen Seite ablaufen. Insgesamt viermal (Reaktionen 3, 5, 8 und 11 in Abb. 16.27) erfolgt durch Vermittlung von Flippasen eine Translokation von Dolichol und seiner hydrophilen Gruppe über die Membran des endoplasmatischen Reticulums. In den abschließenden Schritten dieses Prozesses wird das Oligosaccharid auf den Asn-Rest eines Sequenzabschnitts Asn-X-Ser/Thr in der wachsenden Polypeptidkette übertragen (wobei X ein beliebiger Rest außer Pro und, vermutlich, Asp sein kann). Das resultierende Dolicholpyrophosphat wird zu Dolicholphosphat und P, hydrolysiert, ein Vorgang, der ähnlich der Pyrophosphatasespaltung (PP; in 2 P;) abläuft. Die Prozessierung des Oligosaccharids findet zunächst im endoplasmatischen Reticulum und anschließend im Golgi-Apparat statt (Abb. 8.19), wo bestimmte Monosaccharidreste durch spezifische Glykosylasen abgespalten und dafür andere Reste mittels spezifischer Glykosyltransferasen, die Nucleotidzucker benötigen, angefügt werden.

607

q Ser— GalNAc =

Gal

Ser — GalNAc——-Gal a 2,6

SA

Ser — oc

— Gal Sr Fuc

SA

Abb. 16.25 Synthese einer O-verknüpften Oligosaccharidkette. Hypothetischer Syntheseweg eines Kohlenhydratanteils in Mucin. SA entspricht Sialinsäure.

Kohlenhydrat Abb. 16.26 Dolicholpyrophosphat-Glykosid. Die Kohlenhydratvorstufen von N-verknüpften Glykosiden werden als an Dolichol geknüpfte Oligosaccharide synthetisiert; Dolichol ist ein langkettiges Polyisoprenol (n = 14-25) mit einer gesättigten a-Isopreneinheit.

608

_Giykogenstoffwechsel und Gluconeogenese 3UDP

3 UDP—®

wachsende Polypeptidkette Ribosom

mRNA

4GDPY 4

Membran des endoplasmatischen Reticulums

4 GDP

12

p;

Cytosol

% - Glucose

®- N-Acetyl-Glucosamin

W - Mannose

WWV-P

= Dolichol-phosphat

Abb. 16.27 Der Stoffwechselweg der Dolichol-PP-Oligosaccharidsynthese. (1) Verknüpfung eines N-Acetyl-Glucosamin-1-P und eines weiteren N-Acetyl-Glucosamins an Dolichol-P. (2) Bindung von fünf, von GDP-Mannose stammenden Mannoseresten in Reaktionen, die von fünf verschiedenen Mannosyltransferasen katalysiert werden. (3) Membrantranslokation von Dolichol-PP-(N-Acetyl-Glucosamin),(Mannose), zur Lumenseite des endoplasmatischen Reticulums (ER) durch Flippasen. (4) Synthese von Dolichol-P-Mannose aus GDPMannose und Dolichol-P im Cytosol. (5) Membrantranslokation von Dolichol-P-Mannose ins Lumen des ER. (6) Addition von vier Mannoseresten von Dolichol-P-Mannose in Reaktionen, die von vier verschiedenen Mannosyltransferasen katalysiert werden. (7) Cytosolische Synthese von Dolichol-P-Glucose aus UDPG und Dolichol-P. (8) Membrantranslokation von Dolichol-PGlucose ins Lumen des ER. (9) Bindung von drei Glucoseresten aus Dolichol-P-Glucose. (10) Übertragung des Oligosaccharids von Dolichol-PP auf einen Asn-Rest in der Sequenz Asn-X-Ser/Thr der Polypeptidkette unter Freisetzung von Dolichol-PP. (11) Translokation von Dolichol-PP auf die cytoplasmatische Seite der ER-Membran. (12) Hydrolyse von Dolichol-PP zu Dolichol-P. (13) Dolichol-P kann auch durch Phosphorylierung von Dolichol durch CTP erhalten werden. [Nach Abeijon, C. und Hirschberg, C.B., Trends Biochem. Sci. 17, 34 (1992).]

6% siehe Animated Figures.

Zusammenfassung

609

ot H3C

„CH, ENcu

H3N — ne

N ZENES

I

CH— C —Leu—D-Glu—Ile—Lys—D-Orn

— His —D-Asp —Asn— C=O

(CHa)a

S—-CHa Ile

— Ile —p-Phe

Cys

I Bacitracin

Bacitracin greift in die Dephosphorylierung von Dolicholpyrophosphat ein Einige Verbindungen blockieren die spezifischen Glykosylierungsenzyme. Dazu

zählt auch Bacitracin (Abb. 16.28), ein cyclisches Polypeptid und ein häufig eingesetztes Antibiotikum. Bacitracin bildet mit Dolicholpyrophosphat einen Komplex, der die Dephosphorylierung verhindert (Abb. 16.27, Reaktion 12). Die Synthese von Glykoproteinen aus dolicholgekoppelten Oligosaccharidvorstufen ist somit nicht mehr möglich. Bacitracin findet klinische Anwendung wegen seiner Fähigkeit, die Zellwandbiosynthese von Bakterien (an der ebenfalls dolicholgekoppelte Oligosaccharide beteiligt sind) zu hemmen. Tierische Zellen werden von Bacitracin nicht angegriffen, da es die Zellmembranen nicht überwinden kann.

Zusammenfassung 1. Der Glykogenabbau benötigt drei Enzyme: Die Glykogen-Phosphorylase wandelt die Glykosyleinheiten an nicht reduzierenden Enden des Glykogens in Glucose-1-phosphat (G1P) um. Das Entzweigungsenzym (engl.: debranching enzyme) überträgt ein a(1—4)-verknüpftes Trisaccharid auf ein nicht reduzierendes Ende und hydrolysiert die a(1—6)-Verknüpfung. Phosphoglucomutase wandelt G1P in Glucose-6-phosphat (G6P) um. In der Leber wird G6P durch die Glucose-6-Phosphatase für den Transport zu den Geweben in Glucose überführt. 2. Die Glykogensynthese erfordert einen Stoffwechselweg, der sich von dem des Glykogenabbaus unterscheidet. G1P wird durch UTP unter Bildung von UDP-Glucose aktiviert. Die Glykogen-Synthase addiert Glykosyleinheiten an die nicht reduzierenden Enden des von einem Glykogeninnucleus ausgehenden Glykogenmoleküls. Das Verzweigungsenzym (engl.: branching enzyme) spaltet ein a(1—4)-verknüpftes, sieben Reste langes Segment zunächst ab und fügt es an anderer Stelle über eine a(1—6)-Verknüpfung an, wodurch eine Kettenverzweigung entsteht. 3.

Der Glykogenstoffwechsel wird teilweise durch allosterische Effektoren,

wie AMP, ATP und G6P, kontrolliert. Die kovalente Modifikation durch Phosphorylierung verschiebt das T=R-Gleichgewicht der Glykogen-Phosphorylase sowie der Glykogen-Synthase und verändert dadurch deren Empfindlichkeit gegenüber allosterischen Effektoren. 4. Das Verhältnis zwischen Phosphorylase a (aktiver) und Phosphorylase b (weniger aktiv) hängt zum einen von der Aktivität der Phosphorylase-Kinase ab, die wiederum einer Kontrolle durch die Aktivität derProteinkinase (PKA) unterliegt, zum anderen übt die Aktivität der Phosphoprotein-Phosphatase 1 (PP1) einen Einfluss auf dieses Verhältnis aus. Die Glykogen-Phosphorylase wird durch Phosphorylierung aktiviert, wohingegen die Glykogen-Synthase durch Dephosphorylierung in den aktiven Zustand versetzt wird. 5. Hormone, wie Glucagon, Adrenalin und Insulin, steuern den Glykogenstoffwechsel. Hormonsignale, die entweder zur Bildung des sekundären Botenstoffs cCAMP oder zur Anhebung der intrazellulären Ca”'-Konzentra-

Abb. 16.28 Chemische Struktur von Bacitracin. Es ist zu beachten, dass dieses Dodecapeptid vier D-Aminosäurereste und zwei ungewöhnliche Ringschlüsse innerhalb der Kette aufweist. „Orn“

entspricht der ungewöhnlichen Aminosäure

Ornithin (Abb. 21.9).

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 1. Erklären Sie die Gruppenübertragungsreaktion bei der Bildung von glykosidischen Bindungen, indem Sie das angreifende Nucleophil, das angegriffene Atom und die abgespaltene Gruppe benennen.

610

Glykogenstoffwechsel und Gluconeogenese

tion (Ca?* bindet an die Calmodulinuntereinheit der Phosphorylase-Kinase) führen, fördern den Glykogenabbau. Insulin stimuliert die Glykogensynthese z.TT. durch Aktivierung der Phosphoprotein-Phosphatase 1. 6. Verbindungen, die in Oxalacetat umgewandelt werden können, können anschließend in Glucose überführt werden. Die Umwandlung von Pyruvat in Glucose in der Gluconeogenese erfordert Enzyme, welche die drei exergonen Schritte der Glykolyse umgehen: Die Pyruvat-Carboxylase sowie die PEP-Carboxykinase (PEPCK) umgehen die Pyruvat-Kinase, die Fructose1,6-Bisphosphatase (FBPase) umgeht die Phosphofructokinase und Glucose6-Phosphatase ersetzt die Hexokinase. 7. Die Gluconeogenese wird durch Änderungen in der Enzymsynthese und durch allosterische Effektoren reguliert. Zu den allosterischen Effektoren zählt u.a. Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P), das die FBPase hemmt, die Phosphofructokinase (PFK) aktiviert und deren Synthese vom Phosphorylierungsgrad des bifunktionellen Enzyms Phosphofructokinase-2/FructoseBisphosphatase-2 (PFK-2/FBPase-2) abhängt. 8. Die Bildung glykosidischer Bindungen erfordert Nucleotidzucker.

Wichtige Begriffe Glykogenolyse Phosphorolyse Entzweigung

Glykogenspeicherkrankheit Nucleotidzucker konvertierbare Enzyme

Gluconeogenese Reduktionsäquivalent Dolichol

Aufgaben . Geben Sie die Energieausbeute oder die Energiekosten in Form von ATP-Äquivalenten für die folgenden Abläufe an: (a) Glykogen (3 Reste) > 6 Puyrvat (b) 3 Glucose > 6 Pyruvat (c) 6 Pyruvat > 3 Glucose > Schreiben Sie die Gesamtgleichungen für (a) die Umwandlung von Glucose in Pyruvat bzw. von Pyruvat in Glucose und (b) die Abbauvorgänge von sechs G6P-Molekülen über den Pentosephosphatweg bzw. die anschließende Umwandlung von Ribulose-5-phosphat zurück in G6P über die Gluconeogenese. Se Die Phosphoglucokinase katalysiert die Phosphorylierung der C6-OH-Gruppe von G1P. Warum ist dieses Enzym für die normale Funktionsfähigkeit der Phosphoglucomutase wichtig? r Die Freie Enthalpie der Hydrolyse einer a(1—4)-glykosidischen Bindung beträgt -15,5 kJ] - mol”', dagegen liegt die einer a(1—6)-glykosidischen Bindung bei -7,1 kJ - mol". Erklären Sie mit Hilfe dieser Daten, warum die Glykogenentzweigung drei Reaktionen beinhaltet (Spaltung und erneute Knüpfung von a(1—4)-Bindungen und die Hydrolyse von a(1—6)-Bindungen), während für die Glykogenverzweigung nur zwei Reaktionen erforderlich sind (Spaltung von a(1—4)-Bindungen und Bildung von a(1—6)-Bindungen). wa Berechnungen anhand des Volumens eines Glucoserests und der verzweigten Struktur von zellulärem Glykogen weisen darauf hin, dass ein Glykogenmolekül theoretisch N

bis zu 28 Verzweigungsebenen aufweisen könnte, bevor es zu dicht gepackt-ist. Welche Vorteile könnte solch ein Molekül haben und warum kommt es in vivo nicht vor? Ein Molekül mit der Nahrung aufgenommener Glucose kann durch den oxidativen Abbau in Glykolyse und Citratcyclus maximal 32 ATP erzeugen. Berechnen Sie den Anteil an der Gesamtenergie, der verloren geht, wenn die Glucose zuvor als Glykogen gespeichert wird. Glucose bindet an die Glykogen-Phosphorylase und hemmt kompetitiv das Enzym. Welchen physiologischen Vorteil hat das? Viele Diabetiker zeigen keine Reaktion auf Insulin (sog. Non-Responder) auf Grund eines Mangels an Insulinrezeptoren auf ihren Zellen. Wie beeinflusst das (a) den Blutglucosespiegel unmittelbar nach Einnahme einer Mahlzeit und (b) die Glykogensyntheserate im Muskel? Glucose-6-Phospatase ist innerhalb des Endoplasmatischen Reticulums lokalisiert. Beschreiben Sie die möglichen Symptome eines Defekts im G6P-Transport durch die Membran des Endoplasmatischen Reticulums. . Menschen mit McArdle-Krankheit bekommen häufig die „zweite Luft“, da auf Grund einer kardiovaskulären

Anpassung die aus Leberglykogen mobilisierte Glucose als Brennstoff für die Muskelkontraktion dienen kann. Erklären Sie, warum die Menge an ATP, die im Muskel aus im Blut zirkulierender Glucose gewonnen wird, geringer ist als die Menge an ATP, die erhalten wird, wenn dieselbe Menge an Glucose von Muskelglykogen stammen würde.

Literatur

11. Eine Glykogenprobe eines Patienten mit einer Lebererkrankung wird mit P;, normaler Glykogen-Phosphorylase und normalem Entzweigungsenzym inkubiert. Das Verhältnis von G1P zu Glucose, das sich bei dieser Reaktion einstellt, beträgt 100. Um welche Mangelerkrankung handelt es sich höchstwahrscheinlich bei diesem Patienten?

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611

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 22

Carrier-Mediated Uptake of Lactate in Rat Hepatocytes

The structural characteristics of the lactate transport protein in hepatocytes are determined. Case Study 26 The Role of specific Amino Acids in the Peptide Hormone Glucagon in Receptor Binding and Signal Transduction Amino acid side chains important in glucagon binding and signal transduction are identified.

Insights into its metabolic role, Biochem. Mol. Biol. Educ. 30, 14-20

(2002); und Croniger, C.M., Chakravarty, K., Olswang, Y., Cassuto, H., Reshef, L. und Hanson, R. W., Phosphoenolpyruvate carboxykinase revisited. II. Control of PEPCK-C gene expression. Biochem. Mol. Biol. Educ. 30, 353-362 (2002).

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Die Synthese und der Abbau zahlreicher biologischer Materialien hängt vom Molekül- und Energiefluss durch den Citratcyclus ab, der einem Wasserrad

des Stoffwechsels gleicht. [© Frank Weinreich/Wiley-VCH.]

Citratcyclus EEE

EEE

TEE

TEL ETLTNTEEEN SZENE

REF TTENLTEN|

Citratcyclus

Elektronisches Zusatzmaterial

© Überblick

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 16

e Synthese von Acetyl-Coenzym A © Die Enzyme des Citratcyclus

Interactive Exercise 18

Animated Figure Animated Figure Animated Figure Animated Figure Case Study 21 EEE

EEE

e Regulation des Citratcyclus e Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen

17-1 17-2 17-16 17-17 EEE

EEE ELETREEZITEEEET EEE ZIEL ELEISETZZERTEDESZORFEIITEN

In den vorangegangenen zwei Kapiteln wurde der Katabolismus sowie die Synthese, Speicherung und Mobilisierung von Glucose behandelt. Obwohl Glucose nahezu allen Zellen als Energiequelle dient, ist sie weder der einzige Brennstoff des Stoffwechsels noch ist die Glykolyse der einzige energieliefernde, katabole Stoffwechselweg. Zellen, die zur Deckung ihres Energiebedarfs ausschließlich auf die Glykolyse zurückgreifen, vergeuden den größten Teil der potentiell nutzbaren chemischen Energie von Kohlenhydraten. Beim Umsatz von Glucose zu Lactat oder Ethanol verlässt ein noch relativ stark reduziertes Produkt die Zelle. Diese kann erheblich mehr Energie gewinnen, wenn das Endprodukt der Glykolyse statt dessen noch weiter oxidiert wird. Die Oxidation einer organischen Verbindung erfordert einen Elektronenakzeptor, wie z.B. NO;, SO%, Fe’* oder O,, die alle durch verschiedene Organismen als Oxidationsmittel genutzt werden. In aeroben Organismen werden die Elektronen, die durch oxidativen

Stoffwechsel

Glycolyse

rat]

| Ve

freigesetzt werden, letztendlich auf

O, übertragen. Die Oxidation der zellulären Brennstoffe wird im Citratcyclus durchgeführt. Dieser Begriff beschreibt eine Abfolge von Reaktionen, die sich vor ungefähr 3 Milliarden Jahren nach einem signifikanten Anstieg des Sauerstoffgehalts in der Atmosphäre herausbildeten. Bei der Oxidation der reduzierten Kohlenstoffatome

zellulärer

Brennstoffe

zu CO, werden

Elektronen

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt © 2010 WILEY-VCH

Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

Citrateyclus

auf

Elektronentransportkomponenten übertragen, die anschließend durch O, oxidiert werden. In diesem Kapitel sollen nur die Oxidationsreaktionen des Citratcyclus selbst betrachtet werden. Das weitere Schicksal der Elektronen und wie ihre Energie verwendet wird, um ATP-Synthese zu betreiben, wird im nachfolgenden Kapitel untersucht. Auf den ersten Blick ist es sinnvoll, den Citratcyclus als einen Anhang zur Glykolyse zu betrachten. Aus Glucose gebildetes Pyruvat kann in CO, und ein C;Fragment gespalten werden, das zur Oxidation als Acetyl-CoA in den Cyclus eintritt (Abb. 17.1). Es wäre jedoch zu kurz gedacht, den Citratcyclus bloß als eine Fortsetzung des Kohlenhydratabbaus anzusehen. Der Citratcyclus ist ein zentraler Stoffwechselweg zur Energiegewinnung aus verschiedenen zellulären Brennstofjen, die

Copvrieht

ann

Abb. 17.1

Übersicht zum oxidativen Stoffwechsel

zellulärer Brennstoffe. Aus Kohlenhydraten, Aminosäuren

und Fettsäuren

gebildete Acetylgruppen treten in den Citratcyclus ein, wo sie zu CO, oxidiert werden. 6%, siehe

Animated Figures.

614

Citratcyclus

Kohlenhydrate, Fettsäuren und Aminosäuren umfassen und alle für eine Oxidation bis zum Acetyl-CoA abgebaut werden. Unter bestimmten Bedingungen hat der Citratcyclus vorwiegend die Aufgabe, Energie aus Fettsäuren zu gewinnen. Wir werden sehen, dass der Citratcyclus auch die Ausgangsstoffe für eine Reihe von Biosynthesewegen bereitstellt. Dieses Kapitel beginnt mit einer Übersicht zum Citratcyclus. Als Nächstes wird herausgearbeitet, wie sein Ausgangssubstrat, das Acetyl-CoA, aus Pyruvat gebildet wird. Nachdem für jedes Enzym des Citratcyclus die katalysierten Reaktionen besprochen worden sind, wird die Regulation dieser Enzyme betrachtet. Der Zusammenhang zwischen den Intermediaten des Citratcyclus und anderen Stoffwechselprozessen wird am Ende des Kapitels in Augenschein genommen.

1 2 siehe Guided Exploration 16:

Citric Acid Cycle Overview.

Überblick

Der Citratcyclus (Abb. 17.2) ist eine aufeinander abgestimme Folge von acht Reaktionen, durch welche die Acetylgruppe von Acetyl-CoA in einer solchen Weise zu zwei Molekülen CO, oxidiert wird, dass die freigesetzte Freie Enthalpie in den reduzierten Verbindungen NADH und FADH, konserviert wird. Der Cyclus ist nach dem Produkt der ersten Reaktion, dem Citrat benannt worden. Eine vollständige Runde des Cyclus ergibt zwei Moleküle CO,, drei NADH, ein FADH, und ein Molekül einer „energiereichen Verbindung“ (GTP oder ATP). Die Existenz des Citratcyclus hat sich erst in den 1930er Jahren herausgestellt, als Hans Krebs ein kreisförmiges Reaktionsschema für die Umwandlung von bestimmten Verbindungen postulierte, die zwei oder drei Carbonsäuregruppen enthielten (d.h. Di- oder Tricarboxylate). Zu dieser Zeit waren viele der Intermediate des Citratcyclus aus Pflanzen bereits gut bekannt: Citrat aus Zitrusfrüchten, Aconitat aus Eisenhut (Aconitum), Succinat aus Bernstein (Succinum), Fumarat aus dem Kraut Fumaria und Malat aus Äpfeln (Malus). Zwei andere Intermediate, a-Ketoglutarat und Oxalacetat sind mit ihren chemischen Namen bezeichnet, da sie chemisch synthetisiert wurden, bevor sie in lebenden Organismen gefunden wurden. Krebs war der Erste, der zeigte, wie der Stoffwechsel dieser Verbindungen an die Oxidation von metabolischen Energieträgern gekoppelt ist. Seine Entdeckung des Citatcyclus im Jahr 1937 gilt als eine der wichtigsten Errungenschaften der Stoffwechselchemie (Exkurs 17.1). Obwohl die Enzyme und Intermediate des Citratcyclus heute eindeutig aufgeklärt sind, sind viele Forscher auch weiterhin damit beschäftigt, die molekularen Mechanismen dieser Enzyme aufzuklären und herauszufinden, wie durch Regulation der Enzyme auch unter wechselnden Stoffwechselbedingungen und in unterschiedlichen Organismen eine optimale Arbeitsweise gewährleistet ist. Bevor die Reaktionen im Detail betrachtet werden, sollen einige generelle Merkmale des Citratcyclus hervorgehoben werden: 1. Der auch Krebs-Cyclus oder Tricarbonsäurecyclus (engl.: tricarboxylic acid cycle, TCA cycle) genannte, Stoffwechselkreislauf oxidiert Acetylgruppen, die aus vielerlei Quellen und nicht nur aus Pyruvat stammen. Weil er den Hauptpart bei der Oxidation sowohl der Kohlenhydrate, Fettsäuren als auch Aminosäuren übernimmt, wird der Citratcyclus auch oft als die Drehscheibe des zellulären Stoffwechsels angesehen. 2. Die Nettoreaktion des Citratcyclus ist 3 NAD*

+ FAD + GDP + P; + Acetyl-CoA —

3NADH

+ FADH;

+ GTP + CoA + 2 CO,

Das im ersten Schritt des Citratcyclus verbrauchte Oxalacetat wird im letzten Schritt des Cyclus regeneriert. Damit wirkt der Citratcyclus wie ein Katalysator,

der in der Lage ist, in mehreren Stufen eine unbegrenzte Anzahl von Acetylgruppen zu oxidieren.

Überblick

|; ri CH,0 77000

CoASH + NAD* Pyruvat-Dehydrogenase CO, + NADH oO II+ Sn

on

.

TOR

verteilt v2 +), FAD, der Cofaktor in Reaktion 6,

— N x

+ coo _

Cora

l

CH,

|

HOCH

1. Citrat-

20

Synthase ba

Kasal-ı"

Dr coo-

e

*C00

e

Citrat

8. MalatDehydrogenase

CHR

6% siehe Animated Figures.

On,

+

na

ist kovalent an die Succinat-Dehydrogenase gebunden und ist daher als E-FAD bezeichnet.

GHz

Oxalacetat

ers

Abb. 17.2 Die Reaktionen des Citratcyclus. Die Reaktanten und Produkte dieses katalytischen Cyclus sind umrandet. Die Reaktion Pyruvat > Acetyl-CoA (oben) versorgt den Cyclus mit Substrat aus dem Kohlenhydratstoffwechsel, ist aber nicht als Teil des Cyclus anzusehen. Ein isotopenmarkiertes C4 von Oza resiaı WW) wird zu Cl von a-Ketoglutarat und in der Reaktion 4 als CO, freigesetzt. Ein isotopenmarkiertes C] von AcetylCoA (f) wird C5 von a-Ketoglutarat und erscheint nach Reaktion 5 auf Cl und C4 von Succinat

H,O

Bw

: 2. Aconit Ari

!CcoO

Ya 30007

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let

2 | Elicoo-

L-Malat 1

HOz 'w H 7. Fumarase

”"c00

6 2

Isocitrat

Citratcyclus

NAD Dehydrogenase

ii

N

Fumarat

+

3. Isocitrat-

Yoto 00-

Y2+C007

6. Suceinat[E-FADR,]

tc00”

Dehydrogenase

ie 2

4. a-Ketoglutarat-

“

Dehydrogenase

Yotcoo” | CH, |

5. Succinyl-CoASynthetase

©

2

ASH

CoASH

CH; |

615

- oO *

NAD*

Y2*C00” Succinat

[napH] E

GTP GDP + BP;| Suceinyl-CoA

VER,

*c00 a-Ketoglutarat

Nabe

616

Citratcyclus

Hans Krebs (1900-1981)

Hans Krebs arbeitete von 1926 bis 1930 in Otto Warburgs Labor und erklärte später, dass er von Warburg mehr gelernt habe als von jedem anderen Lehrer (siehe Exkurs 15.1). Krebs setzte Warburgs Gewebeschnitttechnik zur Untersuchung von Biosynthesereaktionen ein (Warburg selbst war in erster Linie an Oxidations- und Abbaureaktionen interessiert). Über Jahre untersuchte Krebs Synthesewege für Harnstoff, Harnsäure und Purine sowie Oxidationsstoffwechselwege. Im Jahre 1933 war er gezwungen seine Heimat Deutschland zu verlassen und ging nach England, konnte aber im Gegensatz zu anderen emigrierten deutschen Wissenschaftlern einen großen Teil seiner Laborgeräte mitnehmen. In England setze Krebs seine Arbeit an einer Reihe von Stoffwechselreaktionen fort und nannte diese Citratcyclus. Den Cyclus entdeckte er nicht durch eine plötzliche Eingebung, sondern durch eine Reihe sorgfältiger Experimente zwischen 1932 und 1937. Krebs war an der „Verbrennungs“-

Phase

der

Brennstoffnutzung

interessiert,

insbesondere

daran, was sich nach der Fermentation von Glucose zu Lactat

abspielt. Bis in die 1930er Jahre war der Mechanismus der Glucoseoxidation und dessen Beziehung zur Zellatmung (Sauerstoffaufnahme) ein Rätsel. Krebs war klar, dass die Stöchiometrie des Gesamtvorgangs (Glucose + 6 O, — 6 CO, + 6 H,O) einen mehrstufigen Stoffwechselweg benötigte. Er wusste auch, dass andere Forscher die Fähigkeit des Muskelgewebes

untersucht

hatten, rasch verschiedene

Dicarboxylate (a-Ketoglutarat, Succinat und Malat) und ein Tricarboxylat (Citrat) zu oxidieren, aber keine dieser Substanzen hatte eine klare Beziehung zu irgendeinem Grundnahrungsmittel. 1935 stellte Albert Szent-Györgyi fest, dass die Zellatmung durch

kleine

Mengen

von

Succinat,

Fumarat,

Malat

oder

Oxalacetat enorm beschleunigt wird. Eine gesteigerte O,-Aufnahme und CO,-Bildung zeigte sich im Experiment, wenn man diese Verbindungen zusetzte. Die O,-Aufnahme jedoch überstieg bei Weitem das, was man für die Oxidation der Stoffe erwartet hätte. Mit anderen Worten: Die Verbindungen kurbelten quasi katalytisch die Verbrennung anderer Verbindungen in der Zelle an. Etwa zur gleichen Zeit zeigten Carl

nat > Fumarat > Malat — Oxalacetat. Damit jedoch diese Reaktionsfolge katalytisch arbeitet, muss sie immer wieder an ihren Ausgangspunkt zurückkehren, d.h. die erste Verbindung muss regeneriert werden. Aber eine klare und einleuchtende Beziehung zum Glucosestoffwechsel fehlte immer noch! Krebs glaubte, dass Citrat und die anderen Zwischenprodukte an der Glucoseverbrennung beteiligt sind, denn sie verbrennen als einzige Substanzen mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Nährstoffe Zucker und Stärke. Auferdem hatten frühere Arbeiten gezeigt, dass die C;-Verbindung Malonat nicht nur die Umwandlung von Succinat zu Fumarat blockiert, sondern die gesamte Verbrennung in lebenden Zellen. Martius und Knoop lieferten Krebs 1937 eine entscheidende Information: Oxalacetat und Pyruvat lassen sich in Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu Citrat umwandeln. Jetzt hatte Krebs das fehlende Bindeglied: Pyruvat ist ein Produkt des Glucosestoffwechsels und seine Reaktion mit Oxalacetat, bei der Citrat entsteht, schloss die lineare Reak-

tionsfolge zu einem Cyclus. Die Vorstellung eines cyclischen Stoffwechselwegs war für Krebs nicht neu. Er hatte mit Kurt Henseleit 1932 den vierstufigen Harnstoffcyclus aufgeklärt (Abschnitt 21.3). Krebs zeigte rasch, dass die Reaktion von Pyruvat mit Oxalacetat, bei der Citrat entsteht, in lebenden

Geweben vorkommt, und dass die Geschwindigkeiten der Citratsynthese und des Citratabbaus hoch genug sind, um die in verschiedenen Gewebstypen beobachtete Verbrennung von Glucose zu erklären. Bemerkenswert ist, dass Krebs’ ursprünglicher Bericht über den Citratcyclus von der führenden Fachzeitschrift Nature abgelehnt wurde, bevor ihn dann die weniger renommierte

Enzymologia zur Veröffentlichung annahm. In seinem Artikel skizzierte Krebs die wichtigste Übersicht des Stoffwechselwegs, obwohl manche Einzelheiten später überarbeitet werden mussten. So wurden z.B. nicht sofort der Mechanismus der Citratbildung (an dem Acetyl-CoA und nicht Pyruvat beteiligt ist) und die Beteiligung von Succinyl-CoA im Cyclus erfasst. Erst 1945 wurde das Coenzym A entdeckt und erst 1951 zeigte sich, dass Acetyl-CoA das Zwischenprodukt ist, das sich mit Oxalacetat zu Citrat zusammenlagert. Die Arbeit von Krebs und anderen bewies, dass der Citratcyclus eine wichtige Rolle bei der Oxidation von Amino- und Fettsäuren spielt. Dieser Stoffwechselweg ist für etwa zwei Drittel der Energie verantwortlich, die von metabolischen Brennstoffen stammt. Krebs erkannte auch die Rolle des Citratcyclus für die Bereitstellung von Vorstufen für Synthesereaktionen.

Martius und Franz Knoop, dass sich Citrat in a-Ketoglutarat

umwandeln lässt. Schon bald hatte Krebs eine vollständige Reaktionsabfolge für die Umwandlung von Citrat in Oxalacetat: Citrat > Aconitat— Isocitrat > a-Ketoglutarat > Succi-

[Krebs, H.A. und Johnson, W.A. The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues, Enzymologia 4, 148-156 (1937).]

Synthese von Acetyl-Coenzzm

3. In Eukaryoten befinden sich alle Enzyme des Citratcyclus im Mitochondrion. Somit müssen alle Substrate, einschließlich NAD* und GDP, in den Mitochondrien synthetisiert oder aus dem Cytosol importiert werden. Entsprechend müssen alle Produkte des Citratcyclus in den Mitochondrien verbraucht oder in das Cytosol exportiert werden. 4. Die Kohlenstoffatome der beiden CO,-Moleküle, die während einer Runde des Cyclus freigesetzt werden, stammen nicht aus der zu Beginn dieser Runde eingebauten Acetylgruppe (Abb. 17.2). Diese Acetylkohlenstoffatome gehen erst in den nachfolgenden Cyclusumläufen verloren. Als Nettoergebnis wird jedoch in jeder Runde eine Acetylgruppe zu 2 CO, oxidiert. 5. Die Intermediate des Citratcyclus sind gleichzeitg Vorstufen für die Biosynthese anderer Verbindungen (z.B. Oxalacetat für die Gluconeogenese; Abschnitt 16.4). 6. Die Oxidation einer Acetylgruppe zu 2 CO, erfordert die Übertragung von vier Elektronenpaaren. Drei Elektronenpaare entfallen auf die Reduktion von 3 NAD* zu 3 NADH

und das vierte auf die von FAD zu FADH.. Die

Freie Enthalpie der Oxidation einer Acetylgruppe wird zum größten Teil in diesen reduzierten Coenzymen gespeichert. Weiterhin wird Energie in Form von GTP (oder ATP) erhalten. In Abschnitt 18.3C wird gezeigt, dass bei der letztendlichen Übertragung der vier Elektronenpaare auf Sauerstoff ungefähr 10 ATP gebildet werden.

2

Synthese von Acetyl-Coenzym A

Acetylgruppen treten als Teil der „energiereichen Verbindung“ Acetyl-CoA (es sei daran erinnert, dass Thioester hohe Freie Hydrolyseenthalpien aufweisen; Abschnitt 14.2D) in den Citratcyclus ein. Obgleich Acetyl-CoA auch beim Abbau von Fettsäuren (Abschnitt 20.2) und einigen Aminosäuren (Abschnitt 21.4) anfällt, werden wir uns hier auf die Bildung von Acetyl-CoA ausgehend von dem aus Kohlenhydraten stammenden Pyruvat konzentrieren. Wie in Abschnitt 15.3 zu sehen war, werden unter anaeroben Bedingungen Lactat und Ethanol als Endprodukte der Glykolyse gebildet. Unter aeroben Bedingungen, wenn das bei der Glykolyse gebildete NADH in den Mitochondrien reoxidiert wird, ist jedoch Pyruvat das Endprodukt. Pyruvat wird zusammen mit H* durch ein Transportprotein (z.B. in einem Pyruvat-H'-Symport) zur weiteren Oxidation in das Mitochondrion importiert.

A.

Der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex

Multienzymkomplexe sind Gruppierungen von nicht kovalent assoziierten Enzymen, die in einem Stoffwechselweg einen oder mehrere aufeinander folgende Schritte katalysieren. Sie sind offensichtlich in allen Organismen vorhanden und stellen in der Evolution der katalytischen Effizienz einen Fortschritt dar, da sie mehrere Vorteile mit sich bringen: 1. Die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen hängt von der Häufigkeit ab, mit der Enzyme mit ihren Substraten zusammentreffen (Abschnitt 11.3D). Wenn eine Folge von Reaktionen innerhalb eines Multienzymkomplexes abläuft, werden die durch Diffusion zu überwindenden Entfernungen zwischen zwei aktiven Zentren minimiert und dadurch die Reaktionsgeschwindigkeiten erhöht. 2. Die Weiterleitung von Stoffwechselintermediaten zwischen zwei in einem Stoffwechselweg aufeinander folgenden Enzymen verringert die Möglichkeit, dass diese Intermediate mit anderen Molekülen reagieren. So werden Nebenreaktionen weitgehend vermieden.

A

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 B

Erklären Sie, warum der

Citratcyclus als Drehscheibe des zellulären Stoffwechsels

angesehen wird. 28 Welches sind die Substrate und Produkte der Nettoreaktion, die

einem Durchlauf des Citratcyclus entspricht?

617

618

Citratcyclus (a)

Abb. 17.4 Strukturelle Organisation des Pyruvat-Dehydrogenase- Multienzymkomplexes aus E. coli. (a) Der Dihydrolipoyl-Transacetylase-Kern (E,). Die 24 E,-Proteine (grüne Kugeln) sind als Trimere an den Ecken eines Würfels angeordnet. (b) Die 24 Pyruvat-Dehydrogenase-Proteine (E), orangefarbene Kugeln) bilden Dimere, die mit dem E,-Kern (schattierter Würfel) entlang dessen 12 Kanten assoziiert sind. Die 12 Dihydrolipoyl-Dehydrogenase-Proteine (E;, purpurfarbene Kugeln) bilden Dimere, die an den sechs Seitenflächen des E,-Würfels lokalisiert sind. (c) Die Teile (a) und (b) bilden zusammen den vollständigen Komplex aus 60 Untereinheiten.

(a)

Abb. 17.3 Elektronenmikroskopische Aufnahmen des Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplexes

aus E. coli. (a) Der intakte Komplex. (b) Der DihydrolipoylTransacetylase-Kernkomplex (E,). [Mit freundlicher Genehmigung von Lester Reed, University of Texas, Austin.]

3. Die durch einen Multienzymkomplex katalysierten Reaktionen können in koordinierter Weise reguliert werden. Die durch oxidative Decarboxylierung stattfindende Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat wird durch einen als Pyruvat-Dehydrogenase bezeichneten Multienzymkomplex katalysiert. Dieser Komplex enthält mehrere Kopien der drei mit E1 bis E3 bezeichneten Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase (E,), Dihydrolipoyl-Transacetylase (E,) und Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E;). Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex aus E. coli ist ein ca. 4600 kD großes Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 30 nm (Abb. 17.3a). Der Kern des Partikels besteht aus 24 in Form eines Würfels angeordneten E,-Proteinen (Abb. 17.3b und 17.4a). Um den E,-Kern herum sind 24 E,-Proteine und 12 E,-Proteine angeordnet (Abb. 17.4b,c). Obgleich Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexe aus Säugetieren, Hefen und einigen Bakterien dieselben Reaktionen katalysieren, sind sie wesentlich größer und komplizierter strukturiert. In diesen etwa 10.000 kD großen Partikeln, die damit zu den größten bekannten Multienzymkomplexen zählen, besteht der E,-Kern aus 60 Untereinheiten, die in Form eines Dodekaeders angeordnet sind [Abb. 17.5; ein Dodekaeder ist ein regelmäßiger Polyeder mit I-Symmetrie (Abb. 6.34c), der 20 Kanten und 12 pentagonale Flächen besitzt], und von einer Hülle umgeben sind, die aus etwa 45 E,a,ß,Heterotetrameren und etwa 9 E;-Homodimeren besteht. E, und E, binden kompetitiv in zufälliger Verteilung an sich wechselseitig ausschließende Bindungsstellen auf E,. Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex aus Säugetieren enthält zusätzlich etwa 12 Kopien des E;-bindenden Proteins, das die Bindung von E; an den E,-Kern erleichtert, sowie einige Kopien einer Kinase und einer Phosphatase, die die Aktivität des Komplexes regulieren (Abschnitt 17.4A). Der Pyruvat-Dehydrogenasekomplex

Der Pyruvat-Dehydrogenasekomplex katalysiert fünf aufeinander folgende Reaktionen mit der Gesamtstöchiometrie: Pyruvat + CoA + NAD * — Acetyl - CoA + CO, + NADH

Es werden fünf unterschiedliche Coenzyme benötigt: Thiaminpyrophosphat (TPP; Abschnitt 15.3B), Liponamid, Coenzym A (Abb. 14.10), FAD (Abb. 14.12) und NAD* (Abb. 11.4). Die Coenzyme und ihre Funktionen bei den Reaktionen werden in Tabelle 17.1 aufgeführt. Die Reihenfolge der durch den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex katalysierten Reaktionen ist wie folgt (Abb. 17.6):

Synthese von Acetyl-Coenzym Tab. 17.1

komplexes.

A

619

Coenzyme und prosthetische Gruppen des Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzym-

Cofaktor Ort Funktion a HESS Thiaminpyrophosphat (TPP)

an E, gebunden

decarboxyliert Pyruvat unter Bildung eines Hydroxyethyl-TPPCarbanions

Liponsäure

kovalent an ein Lys von E, gebunden (Liponamid)

übernimmt das Hydroxyethyl-

Substrat für E,

übernimmt die Acetylgruppe vom Liponamid

Coenzym A (CoA)

carbanion von TPP in Form einer Acetylgruppe

Flavinadenindinucleotid (FAD)

an E, gebunden

wird durch Liponamid reduziert

Nicotinamidadenindinucleotid

Substrat für E;

wird durch FADH, reduziert

(NAD*)

Abb. 17.5 Modell des komplexes von Bacillus Diese im Durchmesser Darstellung basiert auf

Pyruvat-Dehydrogenasestearothermophilus. ungefähr 50 nm große kryoelektronenmikroskopi-

schen Bildern eines Komplexes, der aus einem

Kern von 60 E,-Untereinheiten (grau-grün) besteht, umgeben von einer äußeren Hülle aus 60 E,-Untereinheiten (violett), die voneinander durch

1. Pyruvat-Dehydrogenase (E,), ein TPP-abhängiges Enzym, decarboxyliert Pyruvat unter Bildung eines Hydroxyethyl-TPP-Intermediats. H3;C

einen ringförmigen etwa 9 nm breiten Spalt getrennt sind. Drei E,-Untereinheiten sind detailliert, in rot, grün und gelb, dargestellt, um die Positio-

R’ STE

+

BoD

IB

H3C

.

ER

H

=

——

CO,

7

(eg

RN

nen ihrer katalytischen Domänen (eingebettet in den E,-Kern), ihrer an die periphären Untereinheiten bindenden Domänen (eingebettet in die E;-Hülle), die an die E,- (und E;-) Untereinheiten binden und ihrer Lipoyldomänen, die alle über flexible Polypeptidlinker verbunden sind (Abschnitt 17.2B), aufzuzeigen. Die rote Lipoyldomäne ist

R'

\

Nor

S®E,

TPP ®E, H=- 0-6CH

Et

EEE

abgebildet, wie sie mit einem aktiven Zentrum an

Hydroxyethyl-

ne

E, (weißer Punkt) in Kontakt tritt, während die grüne und die gelbe Lipoyldomäne Wartepositionen in der ringförmigen Region zwischen dem E,-Kern und der E,-Hülle besetzen. In einem normalen Pyruvat-Dehydrogenasekomplex nehmen E,-Untereinheiten den Platz von einigen E,-Untereinheiten ein. Ein Komplex von 60 E;-Untereinheiten und 60 E,-Untereinheiten besitzt eine starke

TPP +E,

Pyruvat

Diese Reaktion ist mit der durch Pyruvat-Decarboxylase aus Hefe (Abb. 15.20) katalysierten Reaktion identisch. Wir haben bereits gesehen (Abschnitt 15.3B), dass die Fähigkeit des Thiazoliumrings des TPP, an CarbonylAbb. 17.6 Die fünf Reaktionen des Pyruvat-DehydrogenaseMultienzymkomplexes. E) (Pyruvat-Dehydrogenase) enthält TPP und katalysiert die Reaktionen 1 und 2. E, (Dihydrolipoyl-Transacetylase) enthält Liponamid und katalysiert Reaktion 3. E, (Dihydrolipoyl-Dehydrogenase) enthält FAD sowie ein redoxaktives Disulfid und katalysiert die Reaktionen 4 und 5. OH

PyruvatDehydrogenase

NAD*+ SH SH Dihydrolipoyl-

(E,)

zu!

n

R r

+ H*+

FAD

Liponamid 2

NADH

Dehydrogenase

|en;

CH3Z2C-ZTPPR HydroxyethylTEE 1

FAD

S

m

CO,

Ähnlichkeit mit dem gezeigten E}E»-Komplex. [Mit freundlicher Genehmigung von Jacqueline Milne und Sriram Subramaniam, National Institutes of Health, Bethesda.]

S

z

HOzen

DihydrolipoylTransacetylase

)

} ISs—

(E})

(0)

Mider4

N

TPP o-

CH;

Pyruvat

—-C—S-CoA

Acetyl-CoA

R Acetyldihydroliponamid

CoA

620

Citratcyclus

Abb. 17.7 Gegenseitige Umwandlung zwischen Liponamid und Dihydroliponamid. Liponamid besteht aus Liponsäure, die über eine Amidbindung kovalent an die &-Aminogruppe eines Lys-Restes gebunden ist.

Liponsäure

Lys

Te SCH2 CH» /

|

S—CH

”

CHa——

CH,

CH,

Ci,

nn

C-=-NH

(CH

—y nn

0-0

Liponamid

2H* +2e7

ae

Sa

BSseH

? CH

Zur CH; Zu CHa =

CH,

u

m

C —

NH

——— (CH9)4

(2

=, =

Dihydroliponamid

gruppen zu addieren und Elektronen abzuziehen, es zu dem in a-KetosäureDecarboylierungsreaktionen am häufigsten verwendeten Coenzym macht. 2. Die Hydroxyethylgruppe wird auf das nächste Enzym, die DihydrolipoylTransacetylase (E,), welche eine Liponamidgruppe enthält, übertragen. Liponamid besteht aus Liponsäure, die über eine Amidbindung an die e-Aminogruppe eines Lysinrestes (Abb. 17.7) gebunden ist. Das reaktive Zentrum ist ein cyclisches Disulfid, das reversibel zum Dihydroliponamid reduziert werden kann. Die aus Pyruvat stammende Hydroxyethylgruppe greift die Disulfidbindung im Liponamid an und TPP wird eliminiert. Hierbei wird das Hydroxyethylcarbanion zu einer Acetylgruppe oxidiert und das Liponamiddisulfid reduziert.

es C

er C

|

ER

H—0—C-—cH, S

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TPP «E

Bo)

er

ra

5

Ss

1

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|

e

S

S

HS

Br

=

HS

Liponamid-E, Acetyldihydroliponamid-E,

3. Anschließend katalysiert E, die Transacetylierungsreaktion, bei der die Acetylgruppe auf CoA unter Bildung von Acetyl-CoA und Dihydroliponamid-E, übertragen wird.

Synthese von Acetyl-Coenzym

A

621

\

CoA—S—C—CH, Acetyl-CoA

A

ns

CoA—SH

_—

ee

HS

HS =

Acetyl-

dihydroliponamid-E,

Dihydroliponamid-E,

4. Nachdem das Acetyl-CoA gebildet wurde, muss die Liponamidgruppe von E, noch regeneriert werden. Um den katalytischen Cyclus von E, abzuschließen, reoxidiert Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E,) das Dihydroliponamid. Oxidiertes E, enthält eine reaktive Cys-Cys-Disulfidgruppe und ein fest gebundenes FAD. Die Oxidation des Dihydroliponamids entspricht einer Disulfidaustauschreaktion.

E:

an Fa.

| :

E, (oxidiert)

E3 (reduziert)

Ey

5. Zum Schluss wird das reduzierte E, reoxidiert. Die Sulfhydrylgruppen werden durch FAD und das resultierende FADH, durch NAD* oxidiert, wobei reduziertes NADH gebildet wird. FAD SEI SH

FADH, >

NAD*

NADH + H+

FAD

n

S

S

S

|

E, (oxidiert) Die Röntgenstruktur von Dihydrolipoyl-Dehydrogenase zeigt zusammen mit Informationen zum Reaktionsmechanismus, dass die Reaktion, die von der Dihydroliponamid-Dehydrogenase (E;) katalysiert wird, komplexer ist als die Reaktionen 4 und 5 in Abbildung 17.6 vermuten lassen. Die redoxaktive Disulfidbrücke des Enzyms wird von Cys43 und Cys48 gebildet, die auf einem hoch konservierten Abschnitt der Polypeptidkette des Enzyms liegen. Die Disulfidbrücke verbindet zwei aufeinander folgende Windungen in einem Segment einer verzerrten a-Helix (in einer optimalen Helix wären die C,-Atome von Cys43 und Cys48 zu weit auseinander, als dass sich eine Disulfidbrücke bilden könnte). Die Flavingruppe des Enzyms ist nahezu vollständig im Protein verborgen. Dies verhindert, dass die umgebende Lösung die Elektronenübertragungsreaktion beeinträchtigt, die von dem Enzym katalysiert wird. Der Nicotinamidring von NAD* bindet an der Seite von Flavin, die der Disulfidbrücke gegenüberliegt. In Abwesenheit von NAD* bedeckt die Phenolseitenkette von Tyr181 die Nicotinamid-Bindungstasche, sodass das Flavin vom Kontakt mit der Lösung abgeschirmt wird (Abb. 17.8). Die Tyr-Seitenkette weicht dann zur Seite, um dem Nicotinamidring die Bindung in der Nähe des Flavinrings zu ermöglichen. Die prosthetischen FAD-Gruppen in Proteinen haben Reduktionspotentiale von etwa 0 V (Tabelle 14.5), deshalb eignet sich FADH, nicht, um Elektronen an NAD* (8° = -0,315 V) abzugeben. Es gibt Hinweise, dass die FAD-Gruppe

Abb. 17.8 Aktives Zentrum der DihydroliponamidDehydrogenase (E;). Gezeigt ist die Röntgenstruktur des Enzyms aus

Pseudomonas putida. Die redoxaktiven Teile der gebundenen Cofaktoren

NAD* und FAD, die

Seitenketten von Cys43 und Cys48 (bilden die

redoxaktive Disulfidbrücke) und die Seitenkette von Tyr131 sind als Kugel-Stab-Modell dargestellt: C ist grün, N blau, O rot, P magentarot und S gelb.

Man beachte, dass die Seitenkette von Tyr18] zwischen den Flavin- und den Nicotinamidring geschoben ist. [Nach einer Röntgenstruktur von Wim

Hol, University of Washington,

PDBid 1LVL.]

622

Citratcyclus

Verständnisfrage zu Abschnitt 2 1. Beschreiben Sie die fünf Reaktionen des PyruvatDehydrogenaseMultienzymkomplexes.

in der Dihydroliponamid-Dehydrogenase niemals vollständig zu FADH, reduziert wird. Auf Grund der präzisen Positionierung des Flavin- und Nicotinamidrings werden die Elektronen rasch vom Enzymdisulfid über FAD auf NAD" übertragen, sodass ein reduziertes Flavin-Anion (FADH') nur vorübergehend existiert. Somit scheint FAD eher als Elektronenüberträger zu fungieren statt als Quelle oder Verbraucher von Elektronen. Ein Schwenkarm überträgt die Zwischenprodukte

Wie werden Reaktionszwischenprodukte von E, (im Innern des PyruvatDehydrogenasekomplexes) zu den Proteinen E, und E; auf der Außenseite transportiert? Der Schlüssel dazu ist die Liponamidgruppe von E,. Der Liponsäurerest und die Seitenkette des Lys-Restes, mit der er verknüpft ist, haben zusammen eine Länge von 1,4 nm. Der Lipoyliysyl-Arm fungiert offensichtlich wie ein lange Kette, welche die Disulfidgruppe von E, (wo sie eine Hydroxyethylgruppe aufnimmt) zum aktiven Zentrum E, (wo die Hydroxyethylgruppe übertragen wird und Acetyl-CoA entsteht) schwenkt und von dort zu E, (wo das reduzierte Disulfid wieder oxidiert wird). Anm

QU

N

Lipoyllysyl-Arm (voll ausgestreckt)

Die Domänen von E,, welche die Lipoyllysyl-Arme tragen, sind über ein hoch flexibles Pro- und Ala-reiches Segment mit dem restlichen E,-Protein verbunden. Dieses Proteinsegment trägt zur Beweglichkeit des Lipoyliysyl-Arms bei. Wegen der Biegbarkeit und Reichweite der Lipoyliysyl-Arme kann ein E,-Protein zahlreiche E,-Proteine acetylieren. Und ein E;-Protein kann mehrere Dihydroliponamidgruppen erneut oxidieren. Die Lipoyllysyl-Arme ragen vermutlich in den Raum zwischen dem E,-Kern und der äußeren E,E;-Hülle (Abb. 17.5) und pendeln zwischen den aktiven Zentren von E,, E, und E;. Der vollständige PyruvatDehydrogenasekomplex kann durch die Reaktion der Liponamidgruppe mit bestimmten arsenhaltigen Verbindungen inaktiviert werden (siehe Exkurs 17.2).

3

Die Enzyme des Citratcyclus

In diesem Abschnitt werden die acht Enzyme des Citratcyclus besprochen. Die Aufklärung des Mechanismus von jedem dieser Enzyme ist das Ergebnis umfangreicher experimenteller Untersuchungen. Dennoch verbleiben immer noch offene Fragen zu mechanistischen Details der Enzyme und zu deren regulatorischen Eigenschaften.

A.

Citrat-Synthase

Citrat-Synthase katalysiert die Kondensation von Acetyl-CoA und Oxalacetat. Diese Initialreaktion des Citratcyclus ist die Stelle, an welcher neue Kohlenstoffatome (aus Kohlenhydraten, Fettsäuren und Aminosäuren) in Form von AcetylCoA „in den Heizkessel eingespeist“ werden. Die Reaktion an der Citrat-Synthase verläuft nach einem geordneten sequenziellen Mechanismus, bei dem Oxalacetat vor Acetyl-CoA gebunden wird. Röntgenstrukturuntersuchungen zeigen, dass das freie Enzym (ein Dimer) in der „offenen“ Form vorliegt. Je zwei Domänen bilden einen Spalt, welcher die Bindungsstelle für Oxalacetat darstellt (Abb. 17.9a). Wenn Oxalacetat bindet, führt die kleinere Domäne

eine Rotation um

18° aus, wodurch der Spalt ver-

schlossen wird (Abb. 17.9b). Das Vorliegen von „offenen“ und „geschlossenen“ Konformationen erklärt das kinetische Verhalten des Enzyms nach einem geordneten sequenziellen Mechanismus. Der Konformationswechsel macht die Bindungsstelle für Acetyl-CoA zugänglich und verschließt diejenige für Oxalacetat. Damit wird das gebundene Substrat gegenüber dem Lösungsmittel abgeschirmt. Ähnliche Konformationsänderungen haben wir bei der Adenylat-Kinase (Abb. 14.9)

Die Enzyme des Citratcyclus

Exkurs 17.2

623

Biochemie im Organismus

Arsenvergiftung Schon im Altertum war Arsen als Gift bekannt. As(IIl)-Verbindungen wie Arsenit (AsO3‘) und organische Arsenverbindungen sind giftig, weil sie an Sulfhydrylverbindungen, die zweizähnige Addukte bilden können (einschließlich Liponamid), binden.

= O—

/

OH

As

%

HS +

OH

—

O—As

HS

/ \

Zimmer

Napoleons

Arsen.

Daher mag die Arsenvergiftung

Napoleons nicht beabsichtigt gewesen sein.

S + 2H,;0

Ss

R Arsenit

Wetter durch Pilze zu einer flüchtigen Verbindung umgesetzt wurde. In der Tat enthielten Proben von Tapeten aus dem

R

Dihydro-

lipoamid

HS R'—As=0O

S

+

—en ge

HS

/

+ H,O

Ss R

Napoleon Bonaparte

R

organische Arsenverbindung

Die Inaktivierung von liponamidenthaltenden Enzymen durch Arsenit, insbesondere die der Pyruvat-Dehydrogenaseund der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexe, führt zu Atmungsstillstand. Allerdings sind organische Arsenverbindungen für Mikroorganismen giftiger als für den Menschen, was wahrscheinlich auf unterschiedlichen Empfindlichkeiten mehrerer ihrer Enzyme gegenüber diesen Verbindungen beruht. Auf Basis dieser unterschiedlichen Toxizität wurden zu Beginn des 20. Jahrhunderts organische Arsenverbindungen bei der Behandlung von Syphilis (von Bakterien hervorgerufene Erkrankung) und Trypanosomiasis (durch Parasiten verursachte Erkrankung) angewendet. Diese Verbindungen stellten so die ersten Antibiotika dar, obwohl — was nicht überrascht — schwere Nebenwirkungen auftraten. Bei plötzlich eintretendem Tod wird oft eine Vergiftung durch Arsen vermutet. Lange Zeit wurde angenommen, dass Napoleon Bonaparte während des Exils auf der Insel St. Helena an einer Arsenvergiftung starb. Diese Vermutung wird durch neuere Befunde, nach denen eine Locke seines Haars

[© akg-images.]

Auch Charles Darwin könnte ein unbeabsichtigtes Opfer einer chronischen Arsenvergiftung gewesen sein. In den Jahren nach seiner berühmten Reise auf der Beagle wurde Darwin durch

Ekzeme,

Schwindelanfälle,

keit und Gicht — alles Symptome heimgesucht.

Fowler’s

verwendetes mL.

Dieses

Kopfschmerzen,

Lösung, ein im 19. Jahrhundert weit

Stärkungsmittel, „Medikament“

enthielt

wurde

von

10 mg Arsenit vielen

Leuten

Jahre eingenommen, möglicherweise auch von Darwin.

hohe Gehalte an Arsen aufweist, stark gestützt. War

es aber Mord? Oder war es eine Umweltverschmutzung? In jener Zeit wurden für Tapeten arsenhaltige Farbstoffe verwendet. Man stellte später fest, dass Arsen bei feuchtwarmem

und bei der Hexokinase (Abb. 15.2) angetroffen, wo sie dazu dienen, die Hydrolyse von ATP zu verhindern. Bei dem von James Remington vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus sind drei ionisierbare Aminosäureseitenketten der Citrat-Synthase an der Katalyse beteiligt (Abb. 17.10):

Übel-

einer Arsenvergiftung -

Charles Darwin [© Photo Researchers.]

pro über

624

Citrateyclus (b)

(a)

Abb. 17.9 Konformationsänderungen der Citrat-Synthase.

(a) Die offene Konformation. (b) Die geschlossene, das Substrat bindende Konformation. In beiden Formen ist das homodimere Protein entlang seiner zweifachen Achse gezeigt. Die molekulare Oberfläche ist transparent dargestellt, die Polypeptidketten sind in Schlangenform abgebildet und in der Reihenfolge der Spektralfarben von blau am N-Terminus bis, rot am C-Terminus gefärbt. Die Reaktionsprodukte Citrat, das an beide enzymatischen Konformationen gebunden ist und Coenzym A, das an die geschlossene Konformation gebunden ist, sind als Kalottenmodelle dargestellt. Die C-Atome des Citrats sind türkis, die C-Atome es CoA grün, die N-Atome blau, O-Atome rot und

P-Atome orange. Die große Konformationsänderung zwischen der offenen und der geschlossenen Form bringt eine Rotation der kleinen Domänen (unten

links und oben rechts) um 18° relativ zur

großen Domäne mit sich. Dies führt zu einer relativen zwischenatomaren Verschiebung von bis zu

1,5 nm. [Nach einer Röntgenstruktur von James

Remington und Robert Huber, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried. PDBids ICTS und 2CTS.] 6% siehe Interactive Exercises.

Im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion erfolgt die Bildung der Enolform des Acetyl-CoA. Dabei entzieht Asp 375 (eine Base, da deprotoniert) der Methylgruppe ein Proton, während His 274 (eine Säure) das Enolatsauerstoffatom protoniert. In einem zweiten, konzertierten Säure-Base-katalysierten Schritt wird durch einen Angriff des nucleophilen Acetyl-CoA-Enols auf Oxalacetat Citryl-CoA gebildet. His 274 entzieht das zuvor übertragene Proton, während His 320 (eine Säure) ein Proton an die Carbonylgruppe des Oxalacetats abgibt. Das Citryl-CoA-Intermediat bleibt am Enzym gebunden. Citrat-Synthase ist eines der wenigen Enzyme, die direkt, d.h. ohne die Hilfe eines Metallions als Cofaktor, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung herstellen können. Durch Hydrolyse wird aus Citryl-CoA Citrat und CoA gebildet. Diese Hydrolyse liefert die thermodynamische Triebkraft (AG°’ = -31,5 kJ - mol’') für die Reaktion. Im Folgenden werden wir sehen, warum diese Reaktion einen so hohen, anscheinend verschwenderischen Aufwand an Energie erfordert.

Die Enzyme des Citratcyclus His 320

His 320

C

H

H

|

E

CH, —COO

CH, —CO0O7

L His

Oxalacetat 00C

1

—N

S

2

—_N

ei N / 374

& no 24

Citryl-CoA

N

C — Asp 375

N

CoASH

SCoA

H;C

0

= DOT

C — Asp 375

\ C — Asp 375

-000-B;€

VA

[6]

Aconitase katalysiert die reversible Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat, über das Intermediat cis-Aconitat. ae

aa

coo-

CH3

CHs

CH

- COO

FEN,

OH CH,—C007

Citrat

Aconitase

Citrat

H=0

3

SCoA

COOz

0

CH,—C— SCoA

\

Acetyl-CoA

ie

OH

-

"On

E0--C

H

H,O

Sy

B.

3

”O0C—BH;C

> 7

SR

320

an

+

H,C

625

De

H,O }

Bel

|

|

r

en: ve CO0O0Z cis-Aconitat

H,O 7

|

oe HO-—- THl C097 Isocitrat

Der erste Schritt der Reaktion ist eine Dehydratation, bei der ein Proton und eine OH-Gruppe entfernt werden. Da Citrat zwei Carboxymethylgruppen als Substituenten an seinem zentralen C-Atom aufweist, ist es zwar nicht chiral, jedoch prochiral. Die Aconitase eliminiert Wasser spezifisch vom unteren (pro-R) Arm des Citrats (d.h. in einer Weise, dass das Produktmolekül die R-Konfiguration aufweist; siehe Exkurs 4.2), obgleich es durchaus denkbar wäre, Wasser aus jedem der Carboxymethylarme zu eliminieren. Aconitase enthält einen [4Fe-4S]-Eisen-Schwefel-Cluster (eine Anordnung von vier Eisenatomen und vier Schwefelatomen, Abschnitt 18.2C), der wahrscheinlich die OH-Gruppe des Citrats koordiniert, um deren Eliminierung zu erleichtern. Eisen-Schwefel-Cluster sind in aller Regel an Redoxprozessen beteiligt. Die Aconitase bildet hier eine verblüffende Ausnahme. Die zweite Stufe der Aconitasereaktion ist die Rehydratation der Doppelbindung von cis-Aconitat unter Bildung von Isocitrat. Die Addition von Wasser an die Doppelbindung von cis-Aconitat könnte potentiell vier Stereoisomere liefern. Da Aconitase aber die Addition von OH” und H* in einer stereospezifischen Weise katalysiert, wird nur eines der möglichen Stereoisomere des Isocitrats gebildet. Die Fähigkeit eines Enzyms zwischen pro-R- und pro-S-Gruppen seines

Abb. 17.10 Mechanismus der Citrat-Synthasereaktion. Als generelle Säure-Base-Katalysatoren sind sowohl His 274 und His 320 in ihrer neutralen Form als auch Asp 375 in die Reaktion mit einbezogen. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (1) ist die Bildung der Enolform von Acetyl-CoA. Diese wird durch eine Wasserstoffbrückenbindung zu dem sich bildenden Anion von His 274 stabilisiert. (2) Das Enol von Acetyl-CoA greift dann nucleophil den Carbonylkohlenstoff des Oxalacetats an. (3) Das daraus resultierende Intermediat, CitrylCoA, wird zu Citrat und CoA hydrolysiert. [Nach J.S. Remington, Curr. Opin. Struct. Biol. 2,

732 (1992).]

626

Citratcyclus

c00 CH |” yP 6 Z | NoHO-OTH 6 = °% 0009

nap*

H*+NADH

Isocitrat

Abb. 17.11 Reaktionsmechanismus der Isocitrat-Dehydrogenase. Oxalsuccinat ist in eckigen Klammern dargestellt, da es am Enzym gebunden bleibt.

CH

er ;

2c=O 0 2

|

CH

Mn**

rn

HG O0 \

Mn*

0° 0

Fr

CH,

|

u+

=

co.

nd

|

2

a

a

Oxalsuccinat

_H

HC

c=0o \

00, a-Ketoglutarat

Substrats zu differenzieren wurde erst 1948 erkannt, als Alexander Ogston zeigte, dass die Aconitase zwischen zwei -CH,COO’-Gruppen des Citrats unterscheiden kann, wenn das Substrat an das Enzym gebunden ist (Abschnitt

11.1B). C.

NAD*-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase

Isocitrat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu a-Ketoglutarat. Diese Reaktion generiert das erste CO, und das erste NADH des Citratcyclus. Man beachte, dass dieses CO, ursprünglich ein Teil des Oxalacetats und nicht des Acetyl-CoA war (Abb. 17.2). Manche Gewebe von Säugetieren enthalten außerdem ein Isoenzym der Isocitrat-Dehydrogenase, das NADP" als Cosubstrat verwendet. NAD*-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase, welche zusätzlich Mn?* oder Mg” als Cofaktor benötigt, katalysiert die Oxidation eines sekundären Alkohols (Isocitrat) zu einem Keton (Oxalsuccinat), gefolgt von einer Decarboxylierung der Carboxylgruppe in ß-Stellung zum Keton (Abb. 17.11). Mn’* unterstützt die Polarisierung der neu gebildeten Carbonylgruppe. Der Reaktionsmechanismus der Isocitrat-Dehydrogenase gleicht dem der Phosphogluconat-Dehydrogenase im Pentosephosphatweg (Abschnitt 15.6A). Da das Oxalsuccinatzwischenprodukt nur intermediär auftritt, war sein experimenteller Nachweis mit großen Schwierigkeiten verbunden. Eine enzymatische Reaktion kann jedoch durch Mutationen im Enzym so verlangsamt werden, dass daraus ein kinetischer „Flaschenhals“ resultiert und es zur Anreicherung von Reaktionsintermediaten kommt. In diesem Fall wurden die katalytisch relevanten Reste Tyr 160 und Lys 230 verändert. Dann wurden Kristalle mutierter Isocitrat-Dehydrogenase mit dem Substrat Isocitrat versetzt und röntgenkristallographische Aufnahmen mittels einer neu entwickelten Technik zur schnellen Messung der Intensität von Röntgenstrahlen erzeugt. Diese Technik erfordert die Erzeugung von Röntgenstrahlen hoher Intensität durch ein Synchrotron. Mit Hilfe dieser Untersuchungen gelang es, das Oxalsuccinatintermediat im aktiven Zentrum des Enzyms nachzuweisen.

D. _ a-Ketoglutarat-Dehydrogenase o-Ketoglutarat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung einer aKetosäure (a-Ketoglutarat). Diese Reaktion liefert das zweite CO, und das zweite NADH des Citratcyclus.

Die Enzyme des Citratcyclus

ie

ih

CoASH

CO,

fa

CH,

CH,

En Ks

= NAD*

< NADH+H*+

a-Ketoglutarat

er IR: h Succinyl-CoA

Es handelt sich wiederum um ein CO,, das in den Citratcyclus als Teil von Oxalacetat und nicht von Acetyl-CoA eintritt (Abb. 17.2). Obgleich in jeder Runde des Citratcyclus zwei C-Atome zu CO, oxidiert werden, erfolgt die Oxidation der eintretenden Acetylgruppen zu CO, erst in nachfolgenden Runden des Cyclus. Die Reaktion der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase ist chemisch der Reaktion ähnlich, die durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex katalysiert wird. a-Ketoglutarat-Dehydrogenase ist ein Multienzymkomplex, der «-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E,), Dihydrolipoyl-Transsuccinylase (E,) und Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E;) enthält. Dieses E; ist tatsächlich mit E, des PyruvatDehydrogenasekomplexes identisch (ein drittes Mitglied dieser 2-KetosäureDehydrogenase-Familie von Multienzymkomplexen ist die Dehydrogenase verzweigtkettiger «a-Ketosäuren, welche am Abbau von Isoleucin, Leucin und Valin beteiligt ist; siehe Abschnitt 21.4). Die durch den a-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex katalysierten Reaktionen erfolgen nach Mechanismen, die mit denen des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes übereinstimmen. Das Produkt ist wiederum ein „energiereicher“ Thioester, in diesem Fall das Succinyl-CoA.

E.

Succinyl-CoA-Synthetase

Succinyl-CoA-Synthetase (auch als Succinat-Thiokinase bezeichnet) koppelt die Spaltung des „energiereichen“ Succinyl-CoA mit der Synthese eines „energiereichen“ Nucleosidtriphosphats (beide Namen des Enzyms beziehen sich auf die Rückreaktion). Durch das Enzym aus Säugetieren wird gewöhnlich GTP (aus GDP und P;) gebildet, bei Pflanzen und Bakterien dagegen ATP (aus ADP und P;). Diese Reaktionen sind jedoch energetisch äquivalent. So werden ATP und GTP mit Hilfe von Nucleosiddiphosphat-Kinase schnell ineinander umgewandelt (Abschnitt 14.2C): GIP+ADP

=

GDP+ATP

AG”=0

Wie koppelt Succinyl-CoA-Synthetase die exergone Spaltung des Succinyl-CoA (AG°’ = -32,6 kJ - mol’) mit der endergonen Bildung von Nucleosidtriphosphat aus dem entsprechenden Nucleosiddiphosphat und P; (AG°’ = 30,5 kJ - mol")? Diese Frage wurde durch ein Experiment mit isotopenmarkiertem ADP an der Succinyl-CoA-Synthetase aus Spinat untersucht. Das Enzym katalysiert in Abwesenheit von Succinyl-CoA die Übertragung der y-Phosphorylgruppe von ATP auf

["*C])-ADP wobei ['*C]-ATP gebildet wird. Als Schlussfolgerung aus dieser Isoto-

penaustauschreaktion kann die folgende Reaktionssequenz unter Beteiligung eines Phosphorylenzymintermediats postuliert werden: Schritt 1

1-®-®-® + E ATP

A-®)-® ADP

Schritt 2

A-®-® + E-®

|

ADP*

+

E-®

A-P)—-P)—-®

Phosphoryl-

ATP*

enzym

\ + E

627

628

Citrateyclus cC007

CH,

+

=) zum oO |

er

20,70

Coas“ oO

c007

E

|

de

CH 5 OHNE

H

+

Hr

N:

IF

G—0-P—-0—-P=0 |

+

0

N|

GDP

(3) Übertragung der Phosphorylgruppe auf GDP unter Bildung von GTP.

ei

REN ae N

weil rn

5

Vetiekh

Abb. 17.12 Die durch Succinyl-CoA-Synthetase katalysierte Reaktion. (1) Bildung von Succinylphosphat, einem energiereichen gemischten Anhydrid. (2) Bildung von Phosphoryl-His, einem energiereichen Intermediat.

+

| CH3

: Ki:

De

3-Phosphoryl-His E

6)

|

CH,

Po3-

Enzym-His

|

c00”

N A

2J

=0,P-0°7 oO

07

7,0

E

C|

N= N

BC

CoASH

Suceinylphosphat

Suceinyl-CoA

P;

+

CH;

Fr

|

Oz

se

CH,

1

CH,

OH

N

It

|

Succinat

E

ET

u

su

N>

0%

Gr

Oz

H

+

|

|

(Or

|

G-0-P—-0—-P—0—-P=0 |

|

o

6)

|

07

PO2-

GTP

Diese Erkenntnisse führten dann zur Isolierung eines kinetisch aktiven Phosphorylenzyms mit einer am N(3) eines His-Rests kovalent gebundenen Phosphorylgruppe. In Abbildung 17.12 wird ein Dreistufenmechanismus für Succinyl-CoA-Synthetase vorgestellt. 1. Succinyl-CoA reagiert mit P; unter Bildung von Succinylphosphat und CoA. 2. Die Phosphorylgruppe wird dann von Succinylphosphat auf einen His-Rest des Enzyms übertragen, wobei Succinat freigesetzt wird. 3. Die Phosphorylgruppe wird unter Bildung von GTP vom Enzym auf GDP übertragen. Man beachte, dass bei jedem dieser Schritte die Energie des Succinyl-CoA durch die Bildung „energiereicher“ Verbindungen (zuerst Succinylphosphat, dann ein 3-Phosphoryl-His-Rest und schließlich GTP) konserviert wird. Der Vorgang erinnert an das Weiterreichen einer heißen Kartoffel. Die von der Succinyl-CoA-Synthetase katalysierte Reaktion ist ein weiteres Beispiel für eine Substratkettenphosphorylierung, d.h. für eine ATP-Synthese, die nicht an die Anwesenheit von Sauerstoff gebunden ist. Bis zu dieser Stelle des Citratcyclus ist ein Acetyläquivalent vollständig zu zwei

CO, oxidiert worden. Ebenso sind zwei NADH und ein GTP (äquivalent zu einem ATP) erzeugt worden. Um den Cyclus zu vollenden, muss Oxalacetat aus Succinat zurückgebildet werden. Dies wird durch die drei verbleibenden Reaktionen des Cyclus erreicht.

Die Enzyme des Citratcyclus

F.

629

Succinat-Dehydrogenase

Succinat-Dehydrogenase katalysiert die stereospezifische Dehydrierung von Succinat zu Fumarat.

Er

&

BC

| H—C—H

+

Se E-FAD

=

coo

| ie

Be

+

00C

coo

Succinat

E--FADH,

H

Fumarat

Das Enzym wird durch Malonat (siehe Formel rechts), ein Strukturanalogon von Succinat und ein klassisches Beispiel für einen kompetitiven Inhibitor, stark gehemmt. Da Malonat die zelluläre Atmung insgesamt hemmte, wurde angenommen, dass Succinat nicht nur ein weiteres Substrat ist, sondern bei der Oxidation anderer Substrate eine katalytische Rolle spielt. Dies war für Krebs eines der Schlüsselergebnisse zur Aufstellung seiner Theorie des Citratcyclus.

Succinat-Dehydrogenase enthält als prosthetische Gruppe FAD, das über einen His-Rest (Abb. 17.13) kovalent an das Enzym gebunden ist (bei den meisten anderen FAD enthaltenden Enzymen ist dieses fest, aber nicht kovalent, gebunden). Im Allgemeinen dient FAD dazu, Alkanstrukturen (wie z.B. bei Succinat) zu Alkenstrukturen (wie bei Fumarat) zu oxidieren, während NAD* bei der stärker exergonen Oxidation von Alkoholen zu Aldehyden oder Ketonen beteiligt ist. Die Dehydrierung von Succinat führt zu FADH,, welches reoxidiert werden muss, bevor Succinat-Dehydrogenase einen weiteren katalytischen Cyclus durchführen kann. Die Reoxidation dieses FADH, erfolgt in der mitochondrialen Elektronentransportkette, die im Detail in Abschnitt 18.2 behandelt werden soll. Succinat-Dehydrogenase, das einzige membrangebundene Enzym des Citratcyclus (die anderen Enzyme sind Komponenten der mitochondrialen Matrix), ist so positioniert, um Elektronen direkt in die Elektronentransportmaschinerie der mitochondrialen Membran einspeisen zu können.

IS: ee

Oi

u

a

coo-

COOz

Malonat

Succinat

erzrR | E

|

CH,

Fumarase

Fumarase (Fumarat-Hydratase) katalysiert die Hydratation der Doppelbindung von Fumarat unter Bildung von Malat. Die Hydratationsreaktion verläuft über einen Carbanion-Übergangszustand. OH wird vor dem H* addiert.

Ho

IS His

G.

HO— °—äl

N

OH

HO—C-—H |

NN

CH,

H,C

Nr

H;C

N

2

IE

N

SH

[0) FAD

ug

„00° c

Abb. 17.13 Kovalente Fixierung von FAD an einen His-Rest der Succinat-Dehydrogenase.

G Far2s OH

ODER, (SE

H

Carbanion-

R steht für den ADP-Teil. ut N

Übergangszustand

Ha: „00

1

C

TOR Fumarat

H Has

00

|

@==O0H

FOoeseDH Malat

630

Citratcyclus

H. _ Malat-Dehydrogenase Malat-Dehydrogenase katalysiert die letzte Reaktion des Citratcyclus, die Regenerierung von Oxalacetat. Die Hydroxylgruppe von Malat wird in einer NAD'-abhängigen Reaktion oxidiert.

H HS Verständnisfragen zu

zooe

°

| U

a |

CSE=20H

ae

|

0" + NADt

x

—

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| HS SEN o

O0en + NADH + H+

en

000” 0 Oxalacetat

Abschnitt 3 1. Zeichnen Sie die Strukturen der acht Intermediate des Citratcyclus und nennen Sie die Enzyme, mithilfe derer sie ineinander umgewandelt werden. . Welche Schritte des Citratcyclus setzen CO, als Produkt frei? Bei welchen Schritten entstehen NADH oder FADH,? Bei welchem Schritt entsteht GTP? Schreiben Sie die Netto-

gleichungen für die Oxidation von Pyruvat, der Acetylgruppe des Acetyl-CoA und Glucose zu CO, auf.

Die Übertragung des Hydridions auf NAD* erfolgt nach dem gleichen Mechanismus der Hydridionenübertragung, der bei Lactat-Dehydrogenase und Alkohol-Dehydrogenase angewendet wird (Abschnitt 15.3). Röntgenkristallographische Vergleiche der NAD*-bindenden Domänen dieser drei Enzyme zeigen bemerkenswerte Ähnlichkeiten und stehen mit der Annahme in Einklang, dass alle NAD*-bindenden Domänen sich aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickelt haben. Der AG?’-Wert für die Malat-Dehydrogenasereaktion beträgt +29,7 kJ - mol”. Daher ist im Gleichgewicht (und unter den in der Zelle vorherrschenden Bedingungen) die Konzentration an Oxalacetat, verglichen mit der von Malat, relativ niedrig. Es ist daran zu erinnern, dass die erste Reaktion des Citratcyclus, die durch Citrat-Synthase katalysierte Reaktion, durch die Spaltung der Thioesterbindung von Citryl-CoA stark exergon ist (AG°’ = -31,5 kJ - mol’'). In diesem Zusammenhang wird die Notwendigkeit eines solchen, anscheinend energievergeudenden Prozesses verständlich. Es wird dadurch möglich, dass selbst bei den in der Zelle niedrigen Konzentrationen an Oxalacetat die Citratbildung exergon sein kann und so hilft, den Citratcyclus in Gang zu halten.

4

Regulation des Citratcyclus

Die Kapazität des Citratcyclus zur Erzeugung der für die Zelle notwendigen Energie wird streng reguliert. Er wird in seinem Ablauf durch die Verfügbarkeit von Substraten, den Bedarf an Intermediaten des Citratcyclus als biosynthetische Vorstufen und den Bedarf an ATP beeinflusst. Es gibt verschiedene Hinweise darauf, dass die Enzyme des Citratcyclus physikalisch miteinander assoziiert sind, was zu deren koordinierter Regulation beitragen könnte. Bevor die verschiedenen Mechanismen zur Regulation des Citratcyclus behandelt werden,

soll zunächst der Gesamtbeitrag des Cyclus zur Erzeugung metabolischer Energie betrachtet werden. Die Oxidation einer Acetylgruppe zu zwei Molekülen CO; ist ein Vier-Elektronenpaar-Prozess (es sollte aber daran gedacht werden, dass nicht die Kohlenstoffatome der eintretenden Acetylgruppe oxidiert werden). Für jedes AcetylCoA, das in den Citratcyclus einritt, werden drei Moleküle NAD* zu NADH, was drei Elektronenpaaren entspricht, und ein Molekül FAD zu FADH, dem vierten Elektronenpaar entsprechend, reduziert. Zusätzlich wird ein GTP (oder ein ATP) erzeugt (Abb. 17.14). Die an NADH und FADH, gebundenen Elektronen werden in die Elektronentransportkette weitergeleitet, welche in der Reduktion von O, zu H,O gipfelt. Die Energie aus dem Elektronentransport wird mittels der oxidativen Phosphorylierung durch Synthese von ATP gespeichert (Abschnitt 18.3). Für jedes elektronenabgebende NADH werden aus ADP + P; ungefähr 2,5 ATP und für jedes FADH, ungefähr 1,5 ATP

Regulation des Citratcyclus

631

Abb. 17.14 Produkte des Citratcyclus. Für je zwei Kohlenstoffatome, die zu CO, oxidiert werden, werden die Elektronen auf drei NADH und ein FADH, übertragen. Es wird auch ein GTP (oder ATP) gewonnen.

u rn ne A

gebildet. Somit liefert eine Runde des Citratcyclus letztendlich ungefähr 10 ATP. In Abschnitt 18.3C werden wir sehen, warum diese Werte nur Näherungswerte sind. Wenn Glucose bei der Glykolyse zu zwei Molekülen Pyruvat umgesetzt wird, werden zwei Moleküle ATP gebildet und zwei Moleküle NAD* reduziert (Abschnitt 15.1). Diese entstandenen NADH-Moleküle ergeben bei Weitergabe ihrer Elektronen an die Elektronentransportkette ungefähr sechs Moleküle ATP. Wenn die zwei Pyruvatmoleküle durch den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex zu zwei Acetyl-CoA umgesetzt werden, entstehen aus den zwei bei diesem Prozess produzierten NADH schließlich auch noch rund 5 ATP. Zwei Runden des Citratcyclus (eine Runde für jede Acetylgruppe) erzeugen rund 20 ATP. Somit kann, unter aeroben Bedingungen, d.h. wenn der Citratcyclus voll aktiv ist, ein Molekül Glucose potentiell rund 32 Moleküle ATP liefern. Im Gegensatz dazu werden unter anaeroben Verhältnissen pro Molekül Glucose nur zwei Moleküle ATP gebildet.

A.

Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase

Angesichts der großen Menge an ATP, die potentiell durch den Katabolismus von Kohlenhydraten über den Citratcyclus erzeugt werden kann, ist es nicht überraschend, dass der Eintritt von Acetyleinheiten in den Cyclus, die aus Kohlenhydratquellen stammen, reguliert wird. Eine entscheidende Bedeutung kommt der Kontrolle der Decarboxylierung von Pyruvat durch den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex zu, da diese Reaktion irreversibel ist und bei Säugetieren auch keine anderen Stoffwechselwege für die Synthese von Acetyl-CoA aus Pyruvat existieren. Hierfür sind zwei Regulationssysteme verantwortlich: 1. Produkthemmung durch NADH und Acetyl-CoA. Diese Verbindungen konkurrieren mit NAD* und CoA bei den entsprechenden Enzymen um die Bindungsstellen und verschieben damit auch die reversiblen Transacetylase- (E,) und Dihydrolipoyl-Dehydrogenasereaktionen (E3) in Richtung der Rückreaktion (Abb. 17.6). Ein hohes Verhältnis von [NADH] zu [NAD] und von [Acetyl-CoA] zu [CoA] stabilisiert somit die acetylierte Form von E,. Damit kann

EEE — >[ae] Be]

BEE —

632

Citratcyclus

Abb. 17.15 Kovalente Modifikation der eukaryotischen Pyruvat-Dehydrogenase. E, wird durch die spezifische Phosphorylierung eines seiner Ser-Reste, die durch Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase katalysiert wird, inaktiviert. Durch Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase wird diese Phosphorylgruppe hydrolysiert, wodurch E, reaktiviert wird.

P;

E,-OH (aktiv)

PyruvatDehydrogenaseKinase

PyruvatDehydrogenasePhosphatase

H,O

ATP

E,-OPO#- (inaktiv)

ADP

die an TPP gebundene Hydroxyethylgruppe von E, nicht übernommen werden, das TPP auf der E,-Untereinheit verbleibt in seiner Hydroxyethylform und die Geschwindigkeit der Pyruvatdecarboxylierung sinkt ab. 2. Kovalente Modifizierung durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von E,. In Eukaryoten aktivieren NADH und Acetyl-CoA als Produkte der Pyruvat-Dehydrogenasereaktion auch die mit dem Enzymkomplex assoziierte Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase. Die daraus resultierende Phosphorylierung eines Ser-Restes der Dehydrogenase inaktiviert den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex (Abb. 17.15). Insulin, das Hormon, welches das Vorhandensein ausreichender Energieressourcen signalisiert, hebt durch Aktivierung der Phosphoprotein-Phosphatase, welche die Phosphatgruppen von der Pyruvat-Dehydrogenase entfernt, die Inaktivierung wieder auf. Es sei daran erinnert, dass Insulin auch die Glykogensynthese durch Aktivierung der Phosphoprotein-Phosphatase aktiviert (Abschnitt 16.3B). Auf diese Weise erhöht Insulin, als Antwort auf das Ansteigen des Blutzuckers, sowohl die Synthese von Acetyl-CoA als auch die von Glykogen. Weitere Regulatoren des Pyruvat-Dehydrogenasesystems sind Pyruvat und ADP, welche die Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase hemmen, sowie Ca?*, das die PyruvatDehydrogenase-Kinase hemmt und die Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase aktiviert. Im Gegensatz zum Kontrollsystem des Glykogenstoffwechsels (Abschnitt 16.3B) hat CAMP keinen Einfluss auf die Aktivität der Pyruvat-Dehydrogenase.

B.

Die geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme des Citratcyclus

Um zu verstehen wie ein Stoffwechselweg kontrolliert wird, müssen die Enzyme, welche geschwindigkeitsbestimmende Schritte katalysieren, die in-vitroEffektoren der Enzyme und die in-vivo-Konzentrationen dieser Substanzen ermittelt werden. Ein vorgeschlagener Kontrollmechanismus eines Stoffwechselflusses muss innerhalb des physiologischen Konzentrationsbereichs des Effektors wirksam sein. Beim Citratcyclus ist die Identifizierung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts viel schwieriger als bei der Glykolyse, weil die meisten Metabolite des Cyclus sowohl in den Mitochondrien als auch im Cytosol vorhanden sind und ihre Verteilung zwischen diesen beiden Kompartimenten nicht bekannt ist (es sei daran erinnert, dass zur Identifizierung der geschwindigkeitsbestimmenden Schritte eines Stoffwechselwegs die AG-Werte aller seiner Reaktionen für die aktuellen Konzentrationen der Substrate und Produkte bestimmt werden müssen). Aber hier soll angenommen werden, dass die Kompartimente miteinander im Gleichgewicht stehen. Daher wird zur Berechnung der mitochondrialen Konzentrationen die Gesamtkonzentration der jeweiligen Substanzen in der Zelle eingesetzt. In Tabelle 17.2 sind für die acht Enzymreaktionen des Citratcyclus die Änderungen der Freien Standardenthalpien und die ermittelten, physiologisch relevanten Änderungen der Freien Enthalpien bei Herzmuskel- oder Lebergewebe angegeben. Es ist ersichtlich, dass unter physiologischen Bedingungen für eine gleichgewichtsferne Reaktion (negative AG-Werte) drei Enzyme in Frage kommen: Citrat-Synthase, die NAD*-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase und a-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Folglich sind diese die geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme des Cyclus.

Regulation des Citratcyclus

633

Tab. 17.2 Änderungen der Freien Standardenthalpien (AG°’) und der physiologisch relevanten Freien Enthalpien (AG) für die Reaktionen des Citratcyclus. \ AG

’ 4 ri “1 \‘ (k)-mol )

NG”

1!

Citrat-Synthase

-31,5

negativ

2

Aconitase

ca. 5

ca. 0

3

Isocitrat-Dehydrogenase

-21

negativ

4

a-Ketoglutarat-DehydrogenaseMultienzymkomplex

-33

negativ

5

Succinyl-CoA-Synthetase

2,1

ca. 0

6

Succinat-Dehydrogenase

+6

ca. 0

7

Fumarase

34

ca. 0

8

Malat-Dehydrogenase

+29,7

ca. 0

Im Herzmuskel, in welchem ein aktiver Citratcyclus vorliegt, verhält sich der Metabolitenfluss durch den Citratcyclus proportional zur Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauches

der Zellen.

Da

Sauerstoffverbrauch,

NADH-Reoxidation

und ATP-Bildung eng gekoppelt sind (Abschnitt 18.3), muss der Citratcyclus durch Feedback-Mechanismen reguliert werden, die NADH-Bildung und Energieverbrauch miteinander koordinieren. Anders als bei den geschwindigkeitsbestimmenden Enzymen der Glykolyse oder des Glykogenstoffwechsels, die den Metabolitenfluss durch ausgeklügelte Systeme allosterischer Kontrolle, Substratkreisläufe und kovalente Modifizierung kontrollieren, scheinen die regulatorischen Enzyme des Citratcyclus den Fluss vorwiegend durch drei einfache Mechanismen zu steuern:

’

Pyruvat Cat --->

+4-- -- N \

ı

\

Acetyl-CoA

-

Abb. 17.16 Regulation des Citratcyclus. Diese graphische Darstellung, welche die PyruvatDehydrogenase mit einbezieht, zeigt die Hemmstellen (rote Achtecke) und die als Hemmstoffe wirkenden Stoffwechselintermediate (gestrichelte rote Pfeile). ADP und Ca?* (grüne Punkte) sind Aktivatoren. @% siehe Animated Figures.

634

Citratcyclus

(1) Substratverfügbarkeit, (2) Produkthemmung und (3) kompetitive FeedbackHemmung durch im Cyclus nachfolgende Intermediate. Einige der hauptsächlichen Regulationsmechanismen sind in Abbildung 17.16 graphisch dargestellt. Beim Citratcyclus gibt es für die Flusskontrolle keinen singulären Kontrollpunkt. Vielmehr sind in die Flusskontrolle mehrere Enzyme einbezogen. Die vielleicht bedeutsamsten Regulatoren des Citratcyclus sind seine Substrate Acetyl-CoA und Oxalacetat sowie sein Produkt NADH. Sowohl Acetyl-CoA als auch Oxalacetat kommen in Mitochondrien in Konzentrationen vor, die für die Citrat-Synthase nicht sättigend sind. Daher variiert der Stoffwechselfluss durch die Enzyme mit der Substratkonzentration und wird durch die Substratverfügbarkeit kontrolliert. Es wurde bereits gezeigt, dass die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat durch die Aktivität der Pyruvat-Dehydrogenase reguliert wird. Die Konzentration von Oxalacetat, die im Gleichgewicht mit der von Malat steht, schwankt mit dem Verhältnis [NADH]/[NAD*] entsprechend der Gleichgewichtsbeziehung [Oxalacetat] [NADH] [Malat|[NAD* ] Wenn z.B. das Arbeitspensum der Muskeln und die Atmungsrate ansteigen, sinkt die NADH-Konzentration in den Mitochondrien. Der daraus resultierende Anstieg der Oxalacetatkonzentration stimuliert die Citrat-Synthasereaktion, welche die Geschwindigkeit der Citratbildung kontrolliert. Aconitase arbeitet nahe dem Gleichgewicht, so dass die Geschwindigkeit des Citratverbrauchs von der Aktivität der NAD*’-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase, die in vitro durch das Reaktionsprodukt NADH stark gehemmt wird, abhängt. Citrat-Synthase wird ebenfalls durch NADH gehemmt, reagiert aber auf Veränderungen der NADH-Konzentration weniger empfindlich als die Isocitrat-Dehydrogenase. Weitere Beispiele für Produkthemmungen im Citratcyclus sind die Hemmung der Citrat-Synthase durch Citrat (Citrat konkurriert mit Oxalacetat) und die Hemmung der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase durch NADH und Succinyl-CoA. Succinyl-CoA konkurriert außerdem in der Citrat-Synthasereaktion mit AcetylCoA (kompetitive Feedback-Hemmung). Dieses ineinander greifende System trägt dazu bei, dass ein koordiniert regulierter Ablauf des Citratcyclus aufrechterhalten wird und dass die Konzentrationen seiner Zwischenprodukte innerhalb bestimmter Grenzen bleiben.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Welche Schritte des Citratcyclus regulieren den Fluss durch den Cyclus? 2. Beschreiben Sie die Funktionen von Ca’*, Acetyl-CoA und NADH bei der Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase und des Citratcyclus.

Zusätzliche Regulationsmechanismen

Bei in vitro-Untersuchungen von Enzymen des Citratcyclus wurden einige allosterische Aktivatoren und Inhibitoren nachgewiesen. ADP ist ein allosterischer Aktivator der Isocitrat-Dehydrogenase, wohingegen ATP dieses Enzym hemmt. Ca’* reguliert - zusätzlich zu seinen vielen anderen zellulären Funktionen — den Citratcyclus an verschiedenen Stellen. Es aktiviert die Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase (Abb. 17.15) und diese ihrerseits - zur Bildung von AcetylCoA - den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex. Ca?* aktiviert außerdem sowohl Isocitrat-Dehydrogenase als auch a-Ketoglutarat-Dehydrogenase (Abb. 17.16). Auf diese Weise stimuliert das die Muskelkontraktion auslösende Ca’*-Signal auch die Bildung von ATP, das den Brennstoff dafür liefert.

5

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen

Auf den ersten Blick scheinen Stoffwechselwege entweder katabol, mit Freisetzung und Speicherung von Freier Enthalpie, oder anabol, mit Verbrauch von Freier Enthalpie, zu sein. Der Citratcyclus ist einerseits katabol, weil er Abbau-

reaktionen beinhaltet. Bei den meisten Organismen ist er der vorherrschende

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen CO,

Pyruvat

Amino-

säuren

Fett-

N

Glucose

Asparat Phenylalanin Tyrosin a

säuren

Oxal Ace

Cholesterin

‚Ma

F

N Succinyl-CoA

Porphyrine /

ao

Isoleucin

säuren

Methionin nn

Fettsäuren mit ungeradzahliger Kettenlänge

Stoffwechselweg zur Umwandlung und Konservierung Freier Enthalpie. Um diese degradative Funktion des Cyclus aufrechtzuerhalten, werden seine Intermediate nur in katalytischen Mengen benötigt. Aber andererseits verwenden verschiedene biosynthetische Stoffwechselwege Intermediate des Citratcyclus als Ausgangsmaterialien für anabole Reaktionen. Der Citratcyclus ist daher amphibol (sowohl anabol als auch katabol). In diesem Abschnitt werden einige der Reaktionen untersucht, die Intermediate in den Citratcyclus einspeisen oder sie ihm entziehen. Außerdem wird der Glyoxylatcyclus betrachtet, eine Variante des Citratcyclus, die in Pflanzen (und Bakterien) vorkommt und Acetyl-CoA zu Oxalacetat umsetzt. Einige der Reaktionen, die Intermediate des Citratcyclus verbrauchen oder ersetzen, sind in Abbildung 17.17 zusammengefasst.

A.

Stoffwechselwege, die Intermediate des Citratcyclus verbrauchen

Reaktionen, die die Zwischenprodukte des Citratcyclus verwerten und so den Citratcyclus leeren, nennt man kataplerotische Reaktionen (entleerend; von griechisch: kata, herab und plerotikos, füllend). Diese Reaktionen dienen nicht nur dazu, wichtige Produkte zu synthetisieren, sondern auch dazu eine Anhäufung von Zwischenprodukten

des Citratcyclus in den Mitochondrien zu vermeiden,

zum Beispiel dann, wenn in großem Umfang Aminosäuren zu Zwischenprodukten des Citratcyclus abgebaut werden. Kataplerotische Reaktionen kommen in den folgenden Stoffwechselwegen vor: 1. Die Biosynthese von Glucose (Gluconeogenese) verwertet Oxalacetat (Abschnitt 16.4). Da die Gluconeogenese im Cytosol stattfindet, muss Oxalacetat für den Transport aus dem Mitochondrion heraus in Malat oder Aspartat umgewandelt werden (Abb. 16.20). Da es sich bei dem Citratcyclus um einen cyclischen Stoffwechselweg handelt, kann jedes seiner Zwischenpro-

635

Abb. 17.17 Amphibole Funktionen des Citratcyclus. Diese graphische Darstellung gibt die Stellen an, bei denen Intermediate für die Verwendung in anabolen Stoffwechselwegen (rote Pfeile) abgezogen werden und bei denen anaplerotische Reaktionen (grüne Pfeile) die Cyclusintermediate ‚auffüllen. Die Reaktionen der Transaminierung und Desaminierung von Aminosäuren sind reversibel. Sie laufen in beiden Richtungen ab, je nachdem wie es die Stoffwechselsituation erfordert. 6% siehe Animated Figures.

636

Citratcyclus

dukte in Oxalacetat umgewandelt werden und für die Gluconeogenese verwendet werden. 2. Die Fettsäurebiosynthese ist ein Prozess, der im Cytosol stattfindet und Acetyl-CoA erfordert. Acetyl-CoA wird in den Mitochondrien gebildet, aber nicht durch die mitochondriale Membran transportiert. Daher wird Acetyl-CoA im Cytosol durch Spaltung von Citrat, welches die Membran durchqueren kann, in einer durch ATP-Citrat-Lyase katalysierten Reaktion erzeugt (Abschnitt 20.4A). Diese Reaktion nutzt die Freie Enthalpie aus ATP, um die Citrat-Synthasereaktion umzukehren: ATP + Citrat + CoA — ADP + P; + Oxalacetat + Acetyl-CoA

3. a-Ketoglutarat und Oxalacetat werden als Vorstufen bei der Biosynthese von Aminosäuren verwendet. Zum Beispiel wird a-Ketoglutarat durch reduktive Aminierung, die durch Glutamat-Dehydrogenase katalysiert wird, zu Glutamat umgesetzt. Hierfür wird NADH oder NADPH benötigt.

Pr

CHIEF |

-NADEV FH

ONE

T—=0O

|

ic: |

+

NAD* + H,O

#—C--NE;

|

coo-

coo-

a-Ketoglutarat

Glutamat

Oxalacetat geht eine Transaminierung mit Alanin unter Bildung von Aspartat und Pyruvat ein (Abschnitt 21.2A). coo-

0=0

coo°

+ HN—C—H En een

En

cHz

coo Oxalacetat

B.

coo-

Um

coo-

+

co CH;

—— Alanin

Aspartat

Pyruvat

Reaktionen, die Intermediate des Citratcyclus auffüllen

Bei aeroben Organismen ist der Citratcyclus die Hauptquelle der Freien Enthalpie. Die katabole Funktion des Citratcyclus darf daher nicht unterbrochen werden und Intermediate des Cyclus, die abgeschöpft wurden, müssen daher wieder nachgefüllt werden. Die Auffüllreaktionen werden als anaplerotische Reaktionen bezeichnet (griech.: ana, auf; plerotikos, füllend). Die wichtigste dieser ReaktioEn wird durch die Pyruvat-Carboxylase katalysiert, die aus Pyruvat Oxalacetat bildet: Pyruvat + CO, + ATP + H,O — Oxalacetat

+ ADP + P;

(Dies ist auch ein Schritt der Gluconeogenese; Abschnitt 16.4A). Pyruvat-Carboxylase „spürt“ den erhöhten

Bedarf an Intermediaten

des Citratcyclus durch

ihren Aktivator, das Acetyl-CoA. Jeder Abfall der Cyelusgeschwindigkeit, die durch zu wenig Oxalacetat oder andere Intermediate verursacht wird, führt zu einem An-

stieg von Acetyl-CoA. Dieses aktiviert Pyruvat-Carboxylase, die Oxalacetat ergänzt.

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen

Die Reaktionen des Citratcyclus setzen Oxalacetat zu Citrat, a-Ketoglutarat, Succinyl-CoA und so weiter um, bis alle Intermediate wieder auf das erforderliche Niveau gebracht worden sind. Ein Konzentrationsanstieg der Zwischenprodukte des Citratcyclus fördert eine erhöhte Flussrate von Acetylgruppen durch den Cyclus. Beispielsweise kann in Muskelzellen während intensiver körperlicher Betätigung die Flussrate durch den Citratcyclus unter Umständen auf das 60- bis 100fache ansteigen. Allerdings geht nicht der gesamte Anstieg auf die erhöhten Konzentrationen an Zwischenprodukten des Cyclus zurück (diese steigen nur um das Vierfache). Auch andere Regulationsmechanismen (wie in Abschnitt 17.4B beschrieben) fördern die Flussrate durch Steigerung der geschwindigkeitssteuernden Schritte des Cyclus. Bei körperlicher Betätigung wird ein Teil des durch die erhöhte glykolytische Flussrate erzeugten Pyruvats zur Oxalacetatsynthese gelenkt, an der die PyruvatCarboxylase beteiligt ist. Pyruvat kann aber auch durch die Transaminierungsreaktion eine Aminogruppe von Glutamat aufnehmen und in Alanin (das Aminosäure-Pendant von Pyruvat) umgewandelt werden. Dabei entsteht aus dem Glutamat a-Ketoglutarat, ein Zwischenprodukt des Citratcyclus. Beide Mechanismen helfen dem Citratcyclus, effizient die Acetylgruppen zu katabolisieren, die aus den Reaktionen des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes stammen. Glykolyse

Das Endergebnis ist eine erhöhte ATP-Bildung, um die Muskelkontraktion mit Energie zu versorgen.

Andere Metabolite, die in den Citratcyclus einfließen, sind Succinyl-CoA, ein Produkt des Abbaus von Fettsäuren mit ungeradzahliger Kettenlänge (Abschnitt 20.2E) und bestimmter Aminosäuren (Abschnitt 21.4), sowie a-Ketoglutarat und Oxalacetat, die durch reversible Transaminierung bestimmter Aminosäuren gebildet werden (wie oben gezeigt). Die Verbindungen zwischen dem Citratcyclus und anderen Stoffwechselwegen bieten einige Anhaltspunkte für seine Evolution (Exkurs 17.3).

637

638

Citratcyclus

Die Evolution des Citratcyclus Der Citratcyclus ist in aeroben Organismen allgegenwärtig und spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel dieser Zellen. Dass ein Cyclus aus acht Schritten spontan entstanden ist, erscheint ziemlich unwahrscheinlich. Er muss sich aus einer einfacheren Reihe von enzymkatalysierten Reaktionen entwickelt haben. Wenn man den Stoffwechsel von Zellen untersucht, die den frühen Lebensformen

ähneln, erhält

man Anhaltspunkte für die Ursprünge. Solche Organismen haben sich vor rund 3 Milliarden Jahren entwickelt, bevor es nennenswerte Mengen an atmosphärischem Sauerstoff gab. Diese Zellen verwendeten vermutlich Schwefel als basales Oxidationsmittel und reduzierten ihn zu H»S. Ihre modernen Pendants sind anaerobe autotrophe Mikroorganismen. Diese gewinnen die Energie auf eine Weise, die nicht von Reaktionswegen abhängt, die kohlenstoffhaltige Verbindungen oxidieren. Solche Organismen verwenden deshalb keinen Citratcyclus, um reduzierte Cofaktoren zu erzeugen, die anschließend durch molekularen Sauerstoff oxidiert werden. Aber alle Organismen müssen die kleinen Bausteine synthetisieren, aus denen

sie Proteine,

Nucleinsäuren,

Kohlenhydrate

und Lipide herstellen können. Die Bioinformatik hat dazu beitragen, die Stoffwechselviel-

Methanococcus jannaschii, ein Organismus ohne Citratcyclus [Mit freundlicher Genehmigung von B. Boonyaratanakornkit, D.S. Clark und G. Vrdoljak, University of California at Berkeley.]

falt von Organismen zu enträtseln. Indem man die Sequenzen prokaryotischer Genome vergleicht und den verschiedenen homologen Genen Funktionen zuweist, ist es möglich, die zentralen Stoffwechselwege dieser Organismen zu rekonstruieren. Dieses Vorgehen war äußerst erfolgreich, denn viele „Haushalts“-Gene,

zu

Oxalacetat

führen,

am

stärksten

konserviert

sind. Dieser Teil des Stoffwechselwegs stellt einen Mechanismus

dar, um

Elektronen

Oxalacetat

NAD* Malat

die Enzyme codieren, die der Zelle

molekulare Bausteine zur Verfügung stellen, sind unter verschiedenen Spezies hoch konserviert und daher relativ leicht zu identifizieren. Die Genomanalyse hat ergeben, dass viele Prokaryoten keinen Citratcyclus haben. Diese Organismen enthalten aber Gene für einige Enzyme des Citratcyclus. Es scheint, dass die vier letzten Reaktionsschritte des Cyclus, die von Succinat

NADH

aufzunehmen,

die während

der

Zuckerfermentierung freigesetzt werden. Die Umkehr dieses Stoffwechselwegs könnte z.B. NAD* aus NADH regenerieren, das im Glycerinaldehyd-3-phosphat-DehydrogenaseSchritt der Glycolyse gebildet wird.

Fumarat

NADH NAD*

Sucecinat

Das entstehende Succinat könnte dann als Ausgangsmaterial für die Biosynthese anderer Verbindungen verwendet werden. Viele Archaea besitzen eine Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase, die Pyruvat zu Acetyl-CoA umwandelt (allerdings ohne NADH zu bilden). In einer primitiven Zelle könnten die entstehenden Acetylgruppen (durch die Tätigkeit der Citrat-Synthase) mit Oxalacetat kondensiert und schließlich

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen zu einer oxidativen Reaktionsabfolge geführt haben, die den allerersten Schritten des heutigen Citratcyclus ähneln. Das auf diese Weise erzeugte a-Ketoglutarat kann zu Glutamat und anderen Aminosäuren umgewandelt werden. Acetyl-C

Plauen; SR

Man

hat in mehreren

modernen

eines solchen Stoffwechselwegs katalysieren. Dieser reduzierende Stoffwechselweg kommt in manchen Archaea vor und existierte bereits vor den CO,-fixierenden Stoffwechselwegen, i : : : die von manchen photosynthetisch aktiven Bakterien und den Chloroplasten der grünen Pflanzen genutzt werden. (Abschnitt 19.3A).

[’&tucose| Phosphoenolpyruvat

Isocitrat NAD* Pyruvat

NADH

a-Ketoglutarat

Are

LEoA E=

Der reduzierende und der oxidierende Zweig des bis jetzt skizzierten Citratcyclus sind in modernen Bakterienzellen wie E. coli noch aktiv, wenn diese anaerob wachsen. Dies lässt vermuten, dass ähnliche Stoffwechselwege die metabo-

lischen Anforderungen der frühen Zellen erfüllt haben könnten. Die Entwicklung eines vollständigen Citratcyclus, in dem die beiden Zweige verknüpft sind und beide in eine oxidative Richtung weiterlaufen (in der Abbildung im Uhrzeigersinn dargestellt), hätte ein Enzym wie a-Ketoglutarat:Ferredoxin-Reduktase (ein Homolog der Pyruvat: FerredoxinOxidoreduktase) erforderlich gemacht, um a-Ketoglutarat mit Succinat zu verknüpfen. Interessanterweise hätte ein primitiver, umgekehrt arbeitender (gegen den Uhrzeigersinn dargestellter) Citratcyclus einen Weg für die CO,-Fixierung bieten können (d.h. den Einbau von CO, in biologische Moleküle).

C.

Oxalacetat

Succinat

Der Glyoxylatcyclus und der Citratcyclus haben einige Schritte gemeinsam

Pflanzen, Bakterien und Pilze - nicht aber Tiere — besitzen Enzyme, die die Nettoumwandlung von Acetyl-CoA in Oxalacetat ermöglichen. Dieses kann für die Gluconeogenese verwendet werden. In Pflanzen bilden diese Enzyme den Glyoxylatcyclus (Abb. 17.18), der in zwei Zellkompartimenten abläuft: im Mitochondrion und im Glyoxysom, einer membranumhüllten pflanzlichen Organelle, bei der es sich um ein spezialisiertes Peroxisom handelt. Die meisten Enzyme des Glyoxylatcyclus sind die gleichen wie im Citratcyclus. Der Glyoxylatweg besteht aus fünf Reaktionen (Abb. 17.18): Reaktion 1 und 2. Glyoxysomales Oxalacetat kondensiert mit Acetyl-CoA und

Reaktion 3. Reaktion 4.

Bakterien

Gene identifiziert, die Enzyme codieren, welche die Schritte

Citrat

29

autotrophen

639

bildet Citrat, das wie im Citratcyclus isomerisiert wird. Da das Glyoxysom keine Aconitase enthält, findet Reaktion 2 vermutlich im Cytosol statt. Die glyoxysomale Isocitrat-Lyase spaltet das Isocitrat in Succinat und Glyoxylat (daher hat der Cyclus seinen Namen). Das glyoxysomale Enzym Malat-Synthase kondensiert Glyoxylat mit einem zweiten Molekül Acetyl-CoA, sodass Malat entsteht.

Citrat

640

Citrateyclus Gliyoxysom Aconitase

on

Bd |

|

Mitochondrion

3 Gluconeogenese i

+——

||

000° —C—CH

NADH +H* + NAD — c00O”

Oxalacetat

on Y

+

&

BOOT CH—CH

ECHO

2

Malat

Abb. 17.18 Gilyoxylatcyclus. Der Stoffwechselweg ergibt netto die Umwandlung von zwei Acetyl-CoA zu Succinat im Glyoxysom. Succinat kann im Mitochondrion in Malat umgewandelt werden und dann in die Gluconeogenese fließen. Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase sind Enzyme, die nur in den Glyoxysomen vorkommen (diese wiederum gibt es nur in Pflanzen). Im Schema sind diese Enzyme blau unterlegt. (1) Die glyoxysomale Citrat-Synthase katalysiert die Kondensation von Oxalacetat und Acetyl-CoA zu Citrat. (2) Die cytosolische Aconitase katalysiert die Umwandlung von Citrat in Isocitrat. (3) Isocitrat-Lyase katalysiert die Spaltung von Isocitrat in Succinat und Glyoxylat. (4) Malat-Synthase katalysiert die Kondensation von Glyoxylat und Acetyl-CoA zu Malat. (5) Die glyoxysomale Malat-Dehydrogenase katalysiert die Oxidation von Malat zu Oxalacetat, dabei schließt sich der Kreis. (6) Succinat wird zum Mitochondrion transportiert, wo es mithilfe des Citratcyclus zu Malat umgewandelt wird. (7) Malat wird zum Cytosol befördert, wo die Malat-Dehydrogenase seine Oxidation zu Oxalacetat katalysiert; dieses kann dann für die Gluconeogenese verwendet werden. (8) Alternativ kann Malat weiter den Citratcyclus durchlaufen, wodurch der Glyoxylatcyclus anaplerotisch wird.

Mit dem Citratcyclus verbundene Reaktionen

Reaktion 5.

Die glyoxysomale Malat-Dehydrogenase katalysiert mithilfe von NAD* die Oxidation von Malat zu Oxalacetat. Der Glyoxylatcyclus ergibt die Nettoumwandlung von zwei Acetyl-CoA zu Succinat

anstatt bis zu vier Molekülen CO,, wie es im Citratcyclus der Fall wäre. Das in Reak-

tion 3 gebildete Succinat wird zum Mitochondrion transportiert, wo es in den Citrateyclus eingeschleust und zu Malat umgewandelt wird. Für Malat gibt es zwei alternative Verwendungen: (1) Es kann im Mitochondrion zu Oxalacetat umgewandelt werden und den Citratcyclus weiter durchlaufen, dabei wird der Glyoxylatcyclus zu einem anaplerotischen Prozess (Abschnitt 17.5B). (2) Es kann ins Cytosol befördert werden, wo es zu Oxalacetat umgewandelt wird und in die Gluconeogenese Eingang findet. Die Nettoreaktion des Glyoxylatcyclus ist somit die Bildung von Oxalacetat aus zwei Molekülen Acetyl-CoA: 2 Acetyl -CoA + 2 NAD*+ Oxalacetat

FAD—

+ 2 CoA + 2 NADH

+ FADH,+2

H*

Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase kommen nur bei Pflanzen vor. Diese Enzyme befähigen keimende Samen, ihre gespeicherten Triacylglycerine zu Acetyl-CoA und dann zu Glucose umzuwandeln. Man hat lange Zeit angenommen, dass dies eine Voraussetzung für die Keimung sei. Aber eine Mutante von Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand, ein Kreuzblütlergewächs und als Modellorganismus in der Pflanzengenetik vielfach untersucht), der die Isocitrat-Lyase fehlt und die somit keine Lipide in Kohlenhydrate umwandeln kann, keimte trotzdem. Der Keimungsprozess wurde nur dann gehemmt, wenn die mutierten Pflanzen bei geringem Licht gehalten wurde. Deshalb scheint die Bedeutung des Glyoxylatcyclus für die Samenkeimung in seiner anaplerotischen Funktion zu liegen: Er liefert dem Citratcyclus Einheiten mit vier Kohlenstoffatomen (C4-Einheiten), die dann das aus Triacylglycerin entstandene Acetyl-CoA oxidieren können. Organismen, die keinen Glyoxylatweg haben, können aus Acetyl-CoA keine Nettosynthese von Glucose betreiben. Dies ist der Grund, warum der Mensch Fette (d.h. Fettsäuren, die zu Acetyl-CoA katabolisiert werden) nicht in Kohlenhydrate (d.h. Glucose) umwandeln kann. Manche Krankheitserreger beim Menschen nutzen den Glyoxylatcyclus mitunter sehr zu ihrem Vorteil. Der Tuberkuloseerreger Mycobacterium tuberculosis z.B. kann über Jahre in der Lunge persistieren, ohne vom Immunsystem attackiert zu werden. Während dieser Phase ernährt sich das Bakterium größtenteils von Lipiden und verwendet den Citratcyclus, um die Vorstufen für die Aminosäuresynthese zu bilden, und den Glyoxylatcyclus, um die Kohlenhydratvorstufen zu bilden. Arzneistoffe, die darauf abzielen, die bakterielle Isocitrat-Lyase zu hemmen, können potentiell das Überleben des Krankheitserregers einschränken. Auch die Virulenz der Hefe Candida albicans - die oft immunsupprimierte Personen infiziert - kann von der Aktivierung des Glyoxylatcyclus abhängen, wenn sich die Hefezellen innerhalb der Makrophagen einnisten.

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 Il, Erklären Sie, wie ein katalytischer

Cyclus die Vorstufen für andere Stoffwechselwege bereitstellen kann, ohne dass er an seinen eigenen Intermediaten verarmt. Beschreiben Sie die Reaktionen des Glyoxylatcyclus.

641

642

Citratcyclus

Zusammenfassung

L—————————————————————————————————————————————

!: Um eine Acetylgruppe zu zwei Molekülen CO, zu oxidieren, führen die acht

Enzyme des Citratcyclus einen mehrstufigen, katalytischen Kreisprozess durch und erzeugen dabei gleichzeitig drei NADH, ein FADH, und ein GTP. Die letztendlich aus den reduzierten Coenzymen durch Reduktion von Sauerstoff abgegebene Freie Enthalpie wird zur Bildung von ATP verwendet. Acetylgruppen fließen in den Citratcyclus als Acetyl-CoA ein. Acetyl-CoA wird aus dem Glykolyseprodukt Pyruvat durch den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex gebildet. Dieser besteht aus drei verschiedenen Enzymen und fünf Arten von Coenzymen. Der flexible Lipoyllysyl-Arm von E, wirkt wie ein Pendel, das reaktive Gruppen zwischen den Enzymen des Komplexes hin und her transportiert. Citrat-Synthase katalysiert in einer stark exergonen Reaktion die Kondensation von Acetyl-CoA und Oxalacetat. Aconitase katalysiert die Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat und IsocitratDehydrogenase dessen oxidative Decarboxylierung zu a-Ketoglutarat, wobei das erste CO, und das erste NADH des Citratcyclus gebildet werden. a-Ketoglutarat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von a-Ketoglutarat unter Bildung von Succinyl-CoA sowie des zweiten CO, und des zweiten NADH des Citratcyclus. Succinyl-CoA-Synthetase koppelt über die Bildung eines Phosphorylproteinintermediats die Spaltung von Succinyl-CoA mit der Synthese von GTP (oder in einigen Organismen von ATP). Die verbleibenden drei Reaktionen des Citratcyclus regenerieren - um den Citratcyclus in Gang zu halten — Oxalacetat. Sie werden durch SuccinatDehydrogenase, Fumarase und Malat-Dehydrogenase katalysiert. Der Zufluss von Acetyl-CoA zum Citratcyclus wird auf der Stufe der PyruvatDehydrogenase durch Produkthemmung (NADH und Acetyl-CoA) und durch kovalente Modifikation reguliert. Der Citratcyclus selbst wird an den durch die Citrat-Synthase, die NAD*abhängige Isocitrat-Dehydrogenase und die a-Ketoglutarat-Dehydrogenase katalysierten Schritten reguliert. Die Regulation erfolgt hauptsächlich durch die Verfügbarkeit von Substrat sowie durch Produkt- und/oder FeedbackHemmung. 10. Kataplerotische Reaktionen verbrauchen die Zwischenprodukte (Inter-

mediate) des Citratcyclus. Einige Intermediate des Citratcyclus sind Substrate für die Gluconeogenese, Fettsäuresynthese und Aminosäuresynthese. 1kıl, Die Intermediate des Citratcyclus werden durch anaplerotische Reaktionen,

wie z.B. die der Pyruvat-Carboxylase, wieder aufgefüllt. 128 Der bei Pflanzen, nicht aber bei Tieren, anzutreffende Glyoxylatcyclus

benötigt die in den Glyoxysomen vorkommenden Enzyme Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase. Diese Variante des Citratcyclus ermöglicht die Synthese von Glucose aus Acetyl-CoA.

Wichtige Begriffe ee nr

Citratcyclus Multienzymkomplex Lipoyllysyl-Arm

amphiboler Stoffwechselweg Glyoxylatcyclus kataplerotische Reaktion

anaplerotische Reaktion Glyoxsysom

———————————

Aufgaben

643

Aufgaben u Enns u 1; (a) Erklären Sie warum obligate Anaerobier einige Enzyme

des Citratcyclus enthalten. (b) Warum haben diese Organismen keinen vollständigen Citratcyclus? Die ersten Lebewesen auf der Erde könnten chemoautotrophe Organismen gewesen sein, bei denen der Citratcyclus entgegengesetzt arbeitete, um atmosphärisches CO, in organische Verbindungen einzubauen. Vervollständigen Sie einen katalytischen Cyclus, der mit der Gesamtreaktion Succinat + 2 CO, — Citrat beginnt. Welcher der fünf Schritte der Reaktion des PyruvatDehydrogenase-Komplexes ist höchstwahrscheinlich metabolisch irreversibel? Erklären Sie. Erklären Sie, warum jemand mit einem Mangel an Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase (PDP) keine körperliche Anstrengung verträgt. Das CO,, das in einer Runde des Citratcyclus gebildet wird, enthält nicht den in derselben Runde eingespeisten Acetylkohlenstoff. (a) Wie viele Runden des Cyclus werden benötigt bis '*CO, freigesetzt wird, wenn Acetyl-CoA am Carbonylkohlenstoffatom mit '*C markiert wird? (b) Wie viele Runden dauert es, wenn Acetyl-CoA an seiner Methylgruppe markiert wird? Erklären Sie, warum durch Anhäufung mancher Zwischenprodukte des Citratcyclus eine metabolische Acidose (Exkurs 2.1) entstehen kann. Der a-Ketosäure-Dehydrogenasekomplex für verzweigtkettige a-Ketosäuren, welcher am Aminosäuren-Katabolismus beteiligt ist, enthält wie der Pyruvat-Dehydrogenaseund der a-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex die gleichen drei Arten von Enzymen. Zeichnen Sie das Reaktionsprodukt von Valin, wenn es in der gleichen Weise wie bei der Reaktion Glutamat = a-Ketoglutarat desaminiert (Abschnitt 17.5A) und dann durch die a-KetosäureDehydrogenase für verzweigtkettige a-Ketosäuren weiter

umgesetzt wird. Erklären Sie anhand der Tabelle 14.5, warum FAD und nicht NAD* bei der Reaktion der Succinat-Dehydrogenase verwendet wird. Bei der Reaktion der Succinat-Dehydrogenase ist Malonat ein kompetitiver Hemmstoff gegenüber Succinat. Erklären Sie, wieso durch eine Erhöhung der Konzentration von Oxalacetat die Hemmung durch Malonat überwunden werden kann. 10. Warum ist es von Vorteil, dass Citrat, das Produkt der Reaktion 1 des Citratcyclus, die Phosphofructokinase hemmt, die die dritte Reaktion der Glykolyse katalysiert? {ll Anaplerotische Reaktionen ermöglichen die Verwendung von Citratcyclusintermediaten für biosynthetische Stoffwechselwege, ohne dass deren Konzentration absinkt. Schreiben Sie die Gleichung für die Nettosynthese von Citrat aus Pyruvat auf.

12. Viele Aminosäuren werden zu Zwischenprodukten des Citratcyclus abgebaut. (a) Warum können diese Aminosäuren-,„Überreste“ im Citratcyclus nicht direkt zu CO, oxidiert werden? (b) Erklären Sie, warum zu Pyruvat abgebaute Aminosäuren im Citratcyclus dennoch vollständig oxidiert werden können. 13. Bestimmte Mikroorganismen mit einem unvollständigen Citratcyclus decarboxylieren a-Ketoglutarat und bilden dabei Succinatsemialdehyd. Eine Dehydrogenase wandelt dann Succinatsemialdehyd zu Succinat um. a

CH, |

CO, }

CH, |

coo-

NAD*

CH;

|

nn (0)

= „a a

NADH

cH, | CH;

|

coo

cooa-Ketoglutarat

Succinatsemialdehyd

Succinat

Diese Reaktionen können mit anderen Standardreaktionen des Citratcyclus kombiniert werden, sodass ein Stoffwechselweg von Citrat zu Oxalacetat entsteht. Vergleichen Sie die Ausbeute an ATP und reduzierten Cofaktoren des Standard- und des alternativen Wegs. 14. Berechnen Sie aus folgenden Angaben den physiologischen AG-Wert für die Reaktion der Isocitrat-Dehydrogenase bei 25°C und pH 7,0: [NAD"]/[NADH] = 8, [a-Ketoglutarat] = 0,1 mM und [lsocitrat] = 0,02 mM. Für CO, sind Standardbedingungen anzunehmen (AG°’ ist in Tab. 17.2 angegeben). Stellt diese Reaktion eine geeignete Kontrollstelle für den Stoffwechsel dar? 15. Obwohl Tiere keine Glucose aus Acetyl-CoA bilden können, ist nach Fütterung einer Ratte mit '*C-markiertem Acetat ein Teil des Markers in aus Muskel extrahiertem Glykogen zu finden. Erklären Sie dies.

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 21

Characterization of Pyruvate Carboxylase from Methanobacterium thermoautotrophicum Pyruvate carboxylase is discovered in a bacterium that was previously thought not to contain the enzyme.

644

Citratcyclus

Literatur Eastmond, P.J. und Graham, I. A., Re-examining the role ofthe glyoxylate cycle in oilseeds, Trends Plant Sci. 6, 72-77 (2001). Huynen, M.A., Dandekar, T. und Bork, P., Variation and evolution of the citric-acid cycle: a genomic perspective, Trends Microbiol. 7, 281-291 (1999). [Erläutert, wie Untersuchungen des Genoms die Rekonstruktion eines Stoffwechselwegs ermöglichen.) Milne, J.L. S., Wu, X., Borgnia, M.]., Lengyel, J.S., Brooks, B.R., Shi, D., Perham, R. N und Subramaniam, S., Molecular structure of a 9-MDa icosahedral pyruvate dehydrogenase subcomplex containing the E2 and E3 enzymes using cryoelectron microscopy, J. Biol. Chem. 281,

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Owen, O.E., Kalhan, S.C. und Hanson, R. W., The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function, J. Biol. Chem. 277, 30409-30412 (2002). [Beschreibt die Zu- und Abflüsse der CitratcyclusIntermediate in verschiedenen Organen.) Perham, R.N., Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions, Annu. Rev. Biochem. 69, 961-1004 (2000). [Eine gute Übersicht zu Multienzymkomplexen.]

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R

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1b

Ein menschlicher Körper verbraucht im Ruhezustand ungefähr 420 kJ pro Stunde, nur wenig mehr als der Energieverbauch einer 100 Watt-Glühbirne. Diese Energie wird im Körper auf elektrochemischem Wege in den Mitochondrien erzeugt. Die dabei erzeugte Spannung ist mit 0,2 V eher bescheiden (der Stromanschluss im Haushalt liefert mehr als das Tausendfache, nämlich 220 V), die Stromstärke von etwa 500 Ampere dagegen ist beachtlich. Sie kommt durch die transmembrane Bewegung von annähernd 3 X 10° Protonen pro Sekunde zustande. Diese Bewegung treibt die ATP-Synthese an.

[Corbis Digital Stock.]

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung Elektronentransport und

Elektronisches Zusatzmaterial

oxidative Phosphorylierung

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet)

e Das Mitochondrion

Guided Exploration 17 Guided Exploration 18 Guided Exploration 19 Interactive Interactive Interactive Interactive

Animated Animated Animated Animated

Exercise Exercise Exercise Exercise

Figure Figure Figure Figure

Elektronentransport e Oxidative Phosphorylierung ® Kontrolle der ATP-Bildung

19 20 21 22

18-8 18-20 13-24 18-29

Kinemage 5 Case Study 24 Case Study 27 Case Study 33

Während des Oxidationsprozesses erzeugen aerobe Organismen aus den Brennstoffen des Stoffwechsels unter Sauerstoffverbrauch Kohlendioxid. Die vollständige Oxidation von Glucose (C;H,,0,) durch Sauerstoff, CGH120%

+6

OÖ, —6

CO;

+6

H>,0

kann in zwei Teilreaktionen des Stoffwechsels aufgeteilt werden. In der ersten werden die Kohlenstoffatome der Glucose oxidiert: C;H1205

+ 6 HzO —

6 CO;

+ 24 H’

+24

©

und in der zweiten wird molekularer Sauerstoff reduziert:

60,

+ 24H*

+24

© — 12 H;0

Wie wir bereits gesehen haben, wird die erste Teilreaktion durch die Enzyme der Glykolyse und des Citratcyclus ausgeführt (der Abbau der Fettsäuren — des anderen bedeutenden Typs von Stoffwechselbrennstoffen — erfordert ebenfalls den Citratcyclus). In diesem Kapitel wird der Stoffwechselweg beschrieben, durch den die Elektronen von reduzierten Brennstoffmolekülen auf molekularen Sauerstoff übertragen werden. Außerdem wird der Frage nachgegangen, wie die Energie der Brennstoffoxidation konserviert und zur Synthese von ATP genutzt wird. Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

648

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Abb. 18.1 Elektronenübertragungsschritte in der Gliykolyse und im Citratcyclus, bei denen NADH und FADH, gebildet werden.

Glykolyse

Glucose Glucose-6-phosphat

2 Glycerinaldehyd-3-phosphat

Glycerinaldehyd-|

_- 2aNAD+

3-phosphatDehydrogenase

2

>ONADH

1,3-Bisphosphoglycerat

2Pyruvat

2NAD+ PyruvatDehydrogenase

2NADH

2Acetyl-CoA

2NADH

Wie bereits beschrieben, werden die 12 Elektronenpaare, die während der Glucoseoxidation freigesetzt werden, nicht direkt auf den Sauerstoff übertragen. Vielmehr werden sie zunächst von den Coenzymen NAD* und FAD unter Bildung von 10 NADH und 2 FADH; (Abb. 18.1) übernommen. Entsprechende Reaktionen werden durch das glykolytische Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Abschnitt 15.2F), durch Pyruvat-Dehydrogenase (Abschnitt 17.2B) und durch die Citratcyclus-Enzyme Isocitrat-Dehydrogenase, a-Ketoglutarat-Dehydrogenase, Succinat-Dehydrogenase und Malat-Dehydrogenase katalysiert (Abschnitt 17.3). Anschließend treten die Elektronen in ein System von miteinander gekoppelten Elektronenüberträgern ein: die mitochondriale Elektronentransportkette. Während dieses Elektronentransportprozesses laufen folgende Vorgänge ab: 1. NADH und FADH, werden durch Übertragung der Elektronen auf andere Verbindungen zu NAD* und FAD reoxidiert, die so für weitere Substratoxidationsreaktionen zur Verfügung stehen. 2.

Bevor die übertragenen Elektronen jedoch O, zu H,O reduzieren, sind sie an

aufeinander folgenden Reduktions-Oxidations-Reaktionen von mehreren Redoxzentren beteiligt, die in insgesamt vier Enzymkomplexen vorkommen.

Das Mitochondrion

649

3. Während der Elektronenübertragung werden aus den Mitochondrien Protonen ausgestoßen, wodurch über die mitochondriale Membran ein Protonengradient aufgebaut wird. Die in diesem elektrochemischen Gradienten gespeicherte Freie Enthalpie ist die Triebkraft für die Synthese von ATP aus ADP + P; durch die oxidative Phosphorylierung.

1

Das Mitochondrion

Der Ort des eukaryotischen oxidativen Metabolismus ist das Mitochondrion (griech.: mitos, Faden; chondros,. Körnchen). Mitochondrien enthalten neben Pyruvat-Dehydrogenase die Enzyme des Citratcyclus, die Enzyme der Fettsäureoxidation (Abschnitt 20.2) und Enzyme sowie Redoxproteine, die am Elektronentransport und bei der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind. Deswegen ist es durchaus gerechtfertigt, wenn das Mitochondrion oft als „Kraftwerk“ der Zelle bezeichnet wird.

A.

Struktur der Mitochondrien

Mitochondrien variieren je nach Vorkommen und Stoffwechselzustand in Größe und Gestalt. Meistens sind sie aber ellipsenförmig und haben Ausdehnungen von 0,5 X 1,0 um - was ungefähr der Größe eines Bakteriums entspricht. Eine typische eukaryotische Zelle enthält rund 2000 Mitochondrien, die ungefähr ein Fünftel ihres Gesamtvolumens einnehmen. Ein Mitochondrion ist von einer glatten, äußeren Membran umgeben und enthält eine vielfach eingestülpte, innere Membran (Abb. 18.2). Die Anzahl der als Cristae (lat.: crista, Hahnenkamm) bezeichneten Einstülpungen spiegelt die respiratorische Aktivität der Zelle wider. Da die Proteine, welche die Elektronenübertragung und die oxidative Phosphorylierung vermitteln, sich in oder an der inneren mitochondrialen Membran befinden, variiert die Atmungsrate mit der verfügbaren Membranoberfläche. Die innere Membran teilt das Mitochondrion in zwei Kompartimente, in den Intermembranraum und in die im Innern befindliche Matrix. Die Matrix ist eine Gel-ähnliche Lösung, die eine extrem hohe Konzentration an löslichen Enzymen des oxidativen Stoffwechsels sowie Substrate, Nucleotide als Cofaktoren und anorganische Ionen enthält. In der Matrix befindet sich auch die genetische

teure

Äußere Membran Innere Membran

Matrix

Intermembranraum

Bi: u

(@)

i Raues endoplasmatisches Reticulum

(b)

arena, (a) Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines tierischen Mitochondrions. [© K.R. Porter/ Photo Researchers, Inc.] (b) Schnittzeichnung eines Mitochondrions.

650

_Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung Maschinerie des Mitochondrions (DNA, RNA und Ribosomen), welche verschie-

Abb. 18.3 Dreidimensonale Rekonstruktionen von elektronenmikroskopischen Aufnahmen eines Mitochondrions aus der Rattenleber.

dene (aber bei weitem nicht alle) Genprodukte synthetisiert, die in Mitochondrien vorkommen. Zweidimensionale elektronenmikroskopische Aufnahmen von Mitochondrien wie in Abb. 18.24 suggerieren, dass es sich bei Mitochondrien um klar abgegrenzte nierenförmige Organellen handelt. Tatsächlich bilden einige Mitochondrien eine röhrenartiges Geflecht, das das gesamte Cytosol durchzieht. Darüber hinaus sind Mitochondrien in ihrer inneren Struktur äußert variabel. Dreidimensonale Rekonstruktionen von elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass Cristae in ihrer Form von einfachen röhrenförmigen Gebilden bis hin zu komplizierteren lamellären Ansammlungen reichen, die mit der inneren Membran nur noch über enge tubuläre Strukturen verbunden sind (Abb. 18.3). Offensichtlich stellen diese Cristae Mikrokompartimente dar, die eine freie Diffusion von Substraten und Ionen zwischen dem Intermembranraum und dem Raum innerhalb der Cristae verhindern. Dies hat Auswirkungen auf die Rate der oxidativen Phosphorylierung, denn es führt an den Cristae-Membranen lokal zur Ausbildung eines größeren pH-Gradienten als an den außerhalb der Cristae liegenden Bereichen der inneren Membran (Abschnitt 18.3).

Die äußere Membran (ÄM) ist rot, die innere Membran (IM) gelb und die Cristae (C) sind grün. Die Pfeilspitzen deuten auf tubuläre Regionen der Cristae, die diese mit der inneren Membran

und

untereinander verbinden. [Mit freundlicher Genehmigung von Carmen

Mannella, Wadsworth

Center, Albany.]

B.

Mitochondriale Transportsysteme

Ähnlich den äußeren bakteriellen Membranen enthält die äußere mitochondriale Membran Porine. Diese Proteine ermöglichen die freie Diffusion von bis zu 10 kD großen Molekülen (Abschnitt 10.2B). Die Metaboliten- und Ionenkonzentrationen des Intermembranraums entsprechen daher denen des Cytosols. Die innere Membran enthält beträchtlich mehr Protein (ca. 75% der Masse) als die äußere Membran (Abb. 18.4). Sie ist nur für O,, CO, und H,O frei permeabel und enthält außer den Proteinkomplexen der Atmungskette zahlreiche Transportproteine, die den Fluss der Metabolite, wie z.B. ATP, ADP und Pyruvat, oder von Ca’* und Phosphat durch die Membran kontrollieren. Die eingeschränkte aber regulierte Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran gegenüber den meisten

Äußere Membran: BE Äußere Seite (2806 Partikel - um”) Innere Seite

Cytosol

(770 Partikel - um?)

Abb. 18.4 Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Gefrierbruch- und Gefrierätz-Präparaten der inneren und äußeren mitochondrialen Membranen. Die Dichte von eingebetteten Partikeln ist in der inneren Membran etwa doppelt so hoch wie in der äußeren Membran. [Mit freundlicher Genehmigung von L. Packer, University of California at Berkeley.]

Innere Seite

(4208 Partikel - um”) Matrix

Das Mitochondrion

651

Ionen und Metaboliten macht die Ausbildung von Ionengradienten an dieser Barriere möglich. Sie führt zu einer Aufteilung von Stoffwechselabläufen zwischen Cytosol und Mitochondrien. Im Cytosol anfallende Reduktionsäquivalente werden in die Mitochondrien „transportiert“

Für die aerobe Oxidation des im Cytosol durch Glykolyse produzierten NADH müssen dessen Elektronen Zugang zur mitochondrialen Elektronentransportkette erhalten. Die innere mitochondriale Membran hat jedoch kein NADHTransportprotein. Es werden nur die Elektronen des NADH vom Cytosol in das Mitochondrion transportiert, wozu eine,oder auch mehrere, raffinierte „Fähren“ (engl.: shuttles) genutzt werden. Wie schon besprochen, wird beim Malat-AspartatShuttle (Abb. 16.20) Oxalacetat des Cytosols für den Transport in das Mitochondrion zu Malat reduziert. Wenn Malat in der Matrix reoxidiert wird, gibt es seine aus dem Cytosol stammenden Reduktionsäquivalente ab. Beim Glycerin-3-phosphat-Shuttle (Abb. 18.5) des Flugmuskels von Insekten (des Organs mit dem größten bekannten andauernden Kraftausstoß - ungefähr mit dem gleichen Kraft/Masse-Verhältnis wie bei einem kleinen Automotor) erfolgt im Cytosol eine Oxidation von NADH durch Dihydroxyacetonphosphat, die durch eine Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase katalysiert wird. Das gebildete NAD* steht wieder für die Glykolyse zur Verfügung. Die Elektronen des entstandenen Glycerin-3-phosphats werden auf eine mitochondriale, flavinabhängige Dehydrogenase unter Bildung von FADH, übertragen. Dieses Enzym, das sich an der äußeren Oberfläche der inneren mitochondrialen Membran befindet, speist die Elektronen direkt in die Elektronentransportkette ein (Abschnitt

18.2D).

Der ADP/ATP-Translokator

Der größte Teil des in der mitochondrialen Matrix durch oxidative Phosphorylierung gebildeten ATP wird im Cytosol verbraucht. Die innere mitochondriale Membran enthält einen ADP/ATP-Translokator (auch Adeninnucleotid-Translokase genannt), der ATP aus der Matrix heraustransportiert. Dies geht mit einem Austausch von ADP einher, das im Cytosol durch ATP-Hydrolyse gebildet wird. Der ADP/ATP-Translokator ist ein Dimer aus zwei identischen 30-kD-Untereinheiten und hat nur eine Bindungsstelle, um die ADP und ATP konkurrieren. Innere mitochondriale

Cytosol

Membran

Dihydroxyacetonphosphat

Matrix

Elektronen transport-

en OH

Kette

c=0 |

nn

t

na

2e”

CH,0PO3

|3

”

FADH; Glycerin-3-

Glycerin-

3-phosphatDehydrogenase

phosphat1

\

des Cytosols

Dehyazr genase

(FAD-

Enzym)

FAD NAD*+

a —oOH HOz m H

GreorVs Glycerin-3-phospat

Abb. 18.5 Giycerin-3-phosphat-Shuttle. Elektronen des cytosolischen NADH werden in drei Schritten auf die mitochondriale Elektronentransportkette übertragen (rot, gezeigt als Hydridtransfer): (1) Mit der Glycerin-3-phosphatDehydrogenase des Cytosols katalysierte Oxidation von NADH durch Dihydroxyacetonphosphat. (2) Oxidation von Glycerin-3-phosphat durch die mitochondriale, flavinabhängige Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Flavoprotein-Dehydrogenase) unter Reduktion von FAD zu FADH..

(3) Reoxidation von FADH, durch Übergang der Elektronen in die Elektronentransportkette.

652

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Beschreiben Sie, wie mithilfe von Shuttle-Systemen Reduktionsäquivalente in die Mitochondrien transportiert werden. 2. Erklären Sie wie die Freie Enthalpie des Protonengradienten den Transport von

Er nimmt hauptsächlich zwei Konformationen ein: In der einen zeigt die ATP/ ADP-Bindungsstelle zum Mitochondrieninneren, in der anderen nach außen (Abb. 18.6). Der Konformationswechsel des Translokators in einer physiologisch relevanten Geschwindigkeit erfordert die Bindung der Liganden. In dieser Hinsicht unterscheidet er sich vom Glucosetransporter (Abb. 10.13), der seine Konformation auch in Abwesenheit eines Liganden ändern kann. Man beachte, dass aus dem Export von ATP (Nettoladung von —4) und dem Import von ADP (Nettoladung von -3) ein Export von einer negativen Ladung pro Transportcyclus resultiert. Dieser elektrogene Antiport wird durch A, die Membranpotentialdifferenz angetrieben, welche sich aus dem transmembranen Protonengradienten über der inneren mitochondrialen Membran (positive Außenseite) ergibt.

ATP, ADP und P; antreibt. Phosphat muss in die Mitochondrien transportiert werden ATP wird in den Mitochondrien aus ADP + P, synthetisiert aber es wird vorwiegend im Cytosol verbraucht. Das für die ATP-Synthese nötige P,; wird über den Phosphattransporter, ein elektroneutrales P,-H*-Symportsystem, das durch den pH-Gradienten angetrieben wird, zurück in die Mitochondrien transportiert. Der durch die Elektronentransportmaschinerie der inneren mitochondrialen Membran erzeugte transmembrane Protonengradient liefert auf diese Weise die Energie nicht nur für die ATP-Synthese (Abschnitt 18.3), sondern auch für den Transport der Ausgangsstoffe dieses Prozesses, ADP und P..

2 Konformation 2

Elektronentransport

Konformation 1

Abb. 18.6 Konformationsbedingter Mechanismus des ADP/ATP-Translokators. Eine Adeninnucleotidbindungsstelle, die im Kontaktbereich zwischen den Untereinheiten des dimeren Translokators liegt, wird abwechselnd von

beiden Seiten der Membran her zugänglich.

Die Elektronentransportkomponenten, welche Elektronen von NADH und FADH, auf O, übertragen, sind mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Einige von ihnen sind frei beweglich, während andere die Komponenten integraler Membranproteinkomplexe sind. Die Abfolge der Elektronenüberträger während des Elektronentransports entspricht ungefähr ihren relativen Reduktionspotentialen, so dass der Elektronentransport insgesamt exergon ist. Dieser Abschnitt beginnt mit Überlegungen zur Thermodynamik des Elektronentransports. Danach werden wir die molekularen Merkmale der verschiedenen Elektronenüberträger betrachten.

A. _ Thermodynamik des Elektronentransports Man kann den thermodynamischen Wirkungsgrad des Elektronentransports durch genauere Betrachtung der Standardreduktionspotentiale der Redoxzentren ermitteln. Wie wir bei der thermodynamischen Betrachtung der Redoxreaktionen (Abschnitt 14.3) gesehen haben, steigt die Elektronenaffinität eines Substrats mit seinem Standardreduktionspotential &°’ an (in Tab. 14.5 sind die Standardreduktionspotentiale einiger biologisch bedeutender Teilreaktionen aufgeführt). Die Differenz der Standardreduktionspotentiale, A®°’ für eine Redoxreaktion, die zwei beliebige Teilreaktionen umfasst, ergibt sich folgendermaßen: A6°=

8° (e — Akzeptor) 7 © (e — Donator)

Die NADH-Oxidation ist stark exergon Die Teilreaktionen für die Oxidation von NADH NAD*

+H*

+2

=

NADH

A&°

=

durch O, lauten:

- 0,315 V

und

1,0, #2

+2 eo

8)

=

0,815 V

Elektronentransport Da die O,/H,O-Teilreaktion das höhere Standardreduktionspotential und daher

eine höhere Affinität zu Elektronen hat, läuft die NADH-Teilreaktion umgekehrt

ab. Damit ist das NADH bei diesem Paar der Elektronendonator und O, der Elektronenakzeptor. Die Gesamtreaktion lautet:

1 O, + NADH + H* =

H,O + NAD*

und

A&°' = 0,815 V- (-0,315 V) = 1,130 V Die Änderung der Freien Standardenthalpie für diese Reaktion kann jetzt aus Gleichung 14.7 berechnet werden: AG? = -nFAE°' Für die Oxidation von NADH ist AG® = -218 kJ - mol’. Mit anderen Worten, die Oxidation von 1 Mol NADH durch O, (die Übertragung von 2 Mol e) unter biochemischen Standardbedingungen geht mit der Freisetzung von 218 kJ Freier Enthalpie einher. Weil für die Synthese von 1 Mol ATP aus ADP + P; 30,5 kJ] - mol’ Freie Standardenthalpie benötigt werden, kann die Oxidation von NADH durch O, theoretisch die Bildung mehrerer Mole ATP antreiben. In den Mitochondrien wird die Kopplung zwischen NADH-Oxidation und ATP-Synthese durch eine Elektronentransportkette ermöglicht, in der die Elektronen drei Proteinkomplexe durchwandern. Dadurch kann der Gesamtbetrag der Änderung der Freien Enthalpie in drei kleinere Pakete aufgeteilt werden, von denen jedes zur ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung beiträgt. Die Oxidation von einem NADH führt zur Synthese von ungefähr 2,5 ATP (warum das Verhältnis nicht streng stöchiometrisch ist, werden wir später noch sehen). Der thermodynamische Wirkungsgrad der oxidativen Phosphorylierung beträgt hiernach unter biochemischen Standardbedin-

gungen 2,5 X 30,5 k]- mol’ x 100/218 kJ - mol” = 35%. Unter physiologischen Bedingungen (bei denen Reaktanten- und Produktkonzentrationen sowie auch der pH-Wert nicht den Standardbedingungen entsprechen) wird für aktive Mitochondrien allerdings ein thermodynamischer Wirkungsgrad von ca. 70% angenommen. Im Vergleich dazu liegt die Energieausbeute eines typischen Verbrennungsmotors unterhalb von 30%.

B.

Die Reaktionsfolge des Elektronentransports

Die Oxidation von NADH und FADH, erfolgt durch die Elektronentransportkette, ein Ensemble von Proteinkomplexen, die Redoxzentren mit zunehmend größeren Elektronenaffinitäten (ansteigenden Standardreduktionspotentialen) enthalten. Durch diese Kette wandern Elektronen von niedrigen zu höheren Standardreduktionspotentialen (Abb. 18.7). Von den Komplexen I und II werden die Elektronen durch Coenzym Q (CoQ oder Ubichinon; so genannt, weil es in allen atmenden Organismen und damit praktisch ubiquitär vorkommt) auf den Komplex III übertragen und von diesem durch das periphere Membranprotein Cytochrom c zu Komplex IV transportiert. Komplex I katalysiert die Oxidation von NADH durch CoQ: NADH + CoQ (oxidiert)

> NAD*

+ CoQ (reduziert)

A®°' = 0,360 V_ AG’ = -69,5 kJ - mol”

6” siehe Guided Exploration 17: Electron Transport and Oxidative Phosphorylation Overview.

653

654

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Abb. 18.7 Übersicht zum Elektronentransport im Mitochondrion.

-0,4r

Aufgeführt sind Standardreduktionspotentiale der beweglichen Komponenten (grün), die Orte, an denen genügend Freie Enthalpie für die Synthese von ATP frei gesetzt wird (blau) und die Angriffspunkte verschiedener Atmungsketteninhibitoren (rot). Die Komplexe I, Ill und IV Se ATP

NADH Be |

|

(+0,031V)

nicht direkt, sondern überführen die Freie Enthalpie, die für dessen Synthese erforderlich ist, in einen Protonengradienten, der durch den aktiven

6

x

er

NAD+ (-0,315 V) ADETB

—-—-—-—

_ Rotenon oder Amytal

ATP

._

ma 0)

: { Export von Protonen aus dem Mitochondrion gebildet wird.

ADP +P,

Fumarat

ZW)

ir . ;Si

x Ei

ARE

+02

|

(----

k

Antimyein A

As E

Cytochrom c (+0,235 V)

+0,4

+0,6

2eT

a8

29H

%0;

H,O (+0,815 V)

Komplex III katalysiert die Oxidation von CoQ (reduziert) durch Cytochrom c: CoQ (reduziert) + 2 Cytochrom c (oxidiert)

AE°' = 0,190 V

> CoQ (oxidiert) + 2 Cytochrom c (reduziert

AG°' = -36,7 kJ - mol"

Komplex IV katalysiert die Oxidation von reduziertem Cytochrom c durch O,, den terminalen Elektronenakzeptor des Elektronentransportprozesses: 2 Cytochrom c (reduziert) + a O, — 2 Cytochrom c (oxidiert) + H,O

A8°' =0,580 V

AG°=-112k]

mol!

Dadurch, dass ein Elektronenpaar sukzessive die Komplexe I, II, und IV durch-

läuft, liefert jeder Schritt genügend Freie Enthalpie für die Synthese jeweils eines Moleküls ATP. Komplex II katalysiert die Oxidation von FADH, durch CoQ: FADH; + CoQ (oxidiert, > FAD + CoQ (reduziert)

A8E°' = 0,085 V

AG? = -16,4 kJ : mol!

Diese Redoxreaktion liefert nicht genügend Freie Enthalpie, um ATP zu synthetisieren. Sie dient allein dazu, die Elektronen von FADR, in die Elektronentransportkette ein-

zuspeisen.

Elektronentransport

Die Arbeitweise der Elektronentransportkette kann mit Hilfe von Hemmstoffen aufgeklärt werden

Die Abfolge des Elektronentransports wurde weitgehend durch die Anwendung spezieller Inhibitoren aufgeklärt und später durch Messung von Standardreduktionspotentialen der Redoxkomponenten bestätigt. Die Geschwindigkeit, mit der O, durch eine Mitochondriensuspension verbraucht wird, ist ein empfindliches Maß für die Aktivität der Elektronentransportkette. Zu den Verbindungen, die den Elektronentransport hemmen - erkennbar an deren negativem Effekt auf den O,-Verbrauch — zählen Rotenon (ein Toxin aus Pflanzen, mit dem die Amazonasindianer Fische vergiften und das auch als Insektizid verwendet wird), Amytal (ein Barbiturat), Antimycin A (ein Antibiotikum) und Cyanid (CN’).

Rotenon

H

CH;

OÖ CH; — CH; — CH(CH;3),

an

CH,—CH, BEN

oO

N

[6)

H

Amytal

2

Cyanid

(6)

C—NH

OÖ

CH;

H;C |

OH

>

NH-—CHO

OÖ

oO

(CH,),— CH;

Antimycin A

Der Elektronentransport in Komplex I wird durch Zugabe von Rotenon oder Amytal zu einer Mitochondriensuspension, durch Antimycin A in Komplex III und durch CN in Komplex IV blockiert (Abb. 18.7). Jeder dieser Inhibitoren führt dabei zu einem Aussetzen des O,-Verbrauchs. Dieser setzt erst wieder ein, wenn Substanzen zugegeben werden, deren Elektronen „stromabwärts“ der Hemmstelle in die Elektronentransportkette eingespeist werden. Zum Beispiel stellt die Zugabe von Succinat zu mit Rotenon gehemmten Mitochondrien den Elektronentransport und den O,-Verbrauch wieder her. Auf diese Weise konnten aus Experimenten mit Hemmstoffen des Elektronentransports die Eintrittstellen von Elektronen aus unterschiedlichen Substraten identifiziert werden. Jeder der vier Atmungskettenkomplexe besteht aus mehreren Proteinkomponenten, die mit einer Vielzahl von redoxaktiven, prosthetischen Gruppen ausgestattet sind. Deren Redoxpotentiale nehmen dabei sukzessive zu (Tab. 18.1). Alle Komplexe sind innerhalb der inneren mitochondrialen Membran lateral frei be-

655

656

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung Tab. 18.1 Reduktionspotentiale von Komponenten der Elektronentransportkette in ruhenden Mitochondrien. x

Komponente

a

"2

ee

j

y

En

UN

-0,315

NADH

Komplex I (NADH:CoQ-Reduktase; 850 kD, 43 Untereinheiten):

‘

FMN

0,380

i

[2Fe-2S]Nla

0,340

[2Fe-2S]N1b

0,250

[4Fe-4S]N3, 4, 5, 6a, 6b, 7

0,250 ;

[4Fe-4S]N2

-0,100 0,031

Succinat

Komplex II (Succinat:CoQ-Oxidoreduktase; etwa 120 kD, 4 Untereinheiten): FAD

0,040

[2Fe-2S]

0,030

[4Fe-4S]

0,245

[3Fe-4S]

0,060

Häm bso

0,080

Coenzym Q

0,045

Komplex III (CoQ:Cytochrom c-Oxidoreduktase; ca. 450 kD, 9-11 Untereinheiten):

Häm by (bse2)

0,030

Häm b, (bs)

0,030

[?2Fe-2S] Häm

|

c,

Cytochrom c

0,280 0,215

0,235

Komplex IV (Cytochrom c-Oxidase; ca. 410 kD, 8-13 Untereinheiten): Häm

a

Cua

0,245

Cup Häm

0;

0,210

0,340 a;

0,385

0,815

Quelle: Hauptsächlich Wilson, D. F., Erecinska, M., und Dutton, P.L., Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 3, 205 und 208 (1974); und Wilson, D. F., in Bittar, E. E. (Hrsg.), Membrane Structure and Function, Band. 1, S. 160, Wiley (1980).

weglich. Sie scheinen keinerlei stabile, übergeordnete Strukturen auszubilden und liegen auch nicht in äquimolaren Mengen vor. In den folgenden Abschnitten betrachten wir sowohl deren Strukturen als auch die Moleküle, welche die

Elektronen zwischen ihnen übertragen. Ihr Zusammenwirken ist in Abbildung 18.8 schematisch dargestellt.

Elektronentransport 4H+

4H*+

657

2)

Intermembran-

chondriale Membran.

SEDILLID Matrix

NADH

Komplex I

Komplex III

40, + >

H,0 €. _ Komplex I (NADH:Coenzym Q-Oxidoreduktase) Komplex I, der Elektronen von NADH auf CoQ weiterleitet und vermutlich der größte Proteinkomplex in der inneren mitochondrialen Membran ist, enthält bei Säugetieren 46 Untereinheiten mit einer Gesamtmasse von etwa 900 kD. Elektronenmikroskopische Abbildungen zeigen ein L-förmiges Protein mit einem Arm, der in der inneren mitochondrialen Membran eingebettet ist und einem, der in die Matrix ragt (Abb. 18.9).

Komplex IV

Abb. 18.8 Mitochondriale Elektronentransportkette. Diese Darstellung zeigt sowohl die Wege der Elektronenübertragung (schwarz) als auch der Protonentranslokation (rot). Zwischen den Komplexen | und Ill werden die Elektronen durch das in der Membran gelöste Coenzym Q (Q) und zwischen den Komplexen Ill und IV durch das periphere Membranprotein Cytochrom c übertragen. Komplex II (hier nicht gezeigt) überträgt Elektronen von Succinat auf Coenzym Q. 6% siehe Animated Figures.

Die Coenzyme des Komplexes I Komplex I enthält ein Molekül Flavinmononucleotid (FMN, eine redoxaktive prosthetische Gruppe, die sich von FAD nur durch das Fehlen des AMP-Rests unterscheidet) und acht oder neun Eisen-Schwefel-Cluster. Eisen-Schwefel-Cluster kommen als prosthetische Gruppen von Eisen-Schwefel-Proteinen (engl.: iron-sulfur proteins, ISP) vor, die auch als Nicht-Häm-Eisenproteine bezeichnet werden. Die zwei häufigsten Typen, als [2Fe-2S]- und [4Fe-4S]-Cluster bezeichnet, bestehen jeweils aus der gleichen Anzahl von Eisen- und Sulfidionen. Beide sind im Allgemeinen durch vier Sulfhydrylgruppen von Cys-Resten des Proteins koordiniert. Man beachte, dass bei beiden hier dargestellten Clusterformen jedes Eisenatom durch vier Schwefelatome koordiniert ist, die mehr oder weniger tetraedrisch um das Eisen angeordnet sind.

Abb. 18.9 Auf Kryoelektronenmikroskopie basierende Bildrekonstruktion des Komplex |. Dessen Struktur in (a) Mitochondrien aus Rinderherz und (b) E.coli wurde bei einer Auflösung von 2,2 nm bzw. 3,4 nm bestimmt. Aufeinander-

folgende Ansichten von oben nach unter sind jeweils um 90 ° um die vertikale Achse gedreht. Die Grenzen der Lipiddoppelschicht, in die der Komplex eingebettet ist, sind durch die gestrichelten Linien angedeutet. Der vertikale Arm, der die Elektronen-transportierenden Gruppen enthält, ragt in die mitochondrielle Matrix bzw. ins bakterielle Cytoplasma hinein. [Mit freundlicher Genehmigung von Nikolaus Grigorieff, Howard Hughes Medical Institute, Brandeis University, Waltham. Die E.coliStruktur wurde bestimmt von Vincent Guenebaut und Kevin Leonard, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg.]

658

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Cys

Eisen-Schwefel-Cluster können Ein-Elektronen-Reduktionen und -Oxidationen eingehen. Die oxidierten und reduzierten Zustände aller Eisen-Schwefel-Cluster unterscheiden sich unabhängig von der Anzahl der Fe-Atome generell durch nur eine Ladung. Dies wird dadurch möglich, dass die Fe-Atome in allen Clustern ein delokalisiertes Elektronensystem ausbilden und die individuellen Fe-Atome somit formal Oxidationsstufen zwischen den Werten +2 und +3 haben können. FMN und CoQ können in drei Oxidationsstufen auftreten (Abb. 18.10). Weil sie stabile Semichinone bilden, können sie entweder ein oder zwei Elektronen

S2-

S2

DE

aufnehmen bzw. abgeben (diese. Semichinone sind stabile freie Radikale, also Moleküle mit einem ungepaarten Elektron). FMN ist an Protein gebunden, während CoQ durch einen hydrophoben Schwanz in der Lipiddoppelschicht der inneren mitochondrialen Membran gelöst ist. In Säugetieren besteht dieser Schwanz aus 10 isoprenoiden C;-Einheiten (Abschnitt 9.1F). Folglich wird das

EI

Coenzym als Q,, bezeichnet. In anderen Organismen kann CoQ auch nur 6 (Q,) oder 8 (Q,) Isoprenoideinheiten haben.

(a)

CH,OPO2

(6)

| [4Fe-4S]

HOCH | HO— nIH CH; |

H;C

(0)

Nano

nr

H;C

N

SE

N

IH

o

H;CO

CH;

H,;CO

| (CHS—CH—CZCHS) Isoprenoideinheiten

o

Flavinmononucleotid (FMN) (oxidierte Form oder Chinon)

CH;

Coenzym @ (CoQ) oder Ubichinon (oxidierte Form oder Chinon)

|)[He]

|)[He]

R

|

N

H;C

EC

N

3

|

N en oO

Radikale als stabile,

DIR

z

semichinoide Zustände.

H

di

“ı N

N

|

CH3

H,CO

R OH

(Radikal-Form oder Semichinon)

H,;C Abb. 18.10 Oxidationszustände von FMN und Coenzym Q. Sowohl FMN (a) als auch Coenzym Q (b) bilden freie

IS

(0)

H

FMNHe

N

[)

Ss H3CO

Coenzym QHe oder Ubisemichinon (Radikal-Form oder Semichinon)

je OH

(0) sg

H;CO

CH;

N

H;3C

n

H

1

SH

OÖ

FMNBR; (reduzierte Form oder Hydrochinon)

H;CO

OH

Coenzym QH; oder Ubichinol (reduzierte wa

Habe

AH

Elektronentransport

659

Die Elektronen wandern über einen mehrstufigen Weg durch Komplex I Komplex I aus Thermus thermophilus besteht aus 14 Untereinheiten mit einer Gesamtmolekülmasse von 550 kD. Die von Leonid Sazanov bestimmte Röntgen-

struktur seines aus acht Untereinheiten bestehenden hydrophilen (außerhalb der Membran befindlichen) Arms zeigt, dass dieses Minimalmodell von Komplex I Y-förmig aufgebaut und 14 nm hoch ist (Abb. 18.11a). Dieser Teilkomplex enthält alle Redoxzentren des Enzyms, ein FMN, sieben [4Fe-4S]-Cluster und zwei [2Fe-2S]-Cluster. FMN sitzt am Ende einer dem Lösungsmittel exponierten Höhle, die wahrscheinlich die NADH-Bindungsstelle darstellt. Der Elektronenübergang von NADH auf CoQ vollzieht sich vermutlich schrittweise, entsprechend dem Reduktionspotential der verschiedenen Redoxzentren in Komplex I (Tab. 18.1). Bei diesem Vorgang wird jede Gruppe vorübergehend reduziert, während sie Elektronen bindet und erneut oxidiert, wenn sie die Elektronen auf die nächste Gruppe weitergibt. Die räumliche Anordnung der Gruppen zeigt den vermuteten Weg der Elektronen (Abb. 18.115). Dabei ist zu beachten, dass Redoxzentren nicht miteinander in direkten Kontakt kommen müssen, um ein Elektron zu übertragen. Seine quantenmechanischen Eigenschaften erlauben es, dass ein Elektron zwischen den im Protein eingebetteten Redoxgruppen „hindurchtunnelt“, wenn diese weniger als 1,4 nm voneinander entfernt sind. Weil die Geschwindigkeit dieses Elektronentransfers mit der Entfernung zwischen den Redoxzentren exponentiell abnimmt (pro 0,17 nm eine etwa 10fache Abnahme), benötigen Elektronentransferreaktionen über Entfernungen von mehr als ca. 1,4 nm immer Ketten aus mehreren Redoxzentren. NADH kann nur eine Zwei-Elektronen-Iransferreaktion eingehen. Im Gegensatz dazu sind die Cytochrome von Komplex III - an die das reduzierte CoQ seine Elektronen weitergibt — (siehe unten) nur zu Ein-Elektronen-Reaktionen fähig. FMN und CoQ, die entweder ein oder zwei Elektronen übertragen können, bieten somit eine Schnittstelle zwischen dem Zwei-Elektronen-Donator NADH und den Ein-Elektronen-Akzeptoren, den Cytochromen.

Abb. 18.11 Röntgenstruktur der hydrophilen Domäne von Komplex I aus Thermus thermophilus. (a) Seitenansicht, in der der Transmembranarm vermutlich unten ist und sich nach rechts erstreckt (umgedreht im Verhältnis zu Abb. 18.9b, untere Struktur). Die acht Untereinheiten sind in Schlangenform mit verschiedenen Farben gezeigt. Die FMN- (oben links) und die neun Eisen-SchwefelCluster sind als Kalottenmodell gezeigt, mit C grün, N blau, © rot, P orange, S gelb und Fe rotbraun. Die vermeintliche CoQ-Bindungsstelle (Q) ist durch einen grauen Pfeil kenntlich gemacht. (b) Die Anordnung der Redoxgruppen aus ähnlichem Blickwinkel wie im Teil a. Die FMN(Stabmodell mit C gelb) und die beiden [Fe-S]- und sieben [4Fe-4S]-Cluster (Kalottenmodelle) sind zusammen mit ihren Abständen zwischen den Zentren in nm aufgeführt (der kürzeste Anstand von Rand zu Rand ist jeweils in Klammer angegeben). Die blauen Pfeile zeigen den Hauptweg der Elektronen, nach ihrer Übertragung von NADH auf FMN. [Teil a nach einer Röntgenstruktur und Teil b mit freundlicher Genehmigung von Leonid Sazanov, Medical Research Council, Cambridge.

PDBid 2FUG)] (a)

(b)

1,35 (1,23)

©. Nia

FMN

a

EG (0,76) ne,

2,23 (1,94)

Na

4 ‚42 (1,10) N1b 1,39 (1,07)

Is

N4

2,42 (2,05

‚N7

1,22 (0,85)

14 nm

|‚69 (1,40)

N6a

1,22 (0,94)

N6b

1,42 (1,05)

®

660

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung Komplex | überträgt vier Protonen Wenn Elektronen zwischen den Redoxzentren von Komplex I übertragen werden, werden vier Protonen von der Matrix zum Intermembranraum transportiert. Der Verbleib der Protonen, die von NADH abgegeben werden, ist unklar: Sie gehören unter Umständen zu denjenigen, die durch die Membran gepumpt oder für die Reduktion von CoQ zu Hydrochinon (CoQH,) verwendet werden. Das Pumpen von Protonen in Komplex I wird offensichtlich durch Konformationsänderungen angetrieben, die durch Veränderungen beim Redoxzustand des Proteins ausgelöst werden. Diese Konformationsänderungen verändern die pK-Werte der ionisierbaren Seitenketten, sodass Protonen aufgenommen oder abgegeben wer-

den, wenn Elektronen übertragen werden. Die Kopplung zwischen dem Elektronentransport und dem Protonenpumpen ist noch nicht gut verstanden. Die Redoxgruppen sind alle auf dem hydrophilen Arm von Komplex I (Abb. 18.11) lokalisiert, während der Protonentransport zwangsläufig über den in die Membran eingebetteten Arm stattfindet. Als „nackter“ Atomkern kann ein Proton nicht auf die gleiche Weise durch eine Membran transportiert werden wie Ionen wie z.B. Na’ und K'. Ein Proton kann aber in einem Transmembrankanal verschoben werden, indem es entlang einer Kette aus Gruppen wandert, die über Wasserstoffbrücken verbunden sind — gerade so wie es in Lösung von Wassermolekül zu Wassermolekül „hüpft“ (Protonensprünge; 2.15). Eine solche Anordnung von über Wasserstoffbrücken verbundenen Gruppen im Protein wird als Protonenleiter bezeichnet. Zu den Gruppen können auch Wassermoleküle gehören. Komplex I enthält vermutlich einen solchen Protonenleiter, der pro Elektronenpaar, das von NADH auf CoQ übertragen wird, vier Protonen durch die Membran pumpt. Bacteriorhodopsin ist das Modell einer Protonenpumpe Ein nützliches Modell für protonentransportierende Komplexe ist Bacteriorho-

dopsin. Dieses integrale Membranprotein aus Halobacterium salinarum enthält sieben Transmembranhelices, die einen zentralen polaren Kanal umschließen (Abb. 9.22). Bacteriorhodopsin ist eine lichtgetriebene Protonenpumpe. Es erhält die zum Pumpen von Protonen erforderliche Freie Enthalpie durch die Absorption von Licht mithilfe seiner prosthetischen Gruppe Retinal. Das Retinal ist mit dem Protein über eine protonierte Schiff’sche Base an der Seitenkette von Lys 216 verknüpft. Bei Absorption von Licht isomerisiert das all-trans-Retinal zu seiner 13-cisKonfiguration: H;C_

_CH,

CH;

en >

I

A SS N (CHS,-—

c=0O

CH; Lys 216

all-trans-Retinal Licht

|

ns

13-cis-Retinal

CH

(CH3),

CH

|

Elektronentransport

661

Diese Strukturveränderung löst eine Abfolge von Konformationsänderungen des Proteins aus, die über einen Zeitraum von ca. 10 ms den Grundzustand des Systems wieder herstellen. Diese Konformationsänderungen verändern die pKWerte mehrerer Aminosäureseitenketten (Abb. 18.12). Unter anderem steigt der pK-Wert von Asp 85 so weit an, dass es als Akzeptor für das Proton der Schiff’schen Base fungieren kann. Asp 85 überträgt dann das Proton auf das extrazelluläre Medium mittels eines Netzwerks aus Wasserstoffbrücken, zu dem Arg 82, Glu 194, Glu 204 und mehrere Wassermoleküle gehören. Ein ähnliches Netzwerk aus Wasserstoffbrücken protoniert die Schiff’sche Base erneut mit einem intrazellulären Proton. An dieser Reprotonierung ist Asp 96 beteiligt, dessen pK-Wert durch die Konformationsänderung abnimmt. In der Summe wandert also ein Proton vom Cytosol zum Zelläußeren (auch wenn das Proton, das das Cytosol verlässt, nicht mit dem Proton identisch ist, das in den extrazellulären Raum gelangt). Die verschiedenen Aminosäureseitenketten, die am Protonentransport in Bacteriorhodopsin beteiligt sind, bewegen sich um ca. 0,1 nm oder sogar weniger. Diese Bewegung ist ausreichend, um deren pK-Werte zu verändern und nacheinander Wasserstoffbrücken auszubilden und wieder aufzulösen. Damit wird es einem Proton ermöglicht, den Protonenleiter zu durchlaufen. Der vektorielle, d.h. gerichete Ablauf dieses Transports ergibt sich aus der Abfolge von gerichteten Konformationsänderungen, die das durch Licht angeregte Retinal durchmacht, wenn es in den Grundzustand zurückkehrt. Die Elektronenübertragungen zwischen den verschiedenen Redox-Cofaktoren von Komplex I bewirken wahrscheinlich eine ähnliche Abfolge von Konformations- und pKWert-Änderungen.

D.

Komplex II (Succinat:Coenzym Q-Oxidoreduktase)

Komplex II, der das Enzym Succinat-Dehydrogenase des Citratcyclus (Abschnitt 17.3F) und drei andere, kleine hydrophobe Untereinheiten enthält, überträgt Elektronen von Succinat auf CoQ. Die Redoxgruppen von Komplex II umfassen das kovalent gebundene FAD der Succinat-Dehydrogenase (Abb. 17.13) als den primären Elektronenakzeptor, einen [4Fe-4S]-Cluster, zwei [2Fe-2S]-Cluster und ein Cytochrom b;;o (Cytochrome werden im Exkurs 18.1 besprochen). Die Freie Enthalpie der Elektronenübertragung von Succinat auf CoQ (Abb. 18.7) reicht für die Synthese von ATP nicht aus. Trotzdem ist der Komplex von Bedeutung, weil er den Eintritt von Elektronen mit relativ hohen Redoxpotentialen in die Elektronentransportkette (unter Umgehung von Komplex I) möglich macht. Man beachte, dass die Komplexe I und II, ungeachtet ihrer Bezeichnung, nicht in Serie arbeiten. Beide erfüllen aber denselben Zweck: die Übertragung von Elektronen aus reduzierten Substraten auf CoQ (sei es von NADH oder Succinat). CoQ, das in der Lipiddoppelschicht zwischen den Atmungskeitenkomplexen hin und her diffundiert, dient damit als eine Art Elektronensammelstelle. Wie in Abschnitt 20.2C zu sehen sein wird, erzeugt auch der erste Schritt der Fettsäureoxidation Elektronen, welche auf dem Niveau von CoQ in die Elektronentrans-

portkette eingeschleust werden. CoQ übernimmt außerdem Elektronen von FADH,, das über den Glycerin-3-phosphat-Shuttle gebildet wird (Abb. 18.5). Komplex Il enthält eine lineare Kette von Redox-Cofaktoren Vom mitochondrialen Komplex II und vom eng verwandten Komplex II aus E. coli hat man die Röntgenstrukturen bestimmt (Abb. 18.13). Der E. coli-Komplex II ist ein pilzförmiges Homotrimer von 360 kD. Seine Protomere bestehen jeweils aus zwei hydrophilen Untereinheiten, einem Flavoprotein (SdhA) und einer EisenSchwefel-Untereinheit (SdhB), die im Cytoplasma (dem Äquivalent der Mitochondrienmatrix) lokalisiert sind, sowie aus zwei hydrophoben Membran-

Abb. 18.12 Protonentranslokation in Bacteriorhodopsin. Die prosthetische Gruppe Retinal, die mit Lys 216 des aus sieben Transmembranhelices bestehenden Proteins verknüpft ist (Schiff'sche Base), ist blaurot dargestellt. Die Seitenketten der Aminosäuren,

die an der lichtgetriebenen Protonentranslokation beteiligt sind, sind als Stabmodell gezeigt; C ist grau, N blau und O rot. Die Pfeile mit den zugehörigen Nummern zeigen die Reihenfolge der Protonenübertragungsschritte während des photochemischen Cyclus: (1) Deprotonierung der Schiff’schen Base und Protonierung von Asp 85. (2) Protonenfreisetzung an der extrazellulären Oberfläche. (3) Erneute Protonierung der Schiff’schen Base und Deprotonierung von Asp 96. (4) Erneute Protonierung von Asp 96 an der cyto-

plasmatischen Oberfläche und (5) Deprotonierung von Asp 85 und erneute Protonierung der Stelle, die das Proton freigegeben hat. [Mit freundlicher Genehmigung von Janos Lanyi, University of

California at Irvine. PDBid 1C3W.]

662

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Cytochrome sind elektronenübertragende Hämproteine Cytochrome sind redoxaktive Proteine. Ihre Funktion wurde 1925 durch David Keilin aufgeklärt. Mit Ausnahme einiger Arten von obligaten Anaerobiern kommen sie in allen Organismen vor. Diese Proteine enthalten Hämgruppen, deren Oxidationszustand während der Elektronenübertragung zwischen Fe(ll) und Fe(lll) wechselt. Die Hämgruppen der reduzierten Fe(ll)-Cytochrome zeigen im sichtbaren Bereich markante Absorptionsspektren mit drei Maxima:

den a-, ß- und y-Banden;

letztere wird auch

als Soret-Bande bezeichnet. Im Folgenden ist das Spektrum von Cytochrom c dargestellt: (a)

ß

a

Cytochroma Cytochromb

439 429

Y

532

600 563

Cytochromc Cytochromc,

415 418

521 524

550 554

Absorption

300

400

500 Wellenlänge (nm)

600

Zur Unterscheidung verschiedener Cytochrome (siehe Tabelle oben rechts in der Abbildung) wird die Wellenlänge des aMaximums verwendet, die charakteristisch mit dem Typ des reduzierten Cytochroms variiert (dieses Maximum ist bei oxidierten Cytochromen nicht vorhanden). Jeder Typ von Cytochromen enthält eine unterschiedlich substituierte Hämgruppe mit dem koordinativ gebundenen, redoxaktiven Eisenion (Formeln rechts). Die Cytochrome vom b-Typ enthalten Protoporphyrin IX, das auch in Myoglobin und Hämoglobin vorkommt (Abschnitt 7.1A). Das Besondere der Hämgruppe vom Cytochrom c-Typ ist, dass an die Doppelbindungen der Vinylgruppen des Protoporphyrin IX Cys-Sulfhydrylgruppen addiert wurden. Dadurch werden Thioetherbrücken zum Protein gebildet. Hämgruppen vom a-Typ haben am Porphyrin einen langen, hydrophoben Schwanz aus isoprenoiden Einheiten und anstelle des Methylsubstituenten in Position 8 der Hämgruppen b und c eine Formylgruppe. Auch die axialen Liganden des Häm-Eisenions variieren mit dem Cytochrom-Typ. Bei den Cytochromen a und b sind beide Liganden His-Reste, während im Cytochrom c ein Ligand ein His-Rest und der andere Ligand das S-Atom eines Met-Rests ist. Innerhalb jeder Gruppe von Cytochromen sind unterschiedliche Proteinumgebungen der Hämgruppe durch geringfügig verschobene Wellenlängen der a-Maxima charakterisiert. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Cytochrome anhand der Wellenlänge (in nm) des Absorptionsmaximums der a-Bande zu identifizieren (z.B. Cytochrom bs. im Komplex Il). Neben dieser eher phänomenologischen Bezeichnung werden Cytochrome auch mit Zahlen oder Buchstaben gekennzeichnet.

anker-Untereinheiten, SdhC und SdhD, die jeweils drei Transmembranhelices enthalten und die gemeinsam ein Häm vom b-Typ und ein Ubichinon binden. SdhA bindet sowohl das Substrat (dessen Bindungsstelle vom Inhibitor Oxalacetat in der Röntgenstruktur besetzt ist) als auch die prosthetische Gruppe FAD. SdhB bindet dagegen die drei Eisen-Schwefel-Cluster des Komplexes. Die Substrat- und die Ubichinonbindungsstelle sind über eine mindestens 4 nm lange Kette von Redoxzentren verbunden. Sie haben die Reihenfolge Substrat-FAD[2Fe-2S]-[4Fe-4S]-[3Fe-4S]-Q (von oben nach unten in Abb. 18.13). Das Häm b liegt nicht auf diesem direkten Elektronenübertragungsweg. Es übernimmt die Feinregulierung der elektronischen Eigenschaften des Systems, sodass Nebenreaktionen unterdrückt werden, die schädigende reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) wie H,O, erzeugen (Abschnitt 18.4A). Die in Komplex I mit Nla bezeichneten [2Fe-2S]-Cluster (Abb. 18.11b) übernehmen unter bestimmten Bedingungen eine ähnliche Aufgabe.

Elektronentransport

Reduzierte Hämgruppen können mit physiologisch relevanten Geschwindigkeiten Elektronen über Entfernungen von 1 bis 2 nm übertragen und sind daher sehr reaktive Spezies. Cytochrome haben somit in einem gewissen Sinn die

(b)

entgegengesetzte Funktion von Enzymen: Anstelle reaktionsträge Substrate zur Reaktion zu bringen, müssen sie verhin-

dern, dass ihre reaktivren Hämgruppen Elektronen unspezifisch auf andere zelluläre Komponenten übertragen. Ohne Zweifel ist dies ein Grund, warum diese Hämgruppen meistens vollständig von Protein umgeben sind. Andererseits müssen Cytochrome aber auch einen Elektronenübertragungsweg zu dem zugehörigen Partner aufweisen. Da die Übertragung von Elektronen über Bindungssysteme viel effizienter abläuft, als die durch den freien Raum,

663

a

Cytochromc

P

Absorption Mitochondrienmembranen aus Rinderherz

scheint die

Struktur des Proteins eine wichtige Determinante für die Geschwindigkeit des Elektronentransports zwischen den Proteinen zu sein.

450

500

550

600

650

Wellenlänge (nm)

2

Protein

CH, +CH, —CH=C—CHy;-H

HO—CH

|

ie

N

CH,

S

| CH—CH,

CH=CH;

CH,

Cys |

|

H,C

CH—CH,

H,C

CH;

[6)

I HC

CH;

iü

fi coo”

coo”

|

|

coo°

c00” Häm b

Häm a

(Eisen-Protoporphyrin IX)

n jr

5 n

co0°

co0”

Häm ce

7/nm

0,46 (0,25) AD

[1,60 (1,11) [2Fe-2S]

|1,24 (0,93)

[4Fe-4S]

|1,19 (0,91)

[3Fe-4S] 1,10

1

UA

0,65 (0,98)

1,85

(1,14)

*Häm b

Abb. 18.13 Röntgenstruktur des Komplexes Il aus E. coli. Hier ist ein Protomer eines trimeren Komplexes parallel zur Membran gezeigt, das Cytoplasma ist oben. SdhA, SdhB, SdhC und SdhD sind blaurot,

braun, grün bzw. blau gefärbt. Der gebundene Oxalacetatinhibitor (OAA; dunkelgrün), FAD (gelb-

grün), die Fe-S-Cluster (Fe rot und S grün), das Ubichinon (grün) und das Häm b (magentarot) sind als Kalottenmodell gezeigt, ebenso die gebundenen Cardiolipinmoleküle (CL; grau). Die Abstände von Mitte zu Mitte und von Rand zu Rand (in Klammern) zwischen den Redoxzentren sind in Nanometern (nm) angegeben. Die angenommene Lage der Membran ist durch die hellblaue Schattierung angedeutet. [Mit freundlicher Genehmigung von So Iwata, Imperial College London. PDBid INEK.]

664

_Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

E.

Komplex Ill transportiert Protonen über den Q-Cyclus

Komplex III (auch als Coenzym-Q-Cytochrom-c-Oxidoreduktase oder Cytochrom bc, bezeichnet) überführt die Elektronen von reduziertem CoQ auf Cytochrom c. Er enthält zwei Cytochrome vom b-Typ, ein Cytochrom c, und einen [2Fe-2S]-Cluster, in dem eines der Fe-Atome von zwei His-Resten anstatt von zwei Cys-Resten koordinativ gebunden ist (und der nach seinem Entdecker, John Rieske, als Rieske-Zentrum bezeichnet wird). Komplex III aus Hefemitochondrien ist ein Homodimer von 419 kD mit neun Untereinheiten (11 im 485 kD großen mitochondrialen Komplex III aus Rinderherz). Seine Röntgenstruktur (Abb. 18.14) zeigt ein birnenförmiges Dimer, dessen breitester Teil sich etwa 7,5 nm in die Mitochondrienmatrix erstreckt. Der 4,0 nm dicke Transmembrananteil besteht pro Protomer aus 12 Transmembranhelices (14 im Komplex III des Rinderherzens), die größtenteils im Bezug zur Membranebene gekippt sind. Acht dieser Helices gehören zur Untereinheit von Cytochrom b, die beide b-Typen des Cytochrom-Häms bindet, nämlich b;., (oder by, für hohes Potential, das in der Nähe der Matrix liegt) und b;;; (oder b,, für niedriges (engl.: low) Potential, das in der Nähe des Intermembranraums liegt). Die Cyto-

chrom-c,-Untereinheit ist mit ihrem globulären Kopf über eine einzelne Transmembranhelix verankert. Diese enthält ein c-Iyp-Häm, das sich in den Intermembranraum erstreckt. Das Eisen-Schwefel-Protein (ISP, engl.: iron sulfur protein) enthält das Rieske-Zentrum. Es ist entsprechend über eine einzelne Transmembranhelix verankert und erstreckt sich in den Intermembranraum. Die beiden ISPs des dimeren Komplexes sind ineinander verschlungen, sodass der [2Fe-2S]-Cluster im ISP eines Protomers mit den Untereinheiten von Cytochrom b und Cytochrom c, des anderen Protomers in Wechselwirkung tritt.

Intermembran-N

raum

ER > Cytochrom c WIE» @

Abb. 18.14 Röntgenstruktur des Komplexes III der Hefe im Komplex mit Cytochrom c und dem Inhibitor Stigmatellin. Der homodimere Komplex ist innerhalb der Membran

dargestellt, wobei der Intermembran-

raum oben ist. Die neun verschiedenen Untereinheiten in jedem Protomer, die zusammen 12 Transmembranhelicies haben, sind unterschiedlich gefärbt. Cytochrom b ist grün, Cytochrom c, blauviolett, das ISP magentarot und Cytochrom c rot. Die vier verschiedenen Hämgruppen, der [2Fe-2S]-Cluster und Stigmatellin sind als Kalottenmodell

in verschiedenen

2 *

$

SERIINAN

( RIED |

“# ach

6

SA

struktur von Carola Hunte, Max-Planck-Institut

I ’P

Matrix

+

$/

NAT EHS N : SI D

Farben gezeigt.,

Alle Fe-Atome sind orangefarben eingefärbt. Die vermutliche Lage der Membran ist durch die blaue Schattierung dargestellt. Man beachte, dass nur ein Cytochrom c an den homodimeren Komplex III gebunden ist. [Nach einer Röntgenfür Biophysik, Frankfurt am Main. PDBid IKYO.] 6% siehe Interactive Exercises

>

r

eny

B>

Elektronentransport

665

Elektronenübertragung im Komplex Ill: Der Q-Cyclus Die Arbeitsweise des Komplexes III ermöglicht es, dass ein Molekül des ZweiElektronen-Überträgers CoQH, zwei Moleküle des Ein-Elektronen-Überträgers Cytochrom c reduzieren kann. Dafür erfolgt eine - zunächst nicht vermutete — Verzweigung des Elektronenflusses von CoQH, zu einerseits Cytochrom cı und andererseits Cytochrom b (wobei der letztere Teil cyclisch abläuft). Durch diesen sogenannten Q-Cyclus wird ermöglicht, dass Komplex III Protonen von der Matrix in den Intermembranraum überführen kann. Das Prinzip des Q-Cyclus besteht darin, dass die Reoxidation von CoQH, in zwei Kreisläufen erfolgt, bei denen das Semichinon CoQ-" als ein stabiles Intermediat auftritt. Der Mechanismus setzt zwei voneinander unabhängige Bindungsstellen für Coenzym Q (Q, und Q;) voraus. Q, bindet CoQH, und liegt zwischen dem [2Fe-2S]-Rieske-Zentrum und Häm b,, in der Nähe des Intermembranraums. Q; bindet sowohl CoQ-" als auch CoQ und liegt nahe Häm b,,, in Nachbarschaft zur Matrix. Im ersten Cyclus (Abb. 18.15, oben) bindet CoQH, aus Komplex I (1 und 2) an die Q,-Bindungsstelle und gibt dort eines seiner Elektronen an das ISP (3) ab. Dabei werden zwei Protonen in den Intermembranraum entlassen und CoQ-" gebildet. Im weiteren Fortgang reduziert das ISP Cytochrom cı,

Von

Komplex I

1

=

®-------mQH,

N 6

g+ ---------Cyclus 1 Von

Komplex I

1

-==— =.

DE

a

a;

ra b;

5

bu

=

a

=

a Q;

Q

—

-

-

-

#

--.-.-. -. -.-. >

Cyclus 2

Q

Abb. 18.15 Der Q-Cyclus. Der gesamte Cyclus besteht in Wirklichkeit aus zwei Cyclen. Der erste wird durch die Reaktionen 1 bis 7 und der zweite durch die Reaktionen 1 bis 6 sowie 8 gebildet. (1) Auf der Matrixseite wird durch Komplex | Coenzym QH; bereitgestellt. (2) QH, diffundiert zur Cytosolseite der Membran, wo es an die Q,-

Bindungsstelle der Cytochrom b-Untereinheit von Komplex III bindet. (3) QH, reduziert das RieskeEisen-Schwefel-Protein (ISP) unter Bildung des Semichinons CoQ- und Freisetzung von 2 H'. ISP reagiert unter Reduktion von Häm cı weiter.

(4) CoQ-” reduziert Häm b, wobei Coenzym Q gebildet wird. (5) Q aus Cyclus 1 und Q-” aus Cyclus 2 diffundieren zur Matrixseite, wo sie an

die Q;-Bindungsstelle am Cytochrom b binden. (6) Häm b, reduziert Häm by. (7, nur Cyclus 1) Q wird durch Häm by, zu CoQ- reduziert. (8, nur Cyclus 2) Das an die Q,-Bindungsstelle gebundene CoQ- wird durch Häm by, zu CoQH, reduziert. Die Nettoreaktion ist die Übertragung von zwei Elektronen von CoQH, auf Cytochrom cı und die Translokation von vier Protonen aus der Matrix in den Intermembranraum. [Nach Trumpower, B.L.,J.Biol. Chem. 265, 11410 (1990).]

666

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

während CoQ:” sein verbliebenes Elektron auf Cytochrom b; (4) überträgt und so ein vollständig oxidiertes CoQ gebildet wird. Anschließend reduziert Cytochrom b, das Cytochrom by; (6). CoQ aus Schritt 4 wird aus der Q,-Bindungsstelle freigesetzt, kann erneut an Q; binden (5) und dort das Elektron von Cytochrom b;; aufnehmen (7). Dabei kehrt es in die Semichinonform Q-" zurück. Die Reaktion für den ersten Cyclus lautet somit:

CoQH, + Cytochrom cı(Fe’*) — CoQ-” + Cytochrom cı(Fe?*) + 2:H* (Intermembranraum)

Im zweiten Cyclus (Abb. 18.15, unten), durchläuft ein weiteres CoQH, aus Komplex I die Schritte 1 bis 6: Ein Elektron reduziert zuerst das ISP und dann das Cytochrom c,, während das andere Elektron nacheinander Cytochrom b; und Cytochrom b;, reduziert. Danach reduziert dieses zweite Elektron das im ersten Cyclus an der Q;-Bindungsstelle entstandene CoQ- zu CoQH; (8). Die im letzten Schritt verbrauchten Protonen stammen aus der mitochondrialen Matrix. Somit lautet die Reaktion für den zweiten Cyclus:

CoQH, + CoQ- + Cytochrom cı(Fe’*) + 2 H* (Matrix) — CoQ + CoQH, + Cytochrom cı(Fe?*) + 2 H* (Intermembranraum) Aus je zwei CoQH,, die in den Q-Cyclus einfließen, wird ein CoQH;, zurückgebildet. Die Kombination beider Cyclen, bei denen zwei Elektronen von CoQH, auf Cytochrom c, übertragen werden, ergibt die folgende Gesamtreaktion:

CoQH, + 2 Cytochrom cı(Fe’*) + 2 H* (Matrix) > CoQ + 2 Cytochrom cı(Fe?*) + 4 H* (Intermembranraum) Wie unterstützt die Struktur von Komplex III den Reaktionsverlauf des Q-Cyclus? Röntgenstrukturuntersuchungen’ liefern direkte Beweise, dass eigenständige Q,- und Q;-Bindungsstellen vorkommen. Das Antimykotikum Stigmatellin, OCH;

O

CH;

CH;

Stigmatellin

CH;

von dem bekannt ist, dass es den Elektronenfluss von CoQH, zu ISP und zum Häm b, hemmt (Schritte 3 und 4 beider Cyclen), bindet in einer Tasche innerhalb von Cytochrom b auf halber Strecke zwischen den Positionen des Eisens im-[2Fe-2S]-Rieske-Zentrum und Häm b,. Somit überlappt diese Bindungstasche wahrscheinlich mit der Q,-Bindungsstelle. Für Antimycin A (Abschnitt 18.2B) konnte man zeigen, dass es den Elektronenfluss von Häm by, zu CoQ oder CoQ-" blockiert (Schritt 7 von Cyclus 1 und Schritt 8 von Cyclus 2). Es bindet ganz ähnlich in einer Tasche in der Nähe von Häm b;,, wodurch

diese Tasche als die Q;-Bindungsstelle identifiziert wurde. Der verschlungene Weg der Elektronen in Komplex III erfordert, dass Coenzym Q sowohl an Q, als auch an Q; binden kann. Dies wird durch die freie Diffusion des Coenzym Q im hydrophoben Inneren der Membran ermög-

licht. Die Mitochondrienmembran

enthält vermutlich ein Reservoir von CoQ,

Elektronentransport

CoQ-"und CoQH,, sodass das von der Q,-Bindungsstelle freigesetzte Ubichinonmolekül unter Umständen nicht das gleiche ist wie dasjenige, das im Cyclus 1 an die O,-Bindungsstelle bindet (Abb. 18.15). Röntgenstrukturen von Cytochrom bc; liefern auch die Erklärung dafür, dass Qu-gebundenes CoQ-” ausschließlich Häm b, reduziert, anstelle des [2Fe-2S]Rieske-Clusters des ISP, obwohl die größere Reduktionspotentialdifferenz (AE) die letztere Reaktion begünstigen würde (Tab. 18.1). Die globuläre Domäne des ISP kann zwischen der Q,-Bindungsstelle und Cytochrom c, ca. 2 nm um ein Gelenk schwingen. Folglich nimmt das ISP von CoQH, in der Q,-Bindungsstelle ein Elektron auf und liefert es mechanisch an die Häm c,-Gruppe. Das CoQ-"-Produkt kann das ISP-Protein nicht reduzieren (nachdem es Cytochrom c, reduziert hat), weil das ISP sich zu weit entfernt hat, und die Reduktion damit unmöglich wird. Die Nettoreaktion des Q-Cyclus zeigt, dass wenn CoQH, oxidiert wird, zwei reduzierte Cytochrom c-Moleküle und vier Protonen auf der Membranaußenseite auftauchen. Der Protonentransport beim Q-Cyclus unterscheidet sich somit vom Protonen-Pumpmechanismus der Komplexe I und IV (siehe unten): Im Q-Cyclus ist eines der Redoxzentren (CoQ) auch der direkte Protonenüberträger. Cytochrom c ist ein löslicher Elektronenüberträger

Die zum Cytochrom c, transportierten Elektronen werden weiter auf Cytochrom c übertragen. Dieses ist im Unterschied zu den anderen Cytochromen der respiratorischen Elektronentransportkette ein peripheres Membranprotein. Es transportiert Elektronen zwischen den Komplexen III und IV auf der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran. Die Struktur und Evolution von Cytochrom c werden in den Abschnitten 5.4A und 6.2D behandelt. Im Cytochrom c sind mehrere stark konservierte Lys-Reste in einem Ring um die einzige von außen zugängliche Kante seiner ansonsten verborgenen Hämgruppe angeordnet (Abb. 18.16). Diese positiv geladenen Reste bilden Bindungsstellen für komplementäre, negativ geladene Gruppen auf Cytochrom c, und Cytochrom

c-Oxidase.

Solche Wechselwirkungen

dienen vermutlich

dazu, Re-

doxgruppen für die optimale Elektronenübertragung auszurichten. Die in Abbildung 18.14 wiedergegebene Röntgenstruktur zeigt, dass die Verknüpfung zwischen Cytochrom bc, und Cytochrom c teilweise schwach ist, weil deren Kontaktfläche (8,8 nm?) erheblich geringer ist als diejenige, die Komplexe mit geringer Stabilität zwischen anderen Proteinen aufweisen (normalerweise über 16 nm?). Eine solch kleine Kontaktfläche eignet sich sehr gut für ein rasche Bindung und Freisetzung. Die Kontaktfläche bezieht nur zwei LysReste von Cytochrom c ein, Lys 86 und Lys 79, die Glu 235 bzw. Ala 164 von Cytochrom c, berühren. Es gibt auch weitere Paare geladener und häufig konservierter Aminosäurereste, die die Kontaktstelle umgeben. Diese sind aber für direkte polare Wechselwirkungen nicht eng genug beisammen. Diese Wechselwirkungen werden eventuell durch Wassermoleküle vermittelt, die man in der Röntgenstruktur nicht sehen kann. Der kleinste Abstand zwischen den Hämgruppen der in Verbindung stehenden Proteine beträgt 0,45 nm zwischen den Atomen ihrer jeweiligen Vinylseitenketten. Dies ist der Grund für die rasche Elektronenübertragung zwischen diesen beiden Redoxzentren.

F.

Komplex IV (Cytochrom c-Oxidase)

Cytochrom c-Oxidase katalysiert die Ein-Elektron-Oxidationen von vier nacheinander reduzierten Cytochrom c-Molekülen bei gleichzeitiger Vier-Elektronen-Reduktion von einem Molekül O;.

4 Cytochrom c (Fe?*) + 4 H* + O2 > 4 Cytochrom c (Fe’*)

+2 H,O

667

Abb. 18.16 Bänderdiagramm von Cytochrom c mit Darstellung der Lys-Reste, die an der intermolekularen Komplexbildung beteiligt sind. Die dunkel- und hellblauen Kugeln markieren die Positionen der Lys-Reste, deren e-Aminogruppen

mehr oder weniger stark durch Cytochrom cı oder Cytochrom c-Oxidase vor einer Acetylierung geschützt werden. Man beachte, dass die Lys-Reste auf der Oberfläche des Proteins um das Häm (ausgefüllter Balken) einen Ring ausbilden. [Nach Mathews, F.S., Prog. Biophys. Mol. Biol. 45, 45 (1986).] 6% siehe Interactive Exercises und Kinemage Exercise 5.

668

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Abb. 18.17 Röntgenkristallstruktur des Dimeren der Cytochrom c-Oxidase aus Rinderherz. Der homodimere Komplex ist vom Inneren der Membranebene aus gesehen mit dem Intermembranraum oben dargestellt. Die 13 verschiedenen Untereinheiten eines jeden Protomers,

die gemeinsam 28 transmembrane Helices besitzen sind in verschiedenen Farben dargestellt. Die an das Protein gebundenen Häm-Gruppen und Cu-lonen sind als Kalottenmodelle dargestellt. C ist magenta, N blau, O rot, Fe orange und Cu cyan

gefärbt. [Nach einer Röntgenstruktur von Shinya Yoshikawa, Himeji Institute of Technology, Hyogo.

PDBid 1V54.] 6% siehe Interactive Exercises.

M207 H161

Cu „Zentrum C196 c200

H204

E198

Der Komplex IV aus Säugetieren ist ein etwa 410 kD großes Homodimer, dessen Protomere aus jeweils 13 Untereinheiten zusammengesetzt sind. Die von Shinya Yoshikawa gelöste Röntgenkristallstruktur von Komplex IV aus Rinderherz-Mitochondrien zeigt, dass 10 dieser Untereinheiten Transmembranproteine sind. Sie enthalten insgesamt 28 die Membran durchspannende oa-Helices (Abb. 18.17). Das Innere des Komplexes IV wird aus seinen drei größten und am stärksten hydrophoben Untereinheiten I, II und III (grün, gelb und violett in Abb. 18.17) gebildet. Diese sind durch mitochondriale DNA codiert (die restlichen Untereinheiten sind im Zellkern codiert und müssen als Proteine in die Mitochondrien importiert werden). Ein konkaves Areal auf der zum Intermembranraum zeigenden Oberfläche des Proteins enthält zahlreiche saure Aminosäurereste. Diese können potentiell mit dem Ring von. Lys-Resten am Cytochrom c, dem Elektronendonor für Komplex IV, interagieren.

Abb. 18.18 Lage der Redoxzentren in der Cytochrom c-Oxidase aus Rinderherz. Die Ansicht ist ähnlich wie die von Abb. 18.17. Fe- und Cu-lonen sind als orange und cyanfarbige Kugeln dargestellt. Ihre Häm- und Proteingruppenliganden sind in Stabform gezeichnet und entsprechend ihrer Atomtypen (Häm-C magenta, Protein-C grün, N blau, O rot und S gelb) gefärbt. Die Peroxygruppe, die das Cu, und die Häm-az-Fe-lonen verbindet, ist in Kugel-Stab-Form (in rot) abbgebildet. Koordinative Bindungen sind als graue Linien dargestellt. Beachten Sie, dass die Seitenketten von His 240 und Tyr 244 durch eine kovalente Bindung (unten rechts) miteinander verbunden sind. [Nach einer Röntgenstruktur von Shinya Yoshikawa, Himeji Institute of Technology, Hyogo. PDBid 20CC.]

Komplex IV enthält vier Redoxzentren: Cytochrom a, Cytochrom a;, ein als Cu, bekanntes Kupferatom und ein Paar von Kupferatomen, das als Cu,-Zentrum bezeichnet wird (Abb. 18.18). Das Cu,-Zentrum ist an Untereinheit II gebunden und befindet sich 0,8 nm oberhalb der Membranoberfläche. Seine beiden Kupferionen sind über zwei Schwefelatome aus Cys-Resten miteinander verbrückt. Dies verleiht diesem Kupferzentrum eine Geometrie, die an einen [2Fe2S]-Cluster erinnert. Die anderen Redoxgruppen - Cu, sowie die Cytochrome a und a; - binden alle an die Untereinheit I und liegen ca. 1,3 nm unterhalb der Membranoberfläche. Spektroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Elektronenübertragung im Komplex IV linear ist. Sie erfolgt von Cytochrom c zum Cu,-Zentrum, dann zum

Häm

a und schließlich zu Häm

a, sowie Cu,. Das Eisenion von

Häm a; liegt nur 0,49 nm von Cu, entfernt. Diese beiden Redoxgruppen bilden tatsächlich einen einzigen zweikernigen Komplex. Zwischen den Redoxzentren des Komplexes IV wandern die Elektronen vermutlich über ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, wobei Aminosäureseitenketten, das Polypeptidrückgrat und die Propionatseitenketten der Hämgruppen mit einbezogen sind. Cytochrom c-Oxidase katalysiert Redoxreaktionen mit vier Elektronen Die Reduktion von O, zu 2 H,O durch Cytochrom c-Oxidase findet an dem

zweikernigen Cytochrom a;-Cuz-Komplex statt und erfordert den nahezu gleichzeitigen Einsatz von vier Elektronen. Der voll reduzierte zweikernige Fe(II)Cu(l)-Komplex kann jedoch auf sein gebundenes O, nur dann und maximal drei Elektronen übertragen, wenn er seinen voll oxidierten Fe(IV)-Cu(Il)-

Elektronentransport

FellID—oH CulD | HO—Y AH

z

H,O zu reduzieren, werden vier, sämtlich von

Cytochrom c gelieferte Elektronen sowie vier Protonen benötigt. [Modifiziert von Babcock, G.T., Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 12971 (1999).]

CutID)

HO—Y F

H,O BER2H*

Abb. 18.19 Reaktionscyclus der Cytochrom c-Oxidase. Um O, an dem zweikernigen a3-Cug-Komplex zu

oxidiert

FelVv)=0”

2

"OH

Eat

ur

Fe(lIV)=0O°

669

reduziert

Cu(ID

Sa pP

3

4

Fell) —O,

ne

HOZY. Oxy-Verbindung

Zustand annimmt [während der Reduktion von O, nimmt Cytochrom a, seinen Fe(IV)- oder Ferryl-Oxidationszustand an; siehe unten]. Woher stammt nun das vierte Elektron? Die Röntgenstrukturen der Cytochrom c-Oxidase zeigen deutlich, dass der His-240-Ligand von Cu, kovalent mit der Seitenkette eines konservierten TyrRests verknüpft ist (Tyr 244; Abb. 18.18, unten rechts). Dies orientiert die phenolische OH-Gruppe von Tyr nahe zum Häm a,-verknüpften O,, sodass Tyr 244 das vierte Elektron liefern kann, indem es vorübergehend ein Tyrosylradikal (TyrO-) bildet. Tyrosylradikale sind auch von mehreren anderen enzymatischen Redoxreaktionen bekannt. Dazu gehören die Erzeugung von O, bei der Photolyse von H,O (Abschnitt 19.2C) und die Ribonucleotid-Reduktase-Reaktion (die NDP zu dNDP umwandelt; Abschnitt 23.3A). Bei der Cytochrom c-Oxidase befindet sich die phenolische OH-Gruppe von Tyr innerhalb des Abstands der Wasserstoffbrücke des enzymgebunden O, und ist somit ein wahrscheinlicher H’-Donator während der Spaltung der O-O-Bindung. Es ist zu erwarten, dass die Ausbildung der kovalenten Quervernetzung sowohl das Reduktionspotential als auch den pK-Wert von Tyr 244 verringert. Dabei werden die Radikalbildung und die Protonenabgabe erleichtert. In Abbildung 18.19 ist eine Reaktionsabfolge für die Cytochrom c-Oxidase vorgeschlagen, die man mit verschiedenen spektroskopischen Techniken aufgeklärt hat: 1 und 2. Der oxidierte zweikernige [Fe(III).;„-OH Cu(ll),]-Komplex wird durch zwei aufeinanderfolgende Ein-Elektronen-Übertragungsreaktionen vom Cytochrom c über Cytochrom a und das Cu, zu seiner [Fe(Il),;Cu(l)s]-Form reduziert. Bei diesem Vorgang wird gleichzeitig ein Proton aus der Matrix aufgenommen und H,O freigesetzt. Tyr 244 (Y-OH) liegt in seiner Phenol-Form vor. 3% O, bindet an den reduzierten zweikernigen Komplex und wird Ligand dessen Fe(II),;-Atoms. Es bindet an Häm mit der ähnlichen Anordnung wie im Oxymyoglobin (Abb. 7.3). 4. Durch interne Umverteilung der Elektronen wird rasch der OxyferrylKomplex [Fe(IV)=0°” HO°-CU(II)] gebildet, in dem Tyr 244 dem Komplex ein Elektron und ein Proton gegeben hat und dabei die neutrale Radikal-Form (Y-O-) angenommen hat. Dies bezeichnet man als Ver-

670

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

9:

bindung P, weil man ursprünglich dachte, es handele sich um eine Peroxyverbindung. Eine dritte Ein-Elektronen-Übertragung von Cytochrom c zusammen mit der Aufnahme von zwei Protonen überführt Tyr 244 wieder in seine Phenolform; dies ergibt Verbindung F (für Ferryl) und die Freisetzung von einem H30.

6.

Die vierte und letzte Elektronenübertragung und Protonenaufnahme ergibt den oxidierten [Fe(Ill).;-OH” Cu(Il),]-Komplex und vollendet damit den Katalysecyclus.

Cytochrom c-Oxidase besitzt zwei protonenübertragende Kanäle

Die von der Cytochrom c-Oxidase katalysierte Reaktion trägt auf zwei Weisen zum Protonengradienten an der Membran bei. Erstens werden vier sogenannte chemische oder skalare Protonen von der Matrix während der Reduktion von O,

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 Ile Beschreiben Sie den Weg der

Elektronen von der Glucose zum Sauerstoff. Erläutern Sie, warum aus der Freien Enthalpie, die durch den Elektronentransport von NADH zu O, freigesetzt wird, mehrere ATP-Moleküle synthetisiert werden können. Stellen Sie die vier Elektronentransport-Komplexe mit ihren relativen Reduktionspotentialen graphisch dar und zeichnen Sie den Weg des Elektronenflusses ein. Listen Sie die Typen von

prosthetischen Gruppen in den Komplexen I, II, III und IV auf und teilen Sie diese in Ein- und

Zwei-Elektronen-Überträger ein. Beschreiben Sie die verschiedenen Mechanismen mithilfe derer Protonen während des Elektronentransports übertragen werden.

durch Cytochrom c-Oxidase aufgenommen und es entstehen 2 H,O. Dabei wird die Protonenkonzentration der Matrix verringert. Zweitens ist die Vier-Elektronen-Reduktionsreaktion an die Übertragung von vier sogenannten gepumpten oder vektoriellen Protonen von der Matrix zum Intermembranraum gekoppelt. Man beachte, dass bei jeder Umsetzung des Enzyms

8 Hy

+ O2 + 4 Cytochrom c (Fe’*) >

4 Cytochrom c (Fe’*) + 2 H,O + 4H}Intermembranraum

die Matrix insgesamt acht positive Ladungen verliert. Dies trägt zur Membranpotentialdifferenz bei, welche die ATP-Synthese antreibt (Abschnitt 18.3). Die Röntgenstrukturen der Cytochrom c-Oxidase zeigen, dass es zwei Kanäle gibt, die von der Matrix in die Nähe des O,-reduzierenden Zentrums führen. Diese könnten möglicherweise über einen Protonenleiter Protonen transportieren. Der K-Kanal (er hat seinen Namen daher, dass er einen essenziellen LysRest enthält) führt von der Matrixseite des Proteins zu Tyr 244 - dem Aminosäurerest, der wie oben beschrieben zu einem freien Radikal wird. Da dieser Kanal nicht mit dem Intermembranraum verbunden zu sein scheint, nimmt man an,

dass er die chemischen Protonen für die O,-Reduktion liefert. Der D-Kanal (so benannt wegen eines wichtigen Asp-Restes) erstreckt sich von der Matrix in die Nähe des Häm-a;-Cu,-Zentrums, wo er sich mit dem sogenannten Ausgangskanal verbindet, der mit dem Intermembranraum in Verbindung steht. Offensichtlich pumpt der in Reihe mit dem Ausgangskanal geschaltete D-Kanal vektorielle Protonen von der Matrix in den Intermembranraum. Zudem fungiert der D-Kanal auch als Leiter für die an der chemischen Reaktion beteiligten Protonen, die für den zweiten Teil des Reaktionscyclus erforderlich sind (die Schritte 5 und 6 von Abb. 18.19). Trotz des Beschriebenen bleibt der Mechanismus, der die O,-Reduktion an das Protonenpumpen in Komplex IV koppelt, noch ein Rätsel.

3

Oxidative Phosphorylierung

Die endergon verlaufende Synthese von ATP aus ADP + P; wird in den Mitochondrien durch den Elektronentransport angetrieben und durch eine ATPSynthase (auch als Komplex V bezeichnet) katalysiert. Die Freie Enthalpie, die während des Elektronentransports durch die Komplexe I-IV freigesetzt wird, muss in einer durch die ATP-Synthase nutzbaren Form konserviert werden. Diese Art der Energiespeicherung wird als energetische Kopplung bezeichnet. Die physikalische Natur dieser energetischen Kopplung war lange Zeit äuferst schwer fassbar. Viele plausible und oft raffinierte Ideen hielten einer exakten experimentellen Überprüfung nicht stand. Zum Beispiel bestand eine heute verworfene Theorie darin, dass der Elektronentransport zu einem „energierei-

Oxidative Phosphorylierung

671

chen“ Intermediat führt, wie z.B. Phosphoenolpyruvat (PEP) in der Glykolyse (Abschnitt 15.2J), dessen nachfolgende Spaltung die ATP-Synthese antreibt. Solch ein Intermediat wurde niemals identifiziert. In Wirklichkeit ist die ATPSynthese mit dem Elektronentransport über einen transmembranären Protonengradienten gekoppelt, der sich ausbildet, während die Elektronen durch die Komplexe I, III oder IV fließen. In diesem Abschnitt soll der Mechanismus der Kopplung und die Arbeitsweise der ATP-Synthase betrachtet werden.

A.

Die chemiosmotische Theorie

Die chemiosmotische Theorie, 1961 durch Peter Mitchell vorgeschlagen, war lange Zeit heftig umstritten, ist inzwischen aber weitestgehend akzeptiert (Exkurs 18.2). Mitchells Theorie besagt, dass die Freie Enthalpie des Elektronentransports dadurch konserviert wird, dass H* aus der mitochondrialen Matrix in den Intermembranraum überführt und so ein elektrochemischer H*-Gradient über der inneren mitochondrialen Membran erzeugt wird. Das elektrochemische Potential dieses Gradienten wird zur Synthese von ATP genutzt (Abb. 18.20). Die chemiosmotische Theorie ist in der Lage, mehrere grundlegende experimentelle Beobachtungen zu erklären: 1. Für eine oxidative Phosphorylierung muss die innere mitochondriale Membran intakt sein. 2. Die innere mitochondriale Membran ist für Ionen, wie H*, OH’, K' und CT’, undurchlässig. Deren freie Diffusion würde den elektrochemischen Gradienten entladen. 3. Während des Elektronentransports wird ein durch Messungen nachweisbarer, elektrochemischer H’-Gradient über der Membran ausgebildet. H* wird aus intakten Mitochondrien exportiert. Der Intermembranraum entspricht in dieser Hinsicht dem Cytosol. 4. Verbindungen, welche die Permeabilität der inneren mitochondrialen Membran gegenüber Protonen erhöhen, hemmen die ATP-Synthese, ohne dass der Elektronenfluss (aus der Oxidation von NADH und Succinat) unterbrochen wird. Durch den Abbau des elektrochemischen Gradienten „entkoppeln“ sie den Elektronentransport von der oxidativen Phosphorylierung. Umgekehrt wird bei Erhöhung der Acidität auf der Außenseite der inneren mitochondrialen Membran die ATP-Synthese stimuliert. Auch in Bakterien läuft ein völlig analoger Prozess ab. Deren Maschinerie des Elektronentransports befindet sich in ihren Plasmamembranen (siehe Exkurs

18.3).

Abb. 18.20 Kopplung von Elektronentransport und ATP-Synthese. Der Elektronentransport (grüner Pfeil) erzeugt einen elektrochemischen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran. Protonen (H*) werden während der Elektronenübertragung aus den Mitochondrien heraus transportiert (blaue Pfeile) und ihr exergoner Rücktransport treibt die Synthese von ATP an (rote Pfeile). Man beachte, dass der Intermembranraum dem Cytosol topologisch äquivalent ist, da die äußere mitochondriale Membran für H" durchlässig ist.

6% siehe Animated Figures.

H,0 ADP

ATP

672

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Exkurs 18.2

Berühmte Biochemiker

Peter Mitchell und die chemiosmotische Theorie

anderer Biochemiker. Erstens war die Chemiosmose ein theoretischer Begriff, für den es keinen direkten Beweis gab. Zweitens wurde die Untersuchung der oxidativen Phosphorylierung von einigen wenigen einflussreichen Laboratorien betrieben, die neuen Theorien gegenüber wenig aufgeschlossen waren. Die Stoffwechseluntersuchungen seit Mitte der 1940er Jahre hatten sich insbesondere auf die Aktivitäten löslicher Enzyme konzentriert. Mitchells Theorie war nicht das Produkt Peter Mitchell (1920-1992) Einer der dramatischsten Paradigmenwechsel in der Biochemie kam durch die Arbeit von Peter Mitchell zustande, dessen

chemiosmotische Hypothese den biologischen Elektronentransport mit der ATP-Synthese verband. Mitchell war in erster Linie ein theoretischer Biochemiker, obwohl er auch Experimente durchführte, um seine Hypothese zu untermauern. Ein-

mal hat er den menschlichen Geist mit einem Garten verglichen, der mit Ideen und Fakten bepflanzt ist, die ständig neu

geordnet werden. Er vertrat jedoch seine eigenen, höchst kontroversen Ideen meist mit großer Beharrlichkeit. Mitchell graduierte an der Universität von Cambridge im Jahre 1942 und legte mit seiner dortigen Forschung den Grundstein für die chemiosmotische Theorie. Nach 1955 setzte er seine Arbeit an der Universität Edinburgh fort. Er war fasziniert von der Idee der Kompartimentierung in lebenden Zellen und von den vektoriellen, gerichteten Abläufen bei

Stoffwechselprozessen. Zunächst entschloss er sich, den Phosphattransport in Bakterien zu untersuchen, weil dieser Prozess sowohl mit dem Stoffwechsel als auch mit dem Transmembrantransport verknüpft ist. Er erkannte, dass der vektorielle Charakter des Membrantransports auf die Anwesenheit von membranassoziierten Systemen zurückgeht, die durch chemische Kräfte angetrieben werden. Mitchell fand auch Interesse an der von David Keilin in Cambridge formulierten Idee der Atmungskette, denn auch dies war ein biologisches Phänomen mit eindeutig vektoriellem

Charakter.

Mitchell

mutmaßte,

dass es ein Enzym

geben muss, das wie Transporter ein Substrat auf einer Seite der Membran zu einem Produkt auf der anderen Membranseite umwandelt. Andere Forscher hatten bereits entdeckt, dass die Aktivität der Atmungskette einen pH-Gradienten erzeugt. Mitchell lieferte nun die geniale Erklärung, wie dieser pH-Gradient die ATP-Synthese antreiben könnte. In seiner bahnbrechenden Veröffentlichung von 1961 machte Mitchell den Vorschlag, dass die mit den Cristae im Mito-

chondrion verknüpfte Atmungskette aufgrund der elektrischen Differenz und der pH-Differenz an der Membran eine protonenmotorische Kraft erzeugt. Diese Kraft treibt eine ATPase an, die umgekehrt die Kondensation von Phosphat mit ADP katalysiert und dabei ATP erzeugt. So elegant Mitchells Hypothese auch war, sie stieß dennoch aus mehreren Gründen auf den starken Widerstand

eines

klassischen,

biochemischen

Ansatzes,

sondern

kam

stattdessen durch sein Verständnis der Membranphysiologie zustande. Zudem konzentrierten sich die vorherrschenden Theorien über die Verbindung zwischen dem Elektronentransport und der ATP-Synthese auf eine phosphorylierte Verbindung als ein energiereiches Zwischenprodukt. Fritz Lipmann (Exkurs 14.3) hatte postuliert, dass eine energiereiche Phosphatgruppe eventuell mit einer Verbindung der Atmungskette verknüpft werden könnte. Diese Hypothese wurde später dahingehend erweitert, dass auch ein lösliches phosphoryliertes Zwischenprodukt postuliert wurde. Die Suche nach dieser vermuteten energiereichen Verbindung dauerte 20 Jahre. Der damit verbundene enorme Aufwand machte es für die beteiligten Forscher vermutlich umso schwerer, diese Theorie zugunsten von Mitchells Idee aufzu-

geben. In der Zwischenzeit wurde eine dritte Theorie vorgeschlagen, bei der der Elektronentransport über Konformationsänderungen eines Proteins an die ATP-Synthese gekoppelt war und bei der der beobachtete pH-Gradient nur ein Nebenprodukt dieses Vorgangs war. Mitchells chemiosmotische Hypothese erhielt in den ersten zehn Jahren nach ihrer Veröffentlichung keine nennenswerte Unterstützung. Während dieses Zeitraums, in dem es zu teilweise erbitterten Debatten

kam, wurde Mitchell krank

und zog nach Cornwall. Dort renovierte er ein Gutshaus, in dem er auch ein privates Labor einrichtete — Glynn Research, das er vom Vermögen seiner Familie finanzierte. Hier arbeitete er mit seiner lebenslangen Mitarbeiterin Jennifer Moyle an den experimentellen Beweisen für die chemiosmotische Theorie. Letztendlich bestätigten andere Forscher, dass Mitchell Recht hatte: Sie zeigten die protonenpumpende Aktivität der gereinigten, in Liposomen wiederhergestellten Mitochondrienkomponenten. Mitchell erhielt daraufhin 1978 den Nobelpreis für Chemie. Mitchell gelang es also, die vorherrschende Ansicht über eine zentrale Eigenschaft des aeroben Stoffwechsels zu revidieren, auch wenn das ein langer Kampf war. Er beklagte in späteren Jahren, dass man seine Arbeit im Nachhinein als selbstverständlich betrachtete, so, als wenn es „von Anfang

an klar“ gewesen wäre. Sonderbarerweise widersetzte sich Mitchell hartnäckig jeder Weiterentwicklung seiner eigenen Ideen. Beispielsweise zweifelte er niemals daran, dass Protonen direkt an der ADP-Phosphorylierung im aktiven Zentrum

Oxidative Phosphorylierung

der ATP-Synthase beteiligt sind. Und viele Jahre lang weigerte er sich, das Pumpen von Protonen anzuerkennen

(von dem

wir jetzt wissen, dass es in Komplex | und IV stattfindet). Stattdessen bestand er darauf, dass die alleinige Quelle des Protonengradienten

eine „Redoxschleife“

sei, in der zwei

Elektronen von der positiven auf die negative Seite der Membran übertragen würden und mit zwei Protonen Chinon zu Hydrochinon reduzierten. Das Hydrochinon diffundiere dann zurück durch die Doppelschicht und würde auf der positiven Seite erneut oxidiert, wo die Protonen freigesetzt würden. Der Redoxschleifenmechanismus erfordert zwei

„aktive Zentren“; er kommt im Q-Cyclus im Mitochondrien-

komplex Ill und in bestimmten Bakteriensystemen vor. Er kann aber nicht die gesamte protonenmotorische Kraft erklären, welche letztlich das Herzstück des chemiosmotischen

Mechanismus ist. Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism, Nature 191, 144-148

(1961). Prebble, J., Peter Mitchell and the ox phos wars, Trends Biochem. Sci. 27,

209-212 (2002).

Elektronentransport erzeugt einen Protonengradienten

Wie wir gesehen haben, bewirkt der Elektronentransport, dass die Komplexe I, III und IV Protonen aus der Matrix — einem Ort niedriger [H*] - durch die innere mitochondriale Membran in den Intermembranraum — einen Ort hoher [H*] - transportieren (Abb. 18.8). Die Freie Enthalpie, die in diesem elektrochemischen Gradienten akkumuliert wird (auch als protonenmotorische Kraft, PMK - engl.: proton motive force, pmf — bezeichnet), treibt die ATP-Synthese. Da H* ein Ion ist, hat die Änderung der Freien Enthalpie für den Transport eines Protons aus dem Mitochondrion sowohl eine chemische als auch eine elektrische Komponente (Abschnitt 10.1). Somit kann das AG für diesen Vorgang durch die Gleichung 10.3 ausgedrückt werden. Bezogen auf den pHWert gilt:

AG = 2,3RT|pH(innen) - pH(außen)]|

+ ZFAY

(18.1)

wobei Z die Ladung des Protons (inklusive des Vorzeichens), # die Faraday-Konstante und AY das Membranpotential bezeichnet. Die Übereinkunft bezüglich des Vorzeichens von AW legt fest, dass beim Transport eines Protons von der negativen zur positiven Seite AWY positiv ist. Da der pH (außen) niedriger ist

als der pH (innen), ist der Export von Protonen aus der mitochondrialen Matrix (gegen den Protonengradienten) ein endergoner Vorgang. Das für die innere Membran von Leber-Mitochondrien gemessene Membranpotential beträgt 0,168 V (innen negativ). Der pH der Matrix liegt um ungefähr 0,75 Einheiten höher als der des Intermembranraums. Somit beträgt AG für den Export eines Protons aus der mitochondrialen Matrix ungefähr 21,5 k] - mol". Da die Bildung des Protonengradienten ein endergoner Prozess ist, ist umgekehrt die Entladung des Gradienten exergon. Diese Freie Enthalpie wird von der ATP-Synthase für die Phosphorylierung von ADP nutzbar gemacht. Die für physiologische Bedingungen geltende Freie Enthalpie zur Synthese eines ATP-Moleküls von +40 bis + 50 kJ : mol” ist zu groß, um die ATP-Synthese durch den Rücktransport eines einzelnen Protons in die mitochondriale Matrix betreiben zu können. Es werden mindestens zwei Protonen benötigt. Tatsächlich ergeben die meisten experimentellen Untersuchungen (die nur schwer präzise zu quantifizieren sind), dass drei Protonen für die Synthese eines ATP benötigt werden.

B.

673

ATP-Synthase

ATP-Synthase, auch als protonenpumpende ATP-Synthase oder F}Fo-ATPase bezeichnet, ist ein aus vielen Untereinheiten bestehender, transmembranärer Pro-

teinkomplex mit einer molekularen Masse von insgesamt 450 kD. Efraim Racker

fand heraus, dass die mitochondriale ATP-Synthase aus zwei funktionellen Ein-

674

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Exkurs 18.3

Biochemie im Überblick

Bakterieller Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

zum Cytosol orientiert ist. Dies entspricht genau der Topologie, die man auf Grund der postulierten evolutionsgeschichtlichen Verbindung von Bakterien und Mitochondrien erwar-

terien wahrscheinlich auch, die oxidative Phosphorylierung besser mit der Verfügbarkeit unterschiedlicher Energiequellen abzustimmen und die ATP-Synthese mit der Regeneration verschiedener reduzierter Coenzyme in Einklang zu bringen. Wenn z.B. bei fakultativ-anaeroben Bakterien (die sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von O, wachsen können) der Energiebedarf durch anaerobe Fermentation abgedeckt wird, kann der Elektronentransport so reguliert werden, dass NAD* regeneriert wird, ohne dabei-ATP durch oxidative Phosphorylierung zu synthetisieren. In bakteriellen Plasmamembranen kommen unterschiedliche Proteinkomplexe vor, die ein oder mehrere Cytochrome

ten würde.

enthalten

Die Oxidation von CoQH; tritt in allen aeroben Organismen auf. In Mitochondrien nimmt CoQ Elektronen auf, die von NADH (über Komplex I), Succinat (Komplex Il) und Fettsäuren stammen. Bei Bakterien ist CoQ die Sammelstelle für Elektronen, die durch spezifische Dehydrogenasen einer Vielfalt von Substraten entzogen werden. Wie in Mitochondrien durchlaufen auch bei Bakterien die Elektronen von CoQ ausgehend zunächst cytochromabhängige Oxidoreduktasen,

gerte“ Versionen der mitochondrialen

Es ist nicht überraschend, dass aerobe Bakterien, aus deren Vorläufern die Mitochondrien entstanden sind, eine ähnliche Maschinerie wie diese verwenden, um reduzierte Coenzyme

zu oxidieren und deren Energie durch ATP-Synthese zu speichern. In Bakterien befinden sich die Komponenten der respiratorischen Elektronentransportkette in der Plasmamembran. Die Protonen werden vom Cytosol zur Außenseite der Plasmamembran transportiert. Die Protonen fließen über eine ATP-Synthase

zurück

in die Zelle, deren

katalytischer Teil

fehlen

können.

Einige dieser

die zusätzlichen

Proteine

Untereinheiten,

stellen

die vom

Komplexen

haben keine eukaryotischen Gegenstücke, weder mitochond-

rial noch kerncodiert.

Ill und IV). In anderen Arten, darun-

ter E. coli, wird für die Reduktion von O, durch die von CoQ abgegebenen

Elektronen nur ein einziger Typ von Enzymen,

eine Quinol-Oxidase verwendet. Der Vorteil eines aus mehreren

Komplexen

bestehenden

Elektronentransportwegs besteht darin, dass er auch mehrere

Möglichkeiten für die Protonentranslokation über die bakterielle Membran

bietet, so dass die ATP-Ausbeute pro Elektron

höher ist. Jedoch könnten in Gegenwart von Toxinen, die das bakterielle Gegenstück des mitochondrialen Komplexes III inaktivieren, die kürzeren Elektronentransportwege einen Selektionsvorteil mit sich bringen. Das Vorhandensein mehrerer Arten von Elektronentransportwegen ermöglicht es den Bak-

Staphylococcus aureus. [© Tony Brain/Photo Researchers.]

Mitochondrien

Dehydrogenase| —-

CoQ —-

Cytochrom-

—>

Cytc —

5

a

|Terminale Oxidase

Name

0:

H,O

Aerobe

Bakterien

© N hTe -

—

Cytc —

3 3 |Terminale Oxidase

—r Dehydrogenase —-

nuclearen

Genom der Eukaryoten codiert werden. Jedoch ist dies kein universelles Merkmal der bakteriellen Atmungskettenkomplexe und viele der bakteriellen Proteine (z.B. Cytochrom d)

bevor sie auf O, übertragen werden. In einigen Spezies erfolgt dies über zwei Proteinkomplexe (analog zu den mitochondrialen

„abgema-

Komplexe dar. Ihnen

%

H,O

CoQ —-

5

6

|Terminale Oxidase

re

0

H,O

Oxidative Phosphorylierung heiten zusammengesetzt

675

ist, Fo und F}. Fo ist ein wasserunlöslicher, trans-

membraner Protonenkanal, der mindestens drei verschiedene Typen von Untereinheiten enthält. F, ist ein wasserlösliches, peripheres Membranprotein, das aus fünf Typen von Untereinheiten zusammengesetzt ist. Bei Behandlung mit Harnstoff dissoziiert der F,-Anteil leicht und reversibel von Fo ab. Solubilisiertes F, hydrolysiert ATP (daher auch die Bezeichnung ATPase), kann es aber nicht synthetisieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran auf der Matrixseite mit Molekülen der ATP-Synthase übersät ist. Die F,-Komponente des Enzyms ist mit dem in die Membran einbetteten Fo-Teil durch einen Proteinstiel verbunden, sodass F, wie ein Lolli

aussieht (Abb. 18.21a). Ähnliche Gebilde hat man in der bakteriellen Plasmamembran und in Chloroplasten entdeckt, wo sie die Innenfläche auskleiden (Abschnitt 19.2D). Höher aufgelöste kryoelektronenmikroskopische Bilder der ATP-Synthase aus Mitochondrien des Rinderherzens zeigen, dass dessen F}und Fo-Komponenten sowohl über einen ca. 5 nm langen zentralen Stiel als auch über ein weniger kräftiges peripher sitzendes Verbindungsstück verbunden sind (Abb. 18.215).

(a)

Die F}-Komponente hat eine pseudodreifache Symmetrie

Die F,-Komponente der ATP-Synthase in den Mitochondrien ist aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt, sodass sich die Anordnung a,ß;yöe ergibt. John Walker und Andrew Leslie bestimmten die Röntgenstruktur der F,-Untereinheit aus Mitochondrien des Rinderherzens. Dieser 3440 Aminosäuren enthaltende Proteinkomplex (371 kD) besteht aus einem 8 nm hohen und 10 nm breiten Sphäroid, das auf einem 3 nm langen Stiel sitzt (Abb. 18.22a). Die aund ß-Untereinheiten wechseln sich ab, sind ähnlich wie die Segmente einer Orange angeordnet und weisen 20% Sequenzidentität sowie nahezu identische Faltungsmuster auf. Sie umgeben den oberen Teil einer 9 nm langen a-Helix, die durch den C-terminalen Abschnitt der y-Untereinheit gebildet wird (Abb. 18.22b). Der untere Teil der Helix bildet mit dem N-terminalen Abschnitt der y-Untereinheit eine antiparallele Superspirale. Diese Superspirale verbindet gemeinsam mit den ö- und e-Untereinheiten, die um sie gewickelt sind - F, mit Fo.

Die periodische Anordnung und die Strukturähnlichkeiten der a- und ß-Untereinheiten von F, verleihen dieser sowohl eine pseudodreifache als auch pseudosechsfache Rotationssymmetrie (Abb. 18.22c). Dennoch ist der Proteinkomplex auf Grund der vorhandenen y-Untereinheit asymmetrisch. Aber noch wichtiger ist, dass jedes Paar aus a- und ß-Untereinheiten eine andere Konformation (mit jeweils einer anderen Substratspezifität) zu einem Zeitpunkt annimmt. Somit bindet eine B-Untereinheit (in Abb. 18.22a als Br bezeichnet) ein Molekül des nicht hydrolysierbaren ATP-Analogons AMMPPNP, die zweite (ßpnp) bindet ADP, und die dritte (ß,) hat eine leere und verzerrte Bindungsstelle. Obwohl auch die a-Untereinheiten AMPPNP binden können, katalysieren nur die ß-Untereinheiten die ATP-Synthese. Die Fo-Komponente beinhaltet einen Transmembranring Die Fo-Komponente der bakteriellen und mitochondrialen F}Fo-ATPasen besteht aus vielen Untereinheiten. Bei E. coli bilden drei Transmembranuntereinheiten - a,b und c- einen a,b,co_1„-Komplex. Die mitochondriale Fo-Komponente enthält zusätzliche Untereinheiten, deren Funktion unklar ist. Die c-Untereinheiten enthalten jeweils zwei a-Helices und lagern sich zu einem Ring zusammen, der

in die Membran eingebettet ist. Eine Röntgenstruktur mit niedriger Auflösung vom F,-Komplex der Hefe mit ihrem c-Ring-Oligomer (Abb. 18.23) zeigt, dass dessen a- und ß-Untereinheiten ähnliche Konformationen und ähnliche gebundene Nucleotide haben wie die F}Untereinheit vom Rind (Abb. 18.22). Das c-Oligomer der Hefe besteht aus 10

(b) Abb. 18.21 Struktur der ATP-Synthase. (a) Elektronenmikroskopische Aufnahme der Cristae von Mitochondrien

mit ihren F}-„Lollis“,

die in die Matrix ragen. [Nach Parsons, D.F.,

Science 140, 985 (1963). Copyright © 1963 American Association for the Advancement of Science.] (b) Aus kryoelektronenmikroskopischen Untersuchungen abgeleitetes Modell der F}Fo-ATPase aus Mitochondrien des Rinderherzens. [Mit freundlicher Genehmigung von John Rubinstein, University of Toronto, und John Walker und Richard Henderson,

MRC Laboratory of

Molecular Biology, Cambridge]

676

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung Abb. 18.22 Die Röntgenkristallstruktur der F}-ATPase aus Rinderherz-Mitochondrien. (a) Ein Bänderdiagramm mit den o-, ß- und y-Untereinheiten in Rot, Gelb und Blau. Die eingefügte Zeichnung gibt die Anordnung der Untereinheiten bei dieser Ansicht wieder. Der Balken hat eine Länge von 2 nm. (b) Querschnitt durch die Elektronendichtekarte des Proteins (a- und ß-Untereinheiten sind blau, die y-Untereinheit orange dargestellt). Darüber gelegt sind die C,-Rückgrate (gelb) dieser Untereinheiten und als raumfüllendes Modell ein gebundenes ATP-Analogon (C: gelb, N: blau, ©: rot). (c) Pseudosymmetrische Anordnung der a3ß3-Grup(a) und (b) ergibt. Die Kolorierung der pierung, wie sie sich aus der Aufsicht auf die Teile Oberfläche entspricht ihrem elektrischen Potential mit blau für positive Potentiale und rot für negative. Man beachte, dass auf der inneren Oberfläche dieser Manschette keine Ladungen vorhanden sind. Entsprechend weist auch derjenige Teil der C-terminalen Helix in der y-Untereinheit, der mit dieser Manschette in Kontakt ist, keine Ladungen auf. [Aus Abrahams, J.P.,

Leslie, A.G.\W., Lutter, R. und Walker, J.E. Nature 370, 623 und 627 (1994). PDBid 18MF.

Mit freundlicher Genehmigung.] 6% siehe Interactive Exercises.

Untereinheiten (die Zahl kann sich von der bei E. coli unterscheiden), diese lagern sich aneinander, sodass zwei konzentrische Ringe von a-Helices entstehen. Untersuchungen des Aufbaus zeigen, dass die ö-Untereinheit sowohl die Basis der y-Untereinheit als auch den c-Ring berührt. Dabei bildet sich eine fußartige Grenzfläche zwischen Fo und F,, sodass etwa zwei Drittel der oberen Oberfläche des c-Rings die Basis des F,-Stiels berühren (Abb. 18.23). Die Sequenz der a-Untereinheit lässt vermuten, dass dieses hoch hydrophobe Protein aus 271 Aminosäuren fünf Transmembranhelices bildet. Die 156 Aminosäuren umfassende b-Untereinheit besteht aus einer einzelnen Transmembranhelix, die eine polare Domäne verankert. Diese lagert sich zum Homodimer zusammen und bildet eine parallele a-helicale Superspirale, die sich von der Peripherie des c-Rings in die Matrix erstreckt, wo sie die Ö60;ß;-Anordnung berührt (das peripher liegende Verbindungsstück in Abb. 18.215). Der Bindungswechsel-Mechanismus Der Mechanismus der ATP-Synthese durch die Protonen translozierende ATPSynthase kann konzeptionell in drei Abschnitte aufgeteilt werden:

1. Von Fo. durchgeführte Protonentranslokation. 2. Von F, katalysierte Bildung der Phosphorsäureanhydridbindung von ATP. 3. Kopplung der ATP-Synthese mit dem Abbau des Protonengradienten, wofür Wechselwirkungen zwischen F, und F, erforderlich sind. Die vorliegenden experimentellen Befunde unterstützen einen Mechanismus, der von Paul Boyer vorgeschlagen wurde. Entsprechend diesem Bindungswechsel-Mechanismus weist F, drei miteinander in Wechselwirkung stehende katalytische Protomere (aß-Einheiten) auf. Jedes dieser Protomere befindet sich in einem anderen Konformationszustand: dem L-Zustand, bei dem Substrate und Produkte nur locker (engl.: loosely) gebunden sind; dem T-Zustand mit deren fester (engl.: tight) Bindung und dem O-Zustand (engl.: open), der diese überhaupt nicht bindet. Die bei der Protonentranslokation freigesetzte Freie Enthalpie wird dazu eingesetzt, diese drei Zustände ineinander umzuwandeln. Die Phosphorsäureanhydrid-Bindung des ATP wird allein im T-Zustand geknüpft und ATP wird nur im O-Zustand abgegeben. Die Gesamtreaktion umfasst drei Schritte (Abb. 18.24): 1. ADP und P; binden (locker) an die Bindungsstelle im L-Zustand (in Abb. 18.22a mit Bpp bezeichnet).

6” Guided Exploration 19: F,Fo-ATP synthase and the binding change mechanism.

2. Eine durch Freie Enthalpie getriebene Konformationsänderung wandelt den LZustand der Bindungsstelle in einen T-Zustand (ß-p bezeichnet) um, der die Bildung von ATP katalysiert. Bei diesem Schritt finden auch Konformationsänderungen an den beiden anderen Protomeren statt, welche die durch ATP

besetzte Bindungsstelle (T-Zustand) in die offene (0) Form (Br bezeichnet) und die im O-Zustand befindliche Bindungsstelle in den L-Zustand überführen.

Oxidative Phosphorylierung

677

Abb. 18.23 Röntgenstruktur des F}-c}9-Komplexes aus Hefemitochondrien. Diese Elektronendichtekarte (pink) hat eine niedrige Auflösung (0,39 nm) und zeigt den Komplex, wie er in der inneren Mitochondrienmembran sitzt. Die Matrix befindet sich oben. Das C,-Rückgrat von Rinder-F, (a ist orange, ß gelb und y grün) ist an eine Elektronendichtekarte angepasst. Das Nebenbild zeigt die Lage der Untereinheiten

8,3 nm

des Komplexes, die gestrichelten Linien geben die

vermeintliche Lage der inneren Mitochondrienmembran (M) an und die c-Untereinheiten sind nummeriert. [Mit freundlicher Genehmigung von Andrew Leslie und John Walker, Medical Research Council, Cambridge. PDBid 1Q01.] 5,0nm

5,8nm

3. Während ATP auf der im T-Zustand befindlichen Untereinheit synthetisiert wird, dissoziiert ATP von der im O-Zustand vorliegenden Untereinheit ab. Die durch den Protonenfluss gelieferte Freie Enthalpie erleichtert in erster Linie die Ablösung des neu synthetisierten ATP vom Enzym, d.h. sie bewirkt den Übergang T — O. Hierbei werden die ATP-Enzym-Wechselwirkungen aufgehoben, die zuvor im T-Zustand die spontane Bildung von ATP aus ADP + P; unterstützt haben.

Abb. 18.24 Der Bindungswechsel-Mechanismus der ATP-Synthase. F} hat drei miteinander interagierende aß-Protomere, die chemisch identisch sind, sich aber in der Konformation ihrer aktiven Zentren voneinander unterscheiden: ©, die offene Konformation hat eine

sehr geringe Affinität zu Liganden und ist katalytisch nicht aktiv; L bindet die Liganden locker,

Wie ist die Enthalpie des Protonentransfers an die Synthese von ATP-gekoppelt? Wegen der cyclischen Natur des Bindungswechsel-Mechanismus schlug Boyer vor, dass die Veränderungen der Bindung durch die Rotation der katalytischen Gruppierung a;ß; im Verhältnis zu anderen Teilen der F,Fo-ATPase hervorgerufen werden. Diese Hypothese wird durch die Röntgenstruktur von F, untermauert. Die eng sitzende, nahezu ringförmige Anordnung der Innenfläche der a- und ß-Untereinheiten um den helicalen C-Terminus der y-Untereinheit erinnert an ein zylindrisches Lager, das in einer Manschette rotiert (Abb. 18.22b, c). Tatsächlich haben die sich berührenden hydrophoben Oberflächen in dieser Anordnung keine Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen, welche die freie Rotation beeinträchtigen würden (Abb. 18.22c), d.h. das Lager und die Manschette sind sozusagen „geschmiert“. Zudem würde die zentrale Aussparung in der a&,ß;-Anordnung (Abb. 18.22b) die Passage der N-terminalen Helix der y-Untereinheit innerhalb des Kerns dieses Partikels während der Drehung erlauben. Letztlich scheinen die Konformationsunterschiede zwischen den drei kata-

w

Energie

ist aber katalytisch ebenfalls nicht aktiv; T bindet die Liganden fest und ist katalytisch aktiv. Die ATPSynthese erfolgt in drei Schritten: (1) ADP und P; binden an die L-Stelle. (2) Ein energieabhängiger Konformationswechsel verändert die Bindungsstellen von L zu T, Tzu O und O zu L. (3) ATP wird an der Stelle T synthetisiert und bei Stelle © freigesetzt. Nach zwei weiteren Schritten dieser Reaktionssequenz befindet sich das Enzym wieder in seinem Ausgangszustand.

Die zum Antrieb der

Konformationswechsel erforderliche Energieübertragung auf die azß3-Gruppierung, die hier durch den im Zentrum befindlichen Zeiger (grün) dargestellt ist, erfolgt über die Rotation der yö-Gruppierung (ye in E. coli). [Nach Cross, R.L., Annu. Rev. Biochem. 50, 687 (1980).] 6% siehe Animated Figures.

678

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Iytischen Zentren von F, mit der Lage der y-Untereinheit in Beziehung zu stehen. Die y-Untereinheit rotiert innerhalb der fixierten a,ß3-Anordnung und fungiert offensichtlich als eine molekulare Nockenwelle, indem sie den durch den Protonengra-

dienten angetriebenen Fo-Motor mit den Konformationsänderungen der katalytischen Zentren von F, verbindet.

Die F}Fo-ATPase ist ein Rotationsmotor Die vorgeschlagene, durch den Bindungsmechanismus hervorgerufene Rotation der a,ß3-Anordnung relativ zur .y-Untereinheit hat zu dem in Abbildung 18.25 dargestellten Modell der F,Fo-ATPase geführt. Ein Rotationsmotor braucht sowohl einen Rotor (der sich dreht) als auch einen Stator (Motorständer, der fest ist). In der F}Fo-ATPase ist der Rotor vermutlich ein Zusammenschluss

des

c-Rings mit der y- und (E. coli) e-Untereinheit, dagegen bildet die ab,-Einheit und die (FE. coli) ö-Untereinheit zusammen mit dem a;ß,-Sphäroid den Stator. Die Drehung des c-Rings in der Membran im Verhältnis zu der stationären a-Untereinheit wird durch den Protonenfluss von außen nach innen angetrieben, wie wir unten noch erörtern werden (hier bezieht sich „außen“ auf den mitochondrialen Intermembranraum oder das Äußere von Bakterien, wohingegen sich „innen“ auf die Mitochondrienmatrix

oder das Bakteriencytoplasma

be-

zieht). Der b,ö-Zusammenschluss hat vermutlich die Aufgabe, das a;ß;-Sphäroid in der Position zu halten, während sich innen die y-Untereinheit dreht.

In Abbildung 18.25 ist ein Modell für die protonengetriebene Rotation der FoUntereinheit dargestellt. Protonen gelangen von außerhalb in einen hydrophilen Kanal zwischen der a-Untereinheit und dem c-Ring, wo sie an eine c-Untereinheit binden. Der c-Ring macht dann fast eine ganze Umdrehung, (Protonen binden an die nachfolgenden c-Untereinheiten, während sie diesen Eingangskanal passieren) bis die Untereinheit einen zweiten hydrophilen Kanal zwischen der a-Untereinheit und dem c-Ring erreicht, der nach innen mündet, wo das Proton

Abb. 18.25

Modell der F}-Fo-ATPase aus E. coli.

Der ye-c];-Ringkomplex ist der Rotor und der ab,-Ü;ß3ö-Komplex der Stator. Die Rotationsbewegung wird dem Rotor durch die Protonenpassage von außen (Periplasma, unten) nach innen (Cytoplasma, oben) vermittelt. Protonen, die von außen hereinkommen, binden an eine c-Untereinheit, an der Stelle an der diese mit der

a-Untereinheit in Wechselwirkung steht und gelangen wie eingezeichnet ins Innere, nachdem der c-Ring eine fast vollständige Umdrehung gemacht hat (schwarze Pfeile), sodass die c-Untereinheit erneut zur a-Untereinheit gelangt. Der b,ö-Komplex soll wahrscheinlich verhindern, dass die o,ß;-Anordnung zusammen mit der y-Untereinheit rotiert. Man beachte, dass die g-Untereinheit von E. coli

der ö-Untereinheit von Mitochondrien entspricht; die ö-Untereinheit entspricht der MitochondrienUntereinheit mit der Bezeichnung OSCP. Die &-Untereinheit der Mitochondrien hat weder in Bakterien-, noch in Chloroplasten-ATPase ein

Pendant. [Mit freundlicher Genehmigung von Richard Cross, State University of New York,

Syracuse.]

Oxidative Phosphorylierung

679

freigesetzt wird. (In einem alternativen Modell werden die Protonen durch mutmaßliche Kanäle zwischen den C-terminalen Helices der benachbarten c-Untereinheiten freigesetzt —- Kanäle, die verschlossen sind, wenn sich die a- und c-Untereinheiten berühren.) Die F}Fo-ATPase erzeugt drei ATP pro Umdrehung und hat (zumindest bei Hefe) zehn c-Untereinheiten in ihrer Fo-Anordnung. Sie bildet somit idealerweise 3/10 = 0,3 ATP für jedes Proton, das sie von außen nach

innen führt. Wie verursacht die Passage der Protonen durch dieses System, dass sich der c-Ring dreht und somit ATP synthetisiert wird? Jede c-Untereinheit besteht aus zwei verschieden langen a-Helices, die über eine polare Schleife aus vier Aminosäuren verknüpft sind und als antiparallele Superspirale angeordnet sind. Protonen binden höchstwahrscheinlich an Asp 61 jeder c-Untereinheit. Dies ist eine konservierte Aminosäure, deren Protonierung und Deprotonierung die Konformation der Untereinheit verändert (Abb. 18.26). Offenbar bindet eine c-Untereinheit ein Proton, wenn dieses den Eingangskanal passiert. Dann ändert sich ihre Konformation, wodurch sie mechanisch gegen die a-Untereinheit drückt, sodass der c-Ring zur Drehung in die in Abbildung 18.25 eingezeichnete Richtung veranlasst wird. Dieser Prozess wird durch die Wechselwirkung von Asp 61 auf der c-Untereinheit und dem konservierten Arg 210 auf der a-Untereinheit verstärkt. Man konnte zeigen, dass diese beiden Aminosäuren zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Rotationscyclus des c-Rings direkt nebeneinander liegen. Deshalb wird vermutet, dass die elektrostatische Anziehung zwischen dem kationischen Arg 210 und dem anionischen Asp 61 mit dazu beiträgt, dass sich der c-Ring dreht, sodass die beiden Aminosäuren sich quasi gegenüber stehen. Während dies geschieht, wird Arg 61 protoniert und forciert dabei den c-Ring, seine Drehung fortzusetzen. Die Drehung des ye-c-Ring-Rotors im Verhältnis zum ab,-a;ßzö-Stator wurde von Masamitsu Futai auf geniale Weise demonstriert (Abb. 18.27a). Das a3ß;Spheroid der F,Fu-ATPase von E. coli wurde umgekehrt auf einer Glasfläche wie folgt fixiert: Sechs aufeinander folgende His-Reste (ein sogenannter His(a)

(b)

P43

Abb. 18.26

NMR-Struktur der c-Untereinheit

der F}Fo-ATPase aus E. coli.

(a) Bei pH 8 ist Asp 61 (D61) deprotoniert. (b) Bei pH 5 ist D61 protoniert. Es sind nur ausgewählte Seitenketten dargestellt, um den Vergleich der beiden Strukturen zu erleichtern. Man beachte,

dass die C-terminale Helix der Struktur bei pH 8 im Verhältnis zur Struktur bei pH 5 um 140° im Uhrzeigersinn gedreht ist, wie man im oberen Teil der Zeichnung erkennen kann. [Mit freundlicher Genehmigung von Mark Girvin, Albert Einstein

College of Medicine. PDBid ICOV]

680

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Streptavidin cCys2 + Biotin

BERAIEBE ANI0% SSIHFFHRNEE TE er

(a)

(b)

Abb. 18.27 Die Drehung des c-Rings in der FıFo-ATPase aus E. coli. (a) Schematische Darstellung des Experimentes, das zur Demonstration der Rotation unternommen wurde (Einzelheiten siehe Haupttext). Der blaue

Tag) wurden durch eine Mutation an den N-Terminus der fügt. Dieser sitzt oberhalb des a,ß,-Sphäroids in Abbildung markierte Aggregat wurde auf eine Glasfläche aufgebracht, peroxidase (die wie die meisten Proteine an Glas haftet)

Pfeil zeigt die beobachtete Drehrichtung des fluoreszenzmarkierten Actinfilaments, das mit dem c-Ring verbunden war. (b) Die Drehung eines

Tags bindet] konjugiert. Dabei bindet die FAFo-ATPase so an die Oberfläche, dass ihre Fo-Seite von der Oberfläche weg zeigt. Die Glu-Reste der c-Untereinheiten dieses Aggregats liegen auf der Seite des c-Rings und zeigen weg von F,. Diese wurden per Mutation durch Cys-Reste ersetzt, die dann kovalent mit Biotin verknüpft (Abschnitt 16.4). Dann wurde ein fluoreszenzmarkiertes und (an einem Ende) biotinyliertes Filament des Muskelproteins Actin (Abschnitt 7.2C) mit der c-Untereinheit verknüpft. Dies erfolgte durch Zugabe des hochaffinen Bindungsproteins, Streptavidin. Streptavidin ist ein Bakterienprotein, das mit jeder seiner vier Bindungsstellen Biotin sehr fest binden kann. Die F}Fo-ATPase von E. coli kann umgekehrt arbeiten, d.h. sie kann unter ATP-Verbrauch Protonen von innen nach außen pumpen (dies ermöglicht dem Bakterium, seinen Protonengradienten unter anaeroben Bedingungen aufrechtzuerhalten, womit es verschiedene Prozesse antreibt). Das beschriebene

3,6 um langen Actinfilaments in Gegenwart von

5 mM MgATP kann man durch die aufeinander folgenden Videobilder sehen, die durch ein Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden [Mit freundlicher Genehmigung von Masamitsu Futai, Iwate Medical University.]

a-Untereinheit ange18.22a. Das His-Tagdie mit Meerrettichbeschichtet war. Das

Enzym war mit Ni’*-Nitrilessigsäure [Ni”’-N(CH,COOH);, das fest an His-

Präparat wurde

unter einem

Fluoreszenzmikroskop

betrachtet, während

eine

5 mM MgATP-Lösung zugegeben wurde. Man konnte sehen, dass viele der Actinfilamente rotierten (Abb. 18.27b), und zwar wenn man (von außen) auf die Glasfläche blickte, immer entgegen dem Uhrzeigersinn. Dies gestattet der y-Untereinheit nacheinander mit den ß-Untereinheiten, wie für die ATP-Hydrolyse erwartete, in der Reihenfolge Pr(O-Zustand) > ßpp (L-Zustand) > Prp (T-Zustand)

in Wechselwirkung zu treten (Abb. 18.22a und 18.24). Ähnliche Experimente zeigten, dass die y-Untereinheit zumeist in 120°-Schritten rotiert. Vermutlich fungieren elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den y- und ß-Untereinheiten von F, als eine Arretierung, die vorübergehend die y-Untereinheit in ihrer Position festhält. Wenn der c-Ring rotiert, baut sich eine Spannung auf, die verursacht, dass die y-Untereinheit zur nächsten ß-Untereinheit weiterrastet. Wenn man in weiteren Experimenten an die y-Untereinheit einer immobilisierten F)-AT’Pase stattdessen eine magnetisches Kügelchen anheftete und ein äußeres Magnetfeld im Uhrzeigersinn rotieren ließ, sodass die y-Untereinheit gezwungen war zu folgen, dann wurde ATP aus ADP + P; synthetisiert.

Oxidative Phosphorylierung

C.

Der P/O-Quotient

Die ATP-Synthese und der Protonengradient sind eng miteinander gekoppelt. Dies bedeutet, dass die ATP-Synthese immer den Abbau des Protonengradienten bedingt und der Protonengradient umgekehrt nicht ohne die Synthese von ATP abgebaut werden kann. Der Protonengradient wird durch die Aktivität der Elektronentransportkomplexe der inneren mitochondrialen Membran aufgebaut. Daher ist es möglich, die Menge an gebildetem ATP auf die Anzahl oxidierter Substratmoleküle zu beziehen. Untersuchungen mit isolierten Mitochondrien zeigen, dass die Oxidation von NADH mit der Bildung von etwa 3 ATP und die Oxidation von FADH, mit der Bildung von etwa 2 ATP verbunden ist. Oxidation von nichtphysiologischen Verbindungen wie Tetramethyl-p-phenylendiamin, welches ein Elektronenpaar direkt auf Komplex IV überträgt, liefert etwa 1 ATP. H;C

CH

er

N

H;C

u

CH;

Tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD), reduzierte Form

H;C

;

CH

er

H3;C

Zu \

CH;

TMPD, oxidierte Form

Diese Stöchiometrie, die als P/O-Quotient bezeichnet wird (er bezieht die Menge von synthetisiertem ATP auf die Menge an dafür reduziertem Sauerstoff), steht mit der chemiosmotischen Theorie und der Struktur der ATP-Synthase gut im Einklang: Der Fluss von je zwei Elektronen durch die Komplexe I, III und IV führt zur Translokation von 10 Protonen in den Intermembranraum (Abb. 18.8). Der Rückfluss dieser 10 Protonen durch die F}Fo-ATPase, die in Eukaryoten 10 c-Untereinheiten besitzt (Abb. 18.23), führt zu einer kompletten Drehung des Rotors aus c-Ring und y-Untereinheit relativ zum a;ß;-Sphäroids und reicht aus, um ca. 3 ATP zu synthetisieren. Elektronen, welche in die Elektronentransportkette am FADH, in den Komplex II eintreten, passieren nicht den Komplex I und führen deswegen zu einem transmembranären Fluss von nur 6 Protonen. Dies reicht lediglich zur Synthese von 2 ATP aus (dies entspricht etwa zwei Dritteln der Rotationsenergie einer vollständigen Drehung der ATPSynthase). Der Transit von zwei Elektronen ausschließlich durch den Komplex IV trägt zwei Protonen zum Gradienten bei, genug für die Bildung von ca. 1 ATP (das entspricht etwa einer Dritteldrehung). Bei intensiv atmenden Mitochondrien sind die Werte der P/O-Quotienten fast nie ganze Zahlen. Dies ist ebenfalls mit der chemiosmotischen Theorie vereinbar. Die Oxidation eines physiologischen Substrats trägt an verschiedenen Orten zur Bildung des transmembranen Protonengradienten bei. Angezapft wird der Gradient aber nur an einer einzigen Stelle, der F}Fo-ATPase.

Die Anzahl der

Protonen, die aus den Mitochondrien durch irgendeine Komponente der Atmungskette heraustransportiert werden, muss daher nicht in einem ganzzahligen Verhältnis zu denen stehen, die zur Synthese von ATP aus ADP + P; benötigt werden. Weiterhin wird der Protonengradient in einem gewissen Maß auch durch unspezifischen Rückfluss von Protonen in die Matrix und durch anderweitigen Verbrauch von Protonen abgebaut, wie z.B. durch den Transport von P; in die Matrix (Abschnitt 18.1B). Bei Einbeziehung des P,-Transports ergibt sich eine Stöchiometrie von vier Protonen, die verbraucht werden, um ein ATP aus ADP + P; zu synthetisieren. Peter Hinkle hat in Untersuchungen gezeigt, dass die oben genannten P/O-Quotienten in Wirklichkeit näher bei 2,5, 1,5 und 1,0 liegen. Folglich beläuft sich die Anzahl an ATP-Molekülen, die pro Molekül oxidierter Glucose synthetisiert werden auf 2,5 ATP/NADH x 10 NADH/Glucose + 1,5 ATP/FADH, x 2 FADH;/Glucose + 2 ATP/Glucose aus dem Citratcyclus + 2 ATP/Glucose aus der Glykolyse = 32 ATP/Glucose.

681

682

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Matrix Hoher pH

os

OH

NO,

H*+

Cytosol Niedriger pH

NO,

——

NO,

Diffusion

sn

NO, tee

Abb. 18.28

‘as

(DNP)

Wirkung von 2,4-Dinitrophenol (DNP).

Ein protonentransportierendes lonophor, wie z.B.

DNP, entkoppelt die oxidative Phosphorylierung vom Elektronentransport, indem es den durch Elektronentransport erzeugten elektrochemischen Protonengradienten abbaut.

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 I. Fassen Sie die chemiosmotische

Theorie zusammen. Beschreiben Sie die allgemeine Struktur der F,- und Fo-Komponenten der ATP-Synthase. Fassen Sie den Ablauf des Bindungswechsel-Mechanismus zusammen. Beschreiben Sie, wie sich die Protonen vom Intermembran-

raum in die Matrix bewegen. Wie ist die Protonentranslokation mit der ATP-Synthese verbunden? Erklären Sie, warum der P/OQuotient für ein bestimmtes Substrat nicht notwendigerweise eine ganze Zahl sein muss. Erklären Sie, wie oxidative Phosphorylierung mit dem Elektronentransport verknüpft ist und wie diese Prozesse entkoppelt werden können.

D.

Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung

Der Elektronentransport (die Oxidation von NADH und FADH; durch O,) und die oxidative Phosphorylierung (die durch einen Protonengradienten getriebene ATP-Synthese) sind normalerweise eng miteinander gekoppelt. Die Kopplung hängt von der Undurchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran ab. Diese macht den Aufbau eines elektrochemischen Gradienten über diese Membran durch die Translokation von H* während des Elektronentransports überhaupt erst möglich. Der Weg durch den Fo-Teil der ATP-Synthase ist für austransportiertes H" offenbar die einzige Möglichkeit, wieder in die Matrix zu gelangen. Im Ruhezustand, d.h. bei nur minimaler oxidativer Phosphorylierung, baut sich an der inneren mitochondrialen Membran der elektrochemische Gradient bis zu einem Wert auf, der weiteres Protonenpumpen verhindert und somit auch den Elektronentransport unterdrückt. Erst wenn die ATP-Synthese zunimmt, wird der elektrochemische Gradient abgebaut und somit ein Fortgang des Elektronentransports möglich. Im Laufe der Jahre wurde entdeckt, dass Verbindungen wie 2,4-Dinitrophenol (DNP) Elektronentransport und ATP-Synthese „entkoppeln“. DNP ist eine lipophile, schwache Säure, die in ihrer neutralen, protonierten Form die Membran leicht passieren kann. Bei Vorliegen eines pH-Gradienten bindet DNP auf der sauren Seite der Membran Protonen, diffundiert durch die Membran und setzt auf der alkalischen Seite der Membran die Protonen wieder frei. Auf diese Weise wirkt es wie ein protonentransportierendes Ionophor (Abschnitt 10.2A) und baut den Gradienten ab (Abb. 18.28). Die chemiosmotische Theorie liefert eine plausible Erklärung zum Verständnis des Wirkmechanismus solcher „Entkoppler“. Wenn in der inneren mitochondrialen Membran ein Stoff vorhanden ist, der ihre Permeabilität gegenüber H* erhöht, wird die oxidative Phosphorylierung vom Elektronentransport entkoppelt. Dies geschieht dadurch, dass für den Abbau des elektrochemischen Gradienten ein von der ATP-Synthese unabhängiger Weg geöffnet wird. Entkopplung führt somit zu einem unkontrollierten, selbst bei gehemmter ATP-Synthese ablaufenden Elektronentransport. Darauf aufbauend wurde in den 1920er Jahren DNP als „Schlankheitspille“ eingenommen. Dies führte zwar mit Erfolg zur Gewichtsabnahme, verursachte aber oft tödliche Nebenwirkungen. Unter physiologischen Bedingungen erzeugt der Abbau eines elektrochemischen H'-Gradienten, der durch einen Elektronentransport aufgebaut aber von der ATP-Synthese abgekoppelt wird, Wärme (siehe Exkurs 18.4).

Kontrolle der ATP-Bildung

4

Kontrolle der ATP-Bildung

Eine erwachsene Frau benötigt pro Tag ungefähr 1500 bis 1800 kcal (63007500 kJ) metabolischer Energie. Dies entspricht der Freien Hydrolyseenthalpie von mehr als 200 Mol ATP (unter Bildung von ADP + P,). Die Gesamtmenge an im Körper vorhandenem ATP liegt unabhängig von der Tageszeit bei weniger als 0,1 Mol. Es ist offensichtlich, dass dieser spärliche Vorrat an ATP ständig erneuert werden muss. Wie wir gesehen haben, umfasst diese Regenerierung mit Kohlenhydraten als Energiequelle unter aeroben Bedingungen die GlykogenoIyse, die Glykolyse, den Citratcyclus und die oxidative Phosphorylierung. Natürlich ist der Bedarf an ATP keine konstante Größe. Zwischen Schlaf und hoher körperlicher Aktivität besteht ein Unterschied in der ATP-Verbrauchsrate um den Faktor 100. Damit ATP nur so schnell wie gerade nötig nachgebildet wird, unterliegen die Aktivitäten der Stoffwechselwege, die es produzieren, einer streng koordinierten Kontrolle. Die Kontrollmechanismen der Glykogenolyse, der Glykolyse und des Citratcyclus (Abschnitte 15.4, 16.3 und 17.4) wurden bereits besprochen. In diesem Abschnitt wird der Mechanismus behandelt, der die Geschwindigkeit der oxidativen Phosphorylierung kontrolliert.

A.

Kontrolle der oxidativen Phosphorylierung

Bei der Betrachtung der Stoffwechselwege haben wir erfahren, dass die meisten ihrer Reaktionen nahe dem Gleichgewicht ablaufen. Die wenigen irreversiblen Reaktionen sind die potentiellen Kontrollstellen der Stoffwechselwege und werden gewöhnlich durch regulatorische Enzyme katalysiert, die unter allosterischer Kontrolle stehen. Im Fall der oxidativen Phosphorylierung verläuft der Weg vom NADH bis zum Cytochrom c nahe am Gleichgewicht:

1a NADH + Cytochrom c (Fe) +ADP+P, = 1, NAD* + Cytochrom c (Fe?*) + ATPAG’ = 0 und somit

[NAD*]\ ? fc2*] [ATP] 2 (a)

[c3*] [ADP][P;]

Dieser Stoffwechselweg kann damit bei Zugabe des Produkts leicht entgegengesetzt ablaufen. Jedoch ist die Reaktion der Cytochrom c-Oxidase (der terminale Schritt der Elektronentransportkette) irreversibel und daher eine potentielle Kontrollstelle. Cytochrom c-Oxidase scheint im Gegensatz zu den meisten anderen regulatorischen Enzymen primär durch die Verfügbarkeit eines ihrer Substrate, in diesem Fall von reduziertem Cytochrom c (c’*), kontrolliert zu werden. Da c** sich im Gleichgewicht mit dem Rest des gekoppelten System der oxidativen Phosphorylierung befindet, hängt die Konzentration von c’* letztendlich von den intramitochondrialen Verhältnissen von [NADH]/[NAD*] und [ATP]/[ADP] [P;] ab (die letztgenannte Größe wird als ATP-Massenwirkungskoeffizient bezeichnet). Nach Umformen des vorangegangenen Ausdrucks für das Gleichgewicht ergibt sich folgende Beziehung:

le

un

[+]

\I[NAD*]

[ADP][P;] „ ATp]ie«

Je höher das [|NADH]/[NAD*]-Verhältnis und je niedriger der ATP-Massenwirkungskoeffizient ist, umso höher ist die Konzentration an reduziertem Cytochrom c und somit auch die Aktivität der Cytochrom c-Oxidase.

683

684

_Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Exkurs 18.4 Biochemie im Fokus Braunes Fettgewebe erzeugt Wärme durch Entkopplung Die physiologische Funktion des braunen Fettgewebes ist die Erzeugung von Wärme. Dieses Gewebe unterscheidet sich vom typischen (weißen) Fettgewebe durch seinen hohen Gehalt an Mitochondrien. Durch deren Cytochrome kommt die braune Färbung zustande. Winterschläfer und neugeborene

Säuger,

die kein

Fell haben,

wie z.B.

der

Mensch,

haben in ihrem Halsbereich und im oberen Teil des Rückens braunes Fettgewebe. Durch dieses wird mittels der sogenannten Grundumsatz-Thermogenese, die ohne Zittern abläuft, Wärme erzeugt. Wärme wird auch durch die ATP-HydroIyse generiert, die während der Muskelkontraktionen (beim Zittern oder bei jeder anderen Bewegung) stattfindet (siehe Abschnitt 15.4B). Der Mechanismus

der Wärmeerzeugung

im braunen Fett-

gewebe erfordert die regulierte Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung. Mitochondrien des braunen Fettgewebes enthalten einen Protonenkanal, der als Entkopplerprotein bekannt ist (engl.: uncoupling protein, UCP1, auch Thermogenin genannt; siehe unten). Dieses Protein ist in den Mitochondrien anderer Gewebe nicht vorhanden. Im Fettgewebe von kälteadaptierten Tieren macht UCP bis zu 15% des Proteins der inneren mitochondrialen Membran aus. Der Protonenfluss durch UCP wird durch physiologische Konzentrationen von

Purinnucleotiden

(ADP,

ATP,

GDP,

GTP)

Erwachsene Menschen besitzen kein braunes Fettgewebe, aber die Mitochondrien von gewöhnlichem Fettgewebe und von Muskeln scheinen Entkopplerproteine zu enthalten, die als UCP2 und UCP3

bezeichnet werden.

Diese Proteine hel-

fen vermutlich Stoffwechselraten zu regulieren. Unterschiede in den UCP-Konzentrationen oder der Aktivität könnten erklären, warum einige Menschen einen „schnellen“ oder „langsamen“ Stoffwechsel zu besitzen scheinen. UCPs wer-

den untersucht als Zielobjekte für die Behandlung von Fettleibigkeit, da eine Steigerung der UCP-Aktivität die Atmung von der ATP-Synthese entkoppeln kann und so dazu führt, dass Brennstoffspeichersubstanzen (insbesondere Fett) in den Stoffwechsel eingespeist werden. Entkopplerproteine könnten auch eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur spielen, und diese Aufgabe ist vermutlich nicht auf das Tierreich beschränkt. Einige Pflanzen exprimieren Entkopplerproteine als Antwort auf Kältestress oder um die Temperatur der Blüte zu erhöhen. Vermutlich kann dadurch der Blütenduft besser verströmt werden, was wiederum

mehr Bestäuber anlockt.

gehemmt.

Diese Hemmung kann aber durch freie Fettsäuren aufgehoben werden. Die Thermogenese im braunen Fettgewebe steht unter hormoneller Kontrolle. Noradrenalin (1) induziert die Produktion des sekundären Botenstoffs CAMP (2) und führt damit zur Aktivierung der Proteinkinase A (3, Abschnitt 13.3C). Die Kinase aktiviert durch Phosphorylierung die hormongesteuerte Triacylglycerin-Lipase (4). Die aktivierte Lipase hydrolysiert Triacylglycerine (5). Die gebildeten freien Fettsäuren wirken dem hemmenden Effekt der Purinnucleotide auf UCP entgegen (6). Der resultierende Protonenfluss durch UCP baut den Protonengradienten an der inneren mitochondrialen Membran ab. Auf diese Weise kann eine Substratoxidation ohne die Synthese von ATP ablaufen und Wärme erzeugen.

[© K.M. Highfill/Photo Researchers.]

Wie wird dieses System durch Änderungen der körperlichen Aktivität beeinflusst? Bei einem in Ruhe befindlichen Individuum ist die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse zu ADP und P, minimal und der ATP-Massenwirkungskoeffizient ist hoch. Daher ist die Konzentration an reduziertem Cytochrom c niedrig und die Geschwindigkeit der oxidativen Phosphorylierung minimal. Erhöhte Aktivitäten führen zur Hydrolyse von ATP zu ADP und P,, wobei der ATP-Massenwirkungskoeffizient absinkt und die Konzentration an reduziertem Cytochrom c zunimmt. Dies führt zu einem Anstieg der Geschwindigkeit des Elektronentransports und der ADP-Phosphorylierung. Die Konzentrationen

von ATP, ADP

und P; in der mitochondrialen

Matrix

hängen von der Aktivität der Transportproteine ab, welche diese Verbindungen aus dem Cytosol importieren. So könnten der ADP/ATP-Translokator und das P;-Iransportprotein eine Rolle bei der Regulation der oxidativen Phosphorylie-

Kontrolle der ATP-Bildung Noradrenalin

ATP

cAMP + P;

3 B.% 6 Sri Proteinkinase (inaktiv)

2C

+

R,(cAMP),

Proteinkinase (aktiv) i

t I

Triacylglycerin-Lipase

(inaktiv)

m

H+

es

Y

Gap ATP

\

TriacylglycerinLipase

ADP

(aktiv)

Elektronentransport

öffnen den Kanal

Fet-

+

——

.-.= =... m.

— —— Triacylglycerine

a

N ATP, ADP, GTP, GDP blockieren den Kanal

rung spielen. Es gibt auch verschiedene experimentelle Hinweise, dass Ca’* die Elektronentransportkomplexe und möglicherweise auch die ATP-Synthase selbst stimuliert. Dies steht im Einklang mit den vielen anderen Beispielen, in welchen Ca?* oxidative Stoffwechselabläufe direkt stimuliert. Mitochondrien

enthalten ein aus 84 Aminosäuren bestehendes Protein, das

IF, genannt wird und dessen Funktion darin besteht, die ATP-Synthase zu regulieren. In aktiv atmenden Mitochondrien, in denen der pH der Matrix relativ hoch ist, liegt IF, als inaktives Tetramer vor. Sinkt aber der pH-Wert unter 6,5,

so dissoziiert das Protein in Dimere und tivität der F\-Komponente, indem es an und der ßpp-Untereinheit bindet, und so ATP einzuschließt. Dies ist offenbar ein zu verhindern, wenn die respiratorische

hemmt in dieser Form die ATPase-Akdie Grenzfläche zwischen dessen Oppdas an die ßpp-Untereinheit gebundene Mechanismus, um die ATP-Hydrolyse Aktivität (und damit der Protonengra-

dient) wegen Sauerstoffmangel gestört ist. Andernfalls würde die FAFo-ATPase, angetrieben durch die Hydrolyse von ATP (aus der Glykolyse), ihre Rotationsrichtung umkehren und dadurch die Zelle ihrer sämtlichen Energiequellen berauben.

Koordinierte Kontrolle des oxidativen Stoffwechsels Vorrangige Quellen der Elektronen, welche in die mitochondriale Elektronentransportkette einfließen, sind Glykolyse, Fettsäureabbau und der Citratcyclus. So werden z.B. pro oxidiertes Molekül Glucose 10 Moleküle NAD* zu NADH umgesetzt (Abb. 18.1). Daher überrascht es nicht, dass die Kontrolle von Glyko-

685

686

Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

lyse und Citratcyclus mit dem Bedarf an oxidativer Phosphorylierung abgestimmt ist. Die Regulation der Kontrollstellen von Glykolyse und Citratcyclus (Phosphofructokinase, Pyruvat-Dehydrogenase, Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und a-Ketoglutarat-Dehydrogenase) durch Adeninnucleotide oder NADH bzw. durch beides sowie durch bestimmte Metabolite (Abb. 18.29), sorgt für eine abgestimmte Versorgung der Elektronentransportkette mit Elek-

Giykolyse

Glucose

Hexokinase

,

Te

PB:

>

t \ N

">= -- Glucose-6-phosphat Glucose-6-phosphatIsomerase A Fructose-6-phosphat \

>=

-> P; AMP m NH,

Phosphofructokinase

ATP ee

en

>»

1:

----=---

\

> -- Fructose-1 ‚6-bisphosphat

\

Y

Y PEP = Pyruv. at-Kinase s

ATP ÄDP

ae Pyruvat >

ADP NADH

tronen. Ein besonders interessanter, regulatorischer Effekt ist die Hemmung der Phosphofructokinase (PFK) durch Citrat. Wenn der Verbrauch an ATP zurückgeht, steigt die ATP-Konzentration an und diejenige von ADP nimmt ab. Weil Isocitrat-Dehydrogenase durch ADP aktiviert und a-Ketoglutarat-Dehydrogenase durch ATP gehemmt wird, kommt die Aktivität des Citratcyclus zum Erliegen. Dadurch wird eine erhöhte Konzentration an Citrat aufgebaut. Citrat verlässt die Mitochondrien über ein spezielles Transportsystem ‘und bewirkt, sobald es im Cytosol ist, durch Hemmung der PFK einen Stopp des weiteren Kohlenhydratabbaus. Die Citratkontentration steigt auch, wenn die Acetyl-CoA-Konzentration steigt. Dies kommt, wie wir in Kapitel 20 sehen werden, bei der Oxidation von Fettsäuen vor. Die Hemmung der Glykolyse durch Oxidation von Fettsäuren wird auch als Glucose-Fettsäurecyclus oder Randle-Cyclus (nach seinem Entdecker, Phillip Randle) bezeichnet, obwohl hier in Wahrheit kein Cyclus vorliegt. Der Randle-Cyclus erlaubt die Verwendung von Fettsäuren als Hauptbrennstoff für den oxidativen Stoffwechsel im Herzmuskel, wodurch mehr Glucose für andere Organe wie das Gehirn, das auf Glucose angewiesen ist, zur Verfügung steht.

nap* |f

Pyruvat-Dehydrogenase

Ca?

B. _ Physiologische Konsequenzen des aeroben Stoffwechsels x

Oxidative Phosphorylierung kommt nicht in allen Organismen vor. Aber diejenigen, die sie durchführen, können aus’einer vorgegebenen Menge eines metabolischen Brennstoffs beträchtlich mehr Energie herausholen. Dieser Sachverhalt wird durch den Pasteur-Effekt (Abschnitt 15.3C) veranschaulicht: Wenn Hefe während anaeroben Wachstums Sauerstoff zugeführt wird, fällt ihr Glucoseverbrauch steil ab. Ein analoger Effekt wird im Säugetiermuskel beobachtet. Die Konzentration von Milchsäure (dem Produkt der anaeroben Glykolyse im Muskel; Abschnitt 15.3A) nimmt dramatisch ab, wenn die Zellen auf aeroben Stoffwechsel umschalten. Diese Effekte sind gut zu verstehen, wenn die Stöchiometrien von anaeroben und aeroben Abbauprozessen der Glucose verglichen werden (Abschnitt 17.4): Anaerobe Glykolyse: Abb. 18.29 Koordinierte Kontrolle von Glykolyse und Citratcyclus. Die Darstellung gibt die von ATP, ADP, AMP,

P,, Ca?* und dem [NADH]/[NAD*]-Quotienten (die vertikalen Pfeile zeigen einen Anstieg dieses Quotienten an) ausgelösten Effekte wieder. Eine grüne Punktmarkierung kennzeichnet Aktivierung und ein rotes Achteck Hemmung. [Nach Newsholme, E.A. und Leech, A.R., Biochemistry for the

Medical Sciences, S. 316, 320, Wiley (1983).] 6% siehe Animated Figures.

CsH1205

+2 ADP +2 P;— 2 Lactat + 2 H* +2 H,O + 2 ATP

Aerober Stoffwechsel von Glucose: C6H1205

+ 32 ADP

+ 32 P; + 6 0,

> 6 CO; + 38 H,O + 32 ATP

Dies zeigt, dass aerober Stoffwechsel hinsichtlich der Produktion von ATP bis zu 16mal effektiver ist als die anaerobe Glykolyse. Aerober Stoffwechsel hat aber auch seine Nachteile. Viele Organismen und Gewebe sind auf einen aeroben Stoffwechsel absolut angewiesen und erfahren unter Sauerstoffverarmung irreversible Schädigungen (siehe Exkurs 18.5). Andererseits geht oxidativer Stoffwechsel auch mit der Bildung reaktiver Sauerstoffmetabolite einher, die - wenn sie auch nur in kleinen Mengen gebildet werden - mit der Zeit zur Schädigung von Zellbestandteilen führen. Organismen, die während der letzten drei Milliarden Jahre auftraten (der Periode, ab der die Erd-

Kontrolle der ATP-Bildung

687

Sauerstoffverarmung bei Herzinfarkt und Schlaganfall Wie in Exkurs 7.] umrissen, brauchen mehr als 1 mm dicke Organismen zirkulierende Systeme, um Nährstoffe zu den Zellen zu bringen und zelluläre Abfallprodukte zu entsorgen. Bei den meisten größeren Organismen enthält die zirkulierende Flüssigkeit zusätzlich Proteine, die auf Sauerstofftransport spezialisiert sind (z.B. Hämoglobin). Die Ausgefeiltheit der sauerstoffbereitstellenden Systeme und ihre ausgeklügelte Regulation spiegeln deren essentielle Bedeutung und ihre lange Evolutionszeit wider. Was passiert bei Sauerstoffverarmung? Als Beispiel wollen wir zwei verbreitete menschliche Todesursachen

nostisches Merkmal für den myocardialen Infarkt. Bei der anaeroben Glykolyse kommt hinzu, dass der durch die Milchsäurebildung erniedrigte, intrazelluläre pH-Wert einen Abbau von Zellkomponenten durch freigesetzte, Iysosomale Enzyme fördert (welche nur bei saurem pH aktiv sind). Somit führt die Sauerstoffverarmung nicht nur zum Stillstand der zellulären Aktivität, sondern zu irreversiblen Zellschädigungen und zum Zelltod. Stark atmende Gewebe, wie die von Herz

und Gehirn, sind gegenüber Schädigungen durch Sauerstoffverarmung besonders empfindlich.

betrachten,

den Myocardinfarkt (Herzinfarkt) und den Schlaganfall, die beide als Folgen einer unterbrochenen Durchblutung (d.h. O,-Versorgung) eines Teils des Herzens bzw. Gehirns auftreten. In Abwesenheit von O, muss eine Zelle für die ATPProduktion allein auf die Glykolyse zurückgreifen und verbraucht schnell ihre Vorräte an Phosphocreatin (eine Quelle für eine rasche ATP-Produktion; Abschnitt 14.2C) und Glykogen. Sinkt die ATP-Produktionsrate unter den Wert, der benö-

tigt wird, damit die Ionenpumpen der Membranen eine physiologische intrazelluläre lonenkonzentration aufrechterhalten

können,

wird

das

osmotische

Gleichgewicht

gestört

und die Zellen bzw. ihre membranumgebenen Organellen beginnen zu schwellen. Als Folge hiervon werden die überdehnten Membranen permeabel und lassen die eingeschlossenen Inhaltsstoffe ausfließen. Das Auftreten herzspezifischer Enzyme im Blut, wie z.B. des H-Typs der Lactat-Dehydrogenase-Isoenzyme (Abschnitt 14.1C), die aus nekrotischem (totem) Herzgewebe austreten, ist daher ein geeignetes diag-

Nekrotisches Gewebe nach einem Herzinfarkt.

[© CNRI/Photo Researchers.]

atmosphäre signifikante Mengen an O, enthält), haben daher physiologische und biochemische Adaptationen entwickelt, um die potentiellen Gefahren des Sauerstoffs zu minimieren und somit die mit der Oxidationskraft des O, verbundenen Vorteile zu nutzen. Reaktive Sauerstoffspezies Die Vier-Elektronen-Reduktion von O, durch Cytochrom c-Oxidase ist so gestaltet, dass sie mit hoher Geschwindigkeit und Genauigkeit abläuft. Dennoch wird

O, gelegentlich nur teilweise reduziert, wobei Sauerstoffspezies erhalten werden, die leicht mit einer ganzen Anzahl zellulärer Komponenten reagieren. Die am besten bekannte reaktive Sauerstoffspezies ist das Superoxidradikal: O, ar i2

0;

Das Superoxidradikal ist ein Vorläufer für andere reaktive Spezies. Protonierung von O;- führt zu HO,-, einem viel stärkeren Oxidationsmittel als O,-. Die in biologischen Systemen am stärksten wirksame Sauerstoffspezies ist wahrscheinlich das Hydroxylradikal, welches aus dem relativ harmlosen Wasserstoffperoxid (H;0,) gebildet wird: H}0, + Fe* > -OH +0H

+ Fe’*

688

_ Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

Das Hydroxylradikal wird auch durch die Reaktion von Superoxid mit H,O, gebildet: 05:4:

49,307

3: OH

+:OH

Obwohl die meisten freien Radikale extrem kurzlebig sind (die Halbwertszeit von O;- liegt bei 1 x 10° s und die von -OH bei 1 x 10° s), entziehen sie leicht anderen Molekülen Elektronen. Dadurch werden diese zu freien Radikalen umgewandelt und somit wird eine Kettenreaktion eingeleitet. Die geringe Selektivität des Angriffs freier Radikale erschwert die Charakterisierung ihrer Reaktionsprodukte. Grundsätzlich sind jedoch alle Biomoleküle gegenüber oxidativen Schädigungen durch freie Radikale empfindlich. Die Oxidation mehrfach ungesättigter Lipide kann die Strukturen biologischer Membranen zerstören und die oxidative Schädigung von DNA zu Punktmutationen führen. Auch die Aktivität von Enzymen kann durch Reaktionen der Radikale mit den Aminosäureseitenketten beeinträchtigt werden. Da die Mitochondrien die Orte sind, an denen der größte Teil des oxidativen Zellstoffwechsels stattfindet,

bekommen deren Lipide, DNA und Proteine wahrscheinlich den Großteil der mit freien Radikalen verbundenen Schädigungen zu spüren. Verschiedene degenerative Krankheiten, darunter Parkinson-Syndrom, Alzheimer- und Huntington-Krankheit sind mit oxidativen Schädigungen der Mitochondrien verbunden. Derartige Beobachtungen führten zu einer Theorie der „Freien Radikale als Ursache des Alterns“. Diese vertritt die Ansicht, dass die freien Radikale, die im Laufe normaler Oxidationsreaktionen entstehen, zumindest teilweise für den Alterungsprozess verantwortlich sind. In der Tat leiden Personen mit einem angeborenen Fehler in ihrer mitochondrialen DNA an einer Reihe von Symptomen, die für ein hohes Alter typisch sind, wie z.B. neuromotorischen Defiziten, Taubheit und Demenz. Deren Mitochondrien könnten durch

ihre genetischen Defekte besonders anfällig gegenüber den reaktiven Sauerstoffspezies sein, die durch die Elektronentransportmaschinerie erzeugt werden. Mechanismen von Antioxidantien Antioxidantien zerstören freie Radikale wie O}- und -OH. 1969 entdeckte Irwin Fridovich, dass das Enzym Superoxid-Dismutase (SOD), das in nahezu allen Zellen vorkommt, die Umwandlung von O;- in H,O, katalysiert. 2 05; +2H*

Abb. 18.30 Elektrostatische Effekte bei der menschlichen Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD). Querschnitt durch den Kanal des aktiven Zentrums

der Cu/Zn-SOD. Die Moleküloberfläche ist gepunktet und ihrer Ladung entsprechend farbig dargestellt: Rot, stark negativ; Gelb, negativ; Grün, neutral; Hellblau, positiv; Dunkelblau stark positiv.

Die elektrostatischen Feldvektoren werden durch in gleicher Weise kolorierte Pfeile angezeigt. Die Cuund Zn-lonen am aktiven Zentrum sind als orange und silber gepunktete Kugeln dargestellt. Die O;-Bindungsstelle liegt zwischen dem Cu-lon und der Seitenkette von Arg 143. [Mit freundlicher Genehmigung von Elizabeth Getzoff, The Scripps Research Institute, La Jolla.]

—H30;

+

©

Sowohl mitochondriale als auch bakterielle SOD sind Mn-enthaltende Tetramere. Die cytosolische SOD bei Eukaryoten ist ein Dimer, das Kupfer und Zink enthält. Die Geschwindigkeit des nicht enzymatischen Zerfalls von Superoxid liegt bei ca. 2 x 10° M' . s', die Geschwindigkeit der durch Cu/Zn-SOD katalysierten Reaktion hingegen bei ca. 2 x 10° M'' . s’'. Diese Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit nahe an den diffusionskontrollierten Wert (Abschnitt 12.1B), wird offenbar dadurch erreicht, dass das negativ geladene Substrat Superoxid elektrostatisch in das aktive Zentrum des Enzyms gelenkt wird (Abb. 18.30). Das Kupferion im aktiven Zentrum jeder Untereinheit befindet sich am Boden einer tiefen Tasche. Ein durch Glu 123, Glu 133, Lys 136 und Thr 137 gebildetes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen am Eingang der Tasche erleichtert die Diffusion von O,: zu einer Bindungsstelle zwischen dem Cu-Ion und einem Arg-Rest. SOD gilt als die erste Verteidigungslinie gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies. Das H,O,, das in dieser Reaktion gebildet wird und potentiell unter Bildung anderer reaktiver Sauerstoffspezies weiterreagieren kann, wird durch Enzyme wie Katalase und Glutathion-Peroxidase umgesetzt. Katalase, welche die Reaktion

Zusammenfassung 2 H>0,

42

H,O

% O0,

katalysiert, führt zu Wasser und Sauerstoff. Glutathion-Peroxidase (siehe Exkurs 15.4) verwendet Glutathion (GSH) als Reduktionsmittel: 2 GSH

+ H>0;

—

GSSG

+ H,O

Das letztere Enzym katalysiert auch den Abbau organischer Hydroperoxide. Einige Typen von Glutathion-Peroxidase benötigen für ihre Aktivität Selen (Se). Dies ist ein Grund dafür, dass Selen scheinbar eine antioxidative Wirkung besitzt. Weitere potentielle Antioxidatien sind Verbindungen pflanzlichen Ursprungs wie z.B. Ascorbat (Vitamin C; Abschnitt 6.1C) und a-Tocopherol (Vitamin E; Abschnitt 9.1F). Diese Verbindungen helfen den Pflanzen dabei, sich vor oxidativen Schädigungen während der Photosynthese, einem Prozess, in dem H,O zu O, oxidiert wird, zu schützen. Ihre Wirksamkeit als Antioxidatien für den Menschen wird jedoch angezweifelt.

Zusammenfassung 1. Bevor Elektronen aus den reduzierten Coenzymen NADH und FADH, Sauerstoff reduzieren, durchlaufen sie eine Serie von Redoxzentren in der mitochondrialen Elektronentransportkette. Während der Elektronenübertragung werden Protonen aus dem Inneren des Mitochondrions heraustransportiert, wodurch ein elektrochemischer Gradient über die innere mitochondriale Mernbran gebildet wird, dessen Freie Enthalpie wiederum die ATP-Synthese antreibt. 2. Das Mitochondrion enthält lösliche und membrangebundene Enzyme des oxidativen Stoffwechsels. Reduktionsäquivalente aus dem Cytosol werden über ein Shuttle-System importiert. Der Transmembrantransport von ADP, ATP, P, und Ca’* erfolgt mithilfe spezifischer Transporter. 3. Elektronen fließen von Redoxzentren mit stärker negativen zu solchen mit stärker positiven Reduktionspotentialen. Durch den Einsatz von Inhibitoren wurden die Reihenfolge der Elektronentransportkomponenten und die Stellen ermittelt, an denen Elektronen in die Elektronentransportkette eintreten.

4. Der Elektronentransport wird sowohl durch Zwei-Elektronen-Überträger (CoQ, FMN, FAD) als auch Ein-Elektronen-Überträger (Fe-S-Cluster, Cytochrome und Cu-Ionen) vermittelt. 5. Komplex I überträgt zwei Elektronen von NADH auf CoQ und transloziert vier Protonen in den Intermembranraum. 6. Komplex II überträgt Elektronen von Succinat über FAD auf CoQ. 7. Komplex III überträgt zwei Elektronen von CoQH, auf zwei Moleküle Cytochrom c. Über den Q-Cyclus werden gleichzeitig vier Protonen in den Intermembranraum transloziert. 8. Unter Verwendung von vier durch Cytochrom c bereitgestellten Elektronen und von vier Protonen aus der Matrix reduziert Komplex IV ein Molekül O, zu 2 H,O. Für je zwei Elektronen, die auf Sauerstoff übertragen werden,

werden zwei Protonen in den Intermembranraum überführt. 9. Die während des Transports von Elektronen durch die Komplexe I, III und IV in den Intermembranraum translozierten Protonen bilden, wie von der chemiosmotischen Theorie postuliert, einen elektrochemischen Gradienten über die innere mitochondriale Membran aus. 10. Der Influx von Protonen durch den Fo-Teil der ATP-Synthase (F,Fo-ATPase) bewirkt am zugehörigen F,-Teil über einen Bindungswechsel-Mechanismus die Synthese von ATP aus ADP + P,. Dieser Vorgang wird mechanisch

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Welche Kontrollmechanismen verbinden die Glykolyse, den Citratcyclus und die oxidative Phosphorylierung? 2. Was sind die Vorteile und die Nachteile eines auf O, beruhenden Stoffwechsels?

689

_Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung

690

11.

12. 13.

14.

vermittelt, wobei die y-Untereinheit von F} gegenüber der katalytischen 4ß3-Gruppierung, angetrieben durch den Fo-Teil, rotiert. Der P/O-Quotient, die Anzahl der ATP-Moleküle, die pro reduzierten Sauerstoffatom gebildet werden, muss keine ganze Zahl sein. Stoffe, die den Protonengradienten entladen, können die oxidative Phosphorylierung vom Elektronentransport entkoppeln. Die oxidative Phosphorylierung wird durch das Verhältnis [NADH] /INAD*] und durch den ATP-Massenwirkungskoeffizienten kontrolliert. Abhängig vom ATP-Bedarf werden Glykolyse und Citratcyclus koordiniert reguliert. Die Oxidationskraft von O, ermöglicht Organismen, mehr Energie aus Stoffwechselbrennstoffen herauszuholen als dies unter anaeroben Bedingungen der Fall ist. Aerobe Organismen müssen sich jedoch vor Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) schützen.

Wichtige Begriffe Redoxzentrum Cristae Intermembranraum mitochondriale Matrix Malat-Aspartat-Shuttle Glycerin-3-phosphat-Shuttle ADP/ATP-Translokator elektrogener Transport

protonenmotorische Kraft F,Fo-ATPase Bindungswechsel-Mechanismus P/O-Quotient Entkoppler ATP-Massenwirkungskoeffizient Glucose-Fettsäurecyclus Antioxidans

Coenzym Q (Ubichinon) Eisen-Schwefel-Protein freies Radikal Protonenleiter Cytochrom Q-Cyclus energetische Kopplung chemiosmotische Theorie

Aufgaben 1. Erklären Sie, warum ein Mitochondrion der Leberzelle weniger Cristae enthält als ein Mitochondrion aus einer Herzmuskelzelle. 2. Wie viele ATP werden für jedes cytosolische NADH synthetisiert, das am Glycerin-3-phosphat-Shuttle im Flugmuskel von Insekten teilnimmt? Wie viel ist dies im Vergleich mit der ATP-Ausbeute, die bei Übertragung der NADH-Redoxäquivalente in die Matrix über den MalatAspartat-Shuttle erhalten wird? 3. Berechnen Sie AG°’ für die Oxidation von freiem FADH,

(a) (b) (c) (d)

zur Zeit t= 1 Amytal; Amytal bei t= 1 und Succinat bei t = 2; Cyanid bei t= 1 und Succinat beit=2; Oligomycin bei t= 1 und DNP bei t = 2 zugegeben werden. 5. Warum können Elektronen innerhalb eines Elektronentransportkomplexes von einem Redoxzentrum mit einem

positiveren &°’ zu dem mit einem negativeren &°’ fließen? 6. Wird eine Mitochondriensuspension hochfrequenten Schallwellen ausgesetzt (Ultraschallbehandlung), werden

durch O,. Wie viele ATP können unter der Annahme

submitochondriale Partikel erzeugt, die aus Bruchstücken

von Standardbedingungen und 100% Energieerhaltung maximal synthetisiert werden? 4. Die O,-Verbrauchskurve einer verdünnten, gut gepufferten

der inneren mitochondrialen Membran bestehen. Bei diesen Vesikeln ist die Membran mit der Innenseite nach aufgen orientiert, so dass der Intermembranraum des

und einen Überschuss an ADP + P; enthaltenden

Mitochondrions dem Lumen des submitochondrialen

Mitochondriensuspension zeigt folgenden Verlauf:

Partikels entspricht. (a) Stellen Sie schematisch den Prozess von Elektronenübertragung und oxidativer Phosphorylierung in diesen Partikeln dar. (b) Angenommen alle Substrate für die oxidative Phosphorylierung seien im Überschuss vorhanden, nimmt

he 2

dann die ATP-Synthese zu oder ab, wenn der pH der

1

2

Skizzieren Sie die Kurven, die erhalten werden, wenn

Lösung, in der die Mitochondrien suspendiert sind, erhöht wird? 7. Der pH-Wert-Unterschied zwischen der Innen- und Außenseite der inneren Mitochondrienmembran beträgt 1,4 pH-Einheiten (die Außenseite ist sauer). Welche Freie SE: Enthalpie wird beim Transport von 1 mol Protonen zurück

Literatur

durch die Membran freigesetzt, wenn das Membranpotential 0,06 V beträgt (innen negativ)? Wie viele Protonen müssen befördert werden, um ausreichend Freie Enthalpie für die Synthese von 1 mol ATP zu liefern (unter Annahme von biochemischen Standardbedingungen)? 8. Betrachten Sie den mitochondrialen ADP-ATP-Translokator und das P;-H'-Symportprotein. (a) Wie beeinflussen die beiden Transporter den elektrochemischen Gradienten an der Mitochondrienmembran? (b) Welche thermodynamische Kraft treibt die beiden Iransportsysteme an? 9. Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) ist ein Reagens, das mit Asp- oder Glu-Resten reagiert.

(me)

691

13. Beschreiben Sie die Veränderungen von [NADH]/[NAD*] und [ATP]/[ADP] während des Umschaltens vom anaeroben zum aeroben Stoffwechsel. Wie beeinflussen diese Quotienten die Aktivität von Glykolyse und Citratcyclus? 14. Aktivierte Neutrophile und Makrophagen (Arten weißer Blutzellen) bekämpfen eingedrungene Bakterien durch Freisetzung von Superoxid. Diese Zellen enthalten eine NADPH-Oxidase, welche folgende Reaktion katalysiert: 2 O, + NADPH

— 2 O;- + NADP* + H*

Erklären Sie, warum in diesen Zellen der Fluss durch die durch Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase katalysierte Reaktion ansteigt.

Elektronisches Zusatzmaterial

auf www.wiley.com/college/voet Dieyclohexylcarbodiimid

(DCCD)

Erklären Sie, warum die Reaktion von DCCD mit den c-Untereinheiten der F}Fo-ATPase deren ATP-SyntheseAktivität blockiert. 10. Wie unterscheidet sich der P/O-Quotient für NADH bei ATP-Synthasen mit 9 und mit 12 c-Untereinheiten? 11. Erklären Sie, warum Verbindungen wie Dinitrophenol die Stoffwechselgeschwindigkeit erhöhen. 12. Worin besteht bei der Stimulation der GrundumsatzThermogenese im braunen Fettgewebe der Vorteil einer hormonellen Aktivierung von Lipase gegenüber der einer direkten Aktivierung von UCP (siehe Exkurs 18.4)?

Case Study 24 Uncoupling Proteins in Plants Uncoupling proteins in plants uncouple oxidative phosphorylation in order to generate heat in the developing plant. Case Study 27 Regulation of Sugar and Alcohol Metabolism in Saccharomyces cerevisiae The regulation of carbohydrate metabolic pathways in yeast serves as a good model for regulation of the same pathways in multicellular organisms. Case Study 33 Modification of Subunit c from Bovine Mitochondrial ATPase Modification of Lys 43 in the mitochondrial ATPase, once thought to be the structural basis of Batten disease, has been found in bovine mitochondria, indicating that this modification is completely normal.

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Pflanzen wie diese Bäume können buchstäblich von Wasser, Luft und Licht leben. Sie oxidieren H,O zu O, und wandeln

in einem Vorgang, der von Licht getrieben wird, CO, aus der Luft in Kohlenhydrate um. [Michael Busselle/Stone/Getty Images.]

Photosynthese EEE

EEE

TE

EEE

EEE

ERTEILT

BNINIITETETTN

Elektronisches Zusatzmaterial

Photosynthese e Chloroplasten

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 20

e Die Lichtreaktion e Die Dunkelreaktion

Interactive Interactive Interactive Interactive

Exercise Exercise Exercise Exercise

23 24 25 26

Animated Figure 19-6 Animated Figure 19-26 Animated Figure 19-28 Kinemage 8-2

Die Kenntnis, dass Pflanzen Nahrungsstoffe aus Licht und Luft gewinnen, wurde erst im 18. Jahrhundert bestätigt. Und die Tatsache, dass Pflanzen eine lebenswichtige Substanz — O, - bilden, wurde erst bekannt, als Joseph Priestley bemerkte, dass die Luft in einem Glas, in welchem eine Kerze ausgebrannt war, durch Einbringen einer kleinen Pflanze in das Glas „erneuert“ werden konnte. In Gegenwart von Sonnenlicht verbrauchen Pflanzen und Cyanobakterien (früher Blaualgen genannt) CO, und H,O, wobei sie O, bilden und Kohlenstoff in Form von Kohlenhydraten fixieren: CO,

Lich + 50

(CH>0)

+ O,

Die Photosynthese reduziert mit Hilfe von Lichtenergie Kohlenstoff, ist also im Grunde die Umkehr

des oxidativen Kohlenhydratstoffwechsels.

Kohlenhydrate,

die in der Photosynthese entstanden sind, dienen deshalb als Energiequelle für jene Organismen, welche sie erzeugen und genauso für Organismen, die nicht zur Photosynthese befähigt sind und sich direkt oder indirekt von photosynthetisch aktiven Organismen ernähren. Man schätzt, dass die Photosynthese jährlich ungefähr 10'' Tonnen Kohlenstoff fixiert, was der Speicherung von über 10'% kJ Energie entspricht. Dieser Vorgang, bei welchem Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt wird, hat seine Wurzeln früh in der Evolution, und seine Komplexität steht im Einklang mit seiner langen Geschichte. Hier sollen zuerst photosynthetisch aktive Purpurbakterien besprochen werden, weil der Aufbau ihres Photosyntheseapparates relativ einfach ist. Im Anschluss werden grüne Pflanzen diskutiert, bei denen die Photosynthese in den Chloroplasten abläuft. Im frühen 20. Jahrhundert wurde irrtümlich davon ausgegangen, dass Licht, welches von den Photosynthesepigmenten absorbiert wurde, direkt CO, reduziere, welches dann mit Wasser verbunden wird, so dass Kohlenhydrate entsteLehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

MM...13 RA 9NiN \YTI DV SITLI \aHlar CmhIoI

8- rn

KCaA

Weinheim

694

Photosynthese

Vorhen. Tatsächlich ist die Photosynthese in Pflanzen aber ein zweistufiger : oxidieren zu H,O wird, genutzt dazu gie gang, bei dem Lichtener

ee, Lich

le

Das dabei entstehende Reduktionsäquivalent (hier als [H-] dargestellt) reduziert anschließend CO;:

4[H'] + CO>>(CH30) + H,O Die zwei Stufen der Photosynthese werden traditionell als Lichtreaktion und Dunkelreaktion bezeichnet: 1. Bei der Lichtreaktion fangen eigens darauf spezialisierte Pigmentmoleküle Lichtenergie ein und werden dabei oxidiert. Eine Kette von Elektronenübertragungsreaktionen, welche in der Reduktion von NADP* zu NADPH münden, bauen über der Membran einen Protonengradienten auf, dessen Energie für die Synthese von ATP aus ADP und P; verwendet wird. Die oxidierten Pigmente werden durch H,O reduziert, wobei O, gebildet wird. 2. Die Dunkelreaktion verwendet NADPH

und ATP, um

CO, zu reduzieren

und baut es in die C,-Ausgangsverbindungen der Kohlenhydrate ein.

Wie zu sehen sein wird, laufen beide Prozesse im Licht ab und werden deshalb besser als lichtabhängige und lichtunabhängige Reaktionen bezeichnet. Nach der Beschreibung der Chloroplasten und deren Bestandteile werden nacheinander die Lichtreaktion und Dunkelreaktion betrachtet.

1 _ Chloroplasten Der Ort der Photosynthese in Eukaryoten.(Algen und höhere Pflanzen) ist der Chloroplast. Photosynthetisch aktive Zellen enthalten 1 bis 100 Chloroplasten, die erheblich in Größe und Form variieren, aber typischerweise etwa 5 um lange Ellipsoide sind. Diese Organellen sind wahrscheinlich aus photosynthetisch aktiven Bakterien hervorgegangen.

A.

Aufbau der Chloroplasten

Chloroplasten sind den Mitochondrien (welchen sie in vielen Dingen ähneln) darin vergleichbar, dass sie eine sehr durchlässige äußere Membran und eine nahezu impermeable innere Membran haben, die durch einen schmalen Intermembranraum getrennt sind (Abb. 19.1). Die innere Membran umhüllt das Stroma, eine konzentrierte Lösung von Enzymen, einschließlich derer, welche für die Kohlenhydratsynthese benötigt werden. Das Stroma enthält außerdem die DNA, RNA und Ribosomen, die an der Synthese einiger Chloroplastenproteine beteiligt sind. Das Stroma umgibt wiederum ein drittes Membrankompartiment, die Thylakoide (griech.: thylakos, Sack oder Beutel). Ein Thylakoidkompartiment besteht vermutlich aus einem einzigen, stark gefalteten Vesikel, obwohl Thylakoide in den meisten Organismen aus Stapeln diskusförmiger Säckchen — Granathylakoide genannt - aufgebaut zu sein scheinen, die durch Stromathylakoide miteinander verbunden sind. Ein Chloroplast enthält gewöhnlich 10 bis 100 Granathylakoide. Thylakoidmembranen entstehen durch Einstülpungen der inneren Membran neu entstehender Chloroplasten und sind deshalb mit den Cristae der Mitochondrien vergleichbar. Die Thylakoidmembran enthält Proteinkomplexe, die am Sammeln der Lichtenergie, dem Elektronentransport und der ATP-Synthese beteiligt sind. In photosynthetisch aktiven Bakterien ist der Appa-

Chloroplasten

695

äußere Membran

Be, Stromathylakoide innere Membran Intermembranraum

hA =

Granathylakoide Stroma

Thylakoidlumen

(a)

(b)

u...

RE

ARE

®

NE

SA

rat für die Lichtreaktion in der Plasmamembran lokalisiert, die häufig Einstül-

pungen oder multilamellare Strukturen ähnlich den Granathylakoiden bildet.

B.

Lichtabsorbierende Pigmente

Der wichtigste Photorezeptor in der Photosynthese ist Chlorophyll. Dieses cyclische Tetrapyrrol wird (wie die Hämgruppe von Globinen und Cytochromen; Abschnitt 7.1A und Exkurs 18.1) biosynthetisch aus Protoporphyrin IX gewonnen. Chlorophylimoleküle unterscheiden sich von Häm jedoch in mehrerer Hinsicht (Abb. 19.2): In Chlorophyll ist das zentrale Metallion Mg°*, anstelle von Fe(ll) oder Fe(III), und ein Cyclopentanonring, Ring \, ist an den Pyrrolring III angefügt. Die wichtigsten Chlorophyliformen in Pflanzen, Chlorophylia (Chla) und Chlorophyllb (Chlb), und die wichtigsten Formen in Cyanobakterien, Bacteriochlorophyll a (BChl a) und Bacteriochlorophyll b (BChl b), unterscheiden sich von Häm und untereinander im Sättigungsgrad der Ringe II und IV und in den Substituenten der Ringe I, II, und IV. Die stark konjugierten Chlorophyllmoleküle absorbieren gemeinsam mit den anderen Photosynthesepigmenten stark das sichtbare Licht (die intensivste Form der Sonnenstrahlung, die die Erdoberfläche erreicht; Abb. 19.3). Die relativ ge-

ringen chemischen Unterschiede zwischen den verschiedenen Chlorophyllen beeinflussen dennoch erheblich ihre Absorptionsspektren. Lichtsammelkomplexe enthalten mehrere Pigmente

Die wichtigsten Reaktionen der Photosynthese (wie in Abschnitt 19.2B erklärt) finden an dem Photosynthese-Reaktionszentrum statt. Jedoch enthalten die photosynthetisch aktiven Komplexe der Photosynthese weit mehr Chlorophylimoleküle als im Reaktionszentrum selbst enthalten sind. Das kommt daher, dass die meisten Chlorophylimoleküle nicht direkt an den photochemischen Reaktionen teilnehmen, sondern als „Lichtfalle“ dienen, d.h. sie wirken als lichtsammelnde Antennenpigmente. Diese Antennenchlorophylle reichen die Energie der absorbierten Photonen (Lichtquanten) von Molekül zu Molekül weiter, bis sie eines der Photosynthese-Reaktionszentren erreicht hat (Abb. 19.4). Die Übertragung der Energie vom Antennensystem auf ein Reaktionszentrum findet in < 10° s mit einer Ausbeute von über 90% statt. Diese hohe Effizienz beruht auf dem entsprechenden Abstand und der relativen Orientierung der Chlorophylimoleküle zueinander. Sogar in direktem Sonnenlicht fängt ein Reaktionszentrum allein nur etwa ein Photon pro Sekunde auf - eine für den Stoffwechsel unzureichende Ausbeute. Deshalb ist ein Komplex aus Antennenpig-

Abb. 19.1 Ein Chloroplast aus Mais. (a) Elektronenmikroskopische Aufnahme. [Mit freundlicher Genehmigung von T. Elliot Weier.]

(b) Schematische Darstellung.

696

Photosynthese

5 CH

Abb. 19.2 Chlorophylistrukturen. Die Strukturformeln von Chlorophyll a und b und der Bacteriochlorophylle a und b im Vergleich mit der Struktur von Eisen-Protoporphyrin IX (Häm). Die isoprenoiden Phytol- und Geranylgeranylschwänze erhöhen wahrscheinlich die Löslichkeit von Chlorophyll in unpolaren Medien.

CH3

H3C

CH —=(CH;

H;C

CH3 |

A l

oe

R,—O

|

CH; Chlorophyll

Chlorophyll «a

u CH

Chlorophyll 5

CH ICHS 10) I —r& (EIER, oO l CZECH;

Bacteriochlorophyli1 b

Ob

ar

er

\—=0O

c—=0

O=

(6)

er

Eisen-Protoporphyrin IX

R}

Bacteriochlorophyll «a

OEL

CS

Ra

Ra

u OH 10) I u

— CH

—CH3 —CH3

a a

R4 CHz

B

— CH,— CH;

B.

—CH,—CH;z — CH

a

P oder G

CH,

BE

“ keine Doppelbindung zwischen C3 und CA.

Ama

Sen 4

ey

Phytol-Seitenkette

Send

N —— RE za, NE — Geranylgeranyl-Seitenkette

FR

Spektrum des

—— Chlorophyll b

Sonnenlichts

Chlorophyll «a

Abb. 19.3

Absorptionsspektren einiger Photosynthesepigmente. Die Chlorophylle besitzen zwei Absorptionsbanden, eine im roten Bereich (lange Wellenlängen) und eine im blauen Bereich (kurze Wellenlängen). Phycoerythrobilin (der Chromophor im Phycoerythrin) absorbiert blaues und grünes Licht, dagegen absorbiert Phycocyanobilin (der Chromophor im Phycocyanin) gelbes Licht. Zusammen absorbieren diese Pigmente den größten Teil des sichtbaren Lichts im Sonnenspektrum. [Nach einer Zeichnung von Govindjee, University of Illinois.)

otinoide h

Bacterio

orophyli a

Phycoerythrobilin

Are Au

Absorption

EE Se

Phycocyanobilin

400

700 Wellenlänge (nm)

Chloroplasten Photon

Photon nn

(X

Photon NN

oo

Photon NN

..

697

Abb. 19.4 Energiefluss durch einen Antennenkomplex der Photosynthese. Die Energie eines absorbierten Photons wandert (weiße Punkte) ziellos durch das Molekül des Antennenkomplexes (hellgrüne Punkte) bis sie ein Chlorophyll des Reaktionszentrums (dunkelgrüne Punkte) erreicht, oder - seltener — wieder

abgestrahlt wird (Fluoreszenz).

menten unerlässlich —- auch Lichtsammelkomplex genannt (engl.: light harvesting complex, LHC). LHC bestehen aus einer Anordnung membrangebundener, hydrophober Proteine, die jeweils mehrere, oft symmetrisch angeordnete Pigmentmoleküle enthalten. Zum Beispiel ist LH-2 aus dem photosynthetisch aktiven Purpurbakterium Rhodospirillum molischianum ein integrales Membranprotein, das aus acht a-Untereinheiten und acht ß-Untereinheiten besteht. Diese sind in zwei konzentrischen Ringen mit achtzähliger Symmetrieachse angeordnet, zwischen denen 32 Pigmentmoleküle liegen (Abb. 19.5). Andere Lichtsammelkomplexe unterscheiden sich stark in ihrer Struktur und Zusammensetzung der lichtsammelnden Pigmente. Die Anzahl und Anordnung der Pigmentmoleküle in jedem LHC wurde in der Evolution wahrscheinlich für eine effiziente Energieübertragung im gesamten LHC optimiert. Tatsächlich sind die 16 BChl a-Molekülen des Rings in LH-2 so fest gebunden, dass sie die Strahlung fast wie eine einzelne Einheit absorbieren (unterer Teil von Abb. 19.55). Die meisten Lichtsammelkomplexe enthalten neben Chlorophyll noch andere lichtabsorbierende Verbindungen. Diese Hilfspigmente füllen sozusagen die Absorptionsspektren der Antennenkomplexe auf, indem sie die Spektralbereiche abdecken, in denen Chlorophylle nur schwach absorbieren (Abb. 19.3). Zum Beispiel sind Carotinoide — lineare Polyene wie ß-Carotin — Bestandteil aller grünen

H;C

ß-Carotin

Pflanzen sowie vieler photosynthetisch aktiver Bakterien. Somit sind sie die häufigsten Hilfspigmente und zum größten Teil verantwortlich für die bunte Herbstfärbung der Laubbäume sowie für die orange Farbe der Möhre (Daucus carota), nach der sie benannt sind. Im Wasser lebende, photosynthetisch aktive Organismen, die fast die Hälfte der Photosynthese auf der Erde leisten, enthalten zusätzlich noch andere Typen von Hilfspigmenten. Das liegt daran, dass Licht außerhalb der Wellenlängen von 450 bis 550 nm (blaues und grünes Licht) beim Durchgang durch mehr

698

Photosynthese

(b)

(a)

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Beschreiben Sie die Struktur eines Chloroplasten. 2. Warum enthalten photosynthetisch aktive Organismen verschiedene Typen von Pigmentmolekülen? 3. Welche Funktion haben Lichtsammelkomplexe?

Abb. 19.5 Die Röntgenkristallstruktur des Lichtsammelkomplexes LH-2 aus R. molischianum. (a) Der Blick senkrecht zur Photosynthesemembran zeigt, dass die a-Untereinheiten (blau, 56 Aminosäuren) und die ß-Untereinheiten (rosa, 45 Aminosäuren) — dargestellt durch ihr C.-Rückgrat - in zwei konzentrischen Ringen mit achtzähliger Symmetrieachse angeordnet sind. 32 Moleküle Bacteriochlorophyl| a (BChl a, grün) und 8 Moleküle Lycopen (ein Carotinoid, gelb) sind zwischen den Proteinringen angeordnet. (b) Blick von der Membranebene aus, wobei dieselben Farben wie in (a) verwendet wurden. Die a-helicalen Teile der Proteine sind als Zylinder dargestellt und die Mg?*-Ionen durch weiße Kugeln. Es ist zu beachten, dass 8 der BChl-a-Moleküle nahe der Oberseite des Komplexes gebunden sind, wobei ihr Ringsystem annähernd parallel zur Membranebene liegt. Dagegen sind die restlichen 16 BChl-a-Moleküle nahe der Unterseite des Komplexes gebunden - mit ihrem Ringsystem annähernd senkrecht zur Membranebene. Diese Anordnung optimiert zusammen mit jener der Lycopenmoleküle wahrscheinlich die Fähigkeit zur Lichtabsorption und Weiterleitung der Anregung dieses Antennensystems. [Mit freundlicher Genehmigung von Jürgen Koepke und Hartmut Michel, Max-Planck Institut für Biophysik, Frankfurt.] 6%, siehe Interactive Exercises.

als 10 m Wasser fast vollständig absorbiert wird. In Rotalgen und Cyanobakterien werden deshalb Chl a und Carotinoide als Antennenpigmente zum Teil durch Phycobilisomen ersetzt. Diese geordneten Proteinkomplexe enthalten vornehmlich die Biliproteine Phycoerythrin (rot) und Phycocyanin (blau). Diese Proteine bestehen aus einem Apoprotein, an das ein lineares Tetrapyrrol - ein Phycobilin — als Chromophor (lichtabsorbierende Gruppe) gebunden ist. Aus den Absorptionsspektren (Abb. 19.3) der jeweiligen Chromophore Phycoerythrobilin Phycocyanobilin ist ersichtlich, dass sie das „optische Fenster“ der Chlorophylle und Carotinoide komplementieren. Ethyl in Phycocyanobilin

’

N dehydriert in Phycocyanobilin

ını

FE |

4

92°

4

mnı

wre

Die Lichtreaktion

2

699

Die Lichtreaktion

Die Photosynthese ist ein Vorgang, bei dem Elektronen angeregter Chlorophylimoleküle über eine Reihe von Akzeptoren weitergereicht werden, welche elektronische Energie in chemische Energie umwandeln. Daraus ergeben sich zwei Fragestellungen: (1) Nach welchem Mechanismus erfolgt die Energieübertragung und (2) wie erlanei a photooxidierten Chlorophylimoleküle ihre abgegebenen Elektronen zu-

rück:

A.

Wechselwirkung von Licht und Materie

Elektromagnetische Strahlung besteht aus einzelnen Quanten deren Energie E durch das Planck’sche Gesetz definiert ist:

(Photonen),

wobei h das Planck’sche Wirkungsquantum (6,626 X 10°°* Js), c die Lichtgeschwindigkeit (2,998 x 10° m-s' im Vakuum), v die Strahlungsfrequenz und A die Wellenlänge sind. Wenn ein Molekül ein Photon absorbiert, wird eines seiner Elektronen aus seinem Grundzustand (seinem Molekülorbital niedrigster Energie) in einen Zustand höherer Energie angehoben. Jedoch kann ein Molekül nur Photonen bestimmter Wellenlängen absorbieren, weil gemäß dem Energieerhaltungssatz die Energiedifferenz zwischen den beiden Zuständen genau mit der Energie des Photons übereinstimmen muss. Ein Molekül, dessen Elektronen sich in angeregtem Zustand befinden, kann seine Energie auf verschiedene Weise wieder abgeben (Abb. 19.6): 1. Strahlungsfreie Konversion (interne Umwandlung) ist eine häufige Form der Energieabgabe, bei der die Energie der angeregten Elektronen in die kinetische Energie von Molekülbewegung umgewandelt wird, d.h. in Wärme. Viele Moleküle kehren auf diese Weise strahlungsfrei in ihren Grundzustand zurück, Chlorophylimoleküle jedoch meistens nur bis auf ihren untersten angeregten Zustand. Demzufolge verändert es die für die Photosynthese nutzbare Anregungsenergie nicht, ob ein Chlorophyllmolekül durch Absorption eines Photons in seinem kurzwelligen Absorptionsbereich (was seinem zweiten angeregten Zustand entspricht) angeregt wurde oder durch die Absorption eines Photons in seinem energieärmeren langwelligen Bereich. 2. Bei der Fluoreszenz fällt ein Molekül mit angeregten Elektronen in seinen Grundzustand zurück, indem es Photonen emittiert. Ein Photon, das durch Fluoreszenz abgegeben wird, hat stets eine längere Wellenlänge (geringere Energie) als das ursprünglich absorbierte. Nur 3 bis 6% der Lichtenergie, die von lebenden Pflanzen absorbiert wird, werden als Fluoreszenz wieder abgegeben. 3. Beim Resonanzenergietransfer überträgt ein angeregtes Molekül seine Anregungsenergie direkt auf benachbarte, nicht angeregte Moleküle mit ähnlichen Elektronenenergieniveaus. Dieser Vorgang erfolgt über die Wechselwirkung der Orbitale der beteiligten Moleküle. Lichtenergie wird durch Energietransfer zwischen den Antennenpigmenten zu den Photosynthese-Reaktionszentren geleitet. Die Energie wird von den Chlorophyllen des Reaktionszentrums „eingefangen“, da das Energieniveau ihres angeregten Zustands geringfügig niedriger liegt als jenes der umgebenden Antennenchlorophylle (Abb. 19.7). 4. Bei der Photooxidation wird ein durch Licht angeregtes Donatormolekül oxidiert, indem

es ein Elektron auf ein Akzeptormolekül

überträgt, welches

dadurch reduziert wird. Dieser Vorgang findet statt, weil das übertragene Elektron im angeregten Zustand weniger fest am Donator gebunden ist als

E\

zweiter

> angeregter Zustand

Fan E interne Umwandlung (strahlungsfrei)

Zn

erster angeregter Zustand

e Absorption

Absorption

un

von blauem N von rotem Licht hv

/zenz

Licht hv

hy

Photooxidation (chemische Reaktionen)

Grundzustand

Abb. 19.6 Energieniveauschema, das die Elektronenzustände von Chlorophyll und dessen wichtigste Umwandlungsformen verdeutlicht. Die geschlängelten Pfeile zeigen die Absorption von Photonen oder deren Emission durch Fluoreszenz. Anregungsenergie kann auch in strah lungsfreien Vorgängen abgegeben werden, wie z.B. durch interne Umwandlung (Wärmebildung) und chemische Reaktionen. 6% siehe Animated Figures.

700

Photosynthese Resonanzenergietransfer

Abb. 19.7 Einfangen der Anregungsenergie durch das Photosynthese-Reaktionszentrum. Lichtenergie, die durch Energietransfer zwischen den Pigmentmolekülen weitergereicht wurde, wird

angeregte Zustände

durch das Chlorophyl| des Reaktionszentrums gefangen, weil das Energieniveau von dessen niedrigstem angeregtem Zustand tiefer liegt als das der Antennenpigmentmoleküle.

I
-|

Reduktase (Stroma)

2NADPH

3

sH+ (Stroma) pool

hv

sH+ (Thylakoid)

Sur Cytochrom

| PC

ER (0)

bef

O, + 4H? B

(Thylakoid)

Abb. 19.12

Wesentlichen aus den gleichen Molekülen (mit Chl a, Phaeo a und Plastochinon, das BChl b ersetzt, BPhaeo b bzw. Menachinon) und sind entlang der pseudo-zweizähligen Achse des Komplexes symmetrisch organisiert. Die beiden Chl-a-Ringe, die in Abbildung 19.14 mit P), und P), bezeichnet sind, sind analog zum „Spezialpaar“ der BChl-b-Moleküle von P960 positioniert. Man nimmt an, dass sie den primären Elektronendonator des PSII, P680, (der Name stammt von der Wellenlänge, bei der er ein Absorptionsmaximum hat) bilden. Das von P680 abgegebene Elektron legt einen ähnlich asymmetrischen Weg zurück wie dasjenige im Reaktionszentrum der photosynthetisch aktiven Purpurbakterien, obwohl die beiden Systeme bei unterschiedlichen Reduktionspotentialen arbeiten (Vgl. Abb. 19.10 und 19.12). Wie im Mittelteil von Abbildung 19.12 gezeigt, wird das Elektron auf ein Molekül Phaeo a (Phaeo,, in Abb. 19.14) übertragen, vermutlich über ein Chl-a-Molekül (Chl),) und dann an ein gebundenes Plastochinon (Q,) weitergegeben. Anschließend wird das Elektron auf ein zweites Plastochinonmolekül (Q,) übertragen. Dieses nimmt an der Stromaseite (cytoplasmatischen Seite in Cyanobakterien) der Thylakoidmembran zwei Protonen auf, nachdem es ein zweites Elektron auf ähnliche Weise übertragen wurde. Das entstehende Plastochinol (Q5H;,) wird dann gegen ein Plastochinonmolekül aus dem membrangebundenen Reservoir ausgetauscht. DCMU und viele andere übliche Herbizide konkurrieren mit Plastochinon um die Q,-Bindungsstellen auf dem PSII. Dies erklärt, auf welche Weise sie die Photosynthese hemmen.

O, wird in einer fünfstufigen Wasserspaltung gebildet Das Elektron, das durch Photooxidation von P680 freigesetzt wird, wird durch ein Elektron ersetzt, das über das OEC aus H,O erhalten wird. Das OEC des PSII wird auch wasserspaltendes Enzym genannt, weil zwei Wassermoleküle in ein Molekül O,, vier Protonen und vier Elektronen gespalten werden. Einbli-

cke in diesen Vorgang wurden durch Pierre Joliet und Bessel Kok gewonnen, die

Z-Schema der Photosynthese.

Elektronen, die das P680 im PSII nach Absorption von Photonen abgibt, werden durch Elektronen

ersetzt, die durch einen Mangankomplex (dem sauerstofferzeugenden Zentrum, OEC) von Wasser abgezogen werden, wobei ©, und vier H* entstehen. Jedes abgegebene Elektron wandert durch eine Kette von Elektronenträgern zu einem Pool an Plastochinonmolekülen (Q). Das entstehende Plastochinol reduziert wiederum den Cytochromb,f-Komplex (gelber Kasten), womit die Abgabe von Protonen in das Thylakoidlumen einhergeht. Cytochrom b,f überträgt anschließend die Elektronen auf Plastocyanin (PC), welches das photooxidierte P700 in PSI regeneriert. Die Elektronen, die P700 abgibt, reduzieren durch die Vermittlung

einer Kette von Elektronenträgern in einem nicht cyclischen Elektronentransport NADP* zu NADPH. Die Elektronen können auch in einem cyclischen Prozess wieder auf den Cytochrom-b,f-Komplex übertragen werden - ein Vorgang, der zusätzlich Protonen in das Thylakoidlumen transloziert. Das Reduktionspotential nimmt von oben nach unten zu, so dass die Elektronen spontan in diese Rich-

tung fließen.

706

Photosynthese

‚Nicht-Häm-Fe

an SRNGL\ a TyaIy A

Stroma

Häm b559

QB

Ga

Lumen

DE

N

e.BLDE 7

f

3

Häm c550

zweizählige Achse

(a)

PsbU Abb. 19.13

Röntgenstruktur des PSII aus T. elongatus.

(a) Das PSII-Dimer ist so gezeigt, wie es in der Membran sitzt. Zu seinen

BE

Fe

za”

«

ER

M

.

_ (PsbN)

2

Transmembranuntereinheiten gehören D1 (gelb), D2 (orange), CP47 (rot), CP43 (grün) und Cytochrom b;;s (magentarot). Die weiteren Transmembranuntereinheiten sind hellblau und blaugrau angefärbt. Seine äußeren Proteine sind PsbO (dunkelblau), PsbU (violett) und PsbV (hellgrün). Die verschiedenen Cofaktoren sind als Stabmodell gezeigt, wobei die Chiorophylimoleküle des D1/D2-Reaktionszentrums hellgrün sind, diejenigen des Antennenkomplexes dunkelgrün, die Phaeophytine sind dunkelblau, die Häm-Gruppen sind rot, die ß-Carotine orange, Q, und Qz purpurn und das Nicht-Häm-Fe ist durch eine rote Kugel dargestellt. Die mutmaßliche Lage der Membran ist durch das hellblaue Band wiedergegeben. (b) Ansicht eines PSII-Protomers, senkrecht zur Membran vom Thylakoidlumen aus. Gezeigt sind nur die Transmembrananteile des Komplexes. Die Färbung entspricht der von Teil a. Ein Teil des anderen Protomers des PSII-Dimers ist mit gedeckten Farben dargestellt, wobei die gestrichelte Linie den Bereich der Wechselwirkungen zwischen den Monomeren andeutet. Die pseudozweizählige Ache ist senkrecht zur Membran und verläuft durch das Nicht-Häm-Fe. Sie verknüpft die Transmembranhelices

(b)

des D1/D2-Heterodimers,

und PsbX, was durch die schwarzen

CP43 und CP47, sowie Psbl

Kreise angezeigt ist, die um diese

Untereinheiten gezogen sind. [Mit freundlicher Genehmigung von James Barber und So Iwata, Imperial College London. PDBid 1S5L.]

die O,-Bildung dunkeladaptierter Chloroplasten untersuchten, welche einer Serie kurzer Lichtblitze ausgesetzt worden waren. O, wurde in einem eigenartigen periodischen Muster gebildet (Abb. 19.15). Bei den ersten beiden Lichtblitzen wird annähernd kein O, gebildet. Der dritte Blitz ruft die stärkste O,-Bildung hervor. Danach erreicht die gebildete O,-Menge bei jedem vierten Blitz ein Maximum bis sich die Schwingungen auf ein stabiles Niveau abdämpfen. Diese Periodizität weist darauf hin, dass jedes OEC vier lichtabhängige Reaktionen durchlaufen muss, ehe es O, freisetzen kann.

Vom OEC wird angenommen, dass es einen Cyclus fünf verschiedener Zustände durchläuft, S, bis S; (Abb. 19.16). ©, wird bei dem Übergang von S,

Die Lichtreaktion

707

Bicarbonat

je O,-Bildung Blitz

—I.

4

e ; ’

Re

: \

-

79

1.04

A AN 0,87 ’ Chlzp2

8

priee

ll

12

16

Br

1

20

24

Anzahl der Blitze

Abb. 19.15 O,-Bildung je Lichtblitz in dunkeladaptierten Spinatchloroplasten. Es ist zu beachten, dass die O,-Bildung bei dem dritten Blitz ein Maximum erreicht und dann wieder nach jedem vierten Blitz, bis sich die

Schwingungen schließlich auf ihren Durchschnittswert abdämpfen. [Nach Forbush, B., Kok, B.

OEC

und McGloin, M.P., Photochem.

(1971).

Photobiol. 14, 309

Abb. 19.14 Anordnung der Cofaktoren der Elektronenübertragung im PSII von T. elongatus. Der Komplex ist entlang der Membranebene gezeigt, wobei das Thylakoidlumen unten ist. Die Cofaktoren sind wie in Abbildung 19.13 angefärbt, aber Mg?* ist gelb, N blau und O rot. Die Phytylschwänze der Chlorophylie und Phaeophytine sind der Übersicht halber weggelassen. Die Seitenketten von Tyrz (D1 Tyr 161) und DI His 190 sind gelb und diejenigen von Tyr, (D2 Tyr 160) und D2 His 189 sind orange. Das OEC ist als Kalottenmodell gezeigt; Mn ist purpurn, Ca?* türkis und O rot. Die Zahlen geben die Mittenabstände (in nm) zwischen den Cofaktoren an, die durch die dünnen schwarzen Linien abgesteckt sind. Man vergleiche die Abbildung mit Abbildung 19.9 (die bezogen auf diese Abbildung umgekehrt dargestellt ist). [Mit freundlicher Genehmigung von James Barber und So Iwata, Imperial College London. PDBid 1S5L.]

zu S, freigesetzt. Die Beobachtung, dass die O,-Bildung erstmals beim dritten anstatt beim vierten Lichtblitz ein Maximum erreicht, weist darauf hin, dass der Ruhezustand des OEC vorwiegend S, und nicht S, sein muss. Die Schwingungen dämpfen sich allmählich ab, weil einige Reaktionszentren bei einem Lichtblitz nicht oder doppelt angeregt werden, so dass die Reaktionszentren schließlich ihre Synchronität verlieren. Der vollständige Reaktionsablauf setzt schrittweise insgesamt vier Protonen, die alle von Wassermolekülen abgespalten wurden, in das Thylakoidlumen frei. Diese Protonen tragen zum transmembranen Protonengradienten bei. Da das OEC Elektronen von Wasser abzieht, müssen dessen fünf Zustände ein außergewöhnlich hohes Reduktionspotential besitzen (zur Erinnerung: in Tab. 14.5 hat die O,/H,O-Teilreaktion ein Standardreduktionspotential von 0,815 V). Weiterhin muss PSII über ausgedehnte Zeiten (im Bereich von Minuten) die hochreaktiven Zwischenprodukte in unmittelbarer Nähe von Wasser stabilisieren. Das OEC liegt auf der Lumenseite der D1-Untereinheit (Abb. 19.14) und ist ein Mn,CaO,- oder Mn,CaO,-Komplex, in dem die O-Atome mit den benachbarten Mn-Atomen Brücken bilden. Die Struktur des OEC ist schwer fassbar aufgrund der relativ schwach aufgelösten Röntgenstrukturen des PSII. Außerdem zerfällt das OEC, wenn es mit Röntgenstrahlen von einer Intensität beschossen wird, wie sie für Strukturuntersuchungen verwendet werden. Durch Einsatz von alternativen Techniken, die mit Röntgenstrahlen geringerer Intensität arbeiten und Bindungslängen abbilden können, konnte man mehrere Strukturmodelle für das OEC aufstellen. Diese sind mit den Röntgenstrukturen von PSII vereinbar. Eines dieser Modelle ist in Abbildung 19.17 gezeigt. Die Wasserspaltreaktion wird durch die Anregung des PSII-Reaktionszentrums angetrieben. Es gibt klare Hinweise, dass die Mn-Ionen in den verschiede-

hv

(Gncdhgumic

=

=

2H,O

hv

Abb. 19.16 Schematischer Mechanismus der O,-Bildung in Chloroplasten. Vier Elektronen werden nacheinander in lichtgetriebenen Reaktionen (Su, —> S,) von zwei gebundenen Wassermolekülen abgezogen. Im Regenerierungsschritt (S; — S,), der lichtunabhängig ist, wird O, freigesetzt und zwei neue

H,O-Moleküle werden gebunden. Drei dieser fünf Schritte setzen Protonen in das Thylakoidlumen frei.

708

Photosynthese Abb. 19.17 Modell für das OEC. Dieser Mn,CaO,;-Komplex ist als Kugel-Stab-Modell dargestellt, die Mn-lonen sind magentarot,

die Ca?*-Ionen türkis und der O rot. Die Bindungen zwischen Ca- und Mn-lonen sind grau gezeichnet, um zu zeigen, dass die Position des Ca-lons relativ ungenau bestimmt ist.

Vermutlich koordinieren zahlreiche Proteinseitenketten und Wassermoleküle die Ca- und Mn-lonen. Mehrere verwandte Modelle sind ebenfalls mit den Strukturdaten vereinbar.

[Nach einem Modell von Vittal Yachandra, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley.]

nen S-Zuständen des OEC (Abb, 19.16) spezifische Oxidationsstufen von Mn(Il), Mn(III), Mn(IV) und Mn(V) durchlaufen, während sie Protonen und Elektronen aus zwei H,O-Molekülen abziehen, bis ein O,-Molekül entsteht, das ins Thyla-

koidlumen abgegeben wird. Der Mechanismus, nach dem diese Reaktion abläuft, d.h. die Anordnung

Abb. 19.18 Röntgenstruktur des Cytochrom-b, fKomplexes aus dem thermophilen Cyanobakterium Mastigocladus laminosus. Von dem dimeren Komplex ist links ein Bänderdiagramm gezeichnet, in dem Cytochrom b, blau ist, die Untereinheit IV purpurn, Cytochrom frot,

das Eisen-Schwefel-Protein (ISP) gelb und die anderen Untereinheiten grün. Die vermutete Lage der Lipiddoppelschicht ist durch das gelbe Band angedeutet. Beim Vergleich dieser Abbildung mit der Abbildung 18.14 ist zu beachten, dass diese ist im Verhältnis zu der hier gezeigten Abbildung auf den Kopf gestellt ist. Rechts sind die Wege des Elektronen- und Protonentransfers durch den Komplex dargestellt sowie die Abstände zwischen den Redoxzentren (in nm). [Abgewandelt nach einer Zeichnung von William A. Cramer und Janet Smith, Purdue University. PDBid 1UM3.]

der fünf S-Zustände, ist nach wie vor unbekannt,

da Strukturinformationen zu diesen Zuständen fehlen. Die vom Wasser durch das OEC abgezogenen Elektronen werden einzeln über eine ursprünglich Z genannte Einheit an das P680* weitergegeben (Abb. 19.12). Spektroskopische Messungen haben Z als ein vorübergehend neutrales Tyrosylradikal (TyrO-) identifiziert, das auf D1 Tyr 161 sitzt (als Tyr, bezeichnet), welches zwischen dem OEC und P680 liegt (Abb. 19.14). Es sei an dieser Stelle daran erinnert, dass auch ein Tyrosylradikal in der Reduktion von O, zu 2 H,O durch die Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) in den Elektronentransport der Atmungskette eine Rolle spielt (Abschnitt 18.2F). Der Elektronentransport durch den Cytochrom-b, f-;Komplex erzeugt einen Protonengradienten Vom Plastochinonreservoir aus wandern die Elektronen durch den Cytochromb,f-Komplex. Dieser Zusammenschluss integraler Membranproteine ähnelt seinem Pendant aus Purpurbakterien, dem Cytochrom bc, (Abschnitt 19.2B),

sowie dem Komplex III der Elektronentransportkette in Mitochondrien (Abschnitt 18.2E). Der Elektronenfluss durch den Cytochrom-b, Komplex verläuft in einem Q-Cyclus (Abb. 18.15). Demnach werden für jedes transportierte Elektron zwei Protonen durch die Membran

transferiert.

Die vier Elektronen, die

durch das OEC aus 2 H,O gewonnen wurden, führen zur Verschiebung von acht H* aus dem Stroma in das Thylakoidlumen. Der Elektronentransport über den Cytochrom-b, f-Komplex erzeugt einen großen Teil des elektrochemischen Protonengradienten, der die Synthese von ATP in den Chloroplasten antreibt. Die Röntgenstruktur von Cytochrom b,f (Abb. 19.18) wurde von Janet Smith und William Cramer sowie unabhängig davon von Jean-Luc Polpot und Daniel

Stroma

Die Lichtreaktion

709

Picot bestimmt. Cytochrom b,fist ein Dimer aus Protomeren von rund 109 kD, die jeweils vier große Untereinheiten (18-32 kD) enthalten. Diese haben ihre Entsprechungen in Cytochrom bcı: Cytochrom b, entspricht der N-terminalen Hälfte von Cytochrom b; Untereinheit IV, entspricht der C-terminalen Hälfte von Cytochrom b; Cytochrom f (f für feuille, franz.: Blatt), ein Cytochrom vom c-Typ, ist ein Funktionsanalogon von Cytochrom c, ist, obwohl die beiden weder hinsichtlich Struktur noch Sequenz verwandet sind. Weiterhin gibt es ein Rieske-Eisen-Schwefel-Protein (ISP), das auch in Cytochrom bc, vorkommt. Allerdings hat Cytochrom b;f vier kleine hydrophobe Untereinheiten, die in Cytochrom bc, keine Entsprechungen haben. Jedes Protomer enthält 13 Transmembranhelices, vier im Cytochrom b,, drei in Untereinheit IV und jeweils eine in den übrigen Untereinheiten. Cytochrom b,f bindet Cofaktoren, die die Äquivalente von allen in Cytochrom bc, sind: Häm f, ein Häm vom c-Typ, das von einem Cytochrom f gebunden ist; ein [2Fe-2S]-Cluster, das vom ISP gebunden ist; die Häme b,, und b,, ein Plastochinonmolekül, das entweder die O;-Bin-

dungsstelle (die Chinonbindungsstelle, an der vollständig reduziertes Chinon während des Q-Cyclus regeneriert wird; Abschnitt 18.2E) oder die Q,-Bindungsstelle besetzt. Zusätzlich bindet Cytochrom b,f mehrere Cofaktoren, die in Cytochrom bc, keine Entsprechungen haben: ein Chl a, ein ß-Carotin und unvermutet ein neues Häm namens Häm x (alternativ Häm c;), das kovalent mit dem Protein über eine einzelne Thioetherbindung mit dem Cys 35 des Cytochrom b, verknüpft ist und dessen einziger Achsenligand ein Wassermolekül ist (vgl. mit den Häm-Gruppen a, b und c in Exkurs 18.1). Plastocyanin transportiert Elektronen von Cytochrom b,f zum PSI Die Elektronenübertragung zwischen Cytochrom f, dem terminalen Elektronenträger des Cytochrom-b, Komplexes, und PSI wird von Plastocyanin (PC) übernommen, einem peripheren Membranprotein, das auf der Lumenseite der Thylakoide lokalisiert ist (Abb. 19.11). Das Cu-enthaltende Redoxzentrum dieses beweglichen Monomers von 10,5 kD wechselt zwischen seinen Oxidationsstufen Cu(I) und Cu(ll). Die Röntgenkristallstruktur von PC aus Pappelblättern zeigt, dass das Cu-Atom in einer verzerrt tetraedrischen Geometrie von einem Cys-, einem Met- und zwei His-Resten koordiniert wird (Abb. 19.19). Cu(II)-Komplexe mit vier Liganden nehmen normalerweise eine quadratisch-planare Koordinierungsgeometrie ein, wohingegen solche mit Cu(I) allgemein tetraedrisch sind. Offensichtlich fördert die Spannung, die das Protein auf die tetraedrische Koordinierung des Cu(lI) in PC ausübt, dessen Reduktion zu Cu(l). Diese Hypothese erklärt das hohe Standardreduktionspotential (0,370 V), verglichen mit dem der normalen Cu(II)/Cu(l)-Teilreaktion (0,158 V) und veranschaulicht, wie Proteine das Reduktionspotential ihres Redoxzentrums verändern können. Im Falle von Plastocyanin ermöglicht dieses die Elektronenübertragung vom Cytochrom-b; f Komplex auf PSI. Die Strukturen von Cytochrom fund PC deuten an, wie diese Proteine miteinander assoziieren. Lys 187 von Cytochrom f, Teil einer konservierten Gruppe von fünf positiv geladenen Resten auf der Oberfläche des Proteins, kann mit Asp 44 von PC quervernetzt werden, das in einem konservierten, negativ geladenen Oberflächenbereich liegt. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die beiden Proteine über elektrostatische Wechselwirkungen assoziieren, auf ganz ähnliche Weise, wie man von Cytochrom c annimmt, dass es mit seinen Redoxpartnern der mitochondrialen Elektronentransportkette interagiert (Abschnitt 18.2E).

Das PSI-Reaktionszentrum gleicht sowohl dem PSIlI-Reaktionszentrum als auch dem Reaktionszentrum der photosynthesetreibenden Purpurbakterien Das Photosystem I (PSI) der Cyanobakterien ist ein Trimer aus Protomeren, die

jeweils aus 11 verschiedenen Proteinuntereinheiten bestehen und über 100 Cofaktoren enthalten. Die Röntgenstruktur des PSI von T. elongatus hat Wolfram Saenger bestimmt (Abb. 19.20). Sie zeigt, dass jedes der 356 kD Protomere

Abb. 19.19 Röntgenstruktur von Plastocyanin (PC) aus Pappelblättern. Dieses monomere

Protein aus 99 Aminosäuren,

ein Mitglied der Familie der blauen Kupferproteine, faltet sich als B-Sandwich. Sein Cu-Atom (orange Kugel), das zwischen den Oxidationsstufen Cu(l) und Cu(Il) wechselt, wird tetraedrisch von den Seitenketten von His 37, Cys 84, His 87 und Met 92

koordiniert, die in Stabform gezeigt sind, mit ihren C-, N- und S-Atomen in grün, blau und gelb. Sechs

konservierte Asp- und Glu-Reste, die einen negativ geladenen Bereich auf der Proteinoberfläche bilden,

sind in rot gezeichnet. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Mitchell Guss und Hans Freeman, University of Sydney. PDBid IPLC.]

710

Photosynthese

(@) Abb. 19.20 Röntgenstruktur des PSI aus T. elongatus. (a) Ansicht des trimeren Komplexes senkrecht zur Membran auf der Stromaseite. Die Stroma-Untereinheiten wurden der Übersicht halber entfernt. Die dreizählige Symmetrieachse des PSI ist durch das kleine, schwarz ausgefüllte Dreieck dargestellt. Für jedes der drei Protomere (I, II und Ill) sind verschiedene Strukturelemente gezeigt. | zeigt die Anordnung der Transmembranhelices (Zylinder), die bei jeder Untereinheit anders angefärbt sind. Die Transmembranhelices von PsaA (blau) und auch von PsaB (rot) sind jeweils vom N- zum CTerminus mit a bis k gekennzeichnet. Die sechs Helices der Schleifenregionen außerhalb der Membran sind als Spiralen gezeichnet. || zeigt die Transmembranhelices als Zylinder mit den in Bänderform gezeichneten Schleifenbereichen des Stromas und Lumens. Ill zeigt die Transmembranhelices als Zylinder, gemeinsam mit allen Cofaktoren. Die Chl-a- und Chinonmoleküle des RC sind in Stabform dargestellt und blau gefärbt, die Fe- und S-Atome der [4Fe-4S]-Cluster sind als orangefarbene und gelbe Kugeln dargestellt. Die Chlorophyll-a-Moleküle des Antennensystems (deren Seitenketten der Übersicht halber weggelassen wurden) sind gelb, die Carotinoide schwarz und die gebundenen Lipide grün. (b) Ein Protomer, parallel zur Membranebene betrachtet, also entlang des Pfeils in Bildteil a; das Stroma befindet sich oben. Die Transmembranuntereinheiten sind so wie im Bildteil

a angefärbt, die Stromaunterein-

heiten PsaC, PsaD und PsaE sind pink, türkis bzw. hellgrün. Die vertikale Linie und das schwarz ausgefüllte Dreieck markieren die dreifache Symmetrieachse. [Mit freundlicher Genehmigung von Wolfram Saenger, Freie Universität Berlin.

PBDid 1)B0.]

neun Transmembranuntereinheiten (PsaA, PsbB, PsaF, Psal-M und PsaX) und drei Stromauntereinheiten (cytoplasmatische Untereinheiten bei Cyanobakterien) (PsaC-E) enthält. Diese binden zusammen 127 Cofaktoren, die 30% der Masse des Photosystems I ausmachen. Die Cofaktoren, die das PSI-Reaktionszentrum bilden, sind alle von den ähnlichen Untereinheiten PsaA (755 Aminosäuren) und PsaB (740 Aminosäuren) gebunden. Die jeweilige Anordnung ihrer 11 Transmembranhelices ähnelt den’L- und M-Untereinheiten des PbRC (Abb. 19.8) und den D1- und D2-Untereinheiten des PSII (Abb. 19.13). Dies bekräftigt die Vorstellung, dass alle Reaktionszentren von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Zusammen mit anderen Transmembranuntereinheiten binden PsaA und PsaB auch die Cofaktoren des Kernantennensystems (siehe unten). Abbildung 19.21 zeigt, dass das Reaktionszentrum des PSI aus 6 Chl-a-Molekülen und zwei Molekülen Phyllochinon besteht,

6) CH,

©)

IM C—CH, CH, | | CH,— (CH,— CH,—CH— CH,),—H Phyllochinon

das die gleiche Phytylseitenkette hat wie die Chlorophylle (Abb. 19.2). Sie sind in zwei pseudosymmetrischen Ästen angeordnet, auf die drei [4Fe-4S]-Cluster folgen. Der primäre Elektronendonator dieses Systems, P700, besteht aus einem

Paar paralleler Chl-a-Moleküle, Al und Bl, deren Mg?*-Ionen 0,63 nm voneinander entfernt sind, und das deshalb dem „Spezialpaar“ im PbRC ähnelt. Im linken Ast von Abbildung

19.21 folgen auf Al zwei weitere Chl-a-Ringe,

B2

und A3, und im rechten Ast folgen auf B1 A2 und B3. Eines oder zwei des dritten Paars von Chl-a-Molekülen, A3 und B3, bildet wahrscheinlich den spektro-

Die Lichtreaktion Abb. 19.21

F

A

1,49

Fx

Fx 1,42

1,41

AKA

Ox-B 0,86

0,86

AS3

B3

0,88

0,82

117

1,20

B2

A2

A1

kopischen Identität mit Fy, F, und F, bezeichnet.

B1

skopisch identifizierten, primären Elektronenakzeptor A, (rechte Seite von Abb. 19.12). Die Mg?*-Ionen von A3 und B3 sind jeweils durch die S-Atome eines Met-Restes axial koordiniert anstatt durch His-Seitenketten (dabei bilden sie das einzige bekannte biologische Beispiel für eine Mg’*-S-Koordinierung). Elektronen werden von A3 und B3 an die Phyllochinone Qx-A und Q,-B weitergegeben, die nahezu sicher dem spektroskopisch identifizierten Elektronenakzeptor A, entsprechen. Spektroskopische Untersuchungen zeigen, dass, anders als beim PbRC, die Elektronen beide Äste des PSI-Reaktionszentrums passieren, wenn auch mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Interessanterweise ist das PSI-RC äusserst nah mit dem Reaktionszentrum der grünen Schwefelbakterien verwandt (eine weitere Klasse Photosynthese treibender Bakterien), bei dem es sich um ein echtes Homodimer handelt. Bis zu diesem Punkt ähnelt das Reaktionszentrum von PSI demjenigen von PSII und dem der Photosynthese treibenden Purpurbakterien. Aber anstatt dass sich die reduzierten

Formen

von

Qx-A oder Q,-B vom

Cofaktoren des PSI-RC und PsaC,

parallel zur Membranebene betrachtet, wobei sich das Stroma oben befindet. Die Chl-a- und die Phyllochinonmoleküle sind zu zwei pseudosymmetrischen Ästen angeordnet. Die Chl-a-Moleküle sind mit A oder B bezeichnet, um zu zeigen, dass ihre Mg?*-Ionen durch die Seitenketten von PsaA bzw. PsaB koordiniert werden. Die Phyllochinone sind mit Q,-A und Qx-B bezeichnet. PsaC ist als Bändermodell dargestellt, wobei die Teile, die den Segmenten in den zwei bakteriellen [4Fe-4S]-Ferredoxinmolekülen ähneln, pink sind und die Insertionen und Erweiterungen grün. Die drei [4Fe-4S]-Cluster sind als Kugel-StabModell gezeigt und entsprechend ihrer spektros-

123

2,2

711

Die Mittenabstände zwischen den Cofaktoren (vertikale schwarze Linien) sind in Nanometer angegeben. Man vergleiche diese Abbildung mit den Abbildungen 19.9 und 19.14. [Mit freundlicher Genehmigung von Wolfram Saenger, Freie Universität Berlin. PBDid 1)BO.]

PSI ablösen,

geben diese beiden Chinone ihr durch Licht angeregtes Elektron direkt an eine Kette von drei spektroskopisch ermittelten [4Fe-4S]-Cluster weiter. Diese Cluster haben die Bezeichnung Fy,, F, und F;z (rechte Seite von Abb. 19.12). F, liegt auf der Pseudodoppelachse, die PsaA mit PsaB verbindet. Es wird von zwei Cys-Resten aus jeder dieser Untereinheiten koordiniert. F, und F, sind an die Stroma-Untereinheit PsaC gebunden, die strukturell dem bakteriellen Ferredoxin ähnelt. Dieses enthält zwei [4Fe-4S]-Cluster (Abb. 19.22). Die Beobachtung, dass beide Äste der Elektronenübertragungswege des PSI aktiv sind und nicht nur ein Ast wie beim PSII und dem PbRC, lässt sich einfach begründen: Die beiden Chinone am Ende jedes Asts sind im PSI funktionell äquivalent, im PSII und PbRc aber funktionell verschieden. Das Kernantennensystem des PSI besteht aus 90 Chl-a-Molekülen und 22 Carotinoidmolekülen (Abb. 19.20a). Die räumliche Verteilung dieser AntennenChlorophyll-a-Moleküle ähnelt derjenigen in den Kernantennenuntereinheiten CP43 und CP47 des PSII (Abb. 19.13). Die N-terminalen Domänen von PsaA und PsaB haben eine ähnliche Sequenz wie diejenigen von CP43 und CP47 und falten sich zu ähnlichen Strukturen, die jeweils sechs Transmembranhelices enthalten. Bei den Carotinoiden handelt es sich zumeist um ß-Carotine, die tief in die Membran eingebettet sind. Dort stehen sie mit Chl-a-Ringen in Van-derWaals-Kontakt. Dies erlaubt eine effiziente Energieübertragung von den durch Licht angeregten Carotinoiden auf Chlorophyll a. In höheren Pflanzen ist das Photosystem I ein Monomer statt ein 'Irimer wie bei den Cyanobakterien. Trotzdem zeigt die Röntgenstruktur des PSI aus Erbsen, dass die Positionen und Ausrichtungen der Chlorophylle in den PSI beider

Abb. 19.22

Röntgenstruktur von Ferredoxin

aus Peptococcus aerogenes. Dieses monomere Protein aus 54 Aminosäuren

enthält zwei [4Fe-4S]-Cluster. Die C,-Atome der vier Cys-Reste, die jeden Cluster koordinieren, sind grün, die Fe-Atome orange und die S-Atome gelb. [Nach einer Röntgenstruktur von Elinor Adman, Larry Sieker und Lyle Jensen, University of Washington. PDBid IFDX.] 6% siehe Interactive Exercises.

712

_ Photosynthese

Organismen nahezu identisch sind. Dies ist eine bemerkenswerte Entdeckung, wenn man bedenkt, dass sich die Chloroplasten vor über einer Milliarde Jahre von ihren Cyanobakterienvorfahren wegentwickelt haben. Das PSI aus Erbsen besitzt allerdings vier Antennenproteine, die im PSI der Cyanobakterien noch nicht vorkommen. Diese sind als ein sichelförmiger Transmembrangürtel um eine Seite seines Reaktionszentrums angeordnet und binden gemeinsam 56 Chlorophylimoleküle. : PSI-aktivierte Elektronen können NADP* reduzieren oder die Bildung eines Protonengradienten anregen

Abb. 19.23 Röntgenstruktur der FerredoxinNADP'-Reduktase (FNR) aus der Erbse, im Komplex mit FAD und NADP*. Dieses aus 308 Aminosäuren aufgebaute Protein

hat zwei Domänen: Die N-terminale Domäne (gold), die die FAD-Bindungsstelle bildet, faltet sich zu einem antiparallelen ßB-Fass. Dagegen bildet die C-terminale Domäne (magentarot) eine dinucleotidbindende Proteinstruktur aus (Abschnitt 6.2C) und enthält eine NADP*-Bindungsstelle. FAD und NADP* sind als Stabmodell dargestellt, wobei der Kohlenstoff von NADP* grün, der von FAD türkis,

N blau, © rot und P gelb ist. Der Flavin- und der Nicotinamidring liegen sich gegenüber, wobei C4 des Nicotinamidrings und C5 des Flavinrings

Elektronen, die von F, im PSI abgegeben werden, können einen von zwei möglichen Wegen einschlagen (Abb. 19.12): 1. Die meisten Elektronen folgen einem nichtcyclischen Weg, indem sie ein aus rund 100 Aminosäuren bestehendes [2Fe-2S]-haltiges Protein namens lösliches Ferredoxin (Fd) reduzieren, das im Stroma angesiedelt ist. Das reduzierte Fd reduziert wiederum NADP* in einer Reaktion, die von einer monomeren, aus etwa 310 Aminosäuren aufgebauten FAD-haltigen FerredoxinNADP*-Reduktase (FNR, Abb. 19.23) vermittelt wird. Dabei entsteht das Endprodukt der Lichtreaktionen im Chloroplasten: NADPH. Zwei reduzierte Fd-Moleküle liefern nacheinander jeweils ein Elektron an FAD der FNR, dieses nimmt dadurch stufenweise den neutralen Semichinon- und dann den voll reduzierten Zustand an, bevor es zwei Elektronen und ein Proton auf das NADP* überträgt. Formal ist dies ein Hydrid-Ionentransfer. 2. Einige Elektronen kehren vom PSI über Cytochrom b, in den Plastochinonpool zurück, wobei sie einen cyclischen Weg durchlaufen, der Protonen durch die Thylakoidmembran transloziert. Man hat folgenden Mechanismus für diesen Vorgang vorgeschlagen: Fd überträgt ein Elektron anstatt auf FNR auf Häm x von Cytochrom b, (Abb. 19.18). Da Häm x mit Häm b, an der Peripherie der Q;-Bindungsstelle von Cytochrom b,f in Kontakt kommt,

0,3 nm entfernt sind — eine Anordnung, die mit

würde man erwarten, dass ein Elektron, das von Häm x abgegeben wird, mit-

der direkten Hydridübertragung im Einklang steht, wie sie auch in der Dihydrolipoyl-Dehydrogenase vorkommt (Abb. 17.8). [Nach einer Röntgenstruktur von Andrew Karplus, Cornell University. PDBid 1QFY.] 6% siehe Interactive Exercises.

hilfe eines Q-Cyclus-artigen Mechanismus Plastochinon reduziert (Abb. 19.15). Man hat festgestellt, dass der cyclische Weg unabhängig von der Tätigkeit des PSII ist und somit keine Sauerstoffbildung zur Folge hat. Dies trägt der Beobachtung Rechnung, dass Chloroplasten pro gebildetes O,-Molekül mehr als acht Photonen absorbieren. Der cyclische Elektronenfluss erhöht wahrscheinlich die produzierte ATP-Menge im Verhältnis zur Bildung von NADPH und ermöglicht es somit der Zelle, die Bildung dieser beiden Verbindungen entsprechend ihres Bedarfs anzupassen. Der Mechanismus, der Elektronen zwischen dem cyclischen und dem nichtcyclischen Weg verteilt, ist allerdings unbekannt. Außerdem hängt die Feineinstellung der Lichtreaktionen von der Verteilung der Photosysteme I und II auf unterschiedliche Bereiche der Thylakoidmembran ab (siehe Exkurs 19.1).

D.

Abb. 19.24 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Thylakoiden. Die CF,-„Lollis“ der ATP-Synthasen stehen von

ihrer Stromaseite ab (vgl. hierzu Abb. 18.21a). [Mit freundlicher Genehmigung von Peter Hinkle, Cornell University.]

Photophosphorylierung

Chloroplasten bilden auf ganz ähnliche Weise ATP wie Mitochondrien, d.h. indem sie den Abbau eines Protonengradienten mit der enzymatischen Synthese von ATP koppeln (Abschnitt 18.3). Diesen lichtabhängigen Prozess nennt man Photophosphorylierung. Photophosphorylierung erfordert - wie auch die oxidative Phosphorylierung - eine intakte Thylakoidmembran und kann durch Verbindungen wie 2,4-Dinitrophenol vom lichtgetriebenen Elektronentransport entkoppelt werden (Abb. 18.28). Elektronenmikroskopische Aufnahmen von der Stromaseite der Thylakoidmembran und von der Innenseite bakterieller Plasmamembranen zeigen lutscherartige Strukturen (engl.: lollipops) (Abb. 19.24). Diese haben große Ähnlich-

Die Lichtreaktion

713

Die Trennung von PSI und PSII Elektronenmikroskopische Aufnahmen teinkomplexe der Thylakoidmembran Verteilung aufweisen (siehe Abbildung 1. PSI kommt hauptsächlich in den

zeigen, dass die Proeine charakteristische unten). ungestapelten Stroma-

thylakoiden vor, wo es in Kontakt mit dem Stroma steht

und so Zugang zu NADP* hat. 2. PSII ist fast ausschließlich zwischen den dicht gestapelten Granathylakoiden zu finden, ohne direkten Kontakt mit dem Stroma. 3. Cytochrom b,f ist gleichmäßig über die Membran verteilt. Die hohe Beweglichkeit von Plastochinon und Plastocyanin, den Elektronenträgern, die Elektronen zwischen diesen Kom-

plexen transportieren, ermöglicht, dass die Photosynthese mit einer angemessenen Geschwindigkeit verläuft. Welche Funktion wird durch die räumliche Trennung von PSI und PSII erfüllt? Wären diese beiden Photosysteme in enger Nachbarschaft, hätte die höhere Anregungsenergie von PSII (P680 im Vergleich zu P700) zur Folge, dass ein großer Teil seiner absorbierten Photonen über Energietransfer an PSI weitergereicht würde. PSII würde dann als Lichtsammelkomplex von PSI arbeiten. Die räumliche Trennung der Partikel um ungefähr 10 nm verhindert, dass es dazu kommt. Weiterhin ermöglicht die physikalische Trennung von PSI und PSII es den Chloroplasten, auf Veränderungen in der Belichtung zu reagieren. Die relativen Lichtmengen, die von

den beiden Photosystemen absorbiert werden, schwanken mit der Verteilung der Lichtsammelkomplexe zwischen den gestapelten und ungestapelten Bereichen der Thylakoidmembran. Bei hoher Belichtung (in der Natur durch direktes Sonnenlicht,

das einen

hohen

Anteil

kurzwelligen,

dann nicht in der Lage, Elektronen so schnell aufzunehmen,

wie PSII sie liefert. Daher liegt Plastochinon vorwiegend in reduziertem Zustand vor. Das reduzierte Plastochinon aktiviert eine Proteinkinase, die spezifische Thr-Reste der LHC phosphoryliert. Diese wandern als Antwort darauf in den ungestapelten Bereich der Thylakoidmembran, wo sie sich an PSI anlagern. Auf diese Weise wird ein größerer Teil des einfallenden Lichts zu PSI geleitet. Bei niedriger Belichtung (in der Natur durch Schattenlicht, das einen hohen Anteil langwelligen, roten Lichts enthält) nimmt PSI Elektronen schneller auf als PSII sie liefern kann,

so

dass

Plastochinon

vorwiegend

ATP-Synthase

seine

oxidierte

Form annimmt. Die LHC werden infolge davon dephosphoryliert und wandern in den gestapelten Bereich der Thylakoidmembran, wo sie sich an PSII anlagern. Die Chloroplasten erhalten auf diese Weise durch einen lichtaktivierten Rückkopplungs-Mechanismus ein Gleichgewicht zwischen ihren beiden Photosystemen aufrecht.

PSII-Komplex ungestapelte Membranen (Stromathylakoide)

blauen

Lichts enthält) absorbiert PSII mehr Licht als PSI. PSI ist

PSI-Komplex

gestapelte Membranen

(Granathylakoide)

[Abbildung nach Anderson, J.M. und Anderson, B., Trends Biochem. Sci. 7, 291 (1982).]

Cytochrom def

Photosynthese

714

Mitokeit mit den F,-Einheiten der protonentransportierenden ATP-Synthase in die se, P-Syntha asten-AT Chloropl die ist ch chondrien (Abb. 18.21a). Tatsächli Mitoaus plex F}Fo-Kom dem st) Chloropla für (C wird CF,CFo-Komplex genannt chondrien erstaunlich ähnlich. Zum Beispiel sind: 1. sowohl die Fo- als auch die CFo-Einheit hydrophobe Transmembranproteine, die einen protonentransportierenden Kanal enthalten, 2. sowohl die F}- als auch die CF,-Einheit hydrophile periphere Membranproteine — aufgebaut aus den Untereinheiten

a,ßzyösg, von denen ß eine

reversible ATPase ist, 3. beide ATP-Synthasen durch Oligomycin und durch Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) hemmbar.

Offensichtlich muss sich die protonentransportierende ATP-Synthase sehr früh in der Geschichte des zellulären Lebens entwickelt haben. Es ist jedoch anzumerken, dass die Chloroplasten-ATP-Synthase Protonen aus dem Thylakoidraum in das Stroma bringt (Abb. 19.11), während die ATP-Synthase in den Mitochondrien Protonen aus dem Intermembranraum in den Matrixraum leitet (Abb. 18.20). Dies ist dadurch begründet, dass das Stroma topologisch der mitochondrialen Matrix entspricht. Photosynthese mit nicht cyclischem Elektronentransport erzeugt ungefähr 1 ATP je absorbiertes Photon

Bei sättigenden Lichtintensitäten bauen Chloroplasten über die folgenden Prozesse einen Protonengradienten von etwa 3,5 pH-Einheiten über ihrer Thylakoidmembran auf: 1. Die Entstehung eines Moleküls O, aus zwei H,O-Molekülen setzt vier Proto-

nen in das Thylakoidlumen frei. 2. Der Transport der freigesetzten vier Elektronen durch den Cytochrom-b,f Komplex geht mit dem Ausschleusen von acht Protonen aus dem Stroma in das Thylakoidlumen einher.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 Il. Wie geben Moleküle absorbierte

Lichtenergie wieder ab? .

Erklären Sie warum der Elektro-

nentransport in photosynthetisch aktiven Purpurbakterien einem Kreislauf folgt. . Beschreiben Sie die Auswirkung der Photooxidation auf die Redoxreaktionen, die im Z-Schema zusammengefasst sind. Welche Bedeutung besitzt die Wasser-spaltende Reaktion für die Photosynthese? . Was sind die Auswirkungen von cyclischem und nicht cyclischem Elektonentransport in PSI? Vergleichen Sie die Photophosphorylierung mit der oxidativen Phosphorylierung.

Bei nicht cyclischem Elektronentransport werden je erzeugtes Molekül O, insgesamt etwa zwölf Protonen in das Lumen transloziert. Die Thylakoidmembran ist im Gegensatz zur inneren Mitochondrienmembran durchlässig für Ionen wie Mg’* und CI’. Der Transport von Protonen und Elektronen durch die Thylakoidmembran ist demnach von der Translokation dieser Ionen begleitet, um elektrische Neutralität aufrechtzuerhalten (Mg?* heraus, CI’ herein). Dieses baut aber das Membranpotential AW ab. Der elektrochemische Gradient in Chloroplasten wird deshalb nahezu vollständig durch den pH- (Konzentrations-) Gradienten bestimmt. Die Chloroplasten-ATP-Synthase erzeugt den meisten Schätzungen nach ein ATP für jeweils drei Protonen, die sie vom Thylakoidlumen in das Stroma trans-

portiert. Nicht cyclischer Elektronentransport bringt in Chloroplasten deshalb etwa 12/3 = 4 Moleküle ATP je gebildetes O, hervor (cyclischer Elektronentransport erzeugt mehr ATP, weil über den Q-Cyclus, der in Cytochrom b,f abläuft, mehr Protonen in das Thylakoidlumen gebracht werden). Nicht cyclischer Elektronentransport bildet natürlich auch NADPH (2 NADPH bei vier Elektronen, die das OEC aus 2 H,O freisetzt). Jedes NADPH besitzt die Freie Enthalpie zur Bildung von 2,5 ATP (Abschnitt 18.3C), was insgesamt 5 weiteren ATP-Äquivalenten je gebildetes O, entspricht. Folglich werden 9 ATP für jedes gebildete O, erzeugt. Mindestens zwei Photonen werden für jedes Elektron benötigt, welches das System von H,O zu NADPH durchläuft, d.h. acht Photonen je gebildetes O,. Dieses wurde durch experimentelle Messungen bestätigt, die darauf hinweisen, dass Pflanzen und Algen 8 bis 10 Photonen sichtbaren Lichts benötigen, um ein Molekül O, zu erzeugen. Somit ist die Gesamtausbeute der Lichtreaktionen 9 ATP/8-10 Photonen oder ungefähr ein ATP je absorbiertes Photon.

Die Dunkelreaktion

3

715

Die Dunkelreaktion

Im vorangegangenen Abschnitt wurde beschrieben, wie Pflanzen Lichtenergie für die Bildung von ATP und NADPH nutzbar machen. In diesem Abschnitt wird betrachtet, wie diese Produkte verwendet werden, um aus CO, Kohlenhydrate und andere Verbindungen zu synthetisieren.

A.

Der Calvin-Cyclus

Der Stoffwechselweg, durch den Pflanzen CO, in Kohlenhydrate einbauen, wurde zwischen 1946 und 1953 durch Melvin Calvin, James Bassham und Andrew Benson aufgeklärt. Dazu verfolgten sie in Kulturen von Algenzellen den Verbleib der radioaktiven Markierung von '*CO, im Stoffwechsel. Einige der frühsten Versuche von Calvin wiesen darauf hin, dass Algen, die für eine Minute oder länger '*CO, ausgesetzt wurden, eine komplexe Mischung markierter Metabolite, darunter Zucker und Aminosäuren synthetisieren. Wurden die Algen jedoch innerhalb von 5 s, in denen sie '*CO, ausgesetzt waren, analysiert, zeigte sich, dass die erste stabile radioaktive Verbindung 3-Phosphoglycerat (3PG) ist, das zunächst nur an seiner Carboxylgruppe markiert ist. Dieses Ergebnis ließ sofort vermuten, dass 3PG durch die Carboxylierung einer C,-Verbindung gebildet wurde. Jedoch wurde keine solche Vorstufe gefunden. Tatsächlich ist an der Carboxylierung die Pentose Ribulose-5-phosphat (Ru5P) beteiligt.

CH,OH

C=0

H—C—OH H-C-OH CH,OPOF Ribulose-5-phosphat (Ru5P)

Das entstehende C,-Produkt spaltet sich in zwei C;-Verbindungen, von denen sich herausstellte, dass sie beide 3PG sind. ATP und NADPH, die Produkte der Lichtreaktionen, werden benötigt, um 3PG in Glycerinaldehyd-3-Phosphat umzuwandeln, das wiederum zur Synthese von Kohlenhydraten und zur Neubildung von Ru5P (Abb. 19.25) eingesetzt wird. Der gesamte Stoffwechselweg, der die Carboxylierung einer Pentose, die Bildung von Kohlenhydratprodukten und die Regenerierung der Pentose beinhaltet, wird Calvin-Cyclus oder reduktiver Pentosephosphatcyclus genannt. Während der Suche nach dem Substrat der Carboxylierung wurden mehrere andere Zwischenprodukte der Photosynthese identifiziert und deren Markierungsmuster aufgeklärt. Zum Beispiel wird die Hexose Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) zunächst nur an ihren C3- und C4-Stellen markiert, aber später in geringerem Ausmaß noch an ihren anderen Kohlenstoffatomen. Die Betrachtung des Flusses markierter Kohlenstoffatome durch die verschiedenen Tetrose-, Pentose-, Hexose- und Heptosephosphate führte zur Ableitung des Calvin-Cyclus, wie er in Abbildung 19.26 wiedergegeben ist. Dies war ein Meilenstein in der Stoffwechselbiochemie. Die Gültigkeit vieler der von ihm postulierten Reaktionen wurde schließlich unter Verwendung gereinigter Enzyme in in-vitro-Untersuchungen bestätigt.

[co;]

Calvin Cyclus

Abb. 19.25 Überblick über die Dunkelreaktionen. Die Produkte der Lichtreaktionen ATP und NADPH werden zur Umwandlung von CO, in Kohlenhydrate eingesetzt, in einem Prozess, den man Calvin-

Cyclus nennt.

716

_ Photosynthese

CH,OPOS

N ATP

ADP

phosphatKinase

=0H

\ 2

| H= n—OH

Ribulose-

CH.OPO? 2

3

Ribulose-

NADPH _OPO;

00;

CO,

|

HC

Ribulose-

HO—C—H

e=o®

—OH. Br o-

Phospho-

bisphos--

H- en OH

phat-

Carboxylase

_ giycerat-

CH,0PO3

1,5-bis-

3-Phospho-

phosphat

glycerat

(RuBP)

(3PG)

2-

CH,OPOF

Kinase

:

1,3-Bisphospho-

NADP*+P, 4

—OH Giycerinaldehyd- Hr 0-

3-phosphat-

br„oPOS

Dehydrogenase

Glycerinaldehyd-

glycerat

3-phosphat

(GAP)

(BPG)

Triosephosphat5 || Isomerase

on

So

C=o

E=0

|

|

H-C--OH

BH=0C-0H

H

H

| EEE s

OH

CH30PO;

| I

(Ru5P i )

SET

Produkte u

iS CH,0OH

OH

2

Ribulose-5phosphat

DD

a 2

0

CHO

Dihydroxyaceton-

CH,OPO;

|

phosphat

Ribulose-5phosphat

A

(DHAP) 6

Ru5P (Ru5P)

| H— 5— OH

Aldolase

CH,OPO; = 2=

Erythrose-4-

a

phosphat (E4P)

Ssar HO — n= H

Ribose-

13|

phosphat-

Pentosephosphat-

12||

g \ Aldolase

HH 0-OH

CH,OPOS

a

.—=0O

Epimerase

|

Isomerase

0-OH

CH,OPO3"

Hr @-0H

bisphosphat (FBP)

| Ei 2— OH

7 OH

s

|

Bisphosphatase

Fi E= 0H

OH

CH,OPO3"

P;

Sedoheptulose-1,7bisphosphat (SBP) Sedoheptulose- |ıg Bisphosphatase P,

CH,OPO?

Ribose-5-

Xylulose-5-

phosphat

Br

CH;0PO3

H0-- CH | Hr |OH

phosphat

(R5P)

H=0--0H

Fructose-

|

H

Ho S=H

Fructose-1,6-

a Bere

Cl

HO—C-H

|

(Xu5P)

er H—C—OH |

S

H0=C-

CH,0POz;Fructose-6phosphat (F6P) 8

LH

| IT ssau HN e==0H

| H— 5—0OH

Transketolase

CH,OPO3

N

Sedoheptulose-7)

phosphat (S7P)

SS 11

Transketolase

5

Die Dunkelreaktion 4 Abb. 19.26 Der Calvin-Cyclus. Die Anzahl der Linien in einem Pfeil bezeichnet die Anzahl der Moleküle, die in diesem Schritt bei einer Runde des Cyclus reagieren. Der Cyclus lässt insgesamt drei Moleküle CO, zu einem GAP-Molekül reagieren. Zur besseren Übersichtlichkeit sind die Zucker alle in ihrer linearen Form gezeigt, obwohl die Hexosen und Heptosen vorwiegend in ihrer cyclischen Form vorliegen.

Die ''C-Markierungsmuster, die in einer Runde des Cyclus durch die Verwendung von '*CO,

entstehen, sind rot gezeigt. Es ist darauf zu achten, dass zwei der gebildeten Ru5P nur am C3 markiert sind, während das dritte Ru5P gleichmäßig am C1, C2 und C3 markiert ist.

6% siehe Animated Figures.

Der Calvin-Cyclus bildet in einem zweistufigen Prozess GAP aus CO, Der Calvin-Cyclus kann in zwei Stufen unterteilt werden: Stufe 1 Die Produktionsphase (oberste Reihe in Abb. 19.26), bei der unter Verbrauch von neun ATP und sechs NADPH drei Moleküle Ru5P mit drei Molekülen CO, zu sechs Molekülen Glycerinaldehyd-3phosphat (GAP) reagieren. Dank des cyclischen Charakters des Stoffwechselwegs entspricht der Prozess der Netto-Synthese eines GAP-Moleküls aus drei Molekülen CO,. An dieser Stelle kann pro Cyclus ein GAP für Biosynthesen entnommen werden. Stufe 2 Die Regenerierungsphase (untere Reihen in Abb. 19.26), bei der die Kohlenstoffatome der verbliebenen fünf GAP in einer außergewöhnlichen Abfolge von Reaktionen (ähnlich denen des Pentosephosphatweges; Abschnitt 15.6) umgelagert werden, um die drei Ru5P wiederherzustellen, mit denen der Cyclus begonnen wurde. Diese Phase kann vom Aufbau her in vier Reaktionsgruppen zerlegt werden (wobei die Zahlen mit den Reaktionen in Abb. 19.26 übereinstimmen): 6.6 +G—G, 8.G+G—C,+G;, 9.G+C,>CG 11.G+G—G+CG;

Die Gesamtstöchiometrie dieses Vorgangs ist daher 5 Gz —3

@s

Man beachte, dass diese Stufe des Calvin-Cyclus ohne weitere Zufuhr von Freier Enthalpie (ATP) oder von Reduktionsäquivalenten (NADPH) verläuft. Die erste Reaktion des Calvin-Cyclus ist die Phosphorylierung von Ru5P durch

die Ribulosephosphat-Kinase, welche Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) bildet. Im Anschluss an die Carboxylierung von RuBP (Reaktion 2, wird weiter unten diskutiert) wird das entstandene 3PG zuerst in 1,3-Bisphosphoglycerat (BPG) und dann in GAP überführt. Diese Abfolge ist die Umkehrung der zwei aufeinander folgenden Reaktionen der Glykolyse (Abschnitt 15.2G und 15.2F), außer dass die Reaktion im Calvin-Cyclus NADPH anstelle von NADH verwendet. Die zweite Stufe des Calvin-Cyclus beginnt mit der Rückreaktion einer verwandten Reaktion der Glykolyse, der Isomerisierung von GAP zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch die Triosephosphat-Isomerase (Abschnitt 15.2E). Daran anschließend wird DHAP auf zwei analogen Wegen weitergeleitet: Reaktionen 6-8 oder Reaktionen 9-11. Die Reaktionen 6 und 9 sind durch Aldolase katalysierte Aldolkondensationen, bei denen DHAP an einen Aldehyd gebunden wird. Reaktion 6 ist zudem die Rückreaktion einer Reaktion der Glykolyse (Abschnitt 15.2D). Reaktionen 7 und 10 sind Phosphathydrolysen, die durch die Fructose-Bisphosphatase (FBPase; Abschnitt 15.4B) bzw. Sedoheptulose-Bis-

717

718

Photosynthese

(a)

Abb. 19.27 Röntgenkristallstruktur von Rubisco im Komplex mit dem Inhibitor des Übergangszustands 2-Carboxyarabinitol-1,5-bisphosphat aus Tabak. Das L3S;-Protein besitzt D,-Symmetrie (die Symmetrie quadratischer Prismen; Abb. 6.345) (a) Oberflächendiagramm, mit seiner vierzähligen Achse zum Betrachter weisend gezeigt. (b) Diagramm entlang seiner zweizähligen Achse. Die Teile (a) und (b) sind gegeneinander um 90° um die horizontale Achse gedreht. Die langgestreckten L-Untereinheiten (cyan und grün) greifen parallel zur vierzähligen Achse ineinander, während die S-Untereinheiten (gelb und orange quadratische Tetramere bilden, die oben und unten den Komplex abdecken. 2-Carboxyarabinitol1,5-bisphosphat ist in Stabform dargestellt,-C ist grün, O rot und P orange gefärbt. (c) Bänderdiagramm einer L-Untereinheit (Blickrichtung entlang der Achse des a/ß-Fasses des Enzyms, ähnlich orientiert wie die grüne Untereinheit unten links in Teil b der Abbildung). 2-Carboxyarabinitol-1,5-bisphosphat ist an die Substratbindungsstelle an der Öffnung des a/ß-Fasses gebunden. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von David Eisenberg, UCLA. PDBid IRLC.]

phosphatase (SBPase) katalysiert werden. Die verbleibenden Reaktionen des Calvin-Cyclus werden durch Enzyme katalysiert, die auch am Pentosephosphatweg beteiligt sind (Abschnitt 14.6, dessen gleichzeitige Aufklärung äußerst hilfreiche Hinweise für den Calvin-Cyclus lieferte). In den Reaktionen 8 und 11, die beide von der Transketolase katalysiert werden, wird eine C,-Ketoeinheit (türkis unter-

legt in Abb. 19.26) von einer Ketose auf GAP übertragen. Dabei entsteht Xylulose-5-phosphat (Xu5P). Zurück bleiben die Aldosen Erythrose-4-phosphat (E4P) in Reaktion 8 und Ribose-5-phosphat (R5P) in Reaktion 11. Das in Reaktion 8 entstehende E4P fließt in Reaktion 9 ein. Die in den Reaktionen 8 und 11 entstehenden Xu5P-Moleküle werden in Reaktion 12 durch die Pentosephosphat-Epimerase in Ru5P umgewandelt. Das R5P aus Reaktion 11 wird ebenfalls in Ru5P umgewandelt — durch die Ribosephosphat-Isomerase in Reaktion 13, womit eine Runde des Calvin-Cyclus vervollständigt wird. Nur drei der elf Enzyme des Calvin-Cyclus - die Ribulosephosphat-Kinase, das Enzym der Carboxylierung Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Rubisco) und die SBPase — haben keine entsprechenden Gegenstücke in tierischen Geweben. Rubisco (RuBP-Carboxylase) katalysiert die CO,-Fixierung

Das Enzym, das die CO,-Fixierung katalysiert, Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Rubisco oder RuBP-Carboxylase), ist wohl das wichtigste Enzym der Welt, weil nahezu alles Leben auf der Erde letztlich von seiner Tätigkeit abhängt. Dieses

Die Dunkelreaktion

719

Protein macht (vermutlich als Folge seiner geringen katalytischen Effizienz, k;. = 3 5") bis zu 50% des Proteins in Blättern aus und ist damit das häufigste Protein in der Biosphäre. Rubisco höherer Pflanzen und der meisten photosynthetisch aktiven Mikroorganismen besteht aus acht großen (L) Untereinheiten (aus 477 Aminosäuren in Tabakblättern), die von der Chloroplasten-DNA kodiert werden, und acht kleinen (S) Untereinheiten (123 Aminosäuren), die von einem Gen im Zellkern codiert werden (die Rubisco einiger photosynthetisch aktiver Bakterien ist ein L,-Dimer, dessen L-Untereinheit in der Sequenz zu 28% mit dem LsS;-Enzym übereinstimmt und auch strukturell diesem ähnlich ist). Rönt-

genstrukturanalysen von Carl-Ivar Bränden und von David Eisenberg zeigten, dass das 1,S;-Enzym die Symmetrie eines quadratischen Prismas aufweist (Abb. 19.27a). Die L-Untereinheit ist aus einer ß-Faltblattdomäne und einer a/ß-Fassdomäne aufgebaut, von denen die letztere das katalytische Zentrum

des Enzyms enthält (Abb. 19.27c). Die Funktion der S-Untereinheit ist unbekannt; Versuche, die zeigen sollten, dass sie analog anderen Enzymen eine regulatorische Rolle besitzt, blieben ohne Erfolg. Der allgemein anerkannte Mechanismus der Rubisco, der im Wesentlichen von Calvin formuliert wurde, ist in Abbildung 19.28 dargestellt. Die Abstraktion eines Protons am C3 von RuBP ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion. Hierbei wird ein Endiolat gebildet, welches CO, nucleophil angreift. Die entstehende ß-Ketosäure wird sehr schnell durch H,O an ihrem C3 angegriffen, so dass ein Addukt entsteht, das in einer Reaktion ähnlich der Aldolspaltung aufspaltet und jene zwei Moleküle 3PG ergibt. Die treibende Kraft für die Gesamtreaktion, die stark exergon verläuft (AG?’' =-35,1 kJ] - mol"), wird von der Spaltung des B-Ketosäurezwischenprodukts geliefert, da daraus eine weitere resonanzstabilisierte Carboxylgruppe entsteht. Rubisco benötigt für ihre Aktivität Mg”, welches wahrscheinlich negative Ladungen stabilisiert, die während der Katalyse entstehen. Das Mg’* ist teilweise durch eine katalytisch bedeutsame Carbamatgruppe (-NH-COO’) an das Enzym gebunden, die durch die Reaktion eines nicht als Substrat dienenden CO, mit der e-Aminogruppe von Lys 201 entsteht. Diese essentielle Reaktion wird in vivo durch das Enzym Rubisco-Aktivase in einem ATP-getriebenen Vorgang katalysiert.

CH,OPO?

Enz-B:

0=C Bee

|

H-C—OH | H—C—OH

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H—C-0OH CH,OPOS

CH.OPOS

CH,OPOF

ß-Ketosäure

Endiolat

RuBP

ON H Hr

CH,OPOZ HO—C-C0,;, |

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3PG

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CH,OPO5" H0O—-C--C0,

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CH,OPO? £ | HO—C--C0, Z.—.—

5

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ISSN

HO—-C-—0

nn ©ee

CH,OPO%

Abb. 19.28 Reaktionsmechanismus der Rubisco. Die Reaktion verläuft über ein Endiolatzwischenprodukt, welches CO, nucleophil angreift und eine ß-Ketosäure bildet. Dieses Zwischenprodukt reagiert mit Wasser zu zwei Molekülen 3PG. 6% siehe Animated Figures.

Photosynthese

720

Die Produkte des Calvin-Cyclus werden in Stärke, Saccharose und Cellulose umgewandelt

B.

Die Gesamtstöchiometrie des Calvin-Cyclus lautet: 3 CO, + 9 ATP + 6 NADPH — GAP

+ 9 ADP + 8 P; + 6 NADP*

GAP ist das Primärprodukt der Photosynthese und wird für eine Vielzahl von Biosynthesewegen - innerhalb und außerhalb der Chloroplasten — verwendet. Durch weitere Enzyme des Calvin-Cyclus kann es z.B. in Fructose-6-phosphat und anschließend durch die Phosphoglucose-Isomerase und PhosphoglucoMutase (Abschnitt 16.1C) zu Glucose-1-phosphat (G1P) umgewandelt werden. G1P ist die Vorstufe der höheren Kohlenhydrate (Saccharose, Stärke), die für Pflanzen typisch sind. Das Polysaccharid a-Amylose, ein Hauptbestandteil der Stärke (Abschnitt 8.2C), wird im Chloroplastenstroma zur vorübergehenden Speicherung von Glucoseeinheiten synthetisiert. Als Langzeitspeicher wird dieses Molekül auch an anderen Orten in der Pflanze gebildet, z.B. in Blättern, Samen und Wurzeln. G1P wird zunächst durch seine Reaktion mit ATP aktiviert. Dabei entsteht durch die Katalyse der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase ADP-Glucose. Die Stärke-Synthase überträgt dann den Glucoserest auf ein nicht reduzierendes Ende eines a-Amylosemoleküls, wobei eine neue glykosidische Bindung entsteht (Abb. 19.29). Die Gesamtreaktion wird durch die exergone Hydrolyse von PP, angetrieben, das bei der Bildung von ADP-Glucose frei wird. Eine ähnliche Reaktionsabfolge spielt sich bei der Glykogensynthese ab, die UDP-Glucose verwendet (Abschnitt 16.2). (0)

CH,0H

(6)

— P—Zz0RZ 97 IB

' HO

O

(ee

o

3

|

e

See)

(0)

|

G1P

|

#Adenosn

e)

ATP

(OB anorganisches

ADP-Glucose-

1

Pyrophosphat

Pyrophophorylase

BE

—

ee

CH,0H

Sm: og ar

O—P—-

Abb. 19.29 Stärkesynthese. ADP-Glucose wird in einer Phosphoanhydridaustauschreaktion aus GIP und ATP gebildet (1). Das Produkt PP; wird rasch hydrolysiert. ADP-Glucose ist das Substrat für die Stärke-Synthase (2), die den Glucoserest an ein vorhandenes Polysaccharid heftet und dabei ADP freisetzt.

Adenosin

Ss ADP - Glucose

CH,OH

Stärke-Synthase HO >

CH,OH

+

HO

HO HO

ADP

OH

Ohren

a-Amylose (n Reste)

CH,0H

r es HO

a-Amylose (n + 1 Reste)

OH

Die Dunkelreaktion

Saccharose - ein Disaccharid aus Glucose und Fructose (Abschnitt 8.2A) - ist der wichtigste Transportzucker, um Kohlenhydrate zu Zellen zu transportieren, die keine Photosynthese treiben. Es ist somit das wichtigste Photosyntheseprodukt der grünen Blätter. Da Saccharose im Cytosol gebildet wird, muss entweder Glycerinaldehyd-3-phosphat oder Dihydroxyacetonphosphat aus dem Chloroplasten ins Cytosol transportiert werden. Dies geschieht durch einen Antiporter, der Phosphat gegen ein Triosephosphat austauscht. Zwei Triosen verbinden sich zu Fructose-6-phosphat (F6P) und nachfolgend entsteht Glucose-1-phosphat (G1P), das dann durch UTP aktiviert wird und als UDP-Glucose vorliegt. Als nächstes wird in einer von der Saccharosephosphat-Synthase katalysierten Reaktion Saccharose-6-phosphat gebildet. Schließlich wird Saccharose-6-phosphat durch die Saccharosephosphat-Phosphatase hydrolysiert, sodass Saccharose entsteht, die dann zu anderen Pflanzengeweben transportiert werden kann. Cellulose besteht aus langen Ketten ß(1—4)-verknüpfter Glucoseeinheiten. Sie ist das wichtigste Polysaccharid der Pflanzen und wird aus UDP-Glucose synthetisiert, wie Saccharose oder Glykogen im tierischen Organismus. Die Zellwände der Pflanzenzellen bestehen aus nahezu kristallinen Kabeln von circa 36 Celluloseketten, die in eine amorphe Matrix aus anderen Polysacchariden und Lignin eingebettet sind (Abschnitt 8.2B). Im Gegensatz zur Stärke in Pflanzen oder Glykogen bei Säugetieren wird die Cellulose durch Enzymkomplexe aus vielen Untereinheiten in der pflanzlichen Plasmamembran synthetisiert und in den extrazellulären Raum ausgestoßen.

€.

Kontrolle des Calvin-Cyclus

Bei Tage erfüllen Pflanzen ihre Energiebedürfnisse durch die Licht- und Dunkelreaktionen der Photosynthese. Bei Nacht müssen sie jedoch wie andere Organismen auch ihre Nahrungsreserven verwenden, um ATP und NADPH durch Glykolyse, oxidative Phosphorylierung und den Pentosephosphatweg zu erzeugen. Das Stroma enthält die Enzyme der Glykolyse und des Pentosephosphatweges, aber auch die des Calvin-Cyclus. Deshalb müssen Pflanzen über einen lichtempfindlichen Kontrollmechanismus verfügen, der verhindert, dass der Calvin-Cyclus dieses katabolisch gebildete ATP und NADPH in einem verschwenderischen, unnützen Kreislauf verbraucht. Wie wir gesehen haben, wird der Ablauf eines Stoffwechselweges an enzymatischen Schritten kontrolliert, die weit vom Gleichgewicht entfernt liegen (stark negative AG-Werte). Tabelle 19.1 zeigt, dass die drei geeignetsten Stellen für die Kontrolle des Ablaufs des Calvin-Cyclus die Reaktionen sind, die von der Rubisco, FBPase und SBPase (Reaktionen 2, 7 und 10 in Abb. 19.26) katalysiert werden. Tatsächlich verändert sich die katalytische Aktivität dieser drei Enzyme in vivo mit der Belichtungsstärke. Die Aktivität der Rubisco wird von drei lichtabhängigen Faktoren beeinflusst: 1. pH-Wert: Bei Belichtung steigt der pH-Wert im Stroma von etwa 7,0 auf etwa 8,0, weil Protonen vom Stroma in das Thylakoidlumen gebracht werden. Rubisco hat ein enges pH-Optimum nahe pH 8,0. 2. [Mg?”']: Man erinnere sich, dass der lichtinduzierte Einstrom von Protonen in das Thylakoidlumen mit dem Ausstrom von Mg’”* in das Stroma einhergeht (Abschnitt 19.2D). Dieses Mg” stimuliert die Rubisco. 3. Dem Analogon des Übergangszustands 2-Carboxyarabinitol-1-phosphat

(CA1P):

UDP-Glucose

+ F6P

SaccharosephosphatSynthase

UDP

Saccharose-6-phosphat H,O p.

SaccharosephosphatPhosphatase

ı

Saccharose

721

722

Photosynthese die Tab. 19.1 Änderungen der Standard- und der physiologischen Freien Enthalpie für Reaktionen des Calvin-Cyclus. i Schritt”

Enzym

1G2 dor di

AG er "mot

1

Ribulosephosphat-Kinase

—21,8

-15,9

2

Ribulosebisphosphat-Carboxylase

-351

3+4

_ Phosphoglycerat-Kinase + Glycerinaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase

»

41,0

+18,0

6,7

-7,5

0,8

5

Triosephosphat-Isomerase

6

Aldolase

-21,8

-1,7

7

Fructose-Bisphosphatase

-14,2

-27,2

8

Transketolase

+6,3

3,8

9

Aldolase

—23,4

0,8

10

Sedoheptulose-Bisphosphatase

14,2

29,7

11

Transketolase

+0,4

-5,9

12

Pentosephosphat-Epimerase

+0,8

0,4

13

Ribosephosphat-Isomerase

+2,1

0,4

* bzgl. Abb. 19.26. Quelle: Bassam, J.A.und Buchanan, B.B., in Govindjee (Hrsg.), Photosynthesis, Bd. II, S. 155, Academic Press (1982). CELOPOS: HO—-C—-C0O, 15 TOH Hz ‘==OH CH,0H 2-Carboxyarabinitol1-phosphat

(CA1P)

Viele Pflanzen synthetisieren diese Verbindung, die die Rubisco hemmt, nur im Dunkeln. Rubisco-Aktivase unterstützt nicht nur die Freisetzung dieses fest bindenden CAI1P von der Rubisco, sondern katalysiert auch die Carbamoylierung des Enzyms (Abschnitt 19.3A). FBPase und SBPase werden ebenfalls durch einen höheren pH-Wert und höhere [Mg?*] aktiviert sowie zusätzlich durch NADPH. Die Wirkung dieser Faktoren wird durch ein zweites Regulierungssystem vervollständigt, das auf das Redoxpotential im Stroma anspricht. Thioredoxin, ein Protein mit ungefähr 105 Aminosäureresten, das in vielen Zelltypen vorkommt, enthält eine Cystein-Disulfidgruppe, die reversibel reduziert werden kann. Reduziertes Thioredoxin aktiviert sowohl FBPase als auch SBPase durch eine Reaktion, bei der Disulfidbrücken ausgetauscht werden (Abb. 19.30). Der Redoxzustand von Thioredoxin wird durch ein zweites disulfidenthaltendes Enzym, Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase aufrechterhalten, welche direkt auf den Redoxzustand des löslichen Ferredoxins im Stroma reagiert. Dieser wiederum verändert sich mit der Belichtungsstärke. Das Thioredoxinsystem deaktiviert außerdem die Phosphofructokinase (PFK), das wichtigste den Ablauf der Glykolyse steuernde Enzym (Abschnitt

Die Dunkelreaktion

15.4A). Somit regt Licht in Pflanzen den Calvin-Cyclus an, deaktiviert aber die Glykolyse, während Dunkelheit die entgegengesetzte Wirkung hat (d.h. die sog. Dunkelreaktion läuft im Dunkeln gar nicht ab).

D.

723

BSl hv 63

Photorespiration |

Es war seit den 1960er Jahren bekannt, dass belichtete Pflanzen O, verbrauchen und CO, durch einen Weg bilden, der von der oxidativen Phosphorylierung verschieden ist. Tatsächlich kann bei niedrigem CO,- und hohem O,-Angebot diese Photore-

Fd

Fd sed

spiration die CO,-Fixierung der Photosynthese übertreffen. Die Grundlage der Photorespiration war allerdings unerwartet: O, konkurriert mit CO, als Substrat der Rubisco (die zusätzliche Oxygenasefunktion der RuBP-Carboxylase führte zu der Namensgebung RuBP-Carboxylase-Oxygenase oder Rubisco). Bei der Oxyge-

nierung reagiert O, mit dem anderen Substrat des Enzyms, RuBP, und bildet 3PG und 2-Phosphoglykolat (Abb. 19.31). 2-Phosphoglykolat wird durch die Glykolat-Phosphatase zu Glykolat hydrolysiert und, wie unten beschrieben, in einer Serie enzymatischer Reaktionen teilweise zu CO, oxidiert. Diese Reaktionen laufen in den Peroxisomen und in den Mitochondrien ab. Somit ist Photorespiration ein scheinbar verschwenderischer Vorgang, der einen Teil der Arbeit der Photosynthese wieder zunichte macht. In diesem Abschnitt wird die biochemische Grundlage der Photorespiration beschrieben und wie einige Pflanzen deren schädliche Auswirkungen umgehen. Photorespiration verbraucht ATP und NADPH Der Weg der Photorespiration ist in Abbildung 19.32 dargestellt. Glykolat wird aus den Chloroplasten in die Peroxisomen gebracht (auch Glyoxysomen ge-

nannt; Abschnitt 17.5C), wo es durch die Glykolat-Oxidase zu Glyoxylat und H;0, oxidiert wird. Das H,O, -— ein potentiell gefährliches Oxidationsmittel — wird durch das Häm-enthaltende Enzym Katalase in Wasser und O, umgewandelt (Abschnitt 18.4B). Das Glyoxylat kann in einer Transaminierung in Glycin überführt (wie in Abschnitt 21.2A beschrieben) und in die Mitochondrien exportiert werden. Dort werden zwei Moleküle Glycin in ein Serinmolekül und ein

Molekül CO, umgewandelt. Das ist der Ursprung des CO,, das bei der Photorespiration gebildet wird. Das Serin wird zurück in die Peroxisomen transportiert, wo es in einer Transaminierung in Hydroxypyruvat überführt wird. Diese Verbindung wird zu Glycerat reduziert und im Cytosol zu 3PG phosphoryliert, was wieder in

CH,OPOF \\

0-6

(N Enz-B:

5

el

H-CC—oH

——

H—C—OH CH,OPO%

RuBP

ea

o

Reduktase

Ferredoxin— Thioredoxin-

/,.4

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SH SH a

Thioredoxin

s—s

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(Bisphosphatase) „iv

Abb. 19.30

/o,

N

j

I 8—8

se SH SH

Reduktase

(Bisphosphatase) „aktiv

WM s—8 Mechanismus der Lichtaktivierung

von FBPase und SBPase. Photoaktiviertes PSI reduziert lösliches Ferredoxin

(Fd), welches die Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase reduziert, welche wiederum die Disulfidbrücke von Thioredoxin reduziert. Reduziertes Thioredoxin aktiviert durch Disulfidbrückenaustausch mit den

inaktiven Enzymen die Bisphosphatasen des Calvin-Cyclus, die den Ablauf des Cyclus kontrollieren.

CH,OPO3 HO—C—0—OH EN c=0 H—C—OH CH,OPO2

CH,OPOF

|

Ferredoxin— Thioredoxin-

|

C-0—H H—C—OH CH,OPO2 |

vom

OL a

Endiolat

Hr

CH,OPOF | C

oo 2-Phosphoglykolat

20:0 0 | u a

CH,OPO? 3PG

H,O

N

CH,OPOF

HO—C-—-0--OH I a

H—0—OH CH,OPO?

Abb. 19.31 Mutmaßlicher Mechanismus der Oxygenierung, den die RuBP-CarboxylaseOxygenase (Rubisco) katalysiert.

Man beachte die Ähnlichkeit dieses Mechanismus mit dem der Carboxylierung, welche von demselben Enzym katalysiert wird (Abb. 19.28).

724

_ Photosynthese

Abb. 19.32 Photorespiration. Dieser Weg setzt das Phosphoglykolat um, das bei der Oxidation von RuBP entsteht, welche von der

Rubisco katalysiert wird. Die Reaktionen verlaufen (wie gekennzeichnet) in den Chloroplasten, den Peroxisomen, den Mitochondrien und dem Cytosol ab. Man beachte, dass zwei Moleküle Glycin für die Bildung von Serin und CO, notwendig sind.

Glycerat-Kinase

ATP

Cytosol

00 H—C—OH h

Oel

CH,0H

N

Glycerat

Glykolat| Oxidase

Hs03

TE

a

30,+H,0 '

CHO Glyoxylat

Hydroxypyruvat (NH;3) Transaminierung

=

CHs—NHF

Peroxisom

-

Glyein

Mitochondrion

die Chloroplasten eintritt und im Calvin-Cyclus in RuBP umgewandelt wird. Das Ergebnis dieses komplexen Kreislaufes der Photorespiration ist, dass ein Teil des ATP und NADPH, das in den Lichtreaktionen entsteht, nutzlos vergeudet wird. Obwohl Photorespiration keine bekannte Funktion im Stoffwechsel hat, zeigen die Rubiscoenzyme aus einer weiten Vielfalt bislang untersuchter photosynthetisch aktiver Organismen alle Oxygenaseaktivität. Jedoch müsste der Evolutionsdruck über die langen Zeiten hin die Funktion dieses wichtigen Enzyms

Die Dunkelreaktion

725

optimiert haben. Photorespiration könnte daher den Selektionsvorteil verleihen, den Photosyntheseapparat vor photooxidativen Schäden zu schützen. Diese entstehen, wenn nicht genügend CO, zur Verfügung steht, um die absorbierte Lichtenergie zu verwerten. Diese Hypothese wird von der Beobachtung unterstützt, dass Chloroplasten oder Blattzellen bei starker Belichtung ihre Photosynthesekapazität schnell und irreversibel verlieren, wenn weder CO, noch O, zur Verfügung stehen. C,-Pflanzen konzentrieren CO,

An einem heißen, sonnigen Tag, wenn die Photosynthese das CO,-Angebot in den Chloroplasten erschöpft und den O,-Spiegel angehoben hat, erreicht die Photorespiration das gleiche Niveau wie die Photosynthese. Dieses Phänomen ist die bedeutendste Wachstumsbegrenzung bei vielen Pflanzen (und damit ein großes Problem für die Landwirtschaft, das man mit gentechnischen Methoden zu lösen versuchte - von denen bislang jedoch keine erfolgreich war). Allerdings besitzen bestimmte Pflanzenarten, wie Zuckerrohr, Mais und die wichtigsten Unkräuter, einen Stoffwechselkreislauf, der CO, in ihren photosynthetisch aktiven Zellen konzentriert, wodurch die Photorespiration fast völlig unterdrückt wird. Die Blätter von Pflanzen, die über diesen sogenannten C,-Cyclus verfügen, haben eine ihnen eigene Anatomie. Ihre feinen Gefäße sind konzentrisch von einer einzelnen Schicht sogenannter Leitbündelscheidenzellen umgeben, welche wiederum von einer Schicht Mesophylizellen umhüllt werden. Der C,-Cyclus (Abb. 19.33) wurde in den 1960er Jahren von Marshall Hatch und Rodger Slack aufgeklärt. Er beginnt damit, dass Mesophylizellen (welche keine Rubisco enthalten) CO, aus der Luft aufnehmen, indem sie es in Form von HCO; mit Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Oxalacetat kondensieren. Oxalacetat wird durch NADPH zu Malat reduziert, das in die Leitbündelscheidenzellen ausgeschleust wird (der Name C, steht für diese Carbonsäuren, die aus vier Kohlenstoffatomen aufgebaut sind). Dort wird Malat mit Hilfe von NADP* oxidativ decarboxyliert, wodurch CO,, Pyruvat und NADPH entstehen. Das CO,, das durch diesen Vorgang konzentriert wurde, tritt in den Calvin-Cyclus ein. Pyruvat wird in die Mesophylizellen zurücktransportiert, wo es phosphoryliert wird, um wieder PEP zu erhalten. Das Enzym, das diese Reaktion vermittelt, die Pyruvat-

co

2

Abb. 19.33 Der C,-Weg. CO, wird in den Mesophylizellen konzentriert und zu den Leitbündelscheidenzellen transportiert, wo es in den Calvin-Cyclus eintritt.

Luft

Mesophylizelle .

F

B

RR:

.

ui

Leitbündelscheidenzelle

Eee ke ev. zw Fe hireh „il E g Tee. i

Photosynthese

726

Phosphatdikinase, aktiviert ungewöhnlicherweise die Phosphatgruppe durch Hydrolyse von ATP zu AMP + PP;. Dieses PP; wird weiter hydrolysiert zu zwei P;, was dem Verbrauch eines zweiten ATP entspricht. CO, wird also in den Leitbündelscheidenzellen mit dem Aufwand von zwei ATP je CO, konzentriert. Die Photosynthese in C,-Pflanzen verbraucht daher insgesamt 5 ATP für jedes fixierte CO,, gegenüber 3 ATP, die allein durch den Calvin-Cyclus benötigt würden. C,-Pflanzen kommen vor allem in tropischen Gebieten vor, weil sie unter heißen und sonnigen Bedingungen schneller wachsen als andere, sogenannte C,-Pflanzen (so genannt, weil sie CO, zunächst in Form von C,-Carbonsäuren

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1: Erklären Sie den Zusammenhang von Licht- und Dunkelreaktion. Fassen Sie die zwei Phasen des Calvin-Cyclus zusammen. .

Beschreiben Sie, wie das im

Calvin-Cyclus produzierte GAP in Saccharose, Stärke und Cellulose umgewandelt wird. Wie können pH, Mg” und Ferredoxin eine Kontrolle des Calvin-Cyclus durch die Lichtreaktionen gewährleisten? . Wie halten Pflanzen die

Photorespiration möglichst niedrig?

fixieren). In kühleren Klimazonen, wo die Belastung durch Photorespiration geringer ist, sind C;-Pflanzen im Vorteil, weil sie weniger Energie benötigen, um CO, zu fixieren.

CAM-Pflanzen speichern CO, mittels einer Abwandlung des-C,-Cyclus

Eine Variation des C,-Cyclus, welche die Aufnahme von CO, und den CalvinCyclus zeitlich anstatt räumlich trennt, findet in vielen Sukkulenten statt, welche Wüsten besiedeln. Öffneten diese Pflanzen tagsüber ihre Spaltöffnungen (Poren in den Blättern zum Gasaustausch), um CO, aufzunehmen, wie es die meisten Pflanzen tun, würden sie durch Verdunstung Unmengen Wassers verlieren. Um diesen Verlust möglichst gering zu halten, absorbieren diese Sukkulenten nur nachts CO, und verwenden die Reaktionen des C,-Cyclus (Abb. 19.33), um es in Form von Malat zu speichern. Dieser Prozess ist unter dem Namen Säurestoffwechsel der Crassulaceae (engl.: Crassulacean acid metabolism, CAM) bekannt, weil er zuerst bei Pflanzen der Familie der Crassulaceae entdeckt wurde. Die großen Mengen PEP, die notwendig sind, um den CO,-Vorrat für einen Tag zu speichern, werden aus dem Abbau von Stärke durch die Glykolyse gewonnen. Im Laufe des Tages wird das Malat zu CO,, welches in den CalvinCyclus eintritt, und Pyruvat abgebaut, welches verwendet wird, um erneut Stärke zu bilden. Auf diese Weise sind CAM-Pflanzen in der Lage, Photosynthese mit einem minimalen Wasserverlust auszuführen.

Zusammenfassung 1. Photosynthese ist der Vorgang, bei dem Lichtenergie die Reduktion von CO, zu Kohlenhydraten treibt. In Pflanzen und Cyanobakterien oxidiert die Photosynthese Wasser zu O,. 2. In Pflanzen ist der Photosyntheseapparat aus Proteinen aufgebaut, die in die Thylakoidmembran eingebettet bzw. im Stroma der Chloroplasten gelöst sind. 3. Chlorophyll und andere lichtabsorbierende Pigmente sind in Lichtsammelkomplexen organisiert, die Lichtenergie zu den Photosynthese-Reaktionszentren leiten. 4. Das Photosynthese-Reaktionszentrum von Purpurbakterien (PbRC) wird photooxidiert, wenn es ein Photon absorbiert. Das angeregte Elektron wandert durch eine Reihe von Elektronenüberträgern, bevor es Ubichinon reduziert. Das reduzierte Ubichinon wird von Cytochrom bc, erneut oxidiert, das bei dem Vorgang über einen Q-Cyclus vier Protonen vom Cytosol zum periplasmatischen Raum verschiebt. Das Elektron wird dann über eine Elektronentransportkette wieder zum PbRC zurückgebracht, sodass keine

Netto-Oxidation oder -Reduktion stattfindet. 5. In Pflanzen und Cyanobakterien arbeiten die Photosysteme I und II in einer Abfolge, deren Anordnung Z-Schema genannt wird. Die Oxidation von Wasser durch das Mn-haltige sauerstoffbildende Zentrum wird von der Photooxidation des PSII getrieben. 6. Die bei der Photooxidation von PSII freigesetzten Elektronen werden über Plastochinon an den Cytochrom-b; Komplex übertragen, der einen Protonen

Wichtige Begriffe

translozierenden Q-Cyclus vermittelt, während er die Elektronen an Plastocyanin weiterleitet. 7. Die Photooxidation von PSI verschiebt die von Plastocyanin erhaltenen Elektronen zu Ferredoxin und schließlich zu NADP*, unter Bildung von

8.

9.

10.

11.

NADPH. Beim cyclischen Elektronenfluss kehren die Elektronen jedoch wieder zum Cytochrom b;f zurück, ohne dass eine Photooxidation von PSII nötig wäre. Die Reaktionszentren von PbRC, PSII und PSI haben ähnliche Strukturen und Mechanismen und scheinen deshalb von einem gemeinsamen Vorfahren zu stammen. Protonen, die durch die Oxidation von Wasser freigesetzt wurden, und der Protonentransport in das Thylakoidlumen bauen einen Protonengradienten über der Membran auf, der von der Chloroplasten-ATP-Synthase abgebaut wird, um die Phosphorylierung von ADP anzutreiben. Ein ähnlicher Vorgang spielt sich bei Photosynthese treibenden Purpurbakterien ab. Die Dunkelreaktion verwendet das ATP und NADPH, welches in der Lichtreaktion gebildet wird, um damit die Synthese von Kohlenhydraten aus CO, zu betreiben. In der ersten Stufe des Calvin-Cyclus reagiert CO, mit Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP), woraus letztlich Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) entsteht. Die übrigen Reaktionen des Kreislaufs regenerieren RuBP den Akzeptor des CO,. Rubisco, das Schlüsselenzym der Dunkelreaktion, wird durch den pH-Wert, die [Mg’*] und den Inhibitor 2-Carboxyarabinitol-1-phosphat (CA1P) reguliert. Die beiden Bisphosphatasen des Calvin-Cyclus werden durch den Redoxzustand der Chloroplasten über Disulfidbrückenaustausch kontrolliert, der zum Teil von Thioredoxin vermittelt wird.

12. Photorespiration, bei der Pflanzen O, verbrauchen und CO, bilden, ver-

wendet das ATP und NADPH, das in den Lichtreaktionen gebildet wurde. C,-Pflanzen setzen diese Oxygenaseaktivität der Rubisco herab, indem sie CO, in ihren photosynthetisch aktiven Zellen konzentrieren. CAM-Pflanzen verwenden einen verwandten Mechanismus, um Wasser einzusparen.

Wichtige Begriffe Photosynthese Lichtreaktionen Dunkelreaktionen Stroma Thylakoide Granathylakoide Stromathylakoide Photosynthese-Reaktionszentrum Antennenchlorophyll

Photon LHC Hilfspigmente Planck’sches Gesetz interne Umwandlung Fluoreszenz Resonanzenergietransfer Photooxidation Spezialpaar

Z-Schema Photophosphorylierung Calvin-Cyclus Photorespiration C,-Pflanzen C,-Pflanzen CAM-Pflanzen

727

728

Photosynthese

Aufgaben IR Mit dem Begriff „rote Flut“ bezeichnet man eine sehr

starke Vermehrung einer bestimmten Algenart, die bewirkt, dass das Meerwasser deutlich rot wird. Beschreiben Sie die spektralen Eigenschaften des vorherrschenden Photosynthesepigments dieser Algen. Die Nettogleichung für die oxidative Phosphorylierung kann man folgendermaßen schreiben: 2 NADH

+ 2H* + 0, — 2 H}0 + 2 NAD*+

Formulieren Sie eine entsprechende Gleichung für die Lichtreaktionen der Photosynthese. Die drei elektronentransportierenden Komplexe der Thylakoidmembran heißen Plastocyanin-FerredoxinOxidoreduktase, Plastochinon-Plastocyanin-Oxidoreduktase und Wasser-Plastochinon-Oxidoreduktase. Wie lautet die gebräuchlichere Bezeichnung dieser Enzyme und in welcher Reihenfolge arbeiten sie? H}°O wird einer Chloroplastensuspension zugegeben, die in der Lage ist, Photosynthese zu betreiben. Wo erscheint die Markierung, wenn die Suspension dem Sonnenlicht ausgesetzt wird? (a) Berechnen Sie die Energie von einem Mol Photonen roten Lichts (A = 700 nm). (b) Wie viele Moleküle ATP könnten theoretisch aus dieser Energie synthetisiert werden? (a) Berechnen Sie &° und AG° für die Lichtreaktionen in Pflanzen, d.h. die Vier-Elektronen-Oxidation von H,O

durch NADP*. (b) Verwenden Sie die Lösung von Aufgabe 19.5, um zu berechnen, wie viel Mol Photonen roten Lichts (A = 700 nm) theoretisch benötigt würden, um diesen Vorgang zu treiben. (c) Wie viel Mol Photonen UV-Lichts (A = 220 nm) würden benötigt? Beschreiben Sie die funktionellen Gemeinsamkeiten des bakteriellen Photosynthese-Reaktionszentrums und mit dem eukaryotischen PSI. Warum ist es Chloroplasten möglich, deutlich mehr als 8-10 Photonen je gebildetes O, zu absorbieren?

I. Bei sehr starker Lichtintensität wird überschüssig absorbierte Sonnenenergie durch die Wirkung photoprotektiver Proteine in der Thylakoidmembran abgeführt. (a) Erklären Sie, warum es vorteilhaft ist, wenn diese Proteine durch den Anstieg des Protonengradienten an der Membran aktiviert werden. (b) Welcher der in Abbildung 19.6 gezeigten Mechanismen zur Ableitung von Lichtenergie würde die Photosysteme am besten vor überschüssiger Lichtenergie schützen? 10. Welche Auswirkung hätte in Chloroplasten ein Entkoppler

wie Dinitrophenol (Abb. 18.28) auf die Bildung von (a) ATP und

(b) NADPH?

IhE Beschreiben Sie die Auswirkungen eines Anstiegs des

Sauerstoffpartialdrucks auf die Dunkelreaktionen der Photosynthese. 12. Chloroplasten werden belichtet, bis das Niveau der CalvinCyclus-Zwischenprodukte ein stationäres Gleichgewicht erreicht. Das Licht wird anschließend ausgeschaltet. Wie verändert sich der Spiegel von RuBP und 3PG nach diesem Zeitpunkt? 15. Berechnen Sie den Energieaufwand für die Bildung von Stärke aus CO, durch Calvin-Cyclus und Gluconeogenese unter Verwendung des in der Photosynthese gebildeten NADPH und ATP. Vergleichen Sie diesen mit dem Energiegewinn bei Abbau und vollständiger Oxidation von Stärke durch Glykolyse und oxidative Phosphorylierung. Nehmen Sie an, dass jedes NADPH energetisch 2,5 ATP entspricht und dass Stärkebiosynthese und -abbau dem Mechanismus nach der Glykogensynthese und dem Glykogenabbau identisch sind. 14. Die Blätter einiger Wüstenpflanzen schmecken am frühen Morgen säuerlich, aber im Laufe des Tages werden sie geschmacklos und später bitter. Erklären Sie diese Beobachtung.

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729

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Lipide sind die Hauptspeicherform der Stoffwechselenergie eines Organismus. Bei Winterschlaf haltenden Säugetieren, wie bei diesem Murmeltier, werden während

der warmen Monate Fettreserven angelegt, die dann während des Winters oxidiert werden, um das Tier am Leben zu erhalten.

Jeff Foote/Bruce Coleman, Inc.]

Lipidstoffwechsel Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 27 Interactive Exercise 28 Animated Figure 20-8 Animated Figure 20-12 Animated Figure 20-23

Animated Figure 20-26 Case Study 23

Zellen enthalten eine Vielzahl verschiedener Lipide, doch sind viele dieser strukturell verschiedenen Moleküle in ihrer Funktion ähnlich. Zum Beispiel können die meisten Zellen Veränderungen in der Lipidzusammensetzung ihrer Membranen tolerieren, solange das Fließvermögen (die Fluidität) der Membranen erhalten bleibt, das größtenteils durch die in den Lipiden enthaltenen Fettsäureketten bestimmt wird (Abschnitt 9.2B). Eine noch größere Vielfalt zeigt sich im zellulären Gehalt derjenigen Lipide, die als Energiereserven gespeichert werden. Vorräte an Triacylglycerinen werden als Antwort auf die wechselnden physiologischen Bedürfnisse aufgebaut und wieder verbraucht. Der Kamelhöcker ist ein bekanntes Beispiel für einen Fettspeicher, der über Zeiträume von Tagen oder Wochen hin sowohl Energie als auch Stoffwechselwasser liefert. Weitere Organismen, deren Körperfettgehalt sehr starken Schwankungen unterliegt, sind Winterschlaf haltende Säugetiere und Zugvögel, die weite Strecken ohne Nahrungsaufnahme zurücklegen. In diesen Fällen ist der Lipidstoffwechsel bemerkenswert wegen der großen Menge an Metaboliten, welche verhältnismäßig einfache biosynthetische und abbauende Stoffwechselwege durchlaufen. In diesem Kapitel wird die zentrale Stellung der Lipide im Energiestoffwechsel dargestellt, wobei zuerst die Resorption und der Transport ihrer Fettsäurebe-

standteile und die Oxidation dieser Fettsäuren zur Energiegewinnung betrachtet werden. Der zweite Teil des Kapitels beschäftigt sich mit der Synthese von Fettsäuren und anderen Lipiden, wie Glycerophospholipiden, Sphingolipiden und Cholesterin.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Lipidstoffwechsel e Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden e Fettsäureoxidation © Ketonkörper ® Fettsäurebiosynthese ® Regulation des Fettsäurestoffwechsels e Synthese von Membranlipiden e Cholesterinstoffwechsel

732

_ Lipidstoffwechsel

Verdauung, Resorption und Transport

1

von Lipiden Triacylglycerine (auch Fette oder Triglyceride genannt) bilden etwa 90% der Lipide in der Nahrung. Sie sind die Hauptform der für den Stoffwechsel gespeicherten Energie beim Menschen. Triacylglycerine bestehen aus Glycerintriestern

von Fettsäuren, wie z.B. Palmitin- oder Ölsäure

1-Palmitoyl-2,3-dioleoylglycerin

(die Namen und Strukturformeln einiger in der Natur häufig vorkommender Fettsäuren sind in Tab. 9.1 aufgeführt). Die Mechanismen von Verdauung, Resorption und Transport der Triacylglycerine vom Darm in die Gewebe müssen der starken Hydrophobizität der Lipide angepasst sein.

A.

Verdauung und Resorption

Die Verdauung der Triacylglycerine findet an Wasser-Lipid-Grenzflächen statt, da Triacylglycerine im Gegensatz zu den wasserlöslichen Verdauungsenzymen wasserunlöslich sind. Daher ist der Umsatz bei der Verdauung von Triacylglycerinen abhängig von der Größe dieser Grenzflächen, die stark vergrößert werden durch die durchmischenden Bewegungen der Darmperistaltik in Verbindung mit Gallensäuren und deren emulgierenden Wirkung. Gallensäuren (oder Gallensalze) sind amphipathische, detergensähnliche Moleküle, welche Fetttröpfchen solubilisieren. Gallensäuren sind Cholesterinderivate, die in der Leber gebildet und als Glycin- oder Taurinkonjugate (Abb. 20.1) in die Gallenblase sekretiert werden, wo sie gespeichert werden. Die Gallenblase gibt sie in den Dünndarm ab, wo Verdauung und Resorption von Lipiden im Wesentlichen stattfinden.

R} =

Abb. 20.1

Strukturformeln der wichtigsten

OH

R} =

H

R,=OH

Cholsäure

Chenodesoxycholsäure

Gallensäuren und ihrer Glycin- und Taurin-

Ra =

Glykocholsäure

Glykochenodesoxycholsäure

konjugate,

R, = NHT-CH,

Taurocholsäure

Taurochenodesoxycholsäure

NH— CH, — COOH

CH,

—SO;H

Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden

733

Lipasen wirken an Wasser-Lipid-Grenzflächen Die Lipase der Bauchspeicheldrüse (Triacylglycerin-Lipase) katalysiert die Hydrolyse von Triacylglycerinen an deren 1- und 3-Position, wobei nacheinander 1,2Diacylglycerine und 2-Acylglycerine entstehen, sowie die Na'- und K*-Salze der abgespaltenen Fettsäuren (Seifen). Die enzymatische Aktivität der Bauchspeicheldrüsen-Lipase steigt bei Kontakt mit einer Wasser-Lipid-Grenzfläche stark an, ein Phänomen, das als Grenzflächenaktivierung bezeichnet wird. Um an Wasser-Lipid-Grenzflächen binden zu können, benötigt diese Lipase die Colipase, ein Protein von 90 Aminosäuren, das mit der Lipase einen Komplex im Verhältnis 1:1 bildet und aus Procolipase gebildet wird. Die Röntgenkristallstrukturen des Bauchspeicheldrüsen-Lipase-Colipase-Komplexes, die von Christian Cambillau gelöst wurden, zeigen die strukturelle Grundlage, auf welcher die Grenzflächenaktivierung beruht. Weiterhin erklärt die Struktur auch, wie die Colipase die Lipase darin unterstützt, an eine Wasser-Lipid-Grenzfläche zu binden

(Abb. 20.2).

Das aktive Zentrum der aus 449 Aminosäuren bestehenden Bauchspeicheldrüsen-Lipase liegt in der N-terminalen Domäne (Aminosäuren 1-336) des Enzyms und enthält eine katalytische Triade, die große Ähnlichkeit mit der Triade in Serin-Proteasen hat (Abschnitt 11.5B, zur Erinnerung: Esterhydrolyse gleicht im Mechanismus der Peptidhydrolyse). Liegt die Lipase frei von Lipidmicellen vor, wird ihr aktives Zentrum von einem „Deckel“ verschlossen, der aus einer

25 Aminosäuren langen Helix besteht. In Gegenwart von Lipidmicellen hingegen durchläuft dieser Deckel eine umfassende, strukturelle Umlagerung, die das aktive Zentrum freilegt. Gleichzeitig ändert eine Schleife von zehn Aminosäuren (ß5-Schleife genannt) ihre Konformation so, dass sie das Oxyanionloch nicht katalytischer C-Terminus >

katalytischer N-Terminus

Abb. 20.2 Mechanismus der Grenzflächenaktivierung der Triacylglycerin-Lipase. Das Enzym liegt im Komplex mit Procolipase vor (dem Vorläufer der Colipase, violett). Um an eine Phospholipidmicelle (grün) zu binden, ändert der Deckel aus 25 Aminosäuren (gelb), der das aktive Zentrum (hellbraun) des Enzyms bedeckt, seine Konformation. Dadurch werden dessen hydrophobe Reste exponiert und das aktive Zentrum freigelegt. Dies veranlasst die zehn Aminosäuren lange ß5-Schleife (braun), sich so zur Seite zu bewegen, dass sich das Oxyanionloch des Enzyms ausbildet. Die Procolipase ändert ebenfalls ihre Konformation und bildet Wasserstoffbrücken zu

Colipase Grenzflächenaktivierung

dem „offenen“ Deckel aus, wodurch sie ihn in

dieser Konformation stabilisiert. Weiterhin bildet die Colipase zusammen mit der Lipase eine ausgedehnte hydrophobe Oberfläche. [Aus Nature 362, 793 (1993). Mit freundlicher Genehmigung. een

Br

a

BRBSEN

PDBid ILPA.]

734

_ Lipidstoffwechsel

des aktiven Enzyms bildet und nahe dem Zugang zum aktiven Zentrum eine hydrophobe Oberfläche entstehen läßt. Die Colipase bindet die C-terminale Domäne (Aminosäuren 337-449) der Lipase so, dass die hydrophoben Spitzen ihrer drei Schleifenbereiche vom Komplex abstehen. Dadurch wird ein durchgehendes, hydrophobes Plateau gebildet, welches das aktive Zentrum der Lipase um mehr als 5 nm überragt und wahrscheinlich die Bindung des Komplexes an die Lipidoberfläche unterstützt. Zudem bildet die Colipase drei Wasserstoffbrücken zu dem geöffneten Deckel aus, wodurch dieser in seiner Konformation stabilisiert wird. Auch andere Lipasen wie Phospholipase A, (Abb. 9.6) katalysieren vorwiegend Reaktionen an Grenzflächen. Phospholipase A, verändert jedoch nicht ihre Konformation, vielmehr enthält das Enzym einen hydrophoben Kanal, der dem Substrat einen direkten Zugang von der Oberfläche der Phospholipidaggregate (Micellen oder Membranen) zum aktiven Zentrum des gebundenen Enzyms ermöglicht (das Enzym ist an die Oberfläche gebunden und saugt das Substrat quasi in sein aktives Zentrum hinein; Abb. 20.3). Auf diese Weise braucht das Substrat, um eine Micelle verlassen und an das Enzym binden zu können, nicht erst solvatisiert und wieder desolvatisiert zu werden. Im Gegensatz dazu müssen lösliche und in Dispersion vorliegende Phospholipide zuerst diese erheblichen kinetischen Barrieren überwinden, um an das Enzym binden zu

(a)

können. Lipidmicelle

Abb. 20.3 Bindung des Substrates an Phospholipase A;,. (a) Hypothetisches Modell der Phospholipase A, im Komplex mit einer Lysophosphatidylethano-

lamin-Micelle (im Querschnitt). Das Protein ist in türkis dargestellt, die Phospholipidkopfgruppen in gelb und deren Kohlenwasserstoffketten in blau. Die Abbildung ist eine Überlagerung einer Serie von Bildern, die aus der Berechnung der atomaren

Bewegungen dieser Anordnung gewonnen wurden. Die überlagerten Bilder geben jeweils die räumliche Position im Abstand von 5 ps wieder. [Mit freundlicher Genehmigung von Raymond Salemme, E.|. du Pont de Nemours & Company] (b) Schematische Darstellung eines Phospholipids, das Teil einer Micelle ist und in den hydrophoben Phospholipidkanal der Phospholipase A, eintritt (roter Pfeil).

Gallensäuren und das fettsäurebindende Protein ermöglichen die Resorption der Lipide im Darm Die bei der Verdauung von Lipiden freigesetzten Fettsäuren, Mono- und Diacylglycerine werden durch die den Dünndarm auskleidenden Zellen der Darm-

schleimhaut aufgenommen. Gallensäuren unterstützen nicht nur die Verdauung von Lipiden, sie sind unerlässlich für die Aufnahme der Verdauungsprodukte. Die Micellen, die mit Hilfe der Gallensäuren gebildet werden, nehmen die unpolaren Produkte des Lipidabbaus auf und ermöglichen dadurch den Transport durch die stationäre wässrige Grenzschicht an der Oberfläche der Darmwand. Die Bedeutung dieses Vorgangs zeigt sich bei Patienten mit verschlossenen Gallengängen: Sie resorbieren nur geringe Mengen der mit der Nahrung aufgenommenen Lipide, der größte Teil wird in hydrolysierter Form mit dem Stuhl wieder ausgeschieden. Gallensäuren werden ebenso für eine effektive Aufnahme der fettlöslichen Vitamine A, D, E und K benötigt. Im Inneren der Darmzellen bilden Fettsäuren Komplexe mit dem fettsäurebindenden Protein des Darms (engl.: intestinal fatty acid-binding protein, I-FABP). Dieses cytoplasmatische Protein erhöht die Löslichkeit dieser wasserunlöslichen Verbindungen und schützt darüberhinaus die Zellen vor deren detergensähnlichen Wirkungen. Die Röntgenkristallstruktur von Ratten-IFABP (ermittelt von James Sacchettini) zeigt, dass der größte Teil dieses monomeren, 131 Aminosäuren umfassenden Proteins von zehn antiparallelen P-Strängen gebildet wird, die zu zwei annähernd orthogonalen ß-Faltblättern gestapelt sind (Abb. 20.4). Ein Fettsäuremolekül füllt eine Lücke zwischen zwei der P-Stränge aus. Dabei liegt es so zwischen den ß-Faltblättern, dass es in etwa parallel zu den beiden, die Lücke bildenden ß-Strängen steht - eine Anordnung, die den Namen „B-clam“ (engl.: clam, Muschel) erhielt. Die Carboxylgruppe der Fettsäure interagiert mit Arg 106, Gln 115 und zwei gebundenen Wassermolekülen, wohingegen der Fettsäureschwanz von mehreren hydrophoben, meist aromatischen Resten umgeben ist.

Abb. 20.4

Röntgenkristallstruktur des fettsäurebindenden Proteins aus dem Darm der Ratte. Das Protein ist in den Spektralfarben dargestellt vom N-Terminus (blau) bis zu seinem C-Terminus (rot). Palmitat ist als Kalottenmodell mit C grün und’O rot dargestellt. [Nach einer Röntgenstruktur von James Sacchettini, Texas ARM University. PDBid 2IFB.]

Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden

B.

Transport von Lipiden

Die Fettsäuren, die bei der Verdauung von Lipiden entstanden sind und von der Darmschleimhaut aufgenommen wurden, werden zu anderen Geweben transportiert, um dort entweder abgebaut oder gespeichert zu werden. Da sie kaum wasserlöslich sind, werden Lipide im Komplex mit Proteinen durch die Blutbahn transportiert. Struktur von Lipoproteinen

Lipoproteine sind globuläre, micellenartige Partikel, die aus einem unpolaren Kern aus Triacylglycerinen und Cholesterinestern bestehen, umgeben von einer amphiphilen Hülle aus Proteinen, Phospholipiden und Cholesterin. Es gibt fünf Klassen von Lipoproteinen (Tab. 20.1): Darmschleimhautzellen wandeln über die Nahrung aufgenommene Fettsäuren in Triacylglycerine um und verpacken sie zusammen mit Nahrungscholesterin in Lipoproteine, die Chylomikronen genannt werden. Diese Partikel werden in die intestinale Lymphe freigesetzt und über die Lymphbahnen transportiert, bis sie schließlich in die Venen abgegeben werden. Über den Blutkreislauf werden die Chylomikronen dann durch den gesamten Körper transportiert. Andere Lipoproteine, bekannt als Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL, von engl.: very low density lipoproteins), Lipoproteine mittlerer Dichte (IDL, von engl.: intermediate density lipoproteins) und Lipoproteine geringer Dichte (LDL von engl.: low density lipoproteins), werden in der Leber synthetisiert, um endogene (im Körper produzierte) Triacylglycerine und Cholesterin aus der Leber ins Gewebe zu transportieren. Lipoproteine hoher Dichte (HDL, von engl.: high density lipoproteins) transportieren Cholesterin und andere Lipide von den Geweben zur Leber. Jedes Lipoprotein enthält so viel Protein, Phospholipid und Cholesterin, dass sich auf der Partikeloberfläche eine einlagige, etwa 2 nm dicke Schicht aus diesen Substanzen ausbilden kann (Abb. 20.5). Da die Dichte ihrer äußeren Hülle größer als die ihres Kerns ist, steigt die Dichte von Lipoproteinen mit abnehmendem Partikeldurchmesser. Infolgedessen sind die HDL als die dichtesten Lipoproteine gleichzeitig auch die kleinsten. Tab. 20.1

Eigenschaften der wichtigsten Lipoproteinklassen im menschlichen

| Chylomikronen

Blutplasma.

VLDL

IDL

LDL

HDL

Dichte (g- cm)

20,95

< 1,006

1,006-1,019

1,019-1,063

1,063-1,210

Partikeldurchmesser (nm)

75-1200

30-80

25-35

18-25

5-12

Partikelmasse (kD)

400.000

10.000-80.000

5000-10.000

2300

175-360

% Protein?

1,5-2,5

5-10

15-20

20-25

40-55

% Phospholipide*

7-9

15-20

22

15-20

20-35

% freies Cholesterin?

1-3

5-10

8

7-10

3-4

% Triacylglycerin?

84-89

50-65

22

7-10

3-5

% Cholesterinester”

3-5

10-15

30

35-40

12

wichtige Apolipoproteine

A-I, A-IIl, B-48, EISEIL, SITE

B-100, C-I, C-II, GENE

B-100, C-III, E

B-100

A-I, AIL, C-],

@ Bestandteile der Oberfläche

’ Lipide im Inneren

CIAEITIEDEE

735

736

_Lipidstoffwechsel

Abb. 20,5 Schematische Darstellung von LDL, dem wichtigsten Cholesterinträger in der Blutbahn. Dieses kugelige Partikel besteht aus rund 1500 Cholesterinestermolekülen, die von einer

amphiphilen Hülle aus etwa 800 Phospholipid-

Cholesterinester

Phospholipid Cholesterin ohne Veresterung Apolipoprotein B-100

molekülen, ca. 500 Cholesterinmolekülen und einem einzigen aus 4536 Aminosäuren

bestehenden Molekül Apolipoprotein B-100 umgeben sind.

Apolipoproteine haben amphipathische Helices, die die Oberfläche der Lipoproteine umhüllen

Die Proteinbestandteile von Lipoproteinen werden als Apolipoproteine oder einfach Apoproteine bezeichnet. Mindestens neun Apolipoproteine kommen in den menschlichen Lipoproteinen in unterschiedlichen Mengen vor (Tab. 20.1). LDL z.B. enthält Apolipoprotein B-100 (apoB-100). Dieses Protein ist ein 4536 Aminosäuren langes Monomer (und damit eines der größten monomeren Proteine, die man kennt). Es besitzt eine Hydrophobizität, die mit der von integralen Membranproteinen vergleichbar ist. Jedes LDL-Partikel enthält nur ein Molekül apoB-100, das eine ausgestreckte Form einnimmt, die mindestens die Hälfte der Partikeloberfläche bedeckt (Abb. 20.5). Anders als apoB-100 sind die meisten Apolipoproteine wasserlöslich und verbinden sich recht leicht mit Lipoproteinen. Diese Apolipoproteine haben einen hohen Anteil an Helices, der zunimmt, wenn sie in Lipoproteine eingebaut werden. Offensichtlich werden die Helices durch eine Lipidumgebung stabilisiert. Durch die Bildung von Helices wird im wasserfreien Inneren der Lipoproteine der Notwendigkeit Rechnung getragen, dass alle möglichen Wasserstoffbrücken des Peptidrückgrats ausgebildet sein müssen. Diese hypothetischen a-Helices haben ihre hydrophilen und hydrophoben Reste auf gegenüberliegenden Seiten des Helixzylinders, man bezeichnet sie als amphiphil oder amphipathisch. In den meisten anderen Apolipoproteinen kommen ähnliche amphiphile Helices vor. Die geladenen Kopfgruppen der Lipide binden wahrscheinlich an die entgegengesetzt geladenen Seitenketten auf der Helix, während die ersten Methylengruppen ihrer Fettsäurereste an den nichtpolaren Teil der Helix binden. Apolipoprotein A-I (apoA-I) kommt in Chylomikronen und HDL vor und ist ein 243 Aminosäuren langes Polypeptid von 29 kD. Es besteht im Wesentlichen aus nacheinander angeordneten, jeweils 22 Aminosäuren langen Abschnitten ähnlicher Sequenz. Die Röntgenstruktur eines abgeschnittenen Apolipoprotein A-I (dem die Reste 1-43 fehlen) enthällt, dass die Polypeptidkette eine pseudokontinuierliche a-Helix bildet, die durch Knicke an den Pro-Seitenketten, etwa alle 22 Reste, unterbrochen ist. Vier Monomere lagern sich zusammen und bilden die in Abb. 20.6a abgebildete Struktur. Die Größe und die gedrehte elliptische Form dieses Komplexes scheinen ideal zu sein, um sich um ein HDL-Teilchen zu wickeln. Abb. 20.6b enthält eine Helixradprojektion eines Teils von apoA-I und verdeutlicht die amphipatische Natur der Helix. Die Lipidbestandteile der Chylomikronen werden in den Blutkapillaren peripherer Gewebe abgetrennt

Chylomikronen bleiben im Skelettmuskel und Fettgewebe an Bindungsstellen des Endothels (der inneren Oberfläche) von Blutkapillaren haften. Der Triacylglycerinanteil der Chylomikronen wird durch das extrazelluläre Protein Lipoprotein-Lipase hydrolysiert. Die dabei freigesetzten Monoacylglycerine und

Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden

737

Abb. 20.6 Struktur von humanem Apolipoprotein A-l. (a) Die Röntgenstruktur des D,-symmetrischen Homotetramers mit seinen vier Untereinheiten,

denen ihre 43 N-terminalen Aminosäuren fehlen. Sie sind in verschiedenen Farben dargestellt. Der Komplex, der eine gedrehte ellipsoide Form besitzt, ist entlang einer seiner zweizähligen Achsen abgebildet. [Nach einer Röntgenstruktur von David Borhani, Southern Research Institute, Birmingham, Alabama und Christie Brouillette,

University of Alabama Medical Center, Birmingham. PDBid 1AV1.] (b) Eine Helixradprojektion der amphipathischen a-Helix, bestehend aus den Resten 143 bis 164 von Apolipoprotein A-I (in einer Helixraddarstellung, die Seitenketten sind entlang der Helixachse auf eine Ebene projiziert). Zu beachten ist die Verteilung der polaren und unpolaren Reste auf verschiedene Seiten der Helix, ebenso wie die Verlagerung der basischen Reste an

2

den äußeren Rand der polaren Oberfläche, wo sie

mit den anionischen Kopfgruppen von Membranunpolar

lipiden in Wechselwirkung treten können. Andere Apolipoproteinhelices zeigen ähnlich amphipathische Verteilungen. [Nach Kaiser, E.T., in Oxender, D.L. und Fox, C.F. (Hrsg.), Protein Engineering,

S. 194, Liss (1987).]

polar

1

\%

Fettsäuren werden dann von den Geweben aufgenommen. Durch die fortschreitende Hydrolyse ihrer Triacylglycerine schrumpfen die Chylomikronen bis sie nur noch aus Chylomikronrestkörpern bestehen, die mit Cholesterin angereichert sind. Diese Restkörper dissoziieren vom Kapillarendothel ab und treten wieder in die Blutbahn ein, um von der Leber aufgenommen werden zu können. Auf diese Weise transportieren Chylomikronen die Triacylglycerine aus der Nahrung in die Muskeln und das Fettgewebe und das Cholesterin der Nahrung in die Leber (Abb. 20.7, blaue Pfeile). VLDL werden schrittweise abgebaut

VLDL, die endogene Triacylglycerine und Cholesterin transportieren, werden ebenfalls durch die Lipoprotein-Lipase in den Blutkapillaren von Fettgewebe und Muskel abgebaut (Abb. 20.7, rote Pfeile). Die freigesetzten Fettsäuren werden von den Zellen aufgenommen und zur Gewinnung von Energie oxidiert oder für die Neubildung von Triacylglycerinen verwendet. Das Glycerinrückgrat der Triacylglycerine wird in die Leber oder die Niere transportiert und zu Dihydroxyacetonphosphat umgesetzt, einem Zwischenprodukt der Glykolyse. Die Oxidation dieser C3-Einheit liefert jedoch nur einen Bruchteil der Energie, die durch die Oxidation der drei Fettsäureketten von Triacylglycerin gewonnen wird. Nachdem sie ihre Triacylglycerine abgegeben haben, treten die VLDL-Restkörper, die auch einen Teil ihrer Apolipoproteine verloren haben im Blutkreislauf zuerst als IDL und dann als LDL auf. Etwa die Hälfte der VLDL werden, nach dem Abbau zu IDL und LDL, über rezeptorvermittelte Endocytose von der Leber aufgenommen.

738

Lipidstoffwechsel

Fett aus der Nahrung

endogenes Cholesterin

Leber

Gallensäure

Gallenblase

Fettgewebe

Große Lipidtröpfchen ..

cholesterinreiche Dünndarm

Chylomikronreste

Lipoprotein Lipase z

5

P\--_,

- Your

Triacylglycerin

Muskelzellen

Fettsäure

——>-

Exogener Weg

——>-

Endogener Weg

intestinale

Chylomikronen

Abb. 20.7 Modell für den Transport von Triacylglycerinen und Cholesterin im Blutplasma des Menschen.

Lymphe

Rezeptorvermittelte Endocytose von LDL

Cholesterin ist, wie in Abschnitt 9.2B besprochen wurde, ein essentieller Bestandteil tierischer Zellmembranen. Zellen können Cholesterin entweder exogen aufnehmen oder, wenn dadurch nicht genügend zu erhalten ist, selbst synthetisieren. Michael Brown und Joseph Goldstein haben gezeigt, dass Zellen exogenes Cholesterin hauptsächlich durch rezeptorvermittelte Endocytose (Aufnahme) von LDL gewinnen, ein Prozess, der folgendermaßen abläuft (Abb. 20.8): Die LDL-Partikel werden über LDL-Rezeptoren aus der Umgebung aufgenommen. Diese Rezeptoren sind Transmembranglykoproteine der Plasmamembran, die spezifisch apoB-100 binden. LDL-Rezeptoren häufen sich in Clathrin-umhüllten Vertiefungen (engl.: coated pits) an, in welchen Zelloberflächenrezeptoren gesammelt werden, die für die Endocytose bestimmt sind. Andere Zelloberflächenproteine werden hier ausgeschlossen. Die auf der cytoplasmatischen Seite mit Clathrin beschichteten umhüllten Vertiefungen stülpen sich von der Plasmamembran ein und bilden Clathrin-umhüllte Vesikel (Abschnitt 9.4E). Dann vereinigen sich die Vesikel ohne ihre Clathrinhüllen mit Endosomen, deren innerer pH-Wert bei ca. 5,0 liegt. Unter diesen Bedingungen trennen sich die LDL-Partikel von ihren Rezeptoren. Die Rezeptoren werden der Zelloberfläche wieder zugeführt, während das Endosom mit dem eingeschlosse-

Verdauung, Resorption und Transport von Lipiden

739

endoplasmatisches Reticulum

LDLRezeptoren

en

7) EI

,5?

Be

10

OO

LDL-Rezeptor-

| HMG-CoA-ReduktaseSynthese

ee

c

SEITEN

b

\ LDL-Rezeptor-Synthese

Cholesterinester-

Golgi-Apparat

Clathrin-umhüllte

q

Vesikel

Tröpfchen

Clathrin-umhüllte Vertiefungen

;

Endosom

ACAT-

Synthese

|

I

Endosom

Cholesterin

Del

(PH-5)

8

4 3

7 seines Lysosom

N

Clathrin-

KR ar B

Triskelione

Lysosom

« %, Aminosäuren

°

\\ Partikel

...

Ga

und Fettsäuren

Be

6

ApoBProtein

Wiederverwertung

der LDL-Rezeptoren Abb. 20.8 Rezeptorvermittelte Endocytose von LDL. Der LDL-Rezeptor wird am endoplasmatischen Reticulum synthetisiert (a), im Golgi-Apparat prozessiert (b) und in die Plasmamembran eingefügt (c), wo er zu einer Komponente der Clathrin-umhüllten Vertiefung wird (d). Die Apolipoprotein B-100 (apoB-100)-Komponente der LDL-Partikel bindet spezifisch an LDL-Rezeptoren auf den Clathrin-umhüllten Vertiefungen (1). Diese stülpen sich in die Zelle ein (2) und bilden umhüllte Vesikel, deren Clathrinhüllen zu Triskelionen depolymerisieren (3), die an der Zelloberfläche wiederverwertet werden. Die Vesikel verschmelzen dann mit Vesikeln, die Endosomen genannt werden (4) und in denen ein pH-Wert von ca. 5,0 herrscht. Durch die sauren Bedingungen wird LDL veranlasst, sich von den Rezeptoren zu lösen. LDL sammelt sich im vesikulären Teil des Endosoms an, während der LDLRezeptor sich in der Membran eines tubulären Bereichs des Endosoms anreichert. Dieser trennt sich von den Endosomen ab (5) und führt den LDL-Rezeptor wieder der Plasmamembran zu (6). Der vesikuläre Teil des Endosoms verschmilzt mit einem Lysosom (7), so dass ein sekundäres Lysosom entsteht. Hier werden der apoB-100-Anteil des LDL und die Cholesterinester hydrolysiert. Dies führt zur Freisetzung von Cholesterin (8), das entweder über die acyl-CoA:CholesterinAcyltransferase (ACAT) zu Cholesterinester umgesetzt wird und als Tröpfchen freigesetzt wird (9) oder wandert in das endoplasmatische Reticulum (10). Erhöhte Cholesterinkonzentration im endolasmatischen Reticulum senkt die Syntheserate von HMG-CoA-Reduktase (dem Enzym, das den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Cholesterinbiosynthese katalysiert; Abschnitt 20.7B) und LDL-Rezeptoren (Pfeile nach unten), während die Syntheserate von ACAT erhöht wird (Pfeil nach oben). [Nach Brown, M.S. und Goldstein, J.L., Curr. Top. Cell. Reg. 26, 7 (1985).] 6% siehe Animated Figures.

Ccholesterinester

740

_Lipidstoffwechsel

nen LDL mit einem Lysosom verschmilzt. Im Lysosom wird das apoB-100 des LDL proteolytisch in seine Aminosäurebestandteile zerlegt und die Cholesterinester werden hydrolysiert, sodass Cholesterin und Fettsäuren entstehen. Die rezeptorvermittelte Endocytose ist ein allgemeiner Mechanismus, bei dem Zellen

große Moleküle aufnehmen, jedes durch einen entsprechenden spezifischen Rezeptor. Viele Zelloberflächenmoleküle wandern wie der LDL-Rezeptor zwischen der Plasmamembran und dem Endosomenkompartiment hin und her, auch ohne Ligand. Der Kreislauf des LDL-Rezeptors in das Innere der Zelle und zurück an die Membran dauert etwa zehn Minuten. Neue Rezeptoren werden am endo-

plasmatischen Reticulum synthetisiert und wandern über Vesikel durch den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche (Abb. 20.8; Abschnitt 9.4E). Die intrazelluläre Konzentration von freiem Cholesterin kontrolliert die Syntheserate des LDL-Rezeptors (Abschnitt 20.7). Störungen im LDL-Rezeptorsystem führen zu ungewöhnlich hohen Cholesterinkonzentrationen im Blut, was ein erhöhtes Risiko für Herzerkrankungen zur Folge hat. HDL transportieren Cholesterin von den Geweben in die Leber

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Erläutern Sie die Funktion von Gallensäuren, Colipase und Fettsäure-bindenden Proteinen bei der Verdauung und Aufnahme von Lipiden. 2. Beschreiben Sie die Funktionen der verschiedenen Lipoproteine beim Transport von Triacylglycerin und Cholesterin.

HDL haben im Wesentlichen die entgegengesetzte Funktion von LDL: Sie führen Cholesterin von den Geweben ab. HDL werden im Blut aus Bestandteilen gebildet, die zum größten Teil aus dem Abbau anderer Lipoproteine erhalten werden. Zirkulierende HDL gewinnen ihr Cholesterin wahrscheinlich, indem sie es aus Zelloberflächenmembranen entnehmen und zu Cholesterinestern umsetzen. Cholesterin wird dann durch das HDL-assoziierte Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT), die durch apoA-I aktiviert wird, in Cholesterinester umgewandelt. HDL fungiert so als Cholesterinreiniger. Die Leber ist das einzige Organ, welches Cholesterin in nennenswerter Menge aus dem Körper eliminieren kann (durch die Umwandlung von Gallensäure; Abb. 20.1). Etwa die Hälfte des VLDL, nach Abbau zu IDL und LDL, wird durch die Leber über LDL-rezeptorvermittelter Endocytose aufgenommen (Abb. 20.7). Leberzellen nehmen HDL dagegen über einen völlig andersartigen Mechanismus auf. Anstatt in einem Vesikel umschlossen und nachfolgend abgebaut zu werden, bindet das HDL-Partikel an einen Zell-Oberflächen-Rezeptor, der SRBI (von engl.: scavenger receptor class B type I) genannt wird, und überträgt der Zelle seine Lipide. Nach Abgabe der Lipide löst sich das HDL-Partikel von der Zelle und tritt wieder in den Kreislauf ein.

2

Fettsäureoxidation

Die Triacylglycerine, die in Adipocyten (Fettzellen) gespeichert sind, werden durch die hormonsensitive Lipase (Abschnitt 20.5) mobilisiert, wenn sie im Stoffwechsel benötigt werden. Die freien Fettsäuren werden in die Blutbahn abgegeben, wo sie an Albumin binden, ein lösliches monomeres Protein von 66 kD. Ohne Albumin liegt die Löslichkeit von Fettsäuren im Blut bei ca. 10°° M - die effektive Löslichkeit von Fettsäuren im Komplex mit Albumin dagegen bei 2 mM. Trotzdem leiden die wenigen Patienten mit Analbuminämie (stark vermindertem Albumingehalt) an keinen offensichtlichen, negativen Symptomen, d.h. ihre Fettsäuren werden im Komplex mit anderen Proteinen des Serums transportiert.

Fettsäuren werden über einen oxidativen Prozess abgebaut, bei dem Freie Enthalpie erzeugt wird. Der biochemische Ablauf der Fettsäureoxidation war schon lange bekannt, ehe die Enzyme der Oxidation isoliert wurden. Bereits 1904 verwendete Franz Knoop erstmals chemische Markierungen, um Stoffwechselwege zu verfolgen. Er fütterte Hunden Fettsäuren, die an ihrem w- (endständigen) Kohlenstoffatom mit einem Benzolring markiert waren und isolierte aus ihrem Urin die phenylhaltigen Stoffwechselprodukte. Hunde, die mit markierten ungeradzahligen Fettsäuren gefüttert wurden, schieden Hippursäure aus,

Fettsäureoxidation

alt

er

| | ) A CH,—(CH,CH,),—CH,— “ ee OH ungeradzahlige Fettsäure

|

|

ANSSSBSIUNE?

) ” — e (6)

6) | C—NH—CH,—COOH

N

(n+1)Cy

(0)

Glycinrest

OH

Hippursäure

(0)

N ae s —

CH,— CH, —(CH,CH3),— CH,— a rw in + 1):C,

geradzahlige Fettsäure

rn)

Sl

Benzoesäure

pi

741

(O)- am

|

6-0,

OH

nen von C,-Einheiten abbauen.

ee

Glyeinrest

Phenylessigsäure

das Glycinamid von Benzoesäure, wohingegen solche, die mit markierten geradzahligen Fettsäuren gefüttert wurden, Phenylacetursäure ausschieden, das Glycinamid der Phenylessigsäure (Abb. 20.9). Knoop folgerte daraus, dass Fettsäuren fortschreitend durch C2-Einheiten abgebaut werden und dass dieser Vorgang die Oxidation des Kohlenstoffatoms in ß-Stellung zur Carboxylgruppe beinhaltet. Andernfalls würde die Phenylessigsäure weiter zu Benzoesäure oxidiert werden. Knoops Hypothese der ß-Oxidation wurde endgültig in den 1950er Jahren bestätigt. Der Weg der ß-Oxidation ist eine Kette enzymatisch katalysierter Reaktionen, welche die Fettsäuren fortschreitend durch das wiederholte Abtren-

—coon

ee

Phenylacetursäure

Abb. 20.9 Franz Knoops klassisches Experiment. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass Fettsäuren im Stoffwechsel an ihrem ß-Kohlenstoffatom oxidiert werden. w-phenylmarkierte Fettsäuren mit einer ungeraden Anzahl Kohlenstoffatome werden zu einem phenylmarkierten C,-Produkt — Benzoesäure — oxidiert. Dahingegen werden solche mit einer geraden Anzahl Kohlenstoffatome zu Phenylessigsäure, einem phenylmarkierten C,-Produkt oxidiert. Diese Produkte werden als ihre entsprechenden Glycinamide, Hippur- und Phenylacetursäure ausgeschieden. Die vertikalen Pfeile bezeichnen die Kohlenstoffatome, die — wie aus

diesem Versuch abgeleitet wurde - oxidiert werden.

A.

Aktivierung der Fettsäuren

Die C,-Zwischenprodukte werden zu CO, und H,O

oxidiert und wurden deshalb nicht isoliert.

Bevor Fettsäuren oxidiert werden können, müssen sie für die Reaktion durch eine ATP-abhängige Acylierung vorbereitet werden, bei der Acyl-CoA gebildet wird. Der Aktivierungsvorgang wird von einer Familie von mindestens drei Acyl-CoA-Synthetasen (auch Thiokinasen genannt) katalysiert, die sich in ihrer Kettenlängenspezifität unterscheiden. Diese Enzyme sind entweder mit dem endoplasmatischen Reticulum oder der äußeren Mitochondrienmembran verbunden und katalysieren alle die Reaktion Fettsäure

+ CoA + ATP = Acyl-CoA + AMP + PP,

Diese Reaktion verläuft über ein Zwischenprodukt, das gemischte Anhydrid Acyladenylat, das von der Sulfhydrylgruppe des CoA angegriffen wird und (0)

Abb. 20.10 Mechanismus der von Acyl-CoASynthetase katalysierten Fettsäureaktivierung. Die Bildung von Acyl-CoA verläuft über ein Zwischenprodukt, das gemischte Anhydrid Acyladenylat.

74

l

R—C

N

R—C —SCoA

(0)

Fettsäure

j oO -o | N |

o-

o Al 2 |

0-

OÖ

\ o

Yl _— O0 — Adenosin |

ce

R—C—0-—P—0-—-Adenosin

|

03 EL

Acyladenylat Pyrophos-

H,0 | phatase

Acyl-CoA

Ö

(gemischtes Anhydrid)

ang Ha

N— O0 —-Adenosin |

07 AMP

2P,ı

742

_ Lipidstoffwechsel

einen Thioester bildet (Abb. 20.10). In dieser „energiereichen“ Thioesterbindung wird die Freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse gespeichert (Abschnitt 14.2D). Das Ablaufen der Gesamtreaktion wird von der stark exergonen Hydrolyse des Pyrophosphats (von Pyrophosphatase katalysiert) getrieben.

B.

Transport durch die Mitochondrienmembran

Obwohl die Aktivierung der Fettsäuren für die Oxidation im Cytosol stattfindet, werden sie in den Mitochondrien oxidiert, wie Eugene Kennedy und Albert Lehninger 1950 herausfanden. Daher muss berücksichtigt werden, wie Fettsäure-Acyl-CoA durch die innere Mitochondrienmembran transportiert wird. Ein langkettiges Fettsäure-Acyl-CoA kann die innere Mitochondrienmembran nicht direkt durchqueren. Stattdessen wird sein Acylteil zuerst auf Carnitin übertragen, eine Verbindung, die sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Geweben vorkommt.

2

+

1

(CH3)„N — CH, —CH— CH,— COO-

+

R— C — SCoA

Carnitin

(4-Trimethylamino-3-hydroxybutyrat) | |Carnitin-Palmitoyltransferase

|

R—C—0 es

(CHz)3N —CH,—CH—CH,—C00

+

H—SCoA

Acylcarnitin

Die Gleichgewichtskonstante dieser :Umesterung liegt nahe Eins, was darauf hindeutet, dass die Freie Hydrolyseenthalpie der O-Acylbindung von Acylcarnitin etwa gleich der der Acyl-CoA-Thioesterbindung ist. Carnitin-Palmitoyltransferasen I und II, die eine Reihe verschiedener Acylgruppen übertragen können (nicht nur Palmitoylgruppen), befinden sich an der äußeren bzw. inneren Seite der inneren Mitöchondrienmembran. Der Übertragungsprozess selbst wird durch ein spezielles Carrier-Protein ausgeführt, welches Acylcarnitin in das Mitochondrion bringt und gleichzeitig freies Carnitin in der entgegengesetzten Richtung transportiert. Das Acyl-CoA-Transportsystem ist in Abbildung 20.11 schematisch dargestellt.

Cytosol

Abb. 20.11 Transport von Fettsäuren in das Mitochondrion. (1) Die Acylgruppe eines cytosolischen Acyl-CoA

o

wird auf Carnitin übertragen, wonach das CoA in

I

seinen cytosolischen CoA-Bestand entlassen wird. (2) Das entstandene Acylcarnitin wird durch das

CoA-Molekül aus dem CoA-Pool des Mitochon-

drions übertragen. (4) Das freigewordene Carnitin wird in das Cytosol zurücktransportiert.

Matrix

Carhiün

R-075C0A 1)

Carrier-Protein in die mitochondriale Matrix

transportiert. (3) Die Acylgruppe wird auf ein

innere

Mitochondrienmembran

H-SCoA

Carnitin

er ‚arnıtıln5

PalmitoylBansteraset ansı as

un

&

Carnitin-

Camitin-

Palmitoyl-

'jerproteir

ne

ransierase

: \

\, Sun

0

{

(0) R-C-SCoA

une =

II

“4:

s Carnitin

OÖ

3

H-SCoA N

Fettsäureoxidation

C.

B-Oxidation

Der Abbau von Fettsäure-Acyl-CoA in der ß-Oxidation geht in vier Schritten vor sich (Abb. 20.12): 1. Einführen einer trans-a,ß-Doppelbindung über die Dehydrierung durch das Flavoenzym Acyl-CoA-Dehydrogenase (AD). 2. Hydratisierung der Doppelbindung durch die Enoyl-CoA-Hydratase (EH), wobei 3-1-Hydroxyacyl-CoA gebildet wird. 3. NAD*-abhängige Dehydrierung dieses ß-Hydroxyacyl-CoA durch die 3-rHydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (HAD), die das entsprechende ß-KetoacylCoA bildet. 4. In einer Thiolyse wird mit Hilfe von CoA die C,-C;-Bindung gespalten. Dieser Schritt wird durch die ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase (KT; auch einfach Thiolase genannt) katalysiert, wobei Acetyl-CoA entsteht und ein neues Acyl-CoA, das um zwei C-Atome kürzer ist als die Ausgangsverbindung.

|

CH3— (CHy),— 05070 HH

SCoA

Fettsäure-Acyl-CoA ETF:Ubichinon-

Acyl- Br Dehydrpeenase\®

EIE

a

6

Oxidoreduktase,,

7

aH,

u ETF:Ubichinon-

FADa

Oxidoreduktase,.a

Elektronen-

transportkette im Mitochonon

Q

2

o

202

2 ADP +2P;

seen. Z 2— SCoA

H,0

2 ATP

H trans-A?-Enoyl-CoA

2

H,O

Abb. 20.12 Die ß-Oxidation von Fettsäure-Acyl-CoA. &Q% siehe Animated Figures.

Enoyl-CoA-Hydratase

1 CH;— (CH),— aa CH,— C — SCoA OH 3-L-Hydroxyacyl-CoA

NAD*+ 3-L-Hydroxyacyl-CoADehydrogenase

NADH

1I

+ Hr

1

CH>=(CH,, B= CH, = C—BC5A ß-Ketoacyl-CoA CoASH

4

ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase

1

I CH;—(CH2), -C—SCoA Fettsäure-Acyl-CoA (um 2 C-Atome verkürzt)

n

+

CH,— C— SCoA Acetyl-CoA

743

744

_Lipidstoffwechsel

Abb. 20.13 Bänderdarstellung des aktiven Zentrums einer Acyl-CoA-Dehydrogenase für mittlere Kettenlängen. Das Enzym (aus Schweineleber-Mitochondrien) ist ein Tetramer identischer Untereinheiten aus je 385 Aminosäuren, von denen jede ein Molekül der prosthetischen Gruppe FAD (grün) und ein Substratmolekül Octanoyl-CoA (Octanoylteil in blau, CoA-Teil in weiß) in gestreckter Konformation bindet. Octanoyl-CoA wird auf eine Weise gebunden, dass seine C,-C;-Bindung zwischen der Carboxylgruppe von Glu 376 (rot) und dem Flavinring (grün) zu liegen kommt. Dieses steht in Einklang mit der Annahme, dass das deprotonierte Glu 376 die Base ist, die bei der a,ß-Dehydrierung,

welche das Enzym katalysiert, das a-Proton abstrahiert. [Nach einer Röntgenstruktur von JungJa Kim, Medical College of Wisconsin.

PDBid

3MDE.] 6% siehe Interactive Exercises.

Die Acyl-CoA-Dehydrogenase ist mit der Elektronentransportkette verbunden Mitochondrien enthalten drei Acyl-CoA-Dehydrogenasen, die spezifisch für kurze (C,-C,), mittlere (C,-C},) und lange (Cz-C,,) Fettsäure-Acyl-CoA sind. Von der Reaktion, die von diesen Enzymen katalysiert wird, nimmt man an, dass sie mit der Abstraktion eines Protons am C,-Kohlenstoff und der Übertragung eines Hydridionäquivalents vom C;-Kohlenstoff auf FAD einhergeht (Abb. 20.12, Reaktion 1). Die Röntgenkristallstruktur einer Acyl-CoA-Dehydrogenase für mittlere Kettenlängen (MCAD von engl.: medium-chain acyl-CoA dehydrogenase) im Komplex mit Octanoyl-CoA, die von Jung-Ja Kim gelöst wurde, zeigt sehr deutlich, wie das Enzym eine basische Seitenkette (deprotoniertes Glu 376), die C,-Cg-Bindung des ‚Substrats und die prosthetische Gruppe FAD für die Reaktion ausrichtet (Abb. 20.13). In etwa 10% der Fälle von plötzlichem Kindstod (SIDS, von engl.: sudden infant death syndrome) wurde ein MCAD-Mangel festgestellt. Direkt nach einer Mahlzeit ist Glucose der Hauptbrennstoff des Stoffwechsels. Wenn später der Glucosespiegel sinkt muss die Fettsäureoxidation entsprechend steigen. Der plötzliche Kindstod bei MCAD-defizienten Säuglingen könnte durch ein Un-

gleichgewicht zwischen Glucose und Fettsäureoxidation verursacht sein. Das FADH,, das bei der Oxidation des Fettsäure-Acyl-CoA-Substrats entsteht, wird in der Elektronentransportkette im Mitochondrion durch eine Reihe von Elektronenübertragungen reoxidiert. Das elektronenübertragende Flavoprotein (ETF, von engl.: electron-transfer flavoprotein) überträgt ein Elektronenpaar von FADH,

auf das Flavo-Eisen-Schwefel-Protein

ETF:Ubichinon-Oxidoreduk-

tase. Diese überträgt anschließend durch Reduktion des Coenzyms Q (CoQ; Abb. 20.12, Reaktionen 5-8) ein Elektronenpaar auf die Elektronentransportkette im Mitochondrion. Die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser durch die Elektronentransportkette beginnt am CoQ und ermöglicht letztendlich die Synthese von 1,5 ATP für jedes Elektronenpaar, das übertragen wird (Abschnitt

18.3C).

Langkettiges Enoyl-CoA wird durch trifunktionelle Proteine aus den Mitochondrien in Acetyl-CoA und ein kürzeres Acyl-CoA umgewandelt

Die Produkte von Acyl-CoA-Dehydrogenasen sind 2-Enoyl-CoAs. In Abhängigkeit von ihrer Kettenlänge wird ihre weitere Umsetzung von einem von drei Enzymsystemen, bestehend aus 2-Enoyl-CoA Hydratase (EH), Hydroxyacyl-CoADehydrogenase (HAD) und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase (KT) bewerkstelligt (Abb. 20.12). Von diesem System gibt es drei Varianten, je eine für den Abbau kurzkettiger, mittellanger und langkettiger Fettsäurereste. Die Langketten (LC; von

Fettsäureoxidation

engl.; long chain)-Versionen dieser Enzyme sind in einem a,ß,-heterooctameren trifunktionellen Protein zusammengefasst, das in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert ist. LCEH und LCHAD sind in den a-Untereinheiten enthalten, während LCKT in den ß-Untereinheiten lokalisiert ist. Das Protein ist daher sowohl ein multifunktionelles Protein (mehr als eine Enzymaktivität auf einer einzelnen Polypeptidkette) als auch ein Multienzymkomplex (ein Komplex von Polypeptiden, der mehr als eine Reaktion katalysiert). Der Vorteil eines solchen trifunktionellen Enzyms ist die Fähigkeit, die Zwischenprodukte wie am Fließband weiterzureichen. Dies bezeichnet man auch als Weiterleiten (engl.: channeling). In der Tat wird durch dieses System kein langkettiges Hydroxyacyl-CoA oder Ketoacyl-CoA in die umgebende Lösung freigesetzt. Die Thiolasereaktion ist eine Claisen-Esterspaltung Der vierte Schritt der ß-Oxidation ist die Reaktion der Thiolase (Abb. 20.12, Reaktion 4), die Acetyl-CoA und ein neues Acyl-CoA ergibt, das um zwei Kohlenstoffatome kürzer ist, als jenes, mit dem der Cyclus begonnen wurde (Abb. 20.14): 1. Eine Thiolgruppe im aktiven Zentrum wird an die ß-Ketogruppe des Acyl-CoA-Substrates addiert. 2. Die Spaltung der C,-C;-Bindung ergibt einen Thioester zwischen dem Acyl-CoA-Carbanion und der Thiolgruppe im aktiven Zentrum, zusammen mit einem Acetyl-CoA-Carbanionzwischenprodukt. Dieses wird durch den Elektronenzug der Carbonylgruppe des Thioesters stabilisiert. Dieser Reaktionstyp ist als Claisen-Esterspaltung bekannt (die Umkehrung der Claisen-Kondensation). Das Enzym Citrat-Synthase aus dem Citratcyclus katalysiert ebenfalls eine Reaktion, die ein stabilisiertes Acetyl-CoA-Carbanionzwischenprodukt enthält (Abschnitt 17.3A). 3. Eine saure Gruppe des Enzyms protoniert das Acetyl-CoA-Carbanion, so dass Acetyl-CoA entsteht. 4.und5. Zum Schluss verdrängt CoA die Enzymthiolgruppe des Enzym-Thioester-Zwischenprodukts, woraus ein Acyl-CoA entsteht, das um zwei CAtome verkürzt ist. Die Fettsäureoxidation ist stark exergon

Die wichtigste Funktion der Fettsäureoxidation ist es, Stoffwechselenergie zu erzeugen. Jede Runde der ß-Oxidation ergibt ein NADH, ein FADH; und ein Acetyl-CoA. Die Oxidation von Acetyl-CoA im Citratcyclus bildet zusätzlich ein FADH;, und 3 NADH, die in der oxidativen Phosphorylierung reoxidiert werden, um ATP zu bilden. Die vollständige Oxidation eines Fettsäuremoleküls ist deshalb ein stark exergoner Vorgang, aus dem sich große Mengen ATP gewinnen lassen. Zum Beispiel wird Palmitoyl-CoA (welches eine C},-Fettsäure-Acylgruppe enthält) in sieben Runden der ß-Oxidation oxidiert. Dabei entstehen 7 FADH,, 7 NADH und 8 Acetyl-CoA. Die Oxidation der 8 Acetyl-CoA ergibt weiterhin 8 GTP, 24 NADH und 8 FADH;.. Da die oxidative Phosphorylierung von 31 NADH-Molekülen

77,5 ATP erzeugt und die von 15 FADH,-Molekülen 22,5

ATP, ergibt (abzüglich der zwei ATP, die für die Bildung von Fettsäure-Acyl-CoA benötigt werden; Abschnitt 20.2A) die Oxidation von einem Molekül Palmitat insgesamt 106 ATP.

D.

Oxidation ungesättigter Fettsäuren

Fast alle ungesättigten Fettsäuren biologischer Herkunft enthalten nur cis-Doppelbindungen, die meistens zwischen C9 und C10 beginnen (was einer A’oder 9-Doppelbindung entspricht, Tab. 9.1). Eventuelle weitere Doppelbindungen treten immer im Abstand von drei Kohlenstoffatomen auf und sind deshalb niemals konjugiert. Zwei Beispiele ungesättigter Fettsäuren sind Ölsäure und Linolsäure.

[6)

Ss -

[6]

>

BH+

+

745

|

R-C-CH,—-C—-SCoA ß-Ketoacyl-CoA

S—Cc=0, Bu+

0 | -CH,— C—SCoA CH,=C—-SCoA 3||>

1

H,C—C—SCoA Acetyl-CoA

Re S—- C=O B Enzym-ThioesterZwischenprodukt

nrCoAS—H

Er

ER.

+

|

R—-C—-SCoA Acyl-CoA

Abb. 20.14 Reaktionsmechanismus der ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase. Ein Cys-Rest im aktiven Zentrum ist an der Bildung eines Enzym-Thioester-Zwischenproduktes beteiligt.

746

Lipidstoffwechsel [6)

i N. 18 NINA Ja Je AI

NoH

Ölsäure (9-eis-Octadecensäure)

Linolsäure (9,12-cis-Octadecadiensäure)

Es ist zu beachten, dass sich bei Linolsäure eine Doppelbindung an einem ungeraden und die andere an einem geraden Kohlenstoffatom befindet. Die Doppelbindungen in Fettsäuren wie Linolsäure führen an zwei Stellen der B-Oxidation zu Komplikationen, die durch die Aktivität von vier zusätzlichen Enzymen gelöst werden (Abb. 20.15). Problem 1: ß,y-Doppelbindungen

Die erste enzymatische Schwierigkeit tritt nach der dritten Runde der ß-Oxidation auf: Das entstandene Enoyl-CoA, welches eine cis-ß,y-Doppelbindung enthält, ist kein Substrat der Enoyl-CoA-Hydratase. Enoyl-CoA-Isomerase überführt

die cis-A’-Doppelbindung in die trans-A’-Form. Diese A’-Verbindung ist das gewöhnliche Substrat der Enoyl-CoA-Hydratase, so dass die B-Oxidation fortgesetzt werden kann. Problem 2:A*-Doppelbindungen hemmen die Enoyl-CoA-Hydratase

Die nächste Komplikation entsteht in der fünften ß-Oxidationsrunde: Das Vorhandensein einer Doppelbindung an einem geraden Kohlenstoffatom führt zur Bildung von 2,4-Dienoyl-CoA, welches für die Enoyl-CoA-Hydratase ein sehr schlechtes Substrat ist. Hier reduziert die NADPH-abhängige 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase die A*-Doppelbindung. Die Reduktase in E. coli erzeugt trans-2-Enoyl-CoA, ein gewöhnliches Substrat der ß-Oxidation. Die Säuger-Reduktase bildet jedoch trans-3-Enoyl-CoA, welches für die weitere ß-Oxidation erst durch die 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase zu trans-2-Enoyl-CoA isomerisiert werden muss. Problem 3: Die unerwünschte Isomerisierung von 2,5-Enoyl-CoA durch die 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase

3,2-Enoyl-CoA-Isomerase aus Säugetieren katalysiert eine reversible Reaktion, die A’- und A’-Doppelbindungen umwandelt. Eine Carbonylgruppe wird durch Konjugation an eine A?’-Doppelbindung stabilisiert. Aber auch eine A°-Doppelbindung (als Resultat des Abbaus einer ungesättigten Fettsäure mit

Abb. 20.15

Oxidation ungesättigter Fettsäuren. Die B-Oxidation ungesättigter Fettsäuren wie Linolsäure führt zu drei Problemen: Das erste wird durch eine ß,y-Doppelbindung verursacht, dargestellt im linken Stoffwechselweg — es wird gelöst, indem diese in eine trans-a,ß-Doppelbindung überführt wird. Das zweite Problem im linken Stoffwechselweg, dass 2,4-Dienoyl-CoA ein sehr schlechtes Substrat für die EnoylHydratase ist, wird dadurch umgangen, dass die A*-Doppelbindung NADPH-abhängig durch die 2,4-Dienoyl-CoA-Reductase reduziert wird und das Substrat der B-Oxidation trans-2-EnoylCoA entsteht. Dieser Schritt erfordert in E. coli ein und in Säugern zwei Enzyme. Das dritte Problem, die Isomerisierung von 2,5-Dienoyl-CoA (das aus der Oxidation von ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen an ungeradzahligen C-Atomen stammt) zu 3,5-Dienoyl-CoA, wird durch Umwandeln von 3,5-Dienoyl-CoA in 2,4-Dienoyl-Co, ein Substrat der 2,4-DienoylCoA-Reduktase gelöst.

Fettsäureoxidation

Linolsäure

2 NAD* + 2 FAD + 2 CoA-SH 2 NADH + 2 FADH; + 2 Acetyl-CoA

2 Runden ß-Oxidation

j

8 5 een

C en SCoA

FAD FADH,

Acyl-CoA-Dehydrogenase

a EN Wr

3

ee‘

2,5,8-Trienoyl-CoA

NAD* + CoASH Abschluss der ß-Oxidationsrunde

NADH + Acetyl-CoA

Problem 1: B,y-Doppelbindung

3,2-Enoyl-CoAIsomerase

? C

YB

2 8

SCoA

na,

We

rn

nen

DE

5

3

C

a

FEST

een

N INGE

3,5,8-Trienoyl-CoA

Enoyl-CoA-Isomerase

EL

Problem: Be een

3,5-2,4-Dienoyl-CoAIsomerase

SCoA &

OÖ

C

|

5

(0) eine Runde ß-Oxidation + und die 1. Oxidation der nächsten Runde

NAD* + FAD + CoASH

NADH + FADH, + Acetyl-CoA en. 2: A*-Doppelbindun 2 i

nen

Ze

+

NADEHSET NADP* Ba

ee

Er

2

Walde)

NADP*+

2,4-Dienoyl-CoAReduktase

nl (0)

[6) -

2,4-Dienoyl-CoAReduktase (Säuger)

EN EEE Ya

ei Dei

2 NADH + 2 FADH, + 2 Acetyl-CoA

5

5

|

C ig

FREIEN

3,2-Enoyl-CoA-

OÖ | Ci

3

SS

SCoA

en

2,4-Dienoyl-

I

C

een

Te

A2, A#, A8-Trienoyl-CoA

++

CoA Reduktase i (E. coli)

8

ee

3

2 NAD* +2 FAD

Isomerase

+2 CoA

SCoA 2 Runden

3,2-Enoyl-CoAIsomerase (Säuger)

10)

I

ae

z are, 4 >

C

Fortsetzung der ß-Oxidation

SCoA

B-Oxidation Innen 8

3 Fir 2

C Er

SCoA

747

748

_Lipidstoffwechsel

CH;— CH,— N— SCoA Propionyl-CoA

ATP + CO, Propionyl-CoA-Carboxylase

ADP +P;

oO

einer Doppelbindung an einem ungeradzahligen C-Atom, wie die A’-Doppelbindung von Linolsäure) wird durch Konjugation mit einer A?’-Doppelbindung stabilisiert. Wenn ein 2,5-Enoyl-CoA durch 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase in ein 3,5Enoyl-CoA umgewandelt wird, was in bis zu 20% der Fälle vorkommt, ist ein weiteres Enzym nötig, um die Oxidation weiterzuführen: die 3,5-2,4-DienoylCoA-Isomerase isomerisiert das 3,5-Dien zu einem 2,4-Dien, das dann durch

die 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase und die. 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase i wird, wie oben für Problem 2 beschrieben.

umgesetzt

1050 — I N— SCoA

CM,

E.

(S)-Methylmalonyl-CoA | Methylmalonyl-CoA-Racemase

H22O een

SCoA

co, (R)-Methylmalonyl-CoA | Methylmalonyl-CoA-Mutase

(0)

Zoo

cı

cu,

I Co Ec0A

Suceinyl-CoA

Abb. 20.16 Umwandlung von Propionyl-CoA in Succinyl-CoA.

Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren

Die meisten Fettsäuren haben (aus Gründen, die in Abschnitt 20.4 erklärt sind) eine gerade Anzahl Kohlenstoffatome und werden deshalb vollständig zu AcetylCoA umgesetzt. Jedoch bilden einige Pflanzen und marine Organismen Fettsäuren mit einer ungeraden Anzahl Kohlenstoffatome. Die letzte B-Oxidationsrunde dieser Fettsäuren ergibt Propionyl-CoA, das in Succinyl-CoA überführt wird und in den Citratcyclus eingeschleust werden kann. Propionat und Propionyl-CoA entstehen auch bei der Oxidation der Aminosäuren Isoleucin, Valin und Methionin (Abschnitt 21.4D). An der Umwandlung von Propionyl-CoA zu Succinyl-CoA sind drei Enzyme beteiligt (Abb. 20.16). 1. Die erste Reaktion wird durch die Hydrolyse von ATP zu ADP und P; getrieben und von der Propionyl-CoA-Carboxylase katalysiert, die als prosthetische Gruppe Biotin benötigt. Diese Reaktion ähnelt jener der Pyruvat-Carboxylase

(Abb. 16.18).

2. Das Produkt der Carboxylierung - (S)-Methylmalonyl-CoA - wird durch die Methylmalonyl-CoA-Racemase in die R-Form überführt. 3. (R)-Methylmalonyl-CoA ist ein Substrat der Methylmalonyl-CoA-Mutase, welche die dritte Reaktion katalysiert, eine Umlagerung des Kohlenstoffgerüsts.

Vitamin-B},-Mangel Vitamin B},; wurde 1926 entdeckt, als George Minot und William Murphy feststellten, dass perniziöse Anämie (Blutarmut) durch tägliche Einnahme großer Mengen roher Leber behandelt werden kann. Diese nicht selten tödliche Krankheit älterer Menschen zeichnet sich durch eine verminderte Zahl roter Blutkörperchen, niedrigen Hämoglobingehalt und fortschreitenden neurologischen Verfall aus. Jedoch wurde die gegen perniziöse Anämie aktive Verbindung -— Vitamin B}, — erst 1948 isoliert. Ds. Vitamin B}, wird weder von Pflanzen noch von Tieren gebildet, sondern nur von einigen Bakterienarten. Pflanzenfresser

erhalten ihr Vitamin B}, von Bakterien, die ihren Darm besiedeln (einige Tiere, wie z.B. Hasen, müssen von Zeit zu Zeit

den eigenen Kot fressen, um ausreichende Mengen dieser essentiellen Verbindung aufzunehmen.) Menschen erhalten fast ihr gesamtes Vitamin B}, direkt aus der Nahrung, vor allem aus Fleisch. Im Darm bindet der intrinsische Faktor,

ein Glykoprotein, welches vom Magen sezerniert wird, spezifisch Vitamin Bı,, und der Protein-Vitamin-Komplex wird über

einen Rezeptor in der Darmschleimhaut aufgenommen. Der Komplex zerfällt und das freigesetzte Vitamin B,, wird in die Blutbahn transportiert. Mindestens drei verschiedene Plasmaproteine im Blut, die Transcobalamine genannt werden, binden das Vitamin und unterstützen dessen Aufnahme

in die Gewebe. Perniziöse Anämie ist gewöhnlich keine durch Mangelernährung bedingte Krankheit, sondern beruht eher auf nicht ausreichender Ausschüttung des intrinsischen Faktors. Ein durchschnittlicher Mensch benötigt sehr wenig Cobalamin, ungefähr 3 ug pro Tag, und die Leber speichert einen Vorrat dieses Vitamins für drei bis fünf Jahre. Dies ist die Ursache für die schleichende Entstehung perniziöser Anämie, aber auch für die Tatsache, dass ein echter Vitamin-B,,-Mangel, auch bei strengen Vegetariern, äußerst selten ist.

Fettsäureoxidation

mıH

|

MethylmalonylCoA-Mutase

H |

an CoAS—C

EOS

E—C—H H

H

C-—-SCoA

lie

Kohlenstoff-

G=>C—E

H |

gerüst

|

C

C

(R)-Methylmalonyl-CoA

Suceinyl-CoA

Methylmalonyl-CoA-Mutase verwendet 5’-Desoxyadenosylcobalamin als prosthetische Gruppe (AdoCbl; auch Coenzym B}, genannt, ein Derivat von Cobalamin; oder Vitamin B,,, siehe Exkurs 20.1). Dorothy Hodgkin bestimmte 1956 in einer bahnbrechenden Arbeit die Struktur dieses komplexen Moleküls (Abb. 20.17)

CH;

N

HC—CH;

q

6

HOH3;C

CH;

N

1%

CH,

H

5’.Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B;5)

Abb. 20.17

Struktur von

5'.Desoxyadenosylcobalamin.

749

750

_ Lipidstoffwechsel

Exkurs 20.2 Biochemie im Überblick Dorothy Crowfoot Hodgkin und die Struktur von Vitamin Bı,

Dorothy Crowfoot Hodgkin

(1910-1994)

Nach Marie Currie (1911) und ihrer Tochter Irene Joliot-Curie (1935) war Dorothy Crowfoot Hodgkin die dritte Frau, die den Nobelpreis erhielt. Er wurde ihr 1964 für die Strukturbestimmung biologischer Moleküle durch Röntgenkristallographie verliehen. Hodgkins wissenschaftliche Laufbahn ist aus zwei Gründen bemerkenswert: Ihr gelang es, die Struktur von Sterolen, Penicillin, Vitamin B}, und Insulin aufzuklären

und sie leistete einen wesentlichen methodischen Beitrag zur Röntgenkristallographie. Hodgkins Faszination an Kristallen begann bereits, als sie zehn

Jahre

alt war,

durch

ein

einfaches

Experiment

mit

roide. Sie zeigte, dass die Berechnungen, die auf Röntgenbeugung in drei statt zwei Dimensionen beruhten, beträchtliche Informationen über die Molekülstruktur und die Stereochemie jedes Kohlenstoffatoms liefern konnten. Hodgkin begann auch mit Untersuchungen von Insulinkristallen, allerdings konnte die vollständige Struktur des Atommodells dieses Proteins aus 777 Atomen erst 34 Jahre später gelöst werden (die Aminosäuresequenz von Insulin wurde von Frederick Sanger erst 1955 bestimmt;-Exkurs 5.1). Während des Zweiten Weltkriegs wandte sich Hodgkin der Struktur von Penicillin zu und nutzte die Röntgenkristallographie, um dessen überraschende Ringstruktur aufzuklären (drei Kohlenstoff- und ein Stickstoffatom; Exkurs 8.3). Diese Entdeckung ebnete den Weg für die Synthese von Penicillin und seiner Derivate. Hodgkins Arbeit markierte auch den Beginn des elektronischen Zeitalters in der biochemischen Forschung, denn sie verwendete einen der ersten analogen Computer von IBM, um die in der Röntgenstrukturanalyse erforderlichen Berechnungen durchzuführen. Im Jahre 1955 brachte ein Besucher Hodgkin Kristalle von Cyanocobalamin mit. Die tiefrote Farbe mag Hodgkin dazu animiert haben, sofort die Röntgenbeugung zu untersuchen.

Alaun. Ihre naturwissenschaftlichen Neigungen wurden von

Beim Cobalamin, das viermal so groß wie Penicillin ist, hat-

ihren

ten alle herkömmlichen Verfahren der chemischen Strukturaufklärung versagt. Hodgkin gelang die Strukturbestimmung

Eltern

gefördert,

insbesondere

von

ihrer Mutter,

die

eine begeisterte Amateurbotanikerin war. Hodgkin schrieb ihr großes Maß an Selbständigkeit später dem Umstand zu, dass ihre Eltern oft für lange Zeit verreist waren,

denn

der Vater arbeitete als Archäologe in Ägypten und im Nahen Osten. Hodgkin erlernte die Kristallographie während ihrer Studienzeit in Oxford und perfektionierte Ihr Wissen, als sie unter der Leitung von J.D. Bernal in Cambridge promovierte.

Im Gegensatz zu vielen seiner Kollegen in jener Zeit förderte Bernal seine jungen Mitarbeiter und zollte ihnen Anerkennung. So wurde Hodgkin bereits 1934 bekannt, als sie gemeinsam mit Bernal das erste Röntgenbeugungsmuster eines Proteins -— Pepsin — veröffentlichte. Damit hatten Bernal und Hodgkin gezeigt, dass Proteine nicht etwa amorphe Kolloide sind, sondern eine eigenständige Struktur besitzen. Sie brachten auch das Gebiet der Makromolekülkristallographie voran, indem sie erkannten, dass Kristalle bei der Untersu-

chung von ihrer Mutterlauge (also der Lösung, aus der das Molekül auskristallisiert) umgeben sein müssen und nicht luftgetrocknet sein dürfen, was damals die Standardprozedur

war. Nach ihrer Rückkehr nach Oxford baute Hodgkin ihr eigenes Labor auf. Dies war Ende der 1930er Jahre eine anspruchsvolle Aufgabe für eine Frau, die ein neues Gebiet bearbeiten wollte und dabei versuchen musste, ihre Arbeit mit

Ehe und Familie in Einklang zu bringen. In Oxford untersuchte Hodgkin kristallisiertes Cholesterin und andere Ste-

von Cobalamin durch ihre Erfahrung und Intuition. Es heißt,

dass sie die Eigenschaften der Molekülstruktur allein durch die Untersuchung von Beugungsmustern erkennen konnte. Sie nutzte aber auch die leistungsfähigen Computer, die ihrem Kollegen Kenneth Trueblood in Los Angeles zur Verfügung standen. Die beiden überbrückten die große Entfernung mit Briefen und Telegrammen. Hodgkin entschloss sich mutig, das im Cobalamin natürlich vorkommende Kobalt für die Lösung des „Phasenproblems“ zu nutzen, da das Pha-

senproblem oft die einfache Bestimmung von Röntgenstrukturen verhinderte (Exkurs 7.2). Obwohl andere der Meinung waren,

dass das Kobaltatom

in Relation zu den leichteren

Atomen in der Struktur die Röntgenstrahlen nicht stark genug beugen würde, konnte Hodgkin die nötigen Phaseninformationen ableiten. Die Herstellung eines mit Schweratomen dotierten Cobalamins wurde dadurch überflüssig. Hodgkin und ihre Mitarbeiter bestimmten die ungewöhnliche Porphyrinstruktur von Cyanocobalamin. In dieser ist der A-Ring direkt mit dem D-Ring verknüpft und der A-Ring ist vollständig gesättigt (Abb. 20.17). Anschließend identifizierten sie Cobalamin mit seiner Co-C-Bindung als die erste bekannte biologische organometallische Verbindung. 1961 bestimmte Hodgkin die Struktur der physiologischen Form von Vitamin B},, Adenosylcobalamin. Nachdem nun die Struktur des Vitamins bekannt war, konnte es synthetisiert und zur Behandlung der perniziösen Anämie eingesetzt

Fettsäureoxidation

werden (Exkurs 20.1). Zusätzlich zum medizinischen Nutzen bei der Behandlung kranker Menschen ermutigte Hodgkins Arbeit mit Cyanocobalamin andere Forscher, die Struktur großer Moleküle zu untersuchen, von denen man zuvor geglaubt hatte, dass sie für die kristallographische Analyse zu kompliziert seien. Hodgkin komplettierte schließlich 1969 ein dreidimensionales Modell des Insulins. Nachdem Hodgkin neben vielen anderen Ehrungen 1964 auch den Nobelpreis verliehen bekam, engagierte sie sich zu-

nehmend bei der International Union of Crystallography und anderen Gesellschaften, die sich der Förderung der wissen-

751

schaftlichen Zusammenarbeit widmeten und dies als einen Weg gegen die internationalen Spannungen während des Kalten Kriegs ansahen. In ihrem eigenen Labor waren Wissenschaftler aus der ganzen Welt tätig. Am Ende ihres Lebens waren

ihre

Bemühungen

digung nicht weniger Kristallographin.

um

die

anerkannt

internationale

Verstän-

als ihre Leistungen

als

Ferry, G., Dorothy Hodgkin: A Life, Cold Spring Harbor Laboratory Press

(2000).

Hodgkin, D.C., Kamper, J., Mackay, M., Pickworth, J., Trueblood, K.N. und White, J.G., Structure of vitamin B-12, Nature 178, 64 (1956).

durch eine Kombination von Röntgenstrukturanalyse und chemischen Abbauuntersuchungen (Exkurs 20.2). 5'-Desoxyadenosylcobalamin enthält einen hämähnlichen Corrinring, dessen vier Pyrrol-Stickstoffatome Liganden eines Cobaltions mit sechs Koordinierungsstellen sind. Der fünfte Co-Ligand ist ein Stickstoffatom eines 5,6-Dimethylbenzimidazol-(DMB-)Nucleotides, welches kovalent an den Ring D des Corrins gebunden ist. Der sechste Ligand ist eine 5’-Desoxyadenosingruppe, in der das C5’-Atom der Desoxyribose eine kovalente C-Co-Bindung ausbildet, eine von nur zwei bekannten Kohlenstoff-Metall-Bindungen der Biologie (die andere ist eine C-Ni-Bindung in dem bakteriellen Enzym Kohlenmonoxid-Dehydrogenase). In einigen cobalaminabhängigen Enzymen ist der sechste Ligand stattdessen eine CH;-Gruppe, die ebenfalls eine C-Co-Bindung ausbildet. Es gibt nur etwa ein Dutzend bekannter cobalaminabhängiger Enzyme, welche alle molekulare Umlagerungen oder Methylgruppenübertragungen katalysieren. Methylmalonyl-CoA-Mutase besitzt ein einzigartiges a/ß-Fass Die Röntgenstruktur der Methylmalonyl-CoA-Mutase aus Propionibacterium shermanii, ein a/ß-Heterodimer, im Komplex mit dem Substratanalogon 2-Carboxypropyl-CoA (dem das Thioester-Sauerstoffatom des Methylmalonyl-CoA fehlt) wurde von Philip Evans bestimmt. Der Adenosylcobalamin (AdoCbl)-Cofaktor des Enzyms ist zwischen die beiden Domänen der katalytisch aktiven a-Untereinheit eingeschoben: eine aus 559 Aminosäuren aufgebaute N-terminale a/ßFass-Struktur (TIM-Fass, das häufigste Enzymmotiv; Abschnitt 6.2c und 15.2) und eine aus 169 Aminosäuren bestehende a/ß-Domäne, die einer RossmannFaltung ähnelt (Abschnitt 6.2C). Die Struktur des a/ß-Fasses weist einige Besonderheiten auf (Abb. 20.18): 1. Das aktive Zentrum von fast allen Enzymen, die eine a/ß-Fass-Struktur haben, sitzt am C-terminalen Ende der ß-Stränge des Fasses. In der Methylmalonyl-CoA-Mutase ist das AdoCbl jedoch gegen die N-terminalen Enden der ß-Stränge des Fasses gepackt. Im freien AdoCbl wird das Co-Atom von einem N-Atom seiner DMB-Gruppe und einer 5‘-CH,-Gruppe des Adenosylrests axial koordiniert (Abb. 20.17). Im Enzym ist das DMB jedoch zur Seite gerückt, bindet in einer separaten Tasche und wurde durch die Seitenkette von His 610 aus der C-terminalen Domäne ersetzt. Wegen der Flexibilität ist die Adenosylgruppe nicht sichtbar in der Struktur und hat sich möglicherweise ebenfalls zur Seite gedreht. In fast allen Enzymen mit a/ß-Fass-Struktur ist das Zentrum des Fasses durch große, oft verzweigte, hydrophobe Seitenketten bedeckt. In der Methylmalonyl-CoA-Mutase bindet jedoch die Pantetheingruppe des 2-Carboxylpropyl-CoA an einen engen Tunnel entlang des Zentrums des a/ß-Fasses, sodass die Methylmalonygruppe eines intakten Substrats in enger Nachbar-

schaft zu der nicht koordinierten Seite des Cobalaminrings orientiert wird. Der Tunnel stellt dabei den einzigen direkten Zugang zu dem Hohlraum des aktiven Zentrums dar, der die bei Katalysereaktionen entstehenden,

752

_ Lipidstoffwechsel

Abb. 20.18 Röntgenstruktur der Methylmalonyl-CoA-Mutase aus P. shermanii im Komplex mit 2-Carboxypropyl-CoA und AdoCbl. (a) Die katalytisch aktive a-Untereinheit mit der N-terminalen Domäne

(türkis), den

B-Strängen (orange) ihrer a/ß-Fass-Struktur und der C-terminalen Domäne (pink). 2-Carboxylpropyl-CoA (magenta) und AdoCbl (grün) sind als Kalottenmodell dargestellt. 2-Carboxylpropyl-CoA schiebt sich durch das Zentrum des a/ß-Fasses und ist so ausgerichtet, dass die Methylmalonylgruppe von Methylmalonyl-CoA den Corrinring von AdoCbl berührt, der zwischen die N- und C-terminalen Domänen des Enzyms gepackt ist. (b) Die Anordnung von AdoCbl und 2-Carboxylpropyl-CoA sowie die Seitenkette von His 610 sind als Stabmodel gezeigt und dem Atomtyp entsprechend angefärbt (der Kohlenstoff von 2-Carboxylpropyl-CoA und His ist grün, der von AdoCbl türkis, N ist blau, O rot, P magentarot

und S gelb). Das Co-Atom des Corrinrings ist durch eine lavendelfarbene Kugel wiedergegeben und die ß-Stränge der a/ß-Fass-Struktur sind durch orangefarbene Bänder dargestellt. Die Ansicht ist ähnlich wie im Bildteil a. Man beachte, dass die

DMB-Gruppe (unten) sich vom Corrinring (seitlich betrachtet) weggedreht hat und durch die Seitenkette von His 610 der C-terminalen Domäne ersetzt wird und dass man die 5‘-Desoxyadenosylgruppe (wegen der Flexibilität) nicht sehen kann. [Nach einer Röntgenstruktur von Philip Evans, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge. PDBid 7REQ.] 6% siehe Interactive Exercises.

DMB

hoch reaktiven freien Radikalzwischenprodukte vor Nebenreaktionen schützt (siehe unten). Der Tunnel ist mit kleinen hydrophilen Resten (Ser und Thr) ausgekleidet. Die Art der Substratbindung der Methylmalonyl-CoA-Mutase ähnelt derjenigen mehrerer anderer AdoCbl-haltiger Enzyme mit bekannter Struktur, die zusammen einzigartig innerhalb der Enzyme mit einer a/ß-Fass-Struktur sind. Methylmalonyl-CoA-Mutase stabilisiert und schützt Zwischenprodukte mit freien Radikalen Der vorgeschlagene Reaktionsmechanismus der Methylmalonyl-CoA-Mutase

(Abb. 20.19) beginnt mit der homolytischen Spaltung der C-Co-Bindung des Cobalamins. Die die C- und Co-Atome erhalten dabei je eines der Elektronen des bindenden Elektronenpaares. Das Co-Atom wechselt dabei zwischen seinen Oxidationsstufen Co(III) und Co(Il) und bildet somit reversibel freie Radikale. Die C-Co(III)-Bindung ist bestens geeignet für diese Aufgabe, weil sie von sich aus schwach ist (Dissoziationsenergie 109 kJ - mol’'). Zusätzlich ist sie durch die sterische Wechselwirkung mit dem Enzym geschwächt. Es sei angemerkt, dass eine homolytische Spaltung in der Biologie ungewöhnlich ist. Die allermeisten Bindungsspaltungen verlaufen über eine heterolytische Spaltung, bei der das bindende Elektronenpaar ganz von einem der durch die Spaltung getrennten Atome übernommen wird. Spektroskopische Messungen deuten darauf hin, dass das Co-Atom in der Methylmalonyl-CoA-Mutase im Co(Il)-Zustand vorliegt, was bestätigen würde, dass es keinen sechsten Liganden besitzt (wie er aber im katalytischen Cyclus vorkommt; Abb. 20.19). Eine durch das Protein hervorgerufene Dehnung verlängert extrem die His N-Co-Bindung (0,25 nm gegenüber 0,19 bis 0,2 nm in vielen anderen B,,-enthaltenden Strukturen), was den Co(ll)-Zustand relativ zum Co(Ill)-Zustand stabilisiert und dabei die Bildung des Adenosinradikals bevorzugt. Dieses Radikal abstrahiert ein Wasserstoffatom vom Methylmalonyl-CoA und erleichtert durch die Bildung eines Cyclopropyloxyradikal-Intermediats die Umlagerung zu Succinyl-CoA. Succinyl-CoA wird nicht direkt durch den Citratcyclus verbraucht Die Methylmalonyl-CoA-Mutase katalysiert die Umwandlung eines Metaboliten zu einem Zwischenprodukt des Citratcyclus. Jedoch sind solche C,-Zwischenprodukte keine Substrate des Citratcyclus, da sie von Acetyl-CoA verschieden

Fettsäureoxidation

basdad

H-0o-O_H

Ado

iR

HEN

“r

(R)-Methylmalonyl-CoA

H—C—H

H

ae —}

Belt

SCoA N

N

/Coım / N

H

ee] H n Hi

|

+

CO;

im h H

el

H

18

+

SCoA

N

2

H

753

N

/Coam) /

N

N

His 610 °\DMB

N

His 610 \pMB

Umlagerung 3

NN

/Com / + N N His 610

Co, Adoyens Kesilene | H—-C—-CH + H—-C—H J N | —0e

\pmB

| SCoA

3]

n

Cyclopropyloxy-

Radikal

N N Com / N N

{ His 610

H

+

\ “DMB

u

Co

I Oo cc I

c=0 | SCoA

Ado

| Hr nac.H | H

hypothetische Zwischenprodukte

SCoA

4

Suceinyl-CoA I

HC

5 BE CH

r

|

C=0O |

Ado | Bee

|

.

H

\

SCoA

+

x

N

und Cobalamin in seiner Oxidationsstufe Co(ll).

/Coam / N N His 610

UpMB

sind. Damit Succinyl-CoA im Citratcyclus oxidiert werden kann, muss Pyruvat überführt werden und daraufhin in Acetyl-CoA. Dieses wird indem Succinyl-CoA in Malat umgewandelt wird (Reaktionen 5-7 des lus; Abb. 17.2), gefolgt von der oxidativen Decarboxylierung von Malat vat und CO, durch das Malatenzym

(OR a

|

Cha

\

0 © Malat

H*+ NADP* NADPH

|

/

CO; |

= on

IN

07 Mor

CO,

=>

nn

a.

CH

3

Pyruvat

Abb. 20.19 Vorgeschlagener Mechanismus der Methylmalonyl-CoA-Mutase. (1) Die homolytische Spaltung der C-Co(IIl)-Bindung ergibt ein 5’-Desoxyadenosinradikal (Ado)

es erst in erreicht, Citratcyczu Pyru-

(2) Das 5’-Desoxyadenosinradikal abstrahiert ein Wasserstoffatom von Methylmalonyl-CoA, wodurch es ein Methylmalonyl-CoA-Radikal erzeugt. (3) Eine C-Co-Bindung bildet sich zwischen dem Methylmalonyl-CoA-Radikal und dem Coenzym, gefolgt von der Umlagerung des Kohlenstoffgerüsts, die ein Succinyl-CoA-Radikal ergibt. (4) Das Succinyl-CoA-Radikal abstrahiert ein Wasserstoffatom von 5’-Desoxyadenosin,

so

dass ein 5’-Desoxyadenosinradikal entsteht. (5) Die Freisetzung von Succinyl-CoA regeneriert

das Coenzym

754

_ Lipidstoffwechsel

(dieses Enzym ist auch am C,-Cyclus der Photosynthese beteiligt; Abb. 19.33). Pyruvat wird anschließend durch die Pyruvat-Dehydrogenase und den Citrateyclus vollständig oxidiert.

F. _ Peroxisomale ß-Oxidation In den Zellen von Säugetieren findet der Großteil der B-Oxidation in den Mitochondrien statt. Aber auch Peroxisomen (Abb. 20.20) oxidieren Fettsäuren, insbesondere solche mit sehr langen oder verzweigten Ketten. In Pflanzen findet die Fettsäureoxidation ausschließlich in Peroxisomen und Glyoxysomen (welche spezialisierte Peroxisomen sind) statt. Zusätzlich zum Abbau von Lipiden sind Peroxisome der Säugetiere an der Synthese von bestimmten Lipiden, einschließlich Gallensäure, beteiligt. Eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen beAbb. 20.20 Peroxisomen. Diese membranumhüllten Organellen üben eine Vielzahl an metabolischen Funktionen aus. Dazu gehört die Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren. [© Donald Fawcett/Visuals Unlimited.)

ruht auf Defekten von peroxisomalen Enzymen oder Proteinen, die Intermediate über die peroxisomale Membran transportieren. Die peroxisomale ß-Oxidation, die sich nur gering von der mitochondrialen B-Oxidation unterscheidet, verkürzt besonders langkettige Fettsäuren (mit mehr als 22 CAtomen), die danach vollständig durch die B-Oxidation in den Mitochondrien abgebaut werden. Besonders langkettige Fettsäuren werden über einen Carnitin-unabhängigen Mechanismus in die Peroxisomen transportiert und durch eine für lange Ketten spezifische Acyl-CoA-Synthetase aktiviert. Die B-Oxidation in den Peroxisomen führt zu den gleichen Abbauzwischenprodukten der Fettsäuren wie im mitochondrialen Weg, benötigt aber nur drei Enzyme: 1. Die Acyl-CoA-Oxidase katalysiert die Reaktion

Fettsäure-Acyl-CoA + O, — trans -— A?-Enoyl-CoA + H,O

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Beschreiben Sie die Aktivierung einer abzubauenden Fettsäure und ihren Transport in das Mitochondrion. 2. Fassen Sie die chemischen Schritte zusammen, die bei

jedem Durchlaufen der ß-Oxidation ablaufen. Wie wird aus

den Produkten der ß-Oxidation ATP gewonnen? 3. Welche zusätzlichen Schritte sind nötig, um ungesättigte und ungeradzahlige Fettsäuren zu oxidieren? 4. Beschreiben Sie die Unterschiede zwischen der ß-Oxidation in Peroxisomen und in Mitochondrien.

Dieses Enzym verwendet FAD als Cofaktor, aber die abstrahierten Elektronen werden direkt auf O, übertragen und durchlaufen nicht die Elektronentransportkette mit der damit einhergehendem oxidativen Phosphorylierung (Abb. 20.12, Reaktionen 5-8). Die peroxisomale Fettsäureoxidation bildet deshalb je C,-Cyclus zwei ATP weniger als die mitochondriale Fettsäureoxidation. Die Katalase überführt das H,O,, das bei der Oxidasereaktion entsteht, in H,O und O,.

2. Die peroxisomale Enoyl-CoA-Hydratase und 3-1-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase sind Bestandteile eines einzigen Polypeptids. Die katalysierten Reaktionen sind identisch denen des mitochondrialen Systems (Abb. 20.12, Reaktionen 2 und 3). 3. Die peroxisomale Thiolase katalysiert den letzten Schritt der Oxidation. Dieses Enzym ist praktisch inaktiv bei Acyl-CoA mit einer Länge von acht C-Atomen oder weniger, so dass Peroxisomen Fettsäuren unvollständig oxidieren. Peroxisomen enthalten sowohl eine Carnitin-Acyltransferase als auch eine Transferase, die spezifisch für längerkettige Acylgruppen ist. Acyl-CoA, deren Ketten durch die peroxisomale ß-Oxidation verkürzt wurden, werden somit in ihre Carnitinester verwandelt. Diese Verbindungen diffundieren größtenteils passiv aus den Peroxisomen heraus zu den Mitochondrien, wo sie aktiv aufgenommen und weiteroxidiert werden.

Ketonkörper

3

755

Ketonkörper

Das bei der Oxidation von Fettsäuren entstehende Acetyl-CoA kann im Citratcyclus weiter oxidiert werden. In den Lebermitochondrien ist jedoch ein erheblicher Teil des Acetyl-CoA für andere Zwecke bestimmt. Ein als Ketogenese bezeichneter Vorgang setzt Acetyl-CoA zu Acetoacetat oder p-ß-Hydroxybutyrat um. Diese Verbindungen werden zusammen mit Aceton etwas ungenau als Ketonkörper bezeichnet:

|

/

o

A)

OH

|

Be

HCC

|

—

CH;

(6)

H

Acetoacetat

Aceton

£

a

(6)

D-ß-Hydroxybutyrat

Ketonkörper sind wichtige Stoffwechselenergielieferanten für viele periphere Gewebe, besonders Herz- und Skelettmuskulatur. Das Gehirn verwendet unter normalen Bedingungen nur Glucose als Energiequelle (Fettsäuren können die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren), aber in Hungerzeiten werden die kleinen, wasserlöslichen Ketonkörper zur Hauptenergiequelle des Gehirns (Abschnitt

22.4A).

Die Bildung von Acetoacetat verläuft in drei Schritten (Abb. 20.21): 1. Zwei Moleküle Acetyl-CoA werden durch die Thiolase (auch Acetyl-CoAAcetyltransferase genannt) zu Acetoacetyl-CoA kondensiert, wobei sie in umgekehrter Richtung arbeitet als bei dem letzten Schritt der ß-Oxidation

(Abb. 20.12, Reaktion 4).

OÖ

(0)

| CH,—C—SCA

| CHz—C—SCoA

+

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA

1 Bra

i

Thiolase (Acetyl-CoA-Acetyltransferase)

ee

CHE; —C_ CH, —C—S00X Acetoacetyl-CoA (0)

l

1,07 CH, -C—5CoA

Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase

H—-SCoA

(HMG-CoA-Synthase)

OH

ee

|

l

CH; ß-Hydroxy-B-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) g Hydroxymethylglutaryl-CoA-Lyase (HMG-CoA-Lyase)

lI

n056- CHs—-C

Acetoacetat

CH}, #

l

CH; —C—-SCoA Acetyl-CoA

Abb. 20.21 Die Ketogenese. Acetoacetat wird in drei Schritten aus Acetyl-CoA

gebildet. (1) Zwei Moleküle Acetyl-CoA kondensieren zu Acetoacetyl-CoA. (2) Eine Claisen-Esterkondensation von Acetoacetyl-CoA mit einem dritten Acetyl-CoA ergibt ß-Hydroxy-B-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). (3) HMG-CoA wird in einer gemischten Aldol-Claisen-Esterspaltung zu Acetoacetat und Acetyl-CoA zerlegt.

756

Lipidstoffwechsel =

CH; — ”— 6:0

C05

H p-ß-Hydroxybutyrat

NAD* ß-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase

NADH + H*

2. Die Kondensation von Acetoacetyl-CoA mit einem dritten Molekül AcetylCoA - katalysiert durch die HMG-CoA-Synthase - ergibt ß-Hydroxy-ß-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). Der Mechanismus dieser Reaktion ähnelt einer umgekehrten Thiolasereaktion (Abb. 20.14), bei der eine Thiolgruppe im aktiven Zentrum ein Acylthioester-Zwischenprodukt bildet. 3. HMG-CoA wird durch die HMG-CoA-Lyase in einer gemischten Aldol-Claisen-Esterspaltung zu Acetoacetat und Acetyl-CoA abgebaut. Der Mechanismus dieser Reaktion verläuft analog der Rückreaktion der Citratsynthase (Abb. 17.10). HMG-CoA ist außerdem eine Vorstufe der Cholesterinsynthese (Abschnitt 20.7A). HMG-CoA-Lyase kommt nur in Lebermitochondrien vor und stört daher nicht die Cholesterinsynthese im Cytoplasma.

| CH; —C— CH, —-C0, Acetoacetat

I 79€ —- CH, —-CH, —-C—-SCoA Succinyl-CoA

Acetoacetat kann durch die B-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase zu D-ß-Hydroxybutyrat reduziert werden: ß

CH; |

c=0O

3-Ketoacyl-CoA-Transferase

|

Suceinat

CHR

1IC

CH

1 CE ISCH

Acetoacetyl-CoA H— SCoA Thiolase

1 2 CH; —C— SCoA

Acetyl-CoA

Abb. 20.22 Umwandlung der Ketonkörper zu Acetyl-CoA im Stoffwechsel.

Verstä ndnisfrage zu Abschnitt 3 1. Wie werden Ketonkörper synthetisiert und abgebaut?

CH; NAD*

u

euer

CH, | Co,

05C— CHa— CH, — CO,

H'+ NADH

a

ß-HydroxybutyratDehydrogenase

Acetoacetat

|

CH, | co,

D-B-Hydroxybutyrat

Weiterhin zerfällt die ß-Ketosäure Acetoacetat spontan in einer nicht enzymatischen Decarboxylierung zu Aceton und CO,. So hat bei Patienten mit Ketose - ein krankhafter Zustand, bei dem Acetoacetat schneller gebildet wird, als es

weiter umgesetzt werden kann (ein Diabetessymptom; Abschnitt 22.4B) — der Atem den typisch süßlichen Geruch von Aceton. Die Leber setzt Acetoacetat und ß-Hydroxybutyrat frei, die über die Blutbahn zu den peripheren Geweben gelangen, wo sie als alternative Energielieferanten genutzt werden. Dort werden diese Produkte zu zwei Molekülen Acetyl-CoA umgesetzt, wie in Abbildung 20.22 gezeigt ist. Succinyl-CoA, das bei diesem Vorgang als CoA-Donor dient, kann auch im Citratcyclus von der Succinyl-CoA-Synthetase (Abschnitt 17.3E) zu Succinat umgesetzt werden, womit die Synthese von einem GTP einhergeht. Die „Aktivierung“ von Acetoacetat umgeht diesen Schritt und „kostet“ deshalb die Freie Enthalpie der GTP-Hydrolyse.

4

Fettsäurebiosynthese

Die Fettsäurebiosynthese verläuft über die Kondensation von C,-Einheiten, der Um-

kehrung der ß-Oxidation. Mittels Isotopenmarkierung zeigten David Ritterberg und Konrad Bloch 1945, dass diese Kondensationseinheiten von Essigsäure abgeleitet sind. Anschließende Untersuchungen zeigten, dass sowohl Acetyl-CoA als auch Bicarbonat benötigt werden und dass der C,-Körper Malonyl-CoA ein Zwischenprodukt der Fettsäurebiosynthese ist. Der Weg der Fettsäuresynthese unterscheidet sich von dem der Fettsäureoxidation. Diese Tatsache ist, wie in Abschnitt 16.3 besprochen, typisch für die entgegengesetzt verlaufenden biosynthetischen und abbauenden Stoffwechselwege, weil dadurch ermöglicht wird, dass beide bei ähnlichen physiologischen Bedingungen thermodynamisch begünstigt ablaufen und voneinander unabhängig re-

guliert werden können. Abbildung 20.23 gibt einen Überblick über die Prozesse der Fettsäureoxidation und -synthese und hebt die Unterschiede zwischen beiden Wegen hervor. Dazu gehören die Lokalisierung beider Stoffwechselwege in der Zelle, die beteiligten Redox-Coenzyme und die Art und Weise, wie die C,-Einheiten von Fettsäure-Acylketten entfernt oder an sie angefügt werden.

Fettsäurebiosynthese ß-Oxidation

757

Biosynthese

im Mitochondrion

im Cytoplasma

CoA ist AcylFettsäure-Acyl-CoA (C, ,o) gruppenträger

ACP ist Acylgruppenträger

FAD FADH,

FAD ist

NADPH

Elektronenakzeptor

Elektronendonator

Fettsäure-Acyl-ACP (C, ,o)

ist

Enoyl-CoA

H,O | 3-L-Hydroxyacyl-CoA

NAD* NADH + H"

L-ß-Hydroxyacyl-

D-ß-Hydroxyacyl-

gruppe

gruppe

NAD" ist Elektronenakzeptor

Acetyl-CoA

+

NADPH + H" ß-Ketoacyl-ACP

Produkt ist die Ca-Einheit

Donator der Cz-

CoA + CO,

Einheit ist

Malonyl-CoA

Acetyl-CoA

Malonyl-CoA

y

Fettsäure-Acyl-CoA (C,)

A.

NADP

NADPH ist Elektronendonator

B-Ketoacyl-CoA

CoA

3-D-Hydroxyacyl-ACP

Transport von mitochondrialem Acetyl-CoA in das Cytosol

Acetyl-CoA — die Ausgangsverbindung der Fettsäuresynthese — entsteht in den Mitochondrien bei der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat, eine Reaktion, die von der Pyruvat-Dehydrogenase katalysiert wird (Abschnitt 17.2B). Außerdem entsteht Acetyl-CoA bei der Oxidation von Fettsäuren. Wenn der ATPVerbrauch niedrig ist, sodass die Oxidation von Acetyl-CoA über Citratcyclus und oxidative Phosphorylierung minimal ist, kann das in den Mitochondrien entstehende Acetyl-CoA in Form von Fett gespeichert werden. Die Fettsäurebiosynthese findet jedoch im Cytosol statt und die Mitochondrienmembran ist undurchlässig für Acetyl-CoA. Acetyl-CoA wird über das Tricarboxylat-Transportsystem in Form von Citrat in das Cytosol gebracht (Abb. 20.24). Die ATP-CitratLyase katalysiert anschließend die Reaktion Citrat + CoA + ATP — Acetyl-CoA + Oxalacetat

+ ADP + P,

die der Rückreaktion der Citrat-Synthasereaktion ähnelt (Abb. 17.10) bis auf die Tatsache, dass die Hydrolyse eines ATP benötigt wird, um die Bildung einer Thioesterbindung zu ermöglichen. Oxalacetat wird dann durch die MalatDehydrogenase zu Malat reduziert. Malat wird durch das Malatenzym oxidativ zu Pyruvat decarboxyliert. Der Mechanismus dieser Reaktion läuft wie folgt ab: Das Malatenzym reoxidiert Malat zu Oxalacetat, einer ß-Ketosäure, welche anschließend zu Pyruvat decarboxyliert wird. (Diese Reaktion erinnert an die Reaktion der Isocitrat-Dehydrogenase im Citratcyclus; Abschnitt 17.3C.) Das dabei entstehende NADPH wird für die reduktiven Reaktionen der Fettsäuresynthese verwendet. Pyruvat kann anschließend in die Mitochondrien zurücktransportiert werden.

ee

Abb. 20.23 Vergleich von ß-Oxidation und Biosynthese der Fettsäuren. Unterschiede bestehen in (1) der Lokalisierung in der Zelle, (2) dem Acylgruppenträger, (3) dem Elektronenakzeptor/-donator, (4) der Stereochemie der Hydratisierung/Dehydratisierung und (5) der Art, wie die C,-Einheiten entstehen/ bereitgestellt werden. %, siehe Animated Figures.

758

_ Lipidstoffwechsel

Abb. 20.24

iDer i a a Ir

:

Diese Abfolge von Reaktionen bringt Acetyl-CoA aus den Mitochondrien in das Cytosol.

Cytoso

|

Mitochondrion

Das Tricarboxylat-Transportsystem.

coz

=

|

00;

I 5

|

©

HO —C—

co;

Citrat

:

H— SCoA Citrat-Synthase

10)

SCoA

C)

&-

2)

@&=

()

©

2

() &

H—SCoA

ATP+

ATP-Citrat-Lyase

ADP + P;, + CH; — C —SCoA co;

Oxalacetat

| e

.

OB |

>

=@®

©

[®

NADH + H*+

Q

ee

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A

ADP +P;

S

(2)

Ozelacetat

a

.=

0)

co;

m (0)

:£

CO,

®@

()

Acetyl-CoA

:

CHs

I: ar DD

N

CH; —C

Citrat

system

CH,

|

Transport-

CH,

i

®

&) &

9

®

O

je

NAD*+ =

Malat Bon

Q

OB,

Pyruvat-Carboxylase

c05

HCOz + ATP

00; is &

NADP*+ OÖ)

C)

()

oO)

S

© Pyruvat

CH;

B.

(else

NADPH + CO,

.

I

0

Pyruvat

= 9

CH;

Acetyl-CoA-Carboxylase

Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) katalysiert den ersten entscheidenden Schritt der Fettsäuresynthese, der zugleich einer ihrer geschwindigkeitsbestimmenden Schritte ist. Dieses biotinabhängige Enzym besitzt einen Mechanismus, der mit dem der Propionyl-CoA-Carboxylase (Abschnitt 20.2E) und Pyruvat-Carboxylase (Abb. 16.18) vergleichbar ist. Die Reaktion verläuft in zwei Schritten, einer CO,-Aktivierung und einer anschließenden Carboxylierung: 10)

HCO; E—-Biotin Biotinyl-Enzym

| CH, —C—SCoA Rate

+ATP ADP+P; en

E—Biotin—CO, Carboxybiotinyl-Enzym

Be

1

|

"0C—CH,—C—SCoA

+ E—Biotin

Malonyl-CoA

Das Ergebnis ist eine C,-(Malonyl-)Gruppe, die als Thioester an CoA gebunden ist.

Fettsäurebiosynthese

Die Acetyl-CoA-Carboxylase aus Säugern, ein Polypeptid von 230 kD, ist Gegenstand allosterischer und hormoneller Kontrolle. Citrat z.B. stimuliert die Acetyl-CoA-Carboxylase, wahrscheinlich indem es deren prosthetische Biotingruppe verlagert und damit V,„,, erhöht. Langkettige Fettsäure-Acyl-CoA-Moleküle wirken als Rückkopplungsinhibitoren des Enzyms. Die Feineinstellung der Enzymaktivität wird durch kovalente Modifizierung erreicht. Acetyl-CoA-Carboxylase ist Substrat für verschiedene Kinasen. Das Enzym hat sechs potentielle Phosphorylierungsstellen, aber nur die Phosphorylierung von Ser 79 ist nachweislich mit der Inaktivierung des Enzyms verbunden. Ser 79 wird durch die AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK) über einen cAMP-unabhängigen Weg phosphoryliert. Jedoch fördern auch Glucagon und Adrenalin über die Proteinkinase A (PKA; Abschnitt 16.3B) die Phosphorylierung von Ser 79 - wahrscheinlich indem sie dessen Dephosphorylierung hemmen. (Zur Erinnerung: Eine vergleichbare Regulation tritt im Glykogenstoffwechsel auf, wo die PKA-vermittelte Phosphorylierung des Phosphoprotein-Phosphataseinhibitors-1 die Dephosphotylierung hemmt; Abb. 16.13) Dagegen stimuliert Insulin die Dephosphorylierung der Acetyl-CoA-Carboxylase und aktiviert damit das Enzym. Acyl-CoA-Carboxylase von Säugetieren besitzt zwei Hauptisoformen

Von den Isoformen der ACC sind hauptsächlich zwei von Bedeutung. a-ACC kommt im Fettgewebe vor und ß-ACC in solchen Geweben, die Fettsäuren oxidieren aber nicht synthetisieren, wie dem Herzmuskel. Gewebe, die Fettsäuren sowohl synthetisieren als auch oxidieren, wie z.B. die Leber, enthalten beide Formen. Die Isoenzyme sind homolog, obwohl die für sie codierenden Gene auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind. Welche Funktion hat ß-ACC? Das Produkt der ACC-katalysierten Reaktion, Malonyl-CoA hemmt die Aufnahme von Fettsäure-Acyl-CoA in die Mitochondrien zur Fettsäureoxidation, dem Hauptkontrollpunkt für diesen Prozess, stark. Möglicherweise besitzt B-ACC hier eine regulatorische Funktion (Abschnitt 20.5). Die Acetyl-CoA-Carboxylase aus E. coli, die aus vielen Untereinheiten besteht, wird durch Guaninnucleotide so reguliert, dass die Fettsäuresynthese mit dem Zellwachstum abgestimmt ist. In Prokaryonten dienen Fettsäuren in erster Linie als Phospholipidvorläufer, da diese Organismen keine Triacylglycerine zur Energiespeicherung synthetisieren.

C. _ Fettsäure-Synthase Die Synthese der Fettsäuren, d.h. vorwiegend von Palmitinsäure, aus AcetylCoA und Malonyl-CoA umfasst sieben enzymatische Reaktionen. Diese Reaktionen wurden zuerst an zellfreien Extrakten von E. coli untersucht, wo die Schritte der Fettsäuresynthese von unabhängigen Enzymen katalysiert werden. Voneinander unabhängige Enzyme mit diesen Aktivitäten kommen auch in Chloroplasten vor (in Pflanzen findet die Fettsäuresynthese nicht im Cytosol statt). In Hefe ist die Fettsäure-Synthase ein 2500 kD großes, multifunktionelles Enzym des Cytosols, mit der Zusammensetzung a,ßs. Dagegen ist dieses Enzym in Tieren ein 534 kD großes multifunktionelles Protein, das aus zwei identischen Polypeptidketten besteht. Vermutlich sind solche Proteine in der Evolution durch Verschmelzung von zuvor eigenständigen Enzymen entstanden. Obwohl die Fettsäuresynthese mit der Synthese eines CoA-Esters (MalonylCoA) beginnt, ist die wachsende Fettsäure an dem Acyl-Carrier-Protein (ACP; Abb. 20.25) verankert. ACP enthält wie CoA eine Phosphopantetheingruppe, die mit der Acylgruppe einen Thioester bildet. Die Phosphatgruppe des Phosphopantetheins wird mit einer Ser-OH-Gruppe von ACP verestert, wohingegen die Phosphatgruppe in CoA an AMP gebunden ist. In E. coli ist ACP ein 10 kD großes Polypeptid, während es in Tieren Teil der multifunktionellen FettsäureSynthase ist.

759

760

_ Lipidstoffwechsel

CH

HB

CH

H | Na

OH

H CN

OH CH, a OÖ H CH;

U)

Cysteamin

Ö

u

prosthetische Phosphopantetheingruppe des ACP

i

H

OH CH, a a oO H CH

ee en ysteami

n (u

Phosphopantetheingruppe des CoA

H

j

=

Adenin

O_ HH

0;PO

H

OH

Abb. 20.25 Phosphopantetheingruppen des Acyl-Carrier-Proteins (ACP) und CoA.

Die Reaktionen, die von der tierischen Fettsäure-Synthase katalysiert werden, sind in Abbildung 20.26 dargestellt: 1. In Säugetieren katalysiert die Malonyl/Acetyl-CoA-ACP-Transacylase (MAT) zwei ähnliche Reaktionen an einem einzigen aktiven Zentrum: Eine Acetylgruppe, die ursprünglich über einen Thioester im AcetylCoA gebunden war, wird zuerst auf ACP übertragen (1a) und eine Malonylgruppe wird von Malonyl-CoA auf ACP übertragen (1b). Dieses sind Einstiegsreaktionen, bei denen die Synthase mit den Vorstufen der Kondensationsreaktion „beladen“ wird.

2,

Die ß-Ketoacyl-ACP-Synthase (KS; auch kondensierendes Enzym genannt) überträgt zuerst die Acetylgruppe von ACP auf einen Cys-Rest des Enzyms (2a). In der Kondensationsreaktion (2b) wird Malonyl-ACP decarboxyliert, das entstehende Carbanion greift den Acetylthioester an und es entsteht ein C,-Körper: Acetoacetyl-ACP. Die Decarboxylierungsreaktion treibt die Kondensationsreaktion:

le mE CHz-0—-S-A0P OÖ

2

Malonyl-ACP

CO, — 0 CH,=C—S—ACP

|

|

—

CH,—C—S—ACP

H,C—C--S—Cys—KS 3 |U

Hr

OÖ

HS—Cys—KS

il

H,C—C—CH,—C—S—ACP

Acetoacetyl-ACP

3.bis5. Zwei Reduktionen und eine Dehydratisierung überführen die ß-Ketogruppe in eine Alkylgruppe. Das Coenzym beider reduktiven Schritte

Fettsäurebiosynthese

|

a

? CH3;—C—SCoA

HSCoA

+

CH,—C—SCoA

H—SACP

Acetyl-CoA la

Malonyl/Acetyl-CoA-ACP-

N

1b | Malonyl/Acetyl-CoA-ACPTransacylase (MAT)

1

It CH5, =C—SACPR

CH; —C--SACP Acetyl-ACP

Malonyl-ACP

ß-Ketoacyl-ACP-Synthase (KS)

6)

2b

€0, + H-S—E

6)

(6) l 4

+ H—SACP

Malonyl-CoA

Transacylase (MAT)

Hr

761

0

65

0

SAGPR

Acetoacetyl-ACP

H* + NADPH 3 |B-Ketoacyl-ACP-Reduktase (KR)

NADP*

ne | CH-C- CH, H

SACP

D-ß-Hydroxybutyryl-ACP 4 ,B-Hydroxyacyl-ACP-Dehydrase (DH)

H,0

np

an

Fark

H a,ß-trans-Butenoyl-ACP

H* + NADPH 5 |Enoyl-ACP-Reduktase (ER)

NADP*

o CH;

-CH,

| -ESACR

=CH,

Butyryl-ACP sechsmalige Wiederholung der Reaktion 2a-5 Abb. 20.26 Reaktionsfolge der Fettsäurebiosynthese. Bei der Bildung von Palmitat wird der dargestellte Weg (die Verlängerung um eine C,-Einheit) siebenmal wiederholt und durch einen Hydrolyseschritt abgeschlossen. 62, siehe Animated Figures.

nach 7 Reaktionscyelen

ı

CH,CH,

— (CH3)]3; — C — SACP Palmitoyl-ACP

H,O —$, Palmitoyl-Thioesterase (TE)

(6) | CH;CH3

—

(CH3)13

— C a

Palmitat

VO

ar

H >=

SACP

762

Lipidstoffwechsel

ist NADPH. Bei der ß-Oxidation wird in den zu 3 und 5 analogen Reaktionen NAD* bzw. FAD verwendet (Abb. 20.12, Reaktionen 3 und 1). Weiterhin benötigt Reaktion 4 die p-ß-Hydroxyacylform als Substrat, wohingegen die vergleichbare Reaktion der ßB-Oxidation das entsprechende ı-Isomer bildet. An diesem Punkt ist die Acylgruppe, die ursprünglich eine Acetylgruppe war, um eine C,-Einheit verlängert. Diese Butyrylgruppe wird anschließend von ACP auf die Cys-SH-Gruppe des Enzyms übertragen (eine Wiederholung der Reaktion 2a), so dass sie in weiteren Runden der Fettsäure-Synthasereaktionsfolge verlängert werden kann. Es ist zu beachten, dass das Malonyl-CoA, das von der Acetyl-CoA-Carboxylase gebildet wird, bei der Kondensation decarboxyliert wird. Die Bildung einer C-C-Bindung ist ein endergoner Prozess und benötigt eine aktivierte Ausgangsverbindung. Malonyl-CoA ist ein ß-Ketoester, dessen exergon verlaufende Decarboxylierung das Acetyl-CoA-Carbanion liefert, das für die Bildung der C-C-Bindung notwendig ist. Die Freie Enthalpie, die für die gesamte Reaktion benötigt wird, entsteht bei der ATP-Hydrolyse der Acetyl-CoACarboxylasereaktion, bei der das Malonyl-CoA gebildet wird. Diese Abfolge von Carboxylierung und Decarboxylierung gleicht der Aktivierung von Pyruvat zu Oxalacetat für die Bildung von Phosphoenolpyruvat in der Gluconeogenese (Abschnitt 16.4A). In jedem Reaktionskreislauf wird das ACP wieder neu mit einer Malonylgruppe beladen und die Acylkette wächst um zwei Kohlenstoffatome. Beachten Sie, dass jede neue Acetyleinheit, die über Malonyl-CoA auf die wachsende Acylkette übertragen wird, an deren Anheftungsstelle an das Enzym angefügt wird. Somit wächst die Fettsäure von ihrem Thioesterende her, nicht vom Methylende (ebenso werden Fettsäuren von ihrem Thioesterende her abgebaut). Sieben solcher Cyclen sind notwendig, um Palmitoyl-ACP zu bilden. Die Thioesterbindung wird dann durch die Palmitoyl-Thioesterase (TE; Abb. 20.26, Reaktion 6) hydrolysiert, wobei Palmitat, das häufigste Produkt des FettsäureSynthaseweges, entsteht, und das Enzym für die nächste Syntheserunde regeneriert wird. Die Stöchiometrie der Palmitatsynthese ist daher

Acetyl-CoA + 7 Malonyl-CoA + 14 NADPH + 7 H' — Palmitat + 7 CO, + 14 NADP*

Da die sieben Moleküle werden:

+ 8 CoA + 6 H,O

Malonyl-CoA wie folgt aus Acetyl-CoA

gewonnen

7 Acetyl-CoA + 7 CO, + 7 ATP — 7 Malonyl-CoA + 7 ADP +7 P,+7 H* ist die Gesamtstöchiometrie der Palmitatsynthese 8 Acetyl-CoA + 14 NADPH + 7 ATP — Palmitat + 14 NADP* +8 CoA +6 H,O + 7 ADP +7 P; Die beiden Hälften der Fettsäure-Synthase arbeiten Hand in Hand Bei Tieren sind die sieben Reaktionen der Fettsäuresynthese in sechs getrennten aktiven Zentren organisiert (MAT führt zwei Reaktionen aus, la und 1b), die auf einer Proteinkette lokalisiert sind. Wie die Enzymaktivitäten entlang der Polypeptidkette angeordnet sind, zeigt Abbildung 20.270. Mehrere andere Enzyme weisen auch eine Multifunktionalität auf, aber kein anderes Enzym hat so viele separate katalytische Aktivitäten wie die Fettsäure-Synthase der Tiere. In Abbildung 20.275 ist ein Modell der Struktur der Fettsäure-Synthase dargestellt. Die beiden Untereinheiten bilden ein asymmetrisches X mit zwei Reaktionskammern, von denen jede einen kompletten Satz katalytischer Domänen hat.

Fettsäurebiosynthese SH Pantethein

Abb. 20.27

763

Struktur der Fettsäure-Synthase

aus Säugern.

(a) Reihenfolge der enzymatischen Aktivitäten entlang der Polypeptidkette. Die Abkürzungen für jede Enzymaktivität sind in Abbildung 20.26 angegeben. (b) Röntgenstruktur der Fettsäure-Synthase des Schweins bei der geringen Auflösung von 0,45 nm. Modelle jeder katalytischen Domäne, die auf den hoch aufgelösten Strukturen der homologen Bakterienenzyme basieren, wurden in die Elektronendichte eingepasst und wie im Bildteil a angefärbt. Die weifßen Sternchen stellen die vermutliche Lage von ACP und der Thioester-Domäne dar. [Mit freundlicher Genehmigung von Nenad Ban und Timm

Die Kondensationsreaktion (2b) erfordert die Nachbarschaft der Sulfhydrylgruppe eines ACP-Phosphopantetheins und den Cys-Rest des aktiven Zentrums, die an den entgegengesetzten Enden des Fettsäure-Synthase-Monomers liegen. Experimente mit Mutanten der Fettsäure-Synthase zeigen, dass diese Gruppen im Monomer in Wechselwirkung treten können. In der natürlichen FettsäureSynthase, die ein Dimer ist, gehören die interagierenden Gruppen zu verschiedenen Monomeren. Dies lässt vermuten, dass die benachbarten Arme und Beine in der Struktur in Abbildung 20.27b zu verschiedenen Untereinheiten gehören. Möglicherweise biegen sich die Arme und Beine nach unten bzw. oben, wodurch es der langen, flexiblen Phosphopantetheinkette von ACP möglich ist, das Substrat zwischen den verschiedenen katalytischen Zentren zu transportieren. Die flexiblen Lipoyliysylarme des Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplexes (Abschnitt 17.2B) erfüllen eine ähnliche Funktion in diesem Enzym. Weil die Fettsäure-Synthase ein Dimer ist, können gleichzeitig zwei Fettsäuren synthetisiert werden. Bei normal ernährten Menschen läuft die Fettsäuresynthese nur in geringem Ausmaß ab. Aber bestimmte Gewebe, insbesondere Malignome, produzieren Fettsäure-Synthase in hohen Konzentrationen und bilden in hohem Maß Fettsäuren. Infolgedessen können Hemmstoffe der Fettsäure-Synthase unter Umständen als Antikrebsmittel wirken. Ein häufig verwendetes antibakterielles Mittel ist tatsächlich ein Hemmstoff der bakteriellen Fettsäuresynthese (Exkurs 20.3). Da das bakterielle Enzym aus getrennten Enzymen und dadurch verschieden aufgebaut ist, eignen sich diese Enzyme als Angriffspunkt für die Entwicklung von Antibiotika.

Maier, ETH Zürich. PDBid 2CF2.]

764

_ Lipidstoffwechsel

Triclosan: ein Hemmstoff der Fettsäure-Synthese Viele Kosmetika, Zahnpasten, antiseptische Seifen und sogar

Plastikspielsachen und Küchengeschirr aus Kunststoff enthalten die Verbindung 5-Chlor-2-(2,4-dichlorphenoxy)phenol, besser bekannt unter dem Namen Triclosan. Cl

OH 10)

ci

Enoyl-ACP-Reduktase (die Schritt 5 katalysiert, wie in Abb. 20.26 zu sehen ist). Das natürliche Substrat des Enzyms hat einen Kyr-Wert von etwa 22 uM, die Dissoziationskonstante für den Inhibitor beträgt hingegen 20 bis 40 pM. Dies weist auf eine extrem feste Bindung hin. Im aktiven Zentrum sitzt einer der Phenylringe von Triclosan, dessen

Struktur die des Reaktionszwi-

schenprodukts nachahmt, oben auf dem Nicotinamidring des NADPH-Cofaktors. Zudem bindet Triclosan über vander-Waals-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken an

el

Aminosäurereste im aktiven Zentrum. Einige E. coli-Stämme,

Triclosan

Diese Verbindung wird seit über 30 Jahren als antibakterielles

die gegen Triclosan

Mittel

einem dieser Kontaktreste. Die spezifische Wirkung von Triclosan als ein Hemmstoff des Enzyms zur Fettsäuresynthese und die Tatsache, dass es resistente Bakterienstämme gibt, zeigen, dass Triclosan die gleichen Nachteile hat wie andere Antibiotika, nämlich die Entstehung von resistenten Bakterien durch Genmutationen. Durch den verbreiteten Einsatz von Triclosan im Wohnbereich und am Arbeitsplatz erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich Resistenzgene ausbreiten. Es ist vermutlich nur noch eine Frage der Zeit, bis diese Resistenzgene allgegenwärtig sind und Triclosan als antimikrobielles Mittel nutzlos sein wird.

verwendet,

obwohl

ihr Wirkmechanismus

bis vor

kurzem völlig unbekannt war. Lange Zeit glaubte man, dass Triclosan als allgemeines Mikrobizid wirkt, was heißt, dass es unspezifisch Mikroorganismen tötet, ähnlich wie Haushaltsbleichmittel oder ultra-

violettes Licht. Solche unspezifischen Mikrobizide sind sehr effektiv, weil es für Bakterien schwierig ist, einen spezifischen Abwehrmechanismus dagegen zu entwickeln. Triclosan wirkt aber tatsächlich eher wie ein Antibiotikum, das ein spezifi-

sches biochemisches Zielmolekül hat - in diesem Fall eines der Enzyme der Fettsäuresynthese (in Bakterien sind die Enzyme getrennte Proteine und nicht Teil einer multifunktionalen Fettsäure-Synthase). In Bakterien hemmt Triclosan die

D.

resistent sind, tragen

Mutationen

an

Elongasen und Desaturasen

Die gesättigte C,,-Fettsäure Palmitinsäure wird durch Elongasen und Desaturasen in längerkettige gesättigte und ungesättigte Fettsäuren überführt. Elongasen sind sowohl in den Mitochondrien als auch dem endoplasmatischen Reticulum zu finden, aber der Mechanismus der Verlängerung ist in den beiden Kompartimenten verschieden. Die Elongation in den Mitochondrien (ein Vorgang, der unabhängig vom Weg der Fettsäure-Synthase im Cytosol verläuft) besteht in der schrittweisen Addition und Reduktion von Acetyleinheiten - der Umkehrung der Fettsäureoxidation. Der einzige chemische Unterschied zwischen den beiden Wegen besteht im letzten Reduktionsschritt, in welchem NADPH anstelle von FADR, als terminales Redox-Coenzym verwendet wird (Abb. 20.28). Die Verlängerung im endoplasmatischen Reticulum wird durch fortgesetzte Kondensation von Malonyl-CoA mit Acyl-CoA realisiert. Auf diese Kondensation folgt jeweils eine NADPH-abhängige Reduktion, die jener ähnlich ist, die von der FettsäureSynthase katalysiert wird. Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Fettsäure in Form ihres CoA-Derivates und nicht als ACP-Derivat verlängert wird. Ungesättigte Fettsäuren werden von terminalen Desaturasen gebildet. Säuger enthalten vier terminale Desaturasen mit einer breiten Kettenlängenspezifität, die als A°-, A®., A°- und A -Fettsäure-Acyl-CoA-Desaturasen bezeichnet werden. Diese Enzyme enthalten ein Nicht-Hämeisenatom und katalysieren die allgemeine Reaktion:

Fettsäurebiosynthese

FE

fa \I ieHaum DES ICH, GTECHA

OÖ

|

RZ-CH,—-C—-SCoA

+ NADH + H* +0,

H—SCoA

=

ICE

6) |

oO

|

ß-Ketoacyl-CoA

Regeln die Bildung der A'’-Doppelbindung

in Linolsäure

Synthese von Triacylglycerinen

Triacylglycerine werden aus Fettsäure-Acyl-CoA-Estern und Glycerin-3-phosphat oder Dihydroxyacetonphosphat gebildet (Abb. 20.29). Der einleitende Schritt in diesem Vorgang wird entweder von der Glycerin-3-phosphat-Acyltransferase in den Mitochondrien und im endoplasmatischen Reticulum oder von der Dihydroxyacetonphosphat-Acyltransferase im endoplasmatischen Reticulum oder in den Peroxisomen katalysiert. Bei Letzteren wird das Produkt Acyl-Dihydroxyacetonphosphat durch eine NADPH-abhängige Reduktase zur entsprechenden Lysophosphatidsäure reduziert. Die Lysophosphatidsäure wird durch die aufeinander folgenden Reaktionen der 1-Acylglycerin-3-phosphatAcyltransferase, Phosphatidsäure-Phosphatase und Diacylglycerin-Acyltransferase in Triacylglycerin überführt. Die Zwischenprodukte Phosphatidsäure und 1,2-Diacylglycerin können auch in Phospholipide umgewandelt werden Weg, der in Abschnitt

| Thiolase

R—- CH, —-C— CH, —C—SCoA

(A”'-Octadecadiensäure), einer notwendigen Vorstufe von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden (Abschnitt 9.1F), aus. Linolsäure muss demzufolge mit der Nahrung aufgenommen werden (letztlich aus Pflanzen, welche A'*- und A’ -Desaturasen besitzen) und ist deshalb eine essentielle Fettsäure. Tatsächlich zeigen Tiere, die fettfrei ernährt werden, ein Krankheitsbild, das anfänglich durch schwaches Wachstum, schlechte Wundheilung und Dermatitis gekennzeichnet ist und schließlich zum Tode führt. Linolsäure ist zudem ein wichtiger Bestandteil der epidermalen Sphingolipide, welche die Wasserundurchlässigkeit der Haut bewirken. Tiere, die nicht genügend Linolsäure aufnehmen, müssen weit mehr Wasser trinken als solche mit ausgewogener Nahrung.

in einem

Acetyl-CoA

I

in der x > 5 und (CH,), eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten kann. Der (CH3),-Teil des Substrates ist stets gesättigt. Doppelbindungen werden auch zwischen bereits bestehenden Doppelbindungen im (CH,),-Teil des Substrats und der CoA-Gruppe eingeführt, so dass die neue Doppelbindung drei Kohlenstoffatome näher an der CoA-Gruppe liegt als die nächste Doppelbindung (nicht konjugiert zu einer bestehenden Doppelbindung) und in Tieren niemals an Positionen jenseits des C9-Kohlenstoffes. Durch eine Kombination von Elongationen und Desaturierungen kann eine Vielzahl ungesättigter Fettsäuren gebildet werden. Da jedoch Palmitinsäure die kürzeste im tierischen Organismus synthetisierte Fettsäure ist, schließen

E.

|

CH,—C—-SCoA

oO

8CHA + 2H,0 + NAD*

HH

die genannten

+

Acyl-CoA (C,)

HH

765

20.6A beschrieben

ist. Die Acyltransferasen

sind nicht streng spezifisch für einzelne Fettsäure-Acyl-CoA, weder hinsichtlich der Kettenlänge noch der Anzahl ungesättigter Doppelbindungen. Jedoch findet man bei Triacylglycerinen im menschlichen Fettgewebe häufig Palmitat an Position 1 und Oleat an Position 2. Glyceroneogenese ist wichtig für die Biosynthese von Triacylglycerinen

Dihydroxyacetonphosphat, das für die Bildung von Glycerin-3-Phosphat für die Triacylglycerinsynthese verwendet wird, kommt entweder aus Glucose über die Glykolyse (Abb. 15.1) oder aus Oxalacetat über eine verkürzte Version der Gluconeogenese (Abb. 16.15), die Glyceroneogenese genannt wird. Glyceroneo-

H* + NADH

3-L-Hydroxyacyl-CoA-

NAD*

ROH,

Dehydrogenase

ii l C-CH,—C—800A OH

L-ßB-Hydroxyacyl-CoA H,O — Enoyl-CoA-Hydratase

if

u

—SCoA

H a,ß-trans-Enoyl-CoA

H* + NADPH Enoyl-CoA-Reduktase

NADP*+

R—CH,

|

CH, —-CH, —-C—-SCoA Acyl-CoA (C, ,)

Abb. 20.28 Verlängerung der Fettsäuren in den Mitochondrien. Dieser Vorgang ist die Umkehrung der Fettsäureoxidation (Abb. 19.9), mit Ausnahme der letzten Reaktion, bei der NADPH Coenzym ist.

statt FADH, das Redox-

766

_Lipidstoffwechsel

(6) a:

DihydroxyacetonphosphatAcyltransferase

CH,—OH | C=O

&

CH,—0—PO3

Dihydroxyacetonphosphat

NADH

c=0

(0)

CH,—0— Por

|

R—C-SCoA

H-—-SCoA

Acyl-Dihydroxyacetonphosphat

NADPH

+ H*+

+ H*

Acyl-Dihydroxyacetonphosphat-Reduktase

Glycerin-3-phosphatDehydrogenase

NADP

NAD*+

+

1 Glycerin-3-phosphatAcyltransferase Er,

CH, —OH HO— ai HA

|

CH,

-0— PO

0|

CH,—O0—PO?

—C—-SCoA N

Glycerin-3pPhosphat P

= 06 CH, 0 _H

H-SCoA 5

e

Lysophosphatidsäure 0

R’—C—SCoA 1-Acylglycerin-3-phosphatAcyltransferase

H—SCoA

nn Phospholipide

—————— — ————

+ —

Ham

1GR

RL=02.® u EL CH, 0

Po

Phosphatidsäure PhosphatidsäurePhosphatase

P; (6)

a

CH,—OH

A en ee

2-Monoacylglycerin-

Acyltransferase Do ;

2-Monoacylglycerin (aus der Verdauung im Darm)

R—C—SCHA

N

o

—ZR

I

CH,—0—C—R

— Co

\

|

CH |

H—SCoA Diacylglycerin o

RC

|

SCoA

DiacylglycerinAcyltransferase

H—SCoA

[6)

Abb. 20.29

Biosynthese von Triacylglycerinen.

Me Triacylglycerin

Fettsäurebiosynthese genese ist in Hungerzeiten notwendig, da annähernd 30% der Fettsäuren, die

während einer Fastenperiode in die Leber gelangen, wieder zu Triacylglycerin verestert werden und als VLDL aus der Leber transportiert werden (Abschnitt 20.1). Auch Fettzellen führen Glyceroneogenese in Hungerzeiten durch. Sie führen keine Gluconeogenese durch, enthalten aber das dazu nötige Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK). Dieses wird vermehrt synthetisiert, wenn die Glucosekonzentration niedrig ist, und dann für die Glyceroneogenese verwendet, welche wiederum für die Biosynthese von Triacylglycerin Vorausset-

Verständnisfragen zu Abschnitt 4

zung ist. An dieser Stelle wird verständlich, weshalb die Fettsäurereste der Triacylglycerine wieder zu Acetyleinheiten abgebaut werden können, denn Fettsäuren wurden aus C,-Acetyleinheiten aufgebaut. In der Leber kann das entstehende Acetyl-

2.

CoA für die Bildung von Ketonkörpern verwendet werden, welche andere Gewebe später wieder in Acetyl-CoA überführen. Dieses kann daraufhin entweder für die Bildung von Fettsäuren eingesetzt werden, die in Form von Triacylglycerinen gespeichert werden, oder es kann im Citratcyclus oxidiert werden, wodurch bei der oxidativen Phosphorylierung beträchtliche Mengen ATP entstehen. Wie wir sehen werden, ist die Richtung des Substratflusses zur Triacylglycerinsynthese oder zum Triacylglycerinabbau abhängig vom Energieverbrauch im Stoffwechsel des Organismus und der Notwendigkeit, andere Verbindungen, wie Membranlipide (Abschnitt 20.6) und Cholesterin (Abschnitt 20.7A), zu synthetisieren. Diese charakteristischen Merkmale des Lipidstoffwechsels sind in Abbildung 20.30 zusammengefasst.

3.

1. Vergleichen Sie die Systeme für den Transport von Fettsäuren

4. 5.

in die Mitochondrien und von Acetyl-CoA in das Cytosol. Beschreiben Sie die Reaktionen, die während der Synthese von Fettsäuren Malonyl-CoA produzieren und verbrauchen. Fassen Sie die Reaktionen zusammen, die von der Fettsäure-Synthase katalysiert werden und stellen Sie sie den Reaktionen der Fettsäureoxidation gegenüber. Welche Aufgabe haben Elongasen und Desaturasen? Beschreiben Sie wie neue Fettsäuren in Triacylglycerine überführt werden.

Triacylglycerine

IV

Membranlipide

SH

Fettsäuren

Fettsäuresynthese

B-Oxidation

we —/ Cholesterin ge]

NADH Ketonkörper

Acetyl-CoA

=)

vor \\

oxidative Phosphorylierung

DEE GTP

Abb. 20.30 Zusammenfassung des Lipidstoffwechsels.

767

768

Lipidstoffwechsel

5

Regulation des Fettsäurestoffwechsels

Betrachtungen der metabolischen Kontrolle konzentrieren sich zumeist auf die Regulierung des Flusses von Metaboliten entlang eines Stoffwechselwegs als Antwort auf veränderte Energiebedürfnisse und Ernährungszustände im Organismus. In Säugern dienen Glykogen und Triacylglycerine als primärer Brennstoff für energieverbrauchende Vorgänge. Steht mehr Energie zur Verfügung als für diese benötigt wird, werden diese Verbindungen für einen späteren Ver-

brauch synthetisiert und gespeichert. Synthese und Abbau von Glykogen und Fetten sind Vorgänge, die den ganzen Organismus betreffen — d.h. dessen Organe und Gewebe, die ein voneinander abhängiges Netzwerk bilden, das durch die Blutbahn verbunden wird. Im Blut werden die Stoffwechselverbindungen transportiert, die für die Energieversorgung verantwortlich sind: Triacylglycerine in Form von Chylomikronen und VLDL, Fettsäuren als ihre Albuminkomplexe, sowie Ketonkörper, Aminosäuren, Lactat und Glucose. Wie im Glykogenstoffwechsel (Abschnitt 16.3), regulieren Hormone wie Insulin und Glucogon die Geschwindigkeiten der gegenläufigen Stoffwechselwege im Lipidstoffwechsel und bestimmen so, ob Fettsäuren oxidiert oder synthetisiert werden. Die wichtigsten Kontrollmechanismen sind in Abbildung 20.31 zusammengefasst. Das Ausmaß der Fettsäureoxidation wird hauptsächlich durch die Konzentration der Fettsäuren im Blut reguliert. Diese wird wiederum durch die Geschwindigkeit bestimmt, mit der Triacylglycerine im Fettgewebe durch die hormonsensitive Triacylglycerin-Lipase hydrolysiert werden. Dieses Enzym erhielt seinen Namen, weil es der Regulation durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung als Antwort auf den hormonell kontrollierten cAMP-Spiegel unterliegt. Glucagon, Adrenalin und Noradrenalin steigern die cCAMP-Konzentration im Fettgewebe. cAMP aktiviert allosterisch PKA (Abb. 13.3C), welche daraufhin mehrere Enzyme phosphoryliert. Phosphorylierung aktiviert die hormonsensitive Lipase, wodurch die Lipolyse im 'Fettgewebe angeregt wird. Dies führt zu einem Anstieg des Fettsäurespiegels im Blut, was letztlich eine Zunahme der ß-Oxidation in anderen Geweben, wie Leber und Muskeln, nach sich zieht. In der Leber führt dieser Prozess zur Bildung von Ketonkörpern, die in die Blutbahn abgegeben und in peripheren Geweben als alternative Energieträger anstelle von Glucose verwendet werden. PKA inaktiviert weiterhin die AcetylCoA-Carboxylase (Abschnitt 20.4B), so dass die CAMP-abhängige Phosphorylierung gleichzeitig die Oxidation von Fettsäuren anregt und deren Synthese hemmt. Insulin, ein Hormon aus der Bauchspeicheldrüse, das bei hohen Blut-Glucosekonzentrationen freigesetzt wird, wie sie nach der Nahrungsaufnahme auftreten, hat die entgegengesetzte Wirkung von Glucagon und Adrenalin: Es stimuliert die Bildung von Glykogen und Triacylglycerinen. Insulin senkt den cAMPSpiegel, was zur Dephosphorylierung und damit zur Inaktivierung der hormonsensitiven Lipase führt. Dies verringert die Menge der Fettsäuren, die für die Oxidation zur Verfügung stehen. Insulin aktiviert zudem die Acetyl-CoA-Carboxylase (Abschnitt 20.4B). Das Verhältnis von Glucagon zu Insulin bestimmt daher die Richtung und die Geschwindigkeit des Fettsäurestoffwechsels. Ein anderer Mechanismus, der die Oxidation von Fettsäuren verhindert, während die Fettsäuresynthese stimuliert wird, ist die Hemmung der CarnitinPalmitoyltransferase I durch Malonyl-CoA. Diese Hemmung verhindert den Transport der neu synthetisierten Fettsäuren in die Mitochondrien (Abschnitt 20.2B) und entzieht sie damit der ß-Oxidation. Tatsächlich enthält der Herzmuskel, ein oxidatives Gewebe, das keine Fettsäurebiosynthese durchführt, eine Iso-

form der Acetyl-CoA-Carboxylase, B-ACC (Abschnitt 20.4B), dessen einzige Funktion die Synthese von Malonyl-CoA zur Regulierung der Festtsäureoxidation zu sein scheint. AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK), die ACC durch Phosphorylierung inaktiviert, könnte selbst ein wichtiger Regulator des Fettsäurestoffwechsels sein.

Regulation des Fettsäurestoffwechsels REDET er.

Kor

o Aktivierung

lei

®

DEBITEL

ATi ken

Aa

|Inhibierung

langfristige

_

uu

12 21,907 22, Mi NSUARDOPEN

BR

Regulation Mitochondrion

Citratcyclus

Malonyl-CoA — FettsäureSynthase

Acetyl-CoA

Palmitat

Fettsäure-Acyl-CoA

Palmitat

glattes

ER

Fettsäure-Acyl-CoA

Fettsäure

Triacylglycerin

Triacylglycerintransport

Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL)

Freisetzung von Fettsäuren aus Fettzellen in die

Fettspeicherung

Blutbahn

freie Fettsäuren

aktiviert durch cAMP-abhängige Phosphonylierung Triacylglycerine

Fettzelle (Adipocyt)

Abb. 20.31

Regulation des Fettsäurestoffwechsels.

769

770

_ Lipidstoffwechsel

Verständnisfrage zu Abschnitt 5 1. Beschreiben Sie die Hauptmechanismen zur Regulierung des Fettsäurestoffwechsels im Menschen.

Das Enzym wird durch AMP aktiviert und durch ATP gehemmt und dient somit vermutlich als Brennstoffanzeiger für die Zelle. Wenn die ATP-Konzentration hoch ist, was einen mit Nahrung versorgten und ausgeruhten Zustand signalisiert, wird die Kinase gehemmt. Dadurch wird ACC dephosphoryliert (aktiviert) und somit die Malonyl-CoA-Produktion für die Fettsäuresynthese in Fettgewebe und die Hemmung der Fettsäureoxidation in Muskelzellen stimuliert. Bei körperlicher Aktivität, die die ATP-Konzentration sinken und gleichzeitig die AMP-Konzentration steigen lässt, wird AMPK aktiviert und phosphoryliert (inaktiviert) ACC. Die führt zu einem Absinken der Malonyl-CoA-Konzentration, wodurch die Fettsäurebiosynthese im Fettgewebe ansteigt und die Fettsäureoxidation im Muskel zunimmt. Auf diese Weise steht bei andauernder Aktivität genügend weiteres ATP zur Verfügung. Faktoren wie Substratverfügbarkeit, allosterische Wechselwirkung und kovalente Modifizierung (Phosphorylierung) regulieren die Enzymaktivität im Minutenbereich oder darunter. Solch eine kurzfristige Regulation wird durch die langfristige Regulation ergänzt, die Stunden oder Tage benötigt. Das zu regulierende Enzym eines Stoffwechselwegs wird dabei durch eine Veränderung der verfügbaren Enzymmenge gesteuert. Dieses wird durch die Änderung der Geschwindigkeit erreicht, mit der das Enzym selbst synthetisiert oder abgebaut wird. Langfristig wird der Lipidstoffwechsel über die Syntheseraten der Acetyl-CoACarboxylase und der Fettsäure-Synthase reguliert. Dabei wird die Synthese dieser beiden Enzyme durch Insulin stimuliert und durch Hunger gehemmt. Dieselbe Auswirkung haben diese beiden Faktoren auf die Synthese der LipoproteinLipase des Fettgewebes. Dieses Enzym ist notwendig für die Aufnahme der in Lipoproteine verpackten Fettsäuren in das Fettgewebe, wo sie gespeichert werden (Abschnitt 20.1B). So fördert ein Glucoseüberschuss, der sich in einem erhöhten Insulinspiegel ausdrückt, die Synthese von Fettsäuren und deren Speicherung in Fettzellen, während Hunger (wenn keine Glucose verfügbar ist) die Fettsäuresynthese und die Aufnahme von Fettsäuren in die Fettzellen herabsetzt.

6

Synthese von Membranlipiden

Fettsäuren sind nicht nur die Vorläufer von Triacylglycerinen, sondern auch von vielen anderen Verbindungen, einschließlich Membranlipiden und bestimmten Signalmolekülen. Die meisten Lipide sind amphipathische Moleküle mit zwei hydrophoben Schwänzen, die entweder aus 1,2-Diacylglycerin oder N-Acylsphingosin (einem Ceramid) bestehen. Diese hydrophoben Anteile sind mit einer polaren Kopfgruppe verknüpft - entweder einem Kohlenhydrat oder einem Phosphatester (Abb. 20.32). In diesem Abschnitt wird die Biosynthese komplexer Lipide aus ihren Vorläufern beschrieben. Diese Lipide werden in Membranen gebildet — meistens an der cytosolischen Seite des endoplasmatischen Reticulums — und von dort in Vesikeln zu ihren entgültigen zellulären Bestimmungs-

Abb. 20.32 Gilycerolipide und Sphingolipide. Die Strukturformeln der häufigsten Kopfgruppen, X, sind in Tab. 9.2 aufgeführt. Pflanzliche

Membranen sind besonders reich an Glyceroglykolipiden.

rn er

a

0

Fi CE

aa AN—i

Glycerolipid

XH X = Kohlenhydrat X = Phosphatester

Be

a

1,2-Diacylglycerin Glyceroglykolipid Glycerophospholipid

an

Zen:

H ec

0%

Sphingolipid

N-Acylsphingosin (Ceramid) Sphingoglykolipid (Glykosphingolipid) Sphingophospholipid

Synthese von Membranlipiden

orten transportiert (Abschnitt 9.4E). Arachidonat-Gruppen, die aus Membranlipiden freigesetzt werden, führen zur Bildung der verschiedenen Typen von Prostaglandinen.

A.

Giycerophospholipide

Glycerophospholipide besitzen eine deutliche Asymmetrie ihrer am C1 bzw. C2 gebundenen Fettsäure-Acylgruppen: Substituenten am C1 sind meistens gesättigte Fettsäuren, wohingegen solche am C2 vorwiegend ungesättigte Fettsäuren sind. Biosynthese von Diacylglycerophospholipiden Die Vorstufen von Triacylglycerin — Phosphatidsäure und 1,2-Diacylglycerin sind auch die Vorstufen der Glycerophospholipide (Abb. 20.29). Die polaren Kopfgruppen der Glycerophospholipide sind über eine Phosphodiesterbindung mit dem C3-Kohlenstoff des Glycerins verknüpft. In Säugern werden die Kopfgruppen Ethanolamin und Cholin aktiviert, ehe sie mit dem Lipid verknüpft werden (Abb. 20.33):

HO—

CH,

R'=H R’=CH,

—CH,—

NR;

Ethanolamin Cholin

Ethanolamin-Kinase oder Cholin-Kinase

ATP ADP

1 oR'=H R’=CH,

Phosphorylethanolamin Phosphorylcholin

CTP:Phosphorylethanolamin-

CTP

Cytidyltransferase | 2

oder CTP:Phosphorylcholin-

Er

Cytidyltransferase

ei

| Cytidin Su! | Or Oz BE R’=CH,

O—

CH, — CH, — NR;*

CDP-Ethanolamin CDP-Cholin,

CDP-Ethanolamin:1,2-DiacylglycerinPhosphorylethanolamintransferase oder CDP-Cholin:1,2-DiacylglycerinPhosphorylcholintransferase

| CH, — 0

1,2-Diacylglycerin

CMP

| z—0 — CH, — CH, —NR3" o-

Phosphatidylethanolamin R’=CH;3

Phosphatidylcholin (Lecithin)

Abb. 20.33 Biosynthese von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin.

In Säugern sind CDP-Ethanolamin und CDP-Cholin die Vorstufen der Kopfgruppen.

771

772 _ Lipidstoffwechsel

1. ATP phosphoryliert die OH-Gruppe von Cholin oder Ethanolamin. 2. Die Phosphatgruppe des entstandenen Phosphorylcholin oder Phosphorylethanolamin greift anschließend CTP an und verdrängt PP; unter Bildung der entsprechenden CDP-Derivate, welche die aktivierten Phosphatester der polaren Kopfgruppen darstellen. 3. Die C3-OH-Gruppe von 1,2-Diacylglycerin greift die Phosphatgruppe des aktivierten CDP-Cholin oder CDP-Ethanolamin an und verdrängt CMP, so dass das entsprechende Glycerophospholipid entsteht.

In der Leber kann Phosphatidylethanolamin durch die Addition von Methylgruppen auch in Phosphatidylcholin umgewandelt werden. Aus Phosphatidylethanolamin wird durch einen Austausch der Kopfgruppen Phosphatidylserin gebildet, eine Reaktion, die von der Phosphatidylethanolamin-Serintransferase katalysiert wird. Dabei greift die OH-Gruppe des Serins die Phosphatgruppe des Donators an. Die ursprüngliche Kopfgruppe wird dabei eliminiert, wodurch Phosphatidylserin entsteht.

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Serintransferase

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Phosphatidylserin

Bei der Synthese von Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerin wird der hydrophobe Schwanz anstelle der polaren Kopfgruppe aktiviert. Phosphatidsäure, die Vorstufe von 1,2-Diacylglycerin (Abb. 20.29), greift das a-Phosphat von CTP an und bildet das aktivierte CDP-Diacylglycerin und PP; (Abb. 20.34). Phosphatidylinositol entsteht durch den Angriff von Inositol an CDP-Diacylglycerin. Phosphatidylglycerin wird in zwei Rektionen gebildet: (1) Angriff der C1OH-Gruppe von Glycerin-3-phosphat an CDP-Diacylglycerin, woraus Phosphatidylglycerinphosphat entsteht und (2) Hydrolyse der Phosphatgruppe zu Phosphatidylglycerin.

Synthese von Membranlipiden

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Cardiolipin

Cardiolipin entsteht durch die Kondensation zweier Moleküle Phosphatidylglycerin, bei der ein Molekül Glycerin eliminiert wird. Enzyme, die Phosphatidsäure synthetisieren, bevorzugen gewöhnlich gesättigte Fettsäuren am C1 und ungesättigte Fettsäuren am C2. Diese allgemeine Spezifität kann jedoch nicht die Beobachtung erklären, dass etwa 80% des Phosphatidylinositols im Gehirn eine Stearoylgruppe (18:0) am C1 sowie eine Arachidonoylgruppe am C2 tragen und dass etwa 40% des Phosphatidylcholins in der Lunge Palmitoylgruppen (16:0) an beiden Stellen aufweisen. Diese letztgenannte Verbindung ist der Hauptbestandteil des Surfactants, welches verhindert, dass die Lungenbläschen beim Ausatmen zusammenfallen. Ein Mangel an dieser Verbindung ist bei Frühgeburten die Ursache für das Atemnot-Syndrom (siehe Exkurs 9.1). William Lands zeigte, dass diese gewebespezifische Seitenkettenverteilung durch „Umlagerungen“ entsteht, wobei spezifische Acylgruppen bestimmter Glycerophospholipide von spezifischen Phospholipasen und Acyltransferasen ausgetauscht werden. Biosynthese von Plasmalogenen und Alkylacylglycerophospholipiden

Eukaryotische Membranen enthalten erhebliche Mengen zweier anderer Arten von Glycerophospholipiden: Plasmalogene, die eine Kohlenwasserstoffkette enthalten, welche über eine Vinyletherbindung an das C1-Kohlenstoffatom des Glycerins gebunden ist, und Alkylacylglycerophospholipide, deren Alkylsubstituent über eine Etherbindung an das C1 des Glycerins gebunden ist. CH, Be,

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5

Allgemeine Struktur der Plasmalogene

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Ein typisches Alkylacylglycerophospholipid

Etwa 20% der Glycerophospholipide in Säugern sind Plasmalogene, der genaue Gehalt variiert jedoch sowohl zwischen einzelnen Arten als auch zwischen verschiedenen Geweben eines Organismus. Zum Beispiel machen Plasmalogene nur 0,8% der Phospholipide in der menschlichen Leber aus, aber 23% der Phospholipide des Nervengewebes. Alkylacylglycerophospholipide kommen viel seltener vor als Plasmalogene. In der Biosynthese der Plasmalogene wird zuerst das Alkylacylglycerophospholipid synthetisiert. Anschließend wird dieser Ether durch eine Desaturase zu einem Vinylether oxidiert, um das Plasmalogen zu erhalten.

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-

CH

773

774

_ Lipidstoffwechsel

Abb. 20.34 Biosynthese von Phosphatidylinositol | und Phosphatidylglycerin. In Säugern verläuft dieser Vorgang über ein CDP-Diacylglycerin-Zwischenprodukt.

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Phosphatidylinositol

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CH,0H Phosphatidylglycerin

B.

Sphingolipide

Die meisten Sphingolipide sind Sphingoglykolipide, was bedeutet, dass ihre polaren Kopfgruppen aus Kohlenhydrateinheiten bestehen. Cerebroside sind Ceramidmonosaccharide, wohingegen Ganglioside Ceramidoligosaccharide sind, die Sialinsäure enthalten (Abschnitt 9.1D). Diese Lipide werden durch Anhängen von Kohlenhydrateinheiten an die C1-OH-Gruppe eines Ceramids (N-Acylsphingosin) gebildet. N-Acylsphingosin wird in vier Schritten aus seinen Vorstufen Palmitoyl-CoA und Serin gebildet (Abb. 20.35): 1. Die 3-Ketosphinganin-Synthase katalysiert die Kondensation von PalmitoylCoA mit Serin, was 3-Ketosphinganin ergibt.

Synthese von Membranlipiden [6) || C0oA—8—-C—CH, —CH,— (CH),

et 2 CH co

CH,

EN

CH,OH Palmitoyl-CoA

Serin 3-Ketosphinganin-Synthase

CO, + CoASH

I

C—CH,—CH,—(CH3)}5 —CHz I.N

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3-Ketosphinganin (3-Ketodihydrosphingosin)

NADPH + H* 2 | 3-Ketosphinganin-Reduktase

NADP* Ye CH—CH,—-CH,—-(CH,)jo CH; ION

CH CH,0H

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)

R—-C-—_SCoA 3 |Acyl-CoA-Transferase

CoASH a N

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CN: CH,0H

Dihydroceramid

(N-Acylsphinganin) FAD 4 |Dihydroceramid-Reduktase

FADH,

oO RO NH

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Ceramid (N-Acylsphingosin)

He H

en

Abb. 20.35 Biosynthese von Ceramid (N-Acylsphingosin).

775

776 _ Lipidstoffwechsel

2. Die 3-Ketosphinganin-Reduktase katalysiert die NADPH-abhängige Reduktion der Ketogruppe von 3-Ketosphinganin, wodurch Sphinganin (Dihydrosphingosin) entsteht. 3. Dihydroceramid wird durch die Übertragung einer Acylgruppe von Acyl-CoA auf die 2-Aminogruppe von Sphinganin gebildet, wobei eine Amidbindung geknüpft wird. 4. Die Dihydroceramid-Reduktase überführt in einer FAD-abhängigen Oxidation Dihydroceramid in Ceramid. Das nicht glykosylierte Lipid Sphingomyelin, ein wichtiges Strukturlipid der Nervenzellmembranen, OHEr Se OÖ

CH—C=C—(CH3)ja—CH;z

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Sphingomyelin

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Arachidonat

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coO-

L 00H

9,| Peroxidase

“ )

Cy,-Fettsäuren sind die Vorstufen der Prostaglandine

Cyclooxygenase 1

“

ist das Produkt einer Reaktion, bei der Phosphatidylcholin seine Phosphorylcholingruppe an die C1-OH-Gruppe von N-Acylsphingosin abgibt. Cerebroside sind meistens 1-ß-Galactoceramide oder 1-ß-Glucoceramide. Sie werden durch die Addition der Glykosyleinheit einer entsprechenden UDP-Hexose an die C1-OH-Gruppe des Ceramids synthetisiert. Die komplexeren Oligosaccharid-Kopfgruppen der Ganglioside (Abb. 9.9) werden durch eine Reihe von Glykosyltransferasen aufgebaut. Störungen in den Stoffwechselabbauwegen dieser komplexen Lipide sind die Ursache für bestimmte Lipidspeicherkrankheiten (Exkurs 20.4).

—

coO-

LG OH PGH,

Abb. 20.36 Prostaglandin-H,-Synthase-Reaktion. Die Cyclooxygenaseaktivität (1) katalysiert die Additionen und Umlagerungen, die zum Cyclo-

pentanring führen. Die Peroxidaseaktivität des Enzyms (2) wandelt das Peroxidzwischenprodukt zu Prostaglandin H, (PGH,) um. Dieses ist die Vorstufe für andere Prostaglandine.

Prostaglandine und verwandte Verbindungen (Abb. 9.12) sind Derivate von CzoFettsäuren wie z.B. Arachidonat, das aus Membranphospholipiden als Reaktion auf Hormone und andere Signale durch die regulierte Aktivität der Phospholipase A2 freigesetzt wird. Die Funktionen der Prostglandine unterscheiden sich je nach Gewebe. Einige von ihnen lösen Schmerz, Fieber oder Entzündungen aus. Die Synthese der Prostaglandine beginnt mit der Bildung eines Cyclopentanrings in einer linearen, ungesättigten Fettsäure, wie sie von der Prostaglandin-H,-Synthase katalysiert wird (Abb. 20.36). Dieses Häm-haltige Enzym besitzt zwei katalytische Aktivitäten: eine Cyclooxygenase, die zwei Moleküle O, an das Arachidonat anfügt, und eine Peroxidase, welche die resultierende Hydroperoxygruppe in eine OH-Gruppe verwandelt. Das Enzym wird auch als COX bezeichnet, nach seiner Cyclooxygenaseaktivität (es sollte aber nicht mit der Cytochrom c-Oxidase verwechselt werden, die ebenfalls mit COX abgekürzt wird). Die Verwendung von Aspirin als Analgetikum (Schmerzmittel), Antipyretikum (Fiebersenker) und entzündungshemmendes Mittel ist seit dem 19. Jahrhundert verbreitet. Aber erst 1971 hat John Vane den Wirkmechanismus aufgeklärt. Aspirin hemmt die Prostaglandinsynthese, indem es einen definierten SerRest der Prostaglandin-H,-Synthase acetyliert. Dies verhindert, dass Arachidonat ins aktive Zentrum der Cyclooxygenase gelangt. Andere nichtsteroidale Entzündungshemmer (NSAID, von engl.: nonsteroidal anti-inflammatory drug) wie z.B. Ibuprofen und Paracetamol (Acetaminophen) binden auf ähnliche Weise, jedoch nichtkovalent an das Enzym, sodass auch sie dessen aktives Zentrum blockieren.

Synthese von Membranlipiden

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fC—OH

Nr N

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Sn CHs

CH—-COOH

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Aspirin (Acetylsalicylsäure)

OH Ibuprofen

Paracetamol (Acetaminophen)

COX-2-Inhibitoren haben nicht die Nebenwirkungen der anderen nichtsteroidalen Entzündungshemmer Die Prostaglandin-H,-Synthase kommt in zwei Isoformen vor, COX-1 und COX2. Diese haben eine zu 60% identische Sequenz und eine hohe Strukturhomologie. COX-1 wird konstitutiv (ohne Regulation) in den meisten, wenn nicht gar allen Geweben von Säugetieren produziert. Es sorgt somit dafür, dass die nötige Prostaglandinmenge synthetisiert wird, die zur Aufrechterhaltung der Organund Gewebshomöostase nötig ist. Im Gegensatz dazu wird COX-2 nur in bestimmten Geweben als Reaktion auf Entzündungsreize gebildet und ist somit für die erhöhten Prostaglandinkonzentrationen verantwortlich, die mit Entzündungen einhergehen. Aspirin und Ibuprofen sind relativ unspezifisch und können deshalb Nebenwirkungen auslösen (z.B. Magen-Darm-Geschwüre), wenn sie zur Behandlung von Entzündung oder Fieber eingesetzt werden. Deshalb hat man mithilfe eines strukturbasierten Ansatzes (Abschnitt 12.4) Wirkstoffe entwickelt, die selektiv COX-2 inhibieren, nicht aber COX-1. Die dreidimensionalen Strukturen von COX-1 und COX-2 sind nahezu identisch. Aber unterschiedliche Aminosäuren führen dazu, dass der Kanal des aktiven Zentrums von COX-2 etwa 20% größer ist als derjenige von COX-1. Durch chemische Synthese gelang die Entwicklung von neuartigen Inhibitoren, sogenannten Coxibs. Diese können in den COX-2Kanal gelangen, sind aber für den COX-1-Kanal zu sperrig. Zwei dieser Hemmstoffe, Rofecoxib (Vioxx) und Celecoxib (Celebrex), wurden wichtige Arzneimittel zur Behandlung von Entzündungskrankheiten wie Arthritis, weil sie nicht die bekannten Nebenwirkungen der nichtsteroidalen Entzündungshemmer aufwiesen. Im Jahre 2004 musste jedoch Vioxx vom Markt genommen werden, da es in Langzeitstudien unerwartete Nebenwirkungen wie eine erhöhte Anfälligkeit für Herzinfarkte gezeigt hatte.

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SO,CH; =>

0

Verständnisfragen zu 3 Abschnitt 6

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N

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SO,NH; Rofecoxib (Vioxx)

Celecoxib (Celebrex)

Interessanterweise bindet das am häufigsten eingesetzte Analgetikum und Antipyretikum Paracetamol nur schwach an COX-1 und an COX-2. Es ist deshalb (obwohl es in dieser Klasse geführt wird) kein Entzündungshemmer im eigent-

lichen Sinn. Sein Wirkmechanismus gab lange Zeit Rätsel auf, bis Daniel Simmons kürzlich eine dritte COX-Isomerase entdeckte, COX-3. Diese wird in hoher Konzentration im Nervensystem gebildet und ist offensichtlich das Zielmolekül

von Arzneistoffen, die Schmerzen stillen und Fieber senken.

1. Erklären Sie, wie GlyceroA € phospholipide durch Aktivieren der Kopfgruppe oder des Lipid-

schwanzes synthetisiert werden. 2. Beschreiben Sie die Biosynthese von Ceramid, Sphingomyelin und Cerebrosiden.

3. Erklären Sie die Wirkungsweise von Medikamenten wie Aspirin, NSAIDs und Coxib.

777

778

_ Lipidstoffwechsel

Sphingolipidabbau- und Lipidspeicherkrankheiten Sphingoglykolipide werden in den Lysosomen in einer Kette von enzymatisch vermittelten Hydrolysen abgebaut.

NANA Gel GaINAc# Galf GIe£ Oer Gangliosid Gyı Gyun-P-Galactosidase G 1 -Gangliosidose

Gal NANA

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GalNAc-£-Gal& GIc# Cer Gangliosid Gya Hexosaminidase A Tay-Sachs-Krankheit GalNAc

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Gangliosid Gys3 art GangliosidNeuraminidase

Sandhoff-Krankheit

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Fabry-Krankheit

Gal

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Glucocerebrosid

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Phosphorylcholin Cer-Phosphoryl-

‚cholin

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Gal

Metachromatische Leukodystrophie

Ceramide

Galactocerebrosidase

Sphingomyelinase

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Ss02

Galft Cer Galactocerebrosid

Krabbe-Krankheit Ceramidase

Krankheit

Farbersche

Lipogranulomatose

Sphingosin

Fettsäuren

Ein erblicher Fehler in einem dieser Enzyme (durch einen Ba-_ ken gekennzeichnet) hat eine Sphingolipidspeicherkrankheit zur Folge. Das Substrat der fehlenden Enzyme sammelt sich deshalb an, häufig mit gravierenden Folgen. In vielen Fällen leiden die betroffenen Patienten an geistiger Behinderung und sterben als Kleinkind oder in der frühen Kindheit. Eine der häufigsten Lipidspeicherkrankheiten, die durch

mangelhaften Abbau von Lipiden verursacht wird, ist die Tay-Sachs-Krankheit, ein autosomal rezessiv vererbter Defekt der Hexosaminidase A, die N-Acetyl-Galactosamin des Gangliosids Gy, hydrolysiert. Das Fehlen der Hexosaminidase-AAktivität hat zur Folge, dass sich in den Nervenzellen Gun in Form schalenförmiger Einschlüsse ansammelt.

Cholesterinstoffwechsel

779

die Träger dieser Krankheit durch einen einfachen Serumtest herauszufinden. Experimente mit Mäusen, die an Tay-Sachs-Krankheit litten, lassen vermuten, dass das Ansammeln von Gy, gemindert werden kann, wenn dessen Synthese gehemmt wird. Dieses konnte in Mäusen durch die Gabe von N-Butyldesoxynojirimycin

H HO

ar „CH,CH,CH;CH, N H H oH H

He

on

N-Butyldesoxynojirimycin

[Mit freundlicher Genehmigung von John S. O’Brien, University of California at San Diego.]

Säuglinge, die mit Tay-Sachs-Krankheit geboren werden, entwickeln sich zunächst normal. Sie werden jedoch ab dem Alter von etwa einem Jahr, wenn sich so viel Gy, angesammelt hat, dass es Nervenfunktionen beeinträchtigt, zunehmend schwächer, behindert und blind, bis sie meistens im

erreicht werden, das die Glykosyltransferase im ersten Schritt

der Glucoceramidsynthese hemmt. Ähnliche Versuche, das „Substrat zu entziehen“ könnten bei der Behandlung anderer

Lipidspeicherkrankheiten erfolgreich sein, insbesondere, wenn das defekte, aber essentielle Enzym noch eine Restaktivität besitzt.

dritten Lebensjahr sterben. Es ist heute allerdings möglich,

7

Cholesterinstoffwechsel

Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der Zellmembranen und der Vorläufer von Steroidhormonen und Gallensäuren. Es ist unbestritten eine essentielle Verbindung, obwohl seine Ablagerung in den Arterien mit Herz-Kreislauferkrankungen verbunden ist und Schlaganfälle verursachen kann, zwei der häufigsten Todesursachen beim Menschen (siehe Exkurs 10.1). Im gesunden Organismus wird die gesundheitsgefährdende Ablagerung auf einem Minimum gehalten, indem ein komplexes Gleichgewicht zwischen Biosynthese, Verbrauch und Transport von Cholesterin aufrechterhalten wird. In diesem Abschnitt werden die Wege der Biosynthese und des Transportes von Cholesterin beschrieben und wie diese kontrolliert werden.

A. _ Cholesterinbiosynthese Die Biosynthese von Cholesterin erfolgt über einen sehr komplexen Weg, der als erstes von Konrad Bloch skizziert wurde. Dabei wird zunächst Acetat in C;-Einheiten überführt, die das Kohlenstoffgerüst von Isopren besitzen.

CH,

“

=C—CH=CH3

Isopren (2-Methyl-1,3-butadien)

|

@70- 206 Isopreneinheit

Die Isopreneinheiten werden dann zu linearen Molekülen aus 30 Kohlenstoffatomen kondensiert, die zu der tetracyclischen Struktur von Cholesterin cyclisieren.

780

Lipidstoffwechsel HMG-CoA besitzt eine Schlüsselrolle als Ausgangsverbindung von Cholesterin Acetyl-CoA wird durch eine Kette von Reaktionen in Isopreneinheiten umgewandelt. Dies beginnt mit der Bildung von Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) durch die Thiolase und die HMG-CoA-Synthase. In Mitochondrien bilden diese beiden Enzyme HMG-CoA für die Ketonkörpersynthese (Abb. 20.21). Die cytosolischen Isozyme dieser beiden Proteine erzeugen HMG-CoA, das für die Cholesterinsynthese verwendet wird. Vier weitere Reaktionen überführen HMG-CoA in das isoprenoide Zwischenprodukt Isopentenylpyrophosphat

(Abb. 20.37):

1. Die CoA-Thioestergruppe von HMG-CoA wird in einer NADPH-abhängigen Vier-Elektronen-Reduktion zu einem Alkohol (Mevalonat, eine C,-Verbindung) reduziert, die von der HMG-CoA-Reduktase katalysiert wird. 2. Die neu entstandene OH-Gruppe wird von der Mevalonat-5-Phosphotransferase phosphoryliert. ; 3. Die Phosphatgruppe wird durch die Phosphorylmevalonat-Kinase in ein Pyrophosphat überführt. 4. Das entstandene Molekül wird durch die Pyrophosphorylmevalonat-Decarboxylase ATP-abhängig decarboxyliert und Wasser abgespalten. @=

P; + ADPF A

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Decarboxylase CH3

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5-Pyrophosphorylmevalonat

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I

Oz

Oz

Isopentenylpyrophosphat

Squalen wird durch die Kondensation von sechs Isopreneinheiten gebildet Isopentenylpyrophosphat wird durch die Isopentenylpyrophosphat-Isomerase in Dimethylallylpyrophosphat umgewandelt.

Isopentenylpyrophosphat

IsopentenylpyrophosphatIsomerase

CH;

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Dimethylallylpyrophosphat

Vier Isopentenylpyrophosphate und zwei Dimethylallylpyrophosphate kondensieren in drei Reaktionen, die von zwei Enzymen katalysiert werden, und bilden die Cz.-Vorstufe von Cholesterin — Squalen (Abb. 20.38): 1. Die Prenyltransferase katalysiert die Kopf-an-Schwanz-Kondensation von Dimethylallylpyrophosphat und Isopentenylpyrophosphat zu der C,,-Verbi ndung Geranylpyrophosphat. 2. Die Prenyltransferase katalysiert eine zweite Kopf-an-Schwanz-Kondensa tion von Geranylpyrophosphat und Isopentenylpyrophosphat zu der C,;-Verbi ndung Farnesylpyrophosphat. Die Prenyltransferase ist eines der wenigen

Cholesterinstoffwechsel HO e „CH; FEN

ho

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Dimethylallylpyrophosphat

781

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Isopentenylpyrophosphat

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ATP

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5-Pyrophosphorylmevalonat

Pyrophosphoryl-

ATP

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Decarboxylase

ADP +P;+C0,+H,0 Squalen

CH,

/ H,c’

CH,

1)

f)

perhci) am O,—0—B-0- 50 ne

Isopentenylpyrophosphat

Abb. 20.37

Bildung von Isopentenylpyrophosphat

aus HMG-CoA.

Abb. 20.38 Bildung von Squalen aus Isopentenylpyrophosphat und Dimethylallylpyrophosphat. Der Weg beinhaltet zwei Kopf-an-Schwanz-Kondensationen, die von der Prenyltransferase katalysiert werden und eine Kopf-an-Kopf-Kondensation, die von der Squalen-Synthase katalysiert wird.

782

_Lipidstoffwechsel

Abb. 20.39

Reaktion der

Squalen-Epoxidase.

SqualenEpoxidase

2,3-Oxidosqualen

Squalen

Enzyme, für das gezeigt werden konnte, dass es über’eine Sn1--Reaktion ein Carbokationzwischenprodukt bildet, wobei es sich eines Ionisierung-Kondensation-Eliminierungs-Mechanismus bedient: lonisierung-Kondensierung-Eliminierung

(

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3. Die Squalen-Synthase katalysiert anschließend die Kopf-an-Kopf-Kondensation von zwei Molekülen Farnesylpyrophosphat zu Squalen. Protosterolkation

Sa:

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:

E

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Farnesylpyrophosphat ist in Säugern außerdem die Vorstufe anderer isoprenoider Verbindungen, einschließlich Ubichinon (Abschnitt 9.1F) und der Isoprenschwänze einiger lipidgebundener Membranproteine (Abschnitt 9.3B). Die Cyclisierung von Squalen ergibt schließlich Cholesterin Der lineare Kohlenwasserstoff Squalen wird in zwei Schritten cyclisiert, wodurch das tetracyclische Steroidgerüst entsteht: Die Squalen-Epoxidase kataly-

siert die Oxidation von Squalen, wodurch 2,3-Oxidosqualen entsteht (Abb. 20.39). Die Squalen-Oxidocyclase überführt dieses Epoxid in das Steroid Lanosterin. Diese Reaktion ist ein komplizierter chemischer Vorgang und umfasst die ee Abb. 20.40 Reaktion der Squalen-Oxidocyclase. (1) 2,3-Oxidosqualen wird zu dem Protosterolkation cyclisiert, in einem Vorgang, der durch die enzymvermittelte Protonierung am Epoxidsauer-

Cyclisierung von 2,3-Oxidosqualen zu einem Protosterolkation und die Umlagerung dieses Kations zu Lanosterin durch eine Kette von 1,2-Hydrid- und Methylverschiebungen (Abb. 20.40). Die Umlagerung von Lanosterin zu Cholesterin

stoffatom des Squalens eingeleitet wird. Die Öffnung des Epoxids hinterlässt ein elektronen-

N

verarmtes Zentrum, dessen Verlagerung eine Kette von Cyclisierungen auslöst, die das Protosterol-

kation bilden. (2) Die Eliminierung eines Protons am C9 des Sterols, die die Bildung einer Doppel-

' ' Kette von bindung zur Folge hat, veranlasst eine

ern

HO

HO

Methyl- und Hydridverschiebungen, die schließlich neutrales Lanosterin ergeben.

Lanosterin

Cholesterin

Cholesterinstoffwechsel

_ ist ein Vorgang von 19 Schritten, der eine Oxidation und den Verlust von drei Methylgruppen beinhaltet. Die Enzyme, die für diesen Prozess benötigt werden,

sind in die Membran des endoplasmatischen Reticulums eingebettet.

Verwendung von Cholesterin Cholesterin ist der Vorläufer von Steroidhormonen wie Cortison, Androgenen

und Östrogenen (Abschnitt 9.1E). Die Leber wandelt Cholesterin in Gallensäure um (Abb. 20.1), die als Emulgator bei der Verdauung und Resorption von Fetten WERE U wirkt (Abschnitt 20.1A). Ein effizientes Recyclingsystem erlaubt es der Gallensäure wieder in den Blutkreislauf einzutreten und zur Leber zurückzukehren, um mehrere Male pro Tag wieder verwendet zu werden. Gallensäure, die dieser Wiederverwertung entkommt, wird von intestinalen Mikroorganismen weiter abgebaut und ausgeschieden. Dies ist der einzige Weg auf dem Cholesterin ausgeschieden wird. Von der Leber synthetisiertes Cholesterin kann von der Acyl-CoA:CholesterinAcyltransferase (ACAT) verestert werden. So entstehen Cholesterinester:

Cholesterinester

Diese stark hydrophoben Verbindungen werden in Lipoproteinkomplexen durch den Körper transportiert (Abschnitt 20.1B).

B.

HMG-CoA-Reduktase kontrolliert die Syntheserate von Cholesterin

HMG-Reduktase ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Cholesterinbiosynthese (Abb. 20.37) und die wichtigste Stellschraube zur Regulierung dieses Stoffwechselwegs. Das Enzym wird zum einen durch kurzfristig wirkende Mechanismen wie kompetitive Hemmung, allosterische Effekte und kovalente Modifikationen, zum anderen durch eine langfristige Modulation der Enzymproduktion reguliert. Zu der Regulation durch kovalente Modifizierung gehört eine physiologisch wichtige, reversible Phosphorylierung. Wie die GlykogenPhosphorylase, die Glykogen-Synthase und andere Enzyme, so kommt auch die HMG-CoA-Reduktase in einer aktiven und in einer inaktiven Form vor. Beide Formen unterschieden sich nur durch eine reversible Phosphorylierung. Dabei ist das Enzym, das am Ser 871 phosphoryliert ist, die weniger aktiver Form. Die Phosphorylierung wird durch die AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK) katalyisiert. Dies ist das gleiche Enzym, das die Acetyl-CoA-Carboxylase inaktiviert (Abschnitt 20.4B). Der biologische Hintergrund diese Regulation ist einfach nachzuvollziehen: Fällt der ATP-Spiegel und steigt damit der AMP-Spiegel, dann wird die AMPK aktiviert. Diese inhibiert die Biosynthesewege, bei denen CoA verbraucht wird, und somit auch die Fettsäurespeicherung. Der vorrangige Regulationsmechanismus für die HMG-CoA-Reduktase ist jedoch die langfristige Rückkopplungskontrolle über die Enzymmenge, die in der Zelle verfügbar ist. Die Enzymmenge kann bis auf das 200fache ansteigen, wenn die Enzymbiosynthese zunimmt und gleichzeitig weniger Enzym abgebaut wird. Cholesterin selbst reguliert die Expression des HMG-CoA-Reduktase-Gens sowie die Expression von über 20 anderen Genen, die an seiner Biosynthese und Aufnahme

783

784

_ Lipidstoffwechsel

Abb. 20.41 Cholesterinvermittelte proteolytische Aktivierung von SREBP. Ist der Cholesterinspiegel in der Zelle hoch, sitzt der SREBP-SCAP-Komplex im ER. Ist der Cholesterinspiegel dagegen niedrig, begleitet SCAP SREBP über Membranvesikel zum Golgi-Apparat. Dort wird SREBP durch die membrangebundenen Proteasen SIP und S2P proteolytisch gespalten. Dabei wird die N-terminale Domäne von SREBP freigesetzt, die in den Zellkern gelangt, wo sie an die SREs ihrer Ziel-Gene bindet. Auf diese Weise wird die Transkription dieser Gene eingeleitet.

SCAP

SREBP

endoplasmisches Reticulum

Cytosol Lumen

_

Zellkern

[Nach Goldstein, J., Rawson, R.B. und Brown, M.,

Arch. Biochem. Biophys. 397, 139 (2002).]

GolgiApparat

Serinprotease

Metalloprotease

beteiligt sind. Dazu gehört auch das Gen, das den LDL-Rezeptor codiert. Diese Gene enthalten alle eine spezifische Erkennungssequenz (Abfolge von definierten Nucleotidsequenzen der DNA) mit der Bezeichnung Sterolregulationselement (SRE; die Steuerung der eukaryotischen Genexpression wird in Kapitel 28 ausführlicher besprochen). Wie Brown und Goldstein gezeigt haben, erfordert die Transkription der SRE-regulierten Gene, dass das Protein SREBP (engl.: sterol regulatory element binding protein) an das SRE bindet. Ist der Cholesterinspiegel hoch, dann ist SREBP in der Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) als eine inaktive Vorstufe aus 1160 Aminosäuren gemeinsam mit dem Protein SCAP (engl.: SREBP cleavage activating protein) lokalisiert. SCAP ist ein intrazellulärer Cholesterinsensor aus 1276 Aminosäuren, der zwei Domänen besitzt: eine N-terminale Transmembrandomäne, die SSD (sterol-sensing domain), die mit Sterolen wechselwirkt und eine C-terminale Domäne, die fünf Kopien eines Motivs für Protein-Protein-Wechselwirkungen enthält, einen sogenannten WD-Repeat. Dieser WD-Repeat interagiert mit der C-terminalen sogenannten Regulationsdomäne von SREBP (Abb. 20.41). Wenn die ER-Membran an Cholesterin verarmt, ändert SCAP seine Konformation und transportiert sein gebundenes SREBP über Membranvesikel zum Golgi-Apparat. Anschließend wird SREBP nacheinander von zwei Golgi-Proteasen gespalten: S1P (site-1 protease), einer Serinprotease, die SREBP nur spaltet, wenn es mit SCAP assoziiert ist, und S2P (site-2 protease), einer Zink-Metalloprotease, die SREBP an einer durch die S1P-Spaltung exponierten Peptidbindung schneidet. Dies hat die Freisetzung des aktiven Fragments zur Folge. Das aktive Fragment ist ein lösliches Protein aus 480 Aminosäuren, das zum Zellkern wandert, wo es

die Transkription von Genen aktiviert, die ein SRE enthalten. Die Genaktivierung erfolgt durch Bindung des SREBP an das SRE über ein DNA bindendes basisches Helix-Loop-Helix-Motiv (DHLH; Abschnitt 24.4C; Abb. 20.41). Dabei steigt der Cholesterinspiegel solange, bis SCAP keine Translokation von SREBP zum Golgi-Apparat mehr auslöst - ein klassischer Fall einer Rückkopplungshemmung.

Cholesterinstoffwechsel

785

Statine hemmen die HMG-CoA-Reduktase

Bei erhöhten Cholesterinwerten spricht man von einer Hypercholesterinämie, die sich mit Arzneimitteln, den sogenannten Statinen, behandeln lässt. Statine hemmen die HMG-CoA-Reduktase (Abb. 20.42). Diese Verbindungen enthalten eine HMG-artige Gruppe, die kompetitiv die Bindung von HMG-CoA an das Enzym hemmt. Die Statine binden extrem fest, die K-Werte liegen im nanomolaren Bereich, wohingegen das Substrat HMG-CoA einen KyrWert von etwa 4 uM hat. Die Röntgenstrukturen der HMG-CoA-Reduktase in ihren Komplexen mit sechs verschiedenen Statinen zeigen, dass die voluminösen, hydrophoben Grup-

pen der Inhibitoren eine wichtige Rolle bei der Regulation der Enzymaktivität spielen. Das aktive Zentrum der HMG-CoA-Reduktase nimmt normalerweise NADPH sowie den Pantothenatanteil von CoA auf. Die Statinbindung beeinträchtigt die NADPH-Bindung nicht. Das Enzym verändert aber seine Konformation, um die großen, hydrophoben Gruppen der Statine aufzunehmen. Es scheint, dass diese Inhibitoren die Flexibilität des Enzymes ausnützen. Obwohl die verschiedenen Statine sich strukturell unterscheiden, haben sie alle ausgedehnte van-der-Waals-Kontakte mit dem Enzym. Der hohe Grad an Komplementarität zwischen den Statinen und dem aktiven Zentrum - der eine Folge der Enzymflexibilität ist — ist für die extrem hohen Inhibitorkonstanten verantwortlich. Die anfänglich verringerte zelluläre Cholesterinversorgung, die durch die Statine verursacht wird, wird durch die Induktion des LDL-Rezeptors und der HMG-CoA-Reduktase kompensiert (Abschnitt 20.1B und 20.7C; Abb. 20.8), sodass im neuen Fließgleichgewicht die HMG-CoA-Konzentration nahezu derjenigen entspricht, wie sie vor der Medikamentbehandlung vorlag. Die erhöhte Zahl der LDL-Rezeptoren verursacht, dass verstärkt LDL und IDL (der ApoB100-haltige Vorläufer für LDL) aus dem Blut aufgenommen werden, sodass der LDL-Cholesterinspiegel beträchtlich sinkt.

HO

HO,

[6)

Abb. 20.42 Kompetitive Hemmstoffe der HMG-CoA-Reduktase, die zur Behandlung der Hypercholesterinämie eingesetzt werden.

= Ze xXeH

xXx=H X=CH,

R=CH,

Lovastatin (Mevacor)

R=OH R=CH,;,

Pravastatin (Pravachol) Simvastatin (Zocor)

Atorvastatin (Lipitor)

Die Strukturformeln von Lovastatin, Pravastatin

(Mevalutin, Pravasin), Simvastatin und Atorvastatin (Sortis) sind hier dargestellt. Diese Verbindungen werden als Statine bezeichnet. Zum Vergleich sind die Strukturformeln von HMG-CoA und des HMG-CoA-Reduktase-Produkts,

HO

coo-

nd

HO

4,0

=

10)

coo

H;0“

S—CoA

HMG-CoA

OH

Mevalonat

Mevalonat,

gezeigt. Man erkennt, dass Lovastatin, Pravastatin und Simvastatin Lactone sind, wohingegen es sich bei Atorvastatin und Mevalonat um Hydroxysäuren handelt. Die Lactone sind sogenannte Prodrugs und werden in vivo enzymatisch hydrolysiert, sodass die aktiven Hydroxysäureformen

entstehen.

786

Lipidstoffwechsel

C.

Ein anomaler Cholesterintransport führt zu Atherosklerose

Wie schon oben erwähnt, hängt die zelluläre Cholesterinkonzentration nicht nur von der Syntheserate des Cholesterins ab, sondern auch von der Fähigkeit der Zellen, Cholesterin von den zirkulierenden Lipoproteinen aufzunehmen (Abschnitt 20.1B). Die Rolle des Lipoproteins im Cholesterinstoffwechsel hat ınan ausgiebig untersucht, da erhöhte Cholesterinkonzentrationen im Blut — hauptsächlich in Form von LDE - einen großen Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellen.

Atherosklerose entsteht durch eine Lipidansammlung in der Arterienwand

Über die Hälfte aller Krankheits- und Todesfälle in den industrialisierten Ländern sind auf eine stenosierende Gefäßerkrankung der großen Arterien zurückzuführen, die auf Vorschlag des Leipziger Pathologen Marchand als Atherosklerose bezeichnet wird (von griech.: atheroma, „Grützbeutel“ und sclerosis, „Verhärtung“). Die „Arteriosklerose“ ist dagegen ein Überbegriff für andere arterielle Gefäßerkrankungen. Die Atherosklerose ist eine schleichende Krankheit, die durch die Einlagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen und einen chronischen Entzündungsprozess charakterisiert ist. Dies führt zu einer Einengung des Gefäßlumens mit einer Mangelversorgung des nachgeschalteten Gewebes. Charakteristische Lokalisationen mit klinischen Manifestationen der Atherosklerose finden sich in den Koronargefäßen (Angina Pectoris und Herzinfarkt), an den Halsarterien (Schlaganfall), an der großen Beinarterein (periphere Verschlußkrankheit) und der Aorta (Aneurysma-Bildung). Die Atherosklerose beginnt mit einer übermäßigen Penetration cholesterinreicher Lipoproteine (LDL) in die innere Aderhaut (Intima) der Arterie. Dies wird begünstigt durch Blutkonzentrationen der LDL und einen erhöhten Scherstress mit Druckbelastung. LDL können durch Bindegewebsgrundsubstanz (Proteoglykane, Kollagen) in der Arterienwand festgehalten werden. (Abschnitt 8.3A). Die immobilisierten LDL werden durch Radikale und enzymatische Vorgänge modifiziert. Die oxidierten LDL induzieren die Ausprägung von Zelladhäsionsrezeptoren an der Gefäßoberfläche des Endothels (z.B. VCAM-1), sie lösen somit eine Entzündungsreaktion aus. Durch diese werden Monocyten, eine Gruppe der weißen Blutkörperchen, aus dem Blut angelockt, die dann über Adhäsionsmoleküle und durch den Einfluss von Chemokinen (z.B. monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) in die Intimaschicht eindringen. Unter dem Einfluss von Cytokinen, wie dem macrophage-colony-stimulating factor (MCSF) differenzieren sich die Monocyten dort zu Makrophagen. Makrophagen bilden Fressrezeptoren (Scavenger-Rezeptoren) aus, die oxidierte und modifizierte Lipoproteine aufnehmen. Unveränderte LDL werden durch Makrophagen nur in geringem Unfang aufgenommen. Dieser Scavenger-rezeptorvermittelte Aufnahmeweg unterliegt keinem feedbackMechanismus. Bei einem großen Angebot an cholesterinreichen Lipoproteinen kommt es daher zu einer Überladung der Makrophagen mit Cholesterinestern. Sie wandeln sich zu „Schaumzellen“ mit Lipidtröpfchen um, die schließlich in Apoptose übergehen. Das freigesetzte Lipidmaterial induziert dann den Endzündungsprozeß von neuem. Die Schaumzellen geben zusätzlich Wachstumsfaktoren ab, was auch bei glatten Muskelzellen und Makrophagen selbst eine Proliferation verursacht. Dies führt dann zur Ausbildung von Fettstreifen („fatty streak“) und schließlich zu einer atherosklerostischen Plaque mit einer fibroproliferativen Umwandlung der Gefäßwand (Abb. 20.43). Es bildet sich ein Lipidkern (Atherom) aus, der nur noch von einer dünnen Schicht aus Bindegewebe und glatten Muskelzellen sowie Endothel vom Blutstrom abgeschirmt ist. Eine Ruptur der Plaque (z.B. durch Kontraktion) führt zu einem schnell eintretenden thrombotischen Verschluss des Lumens, der in der Koronararterie dann zum Myokardinfarkt (Herzinfarkt) führt. Wird der Blutfluss zum Gehirn gestoppt, verursacht dies einen Schlaganfall.

Cholesterinstoffwechsel

787

Die Entstehung der Atherosklerose steht somit in engem Zusammenhang mit der Konzentration des zirkulierenden LDL (man nennt dieses oft auch „schlechtes Cholesterin“). Viele Formen fettreicher Ernährung können zur Atherosklerose beitragen, indem sie die LDL-Konzentration erhöhen, aber auch genetische

Faktoren und Infektionen erhöhen das Risiko für Atherosklerose. Rauchen trägt zur Entstehung der Krankheit bei, weil der Zigarettenrauch LDL oxidiert, wodurch es vermehrt von Makrophagen aufgenommen wird. Bei Personen, die insgesamt eine niedrige Cholesterinkonzentration im Blut haben und eine hohe HDL-Konzentration (das „gute Cholesterin“), tritt Atherosklerose seltener auf. Diese Lipoproteine transportieren überschüssiges Cholesterin zur Leber, wo es für die Bildung von Gallensalzen zur Verfügung steht. Frauen haben mehr HDL als Männer und somit ein geringeres Risiko für koronare Atherosklerose. Auch Statine senken das Risiko einer Herz-Kreislauf-Erkrankung, indem sie die Cholesterinkonzentration im Blut verringern (Abschnitt 20.7B). LDL-Rezeptormangel verursacht Hypercholesterinämie

Die LDL-Rezeptoren spielen nachgewiesenermaßen eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der LDL-Plasmakonzentration. Zirkulierendes LDL und IDL (die beide Apolipoproteine enthalten, die spezifisch an den LDL-Rezeptor binden) gelangen über die rezeptorvermittelte Endocytose (Abb. 20.8) erneut in die Leber. Personen, die an der erblichen familiären Hypercholesterinämie (FH) leiden, haben keine funktionsfähigen LDL-Rezeptoren. FH-Homozygote, denen der Rezeptor vollständig fehlt, haben so hohe Konzentrationen des cholesterinreichen LDL im Blutplasma, dass ihr Cholesterinspiegel im Blut drei- bis fünfmal höher ist als durchschnittlich (normal sind rund 200 mg/dL). Dies führt dazu, dass sich Cholesterin in der Haut und den Sehnen als gelbe Knoten ablagert, man spricht dann von Xanthomen. Das größte Problem dieser Erbkrankheit ist das erhöhte Risiko der Entwicklung einer Atherosklerose. Betroffene Personen können bereits im Alter von fünf Jahren einen Herzinfarkt bekommen. FH-Heterozygote (etwa eine von 500 Personen haben etwa halb so viele funktionsfähige LDL-Rezeptoren wie Gesunde und ihr LDL-Plasmaspiegel ist etwa doppelt so hoch wie im Bevölkerungsdurchschnitt. Sie entwickeln normalerweise erst nach dem 30. Lebensjahr Symptome einer Herz-Kreislauf-Erkrankung. Der Verzehr fettreicher/cholesterinreicher Nahrung über einen langen Zeitraum hat ähnliche, wenngleich deutlich geringere, Auswirkungen wie die FH. Cholesterin reguliert die Synthese des LDL-Rezeptors mithilfe des gleichen Mechanismus, der auch die Synthese der HMG-CoA-Reduktase reguliert (Abschnitt 20.7A). Infolgedessen hemmen hohe intrazelluläre Cholesterinkonzentrationen die Synthese des LDL-Rezeptors, sodass mehr LDL-Partikel im Blutkreislauf bleiben. Überschüssiges Cholesterin aus der Nahrung, das über Chylomikronen zum Gewebe transportiert wird, trägt somit zu hohen LDL-Plasmakonzentrationen bei. Cholesterinfreisetzung aus den Zellen Nur wenige Zelltypen verbrauchen Cholesterin zur Steroidhormonsynthese oder zur Bildung von Gallensalzen, aber alle Zellen benötigen Cholesterin, um die Membranfluidität zu erhalten. Überschüssiges Cholesterin, das zu diesem Zweck nicht gebraucht wird, kann durch Acyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) verestert und als Cholesterinester in intrazellulären Depots gespeichert werden. Cholesterin kann auch aus Zellen beseitigt werden. Der dafür verwendete Mechanismus wurde durch Untersuchungen an Personen mit der Tangier-

Krankheit aufgeklärt. Bei dieser rezessiv vererbten Krankheit wird nahezu kein HDL gebildet, weil die Zellen ein defektes Transportprotein haben — das ATP-

Bindeprotein Al (ABCA1), das zur Klasse der ABC-Transporter (ATP binding casette Transporter) gehört. Bei normalen Menschen fungiert ABCA1 offensichtlich als Flippase (Abschnitt 9.4C), um Cholesterin, Cholesterinester und andere Lipide von der inneren in die äußere Schicht der Plasmamembran zu befördern. Dort können

Abb. 20.43 Atherosklerotische Ablagerung in einer Koronararterie. Die Blutgefäfßwand ist infolge von Lipidansammlungen und Entzündungsprozessen dramatisch verdickt. [© Eye of Science/Photo Researchers.]

788

Lipidstoffwechsel Cholesterin Phospholipid Apolipoprotein B-100

Apolipoprotein AI

di

(b) Familiäre ‚Hypercholesterinämie

Verständnisfragen zu Abschnitt 7 1. Beschreiben Sie die verschiedenen Reaktionstypen, die für die Cholesterinsynthese benötigt werden. 2. Wie kontrolliert Cholesterin seine eigene Synthese? 3. Was enthüllen familiäre Hypercholesterinämie und Tangier-Krankheit über die Entwicklung von Atherosklerose?

(c) Tangier-Krankheit

Abb. 20.44 Rolle von LDL und HDL im Cholesterinstoffwechsel. (a) Zellen nehmen Cholesterin und Cholesterinester über die LDL-rezeptorvermittelte Endocytose von LDL auf (violett). Der ABCA1-Transporter unterstützt die Freisetzung von Cholesterin in Form von HDL (orange). (b) Bei der familiären Hypercholesterinämie verursacht der Mangel an funktionsfähigen LDL-Rezeptoren hohe Konzentrationen von zirkulierendem LDL. (c) Bei der Tangier-Krankheit sind die Zellen mit Cholesterin und Cholesterinestern überladen, weil auf Grund des Mangels an funktionsfähigem ABCAI kein Cholesterin ausgeschleust werden kann.

sie von Apolipoprotein A-1 aufgegriffen werden, um HDL zu bilden. Zellen, die kein ABCA1 haben, können Cholesterin nicht abgeben und häufen Cholesterinester im Cytoplasma an. Mit Lipiden gefüllte Makrophagen tragen zur Entwicklung der Atherosklerose bei, sodass Personen mit Tangier-Krankheit ähnliche Symptome haben wie diejenigen, die an der FH leiden. In Abbildung 20.44 sind die Funktionen des LDL-Rezeptors und des ABCA1 bei der Cholesterinhomöostase schematisch dargestellt.

Zusammenfassung 1. Die Verdauung von Triacylglycerinen hängt von der emulgierenden Wirkung der Gallensäuren und der Aktivierung der Lipasen an der Wasser-LipidGrenzfläche ab. 2. Lipoproteine sind Komplexe aus unpolaren Lipiden, die von einer Hülle aus amphipathischen Lipiden und Apolipoproteinen umgeben sind. Sie transportieren Lipide in der Blutbahn. Zellen nehmen Cholesterin und andere Lipide durch die rezeptorvermittelte Endocytose von LDL auf. 3. Die Fettsäureoxidation beginnt mit der Aktivierung der Acylgruppen, indem diese mit CoA einen Thioester bilden. Die Acylgruppen werden für den Transport in die Mitochondrien auf Carnitin übertragen und in den

Mitochondrien wieder mit CoA verestert.

Zusammenfassung

Die ß-Oxidation verläuft in vier Reaktionen: (1) Bildung einer a,ß-Doppelbindung, (2) Hydratisierung der Doppelbindung, (3) Dehydrierung unter Bildung von ß-Ketoacyl-CoA und (4) Thiolyse durch CoA, wobei Acetyl-CoA und ein Acyl-CoA entstehen, das um zwei Kohlenstoffatome verkürzt ist. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis Fettsäuren mit einer geraden Anzahl Kohlenstoffatome vollständig zu Acetyl-CoA abgebaut sind und Fettsäuren mit einer ungeraden Anzahl Kohlenstoffatome in Acetyl-CoA und ein Molekül Propionyl-CoA überführt wurden. Das Acetyl-CoA wird im Citratcyclus und der oxidativen Phosphorylierung oxidiert, um ATP zu bilden. Zur Oxidation ungesättigter Fettsäuren wird eine Isomerase benötigt, um A°-Doppelbindungen in A?-Doppelbindungen zu überführen, und eine Reduktase, die A*-Doppelbindungen entfernt. Die Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren ergibt Propionyl-CoA, welches in einem Cobalamin (B12)-abhängigen Weg in Succinyl-CoA umgewandelt wird. Sehr langkettige Fettsäuren werden zunächst teilweise von einem System aus drei Enzymen in den Peroxisomen abgebaut. Die Leber verwendet Acetyl-CoA für die Bildung von Acetoacetat und ß-Hydroxybutyrat, die in die Blutbahn abgegeben werden. Gewebe, die solche Ketonkörper als Energiequelle nutzen, wandeln diese wieder in Acetyl-CoA um. Bei der Fettsäuresynthese wird das Acetyl-CoA aus den Mitochondrien über das Tricarboxylat-Transportsystem in das Cytosol transportiert und durch die Acetyl-CoA-Carboxylase in Form von Malonyl-CoA aktiviert. In einer Serie von sieben Enzymaktivitäten, die in Säugern in einem multifunktionellen homodimeren Enzym vereinigt sind, werden die AcylACP-Ketten jeweils um zwei Kohlenstoffatome verlängert. Eine enzymgebundene Acylgruppe und ein Malonyl-CoA kondensieren und bilden ein ß-Ketoacylzwischenprodukt und CO,. Zwei Reduktionen und eine Dehydratisierung ergeben Acyl-ACP in einer Abfolge von Reaktionen, die denen der Umkehrung der ß-Oxidation ähnlich sind, aber von anderen Enzymen im Cytosol katalysiert werden. Palmitat (C,,) ist das häufigste Produkt der Fettsäurebiosynthese und wird in sieben dieser Reaktionskreisläufe synthetisiert und anschließend durch die Thioesterase von ACP abgespalten. Andere Fettsäuren werden aus Palmitat durch Elongasen und Desaturasen gebildet. Menschliche Triacylglycerine, die aus Fettsäure-Acyl-CoA und Glycerinaldehyd-3-phosphat oder Dihydroxyacetonphosphat gebildet werden, tragen häufig gesättigte Fettsäuren am C1 und ungesättigte Fettsäuren am C2. 10. Fettsäureabbau und Fettsäuresynthese werden als gegenläufige Stoffwechselwege hormonell reguliert. Glucagon und Adrenalin aktivieren die hormonsensitive Lipase im Fettgewebe, wodurch mehr Fettsäuren für die Oxidation in anderen Geweben zur Verfügung stehen, außerdem hemmen sie die Acyl-CoA-Carboxylase. Insulin hat die entgegengesetzte Wirkung. Hormone regulieren zudem die Mengen der Acetyl-CoA-Carboxylase und Fettsäure-Synthase, indem sie die Geschwindigkeit kontrollieren, mit der diese Enzyme synthetisiert werden. file Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin aus Säugern werden aus 1,2-Diacylglycerin und den CDP-Derivaten der Kopfgruppen gebildet. Die Synthese von Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerin und Cardiolipin beginnt mit CDP-Diacylglycerin. 122 Sphingolipide werden aus Ceramiden (N-Acylsphingosin, ein Derivat von

Palmitat und Serin) durch die Addition von Glykosyleinheiten gebildet, die aus den Zuckerteilen von Nucleotiden gewonnen werden. 13: Arachidonat ist die Vorstufe der Prostaglandine. Bestimmte Arzneistoffe, einschließlich Aspirin, blockieren die Prostaglandinsynthese, indem sie die Cyclooxygenase hemmen.

789

790

Lipidstoffwechsel

14. Cholesterin wird aus Acetyleinheiten synthetisiert, welche auf dem Wege zu C;-Isopreneinheiten die Zwischenstufen HMG-CoA und Meyalonat

durchlaufen. Sechs Isopreneinheiten kondensieren, um die C;,-Verbindung

Squalen zu bilden, die zu Lanosterin cyclisiert, welches die steroide Ausgangsverbindung von Cholesterin ist. 15. Ein Cholesterin registrierendes System im endoplasmatischen Reticulum reguliert die Synthese der HMG-CoA-Reduktase und des LDL-Rezeptors in der Zelle. Die HMG-CoA-Reduktase ist empfindlich für Statinmedikamente. 16. Die mit bestimmten genetischen Schädigungen oder einer sehr cholesterinreichen Ernährung verknüpfte Hypercholesterinämie trägt zur Entwicklung der Atherosklerose bei.

Wichtige Begriffe Grenzflächenaktivierung Chylomikron VLDL IDL LDL

rezeptorvermittelte Endocytose B-Oxidation homolytische Spaltung heterolytische Spaltung Ketogenese

HDL Apolipoprotein

Ketose Acyl-Carrier-Protein

Elongase Desaturase

essentielle Fettsäuren hormonsensitive Lipase Lipidspeicherkrankheit Hypercholesterinämie Atherosklerose

Aufgaben le Erklären Sie, warum

Patienten mit vererbtem Mangel an Carnitin-Palmitoyltransferase II Muskelschwäche aufweisen. Warum verschlimmern sich diese Symptome beim Fasten? Entfernt man aus Triacylglycerinen die Fettsäuren, so bleibt Glycerin übrig. Zeigen Sie, wie mittels GlycerinKinase und Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase aus Glycerin ein Zwischenprodukt der Glykolyse gebildet wird. Die ersten drei Schritte der ß-Oxidation (Abb. 20.12) ähneln chemisch drei aufeinander folgenden Schritten des Citratcyclus. Welche Schritte sind gemeint? Bestimmte Fettsäuren mit verzweigten Ketten wie Pristansäure

1%

me

CH; £*CH—- CH, CH,—-CHzI;CH— X . Pristansäure

können die ß-Oxidation durchlaufen. (a) Wie viele Cyclen ßB-Oxidation sind notwendig, um diese Fettsäuren vollständig abzubauen? (b) Wie viele C,- (Acetyl-CoA-), Cz- (Propionyl-CoA-) und C,- (Methylpropionyl-CoA-) Produkte entstehen dabei? .

Warum sind von einer Person, die die Aufnahme von

Energie aus der Nahrung begrenzen muss, ungesättigte Fette gesättigten Fetten vorzuziehen? Erklären Sie, warum der Abbau ungeradzahliger Fettsäureketten die Aktivität des Citratcyclus ankurbeln kann.

Die vollständige Verbrennung von Palmitat und Glucose ergibt 9781 kJ-mol”' bzw. 2850 kJ-mol”' Freie Enthalpie. Vergleichen Sie diese Werte mit der Freien Enthalpie

(in Form von ATP), die durch den Abbau von Palmitat und Glucose in der Zelle gewonnen wird. Welcher Prozess ist effizienter? Warum ist es von Bedeutung, dass Leberzellen die 3-Ketoacyl-CoA-Transferase (Abb. 20.22) fehlt? Das Tricarboxylat-Transportsystem stellt das cytosolische Acetyl-CoA für die Palmitatsynthese bereit. Wie viel Prozent des insgesamt für die Synthese von Palmitat benötigten NADPH wird auf diese Weise gebildet? 10. An welchen Kohlenstoffatomen erscheint die Markierung

von ''CO,, das für die Synthese von Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA verwendet wurde, in Palmitat? iR Erklären Sie, warum Fettzellen (Adipocyten) sowohl Glucose als auch Fettsäuren benötigen, um Triacylglycerine zu bilden. 12% Ist für die Fettsäure, die nachfolgend gezeigt ist, anzunehmen, dass sie in Tieren synthetisiert wird? Erklären Sie die Antwort.

CH;

CH,—-CH= CH%+#CH,%—-C

HH

16)

N 9”

13. Vergleichen Sie den Energieaufwand (in ATP-Äquivalen-

ten), der für die Synthese von Stearat aus mitochondrialem Acetyl-CoA notwendig ist, mit der Energie, die durch den Abbau von Stearat zu (a) Acetyl-CoA und (b) CO, gewonnen wird.

Literatur

14. Einem Tier wird Palmitat gefüttert, dessen Carboxylgruppe “C-markiert ist. (a) Wo erschiene unter ketogenen Bedingungen die Markierung in Acetoacetat? (b) Wo erschiene die Markierung im Falle der Synthese von Membranlipiden in Sphinganin? 15. Personen mit Hypercholesterinämie, die Statine einnehmen, wird manchmal geraten, Nahrungsergänzungsmittel mit Coenzym Q zu nehmen. Erklären Sie dies.

791

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 23 The role of uncoupling proteins in obesity The properties of adipose tissue factors that uncouple oxidative phosphorylation are discussed, and possible links between uncoupling proteins and obesity are examined.

Literatur Lipoproteine

Metabolismus anderer Lipide

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Alle Organismen benötigen eine Stickstoffquelle. Komplexe Stoffwechselwege wandeln einige wenige stickstoffhaltige Verbindungen in zahlreiche andere um. Dazu zählen auch die Aminosäuren für die Proteinsynthese. Diese grünen Bohnen

wachsen in Symbiose mit Mikroorganismen, die Stickstoff für sie verfügbar machen. Andere Kulturpflanzen benötigen stickstoffhaltigen Dünger. [Maurice Nimmo/Corbis Images]

Aminosäuremetabolismus Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 29 Interactive Exercise 30 Interactive Exercise 31 Animated Figure 21-8 Animated Figure 21-9 HE

DE

TREE

ZEHTETIEETEESESTTEFTZRTTEN

Der Stoffwechsel der Aminosäuren umfasst ein breites Spektrum synthetischer und abbauender Reaktionen. Dabei werden Aminosäuren sowohl als Ausgangsverbindungen für Polypeptide und andere Verbindungen als auch zur Gewinnung von Stoffwechselenergie herangezogen. Die chemischen Umwandlungen der Aminosäuren unterscheiden sich von denen der Kohlenhydrate und Lipide darin, dass sie das Element Stickstoff einbeziehen. Wir wollen deshalb zunächst den Ursprung des Stickstoffs in biologischen Systemen und dessen Ausscheidung näher betrachten. Ein Großteil der zellulären Aminosäuren wird in Proteine eingebaut, die kontinuierlich synthetisiert und abgebaut werden. Neben diesem dynamischen Pool von polymerisierten Aminosäuren gibt es keine echte Speicherform von Aminosäuren analog zu Glykogen oder Triacylglycerinen. Säugetiere synthetisieren einige Aminosäuren und beziehen die übrigen aus ihrer Nahrung. Überschüssige Aminosäuren aus der Nahrung werden nicht einfach ausgeschieden, sondern in verbreitete metabolische Zwischenprodukte umgewandelt, die dann Vorläufer von Glucose, Fettsäuren und Ketonkörpern sind. Sie dienen daher als Stoffwechselbrennstoffe. In diesem Kapitel betrachten wir die Stoffwechselwege der Aminosäuren. Dabei beginnen wir mit dem Abbau der Proteine und der Desaminierung (Entfernung der Aminogruppe) ihrer Aminosäurebausteine. Danach untersuchen wir den Einbau von Stickstoff in Harnstoff für dessen Ausscheidung. Anschließend betrachten wir die Wege, über die das Kohlenstoffgerüst einzelner Aminosäuren zerlegt bzw. synthetisiert wird. Wir beenden das Kapitel mit einer kurzen Betrachtung einiger anderer biosynthetischer Stoffwechselwege, bei denen Aminosäuren beteiligt sind, und der Stickstofffixierung, eines Prozesses, bei dem atmosphärisches N, in eine biologisch verwendbare Form überführt wird.

1 _ Intrazellulärer Proteinabbau Die Bestandteile lebender Zellen unterliegen einem ständigen Auf- und Abbau. Die Lebensdauer eines Proteins kann bei wenigen Minuten bis zu vielen Wochen liegen. Infolgedessen synthetisieren Zellen ständig Proteine aus Aminosäuren Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyrisht © 2010 WILEY-VCH

Verlag GmbH

& Co. KGaA, Weinheim

Aminosäuremetabolismus e Intrazellulärer Proteinabbau e Aminosäuredesaminierung e Der Harnstoffeyclus e Aminosäureabbau

e Aminosäurebiosynthese © Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels

e Stickstofffixierung

794

Aminosäuremetabolismus

Tab. 21.1 Halbwertszeiten einiger Enzyme aus der Rattenleber.

Enzyme

Halbwertszeit (h)

Kurzlebige Enzyme Ornithin-Decarboxylase

0,2

RNA-Polymerase I

163

Tyrosin-Aminotransferase

2,0

Serin-Dehydratase

4,0

PEP-Carboxylase

5,0

Langlebige Enzyme Aldolase

118

GAPDH

130

Cytochrom b

130

LDH

130

Cytochrom c

150

Quelle: Dice, J.F., und Goldberg, A.L., Arch. Biochem. Biophys. 170, 214 (1975).

Vorund bauen sie wieder zu diesen ab. Dieser anscheinend verschwenderische gen Proteine gang hat drei Funktionen: (1) Nährstoffe werden in Form von im speichert und bei Bedarf wieder freigesetzt — Vorgänge, die insbesondere ng Anhäufu deren Muskelgewebe von Bedeutung sind. (2) Abnormale Proteine, schädlich für die Zelle sein würde, werden entfernt und (3) eine Regulation des

zellulären Metabolismus wird möglich, indem überflüssige Enzyme und regulatorische Proteine gezielt abgebaut werden. Die Kontrolle der Abbaugeschwindigkeit eines Proteins ist demzufolge für den Haushalt der Zelle und des Organismus ebenso wichtig wie die Kontrolle der Bildungsgeschwindigkeit. Die Halbwertszeiten verschiedener Enzyme eines bestimmten Gewebes unterscheiden sich wesentlich voneinander, wie aus Tabelle 21.1 für die Rattenleber zu entnehmen ist. Bemerkenswerterweise werden die Enzyme der metabolischen

Kontrollpunkte am schnellsten abgebaut, während die relativ stabilen Enzyme nahezu

konstante katalytische Aktivitäten unter allen physiologischen Bedingungen aufweisen. Die Anfälligkeiten der Enzyme gegenüber dem Abbau haben sich offensichtlich parallel zu ihren katalytischen und allosterischen Eigenschaften entwickelt, sodass Zellen effizient auf Veränderungen der Umgebung und der metabolischen Anforderungen reagieren können. Die Geschwindigkeit des Proteinabbaus in einer Zelle wird darüber hinaus von ihrem Ernährungs- und Hormonzustand beeinflusst. Bei Nahrungsmangel erhöhen Zellen z.B. die Geschwindigkeit des Proteinabbaus, um notwendige Nährstoffe für unentbehrliche metabolische

Prozesse bereitzustellen.

A.

Lysosomaler Abbau

Lysosomen enthalten rund 50 hydrolytische Enzyme, darunter zahlreiche Proteasen, die auch als Cathepsine bekannt sind. Das Lysosom hält im Inneren einen pH von ca. 5 aufrecht; seine Enzyme weisen saure pH-Optima auf. Diese Situation schützt vermutlich die Zelle bei einem unbeabsichtigten Platzen der Lysosomen, da lysosomale Enzyme bei cytosolischen pH-Werten größtenteils inaktiv sind. Lysosomen bauen Substanzen ab, die von der Zelle durch Endocytose aufgenommen worden sind (Abschnitt 20.1B). Sie verwerten auch intrazelluläre Bestandteile, die in Vakuolen eingeschlossen sind und mit Lysosomen fusionieren. In nährstoffreichen Zellen verläuft der Iysosomale Abbau unselektiv. In hungernden Zellen würden jedoch über diesen Weg lebenswichtige Enzyme und Proteine abgebaut werden. Lysosomen besitzen daher auch einen selektiven Abbauweg, der bei lang anhaltendem Fasten aktiviert wird. Dabei werden cytosolische Proteine mit dem Pentapeptid Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ) oder mit nah verwandten Sequenzen selektiv importiert und abgebaut. Diese KFERQ-Proteine werden nur aus bestimmten Geweben entfernt, die sich dann als Antwort auf das Fasten verkleinern (z.B. Leber und Niere), jedoch nicht aus Geweben wie z.B. Gehirn und Hoden. Viele normale und pathologische Vorgänge sind mit erhöhter lysosomaler Aktivität verbunden, z.B. Muskelschwund, der durch Nichtgebrauch, Denervierung oder traumatische Verletzungen hervorgerufen werden kann. Die Rückbildung des Uterus nach der Geburt eines Kindes ist ein weiteres eindrucksvolles Beispiel. Dabei reduziert sich die Masse dieses Muskels von 2 kg auf 50 gin neun Tagen. Viele chronisch entzündliche Erkrankungen, wie z.B. die rheumatoide Arthritis, bedingen die extrazelluläre Freisetzung lysosomaler Enzyme, wobei umliegendes Gewebe zerstört wird. Abb. 21.1 Röntgenkristallstruktur von Ubiquitin. Das Polypeptid ist in den Spektralfarben von seinem N-Terminus (blau) bis zu seinem C-Terminus (rot) gefärbt. [Nach einer Röntgenstruktur von Charles Bugg, University of Alabama,

Birmingham. PDBid 1UBQ.] 6% siehe Interactive Exercises.

B.

Ubiquitin markiert Proteine für den Abbau

Der gezielte Abbau von Proteinen findet in eukaryotischen Zellen über einen ATP-abhängigen Weg statt, der unabhängig vom unspezifischen Abbau in den Iysosomen verläuft. An diesem Vorgang ist Ubiquitin (Abb. 21.1) beteiligt. Die-

Intrazellulärer Proteinabbau

ses aus 76 Aminosäuren bestehende Protein erhielt seinen Namen auf Grund der Tatsache, dass es überall und häufig (ubiquitär) vorkommt. Es gehört zu den am stärksten konservierten eukaryotischen Proteinen (die Ubiquitine aus

|

Ubiquitinf-C—0O

+

795

EIi—SH

sehr unterschiedlichen Organismen wie Mensch, Forelle und Drosophila sind identisch). Dies deutet darauf hin, dass es an lebensnotwendige Zellfunktionen einzigartig angepasst ist.

Proteine werden für ihren Abbau markiert, indem sie kovalent mit Ubiquitin verknüpft werden. Dieser Vorgang verläuft in drei Schritten, die vor allem von Avram Hershko, Aaron Ciechanover und Irwin Rose aufgeklärt wurden (Abb. 21.2). 1. In einer ATP-verbrauchenden Reaktion wird die C-terminale Carboxylgruppe von Ubiquitin als Thioester mit einer Cys-Seitenkette des ubiquitinaktivierenden Enzym (El) verknüpft. Die meisten Organismen besitzen nur einen E1-Typ. 2. Anschließend wird Ubiquitin auf eine spezielle Cys-Sulfhydrylgruppe eines der zahlreichen homologen Proteine der ubiquitinkonjugierenden Enzyme übertragen (E2; 11 bei der Hefe und über 20 bei Säugetieren). Die verschiedenen E2-Proteine sind durch einen aus etwa 150 Aminosäuren bestehenden katalytischen Kern charakterisiert, der das Cys des aktiven Zentrums enthält. 3. Die Ubiquitin-Protein-Ligase (E3) überträgt das aktivierte Ubiquitin von E2 auf die e-Aminogruppe eines zuvor gebundenen Proteins. Dabei wird eine Isopeptidbindung geknüpft. Zellen enthalten viele Arten von E3s, von denen jede die Ubiquitinylierung einer bestimmten Reihe von Proteinen vermittelt und sie dadurch für den Abbau markiert. Jedes E3 wird von einem oder einigen wenigen, spezifischen E2s beliefert. Die bekannten E3-Proteine gehören zu zwei nicht verwandten Familien: man unterschiedet E3-Proteine, die eine HECT-Domäne enthalten (HECT steht für homolog zum E6AP-CTerminus) und, diejenigen, die einen sogenannten RING-Finger enthalten (RING steht für really interesting new gene). Allerdings reagieren einige E2s mit den Vertretern beider Familien gut. Damit ein Protein effizient abgebaut wird, muss es mit mindestens vier in Kette verknüpften Ubiquitinmolekülen markiert sein. Dabei bildet Lys 48 eines jeden Ubiquitins eine Isopeptidbindung mit der C-terminalen Carboxylgruppe des nachfolgenden Ubiquitins. Diese Polyubiquitinketten können aus 50 oder mehr Ubiquitinmolekülen bestehen. Ubiquitinierte Proteine sind dynamische Gebilde, an die weitere Ubiquitinmoleküle rasch angehängt und wieder entfernt werden können (letzteres durch Ubiquitin-Isopeptidasen). Das Ubiquitinsytem hat sowohl Haushalts- als auch Regulationsfunktionen Bis Mitte der 1990er Jahre glaubte man, dass das Ubiquitinsystem zum Grundhaushalt der Zelle gehört und hauptsächlich dafür verantwortlich ist, die Gleichgewichtskonzentrationen der Stoffwechselproteine einzustellen und beschädigte Proteine zu beseitigen. Alexander Varshavsky fand heraus, dass die Halbwertszeit vieler cytoplasmatischer Proteine von ihrer N-terminalen Aminosäure abhängt. Nach der sogenannten N-Terminus-Regel (engl.: N-end rule) weisen Proteine mit einem „destabilisierenden“ N-terminalen Asp, Arg, Leu, Lys und Phe Halbwertszeiten von nur zwei bis drei Minuten auf, während „stabilisierende“ N-terminale Ala-, Gly-, Met-, Ser-, Thr- und Val-Reste zu Halbwertszeiten von über 10 Stunden bei Prokaryoten und von mehr als 20 Stunden bei Eukaryoten führen. Da die N-Terminus-Regel sowohl für Pro- als auch für Eukaryoten gilt,

liegt die Vermutung nahe, dass der Mechanismus, der Proteine für den Abbau markiert, in Pro- und Eukaryoten konserviert ist, obwohl Prokaryoten kein Ubiquitin besitzen. In Eukaryoten resultiert die N-Terminus-Regel aus den Tätigkeiten eines

RING-Fingers E3 namens E3a, dessen Ubiquitinylierungssignal die destabilisierenden N-terminalen Reste sind. Es ist jedoch inzwischen klar, dass das Ubi-

Ubiquitin

|

— C—S— Ei

’8m j

a

ar

IsopeptidBindung

Abb. 21.2 Reaktionen bei der Anheftung von Ubiquitin an Proteine. Die terminale Carboxylgruppe wird zunächst über eine Thioesterbindung mit EI verknüpft. Diese Reaktion wird durch ATP-Hydrolyse getrieben. Das aktivierte Ubiquitin wird anschließend auf eine Sulfhydrylgruppe von E2 und dann in einer durch E3-katalysierten Reaktion auf die e-Aminogruppe eines Lys im Protein übertragen. Dadurch wird das Protein für den proteolytischen Abbau markiert.

796

Aminosäuremetabolismus

quitinsystem weit mehr ist als nur ein simples System zur Eliminierung beschädigter Proteine. Die Liste der bekannten E3-Proteine wächst ständig. Sie erken-

PIIRB YRAERRI

19S-Kappe

.

ww.

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Were > 8

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0

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—

10 nm

Abb. 21.3 Ein auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen basierendes Bild des 26S-Proteasoms von Drosophila melanogaster. Der Komplex ist ungefähr 45 X 19 nm groß. Der zentrale Teil dieses zweizählig rotationssymmetrischen Multienzymkomplexes (gelb), das 20SProteasom, besteht aus vier gestapelten Ringen, die aus jeweils sieben Untereinheiten aufgebaut sind. Diese Untereinheiten bilden einen Hohlzylinder, in dem die Proteolyse von ubiquitinmarkierten Proteinen stattfindet. Die 19S-Kappen (blau), die an ein oder beide Enden des 20S-Proteasoms angeheften sein können, kontrollieren den Zugang der zum Abbau vorgesehenen Proteine zu dem 20S-Proteasom (siehe Text). [Mit freundlicher Genehmigung von Wolfgang Baumeister, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried.]

nen eine Vielzahl von Ubiquitinylierungssignalen, die häufig auf einer ziemlich begrenzten Anzahl von Zielproteinen vorkommen, von denen viele Regulationsfunktionen besitzen. Seit langem ist beispielsweise bekannt, dass die sogenannten PEST-Proteine mit Segmenten, die reich an Pro (P), Glu (E), Ser (S) und Ihr (T) sind, rasch abgebaut werden. Inzwischen hat man erkannt, dass dies deshalb geschieht, weil diese PEST-Elemente Phosphorylierungsstellen enthalten, welche die jeweiligen Proteine für die Ubiquitinylierung vorsehen. Die Degradation solcher Regulationsproteine hat natürlich wichtige regulatorische Folgen. Interessant ist, dass die reversible Monoubiquitinylierung die Aktivitäten bestimmter Proteine steuert, anstatt deren Abbau zu vermitteln - und zwar auf ganz ähnliche

Weise wie die Phosphorylierung und Dephosphorylierung (Abschnitt 12.3B).

C.

Das Proteasom entfaltet und hydrolysiert ubiquitinierte Polypeptide

Ubiquitinierte Proteine werden proteolytisch in einem ATP-abhängigen Vorgang abgebaut, der durch einen großen (etwa 2100 kD, 265) Multienzymkomplex namens 26S-Proteasom (Abb. 21.3) vermittelt wird. Das 26S-Proteasom besteht aus einem hohlen, zylindrischen Mittelstück, als 20S-Proteasom bezeichnet, das an beiden Enden von einer 19S-Kappe bedeckt ist. [Die Angaben „268“, „20S“ und „198“ beziehen sich auf die Sedimentationskoeffizienten in Svedberg-Einheiten

(S; 1 S = 10°"? s) der entsprechenden Partikel. Sie bezeichnen die Geschwindigkeit, mit der sie innerhalb eines aus einem geeigneten Medium gebildeten Gradienten in der Ultrazentrifuge sedimentieren. Der Sedimentationskoeffizient eines Partikels steigt mit seiner Masse, aber auch andere Faktoren spielen eine Rolle. Infolgedessen ist der Sedimentationskoeffizient eines Komplexes aus Partikeln (z.B. der des 26S-Proteasoms) nicht gleich der Summe der Sedimentationskoeffizienten seiner einzelnen Komponenten (d.h. also nicht gleich der Summe aus den Sedimentationskoeffizienten des 20S-Proteasoms und der beiden 19S-Kappen).] Das 20S-Proteasom der Hefe, das anderen eukaryotischen 20S-Proteasomen ähnelt, besteht aus sieben verschiedenen Untereinheiten vom a- und ß-Typ. Die Röntgenkristallstruktur dieses gigantischen Proteinkomplexes (6182 Aminosäuren, etwa 670 kD) wurde von Robert Huber bestimmt. Er konnte zeigen, dass der Komplex aus vier gestapelten Ringen von Untereinheiten (mit äußeren bzw. inneren Ringen) aus jeweils sieben verschiedenen a- und ß-Untereinheiten besteht (Abb. 21.4a). Die Strukturen der verschiedenen a-Untereinheiten sind sehr ähnlich und gleichen zudem den verschiedenen ß-Untereinheiten. Demzufolge weist dieser aus 28 Untereinheiten bestehende Komplex bezogen auf die zwei Ringpaare eine exakt doppelte Rotationssymmetrie auf, aber keine echte Rotationssymmetrie innerhalb eines Rings (pseudo-siebenzählige Rotationssymmetrie). Der hohle Kern des 20S-Proteasoms besteht aus drei großen Kammern (Abb. 21.4b): Zwei liegen an der Grenzfläche zwischen benachbarten Ringen von a- und ß-Untereinheiten, und die dritte, größere Kammer sitzt zentral zwischen den beiden Ringen der ß-Untereinheiten. Obwohl die Untereinheiten des a- und des ß-Typs strukturell ähnlich sind, weisen nur drei Untereinheiten des ß-Typs eine proteolytische Aktivität auf. Die Röntgenstruktur und die enzymatischen Untersuchungen zeigen, dass die drei aktiven Zentren die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysieren. Dies geschieht mithilfe eines neuen Mechanismus, bei dem die N-terminalen Thr-Reste der B-Untereinheiten als katalytische Nucleophile fungieren. Die aktiven Zentren des 20S-Proteasoms liegen innerhalb der zentralen Kammer und verhindern damit, dass diese „allesfressende“ proteinabbauende Maschine wahllos Proteine

in ihrer Nähe hydrolysiert. Es scheint, dass das Polypeptidsubstrat über eine

Intrazellulärer Proteinabbau

797

enge, axial gelegene Öffnung in den a-Ringen in die zentrale Kammer des Fasses gelangen muss. Diese Ringe sind mit hydrophoben Resten ausgekleidet, sodass nur entfaltete Proteine in die zentrale Kammer eindringen können. Trotzdem sind in der Röntgenstruktur des 20S-Proteasoms aus der Hefe (Abb. 21.4b) diese Öffnungen durch einen Pfropf blockiert, der durch die ineinandergreifenden Schwänze der N-terminalen a-Untereinheit gebildet wird. Die drei Untereinheiten vom ß-Typ haben verschiedene Substratspezifitäten. Sie schneiden hinter sauren Resten (die ß1-Untereinheit), basischen Resten (die B2-Untereinheit) und hydrophoben Resten (die ß5-Untereinheit). Infolgedessen schneidet das 20S-Proteasom sein Polypeptidsubstrat im Durchschnitt in Oktapeptide, die dann aus dem Proteasom diffundieren. Cytosolische Peptidasen bauen dann diese Peptide zu den Aminosäuren ab, aus denen sie aufgebaut sind. Die mit den Zielproteinen verknüpften Ubiquitinmoleküle werden nicht abgebaut, sondern als ganze Proteine abgespalten und stehen für eine erneute Ubiquitinylierung zur Verfügung. Die 19S-Kappe kontrolliert den Zugang der ubiquitinierten Proteine zum 20S-Proteasom

Das 20S-Proteasom kommt wahrscheinlich in vivo nicht alleine vor, sondern meistens im Komplex mit zwei 19S-Kappen, welche die ubiquitinierten Proteine modifizieren, entfalten und sie ATP-abhängig in das 20S-Proteasom einschleusen. Die 19S-Kappe, die aus etwa 18 verschiedenen Untereinheiten besteht, ist kaum charakterisiert. Dies ist zum großen Teil auf ihre geringe innere Stabilität zurückzuführen. Ihr sogenannter Basiskomplex besteht aus neun verschiedenen Untereinheiten, von denen sechs ATPasen sind. Diese bilden einen Ring, der an den a-Ring des 20S-Proteosoms angrenzt (Abb. 21.3). Cecile Pickart zeigte mithilfe von Crosslinking-Experimenten, dass eine dieser ATPasen, S6‘ genannt, mit dem Polyubiquitinsignal wechselwirkt. Dieses Signal bestimmt ein zum Abbau vorgesehenes Protein für das 26S-Proteasom. Dies lässt vermuten, dass die Erkennung der Polyubiquitinkette und ebenso die Entfaltung des Substratproteins ATP-getriebene Vorgänge sind. Zudem muss der Ring aus ATPasen die andernfalls axial verschlossene Öffnung des 20S-Proteasoms öffnen, um dem entfalteten Substrat den Zugang zu ermöglichen. Acht weitere Untereinheiten bilden den sogenannten Deckel-Komplex, den Teil der 19S-Kappe, der vom 20S-Proteasom weiter entfernt ist. Die Funktionen der Deckeluntereinheiten sind weitgehend unbekannt, obwohl ein verkürztes 26S-Proteasom, dem die Deckeluntereinheit fehlt, polyubiquitinierte Substrate nicht abbauen kann. Mehrere andere Untereinheiten sind eventuell vorübergehend mit der 19S-Kappe und/oder mit dem 20S-Proteasom assoziiert. Auch Eubakterien enthalten Proteasen, die ein eigenes Kompartiment ausbilden

Obwohl 20S-Proteasomen in allen bisher untersuchten Eukaryoten und bei den Archaea vorkommen, fehlen sie bei fast allen Eubakterien (was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass Eukaryoten aus Archäen entstanden sind; Abb. 1.9). Nichtsdestotrotz haben Eubakterien ATP-abhängige proteolytische Anordnungen, die wie Proteasomen eine fassähnliche Architektur haben und ähnliche Funktionen ausüben. In E. coli z.B. führen zwei als Lon und Clp bezeichnete Proteine bis zu 80% des Proteinabbaus des Bakteriums durch. Somit scheinen alle Zellen Proteasen zu enthalten, deren aktive Zentren nur von der Innenseite eines Hohlraums zugünglich sind. Der Zugang zu diesem Hohlraum wird kontrolliert. Diese sogenannten Proteasen mit eigenem Kompartiment scheinen früh in der Geschichte iebender Zellen entstanden zu sein, bevor eukaryotische, von Membranen umgebene Organellen wie das Lysosom aufgekommen sind. Das Iysosom führt unspezifische Abbauprozesse durch, aber durch die Membran des Lysosoms vom restlichen Zellinhalt abgetrennt, damit dieser vor wahlloser Zerstörung geschützt ist.

(b) Abb. 21.4 Röntgenkristallstruktur des 20S-Proteasoms aus Hefe. (a) Die 28 Untereinheiten sind als Kugeln dargestellt. Vier Ringe mit je sieben Untereinheiten sind zu einem Fass gestapelt (die Enden des Fasses befinden sich links und rechts). Dabei bilden die Untereinheiten vom a-Typ die äußeren und die Untereinheiten vom ß-Typ die inneren Ringe. Die zweizählige Symmetrieachse (C,) des Komplexes ist durch eine rote vertikale Linie dargestellt. (b) Blick auf die Innenfläche des Proteasoms, das hier entlang der zylindrischen Achse geschnitten dargestellt ist. Drei Moleküle eines gebundenen Proteaseinhibitors sind als raumfüllende Modelle in rot dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Robert Huber, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried. PDBid IRYP.]

798

Aminosäuremetabolismus

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Welche Rolle spielen Lysosomen beim Abbau von extrazellulären und intrazellulären Proteinen?

2. Beschreiben Sie den Weg des Proteasom-vermittelten Proteinabbaus, einschließlich der Rolle

von Ubiquitin und ATP.

Die Clp-Protease besteht aus zwei Komponenten: der proteolytisch aktiven ClpP und einer von mehreren ATPasen; bei E. coli sind dies ClpA und ClIpX. Die Röntgenstruktur der ClpP zeigt, dass sie zu einem fassähnlichen Partikel oligomerisieren. Dieser ist etwa 9 nm lang und breit und besteht aus zwei aufeinander folgenden siebenzähligen symmetrischen Ringen von 193 Aminosäureresten. Er hat dabei die gleiche Rotationssymmetrie wie das 20S-Proteasom (Abb. 21.5). Trotzdem hat die ClpP-Untereinheit eine andere Faltung, die sich vollständig von derjenigen der homologen o- und ß-Untereinheiten des 20S-Proteasoms unterscheidet. Das aktive Zentrum von ClpP ist nur auf der Innenseite des Fasses exponiert und enthält eine katalytische Triade aus Ser 97, His 122 und Asp 171. Es ist somit eine Serin-Protease (Abb. 11.26).

2

_Aminosäuredesaminierung

Freie Aminosäuren entstehen beim Abbau zellulärer Proteine und bei der Verdauung von Proteinen aus der Nahrung. Die Magenprotease Pepsin, die pankreatischen Enzyme Trypsin, Chymotrypsin und Elastase (in den Abschnitten 5.3B und 11.5 beschrieben) sowie eine Vielzahl anderer Endo- und Exoproteasen bauen Polypeptide zu Oligopeptiden und Aminosäuren ab. Diese Substanzen werden von der Darmschleimhaut absorbiert, über den Blutkreislauf transportiert und von anderen Geweben aufgenommen. Der weitere Abbau von Aminosäuren findet intrazellulär statt und beinhaltet einen Schritt, bei dem die a-Aminogruppe entfernt wird. In vielen Fällen findet sich die Aminogruppe in Glutamat wieder und wird anschließend zur Ausscheidung in Harnstoff eingebaut (Abschnitt 21.3). Das verbleibende Kohlenstoffgerüst der Aminosäure (a-Ketosäure) kann zu weiteren Verbindungen abgebaut werden (Abschnitt 21.4). Eine Übersicht über den Abbau von Aminosäuren gibt Abbildung 21.6.

er

ar

Abb. 21.6

Abb. 21.5 Röntgenstruktur von ClpP aus E. coli. Dieser Komplex aus 14 identischen Untereinheiten

hat eine D,-Symmetrie (die Symmetrie eines siebeneckigen Prismas, Abschnitt 6.3). (a) Blick entlang der siebenzähligen Achse wobei jede Untereinheit verschieden gefärbt ist. (b) Blick entlang der Doppelachse des Proteins (das hier im Verhältnis zum Bildteil a um 90° um seine horizontale Achse gedreht ist). [Nach einer Röntgenstruktur von John Flannagan, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York. PDBid ITYF.]

Glucose

Acetyl-CoA

Ketonkörper

Überblick über den Aminosäurekatabolismus.

Zunächst wird die Aminogruppe entfernt und zur Ausscheidung in Harnstoff eingebaut. Das verbleibende Kohlenstoffskelett (a-Ketosäure) kann zu CO, und H,O abgebaut oder in Glucose, Acetyl-CoA oder Ketonkörper umgewandelt werden.

A.

Transaminierung

Die meisten Aminosäuren

werden

durch Transaminierung,

d.h. die Übertra-

gung einer Aminogruppe auf eine a-Ketosäure, desaminiert. Dabei entstehen eine neue Aminosäure und aus der ursprünglichen Aminosäure eine a-Ketosäure. Der wichtigste Akzeptor für die Aminogruppe ist a-Ketoglutarat. Es entsteht Glutamat und die neue a-Ketosäure:

Aminosäuredesaminierung +

NH3

O

R-CH—-C00° =

| 700C—CH;—CH,—C—C00”

+

Aminosäure

a-Ketoglutarat

I 6)

+

NH;

I RC —-C007

+

000

CHsTr CHR ECEH—- 600°

a-Ketosäure

Glutamat

Die Aminogruppe von Glutamat wiederum kann in einer zweiten Transaminierungsreaktion auf Oxalacetat übertragen werden. Dabei wird Aspartat erhalten und a-Ketoglutarat zurückgebildet: =

(6) |

NH;

”00C—CH,—CH,—CH—C00”

+

7000—CH,—C—C00”

Glutamat

Oxalacetat

I

=

1

7006

CB,

NH3

CH, 06-000

1+

2O0C6CHS CH 6007

a-Ketoglutarat

Die Enzyme,

Aspartat

die Transaminierungen

katalysieren, werden

Aminotransferasen

oder Transaminasen genannt. Sie erfordern das Coenzym Pyridoxal-5’-phosphat (PLP; Abb. 21.7a). PLP ist ein Derivat von Pyridoxin (Vitamin B,; Abb. 21.75).

(b)

(a)

N Pyridoxin (Vitamin B,;)

Pyridoxal-5’phosphat (PLP)

(c)

(d) (CH,)4,2/4 — Enzym y

H ö

20,PO

CH,

ra

NX a:

CH

|

; 20,P—0—H;C =

Sn

NH: 2

OH nz

Nee En

*—

N| H

07

en

Enzym-PLPSchiff’sche Base

f : Pyridoxamin-5’phosphat (PMP)

Abb. 21.7

Pyridoxal-5’-phosphatenthaltende

Strukturen i (a) Das Coenzym Pyridoxal-5’-phosphat (PLP). (b) Pyridoxin (Vitamin B,). (c) Schiff’sche Base zwischen PLP und einer e-Aminogruppe des Enzyms. (d) Pyridoxamin-5’-phosphat (PMP).

799

800

Aminosäuremetabolismus

Schritte 1 & 1’: Transiminierung: H | R—C--COO

as:

® Ur

. H

+

|

Ro 0 COoO NH

HZN

=203PO

: Oo

+7

sms

| >

ee

203PO

+7

N

CH3

|

i)

CH3

H Aminosäure-PLP Schiff’sche Base (Aldimin)

geminales DiaminIntermediat

Enzym-PLP Schiff’sche Base

En +7

CH3

H

H

Schritte

He

6x

203PO

aa per

(HB Rotei co0° N ° NH,

OH Ni

H_

— >

| — i\

a-Aminosäure

H ja

S AOSE

Fa

+

we

2 & 2’: Tautomerisierung: Wi

Lys — Enzym

H,N:

H,NH

R-0,..C007

on

H-C

H

5tn6

de

N

o \ _

H

ElBE:: 5

2

!

10

N 8

6) |

de

is CI

CH,

EG

„OH

H =

SA

2-Amino-4-0xo06-methylpterin —

u

\

a —

nn Syn p-Aminobenzoesäure —)

—

a)

Glutamat-Rest(e) (n = 1-6)

Pteroinsäure

ar) Pteroylglutaminsäure (Tetrahydrofolat; THF)

Aum

Aminosäureabbau H

+

|

CH, — NCH,

CH,— °=0005

CHs

:

Ca on co con

ATP + H

P, +

|

/

9

| NHF

NH Ken enin

o

PP ri

Methionin

entsteht das biologische Methylierungsmittel S-Adenosylmethionin (SAM), (2) Methyltransferase,

H HO

OH

S-Adenosylmethionin (SAM)

-

THF

Biosynthetische

e

Metiwilerung

N5-Methyl-THF

er

E

H,O

Enzym),

Methylierter Akzeptor

(5) Cystathionin-B-Synthase (ein PLP-abhängiges Enzym), (6) Cystathionin-y-Lyase, (7) a-Ketosäure-Dehydrogenase, (8) Propionyl-CoA-Carboxylase, (9) Methylmalonyl-CoARacemase und (10) Methylmalonyl-CoA-

|

CH;

NHF

Nut

|

Homocystein

|

0

NH Serin

a

Mutase (ein Coenzym-B;;,-

H/ |

abhängiges Enzym). Auf die Reaktionen 8-10 wird in Abschnitt 20.2E näher

|

HO-=0H

H,0

S-Adenosylhomocystein

eingegangen.

H

S— Er

H

|

ee

H,0

NH+

NH,

|R }

n

CH,—C—C00-

H,C — ee

CO0OZEH+

a

Cystein-

NHZ

+

Biosynthese

9

Cystathionin

A

a-Ketobutyrat CoASH

NADH

+

Cystein

NADt

+ CO,

H,C— CH,— C— SCoA I

OÖ

8

9

a

hen

-00C— CH,— CH,— I: SCoA o

Propionyl-CoA

Succinyl-CoA

Bis zu fünf weitere Glu-Reste können mit dem ersten Glutamat über Isopeptidbindungen verbunden sein und einen Polyglutamylschwanz ausbilden. THF wird aus dem Vitamin Folsäure (lat.: folium, Blatt), der doppelt oxidierten

Form von THF,

gebildet. Bevor die Folsäure zum

aktiven Coenzym

wird,

muss sie enzymatisch reduziert werden (Abb. 21.19). Beide Reduktionsschritte werden durch die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) katalysiert. Säuger können keine Folsäure synthetisieren, sie muss stattdessen mit der Nahrung aufgenommen oder von Mikroorganismen im Darm bereitgestellt werden. C,-Einheiten sind kovalent an den Positionen N5, N10 oder an beiden gebunden. Diese C,-Einheiten, die die Oxidationsstufe von Formiat, Formaldehyd oder Methanol aufweisen (Tab. 21.2), lassen sich durch enzymatische Redoxreaktionen ineinander umwandeln (Abb. 21.20).

(4) Methionin-Synthase (ein Coenzym-B,,-abhängiges

Mey kzenun

N

0

5

(3) Adenosyl-Homocysteinase,

H

H

Abb. 21.18 Methionin-Abbau. Bei diesem Abbauweg entstehen Cystein und Succinyl-CoA. Die beteiligten Enzyme sind (1) Methionin-Adenosyl-Transferase, bei dieser Reaktion

H

H

815

816

Aminosäuremetabolismus

NADPH + N

N

H,N

H

H SS Sun

un

NZ

+ =

H

HN

un

N

HN 2 - >

N

GE

H

5

HN

1 H m

>

N—R

OÖ

H

10N—R

.

7,8-Dihydrofolat (DHF)

Folat

Reduktase katalysiert.

N

CH,

H

Abb. 21.19 Zweistufige Reduktion von Folat zu THF. Beide Reaktionen werden von der Dihydrofolat-

ne

NADP*

ar Hr ae

ie m

N—R

0

N. 8

N

H;N ee

NADPH

I

NADP*

Tetrahydrofolat (THF)

u

Tab. 21.2 Oxidationsstufen der von THF übertragenen C,-Gruppen. Fe er Oxidationsstufe Übertragene Gruppe THF-Derivat(e) Methanol

Methyl (-CH;)

N°-Methyl-THF

Formaldehyd

Methylen (-CH;-)

N’,N'°-Methylen-THF

Formiat

Formyl (-CH=O)

N°-Formyl-THF, N!°-Formyl-THF

Formimino (-CH=NH)

N°-Formimino-THF

Methin (-CH=)

N’,N!’-Methinyl-THF

THF wird mit C,-Einheiten bei der Umwandlung von Serin zu Glycin durch die Serin-Hydroxymethyltransferase (die Umkehrung von Reaktion 4, Abb. 21.14), bei der Spaltung von Glycin (Abb. 21.14, Reaktion 3) und beim Histidinabbau (Abb. 21.17, Reaktion 11) beladen. Die durch THF übertragenen C,-Einheiten werden bei der Synthese von Methionin aus Homocystein (Abb. 21.18) und bei der Synthese von Thyminnucleotiden (Abschnitt 23.3B) verwendet. Indem es diese Prozesse unterstützt, hilft zusätzlich verabreichtes Folat dabei Krankheiten, die mit abnormal hohen Homocysteinkonzentrationen verbunden sind,

vorzubeugen (Exkurs 21.1). Sulfonamide (wie z.B. Sulfanilamid) sind Antibiotika, die strukturell dem p-Aminobenzoesäureteil des THF analog sind. (0) an

)-5-NH-R AN Sulfonamid (R=H, Sulfanilamid)

O mn

(O)-6-0n

p-Aminobenzoesäure

Sie hemmen kompetitiv die bakterielle Synthese von THF auf der Stufe des Einbaus von p-Aminobenzoesäure und blockieren dadurch die THF-abhängigen Reaktionen. Da Säuger keine Folsäure synthetisieren können, bleiben sie vom Einfluss der Sulfonamide unberührt. Dies erklärt die medizinische Bedeutung dieser weit verbreiteten antibakteriellen Wirkstoffe. Beim Abbau von Aminosäuren mit verzweigten Seitenketten ist eine Acyl-CoA-Oxidation beteiligt Der Abbau der Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin, die alle verzweigte

Seitenketten aufweisen, beginnt mit drei Reaktionen, die jeweils durch die gleichen Enzyme katalysiert werden (Abb. 21.21). 1. Transaminierung zur entsprechenden a-Ketosäure.

2. Oxidative Decarboxylierung zum jeweiligen Acyl-CoA. 3. Dehydrierung durch FAD unter Ausbildung einer Doppelbindung.

Aminosäureabbau

H;N

HO CE|

H

N

H N

H

HN

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SB;

| FA N CH,

0.

Serin

Abb. 21.20 Wechselseitige Umwandlung der von THF übertragenen C,-Einheiten.

H

>

—C—ZCoV” _

10

u

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Glycin Serin-

Hydroxymethyltransferase

N°,N"°-Methylen-THF Reduktase

NADH

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R H3N—CH,—COO

Glyein

&

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THF

N°,N'® Methylen-THF

Histidin

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san H

Reduktase

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N'-Formyl-THF

Synthetase

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ADB+P;,

CH

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denn HN” HH N °-Formimino-THF

Cyclohydrolase

Be

817

EN, +P; Br 6Q

N""-Formyl-THF

Die verbleibenden Reaktionen des Isoleucinabbaus verlaufen analog der Fettsäureoxidation (Abschnitt 20.2C), wobei Acetyl-CoA und Propionyl-CoA entstehen. Letzteres wird anschließend über drei Reaktionen zu Succinyl-CoA umgewandelt. Beim Abbau von Valin, das ein Kohlenstoffatom weniger als Isoleucin enthält, wird CO, und Propionyl-CoA erhalten, welches ebenfalls zu Succinyl-CoA umgewandelt wird. Auf den weiteren Abbau von Leucin, bei dem Acetoacetat anstatt Propionyl-CoA erhalten wird, wird in Abschnitt 21.4E näher eingegangen. Die verzweigtkettige-u-Ketosäure-Dehydrogenase (engl.: branched-chain a-keto acid dehydrogenase, BCKDH), die Reaktion 2 in Abbildung 21.21 katalysiert, ist ein Multienzymkomplex, der dem Pyruvat-Dehydrogenase- und dem a-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex ähnelt (Abschnitte 17.2 und 17.3D). Tatsächlich haben alle drei Multienzymkomplexe eine gemeinsame Untereinheit, E, (Dihy-

N °-Formyl-THF

818

Aminosäuremetabolismus

R,

NH$ e

CH-—COO-

R/ a-Ketoglutarat Glutamat

I \ R ”rn) 2

: RR=H—

,‚R,=(CH,CH—

(A) a-Methylbutyryl-CoA

NADH + ar un

(C)Leuin

(A) a-Keto-ß-methylvalerat __..(B) a-Ketoisovalerat (C) a-Ketoisocapronsäure

NAD* + CoASH R

:R/=CH;—,R,=CH,—

=

oO

R,

(A) Isoleuein : R, = CH3—, R, = CH; — CH, —

B)Vain

o

(B) Isobutyryl-CoA

I

(C) Isovaleryl-CoA

(A)

OÖ

CH, -CH=C-C- SCoA

]

CH,

6) ( CH, —C—SCoA Acetyl-CoA

i

nu

Methylacrylyl-CoA

Y

Y

ß-Methylerotonyl-CoA

4 Reaktionen

|

a

| 3 Reaktionen

oO

ll CH; —

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SCoA

H;C

Tiglyl-CoA

|3 Reaktionen

CoASH

=C— C— SCoA

CH;

CH3

(0)

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Acetyl-CoA

Y 16)

CO, (6)

l CH,— CH, —C—SCoA

"00C—CH,— C— CH;

Propionyl-CoA

Acetoacetat

' Y Suceinyl-CoA

Abb. 21.21 Abbau der verzweigtkettigen Aminosäuren. Isoleucin (A), Valin (B) und Leucin (C) haben anfangs einen gemeinsamen Abbauweg, bei dem drei Enzyme verwendet werden: (1) Verzweigtkettige-Aminosäure-Aminotransferase,

(2) Verzweigtkettige-a-Ketosäure-Dehydrogenase und (3) Acyl-CoA-Dehydrogenase. Der Isoleucinabbau (links) verläuft weiter zu Acetyl-CoA und Succinyl-CoA; beim Valinabbau (Mitte) entsteht Succinyl-CoA und der Leucinabbau (rechts) ergibt Acetyl-CoA und Acetoacetat.

drolipoamid-Dehydrogenase) und verwenden neben ihrem terminalen oxidierenden Agens NAD*, die Coenzyme TPP, Liponamid und FAD. Ein genetischer Defekt bei der BCKDH ist die Ursache für die Ahornsirupkrankheit. Dabei nimmt infolge der Anhäufung von verzweigtkettigen a-Ketosäuren der Urin den charakteristischen Geruch von Ahornsirup an. Wird der Ahornsirupkrankheit nicht sofort durch eine spezielle Diät entgegengetreten, die durch einen geringen Anteil an verzweigtkettigen Aminosäuren gekennzeichnet ist, führt sie schnell zum Tod.

Aminosäureabbau

E.

819

Leucin und Lysin werden zu Acetoacetat und/oder Acetyl-CoA abgebaut

Der Leucinabbau beginnt in der gleichen Weise wie der Abbau von Isoleucin und Valin (Abb. 21.21), das dehydrierte CoA-Addukt ß-Methylcrotonyl-CoA wird jedoch in Acetyl-CoA und Acetoacetat, einen Ketonkörper, umgewandelt. Der vorherrschende Abbauweg für Lysin verläuft in der Säugerleber über die Bildung des a-Ketoglutarat-Lysin-Addukts Saccharopin (Abb. 21.22). Dieser Weg . Se H

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CH,

a-Ketoglutarat

|

H;N — CH,CH,CH,CH, ne: NH+ Lysin

om 1 NADP*+

CH,

H

|

|

H— 2 NH— CH,CH,CH,CH, — ee cO0OCO0NH+ Saccharopin

H,0+

NAD*+ 2

NADH

NAD(P)H

"

-00C—CH;CH;CH, run NH+

N

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NAD(P)*

3

PigHC —CH,CH,CH, 0000" j| NH3 a-Aminoadipat-6semialdehyd

a-Aminoadipat a-Ketoglutarat

4 Glutamat

6) -00C—CH,CH,CH,— C—C00”

NAD* + CoA

NADH 2 CO,

\ 5

)

6) -00C—CH,CH,CH, —C— SCoA Glutaryl-CoA

a-Ketoadipat FAD

jI SCoA H,;C— CH=CH—C— H,0

CO,

!

j -00C— CH,CH=CH— C— SCoA

Glutaconyl-CoA

2

Crotonyl-CoA

6

FADH;

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&

H,C— CH— CH, —

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C—SCoA

1

1.0

06H

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Acetyl-CoA

10 CoA

? CH,—0—CH,—C00”

et

Acetyl-CoA

ner 11

0 700C—

CH;

mare OH

Acetoacetat

HMG-CoA

Abb. 21.22 Abbauweg von Lysin in der Säugerleber. Die beteiligten Enzyme sind (1) Saccharopin-Dehydrogenase (bildet NADP*-abhängig in der Rückreaktion Lysin), (2) Saccharopin-Dehydrogenase (setzt NAD*-abhängig Glutamat frei), (3) Aminoadipat-semialdehydDehydrogenase, (4) Aminoadipat-Aminotransferase (ein PLP-abhängiges Enzym), (5) a-Ketosäure-Dehydrogenase, (6) Glutaryl-CoA-Dehydrogenase, (7) Decarboxylase, (8) Enoyl-CoA-Hydratase, (9) ß-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, (10) HMG-CoA-Synthase und (11) HMG-CoA-Lyase.

Die Reaktionen 10 und 11 werden in Abschnitt 20.3 besprochen.

Aminosäuremetabolismus

820

soll näher betrachtet werden, da wir bereits sieben der elf Reaktionen dieses Wegs in anderen Stoffwechselwegen begegnet sind. Reaktion 4 ist eine PLPabhängige Transaminierung. Reaktion 5 ist die oxidative Decarboxylierung einer a-Ketosäure durch einen Multienzymkomplex, ähnlich der Pyruvat-Dehydrogenase (Abschnitt 17.2). Reaktionen 6, 8 und 9 sind Standardreaktionen der Fettsäure-CoA-Oxidation: Dehydrierung durch FAD, Hydratisierung und Dehydrierung durch NAD*. Reaktionen 10 und 11 sind Standardreaktionen bei der Bildung von Ketonkörpern. Bei den Reaktionen 5 und 7 dieses Weges entstehen zwei Moleküle CO,. Es wird angenommen, dass der Saccharopinweg bei den Säugern vorherrscht, weil ein genetischer Defekt bei dem Enzym, das die Reaktion 1 dieses Weges katalysiert, zu Hyperlysinämie und Hyperlysinurie führt (erhöhte Lysinspiegel im

Blut bzw. Urin) und mit geistiger und körperlicher Retardierung einhergeht. Dies ist ein weiteres Beispiel dafür, wie die Untersuchung von seltenen Erbkrankheiten bei der Aufklärung von Stoffwechselwegen geholfen hat.

F.

Tryptophan wird zu Alanin und Acetoacetat abgebaut

Die Komplexität des Hauptabbauwegs von Tryptophan (dargestellt in Abb. 21.23) schließt eine detaillierte Betrachtung all seiner Reaktion aus. Eine Reaktion ist jedoch von besonderem Interesse: Die vierte Reaktion wird von der Kynureninase katalysiert, deren PLP-Gruppe die Spaltung der C;-C,-Bindung unter Freisetzung von Alanin ermöglicht. Die Kynureninasereaktion verläuft anfangs nach

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u CH: 0- c00”

CH, 0- cO00O” {

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H | HTET

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H Tryptophan

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H |

COO-

CO

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H

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OH 3-Hydroxyanthranilat

Alanin

:

NR:

OH 3-Hydroxykynurenin

| 5 Reaktionen

1 | 0

se

Abb. 21.23 Abbauweg von Tryptophan. Die gezeigten enzymatischen Reaktionen werden katalysiert von (1) Tryptophan-2,3-Dioxygenase,

ER

= C—CH,—

Nest

(2) Formamidase,

eaktionen C007

+—

+

+

+

a

CO,

2 00C Ei

BE

(3) Kynurenin-3-Monoxygenase und

(4) : Kynureninase (ein PLP-abhängigiges Enzym). Durch o

fünf Reaktionen wird 3-Hydroxyanthranilat in a-Keto-

adipat umgewandelt, das in sieben Reaktionen, wie in Abb. 21.22 gezeigt (Reaktionen 5-11), weiter zu

CO, a-Ketoadipat

Acetyl-CoA und Acetoacetat abgebaut wird.

Aminosäureabbau

821

demselben Mechanismus wie eine Transaminierung (Abb. 21.8), aber dann greift eine nucleophile Gruppe des Enzyms das C,-Atom des resonanzastabilisierten Intermediats an und es erfolgt eine Spaltung der C,-C,-Bindung. Das . übrigbleibende Tryptophangerüst wird in fünf Reaktionen zu a-Ketoadipat umgewandelt, das ebenfalls ein Intermediat des Lysinabbaus ist. a-Ketoadipat wird, wie in Abbildung 21.22 gezeigt, durch sieben Reaktionen weiter zu Acetyl-CoA und Acetoacetat abgebaut.

G.

_ Phenylalanin und Tyrosin werden zu Fumarat und Acetoacetat abgebaut

Da die erste Reaktion beim Phenylalaninabbau aus einer Hydroxylierung zu Tyrosin besteht, ist ein einziger Stoffwechselweg (Abb. 21.24) für den Abbau beider Aminosäuren verantwortlich. Die Endprodukte des sechsstufigen Abbauwegs sind Fumarat, ein Intermediat des Citratcyclus, und Acetoacetat, ein Ketonkörper. Defekte in den Enzymen, welche die Reaktionen 1 und 4 katalysieren, verursachen Krankheiten (siehe Exkurs 21.2). Pterine sind Redoxcofaktoren Die Hydroxylierung von Phenylalanin durch das Fe(IIl)-haltige Enzym Phenylalanin-Hydroxylase (Abb. 21.24, Reaktion 1) benötigt den Cofaktor Biopterin, ein Pterinderivat. Pterine sind Verbindungen, die den Pteridinring enthalten (Abb. 21.25). Man beachte die Ähnlichkeit zwischen dem Pteridinring und dem Isoalloxazinring der Flavin-Coenzyme (Abb. 14.12); die Positionen der StickstoffTetrahydrobiopterin + O5

Dihydrobiopterin + H,O

NH+

| (U Jen-sn- oo

u HO A

Jan-au-coor Tyrosin

Phenylalanin

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2

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HO Wann

coO(0)

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0 —H

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CH, — COO

16) Acetoacetat

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HO

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4 E—

700C—C

| [6

0,

4-Fumarylacetoacetat

000

f

Homogentisat

®

02-0005

—.° - H-c- mern C—CH,— C00| Ö 4-Maleylacetoacetat

Abb. 21.24 Abbauweg von Phenylalanin. Die beteiligten Enzyme sind (1) Phenylalanin-Hydroxylase, (2) Aminotransferase, (3) p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase, (4) Homogentisat-Dioxygenase, (5) Maleylacetoacetat-Isomerase,

(6) Fumarylacetoacetase.

822

Aminosäuremetabolismus

Exkurs 21.2

Biochemie im Organismus

Phenylketonurie und Alkaptonurie sind Folgen von Defekten beim Phenylalaninabbau Archibald Garrod erkannte zu Beginn des 19. Jahrhunderts, dass menschliche Erbkrankheiten die Folge spezifischer Enzymschäden sind. Wir haben wiederholt gesehen, wie diese Erkenntnis zur Aufklärung von Stoffwechselwegen beigetragen hat. Die erste derartige Krankheit, die Garrod erkannt hat, war die Alkaptonurie, die zur Ausscheidung großer Mengen von Homogentisinsäure führt (Abschnitt 14.4). Dieser Zustand entsteht als Folge eines Mangels an Homogentisat-Dioxygenase (Abb. 21.24, Reaktion 4). Alkaptonuriker leiden an keinen Krankheitssymptomen außer einer Arthritis im Alter (obwohl sich ihr Urin infolge einer schnellen Luftoxidation des ausgeschiedenen Homogentisats alarmierend dunkel färbt). Patienten, die an Phenylketonurie (PKU) leiden, weisen gravierendere Krankheitssymptome auf. Wird die Krankheit nicht sofort nach der Geburt erkannt und behandelt, treten inner-

halb weniger Monate schwere geistige Schäden auf. PKU entsteht, wenn Phenylalanin nicht hydroxyliert werden kann (Abb. 21.24, Reaktion 1), was zu einem erhöhten Phenylalaninspiegel im Blut führt (Hyperphenylalaninämie). Das überschüssige Phenylalanin wird auf einem sonst unbedeutenden Weg zu Phenylpyruvat transaminiert.

|

O)- CH,—C—C00” Phenylpyruvat

Das Auftreten von Phenylpyruvat (ein Phenylketon) im Urin war die erste Beobachtung, die mit der Krankheit in Verbindung gebracht wurde und ihr den Namen gab. In vielen Ländern werden alle Neugeborenen heutzutage unmittelbar nach

der Geburt auf PKU getestet, indem sie auf einen erhöhten Phenylalaninspiegel im Blut untersucht werden. Die klassische PKU resultiert aus einem Mangel an Phenylalanin-Hydroxylase. Mit dieser Feststellung aus dem Jahr 1947 war PKU -der erste angeborene Fehler im Stoffwechsel, dessen zu Grunde liegender biochemischer Defekt identifiziert werden konnte. Da alle Enzyme für den Tyrosinabbau intakt sind, besteht die Behandlung aus einer phenylalaninarmen Ernährung und der Überwachung des Phenylalaningehalts im Blut, um sicherzustellen, dass er während der ersten

5 bis 10 Lebensjahre innerhalb der normalen Grenzen bleibt (die negativen Auswirkungen der Hyperphenylalaninämie scheinen ab diesem Alter zu verschwinden). Aspartam (Nutrasweet),

Hauptbestandteil

von

Süßstoffen

in alkoholfreien

Getränken und vielen diätetischen Nahrungsmitteln, ist ein Asp-Phe-Methylester und damit eine Phenylalaninquelle. Darum erscheint ein Warnhinweis für Phenylketonuriker auf allen Aspartam enthaltenden Produkten. Ein Phenylalanin-Hydroxylasemangel ist auch für ein weiteres verbreitetes Symptom von PKU verantwortlich: Die Betroffenen weisen gegenüber ihren Geschwistern eine hellere Haar- und Hautfarbe auf. Diese Symptome treten auf, weil erhöhte Phenylalaninspiegel die Tyrosinhydroxylierung, die erste Reaktion bei der Bildung des Hautpigments Melanin, inhibieren (Abb. 21.39). Seit der Einführung von Testverfahren für Neugeborene entdeckte man weitere Typen der Hyperphenylalaninämie. Diese werden durch Mangel an Enzymen verursacht, die die Bildung oder Regenerierung von 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin, dem Phenylalanin-Hydroxylase-Cofaktor, katalysieren

(Abb. 21.26).

89 KO NL H

Pteridin

H,N__N ZN

Abb. 21.25 Der Pteridinring ist das Grundgerüst von Biopterin und Folat.

Man beachte die ähnlichen Strukturen von Pteridin und dem Isoalloxazinring der Flavin-Coenzyme.

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N&

R'

Isoalloxazin

N

Biopterin:

85

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N

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6

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il

0

Pterin (2-Amino-4-oxopteridin)

R=

Flavin

Folat:

R=

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? OÖ)

”O0C

Aminosäureabbau

HN._-N\_N H

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Abb. 21.26

H

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N 0

823

Bildung, Verwendung und

Regenerierung von 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin

SICH

bei der Phenylalanin-Hydroxylasereaktion.

|

TREE HO OH

7,8-Dihydrobiopterin

NADPH + H+ Dihydrofolat-Reduktase

NADP*+ H |

H

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HH

5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin (BH,)

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H

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Phenylalanin

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H Tyrosin

H Pterin-4a-carbinolamin

es, Pterin-4a-

H,0

carbinolamine

Dehydratase

atome in Pteridin sind identisch zu denen der B- und C-Ringe des Isoalloxazins. Folsäurederivate enthalten ebenfalls einen Pteridinring (Abschnitt 21.4D). Pterine sind wie Flavine an biologischen Oxidationen beteiligt. Die aktive Form von Biopterin ist die vollständig reduzierte Form 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin. Diese Form wird in einer Art Initialreaktion aus 7,8-Dihydrobiopterin und NADPH durch die Dihydrofolat-Reduktase gebildet (Abb. 21.26), die ebenfalls Dihydrofolat zu Tetrahydrofolat reduziert (Abb. 21.19). Bei der PhenylalaninHydroxylasereaktion wird 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin zu Pterin-4a-Carbinolamin hydroxyliert (Abb. 21.26). Dieses wird durch die Pterin-4a-CarbinolaminDehydratase in 7,8-Dihydrobiopterin (chinoide Form) umgewandelt. Dieses chinoide System wird anschließend durch das NADH-abhängige Enzym Dihydropteridin-Reduktase zur Regenerierung des aktiven Cofaktors reduziert. Obwohl die Dihydrofolat-Reduktase und die Dihydropteridin-Reduktase das gleiche Produkt bilden, verwenden sie unterschiedliche Tautomere ihres jeweiligen Substrats.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Beschreiben Sie die beiden unterschiedlichen metabolischen Abbauwege der Kohlenstoffgerüste von Aminosäuren. 2. Zählen Sie die sieben Metaboliten auf, die die Endprodukte des Aminosäureabbaus darstellen. 3. Beschreiben Sie die Rollen der Cofaktoren Pyridoxal-5'phosphat, Tetrahydrofolat und Tetrahydrobiopterin beim Abbau von Aminosäuren.

824

Aminosäuremetabolismus

5

Aminosäurebiosynthese

Viele Aminosäuren werden über Stoffwechselwege synthetisiert, die nur in Pflanzen oder Mikroorganismen vorkommen. Da Säuger diese Aminosäuren mit ihrer Nahrung aufnehmen müssen, bezeichnet man sie als essentielle Aminosäuren. Die anderen Aminosäuren, die von den Säugern aus vorhandenen Intermediaten synthetisiert werden können, werden als nicht essentielle Aminosäuren bezeich-

Tab. 21.3 Essentielle und nicht essentielle Aminosäuren beim Menschen.

Essentiell

Nicht essentiell

Arginin®

Alanin

Histidin

Asparagin

Isoleucin

Aspartat

Leucin

Cystein

Lysin

Glutamat

Methionin

Glutamin

Phenylalanin

Glycin

Threonin

Prolin

Tryptophan

Serin

Valin

Tyrosin

* Obwohl Säuger Arginin synthetisieren, spalten sie den größten Teil davon zur Bildung von Harnstoff (Abschnitt 21.3A).

net. Ihre a-Ketosäure-Kohlenstoffgerüste werden in den Transaminierungsreaktionen (Abschnitt 21.2A) in- Aminosäuren umgewandelt. Dabei wird der a-Amino-Stickstoff einer anderen Aminosäure verwendet, üblicherweise von Glutamat. Obwohl ursprünglich angenommen wurde, dass Glutamat aus Ammoniak und a-Ketoglutarat über die Umkehrung der GDH-Reaktion synthetisiert werden kann, weiß man heute, dass die unter physiologischen Bedingungen vorherrschende Richtung dieser enzymatischen Reaktion der Abbau von Glutamat ist (Abschnitt 21.2B). Folglich sollte der mit der Nahrung aufgenommene a-Amino-Stickstoff ebenfalls als essentieller Nährstoff betrachtet werden. In diesem Zusammenhang ist es interessant zu erwähnen, dass zusätzlich zu den vier allgemein bekannten Geschmacksrichtungen süß, sauer, salzig und bitter kürzlich ein fünfter Geschmackssinn charakterisiert wurde, und zwar der für den fleischartigen Geschmack von Natriumglutamat (engl.: monosodium glutamate, MSG), der auch als umami (japanisch für Wohlgeschmack) bezeichnet wird. Die für den Menschen essentiellen und nicht essentiellen Aminosäuren sind in Tabelle 21.3 aufgeführt. Arginin wird zwar im Harnstoffcyclus synthetisiert (Abschnitt 21.3A), da aber Kinder während der Wachstumsphase mehr davon benötigen, als dieser Stoffwechselweg liefern kann, zählt man Arginin auch zu den essentiellen Aminosäuren. Die essentiellen Aminosäuren kommen in tierischen und pflanzlichen Proteinen vor. Proteine enthalten essentielle Aminosäuren allerdings in unterschiedlichen Mengenverhältnissen. Milchproteine enthalten z.B. alle essentiellen Aminosäuren in dem Verhältnis, das für eine angemessene Ernährung des Menschen benötigt wird. Proteine aus Hülsenfrüchten wie Bohnen enthalten einen Überschuss an Lysin, dafür aber nicht ausreichend Methionin, wohingegen Weizen zu wenig Lysin, dafür aber mehr als genug Methionin enthält. Eine ausgewogene Proteindiät muss daher eine Vielzahl verschiedene Proteinquellen enthalten, die sich gegenseitig ergänzen, um für ein passendes Verhältnis aller essentiellen Aminosäuren zu sorgen. In diesem Abschnitt untersuchen wir die Synthesewege, die an der Bildung der nicht essentiellen Aminosäuren beteiligt sind. Wir betrachten auch kurz solche Synthesewege, die in Pflanzen und Mikroorganismen für die essentiellen Aminosäuren vorkommen. Es sollte aber berücksichtigt werden, dass es eine bemerkenswerte Vielfalt unter diesen Stoffwechselwegen in verschiedenen Spezies gibt. Im Gegensatz dazu sind die grundlegenden Stoffwechselwege des Kohlenhydratund Lipidmetabolismus nahezu universal.

A.

Biosynthese der nicht essentiellen Aminosäuren

Alle nicht essentiellen Aminosäuren außer Tyrosin werden auf einfachen Wegen synthetisiert, die von einem der vier Grundbausteine des Stoffwechsels ausgehen: Pyruvat, Oxalacetat, a-Ketoglutarat und 3-Phosphoglycerat. Tyrosin ist im Grunde fälschlich als nicht essentielle Aminosäure

klassifiziert, weil es durch

eine einstufige Hydroxylierung aus der essentiellen Aminosäure Phenylalanin gebildet werden kann (Abb. 21.24). In der Tat spiegelt der erforderliche Gehalt an Phenylalanin in der Nahrung auch den Bedarf an Tyrosin wider. Das Vorhandensein von Tyrosin in der Nahrung senkt dagegen den Bedarf an Phenylalanin.

Aminosäurebiosynthese Alanin, Asparagin, Aspartat, Glutamat und Glutamin werden aus

Pyruvat, Oxalacetat und «-Ketoglutarat synthetisiert Pyruvat, Oxalacetat und a-Ketoglutarat sind die a-Ketosäuren (die sog. Kohlenstoffgerüste), die jeweils Alanin, Aspartat und Glutamat entsprechen. In der Tat besteht die Synthese jeder dieser Aminosäuren aus einer einstufigen Transaminierungsreaktion (Abb. 21.27, Reaktionen 1-3). Die eigentliche Quelle für die a-Aminogruppe in diesen Transaminierungsreaktionen ist Glutamat, das in Mikroorganismen, Pflanzen und niederen Eukaryoten über die Glutamat-Synthase (Abschnitt 21.7), ein Enzym, das den Vertebraten fehlt, synthetisiert wird. Asparagin und Glutamin werden jeweils aus Aspartat und Glutamat durch eine ATP-abhängige Amidierung synthetisiert. Bei der Glutamin-Synthetasereaktion (Abb. 21.27, Reaktion 5) wird das Glutamat zunächst durch Reaktion mit ATP unter Bildung des Intermediats y-Glutamylphosphat aktiviert. NH; verdrängt anschließend die Phosphatgruppe und es entsteht Glutamin. Sonderbarerweise verläuft die Aspartatamidierung durch die Asparagin-Synthetase zur Bildung von Asparagin auf einem anderen Weg; sie verwendet Glutamin als Aminogruppendonator und spaltet ATP zu AMP + PP; (Abb. 21.27, Reaktion 4). Die Glutamin-Synthetase ist ein zentraler Kontrollpunkt im Stickstoff-Metabolismus Glutamin ist der Aminogruppendonotor bei der Bildung vieler biosynthetischer Produkte und ist zugleich die Speicherform von Ammoniak. Die Kontrolle der Glutamin-Synthetase ist somit entscheidend für die Regulation des gesamten

“ H,C —C—C00°

o

6) © CH, -C-C00

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Amino-

Aminotransferase

Aminotransferase

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Säure

a-Keto-

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säure

säure

säure

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oO N a

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NHF

> Glutamat

Aspartat

Alanin

Glutamin

ATP

GlutaminSynthetase

ATP AsparaginSynthetase

AMP + PP;

=

Glutamat

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P

en CH,— CH,— °—ie00

NHF

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a-Ketoglutarat

a-Keto-

H | H,C—C—CoO

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har CH,— CH, — C— COO

N

Oxalacetat

Pyruvat

Aminotransferase

oO es

|

GC CH,— OE00 /

ADP

(6)

H

N

|

@_ CH

CH

OPO3”

NH+

y -GlutamylphosphatIntermediat

2

NH;

NHZ

5

Asparagin

P; (0)

H

\

Abb. 21.27 Synthesen von Alanin, Aspartat, Glutamat, Asparagin und Glutamin. Diese Reaktionen umfassen jeweils die Transaminierung von (1) Pyruvat, (2) Oxalacetat und (3) a-Ketoglutarat sowie die Amidierung von (4) Aspartat und (5) Glutamat.

#

e— COO

H,N

|

C—CH5 %

CH,— 5— C0O0

Glutamin

NHZ

i

825

826

Aminosäuremetabolismus

Abb. 21.28 Röntgenkristallstruktur der GlutaminSynthetase aus Salmonella typhimurium. Das Enzym besteht aus 12 identischen Untereinheiten, hier durch ihr C,-Rückgrat dargestellt,

die in einer D;-Symmetrie (der Symmetrie eines hexagonalen Prismas) angeordnet sind. (a) Der Blick entlang der sechszähligen Symmetrieachse zeigt nur sechs Untereinheiten (abwechselnd blau und grün) des oberen Rings. Die Untereinheiten des unteren Rings befinden sich

nahezu direkt unterhalb des oberen Rings. Paare von Mg?*-Ionen (magentafarbige Kugeln), die für die enzymatische Aktivität benötigt werden, sind an jedem aktiven Zentrum gebunden. Jede Adenylierungsstelle, Tyr 397 (orange), liegt zwischen zwei Untereinheiten. In einem aktiven Zentrum sind auch ADP (türkis) und Phosphinothricin (rot), ein

kompetitiver Inhibitor von Glutamat abgebildet. (b) Die Seitenansicht entlang einer der zweizähligen Achsen zeigt nur die acht nächsten Untereinheiten. Die sechszähligen Achse verläuft vertikal zu dieser Ansicht. [Nach einer Röntgenstruktur von David Eisenberg, UCLA. PDBid IFPY.]

Stickstoffmetabolismus. Die Glutamin-Synthetasen der Säuger werden durch aKetoglutarat aktiviert, das Produkt der oxidativen Desaminierung von Glutamat (Abschnitt 21.2B). Diese Regulation verhindert möglicherweise die Akkumulation des durch diese Reaktion erzeugten Ammoniaks. Die bakterielle Glutamin-Synthetase weist, wie Earl Stadtman zeigte, ein viel ausgefeilteres Kontrollsystem auf. Dieses Enzym, das aus 12 identischen Untereinheiten mit je 469 Aminosäureresten besteht, die an den Ecken eines hexagonalen Prismas angeordnet sind (Abb. 21.28), wird durch verschiedene allosterische Effektoren sowie durch kovalente Modifikation reguliert. Einige Aspekte dieses Kontrollsystems verdienen Beachtung. Neun allosterische Rückkopplungsinhibitoren, jeder mit seiner eigenen Bindungsstelle, kontrollieren in einer kumulativen Weise die Aktivität der Glutamin-Synthetase. Sechs dieser Effektoren — Histidin, Tryptophan, Carbamoylphosphat (synthetisiert durch die CarbamoylphosphatSynthetase II), Glucosamin-6-phosphat, AMP und CTP - sind jeweils Endprodukte von Stoffwechselwegen, die von Glutamin ausgehen. Die anderen drei Alanin, Serin und Glycin - reflektieren den Stickstoffgehalt der Zelle.

Die E. coli-Glutamin-Synthetase wird kovalent durch Adenylierung (Anfügen einer AMP-Gruppe) an einen spezifischen Tyr-Rest modifiziert (Abb. 21.29). Die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber kumulativer Rückkopplungshemmung nimmt mit dem Maß seiner Adenylierung zu, während seine Aktivität abnimmt. Der Grad der Adenylierung wird von einer komplexen metabolischen Kaskade kontrolliert, die konzeptionell dem Kontrollsystem für die GlykogenPhosphorylase ähnelt (Abschnitt 16.3B). Sowohl Adenylierung als auch Desadenylierung werden von der Adenyltransferase katalysiert, die mit einem tetrameren regulatorischen Protein (P,)) komplexiert ist. Dieser Komplex desadenyliert die Glutamin-Synthetase, wenn P,, uridyliert ist (ebenfalls an einem Tyr-Rest) und adenyliert die Glutamin-Synthetase, wenn P,; die UMP-Reste fehlen. Das Ausmaß der P,-Uridylierung ist wiederum von der relativen Aktivität zweier enzymatischer Zentren abhängig, die sich auf demselben Protein befinden: einer Uridyltransferase, die P,, uridyliert und ein uridylentfernendes Enzym, das die angefügten UMP-Gruppen hydrolytisch von P,, entfernt. Die Uridyltransferase wird durch a-Ketoglutarat und ATP aktiviert und durch Glutamin und P; gehemmt, während das uridylentfernende Enzym gegenüber diesen Metaboliten unempfindlich ist. Diese komplexe metabolische Kaskade passt die Aktivität der E. coli-Glutamin-Synthetase äußerst genau dem Stickstoffbedarf der Zelle an.

Aminosäurebiosynthese

827

Glutamin-Synthetase (weniger aktiv)

'

Berne,

1)

x Adenin

HH H

H OH

OH

Uridyltransferase a-Ketoglutarat

ATP Glutamin @

Adenyltransferase

p.

=

Br

® |

> Pır

PP;

n

Eee ATP

i|

| Vepeoe | (6)

ADP

uridylentfernendes Enzym

Glutamin-Synthetase (stärker aktiv)

OH

Abb. 21.29 Regulierung der bakteriellen Glutamin-Synthetase. Die Adenylierung/Desadenylierung eines spezifischen Tyr-Rests wird durch das Ausmaß der Uridylierung eines spezifischen Adenyl-

Glutamat ist die Vorstufe von Prolin, Ornithin und Arginin

transferase - P,-Tyr-Rests kontrolliert. Dieser

Die Umwandlung von Glutamat zu Prolin (Abb. 21.30, Reaktionen 1-4) umfasst die Reduktion der y-Carboxylgruppe zu einem Aldehyd, gefolgt von der Ausbildung einer innermolekularen Schiff’schen Base, deren weitere Reduktion Prolin ergibt. Die Reduktion der y-Carboxylgruppe von Glutamat zu einem Aldehyd ist ein endergoner Vorgang, der durch die vorangehende Phosphorylierung der Carboxylgruppe erleichtert wird, die durch die ‘y-Glutamyl-Kinase katalysiert wird. Das instabile Zwischenprodukt Glutamat-5-phosphat konnte bisher nicht nachgewiesen werden. Es wird dennoch angenommen, dass es das Substrat für die nachfolgende Reduktion ist. Der dabei entstehende Glutamat-5-semialdehyd (ebenfalls ein Produkt des Arginin- und Prolinabbaus; Abb. 21.17) cyclisiert spontan unter Ausbildung der innermolekularen Schiff’schen Base A'-Pyrrolin5-carboxylat. Die abschließende Reduktion zu Prolin wird durch die Pyrrolin-5-

Uridylierungsgrad wird wiederum durch die relativen Aktivitäten der Uridyltransferase und des uridylentfernenden Enzyms kontrolliert. Die Uridyltransferase reagiert auf die Spiegel zahlreicher Stickstoffmetabolite, wohingegen die Aktivität des uridylentfernenden Enzyms von der Menge dieser Metabolite unabhängig ist.

828

Aminosäuremetabolismus

Abb. 21.30 Biosynthesen der Aminosäuren aus der Glutamat-Familie: Arginin, Ornithin und Prolin. Die Katalysatoren für die Prolinbiosynthese sind (1) y-Glutamyl-Kinase,

6)

H

\

|

< ERS

N — C00

8)

NHF Glutamat

(2) Dehydrogenase, (3) nicht enzyma-

tisch und (4) Pyrrolin-5-carboxylatReduktase. Bei Säugern wird Ornithin aus Glutamat-5-semialdehyd mittels der Ornithin-ö-Aminotransferase erzeugt (5). Ornithin wird über den Harnstoffeyclus in Arginin umgewandelt (Abschnitt

21.3A).

&

ATP 1

ADP

(6)

H

|

\

© CH,

CH, 0000" NH+

20,P—0O

Glutamat-5-phosphat NAD(P)H

2

NAD(P)

+

Br O

H

>

H

H

H

e

7 zen

we

Glutamat c00”7

NH+

>

a-Ketoglutarat

” +

Glutamat-5-semialdehyd

5

Be

ri

N‚eNgessänes!

= NH3

Ornithin H,C u

H==6

CH»

nn

EC —CHGz

Harnstoff-Cyclus

A!.-Pyrrolin-5-carboxylat

NAD(P)H

NAD(P)* H

a =e/ INS C—C00|

HN

C=-N-CH,

+4/

H;N

HH

1

CH, CH 202000 | NH$ en .

.

H

Prolin

carboxylat-Reduktase katalysiert. Ob das Enzym NADH oder NADPH verwendet, ist nicht bekannt. Bei Menschen führt ein dreistufiger Weg von Glutamat über eine Abzweigung von der Prolinbiosynthese nach Schritt 2 zu Ornithin (Abb. 21.30). Glutamat-5semialdehyd, der im Gleichgewicht mit A'-Pyrrolin-5-carboxylat steht, wird direkt zu Ornithin transaminiert, in einer Reaktion, die durch die Ornithin-öAminotransferase katalysiert wird (Abb. 21.30, Reaktion 5). Ornithin wird anschließend durch Reaktionen des Harnstoffeyclus in Arginin umgewandelt

(Abb. 21.9).

Aminosäurebiosynthese

> ze

HC

{

NAD”

OH

u NADH

\

CH,— OPO2

}

”

1

3-Phosphoglycerat

A

j

es

rs

0=0

Glutamat

a-Ketoglutarat

/

\

CH,—OPOF

nn

3-Phosphohydroxypyruvat

|

CH,—OPO%

i

. Umwandlung der 2-OH-Gruppe von 3-Phosphoglycerat in ein Keton ergibt von

Serin ist an der Glycinsynthese auf zweifache Weise beteiligt: 1. Direkte Umwandlung von Serin zu Glycin durch die Serin-Hydroxymethyltransferase in einer Reaktion, bei der auch N > N'°-Methylen-THF entsteht

(Abb. 21.14, Umkehrung von Reaktion 4). 2. Kondensation des N’,N'’-Methylen-THF mit CO, und NH} durch die GlycinSynthase (Abb. 21.14, Umkehrung von Reaktion 3). In Tieren wird Cystein aus Serin und Homocystein synthetisiert, einem Abbauprodukt von Methionin (Abb. 21.18, Reaktionen 5 und 6). Homocystein verbindet sich mit Serin zu Cystathionin, das dann Cystein und a-Ketobutyrat bildet. Da die Sulfhydrylgruppe von Cystein aus der essentiellen Aminosäure Methionin stammt, kann Cystein als essentielle Aminosäure angesehen werden.

B.

P;

} 3

3-Phosphoserin

Serin, Cystein und Glycin stammen von 3-Phosphoglycerat ab Serin wird aus dem Glykolyseintermediat 3-Phosphoglycerat in drei Reaktionen a (Abb. 21.31):

3-Phosphohydroxypyruvat, das phosphorylierte Ketosäureanalogon Serin. 2. Transaminierung von 3-Phosphohydroxypyruvat zu Phosphoserin. 3. Hydrolyse von Phosphoserin zu Serin.

a

HN—-C-H

2

_ Biosynthese der essentiellen Aminosäuren

Essentielle Aminosäuren werden wie die nicht essentiellen Aminosäuren aus verbreiteten metabolischen Vorstufen gebildet. Ihre Synthesewege sind nur in Mikroorganismen und Pflanzen vorhanden und umfassen gewöhnlich mehr Schritte als jene der nicht essentiellen Aminosäuren. Die Enzyme, die die essentiellen Aminosäuren synthetisieren, gingen der Tierwelt anscheinend frühzeitig in der Evolution verloren, möglicherweise wegen der leichten Verfügbarkeit dieser Aminosäuren in der Nahrung. Wir werden im Folgenden nur einige der zahlreichen Reaktionen der Biosynthese essentieller Aminosäuren betrachten. Die Aspartat-Familie: Lysin, Methionin und Threonin In Bakterien ist Aspartat die gemeinsame Vorstufe von Lysin, Methionin und Threonin (Abb. 21.32). Die Biosynthese dieser drei Aminosäuren beginnt mit

der durch die Aspartokinase katalysierten Phosphorylierung von Aspartat zu Aspartyl-ß-phosphat. Wir haben bereits gesehen, dass die Kontrolle von Stoffwechselwegen gewöhnlich an deren erstem Schritt stattfindet. Man könnte daher erwarten, dass die Lysin-, Methionin- und Threoninbiosynthese gemeinsam reguliert wird. Tatsächlich wird aber jeder Weg unabhängig voneinander reguliert. E. coli besitzt drei Isoenzyme der Aspartokinase, die hinsichtlich der Rückkopplungshemmung der Enzymaktivität und der Repression der Enzymbiosynthese auf die drei Aminosäuren unterschiedlich reagieren. Weiterhin wird die Richtung des Stoffwechselwegs an den Verzweigungspunkten durch die Aminosäureprodukte des jeweiligen Zweigs kontrolliert.

829

Abb. 21.31

BOrsaE

”

NH; Serin

Umwandlung

von 3-Phosphoglycerat

in Serin. : we Die Enzyme dieses Wegs sind (1) 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, (2) eine PLP-abhängige

Aminotransferase und (3) PhosphoserinPhosphatase.

0

830

Aminosäuremetabolismus

Abb. 21.32 Biosynthese von Aminosäuren der Aspartat-Familie:

Lysin, Methionin und Threonin. Von den Enzymen dieses Wegs

I

Aspartat

Di

. ran

CZCH (6)

2 NH3 TB

sind gezeigt (1) Aspartokinase, (2) B-Aspartat-semialdehyd-Dehydro-

5

1

genase, (3) Homoserin-Dehydrogenase

ADP

und (4) Methionin-Synthase (ein Coenzym-B},-abhängiges Enzym).

e o

?0,P—O

OH

&

N =

|

CH—0—000° “

ne

NH

Threonin

T227 NH3

iz

Aspartyl-ß-phosphat

2 Reaktionen

SD

2

NADP* + P,

N

"

;

NADPH

en /

NH3

H

NADP+

|

3

Henn

NH3

OH

3

Homoserin

ß-Aspartat-semialdehyd

| '

|3 Reaktionen

|

|

| 8 Reaktionen

H

\

|

Y

HS

— CH,— Hin

|

99:

NHF Homocystein

N°-Methyl-THF ey

nu (CH3)3 |

H—C—NH} Ina coo Lysin

ur

THF

R

H

H;C —S— CH, — CH,—C— C00” | = N Methionin

NH3

Die Methionin-Synthase (auch als Homocystein-Methyltransferase bezeichnet) katalysiert die Methylierung von Homocystein zur Bildung von Methionin unter Verwendung von N-Methyl-THF als Methylgruppendonator (Abb. 21.18 und 21.32, jeweils Reaktion 4). Die Methionin-Synthase ist in Säugern neben der Methylmalonyl-CoA-Mutase (Abschnitt 20.2E) das einzige mit Coenzym Bı, assoziierte Enzym. Allerdings ist das Cobaltion (Co’*) des Coenzyms B,, in der Methionin-Synthase axial an die Methylgruppe gebunden und bildet Methylcobalamin. Im Gegensatz hierzu ist in der Methylmalonyl-CoA-Mutase das CoIon an die 5’-Adenosylgruppe gebunden (Abb. 21.17). In Säugetieren ist die eigentliche Funktion der Methionin-Synthase nicht die de novo-Synthese von Methionin, da Met eine essentielle Aminosäure ist. Die wichtigere Funktion ist die Synthese bzw. Regenerierung von SAM zur Verwendung in biologischen Methylierungsreaktionen (Abb. 21.18).

Aminosäurebiosynthese

831

Die Pyruvat-Familie: Leucin, Isoleucin und Valin Valin und Isoleucin werden auf dem gleichen Biosyntheseweg gebildet, der Pyruvat als Ausgangsverbindung benutzt. Der einzige Unterschied besteht im ers. ten Schritt dieser Serie (Abb. 21.33). Bei dieser thiaminpyrophosphatabhängigen Reaktion bildet Pyruvat mit TPP ein Addukt, das anschließend zu HydroxyethylTPP decarboxyliert wird. Die Umsetzung ähnelt den von Pyruvat-Decarboxylase (Abb. 15.20) und Transketolase (Abb. 15.32) katalysierten Reaktionen. Das resonanzstabilisierte Carbanion greift dabei entweder auf dem Weg zu Valin die Ketogruppe eines zweiten Pyruvats unter Bildung von Acetolactat oder auf dem Weg zu Isoleucin die Ketogruppe von a-Ketobutyrat unter Ausbildung von aAceto-a-hydroxybutyrat an. Der Leucinbiosyntheseweg zweigt vom Valinweg ab. Der letzte Schritt dieser drei Wege, die von Pyruvat und nicht von einer Aminosäure ausgehen, besteht aus einer PLP-abhängigen Übertragung einer Aminogruppe von Glutamat unter Bildung der jeweiligen Aminosäure.

yie +

H,6 — N=2c00, oO Pyruvat

9.09 CH

Pyruvat

a coO-

C_C007 \ (0)

a-Ketobutyrat

I oo,

Abb. 21.33 Biosynthese von Aminosäuren der Pyruvat-Familie: Isoleucin, Leucin und Valin. Das erste Enzym, Acetolactat-Synthase (ein TPP-haltiges Enzym), katalysiert zwei Reaktionen, von denen eine zu Valin und Leucin und die andere zu Isoleucin führt. Man beachte,

dass die Valin-Aminotransferase die Bildung von Valin und Isoleucin aus ihren entsprechenden a-Ketosäuren katalysiert.

Kerr C—TPP Hydroxyethyl-TPP

jr 16-00-0007

Be O OH

O=0H

a-Aceto-o-

a-Acetolactat

hydroxybutyrat

|3 Reaktionen |3 Reaktionen

HC HC -00600 | H oO

3 Reaktionen Te

a-Ketoisovalerat

Glutamat Valin-Aminotransferase

Hs0

a-Keto-Pmethylvalerat

a-Ketoglutarat H;C

E

35 CH3

er

H

OÖ

Glutamat Valin-Aminotransferase a-Ketoglutarat

a-Ketoisocaproat Glutamat Leucin-Aminotransferase

u

Se H

005 NHS

Valin

ne H,C — ee

H

a-Ketoglutarat

ae

NHZ Leucin

2

CH;

>

H,0C=C6=C=C0007

Hi NHt Isoleucin

832

Aminosäuremetabolismus

Die aromatischen Aminosäuren: Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan Die Vorstufen der aromatischen Aminosäuren sind das Glykolyseintermediat Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-phosphat (ein Intermediat des Pentosephosphatwegs; Abb. 15.30). Ihre Kondensation liefert 2-Keto-3-desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat (Abb. 21.34). Diese C,-Verbindung cyclisiert und wird schließlich zu Chorismat umgewandelt, dem gemeinsamen Vorläufer der aromatischen Aminosäuren. Chorismat wird entweder zu Anthranilat und dann zu Tryptophan oder zu Prephenat und weiter zu Tyrosin oder Phenylalanin umgewandelt. Obwohl Säuger Tyrosin durch Hydroxylierung von Phenylalanin synthetisieren (Abb. 21.24), bilden es viele Mikroorganismen aus Prephenat.

Abb. 21.34 Biosynthese von Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Einige der beteiligten Enzyme sind (1) 2-Keto-3desoxy-p-arabinoheptulosonat-7-phosphatSynthase, (2) Anthranilat-Synthase, (3) TryptophanSynthase, a-Untereinheit, (4) Tryptophan-Synthase, ß-Untereinheit (ein PLP-abhängiges Enzym) und (5) Chorismat-Mutase.

0—POrPhosphoenol-

N>

pyruvat (PEP)

ne

en

0 IT _Cc00

CHs

©

2

En

Erythrose-4phosphat

H: a

n

c

ı 3

}

eg

HO— “—j5l

1

ie

HC — GH

H—-6@-0H

| H;C—OPO3,

CH,OPOZ

2-Keto-3-desoxyarabinoheptulosonat-7-phosphat

6 Reaktionen

Pyruvat S

coo-

—

Glutamat NH,

— Ta coo =

j

ER | 2

Glutamin

O6

oO C065 I

2

=

5

Anthranilat

00C

HO

Chorismat

H

Prephenat 2 Reaktionen 4

\

H

|

CH, — NELcoo

N

2 Reaktionen

H

s

|

CHs BE coo-

+

3 Reaktionen

NH3

NH3

Y

OH

h

9)

Phenylalanin

Glycerinaldehyd-

2 r

Tyrosin

. ii oo

nn — —

&—6--C0CH,

IM

&

H

H

3-phosphat

;

Serin

-0OP0,2

Zu

Neal

3

4

H Indolyl-3-glycerinphosphat

H,O

H Inaal

CH,

TR coo-

Na H Tryptophan

ar

Aminosäurebiosynthese

833

Der letzte Schritt bei der Synthese von Tyrosin und Phenylalanin ist die Addition einer Aminogruppe durch Transaminierung. Bei der Tryptophansynthese ist die Aminogruppe Teil des Serinmoleküls, das an Indol angefügt wird. Indol wird zwischen den zwei aktiven Zentren der Tryptophan-Synthase in einem Tunnel verschoben Die letzten zwei Reaktionen der Tryptophanbiosynthese (Reaktionen 3 und 4 in Abb. 21.34) werden beide durch die Tryptophan-Synthase katalysiert: 1. Die a-Untereinheit (268 Aminosäuren) dieses bifunktionellen a,ß,-Enzyms spaltet Indolyl-3-glycerinphosphat in Indol und Glycerinaldehyd-3-phosphat. 2. Die ß-Untereinheit (396 Aminosäuren) verknüpft in einer PLP-abhängigen Reaktion Indol mit Serin unter ‚Bildung von Tryptophan.

Obwohl jede Untereinheit für sich allein enzymatisch aktiv ist, erhöhen sich die Reaktionsgeschwindigkeit und die Substrataffinität um ein bis zwei Größenordnungen, wenn die Untereinheiten in einem a,ß,-Tetramer miteinander verbun-

den sind. Das Zwischenprodukt Indol erscheint nicht frei in Lösung, sondern bleibt offensichtlich an das Enzym gebunden. Die Röntgenkristallstruktur der Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium, die von Craig Hyde, Edith Miles und David Davies bestimmt wurde, erklärt letztere Beobachtung. Das Protein bildet einen 15 nm langen aßßa-Komplex mit zweizähliger Symmetrieachse, in dem die aktiven Zentren benachbarter a- und P-Untereinheiten ca. 2,5 nm voneinander entfernt sind (Abb. 21.35). Diese aktiven Zentren sind über einen mit Lösungsmittel gefüllten Tunnel miteinander verbunden, der groß genug ist, um das Zwischenprodukt Indol passieren zu lassen. Dies deutet auf den folgenden Ablauf hin: Das Substrat Indolyl-3-glycerinphosphat bindet an die a-Untereinheit, indem es durch eine Öffnung, die sogenannte Vordertür, in das aktive Zentrum eintritt. Das Produkt Glycerinaldehyd3-phosphat verlässt das aktive Zentrum auf demselben Weg. In gleicher Weise besitzt das aktive Zentrum der ß-Untereinheit eine „Vordertür“, die für das Lösungsmittel zugänglich ist und durch die Serin hinein- und Tryptophan hinaustritt. Beide aktiven Zentren weisen darüber hinaus „Hintertüren“ auf, die durch einen Tunnel miteinander verbunden sind. Das Intermediat Indol diffundiert möglicherweise zwischen den zwei aktiven Zentren durch den Tunnel und kann daher nicht ins umgebende Lösungsmittel entweichen. Diese Weiterleitung kann für Indol besonders wichtig sein, da dieses nichtpolare Molekül sonst aus der bakteriellen Zelle durch Diffusion durch dessen Plasmamembran und die äußere Membran entweichen könnte. Damit die katalytische Effizienz der Tryptophan-Synthase durch Weiterleitung erhöht werden kann, müssen (1) ihre verbundenen aktiven Zentren so gekoppelt sein, dass ihre katalysierten Reaktionen phasengleich stattfinden, und (2) muss das aktive Zentrum („Vordertür“) geschlossen werden, nachdem das Substrat an die a-Untereinheit gebunden hat, damit sichergestellt wird, dass das Produkt Indol über den Tunnel („Hintertür“) zur ß-Untereinheit gelangt und nicht zurück ins Lösungsmittel entweicht. Eine Vielzahl von experimentellen Belegen zeigt, dass diese Ereignisabfolge über allosterische Signale ermöglicht wird, die von kovalenten Transformationen des aktiven Zentrums der ß-Untereinheit ausgehen. Dies schaltet das Enzym um zwischen einer offenen, wenig aktiven Konformation, an die das Substrat bindet, und einer geschlossenen, hoch aktiven Konformation, aus der Indol nicht entweichen kann. Histidinbiosynthese

Fünf der sechs C-Atome von Histidin stammen von 5-Phosphoryl-ribosyl-«-pyrophosphat (PRPP; Abb. 21.36), einem Phosphatzuckerintermediat, das auch bei der Biosynthese der Purin- und Pyrimidinnucleotide (Abschnitte 23.1A und 23.2A) beteiligt ist. Das sechste C-Atom von Histidin stammt aus ATP. Die ATP-Atome, die nicht in Histidin eingebaut werden, werden als 5-Aminoimida-

Abb. 21.35 Bänderdiagramm des bifunktionellen Enzyms Tryptophan-Synthase aus S. typhimurium. Nur eine aß-Untereinheit des aßßa-Heterotetramers ist gezeigt. Die a-Untereinheit ist blau, die N-terminale Domäne der ß-Untereinheit ist orange und deren C-terminale Domäne ist rotorange gefärbt. Alle ß-Faltblätter sind beige gezeichnet. Das aktive Zentrum der a-Untereinheit wird durch den gebundenen kompetitiven Inhibitor Indolylpropanolphosphat. (IPP; rotes Kugel-StabModell) identifiziert, während das aktive Zentrum

der ß-Untereinheit durch sein PLP-Coenzym (gelbes Kugel-Stab-Modell) markiert ist. Die für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche des ca. 2,5 nm langen Tunnels, der die aktiven Zentren der a- und

ß-Untereinheiten verbindet, ist mit gelben Punkten umrissen. Einige Indolmoleküle (grüne Kugel-StabModelle) wurden

in den Tunnel hineinmodelliert,

um zu zeigen, dass er groß genug ist, dass Indol von einem aktiven Zentrum zum anderen gelangen kann. [Mit freundlicher Genehmigung von Craig Hyde, Edith Miles und David Davies, NIH.]

6% siehe Interactive Exercises.

834

Aminosäuremetabolismus

N?

R

N-Ribose-®-®-®

FIN

N? "N— Ribose—B—-®—®)

ana

Se

PP;

vs

HN

ee

a 2:0:

1

3

.0

N

N = E

er]

N

renspf

oa

H7

|

OH

OH

N"-5'’-Phosphorylribosyl-ATP nd Se Reaktionen

5-Phosphorylribosyloa-pyrophosphat (PRPP)

In

N 2

+ ——

zur Purin-Biosynthese

oO N

N

N— Ribose—(P) /

HN —CH meer

Glutamin

Glutamat

| c=o | H=>6-0OH

ar

bar

HC—NH}

EI — :—Gi

HC _N

\

; | ıSN a cH

|

2

H

H

5

LEN

|

AO

Ribose —®

En

H;zN—C

NH;

5-Aminoimidazol4-carboxamidribonucleotid

N

FZ N —

[6)

——

H;N —C

N

CH3OPO3 2

ib

5

| ZN OH

N -5’-Phosphorylribulosylformimino-

Hr

5-aminoimidazol-4-

|

carboxamidoribonucleotid

H—C—OH |

CcO0”

CH,OPO3 Imidazolylglycerinphosphat

Histidin

Abb. 21.36 Biosynthese von Histidin. Einige der beteiligten Enzyme sind (1) ATP-Phosphorylribosyltransferase und (2) Glutamin-Amidotransferase.

Verständnisfragen

zu

r Abschnitt 5 1. Wie lauten die metabolischen Vorstufen der nicht essentiellen Aminosäuren? 2. Zählen Sie die Verbindungen auf, die für die Synthese der essentiellen Aminosäuren in

zol-4-carboxamid-ribonucleotid freigesetzt (Abb. 21.36, Reaktion 2), das auch ein

Intermediat bei der Purinbiosynthese ist. Die ungewöhnliche Biosynthese von Histidin aus einem Purin (N"5’-Phosphorylribosyl-ATP, das Produkt von Reaktion 1 in Abb. 21.36) wurde als Argument für die Hypothese herangezogen, dass das Leben ursprünglich auf RNA basierte. His-Reste sind, wie wir gesehen haben, oft Bestandteile aktiver Zentren von Enzymen, wo sie als Nucleophile und/oder allgemein als Säure-Base-Katalysatoren arbeiten. Die Entdeckung, dass RNA katalytische Eigenschaften aufweisen kann, legt nahe, dass der Imidazolteil der Purine eine ähnliche Rolle in die-

Pflanzen und Mikroorganismen

sen RNA-Enzymen

nötig sind.

Histidin ein „Fossil“ des Übergangs zu effizienteren, auf Proteinen basierenden

spielt. Dies lässt vermuten,

Lebensformen darstellt.

dass der Biosyntheseweg von

Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels

6

Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels

. Bestimmte Aminosäuren sind neben ihrer Hauptfunktion als Proteinbausteine wichtige Vorstufen für eine Vielzahl anderer Biomoleküle, wie Nucleotide und

Nucleotid-Coenzyme, Hämgruppen sowie verschiedene Hormone und Neurotransmitter. In diesem Abschnitt betrachten wir die Wege, die zu einigen dieser Substanzen führen. Die Nucleotidbiosynthese wird in Kapitel 23 besprochen.

A.

Hämbiosynthese und -abbau

Häm ist, wie wir bereits gesehen haben, eine Fe-haltige prosthetische Gruppe, die ein essentieller Bestandteil vieler Proteine ist, wie z.B. Hämoglobin, Myoglobin und der Cytochrome. Die ersten Schritte der Hämbiosynthese sind ebenfalls bei der Bildung anderer Tetrapyrrole, einschließlich des Chlorophylis in Pflanzen und Bakterien (Abb. 19.2) und des Coenzyms B,, in Bakterien (Abb. 20.17), anzutreffen. Die Aufklärung der Hämbiosynthese erforderte eine wahre Detektivarbeit. David Shemin und David Rittenberg, die unter den Ersten bei der Aufklärung von Stoffwechselwegen mittels Isotopenmarkierung waren, konnten 1945 zeigen, dass alle C- und N-Atome in Häm aus Acetat und Glycin stammen. Die Hämbiosynthese findet zum Teil in den Mitochondrien und teilweise im Cytosol statt (Abb. 21.37). Mitochondriales Acetat wird über den Citratcyclus zu Succinyl-CoA metabolisiert, das dann mit Glycin in einer Reaktion kondensiert, die CO, und ö-Aminolävulin-Säure (ALA) erzeugt. ALA wird in das Cytosol transportiert, wo es sich mit einem zweiten ALA zu Porphobilinogen (PBG) verbindet. Diese Reaktion wird durch das Zn-abhängige Enzym Porphobilinogen-Synthase katalysiert. Die Hemmung der PBG-Synthase durch Blei ist eines der Hauptsymptome einer akuten Bleivergiftung. Es ist wahrscheinlich, dass die Anhäufung von ALA im Blut, das dem Neurotransmitter y-Aminobuttersäure ähnelt (Abschnitt 21.6B), verantwortlich für die Psychose ist, die oft eine Bleivergiftung begleitet. Die nächste Phase der Hämbiosynthese besteht aus der Kondensation von vier PBG-Molekülen zur Ausbildung von Uroporphyrinogen III, dem Porphyrinkern, in einer Serie von Reaktionen, die durch die Porphobilinogen-Desaminase (auch Uroporphyrinogen-Synthase genannt) und die Uroporphyrinogen-Ill-Cosynthase katalysiert werden. Das erste Produkt, Hydroxymethylbilan ist ein lineares Tetrapyrrol, das dann cyclisiert.

A = Acetyl

P = Propionyl

Hydroxymethylbilan

Protoporphyrin IX, das nach Einbau von Fe zu Häm wird, entsteht aus Uroporphyrinogen III in einer Serie von Reaktionen. Diese werden katalysiert durch (1) Uroporphyrinogen-Decarboxylase, die alle vier Acetatseitenketten (A) zur Bildung von Methylgruppen (M) decarboxyliert, (2) Coproporphyrinogen-Oxidase,

835

836

Aminosäuremetabolismus

M

Mitochondrion

V

Citrateyclus

s

| |

ü a i f N

N

N

(0)

N

B

=00C—CH,;—CH,—C—CoA

CH

—

Suceinyl-CoA

Protoporphyrinogen.

Ferrochelatase

&

+

Oxidase

M

H3N — CH,— C00°

Rt

Se

Glycin

ö-AminolävulinCO, = säure-Synthase

=00C—CH,—

| CH, — C— CH, — NH3

(ALA)

ö ae

=

CH

\

|

|

u |

& N—-Fe—N

N ed

H,C =

M-—

M

NH

|

BR

COO”

H,C

HN

—-M su

CoproporphyrinogenOxidase

2C0,

Cytosol

-

CH,

A

NH

H .

PARNMi Protoporphyrinogen IX

M

Häm

| CH,

CH, N

N H,C Se

CH

ALA e.

PorphobilinogenSynthase

..

V

M

N H

.Porphobilinogen (PBG)

A

4 NH, Porphobilinogen- | UroporDesaminase | phyrinogen IIICosynthase

P

|

HC A

| a

NH

—A

H

——

N

|

B

H,C

HN

- p-—= HC 2

CH,

|

CH

2

M

UroporphyrinogenDecarboxylase

| 4 CO,

—

a

HN

P-——= H,C * 2 2:

A

Uroporphyrinogen III

EN

III

Abb. 21.37 Hämbiosyntheseweg. ö-Aminolävulinsäure (ALA) wird im Mitochondrion aus Succinyl-CoA und Glycin durch die ALA-Synthase synthetisiert. ALA wird dann ins Cytosol transportiert, wo zwei dieser Moleküle unter Bildung von PBG kondensieren, vier dieser Moleküle kondensieren unter Bildung eines Porphyrinrings. Die nächsten drei Reaktionen erfordern die Oxidation der Pyrrolringsubstituenten. Das dabei entstehende Protoporphyrinogen IX wird während seiner Bildung zurück ins Mitochondrion transportiert. Nach der Oxidation der Methingruppen katalysiert die Ferrochelatase den Einbau von Fe?*, um schließlich Häm zu erhalten. A, P, M und V stellen jeweils

Acetyl-, Propionyl-, Methyl- und Vinylgruppen (-CH,=CH,) dar. Die C-Atome, die ursprünglich aus den Carboxylgruppen des Acetats stammen, sind rot markiert.

Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels

837

die oxidativ Propionatseitenketten (P) zu Vinylgruppen (V) decarboxyliert und (3) Protoporphyrinogen-Oxidase, die die Pyrrolringe verbindenden Methylengruppen zu Methingruppen oxidiert. Während der Coproporphyrinogen-Oxida. sereaktion wird das Porphyrin zurück in das Mitochondrion transportiert. In der abschließenden Reaktion der Hämbiosynthese fügt die Ferrochelatase Fe(II) in Protoporphyrin IX ein. Regulation der Hämbiosynthese Die beiden Hauptorte der Hämbiosynthese sind die Erythroblasten (Vorläufer der Erythrocyten), die ca. 85% der Hämgruppen des Körpers synthetisieren, und die Leber, die den größten Teil der übrigen 15% synthetisiert. In der Leber muss das Ausmaß der Hämsynthese an die Erfordernisse des Stoffwechsels angepasst werden. Die Synthese des an Entgiftungsprozessen beteiligten hämhaltigen Cytochroms P450 (Abschnitt 12.4D) schwankt z.B. je nach dessen Bedarf. Im Gegensatz dazu ist die Hämsynthese in Erythroblasten ein einmaliges Ereignis; Häm- und Proteinsynthese enden mit der Zellreifung, sodass das gebildete Hämoglobin für die gesamte Lebensdauer der Erythrocyten (ca. 120 Tage) ausreichen muss. In der Leber ist der Hauptkontrollpunkt der Hämsynthese die ALA-Synthase; das Enzym, das den ersten Schritt des Synthesewegs katalysiert. Häm oder sein Fe(III)-Oxidationsprodukt Hämin kontrollieren die Aktivität dieses Enzyms durch Rückkopplungshemmung, durch Inhibition des ALA-Synthasetransports vom Ort der Synthese im Cytosol zum Wirkungsort in den Mitochondrien (Abb. 21.37) und durch Repression der Enzymsynthese. In Erythroblasten beeinflusst Häm seine Biosynthese auf eine gänzlich verschiedene Weise. Häm stimuliert in Reticulocyten (unreife Eryhtrocyten) die Proteinsynthese anstatt sie zu unterdrücken. Obwohl der größte Teil der von Erythroblasten synthetisierten Proteine aus Globin besteht, führt Häm in diesen Zellen auch dazu, dass die Enzyme der Hämbiosynthese vermehrt synthetisiert werden. Darüber hinaus sind die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Hämbiosynthese in Erythroblasten die Ferrochelatase- und Porphobilinogen-

Die Porphyrien Defekte bei der Hämbiosynthese in der Leber oder in Erythroblasten führen zu einer Anhäufung von Porphyrin und/ oder dessen Vorstufen und sind darum als Porphyrien bekannt. Zwei solcher Defekte betreffen Erythroblasten: ein Mangel an Uroporphyrinogen-Ill-Cosynthase (congenitale erythropoietische Porphyrie) und ein Ferrochelatasemangel (erythropoietische Protoporphyrie). Der erstgenannte Mangel führt zu einer Anhäufung von Uroporphyrinogenderivaten. Durch die Ausscheidung dieser Verbindungen verfärbt sich der Urin rot und deren Ablagerung in den Zähnen führt zu einer rotbräunlichen Verfärbung. Ihre Anhäufung in der Haut macht diese extrem lichtempfindlich, so dass sich Geschwüre und entstellende Narben bilden. Bei den betroffenen

Die häufigste Porphyrie, die hauptsächlich die Leber betrifft, ist ein Mangel an Porphobilinogen-Desaminase (akute intermittierende Porphyrie). Diese Krankheit ist durch zeitweilige Anfälle von Unterleibsschmerzen und neurologischer Funktionsstörung gekennzeichnet. Überschüssige Mengen an ALA und PBG werden bei oder nach solchen Attacken in den Urin ausgeschieden. Durch die Ausscheidung überschüssiger Porphyrine, die aus PBG in nicht hepatischen Zellen synthetisiert werden, verfärbt sich der Urin rot, wenngleich die Haut nicht übermäßig lichtempfindlich wird. König Georg IIl., der England während der Amerikanischen Revolution regierte und der oftmals als wahnsinnig porträtiert

Personen beobachtet man auch verstärkten Haarwuchs, bei

akute intermittierende Porphyrie sind. Es wird weiterhin be-

dem große Teile des Gesichts und der Extremitäten mit feinem Haar bedeckt sind. Diese Symptome gaben Anlass zu der Spekulation, dass die Werwolflegende eine biochemische Basis hat.

wurde, hatte in der Tat Anfälle, die charakteristisch für eine richtet, dass sein Urin die Farbe von Portwein aufwies und

er einige Nachkommen hatte, bei denen diese Krankheit diagnostiziert wurde. Die Weltgeschichte wäre möglicherweise anders verlaufen, wenn Georg Ill. nicht diesen Stoffwechseldefekt geerbt hätte.

838

Aminosäuremetabolismus

Desaminasereaktionen und nicht die ALA-Synthasereaktion. Dies steht in Einklang mit der Vermutung, dass wenn die Hämbiosynthese in Erythroblasten „angeschaltet“ wurde, alle ihre Schritte mit maximaler Geschwindigkeit ablaufen und kein einzelner Schritt den Ablauf des Wegs limitiert. Die hämstimulierte Synthese von Globin gewährleistet, dass Häm und Globin im richtigen Verhältnis für den Zusammenbau zu Hämoglobin synthetisiert werden (Abschnitt 28.3C). Genetische Defekte bei der Hämbiosynthese verursachen Zustände, die als Porphyrien bekannt sind (Exkurs 21.3). Hämabbau Am Ende ihrer Lebenszeit werden die roten lauf entfernt und ihre Bestandteile abgebaut. beginnt mit einer oxidativen Spaltung von und B durch die Häm-Oxygenase, wobei

Blutkörperchen aus dem BlutkreisDer Hämkatabolismus (Abb. 21.38) Porphyrin zwischen den Ringen A Biliverdin, ein lineares Tetrapyrrol

mit grüner Farbe, entsteht. Danach wird die zentrale Methinbrücke im Biliver-

din (zwischen den Ringen C und D) reduziert und das rotorange Bilirubin gebildet. Die wechselnden Farben heilender Blutergüsse sind eine sichtbare Folge des Hämabbaus. Bei der Biliverdinbildung wird das Kohlenstoffatom der Methinbrücke zwischen den Ringen A und B als Kohlenmonoxid (CO) freigesetzt. CO ist allerdings ein Hämligand mit 200fach höherer Affinität für Hämoglobin als O, (Abschnitt 7.1A). Selbst ohne CO-Aufnahme aus der Luft sind infolgedessen rund 1% der Hämoglobinbindungsstellen durch CO blockiert. Das stark lipophile Bilirubin ist in wässrigen Lösungen unlöslich. Wie andere lipophile Metabolite, z.B. freie Fettsäuren, wird es im Blut im Komplex mit Serumalbumin transportiert. Bilirubinderivate werden in die Galle abgesondert und zum größten Teil durch bakterielle Enzyme im Dickdarm weiter abgebaut. Ein Teil des so entstandenen Urobilinogens wird wieder aufgenommen und über das Blut zu den Nieren transportiert, wo es zum gelben Urobilin umgewandelt und ausgeschieden wird. Dadurch erhält Urin seine charakteristische Farbe. Das meiste Urobilinogen wird jedoch mikrobiell in das dunkelrotbraune Stercobilin umgewandelt, das Hauptpigment des Kots. Enthält das Blut erhöhte Mengen Bilirubin, färbt die Ablagerung dieser schwer löslichen Substanz die Haut und die Skleren der Augen gelb. Dieser Zustand, Gelbsucht genannt, zeigt entweder eine abnorm hohe Geschwindigkeit des Erythrocytenabbaus, eine Fehlfunktion der Leber oder eine Verstopfung des Gallengangs an. Neugeborene, vor allem Frühgeborene weisen oft eine Gelbsucht auf, weil ihnen ein Enzym zum Abbau von Bilirubin fehlt. Betroffene Säuglinge werden durch Lichttherapie behandelt. Dabei wird Bilirubin photochemisch in löslichere Isomere umgewandelt, die leichter abgebaut und ausgeschieden werden können.

Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels Abb. 21.38

Der Hämabbauweg.

M, V, P und E repräsentieren Methyl-, Vinyl-,

Propionyl- und Ethylgruppen.

Bilirubin

8He mikrobielle Enzyme

B o

N

Bm

C nn

N

A En

nn

N

HB

Urobilinogen 2He 2He mikrobielle Enzyme (Dickdarm)

Stercobilin

(Nieren)

839

840

Aminosäuremetabolismus

B.

| O-t-om mn

2

H X=0H,

R=CH;

Adrenalin

RSIOHER—H KanszaRren

Noradrenalin Dopamin

N

|

Serotonin

(5-Hydroxytryptamin)

700C

CH, -CH,- CH, NH;

y-Aminobuttersäure (GABA)

nv 8

OH OH

Catechol

N NH

Biosynthese physiologisch aktiver Amine

Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin, Serotonin (5-Hydroxytryptamin), y-Aminobuttersäure (GABA} und Histamin sind Hormone und/oder Neurotransmitter, die von Aminosäuren abstammen. Wir haben bereits erfahren, (1) dass Adrenalin die Adenylat-Cyclase des Muskels aktiviert und dabei den Glykogenabbau stimuliert (Abschnitt 16.3B), (2) dass ein Fehler bei der Dopaminproduktion in bestimmten Bereichen des Gehirns mit dem Parkinson-Syndrom,

einem degenerativen und zu Schüttelläh-

mung führenden Leiden, in Verbindung gebracht wird, (3) dass Serotonin die Kontraktion der glatten Muskulatur verursacht, (4) dass GABA im Gehirn einer der Hauptneurotransmitter mit inhibitorischer Wirkung ist und (5) dass Histamin an allergischen Reaktionen (wie Allergiker, die Antihistaminika einnehmen, bestätigen werden) und an der Kontrolle der Magensäuresekretion beteiligt ist. Die Biosynthese jeder dieser physiologisch aktiven Amine beinhaltet die Decarboxylierung der entsprechenden Aminosäurevorstufe. Aminosäure-Decarboxylasen sind PLP-abhängige Enzyme, die eine Schiff’sche Base aus Substrat und PLP bilden und so das C,-Carbanion stabilisieren, das bei der Spaltung der C,-COO" Bindung gebildet wird (Abschnitt 21.2A).

Hr CH, NH5 Histamin

Die Bildung von Histamin (aus Histidin) und von GABA (aus Glutamat) sind einstufige Prozesse. Die Synthese von Serotonin aus Tryptophan erfordert neben der Decarboxylierung einen Hydroxylierungsschritt. Die verschiedenen Catecholamine — Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin - enthalten Catechol als gemeinsames Strukturelement und werden stufenweise aus Tyrosin synthetisiert (Abb. 21.39): 1. Tyrosin wird in einer Reaktion, die 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin (Abb. 21.26) erfordert, zu 3,4-Dihydroxyphenylalanin (1-DOPA) hydroxyliert. ı-DOPA wird zu Dopamin decarboxyliert. Eine zweite Hydroxylierung führt zu Noradrenalin. BUN . Die Methylierung der Aminogruppe von Noradrenalin durch S-Adenosylmethionin (Abb. 21.18) ergibt Adrenalin.

Welches spezifische Catecholamin eine Zelle produziert, hängt davon ab, welche Enzyme des Stoffwechselwegs vorhanden sind. Im Nebennierenmark z.B. ist Adrenalin das Hauptprodukt. In bestimmten Bereichen des Gehirns ist Noradrenalin vorherrschend. In anderen Hirnarealen endet der Stoffwechselweg beim Dopamin. In den Melanocyten ist 1-DOPA die Vorstufe der roten und schwarzen Melanine, die unregelmäßig miteinander vernetzt sind und Haaren und Haut einen Großteil ihrer Farbe verleihen.

Andere Produkte des Aminosäurestoffwechsels Tetrahydro- Dihydrobiopterin biopt erin +0, +H,0

HO

= 10

1 ))-an-t-coo NET: | Tyrosin-

NH+

841

H | CH, —C—C007

HO

Hydroxylase

—>

Melanin

NHF

Tyrosin

Dihydroxyphenylalanin

(L-DOPA) Aromatische Aminoy. ä -Decarboxylase

sauren

HO

S-Adenosylhomocystein

ni

4

C—-CH,—N—CH, | H

H

S-Adenosylmethionin HO

H,0 + Dehydro- O0, + ascorbat Ascorbat

OH |

HO

C—CH,—NH+

PhenylethanolaminN-Methyltransferase

er

| H

Adrenalin

Dopamin Stufenweise Synthese von L-DOPA,

Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin aus Tyrosin. L-DOPA ist ebenfalls die Vorstufe des Hautpigments Melanin.

Stickstoffmonoxid

Arginin ist die Vorstufe einer Substanz, die ursprünglich als EDRF (von engl.: endothelium-derived relaxing factor) bezeichnet wurde, weil sie von vaskulären Endothelialzellen synthetisiert wird und eine Relaxation der darunter liegenden glatten Muskulatur bewirkt. Das Signalmolekül für die Vasodilation war nicht, wie erwartet, ein Peptid, sondern das stabile freie Radikal NO (Stickstoffmonoxid). Die Identifizierung von NO als Vasodilator resultierte zum Teil aus Studien, die NO als Abbauprodukt von Verbindungen ergaben, welche wie Nitroglycerin

CH,— = _ Di ars) a | | NO, NO, NO, Nitroglycerin

eine gefäßerweiternde Wirkung besitzen. Nitroglycerin wird oftmals Personen verabreicht, die an Angina pectoris leiden (eine Krankheit, die durch unzureichenden Blutfluss durch den Herzmuskel hervorgerufen wird), um schnell aber nur zeitweise deren Schmerzen in der Brust zu lindern. Die Reaktion, in der Arginin zu NO und Citrullin umgewandelt wird, wird durch die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) katalysiert: OH |

@

| NH

CH, | er

EoNs

1— CO07 I

? N

R Br

NADPH + O5

ee |

Rn

H,N

eREN a

1

3NADPH + 0,

l nr

NADP*+ + H,0

Du

1

zNADP*+ + H,0

l a:

ML no

CH N

me

Bi CH

nn

HIN, G—.C00

En

HO

CH,—CH,—NHt

Noradrenalin

M NH,

00,

Dopaminß-hydroxylase

Abb. 21.39

&;

2

H,N+— f— COO

H

H

H

L-Arginin

L-Hydroxyarginin

L-Citrullin

——

842

Aminosäuremetabolismus

Die Reaktion verläuft über ein enzymgebundenes Hydroxyargininintermediat und erfordert eine Reihe von Redoxcoenzymen. NOS ist ein homodimeres Protein, das aus Untereinheiten von 125 bis 160 kD besteht. Jede Untereinheit enthält ein FMN, ein FAD, ein Tetrahydrobiopterin (Abb. 21.26) und ein Fe(lIl)Häm. Diese Cofaktoren ermöglichen die Fünf-Elektronen-Oxidation von Arginin zur Erzeugung von NO. Weil NO ein Gas ist, diffundiert es schnell durch Zellmembranen,

Verständnisfragen zu Abschnitt 6 1. Nennen Sie die Ausgangsmaterialien und die Endprodukte des Hämmetabolismus. 2. Identifizieren Sie die Aminosäuren, aus denen Catecholamine, Serotonin, GABA und Histamin synthetisiert werden. 3. Nennen Sie die Substrate und Produkte der NO-SynthaseReaktion.

obwohl

seine hohe Reaktivität (seine Halbwertzeit liegt bei ca. 5 s) es daran hindert, weiter als ca. 1 mm vom Ort seiner Synthese entfernt zu wirken. NO wird durch endotheliale Zellen als Antwort auf eine Vielzahl von Agenzien und physiologischen Zuständen erzeugt. Neuronale Zellen synthetisieren ebenfalls NO (neuronale NOS ist zu etwa 55% zur endothelialen NOS homolog). Diese endotheliumunabhängige NO-Synthese erweitert cerebrale und andere Arterien und ist u.a. für die Erektion des Penis verantwortlich. Das Gehirn enthält mehr NOS als jedes andere Gewebe im Körper, was nahe legt, dass NO essentiell für das Funktionieren des Zentralen Nervensystems ist. Ein dritter NOS-Typ wurde in Leukocyten (weißen Blutkörperchen) gefunden. Diese Zellen erzeugen NO als Bestandteil ihres cytotoxischen Arsenals. NO in Verbindung mit Superoxid (Abschnitt 18.4B) ergibt das hoch reaktive Hydroxylradikal, das eindringende Bakterien tötet. Folgen einer anhaltenden Freisetzung von NO können ein endotoxischer Schock (eine oftmals tödlich verlaufende Überreaktion des Immunsystems auf eine bakterielle Infektion), eine entzündungsbedingte Gewebeschädigung und eine Schädigung von benachbarten Neuronen sein, die nicht direkt von einem Schlaganfall zerstört wurden (was häufig größeren Schaden anrichtet als der Schlaganfall selbst).

7

Stickstofffixierung

Die bedeutendsten chemischen Elemente in lebenden Systemen sind O,H,C,N und P. Die Elemente O, H und P sind in metabolisch verfügbaren Formen (H,O, O, und P;) weit verbreitet. Die Hauptquellen von C und N jedoch, CO, und N,, sind äußerst stabil (reaktionsträge). So hat z.B. die N=N-Dreifachbindung eine Bindungsenergie von 945 kJ - mol”! (gegenüber 351 kJ - mol! für eine C-O-Einfachbindung). CO, wird mit wenigen Ausnahmen nur durch photosynthetische Organismen metabolisiert bzw. fixiert (Kap. 19). Die N,-Fixierung ist noch seltener. Dieses Element wird nur von einigen Bakterienstämmen, die Diazotrophe genannt werden, in metabolisch verwertbare Formen umgewandelt. Zu diesen Organismen zählen bestimmte marine Cyanobakterien sowie Bakterien, die in den Wurzelknöllchen von Leguminosen (Pflanzen, die zur Familie der Erbsengewächse gehören, einschließlich Bohnen, Klee und Luzerne) leben (Abb. 21.40). Wenn N, einmal fixiert ist, wird der Stickstoff in Form von Aminogruppen assimiliert (in Biomoleküle eingebaut), die dann auf andere Moleküle übertragen werden können. In diesem Abschnitt wird der Prozess der Stickstofffixierung und der Stickstoffassimilierung näher betrachtet.

A.

Nitrogenase reduziert N, zu NH,

Diazotrophe (Bakterien, die elementaren Stickstoff fixieren können) bilden das Enzym Nitrogenase, das die Reduktion von N, zu NH; katalysiert: Abb. 21.40 Wurzelknöllchen einer Erbsenpflanze. Bakterien der Gattung Rhizobium, die Stickstoff fixieren, leben symbiotisch in den Wurzelknöllchen solcher Leguminosen. [Vu/Cabisco/Visuals Unlimited.]

N +8H*

+8e

+16

ATP +16

,O—2

NH;

+ H, + 16 ADP + 16 P;

Bei den Leguminosen bildet das stickstofffixierende System mehr verwertbaren Stickstoff als die Pflanze braucht. Der Überschuss wird in die Erde abgegeben und verbessert die Bodenqualität. Es ist deshalb in der Landwirtschaft üblich,

Stickstofffixierung

[4Fe-4S] |

L P-Cluster

A Bun

ER N

>

‘

v®

A:

m &

z

RN As

ADP:AIF, FeMo-Cofaktor

ein Feld alle paar Jahre mit Luzerne (Medicago sativa) zu bepflanzen. Dadurch erhöht sich der Stickstoffgehalt des Bodens, sodass nachfolgend angebaute Feldfrüchte davon profitieren können. Nitrogenase enthält spezielle Redoxzentren Nitrogenase katalysiert wie erwähnt die Reduktion von N, zu NH;. Sie besteht aus zwei Proteinen, die einen Komplex bilden: 1. Dem Fe-Protein, einem Homodimer, das einen [4Fe-4S]-Cluster und zwei ATP-Bindungsstellen enthält. 2. Dem MofFe-Protein, einem a,ß,-Heterotetramer, das Fe und Mo enthält.

Die Röntgenstruktur der Nitrogenase aus Azotobacter vinelandii im Komplex mit dem Inhibitor ADP:AIF} (der den Übergangszustand in der ATP-Hydrolyse nachahmt) wurde von Douglas Rees bestimmt. Sie zeigt, dass jedes MoFe-Protein mit zwei Molekülen Fe-Protein assoziiert ist (Abb. 21.41). Der einzelne [4Fe-4S]-Cluster jedes Fe-Protein-Dimers sitzt in einem Spalt zwischen den beiden Untereinheiten, der mit dem Lösungsmittel in Kontakt kommt. Er ist mit Cys 97 und Cys 132 von beiden Untereinheiten symmetrisch verbunden, sodass ein Fe-Protein einem „Eisenschmetterling“ ähnelt, dessen Kopf der [4Fe-4S]-Cluster ist. Seine Nucleotidbindungsstellen sitzen an der Grenzfläche zwischen den beiden Untereinheiten. Die «- und ß-Untereinheiten des MoFe-Proteins nehmen eine ähnliche Orientierung ein. Sie bilden ein äußerst stabiles, pseudo-zweifach symmetrisches aßDimer. Zwei solche Dimere sind lockerer verbunden und bilden das zweifach symmetrische &,ß,-Tetramer (Abb. 21.41). Jedes aß-Dimer besitzt zwei gebundene Redoxzentren: 1. Das P-Cluster (Abb. 21.42a,b) besteht aus zwei [4Fe-3S]-Clustern. Diese sind durch ein zusätzliches Sulfid-Ion verbunden - das die achte Ecke beider Cluster bildet, sodass cubanartige Strukturen entstehen — und durch zwei CysThiolliganden überbrückt, die jeweils ein Fe aus jedem Cluster koordinieren. Vier zusätzliche Cys-Thiole koordinieren die restlichen vier Fe-Atome. Bei Oxidation ändern sich die Positionen von zwei der Fe-Atome in einem der [4Fe-3S]-Cluster, dabei reißt die Bindung von diesen Fe-Atomen zu dem verbindenden Sulfid-Ion. Diese Bindungen werden im oxidierten Zustand durch

843

en

Staa Abb. 21.41 Röntgenstruktur der Nitrogenase aus A. vinelandii im Komplex mit ADP:AIF;. Das Enzym ist hier entlang seiner zweifachen Molekülachse betrachtet, es handelt sich um

ein (aßy.)z-Heterooktamer in dem die ß-a-a-BAnordnung, das MoFe-Protein, von zwei

y„Fe-Proteinen flankiert wird, deren aus 289 Aminosäuren bestehende Untereinheiten durch eine lokale Doppelsymmetrie in Beziehung stehen. Die ähnlichen a-Untereinheiten (türkis und rot, 491

Aminosäuren) und.die ß-Untereinheiten (hellrot und hellblau; 522 Aminosäuren) stehen über eine pseudo-zweifach Symmetrie in Beziehung zu einander. Die beiden y-Untereinheiten, aus denen jedes Fe-Protein aufgebaut ist (pink und grün mit rotem bzw. blauem Switch-I- und Switch-Il-Segment), binden an das MofFe-Protein, wobei die zweizählige Achse sie gleichzeitig mit der pseudo-zweizähligen Achse verbindet (die wiederum die a- und ß-Untereinheiten des MofFe-Proteins verbindet). ADP:AIF;, [4Fe-4S]Cluster, FeMo-Cofaktor und P-Cluster sind

als Kalottenmodell dargestellt; C ist grün, N blau, O rot, S gelb, Fe orange, Mo pink und das AlF;-Ion violett. [Nach einer Röntgenstruktur von Douglas Rees, California Institute of Technology. PDBid 1N2C.] 6% siehe Interactive Exercises.

844

Aminosäuremetabolismus Abb. 21.42 Prosthetische Gruppe des Nitrogenase-MoFe-Proteins. Die Moleküle sind als Kugel-Stab-Modell dargestellt, C ist grün, N blau, O rot, S gelb, Fe orange und Mo pink. (a) Reduzierter P-Cluster von Klebsiella pneumoniae. Er besteht aus zwei [4Fe-3S]Komplexen, die über ein zusätzliches Sulfid-Ion gebunden sind - das die achte Ecke jeder cubanartigen Struktur bildet - und über zwei Cys-Thiolliganden verbrückt sind, die jeweils ein Fe aus jedem Cluster koordinieren. Vier zusätzliche Cys-Thiole koordinieren die restlichen vier Fe-Atome. (b) Mit 2 Elektronen oxidierter P-Cluster von Klebsiella pneumoniae. Im Vergleich zum reduzierten Komplex im Bildteil a sind zwei der Fe-S-Bindungen aus dem zentral gelegenen Sulfid-Ion (das die beiden [4Fe-3S]-Cluster verbrückt) durch Liganden aus dem Amid-N von Cys 87a und dem O der Seitenkette von Ser186ß ersetzt worden. Dabei entsteht ein [4Fe-3S]Cluster (links) und ein [4Fe-4S]-Cluster (rechts), die über eine direkte Fe-S-Bindung und zwei überbrückende Cys-Thiole verbunden bleiben. (c) FeMo-Cofaktor aus A. vinelandii. Er besteht aus einem [4Fe-3S]-Cluster und einem [Mo-3Fe-3S]-Cluster, die über drei Sulfid-Ionen verbrückt sind. Der FeMo-Cofaktor ist mit dem Protein nur über zwei Liganden an seinen entgegengesetzten Enden verbunden, einer vom His 442a zum Mo-Atom und einer vom Cys 275a zum Fe-Atom. Das Mo-Atom ist zusätzlich durch Homocitrat doppelt koordiniert. Höchstwahrscheinlich ist ein N-Atom (blaue Kugel) mit den sechs zentralen Fe-Atomen des FeMo-Clusters koordiniert (gestrichelte schwarze Linien). [Teil a und b nach Röntgenstrukturen von David Lawson, John Innes Centre, Norwich. Teil c nach einer Röntgenstruktur von Douglas Rees, California Institute of Technology. PDBids (a) IQGU, (b) TQHI und (c) IMIN.]

einen Ser-Sauerstoffliganden an eines der Fe-Atome und durch eine Bindung an den Amid-N von Cys aus dem anderen Fe-Atom ersetzt. 2. Den FeMo-Cofaktor (Abb. 21.42c), der aus einem [4Fe-3S]- und einem durch drei Sulfid-Ionen verbrückten [Mo-3Fe-3S]-Cluster besteht. Das Mo-Atom des FeMo-Cofaktors ist durch drei Cofaktor-Schwefel, einen His-Imidazol-Stickstoff und zwei Sauerstoffatome aus einem gebundenen Homocitrat-Ion etwa oktaedrisch angeordnet:

Homocitrat

Homocitrat ist damit ein essentieller Bestandteil des FeMo-Cofaktors. Der FeMo-Cofaktor besitzt einen zentralen Hohlraum. Wie eine ebenfalls von Rees erstellte Röntgenstruktur des MoFe-Proteins aus A. vinelandii gezeigt hat, enthält dieser höchstwahrscheinlich ein Stickstoffatom (obwohl auch ein C- oder O-Atom nicht ausgeschlossen werden kann). Dieses vermeintliche N-Atom ist mit den sechs zentralen Fe-Atomen des FeMo-Cofaktors derart angeordnet, dass es die etwa tetraedrische Koordinationsumgebung des Fe-Atoms vervollständigt. ATP-Hydrolyse löst bei der Nitrogenase Konformationsänderungen aus Die Stickstofffixierung durch die Nitrogenase erfordert eine Elektronenquelle.

Diese Elektronen werden je nach Organismus entweder oxidativ oder photosynthetisch erzeugt und auf Ferredoxin übertragen. Ferredoxin ist ein [4Fe-4S]-haltiger Elektronen-Carrier. Der Stickstofffixierungsprozess beginnt mit der Übertragung eines Elektrons von Ferredoxin auf das Fe-Protein der Nitrogenase (Abb. 21.43). Die Elektronenübertragung während der Nitrogenasereaktion erfordert ATPabhängige Konformationsänderungen des Proteins und die Dissoziation des

Stickstofffixiiercung Abb. 21.43

Elektronenfluss bei der N,-Reduktion, der von der Nitrogenase katalysiert wird.

2ADP +2P; (Ferredoxin)..a

(Fe-Protein),x

(Ferredoxin),,

(Fe-Protein).ea

(MoFe-Protein)..a

Na + 8 H"

“Photosynthese oder oxidativer Elektronentransport

| (MoFe-Protein),x 2 ATP

2NH3+

H,

8 mal

Fe-Proteins vom MoFe-Protein nach jedem Elektronentransfer. Während jedes Reaktionscyclus binden zwei ATP-Moleküle an das Fe-Protein und werden hydrolysiert, wenn ein Elektron auf das MoFe-Protein übergeht. Die Hydrolyse von ATP induziert im Fe-Protein eine Konformationsänderung, die das Redoxpotential von -0,29 auf —0,40 V herabsetzt und damit eine N,-Reduktion durch das

Elektron ermöglich (&°’ für die Reaktion N, + 6 H* + 6€ = 2 NH; liegt bei

0,34 V).

Wie sind die Konformationsänderungen an der ATP-Bindungsstelle mit der Elektronenübertragung verknüpft? Die ATP-Hydrolyse findet nur dann mit nennenswerter Geschwindigkeit statt, wenn sich das Fe-Protein im Komplex mit dem MofFe-Protein befindet (und natürlich kann ein Elektronentransfer nur dann vonstatten gehen, wenn die beiden Proteine assoziiert sind). Verblüffenderweise löst die Bindung von ADP:AlF; an das Fe-Protein in zwei Bereichen des Fe-Proteins Konformationsänderungen aus. Diese Bereiche heißen Switch I und Switch II (Abb. 21.41). Sie sind homolog zu den Segmenten der signalübertragenden G-Proteine, in denen die Nucleotidhydrolyse an Konformationsänderungen des Proteins gekoppelt ist (Abschnitt 13.3B). Am Switch I beeinflussen diese Konformationsänderungen die Wechselwirkungen zwischen dem Fe-Protein und dem MoFe-Protein. Am Switch II beeinflussen sie dagegen die Umgebung des [4Fe-4S]-Clusters. Röntgenstrukturen des Fe-Proteins allein und zusammen mit gebundenem ADP oder ATP zeigen, dass die ATP-Hydrolyse eine Strukturänderung auslöst, einschließlich einer Drehung der beiden Untereinheiten des Fe-Proteins um 13° zueinander hin. Diese Konformationsänderung bringt den [4Fe-4S]-Cluster näher an den P-Cluster des benachbarten MoFe-Proteins (von 1,8 auf 1,4 nm Entfernung), dabei wird die Elektronenübertragung vom Fe-Protein auf das MoFe-Protein ermöglicht. Kinetische Untersuchungen der Nitrogenase zeigen, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der N,-Reduktion die Ablösung des Fe-Proteins vom MofFe-Protein ist. Wenn das Fe-Protein auf die ähnliche Weise funktioniert wie ein G-Protein, dann könnte die Nucleotidhydrolyse seine Ablösung vom MofFeProtein auslösen. Eine erneute Assoziation könnte dann stattfinden, wenn das ADP das aktive Zentrum verlässt und durch ATP ersetzt wird. Die ATP-Hydrolyse würde erst dann wieder ablaufen, wenn das Fe-Protein wieder am MoFeProtein andockt und bereit ist, Elektronen zu übertragen. Die N,-Reduktion ist energieaufwändig Die tatsächliche Reduktion von N, vollzieht sich in drei separaten Schritten am MoFe-Protein, wobei jeweils ein Elektronenpaar beteiligt ist: 2H’ 3. +2e =

2H’ + +2e r- H

| N=N

H—N=N—H

/

N—N

%

H Diimin

y2H de 2e dreg

x

\

H

Hydrazin

845

2NH3

846

Aminosäuremetabolismus

Ein Elektronentransfer muss sechsmal pro fixiertes N,-Molekül ablaufen, sodass insgesamt 12 ATP benötigt werden, um ein N,-Molekül zu fixieren. Die Nitrogenase reduziert jedoch auch H,O zu H,, das mit Diimin wieder N, bildet. HN=NH

+ H}

>

N: +2

H>

Dieser Leerlaufcyclus ist begünstigt, wenn der ATP-Spiegel niedrig ist oder die Reduktion des Fe-Proteins schleppend verläuft. Selbst wenn ATP reichlich vorhanden ist, kann der Cyclus nicht unterdrückt werden, sodass etwa ein H,-Molekül pro reduziertes N, entsteht. Der Cyclus stellt anscheinend eine Voraussetzung für die Nitrogenaseaktivität dar. Die Gesamtkosten der N,-Reduktion sind somit acht übertragene Elektronen und 16 hydrolysierte ATP-Moleküle. Unter physiologischen Bedingungen liegen sie sogar eher bei 20-30 ATP. Damit ist die Stickstofffixierung ein energetisch teurer Vorgang. Obwohl atmosphärischer N, die basale Stickstoffquelle für alle Lebewesen darstellt, gehen die meisten Pflanzen keine Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien ein. Sie sind deshalb von einer Quelle von bereits fixiertem Stickstoff wie

Nitrat oder Ammonium abhängig. Diese Nährstoffe stammen von Blitzentladungen (rund 10% des natürlich fixierten N,), verwesendem organischen Material im Boden oder zugesetzten Düngemitteln (50% des fixierten Stickstoffs werden heute mit dem Haber-Bosch-Verfahren gewonnen, das für die industrielle Herstellung von Ammoniak aus N, und H, verwendet wird). Ein bedeutendes, langfristiges Ziel der Gentechnik ist es, landwirtschaftlich genutzte Nicht-Leguminosen dazu zu bringen, dass sie ihren eigenen Stickstoff fixieren können. Dann müssten Landwirte - insbesondere in den Entwicklungsländern - keinen entsprechenden Dünger kaufen, ihre Felder nicht turnusmäfßig brach liegen lassen (damit die Leguminosen wachsen können) und keine Brandrodung einsetzen, die zur fortschreitenden Zerstörung der Tropenwälder beiträgt.

B.

Fixierter Stickstoff wird zu biologischen Molekülen assimiliert

Nachdem atmosphärischer N, in eine biologisch verwertbare Form umgewandelt wurde (z.B. zu Ammonium) muss er in die Biomoleküle einer Zelle eingebaut werden. Wenn der Stickstoff in eine Aminosäure assimiliert wurde, kann die Aminogruppe durch Transaminierung auf andere Verbindungen übertragen werden. Weil die meisten Organismen keinen Stickstoff fixieren und auf bereits fixierten Stickstoff zurückgreifen müssen, sind die Stickstoffassimilierungsreaktionen entscheidend, um dieses lebensnotwendige Element im Organismus zu halten. Die von der Glutamin-Synthetase (Abschnitt 21.5A) katalysierte Reaktion ermöglich in Mikroorganismen einen Stoffwechseleinstieg für fixierten Stickstoff. Bei Tieren dagegen, eliminiert diese Reaktion überwiegend überschüssigen Ammoniak. Die Glutamin-Synthetase-Reaktion benötigt die stickstoffhaltige Verbindung Glutamat als Substrat. Woher stammt dann die Aminogruppe im Glutamat? In Bakterien und Pflanzen - nicht aber bei Tieren - wandelt das Enzym GlutamatSynthase «-Ketoglutarat und Glutamin zu zwei Molekülen Glutamat um:

a-Ketoglutarat + Glutamin

+ NADPH + H* — 2 Glutamat + NADP*

Diese reduzierende Aminierungsreaktion benötigt von NADPH Elektronen und spielt sich an drei separaten aktiven Zentren in dem a,ß,-Heterotetramer ab (Abb. 21.44). Die Röntgenstrukturen des Enzyms zeigen, dass die Substratbindungsstellen weit auseinander liegen. Infolgedessen muss der Ammoniak, der von Glutamin auf a-Ketoglutarat übertragen wird, einen 3,1 nm langen Kanal im Protein passieren. Dieser verhindert vermutlich, dass NH; in das Cytosol abdissoziiert und ermöglicht, dieses Zwischenprodukt in seinem reaktiveren deprotonierten Zustand zu halten (im Cytosol würde NH, sofort ein Proton auf-

Stickstofffixierung

847

Abb. 21.44 Glutamat-SynthaseReaktion. (1) Am aktiven Zentrum 1 auf der P-Untereinheit werden Elektronen von NADPH auf FAD übertragen, wobei FADH, entsteht. (2) Von FADH, gehen Elektronen auf FMN am Zentrum 2 auf eine a-Untereinheit über und es entsteht a-Untereinheit - aktives Zentrum 2

Channeling

I a-Ketoglutarat

T00C—-CH,—CH— C-C00° + H,0

FMNH..

;

(3) Am Zentrum 3 wird Glutamin zu Glutamat und Ammoniak hydrolysiert. (4) Das in Schritt 3 gebildete Ammoniak wandert durch einen Kanal zum Zentrum 2, wo es mit

a-Ketoglutarat reagiert. (5) Das Produkt a-Iminoglutarat wird von FMNH;, reduziert und es entsteht

«-Iminoglutarat

FMNH,

||

e

Klemm

H*

\see NH}

Glutamat

nehmen und zu NH; werden). Zudem wird der Kanal durch die Seitenketten mehrerer Aminosäurereste blockiert und öffnet sich nur, wenn a-Ketoglutarat an das Enzym gebunden ist und NADPH zur Verfügung steht. Dieser Mechanismus verhindert offensichtlich die sinnlose Hydrolyse von Glutamin. Das Nettoergebnis der Glutamin-Synthetase- und der Glutamat-SynthaseReaktion lautet:

a-Ketoglutarat

+ NH; + NADPH + ATP —> Glutamat + NADP' + ADP + P;

Somit assimiliert die kombinierte Tätigkeit dieser beiden Enzyme den fixierten Stickstoff (NH3$) in eine organische Verbindung (a-Ketoglutarat) und erzeugt eine Aminosäure (Glutamat). Sobald der Stickstoff als Glutamat assimiliert ist, kann er zur Synthese anderer Aminosäuren durch Transaminierung verwendet werden. Der Stickstoffkreislauf beschreibt die Umwandlung von Stickstoff in der Biosphäre Der in der Nitrogenase-Reaktion gebildete und in Aminosäuren eingebaute Ammoniak wird, wie im Stickstoffkreislauf beschrieben, letztendlich in der Bio-

sphäre recycelt (Abb. 21.45). Nitrat wird von bestimmten Bakterien gebildet, die NH, zu NO; und dann zu NO; reduzieren — ein Vorgang, den man als Nit-

rifizierung bezeichnet. Wieder andere Organismen setzen Nitrat wieder zu N, um, was man Denitrifizierung nennt. Außerdem wird Nitrat von Pflanzen, Pil-

zen und vielen Bakterien zu NH,

reduziert, dieser Vorgang heißt Ammonifizie-

rung und wird durch die Nitrat-Reduktase katalysiert, die hierfür mit zwei Elektronen die Reduktion von Nitrat zu Nitrit (NO5) ermöglicht:

NO; + 2H* + 2° — NO, + H,O

Glutamat.

848

Aminosäuremetabolismus

Abb. 21.45

Stickstoffkreislauf.

Bei der Stickstofffixierung verwandelt die Nitrogenase elementaren Stickstoff (N,) zum biologisch nutzbaren Ammonium-lon (NHi). Auch Nitrat kann durch die aufeinander folgenden Tätigkeiten der Nitrat-Reduktase und der Nitrit-Reduktase zu Ammoniak verwandelt werden. Ammoniak wird durch Nitrifizierung und anschließende Denitrifizierung zu N, umgewandelt. Ammoniak kann zu stickstoffhaltigen Biomolekülen assimiliert werden,

Dentrifizierung

die sich wieder zu Ammoniak zersetzen.

‚Nitrit; AReduktase

Verständnisfragen zu Abschnitt 7 1. Fassen Sie die Rolle von ATP in der Stickstofffixierung zusammen. 2.

und dann setzt die Nitrit-Reduktase Nitrit zu Ammoniak um,

Beschreiben Sie die Reaktionen,

durch die NH, zu Aminosäuren assimiliert wird. 3. Wie wird fixierter Stickstoff in der Biosphäre recycelt?

NO; + 7H* +6€e> NH; + 2 H,O

Vor kurzem hat man in bestimmten Bakterien die Umkehrung der Stickstofffixierung entdeckt, also die direkte anaerobe Oxidation von NH; zurück zu NH,, ohne Nitrat als Zwischenprodukt.

Zusammenfassung Il, Der Abbau intrazellulärer Proteine erfolgt in den Lysosomen oder, nach

deren Ubiquitinierung, durch das Proteasom. Der Abbau einer Aminosäure beginnt in der Regel mit der Entfernung der Aminogruppe in einer PLP-abhängigen Transaminierungsreaktion. Im Harnstoffeyclus verbinden sich ein Stickstoffatom von Ammoniak (ein Produkt der oxidativen Desaminierung von Glutamat) und ein Stickstoffatom von Aspartat mit HCO3 zu Harnstoff, der ausgeschieden wird. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieses Prozesses wird durch die Carbamoylphosphat-Synthetase katalysiert. Die 20 Standardaminosäuren werden zu Verbindungen abgebaut, die entweder zur Bildung von Glucose, Ketonkörpern oder Fettsäuren verwendet werden. Diese sind Pyruvat, a-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Fumarat, Oxalacetat, Acetyl-CoA oder Acetoacetat. Die nicht essentiellen Aminosäuren werden auf einfachen Stoffwechselwegen aus Pyruvat, Oxalacetat, a-Ketoglutarat und 3-Phosphoglycerat synthetisiert. Die Wege für die Synthese der essentiellen Aminosäuren sind komplizierter und können zwischen den Organismen variieren.

Aufgaben

849

6. Aminosäuren sind Vorstufen für verschiedene Biomoleküle. Häm wird aus Glycin und Acetat synthetisiert. Verschiedene Hormone und Neurotransmitter werden durch Decarboxylierung und Hydroxylierung von Histidin, Glutamat, Tryptophan und Tyrosin synthetisiert. Die Fünf-Elektronen-Oxidation von Arginin ergibt das bioaktive stabile Radikal Stickstoffmonoxid. Die Stickstofffixierung in Bakterien, die 8 Elektronen und mindestens 16 ATP erfordert, wird durch die Nitrogenase katalysiert, ein aus mehreren Untereinheiten bestehendes Protein mit Redoxzentren, die Fe, S und Mo

enthalten. Fixierter Stickstoff wird über die Glutamin-Synthase- und Glutamat-Synthase-Reaktionen in Aminosäuren eingebaut.

Wichtige Begriffe Ubiquitin Isopeptidbindung N-Terminus-Regel Proteasom Sedimentationskoeffizient Transaminierung PLP Desaminierung Hyperammonämie

Harnstoffcyclus Weiterleitung (channeling) glucogene Aminosäure ketogene Aminosäure THF SAM Biopterin essentielle Aminosäure nicht essentielle Aminosäure

Adenylierung Uridylierung Porphyrie Gelbsucht Catecholamin Stickstofffixierung Stickstoffassimilierung

Aufgaben 1% Erklären Sie, warum der Proteinabbau durch das Protea-

som ATP erfordert, obwohl die Proteolyse ein exergoner Prozess ist. Erklären Sie, warum die Symptome bei einem teilweisen

Mangel an Enzymen des Harnstoffcyclus durch eine proteinarme Ernährung gemildert werden können. Die Bildung der Enzyme, die die Reaktionen des Harnstoffcyclus katalysieren, kann je nach Stoffwechselbedarf des Organismus zu- oder abnehmen. Hohe Konzentrationen dieser Enzyme sind sowohl mit einer proteinreichen Ernährung als auch mit Hungern verknüpft. Erklären Sie diesen scheinbaren Widerspruch. Welche drei Enzyme von Säugern können potentiell mit freiem NH; reagieren und dabei dessen Konzentration senken? Das für Magengeschwüre verantwortliche Bakterium Helicobacter pylori kann im Magen (wo der pH-Wert nur 1,5 beträgt) zum Teil deshalb überleben, weil es große Mengen des Enzyms Urease bildet. (a) Formulieren Sie die Reaktion für die Harnstoffhydrolyse durch Urease. (b) Erklären Sie, warum diese Reaktion dazu beitragen könnte, für H. pylori, das Säure toleriert, aber lieber bei einem fast neutralen pH-Wert wächst, eine günstige Umgebung zu errichten.

6. Stellen Sie die Reaktionen des Abbauwegs für Isoleucin

auf (Abb. 21.21), die Tiglyl-CoA in Acetyl-CoA und Propionyl-CoA umwandeln. Zeichnen Sie die Schiff’sche Base, die beim Abbau von 3Hydroxykynurenin zur Bildung von 3-Hydroxyanthranilat beim Tryptophanabbauweg ausgebildet wird (Abb. 21.23, Reaktion 4) und geben Sie die zu spaltende Bindung an. Welche der 20 Standard-Aminosäuren sind (a) rein glucogen, (b) rein ketogen und (c) sowohl glucogen als auch ketogen? Alanin, Cystein, Glycin, Serin und Threonin sind Aminosäuren, bei deren Abbau Pyruvat erhalten wird. Beim Abbau welcher der restlichen 15 Aminosäuren, wenn überhaupt, entsteht ebenfalls Pyruvat? 10. Welche Konsequenzen für den Stoffwechsel von E.coli hätte ein Defekt im uridylentfernenden Enzym? Al, Viele der häufig genutzten Herbizide inhibieren die Synthese aromatischer Aminosäuren. Erklären Sie, warum diese Verbindungen für Tiere ungefährlich sind. 12. Eines der Symptome von Kwashiorkor, einer Protein-

mangelkrankheit bei Kindern, ist die Depigmentierung von Haut und Haaren. Erklären Sie die biochemische Grundlage dieses Symptoms.

850

Aminosäuremetabolismus

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Hepatocyten (Leberzellen) führen eine große Vielzahl von Stoffwechselprozessen aus. Wie werden die spezialisierten Aktivitäten der Hepatocyten und anderer Zelltypen für ein Maximum an Stoffwechselleistung und Anpassungsfähigkeit koordiniert? Wie führt Fehlregulation zu Erkrankungen? [CAMR/A.B. Dowsett/Photo Researchers.]

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 32 Animated Figure 22-6 Animated Figure 22-7

Animated Figure 22-8 Case Study 25 Case Study 28 Case Study 30

Selbst in der einfachsten prokaryotischen Zelle müssen Stoffwechselvorgänge so koordiniert werden, dass entgegengerichtete Stoffwechselwege nicht gleichzeitig ablaufen und dass ein Organismus auf veränderte äußere Bedingungen, wie z.B. die Verfügbarkeit von Nahrung, zu reagieren vermag. Zudem müssen die Stoffwechselaktivitäten eines Organismus den Anforderungen entsprechen, die durch genetisch programmiertes Wachstum und Fortpflanzung an ihn gestellt werden. Die Herausforderungen bei der Koordination der Energieaufnahme und des Energieverbrauchs sind in mehrzelligen Organismen merklich komplexer, hier müssen unterschiedliche Zellen miteinander kooperieren. Bei Tieren und Pflanzen wird diese Aufgabe durch die Aufteilung der Stoffwechselarbeit auf einzelne Gewebe vereinfacht. Bei Tieren wird die Vernetzung verschiedener Gewebe durch neuronale Schaltkreise und durch Hormone gewährleistet. Derartige regulatorische Systeme schalten Zellen nicht einfach an und ab, sondern können ein Spektrum unterschiedlichster Reaktionen auslösen. Die Antwort einer Zelle auf ein regulatorisches Signal hängt von der Fähigkeit der Zelle ab, das Signal wahrzunehmen und vom gleichzeitigen Eintreffen synergistischer oder antagonistischer Signale. Unsere Untersuchungen des Kohlenhydrat-, Lipid- und Aminosäurestoffwechsels in Säugern (Kap. 15-21) wären unvollständig ohne die Betrachtung, wie diese Vorgänge auf molekularer Ebene koordiniert sind und wie Fehlfunktionen Krankheiten verursachen. In diesem Kapitel fassen wir den spezialisierten Stoffwechsel verschiedener Organe und die Stoffwechselwege zusammen, die diese miteinander verbinden. Wir untersuchen auch die Mechanismen, über die extrazelluläre Hormone intrazelluläre Ereignisse beeinflussen. Abschließend betrachten wir Störungen beim Energiestoffwechsel der Säuger.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim zamıaır

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Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation e Spezialisierung von Organen « Hormonelle Kontrolle des Metabolismus der Energieträger im Körper e Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht e Störungen im Energiestoffwechsel

854

_ Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

1

Spezialisierung von Organen

Viele der bisher betrachteten Stoffwechselwege sind bei der Oxidation von Stoffwechselbrennstoffen zur Produktion von ATP beteiligt. Diese Wege, welche die Synthese und den Abbau von Glucose, Fettsäuren und Aminosäuren umfassen,

sind in Abbildung 22.1 zusammengefasst. lo Glykolyse. Der Abbau von Glucose im Stoffwechsel beginnt mit der Umwandlung der Glucose in zwei Moleküle Pyruvat bei einem Nettogewinn von zwei Molekülen ATP (Abschnitt 15.1). Gluconeogenese. Säuger können Glucose aus einer Vielzahl von Vorstufen, wie z.B. Pyruvat, über eine Serie von Reaktionen synthetisieren, die größtenteils eine Umkehrung der Glykolyse darstellen (Abschnitt 16.4). Glykogen — Abbau und Synthese. Diese beiden entgegengesetzten Vorgänge werden von der Glykogen-Phosporylase bzw. von der Glykogen-Synthase katalysiert und reziprok durch hormonell gesteuerte Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert (Abschnitt 16.3). Fettsäuren — Synthese und Abbau. Fettsäuren werden durch ß-Oxidation unter Bildung von Acetyl-CoA abgebaut (Abschnitt 20.2), das nach Umwandlung in Malonyl-CoA ebenfalls das Substrat für die Fettsäuresynthese ist (Abschnitt 20.4). Citratcyclus. Im Citratcyclus (Abschnitt 17.1) wird Acetyl-CoA zu CO, und H,O oxidiert, wobei reduzierte Coenzyme gebildet werden. Die Reoxidation dieser reduzierten Coenzyme treibt die ATP-Synthese an. Viele glucogene Aminosäuren können über den Citratcyclus oxidiert werden, indem die während ihres Abbaus anfallenden Cyclusintermediate (Abschnitt 21.4) weiter zu Pyruvat und schließlich zu Acetyl-CoA abgebaut werden, welches das Substrat des Cyclus darstellt. Oxidative Phosphorylierung. Dieser mitochondriale Weg verbindet die Oxidation von NADH und FADH,, die durch Glykolyse, ß-Oxidation und Citratcyclus erzeugt wurden, mit der Phosphorylierung von ADP (Abschnitt 18.3).

Triacylelycerin Glykogensynthese

Glykogenabbau

Fettsäure

Aminosäure- | |Aminoabbau | |säure-

Abb. 22.1 Hauptwege des Energiestoffwechsels bei Säugern. Proteine, Glykogen und Triacylglycerine werden aus kleineren Einheiten auf- und zu diesen abgebaut. Dazu gehören Aminosäuren, Glucose-6-phosphat und Fettsäuren. Die Oxidation dieser Brennstoffe liefert Stoffwechselenergie in Form von ATP. Pyruvat (ein Produkt des Glucose- und Aminosäureabbaus) und Acetyl-CoA (ein Produkt des Glucose-, Aminosäure- und Fettsäureabbaus) nehmen eine zentrale Stellung beim Energiestoffwechsel der Säuger ein. Verbindungen, die wie Oxalacetat zu Pyruvat führen, können für die Gluconeogenese verwendet werden; aus Acetyl-CoA können Ketonkörper entstehen, jedoch keine Glucose. Nicht alle hier gezeigten Wege treten in allen Zellen oder in einer bestimmten Zelle gleichzeitig auf.

Gluconeogenese | | Glykolyse

Fettsäureßsynthese | | Oxidation

synthese

Acetyl-CoA

A Oxalacetat

Citrat-

Dr

Ketonkörper

oxidative Phosphorylierung

Spezialisierung von Organen

7. Aminosäuren - Synthese und Abbau. Überschüssige Aminosäuren werden zu Intermediaten der Glykolyse und des Citratcyclus abgebaut (Abschnitt 21.4). Die Aminogruppe wird über die Synthese von Harnstoff ausgeschieden (Abschnitt 21.3). Nicht essentielle Aminosäuren werden auf Stoffwechselwegen synthetisiert, die von allgemeinen Metaboliten ausgehen (Abschnitt

21.5A).

Zwei Verbindungen befinden sich an den Kreuzungspunkten dieser großen Stoffwechselwege: Acetyl-CoA und Pyruvat (Abb. 22.1). Acetyl-CoA ist das gemeinsame Abbauprodukt von Glucose, Fettsäuren und ketogenen Aminosäuren. Die Acetylgruppe kann über den Citratcyclus und die oxidative Phosphorylierung zu CO, und H,O oxidiert oder zur Synthese von Ketonkörpern bzw. Fettsäuren verwendet werden. Pyruvat ist das Produkt der Glykolyse und entsteht beim Abbau glucogener Aminosäuren. Es kann oxidativ zu Acetyl-CoA decarboxyliert werden und damit Brennstoff für die Oxidation oder Ausgangsmaterial für die Fettsäurebiosynthese sein. Alternativ kann Pyruvat über die Pyruvat-Carboxylasereaktion zur Bildung von Oxalacetat carboxyliert werden. Dieses kann dann entweder zum Auffüllen von Intermediaten des Citratcyclus dienen oder zur Bildung von Glucose oder bestimmten Aminosäuren herangezogen werden. Nur wenige Gewebe, wie z.B. die Leber, können alle in Abbildung 22.1 gezeigten Reaktionen ausführen. In einer bestimmten Zelle findet nur ein kleiner Teil aller möglichen Stoffwechselreaktionen mit einer nennenswerten Geschwindigkeit statt. Der Fluss durch jede Reaktionssequenz hängt von dem Vorhandensein der entsprechenden Enzyme und von dem Bedarf des Organismus nach den Reaktionsprodukten ab. Wir werden den Stoffwechsel von vier Säugerorganen näher betrachten: Gehirn, Muskel, Fettgewebe und Leber. Die Metabolite fließen zwischen diesen Organen auf wohldefinierten Wegen, deren Durchflussmenge mit dem Ernährungszustand des Organismus variiert (Abb. 22.2). Kurz nach einer Mahlzeit sind z.B. Glucose, Aminosäuren und Fettsäuren direkt aus dem Darm verfügbar. Später, nachdem diese Brennstoffe erschöpft sind, versorgt die Leber andere Gewebe mit Glucose und Ketonkörpern, während das Fettgewebe ihnen Fettsäuren bereitstellt. All diese Organe sind über die Blutbahn miteinander verbunden.

A.

Gehirn

Das Gehirn weist eine bemerkenswert hohe Rate der Zellatmung auf. Obwohl das menschliche Gehirn nur ca. 2 % des Körpergewichts eines Erwachsenen ausmacht, ist es für rund 20% des O,-Verbrauchs im Ruhezustand verantwortlich. Ein Großteil der vom Gehirn produzierten Energie dient dazu, die (Na*-K*)-

ATPase der Plasmamembran anzutreiben (Abschnitt 10.3A), die das für die Fortleitung von Nervenimpulsen erforderliche Membranpotential aufrechterhält. Unter normalen Bedingungen ist Glucose der Hauptenergielieferant für das Gehirn (obgleich das Gehirn bei langanhaltendem Fasten allmählich auf die Verwendung von Ketonkörpern übergeht; Abschnitt 22.4A). Da die Gehirnzellen nur wenig Glykogen speichern, ist eine ständige Zufuhr von Glucose aus dem Blut erforderlich. Fällt die Glucosekonzentration auf weniger als die Hälfte des normalen Wertes von ca. 5 mM, kommt es zu einer Funktionsstörung des Gehirns. Eine weit darunter liegende Glucosekonzentration führt zu Koma, irreversiblen Schädigungen und letztendlich zum Tod.

855

856

_ Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Triacylglycerine

Abb. 22.2 Wechselseitige Stoffwechselbeziehungen zwischen Gehirn, Fettgewebe, Muskel, Leber und Niere. Die roten Pfeile zeigen Stoffwechselwege an, die bei einem ausreichenden Angebot an

Nährstoffen vorherrschen.

B.

Muskel

Die wichtigsten Energiequellen für die Muskeln sind Glucose (aus Glykogen), Fettsäuren und Ketonkörper. Ein ruhender und ausreichend mit Nährstoffen versorgter Muskel legt einen Glykogenspeicher an, der 1 bis 2% seiner Masse entspricht. Obwohl Triacylglycerine die effizientere Form für die Speicherung von Energie sind (Abschnitt 9.1B), ist die Glykogensynthese metabolisch günstiger, weil Glykogen schneller als Fett bereitgestellt und auch anaerob metabolisiert werden kann. Im Muskel wird Glykogen in Glucose-6-phosphat (G6P) für den Eintritt in die Glykolyse umgewandelt. Der Muskel kann keine Glucose exportieren, da ihm die Glucose-6-Phosphatase fehlt. Obwohl der Muskel Glykogen aus Glucose synthetisieren kann, ist er nicht an der Gluconeogenese beteiligt, weil ihm die dazu

Spezialisierung von Organen

857

nötige Enzymausstattung fehlt. Demzufolge dient der Kohlenhydratstoffwechsel des Muskels auch einzig der Versorgung des Muskels. . Bei großer Anstrengung ist die Muskelkontraktion anaerob

Die Muskelkontraktion wird durch ATP-Hydrolyse (Abschnitt 7.2) angetrieben und erfordert dafür entweder ein aerobes oder ein anaerobes ATP-regenerierendes System. Die Atmung (Citratcyclus und oxidative Phosphorylierung) ist die Hauptquelle der ATP-Versorgung des Körpers. Im Ruhezustand beträgt der Anteil der Skelettmuskulatur am O,-Verbrauch des menschlichen Körpers rund 30%. Als Antwort auf eine starke Beanspruchung kann der Sauerstoffumsatz im Muskels um das 25fache ansteigen. Die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse kann sogar noch um ein Mehrfaches davon gesteigert werden. ATP wird zunächst durch eine Austauschreaktion mit Phosphocreatin erneuert (Abschnitt

14.2C):

Phosphocreatin

+ ADP = Creatin + ATP

(Im ruhenden Muskel wird Phosphocreatin durch Umkehrung dieser Reaktion wieder synthetisiert.) Bei maximaler Anstrengung, z.B. bei einem Sprint, reicht der Phosphocreatinvorrat des Muskels gerade 4 s. Danach muss der Muskel auf die ATP-Produktion über die Glykolyse von G6P umschalten - ein Prozess, dessen maximale Geschwindigkeit die des Citratcyclus und der oxidativen Phosphorylierung bei weitem übersteigt. Der größte Teil des G6P wird daher anaerob zu Lactat abgebaut (Abschnitt 15.3A). Wie wir in Abschnitt 22.1F sehen werden, exportiert der Muskel Lactat. Eine Muskelermüdung, die nach ca. 20s maximaler Anstrengung auftritt, wird nicht durch einen erschöpften Glykogenvorrat des Muskels hervorgerufen, sondern durch ein Absinken des pH-Werts, der von der Lactatanhäufung herrührt (Abschnitt 15.3A). Dieses Phänomen ist möglicherweise eine Anpassung, damit die Muskelzellen davor bewahrt werden, durch vollständiges Aufbrauchen ihres ATP-Vorrats sich selbst zu zerstören. Dauert die körperliche Anstrengung mehr als eine oder zwei Minuten an, wird die Energie dafür in erster Linie über die oxidative Phosphorylierung bereitgestellt. Die oxidative Phosphorylierung erzeugt ATP zwar langsamer, aber dafür viel effizienter als die Glykolyse. Am Beispiel verschiedener Sportarten, die jeweils andere Anforderungen an die Ausdauer des Athleten stellen, sind die diversen ATP-Quellen in Abb. 22.3 zusammengefasst.

Anaerobe Systeme

a

Aerobe Systeme

,

—

4-7

=

Hochsprung Gewichtheben Kugelstoßen Tennisaufschlag _]

Sprints

| Football-Linienspiel

200-400 m-Rennen 100 m Schwimmen

Rennen über mehr

als 500 m

OE2475

10s

1.5 min Dauer der Aktivität

3 min

Abb. 22.3 ATP-Quellen während körperlicher Belastung beim Menschen. Freies ATP ist bereits nach wenigen Sekunden verbraucht, kann aber durch Phosphocreatin kurzzeitig regeneriert werden. Wird weiter ATP benötigt, erzeugt der Muskel dieses durch Glykolyse. Der Wechsel vom anaeroben zum aeroben Metabolimus (oxidative Phosphorylierung) erfolgt nach etwa 90 Sekunden, bei durchtrainierten Sportlern auch später. [Nach McArdle, W.D., Katch, F.l. und Katch, V.L., Exercise Physiology, 2. Aufl., Lea & Febiger

(1986), S. 348.]

858

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation Der Herzmuskel arbeitet überwiegend aerob

Das Herz ist ein muskuläres Organ, das nicht sporadisch, sondern kontinuierlich Arbeit verrichtet. Daher ist der Herzmuskel gänzlich auf einen aeroben Stoffwechsel angewiesen und deshalb reichlich mit Mitochondrien ausgestattet, die bis zu 40% des Zellvolumens ausfüllen. Der Herzmuskel kann Fettsäuren, Ketonkörper, Glucose, Pyruvat und Lactat metabolisieren. Bei normaler Beander Wahl. Bei Belasspruchung sind Fettsäuren für das Herz die Energiequelle aus dem relativ bels größtentei die tung steigt jedoch der Verbrauch an Glucose, wird. bezogen grenzten Glykogenspeicher des Herzens

C. _ Fettgewebe Die Funktion des Fettgewebes ist die Speicherung von Fettsäuren und deren Freisetzung, wenn Energie benötigt wird. Das Fettgewebe ist weit über den Körper verteilt, jedoch befindet es sich hauptsächlich unter der Haut, in der Bauchhöhle und im Skelettmuskel. Das Fettgewebe eines normalgewichtigen 70 kg schweren Mannes enthält rund 15 kg Fett. Diese Menge repräsentiert über 570.000 kJ an Energie (141.000 Nahrungskalorien). Sie würde ausreichen, um den Organismus für 3 Monate am Leben zu halten. Das Fettgewebe bezieht einen Großteil der zu speichernden Fettsäuren aus zirkulierenden Lipoproteinen, wie in Abschnitt 20.1B beschrieben wurde. Fettsäuren werden zunächst durch die Bildung der entsprechenden FettsäureAcyl-CoA-Verbindung aktiviert und dann mit Glycerin-3-phosphat verestert, um die Triacylglycerine für die Speicherung zu bilden. Das Glycerin-3-phosphat geht aus der Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat hervor, das glykolytisch aus Glucose erzeugt werden muss. Bei metabolischem Bedarf hydrolysieren die Adipocyten durch die Wirkung der hormonsensitiven Lipase die Triacylglycerine zu Fettsäuren und Glycerin (Abschnitt 20.5). Wenn Glycerin-3-phosphat reichlich vorhanden ist, werden viele der so gebildeten Fettsäuren wieder zu Triacylglycerinen verestert. Steht dagegen Glycerin-3-phosphat nur in geringen Mengen zur Verfügung, werden die Fettsäuren in den Blutkreislauf abgegeben. Die Mobilisierung der Fettsäuren ist somit zum Teil von der Geschwindigkeit der Glucoseaufnahme abhängig, da Glucose die Vorstufe von Glycerin-3-phosphat ist. Der Bedarf des Stoffwechsels wird sowohl direkt durch eine Abnahme der Glucosekonzentration als auch durch hormonelle Stimulierung signalisiert.

D.

Leber

Die Leber ist die zentrale Schaltstation für den Stoffwechsel des Körpers. Sie hält die benötigten Pegel an zirkulierenden Nährstoffen für die Verwendung in Gehirn, Muskulatur und anderen Geweben aufrecht. Für diese Aufgabe ist die Leber auf Grund ihrer Lage prädestiniert, da alle vom Darm aufgenommenen Nährstoffe, mit Ausnahme

der Fettsäuren, zunächst in die Pfortader gelangen,

die direkt zur Leber führt. Glucokinase wandelt Glucose aus dem Blut in Glucose-6-phosphat um

Eine der Hauptfunktionen der Leber ist es, als „Puffer“ des Glucosespiegels im Blut zu Jungieren. Sie tut dies durch Aufnahme und Freisetzung von Glucose als Antwort auf Hormonwirkungen und auf die Glucosekonzentration. Nach einer kohlenhydrathaltigen Mahlzeit, wenn die Glucosekonzentration im Blut ca. 6 mM erreicht, nimmt die Leber Glucose auf, indem diese in G6P umgewandelt wird. Diese Reaktion wird durch die Glucokinase, ein Leber-Isoenzym der Hexokinase, katalysiert. Die Hexokinasen der meisten Zellen weisen Michaelis-Menten-Kinetiken auf, d.h. sie haben eine hohe Glucoseaffinität (Ky < 0,1 mM)

Spezialisierung von Organen

und werden durch ihr Reaktionsprodukt (G6P) inhibiert. Die Glucokinase besitzt im Gegensatz dazu eine wesentlich niedrigere Glucoseaffinität. Sie erreicht die halbmaximale Geschwindigkeit erst bei ca. 5 mM Glucose und zeigt eine sigmoide Kinetik. Demzufolge erhöht sich die Aktivität der Glucokinase schnell, wenn sich die Glucosekonzentration im Blut oberhalb des normalen physiologischen Bereichs befindet (Abb. 22.4). Weiterhin wird die Glucokinase nicht durch physiologische Konzentrationen an G6P inhibiert. Deshalb wandelt die Leber Glucose umso schneller in G6P um, je höher die Glucosekonzentration im Blut ist. Bei niedriger Glucosekonzentration im Blut konkurriert die Leber nicht mit anderen Geweben um die zur Verfügung stehende Glucose. Bei einer hohen Glucosekonzentration im Blut hingegen, wenn der Glucosebedarf dieser Gewebe gedeckt ist, kann die Leber die überschüssige Glucose mit einer Geschwindigkeit aufnehmen, die in etwa der Glucosekonzentration im Blut proportional ist. Da die Glucokinase ein monomeres Enzym ist, gestaltet sich die Erklärung für ihr sigmoides Verhalten bei der Kinetik schwierig. (Modelle für allosterische Interaktionen können kein kooperatives Verhalten bei einem monomeren Protein erklären; Abschnitt 7.1D.) Die Glucokinase unterliegt jedoch der Kontrolle durch den Stoffwechsel. Emile Van Schaftingen hat ein regulatorisches Protein für die Glucokinase aus der Rattenleber isoliert, das in Gegenwart des Glykolyseintermediats Fructose-6-phosphat (F6P) ein kompetitiver Inhibitor der Glucokinase ist. Da F6P und das Glucokinaseprodukt G6P in den Leberzellen über die Phosphogluco-Isomerase miteinander im Gleichgewicht stehen, wird die Glucokinase in der Tat durch ihr Produkt inhibiert. Fructose-1-phosphat (F1P), ein Intermediat des Fructosestoffwechsels in der Leber (Abschnitt 15.5A), hebt diese Inhibition auf. Weil Fructose normalerweise nur aus Nahrungsquellen verfügbar ist, könnte zugleich aufgenommene Fructose das Signal dafür sein, die Aufnahme von Glucose aus der Nahrung durch die Leber auszulösen.

859

Hexokinase

Glucokinase

"o®

5

10

15

[Glucose] (mM)

Abb. 22.4 Relative enzymatische Aktivitäten von Hexokinase und Glucokinase bei physiologischen Blutglucosekonzentrationen. Die Glucokinase besitzt eine wesentlich geringere Affinität zu Glucose (Ky = 5 mM) als die Hexokinase (Ku, = 0,1 mM) und zeigt bezüglich der Glucosekonzentration einen sigmoiden anstatt eines hyperbolischen Verlaufs. [Die Glucokinasekurve wurde unter Verwendung der Hill-Gleichung [7.8] mit den von Cardenas, M.L., Rabajille, E. und Niemeyer, H., Eur.J.Biochem. 145, 163-171 (1984) bestimmten

Parametern

K= 10 mM

und n = 1,5

erstellt.]

Glucose-6-phosphat befindet sich im Zentrum des Kohlenhydratstoffwechsels G6P mündet in Abhängigkeit vom Glucosebedarf in verschiedene alternative Stoffwechselwege in der Leber (Abb. 22.5): 1. G6P kann für den Transport über den Blutkreislauf zu den peripheren Orga-

nen durch die Glucose-6-Phosphatase in Glucose umgewandelt werden. Dies geschieht nur, wenn die Glucosekonzentration im Blut unter ca. 5 mM abfällt. Während körperlicher Anstrengung oder beim Fasten bewirken geringe Glucosekonzentrationen im Blut die Sekretion von Glucagon durch den Pankreas. Glucagonrezeptoren an der Oberfläche von Leberzellen reagieren darauf durch Aktivierung der Adenylatcyclase. Die daraus resultierende Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration löst den Glykogenabbau aus (Abschnitt 16.3). 2. G6P kann zu Glykogen umgewandelt werden (Abschnitt 16.2), wenn der Bedarf des Körpers an Glucose niedrig ist. 3. G6P kann über die Glykolyse und die Wirkung der Pyruvat-Dehydrogenase in Acetyl-CoA umgewandelt werden. Dieses aus Glucose stammende Acetyl-CoA kann, wenn es nicht über den Citratcyclus und oxidative Phosphorylierung zur Erzeugung von ATP verwendet wird, für die Synthese von Fettsäuren (Abschnitt 20.4), Phospholipiden (Abschnitt 20.6) und Cholesterin (Abschnitt 20.7A) genutzt werden. 4. G6P kann über den Pentosephosphatweg (Abschnitt 15.6) zur Erzeugung von NADPH abgebaut werden, das für die Biosynthese der Fettsäuren und anderer Verbindungen erforderlich ist. Die Leber kann Triacylglycerine synthetisieren oder abbauen Fettsäuren werden ebenfalls über verschiedene Stoffwechselwege in der Leber abgebaut. Wenn die Nachfrage nach Stoffwechselbrennstoffen hoch ist, werden Fettsäuren zu Acetyl-CoA und dann zu Ketonkörpern für den Export in die peripheren Gewebe umwandelt. Die Leber selbst kann keine Ketonkörper als Ener-

Fettsäuren

Phospholipide

Cholesterin

Abb. 22.5 Stoffwechselwege von G6P in der Leber. G6P kann (1) in Glucose für den Export oder (2) in Glykogen für die Speicherung umgewandelt werden. Acetyl-CoA aus dem G6P-Abbau (3) ist Ausgangspunkt für die Lipidbiosynthese. Es wird ebenfalls zur Erzeugung von ATP bei der Atmung verbraucht. Der Abbau von G6P über den Pentosephosphatweg (4) ergibt NADPH.

860

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

giequelle verwenden, weil den Leberzellen die 3-Ketoacyl-CoA-Transferase fehlt. Dieses Enzym wird für die Umwandlung von Ketonkörpern zurück in AcetylCoA benötigt (Abschnitt 20.3). Demzufolge sind bei hohem metabolischen Bedarf für die Leber eher Fettsäuren als Glucose oder Ketonkörper die Hauptquelle für Acetyl-CoA. Die Leber erzeugt ihr ATP aus diesem Acetyl-CoA durch den Citratcyclus und die anschließende oxidative Phosphorylierung. Wenn der Bedarf des Stoffwechsels an Brennstoffen gering ist, werden Fettsäuren in Triacylglycerine eingebaut. Diese werden als Lipoproteine (VLDL) in den Blutkreislauf abgegeben und vom Fettgewebe aufgenommen. Fettsäuren können ebenfalls in Phospholipide eingebaut werden (Abschnitt 20.6). Die unter diesen Bedingungen in der Leber synthetisierten Fettsäuren werden nicht zu Acetyl-CoA oxidiert, da die Fettsäuresynthese im Cytosol von der Fettsäureoxidation in den Mitochondrien räumlich getrennt stattfindet. Außerdem hemmt Malonyl-CoA, eines der Zwischenprodukte der Fettsäuresynthese, den Transport von freien Fettsäuren in die Mitochondrien. Aminosäuren sind Energiequellen

Die Leber baut Aminosäuren zu einer Vielzahl von Stoffwechselintermediaten ab, die vollständig zu CO, und H,O oxidiert bzw. in Glucose oder Ketonkörper umgewandelt werden können (Abschnitt 21.4). Unmittelbar nach einer Mahlzeit, wenn Aminosäuren in relativ hoher Konzentration im Blut vorhanden sind, kommt ein signifikanter Teil der Stoffwechselenergie aus der Oxidation von Aminosäuren. Während des Fastens, wenn andere Brennstoffe knapp werden, wird Glucose aus Aminosäuren erzeugt, die größtenteils aus dem Abbau von Muskelproteinen zu Alanin und Glutamin hervorgehen. Proteine stellen daher - neben ihrer strukturellen und funktionellen Rolle — wichtige Energiereserven dar.

E.

Die Niere filtert Abfallprodukte aus dem Blut und hält dessen pH konstant

Die Nieren filtern Harnstoff und andere Abfallprodukte aus dem Blut heraus, während sie wichtige Stoffwechselprodukte wie z.B. Glucose aus dem Filtrat zurückgewinnen. Außerdem halten die Nieren den pH-Wert des Bluts aufrecht, indem sie erschöpfte Blutpuffer wie z.B. Bicarbonat (das über das Ausatmen von CO, verloren geht) regenerieren und überschüssige Protonen zusammen mit den konjugierten Basen von überschüssigen Säuren aus dem Stoffwechsel, wie z.B. den Ketonkörpern Acetoacetat und ß-Hydroxybutyrat ausscheiden. Protonen werden auch in Form von NH; ausgeschieden. Dabei stammt der Stickstoff aus Glutamin oder Glutamat. Das verbleibende Aminosäureskelett, a-Ketoglutarat, kann über die Gluconeogenese in Glucose umgewandelt werden (die Nieren sind neben der Leber das einzige Gewebe, das Glucose synthetisieren kann). Während einer Hungerphase decken die Nieren bis zu 50% des Glucosebedarfs des Körpers.

F.

Stoffwechselcyclen zwischen Organen

Die Fähigkeit der Leber, andere Gewebe mit Glucose oder Ketonkörpern zu versorgen, oder die Fähigkeit der Adipocyten, anderen Geweben Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, erfordert ein funktionierendes Kreislaufsystem. Dieses tauscht Nährstoffe, Intermediate und Abfallprodukte zwischen den Geweben aus. Außerdem sind einige wichtige Stoffwechselwege aus Reaktionen zusammengesetzt, die in unterschiedlichen Geweben stattfinden. In diesem Abschnitt beschreiben wir zwei gut untersuchte Stoffwechselwege, die zwischen mehreren Organen verteilt sind.

Spezialisierung von Organen

861

Abb. 22.6

Cori-Cyclus. Das bei der Glykolyse in der Muskulatur entstandene Lactat wird über den Blutkreislauf zur Leber transportiert, wo es durch die Gluconeogenese in Glucose umgewandelt wird. Der Blutkreislauf bringt die Glucose zurück zur Muskulatur, wo sie

als Glykogen gespeichert werden kann. 6% siehe Animated Figures.

d——

Me En

Der Cori-Cyclus

Das ATP, das die Muskelkontraktion antreibt, wird durch oxidative Phosphorylierung (in mitochondrienreichen, langsam kontrahierenden Muskelfasern; Exkurs 15.3) oder durch schnellen Abbau von Glucose zu Lactat (in schnell kontrahierenden Muskelfasern) erzeugt. Die langsam kontrahierenden Muskelfasern erzeugen ebenfalls Lactat, wenn der ATP-Bedarf die Oxidationsrate übersteigt. Das Lactat wird über den Blutkreislauf zur Leber transportiert, wo es durch die Lactat-Dehydrogenase in Pyruvat und anschließend durch die Gluconeogenese wieder in Glucose umgewandelt wird. Demzufolge sind die Leber und die Muskulatur durch den Blutkreislauf über einen Stoffwechselcyclus miteinander verbunden, der zu Ehren seiner Entdecker Carl und Gerty Cori (Exkurs 16.1) als Cori-Cyclus bezeichnet wird (Abb. 22.6). Der ATP-verbrauchende Glykolyse-Gluconeogenese-Cyclus wäre ein nutzloser Cyclus, wenn er innerhalb einer einzelnen Zelle stattfinden würde. In diesem

Fall finden die zwei Hälften des Cyclus in unterschiedlichen Organen statt. Das Leber-ATP wird zur Neusynthese von Glucose aus Lactat verwendet, das im Muskel erzeugt wurde. Die neu synthetisierte Glucose gelangt wieder in den Muskel, wo sie als Glykogen gespeichert oder sofort wieder zur Erzeugung von ATP für die Muskelkontraktion abgebaut werden kann. Das während des Cori-Cyclus durch die Leber verbrauchte ATP wird durch oxidative Phosphorylierung regeneriert. Nach heftiger Anstrengung dauert es mindestens 30 min, bis der Sauerstoffverbrauch wieder bis auf den Wert des Ruhezustands abgenommen hat. Durch diesen erhöhten O,-Verbrauch wird die Sauerstoffschuld zurückgezahlt, die durch den erhöhten ATP-Bedarf zum Antrieb der Gluconeogenese entstanden ist. Der Glucose-Alanin-Cyclus Über einen weiteren Stoffwechselweg, der dem Cori-Cyclus ähnelt, wird Alanin statt Lactat von der Muskulatur zur Leber transportiert. Bestimmte Aminotransferasen der Muskulatur verwenden Pyruvat als ihre a-Ketosäure, anstelle von a-Ketoglutarat oder Oxalacetat (Abschnitt 21.2A): NH3 R—-CH—-C00 Aminosäure

1 + H;C—C—-C00, Pyruvat

+ NH;

' —

TR C—000 a-Ketosäure

Er

CH--C00: Alanin

Die so entstandene Aminosäure Alanin wird in den Blutkreislauf abgegeben und zur Leber transportiert, wo sie einer Transaminierung zurück zu Pyruvat

unterzogen wird. Dieses Pyruvat ist dann ein Substrat für die Gluconeogenese. Die resultierende Glucose kann dann für einen glykolytischen Abbau wieder in die Muskulatur gelangen. Dies ist der sogenannte Glucose-Alanin-Cyclus (Abb. 22.7). Aus der mit Alanin übertragenen Aminogruppe wird entweder Ammoniak oder Aspartat. Sie kann somit für die Harnstoffbiosynthese (die nur in

862

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Abb. 22.7 Glucose-Alanin-Cyclus. Das während der Glykolyse im Muskel erzeugte Pyruvat ist ein Aminogruppenakzeptor für Amino-

transferasen im Muskel. Das so entstandene Alanin wird über den Blutkreislauf zur Leber transportiert, wo es wieder in Pyruvat umgewandelt wird (die Aminogruppe des Alanins wird über die Harnstoffbiosynthese entsorgt). Das Pyruvat ist anschließend Substrat für die Gluconeogenese. Über

den Blutkreislauf gelangt die entstandene Glucose schließlich zurück zu den Muskeln.

6” siehe Animated Figures.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Fassen Sie die wichtigsten Eigenschaften des Energiestoffwechsels in Gehirn, Muskel,

Fettgewebe, Leber und Nieren

der Leber stattfindet) weiter verwendet werden. Der Glucose-Alanin-Cyclus ist demzufolge ein Mechanismus, um Stickstoff aus der Muskulatur in die Leber zu transportieren. Während des Fastens wird die auf diesem Weg in der Leber erzeugte Glucose auch von anderen Geweben verwendet und der Cyclus ist unterbrochen. Weil das Pyruvat aus dem Abbau von Muskelproteinen stammt, versorgt die Muskulatur über diesen Stoffwechselweg indirekt andere Gewebe mit Glucose, obwohl sie selbst keine Gluconeogenese durchführt.

zusammen. Erklären Sie, warum der hohe Ky

der Glucokinase für die Rolle der Leber bei der Pufferung der Blutglucose von Bedeutung ist. Beschreiben Sie die Bedingungen, unter denen der Cori-Cyclus und der Glucose-Alanin-Cyclus arbeiten.

2

_Hormonelle Kontrolle des Metabolismus der Energieträger im Körper

Vielzellige Organismen koordinieren ihre Aktivitäten auf jeder Organisationsstufe durch komplexe Signalsysteme (Kapitel 13). Die meisten Zellen in einem vielzelligen Organismus nehmen sogar nur dann Brennstoff für das Wachstum und den Stoffwechsel auf, wenn sie ein Signal dafür erhalten haben. Das endokrine System des Menschen reagiert auf den Nährstoffbedarf des Organismus, indem es eine große Vielfalt von Hormonen sezerniert. Diese befähigen den Körper dazu, die Homöostase aufrechtzuerhalten, auf äußere Reize zu reagieren und verschiedene Entwicklungsprogramme zu durchlaufen. Wir haben bereits die Steroidhormone (Abschnitt 9.1E), die Peptidhormone Insulin und Glucagon (Abschnitt 13.1A, 13.4D und 16.3C) sowie die Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin (Abschnitt 13.1B, 16.3C und 21.6B) besprochen. Mit Ausnahme der Steroide müssen die Hormone, die diese Signale ver-

mitteln, zuerst an einen Zelloberflächenrezeptor binden. Die Steroide (die wir im Abschnitt 26.3B detailliert behandeln werden) diffundieren dagegen durch die Zellmembran und binden direkt an ihre intrazellulären Rezeptoren. In diesem Abschnitt betrachten wir die Wirkung der von der Bauchspeicheldrüse und den Nebennieren synthetisierten Hormone, denn diese spielen die wichtigste Rolle bei der Stoffwechselregulation der Brennstoffe in verschiedenen Säugergeweben.

Dabei werden

auch die Rezeptoren und Stoffwechselwege betrachtet,

über die diese Hormone ihre Wirkung auf Zellen entfalten. Die Freisetzung von Insulin wird durch Glucose ausgelöst

Wenn die Blutglucosekonzentration ansteigt, sezerniert die Bauchspeicheldrüse Insulin, das somit ein Signal dafür ist, dass genügend Stoffwechselbrennstoff vorhanden ist. Die ß-Zellen der Bauchspeicheldrüse sind für Glucose am empfindlichsten bei einer Glucose-Konzentrationen zwischen 5,5 und 6,0 mM

(die

normale Blutglucosekonzentration reicht von 3,6 bis 5,8 mM). Es gibt keinerlei

Hinweise darauf, dass ein Glucose-„Rezeptor“ auf der Zelloberfläche ein Signal zu der Sekretionsmaschinerie in der ß-Zelle weiterleiten könnte. Die Glucose

Hormonelle Kontrolle des Metabolismus der Energieträger im Körper gelangt über einen erleichterten, passiven Transport mithilfe von GLUT-Transportern in die ß-Zellen, und der Glucosestoffwechsel selbst erzeugt das Signal zur Insulinsekretion. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Glucosestoffwechsels in ß-Zellen ist die von der Glucokinase (das gleiche Enzym, das auch in Leberzellen vorkommt) katalysierte Reaktion. Folglich wird die Glucokinase als der Glucose„sensor“

der ß-Zelle

angesehen.

Das

Produkt

der Glucokinase,

G6P,

wird

nicht zur Glykogensynthese verwendet und die Aktivität des PentosephosphatStoffwechselwegs ist minimal. Des Weiteren ist die Aktivität der Lactat-Dehydrogenase gering. Infolgedessen wird praktisch das gesamte in ß-Zellen produzierte G6P zu Pyruvat abgebaut und dann zu Acetyl-CoA umgewandelt, damit es im Citratcyclus weiter oxidiert werden kann. Dieser lineare, in nur eine Richtung führende, katabole Stoffwechselweg verbindet direkt die Geschwindigkeit der oxidativen Phosphorylierung in den ß-Zellen mit der Menge an verfügbarer Glucose. Durch noch nicht vollständig verstandene Mechanismen reguliert die Gesamthöhe der Atmungsaktivität der ß-Zellen die Insulinsynthese und -sekretion. Insulin fördert die Speicherung von Brennstoffen im Muskel- und Fettgewebe Das Insulinsignal ist sehr komplex (Abb. 13.31). Es fungiert als primärer Regulator der Blutglucosekonzentration, indem es die Glucoseaufnahme in Muskeln und im Fettgewebe fördert und die Glucosebildung in der Leber hemmt. Insulin stimuliert jedoch auch das Zellwachstum und die -differenzierung und stimuliert die Synthese von Glykogen, Proteinen und Triacylglycerinen. Muskel- und Fettzellen (Adipocyten) exprimieren einen insulinempfindlichen Glucosetransporter namens GLUT4. Insulin stimuliert die GLUT4-Aktivität. Eine solche Steigerung könnte durch einen Aktivitätsanstieg der Transportermoleküle zustande kommen. Im Fall von GLUT4 wird der Anstieg allerdings dadurch erreicht, dass weitere Transportermoleküle in die Plasmamembran eingebaut werden (Abb. 22.8). In Abwesenheit von Insulin ist der GLUT4-Transporter in intrazellulären Vesikeln und Röhrenstrukturen lokalisiert. Insulin fördert die Fusion dieser Vesikel mit der Plasmamembran. Dieser Vorgang wird durch die SNARES (Abschnitt 9.4F) vermittelt. Der GLUT4-Iransporter taucht nur wenige Minuten nach der Insulinstimulierung auf der Zelloberfläche auf. Er besitzt einen relativ niedrigen Kyr-Wert für Glucose (2-5 mM). Wenn Zellen also diesen Transporter enthalten, können sie rasch Glucose aus dem Blut aufnehmen. Verringert sich die Insulin-Konzentration, werden die Glucosetransporter allmählich durch Endocytose wieder von der Plasmamembran entfernt. Das insulinabhängige GLUT4-Transportsystem erlaubt dem Muskel- und Fettgewebe direkt nach einer Mahlzeit rasch Stoffwechselbrennstoffe aufzunehmen. Ein Gewebe wie das Gehirn, das nahezu ausschließlich Glucose als Brennstoff verwendet, exprimiert konstitutiv einen insulinunempfindlichen Glucosetransporter. Infolgedessen unterliegt das Nervensystem keinen starken Schwankungen bei der Glucoseresorption. Die Leber hat ebenfalls keinen GLUT4 und reagiert deshalb bezeichnenderweise auf eine Zunahme der Insulinkonzentration nicht mit einer erhöhten Glucoseaufnahmegeschwindigkeit. Sobald die Glucose in eine Zelle gelangt ist, kann sie zur Glykogensynthese (im Muskel) und zur Synthese von Triacylglycerin (in Adipocyten; zur Fettsäuresynthese muss die Glucose zunächst zu Acetyl-CoA verstoffwechselt werden) verwendet werden. Insulin fördert spezifisch diese Stoffwechselaktivitäten. Wie in Abschnitt 16.3 behandelt, aktiviert Insulin die Glykogen-Synthase, indem es deren Dephosphorylierung fördert. In Adipocyten aktiviert Insulin den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (durch Aktivierung der verknüpften Phosphatase; Abschnitt 17.4A), es aktiviert die Acetyl-CoA-Carboxylase und erhöht die Konzentration der Fettsäure-Synthase (Abschnitt 20.5). Gleichzeitig hemmt Insulin die Lipolyse durch Hemmung der hormonempfindlichen Lipase.

863

864

_Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Glucose

NER,

Abb. 22.8 GLUTA4-Aktivität.

De

Die Glucoseaufnahme in Muskel- und Fettzellen wird durch die insulinstimulierte Exocytose von Membranvesikeln reguliert, die GLUT4 enthalten (links). Wenn Insulin wegfällt, kehrt sich der Vorgang durch Endocytose um (rechts). 6% siehe Animated Figures.

Endocytose

Exocytose

Stimulierung durch Insulin

j

Membranvesikel

Plasmamembran

Insulin blockiert in der Leber die Gluconeogenese und die Glykogenolyse Auch wenn die Leber auf Insulin nicht mit einer höheren Geschwindigkeit der Glucoseaufnahme reagiert, hat die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor auf Leberzellen (Hepatocyten) dennoch einige Konsequenzen. Die Inaktivierung der Phosphorylase-Kinase senkt die Geschwindigkeit der Glykogenolyse, und die Aktivierung der Glykogen-Synthase fördert die Glykogensynthese. Insulin hemmt auch die Transkription der Gene, die Enzyme der Gluconeogenese codieren, wie Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase, Fructose-1,6-Bisphosphatase und Glucose-6-Phosphatase (Abschnitt 16.4). Zudem stimuliert es die Transkription der Gene für die glykolytischen Enzyme Glucokinase sowie Pyruvatkinase. Auch die Produktion lipogener Enzyme, wie Acetyl-CoA-Carboxylase und FettsäureSynthase, nimmt zu. Das Ergebnis dieser regulatorischen Veränderungen ist, dass die Leber Glucose (in Form von Glykogen und Triacylglycerinen) speichert, anstatt durch Glykogenolyse oder Gluconeogenese Glucose zu produzieren. Die wichtigsten Stoffwechselauswirkungen von Insulin sind in Tabelle 22.1 zusammengefasst. Tab. 22.1

Hormonelle Auswirkungen auf den Metabolismus der Energieträger des Körpers

Gewebe Te Muskel

Fettgewebe

Insulin HEREIN

Glucagon Adrenalin TER DESSEN 22SERIES NER T Glucoseaufnahme Keine Auswirkung ANGlykogenolyse T Glykogensynthese T Glucoseaufnahme

T Lipolyse

T Lipolyse

ilGlykogensynthese

J Glykogensynthese

J Glykogensynthese

T Lipogenese \ Gluconeogenese

T Glykogenolyse

T Glykogenolyse Gluconeogenese

T Lipogenese

J Lipolyse Leber

N

Hormonelle Kontrolle des Metabolismus der Energieträger im Körper

Glucagon und Katecholamine wirken Insulin entgegen Wie bereits in Abschnitt 16.3C beschrieben, aktiviert das Peptidhormon Glucagon eine Reihe intrazellulärer Vorgänge, die in der Leber zur Glykogenolyse führen. Dieser Kontrollmechanismus trägt dazu bei, dass anderen Geweben Glucose zur Verfügung steht, wenn die Konzentration der zirkulierenden Glucose abfällt. Muskelzellen besitzen keinen Glucagonrezeptor und können somit nicht direkt auf das Hormon reagieren. Sie profitieren aber indirekt von der Glucose, die von der Leber freigesetzt wird. Glucagon stimuliert auch die Mobilisierung von Fettsäuren im Fettgewebe, indem es die hormonsensitive Lipase aktiviert. Die Katecholamine rufen Reaktionen hervor, die denen von Glucagon ähneln. Adrenalin und Noradrenalin werden bei Stress freigesetzt und binden an zwei verschiedene Rezeptortypen (Abschnitt 13.1B): den ß-adrenergen Rezeptor, der mit dem Adenylat-Cyclasesystem gekoppelt ist (Abb. 13.23) und den o-adrenergen Rezeptor, dessen Second Messenger Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP; Abschnitt 13.4A) zu einem Anstieg der intrazellulären Ca”*-Konzentration führt. Leberzellen reagieren direkt und indirekt auf Adrenalin. Adrenalin fördert die Glucagonfreisetzung aus der Bauchspeicheldrüse, und die Bindung von Glucagon an seinen Rezeptor auf Leberzellen stimuliert den Glykogenabbau. Adrenalin bindet auch direkt an a- und ß-adrenerge Rezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen (Abb. 16.14b, rechts). Die Bindung an die ß-adrenergen Rezeptoren führt zu einer erhöhten intrazellulären CAMP-Konzentration, was wiederum den Glykogenabbau und die Gluconeogenese aktiviert. Bindet Adrenalin an den aadrenergen Rezeptor, so stimuliert dies den Anstieg der intrazellulären Ca?*-Konzentration, und diese wiederum verstärkt die Reaktion der Zelle auf cAMP. Es sei daran erinnert, dass die Phosphorylase-Kinase, welche die Glykogen-Phosphorylase aktiviert und die Glykogen-Synthase inaktiviert, nur im phosphorylierten Zustand

und bei erhöhter

Ca’*-Konzentration

voll aktiv ist; Abschnitt

16.3B.

Außerdem wird die Glykogen-Synthase durch die Phosphorylierung inaktiviert, die von mehreren Ca°’*-abhängigen Proteinkinasen katalysiert wird. Die Adrenalinbindung an den ß-adrenergen Rezeptor auf Muskelzellen fördert entsprechend den Glykogenabbau und mobilisiert dabei Glucose, die durch Glykolyse metabolisiert werden kann, sodass ATP entsteht. Im Fettgewebe führt die Bindung von Adrenalin an mehrere a- und ß-adrenerge Rezeptoren zur Aktivierung der hormonsensitiven Lipase, was die Mobilisierung von Fettsäuren zur Folge hat. Diese Fettsäuren können von anderen Geweben als Brennstoff verwendet werden. Darüber hinaus stimuliert Adrenalin die Entspannung der glatten Muskulatur in den Bronchien und in den Blutgefäßen, welche die Skelettmuskulatur versorgen. Gleichzeitig stimuliert es die Verengung der Blutgefäße, die die Haut und andere periphere Organe versorgen. Insgesamt erlauben diese physiologischen Veränderungen dem Körper auf plötzliche Ereignisse schnell zu reagieren, indem Energiereserven kurzfristig mobilisiert und dort eingesetzt werden, wo sie benötigt werden. Die wichtigsten Reaktionen auf Glucagon und Adrenalin sind in Tabelle 22.1 zusammengefasst, die Stoffwechselwirkungen von Insulin, Glucagon und Adrenalin unter den verschiedenen Bedingungen sind in Abbildung 22.9 schematisch dargestellt. Mehrere Rezeptortypen und biochemische Signalwege sind an der Stoffwechselregulation beteiligt Wie schon in Kapitel 13 beschrieben, besteht jeder Signalweg aus einem Rezeptor, einem Mechanismus, der das Ereignis einer Ligandenbindung an das Zellinnere weiterleitet, und einer Reihe intrazellulärer

Reaktionen,

an denen

ein

oder mehrere Second Messenger und/oder von Kinasen und Phosphatasen katalysierte chemische Veränderungen beteiligt sind. Es gibt drei wesentliche Signaltransduktionswege: Das sind erstens die Wege, an denen mit Ras-Signalkaskaden verknüpfte Rezeptor-Tyrosinkinasen beteiligt sind (Abschnitt 13.2), zweitens die Wege, in denen Adenylat-Cyclase cAMP (cyclisches 3'-5’-AMP) als Second Messenger erzeugt wird (Abschnitt 13.3), und drittens die Wege,

865

866

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation Bauchspeicheldrüse

GLUT4Glucose-

Insulin-

rezeptor

Glucose Q transporter

GLUT2-

Insulin

ee

Insulin

o ©

transporte

© o®

Insulin

ER Insulin-

©

Glucose

rezeptor

GLUT4-

i

Glucosetransporter

Giykogensynthese

| Lipogenese |

Giykogensynthese

(a) Sättigung

5

Bauchspeicheldrüse

Glucagon Glucagon-

Glucagon @)

Adrenalin

receptor

Adrenalin

Nebenniere

Glucagon-

©

rezeptor

adrenerger Rezeptor

er...

Fettgewebe

I

j

Fettsäuren

9-

GlucoseMuskel

”

Glucose

transporter

(b) Fasten/Stress

Abb. 22.9 Übersicht der hormonellen Steuerung des Brennstoffmetabolismus. (a) Direkt nach einer Mahlzeit, wenn Glucose und Fettsäuren in großen Mengen vorhanden sind, signalisiert Insulin den Geweben, Brennstoffin Form von Glykogen und Triacylglycerinen zu speichern. Insulin stimuliert außer der Leber auch andere Gewebe, Glucose über den GLUT4-Transporter aufzunehmen. (b) Wenn keine Nahrungsbrennstoffe zur Verfügung stehen, stimuliert

Glucagon die Leber zur Glucosefreisetzung und das Fettgewebe zur Freisetzung von Fettsäuren.

Verständnisfrage zu Abschnitt 2 1. Fassen Sie die Rollen von Insulin, Glucagon und Adrenalin bei der Regulation des Energiestoffwechsels der Säuger zusammen.

bei denen Phospholipase C (PKC) Phosphoinositid spaltet. Dabei entstehen Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP;), 1,2-Diacylglycerin (DG) und Ca?* als Second Messenger (Abschnitt 13.4). Beide Second-Messenger-Systeme werden über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren moduliert (Abschnitt 13.3). Das wichtigste G-Protein, das die Adenylat-Cyclase aktiviert, ist G, und das G-Protein G, aktiviert die Phospholipase C. In Abbildung 22.10 sind die drei Signalsysteme zusammengestellt. Die oben und in Abschnitt 13.1 beschriebenen Hormone sowie weitere Hormone, Wachstumsfaktoren und andere Signalmoleküle verwenden diese Signaltransduktionswege, um eine Vielzahl biochemischer Reaktionen in Gang zu setzen. Diese wiederum rufen biologische Reaktionen hervor. Dazu gehören ein veränderter Stoffwechsel, Zelldifferenzierung oder Zellwachstum und -teilung. Wie die Reaktion genau abläuft, hängt von vielen Faktoren ab. Zellen reagieren auf ein Hormon - im Allgemeinen Ligand genannt - nur, wenn sie den entsprechenden Rezeptor tragen, der das Hormon erkennt. Spezifische intrazelluläre Reaktionen werden durch die Anzahl, den Typ und die zelluläre Lage der Elemente des Signalsystems moduliert. Des Weiteren erkennt eine bestimmte Zelle viele verschiedene Liganden, sodass die Reaktion auf einen bestimmten Liganden unter Umständen davon abhängt, in welchem Maß andere Liganden ebenfalls auf die Signaltransduktionsmaschinerie der Zelle einwirken. Folglich können Zellen auf einzelne Signale oder eine Kombinationen von Signalen mit Schwankungen in der Stärke und der Dauer der Zellantwort reagieren.

Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht (a) Rezeptor-Tyrosinkinase

(5) Adenylat-Cyclase-Weg

867

(c) Phosphoinositidweg

Ras-Signal-Kaskade

Second Messenger

Second Messenger

cAMP

externes

Signal

G-Protein

IP3, DG, Ca?*

externes Signal

Zell-

G-Protein

reaktion

/

7 RRRRARAAARRO

LIE

OOOO

SERKIIIIIIIOSIHS ILL IN U) Ca

)| Zellkern

Abb. 22.10 Übersicht über die wichtigsten Signaltransduktionswege. (a) Wenn ein Ligand an eine Rezeptor-Tyrosinkinase bindet, wird eine Ras-Signalkaskade induziert, die zu Phosphorylierungskaskaden und damit zu einer veränderten Genexpression führt. (b) Die Bindung eines Liganden an seinen entsprechenden G-Protein-gekoppelten Rezeptor stimuliert (oder hemmt) die Synthese des Second Messengers cAMP durch die AdenylatCyclase. Das cAMP aktiviert wiederum die Proteinkinase A (PKA), die somit ihre Zielproteine phosphoryliert, was zu einer Zellantwort führt. (c) Die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor, der an ein G.-Protein koppelt, führt zum Phosphoinositolweg. Dieser aktiviert die Phospholipase C (PLC), was zur Spaltung des Membranlipids PIP, führt und die Second Messenger IP, und DG bildet. IP, aktiviert Kanäle und führt zur Ca°*-Freisetzung aus endogenen Ca?*-Speichern, DG aktiviert die Proteinkinase C (PKC). Das freigesetzte Ca°* aktiviert sowohl die PKC als auch die Ca?*-calmodulinabhängige Proteinkinase (CaMK). Phosphorylieren die PKC und die CaMK ihre Zielproteine, reagiert die Zelle z.B. mit einer veränderten Genexpression.

3

_Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht

Die Komplexität der Mechanismen, die den Brennstoffmetabolismus bei Säugetieren regulieren, gestattet dem Körper, effektiv auf den sich ändernden Energiebedarf zu reagieren und sich der veränderten Verfügbarkeit verschiedener Brennstoffe anzupassen. So kann die Stoffwechsel-Homöostase (das Gleichgewicht zwischen der Energiezufuhr und dem -verbrauch) angemessen aufrechterhalten werden. Das Gleichgewicht hängt von den Wechselwirkungen vieler Faktoren ab. In diesem Abschnitt werden einige der Komponenten dieses komplexen Netzwerks beschrieben, das den Energieverbrauch, den Appetit und das Körpergewicht reguliert.

Membran des

endoplasmatischen Reticulums

868

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

A.

Die AMP-abhängige Proteinkinase ist der Brennstoffmesser der Zelle

Alle oben besprochenen Stoffwechselwege benötigen auf die eine oder andere Weise ATP, wie man am AMP-zu-ATP-Verhältnis (Abschnitt 15.4A) der Zelle erkennen kann. Mehrere Enzyme werden durch AMP allosterisch entweder aktiviert oder gehemmt, und manche werden von der AMP-abhängigen Proteinkinase (AMPK) phosphoryliert. Dieses Enzym ist ein wichtiger Regulator der Stoffwechsel-Homöostase. AMPK aktiviert Stoffwechselabbauwege, die ATP erzeugen, während sie Biosynthesewege hemmt und dadurch ATP für lebenswichtige Vorgünge einspart. AMPK ist ein aßy-Heterotrimer, das in allen Eukaryoten vorkommt, von der Hefe bis zum Menschen. Die Proteinkinase-Domäne ist Teil der a-Untereinheit, während die regulatorische y-Untereinheit die Zentren für die allosterische Aktivierung durch AMP und die Hemmung durch ATP enthält. Wie andere Proteinkinasen, so muss auch die Kinasedomäne von AMPK zuerst

phosphoryliert werden, damit sie aktiv ist. Bindet AMP an die y-Untereinheit, so kommt es zu einer Konformationsänderung, durch die Thr 172 in der Aktivierungsschleife der a-Untereinheit exponiert wird, was seine Phosphorylierung fördert und die Enzymaktivität mindestens auf das 100fache steigert. AMP kann die Aktivität des phosphorylierten Enzyms zudem fünffach erhöhen. Die wichtigste Kinase, die AMPK phosphoryliert, heißt LKB1. Wird LKB1 spezifisch im Skelettmuskel von Mäusen ausgeschaltet, lässt sich keine AMPK-Aktivität mehr nachweisen. AMPK aktiviert die Glykolyse im ischämischen Herzmuskel

Zu den Zielmolekülen der AMPK gehört das Isoenzym des bifunktionalen Enzyms PFK-2/FBPase 2 aus dem Herzen, das die Fructose-2,6-bisphosphat(F2,6P-)Konzentration steuert (Abschnitt 16.4C). Die Phosphorylierung dieses Isoenzyms aktiviert die PFK-2-Aktivität, wodurch die [F2,6P] ansteigt. Dies aktiviert wiederum PFK-1 und die Glykolyse. In blutarmen (ischämischen) Herzmuskelzellen ist nicht genügend Sauerstoff für die oxidative Phosphorylierung vorhanden, um eine ausreichende ATP-Konzentration aufrechtzuerhalten. Die sich daraus ergebende AMP-Anhäufung verursacht, dass die Zellen zur ATPProduktion auf die anaerobe Glykolyse umschalten. AMPK hemmt die Lipogenese und Gluconeogenese in der Leber

Die AMPK-vermittelte Phosphorylierung hemmt auch die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, die den ersten notwendigen Schritt der Fettsäuresynthese katalysiert; Abschnitt 20.4B), die Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase, die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Cholesterinbiosynthese katalysiert; Abschnitt 20.7B) und die Glykogen-Synthase (welche die geschwindigkeitsbestimmende Reaktion der Glykogensynthese katalysiert; Abschnitt 16.2B). Wenn nun die Geschwindigkeit der ATP-Bildung unzureichend ist, werden folglich diese Biosynthesewege abgeschaltet, sodass ATP für die lebensnotwendigsten Zellfunktionen reserviert wird.

AMPK fördert die Fettsäureoxidation und die Glucoseaufnahme im Skelettmuskel Die Hemmung der ACC hat einen Konzentrationsabfall von Malonyl-CoA zur Folge, dem Ausgangsstoff für die Fettsäure-Biosynthese. Malonyl-CoA hat jedoch eine zusätzliche Aufgabe. Es ist ein Inhibitor der Carnitin-Palmitoyltransferase I (Abschnitt 20.5). Dieses Enzym ist erforderlich für den Transport von cytosolischem Palmitoyl-CoA in die Mitochondrien, wo Palmitoyl-CoA im Stoffwechsel oxidativ abgebaut wird. Wenn die Malonyl-CoA-Konzentration absinkt, kann mehr Palmitoyl-CoA transportiert und folglich oxidiert werden. AMPK steigert zudem die Expression von GLUT1 und GLUT4 auf der Oberfläche von Muskel-

Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht

869

Skelettmuskel

Herzmuskel

Glucose

Fettsäure

Durch AMPK stimuliert =>

Durch AMPK gehemmt >

Abb. 22.11 Die wichtigsten Auswirkungen der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) auf den Glucose- und Lipidstoffwechsel in der Leber, im Muskel und im Fettgewebe. Im Skelettmuskel stimuliert AMPK die Glucoseaufnahme und die Glucose- und Fettsäureoxidation, während die Glykogensynthese gehemmt wird. Im Herzmuskel stimuliert AMPK die Glykolyse. In der Leber hemmt AMPK die LipidBiosynthese und die Gluconeogenese, während

sie die Fettsäureoxidation aktiviert. Im Fettgewebe hemmt AMPK die Fettsäure-Biosynthese und die Lipolyse. [Nach M.C. Towler und D.G. Hardie, Circulation Res. 100, 328 (2007).]

zellen, wodurch die insulinabhängige Glucoseaufnahme in diese Zellen erleichtert wird. AMPK hemmt die Lipolyse in Adipocyten

AMPK phosphoryliert die hormonsensitive Triacylglycerin-Lipase im Fettgewebe (Abschnitt 20.5). Diese Phosphorylierung hemmt das Enzym, anstatt es zu aktivieren, da es die durch Proteinkinase A vermittelte, aktivierende Phosphorylierung des Enzymes sterisch behindert. Folglich werden weniger Triacylglycerine abgebaut, sodass weniger Fettsäuren in die Blutbahn exportiert werden. Die wichtigsten Konsequenzen der AMPK-Aktivierung auf den Glucose- und Lipidstoffwechsel in der Leber, im Skelett- und Herzmuskel sowie im Fettgewebe sind in Abbildung 22.11 dargestellt.

B.

Adiponectin reguliert die AMPK-Aktivität

Adiponectin ist ein aus 247 Aminosäuren aufgebautes Proteinhormon, das ausschließlich von Adipocyten sezerniert wird. Es unterstützt die Regulation der Energiehomöostase und regelt den Glucose- und Lipidstoffwechsel, indem es die AMPK-Aktivität steuert. Seine Monomere bestehen aus einer N-terminalen kollagenartigen Domäne und einer C-terminalen globulären Domäne. Adiponectin kommt in der Blutbahn in verschiedenen Formen vor: zum einen als niedermolekulares (LMW; low molecular weight) Trimer, das durch die Spiralisierung seiner kollagenartigen Domänen zu einer Tripelhelix (Abschnitt 6.1C) geformt ist, zum anderen bilden sich Hexamere (MMW; medium molecular weight) und Multimere (HMW; high molecular weight), die als über Disulfidbrücken quervernetzte Polymere vorliegen (Abb. 22.12). Zusätzlich kommt in geringer Konzentration globuläres Adiponectin vor, das durch Spaltung der kollagenartigen Domäne (bei der globuläre Monomere frei werden) gebildet wird und beinahe ausschließlich aus ß-Faltblattsträngen aufgebaut ist (Abb. 12.12). Die Bindung von Adiponectin an Adiponectinrezeptoren erfolgt auf der Oberfläche von Leber- und Muskelzellen. Sie führt zu einer Zunahme der Phosphorylierung und Aktivitätssteigerung von AMPK. Wie wir gesehen haben

870 Abb. 22.12

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation Adiponectin.

(a) Diese tri-, hexa- und multimeren Komplexe

LMW

bezeichnet man als niedermolekulare (LMW), mittelmolekulare (MMW) und hochmolekulare (HMW) Formen. [Nach Kadowaki, T. und Yamauchi, T., Endocrine Rev. 26, 439 (2005).] (b) Struktur des Trimers der globulären Domäne des Adiponectins aus der Maus. Es ist überwiegend aus ß-Faltblattsträngen aufgebaut. Jedes

MMW

Monomer

ist in einer anderen

)

Farbe (rot, grün,

blau) markiert. [Nach einer Kristallstruktur von Shapiro und Scherer. PDBid 1C28.]

HMW

(a)

(Abschnitt 22.3A), hemmt dies die Gluconeogenese, stimuliert die Fettsäureoxidation in der Leber und regt die Glucoseaufnahme und die Glucose- und Fettsäureoxidation im Muskel an. All diese Reaktionen dienen dazu, die Insulinempfindlichkeit zu steigern - teilweise dadurch, dass Adiponectin und Insulin in Geweben wie z.B. der Leber ähnliche Reaktionen auslösen. Eine verringerte Menge von Adiponectin ist mit einer Insulinresistenz verknüpft (Abschnitt 22.4B). Paradoxerweise sinkt die Blutkonzentration des von Adipocyten sezernierten Adiponectins mit erhöhter Fettgewebemenge. Dies könnte damit zu tun haben, dass ein ausgeprägtes Fettgewebe auch mit der erhöhten Bildung des Tumor-Nekrose-Faktors-a verknüpft ist — ein Proteinwachstumsfaktor, der sowohl die Produktion als auch die Sekretion von Adiponectin-aus dem Fettgewebe senkt.

C.

Leptin ist ein Sättigungshormon

Leptin (griech.: leptos, dünn) ist ein aus 146 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, das normalerweise von Adipocyten gebildet wird (Abb. 22.13a). Man hat es bei der genetischen Analyse von adipösen Mäusen entdeckt. Die meisten Tiere und auch der Mensch haben ein konstantes Körpergewicht. Selbst wenn sie uneingeschränkten Zugang zu Nahrung haben, essen sie nur so viel, dass sie ihr Sollgewicht aufrechterhalten. Mäuse eines Stammes, die jedoch homozygot für Defekte des obese-Gens sind (als ob/ob-Mäuse bezeichnet), haben ein doppelt so hohes Körpergewicht wie normale (OB/OB) Mäuse (Abb. 22.14) und „über-

Abb. 22.13

Leptin und sein Gegenspieler Neuropeptid Y. (a) Röntgenstruktur des menschlichen Leptins-E100. Diese mutierte Form von Leptin (Trp 100 > Glu) hat eine vergleichbare biologische Aktivität wie das Wildtyp-Protein, kristallisiert aber leichter. Das Protein ist vom N-Terminus (blau) zum C-Terminus (rot) in der Reihenfolge der Spektralfarben angefärbt. Es bildet wie viele andere Wachstumsfaktor-Proteine ein Vier-HelixBündel (z.B. menschliches Wachstumshormon, Abb. 13.3). In der Röntgenstruktur sind die Aminosäurereste 25 bis 38 nicht zu sehen. [Nach einer Röntgenstruktur von Faming Zhang, Eli Lilly & Co., Indianapolis. PDBid 1AX8.]. (b) Struktur des Neuropeptides Y. Die C-terminale a-Helix (blaue Bandstruktur) ist für die Interaktion mit seinen Rezeptoren wichtig, die Seitenketten sind als Stab-Modell eingezeichnet. [Nach einer NMR-Struktur von O. Zerbe, Universität Zürich. PDBid IF8P.] 6% siehe Interactive Exercises

Stoffwechsel-Homöostase: die Regulation von Energiestoffwechsel, Appetit und Körpergewicht

871

fressen“ sich, wenn man ihnen Nahrung ad libidum zur Verfügung stellt. Das OB-Gen codiert für Leptin. Wenn man ob/ob-Mäusen Leptin injiziert, fressen sie deutlich weniger und verlieren Gewicht. Deshalb hält man Leptin für ein „Sättigungs“-Signal, welches das Appetitkontrollsystem im Gehirn beeinflusst. Leptin verursacht zudem einen höheren Energieverbrauch. Die einfache genetische Grundlage für die Adipositas bei den ob/ob-Mäusen kann man auf die meisten fettleibigen Menschen nicht ohne weiteres übertragen. Der Leptinspiegel beim Menschen steigt mit dem Körperfettanteil, was mit der Synthese von Leptin durch Adipocyten im Einklang steht. Somit geht die Fettsucht beim Menschen nur in ganz wenigen Fällen auf eine genetisch bedingte, fehlerhafte Leptinproduktion zurück, sondern eher auf eine Leptinresistenz. Die genaue Ursache ist jedoch unbekannt, eine Abnahme der Leptinrezeptoren im Gehirn oder eine Sättigung des Rezeptors, der Leptin über die BlutHirn-Schranke ins Zentralnervensystem befördert, könnten in manchen Fällen eine Rolle spielen. Eine verminderte Reaktion der Gehirnzellen auf Leptin führt zu hohen Konzentrationen des Neuropeptids Y, 1

10

Tyr — Pro— Ser — Lys — Pro —

Asp— Asn— Pro— Gly—Glu— Asp—Ala —

20 Pro—

Ala— Glu — Asp— Met — Ala— Arg— Tyr— Tyr— Ser—

Ala— Leu—

30 Arg— His— Tyr — Ile

— Asn — Leu—

36 Ile — Thr— Arg— Gln— Arg— Tyr— NH;

Neuropeptid Y (Die C-terminale Carboxylgruppe ist amidiert.)

eines Peptids aus 36 Aminosäuren, das von Zellen des Hypothalamus freigesetzt wird (einem Teil des Gehirns, der viele physiologische Funktionen steuert). Neuropeptid Y bildet C-terminal eine amphiphile Helix (Abb. 22.13b), stimuliert den Appetit und fördert die Insulinsekretion, was wiederum zur Anhäufung von Fett führt. Wenn

Leptin oder Insulin an ihre jeweiligen Rezeptoren im Hypo-

thalamus binden, wird die Neuropeptid-Y-Sekretion gehemmt.

D.

Ghrelin und PYY;_;; fungieren als kurzzeitige Appetitregulatoren

Es überrascht nicht, dass Brennstoffmetabolismus, Körpergewicht und Appetit miteinander verknüpft sind. Außer Leptin, Insulin und Neuropeptid Y sind noch andere Peptidhormone an der Kontrolle des Appetits beteiligt. Ghrelin z.B. ist ein appetitstimulierendes Peptid, das vom leeren Magen sezerniert wird:

10 Gly—Ser—

X — Phe— Leu— Ser — Pro — Glu— His — Gln —

20 Arg— Val— Gin — Gln — Arg — Lys— Glu— Ser— Lys— Lys—

28 Pro— Pro— Ala — Lys— Leu — GIn — Pro— Arg

Ghrelin (X = Ser mit n-Octanoylrest)

Ghrelin stimuliert die Steigerung der Neuropeptid-Y-Konzentration und ist höchstwahrscheinlich Teil eines kurzzeitigen Appetitkontrollsystems: Der Ghrelinspiegel schwankt im Verlauf von Stunden, er steigt vor den Mahlzeiten an und sinkt unmittelbar danach wieder ab. Der Magen-Darm-Trakt sezerniert ein appetithemmendes Hormon namens PYY3_36:

Abb. 22.14 Normale (OB/OB, links) und fettleibige (ob/ob, rechts) Mäuse. [Mit freundlicher Genehmigung von Richard D. Palmiter, University of Washington.)

872

_ Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation 10

3

Ile — Lys— Pro — Glu — Ala— Pro—Gly — Glu— 20

Asp— Ala— Ser — Pro — Glu— Glu — Leu— Asn— Arg— Tyr —

30 Tyr— Ala— Ser

— Leu—Arg — His — Tyr — Leu— Asn— Leu—

36 Val—Thr— Arg— Gln— Arg— Tyr

PYYz_36 Eine Infusion mit diesem Peptid senkt bei Tieren oder dem Menschen die Nahrungsaufnahme dadurch, dass die Sekretion von Neuropeptid Y gehemmt wird. Zusammengefasst kann man sagen, dass Ghrelin den Appetit stimuliert, wäh-

rend ihn Leptin, Insulin und PYY;_;, hemmen, indem sie die Sekretion von Neuropeptid Yaus dem Hypothalamus regulieren.

E.

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1. Warum wird AMPK auch als

Brennstoffmesser der Zelle bezeichnet? 2. Vergleichen Sie die Rollen von Leptin, Ghrelin, Insulin und PYY bei der Kontrolle des Appetits. 3. Wie hilft die Thermogenese, Fettleibigkeit zu verhindern?

_ Der Energieverbrauch kann durch die adaptive Thermogenese gesteuert werden

Die Nahrungskalorien der Lebensmittel werden von einem Organismus entweder dazu verwendet, Arbeit zu verrichten oder sie werden als Wärme abgegeben. Überschüssiger Brennstoff wird als Glykogen oder Fett für die zukünftige Nutzung gespeichert. Bei Personen mit ausgewogener Energieaufnahme und Energieverbrauch bleibt die Energiebilanz und damit das Körpergewicht über Jahre hinweg konstant. Wenn die aufgenommene Brennstoffmenge ständig den Energieverbrauch übersteigt, entsteht Adipositas. Der Körper verfügt über mehrere Mechanismen, sich vor Fettsucht zu schützen. Einer davon ist die oben besprochene Appetitkontrolle. Ein anderer ist die nahrungsinduzierte Thermogenese, eine Form der adaptiven Thermogenese (Wärmeproduktion als Reaktion auf Umweltstress). Wir haben-bereits die adaptive Thermogenese als Reaktion auf Kälte behandelt. Sie kommt bei Nagetieren und Neugeborenen vor, indem die oxidative Phosphorylierung im braunen Fettgewebe (Exkurs 18.4) entkoppelt wird. Bei diesem Thermogenesemechanismus wird als Reaktion auf Kälte Noradrenalin im Gehirn freigesetzt, das an die ß-adrenergen Rezeptoren auf dem braunen Fettgewebe bindet. Daran schließt sich ein cAMP-Anstieg an, der eine enzymatische Phosphorylierungskaskade auslöst, wodurch die hormonsensitive Lipase aktiviert wird. Der Konzentrationsanstieg an freien Fettsäuren verschafft Brennstoffe für die Oxidation und bewirkt, dass sich ein Protonenkanal namens UCP1 (uncoupling protein 1; alternativ heißt es auch Thermogenin) in der inneren Mitochondrienmembran öffnet. Die Öffnung von UCP1 löst den durch den Elektronentransport erzeugten (Abschnitt 18.2) elektrochemischen Gradienten auf und entkoppelt damit den Elektronentransport von der oxidativen Phosphorylierung. Die sich daraus ergebende, fortgesetzte Oxidation ohne ATP-Synthese erzeugt Wärme. Obwohl aus Stoffwechselmessungen klar hervorgeht, dass eine hohe Energieaufnahme die Thermogenese verstärkt, ist die Ursache dieser Erhöhung bei Erwachsenen unklar und wird noch untersucht. Erwachsene haben wenig braunes

Fettgewebe, wo die UCP1-vermittelte Thermogenese stattfindet. Man kennt jedoch Homologe von UPC1 (Exkurs 18.4): UCP2 kommt in vielen Geweben vor, einschließlich des weißen Fettgewebes, und seine Synthese wird durch Leptin induziert. UCP3 findet sich im Muskel (ebenso im braunen Fettgewebe) und könnte bedeutend sein, da die Skelettmuskulatur bis zu 40% des gesamten Körpergewichts ausmacht und eine hohe Mitochondrienkapazität besitzt. Dass UCP3 im Muskel an der durch Nahrung ausgelösten Thermogenese beteiligt ist, muss aber noch gezeigt werden.

Störungen im Energiestoffwechsel

4

Störungen im Energiestoffwechsel

Die Komplexität der Mechanismen, die den Energiestoffwechsel der Säuger regulieren, erlaubt es dem Körper, effizient auf wechselnde Energieanforderungen zu reagieren und sich an Schwankungen in der Verfügbarkeit verschiedener Energiequellen anzupassen. Die Fehlfunktion dieser komplexen Systeme führt allerdings zu akuten oder chronischen Krankheiten unterschiedlich starker Ausprägung. Beträchtliche Anstrengungen wurden darauf verwendet, die molekularen Grundlagen von Diabetes und Fettleibigkeit aufzuklären, die beide wesentliche Störungen des Energiestoffwechsels sind. In diesem Abschnitt untersuchen wir die Veränderungen im Stoffwechsel, die während des Hungerns, bei Diabetes und bei Fettleibigkeit auftreten.

A.

Hungern

Da Menschen nicht kontinuierlich Nahrung zu sich nehmen, verändert sich die Verfügbarkeit von mit der Nahrung aufgenommenen Brennstoffen bzw. die Mobilisierung von gespeicherter Energie dramatisch in der Zeit zwischen den Mahlzeiten. Und doch können Menschen selbst monatelanges Fasten überleben, indem sie ihren Energiestoffwechsel anpassen. Solch eine Flexibilität des Stoffwechsels geht zweifellos auf eine Zeit zurück, bevor die Menschen, wie in der westlichen Welt, täglich mehrere Mahlzeiten zu sich nehmen konnten. Die aufgenommene Energie wird umgehend verteilt Wenn eine Mahlzeit verdaut wird, werden die polymeren Nährstoffe in kleine, üblicherweise monomere Einheiten abgebaut, die von der Darmschleimhaut aufgenommen werden. Von dort strömen die Produkte des Verdauungsvorgangs über den Kreislauf durch den Körper. Nahrungsproteine z.B. werden zu Aminosäuren abgebaut, um absorbiert werden zu können. Wenn Aminosäuren über die Pfortader die Leber erreichen, können sie für die Proteinbiosynthese verwendet werden oder, wenn sie im Überschuss vorhanden sind, für die Erzeugung von Energie oxidiert werden. Da es keinen eigenen Speicher für Aminosäuren gibt, zirkulieren überschüssige Aminosäuren, die von der Leber nicht metabolisiert worden sind, zu den peripheren Geweben. Dort können sie abgebaut werden oder stehen für die Proteinbiosynthese zur Verfügung. Mit der Nahrung aufgenommene Kohlenhydrate werden, wie die Proteine, im Darm abgebaut. Ihre monomeren Produkte (z. B. Glucose aus Stärke in der Nahrung) werden anschließend über die Pfortader zur Leber befördert. Bis zu einem Drittel der Nahrungsglucose wird dort sofort in Glykogen umgewandelt. Mindestens die Hälfte der übrigen Glucose wird in den Muskelzellen dann ebenfalls zum Glykogenaufbau verwendet. Der Rest wird von diesen und anderen Geweben zur Deckung unmittelbarer Energiebedürfnisse oxidiert. Die Glucoseaufnahme und Glykogensynthese werden beide durch Insulin stimuliert, dessen Konzentration sich im Blut als Antwort auf eine hohe Blutglucosekonzentration erhöht. Nahrungsfettsäuren werden als Triacylglycerine in Chylomikronen verpackt (Abschnitt 20.1), die zunächst in der lymphe und dann im Blutkreislauf zirkulieren. Sie werden deshalb nicht, wie die aufgenommenen Aminosäuren und Kohlenhydrate, direkt zur Leber transportiert. Dagegen wird ein signifikanter Teil der Nahrungsfettsäuren vom Fettgewebe aufgenommen. Die Lipoprotein-Lipase hydrolysiert zunächst die Triacylglycerine. Die freigesetzten Fettsäuren werden dann von den Adipocyten absorbiert und dort verestert.

873

874

_ Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation Tab. 22.2

Energiereserven eines normalgewichtigen 70 kg schweren Mannes.

| Masse (kg) Energie EHE

Kalorien’ WERNER

Gewebe

Fett (Triacylglycerine der Adipocyten)

15

141.000

Protein (hauptsächlich im Muskel)

6

24.000

Glykogen (Muskel)

0,150

600

Glykogen (Leber)

0,075

300

Glucose (extrazelluläre Flüssigkeit)

0,020

80

freie Fettsäuren (Plasma)

0,0003

Triacylglycerine (Plasma)

0,003

Zirkulierende Brennstoffe

Total

3 30

166.000

° 1 (Nahrungs-) Kalorie = 1 kcal = 4,184 kJ Quelle: Cahill, G.E. Jr., New Engl.J.Med. 282, 669 (1970).

Der Blutglucosespiegel bleibt konstant

300

200 (mM) [Glykogen]

Abb. 22.15 Abbau des Leber-Glykogens während des Fastens. Bei sieben Personen wurde während eines 64-stündigen Fastens der Glykogengehalt in der

Leber mittels ""C-NMR verfolgt. [Nach Rothman, D.L., Magnusson, |., Katz, L.D., Shulman, R.G., und

Shulman, G.l., Science 254, 575 (1991).]

Wenn Gewebe Glucose aufnehmen und metabolisieren, fällt der Blutglucosespiegel. Dadurch werden die pankreatischen a-Zellen veranlasst, Glucagon freizusetzen. Dieses Hormon stimuliert den Glykogenabbau und die Freisetzung von Glucose aus der Leber. Es fördert auch die Gluconeogenese aus Aminosäuren und Lactat. Die gegenläufigen Effekte von Insulin und Glucagon, die beide auf den Blutglucosespiegel reagieren und regulierend wirken, sorgen dafür, dass die für die extrahepatischen Gewebe verfügbare Glucosekonzentration relativ konstant bleibt. Der Körper speichert jedoch weniger Kohlenhydrate, als er für den täglichen Verbrauch benötigt (Tab. 22.2). Nach dem nächtlichen Fasten sorgt eine Kombination aus erhöhter Glucagonsekretion und verminderter Insulinsekretion für die Freisetzung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe (Abschnitt 20.5). Die verringerte Insulinkonzentration verhindert auch die Glucoseaufnahme durch die Muskulatur. Muskeln schalten für die Energiegewinnung deshalb von Glucoseauf Fettsäuremetabolismus um. Durch diese Adaptation wird mehr Glucose für die Aufnahme durch andere Gewebe bereitgestellt, die wie das Gehirn keine Fettsäuren verwenden können. Die Gluconeogenese stellt Glucose während des Hungerns zur Verfügung

Nach längerem Fasten wird der Vorrat an Glykogen in der Leber erschöpft (Abb. 22.15). Unter diesen Bedingungen erhöht sich die Geschwindigkeit der Gluconeogenese. Nach 40 Stunden Fasten stellt die Gluconeogenese 96% der von der Leber produzierten Glucose bereit. In Tieren kann Glucose nicht aus Fettsäuren synthetisiert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass weder Pyruvat noch Oxalacetat, die Vorstufen von Glucose bei der Gluconeogenese, direkt aus Acetyl-CoA synthetisiert werden können. Während des Hungerns muss Glucose deshalb aus Glycerin, dem Produkt des Triacylglycerinabbaus und, was noch wichtiger ist, aus Aminosäuren synthetisiert werden, die im Wesentlichen aus dem proteolytischen Abbau von Muskelproteinen stammen. Der Abbau der Muskulatur kann nicht unbegrenzt fortgesetzt werden, da der Verlust an Muskelmasse ein Tier eventuell daran hindert, sich für die weitere Nahrungssuche zu bewegen. Deshalb braucht der Organismus eine metabolische Alternative.

Störungen im Energiestoffwechsel

Ketonkörper sind im Hungerzustand eine wichtige Energiequelle Nach einigen Tagen des Hungerns wandelt die Leber Acetyl-CoA, das aus der . ß-Oxidation der Fettsäuren stammt, in Ketonkörper um (Abschnitt 20.3). Diese Brennstoffe werden dann in das Blut abgegeben. Das Gehirn passt sich stufenweise an die Verwendung von Ketonkörpern als Energiequelle durch die Synthese der geeigneten Enzyme an: Nach dreitägigem Fasten wird rund ein Drittel der Energieversorgung des Gehirns durch Ketonkörper gedeckt. Nach 40 Fastentagen werden schließlich ca. 70% der vom Gehirn benötigten Energie auf diese Weise bereitgestellt. Während eines längeren Fastens sinkt die Geschwindigkeit des Muskelabbaus folglich auf ca. 25% der Geschwindigkeit bei einem einige Tage andauernden Hungern. Die ‚Überlebenszeit eines hungernden Individuums ist daher viel stärker von der Größe der Fettreserven als von der Muskelmasse abhängig. In der Tat können hochgradig übergewichtige Individuen ein Jahr oder länger ohne Nahrungsaufnahme überleben. Dies konnte in klinisch überwachten Programmen zur Gewichtsreduktion bestätigt werden. Hungern kann die Lebenserwartung erhöhen Eine kontrollierte Form des Hungerns, bei dem die Energieaufnahme um 3040% reduziert wird, während die Aufnahme von Spurenelementen konstant bleibt, kann die Lebenserwartung steigern. Nagetiere, die auf eine solche Diät

gesetzt werden, leben bis zu 50% länger als Nagetiere mit normaler Ernährung. Die Lebenerwartung zahlreicher Organismen, von der Hefe bis hin zu Primaten, kann auf ähnliche Weise erhöht werden. Die biochemischen Zusammenhänge, die zu diesem Effekt führen, sind allerdings noch nicht verstanden.

B.

Diabetes mellitus

Bei der Krankheit Diabetes mellitus, die oft auch nur Diabetes genannt wird und nach Herzkreislauferkrankungen und Krebs die dritthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten und anderen Industrieländern ist, wird Insulin entweder nicht in genügenden Mengen sekretiert oder es stimuliert nicht effizient genug seine Zielzellen. Als eine Konsequenz erhöht sich der Blutglucosespiegel derart, dass die Glucose in den Urin „überläuft“. Damit ist diese Krankheit über einen einfachen Urintest nachweisbar. Trotz dieses hohen Blutglucosespiegels „hungern“ die Zellen, weil die insulinstimulierte Glucoseaufnahme in die Zellen beeinträchtigt ist. Die Triacylglycerinhydrolyse, die Fettsäureoxidation, die Gluconeogenese und die Bildung von Ketonkörpern laufen dann beschleunigt ab. Bei einem Zustand, der auch als Ketose bezeichnet wird, steigt der Ketonkörperspiegel im Blut enorm an. Da Ketonkörper Säuren sind, stellen erhöhte Konzentrationen derselben eine Beanspruchung der Pufferkapazität des Bluts und der Nieren dar, die den pH des Bluts durch Exkretion der überschüssigen H'Ionen in den Urin kontrollieren. Die vermehrte H*-Ausscheidung wird durch die Ausscheidung von NH}, Na*, K*, P;, und H,O begleitet, was eine schwere

Dehydratation (übermäßiger Durst ist ein klassisches Symptom für Diabetes) und eine Abnahme des Blutvolumens zur Folge hat. Beides kann sich zu einem lebensbedrohlichen Zustand entwickeln. Es gibt zwei Hauptformen von Diabetes mellitus: 1. Insulinabhängiger oder juveniler Diabetes mellitus, der meist bereits früh in der Kindheit auftritt. 2. Nicht insulinabhängiger oder Alters-Diabetes-mellitus, der sich gewöhnlich nach und nach ab einem Alter von 40 Jahren entwickelt.

875

876

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Exkurs 22.1 Berühmte Biochemiker Frederick Banting und Charles Best: Die Entdeckung von Insulin

Frederick Banting (1891-1941)

Charles Best (1899-1978)

Eine der herausragendsten Erfolgsgeschichten in der klinischen Forschung ist die Entdeckung und therapeutische Anwendung von Insulin, des Hormons, das Patienten mit Dia-

betes vom Typ I fehlt. Seit Ende des 19. Jahrhunderts war den klinischen Wissenschaftlern klar, dass zwischen Diabetes und den Sekreten der Bauchspeicheldrüse - speziell den Zellhäufchen der sogenannten Langerhans-Inseln - eine Verbindung besteht. Eine Reihe erfolgloser Versuche wurde unternommen,

um

die Sekrete zu extrahieren.

las einen Bericht über diese Arbeiten

Frederick

Banting

und fragte sich, ob

sich eventuell ein aktiver Extrakt reinigen ließe, wenn

man

die Pankreasgänge künstlich verschloss, in denen die möglicherweise degradierend wirkenden Verdauungsenzyme vor der Sekretion gesammelt werden. Banting war ein junger Chirurg, dessen Praxis noch nicht recht in Gang gekommen war, und arbeitete als Prosektor an der Universität von Westontario. Er kam mit seiner Idee zu John J.R. Macleod, dem Leiter der Abteilung Physiologie an der Universität Toronto. Der skeptische Macleod stellte Banting einen Laborraum für den Sommer 1921 zur Verfügung, Zugang zu Versuchshunden und die Unterstützung des Assistenten Charles Best. Trotz seiner medizinischen Ausbildung und Berufspraxis beim Sanitätsdienst der kanadischen Armee war Banting kein großer Experimentator. Best hatte gerade seinen Abschluss in Physiologie und Biochemie erlangt und bereits als Assistent für Macleod gearbeitet. Best lernte rasch Operationstechniken von Banting, und Banting eignete

sich von

Best analytische

Techniken

an, wie z.B.

die Messung des Glucosespiegels im Blut und Urin von Hunden. Bantings und Bests Versuchsanordnung erforderte pankreasektomierte

Hunde,

aber die Operation

war

schwierig,

und viele Hunde starben an einer Infektion (es ging das Gerücht um, dass streunende Hunde aus den Straßen Torontos

als Ersatz eingefangen wurden). Erfolgreich pankreasektomierten Hunden, die die schweren, lebensbedrohlichen Symptome von Diabetes entwickelten, spritzten Banting und Best einen

Pankreasextrakt,

den sie nach dem

|latein-

ischen insula (Insel) als Insulin bezeichneten. Ende Juli erhielten Banting und Best schließlich das gewünschte Ergebnis,

als Insulin dramatisch den Blutzuckerspiegel der Hunde senkte. Man wiederholte das Experiment an anderen Hunden und erhielt ähnliche Ergebnisse. Eigentlich sollte Bantings befristete Stelle zum Ende des Sommers enden. Seine vielversprechenden Ergebnisse sicherten ihm jedoch die weitere Finanzierung, die Betreuung durch den nun enthusiatischeren Macleod und die weitere Unterstützung durch Best. Best hatte ursprünglich vorgehabt, nur zwei Monate mit Banting zu arbeiten. Zum Herbst setzte Bantings und Bests Erfolg, den sie mit der Lebensverlängerung diabetischer Hunde hatten, die beiden unter einen enormen Druck: Sie mussten große Mengen von Insulin mit konstanter Reinheit herstellen. Hilfe wurde ihnen von James Collip angeboten, einem Biochemiker von der Universität von

Alberta, der gerade ein Forschungsfreisemester

hatte.

Collips Insulinpräparate, die er ohne Kenntnis über die proteinartige Beschaffenheit

des Hormons

herstellte, erwiesen

sich als ausreichend gut für die Anwendung am Menschen. Zu jener Zeit war die Diagnose von Diabetes praktisch ein Todesurteil. Die einzige Behandlung bestand darin, eine sehr strenge Diät einzuhalten, die wahrscheinlich

das Leben nur

um einige wenige Monate verlängerte und zum Tode vieler Patienten aufgrund von Mangelernährung führte. Im Januar 1923 injizierte Banting den Extrakt von Collip dem 14-jährigen Diabetiker Leonard Thompson, der dem Tode nahe war. Thompsons Blutzuckerspiegel normalisierte sich umgehend und seine Kraft nahm zu. Ein solch dramatisches klinisches Ergebnis blieb nicht unbeachtet und binnen Monaten eröffnete Banting eine Klinik. Er begann mit der Behandlung von Diabetikern, die dringend eine Therapie brauchten, welche ihnen wieder die Hoffnung auf ein nahezu

normales Leben gab. Um Insulin in einem für die klinische Prüfung geeigneten Maßstab herzustellen, versicherte er sich der Unterstützung durch die Connaught Antitoxin Laboratories an der Universität von Toronto und die Pharmafirma Eli Lilly. Obwohl Best erst 23 Jahre alt war, wurde ihm die Leitung der Insulinproduktion für ganz Kanada übertragen. Schließlich wurde klar, dass Bantings ursprüngliche Annahme - dass die Gegenwart von Verdauungsenzymen die Reinigung von Insulin gefährdete — falsch war, denn Insulin ließ sich erfolgreich aus einer intakten Bauchspeicheldrüse isolieren. Nicht ohne Kontroversen wurde im Jahre 1923 der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin an Banting und Macleod verliehen. Banting war über die Nichtbeachtung von Best verärgert und teilte seinen Anteil des Preises mit seinem Assistenten. Macleod, der während der frühen Forschung nicht viel Unterstützung geboten hatte, teilte seinen Anteil mit Collip.

Banting übernahm anschließend mehrere Verwaltungsstellen und konzentrierte seine Forschung auf die Staublunge, erreichte auf diesem Gebiet aber nicht viel. Er kam 1941 bei

Störungen im Energiestoffwechsel

einer Kriegsmission auf dem Weg nach England bei einem Flugzeugabsturz ums Leben. Best wurde im Alter von 29 Jahren Macleods Nachfolger als Leiter der Physiologie und dehnte seine Forschung auf die biologische Wirkung von Insulin aus. Unter seiner Führung liefen auch Versuche, das

877

Antikoagulans Heparin, ein Glykosaminoglycan, zu reinigen und menschliches Trockenserum für die medizinische Verwendung beim Militär herzustellen. Banting, F.G. und Best, C.H., The internal secretion of the pancreas,

J. Lab. Clin. Med. 7, 251-266 (1922).

Der insulinabhängige Diabetes wird durch einen Mangel an pankreatischen ß-Zellen verursacht

Beim insulinabhängigen (Typ I) Diabetes mellitus fehlt Insulin ganz oder nahezu vollständig, weil das Pankreas keine oder nur defekte ß-Zellen aufweist. Dieser Zustand resultiert in den meisten Fällen aus einer Autoimmunantwott, die selektiv pankreatische B-Zellen zerstört. Wie Frederick Banting und Charles Best im Jahre 1921 als erste zeigen konnten (Exkurs 22.1), ist es für Individuen mit insulinabhängigem Diabetes für das Überleben erforderlich, sich täglich Insulininjektionen zu verabreichen und eine ausgewogene Diät verbunden mit einer gesunden Lebensweise einzuhalten. Infolge degenerativer Komplikationen, wie Nierenversagen, Nervenschädigungen und Herzkreislauferkrankungen, weisen sie dennoch eine reduzierte Lebenserwartung auf, die ein Drittel niedriger liegt als die eines Gesunden. Dies ist offensichtlich auf die ungenaue metabolische Kontrolle zurückzuführen, die bei periodischen Insulininjektionen auftritt. Die Hyperglykämie (ein hoher Blutglucosespiegel) bei Diabetes mellitus führt häufig durch Glykosylierung der Linsenproteine zum Grauen Star und durch Degeneration der Retina zur Erblindung (Abb. 22.16). Das meist schnelle Einsetzen der Symptome beim insulinabhängigen Diabetes könnte vermuten lassen, dass die Autoimmunattacke auf die pankreatischen B-Zellen nur von kurzer Dauer ist. Typischerweise entwickelt sich die Erkrankung jedoch über mehrere Jahre, während das Immunsystem die ß-Zellen langsam zerstört. Erst wenn mehr als 80% dieser Zellen fehlen, treten die klassischen Diabetessymptome auf. Aus diesem Grund ist eine der erfolgreichsten Behandlungen von insulinabhängigem Diabetes die Transplantation von ß-Zellen, ein Verfahren, das mit der Entwicklung gut veträglicher Immunsuppressiva möglich wurde. Nicht insulinabhängiger Diabetes kann durch einen Mangel an Insulinrezeptoren hervorgerufen werden

Der nicht insulinabhängige (Typ II) Diabetes mellitus, der für über 90% der diagnostizierten Diabetesfälle verantwortlich ist und 18% der Bevölkerung über 65 Jahre betrifft, tritt üblicherweise bei übergewichtigen Personen mit einer genetischen Veranlagung für diesen Defekt auf. Die Betroffenen zeigen normale oder sogar stark erhöhte Insulinspiegel. Die Symptome sind auf einen Mangel an Insulinrezeptoren auf normalerweise insulinempfindlichen Zellen zurückzuführen. Daher reagieren diese Zellen auf Insulin nicht normal und können als insulinresistent angesehen werden. Als eine Folge davon ist die Glucosekonzentration im Blut, besonders nach einer Mahlzeit, wesentlich höher als normal (Abb. 22.17). Die mit der Insulinresistenz einhergehende Hyperglykämie induziert in den pankreatischen ß-Zellen eine erhöhte Insulinproduktion. Das hohe Grundniveau der Insulinsekretion vermindert die Fähigkeit der ß-Zellen, auf eine weitere Erhöhung der Blutglucosekonzentration zu reagieren. Dies führt zu einer fortschreitenden Verschlechterung bei der Hyperglykämie und den sie begleitenden Komplikationen. Etliche Mutationen beim Insulinrezeptor konnten mit dem nicht insulinabhängigen Diabetes in Verbindung gebracht werden. Diese Defekte erzeugen Veränderungen bei der Insulinbindung (Mutationen der a-Untereinheit) oder der Tyrosinkinaseaktivität (Mutationen der ß-Untereinheit). Jedoch konnten genetische Defekte nur bei rund 5% der nicht insulinabhängigen Diabetiker festge-

Abb. 22.16

Foto eines Diabetes-bedingten

Grauen Stars.

Die Anhäufung von Glucose in der Linse führt zum Anschwellen und zu einer Präzipitation der Linsenproteine. Die sich daraus ergebende Licht-

undurchlässigkeit verursacht unscharfes Sehen und schließlich den vollständigen Verlust des Sehvermögens. [© Sue Ford/Photo Researchers.]

873

_Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation 20

Abb. 22.17 Glucoseprofile über 24 Stunden bei gesunden Individuen und nicht insulinabhängigen Diabetikern. Die Grundspiegel an Glucose und deren Anstieg nach den Mahlzeiten sind bei Diabetikern erhöht.

nicht insulinabhängiger Diabetes

15

[Nach Bell, G.l., Pilkis, S.)., Weber, 1.T., und

Polonsky, K.S., Annu. Rev. Physiol. 58, 178 (1996).] Pr@)

(mM) [Glucose] Plasma

ja A Frühstück

Mittag

480

240

0

Abendbrot

720

960

1200

1440

Zeit (min)

stellt werden. Es ist daher wahrscheinlich, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung dieser Krankheit eine Rolle spielen. Die erhöhte Insulinproduktion z. B., die auf zu viel aufgenommene Nahrung zurückzuführen ist, vermag möglicherweise die Synthese der Insulinrezeptoren zu unterdrücken. Diese Hypothese erklärt, warum oftmals bereits eine Diät ausreicht, um die Schwere dieser Erkrankung zu mindern. Eine andere Hypothese, die von Gerald Shulman aufgestellt wurde, besagt, dass die erhöhte Konzentration von freien Fettsäuren im Blut, die durch Fettleibigkeit verursacht wird, die Übertragung des Insulinsignals behindert. Eine anhaltend hohe Konzentration freier Fettsäuren führt zur Aktivierung einer PKCIsoform, die die Insulinrezeptorsubstrate am Ser und Thr phosphoryliert und so die Tyr-Phosphorylierung, durch die sie aktiviert werden, hemmt. Dieses Ausbleiben der Aktivierung vermindert die Antwort der Zelle auf Insulin

(Abb. 13.31).

Andere Behandlungsmöglichkeiten von nicht insulinabhängigem Diabetes sind der Einsatz von Arzneimitteln wie Metformin und Thiazolidindionen (TZD), die der Insulinresistenz entweder durch Unterdrückung der Glucosefreisetzung aus der Leber (Metformin) oder durch Förderung des insulinstimulierten Glucoseabbaus im Muskel (TZD) entgegen wirken. H.C 3

NH

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N

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NH NN

Rreu

ZN (6)

ER Metformin

Thiazolidindion (TZD)

Beide Arzneimittel wirken, indem sie die AMPK-Aktivität erhöhen. Dies geschieht jedoch über verschiedene Mechanismen. TZD verursachen einen starken Anstieg des AMP:ATP-Quotienten in den Muskelzellen. Dies wiederum führt zu einem Anstieg der AMPK-Phosphorylierung und -aktivität. Metformin steigert ebenfalls die AMPK-Phosphorylierung und -aktivität, jedoch ohne das AMP:ATP-Verhältnis zu verändern. In beiden Fällen bewirkt die Steigerung der AMPK-Aktivität eine verminderte Gluconeogenese in der Leber und einen reduzierten Glucoseabbau im Muskel (Abb. 22.11). Außerdem wirken TZD der Insulinresistenz entgegen, indem sie insbesondere im Fettgewebe an den Transkriptionsfaktor PPAR-y (von engl.: peroxisome proliferator-activated receptor-y) binden und ihn dadurch aktivieren. Die Aktivierung von PPAR-y induziert unter anderem die Synthese von Adiponectin (Abschnitt 22.3C), das wiederum

Störungen im Energiestoffwechsel

die AMPK-Aktivität erhöht. Im Fettgewebe führt die Funktion der AMPK zu einer Reduktion der Lipolyse und des Fettsäureexports. Dadurch sinkt die Konzentration freier Fettsäuren im Blut, was wiederum eine reduzierte Insulinresistenz zur Folge hat (siehe oben). Adipocyten von Nagetieren sezernieren ein aus 108 Aminosäuren bestehendes Polypeptidhormon, das Resistin genannt wird. Das Hormon ist nach seiner Fähigkeit benannt, die Wirkung von Insulin auf Adipocyten zu blockieren. Tatsächlich wird die Produktion von Resistin durch TZD gesenkt. Man vermutet, dass die Überproduktion von Resistin an der Entwicklung von nicht insulinabhängigem Diabetes beteiligt ist. Ein interessanter Unterschied zwischen Nagetieren und Menschen besteht jedoch darin, dass im menschlichen Körper Resistin von Makrophagen produziert wird, was eine Rolle in der Stoffwechselregulierung beim Menschen fraglich erscheinen lässt.

C. _ Fettleibigkeit (Obesitas) Der menschliche Körper reguliert die Glykogen- und Proteinvorräte innerhalb relativ enger Grenzen. Fettreserven jedoch, die wesentlich größer sind, können enorme Ausmaße erreichen. Die Anhäufung von Fettsäuren als Triacylglycerine im Fettgewebe resultiert größtenteils aus einer übermäßigen Aufnahme von Fett oder Kohlenhydraten im Verhältnis zum Energieverbrauch. Die Synthese von Fett aus Kohlenhydraten findet immer dann statt, wenn die Kapazität der Glykogenspeicher ausgeschöpft ist und dem Körper weiterhin Kohlenhydrate zugeführt werden. Ein chronisches Ungleichgewicht zwischen der Fettaufnahme und dem Fettverbrauch erhöht die Masse des Fettgewebes durch eine Zunahme der Zahl und Größe der Adipocyten. Einmal gebildet, gehen die Adipocyten nicht wieder verloren, nur ihre Größe kann zu- oder abnehmen. Eine Zunahme der Masse des Fettgewebes erhöht den Pool an Fettsäuren, die zur Erzeugung von Stoffwechselenergie mobilisiert werden können. Letztendlich wird ein Gleichgewichtszustand erreicht, in dem die Masse des Fettgewebes nicht länger zunimmt und in dem sich die Speicherung und die Mobilisierung von Fett die Waage halten. Studien an Tieren und Menschen zeigen, dass der prozentuale Anteil des Körperfetts in etwa dem Fettgehalt der Nahrung entspricht. Dieses Phänomen erklärt teilweise das verstärkte Auftreten der Fettleibigkeit in den Wohlstandsgesellschaften, wo fett- und kohlenhydratreiche Kost im Überfluss vorhanden ist und körperliche Aktivität nicht mehr überlebenswichtig ist. Deutliche Hinweise legen nahe, dass das Verhalten (z.B. Essgewohnheiten und das Ausmaß der körperlichen Aktivitäten) die individuelle Zusammensetzung des Körpers beeinflussen. Dennoch gibt es, wie bereits erwähnt (Abschnitt 22.3), auch einige Fälle von Fettleibigkeit, die eindeutig auf angeborene Störungen der individuellen Fähigkeit der Energiemetabolisierung beruhen. Der hormonelle Mechanismus, der heutzutage zur Fettleibigkeit und deren begleitenden gesundheitlichen Problemen wie z.B. Diabetes führen kann, bedeutete vermutlich in früheren Zeiten einen Selektionsvorteil. Die Fähigkeit leicht Gewicht zuzulegen kann zum Beispiel gegen Hungersnöte geschützt haben. Eine Theorie besagt dass im Laufe der menschlichen Evolution die Regulierung des Energiestoffwechsels daraufhin optimiert wurde, sehr große Mengen an Nahrung aufzunehmen, wenn diese verfügbar war. Überschüssige Energie konnte in Form von Fett gespeichert werden und half so, Hungerzeiten zu überbrücken. In modernen Kulturen, in denen Hungerzeiten selten sind und nährstoffreiche Nahrungsmittel leicht verfügbar sind, hat das menschliche Erbgut offenbar zu einem flächendeckenden Auftreten von Fettleibigkeit beigetragen: Nach Erhebungen aus dem Jahr 2007 sind 23% der erwachsenen Deutschen fettleibig und weitere 44% sind übergewichtig.

879

880

Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Beschreiben Sie die metabolischen Veränderungen, die während des Hungerns auftreten. 2. Nennen Sie die Unterschiede zwischen dem insulinabhängigen und dem nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus. 3. Wie ist Fettleibigkeit mit dem nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus verknüpft?

Fettleibigkeit ist ein Faktor des metabolischen Syndroms Das metabolische Syndrom ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Insulin-

resistenz, Entzündungen und eine Prädisposition für verschiedene Störungen gekennzeichnet ist, zu denen Typ 2-Diabetes, Bluthochdruck und Atherosklerose gehören. Oft sind mit diesen Störungen auch Erkrankungen der Herzkranzgefäße verbunden. Fettleibigkeit, Bewegungsmangel und wahrscheinlich genetische Faktoren sind am Auftreten des metabolischen Syndroms beteiligt, von dem allein in den USA 65 Millionen Menschen betroffen sind. Körperliche Bewegung, Kalorien-/Gewichtsreduzierung, Adipoenctin, Leptin, Metformin und TZD wurden alle erfolgreich zur Behandlung des metabolischen Syndroms eingesetzt. Allen diesen Faktoren ist gemein, dass sie die AMPK-Aktivität erhöhen. AMPK ist damit zu einem vielversprechenden Zielobjekt für die Arzneimittelentwicklung geworden.

Zusammenfassung 1. Die Wege für die Synthese und den Abbau der wichtigsten Energiequellen für den Stoffwechsel (Glucose, Fettsäuren und Aminosäuren) laufen bei Acetyl-CoA und Pyruvat zusammen. Bei Säugern ist der Abbau durch die Stoffwechselwege gewebespezifisch. 2. Das Gehirn verwendet Glucose als primäre Energiequelle. Die Muskulatur kann eine Vielzahl von Energieträgern oxidieren, sie ist jedoch bei maximaler Anstrengung auf anaerobe Glykolyse angewiesen. Das Fettgewebe speichert überschüssige Fettsäuren als Triacylglycerine und mobilisiert sie bei Bedarf. 3. Die Leber hält die Konzentrationen der zirkulierenden Energieträger aufrecht. Die Wirkung der Glucokinase ermöglicht es der Leber, überschüssige Glucose aufzunehmen, die anschließend unterschiedlichen metabolischen Stoffwechselwegen zugeführt wird. Die Leber wandelt ebenfalls Fettsäuren in Ketonkörper um und metabolisiert Aminosäuren, die aus der Nahrung oder vom Proteinabbau stammen. Sowohl die Leber als auch die Niere führen die Gluconeogenese durch. 4. Der Cori-Cyclus und der Glucose-Alanin-Cyclus sind Stoffwechselwege, die mehrere Organe umfassen. Die Leber und die Muskulatur tauschen darüber Stoffwechselintermediate aus. 5. Hormone wie Insulin, Glucagon und Adrenalin übermitteln regulatorische Signale an Zielgewebe, indem sie dort an Rezeptoren binden, die das Signal in das Zellinnere weiterleiten. Insulin fördert die Brennstoffspeicherung, und Glucagon und Adrenalin mobilisieren die gespeicherten Brennstoffe. 6. Die AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK), der Brennstoffmesser der Zelle,

registriert den ATP-Bedarf der Zelle und aktiviert Abbauwege des Stoff-

wechsels, während Biosynthesewege gehemmt werden. 7. Adiponectin, eine Hormon der Fettzellen (Adipocyten), das die Insulinempfindlichkeit steigert, wirkt durch Aktivierung der AMPK. 8. Der Appetit wird über die Hormone Leptin, Insulin, Ghrelin und PYY im Hypothalamus gesteuert. 9. Während des Hungerns, d.h. wenn Energie aus der Nahrung nicht verfügbar ist, setzt die Leber zunächst Glucose aus dem Glykogenabbau und später

durch Gluconeogenese aus Aminosäurevorstufen frei. Bei längerem Fasten decken Ketonkörper aus dem Fettsäureabbau den größten Teil der Energiebedürfnisse des Körpers. 10. Diabetes mellitus verursacht Hyperglykämie und andere physiologische Probleme, die aus der Zerstörung der insulinproduzierenden pankreatischen P-Zellen oder aus einer Insulinresistenz (Verlust der Insulinrezeptoren) resultieren. 11. Fettsucht (Adipositas), das Resultat eines Ungleichgewichts zwischen Fettaufnahme und Fettoxidation, resultiert unter Umständen aus der anormalen

Aufgaben

881

Regulation durch Peptidhormone, die von verschiedenen Geweben gebildet werden.

12. Das metabolische Syndrom wird durch Fettleibigkeit, Bewegungsmangel und möglicherweise durch genetische Faktoren verursacht.

Wichtige Begriffe Tr

Cori-Cyclus Sauerstoffschuld Glucose-Alanin-Cyclus Homöostase

nahrungsinduzierte Thermogenese Diabetes mellitus Ketose Hyperglykämie

Insulinresistenz Stoffwechselsyndrom

Aufgaben 1. Beschreiben Sie den Effekt einer Überdosis Insulin auf die Gehirnfunktion einer gesunden Person. 2. Warum würde der ATP-erzeugende oxidative Metabolismus zum Stillstand kommen, wenn der gesamte ATPVorrat einer Zelle aufgebraucht wäre? 3. Der passive Glucosetransporter mit der Bezeichnung GLUT1 (Abb. 10.13) kommt in den Membranen vieler Zellen vor, aber nicht in der Leber. Leberzellen exprimieren stattdessen den GLUT2-Transporter, der andere Transportkinetiken aufweist. (a) Vergleichen Sie die KyWerte von GLUT1 und GLUT2 angesichts dessen, was Sie über die Rolle der Leber bei der Pufferung der Blutglucose wissen. (b) Erklären Sie, warum ein GLUT2-Mangel Symptome hervorruft, die denjenigen der Glykogenspeicherkrankheit vom Typ I ähneln (Exkurs 16.2). 4. Die ß-Zellen des Pankreas exprimieren einen Rezeptor für Fettsäuren. Eine Fettsäure, die an dieses Protein bindet, scheint die Insulinsekretion zu stimulieren. (a) Ergibt dieses Phänomen für den Stoffwechsel einen Sinn? (b) Fettsäuren scheinen die Insulinsekretion in weit größerem Maß zu stimulieren, wenn auch Glucose vorhanden ist. Warum ist dies bedeutsam? 5. Die Anpassung an große Höhen schließt auch eine Zunahme von GLUT1 und Phosphofructokinase im Muskel mit ein. Erklären Sie, warum dies vorteilhaft ist. 6. Personen mit einem Mangel mittelkettiger Acyl-CoADehydrogenase (MCAD, engl.: medium chain acyl-CoA dehydrogenase) neigen zur Entwicklung von nichtketotischer Hypoglykämie. Erklären Sie, warum dieser Defekt verursacht, dass die Personen unfähig sind (a) Ketogenese und . (b) Gluconeogenese zu betreiben. 7. Würden Sie erwarten, dass Insulin die Aktivität des Enzyms ATP-Citrat-Lyase steigert oder senkt? 8. Erklären Sie, warum für die Adipocyten Insulin zur Synthese von Triacylglycerinen aus Fettsäuren erforderlich ist. 9. Erfahrene Läufer wissen, dass es wenig ratsam ist, große Mengen an Glucose unmittelbar vor einem Marathonlauf aufzunehmen. Was ist die metabolische Ursache für diesen scheinbaren Widerspruch?

10. Nach einigen Tagen des Hungerns ist die Fähigkeit der Leber zur Metabolisierung von Acetyl-CoA über den Citratcyclus stark vermindert. Wieso? 11. Wenn das Kreislaufsystem einer ob/ob-Maus chirurgisch mit dem einer normalen Maus verbunden wäre, wie würde sich dies auf den Appetit und das Gewicht der ob/ob-Maus auswirken? 12. Warum kann man das Fettgewebe als endokrines Organ betrachten? 13. Warum muss bei Experimenten zur Untersuchung der appetithemmenden Wirkungen von PYY;.,, das Hormon intravenös statt oral appliziert werden? 14. Man weiß, dass hohe Konzentrationen freier Fettsäuren im Blut eine Insulinresistenz im Muskel verursachen - jedoch erst nach fünf Stunden. Dies legt nahe, dass ein Metabolit der Fettsäuren für dieses Phänomen verantwortlich ist. Man weiß auch, dass während dieses Vorgangs eine Isoform der Proteinkinase C aktiviert wird und dass hohe Konzentrationen freier Fettsäuren zur Anhäufung von Triacylglycerinen im Muskel führen. Betrachten Sie mithilfe dieser Information den Aktivierungsmechanismus der PKC und den Biosyntheseweg der Triacyglycerine und schlagen Sie einen Metaboliten vor, der für die PKC-Aktivierung verantwortlich sein kann. 15. Erörtern Sie mit molekularen Begriffen, wie Bewegungsmangel zur Insulinresistenz führen könnte.

Elektronisches Zusatzmaterial

auf www.wiley.com/college/voet Case Study 25 Glycogen Storage Diseases Disturbances in glycogen utilization result if an enzyme involved in glycogen synthesis or degradation is missing. Case Study 28 The Bacterium Helicobacter pylori and Peptic Ulcers The entire genome of Helicobacter pylori has been sequenced. This allows biochemists to examine the organism’s proteins in detail. In this case, mechanisms employed by Helicobacter pylori that permit it to survive in the acidic environment of the stomach are examined. Case Study 30 Phenylketonuria The characteristics of phenylalanine hydroxylase, the enzyme missing in persons afflicted with the genetic disorder phenylketonuria (PKU), are examined.

882

_ Energiestoffwechsel der Säuger: Vernetzung und Regulation

Literatur Bollen, M., Keppens, S. und Stalmans, W., Specific features of glycogen metabolism in the liver, Biochem J. 336, 19-31 (1998). Huang, H. und Czech, M.P., The GLUT4 glucose transporter, Cell Metabolism 5, 237-252 (2007).

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und Behandlungsmöglichkeiten von Fettleibigkeit.]

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Towler, M.C. und Hardie, D.G., AMP-Activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling, Circulation Res. 100, 328-341

(2007).

U nd

n o i t a k ! p Re

Zur Synthese von zwei kompletten Chromosomensätzen werden große Mengen an neu synthetisierten Nucleotiden benötigt. Während der Zellteilung (Mitose) werden die identischen Chromosomen (violett) voneinander getrennt. [Mit freundlicher Genehmigung von Andrew Bajer, University of Oregon.]

Nucleotidmetabolismus Nucleotidmetabolismus e Synthese von Purinribonucleotiden e Synthese von Pyrimidinribonucleotiden e Bildung von Desoxyribonucleotiden ® Nucleotidabbau

Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 33 Interactive Exercise 34 Interactive Exercise 35

Animated Animated Animated Animated

23-1 23-4 23-5 23-8

Figure Figure Figure Figure

Nucleotide sind Phosphorsäureester einer Pentose (Ribose oder Desoxyribose), bei denen eine Purin- oder Pyrimidinbase an das C1’-Atom des Zuckers geknüpft ist (Abschnitt 3.1). Nucleosidtriphosphate sind die monomeren Bausteine, die als Vorläufer für Nucleinsäuren dienen. Nucleotide erfüllen darüber hinaus eine große Anzahl weiterer biochemischer Funktionen. Wir haben gesehen, wie die Spaltung einer energiereichen Verbindung, wie z.B. ATP, Freie Enthalpie liefert und somit verschiedene Reaktionen thermodynamisch begünstigt. Außerdem haben wir gesehen, dass Nucleotide Bausteine einiger wichtiger Cofaktoren

des

Stoffwechsels

sind. Als Beispiele

seien

hier FAD,

NAD*

und

Coenzym A genannt. Die Bedeutung von Nucleotiden im zellulären Stoffwechsel wird aus der Beobachtung ersichtlich, dass fast alle Zellen sowohl Ribo- als auch Desoxyribonucleotide de novo (neu) und aus den Abbauprodukten der Nucleinsäuren synthetisieren können. Im Gegensatz zu Kohlenhydraten, Aminosäuren und Fettsäuren stellen Nucleotide jedoch keine bedeutende Energiequelle im Stoffwechsel dar. In diesem Kapitel betrachten wir die Natur der Nucleotidbiosynthesewege. Dabei werden wir untersuchen, wie sie reguliert werden und welche Konsequenzen sich aus Ihrer Blockade - sowohl durch genetische Defekte als auch durch chemotherapeutische Stoffe -— ergeben. Danach werden wir diskutieren, auf welche Weise Nucleotide abgebaut werden. Dabei werden wir der zu Grunde liegenden chemischen Systematik des Nucleotidstoffwechsels folgen und unsere Diskussion in Abschnitte über Purine, Pyrimidine und Desoxynucleotide (einschließlich Thymidylat) unterteilen. Die Nomenklatur der Basen, der Nucleoside und der Nucleotide ist in Tabelle 3.1 wiedergegeben.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim znmır

no

2

PN"

NX7/7"7

N

886

Nucleotidmetabolismus

Synthese von Purinribonucleotiden

1

John Erste Hinweise darauf, wie die Purinsynthese de novo abläuft, erhielt an ngen Buchanan 1948, indem er verschiedene isotopenmarkierte Verbindu von der in Atome en Tauben verfütterte und dann die Positionen der markiert den Vögeln ausgeschiedenen Harnsäure (einem Purin) ermittelte. (6)

H\

H

&

IL N

(0)

N

n

|

H

H

Harnsäure

Diese Untersuchungen zeigten, dass das N1 der Purine von der Aminogruppe des Aspartats stammt; C2 und C8 haben ihren Ursprung in Formiat; N3 und N9 werden von der Amidgruppe des Glutamins geliefert; C4, C5 und N7 werden von Glycin beigesteuert (was darauf hindeutet, dass dieses Molekül als Ganzes in den Purinring eingebaut wird) und C6 stammt aus HCO;. HCO; Glycin Aminogruppe

a

if

aus Aspartat \1 a | 50 = : 2 4 Formiat > C\_ 3 _enR

N

,

Formiat

H

Amidgruppe aus Glutamin

Der Weg, auf dem diese Vorstufen in den Purinring eingebaut werden, wurde in weiterführenden Arbeiten vor allem von J. Buchanan und G. Robert Greenberg aufgeklärt. Alle Purine gehen auf Inosinmonophosphat (IMP), (0)

N

HN

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0 Den

07

|

Hypoxanthin> base

N

Ö

H

HH OH

OH

Inosinmonophosphat (IMP)

zurück, das Nucleotid der Base Hypoxanthin. IMP ist sowohl die Vorstufe von AMP als auch von GMP. Dies zeigt, dass die Purine, wider Erwarten, zunächst als Ribonucleotide und nicht als freie Basen gebildet werden. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Biosynthese von Purinen bei so unterschiedlichen Organismen wie E. coli, Hefe, Tauben und Menschen im Wesentlichen nach dem gleichen Mechanismus abläuft. Dies illustriert einmal mehr die biochemische Einheit des Lebens.

Synthese von Purinribonucleotiden

A.

Synthese von Inosinmonophosphat

IMP wird über einen Weg, der aus 11 Reaktionsstufen besteht, synthetisiert

(Abb. 23.1):

1. Aktivierung von Ribose-5-phosphat Die Ausgangsverbindung der Purinbiosynthese ist a-p-Ribose-5-phosphat, ein Produkt des Pentosephosphatwegs (Abschnitt 15.6). Im ersten Schritt der Purinbiosynthese aktiviert die Ribosephosphat-Pyrophosphokinase die Ribose, indem sie diese mit ATP zu 5-Phosphoribosyl-«-pyrophosphat (PRPP) umsetzt. Diese Verbindung ist auch eine Vorstufe bei der Biosynthese der Pyrimidinnucleotide (Abschnitt 23.2A) und der Aminosäuren Histidin und Tryptophan (Abschnitt 21.5B). Die Aktivität der RibosephosphatPyrophosphokinase wird, wie es für ein Enzym an einem solch wichtigen Knotenpunkt des Stoffwechsels zu erwarten ist, genau reguliert. 2. Einbau des Purinatoms N9 In der ersten Reaktion, die ausschließlich der Purinbiosynthese dient, katalysiert Amidphosphoribosyltransferase die Substitution der Pyrophosphatgruppe von PRPP durch das Stickstoffatom der Amidgruppe von Glutamin. Die Reaktion verläuft unter Inversion der a-Konfiguration am C1-Atom von PRPP und liefert ß-5-Phosphoribosylamin. Somit wird die anomere Form des zukünftigen Nucleotids festgelegt. Diese Reaktion, deren Triebkraft die nachfolgende Hydrolyse des freigesetzten PP; ist, stellt den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Stoffwechselwegs dar. 3.

Einbau der Purinatome C4, C5 und N7

Die Carboxylgruppe des Glycins bildet mit der Aminogruppe von Phosphoribosylamin ein Amid, das Glycinamidribotid (GAR). Diese Reaktion ist trotz der damit einhergehenden Hydrolyse von ATP zu ADP + P; reversibel. Sie stellt den einzigen Schritt im Purinbiosyntheseweg dar, bei dem mehr als ein Atom in den Purinring eingebaut wird. 4. Einbau des Purinatoms C8 Die freie a-Aminogruppe von GAR wird formyliert. Dies führt zu Formylglycinamidribotid (FGAR). Der Formyldonor bei dieser Reaktion ist N'’-Formyltetrahydrofolat (N'°-Formyl-THF), ein Coenzym, das C,-Einheiten überträgt (THF-Cofaktoren werden in Abschnitt 21.4D beschrieben). Die Röntgenkristallstruktur des Enzyms GAR-Transformylase, das die Reaktion katalysiert, wurde im Komplex mit GAR und dem THF-Analogon 5-Desazatetrahydrofolat (sdTHF) von Robert Almassy aufgeklärt (Abb. 23.2). Dabei ist die Nähe der Aminogruppe von GAR zum N'’-Atom des 5dTHF zu beachten. Dies stützt die enzymatischen Untersuchungen, aus denen gefolgert wurde, dass die GAR-Transformylasereaktion über einen nucleophilen Angriff der GAR-Aminogruppe am Formylkohlenstoffatom des N'’-Formyl-THF abläuft, unter Ausbildung eines tetraedrischen Intermediats. 5. Einbau des Purinatoms N3 Die Amidgruppe eines zweiten Glutamins wird auf den wachsenden Purinring übertragen und es entsteht Formylglycinamidinribotid (FGAM). Diese Reaktion wird durch die gekoppelte Hydrolyse von ATP zu ADP + P; getrieben. 6. Bildung des Purin-Imidazolrings Der Purin-Imidazolring wird in einer ATP-verbrauchenden intramolekularen Kondensation geschlossen, die zu 5-Amidoimidazolribotid (AIR) führt. Die Aromatisierung des Imidazolrings wird durch eine Tautomerisierung des Reaktanten von seiner Imin- in die Enaminform erleichtert.

7. Einbau von C6 Das Purin-C6-Atom wird durch HCO; eingeführt. Die Carboxylierungsreaktion wird durch AIR-Carboxylase katalysiert und führt zu Carboxyaminoimidazolribotid (CAIR). In E. coli besteht die AIR-Carboxylase aus zwei Protei-

887

888

Nucleotidmetabolismus

7. rr 20P-0- NH

yeH

oO

= O=CH-

|

N = N

H

Ribose-5-phosphat Formylglycinamidribotid (FGAR)

|

Ribose-5-phosphat

5-Formaminoimidazol-4-carboxamidribotid

(FAICAR) ATP + Glutamin + H,O

5) FGAM-Synthetase

$4 ADP + Glutamat + P;

H,O

H

(0)

} 2

|

HN” NH

|

20,P = 0—iCH,

Formylglycinamidinribotid (FGAM)

“

-Synthetase 6) AIR-Synthet

5

Cyelohydrolase

N

I

‚eH

an

| Ribose-5-phosphat

ADP + P;

IMP

11

NS }

> 2

5-Aminoimidazoleribotid (AIR) ATP + HCO;3

Ribosephosphat-

AMP

CE >—N

HN

=

a-D-Ribose-5-phosphat (R5P) ATP

4 >

o HH

|

5

SEO

r

Inosinmonophosphat (IMP)

Synthese von Purinribonucleotiden

889

( Abb. 23.1 Stoffwechselweg zur de novo-Synthese von IMP. Hier wird der Purinrest durch eine Serie von 11 enzymkatalysierten Reaktionsschritten an den Ribosering synthetisiert. Die Röntgenstrukturen aller Enzyme sind an der Außenseite des entsprechenden Reaktionspfeils abgebildet. Die Peptidketten von monomeren Enzymen sind in den Spektralfarben vom N-Terminus (blau) zum C-Terminus (rot) dargestellt. Die oligomeren Enzyme, die alle aus identischen Polypeptidketten bestehen, sind entlang einer Rotationsachse abgebildet. Ihre verschiedenen Ketten sind unterschiedlich gefärbt. Gebundene Liganden sind als Kalottenmodelle dargestellt. [PDBids: Enzym 1: 1DKU; Enzym 2: 1AO0; Enzym 3: 1GSO; Enzym 4: 1CDE; Enzym 5: 1VK3; Enzym 6: ICLI; Enzym 7: 1D7A (PurE) und 1B6S (Purk);

Enzym 8: 1A48; Enzym 9: 1C3U; Enzym 10 und 11: 1G8M] 6% siehe Animated Figures.

Abb. 23.2

DORT NUENEIRDEE Da RE

Dann wäre jedoch für den Ablauf der Reaktion eine hohe, nicht physiologische BHCO;-Konzentration (ca. 100 mM) erforderlich. PurKE verringert die ee 5 Ex

Si Be

tor 1000, allerdings auf Kosten der Hydrolyse von ATP.

GAR zu SdTHF. [Nach einer Röntgenstruktur

Einbau von N1

von Robert Almassy, Agouron Pharmaceuticals,

HCO;-Konzentration, die für die PurE-Reaktion benötigt wird, um den Fak-

8.

Bändermodell einer Untereinheit von

nen, dem sogenannten PurE und Purk. PurE alleine könnte die Carboxylierungsreaktion katalysieren, trotz seines Ky-Werts für HCO; von ca. 110 mM.

Das Purinatom N1 wird von Aspartat in einer amidbildenden Kondensationsreaktion zu 5-Aminoimidazol-4-(N-succinylocarboxamid)-ribotid (SACAIR) beigesteuert. Die Reaktion, die durch die Hydrolyse von ATP getrieben wird, ähnelt chemisch der Reaktion 3. 9. Eliminierung von Fumarat SACAIR wird unter Freisetzung von Fumarat gespalten. Dabei wird 5-Aminoimidazol-4-carboxamidribotid (AICAR) gebildet. Die Reaktionen 8 und 9 ähneln chemisch denen im Harnstoffcyclus, bei denen Citrullin zur Bildung von Arginin aminiert wird (Abschnitt 21.3A). Die Aminogruppe von Aspartat wird jeweils durch eine ATP-getriebene Kopplungsreaktion auf einen Akzeptor übertragen und das Kohlenstoffskelett von Aspartat dann als Fumarat eliminiert. 10. Einbau von C2 Das letzte Atom für den Einbau in den Purinring liefert die Formylierung durch N'’-Formyltetrahydrofolat zu 5-Formaminoimidazol-4-carboxamidribotid (FAICAR). Diese Reaktion und die Reaktion 4 der Purinbiosynthese werden indirekt durch Sulfonamide inhibiert, die strukturelle Analoga des p-Aminobenzoesäure-Bausteins von THF sind (Abschnitt 21.4D). 11. Cyclisierung zu IMP Die letzte Reaktion dieses Wegs, der Ringschluss zu IMP, erfolgt durch EIiminierung von Wasser. Im Gegensatz zu Reaktion 6, der Cyclisierung zum Imidazolring, erfordert diese Reaktion keine ATP-Hydrolyse.

Bei Tieren werden die Reaktionen 10 und 11, wie auch die Reaktionen 7 und 8 von einem bifunktionellen Enzym katalysiert. Die Reaktionen 3, 4 und 6 finden ebenso an einem einzigen Protein statt. Die Zwischenprodukte dieser multifunktionellen Enzyme werden nicht ins Medium abgegeben, sondern werden an das nachfolgende Enzym im Stoffwechselweg weitergeleitet. Wie auch bei den Reaktionen, die vom Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (Abschnitt 17.2), der Fettsäure-Synthase (Abschnitt 20.4C), der bakteriellen Glutamat-Synthase (Abschnitt 21.7) und der Tryptophan-Synthase (Abschnitt 21.5B) katalysiert werden, erhöht das Weiterleiten (engl.: channeling) im Nucleotid-Syntheseweg die Gesamtgeschwindigkeit dieses mehrstufigen Prozesses und schützt die Zwischenprodukte vor dem Abbau durch andere zelluläre Enzyme.

en 2h rn u ee N ee grün, die Atome N, O und P dunkelblau, rot bzw. gelb gekennzeichnet. Beachten Sie die Nähe von

San Diego. PDBid ICDE.]

890

Nucleotid metabolism us

B.

Abb. 23.3 IMP wird in separaten, zweistufigen Reaktionswegen in AMP oder GMP umgewandelt. Die Röntgenstrukturen der homooligomeren Enzyme, die die Reaktionen katalysieren, sind wie in der Legende zu Abb. 23.1 beschrieben gezeigt. [PDBids: Adenylosuccinat-Synthetase: IG1M; Adenylosuccinat-Lyase: 1C3U; IMP-Dehydrogenase: 1)R1; GMP-Synthetase:

Synthese von Adenosin- und Guanosinribonucleotiden

IMP wird innerhalb der Zelle nicht akkumuliert, sondern rasch zu AMP und GMP umgewandelt. AMP, das sich von IMP nur durch den Austausch der 6-Ketogruppe durch eine Aminogruppe unterscheidet, wird über einen zweistufigen Reaktionsweg synthetisiert (Abb. 23.3, links). In der ersten Reaktion - getrieben durch die Hydrolyse von GTP zu GDP und P; - wird die Aminogruppe von Aspartat mit IMP zu Adenylosuccinat verknüpft. In der zweiten Reaktion eliminiert Adenylosuccinat-Lyase Fumarat und bildet so AMP. Das gleiche Enzym katalysiert auch die Reaktion 9 der IMP-Biosynthese (Abb. 23.1). Beide Reaktionen fügen unter Eliminierung von Fumarat Stickstoff ein. GMP wird ebenfalls in zwei Stufen aus IMP synthetisiert (Abb. 23.3, rechts). In der ersten Reaktion wird IMP durch eine NAD*-abhängige Reduktion zu Xanthosinmonophosphat (XMP; dem Ribonucleotid der Base Xanthin) dehydriert. XMP wird dann durch den Transfer eines Glutamin-Amidstickstoffs zu GMP umgewandelt. Diese Reaktion wird durch die Hydrolyse von ATP zu AMP + PP; (und darauf folgend zu 2 P;) getrieben. In B- und T-Lymphocyten, die die Immunantwort vermitteln, ist die IMP-Dehydrogenaseaktivität hoch, um das Guanosin bereitzustellen, das diese Zellen zur Proliferation benötigen. Die aus Pilzen isolierte Verbindung Mycophenolsäure inhibiert das Enzym und wird als Immunsuppressivum nach Nierentransplantationen eingesetzt.

IGPM.]

(0) Yy

S | „ Ribose-5-phosphat Nm)

Aspartat

+ GTP

INE

GDP+P;

AdenylosuccinatSynthetase

NAD* + H,O

, NADH + H+

2000 CH,— is cooNH

OÖ

N

H\

Nahen

DEE

> N

es

yr

Ribose-5-phosphat

j

Adenylosuceinat Adenviostieeingn

Glutamin

+ ATP + H,O

Lyase

Fumarat

GMPSynthetase

Glutamat + AMP + PP, NH,

oO

ZZ N

Ribose-5-phosphat

Xanthosinmonophosphat (XMP)

N

u Ribose-5-phosphat

HS

Cr)N

HN“ Sn

Ribose-5-phosphat

GMP

Synthese von Purinribonucleotiden

891

Mycophenolsäure

Nucleosiddiphosphate und Nucleosidtriphosphate werden durch die Phosphorylierung von Nucleosidmonophosphaten synthetisiert

Damit die Nucleosidmonophosphate für die Nucleinsäurebiosynthese verwendet werden können, müssen sie zuerst in die entsprechenden Nucleosidtriphosphate umgewandelt werden. In der ersten Reaktion werden Nucleosiddiphosphate durch basenspezifische Nucleosidmonophosphat-Kinasen aus den jeweiligen Nucleosidmonophosphaten synthetisiert. Zum Beispiel katalysiert die Adenylat-Kinase (Abschnitt 14.2C) die Phosphorylierung von AMP zu ADP: AMP +ATP

=

2ADP

Auf ähnliche Weise wird GDP durch ein guaninspezifisches Enzym synthetisiert: GMP +ATP

=

GDP + ADP

Diese Nucleosidmonophosphat-Kinasen unterscheiden nicht zwischen Riboseund Desoxyribose enthaltenden Substraten. Nuleosiddiphosphate werden durch Nucleosiddiphosphat-Kinasen in die jeweiligen Nucleosidtriphosphate überführt, z. B.: GDP + ATP

=

GIP + ADP

Ribose-5-phosphat

Obwohl bei dieser Reaktion ATP als Phosphoryldonor und GDP als Akzeptor angegeben sind, ist die Nucleosiddiphosphat-Kinase unspezifisch hinsichtlich der Basen ihrer Substrate oder bezüglich Ribose oder Desoxyribose. Aus den fast Inhibition „»*" identischen Strukturen der Substrate und Produkte kann man schließen, dass diese Reaktionen normalerweise nahe am Gleichgewicht (AG = 0) ablaufen. ADP wird durch eine Vielzahl energiefreisetzender Reaktionen (Glykolyse, oxidative Phosphorylierung) zu ATP regeneriert und letztlich werden dadurch die ; obigen Kinasereaktionen getrieben.

C.

- “- . nn PRPP --.

on . 5 inyl s r L Aktivierung "x,

+-a

sn

xs

"-..

5-Phosphoribosylamin

%

.s

Regulation der Biosynthese von Purinnucleotiden

Die Synthesewege, die zu IMP, ATP und GTP führen, werden in den meisten Zellen individuell reguliert, um zum einen die Gesamtmenge der produzierten Purinnucleotide zu kontrollieren und zum anderen die relativen Mengen an ATP und GTP zu steuern. Dieses regulatorische Netzwerk ist in Abbildung 23.4 dargestellt. Die Regulation des IMP-Wegs greift an den ersten beiden Reaktionen ein. Diese katalysieren die Synthese von PRPP bzw. 5-Phosphoribosylamin. Ribosephosphat-Pyrophosphokinase, das Enzym für die Reaktion 1 des IMP-Wegs (Abb. 23.1), wird durch ADP und GDP gehemmt. Amidophosphoribosyltransferase, die den ersten ausschließlich der IMP-Bildung dienenden Schritt des Wegs katalysiert (Reaktion 2), unterliegt ebenso einer Rückkopplungshemmung. In diesem Fall bindet das Enzym jedoch ATP, ADP und AMP an einer Inhibitorbindungsstelle und GTP, GDP und GMP an einer anderen. Die Geschwindigkeit der IMP-Produktion wird folglich unabhängig, aber synergetisch durch die Konzen-

Abb. 23.4 Regulation der Purinbiosynthese. Rote Achtecke und grüne Punkte zeigen die Regulationsstellen. Eine Rückkopplungshemmung ist durch gestrichelte rote Pfeile, eine Vorwärts-

aktivierung durch gestrichelte grüne Pfeile

dargestellt. 6%, siehe Animated Figures.

892

Nucleotidmetabolismus

tration der Adenosin- und Guanosinnucleotide reguliert. Außerdem wird Amidophosphoribosyltransferase allosterisch durch PRPP stimuliert (Vorwärts-Aktivierung).

Eine zweite Regulationsstelle liegt unmittelbar hinter dem Verzweigungspunkt von IMP zu AMP oder GMP. AMP und GMP wirken als kompetitive Inhibitoren von IMP auf ihrem jeweiligen Syntheseweg. Somit wird eine Überschussproduktion dieser Verbindungen verhindert. Zusätzlich werden die Syntheseraten der Adenosin- und Guanosinnucleotide koordiniert. Zur Erinnerung: GTP treibt die Synthese von AMP aus IMP, während ATP diejenige von GMP aus IMP treibt (Abb. 23.3). Diese wechselseitige Aktivierung dient zum Ausbalancieren der Produktion von AMP und GMP (die bei der Nucleinsäurebiosynthese in ungefähr gleichen Mengen benötigt werden). Die Geschwindigkeit der GMP-Synthese steigt mit [ATP], die der AMP-Synthese mit [GTP!].

D.

Rückgewinnung von Purinen

In den meisten Zellen wird beim Umsatz von Nucleinsäuren (besonders von einigen RNA-Spezies) Adenin, Guanin und Hypoxanthin freigesetzt (Abschnitt 23.4A). Diese freien Purine werden über Rückgewinnungswege (engl.: salvage pathways) wieder zu den entsprechenden Nucleotiden umgesetzt. Im Gegensatz zu den Reaktionen der de novo-Synthese von Purinnucleotiden, die praktisch in allen Zellen identisch abläuft, unterscheiden sich die Recycling-Wege hinsichtlich der Mechanismen und des Vorkommens von Organismus zu Organismus. In Säugern werden Purine zum größten Teil durch zwei Enzyme wiederverwertet: Adenin-Phosphoribosyltransferase (APRT) vermittelt die AMP-Bildung durch die Übertragung von Adenin auf PRPP unter Freisetzung von PP; Adenin + PRPP

=

AMP

+ PP;

Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase loge Reaktion für Hypoxanthin und Guanin: Hypoxanthin

+ PRPP

Guanin + PRPP

=

= GMP

(HGPRT)

katalysiert die ana-

IMP + PP; + PP;

Lesch-Nyhan-Syndrom ist die Folge eines HGPRT-Mangels Die Symptome eines Lesch-Nyhan-Syndroms, das durch einen schweren HGPRT-Mangel verursacht wird, machen deutlich, dass die Purin-RecyclingReaktionen nicht nur dazu dienen, um die bei der de novo-Biosynthese von Purinen benötigte Energie einzusparen. Dieser X-chromosomal rezessiv vererbte De-

fekt (er betrifft fast nur Männer) führt zu überschüssiger Harnsäureproduktion (Harnsäure ist ein Produkt des Purinabbaus; Abschnitt 23.4A) und neurologischen Abnormalitäten, wie Spastik, Retardierung sowie stark aggressivem und destruktivem Verhalten, einschließlich einer bizarren Zwangsneurose bis hin zur Selbstverstümmelung. So haben viele Kinder, die unter dem Lesch-NyhanSyndrom leiden, einen so starken Drang, sich in die Lippen und die Finger zu beißen, dass sie angebunden werden müssen. Wenn man diese Maßnahmen einstellt, werden kommunikative Patienten darum bitten, dass sie wieder ange-

wandt werden, obwohl sie gleichzeitig versuchen, sich zu verletzen. Die übermäßige Harnsäureproduktion bei Patienten mit einem Lesch-NyhanSyndrom ist leicht zu erklären. Sie kommt durch das Fehlen der HGPRT-Aktivität zustande, was zu einer Anhäufung von PRPP führt. Dieses wird normalerweise bei der Wiederverwertung von Hypoxanthin und Guanin eingesetzt. Das überschüssige PRPP aktiviert Amidophosphoribosyltransferase (welche die Reaktion 2 des IMP-Biosynthesewegs katalysiert) und beschleunigt dadurch stark die Synthese von Purinnucleotiden und letztendlich auch die Bildung

Synthese von Pyrimidinribonucleotiden

von deren Abbauprodukt, der Harnsäure. Bislang sind die physiologischen Ursachen der einhergehenden neurologischen Abnormalitäten ungeklärt. Der Defekt eines einzigen Enzyms kann somit tiefgreifende aber sehr klar definierte Verhaltensänderungen verursachen.

2

Synthese von Pyrimidinribonucleotiden

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Listen Sie alle Ausgangsmaterialien und Cofaktoren auf,

die für die IMP-Biosynthese benötigt werden.

Die Biosynthese von Pyrimidinen ist weniger komplex als die von Purinen. Isotopenexperimente haben gezeigt, dass die Atome N1, C4, C5 und C6 des Pyrimidinrings alle aus Asparaginsäure stammen und dass C2 von HCO5 und N3 von Glutamin geliefert werden.

Beschreiben Sie die Reaktionen, die IMP in ATP und GTP umwandeln. Wie hemmen Guanin- und

i Amidgruppe aus

Adeninnucleotide ihre eigene Synthese?

Glutamin

C ra

N;

HCOz —

A.

;5C +

Aspartat

Me

Synthese von UMP

UMP, das auch eine Vorstufe von CMP ist, wird über einen sechsstufigen Reaktionsweg synthetisiert (Abb. 23.5). Im Gegensatz zur Purinnucleotidsynthese wird der Pyrimidinring nach der Ringsynthese an die Ribose-5-phosphateinheit geknüpft. 1. Synthese von Carbamoylphosphat Die erste Reaktion der Pyrimidinbiosynthese ist die Synthese von Carbamoylphosphat aus HCO; und dem Amidstickstoff von Glutamin durch das Enzym Carbamolyphosphat-Synthetase II im Cytosol. Diese Reaktion läuft unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP ab: eines liefert die Phosphatgruppe und das andere die Energie. Carbamoylphosphat wird aber auch über den Harnstoffcyclus synthetisiert (Abschnitt 21.3A). In dieser Reaktion, die durch die mitochondriale Carbamoylphosphat-Synthetase I katalysiert wird, ist Ammoniak die Stickstoffquelle. 2. Synthese von Carbamoylaspartat Die Kondensation von Carbamoylphosphat mit Aspartat zu Carbamoylaspartat wird durch Aspartat-Transcarbamoylase (ATCase) katalysiert. Diese Reaktion läuft ohne ATP-Hydrolyse ab, da Carbamoylphosphat schon ausreichend aktiviert ist. Die Struktur und die Regulation von E. coli-ATCase werden in Abschnitt 12.3 diskutiert. 3. Ringschluss zu Dihydroorotat Der dritte Reaktionsschritt ist eine durch Dihydroorotase katalysierte, intramolekulare Kondensation und liefert Dihydroorotat. 4. Oxidation von Dihydroorotat Dihydroorotat wird durch Dihydroorotat-Dehydrogenase irreversibel zu Orotat oxidiert. Das eukaryotische Enzym, das FMN und nicht hämgebundenes Fe enthält, ist auf der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmem-

bran lokalisiert. Die Chinoneinheiten im Enzym liefern das notwendige Oxidationspotential. Die anderen fünf Enzyme der Pyrimidinnucleotidbiosynthese liegen in tierischen Zellen im Cytosol vor. Hemmung der Dihydroorotat-Dehydrogenase blockiert die Pyrimidin-Synthese in T-Lymphocyten und mildert dadurch die Autoiimmunkrankheit rheumatoide Arthritis. 5. Verknüpfung mit dem Ribosephosphatrest Orotat reagiert mit PRPP, katalysiert durch die Orotat-Phosphoribosyltransferase, zu Orotidin-5’-monophosphat (OMP). Diese Reaktion wird durch die Hydrolyse des freigesetzten PP; getrieben und fixiert die anomere Form des Pyrimidinnucleotids in der ß-Konfiguration. Orotat-Phosphoribosyltrans-

Beschreiben Sie, wie freie Purine zurück in Nucleotide

umgewandelt werden.

893

894

Nucleotidmetabolismus

+ Glutamin

HCO,

2ATP +

1

+ H3O

VOL

1 |Carbamoylphosphat-

en

2 ADP + Glutamat + B

Te &

AI C

II

coo-

07 "n

NH,

H Orotat

Ze s

s

0

Carbamoylphosphat Aspartat Aspartat2 |Transcarbamoylase

Orotat-

PRPP PP;

5) er Phosphoribosylo |

(ATCase)

P;

C

|

ON

NH; Rn

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N

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DOES

3 Dihydroorotase

,c0

“0: 0 PCH, 9 H HAB H

Carbamoylaspartat 0

C

C

HO—C

RO

H

Orotidin-5’-monophosphat (OMP)

€0, o OMP-Decarboxylase

|

OÖ

N HN“ n00H

HN cHs GLo_ r IR es N N O

N

Dihydroorotat Ron

reduziertes Quinon

a:

Dihydroorotat-

N

\

Dehydrogenase

an

Uridinmonophosphat (UMP) Abb. 23.5 De novo-Synthese von UMP. Die Röntgenstrukturen der sechs Enzyme, die die

Reaktionen katalysieren, sind wie in der Legende zu

ferase ist auch an der Rückgewinnung anderer Pyrimidinbasen, wie Uracil

Abb. 23.1 beschrieben gezeigt. [PDBids:

und Cytosin, beteiligt, indem sie diese in die entsprechenden Nucleotide um-

Enzym 1: 1BXR; Enzym 2: 5AT]1; Enzym 3: 1)79; Enzym 4: 1D3H; Enzym 5: 1OPR; Enzym 6: IDBT]

02 ee umazalieues

6:

wandelt. Decarboxylierung unter UMP-Bildung

Die letzte Reaktion des Stoffwechselwegs ist die Decarboxylierung von OMP

durch die OMP-Decarboxylase unter Bildung von UMP. ODCase steigert die Geschwindigkeit (k../Ky) um einen Faktor von 2 X 10° im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion. Dies ist die höchste katalytische Effizienz, die jemals bei einem Enyzm beobachtet wurde. Überraschenderweise kommt das Enzym ohne jegliche Cofaktoren aus, die geeignet wären, das mutmaßliche Carbanion-Intermediat zu stabilisieren. Obwohl der Mechanismus der ODCase-Reaktion nicht vollständig aufgeklärt ist, ist bekannt, dass die Entfernung der Phosphatgruppe des OMP, die in deutlichem Abstand zur C6-Carboxylgruppe liegt, die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor von 7 X 10 verringert. Dies ist ein gutes Beispiel dafür, wie die bevorzugte Bindung des Übergangszustands eine katalytische Aktivität erzeugt.

Synthese von Pyrimidinribonucleotiden In Bakterien kommen die sechs Enzyme der UMP-Biosynthese als unabhängige Proteine vor. Bei Tieren konnte Mary Ellen Jones zeigen, dass sich die ersten drei Enzymaktivitäten des Wegs — Carbamoylphosphat-Synthetase II, ATCase und Dihydroorotase — auf einer einzigen Polypeptidkette von 210 kD befinden. Die Pyrimidin-Biosynthese ist auch das Ziel einiger antiparasitärer Arzneimittel. Der Parasit Toxoplasma gondii z.B. (Abb. 23.6), der die meisten Säugetiere infiziert, verursacht Toxoplasmose, eine Krankheit, die zu Erblindung, neurologischen Funktionsstörungen und bei immunschwachen Personen (z.B. solche mit AIDS) auch zum Tod führen kann. Die meisten Parasiten decken ihren Nährstoffbedarf vollständig über den Stoffwechsel ihres Wirts. T. gondii hingegen ist nicht in der Lage, seinen Nucleotidbedarf allein über die Rückgewinnungswege zu decken und hat deshalb die Fähigkeit beibehalten, de novo Uracil zu synthetisieren. Arzneimittel, die die parasitäre Carbamoylphosphat-Synthetase II (ein Enzym, dessen Struktur und Kinetik sich von der des entsprechenden Gegenstücks im Säuger unterscheidet) als Ziel haben, können daher das Wachstum von T. gondii verhindern. Darüber hinaus gibt es Anhaltspunkte, dass genetisch veränderte T. gondii-Stämme, denen die Carbamoylphosphat-Synthetase II fehlt, nicht virulent sind. Solche Stämme können als Impfstoffe bei Menschen und Tieren nützlich sein.

B.

895

Abb. 23.6 Toxoplasma gondii. Dieser intrazelluläre Parasit (gelb) verursacht Toxoplasmose [© Dennis Kunkel/Phototake.]

Synthese von UTP und CTP

Die Synthese von UTP aus UMP verläuft analog der Synthese der Purinnucleosidtriphosphate (Abschnitt 23.1B). Sie erfolgt durch die aufeinander folgende Katalyse von Nucleosidmonophosphat-Kinase und Nucleosiddiphosphat-Kinase: UMP

+ ATP

UDP + ATP

—n — —— —

UDP + ADP UIP + ADP

CTIP wird durch die Aminierung von UTP durch CTP-Synthetase gebildet (Abb. 23.7). Bei Tieren stammt die Aminogruppe vom Glutamin, bei Bakterien direkt vom Ammoniak.

C.

Regulation der Biosynthese von Pyrimidinnucleotiden

In Bakterien wird die Pyrimidinbiosynthese in erster Linie an Reaktion 2, der ATCase-Reaktion (Abb. 23.8a), reguliert. In E. coli erfolgt die Regulation über eine allosterische Stimulation der ATCase durch ATP und deren Inhibition durch CTP (Abschnitt 12.3). In vielen Bakterien ist jedoch UTP der wichtigste Inhibitor der ATCase. Bei Tieren ist die ATCase kein reguliertes Enzym. Statt dessen wird hier die Pyrimidinbiosynthese über die Aktivität der Carbamoylphosphat-Synthetase II reguliert, die durch UDP und UTP gehemmt sowie durch ATP und PRPP akti-

N

a

Glutamin +ATP+H,0

a RT

Synthese von CTP aus UTP.

Glutamat +ADP+P,

ee

CTP-Synthetase

UTP

Abb, 23.7

70—P=0-P | a

ie

oO—HC H

CTP

0 HH OH OH

H

896

Nucleotidmetabolismus

Abb. 23.8 Regulation der Pyrimidinbiosynthese. Hier ist das Kontrollnetzwerk für (a) E. coli und (b) Tiere gezeigt. Rote Achtecke und grüne Punkte kennzeichnen die Regulationsstellen. Rückkopplungshemmung ist durch gestrichelte rote Pfeile, Aktivierung durch gestrichelte grüne Pfeile dargestellt. 6% siehe Animated Figures.

(a)

HCOz + Glutamin + ATP

HCO3z + Glutamin + ATP

re ee

Carbamoylphosphat

H7

$

©"

|

A ®

Se eu

Dihydroorotat

el

1

ı Carbamoylphosphat

Be =

PRPP

1. Vergleichen Sie die Stoffwechselwege von Purin- und Pyrimidinnucleotidsynthese unter Beachtung (a) der Vorläufermoleküle, (b) des Energieverbrauchs, (c) des Einbaus des Riboseteils und (d) der Anzahl der enzymatischen Schritte. 2. Wie erhält man CTP und UTP aus UMP? 3. Worin unterscheidet sich die Regulierung der Pyrimidinsynthese bei Bakterien und Tieren?

|

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1

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1

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\,

5

Ei

H

NH

H:;0

(Blues

or

f

Abb. 23.18

Zusammenfassung des

Nucleotidstoffwechsels. Nucleotide werden aus Aminosäuren und Ribose-5Phosphat synthetisiert, indem die Base auf dem

Zuckergerüst aufgebaut wird (Purinsynthese) oder

der Zucker der Base nachträglich angefügt wird (Pyrimidinsynthese). Beim Abbau der Nucleotide

entsteht ein Derivat der Base, der Zucker wird als Ribose-1-Phosphat freigesetzt. (0) N

IE >

N

Y

\

HN

I

NN

Rib— GMP

XMP H,0

H,0

Nucleotidase

Nucleotidase

P;

P;

P;

>

N

Rib—(P)

Nucleotidase

P;

NS

|Harnsäure | |Ribose-1-phospat | [Malonyl-CoA]

ON

H,0 Nucleotidase

|Pyrimidinnucleotide |

DNS

2

IMP

H,0

Be —_ [Siyein |

[|_Purinnucleotide |

Rib—(P)

k

AMP

a

O H>

>> ©: N >

F

[Giatamin |—_\

U

Biochemische Überlegungen liefern eine plausible Erklärung für die Ätiologie

AMPDesaminase

Pu

|

(Lehre von den Krankheitsursachen) von SCID. In Abwesenheit von aktiver ADA entstehen durch die andauernde Phosphorylierung von Desoxyadenosin dATP-Konzentrationen, die um das 50-fache höher sind als normal. Diese hohe dATP-Konzentration hemmt die Ribonucleotid-Reduktase (Abschnitt 23.3A), verhindert dadurch die Synthese von anderen dNTPs und blockiert so die gesamte DNA-Synthese und somit auch die Zellproliferation. Die gewebespezifische Wirkung von ADA-Mangel auf das Immunsystem kann dadurch erklärt werden, dass Lymphgewebe in Bezug auf Desoxyadenosinphosphorylierung besonders aktiv ist. ADA-Mangel war eine der ersten genetischen Krankheiten, die mit Gentherapie erfolgreich behandelt werden konnten. NH3

AdenosinAdenosin

+ a

Hi Nur Ribose-1-P

PurinnucleosidPhosphorylase (PNP)

P. i BosePp. Ribose

PurinnucleosidPhosphorylase (PNP)

Xanthin-

Hypoxanthin

Guanosin

Xanthosin

Inosin

——

5

=

0,+H,0

i pr

Xanthin

H50;

XanthinOxidase

H303 (6)

m Abb. 23.19 Hauptwege des Purinkatabolismus in Tieren. Die verschiedenen Purinnucleotide werden letztendlich alle zu Harnsäure abgebaut.

H

l N

EN |

A

o

N

I: Harnsäure

P. ; Riboset-P

GuaninD ä a

NH;

05+H,0

907

0 N

H,O

PurinnucleosidPhosphorylase (PNP)

Guanin

908

Nucleotidmetabolismus

H,O

AMP-

NH}

Desaminase

Aspartat

an (NS Adenylosuccinat-

Adenylosuccinat-

Lyase

Synthetase

GDP+P; Netto: H,O + Aspartat Abb. 23.20

+ GTP —

NH} + GDP + P; + Fumarat

Bändermodell der Adenosin-

Abb. 23.21

Desaminase der Maus. Die Blickrichtung liegt entlang der Achse des a/ß-Fasses, die N-terminalen Enden der ß-Faltblätter zeigen nach oben. Das Übergangszustandsanalogon 6-Hydroxyl-1,6-dihydropurinribonucleotid. (HDPR) ist als Skelett gezeigt,

Der Purinnucleotidcyclus.

Dieser Stoffwechselweg dient im Muskel dazu, den Citratcyclus zu initiieren, indem er Fumarat liefert.

Der Purinnucleotidcyclus

Die Desaminierung von AMP zu IMP führt in Kombination mit der Synthese von AMP aus IMP (Abb. 23.3, links) zur Desaminierung von Aspartat zu Fumarat (Abb. 23.21). John Lowenstein zeigte, dass dieser Purinnucleotidcyclus eine wichtige Rolle im Stoffwechsel des Skelettmuskels spielt. Eine gesteigerte Muskelaktivität erfordert eine Zunahme der Aktivität des Citratcyclus. Gewöhnlich geschieht dies durch vermehrte Produktion von Intermediaten des Citratcyclus (Abschnitt 17.5B). Den Muskeln fehlen aber die meisten der Enzyme, die in anderen Geweben diese anaplerotischen (auffüllenden) Reaktionen katalysieren. Der Muskel ergänzt seine Vorräte an Zwischenprodukten des Citratcyclus stattdessen durch die Produktion von Fumarat im Purinnucleotidcyclus. Auf die Bedeutung des Purinnucleotidcyclus für den Muskelstoffwechsel weist die Beobachtung hin, dass die Aktivitäten der drei beteiligten Enzyme im Muskel um ein Mehrfaches höher sind als in anderen Geweben. Tatsächlich ermüden Individuen mit einem ererbten Mangel an Muskel-AMP-Desaminase (Myoadenylat-Desaminase-Mangel) schnell und leiden nach Anstrengungen unter Krämpfen.

dessen C-, N- und O-Atome grün, blau und rot

dargestellt sind. Das enzymgebundene Zn’*-Ion, das von der 6-Hydroxylgruppe des HDPR koordiniert wird, ist als silberne Kugel dargestellt. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Florante Quiocho, Baylor College of Medicine. PDBid 1ADA] 6% siehe Interactive Exercises.

Xanthin-Oxidase ist ein Mini-Elektronentransportprotein Xanthin-Oxidase (XO) wandelt Hypoxanthin in Xanthin (die Base von IMP) und dieses in Harnsäure (Abb. 23.19, unten) um. Das Reaktionsprodukt ist ein Enol (es besitzt einen pK-Wert von 5,4; daher der Name Harnsäure). Die Enolform tautomerisiert zur stabileren Ketoform.

WD-10(6)

=

Hypoxanthin

Ki

Xanthin

(0)

a

meer

(6)

Rz

Harnsäure (Enol-Tautomer)

Ir“

HN

N

Nyunpnutsinl +H en | ‘Ci

IR HZ

a,

H

|

|

“

Harnsäure (Keto-Tautomer)

Nucleotidabbau

Bei Säugetieren kommt dieses Enzym fast ausschließlich in der Leber und der Dünndarmmucosa vor. Das dimere Protein besitzt identische Untereinheiten von jeweils 130 kD, die beide ein ganzes Arsenal von Elektronenüberträgern enthalten: ein FAD-Molekül, einen Molybdänkomplex, der zwischen den Oxidationsstufen Mo(VI) und Mo(IV) pendelt und zwei verschiedene Fe-S-Cluster. Letztlich ist O, der Elektronenakzeptor, es entsteht H,O,, ein potentiell schädliches Oxidationsmittel (Abschnitt 18.4B), das anschließend von Katalase in H,O und O, umgewandelt wird.

Ausgeschieden von

OÖ \ N

HN

909

|

Primat rimaten )=0

as {0) N

N

H

H

Vögeln

Reptilien Insekten

Harnsäure

2H;0 + 0, Urat-Oxidase

CO, + H,O,

B.

Stoffwechsel der Harnsäure

Bei Menschen und anderen Primaten ist Harnsäure das Endprodukt des Purinabbaus und wird mit dem Urin ausgeschieden. Dasselbe gilt für Vögel, landlebende Reptilien und all diejenigen Insekten und Organismen, die keinen Harnstoff ausscheiden. Sie bauen ihren überschüssigen Stickstoff aus dem Aminosäurestoffwechsel über die Purinbiosynthese in Harnsäure ein. Dieses komplizierte System der Stickstoffexkretion hat eine wichtige Funktion: Es spart Wasser. Harnsäure ist in Wasser nur wenig löslich, so dass sie praktisch kristallin mit sehr geringem Wassergehalt ausgeschieden wird. Die entsprechende Menge des viel besser wasserlöslichen Harnstoffs benötigt dagegen osmotisch eine beträchtliche Wassermenge zur Ausscheidung. In allen anderen Organismen wird Harnsäure vor der Ausscheidung weiter umgesetzt (Abb. 23.22). Säugetiere, die nicht zu den Primaten zählen, oxidieren sie — katalysiert von dem Cu-haltigen Enzym Urat-Oxidase — zu Allantoin, welches ausgeschieden wird. Ein weiteres Abbauprodukt, Allantoinsäure, wird von Knochenfischen ausgeschieden. Knorpelfische und Amphibien bauen Allantoinsäure vor der Exkretion weiter zu Harnstoff ab, marine Wirbellose bauen Harnstoff schließlich zu NH ab. Gicht wird durch Harnsäureüberschuss verursacht Gicht ist eine Erkrankung, die sich durch erhöhte Harnsäurespiegel in den Körperflüssigkeiten auszeichnet. Ihr häufigstes Symptom ist eine entzündliche Arthrose, die von einem plötzlichen starken Schmerz im betroffenen Gelenk (oft der große Zeh) begleitet ist (Abb. 23.23). Ausgelöst wird diese durch die Ablagerung unlöslicher Natriumuratkristalle. Natriumurat oder Harnsäure können sich darüber hinaus in Nieren und Harnleitern als Steine ablagern, was zu Nierenschäden und Störungen im Harntrakt führt. Gicht tritt bei ca. 3 von 1000 Personen auf, hauptsächlich bei Männern, und wurde bisher als Begleiterscheinung von übermäßigem Essen und Trinken angesehen, was nur bedingt richtig ist. Ein möglicher Grund für diesen Irrglauben ist, dass in früheren Jahrhunderten, als Wein oft während der Herstellung und Lagerung mit Blei kontaminiert wurde, ein hoher Weinkonsum zu einer chronischen Bleivergiftung führte, die unter anderem die Fähigkeit der Nieren vermindert, Harnsäure auszuscheiden. Wie man heute weiß, ist die häufigste Ursache von Gicht eine unzureichende Harnsäureexkretion,

normalerweise aus anderen Gründen als einer Bleivergif-

tung. Sie kann vielmehr das Ergebnis zahlreicher anderer Stoffwechseldefekte sein, von denen die meisten noch nicht gut charakterisiert sind. Eine gut ver-

standene Ursache ist HGPRT-Mangel (schwere Fälle des Lesch-Nyhan-Syndroms), der durch PRPP-Anhäufung zu einer überschüssigen Harnsäureproduktion führt (Abschnitt 23.1D). Gicht kann mit dem Inhibitor für die Xanthin-Oxidase, Allopurinol, behandelt werden. Bei diesem Molekül handelt es sich um ein Hypoxanthinanalogon, bei dem die Positionen N7 und C8 gegeneinander vertauscht sind.

H

(0)

bl ar

—_

Senn H

Anderen Säugern

H

Allantoin

no = Allantoinase H,N

COOH

Je

(e)

NH,

un

NH

N

H

H

Knochenfischen

(9)

Allantoinsäure

H,0 Allantoicase

ne CHO Glyoxylsäure

l

Sulz

2

SEN

Knorpelfischen

a

Harnstoff

2H,0 Urease

2C0, 4 NH}

Be Meerestieren

Abb. 23.22 Abbau der Harnsäure zu Ammoniak. Dieser Prozess wird je nach gegebener Spezies auf unterschiedlichen Stufen angehalten und die jeweilige Stickstoffverbindung ausgeschieden.

910

Nucleotidmetabolismus oO HN

|

N N

Allopurinol

N > N H

Hypoxanthin

Xanthin-Oxidase hydroxyliert Allopurinol auf die gleiche Weise wie Hypoxanthin, wodurch Alloxanthin entsteht, O

Abb. 23.23 Eine Karikatur der Gicht von James Gilroy (1799). [Mit freundlicher Genehmigung der Yale University Medical Historical Library.]

HN O

en

N N H

|

/

r

Alloxanthin

welches fest an die reduzierte Form des Enzyms gebunden bleibt und dieses somit inaktiviert. Allopurinol mildert die Symptome der Gicht, indem es die Geschwindigkeit der Harnsäureproduktion senkt und gleichzeitig die Spiegel der löslicheren Verbindungen Hypoxanthin und Xanthin erhöht. Während Allopurinol die Gichtsymptome beim Lesch-Nyhan-Syndrom günstig beeinflusst, hat es keinen Einfluss auf dessen neurologische Symptome. Allopurinol und mehrere andere wichtige Purinderivate wurden von der Chemikerin Gertrude Elion entwickelt (Abschnitt 23.2).

C.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Welche Verbindungen entstehen beim Abbau von Purinen und

Pyrimidinen? 2. Beschreiben Sie, was der Purinabbau mit SCID,

der Muskelfunktion und Gicht zu tun hat.

Katabolismus der Pyrimidine

Tierische Zellen zerlegen Pyrimidinnucleotide in ihre Basenbestandteile (Abb. 23.24, oben). Diese Reaktionen verlaufen, wie bei den Purinnucleotiden, über Dephosphorylierung, Desaminierung und die Spaltung glykosidischer Bindungen. Das entstehende Uracil und Thymin unterliegt in der Leber einer Reduktion (Abb. 23.24, Mitte) und nicht einer Oxidation wie im Purinkatabolismus. Die Endprodukte des Pyrimidinkatabolismus, ß-Alanin und ß-Aminoisobutyrat, sind Aminosäuren und werden als solche metabolisiert. Sie werden über Transaminierungs- und Aktivierungsreaktionen in Malonyl-CoA und MethylmalonylCoA (Abb. 23.24, unten links) umgewandelt. Malonyl-CoA ist eine Vorstufe der Fettsäuresynthese (Abb. 20.26). Methylmalonyl-CoA wird zu Succinyl-CoA (Abb. 20.16), einem Zwischenprodukt des Citratcyclus, weiterverarbeitet. Damit trägt der Katabolismus der Pyrimidinnucleotide zu einem geringen Teil zum Energiestoffwechsel der Zelle bei.

Nucleotidabbau NH,

ne

OÖ

SEN,

|

nZ

911

| (CH;)

un

|

Rib—(P)

(d)Rib—(P)

CMP

UMP (dTMP) H,0

H5;0 Nucleotidase P;

Nucleotidase R

P;

Cytidin-

Grad

een

din Desozythymidin) H\

5

H,0

NH;

i

Ib

N

Pr

Uridin-

NY

oO

Dehyd a er

NADPH+

H

E

N

ur

H

Dihydrouracil-

Uracil (Thymin)

CH

\ Rn

phosphorylase

(d)Ribose-1-P

werası,

ee

NADP

+

H

Dihydrouracil (Dihydrothymin)

1:68)

ge Hydratase

Be

00C | _(CH;)

a

(0)

coo |

|

CH—-(CH; ) | 5

Q

H>N

a,

&

CH=O

(CH3)

x

MN H

Malonsäuresemialdehyd (Methyimalonsäuresemialdehyd)

Aminotransferase

ß-Alanin (ß-Aminoisobutyrat)

NH] + CO,

Glutamat

CoA + NAD’

ß-Ureidopropionase

ß -Ureidopropionat (ß -Ureidoisobutyrat)

H;0

a. -Ketoglutarat

NADH + H* OR ie — (CH;)

WE

S—-CoA Malonyl-CoA (Methylmalonyl-CoA)

Abb. 23.24 Hauptwege des Pyrimidinkatabolismus in Tieren. Die Aminosäureprodukte dieser Reaktion werden

in andere UMP und abgebaut. Klammern

Stoffwechselprozesse eingeschleust. dTMP werden von denselben Enzymen Der Abbauweg von dTMP ist in angegeben.

912

Nucleotidmetabolismus

Eine verwandte Verbindung, Azathioprin, wird intrazellulär zu 6-Mercaptopurin umgewandelt. Es stellte sich heraus, dass es zwar nicht als Anti-

SH

“s

N

N

krebsmittel,

H

Gertrude Elion (1913-1999)

Gertrude Elion traf ihre Berufswahl bereits als Fünfzehnjährige, während sie die High School in New York absolvierte. Als sie sah, wie ihr Großvater an Magenkrebs erkrankte

und starb, beschloss sie, Therapeutika gegen Krebserkrankungen zu suchen. Im darauffolgenden Herbst schrieb sie sich am Hunter College ein und begann mit dem Chemiestudium. Da sie zunächst kein Stipendium für den MasterAbschluss

erhielt, arbeitete

sie die nächsten

als Lehrerin und Laborassistentin. Schließlich 1941 einen Master-of-Science-Abschluss. Nachdem

dafür aber als Hemm-

stoff von Immunreaktionen wirksam 6-Mercaptopurin ist. Dieser Wirkstoff trug dazu bei, das Problem der Abstoßung von Organen nach Transplantationen zu lösen und wurde bei der ersten erfolgreichen Nierentransplantation im Jahre 1961 eingesetzt.

beiden

Jahre

erhielt sie

ee H;C a

N

Ya

NO, H

Br

u. Azathioprin

Untersuchungen, die das Ziel hatten, die Wirksamkeit der Purinderivate zu verbessern - indem sie deren Abbau durch die Xanthin-Oxidase verhinder-

ten — führten zur Entdeckung von Allopurinol (Abschnitt 23.4B). Dieser Stoff wird immer

noch zur Behand-

lung von Gicht und gegen einige parasitäre Krankheiten eingesetzt. Elion war auch an der Entwicklung

sie festgestelit hatte, wie eintönig die Arbeit als

des antibakteriellen Mittels Trimetho-

Industriechemikerin war, wechselte sie auf eine Stelle bei George Hitchings in der Pharmafirma Burroughs Wellcome. Dort fand sie eine intellektuell anregende Umgebung vor, in

prim (Exkurs 23.1) und des weit ver-

der sie ihre Kenntnisse der Chemie, Pharmakologie, Immuno-

logie und auf anderen Gebieten vertiefen konnte. Obwohl sie später zahlreiche Ehrendiplome erhielt, hat Elion niemals formal promoviert. Nachdem sie über mehrere Jahre Abendkurse besucht hatte, musste sie sich schließlich zwischen ihrer Arbeit bei Hitchings, die ihr sehr viel bedeutete,

und

einem Vollzeitstudium entscheiden. Zum Glück für die Wissenschaft blieb Elion ihrer Arbeit treu und brachte die Entwicklung von Medikamenten zur Krebs- und Gichttherapie, für Organtransplantationen und gegen Infektionskrankheiten bedeutend voran. Hitchings bat Elion, den Purinstoffwechsel zu untersuchen.

Er hatte die Idee, die Fähigkeit einer Zelle zur DNA-Synthese dadurch zu unterbinden, dass man ihre Nucleotidversorgung inhibierte. Im DNA-Synthese

Idealfall würden Verbindungen, welche die blockieren, schnell wachsende Krebszellen,

Bakterien und Viren ausschalten, normale Zellen jedoch nicht beeinträchtigen. Ohne die Struktur der relevanten Enzyme oder gar der DNA zu kennen, verwendeten Elion und ihre Kollegen einen einfachen Bakterienwachstumstest, um die Wirksamkeit verschiedener

Purinderivate als „Antimeta-

bolite“ zu untersuchen. Elions erster klinischer Erfolg war 6-Mercaptopurin, das man zur Leukämietherapie bei Kindern verwendete. Viele Patienten zeigten zunächst eine deutliche Besserung, erlitten aber zu Elions Bedauern meist einen Rückfall und überlebten nicht. Die anfängliche Besserung überzeugte Elion jedoch davon, dass die Inhibtion des Nucleotidmetabolismus

sinnvolle therapeutische Strategie war.

eine

breiteten antiviralen Wirkstoffs Acic-

o

lovir (Zovirax) beteiligt. Nachdem Hitchings in Ruhestand gegangen war, wurde Elion 1967 Lei-

terin der Abteilung für experimentelle Therapie. Obwohl sie sich offiziell 1983 zur Ruhe setzte, trug ihr For-

schungsansatz mit der Entwicklung HO-CH3 von Azidothymidin weitere Früchte Ina (AZT; Exkurs 12.4). Dies ist ein CHs CH; Nucleosidanalogon, das bis 1991 Aciclovir das einzige wirksame Medikament zur Behandlung von AIDS war und immer noch eingesetzt wird. Elion erhielt zusammen mit Hitchings und James Black [Black entdeckte Cimitidin (Tagamet), das erste Medikament, das die Magensäuresekretion hemmt, und Propranolol (Dociton), das zur Therapie von Bluthochdruck weit verbreitet ist] im Jahre 1988 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin eine seltene Auszeichnung für eine Wissenschaftlerin aus der Pharmaindustrie. Es war ihre auf dem Verständnis des Nucleotidstoffwechsels basierende Forschung, die ihr diese Anerkennung einbrachte, und nicht nur die Fähigkeit, neue

Verbindungen zu synthetisieren.

Elion, G. B., Hitchings, G.H. und Vanderwerff, H., Antagonists of nucleic

acid derivates. VI. Purines,J. Biol. Chem. 192, 505-518 (1951).

Elion, G.B., Kovensky, A. und Hitchings, G.H., Metabolic studies of allopurinol, an inhibitor of xanthine oxidase, Biochem. Pharmacol. 15,

863-880 (1966).

Wichtige Begriffe

Zusammenfassung 1. Das Purinnucleotid IMP wird in 11 Reaktionsschritten, ausgehend von

Ribose-5-phosphat, Aspartat, Fumarat, Glutamin, Glycin und HCO; synthetisiert. Die Purinnucleotidsynthese wird auf der ersten und zweiten Stufe reguliert. IMP ist eine Vorstufe von AMP und GMP, die dann zu den entsprechenden

Di- und Triphosphaten phosphoryliert werden. Das Pyrimidinnucleotid UMP wird ausgehend von 5-Phosphoribosyl-pyrophosphat, Aspartat, Glutamin und HCO; in sechs Reaktionsschritten synthetisiert. UMP wird durch Phosphorylierung zu UTP und durch dessen Aminierung zu CTP umgewandelt. Die Pyrimidinnucleotidsynthese wird in Bakterien am ATCase-katalysierten Schritt und bei Tieren am Carbamoylphosphat-Synthetase-II-katalysierten Schritt reguliert. Desoxyribonucleosid-diphosphate werden aus den entsprechenden NDPs in einer Reaktion synthetisiert, die von Ribonucleotid-Reduktase katalysiert wird. Dieses Enzym enthält einen binuclearen Fe(III)-Komplex als prosthetische Gruppe sowie ein Tyrosylradikal und einige redoxaktive Sulfhydrylgruppen. Die Enzymaktivität wird durch Disulfidaustausch mit Thioredoxin oder Glutaredoxin wiederhergestellt. Ribonucleotid-Reduktase wird allosterisch durch Effektoren reguliert,

so dass sichergestellt ist, dass Desoxyribonucleotide nur in den für die DNASynthese benötigten Mengen synthetisiert werden. dTMP wird aus dUMP durch eine von Thymidylat-Synthase katalysierte Reaktion gebildet. Das bei dieser Reaktion entstandene Dihydrofolat wird mithilfe der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) zu Tetrahydrofolat regeneriert. Purinnucleotide werden durch Nucleosidasen und Purinnucleosid-Phosphorylase (PNP) abgebaut. Adeninnucleotide werden durch AdenosinDesaminase und AMP-Desaminase desaminiert. Die Synthese und der Abbau von AMP über den Purinnucleotidcyclus im Muskel führen zu Fumarat, einem Intermediat des Citratcyclus. Xanthin-Oxidase katalysiert die Oxidation von Hypoxanthin zu Xanthin und von Xanthin zu Harnsäure. Bei Primaten, Vögeln, Reptilien und Insekten ist Harnsäure das Endprodukt des Purinabbaus und wird ausgeschieden. Andere Organismen bauen Harnsäure vor der Exkretion noch weiter ab. 10. Pyrimidine werden zu Intermediaten des Fettsäurestoffwechsels abgebaut.

Wichtige Begriffe BRBP

Vorwärtsaktivierung Rückgewinnungsweg Selbstmord-Inhibitor Purinnucleotidcyclus

913

914

Nucleotidmetabolismus

Aufgaben

BO

8.

1. Berechnen Sie die Menge an ATP-Äquivalenten, die für die de novo Synthese von

(a) IMP, (b) AMP und

(c) CTP benötigt werden. Berücksichtigen Sie alle Substrate (z.B. Ribose-5-phosphat und Glutamin) und Cofaktoren, die dafür benötigt werden. 2. Bestimmte Glutaminanaloga inaktivieren irreversibel Enzyme, die Glutamin binden. Welche Intermediate der Nucleotidsynthese akkumulieren in Gegenwart dieser Komponenten? 3. Ratten wird Cytidin verfüttert, bei dem sowohl die Basenals auch die Ribosekomponente '""C-markiert ist. Ihre DNA wird danach isoliert und mit Nucleasen gespalten. Charakterisieren Sie das Markierungsmuster der erhaltenen Desoxycytidylatreste, falls die Desoxycytidylatproduktion in der Zelle nach einem Stoffwechselweg verläuft, bei dem (a) intaktes CDP zu dCDP reduziert wird und (b) CDP vor der Reduktion zu Cytosin und Ribose abgebaut wird. 4. Erklären Sie warum Hydroxyharnstoff,

l

nissen

lerne

een

Erklären Sie, warum Methotrexat die Synthese von Histidin und Methionin inhibiert.

9. Manchen Mikroorganismen fehlt eine DHFR-Aktivität, aber ihre Thymidylat-Synthase hat einen FAD-Cofaktor. Welche Funktion besitzt FAD? 10. Erklären Sie, ob die folgenden Inhibitoren Selbstmord-

Inhibitoren sind oder nicht: (a) Trimethoprim für bakterielle Dihydrofolat-Reduktase oder (b) Allopurinol für Xanthinoxidase. 11. Warum ruft die Von-Gierke-Glykogenspeicherkrankheit (Exkurs 16.2) Gichtsymptome hervor? 12. Bei Tieren beginnt ein Weg für die NAD*-Synthese mit Nicotinamid. Zeichnen Sie die Strukturen, die bei den gezeigten Reaktionen entstehen werden. oO

\ —

4

NH,

er

N H Nicotinamid

BEN C-NH-OH

PRPP

Hydroxylharnstoff

PP,

der Tyrosylradikale zerstört, ein geeignetes Antitumormedikament ist. 5. Warum wirkt Desoxyadenosin auf Säugerzellen toxisch? 6. Warum verlieren Patienten, die sich einer Chemotherapie mit FAUMP oder Methotrexat unterziehen, zeitweise ihre Haare? 7. Normale Zellen sterben in einem Nährmedium,

nn

nn

0

das

Thymidin und Methotrexat enthält, ab, wogegen mutierte Zellen, denen die Thymidylat-Synthase fehlt, überleben und wachsen. Erklären Sie dies.

Au PP

Nicotinamid-

phosphoribosyl-

Transferase

NAD*Pyrophosphorylase

Literatur Carreras, C. W., und Santi, D. V., The catalytic mechanism and structure of thymidylate synthase, Annu. Rev. Biochem. 64, 721-762 (1995). Finer-Moore, J.S., Santi, D. V.und Stroud, R.M., Lessons and conclusions from dissecting the mechanism of a bisubstrate enzyme: thymidylate synthase mutagenesis, function and structure, Biochemistry 42, 248-256

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Greasley, S.E., Horton, P., Ramcharan, J., Beardsley, G.P., Benkovic, S.]. und Wilson, I. A., Crystal structure of a bifunctional transformylase and cyclohydroxylase enzyme in purine biosynthesis, Nature Struct. Biol. 8,

402-406 (2001).

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Liu, S., Neidhardt, E. A., Grossman, T.H., Ocain, T. und Clardy, J., Structures of human dihydroorotate dehydrogenase in complex with antiproliferative agents, Structure 8, 25-33 (1999). Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., Valle, D., Stanburry, J. B., Wyngaarden, J.B., und Frederickson, D.S. (Hrsg.), The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (8. Aufl.), Kap. 106-114, McGrawHill (2001). [Diese Kapitel beschreiben normale und nicht konventionelle Wege des Nucleotidstoffwechsels.] Stubbe, J., Ge, J. und Yee, C. S., The evolution of ribonucleotide reduction

revisited, Trends Biochem. Sci. 26, 93-99 (2001).

DNA-Moleküle wie diese hier aus dem Bakteriophagen T2, die nach osmotischer Lyse ausgetreten sind, haben ein enormes Ausmaß. Eine Zelle muss in der Lage sein ihre DNA effizient und sicher zu verpacken. Andererseits muss die Zelle die darin codierte genetische Information jederzeit ablesen und interpretieren können. [Aus Kleinschmidt, A. K., Lang, D. Jacherts, D.

und Zahn, R.K., Biochimica et Biophysica Acta 61, 861 (1962), Elsevier.]

Struktur von Nucleinsäuren Elektronisches Zusatzmaterial

Struktur von Nucleinsäuren

e Die DNA-Helix

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 21 Guided Exploration 22 Guided Exploration 23

® Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren ® Fraktionierung von Nucleinsäuren ® DNA-Protein-Wechselwirkungen

Guided Exploration 24

e Eukaryotische Chromosomenstruktur

Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive

Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise

36 37 38 39 40 4] 42 43 44 45

Animated Figure 24-19 Animated Figure 24-20 Kinemage 17-1, 17-4, 17-5, 17-6

Kinemage Kinemage Kinemage Kinemage Kinemage Kinemage

17-2 17-3 13-1 13-2 19 20 Case Study 31

Die Nucleinsäure stellt in jedem Organismus die Quelle aller biologischer Information dar. Die DNA (bei manchen Viren die RNA) bestimmt durch ihre genetische Information weitgehend Form und Aktivität der einzelnen Zellen. Nach dem zentralen Dogma der Molekularbiologie (Abschnitt 3.3B) codiert die Basensequenz der Nucleinsäuren die Aminosäuresequenz eines Proteins. Viele zelluläre Proteine sind Enzyme, welche die metabolischen Prozesse ausführen, die wir in den Kapiteln 15 bis 23 kennengelernt haben. Andere Proteine wiederum haben strukturelle oder regulatorische Funktionen, oder sind an der Aufrechterhaltung und Weitergabe genetischer Information beteiligt. Die zwei Nucleinsäurearten DNA und RNA speichern Informationen und stellen sie der Zelle zur Verfügung. Die Struktur dieser Moleküle muss folgenden Eigenschaften gerecht werden:

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

918

Struktur von Nucleinsäuren

wer1. Die genetische Information muss in einer geeigneten Form gespeichert

den, so dass sie kompakt und stabil über lange Zeit zur Verfügung steht. 2. Die genetische Information muss (oft mehrmals) zur Weiterverarbeitung entschlüsselt werden. Als Transkription bezeichnet man den Prozess, bei dem die Nucleotidsequenz von DNA in RNA kopiert wird. RNA kann anschließend die Proteinbiosynthese in einem Prozess steuern, der Translation genannt wird. 3. In der DNA oder RNA gespeicherte Information muss für Proteine und andere Nucleinsäuren zugänglich sein. Diese müssen Nucleinsäuren in einer sequenzspezifischen Weise erkennen und an sie binden, so dass deren Funktionen sich ändern. 4. Die Nachkommenschaft eines Organismus muss mit demselben Informationsgehalt wie die Eltern ausgestattet sein. Dazu wird die DNA repliziert, d.h. es wird eine exakte Kopie hergestellt, so dass jede Tochterzelle dieselbe Information erhält. Wie wir sehen werden, müssen viele Zellkomponenten hinzutreten, damit Nucleinsäuren ihre Funktionen ausführen können. Dennoch beinhalten Nucleinsäuren mehr als nur inerte Leseinformation. Speziell die RNA ist durch ihre einzelsträngige Struktur ein dynamisches Molekül. Sie beinhaltet Struktureigenschaften und katalytische Fähigkeiten für eine Vielzahl von Prozessen bei der Entschlüsselung der genetischen Information. In diesem Kapitel wenden wir uns den strukturellen Eigenschaften der Nucleinsäuren zu. Zudem betrachten wir die Interaktion von Proteinen mit Nucleinsäuren, wodurch letztere ihre Funktionen erst ausüben können. In den anschließenden Kapiteln werden wir dann die Replikation (Kap. 25), Transkription (Kap. 26) und Translation (Kap. 27) behandeln.

1

Die DNA-Helix

Zuerst werden wir die verschiedenen Strukturformen der DNA betrachten und versuchen zu verstehen, wie dieses Molekül genetische Information sichert und dennoch zugänglich macht.

«2 siehe Guided Exploration 21:

A.

DNA structures.

Die DNA ist ein doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonucleotiden, welche über Phosphodiesterbindungen verknüpft sind (Abb. 3.3 und 3.8). Die biologisch häufigste Erscheinungsform der DNA wird B-DNA genannt. Ihre Struktureigenschaften wurden erstmals von James Watson und Francis Crick zusammen mit Rosalind Franklin und anderen beschrieben (Abschnitt 3.2B und Exkurs

Geometrie der DNA

24.1):

1. Die zwei Polynucleotidketten winden sich rechtsgängig um eine gemeinsame Achse und bilden eine Doppelhelix von ca. 2 nm Durchmesser. 2. Die planaren Ringsysteme der Nucleotidbasen, welche durch Wasserstoff. brückenbindungen zusammengehaltene Paare ausbilden, sind annähernd senkrecht zur Längsachse der Helix angeordnet. In der B-DNA besetzen die Basen die Innenseite der Helix, während sich die Zucker-PhosphatKetten an der Helixperipherie befinden, wo sie die große und kleine Furche bilden. Lediglich an den Rändern sind die Basenpaare dem Lösungsmittel ausgesetzt.

3. Jedes Basenpaar besitzt exakt dieselbe Breite (Abb. 24.1), was die von der Basenzusammensetzung unabhängige beinahe perfekte Symmetrie des DNA-Moleküls erklärt. Die A - T-und G - C-Basenpaare sind gegeneinander austauschbar, d.h. sie können sich wechselseitig in der Helix ersetzen, ohne dabei

Die DNA-Helix Abb. 24.1 Große Furche

(4

4

oe

r

Watson-Crick-Basenpaare.

Die gedachte Verbindungslinie der C1’-Atome hat in beiden A - T- und G - C-Basenpaaren die gleiche Länge und bildet gleiche Winkel zwischen den

CH;

1)

919

Glykosidbindungen und den Basen. Dies verleiht der DNA eine Reihe zweizähliger pseudo-sym-

(4

(4

>

®

metrischer Achsen, die durch das Zentrum eines

jeden Basenpaars verlaufen (rote Linie) und senk-

Ka. 8 ‘

rom Kleine Furche

2

U

® 6

.:

und Wonacott, A.., Acta Cryst. B25, 2196 (1969)] 6% siehe Kinemage Exercise 17.2.

ZN,

[%)

Große Furche

7

recht zur Helixachse stehen. [Nach Arnott, S.D.

7

:c@®

4

4

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‚

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4

e.

a" (2

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re 1

>

(4

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A

P2

Kleine Furche

Vesses

Zu

ı

OR 2

1

2

®@

die Positionen der C1’-Atome des Zucker-Phosphat-Rückgrats zu verändern. Ebenso bleibt die Doppelhelix beim Austausch der Partner eines WatsonCrick-Basenpaares (d.h.G CzuC - G bzw. A - Tzu T - A) unverändert. Bei jeder anderen Basenkombination dagegen entstünde eine signifikante Verzerrung der Doppelhelix. 4. Die „ideale“ B-DNA hat 10 Basenpaare (bp) pro Windung, was einer helicalen Drehung von 36° pro bp entspricht. Da die aromatischen Basen einen van-der-Waals-Durchmesser von 0,34 nm besitzen und versetzt aufeinander gestapelt sind, hat die Helix eine Ganghöhe (Anstieg pro Windung) von 3,4 nm.

Doppelsträngige DNA kann je nach Lösungsmittelzusammensetzung und Basensequenz mehrere verschiedene Strukturen annehmen. Die wichtigsten Strukturvarianten der DNA sind A-DNA und Z-DNA. Die Geometrien dieser Moleküle sind in Tabelle 24.1 und Abbildung 24.2 zusammengefasst. Die Basenpaare der A-DNA sind zur Helixachse hin geneigt

Unter dehydratisierenden Bedingungen vollzieht die B-DNA eine reversible Konformationsänderung zur A-DNA. Die A-Form bildet eine breitere und flachere rechtsgängige Helix als die B-Form. Sie hat 11,6 bp pro Windung und eine Ganghöhe von 3,4 nm, wodurch ein axialer Hohlraum entsteht (Abb. 24.2c, links). Das markanteste Merkmal der A-DNA ist aber die Neigung der Basenpaare um 20° gegenüber der Helixachse. Da die Achse nicht durch die Basenpaare verläuft, bildet die A-Form eine tiefe große Furche und eine sehr flache kleine Furche; man kann sie als ein flaches Band beschreiben, das sich um

einen Hohlzylinder von 0,6 nm Durchmesser windet.

920

Struktur von Nucleinsäuren

Exkurs241. Berühmte Biochemiker Rosalind Franklin und die Struktur der DNA

Rosalind Franklin (1920-1958) James Watson und Francis Crick waren die Ersten, die ein genaues Modell der DNA-Struktur veröffentlichten. Diese bahnbrechende Entdeckung basierte nicht nur auf ihren eigenen Erkenntnissen,

sondern

baute

wie

alle wissenschaftlichen

Entdeckungen auf der Arbeit anderer auf. Einige der wichtigsten Vorarbeiten kamen von Rosalind Franklin, die sich wahrscheinlich niemals voll darüber im Klaren war, welche Rolle

sie bei dieser Entdeckung gespielt hat, und die auch bei der Nobelpreisverleihung 1962 an Watson, Crick und Maurice Wilkins nicht berücksichtigt wurde. Franklin wurde in England in einer intellektuellen und wohlhabenden Familie geboren. Sie war hervorragend in Mathematik und obwohl die Berufsaussichten für hoch begabte Frauen schlecht waren, promovierte sie im Jahre 1945 in physikalischer Chemie an der Universität Cambridge. Von 1947 bis 1950 arbeitete sie in einem staatlichen französischen Labor, wo sie Fachfrau für die Anwendung der Röntgenstrahlbeugungstechnik bei unvollkommen kristallinen Substanzen wie Kohle wurde. Ihre zahlreichen Publikationen über die Struktur der Kohle und anderer Kohlenstoffformen führten zu einer neuen Sicht dieser altbekannten Substanzen. Im Jahre 1951 kehrte sie auf Einladung von John Randall nach England zurück. Randall war Leiter der Biophysikalischen Forschungsabteilung des Medical Research Council (MRC) am King’s College in London. Franklin sollte dort die DNA-Struktur

untersuchen,

und

Randall

hatte Franklin

zugesagt, dass sie selbständig arbeiten könne. Wilkins dagegen, der seit einiger Zeit am King’s College über DNA arbeitete, wurde der Eindruck vermittelt, dass Franklin unter seiner Führung arbeiten würde. Dieses Missverständnis

Eierstockkrebs im Jahre 1958 führte sie dort bahnbrechende Untersuchungen über die Struktur von Viren durch. Schon früh während ihrer Tätigkeit am King’s College entdeckte Franklin durch die Analyse von Röntgenfaserbeugungsmustern, dass DNA (die sie von Wilkins erhielt, der diese wiederum von Rudolph Signer aus der Schweiz bekommen hatte) in zwei verschiedenen Konformationen vorkommt. Sie nannte diese die A- und die B-Form. Bis zu dieser Entdeckung waren die Röntgenbeugungsmuster der DNA verwirrend, weil es sich dabei um eine Mischung der Aund B-Formen handelte. Durch sorgfältige Kontrolle des Wassergehaltes erhielt Franklin eine Aufnahme der Röntgenfaserbeugung von B-DNA mit einer noch nie dagewesenen Deutlichkeit (Abb. 3.5), die auffallend die helicale Eigenschaft der DNA zeigte. Die Auswertung dieses Fotos ergab, dass die B-DNA doppelhelical ist, einen Durchmesser von 2 nm hat,

jede Windung der Helix 3,4 nm lang ist und 10 Basenpaare umfasst, jeweils in einem Abstand von 0,34 nm. Weitere Un-

tersuchungen legten nahe, dass sich die hydrophilen ZuckerPhosphat-Ketten auf der Außenseite der Helix befinden und die relativ hydrophoben Basen im Innern. Obwohl Franklin die Chargaff-Regeln (Abschnitt 3.2A) und die Arbeit von John Donohue bezüglich der tautomeren Formen der Basen (Abschnitt 3.2B) kannte, leitete sie davon nicht das Vorkommen von Basenpaaren in einer doppelsträngigen DNA ab. Als Watson im Januar 1953 am King’s College zu Besuch war, zeigte Wilkins ihm die Röntgenaufnahmen von Franklin. Zudem zeigte Max Perutz (Exkurs 7.2), Cricks Doktorvater an der Universität Cambridge, Watson und Crick eine Kopie des MRC-Reports

von

1952, in dem

die Arbeiten

aller dortigen

Arbeitgruppenleiter zusammengefasst waren, also auch die Arbeit von Franklin beinhaltete. Innerhalb einer Woche (und nach 13 Monaten vorausgegangener Untätigkeit an dem Projekt) begannen Watson und Crick mit dem Bau eines DNAModells. Dessen Struktur des Zucker-Phosphat-Rückgrats stand im Einklang mit Franklins Daten [in früheren Versuchen zur Modellerstellung hatten sie die Basen auf der Außenseite der Helix platziert (ebenso wie bei einem Modell von Linus Pauling; Exkurs 6.1), denn

sie gingen davon

aus, dass die

und ihre stark gegensätzlichen Persönlichkeiten (Franklin war schnell, durchsetzungsfähig und streitlustig, wohingegen Wilkins bedächtig, schüchtern und indirekt war) führte zu Streit zwischen den beiden, sodass sie kaum miteinander redeten und neben- statt miteinander arbeiteten. Aus einigen weit verbreiteten Beschreibungen über Franklins Leben und Arbeit geht hervor, dass die Atmosphäre am King’ s College frauenfeindlich gewesen sei, aber Franklins Korrespondenz

Basen ihre genetische Information nur dann weitergeben können, wenn sie von außen zugänglich sind]. Bei mehreren Gelegenheiten merkte Crick an, dass Franklins Forschungsergebnisse für dieses Unternehmen entscheidend waren. Watson und Crick publizierten ihr Modell der B-DNA im April 1953 in Nature. Direkt anschließend waren Veröffentlichungen von Wilkins und Franklin über deren Strukturuntersuchungen der DNA abgedruckt. Franklin hatte ihr Manu-

sowie ihre eigenen Berichte belegen eher, dass sie die Atmo-

skript bereits im März 1953 verfasst, bevor sie von Watsons

sphäre dort als sehr förderlich empfand. Aus persönlichen Gründen wechselte sie schließlich im Frühjahr 1953 ans Birkbeck College in London. Bis zu ihrem frühen Tod durch

und Cricks Arbeit wusste. Franklin nahm an ihrem Manu-

skript nur eine einzige Änderung vor, als sie von dem von

Watson und Crick vorgeschlagenen Modell erfuhr. Sie fügte

Die DNA-Helix

einen einzigen Satz hinzu: „Somit stehen unsere allgemeinen Vorstellungen nicht im Widerspruch zu dem von Watson und Crick vorgeschlagenen Modell in der vorangegangenen Mit-

921

und blieb bei ihnen in ihrem Haus in Cambridge, als sie sich von einer Krebsbehandlung erholte. Wenn Watson und Crick nicht ihr Modell der B-DNA formu-

teilung.“ Sie war sich offensichtlich nicht bewusst, dass das

liert hätten, hätte dies dann am Ende Franklin getan, die eine

Watson-Crick-Modell zu einem erheblichen Maß auf ihrer Arbeit fußte. Da Watson und Crick in ihrem Nature-Artikel

Abneigung gegen spekulative Modelle hatte? Wir werden dies

von 1953

Franklin nicht erwähnten, wurde

Franklins Veröf-

natürlich niemals erfahren. Und falls sie noch gelebt hätte, hätte sie dann zusammen mit Watson, Crick und Wilkins

fentlichung weitgehend als Untermauerung des WatsonCrick-Modells angesehen, anstatt als wichtige Vorbedingung für dessen Formulierung. Erst nach Franklins Tod gaben Watson und Crick zu verstehen, dass deren Beiträge bei ihrem Modell eine entscheidende Rolle gespielt hatten. Watson, Crick und Franklin entwickelten eine enge Freundschaft. Ab 1954 korrespondierten sie regelmäßig und berichteten einander über ihre Arbeit. Im Sommer 1954 bot Watson Franklin an, sie im Auto durch die gesamten Vereinigten Staa-

ihre Arbeit unverzichtbar für den Entdeckungsprozess war, würden dies bejahen. Das Nobelpreis-Komitee erkennt jedoch normalerweise diejenigen an, die die Forschung initiierten (d.h. in diesem Fall Wilkins), und der Preis kann nicht an mehr als drei Personen gemeinsam verliehen werden.

ten zu fahren, von Woods Hole, Massachusetts, bis zu ihrem

thymonucleate, Nature 171, 740-741

Ziel am Caltech, wo auch er hin wollte. Im Frühjahr 1956 reiste sie mit Crick und dessen Frau Odilie durch Spanien

Maddox, B., Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA, HarperCollins

Tab. 24.1

den Nobelpreis erhalten (der Preis kann posthum nicht verliehen

werden)?

Diejenigen,

die der

Meinung

sind, dass

Franklin, R.E., und Gosling, R.G., Molecular configuration in sodium

(1953).

(2002).

Struktureigenschaften idealer A-, B- und Z-DNA. A

B

24

helicaler Drehsinn

rechtsgängig

rechtsgängig

linksgängig

Durchmesser

ca. 2,6 nm

ca. 2 nm

ca. 1,8 nm

Basenpaare pro helicale Windung

11,6

10

12 (6 Dimere)

helicale Windung pro Basenpaar

Sur

36°

60° (pro Dimer)

helicale Ganghöhe (Anstieg/Windung)

3,4 nm

3,4 nm

4,4 nm

helicaler Anstieg pro Basenpaar

0,29 nm

0,34 nm

0,74 nm (pro Dimer)

Basenneigung zur Helixachse

20°

6°

72

große Furche

eng und tief

breit und tief

flach

kleine Furche

breit und flach

eng und tief

eng und tief

Zuckerkonformation

C3’-endo

C2'-endo

C2'-endo für Pyrimidine; C3’-endo für Purine

glykosidische Bindung

anti

anti

anti für Pyrimidine; syn für Purine

922

Struktur von Nucleinsäuren

Kleine Furche

Kleine Dr

” Große Furche

(b)

A-DNA

Die DNA-Helix

Abb. 24.2

Z-DNA bildet eine linksgängige Helix

Gelegentlich zeigt ein vertrautes System ziemlich unerwartete Eigenschaften. Über 25 Jahre nach Entdeckung der „Watson-Crick-DNA-Struktur“ ergab die Röntgenkristallstrukturanalyse von d(CGCGCG) durch Andrew Wang und Alexander Rich überraschenderweise eine linksgängige Doppelhelix. Diese Struktur, Z-DNA genannt, hat 12 Watson-Crick-Basenpaare pro Windung, eine Ganghöhe von 4,4 nm, eine tiefe kleine und praktisch keine große Furche. Die Z-DNA gleicht deshalb einem linksgängigen Bohrer (Abb. 24.2, rechts). Beugungsuntersuchungen an DNA-Fasern und NMR-Studien haben gezeigt, dass komplementäre Polynucleotide mit alternierenden Purinen und Pyrimidinen, wie z.B. poly d(GC) - poly d(GC) oder poly d(AC) - poly d(GT), bei hohen Salzkonzentrationen die Z-Konformation einnehmen. Das Salz stabilisiert die Z-DNA im Vergleich zur B-DNA durch Reduktion der elektrostatischen Abstoßung zwischen den am engsten benachbarten Phosphatgruppen auf gegenüberliegenden Strängen (deren Abstand 0,8 nm in der Z-DNA und 1,2 nm in der B-DNA beträgt). Ist die Z-DNA biologisch von Bedeutung? Die Entdeckung von Z-DNA-bindenden Proteinen legt nahe, dass Z-DNA auch in vivo existiert. Rich hat die Röntgenstruktur einer Z-DNA-bindenden Domäne, die als Za bezeichnet wird, im Komplex mit DNA bestimmt. Eine Za-Domäne bindet über Wasserstoffbrückenbindungen und ionische Wechselwirkungen zwischen polaren und basischen Seitenketten und dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA an jeden der beiden Stränge der Z-DNA. Keine der DNA-Basen ist an diesen Bindungen beteiligt (Abb. 24.3). Die DNA-bindende Oberfläche des Proteins ist in der Form komplementär zur Z-DNA und ist positiv geladen, so wie man es von einem Protein erwartet, das mit eng angeordneten anionischen Phosphatgruppen in Wechselwirkung steht. Sequenzen, die in der Lage sind Z-DNA zu bilden, kommen häufig in der Nähe der Genanfänge vor. Reversible Umwandlung von B-DNA in Z-DNA an diesen Stellen spielt vermutlich eine Rolle bei der Kontrolle der Transkription.

923

Strukturen von A-, B- und Z-DNA.

(a) Blickrichtung senkrecht zur Helixachse. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat ist durch ein gelbgrünes Band hervorgehoben, die Basen sind rot gefärbt. (b) Raumfüllendes Modell (C, N, © und P-Atome in Weiß, Blau, Rot bzw. Grün). Die H-Atome sind übersichtshalber weggelassen. (c) Blickrichtung entlang der Helixachse. Die Ribosering-Sauerstoffatome sind in Rot und die vordersten Basenpaare in Weiß gezeigt. [A-DNA nach Strukturen von Olga Kennard, Dov Rabinovitch, Zippora Shakked und

Mysore Viswamitra, Cambridge University. Nucleic Acid Database ID ADH010; B-DNA nach Strukturen von Richard Dickerson und Horace Drew, Caltech,

PDBid IBNA und Z-DNA nach Andrew Wang und Alexander Rich, MIT, PDBid 2DCC.

Illustrationen

in Teil a und c von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute. Modellkoordinaten für Teil b von Helen Berman, Rutgers University.] 6% siehe Kinemage Exercise 17-1, 17-4, 17-5 und 17-6.

Abb. 24.3

Röntgenstruktur von Za im Komplex

mit Z-DNA.

Die DNA-Sequenz d(CGCGCG) ist in Stabform dargestellt. Das Rückgrat ist rot. Die a-Helices der Za-Domänen sind blau und die ß-Faltblätter sind hellgrün abgebildet. Beachten Sie, dass jede Za-Domäne

nur mit einem Z-DNA-Strang Kontakt

hat, und dass keine der Basen der Z-DNA direkt

mit dem Protein in Wechselwirkung tritt. [Mit freundlicher Genehmigung von Alexander Rich, MIT. PDBid

1QB).]

924

Struktur von Nucleinsäuren

RNA kann eine A-Helix ausbilden Doppelsträngige RNA ist das genetische Material bestimmter Viren. Sie wird jedoch als Einzelstrang synthetisiert. Dennoch kann sich ein einzelsträngiges RNA-Molekül falten und dabei intramolekulare Wechselwirkungen eingehen, so dass komplementäre Sequenzen über Basenpaarungen Doppelstränge mit einzelsträngigen Schleifen ausbilden (Abb. 3.9). Darüber hinaus sind kurze Segmente doppelsträngiger RNA an der Kontrolle der Genexpression beteiligt (Abschnitt 28.3C). Doppelsträngige RNA kann keine der B-DNA vergleichbare Konformation einnehmen, da sich ihre 2’-OH-Gruppen gegenseitig stören würden. Stattdessen liegt gewöhnlich eine der A-DNA entsprechende Konformation vor (Abb. 24.2). Sie hat ca. 11 bp pro Windung, eine Ganghöhe von ca. 3,09 nm und ihre Basenpaare haben einen Neigungswinkel von ca. 16,7° zur Helixachse. Hybride Doppelhelices, bei denen ein Strang aus RNA und der andere aus DNA besteht, nehmen offensichtlich ebenfalls eine der A-DNA ähnliche Konformation ein (Abb. 24.4). Andererseits besitzen Hybridhelices auch einige Eigenschaften der B-DNA, denn ihre Konformation liegt zwischen der von A-DNA und B-DNA. Kurze Segmente hybrider RNA-DNA-Helices treten einerseits bei der Initiation der DNA-Replikation durch ein kurzes RNA-Stück auf (Abschnitt 25.1), andererseits bei der Transkription der DNA-Matrize in RNA (Abschnitt

26.1C).

Abb. 24.4 Röntgenkristallstruktur einer 10 bp langen RNA-DNA-Hybrid-Helix. Der Komplex besteht aus der RNA UUCGGGCGCC,

die mit ihrer komplementären DNA basengepaart

ist. Die Struktur ist als Stabmodell dargestellt mit den C-Atomen der RNA in türkis, den C-Atomen der DNA in grün, N-Atomen in blau, den P-Atomen

in gold und O2’-Atomen [Nach einer Horton und

den O-Atomen in rot (aufer den der RNA, die magenta sind). Röntgenkristallstruktur von Nancy Barry Finzel, Pharmacia & Upjohn,

Inc., Kalamazoo.

PDBid IFIX.] 6% siehe Interactive

Exercises.

«

‚ >

@!

Wa

Flexibilität der DNA

Man nimmt an, dass die strukturell verschiedenen A-, B- und Z-Formen der DNA sich in vivo nicht frei ineinander umwandeln können. Vielmehr bedarf es zur Umwandlung der einen in die andere Form ungewöhnlicher physikalischer Bedingungen (z.B. Dehydrierung) oder des Einflusses DNA-bindender Proteine. Zudem weichen reale DNA-Moleküle von den oben beschriebenen idealen Strukturen ab. Röntgenkristallstrukturanalysen von B-DNA-Segmenten zeigen, dass sich - je nach Sequenz - einzelne Reste signifikant von der durchschnittlichen Konformation unterscheiden. Beispielsweise kann die helicale Windung pro Basenpaar von 26° bis 43° variieren. Jedes Basenpaar kann auch von seiner idealen Konformation abweichen, und zwar durch Rollen oder Verkippen in der Art der Rotorblätter eines Propellers. Solche Konformationsvarianten scheinen wichtig zu sein, wenn es um die sequenzspezifische DNA-Erkennung durch Proteine geht, welche dann die genetische Information verarbeiten. DNA-Moleküle, die 2,0. nm dick und ein Vielfaches davon lang sind, sind nicht vollkommen unbewegliche Stäbe. Es ist im Gegenteil wichtig, dass sie in gewisser Weise flexibel sind, damit sie in Zellen verpackt werden können. DNA-Helices können verschiedene Biegungsgrade einnehmen, von leichten Bögen bis zu scharfen Biegungen. Wir werden sehen, dass die größten Abweichungen von der Linearität meistens durch das Binden spezifischer Proteine verursacht werden.

NucleotidEinheit

5 0% s|

B.

Die konformationelle Flexibilität der DNA ist eingeschränkt

Die Konformation einer Nucleotideinheit ist in Abbildung 24.5 dargestellt. Sie wird durch sechs Torsionswinkel der Zucker-Phosphat-Kette und einen Torsionswinkel spezifiziert, der die Orientierung der Base zur glykosidischen Bindung (Bindung zwischen C1’ und der Base) beschreibt. Eigentlich sollten sieben Freiheitsgrade pro Nucleotid den Polynucleotiden viel Flexibilität verleihen. Diese |

Abb. 24.5 Die sieben Torsionswinkel, welche die Konformation einer Nucleotideinheit bestimmen.

Torsionswinkel sind jedoch zahlreichen intramolekularen Einschränkungen unterworfen, welche die konformationelle Freiheit drastisch beschneiden. Die Rotation einer Base um ihre glykosidische Bindung (Winkel x) ist stark eingeschränkt. Purinreste haben zwei sterisch mögliche Orientierungen: die syn- (griech.: mit) und die anti- (griech.: gegen) Konformation (Abb. 24.6). Bei Pyrimidinen ist nur die anti-Konformation stabil, da sich in der syn-Konformation

Die DNA-Helix

NH,

NH,

N =

H

Y

x

Il

N

Be

u

Hal

H

Ib H

OH

7

N

OH

syn-Adenosin

Abb. 24.6 N

en

H

OH

Nat,

Tel

OH

OH

H

OH anti-Adenosin

Die sterisch erlaubten Purin- und

NH;

Pyrimidinbasenorientierungen bezüglich ihrer gebundenen Riboseeinheiten.

N

In der B-DNA-Struktur weisen alle Nucleotide die anti-Konformation auf.

|N3

int

H

H

anti-Cytidin

der Zuckerrest und der Substituent am C2-Atom des Pyrimidins sterisch hindern würden. In den meisten doppelhelicalen Nucleinsäuren befinden sich alle Basen in der anti-Konformation. Die Z-DNA bildet eine Ausnahme (Abschnitt 24.1A), hier nehmen die alternierenden Pyrimidin- und Purinreste ebenfalls jeweils abwechselnd die anti- bzw. die syn-Stellung ein (unter anderem aus diesem Grund wird ein Dinucleotid als repetitive Einheit der Z-DNA angesehen). Die Flexibilität des Riboserings selbst ist ebenfalls eingeschränkt. Die Seitenwinkel eines regulären Fünfecks betragen 108°, was dem Tetraederwinkel von 109,5° sehr nahe kommt, so dass man einen praktisch ebenen Ribofuranosering erwarten könnte. Die Ringsubstituenten wären in diesem Fall jedoch in Reihe angeordnet. Um die Abstoßung, die durch die dichte Packung der Substituenten und der Wasserstoffatome entstehen würde, zu vermindern, knickt der Ring aus der Ebene. In der Mehrzahl der bekannten Nucleosid- und Nucleotidkristallstrukturen findet man Koplanarität bei vier Ringatomen mit wenigen pm Abweichung, während das verbliebene fünfte Atom aus dieser Ebene um mehrere Hundertstel nm herausragt. Das aus der Ebene herausstehende Atom ist fast immer der C2’- oder C3’-Kohlenstoff (Abb. 24.7). Die zwei häufigsten Ribosekonformationen werden als C3’-endo und C2’-endo (griech.: endon, innerhalb) bezeichnet. Erhebt sich das einzelne Atom auf derselben Seite wie das C5’, dann spricht man von endo, wogegen das Herausragen aus der Ringebene zu der dem C5’ abgewandten Seite als exo (griech.: exo, heraus) bezeichnet wird. Die Ribosekonformation ist für die Raumstruktur der Nucleinsäuren wichtig, da sie die relative Lage der Phosphatsubstituenten bezüglich des Riboserests bestimmt. So hat die Ribose der B-DNA eine C2’-endo-Konformation, in der A-DNA hingegen eine C3’-endo. In Z-DNA liegen alle Purinnucleotide in der C3’-endo, die Pyrimidinnucleotide in der C2’-endo-Konformation vor.

Abb. 24.7 Zuckerkonformationen der Nucleotide. (a) Die C3’-endo-Konformation, welche für A-RNA charakteristisch ist; C3’ ist auf derselben Ringseite

wie C5’. (b) Die C2’-endo-Konformation, welche in B-DNA auftritt. Die Abstände benachbarter

P-Atome im Zucker-Phosphat-Rückgrat sind angegeben. [Nach Saenger, W., Principles of Nucleic Acid Structure, S. 237, Springer (1983).] 6% siehe Kinemage Exercise 17.3.

(a)

C3’-endo

925

C2'-endo

926

Struktur von

Nucleinsäuren

Das Zucker-Phosphat-Gerüst hat eingeschränkte Konformationsmöglichkeiten

Wären die Torsionswinkel der Zucker-Phosphat-Kette (Winkel a bis & in Abb. 24.5) in ihrer Rotation völlig frei, gäbe es wahrscheinlich keine stabile Nucleinsäurestruktur. Diese Winkel sind jedoch in der Tat sehr eingeschränkt. Der Grund dafür sind nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen dem Ribosering und den Phosphatgruppen. In Polynucleotiden treten zudem sterische Wechselwirkungen zwischen den Resten auf. Daraus resultiert, dass die Zucker-Phosphatsind jedoch relativ spanKette der Doppelhelix starr ist, die Zucker-Phosphat-Winkel nungsfrei.

6% siehe Guided Exploration 22: DNA supercoiling.

C. _ Superspiralisierte DNA Die Genome vieler Viren und Bakterien bestehen aus einem zirkulären doppelhelicalen DNA-Molekül. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen (z.B. Abb. 24.8) erscheinen einige dieser Moleküle eigenartig verdrillt, ein Phänomen, das man Superspiralisierung oder Superhelicität nennt. Superspiralisierte DNA-Moleküle sind kompakter als relaxierte Moleküle mit derselben Anzahl an Nucleotiden. Dies ist wichtig bei der Packung der DNA in Zellen (Abschnitt 24.5) und von Bedeutung für die Entspiralisierungsvorgänge, welche bei der Replikation und Transkription stattfinden. Die Topologie einer Superhelix ist einfach zu beschreiben

Stellen wir uns ein doppelhelicales DNA-Molekül vor, in dem die beiden jeweils kovalent geschlossenen Stränge ein zirkuläres doppelsträngiges Molekül bilden. Die Geometrie einer solchen Anordnung verlangt, dass die Anzahl der Windungen ohne vorheriges Durchtrennen von mindestens einem seiner Polynucleotidstränge nicht geändert werden kann. Man kann sich das einfach an einem geschlossenen Gürtel veranschaulichen, wobei jede Gürtelkante einem DNA-Strang entspricht. Die Anzahl der vor dem Schließen des Gürtels durchgeführten Umdrehungen kann nicht geändert werden, ohne ihn zu öffnen, was bei dem Doppelstrangmolekül dem Durchtrennen eines Polynucleotidstrangs gleichkäme. Diese Überlegung kann mathematisch ausgedrückt werden:

Lei Abb. 24.8 Elektronenmikroskopische zirkulärer Doppelstrang-DNA. Die Konformationen der abgebildeten variieren von nicht superhelical (links) superhelical (rechts). [Aufnahmen von

Aufnahmen DNA bis stark Laurien

Polder. Aus Kornberg, A. und Baker, T.A., DNA

Replication (2. Aufl.), S. 36, Freeman (1992). Mit freundlicher Genehmigung.]

W

(24.1)

Dabei sind die Parameter wie folgt definiert: 1. L bezeichnet die Verwindungszahl, womit die Anzahl der Windungen eines Strangs um den anderen gemeint ist. Diese ganzzahlige Größe ist einfach zu ermitteln, wenn das Molekül flach in eine Ebene gelegt wird. Die Verwindungszahl kann nicht durch Verdrillen oder Verformung des Moleküls geändert werden, solange die beiden Polynucleotidstränge intakt bleiben.

Die DNA-Helix

927

2. T ist die helicale Windungszahl und bezeichnet die Anzahl vollständiger Umdrehungen eines Polynucleotidstrangs um die Doppelstrangachse. Per definitionem ist T für rechtsgängige Doppelstrangwindungen positiv. Somit kann der T-Wert für B-DNA üblicherweise durch Division der Anzahl Basenpaare durch 10,4 (Basenpaare pro Windung der B-DNA-Doppelhelix in wässriger Lösung) ermittelt werden. 3. W, die superhelicale Windungszahl, ist die Anzahl der Windungen der Doppelstrang- um die Superhelixachse. Sie stellt ein Maß für die Superhelicität einer DNA dar. Der Unterschied zwischen superhelicaler und helicaler Windungszahl ist in Abbildung 24.9 dargestellt. Wenn eine zirkuläre DNA in eine ebene Anordnung gezwungen wird, dann wird W = 0. Die zwei DNA-Konformationen, die im rechten Teil der Abbildung 24.10 wiedergegeben sind, sind topologisch äquivalent. Sie haben dieselbe Verwindungszahl L, unterscheiden sich aber in ihren Windungszahlen (unter Topologie versteht man die geometrischen Eigenschaften eines Objekts, die nur durch Zerschneiden, nicht aber durch bloße Deformation verändert werden). In einer ringförmigen, kovalent geschlossenen Doppelstrang-DNA ist L konstant. Deshalb muss für jede neue doppelhelicale Windung, AT, eine entsprechende und entgegengerichtete superhelicale Windung erfolgen, d.h. AW = -AT. Eine geschlossene, zirkuläre DNA ohne Superspiralisierung (Abb. 24.10, oben rechts) kann in eine Konformation mit negativer Superspiralisierung überführt werden (Abb. 24.10, unten rechts), indem die Doppelhelix um die gleiche Anzahl positiver Windungen (also rechtsgängig) verdreht wird.

| Große superhelicale Windung,

kleine helicale Windung

|

Superspiralisierte DNA wird durch Öffnen eines Strangs entspannt

Superspiralisierte DNA kann durch Behandlung mit pankreatischer DNase I (einer Endonuclease) in die entspannte zirkuläre Form (Abb. 24.8, ganz links) überführt werden, da die DNase unter bestimmten Bedingungen nur einen DNA-Strang der Doppelhelix spaltet. Endonucleasen sind Enzyme, welche Phosphodiesterbindungen innerhalb einer Polynucleotidkette spalten. Eine einzige Spaltung im Einzelstrang (engl.: nick) reicht aus, um superspiralisierte DNA zu entspannen. Die der Spaltstelle gegenüberliegende Zucker-Phosphat-Kette kann sich frei um ihr Rückgrat (Abb. 24.5) drehen und die Verwindungszahl des Moleküls und damit die Superhelicität ändern. Die Superspiralisierung baut große, elastische Spannung in ringförmiger DNA auf, ähnlich wie in einem Gummiband. Deshalb liegt ringförmige DNA im entspannten Zustand auch nicht superspiralisiert vor.

I

3

Se

Kleine superhelicale Windung,

große helicale Windung

Abb. 24.9 Unterschied zwischen superhelicaler und helicaler Windung, gezeigt anhand eines aufgerollten Telefonkabels. Im entspannten Zustand (links) befindet sich das Kabel in helicaler Form mit großer superhelicaler und kleiner helicaler Windungszahl. Wird das Kabel zunehmend gespannt (Mitte), bis es fast gerade ist (rechts), wird seine superhelicale Windungszahl kleiner, seine helicale dagegen immer gröfeer.

Ringschluss

um eine Drehung S 5°

Abb. 24.10

< a Tr

Topologisch

a

äquivalent

S W=0

Zwei Mechanismen, um eine

Superhelix in eine DNA mit 10 Doppelstrangwindungen einzuführen. Die beiden geschlossenen Kreisformen (rechts) sind topologisch äquivalent, d.h. sie sind ineinander überführbar, ohne dass eine kovalente Bindung

2

Eine Verdrehung

L=9

>

T=10

w-

S Ze,

Ringschluss

geöffnet werden muss. Für jede Form sind die Verwindungszahl

L, die helicale Windungszahl

T

und die superhelicale Windungszahl W angegeben. Genau genommen jedoch ist die Verwindungszahl nur für ein geschlossenes ringförmiges DNA-Molekül definiert.

Struktur von Nucleinsäuren

928

Abb. 24.11 Sukzessive Entwindung eines negativ superhelicalen DNA-Moleküls. Mit der Entwindung (ohne Brechen einer kovalenten Bindung) des negativ superhelicalen Kreises (w < 0) nähert sich W dem Wert 0. Weitere Entwindung bringt die DNA dazu, sich entgegengesetzt zu verdrehen, was eine positive Superhelix (W > 0) ergibt.

Wo0

Natürlich vorkommende ringförmige DNA ist unterdreht Die Verwindungszahl natürlicher DNA-Ringe ist geringer als diejenige der entsprechenden relaxierten Moleküle, erstere sind also unterdreht. Da jedoch die DNA dazu tendiert, eine Konformation mit der üblichen 1 Windung/10,4 bp einzunehmen, ist das Molekül negativ superspiralisiert (W < 0; Abb. 24.11, links). Mit der Entwindung des Doppelstrangmoleküls (T wird verringert) steigt Wan (L muss konstant bleiben). Daher verringert sich zunächst die Superhelicität eines unterdrehten Ringmoleküls. Mit zunehmender Entwindung durchläuft der W-Wert zunächst 0 (relaxierter Ring; Abb. 24.11, Mitte) und wird dann positiv, was wiederum eine positiv superspiralisierte Helix bedeutet (Abb. 24.11, rechts).

D.

ASOo—

VIIIIWDoppelsträngige DNA (n Windungen)

Doppelsträngige DNA (n - 1 Windungen)

Abb. 24.12 Aktivität der Typ-I-Topoisomerasen. Durch Schneiden eines DNA-Einzelstrangs, Hindurchführen einer Schleife durch die Schnittstelle und anschließenden Verschluss der Bruchstelle kann die Typ-I-Topoisomerase (a) zwei einzelsträngige Ringe verketten oder (b) Doppelstrang-DNA um eine Drehung entwinden.

Topoisomerasen kontrollieren die DNA-Superspiralisierung

DNA kann ihre normale Funktion nur ausüben, wenn sie sich in einem adäquaten topologischen Zustand befindet. Bei grundlegenden biologischen Prozessen, wie Replikation und Transkription, trennen sich die beiden komplementären Polynucleotidstränge. Die negative Superspiralisierung natürlicher DNA in Pround Eukaryoten fördert diese Trennung, da sie die Entwindung der Doppelhelix fördert (eine Zunahme von W muss mit einer T-Abnahme einhergehen). Fehlt der DNA die notwendige superhelicale Spannung, dann können die gerade beschriebenen lebenswichtigen Prozesse nicht stattfinden. Die Superspiralisierung der DNA wird von einer besonderen Klasse von Enzymen kontrolliert, den Topoisomerasen. Sie werden so genannt, weil sie den topologischen Zustand (die Verwindungszahl) zirkulärer DNA, nicht aber ihre kovalente Struktur verändern. In Pro- und Eukaryoten kommen zwei Klassen von Topoisomerasen vor: 1. Typ-I-Topoisomerasen erzeugen transiente Einzelstrangbrüche in der DNA (Nicks). Typ-I-Enzyme werden weiter eingeteilt in Typ-IA- und Typ-IB-Topoisomerasen, die sich in Sequenz und Reaktionsmechanismus unterscheiden. 2. Typ-II-Topoisomerasen erzeugen transiente Doppelstrangbrüche in der DNA. Typ-IA-Topoisomerasen entspannen negativ superspiralisierte DNA

Typ-IA-Topoisomerasen katalysieren die Entspannung der superspiralisierten DNA, indem sie die Verwindungszahl in Einerschritten verändern. Typ-IA-Enzyme kommen in allen Zellen vor und entspannen nur negativ superspiralisierte DNA. Aufschluss über den Mechanismus der Typ-IA-Topoisomerasen lieferte die Beobachtung, dass sie reversibel einzelsträngige DNA-Ringe miteinander verketten (Abb. 24.12a). Offenbar schneidet das Enzym einen Einzelstrang, führt eine Schleife des zweiten Strangs durch die entstandene Lücke und verschließt danach den Bruch (Abb. 23.11b). Bei negativ superspiralisierter DNA erhöht dies die Verwindungszahl und verursacht, dass die superhelicale Windungszahl posi-

Die DNA-Helix

929

tiver wird (weniger negative Superspiralen). Dieser Vorgang kann so lange wie-

derholt werden, bis alle Superspiralen entfernt sind (W = 0). Dieser Mechanis-

mus der Strangpassage wird durch die Beobachtung unterstützt, dass die Denaturierung der Typ-IA-Topoisomerase, die mit einzelsträngiger, zirkulärer DNA inkubiert wurde, eine lineare DNA ergibt. Deren 5’-terminale Phosphatgruppe ist mit dem Enzym über eine Phospho-Tyr-Diesterbindung kovalent verknüpft: Ne

CH,

Tyr

OzEH

T

020-0

(0)

P-0-cH, o

(6) DNA

Base

FIT H

OHH

Die Bildung des kovalenten Enzym-DNA-Zwischenprodukts konserviert die Freie Enthalpie der geschnittenen Phosphodiesterbindung, sodass kein Energieaufwand nötig ist, um den Bruch in der DNA später wieder zu verschließen. Die Topisomerase III aus E. coli, ein Typ-IA-Enzym, ist ein Monomer aus 659

Aminosäuren. Alfonso Mondragön hat die Röntgenstruktur der katalytisch inaktiven Variante Y328F im Komplex mit dem einzelsträngigen Oktanucleotid d(CGCAACTT) bestimmt. Das Enzym faltet sich in vier Domänen, die ein etwa 2,0 bis 2,8 nm großes Loch umschließen. Dieses ist groß genug, um doppelsträngige DNA aufzunehmen, und es ist mit zahlreichen Arg- und Lys-Resten ausgekleidet (Abb. 24.13). Das Oktanucleotid bindet in einer Mulde, die ebenfalls mit Arg- und Lys-Seitenketten ausgekleidet ist. Dabei steht sein ZuckerPhosphat-Rückgrat im Kontakt mit dem Protein, und die meisten seiner Basen sind für mögliche Basenpaarungen exponiert. Diese einzelsträngige DNA nimmt eine B-DNA-artige Konformation an, obwohl ihr komplementärer

Abb. 24.13 Röntgenstruktur der Topoisomerase Ill Variante Y323F aus E. coli im Komplex mit dem einzelsträngigen Oktanucleotid d(CGCAACTT). Die vier Domänen des Proteins sind in verschiedenen Farben gezeichnet, und die beiden Ansichten

sind im Verhältnis zueinander um 90° um eine vertikale Achse gedreht. Die DNA ist als Kalottenmodell gezeichnet, wobei C weiß, N blau, O rot

und P gelb gefärbt sind. Das aktive Zentrum dieser Topoisomerase vom Typ IA ist durch die Seitenkette von Phe 328 gekennzeichnet, die als gelb-grünes Kalottenmodell gezeigt ist [Nach einer Röntgenstruktur von Alfonso Mondragön, Northwestern University. PDBid 117D.]

930

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.14 Für Topoisomerasen vom Typ IA vorgeschlagener Mechanismus. Das Enzym ist blau gefärbt und die gelbe Fläche stellt die Bindungstasche für einzelsträn-

1. Bindung

ee

2. Schneiden

7. Regeneration gige DNA dar. Die beiden DNA-Stränge, 5’ die rot und grün gezeichnet sind, sollen g 3, 3. Strangpassage die beiden Stränge eines kovalent geschlossenen, zirkulären Doppelstrangs oder zwei einzelsträngige Ringe darstellen. (1) Das Enzym erkennt eine einzelS strängige Region der DNA, hier den 5 roten Strang, und bindet ihn in seiner Bindungstasche. Entweder gleichzeitig oder anschließend öffnet sich eine Lücke zwischen Domäne I und Ill. 6. Freisetzung 3 (2) Die DNA wird gespalten und das neu gebildete 5’-Ende wird kovalent mit dem 5) 3 ER Tyr des aktiven Zentrums verknüpft. Der Abschnitt 5) des Strangs mit dem neu gebildeten 3’-Ende bleibt eng, aber 5. Wiederverknüpfung nicht kovalent mit der Bindungstasche verbunden. (3) Der nicht gespaltene Strang (grün) wird durch die Öffnung geschoben, die durch den geschnitteStrang sterisch nicht in die Mulde passen würde. Der DNA-Strang ist so ausgenen (roten) Strang entsteht, und gelangt in das zentrale Loch des Proteins. (4) Der nicht gespalrichtet, dass sich sein 3’-Ende in der Nähe des aktiven Zentrums befindet. Wenn tene Strang ist durch den partiellen Verschluss der statt der Variante mit Phe in Position 328 der Wildtyp mit Tyr an dieser Stelle Lücke gefangen. (5) Die beiden geschnittenen vorläge, wäre dessen Seitenkette korrekt positioniert, um die Phosphatgruppe 5’

ne

Enden des roten Strangs werden wieder verbunden,

dies ist vermutlich eine Umkehr der Spaltreaktion. (6) Die Lücke zwischen den Domänen | und Ill öffnet sich erneut und ermöglicht die Freisetzung des roten Strangs. In dem dabei entstehenden Reaktionsprodukt wurde der grüne Strang durch einen vorübergehenden Bruch im roten Strang geschoben. (7) Das Enzym kehrt in seinen Ausgangszustand zurück. Wenn die beiden Stränge einen negativ superspiralisierten DNA-Doppelstrang bilden, dann hat seine Verwindungszahl L um ] zugenommen. Wenn sie getrennte,

einzelsträngige Ringe waren, sind sie nun verkettet oder entkettet. Bei einem negativ superspiralisierten DNA-Doppelstrang kann dieser Vorgang so lange wiederholt werden, bis alle Superspiralisierungen beseitigt sind (W = 0). [Nach einer Zeichnung von Alfonso Mondragön, Northwestern University.]

nucleophil anzugreifen, welche die Nucleotide C-6 und T-7 der DNA verbrückt, und eine 5’-Phospho-Tyr-Bindung mit T-7 zu bilden und C-6 mit einer freien 3’OH-Gruppe zu entlassen. Diese Struktur weist auf den in Abbildung 24.14 dargestellten Mechanismus für die von der Typ-IA-Topoisomerase katalysierte Strangpassage hin. Typ-IB-Topoisomerasen entspannen superspiralisierte DNA über eine

gesteuerte Drehung Typ-IB-Topoisomerasen können sowohl negative als auch positive Superspiralen

entspannen. Wenn sie dies machen, schneiden sie vorübergehend einen Strang der DNA-Doppelhelix durch den nucleophilen Angriff eines Tyr im aktiven Zentrum auf ein P-Atom der DNA, sodass ein 3’-verknüpftes Phospho-Tyr-Zwischenprodukt und eine freie 5’-OH-Gruppe auf dem nachfolgenden Nucleotid entsteht (im Gegensatz zu der 5’-verknüpften Phospho-Tyr- und freien 3’-OHGruppe, die durch die Topoisomerasen vom Typ IA entstehen). Wim Hol bestimmte die Röntgenstruktur der katalytisch inaktiven Variante Y723F der menschlichen Topoisomerase I, einer Typ-IB-Topoisomerase, im Komplex mit einer doppelsträngigen DNA von 22 bp. Die Kerndomäne dieses zweiflügeligen Proteins ist eng um die DNA gewunden (Abb. 24.15). Wenn es sich - statt um die Phe 723-Variante - um den Wildtyp handeln würde, wäre deren OH-Gruppe ideal positioniert, um den P an der zu spaltenden P-O5’-Bindung nucleophil anzugreifen, sodass mit dem 3’-Ende des geschnittenen Strangs eine kovalente Bindung entstünde. Das Protein interagiert in weit größerem Ausmaß mit den fünf Basenpaaren des downstream-Segments der DNA (welches das neu gebildete 5’-Ende des geschnittenen Stranges enthalten würde) als mit den Basenpaaren des upstream-Segments der DNA (mit dem Tyr 723 kovalent verknüpft wäre). In beiden Fällen geschieht dies größtenteils sequenzunabhängig. Topoisomerase I scheint sterisch nicht in der Lage zu sein, die superspiralisierte DNA über den Strangpassagemechanismus zu entwinden, den Topoisomerasen vom Typ IA verfolgen (Abb. 24.14). Wahrscheinlich entspannt stattdessen Topoisomerase I die DNA-Superspiralen, indem sie dem locker gehaltenen downstream-Segment der geschnittenen doppelsträngigen DNA erlaubt, sich in Bezug auf das festgehaltene upstream-Segment zu drehen. Diese Drehung kann nur um

Die DNA-Helix

N Kern-Subdomäne

BB

Ket. R ern-Subdomäne I

II

93]

Abb, 24.15 Röntgenstruktur der Variante Y723F der menschlichen Topoisomerase I im Komplex mit einer doppelsträngigen 22 bp DNA. Diese Topoisomerase vom Typ IB besteht aus mehreren Domänen

und Subdomänen, die hier

verschiedenfarbig gezeigt sind. Tyr 723 befindet sich in der C-terminalen Domäne (grün). Der nicht geschnittene DNA-Strang ist türkisfarben, und die Teile des geschnittenen Strangs sind vor dem Schnitt (upstream) und nach dem Schnitt (downstream) magentarot bzw. pink. [Mit freundlicher Genehmigung von Wim Hol, University of Washington. PDBid 1A36.]

A > Kern-Subdomäne III { "y” Verbindungsdomäne ee

die Zucker-Phosphat-Bindungen (a, ß, y, und & in Abb. 24.5) im nicht geschnittenen Strang stattfinden, die gegenüber der Schnittstelle liegen, denn die Spaltung ermöglicht diesen Bindungen sich zu drehen. Zur Unterstützung dieser Reaktion enthält die Proteinregion, die das downstream-Segment umgibt, 16 konservierte, positiv geladene Aminosäurereste. Diese bilden einen Ring um die doppelsträngige DNA. Der Ring hält die DNA aber offensichtlich nicht in irgendeiner bestimmten Orientierung. Nichtsdestotrotz kann das downstream-Segment wahrscheinlich nicht frei rotieren, weil der Hohlraum, in dem es sich befindet,

so geformt ist, dass es während einiger Rotationsschritte mit dem downstreamSegment interagiert. Man sagt deshalb, dass die Topoisomerasen vom Typ IB bei der Entspannung superspiralisierter DNA einen gesteuerten Rotationsmechanismus vermitteln. Diese Entwindung wird durch die superhelicale Spannung in der DNA angetrieben und benötigt somit keinen weiteren Energieeinsatz. Schließlich wird die DNA durch Umkehrung der Spaltungsreaktion wieder verschlossen, und die jetzt weniger superspiralisierte DNA wird freigesetzt. Typ-Il-Topoisomerasen hydrolysieren ATP Typ-II-Topoisomerasen sind multimere Enzyme, welche ATP-Hdrolyse zur Aus-

übung ihrer Funktion benötigen. Ein Reaktionscyclus besteht darin, dass beide DNA-Stränge gespalten, Doppelstrang-DNA durch den Bruch geschoben und die Bruchstelle wieder geschlossen wird. Pro- und eukaryotische Typ-II-Enzyme entspannen positive und negative Superspiralisierungen, jedoch allein das prokaryotische Enzym (DNA-Gyrase genannt) kann negative Superspiralisierungen

einführen. Negative Superspiralisierungen in eukaryotischen Chromosomen resultieren primär aus der Verpackung in Nucleosomen (Abschnitt 24.5B) und nicht aus Topoisomeraseaktivität. Oberflächlich betrachtet gleichen die Typ-II-Topoisomerasen den Typ-I-Enzymen: Sie besitzen ein Paar katalytischer Tyr-Reste, welche temporär kovalente Zwischenprodukte mit den 5’-Enden doppelsträngiger DNA bilden. Somit vermitteln sie die Spaltung zweier DNA-Stränge an versetzten Stellen, so dass vier Basen lange „klebrige Enden“ (engl.: sticky ends) entstehen. Stephen Harrison und James Wang haben die Röntgenkristallstruktur eines großen homodimeren Hefe-Typ-II-Topoisomerasefragments bestimmt, welches doppelsträngige DNA schneidet, aber sie nicht durch den Bruch transportieren kann, da die intakte ATPase-Domäne fehlt. Das herzförmige Dimer besitzt eine dreieckige Aus-

932

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.16 Röntgenkristallstruktur von Typ-IlTopoisomerase aus Hefe (Reste 410-1202 der 1429 Reste langen Untereinheit). Das homodimere Protein ist in Bänderform

gezeigt, mit seinen zwei Untereinheiten A’ in Hellund Dunkelblau, und seinen zwei B’-Unterein-

heiten in Rot und Gold. Die Tyr-Reste des aktiven Zentrums sind durch grüne Kugeln und Y* markiert. [Nach einer Röntgenstruktur von James Berger, Stephen Harrison und James Wang,

Harvard University. PDBid 1BGW.] 6% siehe Interactive Exercises.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Beschreiben Sie die strukturellen Unterschiede zwischen A-, Bund Z-DNA, einschließlich des

ee Furchen. 2. Wie unterscheiden sich die Strukturen von RNA und DNA? 3. Erklären Sie, warum die meisten Nucleotide die anti-Konformation annehmen. 4. In welcher Nucleinsäurekonformation nimmt die Ribose die C2’-endo- bzw. die C3’-endoKonformation ein? 5, Erklären Sie den Zusammenhang von Verwindungszahl,

helicaler Windungszahl und superhelicaler Windungszahl. 6. Wie.verändern Typ-IA, Typ-IB und Typ-Il-Topoisomerasen die DNA-Topologie?

Abb. 24.17 Vorgeschlagener Mechanismus für die Topoisomerase Il. (1) Ein freies Enzym (Untereinheiten in Gelb, Rot und Blau) bindet Doppelstrang-DNA (das G-Segment, grau) und eine Konformationsänderung (2) klemmt die DNA fest. (3) ATP-Bindung (dargestellt durch Sternchen) vermittelt die G-Segmentspaltung, so dass eine andere Doppelstrang-DNA (T-Segment, grün) in die zentrale Öffnung des Enzyms eindringen kann (4). Das G-Segment wird wieder verschlossen (5) und das T-Segment verlässt das Enzym. ATP- Hydrolyse und -Dissoziation regenerieren den Ausgangszustand (2). [Mit freundlicher Genehmigung von Stephen Harrison und James Wang, Harvard University.]

sparung, welche 5,5 nm breit und 6 nm hoch ist (Abb. 24.16). Diese ist bei weitem breiter als der Durchmesser von B-DNA. Die Tyr-Reste des aktiven Zentrums sind 2,7 nm entfernt, so dass sie eine beträchtliche Entfernung zurücklegen müssen, um sich mit den 5’-Enden einer gespaltenen Doppelhelix zu verbinden. Ein auf Röntgenkristallstrukturen basierender Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der Typ-II-Topoisomerasen ist in Abbildung 24.17 dargestellt. Die zu spaltende DNA wird zuerst gebunden und somit fixiert. In Gegenwart von ATP wird die gebundene DNA gespalten und eine zweite DNA wird durch die

Öffnung in die zentrale Öffnung des Proteins gezogen. Die erste gespaltene DNA wird verschlossen und die zweite verlässt den Komplex auf der ihrem Eintritt gegenüberliegenden Seite. ATP wird zu ADP + P; hydrolysiert, womit das Enzym für weitere katalytische Cyclen bereit ist.

Die Bedeutung von Topoisomerasen für den Erhalt der DNA-Topologie belegt auch die Tatsache, dass viele Antibiotika und Chemotherapeutika Topoisomeraseinhibitoren sind (vgl. Exkurs 24.2). ATPase

3

ED) G-Segment

T-Segment

Die DNA-Helix Fo

ar

£

EB

933

b,

ie4 im Organismus

Inhibitoren der Topoisomerasen II als Antibiotika und Zytostatika Typ-Il-Topoisomerasen werden durch eine Vielzahl von Verbindungen inhibiert. Ciprofloxacin und Novobiocin hemmen spezifisch prokaryotische DNA-Gyrasen, nicht aber die eukaryotische Topoisomerase Il, weshalb sie als Antibiotika verwendet werden können. Ciprofloxacin ist derzeit eines der wirksamsten oralen Antibiotika in der Klinik (z.B. ist es das bevorzugte Antibiotikum zur Behandlung von Milzbrand). Wegen der Nebenwirkungen und schnellen Resistenzentwicklung wurde die Verwendung von Novobiocin zur Infektionsabwehr beim Menschen dagegen eingestellt. Einige Substanzen, wie Doxorubicin

und Etoposid, hemmen

eukaryotische

Topoisomerasen Il und sind deshalb in der Chemotherapie gegen Krebs weit verbreitet. Die verschiedenen Inhibitoren der Typ-Il-Topoisomerasen können auf zwei unterschiedliche Weisen wirken. Viele, wie

z.B. Novobiocin, hemmen die ATPase-Aktivität ihres Zielenzyms und legen es damit lahm. Ihre Wirkung beruht darauf, dass die Zelle nun nicht mehr das Ausmaß der Superspiralisierung ihrer DNA steuern kann. Dies führt unweigerlich zum Stopp der DNA-Replikation und der RNA-Transkription. Andere Substanzen wiederum, wie Ciprofloxacin, Doxorubicin und Etoposid, erhöhen die Geschwindigkeit, mit der ihre

und Transkriptions-Maschinerie“ leicht wieder abgestreift, so dass die Brüche dauerhaft in der DNA verbleiben. Obwohl die Zelle über ein ganzes Arsenal an enzymatischen Reparatursystemen verfügt (Abschnitt 25.5), überfordert ein zu groes Ausmaß an DNA-Schäden den Reparaturmechanismus und löst den Zelltod aus. Sich schnell teilende Zellen wie Krebszellen weisen erhöhte Spiegel an Typ-Il-Topoisomerasen auf. Daher ist es viel wahrscheinlicher, dass diese durch Hemmung ihrer Typ-Il-Topoisomerasen eine kritische DNA-

Schädigung erleiden als langsam wachsende oder ruhende Zellen. Camptothecin und seine Derivate sind die einzigen bekannten Inhibitoren der Typ-IB-Topoisomerasen. Sie verlängern die Lebenszeit des kovalenten Enzym-DNA-Zwischenprodukts. Diese Substanzen binden an den Komplex zwischen den Enden des durchtrennten DNA-Strangs. Dabei werden die 5’-OH-Gruppen, die bei der Religation wieder verbunden

werden

Phosphatgruppen

müssten,

mehr

als 0,45

entfernt. Da die gebrochene

N

N

Tu

CH,—cH,

%H

COOH |

Ciprofloxacin

NHt H;C

CH;

ar

er: 3 DH

H

0

iakı

o OH

H

H;C. Rs)

NG

a

Novobiocin

OH

CH;

den

nicht

repliziert werden kann, verhindert Camptothecin die Prolifera-

Camptothecin

oO

von

DNA

tion sich rasch teilender Zellen wie Krebszellen und ist somit ein wirksames Zytostatikum.

Ziel-Topoisomerasen vom Typ Il doppelsträngige DNA schneiden, und/oder verringern die Geschwindigkeit, mit der die Brüche wieder verschlossen werden. Folglich erzeugen diese Substanzen in den behandelten Zellen eine hohe Zahl von vorübergehend mit Protein verbundenen Bruchstellen in der DNA. Die Proteine werden von der „Replikations-

F

nm

Doxorubicin

|

|

0

Etoposid

934

Struktur von Nucleinsäuren

2

Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren

Die DNA zeigt nicht die strukturelle Komplexität der Proteine, da sie nur ein begrenztes Repertoire an Sekundärstrukturen und keine vergleichbaren Tertiär-

oder Quartärstrukturen besitzt. Dies ist vielleicht auch nicht überraschend, da die 20 proteinogenen Aminosäuren ein viel breiteres Spektrum chemischer

und physikalischer Eigenschaften besitzen als die vier Basen der DNA. Dennoch bilden viele RNAs wohldefinierte Tertiärstrukturen aus. In diesem Abschnitt werden wir die Kräfte betrachten, welche für die Struktur der Nucleinsäuren verantwortlich sind. Denaturiert (ungeordnet)

A.

Wird eine Lösung doppelsträngiger DNA über eine kritische Temperatur hinaus erhitzt, bricht die natürliche Struktur auf, die komplementären Stränge trennen sich und nehmen eine zufällige, ungeordnete Struktur an (Abb. 24.18). Dieser Denaturierungsprozess geht mit qualitativen Veränderungen der physikalischen Eigenschaften der DNA einher. Die charakteristisch hohe Viskosität nativer DNA-Lösungen (bedingt durch den hohen Widerstand der starren, stabähnlichen Doppelstrangmoleküle gegenüber Verformung) geht verloren, wenn die DNA in konformationell flexible Einzelstränge zerfällt. Die UV-Absorption der DNA, die ausschließlich von den aromatischen Basen stammt, erhöht sich um rund 40% bei der Denaturierung. Dies wird durch die Aufhebung elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen benachbarten Basen verursacht (Abb. 24.19). Die Zunahme der Absorption ist als hyperchromer Effekt bekannt. Verfolgt man die Absorptionsänderungen bei einer Wellenlänge von 260 nm mit steigender Temperatur, so sieht man, dass diese Absorptionszunahme in einem engen Temperaturbereich abläuft (Abb. 24.20). Dies. weist darauf hin, dass die Denaturierung der DNA ein kooperatives Phänomen ist, bei dem der Zusammenbruch einer Teilstruktur die übrige Struktur ebenfalls destabilisiert. In Analogie zum Schmelzen eines Festkörpers bezeichnet man Abbildung 24.20 als Schmelzkurve, und die Temperatur am Wendepunkt wird Schmelztemperatur, T, genannt. Die Stabilität der DNA und damit ihr T,,-Wert hängen von mehreren Faktoren ab, wie z.B. Art des Lösungsmittels, der Art und Konzentration gelöster Ionen, und dem pH-Wert. T,, steigt linear mit dem Anteil an G - C-Basenpaaren. Dabei ist dies jedoch nicht alleine auf die Tatsache zurückzuführen, dass G - C-Basenpaare eine Wasserstoffbrückenbindung mehr als A - T-Basenpaare besitzen (siehe unten).

Abb. 24.18 Schematische Darstellung der DNA-Denaturierung.

T P [®)

Denaturiert (82°C)

©o 0%) o

T

OO > — Relative Absorption Nativ (25°C) [0)

180

|

pl

200

l

Se]

220

|

240

260

l

280

l

300

Wellenlänge (nm)

Abb. 24.19 UV-Absorptionsspektren nativer und hitzedenaturierter DNA aus E. coli. Man beachte, dass die Denaturierung den

allgemeinen Kurvenverlauf nicht verändert, sondern nur die Intensität erhöht. [Nach Voet, D., Gratzer, W.B., Cox, R.A. und Doty, P., Biopolymers

1, 205 (1963).] 6% siehe Animated Figures.

Denaturierung und Renaturierung

Denaturierte DNA kann renaturiert werden Kühlt man eine Lösung denaturierter DNA rasch unter ihre Schmelztemperatur ab, erfolgt lediglich eine unvollständige Basenpaarung (Abb. 24.21). Es ist nicht genügend Zeit vorhanden, damit sich komplementäre Stränge finden, bevor willkürlich gepaarte Strukturen „eingefroren“ werden. Hält man jedoch die Temperatur ca. 25°C unter T,, so steht genügend thermische Energie zur Verfügung, damit sich kurze gepaarte Regionen durch Schmelzen und Neuassoziation umordnen können. Unter solchen sogenannten Annealing-Bedingungen (engl.: anneal, aushärten) kann denaturierte DNA letztlich vollständig renaturiert werden, was Julius Marmur 1960 entdeckte. Desgleichen bilden komplementäre RNA- und DNA-Stränge in einem Hybridisierung genannten Prozess hybride RNA-DNA-Doppelhelices, die geringfügig stabiler als die entsprechenden DNA-Doppelstränge sind.

Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren Abb. 24.20 Beispiel für eine DNA-Schmelzkurve. Die relative Absorption ist das Verhältnis der Absorption (bei 260 nm gemessen) bei der angegebenen Temperatur zu der Absorption bei 25°C. Die Schmelztemperatur T,, ist die Temperatur, bei der die relative Absorptionsänderung 50% des Maximums erreicht hat.

935

1,4

+— Übergangsbereich —

6% siehe Animated Figures.

B.

Basenpaarung

Die Basenpaarung wirkt offensichtlich wie ein „Leim“, der doppelsträngige Nucleinsäuren zusammenhält, obwohl noch andere intramolekulare Kräfte helfen, die Nucleinsäurestrukturen zu bilden. Normalerweise kommen nur WatsonCrick-Basenpaare in DNA-Strukturen vor. Dennoch werden insbesondere in RNA auch über andere Wasserstoffbindungen verbrückte Basenpaare gefunden (Abb. 24.22). In einigen A - T-Basenpaaren ist z.B. das N7-Atom des Adenins der Wasserstoffbrückenakzeptor (Hoogsteen-Geometrie; Abb. 24.22a) anstatt des N1-Atoms (Watson-Crick-Geometrie; Abb. 24.1). Diese und andere Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Watson-CrickGeometrie die stabilste Art der Basenpaarung darstellt, obwohl Nicht-Watson-CrickPaare theoretisch möglich wären. Ursprünglich wurde angenommen, dass die geometrischen Einschränkungen der Doppelhelix andere Basenpaarungen ausschließen würden. Man erinnere sich daran, dass die Basenpaare A-T, T- A, G-C und C-G geometrisch ähnlich sind und deshalb ausgetauscht werden können, ohne die Konformation der Zucker-Phosphat-Kette zu verändern. Experimentelle Untersuchungen haben aber gezeigt, dass der Hauptgrund für das Fehlen anderer Basenpaare in der Doppelhelix die Tatsache ist, dass WatsonCrick-Basenpaare gegenüber den anderen eine innere Stabilität aufweisen. Die Watson-Crick-Paare haben also eine höhere gegenseitige Affinität als Nicht-WatsonCrick-Paarungen. Im weiteren Verlauf werden wir aber auch sehen, dass die doppelhelicalen Segmente vieler RNAs ungewöhnliche Basenpaare (wie beispielsweise G - U) besitzen, welche die tertiäre Struktur stabilisieren. Nicht nur Wasserstoffbrücken stabilisieren die Struktur von Nucleinsäuren Es ist selbstverständlich, dass die Wasserstoffbrückenbindung für die spezifische Basenpaarung in der DNA erforderlich ist. Dennoch leisten Wasserstoffbrücken nur einen geringen Beitrag zur Stabilität der Nucleinsäurestrukturen (wie auch bei den Proteinen, vgl. Abschnitt 6.4A). Der Grund ist der, dass die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren nativer Nucleinsäuren bei der Denaturierung durch energetisch gleichwertige Wasserstoffbrücken zwischen Basen und Wasser ersetzt werden. Andere Arten von Kräften müssen demnach eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Nucleinsäurestrukturen spielen.

Abb. 24.22 Beispiele für Nicht-Watson-Crick-Basenpaare. (a) Hoogsteen-Paarung zwischen Adenin- und Thyminresten (b) Ein A - A-Basenpaar (c) Ein U - C-Basenpaar. (R steht für Ribose-5-Phosphat). Man vergleiche diese Strukturen mit denjenigen aus Abb. 24.1.

(a)

R o

H

H Set

&

Een: NN

N

(b) NeCH;

or

(6)

a Bean NN RZ

2 H

N

N—R

260 bei Absorption Relative nm I r

150

50

_—

70

90

Temperatur (°C)

\ Intramolekulare Basenpaarung

Intermolekulare Basenpaarung

Abb. 24.21 Partiell renaturierte DNA. Diese schematische Darstellung zeigt unvollständige Basenpaarungen, wie sie die DNA nach Hitzedenaturierung und rascher Abkühlung ausbildet. Man beachte, dass sowohl intra- als auch intermolekulare Aggregationen stattfinden können.

(€)

Va

| re en

N

NN

w E6) 1

N

m:

R

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RE

EN N

VERR

936

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.23 Stapelung von Adeninringen in der Kristallstruktur von 9-Methyladenin. Die partielle Überlappung der Ringe ist typisch für die Assoziation von Basen in Kristallstrukturen und in doppelhelicalen Nucleinsäuren. [Nach Stewart, R.F. und Jensen, L.H.,J.Chem.

Phys. 40, 2071 (1964).

Tab. 24.2 Stapelungsenergien für die zehn möglichen Dimere der B-DNA. Gestapeltes Dimer

Stapelungsenergie

(k} mol") -61,0

PIOTEAE@

|

>

5

un

34,6

28,4

27,9

ao ea Herta -27,5 An or > Aa ne ana

IS)

-16,0 Er SeEn ru

Aus: Ornstein, R.L., Rein, R., Breen, D.L. und

MacElroy, R.D., Biopolymers 17, 2356 (1978).

Basenstapelung und hydrophobe Wechselwirkungen Purine und Pyrimidine neigen zur Ausbildung von Stapeln aus übereinander liegenden planaren Molekülen. Dies hat sich in den Strukturen von Nucleinsäuren (Abb. 24.2c) und kristallinen Nucleinsäurebasen (Abb. 24.23) gezeigt. Diese Stapelinteraktionen sind eine Art van-der-Waals-Wechselwirkungen (Abschnitt 2.1A). Interaktionen zwischen gestapelten G- und C-Basen sind größer als diejenigen zwischen A und T (Tab. 24.2), was zum Teil die größere thermische Stabilität von G- und C-haltiger DNA erklärt. Man beachte, dass verschiedene Basenpaarungen in einem Stapel unterschiedliche Stapelenergien besitzen. Somit ist die Stapelenergie einer Doppelhelix sequenzabhängig. Man könnte nun vermuten, dass die hydrophoben Wechselwirkungen bei Nucleinsäuren denen von Proteinen ähnlich sind. Dies ist jedoch nicht der Fall. Wie wir gesehen haben, werden gefaltete Proteine primär durch die Entropiezunahme des Lösungsmittels Wasser stabilisiert (der sog. hydrophobe Effekt, vgl. Abschnitt 6.4A). Somit ist die Proteinfaltung entropiegetrieben und geht in Richtung höherer Enthalpie. Im Gegensatz dazu haben thermodynamische Messungen bei Nucleinsäuren ergeben, dass es hier genau umgekehrt ist, dass also die Basenstapelung enthalpiegetrieben ist und in Richtung niedrigerer Entropie geht. Theoretisch kann diese Beobachtung aber nicht erklärt werden. Dieser Unterschied zwischen hydrophoben Wechselwirkungen in Proteinen und in Nucleinsäuren kann die Tatsache widerspiegeln, dass Nucleinsäurebasen viel polarer als die meisten Aminosäureseitenketten sind (wenn man beispielsweise Adenin mit Phe- oder Leu-Seitenketten vergleicht). Was auch immer die Ursache sein mag, hydrophobe Wechselwirkungen spielen bei der Ausbildung der Nucleinsäurestruktur eine zentrale Rolle, wie durch die Denaturierung wässriger DNA-Lösungen nach Zusatz apolarer Substanzen ersichtlich ist. lonische Wechselwirkungen Jede Theorie zur Stabilität von Nucleinsäuren muss die elektrostatischen Wechselwirkungen ihrer geladenen Phosphatgruppen berücksichtigen. Beispielsweise

nimmt die Schmelztemperatur von doppelsträngiger DNA mit steigender Na*Konzentration zu, da diese Ionen die anionischen Phosphatgruppen elektrostatisch voneinander abschirmen. Andere monovalente Kationen, wie Li* und K*, zeigen ähnliche unspezifische Wechselwirkungen mit Phosphatgruppen. Divalente Kationen, wie Mg”*, Mn?* und Co?*, binden hingegen spezifisch an die Phosphatgruppen, d.h. divalente Kationen schirmen Nucleinsäuren weitaus effektiver ab als monovalente Kationen. Der Einfluss eines einzigen Mg?*-Ions ist vergleichbar mit dem von 100 bis 1000 Na*-Ionen. Tatsächlich benötigen Enzyme, die Reaktionen mit Nucleinsäuren oder Nucleotiden katalysieren, üblicherweise Mg?" zur Aktivierung. Mg”'-Ionen spielen zudem eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung vieler komplexer RNA-Strukturen.

C.

Struktur der RNA

Die RNA-Struktur wird durch dieselben Kräfte stabilisiert wie die der DNA, und ihre konformationelle Flexibilität wird durch die gleichen Faktoren wie bei der DNA eingeschränkt. Tatsächlich kann RNA sogar noch rigider sein, da mehr Wassermoleküle mit der 2’-OH-Gruppe Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Zusätzlich kommt RNA in einer höheren Vielzahl an Form und Größe vor und weist in einigen Fällen sogar katalytische Aktivität auf. Ribosomale RNA enthält doppelsträngige Abschnitte

Bakterielle Ribosomen, bestehen zu 2/3 aus RNA und zu 1 /3 aus Protein und enthalten drei stark konservierte RNA-Moleküle (vgl. Abschnitt 27.3). Das klein-

ste davon ist die aus 120 Resten bestehende 55 RNA (so benannt, da sie in der

Ultrazentrifuge einen Sedimentationskoeffizienten von 5 Svedberg (S) aufweist;

Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren (a)

2

937

5

Cal CWU FERN c—G Helix Haarnadelschleife

GO

”

2’G

G—c C—G

Interne Schleife

Gus=.G CH

ai

CUCUGGGA a ac

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Helix 4

AACTCGOUU Acad a a a

C

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Abb. 24.24 Sekundär- und Tertiärstruktur von 5S RNA von Haloarcula marismortui. (a) Sekundärstrukturdiagramm. Dieses Einzelstrang-RNA-Molekül enthält vier doppelsträngige basengepaarte Helices sowie Haarnadelschleifen, interne Schleifen und Ausbuchtungen. Die Striche stehen für Watson-Crick-Basenpaare, die Kreise stehen für andere Arten der Basenpaarung. (b) Die Röntgenstruktur in Stabform, entsprechend ihrer Sekundärstruktur wie in Teil a gefärbt. [Nach einer Röntgenstruktur von Peter Moore und Thomas Steitz, Yale University. PDBid 1))2.]

Abschnitt 21.1C). Die Sekundärstruktur von 5S RNA besteht aus mehreren Abschnitten mit Basenpaaren, die über verschiedenartige Schleifen verbunden sind (Abb. 24.240). Diese Strukturelemente kann man in der Röntgenstruktur dieses RNA-Moleküls erkennen. Die Abschnitte mit Basenpaaren bilden meistens A-Typ-Helices aus (Abb. 24.24b). In 55 RNA sind etwa zwei Drittel der Basen an Basenpaar-Wechselwirkungen beteiligt. Die übrigen Nucleotide, die sich in den Schleifen und an den 3’- und 5’-Enden befinden, können frei mit ribosomalen Proteinen oder mit ungepaarten Nucleotiden anderer rRNA-Moleküle in Wechselwirkung treten. Große RNA-Moleküle falten sich wahrscheinlich schrittweise, wie das auch bei Multidomänenproteinen der Fall ist (Abschnitt 6.5). Die RNA-Faltung stellt einen kooperativen Prozess dar, bei dem die schnelle Ausbildung kurzer Doppelstrangregionen der kollapsartigen Faltung in die endgültige Konformation vorausgeht. Die komplette Faltung kann mehrere Minuten in Anspruch nehmen, über vergleichsweise stabile Zwischenprodukte ablaufen und die Mithilfe von Proteinen erfordern. Transfer-RNA wird durch Stapelwechselwirkungen stabilisiert Die dreidimensionale Struktur einer mit Phe beladenen Hefe-Transfer-RNA (tRNAP"®) wurde 1974 von Alexander Rich in Zusammenarbeit mit Sung-Hou

Kim und ebenfalls in einer anderen Kristallform von Aaron Klug aufgeklärt. Das Molekül ist kompakt und L-förmig, wobei jeder Schenkel des L ca. 6 nm

lang ist (Abb. 24.25). Die strukturelle Komplexität der Hefe-tRNA”" erinnert an ein Protein. Obwohl nur 42 ihrer 76 Basen in einem doppelhelicalen Bereich liegen, nehmen 71 von ihnen an Basenstapelassoziationen teil. Die Kennzeichen der tRNA-Struktur sind kovalent modifizierte Basen und ungewöhnliche Basenpaare, beispielsweise Wasserstoffbrücken-Assoziate aus drei

Abb. 24.25

Röntgenkristallstruktur von

Hefe-tRNAP"*. Die 76 Nucleotide lange RNA ist in Stabform mit C grün, N blau, © rot und P orange gezeigt. Aufeinander folgende P-Atome sind über orange Stäbe miteinander verbunden. Fast alle Basen sind gestapelt und stabilisieren so die kompakte Struktur der tRNA. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Alexander Rich und Sung-Hou MIT. PDBid 6TNA.]

Kim,

938

Struktur von Nucleinsäuren

Basen. Diese tertiären Wechselwirkungen tragen zur kompakten Struktur der tRNA bei (vgl. Abschnitt 27.2A für eine eingehendere Betrachtung). Manche RNA-Moleküle sind Katalysatoren

Obwohl die Entdeckung katalytisch aktiver RNA im Jahre 1982 anfangs mit Skepsis gesehen wurde, haben nachfolgende Untersuchungen gezeigt, dass das katalytische Potential der RNA praktisch unbegrenzt ist. Es wurden mindestens neun natürlich vorkommende Typen katalytischer RNA beschrieben, und sehr viel mehr Ribozyme hat man im Labor entwickelt. Die meisten natürlich vorkommenden RNA-Katalysatoren sind am RNA-Metabolismus beteiligt wie dem Spleißen der mRNA (Abschnitt 26.3A) und der hydrolytischen RNA-Prozessierung (Abschnitt 26.3B). Die Bildung von Peptidbindungen während der Proteinsynthese wird von ribosomaler RNA katalysiert (Abschnitt 27.4). In vitro können RNA-Moleküle einige der Reaktionen katalysieren, die für ihre eigene Bildung erforderlich sind, wie z.B. die Synthese von Glykosidbindungen und die Nucleotidpolymerisierung. Diese funktionelle Vielseitigkeit hat zur Hypothese geführt, dass RNA einst viele grundlegende Aktivitäten des frühen Lebens ausgeführt hat, bevor sich DNA oder Proteine entwickelt haben. Dieses Szenario hat man RNA-Welt genannt (Exkurs 24.3). Eines der am besten beschriebenen Ribozyme ist das Hammerhead-Ribozym (engl.: hammerhead, Hammerkopf). Es handelt sich um ein kleines Molekül aus etwa 40 Nucleotiden (nt), das an der Replikation bestimmter virusartiger RNAMoleküle beteiligt ist, die Pflanzen infizieren. Außerdem kommt es in Schistosomen vor (parasitäre Plattwürmer). Das Hammerhead-Ribozym katalysiert die ortspezifische Spaltung einer seiner eigenen Phosphodiesterbindungen. Die Sekundärstruktur des 63 Nucleotide umfassenden Hammerhead-Ribozyms aus Schistosoma mansoni, das sich selbst zwischen seinen Nucleotiden C-17 und C-1.1 schneidet, weist drei doppelsträngige Stämme und einen katalytischen Kern mit zwei nichthelicalen Segmenten auf (Abb. 24.260). Die von William Scott ermittelte Röntgenstruktur dieses Hammerhead-Ribozyms (Abb. 24.265) lässt erkennen, dass es drei Helices vom A-Typ bildet. Die Nucleotide in den helicalen Stämmen.bilden hauptsächlich normale Watson-Crick-Basenpaare, wohingegen die verschiedenen Schleifen und Ausbuchtungen über eine Vielzahl von Wasserstoffbrücken und Basenstapelwechselwirkungen interagieren. Die Basen des stark konservierten, katalytischen Kerns des Hammerhead-Ribozyms sind an einem ausgedehnten Netz von Wasserstoffbrücken beteiligt.

c C Abb. 24.26

-U

Struktur eines Hammerhead-

(a) Die Sequenz und schematische Strukturdarstellung des Ribozyms ist entsprechend der in b gezeigten Röntgenstruktur angeordnet und

pp nn ftFR A

gefärbt. Farbige Linien repräsentieren die

URL,

Basenpaare, und die gestrichelten Linien

an der Spaltstelle (das C-17 und C-1.1 verbindet) und das Nucleophil (02’ von

C-17) sind weiß hervorgehoben. [Mit freundlicher Genehmigung von William Scott, University of California, Santa Cruz. PDBid 2G0Z.] 6% siehe Interactive Exercises.

%

a

a

G-C Stamm Ill C=G ce

(a)

3

AU

102 10,1

2G- A? a RR 4A A-U

ist als Stabmodell gezeigt. Das Phosphat

6. c-g-emm

|

Stamm Il

ng A=-V R Nı1c= G2!

er,

c

B

U 2

5°

U®

"U=-A

N13G_ (103

Stamm Ilt24..y nic

nl |

er.

G-C N

stellen tertiäre Wechselwirkungen dar. Die

Nucleotide sind nach dem universellen Nummerierungssystem bezeichnet. (b) Die Röntgenstruktur des Ribozyms

Stamm I

"A

Ribozyms.

al A, 9 UridinSchleife

(b)

Stamm Ill

Strukturstabilisierende Kräfte bei Nucleinsäuren

939

Die RNA-Welt Eine Reihe von Beobachtungen haben zu der Hypothese geführt, dass RNA-Moleküle die ursprünglichen biologischen Katalysatoren in der vorzellulären Zeit waren - der sogenannten RNA-Welt:

Nucleinsäuren,

aber nicht Proteine, können

ihre

eigene Synthese steuern. Zellen enthalten ein Arsenal an proteinbasierten Enzymen, zur Bearbeitung von DNA, aber nur wenige für die Prozessierung der RNA (Kapitel 25). Viele Coenzyme

in Biosyntheseprozessen

nahezu identischen Reaktionsabfolge, erzeugt aber nur 3’Phosphate; Abschnitt 11.3A). DNA ist gegenüber dieser Art Abbau nicht anfällig, weil sie keine 2’-OH-Gruppe trägt. Wegen dieser höheren chemischen Stabilität ist die DNA für die Langzeitspeicherung genetischer Information wesentlich geeigneter als RNA. B,

und Energie gewinnen-

den Stoffwechselwegen sind Ribonucleotide (z.B. ATP, NAD*, FAD und Coenzym A). Bei Viren mit einzel- oder doppelsträngigem RNA-Genom ist RNA bis heute der Träger der genetischen Information. Die Tatsache, dass RNA-basierte Funktionen über alle drei Domänen des Lebens (Archäa, Bakterien und Eukaryoten) verteilt sind, liefert zusätzliche Belege dafür, dass die Aufgabe der RNA in heutigen Zellen schon früh in der Evolution festgelegt wurde. Wenn wir unterstellen, dass es einst eine RNA-Welt gegeben hat, dann müssen wir zwei Fragen beantworten: Warum haben Proteinkatalysatoren den Platz der meisten Ribozyme eingenommen und warum wurde DNA zum vorherrschenden Molekül der Vererbung? Die erste Frage lässt

270 3’

OH

oO

5

[0] ...

oO

RNA

B,

B, +1

oO oO

ne

(0)

OH

Ne O

(6)

HO 2',3’-cyclisches Nucleotid Ba

N

D2

sie stabiler ist als RNA, weil RNA für die basenkatalysierte

Hydrolyse sehr anfällig ist. Der Reaktionsmechanismus ist in der nebenstehenden Abbildung gezeigt. Die baseninduzierte Deprotonierung der 2’-OH-Gruppe erleichtert den nucleophilen Angriff auf das benachbarte Phosphoratom, bei dem das RNA-Rückgrat gespalten wird. Die entstehende cyclische 2’,3’-Phosphatgruppe hydrolysiert nachfolgend, und es entsteht als Produkt ein 2’- oder 3’-Phosphat (die von der RNase A katalysierte Hydrolyse der RNA folgt einer

B, +1

5H

So v= ‚Be ..d

sich leicht beantworten, wenn man bedenkt, dass die 20 Ami-

nosäurereste der Proteine funktionelle Gruppen besitzen Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Amid- und Carboxylatgruppen - die in der RNA fehlen. Deren vier Nucleotide sind viel einheitlicher und weniger reaktiv. Somit haben Proteine die RNA wahrscheinlich auf Grund ihrer größeren chemischen Vielfalt als zelluläre Arbeitspferde ersetzt. Trotzdem spielt die RNA weiterhin die vorherrschende Rolle bei der Proteinsynthese. Ribosomen bestehen vorwiegend aus RNA, und diese ist auch für die Knüpfung von Peptidbindungen verantwortlich (Abschnitt 27.4B). Hinsichtlich des Auftretens von DNA lässt sich sagen, dass

OH

B,

0—Po3

Drpm

OH

oder

0— Por

...

2'-Nucleotid

Dies hilft, C-17 so zu positionieren, dass sein O2’-Atom für den nucleophilen

Angriff auf das P-Atom korrekt ausgerichtet ist. Dieses P-Atom verbindet das O3’-Atom von C-17 mit dem O5’ von C-1.1, sodass ein cyclischer 2’,3'-Phosphodiester an C-17 und eine freies 5’-OH an C-1.1 entsteht. Die 2’-OH-Gruppe des

invarianten G-8 und N1 des invarianten G-12, wenn deprotoniert, scheinen kor-

rekt positioniert zu sein, um in dieser Reaktion als Säure- und Basenkatalysator zu fungieren. Interessant ist, dass keine Metallionen im Bereich des aktiven Zentrums des Ribozyms vorkommen.

3’-Nucleotid

940

Struktur von Nucleinsäuren

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Erklären Sie die molekularen

Vorgänge bei der Denaturierung und Renaturierung von Nucleinsäuren. 2. Beschreiben Sie die Kräfte, die Nucleinsäurestrukturen stabilisieren.

3. Welche Eigenschaften befähigen RNA-Moleküle, als Katalysatoren zu wirken?

Das Hammerhead-Ribozym ist kein echter Katalysator, da es sein eigenes Substrat darstellt und somit nicht in seinen Ausgangszustand zurückkehren kann. Andere Ribozyme katalysieren jedoch vielfache Umsetzungen, ohne dass sie selbst dabei verändert werden. Ribozyme lassen sich in vielem mit Proteinenzymen vergleichen: bezüglich ihrer Geschwindigkeitserhöhung (10°’fach für das Hammerhead-Ribozym), bezüglich ihrer Fähigkeit, Cofaktoren wie Metallionen oder Imidazolgruppen zu verwenden und bezüglich ihrer Regulation durch kleine allosterische Effektoren. RNA-Molekülen fehlt allerdings das Repertoire funktioneller Gruppen, das Proteinkatalysatoren haben. Trotzdem können RNA-Moleküle

Konformationen

annehmen,

die spezifisch

Substrate

binden,

sie für die Reaktion ausrichten und den Übergangszustand stabilisieren — typische Kennzeichen von Enzym-Katalysatoren.

3

_Fraktionierung von Nucleinsäuren

In Abschnitt 5.2 haben wir uns mit den geläufigsten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Proteinen beschäftigt. Die meisten dieser Verfahren werden, oft in modifizierter Form, zur Fraktionierung von Nucleinsäuren nach Größe, Zusammensetzung und Sequenz benutzt. Natürlich gibt es auch Techniken, die ausschließlich für Nucleinsäuren verwendet werden. Dieser Abschnitt konzentriert sich auf die gebräuchlichsten Nucleinsäuretrennverfahren. In Zellen sind Nucleinsäuren immer mit Proteinen assoziiert. Nach dem Zellaufschluss werden die Nucleinsäuren üblicherweise von den Proteinen getrennt. Dies kann durch Extraktion einer Protein-Nucleinsäure-Mischung mit einer Phenoliösung erreicht werden, wobei die Proteine ausfallen und durch Zentrifu-

gation abgetrennt werden können. Alternativ können Proteine und Nucleinsäuren durch die Behandlung mit Detergenzien, Guanidiniumchlorid oder durch hohe Salzkonzentrationen voneinander getrennt werden. Ebenso können Proteine enzymatisch durch Proteasen abgebaut werden. Bei all diesen Verfahren können die Nucleinsäuren als RNA-DNA-Gemisch durch Ausfällung mit Ethanol isoliert werden. Bei Behandlung der Präzipitate mit pankreatischer DNase wird DNA eliminiert und RNA gewonnen. Umgekehrt kann DNA von RNA durch RNase befreit werden. Bei allen sonstigen Manipulationen müssen die Nucleinsäuren vor Nucleaseabbau geschützt werden, wobei Nucleasen sowohl im Untersuchungsmaterial als auch an menschlichen Händen vorkommen. Chelatisierende Agenzien, wie EDTA, inhibieren Nucleasen, indem sie Komplexe mit divalenten Metallionen bilden, welche für die Nucleaseaktivität erforderlich sind. Glasgeräte im Labor können zudem autoklaviert werden, wobei einige Nucleasen hitzedenaturiert werden. Dennoch sind Nucleinsäuren gewöhnlich leichter handhabbar als Proteine, da ersteren in vielen Fällen eine komplexe Tertiärstruktur fehlt, was sie relativ unempfindlich gegenüber extremen Versuchsbedingungen macht.

A.

Chromatographie

Viele chromatographische Techniken, welche zur Trennung von Proteinen (Abschnitt 5.2C) benutzt werden, eignen sich auch für Nucleinsäuren. Besonders häufig wird dabei Hydroxylapatit (eine Form des Calciumphosphats [Cas(PO,);OH]) zur Reinigung und Fraktionierung von DNA eingesetzt. Doppelsträngige DNA bindet daran fester als die meisten anderen Moleküle. Somit kann DNA rasch isoliert werden, wenn man ein Zelllysat auf eine Hydroxylapatitsäule gibt, diese mit einem Phosphatpuffer niedriger Konzentration zur Elution von RNA und Proteinen wäscht und dann die DNA mit einer konzentrier-

ten Phosphatlösung eluiert.

Fraktionierung von Nucleinsäuren

941

Affinitätschromatographie ist zur Isolierung bestimmter Nucleinsäuren hilfreich. So haben beispielsweise die meisten eukaryotischen Messenger-RNAs (mRNAs) eine poly(A)-Sequenz am 3’-Ende (Abschnitt 26.3A). Sie können deshalb mit an Agarose oder Cellulose gebundenen poly(dT)-Sequenzen isoliert werden. Die poly(A)-Sequenzen binden bei hohen Salzkonzentrationen und tiefen Temperaturen spezifisch an die komplementären poly(dT)-Reste und können später unter dissoziierenden Bedingungen freigesetzt werden.

B.

Elektrophorese

Spezifische Nucleinsäuren können durch Gelelektrophorese (Abschnitt 3.4B) getrennt werden, da ihre elektrophoretischen Mobilitäten in diesen Gelen umgekehrt proportional zu ihren molaren Massen sind. DNA mit mehr als ein paar Tausend Basenpaaren können jedoch selbst schwach quervernetzte Polyacrylamidgele nicht mehr durchwandern, weshalb sie in Agarosegelen getrennt werden müssen. Konventionelle Gelelektrophorese kann nur DNA unter 100.000 bp trennen, denn bei größeren Molekülen geht die Linearität zwischen Mobilität und Größe zunehmend verloren. Die Entwicklung der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFG) (engl.: pulsed-field gel elecrophoresis, PFGE) durch Charles Cantor und Cassandra Smith hat diese Obergrenze bis zu 10 Millionen bp (6,6 GD) heraufgesetzt. In einem einfachen PFG-Gerät wird die Polarität der Elektroden periodisch umgekehrt, wobei jeder Puls zwischen 0,1 bis 1000 s dauert, je nach Größe der zu trennenden DNA. Mit jedem Polaritätswechsel muss sich die wandernde DNA nach dem neuen elektrischen Feld ausrichten, bevor sie weiterlaufen kann. Für eine gewisse Zeit wandert sie dann sogar rückwärts. Da sich kleinere Moleküle schneller umorientieren, als große dies vermögen, werden im Laufe der Zeit unterschiedlich große DNA-Moleküle getrennt

(Abb. 24.27).

Interkalierende Agenzien färben DNA Die verschiedenen DNA-Banden in einem Gel können durch planare, aromati-

sche Kationen wie Ethidium, Proflavin und Acridin-Orange angefärbt werden.

+

OH;

Ethidium

HN

L N

| 1% r H Proflavin

NH,

EG (CH3)aN en. N {

NICH),

Acridinorange

Diese Farbstoffe binden an die Doppelstrang-DNA durch Interkalation (sie schieben sich zwischen die gestapelten Basen; Abb. 24.28), wobei die Fluoreszenz im UV-Bereich im Vergleich zum freien Farbstoff intensiviert wird. Kleinste DNAMengen (bis zu 50 ng) können in einem Gel durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht werden. Einzelsträngige DNA und RNA stimulieren ebenfalls

Abb. 24.27 Pulsfeld-Gelelektrophorese. Die drei Proben enthalten DNA-Fragmente mit Größen von 0,5 bis 48,5 kb. Die kleinsten Fragmente, die am schnellsten wandern, befinden

sich unten im Gel. [Mit freundlicher Genehmigung von Hoefer Scientific Instruments.]

942

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.28 Röntgenkristallstruktur eines Komplexes aus Ethidium und 5-lodo-UpA. Ethidium (rot) interkaliert zwischen die Basenpaare doppelhelicaler Dinucleotide und liefert somit ein Modell für die Bindung von Ethidium an Doppelstrang-DNA. [Nach Tsai, C.-C., Jain, S.C. und Sobell,

H.M., Proc. Nact. Acad. Sci. 72, 629 (1975).]

eine Ethidiumfluoreszenz, wenn auch in einem weit geringeren Ausmaß Doppelstrang-DNA.

als

Durch die Southern-Blot-Technik wird DNA mit spezifischen Sequenzen identifiziert

Eine von Edwin Southern entwickelte Technik, der Southern-Blot, erlaubt, DNA mit spezifischer Basensequenz zu identifizieren (Abb. 24.29). Dieses Verfahren macht sich die besonderen Eigenschaften von Nitrocellulose zunutze, einzelsträngige, aber nicht doppelsträngige DNA fest zu binden. Im Anschluss an die Gelelektrophorese einer Doppelstrang-DNA wird das Gel in 0,5 M NaOH-Lösung getaucht, was die DNA in die Einzelstränge trennt. Das Gel wird dann mit einer Nitrocellulosemembran bedeckt. Die Moleküle im Gel werden anschließend auf die Nitrocellulose übertragen, indem die Flüssigkeit von einer adsorbierenden Papierschicht durch die Nitrocellulose gesogen- wird. Die DNA kann auch elektrophoretisch auf die Nitrocellulose transferiert werden, was man Elektro-Blot nennt. Die einzelsträngige DNA bindet an die Nitrocellulose an derselben Position, die sie im Gel innehatte. Nach Trocknung bei 80°C zur permanenten Fixierung der DNA wird die Nitrocellulose mit einem minimalen

Volumen an °*P-markierter einzelsträngiger DNA oder RNA mit zur gesuchten Abb. 24.29 Detektion von DNA mit spezifischer Basensequenz durch Southern-Blot-Hybridisierung.

rn 2

— Be

Inkubation der an

-

Il RT

—

[|

——

NaOH-Denatu-

Nitrocellulose

rierung und F Ubertragung (Blot) auf Nitrocellulose- |

gebundenen DNA mit einer 32P-markierten DNA oder RNA

Papier

spezifischer Sequenz

a

Autoradiographieren

—>-

——

SEEN

|

—| —,—

DNA komplementär

|

zur 32P-markierten

| m

Sonde

|

nen

)

Elektrophoresegel

Nitrocellulose-

mit der zu

Replikat des

untersuchenden DNA

Elektrophoresegels

Hybridisierung

Autoradiogramm

DNA-Protein-Wechselwirkungen DNA komplementärer Sequenz inkubiert. Der Blot wird mehrere Stunden bei geeigneter Renaturierungstemperatur inkubiert, damit die Sonde mit ihrer Ziel_ „ sequenz hybridisieren kann. Die Nitrocellulose wird gewaschen, um ungebundene radioaktive Nucleinsäure zu entfernen, getrocknet und dann durch Auflegen eines Röntgenfilms autoradiographiert. Die Moleküle, die komplementär zur Sequenz der radioaktiv markierten Sonde sind, hinterlassen an der jeweili-

gen Position geschwärzte Stellen auf dem entwickelten Film.

Spezifische RNA-Sequenzen können durch eine Variante des Southern-Blots, die als Wortspiel Northern-Blot genannt wird, detektiert werden. Dabei wird RNA auf der Nitrocellulose immobilisiert und anschließend mit radioaktiver, komplementärer RNA oder DNA erfasst. Ein spezifisches Protein kann durch den Western- oder Immunoblot analog identifiziert werden, indem gegen das Protein gerichtete Antikörper verwendet werden, ähnlich wie beim ELISA

(Abb. 5.3).

4

DNA-Protein-Wechselwirkungen

Die Zugänglichkeit genetischer Information hängt von der Funktion von Proteinen ab. Diese müssen die DNA erkennen und mit ihr wechselwirken, so dass die verschlüsselte Information der DNA (bei der Replikation) oder der RNA (bei der Transkription) abgelesen werden kann. Selbst die grundlegendsten Vorgänge setzen bereits das Vorhandensein vieler Proteine voraus, die miteinander und mit den Nucleinsäuren wechselwirken können. Zusätzlich reguliert der Organismus die Expression der meisten Gene, wozu wiederum weitere Proteine als

Repressoren oder Aktivatoren der Transkription benötigt werden. Viele Proteine binden DNA unspezifisch, d.h. unabhängig von der Nucleotidsequenz. Beispielsweise binden Histone (diese Proteine sind für die DNA-Packung verantwortlich; Abschnitt 24.5A) und gewisse DNA-Replikationsproteine (diese müssen potentiell mit allen Sequenzen eines Genoms interagieren können) primär durch Interaktionen der funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat an die DNA. Proteine, die spezifische DNA-Sequenzen erkennen, binden zunächst vermutlich nur schwach und unspezifisch an die DNA, suchen die Polynucleotidkette bis zu ihrer Zielsequenz ab und binden erst dort spezifisch und fest. Die meisten DNA-Protein-Komplexe besitzen

Dissoziationskonstanten im Bereich von 10°” bis 10°'” M. Diese Werte entsprechen einer Bindung, die 10° bis 10’mal fester ist als unspezifische Bindungen. Sequenzspezifische DNA-Protein-Wechselwirkungen müssen extrem genau sein, so dass die Proteine eine Bindung an der genau richtigen Stelle - im menschlichen Genom unter Milliarden von Basenpaaren — eingehen können. Wie interagieren solche Proteine mit ihrer Zielsequenz auf der DNA? Die sequenzspezifischen DNA-bindenden Proteine brechen normalerweise die Basenpaare der DNA, an die sie binden, nicht auf. Sie unterscheiden jedoch die vier Basenpaare (A- T,T-A,G- Cund C- G) anhand ihrer funktionellen Gruppen, die in die große und kleine Furche der DNA reichen. Wie in Abbildung 24.2 gezeigt, sind diese Gruppen der B-DNA in der großen Furche stärker exponiert als in der engeren kleinen Furche. Zudem enthält die große Furche mehr sequenzspezifische Gruppen als die kleine (Abb. 24.1). Wie in einer systematischen Untersuchung von 129 Protein-DNA-Komplexen gezeigt werden konnte, sind nur etwa ein Drittel der Wechselwirkungen zwischen dem bindenden Protein und der DNA Wasserstoffbrückenbindungen, entweder direkt oder über dazwischenliegende Wassermoleküle vermittelt. Etwa zwei Drittel aller Wechselwirkungen sind van-der-Waals-Kontakte. Ebenso treten ionische Wechselwirkungen mit den Phosphatgruppen des Rückgrats auf. Oft wird die Komplementarität der Bindungspartner durch einen „induced fit“ (engl.: induzierte Passform, d.h. durch die Bindung herbeigeführte Konformationsänderung) erhöht. Dabei ändern Protein und Nucleinsäure ihre Konformation und sorgen so für eine en-

Verständnisfrage zu Abschnitt 3 Ih Welche Fraktionierungsverfahren

trennen Nucleinsäuren nach ihrer Bindungsaffinität? Welche nach ihrer Größe?

943

Struktur von Nucleinsäuren

944

gere Wechselwirkung. Manchmal bewirken diese Änderungen, dass die bindenden Proteine mit anderen Proteinen wechselwirken können oder dass die Zugänglichkeit der DNA für andere Moleküle verändert wird. Im Folgenden werden wir einigen Beispielen spezifischer DNA-Protein-Bindungen begegnen und werden auch in späteren Abschnitten immer wieder auf sie stoßen.

A.

Restriktionsendonucleasen

Typ-ll-Restriktionsendonucleasen zerstören fremde DNA in Bakterienzellen, indem sie diese an spezifischen Stellen spalten, welche normalerweise durch die wirtseigene Methyltransferase modifiziert werden (Abschnitt 3.4A). Restriktionsenzyme erkennen palindromische DNA-Sequenzen von 4 bis 8 bp so spezifisch, dass ein einziger Basenaustausch ihre Aktivität millionenfach reduziert. Dieses hohe Maß an Spezifität ist notwendig, da sonst fälschlicherweise andere DNA-Sequenzen gespalten werden könnten.

(a)

Die Röntgenkristallstruktur der Endonuclease EcoRI im Komplex mit einem

B-DNA-Segment, welches die Erkennungssequenz des Enzyms beinhaltet, wurde von John Rosenberg bestimmt. Die DNA bindet in der symmetrischen Spalte zwischen den beiden identischen, 276 Reste großen Untereinheiten des dimeren Enzyms, was die palindromische Erkennungssequenz der DNA erklärt (Abb. 24.30). Die Proteinbindung bewirkt, dass sich der Öffnungswinkel zwischen den zwei zentralen Basenpaaren der Erkennungssequenz um ca. 50° zur kleinen Furche hin öffnet. Somit sind diese zwei Basenpaare nicht mehr gestapelt, dennoch bleibt die DNA fast gerade, da sich die benachbarten Basenpaare kompensatorisch biegen. Dies entwindet die DNA um 28° und öffnet die große Furche an der Erkennungssequenz um 0,35 nm. Die N-terminalen Enden eines Paares paralleler Helices werden in die erweiterte große Furche verschoben und werden dort Teil eines Wasserstoffbrücken-Netzwerks mit den Basen der Erkennungssequenz. Jede der beiden Helices stammt dabei von einer Untereinheit des dimeren Proteins. Die Phosphodiesterspaltstellen der DNA liegen zwei Basen vom Zentrum des Palindroms entfernt (Tab. 3.2). Bestimmte andere Restriktionsendonucleasen (beispielsweise EcoRV; Abb. 24.31) induzieren ebenfalls Knicke in der DNA, indem sie entweder die kleine Furche öffnen eo die grofBe Furche ae: Dennoch sind die

(b)

Abb. 24.30

ten oder dem , Rückgrat des Proteins dit primäre rc für die Kahl sequenzspezifischer Endonuclease-DNA-Komplexe und nicht die DNA-Verkrummung

Röntgenkristallstruktur der Restrik-

tionsendonuclease EcoRl im Komplex mit DNA. Einzelsträngige Oligonucleotide mit der Sequenz 5'- TCGEGAATTCGCG

per se. Im BamHI-DNA-Komplex

- 3’ sind mit Ausnahme des

am 5’-Ende angehängten T selbstkomplementär

und bilden spontan 12 bp lange, RS DNA-Fragmente jedem

Ende.

des Enzyms

mit einem

ängig

© c

überhäng enden Tan

Die 6 bp lange Erkennungssequenz ist unterstrichen

Kalottenmodell

z.B. nimmt

jeder mögliche Wasserstoffbrü-

ckendonator und -akzeptor in der großen Furche der Erkennungssequenz an direkten oder von Wassermolekülen vermittelten Wasserstoffbrückenbindungen zum Protein teil. Keine andere DNA-Sequenz ermöglicht ein solches Maß an Komplementarität zu BamHl.

Gezeigt sind das

mit den Zucker-Phosphat-Ketten

in Gelb, den Basen der Erkennungssequenz e Cyan und den übrigen Basen in Weiß. Das Protein

B.

ist in Bänderform

In Prokaryoten wird die Expression vieler Gene zumindest teilweise über Repressoren geregelt. Diese Proteine binden innerhalb der Gene oder in deren Nähe an die DNA und verhindern so deren Transkription (Abschnitt . Diese Repressoren enthalten oft Polypeptidsegmente aus ca. 20 Resten, wel vr ein Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH; engl.: turn, Biegung) aus zwei a-Helices bilden, die in einem Winkel von 120° zueinander stehen. HTH-Motive, welche offensichtlich evolutionär miteinander verwandt sind, treten als Teile von Domänen auf, die zwar alle DNA binden, aber ansonsten strukturell stark vari. Es ist bedeutsam, dass HTH-Motive strukturell nur stabil sind, wenn sie Teile;größerer Proteine darstellen.

mit seinen

zwei

identischen

Untereinheiten in Rot und Blau wiedergegeben Der Komplex wird sowohl

mit Blickrichtung

im rechten Winkel auf die DNA-Helixachse (a) als auch es

Achse ne ee Furche der DNA [Nach

einer

Rosenberg,

62«|

dieser Achse

|horizontal und die große

zeigt von

rechts zum

Röntgenkri stallstruktur

University

(b) geze

of Pittsbur

siehe Kinemage Exercise 18.1

v

Protein

hin

Motive der prokaryotischen Transkriptionskontrolle

DNA-Protein-Wechselwirkungen

945

Röntgenkristallstruktur der Restriktionsendonuclease EcoRV im Komplex mit DNA.

Das 10 bp DNA-Segment besitzt die selbstkomplementäre Sequenz 5’-GGGATATCCC-3’; die 6 bp lange Erkennungssequenz des Enzyms ist unterstrichen. Die Farbgebung entspricht der in Abb. 24.30. (a) Der Komplex entlang seiner zweizähligen Achse betrachtet, auf die große Furche der DNA gerichtet. Die beiden symmetrisch angeordneten Proteinschleifen über der großen Furche (Reste 182186) sind die einzigen Stellen, an denen das Protein basenspezifische Kontakte zur DNA ausbildet. (b) Der Komplex aus a von rechts gesehen (die große Furche zeigt nach links). Man beachte, wie das Protein die DNA zur

(a)

großen Furche hin knickt. [Nach einer

(b)

Röntgenkristallstruktur von Fritz Winkler,

Hoffmann-LaRoche Ltd., Basel. PDBid 4RVE]

Wie bei den Endonucleasen sind die Erkennungssequenzen, an welche die Re-

siehe Kinemage Exercise 18.2.

pressoren binden, meist in palindromischer Symmetrie angeordnet und werden Operatoren genannt. Typischerweise sind Repressoren Homodimere, obwohl ihre Interaktionen mit der DNA nicht immer genau symmetrisch sein müssen. Für die Bindung sind Wechselwirkungen zwischen den Aminosäureseitenketten der zweiten Helix aus dem HTH-Motiv (der „Erkennungs“-Helix) und den Basen sowie dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA bestimmend. Stephen Harrison hat die Röntgenkristallstruktur eines dimeren Repressors aus dem Bakteriophagen 434, gebunden an seine 20 bp lange Erkennungssequenz, aufgeklärt. Der 434-Repressor assoziiert mit der DNA zu einem Komplex mit zweizähliger Symmetrie. Dabei bindet eine Erkennungshelix von jeder Untereinheit in aufeinander folgenden Windungen an die große Furche der DNA (Abb. 24.32). Der Repressor fügt sich eng an die DNA-Oberfläche an und interagiert mit den gepaarten Basen und den Zucker-Phosphat-Ketten durch ein ausgeklügeltes Netzwerk aus Wasserstoffbrücken, Salzbrücken und van-der-WaalsRöntgenkristallstruktur eines Teils des Repressors aus dem Phagen 434 im Komplex mit seiner Ziel-DNA. Ein Strang der 20 bp langen DNA (links) besitzt die Sequenz 5'-TATACAA-

GAAAGTTTGTACT-3’. (a) Ein Skelettmodell zeigt die DNA und die ersten 63 Reste der zwei identischen Untereinheiten des Proteins (blau und rot, nur C,-Rückgrat). (b) Schematische Darstellung, die zeigt, wie das Helix-Turn-Helix-Motiv (umfasst Helices a2 und a3) mit der DNA interagiert. Die Aminosäurereste sind

durch den Ein-Buchstaben-Code gekennzeichnet. Kurze Striche aus der Polypeptidkette repräsentieren NH-Gruppen,

gestrichelte Linien Wasserstoffbrücken und nummerierte Kreise bezeichnen DNAPhosphate. Der kleine Kreis stellt ein Wassermolekül dar. (c) Ein (a) entsprechendes Kalottenmodell. Alle Nicht-HAtome des Proteins sind gelb gezeichnet. [Mit freundlicher Genehmigung von Aneel Aggarwal, John Anderson und Stephen Harrison, Harvard University.

PDBid 2OR1.] siehe Interactive Exercises und Kinemage Exercise 19.

(€)

946

Struktur von

Nucleinsäuren

Kontakten. In diesem Repressor-DNA-Komplex krimmt sich die DNA um das Protein in einem Bogen, der einen Radius von ca. 6,5 nm hat. Dadurch wird die kleine Furche nahe der Mitte (zwischen den zwei Protein-Monomeren) um ca. 0,25 nm gestaucht und gleichzeitig an den Enden der Furche um ca. 0,25 nm geöffnet. 62 siehe Guided Exploration 23: Transcription factor-DNA interactions.

Der trp-Repressor aus E. coli bindet indirekt an DNA Der trp-Repressor aus E. coli reguliert die Transkription von Genen, die für die Tryptophanbiosynthese zuständig sind (Abschnitt 28.2C). Paul Sigler be-

stimmte die Röntgenkristallstruktur dieses Proteins im Komplex mit einem 18 bp langen, palindromischen DNA-Abschnitt, der dem trp-Operator sehr ähnelt. Die durch ein zusätzliches Tam 5’-Ende verlängerte Sequenz eines Einzelstrangs lautet TGTACTAGTTAACTAGTAC, wobei die Zielsequenz des trpRepressors unterstrichen ist. Das homodimere Repressofprotein zeigt ebenfalls ein HTH-Motiv. Die Erkennungshelices binden erwartungsgemäß an aufeinander folgende große Furchen der DNA, wobei jede in Kontakt mit der halben Operatorsequenz steht (ACTAGT:; Abb. 24.33). Es bestehen zahlreiche Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem trp-Repressor und den nicht veresterten Phosphatsauerstoffatomen der DNA. Erstaunlicherweise gibt es aber keine direkten Wasserstoffbrücken oder apolare Kontakte, welche die Spezifität des Repressors für seinen Operator erklären könnten. Vielmehr sind alle Wasserstoffbrückenbindungen bis auf eine über Wassermoleküle verbrückt. Zudem enthält der Operator mehrere Basenpaare, welche keinen Kontakt zum Repressor haben, deren Mutation aber dennoch die Repressorbindungsaffinität drastisch erniedrigt. Es liegt daher nahe, dass der Operator eine sequenzspezifische Konformation annimmt, welche günstige Kontakte mit dem Repressor ermöglicht. Andere DNA-Sequenzen könnten theoretisch dieselbe Konformation annehmen, wären aber wegen der zu hohen energetischen Anforderungen außerstande, einen stabilen Komplex mit dem Repressor zu bilden. Dieses Phänomen, bei dem das Protein die Basensequenz einer DNA an deren Rückgratkonformation oder -flexibilität erkennt, nennt man indirektes Ablesen. Damit ist die Vorstellung, dass Proteine Nucleinsäuresequenzen ausschließlich durch Paarung von spezifischen Aminosäureseitenketten mit Nucleotidbasen erkennen, analog einer Watson-Crick-Basenpaarung, nicht länger haltbar. Der met-Repressor bindet DNA über ein zweisträngiges ß-Faltblatt

Abb. 24.33

Röntgenkristallstruktur eines

trp-Repressor-Operator-Komplexes aus E. coli. Die zweizählige

molekulare

Achse verläuft hori-

zontal und liegt in der Papierebene. Die zwei identischen

Proteinuntereinheiten

sind als Bänder-

modell in Grün und Blau dargestellt, wobei die HTH-Motive dunkler sind. Die 18 bp lange, selbstkomplementäre

Repressor

DNA

ist gelb. Der Trp-

bindet seinen Operator

nur, wenn

auch

L-Tryptophan (rot) gebunden ist. Man beachte, dass die Protein-Erkennungshelices erwartungs-

gemäß an aufeinander folgende große Furchen der DNA

binden;

sie erstrecken

zur DNA-Helixachse, 434-Repressors

Furchen

ihrer

(Abb. 24.32). von N

&

Pau sieha

sıene

beinahe

gebu

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sich jedoch senkrecht

wohingegen

des

großen

Röntgenkristallstruktur D

EXETCISES.

|

Der met-Repressor reguliert die Transkription von Genen, die in der Methioninbiosynthese eine Rolle spielen. Simon Phillips bestimmte zuerst die Röntgenkristallstruktur des met-Repressors aus E. coli ohne DNA. Dem homodimeren Protein fehlt ein HTH-Motiv. Modellstudien weisen aber darauf hin, dass der Repressor an seine palindromische Ziel-DNA durch ein Paar symmetrischer, hervorstehender a-Helices bindet, ähnlich wie die Erkennungshelices in HTHMotiven mit DNA interagieren. Die anschließende Bestimmung der Röntgenkristallstruktur des met-Repressor-Operator-Komplexes zeigte jedoch, dass das Protein seine DNA-Zielsequenz durch ein Paar symmetrischer ß-Stränge bindet, welche den überstehenden a-Helices gegenüber liegen. Sie bilden ein zweisträngiges antiparalleles ß-Faltblatt, das in die große Furche der DNA hineinragt (Abb. 24.34). Die sequenzspezifischen Kontakte zur DNA werden durch Wasserstoffbrückenbindungen und wahrscheinlich durch indirektes Ablesen hergestellt. Dies zeigt, dass Erkenntnisse selbst aus einfachen Modellstudien mit Vorsicht zu genießen sind. Im Falle des met-Repressor-Operator-Komplexes erwies sich das Modell als falsch, weil es die kleinen Anpassungen des Proteins und der DNA zur besseren Bindung aneinander im Modell nicht berücksichtigen konnte.

DNA-Protein-Wechselwirkungen Abb. 24.34

947

Röntgenkristallstruktur eines

met-Repressor-Operator- Komplexes aus E. coli.

Die aus 104 Resten bestehenden Repressoruntereinheiten sind in Gold wiedergegeben. Die selbstkomplementäre, 19 bp lange DNA ist als blaues Kugel-Stab-Modell'gezeigt. Das Methioninderivat S-Adenosylmethionin (grün) muss an den Repressor gebunden sein, damit dieser an die DNA bindet. Man beachte, dass die DNA vier Repressoruntereinheiten gebunden hat: Untereinheitenpaare bilden symmetrische Dimere, in welchen jede Untereinheit einen Strang des zweisträngigen ß-Faltblattes liefert, welches in die große Furche der DNA ragt (oben links und unten rechts). Zwei dieser Dimere interagieren quer zur zwei-

zähligen Komplexachse über ihre N-terminalen Helices, die sich über der großen Furche treffen.

C

Eukaryotische Transkriptionsfaktoren

[Mit freundlicher Genehmigung von Simon Philips, Rutherford Appleton Laboratory, Oxon. PDBid ICMA.] 6% siehe Interactive Exercises.

Da in Eukaryoten die Gene in verschiedenen Zelltypen selektiv exprimiert werden müssen, erfordert dies eine komplexere Maschinerie als in Prokaryoten. Bekannte prokaryotische Repressoren enthalten entweder ein HTH-Motiv oder ähneln dem met-Repressor. Eukaryotische DNA-bindende Proteine dagegen verwenden eine viel größere Anzahl struktureller Motive. Diese Proteine, die Transkriptionsfaktoren genannt werden (Abschnitt 26.2C), fördern die Transkription der Gene, indem sie an diese oder in der Nähe von diesen an DNA-Sequenzen binden. In diesem Abschnitt beschreiben wir einige DNA-bindende Motive in eukaryotischen Transkriptionsfaktoren. Zinkfinger als DNA-Bindungsmotive Das erste bei Eukaryoten vorkommende DNA-Bindungsmotiv, den sogenannten Zinkfinger, entdeckte Aaron Klug im Transkriptionsfaktor IIITA (TFIIIA) aus Xenopus laevis, einem afrikanischen Krallenfrosch. TFIIIA besteht aus 344 Aminosäureresten und enthält neun ähnliche, ca. 30 Aminosäuren lange Abschnitte, in denen jeweils zwei invariante Cys- und His-Reste liegen. Jeder dieser Abschnitte bindet ein Zn?*-Ion, welches durch diese His- und Cys-Reste tetraedrisch koordiniert wird (ein Cys,-His,-Zinkfinger; Abb. 24.35a und Abb. 6.37). In manchen Zinkfingern sind die zwei His durch zwei Cys ersetzt, oder manche enthalten sechs Cys-Reste, welche zwei Zn’*-Ionen binden. Tatsächlich sind die

Zinkfinger durch strukturelle Vielfalt gekennzeichnet. Die Zinkionen scheinen immer relativ kleine, globuläre Domänen miteinander zu verbrücken, eine Leistung, die sonst von viel größeren, hydrophoben Proteinkernen erbracht wird (Abschnitt 6.4A). Abb. 24.35 Cys,-His,-Zinkfinger-Motiv. (a) NMR-Struktur eines Zinkfingers aus dem Xenopus-Protein Xfin. Die Zn’*-Ionen sind mit den Atomen ihrer His- und Cys-Liganden kugelförmig gezeigt; Zn hellblau, C grau, N blau, S gelb

und H weiß. [Mit freundlicher Genehmigung von Michael Pique, The Scripps Research Institute, La Jolla, California. Nach einer NMR-Struktur von Peter E. Wright, The Scripps Research Institute. PDBid IZNF.] (b) Röntgenkristallstruktur eines Drei-Zinkfinger-Segments von Zif268 im Komplex mit einer 10 bp langen DNA. Das Protein und die DNA (mit einem Einzelnucleotidüberhang an beiden Enden) sind in Stabform wiedergegeben. Die überlagerten Zylinder und Bänder markieren die a-Helices und ß-Faltblätter des Proteins. Finger 1 ist orange, Finger 2 gelb, Finger 3 violett, die DNA

blau und die Zn?*-Ionen sind als weiße Kugeln dargestellt. Man

beachte, wie sich der N-Terminus (tiefer liegend) von jeder Zinkfinger-Helix in die große DNA-Furche erstreckt und dort mit drei Basenpaaren Kontakte ausbildet. [Mit freundlicher Genehmigung von Carl Pabo, MIT. PDBid 1ZAA.] @% siehe Interactive Exercises.

(b)

948

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.36 Röntgenkristallstruktur der GAL4 DNA-Bindungsdomäne im Komplex mit DNA. (a) Ein Bändermodell der Zinkfinger-Domäne des Proteins (Reste 8-40) mit den sechs Cys-Seitenketten in Stabform (gelb) und den Zn’*-Ionen als silberne Kugeln. Man vergleiche diese Struktur mit denen in Abb. 6.37 und 24.35a. (b) Der Komplex aus dimerem GAL4-Protein und einer 19 bp langen, palindromischen DNA (das zentrale Basenpaar ausgenommen), welche die Protein-

bindungsstelle enthält. Die Struktur ist in Röhrenform dargestellt, mit der DNA in Rot, dem

Proteinrückgrat in Cyan und Zn?* als gelbe Kugeln. Die Blickrichtung verläuft entlang der zweizähligen Komplexachse (links) und, um 90° gedreht, entlang der horizontalen Achse (rechts). Man beachte, wie das C-terminale Ende jeder N-terminalen Helix einer Untereinheit in die große DNA-Furche ragt. [Teil b mit freundlicher Genehmigung und Teil a nach einer Röntgenkristallstruktur von Ronen Mamorstein und Stephen Harrison, Harvard

University. PDBid 1D66.] 6%, siehe Interactive Exercises.

Der Cys,-His,-Zinkfinger enthält ein zweisträngiges, antiparalleles ß-Faltblatt und eine a-Helix. Drei dieser Motive sind in einem 72 Reste langen Segment des Maus-Proteins Zif268 enthalten, von dessen Komplex mit der Ziel-DNA Carl Pabo die Röntgenkristallstruktur aufgeklärt hat (Abb. 24.355). Die drei Zinkfinger sind als separate Domänen in einer C-förmigen Struktur angeordnet, welche gut in die große Furche der DNA passt. Jeder Zinkfinger interagiert in der gleichen Weise mit drei aufeinander folgenden Basenpaaren der DNA, überwiegend durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der a-Helix des Zinkfingers und einem DNA-Strang. Jeder. der drei Zinkfinger bildet ganz spezifische Brücken zu zwei Basen in der großen Furche. Interessanterweise beinhalten fünf von sechs solcher Assoziationen Arg-Guanin-Paarungen. Zusätzlich zu diesen sequenzspezifischen Interaktionen bildet jeder Finger über konservierte Arg- und His-Reste Wasserstoffbrücken zu den Phosphatgruppen der DNA. Der Cys,-His,-Zinkfinger ähnelt im Allgemeinen dem prokaryotischen HTHMotiv, anderen Zinkfingermotiven und den meisten anderen DNA-Bindungsmotiven, welche wir noch antreffen werden. Sie alle ermöglichen es, dass eine a-Helix in die große Furche greifen kann. Im Gegensatz zu den anderen Bindungsmotiven treten jedoch die Cys,-His,-Zinkfinger als Module auf, die mehrere aufeinander folgende DNA-Segmente binden können (manche Transkriptionsfaktoren enthalten mehr als 60 Zinkfinger). Solch ein modulares System ist in der Lage, verlängerte asymmetrische Basensequenzen zu erkennen. Ein zweikerniger Cys;-Zinkfinger vermittelt die DNA-Bindung des Hefeproteins GALA4, eines Transkriptionsaktivators mehrerer Gene, welche am Galacto-

sestoffwechsel beteiligte Enzyme codieren. In den Resten 1 bis 65 dieses Proteins aus 881 Resten befinden sich die sechs Cys-Reste, die kollektiv zwei Zn’*-Ionen binden (Abb. 24.36). Jedes Zn?*-Ion wird dabei tetraedrisch von vier Cys-Resten koordiniert, wobei zwei Reste an beide Metallionen binden. GAL4 bindet seine 17 bp lange Ziel-DNA als symmetrisches Dimer (Abb. 24.36b), liegt jedoch ohne DNA als Monomer vor. Jede Untereinheit besteht aus einem kompakten Zinkfinger (Reste 8-40) zur DNA-Bindung, einem verlängerten Verbindungsstück (Linker) (Reste 41-49) und einer a-Helix (Reste 5064), welche die GAL4-Dimerisierung ermöglicht. Die N-terminale Helix dieses Fingers greift in die große Furche der DNA, wobei sequenzspezifische Kontakte zu stark konservierten CCG-Sequenzen an jedem Ende der Erkennungssequenz ausgebildet werden. Die gebundene DNA behält ihre B-Konformation bei. Die Dimerisierungshelices von GAL4 (Abb. 24.36b, Mitte) liegen über der kleinen Furche der DNA. Die Linker, welche diese Helices mit den Zinkfingern

DNA-Protein-Wechselwirkungen

(Ye

hm

ee

Faaae) a ruha

(b)

verbinden, umschlingen die DNA und folgen der kleinen Furche. Die zwei symmetrisch angeordneten Zinkfinger nähern sich deshalb der großen Furche von entgegengesetzen Seiten der DNA rund 1,5 Helixwindungen voneinander entfernt. HTH-Motive dagegen greifen von derselben DNA-Seite an, also etwa im Abstand von einer Windung. Diese relativ offene Struktur des GAL4-DNAKomplexes könnte es anderen Proteinen erlauben, gleichzeitig an die DNA zu binden.

949

Abb. 24.37 Das GCNA4 Leucin-Zipper-Motiv. (a) Eine Helixraddarstellung des Motivs mit den zwei Helices von ihren N-Termini aus gesehen. Die Sequenzen der Reste an jeder Position sind mit dem Ein-Buchstaben-Code angegeben. Reste, die in der Kristallstruktur lonenpaare bilden, sind durch gestrichelte Linien verbunden.

Man beachte, dass

alle Reste an den Positionen d und d’ Leu (L) sind, die an a und a’ meistens Val (V) und die an den übrigen Positionen meistens polar sind. [Nach O’Shea, E.K. Klemm, )J.D., Kim, P.S. und Alber, T.,

Transkriptionsfaktoren mit Leucin-Zippern Segmente bestimmter eukaryotischer Transkriptionsfaktoren, beispielsweise im Hefeprotein GCNA4, haben in jeder siebten Position ein Leu. Wie wir bereits gesehen haben, haben bestimmte a-Helices mit einer sieben Reste langen pseudorepetitiven Sequenz (a-b-c-d-e-f-g)„, in der die Reste a und d hydrophob sind, eine hydrophobe Seite, welche eine Dimerisierung zur Superhelix ermöglicht (z.B. a-Keratin; Abschnitt 6.1C). Steven McKnight postulierte, dass solche DNA-Bindungsproteine mit heptadischen (aus sieben Elementen bestehenden)

Wiederholungen ebenfalls Superhelices bilden, wobei die Leu-Seitenketten wie bei einem Reißverschluss ineinander greifen (Abb. 24.37). Tatsächlich vermitteln solche Leucin-Zipper (engl.: zipper, Reißverschluss) die Dimerisierung bestimmter DNA-bindender Proteine, wenngleich sie selbst nicht an der DNA-Bindung beteiligt sind. Peter Kim und Thomas Alber bestimmten die Röntgenkristallstruktur des 33 Aminosäurereste langen Polypeptids, welches dem Leucin-Zipper des GCN4 entspricht. Die ersten 30 Reste enthalten ca. 3,6 heptadische Wiederholungen (Abb. 24.370). Diese bilden eine ca. 8-windige a-Helix, welche, wie McKnight vorschlug, dimerisiert und dabei eine parallele linksgängige Superhelix formt, die um eine Vierteldrehung in sich verdreht ist (Abb. 24.37b). Man kann sich das Dimer am besten als verdrehte Leiter vorstellen, wobei die Seiten durch die Helixrückgrate und die Sprossen durch die interagierenden hydrophoben Seitenketten gebildet werden. Die konservierten Leu-Reste in der siebten Position d (entsprechend jeder zweiter Sprosse) greifen jedoch nicht ineinander, wie es McKnight ursprünglich vorschlug, sondern liegen stattdessen nebeneinander. Die dazwischen liegenden Leitersprossen werden in gleicher Weise durch den a-Rest der heptadischen Wiederholung (meistens Val) gebildet. Diese Kontakte sorgen für eine ausgedehnte Verbindung zwischen den zwei Helices. Bei vielen Leucin-Zipper-Proteinen schließt sich N-terminal an den Reifsverschluss eine DNA-Bindungsregion an. Daher sind diese Proteine als Leucin-Zipper-Proteine mit basischer Region (bZIP) bekannt. In GCN4 bilden beispiels-

Science 254, 540 (1991).] (b) Die Röntgenkristallstruktur in Seitenansicht, in der die Helices in

Bänderform dargestellt sind. Seitenketten sind in Stabform mit den kontaktierenden Leu-Resten in den Positionen d und d’ in Gelb und den Resten in den Positionen a und a’ in Grün wiedergegeben. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Peter Kim, MIT und Tom Alber, University of Utah School of Medicine. PDBid 2ZTA.] 6% siehe Kinemage Exercise 20

950

Struktur von

Nucleinsäuren

seiner Ziel-DNA. Abb. 24.38 Röntgenkristallstruktur eines GCN4-Fragments im Komplex mit einzelnen einem mit Segment langen bp 19 einem aus besteht Stabform) in Die DNA (rot, Nucleotidüberhang an jedem Ende und enthält die palindromische (mit Ausnahme des zentralen Basenpaars), 7 bp lange Zielsequenz für das Proteins. Die zwei identischen GCNA4-Untereinheiten (in Bänderform gezeigt) beinhalten je eine 52 Reste lange a-Helix. An ihrem C-terminalen Ende (gelb) assoziieren die zwei Untereinheiten zu einer parallelen Superhelix (einem Leucin-Zipper) und an ihren basischen Regionen (grün) öffnen sich diese Helices leicht, so dass jede die DNA in ihrer großen Furche an der Zielsequenz binden kann. Die N-Termini sind weiß gezeichnet. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Stephen Harrison, Harvard University. PDBid IYSA] 6% siehe Interactive Exercises.

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 il

Beschreiben Sie die verschiedenen Typen der Wechselwirkungen zwischen Nucleinsäuren und Proteinen.

Wie unterscheidet sich die DNA-Bindung eines ZinkfingerTranskriptionsfaktors von der eines prokaryotischen Repressors?

weise die C-terminalen 56 Reste eine verlängerte a-Helix. Die letzten 25 Reste dieser Helix assoziieren zum Zipper. Die N-terminalen Regionen der Helices laufen leicht auseinander, um in der großen Furche (auf gegenüberliegenden Seiten der DNA) binden zu können. So klemmen sie die DNA wie in einem Scherengriff ein (Abb. 24.38). Die entsprechenden basischen Aminosäurereste bilden eine Vielzahl von Kontakten mit den Basen und Phosphatsauerstoffatomen der DNA-Zielsequenz, ohne deren Konformation jedoch zu verzerren. Viele eukaryotische Transkriptionsfaktoren enthalten eine konservierte DNAbindende basische Region, der direkt zwei amphipathische Helices folgen, die über eine Schleife verbunden sind, und so ein sogenanntes basisches HelixLoop-Helix (DHLH)-Motiv bilden. Die basische Region bindet zusammen mit dem N-terminalen Teil der ersten (H1) Helix des DHLH-Motivs in der großen Furche der Ziel-DNA. Die C-terminale (H2) Helix des DHLH-Motivs vermittelt die Dimerisierung des Proteins über die Bildung einer Superhelix. In vielen Proteinen schließt sich dem DHLH-Motiv direkt ein Leucin-Zipper (Z) an, der vermutlich die Dimerisierung verstärkt. Das dimere DHLH/Z-Protein umgreift so die DNA von beiden Seiten wie eine Zange, wie es am Beispiel des Proteins Max in Abbildung 24.39 dargestellt ist. Jede basische Region des Proteins wechselwirkt mit spezifischen Basen der DNA und auch mit Phosphatgruppen. Die Seitengruppen der Schleife und des N-Ierminus der H2-Helix binden ebenfalls Phosphatgruppen.

5

Eukaryotische Chromosomenstruktur

Obwohl jedes Basenpaar lediglich ca. 0,34 nm zur Konturlänge (Länge eines ausgestreckten, nativen Moleküls) der B-DNA beiträgt, haben DNA-Moleküle im Allgemeinen ein enormes Ausmaß. Die 23 Chromosomen mit den 3 Milliarden bp des humanen Genoms weisen eine gesamte Konturlänge von fast 1 m auf. Eine der Grundfragen in der Molekularbiologie ist, wie eine solch riesige Masse an genetischer Information in vernünftiger Zeit gelesen und entschlüsselt werden kann, obwohl sie in einem kleinen Teil einer Zelle Platz finden muss. Durch ihre langgestreckte Form (ihr Durchmesser beträgt lediglich 2 nm) und ihre relative Steifheit ist Doppelstrang-DNA außerhalb der schützenden Zelle

Abb. 24.39

Röntgenkristallstruktur von Max mit gebundener DNA. Die Reste 22-113 des Max-Dimers bilden einen Komplex mit einer 22 bp langen DNA,

welche die palindromische Zielsequenz des Proteins enthält. Die DNA ist rot, in Stabform,

gezeigt, und das homodimere Protein in Bänderform. Die N-terminale basische Proteinregion (grün) bildet eine a-Helix aus, die an ihre DNA-Zielsequenz in der großen Furche bindet. Sie geht nahtlos in die H1-Helix (gelb) des Helix-Loop-Helix-Motivs über. Folgt man der Schleife (pink), gehen die zwei H2-Proteinhelices (lila) des HLH-Motivs in die Leucin-Zipper-Helices (cyan) über, um eine parallele Superhelix zu bilden. Die N- und C-Termini des Proteins sind weiß dargestellt. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Edward Ziff und Stephen Burley, The Rockefeller University. PDBid IAN2.] 6% siehe Interactive Exercises.

Eukaryotische Chromosomenstruktur

951

Abb. 24.40 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines humanen Metaphase-Chromosoms. [Mit freundlicher Genehmigung von Gunther Bahr, Armed Forces Institute of Pathology.]

für mechanische Schädigungen anfällig. Wenn man z.B. ein Drosophila-Chromosom um den Faktor 500.000 vergrößern würde, hätte dieses die Form und die Stabilitätseigenschaften einer 6 km langen, ungekochten Spaghettinudel. Tatsächlich stellt das Scheren der DNA beim Rühren, Schütteln oder Pipettieren einer DNA-Lösung im Labor eine Standardmethode dar, um DNA zu fragmentieren. Prokaryotische Genome bestehen typischerweise aus einem einzelnen zirkulären DNA-Molekül. Die meisten Eukaryoten jedoch kondensieren und verpacken ihr Genom in mehrere Chromosomen. Jedes Chromosom ist ein Komplex aus einem einzelnen linearen DNA-Molekül mit zahlreichen Proteinen, der auch als Chromatin bezeichnet wird. Die Chromosomen sind dynamische Gebilde, deren Erscheinungsbild sich im Verlauf des Zellcyclus drastisch ändern kann. Mit Zellcyclus umschreibt man die geordnete Abfolge von Ereignissen, die im Leben einer eukaryotischen Zelle stattfinden (Abschnitt 28.4A). Chromosomen nehmen ihre am höchsten kondensierte Form nur während der Metaphase der Zellteilung ein (Abb. 24.40). Während des restlichen Zellcyclus, wenn die DNA transkribiert und repliziert wird, verteilen sich die Chromosomen so fein, dass sie nicht mehr hervortreten. Und doch ist die DNA dieser Chromoso-

men noch immer kompakt im Vergleich zur freien B-Helixform. Humane Chromosomen weisen Konturlängen zwischen 1,5 und 8,4 cm auf, sind aber in ihrer dichtesten Packung nur 1,3 bis 10 um lang. Im nächsten Abschnitt werden wir sehen, wie die DNA in Zellen gepackt wird, um solch einen hohen Kondensationsgrad zu erreichen.

A.

Histone

Der Proteinbestandteil des Chromatins macht etwa die Hälfte seiner Masse aus und besteht zum größten Teil aus Histonen. Um die DNA-Packung zu verstehen, beschäftigen wir uns nun zunächst mit diesen Proteinen. Die fünf Histon-Hauptklassen (Hl, H2A, H2B, H3 und H4) besitzen alle einen großen Anteil an positiv geladenen Aminosäuren (Arg und Lys; Tab. 24.3). Deshalb binden diese Proteine an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA durch elektrostatische Wechselwirkungen. Die Aminosäuresequenzen der Histone H2A, H2B, H3 und H4 wurden jeweils während der Evolution erstaunlich gut konserviert. So unterscheiden sich beispielsweise die Histone H4 aus Rind und Erbse (diese Arten trennten

952

Struktur von Nucleinsäuren

Tab. 24.3 Histon

Histone aus Kalbs-Thymus. %Arg

% lys

Anzahl

Masse

der Reste

(kD)

Hl

215

23,0

1

29

H2A

129

14,0

9

11

H2B

125

13,8

6

16

H3

135

15,3

13

10

H4

102

11,3

14

11

sich vor 1,2 Milliarden Jahren) nur durch zwei konservative Aminosäureaustau (Abpt überhau Proteinen rvierten bestkonse den zu H4 gehört sche. Damit schnitt 5.4A). Diese hohe entwicklungsgeschichtliche Stabilität lässt darauf schließen, dass die Histone entscheidende Funktionen erfüllen und ihre Strukturen dafür so perfektioniert wurden, dass sie äußerst empfindlich gegenüber Veränderungen sind. Das Histon H1 ist dagegen variabler als die übrigen. Wie wir im Anschluss sehen werden, erfüllt es auch andere Aufgaben. ° Histone unterliegen postranslationalen Modifikationen, u.a. der Methylierung, Acetylierung und Phosphorylierung spezifischer Arg-, His-, Lys-, Serund Thr-Reste. All diese Modifikationen, von denen viele reversibel sind, verringern

die positive Ladung des Proteins und verändern deshalb die Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA. Trotz der evolutionären Stabilität der Histone variiert das Ausmaß an Modifikationen je nach Spezies, Gewebe und Zellcyclusstadium sehr stark. Wie wir in Abschnitt 28.3A sehen werden, wird die Histonmodifika-

tion mit der Transkriptionsaktivierung in Verbindung gebracht. Die Modifikationen erschaffen eventuell neue Proteinbindungsstellen an den Histonen selbst oder an der mit ihnen assoziierten DNA.

62 siehe Guided Exploration 24: Nucleosome structure.

B.

Nucleosomen

Auf die erste Organisationsebene des Chromatins wies Roger Kornberg 1974 hin, als er Hinweise aus mehreren Untersuchungen zusammenfasste: 1. Chromatin enthält in etwa dieselbe Anzahl an H2A-, H2B-, H3- und H4-Histonen und höchstens halb so viele H1-Histone. 2. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Chromatin zeigen Partikel mit einem Durchmesser von ca. 10 nm, die perlenschnurartig auf einem dünnen Faden scheinbar nackter DNA aufgereiht sind (Abb. 24.41). 3. Durch kurzfristige Behandlung mit Micrococcus-Nuclease (dieses Enzym hydrolysiert doppelsträngige DNA) wird die DNA nur zwischen diesen Partikeln gespalten. Offenbar schützen die Partikel die inkorporierte DNA gegen Nucleaseabbau. Nach Untersuchungen mittels Gelelektrophorese enthält jedes Partikel ca. 200 bp DNA.

Deshalb postulierte bezeichnet werden, angelagerter DNA Art der Assoziation

P er

KORRRZEE Abb. 24.41 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Ketten eng zusammenliegender Nucleosomen aus Chromatin von D. melanogaster. [Mit freundlicher Genehmigung von Oscar L. Miller, Jr. und Steven McKnight, University of Virginia.]

Kornberg, dass die Chromatinpartikel, die als Nucleosomen aus dem Oktamer (H2A),(H2B),(H3),(H4), und ca. 200 bp bestehen. Für H1, das fünfte Histon, wurde eine andere mit dem Nucleosom angenommen (siehe unten).

DNA windet sich um ein Histonoktamer und bildet so den Nucleosomenkern Die Micrococcus-Nuclease spaltet das Chromatin anfangs in einzelne Nucleosomen, die noch mit dem Histon H1 verbunden sind. Beim weiteren Abbau wird zusätzliche DNA abgespalten und damit H1 freigesetzt. Übrig bleibt das sogenannte Nucleosomenkernpartikel, das aus einem DNA-Strang von 146 bp und dem Histonoktamer besteht. Die beim Abbau entfernte DNA verbindet benachbarte Nucleosomen und wird Linker-DNA genannt. Sie ist in der Regel ca. 55 bp lang, ihre Länge kann aber je nach Organismus und Gewebe zwischen 8 und 114 bp variieren. Die Röntgenkristallstruktur des Nucleosomenkernpartikels, die von Timothy Richmond bestimmt wurde, zeigt einen annähernd zweizählig symmetrischen Komplex. Dabei ist die B-DNA um das Histonoktamer gewickelt, und zwar mit 1,65 Windungen einer linksgängigen Superhelix (Abb. 24.42). Dies ist der Beginn der Bildung von Superhelices in eukaryotischer DNA. Obwohl sie geringe Sequenzähnlichkeiten aufweisen, besitzen alle vier Histon-Typen ein ähnliches etwa 70-Aminosäuren langes Strukturmotiv, in dem eine lange zentrale Helix beiderseits von einer Schleife und einer kürzeren Helix flankiert wird (Abb. 24.43). Paare aus Histonen

greifen wie eine Art „molekularer

Hände-

Eukaryotische Chromosomenstruktur

953

(b)

(a)

druck“ ineinander und bilden dadurch die sichelförmigen Heterodimere H2AH2B und H3-H4. Jedes Heterodimer bindet 2,5 Windungen der DoppelstrangDNA, welche mit einer Neigung von 140° um den Proteinkomplex läuft. Die H3-H4-Paare interagieren über eine Vierhelixbündelstruktur der beiden Histone H3 und bilden so das (H3-H4),-Tetramer. Damit wiederum interagiert jedes der H2A-H2B-Paare über ein ähnliches Vierhelixbündel von H2A und H4, um schließlich das Histonoktamer zu bilden (Abb. 24.425). Das Histon bindet ausschließlich an die innere Seite der DNA, in erster Linie

über deren Zucker-Phosphat-Rückgrat über Wasserstoffbrücken, Salzbrücken und Helixdipole (an deren positiven N-terminalen Enden). Die Interaktionen finden alle an den Phosphatsauerstoffatomen statt, jedoch gibt es auch hydrophobe Interaktionen mit den Desoxyriboseringen. Es gibt wenige Kontakte zwischen den Histonen und den Basen. Dies stimmt mit der fehlenden Sequenzspezifität der Nucleosomen überein. Eine Arg-Seitenkette reicht aber in die kleine DNA-Furche, und zwar in allen 14 Positionen, in denen die DNA zum Oktamer hin gerichtet ist. Die DNA-Superhelix besitzt einen Radius von 4,2 nm und eine Ganghöhe von 2,6 nm. Dennoch ist die DNA nicht gleichförmig superhelical, sondern auf Grund der Wölbungen des Histonkerns an meh-

Röntgenkristallstruktur des Nucleosomenkernpartikels. (a) Das gesamte Kernpartikel (links) entlang seiner superhelicalen Achse und (rechts) um 90° um die Vertikalachse gedreht gesehen. Die Proteine des Histonoktamers sind in Bänderform gezeichnet mit H3 in Blau, H4 in Grün, H2A in Gelb und H2B in Rot. Die Zucker-Phosphat-Rückgrate der 146 bp langen DNA sind in braunen sowie türkisen Schleifen und ihre angehefteten Basen als gleichfarbige Polygone gezeichnet. Bei beiden Betrachtungsweisen ist die pseudo-zweizählige Achse vertikal und verläuft oben durch das DNA Zentrum. (b) Obere Hälfte des Nucleosomenkernpartikels wie in (a) links gesehen (gleiche Farben). Die Ziffern 0-7 im Innern der 73 bp langen DNA markieren die Positionen sequentieller Doppel-

helixwindungen. Die vollständig gezeichneten Histone sind primär mit diesem DNA-Segment assoziiert, während

von H3 und H2B der anderen

Partikelhälfte nur Fragmente sichtbar sind. Die zwei gezeigten Vierhelixbündel

sind mit H3’, H3, H2B

und H4 markiert. [Mit freundlicher Genehmigung von Timothy Richmond, ETH Zürich. PDBid 1AOI.]

Röntgenstruktur der Hälfte eines Histonoktamers mit dem Nucleosomkernpartikel. Die Teile von H2A, H2B, H3 und HA, die die

Histonfalten bilden, sind jeweils gelb, rot, blau und grün gefärbt. Ihre N- und C-terminalen Schwänze sind als helle Schatten abgebildet. [Nach einer Röntgenstruktur von Gerard Bunick, University of Tennessee und Oak Ridge National Laboratory. PDBid

1EQZ.]

954

Struktur von Nucleinsäuren

Abb. 24.44

Bindung von Histon Hl

(@)

an das Nucleosom.

(a) Modell der Bindung des Histons HI an die DNA des 166-bp-Nucleosoms. Da die DNA-Superhelix (blau) zwei vollständige Windungen beschreibt, kann H1 (oranger Zylinder) an die beiden Enden dieses Abschnitts und in seiner Mitte binden. Das Histonoktamer ist hier durch das kugelförmige Gebilde in der Mitte dargestellt. (b) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Hl-enthaltendem Chromatin. Vergleichen Sie mit Abb. 24.41. [Mit freundlicher Genehmigung

DNA

HistonOkt

8,0.nm

5

von Fritz Thoma, ETH Zürich.]

reren Stellen stark gekrümmt. Außerdem zeigt sich die Doppelstrang-DNA ziemlich variabel. So variiert beispielsweise ihre helicale Windungszahl von 7,5 bis 15,2 bp pro Windung mit einem Durchschnittswert von 10,4 bp pro Windung (im Vergleich zu 10,4 bp für DNA in Lösung). Fast 75% der DNAOberfläche ist für das Lösungsmittel zugänglich und scheint daher für Wechselwirkungen mit DNA-bindenden Proteinen verfügbar zu sein. Linker-Histone bringen Nucleosomen zusammen

Behandelt man die Nucleosomen mit Mikrococcus-Nuclease, so wird die rund 200 bp lange DNA zunächst bis auf 166 bp abgebaut. Dann tritt eine Pause ein, anschließend wird das Histon H1 freigesetzt und die DNA bis auf 146 bp

verkürzt. Da die 146 bp des Kernpartikels 1,65 Superhelixwindungen beschreiben, sollte das Zwischenprodukt mit 166 bp fast zwei volle Windungen bilden können, so dass seine zwei Enden nahe beieinander liegen sollten. Aaron Klug schlug vor, dass das Histon H1 dort an die nucleosomale DNA binden könnte, wo die DNA-Segmente in das Kernpartikel ein- und wieder austreten (Abb. 24.44a). Chromatinfasern, die Hl enthalten, weisen enge Nucleosomenabstände auf (Abb. 24.44b). Fehlt dem Chromatin dagegen das H1 (z.B. Abb. 24.41), so sind die Nucleosomen verstreuter. Das lässt vermuten, dass Linker-Histone eine aktive Rolle bei der Chromatinfaserkondensation und bei der Regulation der Zugänglichkeit der DNA für andere Proteine spielen.

C. Abb. 24.45 Modell der 30-nm-Faser. Aufeinanderfolgende Nucleosomen mit gold und violett gefärbter DNA sind zickzackförmig übereinander gestapelt und bilden eine Doppelhelixstruktur. Die Faserachse ist als vertikale, graue

Linie dargestellt. Dieses Modell basiert auf der Röntgenstruktur einer aus vier Nucleosomen bestehenden

Einheit, in der jedes Nucleosom

aus 147 bp DNA und einem Histonoktamer (als Bändermodell gezeigt und blau, grün, rot

und gelb gefärbt) besteht und mit dem nächsten Nucleosom über 20 bp lange DNA verbunden ist. Dieses Modell enthält keine Linker-Histone. [Mit freundlicher Genehmigung von Timothy Richmond, ETH Zürich.)

__Chromatin bildet hochgeordnete Strukturen

Durch die Wicklung der DNA-Helix um ein Nucleosom verkürzt sich ihre Konturlänge um den Faktor 7. Die 56 nm langen 166 bp werden zu einer etwa 8 nm dicken Superspirale komprimiert. Unter physiologischen Bedingungen kondensiert Chromatin weiter zu einem 30 nm dicken Filament, indem es sich zickzackartig faltet. Ein Modell dieser 30-nm-Faser, das auf der Röntgenstruktur eines Tetranucleosoms basiert und im Einklang mit cross-linking Untersuchungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen steht, zeigt, dass die aufeinan-

derfolgenden Nucleosomen um etwa 71° gegeneinander verdreht sind. Die Nucleosomen sind zickzackartig angeordnet, sodass alle ungeradzahligen Nucleosomen und alle geradzahligen Nucleosomen nebeneinander gestapelt sind (Abb. 24.45). Die Struktur hat einen Durchmesser von rund 25 nm, und die beiden

Stapel winden sich als zwei linksgängige Helices umeinander. Eine Umdrehung umfasst 18,9 Nucleosomen und erstreckt sich über eine Distanz von 31,6 nm entlang der Faserachse.

Eukaryotische Chromosomenstruktur y

REITEN x,

955

BCE

TA “r?r

IEHESEV

PN

n+$ NAU Ar ur

:

BSR

a

Fäx

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Te met 7

3=

37 Re

ER

Tut,

(a)

Die 30-nm-Faser wird durch Wechselwirkungen stabilisiert, an denen H2AH2B-Dimere und Histon H4 beteiligt sind. Wie die Röntgenstruktur des Nucleosoms zeigt (Abb. 24.42a), kann der positiv geladene N-terminale Schwanz von H4 an die stark negativ geladene Region auf einer exponierten Seite des H2AH2B-Dimers in einem benachbarten Nucleosom binden. Eine Acetylierung des N-terminalen Schwanzes von H4 reduzierte seine positive Ladung und würde deshalb diese Wechselwirkung abschwächen. Die stark basischen Schwänze von H2B und H3 ragen ebenfalls aus dem Nucleosomenkern heraus (Abb. 24.422). Da die Histonschwänze zahlreiche Acetylierungsstellen enthalten, wird die Chromatinstruktur wahrscheinlich - zumindest teilweise - durch Acetylierung ganz bestimmter Histonreste moduliert. DNA-Schleifen sind an ein Gerüst gebunden Von Histonen befreite Metaphase-Chromosomen zeigen ein zentrales fibrilläres Proteingerüst, das von einer ausgedehnten DNA-Wolke umgeben wird (Abb. 24.460). Einzelne Stränge bilden Schleifen, deren Ein- und Austrittspunkte am zentralen Proteingerüst zusammenfallen (Abb. 24.46b). Die meisten Schleifen sind zwischen 15 und 30 um lang, (was 45 bis 90 kb entspricht), sodass sie etwa 0,6 um lang wären, wenn sie zu 30-nm-Filamenten kondensiert wären. Elektronenmikroskopische Aufnahmen (Abb. 24.47) lassen stark vermuten, dass die Chromatinschleifen radial angeordnet sind und jeweils 0,3 um zum Durchmesser des Chromosoms beitragen (eine Faser muss dabei rücklings geschlungen werden, um eine Schleife zu bilden). Zieht man noch in Betracht, dass das Gerüst 0,4 um breit ist, kommt man nach diesem Modell für das Metaphase-Chromosom auf einen Durchmesser von 1,0 um. Ein typisches menschliches Chromosom mit seinen rund 140 Millionen bp ist etwa 6 um lang und hätte demnach etwa 2000 Radialschleifen. Die Nichthiston-Proteine, die etwa 10% der chromosomalen Proteine ausmachen, sind vermutlich an der Organisation der DNA zu diesen hochgeordneten Strukturen beteiligt (Abb. 24.48) sowie an der gegenseiti-

Abb. 24.46 Elektronenmikroskopische Aufnahmen eines histonfreien menschlichen Metaphase-Chromosoms. (a) Die faserige zentrale Proteinmatrix (Gerüst) verankert die umgebende DNA. (b) Die stärkere Vergrößerung lässt erkennen, dass die DNA schleifenartig mit dem Gerüst verbunden ist. [Mit freundlicher Genehmigung von Ulrich Laemmli, Universität Genf.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 1. Welche Rolle spielen Histone bei der DNA-Packung? 2. Beschreiben Sie die Stufen der DNA-Packung in eukaryotischen Zellen von freier B-DNA bis zu einem Metaphase-Chromosom.

956

Struktur von Nucleinsäuren

MetaphaseChromosom, Durchmesser 1um

0,4 um

30-nm-Faser

Abb. 24.47 Menschliches Metaphase-Chromosom im Querschnitt. Man beachte, dass die meisten Chromatinfasern sternförmig aus dem zentralen Gerüst ragen. [Mit freundlicher Genehmigung von Ulrich Laemmli, Universität Genf.]

Nucleosom

gen Umwandlung der stark kondensierten Metaphase-Chromosomen zu der eher aufgelockerten DNA, die während der Ruhephase des Zellcyclus vorkommt. Bei Prokaryoten ist die DNA ebenfalls durch ihre Assoziation mit hoch basischen Proteinen komprimiert, die funktionell den Histonen ähneln. Nucleosomenartige Partikel kondensieren und bilden große Schleifen, die mit einem Proteingerüst verknüpft sind, sodass ein relativ kompaktes Chromosom entsteht.

Zusammenfassung

B-DNA, Durchmesser 2 nm

Abb. 24.48 Ebenen der Chromatinstruktur. B-DNA windet sich um Histonoktamere und bildet Nucleosomen. Diese falten sich zu einer 30-nmFaser. Chromatinschleifen sind mit einem

Proteingerüst verbunden und bilden das Metaphase-Chromosom.

1. Die häufigste Form der DNA ist die B-DNA, welche eine rechtsgängige Doppelhelix mit A - T- und G - C-Basenpaaren ähnlicher Geometrie darstellt. Im Gegensatz zur B-DNA ist die Helix der A-DNA breiter und flacher und kommt auch in doppelsträngiger RNA vor. Die linksgängige Z-DNA kann in Sequenzen mit alternierenden Purinen und Pyrimidinen vorkommen. 2. Die Nucleotidflexibilität in Nucleinsäuren ist durch die erlaubten Rotationswinkel um die glykosidische Bindung, die Faltung des Riboserings und die Torsionswinkel des Zucker-Phosphat-Rückgrats beschränkt. 3. Natürlich vorkommende DNA ist negativ superspiralisiert (unterdreht). Topoisomerasen entspannen Superhelices, indem sie einen oder beide DNAStränge schneiden, die DNA durch den Spalt führen (Topoisomerasen vom Typ IA und II) oder dem nicht geschnittenen Strang eine kontrollierte Drehung erlauben (Typ-IB-Topoisomerase) und den/die geschnittenen Strang/Stränge wieder verknüpfen.

Wichtige Begriffe

Nucleinsäuren können denaturiert werden, indem man die Temperatur über deren T,, erhöht. Zur Renaturierung muss die Temperatur wieder auf ca. 25°C unter den T,-Wert gesenkt werden. Die Nucleinsäurestrukturen werden durch Watson-Crick-Basenpaarungen, hydrophobe Wechselwirkungen zwischen gestapelten Basenpaaren und durch divalente Kationen stabilisiert, welche die anliegenden Phosphatgruppen abschirmen. RNA-Moleküle nehmen eine Vielzahl von Strukturen an, welche doppelsträngige Stämme und einzelsträngige Schleifen enthalten. Einige RNAs besitzen katalytische Aktivität. Zur Nucleinsäurefraktionierung werden ähnliche Methoden wie bei Proteinen verwendet, also Solubilisierung, Affinitätschromatographie und Elektrophorese. Sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine interagieren primär mit Basen in der großen Furche und mit Phosphatgruppen. Die Wechselwirkungen schließen ionische sowie direkte und indirekte Wasserstoffbrücken ein. Bei der Bindung können sich die Konformationen des Proteins und der DNA ändern. Häufige Strukturmotive der DNA-Bindungsproteine sind Helix-Turn-HelixMotive (HTH) in prokaryotischen Repressoren und Zinkfinger, LeucinZipper sowie basische Helix-Loop-Helix-Motive (bHLH) in eukaryotischen Transkriptionsfaktoren. 10. Im eukaryotischen Chromatin windet sich die DNA um Histonoktamere und bildet so Nucleosomenkernpartikel, welche durch Linker-Histone weiter kondensieren. Zusätzliche Kondensation wird durch die Faltung des Chromatins in 30-nm-Filamente erreicht, welche als Schleifen an ein Proteingerüst gebunden sind. So entsteht ein kondensiertes Metaphase-Chromosom.

Wichtige Begriffe haptadische Wiederholung

syn-Konformation

Watson-Crick-Basenpaar

anti-Konformation

Hoogsteen-Basenpaar

Leucin-Zipper

C2’-endo C3’-endo Superspiralisierung Verwindungszahl helicale Windungszahl superhelicale Windungszahl Topoisomerase hyperchromer Effekt Te Annealing (Aushärten) Hybridisieren

Basenstapelungsinteraktionen Ribozym Pulsfeld-Gelelektrophorese interkalierende Agenzien Southern-Blot Repressor HTH-Motiv Operator indirektes Ablesen Transkriptionsfaktor Zinkfinger

bHLH-Motiv Konturlänge Scheren Chromosom Chromatin Histon Nucleosom Nucleosomenkernpartikel Linker-DNA 30-nm-Faser

957

958

Struktur von Nucleinsäuren

Aufgaben

nn

OT 1. Aminosäuren werden in Nucleinsäuren durch drei aufeinander folgende Basen spezifiziert. Wie groß ist die Konturlänge eines B-DNA-Segments, das für ein 50-kDProtein codiert? Berechnen Sie zusätzlich die Konturlänge unter der Annahme, dass eine A-DNA-Konformation vorläge. 2. Ungewöhnliche Basen und Nicht-Watson-Crick-Basenpaare treten häufig in tRNA-Molekülen auf. (a) Welche Base bindet am wahrscheinlichsten an Hypoxanthin (Abschnitt 23.1)? Zeichnen Sie dieses Basenpaar.

(b) Zeichnen Sie die Struktur des G - U-Basenpaars. 3. Die Enden eukaryotischer Chromosomen schließen mit einem G-reichen einzelsträngigen Überhang ab, der sich über sich selbst zurückfalten und eine viersträngige Struktur bilden kann. In dieser Struktur nehmen vier Guaninreste eine planare, über Wasserstoffbrücken verbundene Anordnung an, deren Gesamtgeometrie folgendermaßen aussieht:

Be go

(a) Zeichnen Sie die vollständige Struktur dieses „G-Quartetts“ einschließlich der Wasserstoffbrücken

zwischen den Purinbasen. (b) Zeigen Sie schematisch, wie sich ein Einzelstrang aus vier sich wiederholenden TITAGGG-Sequenzen falten kann, um eine Struktur hervorzubringen, bei der drei gestapelte G-Quartette durch TTA-Schleifen verbunden sind. 4. Das Enzym Ornithin-Decarboxylase erzeugt ein Produkt, für das man eine Rolle bei der Stabilisierung verdichteter DNA vorgeschlagen hat. Zeichnen Sie die Struktur des Reaktionsprodukts der Ornithin-Decarboxylase und erklären Sie, wie es mit der DNA wechselwirkt. 5. Sie haben ein Enzym entdeckt, das von einem besonders virulenten Bakterium sekretiert wird und die C2’-C3’Bindung in Desoxyriboseresten von Doppelstrang-DNA spalten kann. Was würde dieses Enzym an superspiralisierter DNA bewirken?

Eine geschlossene, zirkuläre Doppelstrang-DNA besitzt ein 100-bp-Segment aus alternierenden C- und G-Resten. Beim Übergang zu einer hohen Salzkonzentration ändert sich die Konformation von B nach Z. Welche Änderungen ergeben sich dabei für die Verwindungszahl, die helicale und die superhelicale Windungszahl? Vergleichen Sie die Schmelztemperatur eines 1 kb langen DNA-Fragments, das 20% A-Reste enthält, mit einem 1 kb

langen DNA-Fragment, das 30% A-Reste enthält, unter denselben Bedingungen. Wie ändert sich die Schmelzkurve von Doppelstrang-DNA durch (a) Verminderung der Ionenstärke in der Lösung und (b) Zugabe einer kleinen Menge Ethanol? Die Schmelzkurve für das Polyribonucleotid Poly(A) ist nachfolgend gezeigt. (a) Erklären Sie, warum die Absorption mit zunehmender Temperatur steigt. (b) Warum unterscheidet sich die Form der Kurve von der in Abbildung 24.20 gezeigten?

258 bei Absorption Relative nm

(0)

L 20

Beni. 40

Zelle 60

| 80

100

Temperatur (°C)

10. Zeichnen Sie für die RNA-Sequenz AUUGGCAUCC-

GAUAA die Sekundärstruktur, die ihre Basenpaarung maximiert. IN, Neben der basengepaarten Standard-Helixstruktur (z.B. Abb. 24.2) kann DNA X-förmige Haarnadelstrukturen, sog. Kreuze, bilden, in denen die meisten Basen an WatsonCrick-Paaren beteiligt sind. Solche Strukturen treten eher an Sequenzen mit umgekehrten Wiederholungen (inverted repeats) auf. Zeichnen Sie die kreuzförmige Struktur, die von der DNA-Sequenz TCAAGTCCACGGTGGACTTGC gebildet wird. 12: Ribosomen aus E. coli enthalten drei RNA-Moleküle, welche nach ihrem Sedimentationsverhalten benannt werden: >S-, 185- und 28S-RNA. Zeichnen Sie ein Elektropherogramm, das zeigt, wo in etwa sich diese drei RNA-Typen nach Durchführung einer Elektrophorese befinden.

Literatur

13. Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass die palindromische Sequenzsymmetrie der trp-Repressor-Ziel-DNA . (Abschnitt 24.4B) rein zufällig ist? 14. Das Genom von E. coli enthält etwa 4639 kb. (a) Wie viele Kopien der 6 bp langen Erkennungssequenz für den trp-Repressor würde man im E.-coli-Chromosom erwarten? (b) Erklären Sie, warum es für den trp-Repressor einen

959

Experiment 1. Das Autoradiogramm zeigt einen großen Fleck an der Startposition der Elektrophorese. Experiment 2. Das Autoradiogramm zeigt einen Fleck, der über die gesamte Maus-DNA enthaltende Bahn

verschmiert ist. Experiment 3. Das Autoradiogramm zeigt drei Banden unterschiedlicher Intensität.

Sinn ergeben würde, wenn er ein Dimer wäre, das zwei

benachbarte 6 bp lange Sequenzen erkennt. 15. Berechnen Sie für eine B-DNA mit 50.000 kb (a) die Konturlänge, (b) die DNA-Länge bei Packung in Nucleosomen mit Histonen und (c) die DNA-Länge in einem 30-nm-Filament. 16. Genomische DNA der Maus wird mit Restriktionsendonucleasen behandelt und elektrophoretisch in einem Agarosegel getrennt. Mit einer radioaktiven Sonde aus dem humanen Gen rxr-1 wurde ein Southern-Blot gemacht. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Erklären Sie die Resultate dieser drei Experimente:

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 31

Hyperactive DNase I Variants: A Treatment for Cystic Fibrosis Understanding the mechanism of action of an enzyme can lead to the construction of hyperactive variant enzymes with a greater catalytic efficiency than the wild-type enzyme.

Literatur Nucleinsäurestruktur

DNA-Protein-Wechselwirkungen

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Jedesmal wenn sich eine menschliche Zelle teilt, muss die DNA jedes ihrer 46 Chromosomen schnell und akkurat repliziert werden. Aufgetretene Fehler werden repariert, um die exakte Weitergabe der genetischen Information zu gewährleisten. [L.Willatt/Photo Researchers.]

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination Elektronisches Zusatzmaterial

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 25

© DNA-Replikation: Ein Überblick © DNA-Replikation in Prokaryoten

Interactive Interactive Interactive Interactive

e Eukaryotische DNA-Replikation e DNA-Schäden und Mutationen

Exercise Exercise Exercise Exercise

46 47 48 49

Animated Figure 25-1 Animated Figure 25-36 Case Study 32

Watson und Crick schlossen ihren richtungsweisenden Artikel über die DNADoppelhelix mit den Worten: „Es ist uns nicht entgangen, dass die von uns vorgeschlagene spezifische Basenpaarung unmittelbar auf einen möglichen Vervielfältigungsmechanismus für das genetische Material hindeutet.“ Wie sie es vorhersagten, dient jeder Polynucleotidstrang bei der DNA-Replikation als Matrize, um durch Basenpaarung einen Komplementärstrang zu bilden. Die zwei Stränge des Elternmoleküls müssen zuvor getrennt werden, damit die komplementären Tochterstränge enzymatisch auf der Oberfläche jedes Elternstrangs synthetisiert werden können. Das ergibt schließlich zwei Doppelstränge, wobei jeder aus je einem elterlichen und aus einem neu synthetisierten Komplementärstrang besteht (Abb. 3.11). Diese Art der Replikation wird semikonservativ genannt. Bei einer konservativen Replikation würde die Eltern-DNA intakt bleiben und beide Stränge der Tochterdoppelhelix neu synthetisiert werden. Die semikonservative DNA-Replikation wurde 1958 durch Matthew Meselson und Franklin Stahl auf elegante Art nachgewiesen. Die Masse der DNA wurde

durch Markierung mit "”N erhöht, einem schweren Stickstoffisotop ('*N ist das in der Natur am häufigsten vorkommende Isotop), was zu einem Ansteigen der Dichte führte. Dazu wurden E. coli-Bakterien in einem Medium mit ”NH,Cl

als einziger Stickstoffquelle kultiviert. Die markierten Bakterien wurden an-

schließend abrupt in '*N-haltiges Medium transferiert und die DNA-Dichte über mehrere Generationen durch Ultrazentrifugation überwacht. Meselson und Stahl sahen, dass die DNA-Dichte nach einer Generation (Verdoppelung der Zellpopulation) genau zwischen derjenigen von BN-DNA und

unmarkierter DNA lag. Diese DNA musste demnach gleiche Mengen an '"N und "N enthalten, wie man es nach einer Generation semikonservativer Replikation erwartet (Abb. 25.1). Bei der konservativen Replikation würde dagegen der ursprüngliche Strang vollständig markiert sein und eine gleiche Anzahl unmarkierter Stränge produzieren. Nach zwei Generationen erwies sich die Hälfte

der DNA als unmarkiert, der Rest waren '*N-""N-Hybride. In den darauf folgen-

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

© DNA-Reparatur

® Rekombination

962

_DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

den Generationen erhöhte sich die Menge unmarkierter DNA verglichen mit der Hybrid-DNA, obwohl letztere nie vollständig verschwand. Dies kann nur in Übereinstimmung mit einer semikonservativen Replikation stehen und ist bei einer konservativen Replikation nicht möglich, da dort gar keine YN.BN-Hybride gebildet würden. Die Details der DNA-Replikation wurden seit 1958 schrittweise aufgeklärt, einschließlich der Entwindung der elterlichen Stränge und der Bildung komplementärer Tochterstränge aus Nucleosidtriphosphaten. Die DNA-Replikation ist weit komplexer als es die Chemie dieses Prozesses erahnen lässt, vor allem muss sie so exakt wie möglich durchgeführt werden, um die Integrität des Genoms von einer Generation zur nächsten zu gewährleisten. In diesem Kapitel befassen wir uns mit den Proteinen, welche die DNA-Replikation in Pro- und Eukaryoten vermitteln. Wir werden auch Mechanismen betrachten, welche die exakte Replikation gewährleisten und Korrekturen von fehlerhaft eingebauten Basen und anderen DNA-Schäden ermöglichen.

[Z 15N-DNA (schwer) un

1. Generation

3 Ar 3 Hybrid-DNA

i

95% 23 Be?

+ % fü+ [Z 14N-DNA

77

2 (leicht)

1

3. Generation

%.%

4. Generation

IQ F 7]

Abb. 25.1

=

DNA wird von Enzymen repliziert, die als DNA-abhängige DNA-Polymerasen oder einfach als DNA-Polymerasen bezeichnet werden. Diese Enzyme benutzen einzelsträngige DNA als Matrize für die Synthese des komplementären Strangs aus den entsprechenden Desoxynucleotidtriphosphaten (Abb. 25.2). Dies geschieht dadurch, dass die 3'’-OH-Gruppe der wachsenden DNA-Kette nucleophil den a-Phosphorylrest des hinzukommenden Nucleosidtriphosphats angreift. Die ansonsten reversible Reaktion wird durch die anschließende Hydrolyse des eliminierten PP; getrieben. Die neu hinzukommenden Nucleotide werden so ausgewählt, dass sie mit der Matrizen-DNA Watson-Crick-Basenpaare bilden können. Auf diese Weise kann der neu synthetisierte DNA-Strang eine Doppelhelix mit der Matrize ausbilden. Alle bekannten DNA-Polymerasen können neue Nucleotide lediglich an die freie 3'-OH-Gruppe der basengepaarten Polynucleotide anfügen, weshalb die DNA-Kettenverlängerung stets in 5' — 3'-Richtung erfolgt.

T

e

DNA-Replikation: Ein Überblick

R

Das Experiment von Meselson

und Stahl. Elterliche ("N-markierte oder „schwere“) DNA wird semikonservativ repliziert, so dass alle

DNA-Moleküle in der ersten Generation einen

DNA-Replikation erfolgt an Replikationsgabeln

elterlichen (blauen) und einen neu synthetisierten (roten) Strang besitzen. In den folgenden

John Cairns untersuchte die DNA-Replikation anhand von Autoradiogrammen mit dem Genom von E.coli, welche in einem [°H]-Thymidin-haltigen Medium gewachsen waren. Diese zirkulären Genome weisen Replikations-„Augen“ oder -„Blasen“ auf (Abb. 25.3), die #-Strukturen genannt werden (auf Grund ihrer Ähnlichkeit mit dem griechischen Buchstaben Theta). Diese werden bei

Generationen nimmt der Anteil der leichten,

"*N-markierten Stränge zu, aber die Hybride aus einem schweren und einem leichten Strang bleiben

erhalten. @%, siehe Animated Figures.

Matrizen-DNA

N

Abb. 25.2

Wirkung von DNA-Polymerasen.

——

Be IBEELE

.

PP;

22 BER

Diese Enzyme setzen an einer Matrize aus

Einzelstrang-DNA freie DesoxyribonucleosidDie OH-Gruppe am 3'-Ende eines wachsenden Polynucleotidstrangs ist ein Nucleophil, das die a-Phosphatgruppe

Bi;

triphosphate zusammen.

des hinzukommenden

iB3";

} ö BSulERSEB;

DNA-Polymerase

Y

B4

B

BB

:

Bien

BIS

BahrlebFaser:

B,

B,

B,

B,

dNTPs, das mit der

Matrizen-DNA ein Basenpaar ausbildet, angreift und so den wachsenden Strang in

5’ 3'-Richtung verlängert. Obwohl die Bildung einer neuen Phosphodiesterbindung reversibel ist, macht die nachfolgende HydroIyse des PP; die gesamte Reaktion irreversibel.

OH ...

p

pP

5’

P

>

3’

replizierte DNA

+

OH

OH ...

pP

p

p

p

DNA-Replikation: Ein Überblick

Replikationsauge —

Replikationsgabel

der Trennung des Elternstrangs gebildet, wenn die zwei komplementären Tochterstränge synthetisiert werden. Eine DNA-Replikation, bei der -Strukturen auftreten, nennt man auch #-Replikation. Die DNA-Synthese findet an den Verzweigungspunkten in Replikationsaugen (so genannte Replikationsgabeln) statt. Ein Replikationsauge kann eine oder zwei Replikationsgabeln enthalten (unidirektionale oder bidirektionale Replikation). Autoradiographische Untersuchungen haben gezeigt, dass die O-Replikation fast immer bidirektional ist (Abb. 25.4). Mit anderen Worten, die DNA-Synthese verläuft von ihrem Startpunkt aus in beide Richtungen gleichzeitig ab.

963

Abb. 25.3 Autoradiographie und zeichnerische Interpretation eines sich replizierenden E. coli-Genoms. Das Bakterium ist in einem [°H]-Thymidin-haltigen Medium gewachsen, so dass die in dieser Zeit synthetisierte DNA markiert wird und als eine Linie schwarzer Punkte auf dem Film erscheint (rote Linien in der Zeichnung). Aus der Größe des Replikationsauges lässt sich schließen, dass dieses zirkuläre Genom zum Zeitpunkt der Fixierung zu ca. einem Sechstel repliziert worden war. [Mit freundlicher Genehmigung von John Cairns, Cold Spring Harbor Laboratory.]

Die Replikation ist semidiskontinuierlich

Autoradiogramme geringer Auflösung (z.B. Abb. 25.3 und 25.4b) lassen eine gleichzeitige Replikation der beiden antiparallelen Stränge von DoppelstrangDNA vermuten. Da aber DNA-Polymerasen nur in 5’ —3’-Richtung synthetisieren, stellt sich die Frage, wie die Polymerase denjenigen Elternstrang repliziert, der sich hinter der Replikationsgabel in 5’—3’-Richtung erstreckt. Diese Frage beantwortete 1968 Reiji Okazaki mit folgendem Experiment: Wird eine wachsende E.coli-Kultur durch einen 30 s Puls mit [°H]-Thymidin markiert, so besteht der Grofßsteil der radioaktiven und damit neu synthetisierten DNA aus Fragmenten mit 1000 bis 2000 Nucleotidresten (nt); in Eukaryoten sind diese so genannten Okazaki-Fragmente nur 100-200 nt lang. Überführt man die Bakterien nach dem Puls in ein nicht radioaktives Medium, nimmt die Größe der markierten Fragmente mit der Zeit zu. Die Okazaki-Fragmente müssen also kovalent in längere DNA-Moleküle eingebaut werden. Okazaki interpretierte diese experimentellen Befunde mit dem Modell der semidiskontinuierlichen Replikation (Abb. 25.5). Danach werden die beiden Elternstränge auf verschiedene Weise repliziert. Der neu synthetisierte DNAStrang, der in der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel (5’—3’) verläuft, (a)

B) RN Aa

unidirektionale Replikation

lo

eu

Na,

——

markierte DNA

schwach markierte DNA

IS EISthe

AsAy

Medium vermehrt, so dass die gesamte DNA

Aa bidirektionale

Replikation

Aug)

DS>

SUN

(b) Eu

2 E = REIT TE

ET

Abb. 25.4 Unterscheidung von uni- und bidirektionaler 6-DNA-Replikation mittels Autoradiographie. (a) Ein Organismus wird für mehrere Generationen in einem schwach mit [PH]-Thymidin markierten

er ae a EeePe Z

nee

autoradiographisch sichtbar wird. Dann wird wenige Sekunden vor der DNA-Isolierung eine große [’H]-Thymidinmenge zum Medium gegeben (Puls-Markierung), um Basen nahe der Replikationsgabel(n) stark zu markieren. Bei unidirektionaler Replikation träte nur ein stark markierter Verzweigungspunkt auf, während bei bidirektionaler Replikation zwei solche Stellen sichtbar wären. (b) Autoradiogramm einer bidirektional replizierten E. coli-DNA. [Mit freundlicher Genehmigung von David M. Prescott, University

of Colorado.]

964

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Abb. 25.5 Semidiskontinuierliche DNA-Replikation. Beide Tochterstränge (Leitstrang rot, Folgestrang blau) werden in 5’ —3’-Richtung synthetisiert. Der Leitstrang wird kontinuierlich, der Folgestrang diskontinuierlich synthetisiert. Die Segmente des Folgestrangs nennt man auch Okazaki-Fragmente.

0000000

Bewegung > der

Replikationsgabel

g'

Bi

3' Leitstrang

Folgestrang (Okazaki-Fragmente)

Elternstränge

wird als Leitstrang bezeichnet. Er wird kontinuierlich in 5’ — 3’-Richtung hergestellt, während die Replikationsgabel vorrückt. Der andere neue Strang, der Folgestrang, wird ebenfalls in 5’ —3’-Richtung synthetisiert. Er kann jedoch nur diskontinuierlich, in Form von Okazaki-Fragmenten, synthetisiert werden, wenn ein entsprechend langes neues Stück einzelsträngiger Eltern-DNA an der Replikationsgabel auftritt. Die Okazaki-Fragmente werden später durch das Enzym DNA-Ligase kovalent verknüpft.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Erklären Sie, warum die DNAPolymerase eine Matrize und einen Primer benötigt. 2. Warum wird DNA semikonservativ und semidiskontinuierlich repliziert?

Abb. 25.6 Kurze RNA-Fragmente dienen als Primer für die DNA-Synthese. Jedes Okazaki-Fragment besteht aus einem RNA-Primer (grün), der durch die DNA-Polymerase verlängert wurde. Der RNA-Primer wird später entfernt.

DNA-Synthese verwendet RNA-Primer Da die DNA-Polymerasen auf eine freie 3’-OH-Gruppe zur Kettenverlängerung

angewiesen sind, stellt sich die Frage, wie die DNA-Synthese eingeleitet wird. Eine genaue Analyse von Okazaki-Fragmenten zeigte, dass deren 5’-Enden aus 1-60 nt langen RNA-Segmenten bestehen (die genaue Länge ist abhängig von der Spezies), die zur Matrizen-DNA komplementär sind (Abb. 25.6). In E. coli werden diese sogenannten RNA-Primer durch das Enzym Primase synthetisiert. Zur Herstellung des Folgestrangs werden mehrere Primer benötigt, für die Synthese des Leitstrangs nur einer. Reife DNA enthält keine RNA; d.h. die RNA-Primer werden schließlich durch DNA ersetzt.

DNA-Replikation in Prokaryoten

2

965

DNA-Replikation in Prokaryoten

An der DNA-Replikation ist eine Vielzahl von Enzymen beteiligt, von denen einige wenige bereits oben erwähnt wurden. Viele dieser Enzyme wurden erstmalig aus Prokaryoten isoliert, weshalb wir in der Regel deren Wirkungsweise besser verstehen als die ihrer eukaryotischen Gegenstücke. Deshalb beginnen wir mit einer ausführlichen Betrachtung prokaryotischer DNA-Replikation, die eukaryotische werden wir in Abschnitt 25.3 besprechen.

A.

_DNA-Polymerasen

Arthur Kornberg entdeckte 1957 in E.coli ein Enzym, welches die Synthese von DNA katalysiert, wobei der Nachweis seiner Aktivität durch Einbau von markiertem ['*C]-Thymidintriphosphat in DNA ermöglicht wurde (Exkurs 25.1). Dieses Enzym ist heute als DNA-Polymerase I oder Pol I bekannt; es besteht aus einer einzigen Polypeptidkette von 928 Aminosäureresten. Pol I katalysiert eine ganze Reihe von Polymerisationsschritten, in der Regel mindestens 20, ohne von der Matrize abzuspringen. Man bezeichnet das Enzym daher als prozessiv. Pol I besitzt Exonucleaseaktivität Zusätzlich zur Polymeraseaktivität besitzt Pol I zwei voneinander unabhängige Hydrolaseaktivitäten, die in unterschiedlichen aktiven Zentren lokalisiert sind: eine 3’—5’- sowie eine 5’—3’-Exonucleaseaktivität. Erstere erlaubt der Pol I, ihre eigenen Fehler zu korrigieren. Hat das Enzym versehentlich ein falsches (ungepaartes) Nucleotid an die wachsende DNA-Kette angehängt, ist die Polymeraseaktivität inhibiert, und die 3’ —5'’-Exonuclease spaltet das fehlgepaarte Nucleotid ab (Abb. 25.7). Die Polymerase-Funktion setzt daraufhin wieder ein und die DNA-Replikation wird fortgesetzt. Diese Fähigkeit zum „Korrekturlesen“ (engl.: proofreading) erklärt die große Genauigkeit, mit der Pol I die DNA repliziert. Die 5’—3’-Exonuclease der Pol I bindet an Einzelstrangbrüche in Doppelstrang-DNA. Sie baut den gebrochenen Einzelstrang innerhalb einer basengepaarten Region jenseits des Bruchs ab und setzt bis zu 10 Reste in Form von Mono- oder Oligonucleotiden frei (Abb. 25.8). fehlgepaarte

Hydrolyse durch 3

—-

5’.

Exonuclease

el

Abb. 25.7 3'’—5’-Exonucleasefunktion der DNA-Polymerase I. Dieses Enzym entfernt fehlgepaarte Nucleotide vom 3'-Ende des wachsenden DNA-Strangs (blau).

Hydrolyse durch 5’ —- 3'-Exonuclease

Einzelstrangbruch

Abb. 25.8 5’—3’-Exonucleasefunktion der DNA-Polymerase I. Dieses Enzym entfernt bis zu 10 Nucleotide vom 5’.Ende eines Einzelstrangbruchs. Das Nucleotid unmittelbar hinter dem Einzelstrangbruch (X) muss nicht unbedingt basengepaart sein.

966

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Exkurs 25.1 Berühmte Biochemiker Arthur Kornberg und die DNA-Polymerase |

Arthur Kornberg (1918-2007)

Wie eine Reihe seiner Zeitgenossen, so entschied sich auch Arthur Kornberg während der Weltwirtschaftskrise für den Arztberuf, weil es keine Stellen in der Lehre oder in der In-

dustrie gab. Anschließend

diente er bei der U.S.-Küsten-

wache als Schiffsarzt, erkannte aber schnell, dass er besser

für die Arbeit im Labor als auf See geeignet war. Als er 1942 bei den National Institutes of Health zu arbeiten begann, wurde gerade die klassische Ernährungsforschung von der neuen Wissenschaft Enzymologie abgelöst. Seine Begeisterung für Enzyme entdeckte er, nachdem er Aconitase aus Rattenherzen gereinigt hatte. Er verglich die Reinigung

zu und maß die Bildung radioaktiver DNA. Leider war der Einbau von Thymidin extrem gering, aber mit Thymidinphosphat (TMP) klappte es besser, und mit Thymidintriphosphat (TTP) sogar noch besser. Kornberg stellte auch fest, dass die Menge der neu synthetisierten DNA zunahm, wenn man dem Reaktionsgemisch eine kleine Menge DNA zusetzte. Dies war nicht völlig überraschend, denn Kornberg wusste bereits, dass eine kleine Menge Glykogen als Primer für die weitere Glykogensynthese dienen konnte. Zunächst glaubte Kornberg jedoch, dass die dem Reaktionsgemisch zugesetzte DNA als

Substrat für die Nucleasen fungieren würde und dabei die neu synthetisierte radioaktive DNA vor dem Abbau schützt. Später erkannte er, dass die zugefügte DNA als Matrize für die Synthese eines neuen Stranges diente. Durch ihren teilweisen Abbau liefert sie außerdem die anderen nicht radioaktiven

Nucleotide, die für die Polymerisierung erforderlich

sind. Die Vorstellung von einer Matrize war zu jener Zeit den meisten Enzymologen und anderen Biochemikern noch fremd,. aber die Biologen waren

für die Idee einer Matrize

und die Genugtuung, dass man als erster Mensch auf dem Gipfel gewesen ist. Kornberg verbrachte sechs Monate im Labor der Coris (Exkurs 16.1) und begann 1948 mit der Arbeit an Enzymen, die an der Synthese von Nucleotidcofaktoren beteiligt sind. Er stellte fest, dass das Enzym Nucleotid-Pyrophosphorylase

bei der DNA-Synthese aufgeschlossen. Für seine Entdeckung und Charakterisierung der DNA-Polymerase (später als DNAPolymerase | oder Pol I bezeichnet) erhielt Kornberg 1959 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Nachdem er die gereinigte Pol | in Händen hielt, musste Kornberg noch zeigen, dass das Reaktionsprodukt biologisch aktiv ist. Dazu verwendete er Pol | für die Synthese der 5386 bp langen DNA des Bakteriophagen #X174 mittels viraler DNA-Matrizen. Er setzte außerdem DNA-Ligase ein,

eine Reaktion

um

eines Enzyms mit der Besteigung eines unerforschten Bergs, für die die Belohnung der Blick hinab ins Tal ist,

katalysiert, bei der ein Nucleotid

in ein Co-

enzym eingebaut wird: Nicotinamid-Ribonucleotid

+ ATP — NAD* + PP;

Als nächstes suchte Kornberg nach einem Enzym, das viele Nucleotide zu einer Nucleinsäurekette zusammenbauen kann. Es ist verschiedentlich kolportiert worden, dass Kornberg durch die Publikation des Watson-Crick-Modells 1953 dazu inspiriert wurde, nach der DNA-Polymerase zu suchen.

Tatsächlich folgte Kornberg jedoch allein seinem Instinkt als Enzymologe: Durch seine Arbeit mit der Glykogen-Phosphorylase, die das Polymer Glykogen in vitro synthetisieren kann, war er bereits mit Polymerasen vertraut. Außerdem hatte er Erfahrung mit den Enzymen der Phospholipid-Synthese, die Phosphodiesterbindungen - wie sie auch in der DNA enthalten sind — knüpfen können. Kornberg hatte diese Forschungsrichtung aber nicht weiterverfolgt, weil er nicht mit „fettigen“ Molekülen arbeiten wollte. Um ein DNA-synthetisierendes Enzym zu reinigen, begann Kornberg mit Extrakten schnell wachsender E.coli-Zellen. Diese ersetzten die langsamer wachsenden Hefezellen als Labormodell. Er fügte den Extrakten radioaktives Thymidin

die synthetischen

DNA-Moleküle

zu schließen,

und er-

hielt so eine zirkuläre, infektiöse DNA. Zu Kornbergs Leidwesen interpretierte die Boulevardpresse seine Arbeit falsch und bejubelte sie als die Schaffung von Leben im Reagenzglas. Kornberg

bekannte

später, dass er über die „Kunstfertig-

keit“ der DNA-Polymerase aus E.coli verblüfft war: Das Enzym konnte eine Kette aus Tausenden von Nucleotiden synthetisieren

—

und

das

mit einer

Genauigkeit,

die alle

Vorhersagen übertraf. Während der 1970er Jahre zeigten genetische Untersuchungen, dass hauptsächlich andere Proteine für die DNA-Replikation bei E. coli verantwortlich sein mussten, und schon bald entdeckte und charakterisierte man die Polymerasen II und Ill. Während der nächsten beiden Jahrzehnte widmete sich Kornberg der Aufklärung des Mechanismus der DNA-Replikation. Viele der führenden Forscher auf diesem Gebiet wurden in seinem Labor ausgebildet. Kornberg, A., Active center of DNA-Polymerase, Science 163, 1410-1418

(1969).

Kornberg, A., For Love of Enzyme: The Odyssey of a Biochemist, Harvard University Press (1989). [Eine naturwissenschaftliche Autobiografie.]

DNA-Replikation in Prokaryoten

Obwohl Pol I die zuerst entdeckte Polymerase war, ist dieses Enzym nicht die wichtigste Replikase in E. coli. Die wichtigste und essentielle Funktion dieses Enzyms liegt in der Beteiligung an der Synthese des Folgestrangs, da sie dort die RNA-Primer entfernt und durch DNA ersetzt. Dieser Vorgang erfordert ein Zusammenwirken der 5’—3’-Exonuclease- und der Polymeraseaktivität der Pol I. Die Ribonucleotide am 5’-Ende des Einzelstrangbruchs (engl.: single-strand nick) zwischen dem neuen und alten (zuvor synthetisierten) Okazaki-Fragment werden herausgeschnitten. Anschließend werden sie durch Desoxynucleotide (angehängt an das 3'-Ende des alten Okazaki-Fragments) ersetzt (Abb. 25.9). Durch diese Reaktionsfolge wird der Einzelstrangbruch in Richtung 3'-Ende verschoben (translatiert), was man als Nick-Translation bezeichnet. Nachdem die ge-

3’ 5’

Fragment 1 Fragment 2 Einzelstrangbruch RNAPrimer

dNTPs

Struktur des Klenow-Fragments Die DNA-Polymerase I aus E.coli, deren drei enzymatische Aktivitäten an jeweils verschiedenen aktiven Zentren lokalisiert sind, kann proteolytisch in zwei Teile gespalten werden. Das dabei entstehende große, sogenannte „Klenow“-Fragment (Reste 324-928) beinhaltet die Polymerase- und die 3’ —5’-Exonucleaseaktivität, wohingegen das kleinere Fragment (Reste 1-323) die 5’— 3’-Exo-

DNA-

PP.

Polymerase I ı

„ NEUE, 5!

samte eingebaute RNA ausgeschnitten wurde, wird der Bruch durch die DNA-

Ligase (Abschnitt 25.2C) verschlossen und somit das alte Okazaki-Fragment mit dem neuen verbunden. Biochemiker nutzen die Nick-Translation u.a. zur Radiomarkierung von DNA. In Doppelstrang-DNA werden durch kleine Mengen pankreatischer DNase I an einigen wenigen Stellen Strangbrüche erzeugt. Radioaktive dNTPs werden zugegeben und Pol I ersetzt während der Nick-Translation unmarkierte Desoxynucleotide durch markierte. Pol I kann auch beschädigte DNA reparieren. Wie wir in Abschnitt 25.5 sehen werden, wird ein Defekt in der DNA durch mehrere DNA-Reparatursysteme erkannt, von denen viele endonucleolytisch die DNA am 5’-Ende der Läsion spalten. Pol I schneidet dann als 5’ — 3’-Exonuclease die defekte DNA aus, während sie als Polymerase die entstandene Lücke wieder füllt, analog zum Ersatz der RNA-Primer in Okazaki-Fragmenten. Damit spielt Pol I eine unentbehrliche Rolle bei der DNA-Replikation und -Reparatur in E.coli, wenn sie auch nicht, wie ursprünglich angenommen, für die gesamte DNA-Synthese zuständig ist.

Interactive Exercises.

>

3’

EN

Mononucleotide

\ EN)

RES

DNA-Ligase

„ NEE,

S

,

5!

DNA

Abb. 25.9 Austausch von RNA-Primern durch DNA während der Folgestrangsynthese. (1) Der RNA-Primer am 5’-Ende des neusynthetisierten Okazaki-Fragments (Fragment 1) wird durch die 5’—3’-Exonucleasefunktion der Pol | ausgeschnitten und durch ihre Polymerasefunktion ersetzt, die Desoxynucleotide an das 3’-Ende des zuvor synthetisierten Okazaki-Fragments (Fragment 2) anfügt. Dies verschiebt den Einzelstrangbruch (engl.: nick) vom ursprünglichen 5’-RNA-Ende an die vorherige Position des 3’-Endes (Nick-Translation). (2) Der Bruch wird durch DNA-Ligase verschlossen.

nucleaseaktivität enthält. Die von Thomas Steitz ermittelte Röntgenstruktur des Klenow-Fragments zeigt zwei Domänen (Abb. 25.10). Die kleinere Domäne (Reste 324-517, der untere Teil der in Abb. 25.10 dargestellten Struktur) enthält das aktive Zentrum der 3’ —5’-Exonuclease. Die größere Domäne (Reste 521928) enthält das aktive Zentrum der Polymerase, welches in einer deutlich erkennbaren Tasche liegt. Die Entfernung zum 3’—5’-Exonucleasezentrum ist dabei überraschend groß (ca. 2,5 nm). Die Tasche ist mit positiven Resten ausgekleidet, und hat zudem die richtige Form und Größe (ca. 2,2 X 3 nm), um ein B-DNA-Molekül aufzunehmen. Die Bindung an die DNA erinnert an eine rechte Hand, die einen Stab umfasst (Beachten Sie die Strukturen von „Daumen“, „Finger“ und „Handfläche“ in Abb. 25.10). Die aktiven Zentren fast aller bekannten DNA- und RNA-Polymerasen befinden sich jeweils am Boden ähnlich geformter Taschen. Abb. 25.10 Röntgenstruktur des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase | aus E. coli im Komplex mit einer DNA-Doppelhelix. Das Protein (magenta) ist als Oberflächendiagramm dargestellt. Die gebundene DNA ist als Kalottenmodell dargestellt und entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt (C-Atome des 12-ntMatrizenstrangs grün, C-Atome des 14-nt-Primerstrangs türkis, N blau, O rot und P orange). Beachten Sie, dass das 3’-Ende des Primerstrangs die 3'—5’-Exonucleasestelle des Enzyms besetzt und diese Struktur daher einen sogenannten Korrekturlesekomplex darstellt. 6% siehe [Nach einer Röntgenstruktur von Thomas Steitz, Yale University, PDBid IKLN.]

967

Handfläche $ o.

968

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination Steitz cokristallisierte das Klenow-Fragment mit einem kurzen DNA-„Matri-

zen“-Strang und einem komplementären „Primer“-Strang. Das Protein interagiert nur mit dem Phosphatrückgrat der Doppelstrang-DNA, wie auch die Pol I unspezifisch mit DNA wechselwirkt. Die große Distanz zwischen den aktiven Zentren der Polymerase und der 3’ —5’-Exonuclease lässt darauf schließen, dass die gebundene DNA große Konformationsänderungen durchläuft, wenn sie sich vom einen zum anderen Zentrum bewegt. DNA-Polymerase erkennt die Watson-Crick-Basenpaare über sequenzunabhängige Wechselwirkungen Die C-terminale Domäne der thermostabilen DNA-Polymerase I von Thermus aquaticus (Tag) (Klentaql) hat eine zu 50% identische Sequenz und eine ganz

Abb. 25.11 Röntgenstruktur von Klentaq] im Komplex mit DNA in der geschlossenen

und offenen Konformation. (a) Geschlossene Konformation (mit ddCTP). (b) Offene Konformation (nach Waschen mit ddCTP-freier Lösung). Das Protein ist aus dem gleichen Blickwinkel wie in Abbildung 25.10 und in Schlangenform dargestellt; seine N-terminale, Handflächen-, Finger- und Daumen-Domänen

sind

gelb, bzw. magentarot, grün und blau gefärbt. Die DNA ist in der Stabform gezeigt, der 3’-terminale ddC-Rest des Primerstrangs ist ebenso wie das ddCTP im Bildteil a als Kalottenmodell gezeigt. Das ddCTP bildet mit einem G-Rest der Matrize in der Bindungstasche des aktiven Zentrums des Enzyms eine Basenpaarung aus. Die Atome sind

entsprechend des Atomtyps gefärbt, C des Matrizenstrangs ist türkis, C im Primerstrang grün,

C im ddCTP gelb, N blau, O rot und P orange. [Nach Röntgenstrukturen von Gabriel Waksman, Washington University School of Medicine. PDBids 3KTQ und 2KTQ.]

ähnliche Struktur wie die große Domäne des Klenow-Fragments (Klentaql fehlt ein funktionales 3’ —5’-Exonuclease-Zentrum). Gabriel Waksman kristallisierte Klentagl im Komplex mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül, das einen GGAAA-Überhang an seinem 5’-Ende hat (das eine Matrize mit einem komplementären DNA-Primer darstellt). Dann wurden die Kristalle mit 2’,3’-Didesoxy-CTP inkubiert (d4CTP, weist weder eine 2’- noch eine 3’-OH-Gruppe auf). Die Röntgenstruktur (Abb. 25.11a) zeigt, dass ein ddC-Rest kovalent mit dem 3’-Ende des Primers verknüpft ist, wo er mit dem G-Rest am 3’-Ende des Überhangs ein Watson-Crick-Paar bildet. Zudem besetzt ein separates ddCTP-Molekül (mit dem der neue 3’-terminale ddC-Rest des Primers keine kovalente Bindung eingehen kann) das aktive Zentrum des Enzyms, wo es ein Watson-Crick-Paar mit dem nächsten G der Matrize bildet. Klentaql behält in diesem Kristall offensichtlich seine katalytische Aktivität. Eine DNA-Polymerase muss gepaarte Basen korrekt von fehlgepaarten unterscheiden und dies auch über sequenzunabhängige Wechselwirkungen mit den hinzukommenden dNTP realisieren können. Die Klentaql-Struktur verrät, dass sich dies in der Bindungstasche des aktiven Zentrums abspielt, deren Form komplementär zu den Watson-Crick-Basenpaaren ist. Obwohl die gebun-

DNA-Replikation in Prokaryoten

969

dene doppelsträngige DNA (dsDNA) hauptsächlich in der B-Konformation vorliegt, nehmen zusätzlich die drei Basenpaare, die dem aktiven Zentrum am nächsten sind, die A-Konformation an. Dies konnte man auch in der Röntgenstruktur einiger anderer DNA-Polymerasen im Komplex mit DNA beobachten. Die entstehende breitere und flachere kleine Furche (Abschnitt 24.1A) erlaubt den Proteinseitenketten, mit den ansonsten unzugänglichen N3-Atomen der Purinbasen und O2-Atomen der Pyrimidinbasen Wasserstoffbrücken zu bilden. Die Positionen dieser Wasserstoffbrückenakzeptoren sind sequenzunabhängig, wie Abbildung 24.1 zeigt (dagegen variieren die Positionen der Wasserstoffbrückenakzeptoren in der großen Furche je nach Sequenz). Mit einer Nicht-WatsonCrick-Paarung jedoch - d.h. mit einem fehlgepaarten dNTP im aktiven Zentrum — würden diese Wasserstoffbrücken stark verdreht, wenn nicht sogar vollständig zerstört. Die Polymerase bildet auch ausgedehnte, sequenzunabhängige Wasserstoffbrücken und geht Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA ein. Werden die oben beschriebenen Klentaql - DNA - ddCTP-Kristalle mit ddCTPfreier Lösung gespült, nimmt die Fingerdomäne des Enzyms eine sogenannte offene Konformation an (Abb. 25.11b). Diese unterscheidet sich erheblich von der geschlossenen Konformation, die in Abbildung 25.11a gezeigt ist. Offenbar bewegen sich die Helices der Fingerdomäne in der offenen Konformation zum aktiven Zentrum hin, wenn ddCTP bindet. Dadurch wird das Nucleotid im katalytisch aktiven, geschlossenen Komplex verborgen. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit kinetischen Messungen, die zeigen, dass die Bindung des korrekten dNTP an Pol I eine geschwindigkeitsbestimmende Konformationsänderung auslöst, was zu einem stabilen Komplex von drei Komponenten führt. Es scheint daher, dass das Enzym in seiner offenen Konformation rasch die verfügbaren dNTPs überprüft. Aber nur wenn die Bindung des korrekten dNTP eine Watson-Crick-Paarung mit der Matrizenbase ergibt, bildet es die zur Katalyse fähige geschlossene Konformation. Nachdem sich die Phosphodiesterbindung ausgebildet hat, wird nach einer zweiten Konformationsänderung das Produkt PP; entlassen und die DNA wird ins aktive Zentrum transloziert, um

sie für den nächsten Reaktionscyclus zu positionieren. Der Katalysemechanismus der DNA-Polymerase benötigt zwei Metallionen

Die Röntgenstruktur einer Vielzahl von DNA-Polymerasen legt nahe, dass sie einen gemeinsamen Katalysemechanismus für den Nucleotidyltransfer haben. Ihre aktiven

Zentren

enthalten

alle zwei Metallionen,

gewöhnlich

Mg”, die

über zwei invariable Asp-Seitenketten in der Handflächen-Domäne koordiniert sind (Abb. 25.12). Das Metallion B wird über alle drei Phosphatgruppen des gebundenen dNTP koordiniert, wohingegen Metallion A die a-Phosphatgruppe dieses dNTP und die 3’-OH-Gruppe des Primers verbrückt. Metallion A aktiviert vermutlich die 3’-OH-Gruppe des Primers für den nucleophilen Angriff auf die a-Phosphatgruppe. Das Metallion B dient hingegen dazu, die gebundene Triphosphatgruppe auszurichten und seine negativen Ladungen sowie die zusätzliche negative Ladung des Übergangszustandes elektrostatisch abzuschirmen, was dann zur Freisetzung des PP;-Ions führt. DNA-Polymerase Ill ist die DNA-Replikase von E. coli

Die Entdeckung normal wachsender E. coli-Mutanten mit nur wenig Pol-I-Aktivität gab Anlass für die Suche nach weiteren Proteinen mit DNA-polymerisierender Aktivität. So wurden zwei weitere Enzyme gefunden, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung als DNA-Polymerase II (Pol II) und DNA-Polymerase III (Pol II) bezeichnet wurden. Die Eigenschaften dieser Enzyme sind in Tabelle 25.1 denen von Pol I gegenübergestellt. Pol II und III waren nicht früher entdeckt worden, weil die Aktivität beider Enzyme zusammen in den verwendeten Tests üblicherweise unter 5% der Pol-I-Aktivität liegt. Pol II spielt eine Rolle bei der DNA-Reparatur; Mutanten ohne Pol II werden deshalb unter normalen

Glu/Asp Asp

Abb. 25.12 Bedeutung von Metallionen beim Nucleotidyl-Transfer. A und B stellen enzymgebundene Metallionen — üblicherweise Mg’* - im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase dar. Die Atome sind entsprechend des Atomtyps gefärbt (C grau, N blau, O rot und P gelb), und die Koordinierung der Metallionen ist durch grün gepunktete Linien dargestellt. Metallion A aktiviert die 3'-OH-Gruppe des Primers für den nucleophilen Angriff (Pfeil) auf die a-Phosphatgruppe des hinzukommenden Nucleotids (hier ddCTP). Das Metallion B richtet die negativ geladene Triphosphatgruppe aus und stabilisiert sie elektrostatisch. [Mit freundlicher Genehmigung von Tom Ellenberger, Harvard Medical School]

970

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination Tab. 25.1

Eigenschaften der E. coli-DNA-Polymerasen.

a

Pol I

Poll

Masse (kD)

103

90

130

Moleküle/Zelle

400

?

10-20

Wechselzahl®

600

30

zugehöriges Strukturgen

polA

polB

polC

letale Mutante

+

-

+

Polymerisierung: 5’—3’

+

Es

+

Exonuclease: 3’—5’

+

r

Exonuclease: 5’—3’

+

=

;

-

9000

er =

@ Polymerisierte Nucleotide pro min und Molekül bei 37°C. Quelle: Kornberg, A., und Baker, T.A., DNA Replication (2. Aufl.), S. 167, Freeman (1992).

Bedingungen im Wachstum nicht beeinträchtigt. Das Fehlen von Pol III ist dagegen letal, was beweist, dass diese die DNA-Replikase von E. coli ist. Der katalytische Kern der Pol III besteht aus drei Untereinheiten: Die a-Untereinheit (das Produkt des polC-Gens in E.coli) enthält die Polymerasefunktion, die e-Einheit stellt die 3’ —>5’-Exonuclease dar und die 8-Untereinheit. Mindestens sieben weitere Untereinheiten (t, y, ö, ö’, x, w und ß) bilden zusammen einen labilen Enzymkomplex, den man als Pol-III-Holoenzym bezeichnet. Die katalytischen Eigenschaften des Pol-III-Kerns ähneln denjenigen der Pol I, nur fehlt die 5’—3’-Exonucleaseaktivität für Doppelstrang-DNA. Demnach kann die Pol III einen DNA-Strang komplementär zu einer einzelsträngigen Matrize herstellen und zur Gewährleistung einer exakten Replikation Basenkorrekturen im neu synthetisierten Strang durchführen. Eine Nick-Translation kann sie jedoch nicht katalysieren.

2 siehe Guided Exploration 25: The Replication of DNA in E. coli.

B.

Für die Initiation der Replikation sind eine Helicase und eine Primase erforderlich

Das Chromosom von E.coli ist ein superspiralisiertes DNA-Molekül aus 4,6 X 10° bp. Da die DNA-Polymerase eine einzelsträngige Matrize braucht, sind zahlreiche Proteine an der DNA-Replikation beteiligt. Sie lokalisieren die Stelle, an der die Replikation beginnt, entwinden die DNA und verhindern, dass sich die Einzelstränge wieder verbinden. Bei E. coli beginnt die Replikation in einer Region aus 245 bp, dem oriC. Die Elemente dieser Sequenz sind bei den gramnegativen Bakterien hoch konserviert. Mehrere Exemplare eines 52-kDProteins, DnaA, binden an oriC und verursachen, dass sich das aus etwa 45 bp bestehende AT-reiche Segment der DNA in Einzelstränge trennt. Dieses Schmelzen der DNA erfordert Freie Enthalpie aus der Hydrolyse von ATP.

Zudem erleichtert die AT-reiche Beschaffenheit des DNA-Segments und die negative Superspiralisierung des ringförmigen DNA-Chromosoms diesen Prozess (letzteres wird durch DNA-Gyrase erzeugt, eine Topoisomerase vom Typ II (Abschnitt 24.1D), deren Aktivität für die Replikation der prokaryotischen DNA erforderlich ist].

Helicasen entwinden die DNA DnaA, das an oriC gebunden ist, rekrutiert zwei hexamere Komplexe von DnaB, für jedes Ende der geschmolzenen Region einen. DnaB ist eine Helicase, welche die DNA-Stränge weiter auftrennt. Helicasen stellen eine breitgefächerte Gruppe

DNA-Replikation in Prokaryoten

971

von Enzymen dar, die die DNA während der Replikation, Transkription und einer Reihe anderer Prozesse entwinden. DnaB ist eine der 12 Helicasen, die von E.coli produziert werden. Helicasen schieben sich an einem Strang einer doppelhelicalen Nucleinsäure entlang, sodass sie die Helix auf ihrem Weg mechanisch entwinden. Dieser Vorgang wird durch die Freie Enthalpie der NTPHydrolyse angetrieben. DnaB aus E.coli ist ein Hexamer aus identischen Untereinheiten von 471 Aminosäureresten. Es trennt die beiden Stränge der Eltern-DNA, indem es sich entlang der Matrize des Folgestrangs in 5’—3’-Richtung schiebt und dabei ATP

hydrolysiert

(es kann auch GTP

und CTP

verwenden,

aber kein

UTP). Manche Helicasen wandern in die 3’ —5'-Richtung und manche sind Dimere statt Hexamere. Die Röntgenstruktur einer hexameren Helicase aus dem Bakteriophagen T7, der E. coli infiziert, verrät, dass das Protein einen Ring mit einem zentralen Kanal bildet. Dieser ist groß genug, um einen DNA-Strang aufzunehmen (Abb. 25.13). Nebeneinander liegende Helicaseuntereinheiten weisen verschiedene Konformationen zu einem definierten Zeitpunkt auf - analog der Situation in der F,Fo-ATPase (Abschnitt 18.3B). Dies lässt vermuten, dass eine Helicaseuntereinheit eine Konformationsänderung erfährt, wenn sie ein NTP bindet und hydrolysiert, wodurch ihre Wechselwirkung mit der einzelsträngigen DNA (ssDNA) im Zentrum des Rings verändert wird. Jede Untereinheit bindet nacheinander NTP, hydrolysiert es und setzt das Produkt frei. Im Endeffekt hangelt sich das Protein selbst entlang eines DNA-Stranges und trennt dabei die vor sich liegende dsDNA mechanisch auf. Das Einzelstrang-Bindeprotein verhindert, dass sich die DNA wieder zusammenlagert

Die hinter einer voranschreitenden Helicase befindlichen getrennten DNAStränge schließen sich nicht wieder zu einem Doppelstrang, weil sie mit Einzelstrang-Bindeproteinen (SSB, singlestrand binding protein) abgedeckt werden. Der SSB-Überzug verhindert auch, dass die ssDNA Sekundärstrukturen (wie z.B. Stämme und Schleifen) ausbildet und schützt sie auch vor Nucleasen. Man beachte, dass die SSBs entfernt werden müssen, bevor die DNA von der DNA-Polymerase repliziert werden kann. Das SSB aus E.coli ist ein Tetramer aus 177 Aminosäureeinheiten, das an DNA auf verschiedene Weise binden kann. Bei der wichtigsten Bindungsart (Abb. 25.14) ist jeder U-förmige Strang von ssDNA über zwei der vier Untereinheiten von SSB drapiert. Dies erlaubt einer unbeschränkten Anzahl von SSBTetrameren, durchgehend entlang der ssDNA zu agieren. Der DNA-bindende Spalt des SSB, der sich innerhalb der 115 N-terminalen Reste befindet, ist positiv geladen, sodass das Protein elektrostatisch mit DNA-Phosphatgruppen in Wechselwirkung treten kann. Der Spalt ist zu eng, um dsDNA aufzunehmen. Das Primosom synthetisiert RNA-Primer

Jede DNA-Synthese, ob Leit- oder Folgestrang, erfordert zunächst die Synthese eines RNA-Primers. Die Primersynthese in E.coli wird durch einen ca. 600 kD großen Proteinkomplex, das sogenannte Primosom, vermittelt. Dieser Komplex beinhaltet eine Helicase (DnaB) und eine RNA-synthetisierende Primase na-

Abb. 25.14 Röntgenstruktur von SSB im Komplex mit dC(pC);.. Das Homotetramer hat eine D,-Symmetrie und ist entlang einer seiner Doppelachsen betrachtet; seine anderen Doppelachsen sind horizontal und vertikal. Jede seiner Untereinheiten (welche die 134 N-terminalen Aminosäurereste des aus 177 Resten bestehenden Polypeptids umfassen) ist unterschiedlich eingefärbt. Seine beiden ssDNA-Moleküle sind als Kalottenmodell gezeigt und je nach Atomtyp gefärbt. C des oberen Strangs ist türkis, C des unteren Strangs grün, N ist blau, O rot und P orange. (Der untere Strang ist teilweise ungeordnet und scheint Lohman somit aus zwei Bruchstücken zu bestehen). [Nach einer Röntgenstruktur von Timothy 1EYG.] PDBid Medicine. of und Gabriel Waksman, Washington University School

Abb. 25.13 Röntgenstruktur der T7-Helicase. Jede Untereinheit des cyclischen Hexamers ist in einer anderen Farbe dargestellt. Vier gebundene ATP-Analoga sind in der Kugel-Stab-Form gezeigt. Man beachte, dass die Konformation der

benachbarten Untereinheiten nicht identisch ist. Diese Struktur ist Teil eines größeren Proteinkomplexes, der auch eine Primaseaktivität besitzt. [Mit freundlicher Genehmigung von Dale Wigley, Cancer Research U.K., London Research Institute. PDBid 1EO].]

972

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

E. coli ist mens DnaG sowie fünf andere Arten von Untereinheiten. DnaG aus anderen der keiner Domäne che katalytis dessen ein monomeres Protein, katalym Trotzde ähnelt. Struktur r bekannte mit n ymerase DNA- und RNA-Pol von ung Verwend mit 25.2, (Abb. reaktion sierungs Polymeri gleiche siert es die bilden. zu den Nucleoti 11 etwa aus ment RNA-Seg ein um dNTPs), statt NTPs Für den Folgestrang wird das Primosom entlang der DNA-Matrize in 5’—3'Richtung (d.h. in Richtung Replikationsgabel) getrieben, zum Teil durch DnaBkatalysierte ATP-Hydrolyse. Durch diese Bewegung, die der Matrizen-Leserichtung während der DNA-Synthese entgegengerichtet ist, wird SSB verdrängt. Folglich wechselt das Primosom seine Laufrichtung vorübergehend, damit die Primase einen RNA-Primer in 5’—3’-Richtung synthetisieren kann

(Abb. 25.6).

Das Primosom wird zur Initiierung jedes Okazaki-Fragments benötigt. Das einzelne RNA-Segment zur Leitstrangsynthese kann (zumindest in vitro) sowohl durch Primase als auch durch RNA-Polymerase (das Enzym, das RNA-Transkripte von der DNA-Matrize herstellt; Abschnitt 26.1) synthetisiert werden. Die Syntheserate ist jedoch stark erhöht, wenn beide Enzyme vorhanden sind.

C. _ Synthese von Leit- und Folgestrang In E.coli katalysiert das Pol-III-Holoenzym die Synthesen von Leit- und Folgestrang. Dies findet an einem einzigen Multiproteinpartikel, dem Replisom, statt, welches zwei Pol-III-Enzyme enthält. In einigen anderen Prokaryoten und in Eukaryoten synthetisieren zwei verschiedene Polymerasen den Leitstrang und den Folgestrang. Wie bei Pol III sind sie ein Teil eines Replisoms. Damit das komplette Replisom in 5’ — 3'-Richtung entlang des Leitstrangs wandern kann, muss sich die Folgestrangmatrize in eine Schleife legen (Abb. 25.15). Nachdem die Synthese eines Okazaki-Fragments abgeschlossen ist, beginnt das Holoenzym des Folgestrangs an einem neuen Primer nahe der Replikationsgabel mit der Synthese des nächsten. DNA-Fragments. Aus dieser Syntheseaktivität resultieren ein kontinuierlicher Leitstrang und eine Serie von RNA-Primer enthaltenden OkazakiFragmenten, welche durch Einzelstrangbrüche separiert sind. Die RNA-Primer werden über Pol-I-katalysierte Nick-Translation durch DNA ersetzt und die Bruchstellen im Folgestrang durch DNA-Ligase geschlossen (siehe unten). Die ß-Untereinheit von Pol Ill fördert die Prozessivität

Das Pol III-Kernenzym dissoziiert von der Matrizen-DNA, nachdem es nur etwa 12 Reste repliziert hat. Das bedeutet, es besitzt eine Prozessivität von etwa 12 Resten. Das Pol III-Holoenzym kann jedoch in Anwesenheit der ßB-Untereinheit mehr als 5000 Reste replizieren. Die ß-Untereinheit bindet an eine aufgeschnittene ringförmige DNA, wandert bis zur Spaltstelle und fällt dort ab. Dies weist darauf hin, dass die ß-Untereinheit einen Ring um die DNA herum bildet, der als bewegliche Klammer (oder ß-Klammer) fungiert und sich entlang der DNA bewegen kann. Diese Klammer verhindert, dass das Pol III-Holoenzym sich von der DNA ablöst. Die B-Klammer erhöht auch die Geschwindigkeit der Nucleotidpolymerisie-

rung. John Kuryian löste die Kristallstruktur (Abb. 25.16), aus der hervorgeht, dass

dieses Protein ein Dimer aus C-förmigen Monomeren ist, die zusammen eine schwimmringförmige Struktur mit einem Durchmesser von ca. 8 nm bilden. Das zentrale Loch ist mit ca. 3,5 nm Durchmesser größer als die Durchmesser von B- und A-DNA mit 2,0 bzw. 2,6 nm (Hybridhelices aus RNA-Primer und

DNA-Elternstrang haben eine ähnliche Konformation wie A-DNA; vgl. Abschnitt

24.1A). Jedes B-Monomer besitzt drei Domänen mit ähnlicher Struktur, so dass

der dimere Ring einen pseudosymmetrischen sechseckigen Stern darstellt. Berechnungen des elektrostatischen Potentials haben ergeben, dass die innere Ringoberfläche positiv, die äußere jedoch negativ geladen ist.

DNA-Replikation in Prokaryoten

973

DNA-Polymerase-IllHoloenzym

e) B-Klammer

5

Leitstrang

GISGSDSQDSISDSDSDSGIGNEE DnaB-Protein

Primosom

NDS ae

RNA-Primer

5

wachsendes Okazaki-

(b)

Fragment

SVSISDISIINUNONNG,

SYUSOSDSDIASANDNGE Primosom, das neuen RNA-Primer herstellt

DIDSISYSZIQSANEIN SINE fertiges Okazaki-Fragment

RNA-Primer, der von Pol I durch DNA ersetzt wird; Einzelstrangbruch wird von DNA-Ligase verschlossen

(€)

EBOSSZSGSGSGSZSUSGSGSGSGSANET

OSOSIN

DD

g’

begonnenes Okazaki-Fragment

INION:5 altes OkazakiFragment

Abb. 25.15 Replikation von DNA in E. coli. (a) Das Replisom, das zwei DNA-Polymerase-IIl-

Modellstudien, bei denen eine B-DNA-Helix durch die zentrale Öffnung geführt wurde (Abb. 25.16), zeigten, dass die a-Helices des Proteins die große und kleine Furche umgreifen, anstatt sich in diese hineinzulegen (wie es z.B. die Erkennungshelices bei Helix-Turn-Helix-Motiven tun; Abschnitt 24.4B). Es scheint, als ob die ß-Untereinheit so konzipiert sei, dass sie ihre Assoziation mit der DNA minimiert. So kann das Protein wahrscheinlich ungehindert an der DNA-Helix entlangwandern. E. coli-DNA wird mit einer Rate von ca. 1000 nt - s” repliziert. Deshalb muss das DNA-Polymerase-Holoenzym bei der Folgestrangsynthese alle 1-2 s wieder auf den Matrizenstrang gesetzt werden (Okazaki-Fragmente sind etwa 1000 nt lang). Folglich muss im Schnitt einmal pro Sekunde eine neue ß-Klammer, die die Prozessivität von Pol III fördert, um die Folgestrangmatrize herum angesetzt werden. Der ‘y-Komplex des Pol-III-Holoenzyms (Untereinheitzusammensetzung y1,öö'yı)) wird auch als Klammer-Öffner (engl.: clamp loader) bezeichnet, denn er öffnet die B-Klammer und belädt sie unter ATP-Verbrauch mit der DNAMatrize. Der y-Komplex überbrückt die zwei Pol III-Kerne (u£0) des Replisoms über die C-terminalen Segmente seiner zwei t-Untereinheiten (Abb. 25.15), an die auch die DnaB-Helicase bindet. Dies ermöglicht es wahrscheinlich der Helicase, die Aktivität der beiden Polymerasen zu synchronisieren.

Holoenzyme enthält, synthetisiert sowohl Leit-

als auch Folgestrang. Die Folgestrangmatrize muss eine Schleife bilden, damit das Holoenzym den Primer des Folgestrangs verlängern kann. (b) Das Holoenzym setzt die Matrize des Folgestrangs frei, wenn es auf das zuvor synthetisierte Okazaki-Fragment trifft. Dies ist möglicherweise das Signal für das Primosom, einen neuen

RNA-

Primer für den Folgestrang zu synthetisieren.

(c) Das Holoenzym bindet erneut an die Matrize des Folgestrangs und verlängert den RNA-Primer zu einem neuen Okazaki-Fragment.

Man beachte,

dass nach diesem Modell die Synthese des Leitstrangs immer der des Folgestrangs voraus ist.

974

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Röntgenstruktur der ß-Untereinheit aus dem Pol-Ill-Holoenzym von E. coli. (a) Das Bändermodell zeigt die zwei monomeren Einheiten des Proteindimers

in Gelb und Rot,

und zwar entlang der zweizähligen Symmetrieachse des Dimers. Ein Stabmodell einer B-DNA liegt im Zentrum, so dass seine Achse und

diejenige des Proteins zusammenfallen. (b) Kalottenmodell des wie in (a) eingefärbten Proteins, das einen hypothetischen Komplex mit B-DNA (cyan) bildet. [Mit freundlicher Genehmi-

gung von John Kuriyan, The Rockefeller University,

PDBid 2POL.]

Sitzt dann die ßB-Klammer auf der DNA, bindet der Pol-III-Kern stärker an die B-Klammer als der y-Komplex, wodurch dieser verdrängt wird und die DNA-Replikation wieder aufgenommen werden kann. Trifft die Polymerase auf das zuvor synthetisierte Okazaki-Fragment, d.h. wenn die Lücke zwischen den zwei nacheinander synthetisierten Okazaki-Fragmenten auf einen Einzelstrangbruch reduziert ist, dissoziiert der Pol-III-Kern von der DNA und büßt gleichzeitig seine Affinität zur ß-Klammer ein. Die Komponenten des Replisoms bleiben jedoch in unmittelbarer Nähe. Die y-Untereinheit und der Pol III-Kern werden durch ihre Verbindung mit dem Pol III-Kern der Führungsstrangsynthese (der über seine assoziierten ß-Klammern an die DNA gebunden bleibt) in der Nähe der Folgestrangmatrize gehalten. Deshalb kann der y-Komplex am nächsten Primer umgehend eine neue ß-Klammer um die DNA-Matrize anbringen, so dass Pol III mit der Synthese des nächsten Okazaki-Fragments beginnen kann. Die Pol III des Führungsstrangs wird so nur kurzzeitig angehalten, während die Folgestrang-Polymerase neu positioniert wird. Die bewegliche Klammer, die um das fertiggestellte Okazaki-Fragment zurückbleibt, dient als Anlaufstelle für Pol I und DNA-Ligase, mit deren Hilfe der RNA-Primer auf dem vorherigen Okazaki-Fragment durch DNA ersetzt und der Einzelstrangbruch verschlossen wird. Schließlich muss die Klammer dem Kreislauf wieder zugeführt werden. Anfänglich nahm man an, dass dies die Aufgabe des Klammeröffners sei. Inzwischen weiß man, dass die Freisetzung der Klammer von der gebundenen DNA von einer freien ö-Untereinheit bewerkstelligt wird. Dieser „Schraubenschlüssel“ im Klammeröffner, der die ßUntereinheiten der Klammer voneinander trennt, wird im Vergleich zu den andern Komponenten des Klammeröffners von der Zelle im fünffachem Überschuss synthetisiert. Die Reaktion der DNA-Ligase wird durch NAD* oder ATP aktiviert

Die Energie für die Reaktion der DNA-Ligase wird speziesabhängig entweder durch Hydrolyse von NAD" zu Nicotinamid-Mononucleotid (NMN*) und AMP oder von ATP zu PP; und AMP erhalten. Die E. coli-DNA-Ligase, ein 77-kD-Mo-

nomer, welches NAD" einsetzt, katalysiert eine dreistufige Reaktion (Abb. 25.17): 1. Die Adenylgruppe von NAD" wird auf eine e-Aminogruppe eines Lys-Rests im Enzym übertragen und bildet ein ungewöhnliches Phosphorsäureamidaddukt.

|

DNA-Replikation in Prokaryoten

2. Die Adenylgruppe dieses aktivierten Enzyms wird auf den 5’-Phosphorylterminus des Strangbruchs übertragen. Dadurch ist AMP an das 5’-Nucleotid über ein Pyrophosphat anstatt des üblichen Phosphodiesters gebunden. 3. Die DNA-Ligase katalysiert die Bildung eines Phosphodiesters durch Angriff am 3’-OH der 5’-Phosphorylgruppe, wodurch der Bruch geschlossen und AMP freigesetzt wird.

ATP-abhängige DNA-Ligasen (wie diejenigen der Eukaryoten) spalten PP, anstelle von NMN* im ersten Reaktionsschritt ab. Bemerkenswert ist die DNALigase des Bakteriophagen T4, da sie zwei doppelsträngige DNA-Moleküle verbinden kann, die keine komplementären Einzelstrangüberhänge aufweisen (Ligation glatter Enden, engl.: blunt end ligation). Diese Reaktion ist in der Gentechnologie sehr wichtig (siehe Abschnitt 3.5).

Termination der Replikation

ö fo) | | N-R-0—P—0-P—O—R-—A A 0) 0”

X

E—Lys—NH, +

1

||

E— Lys—NH,

-P—-O—R-—A

IN

oO OH

2

of

NA

of

P 9 TEN o-

+ E—Lys—NH,

NZ

OH

P FEN

22%

(0)

Der Replikationsterminus von E.coli umfasst eine große Region (350 kb), die von sieben fast identischen, nicht palindromischen, — 23 bp langen Terminationssequenzen (TerE, TerD und TerA auf der einen Seite, TerG, TerF, TerB und TerC auf der anderen) flankiert wird (Abb. 25.18). Man beachte, dass diese Terminationsregion auf dem E.coli-Chromosom dem oriC genau gegenüberliegt. Eine Replikationsgabel wandert, wie in Abb. 25.18 abgebildet, entgegen dem Uhrzeigersinn durch TerG, TerF, TerB und TerC, stoppt aber, wenn sie auf TerA, TerD oder TerE trifft (TerD und TerE sind wahrscheinlich Sicherungsposten für TerA). Ähnlich läuft eine im Uhrzeigersinn wandernde Replikationsgabel durch TerE, TerD und TerA, stoppt aber bei TerC (oder, falls dies misslingt, bei TerB, TerF oder TerG). Diese Terminationssequenzen sind polar, d.h. richtungsabhängig. Sie wirken als Einwegventile, welche es den Replikationsgabeln erlauben, den Terminus zu betreten, ihn aber nicht zu verlassen. Dadurch wird sichergestellt, dass die beiden durch bidirektionale Initiation an oriC entstandenen Replikationsgabeln am Replikationsterminus aufeinander treffen, auch wenn eine der beiden wesentlich früher als die andere dort ankommen sollte. Zum Anhalten der Replikationsgabeln an den Ter-Stellen wird das Tus-Protein benötigt, ein 309 Reste langes Protein, das durch das tus-Gen (von engl.: terminator utilization substance) codiert wird. Tus bindet spezifisch an eine TerSequenz, wo es die Strangverdrängung durch DnaB-Helicase verhindert, so dass die Replikationsgabel zum Stillstand kommt. Die Röntgenstruktur von Tus im Komplex mit einem 15 bp grofsen Ter-Fragment (Abb. 25.19) zeigt, dass das Protein eine tiefe, positiv geladene Tasche bildet, in der die DNA bindet. Ein 5-bp-Segment der DNA an dem Ende von Tus, das die Passage der Replikationsgabel zulässt, ist deformiert und unterdreht im Vergleich zur normalen DNA; seine große Furche ist tiefer und seine kleine Furche signifikant erweitert. Proteinseitengruppen am Taschenboden reichen in die große Furche der DNA hinein und bilden sequenzspezifische Kontakte aus, so dass das Protein die gebundene DNA nicht ohne größere Konformationsänderungen entlassen könnte. Nichtsdestotrotz ist der Mechanismus weiterhin unklar, durch welchen Tus die Passage der Replikationsgabel auf der einen Seite von Ter verhindert, auf der anderen dagegen gestattet. Seltsamerweise ist dieses System jedoch nicht essentiell für die Termination. Wenn der Replikationsterminus entfernt wird, stoppt die Replikation dennoch, offenbar durch die Kollision mit der gegenüberliegenden Replikationsgabel. Nichtsdestotrotz ist dieses Terminationssystem in gram-negativen Bakterien hoch konserviert. Der letzte Schritt der DNA-Replikation in E. coli ist die Trennung der nach der Replikation verketteten, elterlichen DNA-Stränge. Durch diese Reaktion, die wahrscheinlich von einer oder mehreren Topoisomerasen katalysiert wird, werden die beiden Replikationsprodukte freigesetzt.

NAD* NMN*

0

+

LIT] VEN

D.

975

=

LEN

OÖ

E—

O—RTA

Lys— NH,

>

AMP

[6)

l

OOPU

| o-

Abb. 25.17 Reaktionsmechanismus der DNA-Ligase aus E. coli.

Bei den Ligasen von Eukaryoten und T4-Phagen tritt ATP an die Steile von NAD*, so dass PP;

anstatt NMN* im ersten Reaktionsschritt freigesetzt wird. A = Adenin, R = Ribose,

N = Nicotinamid.

Abb. 25.18

Genomkarte von E. coli, welche

die Positionen der Ter-Stellen zeigt. Die Stellen TerC, TerB, TerF und TerG erlauben in Kombination

mit dem Tus-Protein, dass ein

Replisom entgegen dem Uhrzeigersinn, aber nicht im Uhrzeigersinn passieren kann. Das Umgekehrte gilt für TerA, TerD und TerE. Damit ist sichergestellt, dass sich zwei Replikationsgabeln, die durch Auslösen der bidirektionalen DNA-Replikation am oriC entstehen, am gegenüberliegenden Ter treffen.

976

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

E.

_ Genauigkeit der Replikation

Wenn bereits ein so kleines Polypeptid wie das Klenow-Fragment der Pol I die Replikation von DNA katalysieren kann, warum verfügt E.coli dann über eine Batterie von mehr als zwanzig kompliziert aufeinander abgestimmten Enzymen, um sein Chromosom zu replizieren? Offensichtlich ist dies nötig, um die nahezu perfekte Genauigkeit der DNA-Replikation zu gewährleisten, damit die genetische Information unversehrt von einer Generation zur nächsten weitergegeben werden kann. Auf Grund der beobachteten Häufigkeit, mit der Mutanten von E.coli oder

T4-Phagen zum Wildtyp revertieren, kann man sagen, dass pro 10° bis 10"

Abb. 25.19 Röntgenstruktur des Tus-Proteins aus E. coli im Komplex mit einer 15 bp Ter-DNA. Die N- und C-terminalen Domänen des Proteins (in Bänderdarstellung) sind grün und türkis gezeigt. Die DNA ist als Kalottenmodell abgebildet und entsprechend ihrer Atomtypen angefärbt (C grün, N blau, © rot und P orange). [Nach einer Röntgenstruktur von Kosuke Morikawa, Protein Engineering Research Institute, Osaka. PDBid 1ECR.] 6% siehe Interactive Exercises.

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Fassen Sie die Funktionen der folgenden Proteine bei der DNAReplikation in E. coli zusammen: DNA-Polymerase I, DNAPolymerase III, DnaA, Helicase,

replizierte Basenpaare nur eine Fehlpaarung auftritt. Dies entspricht ca. 1 Fehler pro 1000 Bakterien pro Generation. Solch eine hohe Replikationsgenauigkeit beruht auf vier Faktoren: 1. Die Zellen halten die dNTP-Mengen durch die in den Abschnitten 23.1C und 23.2C beschriebenen Mechanismen konstant. Dies ist wichtig, denn ein zu häufig vorkommendes dNTP würde sonst fälschlicherweise anstelle des seltenen eingebaut, und ein zu selten vorkommendes würde im Gegensatz dazu durch ein häufiges dNTP ersetzt. 2. Die Polymerasereaktion selbst ist äußerst genau, da sie in zwei Stufen stattfindet. Im ersten Schritt bildet das neue dNTP mit der Matrize eine Basenpaarung aus, während das Enzym in einer offenen, inaktiven Konformation vorliegt. Die Polymerisationsreaktion beginnt erst, nachdem sich die Polymerase um das neugebildete Basenpaar geschlossen hat, wodurch die katalytischen Reste richtig positioniert werden (ein weiteres Beispiel für einen induced fit, Abb. 25.11). Die Konformationsänderung des Proteins bewirkt eine doppelte Kontrolle für die korrekte Watson-Crick-Basenpaarung zwischen dem dNTP und der Matrize.

,

3. Die 3’ —5’-Exonucleasefunktionen der Pol I und Pol III detektieren und eliminieren die gelegentlich auftretenden Fehler ihrer Polymerasefunktionen. 4. Ein besonderes Enzymsystem in allen Zellen repariert die verbliebenen Fehler in neu synthetisierter DNA und auch solche DNA-Schäden, die erst nach der Replikation durch chemische oder physikalische Einwirkungen entstehen. Diese Reparatursysteme werden wir in Abschnitt 25.5 kennenlernen.

SSB, Primase, ß-Klammer,

Klammeröffner, DNA-Ligase, Tus und Topoisomerase. 2. Wieviele ß-Klammern und Klammeröffner-Durchgänge sind für die Synthese des Leitstrangs und des Folgestrangs nötig? 3. Erklären Sie die vier Faktoren, die zur hohen Genauigkeit der DNA-Replikation beitragen.

Zusätzlich erhöht sich die DNA-Replikationsgenauigkeit dadurch, dass die Polymerase ohne Primer keine Kettenverlängerung starten kann. Die ersten Nucleotide einer Kette sind die am häufigsten falsch gepaarten, bedingt durch die Kooperativität der Basenpaarwechselwirkungen (Abschnitt 24.2). Die Verwendung von RNA-Primern eliminiert diese Fehlerquelle, da die RNA anschließend durch DNA ersetzt wird, und zwar unter Bedingungen, die eine genauere Basenpaarung erfordern.

3

Eukaryotische DNA-Replikation

Der Mechanismus der DNA-Replikation ist bei Eu- und Prokaryoten erstaunlich ähnlich, obwohl das eukaryotische System hinsichtlich der zu replizierenden DNA-Menge und der Anzahl der erforderlichen Proteine (bei Säugern und in Hefe über 27) erheblich komplexer ist. In eukaryotischen Zellen kommen verschiedene DNA-Replikationsarten vor. Diese Zellen enthalten nicht nur Kern-DNA, sondern auch mitochondriale DNA und Pflanzen zusätzlich Chloroplasten-DNA. In diesem Abschnitt behandeln wir einige Komponenten der eukaryotischen DNA-Replikation und die Problematik, die Enden der linearen Chromosomen zu replizieren.

Eukaryotische DNA-Replikation

977

A. _ Eukaryoten verwenden verschiedene DNA-Polymerasen Tierische Zellen enthalten mindestens 13 verschiedene DNA-Polymerasen, die mit griechischen Buchstaben in der Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt wurden. Eine neuere Klassifizierung verwendet die Sequenzhomologie, um die eukaryotischen und prokaryotischen Polymerasen in sechs Familien einzuteilen: A, B,C, D, X und Y. In diesem Abschnitt beschreiben wir die drei wichtigsten Enzyme, die an der Replikation eukaryotischer Kern-DNA beteiligt sind: die Polymerasen «a, ö und e, die alle zur B-Familie der Polymerasen gehören (Tabelle 25.2). Wie alle DNA-Polymerasen, repliziert auch die DNA-Polymerase a (Pol «) die DNA, indem sie unter Vorgabe einer ssDNA-Matrize einen Primer in die 5'’— 3’Richtung verlängert. Dieses Enzym besitzt keine Exonuclease-Aktivität und kann deshalb sein Polymerisierungsprodukt nicht auf Korrektheit überprüfen. Die Pol a ist nur mäßig prozessiv (sie polymerisiert jeweils etwa 100 Nucleotide) und ist fest mit einer Primase assoziiert, was zeigt, dass sie an der Initiation der DNA-Replikation beteiligt ist. Der Pol a/Primase-Komplex synthetisiert einen RNA-Primer aus sieben bis zehn Nucleotiden RNA und erweitert ihn um etwa 15 zusätzliche Desoxyribonucleotide. Dass er keine Korrekturleseaktivität hat, ist ohne Auswirkung, weil die ersten Reste der neu synthetisierten DNA normalerweise entfernt und zusammen mit dem RNA-Primer ersetzt werden. DNA-Polymerase ö (Pol ö) assoziiert nicht mit einer Primase und enthält ein aktives 3’ —5’ Exonuclease-Zentrum. Die Prozessivität der Pol ist außerdem praktisch unbegrenzt (sie kann die gesamte Länge einer DNA-Matrize replizieren), aber nur im Komplex mit einem Gleit-Klammer-Protein namens

PCNA

(proliferating cell nuclear antigen). Die von Kuriyan gelöste Röntgenstruktur (Abb. 25.20) zeigt, dass es einen trimeren Ring mit nahezu identischer Struktur (und vermutlich Funktion) wie die B-Klammer bei E. coli (Abb. 25.16) bildet. Verblüffenderweise zeigen PCNA und die ß-Klammer keine signifikanten Sequenzidentitäten, auch dann nicht, wenn ihre strukturell ähnlichen Teile überlagert werden. Pol ö wird zusammen mit PCNA für die DNA-Synthese gebraucht. Während der Replikation lädt der RFC (Replikationsfaktor C, ein Klammer-Öffner, der das eukaryotische Pendant zum y-Komplex von E. coli ist, PCNA auf den Matrizenstrang in der Nähe des Primers. Dies verschiebt die Pol a und erlaubt Pol ö, den neuen DNA-Strang zu binden und ihn schrittweise zu verlängern. Die DNA-Polymerase & (Pol e) ähnelt oberflächlich der Pol ö, ist aber in Abwesenheit von PCNA hoch prozessiv. Aus diesem Grund und weil sie für die DNA-Replikation essenziell ist, hat man angenommen, dass Pol & als Leitstrang-Polymerase fungiert, während Pol a und Pol ö zusammenwirken und den Folgestrang synthetisieren. Experimente mit Hefe legen jedoch nahe, dass die essenzielle Funktion der Pol & allein durch die nichtkatalytische C-terminale Hälfte der katalytischen 256-kD Untereinheit erfüllt werden kann. Dies ist für die DNA-Polymerasen der B-Familie einzigartig. Es scheint deshalb, dass zumindest in der Hefe Pol & eine unverzichtbare Kontrollfunktion, aber keine solche Katalysefunktion hat. Tab. 25.2

Eigenschaften einiger eukaryotischer DNA-Polymerasen

a. ö III ja nein 3’ > 5'-Exonuclease

€ ja

Mit Primase assoziiert

ja

nein

nein

Prozessivität

mäßig

hoch

hoch

Erfordert PCNA

nein

ja

nein

nn

Abb. 25.20 Röntgenstruktur von PCNA. Die drei Proteinmonomere (rot, grün und gelb) bilden eine dreifach symmetrische Ringstruktur.

In die Mitte des PCNA-Rings wurde das Modell einer doppelsträngigen B-DNA platziert (mit Blick entlang der Helixachse). Man vergleiche diese Struktur mit derjenigen der B-Klammer des PolIII-Holoenzyms aus E. coli (Abb. 25.16). [Mit freundlicher Genehmigung von John Kuriyan. The Rockefeller University. PDBid IPLQ.] 6% siehe Interactive Exercises.

978

_DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Reverse Transkriptase y in Retrog Enzym i i ein wichtiges (RT)RT) ist Reverse Transkriptase eukaryotische viren. So werden bestimmte RNA-haltige Viren bezeichnet,

darunter das menschliche

h

Immunschwä-

che-Virus (engl.: human immunodeficiency virus, HIV; die Ursache für AIDS). RT, die 1970 unabhängig voneinander durch

AAAAA ST

E B ee poly(T)-Primer + INTPs —\| reverse Tranekiptasee

Howard Temin und David Baltimore entdeckt wurde, synthe-

tisiert DNA in 5’—3’-Richtung ausgehend von einer RNAMatrize. Zuerst glaubte man, die Aktivität dieses Enzyms widerspräche dem zentralen Dogma der Molekularbiologie (Abschnitt 3.3B). Die RT-Reaktion ist jedoch thermodynamisch möglich; sogar Pol I kann unter bestimmten Bedingungen RNA-Matrizen

Einzelstrang-RNA

ar

mentären DNA-Strangs, wodurch eine RNA-DNA-Hybridhelix entsteht. Die Initiation der DNA-Synthese wird durch eine tRNA der Wirtszelle ermöglicht, deren 3’-Ende mit dem komplementären viralen RNA-Segment Basenpaarungen ausbildet. Der virale RNA-Strang wird anschließend durch die

H oder alkalische Behandlung RNase

ee

des

Nachdem das Virus in eine Zelle eingedrungen ist, benutzt die RT die virale RNA als Matrize zur Synthese des komple-

RNase

NA DNA IIEIG

3

kopieren. RT katalysiert den ersten Schritt in

der Umwandlung der genomischen Virus in Doppelstrang-DNA.

RAN Kehlleiigilen TERN

3 RVRVNVIWINIVAVAN

= NMP TTTTT

3

ARE

N (benutzt das 3'-Ende als Primer) RER

H abgebaut. Dies ist eine RNase, welche spezifisch

die RNA in einer RNA-DNA-Hybridhelix hydrolysiert. Danach dient der entstandene DNA-Einzelstrang als Matrize für die Synthese seines komlementären DNA-Strangs. Die resultie-

5

einzelsträngige DNA

/

OWEN Gopngisiimaeles Ei

h1 1 IT 5

rende Doppelstrang-DNA wird schließlich in ein Chromosom

SIeNeleaen

der Wirtszelle eingebaut. Die RT ist ausgesprochen nützlich in der Gentechnik, da sie mRNAs in komplementäre DNA-Stränge (cCDNA, rechts) überführen kann. cDNAs können beispielsweise dazu verwendet werden, eukaryotische Strukturgene in E.coli zuexprmieren (Abschnitt 3.5D). Da E. coli keine Introns herausspleifen kann (Abschnitt 26.3A), müssten bei der Verwendung genomischer DNA zur Expression eukaryotischer Strukturgene in Bakterien zuerst die Introns herausgeschnitten werden, was technisch sehr schwierig wäre.

(eine Einzelstrang-Endonuclease)

{

‚ ; BSDISOIGSDNDNDNSONGEREE 3 cDNA-Kopie der mRNA

‚ i

Reverse Transkriptase aus HIV-1 wird als dimeres Protein aus zwei identischen 66 kD Polypeptiden, p66 genannt, synthetisiert. Jedes p66 besitzt eine Polymerase- und eine RNase-HDomäne. Eine der beiden RNase H-Domänen wird jedoch

DNA-Polymerase y (Pol y), ein Enzym der A-Familie, kommt ausschließlich in Mitochondrien vor, wo sie wahrscheinlich das mitochondriale Genom repliziert. Chloroplasten enthalten ein ähnliches Enzym. Ein weiteres Mitglied der Polymerasefamilie ist das virale Enzym Reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Exkurs 25.2). An der DNA-Replikation von Eukaryoten sind weitere Enzyme beteiligt Wie bei der prokaryotischen DNA-Replikation, ist auch hier eine Helicase erforderlich, um die beiden Matrizenstränge zu trennen. Bei Eukaryoten übernimmt

diese Funktion der hexamere Komplex mit der Bezeichnung MCM. Einzelsträngige DNA wird mit trimeren RPA-Molekülen überzogen, das eukaryotische Äquivalent des bakteriellen SSB. Das eukaryotische Replisom enthält noch zusätzliche Proteine, die keine Entsprechungen bei Prokaryoten haben und deren Funktionen man noch nicht verstanden hat.

Eukaryotische DNA-Replikation

Bingen herausgeschnitten, wodurch das 51 kD große

olypeptid p51 entsteht. Somit ist RT in Wahrheit ein Dimer aus p66 und p51. Die Röntgenstruktur der HIV-1-RT zeigt, dass die zwei Untereinheiten verschiedene Strukturen besitzen, obwohl beide Finger-, Handfläche-, Daumen- und eine „Verbindungs“-Do-

mäne aufweisen. Die RNase-H-Domäne von p66 folgt der Verbindungsdomäne. p66 und p51 assoziieren sich in einer Art Kopf-an-Schwanz-Anordnung, das Dimer hat also keine zweizählige Symmetrie (dies ist zwar selten, aber nicht un-

möglich). Folglich hat RT nur ein aktives Zentrum, das eine Polymerasefunktion besitzt.

Der RT fehlt eine Exonucleasefunktion zum Korrekturlesen

und das Enzym neigt dadurch sehr stark zu Fehlern. Tatsächlich ist es auch die daraus resultierende Fallen des HIV zur schnellen

Entwicklung,

selbst innerhalb eines einzigen

Wirts, die eine wirksame anti-HIV-Impfung verhindert. Die häufige Mutationsrate ist außerdem ein Grund dafür, de HIV so schnell Resistenzen gegen Pharmaka Enden die viral codierte Enzyme, inklusive der RT, hemmen. 6% dns Interactive Exercises.

pP66 er Bruer

Daumen

Handfläche

Verbindung

[RT-Strukturen mit freundlicher Genehmigung von Thomas Steitz, Yale University. PDBid 3HVT.]

Eukaryoten fehlt eine zur „nick-translation“ befähigte Polymerase wie die Pol I bei E.coli. Stattdessen werden die RNA-Primer von Okazaki-Fragmenten durch die Aktivität von zwei Enzymen entfernt: RNase H1 beseitigt den größten Teil der RNA und lässt nur das der DNA benachbarte 5’-Ribonucleotid übrig. Dieses wird dann durch die Flap-Endonuclease-1 (FEN1) entfernt. Wie wir gesehen haben, erweitert Pol

« den RNA-Primer

um

etwa

15 Nucleotide

979

DNA,

el

5’

a’ RNA-Primer

von Pol a synthetisierte DNA

bevor

sie durch Pol ö verdrängt wird. Da Pol a nicht Korrekturlesen kann, enthält der erweiterte Primer häufiger Fehler als die von der Pol ö synthetisierte DNA. FEN1 verschafft jedoch faktisch der Pol a eine Korrekturlesefunktion: Sie ist ebenfalls eine Endonuclease, die bei einem an einen komplementären Strang angelagerten fehlgepaarten Oligonucleotide bis zu 15 Nucleotide vom 5’-Ende her wieder herausschneiden kann. Zudem kann FEN1 mehrere solche Ausschnitte hintereinander erzeugen, um weiter entfernte Fehlpaarungen zu beseitigen. Das ausgeschnittene Segment wird später von Pol ö ersetzt, wenn diese das nachfolgende Okazaki-Fragment synthetisiert (Abb. 25.21).

14

FE

|

2

\

RNase H1

Flap-

Endonuclease-1

u,

Beseitigung der RNA-Primer bei Eukaryoten. Abb. 25.21 (1) RNase H1 schneidet bis auf das 5’-Nucleotid den gesamten RNA-Primer. (2) FEN], eine 5’->3’-Endonuclease, entfernt dann das verbliebene Ribonucleotid zusammen

mit einem

Segment benachbarter DNA, falls es Fehlpaarungen enthält. (3) Die ausgeschnittenen Nucleotide werden ersetzt, wenn die DNA-Polymerase ö die Synthese des nächsten Okazakider Fragments fertigstellt (in dieser Zeichnung links). Der Bruch wird schließlich von DNA-Ligase verschlossen.

3 |DNA-Polymerase ö

BANIIRRRRRRRERLLLLLURG

980

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

B.

Die Replikation der eukaryotischen DNA beginnt an mehreren Startpunkten

Die Replikationsgabel bewegt sich bei Eukaryoten rund 10mal langsamer als bei Prokaryoten. Da ein eukaryotisches Chromosom normalerweise 60mal mehr DNA enthält als ein prokaryotisches, würde seine von einem einzigen Startpunkt ausgehende Replikation in zwei Richtungen (wie bei den Prokaryoten) einen Monat dauern. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wie in Abbildung 25.22 zeigen jedoch, dass eukaryotische Chromosomen viele Replikationsstartpunkte haben; pro 3 bis 300 kb einen, je nach Spezies und Gewebe. Somit dauert die gesamte Replikation nur einige wenige Stunden. Bei der Hefe beginnt die DNA-Replikation an autonomen Replikationssequenzen (ARS, autonomously replicating sequences), bei denen es sich um konservierte Sequenzen von 11 bp handelt, die neben leicht zu entwindender DNA sind. Im Genom von Säugern zeigen die Replikationsstartpunkte keine Sequenzkonservierung, aber diese Stellen unterstützen alle die Bindung eines Startpunkterkennungskomplexes (ORC, origin recognition complex). Zusätzliche ATP-hydrolysierende Proteine helfen, die Helicase MCM aufzubauen. Der entstehende Präreplikationskomplex (Prä-RC) kann die Replikation nicht starten, bevor er nicht durch andere Faktoren aktiviert wurde, die das Fortschreiten des Zellcyclus’ überwachen (Abschnitt 28.4A). Die separate Steuerung des PräRC-Aufbaus und dessen Aktivierung erlauben den Zellen, Replikationsstartpunkte auszuwählen, bevor MCM die Matrizen-DNA entwindet und die Replikation beginnt. Wenn die DNA-Synthese einmal im Gang ist, können sich keine neuen Prä-RC-Komplexe mehr bilden. Damit ist sichergestellt, dass die DNA pro Zellcyclus nur einmal repliziert wird und nicht häufiger. Die Startpunkte sind in der frühen Embryogenese, wenn die Zellteilung rasch abläuft, einheitlich über das Genom verteilt. Wenn sich die Zellen aber differenziert haben, ändert sich die Verteilung der Replikationsstartpunkte. Sie spiegelt möglicherweise das Genexpressionsmuster und/oder Veränderungen der DNAPackung in verschiedenen Zelltypen wider. Zytologische Untersuchungen zeigen, dass die verschiedenen Bereiche eines Chromosoms nicht alle gleichzeitig repliziert werden. Stattdessen werden Gruppen von 20 bis 80 benachbarten Replicons (Replikationseinheiten; DNAAbschnitte, die von einem spezifischen Startpunkt aus repliziert werden) gleichzeitig aktiviert. Neue Gruppen von Replicons werden so lange aktiviert, bis das gesamte Chromosom repliziert wurde. Die DNA-Replikation schreitet vom Replikationsstartpunkt in jede Richtung voran, bis jede Replikationsgabel auf die Gabel einer benachbarten Replikation stößt. Eukaryoten scheinen keine den Ter-Stellen bei E. coli analogen Stopp-Sequenzen aufzuweisen. Hinter den Replikationsgabeln bauen sich die Nucleosomen wieder zusammen Im Gegensatz zur prokaryotischen DNA ist die eukaryotische DNA in Nucleosomen gepackt (Abschnitt 24.5B). Für die Initiation ist wahrscheinlich eine Veränderung der Struktur nötig, aber wenn die Replikation einmal im Gang ist, dann scheinen die Nucleosomen das Fortschreiten der DNA-Polymerasen nicht aufzu-

Abb. 25.22 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Fragments replizierender DNA aus Drosophila. Die Pfeile zeigen die vielen Replikationsaugen. [Nach Kreigstein, H.J. und Hogness, D.S., Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 136 (1974).]

Eukaryotische DNA-Replikation

981

halten. Experimente mit markierten Histonen zeigen, dass die Nucleosomen vor

der Replikationsgabel zerfallen und sich die freien Histone entweder einzeln oder als Di- oder Trimere mit den auftauchenden Tochterdoppelsträngen wieder zusammenlagern. Die ursprünglichen Histone assoziieren zufällig mit den Leitund Folge-Doppelsträngen. Die DNA-Replikation (die sich im Zellkern abspielt) ist mit der Histonsynthese im Cytosol abgestimmt, sodass neue Histone im benötigten Umfang zur Verfügung stehen.

Leitstrang RNAPrimer Folgestrang (%

a’

&

Telomere und Telomerasen

Die Enden der linearen eukaryotischen Chromosomen stellen ein Problem für die Replikationsmaschinerie dar. DNA-Polymerasen können das äußerste 5'-Ende des Folgestrangs nicht synthetisieren (Abb. 25.23). Selbst wenn ein RNA-Primer mit dem 3’-Ende der DNA-Matrize gepaart würde, könnte er nicht durch DNA ersetzt werden (die DNA-Polymerase kann nur in der 5’—3’-Richtung operieren; sie kann nur einen bestehenden Strang verlängern und der Primer muss an seinen komplementären Strang gebunden sein). Ohne einen entsprechenden Mechanismus zur Folgestrangfertigstellung würden folglich DNA-Moleküle bei jeder Replikationsrunde beidseits um eine RNA-Primerlänge gekürzt.

Abb. 25.23 Replikation eines linearen Chromosoms mit glatten Enden. Die Leitstrangsynthese kann bis zum Chromosomenende erfolgen (oben). Die DNAPolymerase kann aber das äußerste 5’-Ende des Folgestrangs nicht synthetisieren, da sie nur einen RNA-Primer verlängern kann, der mit dem 3’-Ende eines Matrizenstrangs gepaart ist (unten). Die

Entfernung des Primers und der Abbau des zurückbleibenden Einzelstrangendes würde das Chromosom bei jeder Replikationsrunde verkürzen.

Telomere werden an RNA-Matrizen gebildet

Die Enden eukaryotischer Chromosomen, die Telomere (griech.: telos, Ende), besitzen eine ungewöhnliche Struktur. Telomer-DNA besteht aus tausend oder mehr Wiederholungen einer einfachen, G-reichen Sequenz (TTGGGG im Wimpertierchen Tetrahymena und TTAGGG im Menschen) an den 3’-Enden der chromosomalen DNA-Stränge. Elizabeth Blackburn zeigte, dass telomere DNA durch ein Enzym namens Telomerase, ein Ribonucleoprotein (ein Komplex von Protein und RNA) synthetisiert und aufrechterhalten wird. Zu der RNA-Komponente (451 nt beim Menschen) gehört ein Segment, das komplementär zu der repetitiven Telomerse-

Blikseye

a

ee

3

sehköcoonne

telomere DNA

(@Telomerase-RNA ee) 3

5’

dGTP + dTTP Polymerisation

PP; ı

DR -

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END

EHE EENZUEN UN.E.TT.708,

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Translokation

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5’

)

Abb. 25.24 Vorgeschlagener Mechanismus für die Synthese telomerer DNA durch Telomerase aus Tetrahymena. Der 5’-Endstrang des Telomers wird später durch normale Folgestrangsynthese verlängert. [Nach Greider, C.W., und Blackburn, E.H., Nature

337, 336 (1989).]

_DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

982

Abb. 25.25 Struktur des telomeren Oligonucleotids dIGGGGTTTTGGGG). (a) Die Basenpaarinteraktionen in einem

G-Quartett. (b) Diagramm der NMRspektroskopisch in Lösung bestimmten Struktur {links} und der Röntgenstruktur (rechts). Die Strangrichtung ist durch Pfeile angegeben. Die Nucleotide sind mit 1 bis 12 in einem und mit 1* bis 12* im anderen Strang nummeriert. Die Guaninreste G1-G4 sind durch blaue Rechtecke symbolisiert, G9-G12 sind cyan, G1*-G4* rot, G9*-G12* pink.

[Nach Schultze, P., Smith, F.W. und Feigon, J., Structure 2, 227 (1994).

PDBid 156D.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 1.

Beschreiben Sie, wie Pol a, Pol 6, PCNA, RNase Hl, FEN1

und DNA-Ligase an der DNA-Synthese in Eukaryoten beteiligt sind. 2. Welche Funktion hat der Präreplikationskomplex? 3. Beschreiben Sie die Struktur, Funktion und Synthese von Telomeren.

quenz ist. Dieses Segment dient als Matrize beim Anhängen von Nucleotiden an das 3’-Ende der DNA (Abb. 25.24, oben). Die Telomerase funktioniert demnach ähnlich wie die Reverse Transkriptase (Exkurs 25.2); tatsächlich ist eine ihrer Proteinkomponenten homolog zur Reversen Transkriptase. Telomerase wandert immer wieder an das neue 3’-DNA-Ende und addiert multiple Telomersequenzen an die DNA (Abb. 25.24, unten). Der zum G-reichen Telomerstrang komplementäre Gegenstrang wird offensichtlich mit den gleichen zellulären Werkzeugen hergestellt, die auch bei der normalen Folgestrangsynthese zum Einsatz kommen, was zu einem 100 bis 300 nt langen Einzelstrang-Überhang am G-reichen Strang führt. In Abwesenheit von Telomerase kommt es zur schrittweisen Verkürzung der Chromosomen mit jeder DNA-Replikationsrunde. Dieser Vorgang ist Teil des normalen Alterungsprozesses der Zelle. Umgekehrt ermöglicht eine gesteigerte Telomeraseaktivität unkontrollierte Replikation und Zellwachstum, wie es bei Krebs vorkommt (Exkurs 25.3). Telomere bilden G-Quartetten aus Guaninreiche Polynucleotide sind dafür bekannt, dass es schwer ist, mit ihnen zu arbeiten. Dies liegt an ihrer Neigung, über Hoogsteen-Basenpaarung zu aggregieren (Abschnitt 24.2B) und cyclische Tetramere auszubilden, die auch als

G-Quartette (Abb. 25.25) bezeichnet werden. Dabei bilden die G-reichen überhängenden Telomerstränge zunächst Haarnadelstrukturen (engl.: hairpins) aus. Jeweils zwei dieser Haarnadelstrukturen lagern sich antiparallel zusammen und bilden stabile Komplexe gestapelter G-Quartette (Abb. 25.255). Solche Strukturen dienen vermutlich als Bindungsstellen für umhüllende Proteine, die dabei helfen, die Länge der Telomere zu regulieren und die Aktivierung des DNA-Reparaturmechanismus zu verhindern, der normalerweise die freien Enden unterbrochener DNA-Stränge erkennt.

DNA-Schäden

und Mutationen

983

Telomerase, Alterung und Krebs Ohne Telomerase würde ein lineares Chromosom bei jeder DNA-Replikationsrunde und Zellteilung um mindestens die Länge eines RNA-Primers verkürzt. Man hat deshalb zunächst angenommen, dass ohne Vorhandensein einer Telomeraseaktivität

essenzielle

Gene,

die in der Nähe

der

Telomere (Chromosomenenden) liegen, verloren gehen und dadurch die Tochterzellen irgendwann nicht mehr lebensfähig sind. Inzwischen ist jedoch erwiesen, dass Telomere eine an-

dere, ebenfalls lebenswichtige, Funktion für die Integrität der

Chromosomen erfüllen. Freie DNA-Enden kurbeln ein Reparatursystem zur Behebung von DNA-Schäden an, das normalerweise dazu dient, die losen Enden gebrochener Chromoso-

men wieder zu verbinden (Abschnitt 25.5E). Folglich würde an den Telomeren exponierte DNA dazu führen, dass Chro-

mosomen an den Enden miteinander fusionieren - ein Vorgang, der zur Chromosomeninstabilität und schließlich zum Zelltod führte (fusionierte Chromosomen zerbrechen oft in der Mitose;

da sie zwei Centromere

haben, werden

sie gleichzeitig in zwei entgegengesetzte Richtungen gezogen). Durch den als Capping bezeichneten Vorgang wird DNA der Telomere spezifisch von Proteinen gebunden, um die DNA-Enden zu verdecken. Es gibt zunehmend Beweise, dass das Capping ein dynamischer Vorgang ist: Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Telomer spontan die Kappe verliert, steigt in dem Maße, wie die Telomerlänge abnimmt. Somatische Zellen vielzelliger Organismen besitzen keine Telomeraseaktivität. Dies erklärt, warum solche Zellen in Kultur nur eine beschränkte Anzahl von Teilungsrunden (20-60) durchlaufen

können, bevor sie die Seneszenz erreichen

(ein

Stadium, in dem sie die Teilung einstellen) und schließlich sterben. Normalerweise unsterbliche Tetrahymena-Kulturen mit mutierter Telomerase gleichen alternden Säugetierzellen vor dem Absterben. Offensichtlich ist der Verlust der Telomera-

DNA-Schäden

sefunktion in somatischen Zellen eine Grundlage für die Alterung vielzelliger Organismen. Es besteht jedoch nur ein schwacher Zusammenhang zwischen der Proliferationskapazität einer kultivierten Zelle und dem Alter ihres Ursprungsorganismus (Spender). Dagegen gibt es eine enge Korrelation zwischen der anfänglichen Telomerlänge in einer Zelle und ihrer Proliferationskapazität. Zellen, die zu Beginn relativ kurze Telomere haben, erfahren erheblich weniger Zellteilungen als Zellen mit längeren Telomeren. Kurze Telomere findet man z.B. in Fibroblasten von Personen, die an Progerie leiden (einer seltenen Krankheit, die

durch schnelles und vorzeitiges Altern gekennzeichnet ist und bereits in der Kindheit zum Tod führt). Diese Beobachtung steht im Einklang mit der reduzierten Proliferationskapazität in Zellkulturen. Im Gegensatz dazu haben Spermien Telomere,

deren

Länge

nicht vom

Alter des Spenders

ab-

hängt. Dies zeigt, dass die Telomerase während des Keimzellwachstums aktiv ist. Desgleichen haben die wenigen Zellen in Kultur,

die zu

unbeschränkter

Proliferation

fähig sind,

eine aktive Telomerase und eine feste Telomerlänge, genauso wie Zellen einzelliger Eukaryoten (die ebenfalls unbegrenzt teilunsgfähig sind). Welchen Selektionsvorteil mögen Vielzeller davon haben, dass sie die Telomeraseaktivität ihrer somatischen Zellen abschalten?

Eine zunächst verblüffende

Erklärung wäre, dass

die Zellalterung ein Mechanismus ist, der Vielzeller vor Krebs schützt. Tatsächlich enthalten Krebszellen (die unsterblich sind und unkontrolliert wachsen) aktive Telomerase. Das Enzym ist beispielsweise in Eierstockkrebszellen aktiv, aber nicht in normalen Eierstockzellen. Dieser Befund macht Telomeraseinhibitoren zu attraktiven Kandidaten für die bei der Entwicklung von Zytostatika.

und Mutationen

Die Replikationsgenauigkeit der DNA-Polymerasen, gepaart mit deren Korrekturlesefunktion, ist essentiell zur fehlerfreien Weitergabe der genetischen Information bei der Zellteilung. Dennoch können dabei gelegentlich Fehler auftreten, welche (sofern sie nicht korrigiert werden) die Nucleotidsequenz in Genen ändern können. Die DNA kann aber auch chemisch verändert werden, durch Reagenzien, die natürlicherweise in der Zelle oder in ihrer Umgebung vorkommen. Oft kann fehlerhafte DNA repariert werden, wie wir in Abschnitt 25.5 sehen werden. Schwerwiegende Läsionen können jedoch irreversibel sein und so zum Verlust genetischer Information oder zum Zelltod führen. Wenn die Reparatur der schadhaften DNA jedoch nicht fehlerfrei ist, führt dies zu einer Mutation, also einer vererbbaren Änderung der genetischen Information. In Vielzellern werden genetische Änderungen normalerweise nur sichtbar, wenn sie werZellen der Keimbahn betreffen und somit auf die Nachkommen übertragen

984

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

den. Dagegen bleiben DNA-Schäden in somatischen Zellen meist auf diese beschränkt, außer die Mutation führt zu einer malignen Transformation (Krebs).

N

£

> — Ce (

©

N

H

CH3

o

H

a

Oo

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Z

N

IR

H

%

v2 —® Cu C

a N

CH;

CyclobutanRing

Abb. 25.26 Cyclobutylthymin-Dimer. Es bildet sich bei UV-Bestrahlung zwischen zwei benachbarten Thyminresten in einern DNA-Strang aus. Die ca. 0,16 nm langen Bindungen, über welche die beiden Thyminringe miteinander verknüpft sind (rot), sind viel kürzer als der normale Abstand (0,34 nm) zwischen gestapelten

A.

Chemische Mutagenese

Umweltfaktoren wie UV-Licht, ionisierende Strahlung und bestimmte chemische Substanzen können DNA physikalisch schädigen. Beispielsweise kann UV-Strahlung (mit einer Wellenlänge von 200-300 nm) zu der Bildung eines Cyclobutylrings zwischen zwei benachbarten Thyminresten desselben DNAStranges führen, was ein intramolekulares Thymindimer zur Folge hat (Abb. 25.26). Analoge Cytosin- und Thymin-Cytosin-Dimere werden weniger häufig gebildet. Solche Pyrimidindimere deformieren lokal die DNA-Basenpaarstruktur, was zu Störungen in Transkription und Replikation führen kann. Ionisierende Strahlung schädigt DNA auch. Dies geschieht entweder über direkte Einwirkung auf das DNA-Molekül oder indirekt über die Bildung freier Radikale, insbesondere von Hydroxylradikalen (HO-) im umgebenden wässrigen Medium. Dies kann zum Strangbruch führen. Chemische Mutagene (Substanzen, die Mutationen induzieren) bewirken zwei Hauptarten von Mutationen:

1. Punktmutationen, bei denen eine Base durch eine andere ersetzt wird. Diese werden wiederum unterteilt in: (a) Transitionen, hier wird ein Purin (oder Pyrimidin) durch ein anderes er-

Ringen in B-DNA, so dass die DNA lokal in ihrer

setzt.

Konformation gestört ist.

(b) Transversionen, hier wird ein Purin durch ein Pyrimidin oder umgekehrt ersetzt.

2. Insertions- oder Deletionsmutationen, bei denen ein oder mehrere Nucleotidpaare in die DNA eingeschoben oder aus ihr entfernt werden. Punktmutationen entstehen durch veränderte Basen Punktmutationen können durch die Behandlung von DNA mit salpetriger Säure (HNO,) ausgelöst werden, die aromatische, primäre Amine oxidativ desaminiert. Dabei wird Cytosin zu Uracil und Adenin zum guaninähnlichen Hypoxanthin umgewandelt (das mit Cytosin zwei der ursprünglich drei Wasserstoffbrücken zum Guanin bildet, Abb. 25.27). Behandelt man also DNA mit salpetriger Säure, so verwandelt sich A-T zu G-C (A-T — G.C-Transition) und G-C zu A-T (G-C > A-T-Transition). Obwohl Nitrit (die konjugierte Base der salpetri(a)

H

H N—H

N

INN

O---H—N

HNO,

ee;

Abb. 25.27 Oxidative Desaminierung durch salpetrige Säure. (a) Cytosin wird zu Uracil, das mit Adenin paart.

(b) Adenin wird zu Hypoxanthin, einem Guaninderivat (die 2-Aminogruppe des Guanins fehlt), das mit Cytosin paart.

ee

Uracil

H N

ni

N

7)

Cytosin

(b)

N

Adenin

H

\

N—H

N HNO,

OH ZN

Ehre

N

Hypoxanthin

Da

x

N

Va\

Cytosin

DNA-Schäden

gen Säure) möglicherweise mutagen ist, wird es als Konservierungsmittel für Lebensmittel wie Wiener Würstchen und andere gepökelte Fleisch- und Wurst' waren verwendet, weil es auch das Wachstum des Botulismuserregers Clostridium botulinum hemmt. Desaminierungsreaktionen an Basen treten auch spontan in Abwesenheit von salpetriger Säure auf. Der Zellstoffwechsel selbst bringt DNA mit den schädigenden Auswirkungen reaktiver Sauerstoffspezies (wie z. B. dem Hyperoxid-Anion O,:", dem Hydroxylradikal OH- und Wasserstoffperoxid H,0O,) in Kontakt, die normale Nebenpro-

dukte des oxidativen Stoffwechsels sind (Abschnitt 18.4B). Man hat über 100 verschiedene oxidative Veränderungen an der DNA klassifiziert. Guanin kann beispielsweise zu 8-Oxoguanin (0x0G) oxidiert werden: (6)

H

8-Oxoguanin (0oxoG)

Wenn der modifizierte DNA-Strang repliziert wird, kann 0x0G entweder mit C oder mit A eine Basenpaarung eingehen, sodass es zu einer G-C — A-T-Transition kommen kann. Alkylierende Substanzen, wie Dimethylsulfat, Stickstofflost, Ethylnitrosoharnstoff und N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG)

N

/

CH; —-CH,=cıl

& ge

CH,—CH;

HC

nn

CH,—CH,— CI Stickstofflost

NH H

N N ON /

—o Ethylnitrosoharnstoff

en

N

NO,

N-Methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidin (MNNG)

können ebenfalls Transversionen erzeugen. Kommt DNA beispielsweise mit MNNG in Kontakt, so entstehen neben anderen Produkten auch O°-Methylguaninreste,

06-Methylguaninrest

die entweder mit C oder Teine Basenpaarung eingehen können. S-Adenosylmethionin, das bei vielen Stoffwechselreaktionen die zu übertragende Methylgruppe bereit stellt (Abschnitt 21.4D), methyliert gelegentlich auch nichtenzymatisch eine Base, so dass Derivate wie 3-Methyladenin- und 7-Methylguaninreste entstehen. Basenmethylierungen haben aber auch „normale“ physiologische Funktionen (Exkurs 25.4). Die Alkylierung des N7 eines Purins macht die Glykosidbindung hydrolyseempfindlich, was zum Basenverlust führt. Die entstandene Lücke wird durch ein fehleranfälliges Reparaturenzym aufgefüllt. Transversionen entstehen, wenn das fehlende Purin durch ein Pyrimidin ersetzt wird. Sogar ohne Einwirkung von Alkylierungsmitteln hydrolysieren täglich spontan in jeder menschlichen Zelle schätzungsweise bei 10.000 der 3,2 Milliarden Purinnucleotide die glykosidischen Bindungen.

und Mutationen

985

986

_DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

DNA-Methylierung Nicht alle DNA-Modifikationen sind schädlich. Beispielsweise werden A- und C-Reste in einem speziesspezifischen Muster methyliert, wodurch N°-Methyladenin (m°A), N*-

Methylcytosin (m*C) und 5-Methylcytosin (m°C) entstehen:

Ba, Se CH, N

a N

NH,

—

\

CH;

|

N®.Methyladenin (m°A)-

5-Methylcytosin (mC)Rest

Rest

N-Methyleytosin (m?C)Rest

Diese Methylgruppen hinein, wo

ragen in die große Furche der DNA

sie mit DNA-bindenden

Proteinen

interagieren

können. In den meisten Zellen sind nur ein paar Prozent der entsprechenden Basen methyliert. Bei einigen Pflanzenarten liegen aber über 30% der C-Reste methyliert vor. Bakterielle DNA ist an den Stellen methyliert, die von den eigenen Restriktionsendonucleasen erkannt würden. Hierdurch wird eine Spaltung der eigenen DNA durch die entsprechende Restriktionsendonuclease verhindert (Abschnitt 3.4A). Auch andere Methyltransferasen modifizieren sequenzspezifisch andere Reste. Bei E.coli z.B. methyliert die Methyltransferase Dam den A-Rest in allen GATC-Sequenzen, und die Methyltransferase Dcm methyliert beide C-Reste in CCTTGG an deren C5-Positionen. Man beachte, dass zwei dieser Sequenzen Palindrome sind. Neben dieser Funktion in Restriktions-Modifikations-Systemen ist die DNA-Methylierung in Prokaryoten offensichtlich sehr bedeutend als Marker der elterlichen DNA bei der Reparatur fehlgepaarter Basenpaare. Jede Fehlpaarung bei der Replikation, die sich den Editing-Funktionen

von

Pol | und

Pol Il entzogen hat, kann immer noch mithilfe der sogenannten Fehlpaarungsreparatur (Abschnitt 25.5D) korrigiert werden. Wenn dieses System aber zur Fehlerkorrektur befähigt sein soll, anstatt die entstandenen

Fehler zu manifestieren,

muss es die elterliche DNA mit der richtigen Base vom Tochterstrang mit der „falschen“ Base unterscheiden können. Man kann beobachten, dass E. coli-Zellen mit einer defizien-

ten Dam-Methyltransferase höhere Mutationsraten aufweisen als die Wildtyp-Bakterien. Dies legt nahe, dass hier zwischen dem Elternstrang mit der ursprünglichen Sequenz und dem Tochterstrang mit der fehlerhaften Sequenz keine Unterscheidung getroffen werden kann und Mutationen manifestiert werden. Normalerweise ist beim Wildtyp ein neu synthetisierter Tochterstrang im Vergleich zum Elternstrang untermethyliert, weil die DNA-Methylierung der DNA-Synthese hinterherhinkt. Beim Hauptteil der eukaryotischen DNA - auch bei Wirbeltieren — ist 5-Methylcytosin die einzige methylierte Base. Diese Modifikation kommt hauptsächlich im CG-Dinucleotid verschiedener Palindromsequenzen vor. CG kommt im Wirbeltiergenom nur zu einem Fünftel der zufällig zu erwartenden Häufigkeit vor. Die vielen Genen vorgelagerten Regionen (upstream) haben jedoch normale CG-Häufigkeiten und heißen deshalb CpG-Inseln. Es gibt eindeutige Hinweise darauf, dass die DNA-Methylierung die eukaryotische Genexpression abschaltet, insbesondere wenn sie in den Promotorregionen vorkommt, die der transkribierten Sequenz eines Gen vorgelagert sind (upstream) (Abschnitt 28.3A). So sind beispielsweise Globingene in erythroiden Zellen (Erythrocyten-Stammzellen) stärker methyliert als in nichterythroiden Zellen. Und tatsächlich hemmt die spezifische Methylierung einer Kontrollregion in einem rekombinanten Globin-Gen dessen Transkription. Zudem steuert das Methylierungsmuster eines elterlichen DNAStrangs die Methylierung seines Tochterstrangs (eine methylierte CG-Sequenz weist eine Methyltransferase dazu an, ihre komplementäre CG-Sequenz zu methylieren). Durch die „Vererbung“ des Methylierungsmusters

in einer Zelllinie ist

es möglich, dass alle Zellen einen identisch differenzierten Phänotyp haben. Methylierungsvariationen könnten für die genomische Prägung (engl.: genomic imprinting) von Säugetieren verantwortlich sein. Dabei werden bestimmte mütterliche und väterliche Gene in den Nachkommen unterschiedlich exprimiert (Abschnitt 28.3A).

Insertions- und Deletionsmutationen werden durch interkalierende Agenzien hervorgerufen

Insertions-/Deletionsmutationen können durch DNA-Behandlung mit interkalierenden Agenzien, wie Acridin-Orange oder Proflavin, entstehen (Abschnitt 24.3B). Der Abstand zwischen zwei aufeinander folgenden Basen wird durch den Einbau eines solchen Moleküls in etwa verdoppelt. Die Replikation dieser deformierten DNA führt manchmal zur Insertion oder Deletion eines oder meh-

DNA-Schäden

und Mutationen

987

rerer Nucleotide im neu synthetisierten Polynucleotid. Allerdings sind die meisten Insertionen und Deletionen großer Segmente die Folge von irrtümlichen " Kreuzungsereignissen (Abschnitt 25.64). Alle Mutationen geschehen zufällig Eine große Zahl wissenschaftlicher Experimente belegt, dass Mutationen unabhängig von ihrer Ursache (Polymerasefehler, spontane Modifikationen oder chemische DNA-Schäden) immer zufällig auftreten. Dieses Paradigma wurde von John Cairns in Frage gestellt. Er zeigte, dass in Bakterien, welche keine Lactose verwerten können, die dafür notwendige Mutation vermehrt auftritt, wenn Lactose die einzig vorhandene Nahrungsquelle darstellt. Diese Beobachtung würde bedeuten, dass Bakterien für sie nützliche Mutationen „lenken“ könnten. Vielmehr ist es aber so, dass die Mutationsrate in metabolisch gestressten Zellen quasi als unspezifische adaptive Reaktion erhöht wird, und zwar unabhängig davon, ob die entsprechende Mutation der Zelle nützt oder nicht. Die erhöhte Mutationsrate scheint aus der Aktivierung fehleranfälliger DNA-Reparatur- und Rekombinationssysteme zu resultieren, welche unter normalen Bedingungen wenig aktiv sind.

B.

Carcinogene

Nicht alle Änderungen in der DNA haben phänotypische Konsequenzen. So sind z.B. Mutationen nicht codierender DNA-Segmente oft nicht sichtbar. Ebenso kann die Redundanz des genetischen Codes (mehr als ein Trinucleotid kann eine Aminosäure spezifizieren; Abschnitt 27.1C) Punktmutationen maskieren. Selbst wenn die Aminosäuresequenz im Protein geändert wird, kann dessen Funktion noch erhalten bleiben, wenn die Substitution konservativ ist (Abschnitt 5.4A) oder sich an einer Oberflächenschleife befindet. Dennoch kann eine einzige Punktmutation an der richtigen Stelle den Zellmetabolismus irreversibel verändern, beispielsweise indem sie Krebs verursacht. Bis zu 80% der menschlichen Krebsfälle werden durch Carcinogene verursacht, die DNA schädigen oder ihre Replikation oder Reparatur stören. Folgerichtig sind viele Mutagene auch carcinogen. Zurzeit gibt es über 70.000 synthetische Chemikalien, die kommerziell eingesetzt werden, und jedes Jahr kommen ca. 1000 neue dazu. Der Standardtest auf carcinogene Wirkung einer Substanz besteht darin, Ratten oder Mäuse hohen Konzentrationen der Testsubstanz auszusetzen und die Tiere anschließend auf Krebs zu untersuchen. Solche Testreihen dauern ca. 3 Jahre bis zum Abschluss und sind sehr teuer. Deshalb werden nicht alle Verbindungen auf diese Weise getestet. Ähnlich sind auch epidemiologische Studien an Menschen teuer, zeitaufwendig und oft wenig aussagekräftig. Bruce Ames erdachte einen schnellen und einfachen Bakterientest auf Carcinogenität, der auf der engen Korrelation zwischen Carcinogenese und Mutagenese basiert. Er konstruierte spezielle Teststämme von Salmonella typhimurium, die einen his--Phänotyp haben, d.h. die kein His synthetisieren können und deshalb ohne externe His-Versorgung nicht lebensfähig sind. Die Mutationsrate in diesen Stämmen wird durch deren Reversion zum his*-Phänotyp sichtbar. Für den Ames-Test werden ca. 10° Testbakterien auf einer Kulturplatte ausgestrichen, die kein Histidin enthält. Wird eine mutagene Substanz aufgebracht, so bewirkt diese, dass einige his -Bakterien his’ werden, was durch das Wachstum sichtbarer Kolonien nach zwei Tagen bei 37°C detektierbar ist (Abb. 25.28). Die Mutagenität einer Substanz lässt sich an der Zahl gewachsener Kolonien ablesen, abzüglich derjenigen Kolonien, die spontan ohne Mutagen auf einer Kontrollplatte revertiert sind. Dosis-Wirkungs-Kurven, die mithilfe verschiedener Konzentrationen einer gegebenen Verbindung erstellt werden, verlaufen fast immer linear; es gibt also keine Schwellenkonzentration für Mutageneseauslösung.

Abb. 25.28 Ames-Test auf Mutagenese. Ein Filterpapier, das mit einem Mutagen getränkt ist (in diesem Fall mit dem alkylierenden Agens Ethylmethansulfonat), wird in die Mitte einer Kulturplatte gelegt, die his -Teststämme von Salmomella typhimurium in einem Medium ohne Histidin enthält. Um den Papierfilter, von dem aus das Mutagen ins Medium

diffundiert, bildet sich

ein dichter Kranz von revertierten Bakterienkolonien. Die größeren Kolonien, die über die Kulturplatte verteilt sind, stellen spontane Revertanten dar. Die Bakterien in unmittelbarer Filternähe werden durch die hohe Mutagenkonzentration abgetötet. [Mit freundlicher Genehmigung von Raymond Devoret, Institut Curie, Orsay.]

988

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Zählen Sie die Wege auf, auf denen Mutationen ablaufen können. 2. Warum ist es praktisch, Carcinogene in einem Mutagenesetest zu untersuchen?

herausUngefähr 80% der Substanzen, die sich im Tierversuch als carcinogen carcinicht Viele . gestellt hatten, erwiesen sich auch im Ames-Test als mutagen Vieleine durch Geweben nogene Stoffe werden erst in der Leber oder anderen P450 om Cytochr von die en, zahl von Detoxifikationsreaktionen (z.B. Reaktion katalysiert werden; Abschnitt 12.4D) in Carcinogene umgewandelt. Deshalb wird eine kleine Menge Rattenleberhomogenat dem Ames-Testmedium zugegeben, um zumindest ansatzweise die Effekte im Säugetiermetabolismus zu berücksichtigen. Alternativ können Carcinogenitätstests auch mit Säugetierzellkulturen statt mit Bakterien durchgeführt werden. Mehrere Verbindungen, denen Menschen extensiv ausgesetzt waren und die sich im Ames-Test als mutagen herausstellten, wurden auch später im Tierversuch als Carcinogene identifiziert. Dazu gehört Tris(2,3-dibromopropyl)phosphat, das in der Mitte der 1970er Jahre als Entflammungshemmer in Kinderschlafanzügen verwendet wurde und über die Haut aufgenommen wird. Auch Furylfuramid, das in Japan in den 1960er und 1970er Jahren als antibakterieller Nahrungsmittelzusatz verwendet worden war, wurde als mutagen entlarvt, obwohl es zuvor in zwei Tierversuchen unauffällig gewesen war.

5

DNA-Reparatur

DNA-Schäden müssen repariert werden, wenn die genetische Information unversehrt erhalten werden soll. Die biologische Bedeutung der DNA-Reparatur zeigt sich in der Vielzahl an Reparaturmechanismen, über die selbst so einfache Organismen wie E.coli verfügen. Das Repertoire reicht von Enzymen, die einfach die chemischen Modifikationen der Nucleotidbasen rückgängig machen, bis hin zu komplizierteren Multienzymsystemen, die auf Grund der Informationsredundanz in doppelsträngiger DNA in der Lage sind, den fehlerhaften Strang zu reparieren.

A.

Manche Schäden können direkt repariert werden

Mehrere Enzyme sind in der Lage, bestimmte DNA-Schäden zu erkennen und wieder rückgängig zu machen. Beispielsweise können Pyrimidindimere (Abb. 25.26) durch Photoreaktivierung wieder in ihre monomere Form überführt werden, eine Reaktion, die von lichtabsorbierenden Enzymen - sogenannten DNAPhotolyasen — katalysiert wird. Diese monomeren Enzyme, die zwischen 55 und 65 kD aufweisen, kommen in vielen Pro- und Eukaryoten vor, aber nicht beim Menschen. Photolyasen enthalten zwei prosthetische Gruppen: einen lichtabsorbierenden Cofaktor und FADH’. Im E.coli-Enzym absorbiert der Cofaktor N’,‚N'’-Methenyltetrahydrofolat (Abschnitt 21.4D) sichtbares Licht mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 500 nm und überträgt die Anregungsenergie auf das FADH". Dieses überträgt wiederum ein Elektron auf das Pyrimidindimer und spaltet es dabei. Das entstehende Pyrimidin-Anion reduziert FADH: um das Enzym zu regenerieren.

Abb. 25.29 Röntgenstruktur der DNA-Photolyase aus E. coli. Gezeigt ist die lösungsmittelzugängliche Oberfläche, die entsprechend dem elektrostatischen

Potential gefärbt ist (blau positiv, rot negativ und weiß neutral). Die gestrichelten Linien markieren die Tasche, in der vermutlich das Pyrimidindimer bindet. [Mit freundlicher Genehmigung von Johann Deisenhofer, University of Texas Southwestern

Medical Center, Dallas. PDBid 1DNP.]

Die DNA-Photolyase aus E.coli bindet sequenzunspezifisch einzel- oder doppelsträngige DNA. Ihre Röntgenstruktur zeigt, dass die DNA-Bindunsgsstelle eine positiv geladene Fläche ist, in der eine Tasche mit einer für Pyrimidindimere passenden Größe und Polarität sitzt (Abb. 25.29). Das Dimer muss aus der Doppelhelix herausklappen, um an dieser Stelle zu binden und das Elektron des FADH'-Isoalloxazinrings aufzunehmen. Diese Konformationsänderung wird wahrscheinlich durch die relativ schwache Basenpaarung des Pyrimidindimers und die resultierende Helixverformung begünstigt. Base-flipping ist ein übliches Charakteristikum bei Enzymen, die DNA-Basen während eines Reparaturvorganges oder im normalen Stoffwechsel chemisch verändern (z. B. Cytosinmethylierung; Abschnitt 28.3A).

DNA-Reparatur

Ein anderer Typ der direkten DNA-Reparatur ist die Umkehr der Basenmethylierung durch Alkyltransferasen. Beispielsweise werden O°-Methylguanin- und O°-Ethylguaninläsionen der DNA durch die O° -Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase repariert, die direkt die störende Methyl- oder Ethylgruppe auf einen ihrer eigenen Cys-Reste überträgt. Diese Reaktion inaktiviert das Protein, das deshalb im engeren Sinne nicht als Enzym bezeichnet werden kann. Offensichtlich rechtfertigt das hoch mutagene Potential des modifizierten Guaninrests, dass die Alkyltransferase geopfert wird.

B.

Die Basen-Excisionsreparatur erfordert eine Glykosylase

Beschädigte Basen, die nicht direkt repariert werden können, werden unter den meisten Umständen entfernt und ersetzt. Diesen Vorgang nennt man Basen-Excisionsreparatur (engl.: base excision repair, BER). Wie der Name andeutet, beginnt dieser Prozess mit der Beseitigung der beschädigten Base. Zellen enthalten eine Vielzahl von DNA-Glykosylasen, die jeweils die Glykosidbindung eines entsprechend veränderten Nucleotids spalten, sodass der Desoxyriboserest ohne verknüpfte Base bleibt (Abb. 25.30). Solche purin- oder pyrimidinfreien Stellen (AP-Stellen; apurinic und apyrimidinic sites) können auch gelegentlich durch spontane Hydrolyse einer Glykosidbindung entstehen. Der Desoxyriboserest wird dann auf einer Seite von einer AP-Endonuclease gespalten und zusammen mit einigen benachbarten Resten durch eine zelluläre Exonuclease (möglicherweise mit einer DNA-Polymerase assoziiert) entfernt. Die Lücke wird durch die DNA-Polymerase aufgefüllt und DNA-Ligase geschlossen. Zu den Enzymen der BER, die den häufigsten Schadenstyp bei der DNA korrigieren, gehört eine Glykosylase, die 8-Oxoguanin erkennt sowie das Enzym Uracil-DNA-Glykosylase (UDG), das Uracilreste ausschneidet. Uracil rührt von der Desaminierung von Cytosin her sowie von dem gelegentlichen falschen Einbau anstelle von Thymidin in die DNA (Exkurs 25.5). Die von John Tainer ermittelte Röntgenstruktur von menschlicher UDG im Komplex mit einer 10 bp langen DNA, die eine U-G-Fehlpaarung (diese bildet ein Basenpaar über zwei Wasserstoffbrücken, dessen Form von der der WatsonCrick-Basenpaare abweicht; Abschnitt 24.1A) enthält, zeigt, dass das Enzym die DNA gebunden hat und das Uridin-Nucleotid des U-G-Basenpaars aus der Doppelhelix herausgeklappt ist (Abb. 25.31). Zudem hat das Enzym die Glykosidbindung von Uridin hydrolysiert, sodass eine freie Uracilbase und eine AP-Stelle

989

sessve ELLAELG | DNA-GIykosylase

gye’ge ELLZELG Abb. 25.30 Wirkung der DNA-Glykosylasen. Diese Enzyme hydrolysieren die Glykosidbindungen ihrer korrespondierenden, veränderten Base (rot), so dass eine AP-Stelle entsteht.

Wieso kommt Uracil nicht in DNA vor?

Drei der DNA-Desoxynucleotidbasen (Adenin, Guanin und Cytosin) kommen als Ribonucleotidbasen auch in RNA vor. Thymin wird als vierte Desoxynucleotidbase (unter erheblichem

metabolischem

Aufwand;

vgl. Abschnitt 23.3B) aus

Uracil synthetisiert, das in RNA vorkommt. Angesichts der Tatsache, dass Uracil und Thymin identische Basenpaarungseigenschaften aufweisen, stellt sich die Frage, warum

Zellen

„die Mühe auf sich nehmen“, Thymin überhaupt zu produzieren.

Des Rätsels Lösung liegt in der Tendenz von Cytosin, sich durch Desaminierung, entweder spontan oder durch Reak-

tion mit Nitriten (Abschnitt 25.4A), in Uracil umzuwandeln.

Wäre U eine normale DNA-Base, wäre eine C-Desaminierung

höchst mutagen, da nicht klar wäre, ob das entstandene, fal-

sche Basenpaar G - U ursprünglich G - C oder A - U gewesen war. Durch die Verwendung von T als normale DNA-Base ist jedes U in DNA höchstwahrscheinlich ein desaminiertes C und kann somit durch Uracil-N-Glykosylase entfernt werden. Uracyl-N-Glykosylase hat auch eine wichtige Funktion bei der DNA-Replikation. dUTP, ein Intermediat bei der dTTPSynthese, ist in geringer Menge in allen Zellen vorhanden. DNA-Polymerasen können nicht gut zwischen dUTP und dTTP unterscheiden, weshalb beide mit einem A der Matrize

eine Basenpaarung ausbilden können. So enthält neusynthetisierte DNA gelegentlich ein U, welches aber rasch mittels

Excisionsreparatur durch ein T ersetzt wird.

990

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Abb. 25.31 Röntgenstruktur eines Komplexes aus menschlicher Uracil-DNA-Glykosylase mit einer ein U.-G-Basenpaar enthaltenden 10 bp langen DNA. Das Protein (die C-terminalen 223 Reste des 304

Reste umfassenden Monomers) ist als Bänderdiagramm wiedergegeben, das in seine transparente Moleküloberfläche eingebettet ist. Die DNA ist mit

Blick auf ihre große Furche gezeigt. Sie ist als Stabmodell dargestellt und entsprechend des Atomtyps gefärbt (C grün, N blau, O rot, P orange). Das Uridinnucleotid des U-G-Basenpaars ist aus der Doppelhelix herausgeklappt (auf die rechte Seite der DNA) und wurde hydrolysiert, sodass eine AP-Stelle (Stabform mit C türkis) und Uracil (Kalottenmodell mit C türkis) entstanden sind. Das Uracil bleibt in der Bindungstasche des Enzyms gebunden. Die Seitenkette von Arg 272 (Kalottenmodell mit C gelb) ist in den DNA-Basenstapel interkaliert, um den freien Raum zu besetzen, der

durch die herausgeklappte Uracilbase entstanden ist. [Nach einer Röntgenstruktur von John Tainer, The Scripps Research Institute, La Jolla.

PDBid 4SKN.]

auf der DNA entstehen. Trotzdem bleiben beide Produkte mit dem Enzym verbunden. Der Hohlraum im Basenstapel der DNA, der ansonsten mit dem herausgeklappten Uracil besetzt wäre, wird nun durch eine Seitenkette von Arg 272 ausgefüllt. Diese schiebt sich in die DNA von der Seite ihrer kleinen Furche. Wie spürt die UDG ein gepaartes Uracil in der Mitte der DNA auf, und wie unterscheidet sie so exakt zwischen Uracil und anderen: Basen, insbesondere zwischen Uracil und dem sehr ähnlichen Thymin? Die Röntgenstrukturen zeigen, dass die Phosphatgruppen, welche die herausgeklappte Base flankieren, 0,4 nm dichter beisammen sind als in der B-DNA (0,8 nm im Vergleich zu 1,2 nm). Dies verursacht, dass die DNA einen Knick von 45° bekommt und zwar in die Richtung, die parallel zu der Ansicht in Abbildung 25.31 liegt. Tainer postulierte, dass die UDG ein DNA-Molekül rasch nach Uracil absucht, indem sie in regelmäßigen Abständen an sie bindet, sie zusammendrückt und dabei das DNA-Rückgrat leicht biegt. Die DNA biegt sich leichter an einer uracilhaltigen Stelle (ein U-G-Basenpaar ist kleiner als ein C-G-Paar und hinterlässt somit eine Lücke im Basenstapel; wohingegen ein U-A-Basenpaar sogar eine schwächere Wechselwirkung als ein T-A-Paar ausbildet) und erlaubt somit dem Enzym, das Uracil herauszuklappen, indem es Arg 272 in die kleine Furche schiebt. Die besondere Spezifität der UDG-Bindungstasche für Uracil verhindert die Bindung und Hydrolyse irgendeiner anderen Base, die das Enzym eventuell herausgeklappt haben könnte. Somit sind Adenin und Guanin durch ihre Gesamtform von dieser Tasche ausgeschlossen, wohingegen die 5-Methylgruppe von Thymin durch die starr gehaltene Seitenkette von Tyr 147 sterisch blockiert wird. Cytosin hat in etwa die gleiche Form wie Uracil. Es wird durch eine Reihe von Wasserstoffbrücken ausgeschlossen, die von dem Protein ausgehen und die Wasserstoffbrücken nachahmen, die durch Adenin in einem Watson-Crick-A -UBasenpaar gebildet werden (dUTPase unterscheidet ähnlich zwischen Uracil und anderen Basen; Abb. 23.14).

AP-Stellen in der Säuger-DNA sind äußerst cytotoxisch, weil sie die SäugerTopoisomerase I irreversibel in ihrem kovalenten Komplex mit DNA einschließen (Abschnitt 24.1D). Da der Ribose zudem an der AP-Stelle eine Glykosidbindung fehlt, kann sie leicht in ihre lineare Form übergehen (Abschnitt 8.1B). Ihre reaktive Aldehydgruppe kann sich leicht mit anderen Zellkomponenten quervernetzen. Dies erklärt, warum AP-Stellen fest an die UDG in Lösung gebunden bleiben. Die UDG-Aktivität wird durch die AP-Endonuclease, das nächste Enzym bei der Basen-Excisionsreparatur, verstärkt. Die beiden Enzyme treten in Abwesenheit von DNA allerdings nicht miteinander in Wechselwirkung. Dies lässt vermuten, dass UDG solange an die von ihr erzeugte AP-Stelle gebunden bleibt, bis sie durch die fester bindende AP-Endonuclease verdrängt wird. Dabei wird die Zelle vor den cytotoxischen Auswirkungen der AP-Stelle geschützt. Wahrscheinlich arbeiten die anderen schadensspezifischen DNA-GIykosylasen ähnlich.

€.

Die Nucleotid-Excisionsreparatur schneidet einen Abschnitt eines DNA-Strangs aus

Alle Zellen verfügen über einen ausgeklügelten Weg - die sogenannte NucleotidExcisionsreparatur (NER) - um Pyrimidindimere und andere DNA-Schäden auszubessern, bei denen die Basen aus ihrer normalen Position verdrängt sind oder voluminöse Substituenten haben. Das NER-System scheint auf Helixverkrümmungen zu reagieren, anstatt eine bestimmte Gruppe zu erkennen. Beim Menschen ist die NER die wichtigste Abwehr gegen zwei bedeutende Karzinogene: Sonnenlicht und Zigarettenrauch. Bei E.coli wird die NER in einem ATP-abhängigen Vorgang von den UvrA-, UvrB- und UvrC-Proteinen (den Produkten der uvrA-, uvrB- und uvrC-Gene) aus-

DNA-Reparatur Abb. 25.32 Mechanismus der Nucleotid-Excisionsreparatur (NER) eines Pyrimidindimers.

UvrABC-Endonuclease

as Zn aa

UvrD

he un

geführt. Dieses System wird oft als UvrABC-Endonuclease bezeichnet (obwohl es keinen Komplex gibt, der alle drei Untereinheiten enthält). Es schneidet den beschädigten DNA-Strang an der siebten und der dritten oder vierten Phosphodiesterbindung relativ zur 5’- bzw. 3'-Stelle des Schadens (Abb. 25.32). Das herausgeschnittene 11 oder 12 Nucleotide lange Oligonucleotid wird dann durch die Bindung von UvrD (auch Helicase II genannt) verdrängt und mittels Pol I ersetzt. Die DNA-Ligase schließt die Lücke im Ketten-Rückgrat. Xeroderma pigmentosum und das Cockayne-Syndrom werden durch eine genetisch defekte NER verursacht

Beim Menschen erfordert die NER mindestens 16 Proteine und entfernt Oligonucleotide mit etwa 30 Resten. Viele der an dem Reparaturweg beteiligten Enzyme wurden durch Mutationen entdeckt, die sich in zwei genetischen Krankheiten niederschlagen. Die Erbkrankheit Xeroderma pigmentosum (XP, griech.: xeros, trocken; derma, Haut) ist durch die Unfähigkeit der Hautzellen charakterisiert, UV-induzierte DNA-Schäden zu reparieren. Personen mit diesem autoso-

mal-rezessiven Defekt sind extrem empfindlich gegenüber Sonnenlicht. Bereits in der Kindheit zeigen sich Hautveränderungen wie Trockenheit, übermäßig viele Sommersprossen und Keratosen (eine Form von Hauttumor; die Haut dieser Kinder ähnelt der Haut von Landarbeitern, die über viele Jahre in der Sonne gearbeitet haben) sowie Augenschäden in Form einer Linsentrübung oder Corneawucherungen. Verglichen mit normalen Personen entwickeln sie zudem mit einer etwa 2000fach höheren Wahrscheinlichkeit lebensbedrohliche Formen von Hautkrebs und 10- bis 20mal häufiger Krebs an inneren Organen. Seltsamerweise zeigen XP-Patienten oft eine Vielzahl von Symptomen, die auf den ersten Blick nicht miteinander in Verbindung stehen, beispielsweise eine progressive Neurodegeneration und Entwicklungsdefizite. Beim Cockayne-Syndrom (CS), einer Erbkrankheit, die ebenfalls durch eine defekte NER verursacht wird, sind zusätzlich zu zwei weiteren, einige derselben Gene defekt wie bei XP. Personen mit CS sind überempfindlich gegenüber UVLicht, weisen auf Grund der Demyelisierung von Neuronen Verkrüppelungen und neurologische Dysfunktion auf und altern vorzeitig. Interessanterweise

991

992

_ _DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination Fehlpaarung

me

5 CATC

Eltern-DNA

SI CTAG

Tochter-DNA

ı

®—.: MutS

erhaben sie jedoch keine erhöhte Hautkrebsrate. Die bei CS defekten Proteine eine durch iten Fortschre deren merase, kennen normalerweise eine RNA-Poly beschädigte oder verdrehte DNA-Matrize zum Erliegen gekommen ist. Damit die Transkription weiter fortgesetzt werden kann, muss die angehaltene RNAPolymerase entfernt werden, sodass der DNA-Schaden vom NER-System repariert werden kann. Bei CS kann die DNA nicht repariert werden, sodass die Zelle den programmierten Zelltod (Apoptose; Abschnitt 28.4C) stirbt. Der Tod transkriptionsaktiver Zellen könnte die Entwicklungssymptome des CockayneSyndroms bewirken.

D.

N,

5'— 3—

| GATC CTÄG

aw

Schneiden

UvrD + Exonuclease

|5

g'

CH3 | 5'— GATC N — CT ——

5

3' 5’

Abb, 25.33 Mechanismus der Fehlpaarungsreparatur bei E. coli. (1) MutS bindet. (2) MutL bindet. (3) Die DNA mit der Fehlpaarung bildet eine Schleife. (4) MutHEndonuclease bindet. (5) Der unmethylierte DNA-

i

Fehlpaarungsreparatur korrigiert Replikationsfehler

Jede Fehlpaarung bei der Replikation, die der Korrekturlesefunktion der DNAPolymerase entkommen ist, kann immer noch mithilfe der Fehlpaarungsreparatur (engl.: mismatch repair, MMR) korrigiert werden. Das MMR-System kann auch Insertionen oder Deletionen von bis zu vier Nucleotiden korrigieren (die durch das Verrutschen eines Strangs im Verhältnis zum anderen im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase zustande kommen). Wie wichtig die Fehlpaarungsreparatur ist, zeigt sich daran, dass ein schadhaftes Fehlpaarungsreparatursystem beim Menschen zu einer großen Zahl an Krebserkrankungen führt insbesondere zum hereditären kolorektalen Karzinom ohne Polyposis (engl.: hereditary nonpolyposis colorectal cancer, abgekürzt HNPCC), das mehrere Organe beeinträchtigt und vermutlich die am häufigsten vererbte Prädisposition für Krebs ist. Bei E.coli wird die Fehlpaarungsreparatur durch drei Proteine ausgeführt (Abb. 25.33). Ein Homodimer von Mut$ bindet an ein fehlgepaartes Basenpaar oder an ungepaarte Basen und bindet dann ein Homodimer von MutL. Daraufhin verschiebt sich in einem ATP-abhängigen Prozess der resultierende MutS,MutL,-Komplex entlang der DNA in beide Richtungen. Dabei wird die DNA dazu veranlasst, eine Schleife zu bilden, welche die Fehlpaarung enthält und vom MutS,MutL,-Komplex geschlossen wird. Das Fehlpaarungssystem kann die beiden DNA-Stränge voneinander unterscheiden, weil neu replizierte DNA unmethyliert bleibt, bis eine Methyltransferase ausreichend Zeit gehabt hat, den Tochterstrang zu methylieren (Exkurs 25.4). Stößt der MutS,MutL,-Komplex auf ein hemimethyliertes GATC-Palindrom, rekrutiert er MutH und aktiviert diese Endonuclease dazu, an der 5’-Stelle der unmethylierten GATC-Region einen Bruch vorzunehmen. Diese Stelle kann auf jeder Seite der Fehlpaarung und mehr als 1000 bp von ihr entfernt liegen. Die an der NER beteiligte UvrD-Helicase trennt den elterlichen vom Tochterstrang. Dann entfernt eine Exonuclease den defekten Abschnitt auf dem Tochterstrang vollständig, der nun von der DNA-Polymerase III ersetzt wird. Eukaryotische Zellen enthalten mehrere Homologe von Mut$S und MutL, aber nicht von MutH. Sie müssen deshalb einen anderen Hinweis als den Methylierungszustand verwenden, um den Tochter- vom Elternstrang zu unterscheiden. Eine Möglichkeit wäre, dass ein neu synthetisierter Tochterstrang durch die noch nicht geschlossenen Brüche identifiziert wird.

Strang, der die fehlgepaarte Base enthält, wird

ausgeschnitten.

E.

Manche DNA-Reparaturmechanismen führen Fehler ein

Personen mit einer XP-Variante zeigen erhöhte Hautkrebsraten, obwohl ihre NER-Proteine normal sind. Bei dieser Krankheit ist der Defekt in einem Enzym lokalisiert, das man als DNA-Polymerase n bezeichnet (Pol n). Wenn sie normal funktioniert, kann Polın DNA-Schäden umgehen, wie z.B. UV-induzierte Thymindimere, indem sie zwei Adeninbasen in den neuen Strang einbaut. Obwohl Pol n als Transläsionspolymerase hilfreich ist, ist sie relativ unge-

DNA-Reparatur

993

nau und hat keine Exonucleaseaktivität zum Korrekturlesen. Sie baut durchschnittlich alle 30 Nucleotide eine falsche Base ein. Das Vorkommen von fehleranfälligen Polymerasen bietet einen Ausfall-Sicherungs-Mechanismus (engl.: fail-safe mechanism) für die Replikation von DNAStücken, die von der Standard-Replikationsmaschinerie nicht erfasst werden. In der Tat übertreffen solche alternativen DNA-Polymerasen normalerweise zahlenmäßig die Polymerasen, die für die normale Replikation zuständig sind. Eukaryoten enthalten beispielsweise mindestens fünf solcher „Umgehungs“Polymerasen, die unterschiedlich genau arbeiten. Die von den Umgehungspolymerasen verursachten Fehler können aber immer noch vom Fehlpaarungssystem korrigiert werden. Die Rekombination repariert Doppelstrangbrüche

Sowohl die Basen-Excisionsreparatur als auch die Nucleotid-Excisionsreparatur findet immer dann statt, wenn nur ein DNA-Strang betroffen ist. DNA ist aber anfällig für Doppelstrangbrüche (DSB), die häufig durch ionisierende Strahlung oder freie Radikale (Nebenprodukte des Oxidationsstoffwechsels) verursacht werden. Nicht reparierte DSBs können für Zellen tödlich sein oder Chromosomenaberrationen verursachen, die unter Umständen zu Krebs führen. Deshalb ist eine erfolgreiche Reparatur der DSBs für die Lebensfähigkeit der Zelle und ein intaktes Genom unerlässlich. Zellen verfügen über zwei übliche Reparaturmechanismen, um DSBs zu reparieren: Rekombinationsreparatur und nichthomologe Rekombination (NHE], engl.: nonhomologous end-joining). Wir besprechen hier die NHE], die, wie ihr Name andeutet, direkt DSBs verbindet. Bei der NHE] müssen die Enden der gebrochenen DNA ausgerichtet, ausgefranste Enden beschnitten oder aufgefüllt und die Stränge verbunden werden. Das Herzstück der Maschinerie für die Verknüpfung von Enden ist bei Eukaryoten das Protein Ku (ein Heterodimer mit homologen 70- und 83-kD-Untereinheiten; Ku70 und Ku80). Dieses scheint der Sensor der Zelle für gebrochene DNA zu sein. Die von Jonathan Goldberg bestimmte Röntgenstruktur von Ku im Komplex mit einer 14 bp langen DNA ergab, dass das Protein den dsDNAAbschnitt entlang der gesamten Länge festhält und seinen mittleren Abschnitt von etwa 3 bp umschließt (Abb. 25.34). Ku stellt keine spezifischen Kontakte mit den Basen der DNA her und nur wenige Kontakte mit ihrem Rückgrat. Stattdessen passt es gut in die großen und kleinen Furchen. Ku-DNA-Komplexe dimerisieren, sodass beide Hälften des Doppelstrangbruchs in eine Linie gebracht werden, während die Strangenden für die Nucleasen, Polymerasen und Ligasen zugänglich bleiben. Der dabei nicht ausbleibende Verlust von Nucleotiden erzeugt natürlich Mutationen, ein nicht reparierter Doppelstrangbruch wäre für die Zelle allerdings noch katastrophaler. Die SOS-Antwort von E.coli ist mutagen Bei E. coli induzieren DNA-schädigende Substanzen ein komplexes System zel-

lulärer Veränderungen, das man als SOS-Antwort bezeichnet. Zellen, die sich der SOS-Antwort unterziehen, stellen die Teilung ein und erhöhen ihre Kapazität für die Reparatur der beschädigten DNA. Der Repressor LexA und das DNABindeprotein RecA regulieren die Aktivität dieses Systems. (RecA ist auch ein wichtiger Akteur bei der homologen Rekombination, die im folgenden Abschnitt behandelt wird und die ein Mittel für die Reparatur beschädigter DNA nach der Replikation ist.) Während des normalen Wachstums unterdrückt LexA die Expression der SOS-Gene. Wenn die DNA aber beschädigt ist (und nicht vollständig repliziert werden kann), binden die sich ergebenden DNA-Einzelstränge an RecA. Der dabei gebildete Komplex aktiviert dann LexA, sich zu spalten und sich dabei selbst zu inaktivieren. Die SOS-Gene, zu denen recA und lexA ebenso gehören wie die NER-Gene uvrA und uvrB (Abschnitt 25.5C), werden dadurch exprimiert. Mit der Reparatur der DNA ist der DNA : RecA-Komplex nicht mehr

Abb. 25.34 Röntgenstruktur des menschlichen Ku-Proteins im Komplex mit einer 14 bp langen DNA.

Die Untereinheiten von Ku70 (rote Helices und gelbe B-Stränge) und Ku80 (blaue Helices und grüne B-Stränge) mit Blick entlang der pseudo-zweizähligen Achse. Die DNA ist als Kalottenmodell gezeigt, ihr Zucker-Phosphat-Rückgrat ist dunkelgrau, die Basenpaare sind hellgrau. Man beachte, dass die DNA von einem Proteinring umgeben ist. [Mit freundlicher Genehmigung von John Tainer, The Scripps Research Institute, La Jolla, California. Nach einer Röntgenstruktur von Jonathan Goldberg, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York. PDBid 1JEY.]

994

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

länger vorhanden, sodass das neu synthetisierte LexA wieder die Expression der

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 1. Welche Funktionen haben

DNA-Photolyasen und Alkyltransferasen? Beschreiben Sie die enzymatischen Aktivitäten, die für Basen-Excisionsreparatur, Nucleotid-Excisionsreparatur und

Fehlpaarungsreparatur benötigt werden. Beschreiben Sie, warum Zellen fehleranfällige Reparatursysteme

SOS-Gene reprimiert.

Zu den 43 Genen, die vom SOS-System kontrolliert werden, gehören die DNAPolymerasen IV und V. Beide replizieren DNA mit geringer Genauigkeit und besitzen keine Exonuclease-Korrekturlesefunktion. Weil diese Transläsionspolymerasen auch dann DNA synthetisieren können, wenn es keine Information darüber gibt, welche Basen ursprünglich vorhanden waren, ist das SOS-Reparatursystem fehleranfällig und infolgedessen mutagen. Es handelt sich deshalb um einen Prozess, der erst dann initiiert wird, „wenn alle Stricke gerissen sind“ — und zwar erst etwa 50 Minuten nach der Einleitung der SOS, sofern die DNA bis dahin nicht bereits auf anderem Wege repariert wurde. Die Existenz des SOS-Reparatursystems ist ein Beleg dafür, dass im Darwinschen Sinne das Überleben mit einem Funktionsverlust (und dem eventuellen Erwerb einer neuen Funktion) immer noch besser ist als der Tod - obwohl nur ein kleiner Teil der Zellen diesen Prozess überleben.

wie Pol n, nichthomologe

Replikation und SOS-Antwort benötigen.

6

Rekombination

Über die Jahre wurde durch viele genetische Studien klar, dass Gene nicht unveränderbar sind. In höheren Organismen können sich Genpaare durch Crossing-over (von engl.: Überkreuzen) austauschen, wenn homologe Chromosomen nebeneinander liegen (Abb. 25.35). Bakterien, die keinen doppelten Chromosomensatz besitzen, verfügen ebenfalls über hochspezialisierte Mechanismen für die Rekombination genetischer Information. Zusätzlich kann fremde DNA durch Rekombination in ein Wirtsgenom eingebracht werden. Im folgenden Abschnitt werden wir die molekularen Mechanismen der Rekombination untersuchen und die Biochemie von mobilen genetischen Elementen, den Transposons, diskutieren.

A.

Der Mechanismus der allgemeinen Rekombination

Homologe Rekombination (auch allgemeine Rekombination genannt) tritt zwischen DNA-Segmenten mit weitreichender Homologie auf. Ortsspezifische Rekombination (engl.: site-specific recombination) findet zwischen zwei kurzen, genau definierten DNA-Sequenzen statt. Das prototypische Modell der allgemeinen Rekombination formulierte Robin Holliday im Jahre 1964 (Abb. 25.36). Die

Abb, 25.35 Crossing-over. (a) Elektronenmikroskopische Aufnahme und (b) entsprechende schematische Zeichnung zweier homologer Chromatidenpaare während der Meiose in der Heuschrecke Chorthippus parallelus. Chromatiden, die keine Schwesterchromatiden

Sind (verschiedene Farben) können an jedem dieser Kreuzungspunkte rekombinieren. [Mit freundlicher Genehmigung von Bernhard John, The Australian National University, Canberra.]

|{i | >

| (a)

>

(b)

(c)

(d)

(e)

Rekombination Abb. 25.36 Das Holliday-Modell der allgemeinen Rekombination zwischen homologen DNA-Doppelsträngen. 6% siehe Animated Figures.

& I+

&

j

(N

N

|

N’

9% =N

(k)

(8) >a

(D

[ecke

>08

2

einander entsprechenden Einzelstränge zweier aneinander ausgerichteter, homologer DNA-Doppelstränge werden gebrochen, beide Einzelstränge überkreuzen sich und bilden mit den nahezu komplementären Strängen des homologen Doppelstranges neue Paarungen, so dass in diesem Bereich ein Abschnitt mit sogenannter heterologer DNA entsteht. Schließlich werden die Einzelstrangbrüche verschlossen (Abb. 25.360-). Der Kreuzpunkt der viersträngigen Struktur wird als Holliday-Junction (engl.: junction, Kreuzung) bezeichnet. Eine Holliday-Junction wurde tatsächlich in der Röntgenstruktur des selbst-komplementären d(CCGGTACCGG) beobachtet, die von Shing Ho bestimmt wurde (Abb. 25.37). Die Überkreuzungsstelle kann sich bei der so genannten Gabelwanderung in beide Richtungen verschieben (Abb. 25.36e und f). Es gibt zwei, gleich häufig beschrittene Wege, auf denen die Holliday-Junction geöffnet werden kann (Abb. 25.36g-J): 1. Durch ein Aufbrechen der bisher unveränderten Einzelstränge werden die Enden der ursprünglichen Doppelstränge gegeneinander ausgetauscht, und nach Verschluss der Einzelstrangbrüche entsteht das allgemein bekannte rekombinante DNA-Molekül (rechte Seite Abb. 25.36j-)). 2. Durch eine Spaltung der heterologen DNA-Stränge werden nur homologe Einzelstrangsegmente ausgetauscht (linke Seite Abb. 25.36j-)).

995

996

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

D

Beer:

Co —Gg

Cı C2 G3 G4

"Gy 7G9 "Cs —C7

Ga

T;

—Ag

Be

C,-Gio —-0g

G4 -Cz v; zit;

T, Ag

#C7 4

Cg —G3

Abb. 25.37

Röntgenstruktur einer Holliday-Junction. (a) In der Sekundärstruktur der viersträngigen Holliday-Junction, die von der palindromen Sequenz d(CCGGTACCGG) gebildet wird, sind die vier Stränge A, B, C und D unterschiedlich gefärbt, Ihre Nucleotide sind von ihrem 5’-Ende zu ihrem 3’-Ende von 1 bis 10 durchnummeriert. Die Watson-Crick-Basenpaarungen sind durch schwarze Striche angezeigt. Die zweizählige Achse, die die zwei Helices verbindet, wird durch das schwarze linsenförmige Symbol dargestellt. (b) Dreidimensionale Struktur der Holiday junction, entlang ihrer zweizähligen Achse betrachtet. Die Oligonucleotide sind in Stabform dargestellt. Ihre Gerüste sind durch Bänder skizziert. Sie sind alle wie in Teil a angefärbt. Mit Ausnahme der Gerüste der Stränge B und D an der Überkreuzung bilden die zwei Arme dieser Struktur jeder eine unverdrehte B-DNA-Helix einschließlich des Stapels der Basenpaare, die die Überkreuzung flankieren. Beachten Sie, dass Abb. 25.36g eine schematische Darstellung dieser Struktur von der Seite ist. [Mit freundlicher Genehmigung von Shing Ho, Colorado State University. PDBid 1DCW.]

RecA katalysiert die allgemeine Rekombination in E. coli Das 352 Reste lange RecA-Protein bindet in Form eines polymeren Filaments an

Abb. 25.38

Modell eines Komplexes aus RecA

mit DNA. In dieser auf elektronenmikroskopischen

Aufnahmen basierenden Zeichnung repräsentiert die durchsichtige Oberfläche ein E. coli-RecAFilament. Der verlängerte und entwundene DNA-Doppelstrang (rot) wurde ins Bild eingepasst. [Mit freundlicher Genehmigung von Edward Egelmann, University of Minnesota Medical School]

Einzelstrang-DNA oder an Doppelstrang-DNA mit einer Stranglücke. Elektronenmikrokopische Aufnahmen zeigen, dass an DNA gebundene RecA-Filamente eine rechtsgängige Helix mit ca. 6,2 RecA-Monomeren pro Windung bilden (Abb. 25.38). An jedes RecA-Monomer binden drei Nucleotide, so dass die DNA eine gestreckte Konformation mit ca. 18,6 Nucleotiden pro Windung annimmt (B-DNA besitzt 10,4 bp pro Windung). Wie die Röntgenstruktur zeigt, hat das RecA-Filament eine zentrale Öffnung mit 2,5 nm Durchmesser, also groß genug, um die DNA aufzunehmen. Wie vermittelt RecA den Strangaustausch zwischen einzel- und doppelsträngiger DNA? Trifft RecA auf einen DNA-Doppelstrang, dessen einer Strang zu dem von RecA gebundenen Einzelstrang komplementär ist, entwindet RecA den DNA-Doppelstrang teilweise und tauscht in einer ATP-abhängigen Reaktion den DNA-Einzelstrang gegen den entsprechenden Strangabschnitt der Doppelhelix aus. Die ATP-Hydrolyse treibt vermutlich die Umlagerung eines dreisträngigen DNA-Zwischenprodukts an, das an das Protein gebunden ist (Abb. 25.39). Dieser Prozess verträgt nur ein begrenztes Ausmaß an Fehlpaarungen. Wenn sich das RecA-Filament um seine Achse dreht, wird der DNA-Doppelstrang aufgespult (Abb. 25.40). Bei einer Holliday-Junction müssen zwei solche Strangaustauschprozesse gleichzeitig ablaufen. Das eukaryotische Protein Rad51 ist zum

Rekombination

N

997

v

Rec-A-Protein

Abb. 25.39 Modell für die RecA-vermittelte Paarung. (1) Für die Bildung des Initiationskomplexes bindet eine ssDNA an RecA. (2) Die dsDNA bindet an den Initiationskomplex, sodass vorübergehend eine dreisträngige Helix entsteht. (3) In einem ATP-getriebenen Prozess verdreht RecA die Basen, um den Strangaustausch zu ermöglichen. [Nach West, S.C., Annu. Rev. Biochem. 61, 618 (1992).]

Einspulen

Ausspulen

dreisträngige DNA

Abb. 25.40 Modell für den RecA-vermittelten Strangaustausch. Homologe DNA-Moleküle werden vor einem Strangaustausch in einer dreisträngigen Helix angeordnet. Die durch ATP-getriebene Rotation des RecA-Filaments (violett) um die Helixachse verursacht, dass der DNA-Doppelstrang ins Filament „eingespult“ wird, und zwar wie gezeigt von links nach rechts. [Nach West, S.C., Annu. Rev. Biochem. 61, 617 (1992).]

ATP

RecBCD 1

ADP+P; '

E. coli-Protein RecA homolog. Es arbeitet offensichtlich auf eine ähnliche ATPabhängige Weise, um die DNA-Rekombination zu vermitteln.

——

—

®)

’

=

ne RecA

B-

Ne

E-

2

RecBCD initiiert die Rekombination, indem es einen Einzelstrang zur Verfügung stellt

Die einzelsträngigen Segmente, an die RecA bindet, werden von dem 330 kD Protein RecBCD hergestellt. Dieses Protein ist ein heterotrimeres Produkt der SOS-Gene recB, recC und recD und besitzt sowohl Helicase- als auch NucleaseAktivität (Abb. 25.41). Der Prozess beginnt damit, dass RecBCD an das Ende einer doppelsträngigen DNA bindet und diese dann mithilfe seiner ATP-getriebenen Helicasefunktion entwindet. Bei diesem Vorgang baut es nucleolytisch den entwundenen Einzelstrang hinter sich ab, wobei der Strang mit dem 3’Ende öfter geschnitten und somit zu kleineren Fragmenten abgebaut wird als der Strang mit dem 5’-Ende. Stößt RecBCD jedoch vom 3’-Ende auf die Sequenz GCTGGTGG (die so genannte Chi-Sequenz, die im Genom von E. coli etwa alle 5 kb vorkommt), beendet es die Degradation des Strangs mit dem 3’-Ende und schneidet den Strang mit dem 5’-Ende häufiger. Dabei entsteht ein Einzelstrangabschnitt mit einem 3’-Ende, an den RecA bindet. Dies erklärt, warum Regionen mit Chi-Sequenzen erhöhte Rekombinationsraten haben. RecBCD kann mit der Entwindung der DNA nur an einem freien Doppelstrangende beginnen. Da E. coli bekanntermaßen ein ringförmiges Chromosom besitzt, kommen solche Enden normalerweise nicht vor. Während des Rekombi-

nationsvorgangs können sie jedoch auftreten.

Abb. 25.41

Bildung eines einzelsträngigen

DNA-Abschnitts mit einem 3’-Ende mithilfe von

RecBCD, um die Rekombination zu initiieren.

(1) RecBCD bindet an das freie Ende einer doppelsträngigen DNA und wandert ATP-getriebenen

entlang der Helix. Dabei wird die DNA entwunden. Die dahinter entstehenden Einzelstränge werden abgebaut, wobei der Strang mit dem 3’-Ende öfter geschnitten wird als der Strang mit dem 5’-Ende. (2) Wenn RecBCD auf eine korrekt ausgerichtete Chi-Sequenz stößt, wird der Strang mit dem 5’.Ende häufiger geschnitten, der Strang mit dem 3’-Ende wird hingegen nicht mehr geschnitten. Dabei entsteht der Strangabschnitt mit dem 3’-Ende, an welchen RecA bindet.

998

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

RuvABC vermittelt die Gabelwanderung und die Auflösung der Holliday-Junction

Abb. 25.42 Röntgenstruktur eines RuvA-HollidayJunction-Komplexes. Das Protein-Tetramer ist mit Blick auf seine vierfache Achse dargestellt, zu sehen ist die Moleküloberfläche (grau). Die DNA ist als Stabmodell gezeigt und je nach Atomtyp gefärbt (C weiß, N blau, © rot und P gelb). [Mit freundlicher Genehmigung von Kosuke Morikawa, Biomolecular Engineering Research Institute, Osaka. PDBid 1C7Y.]

Die Gabelwanderung benötigt die Proteine RuvA und RuvB. Die von Kosuke Morikawa ermittelte Röntgenstruktur von RuvA im Komplex mit einer Holliday-Junction zeigt, dass RuvA ein Homotetramer bildet. Dieses erinnert flach ist relativ und (C,-Symmetrie) Blüte eine vierblättrige an ist konvex andere die und konkav Seite eine wobei (8,0 x 8,0 X 4,5 nm), gepositiv stark ist sieht) 25.42 Abb. in man (die Seite konkave (Abb. 25.42). Die laden und mit zahlreichen konservierten Resten übersät. Sie hat vier symmetrisch verbundene Taschen, welche die vier Arme der Holliday-Junction binden. Vier negativ geladene Ausbuchtungen oder „Zapfen“ sitzen in der Mitte. Die Abstoßungskräfte zwischen den Zapfen und den anionischen Phosphatgruppen der Holliday-Junction erleichtern wahrscheinlich die Trennung der einzelsträngigen DNA-Segmente und leiten sie von einer Doppelhelix zur anderen. Aber dies ist noch nicht alles. Die Röntgenstruktur eines RuvA-Holliday-Junction-Komplexes, der unter anderen Bedingungen kristallisiert wurde als der Komplex in Abbildung 25.42, ähnelt diesem zwar, allerdings steht jetzt ein zweites RuvA-Tetramer dem ersten direkt gegenüber. Hier verläuft die Holliday-Junction in zwei Quertunneln, die durch das entstehende D,-symmetrische RuvAOktamer laufen. In Anwesenheit von doppelsträngiger DNA oligomerisiert RuvB, eine ATPase, und bildet einen pseudohexameren Ring. Dieser Ring hat ein Loch mit einem Durchmesser von 3,0 nm, durch das eine doppelsträngige DNA gefädelt werden kann. In einem Modell zur Funktion von RuvAB, das auf der Röntgenstruktur von RuvA im Komplex mit RuvB sowie auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen des RuvAB-Holliday-Junction-Komplexes basiert (Abb. 25.43a), sind zwei RuvB-Hexamere auf der dem RuvA-Oktamer-HollidayJunction-Komplex gegenüberliegenden Seite platziert (Abb. 25.435). Ursprünglich hat man postuliert, dass die beiden RuvB-Ringe sich durch ATPHydrolyse getrieben gegeneinander drehen, sodass sich die einzelnen Stränge der vertikalen, doppelsträngigen DNA-Moleküle durch die Mitte der Junction und in die horizontalen, doppelsträngigen DNA-Moleküle schrauben. Dabei sollte die Gabelwanderung zustande kommen. Die große Kontaktfläche zwi-

(a)

(b) Abb. 25.43 RuvAB-Holliday-Junction-Komplex. (a) Elektronenmikroskopische Darstellung des Komplexes. (b) Modell des

Komplexes; hier sind die Röntgenstrukturen des RuvA-Oktamers und des hexameren RuvB-Rings in die Struktur aus Teil a eingepasst. Das RuvAOktamer ist gelb, und seine RuvB-berührenden Domänen sind orange. Die Domänen der RuvB-Untereinheiten sind violett, hellgrün und dunkelgrün gefärbt. Die DNA der Holliday-Junction ist in der Leiterform dargestellt, wobei ihre homologen roten und violetten Stränge komplementär zu den grünen und blauen Strängen sind. Die Gabelwanderung kommt durch die ATP-getriebene „entgegengesetzte Drehung“ von zwei entgegengesetzt liegenden doppel-

strängigen DNA-Strängen mithilfe ihrer verknüpften RuvB-Hexamere zustande. Dies schraubt die vertikalen, doppelsträngigen DNA-Stränge in e Richtung durch die Mitte der Holliday-Junction auf RuvA nach innen und durch die RuvB-Hexamere nach außen. Bei diesem Vorgang trennt sich die vertikale, doppelsträngige DNA und verbindet sich wieder über Baser paarungen so, dass sich die horizontalen, doppelsträngigen DNA-Moleki bilden. [Mit freundlicher Genehmigung von Kazuhiro Yamada, Tomoko Mit und Kosuke Morikawa, Biomolecular Engineering Research Institute, Osa

Rekombination

schen RuvA und RuvB lässt jedoch vermuten, dass das RuvB-Hexamer sich im Verhältnis zum RuvA-Oktamer nicht dreht. Vielmehr scheinen die mit der DNA "in Kontakt stehenden Schleifen von RuvB in einer Richtung entlang der Furchen der horizontalen, doppelsträngigen DNA zu „wandern“ (ganz so wie die hexagonalen Helicasen; Abschnitt 25.2B). Dadurch werden diese doppelsträngigen DNA-Moleküle durch RuvB nach außen geschraubt. Dies zieht die Einzelstränge der vertikalen, doppelsträngigen DNA-Moleküle durch das Zentrum von RuvA, wo sie sich wieder zu den horizontalen, doppelsträngigen DNA-Molekülen verbinden. Die Richtung der Gabelwanderung hängt davon ab, auf welches Paar der gegenüberliegenden Arme der Holliday-Junction die RuvB-Hexamere geladen werden. Die letzte Phase der homologen Rekombination ist die Auflösung der Holliday-Junction zu zwei homologen doppelsträngigen DNA-Molekülen. Dieser Vorgang wird von RuvC, einer homodimeren Nuclease, ausgeführt. Dies erfordert, dass sich eines der RuvA-Tetramere von dem in Abbildung 25.43b gezeigten Komplex ablöst, um die Holliday-Junction-DNA zu exponieren. RuvC setzt sich vermutlich auf die offene Seite des entstehenden RuvA-Holliday-JunctionKomplexes (die in Abb. 25.42 sichtbare Seite), um gegenüberliegende Stränge an der Holliday-Junction zu schneiden (Abb. 25.36i und j). Die entstehenden Einzelstrangbrüche werden dann von der DNA-Ligase verschlossen (Abb. 25.36k und |).

B.

DNA kann durch Rekombination repariert werden

Bei haploiden Organismen wie den Bakterien ist die homologe Rekombination zwischen chromosomaler und von außen, z.B. bei einer Transformation, eingeschleuster DNA (Abschnitt 3.3A) dermaßen selten, dass der Vorgang bei der überwiegenden Mehrzahl dieser Zellen niemals auftritt. Analog kommt bei Vielzellern nur während der Meiose eine Genmischung durch homologe Rekombination vor (Abb. 25.35). Die Meiose findet nur in Keimzellen statt. Warum haben dann fast alle Zellen ausgeklügelte Systeme, um eine homologe Rekombination durchzuführen? Der Grund dafür ist der, dass beschädigte Replikationsgabeln mindestens einmal pro Bakterienzellgeneration vorkommen und vielleicht zehnmal pro eukaryotischem Zellcyclus. Die zu Grunde liegenden DNA-Schäden können mittels homologer Rekombination korrigiert werden — ein Prozess, den man als Rekombinationsreparatur bezeichnet. Die direkte Reparatur durch fehleranfällige Polymerasen (Abschnitt 25.5E), die hoch mutagen ist, ist nur der letzte Ausweg. In der Tat ist die Syntheserate von RuvA und RuvB bei einer SOS-Antwort enorm

gesteigert. Wie Michael Cox herausstellte, ist somit

die primäre Funktion der homologen Rekombination die Reparatur beschädigter Replikationsgabeln. Die Rekombinationsreparatur läuft in E. coli folgendermaßen ab (Abb. 25.44): 1. Wenn eine Replikationsgabel auf einen nicht gepaarten Einzelstrangbruch oder eine Lücke stößt, kollabiert die Gabel (sie fällt auseinander). 2. Der Reparaturprozess beginnt damit, dass RecBCD- und RecA-vermittelt der neu synthetisierte und unbeschädigte Strang mit dem 3’-Ende — vom gebrochenen Ende her - sich in die homologe, doppelsträngige DNA hineinschiebt. 3. Die von RuvAB vermittelte Gabelwanderung ergibt dann eine Holliday-Junction, welche die Stränge mit den 3’-Enden der Replikationsgabel gegeneinander austauscht. 4. RuvC löst dann die Holliday-Junction auf, wodurch eine wiederhergestellte Replikationsgabel entsteht, die zur erneuten Replikation bereit ist.

Somit ist der Strang mit dem 5’-Ende faktisch das 5’-Ende eines Okazaki-Fragments geworden.

999

1000

=

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

Abb. 25.44 Rekombinationsreparatur einer Replikationsgabel, die auf einen Einzelstrangbruch gestoßen ist. Die dicken Linien stellen die Eltern-DNA dar,

die dünnen Linien die neu synthetisierte DNA; die Pfeile zeigen in die 5’—3’-Richtung. [Nach Cox, M.M., Annu. Rev. Genet. 35, 53 (2001).]

Y

1 Replikationsgabel fällt auseinander

RecBCD + RecA | 2 Strang fädelt ein

RuvAB

| 3 Gabelwanderung

RuvC | 4 Auflösen der Holliday-Junction

Der letzte Schritt in der Rekombinationsreparatur ist der Neustart der DNAReplikation. Dieser Prozess unterscheidet sich zwangsläufig von der Initiation der Replikation, die am oriC beginnt (Abschnitt 25.2B). Der Neustart der startpunktunabhängigen Replikation wird durch ein spezielles Primosom aus sieben Untereinheiten vermittelt, das man deshalb als Neustart-Primosom bezeichnet. Die Rekombinationsreparatur stellt Doppelstrangbrüche wieder her

Wir haben gesehen, dass Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA durch nichthomologe Rekombination (NHE]J, nonhomologous end-joining; Abschnitt 25.5E), häufig aber mutagen, wieder verschlossen werden können. DSBs können auch nichtmutagen durch einen Reparaturvorgang repariert werden, den man als homologe Rekombination bezeichnet. Diese beinhaltet zwei Holliday-Junctions (Abb. 25.45):

Rekombination

1001

1. Die doppelsträngigen Enden des DSB werden so herausgeschnitten, dass einzelsträngige Enden enstehen. Einer der Stränge mit dem 3’-Ende schiebt sich bei der entsprechenden Sequenz eines homologen Chromosoms hinein und bildet eine Holliday-Junction — ein Vorgang, der durch Rad51 (das eukatyotische Homolog zu RecA) vermittelt wird. Der Strang mit dem anderen 3'-Ende paart sich mit dem verdrängten Strangabschnitt auf dem homologen Chromosom, um eine zweite Holliday-Junction zu bilden. 2. Die DNA-Polymerase füllt die Lücken auf und die Ligase verschließt die Verbindungsstellen. 3. Beide Holliday-Junctions werden aufgelöst, sodass zwei intakte doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Somit werden die Sequenzen, die unter Umständen bei der Bildung des DSB verlorengingen, vom homologen Chromosom kopiert. Die homologe Rekombination kann natürlich insbesondere in haploiden Zellen eingeschränkt sein, weil eventuell kein homologer Chromosomenabschnitt zur Verfügung steht. Wie wichtig die Rekombinationsreparatur beim Menschen ist, zeigt sich an Defekten der Proteine BRCA1 (1863 Aminosäuren) und BRCA2 (3418 Aminosäuren). Diese Proteine treten beide mit Rad51 in Wechselwirkung, und bei Defekten beobachtet man ein stark erhöhtes Risiko für Brust-, Eierstock-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Personen mit mutierten BRCAI- oder BRCA2-Genen haben ein bis zu 80%iges Risiko, im Laufe ihres Lebens an Krebs zu erkranken.

RAD5S1 |1 Bildung von zwei

Y

Holliday-Junctions je

||

|

LTLL———————————————————————j-

2 DNA-Synthese und Ligation a

see

—

—————

EN

|

__

—

nennen.

3 Auflösen der Holliday-Junctions

Abb. 25.45 Reparatur eines Doppelstrangbruchs in DNA durch homologe Rekombination.

en Lu

Die dicken Linien stellen die Eltern-DNA dar,

gay,

ns TI

>

die dünnen Linien die neu synthetisierte DNA; die Pfeile zeigen in die 5’ —3'-Richtung. [Nach Haber, ).E., Trends Genet. 16, 259 (2000).]

10022

__DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

C.

Transposition

In den frühen 1950er Jahren faltige Pigmentierungsmuster steht, die sich innerhalb des wurde lange ignoriert, da sie

berichtete Barbara McClintock, dass das mannigvon Maiskörnern durch genetische Elemente entMais-Genoms bewegen können. Die Hypothese im Gegensatz zur damals gültigen Lehrmeinung

stand, nach der Chromosomen aus hintereinander aufgereihten Genen in festgelegter Ordnung bestehen. Es mussten 20 Jahre vergehen, bis man auch in

einem anderen Organismus, nämlich in E. coli, solche mobilen genetischen Elemente fand. Transposons verschieben Gene an eine beliebige Stelle des Genoms

Heute weiß man, dass transponierbare Elemente oder Transposons sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten weit verbreitet sind. Kurzfristig bewirken sie Variationen im Phänotyp, langfristig beeinflussen sie die Evolution. Jedes Transposon codiert Enzyme, die für seinen Einbau in die Empfänger-DNA verantwortlich sind. Dieser Prozess unterscheidet sich insofern von der allgemeinen Rekombination, dass keine Sequenzähnlichkeit zwischen Donator- und Akzeptor-DNA bestehen muss; zudem tritt ein solches Ereignis nur einmal alle 10*

bis 107 Zellteilungen auf. Es wurden drei Arten von Transposons mit jeweils unterschiedlicher Komplexität identifiziert: 1. Die einfachsten Transposons werden Insertionssequenzen oder IS-Elemente genannt. Sie sind häufige Bestandteile bakterieller Chromosomen und Plasmide (autosomal replizierte zirkuläre DNA-Moleküle, die gewöhnlich aus einigen Tausend bp bestehen, Abschnitt 3.5A). Ein gewöhnlicher E. coliStamm besitzt beispielsweise acht Kopien von IS1 und fünf von IS2. IS-Elemente bestehen in der Regel aus weniger als 2000 bp. Sie enthalten das Gen für eine sogenannte Transposase sowie in einigen Fällen ein regulatorisches Gen und sind von kurzen inversen (entgegengesetzt orientierten) Repetitionen an den Enden eingeschlossen. An beiden Enden eines IS-Elements findet man direkte (gleichsinnig orientierte) Repetitionen eines Abschnitts der Empfänger-DNA (Abb. 25.46). Dies deutet darauf hin, dass die Insertion von IS-Elementen an versetzten Schnittstellen in der Wirts-DNA erfolgt, die anschlie‚Kend aufgefüllt werden (Abb. 25.47). Die Länge dieser Zielsequenz (meistens 5-9 bp), nicht aber deren Basensequenz, ist für ein IS-Element charakteristisch. 2. Komplexere Transposons tragen Gene, die nicht am Transpositionsprozess beteiligt sind, z.B. solche für Antibiotikaresistenz. Das Transposon Tn3 besteht beispielsweise aus 4957 bp und besitzt inverse terminale Repetitionen von je 38 bp Länge. inverse

interne

inverse

Repetition

Auflösungsstelle

Repetition

ee

Transposase

Ziel-

le.

ee

“ IS-Element

nn

Ziel-

B-Lactamase

Repressor und Resolvase

sequenz

Abb. 25.46 Struktur von IS-Elementen. Diese und andere Transposons besitzen inverse terminale Repetitionen (Zahlen) und sind von direkten Wiederholungen der Zielsequenzen der Wirts-DNA flankiert (Buchstaben).

Der zentrale Tn3-Bereich codiert drei Proteine: (1) eine Transposase aus 1015 Resten, TnpA genannt, (2) ein Protein aus 185 Aminosäuren, InpR, das sowohl als Repressor für tnpA- und tnpR-Expression wirkt als auch die ortsspezifische Rekombination katalysiert, welche für die Transposition notwendig ist (vgl. unten), und (3) eine ß-Lactamase, die Ampicillin inaktiviert

Rekombination versetzter Schnitt in Wirts-DNA Y BRUST...

1003

Abb. 25.47 Modell für die Transposoninsertion. Ein versetzter Schnitt, der später aufgefüllt wird, erzeugt direkte Wiederholungen der Zielsequenz.

t

ER Transposon

inverse Repetition

}

Auffüllen und Ligation |

(Exkurs 8.3). Die ortsspezifische Rekombination findet in einer AT-reichen Region zwischen tnpA und tnpR statt, die als interne Auflösungsstelle bezeichnet wird. So genannte zusammengesetzte Transposons (Abb. 25.48) bestehen aus einem zentralen codierenden Bereich, der von zwei identischen oder nahezu identischen IS-ähnlichen Modulen flankiert wird, welche entweder in derselben oder in entgegengesetzter Orientierung zueinander liegen können. Zusammengesetzte Transposons sind also scheinbar durch Vereinigung zweier einstmalig unabhängiger IS-Elemente entstanden. Es wurde experimentell gezeigt, dass zusammengesetzte Transposons in ihrer zentralen Region jede beliebige Sequenz transportieren können.

(a) IS-ähnliches Modul

IS-ähnliches Modul Eiern

_—

(D% FIBBBF- ID RNinverse a

Repetitionen

2entabereich

7

-IdEE-| N inverse Ai

Repetitionen

Abb. 25.48 Zusammengesetztes Transposon. Dieses Element besteht aus zwei genau oder nahezu genau gleichen IS-ähnlichen Modulen (grün), die eine Zentralregion mit verschiedenen Genen flankieren. Die IS-ähnlichen Module können entweder in (a) gleicher oder (b) entgegengesetzter

Orientierung zueinander liegen.

1004

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination Mutmaßlicher Mechanismus der Transposition

intakte Plasmide sequenzspezifische Spaltung

ee

Transposon

RN

Y A

Donator-

Plasmid

25.49):

1. In die Zielsequenz des Rezipienten-Plasmids werden (wie in Abb. 25.47) zwei versetzte Einzelstrangbrüche eingeführt. Ebenso wird die DNA auf beiden Seiten des Transposons in jeweils einem der beiden Stränge aufgeschnit-

B

Spalt- BEN stellen

Transposons springen nicht einfach von einem Punkt im Genom zum anderen, eine wie es der Name vermuten lässt. Stattdessen beinhaltet die Transposition eines ben Verschie das für mus Transposon-Replikation. Ein möglicher Mechanis Transposons zwischen zwei Plasmiden umfasst die folgenden Schritte (Abb.

Y

EmpfängerPlasmid

ten.

2. Die beiden freien Transposon-Enden werden jeweils mit einem überhängenden Einzelstrang-Ende an der Insertionsstelle verknüpft. So entstehen an beiden Enden des Transposons Replikationsgabeln. 3. Das Transposon wird repliziert, es entsteht ein Cointegrat als Fusion aus beiden Plasmiden. Solche Cointegrate konnten bereits isoliert werden. 4. Durch sequenzspezifisches Crossing-over zwischen den internen Auflösungsstellen der Transposons kann das Cointegrat wieder in die beiden Ursprungsplasmide getrennt werden, die nun beide das Transposon enthalten. Dieser Rekombinationsprozess wird von einer vom Transposon codierten Resolvase (TnpR in Tn3) katalysiert, und nicht von RecA. Genetische Umordnung wird hauptsächlich durch Transposons verursacht Transposons bewirken nicht nur ihre eigene Insertion in andere DNA-Regionen,

Cointegrat

Rekombinationsstellen

4

lAuflösung DonatorPlasmid,

n

3

Ausgangszustand wiederhergestellt

EmpfängerPlasmid, enthält Transposon und duplizierte Zielsequenz

Abb. 25.49 Modell für die Transposition, bei dem ein Cointegrat als Intermediat auftritt. Heller dargestellte Abschnitte repräsentieren die neu synthetisierte DNA. [Nach Shapiro, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 1934 (1979).]

sie begünstigen auch Inversionen, Deletionen und Umlagerungen in der Wirts-DNA. Inversionen können dann auftreten, wenn die Wirts-DNA zwei Kopien eines Transposons in entgegengesetzter Orientierung enthält. Die Rekombination dieser Transposons invertiert den dazwischenliegenden Bereich (Abb. 25.508). Haben jedoch beide Transposons die gleiche Orientierung, führt eine Rekombination zur Deletion des dazwischenliegenden Segments (Abb. 25.50b). Wird ein Chromosomenabschnitt auf diese Weise deletiert und anschließend an einer anderen Stelle durch eine weitere Rekombination wieder ins Chromosom integriert, ist das Ergebnis eine Umlagerung innerhalb des Chromosoms. Man kann Transposons als die gentechnischen „Werkzeuge“ der Evolution betrachten. Beispielsweise wurde seit dem häufigen Antibiotikagebrauch eine rasche Evolution von Plasmiden beobachtet, die Resistenzen gegen mehrere Antibiotika verleihen (Abschnitt 3.5A). Der Grund liegt in der Anhäufung von entsprechenden Transposons mit Antibiotikaresistenzen auf diesen Plasmiden. Transposonvermittelte Umordnung ist vermutlich auch für die Bildung neuer Proteine verantwortlich, indem zwei vorher unabhängige Genabschnitte verknüpft werden. Zudem können Transposons offensichtlich genetische Information zwischen nicht verwandten Spezies übertragen. Eukaryotische Transposons gleichen Retroviren Transposons kommen in so entfernt verwandten Eukaryoten wie Hefe, Mais und Fruchtfliegen vor. Tatsächlich besteht das menschliche Genom zu ca. 3% aus Transposons, obwohl ihre Sequenzen in den meisten Fällen so mutiert sind, dass sie inaktiv sind. Man kann diese Transposons daher als Fossilien der Evolution ansehen. Ungeachtet des gerade Gesagten zeigen viele eukaryotische Transposons geringe Ähnlichkeit mit denen der Prokaryoten. Ihre Sequenzen ähneln eher denen von Retroviren (Exkurs 25.2), was vermuten lässt, dass diese Transposons degenerierte Retroviren sind. Die Transposition dieser sogenannten Retrotransposons geschieht über einen Weg, der der Replikation retroviraler DNA ähnelt: (1) ihre Transkription zu RNA, (2) Kopieren dieser RNA in cDNA durch die Reverse Transkriptase und (3) die weitgehend zufällige Insertion dieser DNA in das Genom des Wirtsorganismus’ über das als Integrase bekannte Enzym

(das der DNA-Transposase in Struktur und Mechanismus ähnelt)

Zusammenfassung Transposons in entgegengesetzter Orientierung

1005

Transposons in gleicher Orientierung

Paarung der inversen Repetitionen

Rekombination

Rekombination

mE

Eu: =: invertiertes Segment .

es

' Chromosom mit einem Transposon

Abb. 25.50 Chromosomenumordnung durch Rekombination. (a) Die Inversion eines DNA-Abschnitts zwischen zwei identischen Transposons in entgegengesetzter Orientierung. (b) Die Deletion eines DNA-Abschnitts zwischen zwei identischen Transposons in gleicher Orientierung.

Das Genom von Wirbeltieren enthält auch Retrotransposons, die sich über einen Mechanismus replizieren, der sich von dem der Retroviren unterscheidet. Eine häufige Familie dieser nichtviralen Retrotransposons sind eine Gruppe von 6 bis 8 kb langen, häufig wiederholten DNA-Sequenzen (engl.: long interspersed nuclear elements, LINEs). Etwa 1,4 Millionen LINEs oder LINE-Fragmente gibt es im menschlichen Genom. Sie machen etwa 20% von dessen 3,2 Milliarden Basenpaaren aus. Der Großteil dieser „molekularen Parasiten“ ist so weit mutiert, dass er inaktiv ist, aber einige scheinen immer noch zur Transposition in der Lage zu sein. Tatsächlich werden einige Erbkrankheiten durch die Insertion eines LINE in ein Gen verursacht. Verschiedene andere Retrotransposontypen machen zusammen weitere 22% des menschlichen Genoms aus. Das ergibt einen Gesamttransposongehalt von etwa 45%.

Zusammenfassung 1. DNA wird semikonservativ repliziert. Dazu benutzen die DNA-Polymerasen die getrennten Elternstränge als Matrizen und synthetisieren die komplementären Tochterstränge. 2. Die Replikation verläuft semidiskontinuierlich: Der Leitstrang wird kontinuierlich synthetisiert, während der Folgestrang aus Okazaki-Fragmenten mit anhängenden RNA-Primern synthetisiert wird, die anschließend zusammengefügt werden. 3. Die DNA-Polymerase I (Pol I) aus E. coli besitzt zusätzlich zu ihrer 5’ —3'Polymeraseaktivität eine 3’ —5’- und 5’— 3'-Exonucleaseaktivität. Dadurch kann sie weitere physiologische Funktionen ausüben, die darin bestehen, RNA-Primer auszuschneiden und durch DNA zu ersetzen sowie beschädigte DNA zu reparieren. Pol III ist die wichtigste Polymerase in E. coli. 4. Zum Replikationsbeginn werden zuerst die Elternstränge an spezifischen Stellen namens oriC aufgeschmolzen und durch Helicase weiter entwunden.

deletiertes Segment mit einem

Transposon

Verständnisfragen zu Abschnitt 6 1. Beschreiben Sie die Vorgänge der Stranginvasion, Gabelwanderung und Auflösung während der homologen Rekombination. 2. Welche Rolle spielt die Rekombination bei der Reparatur von geschädigter DNA? 3. Wie führen Transposons zu

genetischer Neuordnung?

1006

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

SSBs verhindern die Wiedervereinigung der Einzelstränge. Ein Primase enthaltendes Primosom synthetisiert einen RNA-Primer. Da DNA-Polymerasen nur in 5’—3’-Richtung operieren, muss sich die Matrize des Folgestrangs in einer Schleife auf das Replisom zurückfalten, das zwei Polymerasen enthält. Eine bewegliche Klammer erhöht die Prozessivität der Pol III. DNA-Ligase versiegelt die Brüche zwischen den Okazaki-Fragmenten. Die Replikation schreitet voran, bis die sich in entgegengesetzter Richtung bewegenden Replikationsgabeln in der Terminationsregion zwischen gegeneinander gerichteten Ter-Sequenzen aufeinander treffen. Die hohe Replikationsgenauigkeit der DNA wird durch mehrere Faktoren erreicht: Ausbalancierung der dNTP-Konzentrationen, Verwendung eines RNA-Primers, 3’ —5’-Korrekturleseaktivität und DNA-Reparaturmechanismen. Eukaryoten besitzen eine Reihe DNA-Polymerasen. Pol a dehnt Primer aus, und die hoch prozessive Pol ö ist die wichtigste Polymerase. In Eukaryoten setzt die Replikation an mehreren Stellen zugleich ein, die in Replikons organisiert sind, und läuft über die Nucleosomen hinweg. Um das 5’-Ende des Folgestrangs replizieren zu können, haben eukaryotische Chromosomen-Enden repetitive telomere Sequenzen, welche durch das Ribonucleoprotein Telomerase angefügt werden. Die 3’-Verlängerung an jedem Chromosomen-Ende dient als Matrize für die Primersynthese. Somatische Zellen besitzen keine Telomeraseaktivität und sind so vor einer Transformation zu Krebszellen geschützt. Mutationen in Nucleotidsequenzen treten spontan auf, entweder durch Replikationsfehler oder durch den Einfluss von UV-Licht, Strahlung oder chemischer Mutagene. Viele Verbindungen, die im Ames-Test mutagen sind, sind auch carcinogen. 10. Einige DNA-Fehler (z.B. alkylierte Basen und Pyrimidindimere) können in einem einzigen Schritt behoben werden. Bei der Basen-Excisionsreparatur beseitigt eine Glykosylase eine beschädigte Base. Bei einer Nucleotid-Excisionsreparatur wird ein den Fehler enthaltendes Oligonucleotid entfernt und ersetzt. Reparaturwege, die fehleranfällige Polymerasen, nichthomologe Rekombination und die SOS-Antwort in E.coli verwenden, sind mutagen. 1ık Bei der allgemeinen Rekombination werden Stränge homologer DNAAbschnitte ausgetauscht. Die dabei entstehende Crossing-over-Struktur (Holliday-Junction) kann auf zwei Arten aufgelöst werden. Das E. coli-RecA polymerisiert entlang der DNA und vermittelt einen ATP-abhängigen Strangaustausch über einen drei- oder viersträngigen Übergangszustand. Zur Rekombination sind auch Proteine notwendig, welche die DNA ent-

winden, Brüche einführen, die Superspiralisierung regulieren, die Gabelwanderung vermitteln, die Holliday-Junction lösen und DNA-Segmente verbinden. Beschädigte DNA kann mithilfe der Rekombination repariert werden. 1172. Transposons sind genetische Elemente, welche sich innerhalb des Genoms bewegen. Die Bewegung beinhaltet ihre Replikation. Transposons können auch eine Umordnung der Wirts-DNA bewirken.

Aufgaben

1007

Wichtige Begriffe semikonservative Replikation 9-Struktur Replikationsgabel Okazaki-Fragment semidiskontinuierliche Replikation Leitstrang Folgestrang DNA-Ligase

Telomer Telomerase Ribonucleoprotein G-Quartett Mutation Pyrimidindimer mutagen Punktmutation

Primer

Transition

Prozessivität Korrekturlesen Nick-Translation Helicase SSB

Rekombinationsreparatur

Transversion Insertions-/Deletionsmutation carcinogen Ames-Test Photoreaktivierung

homologe Rekombination Transposon IS-Element zusammengesetztes Transposon Cointegrat

Primosom

Basen-Excisionsreparatur (BER)

Retrovirus

Primase Replisom Replikon

DNA-Glykosylase AP-Stelle Nucleotid-Excisionsreparatur (NER)

Retrotransposon

Fehlpaarungsreparatur nichthomologe Rekombination SOS-Antwort allgemeine Rekombination Rekombinationsreparatur heterologe DNA Holliday-Junction Gabelwanderung

Aufgaben 1. Wieviele Okazaki-Fragmente müssen in etwa bei der Rep-

likation des E. coli-Chromosoms synthetisiert werden? Erklären Sie, warum eine (hypothetische) DNA-Polymerase, welche in 3’ —5’-Richtung synthetisieren könnte, auch dann einen Selektionsnachteil hätte, wenn sie in 5’—3’-Richtung korrekturlesen könnte. Sie haben einen Arzneistoff entdeckt, der die Aktivität der anorganischen Pyrophosphatase hemmt. Welche Auswirkung hätte dieser Arzneistoff auf die DNA-Synthese? Ein Reaktionsansatz enthält DNA-Polymerase, die vier dNTPs und eines der DNA-Moleküle, deren Struktur unten dargestellt ist. Welcher der Ansätze generiert PP;?

OB NRERRRAEEEEERBRHREBERERERRERN

. Wieso gibt es keine Pol-I-Mutanten, denen die 5’—3’Exonucleaseaktivität völlig fehlt? Warum ist es bei DNA-Sequenzierungen (Abschnitt 3.4C) vorteilhaft, nur das Klenow-Fragment anstatt der intakten E. coli-Pol-I zu verwenden ? Der oriC von E.coli ist reich an A-T-Basenpaaren. Warum

ist dies von Vorteil? Erklären Sie, warum die DNA-Gyrase für ein effektives Entwinden der DNA durch die Helicase an der Replikationsgabel notwendig ist. Wieso beträgt die Mutationsrate in E.coli 10° bis 10""° pro repliziertes bp, obwohl die Fehlerraten bei Pol I und III 10° bis 10” pro repliziertes bp beträgt? 10. Wieso kann eine lineare Doppelstrang-DNA (z.B. diejenige des Bacteriophagen T7) nicht vollständig allein durch E. coli-codierte Proteine repliziert werden? ib Das Basenanalogon 5-Bromuracil (5BU), Br

Ö

(b)

5-Bromuracil (5BU) (e)

(d)

das Thymin sterisch ähnelt, tautomerisiert leichter von seiner Keto- zu seiner Enolform als Thymin. 5BU kann in neu synthetisierte DNA eingebaut werden, wenn es mit dem Adenin auf dem Matrizenstrang eine Basenpaarung eingeht. Die Enolform von 5BU kann jedoch mit Guanin anstatt mit Adenin paaren. (a) Zeichnen Sie das 5BU-G-Basenpaar. (b) Welche Art von Mutation ist die Folge?

DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination

10068

12. Die Desaminierung von Adenin ergibt die Base Hypoxanthin, die mit Cytosin paaren kann. Welchen Reparaturmechanismus würden Zellen höchstwahrscheinlich verwenden, um DNA mit einem desaminierten Adenin zu reparieren?

13. Hydroxylamin (NH,OH) wandelt Cytosin in die untenstehende Verbindung um. ER)

Mit welcher Base bildet diese modifizierte Base ein Paar aus? Führt dies zu einer Transition oder zu einer TIransversion?

14. In eukaryotischen Zellen spaltet eine spezifische Triphosphatase Desoxy-8-oxoguanosintrisphosphat (oxo-dGTP) zu oxo-dGMP + PP;. Welchen Nutzen hat diese Reaktion? 15. Bestimmte Stellen im E. coli-Chromosom werden als heiße

Stellen (engl.: hot spots) bezeichnet, da sie ungewöhnlich hohe Mutationsraten aufweisen. Viele dieser Stellen enthalten einen 5-Methylcytosinrest. Erklären Sie, wieso diese heißen Stellen auftreten.

16. Sagen Sie voraus, ob ein Verlust der folgenden Gene in E. coli letal wäre oder nicht: (a) dnaB (das für DnaB codiert), (b) polA (das für Pol I codiert, (c) ssb und (d) recA. 17. In E. coli scheint alle neu synthetisierte DNA fragmentiert zu sein. Dies könnte so interpretiert werden, dass Leit- und Folgestrang diskontinuierlich synthetisiert werden. In E. coli-Mutanten, denen die Uracil-N-Glykosylase fehlt, ist jedoch nur etwa die Hälfte der neu entstandenen DNA fragmentiert. Warum? 18. Bei E.coli hat die Polymerase V die. Fähigkeit, Thymindimere zu umgehen. Pol V neigt aber dazu, gegenüber beschädigten T-Basen statt A G einzubauen. Würden Sie erwarten, dass Pol V mehr oder weniger prozessiv als Pol III ist? Geben Sie eine Erklärung.

Elektronisches Zusatzmaterial auf www.wiley.com/college/voet Case Study 32 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Activity and Cell Growth The activity of the pentose phosphate pathway enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase has been found to be important in the regulation of cell growth.

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Die Transkriptionsmaschinerie einer Zelle liest bestimmte Abschnitte einer DNA-Matrize ab. Die in der DNA enthaltene Information muss, ähnlich wie bei dem

Rosetta-Stein in der Abbildung oben, erst decodiert werden, um in diesem Falle

die Produktion der Zellproteine zu steuern. [Photo mit freundlicher Genehmigung des British Museum, London.]

Transkription und RNA-Prozessierung Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Interactive Exercise 50 Interactive Exercise 51 Interactive Exercise 52 EEE

EEE

EEE

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Durch den Einsatz mikroskopischer Techniken konnte in den 1930er Jahren gezeigt werden, dass sich DNA fast ausschließlich im Kern eukaryotischer Zellen befindet. In den 1950er Jahren wurde der Ort der Proteinbiosynthese identifiziert, indem gezeigt werden konnte, dass radioaktiv markierte Aminosäuren, die in Proteine eingebaut worden waren, mit cytosolischen RNA-Protein-Komplexen — den Ribosomen - assoziiert vorlagen. Somit wird die Proteinbiosynthese nicht unmittelbar von der DNA gesteuert, da die DNA und die Ribosomen — zumindest in Eukaryoten — zu keinem Zeitpunkt miteinander in Kontakt treten. Das Bindeglied zwischen der DNA und der Proteinproduktionsmaschinerie ist die RNA, wie es in Cricks zentralem Dogma der Molekularbiologie dargelegt ist (Abschnitt

3.3B).

-

Zellen enthalten drei Klassen von RNA: Ribosomale RNA (rRNA), die zwei Drittel der Ribosomenmasse ausmacht, Transfer-RNA (tRNA), einen Satz kleiner kompakter Moleküle, die den Ribosomen Aminosäuren zum Einbau in Proteine liefern und schließlich Messenger-RNA (mRNA), deren Nucleotidsequenz die Proteinsynthese steuert. Zusätzlich übernimmt eine Vielzahl anderer kleiner RNA-Moleküle verschiedene Aufgaben beim Prozessieren von neu transkribierten RNA-Molekülen. Für alle RNA-Typen kann gezeigt werden, dass sie mit komplementären DNA-Sequenzen des Genoms hybridisieren. Somit werden alle zellulären RNA-Typen von DNA-Matrizen transkribiert. Die Transkription von DNA in RNA wird von RNA-Polymerasen (RNAPSs) durchgeführt, die als Komplexe aus vielen Untereineinheiten aufgebaut sind, genauso wie die DNA-Polymerasen, welche die DNA-Replikation katalysieren. In diesem Kapitel befassen wir uns mit den katalytischen Eigenschaften der RNA-Polymerasen und diskutieren, wie diese Proteine — im Gegensatz zu DNA-Polymerasen — bestimmte Gene erkennen. Darüber hinaus betrachten wir, wie neu synthetisierte RNA prozessiert wird, um vollständig funktionell zu werden.

W. Pratt Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte

Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

Transkription und RNA-Prozessierung e RNA-Polymerase e Transkription in Eukaryoten e Posttranskriptionale Prozessierung

1012

_ Transkription und RNA-Prozessierung

1

_RNA-Polymerase

Die RNAP ist das Enzym, das für die DNA-gesteuerte Synthese der RNA verantwortlich ist. 1960 wurde sie unabhängig voneinander von Samuel Weiss und Jerard Hurwitz entdeckt. Das Enzym koppelt die Ribonucleosidtriphosphate (NTPs) ATP, CTP, GTP und UTP unter der Verwendung einer DNA-Matrize aneinander. Diese Reaktion wird durch die Freisetzung und die anschließende

Hydrolyse von PP; getrieben: (RNA), Restet NTP

=>

(RNA), +1 Reste + DE;

H,0 Abb. 26.1 Elektronenmikroskopische Aufnahme des RNA-Polymerase Holoenzyms aus E. coli. Dieses Enzym, eines der größten bekannten, löslichen Enzyme, ist hier an verschiedene

Promotorstellen von DNA des Bakteriophagen 17 gebunden. [Aus: Williams, R.C., Proc. Natl. Acad.

Sci. 74, 2313 (1977)]

2Pp, Alle Zellen enthalten RNA-Polymerasen. In Bakterien synthetisiert ein einziges derartiges Enzym die gesamte RNA der Zelle mit Ausnahme der kurzen RNAPrimer, die bei der DNA-Replikation benötigt werden (Abschnitt 25.2B). Eukaryotische Zellen enthalten vier oder fünf verschiedene RNA-Polymerasen, von denen jede einen anderen RNA-Typ synthetisiert. Wir werden zunächst das Enzym aus E.coli betrachten, da es kleiner und einfacher ist als die eukaryotischen Enzyme.

A.

Enzymstruktur

Das Holoenzym der RNA-Polymerase aus E.coli ist ein Protein von ca. 449 kD mit der Untereinheitenzusammensetzung a,ßß’wo. Sobald die RNA-Synthese begonnen hat, dissoziiert die o-Untereinheit (auch o-Faktor genannt) vom Kernenzym o,ßß'w ab, das dann den eigentlichen Polymerisationsprozess ausführt. Die RNA-Polymerase ist groß genug, um in elektronenmikroskopischen Aufnahmen deutlich sichtbar zu sein (Abb. 26.1). Die Röntgenstruktur eines verwandten RNAP-Kernenzyms aus Thermus aquaticus (Tag), die von Seth Darst bestimmt wurde, zeigt, dass es die Form einer Krebsschere hat, deren zwei Zangen von der ß- und der ß’-Untereinheit gebildet werden (Abb. 26.2). Der Kanal zwischen den Zangen ist ca. 2,7 nm breit. Das aktive Zentrum, das ein Mg?*-Ion enthält, befindet sich am Boden dieses Kanals. Im Tag-Holoenzym befindet sich die o-Untereinheit oberhalb des Kernenzyms und führt zum Schließen der Schere, so dass sich der Kanal um 1 nm verengt. Die äußere Oberfläche des Holoenzyms trägt fast flächendeckend eine negative Ladung, während die Stellen im Inneren des Kanals, die vermutlich mit Nucleinsäuren in Wechselwirkung treten, positiv geladen sind.

B. Abb. 26.2 Röntgenstruktur der Taq-RNA-Polymerase. Die zwei a-Untereinheiten sind gelb und grün, die ß-Untereinheit ist türkis, die ß’-Untereinheit (deren ungeordneter Anteil in diesem Model nicht gezeigt is) ist pink und die w-Untereinheit ist grau.

Gebundene Mg?*- und Zn’*-Ionen sind jeweils als rote und orange Kugeln dargestellt. [Nach einer Röntgenstruktur von Seth Darst, The Rockefeller University. PDBid THQM.]

Matrizenbindung

Die RNA-Synthese wird normalerweise nur an definierten Sequenzen der DNA-Matrize begonnen. Im Gegensatz zur Replikation, bei der beide Stränge der Chromosomen vollständig kopiert werden müssen, sind in die regulierte Expression von genetischer Information viel kleinere, einzelsträngige Bereiche des Genoms einbezogen. Der DNA-Strang, der während der Transkription als Matrize dient, wird als Anti-

sense- oder nicht codierender Strang bezeichnet, da seine Sequenz komplementär zur RNA-Sequenz ist. Den anderen DNA-Strang, der (abgesehen vom Ersatz von U durch T) dieselbe Sequenz wie die transkribierte RNA hat, nennt man Sense- oder codierenden Strang (Abb. 26.3). Die zwei DNA-Stränge in einem Chromosom eines Organismus können deshalb unterschiedliche Gensätze enthalten.

RNA-Polymerasse

Sense-(codierender) Strang

Antisense-(nicht codierender) Strang

1013

Abb. 26.3 Sense- und Antisense-Strang der DNA. Der Matrizenstrang der doppelsträngigen DNA wird als Antisense- oder nicht codierender Strang bezeichnet. Ihr Sense- oder codierender Strang besitzt dieselbe Nucleotidsequenz und Orientierung wie die transkribierte RNA.

Man muss beachten, dass „Gen“ ein relativ weit gefasster Begriff ist, der sich

sowohl auf Sequenzen bezieht, die Polypeptide codieren, als auch auf solche, die den Sequenzen von rRNA, tRNA und anderen RNA-Klassen entsprechen. Darüber hinaus enthält ein Gen typischerweise Sequenzen, die an der Initiation und Termination der Transkription (und Translation) beteiligt sind, aber nicht transkribiert (oder translatiert) werden. Die Expression vieler Gene hängt von regulatorischen Sequenzen ab, welche die codierenden Regionen nicht direkt flankieren, sondern in einer beachtlichen Entfernung lokalisiert sein können. Die meisten proteincodierenden Gene (auch Strukturgene genannt) werden in Eukaryoten einzeln transkribiert. In prokaryotischen Genomen sind Gene oftmals tandemartig auf einem einzelnen Strang so angeordnet, dass sie zusammen transkribiert werden können. Diese genetischen Einheiten, die sogenannten Operons, enthalten typischerweise Gene mit verwandten Funktionen. Zum Beispiel liegen die drei verschiedenen rRNA-Gene von E.coli in einem Operon (Abschnitt 26.3B). Das lac-Operon in E.coli, dessen Expression in Abschnitt 28.2A detailliert beschrieben ist, enthält drei Gene, die Proteine codieren, welche im Lactosemetabolismus eine Rolle spielen, sowie Sequenzen, die deren Transkription kontrollieren (Abb. 26.4). Andere Operons enthalten Gene, die Proteine codieren, welche für biosynthetische Stoffwechselwege benötigt werden, wie z.B. das trp-Operon, dessen sechs Genprodukte (Proteine werden oft als Genprodukte bezeichnet) die TIryptophansynthese katalysieren. Ein Operon wird als ganze Einheit transkribiert, was zur Bildung einer polycistronischen mRNA führt, welche die mehr oder weniger simultane Synthese jedes der codierten Polypeptide steuert (der Ausdruck Cistron ist ein Synonym für Gen). Im Gegensatz dazu führen eukaryotische Strukturgene, die niemals Teil von Operons sind, nur zur Bildung von monocistronischen mRNAs. Das RNA-Polymerase-Holoenzym bindet an Promotoren

Wie erkennt die RNAP den richtigen DNA-Strang und wie initiiert sie die RNASynthese am Anfang eines Gens (oder Operons)? Die Initiation der Transkription erfolgt durch Bindung der RNAP an Basensequenzen, die als Promotoren bezeichnet und von dem entsprechenden o-Faktor erkannt werden. Auf die Existenz von Promotoren wurde man erstmals durch Mutationen aufmerksam, die die Transkriptionsgeschwindigkeiten bestimmter Gene verstärkten oder abschwächten. Promotoren bestehen aus ca. 40 bp langen Sequenzen, die stromaufwärts bezüglich des Transkriptionsstartpunkts lokalisiert sind. Vereinbarungsgemäß wird die Sequenz dieser DNA durch ihren Sense-(Nicht-Matrizen-)Strang repräsentiert, so dass sie dieselbe Sequenz und Direktionalität besitzt wie die transkribierte RNA. Ein Basenpaar in der Promotorregion wird positiv bzw. negativ nummeriert, je nach seiner Position relativ zur RNA-Polymerasebewegung, wobei vom ersten Nucleotid aus gezählt wird, das in RNA transkribiert wird. Die Startstelle erhält die Nummer +1, es gibt kein Nucleotid mit der Nummer 0. Da die RNA in

Abb. 26.4

lac-Operon aus E. coli.

Dieser DNA-Abschnitt beinhaltet Gene, die

Proteine codieren, welche für den Lactosemetaboliimus benötigt werden. Außerdem enthält er die Abschnitte, die die Expression dieser Proteine

Regulations-

Er

kontrollieren. Die Z-, Y- und A-Gene spezifizieren die Proteine ß-Galactosidase (Exkurs 8.1),

Kontroll-

segmente I Se

+

Strukturgene

Lactose-Operon

m

Galactose-Permease (Exkurs 10.3D) und

Thiogalactosid-Transacetylase. Das nahe gelegene Regulatorgen I, das nicht Teil des Operons ist, codiert einen Repressor, der die Transkription des /ac-Operons inhibiert.

1014

Transkription und RNA-Prozessierung

lac lacl

CTTTATGETTCCGGCTCG

ACCCCAGGC

galP2 araBAD araC trp

Ä GCCGTGATTA’ AAATGAGCTGT]

bioA bioB

TTCCAAAACGT CATAATCGA

tERNAIT rrnDI rrnEl

CAACGTAACACI CAAAAAAATACN CAATTTTTCTAF

rrnAl

AAAATAAATG

Abb. 26.5 Nucleotidsequenzen des Sense-(codierenden) Strangs ausgewählter E. coli-Promotoren. Sowohl eine 6 bp lange Region, deren Zentrum um Position -10 liegt (rot unterlegt), als auch eine 6 bp lange Sequenz um die Position -35 (blau unterlegt) sind konserviert. Die Startpunkte der Transkription (+1), die sich bei den meisten Promotoren an einem einzelnen Purinnucleotid befinden, sind

grün unterlegt. Die untere Reihe zeigt die Konsensussequenz von 298 E.coli-Promotoren. Die Zahl unter jeder Base gibt ihre prozentuale Häufigkeit wieder. [Nach Rosenberg, M. und Court, D., Annu.

Rev. Genet. 13, 321-323 (1979). Konsensussequenz nach Lisser, D. und Margalit, H., Nucleic Acids Res.

21, 1512 (1993).]

TGTGGAATTGTGAGCGG

TTTTTATCGCAACTCTC ET TRRELTACGEETEER ATTAATCATCGAACTAG

... 16-1900...

EEE 69 79 61 56 54

Initiationsstelle

-10 Region

-35 Region KonsensusSequenz:

Initiationsstelle (+1)

-10 Region (Pribnow-Box)

-35 Region

Operon

54

en

...5-5 02...

|

72701,6560461556582

5’ 3’-Richtung synthetisiert wird (siehe unten), liegt ihr Promotor stromaufwärts vom Anfangsnucleotid der RNA. Das Holoenzym bildet feste Komplexe mit den Promotoren (Dissoziationskon-

stante K=-10°'* M). Diese starke Bindung wird dadurch veranschaulicht, dass das Holoenzym die gebundenen DNA-Segmente in vitro vor einem enzymatischen Abbau durch die Endonuclease DNase I schützt. Sequenzbestimmungen von auf diese Weise geschützten Abschnitten zahlreicher E.coli-Gene führten zur Identifizierung einer Konsensussequenz der E. coli-Promotoren (Abb. 26.5). Ihre am stärksten konservierte Sequenz ist ein Hexamer, dessen Zentrum sich etwa bei der Position -10 befindet (sie wird manchmal auch als Pribnow-Box bezeichnet, nach David Pribnow, der sie im Jahre 1975 beschrieb). Die Konsensussequenz dieses Abschnitts ist TATAAT, wobei TA am Anfang und das Tam Ende am stärksten konserviert sind. Stromaufwärts gelegene Sequenzen, etwa bei der Position -35, weisen ebenfalls eine Region mit einer Sequenzhomologie auf (TTGACA). Das Startnucleotid (+1), das fast immer A oder G ist, liegt im Zentrum einer schwach konservierten CAT- oder CGT-Sequenz. Die meisten Promotorsequenzen weichen jedoch erheblich von der Konsensussequenz ab (Abb. 26.5). Dennoch kann eine Mutation in einem der konservierten Abschnitte die Initiationseffizienz eines Promotors stark erhöhen oder erniedrigen. Der Grund dafür ist, dass die Transkriptionsgeschwindigkeiten von E. coli-Genen direkt von der Geschwindigkeit abhängen, mit der ihre Promotoren stabile Initiationskomplexe mit dem Holoenzym bilden. Die Initiation erfordert die Bildung eines „offenen“ Komplexes Die Promotorregionen, die mit dem RNAP-Holoenzym

in Kontakt treten, wur-

den mit einer Methode identifiziert, die man Footprinting (engl.: footprint, Fußabdıuck) nennt. Bei dieser Prozedur wird DNA mit einem Protein inkubiert, an das sie bindet und dann mit einem Alkylierungsreagens, wie Dimethylsulfat (DMS), behandelt, wodurch die Basen der DNA alkyliert werden. Danach wird das Rückgrat an den alkylierten Positionen gespalten. Die DNA-Abschnitte, die an das Protein binden, sind vor einer Alkylierung und damit vor einer Spaltung geschützt. Das entstehende Muster der geschützten Basen wird als Footprint eines Proteins bezeichnet. Der Footprint des RNAP-Holoenzyms zeigt, dass seine Kontaktstellen zum Promotor vorwiegend an dessen -10- und -35Regionen liegen. Bei manchen Genen können zusätzliche, stromaufwärts gele-

gene Sequenzen die Bindung der RNAP an die DNA beeinflussen.

RNA-Polymerasse

1015

DMS methyliert G-Reste am N7 und A-Reste am N3 sowohl in doppelsträngiger als auch in einzelsträngiger DNA. DMS methyliert auch N1 von A und N3 von C, jedoch nur, falls diese letztgenannten Positionen nicht in Basenpaarungen mit einbezogen sind. Das Muster der DMS-Methylierung gibt deshalb Aufschluss darüber, ob die DNA einzel- oder doppelsträngig ist. Footprinting-Studien zeigen, dass die Bindung des Holoenzyms einen Bereich von etwa 11 bp der DNA (von -9 bis +2) „aufschmilzt“ (trennt). Der entstehende offene Komplex ist dem Bereich der entwundenen DNA am Replikationsursprung analog

(Abschnitt 25.28).

Das Kernenzym, welches keine Bindungsspezifität für Promotoren besitzt, bindet fest an Doppelstrang-DNA (die Dissoziationskonstante des Komplexes ist K=5x 10°? M; seine Halbwertszeit beträgt ca. 60 min). Das Holoenzym dagegen bindet Nicht-Promotor-DNA vergleichsweise schwach (K = 10°” M mit einer Halbwertszeit von > 1 s. Offensichtlich ermöglicht die o-Untereinheit dem Holoenzym bei der Suche nach der für die o-Untereinheit geeigneten Promotorsequenz eine rasche Bewegung entlang des DNA-Strangs. Sobald die Transkription initiiert worden und die o-Untereinheit abdissoziiert ist, stabilisiert die feste Bindung des Kernenzyms an die DNA offensichtlich den ternären Enzym-DNARNA-Komplex. Die Genexpression wird durch verschiedene o-Faktoren gesteuert

Da verschiedene o-Faktoren verschiedene Promotoren erkennen, bestimmt der vorhandene Satz an o-Faktoren, welche Gene einer Zelle transkribiert werden. Die Entwicklung und die Differenzierung, welche die zeitlich geordnete Abfolge der Expression von Gensätzen erfordern, können durch eine „Kaskade“ von oFaktoren bewerkstelligt werden. Bei der Infektion von Bacillus subtilis durch den Bakteriophagen SP01 z.B. ist die Expression von verschiedenen Sätzen der Phagengene zu unterschiedlichen Zeiten notwendig. Der erste Satz, auch bekannt als frühe Gene, wird mit Hilfe des bakteriellen o-Faktors transkribiert. Eines der frühen Phagen-Genprodukte ist eine o-Untereinheit, die man als o®P?? bezeichnet. Sie verdrängt den ursprünglichen o-Faktor vom Kernenzym und erlaubt dadurch der RNA-Polymerase, nun die Promotoren der mittleren Gene des Phagen zu erkennen. Die mittleren Gene des Phagen codieren wiederum o®”! der seinerseits die Transkription der späten Gene fördert. Einige Bakterien, zu denen auch E. coli und Bacillus subtisis gehören, besitzen ebenfalls verschiedene o-Faktoren. Diese Enzymfaktoren kommen nicht notwendigerweise nacheinander zum Einsatz. Zum Beispiel kontrollieren o-Faktoren in E. coli, die sich vom primären o-Faktor unterscheiden (welcher auch 0° genannt wird, da er ein Molekulargewicht von 70 kD hat), die Transkription von koordiniert exprimierten Gengruppen mit speziellen Funktionen, deren Promotoren sich deutlich von denen unterscheiden, die von o’’ erkannt werden.

Abb. 26.6 RNA-Kettenverlängerung in 5'—3’-Richtung. Die Nucleotide werden durch einen nucleophilen Angriff der 3’-OH-Gruppe am anzufügenden Nucleosidtriphosphat an das 3’-Ende der wachsenden RNA-Kette geknüpft. Eine radioaktive Markierung an der y-Position eines NTPs (symbolisiert durch einen Stern) bleibt lediglich am ersten Nucleotid der RNA (dem 5’-Ende) erhalten. Die gleiche Markierung später eintretender Nucleotide geht während der Polymerisation als

C. _ Kettenverlängerung Da die RNA-Synthese - wie die DNA-Synthese - in 5’—3’-Richtung verläuft (Abb. 26.6), trägt das wachsende RNA-Molekül eine 5’-Triphosphatgruppe. Wie wir sehen werden, können reife RNA-Moleküle auch an einem Ende oder an beiden Enden chemisch modifiziert werden. N,

N,

N,

N,

N, +1

PP; verloren.

N;

OH

N,

OH

N. +1

OH

+

*ppp

p

pP‘

OH + *PPj

OH DKSan

OH

*ppp

*ppp

5' —>-

OH

3'-Wachstum

p \\

Dr

p

1016

Transkription und RNA-Prozessierung entstehende RNA

15%

(Se)

RNAPolymerase

Entspiralisierung

Abb. 26.7 Superspiralisierung der DNA während der Transkription. In dem Abschnitt, der gerade transkribiert wird,

ist die DNA-Doppelhelix um etwa eine Drehung entwunden,

um dem Antisense-DNA-Strang zu

ermöglichen, ein kurzes Segment einer doppelsträngigen DNA-RNA-Hybridhelix zu bilden. Wenn die RNA-Polymerase entlang des Matrizen-DNAStrangs (hier nach rechts) wandert, entwindet sich die DNA vor dem wachsenden 3’-Ende der RNA und nimmt danach wieder ihre normale Konformation ein. Dabei wird der neu synthetisierte RNAStrang vom Matrizenstrang abgestreift. Da die Enden der DNA, wie auch die RNA-Polymerase,

offenbar durch Anheftungen innerhalb der Zelle (schwarze Balken) vor einem Rotieren geschützt werden, wird die DNA vor der voranschreitenden

Transkriptionsblase überdreht und nach ihr entwunden (man stelle sich die Folgen vor, die sich ergeben würden, wenn

man den Finger in die

gewundenen DNA-Stränge dieses Modells stecken und nach rechts drücken würde). [Nach Futcher, B.,

Trends Genet. 4, 272 (1988).

DNA Antisense-Strang

Transkriptionsblase

Überspiralisierung —-

Ein Teil der doppelsträngigen DNA-Matrize öffnet sich für die RNA-Synthese. Dies ermöglicht, dass der Antisense-Strang in den komplementären RNA-Strang transkribiert werden kann. Die wachsende RNA-Kette bildet dabei vorübergehend ein kurzkettiges RNA-DNA-Doppelstranghybrid. Die „Blase“ der ungepaarten DNA im offenen Initiationskomplex wandert zusammen mit der RNAP an der DNA entlang (Abb. 26.7). Da die helicalen Windungen der DNA während der Transkription vorwärts geschoben werden, verwinden sie sich dadurch stärker (sie werden dabei positiv superspiralisiert), während die DNA hinter der Blase im gleichen Maße entwunden (negativ superspiralisiert) wird. Dieses Szenario wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Transkription von Plasmiden in E. coli die positive Superspiralisierung der Plasmide in Stämmen mit Mutationen der Gyrase induziert (diese können die positive Superspiralisierung nicht entspannen; Abschnitt 24.1D). Das gleiche gilt für die negative Superspiralisierung bei Topoisomerase-I-Mutanten (welche die negative Superspiralisierung nicht entspannen können). Eine ungewöhnliche Superhelixbildung in der transkribierten DNA führt zum Transkriptionsstopp. Man nimmt an, dass die Torsionsspannung in der DNA, die durch negative Superhelizität hinter der Transkriptionsblase verursacht wird, nötig ist, um den Transkriptionsprozess voranzutreiben, wohingegen zu viel dieser Spannung das Öffnen einer Transkriptionsblase und deren Aufrechterhaltung verhindert. Die Spannung, die sich in der DNA-Matrize aufbaut, ist anscheinend für eine ungewöhnliche Eigenschaft der RNAP verantwortlich: Sie entlässt regelmäßig die neu synthetisierte RNA nach der Polymerisierung von nur etwa 9 bis 11 Nucleotiden. Diesen Prozess nennt man abortive Initiation. Wenn die RNAP mit der Transkription beginnt, wird der Kontakt zum Promotor (der sich auf dem NichtMatrizenstrang der DNA befindet) zunächst aufrecht erhalten. In der Folge entsteht eine Konformationsspannung, wenn der Matrizenstrang durch das aktive Zentrum der RNAP gezogen wird. Damit die Transkription nicht stoppt, muss die größer werdende Transkriptionsblase innerhalb der RNAP untergebracht werden. Diesen Prozess nennt man Scrunching (von engl. to scrunch, knirschen). Bei erfolgreicher Initiation baut sich irgendwann genügend Spannung auf, um die RNAP vom Promotor abzulösen. Bei der abortiven Initiation wird die Konformationsspannung statt dessen so gelöst, indem das neu synthetisierte RNA-Fragment freisetzt wird. Dadurch kann sich die Transkriptionsblase zu ihrer normalen Größe entspannen. Die RNAP beginnt die Trankription dann wieder bei Position +1. Die RNA-Polymerase ist prozessiv

Sobald der offene Komplex gebildet worden ist, schreitet die Transkription voran, ohne dass das Enzym von der Matrize abdissoziiert. Die Prozessivität wird ohne eine ersichtliche klammerartige Struktur erreicht (wie z.B. die ßKlammer der E. coli-DNA-Polymerase III; Abb. 25.16), obwohl die RNAP scheinbar selbst als bewegliche Klammer fungiert, indem sie fest aber flexibel an den DNA-RNA-Komplex bindet. In Experimenten, in denen die RNAP immobilisiert

wurde und ein magnetisches Kügelchen an die DNA geheftet wurde, konnte man 180 Kreisläufe (das bedeutet fast zweitausend Basenpaare bei 10,4 bp pro

RNA-Polymerasse

1017

Kollisionen zwischen der DNA-Polymerase und der RNA-Polymerase In schnell proliferierenden Bakterienzellen kommt es wahrscheinlich sogar zur DNA-Synthese, wenn die Gene gerade transkribiert werden. Die DNA-Replikationsmaschinerie bewegt sich mit einer Geschwindigkeit entlang des zirkulären

derweise veranlasst dies die RNA-Polymerase, ihren Matrizenstrang zu wechseln. Die wachsende RNA-Kette dissoziiert von dem ursprünglichen DNA-Matrizenstrang ab und hybri-

Chromosoms,

bevor die RNA-Verlängerung weitergeht. Frontale Kollisionen sind ungünstig für die Zelle, weil sich (1) die Replikation verlangsamt, wenn die DNA-Polymerase anhält und (2) die Dissoziation der RNA-Polymerase während des Sprungs von einem Matrizenstrang zum anderen den Transkriptionsprozess beenden kann. Tatsächlich sind in vielen Bakterien- und Phagengenomen die am häufigsten transkribierten Gene so orientiert, dass sich die Replikationsund Transkriptionskomplexe in dieselbe Richtung bewegen. Es bleibt zu klären, ob eukaryotische Genome eine vergleichbare Anordnung besitzen, da sie viele Replikationsursprünge und Gene enthalten, die weit größer als prokaryotische Gene sind.

die um

ein Vielfaches

höher ist als die Ge-

schwindigkeit der Transkriptionsmaschinerie. Kollisionen zwischen der DNA-Polymerase und der RNA-Polymerase scheinen unvermeidbar zu sein. Was geschieht, wenn diese beiden Enzymkomplexe kollidieren? Durch Untersuchungen an in vitro-Modellsystemen zeigte Bruce Alberts, dass, wenn sich beide Enzyme in dieselbe Richtung bewegen, die Replikationsgabel die RNA-Polymerase passiert, ohne sie zu verdrängen und eine umgehende Wiederaufnahme der RNASynthese gewährleistet. Wenn die Replikationsgabel frontal mit dem Transkriptionskomplex kollidiert, hält die Replikationsgabel kurz an, ehe sie sich hinter der RNA-Polymerase weiterbewegt. Überraschen-

disiert

mit

dem

Runde) beobachten, bevor die Polymerase sich löste. Solche Prozessivität ist notwendig, da Gene oft Tausende (in Eukaryoten manchmal Millionen) von Nucleotiden lang sind. Die enge Verbindung zwischen RNAP und DNA und ihren multiplen Verbindungsstellen könnten erklären, warum ein Transkriptionskomplex auch dann nicht komplett von einer DNA-Matrize abdissoziiert, wenn die Transkription durch die DNA-Replikationsmaschinerie unterbrochen wird, die entlang desselben DNA-Strangs fortschreitet (siehe Exkurs 26.1). Die Transkription verläuft schnell

Die Transkriptionsgeschwindigkeit in E. coli beträgt in vivo 20 bis 50 Nucleotide pro Sekunde bei 37°C (sie ist aber um einige Faktoren niedriger als die DNAReplikationsgeschwindigkeit; Abschnitt 25.2C). Die Fehlerrate der RNA-Synthese beläuft sich auf eine falsch eingebaute Base pro ca. 10° transkribierte Nucleotide. Diese Fehlerhäufigkeit, die um den Faktor 10* bis 10° höher liegt als die der DNA-Synthese, ist, wegen der wiederholten Transkription der meisten Gene akzeptabel. Darüber hinaus enthält der genetische Code zahlreiche Synonyme (Abschnitt 27.1C) und die Substitution von Aminosäuren ist oftmals funktionell ohne Konsequenzen. Sobald ein RNAP-Molekül die Transkription begonnen und sich vom Promotor wegbewegt hat, kann eine andere RNAP in gleicher Weise folgen. Die Synthese von RNA, die in großen Mengen benötigt wird, wie z.B. rRNA, wird so

oft es sterisch möglich ist initiiert - etwa einmal pro Sekunde. Dies verursacht das pfeilspitzenähnliche Erscheinungsbild einer transkribierten DNA (Abb. 26.8). Die mRNAs,

welche

Proteine codieren, werden normalerweise

nicht in solch

rascher Folge synthetisiert. Außerdem gibt es eine enorme Variation der Mengen, in denen verschiedene Polypeptide synthetisiert werden. So kann z.B. eine E. coli-Zelle 10.000 Kopien eines ribosomalen Proteins enthalten, während ein regulatorisches Protein nur in wenigen Kopien vorhanden sein kann. Viele Enzyme, besonders diejenigen, die in die elementaren „Haushaltsfunktionen“ der Zelle einbezogen sind, werden mit einer mehr oder weniger konstanten Geschwindigkeit synthetisiert und werden auch als konstitutive Enzyme bezeichnet. Andere Enzyme, die man induzierbare Enzyme nennt, werden mit

neu

synthetisierten

DNA-Tochterstrang,

1018

Transkription und RNA-Prozessierung BEZPRU

Abb. 26.8 Elektronenmikroskopische Aufnahme dreier benachbarter ribosomaler Gene während der Transkription. Die Pfeilspitzen-Struktur ergibt sich aus den zunehmenden Längen der

_“RNA-Fasern

4

naszierenden RNA-Ketten, da die

Initiationsstelle

RNA-Polymerasemoleküle, die sie synthetisieren, sich vom

Initiations-

punkt auf der DNA zur folgenden Terminationstelle bewegen. [Mit freundlicher Genehmigung von Ulrich Scheer, Univerität Würzburg.]

einer Geschwindigkeit synthetisiert, die mit den Lebensbedingungen der Zelle variiert. Die Regulation der Genexpression stützt sich, wie wir in Abschnitt 28.2 sehen werden, zu einem großen Anteil auf Mechanismen, welche die Ge-

schwindigkeit der Transkription steuern. Die Produkte der Transkription variieren auch in ihrer Stabilität. Ribosomale RNA wird viel langsamer umgesetzt als mRNA, die in Prokaryoten schnell synthetisiert und schnell abgebaut wird (manchmal so schnell, dass das 5’-Ende einer mRNA abgebaut wird, bevor das 3’-Ende synthetisiert worden ist).

D.

Kettentermination

Elektronenmikroskopische Aufnahmen wie die in Abbildung 26.8 legen nahe, dass die DNA spezifische Stellen enthält, an denen die Transkription beendet wird. Die Sequenzen für die Transkriptionstermination einiger E.coli-Gene haben zwei gemeinsame Merkmale (Abb. 26.9a): 1. Eine Serie von 4 bis 10 aufeinander folgenden A - T-Basenpaaren, wobei die A-Moleküle auf dem Matrizenstrang lokalisiert sind. Die transkribierte RNA wird innerhalb oder kurz nach dieser Sequenz abgebrochen. 2. Eine G- und C-reiche Region mit einer palindromischen Sequenz, die der A . T-Sequenz unmittelbar vorausgeht.

Abb. 26.9

Hypothetische starke (effiziente)

Terminationssequenz in E. coli. Die Basensequenz wurde von den Sequenzen

einiger Transkripte abgeleitet. (a) DNA zusammen mit ihrer entsprechenden RNA. Die A - T- und G - C-reichen Sequenzen sind blau bzw. rot dargestellt. Die zweizählige Symmetrieachse (grünes Symbol) bezieht sich auf die flankierenden schattierten Segmente, die gegenläufige Wiederholungen darstellen. (b) Haarnadelstruktur der RNA und Poly(U)-Schwanz, der die Termination der

Das RNA-Transkript- dieser Region kann daher eine selbstkomplementäre Haarnadelstruktur bilden, die an ihrem Ende einige U-Reste trägt (Abb. 26.95). Die strukturelle Stabilität eines RNA-Transkripts an seiner GC-reichen Haarnadelstruktur, der Terminationssequenz, sowie die schwache Basenpaarung seines Oligo(U)-Schwanzes mit der Matrizen-DNA, scheinen wichtige Faktoren zu sein, um die korrekte Kettentermination sicherzustellen. Die Bildung einer GCreichen Haarnadelstruktur veranlasst die RNAP, für einige Sekunden an der Terminationsstelle anzuhalten. Dies induziert wahrscheinlich eine Konformationsänderung in der RNAP, die es dem Nicht-Matrizen-DNA-Strang ermöglicht, den schwach gebundenen Oligo(U)-Schwanz vom Matrizenstrang zu verdrängen und dadurch die Transkription zu beenden. Trotzdem zeigen Experimente von Michael Chamberlin, dass die Funktionen der Haarnadelstruktur der RNA-Terminationssequenz und des U-reichen 3'-Schwanzes nicht unabhängig von ihren stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Regionen sind. In der Tat können Terminationssequenzen, denen das

Transkription in Gang setzt. [Nach Pribnow, D. in

Goldberger, R.F. (Hrsg.) Biological Regulation and Development, Bd. 1, S. 253, Plenum Press (1979).]

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Ss:

RNA-Polymerasse

1019

U-reiche Segment fehlt, hocheffizient sein, wenn sie an eine entsprechende Sequenz geknüpft werden, die unmittelbar stromabwärts von der Terminations_ stelle liegt. Die Effizienz der Termination variiert auch mit der Konzentration der Nucleosidtriphosphate, mit dem Grad der Superspiralisierung der DNAMatrize, mit den Änderungen der Salzkonzentration und mit der Terminationssequenz. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Termination ein komplexer, vielstufiger Prozess ist. Für die Termination wird oft ein Rho-Faktor benötigt Die oben beschriebenen Terminationssequenzen induzieren die spontane Termination der Transkription. Anderen Terminationsstellen fehlt jede deutliche Ähnlichkeit und sie sind nicht in der Lage Haarnadelstrukturen zu bilden. Um die Transkription zu beenden, benötigen sie ein Protein, das als Rho-Faktor bezeichnet wird. Dieser ist ein Hexamer aus identischen Untereinheiten von je 419 Aminosäuren, verstärkt die Terminationseffizienz von spontan endenden Transkripten und induziert die Termination von nicht spontan endenden Transkripten. Aus einigen wichtigen Beobachtungen konnte ein Modell der Rho-abhängigen Termination abgeleitet werden: 1. Der Rho-Faktor ist ein Enzym, das die Entwindung der RNA-DNA- und der RNA-RNA-Doppelhelices katalysiert. Dieser Prozess wird durch die Hydrolyse von ATP zu ADP + P; getrieben. 2. Genetische Manipulationen zeigen, dass die Rho-abhängige Termination stromaufwärts von der Terminationsstelle eine spezifische Erkennungssequenz auf der naszierenden (gerade entstehenden) RNA benötigt.

Diese Beobachtungen legen nahe, dass der Rho-Faktor an die Erkennungssequenz der RNA bindet und dann in 5’—3’-Richtung entlang der RNA wandert, bis er auf eine RNAP trifft, die an der Terminationsstelle angehalten hat (ohne deren Anhalten wäre Rho wahrscheinlich nicht in der Lage, die RNAP einzuholen). Dort entwindet Rho die RNA-DNA-Doppelhelix an der Transkriptionsblase und setzt dadurch das RNA-Transkript frei. Transkripte, die mit Hilfe von Rho fertiggestellt wurden, tragen 3'-Enden, deren Länge typischerweise über eine Spanne von ca. 50 Nucleotiden variiert. Dies deutet darauf hin, dass Rho die RNA nach und nach von der Matrizen-DNA verdrängt und sie nicht an einem bestimmten Punkt freisetzt. Jede Rho-Untereinheit besteht aus zwei Domänen: Eine N-terminale Domäne,

die einzelsträngige Polynucleotide bindet, und eine C-terminale Domäne, die homolog zu den a- und ß-Untereinheiten der F,-ATPase (Abschnitt 18.3B) ist und ein NTP bindet. Die Röntgenstruktur von Rho im Komplex mit AMPPNP und einer 8 Nucleotide langen RNA (Abb. 26.10a) zeigt, dass Rho eine hexamere Helix ausbildet, mit einem Durchmesser von 12 nm und einer etwa 3 nm großen zentralen Öffnung. Die erste und die sechste Untereinheit sind durch einen 1,2 nm breiten Spalt und einen Abstand von 4,5 nm entlang der Helixachse getrennt. Die RNA bindet entlang des Helixinneren an die sogenannte primäre RNA-Bindungsstelle der N-terminalen Domäne und an die sogenannte sekundäre RNA-Bindungsstelle der C-terminalen Domäne. Diese Röntgenstruktur stellt einen offenen Zustand dar, der mRNA zu binden vermag, indem diese durch den Spalt in den zentralen Hohlraum eingeschleust wird. In der Röntgenstruktur von Rho im Komplex mit einer 30 Nucleotide langen RNA (Abb. 26.105) bilden die sechs Untereinheiten des Proteins dagegen einen geschlossenen Ring, in dem aufeinander folgende Untereinheiten verschiedene Konformationen besitzen, d.h. das Protein bildet jetzt ein aus Dimeren bestehendes Trimer.

Dies legt nahe, dass Rho entlang der gebundenen RNA in 5° > 3'-Richtung wandert. Diese Bewegung wird vermutlich durch ATP-Hydrolyse-Cyclen und damit einher gehende Konformationsänderungen in den einzelnen Untereinheiten angetrieben.

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1" Vergleichen Sie DNA- und

RNA-Polymerasen hinsichtlich ihrer Struktur, Substrate, Wirkungsmechanismen, Fehler-

rate und Matrizenspezifität. Warum ist es schwer, den

Ausdruck „Gen“ genau zu definieren?

. Worin liegt die Bedeutung der unterschiedlichen DNABindungseigenschaften des Kern- und Holoenzyms der prokaryotischen RNA-Polymerase? Erklären Sie, warum ein einziges Gen schnell viele Kopien seines Genprodukts (RNA oder Protein) erzeugen kann. Beschreiben Sie, wie die Transkription mit und ohne Rho-Faktor beendet wird.

1020

Transkription und RNA-Prozessierung

(@)

Abb. 26.10 Röntgenstruktur des Rho-Faktors von E.coli im Komplex mit RNA. (a) Komplex mit einer 8 nt RNA, (CU).. Das semitransparente Oberflächendiagramm des Rho-Hexamers mit seinen Untereinheiten, die abwechselnd gelb und türkis gefärbt sind, ist von der

Spitze der unterlegscheibenförmigen Helix aus gesehen. Die primären und sekundären RNA-Bindungsstellen sind magenta und grün. Die RNA, die als Kalottenmodell gezeichnet ist und entsprechend ihrer Atomtypen gefärbt ist (C grün, N blau, O rot und P orange), ist in der Röntgenstruktur nur teilweise sichtbar. Sie bindet an die primären RNABindungsstellen. (b) Komplex mit einer 30 nt RNA, (CU)}5;, dargestellt und gefärbt wie in Teil a. In diesem Komplex bilden die sechs Rho-Untereinheiten einen geschlossenen Ring, in dem die Untereinheiten sich in ihren Konformationen abwechseln. [Nach einer Röntgenstruktur von Emmanuel

Skordalakes und James Berger,

University of California at Berkeley. PDBids IPVO

und 2HT1]

2

Transkription in Eukaryoten

Obwohl die grundlegenden Prinzipien der Transkription in Prokaryoten und Eukaryoten gleich sind, unterscheidet sich die eukaryotische Transkription dadurch, dass mehrere RNAPs und relativ komplizierte Kontrollsequenzen einbezogen sind. Die eukaryotische Transkriptionsmaschinerie ist also komplizierter und benötigt mehr als 100 Polypeptide, die Aggregate mit molekularen Massen von mehreren Millionen Dalton bilden, um die Kontrollsequenzen zu erkennen und die Transkription einzuleiten.

A.

Eukaryotische RNA-Polymerasen

In eukaryotischen Zellkernen kommen drei verschiedene Arten an RNA-Polymerasen vor, die sich hinsichtlich der RNAs unterscheiden, die sie synthetisie-

ren: 1. Die RNA-Polymerase I (RNAP I), die in den Nucleoli (dunkel gefärbte Kernkörperchen, in denen die Ribosomen assembliert werden; Abb. 1.8) lokalisiert ist und die Vorläufer der meisten rRNAs synthetisiert. 2. Die RNA-Polymerase II (RNAP II), die im Nucleoplasma vorkommt und mRNA-Vorläufer synthetisiert. 3. Die RNA-Polymerase III (RNAP III), welche ebenfalls im Nucleoplasma vorkommt und die Vorläufer der 5S-rRNA, der tRNAs und einer Vielzahl anderer nucleärer und cytosolischer RNAs synthetisiert.

Zusätzlich zu den nucleären Enzymen enthalten eukaryotische Zellen verschiedene RNAPSs in den Mitochondrien und (bei Pflanzen) in den Chloroplasten. Die essentielle Funktion der RNAPS in allen Zellen macht diese Enyzme zu gut geeigneten Angriffspunkten für Antibiotika und andere Wirkstoffe (Exkurs 26.2). Eukaryotische RNAPs, deren molekulare Masse bis zu 600 kD betragen kann, haben eine charakteristische Untereinheitenzusammensetzung, die eine bemerkenswerte Komplexität aufweist. Jede eukaryotische RNAP enthält zwei nicht identische „große“ (> 120 kD) Untereinheiten, die homolog zu den ß- und ß'Untereinheiten der Prokaryoten sind. Weiter enthalten sie bis zu 13 verschie-

Transkription in Eukaryoten

dene „kleine“ ( A>

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P13/P14

1048

Transkription und RNA-Prozessierung

Alfonso Mondragön bestimmt wurde, besteht hauptsächlich aus gestapelten helicalen Stamm-Strukturen mit einer kompakten Gesamtstruktur, wie sie typisch

Verständnisfragen zu Abschnitt 3

für Proteinenzyme ist. Biochemische Studien und Modelle weisen darauf hin,

dass das aktive Zentrum der RNase in einer Spalte zwischen der P2/P3-Region (türkis in Abb. 26.32) und der P1/P4/P5-Region (dunkelblau in Abb. 26.32) liegt. Dieser Teil der Struktur, der P1 bis P4, P9 bis P11, J11-12 und J12-11 umspannt, kommt in allen bekannten Formen der RNase P vor und bildet die universale minimale Konsensusstruktur. Diese Struktur geht vermutlich auf die Urform der RNase P zurück.

1. Fassen Sie posttranskriptionale Prozessierungen der eukaryotischen mRNA zusammen 2. Worin liegt der Vorteil, die RNA-Prozessierung zu beginnen, bevor die Transkription abgeschlossen ist? 3. Diskutieren Sie die Vorteile hinsichtlich Proteinstruktur und -evolution, die sich aus alternativrem mRNA-Spleißen ergeben. 4. Beschreiben Sie die Modifikationen, die während der

Viele eukaryotische prä-tRNAs enthalten Introns

Eukaryotische Genome enthalten einige Hundert bis einige Tausend tRNAGene. Häufig enthalten eukaryotische primäre tRNA-Transkripte, z.B. das für Hefe-tRNA”" (Abb. 26.33), kleine Introns sowie zusätzliche Nucleotide am 5'und 3’-Ende. Die Prozessierung der tRNA schließt deshalb die Entfernung dieser zusätzlichen Sequenzen mit ein. Das 3’-terminale CCA-Ende der tRNAs, die Stelle, an welche die Aminosäuren gebunden werden (Abschnitt 27.2B), fehlt dem unreifen tRNA-Transkript. Dieses Trinucleotid wird durch das Enzym tRNA-Nucleotidyltransferase angehängt, das schrittweise zwei C-Reste und einen A-Rest an die tRNA addiert. Bei diesem Vorgang werden CTP und ATP als Substrate verwendet (primäre tRNA-Transkripte aus Prokaryoten besitzen be-

Prozessierung von prokaryotischer und eukaryotischer rRNA und tRNA auftreten.

reits eine CCA-Sequenz).

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Prozessierung

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Primäres Transkript der {RNA’’” (108 Nucleotide)

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(78 Nucleotide) Abb: 26.33 Posttranskriptionale Prozessierung von Hefe-tRNA”. Eine 14 nt lange Sequenz (rot) sowie ein 19 nt langes 5’-terminales Fragment (grün) werden aus dem primären Transkript herausgeschnitten. Ein CCA-Ende (blau) wird enzymatisch an das 3’-Ende angehängt. Zudem werden einige Nucleotide modifiziert, um die reife tRNA zu bilden. (m’G, N?-Methylguanosin; D, Dihydrouridin; Gm, 2’-Methylg uanosin; m3G, N?,N?-Dimethylguanosin; y), Pseudouridin: i°A, N°-Isopentenyladenos in; m’C, 5-Methyleytosin; m'A, 1-Methyladenosin; siehe Abb. 27.4). Das Anticodon ist schattiert

dargestellt. [Nach DeRobertis, E.M. und Olsen, M.V,, Nature 278, 142 (1989) .]

Wichtige Begriffe

Zusammenfassung

Ua

nen,

MR

Die RNA-Polymerase synthetisiert eine Polynucleotidkette aus Ribonucleosidtriphosphaten, wobei ein DNA-Einzelstrang (der Antisense- oder nicht codierende Strang) als Matrize dient. Der o-Faktor des RNA-Polymerase-Holoenzyms aus E.coli erkennt und bindet eine Promotorsequenz, um das Enzym für die Initiation der

Transkription zu positionieren. Zur Synthese der RNA ist die Bildung eines offenen Komplexes erforderlich. Die Transkriptionsblase wandert während der Verlängerung der RNA-Kette durch die RNA-Polymerase entlang der DNA. Die RNA-Synthese in E.coli wird auf Grund spezifischer Sekundärstrukturelemente im Transkript beendet. Dies erfordert in einigen Fällen die Anwesenheit eines Rho-Faktors. Eukaryoten besitzen drei Klassen von RNA-Polymerasen, die jeweils unterschiedliche RNA-Typen synthetisieren. Eukaryotische Promotoren unterscheiden sich hinsichtlich der Position des Transkriptionsstartpunkts und können aus mehreren stromaufwärts gelegenen Sequenzen bestehen. Verstärker- und Dämpfersequenzen bilden die Bindungsstellen für regulatorische Proteine und fungieren als Aktivatoren und Repressoren der Transkription. Die basale Transkription eukaryotischer Gene erfordert sechs allgemeine Transkriptionsfaktoren, einschließlich TBP, die einen Präinitiationskomplex mit RNA-Polymerase am Promotor bilden. Einige dieser Proteine verbleiben an der Polymerase, wenn sie phosphoryliert wird und in den Elongationsmodus wechselt. Die primären Transkripte der meisten eukaryotischen Strukturgene werden posttranskriptional durch Anfügen einer 5’-Kappe und eines 3’-Poly(A)Schwanzes modifiziert. mRNAs, die Introns enthalten, werden gespleißt, wobei die Introns herausgeschnitten und die flankierenden Exons über zwei Umesterungsreaktionen miteinander verbunden werden, die von einem snRNA enthaltenden Spleißosom gesteuert werden. Die Prozessierung der prä-RNAs beinhaltet deren Spaltung und die snoRNAunterstützte Methylierung im Kern. Einige eukaryotische rRNA-Transkripte unterliegen einem Spleifvorgang, der vom Intron selbst katalysiert wird. 10. tRNA-Transkripte werden durch die Addition, die Entfernung und die Modifikation von Nucleotiden prozessiert.

Wichtige Begriffe mRNA rRNA tRNA RNAP Holoenzym o-Faktor Antisense-Strang nicht codierender Strang Sense-Strang codierender Strang Strukturgen Operon polycistronische RNA Cistron monocistronische RNA Promotor

Pribnow-Box Footprinting (Fußabdruck) offener Komplex konstitutives Enzym induzierbares Enzym Rho-Faktor Nucleolus TATA-Box CCAAT-Box Enhancer allgemeiner Transkriptionsfaktor Präinitiationskomplex AUEE TAF primäres Transkript posttranskriptionale Modifikation

Kappenstruktur Poly(A)-Schwanz hnRNA Intron Exon

Spleißen snRNA snRNP

Spleißosom alternatives Spleißen Edierung von RNA gRNA Gruppe-I-Intron Gruppe-II-Intron

1049

1050

Transkription und RNA-Prozessierung

Aufgaben 6. Ein eukaryotisches Ribosom enthält vier verschiedene

1. Das antibiotisch wirksame Cordycepin inhibiert die bakterielle RNA-Synthese.

rRNA-Moleküle und ca. 82 unterschiedliche Proteine.

Warum enthält eine Zelle viel mehr Kopien der

NH,

ıRNA-Gene als Gene für ribosomale Proteine?

Cordycepin

(a) Von welchem Nucleosid lässt sich Cordycepin ableiten? (b) Erklären Sie den Wirkungsmechanismus von Cordycepin. 2. Finden Sie die -10-Region und die -35-Region sowie das Startnucleotid des Sense-Strangs im unten abgebildeten tRNA””-Promotor aus E. coli: 5’ CAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTCCCGATA 3’ GTTGCATTGTGAAATGTCGCCGCGCAGTAAACTATACTACGOGGGGCEGAAGGGCTAT

3 5

3. Entwerfen Sie eine Sonde aus sechs Nucleotiden, die mit den meisten Promotoren von E. coli-Genen hybridisieren würde. 4. Erklären Sie, warum das Einfügen einer 5 bp langen DNA an Position -50 eines eukaryotischen Gens die Geschwindigkeit der Transkriptionsinitiation der RNA-Polymerase II stärker verringert als das Einfügen von 10 bp an derselben Stelle. 5. Warum nimmt in der Regel die Promotoreffizienz mit der Anzahl der G - C-Basenpaare in der -10-Region eines prokaryotischen Gens ab?

7. Schlagen Sie ein Affinitätschromatographiesystem vor, bei dem Oligonucleotide verwendet werden, um reife mRNA aus eukaryotischen Zelllysaten zu isolieren. 8. Eine eukaryotische Zelle, die die Transkription und RNA-Prozessierung ausführt, wird mit °”P-markiertem ATP inkubiert. Wo wird das radioaktive Isotop in der reifen mRNA auftauchen, wenn das ATP an (a) der a-Position, (b) der ß-Position und (c) der y-Position markiert wird? 9. Vergleichen Sie die DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Poly(A)-Polymerase und die tRNA-Nucleotidyltransferase im Hinblick auf das Erfordernis eines Primers, einer Matrize und Substraten. 10. Erklären Sie, warum das aktive Zentrum der Poly(A)Polymerase viel enger ist als dasjenige der DNA- und RNA-Polymerase. 11. Erklären Sie, warum die O?’-Methylierung von Riboseresten die rRNA vor dem Abbau durch RNasen schützt. 12. Wäre zu erwarten, dass die durch Spleißosomen katalysierte Entfernung eines Introns in einem hochreinen in-vitro-System oder in vivo reversibel ist? Geben Sie eine Erklärung hierfür. 13. Die Introns in eukaryotischen Genen, die für Proteine codieren, können recht groß sein, aber nahezu keines ist kleiner als etwa 65 bp. Was ist der Grund für diese Mindestgröße eines Introns? 14. Die Infektion mit bestimmten Viren inhibiert die Prozessierung der snRNA innerhalb eukaryotischer Zellen. Erklären Sie, warum dies die Expression viraler Gene in der Wirtszelle begünstigt.

Literatur RNA-Polymerasen

RNA-Prozessierung

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and protein worlds, Trends Biochem. Sci. 31, 333-341 (2006). Maniatis, T. und Reed, R., An extensive network of coupling among gene expression machines, Nature 416, 499-506 (2002). [Beschreibt wieso eine effiziente Genexpression die Kopplung zwischen Transkription und RNA-Prozessierung erfordert.) Proudfoot, N.]., Furger, A. und Dye, M.]., Integrating mRNA processing with transcription, Cell 108, 501-512 (2002). Stark, H. und Lührmann, R., Cryo-electron microscopy of spliceosomal components, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 435-457 (2006). Vincens, Q. und Cech, T.R., Atomic level architecture of group I introns revealed, Trends Biochem. Sci. 31, 41-51 (2005).

Ähnlich einer Druckerpresse, die von einer Druckseite zahllose Kopien herstellen kann, stellt das aus RNA und Protein

bestehende Ribosom von einer mRNA-Vorlage eine große Zahl an Proteinmolekülen her. [Erich Lessing/Art Resource]

Proteinbiosynthese EEE

ra

Te

EEE

ET

EST EEE

EN

TARNEET

BIENEN

Proteinbiosynthese

Elektronisches Zusatzmaterial

e Der genetische Code

(in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 26 Guided Exploration 27 Guided Exploration 28 Guided Exploration 29 Interactive Interactive Kinemage Kinemage Kinemage

e Transfer-RNA und ihre

Aminoacylierung e Ribosomen e Translation e Posttranslationale Modifikation (PTM)

Exercise 53 Exercise 54 21-1 21-2 22

Case Study 29 EEE REEL IOEEE SEN PETE

EEZEZENETN,

Wie wird die von der DNA codierte Information decodiert? Im vorhergehenden Kapitel haben wir gesehen, wie die Basensequenz der DNA in die RNA-Sequenz transkribiert wird. In diesem Kapitel werden wir den restlichen Teil des Decodierungsprozesses betrachten, indem wir untersuchen, wie die Basensequenzen der RNAs in die Aminosäuresequenzen der Proteine translatiert werden. Dieser zweite Teil des zentralen Dogmas der Molekularbiologie (DNA—RNA—Protein) hat einiges mit den anderen Hauptvorgängen im Nucleinsäurestoffwechsel, der DNA-Replikation und der Transkription gemeinsam. Alle drei Prozesse werden durch große, kompliziert aufgebaute, proteinenthaltende Maschinerien ausgeführt, deren genaues Funktionieren von einer Vielzahl spezifischer und unspezifischer Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkungen abhängt. Oft werden auch Hilfsfaktoren für die Initiations-, Elongations- und Terminationsphasen dieser Abläufe benötigt. Darüber hinaus muss die Translation — wie die Replikation und die Transkription - mit großer Genauigkeit ausgeführt werden. Auch wenn die Translation unter Basenpaarung zwischen komplementären Nucleotiden abläuft, so sind es letztendlich doch die Aminosäuren

und nicht die Nucleotide,

die miteinander verknüpft werden, um ein polymeres Produkt zu bilden. Dieser Prozess ist, wie die Replikation und die Transkription, endergonisch und erfordert die Spaltung von „hochenergetischen“ Phosphoanhydridbindungen.

Um die Translation zu verstehen, ist nicht nur ein Wissen über die Makromoleküle erforderlich, die an der Polypeptidbiosynthese beteiligt sind, sondern auch eine Vorstellung über den Mechanismus, der zu einer Kette von Aminosäuren führt, die in exakt der Reihenfolge verknüpft sind, wie sie durch die entsprechende mRNA vorgegeben wird. Dementsprechend untersuchen wir zu Beginn dieses Kapitels den genetischen Code, den Zusammenhang zwischen Nucleinsäuresequenzen und Polypeptidsequenzen. Danach betrachten wir der Reihe nach die Strukturen und Eigenschaften von tRNAs und Ribosomen. Außerdem Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

1054

Proteinbiosynthese

werden wir beschreiben, wie die Translationsmaschinerie als koordinierte Einheit arbeitet. Schließlich werfen wir einen Blick auf einige nach der Translation stattfindende Teilschritte der Proteinbiosynthese.

1

Der genetische Code

Es ist eines der faszinierendsten Rätsel der Molekularbiologie, wie eine Nucleotidsequenz, die aus nur vier verschiedenen Nucleotiden aufgebaut ist, eine Sequenz aus bis zu 20 verschiedenen Aminosäuren in einer Polypeptidkette spezi-

fizieren kann. Offensichtlich ist eine 1:1-Beziehung zwischen Nucleotiden und Aminosäuren nicht möglich. Um eine einzige Aminosäure zu codieren, ist eine Gruppe aus mehreren Basen notwendig, die man als Codon bezeichnet. Ein Triplett-Code, der eine Aminosäure mit 3 Basen pro Codon codiert, ist mehr als ausreichend, um alle Aminosäuren zu spezifizieren, denn er verfügt über 4 = 64 verschiedene Basentripletts. Ein Dublett aus 2 Basen pro Codon (was zu 4 = 16 möglichen Dubletts führen würde) wäre dagegen nicht ausreichend. Der Triplett-Code erlaubt, dass viele Aminosäuren durch mehr als ein Codon spezifiziert werden; man sagt - in Anlehnung an einen Begriff aus der Mathematik er sei degeneriert. Wie kann der Apparat, der die Polypeptide synthetisiert, die kontinuierliche DNA-Basensequenz in Codons einteilen? Zum Beispiel könnte der Code überlappend sein, d.h. in der Sequenz

ABCDEFGHI]] : könnte ABC die erste Aminosäure codieren, BCD eine zweite und CDE eine dritte etc. Alternativ könnte der Code nicht überlappend sein, so dass ABC eine Aminosäure spezifiziert, DEF eine zweite und GHI eine dritte etc. Tatsächlich handelt es sich beim genetischen Code um einen nicht überlappenden, degenerierten Triplett-Code. Eine Vielzahl eleganter Experimente, von denen einige im Folgenden beschrieben werden, haben Aufschluss über die Natur des genetischen Codes gegeben.

A.

Codons sind Tripletts, die sequentiell gelesen werden

Durch genetische Experimente mit dem Bakteriophagen T4 fanden Francis Crick und Sydney Brenner heraus, dass eine Mutation, die durch die Deletion eines einzigen Nucleotids entstand, die Funktion eines bestimmten Gens aufheben kann. Eine zweite Mutation, bei der ein Nucleotid in eine andere aber nahegelegene Position eingefügt wurde, konnte die Funktion des Gens wiederherstellen. Bei diesen zwei Mutationen spricht man von gegenseitigen Supressoren, d.h. die jeweiligen Mutationen heben sich gegenseitig auf. Crick und Brenner folgerten, basierend auf diesen Experimenten, dass der genetische Code sequentiell von einem festen Startpunkt im Gen ausgehend abgelesen wird. Die Insertion oder Deletion eines Nucleotids verschiebt das Leseraster, in dem die nachfolgenden Nucleotide als Codons abgelesen werden. Insertionen und Deletionen werden deshalb auch als Rasterschub-Mutanten (engl.: frameshift mutations) bezeichnet. Durch weitere Experimente fanden Crick und Brenner heraus, dass zwei nahe

beieinander gelegene Deletionen oder zwei nahe beieinander gelegene Insertionen dagegen nicht suppressiv aufeinander wirkten (die Genfunktion nicht wiederherstellten). Bei drei nahe beieinander gelegenen Deletionen oder Insertionen war dies allerdings möglich. Diese Beobachtungen waren ein deutliches Indiz dafür, dass der genetische Code ein Triplett-Code ist.

Der genetische Code

1055

Die vorausgegangenen Prinzipien werden durch das folgende analoge Beispiel illustriert. Betrachten Sie einen Satz (Gen) bei dem jedes Wort (Codon) aus drei Buchstaben (Basen) besteht: DIE

KUH

KAM

AUF

DAS

EIS

Dabei haben die Abstände zwischen den Wörtern keine physikalische Relevanz, sie sind nur da, um das Leseraster zu verdeutlichen. Die Deletion des vierten Buchstabens verändert den Satz auf Grund einer Verschiebung des Leserasters wie folgt: DIE

UHK

AMA

UFD

ASE

IS

Damit sind alle Wörter nach dem Ort der Deletion unverständlich (codieren die falschen Aminosäuren). Die Insertion eines beliebigen Buchstabens in der neunten Position, in diesem Fall X, DIE

UHK

AMX

AUF

DAS

EIS

führt wieder zum ursprünglichen Leseraster zurück. Folglich sind nur die Wörter zwischen den zwei ausgetauschten Basen (Mutationen) verändert. Wie in diesem Beispiel kann solch ein Satz insbesondere dann verständlich bleiben (das Gen kann ein funktionelles Protein codieren), wenn die Änderungen nahe beieinander liegen. Zwei Deletionen oder zwei Insertionen - egal wie nahe sie zusammen liegen — können sich nicht supprimieren, sondern verschieben in jedem Fall das Leseraster. Drei Insertionen, z.B. X, Yund Z in den Positionen 5, 8 und 12 verändern den Satz zu: DIE

KXU

HYK

AMZ

AUF

DAS

EIS

Dies führt nach der dritten Insertion wieder zum ursprünglichen Leseraster zurück. Dasselbe würde für drei Deletionen gelten. Wie zuvor würde die Aussage des Satzes nahezu erhalten bleiben, falls alle drei Veränderungen nahe beieinander liegen. Der genetische Code besitzt — wie dieses textliche Analogon - keine Interpunktion, um das Leseraster anzuzeigen. Die Nucleotidsequenz wird stattdessen Triplett für Triplett sequentiell abgelesen. Da eine Nucleotidsequenz drei Leseraster besitzt, ist es möglich, dass eine Polynucleotidkette - zumindest prinzipiell - zwei oder sogar drei verschiedene Polypeptide codiert. Einige Bakteriophagen mit einzelsträngiger DNA (die vermutlich einen maximalen Nutzen aus ihrem kleinen Genom ziehen müssen) enthalten in der Tat sich komplett überlappende Gene, die unterschiedliche Leseraster besitzen. Eine ähnliche Codierungsweise zeigen Bakterien, bei denen die ribosomale Initiationssequenz eines Gens in einer polycistronischen mRNA oftmals mit dem Ende des vorhergehenden Gens überlappt.

B. Um

es

N

R- ®“

Aminosäure-

Rest

@=—®

Die Entschlüsselung des genetischen Codes zu verstehen, wie der genetische Code entschlüsselt wurde, müssen

wir

zuerst kurz betrachten, wie Proteine synthetisiert werden. Eine mRNA erkennt Aminosäuren nicht unmittelbar. Sie bindet dagegen spezifisch die tRNA-Moleküle, die jeweils die entsprechende Aminosäure tragen (Abb. 27.1). Jede tRNA enthält eine Trinucleotidsequenz, ihr Anticodon, das komplementär zu einem mRNACodon ist, welches die Aminosäure der tRNA spezifiziert. Während der Translation werden die Aminosäuren, mit der die tRNAs beladen sind, in der Reihen-

folge miteinander verbunden, mit der die tRNA-Anticodons an die mRNA-Codons am Ribosom binden (Abb. 3.14).

Anticodon

Abb. 27.1

Transfer-RNA in ihrer „Kleeblatt“-Form.

Ihr kovalent gebundener Aminosäurerest befindet sich oben und ihr Anticodon (ein Trinucleotidsegment, das mit dem komplementären mRNA-Codon während der Translation Basenpaare ausbildet) befindet sich unten.

1056

Proteinbiosynthese

Der genetische Code könnte prinzipiell durch den einfachen Vergleich der Basensequenz einer mRNA mit der Aminosäuresequenz der codierten Polypeptidkette bestimmt werden. In den 1960er Jahren waren allerdings noch keine Techniken entwickelt worden, um

mRNAs

zu isolieren und zu sequenzieren.

Darüber hinaus waren die Techniken zur Synthese von RNAs nur sehr rudimentär entwickelt. Man benutzte dazu Polynucleotid-Phosphorylase, ein Enzym aus Azotobacter vinelandii, das Nucleotide ohne die Verwendung einer Matrize miteinander verbindet.

(RNA), + NDP= (RNA), ,, +P: Die NDPs werden dabei so miteinander verknüpft, dass die Basenzusammensetzung der Produkt-RNA die Mischung der reagierenden NDPs widerspiegelt. Die Aufklärung des genetischen Codes erwies sich daher trotz der Entwicklung zellfreier Translationssysteme als schwierige Aufgabe. E. coli-Zellen, die hierfür vorsichtig aufgeschlossen und danach zentrifugiert werden, um Zellwände und Membranen zu entfernen, liefern einen Extrakt, der DNA, mRNA, Ribosomen, Enzyme und andere Zellbestandteile enthält,

die für die Proteinbiosynthese notwendig sind. Wenn man den Extrakt mit ATP, GTP und Aminosäuren versetzt, synthetisiert dieses System kleine Mengen an Protein. Auch ein zellfreies Translationssystem produziert natürlich zunächst Proteine, die durch die Zell-DNA codiert werden. Die Zugabe von DNase stoppt die Proteinsynthese nach ein paar Minuten, da das System nicht länger mRNA synthetisieren kann und die ursprünglich vorhandene mRNA schnell abgebaut wird. An diesem Punkt kann dem System gereinigte mRNA oder synthetische mRNA zugefügt werden und die entstehenden Polypeptidprodukte können später daraus isoliert werden. Im Jahre 1961 fügten Marshall Nirenberg und Heinrich Matthaei einem zellfreien Translationssystem, das isotopenmarkierte Aminosäuren enthielt, das synthetische Polyribonucleotid Poly(U) hinzu und erhielten ein markiertes Poly(Phe)-Polypeptid. Sie folgerten daraus, dass UUU das Codon sein muss, das Phe codiert. Gleiche Experimente mit Poly(A) und Poly(C) ergaben Poly(Lys) bzw. Poly(Pro), wodurch AAA als Codon für Lys und CCC als Codon für Pro identifiziert werden konnte. In weiteren Experimenten wurden diverse Trinucleotide daraufhin untersucht, ob sie die Bindung von tRNAs an Ribosomen unterstützen. Ribosomen werden zusammen mit ihrer gebundenen tRNA von einem Nitrocellulosefilter zurückgehalten, nicht jedoch freie tRNA. Die gebundene tRNA wurde identifiziert, indem man Mischungen beladener tRNAs verwendete, bei denen jeweils nur einer der vorhandenen Aminosäurereste radioaktiv markiert war. So wurde z.B. herausgefunden, dass UUU ausschließlich die ribosomale Bindung von Phe-tRNA stimuliert. Auf die gleiche Weise stimulieren UUG, UGU und GUU die Bindung von Leu-, Cys- bzw. Val-tRNAs. Demnach müssen UUG, UGU und GUU Codons sein, die Leu, Cys bzw. Val codieren. Auf diesem Wege wurden die Aminosäuren identifiziert, die durch etwa 50 Codons spezifiziert werden. Der Bindungstest für die übrigen Codons war entweder negativ (es konnte keine tRNA-Bindung festgestellt werden) oder nicht eindeutig. Die entgültige Entschlüsselung des genetischen Codes erfolgte durch die chemische Synthese von Polynucleotiden durch H. Gobind Khorana, wodurch frühere Ergebnisse bestätigt oder vervollständigt wurden. Mit dieser Synthese war es möglich, bestimmte sich wiederholende Sequenzen zu synthetisieren (was zur damaligen Zeit ein enorm arbeitsaufwendiger Prozess war). In einem zellfreien Translationssystem wird UCUCUCUC -. . z.B. als VEUNGUCH

UEU

FEUER

EUEFEERR

Der genetische Code gelesen, so dass es eine Polypeptidkette aus zwei alternierenden Aminosäureresten codiert. Diese bestimmte mRNA stimulierte die Produktion von Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu « »»

da UCU für Ser und CUC für Leu codiert.

Alternierende Sequenzen aus drei Nucleotiden, so wie Poly(UAC), spezifizieren drei verschiedene Homopolypeptide, da Ribosomen die Polypeptidsynthese an dieser mRNA in jedem der drei Leseraster beginnen können (Abb. 27.2), Die Analysen der Polypeptide, die durch verschiedene alternierende Sequenzen aus zwei oder drei Nucleotiden codiert wurden, bestätigten die Identität vieler Codons und füllten die Lücken im genetischen Code auf.

1057

Erstes Leseraster, Start — Zweites Leseraster, Start Drittes Leseraster, ImStart

«U -A-C-U-A-C-U-A-C-U-A-C Leseraster

Leseraster

Leseraster

C.

Die Natur des genetischen Codes

Der ser ten 1.

genetische Code ist in Tabelle 27.1 dargestellt. Die nähere Betrachtung dieTabelle zeigt, dass der genetische Code einige bemerkenswerte Eigenschafbesitzt: Der Code ist in hohem Maße degeneriert. Drei Aminosäuren - Arg, Leu und Ser — werden jeweils durch sechs verschiedene Codons codiert, die meisten anderen werden durch je vier, drei oder zwei Codons codiert. Nur Met und Trp, zwei der seltensten Aminosäuren in Proteinen (Tab. 4.1), werden durch ein einziges Codon spezifiziert. Codons, welche dieselbe Aminosäure codieren, werden als Synonyme bezeichnet. 2. Die Codetabelle ist nicht willkürlich aufgebaut. Die meisten Synonyme stehen in Tabelle 27.1 im gleichen Kästchen, d.h. sie unterscheiden sich nur in ihrem dritten Nucleotid. XYU und XYC spezifizieren sogar immer dieselbe Aminosäure. Bei XYA und XYG ist es bis auf zwei Ausnahmen genauso. Darüber hinaus führen Veränderungen in der ersten Position des Codons dazu, dass ähnliche (wenn nicht sogar dieselben) Aminosäuren codiert werden. Codons, die an der zweiten Position ein Pyrimidin tragen, codieren meistens hydrophobe Aminosäuren (braun in Tab. 27.1) und solche mit einem Purin in der zweiten Position codieren häufig polare Aminosäuren (blau, rot und violett gefärbt in Tab. 27.1). Diese Beobachtungen deuten auf einen nicht willkürlichen Ursprung des genetischen Codes hin und zeigen, dass der Code sich deshalb so entwickelte, um nachteilige Auswirkungen von Muta-

3.

tionen zu minimieren (siehe Exkurs 27.1). UAG, UAA und UGA sind Stoppcodons. Diese drei Codons (die man auch als

Nonsens-Codons bezeichnet) spezifizieren keine Aminosäuren, sondern signalisieren dem Ribosom das Ende der Kettenverlängerung. UAG, UAA und UGA werden oft auch als Amber-, Ocker- und Opal-Codons bezeichnet. Diese Namen gehen auf ein scherzhaftes Wortspiel zurück: Das deutsche Wort für Amber ist Bernstein, der Name desjenigen Mitarbeiters, der an der Entdeckung von Amber-Mutationen beteiligt war. Diese Mutationen verändern einige andere Codons zu UAG. Ocker und Opal sind weitere Wortspiele, die von Amber abgeleitet sind. 4. AUG und GUG sind Codons für die Ketteninitiation. Die Codons AUG und weniger häufig GUG - spezifizieren den Startpunkt für die Synthese der Polypeptidkette. Sie codieren ebenfalls die Aminosäuren Met und Val an internen Positionen der Polypeptidketten. Wir werden in Abschnitt 27.4A sehen, wie Ribosomen zwischen diesen zwei Codon-Typen unterscheiden. Der genetische „Standard“-Code ist nicht universell

Über viele Jahre dachte man, dass der „Standard“-Code (der in Tab. 27.1 gezeigt ist) universell sei. Diese Annahme basierte teilweise auf der Beobachtung, dass ein bestimmter Organismus (z.B. E. coli) die Gene vieler ziemlich verschiedener

Abb. 27.2

Die drei möglichen Leseraster

einer mRNA.

Jedes Leseraster würde ein anderes Polypeptid ergeben.

1058

_Proteinbiosynthese

Tab. 27.1

Der genetische „Standard“-Code?.

| o

Dritte

Erste Position (5’-Ende)

Position (3'-Ende)

uN E nn

UGA

STOPP

UGG

Trp

ie

di, N H

AUA

AUG

Met?

H;C—S—CH,— CH,

“ Unpolare Aminosäurereste sind braun, basische Reste blau, saure Reste rot und polare Reste violett gefärbt. ’ AUG bildet einen Teil des Initiationssignals und codiert daneben den internen Met-Rest.

Der genetische Code gr

ur

13

Hi Ei ' Er REN >

TEL

en

Ki:

R

1059

wer

_Exkurs 27.1 Biochemie im Fokus

411°3

Evolution des genetischen Codes Wegen der Degeneration des genetischen Codes verändert eine Punktmutation an der dritten Position eines Codons nur selten die spezifizierte Aminosäure. Zum Beispiel führt ein Übergang von GUU zu GUA dazu, dass immer noch Val codiert wird, weshalb dies als eine vom Phänotyp her stille Mutation bezeichnet wird. Andere Punktmutationen, selbst an der ersten und zweiten

Position des Codons, führen zur

Substitution durch eine chemisch ähnliche Aminosäure und haben häufig nur einen geringen Einfluss auf die Gesamtstruktur und die Funktion eines Proteins. Ein Beispiel hierfür ist AUU (Ile) oder GCU (Ala). Dieser eingebaute Schutz gegenüber Mutationen ist sicherlich nicht zufällig entstanden. In den 1960er Jahren schlug Francis Crick — unter der Annahme, der genetische Code sei universell — die Theorie des „eingefrorenen Zufalls“ vor, die besagt, dass die Codons

Aminosäuren gänzlich per Zufall zugeordnet wurden. Einmal zugeteilt, konnte sich die Bedeutung eines Codons nicht mehr ändern, wegen der hohen Wahrscheinlichkeit, die Struktur des codierten

Proteins zu zerstören.

sich der genetische Code rach seiner mehr weiterentwickeln konnte.

Man

dachte, dass

Etablierung

nicht

Dennoch legt die Verteilung der Codons, die in Tabelle 27.1

wiedergegeben ist, eine alternative Evolutionsgeschichte des genetischen Codes nahe, in deren Verlauf eine paar wenige einfache Codons, die einer Handvoll Aminosäuren entsprachen, schrittweise immer komplexer wurden. Ein Szenario

beginnt mit einer RNA-Welt, die nur A- und U-Nucleotide enthält.

Uracil ist fast sicher eine Ur-Base,

da der Biosyn-

theseweg von Pyrimidinen Uracilnucleotide liefert, bevor Cytosin- oder Thyminnucleotide gebildet werden (Abschnitt 23.2). Adenin wäre dann als Gegenstück von Uracil benötigt worden. In der Annahme, dass ein genetischer Code, der auf Tripletts basiert, zu Beginn etabliert wurde (und es ist schwer vorstellbar, wie irgendeine andere Aufgliederung die Entstehung des heutigen Triplett-Codes verursacht haben könnte), konn-

ten die Basen für 2° = 8 Aminosäuren codieren. Der gegenwärtig gültige genetische Code weist die U/A-Codons sechs verschiedenen Aminosäuren und einem Stoppsignal zu:

UUU UUA UAU AUU

= = = =

Phe Leu Tyr Ile

AAA AAU AUA UAA

Lys Asn Ile Stopp

Das AUA-Codon könnte ursprünglich die Start-Aminosäure Met (jetzt durch AUG spezifiziert) codiert haben, was die mögliche Gesamtzahl der Aminosäuren auf sieben reduziert. Als G und C in den entstehenden Lebensformen auftraten,

wurden diese Nucleotide in RNA eingebaut. Codons, die drei oder vier Basenarten enthalten, konnten zusätzliche Amino-

säuren spezifizieren. Aber wegen des hohen Selektionsdrucks gegen eintretende störende Mutationen in Proteinen nahm die Anzahl der redundanten Codons zu. Ein Blick auf Tabelle 27.] zeigt, dass Triplett-Codons, die komplett aus G und C bestehen,

nur vier Aminosäuren

codieren,

was

der Hälfte

der theoretisch zu erwartenden maximalen Zahl von acht entspricht: GGG,GGC = Gly GCG, GCC = Ala CGG, CGC = Arg CCC, CCG

= Pro

Diese basenabhängige Zuweisung der Codons zu Aminosäuren spricht gegen einen völlig zufälligen Ursprung des genetischen Codes. Die schrittweise Einführung von zwei neuen Basen (G und C) in einen primitiven genetische Code, der nur auf A und U basierte, muss eine größere Informationska-

pazität ermöglicht haben

(indem er 20 Aminosäuren

co-

dierte), während er das Maf an schädlichen Substitutionen minimierte.

Organismen (z. B. des Menschen) fehlerfrei translatieren kann. In der Tat ist dieses Phänomen die Basis der Gentechnik. DNA-Untersuchungen aus dem Jahre 1981 zeigten jedoch, dass der genetische Code bestimmter Mitochondrien eine Variante des “Standard“-Codes darstellt. So stellt z.B. AUA in Säugermitochondrien,

genau wie das Standard-AUG, das kombinierte Met/Startcodon dar. UGA spezifiziert Trp und nicht etwa „Stopp“; AGA und AGG markieren häufig „Stopp“ statt Arg. Scheinbar unterliegen Mitochondrien, die ihre eigenen Gene und Proteinbiosynthese-Maschinerien enthalten, nicht denselben evolutionären Zwängen wie das im Kern lokalisierte Genom. In Wimperntierchen, die sehr früh während der eukaryotischen Evolution einen eigenen Weg einschlugen, hat sich offenbar ebenfalls ein alternativer genetischer Code entwickelt. Somit ist der genetische „Standard“-Code nicht völlig universell, obwohl er sehr weit verbreitet ist.

= = = =

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Erklären Sie, warum Rasterschub-Mutationen bei der Insertion oder Deletion von einer oder zwei aber nicht von drei Nucleotiden auftreten. 2. Beschreiben Sie, wie die

Bedeutung eines jeden Codons bestimmt wurde. 3. Erklären Sie, warum Codons mindestens aus drei Nucleotiden bestehen müssen.

1060

Proteinbiosynthese

_Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung

2

Zellen müssen die Sprache der RNA-Basensequenz in die Sprache von Polypeptiden übersetzen. Nucleinsäuren binden jedoch Aminosäuren nicht spezifisch. Im Jahre 1955 stellte Francis Crick die Hypothese auf, dass die Translation unter Beteiligung von Adaptermolekülen abläuft, die eine bestimmte enzymatisch angehängte Aminosäure tragen und die das entsprechende Nucleinsäurecodon erkennen.

A. 62 siehe Guided Exploration 26: The Structure of tRNA.

Struktur der tRNA

Im Jahre 1965, nach sieben Jahre andauernden Bemühungen, veröffenlichte Robert Holley die erste Basensequenz einer biologisch bedeutsamen Nucleinsäure: Er hatte die 76 Reste lange Sequenz von Alanin-tRNA (tRNA**) aus Hefe ermittelt. Gegenwärtig sind die Basensequenzen von mehr als 7600 tRNAs aus über 200 Organismen und Organellen bekannt (meist aus DNA-Sequenzen abgeleitet). Sie variieren in ihren Längen zwischen 54 und 100 Nucleotiden (18-28 kD), die meisten bestehen jedoch aus ca. 76 Nucleotiden. Fast alle bekannten tRNAs können schematisch in der sogenannten KleeblattSekundärstruktur dargestellt werden (Abb. 27.3). Ausgehend vom 5’-Ende, besitzen sie folgende gemeinsame Charakteristika: 1. Eine 5’-terminale Phosphatgruppe. 2. Einen 7 bp langen Stamm, der das 5’-terminale Nucleotid einbezieht und Nicht-Watson-Crick-Basenpaare, wie G - U, beinhalten kann. Dieser Aufbau ist als Akzeptor- oder Aminosäurestamm bekannt, da der Aminosäurerest, den die tRNA trägt, an die 3’-terminale OH-Gruppe geknüpft ist. 3. Einen 3 oder 4 bp langen Stamm, der am Ende eine 5-7 nt lange Schleife trägt, welche häufig die modifizierte Base Dihydrouridin (D) enthält. Dieser Stamm und die Schleife werden zusammen als D-Arm bezeichnet. 3

A-OH ) C

_AkzeptorArm

h

en [sl p =.

.

®

ar eh “en en

e. o

Die ausgefüllten Kreise, die durch Punkte verbunden sind, stellen Watson-Crick-Basenpaare dar. Offene Kreise symbolisieren Basen, die keine

Watson-Crick-Basenpaarung eingehen. Invariante

Positionen werden wie folgt angezeigt: R und Y repräsentieren invariante Purine bzw. Pyrimidine,

Ty C-Arm .

Pr

(4

22 .B-o

@ 9

. en

C

O-ar

.

®

oo

R

ee 0O-@ . ©

wen | |

Anticodon- ® 3 .

Arm

Se .o:.® L

ı steht für Pseudouracil. Die mit Sternchen

versehenen Nucleotide sind oft modifiziert. Der D-Bereich und die variablen Arme enthalten in den verschiedenen tRNAs eine unterschiedliche Zahl an Nucleotiden.

x

j

e.-e-e-e-C

o-0-®-0

\

Kleeblatt-Sekundärstruktur der tRNA.

Gene

A

as Abb. 27.3

U ® .o

Anticodon

© (©)

®-®-

i

Variabler Arm

Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung

1061

4. Einen 5 bp langen Stamm, der am Ende eine Schleife trägt, die das Anticodon enthält. Diesen Bestandteil nennt man Anticodonarm. ‚5. Einen 5 bp langen Stamm, der am Ende eine Schleife trägt, die üblicherweise die Sequenz TC enthält (wobei y das Symbol für Pseudouridin ist). Dieser Teil wird als TyC- oder T-Arm bezeichnet. 6. Eine 3’-CCA-Sequenz mit einer 3’-OH-Gruppe. Die CCA-Sequenz kann, abhängig von der Art (Abschnitt 26.3C), genetisch codiert oder enzymatisch an die Vorläufer-tRNA angehängt werden. tRNAs besitzen 15 invariante Positionen (alle tragen an dieser Stelle jeweils dieselbe Base) und 8 semi-veränderliche Positionen (entweder nur ein Purin oder nur ein Pyrimidin), die meist in den Schleifenbereichen vorkommen. Das Purin auf der 3'-Seite des Anticodons ist stets modifiziert. Der Bereich mit der größten Variabilität in den bekannten tRNAs tritt in dem sogenannten variablen Arm auf. Dieser weist 3-21 Nucleotide auf und kann einen Stamm aus bis zu 7 bp enthalten. tRNAs besitzen zahlreiche modifizierte Basen Eines der auffälligsten Merkmale von tRNAs ist ihr hoher Anteil an posttranskriptional modifizierten Basen (bis zu 25%). Es wurden fast 80 solcher Basen charakterisiert, die in mehr als 60 verschiedenen Positionen der tRNA gefunden wurden. Einige von ihnen sind mit ihren Standardabkürzungen in Abbildung 27.4 wiedergegeben. Keine dieser Modifikationen ist für den Erhalt der vollständigen Struktur einer tRNA oder für deren korrekte Bindung an das Ribosom essentiell. Die Modifikationen der Basen können jedoch das Anfügen der richtigen Aminosäure an den Akzeptorstamm begünstigen oder die Wechselwirkung zwischen Codon und Anticodon verstärken. Abb. 27.4

tRNA besitzt eine komplexe Tertiärstruktur Wie in Abschnitt 24.2C beschrieben, haben tRNA-Moleküle eine L-förmige Struktur, in der Akzeptor- und T-Arm den einen Schenkel, sowie der D- und der Anticodonarm den anderen Schenkel (Abb. 27.5) ausbilden. Jeder dieser Schenkel der L-förmigen Struktur ist ca. 6 nm lang, und die Anticodon- und Aminosäureakzeptorstellen liegen auf entgegengesetzten Enden, ungefähr

von Adenosin abgeleitet wird, obwohl es chemisch Guanosin ähnelt. Nucleoside können auch an der 2'-Position der Ribose methyliert sein, wie z.B. Cm,

Gm und Um. 6% siehe Kinemage Exercise 21-2.

er

Ki

RUN

(0)

A

TOTER

er

O

H

Kanye:

=

|

“N

HN

|

Ribose

GE +

H,N—CH— COO”

Ribose

Ribose

Ribose

Pseudouridin (y)

Dihydrouridin (D)

Lysidin (L)

3-Methyleytidin (m?C)

Guanin-Derivate

Adenin-Derivate OÖ

NHs

iS2008%

H_

H;C

S,

|

ne

(6)

H

N

Na

NH,

H;C

n

N

OÖ

F

NH3

Cytosin-Derivate

Uracil-Derivate

0 1

Einige der modifizierten Nucleoside,

die in tRNAs vorkommen. Man beachte, dass Inosin bei der Biosynthese

Se

N

2 Ribose

Ribose 1-Methyladenosin (m!A)

Inosin (D

+

KL a) N

Nr

Ribose

N’-Methylguanosin (m’G)

3

CL a) N

N

(CH), N NN

Ribose

N 2N ?_Dimethylguanosin (m} G)

1062

Proteinbiosynthese

(a)

3

OÖ Konsenviertes Nucleotid @

OH Akzeptor-Arm

Konserviertes Purin oder Pyrimidin

70

D-Schleife

TycC-Schleife

®

62

GmA

Anticodon-Schleife

A

35

Abb. 27.5

Struktur von Hefe-tRNAP".

(a) Die Basensequenz ist als Kleeblattstruktur gezeichnet. Die tertiären Wechselwirkungen über Basenpaare sind durch dünne rote Linien dargestellt, welche die beteiligten Basen miteinander verbinden. Basen, die in allen tRNAs konserviert oder semikonserviert sind, sind entsprechend

mit durchgezogenen bzw. gestrichelten Linien eingekreist. Der 5’-Terminus ist dunkelgrün, der Akzeptorstamm donarm

gelb, der D-Arm weiß, der Antico-

hellgrün, der variable Arm orange, der

TıpC-Arm hellblau und das 3’-Ende rot gefärbt. (b) Die Röntgenkristallstruktur zeigt, wie ihre basengepaarten Stämme angeordnet sind, um ein

L-förmiges Molekül zu bilden. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat ist durch ein Bändermodell nach demselben Farbschema wie in (a) dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Mike Carson, University of Alabama in Birmingham.

PDBid 6TNA.] 6% siehe Kinemage Exercise 21-1.

6% siehe Guided Exploration 27: The Structures of Aminoacyl-tRNA Synthetases and Their Interactions With tRNAs.

7,6 nm voneinander getrennt. Der schmale

Durchmesser der tRNA von 2-2,5

nm ist für ihre biologische Funktion essentiell: Während der Proteinbiosynthese binden zwei tRNA-Moleküle gleichzeitig dicht nebeneinander an benachbarte Codons der mRNA (Abschnitt 27.4B). Die komplexe Tertiärstruktur einer IRNA wird durch umfangreiche Stapelwechselwirkungen und durch Basenpaarungen innerhalb und zwischen den helicalen Stämmen aufrechterhalten. In der Struktur von tRNA”"® treten z.B. neun Wechselwirkungen auf, von denen alle bis auf eine Nicht-Watson-Crick-Basenpaare sind. Darüber hinaus sind die meisten Basen, die an diesen Wechselwirkungen beteiligt sind, invariant oder semi-invariant, was in Übereinstimmung mit der Vorstellung ist, dass alle tRNAs die gleiche Konformation einnehmen. Die kompakte Struktur von tRNA”" aus Hefe zeigt, dass die meisten Basen für das Lösungsmittel unzugänglich sind. Die bemerkenswertesten Ausnahmen davon sind die Basen des Anticodons und diejenigen des CCA-Terminus, der die Aminosäure trägt. Beide Gruppierungen müssen zugänglich sein, um ihre biologischen Funktionen erfüllen zu können.

B.

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Für die präzise Translation sind zwei gleich wichtige Erkennungsschritte erforderlich: 1. Die richtige Aminosäure muss für die kovalente Verknüpfung mit der tRNA durch eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase ausgewählt werden (siehe unten). 2. Die richtige Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) muss mit einem mRNA-Codon am Ribosom Basenpaare ausbilden (wie in Abschnitt 27.4B beschrieben).

Eine für jede Aminosäure spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) hängt eine Aminosäure an den 3’-terminalen Riboserest der entsprechenden tRNA an,

um eine Aminoacyl-tRNA zu bilden (Abb. 27.6). Die Aminoacylierung läuft in

Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung

zwei aufeinander folgenden Reaktionen ab, die von einem einzigen Enzym katalysiert werden. 1. Zuerst wird die Aminosäure durch ihre Verknüpfung mit ATP „aktiviert“. Es entsteht ein Aminoacyladenylat, ji Rn

o

4 o-

A

TB

—

NH3

Adenin

HRG

(6)

eh

|

a

Sg

NH3

realen

H

+ ER}

+ tRNA = Aminoacyl-#RNA

H

2 |

das von allen bis auf drei aaRSs in der Abwesenheit von tRNA gebildet werden kann. Dieses Intermediat kann tatsächlich isoliert werden, obwohl es normalerweise fest am Enzym gebunden bleibt. 2. Das gemischte Anhydrid reagiert dann mit der entsprechenden tRNA unter Bildung der Aminoacyl-tRNA: Aminoacyl-AMP

2 OBZOFE

0” Aminoacyladenylat (Aminoacyl-AMP)

Aminosäure

8

H=ZCZR

|

NH3 Aminoacyl-tRNA

Abb. 27.6

Aminoacyl-tRNA.

Die Aminosäure ist mit dem 3’-terminalen Nucleotid der tRNAs entweder über dessen 2'-OH-Gruppe oder, wie hier gezeigt, über

+ AMP

dessen 3’-OH-Gruppe verestert.

Die Gesamtreaktion der Aminoacylierung Aminosäure

+ tRNA

+ ATP

— Aminoacyl-tRNA

+ AMP

+ PP;

wird durch die Hydrolyse von PP; getrieben, das im ersten Reaktionsschritt entstanden ist. Das Aminoacyl-tRNA-Produkt ist eine energiereiche Verbindung (Abschnitt 14.2A). Aus diesem Grund bezeichnet man die Aminosäure als „aktiviert“ und die tRNA als „beladen“. Die Aktivierung der Aminosäuren ähnelt der Fettsäureaktivierung (Abschnitt 20.2A). Der Hauptunterschied ist jedoch, dass bei der Aminosäureaktivierung tRNA der Acylakzeptor ist, wohingegen diese Funktion bei der Fettsäureaktivierung von CoA übernommen wird. Es gibt zwei Klassen von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Zellen müssen mindestens eine aaRS für jede der 20 Aminosäuren enthalten. Die Ähnlichkeit der Reaktion, die von diesen Enzymen

katalysiert wird, und

die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den tRNAs legen nahe, dass sich alle aaRSs von einem gemeinsamen Vorfahren ausgehend entwickelten und daher strukturell verwandt sein sollten. Das ist jedoch nicht der Fall. Tatsächlich bilden die aaRSs eine facettenreiche Gruppe von Enzymen mit unterschiedlichen Größen und Quartärstrukturen und einer geringen Sequenzähnlichkeit. Trotzdem können diese Enzyme in zwei Klassen unterteilt werden, von denen jede dieselben 10 Vertreter in allen Organismen besitzt (Tab. 27.2). Klasse-I- und Klasse-II-Aminoacyl-tRNA-Synthetasen unterscheiden sich in einigen Punkten: 1. Strukturelle Motive. Die Klasse-I-Enzyme haben als gemeinsames Merkmal zwei homologe Polypeptidsegmente. Beide Segmente sind Bestandteile eines Dinucleotid-Bindungsfaltungsmotivs, der sogenannten Rossmann-Faltung, die auch in vielen NAD*- und ATP-bindenden Proteinen vorkommt (Abschnitt 6.2C). Den Klasse-II-Synthetasen fehlen die oben genannten Sequenzen, doch haben sie drei andere Sequenzen gemeinsam. 2. Anticodonerkennung. Viele Klasse-I-aaRSs müssen für die Aminoacylierung der entsprechenden tRNAs die Anticodons erkennen. Im Gegensatz dazu treten einige Klasse-II-Enzyme nicht mit dem Anticodon ihrer gebundenen tRNA in Wechselwirkung. 3. Aminoacylierungsstelle. Alle Klasse-I-Enzyme aminoacylieren die 3'-terminale 2’-OH-Gruppe ihrer gebundenen tRNA, wohingegen Klasse-II-Enzyme die 3’-OH-Gruppe mit einer Aminosäure beladen. Es besteht ein Gleichge-

Tab. 27.2 Klassifizierung von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen aus E. coli. Klasse I

Klasse II

Arg

Ala

Cys

Asn

Asp

Gly His

1063

1064

_ Proteinbiosynthese

TSchleife |

-

D-

Schleife‘/

Akzeptor-Arm

wicht zwischen der Bindung der Aminoacylgruppe an die 2’- oder 3'-Position (sie muss aber an der 3’-Position gebunden sein, um an der Proteinbiosynthese teilzunehmen). 4. Aminosäurespezifität. Die Aminosäuren, für die Klasse-I-Enzyme spezifisch sind, sind meistens größer und hydrophober als jene für die Klasse-II-Synthetasen. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen erkennen einzigartige strukturelle Merkmale von tRNAs Wie erkennt eine aaRS eine tRNA, sodass sie mit der richtigen Aminosäure be-

laden werden kann? Zunächst besitzen alle tRNAs eine ähnliche Struktur, sodass die Merkmale,

[VolütexoYo[e]ı]

[el-Xe]er:[eJa1d-l: Abb. 27,7 Experimentell beobachtete Erkennungselemente von tRNAs. Das tRNA-Rückgrat ist blau gefärbt und jedes seiner Nucleotide ist durch einen gelben Punkt dargestellt. Der Durchmesser dieses Punkts gibt den Anteil der 20 tRNA-Akzeptortypen an, für die das betreffende Nucleotid ein Erkennungsmerkmal darstellt. [Mit freundlicher Genehmigung von Wilhelm

H. McClain, University of Wisconsin,

Madison.]

die sie unterscheiden,

ey

Abb. 27.8

Röntgenkristallstruktur von

GInRS-tRNA“" . ATP aus E. coli. Das am aktiven Zentrum des Proteins gebundene ATP ist als Kalottenmodell dargestellt. C ist grün, N blau, © rot und P orange eingefärbt. Die tRNA ist in Stabform gezeichnet und wie das ATP gefärbt. Die C-Atome des Anticodons (UCG) und das 3'-CCA-Ende sind gelb dargestellt. Ein oranger Stab verbindet die aufeinanderfolgenden P-Atome. Das Protein ist als durchscheinendes blaues Kugelmodell abgebildet, sodass die verdeckten Teile der tRNA und des ATPs erkennbar sind. Man beachte, dass sowohl das 3’-Ende der tRNA

(oben rechts) als auch die Anticodonbasen (unten) in tiefe Einstülpungen innerhalb des Proteins eingebettet sind. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Thomas Steitz, Yale University. PDBid IGTR.] 6% Siehe Kinemage Exercise 22.

feine Unterschiede in der Sequenz

oder der lokalen Struktur sein müssen. Auf der anderen Seite kann mehr als nur eine tRNA eine gegebene Aminosäure tragen, da der genetische Code degeneriert ist. Diese sogenannten isoakzeptierenden tRNAs müssen alle von ihren entsprechenden aaRSs erkannt werden. Letztendlich darf die tRNA nur mit der Aminosäure beladen werden, die ihrem Anticodon entspricht und nicht etwa mit einer der anderen 19 Aminosäuren. Hinweise auf die Spezifität von Synthetase-tRNA-Wechselwirkungen wurden aus Untersuchungen erhalten, bei denen tRNA-Fragmente, mutierte tRNAs oder chemische Verbrückungsreagentien verwendet wurden, sowie durch computergestützte Sequenzvergleiche und natürlich durch röntgenkristallographische Untersuchungen. Wenn man die experimentell bestimmten Erkennungsmerkmale für eine Vielzahl von tRNAs in einem dreidimensionalen Modell eines tRNA-Moleküls kartiert, erkennt man, dass sie gehäuft im Akzeptorstamm, in der Anticodonschleife sowie an anderen Stellen entlang der inneren (konkaven) Seite der L-förmigen Struktur auftreten (Abb. 27.7). Es gibt aber offenbar nur wenige Gemeinsamkeiten in der Art und Weise, wie die Synthetasen ihre zugehörigen tRNAs erkennen. Einige dieser Wechselwirkungen zwischen Enzym und tRNA finden ganz ohne Beteiligung des Anticodons statt. Synthetasen, die sowohl mit dem-Anticodon als auch mit dem Akzeptorstamm in Wechselwirkung treten, müssen die passende Größe und Struktur haben, um an beide Schenkel der L-förmigen tRNA binden zu können. Ein anschauliches Beispiel dafür ist der Komplex von Glutamyl-tRNA-Synthetase (GlnRS) aus E. coli mit IRNA®" und ATP (Abb. 27.8), dessen Struktur von Tho-

Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung

1065

mas Steitz bestimmt wurde. Er war gleichzeitig der erste dieser Komplexe, dessen Struktur aufgeklärt wurde. GInRS, ein monomeres Klasse-I-Enzym aus 553 ‚ Aminosäuren, hat eine langgestreckte Form, sodass es das Anticodon nahe dem einen Ende des Proteins und den Akzeptorstamm nahe dem anderen Ende bindet. Genetische und biochemische Daten belegen, dass die Erkennungselemente für tRNAC"* alle sieben Basen der Anticodonschleife einbeziehen. Die Basen des Anticodons selbst sind nicht gestapelt und ragen nach außen, so dass sie in separaten Erkennungstaschen der GlnRS binden können. Das 3’-Ende der tRNA®® liegt in einer tiefen Proteintasche, in der auch das Cosubstrat ATP und das Substrat Glutamin gebunden sind. AspRS aus Hefe ist ein Klasse-Il-Enzym und liegt als a,-Dimer vor, dessen Untereinheiten jeweils aus 557 Aminosäuren bestehen. Die Röntgenkristallstruktur im Komplex mit tRNA”®, die von Dino Moras bestimmt wurde, zeigt, dass das Protein symmetrisch zwei tRNA-Moleküle bindet und dabei hauptsächlich mit deren Akzeptorstämmen und dem Anticodonbereich in Kontakt tritt (Abb. 27.9). Der Anticodon-Arm von tRNA”” wird im Vergleich zur Röntgenkristallstruktur von unkomplexierter tRNA“P um immerhin 2 nm zur Innenseite der L-förmigem Struktur hin verbogen. Die Anticodonbasen sind nicht gestapelt. Das „Scharnier“ dieser Krümmung bildet ein G30 - U40-Basenpaar im Anticodonarm (fast alle anderen tRNA-Arten enthalten an dieser Stelle ein Watson-Crick-Basenpaar). Die Anticodonbasen der tRNA@" sind auch während des Kontakts mit GlnRS ungestapelt, aber die Konformation des Rückgrats unterscheidet sich von der in tRNA“®. Tatsächlich wird die Struktur einer tRNA im Komplex mit ihrer korrespondierenden Synthetase stärker durch die Wechselwirkungen mit dem Protein (“induced fit“; Abschnitt 11.1B) als durch die Sequenz bestimmt. Dies ist vielleicht ein Grund dafür, dass die Vertreter eines Satzes an Isoakzeptor-RNAs in der Zelle von einer einzigen aaRS erkannt werden. Die verschiedenen Arten der tRNA-Bindung durch GInRS und AspRS werden durch einen Vergleich der Abbildungen 27.8 und 27.9 deutlich. Obwohl beide tRNAs sich ihren Synthetasen entlang der Innenseite der L-förmigen Struktur nähern, geschieht dies bei tRNA“'” von der kleinen Furche ihres Akzeptorstammes her und bei tRNA”” ausgehend von der großen Furche. Das 3’-Ende der tRNA behält beim Eintreten in das aktive Zentrum der AspRS seine helicale Form, wohingegen sich das 3'-Ende von tRNA"" während dieses Vorgangs zu einer Haarnadelschleife zurückfaltet. Diese strukturellen Unterschiede erklären die Beobachtung, dass Klasse-I- und Klasse-II-Enzyme verschiedene OH-Gruppen der 3’-terminalen Ribose einer tRNA aminoacylieren.

Abb. 27.9

Röntgenkristallstruktur von

AspRS - tRNA”°P aus Hefe. Das homodimere Protein mit seinen zwei symmetrisch gebundenen tRNAs ist so abgebildet, dass seine zweizählige Achse fast vertikal verläuft. Die tRNAs sind als Stabmodelle gezeigt, mit gelb gefärbten C-Atomen am GUC-Anticodon und am 3’-CCA-Ende. Die übrigen C-Atome sind grün, N blau, © rot und P orange gefärbt. Die zwei Proteinuntereinheiten sind durch durchscheinende rosa und violette Oberflächenmodelle dargestellt, damit die innenliegenden Teile der tRNAs zu sehen sind. [Nach einer Röntgenkristallstruktur von Dino Moras, CNRS/INSERM/ULP,

PDBid 1ASY.]

Illkirch.

1066

Proteinbiosynthese Korrekturlesen erhöht die Genauigkeit, mit der die Aminosäuren an tRNAs geknüpft werden

Das Beladen der tRNA mit ihrer zugehörenden Aminosäure ist ein bemerkens-

wert genauer Prozess. Experimentelle Messungen zeigen, dass z.B. IleRS bei gleichen Konzentrationen an Isoleucin und Valin pro ca. 40.000 Moleküle Isoleucin nur ein Valin auf tRNA!* überträgt. Dieser hohe Genauigkeitsgrad ist überraschend, da Valin, das sich von Isoleucin nur durch das Fehlen einer ein-

zigen IleRS einer chung denen druck

Re K,

Methylengruppe unterscheidet, problemlos in die Bindungsstelle von passen sollte. Die zusätzliche Bindungsenergie, die schätzungweise von Methylengruppe geliefert wird, liegt bei rund 12 kJ - mol"'. Nach Glei1.16 ist das Verhältnis der Gleichgewichtskonstanten

K, und K,, mit

zwei Substanzen an eine Bindungsstelle binden, durch folgenden Ausgegeben:

er

eAG/RT

AAG°'

(27.1)

entspricht dabei AGY’- AG3} also der Differenz zwischen den freien

Enthalpien der Bindung der zwei Substanzen. Es wird deutlich, dass die Isoleucyl-tRNA-Synthetase zwischen Isoleucin und Valin eigentlich um maximal den Faktor 100 unterscheiden können sollte. Paul Berg löste dieses scheinbare Paradoxon, indem er zeigte, dass IleRS in Gegenwart von tRNA"® die quantitative Hydrolyse von Valinadenylat, der Zwischenstufe der Aminoacylierungsreaktion, katalysiert, wobei Valin-AMP statt Val-tRNA"® entsteht. Somit führt die Isoleucyl-{RNA-Synthetase einen Korrekturleseoder Edierungsschritt der Aminoacyladenylate durch. Dieser Prozess erinnert an den der DNA-Polymerase I (Abschnitt 25.2A). lleRS hat zwei aktive Zentren, die wie zwei hintereinander geschaltete Siebe arbeiten. Das erste Zentrum aktiviert Isoleucin und das chemisch ähnliche Valin. Das zweite aktive Zentrum bindet nur Aminoacylgruppen, die kleiner als Isoleucin sind (z.B. bei Val-tRNA"®) und hydrolysiert diese aminoacylierte tRNA®. Die Röntgenstruktur einer bakteriellen IleRS, einem Klasse-I-Enzym, wurde von Steitz ermittelt. Diese Struktur offenbart, dass das Protein eine zusätzliche Edierungs-Domäne enthält, die in die Dinucleotidbindungsdomäne eingefügt ist (Abb. 27.10). Der 3’-Terminus von tRNA"* scheint über eine Kon-

{.

CP1-/Editing- \) Domäne

Abb. 27.10 Röntgenstruktur der Isoleucyl-tRNASynthetase von Staphylococcus aureus im Komplex

mit tRNA'®, Die tRNA ist weiß, das Protein ist je nach

Domäne unterschiedlich gefärbt. Das Antibiotikum Mupirocin, das lleRS bindet, ist als Stabmodell in

pink wiedergegeben. Die vier terminalen Reste der tRNA sind hervorgehoben. Der 3’-Terminus der tRNA sitzt in der Nähe des Edierungs-Zentrums. [Mit freundlicher Genehmigung von Thomas Steitz, Yale University. PDBid 1QU2.]

C-terminale

Dömäne

Verbindungsf domäne

#

SE

\

\

{

ER

A

N

” Helicale Domäne

ey N-terminale Domäne Zn®=-bindende

®

R

L Domäne mit Rossmann-Faltung

Domäne

Transfer-RNA und ihre Aminoacylierung

formationsänderung zwischen dem Aminoacylierungs- und dem EdierungsZentrum hin und her zu pendeln. Die kombinierten Selektivitäten der Aminoacy- lierungs- und Edierungsschritte sind für die hohe Genauigkeit der Translation verantwortlich — eine Leistung, die durch ATP-Hydrolyse bezahlt wird. Andere Aminoacyl-tRNA-Synthetasen unterscheiden zwischen den richtigen und falschen Aminosäuren über verschiedenartige nichtkovalente Wechselwirkungen. Val und Thr sind isoster, haben die gleiche Form und sind somit schwierig zu unterscheiden. In der VaIRS ragt die Seitenkette von Asp 279 in das aktive Edierungs-Zentrum, wo sie die Hydroxylgruppe von Threonin durch Wasserstoffbrücken bindet und nicht in das aktive Zentrum lässt. Valin fehlt diese Hydroxylgruppe, weshalb es nicht in die Edierungs-Tasche passt und somit nicht umgesetzt werden kann. ThrRS hat das entgegensetzte Problem: Sie muss Thr-tRNA"” und nicht Val-tRNAT” synthetisieren. Ihre Spezifität wird durch das Aminoacylierungszentrum gewährleistet, das ein Zn?*-Ion enthält, welches durch die OH-Gruppe der Threoninseitenkette koordiniert wird. Valin kann Zn’* nicht koordinieren, da es keine Hydroxylgruppe trägt, und ist somit nicht Substrat der ThrRS. Ein separates Edierungs-Zentrum spaltet fehlacylierte Ser-IRNA’”. TyrRS unterscheidet zwischen Tyrosin und Phenylalanin anhand von Wasserstoffbrücken mit der OH-Gruppe von Tyrosin. Da es keine andere Aminosäure gibt, die Tyrosin ähnelt, kann das Enzym dies ohne eine Edierungs-Funktion bewerkstelligen.

€.

__Codon-Anticodon-Wechselwirkungen

Bei der Proteinbiosynthese wird die passende tRNA allein durch Codon-AnticodonWechselwirkungen ausgewählt. Die Aminoacylgruppe nimmt an diesem Prozess nicht teil (dies ist ein Grund dafür, dass die fehlerfreie Aminoacylierung für die Proteinsbiosynthese entscheidend ist). Die drei Nucleotide eines mRNA-Codons paaren - in antiparalleler Weise - mit den drei Nucleotiden des komplementären tRNA-Codons. Man könnte nun ganz naiv vermuten, dass jedes der 61 Codons, das eine Aminosäure spezifiziert, von einer eigenen tRNA abgelesen würde. Obwohl die meisten Zellen zahlreiche isoakzeptierende tRNAs enthalten,

binden säuren (wobei Codons

viele tRNAs an zwei oder drei der Codons, die ihre entsprechenden Aminocodieren. Die tRNAF" aus Hefe, die das Anticodon GmAA besitzt Gm ein G mit einer 2’-Methylgruppe symbolisiert), erkennt z.B. die UUC und UUU, 3.

Hi!

Anticodon?

—A—A—Gm — 5’

Codon:

.

=

.

.

3’

5% AA

5’

U—I—C-

.

Gm .

.

34

— uUÜ—ZU-

und Hefe-tRNA**, die das Anticodon IGC enthält (wobei I für Inosin steht), erkennt die Codons GCU, GCC und GCA.

—

Eu Codon:

—

—

AT

el

5’

Su83%

Dr3%

3

Anticodon:

Gl

RN

a —

RE

00

AU—

el

ER En a

We

N

Es scheint deshalb so, dass an der dritten Codon-Anticodon-Position auch NichtWatson-Crick-Basenpaarungen auftreten können (die erste Anticodonposition ist als dessen 3’-Nucleotid definiert). Dies ist die am stärksten degenerierte Stelle (Tab. 27.1). Dabei ist zu beachten, dass an der dritten (5’)-Anticodonposition üblicherweise eine modifizierte Base, wie Gm oder I, auftritt.

1067

Proteinbiosynthese

1063 Abb. 27.11

H

U - G- und I - A-Wobble-

Basenpaare.

Beide wurden in Röntgenkristallstrukturen beobachtet.

N-H---O

x HEN

a HaN U-G

=

NN

-

c1

|

2 c1

O--H-N

N FRRRSSRBERN ge -

N n> N sa

I-A

Die Wobble-Hypothese erklärt die Degeneration der Codons

Tab. 27.3 Erlaubte Kombinationen von WobbleBasenpaarungen an der dritten Codon-AnticodonPosition.

5’.Base des Anticodons

3’-Base des Codons

G U A oder G er ae

U oder C

-

U, C oder A

Crick schlug als logische Schlussfolgerung aus diesen strukturellen Erkenntnissen die Wobble-Hypothese (engl.: wobble, wackeln) vor, um zu erklären, wie eine tRNA mehrere degenerierte Codons erkennen kann. Er nahm an, dass die ersten zwei Codon-Anticodon-Paarungen eine normale Watson-Crick-Geometrie einnehmen und dass die dritte Anticodon-Position etwas Spiel besitzt und somit ein “wobbling“ auftreten kann, was eine beschränkte konformative Anpassung der Basenpaarungsgeometrie erlaubt. Dies ermöglicht die Bildung einiger Nicht-Watson-Crick-Paare, wie U- GundI - A (Abb. 27.11). Die erlaubten Basenpaarbildungen für die dritte Codon-Anticodon-Position sind in Tabelle 27.3 aufgelistet. Ein Anticodon mit C oder A an der dritten Position kann nur mit seinem komplementären Watson-Crick-Codon paaren (obwohl es in Wirklichkeit kein bekanntes Beispiel einer tRNA mit einem A an der dritten Anticodonposition gibt). Falls U oder G die dritte Anticodonposition besetzen, können potentiell zwei Codons erkannt werden. I an der dritten Anticodonposition kann mit U, C oder A paaren. Eine Betrachtung der verschiedenen Wobble-Basenpaare zeigt, dass mindestens 31 tRNAs benötigt werden, um alle 61 codierenden Tripletts des genetischen Codes zu translatieren (als minimaler Satz werden daher 32 tRNAs benötigt, weil für die Initiation der Translation eine separate tRNA nötig ist; Abschnitt 27.4A). Die meisten

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 Il Beschreiben Sie die strukturellen

Hauptmerkmale einer tRNA. Warum ist es wichtig, dass alle tRNAs eine ähnliche Struktur besitzen? Welche Aspekte der tRNA-Struktur sind für die Erkennung und Beladung durch eine aaRS von Bedeutung? Beschreiben Sie den doppelten Aussiebemechanismus der IleRS. Erklären Sie die Wobble-Hypothese.

Zellen haben

mehr

als 32 tRNAs,

von denen

einige identische Anticodons besitzen. In Wirklichkeit kommen in Säugerzellen über 150 tRNAs vor. Einige Organismen enthalten einzigartige tRNAs, die mit Selenocystein (Sec) oder anderen ungewöhnlichen Aminosäuren beladen werden (Exkurs 27.2). Die am häufigsten verwendeten Codons entsprechen den am häufigsten verwendeten tRNAs Die Basensequenzanalyse einiger stark exprimierter Strukturgene der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae hat eine bemerkenswerte Eigenschaft ihres Codongebrauchs aufgedeckt. Nur 25 der 61 codierenden Tripletts werden üblicherweise genutzt. Die bevorzugten Codons sind diejenigen, die fast vollständig den Anticodons - im Watson-Crick Sinne — komplementär sind, die in dem jeweils am häufigsten vorkommenden Vertreter in jedem Satz isoakzeptierender tRNAs anzutreffen sind. Ein

ähnliches Phänomen tritt in E. coli auf, obwohl einige seiner bevorzugten 22 Codons sich von denen der Hefe unterscheiden. Das Ausmaß, in dem die bevorzugten Codons in einem gegebenen Gen vorkommen, korreliert in beiden Organisınen streng mit dem Grad der Expression des Gens. Dies ermöglicht es wahrscheinlich, dass die mRNAs von Proteinen, die in großer Anzahl benötigt werden, schnell und reibungslos translatiert werden können.

3

Ribosomen

Ribosomen sind kleine Organellen, von denen man ursprünglich glaubte, dass sie Artefakte des Zellaufschlusses seien. Im Jahre 1955 wurden sie von Paul Zamecnik als Orte der Proteinbiosynthese identifiziert. Er zeigte, dass '*C-mark-

1069

Ribosomen

iehBR SE u

Fe

nr

Ay

Biochemie im Fokus des genetischen Codes

Man liest oft, dass Proteine aus 20 „Standard“-Aminosäuren

aufgebaut sind. Es gibt aber zwei weitere Aminosäuren, die während der Translation in Proteine eingebaut werden können (andere nichtstandardmäßige Aminosäurereste in Proteinen sind das Ergebnis von posttranslationalen Modifikationen). In diesen beiden Fällen werden die Aminosäuren auf eine ganz besondere tRNA geladen, die ein Stoppcodon erkennt. Mehrere eu- und prokaryotische Enzyme enthalten die spezielle Aminosäure Selenocystein (Sec):

4 bp statt 5 bp und ihr Anticodon, UCA, erkennt ein UGAStoppcodon anstelle eines Ser-Codons. Zusätzlich sind einige der in anderen tRNAs invarianten Reste in tRNA°“ verändert. Diese Veränderungen erklären, warum tRNA°“ nicht von EF-

Tu-GTP erkannt wird, welcher andere Aminoacyl-{RNAs zum

Ribosom geleitet (Abschnitt 27.4B). Somit ist ein bestimmtes Protein (ein spezieller Elongationsfaktor) namens SELB im Komplex mit GTP erforderlich, um Sec-tRNA°° dem Ribosom zuzuführen. SELB-GTP-Sec-tRNA°“ liest das UGA-Codon als „sec“ anstatt als „Stopp“, vorausgesetzt, dass die entspre-

chende ribosomal gebundene mRNA eine Haarnadelschleife auf der 3’-Seite des UGA-spezifizierenden Sec hat. Methylamin-Methyltransferase aus Archaea enthält die spezielle Aminosäure Pyrrolysin (Pyl) — ein Lysin, dessen eStickstoff über eine Peptidbindung mit einer Pyrrolingruppe verknüpft ist.

Selenocystein(Sec)-Rest

Man nimmt an, dass die Sec-Reste der Selenoproteine an Redoxreaktionen beteiligt sind, z.B. an solchen, die bei Säugern von der Glutathion-Peroxidase (Exkurs 15.4) und der Thioredoxin-Reduktase (Abschnitt 23.3A) katalysiert werden. Aus diesem Grund ist Selen ein essentielles Spurenelement. Das menschliche Genom codiert schätzungsweise 25 Selenoproteine. Selenocystein wird manchmal

als „einundzwanzigste Ami-

nosäure“ bezeichnet. Es wird mithilfe einer tRNA in Proteine eingebaut, die das UGA-Stoppcodon als ein Sec-Codon interpretiert. Zunächst wird tRNA°“ mit Serin beladen, und zwar über eine Reaktion, die von der gleichen SerRS katalysiert wird, die auch tRNA°” belädt. In die daraus entstehende

Ser-tRNA°“ wird enzymatisch Selen eingebaut, sodass Selenocysteinyl-IRNA°° resultiert. Obwohl tRNA°“ der tRNA°“ soweit ähneln muss, dass sie mit derselben SerRS in Wechselwirkung treten kann, hat ihr Akzeptorstamm 8 bp (statt 7) und ihr D-Arm einen Stamm aus 6 bp sowie eine Schleife aus 4 Basen (statt eines 4 bp langen Stamms und einer Schleife aus 7 bis 8 Basen). Ihr TıpC-Stamm besteht aus

i

m

Eng,

CC

CH

NEE.

e=0

N

|

:

N

Pyrrolysin(Py]l)-Rest

Pyl wird vom Codon UAG (normalerweise ebenfalls ein Stoppcodon) spezifiziert. Der Unterschied zwischen tRNA”" und den übrigen typischen tRNAs besteht darin, dass sie einen Anticodonstamm mit 6 statt 5 bp hat. Die tRNA wird durch eine spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetase beladen, die sich von den bekannten Lysyl-tRNA-Synthetasen unterscheidet. Weil PyIRS relativ schnell tRNA”! mit Pyrrolysin belädt, ist nicht klar, ob das Substrat für die Aminoacylierung

Lysin ist, das dann später verändert wird, oder präformiertes Pyrrolysin. Die mRNA-Signale, die es ermöglichen, dass UAG als Pyl-Codon statt als Stoppcodon gelesen wird, hat man bis jetzt noch nicht aufgeklärt.

ierte Aminosäuren vorübergehend mit Ribosomen assoziiert sind, bevor sie als freie Proteine vorliegen. Das Ribosom ist sowohl enorm groß (rund 2500 kD in E. coli und 3900 bis 4500 kD in Eukaryoten) als auch komplex aufgebaut (Ribosomen enthalten einige große RNA-Moleküle und Dutzende verschiedener Proteine). Diese Komplexität beim Ribosom ist notwendig, um die folgenden Funktionen auszuführen: 1, Das Ribosom bindet mRNA, damit deren Codons mit hoher Genauigkeit gelesen werden können. Das Ribosom besitzt spezifische Bindungsstellen für tRNA-Moleküle. Das Ribosom steuert die Wechselwirkungen nicht ribosomaler Proteinfaktoren, welche die Initiation, Elongation und Termination der Polypeptidkette ermöglichen. Das Ribosom katalysiert die Ausbildung der Peptidbindung.

1070

Proteinbiosynthese 5.

Das Ribosom wandert entlang der mRNA, dons translatiert werden können.

sodass aufeinander folgende Co-

A. _ Das prokaryotische Ribosom besteht aus zwei Untereinheiten Ribosomenbestandteile werden traditionsgemäß nach ihrer Sedimentationsgeschwindigkeit während einer Ultrazentrifugation klassifiziert. Diese Sedimentationsgeschwindigkeit korreliert grob mit der Größe der Partikel (Abschnitt 21.1C). Das intakte Ribosom aus E.coli hat einen Sedimentationskoeffizienten von 70S. Wie James Watson entdeckte, kann das Ribosom in zwei ungleiche Untereinheiten zerfallen (Tabelle 27.4). Die kleine (30S) Untereinheit besteht aus einem 16S-rRNA-Molekül und 21 verschiedenen Proteinen, wohingegen die große (50S) Untereinheit eine 5S- und eine 23S-rRNA enthält und dazu noch 31 verschiedene Proteine. Gemäß einer Vereinbarung werden die ribosomalen Proteine der kleinen bzw. großen Untereinheit mit S (von small) bzw. L (von large) benannt, gefolgt von einer Zahl, welche die absteigende Rangfolge der entsprechenden Größen wiedergibt. Die Größe dieser Proteine schwankt zwischen 46 und 557 Resten. Jedes Protein kommt nur einmal vor. Eine Ausnahme bildet L12, das viermal vertreten ten dieser Proteine weisen nur geringe Sequenzähnlichkeiten auf, sie sind reich an den basischen Aminosäuren Lys und Arg einige wenige aromatische

Reste, wie man

pro Ribosom ist. Die meisuntereinander und enthalten

es für Proteine erwartet, die eng

mit polyanionischen RNA-Molekülen assoziiert sind. Die bis zu 20.000 Ribosomen in einer E.coli-Zelle machen etwa 80% deren RNA-Gehalts und 10% von deren Proteinen aus. Ribosomale RNAs haben komplizierte Sekundärstrukturen

Die von Harry Noller sequenzierte 16S-rRNA von E. coli besteht aus 1542 Nucleotiden. Eine Überprüfung dieser Sequenz auf stabile doppelhelicale Segmente mithilfe eines Computerprogramms ergab viele plausible, aber sich oft gegenseitig ausschließende

Sekundärstrukturen.

Unter

der Annahme,

dass

sich die

Struktur während der Evolution konserviert hat, führte man Sequenzvergleiche von 16S-rRNAs verschiedener Prokaryoten durch. Diese ergaben die blütenartige Sekundärstruktur für die 16S-rRNA, die in Abbildung 27.12a zu sehen ist. Diese aus vier Domänen bestehende Struktur enthält zu 54% Basenpaarungen. Die Tab. 27.4

Komponenten des E. coli-Ribosoms.

Ribosom

Kleine Untereinheit

Große Untereinheit

Sedimentationskoeffizient

708

308

50S

Masse (kD)

2520

930

1590

16 S, 1542 Nucleotide

23 S, 2904 Nucleotide

RNA

groß klein RNA-Masse

5 S, 120 Nucleotide (kD)

Massenanteil

1664

560

1104

66%

60%

70%

21 Polypeptide

31 Polypeptide

Proteine Proteinmasse (kD)

857

370

487

Massenanteil

34%

40%

30%

Ribosomen

1071

Dom Ill

5S-RNA EI

kleine 3' Domäne

16S-RNA

doppelhelicalen Stämme sind eher kurz ( C-Terminus

Peptidzahl, ß-Kette

Ruun= wi

a

(0)

oo

u

| Ren

®H Menge Relative an

|

a

‘NH,

|

er

BE

R.—CH

|

NH

|

Abb. 27.20 Nachweis dafür, dass die Polypeptidsynthese vom N- zum C-Terminus voranschreitet. Kaninchen-Reticulocyten wurden über die ange-

gebenen Zeiträume mit [’H]-Leucin inkubiert. tRNA (n+1)

Peptidyl-IRNA

Ribosomale Peptidyl-Transferase-Reaktion, die zur Ausbildung Abb. 27.21 einer Peptidbindung führt. Die Aminogruppe der Aminoacyl-tRNA der A-Stelle ersetzt über eine nucleophile Substitution die tRNA der Peptidyl-tRNA in der P-Stelle; dabei wird eine neue Peptidbindung gebildet und die wachsende Peptidkette zur A-Stelle transferiert.

Die Kurven zeigen die Verteilung von [PH]-Leu in den Peptiden, die durch Behandlung der ß-Untereinheit des löslichen Kaninchen-Hämoglobins mit Trypsin entstanden sind. Die Zahlen auf der X-Achse entsprechen charakteristischen Peptiden. Sie sind vom N- zum C-Terminus hin angeordnet. [Nach Dintzis, H.M., Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 255

(1961)]

1073

_Proteinbiosynthese

Abb. 27.22 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Polysomen aus der Seidendrüsenzelle der Seidenraupe Bombyx mori. Das 3’-Ende der mRNA befindet sich auf der rechten Seite. Die Pfeile markieren SeidenfibroinPolypeptide. Balken = 0,1 um. [Mit freundlicher Genehmigung von Oscar L. Miller, Jr. und Steven McKnight, University of Virginia.)

Ribosomen lesen die mRNA in 5'—3'-Richtung. Dies wurde durch die Verwendung eines zellfreien, proteinsynthetisierenden Systems und einer mRNA bewiesen, die aus Poly(A) mit einem 3’-terminalen C bestand. 5’ A-A-A- ee 0 -A-A-A-C 3’

Ein solches System synthetisiert Poly(Lys), das ein C-terminales Asn trägt: H3;N+-Lys-Lys-Lys- » « « -Lys-Lys-Asn-CO0”

Zusammen mit dem Wissen, dass AAA und AAC Lys bzw. Asn codieren (Tab. 27.1), und der Kenntnis über die Polarität der Polypeptidsynthese war so der Beweis erbracht, dass die mRNA in 5’—3’-Richtung abgelesen wird. Da die mRNA auch in 5’ — 3'-Richtung synthetisiert wird, können prokaryotische Ribosomen die Translation an naszierender mRNA beginnen. Dies ist bei Eukaryoten nicht möglich, weil die Kernmembran den Ort der Transkription (Zellkern) von dem Ort der Translation (Cytosol) trennt. Die aktive Translation erfolgt an Polysomen. Sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten können viele Ribosomen an ein einziges RNA-Transkript binden und sind so in einer Perlenkettenstruktur angeordnet, die man Polyribosom oder Polysom nennt (Abb. 27.22). Die einzelnen Ribosomen sind durch 5 bis 15 nm breite Zwischenräume voneinander getrennt, woraus eine maximale Dichte von einem Ribosom auf rund 80 Nucleotide resultiert. Polysomen entstehen, wenn ein aktives Ribosom seine Initiationsstelle auf der mRNA

geräumt

hat und ein zweites Ribosom dort die Synthese beginnt.

A.

6% siehe Guided Exploration 28: Translational Initiation.

Ketteninitiation

Der erste Hinweis darauf, wie Ribosomen die Polypeptidsynthese initiieren, war die Beobachtung, dass fast die Hälfte aller E. coli-Proteine mit der eher seltenen Aminosäure Methionin beginnen. Tatsächlich ist die tRNA, welche die Translation initiiert, eine eigentümliche Form von Met-tRNA”“, bei welcher der MetRest N-formyliert ist:

S—CH,

CM, oO

um 6)

us NH ER

OIRNA,

N-Formylmethionin-IRNAM® (fMet-tRNAM®t)

Translation

1079

Da der N-Formylmethioninrest (fMet) bereits eine Amidbindung enthält, kann er nur den N-terminalen Rest des Polypeptids bilden. E.coli-Proteine werden posttranslational durch Deformylierung ihres fMet-Rests und bei vielen Proteinen durch die darauf folgende Entfernung ihres N-terminalen Met-Rests modifiziert. Diese Prozessierung erfolgt normalerweise am entstehenden Polypeptid, was die Beobachtung erklärt, dass allen reifen E. coli-Proteinen fMet fehlt. Die tRNA, die das Initiationscodon erkennt, tRNAY“, unterscheidet sich von

der tRNA, die die internen Met-Reste trägt, IRNAM“, obwohl beide dasselbe AUG-Codon erkennen. Offensichtlich sind die Konformationen dieser tRNAs so verschieden, dass es dadurch möglich ist, sie in der Ketteninitiations- und Elongationsreaktion zu unterscheiden. In E.coli wird unbeladene tRNA}'“ zunächst mit Met aminoacyliert; dies geschieht durch dieselbe

MetRS,

die auch tRNAM“

belädt.

Die resultierende

Met-tRNAY'“ wird spezifisch durch eine Transformylase mit N!°-Formyltetrahydrofolat (Abschnitt 21.4D) als Formyldonator N-formyliert, wodurch fMet-tRNA!“ entsteht. Diese Transformylase erkennt Met-IRNAM“ nicht.

Basenpaarung zwischen mRNA und der 16S-rRNA hilft bei der Selektion der Translationsinitiationsstelle AUG codiert internes Met sowie das Initiations-Methionin eines Polypeptids. Darüber hinaus enthalten mRNAs üblicherweise viele AUG- (und GUG-Sequenzen) innerhalb verschiedener Leseraster. Damit ist klar, dass die Startstelle der Translation durch mehr als nur das Initiationscodon spezifiziert sein muss. In E.coli enthält die 16S-rRNA eine pyrimidinreiche Sequenz an ihrem 3’Ende. Wie John Shine und Lynn Dalgarno im Jahre 1974 zeigten, ist diese Sequenz teilweise komplementär zu einem purinreichen Abschnitt aus 3 bis 10 Nucleotiden, der Shine-Dalgarno-Sequenz, deren Zentrum sich bei nahezu allen bekannten mRNAs ca. 10 Nucleotide stromaufwärts vom Startcodon befindet (Abb. 27.23). Offensichtlich ermöglichen Basenpaarungswechselwirkungen zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz einer mRNA und der 16S-rRNA dem Ribosom, das richtige Startcodon auszuwählen. Die Röntgenstruktur des 70S-Ribosoms zeigt in Übereinstimmung mit Abbildung 27.13b, dass ein RNA-Abschnitt aus 30 Nucleotiden in eine Furche eingebettet ist, die den Hals der 30S-Untereinheit umgibt (Abb. 27.24). Die mRNACodons in der A- und P-Stelle sind auf der Kontaktfläche der 30S-Untereinheit exponiert, wohingegen ihr 5’- und ihr 3’-Ende in aus RNA und Protein bestehenden Tunneln verborgen sind. Die Shine-Dalgarno-Sequenz der mRNA befinInitiationscodon

araB galE lacI lacZ

- UUUGGAUGGAGUGAAACGAUGGCGAUU -AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUGAGAGUU - CAAUUCAGGGUGGUGAUUGUGAAACCA- UUCACACAGGAAACAGCUAÄAUGACCAUG-

-UAACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCUAAG QB-Phagen-Replikase &6X174-Phagen-A-Protein - AAUCUUGGAGGCUUUUUUAUGGUUCGU R17-Phagen-Hüllprotein Ribosomales S12

Ribosomales L10 trpE trp Leitpeptid

- UCAACCGGGGUUUGAAGCAUGGCUUCU- AAAACCAGGAGCUAUUUAAUGGCAACA - CUACCAGGAGCAAAGCUAAUGGCUUUA -CAAAAUUAGAGAAUAACAAUGCAAACA- GUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCA-

3°-Ende der 16S-rRNA

Abb. 27.23

Einige Translationsinitiationssequenzen, die von E. coli-Ribosomen erkannt werden.

Die RNAs sind gemäß ihrer Startcodons angeordnet (blau schattiert). Berücksichtigt man

G : U-Paare, dann sind ihre Shine-Dalgarno-Sequenzen

(rot schattiert) einem Abschnitt am

3’-Ende der 16S-rRNA (unten) komplementär. [Nach Steitz, ]. A., in Chambliss, G., Craven, G.R., Davies, J., Davis, K., Kahan, L. und Nomura,

M. (Hrsg.), Ribosomes. Structure, Function and

Genetics. S. 481-482, University Park Press (1979).]

Abb. 27.24 Weg der mRNA durch die 30SUntereinheit aus T. thermophilus. Die Ansicht zeigt die Kontaktfläche der kleinen zur großen ribosomalen Untereinheit. Die 16S-rRNA ist türkis, die mRNA

in Schlangenform dargestellt,

wobei ihre Codons an der A- und an der P-Stelle orangefarben bzw. rot sind, die Shine-DalgarnoHelix (die einen Abschnitt der 16S-rRNA enthält) ist magentafarben und die restlichen Abschnitte sind gelb. Die ribosomalen Proteine, die teilweise den Eingangs- und Ausgangstunnel für die mRNA bilden, sind grün und purpur gefärbt. Die restlichen

ribosomalen Proteine sind der Übersicht halber weggelassen. [Mit freundlicher Genehmigung von Gloria Culver, lowa State University. Nach einer Röntgenstruktur von Harry Noller, University of California at Santa Cruz. PDBid 1)GO.]

1080

Proteinbiosynthese

det sich in der Nähe ihres 5’-Endes. Sie ist wie erwartet mit der Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz der 16S-rRNA gepaart, die in der Nähe der E-Stelle sitzt. Die Proteine, die zum Teil den Tunnel bilden, durch den die mRNA in das Ribosom gelangt (grün in Abb. 27.24), fungieren wahrscheinlich als Helicase und entwinden die mRNA. Ansonsten würde die Interaktion mit der tRNA behindert. Zur Initiation werden lösliche Proteinfaktoren benötigt Die Initiation der Translation bei E.coli ist ein komplexer Prozess: Die beiden Ribosomenuntereinheiten und die fMet-IRNAf" lagern sich mit. einer korrekt

ausgerichteten mRNA zu einem Komplex zusammen, der die Kettenverlängerung einleiten kann. Dieser Prozess benötigt zudem Initiationsfaktoren, die nicht permanent mit dem Ribosom assoziiert sind. In E. coli gibt es drei solche Initiationsfaktoren, IF-1, IF-2 und IF-3 (Tabelle 27.6). _ Die Initiation der Translation erfolgt bei E. coli in drei Stufen (Abb. 27.25): 1. Nach der Beendigung eines Polypeptidsynthesecyclus bleiben die 30S- und die 50S-Untereinheit als inaktives 70S-Ribosom verbunden. IF-3 bindet an die 30S-Untereinheit und fördert damit den Zerfall dieses Komplexes. 2. Daraufhin binden mRNA und IF-2 in einem ternären Komplex mit GTP und fMet-tRNAY zusammen mit IF-1 in beliebiger Reihenfolge an die 30S-Untereinheit. Da der ternäre Komplex, der fMet-tRNAY“ enthält, vor der mRNA an das Ribosom binden kann, kann die fMet-tRNAf"-Bindung nicht über eine Codon-Anticodon-Wechselwirkung vermittelt werden. Es ist die einzige tRNA-Ribosom-Assoziation, die keine Codon-Anticodon-Wechselwirkung benötigt, obwohl eine solche die Bindung von fMet-IRNAf“ an das Ribosom begünstigt. IF-1 bindet in der A-Stelle und verhindert somit vermutlich die ungewollte Bindung einer tRNA. In diesem Stadium der Initiation wird Tab. 27.6

Die löslichen Proteinfaktoren der Proteinbiosynthese bei E. coli.

Faktoren

Länge in

Funktion

. Amino-

an

J

säureresten“ a

a

re

VE

EEE

ir

En

ERENE RE NE

Initiationsfaktoren

IF-1

71

unterstützt die Bindung von IF-3

IF-2

890

bindet Initiator-tRNA und GTP

IF-3

180

setzt die 30S-Untereinheit vom inaktiven Ribosom frei

und hilft bei der mRNA-Bindung

Elongationsfaktoren EF-Iu

393

bindet Aminoacyl-tRNA und GTP

EF-Is

2832

verdrängt GDP von EF-Tu

EF-G

703

fördert die Translokation durch Bindung von GTP an das Ribosom und dessen Hydrolyse

RF-1

360

erkennt die Stoppcodons UAA und UAG

RF-2

365

erkennt die Stoppcodons UAA und UGA

RF-3

528

bindet GTP und stimuliert die RF-1- und RF-2-Bindung

RRF

185

Freisetzungsfaktoren (release factors)

induziert die Dissoziation des Ribosoms in kleine und

große Untereinheit, gemeinsam mit EF-G * Alle Faktoren sind monomere

Proteine in E. coli.

Translation Abb. 27.25

bei E. coli.

a

_30S-Unte

inaktives 70S-Ribosom

nsie

a a

Shine-DalgarnoSequenz

SEE

m

AUG

3°

=

IF-2-GTP - fMet -tRNA? Met oe. ®

+

70S-Initiationskomplex

auch IF-3 aktiv: Er verhindert die Bindung aller anderen tRNAs, ausgenommen fMet-tRNAM“. Schließlich verbinden sich in einem Prozess, dem die Ablösung von IF-1 und IF-3 vorausgeht, die 50S-Untereinheit und der 30S-Initiationskomplex derart, dass IF-2 dazu stimuliert wird, sein gebundenes GTP zu GDP und

Verlauf der Translationsinitiation

1031

1082

_Proteinbiosynthese

P; zu hydrolysieren. Bei dieser irreversiblen Reaktion ändert sich die Konformation der 30S-Untereinheit und IF-2 wird für eine weitere Initiationsreaktion freigesetzt.

Das Ergebnis der Initiation ist die Bildung eines JMet-tRNAF" mRNA-Ribosom-Komplexes, bei dem fMet-t*RNAY” die P-Stelle des Ribosoms besetzt, während die A-Stelle zur Aufnahme der nächsten Aminoacyl-{RNA bereitsteht (eine Anordnung, die derjenigen bei der Beendigung einer Elongationsrunde entspricht; Abschnitt 27.4B). Man beachte, dass die tRNAY“ die einzige tRNA ist, die direkt an die P-Stelle

bindet. Alle anderen tRNAs müssen während der Kettenverlängerung zuerst an die A-Stelle binden. Bei Eukaryoten ist die Initiation weit komplizierter als bei Prokaryoten

Abb. 27.26 Röntgenstruktur des elF4E der Maus im Komplex mit dem m’G-Kappe-Analogon

m’GDP. Das Protein ist von seiner lösungsmittelzugänglichen Seite gezeigt und entsprechend seinem elektrostatischen Potential gefärbt (rot negativ, blau positiv und weiß neutral). Das m’GDP ist in Stabform gezeichnet, mit C grün, N blau, © rot und P gelb. Die beiden Trp-Reste, die an die m’G-Base binden, sind markiert, ebenso der Lys- und SerRest, welche die vermeintliche mRNA-Bindungstasche flankieren (gelber Pfeil). [Mit freundlicher Genehmigung von Nahum Sonenberg, McGill University, Montreal. PDBid 1EJ1.]

Bei Eukaryoten erfordert die Initiation der Proteinbiosynthese die Mitwirkung von mindestens 11 Initiationsfaktoren (als eIFn bezeichnet; „e“ steht für eukaryotisch), die aus 26 Polypeptidketten bestehen. Trotzdem sind die Schritte 1 und 3 des prokaryotischen Prozesses (Abb. 27.25) oberflächlich betrachtet ähnlich wie bei Eukaryoten. Aber die Art und Weise, auf die das Startcodon der mRNA bei Eukaryoten identifiziert wird, ist grundlegend anders als bei Prokaryoten. Die Paarung der Initiator-tRNA mit dem Startcodon AUG an der P-Stelle des Ribosoms beginnt mit eIF2, einem Heterotrimer im Komplex mit GTP. Die Initiator-tRNA wird von eIF2 zum Komplex aus der 40S-Untereinheit und mehreren anderen Initiationsfaktoren geleitet. Dabei bildet sich der 43S-Präinitiationskomplex (ein Prozess, der Schritt 2 in der prokaryotischen Initiation ähnelt, aber ohne mRNA). Die Initiator-RNA ist tRNAY“ („i“ steht für Initiator). Ihr angehängter Met-Rest ist nicht formyliert wie bei Prokaryoten. Trotzdem sind beide Arten der Initiator-IRNA in vitro leicht gegeneinander austauschbar. Eukaryotische mRNAs besitzen keine der Shine-Dalgarno-Sequenz vergleichbaren Regionen, um die 18s-rRNA zu binden. Stattdessen unterliegt der Erkennung des AUG-Startcodons auf der mRNA ein gänzlich anderer Mechanismus. Eukaryotische mRNAs haben nahezu alle eine 7-Methylguanosin-(m’G-)Kappe und einen Poly(A)-Schwanz (Abschnitt 26.3A). Sie sind ausnahmslos monocistronisch und initiieren die Translation nahezu immer an ihrem führenden AUG. Dieses AUG, das am Ende einer nichttranslatierten 5’-Region von 50 bis 70 Nucleotiden vorkommt, ist in die Konsensussequenz GCCRCCAUGG eingebettet (sogenannte Koszak-Sequenz). Veränderungen des Purins (R), 3 Nucleotide vor AUG, und des G, das unmittelbar auf AUG folgt, reduzieren die Effizienz der Translation jeweils um das zehnfache. Die Erkennung der Startstelle beginnt mit der Bindung des eIF4F an die m’G-Kappe der mRNA. eIFA4F ist ein heterotrimerer Komplex aus eIF4E, eIF4G und eIF4A (alle Monomere), in dem eIF4E (auch als Kappenbindungsprotein bezeichnet) die m’G-Kappe der mRNA erkennt und eIF4G als Gerüst dient, um eIF4E mit eIF4A zu verbinden. Die Struktur von elF4E im Komplex mit m’GDP zeigt, dass das Protein die m’G-Base bindet, indem es sie zwischen zwei hoch konservierte Trp-Reste in einer Region schiebt, die einem positiv geladenen Spalt benachbart ist, der vermutlich die mRNA-Bindungsstelle darstellt (Abb. 27.26). Die m’G-Base wird spezifisch durch Wasserstoffbrücken zu Proteinseitenketten erkannt, und zwar auf eine Weise, die an die G.C-Basenpaarung erinnert; eIF4G bindet auch das

Poly(A)-Bindeprotein (PABP; Abschnitt 26.3A), das den Poly(A)-Schwanz der mRNA umhüllt und dabei die mRNA zirkularisiert. Obwohl dies den Synergismus zwischen der m’G-Kappe der mRNA und ihrem poly(A)-Schwanz hinsichtlich der Translationsinitiation erklärt, ist die Funktion des Rings unklar. Eine plausible Hypothese besagt, dass der Ring das Ribosom, nachdem es die Translation der mRNA abgeschlossen hat, dazu befähigt die Translation erneut zu beginnen, ohne dass es zerfallen und wieder zusammengesetzt werden muss. Eine andere Erklärung wäre, dass der Ring die Translation unvollständiger (gebrochener) mRNAs verhindern könnte.

Translation

1083

Mit dem eIF4F-mRNA-Komplex verbinden sich anschließend mehrere weitere Initiationsfaktoren. Der resultierende Komplex assoziiert mit dem 43S-Präinitia‚tionskomplex, der dann in einem ATP-gespeisten Prozess die mRNA abtastet, bis er auf das AUG-Startcodon der mRNA stößt und dabei den 48S-Initiationskomplex bildet. Die Erkennung des AUG-Codons spielt sich hauptsächlich über die Basenpaarung mit dem CUA-Anticodon der gebundenen Met-tRNA”“ ab. Dies wurde nachgewiesen, indem man das Anticodon veränderte, was zur Erkennung eines neuen komplementären Codons anstelle von AUG führte. Analog zu Schritt 3 der Initiation bei Prokaryoten (Abb. 27.25) induziert die elF2-katalysierte Hydrolyse des gebundenen GTP die Freisetzung aller Initiationsfaktoren aus dem 48S-Initiationskomplex. Die 60S-Untereinheit wird — durch Vermittlung von elF5B (ein Monomer und Homolog des prokaryotischen IF-2) - in einer GTP-abhängigen Reaktion mit dem resultierenden 40S-Untereinheit-Met-tRNA}*-Komplex verbunden. Dabei entsteht der ribosomale 80SInitiationskomplex. 62 siehe Guided Exploration 29:

B.

Das Ribosom dechiffriert die mRNA, katalysiert die Bildung der Peptidbindung und geht dann zum nächsten Codon weiter

Ribosomen verlängern Polypeptidketten in einem dreistufigen Reaktionscyclus

(Abb. 27.27):

1. Dechiffrierung, bei der das Ribosom eine Aminoacyl-tRNA auswählt und bindet. Deren Anticodon ist komplementär zum Codon der mRNA an der A-Stelle. EF-Ts

GIE

Translational Elongation.

Abb. 27.27 Elongationscyclus bei E. coli-Ribosomen. Die E-Stelle ist nicht gezeigt. Die eukaryotische Elongation läuft in einem ähnlichen Cyclus ab,

aber EF-Tu und EF-Ts werden durch ein Protein aus vielen Untereinheiten, eEFl, ersetzt und eEF2 übernimmt die Funktionen von EF-C.

wachsendes

Polypeptid

EF-Tu.EF-Ts

EF-Tu.GTP

GDP

Aminoacyl-tRNA

EF -Ts PeptidyI-tRNA

Aminoacyl-

EF-Tu.GDP

Aminoacyl-tRNA .

tRNA

EF-Tu.GTP

Dechiffrierung

1 A-Stelle

2

3 Translokation

+GDP+P;

Transpeptidierung

P-Stelle

j PeptidyI-tRNA

unbeladene !

tRNA

tRNA

GTP

A-Stelle

1084

_ Proteinbiosynthese

2. Transpeptidierung oder Bildung der Peptidbindung, bei der die Peptidylgruppe von der tRNA in der P-Stelle auf die Aminoacylgruppe an der A-Stelle übertragen wird. 3. Translokation, bei der die an der A- bzw. P-Stelle befindlichen tRNAs — zusammen mit der gebundenen mRNA - entsprechend an die P- bzw. E-Stelle befördert werden. Die mRNA rastet somit gemeinsam mit den gepaarten tRNAs um ein Codon am Ribosom weiter. Dieser Vorgang spielt sich mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 20 Aminosäureresten pro Sekunde ab und erfordert mehrere nichtribosomale Proteine, die man als Elongationsfaktoren bezeichnet (Tabelle 27.6). Dechiffrierung: Eine Aminoacyl-tRNA bindet an die ribosomale A-Stelle Im ersten Schritt des Elongationscyclus von E.coli verbindet sich ein dualer Komplex aus GTP und dem Elongationsfaktor EF-Tu mit einer aminoacylierten RNA (aa-tRNA). Der resultierende ternäre Komplex bindet an das Ribosom. Die Bindung der aa-tRNA im Codon-Anticodon-Komplex an die ribosomale A-Stelle ist von der Hydrolyse von GTP zu GDP begleitet, sodass EF-Tu-GDP und P; freigesetzt werden. Der EF-Tu-GTP-Komplex wird regeneriert, wenn GDP durch

den Elongationsfaktor EF-Is vom EF-Tu:GDP verdrängt wird, der wiederum durch GTP verdrängt wird. Aminoacyl-tRNA kann zwar auch ohne EF-Tu an die ribosomale A-Stelle binden, aber die Geschwindigkeit der spontanen Bindung ist zu langsam, um ein Zellwachstum zu ermöglichen. Die Bedeutung von EF-Tu zeigt sich darin, dass es das am häufigsten vorkommende Protein in E.coli ist. Es liegt mit ca. 100.000 Exemplaren pro Zelle vor (> 5% der Proteine einer Zelle), was ungefähr der Zahl an tRNA-Molekülen in der Zelle entspricht. Folglich liegen alle Aminoacyl-{RNAs einer Zelle ständig im Komplex mit EF-Tu vor. Brian Clark und Jens Nyborg bestimmten die Röntgenstrukturen von bakteriellem EF-Tu im Komplex mit Phe-tRNA”” und dem nicht hydroylsierbaren GTP-Analogon Guanosin-5’-(ß,y-imido)triphosphat (GMPPNP; alternativ

GDPNP; Abb. 27.28).

a

6) I Oz

a

0 |

ae

Oz

6) |

G o

Oz

HH H

H OH

OH

Guanosin-5’-(ß,y-imido)triphosphat

(GDPNP) Abb. 27.28 Röntgenstruktur des ternären Komplexes aus Phe-tRNA”", Thermus aquaticusEF-TU und GMPPNP der Hefe. EF-Tu ist in Bänderform gezeigt und in den Spektralfarben gefärbt, wobei der N-Terminus

blau

und der C-Terminus rot ist. Die tRNA ist in Stabform dargestellt und je nach Atomtyp gefärbt: C ist grün, N blau, O rot und P orange, ein orangefarbenes Stäbchen verbindet aufeinanderfolgende P-Atome. Das an die tRNA gebundene Phe und das an EF-Tu gebundene GMPPNP sind als Kalottenmodell gezeigt, wobei die C-Atome türkis bzw. gelb sind. Zwei gebundene Mg’*-Ionen sind durch magentafarbene Kugeln wiedergegeben. [Nach einer Röntgenstruktur von Jens Nyborg, University

of Aarhus, Ärhus. PDBid 1TTT.]

Dieser Komplex hat eine korkenzieherartige Struktur, in der EF-Tu und der Akzeptorstamm der tRNA einen knaufähnlichen Griff und die AnticodonHelix der tRNA eine Schraube bilden. Die Makromoleküle scheinen über hauptsächlich drei Regionen relativ schwach verbunden zu sein: (1) Das 3’-CCA-PheSegment der Phe-tRNA”" bindet an den Spalt zwischen Domäne 1 und 2 von EF-Tu-GMPPNP (die blaue und grüne, hauptsächlich helicale Domäne und die gelbe ß-Faltblattdomäne in Abb. 27.28), (2) das 5’-Phosphat der tRNA bindet in einer Vertiefung an der Verbindungsstelle der drei Domänen von EF-Tu und (3) eine Seite des TyyC-Stamms der tRNA bildet Kontakte mit der exponierten Hauptkette und den Seitenketten der EF-Tu-Domäne 3 aus (die orangefarbene P-fasshaltige Domäne in Abb. 27.28). EF-Tu bindet alle aminoacylierten tRNAs, aber keine unbeladenen tRNAs oder Initiator-tRNAs. Die enge Interaktion zwischen der Aminoacylgruppe und EF-Tu erhöht offenbar stark dessen Affinität zu der ansonsten nur locker gebundenen tRNA. Die Initiator-RNAY" weist einen 5 Nucleotide langen 3’-Überhang auf

Translation

und bindet deshalb nicht an EF-Tu - im Gegensatz zu den Elongator-tRNAs, die einen nur 4 Nucleotide langen 3’-Überhang aufweisen. Diese Tatsache, zusam. men mit der Formylgruppe an ihrem fMet-Rest, hindert fMet-tRNA!“ offensichtlich dran, an EF-Tu zu binden und erklärt auch, warum die InitiatortRNA niemals interne AUG-Codons akzeptiert. EF-Tu ist ein G-Protein, das eine starke Konformationsänderung erfährt, wenn sein GTP hydrolysiert wird. Seine N-terminale Domäne 1 (blau, türkis und grün in Abb. 27.28) ähnelt anderen G-Proteinen (Abschnitte 13.2B und 13.3B). Die Switch-I- und Switch-II-Regionen signalisieren den Zustand des gebundenen Nucleotids (GTP oder GDP). Die Hydrolyse von GTP verursacht, dass sich Domäne 1 im Verhältnis zu den Domänen 2 und 3 neu ausrichtet: sie führt eine starke Drehung um 91° durch (Abb. 27.29). Diese Konformationsänderung eliminiert damit die tRNA-Bindungsstelle. Da EF-Tu ein G-Protein ist, kann das Ribosom als ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP) klassifiziert werden, und EF-Tu fungiert als sein Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor (engl.: guanine exchange factor, GEF).

1085

Abb. 27.29 Vergleich der Röntgenstrukturen des ribosomalen Elongationsfaktors EF-Tu in seinen Komplexen mit GDP und GMPPNP. Gezeigt ist das C,-Rückgrat mit der Domäne 1,

Das Ribosom überwacht die korrekte Codon-Anticodon-Wechselwirkung Wenn EF-Tu-GTP eine aminoacylierte tRNA (aa-tRNA) an das Ribosom liefert, führt dieser Komplex zuerst das Anticodon-Ende der tRNA in das Ribosom ein. Das Aminoacylende der tRNA wandert erst dann vollständig in die A-Stelle, wenn GTP hydrolysiert wurde und EF-Tu dissoziiert ist. Dieser mehrstufige Prozess erlaubt dem Ribosom zu überprüfen, ob die aa-tRNA sich mit dem Codon der mRNA korrekt gepaart hat. Wie überwacht das Ribosom die Codon-Anticodon-Paarung? Ramakrishnan bestimmte die Röntgenstruktur der 30S-Untereinheit aus T. thermophilus im Komplex mit einem aus sechs U bestehenden Hexanucleotid als „mRNA“ und einer 17 Basenpaare langen RNA, die dem Anticodonarm der tRNAF"® entspricht (Abb. 27.5, allerdings mit nicht modifizierten Nucleotiden). Diese Röntgenstruktur zeigt, wie eine mRNA-spezifizierte tRNA zu Anfang an das Ribosom bindet. Die Codon-Anticodon-Wechselwirkung wird durch ihre Interaktion mit drei allgemein konservierten ribosomalen Basen, A1492, A1493 und G530, stabilisiert (Abb. 27.30). 1. Das erste Codon-Anticodon-Basenpaar, dasjenige zwischen mRNA-Ul und tRNA-A36, wird durch die Bindung der Base A1493 der rRNA in der kleinen Furche des Basenpaars stabilisiert (Abb. 27.30a). 2. Das zweite Codon-Anticodon-Basenpaar, also jenes zwischen U2 und A35, wird durch A1492 und G530 stabilisiert, die beide in der kleinen Furche dieses Basenpaars binden (Abb. 27.305). 3. Das dritte Codon-Anticodon-Basenpaar (das Wobble-Paar; Abschnitt 27.2C), also dasjenige zwischen U3 und G34, wird durch die Bindung von G530 in der kleinen Furche unterstützt (Abb. 27.30c). Die letztgenannte Wechselwirkung scheint nicht so stark zu sein wie diejenige in der ersten und zweiten Codon-Anticodon-Position. Dies steht im Einklang mit der Notwendigkeit, dass

die dritte Codon-Anticodon-Paarung

Nicht-Watson-Crick-Basen-

welches die GTP-Bindungsdomäne ist. Sie ist im GDP-Komplex magenta und im GMPPNP-Komplex rot gefärbt. Die Domänen 2 und 3, die in beiden Komplexen die gleiche Ausrichtung haben, sind grün und türkis abgebildet. Das gebundene GDP und GMPPNP sind skelettartig mit C in Gelb, N in Blau, © in Rot und P in Grün gezeigt. [Mit freundlicher Genehmigung von Morton Kjeldgaard und Jens Nyborg, University of Aarhus, Ärhus. PDBid 1EFT.] 6% siehe Interactive Exercises.

Abb. 27.30 Codon-Anticodon-Wechselwirkungen im Ribosom. Das erste (a), zweite (b) und dritte (c) CodonAnticodon-Basenpaar, wie es in der Röntgenstruk-

tur der 30S-Untereinheit im Komplex mit U, (eine Modell-mRNA) und dem 17 Nucleotide langen Anticodonarm der tRNA”"® (dessen Anticodon GAA ist) von T. thermophilus zu sehen ist. Die Strukturen sind in der Kugel-Stab-Form gezeigt und in ihre halbtransparenten Van-der-WaalsOberflächen eingebettet. Die Codons sind violett, die Anticodons gelb und die rRNA ist braun oder grau, wobei die Atome, die kein C sind, je nach Atomtyp gefärbt sind (N blau, O rot und P grün).

Die Proteinabschnitte sind grau, und die Mg’*Ionen sind durch magentafarbene Kugeln wiedergegeben. [Mit freundlicher Genehmigung von V. Ramakrishnan,

MRC Laboratory of Molecular

Biology, Cambridge. PDBid 11BM.]

paare tolerieren muss (Abschnitt 27.2C).

550 (512) A1492

1086

Proteinbiosynthese

Abb. 27.31 Ribosomale Dechiffrierungsstelle. Die Röntgenstrukturen der 30S-Untereinheit aus T. termophilus (a) alleine und (b) im Komplex mit U6 und der Anticodon-Stammschleife von tRNAP"®. Die RNAs sind als Bänder gezeigt, wobei ihre Basen eine Paddelform haben. Die tRNA ist goldfarben, die mRNA

an der A-Bindungsstelle violett,

die mRNA an der P-Stelle grün, die rRNA grau und die Nucleotide, die eine Konformationsänderung erfahren, sind rot. Protein S12 ist hellbraun und die

Mg?*-Ionen sind durch rote Kugeln dargestellt. [Mit freundlicher Genehmigung von V. Ramakrishnan, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge. PDBids (a) IFJF und (b) 11BM.]

Ein Vergleich dieser Struktur mit der Struktur der 30S-Untereinheit allein zeigt, dass die vorhergehenden rRNA-Nucleotide bei der Bildung eines Codon-Anticodon-Komplexes eine Konformationsänderung erfahren (Abb. 27.31). In Abwesenheit der tRNA stapeln sich die Basen von A1492 und A1493 im Innern einer RNA-Schleife. Dagegen sind diese Basen im Codon-Anticodon-Komplex aus der Schleife herausgeklappt und G530 wechselt von der syn- in die anti-Konformation (Abschnitt 24.1B). All diese Wechselwirkungen erlauben dem Ribosom zu überwachen, ob die eintreffende tRNA zum Codon in der A-Stelle passt. Ein Nicht-Watson-Crick-Basenpaar könnten diese ribosomalen Basen nicht auf die gleiche Weise binden. Tatsächlich ist jede Mutation von A1492 oder A1493 tödlich, weil Pyrimidine in diesen Positionen nicht weit genug reichen würden, um mit dem Codon-Anticodon-Komplex oder G530 in Wechselwirkung zu treten, und weil ein G in einer der beiden Positionen nicht in der Lage wäre, die erforderlichen Wasserstoffbrücken zu bilden - sein N2 würde sterisch kollidieren. Eine nicht korrekte Codon-Anticodon-Wechselwirkung bietet nicht genug Freie Enthalpie, um die tRNA an das Ribosom zu binden. Diese fällt vielmehr vom Ribosom ab -— immer noch im ternären Komplex mit EFTu und GTP. Die GTP-Hydrolyse durch EF-Tu ist eine thermodynamische Vorbedingung für das Korrekturlesen des Ribosoms Eine aminoacylierte tRNA wird vom Ribosom nur nach Vorgabe seines Anticodons ausgewählt — ein Prozess, bei dem man eine Fehlerrate von nur etwa 10° pro Rest gemessen hat. Demgegenüber beträgt der Bindungsenergieverlust durch eine einzige Basenfehlpaarung bei einer Codon-Anticodon-Wechselwirkung schätzungsweise etwa 12 kJ-mol’'. Dieser kann gemäß Gleichung

27.1 also nicht allein für die ribosomale Dechiffriergenauigkeit von weniger als etwa 10°” Fehler pro Codon verantwortlich sein. Offenbar besitzt das Ribosom irgendeinen Korrekturlesemechanismus, der seine Dechiffriergenauigkeit erhöht. Nur wenn der Korrekturleseschritt völlig unabhängig vom anfänglichen Auswahlschritt ist, entspricht die Gesamtfehlerwahrscheinlichkeit dem Produkt der Fehlerwahrscheinlichkeiten der einzelnen Auswahlschritte. Wir haben gesehen,

Translation

1087

dass DNA-Polymerasen und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen die Unabhängigkeit ihrer beiden Auswahlschritte gewährleisten, indem sie diese an getrennten akti‚ ven Zentren ausführen (Abschnitte 25.2A und 27.2B). Allerdings erkennt das Ribosom die eintreffende aa-tRNA nur dadurch, dass ihr Anticodon zum Codon in der A-Stelle komplementär ist. Folglich muss das Ribosom diese Codon-Anticodon-Wechselwirkung irgendwie durch zwei unabhängigen Mechanismen überprüfen. Wie spielt sich dies ab? Kryoelektronenmikroskopische Untersuchungen von Frank zeigen, dass im Ribosom -aa-tRNA-EF-Tu-GTP-Komplex die aa-tRNA eine ansonsten energetisch ungünstige Konformation annimmt, bei der der Anticodonarm sich über eine Gelenkbewegung zum Innern des L der tRNA bewegt hat (die Raumstruktur einer tRNA wird allgemein als L-förmig beschrieben). Die Bildung eines korrekten Codon-Anticodon-Komplexes veranlasst EF-Tu dazu, sein gebundenes GTP zu hydrolysieren und dabei von der aa-tRNA abzufallen. Diese nimmt dann eine energetisch günstigere Konformation an, während sie ihre Codon-Anticodon-Wechselwirkung aufrechterhält. Im Zuge dieser Bewegung klappt der Akzeptorstamm mit seiner angehefteten Aminoacylgruppe ins Zentrum der Peptidyltransferase auf der 50S-Untereinheit (siehe unten). Bei einer unpassenden (fehlgepaarten) aa-tRNA wäre vermutlich die Codon-Anticodon-Wechselwirkung nicht ausreichend stark, um die aa-tRNA während der Konformationsänderung in ihrer Position zu halten - sie würde deshalb vom Ribosom abfallen. Die irreversible GTPase-Reaktion des EF-Tu muss diesem Korrekturleseschritt vorausgehen, weil andernfalls die Ablösung einer unpassenden aa-tRNA (die Freisetzung ihres Anticodons vom Codon) nur einfach die Umkehr des anfänglichen Bindungsschritts wäre; d.h. sie wäre Teil des anfänglichen Auswahlschritts anstatt ein getrennter Korrekturlesevorgang. Die GTP-Hydrolyse liefert somit die Grundlage für ein von der Bindung unabhängiges Korrekturlesen. Es ist der „entropische Preis“, den das System für die exakte Auswahl der tRNA bezahlen muss. Transpeptidierung: Das Ribosom ist ein Ribozym

Im zweiten Schritt des Elongationscyclus (Transpeptidierung; Abb. 27.27) wird die Peptidbindung geknüpft, indem durch die Aminogruppe der 3’-verknüpften Aminoacyl-tRNA aus der A-Stelle eine nucleophile Substitution der P-StellentRNA erfolgt (Abb. 27.21). Die entstehende Polypeptidkette wird dabei an ihrem C-Terminus um einen Rest verlängert und dabei zur tRNA der A-Stelle transferiert. Diese Reaktion läuft ohne aktivierende Cofaktoren wie ATP ab, weil die Esterbindung zwischen dem entstehenden Polypeptid und der tRNA der P-Stelle bereits eine „energiereiche“ Bindung ist. Das Peptidyltransferase-Zentrum, das die Bildung der Peptidbindung katalysiert, befindet sich auf der großen Untereinheit und besteht vollständig aus rRNA. Zahlreiche Beobachtungen haben nahegelegt, dass das Ribosom tatsächlich ein Ribozym ist und kein Proteinenzym. Zum Beispiel sind rRNAs während der Evolution stärker konserviert worden als ribosomale Proteine, und die meisten Mutationen, die

eine Antibiotikaresistenz verleihen (bei Antibiotika, die die Proteinsynthese hemmen), spielen sich in Genen ab, die rRNAs codieren anstatt Ribosomenproteine. Die Röntgenstruktur der großen Ribosomenuntereinheit hat unmissverständlich gezeigt, dass rRNA eine Katalysefunktion bei der Proteinbiosynthese hat. Im Nachhinein scheint dies vor dem Hintergrund der Evolution klar zu sein: Da alle Proteine, einschließlich der mit den Ribosomen assoziierten, am Ribosom

synthetisiert werden, muss das ursprüngliche Ribosom den ursprünglichen Proteinen vorausgegangen sein und somit vollständig aus RNA bestanden haben. Das aktive Zentrum des Ribosoms liegt in der hoch konservierten Region in Domäne V auf der 23S-rRNA (Abb. 27.12b, 27.18 und 27.32). Die nächste Proteinseitenkette ist etwa 1,8 nm von der neu gebildeten Peptidbindung entfernt, und das nächste Mg?*-Ion ist rund 0,85 nm - beides zu weit, um an der Katalyse beteiligt zu sein. Dies zeigt unmissverständlich, dass die ribosomale Transpeptidase-Reaktion einzig und allein von RNA katalysiert wird.

Ausgangs-%

tunnel

A

BERNIE

RN

Zentrum

Abb. 27.32 Schnittbild der großen Ribosomenuntereinheit aus H. marismortui. Die drei tRNAs sind entsprechend ihrer Bindung an die A-, P- und E-Stelle des 70S-Ribosoms positio-

niert. In diesem Schnittbild sind das Lumen des Peptid-Ausgangstunnels und das Zentrum der Peptidyltransferase (Kasten) freigelegt. Der Komplex ist als Kalottenmodell gezeigt, wobei rRNA weiß und Proteine gelb sind. Die tRNAs in der A-, P- und E-Stelle sind grün, magenta bzw. braun,

und einige der Nucleotide, die mit der tRNA an

der A-Stelle wechselwirken, sind rot und braun. [Mit freundlicher Genehmigung von Peter Moore und Thomas Steitz, Yale University.]

1088

_Proteinbiosynthese

Abb. 27.33 Modell des Substratkomplexes der 50S-Ribosomenuntereinheit. Die Atome sind folgendermaßen gefärbt: C im

n up

VG E on

Substrat der A-Stelle (Tyr-tRNA”") ist violett, C im Substrat der P-Stelle grün, C in der 23S-rRNA

Carbonylgruppe

orangefarben, N blau und O rot. Die angreifende

Aminogruppe des Aminoacylrests in der A-Stelle wird für den nucleophilen Angriff (violetter Pfeil) auf den Carbonyl-Kohlenstoff des Aminoacylesters an der P-Stelle durch Wasserstoffbrücken zwischen A2486-N3 und dem 2'O von A76 in der P-Stelle (gestrichelte schwarze Linien) in Position gehalten. [Mit freundlicher Genehmigung von Peter Moore und Thomas Steitz, Yale University.]

.

angreifende Aminogrup

=

Die ribosomale Transpeptidase-Reaktion läuft etwa 10’mal schneller ab als die nicht katalysierte Reaktion. Wie katalysiert das Ribosom diese Reaktion? Die vom Ribosom vermittelte Bildung der Peptidbindung schreitet über einen nucleophilen Angriff der Aminogruppe auf die Carbonylgruppe eines Esters voran. Das dabei entstehende tetraedrische Zwischenprodukt zerfällt in ein Amid und einen Alkohol (Abb. 27.21). Bei physiologischem pH-Wert liegt die angreifende Aminogruppe jedoch vorwiegend in ihrer Ammoniumform vor (RNH3). Dieser fehlt das freie Elektronenpaar, das für den nucleophilen Angriff nötig ist. Dies legt nahe, dass die Transpeptidase-Reaktion zum Teil durch eine allgemeine Base katalysiert wird, die ein Proton von der Ammoniumgruppe anzieht, um die erforderliche, freie Aminogruppe (RNH;3) zu generieren. Untersucht man das aktive Zentrum der Peptidyltransferase von H. marismortui, so zeigt sich Folgendes: Die einzige basische Gruppe, die nicht weiter als 0,5 nm von der vermuteten Position der angreifenden Aminogruppe entfernt ist, ist das Atom N3 der konservierten rRNA-Base A2486 (A2451 bei E. coli). Es ist von der angreifenden Aminogruppe etwa 0,3 nm entfernt und deshalb mit ihr über eine Wasserstoffbrücke verbunden (Abb. 27.33). Dies lässt weiter vermuten, dass das protonierte A2486-N3 das Oxyanion des tetraedrischen Reaktionszwischenprodukts elektrostatisch stabilisiert und das Proton dann der abgehenden Gruppe der tRNA in der P-Stelle liefert, sodass eine 3’OH-Gruppe entsteht (allgemeine Säurekatalyse). Damit jedoch A2486-N3 als allgemeine Base fungieren und das Proton aus der Ammoniumgruppe binden kann (deren pK rund 10 beträgt), muss es einen pK-Wert von mindestens 7 haben (rufen Sie sich wieder ins Gedächtnis, dass Protonenübertragungen zwischen über Wasserstoffbrücken verknüpften Gruppen mit physiologisch relevanten Geschwindigkeiten nur vorkommen, wenn der pK-Wert des Protonendonators höchstens 2 oder 3 pH-Einheiten größer ist als derjenige des Protonenakzeptors; Abschnitt 11.5C). Man hat jedoch festgestellt, dass der pK von N3 in AMP unterhalb von 3,5 liegt. Zudem zeigt das Modell aus Abbildung 27.33, dass das Oxyanion des tetraedrischen Zwischenprodukts vom protonierten A2486-N3 weg weist und von diesem somit nicht stabilisiert wird. Das Ribosom ist eine Entropiefalle

Die Lösung dieses Rätsels wurde von Marina Rodnina und Richard Wolfenden gefunden. Die beiden stellten fest, dass die unkatalysierte Reaktion von Estern

mit Aminen, bei der Amide entstehen, in wässriger Lösung ziemlich leicht abläuft. Sie maßen deshalb die Geschwindigkeiten sowohl der nicht katalvsierten Bildung der Peptidbindung mithilfe von Modellverbindungen als auch des Peptidyltransfers durch das Ribosom bei verschiedenen Temperaturen. Dies ergab

Translation

Werte von AAH,. und AAS,., die Änderung der Enthalpie und der Aktivierungsentropie der Reaktion durch das Ribosom im Verhältnis zur nicht kataly-

sierten Reaktion. Hier ist AAHj., - TAASı, = AAG,., = AG! (unkat) - AG! (kat): wobei AAG;.. die Änderung der Freien Aktivierungsenthalpie der Reaktion durch das Ribosom im Verhältnis zur nicht katalysierten Reaktion ist; und AG' (unkat) und AG’ (kat) sind die Freien Aktivierungsenthalpien der nicht katalysierten und katalysierten (ribosomalen) Reaktionen (Abschnitt 1.3D und 11.2). Der für AAH gemessene Wert betrug -19 kJ-mol”', ein Betrag, der positiv sein müsste, wenn die ribosomale Reaktion eine bedeutsame Komponente der chemischen Katalyse wäre, wie z.B. die Säure-Basen-Katalyse und/oder die Bildung neuer Wasserstoffbrücken. Im Gegensatz dazu beträgt TAAS,., +52 kJ-mol', was zeigt, dass der Michaelis-Komplex (E-S; Abschnitt 12.1B) im Verhältnis zum Übergangszustand bei der ribosomalen Reaktion erheblich geordneter ist als bei der nicht katalysierten Reaktion. Der Wert von TAASIE,

ist zum großen Teil für die beobachtete rund 10’fache Geschwindigkeitserhöhung der ribosomalen Reaktion im Verhältnis zur nicht katalysierten Reaktion verantwortlich (die Geschwindigkeitserhöhung durch das Ribosom ist gegeben durch e**“w/RT; Abschnitt 11.2). Offensichtlich erhöht das Ribosom die Geschwindigkeit der Bildung von Peptidbindungen nicht durch chemische Katalyse, sondern indem es seine Substrate günstig positioniert und ausrichtet und/oder Wasser aus der vororganisierten elektrostatischen Umgebung des aktiven Zentrums ausschließt (eine Form von Reaktantenausrichtung). Die Röntgenstrukturen der großen Ribosomenuntereinheit im Komplex mit einer Aminoacyl-tRNA und Peptidyl-tRNA zeigen, dass man beim Ribosom von einem induced fit-Mechanismus sprechen kann, der auch bei vielen anderen Enzymen vorkommt, wie z.B. der Hexokinase (Abschnitt 15.2A). Konformationsänderungen in der 23S-rRNA, die wahrscheinlich durch die korrekte Bindung der Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle ausgelöst werden, richten die Estergruppe der Peptidyl-tRNA für den nucleophilen Angriff aus. Sitzt an der A-Stelle keine tRNA, wird die Peptidyl-tRNA in einer Position gehalten, die den nucleophilen Angriff durch Wasser verhindert (Hydrolyse, die die Peptidylgruppe vom Ribosom freisetzen würde). Translokation: Das Ribosom wandert zum nächsten Codon Nach der Transpeptidierung wird die nun unbeladene tRNA von der P-Stelle zur E-Stelle verlagert (in Abb. 27.27 nicht dargestellt) und die neue Peptidyl-tRNA in der A-Stelle wandert zusammen mit ihrer gebundenen mRNA zur P-Stelle. Diese Vorgänge führen zu einer unbesetzten A-Stelle und bereiten das Ribosom auf den nächsten Elongationscyclus vor. Während der Translokation fungiert die für die Aminosäurespezifikation nun nicht mehr erforderliche Wechselwirkung der Peptidyl-t*RNA mit dem Codon als Platzhalter, sodass das Ribosom um genau drei Nucleotide entlang der mRNA voranschreiten kann - so wie es für die Einhaltung des Leserasters nötig ist. Ein durch Mg”* stabilisierter Knick in der mRNA zwischen den A- und P-Codons hilft, das Abrutschen zu verhindern. Tatsächlich veranlassen bestimmte mutierte tRNA-Moleküle, die eine Verschiebung des Leserasters verursachen, das Ribosom dazu, vier Nucleotide weiterzugehen. Dies zeigt, dass die Bewegung der mRNA direkt an die Bewegung der

tRNA gekoppelt ist. Für den Translokationsprozess wird ein Elongationsfaktor benötigt, EF-G bei E. coli, der gemeinsam mit GTP an das Ribosom bindet und nur durch die Hydrolyse des GTP zu GDP + P; (Abb. 27.27) freigesetzt werden kann. Die EF-GFreisetzung ist die Voraussetzung für den Beginn des nächsten Elongationscyclus, da sich die ribosomalen Bindungsstellen von EF-G und EF-Tu teilweise oder vollständig überlappen und sich deren Bindung an das Ribosom daher gegenseitig ausschließt. Die GTP-Hydrolyse, die der Translokation vorausgeht, liefert die Freie Enthalpie für die Bewegung der tRNA.

1089

1090

_ Proteinbiosynthese EF-G imitiert strukturell den EF-Tu-tRNA-Komplex

Die Röntgenstruktur von EF-G (Abb. 27.34) zeigt, dass dieses Protein eine längliche Form hat und aus fünf Domänen besteht, wovon die beiden ersten (blau bis grün in Abb. 27.34) ähnlich angeordnet sind wie die beiden ersten Domänen des EF-Tu-GMPPNP-Komplexes (Abb. 27.28). Am meisten fasziniert, dass die restlichen drei Domänen von EF-G (gelb, orange und rot in Abb. 27.34) eine Konformation haben, die der Form des EF-Tu mit gebundener tRNA ähnelt. Eine solche molekulare Mimikry bietet die Möglichkeit, dass EF-G die Translokation nicht nur durch Herbeiführen einer Konformationsänderung antreibt, sondern durch eine aktive Verdrängung der Peptidyl-*RNA von der A-Stelle. Die Strukturähnlichkeit zwischen den Domänen 3 und 5 von EF-G und der tRNA lässt auch vermuten, dass sich zu Beginn der Evolution in den ersten Zel-

len - deren Funktionen auf RNA fußten - solche Proteine entwickelten, welche die Form von bereits erfolgreich eingesetzter RNA nachahmten. Die Translokation durchläuft Zwischenstadien

Abb. 27.34 Röntgenstruktur von EF-G aus Thermus thermophilus im Komplex mit GMPPNP.

Das Protein ist als Bändermodell dargestellt und beginnend vom N-Terminus (blau) bis zu seinem C-Terminus (rot) in den Spektralfarben gefärbt. GDP ist als Kalottenmodell gezeigt und dem Atomtyp entsprechend gefärbt: C ist gelb, N blau, O rot und P orange. Ein an GMPPNP gebundenes Mg?*-Ion ist durch eine magentafarbene Kugel wiedergegeben. Einige Teile der Struktur sind nicht zu sehen. Man beachte die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Struktur dieses Komplexes mit der von

Phe-tRNA”"-EF-Tu-GMPPNP (Abb. 27.28) [Nach einer Röntgenstruktur von Anders Liljas und Derek Logan, Lund University, Lund. PDBid 2BV3.]

Variationen der chemischen Footprinting-Muster während des Elongationscyclus zeigen zusammen mit Röntgen- und Kryo-EM-Untersuchungen, dass sich die Translokation der tRNA durch das Ribosom in mehreren getrennten Schritten abspielt (Abb. 27.35): 1. In der Posttranslokationsphase besetzt eine deacylierte tRNA die E-Stelle der 30S- und der 50S-Untereinheit (die E/E-Phase), eine Peptidyl-tRNA besetzt beide P-Stellen (die P/P-Phase) und die A-Stelle ist nicht besetzt. Eine aatRNA im Komplex mit EF-Tu-GTP bindet an das Ribosom, begleitet von der Freisetzung der tRNA an der E-Stelle (siehe unten). Dies ergibt einen Komplex, bei dem die hinzukommende aa-tRNA über eine Codon-Anticodon-Wechselwirkung an die A-Stelle der 30S-Untereinheit gebunden ist (rufen Sie sich in Erinnerung, dass auch die mRNA an die 30S-Untereinheit gebunden ist). EF-Tu-GTP verhindert dabei, dass das Aminoacylende der tRNA in die A-Stelle der 50S-Untereinheit gelangt; diese Anordnung nennt man A/T-Phase (T steht für EF-Tu). 2. Wie wir weiter oben gesehen haben, hydrolysiert EF-Tu sein gebundenes GTP zu GDP + P, und wird vom Ribosom freigesetzt. Dadurch wird es der aa-tRNA möglich, vollständig an die A-Stelle zu binden (die A/A-Phase). 3. Die Transpeptidierungsreaktion läuft ab, und es beginnt die Prätranslokationsphase. 4. Das Akzeptorende der neuen Peptidyl-tRNA verlagert sich zur P-Stelle der 50S-Untereinheit, während das Anticodonende der tRNA mit der A-Stelle der 30S-Untereinheit verbunden bleibt (ergibt die A/P-Phase). Das Akzeptorende der neu deacylierten tRNA wandert gleichzeitig zur E-Stelle der 508Untereinheit, während ihr Anticodonende mit der P-Stelle der 30S-Untereinheit verbunden bleibt (Die P/E-Phase). 5. Die EF-G-GTP-Bindung an das Ribosom und die resultierende GTP-Hydrolyse bringt die Anticodonenden der beiden tRNAs dazu, sich zusammen mit ihrer gebundenen mRNA relativ zur kleinen Ribosomenuntereinheit zu bewegen, sodass die Peptidyl-tRNA den P/P-Zustand und die deacylierte tRNA den E/E-Zustand (den Posttranslokationszustand) annimmt und somit der Elongationscyclus abgeschlossen ist.

Wie Knud Nierhaus gezeigt hat, weist die Bindung der tRNAs an die A- und EStelle des Ribosoms eine negative allosterische Kooperativität auf. Im Prätranslokationszustand bindet die E-Stelle die neu deacylierte tRNA mit hoher Affinität, wohingegen die jetzt freie A-Stelle eine geringe Affinität für eine aa-tRNA hat. Die Bindung eines neuen aa-tRNA- EF-Tu-GTP-Komplexes veranlasst das Ribosom zu einer Konformationsänderung, die die A-Stelle in einen hochaffinen und die E-Stelle in einen niedrigaffinen Zustand versetzt, der folglich die deacy-

lierte tRNA freisetzt. Somit ist die E-Stelle nicht nur ein passiver „Abstellplatz“

Translation

1091

Stelle:

50S

30S

EF-G - GDP+ P;

Bindungsphase:

E/E

P/P

aa-tRNA »- EF-Tu - GTP

Posttranslokationsphase

EF-G »- GTP

5

OH 1

EF-Tu » tRNA

2

EF-Tu - GDP + P; E

Te

3

B

A

——

Transpeptidierung P/R

A/A

DAR

A/A

Prätranslokationsphase

NN“

2 = Aminosäurerest

für gelieferte tRNAs, sondern sie hat beim Translationsprozess eine unverzichtbare Funktion. Da sich die GTP-hydrolysierenden Proteine EF-Tu und EF-G bei ihrer Aktivität abwechseln müssen, ist sichergestellt, dass das Ribosom nur in eine Richtung durch die Transpeptidierungs- und Translokationsphase der Translation läuft. Die Translokation kann in Abwesenheit von GTP ablaufen, was zeigt, dass die freie Enthalpie der Transpeptidierungsreaktion ausreicht, um den gesamten Translationsprozess anzutreiben. Die von EF-Tu und EF-G katalysierte GTP-Hydrolyse erhöht

jedoch die Nettogeschwindigkeit der Translation. Weil die GTP-Hydrolyse irreversibel ist, sind auch die begleitenden Konformationsänderungen im Ribosom irreversibel

und somit gerichtet.

Abb. 27.35 Bindungsphasen im ribosomalen Elongationscyclus. Man beachte, wie dieses Schema den klassischen Elongationscyclus aus Abbildung 27.27 näher ausführt. Neben den Schemazeichnungen stehen jeweils Kryo-EM-basierte Bilder des 70S-Ribosoms aus E. coli bei einer Auflösung von 1,7 nm

(30S-Untereinheit transparent gelb, 50S-Untereinheit transparent blau, tRNAs und Elongationsfaktoren sind der Schemazeichnung entsprechend gefärbt). [Kryo-EM-Bilder mit freundlicher Genehmigung von Knud Nierhaus, Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik, Berlin und Joachim Frank,

State University of New York at Albany.]

Proteinbiosynthese

1092

Auswirkungen von Antibiotika auf die Proteinbiosynthese Die Mehrzahl der bekannten Antibiotika, einschließlich vieler auch medizinisch gebräuchlicher Wirkstoffe, blockiert die

Translation. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der enormen Komplexität der Translationsmaschinerie, die sie gegenüber Störfaktoren auf vielerlei Arten anfällig macht. Antibiotika waren auch nützlich bei der Aufklärung ribosomaler Mechanismen, denn die Blockade einer bestimmten

Funktion er-

möglicht oft die biochemische Auftrennung einzelner Teilschritte. Beispielsweise wurde der ribosomale Elongationscyclus ursprünglich durch den Einsatz des Antibiotikums Puromycin charakterisiert, das dem 3’-Ende von Tyr-tRNA ähnelt.

Streptomycin,

n

NH—C—NH3

Nun ST | H,N—C—HN

H

H

o OH.

..H

NH;

IC3

Sy’

N” N

Rn

...CH 5 N | >

N

tRNA—03PO—CH,

N

HO—CH, H

LG

|

N>

(9

HH

0

u ?

HH

A

|

H

c=o CH- CH, N NH

OH

ia CH—CH; |

NH3

Yisl

ae

OCH,

iel

Streptomycin

OH

Tyrosyl-tRNA

Puromycin

Puromycin bindet ohne Mithilfe von Elongationsfaktoren an die ribosomale A-Stelle. Die Transpeptidierungsreaktion ergibt ein Peptidylpuromycin, bei dem der „Aminosäurerest“ von Puromycin über eine Amidbindung und nicht über eine Esterbindung an die „IRNA“ gebunden ist. Das Ribosom kann daher keine weitere Transpeptidierung katalysieren und die Polypeptidsynthese bricht ab.

ist ein medizinisch wichtiger Vertreter einer Antibiotikafamilie, die als Aminoglycoside bezeichnet werden. Sie inhibieren prokaryotische Ribosomen auf vielfältige Weise. In geringen Konzentrationen verursacht Streptomycin, dass das Ribosom die mRNA auf charakteristische Weise falsch liest: Pyrimidinbasen können in den ersten und zweiten Codonpositionen nicht mehr unterschieden werden und jede Pyrimidinbase kann in der ersten Position fälschlicherweise als ein Adenin gelesen werden. Dies inhibiert das Wachstum empfindlicher Zellen, aber tötet sie nicht. In höheren Konzentrationen verhindert Streptomycin die exakte Ketteninitiation und verursacht dadurch den Zelltod.

Einige der vielen Antibiotika, welche die Ribosomenfunktion zum Erliegen bringen, werden im Exkurs 27.3 besprochen. Der eukaryotische Elongationscyclus ähnelt demjenigen der Prokaryoten Die Elongation bei Eukaryoten hat große Ähnlichkeit mit der bei Prokaryoten. Bei Eukaryoten übernehmen die eukaryotischen Elongationsfaktoren eEF1A und eEF1B die Funktion von EF-Tu und EF-Ts. Entsprechend arbeitet eEF2 auf eine Weise, die der des prokaryotischen EF-G analog ist. Die einander entsprechenden eukaryotischen und prokaryotischen Elongationsfaktoren sind jedoch nicht gegeneinander austauschbar.

C.

Freisetzungsfaktoren beenden die Translation

Wird die Polypeptidsynthese mit einer synthetischen mRNA wie Poly(U) durchgeführt, so entsteht eine Peptidyl-IRNA, die am Ribosom ‚festsitzt“. Bei der Translation natürlicher mRNAs mit den entsprechenden Stoppcodons UAA,

Translation

Chloramphenicol,

und seine

Derivate

sind Breitband-Antibiotika,

1093

die an die

kleine Untereinheit prokaryotischer Ribosomen binden. Das gebundene Tetracyclin sperrt die A-Stelle für aminoacyltRNAs, aber verhindert nicht die Hydrolyse des GTP in EFTu. Infolgedessen kommt die Proteinbiosynthese zum Erliegen, während die ständige GTP-Hydrolyse bei jedem Versuch einer aminoacyl-tRNA, in das Ribosom einzutreten, zu einem

Chloramphenicol

das erste „Breitband-Antibiotikum“, inhibiert die Aktivität der

Peptidyltransferase prokaryotischer Ribosomen. Dennoch ist

seine klinische Anwendung,

wegen

seiner toxischen

Neben-

wirkungen, auf einige schwere Infektionen beschränkt. Diese Nebenwirkungen werden teilweise durch die Sensibilität mitochondrialer Ribosomen gegenüber Chloramphenicol verursacht. Chloramphenicol bindet offensichtlich an die große Untereinheit nahe der A-Stelle, da Chloramphenicol mit Puromycin und dem 3’-Ende von Aminoacyl-RNAs, nicht jedoch mit Peptidyl-tRNAs, um die Bindung konkurriert. Tetracyclin,

massiven Energieverlust für die Zelle führt. Tetracyclinresistente Bakterienstämme sind mittlerweile weit verbreitet und stellen daher ein ernst zu nehmendes klinisches Problem dar. Am häufigsten beruht die Resistenz auf einer Abnahme der Permeabilität der bakteriellen Zellmembran gegenüber Tetracyclin und nicht auf einer Veränderung der ribosomalen

Komponenten,

die den inhibitorischen

Ef-

fekt auf die Translation umgehen würden. Das Enyzm Ricin kann trotz seiner Größe ebenfalls zu den Antibiotika gerechnet werden. Ricin ist eine N-Glycosidase aus

den

Samen

des

afrikanischen

Wunderbaums,

aus

denen das Ricinusöl gewonnen wird. Das Enzym inaktiviert die große Untereinheit eukaryotischer Ribosomen, indem es

H;C, OH

die Adeninbase eines hochkonservierten Restes der 28S rRNA hydrolytisch abspaltet. Das so veränderte Ribosom ist

N(CH;),

nicht mehr in der Lage, Elongationsfaktoren zu binden, woNH 3„NA

=r.®

ÖH

OH

(6)

OH

1 (6)

Tetracyclin

fe)

durch die Translation zum Erliegen kommt. Da Ricin seine Wirkung katalytisch entfaltet, kann ein einziges Ricinmolekül zehntausende Ribosomen inaktivieren. Durch diese enorme Giftigkeit selbst kleinster Enzymmengen könnte Ricin als biologischer Kampfstoff eingesetzt werden. Andererseits könnte Ricin auch einen therapeutischen Nutzen haben, wenn es gelänge, das Enzym selektiv in Krebszelien einzubringen.

UGA oder UAG entstehen dagegen freie Polypeptide. Bei E.coli werden die Stoppcodons, die normalerweise keine korrespondierenden tRNAs besitzen, von Freisetzungsfaktoren (RF; von engl.: release factor) erkannt (Tabelle 27.6): RF-1 erkennt UAA und UAG, während der zu 38% identische RF-2 UAA und UGA erkennt. Bei Eukaryoten erkennt ein einziger Freisetzungsfaktor, eRF1, alle drei Stoppcodons. Die Termination hat wie die Initiation und Elongation mehrere Phasen. Die Abfolge der Ereignisse bei E. coli ist in Abbildung 27.36 dargestellt: % RF-1 oder RF-2 erkennen ein entsprechendes Stoppcodon in der A-Stelle des Ribosoms. Der Freisetzungsfaktor leitet die Übertragung der Peptidylgruppe von der Peptidyl-RNA auf Wasser ein - und nicht etwa auf eine andere aa-tRNA - sodass an der P-Stelle eine unbeladene tRNA und ein freies Polypeptid entstehen, die das vom Ribosom entlassen werden. Ein dritter Faktor, RF-3 (eRF bei Eukaryoten), ein G-Protein, bindet an das Ribosom im Komplex mit GTP. Die nachfolgende Hydrolyse dieses GTP veranlasst das Ribosom dazu, seine gebundenen RF-1 und RF-2 freizusetzen. Der RF-3-:GDP-Komplex wird freigesetzt und dann bindet der RibosomenRecycling-Faktor (RRF), der hauptsächlich von Akira Kaji charakterisiert wurde, in der A-Stelle, gefolgt von EF-G-GTP. EF-G hydrolysiert sein gebundenes GTP. Dieses veranlasst RRF dazu, zur PStelle zu wandern. Die an der P- und E-Stelle sitzenden tRNAs werden freigesetzt (letztere ist in Abb. 27.36 nicht gezeigt). Schließlich fallen der RRF und dann EF-G-GDP und die mRNA vom Ribosom ab. Es entsteht ein inaktives 70S-Ribosom, das für eine neue Initiation bereitsteht (Abb. 27.25).

1094

_Proteinbiosynthese wachsendes Polypeptid

308 S-Unterei

=

mRNA

inaktives 70S-Ribosom

5’

H;0 Polypeptid

COO-

Abb. 27.36 Termination der Translation bei E. coli-Ribosomen. RF-1 erkennt die Stoppcodons UAA und UAG, während RF-2 (nicht dargestellt) UAA und UGA erkennt. Die Termination verläuft bei Eukaryoten auf einem analogen Weg, erfordert jedoch nur einen einzigen Freisetzungsfaktor, eRF1, der alle drei Stoppcodons erkennt.

Die Funktionsmimikry der Freisetzungsfaktoren legt nahe, dass sie den tRNAs strukturell ähneln. In der Tat zeigen die Röntgenstrukturen des menschlichen eRF1 (Abb. 27.37a) und des RF-2 von E.coli (Abb. 27.37b), dass diese beiden nicht verwandten Proteine in ihrer Struktur der der tRNA sehr ähnlich sind. Kryo-EM-Untersuchungen zeigen jedoch, dass RF-2 bei der Bindung an das Ribosom eine starke Konformationsänderung erfährt, sodass es nicht mehr länger die tRNA nachahmt. Die Röntgenstruktur von RRF aus Thermotoga maritima (Abb. 27.37c) offenbart eine L-förmige Struktur, die‘ möglicherweise zu einer der tRNA-Bindungsstellen des Ribosoms passen könnte. Die Footprinting- und Kryo-EM-Untersuchungen zeigen jedoch, dass RRF die A- und die P-Stelle teilweise belegt, und zwar in einer Ausrichtung, die sich erheblich von jeder zuvor bei einer tRNA beobachteten unterscheidet. Offenbar muss die Hypothese der Strukturmimikry erweitert werden. Nonsense-Suppressoren verhindern die Termination

Eine Mutation, die ein eine Aminosäure codierendes („sense“) Codon in ein Stoppcodon verwandelt, wird als Nonsense-Mutation bezeichnet und führt zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Ein Organismus mit einer solchen Mutation kann aber durch eine zweite Mutation in einem tRNA-Gen

„gerettet“

werden. Diese führt dazu, dass die tRNA ein Stopp- („nonsense“) Codon erkennt. Diese Nonsense-Suppressor-tRNA trägt die gleiche Aminosäure wie ihr

Posttranslationale Modifikation (PTM)

(e)

RRF Abb. 27.37

Röntgenstrukturen von vermeintlichen tRNA-Imitatoren,

die an der Termination der Translation beteiligt sind. (a) Menschlicher eRF1, (b) RF-2 aus E. coli und (c) RRF aus Thermotoga maritima (die Struktur von RF-] hat eine große Ähnlichkeit mit derjenigen von RF-2). Die verschiedenen Domänen in diesen Proteinen sind unterschiedlich gefärbt, wobei die Domänen, die den Anticodonstamm

der tRNA nachzuahmen scheinen, rot sind. Man nimmt an, dass das SPF-Tripeptid in RF-2 als Anticodon fungiert. Man vergleiche diese Strukturen mit denen in den Abbildungen 27.28 und 27.34. [Mit freundlicher Genehmigung von V. Ramakrishnan, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge. Bildteil a nach einer Röntgenstruktur von David Barford, Institute of Cancer Research, London. Bildteil

b nach einer Röntgenstruktur von Richard Buckingham, CNRS, Paris

sowie Jens Nyborg und Morten Kjeldgaard, University of Aarhus, Ärhus. Bildteil c nach einer Röntgenstruktur von Akira Kaji, University of Pennsylvania und Anders Liljas, Lund University,

Lund. PDBids (a) 1DT9, (b) IGQE und (c) 1DD5.]

entsprechender Wildtyp-Vorläufer und fügt diese am Stoppcodon in die wachsende Polypeptidkette ein, wodurch der Kettenabbruch verhindert wird. Der Amber-Suppressor von E.coli, der auch als su3 bezeichnet wird, ist z.B. eine tRNA””, deren Anticodon vom Wildtyp-GUA (das die Tyr-Codons UAU und UAC liest) zu CUA mutiert ist (welches das Amber-Stoppcodon erkennt). Eine su3'-E.coli-Zelle mit einer ansonsten letalen Amber-Mutation in einem Gen, das ein essentielles Protein codiert, wäre lebensfähig, wenn der Ersatz der Wildtyp-Aminosäure durch Tyr das Protein nicht inaktivierte. Wie können Zellen eine Mutation tolerieren, die sowohl eine normale tRNA außer Gefecht setzt als auch die Termination der Polypeptidbiosynthese verhindert? Sie überleben, weil die mutierte tRNA üblicherweise ein untergeordneter Vertreter einer Reihe isoakzeptierender tRNAs ist und weil die Nonsense-Suppressor-tRNAs mit den Freisetzungsfaktoren um die Bindung an Stoppcodons konkurrieren müssen. Daher wachsen viele durch Suppression gerettete Mutanten deutlich langsamer als Wildtyp-Zellen.

5

Posttranslationale Modifikation (PTM)

Der Tunnel, der vom aktiven Zentrum der Peptidyltransferase zur Außenseite des Ribosoms führt (Abb. 27.32), ist etwa 10 nm lang — lang genug, um eine Polypeptidkette aus rund 30 Resten zu beherbergen. Sobald das Polypeptid aus dem Ribosom heraustritt, ist es mit zwei Problemen konfrontiert: Wie faltet es sich korrekt und wie erreicht es seinen endgültigen Bestimmungsort in der Zelle? Beide Vorgänge laufen mithilfe anderer Proteine ab. Außerdem wird ein entstehendes Polypeptid unter Umständen kovalent modifiziert, bevor es seine reife Form annimmt. In diesem Abschnitt behandeln wir einige Aspekte der posttranslationalen Proteinmodifikation (PTM).

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Vergleichen Sie den Initiationsvorgang in prokaryotischen und eukaryotischen Ribosomen. 2. Fassen Sie die Bedeutungen der Initiations-, Elongations- und

Freisetzungsfaktoren bei der Translation zusammen. 3. Welche Schritte der ribosomalen Funktion erfordern eine GTP-Hydrolyse? 4. Wie überprüft das Ribosom die korrekte Paarung von tRNA und mRNA?

1095

1096

Proteinbiosynthese

PeptidyltransferaseZentrum

wachsendes Polypeptid

Triggerfaktor

Abb. 27.38 Komplex aus Triggerfaktor und 50S-Untereinheit des Ribosoms. Die 50S-Untereinheit ist als Schnittbild dargestellt und zeigt ihren Peptidausgangstunnel, in dem eine sich aus dem Zentrum der Peptidyltransferase (PT) erstreckende a-Helix (magenta) abgebildet ist. Die ribosomale RNA ist pink und die Ribosomenproteine sind grau. Der Triggerfaktor ist schlangenförmig dargestellt, wobei seine vier Domänen vom

N-Terminus zum C-Terminus rot, gelb, grün

bzw. blau gefärbt sind. [Mit freundlicher Genehmigung von Nenad Ban, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich.]

A.

Ribosomenassoziierte Chaperone unterstützen die Proteinfaltung

Der Ausgangstunnel des Ribosoms, durch den das Peptid das Ribosom verlässt, ist mit seiner Breite von ca. 1,5 nm zu eng, um (außer bestenfalls einer Helix) die Bildung einer Sekundärstruktur zu erlauben. Deshalb kann sich ein entstehendes Polypeptid erst falten, nachdem es aus dem Ribosom herausgetreten ist. Diese Faltung beginnt bereits, bevor die Translation abgeschlossen ist. Molekulare Chaperone (Abschnitt 6.5B) binden an den N-Terminus der entstehenden Polypeptide, um deren Aggregation zu verhindern, ihre Faltung zu erleichtern und ihre bestimmungsgemäße Interaktion mit anderen Untereinheiten zu fördern. Es gibt zunehmend Beweise dafür, dass ribosomale Proteine eine Rolle bei der Proteinfaltung spielen, indem sie Chaperone rekrutieren. Bei E. coli z.B. verbindet sich ein Protein namens Triggerfaktor mit dem ribosomalen Protein L23, das am Ausgang des Peptidtunnels sitzt. Der Triggerfaktor erkennt relativ kurze, hydrophobe Proteinabschnitte, wenn sie erstmals aus dem Ribosom auftauchen. DnaK, ein Vertreter der Hsp70-Chaperonfamilie, und Dna]J, ein Hsp40-Chaperonin (Abschnitt 6.5B), können an längere Polypeptide binden und diese schützen (DnaK und Dna] haben ihre Bezeichnung aus folgendem Grund: Man entdeckte sie bei der Charakterisierung von E. coli-Mutanten in denen die Vermehrung des Bakteriophagen X gestört war. Man hatte anfangs angenommen, dass die durch die Mutationen betroffenen Genprodukte an der DNA-Replikation beteiligt wären). Die Aktivitäten des Triggerfaktors und von DnaK/] sind so ähnlich, dass E. coli die Deletion von einem der beiden tolerieren kann. Jedoch ist der Verlust beider Triggerfaktoren bei Temperaturen über 30°C tödlich und von einer massiven Aggregation neu synthetisierter Proteine begleitet. Schließlich fördern die Chaperonine GroEL und GroES die Proteinfaltung nach Beendigung der Translation (Abschnitt 6.5B). Die Röntgenstruktur des Triggerfaktors von E. coli zeigt ein längliches Protein mit vielen Domänen, das entlang seines zentralen Bereichs einen ausgeprägten hydrophoben Spalt hat. Die Röntgenstruktur der aus 144 Resten bestehenden ribosomenbindenden N-terminalen Domäne im Komplex mit der 50S-Untereinheit von H. marismortui zeigt, dass diese Domäne nahe am Ausgang des Peptidtunnels des Ribosoms bindet. Überlagert man diese N-terminale Domäne mit der aus der Röntgenstruktur des intakten, 432 Reste umfassenden Triggerfaktors, ergibt sich ein Modell für die Wechselwirkung des Triggerfaktors mit der 50S-Untereinheit (Abb. 27.38). In diesem Modell krümmt sich der Triggerfaktor über dem Ausgang des ribosomalen Peptidtunnels, wobei seine hydrophobe, konkave Seite so positioniert ist, dass sie mit einem neu synthetisierten Polypeptidabschnitt wechselwirken kann, wenn dieser aus dem Tunnel heraustritt. Zudem zeigen Fluoreszenzenergietransferexperimente, dass der Triggerfaktor bei der Bindung an das Ribosom eine gedehnte Konformation einnimmt, sodass seine hydrophobe Oberfläche noch weiter exponiert ist. Im Gegensatz zu anderen Chaperonen (z.B. DnaK/] und GroEL/ES) benötigt der Triggerfaktor für seine Aktivierung kein ATP. Der aktivierte Triggerfaktor fällt nach etwa 10 s vom Ribosom ab, kann aber mit dem sich verlängernden Polypeptid über mehr als 30 s verbunden bleiben. Während dieser Zeit kann ein weiteres Molekül des Triggerfaktors an das Ribosom binden und weitere hydrophobe Bereiche entlang der Polypeptidkette abschirmen. Offensichtlich schirmt der Triggerfaktor hydrophobe Abschnitte der neu synthetisierten und somit ungefalteten Polypeptide ab, um ihre Fehlfaltung und Aggregation zu verhindern. Eukaryotische Zellen haben kein Homolog zum Triggerfaktor, enthalten aber andere kleine Chaperone, die vermutlich ähnliche Funktionen erfüllen.

Posttranslationale Modifikation (P’TM)

B.

1097

Neu synthetisierte Proteine können kovalent modifiziert werden

Die Liste der bekannten posttranslationalen Modifikationen ist lang und beinhaltet die Abspaltung und/oder Derivatisierung spezifischer Reste. Beispielsweise wird der N-terminale Met- oder fMet-Rest normalerweise abgespalten. Andere häufig auftretende posttranslationale Modifizierungen sind die Hydroxylierung von Pro- und Lys-Resten in Kollagen (Abschnitt 6.1C), die Glykosylierung (Abschnitte 8.3C und 16.5) und die Prenylierung sowie Fettsäure-Acylierung membranverankerter Proteine (Abschnitt 9.3B). Viele kovalente Modifikationen, wie die Phosphorylierung (Abschnitt 12.3B) und die Palmitoylierung (Abschnitt 9.3B), sind reversibel. Man kennt über 150 verschiedene Modifikationsarten von Seitenketten. Diese betreffen fast alle Seitenketten, mit Ausnahme derjenigen von Ala, Ile, Leu und Val. Die Funktionen solcher Modifkationen sind mannigfaltig und in vielen Fällen noch nicht aufgeklärt. Von einer wachsenden Zahl von Proteinen weiß man, dass sie ubiquitiniert werden. Rufen Sie sich aus Abschnitt 21.1B wieder in Erinnerung, dass das aus 76 Aminosäuren bestehende Protein Ubiquitin ein anderes Protein für den Abbau durch das Proteasom markiert. Ein ähnliches Protein ist SUMO (small ubiquitin-related modifier, engl. für: kleiner, mit Ubiquitin verwandter Modifizierer), das aus 97 Aminosäuren besteht. Es kann wie Ubiquitin mit einem Lys-Rest verknüpft werden, um die Proteinfunktion zu regulieren. Aber während die Ubiquitinierung normalerweise mit dem Proteinabbau verknüpft ist, scheint die Sumoylierung eine Rolle bei der Zielsteuerung von Proteinen innerhalb der Zelle zu spielen. Proteine, die als inaktive Vorstufen synthetisiert werden, heißen Proproteine oder Proenzyme und werden durch kontrollierte Proteolyse aktiviert. Die Zymogene von Serinproteasen werden auf diese Weise in aktive Enzyme überführt (Abschnitt 11.5D). Proteine, die für den Export aus dem Cytoplasma in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums transloziert werden, enthalten normalerweise ein Signalpeptid, das abgespalten werden muss (Abschnitt 9.4D). Proteine mit einem Signalpeptid nennt man Präproteine oder Präproproteine, falls sie während ihrer weiteren Reifung einer zusätzlichen Proteolyse unterliegen. Beispielsweise wird das Hormon Insulin (Abschnitt 22.2) als Präproinsulin (Präproprotein) synthetisiert. Daraus entsteht durch Abspaltung des Signalpeptides das Proinsulin (Proprotein), das aus einer einzigen Polypeptidkette von 84 Aminosäureresten besteht. Eine weitere an zwei Stellen stattfindende Proteolyse führt schließlich zum reifen Hormon, dessen A- und B-Kette über Disulfidbrücken verbunden sind (Abb. 27.39). Dabei sollte festgehalten werden, dass die Ausbildung der Disulfidbrücken vor der Proteolyse erfolgt. Die Funktion der herausgeschnittenen C-Kette (C-Peptid), die aus 33 Resten besteht, ist unklar, sie wird jedoch in der Diagnostik für den Nachweis an gebildetem Insulin ver-

wendet.

C-Kette

B-Kette

Abb. 27.39 Umwandlung von Proinsulin zu Insulin. Das Prohormon hat drei Disulfidbrücken und wird an zwei Stellen (Pfeile) proteolysiert, um die C-Kette zu entfernen. Das reife Hormon Insulin besteht aus den über Disulfidbrücken verknüpften A- und B-Ketten.

1098

__Proteinbiosynthese Das Signalerkennungspartikel ist ein Ribonucleoprotein

An der Tranlokation von Transmembran- und sekretorischen Proteinen in oder durch Zellmembranen - dem Sekretionsweg (Abschnitt 9.4D) - sind verschiedenste Komponenten beteiligt. Dies gilt gleichermaßen z.B. für die Translokation in das endoplasmatische Reticulum (ER) bei Eukaryoten als auch für den Transport durch die Plasmamembran bei Prokaryoten. Wenn die N-terminalen Signalpeptide von für die Sekretion vorgesehenen Proteinen aus dem Ribosom heraustreten, interagieren diese Proteine mit dem Signalerkennungspartikel (SRP; signal recognition particle). Die Synthese der Peptidkette wird angehalten, wenn SRP an das Ribosom gebunden hat und wird wieder aufgenommen, wenn SRP an seinen Rezeptor auf der ER-Membran andockt. Danach verläßt SRP das Ribosom und ermöglicht so dem wachsenden Polypeptid, durch eine Proteinpore — den Translokationskomplex - in die Membran zu gelangen oder diese zu passieren. Wie beim Ribosom und dem Spleißosom (Abschnitt 26.3A) handelt es sich beim SRP auch um ein Ribonucleoprotein. Das eukaryotische SRP enthält sechs verschiedene Polypeptide und eine RNA aus 300 Resten. Das SRP aus E. coli besteht aus einem einzigen Polypeptid namens Ffh und einer RNA von 114 Nucleotiden. Es scheint eine strukturell verkleinerte Version des eukaryotischen SRP zu sein. Jennifer Doudna bestimmte die Struktur des stark konservierten Kerns des SRP, der durch die sogenannte M-Domäne

von Ffh und Domäne

IV der RNA

repräsentiert wird. Der 49 Nucleotide umfassende RNA-Abschnitt bildet einen 7,0 nm langen, doppelhelicalen Stab, in dem die RNA-Kette mehrfach gewunden vorliegt (Abb. 27.40a). Die RNA und das Protein interagieren hauptsächlich über ein dichtes Netz aus Wasserstoffbrücken, an denen die ungepaarten Basen der RNA und a-Helix-Bereiche des Proteins beteiligt sind (Abb. 27.40b). Ffh bildet eine tiefe Furche, die nahezu vollständig mit hydrophoben Resten ausgekleidet ist, einschließlich 11 der 14 Met-Reste des Proteins. Diese 1,5 nm breite und 2,5 nm lange Furche bindet offensichtlich das Signalpeptid als a-Helix. Die Met-Seitenketten haben eine ähnliche Flexibilität und Polarität wie n-ButylGruppen und sorgen für etwas strukturelle Plastizität, sodass das SRP verschiedene Signalpeptide erkennen kann, solange sie hydrophob sind und eine a-Helix bilden. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat der SRP-RNA bildet eine Leiste, die sich

AA

G A C=G c—-G

-— A

G » A-o G°:G

arg 0-00 *G cc

—-C

CAG-C

Bindungsfurche

A U-A U°.G

Abb. 27.40 Röntgenstruktur des SRP-Kerns aus E.coli. (a) Sekundärstruktur der 49-nt-RNA. (b) Die Moleküloberfläche des Komplexes ist so ausgerichtet, dass man die Signalpeptid-Bindungsfurche sieht. Die doppelhelicale RNA ist dunkelblau, das Protein ist pink, die hydrophoben Reste, welche die Signalpeptid-Bindungsfurche auskleiden, sind gelb, und die angrenzenden Phosphatgruppen der RNA rot. [Mit freundlicher Genehmigung von Robert Batey und Jennifer Doudna, Yale University. PDBid 1DUL.]

Signalpeptid-

U. G-n G-C U-A cC—-G U-A C—-G

»-G—C G-C

5

(a)

(b)

Posttranslationale Modifikation (PTM)

1099

SRP5S4NG Signalpeptid

auf den hydrophoben Bindungsfurchen des Proteins erstreckt und eine anionische Oberfläche bietet, um die basischen Reste des Signalpeptides zu binden

(Abb. 9.36).

Von SRP aus Säugern konnte ein Atommodell konstruiert werden, indem die bekannten Röntgenstrukturen seiner verschiedenen Bestandteile in das auf Kryoelektronenmikroskopie basierende Bild des SRP eingepaßt wurden. Das SRP war an das 80S-Ribosom gebunden und trug ein Signalpeptid. Dieses Modell zeigt, dass der Komplex eine gebogene Konformation annimmt, in dem die RNA die Gelenke darstellt (Abb. 27.41a). Die Kryo-EM-Struktur des SRP im Komplex mit dem 80S-Ribosom (Abb. 27.415) zeigt, dass sich das SRP aus dem Polypeptidausgangskanal auf der 60S-Untereinheit zum Zwischenraum zwischen den Untereinheiten in der Nähe der A-Stelle erstreckt. Struktur- und biochemische Untersuchungen zeigen, dass das eukaryotische SRP zunächst über sein SRP54-Protein — ein Homolog des Ffh aus E. coli — an das Ribosom bindet. An dieser Wechselwirkung sind mehrere ribosomale Proteine beteiligt, einschließlich 123, an das auch der Triggerfaktor bindet. Wenn ein auftauchendes Signalpeptid an die Met-reiche M-Domäne des SRP54-Proteins (SRP54M) bindet, ändert das Ribonucleoprotein seine Konformation derart, dass sein anderes Ende - die Alu-Domäne (weil sie Alu-ähnliche Sequenzen enthält; Abschnitt 28.1C) - in die Stelle auf der Kontaktfläche zwischen den Untereinheiten passt, an die auch der Elongationsfaktor eEF2 (das eukaryotische Pendant des EF-G von E. coli) bindet. Dies stört vermutlich den ribosomalen Elongationscyclus (Abb. 27.27) und erklärt, wie das SRP die Translation anhält. Dem E.coli-SRP fehlt die Alu-Domäne und es muss deshalb die Translation durch einen anderen Mechanismus unterbrechen - nicht durch Imitierung eines Elongationsfaktors. Die Proteinsynthese wird wieder aufgenommen, nachdem das SRP an seinen Membranrezeptor dockt und sein Platz vom Translocon (auch Protein leitender Kanal genannt; PCC, von engl.: protein-conducting channel) eingenommen wurde. Dessen Ribosomenbindungsstelle überlappt weitgehend diejenige des SRP. Bei E.coli besteht PCC aus zwei Komplexen jeweils dreier Proteine, die man als SecYEG bezeichnet (die Struktur des größten davon, SecY, ist in Abb. 9.37 dargestellt). Kryo-EM-Untersuchungen von Ribosomen bei der Synthese eines Polypeptids mit einem Transmembransegment zeigen, dass der Translokationskomplex wie erwartet am Polypeptidausgangskanal sitzt (Abb. 27.42). Der Translokationskomplex berührt das Ribosom an drei Punkten über Protein-Protein- und Protein-rRNA-Wechselwirkungen. Eine Öffnung zwischen dem Translokationskomplex und dem Ribosom lässt unter Umständen andere Proteine zu, wie etwa den Triggerfaktor. Glykosylierung dient als Qualitätskontrollmechanismus Bei Eukaryoten werden die Polypeptide glykosyliert, die über den Sekretionsweg

ins ER transloziert werden. Erster Schritt bei der Herstellung von N-verknüpften Glykoproteinen (Abschnitt 8.3C) ist die kotranslationale Anheftung eines Oligo-

SRPS Abb. 27.41 Eukaryotisches Signalerkennungspartikel. (a) Modell des SRP, in dem die RNA als Stabmodell gezeichnet und dem Atomtyp entsprechend gefärbt ist (C grün, N blau, O rot und P orange). Die aufeinanderfolgenden P-Atome sind durch orangefarbene Stäbchen verbunden. Das Signalpeptid (violett) des entstehenden Polypeptids bindet an die M-Domäne des Proteins SRP54 (SRP54M; SRPS4 ist das eukaryotische Pendant zu

Ffh aus E. coli). Der Überrest von SRP54 (SRP54NG) beinhaltet die GTPase-Domäne. Die Proteine SRP9 und SRP14 und die verbundene RNA bilden die Alu-Domäne, die an der Kontaktfläche zwischen den Untereinheiten des Ribosoms bindet. [Nach einem Modell von Joachim Frank, State University of New York at Albany und Roland Beckmann, Universität München. PDBid IRY1.] (b) Auf Kryo-EM basierendes Bild des an ein 80SRibosom gebundenen SRP. Die S- (Signalpeptid bindende) Domäne des SRP (rot) interagiert mit dem Polypeptid, das aus dem Ausgangskanal des Ribosoms hervortritt. Die Alu-Domäne des SRP bindet an das Ribosom an der ElongationsfaktorBindungsstelle. Die kleine (40S-) Untereinheit ist gelb, die große (60S-) Untereinheit türkis, und eine tRNA in der P-Stelle grün. [Mit freundlicher Genehmigung von Roland Beckmann, Universität München.)

1100

_ Proteinbiosynthese

Abb. 27.42 Kryo-EM-Struktur von E. coli-Ribosom und Translokationskomplex. Die 30S-Untereinheit ist gelb, die 50S-Untereinheit

nicht translozierender

PCC

hellblau, die tRNAs der A-, P- und E-Stelle sind

magenta bzw. grün und orange. Die mRNA ist

türkis, das entstehende Polypeptid gold und der Translokationskomplex am Ausgang des Polypeptidkanals dunkelblau. Der Translokationskomplex enthält zwei Exemplare des SecYEGKomplexes. Ein zweiter, nicht funktionsfähiger PCC (rot) ist am Ausgang des mRNA-Kanals an das Ribosom gebunden. [Mit freundlicher Genehmigung von Joachim Frank, Columbia University, New York.]

Austritt der mRNA

translozierender PCC

Verständnisfragen zu Abschnitt 5 1. Welche Funktion hat der

Triggerfaktor? Warum müssen in der Zelle mindestens ebenso

viele Triggerfaktoren wie Ribosomen vorhanden sein?

2. Nennen Sie mögliche posttranslationale Veränderungen von Proteinen. 3. Beschreiben Sie die Funktion der Komplexe, die in der Nähe des Austrittstunnels an das Ribosom binden.

saccharids aus 14 Resten an einen Asn-Rest. Die Verknüpfung des Oligosaccharids bestätigt, dass das Protein erfolgreich vom Cytosol zum Lumen des endoplasmatischen Reticulums transloziert wird. Die nachfolgende Beseitigung der beiden endständigen Glucosereste erlaubt dem Protein, mit einem Chaperon zu interagieren, welches das teilweise prozessierte Oligosaccharid erkennt. Die membrangebundene, 572 Reste umfassende Form des Chaperons namens Calnexin oder sein lösliches Homolog Calreticulin aus 400 Resten bindet das unreife (nicht gefaltete) Glykoprotein, um dessen Faltung zu unterstützen und es vor dem Abbau oder dem vorzeitigen Transfer zum Golgi-Apparat (wo die letzten Phasen der Oligosaccharidprozessierung stattfinden) zu schützen. Nachdem das gefaltete Glykoprotein von Calnexin/Calreticulin freigesetzt wurde, durchläuft es den restlichen Weg der Oligosaccharidprozessierung. Ein Glykoprotein, das freigesetzt wird, bevor es seine reife Konformation angenommen hat, kann trotzdem den nächsten Prozessierungsschritt durchlaufen - die Beseitigung eines weiteren Glucoserests. Wenn dies geschieht, dann verknüpft eine Glykosyltransferase (die das nicht gefaltete Glykoprotein erkennt) erneut einen Glucoserest mit dem Vorläufer-Oligosaccharid. Das Ergebnis ist, dass das Glykoprotein wieder an Calnexin/Calreticulin binden kann und eine neue Chance bekommt, sich korrekt zu falten (Abb. 27.43). Die meisten Glykoproteine werden mindestens noch einmal erneut glykosyliert.

Glucoserest

Deglykosylierung —Ir

I

1

Calnexin/Calreticulin Vz

Deglykosylierung

ee

>-

weitere Prozessierung

Polypeptid

Reglykosylierung

Deglykosylierung

gefaltetes Polypeptid

Abb, 27.43 Qualitätskontrolle bei der Oligosaccharidmodifizierung. Ein teilweise modifiziertes Glykoprotein, das einen endständigen Glucoserest trägt, kann an die Chaperone Calnexin oder Calreticulin binden. Das gebundene Glykoprotein wird dann deglykosyliert und weiter modifiziert. Ein nicht korrekt gefaltetes Glykoprotein, das deglykosyliert wird,

wird von einem Enzym mit einer Spezifität für nicht gefaltete Glykoproteine erneut glykosyliert. Dieser Mechanismus ermöglicht die korrekte Faltung und die Oligosaccharidmodifizierung neu synthetisierter Glykoproteine.

Zusammenfassung

Zusammenfassung EEE ar

Der genetische Code, durch den Nucleinsäuresequenzen in Aminosäuresequenzen translatiert werden, ist aus Trinucleotidcodons aufgebaut, die nicht überlappen und sequentiell von der proteinsynthetisierenden Maschinerie gelesen werden. Der genetische „Standard-Code“ aus 64 Codons beinhaltet zahlreiche Synonyme, drei Stoppcodons sowie Intiationscodons. Alle tRNAs besitzen zahlreiche, chemisch modifizierte Basen und eine ähnliche Kleeblatt-Sekundärstruktur, die einen Akzeptorstamm, einen D-Arm, einen TyC-Arm, einen Anticodonarm und einen variablen Arm umfasst. Die dreidimensionalen Strukturen von tRNAs sind einander ähnlich und werden durch Stapelwechselwirkungen und Basenpaarungen, die teilweise nicht dem Watson-Crick-Typ entsprechen, aufrechterhalten. . Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (aaRS) katalysieren die ATP-abhängige Verknüpfung einer Aminosäure mit der passenden tRNA. Klasse-I- und KlasseIl-aaRS unterscheiden sich in ihrer Struktur, der Art der tRNA-Erkennung und ihrer Aminoacylierungsstelle. Der Akzeptorstamm und die Anticodonschleife sind allgemeine Erkennungsmerkmale für tRNA-aaRS-Wechselwirkungen. Die Genauigkeit der Aminoacylierung wird durch Korrekturlesen erhöht. Die Wobble-Basenpaarung zwischen mRNA-Codons und tRNA-Anticodons an der dritten Position erklärt zum größten Teil die Degeneration des genetischen Codes. Innerhalb einer Art entsprechen die bevorzugten Codons den am zahlreichsten vorhandenen Typen in einem Satz isoakzeptierender tRNAs.

Ribosomen sind große Komplexe aus einigen RNA-Molekülen und zahlreichen Proteinen. Ihre Struktur wird durch ihre RNA-Bestandteile festgelegt. Eine kleine und eine große Untereinheit verbinden sich zu einem intakten Ribosom, das eine aa-tRNA an der A-Stelle, eine Peptidyl-tRNA an der P-Stelle und eine deacylierte tRNA an der E-Stelle aufnehmen kann. Während der Translationsinitiation verbinden sich eine mit fMet (in Prokaryoten) oder Met (in Eukaryoten) beladene Initiator-tRNA, eine mRNA mit einem AUG-Startcodon und die Ribosomenuntereinheiten. Die Initiation erfordert GTP-hydrolysierende Initiationsfaktoren. Das initiierende AUGCodon wird in Prokaryoten über die Shine-Dalgarno-Sequenz der mRNA identifiziert. In Eukaryoten wird das Start-AUG der mRNA in einem komplexen Vorgang durch seine Nähe zur 5’-Kappe der mRNA identifiziert. Polypeptide werden vom N-Terminus in Richtung zum C-Ierminus syn-

thetisiert. Eine aa-tRNA im Komplex mit einem GTP-hydrolysierenden Elongationsfaktor bindet an die A-Stelle, wo das Ribosom eine korrekte Codon-Anticodon-Paarung registriert - ein Vorgang, dessen Genauigkeit

durch das Korrekturlesen gesteigert wird. Die Peptidyltransferase-Aktivität der RNA der großen Untereinheit katalysiert den Angriff der Aminogruppe der an der A-Stelle gebundenen aa-tRNA auf die Peptidyl-tRNA in der PStelle. Nach der Transpeptidierung fördert ein zweiter GTP-hydrolysierender Elongationsfaktor die Translokation der neuen Peptidyl-tRNA zur P-Stelle. Zur Termination der Translation werden Freisetzungsfaktoren benötigt, die Stoppcodons erkennen. 10. Sobald ein Polypeptid das Innere des Ribosoms verlässt, beginnt es sich mithilfe von Chaperonen zu falten. Proteine können eine posttranslationale Prozessierung erfahren, dazu gehören Proteolyse, kovalente Modifikation, Translokation durch eine Membran und Glykosylierung.

1101

1102

Proteinbiosynthese

Wichtige Begriffe Shine-Dalgarno-Sequenz Initiationsfaktor Transpeptidierung Elongationsfaktor Translokation Freisetzungsfaktor Nonsense-Mutation

genetischer Code Codon Degeneration Suppressor Leseraster Rasterschubmutation Anticodon

variabler Arm

Synonym

A-Stelle

Stoppcodon Akzeptorstamm D-Arm Anticodonarm TyC-Arm

P-Stelle E-Stelle Peptidyltransferase

posttranslationale Modifikation Proprotein Präprotein

Polysom fMet

Präproprotein

aaRS Aminoacyl-tRNA isoakzeptierende-tRNA Wobble-Hypothese Peptidyl-tRNA Kryoelektronenmikroskopie

Nonsense-Suppressor

Aufgaben ||| ————— EEE —————

————————————————————

————————————————————

1. Könnte die Deletion eines einzelnen Nucleotids die Funktion eines proteincodierenden Gens wiederherstellen, das durch die Insertion einer 4 nt langen Sequenz unterbrochen ist? Begründen Sie Ihre Antwort! 2. Zählen Sie alle möglichen Codons auf, die in einem Ribonucleotidpolymer vorliegen, das eine zufällig angeordnete Sequenz aus U- und G-Nucleotiden besitzt. Welche Aminosäuren werden durch diese RNA codiert? 3. Nennen Sie alle Aminosäuren, die durch Codons spezifiziert werden, welche durch eine Punktmutation zu einem Amber-Codon verändert werden können. 4. Ein doppelsträngiges Fragment einer viralen DNA, deren einer Strang unten abgebildet ist, codiert zwei Peptide, die als vir-1 und vir-2 bezeichnet werden. Die Zugabe dieses doppelsträngigen DNA-Fragments zu einem in-vitroTranskriptions- und Translationssystem liefert Peptide aus 10 Aminosäuren (vir-1) und 5 Aminosäuren (vir-2). AGATCGGATGCTCAACTATATGTGATTAACAGAGCATGCGGCATAAATCT (a) Identifizieren Sie die DNA-Sequenz, die jedes Peptid codiert. (b) Bestimmen Sie die Aminosäuresequenz jedes Peptids. (cC) In einem mutierten viralen Stamm wurde Tan der Position 23 durch G ersetzt. Bestimmen Sie die Aminosäuresequenzen der zwei codierten Peptide in dieser Virusmutante. 5. Unten ist die Sequenz des Sense-Strangs eines Säugergens gezeigt. Bestimmen Sie die Sequenzen der reifen mRNA und des codierten Proteins. Gehen Sie dabei von der Annahme aus, dass die Transkription ungefähr 25 bp stromabwärts der TATAAT-Sequenz beginnt, dass jede 5'-Spleißstelle die Sequenz AG/GUAAGLU besitzt und dass jede 3'-Spleißstelle die Sequenz AGG/N besitzt, wobei N für jede der vier RNA-Basen steht und das Symbol „/“ den Ort des Spleißens markiert. TATAATACGCGCAATACAATCTACAGCTTCGCGTA AATCGTAGGTAAGTTGTAATAAATATAAGTGAGT ATGATAGGGCTTTGGACC-

GATAGATGCGACCCTG GAGGTAAGTATAGATAATTAAGCACAGGCATGCAGGG ATATCCTCCAAATAGGTAAGTAACCTTACGG TCAATTAATTAGGCAGTAGATGAATAAACGATAT CGATCGGTTAGGTAAGTCTGAT 6. IleRs verwendet einen Mechanismus des zweifachen Aussiebens, um exakt Ile-tRNA"® zu bilden und die Synthese von Val-tRNA"* zu verhindern. Welche anderen Aminosäurenpaare unterscheiden sich in der Struktur durch

einen einzigen Kohlenstoff und könnten aaRS haben, die einen ähnlichen Mechanismus des zweifachen Aussiebens zum Korrekturlesen verwenden? 7. Bei Eukaryoten ist das primäre rRNA-Transkript eine 45SıRNA, die die Sequenzen der 18S-, 5S- und 28s-rRNAs

8.

9.

10.

11.

beinhaltet, die durch kurze Zwischenstücke getrennt sind. Was ist der Vorteil dieser operonartigen Anordnung der IRNA-Gene? Erklären Sie, warum die Translation einer mRNA durch ein Segment ihrer komplementären Sequenz, der sogenannten Antisense-RNA, inhibiert werden kann. Welchen Grund könnte es haben, dass Peptide wie z.B. fMet-Leu-Phe die Phagocytoseaktivität (das Umschließen und Abbauen von Partikeln) von Säugerleukocyten (weiße Blutkörperchen) stimulieren? Erklären Sie, warum prokaryotische Ribosomen ein ringförmiges mRNA-Molekül translatieren können, während eukaryotische Ribosomen dies sogar in Anwesenheit der erforderlichen Cofaktoren normalerweise nicht können. Der Faktor EF-TU bindet alle Aminoacyl-IRNAs mit annähernd gleicher Affinität, sodass er sie an das Ribosom mit der gleichen Effizienz liefern kann. Erklären Sie basierend auf den experimentell bestimmten Bindungskonstanten für EF-Tu und korrekt und falsch beladener Aminoacyl-tRNAs (siehe Tabelle), wie das tRNA-EF-TuErkennungssystem dennoch den Einbau der falschen Aminosäure während der Translation verhindern könnte.

Literatur Aminoacyl-tRNA

Dissoziationskonstante (nM)

Ala-tRNA*:

er

Gln-tRNA"

0,05

Gln-tRNAC"

4,4

260 Ala-tRNAC!" EE _-_: _» E. __.. an. 0 [Quelle: LaRiviere, F.)., Wolfson, A.D. und Uhlenbeck, ©.C., Science

294, 167 (2001).]

12. Der eukaryotische Initiationsfaktor eIF2B ist ein GuaninNucleotid-Austauschfaktor. Erklären Sie, warum eIF2B die Aktivität von eIF2 erhöhen würde. 13. Das Antibiotikum Paromomycin bindet an ein Ribosom und induziert die gleichen Konformationsänderungen in den 16S-rRNA-Resten A1492 und A1493, die durch CodonAnticodon-Paarung induziert werden (Abb. 27.31). Erklären Sie anhand dieser Beobachtung die antibiotische Wirkung von Paromomycin. 14. Die Geschwindigkeit der Peptidyltransferase-Reaktion nimmt zu, wenn der pH-Wert von 6 auf 8 ansteigt. (a) Erklären Sie dies anhand des Reaktionsmechanismus.

1103

(b) Man hat vorgeschlagen, dass der Rest A2486 protoniert ist und deshalb das tetraedrische Reaktionszwischenprodukt stabilisiert. Steht diese Hypothese im Einklang mit dem beobachteten pH-Effekt? 15. Alle Zellen enthalten ein Enzym namens Peptidyl-IRNAHydrolase, und Zellen, denen das Enzym fehlt, wachsen sehr langsam. Welche Funktion hat das Enzym wahrscheinlich und warum ist es erforderlich? 16. Berechnen Sie die Energie in ATP-Äquivalenten, die notwendig ist, um ein Protein aus 100 Aminosäuren, ausgehend von den freien Aminosäuren, in E.coli zu syn-

thetisieren. Nehmen Sie an, dass das N-terminale Met nicht abgespalten wird und dass kein Korrekturlesen am Ribosom erfolgt. 17. Entwerfen Sie eine mRNA, die das Oktapeptid Lys-Pro-AlaGly-Thr-Glu-Asn-Ser codiert, mit allen dazu notwendigen prokaryotischen Regulationsstellen.

Elektronisches Zusatzmaterial

auf www.wiley.com/college/voet Case Study 29 Pseudovitamin D Deficiency An apparent vitamin D deficiency is actually caused by a mutation in an enzyme leading to the vitamin’s synthesis.

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Die kontrollierte Expression der genetischen Information erfordert eine Vielzahl an Faktoren, die spezifisch und unspezifisch mit der DNA interagieren. Diese Zeichnung zeigt schematisch Transkriptionsfaktoren im Präinitiationskomplex, der in Eukaryoten vor der Transkription von DNA in mRNA gebildet werden muss. [Illustration von Irving Geis. © The Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute.)

Regulation der Genexpression Elektronisches Zusatzmaterial (in englischer Sprache, verfügbar auf www.wiley.com/college/voet) Guided Exploration 30 Interactive Interactive Interactive Interactive Interactive

Exercise Exercise Exercise Exercise Exercise

55 56 57 58 59

EEE ZELTE EEE FEZSOTETZÄS DATTELN

Die getreue Replikation der DNA garantiert, dass alle Nachkommen einer einzelnen Zelle quasi identische genetische Informationen besitzen. Dennoch können einzelne Zellen von ihren Vorläufern z.T. recht stark abweichen, je nachdem, wie diese Informationen abgelesen werden. Die Expression genetischer Information in einer bestimmten Zelle oder einem Organismus, also die Synthese von RNA und Proteinen entsprechend der DNA-Sequenz, ist weder zufällig, noch ist sie vollständig genetisch vorgegeben. Die genomische Information eines Organismus muss vielmehr schrittweise während der Entwicklung abrufbar sein und muss dann zur Verfügung stehen, wenn der Organismus auf veränderte innere oder äußere Einflüsse reagieren muss. Bei der Regulation der Genexpression kommt es darauf an, wie die genetische Information organisiert ist und wie sie bei Bedarf möglichst rasch ausfindig gemacht und abgelesen werden kann. Da die Mechanismen für die Gentranskription und Gentranslation recht komplex sind, ist zu erwarten, dass diejenigen zur Steuerung dieser Prozesse noch komplizierter sind. Tatsächlich haben wir bereits zahlreiche Beispiele kennen gelernt, wie akzessorische Proteine die Spezifität oder die Rate von Transkription und Translation beeinflussen können. In diesem Kapitel werden wir zusätzliche Aspekte der Genexpression betrachten. Wir werden anhand einiger Strategien von Pro- und Eukaryoten sehen, wie ihre genetische Information den Aufbau der Zelle und deren metabolische Funktionen festlegt.

1

Organisation des Genoms

Die Genomik, das Studium des Genoms eines Organismus, wurde erst möglich,

als Techniken zur raschen Sequenzierung großer DNA-Mengen (wie sie z.B. in Chromosomen vorkommen) verfügbar waren. Die Identifizierung von Genen, die früher durch Hybridisierung von Oligonucleotidsonden erfolgte, gelingt nun durch Sequenzvergleiche in einer Datenbank (Abschnitt 5.3E). Im Grunde ist eine rechnergestützte Datenbank die einzige Möglichkeit, die riesigen InforLehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt Copyright © 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32667-9

Regulation der Genexpression e Organisation des Genoms e Regulation der prokaryotischen Genexpression

© Regulation der eukaryotischen Genexpression

e Zellcyclus, Krebs und Apoptose

1106

Regulation der Genexpression

Abb. 28.1 Genkarte des 1670 kb großen zirkulären Genoms von H. pylori. Die 1590 vorhergesagten proteincodierenden Sequenzen (91% des Genoms) sind durch verschiedene Farben im äußeren Ring angegeben, der den (+)-Strang der DNA darstellt. Der zweite Ring repräsentiert den (-)-Strang. Der dritte und vierte Ring zeigen eingeschobene Sequenzelemente und andere repetitive Sequenzen (2,3% des Genoms). Der fünfte und sechste Ring zeigen

Genehmigung von )J. Craig Venter Institute,

{

1,500,000 aLlur j N, 77) m

, 200,000

SSNN 1,400,000

inf. a

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1,300,000 —S

Gene für tRNAs, rRNAs und andere kleine RNAs

(0,7% des Genoms). Intergenische Sequenzen machen 6% des Genoms aus. [Mit freundlicher

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1,600,000

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700.000

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mationsmengen in einer gesamten Genomsequenz zu verwalten. Selbst ein vereinfachtes Diagramm des Genoms eines gewöhnlichen Bakteriums, wie z.B. Helicobacter pylori (Abb. 28.1), zeigt eine riesige Genanzahl. Dennoch macht es die Sequenzierung und Aufzeichnung eines Gesamtgenoms möglich, weit reichende Schlüsse zu ziehen; beispielsweise wie viele Gene ein Organismus enthält, wie sie organisiert sind und wozu sie dienen.

A.

Anzahl der Gene

Selbst eine grobe Korrelation zwischen der Menge des genetischen Materials eines Organismus (dem C-Wert) und der Komplexität seiner Morphologie und seines Metabolismus (Tab. 3.3) ist nicht immer gegeben. Dies nennt man das C-Wert-Paradoxon. So ist beispielsweise das Genom von Lungenfischen 10 bis 15-mal größer als das von Säugetieren (Abb. 28.2); das Genom einiger Algen ist immerhin noch 10-mal größer. Man weiß zwar, dass ein großer Teil dieser „überschüssigen“ DNA nicht exprimiert wird, aber über deren eigentliche Funktion kann man bis heute nur spekulieren. Die gesamten Genomsequenzen mehrerer Pro- und Eukaryoten, einschließlich einiger relativ großer und komplexer Organismen, weisen jedoch darauf hin, dass die Anzahl der Gene bzw. die Gesamtmenge an DNA in etwa mit der Komplexität eines Organismus korreliert (Tab. 28.1). So besitzen Menschen etwa 23.000 Gene, E.coli jedoch lediglich ca. 4.300. Nur ein kleiner Teil des menschlichen Genoms codiert Proteine

Etwa 3.000.000 kb der 3.200.000 kb des menschlichen Genoms wurden vollständig sequenziert. Die restliche DNA beinhaltet genarme Regionen in der Nähe der Centromere und Telomere. Nicht mehr als 1,4% des Genoms codieren Proteine, und die rund 23.000 Proteine codierenden Gene sind - manchmal in Gruppen über das gesamte Genom verteilt. Zur Identifizierung der Gene des Humangenoms oder anderer Genome gibt es mehrere Herangehensweisen. Ein Gen kann anhand seiner Komplementarität zu einer zuvor beschriebenen mRNA oder Proteinsequenz identifiziert werden. Ein proteincodierendes Gen kann auch über ein offenes Leseraster (engl.: open reading frame; ORF) identifiziert werden - eine Sequenz, die nicht durch Stoppcodons unterbrochen ist und eine ähnliche Codonverteilung wie bekannte Gene des Organismus aufweist. Wir haben nur ein lückenhaftes Wissen darüber, anhand welcher Eigenschaften

Organisation des Genoms > 100 BE

BE Vögel

1107

Säuger

Reptilien und Kröten -Tösche Salamander GE H Apoda I Lungenfische ME Knochenfische BEE Haie BEE Agnatha (Neunaugen) I Cephalochordata I Urochordata (Tunicata) thropoden HE \V\ollusken I Anneliden BEE

55

BEE Echinodermen

40

An

Siospermen Gymnospermen

Dteridophyten (Farne) u | \copoda (Bärlappgewächse)

ungefähre Zahl Zelltypen verschiedener 20

HE I Nematoden

14-20 11 1-5 1-5 1-5

Bryophyten (Moose)

I Coelenteraten

wachsende morphologische Komplexität ———-

E Schwämme

PETE

TEESENFITTEITTEFTENEE

ee ERBEN Pilze

1-27

ee 10

Algen

Protozoen

Bakterien 10

10°

40%

40"°

1071

1072

Größe des haploiden Genoms (Nucleotidpaare)

Abb. 28.2 Unterschiedlicher DNA-Gehalt des haploiden Genoms bei verschiedenen

Zellen Gene erkennen, zumal die menschlichen Gene aus relativ kurzen Exons bestehen (durchschnittlich etwa 150 Nucleotide), die durch viele längere Introns getrennt sind (durchschnittlich rund 3500 Nucleotide und oft mehr). Die genannten Tatsachen haben den Erfolg von rechnerbasierten Algorithmen zur Genidentifizierung eingeschränkt. Solche Algorithmen greifen nämlich auf Sequenzabgleiche mit Expressed Sequence Tags (ESTs; cDNAs, die von mRNAs zurücktranskribiert wurden und die Gene charakterisieren, die in dieser Zelle exprimiert werden) und Abgleiche mit bekannten Genen aus anderen Organismen zurück. Gene werden manchmal auch durch das Vorhandensein Tab. 28.1

Genomgröße und Anzahl der Gene in verschiedenen Organismen.

Organismus

Genomgröße (kb)

Anzahl Gene

Haemophilus influenzae (Bakterium)

1.830

1.740

Escherichia coli (Bakterium)

4.639

4.289

Saccharomyces cerevisiae (Hefe)

11.700

6.034

Caenorhabditis elegans (Nematode)

97.000

19.099

Oryza sativa (Reis)

390.000

ca.

35.000

Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand)

117.000

ca.

26.000

Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)

137.000

13.061

Mus musculus (Maus)

2.500.000

ca. 23.000

Homo sapiens (Mensch)

3.200.000

ca. 23.000

Organismengruppen. Die morphologische Komplexität der Organismen, wie sie sich nach der Zahl ihrer verschiedenen Zelltypen abschätzen lässt, nimmt von unten nach oben zu. Die haploide Genomgröße korreliert in etwa mit der Komplexität; Ausnahmen werden durch das C-Wert-Paradoxon beschrieben. [Nach Raff, R.A., und Kaufman, T.C., Embryos, Genes, and Evolution, S. 314, Macmillan (1983).]

1108

Regulation der Genexpression Zelladhäsion (577; 1,9 %) Verschiedenes (1318; 4,3 %) virale Proteine (100; 0,3 %)

Transportproteine (203; 0,7 %) Transkriptionsfaktoren (1850; 6,0 %)

Chaperone (159; 0,5 %) Strukturproteine des Cytoskeletts (876; 2,8 %)

extrazelluläre Matrix (437; 1,4 %) Immunglobuline (264; 0,9 %) lonenkanäle (406; 1,3 %) Motoren (376; 1,2 %)

Strukturproteine der Muskeln (296; 1,0 %) Protoonkogene (902; 2,9 %) ö Calcium-Bindungsproteine (34; 0,1 %)

Enzyme des NucleinsäureStoffwechsels (2308; 7,5 %)

intrazelluläre Transporter (350; 1,1 %) Transporter (533; 1,7 %) Signalmoleküle (376; 1,2 %)

Rezeptoren (1543; 5,0 %)

Kinasen (868; 2,8 %)

andere regulatorische Moleküle (988; 3,2 %) Transferasen

Synihasen und Synthetasen (313; 1,0 %) Oxidoreduktasen (656; 2,1 %) Lyasen (117; 0,4 %) Ligasen (56; 0,2 %)

Isomerasen (163; 0,5 %) Hydrolasen (1227; 4,0 %)

Abb. 28.3 Verteilung der molekularen Funktionen mutmaßlicher Strukturgene im menschlichen Genom. Jedes Segment des Tortendiagramms führt in Klammern die Anzahl und den Prozentsatz der Gene auf, die der angegebenen molekularen Funktionsklasse zugeordnet sind. Der äußere Kreis gibt die allgemeinen Funktionsklassen an, während der innere Kreis die Klassen näher aufschlüsselt. [Mit freundlicher Genehmigung von J. Craig Venter Institute, Rockville.]

unbekannte molekulare Funktionen (12809; 41,7 %)

von CpG-Inseln (Exkurs 25.4) erkannt. CpG-Dinucleosidphosphate kommen im Wirbeltiergenom nur zu etwa einem Fünftel der bei Zufallsverteilung erwarteten Häufigkeit vor (weil die spontane Desaminierung von m’C ein normales T ergibt und deshalb oft eine CG—TA-Mutation zur Folge hat), aber in Gruppen oder Inseln in stromaufwärts gelegenen Regionen vieler Gene (ca. 56% der menschlichen Gene) kommen sie mit nahezu normaler Häufigkeit vor. Die Anzahl der menschlichen Gene ist weit geringer als man einst vorhergesagt hatte. Die Diskrepanz zwischen den augenblicklichen Schätzungen — manche sagen weniger als 20.000 Gene vorher — und früheren Schätzungen von 140.000 Proteine codierenden Strukturgenen, wird zum großen Teil der hohen Verbreitung des alternativen Spleißens (Abschnitt 26.3A) zugeschrieben. Außerdem bewirken Veränderungen der posttranslationalen Modifikation (Abschnitt 27.5B), dass eine bestimmte DNA-Sequenz zu mehreren funktionell verschiedenen Proteinprodukten führen kann. Die Funktionen vieler menschlicher Gene wurden durch Sequenzvergleiche auf der Ebene von Proteinfamilien und von Domänen identifiziert (Abb. 28.3). Man bedenke, dass nahezu 42% dieser Gene unbekannte Funktionen haben, gleiches gilt für die meisten anderen Genome bekannter Sequenz, einschließlich der Genome von Prokaryoten. Gene ohne bekannte Funktion heißen Waisengene (engl.: orphan genes). Manche dieser Sequenzen stellen unter Umständen Gene dar, deren Proteinprodukte noch nicht entdeckt wurden. Andere sind eventuell nur einfach Pendants bekannter Gene, haben aber eine zu unterschiedliche Sequenz um als solche erkannt zu werden. Etwa drei Viertel aller bekannten menschlichen Gene scheinen in anderen Spezies Entsprechungen zu haben. Ein Viertel kommt nur bei anderen Wirbeltieren vor und ein weiteres Viertel sowohl bei Pro- als auch bei Eukaryoten. Wie erwartet, enthält das menschliche

Genom

etwa die gleiche Anzahl an „Haus-

haltsgenen“ (Genen, die für die grundlegendsten den) wie die anderen Eukaryoten. Aber es enthält tierspezifische Aktivitäten, wie diejenigen, die für nale und hormonelle Signalwege von Bedeutung

Zellaktivitäten gebraucht werrelativ mehr Gene für wirbeldas Immunsystem und neurosind.

Organisation des Genoms

1109

Ein erheblicher Teil des menschlichen Genoms wird zu RNA transkribiert,

die jedoch nicht translatiert wird . Obwohl der Anteil der Exon-DNA im menschlichen Genom relativ klein ist (rund 1,4%), werden unter Umständen 60% des Genoms transkribiert. Die RNA-Menge umfasst die Produkte von etwa 4000 identifizierten Genen für tRNAs, rRNAs und anderen kleinen RNAs sowie Zehntausende von anderen nicht codierenden RNAs (ncRNAs), deren Funktion bislang vielfach noch unbekannt ist. Manche ncRNAs sind wie mRNAs polyadenyliert (Abschnitt 26.3A), entsprechen aber keinen bekannten Genen. Eine Möglichkeit ist, dass diese RNA das „Transkriptionsrauschen“ von promotorartigen Elementen darstellt, die über das ganze Genom verstreut sind.

Viele für Krankheiten verantwortliche Gene hat man identifiziert Die Verfügbarkeit menschlicher Genomdaten hat die Identifizierung von Sequenzvarianten erleichtert, die mit bestimmten Krankheiten in Verbindung stehen. Man hat über 2000 solcher Gene katalogisiert, einschließlich der Gene für die cystische Fibrose (siehe Exkurs 3.1) und für einige erbliche Krebsformen. Krankheiten, die nur durch ein Gen verursacht werden, sind jedoch ziemlich selten. Die meisten Krankheiten rühren von der Wechselwirkung mehrerer Gene mit Umweltfaktoren her. Ein Ziel der Genomik ist, genetische Eigenschaften zu identifizieren, die mit der Krankheits- und Infektionsanfälligkeit verknüpft werden können. Zu diesem Zweck wird ein Katalog menschlicher DNA-Sequenzvarianten in Form einer Datenbank mit Einzelnucleotidpolymorphismen (engl.: single nucleotide polymorphisms, SNPs; „snips“ ausgesprochen) aufgestellt. Ein SNP oder einzelner Basenunterschied zwischen zwei Individuen kommt durchschnittlich etwa alle 1250 bp vor. Man hat nahezu 2 Millionen SNPs beschrieben. Zwar haben weniger als 1% von ihnen Proteinvarianten zur Folge und wahrscheinlich noch weniger funktionelle Konsequenzen, aber es wird immer offensichtlicher, dass SNPs zum großen Teil für die Anfälligkeit einer Person gegenüber zahlreichen Krankheiten sowie für Unverträglichkeiten von Arzneistoffen verantwortlich sind (Nebenwirkungen; Abschnitt 12.4). Zudem können SNPs als genetische Marker für benachbarte, mit Krankheiten in Beziehung stehende Gene dienen.

B.

Gencluster

Die Verteilung der Gene innerhalb des Genoms ist nicht zufällig. Die Genfrequenz im menschlichen Genom zum Beispiel, die im Mittel bei einem Gen auf rund 100 kb liegt, kann zwischen 0 und 64 Genen je 100 kb variieren. Darüberhinaus weisen einige proteincodierende Gene und andere chromosomale Elemente einen gewissen Grad an Organisation auf. Beispielsweise enthalten prokaryotische Genome zahlreiche Operons, auf denen Gene mit verwandten Funktionen (die z.B. Proteine eines speziellen metabolischen Reaktionswegs codieren) nahe beieinander liegen, wie wir in Abschnitt 26.1B gesehen haben. Unter Umständen entspricht sogar deren Reihenfolge der Abfolge der codierten Proteine in der Reaktionssequenz, und die Gene werden gemeinsam in eine polycistronische mRNA transkribiert. Gencluster kommen in Pro- und Eukaryoten vor. Obwohl die meisten Gene nur einmal im haploiden Genom eines Organismus vorhanden sind, können z.B. Gene für rRNA und tRNA (deren Produkte in relativ großen Mengen benötigt werden) auch mehrfach vorkommen. Wie wir in Abschnitt 26.3B gesehen haben, werden lange rRNA-Transkripte in die gewünschten rRNA-Moleküle ge-

spalten. Zudem sind bei Eukaryoten die Gene, welche die 18S, 5,8S und 28S ıRNA codieren, in tandemförmiger Wiederholung angeordnet, die durch nicht transkribierte Zwischensequenzen getrennt sind (Abb. 28.4). Die rRNA-Gene können auf mehreren Chromosomen lokalisiert sein, und ihre haploide Anzahl

Abb. 28.4 Elektronenmikroskopische Aufnahme der tandemförmig angeordneten Gene für die 18S, 5,8S und 28S rRNA des Wassermolches Notophthalmus viridescens während der Transkription. Die Längsfasern sind die DNA. Die „Christbaumstrukturen“ entstehen durch neu synthetisierte RNA-Stränge, die mit Proteinen komplexiert sind;

sie markieren die Länge der Transkriptionseinheiten. Man beachte, dass die längsten Ribonucleoprotein-„Äste“ nur etwa 10% der Länge

ihrer entsprechenden DNA-Abschnitte erreichen. Offensichtlich sind die RNA-Stränge durch Sekundärstrukturinteraktionen und/oder Proteinassoziationen verkürzt. Die matrixfreien DNA-Abschnitte sind nicht transkribierte Zwischensequenzen.

[Mit freundlicher Genehmigung von Oscar L. Miller, Jr. und Barbara R. Beatty, University of Virginia.]

1110

Regulation der Genexpression

Abb. 28.5 Organisation und Länge der repetitiven Einheiten der Histon-Gencluster bei verschiedenen Organismen. Codierende Abschnitte sind farbig angegeben, Zwischensequenzen sind grau. Die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an (die oberen drei Organismen sind entfernt verwandte Seeigel).

P. miliaris R (früh)

6000 bp

S. purpuratus

6540 bp

(früh)

L. pietus (früh)

7240 bp

D. melanogaster

4800 bp

Ic

H1

H3

N.srl EEE

H2B

H2A

BES

HA

ES] 0000 vo

schwankt je nach Spezies von 50 bis über 10.000. Beim Menschen findet man z.B. 50 bis 200 rRNA-Blöcke, die auf fünf Chromosomen verteilt sind. tRNAGene sind ähnlich repetitiv und kommen in Clustern vor. Proteincodierende Gene kommen fast nie in mehreren Kopien vor, wahrscheinlich weil die wiederholte Translation einiger weniger mRNA-Transkripte schon genügende Mengen der meisten Proteine liefert. Eine Ausnahme stellen die Histonproteine dar, die während der kurzen Zeit, die für die eukaryotische DNA-Synthese zur Verfügung steht, in großen Mengen vorhanden sein müssen. Die Histongene wiederholen sich vielfach (bis zu ca. 100-mal in Drosophila) und kommen als Fünfergruppen vor. Jede Gruppe enthält je ein Gen für jedes der fünf Histone und diese Gene sind durch nicht transkribierte Zwischensequenzen getrennt (Abb. 28.5). Die Genanordnung und Transkriptionsrichtung in diesen Quintetten ist dabei evolutionär stark konserviert. Die Zwischensequenzen variieren allerdings stark mit der Spezies und bis zu einem gewissen Grad auch zwischen den Quintetten innerhalb eines Genoms. In Vögeln und Säugern, die 10 bis 20 Kopien jedes der fünf Histongene enthalten, kommen die Gene in Clustern, nicht jedoch in einer speziellen Reihenfolge vor. Andere Gencluster enthalten Gene mit ähnlichen, aber nicht identischen Sequenzen. Die menschlichen Globingene sind beispielsweise in zwei Clustern auf verschiedenen Chromosomen angeordnet (Abb. 28.6). Die verschiedenen Gene werden in verschiedenen Entwicklungsstadien transkribiert. Das Hämoglobin eines erwachsenen Menschen ist ein a,ß,-Tetramer, während das erste Hämoglobin, das ein Embryo bildet, ein &,£,-Tetramer ist, in welchem & und &

Abb. 28.6 Organisation der menschlichen Globingene. Aktive Gene sind rot, Pseudogene grün und Kpn-Sequenzen gelb dargestellt; ihre relative Orientierung ist durch die Pfeile angegeben. Die Dreiecke sind Alu-Sequenzen, ebenfalls in ihrer relativen Orientierung. [Nach Karlsson, S. und Nienhuis, A.W., Annu. Rev. Biochem. 54,

1074 (1985).] o.-artige Gene

aktives Gen

jeweils a- und ß-ähnliche Untereinheiten sind (Abb. 28.7). Etwa acht Wochen nach der Befruchtung tritt fötales Hämoglobin mit a- und y-Untereinheiten auf. Einige Wochen vor der Geburt wird dann die y-Untereinheit schrittweise durch ß ersetzt. Humanes Erwachsenenblut enthält ca. 97% ,ß,-Hämoglobin, 2% 0,0, (Ö ist eine weitere ß-Variante) und 1% a,y..

Der a-Globin-Gencluster (Abb. 28.6, oben) umfasst 28 kb und enthält drei funktionale Gene: das embryonale &-Gen und zwei leicht unterschiedliche aGene (al und a2), die beide identische Polypeptide codieren. Der a-Cluster enthält ebenfalls vier Pseudogene (nicht transkribierte Überreste alter Genduplikationen): WG, Wa2, Wal und 9. Der ß-Globin-Gencluster (Abb. 28.6, unten) umfasst über 60 kb und A fünf funktionale Gene: das embryonale Gen g, die beiden fötalen Gene “y und *y (eigentlich zwei Kopien eines Gens, deren zuge-

Pseudogen (y)

Alu-Sequenz

5 Chromosom

16

ß-artige Gene

Kpn-Sequenz 3

Chromosom

11

Organisation des Genoms

1111

Abb. 28.7 Entwicklung der fötalen Globinsynthese im Menschen. Man beachte, dass jede Blutzelle nur einen Typ der a- und ß-artigen Untereinheiten enthält. [Nach Weatherall, D.)., und Clegg, J.B., The Thalassaemia Syndromes (3. Aufl.), S. 64, Blackwell Scientific Publications (1981).]

50

40 30 20 10 % in Gesamtglobinsynthese Anteil an 6 12 18 24 30 SOREE

65.122187

24 7307362412218

Geburt

Wochen nach der Befruchtung

Wochen nach der Geburt

hörige Polypeptide sich nur durch Gly bzw. Ala in Position 136 unterscheiden), sowie die beiden adulten Gene ö und ß. Der ß-Globin-Cluster besitzt auch ein Pseudogen, nämlich WB. Sowohl a- wie B-Globin-Gencluster beinhalten Kopien repetitiver DNA-Sequenzen (siehe unten).

C. _ Eukaryotische Genome haben repetitive Sequenzen Ca. 11% des E.coli-Genoms besteht aus nicht transkribierten Regionen. Diese Regionen schließen Regulationssequenzen (trennen einzelne Gene) und Stellen zum Replikationsstart bzw. Replikationsende ein. Zusätzlich enthalten bakterielle Genome typischerweise Insertionssequenzen (Abschnitt 25.6C) und die

Überreste integrierter Bakteriophagen. Durch die geringe Größe der prokaryotischen Genome wird vermutlich ein Selektionsdruck gegen die Anhäufung nutzloser DNA ausgeübt. Eukaryotische Genome jedoch, die normalerweise viel größer sind, unterliegen diesem Selektionsdruck offensichtlich nicht. Ca. 30% des Hefegenoms besteht beispielsweise aus nicht transkribierten Sequenzen. Der Anteil ist in Eukaryoten noch viel größer. Zum Großteil besteht diese DNA aus repetitiven Sequenzen, die unter anderem für die enorme Größe einiger Pflanzen- und Amphibiengenome verantwortlich sind. Repetitive DNA hat eine strukturbildende Funktion an den Centromeren eukaryotischer Chromosomen, also den Regionen, an die sich während der Mitose die Mikrotubuli des Spindelapparats anheften. Diese Sequenzen könnten die Chromosomen ausrichten und die Rekombination erleichtern. Telomere bestehen ebenfalls aus repetitiven Sequenzen (Abschnitt 25.3C). Mindestens ein Duzend humaner Erkrankungen entsteht durch exzessiv wiederholte Trinucleotidsequenzen (vgl. Exkurs 28.1). Hochrepetitive Sequenzen werden millionenfach aneinandergereiht

Nahezu identische, bis zu 10 Basenpaare lange Sequenzen, die in Gruppen hintereinander wiederholt werden, kommen unter Umständen mit über 10° Kopien pro haploides Genom vor. Etwa 3% des menschlichen Genoms bestehen aus hochrepetitiven DNA-Sequenzen (auch als kurze Sequenzwiederholungen oder short tandem repeats, STRs, bezeichnet). Am meisten (0,5%) tragen dazu Dinucleotidwiederholungen bei, zumeist CA und TA. Es scheint, dass STRs durch Matrizenverschiebung während der DNA-Replikation zustande gekommen sind. Dies passiert häufiger bei kurzen Sequenzwiederholungen, die deshalb einen hohen Grad an Längenpolymorphismus innerhalb der menschlichen Bevölkerung haben. Weil die Anzahl der Wiederholungen an einem bestimmten STR-Locus zwischen den einzelnen Individuen variiert, ist die Analyse der STRs für DNA-Fingerabdrücke weit verbreitet (Exkurs 3.2).

1112

_ Regulation der Genexpression

Exkurs 28.1

Biochemieim Organismus

Krankheiten durch Trinucleotidwiederholungen Mindestens 14 Krankheiten beim Menschen sind mit repetitiven Trinucleotiden in bestimmten Genen verknüpft. Diese Trinucleotidwiederholungen oder Trinucleotid-Repeats sind genetisch ungewöhnlich instabil: Oberhalb eines Schwellenwerts von ca. 35 bis 50 Kopien (100-150 bp) neigen diese Wiederholungen

dazu,

sich von

Generation

zu Generation

auszuweiten. Da die Länge der Wiederholungen normalerweise mit dem Zeitpunkt des Krankheitsausbruchs korreliert, sind die Nachkommen eines kranken Individuums schwerer und früher davon betroffen. Man sagt deshalb, die Krankheit zeigt eine genetische Antizipation. Einige mit Trinucleotidwiederholungen verknüpfte Krankheiten werden durch massive Expansion (bis zu Hunderten von Kopien) eines Trinucleotids aus einer nicht codierenden Genregion verursacht. Eine solche Region kann z.B. stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes, in einer nicht translatiertten Region am 5’- oder 3’-Ende der mRNA (engl.: untranslated region, UTR) oder in einem Intron liegen (vgl. Tab.). Diese Expansionen beeinträchtigen im Allgemeinen die Genexpression. Beispielsweise ist die myotone Dystrophie die Folge einer anormalen Produktion einer Proteinkinase. Die Schwere der Symptome, progrediente Muskelschwäche und Muskelschwund, korrelieren mit der Anzahl von CTG-Wiederholungen (in manchen Fällen über 2000) in der 5’-UTR der mRNA. Krankheit

Wiederholung

Ort der Wiederholung

Fragiles X-Syndrom

CCG

5’-UTR

Myotone Dystrophie

CTG

stromaufwärtige Region, 3’-UTR

Friedreich-Ataxie

GAA

Intron

Das beim fragilen X-Syndrom, FMRI (für mentale Retardierung durch das fragile X; engl.: fragile X mental retardation 1), betroffene Gen codiert ein 632 Reste umfassendes RNA-Bindungsprotein namens FMRP (für FMR-Protein), das offensichtlich beim Transport bestimmter mRNA vom Zellkern zum Cytoplasma eine Rolle spielt. FMRP ist bei Wirbeltieren hoch konserviert und wird im Gehirn stark produziert. Es gibt mehrere

Anhaltspunkte

dafür,

dass

es

an

der

korrekten

Bildung und/oder Funktion von Synapsen beteiligt ist. In der allgemeinen Bevölkerung enthält die nicht translatierte 5’.Region von FMRI eine (CGG),-Sequenz, bei der n zwischen 6 und 60 liegt (man nennt ein solches Gen polymorph). Bei Personen mit fragilem X-Syndrom hat dieses Triplett jedoch eine erstaunliche Ausdehnung erfahren, hier liegt n bei über 200 bis zu mehreren Tausend. Zudem unterscheiden sich diese Tripletts hinsichtlich ihrer Größe zwischen Geschwistern und zeigen innerhalb einer Person oft Heterogenität. Dies legt nahe, dass sie durch somatische Prozesse gebildet werden. Einige Trinucleotid-Repeat-Krankheiten rühren von der mäftigen Ausweitung eines CAG-Tripletts (das die Aminosäure Glutamin codiert) in der proteincodierenden Region eines Gens her. Bei normalen Personen z.B. enthält Huntingtin, ein polymorphes Protein unbekannter Funktion aus rund 3150 Resten, einen Abschnitt aus 11 bis 34 aufeinander fol-

genden GIn-Resten. Dieser beginnt 17 Reste vom N-Terminus entfernt. Bei Morbus Huntington (Chorea Huntington) ist dieses Poly(GIn) auf 37 bis 86 Wiederholungen ausgedehnt. Synthetisches Poly(GIn) aggregiert zu ß-Faltblättern, die über Wasserstoffbrücken verbunden sind und dabei sowohl die Hauptketten- als auch die Seitenketten-Amidgruppen einbeziehen. Personen

nanten

mit Morbus

Krankheit,

Huntington, einer autosomal

leiden an

progredienten

domi-

unkoordinierten

Spinobulbäre Muskelatrophie Typ Kennedy

CAG

Exon

Bewegungen, dem Verlust kognitiver Fähigkeiten und psychischen Störungen. Die Krankheit kann sich über 15 bis 20

Chorea Huntington

CAG

Exon

Jahre hinziehen und ist ausnahmslos tödlich. Die verheerende Krankheit bricht normalerweise in einer späteren Lebensphase

Beim fragilen X-Syndrom, nach dem Down-Syndrom die häufigste Ursache für mentale Retardierung, ist die Spitze des langen Arms im X-Chromosom mit dem restlichen Chromosom über einen dünnen fragilen Faden verbunden. Wie bei vielen anderen Trinucleotid-Repeat-Erkrankungen auch, ist die Genetik des fragilen X-Syndroms ungewöhnlich. Die Grofväter

mütterlicherseits

von

Personen,

die am

fragilen

X-Syndrom leiden, können symptomfrei sein. Deren Töchter sind gleichfalls symptomfrei, aber die Kinder dieser Töchter beiderlei Geschlechts haben unter Umständen das Syndrom. Offensichtlich wird der Defekt des fragilen X bei der Passage durch eine Frau aktiviert.

aus, etwa

im Alter um

40, bei Personen

mit

einer großen Anzahl von Trinucleotidwiederholungen auch früher. Ein Kennzeichen von Chorea Huntington ist wie bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen (z.B. Morbus Alzheimer) die Ablagerung von unlöslichen Proteinaggregaten im Cytosol und in den Zellkernen von Nervenzellen (Abschnitt 6.5C). Das Auftreten dieser intrazellulären Aggregate (bei Morbus Huntington wahrscheinlich Huntingtin und/oder seine proteolytischen Produkte) deckt sich oft mit dem Ausbruch neurologischer Symptome. Es ist noch nicht klar, ob die Proteinaggregation direkt den Tod der Nervenzellen und die Begleitsymptome verursacht. Die lange Inkubationszeit bis zum Auftreten der Symptome von Morbus

Organisation des Genoms

Huntington geht auf die lange Keimbildungszeit für die Aggregatbildung zurück - ganz ähnlich, wie wir es bei der Bildung von Amyloidfibrillen gesehen haben (Abschnitt 6.50). Die Ausbreitung der Trinucleotidwiederholungen spielt sich über einen unbekannten Mechanismus ab. Es gibt eine Theorie, die besagt, dass zusätzliche

Nucleotide

während

der

Replikation durch Verschiebung der DNA-Polymerase eingeführt werden. Dies steht aber im Widerspruch zu der allmählichen Ansammlung von Trinucleotidwiederholungen bei Zellen (wie Nervenzellen), die sich normalerweise nicht teilen.

*

CAG-Wiederholung r ) IILLITITTTITTTTETTTTITTT

napagel

Ben

Eine andere Möglichkeit ist, dass die zusätzlichen Nucleotide

im Laufe von DNA-Reparaturprozessen eingeführt werden (die permanent stattfinden und von der DNA-Replikation unabhängig sind) und durch Haarnadelbildung innerhalb der Trinucleotidwiederholungsregion herrühren. Diese Basenpaarungsstrukturen innerhalb des Strangs (siehe Abbildung) können zu Ausrichtungsfehlern der DNA-Stränge und zur Polymerisierung

zusätzlicher

Nucleotide

führen,

um

Lücken zu füllen.

die

sul

nn

BEBEHEENLIEERDIEELERESTTRRSONRNEN Perg

N

ee

en

en

u

erweiterte CAG-Wiederholung

Mittelrepetitive Sequenzen sind aus Transposons entstanden

Mittelrepetitive DNA (mit weniger als 10° Kopien pro haploides Genom) kommt in Segmenten von hundert bis zu mehreren Tausend Basenpaaren vor, die mit großen Blöcken einmaliger DNA durchsetzt sind. Die meisten repetitiven Sequenzen sind die Überbleibsel von Retrotransposons (transponierbaren Elementen, die sich über die zwischengeschaltete Synthese der RNA verbreiten; Abschnitt 25.6C). Rund 42% des menschlichen Genoms bestehen aus drei Arten von Retrotransposons:

1. Lange, eingeschobene nucleäre Elemente (LINESs, engl.: long interspersed nuclear elements) sind Abschnitte von 6 bis 8 kb Länge (Abschnitt 25.6C). Bei der überwiegenden Mehrheit dieser Elemente treten Mutationen akkumuliert auf, sodass sie transkriptionsinaktiv sind. 2. Kurze, eingeschobene nucleäre Elemente (SINEs, engl.: short interspersed nuclear elements) sind Elemente aus 100 bis 400 Basenpaaren. Die üblichsten SINEs im menschlichen Genom sind die Vertreter der Alu-Familie. Diese werden so bezeichnet, weil die meisten ihrer rund 300 bp langen Abschnitte eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease Alul enthalten (AGCT; Tab. 3.2). Das Globin-Gen-Cluster enthält mehrere Alu-Elemente (Abb. 28.6). 3. Retrotransposons mit langen terminalen Wiederholungen (LTRs; engl.: long terminal repeats). Außerdem enthält das menschliche Genom DNA-Transposons, die den bakteriellen Transposons ähneln. Insgesamt besteht das menschliche Genom aus rund 45 % weit verstreuten und nahezu vollständig inaktiven, transponierbaren Elementen (Tab. 28.2). Der DNA mit mittelrepetitiver Sequenz hat man bislang keine eindeutige Funktion zuordnen können, weshalb man sie als nutzlose (eigennützige) oder Junk-DNA (engl.: junk, Schrott) bezeichnet hat. Diese DNA ist offensichtlich

1113

1114

Regulation der Genexpression Tab. 28.2 Mittelrepetitive Sequenzen im menschlichen Genom De en a ee TE an nn Anzahl der Kopien Länge (bp) Art der Wiederholung (X 1000)

Verständnisfragen zu Abschnitt 1 1. Welche Faktoren ermöglichen es, dass ein Mensch mit nur wenig mehr Genen als ein wirbelloses Lebewesen existieren kann? 2. Welche Funktion haben Gencluster, und wie sind sie entstanden? 3. Geben Sie das Verhältnis

zwischen Genomgröße, repetitiver DNA, transkribierter DNA und Protein-codierenden Exons im menschlichen Genom an.

Prozentualer Anteil am Genom

LINEs

6000-8000

868

20,4

SINEs

100-300

1558

13,1

1500-11000

443

8,3

294

2,8

LTR-Retrotransposons DNA-Transposons

Insgesamt

80-3000

44,8

Quelle: International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409, 800 (2001).

ein molekularer Parasit, der sich über viele Generationen hinweg über das Genom durch Transposition (Umgruppierung) verbreitet hat. Die Replikation einer ansonsten harmlosen eigennützigen DNA bürdet der Zelle allerdings eine erhöhte Stoffwechsellast auf. Gemäß der natürlichen Selektion würde dies schließlich zur Beseitigung dieser DNA führen. Bei langsam wachsenden Eukaryoten wäre der relative Nachteil durch die Replikation weiterer 100 bp eigennütziger DNA in einem circa 1 Milliarde Basenpaare umfassenden Genom aber so unerheblich, dass der Gewinn ihrer Eliminierung und der Preis für deren Verbreitung sich in etwa ausgleichen. Da nicht exprimierte Sequenzen kaum einem Selektionsdruck ausgesetzt sind, können sie in höherem Maß Mutationen ansammeln als exprimierte Sequenzen.

2

Regulation der prokaryotischen Genexpression

Die komplette Genomsequenz offenbart die metabolischen Fähigkeiten eines Organismus, aber die Gensequenz alleine zeigt nicht unbedingt an, wann oder wo die codierten Moleküle produziert werden. Der Weg von der Gensequenz bis zum vollständig funktionsfähigen Genprodukt beinhaltet viele mögliche Regulationspunkte. In Prokaryoten wird allerdings die Genexpression beinahe ausschließlich auf der Ebene der Transkription kontrolliert. Der Grund mag sein, dass prokaryotische mRNA nur für einige Minuten stabil ist, so dass sich eine Translationskontrolle erübrigt. In diesem Kapitel werden wir einige gut untersuchte Beispiele transkriptionaler Kontrolle in Prokaryoten betrachten. Anschließend widmen wir uns der Frage, wie eukaryotische Zellen die Genexpression regeln.

A. 62 Siehe Guided Exploration 30: The Regulation of Gene Expression by the lac Repressor System.

Der lac-Repressor

Bakterien passen sich ihrer Umgebung an, indem sie Enzyme zur Metabolisierung bestimmter Nährstoffe nur dann produzieren, wenn diese Nährstoffe auch vorhanden sind. So sind z.B. E.coli-Bakterien, die ohne Lactose im Medium wachsen, zunächst nicht in der Lage, dieses Disaccharid zu metabolisieren. Sie benötigen hierzu zwei Proteine, ß-Galactosidase, die Lactose in ihre Monosaccharidkomponenten zerlegt, und Galactosid-Permease (auch Lactose-Permease genannt, Abschnitt 10.3D), die den Transport von Lactose in die Zellen vermittelt.

Regulation der prokaryotischen Genexpression

CH,OH HO

CH,0OH

16)

H

H

o

OFZEH

H

OH

H

OH

H H OH

H

OH

H

O\_

H

Lactose

H,O ar B-Galactosidase

CH,0H

HO

O\

H OHs

OH i

H

H

H

CH,OH H

H

HO

OH

OH

ORZEEEH H

Galactose

O\

OH

Glucose

Wachsen E. coli-Bakterien in Abwesenheit von Lactose, so enthalten sie nur wenige Moleküle dieser Enzyme. Wird nun Lactose zum Kulturmedium gegeben, so steigern die Bakterien nach kurzer Zeit die Geschwindigkeit, mit der diese Proteine synthetisiert werden, etwa 1000fach und behalten diese Geschwindigkeit so lange bei, bis keine Lactose mehr vorhanden ist. Die Fähigkeit, gewisse Proteine nur dann zu synthetisieren, wenn die zu metabolisierenden Substanzen auch tatsächlich vorhanden sind, verleiht den Bakterien die notwendige Anpassungsfähigkeit an ihre Umgebung und enthebt sie der Notwendigkeit, ständig große Mengen nutzloser Proteine zu synthetisieren. Lactose oder eines ihrer Abbauprodukte muss also irgendwie die Synthese der genannten Proteine auslösen. Der physiologische Induktor des Lactose-Operons, das Lactoseisomer 1,6-Allolactose,

CH,OH HO

CH, o

H oH

Den

H

2

H

HO

KOH

H DE Hr

0

OH

H »gOH

1,6-Allolactose

entsteht bei der zufälligen Transglykosylierung der Lactose durch ß-Galactosidase. Bei den meisten invitro-Untersuchungen zum Lactosemetabolismus wird allerdings Isopropylthiogalactosid (IPTG) verwendet,

CH “

CH,OH

HO H

H

Or

OH

H

H

OH

sec | H

CH;

Isopropylthiogalactosid (IPTG)

ein synthetischer Induktor, der strukturell der Allolactose ähnelt, aber von PGalactosidase nicht abgebaut wird. Natürliche und synthetische Induktoren stimulieren ebenfalls die Synthese von Thiogalactosid-Transacetylase, einem Enzym, dessen physiologische Rolle bislang unbekannt ist.

1115

1116 (a)

Regulation der Genexpression (b)

ohne Induktor

mit Induktor

lae-0 pe[ON ne

Operator

Repressor bindet an Operator, dadurch wird das lac-Operon nicht transkribiert

) N

Repressor

Abb. 28.8 Expression des lac-Operons. (a) In Abwesenheit des Induktors bindet der Repressor (das Produkt des I-Gens) an den Operator (0) und verhindert dadurch die Transkription des lac-Operons vom Promotor (P) aus. (b) Nach Bindung des Induktors dissoziiert der Repressor vom Operator, so dass die Transkription

und anschließende Translation der lac-Strukturgene stattfinden kann (Z, Yund A, die ß-Galactosidase,

Lactosepermease und Thiogalactosid-Transacetylase codieren).

|

ß-Galactosidase

" Permease

Transacetylase

Transkription und

Induktor-RepressorKomplex bindet nicht an den Operator

Translation der

lac-Strukturgene

Die Gene, welche die ß-Galactosidase, Galactosid-Permease und Thiogalactosid-Transacetylase codieren, werden mit Z, Y bzw. A bezeichnet. Sie sind nebeneinander im lac-Operon angeordnet (Abb. 26.4). Alle drei Strukturgene werden in ein einziges mRNA-Transkript umgeschrieben. Ein nahe gelegenes Gen (I) codiert den so genannten lac-Repressor, welcher die Synthese der drei lac-Proteine inhibiert. Der lac-Repressor erkennt Operatorsequenzen

Die Zielsequenz des lac-Repressors ist eine Region auf dem lac-Operon, die als Operator bezeichnet wird, und nahe dem Beginn des ß-Galactosidase-Gens liegt. Fehlt der Induktor, so bindet der lac-Repressor spezifisch an den Operator und verhindert so die mRNA-Transkription (Abb. 28.8). Bindet hingegen der Induktor an den Repressor, so dissoziiert dieser vom Operator ab, und die Enzyme des lac-Operons können transkribiert und translatiert werden (Abb. 28.85). Der lac-Operator enthält drei Operatorsequenzen (O,, O, undO; genannt), an die der lac-Repressor mit hoher Affinität bindet. O,, die primäre Repressorbindungsstelle, wurde dadurch identifiziert, dass sie durch den lac-Repressor vor Nucleaseabbau geschützt ist. Die 26 bp lange, geschützte Sequenz liegt innerhalb einer beinahe symmetrischen Abfolge von 35 bp (Abb. 28.9). O, überlappt mit dem Transkriptionsstart des lacZ-Gens. Die Operatorsequenz O, liegt 401 bp stromabwärts, inmitten des Z-Gens, und O, befindet sich 93 bp stromaufwärts von O,, am Ende des lacI-Gens. Gentechnologische Experimente haben gezeigt, dass alle Operatorsequenzen vorhanden sein müssen, um in vivo eine maximale Repression zu erreichen.

Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Bindung des lac-Repres-

sors an den lac-Operator beträgt k=10'° M' -s'. Die daraus abgeleitete Bindungsrate ist wesentlich größer als die für den diffusionskontrollierten Prozess von Molekülen ähnlicher Größe in Lösung berechnete (k=107 M!.s!). Da eine Reaktion niemals schneller als die Diffusionsrate der beteiligten Moleküle ablaufen kann, kann der lac-Repressor nicht aus der Lösung in einer zufälligen, dreidimensionalen Suche auf den Operator treffen. Es muss vielmehr so sein, dass der lac-Repressor unspezifisch an die DNA bindet, an ihr entlang wandert und die Bindungsstelle am Operator in einer viel effektiveren eindimensionalen Suche findet. ..———

Abb, 28.9

Basensequenz des lac-Operators O\.

Die symmetrischen Regionen, welche 28 der 35 bp umfassen, sind rot unterlegt.

geschützt durch den lac-Repressor

——

I’ TGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA

3’

S’ACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT

5’

—

Regulation der prokaryotischen Genexpression

1117

Der lac-Repressor bindet gleichzeitig an zwei DNA-Segmente

Bei der Isolation des lac-Repressors stießen Benno Müller-Hill und Walter Gil. bert 1966 auf große Schwierigkeiten, da er lediglich ca. 0,002% des Proteins vom E.coli Wildtyp ausmacht. Durch molekulare Klonierung (Abschnitt 3.5) konnten später aber große Mengen des lac-Repressors isoliert werden. Die vollständige dreidimensionale Struktur wurde dennoch erst 1996 von Ponzy Lu und Mitchell Lewis gelöst. Jede der 360 Reste langen Untereinheiten des Repressorhomotetramers hat vier funktionale Bereiche (Abb. 28.10): 1. Ein N-terminales „Kopfstück“ mit Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH), das vergleichbaren Motiven in prokaryotischen DNA-Bindungsproteinen ähnelt (Abschnitt 24.4B). Es bindet spezifisch an DNA-Abschnitte des Operators. 2. Ein Verbindungsstück, das aus einer kurzen a-Helix besteht, als Scharnier dient und ebenfalls DNA bindet. In Abwesenheit von DNA sind die Scharnierhelices des lac-Repressortetramers ungeordnet, so dass sich die Kopfstücke frei bewegen können. 3. Einen Kern aus zwei Domänen, welcher Induktoren, wie IPTG, bindet. 4. Eine C-terminale a-Helix, welche für die Quartärstruktur des lac-Repressors wichtig ist. Alle vier C-terminalen Helices sind im Tetramer assoziiert. Überraschenderweise hat das Homotetramer keine D2-Symmetrie (d.h. zwei zueinander senkrechte zweizählige Achsen; Abschnitt 6.3), wie sie sonst fast alle homotetrameren Proteine aufweisen. Es ist vielmehr V-förmig (mit einer nur zweizähligen Symmetrie), weshalb man es auch als ein dimeres Dimer bezeichnen könnte (Abb. 28.11). Die Röntgenstruktur des Komplexes aus lac-Repressor und einer 21 bp langen, hochaffinen, synthetischen DNA zeigt, dass jedes Repressortetramer zwei DNAAbschnitte bindet (Abb. 28.11). Das Repressor-HTH-Motiv passt genau in die große Furche, wobei es die DNA so biegt, dass ein Radius von 6 nm entsteht. Die zwei gebundenen DNA-Segmente haben einen Abstand von ca. 2,5 nm. IPTG bindet an den Repressorkern, und zwar an der Verbindung zwischen den beiden Domänen (hell- und dunkelblau in Abb. 28.10). Die Bindung induziert eine Konformationsänderung, die über die Scharnierregionen an die Kopfstücke vermittelt wird. Dadurch werden die zwei DNA-Bindungsdomänen in jedem Dimer um ca. 0,35 nm voneinander getrennt, so dass sie nicht länger beide gleichzeitig an die DNA binden können, wodurch der Repressor von der DNA dissoziiert.

Abb. 28.10 Schleifendiagramm des lac-Repressormonomers. Die DNA-Bindungsdomäne mit ihrem Helix-TurnHelix-Motiv ist rot dargestellt, die DNA-bindende Scharnierhelix ist gelb, der den Induktor bindende Kern ist hell- und dunkelblau, die Tetramerisie-

rungshelix ist purpurrot gefärbt. [Mit freundlicher Genehmigung von Ponzy Lu und Mitchell Lewis, University of Pennsylvania. PDBid ILBG.]

Abb. 28.11 Röntgenstruktur des lac-Repressor-Tetramers, gebunden an zwei, 21 bp lange DNA-Segmente. Die Monomereinheiten des Repressors (in Schleifenform) sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Die DNA ist als Kalottenmodell gezeigt, mit C grün, N blau, O rot und P orange.

[Nach einer Röntgenstruktur von Ponzy Lu und Mitchell Lewis, mit Koordinaten von Benjamin

Wieder, University of Pennsylvania. PDBid 1LBG.]

1118

Regulation der Genexpression

Der lac-Repressor ist ein allosterisches Protein. Die IPTG-Bindung an eine Untereinheit verändert die DNA-Bindungsaktivität der zweiten Untereinheit im Dimer (aber nicht diejenige des anderen Dimers im Tetramer). Wenn eine allosterische Transition innerhalb eines Dimers möglich ist, warum muss dann der vollständig aktive Repressor ein Tetramer sein? Modellstudien liefern auch dafür eine plausible Erklärung. Ein lac-Repressortetramer bindet gleichzeitig an zwei Operatoren und bringt diese dadurch zusammen. So wird eine DNA-Schleife gebildet, entweder aus 93 oder 401 bp, je nachdem, ob der Repressor an O, und O; oder O, und O, bindet. Die Ausbildung einer stabilen Schleifenstruktur kann zu-

Abb. 28.12 Modell der 93 bp langen Schleife, die durch die lac-Repressor-Tetramerbindung an O, und O, entsteht.

Die Proteine sind durch ihre C,-Rückgrate

sätzliche DNA-Bindungsproteine erfordern; ein Kandidat dafür ist CAP (siehe weiter unten), das zwischen O, und O; an die DNA bindet. Im Modell in Abbildung 28.12 ist der lac-Promotor ein Teil der DNA Schleife. Über Jahre hinweg war man der Überzeugung, dass der lac-Repressor einfach physikalisch die Bindung von RNA-Polymerase an den lac-Promotor verhindert. Experimente haben jedoch gezeigt, dass die RNA-Polymerase sehr wohl an den Promotor binden kann, auch wenn der Repressor vorhanden ist; sie kann lediglich die Transkription nicht richtig in Gang setzen. Dissoziiert der Repressor auf Grund der Anwesenheit eines Induktors, so kann eine Transkription ungehindert stattfinden. Wäre die RNA-Polymerase tatsächlich schon an den lac-Promotor gebunden, könnte die Transkription sofort beginnen. Wie das Modell in Abbildung 28.12 jedoch zeigt, liegt die Kontaktfläche für die Polymerase auf der Innenseite der DNA-Schleife, was eigentlich eine Polymerasebindung bei gebundenem Repressor ausschließt. Weitere Untersuchungen sind zur Klärung dieses offensichtlichen Widerspruchs notwendig.

dargestellt, und die DNA in Skelettform, wobei die

Zucker-Phosphat-Ketten durch helicale Schleifen markiert sind. Das Modell basiert auf der Röntgenstruktur des lac-Repressors (rot) im Komplex mit zwei, 2] bp langen Operator-DNA-Segmenten (orange) und der Röntgenstruktur von CAP (violett) im Komplex mit seiner 30 bp langen Ziel-DNA (cyan). Die restliche DNA-Schleife wurde generiert, indem eine leichte Krümmung in die B-DNA (weiß) gelegt wurde, die -10 und -35 Regionen des lac-Promotors sind in Grün hervorgehoben. [Mit freundlicher Genehmigung von Ponzy Lu und Mitchell Lewis, University of Pennsylvania.]

B.

Katabolitrepression: Ein Beispiel für Genaktivierung

Glucose ist der wichtigste Stoffwechseibrennstoff für E.coli. Ist genügend Glucose vorhanden, wird die Expression von Genen für viele Enzyme des fermentativen Stoffwechsels unterdrückt. Somit werden in Anwesenheit von Glucose zahlreiche Katabolite wie Lactose, Arabinose und Galactose nicht fermentiert, selbst wenn sie in hohen Konzentrationen vorliegen. Diese so genannte Katabolitrepression verhindert, dass unnötigerweise gleichzeitig mehrere, energieliefernde Enzymsysteme synthetisiert werden. In Abwesenheit von Glucose wird die Katabolitrepression durch einen cAMP-abhängigen Mechanismus aufgehoben (der cAMP-Spiegel ist gering in Gegenwart von Glucose, steigt jedoch an, wenn Glucose knapp wird). Der CAP-CAMP-Komplex stimuliert die Transkription von katabolitrepressionssensitiven Operons

Einigen E.coli-Mutanten, die bei Glucosemangel die Katabolitrepression nicht aufheben können, fehlt ein cAMP-Bindungsprotein, das Katabolitgen-Aktivierungsprotein (engl.: catabolite gene activator protein, CAP) oder cCAMP-Rezeptorprotein (CRP) genannt wird. Das dimere CAP besteht aus identischen Untereinheiten mit 210 Resten und erfährt eine große Konformationsänderung, sobald es cAMP bindet. Der CAP-CAMP-Komplex (aber nicht CAP alleine) bindet u.a. an die Promotorregion des lac-Operons und stimuliert die Transkription, wenn der Repressor fehlt. CAP ist ein Beispiel für einen positiven Regulator (er initiiert die Transkription), während der lac-Repressor dagegen ein negativer Regulator ist (er unterdrückt die Transkription). Wie arbeitet der CAP-CAMP-Komplex? Das lac-Operon hat einen schwachen, d.h. ineffizienten Promotor. Eine Erklärungsmöglichkeit wäre, dass die CAPcAMP-Bindung die Fähigkeit der RNA-Polymerase zur Transkription des lacOperons erhöht, und zwar durch eine Konformationsänderung in der Promotor-DNA. Die Röntgenstruktur von CAP-cCAMP im Komplex mit einem 30 bp langen DNA-Abschnitt (der eine ähnliche Sequenz wie die CAP-Bindungsstelle

Regulation der prokaryotischen Genexpression

1119

Abb. 28.13 Röntgenstruktur des CAP-CAMP-Dimers im Komplex mit DNA. Die beiden Untereinheiten des homodimeren Proteins (dessen zweizählige Symmetrieachse . horizontal verläuft) sind in Violett und in Blau dargestellt, die C-terminalen DNA-Bindungsdomänen sind jeweils dunkler gefärbt. Die 30 bp lange, selbstkomplementäre DNA ist in Stabform, und die cAMP-Moleküle sind in Kalottenform wiedergegeben, mit C grün, N blau, O rot und P orange. Die P-Atome der DNA sind durch orange Stäbe zur besseren Visualisierung verbunden. [Nach einer Röntgenstruktur von Thomas Steitz, Yale University. PDBid 1CGP.] 6% siehe Interactive Exercises.

hat) ist in Abbildung 28.13 dargestellt. Man sieht, dass das CAP-Dimer tatsächlich über seine zwei HTH-Motive in aufeinander folgenden großen Furchen an die DNA bindet, so dass sie im Winkel von ca. 90° um das Proteindimer gebogen ist. Die Biegung resultiert aus zwei Knicken von jeweils ca. 45° in der DNA, die fünf bis sechs Basen von der zweizähligen Achse des Komplexes entfernt auftreten. Dabei wird in jedem Knick die große Furche geschlossen, und die kleine Furche extrem geöffnet. Die deformierte DNA könnte ein besseres Substrat für den Transkriptionsbeginn sein als die lineare Form. Die zweite Erklärungsmöglichkeit bestünde darin, dass CAP-cAMP die Transkription durch direkten Kontakt mit der RNA-Polymerase stimuliert. Tatsächlich überlappt die CAPcAMP-Bindungsstelle auf dem lac-Operon mit dem lac-Promotor. Das Modell für die lac-Repressorbindung (Abb. 28.12) beinhaltet paradoxerweise CAP, das ja ein Aktivator ist. Diese duale Bindung könnte ein zellulärer Mechanismus

zur

Konservierung

von

Energie

sein, wenn

sowohl

Glucose

als auch Lactose fehlen. Würde Lactose verfügbar, könnte der lac-Repressor abdissoziieren und CAP-cAMP würde die lac-Operontranskription ermöglichen.

Abb. 28.14 Genkarte des trp-Operons aus E. coli, auf der die codierten Enzyme und die zugehörigen katalytischen Reaktionen gezeigt sind. Das trpC-Genprodukt katalysiert zwei aufeinander folgende Reaktionen bei der Tryptophansynthese (Abschnitt 21.5B). [Nach Yanofsky, C.,J.Am. Med.

Assoc. 218, 1027 (1971).] Kontroll-

See

elemente

|—

Attenuator

mRNA

\

Y

Synthase Komponente I

AnthranilatSynthase Komponente Il

TryptophanSynthase ß-Untereinheit

TryptophanSynthase

er

a-Untereinheit

Anthranilat-

N-(5'-Phosphoribosyl])-

Tryptophan-Synthase

Synthase

anthranilat-Isomerase

(a 9% ß 9)

(Cola Colls)

Indol-3-glycerin

phosphat-Synthase

Chorismat Glutamin

ng N-(5'-Phosphoribosyl)- — anthranilat PRPPePBR;

ZERg Anthranilat

Glutamat?

en

Pyruvat

Enol-1-O-carboxy- Br a phenylaminoC03 L-Serin 1-desoxyribulose-

phosphat

L-Tryptophan Glycerinaldehyd-3-P

1120

Regulation der Genexpression

C.

Attenuierung

Das trp-Operon von E.coli codiert fünf Polypeptide (die drei Enzyme bilden), welche die Synthese von Tryptophan aus Chorismat vermitteln (Abschnitt 21.5B). Diese fünf Operongene (A-E; Abb. 28.14) werden koordiniert unter der Kontrolle des trp-Repressors exprimiert. Dieser Repressor bildet mit ı-Tryptophan (dem Endprodukt des Stoffwechselwegs) einen Komplex, der spezifisch an den trp-Operator bindet. Dadurch wird die Transkriptionsgeschwindigkeit des

trp-Operons um den Faktor 70 verlangsamt (Abschnitt 24.4B). Tryptophan wirkt somit als Corepressor, wodurch eine überflüssige Tryptophanbiosynthese verhindert wird. Zuerst glaubte man, das trp-Repressor-Operator-System allein würde die Tryptophanbiosynthese in E.coli regulieren. Die Entdeckung von trp-Deletionsmutanten (die stromabwärts vom Operator (trpO) lokalisiert sind), bei denen die trp-Operonexpression um das 6fache gesteigert ist, deutete jedoch auf die Existenz eines weiteren Transkriptionskontrollelements hin. Dieses Kontrollelement befindet sich ca. 30-60 Nucleotide stromaufwärts vom Strukturgen trpE, und zwar in einer 162 Nucleotide langen Leitsequenz (trpL; Abb. 28.14). Wenn Tryptophan in der Zelle knapp wird, wird die gesamte 6720 Nucleotide lange, polycistronische trp-mRNA einschließlich der trpL-Sequenz synthetisiert. Beginnen die neu synthetisierten Enzyme Tryptophan herzustellen, so sinkt die trp-Operon-Transkription, da Tryptophan an den trp-Repressor bindet. Bei der dann transkribierten trp-mRNA handelt es sich zunehmend um ein Segment von lediglich 140 Nucleotiden, das dem 5’-Ende von trpL entspricht. In Gegenwart von Tryptophan kommt es also zu einem vorzeitigen Transkriptionsabbruch des trp-Operons. Das für diesen Effekt verantwortliche Kontrollelement bezeichnet man als Attenuator. Der Terminator des trp-Transkriptionsattenuators ist bei Tryptophanmangel maskiert Das Attenuatortranskript enthält vier komplementäre Segmente, die sich in zwei unterschiedlichen, sich gegenseitig ausschließenden, Haarnadelstrukturen zusammenlagern können (Abb. 28.15). Die Segmente drei und vier bilden mit

den angrenzenden Resten einen Transkriptionsterminator (Abschnitt 26.1D): eine G- und C-reiche Haarnadelstruktur, an die sich mehrere Us anschließen (vgl. Abb. 26.9). Ist genügend Tryptophan vorhanden, so bricht die Transkription meist an diesem Terminator ab. Wie kann aber bei Tryptophanmangel die Transkription am Terminator fortgesetzt werden? Ein Abschnitt der Leitsequenz, welcher das Segment 1 des Attenuators enthält, wird als 14 Reste langes Polypeptid mit zwei Trp-Resten hintereinander produziert (Abb. 28.15, links). Wie Charles Yanofsky vorschlug, spielt die Position dieses äußerst seltenen Dipeptids (nur ca. 1% der Aminosäurereste in E.coli-Proteinen sind Trp) eine wichtige Rolle bei der Attenuierung (Abb. 28.16): Ein RNA-Polymerasemolekül initiiert die Transkription des trp-Operons trotz bestehender Repression. Kurz nachdem die ribosomale Startstelle des trpL-Gens transkribiert wurde, dockt ein Ribosom an und beginnt mit der Translation der Leitsequenz. Wenn reichlich Tryptophan vorhanden ist und damit auch ausreichend Tryptophanyl-tRNA"P, folgt das Ribosom dicht auf die RNAPolymerase. Tatsächlich pausiert die RNA-Polymerase hinter der Position 92 des Transkripts und führt die Transkription nur nach Anlagerung eines Ribosoms weiter. Somit sind Transkription und Translation eng gekoppelt. Das Fortschreiten des Ribosoms verhindert die Bildung einer 2-3-Haarnadel, ermöglicht aber eine 3.4-Haarnadel, welche die Transkription beendet (Abb. 28.160). Ist jedoch wenig Trp vorhanden, so wird das Ribosom an den beiden benachbarten UGG-Codons (die Trp codieren) verlangsamt, da Tryptophanyl-tRNATP fehlt. Wird die Transkription fortgesetzt, so bilden die neu synthetisierten Segmente 2 und 3 eine Haarnadelstruktur, da das angehaltene Ribosom die Bildung der

Regulation der prokaryotischen Genexpression U G

=

1121

A A

GIG GZI® U-A

A-50 G G

A U

U C A

—110

all)

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Eu U U UUUU C G G G —130 C G A G

C

U A r U

3.4

2.3

„Terminator“

„Antiterminator“

alternativen 1-2-Struktur verhindert (Abb. 28.16b). Der Transkriptionsterminator 3.4 wird nicht gebildet, so dass die Terminatorsequenz und der Rest des trp-

Abb. 28.15

Operons abgelesen werden können. Somit reguliert die Attenuierung die Tran-

der trpL-mRNA.

skription des trp-Operons entsprechend der vorhandenen Tryptophanmenge. Die Leitpeptide der anderen fünf Operons für Aminosäurebiosynthesen, denen man weiß, dass sie durch Attenuierung reguliert werden, besitzen eine große Zahl der entsprechenden Aminosäurereste. Das his-Operon E.s coli z. B., welches histidinsynthetisierende Enzyme spezifiziert, hat sieben ; \ g ; ß : e

Alternative Sekundärstrukturen

Die Entstehung der basengepaarten 2-3-Haarvon alle von auf-

einander folgende His-Reste in seinem Leitpeptid von 16 Aminosäuren. Analog

nadelstruktur (Antiterminator, rechts) schließt die Bildung der 1-2- bzw. 3-4-Haarnadelstrukturen (Terminator, links) aus und umgekehrt. Liegt die 3-4-Haarnadelstruktur

(Terminator) vor, wird die

nn ption vorzeitig, Bi“ unmittelbar hinter Nucleo-

tid 140 beendet (Attenuierung). Der Pfeil markiert die Stelle auf der mRNA,

(a)

an der die RNA-Polyme-

rase so lange wartet, bis sich ein aktives Ribosom

viel Tryptophan

anlagert. [Nach Fischer, R. F. und Yanofsky, C., J.

Leitpeptid

AM Transkriptions-

Biol. Chem. 258, 8147 (1933).]

terminator nr

a

are

RNA-Polymerase

/ trpL mRNA

Ribosom, das die mRNA des Leitpeptids transkribiert

Abb, 28.16 Attenuierung des trp-Operons. „ Tr (a) Ist genügend Trp-tRNA vorhanden, translatiert das Ribosom die trpL-mRNA. Die Anwesenheit des Ribosoms auf Segment 2 verhindert die

Bildung der basengepaarten 2-3-Haarnadelstruktur. Dadurch kann sich die 3-4-Haarnadelstruktur bilden, eine essentielle Komponente des Trans-

0 s

(b) wenig Tryptophan ’ Antiterminator

transkribierende

ee trp -Operon-mRNA

Ribosom wird an Trp-Codons aufgehalten

?

kriptionsterminators, und so die Transkription unterbrechen. (b) Liegen geringe Mengen von TrptRNA"P vor, bleibt das Ribosom an den tandem-

förmigen Trp-Codons von Segment ] hängen. Dadurch kann sich die 2-3-Haarnadelstruktur bilden (was wiederum die Bildung der 3-4-Haarnadelstruktur verhindert). Die RNA-Polymerase kann nun über diesen nicht gebildeten Terminator

DNA, die das

hinweglesen und die Transkription des trp-Operons

trp -Operon codiert

fortführen.

1122

Regulation der Genexpression

finden sich im 32 Reste langen Leitpeptid des ilv-Operons, das Biosyntheseenzyme

für Isoleucin,

D.

Riboswitches

Leucin

und Valin spezifiziert,

fünf Ile-, drei Leu- und

sechs Val-Reste. Die Leittranskripte dieser Operons ähneln dem trp-Operon insofern, dass sie zwei alternative Sekundärstrukturen ausbilden können, von denen eine als Transkriptionsterminator fungiert.

Abb. 28.17 Struktur des TPP-registrierenden Riboswitches aus E. coli. (a) Vorhergesagte Sekundärstruktur eines Abschnitts aus 165 Resten vom 5’-Ende der thiMmRNA in Abwesenheit (links) und in Gegenwart (rechts) von TPP. Die TPP-bindende Konformation maskiert die Shine-Dalgarno-Sequenz (violett), an die das Ribosom binden muss, um die Translation

an der AUG-Sequenz (rot) stromabwärts starten zu können. [Nach Winkler, W., Nahvi, A. und Breaker,

R.R., Nature 419, 952 (2002).] (b) Röntgenstruktur der TPP-erkennenden Domäne des Riboswitches. Die RNA ist in Leiterform gezeichnet, wobei ihr Zucker-Phosphat-Rückgrat durch einen orangefarbenen Schlauch und ihre Basen durch grüne und blaue Stifte dargestellt sind. Das TPP ist als Kalottenmodell gezeigt; C ist grün, N blau, O rot

und S gelb. Mg?*-Ionen sind durch magentafarbene Kugeln wiedergegeben. [Nach einer Röntgenstruktur von Ronald Breaker, Yale University und Dinshaw Patel, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York. PDBid 2GDI.]

gebieten

"A-125

| Ei

’

Ribosom d— = =

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N

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ihre Sekundärstruktur ändert, wenn TPP an sie bindet (die Bindung eines Meta-

boliten durch RNA ist nicht beispiellos; synthetische Oligonucleotide, die sogenannten Aptamere, binden Moleküle mit hoher Spezifität und Affinität). Das TPP-registrierende mRNA-Element hat man Riboswitch (von engl.: switch, Schalter) genannt. Die vorhergesagte Sekundärstruktur des TPP-registrierenden Riboswitches und der dafür vorgeschlagene Mechanismus sind in Abbildung 28.17a dargestellt. In Abwesenheit von TPP nimmt die mRNA eine Konformation an, die

G G

)

5,

Wir haben gerade gesehen, wie die Bildung einer Sekundärstruktur in einem wachsenden RNA-Transkript die Genexpression durch Attenuierung regulieren kann. Die Konformationsflexibilität der mRNA erlaubt ihr auch, Gene durch direkte Wechselwirkung mit bestimmten zellulären Metaboliten zu regulieren. Dadurch werden Sensor-Proteine wie der lac-Repressor, CAP und der trp-Repressor überflüssig. Bei E.coli erfordert die Biosynthese von Thiaminpyrophosphat (TPP; Abschnitt 15.3B) die Mitwirkung mehrerer Proteine, deren Spiegel je nach TPP-Bedarf der Zelle schwankt. In mindestens zwei der relevanten Gene beinhalten die nicht translatierten Regionen am 5’-Ende der mRNA eine hoch konservierte Region namens thi-Box. Wie Ronald Breaker zeigte, ist die thi-Box für eine chemische oder enzymatische Spaltung unterschiedlich empfindlich, je nachdem, ob TPP anwesend oder abwesend ist. Dies legt nahe, dass die RNA

Ei

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TPP

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Regulation der eukaryotischen Genexpression

es einem Ribosom gestattet, die Translation zu beginnen. In Gegenwart von TPP maskiert eine alternative Sekundärstruktur die Shine-Dalgarno-Sequenz ‚(Abschnitt 27.4A), sodass das Ribosom die Translation der RNA nicht starten kann. Somit kann die Konzentration eines Metaboliten die Expression des Gens regulieren, das für seine Synthese erforderlich ist. Ronald Breaker und Dinshaw Patel haben die Röntgenstruktur der 80 Nucleotide umfassenden TPP-Bindungsdomäne aus dem TPP-registrierenden Riboswitch von E. coli bestimmt. Die Struktur zeigt eine verschlungen gefaltete RNA, die TPP in einer ausgestreckten Konformation bindet (Abb. 28.17b). Bis jetzt hat man neun bakterielle Riboswitch-Arten identifiziert, darunter auch diejenigen, welche die Expression von Enzymen regulieren, die an der Synthese des Coenzyms B,, (Abb. 20-17), von Riboflavin (Abb. 14.12) und von S-Adenosylmethionin (SAM; Abb. 21-18) beteiligt sind. Diese regulieren zusammen über 2% der Gene bei bestimmten Bakterien. In manchen Fällen steuert die Bindung des Metaboliten an die mRNA die Bildung einer internen Transkriptionsterminationsstelle, sodass die Transkription hinter diesem Punkt nur fortgesetzt wird, wenn kein Metabolit vorhanden ist. In anderen Fällen wird ein Ribozym, das einen Teil einer mRNA bildet, durch die Bindung eines Metaboliten zur Selbstspaltung aktiviert. Dabei wird die mRNA inaktiviert. Auch Pflanzen und Pilze enthalten Riboswitches. Die Wechselwirkung der Riboswitches mit ihren Effektoren erfordert keine Beteiligung von Proteinen. Diese Tatsache legt nahe, dass Riboswitches Überbleibsel aus der RNA-Welt sind (Exkurs 24.3) und somit zu den ältesten Regulationssystemen gehören.

3

Regulation der eukaryotischen Genexpression

Die allgemeinen Prinzipien der prokaryotischen Genexpression treffen auch auf eukaryotische Gene zu: Die Expression spezifischer Gene kann aktiv verhindert oder gefördert werden, indem Proteine an DNA oder RNA binden. Wie bei Prokaryoten laufen die meisten Regulationsmechanismen auf der Ebene der Gentranskription ab. Aber im Gegensatz zu prokaryotischen Kontrollsystemen müssen eukaryotische Mechanismen mit viel mehr DNA fertig werden, die in scheinbar unzugänglichen Strukturen verpackt ist. In diesem Abschnitt beschreiben wir einige der Strategien, mithilfe derer eukaryotische Zellen ihre genetische Information verwalten.

A.

Chromatinstruktur und Genexpression

Der größte Teil der DNA wird bei vielzelligen Organismen nicht exprimiert. Dazu gehören der Anteil des Genoms, der nicht Proteine oder RNA codiert, sowie diejenigen Gene, deren Expression in einem bestimmten Zelltyp ungewollt ist. Obwohl beinahe alle Zellen eines Organismus über eine identische Ausstattung an DNA verfügen, werden die Gene in einer streng gewebsspezifischen Weise exprimiert. Beispielsweise synthetisieren und sezernieren die meisten Pankreaszellen Verdauungsenzyme, während die Pankreas-Inselzellen Insulin oder Glucagon produzieren (Abschnitt 22.2). Nicht exprimierte DNA liegt normalerweise stark kondensiert als Heterochromatin vor (Abb. 28.18). Ein extremes Beispiel dafür ist die vollständige Inaktivierung eines der zwei X-Chromosomen von weiblichen Säugern (Exkurs 28.2). Transkriptionsaktive DNA, das Euchromatin, ist hingegen weniger kondensiert, wahrscheinlich um der Transkriptionsmaschinerie einen besseren Zugang zu gewährleisten. Harold Weintraub konnte zeigen, dass Euchromatin leichter durch Pankreas-DNase I gespalten wird als das transkriptionsinaktive Heterochromatin. Die Nucleasesensitivität spiegelt jedoch eher das Potential für die Transkription wider als die eigentliche Transkription.

1123

Abb. 28.18 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines B-Lymphocyten. Der große Körper in der Zellmitte ist der Zellkern, in dem Heterochromatin (rot) an der inneren Kernmembran haftet und das transkriptionsaktive Euchromatin (orange) zentraler sitzt. Der kleine rote Körper in der Mitte des Zellkerns ist der Nucleolus. Man beachte auch das ausgedehnte raue endoplasmatische Reticulum, mit dem das Cytoplasma dieser antikörperbildenden Zelle ausgefüllt ist (Abschnitt 7.3). Man vergleiche diese Abbildung mit Abbildung 1.8. [Don Fawcett/Visuals Unlimited.]

Verständnisfragen zu Abschnitt 2 1. Welchen Vorteil für die Regulation bietet es, wenn Gene zu Operons zusammengefasst werden? 2. Beschreiben Sie die Regulation des lac-Operons durch den lac-Repressor und CAP. 3. Wie beeinflusst die Konformation der mRNA die Genexpression? Erläutern Sie dies am Beispiel der Attenuierung und der Riboswitches.

1124

_ Regulation der Genexpression

Exkurs 28.2

Biochemie im Fokus

Die Inaktivierung des X-Chromosoms Zellen

weiblicher

Säuger

enthalten

zwei

X-Chromosomen,

wohingegen Zellen von Männchen ein X- und ein Y-Chromosom besitzen. Die Körperzellen der Weibchen halten jedoch nur ein X-Chromosom in einem transkriptionsaktiven Zustand. Infolgedessen bilden Männchen und Weibchen etwa die gleichen Mengen X-chromosomencodierter Genprodukte - ein Phänomen, das man als Dosisausgleich oder Dosiskompensation bezeichnet. Das inaktive X-Chromosom ist als stark kondensiertes und sich dunkel färbendes Barr-Körperchen an der Peripherie des Zellkerns zu erkennen.

auf weißem Grund, ist nahezu immer eine weibliche Katze,

deren beiden X-Chromosomen die verschiedenen Farben ihres Fells spezifizieren. Erst allmählich kommt Licht ins Dunkel der Chromosomeninaktivierung. Die Inaktivierung scheint durch die Transkription des Xist-Gens nur im inaktiven Chromosom ausgelöst zu werden. Die resultierende Xist-RNA bedeckt das inaktive X-Chromosom auf seiner ganzen Länge, bindet aber nicht an das aktive X-Chromosom. Die gebundene Xist-RNA rekrutiert vermutlich spezifische DNA-Bindeproteine,

die die

Transkription unterdrücken, sowie verschiedene Histone. Die CpG-Inseln (Abschnitt 28.1A) innerhalb vieler Promotoren auf dem inaktiven X-Chromosom werden methyliert — wahrscheinlich als Teil des Mechanismus, der den inaktiven Zustand des Chromosoms in den nachfolgenden Zellgenerationen aufrecht erhält. Schätzungsweise entkommen aber immer noch 25% der X-chromosomalen Gene dieser Repression und werden zu einem gewissen Grad exprimiert.

[Aus Moore, K.L. und Barr, M.L., Lancet 2, 57 (1955).]

Bei den Beuteltieren (Marsupialia, wie z.B. dem Känguru) ist das Barr-Körperchen immer das väterlich vererbte X-Chromosom. Bei den Plazentatieren (Placentalia) hingegen wird zu einem Zeitpunkt, zu dem der Embryo aus nur wenigen Zellen besteht, in jeder Zelle ein zufällig ausgewähltes X-Chromosom inaktiviert. Die Nachkommen jeder dieser Zellen behalten dasselbe inaktivierte Chromosom bei. Weibliche Placentalia sind deshalb Mosaike von Zellklongruppen, in denen das aktive X-Chromosom entweder väterlicherseits oder mütterlicherseits ‚vererbt wurde. Die dreifarbige Glückskatze beispielsweise, mit ihren schwarzen und gelben Pelzflecken

[© Hank Delespinasse/Age Fotostock America, Inc.]

Damit genetische Information exprimiert wird, muss die Transkriptionsmaschinerie Zugang zur DNA erhalten, die wiederum in Nucleosomen verpackt ist (Abschnitt 24.5B). Es überrascht nicht, dass Nucleosomen keine fixierten Strukturen sind, sondern umgestaltet werden können. Außerdem können Histone kovalent modifiziert werden, um ihre Fähigkeit für die Wechselwirkung mit anderen Zellkomponenten zu verändern. Chromatin umgestaltende Komplexe verschieben Nucleosomen Sequenzspezifische DNA-Bindeproteine müssen zunächst Zugang zu ihrer ZielDNA erhalten, bevor sie an diese binden können. Jedoch ist nahezu alle DNA bei Eukaryoten in Nucleosomen verpackt oder sogar in höher geordnetem Chromatin. Wie bekommen dann die Proteine, die an DNA-Abschnitte binden, Zugang

zu ihren Ziel-DNAs? Die Antwort wurde erst Mitte der 1990er Jahre klar: Chromatin enthält ATP-getriebene Komplexe, welche die Nucleosomen umgestalten, d.h. sie brechen in den Nucleosomen die Wechselwirkungen zwischen Histonen

und DNA auf, damit diese besser zugänglich wird. Dies kann dazu führen, dass das Histonoktamer am DNA-Strang entlang gleitet und zu einer anderen Stelle oder sogar auf einen anderen DNA-Strang gelangt. Diese Chromatin umgestaltenden Komplexe zwingen somit dem Chromatin einen „fließenden“ Zustand

Regulation der eukaryotischen Genexpression Histon-

Eintritt/Austritt der DNA

H3-Schwanz

Abb. 28.19 Modell des RSC mit einem gebundenen Nucleosom. Die Röntgenstruktur des Nucleosoms (mit den als orangefarbenen Bändern gezeigten Proteinen

und dem DNA-Rückgrat in gelb) wurde in das EM-basierte Bild des RSC (grau) eingepasst. Die beiden Bilder zeigen die Rück- und Vorderseite des Komplexes. Die zweizählige Symmetrieachse der DNA ist durch einen blauen Stab dargestellt und die beiden möglichen Bindungsstellen für die ATP-hydrolysierende Translokaseuntereinheit sind markiert [Mit freundlicher Genehmigung von Eva Nogales und Andres Leschziner, University of California at Berkeley.]

22; a...

TranslocaseBindungsstelle

1125

Doppelachse

auf, der die Gesamtpackung der DNA aufrecht erhält, aber vorübergehend einzelne Sequenzen für die interagierenden Faktoren freilegt. Chromatin umgestaltende Komplexe bestehen aus mehreren Untereinheiten. Die Untereinheit, die zuerst charakterisiert wurde, ist der SWI/SNF-Komplex aus der Hefe. Dieser hat seine Bezeichnung daher, dass er für den Wechsel des Paarungstyps (SWI steht für switching defective; engl.: to switch, umschalten) und für Wachstum auf Saccharose (SNF für sucrose nonfermenter, kein Saccharosevergärer) unbedingt notwendig ist. SWI/SNF, ein 1150-kD-Komplex aus 11 verschiedenen Arten von Untereinheiten, ist für die Expression von nur rund 3% der Hefegene essentiell und für das Überleben der Zelle nicht erforderlich. Ein verwandter Komplex namens RSC (für remodelliert die Struktur von Chromatin) ist in der Hefe etwa 100-mal häufiger und für das Überleben der Zelle unbedingt nötig. RSC hat zwei Untereinheiten mit SWI/SNF gemeinsam, und viele der übrigen Untereinheiten sind Homologe, einschließlich ihrer ATPaseUntereinheiten. Alle Eukaryoten enthalten mannigfaltige Chromatin umgestaltende Komplexe. Biochemische Untersuchungen zeigen, dass RSC in einem 1:1-Komplex fest an Nucleosomen bindet. Auf Kryoelektronenmikroskopie basierende Bilder des RSC der Hefe zeigen, dass er eine unregelmäßige Struktur mit einem großen zentralen Hohlraum hat, dessen Größe und Form bemerkenswert komplementär zu einem einzelnen Nucleosomenkernpartikel ist (Abb. 28.19). Die gleichzeitige Freigabe der vielen Wechselwirkungen, die die DNA an einem Histonoktamer festhalten, würde einen enormen Energieaufwand erfordern. Es ist somit unwahrscheinlich, dass dies geschieht. Wie funktionieren dann die Chromatin umgestaltenden Komplexe? Ihre zahlreichen ATP-hydrolysierenden Translokaseuntereinheiten haben eine zu den Helicasen homologe Region (Abschnitt 25.2B), obwohl sie keine Helicaseaktivität besitzen. Trotzdem scheint es plausibel, dass Chromatin umgestaltende Komplexe, wie Helicasen, von ATP-Hydrolyse getrieben, die DNA-Stränge „entlang wandern“. Wenn ein solcher Komplex wie auch immer an ein Histon gekoppelt wäre, würde dies der DNA im Nucleosom eine Torsionsspannung auferlegen, wodurch ihre lokale, helicale Windung (twist) abnähme (DNA-Superspiralisierung wird in Abschnitt 24.1C behandelt). Der Bereich der verminderten helicalen Windung könnte sich entlang der DNA ausbreiten, die um das Nucleosom gewickelt ist. Dabei wird vorübergehend die Haftung des Histonoktamers an einem DNA-Abschnitt lockerer. Die Torsionsspannung könnte unter Umständen auch teilweise als superhelicale Windung (writhe) ausgeglichen werden. Dadurch könnte ein DNA-Segment an der Oberfläche des Nucleosoms angehoben werden. In jedem Fall könnte sich die resultierende DNA-Deformation entlang der Oberfläche des Nucleosoms als Welle ausbreiten, die bei ihrer Passage lokal und vorübergehend die DNA vom Histonoktamer freisetzen würde (Abb. 28.20). Mehrere Cyclen der ATP-Hydrolyse würden mehrere DNA-lockernde Wellen um die

1126

Regulation der Genexpression unterspiralisierte DNA-Wellen

Zi ges ATP eindimensionale Diffusion

Translokation

Translokation

Überspiralisierung hinter dem Umformer

Bindung des Umformers

Abb. 28.20 Modell für die Nucleosomenumformung durch Chromatin umgestaltende Komplexe. Der Chromatin umgestaltende Komplex (grün) nutzt die Freie Enthalpie aus der ATP-Hydrolyse für die Translokation und für das Biegen der DNA im Nucleosom (blau, der Übersicht halber ist nur eine Hälfte gezeigt), was durch die Bewegung eines Festpunktes auf der DNA (gelber Ball) dargestellt ist. Dadurch werden lokal die Kontakte zwischen den Histonen und der DNA gelöst. Die Stelle der unterspiralisierten und/oder gewölbten DNA breitet sich um das Nucleosom herum als eindimensionale Welle aus, die vorübergehend die DNA von den Histonen ablöst. Der Gesamteffekt ist die Translokation des Nucleosoms entlang der DNA. [Nach einer Zeichnung von Saha, A., Wittmeyer, J. und Cairns, B.R., Genes Dev. 16, 2120

(2002).]

Auslösen der Welle

Nucleosomen herum schicken. Dabei glitte das Nucleosom entlang der DNA und verschaffte den DNA-Bindeproteinen Zugang zur DNA. HMG;-Proteine unterstützen die Genregulation

Die zelltypabhängige Variation der Transkriptionsaktivität eines Gens zeigt, dass chromosomale Proteine am Genaktivierungsvorgang beteiligt sind. Die in den Chromosomen vorkommende Menge und die mangelnde Vielfalt der Histone macht es unwahrscheinlich, dass diese eine für diese Aufgabe ausreichende Spezifität besitzen. Unter den wichtigsten Nicht-Histon-Proteinkomponenten von Chromatin sind die Vertreter der high mobility group (HMG), die ihren Namen daher haben, dass sie in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine hohe Mobilität aufweisen. Diese Proteine sind stark konserviert und besitzen eine niedrige Molekülmasse (unter 30 kD). Sie haben eine ungewöhnliche Aminosäurenzusammensetzung mit rund 25% basischen und 30% sauren Seitenketten und sind mit etwa 1 HMG-Molekül pro 10 bis 15 Nucleosomen relativ häufig. Das HMG-Protein der Hefe, NHP6A, enthält ein Strukturmotiv mit etwa 80 Resten, die HMG-Box. Juli Feigon bestimmte seine NMR-Struktur im Komplex mit DNA. Diese zeigt, dass das Protein die DNA dazu veranlasst, sich um 70 °in Richtung ihrer großen Furche zu krümmen (Abb. 28.21). Solche Proteine erleichtern vermutlich die Bindung anderer Regulatorproteine an die DNA und werden deshalb als Architekturelemente des Chromatins bezeichnet. Andere HMG-Proteine unterscheiden sich hinsichtlich der Struktur, können aber auch die DNA-Konformation

verändern, indem

sie diese dazu veranlassen, sich zu

biegen, zu strecken, zu entwinden oder Schleifen zu bilden. Manche HMG-Proteine konkurrieren mit Histonen um DNA und verändern dabei die Nucleosomenstruktur. Histone werden kovalent modifiziert Zu den posttranslationalen Modifikationen, denen Kernhistone unterworfen sind, zählen die Acetylierung spezifischer Lys-Seitenketten, die Methylierung spezifischer Lys- und Arg-Seitenketten, die Phosphorylierung spezifischer Serund möglicherweise Thr-Seitenketten sowie die Ubiquitinierung spezifischer Lys-Seitenketten (Abb. 28.22). Zudem können die Lys-Seitenketten mono-, dioder trimethyliert sein, und die Arg-Seitenketten können mono- und sowohl

Regulation der eukaryotischen Genexpression

1127

Abb. 28.21 NMR-Struktur des NHP6A-Proteins der Hefe im Komplex mit einer 15 bp langen DNA. Das Protein ist in Bänderform gezeichnet (türkis) und die DNA in Stabform ist entsprechend dem Atomtyp gefärbt (C grün, N blau, O rot und P gelb). Die drei Helices der HMG-Box bilden eine L-Form, wobei die Innenseite des L in die große Furche der DNA eingeschoben ist, sodass sich die DNA um rund 70 ° zur großen Furche hin biegt. [Nach einer NMR-Struktur von Juli Feigon, University of California at Los Angeles. PDBid 1J5N.]

symmetrisch als auch asymmetrisch dimethyliert vorliegen. All diese Modifikationen können von bestimmten Enzymen rückgängig gemacht werden. Wie wir gesehen haben (Abschnitt 24.5C), sind die N-terminalen Schwänze der Kernhistone an der Stabilisierung der Struktur von Kernnucleosomen und von Chromatin höherer Ordnung beteiligt. Alle obigen Modifikationen, mit Ausnahme der Methylierung, reduzieren die elektrische Ladung ihrer entsprechenden Seitenketten (machen sie negativer) und schwächen somit offensichtlich die Histon-DNA-Wechselwirkungen. Dadurch wird die Chromatindekondensation gefördert — obwohl dies nicht immer der Fall ist, wie wir noch sehen werden.

a

H3K79

Abb. 28.22 Histonmodifikationen auf den Nucleosomenkernpartikeln. Posttranslationale Modifikationsstellen sind mit den Nummern der Reste und Farbsymbolen

H2B C-term

@®

versehen, die im Schlüssel unten links erklärt

H2BK123 globuläre Histonregionen

\| 5

sind (acK = Acetyl-Lys, meR = Methyl-Arg, meK = Methyl-Lys, PS = Phospho-Ser, uK = ubiquitiniertes Lys). Man beachte, dass H3-Lys 9 entweder methyliert oder acetyliert sein kann. Die Modifikationen des N-terminalen Schwanzes sind nur auf einem der beiden Moleküle von H3 und H4 gezeigt, und es ist jeweils nur ein Molekül von H2A und H2B dargestellt. Die C-terminalen Schwänze eines H2A und eines H2B sind durch gestrichelte Linien wiedergegeben. Die grünen Pfeile weisen auf die Stellen in intakten Nucleosomen hin, die für die Trypsinspaltung zugänglich sind. Diese Zeichnung fasst die Daten aus mehreren Organismen zusammen,

uk 1BH®e0®

von denen manche nicht alle der

gezeigten Modifikationen haben. [Mit freundlicher Genehmigung von Bryan Turner, University of Birmingham School of Medicine.]

1123

Regulation der Genexpression

Demgegenüber erhöhen Methylgruppen die Basizität und Hydrophobizität der modifizierten Lys- und Arg-Seitenketten und stabilisieren daher eher die Histon-DNA-Wechselwirkungen. Modifizierte Histonschwänze wechselwirken auch mit spezifischen chromatinassoziierten Nicht-Histon-Proteinen auf eine Weise, welche die Transkriptionszugänglichkeit der dazugehörigen Gene verändert. Wechselwirkungen zwischen den Nucleosomen und Histon-Histon-Wechselwirkungen sind wahrscheinlich ebenfalls ‘von kovalenten Modifikationen der globulären Kerne der Histonproteine und nicht nur ihrer Schwänze betroffen. Die Charakterisierung einer. Vielzahl von Histonschwanz-Modifikationen brachte David Allis zu der Hypothese, dass es einen Histon-Code gibt, bei dem spezifische Modifikationen bestimmte chromatinbasierte Funktionen hervorrufen und dass diese Modifikationen hintereinander oder in Kombination wirken, um einzigartige biologische Ergebnisse hervorzubringen. Beispielsweise ist nicht kondensiertes und somit transkriptionsaktives Chromatin mit der Acetylierung von H3-Lys 9 und 14 und H4-Lys 5 sowie der Methylierung von H3-Lys 4 und H4-Arg 3 verknüpft. Kondensiertes und damit transkriptionsinaktives Chromatin ist mit der Acetylierung von H4-Lys 12 und der Methylierung von H3-Lys 9 assoziiert und die Nucleosomendeposition ist an die Phosphorylierung von H3-Ser 10 und 28 gekoppelt. In Abbildung 28.22 kann man sehen, dass es eine enorme Anzahl möglicher Kombinationen von Histonmodifikationen gibt. Histon-Acetyltransferasen sind Bestandteile von Transkriptionscoaktivatoren Lys-Seitenketten von Histonen werden sequenzspezifisch von Enzymen mit der Bezeichnung Histon-Acetyltransferasen (HATS) acetyliert, die alle als Acetylgruppen-Donator Acetyl-CoA verwenden:

1 CoA—-S—C--CH;3

SR

Lys

Acetyl-CoA

HAT

CoA—SH

+

(CHos

NH:

Histon-Lys

|

5

1

Lys—(CHy)), -NH—-C—CH; Histon-Acetyl-Lys

Die meisten, wenn nicht gar alle HATs sind in vivo Bestandteil von oft großen Komplexen aus vielen (10-20) Untereinheiten, von denen viele ursprünglich als Transkriptionsregulatoren charakterisiert wurden. So ist beispielsweise TAFI, die größte Untereinheit des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIID eine HAT (TAF steht für TBP-assoziierter Faktor, wobei TBP ein TATA-Box-Bindungsprotein ist; Abschnitt 26.2C). Zudem haben viele HAT-Komplexe gemeinsame Untereinheiten. So enthält der HAT-Komplex namens SAGA - ebenso wie der PCAF-Komplex — die Faktoren TAF5, TAF6, TAF9, TAF10 und TAF12, mit der Ausnahme, dass im PCAF-Komplex TAF5 und TAF6 durch ihre engen Homologe PAF65ß und PAF65« ersetzt sind. Teile von TAF6, TAF9 und TAF12 sind Strukturhomologe der Histone H3, H4 bzw. H2B (Abschnitt 24.5). Man nimmt an, dass diese TAFs ein Strukturelement ausbilden, das allen drei Komplexen, TFIID, SAGA und dem PCAF-Komplex gemeinsam ist. Somit ist es wahrscheinlich, dass diese Komplexe mit TBP auf ähnliche Weise wechselwirken. Die verschiedenen HAT-Komplexe leiten ihre HAT-Komponenten vermutlich zu den Promotoren der aktiven Gene. Ronen Marmorstein bestimmte die Röntgenstruktur der HAT-Domäne GCN5

(die Reste 48-210 des 418 Reste umfassenden Proteins), aus Tetrahymena thermophila, im Komplex mit einem Bisubstratinhibitor. Der Bisubstratinhibitor (Abb. 28.23a) bestand aus CoA, das mit seinem S-Atom kovalent über eine Isopropionlygruppe (ahmt die Acetylgruppe nach) mit der Seitenkette von Lys 14 (dem Acetylgruppenakzeptor) des 20 Reste umfassenden N-terminalen Abschnitts des Histons H3 verknüpft war. Das Enzym hat einen tiefen Spalt und

Regulation der eukaryotischen Genexpression (a) RER

N-terminales Peptid von Histon H3 TR ET ER

ER — K—Q— 1.2

1129

000-

CH; CH3 CHs CH,

O

CH;

HNZ6 CH S—CoA Isopropionylgruppe

Abb. 28.23 Röntgenstruktur von GCN5 aus Tetrahymena im Komplex mit einem Inhibitor. (a) Der Bisubstratinhibitor, ein Peptid-CoA-Konjugat, besteht aus CoA, das mit seinem S-Atom kovalent über eine Isopropionylgruppe mit der Seitenkette von Lys 14 des 20 Reste umfassenden N-terminalen Segments von Histon H3 verknüpft ist. (b) Das Protein ist in Bänderform pink gezeichnet mit magentafarbener Kernregion. Das Peptid-CoA-Konjugat ist in Stabform dargestellt und entsprechend dem Atomtyp gefärbt (Histon-C blau, C der Isopropionylgruppe orange, C von CoA grün, N blau, © rot, S gelb und P golden). [Teil b nach einer Röntgenstruktur von Ronen Marmorstein, The Wistar Institute, Philadelphia. PDBid 1MID.]

enthält eine Kernregion, die allen HATs mit bekannter Struktur gemeinsam ist (magenta in Abb. 28.23b). Sie besteht aus einem dreisträngigen, antiparallelen ß-Faltblatt, das über eine «a-Helix mit einem vierten ß-Strang verbunden ist, der mit dem ß-Faltblatt eine parallele Wechselwirkung ausbildet. Nur sechs Reste des Histonschwanzes, Gly 12 bis Arg 17, sind in der Röntgenstruktur zu sehen. Die CoA-Hälfte bindet im Spalt des Enzyms, sodass sie hauptsächlich zu den Kernresten Kontakte hat. Der Vergleich dieser Struktur mit anderen GCNS5-haltigen Strukturen zeigt, dass der Spalt über der CoA-Hälfte geschlossen ist. Bromodomänen rekrutieren Coaktivatoren Die unterschiedlichen Muster der Histonacetylierung, die für die verschiedenen Funktionen erforderlich sind (der Histon-Code), legen nahe, dass die Funktion der Histonacetylierung komplexer ist als nur eine Abschwächung der Ladungs-Wechselwirkungen zwischen den N-terminalen Schwänzen der kationischen Histone und der anionischen DNA zu bewirken. Es gibt inzwischen immer mehr Belege dafür, dass spezifische Acetylierungsmuster von Proteinmodulen auf ganz ähnliche Weise von Transkriptionscoaktivatoren erkannt werden wie spezifisch phosphorylierte Regionen von Proteinmodulen wie der SH2-Domäne. SH2-Domänen vermitteln die Signaltransduktion der Proteinkinasekaskaden durch spezifische Erkennung von bestimmten phosphorylierten Tyrosinresten (Abschnitt 13.2B). Somit enthalten nahezu alle HAT-assoziierten Transkriptionscoaktivatoren Module mit ungefähr 110 Resten, die man als Bromodomänen bezeichnet und die spezifisch acetylierte Lys-Reste auf Histonen binden. GCN5 besteht tatsächlich aus einer HAT-Domäne, gefolgt von einer Bromodomäne, während TAF1 hauptsächlich aus einer N-terminalen Kinasedomäne besteht, auf die eine HAT-Domäne und zwei hintereinander liegende Bromodomänen folgen.

1130

Regulation der Genexpression

C

/ Acetyl-Lys-Bindungsstelle

Abb. 28.24 Röntgenstruktur der menschlichen TAF1-Doppelbromodomäne. Jede Bromodomäne besteht aus einem antiparallelen Vier-Helix-Bündel, dessen Helices vom

N- zum C-Terminus rot, gelb, grün und blau gefärbt sind; die restlichen Teile des Proteins sind orange.

Die Acetyl-Lys-Bindungsstellen stellen tiefe, hydrophobe Taschen am Ende jedes Vier-Helix-Bündels gegenüber seinen N-und C-Termini dar. [Nach einer Röntgenstruktur von Robert Tjian, University of California at Berkeley. PDBid 1EQF.]

Abb. 28.25

Vereinfachtes Modell für den Aufbau

eines Transkriptions-Initiations-Komplexes an chromatingebundenen Matrizen. Die DNA ist hier als gelbe Schlange dargestellt;

Die von Robert Tjian bestimmte Röntgenstruktur der Doppelbromodomäne des menschlichen TAF1 (Reste 1359-1638 des 1872 Reste umfassenden Proteins) zeigt, dass sie aus zwei nahezu identischen antiparallelen Vier-Helix-Bündeln besteht (Abb. 28.24). Eine Vielzahl von Hinweisen - einschließlich der NMR-Strukturen einzelner Bromodomänen im Komplex mit ihren Acetyl-Lyshaltigen Zielpeptiden - zeigt, dass sich die Acetyl-Lys-Bindungsstelle jeder Bromodomäne in einer tiefen, hydrophoben Tasche am Ende seines VierHelix-Bündels befindet, das entgegengesetzt zum N-und C-Terminus lokalisiert ist. Die beiden Bindungstaschen der Doppelbromodomäne sind etwa 2,5 nm voneinander getrennt, wodurch sie ideal positioniert sind, um zwei Acetyl-LysReste zu binden, die 7 bis 8 Reste voneinander getrennt sind. Tatsächlich enthält der N-terminale Schwanz des Histons H4 Lys-Reste an den Positionen 5, 8, 12 und 16 (Abb. 28.22), deren Acetylierung mit einer erhöhten Transkriptionsaktivität zusammenhängt. Zudem bindet das aus 36 Resten bestehende N-terminale Peptid von H4 an die TAF1-Doppelbromodomäne im Verhältnis 1:1 mit 70fach höherer Affinität als an Einzelbromodomänen. Es kann aber nicht gebunden werden, wenn es nicht acetyliert ist. Die Struktur legt nahe, dass die TAF1-Bromodomänen dazu dienen, TFIID zu Promotoren zu lenken, die sich innerhalb oder in der Nähe von Nucleosomen befinden - im Gegensatz zu der oft vertretenen Theorie, dass TFIID die Bildung von PICs (Präinitiationskomplexen) in nucleosomenfreien Regionen fördert. Tjian hat deshalb postuliert, dass der Initiationsprozess der Transkription mit der Rekrutierung eines HAT-haltigen Coaktivatorkomplexes durch ein stromaufwärtiges DNA-Bindungsprotein beginnt (Abb. 28.25). HAT könnte dann die N-terminalen Histonschwänze von benachbarten Nucleosomen acetylieren, die TFIID für einen passend positionierten Promotor über die Bindung seiner TAF1-Bromodomänen an die Acetyl-Lys-Reste rekrutieren würde. Zudem könnte die HAT-Aktivität von TAF1 andere benachbarte Nucleosomen acetylieren und dabei eine Kaskade von Acetylierungsereignissen auslösen, welche die DNA-Matrize zur Initiation der Iranskription vorbereiten könnten. (@)

die Histonoktamere, um die sich die DNA wickelt und Nucleosomen bildet, sind als rote Kugeln abgebildet; die N-terminalen Histonschwänze sind als türkise Stäbchen gezeigt; die roten Punkte und kleinen, schwarzen Kreise stellen nicht acetylierte bzw. acetylierte Lys-Reste dar. Der Transkriptionsstartpunkt ist durch den schwarzen Ring um die

HAT-Coaktivator-Komplex Aktivator

DNA gekennzeichnet, von dem aus der Pfeil

stromabwärts zeigt. (a) Der Prozess beginnt mit

der Rekrutierung eines HAT-enthaltenden Transkriptions-Coaktivator-Komplexes (gelbgrün); dieser interagiert mit einem DNA-bindenden Aktivatorprotein (violett), das an einen stromaufwärtigen Enhancer gebunden ist (hellblau). Der HAT-Coaktivator-Komplex wird dabei so positioniert, dass er

den N-terminalen Schwanz benachbarter Nucleosomen acetyliert (gebogene Pfeile). (b) Die Bindung der Bromodomänen seiner TAFs an die acetylierten Histonschwänze könnte dann dazu beitragen, TFIID (magenta) für eine benachbarte TATA-Box (orangener Fleck) zu rekrutieren. Die weitere Acetylierung benachbarter Histonschwänze durch die HAT-Domäne

von TAF]

grundlegende Faktoren (orange) am Promotor wird die Bildung eines Zeichnung von Robert California at Berkeley.]

könnte helfen, andere

(türkis) und RNAP II zu rekrutieren. Dadurch PIC stimuliert. [Nach einer Tjian, University of

(b) Aktivator

??

zum TFIID gehörende HAT- und Kinaseaktivitäten

Regulation der eukaryotischen Genexpression

Die Histonacetylierung ist ein reversibler Prozess. Die Enzyme, die Acetylgruppen von Histonen entfernen, die sogenannten Histon-Deacetylasen . (HDACs), fördern die Repression der Transkription und damit die Stilllegung von Genen. Eukaryotische Zellen - von der Hefe bis zum Menschen - enthalten normalerweise verschiedene HDACs. Bei der Hefe hat man 10, beim Menschen 17 HDACs identifiziert.

Die Histonmethylierung kann Gene stilllegen oder aktivieren

Die Histonmethylierung an Lys- und an Arg-Seitenketten der N-terminalen Schwänze der Histone H3 und H4 (Abb. 28.22) legt die assoziierten Gene still, indem die Bildung von Heterochromatin eingeleitet wird. Trotzdem ist

das trimethylierte Lys 4 von Histon H3 mit aktiven Genen assoziiert. Die Enzyme, welche die Histonmethylierung vermitteln, die Histon-Methyltransferasen (HMTS), verwenden als Methyldonatoren allesamt S-Adenosylmethionin (SAM). Die am besten charakterisierten HMTs, die Lysin-HMTs, katalysieren folgende Reaktion: Rt =

(CH),

+

Es

CH;

NH3

H

| CH, —-C—C00”

NH5

O__

Histon-Lys

Lysin-HistonMethyltransferase —

Adenin

| = ae

(CH3)4

CH3

|

H

CH;

S-Adenosylmethionin

Di- oder Trimethylform — erkennen.

{al

Adenin

Ast

H

H

OH

OH

NH3 O

NH;

OH

S-Adenosylhomocystein

Diese Enzyme besitzen allesamt die sogenannte SET-Domäne, die ihr katalytisches Zentrum enthält. Die menschliche Lysin-HMT namens SET7/9 monomethyliert Lys 4 von Histon H3. Die Röntgenstruktur der SEI-Domäne von SET7/9 (Reste 108-366 des aus 366 Resten bestehenden Proteins) im Komplex mit S-Adenosylmethionin (SAM) und dem N-terminalen Dekapeptid von Histon H3, in dem Lys 4 monomethyliert ist, wurde von Steven Gamblin bestimmt. Interessanterweise binden SAM und das Peptidsubstrat an entgegengesetzten Seiten des Proteins (Abb. 28.26). Es gibt jedoch einen dünnen Tunnel durch das Protein, in den die Lys-Seitenkette eingeschoben wird, sodass ihre Aminogruppe für die Methylierung durch SAM korrekt positioniert wird. Die Anordnung des Wasserstoffbrückenakzeptors für die Lys-Aminogruppe stabilisiert die Methyl-Lys-Seitenkette in ihrer beobachteten Ausrichtung um die C,-N.-Bindung und hindert damit sterisch die Methyl-Lys-Gruppe, eine Konformation einzunehmen, in der sie durch SAM noch weiter methyliert werden könnte. Die methylierten Histone werden von mehreren Arten von Proteindomänen gebunden, die spezifische Lys-Reste - mit einer gewissen Vorliebe für ihre Mono-,

RE

Be

H

H OH

\RR

H

r CH; — n—CH,

Die sogenannte

Chromodomäne

und das als PHD-Finger (von engl.: plant homeodomain; pflanzliche Homöodomäne) bekannte Motiv beinhalten beide Bindungsstellen für methylierte Lys-

Abb. 28.26 Röntgenstruktur der menschlichen Histon-Methyltransferase Set7/9 im Komplex mit SAM und dem N-terminalen Dekapeptid von Histon H3, dessen Lys 4 einfach methyliert ist. Das Protein ist als Oberflächendiagramm gezeigt und je nach Ladung gefärbt (blau am positivsten, rot am negativsten, grau neutral). Das H3-Dekapeptid ist durch ein grünes Band wiedergegeben. Man beachte den engen Tunnel durch das Protein, in den die Methyl-Lys-Seitenkette geschoben ist. Der Bildausschnitt unten zeigt eine Vergrößerung dieses für Lys zugänglichen Tunnels. Er enthält die Methyl-Lys-Seitenkette (grün) und ist von der der SAM-Bindungsstelle gegenüberliegenden Seite betrachtet. [Mit freundlicher Genehmigung von Steven Gamblin, MRC National Institute for Medical Research, London. PDBid 1095.]

1131

1132

_ Regulation der Genexpression

Abb. 28.27 Bindungsstellen für Histon-Trimethyl-Lys-Reste. (a) H3-Trimethyl-Lys 9 ist an die Chromodomäne des Heterochromatinproteins I (HP1) aus Drosophila gebunden, und (b) H3-Trimethyl-Lys 4 ist an den menschlichen PHD-Finger gebunden. Die Kohlenstoffatome der H3-Trimethyl-Lys-Reste sind grün, die Stickstoffatome blau, das Peptid-

rückgrat ist gelb dargestellt. Die aromatischen Seitenketten von HP1 und der PHD-Finger, welche

die Trimethylammoniumgruppe einschließen, sind mit C türkis, N blau und O rot wiedergegeben. Die gepunkteten Oberflächen skizzieren die vander-Waals-Oberflächen der aromatischen Seitenketten und die Trimethylammoniumgruppen. [Teil a nach einer Röntgenstruktur von Sepideh Khorasanizadeh, University of Virginia. PDBid

(a)

IKNE. Teil b nach einer Röntgenstruktur von David Allis, Rockefeller University und Dinshaw Patel, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York.

PDBid 2F6].]

Reste, die als aromatische Käfige beschrieben werden können (Abb. 28.27). Interessanterweise gehören zu den Methyl-Lys-Bindungsproteinen oft zusätzliche, Histon-Code lesende Motive wie eine Bromodomäne oder ein histonmodifizierendes Enzym wie z.B. eine Deacetylase. Das eine Chromodomäne enthaltende Heterochromatin-Protein 1 (HP1) bindet dimethyliertes H3-Lys 9 und trägt zur Stilllegung von Genen bei. Das gebundene HP1 rekrutiert die HMT Suv39h, die benachbarte Nucleosomen an ihren H3-Lys-9-Resten methyliert; dabei wird weiteres HP1 rekrutiert, usw. Dieser Mechanismus könnte erklären, warum Heterochromatin zur Ausbreitung neigt, sodass benachbarte Gene stillgelegt werden. Im Chromatin, in dem die Transkription stillgelegt ist, ist unter Umständen die DNA selbst methyliert. Methyltransferasen Wie wir gesehen haben (Exkurs 25.4), schaltet die Methylierung der DNA die eukaryotische Genexpression ab. Eukaryotische DNA wird nur an ihren Cytosinresten methyliert, wobei 5-Methylcytosin-(m’C-)Reste entstehen. Diese Modifikation kommt hauptsächlich auf den palindromischen CpG-Inseln vor, die im Allgemeinen in den stromaufwärtigen Promotorregionen von Genen zu finden sind (Abschnitt 26.2B). Die Enzyme, die diese Reaktionen katalysieren, die soge-

nannten DNA-Methyltransferasen (DNA-MTIasen), verwenden allesamt SAM als Methyldonator. Zellen enthalten auch Demethylasen. Sie katalysieren nachfolgende Reaktion: 5-Methylcytosin + H3O

> Cytosin + HO-CH;

Bei den DNA-MTase-Reaktionen reagiert SAM mit der Zielbase Cytosin, sodass ein tetraedrisches Zwischenprodukt entsteht, in dem das C5 des Cytosins an seinem ursprünglichen Wasserstoffatom als auch der übertragenen Methylgruppe substituiert ist. Dies erfordert, dass die angreifende Methylgruppe sich dem C5 von oben oder unterhalb des Cytosinrings nähert. Allerdings sind die Oberflächen der Nucleinsäurebasen innerhalb der DNA-Doppelhelix unzugänglich. Folglich muss eine DNA-MTase ihre Zielbase Cytosin aus der Doppelhelix nach außen klappen, wo sie mit Hilfe von SAM methyliert werden kann. In der von Richard Roberts und Xiaodong Cheng bestimmten Röntgenstruktur der DNA-MTase (M.Hhal) aus Haemophilus haemolyticus, ist ein solch nach außen geklapptes Zwischenprodukt zu sehen. Hier wurde die Zielbase Cytosin durch 5-Fluorcytosin ersetzt (Abb. 28.28). Das normalerweise vorhandene C5-H-Atom aus dem obigen tetraedrischen Zwischenprodukt wurde als H* eliminiert, sodass m’C als Produkt der Methylierungsreaktion entsteht. Dennoch verhindert die hohe Elektronegativität von Fluor, dass das C5-F-Atom als F* eli-

Regulation der eukaryotischen Genexpression

u Du 4.0 ms LUD ll a

1133

Abb. 28.28 Röntgenstruktur der M.Hhal-DNAMethyltansferase im Komplex mit S-Adenosylhomocystein und einer doppelsträngigen DNA, die eine methylierte 5-Fluorcytosin-Base an der Zielstelle des Enzyms enthält. Das Protein ist durch ein halbtransparentes Band dargestellt. Die DNA ist in Stabform gezeichnet und entsprechend dem Atomtyp gefärbt (C grün, N blau, O rot und P orange). Ihr methylierter 5Fluorcytidin-Rest ist aus der DNA-Helix herausgeklappt und sitzt in einer Tasche im aktiven Zentrum des Enzyms, wo sein C6 eine kovalente Bindung mit dem S-Atom eines Cys-Rests des Enzyms eingeht (C-Atome magenta und S gelb). Die Methylgruppe und ein Fluoratom an C5 (das verhindert, dass die Methylierungsreaktion vollendet wird) sind durch magentafarbene bzw. gelbgrüne Kugeln wiedergegeben. Die Position der nach außen geklappten Base Cytosin in der DNA-Doppelhelix wird von der Seitenkette eines GIn-Rests eingenommen (als Kalottenmodell mit gelbem C gezeigt), die zur „verwaisten“ Base Guanin eine Wasserstoffbrücke

ausbildet. S-Adenosylmethionin, das seine Methylgruppe abgegeben hat, ist in Stabform mit pinkfarbenem Kohlenstoff gezeichnet. [Nach einer Röntgenstruktur von Richard Roberts, New England Biolabs, Beverly und Xiaodong Cheng, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. PDBid IMHT.]

miniert wird. Dabei wird das tetraedrische Zwischenprodukt vom Enzym eingeschlossen. Bestimmte Enzyme, die bei der Reparatur der DNA einzelne DNABasen methylieren, klappen ebenfalls ihre Zielbase aus der DNA-Helix nach außen, um ihre Arbeit zu verrichten (Abschnitt 25.5A). DNA-Methylierung bei Eukaryoten bleibt bei der Vererbung erhalten

Die palindromische Beschaffenheit der DNA-Methylierungsstellen bei Eukaryoten erlaubt dem Methylierungsmuster auf dem elterlichen DNA-Strang, die Erzeugung des gleichen Musters auf dem Tochterstrang zu steuern (Abb. 28.29). Diese Erhaltungsmethylierung (maintenance methylation) hat eine stabile „Vererbung“ eines Methylierungsmusters in einer Zelllinie zur Folge und verursacht somit, dass alle diese Zellen den gleichen differenzierten Phänotyp haben. Solche Veränderungen am Genom werden epigenetisch genannt (griech.: epi, auf oder neben), weil sie eine zusätzliche Informationsebene bieten, die spezifiziert,

wann und wo bestimmte Teile des ansonsten fixen Genoms exprimiert werden [epigenetische Veränderungen, auf die wir bereits gestoßen waren, sind die Verlängerung der Telomere bei Keimzellen (Abschnitt 25.3C) und die Inaktivierung eines bestimmten X-Chromosoms bei weiblichen Säugetieren (Exkurs 28.2)]. Wie wir noch sehen werden, sind epigenetische Eigenschaften nicht an die Regeln von Mendels Vererbungslehre gebunden. Es gibt zahlreiche Belege für die Existenz der Erhaltungsmethylierung: Wenn künstlich methylierte virale DNA von eukaryotischen Zellen aufgenommen wird, bleibt das Methylierungsmuster über mindestens 30 Zellgenerationen er-

1134

_ Regulation der Genexpression

halten. Die Erhaltungsmethylierung bei Säugern scheint hauptsächlich vom Pro-

| CH; —C

tein DNMTI

G

niireg Te G C—CH;

CG GC

u

| Replikation

w

Lil

CH; —-C G

CG

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G7C7

Ba ja

rn ae

7777656 CH,

CG GC

CG GC

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|

Erhaltungsmethylierung

|

has,

CH; _C7G

a Br u G C—CH;

C7G

+

@Er

CIE

GC

| Q er | Qa

CG

en

Abb. 28.29 Erhaltungsmethylierung. Das Methylierungsmuster auf einem Eltern-DNAStrang erzeugt das entsprechende Methylierungsmuster auf dem komplementären Strang. Auf diese

Weise kann ein stabiles Methylierungsmuster in einer Zelllinie"aufrecht erhalten werden.

vermittelt zu werden, das eine starke Präferenz hat, halbmethy-

lierte Substrat-DNA zu methylieren. Im Gegensatz dazu unterscheiden prokaryotische DNA-MTasen wie M.Hhal nicht zwischen halbmethylierter und vollständig methylierter Substrat-DNA. Die Bedeutung der Erhaltungsmethylierung wird an Beobachtungen bei Mäusen deutlich: Mäuse, die homozygot für die Deletion des DNMTI-Gens sind, sterben bereits während der frühen Embryonalentwicklung. Das DNA-Methylierungsmuster bei Säugern variiert in der frihen Embryonalentwicklung. Die DNA-Methylierung ist bei reifen Gameten (Spermien und Eizellen) hoch, aber wenn eine befruchtete Eizelle zur Blastocyste (eine Hohlkugel aus Zellen, das Stadium, in dem sich der Embryo in die Gebärmutterschleimhaut einnistet; die Embryonalentwicklung wird in Abschnitt 28.4D behandelt) wird, verschwindet sie nahezu. Nach diesem Stadium steigt der DNA-Methylierungsgrad jedoch generell an, bis zu dem Zeitpunkt, an dem der Embryo das Entwicklungsstadium der Gastrula erreicht hat. Sein DNA-Methylierungsgrad hat nun den von ausgewachsenen Tieren erreicht und bleibt so während der ganzen Lebenszeit des Tiers. Diese de-novo-Methylierung scheint durch zwei DNA-MTasen vermittelt zu werden, die sich von DNMT1 unterscheiden und als DNMT3a und DNMT3b bezeichnet werden. Eine wichtige Ausnahme von diesem Remethylierungsprozess ist, dass die CpG-Inseln der Keimbahnzellen (aus denen später Spermien und Eizellen entstehen) unmethyliert bleiben. Dies gewährleistet die getreue Weitergabe der CpG-Inseln an die nachfolgende Generation, trotz des starken mutagenen Drucks der m’C-Desaminierung (wodurch Tentsteht, eine Mutation, welche die Fehlpaarungsreparatur gelegentlich nicht korrigiert; Exkurs 25.5). Bei weiblichen Säugetieren ist die Inaktivierung des gleichen Chromosoms von Zellgeneration zu Zellgeneration zumindest teilweise durch die Erhaltungsmethylierung konserviert (Exkurs 28.2). Die Veränderung des DNA-Methylierungsgrads (epigenetische Reprogrammierung) während der Embryonalentwicklung legt nahe, dass sich das Muster der Genexpression in embryonalen Zellen von demjenigen in Körperzellen unterscheidet. Dies erklärt auch die hohe Fehlerrate beim Klonieren von Säugetieren (Schafen, Mäusen, Rindern etc.) durch Übertragung des Zellkerns in eine entkernte Oocyte (unreife Eizelle). Einige wenige der klonierten Tiere überleben bis zur Geburt, viele sterben aber kurz danach, und der größte Teil der rund 1% Überlebenden hat eine Vielzahl von Abnormitäten. Am auffälligsten ist die ungewöhnlich große Körpergröße. Dass überhaupt irgendein Embryo überlebt, zeigt, dass die Eizelle eine bemerkenswerte Kapazität zur epigenetischen Neuprogrammierung somatischer Chromosomen besitzt (obwohl sie selten dabei vollen Erfolg hat) und dass Säugerembryonen relativ tolerant für epigenetische Anomalien sind. Die Klonierung des Menschen aus adulten Zellkernen verbietet sich aus gesellschaftlichen und ethischen Gründen. Sie hätte wahrscheinlich ähnliche Anomalien wie bei Tieren zur Folge und sollte schon deshalb nicht ausprobiert werden. Genomic Imprinting resultiert aus unterschiedlicher DNA-Methylierung Seit Tausenden von Jahren weiß man, dass sich die mütterliche und die väterli-

che Vererbung unterscheiden können. Beispielsweise haben ein Maultier (Nachkomme einer Stute und eines männlichen Esels) und ein Maulesel (Nachkomme eines Hengstes und eines weiblichen Esels) deutlich unterschiedliche Körpereigenschaften: Ein Maulesel hat kürzere Ohren, eine dickere Mähne und einen dickeren Schwanz sowie kräftigere Beine als ein Maultier. Dies liegt daran, dass nur bei Säugern bestimmte mütterlicherseits und väterlicherseits beigesteuerte Gene unterschiedlich exprimiert werden - ein Phänomen, das man genetische Prägung oder Genomic Imprinting nennt. Rudolph Jaenisch konnte zeigen, dass Gene, die Gegenstand des Genomic Imprinting sind, bei beiden Eltern während der Gametenentstehung (Gametogenese) unterschiedlich

Regulation der eukaryotischen Genexpression

methyliert sind. Die resultierenden unterschiedlichen Methylierungsmuster widerstehen der Demethylierungswelle, die während der Bildung der Blastocyste auftritt, und der Welle der de novo-Methylierung, die danach abläuft. Die Bedeutung des Genomic Imprinting zeigt sich an der Beobachtung, dass sich aus der Übertragung von zwei männlichen oder zwei weiblichen Vorkernen (Pronuclei) in eine Eizelle kein Embryo entwickelt (Pronuclei sind die Zellkerne des reifen Spermiums oder der Eizelle, bevor sie nach der Befruchtung verschmelzen). Ein fehlerhaftes Imprinting ist auch mit bestimmten Krankheiten verknüpft. Ein Beispiel ist das Prader-Willi-Syndrom (PWS). Es ist durch eine Wachstumsstörung in der Kindheit gekennzeichnet und manifestiert sich in kleinen Händen und Füßen, einer. ausgeprägten Fettsucht und unterschiedlich ausgeprägter geistiger Retardierung. Es wird durch eine über 5000 kb umfassende Deletion in einer bestimmten Region des väterlich vererbten Chromosoms 15 verursacht. Wenn die Deletion der gleichen Region aber auf dem mütterlicherseits ererbten Chromosoms 15 vorkommt, entsteht das Angelman-Syndrom (AS). Dieses schlägt sich in einer schweren geistigen Retardierung, einem an eine Marionette erinnernden, ataxischen (unkoordinierten) Gang und unpassenden Lachanfällen nieder. Diese Syndrome zeigen sich auch in den seltenen Fällen, in denen ein Mensch die beiden Chromosomen Nummer 15 von der Mutter (PWS) oder vom Vater (AS) geerbt hat (uniparentale Disomie). Daher tritt PWS immer dann auf, wenn die bestimmte Chromosomenregion des Chromosoms 15 des Vaters fehlt - um AS zu verhindern, müssen diese Gene mütterlich vererbt werden. Mehrere andere menschliche Erkrankungen sind ebenfalls mit der mütterlichen oder väterlichen Vererbung oder Nichtvererbung verknüpft. Anomale genetische Programmierung spielt unter Umständen auch beim Tumorwachstum eine Rolle, da Krebszellen oft abnorme DNA-Methylierungsmuster aufweisen.

B.

Eukaryoten enthalten mehrere Transkriptionsaktivatoren

Außer den sechs im Abschnitt 26.2C beschriebenen allgemeinen Transkriptionsfaktoren enthalten eukaryotische Zellen viele andere Proteine, die mit der DNA und/oder anderen Transkriptionsfaktoren interagieren, um die Transkription der Klasse-II-Gene (Gene, die durch die RNA-Polymerase II transkribiert werden) zu stimulieren oder zu reprimieren. Einige dieser Proteine binden an jede verfügbare DNA, die ihre Zielsequenzen enthält; andere müssen hingegen aktiviert oder deaktiviert werden — oft als Teil eines Signaltransduktionswegs (Abschnitt 13.2B). Diese Regulatorproteine heißen Aktivatoren und Repressoren, und ihre Zielorte auf der DNA sind die sogenannten Enhancer (vom engl.: to enhance, verstärken) bzw. Silencer (vom engl.: to silence, stilllegen). Ein Enhancer ist normalerweise für die Transkription nicht unbedingt erforderlich, erhöht aber deren Geschwindigkeit enorm. Promotoren müssen zwingend in geringer Entfernung zum Transkriptionsstartpunkt liegen. Im Gegensatz dazu benötigen Enhancer (oder Silencer) keine fixen Positionen und Ausrichtungen (Abschnitt 26.2B). William Rutter verknüpfte beispielsweise die stromaufwärtigen (5’-flankierenden) Sequenzen des Insulingens oder des Chymotrypsingens mit der Sequenz, welche die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codiert. CAT ist ein einfach zu untersuchendes Enzym, das normalerweise in eukaryotischen Zellen nicht vorkommt. Ein Plasmid, das die Insulin-Gensequenzen

enthält, exprimiert nur dann das CAT-Gen,

wenn

es in kultivierte

Zellen eingebracht wird, die normalerweise Insulin bilden. Gleichfalls sind die Chymotrypsin-Rekombinanten nur in Chymotrypsin bildenden Zellen aktiv. Die Analyse der Steuersequenz des Insulingens zeigte, dass der Enhancer zwischen den Positionen -103 und -133 liegt und (nur in insulinbildenden Zellen) die Transkription des CAT-Gens mit wenig Rücksicht auf seine Position und Ausrichtung im Verhältnis zum Promotor stimuliert. Da so viele Enhancer

1135

1136

Regulation der Genexpression

stromaufwärts vor den transkribierten Sequenzen liegen, werden die Proteine, die an sie binden, oft stromaufwärtige Transkriptionsfaktoren (upstream transcription factors) genannt. Stromaufwärtige Transkriptionsfaktoren arbeiten kooperativ miteinander und mit dem PIC Wie stimulieren (oder hemmen) stromaufwärtige Transkriptionsfaktoren

die Nachbarder in DNA der auf Transkription? Wenn diese Proteine an ihre Zielstellen schaft eines Präinitationskomplexes (PIC) binden (in manchen Fällen viele Tausend Basenpaare entfernt), aktivieren (oder reprimieren) sie offensichtlich dessen RNAP II-Komponente. Transkriptionsfaktoren können kooperativ aneinander und/oder an den PIC binden und stimulieren (oder reprimieren) dabei synergistisch die Initiation der Transkription. Molekulare Klonierungsexperimente zeigen, dass viele Enhancer oder Silencer aus Abschnitten‘ (Modulen) bestehen, deren individuelle Deletion die Enhancer-/Silencer-Aktivität zwar reduziert, sie aber nicht beseitigt. Solch komplexe Anordnungen erlauben den Transkriptionskontrollsystemen vermutlich, auf eine Vielzahl von Reizen auf abgestufte Weise zu reagieren. In manchen Fällen lagern sich jedoch mehrere Transkriptionsfaktoren gemeinsam mit den Architekturelementen des Chromatins auf einem ca. 100bp-Enhancer kooperativ zusammen und bilden einen Komplex aus vielen Untereinheiten, den man als Enhanceosom bezeichnet. Fehlt diesem Komplex auch nur eine einzige Untereinheit, wird dessen Stimulation der TranskriptionsInitiation am entsprechenden Promotor nahezu eliminiert. Somit fungieren Enhanceosomen eher wie An-/Ausschalter als dass sie eine abgestufte Antwort liefern. Enhanceosomen können auch Coaktivatoren und/oder Corepressoren enthalten, also Proteine, die nicht an DNA binden, sondern mit Proteinen wechselwirken und so die Transkription aktivieren oder reprimieren. Die Funktionseigenschaften vieler stromaufwärtiger Transkriptionsfaktoren sind überraschend einfach. Sie bestehen normalerweise aus (mindestens) zwei Domänen:

;

1. Einer DNA-bindenden Domäne, die spezifisch an die DNA-Zielsequenz des Proteins bindet (mehrere solche Domänen sind im Abschnitt 24.4C beschrieben). 2. Einer Domäne, welche die Aktivierungsfunktion des Transkriptionsfaktors enthält. Die Sequenzanalyse zeigt, dass viele dieser Transaktivierungsdomänen (TAD) auffällig saure Oberflächenregionen haben, deren negative Ladungen - wenn sie durch Mutation erhöht oder erniedrigt sind — die Aktivität des Transkriptionsfaktors erhöhen bzw. senken. Dies legt nahe, dass die Assoziationen zwischen diesen Transkriptionsfaktoren und einem PIC durch relativ unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt werden, und nicht durch Wasserstoffbrücken, die eine definierte Konformation voraussetzen würden. Man hat auch andere Arten von Transaktivierungsdomänen gefunden, unter anderem solche mit Gln-reichen und mit Pro-reichen Regionen.

Die DNA-bindenden und DNA-Transaktivierungsfunktionen der eukaryotischen Transkriptionsfaktoren können räumlich getrennt sein (deshalb glaubt man, dass sie auf verschiedenen Domänen vorkommen). Tatsächlich aktiviert ein gentechnisch verändertes Hybridprotein, das die DNA-bindende Domäne eines Transkriptionsfaktors und die Transaktivierungsdomäne eines zweiten Transkriptionsfaktors enthält, die gleichen Gene wie der erste Transkriptionsfaktor. Zudem macht es nur einen geringen Funktionsunterschied, ob die Transaktivierungsdomäne auf der N-terminalen Seite der DNA-bindenden Domäne sitzt oder auf ihrer C-terminalen Seite. Diese geometrische Toleranz bei der Bindung zwischen der Transaktivierungsdomäne und ihrem Zielprotein ist auch durch die Beobachtung bestätigt, dass Transkriptionsfaktoren größtenteils für die Ausrichtung und Position (bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt) ihrer ent-

Regulation der eukaryotischen Genexpression

1137

sprechenden Enhancer unempfindlich sind. Natürlich muss die DNA zwischen einem Enhancer und seinem entfernten Transkriptionsstartpunkt eine Schleife ausbilden, damit ein enhancergebundener Transkriptionsfaktor mit dem promotorgebundenen PIC wechselwirken kann (Abschnitt 26.2C). Die Synergie (Kooperativität) vieler Transkriptionsfaktoren bei der Initiierung der Transkription kann man in Form eines einfachen Rekrutierungsmodells verstehen. Angenommen, ein enhancergebundener Transkriptionsfaktor erhöht die Affinität, mit der ein PIC an den zum Enhancer gehörenden Promotor bindet, sodass die Geschwindigkeit, mit der der PIC die Transkription dort startet, um den Faktor 10 zunimmt. Wenn dann ein anderer Transkriptionsfaktor, der an einer anderen Stelle bindet, die Transkription um den Faktor 20 steigert, wirken beide Transkriptionsfaktoren zusammen, und die Initiationsgeschwindigkeit steigt um den Faktor 200. Auf diese Weise kann eine begrenzte Anzahl von Transkriptionsfaktoren eine weit größere Anzahl von Transkriptionsmustern erzeugen. Die Transkriptionsaktivierung ist gemäß diesem Modell im Wesentlichen ein Massenwirkungseffekt: Die Bindung eines Transkriptionsfaktors an einen Enhancer erhöht die wirksame Konzentration des Transkriptionsfaktors an dem zugehörigen Promotor (die DNA hält den Transkriptionsfaktor in der Nachbarschaft des Promotors), was folglich die Geschwindigkeit erhöht, mit der PIC an den Promotor bindet. Dies erklärt, warum ein nicht an die DNA gebundener Transkriptionsfaktor (sogar einer, der überhaupt keine DNA-bindende Domäne hat) die Initiation der Transkription hemmen kann. Solch nicht gebundene Transkriptionsfaktoren konkurrieren mit DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren um deren Bindungsstellen und verringern dabei die Geschwindigkeit, mit der der PIC für den zugehörigen Promotor rekrutiert wird. Dieses als Squelching (engl.: to squelch, unterdrücken) bezeichnete Phänomen ist offensichtlich der Grund, warum Transkriptionsfaktoren im Zellkern nahezu immer an Inhibitoren gebunden sind, bevor sie aktiv an der Initiation der Transkription beteiligt sind. Der Mediator verbindet die Transkriptionsaktivatoren und die RNA-Polymerase Il

Eukaryotische Genome codieren mehrere Tausend Transkriptionsregulatoren von Klasse-II-Genen (z.B. Abb. 28.3). Die Aktivatoren stimulieren die Transkription durch einen wiederhergestellten PIC in vitro jedoch nicht. Offensichtlich wird dafür ein zusätzlicher Faktor benötigt. Genetische Untersuchungen an der Hefe führten Roger Kornberg zur Entdeckung eines etwa 1000-kD-Komplexes aus rund 20 Untereinheiten namens Mediator. Dessen Gegenwart ist für die Transkription nahezu aller Klasse-II-Gen-Promotoren in der Hefe erforderlich. Der Mediator, von dem man deshalb annimmt, dass er ein Coaktivator ist, bindet an die C-terminale Domäne (CTD) der ß‘-Untereinheit der RNAP II (Abschnitt 26.2A). Weitere Untersuchungen ergaben, dass Vielzeller Komplexe aus vielen Untereinheiten enthalten, die ähnlich wie der Mediator bei der Hefe funktionieren. Zudem sind viele der Untereinheiten, wenn auch entfernt, mit denen des Hefe-Mediators verwandt. Mediatoren fungieren offensichtlich als Adaptoren, die DNA-gebundene Transkriptionsregulatoren und RNAP II verbrücken, sodass sie die Bildung eines stabilen PIC an dem zugehörigen Promotor beeinflussen (induzieren oder hemmen). Sie integrieren dabei die verschiedenen Signale, welche die Bindung dieser Transkriptionsregulatoren an ihre DNAs mit sich bringen. Das EM-basierte und von Roger Kornberg und Francisco Asturias angefertigte

Bild des RNAP-II-Mediator-Komplexes aus der Hefe (Abb. 28.30) zeigt, dass der Mediator aus drei Domänen besteht: der Kopf-, Mittel- und Schwanzdomäne. Die Kopfdomäne interagiert eng mit der RNAP II, obgleich über 75% der RNAP-IIOberfläche für die Wechselwirkungen mit anderen Komponenten des PIC zugänglich bleiben. Die Schwanzdomäne scheint aber zur RNAP II überhaupt keinen Kontakt zu haben. Die Transkriptionsmaschinerie für die Klasse-IlGene, einschließlich Mediator, umfasst fast 60 Polypeptide, mit einer Gesamtmolekülmasse von rund 3 Millionen D (zum Vergleich: Das eukaryotische Ribosom ist mit einer Molekülmasse von 4,2 Millionen D nur wenig größer; Tab. 27.5).

Schwanz

Abb. 28.30 Auf Elektronenmikroskopie basierender Entwurf des RNA-Polymerase-IlMediator-Komplexes aus der Hefe bei einer

Auflösung von 3,5 nm. Die Kopf-, Mittel- und Schwanzdomäne des Mediators (blau) sind klar zu erkennen. Das unabhängig davon bestimmte EM-basierte Bild der RNAP II (silber) ist so ausgerichtet, dass es am

besten in die Polymerasedichte des Holoenzyms bei geringerer Auflösung passt. Die Promotor-DNA

(orange) wurde anhand der Struktur des RNAP IlKomplexes der Hefe abgebildet (Abb. 26.12b). Man beachte, dass der DNA-bindende Spalt der RNAP II im Holoenzymkomplex voll zugänglich bleibt. Der mit CTD markierte rote Punkt repräsentiert die Stelle, an der sich die C-terminale Domäne der RNAP II aus dem Enzym erstreckt. [Mit freundlicher Genehmigung von Francisco Asturias, The Scripps Research Institute, La Jolla, California und Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.)

1138

Regulation der Genexpression

Isolatoren begrenzen die Wirkung der Enhancer und stoppen die Ausbreitung von Heterochromatin

Enhancer arbeiten unabhängig von ihrer Lage zum Promotor. Was hindert also einen Enhancer daran, die Transkription aller Gene auf dem entsprechenden Chromosom zu beeinflussen? Umgekehrt scheint Heterochromatin, wie wir gesehen haben (Abschnitt 28.3A), spontan entstehen zu können. Was hindert Heterochromatin daran, sich auf benachbarte Euchromatinabschnitte auszudehnen? Man hat Experimente durchgeführt, bei denen DNA-Sequenzen in der Nähe von Drosophila-Genen neu angeordnet wurden. Diese Experimente zeigten, dass kurze DNA-Abschnitte (unter 2 kb), die sogenannten Isolatoren, die Grenzen für die Funktionseinheiten zur Transkription darstellen. Fügt man zwischen ein Gen und seinen stromaufwärtigen Enhancer einen Isolator ein, wird der Einfluss des Enhancers auf die Transkription blockiert. Isolatoren verhindern unter Umständen auch, dass sich Heterochromatin ausbreitet. So rekrutiert beispielsweise der HS4-Isolator im ß-Globin-Gen-Cluster des Huhns HATSs, die H3-Lys 9 auf benachbarten Nucleosomen acetylieren (was mit Transkriptionsaktivität verknüpft ist). Dabei wird deren Methylierung blockiert, was die Bildung von Heterochromatin einleitet. Der Wirkmechanismus der Isolatoren ist unbekannt. Vermutlich sind es nicht die Isolatoren selbst, sondern die an sie bindenden Proteine, die die aktiven Isolatorelemente bilden. In der Tat unterscheidet sich die HAT-rekrutierende Aktivität von HS4 von der EnhancerBlockierungsfunktion. Die Enhancer-Blockierungsfunktion wird vermittelt durch die Bindung eines 11-Zinkfingerproteins namens CTCF an eine andere Stelle von HS4 als die, an welche HATSs binden. Viele Signaltransduktionswege aktivieren Transkriptionsfaktoren Eine Vielzahl von Signalwegen führen zu einer Aktvierung (oder Inaktivierung) von Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Signalwegen zählen solche, an denen

Steroidhormone beteiligt sind, sowie einige, an denen heterotrimere G-Proteine, Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) und Phosphoinositid-Kaskaden (Kapitel 13) beteiligt sind. Auf diese Weise können z.B. Hormone die Genexpression in einer Zelle beeinflussen. Wir haben bereits gesehen, dass die Ras-Signalkaskade (Abb. 13.7) die Phosphorylierung mehrerer Transkriptionsfaktoren zur Folge hat, einschließlich Fos, Jun und Myc. Dabei wird deren Aktivität reguliert. Das Protein SREBP (engl.: sterol regulatory element binding protein) ist ebenfalls ein induzierbarer Transkriptionsfaktor. SREBP reguliert die Expression der Gene, die an der Cholesterin-Biosynthese beteiligt sind, indem es an deren Sterolregulationselemente (SREs; Abschnitt 20.7B) bindet. In den folgenden Abschnitten behandeln wir zwei weitere Beispiele für Signalwege, die Transkriptionsfaktoren aktivieren. Der JAK-STAT-Weg gibt Cytokin-Signale weiter Die Protein-Wachstumsfaktoren, welche die Differenzierung, Proliferation und Aktivität zahlreicher Zelltypen - allen voran die der weißen Blutkörperchen - regulieren, sind die Cytokine. Das Signal bestimmter Cytokine, die an ihre entsprechenden extrazellulären Rezeptoren gebunden haben, wird innerhalb der Zelle weitergeleitet. Dies konnte James Darnell am Beispitel des JAK-STATWegs zeigen. Cytokinrezeptoren bilden Komplexe mit Proteinen der Janus-Kinase-(JAK-)Familie der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen (NRTKs). Diese haben ihren Namen, weil jeder ihrer vier aus jeweils ca. 1150 Resten bestehenden Vertreter zwei Tyrosinkinase-Domänen hat (Janus war der römische Gott der Türen und Tore mit zwei Gesichtern), obwohl nur die C-terminale Domäne funktionsfähig ist. STATS (signal transducers and activators of transcription; Überträger und Aktivatoren der Transkription) umfassen eine Familie von sieben Proteinen aus je etwa 800 Aminosäuren.

Sie sind die einzigen bekannten Transkriptionsfakto-

ren, deren Aktivität durch Tyr-Phosphorylierung reguliert wird und die SH2-Domänen haben.

Regulation der eukaryotischen Genexpression

1139

Extrazellulärraum

Plasma-

membran NER

Rn

2 . PB

Cytoplasma

ßı-Untereinheit des Cytokinrezeptors

Bß,-Untereinheit des Cytokinrezeptors

ATP

6

3

STAT

4 ET

Cytokin +

JAK +

Rezeptoren

Der JAK-STAT-Weg funktioniert wie in Abbildung 28.31 dargestellt: Die Bindung des Liganden verursacht eine Dimerisierung des Rezeptors (oder in manchen Fällen eine Tri-, Tetra- oder Hexamerisierung). Die beiden assoziierten JAKs des Cytokinrezeptors lagern sich dabei aneinander, worauf sie sich gegenseitig und dann ihre verknüpften Rezeptoren phosphorylieren. Dieser Vorgang ähnelt der Autophosphorylierung dimerisierter RTKs (Abschnitt 13.2A). STATs binden über ihre SH2-Domäne an die Phospho-Tyr-Gruppe auf ihrem entsprechenden aktivierten Rezeptor und werden dann an einem konservierten Tyr-Rest von der assoziierten JAK phosphoryliert. Nachdem sie sich vom Rezeptor gelöst haben, homo- oder heterodimerisieren die phosphorylierten STATs über die Wechselwirkung ihres PhosphoTyr-Rests mit der SH2-Domäne auf der gegenüberliegenden Untereinheit. Die STAT-Dimere werden dann zum Zellkern transloziert, wo die jetzt funktionsfähigen Transkriptionsfaktoren spezifisch an 9 bp DNA-Segmente mit der Konsensussequenz TTCCGGGAA binden. Dabei induzieren sie die Transkription ihrer assoziierten Gene. Wie viele andere Komponenten der Signaltransduktionswege wird auch das STAT-Signal durch Phosphatasen inaktiviert, sodass ein STAT normalerweise nur für einige wenige Minuten aktiv bleibt. Die von Christoph Müller bestimmte Röntgenstruktur von STAT, namens Stat3ß, ist in Abbildung 28.32 gezeigt.

Abb. 28.31 Der JAK-STAT-Weg für die intrazelluläre Weitergabe von Cytokinsignalen. Zu Einzelheiten siehe Text. [Nach Carpenter, L.R. Yancopoulos, G.D. und Stahl, N., Adv. Prot. Chem.

52, 109 (1999).]

1140

Regulation der Genexpression

Abb. 28.32 Röntgenstruktur des Stat3ß-Homodimers im Komplex mit einer DNA aus 17 bp, die seine 9 bp lange Zielsequenz enthält. Der Komplex ist entlang der Helixachse der DNA betrachtet, die als violettes Band gezeigt ist. Die verschiedenen Domänen des Proteins sind in verschiedenen Farben dargestellt. Die phosphorylierbaren Tyr-Reste sitzen in den SH2-Domänen (gelb), welche die Dimerisierung des Proteins vermitteln. Man beachte, wie das STAT-Dimer die

DNA zangenartig packt. [Mit freundlicher Genehmigung von Christoph Müller, European Molecular Biology Laboratory, Grenoble. PDBid 1BG1.]

Kernrezeptoren werden durch Hormone aktiviert

Die Kernrezeptor-Superfamilie, die von den Würmern bis zum Menschen bei allen höheren Tieren vorkommt, setzt sich aus über 150 Proteinen zusammen, die eine Vielzahl von Hormonen binden, einschließlich der Steroide (Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Östrogene und Androgene; Abschnitt 9.1E), Schilddrüsenhormone wie Thyroxin (Abb. 4.15), die den Stoffwechsel anregen, und Vitamin D (Abschnitt 9.1E). Sie alle sind unpolare Moleküle. Die Kernrezeptoren, von denen viele ganz bestimmte, sich jedoch überlappende Gensätze aktivieren, haben alle eine konservierte, modulare Struktur. Sie umfasst - vom NTerminus zum C-Terminus — eine schwach konservierte Transaktivierungsdomäne,

eine stark konservierte

DNA-bindende

Domäne,

eine verbindende

Ge-

lenkregion und eine ligandenbindende Domäne. Die DNA-bindende Domäne enthält jeweils acht Cys-Reste, die jeweils in Vierergruppen zwei Zn’'-Ionen tetraedrisch koordinieren. Viele Mitglieder der Kernrezeptor-Superfamilie erkennen spezifische DNA-Segmente, die sogenannten Hormon-Response-Elemente (HRESs). HREs weisen die Halbseiten-Konsensussequenzen 5’-AGAACA-3’ für Steroidrezeptoren und 5’-AGGTCA-3’ für andere Kernrezeptoren auf. Diese Sequenzen sind zu direkten Wiederholungen (directed repeats) (>n>), umgekehrten Sequenzwiederholungen (inverted repeats) (>n) angeordnet, wobei n einen 0 bis 8 bp großen Abstandshalter (gewöhnlich 1-5 bp) darstellt, dessen Länge ein weiteres, spezifisches Erkennungsmerkmal für einen Rezeptor darstellt. Steroidrezeptoren binden an ihre Hormon-Response-Elemente als Homodimere, wohingegen andere Kernrezeptoren als Homodimere, als Heterodimere und in einigen wenigen Fällen als Monomere aktiv sind. Die unpolaren Steroidhormone gelangen sehr schnell durch Zellmembranen ins Cytosol oder zum Zellkern, wo sie an ihre Rezeptoren binden (obwohl sie auch in manchen Fällen mit Zelloberflächenrezeptoren in alternativen Signalwegen wechselwirken können). In Abwesenheit ihrer zugehörigen Steroide sind diese Rezeptoren Teil eines großen Multiproteinkomplexes. Die Steroidbindung setzt diese Rezeptoren frei, worauf sie dimerisieren und, wenn sie im Cytoplasma vorkommen, in den Zellkern gelangen und dort an ihre HREs binden. Sie induzieren - oder reprimieren — damit die Transkription der zugehörigen Gene.

Paul Sigler und Keith Yamamoto bestimmten die Röntgenstruktur der aus 86 Resten bestehenden DNA-Bindungsdomäne des Glucocorticoidrezeptors (GR; dieser reguliert den Kohlenhydrat-, Protein- und Lipidstoffwechsel) der

Regulation der eukaryotischen Genexpression

1141

Ratte im Komplex mit DNA (Abb. 28.33). Diese DNA enthielt zwei ideale, 6 bp lange Glucocorticoid-Response-Element-(GRE)-Halbsequenzen, die als umgekehrte Wiederholungen angeordnet waren. Das Protein bildet ein symmetrisches Dimer, das Protein-Protein-Kontakte ausbildet, auch wenn es in Abwesenheit von DNA keine Neigung zur Dimerisierung zeigt (NMR-Messungen zeigen, dass die Kontaktregion in Lösung flexibel ist). Jede Proteinuntereinheit besteht aus zwei strukturell unterschiedlichen Modulen, deren Kern jeweils von einem Zn?*-Koordinationszentrum gebildet wird. Diese Module lagern sich eng aneinander und bilden eine kompakte, globuläre Faltung. Das C-terminale Modul liefert die gesamte Dimerisierungskontaktfläche und stellt auch mehrere Kontakte mit den Phosphatgruppen des DNA-Rückgrats her. Das N-terminale Modul (Transaktivierungsdomäne), das ebenfalls mit dem Phosphatrückgrat verankert ist, stellt über drei Seitenketten alle sequenzspezifischen Wechselwirkungen mit dem GRE her. Diese drei Seitenketten hängen an der N-terminalen a-Helix, der Erkennungshelix, die in die große Furche des GRE eingeschoben ist. Schlussbetrachtung Wie wir gesehen haben, ist die Initiation der eukaryotischen Transkription ein

erstaunlich komplexer Prozess, der große Abschnitte der DNA einbezieht sowie die synergistische Teilnahme zahlreicher, aus vielen Untereinheiten bestehender Komplexe erfordert. Diese umfassen mehrere Hundert, oft locker oder sequentiell interagierende Polypeptide (z.B. Histone, den PIC, Mediatoren, Transkriptionsfaktoren, Architekturelemente des Chromatins, Coaktivatoren, Corepressoren, Chromatin umgestaltende Komplexe und histonmodifizierende Enzyme). Viele dieser Faktoren sind ausgiebig charakterisiert. Trotzdem sind wir weit davon entfernt, mehr als nur rudimentär zu verstehen, wie diese verschiedenen Komponenten in vivo interagieren, um nur die Gene zu transkribieren, deren Genprodukte die Zelle unter den jeweiligen Umständen in der richtigen Menge und zum geeigneten Zeitpunkt braucht. Sicher ist jedoch, dass die großen Unterschiede in der Morphologie und dem Verhalten von Organismen wie Nematoden, Fruchtfliegen und Menschen nicht durch eine größere Zahl von Genen per se entstehen, denn sie alle besitzen eine vergleichbare Anzahl an Genen. Diese Unterschiede entstehen - zumindest teilweise - durch eine Zunahme der Komplexität der Transkriptionsregulation (Tab. 28.1).

C. _ Posttranskriptionale Kontrollmechanismen Obwohl sich die Regulation der Genexpression bei Eukaryoten hauptsächlich auf der Ebene der Transkription abspielt, gibt es zusätzliche Kontrollmechanismen, nachdem ein RNA-Transkript synthetisiert wurde. In diesem Abschnitt betrachten wir einige dieser Mechanismen,

einschließlich des Abbaus der mRNA,

der

RNA-Interferenz und der Kontrolle der Translationsinitiation. Wir haben bereits das alternative mRNA-Spleifßen (Abschnitt 26.3A) als einen posttranskriptionalen Mechanismus für die Regulierung der Genexpression durch die Kombination verschiedener Exons erörtert. mRNAs werden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut

Die anhand der Halbwertszeit gemessene schen

Zellen schwankt

zwischen

wenigen

Stabilität der mRNA Minuten

bei eukaryoti-

und mehreren

Stunden

oder Tagen. Die mRNA-Moleküle scheinen selbst Elemente zu enthalten, die ihre Abbaugeschwindigkeit vorgeben. Zu diesen Elementen gehören der Poly(A)Schwanz, die 5'-Kappe und Sequenzen, die innerhalb der codierenden Region liegen. Ein Hauptweg für den mRNA-Abbau beginnt mit der fortschreitenden Beseitigung ihres Poly(A)-Schwanzes — einem Vorgang, der von Desadenylasen katalysiert wird, die anscheinend im gesamten Cytosol lokalisiert sind. Wenn der ver-

Abb. 28.33 Röntgenstruktur der dimeren DNA-bindenden Domäne des Glucocorticoidrezeptors im Komplex mit DNA. Die 18 bp lange DNA, die einen einzelnen

Nucleotidüberhang an jedem ihrer 5’-Enden hat, enthält zwei symmetrische, 6 bp lange Glucocorticoid-Response-Element-Halbseiten (magenta), die durch einen Abstandshalter aus 4 bp getrennt sind (türkis). Die Proteinuntereinheiten sind als grüne und goldene Bänder gezeichnet und enthalten jeweils zwei Zinkfinger (Abschnitt 24.4C), in denen jedes Zn?*-Ion (silberne Kugeln) von vier CysSeitenketten tetraedrisch koordiniert wird. Man beachte, wie die beiden N-terminalen Helices des Glucocorticoidrezeptors in die aufeinanderfolgenden großen Furchen eingeschoben werden, und zwar auf eine Weise, die an die Erkennungshelices der prokaryotischen Helix-TurnHelix-(HTH-) Domänen erinnert (Abschnitt 24.4B). [Nach einer Röntgenstruktur von Paul Sigler, Yale University und Keith Yamamoto, University of California at San Francisco. PDBid IGLU.] 6% siehe Interactive Exercises.

1142

Regulation der Genexpression

bleibende Poly(A)-Schwanz weniger als etwa 10 Nucleotide umfasst und somit nicht mehr mit dem Poly(A)-Bindeprotein wechselwirken kann (Abschnitt 26.3A), wird die mRNA zum Substrat für ein Enzym, das die m’GDPKappe hydrolytisch von der mRNA abtrennt (decapping enzyme). Bei der Hefe und anderen Zellen scheinen ein solches kappenabbauendes Enzym, 5’ 3’.Exonucleasen und andere Hilfsproteine einen Komplex mit der Bezeichnung Prozessierungskörper oder P-Körper zu bilden. Dieser P-Körper kann die mRNA abbauen oder sie in inaktiver Form speichern. Wie stimuliert der Abbau des 3’-Endes der mRNA den Kappenabbau am 5'Ende? Wie wir gesehen haben (Abschnitt 27.4A), interagiert der Translationsinitiationsfaktor eIF4G in vivo sowohl mit dem Poly(A)-Bindungsprotein als auch dem Kappen-Bindungsprotein. Dabei bildet die mRNA einen Ring aus, sodass die Vorgänge am 3’-Ende mit den Vorgängen am 5’-Ende gekoppelt werden kön-

nen. Proteine, die an AU-reiche Sequenzen in der nicht translatierten 3’-Region der mRNA binden, scheinen ebenfalls die Abbaugeschwindigkeit der mRNA zu erhöhen oder zu senken, obgleich ihre genaue Arbeitsweise nicht verstanden ist. In manchen Fällen spielen die RNA-Sekundärstruktur und die RNA-Bindungsproteine - die für eine Modifikation durch zelluläre Signalwege empfänglich sind — bei der Regulierung der mRNA-Stabilität eine Rolle. Auch mRNAs,

die

wegen vorhandener vorzeitiger Stoppcodons nicht translatiert werden können, stellen spezifische Targets für den Abbau dar (Exkurs 28.3). RNA-Interferenz ist eine Art posttransskriptionaler Genstilllegung

In den letzten Jahren wurde zunehmend klarer, dass nicht codierende RNAs wichtige Funktionen bei der Steuerung der Genexpression ausüben können. Richard Jorgensen unternahm einen Versuch, der erste Hinweise zu diesem Phänomen erbrachte. Er versuchte auf gentechnischem Wege farbintensivere violette Petunien zu kreieren, indem er in Pflanzenzellen zusätzliche Kopien des Genes einbrachte, das für die Synthese des violetten Pigments verantwortlich ist. Völlig unerwartet hatten die erzeugten transgenen Pflanzen bunt gescheckte oder völlig weiße Blüten. Offensichtlich schalteten sich die Gene für die violette Farbe gegenseitig aus. Das Ergebnis schrieb man zuerst dem schon länger bekannten Phänomen zu, dass Antisense-RNA (RNA, die komplementär zu einem Teil einer mRNA ist) die Translation der entsprechenden mRNA verhindert, weil das Ribosom keine doppelsträngige RNA translatieren kann. Injektion von Sense-RNA (RNA, mit derselben Sequenz wie die mRNA) in Versuchsorganismen wie z.B. dem Nematoden C. elegans blockierte ebenfalls die Proteinproduktion. Da die hinzugefügte RNA auf irgendeine Weise die Genexpression beeinträchtigte, nannte man dieses Phänomen RNA-Interferenz (RNAi; engl.: to interfere, beeinträchtigen). Man weiß inzwischen, dass RNAi bei allen Eukaryoten vorkommt. Weitere Experimente von Andrew Fire und Craig Mello zeigten, dass doppelsträngige RNA sogar noch wirksamer die Genexpression verhindert als die entsprechenden Einzelstränge allein. In der Tat kann RNAi durch nur einige wenige Moleküle doppelsträngiger RNA ausgelöst werden, was zeigt, dass RNAi eher ein katalytisches als ein stöchiometrisches Phänomen ist. RNAi ist kein bloßes Artefakt der Gentechnik. In vielen Zellen regulieren natürlich vorkommende, kleine RNA-Moleküle namens siRNAs (short interfering RNAs) oder miRNAs (Mikro-RNAs), je nach Ursprung, die Genexpression herunter, indem sie an komplementäre mRNA-Moleküle binden. Bei Säugern hat man Tausende von miRNAs identifiziert. Diese sind zwischen 18 und 25 Nucleotide lang. Allerdings hat man eben erst begonnen, ihre mRNA-Ziele zu charakterisieren. Mehrere Nucleasen sind an RNAi beteiligt

Die Arbeiten mit exogener, doppelsträngiger RNA bei C. elegans und Drosophila haben zur Aufklärung des folgenden Wegs für RNAi geführt (Abb. 28.34):

Regulation der eukaryotischen Genexpression

1143

Nonsense-vermittelter RNA-Abbau Fehler bei der DNA-Replikation, der Transkription oder beim mRNA-Spleißen können dazu führen, dass durch Substitution eines Nucleotids oder durch Verschieben des Leserasters ein Stoppcodon entsteht. „Vorzeitige“ Stoppcodons, welche die codierende Sequenz terminieren, sind für etwa ein Drittel der genetischen Krankheiten beim Menschen verantwortlich. Interessanterweise bilden eukaryotische mRNAs mit vorzeitigen Stoppcodons selten das entsprechende verkürzte Polypeptid, weil die mRNA bald nach ihrer Synthese durch den sogenannten NMD (nonsense-mediated decay; ein durch fehlerhafte Transkripte ausgelöster RNA-Abbau) abgebaut wird. Wie unterscheiden Zellen ein vorzeitiges Stoppcodon von einem normalen Stoppcodon am Ende einer codierenden Sequenz? Experimente legen nahe, dass das Signal für NMD vom RNA-Spleißen abhängt. Nach der Beseitigung der Introns bleiben die Exon-Exon-Grenzen innerhalb der mRNA durch einen Proteinkomplex, den Exon-junction pro-

tein complex (EJC), der Spleifßfaktoren und andere Komponenten enthält, markiert. Dies ist sogar dann noch der Fall,

nachdem die mRNA zur Translation ins Cytosol gelangt ist. Ein E)JC, der auf ein Stoppcodon folgt, markiert offenbar das Transkript für die Zerstörung. Weitere Qualitätskontrollmechanismen hängen ebenfalls von der Translation ab; mRNAs, denen Stoppcodons gänzlich fehlen, werden durch non-stop decay abgebaut. Wenn das Ribosom

das 3’-Ende der defekten

mRNA

erreicht, bindet

ein Protein namens Ski7p — das strukturell dem Freisetzungsfaktor eRF3 ähnelt - an die A-Stelle und rekrutiert einen Nuclease-Komplex. Dieser Exosom genannte Komplex baut die mRNA ab. Bei der Hefe wird auf MRNAs, die ein Hindernis wie z.B. eine stabile Stammschleife enthalten, welche die

Translation anhält, der NGD-Mechanismus (no-go decay) angewandt. In diesem Fall wird die mRNA durch eine Endonuclease abgebaut, die mit dem pausierenden Ribosom assoziiert ist.

dr Eee 326 2855 auslösende dsRNA

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Abb. 28.34 Mechanismus der RNA-Interferenz. Zu Einzelheiten siehe Text. Für die Entwindung

Tores ii Taindehe

AT Tehelehet Are Tobi"

geschnittene mRNA

doppelsträngiger RNA durch die RISC-assoziierte Helicase ist ATP erforderlich. Je nach Spezies kann die mRNA nicht vollständig abgebaut werden.

1144

Regulation der Genexpression

1. Die auslösende, doppelsträngige RNA wird, wie Phillip Zamore feststellte, in Bruchstücke von rund 21 bis 23 Nucleotide geschnitten (diese heißen dann siRNAs), deren Stränge jeweils ein 5’-Phosphat und einen 2-nt-Überhang an ihren 3'-Enden haben. Die Spaltungsreaktion wird von einer RNase namens Dicer katalysiert. Untersuchungen zum Modellbau, die auf homologen RNasen basierten, lassen vermuten, dass Dicer als Homodimer arbeitet. Seine aktiven Zentren haben einen Abstand voneinander, der rund 22 Nucleotiden einer RNA-Helix entspricht. 2. Ein Strang der siRNA wird Bestandteil eines 250 bis 500 kD Enzymkomplexes, des sogenannten RISC (RNA-induced silencing complex). RISC besteht aus mindestens vier Proteinkomponenten, wovon eine eine ATP-abhängige RNA-Helicase ist. Diese ist wahrscheinlich für die Bildung einer einzelsträngigen siRNA verantwortlich. Bei manchen Spezies, aber offensichtlich nicht beim Menschen, wird das ursprüngliche siRNA-Signal durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase verstärkt. 3. Der Antisense-Strang der siRNA lenkt RISC an eine mRNA mit der komplementären Sequenz.

4. Die Endonuclease-Komponente des RISC spaltet die mRNA, wahrscheinlich auf der gegenüberliegenden Seite der gebundenen siRNA. Die geschnittene mRNA wird dann durch zelluläre Nucleasen weiter abgebaut, wodurch naturgemäß deren Translation unterbunden wird.

Obwohl die molekulare Maschinerie, die an RNAi beteiligt ist, von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert ist, gibt es dennoch reichliche Variationen — sogar innerhalb eines einzelnen Organismus. So können beispielsweise verschiedene Dicer-Enzyme verschieden lange siRNAs erzeugen, die unterschiedliche Gen-Stillegungsaktivitäten haben. Die genaue Länge der siRNA oder das Ausmaß der Komplementarität zur mRNA kann entscheidend dafür sein, ob eine entsprechende mRNA vollständig abgebaut oder nur in einen nicht translatierbaren Zustand überführt wird. Die Einfachheit, mit der RNAi durch exogene RNAs induziert werden kann, lässt vermuten, dass sich dieser Mechanismus als eine Abwehr gegen Viren entwickelt hat. Bei vielen Eukaryoten sind RNA-Viren die Hauptquelle für doppelsträngige RNA. Viele dieser Viren codieren ihre eigene RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ihr einzelsträngiges Genom in doppelsträngige RNA umzuschreiben. In der Tat enthalten viele Pflanzenviren Gene, die verschiedene Schritte der RNAi unterdrücken und die deshalb für die Pathogenese unbedingt nötig sind. RNAi hat zahlreiche Anwendungen

RNAi wurde die Methode der Wahl, um Gene bei Pflanzen und Wirbellosen spezifisch „auszuschalten“ (knocking out). Bei dem Versuch, jedem Gen eine Funktion zuzuordnen, wurde z.B. bei C. elegans RNAi dazu verwendet, um systematisch über 16.000 seiner 19.000 Protein-codierenden Gene zu inaktivieren. C. elegans lässt sich mit dem Ansatz der RNAi besonders leicht untersuchen,

da dieser Wurm E. coli-Zellen frisst. Es ist deshalb relativ einfach, auf gentechnischem Wege Bakterienzellen zu konstruieren, die doppelsträngige RNA produzieren, die dann der Wurm quasi mit der Nahrung aufnimmt. Eine Einschränkung der RNAi-Methode ist, dass nur die direkte Geninaktivierung - nicht die Genaktivierung — untersucht werden kann. Bei Säugetieren ist es komplizierter, in den RNAi-Weg einzugreifen, hauptsächlich wegen der Schwierigkeit, doppelsträngige RNA in Zellen zu befördern und mehr als nur eine vorübergehende Genstilllegung auszulösen. Um die Sache noch schwieriger zu machen, besitzen Säugerzellen zusätzliche Wege, mit fremder RNA umzugehen. Hier erfolgt der Abbau der RNA unspezifisch, was den Stillstand der gesamtenTranslation zur Folge haben kann (diese Reaktionen helfen wahrscheinlich ebenfalls, die Infektion durch RNA-Viren zu verhindern). Gleichwohl haben Experimente gezeigt, dass es - zumindest bei Mäu-

Regulation der eukaryotischen Genexpression

sen — möglich ist, RNAi zum Blockieren einer Entzündungsreaktion in der Leber durch Hepatitisviren zu verwenden und bei kultivierten menschlichen . Zellen die HIV-Replikation zu unterbinden. Eine zukünftige Herausforderung wird es sein, Protokolle zu entwickeln, mit deren Hilfe Gene spezifischer und länger stillgelegt werden können. Damit könnte es möglich werden, Virusinfektionen zu verhindern oder die Auswirkungen von pathogenen, mutierten Genen zu blockieren. mRNA-Translation kann gesteuert werden

Die Beeinflussung der Geschwindigkeit der mRNA-Synthese und deren Abbaus stellt in manchen Zellen keine ausreichende Kontrollmöglichkeit dar. Die frühe Embryonalentwicklung bei Seeigeln, Insekten und Fröschen beispielsweise hängt von der raschen Translation der mRNA ab, die in der Eizelle deponiert wurde. Die mRNA wird in inaktiver Form in Verbindung mit Proteinen gespeichert, steht aber bei der Befruchtung für die Translation zur Verfügung. Dadurch kann die Embryogenese unverzüglich beginnen, ohne auf mRNAs warten zu müssen, die von väterlichen Genen codiert werden. Auch die Globinsynthese in Reticulocyten (unreifen roten Blutkörperchen) schreitet rasch voran, allerdings nur, wenn Häm verfügbar ist. Die Hemmung der Globinsynthese findet auf der Ebene der Translationsinitiation statt. In Abwesenheit von Häm sammeln die Reticulocyten ein Protein namens hämregulierter Inhibitor (HRI) an. HRI ist eine Kinase und phosphoryliert einen spezifischen Ser-Rest, Ser51, auf der a-Untereinheit von eIF2 (dem Initiationsfaktor, der GTP und Met-tRNA}“ zum Ribosom liefert; Abschnitt 27.4A). Phosphorylierter eIF2 nimmt an der Initiation der Translation teil, und zwar auf ganz ähnliche Weise wie der nicht phosphorylierte eIF2, wird aber nicht normal regeneriert. Bei Beendigung des Initiationsprozesses tauscht der nicht modifizierte eIF2 sein gebundenes GDP gegen GTP in einer Reaktion aus, die von einem anderen Initiationsfaktor vermittelt wird, dem eIF2B: GDP

eIF-2B

«eGTP

(ZPB

elF-2B » GDP

eIF-2 « GDP ee

eIF-2 « GTP

Der phosphorylierte eIF2 bildet einen viel engeren Komplex mit eIF2B als der nicht phosphorylierte eIF2. Dies kapselt eIF2B ab (Abb. 28.35), das in geringedurch Häm

gehemmt &

HRI

ATP

ADP

elF-2B

eIF2B P;

H,0

eIF2-Phosphatase

Abb. 28.35 Modell für die hämgesteuerte Proteinsynthese in Reticulocyten.

1145

1146

Regulation der Genexpression

rem Umfang vorhanden ist als eIF2. Dadurch wird die Regeneration des für die Translation erforderlichen eIF2-GTP verhindert. In Gegenwart von Häm sind die Häm-Bindungsstellen im HRI besetzt, was die Kinase inaktiviert. Die bereits phosphorylierten eIF2-Moleküle werden von der eIF2-Phosphatase reaktiviert, was von Häm unbeeinflusst ist. Der Reticulo-

cyt koordiniert auf diese Weise seine Globin- und Hämsynthese.

D. _ Antikörpervielfalt entsteht durch somatische Rekombination und Hypermutation Wie im Abschnitt 7.3B beschrieben, kann ein Mensch eine außerordentliche An-

zahl verschiedener Antikörpermoleküle aus einer begrenzten Anzahl von Immunglobulin-Genabschnitten erzeugen. Diese Eigenschaft wird durch einen ungewöhnlichen Mutationsprozess sowie durch somatische Rekombination in Zellen des Immunsystems erreicht. Die homologe Rekombination (Abschnitt 25.6A) ist eine grundlegende Eigenschaft der Reproduktion bei Vielzellern und kommt nur in Keimbahnzellen vor. Der Mechanismus, mithilfe dessen ein B-Lymphocyt die Gensegmente der leichten und schweren Kette zur Expression „auswählt“, ist nachfolgend beschrieben. Ähnliche Ereignisse spielen sich bei T-Lymphocyten ab, um die große Anzahl einzigartiger T-Zell-Rezeptoren zu generieren. Die Gene für die Immunglobulinketten werden aus mehreren Genabschnitten zusammengesetzt

Abb. 28.36

Organisation und Neuordnung der menschlichen x-Ketten-Genfamilie. In der Keimbahn besteht die «-Ketten-Genfamilie aus rund 40 hintereinanderliegenden Paaren von L,- und V,-Gensegmenten, auf die fünf JuSegmente und ein C,-Segment folgen. (1) Während der Lymphocytendifferenzierung wird eine einzelne L,-V,-Einheit mit einer J,-Einheit durch somatische Rekombination verbunden. In den Nachkommen der B-Zelle wird das neu geordnete Gen transkribiert (2) und gespleißt (3), sodass die zuvor ausgewählten Exons L,, V, und J; mit dem Exon C, verknüpft werden.

Die x-Kette gehört zu einem der beiden Typen von leichten Immunglobulinketten und wird von vier Exons codiert (Abb. 28.36): 1. Ein Signal- oder L,-Segment (leader segment) codiert ein 17-20 Aminosäuren langes, hydrophobes Signalpeptid. Dieses Peptid lenkt neu synthetisierte x-Ketten zum endoplasmatischen Reticulum und wird dann entfernt

(Abschnitt 9.4D).

2. Das V,-Segment codiert in der x-Kette die ersten 95 Reste der variablen Region, die insgesamt aus 108 Aminosäuren besteht. 3. Das J,-Segment (joining segment, vom engl.: to join, verbinden) codiert die übrigen 13 Reste der variablen Region. 4. Das C,-Segment codiert die konstante Region der x-Kette.

Diese Exons sind im menschlichen Embryonalgewebe (das noch keine Antikörper produziert) in Clustern angeordnet. Die Genfamilie der x-Ketten ist beim Menschen aus rund 40 funktionalen L,- und V,-Segmenten aufgebaut, die durch Introns getrennt sind, wobei die L,-V,-Einheiten durch Zwischenstücke

ke

1

|V/Rekombinator

- Poly(a)

Regulation der eukaryotischen Genexpression

von etwa 7 kb getrennt sind. Auf diese Reihe von Exonpaaren folgen sehr viel weiter stromabwärts fünf J,-Segmente in Abständen von ca. 300 bp, eine Zwi„schensequenz von 2,4 kb und ein einzelnes C,-Segment. Die Synthese der mRNA für die x-Kette ist ein komplexer Vorgang, an dem sowohl somatische Rekombination als auch selektives Genspleißen über mehtere Zellgenerationen beteiligt sind (Abschnitt 26.3A). Der erste Schritt dieser Rekombination spielt sich im Vorläufer des B-Zellklons ab: Durch intrachromosomale Rekombination wird eine L,-V,-Einheit an ein J,-Segment angefügt und die dazwischenliegende Sequenz deletiert (Abb. 28.36). In späteren Zellgenerationen wird das gesamte modifizierte Gen transkribiert und das resultierende Transkript so gespleißt, dass die L,-V,-J,-Einheit mit dem C,-Segment verbun-

2 »-GTTGATA

wird auf ähnliche Weise von einer Genfamilie codiert, welche die L- V;-, J;-

und CG,-Segmente enthält. Deren Rekombination ergibt gleichermaßen eine große Anzahl möglicher Polypeptide. Die Gene für die schwere Kette werden auf recht ähnliche Weise zusammengebaut wie die der leichten Kette. Allerdings wird zwischen die V;;- und Jı-Segmente noch ein zusätzliches Segment aus rund 13 bp eingebaut, das Diversitätsoder D-Segment. Die menschliche Gen-Cluster-Familie für die schwere Kette besteht aus rund 65 verschiedenen funktionellen L}5-V;;-Einheiten, ca. 27 D-Segmenten, 6 Ju-Segmenten und 8 C,-Segmenten (Abb. 28.38). Die Vy-, D- und Ju-Segmente werden in einer bestimmten Reihenfolge verbunden (D wird mit Keimbahn-DNA für schwere Kette

K

CAGCTTG---

EEEBAGCTTG--Val

Ser

Leu

BEL EEGCTTG--Val ZEIT

den wird. In diesem Schritt werden auch die Segmente L,- und V, zusammengespleißt, sodass die entstehende mRNA alle vier Elemente eines x-Kettengens

jeweils einmal enthält. Die Verknüpfung eines von 40 funktionellen V,-Segmenten mit einem von 5 JSegmenten kann nur 40 X 5 = 200 verschiedene x-Ketten hervorbringen, weit weniger als man tatsächlich beobachtet. Die Untersuchung vieler Verbindungsereignisse, die die gleichen V,- und J,-Segmente beinhalteten, zeigten, dass die V/J-Rekombinationsstelle nicht exakt definiert ist: Die beiden Gensegmente können sich an verschiedenen Punkten verbinden (Abb. 28.37). Die Aminosäuren, die von den Codons in der Nachbarschaft der V/J-Anschlussstelle spezifiziert werden sie entspricht der dritten hypervariablen Schleife (Abb. 7.40) - hängen folglich davon ab, welche Nucleotide durch das V,-Segment der Keimbahn und welche von dem J.Segment der Keimbahn geliefert werden. Wenn man annimmt, dass die Verbindungsflexibilität die mögliche Vielfalt der «-Kette um das 10fache erhöht, dann steigt die zu erwartende Zahl möglicher unterschiedlicher x-Ketten auf etwa 40 x 5 X 10 = 2000. Die A-Kette gehört zum zweiten Typ der leichten Immunglobulinketten und

J

1147

Val

Gly

Leu

ERACTTG--Asp

Leu

SEI TGEBAETTG--Val Abb. 28.37

Asp

Leu

Variation der V,/J,-Verbindung.

Die Crossover-Stelle, an der die somatische

Rekombination zwischen V,- und J,-Sequenzen stattfindet, kann sich um einige Nucleotide verschieben, sodass sich Variationen der Nucleotid-

sequenz im aktiven x-Gen ergeben. In diesem Beispiel der Verbindungsflexibilität kann die zweite Aminosäure Ser, Gly oder Asp sein.

Abb. 28.38

Organisation und Neuordnung der Genfamilien für die schweren Ketten beim Menschen. Diese Genfamilie besteht aus rund 65 hintereinander angeordneten Paaren von L,- und V}-Gensegmenten, gefolgt von ca. 27 D-Segmenten, 6 J4-Segmenten und 8 C,,-Segmenten (je eines

für jede Klasse oder Unterklasse der schweren Ketten; Tabelle 7.2). Bei der Lymphocytendifferenzierung wird eine L}-V}-Untereinheit mit einem Dund einem Ju-Segment verbunden. Dadurch liegen

beiderseits des D-Segments kurze Abschnitte mit Zufallssequenzen, die man

N-Regionen nennt.

In der B-Zelle und ihren Nachkommen wird die Einheit L4-Vy-N-D-N-/y durch Transkription

und Spleißen mit einem der acht C,-Segmente verbunden. C-Gene

1148

Regulation der Genexpression

Ju verbunden, bevor Vj; mit DJ} verknüpft wird) und die Verbindungsstellen sind der gleichen Verbindungsflexibilität unterworfen wie die V/J-Stellen der leichten Kette. Somit beträgt die Anzahl der möglichen verschiedenen schweren

Ketten etwa 65 X 27x 6X 8 X 10° = 8,4 X 10°.

Somatische Rekombination Stark konservierte Sequenzen, welche die V-, D- und J-Gensegmente flankieren,

fungieren als Rekombinationssignalsequenzen (RSS; Abb. 28.390). Jede RSS besteht aus einem Palindromheptamer und einem AT-reichen Nonamer, die entweder durch 12 bp (entspricht etwa einer Umdrehung der DNA-Helix) oder 23 bp (entspricht ca. 2 Helixumdrehungen) voneinander getrennt sind. Die Rekombinationsmaschinerie verbindet ein Segment mit einer sogenannten 12-RSS mit einem anderen Segment mit einer 23-RSS. Weil jedes V,-Gensegment eine 12-RSS und jedes J-Segment eine 23-RSS hat, kann die somatische Rekombination nicht zwei V,- oder zwei J‚-Segmente verbinden. Entsprechend ist in den Gensegmenten der schweren Kette die Verteilung der 12-RSS- und der 23-

Abb. 28.39 Rekombinationssignalsequenzen. (a) Die RSS-Elemente bestehen aus konservierten Sequenzen von 7 bp und 9 bp, die durch ein 23 bp oder 12 bp langes Zwischenstück getrennt sind (weiße und schwarze Pfeile). (b) Lage der 12-RSS(schwarz) und 23-RSS- (weiß) Elemente im Verhältnis zu den Gensegmenten der leichten und schweren

Kette. Die Rekombination, durch die

Pfeile mit zwei Spitzen wiedergegeben, verbindet immer ein Gensegment mit einer 12-RSS mit einem Gensegment mit einer 23-RSS; dabei wird

sichergestellt, dass die V,/J. und V1/D/Ju-Gensequenzen korrekt zusammengesetzt werden. (a)

(b) DNA für «-Kette

RSS-Elemente derart, dass sich V;; mit D,; und D,, mit Ju verbinden müssen, was eine Vj/Ju-Verknüpfung ausschließt (Abb. 28.395). Die Rekombination erfordert Enzyme, die nur in sich entwickelnden Lymphocyten synthetisiert werden, sowie allgegenwärtige DNA-Reparaturproteine. Alle V(D)J-Verbindungsreaktionen werden von einem evolutionär konservierten V(D)J-Rekombinasesystem katalysiert. David Baltimore hat in der Tat zwei Proteine entdeckt, RAG1 und RAG2 (RAG steht für rekombinationsaktivierende Gene), die zusammenarbeiten, um die RSS-Elemente von zwei verschiedenen Gensegmenten zu erkennen, sie auszurichten und die DNA-Spaltung zu katalysieren. Dieser Vorgang wird durch die HMG-Proteine HMG1 und HMG2 unterstützt, welche die DNA zu biegen scheinen. Unter Laborbedingungen können RAG1 und RAG2 die Transposition katalysieren, d.h. die inter- oder intramolekulare Umplatzierung eines DNA-Segments (Abschnitt 25.6C). Dies steht im Einklang mit der Hypothese, dass’das RAG-Protein von einem Transposon stammt, das in Wirbeltieren vor etwa 450 Millionen Jahren auftauchte. Während der Rekombination werden die beiden RSS-Elemente sauber ausgeschnitten, aber ihre benachbarten codierenden Sequenzen werden unter Umständen durch Nucleasen gestutzt und ungleich verknüpft, was zur Verbindungsflexibilität beiträgt (Abb. 28.37). Die Schneide- und Verbindungsreaktionen sind nicht auf Iymphocyten beschränkt, sondern nutzen offensichtlich die Vielzahl von DNA-Reparaturenzymen, die in allen Zellen tätig sind (Abschnitt 25.5).

|

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

Zusätzlich werden einige wenige Nucleotide an den Verbindungsstellen der Rekombination hinzugefügt, entweder als Folge des DNA-Reparaturprozesses oder, im Fall der Gene der schweren Kette, durch das für Lymphocyten spezifische Enzym terminale Desoxynucleotidyltransferase. Diese DNA-Polymerase ist insofern ungewöhnlich, als sie keine Matrize benötigt. Sie kann bis zu 15 Nucleotide an V;/Dy- und Dy/Ju-Verbindungsstellen anheften, was natürlich das Potential für die Sequenzdiversität in der codierten variablen Region der Immunglobulinkette enorm steigert.

_ Somatische Hypermutation _ Trotz der enormen Antikörpervielfalt, die durch somatische Rekombination erzeugt wird, unterliegen Immunglobuline sogar noch einer weiteren Variation. Diese kommt zustande, wenn sich die B-Zellen teilen. Die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten sind vielfältiger als man von ihren ursprünglichen Nucleotidsequenzen der Keimbahn erwarten würde. Tatsächlich mutieren diese Regionen mit einer Rate von bis zu 10° Basenänderungen pro Nucleotid und pro Zellgeneration — Raten, die mindestens millionenfach höher sind als die Raten der spontanen Mutationen bei anderen

1149

Verständnisfragen zu Abschnitt 3 ir Inwiefern ist die Umgestaltung

des Chromatins notwendig, um eine effiziente Genexpression

zu gewährleisten? 2. Wie beeinflussen Modifikationen an Histonen die Struktur der Nucleosomen und die Funktion von Transkriptionsfaktoren? 3. Fassen Sie die Rolle der DNAMethylierung für genetische Prägung und epigenetische Vererbung zusammen.

4. Warum werden für die eukaryotische Genexpression

Genen. B-Zellen und/oder ihre Vorläufer besitzen offensichtlich Enzyme, welche

neben den sechs allgemeinen

die somatische Hypermutation von Immunglobulingensegmenten vermitteln. Die Mutationen, bei denen es sich zumeist um Nucleotidsubstitutionen handelt,

Transkriptionsfaktoren weitere Proteine benötigt?

kommen in den gesamten V/J- und V/D/J-Regionen voı, sind aber auf die Se-

5. Wieso ist der Abstand

quenzen konzentriert, die den drei hypervariablen Schleifen jeder Kette entsprechen. DNA-Sequenzen in anderen Genen scheinen nicht betroffen zu sein. Somatische Hypermutation wirkt offenbar nach der Stimulierung durch ein Antigen über viele Zellgenerationen. Weil antikörperbildende B-Zellen mit

zwischen Enhancern und . Promotoren variabel? 6. Beschreiben Sie den Prozess der RNA-Interferenz. 7. Wie wird die Vielfalt der Antikörper erzeugt? Nennen Sie alle daran beteiligten

hoher Affinität für ihr Antigen schneller proliferieren als B-Zellen, die schwach

bindende Antikörper bilden, wird das Antikörperreservoir mit der Zeit immer besser auf ein bestimmtes Antigen zugeschnitten. Die sich aus der somatischen Rekombination mit ihrer Verbindungsflexibilität und aus der Hypermutation ergebende Vielfalt gestattet dabei dem Immunsystem eines Menschen - in einer Art Darwinschen Kampf - den schnellen Mutationsraten pathogener Mikroorganismen gerecht zu werden.

4

Enzymaktivitäten, die nur in

Lymphocyten vorkommen.

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

Eine Zelle muss nicht nur entscheiden, welche Gene von den Tausenden im Genom vorhandenen sie exprimiert, sondern auch wann dies geschehen soll. So kann eine Zelle ein bestimmtes Entwicklungsprogramm ausführen oder wirksam auf sich ändernde Bedingungen reagieren. Die Ereignisse des eukaryotischen Zellcyclus, zu denen die normale und anomale Zellreproduktion sowie der Zelltod gehören, zeigen exemplarisch, wie bestimmte Genprodukte die Zellaktivitäten zu verschiedenen Zeiten regulieren. Mitose

Vorbereitung auf die

A.

Der Zellcyclus ist streng reglementiert

Der Zellcyclus, also die allgemeine Abfolge von Ereignissen, die im Leben aller eukaryotischen Zellen vorkommt, wird in vier Phasen eingeteilt (Abb. 28.40): 1. Mitose und Zellteilung finden in der relativ kurzen M-Phase (M steht für Mitose) statt. 2. Darauf folgt die G,-Phase (G steht für engl.: gap, Unterbrechung), die den größten Zeitraum im Zellcyclus einnimmt. zu 3. Die G,-Phase geht in die S-Phase über (S für Synthese). Im Gegensatz während Zelleyclus, im Phase einzige die sie ist en den Vorgängen bei Prokaryot der DNA synthetisiert wird.

er

DNAReplikation

(6-8 h)

und Zellteilung

(in)

Entscheidung zur DNAReplikation

(ca. 10 DSG Ruhephase (unterschiedlich)

Abb. 28.40 Der eukaryotische Zellcyclus. Anstatt den Zellcyclus weiter zu durchlaufen, können Zellen in die Ruhephase (G,) eintreten.

1150

Regulation der Genexpression

4. In der nun relativ kurzen G,-Phase bereitet sich die nunmehr tetraploide Zelle auf die Mitose vor. Dann tritt sie erneut in die M-Phase ein, womit eine neue Runde des Zellcyclus beginnt. Während der Zellcyclus bei Zellen in Kultur normalerweise zwischen 16 und 24 h dauert, kann er bei Vielzellern je nach Zelltyp zwischen 8 h und mehr als 100 Tage in Anspruch nehmen. Am meisten schwankt die Zeitdauer der G,-Phase. Zudem teilen sich viele ausdifferenzierte Zellen, wie Nerven- oder Muskelzellen, überhaupt nicht mehr. Sie befinden sich in einem Ruhezustand, den man als G,-Phase bezeichnet.

Das Durchschreiten des Zellcyclus wird von äußeren und inneren Signalen kontrolliert. Zusätzlich weist der Zellcyclus eine Reihe von Kontrollpunkten auf, die seinen Fortgang und den Zustand der Zelle überwachen. An diesen Kontrollpunkten kann der Zellcyclus angehalten werden, falls bestimmte Bedingungen nicht erfüllt sind. G, hat beispielsweise einen Kontrollpunkt, der den Beginn der M-Phase solange unterdrückt, bis die gesamte DNA der Zelle repliziert ist. Damit wird gewährleistet, dass beide Tochterzellen einen vollständigen DNA-Satz erhalten. Entsprechend verhindert ein Kontrollpunkt in der M-Phase die Mitose, bevor nicht alle Chromosomen korrekt an die Mitosespindel geheftet sind (falls dies nicht der Fall wäre, auch wenn es nur ein Chromosom beträfe, würde einer Tochterzelle dieses Chromosom fehlen und die andere Zelle hätte zu viele Exemplare; beides sind schädliche, wenn nicht gar tödliche Zustände). Kontrollpunkte in der G,- und der S-Phase halten ebenfalls den Zellcyclus an, wenn die DNA beschädigt ist, sodass die Zelle Zeit bekommt, den Schaden zu reparieren (Abschnitt 25.5). Wenn nach einer gewissen Zeit die Kontrollbedingungen nicht erfüllt sind, wird die betreffende Zelle bei Vielzellern dazu angewiesen, Selbstmord zu begehen. Diesen Vorgang bezeichnet man als Apoptose (siehe unten). Auf diesem Wege wird die Proliferation einer irreparabel geschädigten und somit gefährlichen (z.B. kanzerösen) Zelle verhindert. Die Aktivitäten der cyclinabhängigen Proteinkinasen verändern sich während des Zellcyclus Das Durchschreiten des Zellcyclus wird von Proteinen iR die man als Cycline und cyclinabhängige Proteinkinasen (Cdks; Cdk steht für engl.: cycline-dependent protein kinase) bezeichnet. Cycline haben ihren Namen daher, dass sie während einer Phase des Zellcyclus synthetisiert und während der nachfolgenden Phase abgebaut werden (der Proteinabbau wird im Abschnitt 21.1 behandelt). Ein bestimmtes Cyclin bindet an seine entsprechenden Cdk(s) - Ser/ Thr-Proteinkinasen - und aktiviert sie dazu, ihre Zielproteine im Zellkern zu phosphorylieren. Zu diesen Proteinen zählen Histon H1, mehrere onkogene

Proteine (siehe unten) und Proteine, die an der Auflösung des Zellkerns und der Umgestaltung -des Cytoskeletts beteiligt sind. Diese Proteine werden dadurch aktiviert, die Prozesse in Gang zu setzen, die diese Phase des Zellcyclus ausmachen. Die menschliche Cdk namens Cdk2 wird durch Bindung von Cyclin A und durch Phosphorylierung ihres Thr 160 aktiviert, was die Cdk-aktivierende Kinase (CAK; diese Kinase ist ihrerseits ein Komplex aus Cyclin H und Cdk7) katalysiert. Die Cdk2-Aktivität wird durch die Phosphorylierung der Thr 14- und Iyr 15-Reste der Cdk2 negativ reguliert. Die Röntgenstruktur der nicht phosphorylierten Cdk2 im Komplex mit ATP, aber in Abwesenheit von Cyclin A (Abb. 28.41a), ähnelt stark derjenigen der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A (PKA; Abb. 13.21). Die Cdk2 ist jedoch als Kinase zum Teil inaktiv, weil der Zugang der Proteinsubstrate zum y-Phosphat des gebundenen ATP durch eine Proteinschleife aus 19 Aminosäuren namens T-Schleife (die Tyr 160 enthält) blockiert wird. Die Phosphorylierung von Tyr 160 und die Bindung von Cyclin A verändern die Konformation der Cdk2 (Abb. 28.415). Speziell dreht sich eine N-terminale a-Helix von Cdk2, die das für die Cdk-Familie cha-

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

rakteristische PSTAIRE-Sequenz-Motiv enthält, um 90° um ihre Achse und bewegt sich mehrere Zehntel Nanometer, um mehrere Reste in einer katalytisch aktiven Anordnung zu positionieren. Außerdem erfährt die T-Schleife der Cdk2 eine signifikante Umgestaltung, wozu Positionsverschiebungen von bis zu 2,1 nm gehören, die den Proteinsubstraten den Zugang zum aktiven Zentrum erlauben. Die Phosphatgruppe auf Thr 160 passt gut in eine positiv geladene Tasche, die aus drei Arg-Resten aufgebaut ist und sich zum Teil auf die Cyclin-A-Bindung hin bildet. Die Cdk-Aktivitäten werden nicht nur durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung und Bindung an das entsprechende Cyclin reguliert, sondern auch durch cyclinabhängige Kinase-Inhibitoren (CKls). Diese Inhibitoren halten den Zellcyclus als Reaktion auf Antiproliferationssignale an. Solche Signale sind z.B. Kontakt mit anderen Zellen, DNA-Schäden, Ausdifferenzierung und Seneszenz (bei der der Zellcyclus dauerhaft angehalten ist). Wie wichtig CKls sind, zeigt sich daran, dass sie bei Krebs häufig verändert sind, was sich in einer unkontrollierten Zellteilung niederschlägt. Die Wege, auf denen Sensorproteine die zellulären Bedingungen überwachen und Cdks aktivieren und inaktivieren, sind nicht voll verstanden. Durch Untersuchungen einzelner Proteine, einschließlich p53 und pRb (siehe unten), konnte man jedoch einige wichtige Erkenntnisse gewinnen: Wenn diese beiden Proteine mutieren, geht die Zellcycluskontrolle verloren.

B.

_Tumorsuppressoren verhindern Krebs

1151

Abb. 28.41 Röntgenstruktur der menschlichen cyclinabhängigen Kinase 2 (Cdk2). (a) Cdk2 im Komplex mit ATP. Das Protein ist in der Standardausrichtung einer Proteinkinase gezeigt, wobei sein N-terminaler Flügel pink, sein C-terminaler Flügel türkis, seine PSTAIRE-Helix (Reste 45-56) magenta und seine T-Schleife (Reste 152-170) orange sind. ATP ist als Kalottenmodell dargestellt und die phosphorylierbaren Seitenketten von Thr 14, Tyr 15 und Thr 160 sind in der

Stabform abgebildet. Alle sind entsprechend dem Atomtyp gefärbt (C grün, N blau, O rot und P gelb). Man vergleiche diese Struktur mit derjenigen von Proteinkinase A (PKA; Abb. 13.21). [Nach einer Röntgenstruktur von Sung-Hou Kim, University

of California at Berkeley. PDBid IHCK.] (b) Komplex aus Cyclin A, ATP und der an Thr 160 phosphorylierten Cdk2. Cdk2 und ATP sind wie im Bildteil a und aus entsprechender Blickrichtung dargestellt. Cyclin A ist hell- und dunkelgrün gefärbt. Die Phosphorylgruppe an Thr 160 von Cdk2 ist als Kalottenmodell

gezeichnet. Man beachte, wie

die Bindung von Cyclin A zusammen mit der Phosphorylierung von Thr 160 eine wesentliche Umgestaltung der T-Schleife und des N-terminalen Flügels der Cdk2, einschließlich ihrer PSTAIRE-

Personen mit der seltenen Erbkrankheit Li-Fraumeni-Syndrom sind sehr anfällig

für eine Vielzahl bösartiger Tumore, insbesondere für Brustkrebs, den sie oft bereits vor dem 30. Lebensjahr entwickeln. Diese Menschen haben in der Keimbahn Mutationen im p53-Gen, was vermuten lässt, dass das normale Proteinprodukt, p53 (ein Polypeptid mit einer Masse von 53 kD), ein Tumorsuppressor ist. Mit anderen Worten, p53 hat die Aufgabe, die ungehemmte Zellproliferation in Schranken zu halten, die für Krebs typisch ist. In der Tat ist p53 das am häufigsten veränderte Gen bei Krebserkrankungen des Menschen. Ungefähr 50% der

Helix, verursacht hat. Man beachte außerdem

die verschiedenen Konformationen der ATPTriphosphatgruppe in beiden Strukturen. [Nach einer Röntgenstruktur von Nikola Pavletich, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York. PDBid 1JST.] &% siehe Interactive Exercises.

1152

Regulation der Genexpression

menschlichen Krebserkrankungen zeigen eine Mutation von p53, und viele andere onkogene (krebsverursachende) Mutationen treten bei Genen auf, die Proteine codieren, die direkt oder indirekt mit p53 wechselwirken. Offensichtlich fungiert p53 als ein „Wächter des Genoms“, der die genomische Integrität überc wacht.

p53 arretiert den Zellcyclus in der G,-Phase

Obwohl p53 für die Verhinderung einer Tumorbildung von zentraler Bedeutung ist, ist der Mechanismus dafür erst nach und nach ans Licht gekommen. p53 wird spezifisch von Mdm2-Protein gebunden, einer Ubiquitin-Proteinligase (E3), die spezifisch p53 ubiquitiniert und es dabei für den proteolytischen Abbau in einem Proteasom markiert (Abschnitt 21.1). Infolgedessen führt die Amplifikation (Erzeugung mehrerer Kopien) des mdm2-Gens, die bei über 35% der menschlichen Sarkome (von denen keines ein mutiertes p53-Gen hat; Sarkome sind bösartige [maligne] Tumoren des Bindegewebes wie Muskeln, Sehnen und Knochen) vorkommt, zu einer erhöhten Abbaurate von p53. Dabei werden die Zellen für eine (maligne) Transformation disponiert. Ein weiterer Weg, auf dem Onkogene (krebsverursachende Gene; Exkurs 13.3) Krebs hervorrufen können, ist somit die Inaktivierung normaler Tumorsuppressoren. p53 ist ein wirksamer Transkriptionsaktivator. In der Tat haben alle Mutanten von p53, die zu Krebs führen, ihre sequenzspezifischen DNA-Bindungseigenschaften verloren. Wie kann dann p53 als Tumorsuppressor agieren? Ein Hinweis zur Lösung dieses Rätsels kam durch die Beobachtung, dass die Behandlung von Zellen mit DNA-schädigender ionisierender Strahlung eine Anhäufung von normalem p53 zur Folge hatte. Dies führte zur Entdeckung, dass die beiden aktivierten Proteinkinasen ATM und Chk2 p53 phosphorylieren (ATM steht für ataxia teleangiectasia mutated; Ataxia teleangiectasia, oder auch Louis-Bar-Syndrom genannt, ist eine seltene genetische Krankheit, die durch fortschreitenden Verlust der motorischen Steuerung, Wachstumsverzögerung, vorzeitige Alterung und ein stark erhöhtes Krebsrisiko charakterisiert ist; Chk steht für engl.: checkpoint kinase, Kontrollpunktkinase). Für ATM und Chk2 hatte man zuvor zeigen können, dass sie durch eine Phosphorylierungskaskade aktiviert werden und an einer Phosphorylierungskaskade beteiligt sind, die den Zellcyclusstillstand am Kontrollpunkt von G, bewirkt, wenn beschädigte oder nicht replizierte DNA entdeckt wird. Die Phosphorylierung von p53 verhindert dessen Bindung durch Mdm2 und erhöht somit den ansonsten niedrigen p53-Spiegel im Zellkern. Obwohl p53 die Hemmung des Zellcyclus in der G;Phase nicht einleitet, ist seine Anwesenheit erforderlich, um diesen Prozess hinauszuzögern. Dabei aktiviert p53 die Transkription des Gens, das den cyclinabhängigen Kinaseinhibitor (CKI) namens p21“P! codiert; dieser bindet an mehrere Cdk-CyclinKomplexe, sodass er sowohl den G,/S- als auch den G,/M-Übergang hemmt. Zellen, die irreparabel geschädigt sind, synthetisieren p53 in einer übermäßig hohen Konzentration, die wiederum die Zellen dazu veranlasst, Selbstmord zu begehen, indem mehrere an der Apoptose beteiligte Proteine aktiviert werden (siehe unten). In Abwesenheit der p53-Aktivierung kontrollieren Zellen die p>3-Konzentration durch eine Rückkopplungsschleife, in der p53 die Transkription des mdm2-Gens stimuliert. Die Struktur von p53 erklärt dessen onkogene Mutationen p>3 ist eine Tetramer aus identischen Untereinheiten mit je 393 Resten, die jeweils einen sequenzspezifischen DNA-bindenden Kern enthalten. Die von Nikola Pavletich bestimmte Röntgenstruktur dieser Domäne (Reste 102-313) im Komplex mit einer 21 bp langen DNA-Zielsequenz ist in Abbildung 28.42 gezeigt. Das DNA-bindende Motiv von p53 hat keine Ähnlichkeit mit irgendeinem anderen bisher beschriebenen (Abschnitt 24.4B und 24.4C). Es bildet sequenzspezifische Kontakte mit den Basen der DNA in deren großer Furche aus (unten rechts in Abb. 28.42). Außerdem ragt die Seitenkette von Arg 248 in

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

1153

Abb. 28.42 Röntgenstruktur der DNA-Bindungsdomäne des menschlichen p53 im Komplex mit seiner Ziel-DNA. Die DNA ist in Stabform gezeichnet und entsprechend dem Atomtyp angefärbt (C grün, N blau, O rot und P orange), wobei die aufeinanderfolgenden P-Atome durch orange Stäbchen verbunden sind. Das Protein ist in Bänderform gezeigt und beginnend vom N-Terminus (blau) bis zum C-Terminus (rot) in den Spektralfarben gefärbt. Ein tetraedrisch koordiniertes Zn’*-Ion ist durch eine magentafarbene Kugel wiedergegeben, und die Seitenketten der sechs bei menschlichen Tumoren am häufigsten mutierten Reste sind in Stabform dargestellt, mit gelbem Kohlenstoff und mit dem Einbuchstabencode gekennzeichnet. [Nach einer Röntgenstruktur von Nikola Pavletich, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York. PDBid

ITSR.] 6% siehe Interactive Exercises.

die kleine Furche der DNA hinein (oben rechts in Abb. 28.42). Das Protein berührt auch das DNA-Rückgrat zwischen der großen und kleinen Furche in diesem Bereich (insbesondere mit Arg 273). Das auffälligste Merkmal der Struktur ist, dass ihr DNA-bindendes Motiv aus konservierten Regionen besteht. Diese Regionen beinhalten die am häufigsten mutierten Reste der über 1000 p53-Varianten, die man bei menschlichen Tumoren gefunden hat. Darunter sind ein Gly- und fünf Arg-Reste (in Abb. 28.42 markiert), deren Mutationen zusammen für über 40% der p53-Varianten bei Tumoren verantwortlich sind. Die beiden am häufigsten mutierten Reste, Arg 248 und Arg 273, berühren die DNA direkt, wie wir gesehen haben. Die vier anderen Reste, die „Mutationszentren“ sind, scheinen eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung der DNA-bindenden Oberfläche von p53 zu spielen. Die relativ spärliche Sekundärstruktur in den Polypeptidabschnitten, die diese Oberfläche bilden (eine Helix und drei Schleifen), bedingt diese hohe Mutationsanfälligkeit: Ihre strukturelle Integrität basiert hauptsächlich auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen Seitenketten und zwischen Seitenkette und Rückgrat. p53 ist ein Sensor, der Informationen aus mehreren Signalwegen bündelt

p53 kann durch mehrere andere Signalwege aktiviert werden. Irrtümliche Wachstumssignale verursachen beispielsweise die unpassende Aktivierung einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Signalen gehören diejenigen, die von onkogenen Varianten der Bestandteile von Ras-Signalkaskaden (Abb. 13.7) wie Ras erzeugt werden. Einer dieser Transkriptionsfaktoren, Myc, aktiviert die Transkription des Gens, das p14“*" codiert. Dieses bindet an Mdm2 und hemmt dabei dessen Aktivität. Dies verhindert den Abbau von p53

1154

Regulation der Genexpression

und leitet somit p53-abhängige Transkriptionsprogramme ein, was sowohl zum Stillstand des Zellcyclus als auch zur Apoptose führt. Offensichtlich fungiert p14“*" als Teil eines p53-abhängigen Sicherungssystems, um den hyperproliferativen Signalen entgegenzuwirken.

Ein dritter Aktivierungsweg für p53 wird durch eine Vielzahl DNA-schädigender Chemotherapeutika, Proteinkinaseinhibitoren und UV-Strahlung eingeleitet. Diese aktivieren die Proteinkinase namens ATR dazu, p53 zu phosphorylieren, sodass sich dessen Affinität für Mdm2 auf ganz ähnliche Weise verringert wie durch die Wirkung von ATM und Chk2. p53 ist auch Gegenstand einer großen Vielfalt reversibler posttranslationaler Modifikationen, die deutlich die Expression seiner Zielgene beeinflussen. Dazu gehören neben seiner Phosphorylierung an mehreren Ser/Thr-Resten und Ubiquitinierung die Acetylierung mehrerer Lys-Reste, Glykosylierung und Sumoylierung (Abschnitt 27.5B). Wie diese kurze Übersicht zeigt, empfängt p53 eine große Anzahl intrazellulärer Signale und steuert seinerseits die Aktivitäten einer großen Anzahl von nachgeschalteten Regulatoren. Ein Weg, um die Arbeitsweise dieses hoch komplexen und miteinander verbundenen Netzwerks zu verstehen, ist ein Vergleich mit dem Internet. Im Internet (Zelle) überträgt eine kleine Anzahl stark vernetzter Server oder Netzknoten („Master“-Proteine) die Information zu oder von einer großen Anzahl von Computern oder Knotenpunkten (andere Proteine), die direkt nur mit einigen wenigen anderen Knotenpunkten (Proteine) wechselwirken. In einem solchen Netzwerk ist die Gesamtleistung durch Inaktivierung eines der Knotenpunkte (anderer Proteine) weitgehend unbeeinflußt. Wenn jedoch ein Netzknoten („Master“-Protein) inaktiviert wird, hat das einen enormen Einfluss auf die Leistung des Systems. Bei p53 handelt es sich um ein „Master“-Protein, d.h. es entspricht einem Netzknoten. Die Inaktivierung eines der vielen Proteine, die seine Leistung beeinflussen, oder eines der vielen Proteine, deren Aktivität p53 beeinflusst, hat gewöhnlich geringe Auswirkungen auf zelluläre Ereignisse, weil die entsprechenden Komponenten in der Zelle im Überfluss vorhanden sind und alle miteinander verbunden sind. Wenn jedoch p53 selbst oder mehrere seiner am stärksten assoziierten Proteine (z.B. Mdm2) inaktiviert werden, kommt die Reaktion der Zelle auf DNA-Schäden und tumorprädisponierenden Stress zum Erliegen, und dies führt schließlich zur Tumorbildung. Der Verlust des Proteins pRb führt zu Krebs

Beim Retinoblastom, einer Krebserkrankung der sich entwickelnden Netzhaut, die Säuglinge und Kleinkinder befällt, liegt ein Verlust des Rb-Gens vor. Dieses Gen codiert den Tumorsuppressor pRb. Er ist ein DNA-Bindungsprotein aus 928 Aminosäuren und interagiert mit Vertretern der E2F-Familie der Transkriptionsfaktoren, die bei Säugern sechs Mitglieder hat. E2F-Proteine induzieren die Transkription von Genen, die Proteine codieren, die für den Eintritt in die SPhase erforderlich sind. pRb kann an 16 seiner Ser/Thr-Reste durch verschiedene Cdk-Cyclin-Komplexe phosphoryliert werden (die verschiedenen Komplexe phosphorylieren unterschiedliche Reste bei pRb). In nicht proliferierenden Zellen (denjenigen in der frühen G,-Phase) ist pRb unterphosphoryliert. In diesem Zustand bindet es an E2F, sodass dieser daran gehindert wird, die Transkription an den Promotoren zu aktivieren, an die er gebunden ist. Als Reaktion auf ein mitogenes Signal (ein Signal, das die Mitose induziert) steigen die Konzentrationen der Cycline vom D-Typ an. Dies löst die Phosphorylierung von pRb durch Cdk4/6-Cyclin-D-Komplexe aus. Das überphosphorylierte pRb setzt E2F frei, der daraufhin die Expression von Genen induziert, die das Fortschreiten des Zelleyclus stimulieren. Dazu zählen auch die Gene für weitere Cycline und Cdks. Die E2F-Bindungstelle von pRb ist die wichtigste Stelle der Rb-Genveränderungen bei Tumoren.

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

1155

C. _ Apoptose Der programmierte Zelltod oder Apoptose (von griech.: abfallen, abwerfen) wurde erstmals in den späten 1960er Jahren von John Kerr beschrieben. Es handelt sich dabei um einen normalen Prozess in der Entwicklung und auch der Aufrechterhaltung sowie der Verteidigung des erwachsenen Tierkörpers. Bei vielen Wirbeltieren sind die Finger und Zehen der sich entwickelnden Hände bzw. Füße anfangs durch Schwimmhäute verbunden, die durch den programmierten Zelltod beseitigt werden (Abb. 28.43). Der menschliche Körper besteht aus etwa

10'* Zellen, und man schätzt, dass 10'' Zellen täglich mithilfe des programmier-

ten Zelltods beseitigt werden (das entspricht ziemlich genau der Anzahl der durch Mitose neu gebildeten Zellen). Das Immunsystem beseitigt virusinfizierte Zellen zum Teil, indem es die Zellen dazu veranlasst, in den programmierten Zelltod zu gehen. Auf diese Weise wird die Virusreplikation verhindert. Zellen mit irreparabel geschädigter DNA laufen Gefahr, eine maligne Transformation zu erleiden. In diesen Zellen wird ebenfalls die Apoptose ausgelöst, womit der Gesamtorganismus vor Krebs bewahrt wird. Wie Martin Raff betont hat, scheint die Apoptose für alle tierischen Zellen vorprogrammiert zu sein: Sofern sie keine hormonellen und/oder neuronalen Signale erhalten, dass sie keinen Selbstmord begehen sollen, begehen sie diesen. So erhalten ausgewachsene Organismen ihre Größe aufrecht, indem sie die Zellproliferation durch Apoptose ausgleichen. Es überrascht nicht, dass eine Entgleisung der Apoptose bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen vorkommt, wie Morbus Alzheimer (Abschnitt 6.5C), Morbus Parkinson (Abschnitt 21.6B) und Chorea Huntington (Exkurs 28.1), sowie bei einem großen Teil der Schädigungen, die durch Schlaganfall oder Herzinfarkt verursacht werden. Die Apoptose unterscheidet sich von der Nekrose — der Art von Zelltod, die durch Verletzungen verursacht wird (z.B. Sauerstoffmangel, extreme Temperaturen und mechanische Verletzung). Von Nekrose betroffene Zellen explodieren gleichsam: Sie und ihre membranumhüllten Organellen schwellen an, weil Wasser unkontrolliert durch ihre defekten Membranen eindringt. Dabei werden Iytische Enzyme freigesetzt, die den Zellinhalt verdauen, bis sich die Zelle auflöst und ihren Inhalt in die Umgebung abgibt (Exkurs 18.5). Die Cytokine, welche die Zelle freisetzt, induzieren oft eine Entzündungsreaktion (die umgebende Zellen schädigen kann). Im Gegensatz dazu beginnt die Apoptose mit dem Verlust der interzellulären Kontakte einer scheinbar gesunden Zelle, die anschließend schrumpft und deren Chromatin an der Kernperipherie kondensiert. Dann kollabiert das Cytoskelett, die Kernhülle löst sich auf, die DNA zerbricht und die Plasmamembran bildet zahlreiche Bläschen (dieser Vorgang wird auch als blistering bezeichnet). Schließlich zerfällt die Zelle in membranumhüllte Apoptosekörper, die von benachbarten Zellen und von umherstreifenden Makrophagen phagocytiert (einverleibt) werden, ohne dass Zellinhalt unkontrolliert nach außen gelangt. Somit wird keine Entzündungsreaktion ausgelöst. Caspasen sind an der Apoptose beteiligt

An der Apoptose ist eine Familie von Proteasen beteiligt, die man als Caspasen (für cysteinyl-aspartatspezifische Proteasen) bezeichnet. Diese sind Cysteinproteasen, deren Mechanismus

dem von

Serinproteasen

(Abschnitt 11.5) ähnelt,

wobei aber Cys das Ser im aktiven Zentrum ersetzt. Caspasen schneiden Zielpeptide nach einem Asp-Rest. Caspasen sind @,ß,-Heterotetramere, die aus zwei großen a-Untereinheiten (ca. 300 Reste) und zwei kleinen ß-Untereinheiten (ca. 100 Reste) bestehen. Sie werden als einzelkettige Zymogene (Procaspasen) hergestellt, die durch die proteolytische Entfernung ihrer N-terminalen Prodomänen und proteolytische Trennung ihrer a- und ß-Untereinheiten aktiviert werden. Die Aktivierungs-Schnittstellen folgen selbst alle auf Asp-Reste und sind somit Ziele

Abb. 28.43 Programmierter Zelltod in der Pfote des Mausembryos. Am Tag 12,5 der Entwicklung sind die Zehen vollständig durch Schwimmhäute verbunden. Am Tag 13,5 hat die Rückbildung der Schwimmhaut

begonnen. Am Tag 14,5 ist dieser apoptotische Prozess abgeschlossen. [Mit freundlicher Genehmigung von Paul Martin, University College London.]

1156

Regulation der Genexpression

von Caspasen. Dies legt nahe, dass die Caspaseaktivierung entweder autokatalytisch ist oder durch eine andere Caspase katalysiert wird. Die von Keith Wilson und Paul Charifson bestimmte Röntgenstruktur der menschlichen Caspase-7 (Abb. 28.44) zeigt, dass jedes aß-Heterodimer ein sechssträngiges ß-Faltblatt enthält, das von fünf a-Helices flankiert wird, die nahezu parallel zu den ß-Strängen liegen. Das ß-Faltblatt setzt sich über die zweifache Achse des Enzyms fort, was letztendlich zu einem verdrehten 12strängigen ß-Faltblatt führt. Das aktive Zentrum des aß-Heterodimers sitzt an den C-terminalen Enden seiner parallelen ß-Stränge. Die Strukturen der anderen Caspasen unterscheiden sich hauptsächlich hinsichtlich der Konformation der vier Schleifen, die ihre aktiven Zentren bilden. In der inaktiven Procaspase-7 sind diese Schleifen so gefaltet, dass das aktive Zentrum verdeckt wird. Über 60 Zellproteine hat man als Caspase-Substrate identifiziert. Dazu zählen Proteine des Cytoskeletts, Proteine, die an der Regulation des Zellcyclus beteiligt

sind (einschließlich Cyclin A, p21“®', ATM und pRb), Proteine, die an der DNA-

Abb. 28.44 Röntgenstruktur der Caspase-7 im Komplex mit einem Tetrapeptid-Aldehyd-Inhibitor. Das a,ß,-heterotetramere Enzym ist entlang seiner zweizähligen Achse betrachtet, wobei seine großen

(a-) Untereinheiten orange und goldfarben und seine kleinen (ß-) Untereinheiten türkis und hellblau sind. Der Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO-Inhibitor ist in Stabform gezeigt, mit C grün, N blau und

O rot. [Nach einer Röntgenstruktur von Keith Wilson und Paul Charifson, Vertex Pharmaceuticals,

Cambridge. PDBid IF1J].

Replikation beteiligt sind, Transkriptionsfaktoren und Proteine, die Teil von Signaltransduktionkaskaden sind. Trotzdem ist unklar, wie die Spaltung dieser zahlreichen Proteine die morphologischen Veränderungen verursacht, die die Zellen während der Apoptose erfahren. Die Einleitung der Apoptose verursacht auch den raschen Abbau der DNA durch die caspaseaktivierte DNase. Der DNAAbbau verhindert wahrscheinlich die genetische Transformation der anderen Zellen, die nachfolgend Apoptosekörper phagocytieren, die virale oder beschädigte chromosomale DNA enthaltenen. Apoptose wird extrazellulär oder intrazellulär ausgelöst In einer bestimmten Zelle wird die Apoptose auf verschiedene Weise induziert: entweder durch externe Signale, im sogenannten extrinsischen (von außen wirkenden) Weg (Tod auf Befehl), oder durch die Abwesenheit äußerer Signale, welche die Apoptose hemmen, im sogenannten intrinsischen Weg (Tod durch Unterlassung). Der extrinsische Weg wird durch die Verbindung einer für die Apoptose vorgesehenen Zelle mit einer Zelle ausgelöst, die sie dafür ausgewählt hat. Der vielleicht am besten charakterisierte Weg ist in Abbildung 28.45 dargestellt: Ein Transmembranprotein namens Fas-Ligand (FasL), ein sogenannter Todesligand, ragt aus der Plasmamembran der induzierenden Zelle und bindet an ein Transmembranprotein, Fas, den sogenannten Todesrezeptor, der auf der Plasmamembran einer der Apoptose geweihten Zelle präsentiert wird. Der Fas-Ligand ist ein homotrimeres Protein, dessen Bindung an drei Fas-Moleküle zur Trimerisierung der cytoplasmatischen Domäne von Fas führt. Das trimerisierte Fas rekrutiert drei Moleküle eines aus 208 Resten bestehenden Adaptorproteins namens FADD (für Fas-associating death domain-containing protein), die wiederum Procaspase-8 und Procaspase-10 rekrutieren. Die folgende Clusterbildung der Procaspase-8 und Procaspase-10 hat die proteolytische Autoaktivierung dieser Zymogene zur Folge, dabei werden Caspase-8 und -10 generiert, die InitiatorCaspasen genannt werden. Diese Enzyme aktivieren dann Caspase-3, die als Effektor-(Henker-)Caspase bezeichnet wird, weil durch deren Tätigkeit die Zelle in die Apoptose eintritt. Der intrinsische Weg der Einleitung der Apoptose nimmt einen etwas anderen Verlauf zur Caspase-3-Aktivierung. Die meisten tierischen Zellen sind zeitlebens von einer extrazellulären Flüssigkeit umgeben, die zum Teil von ihren Nachbar-

zellen gebildet wird. Dieses Medium enthält eine Vielzahl von Substanzen, die das Wachstum der Zelle, ihre Differenzierung, Aktivität und ihr Überleben regulieren. Wird einer Zelle diese chemische Unterstützung für ihr Überleben entzogen oder verliert sie den direkten Zell-Zell-Kontakt, wird die Apoptose über den intrinsischen Weg eingeleitet. Der Anfangsschritt dieses Wegs scheint die Aktivierung eines oder mehrerer Vertreter der Bcl-2-Familie zu sein (so benannt, weil der erste beschriebene Vertreter an B-Zell-Lymphomen [B-cell Iymphoma] beteiligt ist). Die Verbindung bestimmter Bcl-2-Proteine mit dem Mitochond-

Zellcyclus, Krebs und Apoptose induzierende Zelle

Todesligand [FasL] Todesrezeptor [Fas]

1157

Abb. 28.45 Der extrinsische Weg der Apoptose. Flächige graue Pfeile bedeuten Aktivierung. (1) Die Bindung eines trimeren Todesliganden (z.B. FasL, grün) auf der induzierenden Zelle an den Todesrezeptor (z.B. Fas, rot) auf der der Apoptose geweihten Zelle verursacht, dass die cytoplasmatischen Todesdomänen (DDs, engl.: death domains) des Todesrezeptors trimerisieren (2). Dies rekrutiert Adaptoren (z.B. FADD), die über ihre DDs an die DDs des Todesrezeptors binden. Die Adaptoren rekrutieren wiederum Initiator-Procaspasen (z.B. Procaspase-8) über die Wechselwirkungen zwischen den Todeseffektordomänen (DEDs, engl.: death effector domains) auf den Adaptoren und den Initiator-Procaspasen (3). Dies induziert die Autoaktivierung

(4) der Initiator-Procaspasen, um die entsprechenden heterotetrameren Initiator-Caspasen (z.B. Caspase-8) zu bilden. (5) Die Initiator-Caspasen aktivieren dann proteolytisch EffektorProcaspasen (z.B. Procaspase-3), damit die heterotetrameren Effektor-Caspasen (z.B. Caspase-3) entstehen, die dann die proteolytischen Spaltungen katalysieren, die zur Apoptose führen.

apoptotische Zelle

Initiator-CaspaseZymogen [Procaspase-8]

Initiator-Caspase

[Caspase-8]

Effektor-CaspaseZymogen

[Procaspase-3]

Effektor-Caspase [Caspase-3]

Apoptose

rion verursacht, dass dieses Cytochrom c (Abschnitt 18.2E) aus dem Intermembranraum ins Cytosol freisetzt. Es ist nicht klar, wie Cytochrom c aus dem Mitochondrion gelangt. Es kann die äußere Membran über eine neu gebildete oder über eine vorhandene Pore durchqueren, deren Konformation verändert wird, um das Cytochrom c (ca. 12 kD) aufzunehmen, oder die Außenmembran kann infolge der Bcl-2-Aktivität reifen. Das Cytochrom c bindet an ein Protein aus 1248 Aminosäuren namens Apaf-l (für apoptosis protease-activating factor-1) und ATP oder dATP, um einen radförmigen ca. 1100 kD-Komplex mit der Bezeichnung Apoptosom (Abb. 28.46) zu

bilden. Das Apoptosom bindet mehrere Moleküle Procaspase-9 so, dass deren

Autoaktivierung ausgelöst wird. Die entstehende Caspase-9, die immer noch an das Apoptosom gebunden ist, aktiviert dann Procaspase-3 und leitet den Zelltod ein.

Abb. 28.46 Auf Kryoelektronenmikroskopie basierendes Bild des Apoptosoms bei einer Auflösung von 1,28 nm. In der Aufsicht blickt man entlang der sieben-

zähligen Symmetrieachse des Partikels. Die Seitenansicht zeigt die abgeflachte Struktur dieses radförmigen Partikels, das einen Durchmesser von ca. 25 nm hat. Cytochrom c bildet die Ausbuchtung, die oben aus dem großen Höcker am Ende jedes Arms ragt. [Mit freundlicher Genehmigung von Christopher Akey, Boston University School

of Medicine.]

1158

Regulation der Genexpression

D.

Molekulare Grundlagen der Entwicklung

Vielleicht eines der faszinierendsten Ereignisse in der Biologie ist die Entwicklung eines befruchteten Eis zum vollständig differenzierten Organismus. Dazu sind keinerlei Informationen von außerhalb notwendig. Befruchtete Eier enthalten sämtliche nötigen Informationen, um einen komplexen Organismus, wie z.B. einen Menschen, zu bilden. Die meisten Erkenntnisse über die molekularen Grundlagen der Entwicklung wurden anhand der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gewonnen. Wir beginnen deshalb diesen Abschnitt mit einer Übersicht über die Drosophila-Embryogenese. Entwicklung von Drosophila

Fast sofort nach der Eiablage (denn diese ist es, welche die Entwicklung in Gang setzt, nicht die Befruchtung) beginnen alle 6-10 min eine Reihe schneller, synchroner Kernteilungen (Abb. 28.47a). Hierbei werden keine neuen Zellmembranen gebildet, d.h. die Zellkerne befinden sich in einem gemeinsamen Cytoplasma und bilden ein so genanntes Syncytium (Abb. 28.47b). Nach der achten Kernteilung beginnen die ca. 256 Zellkerne, zum Cortex (Außenschicht) zu wandern. Dort bilden sie bis zur elften Kernteilung eine einlagige Schicht, die das dotterreiche Innere umgibt (Abb. 28.47c; die Keimbahnvorläufer, die Polzellen,

werden nach der neunten Teilung abgesondert). Von nun an werden die Mitosecyclen länger, und die Gene, die bisher ausschließlich an der DNA-Replikation beteiligt waren, werden nun in der Transkription aktiv (eine frisch gelegte Eizelle enthält einen riesigen Vorrat an mRNA, der von den die Oocyte umgebenden „Ammenzellen“ beigesteuert wird). Beim 14. Kernteilungscyclus, der ca. 60 min dauert, stülpt sich die Plasmamembran der Eizelle um die ca. 6000 Zellkerne herum ein, es entsteht eine Einzelzellschicht, die als Blastoderm bezeichnet wird (Abb. 28.47d). Zu diesem Zeitpunkt (etwa 2,5 h nach der Eiablage) erreicht die Transkriptionsaktivität ihr Maximum und die mitotische Synchronisation ist verlorengegangen.

In den nun folgenden Stunden durchläuft der Embryo die Gastrulation (Zellmigration, die zu einer dreilagigen Struktur führt) und Organogenese. Dabei zeigt sich bei Drosophila wie auch bei höheren Tieren ein verblüffender Effekt: Der Embryo teilt sich in eine Reihe von Segmenten, entsprechend der Struktur des adulten Organismus (Abb. 28.47e). Im Drosophila-Embryo gibt es mindestens drei Kopfsegmente (Md, Mx und Lb von lat. mandibula, maxilla und labia), drei Thoraxsegmente (T1-T3) und acht Abdominalsegmente (A1-AB). In der weiteren Entwicklung wächst der Embryo in die Länge und mehrere Abdominalsegmente falten sich über die Thoraxsegmente (Abb. 28.47f). In diesem Stadium gliedern sich die Segmente jeweils in ein vorderes (anteriores) und hinteres (posteriores) Kompartiment. Jetzt verkürzt und entfaltet sich der Embryo, so dass eine Larve entsteht, die einen Tag nach dem Entwicklungsbeginn schlüpft (Abb. 28.47g). In den nächsten fünf Tagen frisst die Larve, häutet sich zweimal, verpuppt sich und durchläuft die Metamorphose zum adulten Tier (Abb. 28.47h). Bei diesem letzten Vorgang wird die Larvenepidermis fast vollständig durch ein Gewebe ersetzt, das aus offensichtlich undifferenzierten Anteilen des Larvenepithels hervorgeht. Diese sogenannten Imaginalscheiben werden schon im Blastodermstadium angelegt. Sie halten die Segmentabgrenzungen der Larve aufrecht und bilden beim adulten Tier Beine, Flügel, Anten-

nen, Augen usw. aus. Etwa zehn Tage nach Entwicklungsbeginn setzt die nun ausgewachsene Fliege innerhalb weniger Stunden einen neuen Vermehrungscyclus in Gang.

Zellcyclus, Krebs und Apoptose Abb. 28.47 (a)

1159

Entwicklung von Drosophila.

Die einzelnen Stadien sind im Text erklärt. Man beachte, re

dass Embryonen und frisch geschlüpfte Larven gleich lang sind (ca. 0,5 mm). Das adulte Tier ist natürlich viel größer. Die Anzahl der Zellen in den frühen Entwicklungsstadien sind in Klammern angegeben.

Posterior

Micropyle

(1)

ventral

(b)

Synceytium

(256) syncystiales Blastoderm

(e) Polzellen Cortex

(1500)

(d)

Blastoderm

Md Mx Lb T2 A1 A3 A5 A7

(e)

9

(@

Larve

A8

TE (h)

rı 72

a

ARD

A6

(40.000) Adultes Tier

1160

Regulation der Genexpression Entwicklungsmuster werden genetisch gesteuert

Wie sieht der Mechanismus aus, der das Entwicklungsmuster des Embryos bestimmt? Ein Großteil unseres Wissens darüber stammt aus Genanalysen mehrerer auffälliger Mutationen in drei Gengruppen von Drosophila, die normalerweise für die zelluläre Spezialisierung zuständig sind. I. Gene mit maternalem Effekt bestimmen die Polarität des Embryos, d.h. seine anterioposteriore (Kopf-Schwanz-) und seine dorsoventrale (Rücken-Bauch-) Achse. Mutationen dieser Gene führen zur Veränderung der gesamten embryonalen Körperstruktur. So können beispielsweise nicht lebensfähige Embryonen mit zwei vorderen oder zwei hinteren Enden, die in entgegengesetzte Richtungen weisen, entstehen. Segmentierungsgene legen die richtige Anzahl und Polarität der embryonalen Körpersegmente fest. Sie werden aufbauend auf den Arbeiten von Christiane Nüsslein-Volhard und Eric Wieschaus folgendermaßen klassifiziert: (a) Gap-Gene werden zuerst transkribiert und sind so benannt, weil eine Mutation zu Lücken (engl.: gaps) im embryonalen Segmentationsmuster führt. Embryonen mit fehlerhaften hunchback-Genen (hb) fehlen z.B. Mund- und Thoraxstrukturen. (b) Pair-rule-Gene (von engl.: pair, Paar und rule, Regel) spezifizieren die Segmentunterteilung der großen Lückendomänen. Diese Gene werden so genannt, weil ihre Mutationen normalerweise Teile jedes zweiten Segments deletieren. (c) Segmentpolaritätsgene spezifizieren die Polarität der entstehenden Segmente. Deshalb fehlt homozygoten en-Mutanten (von engl.: engrailed, eingekerbt) das hintere Kompartiment in jedem Segment. Homöotische Auswahlgene legen die Identität der Segmente fest. Ihre Mutation transformiert einen Körperteil in einen anderen. Antennapedia-Mutanten z.B. (Antp, Antennenfuß) haben Beine anstelle der Antennen (Abb. 28.48a), und die Mutationen bithorax (bx), anteriobithorax (abx) und postbithorax (pbx) wandeln jeweils Abschnitte der Halteren (zurückgebildete Flügel, die zur Balance dienen), die normalerweise nur am Segment T3 vorhanden sind, in Flü-

gelabschnitte um, die normalerweise am T2-Segment liegen (Abb. 28.485).

Abb. 28.48 Entwicklungsmutanten von Drosophila. Kopf und Thorax einer erwachsenen WildtypFliege (links) und einer Fliege, die homozygot für die homöotische Antennapedia (antp)-Mutation ist (rechts). Das mutierte Gen wird fälschlicherweise bei den Imaginalscheiben exprimiert, aus denen normalerweise die Antennen hervorgehen (wo das WildtypGen antp nicht exprimiert wird). So entwickeln sich Beine, die sich normalerweise nur am Segment T2 befinden. [Mit freundlicher Genehmigung von Gines Morata, Universidad Autönoma de Madrid.] (b) Eine vierflügelige Drosophila (normalerweise hat sie zwei Flügel) resultiert aus drei Mutationen des Bithoraxkomplexes. Durch diese Mutationen entwickelt sich das halterentragende Segment T3 so, als wäre es das flügeltragende Segment T2. [Mit freundlicher Genehmigung von Edward B. Lewis, Caltech.]

(a)

(b)

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

1161

Die Eigenschaften von Genen mit maternalem Effekt weisen darauf hin, dass diese so genannte Morphogene spezifizieren, deren Verteilung im Eicytoplasma die zukünftige . Raumorganisation im Embryo bestimmen. Tatsächlich zeigten Immunfluoreszenzstudien von Christiane Nüsslein-Volhard, dass das Genprodukt von bicoid (bed) innerhalb des normalen Embryos in einem Gradienten (von vorne nach hinten abnehmend) vorliegt (Abb. 28.49a), während Embryonen mit bed-defizienten Müttern dieser Gradient fehlt. Dieser Gradient entsteht dadurch, dass ovarielle Ammenzellen während der Oogenese bed-mRNA in das vordere Ende der Oocyte sekretieren. Die mRNA des nanos-Gens wird ähnlich nahe dem hinteren Eipol akkumuliert. Die bed- und nanos-Genprodukte regulieren die Expression spezifischer Gap-Gene. Einige maternale Effektgene codieren Proteine, welche

umliegende mRNA-Moleküle einfangen. Das erklärt, warum frühe Embryonen von Weibchen, welche homozygot für maternale Effektmutationen sind, oft durch eine Injektion von Cytoplasma (oder manchmal nur der mRNA) aus Wildtyp-Embryonen „gerettet“ werden können. Die mRNA des Gap-Gens hb (engl.: hunchback, der Bucklige) ist im unbefruchteten Ei gleichmäßig verteilt (Abb. 28.49a). Das Bicoid-Protein jedoch akti(a)

hunchback-mRNA

nanos-mRNA

Hunchback(6)

Protein

Nanos-Protein

Bicoid-Protein

inhibiert hb-

BASE

stimuliert hb-Transkription

(e)

giant-

Krüppel-

mRNA

knirpsmRNA

Hunchback-

— +

= : Körperregion

rioren Polen, zusammen

mit einer gleichmäßigen

Verteilung an hunchback-mRNA. (b) Bei der Befruchtung werden die drei mRNAs translatiert. Bicoid- und Nanos-Proteine bleiben nicht lokal verteilt, wie ihre mRNAs, weshalb ihre Gradienten

Protein

Anteriorvr

Abb. 28.49 Bildung und Effekte des HunchbackProteingradienten in Drosophila-Embryonen. (a) Das unbefruchtete Ei enthält mütterliche bicoidund nanos-mRNAs an den anterioren und poste-

— > Posterior

breiter als die der mRNAs verlaufen. Bicoid-Protein stimuliert die hunchback-mRNA-Transkription, während das Nanos-Protein seine Translation verhindert, was zu einem Hunchback-Proteingradienten führt, der nicht linear von anterior nach posterior abnimmt. (c) Spezifische HunchbackProteinkonzentrationen induzieren die Transkriptionen der giant-, krüppel- und knirps-Gene. Der Hunchback-Proteingradient spezifiziert somit die Position, in der diese mRNAs

synthetisiert

werden. (d) Aufnahme eines Drosophila-Embryos (anteriores Ende links), der mittels Immunfluores-

zenz markiert wurde, und zwar für Hunchback(grün) und Krüppel-Proteine (rot). Die Region, in der sich beide Proteine überlappen, erscheint gelb. [Teil (a-c) nach Gilbert, S. F., Developmental Biology

(5. Aufl.), S. 550 und 565, Sinauer Associates (1997); Teil (d) mit freundlicher Genehmigung von Jim Langeland, Stephen Paddock und Sean Carroll, Howard

Hughes Medical Institute, University of

Wisconsin-Madison.]

(d)

1162

Regulation der Genexpression Antennensegmente Arista

Klauen

Tarsus-

Trochanter

segmente Tibia

Abb. 23.50 Beziehung zwischen Drosophila-Antennen und -Beinen. [Nach Postlethwait, J.H., und Schneidermann,

H.A., Dev. Biol.25, 622 (1971).]

viert die hb-Gentranskription des Embryos, während das Nanos-Protein die Translation der hb-mRNA inhibiert. Dadurch verteilt sich das Hunchback-Protein in einem Gradienten von vorne nach hinten (Abb. 28.495). Footprinting-Studien haben gezeigt, dass das Bicoidprotein an fünf homologe Stellen (mit der

Konsensussequenz TCTAATCCC) im hb-Gen stromaufwärts der Promotorregion bindet. Das Hunchback-Protein kontrolliert die Expression mehrerer Gap-Gene (Abb. 28.49c, d): Hohe hb-Proteinkonzentrationen induzieren die Expression von giant. Krüppel wird dagegen dort exprimiert, wo der hb-Level sinkt, knirps wird bei noch kleineren hb-Proteinmengen exprimiert, und giant wird schließlich wieder in Regionen aktiviert, wo überhaupt kein hb-Protein vorkommt. Diese Genexpressionsmuster werden durch zusätzliche Interaktionen stabilisiert und aufrechterhalten. Beispielsweise bindet und aktiviert das Krüppel-Protein die hb-Genpromotoren, inaktiviert aber die knirps-Gene. Im Gegensatz dazu reprimiert das Knirps-Protein die krüppel-Gene. Diese gegenseitige Repression ist wahrscheinlich verantwortlich für die scharfen Abgrenzungen zwischen den verschiedenen Gap-Domänen. Pair-rule-Gene werden in Streifen exprimiert, welche jeweils nur wenige Zellkerne umfassen, und zwar entlang der frühen embryonalen Längsachse (Abb. 28.50). Die Gap-Genprodukte kontrollieren in direkter Weise drei primäre Pair-rule-Gene: hairy, even-skipped (eve) und runt. Die Promotoren der meisten primären Pair-rule-Gene bestehen aus mehreren Modulen, von denen jedes spezielle aktivierende und inhibierende Bindungsstellen für die verschiedenen GapGenproteine besitzt. Dadurch reflektiert die Expression der Pair-rule-Gene die vorhandene Kombination der Gap-Genproteine und es entsteht ein Muster wie bei einem Zebrastreifen. Die Expressionsmuster der primären Pair-ruleGene werden durch gegenseitige Interaktionen stabilisiert, genau wie bei den Gap-Genen. Die primären Pair-rule-Genprodukte induzieren oder inhibieren auch die Expression von fünf sekundären Pair-rule-Genen, zu denen fushi tarazu gehört (ftz; japan.: „nicht genügend Segmente“). Wie Walter Gehring zeigen konnte, treten fiz-Transkripte zuerst in den Kernen am corticalen Cytoplasma auf, und zwar während des zehnten Kernteilungscyclus. Bis zum 14. Teilungscyclus (wenn das zelluläre Blastoderm gebildet wird) wird fiz in einem Muster von sieben Ringen (jeder 3-4 Zellen breit) um das Blastoderm exprimiert (Abb. 28.50). Die Expression von acht bekannten Segmentpolaritätsgenen wird durch Pairrule-Genprodukte ausgelöst. Thomas Kornberg zeigte z.B., dass beim 13. Teilungscyclus engrailed (en)-Transkripte sichtbar werden, die aber mehr oder minder gleichmäßig im Embryonalcortex verteilt sind. Da jedoch en hauptsächlich in Kernen mit hohen Eve- oder Ftz-Proteinkonzentrationen exprimiert wird, bilden sich bis zum 14. Cyclus 14 markante Streifen um das Blastoderm (d.h. mit dem halben Abstand verglichen zur fiz-Expression). Auf diese Weise bringt das en-Genprodukt die vordere Hälfte jedes Segments dazu, sich anders als die hintere zu entwickeln. Homöotische Gene steuern die Entwicklung einzelner Körperpartien

Körperteile, die sich analog entwickeln, z.B. Beine und Antennen von Drosophila, entstehen aus fast identischen Strukturbestandteilen; sie unterscheiden sich lediglich in ihrem Aufbau (Abb. 28.50). Die Funktion von Entwicklungsgenen muss also darin bestehen, das Expressionsmuster der Strukturgene zu steuern, und nicht nur diese Gene einfach an- oder abzuschalten. Bei Drosophila findet man die homöotischen Auswahlgene in zwei großen Genfamilien: dem Bithorax-Komplex (BX-C), der die Entwicklung der Thoraxund Abdominalsegmente steuert, und dem Antennapedia-Komplex (ANT-C), der vorwiegend für die Kopf- und Thoraxsegmente zuständig ist. Homozygote Mutationen in BX-C bewirken, dass ein oder mehrere Segmente sich so entwickeln, als würde es sich um ein weiter vorne gelegenes Segment handeln (z.B. Segment

Zellcyclus, Krebs und Apoptose

T3 würde sich wie T2 entwickeln; Abb. 28.48b). Ebenso führt eine vollständige BX-C-Deletion dazu, dass alle Segmente hinter T2 dem T2 ähneln; offensichtlich stellt T2 also eine Art „Entwicklungsgrundzustand“ der distalen Segmente dar. Vermutlich war die Evolution solcher Genfamilien die Voraussetzung für die Entwicklung der Gliederfüßler (des Stammes, zu dem auch Insekten gehören) aus den einfachen Anneliden (segmentierte Ringelwürmer), deren Segmente fast alle gleich sind. Edward B. Lewis stellte nach eingehender genetischer Analyse von BX-C ein Modell für die Segmentdifferenzierung auf (Abb. 28.51). Danach gibt es in BX-C für jedes Segment von T3 bis A8 (Nummer 0-8 in Abb. 28.51) mindestens ein Gen. Angefangen mit dem Segment T3 exprimieren die weiter hinten gelegenen immer mehr BX-C-Gene, bis schließlich im Segment A8 alle diese Gene ausgeprägt werden. Solch ein Genexpressionsmuster könnte aus einem Konzentrationsgradienten (zwischen anterior und posterior) des BX-C-Repressors resultieren. Der Entwicklungsweg eines Segments wird so durch seine relative Position im Embryo bestimmt. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die neun postulierten segmentspezifischen Gene des Lewis-Modells in Wirklichkeit Enhancerelemente für drei BX-C-Gene sind. Bei der Untersuchung des Antennapedia- (Antp-) Gens entdeckten Walter Gehring und Matthew Scott unabhängig voneinander, dass Antp-cDNA sowohl mit dem Antp- als auch mit dem fiz-Gen hybridisiert; demnach haben diese Gene eine gemeinsame Basensequenz. Weitere Experimente zeigten, dass in vielen homöotischen Drosophila-Genen eine ähnliche Sequenz vorkommt, die so genannte Homöodomäne oder Homöobox. Diese Sequenzen sind untereinander zu 70-90% homolog und codieren Polypeptidabschnitte von 60 Resten, die einander noch ähnlicher sind. Weitere Hybridisierungsstudien mit Homöodomänen-Sonden zeigten überraschenderweise, dass Homöodomänen auch in vielen tierischen Genomen vorkommen. Gene mit Homöodomänen bezeichnet man als Hox-Gene. In Wirbeltieren sind sie in Gruppen von 9 bis 11 Genen organisiert, von denen jedes auf einem anderen Chromosom liegt und jeweils mehr als 100 kb umfasst. Dagegen besitzt Drosophila, wie wir gesehen haben, nur zwei Hox-Gruppen. Nematoden (Fadenwürmer) stehen in der Evolution unter den Insekten und haben nur eine HoxGruppe. Die verschiedenen Hox-Cluster und ihre Gene entstanden höchstwahrscheinlich durch Genduplikationen. Hox-Gene codieren Transkriptionsfaktoren

Einige Hox-Gene sind erstaunlich homolog. Die Homöodomänen des AntpGens aus Drosophila und des MM3-Gens aus Fröschen codieren Polypeptide, bei denen 59 von 60 Aminosäuren identisch sind. Da Wirbeltiere (Vertebraten) und Wirbellose (Invertebraten) sich vor über 600 Millionen Jahren getrennt haben, ist es höchst wahrscheinlich, dass die Homöodomänen-Genprodukte eine essentielle Funktion besitzen. Das Polypeptid der Homöodomäne des engrailed-Gens aus Drosophila bindet spezifisch an DNA-Sequenzen, und zwar gerade stromaufwärts der Transkriptionsstartstellen der en- und fiz-Gene. Fusioniert man zudem die Sequenz stromäufwärts des fiz-Gens mit anderen Genen, führt das bei der Expression dieser Gene in Drosophila-Embryonen zum fiz-Streifenmuster (Abb. 28.50). Dies weist darauf hin, dass Gene mit Homöodomänen Transkriptionsfaktoren codieren, welche wiederum die Expression anderer Gene regulieren. Thomas Kornberg und Carl Pabo bestimmten die Röntgenkristallstruktur der 61 Reste langen Homöodomäne des Engrailed-Proteins aus Drosophila im Komplex mit einer 21 bp langen DNA (Abb. 28.52). Die Homöodomäne besteht zum größten Teil aus drei a-Helices; die letzten zwei davon bilden ein HTH-Motiv,

das den HTH-Motiven

24.4B).

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Segmente

Abb. 28.51 Modell für die Differenzierung der Embryonalsegmente von Drosophila. Die Segmente T2, T3 und Al bis A8 sind, wie

im unteren Teil gezeigt, jeweils durch eine charakteristische Kombination aktiver (violette Punkte) und inaktiver (gelbe Punkte) BX-C-Gene gekennzeichnet. Diese Gene (hier von 0 bis 8 nummeriert) werden im Embryo vermutlich von anterior nach posterior nacheinander aktiviert, so dass T2, das

entwicklungsgeschichtlich einfachste Segment, kein aktives BX-C-Gen besitzt, während im

Segment Aß alle diese Gene aktiv sind. [Nach Ingham, P., Trends Genet.1, 113 (1985).]

1164

Regulation der Genexpression

Verständnisfragen zu Abschnitt 4 1. Fassen Sie die Phasen des

Zellcyclus zusammen. Welche Rolle spielen dabei die Cycline? Erläutern Sie, wie p53 und pRb die Bildung von Tumoren unterdrücken. Beschreiben Sie den Vorgang der Apoptose. Fassen sie den Ablauf der Embryogenese in Drosophila zusammen und beschreiben Sie die Funktionen der Substanzen, die diesen steuern.

Abb. 28.52 Röntgenstruktur der Engrailed-Protein-Homöodomäne aus Drosophila im Komplex mit ihrer Ziel-DNA. Das Protein ist in Schleifenform in den Spektralfarben vom N-Terminus (blau) zum C-Terminus (rot) gefärbt. Die DNA ist in Stabform gezeigt und entsprechend ihrer Atom-Typen gefärbt (C grün, N blau, O rot und P orange). Die Basenpaare der TAAT-Sequenz sind mit türkisen C-Atomen hervorgehoben. Aufeinander folgende P-Atome sind über orange Stäbe miteinander verbunden. Zu beachten ist, dass die Erkennungshelix des Proteins, dessen C-terminale Helix

(rot und orange), an die große Furche der DNA gebunden ist und, dass sich das N-terminale Segment des Proteins (blau) in die kleine Furche der DNA hineinschiebt. [Nach einer Röntgenstruktur von Carl Pabo, MIT. PDBid IHDD.] 6% siehe Interactive Exercises.

Abb. 28.53

Expressionsmuster des Hox-3.1-Gens in einem 12,5 Tage alten Mausembryo. Der proteincodierende Teil des Hox-3. 1-Gens wurde

durch das lacZ-Gen ersetzt. Die Regionen dieses transgenen Embryos, die Hoc-3.1 exprimieren, werden sichtbar gemacht, indem der Embryo in

einem

Puffer getränkt wird, der eine Substanz

erhält (X-Gal; Abschnitt 3.5A), die bei der HydroIyse durch ß-Galactosidase (das lacZ-Genprodukt) blau wird. [Mit freundlicher Genehmigung von Philippe Brület, College de France und Institut Pasteur, Paris.)

Die Hox-Gene der Wirbeltiere werden, wie diejenigen in Drosophila, in spezifischen Mustern und zu bestimmten Zeitpunkten während der Embryogenese exprimiert. Das folgende Beispiel konnte zeigen, dass die Hox-Gene die Identität und die weitere Entwicklung embryonaler Zellen direkt bestimmen. Transgenen Mäuseembryonen wurde das Hox-1.1-Gen, das normalerweise nur im Nacken exprimiert wird, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, der gleichmäßig im ganzen Körper verteilt ist. Die entstandenen Mäuse wiesen schwere craniofaciale Abnormalitäten auf, wie z.B. Wolfsrachen, einen zusätzlichen Wirbel und eine Bandscheibe an der Schädelbasis. Einige hatten ein zusätzliches Wirbelpaar in der Nackenregion. Die veränderte Hox-1.1-Genexpression löste also eine homöotische Mutation aus, ein verändertes Entwicklungsmuster, analog denen bei Drosophila (Abb. 28.48). Homozygote Mäuse, deren Hox-3.1-codierende Sequenz durch diejenige von lacZ ersetzt wurde, werden zwar lebend geboren, sterben aber nach wenigen Tagen. Sie weisen schwere Skelettdeformationen auf, wobei mehrere Segmente des Oberkörpers zu Kopfsegmenten transformiert werden. Man kann das Muster der B-Galactosidaseaktivität anhand eines Substratanalogons betrachten, des-

sen Hydrolyseprodukte blau erscheinen (Abb. 28.53). Diese Verteilung weist darauf hin, dass eine Hox-3.1-Deletion zwar die Eigenschaften, nicht aber die Position der Embryonalzellen verändert, die normalerweise Hox-3.1 exprimieren.

Zusammenfassung

Zusammenfassung NE ee Ze 1.

Sequenzdaten genomischer DNA erlauben es, die Gesamtzahl der Gene zu bestimmen, deren vermutliche Funktionen und mögliche Verbindungen zu Krankheiten. Einige Gene sind in Clustern angeordnet, z.B. diejenigen in bakteriellen Operons, rRNA- und tRNA-Gene sowie eukaryotische Histongene.

Die humanen Globin-Gencluster enthalten Gene, die in verschiedenen

Entwicklungsstadien exprimiert werden. Prokaryotengenome enthalten kleine Mengen nicht transkribierter DNA, die Kontrollregionen für Replikation und Transkription enthalten. In den Genomen höherer Eukaryoten kommt viel mehr nicht transkribierte DNA vor, und zwar in Form repetitiver Sequenzen und als Transposon-Überbleibsel. Prokaryotische Genexpression wird auf der Transkriptionsebene kontrolliert. Die Regulation des lac-Operons wird durch die Bindung des lac-Repressors an seine Operatorsequenz vermittelt. Diese Bindung, welche die Operontranskription inhibiert, wird durch einen Induktor aufgehoben. Dieser bindet an den lac-Repressor, wenn Lactose als Substrat für die vom lac-Operon codierten Enzyme vorhanden ist. Bei der Katabolitrepression bindet ein CAP-cCAMP-Komplex bei Glucosemangel an DNA, um die Transkription derjenigen Gene anzukurbeln, die Proteine codieren, welche in den Metabolismus anderer Zucker involviert sind. Attenuierung ist ein Mechanismus, bei dem die translationsabhängige Bildung alternativer mRNA-Sekundärstrukturen in der Operon-Leitsequenz bestimmt, ob die Transkription fortgesetzt oder beendet wird. In einem Riboswitch reguliert die Bindung des Metaboliten an die mRNA die Genexpression. Die Expression der genetischen Information bei Eukaryoten beinhaltet die Neupositionierung von Nucleosomen und die kovalente Modifikation von Histonen als Teil des sogenannten Histon-Codes, der von Regulatorproteinen gelesen wird. Die Methylierung der DNA gestattet eine epigenetische Vererbung. Bei Eukaryoten arbeiten Aktivatoren und Repressoren, die an DNA-Enhancer und -Silencer binden, kooperativ zusammen, um die Geschwindigkeit der Transkriptionsinitiation zu regulieren. Einige dieser Transkriptionsfaktoren werden durch Hormonsignale aktiviert. Die eukaryotische Genexpression kann auch durch Veränderung der Geschwindigkeit des mRNA-Abbaus und durch die Regulation der Translationsinitiation gesteuert werden. RNA-Interferenz ist ein posttranskriptionaler Weg zur Genstilllegung, bei dem doppelsträngige RNA den selektiven Abbau komplementärer mRNA steuert. 10. Die Antikörpervielfalt resultiert aus der somatischen Rekombination. Diese beinhaltet die Umordnung von Gengruppen, welche die Segmente der leichten und schweren Immunglobulinketten codieren. Die Vielfalt wird durch ungenaues Verbinden von V/D/J und durch somatische Hypermutation noch erhöht. like Der eukaryotische Zellcyclus wird von cyclinabhängigen Kinasen gesteuert, zu deren Zielstrukturen die Tumorsuppressoren p53 und pRb gehören. p53 fungiert als Transkriptionsaktivator, der eine Vielzahl pathologischer Zustände wie z.B. DNA-Schäden entdeckt und daraufhin den Zellcyclus anhält, beziehungsweise, falls der Schaden nicht reparabel ist, die Apoptose (den programmierten Zelltod) einleitet. 1122 Extrazelluläre oder intrazelluläre Signale können die Apoptose auslösen, einen von der Zelle selbst ausgelösten Zelltod. Dies erfordert die Aktivität

verschiedener Caspasen.

1165

1166

Regulation der Genexpression

13. Die Entwicklung des Drosophila-Embryos wird durch maternale Effektgene kontrolliert, welche die Polarität des Embryos bestimmen. Gap-, Pair-ruleund Segmentpolaritätsgene spezifizieren die Anzahl und Polarität der embryonalen Körpersegmente. Homöotische Auswahlgene (Hox-Gene) codieren Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von Genen regulieren und somit die Zelldifferenzierung steuern. Hox-Gene regulieren in ähnlicher Weise die Entwicklung bei Wirbeltieren.

Wichtige Begriffe Genexpression Genomik C-Wert

C-Wert-Paradoxon ORF EST

CpG-Insel Waisengen ncRNA SNP Gencluster Centromer genetische Antizipation hochrepetitive DNA

STR mittelrepetitive DNA egoistische DNA Induktor Repressor Operator

Katabolitrepression Corepressor Leitsequenz

Attenuierung Aptamer

RNAi siRNA

Riboswitch Heterochromatin Euchromatin Chromatin umgestaltende Komplexe

somatische Rekombination somatische Hypermutation Zellcyclus Cyclin

Barr-Körperchen HMG-Protein

Tumorsuppressor Apoptose

Histon-Code HAT Bromodomäne Chromodomäne Epigenetik Prägung (Imprinting) Enhancer Silencer Enhanceosom Squelching Isolator STAT Hormon-Response-Element Nonsense-vermittelter Abbau

Nekrose Caspase Syncytium Blastoderm Gastrulation Imaginalscheibe maternale Effektgene Segmentierungsgene Gap-Gene Pair-rule-Gene Segmentpolaritätsgene homöotisches Auswahlgen Morphogen Homöodomäne

Antisense-RNA

Hox-Gen

Aufgaben 1. Aus einem Organismus isolierte DNA kann durch Scheren in Fragmente gleicher Größe (ca. 1000 bp) zerlegt, zur Strangtrennung erhitzt und anschließend wieder abgekühlt werden, damit die Komplementärstränge sich wieder verbinden. Diese Renaturierung kann verfolgt werden. Erklären Sie, warum die Renaturierung der E. coli-DNA ein einphasiger Prozess, die Renaturierung humaner DNA jedoch ein zweiphasiger ist (eine schnelle initiale Phase, gefolgt von einer langsameren). Erklären Sie, warum eine Genorganisation in Operons die Aufklärung der Funktion von zuvor unidentifizierten ORFs in einem Bakteriengenom erleichtert. Erklären Sie, warum (a) die O,-Sequenzinaktivierung des lac-Operators beinahe vollständig die Repression des lac-Operons aufhebt, (b) O,- oder O;-Inaktivierung lediglich einen zweifachen Verlust an Repressionswirkung zur Folge hat und (c) eine O,- und O;-Inaktivierung die Repression ca. 70fach reduziert.

4. Wieso zeigen E.coli-Zellen mit defektem lacZ-Gen keine Galactosid-Permease-Aktivität nach einer Lactosezugabe in Abwesenheit von Glucose? Beschreiben Sie den wahrscheinlich vorliegenden genetischen Defekt, wenn die lac-Operonempfindlichkeit auf Glucoseabwesenheit fehlt, aber andere metabolische Operons noch immer auf Glucosemangel reagieren. . Wieso kann die eukaryotische Transkription nicht durch Attenuierung reguliert werden? Sagen Sie den Effekt voraus, der eintritt, wenn die

Peptidleitsequenz zur trp-Operonregulierung deletiert wird. Rot-Grün-Blindheit wird durch einen X-Chromosomgekoppelten Gendefekt verursacht. Somit haben Frauen selten den Phänotyp der Rot-Grün-Blindheit, sie können aber Träger des defekten Gens sein. Wenn ein dünner Strahl roten oder grünen Lichts auf bestimmte Flächen der Netzhaut einer Trägerin projiziert wird, kann sie die beiden Farben leicht unterscheiden, sie hat aber auf anderen Bereichen der Netzhaut damit Schwierigkeiten. Geben Sie eine Erklärung dafür.

Literatur

9. Zeichen Sie die Molekülformeln der kovalent modifizierten Histonseitenketten Acetyllysin, Methyllysin und Methylarginin. Wie verändern diese Modifikationen die chemischen Eigenschaften der Seitenketten? 10. Erklären Sie, warum ein Mangel des Vitamins Folsäure zur Untermethylierung von Histonen und DNA führen könnte. 11. Die Monomethylierung von Histon-Arg-Resten lässt sich durch die Tätigkeit einer Peptidylarginin-Desiminase umkehren, die unter Verwendung eines Wassermoleküls die Methylgruppe mitsamt der Iminogruppe abspaltet. Zeichnen Sie die Struktur der sich ergebenden Aminosäureseitenkette und benennen Sie diese NichtstandardAminosäure. 12. Warum ist transkriptionsaktives Chromatin etwa 10-mal empfänglicher für die Spaltung durch DNase I als transkriptionsinaktives Chromatin? 13. Kann ein Transkriptions-Verstärker (Enhancer) in der proteincodierenden Sequenz eines Gens lokalisiert sein? Warum? 14. Erklären Sie, warum die natürliche Selektion instabile mRNA favorisiert.

1167

15. Warum wäre RNAi ein weniger effizienter Mechanismus zur Regulation der Expression bestimmter Gene, wenn Dicer doppelsträngige RNA anstatt nach jeweils 11 bp nach jeweils 22 bp hydrolysieren würde? Erklären Sie dies. 16. Wie viele verschiedene variable Regionen der schweren Kette können theoretisch durch somatische Rekombination beim Menschen generiert werden (ohne Berücksichtigung der Flexibilität der Verbindungen)? Wenn sich jede dieser schweren Ketten mit jeder der etwa 2000 leichten x-Ketten verbinden würde, wie viele verschiedene Immunglobuline könnten dann gebildet werden? 17. Die V/D/J-Rekombination ergibt häufig ein Gen, dessen mRNA nicht zu einer Immunglobulinkette translatiert werden kann. Welcher Aspekt der somatischen Rekombination ist wahrscheinlich für eine solche nicht translatierbare Gensequenz verantwortlich? 18. Warum ist es für einzellige Eukaryoten wie Hefe nachteilig, sich der Apoptose zu unterziehen? 19. In Drosophila entwickelt sich eine esc"-homozygote Larve normal, wenn die Mutter ebenfalls für esc homozygot ist. Warum?

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4

TEILVI

Anhänge

Glossar Zahlen und griechische Buchstaben erscheinen im Alphabet entsprechend ihrer Aussprache

Zentrum eines Enzyms reagiert und so zu deren Identifizierung genutzt werden kann.

Agarose. Von Rotalgen produzierte, ein lockeres Netz bildende lineare Kohlenhydratpolymere. A. Siehe Absorption.

Agarosegel-Elektrophorese. Siehe Gelelektrophorese.

A-Stelle. Siehe Aminoacyl-Stelle.

Agonist. Substanz, die an einer Rezeptor bindet, um eine zelluläre Antwort hervorzurufen.

aa-{RNA. Siehe Aminoacyl-tRNA.

aaRS. Siehe Aminoacyl-tRNA-Synthetase. ABC-Transporter. Eine große Familie transmembraner Proteine, die den ATP-abhängigen Transport von polaren oder unpolaren Substanzen über die Membran hinweg vermitteln. ABO-Blutgruppenantigene. Oligosaccharidkomponenten von Glykolipiden auf der Oberfläche von Erythrocyten und anderen Zellen.

Absolute Konfiguration. Räumliche Anordnung chemischer Gruppen um ein chirales Zentrum. Absorption (A). Funktion der Menge Licht (N), die durch eine Lösung übertragen wird im Verhältnis zum einfallenden Licht (I,) bei einer vorgegebenen Wellenlänge: A = log(I,/I). Auch optische Dichte genannt. Absorptionsvermögen (e). Eine Konstante, die die Absorption einer Lösung mit der Konzentration des gelösten Stoffs bei einer vorgegebenen Wellenlänge in Verbindung setzt. Auch Extinktionskoeffizient genannt. Acidose. Pathologischer Zustand, bei dem der pH-Wert von Blut unter seinen Normalwert von 7,4 abfällt. Acyl-carrier-Protein. Phosphopantethein-enthaltendes Protein, das die Intermediate der Fettsäuresynthese als Thioester bindet.

Acylgruppe. Strukturelement der Formel R-CO-, wobei R ein Alkyl- oder Arylrest ist. Adenylat-Cyclase-System. Signaltransduktionsweg, bei dem ein Hormon durch Bindung an einen Zelloberflächenrezeptor ein G-Protein aktiviert,

das seinerseits die Adenylat-Cyclase zur Synthese des sekundären Botenstoffs 3’,5’-cyclisches AMP (cAMP) aus ATP stimuliert.

Adenylierung. Anfügen eines Adenylrests (AMP). Adipozyte. Fettzelle, die auf die Synthese und Speicherung von Triacylglycerinen aus freien Fettsäuren spezialisiert ist. ADP-ATP Translokator. Membrantransportprotein mit einer Adeninnucleotid-Bindungsstelle, die abwechselnd ADP in die mitochondriale Matrix eintreten und ATP die mitochondriale Matrix verlassen läßt. Adrenorezeptor. Zelloberflächenrezeptor, der Nebennierenhormone wie Adrenalin und Noradrenalin bindet und auf diese Hormone reagiert. Auch adrenerger Rezeptor genannt. Aerobier. Organismus, der Sauerstoff als Oxidationsmittel für den Abbau von Nährstoffen verwendet.

Affinitätschromatographie. Verfahren, bei dem ein Molekül auf Grund seines Vermögens, spezifisch an einen immobilisierten Liganden zu binden, von einem Gemisch anderer Moleküle getrennt wird. Affinitätsmarkierung. Technik, bei der eine markierte substratanaloge Verbindung irreversibel mit einer funktionellen Gruppe im aktiven

Aktionspotential. Welle von vorübergehender Depolarisierung und Repolarisierung, die das elektrische Signal bildet, das von einer Nervenzelle erzeugt wird. Aktiver Transport. Endergoner Transport einer Substanz durch eine Membran von niedriger zu hoher Konzentration, der durch ein Protein katalysiert wird, das ihn mit einem exergonen Prozess, wie z. B. ATPHydrolyse, koppelt. Aktives Zentrum. Bereich eines Enzyms, in dem die Katalyse abläuft.

Akzeptorstamm. Basengepaarte Region eines tRNA-Moleküls, die das 5’-Ende und das 3’-Ende, an das die Aminosäure angeheftet ist, enthält. Akzessorisches Pigment. Molekül im photosynthetischen System, das Licht bei anderen Wellenlängen als Chlorophyll absorbiert. Auch Hilfspigment genannt. Alditol. Ein aus einer Aldose oder Ketose durch Reduktion zu einem

Polyhydroxyalkohol gebildeter Zucker.

Aldolspaltung. Kohlenstoff-Kohlenstoff-Spaltungsreaktion eines Aldols (ein Aldehyd oder Keton mit einer ß-Hydroxygruppe), bei der kleinere Carbonylverbindungen entstehen. Aldonsäure. Zucker, der aus einer Aldose durch Oxidation der Aldehydgruppe zu einer Carboxylgruppe gebildet wird. Aldose. Zucker mit einer Aldehyd-Carbonylgruppe. Alkalische Lösung. Lösung, deren pH-Wert größer als 7,0 ist

((H*] < 107 M). Alkalose. Pathologischer Zustand, bei dem der Blut-pH-Wert über seinen Normalwert von 7,4 ansteigt.

Alkoholische Gärung. Stoffwechselweg, bei dem durch Decarboxylierung und Reduktion aus Pyruvat Ethanol gebildet wird. Allel. Alternierende Form eines Gens; diploide Organismen enthalten zwei Allele eines jeden Gens, die identisch sein können oder auch nicht. Allgemeine Basenkatalyse. Katalysemechanismus, bei dem der partielle Entzug von Protonen durch eine Base die Freie Enthalpie des Übergangszustands einer Reaktion erniedrigt. Allgemeine Säurekatalyse. Katalysemechanismus, bei welchem eine partielle Verschiebung von Protonen einer Säure die Freie Enthalpie des Übergangszustands einer Reaktion erniedrigt.

Allgemeiner Transkriptionsfaktor (GTF). (engl.: general transcription factor) Eines der für die Synthese aller mRNAs erforderlichen eukaryotischen Proteine.

Allosterische Wechselwirkung. Bindung eines Liganden an einer bestimmten Stelle eines Makromoleküls, welche die Bindung anderer Liganden an anderen Stellen im Molekül beeinflusst. Siehe auch kooperative Bindung.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt "or."l.ı 7A

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Glossar Allosterischer Effektor. Kleines Molekül durch dessen Bindung an ein Protein die funktionellen Eigenschaften einer anderen Stelle des Proteins _

beeinflusst werden.

aa-Motiv. Proteinmotiv, das aus zwei a-Helices, die mit geneigten Achsen gegen einander gepackt sind.

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Amphiphile Verbindung. Verbindung, die sowohl polare als auch apolare Regionen enthält und daher sowohl hydrophil als auch hydrophob ist. Auch als amphipathische Verbindung bezeichnet.

a-Aminosäure. Siehe Aminosäure.

Amyloid. Unlösliche extrazelluläre Aggregate fibröser Proteine, die charakteristisch sind für Krankheiten wie die Alzheimer-Krankheit und übertragbare spongiforme Enzephalopathie.

a-Anomer. Siehe Anomere.

Anabolismus. Reaktionen, bei denen aus einfacheren Verbindungen

a/ß-Fass. Ein ß-Fass (engl.: B-barrel), bei dem aufeinander folgende, parallele B-Stränge so über a-Helices verbunden sind, dass ein Zylinder

Biomoleküle synthetisiert werden.

von a-Helices das ß-Fass umgibt.

Anaerobier. Organismus, der für den Nährstoffabbau kein O, als Oxidationsmittel verwendet. Ein obligater Anaerobier kann in Gegenwart von

a-Glykosid. Siehe Glykosid.

O, nicht wachsen, während ein fakultativer Anaerobier dies sowohl in Anals auch Abwesenheit von O, kann.

e-Helix. Reguläre Sekundärstruktur von Polypeptiden mit 3,6 Resten pro rechtsgängiger Windung, einer Ganghöhe von 0,54 nm und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen jeder N-H-Gruppe des Rückgrats und der C=O-Gruppe des Rückgrats vier Reste zuvor. a-Kohlenstoff. Kohlenstoffatom einer a-Aminosäure an welches die

Amino- und die Carboxylgruppe gebunden sind.

a-Zelle. Pankreatische Inselzelle, die bei niedrigen Glucosewerten im Blut das Hormon Glucagon sekretiert. Alternatives Spleißen. Gewebespezifische Spleißmuster einer vorgegebenen prä-mRNA, die zu Veränderungen der Excision und Retention von Exons und Introns führen. Alzheimer Krankheit. Neurodegenerative Krankheit, die durch eine

Ablagerung von B-Amyloidprotein im Gehirn gekennzeichnet ist. Ames-Test. Methode zur Einschätzung der Mutagenität einer Verbindung anhand der Fähigkeit, die Reversion genetisch defekter Bakterienstäimme zu normalem Wachstum auszulösen.

Amidgruppe. Teil eines Moleküls mit der Formel -CONH-. Aminoacyl-Stelle (A-Stelle). Stelle des Ribosoms, an die eine tRNA mit der angehefteten Aminoacylgruppe während der Proteinsynthese bindet.

Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA). Kovalenten Esterkomplex zwischen einer „aktivierten“ Aminosäure und einem tRNA-Molekül. Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS). Enzym, das die ATP-abhängige Veresterung einer Aminosäure und einer tRNA mit hohen Spezifität für die Aminosäure und das tRNA-Molekül katalysiert. Aminoende. Ende eines Polypeptids, das eine freie Aminogruppe aufweist. Auch N-Terminus genannt. Aminogruppe. Molekülteil der Formel -NH,, -NHR oder -NR,, wobei R

ein Alkyl- oder Arylrest ist. Aminogruppen liegen bei physiologischem pH-Wert normalerweise protoniert vor. Aminosäure. Verbindung, die aus einem Kohlenstoffatom besteht, an

dem eine primäre Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Seitenkette (R-Gruppe) und ein H-Atom gebunden sind. Wird auch als a-Aminosäure bezeichnet.

Anämie. Zustand, der durch unzureichende rote Blutzellen verursacht wird.

Anaplerotische Reaktion. Reaktion, die Intermediate eines Stoffwechselwegs ergänzt.

Androgen. Steroid, das in erster Linie als männliches Sexualhormon fungiert. Angina. Schmerzen in der Brust, hervorgerufen durch ungenügende Versorgung des Herzens mit roten Blutzellen. Anionenaustausch. Chromatographisches Verfahren, bei dem anionische Moleküle an eine kationische Matrix binden. Annealing. Zusammenlagern komplementärer Einzelstränge von Polynucleotiden unter Bedingungen, die eine lockere, reversible Basenpaarung erlauben.

Anomere. Zucker, die sich nur in der Konfiguration am anomeren Kohlenstoff unterscheiden. Beim a-Anomer befindet sich die OH-Gruppe des anomeren Kohlenstoffs auf der Ringseite gegenüber der CH,OH-Gruppe des chiralen Zentrums, durch welches die D- oder 1-Konfiguration gekennzeichnet wird. Beim B-Anomer befindet sich die OH-Gruppe auf der gleichen Seite. Anomerer Kohlenstoff. Carbonylkohlenstoff eines Monosaccharids, der ein chirales Zentrum bildet, wenn der Zucker zu einem Halbacetal oder

Halbketal cyclisiert.

Anorganische Verbindung. Verbindung, die keinen Kohlenstoff enthält. Antagonist. Substanz, die an einen Rezeptor bindet, aber keine zelluläre Antwort auslöst. Antennen-Chlorophyll. Chlorophyligruppe, die Lichtenergie absorbiert und sie über Exciton-Transfer auf ein Photosynthese-Reaktionszentrum überträgt. Anti-Konformation. Purin- oder Pyrimidinnucleotidkonformation, in der

die Ribose und die Base von einander weg zeigen. Siehe auch Syn-Konformation. Anticodon. Aus drei Nucleotiden bestehende Sequenz in tRNA, welche durch komplementäre Basenpaarung ein mRNA-Codon erkennt.

Aminozucker. Zucker, bei welchem eine oder mehrere OH-Gruppen durch eine, oft acetylierte Aminogruppe ersetzt sind.

Anticodonarm.

Amphibol. Begriff zur Beschreibung eines Stoffwechselwegs, der sowohl katabol als auch anabol sein kein.

Antigen. Substanz, die beim Eindringen in einen tierischen Organismus eine Immunantwort auslöst (Bildung von Antikörpern). Sie wird durch einen Antikörper spezifisch erkannt.

Amphipathische Verbindung. Siehe amphiphile Verbindung.

Konservierte Stamm-Schleifen-Struktur in einem tRNA-

Molekül, die das Anticodon enthält.

Antikörper. Protein, das durch das tierische Immunsystem als Antwort auf das Eindringen eines Fremdkörpers (Antigen) gebildet wird. Es ent-

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Glossar

hält mindestens je ein Paar identische, schwere und leichte Ketten. Auch

ATP-Synthase. Siehe F,Fo-ATPase.

als Immunoglobulin (Ig) bezeichnet.

ATPase. Enzym, das die Hydrolyse von ATP zu ADP + P; katalysiert.

Antioxidans. Substanz, die ein oxidierendes freies Radikal wie O5: oder

Attenuator. Kontrollelement bei Prokaryoten, das die Transkription eines Operons entsprechend der Verfügbarkeit der Aminosäure steuert, welche durch die in dem Operon codierten Proteine synthetisiert wird.

OH:

zerstört.

Antiparallel. In entgegengesetzte Richtungen verlaufend. Antiport. Gleichzeitiger Transport zweier Moleküle oder Ionen durch eine Membran in jeweils entgegengesetzte Richtungen. Siehe auch Symport und Uniport.

Attenuierung. Mechanismus zur Regulation der Genexpression in Prokaryoten, bei dem die Verfügbarkeit einer Aminosäure bestimmt, ob

ein Operon (das aus den Genen der Biosyntheseenzyme der Aminosäure

besteht) transkribiert wird.

antisense-RNA. Einzelstängiges RNA-Molekül, das mit einer komplementären mRNA eine doppelsträngige Struktur bildet, und so seine Translation in ein Protein blockiert.

Aussalzeffekt. Abnahme der Löslichkeit eines Proteins (oder eines anderen Moleküls) mit (auf hohem Niveau) zunehmender Salzkonzentration.

antisense-Strang. DNA-Strang, der als Matrize für die Transkription dient. Er ist zu der RNA komplementär. Wird auch nichtcodierender Strang

Autoimmunerkrankung. Erkrankung, bei der das Immunsystem teilweise seine Selbstverträglichkeit verloren hat und Antikörper gegen bestimmte

genannt.

körpereigene Antigene produziert.

AP-Stelle. Purin- oder pyrimidinfreie Stelle in einer Nucleinsäure. Der

Autokatalytische Reaktion. Reaktion, bei der ein Produktmolekül als Katalysator der gleichen Reaktion wirken kann. Somit scheint das reagierende Molekül seine eigene Reaktion zu katalysieren.

Desoxyriboserest, der nach Entfernung einer Base aus einem DNA-Strang

übrig bleibt. Apoenzym. Durch Fehlen von Cofaktoren inaktives Enzym.

Apolipoprotein. Proteinkomponente eines Lipoproteins. Auch als Apoprotein bezeichnet. Apoprotein. Protein ohne die prosthetische Gruppe oder das Metallion, welche es voll funktionsfähig machen. Siehe auch Apoenzym und Apolipoprotein. Apoptose. Programmierter Zelltod, reguliert durch einen Prozess, bei dem die Zelle schrumpft und sich in membrangebundenen Fragmente aufteilt, die von anderen Zellen phagocytiert werden. Aptamer. Nucleinsäure, deren Konformation eine hochspezifische und

hochaffine Bindung eines bestimmten Liganden gestattet. Aquaporin. Tetrameres Membranprotein, das die schnelle Diffusion von Wassermolekülen, aber nicht von Protonen oder anderen Ionen über die Membran vermittelt.

Äquatorialer Substituent. Molekülgruppe, die größtenteils in die Ebene des Rings, an den sie gebunden ist, ragt. Siehe auch axialer Substituent. Archaea. Eine der beiden Hauptgruppen der Prokaryoten. Früher auch als Archaebakterien bezeichnet. (Die andere Hauptgruppe bilden die Bacteria.)

Autolyse. Autokatalytischer Prozess, bei dem ein Molekül seinen eigenen Abbau katalysiert.

Autophosphorylierung. Die kinasekatalysierte Phosphorylierung der Kinase selbst oder die eines identischen Moleküls. Autoradiographie. Eine Methode, bei der ein Röntgenfilm die Position radioaktiven Materials wiedergibt, z. B. von Proteinen oder Nucleinsäuren, die in einer Matrix wie z. B. einer Nitrocellulosemembran oder einem Elektrophoresegel immobilisiert wurden. Autotropher Organismus. Organismus, der alle seine zellulären Bestandteile aus einfachen Molekülen mit Hilfe der Energie aus dem Sonnenlicht (photoautötroph) oder aus der Oxidation anorganischer Verbindungen (chemolithotroph) synthetisieren kann. Axialer Substituent. Eine Gruppe, die senkrecht zur Ebene des Rings, an den sie gebunden ist, angeordnet ist. Siehe auch äquatorialer Substituent.

B-Gedächtniszelle. Typ einer B-Zelle, die Wochen und Jahre, nachdem sie erstmals auf ein Antigen gestoßen ist, das ihr entsprechende Antigen erkennen kann und dann schnell, unter Produktion spezifischer Antikörper, proliferiert. BAC. Siehe künstliches bakterielles Chromosom.

Archaebakterien. Siehe Archaea.

Arteriosklerose. Krankheit, für welche die Bildung cholesterinhaltiger, fibrillärer Ablagerungen in den Blutgefäßwänden charakteristisch ist. Dies führt zu Elastizitätsverlust und zur Verengung der Blutgefäße mit einem Stau der Blutzirkulation.

Bacteria. Eine der zwei Hauptgruppen der Prokaryoten (die andere ist die der Archaea). Auch oft als Eubakterien bezeichnet.

Bakterien. Organismen, die zu den zwei Hauptgruppen der Prokaryoten, den Archaea und den Bacteria gehören. Eine nichtsystematische Bezeichnung.

Assay. Labormethode für die Detektion und gegebenenfalls Quantifizierung eines Makromoleküls oder seiner Aktivität.

Bakteriophage. Für Bakterien typisches Virus. Auch als Phage bezeichnet.

Asymmetrisches Zentrum. Siehe chirales Zentrum.

Barr-Körperchen. Verdichtetes und dunkel gefärbtes inaktives X-Chromosom im Zellkern einer weiblichen Säugerzelle.

Atemnotsyndrom. Atemnot bei frühgeborenen Kindern, die durch Zusammenfallen der Lungenalveolen infolge ungenügender Bildung des Lungen-Surfactants verursacht wird.

Base. (1) Verbindung, die Protonen aufnehmen kann. (2) Purin- oder Pyrimidinkomponente eines Nucleosids, Nucleotids oder einer Nucleinsäure.

Atmen. Konformationelle Flexibilität eines Proteinmoleküls.

ATP-Massenwirkungskoeffizient. Verhältnis [ATP]/[ADP][P;]. Dieses bestimmt die Geschwindigkeit der oxidativen Phosphorylierung und somit auch des Elektronentransports.

Basen-Excisions-Reparatur (BER). Entfernen und Ersetzen eines beschädigten Nucleotids in der DNA, das durch die Entfernung der Base initiiert wird.

Glossar

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Basenpaar. Spezifische, durch Wasserstoffbrückenbindung bewirkte Assoziation von Nucleinsäurebasen. Watson-Crick-Basenpaare sind A-T und GC.

Bioinformatik. Untersuchung biologischer Information in Form von molekularen Sequenzen und Strukturen.

Basische Lösung. Lösung deren pH größer als 7,0 ((H*] < 107 M).

Biopterin. Pterinderivat, das als Cofaktor bei der Hydroxylierung von Phenylalanin zu Tyrosin wirkt.

Basisches Helix-Loop-Helix (bBHLH)-Motiv. Eukaryotisches Proteinmotiv, das eine basische DNA-bindende Region enthält, der sich zwei amphipatische Helices, die durch eine Schleife verbunden sind, anschließen. An die zweite Helix, die die Proteindimerisierung vermittelt, schließt sich oft ein Leucin-Zipper-Motiv an.

Bioverfügbarkeit. Der Anteil eines vom Körper aufgenommenen Arzneistoffs, der sein Zielgewebe erreicht. Dieser hängt von der Dosierung und der Pharmakokinetik des Arzneistoffs ab. Blastoderm. Einzelne Schicht aus Zellen, die einen Eidotter-ähnlichen

Kern umgeben, der sich während der frühen Entwicklung einer

BER. Siehe Basen-Excisions-Reparatur.

Insektenlarve bildet.

Beriberi. Krankheit, die durch Mangel an Thiamin (Vitamin B,) verursacht wird, das eine Vorstufe des Cofaktors Thiaminpyrophosphat ist.

Bohr-Effekt. Die Zunahme der O,-Bindungsaffinität von Hämoglobin in Abhängigkeit vom Anstieg des pH-Werts.

Paß-Motiv. Proteinmotiv, das aus einer a-Helix, die mit zwei parallelen Strängen eines ß-Faltblatts verbunden ist, besteht.

Bösartiger Tumor. Anhäufung von unkonttrolliert proliferierenden Zellen; Krebs.

ß-Anomer. Siehe Anomere.

bp. Basenpaar: die für DNA-Moleküle verwendete Längeneinheit. Tausende von Basenpaare (Kilobasenpaare) werden mit kb abgekürzt.

ß-Beule. (engl.: B-bulge) Unregelmäßigkeit in einem ß-Faltblatt, die durch einen zusätzlichen Rest entsteht, der keine Wasserstoffbrückenbindung zu einer benachbarten Kette bildet.

ß-Faltblatt. Regelmäßige Sekundärstruktur, bei der langgestreckte Polypeptidketten zwischen den Strängen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden. In parallelen ß-Faltblättern laufen alle Polypeptidketten in die gleiche Richtung, in antiparallelen ß-Faltblättern weisen benachbarte Polypeptidketten in entgegengesetzte Richtungen. ß-Fass. Proteinmotiv, das aus einem zu einem Zylinder gerollten ß-Faltblatt besteht.

Bradford-Assay. Spektroskopische Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration einer Lösung aus der Absorption eines an das Protein gebundenen Farbstoffs. Bromodomäne. Proteinmodul, das acetylierte Lysinreste in Histonen bindet.

C2'-endo. Ribosekonformation, bei der C2’ auf die selbe Seite des Rings verschoben wird wie C5’.

ß-Glykosid. Siehe Glykosid.

C3’-endo. Ribosekonformation, bei der C3’ auf die selbe Seite des Rings verschoben wird wie C5’.

ß-Haarnadel. (engl.: B-hairpin) Proteinmotiv, bei dem zwei antiparallele B-Stränge über eine Umkehrschleife verbunden sind.

in C3-Verbindungen akkumulieren.

ß-Kehre. (engl.: ß-bend) Siehe Umkehrschleife.

C,-Pflanzen. Pflanzen, deren Photosynthese auf CO, angewiesen ist, das

ß-Oxidation. Abfolge enzymkatalysierter Reaktionen, bei der Fettsäuren fortschreitend durch die Entfernung von C,-Einheiten (in Form von Acetyl-CoA) abgebaut werden. ß-Zelle. Pankreatische Inselzelle. Sekretiert das Hormon Insulin als

Antwort auf hohe Glucosespiegel im Blut. Beugungsmuster. Aufzeichnung von Interferenzen der von einem Objekt gestreuten Strahlung. In der Röntgenkristallographie geschieht dies in Form einer Reihe diskreter Flecken, die aus der Streuung eines gebündelten Röntgenstrahls an einem Einkristall resultieren. bHLH-Motiv. Siehe basisches Helix-Loop-Helix-Motiv.

Bindungswechsel-Mechanismus. Mechanismus, nach dem die Untereinheiten der F}Fo-ATP-Synthase drei aufeinander folgende Konformationen Die Konformations-

änderungen werden durch die Dissipation des transmembranen Protonengradienten bewirkt. Biochemischer Standardzustand. Eine Reihe von Randbedingungen, zu denen die Aktivität der betroffenen Spezies, eine Temperatur von 25 °C, ein Druck von 1,01 X 10° Pa und ein pH-Wert von 7,0 gehören.

Biofilm. Oberflächenassoziierte Aggregate bakterieller Zellen und extrazellulärer Polysaccharide, die die Bakterien vor Umwelteinflüssen schützen.

durch Bildung von Oxalacetat (einer C,-Verbindung) akkumuliert wird. C-Ierminus. Siehe Carboxylende.

C-Wert. Maßeinheit für die Menge des genetischen Materials, das für einen Organismus einzigartigen ist.

C-Wert-Paradoxon. Ausnahmen von der Regel, dass die Menge des für einen Organismus typischen genetischen Materials (sein C-Wert) mit der Komplexität seiner Morphologie und seines Stoffwechsels korreliert. Cahn-Ingold-Prelog-System (RS-System). System zur eindeutigen Beschreibung der Konfiguration von Molekülen mit ein oder mehreren

asymmetrischen Zentren, wobei den Substituenten eines jeden asymmetrischen Zentrums eine Rangordnung zugewiesen wird.

Bilayer. Siehe Lipiddoppelschicht.

einnehmen, um ADP + P; in ATP umzuwandeln.

C;-Pflanzen. Pflanzen, die das aufgenommene CO, in der Photosynthese

Calmodulin (CaM). Kleines Ca’*-bindendes Molekül, das in Gegenwart von Ca°’* an andere Proteine bindet und dabei ihre Aktivität reguliert. Calvin-Cyclus. Abfolge der Dunkelreaktionen der Photosynthese, in denen Ribulose-1,5-bisphosphat carboxyliert, in C,-Vorstufen von Kohlenhydraten umgewandelt und wieder regeneriert wird. CaM. Siehe Calmodulin. CAM. Siehe Crassulaceen-Säurestoffwechsel.

cAMP. 3',5'-cyclisches AMP, ein intrazellulärer sekundärer Botenstoff. Carbamat. (Salz der Carbamidsäure) Produkt der Reaktion von CO, mit einer Aminogruppe: -NH-COO..

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Glossar

Carbonylgruppe. Molekülteil mit der Formel >C=0. Carboxylende. Das Ende eines Polypeptidmoleküls, welches eine freie Carboxylgruppe aufweist. Auch als C-Terminus bezeichnet.

Chromodomäne. Proteinmodul, das methylierte Lysinreste in Histonen bindet. Chromophor. Lichtabsorbierende Gruppe oder Molekül.

Carboxylgruppe. Molekülteil der Formel -COOH. Carboxylgruppen liegen bei physiologischem pH-Wert üblicherweise ionisiert vor.

Chromosom. Komplex aus Protein, RNA und einem einzelnen DNAMolekül, das einen Teil oder das ganze Genom eines Organismus

Carcinogen. Agens, das DNA durch Auslösen von Mutationen schädigt, und so zu unkonttrollierter Zellproliferation (Krebs) führt.

umfasst.

Caspase. Heterotetramere Cysteinprotease, die zelluläre Proteine einschließlich Caspase-Zymogene als Teil des Apoptoseprozesses hydrolysiert

Triacylglycerine und Cholesterin vom Darm in die Gewebe transportieren.

Catenane. Circuläre DNA-Moleküle, die wie die Glieder einer Kette

verknüpft sind.

CCAAT-Box. Ungefähr 70 bis 90 Nucleotide stromaufwärts des Transkriptionsstarts befindliches, eukaryotisches Promotorelement mit der Konsensussequenz CCAAT.

cDNA. Siehe komplementäre DNA

CE. Siehe Kapillarelektrophorese. Centromer. Region eukaryotischer Chromosomen, die bei der Zellteilung den Anheftungspunkt für die Mitosespindel darstellt. Sie enthält hohe Anteile repetitiver DNA. Ceramid. An der Aminogruppe acyliertes Sphingosinderivat. Cerebrosid. Ceramid mit einem Zuckerrest als Kopfgruppe. Chaotropes Reagens. Substanz, welche die Löslichkeit apolarer Stoffe in Wasser erhöht und dadurch zur Denaturierung von Proteinen neigt.

Chaperon. Siehe Molekulares Chaperon. Chargaff-Regel. Die zuerst von Erwin Chargaff gefundene Tatsache, dass DNA jeweils die gleiche Anzahl von Adenin- und Thyminresten einerseits und von Guanin- und Cytosinresten andererseits aufweist.

Chemiosmotische Theorie. Postulat, dass die Freie Elektronentransports in der Ausbildung eines über genden Protonengradienten gespeichert wird. Das Potential dieses Gradienten wird als Triebkraft für

Enthalpie des die Membran anlieelektrochemische die ATP-Synthese

genutzt.

Chylomikronen. Lipoproteinpartikel, die aus der Nahrung stammende Cis-Konformation. Anordnung einer Peptidgruppe in der aufeinander folgende C,-Atome auf der selben Seite der Peptidbindung liegen.

Cis-Peptidbindung. Konformation, bei der aufeinander folgende C,-Atome auf der gleichen Seite der Polypeptidkette liegen.

Cistron. Veraltete Bezeichnung für ein Gen. Citratcyclus. Folge von acht, in einem Cyclus angeordneten enzymatischen Reaktionen, bei der aus der Oxidation der Acetylgruppe von AcetylCoA zu CO, Freie Enthalpie in Form von ATP, NADH und FADH; gewonnen wird. Auch als Krebs-Cyclus oder Tricarbonsäure-(TCA-)Cyclus bezeichnet. Clathrin. Dreisträngiges Protein, das polymerisiert und eine polyedrische Struktur bildet, die die Form membranöser Vesikel festlegt, die zwischen der Plasmamembran und intrazellulären Organellen wie dem GolgiApparat hin und her wandern. Codierender Strang. Siehe Sinnstrang. Codon. Für nur eine Aminosäure spezifische Sequenz von drei Nucleotiden in DNA oder RNA. Coenzym. Kleines, organisches Molekül, das für die katalytische Aktivität eines Enzyms benötigt wird. Ein Coenzym kann entweder ein Cosubstrat oder eine prosthetische Gruppe sein. Coenzym Q. Isoprenoid, das in Elektronentransportwegen als fettlöslicher Elektronenüberträger fungiert. Auch Ubiquinon genannt.

Cofaktor. Kleines organisches Molekül (Coenzym) oder Metallion, das für die katalytische Aktivität eines Enzyms erforderlich ist.

Chemisches Potential. Partielle molare freie Enthalpie einer Substanz.

Cointegrat. Als Intermediat bei Transpositionsvorgängen auftretendes Fusionsprodukt aus zwei Plasmiden.

Chembolithotroph. Autotropher Organismus, der seine Freie Enthalpie aus der Oxidation anorganischer Verbindungen bezieht.

Corepressor. Substanz, die mit einem Repressorprotein reagiert, um eine

Chimäre. Siehe Rekombinante

Gentranskription zu blockieren.

Chirales Zentrum. Atom, dessen Substituenten so angeordnet sind, dass es mit seinem Spiegelbild nicht zur Deckung gebracht werden kann. Auch als asymmetrisches Zentrum bezeichnet.

Cori-Cyclus. Stoffwechselweg, bei dem durch Glykolyse in den Muskeln produziertes Lactat über den Blutstrom in die Leber transportiert und dort zur Gluconeogenese verwendet wird. Die gebildete Glucose wird wieder zurück in die Muskeln transportiert.

Chiralität. Eigenschaft asymmetrisch zu sein. Ein asymmetrisches Molekül kann mit seinem Spiegelbild nicht zur Deckung gebracht werden.

Cosubstrat. Coenzym, das nur vorübergehend an das Enzym gebunden wird und somit wie ein Substrat fungiert.

Chloroplasten. Pflanzenorganellen, in denen die Photosynthese abläuft.

CpG-Insel. Cluster von CG-Dinucleotiden, die strangaufwärts von vielen Wirbeltiergenen liegen. Solche Sequenzen kommen an einem anderen Ort im Genom nur mit einem Fünftel ihrer zufällig erwartenen Häufigkeit vor.

Chromatin. Komplex von DNA und Protein, aus dem eukaryotische Chromosomen bestehen.

Chromatin umgestaltender Komplex. Ein aus mehreren Untereinheiten bestehendes ATP-abhängiges eukaryotisches Protein, das DNA-HistonWechselwirkungen vorübergehend unterbricht, so dass sich die Zugänglichkeit der DNA in Nucleosomen ändert. Chromatographie. Technik zur Trennung der Komponenten eines Molekülgemischs auf Basis ihrer Verteilung zwischen einer mobilen Lösungsmittelphase und einer porösen Matrix (stationäre Phase).

Crassulaceen-Säurestoffwechsel (CAM). (engl.: Crassulacean acid metabolism) Variante des photosynthetischen C,-Cyclus, bei der CO, vorübergehend als Malat gespeichert wird.

Creutzfeldt-Jakob-Krankheit. BSE-ähnliche, neurodegenerative Krankheit beim Menschen. Cristae. Einstülpungen der inneren Mitochondrienmembran.

Glossar

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Crosstalk. Interaktion verschiedener Signaltransduktionswege durch (1) Aktivierung der gleichen Signalkomponenten, (2) Erzeugung eines gemeinsamen sekundären Botenstoffs oder (3) durch ähnliche Phosphorylierungsmuster am Zielprotein.

Diabetes bezeichnet) oder aber der Körper nur unzureichend auf das eirculierende Insulin anspricht (Typ-Il-, insulinunabhängiger oder Erwachsenen-Diabetes). Diabetes ist durch erhöhte Glucosespiegel im Blut gekennzeichnet.

Cyanose. Bläuliche Färbung der Haut. Zeigt die Anwesenheit von Desoxyhämoglobin im arteriellen Blut an.

kleiner als die Poren einer semipermeablen Membran sind, in freiem

Cyclin. Mitglied einer Familie von Proteinen, die an der Regulation der Zellcyclusstadien beteiligt sind. Ihre Konzentrationen variieren im Laufe des Zellcyclus dramatisch.

Austausch mit einem großvolumigen Medium stehen, während größere, gelöste Stoffe zurückgehalten werden. Dadurch wird die Lösung, in der die größeren Moleküle gelöst sind, ausgetauscht.

Cyclische Symmetrie. Symmetrieart, bei der die asymmetrischen Elemente eines symmetrischen Objekts über nur eine Rotationsachse miteinander in Verbindung stehen. Cytochrom. Redoxaktives, elektronentransportierendes Protein mit Häm (Fe enthaltend) als prosthetischer Gruppe.

Cytochrom P450. Häm-enthaltende Monooxygenasen, die die Anlagerung von OH-Gruppen an Arzneistoffe und Toxine katalysieren, um diese zu entgiften und ihre Ausscheidung zu erleichtern. Cytoplasma. Vollständiger Inhalt einer Zelle mit Ausnahme des Zellkerns.

Cytoskelett. Intrazelluläres Fasergeflecht, das der Zelle Gestalt und strukturelle Festigkeit verleiht. Cytosol. Inhalt einer Zelle (Cytoplasma) mit Ausnahme ihres Zellkerns und anderer membranumschlossener Organellen.

Dialyse. Verfahren bei dem das Lösungsmittel und gelöste Stoffe, die

Diät-induzierte Thermogenese. Siehe Thermogenese. Diazotroph. Stickstofffixierendes Bakterium. Dickes Filament. Element eines Sarkomers, das hauptsächlich aus mehreren Hundert Myosinmolekülen besteht. Didesoxymethode. Siehe Kettenabbruchmethode. Dieder-Winkel. Siehe Torsionswinkel. Diedrische Symmetrie. Symmetrieart, bei der asymmetrische Grundeinheiten über eine zweizählige Rotationsachse, die eine andere Rotations-

achse im rechten Winkel schneidet, miteinander in Beziehung stehen. Diffusion. Wanderung von Molekülen durch ungeordnete Bewegung. Diffusionskontrollierter Grenzwert. Theoretische Maximalgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion in Lösung, ungefähr 10° bis

10°. Ms’. Dimer. Assoziat aus zwei, selbst nicht dissoziablen Grundeinheiten

D. Dalton. Einheit der molekularen Masse; 1/12 der Masse eines "’CAtoms.

D-Arm. Konservierte Stamm-Schleifen-Struktur in einem tRNA-Molekül, das üblicherweise die modifizierte Base Dihydrouridin enthält. ddNTP. Abkürzung für ein beliebiges Didesoxynucleosidtriphosphat.

Degenerierter Code. Code, bei dem das gleiche Objekt durch mehr als ein „Wort“ codiert wird. A. siehe Elektronenmotorische Kraft AG. siehe freie Aktivierungsenthalpie A\W. siehe Membranpotential Denaturieren. Zerstören der nativen Konformation eines Polymers.

(Protomeren).

Dinucleotid-Bindungsfaltung. Strukturmotiv von Proteinen, das aus zwei Baßaß-Einheiten besteht, die Dinucleotide, wie z. B. NAD*, binden.

Auch als Rossmann-Faltung (engl.: Rossmann fold) bezeichnet. Dipeptid. Aus zwei Aminosäuren bestehendes Polypeptid.

Diphosphorylgruppe (Pyrophosphatrest). Zwei durch eine Phosphoanhydridbindung verknüpfte Phosphatgruppen (-O;P-O-PO;-)”. Diploid. Mit zwei äquivalenten Chromosomensätzen ausgestattet. Dipolares Ion. Siehe Zwitterion.

Disaccharid. Kohlenhydrat, das aus zwei über eine Glykosidbindung verknüpften Monosacchariden besteht.

Depolarisierung. Verlust des Membranpotentials, der während der elektrischen Signalübertragung in Zellen wie den Neuronen vorkommt.

Dissoziationskonstante (K). Quotient aus den Produkten der Gleichgewichtskonzentrationen dissoziierter Komponenten und denen der Ausgangsverbindungen.

Desaminierung. Entfernung einer Aminogruppe unter Anlagerung von

Disulfidbindung. Kovalente -S-S- Verknüpfung.

Wasser.

DNA. Desoxyribonucleinsäure (engl.: acid; Säure). Ein Polymer von Desoxynucleotiden, dessen Basensequenz in allen lebenden Zellen die

Desaturase. Enzym, das Doppelbindungen in Fettsäuren einfügt.

Desensibilisierung. Anpassung von Zellen oder Organismen an einen Langzeitreiz durch eine abgeschwächte Antwort auf den Reiz. Desoxynucleotid. Siehe Desoxyribonucleotid.

genetische Information trägt. DNA-Chip. Siehe DNA-Microarray.

DNA-Datenbank. Ein Satz klonierter DNA-Fragmente, die einen Teil oder das gesamte Genom eines Organismus repräsentieren.

Desoxyribonucleinsäure. Siehe DNA.

Desoxyribonucleotid. Nucleotid, welches 2’-Desoxyribose als Pentose enthält. Auch als Desoxynucleotid bekannt.

Desoxyzucker. Saccharid, das durch den Austausch einer OH-Gruppe durch H gebildet wird.

Diabetes mellitus. Krankheit, bei der das Pankreas nicht genügend Insulin ausscheidet (auch als Typ-I-, insulinabhängiger oder juveniler

DNA-Fingerabdruck. (engl.: DNA-fingerprinting). Verfahren zur Unterscheidung von Individuen auf der Grundlage des DNA-Polymorphismus, wie z.B. der Anzahl an hochrepetitiven DNA-Sequenzen (engl.: short tandem repeats, STRs). Auch genetischer Fingerabdruck genannt. DNA-GIykosylase. Enzym, das die Basen-Excisionsreparatur von DNA initiiert, indem es die glykosidische Bindung spaltet, die eine Nucleotidbase an die Ribose bindet.

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Glossar

DNA-Microarray. Ein Satz von DNA-Segmenten mit bekannter Sequenz, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wo sie mit den (unbekannten) Nucleinsäuren in einer Probe hybridisieren. Auch DNA-Chip genannt.

DNA mit mittelrepetitiver Sequenz. Aus Hunderten bis Tausenden von Basenpaaren bestehendes Segment, das beim Menschen in einer Kopienzahl von < 10° pro haploidem Genom vorkommt. dNTP. Beliebiges Desoxyribonucleosidtriphosphat. Dolichol. Isoprenoid, das als fettlöslicher Carrier von N-gebundenen Oligosacchariden während deren Synthese im endoplasmatischen Reticulum fungiert. Domäne. Gruppe von einem bis zu einigen wenigen, ungefähr 100-200 Aminosäuren umfassenden Polypeptidabschnitten, die sich zu einer strukturellen Einheit falten. Doppelt-reziproke Auftragung. Siehe Lineweaver-Burk-Auftragung.

Doppelverdrängungsreaktion. Reaktion, bei der in einer ersten Stufe ein Substrat bindet und ein Produkt freigesetzt wird sowie in einer zweiten Stufe das andere Substrat bindet und ein weiteres Produkt freigesetzt wird. 3’-Ende. Ende eines Polynucleotids, dessen C3’ nicht mit einem anderen Nucleotidrest verestert ist. 30 nm-Faser. Kondensierte Chromatinstruktur, bei der Nucleosomen im Zickzack-Muster gefaltet sind und eine Faser mit einem Durchmesser von ungefähr 30 nm bilden.

Dunkelreaktionen. Teil der Photosynthese, in dem CO, unter Nutzung des durch die Lichtreaktionen produzierten NADPH und ATP in Kohlenhydrate eingebaut wird. Dünnes Filament. Element eines Sarkomers, das neben Tropomyosin und

Troponin vorrangig aus Actin besteht.

©. Siehe Redoxpotential. ©°’. Redoxpotential unter biochemischen Standardbedingungen. E-Stelle. Siehe Exit-Stelle.

EC-Klassifizierung. (engl.: enzyme commission). Enzymklassifizierungssystem zur Klassifizierung und Nummerierung von Enzymen entsprechend der Typs der Reaktion, die sie katalysieren. Edman-Abbau. Methode zur schrittweisen Entfernung und Identifizierung der N-terminalen Reste eines Polypeptids. EF-Hand. Weit verbreitetes Helix-Loop-Helix-Strukturmotiv,

das eine Ca?*-Bindungstelle bildet.

Effektorgesteuerter Kanal. Kanal, dessen Öffnen und Schließen (Torsteuerung) durch die Bindung eines intrazellulären Signalmoleküls kontrolliert wird. Eicosanoide. C;,-Verbindungen, die sich von der C,,-Fettsäure Arachi-

donsäure ableiten und als lokale Mediatoren wirken. Prostaglandine, Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene sind Eicosanoide. Einsalzeffekt. Zunahme der Löslichkeit eines Proteins (oder eines anderen Moleküls) mit (auf niedrigem Niveau) zunehmender Salzkonzentration.

Einzelnucleotidpolymorphismus. (engl.: single nucleotide polymorphism, SNP) Unterschied in nur einer Base im Genom zwei Organismen. Solche

Unterschiede treten im menschlichen Genom durchschnittlich alle

1250 bp auf.

Einzelstrang-Bindeprotein. (single-strand binding protein, SSB) Tetrameres Protein des Zellkerns. Viele dieser Moleküle umhüllen die EinzelstrangDNA während der Replikation, um die Bildung von Doppelstrang-DNA zu verhindern. Einzelverdrängungsreaktion. Gruppenübertragung von einem Molekül zu einem anderen durch eine konzertiert (ohne Zwischenstufen) ablaufende Reaktion.

.

Eisen-Schwefel-Cluster. Prosthetische Gruppe, die meistens aus der gleichen Anzahl von Eisen- und Sulfidionen besteht (z. B. [2Fe-2S] und [4Fe-4S]), und die gewöhnlich an Reduktions-Oxidations-Reaktionen beteiligt ist.

Elektrochemische Zelle. Vorrichtung, in der zwei Halbreaktionen in getrennten Kammern ablaufen, die über einen Draht zum Transport von Elektronen und über eine Salzbrücke zur Aufrechterhaltung der elektischen Neutralität verbunden sind. Der gleichzeitige Ablauf der Halbreaktionen ergibt eine komplette Oxidations-Reduktions-Reaktion. Elektrochemisches Potential. Partielle molare Freie Enthalpie einer Substanz (chemisches Potential) in Gegenwart eines elektrischen Potentials. Elektrogener Transport. Transport einer geladenen Substanz durch eine Membran unter Ausbildung einer Ladungsdifferenz über die Membran. Elektromotorische Kraft (EMK). A®. Siehe auch Redoxpotential. Elektronendichte. Anordnung von Elektronen, die in der Röntgenkristallographie ein Beugungsmuster ergeben. Elektronenkristallographie. Methode zur Bestimmung molekularer Strukturen, bei welcher der Elektronenstrahl eines Elektronenmikroskops verwendet wird, um von einem zweidimensionalen Kristall des interessierenden Moleküls Beugungsmuster zu erzeugen. Elektronentransportkette. Anordnung membranassoziierter ElektronenCarrier, die Elektronen von reduzierten Coenzymen (NADH und FADH3) auf molekularen Sauerstoff leiten, wobei Freie Enthalpie für die Synthese von ATP gewonnen wird. Elektrophil. Atomgruppe mit einer nicht aufgefüllten Hülle von Valenzelektronen oder mit einem elektronegativen Atom. Ein Elektrophil reagiert leicht mit einem Nucleophil. Elektrophorese. Siehe Gelelektrophorese.

Elektrosprayionisierung (ESI). Verfahren zum Verdampfen von Makromolekülen für deren Massenspektrometrie, bei der eine Makromolekül-

lösung aus einer engen Kapillare bei hohen Spannung gesprüht wird, um feine, äußerst geladene Tröpfchen zu erhalten, die schnell verdampfen und das nun geladene Makromolekül in der Gasphase zurücklassen. Elektrostatische Katalyse. Katalysemechanismus, bei dem die Delokalisierung von Ladungen im katalytischen Zentrum die Freie Enthalpie des Übergangszustands einer Reaktion erniedrigt.

Elementarreaktion. Einfacher, einstufiger chemischer Vorgang. In einer chemischen Reaktion können verschiedene Elementarreaktionen nacheinander ablaufen.

ELISA. Siehe enzymgekoppelter Immunnachweis.

Elongase. Enzym, das Acetyl-Einheiten an Fettsäuren anfügt, die vorher von der Fettsäure-Synthase synthetisiert wurden.

Elongationsfaktor. Protein, das mit tRNA und/oder dem Ribosom während der Polypeptidsynthese interagiert.

Glossar

1177

Eluent. Lösung, die zum Waschen einer Chromatographiesäule und zur Elution verwendet wird.

Enthalpie (H). Thermodynamische Größe, H = U + PV. die der bei konstantem Druck aufgenommenen Wärme (q,) äquivalent ist.

Elution. Ablösung (Auswaschen) eines an einer chromatographischen Matrix gebundenen Moleküls.

Entkoppler. Substanz, die eine Aufhebung des Protonengradienten an einer Membran ermöglicht, ohne dass ATP synthetisiert wird und so den Elektronentransport ohne oxidative Phosphorylierung ablaufen lässt.

Emergente Eigenschaft. Eigenschaft eines komplexen Systems, die sich keiner seiner Einzelkomponenten zuschreiben lässt, sondern als Folge der Wechselwirkungen innerhalb des Systems auftritt.

Entropie (S). Maß für den Grad der Zufälligkeit oder Unordnung in einem System. Definiert als S = k, In W. Hierbei ist k, die Boltzmann-

EMK. Elektromotorische Kraft (engl.: electromotive force: emf). Siehe Reduktionspotential.

Konstante und W die Anzahl äquivalenter Möglichkeiten, das System in seinem speziellen Zustand anzuordnen.

Enantiomere. Nicht miteinander deckungsgleiche, spiegelbildliche Moleküle. Enantiomere sind ein Typ der Stereoisomeren.

Entzweigung. Enzymatisches Entfernen von Seitenketten von einem verzweigten Polymer wie z.B. Glykogen.

(-)-Ende. Das Ende eines polymeren Filaments, das langsamer wächst. Siehe auch (+)-Ende

Enzym. Biologischer Katalysator. Die meisten Enzyme sind Proteine, einige wenige sind RNA-Moleküle.

(+)-Ende. Das Ende eines polymeren Filaments, das schneller wächst. Siehe auch (-)-Ende Endergoner Prozess. Vorgang mit einer insgesamt positiven Änderung der Freien Enthalpie (ein nicht spontan ablaufender Prozess). Endiol-Intermediat. Ein Reaktionsintermediat, das eine Kohlenstoff-Koh-

lenstoff-Doppelbindung und eine Hydroxylgruppe an jedem Kohlenstoff enthält.

Endocytose. Aufnahme von extrazellulärem Material durch die Bildung von Vesikeln, die aus der Plasmamebran entstehen. Gegenteil von Exocytose. Siehe auch Rezeptorvermittelte Endocytose. Endoglykosidase. Enzym, das die Hydrolyse der Glykosidbindungen zwischen zwei Monosaccharideinheiten innerhalb eines Polysaccharids katalysiert. Endokrine Drüse. Gewebe höherentwickelter Tiere, das Hormone

Enzymgekoppelter Immunnachweis (ELISA). (engl.: enzyme-linked immunosorbent assay). Technik zum Nachweis und in einigen Fällen auch zur quantitativen Bestimmung eines Moleküls. Beruht auf seinem Vermögen, an einen Antikörper zu binden. An diesen ist seinerseits ein Enzym angefügt, das ein leicht nachweisbares Reaktionsprodukt liefert. Enzymsättigung. Zustand, in dem die Substratkonzentration so hoch ist, dass im wesentlichen alle Enzymmoleküle in der ES-Form vorliegen. Epigenetik. Vererbung von Genexpressionsmustern, die von Generation zu Generation unabhängig von der DNA-Basenstruktur beibehalten werden. Dies erfolgt z. B. über DNA-Methylierung. Epimere. Zucker, die sich nur durch die Konfiguration an einem einzigen C-Atom (mit Ausnahme des anomeren Kohlenstoffs) unterscheiden. ER. Siehe endoplasmatisches Reticulum. Erleichterte Diffusion. Siehe passiver vermittelter Transport.

synthetisiert und ins Blut abgibt.

Erythroblast. Vorstufe des Erythrocyten. Siehe auch Reticulocyt.

Endonuclease. Enzym, das die Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleotidresten innerhalb eines Polynucleotidstrangs katalysiert.

Erythrocyt. Rote Blutzelle mit der Funktion, O, zu den Geweben zu transportieren. Im Wesentlichen ein Hämoglobin enthaltender Membransack.

Endopeptidase. Enzym, das die Hydrolyse einer Peptidbindung innerhalb eines Polypeptids katalysiert.

Erythrocyten-Geister. Geschlossene Erythrocytenmembranen, die noch deren ursprüngliche Gestalt, aber kein Cytoplasma aufweisen (engl.: ghosts).

Endoplasmatisches Reticulum (ER). Labyrinthähnliche Membranorganelle in eukaryotischen Zellen, in der Membranlipide synthetisiert und verschiedene Proteine posttranslational modifiziert werden.

Endosom. Membranumgebenes Vesikel, das Stoffe, welche die Zelle durch rezeptorvermittelte Endocytose aufnimmt, inkorporiert und sie für einen Abbau an Lysosomen weitergibt. Energiekopplung. Art der Konservierung der Freien Enthalpie des Elektronentransports, die zur Synthese von ATP aus ADP und P; genutzt

werden kann.

“Energiereiche“ (der zumindest biochemischen P, > 30,5 kJ] -

Verbindung. Substanz, deren Abbau stark endergon ist soviel Freie Enthalpie ergibt wie unter Standardbedingungen zur Synthese von ATP aus ADP + mol”', benötigt wird).

Enhanceosom. Komplex aus mehreren Transkriptionsfaktoren, die die Genexpression in Eukaryoten regulieren. Enhancer. Eukaryotische DNA-Sequenz, die sich in einer gewissen Entfernung vom Transkriptionsstartpunkt befindet und an die ein Aktivator der Transkription binden kann.

ES-Komplex. Enzym-Substrat-Komplex. Die Bildung des Enzym-SubstratKomplexes ist eine Schlüsselkomponente des Michaelis-Menten-Models der Enzymfunktion. Auch Michaelis-Komplex genannt. ESI. Siehe Elektrosprayionisierung

Essentielle Aminosäure. Aminosäure, die ein tierischer Organismus nicht selbst synthetisieren kann und die deshalb in der Nahrung enthalten sein

muss. Essentielle Fettsäure. Fettsäure, die ein tierischer Organismus nicht selbst synthetisieren kann und die deshalb in der Nahrung enthalten sein muss. EST. Siehe Exprimierte Sequenz-Tag.

Estergruppe. Teil eines Moleküls mit der Formel -COOR, wobei R eine Alkyl- oder Arylgruppe ist. Ether. Molekül mit der Formel ROR’, wobei R und R’ Alkyl- oder Arylgruppen sind. Eubakterien. Siehe Bacteria.

Euchromatin. Transkriptionsaktives, weniger dichtes Chromatin in einer eukaryotischen Zelle.

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Glossar

Eukarya. Siehe Eukaryot. Eukaryot. Organismus, der aus einer Zelle (oder Zellen) besteht, deren genetisches Material in einem membranumschlossenen Zellkern enthalten ist. Evolution. Allmähliche Veränderung einer Art (Organismus oder eines seiner Bestandteile) als Ergebnis genetischer Veränderungen, die von Eltern zu Nachkommen weitergegeben werden. Excitonwanderung. Weitergabe elektronischer Energie von einem energetisch angeregten Molekül auf ein nahegelegenes, nicht angeregtes Molekül. Auch als Resonanzenergietransfer bekannt. Exergoner Prozess. Vorgang mit einer insgesamt negativen Änderung der Freien Enthalpie (ein spontaner Vorgang).

Exit-Stelle (E-Stelle). Ribosomale Bindungsstelle, die ein tRNA-Molekül aufnimmt, das vorher seine Peptidylgruppe auf eine nachfolgende Aminoacyl-tRNA übertragen hat und bereit ist, sich vom Ribosom zu lösen. Exocytose. Abgabe des Inhalts eines Vesikels ins Medium außerhalb der Zelle durch Fusion der Vesikelmembran mit der Plasmamembran; Gegenteil von Endocytose. Exoglykosidase. Enzym, das die hydrolytische Entfernung einer Monosaccharideinheit vom Ende eines Polysaccharids katalysiert. Exon. Teil eines Gens, das sowohl im Primärtranskript als auch in der reifen mRNA vorhanden ist.

Exonuclease. Enzym, das die hydrolytische Entfernung eines Nucleotidrests am Ende eines Polynucleotidstrangs katalysiert.

werden, wobei zwischen Eltern- (korrektem) und Tochter- (nicht korrektem) DNA-Strang unterschieden wird. Fett. Gemisch von Triacylglycerinen, das bei Raumtemperatur fest ist. Fettgewebe. Gewebe, das aus Fettzellen aufgebaut ist. Ist im ganzen tierischen Körper verteilt. Fettsäure. Carbonsäure mit einem langkettigen Kohlenwasserstoffrest. F,Fo-ATPase. Protein, das aus mehreren Untereinheiten besteht und eine

Protonenverlagernde membrangebunden Komponente (Fo) besitzt, die an eine lösliche katalytische Komponent (F,) gebunden ist, die die ATPSynthese in Gegenwart einer protonenmotorischen Kraft katalysiert. Auch ATP-Synthase genannt. Fischer-Nomenklatur. System zur Beschreibung der Konfiguration chiraler Moleküle durch Rückführung ihrer Strukturen auf die von D- oder LGlycerinaldehyd. Fischer-Projektion. Grafikregel zur Charakterisierung molekularer Konfigurationen, bei der horizontale Striche Bindungen darstellen, die aus der Papierebene herausragen und vertikale Striche Bindungen, die hinter der Papierebene liegen. Fließgleichgewicht. Zustand eines offenen Systems, in dem Bildung und Abbau einzelner Komponenten sich ausgleichen, so dass das System sich zeitlich nicht verändert. Fließgleichgewichtsannahme. Bedingung zur Anwendung des MichaelisMenten-Models auf eine enzymatische Reaktion, bei der die Konzentration des ES-Komplexes über den Reaktionsverlauf unverändert bleibt. Flip-Flop. Siehe Transversaldiffusion.

Exopeptidase. Enzym, das die hydrolytische Entfernung eines Aminosäurerests am Ende einer Polypeptidkette katalysiert.

Flipase. Enzym, das die Translokation eines Membranlipids von der einen Lage einer Lipiddoppelschicht zur anderen (einen Flip-Flop) katalysiert.

Expressionsvektor. Vektor, der Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen enthält, die in einer Wirtszelle für die Synthese eines Genprodukts (RNA oder Protein) von Fremd-DNA benötigt werden.

Fluoreszenz. Zerfallsart des energetisch angeregten Zustands eines Moleküls, bei der Elektronenenergie in Form eines Photons ausgestrahlt wird.

Exprimierte Sequenz. Siehe Exon.

Fluoreszenzregenerierung nach Photobleichung. Technik zur quantitativen Beschreibung der Diffusion von Membranbestandteilen. Es wird die Geschwindigkeit ermittelt, mit der fluoreszenzmarkierte Komponenten in ein Gebiet wandern, das zuvor durch einen Laserpuls ausgebleicht wurde.

Exprimierte Sequenz-Tag (EST). cCDNA-Segment, das einer zellulären mRNA entspricht. Es kann dazu verwendet werden, Gene, die transkribiert werden zu identifizieren.

Extinktionskoeffizient. Siehe Absorptionsvermögen Extrinsisches Protein. Siehe peripheres Protein.

%#. Faraday, die elektrische Ladung von einem Mol Elektronen. Fab-Fragment. Proteolytisches Bruchstück eines Antikörpermoleküls, das die antigenbindende Stelle enthält. Siehe auch Fc-Fragment. Familiäre Hypercholesterinämie. Siehe Hypercholesterinämie. Faserprotein. Protein, das eine starre, länglich ausgedehnte Struktur aufweist und zur Bildung von Fasern neigt. Fc-Fragment. Proteolytisches Bruchstück eines Antikörpermoleküls, das die C-terminalen Teile seiner zwei schweren Ketten enthält. Siehe auch Fab-Fragment. Fe-S-Cluster. Siehe Eisen-Schwefel-Cluster.

Feedback-Hemmung. Hemmung eines frühen Schritts in einer Reaktionsfolge durch das Produkt eines späteren Reaktionsschritts. Fehlpaarungsreparatur (engl.: mismatch repair, MMR). Postreplikationsprozess, in dem falschgepaarte Nucleotide herausgeschnitten und ersetzt

Fluorophor. Fluoreszierende Gruppe.

Fluss. (1) Flussrate von Metaboliten durch einen Stoffwechselweg. (2) Die TIransportrate pro Flächeneinheit. Flüssig-Mosaik-Modell. Modell biologischer Membranen, bei dem integrale Membranproteine in einer fluiden Lipiddoppelschicht schwimmen und sich durch laterale Diffusion fortbewegen.

fMet. Formyliertes Methionin, das die ribosomale Polypeptidsynthese in Prokaryoten initiiert.

Folgestrang. (engl.: lagging strand) DNA-Strang, dessen Elternstrang (Matrize oder Templat) 5’—3’ in Wanderungsrichtung der Replikationsgabel orientiert ist. Dieser Strang wird als eine Folge diskontinuierlicher Fragmente synthetisiert, die später zusammengefügt werden.

Footprinting. Nachweismethode für eine proteinbindende DNA-Sequenz durch Bestimmung der Basen, die in Gegenwart des Proteins vor chemischer oder enzymatischer Modifikation geschützt sind.

Fraktionierung. Labortechnik für die Trennung von Bestandteilen eines Molekülgemischs auf Basis unterschiedlicher chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften.

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Glossar Freie Aktivierungsenthalpie (AG#). Freie Enthalpie des Übergangszustands abzüglich der Freien Enthalpie der Reaktionspartner bei einer chemischen Reaktion.

Freie Enthalpie (G). Thermodynamische Größe, G= H- TS, deren Änderung bei konstantem Druck die Spontaneität eines Vorgangs anzeigt. Für spontane Vorgänge ist AG < 0, wohingegen für den Gleichgewichtszustand AG = 0 ist. Auch Gibbs’sche Freie Energie genannt. Freies Radikal. Molekül mit einem ungepaarten Elektron. Freisetzungsfaktor. (engl.: release factor) Protein, das ein Stopp-Codon erkennt und damit Ribosomen hilft, eine Beendigung der Polypeptidsynthese herbeizuführen. 5’-Ende. Ende eines Polynucleotids, bei dem an Position C5’ keine Veresterung mit einem anderen Nucleotidrest vorliegt. Funktionelle Gruppe. Teil eines Moleküls, das an Wechselwirkungen mit anderen Substanzen beteiligt ist. In der Biochemie häufig vorkommende funktionelle Gruppen sind Acyl-, Amido-, Amino-, Carbonyl-, Carboxyl-, Diphosphoryl- (Pyrophosphoryl-), Ester-, Ether-, Hydroxyl-, Imino-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen.

Furanose. C;-Ring-Zucker. G. Siehe Freie Enthalpie. G*. Freie Enthalpie des Übergangszustands. Siehe auch Freie Aktivierungsenthalpie. G-Protein. An der Signaltransduktion beteiligtes, GDP/GTP-bindendes Protein, das bei Bindung von GDP inaktiv, bei Bindung von GTP aktiv ist. Die GTPase-Aktivität des G-Proteins limitiert seine eigene Aktivität. Heterotrimere G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten, die bei Aktivierung in die Komponenten G, (an das GTP bindet) und G;, dissoziieren. G-Quartett. Cyclisches Tetramer aus über Wasserstoffbrückenbindungen verebundenen Guaningruppen. Stapel von G-Quartetten ergeben sich aus der antiparallenen Assoziation von G-reichen telomeren DNA-Haarnadelstrukturen.

Gabelwanderung. Bewegung einer Überkreuzungsstelle in einer Holliday-Junction während der DNA-Rekombination. Gallensäure. Amphiphiles Cholesterinderivat. Wirkt als Detergens, um im Darm Lipide für die Verdauung und Absorption zu solubilisieren. Ganghöhe. (engl.: pitch) Zunahme der Helixlänge entlang ihrer x-Achse während einer vollen Umdrehung; 0,54 nm bei einer a-Helix, 3,4 nm bei B-DNA.

Gangliosid. Ceramid mit einem Oligosaccharid als Kopfgruppe, das mindestens einen Rest von Sialinsäure enthält. gap-Gen. Siehe Segmentierungsgen.

Gap junction. Interzellulärer Kanal für Ionen und kleine Moleküle, der von Proteinkomplexen in den Membranen von adaptierten Zellen gebildet wird. Gärung. Ein anaerober, kataboler Prozess.

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Gekoppelter Enzymtest. Methode zur Messung von Enzymaktivitäten, bei der ein zweites Enzym genutzt wird, um aus dem Produkt der ersten Enzymreaktion eine nachweisbare Verbindung zu bilden.

Gelbsucht. Gelbliche Verfärbung der Haut und der Skleren der Augen durch die Ablagerung des Hämabbauproduktes Bilirubin in diesen Geweben. Symptom einer Dysfunktion der Leber, einer Gallengangverstopfung oder einer mit hoher Rate erfolgenden Zerstörung der roten Blutkörperchen. Gelelektrophorese. Verfahren, bei dem Makromoleküle auf Basis von

Ladung und/oder Größe unter der Einwirkung eines elektrischen Feldes anhand ihrer unterschiedlichen Wanderung durch eine gelähnliche Matrix voneinander getrennt werden. Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) besteht die Matrix aus einem quervernetzten Polyacrylamid. Um Moleküle sehr großer Masse, wie z. B. DNA, zu trennen, werden Agarosegele verwendet. Siehe auch SDS-PAGE und Pulsfeldgelelektrophorese.

Gelfiltrationschromatographie. Verfahren, bei dem Makromoleküle auf Basis ihrer Größe und Gestalt voneinander getrennt werden. Auch als Ausschlusschromatographie oder Molekularsiebchromatographie bezeichnet. Gemischte Hemmung. Typ einer Enzymhemmung, bei der ein Inhibitor sowohl an das Enzym als auch an den Enzym-Substrat-Komplex bindet. Dadurch werden V„., und Ky unterschiedlich beeinflusst. Auch als

nichtkompetitive Hemmung bezeichnet. Gen. Definierte Sequenz von Nucleotiden, die ein Polypeptid oder eine RNA codiert. Kann auch nichttranskribierte und -translatierte Sequenzen einschließen, die regulatorische Funktionen haben. Gen-Knockout. Gentechnisches Verfahren, durch das in einem

Organismus ein bestimmtes Gen entfernt oder inaktiviert wird. Gencluster. Region der DNA, die multiple Kopien eines Gens, üblicherweise tRNA oder rRNA-Gene, deren Produkte in großen Mengen benötigt werden, enthält.

Genduplikation. Ereignis, wie z. B. ein ungleiches Crossing-over, das zu zwei Kopien eines Gens auf demselben Chromosom führt, die sich dann jeweils unabhängig voneinander weiterentwickeln können. Genetische Antizipation. Vererbungsmuster einer genetischen Erkrankung, bei der die Symptome mit jeder Generation früher einsetzen.

Genetische Prägung. Differenzierte Expression von maternalen und paternalen Genen in einem Nachkommen, die sich aus unterschiedlichen Methylierungsmustern bei diesen Genen ergibt. Siehe auch Epigenetik.

Genetischer Code. Übereinstimmung zwischen der Sequenz von Nucleotiden in einer Nucleinsäure und der Sequenz von Aminosäuren in einem Polypeptid. Eine Aufeinanderfolge von drei Nucleotiden (ein Codon) determiniert eine Aminosäure. Genexpression. Über Transkription und Translation ablaufende Decodierung der in einem Gen enthaltenen Information, um eine funktionstüchtige RNA oder ein Protein zu erhalten. Genom. Kompletter Satz genetisch-fixierter Informationen eines Organismus.

Gastrulation. Embryonales Entwicklungsstadium, bei dem unter Zellwanderung eine dreischichtige Struktur gebildet wird.

Genombibliothek. Satz klonierter DNA-Fragmente, der das vollständige Genom eines Organismus beinhaltet.

Gebogener-Pfeil-Konvention. Schreibweise zum Anzeigen der Bewegung eines Elektronenpaars in einer chemischen Reaktion. Es wird ein gebogener Pfeil gezeichnet, der von den Elektronen ausgeht und zu dem elektronenarmen, das Elektronenpaar anziehenden Zentrum zeigt.

Genomik. Die Erforschung der Größe, Organisation und Zusammensetzung des Genoms eines Organismus.

Genotyp. Die genetischen Merkmale eines Organismus.

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Glossar

Genprodukt. Durch ein Gen codierte RNA oder das Protein, welches über Transkription und Translation das Produkt der Genexpression bildet.

Glucogene Aminosäure. Aminosäure, deren Abbau zu einer Vorstufe der Gluconeogenese führt. Siehe auch ketogene Aminosäure.

Genrekombination. Siehe Rekombination.

Gluconeogenese. Synthese von Glucose aus Vorstufen, die keine Kohlenhydrate sind.

Gentechnologie. Siehe rekombinante DNA-Technologie. Gentherapie. Einführen genetischen Materials in die Zellen eines Organismus, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Geordneter Mechanismus. Sequentielle Reaktion mit einer festgelegten Reihenfolge der Substratbindung an das Enzym. Gesättigte Fettsäure. Fettsäure ohne Doppelbindung in ihrer Kohlenwasserstoffkette. Geschlossenes System. Thermodynamisches System, das mit seiner Umgebung weder Stoffe noch Energie austauschen kann.

Geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Der langsamste Schritt in einer Mehrstufenreaktion. Er weist die höchste Freie Enthalpie des Übergszustands auf. Geschwindigkeitsgleichung. Mathematischer Ausdruck für den zeitabhängigen Ablauf einer Reaktion als eine Funktion der Konzentration der Reaktionspartner.

Geschwindigkeitskonstante (k). Proportionalitätskonstante für die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion bezogen auf die Konzentration(en) des (der) Reaktionspartnerfs). Gibbs’sche Freie Energie. Im englischsprachigen Raum verwendeter Begriff für Freie Enthalpie; dann oft auch nur als „Freie Energie“ bezeichnet. Siehe auch Freie Enthalpie. Gicht. Durch einen Harnsäurespiegel charakterisierte Krankheit, die gewöhnlich das Ergebnis einer gestörten Harnsäureausscheidung ist. Ihre häufigste Ausprägung besteht in einer schmerzhaften, arthritischen (Gelenk-) Entzündung, die durch die Ablagerung von Natriumurat verursacht wird. Glatte Enden. Vollständig basengepaarte Enden eines DNA-Fragments, das durch eine Restriktionsendonuclease gespalten wurde, die DNAStränge an genau gegenüberliegenden Stellen schneidet. Gleichgewicht. Zustand in einem Prozess, bei dem die Geschwindigkeiten von Hin- und Rückreaktion genau ausgeglichen sind, so dass dieser keiner Nettoveränderung unterliegt.

Gleichgewichtskonstante (K,,). Quotient aus den Produkten der Gleichgewichtskonzentrationen von Reaktionsprodukten zu deren Ausgangsstoffen. K., und AG° der Reaktion hängen folgendermaßen zusammen: AG° =-RT In K.. Gewöhnlich mit K abgekürzt. Gleichgewichtsnahe Reaktion. Reaktion deren AG-Wert nahe bei Null liegt, so dass sie in Abhängigkeit von den Substrat- und Produktkonzentrationen in beide Richtungen ablaufen kann. Gleitfasermodell. Mechanismus zur Muskelkontraktion, bei dem ineinander geschobene dünne und dicke Filamente aneinander vorbeigleiten, um so die Gesamtlänge eines Sarkomers-zu verkürzen. Globin. Polypeptidkomponente von Myoglobin und Hämoglobin. Globosid. Ceramid mit einem neutralen Oligosaccharid als Kopfgruppe. Globuläres Protein. Wasserlösliches Protein, das sich durch eine

kompakte, stark gefaltete Struktur auszeichnet. Glucocorticoid. Steroidhormon, das eine Reihe von Stoffwechselwegen und die Entzündungsantwort beeinflusst.

Glucose-Alanin-Cyclus. Stoffwechselweg, bei dem das in Muskeln durch Glykolyse gebildete Pyruvat zu Alanin umgewandelt und zur Leber transportiert wird. Dort wird es für die Gluconeogenese wieder zu Pyruvat rückkonvertiert. Die dabei erhaltene Glucose wird wieder zu den Muskeln transportiert.

Glucose-Fettsäure-Cyclus. Herunterregulierung der Glykolyse durch die Fettsäureoxidation. Verursacht wird dies durch die durch Acetyl-CoA induzierte Hemmung der Phosphofructokinase durch Citrat. Auch Randle-Cyclus genannt.

Glycerophosphat-Shuttle. Stoffwechselweg, der die gegenseitige Umwandlung von Dihydroxyacetonphosphat und 3-Phosphoglycerin nutzt, um Reduktionsäquivalente aus dem Cytosol in die Mitochondrien zu transportieren.

Glycerophospholipid. Amphiphiles Lipid, in welchem zwei langkettige Acylgruppen an Glycerin-3-phosphat gebunden sind, dessen Phosphatgruppe mit einer polaren Gruppe verknüpft ist.

Glykan. Siehe Polysaccharid. Glykoformen. Glykoproteine, die sich nur in der Sequenz, der

Bindungsstelle und der Anzahl kovalent gebundener Kohlenhydrate unterscheiden. Glykogen. «u(1—6)-verzweigtes Polymer aus a(1—4)-verknüpften Glucoseresten, das bei Tieren als Speichermolekül für Glucose dient. Glykogenolyse. Enzymatischer Abbau von Glykogen zu Glucose-6-phosphat. ,

Glykogenspeicherkrankheit. Vererbbare Störung des Glykogenstoffwechsels, bei der die Größe und Struktur der Glykogenmoleküle oder ihre Mobilisierung im Muskel und/oder in der Leber betroffen sind. Glykokonjugat. Molekül, wie z. B. ein Glykolipid oder Glykoprotein, das kovalent gebundene Kohlenhydrate enthält. Glykolipid. Lipid mit kovalent gebundenen Kohlenhydraten.

Glykolyse. Stoffwechselweg aus 10 Reaktionen, in dem Glucose zu 2 Pyruvat abgebaut wird, unter gleichzeitiger Produktion von 2 ATP und der Reduktion von 2 NAD* zu 2 NADH.

Glykomik. Erforschung der Strukturen und Funktionen aller Kohlenhydrate einer Zelle, einschließlich deren Glykanen und Saccharidanteilen von Glykoproteinen. Glykoprotein. Protein, an das Kohlenhydrate kovalent gebunden sind. Glykosaminoglykan. Unverzweigtes Polysaccharid, das aus alternierenden Resten von Uronsäure und Hexosamin besteht. Glykosid. Molekül, das ein Saccharid und ein anderes Molekül enthält,

das über eine Glykosidbindung an den anomeren Kohlenstoff der a-Konformation (a-Glykosid) oder der ß-Konformation (ß-Glykosid) gebunden ist.

Glykosidbindung. Kovalente Verknüpfung (Acetal oder Ketal) zwischen dem anomeren Kohlenstoff eines Saccharids und einem Alkohol (O-glykosidische Bindung) oder einem Amin (N-glykosidische Bindung). Glykosidbindungen verknüpfen die Monosaccharidreste eines Polysaccharids.

Glossar Glykosylierung. Über N- oder O-glykosidische Verknüpfungen erfolgende Anlagerung von Kohlenhydratketten an Proteine.

- Glyoxylatweg. In Pflanzen vorkommende Variante des Citrateyclus, die es ermöglicht, Acetyl-CoA quantitativ in Vorstufen der Gluconeogenese umzuwandeln. Glyoxysom. Pflanzliche, membranumgebene Organelle, in der die Reaktionen des Glyoxylatwegs ablaufen. Es handelt sich um einen spezialisierten Typ der Peroxisomen. Golgi-Apparat. Eukaryotische Organelle, die aus einer Reihe abgeflachter Membranbeutel besteht, in welchen neugebildete Proteine und Lipide modifiziert werden. GPCR. (engl.: G protein-coupled receptor). An ein G-Protein gekoppelter Rezeptor. Ein Zelloberflächenprotein mit sieben transmembranen Helices, die mit einem assoziierten G-Protein bei der Bindung des Liganden in Wechselwirkung treten. GPI-verankertes Protein. Ein Protein, das in einer Membran über eine

kovalent gebundene Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Gruppe verankert ist.

Gram-negatives Bakterium. Bakterium, das den Gram-Farbstoff nicht aufnimmt, was anzeigt, dass seine Zellwand durch eine komplexe äußere Membran umgeben ist, die für den Gram-Farbstoff nicht durchlässig ist. Gram-positives Bakterium. Bakterium, das den Gram-Farbstoff aufnimmt, was anzeigt, dass die Zellwand seine äußerste Schicht darstellt.

Grana. (Sing.: Granum) Stapelförmige Anordnung von Thylakoiden in einem Chloroplasten. Grenzflächenaktivierung. Anstieg der Aktivität eines lipidspezifischen Enzyms beim Kontakt mit der Lipid-Wasser-Grenzfläche. gRNA. Siehe Lotsen-RNA

Große Furche. Furche auf einer DNA-Doppelhelix auf der die Glykosidbindungen eines Basenpaars einen Winkel >180° bilden. In B-DNA ist diese Furche weiter als die kleine Furche. Größenausschlusschromatographie. Siehe Gelfiltrationschromatographie. GTEF. Siehe allgemeiner Transkriptionsfaktor. GTPase. Ein Enzym, das die Hydrolyse von GTP zu GDP + P; katalysiert.

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Häm. Porphyrinderivat, dessen zentrales Fe(II)-Atom die Stelle der reversiblen Sauerstoffbindung (in Myoglobin und Hämoglobin) oder der Oxidoreduktion (in Cytochromen) ist. Hämolytische Anämie. Verlust roter Blutkörper im Blut durch Lyse (Zerstörung).

Haploid. Ausgetattet mit nur einen Satz von Chromosomen. Harnstoffeyclus. Katalytischer Cyclus als Stoffwechselweg zur Eliminierung von Stickstoff, der aus dem Proteinabbau stammt. Für die Ausscheidung verbinden sich als Ammoniak und durch Aspartat bereitgestellte Aminogruppen mit dem Kohlenstoffatom von HCO5 zu Harnstoff. HAT. Siehe Histon-Acetyltransferase.

Hauptkette. Siehe Rückgrat. Haworth-Projektion. Bildliche Darstellung eines Zuckerrings, bei der Bindungen im Ring, die aus der Ebene des Papiers herausragen, als dicke Linien und Bindungen im Ring, die hinter die Papierebene zeigen, als dünne Linien gezeichnet werden. Helicale Windungszahl (T). (engl.: twist) Anzahl vollständiger Umdrehungen, die der Strang kovalent geschlossener, zirkulärer Doppelhelix-DNA um die Duplexachse macht. Der Wert ist für rechtshändige superhelicale Spiralen positiv und für linkshändige superhelicale Spiralen negativ. Helicase. Enzym, das DNA entwindet und dabei positive Superspiralen bildet.

Helix-Kappe. Strukturelement von Proteinen. Bei diesem ist die Seitenkette von einem Rest, welcher der Helix vorangeht oder ihr folgt, so orientiert, dass er unter Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung die Polypeptidkette zu einem der ersten oder letzten vier Helixreste hin faltet. Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH). Etwa 20 Reste langes Proteinmotiv, das 2 a-Helices bildet, die sich in einem Winkel von ca. 120° kreuzen. Dieses

Motiv kommt in zahlreichen prokaryotischen, DNA-Bindungsproteinen vor. Henderson-Hasselbalch-Gleichung. Mathematischer Ausdruck für die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Lösung einer schwachen Säure und ihrem pK: pH = pK + log([A7]/[HA)). Heptadische Wiederholung. Sequenz von sieben Resten, die sich im selben Polymer wiederholen.

H. Siehe Enthalpie. Halbacetal. Produkt der Reaktion zwischen einem Alkohol und der

Carbonylgruppe eines Aldehyds. Halbketal. Produkt der Reaktion zwischen einem Alkohol und der

Carbonylgruppe eines Ketons.

Halbreaktion. Einzelner, einen Elektronendonor und seinen konjugierten Elektronenakzeptor umfassender Oxidations- bzw. Reduktionsprozess, der in einer elektrischen Zelle stattfindet. Auch als Redoxpaar bezeichnet. Es ist aber ein direkter Kontakt mit einer anderen solchen Reaktion erforderlich, um eine vollständige Reduktions-Oxidations-Reaktion herzustellen.

Halbwertszeit (t,,). Zeit, die für eine Reaktion der Hälfte aller anfangs vorhandenen Reaktionspartner benötigt wird. Halobakterien. Bakterien, die bei hoher Salzkonzentration leben

(und diese in der Regel zum Überleben brauchen).

Heterochromatin. Hochkondensierte, eukaryotische DNA, die nicht exprimiert wird.

Heterogene nucleäre RNA (hnRNA). Eukaryotische mRNA, deren Introns noch nicht herausgeschnitten wurden. Auch prä-mRNA genannt. Heterologe DNA. DNA-Abschnitt, der aus nicht vollständig komplementären Strängen besteht. Heterolytische Spaltung. Spaltung einer Bindung, bei der nur eines von zwei chemisch verbundenen Atomen beide, an der Bindung beteiligten Elektronen erhält. Heteropolysaccharid. Aus mehr als nur einem Typ von Monosacchariden bestehendes Polysaccharid. Heterotrimeres G-Protein. Siehe G-Protein.

Heterotroph. Organismus, der Freie Enthalpie aus der Oxidation von durch andere Organismen produzierten organischen Verbindungen bezieht.

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Glossar

Heterozygot. Besitzt von zwei Genvarianten jede nur einmal. Hexosemonophosphat-Shunt. Siehe Pentosephosphatweg.

Hill-Gleichung. Mathematischer Ausdruck für den Sättigungsgrad der Ligandenbindung an ein Molekül als Funktion der een)

Homöstische Selektorgene. Insektengene, welche die Identität von Körperteilen festlegen.

Homopolysaccharid. Aus nur einem Typ von Monosaccharideinheiten bestehendes Polysaccharid.

ton.

Homozygot. Enthält zwei identische Kopien eines bestimmten Gens.

Hill-Koeffizient. Exponent in der Hill-Gleichung. Liefert ein Maß für den Grad der Kooperaiivität bei der Ligandenbindung an ein Molekül.

Hoogsten-Basenpaar. Form der Basenpaarung, bei der das N3 von Thymin oder Uracil Wasserstoffbrücken mit dem N7 von Adenin bildet und das N6 von Adenin Wasserstoffbrücken mit dem O4 von Thymin

Histon-Aceiyltransferase (HAT). Enzym, das die sequenzspezifische Acetylierung von Histonen katalysiert, um die Gentranskription zu regulieren.

Histon-Code. Verhältnis zwischen den Mustern der Histonmodifikation und der Transkriptions-Aktivitat der assozüerten DNA. Histone. Hochkonservierte basische Proteine, die in einem Nudeosom

einen inneren Kern bilden, an den die DNA gebunden ist. Hitzeschockprotein (Hsp). Siehe molekulares Chaperon. HIV. Humanes Immundefizienz Virus: Verursacher des erworbenen

Immunschwächesyndroms (engl.: acquired immumz deficiency syndromz;

AIDS). HMG-Proiein. Mitglied der kigk mobility group (HMG) der Nicht-HistonProieinkomponenien von Chromatin. Sie besitzen viele geladenen Gruppen, die ihnen eine hohe elekirophoreiische Mobilität verleihen.

oder Uracil bildet. Siehe auch Watson-Crick-Basenpaar. Hormon. Substanz (z. B. ein Peptid oder ein Steroid), die von einem Gewebe ins Blut abgesondert wird und in einem anderen Gewebe eine physiologische Antwort (z. B. Wachstum und Stoffwechsel) auslöst.

Hormon-Antwort-Element (HRE). (engl.: kormone response element). DNA-Sequenz, an die ein Steroidhormon-Rezeptor-Komplex bindet, um die Transkription eines dazugehörigen Gens zu steigern oder zu unterdrücken. Hormonsensitive Lipase. Enzym des Fettgewebes, das Fettsäuren aus Triacylgiycerinen als Antwort auf eine hormonell gesteuerte Erhöhung der cAMP-Konzentration freisetzt. Auch bekannt als hormonsensitive Triacylgiycerin-Lipase.

Hox-Gen. Gen, das einen Transkriptionsfaktor codiert, der eine Homöodomäne enthält.

hnRNA Siehe heterogene nudeäre RNA.

HPLC. Siehe Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.

Hoch-repetitive DNA. Cluster beinahe identischer Sequenzen von bis zu 10 bp, die iausende Male wiederholt werden: Diese Sequenzen kommen in mehr als 10° Kopien pro haploidem Genom vor. Auch bekannt als short tandem repeat (STR).

HRE. Siehe Hormon-Antwort-Element.

Hochleistungsflüssiskeitschromatographie (HPLC). (engl.: higk-performance liquid chromaiography) Automatisiertes, Chromatographisches Verfahren zur Molekültrennung unier Verwendung von mit hoher Präzision

Humorale Immunität. Wird durch Antikörper (Immunglobuline) vermittelt, welche von B-Iymphocyten (B-Zellen) gebildet werden.

hergesiellien Mairizmaterialien und von mit Überdruck betriebenen

Flüssen exakt gemischter Lösungsmittel. Holliday-Junction. Viersträngige Siruktur, die sich als Intermediat bei DNA-Rekombination bildet. Holoenzym. Katalytisch aktiver Enzym-Cofaktor-Komplex.

Hombolactische Gärung. Reduktion von Pyruvat zu Lactat bei gleichzeitiger Oxidation von NADH zu NAD”,

Hormologe Proteine. Proteine, die sich aufgrund ihrer Entwicklung aus einem gemeinsamen Vorläufer ähnlich sind. Homologe Rekombination. Stoffwechselweg. in dem DNA mit Doppelsirangbrüchen nichimutagen über Rekombination mit einem intakten homologen Chromosom repariert wird. Hombolytische Spaltung. Spaltung einer Bindung, bei der jedes der beteiligten Atome jeweils ein Bindungselektron behält. Homöobox.

Siehe Homöodomäne.

Homöodomäne. Etwa 60 Aminosäuren langes DNA-Bindungsmotiv, das in vielen Genen vorkommi, welche die Identität und Bestimmuns embryonaler Zellen festlegen. Solche Gene codieren Transkriptionsfaktoren.

Auch als Homöobex bezeichnet.

Homöostase. Auf echterhaltung eines Fließgleichgewichis (engl: steady saie) in emem Organismus.

Hsp. Hitzeschockprotein. Siehe molekulares Chaperon. HTH-Motiv. Siehe Helix-Turn-Helix-Motiv.

Hybridisierung. Bildung von Doppelstrangabschnitten aus komplementären DNA- und/oder RNA-Sequenzen. Hybridom. Zellklone, die durch Fusion eines antikörperproduzierenden Lymphocyten mit einer unsterblichen Myelomzelle hergestellt werden. Diese Zellen produzieren monoklonale Antikörper. Hydrathülle. Schale aus relativ unbeweglichen Wassermolekülen, die ein gelöstes Molekül umgibt und die mit ihm interagiert (d. h. es in Lösung bringt). Hydratisierung. Zustand eines Moleküls, in dem es mit mehreren Molekülschichten des Lösungsmittels Wasser umgeben ist und mit diesen in Wechselwirkung tritt, d. h. durch Wasser solvatisiert wird.

Hydrolase. Enzym, das eine hydrolytische Reaktion katalysiert. Hydrolyse. Spaltung einer kovalenten Bindung durch Anlagerung der Bestandteile des Wassers; Umkehrung einer Kondensation. Hydroniumion. Proton, an das ein Wassermolekül angelagert ist; H,O*.

Hydropathie. Maß für die Eigenschaft eines Aminosäurerests, die sich aus der Kombination von Hydrophobizitäts- und Hydrophiliewerten ergibt. Weist auf die Wahrscheinlichkeit hin, diesen Rest im Inneren eines Proteins zu finden.

Hydrophile Substanz. Substanz, deren hohe Polarität dazu führt, mit Wassermolekülen in Wechselwirkung zu treten und sich damit in Wasser zu lösen.

N a N N

Glossar

1183

ne

Hydrophobe Interaktionschromatographie. Verfahren, bei dem Moleküle auf Grund ihrer Hydrophobizität selektiv an einer apolaren Matrix zurückgehalten werden. Hydrophobe Substanz. Substanz, deren apolare Natur ihr Vermögen durch Wassermoleküle solvatisiert zu werden, herabsetzt. Hydrophobe Substanzen neigen dazu, sich in apolaren Lösungsmitteln, nicht aber in Wasser zu lösen. Hydrophober Effekt. Tendenz des Wassers, seine Kontaktfläche mit apolaren Substanzen zu minimieren, wodurch diese veranlasst werden zu aggregieren.

Hydrophober Kollaps. Treibende Kraft bei der Proteinfaltung, die aus der Tendenz hydrophober Reste resultiert, den Kontakt mit Wasser zu vermeiden und folglich das Innere des Proteins zu bilden.

Hydroxidion. OH’, ein Produkt der Ionisierung eines Wassermoleküls. Hydroxylgruppe. Molekülteil der Formel -OH. Hyperammonämie. Erhöhter Ammoniakspiegel im Blut; ein toxischer Zustand. Hyperbolische Kurve. Graphische Darstellung der mathematischen Gleichung, die die nicht-kooperative Bindung eines Liganden an ein Molekül oder die Geschwindigkeit einer Reaktion, die von einem Michaelis-Menten-Enzym katalysiert wird, beschreibt. Hypercholesterinämie. Hoher Cholesterinspiegel im Blut; ein Risikofaktor für Herzinfarkt. Familiäre Hypercholesterinämie geht gewöhnlich aus einem Erbfehler im LDL-Rezeptor hervor.

Hyperchromer Effekt. Zunahme der UV-Absorption von DNA nach dem Verlust von Stapelinteraktionen, wenn die DNA denaturiert. Hyperglykämie. Erhöhter Glucosespiegel im Blut. Hypervariabler Rest. Aminosäurerest an einer Position in einem Protein,

die bei phylogenetisch verwandten Proteinen durch viele unterschiedliche Reste besetzt ist. Das Gegenteil eines hypervariablen Restes ist ein invarianter Rest.

Hypoxie. Zustand, bei dem der Sauerstoffgehalt im Blut niedriger als normal ist.

viersträngiges antiparalleles ß-Faltblatt über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Immunoaffinätschromatographie. Verfahren, bei dem ein Molekül durch seine spezifische Bindung an einen immobilisierten Antikörper von einem Gemisch anderer Moleküle getrennt wird.

Immunoassay. Methode zum Nachweis und in einigen Fällen zur quantitativen Bestimmung einer Substanz mit Hilfe eines Antikörpers oder eines Gemischs von Antikörpern, die spezifisch mit dieser Substanz reagieren. Immunoblot. Methode, bei der ein auf einem Membranfilter immobilisiertes Molekül anhand seiner Eigenschaft, an einen gegen ihn gerichteten Antikörper zu binden, nachgewiesen werden kann. Ein Westernblot ist ein Immunoblot zur Detektion immobilisierter Proteine nach einer Elektrophorese. Immunsystem. Zellen oder Organe, die auf eine mikrobielle Infektion

durch Bildung von Antikörpern und durch Töten pathogener Organismen und infizierter Wirtszellen reagieren. in silico. In einer Computersimulation (elektronische Schaltkreise basieren vorwiegend auf Silicon). in situ. Am Ort.

in situ-Hybridisierung. Siehe Koloniehybridisierung. in vitro. Im Reagenzglas (wörtlich, im Glas). in vivo. Innerhalb eines lebenden Organismus.

Inaktivator. Inhibitor, der irreversibel an ein Enzym bindet. Indirektes Ablesen. Eigenschaft eines DNA-bindenden Proteins, seine Zielsequenz, anstatt über eine direkte Interaktion mit den Basen, über die sequenzabhängige Konformation und/oder die Biegsamkeit ihres DNA-Rückgrats zu erkennen. Induced fit. Interaktion zwischen einem Molekül und seinem Liganden, welche die Affinität des Moleküls zu dem Liganden durch Induktion einer Konformationsänderung erhöht (induzierte Passform). Induktor. Substanz, welche die Genexpression begünstigt. Induzierbares Enzym. Enzym, das nur synthetisiert wird, wenn die Zelle

I-Zell-Krankheit. Vererbbares Fehlen mehrerer lysosomaler Hydrolasen, das zur Akkumulation von Glykosaminoglykanen und zu Glykolipideinschlüssen in den Lysosomen führt.

IDL. Lipoprotein mittlerer Dichte (engl.: intermediate density lipoprotein), Siehe Lipoprotein.

es benötigt. Siehe auch konstitutives Enzym. Inhibitionskonstante (K,). Dissoziationskonstante eines Enzym-InhibitorKomplexes. Inhibitor. Substanz, welche die Aktivität eines Enzyms entweder durch

Beeinflussung seiner Substratbindung und/oder der Wechselzahl verringert.

IEF. Siehe isoelektrische Fokussierung. Initiationsfaktor. Protein, das mit mRNA

und/oder dem Ribosom

Ig. Immunglobulin. Siehe Antikörper.

interagiert. Es ist für die Initiation der Translation erforderlich.

Imaginalscheibe. Gebiet in einer Insektenlarve von scheinbar nichtdifferenzierten aber hinsichtlich der Entwicklung vorbestimmten Zellen, die letztendlich zu einer spezifischen externen Struktur beim ausgewachsenen Organismus führen.

Insertions-/Deletionsmutation. Genetische Veränderung, die sich aus der Addition oder dem Verlust von Nucleotiden ergibt. Auch Indel genannt.

Iminogruppe. Molekülteil der Formel >C=NH.

Immunfluoreszenzmikroskopie. Mikroskopietechnik, bei der ein fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet wird, um die Anwesenheit eines Antigens, an das er bindet, sichtbar zu machen. Immunglobulin (Ig). Siehe Antikörper.

Immunglobulinfaltung. In Antikörpermolekülen vorkommende Domäne, die aus einem Sandwich besteht, bei dem ein dreisträngiges und ein

Insertionssequenz. Einfaches Transposon, das von kurzen invertierten

Sequenzwiederholungen (engl.: inverted repeats) flankiert ist. Auch als IS-Element bezeichnet. Insulinresistenz. Unfähigkeit von Zellen, auf Insulin mit einer Erhöhung der Glucoseaufnahme zu antworten. Integrales Protein. Membranprotein, das in die Lipiddoppelschicht eingebettet ist und aus dieser nur durch Behandlung mit membranenzerstörenden Agenzien abgetrennt werden kann. Auch als intrinsisches Protein bezeichnet.

1184

Glossar

Interkalierendes Agens. Planares, aromatisches Kation, das sich zwischen die Basenstapel eines Polynucleotids schiebt.

Isoprenoid. Aus C,-Einheiten bestehendes Lipid mit dem selben Kohlenstoffgerüst wie Isoprene.

Interkonvertierbares Enzym. Enzym, das zur Modulation seiner Aktivität Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen unterliegt

Isoschizomere. Restriktionsendonucleasen, welche dieselbe

Intermembranraum. Kompartiment zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran. Auf Grund der Porosität der äußeren Membran entspricht der Intermembranraum hinsichtlich seines Gehalts an kleinen Molekülen dem Cytosol.

Isozyme. Enzyme, welche dieselbe Reaktion katalysieren, aber durch unterschiedliche Gene codiert werden.

Interne Umlagerung. Zerfall des angeregten Zustands eines Moleküls, bei der Elektronenenergie in Wärme (kinetische Energie der Molekularbewegung) umgewandelt wird. Auch strahlungsfreie Konversion genannt. Intervenierende Sequenz. Siehe Intron.

Intrinsisches Protein. Siehe integrales Protein. Intron. Teil eines Gens, der transkribiert, aber vor der Translation

Nucleotidsequenz schneiden.

Junk-DNA. Siehe nutzlose DNA

K. Siehe Dissoziationskonstante und Gleichgewichtskonstante. k. Siehe Geschwindigkeitskonstante. k,. Geschwindigkeitskonstante einer Umkehrreaktion, z.B. des Abbaus des ES-Komplexes zu E + S.

herausgeschnitten wird. Auch als dazwischenliegende Sequenz (engl.: intervening sequence) bezeichnet.

k,. Geschwindigkeitskonstante für den zweiten Schritt einer einfachen Enzym-katalysierten Reaktion, die der Michaelis-Menten-Kinetik folgt, d.h. die Überführung des ES-Komplexes in E + P.

Intron der Gruppe I. Intron in einem rRNA-Molekül, dessen selbstspleißende Reaktion ein Guaninnucleotid benötigt und ein cyclischen Intronprodukt generiert.

K... Siehe Gleichgewichtskonstante.

Intron der Gruppe II. Intron in einem eukaryotischen rRNA-Molekül,

dessen selbstspleißende Reaktion kein freies Nucleotid benötigt und ein Lasso-Intronprodukt generiert. Invarianter Rest. Rest in einem Protein, der in allen entwicklungsgeschichtlich verwandten Proteinen gleich ist. Das Gegenteil eines invarianten Rests ist ein (hyper)variabler Rest.

Kanalisierung. (engl.: channeling) Die Übertragung eines Zwischenprodukts von einem aktiven Zentrum eines Enzyms zu einem anderen, wobei das Intermediat ständig durch das Protein geschützt wird. Kapillarelektrophorese (CE). (engl.: capillary electrophoresis) Elektrophoreseverfahren, das in Kapillarröhren geringer Weite durchgeführt wird. Kappe. 7-Methylguanosinrest, der noch während der Transkription an das 5'-Ende eukaryotischer mRNA angehängt wird.

Ionenaustauschchromatographie. Trennverfahren, bei dem Moleküle durch eine Matrix, die entgegengesetzt geladene Gruppen trägt, selektiv zurückgehalten werden.

Katabolismus. Degradative Stoffwechselreaktionen, bei denen Nährstoffe und Zellbestandteile abgebaut werden, um Energie und Synthesebausteine zu gewinnen.

Ionenpaar. Elektrostatische Wechselwirkung zwischen zwei ionischen Gruppen entgegengesetzter Ladung. In Proteinen auch als Salzbrücke bezeichnet.

Katabolitrepression. Effekt, bei dem die Anwesenheit von Glucose die Expression der Gene verhindert, die am Stoffwechsel anderer Nährstoffe beteiligt sind.

Ionophor. Organisches Molekül, oft ein Antibiotikum, das die

Katalysator. Substanz, die eine chemische Reaktion begünstigt, ohne selbst bleibend verändert zu werden. Ein Katalysator erhöht die Geschwindigkeit, mit der eine Reaktion sich dem Gleichgewichtszustand annähert, hat aber keinen Einfluss auf die Freie Enthalpie der Reaktion.

Permeabilität einer Membran für ein bestimmtes Ion erhöht.

IS-Element. Siehe Insertionssequenz.

Isoakzeptor-tRNA. tRNA, welche die gleiche Aminosäure wie eine andere tRNA trägt, aber ein anderes Anticodon aufweist. Isoelektrische Fokussierung (IEF). Elektrophorese durch einen stabilen pH-Gradienten, so dass ein geladenes Molekül zu der Position wandert, die seinem isoelektrischen Punkt entspricht.

Katalysefaktor. Verhältnis der Geschwindigkeiten einer katalysierten zu einer nichtkatalysierten, chemischen Reaktion. Katalytische Perfektion. Fähigkeit eines Enzyms, eine Reaktion so schnell zu katalysieren, wie die Diffusion es erlaubt, das Substrat zu binden.

Isoelektrischer Punkt (pJ). Der pH-Wert, bei dem ein Molekül keine Nettoladung aufweist.

Katalytische Triade. Die in Serinproteasen an der Katalyse beteiligten, über Wasserstoffbrücken gekoppelten Ser-, His- und Asp-Reste.

Isoformen. Siehe Isozyme.

Kataplerotische Reaktion. Reaktion, die die Intermediate eines

Isolator. DNA-Segment, das den wirksamen Bereich eines Elements, das die Transkription reguliert, begrenzt. Isoliertes System. Thermodynamisches System, das mit seiner Umgebung weder Substanzen noch Energie austauschen kann.

Isomerase. Enzym, das eine Isomerisierungsreaktion katalysiert. Isopeptidbindung. Amidbindung zwischen der a-Carboxylatgruppe einer Aminosäure und der e-Aminogruppe von Lys oder zwischen der a-Aminogruppe einer Aminosäure und der ß- oder y-Carboxylatgruppe von Asp oder Glu.

Stoffwechselwegs abzieht. Katecholamine. Hydroxylierte Tyrosinderivate, wie z.B. Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin.

Kationenaustauscher. Anionische Matrix, die verwendet wird, um kationische Moleküle in der Ionenaustauschchromatographie zu binden.

kz. Boltzmann-Konstante (1,3807 x 10° J-K'); k, ist gleichbedeutend mit R/N, wobei R die Gaskonstante und N die Avogadro-Zahl ist.

kb. Kilobasenpaar; 1 kb = 1000 Basenpaare (bp). kD. Kilodalton; 1000 Dalton (D).

Glossar Kernspinresonanz (NMR). (engl.: nuclear magnetic resonance) Spektrosko-

pische Methode zur Charakterisierung atomarer und schaften auf der Basis von Signalen, die auf in einem _ befindliche, durch Radiowellen angeregte Atomkerne zur Ermittlung der dreidimensionalen Struktur eines Nucleinsäure eingesetzt werden.

molekularer Eigenmagnetischen Feld zurückgehen. Kann Proteins oder einer

1185

Kohlenhydrat. Verbindung der Formel (C-H,O), mit n > 3. Auch als Saccharid bezeichnet.

Ki. Scheinbare (beobachtete) Michaelis-Konstante für eine Enzymkatalysierte Reaktion, die sich vom tatsächlichen Wert aufgrund der Anwesenheit eines Enzyminhibiors unterscheiden kann.

Ketogene Aminosäure. Aminosäure, bei deren Abbau in Tieren Verbindungen entstehen, die zu Fettsäuren oder Ketonkörpern, aber nicht zu Glucose umgewandelt werden können. Siehe auch glucogene Amino-

Kolligative Eigenschaft. Physikalische Eigenschaft, wie z. B. Gefrierpunktserniedrigung oder osmotischer Druck, die mehr von der Konzentration der gelösten Substanz als von ihrer chemischen Natur abhängt.

säuren.

Koloniehybridisierung. Verfahren, bei dem DNA aus einer Vielzahl von Zellkolonien auf eine Membran oder ein Filter übertragen und mit einer DNA- oder RNA-Sonde inkubiert wird, um das Vorhandensein eines gewünschten DNA-Fragments in den Zellkolonien zu überprüfen. Auch als in-situ-Hybridisierung bezeichnet.

Ketogenese. Synthese von Ketonkörpern aus Acetyl-CoA. Ketonkörper. Acetoacetat, D-B-Hydroxybutyrat und Aceton. Diese Verbindungen werden in der Leber aus Acetyl-CoA gebildet, um in peripheren Geweben bei Glucosemangel als Nährstoff zu dienen.

Ketose. (1) Zucker mit ketonischer Carbonylgruppe. (2) Ein pathologischer Zustand, bei dem mehr Ketonkörper gebildet als umgesetzt werden.

Kettenabbruchmethode. Methode zur Sequenzbestimmung von DNA, bei der Didesoxynucleotide eingesetzt werden, um einen Satz von Tochtersträngen aller möglichen Längen zu erhalten. Auch als Didesoxymethode bezeichnet. Kı. Siehe Inhibitionskonstante.

Kinase. Enzym, das eine Phosphorylgruppe zwischen einem Nucleosidtriphosphat und einem anderen Molekül überträgt. Kinase-Kaskade. Gruppe von Reaktionen, bei denen Kinase-katalysierte Phosphorylierung die nächste Kinase in einer Reihe aktiviert und dadurch die Wirkung der ersten Kinase verstärkt. kı.ı. Katalytische Konstante einer enzymatischen Reaktion. Entspricht

Kombinatorische Chemie. Verfahren zur schnellen und günstigen Synthese vieler verwandter Verbindungen durch systematisches Variieren eines Teils der Struktur. Kompartimentierung. Unterteilung einer Zelle in kleinere Einheiten mit speziellen Funktionen. Kompetitive Hemmung. Typ einer Enzymhemmung, bei der eine Verbindung mit dem Substrat um die Bindung im aktiven Zentrum konkurriert und dadurch scheinbar den K-Wert erhöht. Komplementäre DNA (cDNA). (engl.: complementary DNA) DNA-Molekül, das üblicherweise durch reverse Transkriptase synthetisiert wird und komplementär zu einem mRNA-Molekül ist.

Kondensationsreaktion. Bildung einer kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen unter Abgabe von Bestandteilen des Wassers; Umkehrung der

Hydrolyse.

dem Quotienten aus der Maximalgeschwindigkeit (V,„.,) und der Enzymkonzentration ([E]). Auch als Wechselzahl (engl.: turnover number) bezeichnet.

Konservative Replikation. Hypothetische Art der DNA-Duplikation, bei der das Elternmolekül als solches erhalten bleibt und beide Stränge des Tochtermoleküls neu synthetisiert werden.

kur/ Km Scheinbare Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung einer

enzymatischen Reaktion; Maß für die katalytische Leistungsfähigkeit

Konservative Substitution. Austausch eines Aminosäurerests in einem Protein gegen einen Rest mit ähnlichen Eigenschaften; z. B. Leu gegen

eines Enzyms

Ile oder Asp gegen Glu.

Klebriges Ende. Einzelstrangverlängerung eines DNA-Fragments. Durch Spaltung einer spezifischen Sequenz mit einem versetzten Schnitt (oft durch eine Restriktionsendonuclease), ist diese Einzelstrangverlängerung zu solchen komplementär, die bei in gleicher Weise geschnittenen DNAMolekülen erhalten werden.

Konstante Region. Der C-terminale Teil einer Untereinheit eines Antikörpers (Immunglobulins), der nicht die hohe Sequenzvariabilität wie die das Antigen erkennende (variable) Region des Antikörpers aufweist.

Kleine Furche. Furche auf einer DNA-Doppelhelix, auf der die Glykosidbindungen eines Basenpaars einen Winkel von < 180° bilden. In B-DNA ist diese Furche enger als die große Furche. Klinische Prüfung. In drei Phasen unterteilte Serie von Untersuchungen zur Arzneistoffsicherheit, zur Wirksamkeit eines Arzneistoffs und zu Nebenwirkungen eines Arzneistoffs im menschlichen Organismus.

Klon. Ansammlung genetisch identischer Zellen, die sich von einem einzigen Vorgänger ableiten.

Klonieren. Herstellung einer exakten Kopie eines DNA-Abschnitts oder des Organismus, der diesen in sich trägt. Klonierungsvektor. DNA-Molekül, z. B. Plasmid, Virus oder künstliches Chromosom, das einen Abschnitt fremder DNA zur Klonierung aufnehmen kann. Ky. Siehe Michaelis-Konstante.

Konstitutives Enzym. Enzym, das für die Basisfunktionen einer Zelle gebraucht und mit einer mehr oder weniger gleichmäßigen Rate synthetisiert wird (engl.: housekeeping enzyme). Siehe auch induzierbares Enzym.

Kontakthemmung. Hemmung der Proliferation in Kulturen von Tierzellen, wenn die Zellen einander berühren. Konturlänge. Gesamtlänge eines ausgestreckten Polymermoleküls.

Konvergente Evolution. Voneinander unabhängige Entwicklung gleicher Eigenschaften in miteinander nicht verwandten Spezies oder Proteinen. Kooperative Bindung. Vorgang, bei dem die Bindung eines Liganden an einer Stelle eines Makromoleküls die Affinität an einer anderen, den gleichen Liganden bindenden Stelle beeinflusst. Es gibt sowohl negative als auch positive Kooperativität. Siehe auch allosterische Wechselwirkungen. Korrekturlesen. (engl.: proofreading) Zusätzliche katalytische Aktivität eines Enzyms für die Korrektur von Fehlern, die bei der primären enzymatischen Reaktion gemacht wurden.

1186

Glossar

Korrespondierende Säure. Verbindung, die sich bildet, wenn eine Base ein Proton aufnimmt.

Lesch-Nyhan-Syndrom. Genetisch bedingte Krankheit, die durch den Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoryltransferase, einem Enzym, das für die Purin-Wiederverwertungsreaktionen erforderlich ist, verursacht wird. Betroffene Individuen produzieren im Übermaß Harnsäure und weisen neurologische Abnormalitäten auf.

Korrespondierendes Redoxpaar. Elektronendonor und -akzeptor, die eine Halbreaktion darstellen. Auch Redoxpaar genannt.

Leseraster. Anordnung von Nucleotiden in Dreierformationen, deren Reihenfolge einer Polypeptidsequenz entspricht.

Kovalente Katalyse. Katalysemechanismus, bei dem die vorübergehende Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Katalysator und einem

ö Leucin-Zipper. (engl.: zipper; Reißverschluss) Strukturmotiv von Proteinen, bei dem zwei a-Helices, jede mit einem hydrophoben Streifen 3 entlang einer Seite, als Superhelix (engl.: coiled coil) assoziieren. Dieses | Motiv, das ein Leucin an fast jedem siebten Rest aufweist, vermittelt die Assoziation vieler Arten von DNA-Bindungs- und anderen Proteinen.

Korrespondierende Base. Verbindung, die sich bildet, wenn eine Säure ein Proton abgibt.

Reaktionspartner die Freie Enthalpie des Übergangszustands der Reaktion herabsetzt. Krebs-Cyclus. Siehe Citratcyclus. Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM). Verfahren in der Elektronenmikroskopie, bei dem eine Probe schnell bei sehr niedrigen Temperaturen gefroren wird, so dass sie ihre native Gestalt in einem größerern Ausmaß beibehält als bei konventioneller Elektronenmikroskopie. Künstliches bakterielles Chromosom (BAC). (engl.: bacerial artificial chromosome) Aus einem Plasmid stammendes DNA-Molekül, das in einer bakteriellen Zelle repliziert werden kann. BACs werden üblicherweise als Klonierungsvektoren verwendet. Künstliches Hefechromosom (YAC). (engl.: yeast artificial chromosome) Lineares DNA-Molekül, das die chromosomalen Elemente enthält, die für eine normale Replikation und Segregation in einer Hefezelle benötigt werden. YACs sind häufig verwendete Klonierungsvektoren.

K,. Ionenprodukt des Wassers = 10'* M’.

Leukocyt. Weiße Blutzelle. LHC. Siehe Lichtsammelkomplex Lichtreaktionen. Teil der Photosynthese, bei dem spezialisierte Pigmentmoleküle Lichtenergie einfangen und dabei oxidiert werden. Die Elektronen werden weiter auf NADP* übertragen wobei ein Protonengradient über die Membran erzeugt wird, der die ATP-Synthese treibt.

-

Lichtsammelkomplex (LHC). (engl.: light harvesting complex) Pigmententhaltende Membranproteine, die die Lichtenergie sammeln und sie auf ein Photosynthese-Reaktionszentrum übertragen.

ö

Ligand. (1) Kleines Molekül, das an ein größeres Molekül bindet. (2) Molekül oder Ion, das an ein Metallion gebunden ist.

Ligandgesteuerter Kanal. Kanal, dessen Öffnen und Schließen durch die Bindung eines spezifischen Moleküls (Ligand) kontrolliert wird.

L Siehe Verknüpfungszahl. Lactoseunverträglichkeit. Auf dem Ausfall des Enzyms ß-Galactosidase (Lactase) beruhende Unfähigkeit, das Disaccharid Lactose abzubauen.

Lambert-Beer'sches Gesetz. Gleichung, die das Verhältnis der Absorption (A) eines gelösten Stoffs und seiner Konzentration (c): A = ecl, wobei s das molare Absorptionsvermögen und |! die Länge des Lichtwesgs ist. Lateraldiffusion. Bewegung eines Lipids innerhalb einer Lage einer Lipiddoppelschicht. LBHB. Siehe Low-barrier hydrogen bond. LIDL. Lipoprotein geringer Dichte (engl.: low density lipoproteins) Lectin. Protein, das an ein spezifisches Saccharid bindet.

Leerlaufceychus. Siehe Substratcyclus. Leitpeptid. An der Attenuierung beteiligtes Peptid, das eine ungewöhnlich hohe Anzahl an Aminosäuren des entsprechenden regulierten Stoffwechselwegs enthält. Leitsequenz. (1) Nucleotidsequenz stromaufwärts des ersten Gens in einem Operon, deren Translation die Transkription des gesamten Operons regelt. Siehe Attenuierung. (2) N-terminale Sequenz eines Polypeptids, die für seine Passage in oder durch eine Membran verantwortlich ist, aber im fertigen Protein oft nicht mehr vorhanden ist.

Leitstrang. (engl.: leading strand) DNA-Strang, dessen Elternstrang (Matrize oder Templat) 3’—5’ in Wanderungsrichtung der Replikationsgabel orientiert ist. Dieser Strang wird in kontinuierlicher Weise synthetisiert.

Leitverbindung. (engl.: lead compound) Arzneistoffmolekül, das als Ausgangspunkt für die Entwicklung von wirksameren Arzneistoffmolekülen dient.

Ligase. Enzym, das eine mit ATP-Hydrolyse gekoppelte Bildung einer Bindung katalysiert. Ligation. Aneinanderfügen von zwei Molekülen, wie z. B. zweier DNA-Segmente.

Limitierte Proteolyse. Methode, bei der ein Polypeptid durch Proteasen

nicht vollständig verdaut wird. Lineweaver-Burk-Diagramm. Durch eine Umstellung der MichaelisMenten-Gleichung mögliche lineare Auftragung, welche die direkte Bestimmung von K,, und V„.. gestattet. Auch als doppelt-reziproke Auftragung bezeichnet. Linker-DNA. Das ca. 55 bp lange DNA-Segment, das NucleosomenKernpartikel im Chromatin miteinander verbindet.

Linksdrehend. Schwingungsebene von polarisiertem Licht, vom Blickpunkt des Betrachters aus, gegen den Uhrzeigersinn drehend. Das Gegenteil von rechtsdrehend. Lipid. Verbindung, die einem breiten Spektrum verschiedenartiger Biomoleküle zugeordnet wird, welche weitgehend oder gänzlich hydrophob sind und deshalb dazu neigen, sich nicht in Wasser, aber in organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Hexan, zu lösen.

Lipiddoppelschicht. Regelmäßige Anordnung von amphiphilen Molekülen in zwei Lagen, bei der die polaren Abschnitte zu den zwei dem Lösungsmittel ausgesetzten Oberflächen hin orientiert sind und die apolaren Abschnitte sich im Inneren zusammenlagern (engl.: lipid bilayer).

Lipidfloß. (engl.: lipid raft) Semikristalline Region einer Zellmembran, die dicht gepackte Glykosphingolipide und Cholesterin enthält.

Z

Glossar Lipidgebundenes Protein. Protein, das über ein kovalent gebundenes Lipid, wie eine Farnesyl-, Geranylgeranyl-, Myristoyl-, Palmitoyl- oder _ Glucosylphosphatidylinositolgruppe, in einer biologischen Membran verankert ist.

Lipidspeicherkrankheit. Defekt in einem lipidabbauenden Enzym, der dazu führt, dass sich das Substrat dieses Enzyms in Lysosomen ansammelt. Lipoprotein. Globuläres Partikel, dessen Inneres aus unpolaren Lipiden besteht und von einer amphiphilen Hülle aus Protein, Phospholipid und Cholesterin umgeben wird. Lipoproteine transportieren über das Blut Lipide zwischen den Geweben. Liposom. Vesikel, das durch eine einfache Lipiddoppelschicht umschlossen ist. Lipoyliysyl-Arm. Gestreckte Struktur, die aus Liponsäure, die an eine Lysinseitenkette gebunden ist besteht. Der Lipoyliysyl-Arm überträgt Intermediate zwischen aktiven Zentren innerhalb von Multienzymkomplexen wie z.B. dem Pyruvat-Dehydrogenasekomplex.

Londori'sche Dispersionskräfte. Schwache Anziehungskräfte zwischen elektrisch neutralen, stark angenäherten Molekülen, die durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen ihren fluktuierenden Dipolen entstehen. Lotsen-RNA (gRNA,). (engl.: guide RNA) Kleines RNA-Molekül, das sich mit einer unreifen mRNA

zusammenlagert, um dessen posttranskrip-

tionale Modifizierung zu steuern.

Low-barrier hydrogen bond (LBHB). Ungewöhnlich kurze und starke Wasserstoffbrückenbindung, die entsteht wenn Donor- und Akzeptorgruppen fast den selben pK-Wert besitzen, so dass das Wasserstoff-Atom gleichermaßen zwischen ihnen verteilt ist. Lungen-Surfactant. Amphipathisches Gemisch aus Proteinen und Lipiden, welches das Zusammenfallen der Lungenalveolen (mikroskopisch kleine Lufträume) beim Ausatmen verhindert. Lyase. Enzym, das die Eliminierung einer Gruppe unter Bildung einer Doppelbindung katalysiert. Lymphocyt. Typen weißer Blutkörperchen, der die Immunantwort übermittelt. B-Lymphocyten von Säugern entwickeln sich im Knochenmark, T-Lymphocyten in der Thymusdrüse.

Lyse. Auflösen von Zellen durch Aufbrechen ihrer Zellwände. Lysophospholipid. Glycerophospholipid-Derivat, dem eine Fettsäuregruppe an Position C2 fehlt. Es wirkt als Detergens beim Aufspalten von Zellmembranen.

Lysosom. Membranumgebene Organelle in einer eukaryotischen Zelle mit der Funktion, aufgenommenes Material zu verdauen und Zellbestandteile zurückzugewinnen. Enthält einen Satz hydrolytischer Enzyme mit einem sauren pH-Optimum.

Makronährstoff. Nährstoff, der in relativ großen Mengen benötigt wird, wie z.B. Proteine, Kohlenhydrate und Fette. Siehe auch Mikronährstoff. Malaria. Durch Moskitos übertragene Krankheit, die u. a. durch das Protozoon Plasmodium falciparum verursacht wird, welches sich über einen großen Teil seines Lebenscyclus in roten Blutkörperchen aufhält.

Malat-Aspartat-Shuttle. Stoffwechselkreislauf, der die Malat- und Aspartat-Transporter und die gegenseitige Umwandlung von Malat, Oxalacetat und Aspartat in einander verwendet, um Reduktionsäquivalente in die Mitochondrien zu befördern.

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Massenspektrometrie. Technik zur Identifizierung von Molekülen durch Messung des Masse:Ladung-Verhältnisses von molekularen Ionen in der Gasphase.

Maternale Effektgene. Insektengene, deren Produkte, mRNA oder Protein, durch die Mutter in das Ovum eingebracht werden und die Polarität des embryonalen Körpers festlegen. Matrix. Gelähnliche Lösung von Enzymen, Substraten, Cofaktoren und Ionen im Inneren des Mitochondrions.

Mechanismusgestützter Inhibitor. Molekül, das ein Enzym chemisch erst dann inaktiviert, nachdem es einen Teil oder alle seiner normalen katalytischen Reaktionen durchlaufen hat; auch Selbstmordsubstrat genannt. Mechanosensitiver Kanal. Kanal, dessen Öffnen und Schließen durch

verschiedene Reize, wie z.B. Berührung, Schall und Änderung des osmotischen Drucks kontrolliert wird.

Mehrfach ungesättigte Fettsäure. Fettsäure mit mehr als einer Doppelbindung in ihrer Kohlenwasserstoffkette. Membranpotential (AW). Elektrische Potentialdifferenz über eine Membran. Membranumhüillter Virus. Virus, der durch Knospung aus der Oberfläche einer Wirtszelle entsteht, so dass das Viruspartiekel von einer Membran umgeben ist, die aus der Wirtszelle stammt.

Mercaptan. Verbindung mit einer -SH-Gruppe. Messenger-RNA (mRNA). Ribonucleinsäure deren Sequenz komplementär zu der Sequenz eines proteincodierenden Gens ist. Die mRNA steuert am Ribosom die Polymerisation von Aminosäuren so, dass ein Polypeptid gebildet wird, das der Sequenz des Gens entspricht. Metabolisches Syndrom. Mit Fettleibigkeit zusammenhängende Erkrankung, zu der Insulinresistenz, Bluthochdruck und Atherosklerose gehören. Metabolit. Reaktionspartner, Intermediat oder Produkt einer Stoffwechselreaktion.

Metabolomik. Erforschung aller Metaboliten, die von einer Zelle unter vorgegebenen Bedingungen produziert werden, einschließlich ihrer Konzentrationen und Funktionen. Metallchelataffinitätschromatographie. Verfahren, in dem ein Molekül, das Metall-chelierende Gruppen besitzt, durch dessen Fähigkeit Metallionen, die an eine chromatographischen Matrix gebunden sind, zu binden, aus einer Mischung anderer Molekülen abgetrennt wird. Metallionenkatalyse. Katalytischer Mechanismus, der die Anwesenheit von Metallionen erfordert, um die Freie Enthalpie des Übergangszustands einer Reaktion herabzusetzen.

Metalloenzym. Enzym, das ein fest gebundenes Metallion als Cofaktor enthält. Typisch sind Ionen der Übergangsmetalle, wie Fe’*, Zn’* oder Mn?*. Methanogener Organismus. Organismus, der Methan bildet. Micelle. In wässriger Lösung sich bildendes, globuläres Aggregat amphiphiler Moleküle. Diese sind so orientiert, dass die polaren Abschnitte die Oberfläche und die apolaren Teile das Innere (welches keinen Kontakt mehr mit dem Lösungsmittel hat) bilden. Michaelis-Komplex. Siehe ES-Komplex.

Michaelis-Konstante (Ky). Bei einem Enzym, für welches das MichaelisMenten-Modell gilt, ist Ky = (k.ı + k))/kı. Ku ist gleich der Substratkon-

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Glossar

zentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit beträgt.

Monosaccharid. Kohlenhydrat, das aus einem einzigen Saccharid (Zucker) besteht.

Michaelis-Menten-Gleichung. Mathematischer Ausdruck, der die Aktivität eines Enzyms in Abhängigkeit von der Substratkonzentration ([S]), der Maximalgeschwindigkeit des Enzyms (V,..„) und seiner MichaelisKonstante (K,) beschreibt: v, = Vma[S]/(Ku + IS))-

Morphogen. Substanz, deren Verteilung in einem Embryo — zumindest zum Teil — dessen Entwicklungsmuster steuert.

Microarray. Siehe DNA-Microarray.

Motorprotein. intrazelluläres Protein, das die Freie Enthalpie der ATPHydrolyse an die molekulare Bewegung relativ zu einem anderen Protein koppelt, das oft als Bahn für eine lineare Bewegung des Motorproteins

Mikro-RNA (miRNA). Siehe short interfering RNA. Mikrofilament. Aus Actin bestehender Baustein des Cytoskeletts mit einem Durchmesser von 7 nm.

Motiv. Häufiger vorkommende Gruppierung sekundärer Strukturelemente. Auch als Supersekundärstruktur bezeichnet.

fungiert.

Mikroheterogenität. Variabilität bei der Kohlenhydratzusammensetzung von Glykoproteinen.

M, Relative molekulare Masse. Dimensionslose Größe, die als das Verhältnis der Masse eines Partikels zu 1/12 der Masse eines '”C-Atoms definiert ist. Auch als Molekulargewicht bekannt.

Mikronährstoff. Nährstoff, der in relativ geringen Mengen benötigt wie. Dazu gehören Vitamine und Mineralstoffe. Siehe auch Makronährstoff.

mRNA. Siehe Messenger-RNA.

Mineral. Anorganische Substanzen, die für Stoffwechselaktivitäten benötigt werden. Dazu gehören Natrium, Kalium, Chlorid und Calcium. Minerale wie Eisen, Kupfer und Zink, die in geringen Mengen benötigt werden, werden als Spurenelemente bezeichnet.

Mineralcorticoid. Steroidhormon, das die Ausscheidung von Salz und Wasser über die Nieren reguliert.

miRNA. Mikro-RNA. Siehe short interfering RNA. Mitochondriale Matrix. Siehe Matrix. Mitochondrien. (Sing.: Mitochondrion) Von zwei Membranen umschlossene eukaryotische Organellen, in denen aerobe Stoffwechselreaktionen einschließlich des Citratcyclus, der Fettsäureoxidation und der oxidativen Phosphorylierung ablaufen. MMR. Siehe Fehlpaarungsreparatur (engl.: mismatch repair). Modifikationsmethyltransferase. Bakterielles Enzym, das als Teil eines Restriktionsmodifikationssystems eine bestimmte DNA-Sequenz methyliert.

Molekulare Klonierung. Siehe rekombinante DNA-Technologie. Molekulares Chaperon. Protein, das ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine bindet, um eine normale Faltung und die Ausbildung einer nativen Quartärstruktur zu fördern. Auch als Hitzeschockprotein (HSP) bekannt. Siehe auch Chaperonine.

Multienzymkomplex. Gruppe nichtkovalent assoziierter Enzyme, die zwei oder mehrere aufeinander folgende Schritte in einem Stoffwechselweg katalysieren.

Multiples Myelom. Krankheit bei der eine krebsbefallene B-Zelle proliferiert und enorme Mengen eines einzelnen Antikörpers, bekannt als Myelomprotein (Protein M) produziert. Multiproteinkomplex. Protein, das aus mehr als einer Polypeptidkette (Untereinheit) besteht.

Mutagen. Substanz, die eine Mutation in einem Organismus hervorruft. Mutase. Enzym, das die Übertragung einer funktionellen Gruppe von der einen zu einer anderen Position im Molekül katalysiert. Mutation. Vererbbare Veränderung im genetischen Material eines Organismus.

Myocardinfarkt. Absterben von Herzgewebe beim Ausfall der Durchblutung (Herzattacke). Myofibrille. Bündel von Fasern, die registerartig angeordnet in quergestreiften Muskelzellen vorkommen. Myristolierung. Anheften einer Myristoylgruppe an ein Protein, um ein Lipid-verknüpftes Protein zu bilden.

N-glykosidische Bindung. Siehe Glykosidbindung.

Molekulargewicht. Siehe M,.

N-Terminus. Siehe Aminoende.

Molekularität. Anzahl der Moleküle, die an einer elementaren

N-Terminus-Regel. Abhängigkeit der Halbwertszeit eines zellulären Polypeptids von der Art seines N-terminalen Rests.

chemischen Reaktion beteiligt sind. Molekularsiebchromatographie. Siehe Gelfiltrationschromatographie. Molten globule. Kollabiertes aber konformationsmäßig mobiles Intermediat der Proteinfaltung, das weitgehend in den Sekundärstrukturen,

aber nur wenig in der Tertiärstruktur dem nativen Protein entspricht. Monocistronische mRNA. Transkript, das ein einziges Gens enthält.

Monoklonaler Antikörper. Singulärer Typ eines Antikörpermoleküls, der durch einen Klon von Hybridomzellen produziert wird, welche aus der Fusion einer Myelomzelle mit einem diesen Antikörper bildenden Lymphocyten gewonnen wurden. Monomer. (1) Struktureinheit, aus der ein Polymer aufgebaut ist. (2) Einzelne Untereinheit oder ein Protomer bei einem aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protein.

N-verknüpftes Oligosaccharid. Bei Proteinen über eine Glykosidbindung mit der Amidgruppe eines Asn-Seitenrests verknüpftes Oligosaccharid. Nachbarschaftseffekt. Katalytischer Mechanismus, bei dem die freie Aktivierungsenthalpie einer Reaktion durch das Annähern der reagierenden Gruppen herabgesetzt wird. Native Struktur. Korrekt gefalteter Konformationszustand eines Makromoleküls.

Natürliche Selektion. Evolutionsprinzip, nach dem das Fortbestehen einer sich selbst reproduzierenden Einheit von ihrer Fähigkeit abhängt, unter vorgegebenen Bedingungen zu überleben und sich zu vermehren.

ncRNA. Siehe nichtcodierende RNA. NDP. Beliebiges Ribonucleosiddiphosphat.

Glossar Negative Kooperativität. Siehe kooperative Bindung

Nekrose. Durch ein Trauma verursachter Zelltod, der zur unregulierten . Zersetzung der Zelle und zur Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen führt. Siehe auch Apoptose. NER. Siehe Nucleotideliminierungsreparatur.

Nernst'sche Gleichung. Gleichung für die Beziehung zwischen der Reduktionspotentialdifferenz (A®) und der Konzentration der Elektronendonoren und -akzeptoren (A, B): A& = A&° - RT/nE In([A,ca]lBax]/

[Acxl[Brea))Neurotransmitter. Durch eine Nervenzelle zur Veränderung des Erregungszustands einer anderen Nervenzelle freigesetzte Substanz.

Neutrale Drift. Veränderungen während der Evolution, die eher zufällig als durch natürliche Selektion manifest wurden. Neutrale Lösung. Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 ([H*] = 10°”M). NHE]. Siehe nichthomologe Rekombination (engl.: nonhomologous endJoining). Nichtcodierende RNA (ncRNA). RNA-Molekül, wie z.B. rRNA, tRNA oder eine andere kleine RNA, die nicht abgelesen wird. Nichtcodierender Strang. Siehe antisense-Strang. Nichtessentielle Aminosäure. Aminosäure, die ein Organismus aus den üblichen Stoffwechselintermediaten selbst synthetisieren kann. Nichthomologe Rekombination. (engl.: nonhomologous end-joining, NHE]). Fehleranfälliger Stoffwechselweg zur Reparierung von DNA mit Doppelstrangbrüchen Nichtkompetitive Hemmung. (1) Synonym für gemischten Hemmtyp. (2) Spezialfall gemischter Hemmung bei welcher der Inhibitor das Enzym und den Enzym-Substrat-Komplex mit der gleichen Affinität (Kı= Kı’) bindet, wodurch der scheinbare V,„.‚Wert herabgesetzt, der Ky-Wert aber

nicht verändert wird. Nichtkooperative Bindung. Situation, bei der durch die Bindung eines Liganden an ein Makromolekül die Affinität anderer Bindungsstellen des gleichen Moleküls nicht beeinflusst wird. Nichtrepetitive Struktur. Abschnitt eines Polymers in dem das Rückgrat eine Strukturordnung aufweist, die durch sich nicht wiederholende Konformationen charakterisiert ist.

Nichtrezeptor-Tyrosin-Kinase. Intrazelluäre Tyrosin-Kinase, die indirekt über die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor aktiviert wird. Nichtvermittelter Transport. Durch einfache Diffusion erfolgender Transport eines Stoffs durch die Membran. Gegenteil des vermittelten Transports.

Nick-Translation. Fortschreitende Wanderung eines Einzelstrangbruchs (engl.: nick) in doppelsträngiger DNA durch die koordinierte Aktion von 5'3’-Exonucleaseaktivität und einer Polymeraseaktivität. Erstere entfernt Reste vom 5’-Ende des Bruchs, die von der zweiten Aktivität am 3’-Ende wieder angefügt werden. NMD. Siehe Nonsense-mediated Decay. NMR. Siehe Kernspinresonanz. Nonsense-Codon. Siehe Stopp-Codon.

Nonsense-mediated Decay (NMD). Abbau einer mRNA, die ein verfrühtes Stopp-Codon enthält. Nonsense-Suppressor-tRNA. Eine tRNA, die auf Grund einer Mutation ein Stopp-Codon erkennt. Bei einem Strukturgen wird so die Auswirkung

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einer Nonsens-Mutation abgeschwächt, da trotz eines Stopp-Codons eine Aminoacylgruppe an die Polypeptidkette angehängt wird.

Nonsense-Mutation. Mutation, die ein aminosäurespezifisches Codon in ein Stopp-Codon umwandelt. Hierdurch wird ein vorzeitiger Abbruch der Translation verursacht.

Northern-Blot. Technik zur Identifizierung einer RNA, die eine bestimmte Nucleotidsequenz enthält. Sie beruht auf deren Fähigkeit, mit einem komplementären, einzelsträngigen DNA- oder RNA-Segment zu hybridisieren. Siehe auch Southern-Blot. nt. Nucleotid. NTP. Beliebiges Ribonucleosidtriphosphat.

Nuclease. Nucleinsäuren abbauendes Enzym. Nucleinsäure. Polymer von Nucleotidresten. Die bedeutendsten Nucleinsäuren sind Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA). Werden auch als Polynucleotide bezeichnet. Nucleolus. (pl. Nucleoli) Dunkel angefärbte Region des eukaryotischen Zellkerns. Ort, an dem Ribosomen zusammengefügt werden. Nucleophil. Gruppe, die freie Elektronenpaare enthält, die leicht mit einer elektronenarmen Gruppe (Elektrophil) reagieren. Ein Nucleophil reagiert mit einem Elektrophil. Nucleosid. Verbindung, die aus einer Stickstoffbase und einem C5-Zucker

(Ribose oder Desoxyribose) in N-glykosidischer Verknüpfung besteht. Nucleosom. Komplex aus einem Histonoctamer und etwa 200 bp von

DNA, der die niedrigste Organisationsebene von DNA im eukaryotischen Chromosom darstellt. Nucleosomen-Kernpartikel. (engl.: nucleosome core particle) Komplex aus Histonen und ca. 146 bp von DNA, der ein kompaktes, scheibenförmiges Partikel bildet, in dem die DNA in ca. 2 Helixwindungen um die

Außenseite des Histon-Octamers gewunden ist.

Nucleotid. Verbindung, die aus einem Nucleosid besteht, das mit einer oder mehreren Phosphatgruppen verestert ist. Nucleotide sind die monomeren Einheiten der Nucleinsäuren. Nucleotideliminierungsreparatur (NER). In mehreren Stufen ablaufende DNA-Reparatur. Der einen Fehler enthaltende Teil der DNA wird dabei herausgeschnitten und durch normale DNA ersetzt. Nucleotidzucker. Saccharid, das über eine Phosphatesterbindung mit einem Nucleotid verknüpft ist. Die Spaltung dieser Bindung treibt die Bildung einer glykosidischen Bindung an. Nutzlose DNA. DNA des Genoms, der keine eideutige Funktion zugeordnet werden kann. Auch Junk-DNA genannt.

O-glykosidische Bindung. Siehe Glykosidbindung.

O-verknüpftes Oligosaccharid. Oligosaccharid, das über eine Glykosidbindung an die Hydroxylgruppe einer Ser- oder Thr-Seitenkette in einem Protein gebunden ist.

Oberflächenmarkierung. Technik, bei der ein lipidunlösliches Proteinmarkierungsreagens verwendet wird, um den Teil eines Membranproteins zu identifizieren, der dem Lösungsmittel ausgesetzt ist. Offener Komplex. Getrennte DNA-Stränge an der Startstelle der Transkription.

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Glossar

Offenes Leseraster (ORF). (engl.: open reading frame) Abschnitt eines Genoms der potentiell ein Protein codiert. Dieser Nucleotidabschnitt enthält keine Stopp-Codons, wird durch geeignete Kontrollsequenzen flankiert und zeigt die gleiche bevorzugte Codonnutzung wie andere Gene in dem Organismus. Offenes System. Thermodynamisches System, das mit seiner Umgebung Materie und Energie austauschen kann.

aber nicht für den gelösten Stoff durchlässig). Der osmotische Druck einer 1 M Lösung eines beliebigen gelösten Stoffs, der vom reinen Lösungsmittel durch eine semipermeable Membran getrennt ist, beträgt

22,624 x 10° Pa. Östrogen. Steroid, das in erster Linie als weibliches Sexualhormon fungiert. Oxidation. Verlust von Elektronen. Die Oxidation einer Substanz ist mit der Reduktion einer anderen Substanz verbunden.

Okazaki-Fragment. Kurze DNA-Segmente, die bei der Folgestrang-DNASynthese gebildet werden.

Oxidationsmittel. Substanz, die Elektronen aufnehmen kann und dabei

Öl. Gemisch von Triacylglycerinen, das bei Raumtemperatur flüssig ist.

reduziert wird.

Oligomer. (1) Kurzes, aus wenigen, miteinander verbundenen monomeren Einheiten bestehendes Polymer. (2) Aus einigen Protomeren

Oxidative Phosphorylierung. Stoffwechselprozess, bei dem die aus der Oxidation von Nahrungsstoffen erhaltene Freie Enthalpie zur Erzeugung

(Untereinheiten) zusammengesetztes Protein.

von ATP aus ADP + P; verwendet wird.

Oligopeptid. Polypeptid, das aus wenigen Aminosäuren besteht.

Oxidoreduktase. Enzym, das eine Oxidations-Reduktions-Reaktion katalysiert.

Oligosaccharid. Nur wenige Monosaccharidreste enthaltendes polymeres Kohlenhydrat. Oligosaccharid-Prozessierung. Zellulärer Stoffwechselweg, bei dem einem neuglykosyliertes Protein mit Hilfe von Enzymen MonosyccharidReste entfernt oder hinzugefügt werden. Onkogen. Mutierte Version eines normalen Gens (Proto-Onkogen), die durch eine virale Infektion erworben werden kann. Es interferiert mit den Mechanismen, die normalerweise Wachstum und Differenzierung der Zellen kontrollieren und trägt damit zu einer unkontrollierten Proliferation (Krebs) bei. Operator. DNA-Sequenz am oder in der Nähe des Transkriptionsstart(s) eines Gens, an die ein Repressor zur Regulation der Gentranskription binden kann. Operon. Genetische Einheit bei Prokaryoten, die aus mehreren, funktionell verwandten Genen besteht, welche als ein einziges mRNA-Molekül transkribiert werden.

Oxoniumion. Resonanzstabilisiertes Carbokation, so wie es z.B. während

der Lysozym-katalysierten Hydrolyse eines Glykosids entsteht. Oxyanion-Loch. Struktur am aktiven Zentrum eines Enzyms, die bevorzugt bindet und dadurch das oxyanionische tetraedrische Zwischenprodukt der Reaktion stabilisiert.

Oxygenierung. Bindung von molekularem Sauerstoff z.B. an eine Hämgruppe.

P-Stelle. Siehe Peptidyl-Stelle. Pso- Halbsättigungskonzentration (üblicherweise in Torr-Einheiten angegeben) eines gasförmigen Liganden von Bindungsproteinen, wie z. B. Hämoglobin. P/O-Quotient. Verhältnis zwischen der Zahl der ATP-Moleküle, die aus ADP + P; gebildet wurden, zur Anzahl reduzierter Sauerstoffatome.

Optische Aktivität. Eigenschaft eines Moleküls, die Ebene von polarisiertem Licht zu drehen.

PAGE. Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Siehe Gelelektrophorese.

Optische Dichte. Siehe Absorption

Palindrom. Wort oder eine Phrase oder Nucleotidsequenz, die sich vorwärts wie rückwärts gleich lesen lässt.

ORF. Siehe offenes Leseraster.

Organelle. Eigenständige, ausdifferenzierte Struktureinheit innerhalb einer eukaryotischen Zelle, die spezielle Funktionen ausübt; z. B. ein Mitochondrion oder Lysosom. Organische Verbindung. Verbindung die das Element Kohlenstoff enthält. Orthologe Gene. Verwandte Gene in verschiedenen Arten, die die selbe Funktion besitzen. Orthophosphatspaltung. Hydrolyse von ATP. Es entstehen ADP + P..

Pair-rule-Gene. Siehe Segmentierungsgene.

Palmitoylierung. Anheften einer Palmitoylgruppe an ein Protein. Es entsteht ein Lipid-verknüpftes Protein. Paraloge Gene. Verwandte Gene im gleichen Organismus, die durch Genduplikation entstanden sind. Passiver vermittelter Transport. Durch Carrier vermittelter Transport eines Stoffs durch die Membran, der thermodynamisch spontan von hoher zu niedriger Konzentration verläuft. Auch als erleichterte Diffusion bezeichnet.

Ortsgerichtete Mutagenese. Technik, mit der ein kloniertes Gen in spezifischer Weise mutiert wird.

Pasteur-Effekt. Stark erhöhter Zuckerverbrauch von Hefe unter anaeroben

Ortsspezifische Rekombination. Siehe Rekombination.

Pathogen. Organismus, der eine Krankheit verursacht.

Osmose. Wanderung eines Lösungsmittels durch eine semipermeable Membran von einer Seite geringer zu einer Seite hoher Konzentration des gelösten Stoffs.

PCR. Siehe Polymerasekettenreaktion.

Osmotischer Druck. Druck, der auf eine hochkonzentrierte Lösung eines Stoffs wirken muss, um zu vermeiden, dass es zu einem Nettofluss des Lösungsmittels durch eine semipermeable Membran kommt, welche erstere Lösung von einer Lösung niedriger Konzentration des gelösten Stoffes trennt (eine semipermeable Membran ist für das Lösungsmittel,

Bedingungen im Vergleich zum Verbrauch bei aerobem Wachstum.

Pellagra. Menschliche Erkrankung, die durch einen Mangel an dem Vitamin Niacin (Nikotinsäure) verursacht wird, einer Vorstufe der Nikotinamid enthaltenden Cosubstrate NAD* und NADP*.

Pentosephosphatweg. Ribose-5-phosphat und NADPH bereitstellender Stoffwechselweg des Glucoseabbaus. Auch Hexosemonophosphat-Shunt genannt.

Nast r

Glossar Peptid. Polypeptid mit weniger als ca. 40 Resten. Peptidase. Enzym, das Peptidbindungen hydrolysiert. Auch Protease . genannt.

Peptidbindung. Verknüpfung der a-Aminogruppe einer Aminosäure mit der a-Carboxylgruppe einer anderen durch Amidbildung. Peptidbindungen verknüpfen die Aminosäurereste in einem Polypeptid miteinander.

Peptidgruppe. Planare (-CO-NH-)-Struktur, in welche die Peptidbindung zwischen Aminosäureresten eines Polypeptids eingebettet ist. Peptidoglykane. Sackförmige, aus Polysaccharid- und Polypeptidketten bestehende, vernetzte Makromoleküle, welche die bakterielle Zellwand bilden.

Peptidyl-Stelle (P-Stelle). Stelle des Ribosoms, an der sich eine tRNA mit einer angehefteten Peptidylgruppe während der Proteinsynthese befindet. Peptidyl-Transferase. Katalytischer Aktivität des Ribosoms, die die Synthese von Peptidbindungen durchführt indem sie den nucleophilen Angriff einer hereinkommenden Aminoacylgruppe an die wachsende

Peptidylgruppe unterstützt. Peptidyl-tRNA. Kovalenter Komplex zwischen einem tRNA-Molekül und einer wachsenden Polypeptidkette während der Proteinsynthese. Peripheres Protein. Protein, das lose mit der Oberfläche einer biologischen Membran assoziiert ist. Auch als extrinsisches Protein bezeichnet.

Periplasma. Bereich zwischen der Zellwand und der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Peroxisom. Auf oxidative Funktionen spezialisierte eukaryotische

Organelle. Perutz-Mechanismus. Modell für die kooperative Bindung von Sauerstoff an Hämoglobin, bei dem die Bindung von O, einen Shift von der desoxy(T-Zustand) zu der oxy-Konformation (R-Zustand) auslöst. PFGE. Siehe Pulsfeldgelelektrophorese. pH. Zu -log [H*] äquivalente Größe für die Beschreibung der Acidität einer Lösung.

Phage. Siehe Bakteriophage. Phänotyp. Physikalische Merkmale bzw. Erscheinungsbild eines Organismus. Pharmakogenomik. Erforschung, wie die genetische Zusammensetzung eines Individuums die Wirksamkeit eines Arzneimittels beeinflusst. Pharmakokinetik. Das Verhalten eines Arzneistoffs im Körper über die Zeit hinweg, einschließlich dessen Verteilung im Gewebe und der Zeit bis zur Ausscheidung oder zum Abbau des Arzneimittels. @(phi). Torsionswinkel, der die Rotationsposition um die (C„-N)-Bindung in einer Peptidgruppe angibt; der diedrische Winkel zwischen den Bindungen, die die C-N-C,-C-Atome in einer Peptidkette miteinander verbinden.

Phosphagen. Phosphaguanidin, dessen Phosphorylgruppen-Übertragungspotential größer ist als das von ATP; diese Verbindungen können daher ADP phosphorylieren, so dass ATP entsteht. Phosphatase. Phosphorylestergruppen hydrolysierendes Enzym. Siehe auch Proteinphosphatase.

Phosphatidsäure. Das einfachste Glycerophospholipid, das aus zwei Fettsäuregruppen besteht, die an Glycerin-3-phosphat gebunden sind.

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Phosphatidylinositolweg. Signaltransduktionsweg, bei dem die Hormonbindung an einen Zelloberflächenrezeptor dazu führt, dass Phospholipase C die Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP,) zu Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP;) und 1,2-Diacylglycerin (DG) katalysiert (beides sind sekundäre Botenstoffe). Phosphodiesterbindung. Verknüpfung einer Phosphatgruppe mit zwei Alkoholgruppen zu Estern; z. B. bei Phosphatgruppen, die benachbarte Nucleosidreste in einem Polynucleotid miteinander verbinden. Phosphoglycerid. Siehe Glycerophospholipid. Phospholipase. Enzym, das eine oder mehrere Bindungen in einem Glycerophospholipid hydrolysiert. Phosphoprotein-Phosphatase. Siehe Proteinphosphatase

Phosphorolyse. Spaltung einer chemischen Bindung durch die Substitution mit einer Phosphatgruppe anstelle mit Wasser. Phosphorylgruppe. Molekülteil mit der Formel -PO,H,. Phosphorylgruppen-Übertragungspotential. Maß für die Tendenz einer phosphorylierten Verbindung zur Übertragung ihrer Phosphorylgruppe auf Wasser; der negative Wert ihrer freien Hydrolyseenthalpie.

Photoautotroph. Autotropher Organismus, der seinen Energiebedarf aus dem Sonnenlicht deckt. Photon. Bündel von Lichtenergie. Siehe auch Planck’sches Gesetz. Photooxidation. Zerfallsart des angeregten Zustands eines Moleküls, bei dem dieses durch den Übergang eines Elektrons auf ein Akzeptormolekül oxidiert wird. Photophosphorylierung. Synthese von ATP aus ADP + P,, die mit dem Abbau eines Protonengradienten gekoppelt ist, der durch lichtgetriebenen Elektronentransport erzeugt wird. Photoreaktivierung. Durch Licht bewirkte Konversion von Pyrimidindimeren, die eine DNA-Schädigung darstellen, zu Monomeren. Photorespiration. Bei Pflanzen unter Freisetzung von Kohlendioxid ablaufender Verbrauch von Sauerstoff (Abbau der Photosyntheseprodukte); resultiert aus der Konkurrenz zwischen Sauerstoff und Kohlendioxid um die Bindung an das Enzym Rubisco.

Photosynthese. Durch Licht getriebene Reduktion von Kohlendioxid zu (CH,O), in Pflanzen und Bakterien. Photosynthese-Reaktionszentrum. Proteinkomplexe, die Pigmente enthalten, die während der Lichtreaktionen der Photosynthese einer Photooxidation unterliegen. Phylogenetischer Stammbaum. Rekonstruktion des wahrscheinlichen Entwicklungswegs einer Organismengruppe. Geht hauptsächlich von Sequenzunterschieden bei homologen Proteinen und Nucleinsäuren aus. Eine Art Familienstammbaum.

Phylogenie. Lehre von den entwicklungsgeschichtlichen Beziehungen zwischen Organismen. pl. Siehe isoelektrischer Punkt.

PIC. Siehe Präinitiationskomplex. Ping-Pong-Reaktion. Gruppenübertragungsreaktion, bei der ein oder mehrere Produkte freigesetzt werden, noch bevor alle Substrate an das Enzym gebunden haben. pK. Größe, die verwendet wird, um die Bereitschaft einer Säure zur Abgabe eines Protons (zu dissoziieren) anzugeben. pK ist gleich -log K, wobei K die Dissoziationskonstante der Säure ist. Auch als pK, bekannt.

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Glossar

Plancksches Gesetz. Ausdruck für die Energie (E) eines Photons: E = he/ *, wobei c die Lichtgeschwindigkeit, A seine Wellenlänge und h das Planck’sche Wirkungsquantum (6,626 X 10° J . s) ist. Plaque. (1) Zone Iysierter Zellen auf einem „Rasen“ kultivierter Zellen, welche das Vorhandensein infektiöser Bakteriophagen anzeigt. (2) Ablagerung unlöslichen Materials in tierischen Geweben. Plasmalogen. Glycerophospholipid, bei dem der C,-Substituent über eine

Polysaccharid. Mehrere Monosaccharidreste enthaltendes polymeres Kohlenhydrat. Auch Glykan genannt. Polysom. Siehe Polyribosom.

Porphyrie. Genetischer Defekt bei der Hämbiosynthese, der zu einer Akkumulation von Porphyrin und/oder dessen Vorstufen führt. Positive Kooperativität. siehe Kooperative Bindung.

Etherbindung anstelle einer Esterbindung gebunden ist.

Postreplikationsreparatur. Siehe Rekombinationsreparatur.

Plasmid. Kleines zirkuläres DNA-Molekül, das autonom in einer Bakterien- oder Hefezelle repliziert wird. Plasmide liegen für Anwendungen als Klonierungsvektoren oft modifiziert vor.

Posttranskriptionale Modifikation. Nach Synthese von RNA erfolgende Entfernung oder Addition von Nucleotidresten bzw. deren Modifikation.

PMRK. Siehe protonenmotorische Kraft.

PLP. Pyridoxal-5’-phosphat, ein Cofaktor, der hauptsächlich in Transaminierungsreaktionen verwendet wird.

pO;. Siehe Sauerstoffpartialdruck. Polares Molekül. Molekül mit einer oder mehreren Gruppen mit permanentem Dipol. Polarimeter. Gerät, mit dem die optische Drehung einer Lösung gemessen werden kann. Es kann dazu verwendet werden, die optische Aktivität einer Substanz zu bestimmen. Poly(A)-Schwanz. Sequenz von Adenylatresten, die posttranskriptional an das 3’-Ende eukaryotischer mRNA angehängt wird.

Posttranslationale Modifikation. Entfernung oder Derivatisierung von Aminosäureresten nach deren Einbau in ein Polypeptid. prä-mRNA. Siehe heterogene nucleäre RNA.

prä-rRNA. Unreife rRNA. prä-tRNA. Unreife tRNA. Präbiotische Ära. Zeitalter zwischen der Bildung der Erde vor ca. 4,6 Milliarden Jahren und dem Aufkommen von lebenden Organismen vor mindestens 3,5 Milliarden Jahren. Präinitiationskomplex (PIC). Komplex von an DNA gebundenen Transkriptionsfaktoren, die bei Eukaryoten DNA für eine Transkription durch RNA-Polymerase vorbereiten.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Siehe Gelelektrophorese.

Präproprotein. Protein, das sowohl ein Signalpeptid (Präprotein) enthält als auch als Propeptid (Proprotein) vorliegt.

Polycistronische mRNA. mRNA als Transkript eines bakteriellen Operons. Codiert mehrere Polypeptide.

Präprotein. Protein, das ein Signalpeptid enthält, das nach der Translokation des Proteins durch die Membran abgespalten wird.

Polycythämie. Durch eine erhöhte Anzahl von Erythrocyten gekennzeichneter Gesundheitszustand.

Prenylierung. Anheften einer Isoprenoidgruppe an ein Protein.

Polyelektrolyt. Makromolekül, das mehrere geladene Gruppen trägt.

Pribnow-Box. Prokaryotisches Promotorelement mit der Konsensussequenz TATAAT, das um die -10-Position herum (bezogen auf den Transkriptionsstart) lokalisiert ist.

Polymer. Molekül, das aus zahlreichen kleineren Einheiten besteht, die in einer geordneten Weise miteinander verbunden sind. Polymere können linear oder verzweigt sein und ein oder mehrere Arten von Struktureinheiten (Monomeren) enthalten. Polymerase. Enzym, das die Addition eines Nucleotidrests an ein Polynucleotid katalysiert. Dies erfolgt durch nucleophilen Angriff der 3’-OHGruppe des Polynucleotids auf die a-Phosphorylgruppe des dazukommenden Nucleosidtriphosphats. DNA- und RNA-abhängige Polymerasen benötigen ein Matrizenmolekül, mit dem das dazukommende Nucleotid eine Basenpaarung eingehen muss.

Polymerasekettenreaktion (PCR). (engl.: polymerase chain reaction) Methode zur Vervielfältigung eines DNA-Abschnitts durch wiederholte Durchführung von Replikationsrunden zwischen Primern, die mit den beiden Enden des interessierenden DNA-Abschnitts hybridisieren. Polymorphismus. Abweichungen in der DNA oder in der Aminosäuresequenz zwischen einzelnen Individuen.

Polynucleotid. Siehe Nucleinsäure.

Polypeptid. Aus linear miteinander verknüpften Aminosäureresten bestehendes Polymer. Polyprotonige Säure. Substanz, die mehr als ein Proton abgeben kann. Polyprotonige Säuren nehmen mehrere Ionisationszustände ein. Polyribosom. mRNA, die mit mehreren translationsaktiven Ribosomen assoziiert ist. Auch Polysom genannt.

Es entsteht ein lipidverknüpftes Protein.

Primär aktiver Transport. Durch die exergone Hydrolyse von ATP getriebener Transport durch eine Membran.

Primärstruktur. Sequenz von Molekülresten in einem Polymer. Primärtranskript. Unmittelbares Transkriptionsprodukt, das möglicherweise noch modifiziert wird, bevor es voll aktiv wird.

Primase. RNA-Polymerase, die verantwortlich ist für die Synthese des RNA-Segments, das die DNA-Synthese initiiert. Primer. Oligonucleotid, das bei der durch DNA-Polymerase katalysierten Bildung eines Polynucleotids als Startpunkt der verlängernden Polymerisationsreaktionen dient. Hierbei geht der Primer mit einem Abschnitt des als Matrize dienenden Polynucleotids eine Basenpaarung unter Bildung eines kurzen doppelsträngigen Segments ein, das dann durch eine matrizenabhängige Polymerisation verlängert werden kann. Primosom. Proteinkomplex, der die Synthese eines Okazaki-Fragments während der diskontinuierlichen DNA-Synthese initiiert.

Prion. Protein, dessen Fehlfaltung zu Aggregationen und zur Ausbildung des neurodegenerativen Symptoms Rinderwahnsinn (BSE) oder ähnlicher Krankheiten führt. Fehlgefaltete Prionen veranlassen korrekt gefaltete Proteine zu falschen Faltungen und wirken auf diese Weise infektiös.

Prochiralität. Eigenschaft eines nichtchiralen Moleküls, eine Gruppe zu enthalten, deren Substitution durch eine andere Gruppe zu einem chiralen Molekül führt.

Glossar Produkthemmung. Enzymhemmung, bei der das Produkt, das sich während des Reaktionsablaufs anhäuft, mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum konkurriert. Proenzym. Inaktive Vorstufe eines Enzyms.

Profilkarte. Karte, die Linien (Konturen) enthält, die Positionen von gleichen Werten einer bestimmten Eigenschaft der Karte aufzeigen (z.B. Höhe über dem Meeresspiegel, Elektronendichte). Prokaryot. Einzelliger Organismus ohne membranumschlosssenen Zellkern. Alle Bakterien sind Prokaryoten. Promotor. DNA-Sequenz, an die RNA-Polymerase bindet, um die Transkription einzuleiten. Propeptid. Polypeptidkette eines unfertigen Proteins, die proteolytisch geschnitten werden muss, um das Protein zu aktivieren. Proprotein. Inaktive Vorstufe eines Proteins. Um voll aktiv zu werden, muss das Propeptid durch limitierte Proteolyse geschnitten und ggf. modifiziert werden.

Prostaglandin. Siehe Eicosanoide. Prosthetische Gruppe. Cofaktor, der permanent (oft kovalent) an ein Protein gebunden ist. Protease. Siehe Peptidase. Proteasom. Multiproteinkomplex mit einem hohlen, zylindrischen Inneren, in dem zelluläre Proteine in einem ATP-abhängigen Prozess zu Peptiden abgebaut werden. Protein. Makromolekül, das aus einer oder mehreren (kovalent verknüpften) Polypeptidketten besteht.

Proteinkinase. Enzym, das die Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf eine OH-Gruppe eines Ser-, Thr- oder Tyr-Rests in einem Protein katalysiert.

Proteinphosphatase. Enzym, das bei Proteinen die hydrolytische Abspaltung von Phosphorylgruppen katalysiert. Proteoglykan. Extrazelluläres Aggregat aus Protein und Glykosaminoglykanen. Proteomik. Erforschung aller Proteine einer Zelle einschließlich ihrer Quantifizierung, Lokalisierung, Modifikationen, Wechselwirkungen und Aktivitäten. Protomer. Eine von zwei oder mehreren identischen Einheiten eines oligomeren Proteins. Ein Protomer kann aus einer oder mehreren Polypeptidketten bestehen.

Protonenleiter. Gruppe von über Wasserstoffbrücken verbundenen Proteingruppen und Wassermolekülen, die als Kreislauf für Protonen dienen, um mithilfe von Protonenpunpen eine Membran zu durchqueren.

Protonenmotorische Kraft (PMK). (engl.: proton motive force) Freie Enthalpie des elektrochemischen Protonengradienten, der sich während der Elektronentransportvorgänge bildet.

Protonensprung. Schneller Austausch eines Protons zwischen Wassermolekülen über Verschiebung von Wasserstoffbrückenbindungen. Protonensprünge sind Ursache der hohen Geschwindigkeit, mit der sich Hydronium- und Hydroxylionen scheinbar durch eine wässrige Lösung bewegen.

Proto-Onkogen. Normales zelluläres Analogon eines Onkogens. Die Mutation eines Proto-Onkogens kann zu einem Onkogen führen, das zur unkontrollierten Zellproliferation (Krebs) beiträgt.

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Prozessives Enzym. Enzym, das viele Runden einer Polymerisationsreaktion katalysiert, ohne von dem wachsenden Polymer abzudissoziieren.

PRPP. 5-Phosphoribosyl-a-pyrophosphat, eine „aktivierte“ Form der Ribose, die bei der Synthese von Histidin, Tyrosin und Purin- und Pyrimidinnucleotiden als Vorläufer dient. PSI. Photosystem I, der Proteinkomplex, der NADP* während der Lichtreaktionen der Photosynthese reduziert. PSII. Photosystem II, der Proteinkomplex, der H,O während der Lichtreaktionen der Photosynthese zu O, oxidiert. Pseudogen. DNA-Sequenz, die nicht exprimiert wird und anscheinend der defekte Überrest eines duplizierten Gens ist. AW. Siehe Membranpotential.

\(psi). Torsionswinkel, der die Position der Rotation um die (C«-C)-Bindung in einer Peptidgruppe angibt. Puffer. Lösung einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base in ungefähr gleichen Mengen. Eine solche Lösung wirkt pH-Wertänderungen bei Zugabe von Säuren oder Basen entgegen. Pufferkapazität. Eigenschaft einer Pufferlösung bei Zugabe von Säuren oder Basen pH-Wertänderungen entgegenzuwirken. Puffer haben die größte Kapazität, wenn der pH-Wert, bezogen auf den pK-Wert der Säurekomponente, im Bereich einer Einheit, liegt.

Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE). Elektrophoretische Methode, bei der an Elektroden, die um die Peripherie eines Agarose-Flachbettgels angeordnet sind, pulsartig Spannung angelegt wird, so dass DNA-Moleküle sich ständig neu orientieren müssen. Dies macht eine größenabhängige Trennung auch sehr großer Moleküle möglich. Pulsmarkierung. Technik zur Aufklärung von Stoffwechselwegen, bei der Zellen oder ein Reaktionssystem kurzzeitig hohen Konzentrationen einer markierten Verbindung ausgesetzt werden. Punktmutation. Substitution einer einzelnen DNA-Base durch eine andere. Punktmutationen können durch Fehlpaarung während der DNAReplikation oder durch chemische Veränderung vorhandener Basen entstehen. Purine. Derivate der Verbindung Purin, eines planaren, heterocyclisch aromatischen Moleküls. Adenin und Guanin, zwei der Stickstoffbasen von Nucleotiden, sind Purine.

Purinnucleotidcyclus. Ergänzung von Citratcyclusintermediaten durch die Konversion von Aspartat zu Fumarat, bei welcher in einem cyclischen Ablauf AMP zu IMP desaminiert wird. Pyranose. Sechsringzucker. Pyrimidindimer. Struktur, die Cyclobutan enthält und durch UV-Bestrahlung benachbarter Thymin- oder Cytosinreste in der DNA entsteht. Pyrimidine. Derivate der Verbindung Pyrimidin, eines planaren, heterocyclisch aromatischen Moleküls. Cytosin, Uracil und Thymin, drei der Stickstoffbasen von Nucleotiden, sind Pyrimidine. Pyrophosphatspaltung. Hydrolyse von ATP, um AMP + PP, zu erhalten.

Pyrophosphorylgruppe. Siehe Diphosphorylgruppe. q. Thermodynamisches Symbol für aufgenommene Wärme. q,. Thermodynamisches Symbol für bei konstantem Druck aufgenommene Wärme.

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Glossar

Q-Cyclus. Mit dem Transport von Protonen verbundener, cyclischer Elektronenfluss, der als Intermediat ein stabiles CoQ-Semichinon am Komplex III des mitochondrialen Elektronentransports beinhaltet. Kommt auch beim photosynthetischen Elektronentransport vor.

Quantenausbeute. Verhältnis von reagierenden Molekülen zu absorbierten Photonen.

Quantum. (pl. Quanten). Energiepaket. Siehe auch Photon. Quartärstruktur. Räumliche Anordnung der einzelnen Untereinheiten eines Makromoleküls. Quergestreifte Muskulatur. Willkürliche oder Skelettmuskulatur. Hat unter dem Mikroskop ein streifenförmiges Aussehen.

Reaktionskoordinate. Verlauf der minimalen Freien Enthalpie entlang des Reaktionswegs. Reaktionsordnung. Summe der Exponenten von Konzentrationstermen, die in einer Reaktionsgeschwindigkeitsgleichung vorkommen.

Rechtsdrehend. Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht; vom Blickpunkt des Betrachters aus in Uhrzeigersinn drehend. Das Gegenteil von linksdrehend. Redoxpaar. Siehe Halbreaktion.

Redoxzentrum. Gruppe, die eine Reduktions-Oxidations-Reaktion eingehen kann.

Redoxpotential (€). Maß für die Elektronenaffinität eines Stoffs. Reduktion. Gewinn von Elektronen. Parallel zur Reduktion einer

R-Rest. Symbol für einen variablen Teil eines organischen Moleküls, wie z. B. die Seitenkette einer Aminosäure.

R-Zustand. Eine von zwei Konformationen eines allosterischen Proteins. Der andere Zustand ist der T-Zustand. Der R-Zustand ist üblicherweise

der katalytisch aktivere Zustand.

Racemisches Gemisch. Probe einer Verbindung, in der beide Enantiomere in gleichen Mengen vorhanden sind. Rachitis. Vitamin-D-Mangelkrankheit bei Kindern. Charakteristische Symptome sind gehemmtes Wachstum und deformierte Knochen.

Radioimmunoassay (RIA). Methode zur Konzentrationsbestimmung eines Moleküls, die darauf beruht, dass dieses mit einem kleinen Anteil gleicher, radioaktiv markierter Moleküle bei der Bindung an einen entsprechenden Antikörper konkurriert. Radionuclid. Radioaktives Isotop. Ramachandran-Diagramm. Auftragung von ®- und W-Werten, welche die sterisch erlaubten Konformationen eines Polypeptids anzeigt. Randle-Cyclus. Siehe Glucose-Fettsäure-Cyclus. Random coil. Völlig ungeordnete und rasch fluktuierende Konformation eines Polymers.

Randorn Mechanismus. Sequentielle Reaktion ohne vorgeschriebene Reihenfolge der Substratbindung an das Enzym. Rasterschub-Mutation. Insertion oder Deletion von Nucleotiden in einer DNA, die das folgerichtige Ablesen (den Rahmen) von Nucleotid-Dreiergruppen (Codons) während der Translation ändert. Rationales Drug Design. Siehe strukturbasiertes Drug Design.

Raues endoplasmatisches Reticulum (rER). Mit Ribosomen assoziierter Anteil des endoplasmatischen Reticulums. Syntheseort für Membranproteine und Proteine, die zum Verbleib in einer speziellen Organelle oder zur Sekretion bestimmt sind. Reaktion erster Ordnung. Reaktion, deren Geschwindigkeit proportional zur Konzentration nur eines Reaktanten ist. Reaktion nullter Ordnung. Reaktion, deren Geschwindigkeit sich nicht mit der Konzentration eines seiner Ausgangsstoffe verändert. Reaktion pseudo-erster Ordnung. Bimolekulare Reaktion, deren Geschwindigkeit scheinbar zur Konzentration nur eines Reaktionspartners proportional ist. Reaktion zweiter Ordnung. Reaktion, deren Geschwindigkeitsrate dem Quadrat der Konzentration eines Reaktanten oder dem Produkt der Konzentrationen zweier Reaktionspartner proportional ist.

Substanz erfolgt die Oxidation einer anderen Substanz.

Redüktionsäquivalent. Begriff zur Beschreibung der Elektronen, die bei einer Redoxreaktion von einem Molekül auf ein anderes übertragen werden. Reduktionsmittel. Substanz die Elektronen abgeben kann, wobei sie in den oxidierten Zustand übergeht. Reduktiver Pentosephosphatcyclus. Siehe Calvin-Cyclus. Reduzierender Zucker. Saccharid mit anomerem

Kohlenstoffatom,

das keine Glykosidbindung ausgebildet hat und daher durch schwache Oxidationsmittel oxidiert werden kann.

Reguläre Sekundärstruktur. Strukturelement eines Polymers, bei dem das Rückgrat eine sich regelmäßig wiederholende Konformation einnimmt. Rekombinante. DNA-Molekül, das durch Kombination von DNA aus verschiedenen Quellen konstruiert wird. Auch Chimäre genannt. Rekombinante DNA-Technologie. Isolierung, Konstruktion, Amplifizierung und Modifizierung spezifischer DNA-Sequenzen. Auch als molekulare Klonierung oder Gentechnik bezeichnet. Rekombination. Austausch von Polynucleotidsträngen zwischen auseinander liegenden DNA-Segmenten. Die allgemeine Rekombination erfolgt zwischen DNA-Segmenten mit hoher Sequenzähnlichkeit, während die ortsspezifische Rekombination zwischen zwei kurzen, spezifischen DNA-Sequenzen geschieht. Rekombinationsreparatur. Reparaturmechanismus für beschädigte DNA. Hierbei wird durch Rekombination ein Teil des beschädigten Strangs gegen ein homologes Segment ausgetauscht, welches dann als Matrize für das Ersetzen der beschädigten Basen dienen kann (auch Postreplikationsreparatur genannt). Renaturierung. Rückfaltung eines denaturierten Proteins zur Wiederherstellung seiner nativen Konformation. Repetitive DNA. DNA-Sequenzen von bis zu mehreren Tausend Basen, die in vielfachen Kopien im Genom eines Organismus vorkommen. Sie sind oft tandemartig angeordnet.

Replika-Plattierung. Übertragung von Hefe- oder Bakterienkolonien sowie Phagenplaques von einer Kulturplatte auf eine andere, eine Membran oder ein Filter. Diese erfolgt so, dass das Verteilungsmuster der Zellen dem auf der Originalplatte entspricht.

Replikation. Herstellung der identischen Kopie eines DNA-Moleküls. Während der Replikation trennen sich die Elternstränge des Polynucleotids, so dass ein jeder die Synthese eines komplementären Tochterstrangs leiten kann. Dies führt zu zwei vollständigen DNA-Doppelhelices.

Glossar Replikationsgabel. Verzweigungspunkt, an dem bei einem

DNA-Molekül der Replikation die zwei Stränge des Elternmoleküls voneinan| _ während der getrennt

|

|

werden, um als Matrizen für die Synthese der Tochterstränge

1195

Ribosom. Makromolekül, das unter der Regie von mRNA Polypeptide synthetisiert. Besteht zu rund zwei Dritteln aus RNA und zu einem Drittel aus Protein.

zu dienen.

Replikon. DNA-Einheit bei Eukaryoten, die von einem einzigen Replikationsstartpunkt aus repliziert wird.

Replisom. DNA-Polymerase enthaltender Proteinkomplex, der die Synthese sowohl des Leit- als auch des Folgestrangs von DNA an der Replikationsgabel katalysiert. Repolarisierung. Wiedererlangen des Membranruhepotentials. Dies geschieht während der elektrischen Signalübertragung in Zellen wie den Neuronen. Repressor. Protein, das in bestimmter Weise an ein oder nahe einem Gen bindet, um dessen Transkription zu verhindern. TER. Siehe raues endoplasmatisches Reticulum. Resonanzenergietransfer. Siehe Excitonwanderung. Rest. Bezeichnung für eine monomere Einheit eines Polymers. Restriktionsendonuclease. Bakterielles Enzym, das eine bestimmte DNASequenz schneidet und Teil des Restriktionsmodifikationssystems ist.

Restriktionsmodifikationssystem. Aufeinander abgestimmtes Paar bakterieller Enzyme, die eine spezielle DNA-Sequenz erkennen: Eine Modifikationsmethyliransferase, die in dieser Sequenz Basen methyliert und eine Restriktionsendonuclease, welche in der Regel nichtmethylierte DNA dieser Sequenz schneidet. Es handelt sich um ein Fremd-DNA (z. B. Viren) eliminierendes Abwehrsystem. Reticulocyt. Unreife rote Blutzelle, welche aktiv Hämoglobin synthetisiert. Retrotransposon. Transposon, dessen Sequenz und Transpositions-

mechanismus vermuten lässt, dass es aus einem Retrovirus stammt.

Retrovirus. Virus mit RNA als genetischem Material. Die RNA muss während der Infektion der Wirtszelle zu Doppelstrang-DNA rücktranskribiert werden. Reverse Transkriptase. DNA-Polymerase, die RNA als Matrize verwendet (RNA-abhängige DNA-Polymerase). Rezeptor. Protein, das Liganden mit einer hohen Spezifität bindet und nach Bindung des Liganden einen speziellen biochemischen Effekt hervorruft. Rezeptor-Tyrosin-Kinase. Hormonrezeptor, dessen intrazelluläre Domäne als Ergebnis der Hormonbindung dazu aktiviert wird, Tyrosinreste an anderen Proteinen und/oder an anderen Untereinheiten desselben Rezeptors zu phosphorylieren.

Rezeptorvermittelte Endocytose. Vorgang, bei dem ein extrazellulärer Ligand an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor bindet und der resultierende Rezeptor-Ligand-Komplex dann von der Zelle aufgenommen wird. Rho-Faktor. Prokaryotische Helicase, die DNA und RNA trennt, um die

Beendigung der Transkription zu unterstützen.

Ribosomale RNA (rRNA). RNA-Moleküle, die den Hauptteil des Ribosoms, des Ortes der Polypeptidsynthese, ausmachen. rRNA liefert das Strukturgerüst des Ribosoms und katalysiert offensichtlich auch die Bildung der Peptidbindung.

Riboswitch. mRNA-Struktur, die durch Veränderung ihrer Struktur die Genexpression reguliert. Dies wird durch die Gegenward des Metaboliten ausgelöst, der durch das codierte Protein synthetisiert wird. Ribozym. RNA-Molekül mit katalytischer Aktivität. Rinderwahnsinn (BSE). (engl.: bovine spongiform encephalopathy oder mad cow disease) Neurodegenerative, ausnahmslos tödliche Krankheit bei Rindern, die durch eine Prioneninfektion verursacht wird. Sie ist der Traberkrankheit (engl.: scrapie) bei Schafen und der Creutzfeldt-JakobKrankheit bei Menschen ähnlich. RNA. Ribonucleinsäure. Polymer aus Ribonucleotiden. Die Hauptformen von RNA umfassen Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale RNA (rRNA). RNA-Editing. Posttranskriptionale Insertion, Deletion oder Veränderung von Basen in der RNA.

RNA-Interferenz (RNAi). Form der posttranskriptionalen Genregulation, bei der ein kurzes doppelsträngiges RNA-Segment den Abbau des homologen mRNA-Moleküls auslöst. RNAi. Siehe RNA-Interferenz.

RNAP. RNA-Polymerase, das Enzym das mit DNA als Matrize RNA synthetisiert.

Röntgenstrukturanalyse. Methode zur Ermittlung dreidimensionaler Molekülstrukturen anhand des Beugungsmusters eines Molekülkristalls, das bei dessen Exposition mit Röntgenstrahlen erzeugt wird. Rossmann-Faltung. (engl.: Rossmann fold) Siehe Dinucleotidbindungsfaltung. Rotationssymmetrie. Symmetrietyp, bei dem die asymmetrischen Einheiten eines symmetrischen Objekts durch Rotation in Übereinstimmung gebracht werden können.

rRNA. Siehe ribosomale DNA. RS-System. Siehe Cahn-Ingold-Prelog-System. Rückgewinnungsweg. (engl.: salvage pathway) Stoffwechselweg zur Umwandlung freier Purine und Pyrimidine in ihre Nucleotidformen. Rückgrat. (engl.: backbone) Atome, welche die sich wiederholenden Verknüpfungen zwischen aufeinander folgenden Resten eines polymeren Moleküls, ausgenommen der Seitenketten, darstellen. Auch als Hauptkette bezeichnet. S. Siehe Entropie.

S. Svedberg, eine Maßeinheit für den Sedimentationskoeffizienten,

RIA. Siehe Radioimmunoassay.

10° s entsprechend.

Ribonucleinsäure. Siehe RNA.

Saccharid. Siehe Kohlenhydrat.

Ribonucleoprotein. Komplex aus Protein und RNA.

Salzbrücke. Siehe Ionenpaar.

Ribonucleotid. Nucleotid mit Ribose als Pentose.

SAM. S-Adenosylmethionin, ein Nucleotidcofaktor, der meistens als Methylgruppendonor fungiert. Auch AdoMet genannt.

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Glossar

Sarkomer. Sich wiederholende Einheit einer Myofibrille, die aus dünnen und dicken Filamenten besteht, die während der Muskelkontraktion aneinander entlang gleiten. Sättigung. Zustand, bei dem alle Ligandenbindungsstellen eines Makromoleküls durch einen Liganden besetzt sind. Sättigungsgrad (Y). Durch Liganden besetzter Anteil an den Ligandenbindungsstellen eines Proteins. Yo, ist zum Beispiel der Sättigungsgrad der Sauerstoffbindungsstelle eines Proteins.

l wenn es aus dem Ribosom erkannt wird, rtike ngspa kennu(SRP) Reticulums mitheraustritt, über die Membran des endoplasmatischen hilfe eines Translocons transportiert wird und von einer Siganlpeptidase gespalten wird. Sekundärer aktiver Transport. Durch im elektrochemischen Gradienten gespeicherte Energie getriebener Transport durch die Membran. Der Gradient wird unter Nutzung der Freien Enthalpie derATP-Hydrolyse oder des Elekironentransports erzeugt. E

Sekundärer Botenstoff. Intrazelluläres Ion oder Molekül, das als Signal

Sauerstoffpartialdruck (pO,). Konzentration gasförmigen Sauerstoffs in Torr-Einheiten.

eines extrazellulären Ereignisses wirkt, wie z.B. die Bindung eines

Sauerstoffschuld. Nach einer Belastung andauernder, erhöhter Sauerstoffverbrauch, der erforderlich ist, um das durch die Leber während der Arbeit des Cori-Cycdlus verbrauchte ATP wieder aufzufüllen.

Sekundärstruktur. Lokale räumliche Anordnung der Atome des Rückgrats eines Polymers ohne Berücksichtigung der Konformation seiner Seiten-

Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor.

kettensubstituenten. Häufige Sekundärstrukturelemenie von Proteinen

Säure. Substanz, die Protonen abgeben kann.

sind a-Helices und ß-Faltblätter.

Säure-Base-Katalyse. Katalysemechanismus, bei welchem eine partielle Protonenverschiebung von einer Säure und/oder ein partieller Protonenentzug durch eine Base die Freie Enthalpie des Reaktionsübergangszustands erniedrigt. Siehe auch allgemeine Säurekatalyse und allgemeine Base-Katalyse.

Selektierbarer Marker. Gen, dessen Produkt eine Aktivität aufweist, z. B. Antibiotikaresistenz, anhand derer Zellen, die dieses Gen aufgenommen haben, von denen, die es nicht haben, unter geeigneten Bedingungen unterschieden werden können.

Saure Lösung. Lösung, deren pH-Wert kleiner als 7,0 ist ([H*] > 10” M). Scheren. Fragmentierung von DNA durch Einwirken mechanischer Kräfte wie Schütteln oder Rühren. Schiff’ sche Base. Bei Reaktionen zwischen einem Amin und einem

Aldehyd oder Keton gebildetes Imin. Schmelztemperatur (T,,). Temperatur am Wendepunkt einer Schmelzkurve für die thermische Denaturierung eines Makromoleküls.

Semidiskontinuierliche Replikation. Art der DNA-Replikation, bei der ein Strang als zusammenhängender Polynucleotidstrang (Leitstrang), der andere hingegen in aufeinander folgenden Bruchstücken (OkazakiFragmente) synthetisiert wird. Letziere werden später zusammengefüst

(Folgestrang). Semikonservative Replikation. Natürliche Art der DNA-Duplikation, bei der jedes neue Doppelstrangmolekül einen Strang aus dem Elternmolekül und einen neu syniheiisierten Strang enthält.

Schwache Säure. Säure, die in wässriger Lösung nur teilweise ionisiert vorliegt. Die Dissoziationskonstante einer schwachen Säure ist kleiner als eine Einheit (pK > 0).

Sequentielle Reaktion. Reaktion, bei der alle Substrate an das Enzym gebunden werden müssen, bevor sie ablaufen kann. Dies kann nach einem geordneten Mechanismus oder einem Random-Mechanismus geschehen.

Schwerer kombinierter Immundefekt (SCID). Erbkrankheit, die in hohem Maße das Immunsystem schwächt. Einer der Defekte ist ein Mangel an dem Enzym Adenosin-Desaminase.

Sequentielles Allosteriemodell. Modell für allosterisches Verhalten, bei dem die Untereinheiten eines oligomeren Proteins ihre Konformation mit zunehmender Anzahl gebundener Liganden schrittweise ändern.

SCID. Siehe schwerer kombinierter Immundefekt.

Serinprotease. Peptide hydrolysierendes Enzym mit einem reaktiven Serinrest im aktiven Zentrum.

Scrapie. Siehe Rinderwahnsinn.

Screenen. Technik zur Identifizierung von Klonen, die ein gesuchtes Gen enthalten. SDS-PAGE. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Gegenwart des Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS; engl.: sodium dodecyl sulfate). Dieses denaturiert Polypeptide und versieht sie mit einer gleichförmigen negativen Ladungsdichte, was eine mehr nach Größe als nach inhärenter Ladung erfolgende Trennung gestattet. Sedimentationskoeffizient. Messung der Sedimentationsgeschwindigkeit eines Partikels in einer Ultrazentrifuge, üblicherweise in Svedberg-Einheiten (S) ausgedrückt. Segmentierungsgene. Gene von Insekten, welche die korrekte Anzahl und Polarität von Körperteilen festlegen. Gap-Gene, pair-rule-Gene und Segmentpolaritätsgene sind alle Segmentierungsgene. Segmentpolaritätsgene. Siehe Segmentierungsgene. Seife. Salz einer langkettigen Fettsäure. Enthält eine polare Kopfgruppe und einen langen hydrophoben Schwanz. Sekretionsweg. Folge von Reaktionen, in denen ein integrales Membranprotein oder ein sekretorisches Protein von einem Siganler-

Shine-Dalgarno-Sequenz. Purinreiche Sequenz vieler prokaryotischer mRNAs, die ca. 10 Nudeotide stromaufwärts des Start-Codons liegt und zum 3'-Ende der 16S-rRNA partiell komplementär ist. Diese Sequenz hilft, das Ribosom in die richtige Position für den Translationsstart zu bringen.

Short interfering RNA (siRNA). Natürliche, aus 18 bis 25 Nudeotiden

bestehende RNA, die die Genexpression über Bindung an komplementäre mRNA-Moleküle hemmt. Auch bekannt als Mikro-RNA (miRNA). Short tandem repeat (STR). Siehe Hoch-repetitive DNA.

Shotgun-Klonierung. Klonierung des Genoms eines Organismus als Satz von Zufallsfragmenten. Sichelzellanämie. Erbkrankheit, bei der Erythrocyten durch das Vorkommen einer Hämoglobinmutante (Glu 6 Val). die in ihrer Desoxyform zu Fasern polymerisiert, deformiert und beschädigt werden.

o-Faktor. Den Promotor eines Gens erkennende Komponente der bakteriellen RNA-Polymerase. Sobald die Ketteninitiation erfolgt ist, wird er wieder abgelöst.

Glossar Sigmoide Kurve. S-förmige graphische Darstellung der kooperative Bindung eines Liganden an ein Molekül.

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SOS-Antwort. Bakterielles System, das beschädigte DNA erkennt, ihre

Replikation stoppt und den Schaden, in einer allerdings fehleranfälligen

Signalerkennungspartikel (SRP). Protein-RNA-Komplex, der an das Signalpeptid eines gerade entstehenden transmembranen oder sekretorischen Proteins bindet und es zum endoplasmatischen Reticulum (in Eukaryoten) oder zur Plasmamembran (in Prokaryoten) zum Transport durch die Membran leitet.

Weise, repariert.

Signalpeptid. Kurze Peptidsequenz, welche die zelluläre Lokalisierung eines Proteins bestimmt. Zum Beispiel die N-terminale Sequenz von 13

Spannungsgesteuerter Kanal. Kanal, dessen Öffnen und Schließen (Torsteuerung) durch eine Veränderung des Membranspotentials kontrolliert wird.

bis 36 Resten von sich gerade bildenden, sekretorischen oder membran-

durchdringenden Proteinen. Sie vermittelt z. B. die Erkennung durch die Maschinerie, die das Protein in das endoplasmatische Reticulum transloziert. Das Signalpeptid wird anschließend durch eine Signalpeptidase abgespalten. Signaltransduktion. Transmission eines extrazellulären Signals in das Zellinnere. Um eine zelluläre Antwort auszulösen, wird durch Bindung eines Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor — häufig unter Bildung sekundärer Botenstoffe - eine Folge intrazellulärer Abläufe aktiviert. Silencer. In einer gewissen Entfernung vom Transkriptionsstart befindliche DNA-Sequenz, an die ein Transkriptionsrepressor binden kann. Sinnstrang. Zum transkribierten DNA-Strang komplementärer Strang. Er hat (der Austausch von U gegen T ausgenommen) die gleiche Basensequenz wie die synthetisierte RNA. Wird auch codierender Strang genannt. siRNA. Siehe Short interfering RNA.

Skorbut. Durch Mangel an Vitamin C (Ascorbinsäure) verursachte Krankheit, die zu einer unzureichenden Quervernetzung von Kollagenketten im Bindegewebe führt. SNARE. (Abkürzung von engl.: soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor) Membran-assoziiertes Protein, das an der Fusion von Vesikeln beteiligt ist. SNAREs von zwei fusionierenden Membranen bilden ein Bündel aus vier Helices, die die Membranen nahe bei einander halten. SNP. Siehe Einzelnucleotidpolymorphismus.

snRNA. Kleine nucleäre RNA: Beim Spleißen von mRNA beteiligte, 60 bis 300 Nucleotide lange, hochkonservierte RNA. snoRNA. Kleine nucleoläre RNA: Eukaryotische RNA-Moleküle, bestehend aus 70 bis 100 Nucleotiden, die sich mit noch nicht gereiften rRNAs zusammenlagern, um ihre sequenzspezifische Methylierung zu steuern.

Southern Blot. Verfahren zur Identifizierung einer DNA-Basensequenz nach Elektrophorese. Es beruht auf deren Fähigkeit mit einem komplementären Einzelstrangabschnitt markierter DNA oder RNA (Sonde) zu hybridisieren. Siehe auch Northern Blot.

Spezialpaar. Zwei eng beieinander liegender Chlorophyligruppen innerhalb eines Photosynthese-Systems, die photooxidiert werden. Sphärocytose. Vererbbare Abnormalität im Cytoskelett des Erythrocyten, die zu kugelförmigen, starren Zellen und in der Folge zu hämolytischer Anämie führt.

Sphingolipid. Derivat des C,3-Aminoalkohols Sphingosin. Sphingolipide umfassen Ceramide, Cerebroside und Ganglioside. Sphingolipide mit Phosphatkopfgruppen werden Sphingophospholipide genannt. Sphingomyelin. Das häufigste Sphingolipid. Es besteht aus einem Ceramid mit einer Phosphocholin- oder Phosphoethanolamin-Kopfgruppe. Spleißen. Üblicherweise durch Ribonucleoproteine katalysierter Prozess zur Bildung reifer Transkripte. Es werden Introns entfernt und Exons vereinigt. Einige RNAs spleißen sich auch selbst. Spleißosom. 50S- bis 60S-Partikel, das Proteine, snRNP und prä-mRNA

enthält. Führt die Spleißreaktionen durch, bei denen die prä-mRNA zu reifer mRNA umgewandelt wird. Spontaner Vorgang. Vorgang, der thermodynamisch ohne Zufuhr Freier Enthalpie aus der Umgebung des Systems abläuft. Spontaneität hängt nicht mit der Geschwindigkeit eines Vorgangs zusammen. Spurenelement. Siehe Mineral.

Squelching. Hemmung der Aktivität eines Transkriptionsfaktors durch einen anderen Transkriptionsfktor, der mit diesem um die Bindung an die DNA konkurriert. SR. Siehe SRP-Rezeptor. SRP. Siehe Signalerkennungspartikel.

SRP-Rezeptor (SR). Protein des endoplasmatischen Reticulums, das während der Synthese eines transmembranen oder eines sekretorischen Proteins als Andockpunkt für das Signalerkennungspartikel (SRP) dient.

snRNP. Kleines nucleäres Ribonucleoprotein: Beim Spleißen von mRNA beteiligter Komplex aus Protein und kleiner nucleärer RNA.

SSB. Siehe Einzelstrang-Bindeprotein.

Solvatisierung. Zustand bei der eine Substanz mit mehreren Schichten regelmäßig angeordneter Lösungsmittelmoleküle umgeben ist. Die Solvatisierung durch Wasser heißt Hydratisierung.

Stamm-Loop-Struktur. Sekundäres Strukturelement einer EinzelstrangNucleinsäure, bei dem zwei komplementäre Abschnitte einen basengepaarten Stamm bilden, dessen Stränge durch eine Schleife aus ungepaarten Basen verbunden sind.

Somatische Hypermutation. Stark erhöhte Mutationsrate, die in proliferierenden B-Lymphozyten in den Genen für Immunglobuline auftritt und die über mehrere Zellgenerationen hinweg zur Bildung von Antikörpern mit höherer Antigenaffinität führt.

Standardzustand. Satz von Bedingungen, der die Einheitsaktivität des betrachteten Stoffs, eine Temperatur von 25 °C, einen Druck von 1,01 x 10° Pa und einen pH-Wert von 7,0 umfasst. Siehe auch biochemischer Standardzustand.

Somatische Rekombination. Genetische Umordnung in Nicht-Keimbahnzellen.

Sonde. Markierter DNA- oder RNA-Einzelstrangabschnitt, der bei einem Screening mit einer gesuchten DNA oder RNA hybridisieren kann.

Stapeleffekte. Stabilisierende van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen aufeinander folgenden (gestapelten) Basen und Basenpaaren in einem Polynucleotid. Stärke. Gemisch von linearen und verzweigten Glucosepolymeren. Dient bei Pflanzen als hauptsächliche Energiereserve.

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Glossar

Starke Säure. Säure, die in wässriger Lösung nahezu vollständig ionisiert vorliegt. Eine starke Säure hat eine Dissoziationskonstante, die viel größer als die Einheitskonzentration ist (pK < 0). STAT. Mitglied einer Proteinfamilie, die als Signalüberträger und als Aktivatoren der Transkription über die Bindung an DNA fungieren. Ihre Aktivität wird durch Tyrosinphosphorylierung reguliert.

Superhelix. (engl.: coiled coil) Anordnung von Polypeptidketten, bei der sich zwei a-Helices umeinander winden, wie z. B. beim a-Keratin.

Superoxidradikal. O,'-, teilweise reduzierte Sauerstoff-Spezies, die über freie Radikal-Reaktionen Biomoleküle beschädigen kann. Supersekundärstruktur. Siehe Motiv.

Stereoisomere. Chirale Moleküle, die unterschiedliche Konfigurationen an mindestens einem ihrer asymmetrischen Zentren aufweisen aber ansonsten identisch sind.

Superspiralisierung. Der topologische Zustand kovalent geschlossener, zirkulärer Doppelhelix-DNA, der durch Über- und Unterdrehung der Doppelhelix entsteht und dem DNA-Ring ein verdrilltes Aussehen verleiht. Auch als Superhelicität bezeichnet.

Steroid. Eines von vielen in der Natur vorkommenden Lipiden. Besteht aus vier fusionierten Ringen. Viele Steroide sind von Cholesterin abgeleitete Hormone.

Suppressormutation. Mutation, welche die Auswirkung einer anderen Mutation aufhebt.

Sterol. Alkoholderivat eines Steroids.

Stickstoffassimilierung. Aufnahme von fixiertem Stickstoff (z.B. Ammoniak) in ein biologisches Molekül wie z.B. eine Aminosäure.

Symbiose. Sich gegenseitig bedingende Beziehung zwischen zwei i

Organismen.

Ammoniak, oft über Nitrat und Nitrit, in einander überführt werden.

Symmetriemodell der Allosterie. Modell allosterischen Verhaltens, bei dem alle Untereinheiten eines oligomeren Proteins gezwungen sind, in einer konzertierten Weise ihre Konformation so zu ändern, dass die Symmetrie des Oligomeren erhalten bleibt.

Stickstofffixierung. Stoffwechselprozess, durch den N, der Atmosphäre in eine biologisch verwertbare Form, wie z. B. NH, umgewandelt wird.

Symport. Gleichzeitig, in die gleiche Richtung verlaufender Transport zweier Moleküle durch die Membran.

Stoffwechsel. Gesamtheit aller degradativen und biosynthetischen Reaktionen der Zelle.

Syn-Konformation. Purinnucleotidkonformation, bei der die Ribose und die Base ekliptisch sind. Siehe auch Anti-Konformation.

Stoffwechselbrennstoff. Oxidierbares Molekül zur Versorgung des Organismus mit Freier Enthalpie.

Syncytium. Einzelne Zelle, die als Ergebnis wiederholter Kernteilungen, ohne dass neue Plasmamembranen gebildet werden, mehrere Zellkerne enthält.

Stickstoffeyclus. Reaktionsfolge, in der von vielen Organismen N, und

Stopp-Codon. Sequenz von drei Nucleotiden, die keine Aminosäure codiert, sondern anstelle dessen die Termination der Translation verursacht. Auch als Nonsense-Codon bezeichnet.

Synonymes Codon. Codiert die gleiche Aminosäure wie ein anderes Codon.

STR. (engl.: short tandem repeat) Siehe Hoch-repetitive DNA.

System. In der Thermodynamik: Teil des Universums, der für einen betrachteten Vorgang von Interesse ist. Der Rest des Universums ist die Umgebung. Siehe auch geschlossenes System, isoliertes System und offenes System.

Stroma. Konzentrierte Lösung von Enzymen, niedermolekularen Verbin-

dungen und Ionen im Inneren eines Chloroplasten; Syntheseort von Kohlenhydraten. Stromalamelle. Membransystem, das die Granathylakoide in Chloroplasten miteinander verbindet.

Systembiologie. Computerbasierende Sammlung und Analyse von Datensätzen, um der Beziehungen zwischen dynamischen und vollständig biologischen Netzwerken zu untersuchen.

Strukturbasiertes Drug Design. Synthese von wirksameren Arzneistoffen basierend auf dem Wissen um die Struktur des Zielmoleküls und um Wechselwirkungen mit anderen Arzneistoffen. Auch rationales Drug Design genannt.

T. Siehe helicale Windungszahl.

Strukturbioinformatik. Siehe Bioinformatik. Strukturgen. Gen, das ein Protein codiert. Substrat. Ausgangsstoff einer enzymatischen Reaktion.

Substratcyclus. Zwei gegenläufige Stoffwechselreaktionen mit der Funktion, einen Kontrollpunkt für die Regulation eines metabolischen Fluxes zu liefern. Wird auch Leerlaufcyclus genannt. Substratkettenphosphorylierung. Direkte Übertragung einer Phosphorylgruppe auf ADP.

Suizidsubstrat. Siehe mechanismusgestützter Inhibitor. Sulfhydrylgruppe. Molekülteil mit der Formel -SH.

Superhelicale Windungszahl (W). (engl.: writhing number) Anzahl von Windungen der Duplexachse einer kovalent geschlossenen, zirkulären, doppelhelicalen DNA um die Superhelixachse. Maß für die Superhelicität. Superhelicität. Siehe Superspiralisierung.

tı/2. Siehe Halbwertszeit.

T-R-Übergang. Durch Ligandenbindung verursachter Konformationswechsel eines allosterischen Enzyms. T-Zustand. Eine von zwei Konformationen eines allosterischen Proteins; die andere ist der R-Zustand.

TAFs. TBP-assoziierte Faktoren, die zusammen mit TBP den allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIID bilden, der für die Transkription von eukaryotischen Strukturgenen benötigt wird.

TATA-Box. Eukaryotisches Promotorelement mit der Konsensussequenz TATAAAA, die 10 bis 27 Nucleotide stromaufwärts des Transkriptionsstarts liegt. Tautomere. Isomere, die sich nur in der Position ihrer Wasserstoffatome unterscheiden.

Taxonomie. Lehre von der biologischen Klassifikation.

Tay-Sachs-Krankheit. Tödliche Sphingolipidspeicherkrankheit, die durch einen Mangel an Hexosaminidase A verursacht wird. Dieses Enzym baut das Gangliosid Gy, ab.

ee

Glossar

1199

TBP. TATA-Bindungsprotein. Eine DNA-bindendes Protein, das für die Transkription eukaryotischer Gene benötigt wird.

rung, Bindung eines Liganden, Gegenwart eines Signalmoleküls oder eine Veränderung der Membranspannung.

TCA-Cyclus. Tricarbonsäurecyclus. Siehe Citrateyclus.

Totenstarre. Steifwerden der Muskeln nach dem Tod.

Telomer. Ende eines linearen, eukaryotischen Chromosoms. Besteht aus Tandemwiederholungen (engl.: tandem repeats) einer kurzen G-reichen Sequenz an dem das 3’-Ende tragenden Strang und der dazu komplementären Sequenz am das 5’-Ende tragenden Strang. Telomerase. Telomere bildende, RNA-enthaltende DNA-Polymerase. Katalysiert mit der RNA als Matrize das wiederholte Anhängen einer spezifischen G-reichen Sequenz an das 3’-Ende eukaryotischer DNA. Tertiärstruktur. Vollständige, dreidimensionale Struktur eines monomeren Polymers einschließlich seiner Seitenketten. Tetraedrisches Zwischenprodukt. Zwischenprodukt bei der Hydrolyse von Peptidbindungen, bei dem das Carbonyl-C-Atom der zu spaltenden Bindung einen nucleophilen Angriff durchläuft, so dass es vier Substituenten besitzt. Tetramer. Komplex aus vier monomeren Untereinheiten. Therapeutischer Index. Verhältnis der Dosis eines Arzneistoffs, der Toxizität bewirkt zu der Dosis, die die gewünschte Wirkung erzielt.

Thermodynamik. Lehre über die Wechselbeziehungen zwischen verschiedenen Formen der Energie. Thermogenese. Wärmeproduktion ohne Auftreten von Schüttelfrost und anderen Muskelbewegungen durch Oxidation von Nahrungsstoffen ohne die Synthese von ATP. Thermophiler Organismus. Organismus, der bei hohen Temperaturen leben kann. THF. Tetrahydrofolat, ein Cofaktor für Reaktionen, die C,-Einheiten in verschiedenen Oxidationszuständen übertragen.

#-Struktur. Auftreten eines circulären DNA-Moleküls, das durch die fortlaufende Auftrennung seiner zwei Stränge die Replikation durchläuft. Thylakoid. Innerstes Kompartiment in Chloroplasten. Entsteht durch Einstülpungen der inneren Chloroplastenmembran. Die Thylakoidmembran ist der Ort der Lichtreaktionen bei der Photosynthese. Titrationskurve. Graphische Darstellung der Beziehung zwischen dem pH-Wert einer säure- oder basehaltigen Lösung und dem Dissoziationsgrad von Protonen (ungefähr äquivalent zu der Menge einer starken Base oder Säure, die der Lösung zugefügt wurde). T,. Siehe Schmelztemperatur. Topoisomerase. Enzym, das die Superspiralisierung von DNA verändert, indem es Bruchbildungen in einem oder beiden Strängen, das Hindurchgleiten der DNA durch den Bruch und das Wiederverschließen des Bruchs katalysiert.

Topologie. Lehre von den geometrischen Eigenschaften eines Objekts.

Tor- und Zaun-Model. Model einer Membranstruktur, das Cytoskelettproteine beeinhaltet, die die freie Diffusion anderer Membranproteine verhindern oder einschränken.

Torsionswinkel. Diedrischer Winkel, der von den Bindungen zwischen vier aufeinander folgenden Atomen gebildet wird. Die Torsionswinkel ® und \Y zeigen die Rückgratkonformation einer Peptidgruppe in einem Polypeptid an. Torsteuerung (engl.: gating). Öffnen und Schließen eines transmembranen Kanals als Antwort auf ein Signal wie z.B. mechanische Stimulie-

TWC-Arm.

Konservierte Stamm-Schleifen-Struktur in einem tRNA-

Molekül, das üblicherweise die Sequenz TC

enthält, wobei W Pseudo-

uridin ist.

TPP. Thiaminpyrophosphat, ein Cofaktor für Reaktionen, in denen a-Ketosäuren decarboxyliert werden. Trans-Konformationen. Anordnung einer Peptidgruppe in der aufeinander folgende C,-Atome auf der gegenüberliegenden Seite der Peptidbindung liegen. Transaminierung. Übertragung einer Aminogruppe von einer a-Aminosäure auf eine a-Ketosäure, um eine neue Ketosäure und eine neue

Aminosäure zu erhalten.

Transfer-RNA (tRNA). Kleine L-förmige RNA-Moleküle, die an Ribosomen bestimmte, kovalent an ihre 3’-Enden gebundene Aminosäuren bereitstellen. Durch komplementäre Basenpaarung des aus drei Nucleotiden bestehenden tRNA-Anticodons mit dem Codon auf der mRNA wird entsprechend der Sequenz einer angelagerten mRNA die jeweils passende tRNA ausgewählt und ihre Aminosäuregruppe auf das anwachsende Polypeptid übertragen. Transferase. Enzym, das die Übertragung einer funktionellen Gruppe von einem Molekül zu einem anderen katalysiert. Transformation. (1) Bleibende Veränderung der genetischen Information einer Zelle durch das Einschleusen fremder DNA. (2) Genetische Veränderungen, die eine normale Zelle in eine Krebszelle umwandelt. Transgen. Fremdes Gen, das in einem Wirtsorganismus stabil exprimiert wird.

Transgener Organismus. Organismus mit stabiler Expression eines fremden Gens (Transgen).

Transition. Mutation, bei der ein Purinrest (oder Pyrimidinrest) durch einen anderen ausgetauscht wird. Transkription. Prozess der RNA-Synthese unter Verwendung von DNA als Matrize, wobei genetische Information von DNA zu RNA transferiert

wird. Die Transkription wird durch RNA-Polymerase katalysiert und durch zahlreiche andere Proteine beeinflusst.

Transkriptionsfaktor. Protein, das direkt oder durch Wechselwirkung mit anderen an DNA bindenden Proteinen an DNA-Sequenzen im Gen bzw. in seiner Nähe bindet und dadurch die Transkription eines Gens beeinflusst. Transkriptomik. Erforschung aller mRNA-Moleküle, die eine Zelle transkribiert. Translation. Zellulärer Vorgang, bei dem die in der Nucleotidsequenz einer RNA enthaltene Information gemäß dem genetischen Code in die entsprechende Aminosäuresequenz eines Polypeptids übersetzt wird. Die Translation wird durch Ribosomen unter weiterer, notwendiger Beteiligung von mRNA, tRNA und einer Reihe verschiedener Proteine katalysiert. Translokation. (1) Bewegung eines Polypeptids durch eine Membran während der Synthese eines sezernierten Proteins. (2) Bewegung des

Ribosoms über die Länge eines Codons hinweg entlang der mRNA nach der Peptidbindungssynthese. Translokationskomplex. Protein mit vielen Untereinheiten, das eine wässrige Pore über die Membran des endoplasmatischen Reticulums

1200

Glossar

bildet, um ein Protein als Teil des sekretorischen Stoffwechselwegs zu transportieren.

Transmembranprotein. Integrales Protein, das die Membran vollständig durchspannt. trans-Peptidbindung. Konformation, bei der aufeinander folgende C.-Atome sich auf den gegenüberliegenden Seiten der Peptidbindung befinden. Transpeptidierung. Ribosomaler Vorgang zur Bildung einer neuen Peptidbindung, bei dem das entstehende, an tRNA gebundene Polypeptid auf eine ebenfalls an tRNA gebundene Aminoacylgruppe übertragen wird. Das Polypeptid wird dabei an seinem C-Terminus um einen Rest verlängert.

Transponierbares Element. Siehe Transposon. Transposition. Verschieben (Kopieren) von genetischem Material aus einem Teil des Genoms in einen anderen oder, in einigen Fällen, von

einem Organismus zu einem anderen.

Transposon. Genomische Einheit, die sich durch Kopieren von einer Position im Genom zu einer anderen bewegen kann. Wird auch als transponierbares Element bezeichnet. Transversaldiffusion. Übergang eines Lipids von der einen Lage einer Lipiddoppelschicht in die andere. Auch Flip-Flop genannt. Transversion. Mutation, bei der ein Purinrest durch einen Pyrimidinrest, oder auch umgekehrt, ausgetauscht wird. Tretmühleneffekt. (engl.: treadmilling) Anfügen monomerer Einheiten an das eine Ende eines linearen Aggregats unter ihrer Entfernung vom entgegengesetzten Ende, so dass die Länge des Aggregats unverändert bleibt; z. B. bei einem Actinfilament.

Triacylglycerin. Lipid, bei dem an einem Glycerinrückgrat drei Fettsäuren verestert sind. Auch als Triglycerid bezeichnet. Tricarbonsäurecyclus (TCA-Cyclus). Siehe Citratcyclus. Triglycerid. Siehe Triacylglycerin.

Ubiquitinylierung. Kovalente Verknüpfung von Ubiquitin mit einem eukaryotischen, intrazellulären Protein, wodurch dieses in den meisten Fällen für den Abbau durch ein Proteasom markiert wird. Ultraschallbehandlung. Behandlung mit Schallwellen hoher Frequenz. Wird zum Zerreißen von Zellen und subzellulären Membranen angewendet. Ultrazentrifugation. Verfahren, bei dem Makromoleküle einer hohen Zentrifugalkraft ausgesetzt und dabei nach Größe und/oder Dichte (in einer Ultrazentrifuge) getrennt werden. Eine Methode zur Bestimmung von Masse und Tertiärstruktur. Umgebung. In der Thermodynamik: Der Rest des Universums außer dem aktuell interessierenden Teil des Universums. Umhülltes Vesikel. (engl.: coated vesicle) Membranumhülltes, intrazelluläres Transportvesikel, das in einem käfigartigen Gerüst aus dem Protein Clathrin oder aus einem anderen Protein eingeschlossen ist. Umkehrschleife. Polypeptidkonformation, bei der die Kette einen Richtungswechsel vollzieht. Besteht gewöhnlich aus vier aufeinander folgenden Resten. Wird auch ß-Kehre genannt.

Ungesättigte Fettsäure. Fettsäure, die mindestens eine Doppelbindung in ihrer Kohlenwasserstoffkette enthält. Uniport. Durchqueren der Membran als einzelnes Molekül. Unkompetitive Hemmung. Enzymatischer Hemmtyp, bei dem der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex bindet und dabei die scheinbaren Kyr und V„.„„Werte des Enzyms um den gleichen Faktor verändert.

Unpolares Molekül. Molekül, dem eine Gruppe mit einem permanenten Dipol fehlt. Untereinheit. Eine von mehreren, ein Protein bildenden Polypeptidketten. ö Uridylierung. Anfügen einer Uridylgruppe (UMP). Uronsäure. Zucker, der aus einer Aldose durch Oxidation der primären Alkoholgruppe zu einer Carboxylgruppe entsteht.

Irimer. Assoziat aus drei monomeren Einheiten. tRNA. Siehe Transfer-RNA.

Tumorsuppressor. Protein dessen Abwesenheit oder Inaktivierung zu Krebserkrankungen führen kann.

v. Reaktionsgeschwindigkeit, typischerweise gemessen als Geschwindigkeit des Erscheinens eines Produkts oder des Verschwindens eines Ausgangsstoffs. vo. Initialgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion.

Tyrosin-Kinase. Enzym, das die ATP-abhängige Phosphorylierung einer Tyr-Seitenkette katalysiert.

U. Thermodynamisches Symbol für Energie.

Übergangstemperatur. Temperatur, bei der eine Lipiddoppelschicht von einem gelähnlich festen in einen mehr fluiden, flüssigkristallinen Zustand übergeht. Übergangszustand. Molekülanordnung im Reaktionskoordinatendiagramm einer chemischen Reaktion am Punkt maximaler Freier Enthalpie.

Vakuole. Intrazelluläres, Wasser oder andere Moleküle speicherndes Vesikel. Van-der-Waals-Kräfte. Nichtkovalente Interaktion zwischen Molekülen durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen permanenten und/oder induzierten Dipolen. Van-der-Waals-Radius. Abstand zwischen zwei Atomen, die sich in

größtmöglicher Annäherung befinden, ohne eine Bindung auszubilden. Van’t Hoff-Auftragung. Graphische Auftrag von Re. gegen 1/T. Sie wird verwendet, um AH° und AS° und daraus AG? für eine chemische Reaktion zu bestimmen.

Übergangszustandsanalogon. Stabile Verbindung, die geometrisch und elektronisch dem Übergangszustand einer chemischen Reaktion ähnlich ist.

Variable Region. N-terminaler, eine hohe Sequenzvariabilität aufweisender Teil eines Antikörpermoleküls, an dem das Antigen bindet.

Überproduzent. Gentechnisch veränderter Organismus, der große Mengen eines Genprodukts bildet, das von Fremd-DNA codiert wird.

Variabler Arm. Nichtkonservierte Region eines tRNA-Moleküls, die 3 bis 21 Nucleotide enthält und die eine basengepaarte Stamm-Struktur enthalten kann.

Ubichinon. Siehe Coenzym Q Variante. Natürlich vorkommende

Form einer Mutante.

Glossar Vektor. Siehe Klonierungsvektor.

Verknüpfungszahl (I). (engl.: linking number) Anzahl, wie oft ein Strang einer kovalent geschlossenen, zirkulären Doppelstrang-DNA sich um den anderen Strang windet. Sie kann ohne Aufbrechen der kovalenten Bindung nicht verändert werden.

1201

Wobble-Hypothese. Erklärung für die tolerante {RNA-mRNA-Paarung an der dritten Anticodonposition, zu der auch Nicht-Warson-Crick-Basenpaare gehören. Dies erlaubt vielen tRNAs, zwei oder drei verschiedene (degenerierte) Codons zu erkennen.

Vermittelter Transport. Transport einer Substanz durch eine Membran, der im Unterschied zum unvermittelten Transport mit Hilfe eines spezifischen Carrier-Proteins erfolgt.

Xenobiotikum. Molekül, das normalerweise in einem Organismus nicht vorkommt.

Vesikel. Von einer Membran umgebener, mit Flüssigkeit gefüllter Beutel.

Y. Siehe Sättigungsgrad.

Virulenz. Krankheitserregendes Potential eines Mikroorganismus.

YAC. Siehe künstliches Hefechromosom.

Virus. Ein nicht selbst lebensfähiges Gebilde, das den Stoffwechsel einer Wirtszelle nutzt, um sich zu reproduzieren.

Ylid. Molekül mit entgegengesetzten Ladungen an benachbarten Atomen.

Vitamin. Für den Stoffwechsel notwendige Verbindung, die durch einen tierischen Organismus nicht synthetisiert werden kann und deswegen in der Nahrung enthalten sein muss.

Z-Schema. Z-förmiges Diagramm, in dem die Reaktionsschritte und deren Redoxpotentiale für das zwei Reaktionszentren enthaltende photosynthetische Elektronentransportsystem von Pflanzen und Cyanobakterien dargestellt sind.

VLDL. Lipoprotein sehr geringer Dichte (engl.: very low density lipoprotein) Siehe Lipoprotein. Vnax: Maximalgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion.

Vipt. Beobachtete maximale Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion, die sich aufgrund der Anwesenheit eines Inhibitors vom tatsächlichen Wert unterscheiden kann. Vorstufe. Objekt, aus dem durch Prozesse wie Evolution oder chemische Reaktion ein anderes Objekt entsteht. Vorwärtsaktivierung. Aktivierung eines späteren Schritts in einer Reaktionsfolge durch das Produkt eines frühen Reaktionsschritts.

Zellcyclus. Bei Eukaryoten zwischen den Zellteilungen aufeinander folgende Vorgänge. Sie beinhalten: Mitose und Zellteilung (M-Phase), ein Zwischenstadium (G,-Phase), eine Periode der DNA-Synthese (S-Phase) und ein zweites Zwischenstadium (G,-Phase) vor der nächsten M-Phase. Zellkern. Membranumschlossene Organelle, in der sich das genetische Material der eukaryotischen Zelle befindet. Zelluläre Immunität. Immunität, die durch T-Lymphocyten (T-Zellen) vermittelt wird. Zentrales Dogma der Molekularbiologie. Dogma, nach dem DNA sowohl ihre eigene Replikation als auch ihre Transkription in RNA, welche dann in ein Polypeptid übersetzt wird, betreibt. Der Informationsfluss verläuft

W. (1) Siehe superhelicale Windungszahl. (2) Die Anzahl an energetisch

stets von DNA zur RNA und zum Protein.

gleichwertigen Arten, die Komponenten eines Systems anzuordnen.

w. Thermodynamisches Symbol für die durch ein System nach außen geleistete Arbeit.

Zinkfinger. Proteinstrukturmotiv, das an der Bindung von DNA beteiligt ist und aus 25 bis 60 Aminosäureresten besteht. Diese umfassen Hisund/oder Cys-Reste, an die ein oder zwei Zn’*-Ionen tetraedrisch, koordinativ gebunden sind.

Wachstumsfaktor. Die Proliferation und Differenzierung seiner Zielzellen stimulierendes Proteinhormon.

Zucker. Einfaches Mono- oder Disaccharid.

Waisengen. (engl.: orphan gene) Gen mit unbekannter Funktion, das ü;blicherweise über Genomsequenzierung identifiziert wird. Wasserstoffbrückenbindung. Vorwiegend elektrostatische Wechselwirkung zwischen einer schwach sauren Donatorgruppe, wie z. B. O-H oder N-H, und einem schwach basischen Akzeptoratom, wie O oder N. Watson-Crick-Basenpaar. Stabile Paarung von Nucleotidbasen. Entweder Adenin mit Thymin oder Guanin mit Cytosin. Sie kommt in DNA und seltener in RNA vor. Siehe auch Hoogsten-Basenpaar.

Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln. Anstieg oder Abfall der Bioverfügbarkeit eines Arzneimittels, verursacht durch Stoffwechseleffekte anderer Arzneimittel.

Zusammengesetztes Transposon. Genetische Sequenz, die eine Reihe von Genen enthalten kann und von IS-ähnlichen Elementen flankiert ist. Solche Transposons entstehen anscheinend durch Vereinigung von zwei unabhängigen IS-Elementen.

Zustandsfunktion. Größen wie Energie, Enthalpie, Entropie und Freie Enthalpie, deren Werte nur vom aktuellen Zustand des Systems abhängen, aber nicht davon, wie dieser erreicht wurde. Zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese. Technik, bei der Proteine erst über eine isoelektrische Fokussierung nach ihrer Nettoladung getrennt werden und dann senkrecht dazu durch eine SDS-PAGE nach ihrer Größe getrennt werden.

Wechselzahl. Siehe k;..-

Zwitterion. Verbindung mit entgegengesetzt geladenen Gruppen. Auch als dipolares Ion bezeichnet.

Western-Blot. Siehe Immunoblot.

Zymogen. Inaktive Vorstufe (Proenzym) eines proteolytischen Enzyms.

Wildtyp. Natürliche vorkommende Version eines Organismus oder Gens.

Lösungen zu den Aufgaben Kapitel1 1.

A B C D

Imzl za

-RT In Kg = -RT In [CJ[D] / [AJ[B]

INES“

- (8,314 J K' mol"') (298 K) In (3)(5)/(10)(15)

Thiol-(Sulfhydryl-)gruppe Carbonylgruppe Peptidbindung Phosphoanhydrid(Pyrophosphoryl-)bindung Phosphorylgruppe (P;) Hydroxylgruppe

Die Zellmembran muss semipermeabel sein, damit die Zelle essentielle Verbindungen zurückhalten kann, während Nahrungsstoffe eindringen und Abfallstoffe austreten können.

= 5700.] mol! = 5,7 kJ mol"

Die Reaktion ist bei Standardbedingungen endergon, da AG°' positiv ist. 10. Aus Gleichung 1.17 folgt:

K., = [G6P]/[G1P] = e*° [G6P]/[G1P]

a, e

7100 J/mol) / (8,314 ] / K mol) (298 K)

[G6P]/[G1P] = 17,6 [G1P]/[G6P] = 0,057 1hla AG = AH -TAS

AG = -7000 J - mol"! - (298 K)(-25 J - K' - mol") AG = -7000 + 7450 ] - mol! = 450 J - mol"

Konzentration = Molanzahl / Volumen Volumen Mol Protein

= (4/3)nr? = (4/3)n(5 X 10m)’ 504 210.0. 524 x 10 [L = (2 Moleküle) /(6,022 x 10° Moleküle mol"') = 3,32 x 10°°* mol

Konzentration = (3,32 X 10°°* mol)/(5,24 x 10° I)

Diese Reaktion läuft nicht spontan ab, weil AG > 0 ist. Die Temperatur muss gesenkt werden, um den Wert des Terms TAS zu senken. 10 Damit AG negativ wird (die spontan ablaufende Reaktion),

muss TAS größer als AH sein. TINSSENT

=6,3 X 10° M = 6,3 nM Anzahl an Molekülen = Molare Konzentration X Volumen

(6,022 x 10° Moleküle mol) = (10° mol L7')(5,24 x 10°"°L) (6,022 x 10° Molekülemol") = 3,2 x 10° Moleküle

TSZAHJAS

T > 7000 J - mol!/20 ] - K'. mol" T->1350K:oder 77 G 13. (a) Falsch. Eine spontane Reaktion läuft nur in eine Rich-

tung ab. (b) Falsch. Die Thermodynamik spezifiziert nicht die Reaktionsgeschwindigkeit. (c) Richtig. (d) Richtig. Eine Reaktion ist so lange spontan, wie AS >

(a) Flüssiges Wasser; (b) Eis hat bei der niedrigeren Temperatur eine geringere Entropie.

(a) (b) (c) (d)

nimmt ab; nimmt zu; nimmt zu; keine Veränderung.

AHJT ist.

14. Diese Strategie funktioniert NICHT, weil Reaktion 1 eine

(a) T= 273 + 10.= 283 K AG=AH-TAS

AG=15kJ- (283 K)(0,05 kJ] K'') = (15-14,15 kJ) =0,85 kJ. AG ist größer als Null. Damit läuft die Reaktion nicht spontan ab.

(b) T = 273 + 80 = 353 K AG =AH-TASAG = 15 kJ - (353 K)(0,05 kJ K'') = (15-17,65 kJ) = -2,65 kJ

AG ist kleiner als Null. Damit läuft die Reaktion spontan ab. Ka = eAG”/RT _ g-1-20.900 Jjmol-1)/(8,314 JK-!mol-1)(298 K) _ 4,6 X 10

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt K 8 W C V W 2

negative Änderung der Enthalpie hat, wodurch Wärme freigesetzt wird, weshalb die Reaktion mit sinkender Temperatur begünstigt wird; Reaktion 2 hat eine positive Enthalpieänderung und wird daher ungünstiger. Senkt man also die Temperatur, so ist das für Reaktion 1, aber nicht für Reaktion 2 von Vorteil. Damit Reaktion 2 begünstigt wird, muss die Temperatur ansteigen. Um die benötigte Wärmemenge zu berechnen, kann man Gleichung 1.18 verwenden: -AH®

In K, =

In

RK Ks

R

-

/1 1

Asl +

R

zAbl (al B R Ni mE

Lösungen zu den Aufgaben

gebenden Lösung diffundieren in den Dialyseschlauch. Im Gleichgewichtszustand sind die Lösungszusammensetzungen innerhalb und außerhalb identisch. Wäre die Membran für gelöste Substanzen undurchlässig, würde fast das gesamte Wasser aus dem Dialyseschlauch entweichen.

Zieht man die beiden Gleichungen voneinander ab und berücksichtigt, dass Kj'/K/' =1 ist, erhält man In

Kick Kırky'

RK

re

RR

R

Wir hätten gerne, dass Ky”"/K/?: =10.

-) Setzt man

1203

(a)

I

(b)

CH

alle

oe

H—-C—H

Werte ein und löst nach T; auf, so erhält man

RK: mans RK

In —.

28.000 + 28.000 (1 8,31 298

600-

-) 7

(e) * coo 1-6 —H

Löst man nach T; auf, so erhält man

I, =

7 298

(a

NH,

1 ggg31 — ?22K 56.000

MEEOON H-0—CH,-000-

Nut

(a) pH 4, NH}; pH 8, NH}, pH 11, NH;.

(b) pH 4, H,PO5; pH 8, HPO7; pH 11, HPOX".

Um K,/K, von 1 auf 10 zu erhöhen, muss somit die Temperatur von 298 K auf 322 K erhöht werden.

Der Anstieg der H*-Konzentration durch Zugabe von HCl

beträgt (50 mL)(1 mM)/(250 mL) = 0,2 mM=2x

10*M.

Kapitel 2

Weil die H*-Konzentration von reinem Wasser, 10” M, relativ unbedeutend ist, ist der pH-Wert der Lösung gleich

1. (a) Donatoren: NH1, NH, an C2, NH9; Akzeptoren: N3, O an C6, N7. (b) Donatoren: NH1, NH, an C4; Akzeptoren: O an C2, N3. (c) Donatoren: NH3-Gruppe, OH-Gruppe; Akzeptoren: COO’”-Gruppe, OH-Gruppe.

-log(2 X 10°*) oder 3,7.

2. Ein protonierter (und damit positiv geladener) Stickstoff würde die Trennung der Ladung in der benachbarten C-H-Bindung fördern, sodass C eine partielle negative Ladung und H eine partiell positive Ladung hätte. Die würde es wahrscheinlicher machen, dass H an einen Wasserstoffbrücken-Akzeptor gegeben würde. 3. Vom löslichsten (polarsten) zum am wenigsten löslichen (am wenigsten polaren) c, b, e, a, d. 4.

(a) Wasser (b) Wasser

(c) Micelle. 5. Ein frisch gewachstes Auto stellt eine hydrophobe Oberfläche dar. Um die Wechselwirkung mit den hydrophoben

Molekülen (Wachs) so klein wie möglich zu halten, minimiert jeder Wasserstropfen seine Oberfläche, indem er kugelförmig wird (die Kugel hat im Verhältnis zu ihren Volumen die kleinste Oberfläche). Wasser perlt nicht auf Glas, weil Glas eine hydrophile Oberfläche darstellt, mit der die Wassermoleküle wechselwirken können. Dies ermöglicht es dem Wasser, sich auszubreiten. 6. Wassermoleküle wandern vom Innern des Dialyseschlauchs in die umgebende Lösung. Ionen aus der um-

10.

(a) (0,01 L)(5 mol IL! NaOH)/(1 L) = 0,05 M NaOH = 0,05 M OH}; [H*] = K,/[OH] = (10"* M?)/(0,05 M) =2x 10" M; pH = -log[H*] = -log (2 X 10°) = 12,7.

(b) (0,02 L)(5 mol L' HCl)/(1 L)=0,1 MHCI=0,1MHY;

da der Anteil von 0,01 L x 100 mM/(1 L) = 1 mM Glycin bei 0,1 M HCl unbedeutend ist, ergibt sich pH = -log[H*] = -log (0,1) = 1,0. (c) pH = pK + log ([Acetat]/[Essigsäure]); [Acetat] = (5 g)

(1 mol/82 g)/(1 L) = 0,061 M; [Essigsäure] = (0,01 L) (2 mol L')/(1 L) = 0,02 M; pH = 4,76 + log (0,061/ 0,02) = 4,76 + 0,48 = 5,24. Nik. Die Änderung der Freien Standardenthalpie lässt sich mit-

hilfe von Gleichung 1.16 und dem K-Wert aus Tabelle 2.4 berechnen.

AG" =-RT inK

= -(8,314 J - K' - mol')(289 K)In(3,39 x 10°°) = 42.600 ] mol! = 42,6 ]- K’' mol" 12. Der pK, der dem

Gleichgewicht zwischen H,PO; (HA) und HPO} (A’) entspricht, ist 6,82 (Tabelle 2.4). Die Konzentration von A’ ist (50 mL)(2,0 M)/(200 mL) = 0,5 M, und die Konzentration von HA ist (25 mL)(2,0 M)/ (200 mL) = 0,25 M. Setzt man diese Werte in die Henderson-Hasselbalch-Gleichung ein (Gl. 2.9):

pH pH pH pH

= = = =

pK + log[A’]/[HA] 6,82 + 10g[0,5]/[0,25] 6,82 + log2 6,82 + 0,30 = 7,12

1204

Lösungen zu den Aufgaben pH = pK + log[A7]/[HA]

13. Verwenden Sie die Henderson-Hasselbalch-Gleichung (Gl. 2.9) und lösen Sie nach pK auf:

2,65= pK + log(0,02/0,01) pK= 2,65 - 03 = 6,2 pK = 2,35

pH = pK + log[A’]/[HA]

pK = pH - log[A’]J/[HA]

(d)

pK = 6,5 - 10g(0,2/0,1) pH = 6,5 - 0,30 = 6,2

14. HA [A°] und pH

12

10

= Natriumsuccinat, A" = Dinatriumsuccinat; + [HA] = 0,05 M, dann gilt: [A’] = 0,05 M - [HA]; aus Gleichung 2.9 und Tabelle 2.4: log ([A]/[HA]) = - pK = 6,0-5,64 = 0,36;

[A’J/[HA] = 10° = 2,29;

(0,05 M - [HAJ)/[HA] = 2,29; [HA] = 0,015 M;

pH

6

[A] = 0,05 M - 0,015 M = 0,035 M;

Menge (140 g Menge (162 g

an Natriumsuccinat = (0,015 mol L") mol')/(1 I) = 2,18; an Dinatriumsuccinat = (0,035 mol L"') mol")/(1 1) =5,78.

4

2

15. Bei pH 4 liegt quasi alle Phosphorsäure als H,PO, vor, und bei pH 9 als HPO? (Abb. 2.18). Deshalb ist die notwendige OH’-Konzentration gleich derjenigen der Säure; (0,1 mol L’' Phosphorsäure)(0,1 L) = 0,01 mol; benötigte NaOH =

(0)

0.5

1.0

125

2.0

Anzahl der abgebenen Protonen je Molekül

(0,01 mol)/(1 L/5 mol NaOH) = 0,002 L= 2 ml.

Kapitel 3

16. (a) Bernsteinsäure (b) Ammoniak (SPHEPES.

17. Die Dissoziation von TrisH* in seine basische Form und H* ist mit einer großen positiven Enthalpieänderung verknüpft. Folglich wird bei der Dissoziation vom Reaktanden Wärme aufgenommen. Wenn die Temperatur gesenkt wird, dann steht für diesen Prozess weniger Wärme zur Verfügung, wodurch sich die Gleichgewichtskonstante in Richtung der assoziierten Form verschiebt (die Auswirkung der Temperatur auf die Gleichgewichtskonstante eine Reaktion ist durch Gl. 1.18 gegeben). Um dieses Problem zu verhindern, sollte der Puffer bei der gleichen Temperatur hergestellt werden, bei der man ihn auch einsetzen möchte. 18. (a) Carboxylgruppen sind stärkere Säuren als Ammoniumgruppen und geben deshalb ihr Proton bei niedrigerem pH-Wert ab. Dies kann man in Abb. 2.17 sehen, in der die Carboxylgruppe von CH,COOH bei pH 4,7 zu 50% zu CH,COO” + H* dissoziiert ist, während das Ammoniumion erst bei pH 9,25 zu 50% zu NH; dissoziiert ist.

1. (a) Ja; (b) nein; (c) nein;

(d) ja 2. Da das haploide Genom zu 21% G enthält, muss es auch zu 21% C enthalten (daG=C) und zu58% A +T (oder zu 29% A und zu 29% T, weil A = T). Jede Zelle ist diploid und enthält 90.000 kb bzw. 9 x 107 Basen. Daraus folgt:

A=T = (0,29) (9 x 107) = 2,61 x 107 Basen C =G = (0,21) (9 x 107) = 1,89 x 107 Basen 3. Die DNA enthält insgesamt 40 Basen. DaG =C ist, gibtes 7 Cytosinreste. Der Rest (40 - 14 = 26) muss Adenin und Thymin sein. Da A = T ist, gibt es 13 Adeninreste. Es gibt keine Uracilreste (U ist ein Bestandteil der RNA, nicht der DNA).

(b) H3N* CHHCOOH = H5N+CH,COO- + H+ =

H,NCH,COO”

+ H*

(c) Die pK-Werte der beiden ionisierbaren Gruppen von Glycin sind ausreichend unterschiedlich, sodass die Henderson-Hasselbalch-Gleichung (Abschnitt 2.2B) das Verhalten der Lösung der zweiprotonigen und der einfach dissoziierten Spezies angemessen beschreibt.

H

Lie

H

Lösungen zu den Aufgaben H

N

2

nicht wachsen, weil ihnen das amp*-Gen des Plasmids fehlt. Klone, die nur mit dem Plasmid transformiert wor-

NE TIIEN

N =

\

den wären, wären blau, weil sie ein intaktes lacZ-Gen hätten und ß-Galactosidase bildeten, die das farberzeugende

N2 H

—N

Hypoxanthin

Adenin

F a

DR

1205

«N

\

N

D Hypoxanthin

is} (a) Man erhielte nur die DNA-Einzelstränge, die von dem

H

7A

Substrat X-Gal spaltet. Klone, die das Plasmid mit dem Insert enthielten, wären farblos, weil das Insert das lacZ-Gen unterbricht.

H

Cytosin

Der hohe pH-Wert beseitigt die Wasserstoffbrücken zwischen Basen, wodurch sich die DNA-Stränge leichter trennen lassen. Die Anzahl der möglichen Sequenzen bei vier verschiedenen Nucleotiden beträgt 4" wobei n die Anzahl der Nucleotide der Sequenz ist. Daraus folgt

(a) 4' = 4;

verbliebenen Primer ausgehen. Die Anzahl dieser Stränge nähme linear und nicht etwa exponentiell mit der Anzahl der Cyclen zu. (b) Die PCR ergäbe eine Mischung von DNA-Segmenten, deren Längen dem Abstand zwischen der Position des Primers mit nur einer Bindungsstelle und den verschiedenen Bindungsstellen, wo der Primer mit den unspezifischen Bindungsstellen bindet, entsprächen. (c) Der erste Cyclus der PCR ergäbe nur den neuen Strang, der komplementär zum intakten DNA-Strang ist, da die DNA-Synthese nicht fortschreiten kann, wenn der Vorlagestrang unterbrochen ist. Da der neue Strang dieselbe Sequenz wie der unterbrochene Strang besitzt, kann die PCR dennoch vom zweiten Cyclus an normal weitergehen. (d) Die DNA-Synthese würde an den Unterbrechungsstellen im ersten Cyclus der PCR beendet werden.

(b) 4° = 16; 14. ATAGGCATAGGC

(c) 4° = 64; (d) 4° = 256.

und CTGACCAGCGCC.

15: (a) Die Genomische

SACCT 3 BETEEACE 5"

SLEGAATC-3" BUING

(a) Alul, EcoRV, Haelll, Pvull, (b) Hpall und Mspi, (c) BamHI und BgllIl; Hpall und Taql; Sall und Xhol. 10. (a) Neu synthetisierte Ketten würden

weniger häufig abbrechen und die Banden dieser verkürzten Fragmente erschienen im Sequenziergel schwächer. (b) Der Kettenabbruch träte häufiger auf, so dass längere Fragmente weniger oft aufträten. (c) Das Ausmaß der DNA-Synthese nähme ab und die resultierenden Gelbanden würden schwächer werden. (d) kein Effekt.

I. Das C. elegans-Genom umfasst 97.000 kb,

sodass f = 5/97.000 = 5,2 x 10°. Anwendung von Gleichung 3.2 ergibt: N=log (1-P) /log(1-f)

N = log (1 - 0,99) / log (1 - 5,2 x 10°) ni E22 yE;shlex 1 10% Die gewünschten Klone sind farblos, wenn sie in Gegen-

wart von Ampicillin und X-Gal wachsen. Nichttransformierte Bakterienzellen würden bei Zugabe von Ampicillin

Bibliothek enthält DNA-Sequenzen, die der DNA aller Organismen entspricht, wozu Gene und nicht transkribierte Sequenzen gehören. Eine cDNA-Bibliothek stellt nur die DNA-Sequenzen dar, die als mRNA transkribiert werden. (b) Verschiedene Zelltypen exprimieren unterschiedliche Gensätze. Deshalb unterscheiden sich auch die Populationen der mRNA-Moleküle, die zum Aufbau der cDNA-Bibliotheken verwendet werden.

16. (a) Wenn eine Person an einem Locus homozygot ist (vom

gleichen Allel zwei Exemplare hat), dann erscheint nur ein Peak im Elektropherogramm (z.B. der D3S1358Locus vom Verdächtigen 2). (b) Vom Verdächtigen 3 stammt wahrscheinlich das Blut, da seine Allele exakt zu denen aus den Blutspuren passen. (c) Die Analyse eines jeden der drei STR-Loci in diesem Beispiel zeigt, dass die Probe und Verdächtiger 3 übereinstimmen; zwischen der Probe und den anderen Verdächtigen besteht aber keine Übereinstimmung. In der Praxis werden jedoch viele Loci untersucht, um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass man zufällig eine Übereinstimmung erhält. (d) Die Höhe der Peaks sind beim Verdächtigen 1 im Vergleich zum Verdächtigen 4 niedriger, dies legt nahe, dass weniger DNA für die PCR-Amplifizierung vom Verdächtigen 1 erhältlich war.

1206

Lösungen zu den Aufgaben

FE

TEN S

1. Gly und Ala; Ser und Thr, Val, Leu und Ile; Asn und Gln;

2: FE. NSCH;=CH,=C0O

A

ö HN

as

CH;

CH;

Int.

ar HN—C-H] +

|

2,

192

H

HR

Oo

CH30

H

(a) +1;

13. (25,3S)-Isoleucin

(b) 0; (c) -1; (d) -

14. (a) Glutamat; (b) Aspartat.

(a)rpıl = (2,35 #987) / 2='6.11 (b) pI! = (6,04 + 9,33) / 2 = 7,68

16.

o BEN THSENACHEL TI > ae

löslich machen, durch Ausbildung der Peptidbindung in BEE ;

H;N H-C—H | H=C—H .

o

G |

rn

0 SENE

a

0 u eh

Or

(6)

od |

Ri

Ci

Sn

Sul

dass die terminale Carboxylgruppe von Lys einen pK . b von 3,5 und die terminale Aminogruppe von Ala einen pK von 8,0 aufweist (Abschnitt 4.1D). Der pl ist

Oo

na

al

CH;

H

x

HOLE Ren

Symmetrie-

rungen,

„0°

BR

er

pK von Asp und den des N-Terminus):

| N

DE (0)

j

_

H

HO

°

(a) Die pK-Werte der ionisierbaren Seitenketten (Tabelle 4.1) sind 3,9 (Asp) und 10,54 (Lys). Nehmen Sie an,

9 Or

2CH5

H,C:,

5:

(c) Methionin (N-Formylmethionin).

8. Das Polypeptid wäre sogar schlechter löslich als freies Tyr, weil die meisten der Amino- und Carboxylatgruppen, die mit Wasser wechselwirken und Tyr zumindest schwach

\Y

n ”

N-0-0-R ch

15. (a) Serin (N-Acetylserin); (b) Lysin (5-Hydroxylysin);

(c) p! = (2,10 + 4,07) / 2 = 3,08

o

|

ca

12Mo@l 6.

en

N

ee I er ” } ne H Cm, 2} "

r0

BD

elle Stell

ergibt o-Ala

H

H

5, Der erste Rest kann einer der fünf Reste sein, der zweite einer der restlichen vier etc. NeBSPr

C H;3 an a dieserKa

|

6—CHOE

CN

EN—

CO0H-C—NH}

HOCH

1lil,

| | u

2

CH;

|

L

+

en

COOee: |

Fe

ar

H--CNHSs |

CH3

3. Wasserstoffbrücken-Donator: «-Aminogruppe, Amid-Sticka-Carboxyl-Gruppe, stoff Wasserstoffbrücken-Akzeptor: Amid-Carbonyl.

a

OH |

m

Asp und Glu.

coo7 |

CO0-

os

10.

Kapitel 4:

Os

[0)

ungefähr die Hälfte der pK-Werte der beiden Ionisie-

0

die die neutralen

Spezies einbeziehen

(den

pI>1% (3,90 + 8,0)=-5,95 (Dr

(b) Die Nettoladung bei pH 7,0 ist 0 (wie oben gezeichnet). 17. Bei Position A8 besitzt das Enten-Insulin einen Glu-Rest, während das menschliche Insulin einen Thr-Rest aufweist.

Da Glu bei einem physiologischen pH negativ geladen ist und Thr sich neutral verhält, hat das humane

Insulin

einen höheren p/ als das Enten-Insulin. (Die anderen Aminosäuren, bei denen sich die beiden Proteine unterschei-

den, beeinflussen den p/ nicht, da sie ungeladen sind.)

Lösungen zu den Aufgaben

Kapitel 5 e1.

9. (a)

Peptid (b), weil es mehr Trp und andere aromatische Reste enthält.

Da A = cl ist, beträgt A = (0,4 mL. mg"! - cm’')(2,0 mg mL”')(1 cm) = 0,8 Senkt man den pH-Wert von 7,0 auf 5,0, so fördert dies die Präzipitation des Proteins Q, weil das Protein am wenigsten löslich ist, wenn seine Nettoladung Null ist (wenn der pH = pl ist).

Reinigungsschritt

Gesamtprotein in mg

umol Mb

Spezifische % Ausbeute Aktivität (umol Mb/mg Gesamtprotein)

Xfache Aufreinigung

1. Rohextrakt

1550

0,75

48x 10%

100

1

2. DEAE-

550

0,35

6,4 x 10*

47

13

5,0

0,28

5,9 x 107

CelluloseChromatographie 3. Affinitäts-

chromatographie

(a) Leu, His, Arg. (b) Lys, Val, Glu.

RNA-Polymerase Cytochrom c

280 bei Absorbtion nm

Elutionsvolumen

(b) Oben ®) RNA-Polymerase Bewegungs- ' richtung

80 aus der

123fach

Affinitätschromatographie (37 insgesamt)

insgesamt, 92fach aus der Affinitätschromatographie

(b) Der DEAE-Chromatographie-Schritt ergibt nur eine 47%ige Ausbeute, während die Affinitätschromatographie 80% des vorausgegangenen Schritts ergibt. Der DEAE-Chromatographie-Schritt hat somit den größten Mb-Verlust zur Folge. (c) Der DEAE-Chromatographie-Schritt bringt eine 1,3fache Aufreinigung, der AffinitätschromatographieSchritt hingegen eine 92fache Aufreinigung gegenüber dem vorausgegangenen Schritt. Somit verschafft der Affinitätschromatographie-Schritt die größte Aufreinigung von Mb. (d) Der Affinitätschromatographie-Schritt ist in diesem Beispiel die beste Wahl für Mb, wenn man nur einen Reinigungsschritt einsetzen möchte. 10. Dansylchlorid reagiert mit primären Aminogruppen, einschließlich der -Aminogruppen von Lys-Resten. 11. (a) Gly;

(b) Thr;

Cytochrom c

Unten

1207

©)

Das Protein hat eine längliche Gestalt, so dass es sich während der Gelfiltration wie ein größeres Protein verhält. Die mit SDS-PAGE bestimmte Masse ist genauer, weil die Beweglichkeit eines denaturierten und mit SDS beladenen Proteins beinahe ausschließlich von seiner Größe abhängt.

Das Protein enthält zwei 60 kD und zwei 40 kD große Polypeptide. Jede 40 kD-Kette ist über eine Disulfidbindung mit einer 60 kD-Kette verbunden. Die 100 kD-Einheiten assoziieren nicht-kovalent zu einem Protein mit einer molekularen Masse von 200 kD. Da Protein 1 einen größeren Anteil hydrophober Reste hat (Ala, Ile, Pro, Val) als die Proteine 2 und 3, kann für seine Isolierung die hydrophobe Interaktions-Chromatographie eingesetzt werden.

(c) keinen (die N-terminale Aminogruppe ist acetyliert und deshalb gegenüber dem Edman-Reagenz nicht reaktiv). 12. Thermolysin würde die meisten Bruchstücke ergeben (9) und Endopeptidase V8 die wenigsten (2). 13. (a) Die positiven Ladungen werden durch die Portionierung von basischen Seitenketten (H, K und R) und die N-terminalen Aminogruppen des Proteins verursacht. (b) Es gibt 1H,6K, 11 Rund 1 NH, am N-Terminus. Deshalb ist die maximal erhältliche Anzahl positiver Ladungen'19. (c) Aus dem Rechenbeispiel 5.1 können wir sehen, das

M = (p-1)(pı-1)(p-pı) ist. Somit ist

M = (1789,2-1)(1590,6-1)/(1789,2-1590,6) = (1788,2)(1589,6)/198,6 = 14.312,8 (d) In unserer Berechnung ist Peak 5 p,, Aus dem Rechenbeispiel 5.1 ist

pı = (Mrz)/z

1590,6 = (14312,8 + z)/z

1208

Lösungen zu den Aufgaben

Kapitel 6

1590,6z - z = 14312,8 2(1590,6-1) = 14312,8 z = 14312,8/1589,6 = 9,00

H

Die Ladung des fünften Peaks im Massenspektrum beträgt 9,00.

RER

R

EN BEN

5228

ZN

14. Gln-Ala-Phe-Val-Lys-Gly-Tyr-Asn-Arg-Leu-Glu

H

N

(0)

\

H

15. Asp-Met-Leu-Phe-Met-Arg-Ala-Tyr-Gly-Asn .

16. (a) Es gibt ein Met, sodass CNBr zwei Peptide erzeugt. (b) Es gibt vier mögliche Stellen, an denen Chymotrypsin das Peptid hydrolysieren kann: nach Phe, Tyr (zweimal) und Trp. Dies ergibt fünf Peptide. (c) Vier Cys-Reste bilden zwei Disulfidbrücken. (d) Wenn man willkürlich einen Cys-Rest auswählt, kann dieser eine Disulfidbrücke mit den restlichen drei Cys-Resten bilden. Nachdem dafür ein Cys-Rest ausgewählt wurde, gibt es nur einen Weg, auf dem die beiden restlichen Cys-Reste eine Disulfidbrücke bilden können. Somit existieren 3 X 1 = 3 mögliche Anordnungen der Disulfidbrücken. 17.

Ala— Val— Cys — Arg — Thr— Gly— Cys— Lys— Asn — Phe— Leu

|

we;

(a) 3,613;

(b) steiler.

(100 Reste)(1 a-helikale Windung/3,6 Reste) (0,51 nm/Keratin-Windung) = 14,2 nm (a) Die erste und die vierte Seitenkette der beiden Helices einer Superspirale bilden verborgene hydrophobe wechselwirkende Oberflächen, aber die restlichen Seitenketten sind dem Lösungsmittel ausgesetzt und sind deshalb eher polar oder geladen. (b) Obwohl die Reste an Position 1 und 4 in beiden Sequenzen hydrophob sind, sind Trp und Tyr viel größer als Ile und Val und würden deshalb nicht genauso gut in den Kontaktbereich zwischen zwei Polypeptiden in einer Superspirale passen.

Tyr — Lys— Cys— Phe— Arg — His — Thr — Lys — Cys— Ser

Ein Faserprotein wie a-Keratin hat keinen separaten globulären Kern. Die meisten seiner Reste in seiner Superspiral-

18. Arg-Ile-Pro-Lys-Cys-Arg-Lys-Phe-GIn-GlIn-Ala-Gln-His-LeuArg-Ala-Cys-Gln-Gln-Trp-Leu-His-Lys-GIn-Ala-Asn-Gln-SerGly-Gly-Gly-Pro-Ser

struktur sind dem Lösungsmittel ausgesetzt. Die Ausnahme ist der Streifen unpolarer Seitenketten an der Grenzfläche zwischen zwei Spiralen.

19. Weil die Seitenkette von Gly nur ein H-Atom ist, kommt es in einem Protein oft an einer Position vor, an die kein anderer Rest passt. Folglich kann Gly den Platz eines größeren Rests leichter einnehmen als ein großer Rest wie z.B. Val den Platz von G]y.

Die reduzierenden Bedingungen fördern die Spaltung der Disulfidbrücken, die die a-Keratinmoleküle quervernetzen. Dies hilft der Larve, die Wollkleidung zu verdauen, die sie frisst.

20. (a) Position 6 (Gly) und Position 9 (Val) scheinen unveränderlich zu sein. (b) Konservative Substitutionen treten an Position 1 (Asp und Lys, beide geladen), Position 10 (Ile und Leu, ähnliche Struktur und Hydrophobizität) und Position 2 (alle ungeladene sperrige Seitenketten) auf. Die Positionen 5 und 8 scheinen eine Substitution tolerieren zu können. (c) Die variabelsten Positionen sind 3, 4 und 7, an denen eine Vielzahl von Resten vorkommen.

Die Primärstruktur des Kollagens ist seine Aminosäuresequenz, bei der es sich um ein sich wiederholendes Triplet von hauptsächlich Gly-Pro-Hyp handelt. Seine Sekundärstruktur ist die linksgängige helicale Konformation, die für seine Wiederholungssequenz typisch ist. Seine Tertiärstruktur ist im Wesentlichen die gleiche wie seine Sekundärstruktur, da der größte Teil des Proteins aus einer Art Sekundärstruktur besteht. Die Quartärstruktur von Kollagen ist die Anordnung seiner drei Ketten zu einer rechtsgängigen Dreifachhelix.

Da Kollagen eine solch ungewöhnliche Aminosäurezusammensetzung hat (nahezu zwei Drittel bestehen aus Gly und Pro oder Pro-Derivaten), enthält es relativ weniger der anderen Aminosäuren und ist somit keine so gute Aminosäurenquelle wie Proteine, die eine größere Vielfalt von Aminosäuren enthalten.

Ja, obwohl eine solche Unregelmäßigkeit nicht als zufällig aufgefasst werden sollte.

Lösungen zu den Aufgaben 10. (a) GIn,

dert auch die Bildung von ß-Faltblattsträngen, somit hat Peptid b auch die geringste Wahrscheinlichkeit, ein ß-Faltblatt zu bilden.

(b) Ser, (c) De, (d) Cys, Siehe Tabelle 6.1.

9% In einem Proteinkristall haben die Reste am Ende einer Polypeptidkette weniger intramolekulare Kontakte und

I: (a) C, und D,; (b) C, und D;. 12: (a) Phe. Ala und Phe sind beide hydrophob, aber Phe ist

viel größer und passt wohl nicht so gut an Vals Stelle. (b) Asp. Ersetzt man einen positiv geladenen Lys-Rest durch einen entgegengesetzt geladenen Asp-Rest, so wäre dies störender. (c) Glu. Die amidhaltige Asn wäre ein besserer Substituent für Gln als das saure Glu. (d) His. Die erzwungene Geometrie von Pro wird am besten von Gly erreicht, dem eine Seitenkette fehlt, als von einem wie z.B. His.

1209

Rest mit einer sperrigen

sind deshalb eher ungeordneter (beweglicher im Kristall). Wenn diese Unordnung verhindert, dass ein einheitliches Beugungsmuster entsteht, ist es unter Umständen unmög-

lich, ihre Elektronendichte aufzuzeichnen.

Kapitel7 1,0

Seitenkette

13: Ein in einer lebenden Zelle synthetisiertes Polypeptid hat

eine Sequenz, die durch natürliche Selektion optimiert wurde, sodass es sich korrekt faltet (mit den hydrophoben Resten nach innen und den polaren Resten auf der Außenseite). Die zufällige Sequenz des synthetischen Peptids kann keinen einheitlichen Faltungsprozess steuern, somit aggregieren hydrophobe Seitenketten auf verschiedenen Molekülen und verursachen, dass das Polypeptid aus der Lösung ausfällt.

K=

0,6 mM

[Ligand] (mM)

(b) beschreibt eine sigmoide Bindung an ein oligomeres Protein und repräsentiert daher eine kooperative Bindung. 450

14. Nein.

(a) nicht kooperative Bindung: 0,8

hyperbolische Kurve

15: Während der Denaturierung werden hydrophobe Effekte,

Van-der-Waals-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken zerstört. Kovalente Quervernetzungen bleiben erhalten.

0,6 2% 0,4

16. Bei einem physiologischen pH-Wert stoßen die positiv geladenen Lys-Seitenketten einander ab. Erhöht man den pH-Wert über den pK-Wert (>10,5), so neutralisiert dies die Seitenketten und ermöglicht die Bildung einer a-Helix.

(b) kooperative Bindung an ein oligomeres Protein: sigmoide Kurve

0,2

(6)

027

OEL

0852. 0,4=20,555 [Ligand] (mM)

0,6507

17 Die Molekülmasse von O; ist 32 D. Somit ist das Verhältnis

der Massen von Hämoglobin und 4 O,, das gleich dem Verhältnis ihrer Volumina ist, 65.000/(4 X 32) = 508. Das

Volumen des Angestellten beträgt 70 kg X 1 cm’/g X (1000 g/kg) X (1 m/100 cm)’ = 0,070 m’. Folglich ergibt

sich ein Volumenverhältnis von Büroraum zu Angestellten von (4 x 4 x 3)/0,070 = 686. Die Ergebnisse bewegen sich in derselben Größenordnung, was man vermutlich nicht erwartet hätte. 18. Peptid c hat die höchste Wahrscheinlichkeit, eine o-Helix

zu bilden, mit seinen drei geladenen Resten (Lys, Glu und Arg) auf einer Seite der Helix. Peptid a besitzt benachbarte basische Reste (Arg und Lys), die eine Helix destabilisieren würden. Peptid b enthält die Helixbrecher Gly und Pro (Tabelle 6.1). Die Anwesenheit von Gly und Pro behin-

Nach Gleichung 7.6

POL ren END; Wenn pO, = 10 Torr ist, dann ist Yo,

a

10 = — =

o%

=0,78

Wenn pO, = 1 Torr ist, dann ist Yo,

1

De

= 0,26

Der Unterscheid der Yo,-Werte ist 0,78-0,26 = 0,52. In aktiven Muskelzellen kann deshalb Myoglobin eine erhebliche O,-Menge durch Diffusion von der Zelloberfläche zu den Mitochondrien transportieren.

Lösungen zu den Aufgaben

1210 4.

(a) Hyperventilieren beseitigt CO,, beeinflusst aber die O,-Konzentration nicht signifikant, da das Hämoglobin im arteriellen Blut bereits im Wesentlichen mit Sauerstoff gesättigt ist. (b) Die Beseitigung von CO, beseitigt auch Protonen nach der Reaktionsgleichung H*

+ HCO;-- =

H30

+ CO;

Der resultierende Anstieg des Blut-pH-Werts hätte durch den Bohr-Effekt eine Erhöhung der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin zur Folge. Das Endergebnis wäre, dass weniger Sauerstoff zum Gewebe befördert würde, bis das CO,-Gleichgewicht wieder hergestellt ist. Damit bewirkt die Hyperventilierung das Gegenteil dessen, was beabsichtigt wurde (Man beachte, dass die Hyperventilierung die Notwendigkeit zu atmen unterdrückt und durch dieses Verhalten der Taucher aufgrund von Sauerstoffmangel das Bewusstsein verlieren und ertrinken kann). 52 (a) Vitamin O ist nutzlos, weil die Kapazität des Körpers für die Sauerstoffaufnahme nicht durch die Menge des verfügbaren Sauerstoffs beschränkt ist, sondern durch die Fähigkeit von Hämoglobin, O, zu binden und zu transportieren. Zudem wird Sauerstoff normalerweise über die Lungen vom Körper aufgenommen; deshalb ist es unwahrscheinlich, dass der MagenDarm-Irakt einen wirksamen Mechanismus besitzt, um den Sauerstoff zu extrahieren. (b) Die Tatsache, dass bei Wirbeltieren die Sauerstoffversorgung ein eigens dafür vorgesehenes O,-Bindeprotein (Hämoglobin) erfordert, zeigt, dass gelöster Sauerstoff als solcher die erforderlichen hohen Konzentrationen nicht erreichen kann. Zudem würden einige wenige Tropfen Vitamin O einen unbedeutenden Beitrag zu der in dem sehr viel größeren Blutvolumen bereits vorhandenen Sauerstoffmenge leisten. (a) Geringer;

(b) höher. Die Mutation Asp 99ß —> His in Hämoglobin Yakima führt zum Bruch einer Wasserstoffbrücke an der a,-ß,-Kontaktstelle im T-Zustand (Abb. 7.9a); dies verschiebt das T = R-Gleichgewicht zum R-Zustand (niedrigerer pso). Die Asn 102ß — Thr-Mutation im Hämoglobin Kansas bewirkt eine entgegengesetzte Verschiebung des T = R-Gleichgewichts durch den Bruch einer Wasserstoffbrücke des R-Zustands (Abb. 7.95). Die erhöhte BPG-Konzentration hilft den verbleibenden Erythrozyten, O, zu den Geweben zu bringen. Allerdings stabilisiert BPG den T-Zustand des Hämoglobins, fördert so die Sichelzell-Bildung und führt daher zu einer Verschlimmerung der Erkrankung. 8.

(a) Weil die Mutation die T-Konformation von Hämoglobin Rainier destabilisiert, ist die R-(Oxy-)Konformation sta-

biler. Deshalb ist die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin Rainier höher als normal. (b) Die Ionenpaare, die sich normalerweise in Desoxyhämoglobin bilden, absorbieren Protonen. Die Abwesenheit dieser Ionenpaare in Hämoglobin Rainier senkt den Bohr-Effekt (tatsächlich ist der Bohr-Effekt bei Hämoglobin Rainier etwa halb so hoch wie bei normalem Hämoglobin). (c) Weil die-R-Konformation von Hämoglobin Rainier stabiler als die T-Konformation ist - auch wenn das Molekül nicht oxygeniert ist - ist die O,-Bindungskooperativität reduziert. Der Hill-Koeffizient ist somit für Hämoglobin Rainier geringer als für normales Hämoglobin. Während das Krokodil ohne zu atmen unter Wasser bleibt,

produziert sein Stoffwechsel CO,, folglich steigt die HCO35Konzentration im Blut. Das HCOz bindet bevorzugt an das Desoxyhämoglobin des Krokodils, was allosterisch die Einnahme des Desoxyzustands des Hämoglobins und die Freisetzung des gebundenen O, bewirkt. Dadurch kann das Krokodil so lange unter Wasser bleiben, bis es seine Beute ertränkt hat. 10. (a)ı

70

34 (0), =

POz

(b) Der Hill-Koeffizient hat höchst wahrscheinlich einen Wert zwischen 1 (keine Kooperativität) und 2 (vollkommene Kooperativität zwischen zwei Untereinheiten). Lil Myoglobin ist sowohl faserig als auch globulär. Seine bei-

den Köpfchen sind globulär, mit mehreren Sekundärstrukturschichten. Sein Schwanz besteht jedoch aus einer langen faserigen Superspirale. 19% Da viele Myosinköpfchen

entlang des dünnen Filaments binden, wo es mit einem dicken Filament überlappt, und weil die Myosinmoleküle ihre Kraftschläge nicht gleichzeitig ausführen, können sich dicke und dünne Filamente in den Intervallen zwischen den Kraftschlägen eines einzelnen Myosinmoleküls um mehr als 6 nm gegeneinander bewegen.

132 Ohne ATP befinden sich die Myosinköpfchen alle in ihrer

niederenergetischen Konfiguration und können das gebundene Actinmolekül nicht freisetzen. Folglich bilden dicke und dünne Filamente eine starre, quervernetzte Anordnung.

Lösungen zu den Aufgaben

14. Mikrofilamente bestehen vollständig aus Actinuntereinheiten, die Kopf an Schwanz verbunden sind, sodass die Polarität der Untereinheiten in der vollständig zusammengebauten Faser bewahrt wird. Bei Keratinfilamenten ordnen sich die aufeinander folgenden Heterodimere jedoch auf antiparallele Weise an, sodass in einem vollständig aufgebauten Intermediärfilament die Hälfte der Moleküle in eine Richtung und die andere Hälfte in die entgegengesetzte Richtung ausgerichtet ist (Abb. 6.16).

15. (a) 150-200 kD; (b) 150-200 kD; () —23 kD und 53-75 kD.

OÖ

Deut

H

Br

H-0-on en

HO—OH

On,

L-Fucose

ı-Fucose ist die Desoxyform der 1-Galactose.

16. Die Schleifen befinden sich an der Oberfläche der Domäne, daher können sie leichter Aminosäuresubstitutionen tolerieren. Ein Aminosäureaustausch in den ß-Faltblättern würde die Domäne vermutlich stärker destabilisieren.

(a) a-p-Glucose-(1—1)-a-D-Glucose oder a-D-Glucose-(1—1)-ß-D-Glucose. (b) Die zahlreichen Wasserstoffbrücken bildenden -OHGruppen des Disaccharids fungieren als Ersatz für Wassermoleküle.

17. Die antigene Stelle eines nativen Proteins besteht gewöhnlich aus mehreren Peptidsegmenten, die bei Verlust der Tertiärstruktur nicht mehr benachbart sind.

19

18. (a) Fab-Fragmente sind monovalent und können daher Antigene nicht quervernetzen, folglich bildet sich kein

cl

Präzipitat.

(b) Ein kleines Antigen besitzt nur eine antigene Stelle, kann deshalb nicht mehr als einen Antikörper binden und bildet keinen Niederschlag. (c) Wenn der Antikörper in großem Überschuss vorliegt, binden die meisten Antigen-gebundenen Antikörper nur ein Antigen pro Immunglobulin-Molekül. Liegt das Antigen im Überschuss vor, binden die meisten Immunglobuline an zwei unabhängige Antigene.

Kapitel 8

CH,0H OH

H

OH

H

H

OH

(b) 8; (c) 16.

12: Glucosamin ist ein Baustein bestimmter Glykosaminglykanbestandteile der Proteoglykane (Abb. 8.12). Wird die Versorgung des Körpers mit Glucosamin gesteigert, so

H

H 04

Eros 0

OH

HOHEN

OH

Or

on mlOH u OH OH

(b) Nein (die symmetrischen Hälften sind deckungsgleich);

(c) Nein.

OH

denn sie besitzt nur ein nicht reduzierendes Ende, von dem Glucose freigesetzt werden kann.

4

(a) ja;

CH;Cl

1% Amylose,

cCO0O

>

H

10. Eines

3. Tagatose leitet sich von Galactose ab.

OH

0

HH

o

lc ca. 200

2. (a) und (d)

HO

cCICH

kann dadurch unter Umständen das Fortschreiten der degenerativen Arthritis verlangsamt werden; diese Krankheit ist charakterisiert durch den Abbau des proteoglykanreichen Gelenkknorpels.

1. (a) 4;

an

1211

Ö

H

OHZZH

H

In H

OH

1212

_ Lösungen zu den Aufgaben

HO

H

(a) Palmitinsäure und 2-Oleoyl-3-phosphatidylserin; (b) Ölsäure und 1-Palmitoyl-3-phosphatidylserin; (c) Phosphoserin und 1-Palmitoyl-2-oleoylglycerin; (d) Serin und 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidsäure.

CH,OH

CH,OH

15.

OÖ

H

O

H

H

O0

OH

H

H

NH Ir

|

0H

H

GleNAc

Mit Ausnahme von Cholin können alle Wasserstoffbrücken bilden. :

Nein; die zwei Acylketten der „Kopfgruppe“ sind im Inneren der Doppelschicht verborgen, so dass nur eine Diphosphoglycerin-Kopfgruppe verbleibt.

CH;

Sowohl DNA als auch Phospholipide haben exponierte Phosphatgruppen, mit denen die Antikörper reagieren.

16. (a) Es gibt vier Arten methylierter Glucosemoleküle, entsprechend (1) dem Rest am reduzierenden Ende des Glykogenmoleküls, (2) den Resten an den nicht reduzierenden Enden, (3) den Resten an den a(1—6)-Verzweigungspunkten und (4) den Resten von den linearen a(1—%4)-verknüpften Abschnitten von Glykogen. Die Art Nummer 4 kommt am häufigsten vor.

(b)

Steroidhormone sind hydrophob und können durch die Zellmembran diffundieren, um ihren Rezeptor zu erreichen. 10. Eicosanoide werden aus Arachidonsäure gebildet und sind für die intrazelluläre Kommunikation notwendig. In Zell-

kulturen gehaltene Zellen benötigen keine solche Kommunikation und kommen deshalb ohne Linolsäure aus.

CH,OCH; H

1Eıl. Triacylglycerine

haben keine polare Kopfgruppe, daher orientieren sie sich in einer Doppelschicht nicht von selbst mit ihren Acylketten nach innen und mit ihrem Glycerinteil zur Oberfläche.

OH H

OCH; H HO H

OCH3

112% Die großen Oligosaccharid-Kopfgruppen

würden eine genügend dichte “einer Doppelschicht verhindern.

Packung

der Ganglioside der Lipide in

Kapitel 9 13: (a) Gesättigt;

1%

?

FuCHCH

CHICH.)

|

00

a

0 0 CH,—0-P—-0—-CH,CH,NH; .

2. trans-Ölsäure hat eine höhere Schmelztemperatur, weil ihre Kohlenwasserstoffketten sich im festen Zustand enger packen als die von cis-Ölsäure. 3. Von den 4 X 4 = 16 Paaren von Fettsäuren am C1 und C3

sind nur 10 einzigartig, weil ein Molekül mit unterschiedlichen Substituenten am C1 und C3 einem Molekül mit der umgekehrten Reihenfolge der Substituenten identisch ist. Jedoch kann am C2 jeder der Substituenten gebunden sein, was insgesamt zu 4 X 10 = 40 verschiedenen Triacylglycerinen führt. Das Triacylglycerin mit Stearinsäureresten Energie, weil es vollständig reduziert ist.

liefert mehr

(b) langkettig. Durch Erhöhen des Anteils an gesättigten und langkettigen Fettsäuren, die höhere Schmelztemperaturen haben, können die Bakterien bei der höheren Temperatur eine gleichbleibende Membranfluidität aufrechterhalten. 14. (a) (1 Windung/0,54 nm)(3 nm) = 5,6 Windungen.

(b) (3,6 Reste/Windung)(5,6 Windungen) = 20 Reste. (c) Die zusätzlichen Reste bilden eine Helix, die teilweise den Bedarf an Wasserstoffbrücken des Rückgrats deckt, wo die Lipidkopfgruppen keine Partner für Wasserstoffbrücken bieten. 1x Nein. Obwohl der ß-Strang die Doppelschicht durchspan-

nen könnte, wäre ein Einzelstrang instabil, weil das Rückgrat nicht die Wasserstoffbrücken ausbilden könnte, die es mit Wasser in wässrigen Lösungen bildet. 16. (a) Innere;

(b) äußere. Siehe Abbildung 9.32.

Lösungen zu den Aufgaben 17: (a) Es werden sowohl intra- als auch extrazelluläre Anteile markiert. (b) Nur der extrazelluläre Teil wird markiert. (c) Nur der intrazelluläre Teil wird markiert.

. Verwenden Sie Gleichung 10.3 und setzen Sie für Z=2 und für T=310 K:

ea

19. Damit ein Neuron wiederholt Neurotransmitter freisetzen kann, müssen die Bestandteile seiner Exocytosemaschinerie recycelt werden. Nach der Fusion der synaptischen Vesikel mit der Plasmamembran wird der Vier-Helix-SNAREKomplex abgebaut, sodass die Q-SNARESs in der Plasmamembran verbleiben, während Teile der Membran, die die R-SNARESs enthalten, dazu verwendet werden können, erneut synaptische Vesikel zu bilden. Dieser Recycling-Prozess wäre nicht möglich, wenn die R-und Q-SNARES verbunden blieben, und die Nervenzelle wäre schließlich un-

fähig, Neurotransmitter freizusetzen.

Kapitel 10

u

= (8,314] - K“! . mol"')(310K) In (10°7)/(10°°) (2) (96,485) - V’'mol"')(-0,050V) - 23,700]mol"' - 9600] : mol"! - 33,300] : mol’ = - 33,3k] - mol"

18. Die mutierte Signalpeptidase würde viele Präproteine in-

nerhalb ihrer Signalpeptide spalten, die häufig Leu-Leu-Sequenzen enthalten. Dieses würde nicht die Translokation in das ER beeinflussen, weil die Signalpeptidase schneidet, nachdem das Signalpeptid in das ER-Lumen eingetreten ist. Proteine, die keine Leu-Leu-Sequenz enthalten, würden ihre Signalpeptide behalten. Diese Proteine und solche mit nicht korrekt geschnittenen Signalsequenzen würden sich mit einer höheren Wahrscheinlichkeit nicht korrekt falten und daher nicht richtig arbeiten.

1213

+

Der negative Wert von AG zeigt, dass der Prozess thermodynamisch günstig ist. A].

(DWAG RT In 9 innen + ZFAY [Ca

Pausen

= (8,314] - K! - mol"')(310K) In (10°7)/(10°) (2)(96,485] - V’'mol"')(+ 0,150V) uDr - 23,700]Jmol”' + 28900] - mol" + 5200] - mol! =

+ 5,2k] - mol!

Der positive Wert von AG zeigt, dass der Prozess thermo-

dynamisch ungünstig ist. Der K*-Iransport erlischt, weil der Ionophor-K’-Komplex nicht durch die Membran diffundieren kann, wenn die Lipide in einem gelartigen Zustand immobilisiert sind. Die

Anzahl

der

Ionen,

die transportiert

werden,

ist

(10 mM)(100 um’)(N) = (0,01 mol L7')(10”° L)(6,02 x T-

(a) Nicht vermittelt; (d) vermittelt.

(b) vermittelt;

(c) nicht vermittelt;

Je weniger polar eine Substanz ist, umso schneller kann sie durch die Lipiddoppelschicht diffundieren. Von der langsamsten zur schnellsten: C, A, B.

a

=

RTI

[Glucose] innen " TGhucose] außen

= (8,3145) - K! - mol"')(298K) In

(0,003) (0,005)

= -1270 ] - mol"! = -1,27k] : mol!

(a) AG = RT In ([Na*]nen/[Na" außen) = (8,314 J K' mol')(310 K)(In [10 mM/150 mM)) = (8,314)(310)(-2,71) J mol” Il

(b) AG

-6980 ] mol! = 7,0 kJ mol’

RT In ([Na*]innen /INa" Jaupen) + ZAFAW = -6980 + (1)(96485 C mol')(-0,06 ] C"') = -6980 ] mol! - 5790 J mol! = -12770 J mol! = 12,8 kJ mol”

10° Ionen mol!) = 6,02 X 10° Ionen Da es mehr als 100 Ionophore gibt, muss jeder 6,02 x 10° Ionen transportieren. Die Zeit, die dafür benötigt wird, ist

(6,02 X 10° Ionen)(1 s/10* Ionen) = 602 s = 10 min (a) Die Daten lassen nicht erkennen, dass ein Transportprotein beteiligt ist, da die Transportgeschwindigkeit sich keinem Maximum nähert, wenn die [X] ansteigt. (b) Um zu beweisen, dass ein Transportprotein beteiligt ist, erhöhen Sie die [X] und zeigen eine Sättigung des Transporters bei hoher [X], oder Sie fügen ein Strukturanalogon von X hinzu, das mit X um die Bindung an den Transporter konkurriert, was einen geringeren Fluss von X zur Folge hat.

In Abwesenheit von ATP käme das Ausschleusen von Na’ durch die (Na*-K*)-ATPase zum Erliegen, so dass keine Glucose mehr über den Na*-Glucose-Import in die Zelle gebracht werden könnte. Alle Glucose in der Zelle verließse dann durch den passiv vermittelnden Glucose-Transporter die Zelle, und die zelluläre [Glucose] würde abfallen, bis sie die extrazelluläre Glucosekonzentration erreicht hätte (wahrscheinlich würde die Zelle aber osmotisch platzen, bevor dies einträte).

1214

Lösungen zu den Aufgaben

10. Die hyperbolische Kurve für den Glucosetransport in die Pericyten deutet auf einen proteinvermittelten, Na*-abhängigen Vorgang hin. Das Transportprotein besitzt Bindungsstellen für Natriumionen. Bei niedriger [Na*] ist der Glucosetransport direkt proportional zur [Na]. Jedoch sind bei hoher [Na*] alle Na*-Bindungsstellen am Transportprotein besetzt, so dass der Glucosetransport seine Maximalgeschwindigkeit erreicht. Glucosetransport in Endothelzellen ist nicht Na*-abhängig und läuft mit einer hohen Geschwindigkeit ab, gleich, ob Na* zugegen ist oder nicht. Die Abbildung enthält nicht genügend Information, um bestimmen zu können, ob der Glucosetransport in die Endothelzellen proteinvermittelt ist.

13. (a) Die Bindung von Acetylcholin löst das Öffnen des Kanals aus, ein Beispiel für ein ligandengesteuertes Transportprotein.

(b) Na*-Ionen strömen in die Muskelzelle, wo ihre Konzentration niedrig ist. (c) Der Einstrom positiver Ladungen verursacht, dass das Membranpotential zunimmt. 14 . (a) PH = -log[H*]= -log(0,15) = 0,82

Der pH-Wert des sezernierten HCl ist über 6 pH-Einheiten niedriger als der cytosolische pH-Wert, was

einer [H*] von —4 X 10°° M entspricht.

(b) CO, + H,O = HCO5 + H*

11: (a) Nein; es gibt kein Glycerinrückgrat.

(b) Miltefosin ist amphipathisch und kann somit die Zellmembran des Parasiten nicht mittels Diffusion durchqueren. Da es kein normaler Zellbestandteil ist, hat es vermutlich keinen zugehörigen aktiven Transporter. Es gelangt höchstwahrscheinlich über ein passives Transportprotein in die Zelle. (c) Dieses amphipathische Molekül sammelt sich höchstwahrscheinlich in der Membran an, wobei sein hydrophober Schwanz in der Doppelschicht vergraben und seine polare Kopfgruppe dem Lösungsmittel ausgesetzt

15. Die Überexprimierung eines MDR-Transporters würde die Krebszelle befähigen, mehr Antikrebsmittel auszuscheiden. Um die arzneimittelresistenten wären dann höhere Konzentrationen

ist.

(d) Das Protein erkennt die Phosphocholinkopfgruppe, die auch in manchen Sphingolipiden und manchen Glycerophospholipiden vorkommt. Da das Protein nicht alle Phospholipide oder Triacylglycerine bindet, erkennt es nicht den Kohlenwasserstoffschwanz. 12: (a) Ein Transporter, der einem Porin ähnelt, wäre ungeeig-

net, da sogar ein großes ß-Fass viel zu klein wäre, um das große Ribosom aufzunehmen. Gleichfalls wäre ein Transportprotein mit alternierenden Konformationen wegen seiner kleinen Größe im Verhältnis zum Ribosom der Aufgabe nicht gewachsen. Außerdem wäre keines der Proteine für den Transport von Partikeln durch zwei Membranen geeignet. (Tatsächlich bewegen sich Ribosomen und andere große Partikel zwischen dem Zellkern und dem Cytoplasma über Kernporen, die aus vielen verschiedenen Proteinen aufgebaut sind und eine Struktur bilden, die weit größer ist als das Ribosom und beide Kernmembranen durchspannt.) (b) Der Transport von Ribosomen scheint thermodynamisch günstig zu sein, da die Konzentration an Ribosomen im Zellkern, wo sie synthetisiert werden, höher ist. Um aber eine Pore zu errichten (die zwei Membrandicken durchspannt), die das Ribosom passieren könnte, wäre andererseits Freie Enthalpie erforderlich. (Tatsächlich erfordert der Transport vom Zellkern zum Cytoplasma für alle Substanzen außer sehr kleinen Substanzen die Aktivität von GTPasen, die Partikel durch die Anordnung der Kernpore geleiten und gewährleisten helfen, dass der Transport in eine Richtung verläuft.)

Zellen zu töten, der Arzneimittel

oder verschiedene Arzneimittel nötig.

Kapitel 11 1% b

2

(a) (b) (c) (d)

Isomerase (Alanin-Racemase); Lyase (Pyruvat-Decarboxylase); Oxidoreduktase (Lactat-Dehydrogenase); Ligase (Glutamin-Synthetase).

3: Wie in Tabelle 11.1 gezeigt, ist die einzige Beziehung zwischen der Geschwindigkeit einer katalysierten und einer nicht katalysierten Reaktion, dass die katalysierte Reaktion schneller abläuft als die nicht katalysierte. Die absolute Ge-

schwindigkeit einer nicht katalysierten Reaktion korreliert nicht mit dem Grad, mit dem sie durch das Enzym beschleunigt wird. Es gibt drei Übergangszustände (X) und zwei Zwischenproduktzustände (I). Die Reaktion ist thermodynamisch nicht günstig, weil die Freie Enthalpie des Produkts größer ist als diejenige der Reaktanden.

Lösungen zu den Aufgaben

1215

10. Zwei solcher Analoga sind

Le Nse00g-

I \oo0-

OÖ

S

Furan-2-carboxylat

Thiophen-2-carboxylat

Beide Moleküle sind planar. Insbesondere das C-Atom, an

das die Carboxylatgruppe gebunden ist, befindet sich in der Ringebene, so wie es im Übergangszustand der ProlinRacemasereaktion vorkommt. I Die

Stabilisierung des Übergangszustands durch ein Enzym ist eine wichtige (oft die allerwichtigste) Komponente des Katalysemechanismus eines Enzyms. Folglich ist die katalytische Stelle ein Teil der Substratbindungsstelle.

Reaktionskoordinate

3: Je fester S an das Enzym bindet, desto größer wird AG}. Wenn sich AG} an AG$ annähert, nähert sich die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion der Geschwindigkeit der nichtenzymatischen Reaktion.

12. Das aktive Zentrum des Lysozyms ist so angeordnet, dass

es Oligosaccharide zwischen dem vierten und fünften Rest schneidet. Darüber hinaus wäre (NAG), wesentlich fester an das Enzym gebunden als (NAG),, da das aktive Zentrum des Lysozyms mindestens sechs MonosaccharidEinheiten binden kann. Diese zusätzliche Bindungsenergie würde für eine Verzerrung des D-Rings in seine Halbsessel-Konformation verwendet und so die Reaktion begünstigen. 13; Asp 101 und Arg 114 bilden Wasserstoffbrücken mit dem

Substrat (Abb. 11.19). Ala kann diese Wasserstoffbrücken nicht ausbilden, daher ist das substituierte Enzym weniger aktiv.

Reaktionskoordinate

Bei 25 °C entspricht jeder 10fache Geschwindigkeitsanstieg einer Abnahme

um

etwa 5,7 kJ] : mol! bei AG‘. Bei der

14.

Nuclease, mit einer Geschwindigkeitserhöhung in der Grö-

=.

ßenordnung von 10'*, wird AG um etwa 14 X 5,7 kJ-

go sieeb SCH ö

mol"' oder 80 kJ - mol”' gesenkt. Da die Geschwindigkeitserhöhung k durch k = eG RT gegeben ist, ist alternativ

Eh

In k = In (10'%)= AAG’„./8,3145 X (273 + 25). Somit ist AAGga: = 80 kJ - mol".

ae

“

Form,

oder

ya

Glu besitzt einen pK von —4 und fungiert, in seiner ionisierten Form, als Base-Katalysator. Lys hat einen pK von —-10 und wirkt, in seiner protonierten

C-Cicl

oO

|

OH NH HC CH;Cl

als Säure-

Katalysator.

Die aktive Form des Enzyms enthält das Thiolat-Anion. Der erhöhte pK würde die Nucleophilie des Thiolats steigern und dadurch die Geschwindigkeit der von der aktiven Form des Enzyms katalysierten Reaktion erhöhen. Allerdings läge bei physiologischem pH eine geringere Menge des Enzyms in aktiver Form vor, daher wäre die Gesamtgeschwindigkeit erniedrigt.

Der DNA fehlt die für die Bildung des 2',3’-cyclischen Zwischenprodukts notwendige 2’-OH-Gruppe.

Tosyl-L-valinchlormethylketon

in Ja. Ein Enzym

senkt die Aktivierungsenergiebarriere

wohl für die Hin- als auch für die Rückreaktion. 16.

so-

Lösungen zu den Aufgaben

1216

17. Die Beobachtung, dass Subtilisin und Chymotrypsin gene-

tisch nicht verwandt sind, zeigt, dass die Geometrie ihrer aktiven Zentren durch konvergente Evolution entstanden sind. Unter der Annahme, dass während der Evolution die katalytische Wirksamkeit dieser Enzyme optimiert wurde und dass es nur eine optimale Anordnung der katalytischen Gruppen gibt, müssen sämtliche Ähnlichkeiten der aktiven Zentren von Subtilisin und Chymotrypsin von Bedeutung für die Katalyse sein. Im Umkehrschluss sollten Unterschiede der aktiven Zentren daher unbedeutend für die Katalyse sein.

4. Für Reaktion A ergibt nur die Auftragung von 1/[Reaktant] gegen t eine Gerade, somit ist die Reaktion zweiter Ordnung. Die Steigung k ist 0,15 mM s’'. Bei Reaktion B führt nur die Auftragung von In[Reaktant] gegen t zu . einer Geraden, folglich ist die Reaktion erster Ordnung.

0

0,16

1,69

18. (a) geringer oder kein Effekt; (b) die Katalyse verliefe wesentlich langsamer, weil die Mutation die Funktion der katalytischen Triade zerstört.

1

0,32

1,53

2

0,48

1,36

3

0,62

1,16

19. Der aktivierte Faktor IXa führt über mehrere Schritte zur

4

0,78

0,99

5

0,91

0,83

Aktivierung der letzten Gerinnungsprotease Thrombin. Fehlt Faktor IX, so ist damit die Thrombinbildung verlangsamt, was die Gerinnselbildung verzögert und die Blutung bei Hämophilie verursacht. Obwohl auch der aktivierte Faktor Xla zur Thrombinbildung führt, spielt Faktor XI keine Rolle, solange er nicht durch Thrombin aktiviert wird. An diesem Punkt ist die Gerinnung bereits voll im Gange, sodass ein Mangel an Faktor XI die Blutgerinnung nicht erheblich verzögert. 20. Als Verdauungsenzym hat Chymotrypsin die Aufgabe, ohne Unterscheidung eine große Vielzahl aufgenommener Pro-

Reaktion A

1,0r-

=

ie

E
AMP + PP;

-45,6 kJ] mol"

DL ADPEr 2P

2 x 30,5 kJ] mol"

> > DIATPFDEERO

= 61,0 kJ] mol"

MWGCKDrAs EHB PP4H0->3'P,

2:(a)\DalIAG° =/-RTlnKistjiist

2 ADP > ATP + AMP

K = eAG” RT K = e-(7500]-mol"')/(8,3145]-K“'mol"')(298K)

K = 0,048

19,2 kJ mol" AG°' = -3,8 kJ mol!

Da AG für die Reaktion im Gleichgewicht Null beträgt, gilt

[B]

(b) AG = AG” + RTin,

'

[A]

EAST für Gl. 14.1: AG?’ = -RT In K,, und damit K., =

AG = 7500] - mol”' + (8,3145) - K’'mol ")(310K) In a AG = 7500] - mol! - 4150] - mol" AG = 3350] - mol! = 3,35kJ - mol" Die Reaktion läuft nicht spontan ab, da AG>0 ist. (c) Die Reaktion könnte in der Zelle fortschreiten, wenn das Produkt B das Substrat für eine zweite Reaktion ist, sodass die zweite Reaktion fortwährend B abzieht; dies verursacht, dass die erste Reaktion aus A fortwährend weiteres B bildet.

b Die theoretisch zu erreichende maximale Menge an ATP entspricht (AG°’ für die Oxidation des Stoffwechselbrennstoffs) / (AG°’ für die ATP-Synthese).

(a) (-2850 kJ mol')/(30,5 kJ mol!) = 93 ATP (b) (-9781 kJ mol"')/(30,5 kJ] mol’) = 320 ATP Bei pH 6 sind die Phosphatgruppen stärker ionisiert als bei pH 5. Dadurch steigt die gegenseitige elektrostatische Abstoßung, AG für die Hydrolyse nimmt damit zu (wird negativer). Die exergone Hydrolyse von PP, durch die Pyrophosphatase (AG°’ = -33,5 kJ] mol’) treibt die Fettsäureaktivierung an. Um AG der Reaktion ATP + Creatin = Phosphocreatin + ADP zu berechnen, wird Gl. 14.1 angewendet:

AG = AC®' + RTin (er

2 [AMP] = =x er x e-(-3800] - mol") /(8,3145] - K"'mol"')(289K) (5Sx103M\

[AMP] = 2,3x10 - *M = 0,23 mM Je positiver das Reduktionspotential einer Verbindung, desto besser geeignet ist sie als Oxidationsmittel. Aus Tab. 14.5 ergibt sich: Verbindung

2 m.

so,

0,515

Acetoacetat

0,346

NAD*

0,315

Pyruvat

0,185

Cytochrom b (Fe’*)

ae

0,077

10. Die Gleichgewichtsreaktion lautet: 2 Cyto c(Fe’*) + Ubichinol — 2 Cyto c(Fe”*) + Ubichinon + 2 H* Setzt man die Angaben von Tab. 14.5 ein, gilt:

NE" =E, Azeptor ©” e-Donator) = 0,235 V- 0,045 V=0,190V AG? = -nFAE” = -(2)(96.485 ] V' mol!)(0,190 V)

= -36,7 kJ] mol"

leoeN)

[Creatin][ATP]

= 12,6 kJ] mol”! + (8,3145 J K“! mol-1)(298 K)

N ee: mM)(0,15 u (1 mM)(4 mM)

= 12,6 kJ] mol! -5,9 kJ mol“! = 6,7 kJ] mol!

11. Aus Tab. 14.5 ergibt sich: (a) AE°

= ©

Ve Akzenn ” ©

2 Bonatn) = ET

rar er ©

Nas)

= 0,031 V - (-0,315V) = 0,346 \.

Da A&° > 0, AG°’< 0 ist, wird die Reaktion spontan wie geschrieben ablaufen.

Lösungen zu den Aufgaben (b) AE°

= ers

Si ee

= &°

= 0,077 V - (0,290V) = 0,213 V.

oyo bye &°

(a) Glucose + 2 NAD*

(cyto a)

+2 ADP +2 P,—

2 Pyruvat + 2 NADH

Da A&° < 0, AG” > 0 ist, wird die Reaktion spontan in die entgegengesetzte Richtung wie geschrieben ablaufen.

1221

+ 2 ATP + 2 H,O

(b) Glucose + 2 NAD* + 2 ADP + 2 AsO} — 2 Pyruvat + 2 NADH + 2 ADP-AsO3+ 2 H,O

2 ADP-AsO} + 2 H,O — 2 ADP + 2 AsO}" +4 H* Gesamtgleichung.: Glucose + 2 NAD* —

12. Unter Verwendung der Daten in Tab. 14.5 für die Oxidation von freiem FADH, (&° = -0,219 V) durch Ubichinon

2 Pyruvat + 2 NADH

(c) Arsenat ist ein Gift, weil es die ATP-Bildung von der Glykolyse abkoppelt. Folglich kann die Energiegewinnung durch die Glykolyse nicht ablaufen.

(8° = 0,045 V) gilt:

AE'=E° upichinon)-&° anna =(0,045 V)-(-0,219V)=0,264V AG?” = nFA8° = -(2)(96.485 ] - V' mol')(0,264 V) = -50,9 kJ] - mol"! Damit steht genügend Freie Enthalpie zur Verfügung, um die Synthese von ATP aus ADP + P; (AG?’ = +30,5

.

H

kJ - mol’, Tab. 14.4) zu ermöglichen.

Bue

B

G

Ribulose-5-phosphat-

Ribulose-5-phosphatIsomerasereaktion:

Epimerasereaktion:

OH

H | Hr 0— OH

SIG 1

X

I05

14. (a) Der vom Enzym Y katalysierte Schritt ist wahrscheinlich der wichtigste Regulationspunkt für den Stoffwechselweg, da dieser Schritt am weitesten vom Gleichgewicht entfernt ist (es ist ein irreversibler Schritt). (b) Die Hemmung von Enzym Z würde verursachen, dass die Konzentration von D - das Reaktionsprodukt sinkt, und sie würde verursachen, dass C - das Substrat der Reaktion —- sich ansammelt. Die Konzentrationen

von A und B würden sich nicht ändern, weil die von den Enzymen X und Y katalysierten Schritte nicht beeinträchtigt wären. Das angehäufte C würde nicht zu B zurückverwandelt werden, da der von Enzym Y katalysierte Schritt irreversibel ist.

Kapitel 15

O0

H— N— OH

@OH

EZ G—SOE

IE S— OH

CH,OPO? 7

CH,OPO? T

1,2-Endiolat-

2,3-Endiolat-

Zwischenprodukt

Zwischenprodukt

(a) AG-Werte unterscheiden sich von AG°’-Werten, da AG = AG°' + RT In [Produkte]/[Reaktanten] gilt und zelluläre Reaktanten und Produkte nicht in ihrem Standardzustand auftreten. (b) Ja, dieselben in vivo-Bedingungen, welche die Höhe an AG im Verhältnis zu AG?’ abnehmen lassen, können ebenfalls AG für die ATP-Synthese herabsetzen.

Gilt [GAP] = 10°* M, ist [DHAP] = 5,5 x 10°* M. Entsprechend Gl. 1.17 ist

%

(a) (b) (c) (d) (e)

Ke

Reaktionen 1, 3, 7 und 10; Reaktionen 2, 5 und 8; Reaktion 6; Reaktion 9; Reaktion 4.

BT:

[GAP][DHAP] _ _ [FBP] 15

Das C1-Atom des DHAP und das C1-Atom von GAP sind achiral, werden aber chiral in FBP (als C3 und C4). Es gibt vier stereoisomere Produkte, die sich in der Konfiguration am C3- und C4-Atom unterscheiden: Fructose-1,6-bisphosphat, Psicose-1,6-bisphosphat, Tagatose-1,6-bisphosphat und Sorbose-1,6-bisphosphat (siehe Abb. 8.2).

Das Zn”* polarisiert den Carbonylsauerstoff des Substrats, um das Enolat-Zwischenprodukt der Reaktion zu stabilisieren.

CH,0PO%

CH,OPO2

C=0---Zn- Enzymer
.0- 0m: Zn

|

|

26H

ESS

HO

AUS

Enzyme

(10*)(5,5 x 10) [FBP]

(-22.800 ] mol-!)/(8,3145 ] K mol-!)(310K)

= 1,4 x 10%

[FBP] = 3,8 x 10°* M [FBP]/[GAP] = (3,8 x10°* M)/(10°* M) = 3,8 Die gekoppelte Reaktion Pyruvat + NADH + H*— Lactat + NAD*

ist A&°’ = (-0,185 V) - (-0,315 V) = 0,130 V. Entsprechend Gl. 14.8 gilt Nö= Ne

-

Er ([Lactat]|NAD*] nF

[Pyruvat]|]NADH]

und AG = -nFA® (Gl. 14.7). Da zwei Elektronen in der oben aufgeführten Reaktion übertragen werden, ist n = 2.

1222

Lösungen zu den Aufgaben

RT (a) A® = 0,130 V- Pr In (1) = 0,130 V n

AG = -(2)(96.485 ] V! mol"')(0,130 V) = -25,1 kJ] mol" (b) RT/n$ = (8,3145 ] K! mol’')(298 K) / (2)(96.485 ] V' mol’') = 0,01284 V A® = 0,130 V - 0,01284 V In (160 x 160) A& = 0,130 V - 0,130 V=0 AG =0

Gehirn-PFK-1. Das Gehirn muss permanent mit Brennstoff versorgt werden, während die Leber eine Vielzahl an physiologischen Aufgaben hat und eher zelluläre Stoffwechselwege reguliert.

15. (a)

(c) A& = 0,130 V - 0,01284 V In (1000 x 1000)

coo-

VE |

Di

Eu

A& = 0,130 V- 0,177 V = - 0,047 V

(a) Die Pyruvat-Kinase-Regulation ist wichtig für die Steuerung des Metabolitenflusses, wie z.B. der Fructose (in der Leber), die nach dem PFK-Schritt in die Glykolyse eintreten. (b) FBP ist das Produkt der dritten Reaktion der Glykolyse, somit fungiert es als ein Vorwärtsaktivator des Enzyms, das Schritt 10 katalysiert. Dieser Regulationsmechanismus

stellt sicher, dass die Metaboliten den Stoffwech-

selweg weiter durchlaufen, sobald sie einmal PFK-Schritt der Glykolyse passiert haben.

7

(6)

X

1— 9151

Kw>A ge cc ı

CH3OPO2"

AG=-(2)(96.485 ] V ! mol')(minus;0,047 V)=9,1kJ mol” (d) Bei den Konzentrationsverhältnissen von Teil a ist AG negativ und die Reaktion läuft wie aufgeführt ab. Wenn [Lactat]/[Pyruvat] steigt, dann nimmt AG der Reaktion zu, obwohl auch [NAD*]/[NADH] ansteigt, sodass im Teil b die Reaktion im Gleichgewicht ist (AG=0) und in Teil c ist AG positiv und die Reaktion läuft spontan in entgegengesetzte Richtung ab.

ur

H

Pyruvat

GAP

(b) Das Produkt Pyruvat der Aldolasereaktion wird nicht weiter verändert. Das Produkt GAP wird durch die Glykolyseenzyme Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglycerat-Kinase, Phosphoglycerat-Mutase, Enolase und Pyruvat-Kinase zu Pyruvat umgewandelt. (cl) Wenn Glucose zu Glucose-6-phosphat umgewandelt wird, wird ein ATP-Molekül verbraucht. Bei der Phosphoglycerat-Kinase-Reaktion und bei der PyruvatKinase-Reaktion wird jeweils ein ATP-Molekül erzeugt (diese Mengen werden nicht verdoppelt, weil nur ein C3-Bruchstück der Glucose diesen Weg nimmt); dies ergibt eine Nettoausbeute von einem ATP-Molekül pro Glucosemolekül. Der Standardweg der Glykolyse erzeugt zwei ATP pro Glucose.

den

10. Die drei Glucose-Moleküle, die in der Glykolyse verwertet

werden, ergeben sechs Moleküle ATP. Wird die Glykolyse über den Pentosephosphatweg umgangen, werden fünf ATP-Moleküle produziert. 1, Die Markierung wird am C1 und C3 von F6P auftauchen

(siehe Abb. 15.30). 12. (a) Die Transketolase überträgt Einheiten mit zwei Kohlen-

stoffatomen von einer Ketose auf eine Aldose, somit sind die Produkte ein Zucker aus drei Kohlenstoffatomen und ein Zucker aus sieben Kohlenstoffatomen. (b) Die Produkte sind ein Zucker mit vier Kohlenstoffatomen und ein Zucker mit sieben Kohlenstoffatomen. Die Reihenfolge der Bindung spielt eine Rolle. Die Ketose bindet zuerst und überträgt die Einheit mit zwei Kohlenstoffatomen auf das TPP auf dem Enzym. Dann bindet die Aldose und nimmt die C2-Einheit auf. 13: Auch wenn der Fluss der Glucose durch die Glykolyse und

damit auch durch den Citratcyclus blockiert ist, kann Glucose über den Pentosephosphatweg unter Bildung von CO, oxidiert werden. 14. Das Leberenzym reagiert auf die drei Aktivatoren weitaus

sensitiver als das Gehirnenzym. Es ist möglich, dass die Leber-PFK-1 einer stärkeren Regulation unterliegt als die

Kapitel 16

1. (a) +9ATP, (b) +6ATP, (c) -18ATP. (a) Die Gleichung der Glykolyse lautet: Glucose + 2 NAD* +2 ADP + P,—> 2 Pyruvat +2 NADH +4 H* +2 ATP +

2 H,O

Die Gleichung für die Gluconeogenese lautet: 2 Pyruvat +2 NADH +4 H" +4 ATP + 2 GTP + 6 H,O — Glucose +2

NAD’ +4

ADP +2 GDP +6 P;

Für die beiden Vorgänge ergibt sich damit insgesamt: 2AIP+2GIP+4H, 0 >22 ADP+2GDP +4P;

(b) Die Gleichung für den Abbau von 6 G6P durch den Pentosephosphatweg lautet: 6 G6P + 12 NADP* + 6 H,O — 6 Ru5P + 12 NADPH

+ 12 H* +6 CO,

Ru5P kann in G6P durch die Transaldolase und Transketolase und über die Gluconeogenese umgewandelt werden: 6 Ru5P + H,O > 5 G6P + P;

Die Nettogleichung lautet daher: G6P + 12 NADP* + 7

H,0 >12 NADPH +12 H*+6CO,+P,

Durch die notwendig phoryliert abgegeben zen.

Phosphoglucokinase wird G1,6P gebildet, das ist, um Phospoglucomutase, die zuvor dephoswurde und dabei ihr G1,6P-Zwischenprodukt hat, wieder in den aktiven Zustand zu verset-

Lösungen zu den Aufgaben

Die gesamte Freie Enthalpieänderung für die Entzweigung beträgt: Spaltung einer a(1—4)-Bindung

AG? = -15,5 kJ] mol"

Knüpfung einer a(1—4)-Bindung

+15,5 kJ mol"

Hydrolyse einer a(1—6)-Bindung

-7,1 kJ] mol”!

Gesamt

AG®' = -7,1 kJ] mol!

Die gesamte Freie Enthalpieänderung für die Verzweigung beträgt: Spaltung einer a(1—4)-Bindung

AG°’ = -15,5 kJ mol!

Knüpfung einer a(1—6)-Bindung

+7,1 kJ mol”

Gesamt

AG?’ = -8,4 kJ] mol!

Die Summe der beiden Verzweigungsreaktionen weist ein AG < 0 auf, die Entzweigung jedoch würde ohne den zusätzlichen Schritt der Hydrolyse der a{1—6)-Bindung zu Glucose endergon (AG > 0) verlaufen. Ein Glykogenmolekül mit 28 Verzweigungsebenen würde die effizienteste Anordnung zur Speicherung der Glucose bedeuten. Dessen äußerste Verzweigungsebene würde bedeutend mehr Glucosereste enthalten als die tatsächlich beobachtete zwölfte Verzweigungsebene des Glykogenmoleküls. Sehr dicht gepackte Glucosemoleküle wären jedoch der Phosphorylase nicht mehr zugänglich. Solch ein dicht gepacktes Glykogenmolekül kann darüber hinaus gar nicht synthetisiert werden, da die Glykogen-Synthase und das Verzweigungsenzym keinen Platz zum Arbeiten hätten (siehe Exkurs 16.3 mit der Diskussion der Glykogenstruktur). Im Verlauf des Glykogenabbaus beginnt und endet die Schleife über Glykogensynthese und -abbau bei G6P. Die Energiekosten dieser Schleife betragen ein ATP-Äquivalent, das bei dem UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Schritt verbraucht wird. Der gesamte Energieverlust beläuft sich daher auf 1/32 oder —3%. Dieser Mechanismus ermöglicht, dass die Aktivität der Glykogen-Phosphorylase durch die Glucosekonzentration reguliert wird, sodass kein Glykogen abgebaut wird, wenn bereits Glucose in großer Menge vorhanden ist.

(a) Der Blutglucosespiegel ist hoch, da Zellen auf das Insulinsignal zur Glucoseaufnahme keine Antwort geben können. (b) Insulin ist unfähig, in Muskeln Phosphoprotein-Phosphatase-1 zu aktivieren, die Glykogensynthese wird daher nicht stimuliert. Vielmehr ist die Glykogensynthese durch den Mangel an verfügbarer Glucose in der Zelle stark reduziert.

1223

Ein Defekt im G6P-Transport würde die Symptome eines Glucose-6-Phosphatasemangels auslösen: Akkumulation von Glykogen und Hypoglykämie. 10. Die Umwandlung von Glucose aus dem Blutkreislauf in Lactat generiert in den Muskeln 2 ATP. Kann Muskel-Gly-

kogen mobilisiert werden, beträgt der Energiegewinn 3 ATP, da die Phosphorolyse von Glykogen den von der Hexokinase katalysierten Schritt, der im ersten Schritt der Glykolyse ein ATP verbraucht, umgeht. Ill, Der Mangel tritt beim Verzweigungsenzym auf (Glykogenspeicherkrankheit vom Typ IV). Das Verhältnis von G1P zu Glucose ist hoch (normalerweise beträgt es ca. 10) und

weist auf abnormal lange Ketten mit a(1—4)-verknüpften Resten und wenigen a(1—6)-Verzweigungspunkten hin.

Kapitel17 il, (a) Anaerobier müssen in der Lage sein, Intermediate des

Citratcyclus wie Citrat und Succinyl-CoA zu synthetisieren, da diese Vorstufen für die Biosynthese anderer Verbindungen sind. (b) Diese Organismen benötigen keinen vollständigen Citratcyclus. Er würde reduzierte Coenzyme liefern, die reoxidiert werden müssten. Citrat muss gespalten werden, um eine Acetylgruppe und Oxalacetat zu erzeugen. Aus Oxalacetat kann dann zur Vervollständigung des Cyclus Succinat gebildet werden. Der Decarboxylierungsschritt ist höchstwahrscheinlich metabolisch irreversibel, da das Produkt CO, rasch zu Bicarbo-

nat hydratisiert wird. Die Umkehrreaktion, die Carboxylierung, erfordert für ihren Ablauf den Einsatz Freier Enthalpie (Abschnitt 16.4A). Die vier anderen Reaktionen sind Transferreaktionen oder Oxidation-Reduktions-Reaktionen (Übertragung von Elektronen), die leichter umkehrbar sind. PDP beseitigt die Phosphatgruppe, die den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex inaktiviert. Ein Mangel an PDP führt zu einer geringeren Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität in Muskelzellen, wodurch es für den Muskel schwierig wird, den Fluss durch den Citratcyclus zu erhöhen, um

den Energiebedarf der körperlichen Betätigung zu decken. (a) Der markierte Kohlenstoff wird zu C4 des Succinylanteils von Succinyl-CoA. Da Succinat ein symmetrisches

Molekül ist, erscheint im Succinat die Markierung sowohl an C1 als auch an C4. Wenn das resultierende Oxalacetat in die zweite Runde geht, treten markierte Kohlenstoffe als '*CO, in den Reaktionen der Isocitrat-Dehydrogenase und der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase auf (siehe Abb. 17.2). (b) Der markierte Kohlenstoff wird zu C3 im Succinylanteil von Succinyl-CoA und erscheint folglich als C2 oder C3

Lösungen zu den Aufgaben

1224

von Succinat, Fumarat, Malat und Oxalacetat. In der zweiten Runde des Cyclus werden weder C2 noch C3

Die Netto-Reaktion ist

2 Pyruvat + ATP+ NAD*

+H,O—Citrat+ ADP +P;+ NADH

des Oxalacetats als CO, freigesetzt. Die '"C-Markierung erscheint jedoch in der zweiten Runde in C1 oder C2 des Succinylanteils von Succinyl-CoA und folglich an allen vier Positionen des daraus entstehenden Oxalace-

1l02, (a) Der Citratcyclus ist ein mehrstufiger Katalysator. Wird

tats. Schließlich wird !*C in der dritten Runde als '*CO,

Cyclus an, ändert aber nicht die Stöchiometrie der Ge-

freigesetzt.

samtreaktion (Acetyl-CoA > 2CO,). Damit das Intermediat des Citratcyclus oxidiert wird, muss es den Cyc-

Die Zwischenprodukte des Citratcyclus sind allesamt Säuren und stellen damit eine Quelle für Wasserstoffionen dar, die zur Abnahme des Blut-pH-Werts (Acidose) führen.

H;C

|

H,C NAD* hat ein zu niedriges Reduktionspotential (&” = -0,315 V), um die Oxidation von Succinat zu Fumarat (&” = +0,031 V) zu ermöglichen. Somit reicht die Freie Enthalpie der Succinat-Dehydrogenasereaktion nicht aus, um NAD* zu reduzieren. Für die Oxidation von Succinat ist enzymgebundenes FAD (&°” > 0) besser geeignet. Kompetitive Hemmungen können durch Zugabe von mehr Substrat - in diesem Fall Succinat — überwunden werden. Oxalacetat verringert die Hemmung durch Malonat, weil es durch die Reaktionen des Citratcyclus zu Succinat umgesetzt wird. ist der wichtigste Kontrollpunkt für den Fluss durch die Glykolyse. Wird die Phosphofructokinase gehemmt, so verlangsamt sich der gesamte Stoffwechselweg; somit kann die Bildung von Acetyl-CoA bei der Glykolyse, die durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex erfolgt, gesenkt werden, wenn der Citratcyclus mit maximaler Kapazität arbeitet und die Citratkonzentration hoch ist. Wenn die Zwischenprodukte des Citratcyclus in den Synthesewegen verbraucht werden, sinkt die Citratkonzentration, wodurch die Hemmung der Phosphofructokinase abgeschwächt wird und die Glykolyse voranschreiten kann, damit die Zwischenprodukte des Citratcyclus wiederaufgefüllt werden.

eine Aminosäure zu einem Intermediat des Citratcyclus abgebaut, so kurbelt dies die katalytische Aktivität des

lus verlassen und zu Acetyl-CoA umgewandelt werden,

damit es als Substrat erneut in den Cyclus eintreten kann. (b) Pyruvat aus dem Abbau einer Aminosäure kann durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA umgewandelt werden; diese Aminosäuren-Kohlenstoffe können dann im Citratcyclus vollständig oxidiert werden. 13: Der alternative Stoffwechselweg umgeht die Succinyl-CoA-

Synthetase-Reaktion des Standard-Citratcyclus - ein Schritt, der von der Phosphorylierung von ADP begleitet wird. Der alternative Weg erzeugt deshalb ein ATP weniger als der Standard-Citratcyclus. Die Anzahl der reduzierten Cofaktoren ist gleich. 14. Für die Reaktion

Isocitrat + NAD* = a-Ketoglutarat + NADH + CO, + H* werden [H*] und [CO;] = 1 gesetzt. Entsprechend Gl. 14.1 ist: NADH][a-Ketoglutarat] AG =AG' + Rrin(! [NAD * ][Isocitrat] )

10. Die Phosphofructokinasereaktion

1 m . Für die Synthese von Citrat muss Pyruvat durch die Pyru-

vat-Carboxylase zu Oxalacetat umgesetzt werden: Pyruvat + CO, + ATP + H2O — Oxalacetat

+ ADP + P;

Ein zweites Pyruvat wird durch Pyruvat-Dehydrogenase zu Acetyl-CoA umgesetzt: Pyruvat

+ CoASH + NAD'— Acetyl - CoA+CO, + NADH

Acetyl-CoA verbindet sich dann mit Oxalacetat unter Bildung von Citrat: Oxalacetat + Acetyl - CoA—Citrat + CoASH

= -21 kJ] mol’' + (8,3145 ] K' mol'')(298 K) In Rn (8) (0,02) AG = -21 kJ mol”! -1,16 kJ] mol”! = -22,16 kJ] mol! Mit einer solchen, unter physiologischen Bedingungen stark negativen Freien Reaktionsenthalpie ist es sehr wahrscheinlich, dass Isocitrat-Dehydrogenase einen Kontrollpunkt des Stoffwechsels darstellt. 15. Tiere können keine Nettosynthese von Glucose aus Acetyl-

CoA

(wozu Acetat umgesetzt wird) durchführen.

Aller-

dings fließt '"C-markiertes Acetyl-CoA in den Citratcyclus ein und wird zu Oxalacetat umgewandelt. Ein Teil dieses Oxalacetats könnte durch Gluconeogenese zu Glucose umgesetzt, anschließend durch die Muskeln aufgenommen und in Glykogen eingebaut werden.

Lösungen zu den Aufgaben

Kapitel 18 sl

7 Se WE ne

(a) Der Sauerstoffverbrauch hört auf, weil Amytal den Elektronentransport in Komplex I hemmt. (b) Die Hemmung durch Amytal hat für die Elektronen vom Succinat keine Bedeutung, da diese direkt am Komplex II in die Elektronentransportkette eintreten und so den Elektronentransport durch die Komplexe III und IV wieder herstellen. (c) CN’ blockiert die oxidative Phosphorylierung am Komplex IV, nach der Eintrittsstelle für Succinat. (d) Oligomycin blockiert die oxidative Phosphorylierung und damit den O,-Verbrauch. DNP entkoppelt den Elektronentransport von der oxidativen Phosphorylierung und ermöglicht somit eine Wiederaufnahme des O,-Verbrauchs.

Mitochondrien, die mehr Cristae enthalten, haben eine größere Oberfläche und daher mehr Proteine für den Elektronentransport und die oxidative Phosphorylierung. Gewebe mit einem hohen Bedarf an ATP-Synthese (wie z.B. das Herz) enthalten Mitochondrien mit mehr Cristae als Gewebe mit einem niedrigen Bedarf an oxidativer Phosphorylierung (wie z.B. die Leber). Wenn NADH am Glycerin-3-phosphat-Shuttle beteiligt ist, fließen die Elektronen unter Umgehung von Komplex I zu FAD und dann zu CoQ. So werden pro NADH 2 ATP synthetisiert. Wenn NADH in den Malat-Aspartat-Shuttle einbezogen wird, werden 3 ATP gebildet. Die in Frage kommenden sind FAD+2H’+2e

Halbreaktionen

=FADH,

. © kann sich von &°’ in Abhängigkeit vom Mikromilieu des Redoxzentrums und den Konzentrationen von Reaktanten und Produkten unterscheiden. Außerdem könnte die enge Kopplung zwischen aufeinander folgenden Elektronentransfers innerhalb eines Komplexes zu einem „Elektronensog“ führen, so dass der Gesamtprozess spontan verliefe.

(Tabelle 14.5)

A&°' = -0,219 V

AUF2H+2e=H0

1225

A&°' = 0,815 V

(a)

Da die O,/H,O-Halbreaktion das positivere A&°’ aufweist, läuft die FAD-Halbreaktion in die andere Richtung und die Gesamtreaktion lautet

ElektronenTransport-

Komplexe

la O2 + FADH,H3>0 + FAD A®=0,815 V- (-0,219 V) = 1,034V

ADP +P; H+

Da AG°' = - n#A%&°', ist ATP

AG’ = -(2)(96,485 kJ] V' mol')(1,034 V) = -200 kJ mol”

ATP-Synthase

Daher ist die maximale Anzahl von ATP, die synthetisiert werden könnte

200 kJ mol'/30,5 kJ] mol” =6,6 Mol ATP/Mol FADH,

(b) Ein Anstieg des externen pH (Abnahme von [H']) erhöht das elektrochemische Potential an der mitochondrialen Membran und führt daher zu einem Anstieg der ATP-Synthese.

(oxidiert durch O,) (a)

(b) =

[O,]

[O,] Zu

1

2

l

|

1

2

t

(

(8

(d)

Für den Transport eines Protons von außen nach innen (Gl. 18.1) ist

AG = 2,3 RT[pH(Seite 1) - pH(Seite 2)] + ZFAY

Der pH-Unterschied beträgt -1,4. Da ein Ion von der positiven zur negativen Seite der Membran transportiert wird, ist AW negativ.

AG = (2,3)(8,314 ] - K! - mol"')(298 K)(-1,4) + (1)(96,485 ] - V’! mol”')(-0,06 V) AG = -7980 ] : mol"! -5790 ] - mol! = 13,8 KJ - mol” Da AG” für die ATP-Synthese 30,5 kJ - mol’ und 30,5/

[O,]

[0,] BEE: Ein

t

|

De

id

2

1

2

t

[e

13,8 = 2,2 ist, müssen zwischen zwei und drei Mole Proto-

nen transportiert werden, um die Freie Enthalpie bereitzustellen, damit unter biochemischen Standardbedingungen ein Mol ATP synthetisiert wird.

1226

Lösungen zu den Aufgaben

8. (a) Der Import von ADP (Nettoladung -3) und der Export

von ATP (Nettoladung -4) stellt den Verlust einer negativen Ladung innerhalb der Mitochondrien dar. Dies senkt die Differenz der elektrischen Ladung an der Membran, da die Außenseite aufgrund der Verschiebung von Protonen während des Elektronentransports positiv ist. Folglich wird der elektrochemische Gradient durch die Aktivität des ADP-ATP-Translokators verringert. Die Aktivität des P;-H*-Symportproteins verringert den Protonengradienten, indem es Protonen aus dem Intermembranraum den Wiedereintritt in die Matrix gestattet.

(b) Beide Transportsysteme werden durch die Freie Enthalpie des elektrochemischen Protonengradienten angetrieben.

Die Protonierung und nachfolgende Deprotonierung von Asp 61 der c-Untereinheiten der F}Fo-ATPase induziert die Drehung des c-Rings, der wiederum mechanisch die Synthese von ATP antreibt. DCCD reagiert mit Asp 61 auf eine Weise, die es daran hindert, ein Proton zu binden und damit wird auch die ATP-Synthese verhindert. 10. Bei einer ATP-Synthase,

die mehr c-Untereinheiten hat, sind mehr Protonentranslokationsereignisse nötig, um eine vollständige Rotation des c-Rings anzutreiben. Folglich ist mehr Substratoxidation (O,-Verbrauch) erforderlich, um drei ATP-Moleküle (die Ausbeute eines Cyclus des Rotationsmotors) zu synthetisieren, und der P/O-Quotient ist niedriger.

11. DNP und ähnliche Verbindungen bauen den für die ATP-

Synthese erforderlichen Protonengradienten ab. Der Abbau des Protonengradienten senkt die Geschwindigkeit der ATP-Synthese was seinerseits den ATP-Massenwirkungskoeffizienten erniedrigt. Durch Erniedrigung dieses Koeffizienten wird die Hemmung der Elektronentransportkette aufgehoben. Dies führt zu einer erhöhten Stoffwechselrate. 122 Durch

die hormonelle Stimulierung von Lipase werden aus gespeicherten Triacylglycerinen Fettsäuren freigesetzt. Diese aktivieren einerseits UCP (Thermogenin) und liefern außerdem den Brennstoff, durch dessen Oxidation Elektronen für den Wärme erzeugenden Elektronentransport bereitgestellt werden.

13: Das Umschalten auf den aeroben Stoffwechsel macht die

ATP-Bildung durch oxidative Phosphorylierung möglich. Die Phosphorylierung von ADP erhöht das [ATP]/[ADP]Verhältnis. Weil ein hoher ATP-Massenwirkungskoeffizient den Elektronentransport verlangsamt, wird dann der Quotient [NADH]/[NAD*] erhöht. Die Konzentrationsanstiege von ATP und NADH hemmen deren Zielproteine in Glykolyse und Citratcyclus (Abb. 18.29) und verlangsamen auf diese Weise diese Stoffwechselwege.

14. Um NADPH zu erzeugen, dessen Elektronen für die Re-

u

duktion von O, zu O; benötigt werden, wird Glucose zum Pentosephosphatweg umgeleitet.

Kapitel 19 1. Die Färbung des Meerwassers weist darauf hin, dass die Photosynthesepigmente der Algen in anderen Farbbereichen des sichtbaren Lichts als Rot absorbieren.

2. 2H,O + 2NADP* > 2NADPH + 2H* + O, 3. Die Arbeitsreihenfolge lautet Wasser-Plastochinon-Oxidoreduktase (Photosystem II), Plastochinon-PlastocyaninOxidoreduktase (Cytochromb,f) und Plastocyanin-Ferredoxin-Oxidoreduktase (Photosystem I).

4. Die Markierung erscheint als '°O;:

HISO + CO, = (CH,O) + 180, 5. (a) Die Energie eines Photons ist E = hc/X. Somit ist die Energie eines Mols Photonen:

E = Nhc/A = (6,022 x 1023 mol’')(6,626 x 10° J s) (2,998 X 108 m s!)/(7 x 10 m)

= 1,71X 10° J mol! = 171 k} mol" (b) (171 kJ mol’')/( 30,5 kJ] mol!) = 5,6 Fünf Mol ATP könnten theoretisch synthetisiert werden (zumindest unter biochemischen Standardbedingungen).

6. (a) Die maßgeblichen Halbreaktionen sind (Tabelle 14.5):

O, +4e +4H*—>2H,0A® NADP*

+H*

= 0,815 V

+2e- >NADPH

Die Gesamtreaktion

A& —L0320V

ist

2 NADP* + 2 H50 — 2 NADPH + O, +2 H* AE = -0,320 V - (0,815 V) = -1,135 V

AG" = -nFAE = -(4)(96,485 ] V! mol?)(-1,135 V)= 438 k (b) Ein Mol Photonen roten Lichtes (A = 700 nm) hat eine Energie von 171 kJ. Somit werden theoretisch 438/171 = 2,6 Mol Photonen benötigt, um die Oxidation von H,O durch NADP* zu treiben, die zur Bildung von einem Mol O, führt.

(

V

18. Pol V ist weniger prozessiv als Pol III. Wenn die Pol III

HN

/

durch die Anwesenheit eines Thymindimers angehalten wird, dann kann die Pol V übernehmen, wodurch die Replikation mit hoher Geschwindigkeit fortgesetzt werden kann- wenn auch mit einer höheren Fehlpaarungsrate. Der Schaden ist jedoch minimal, da Pol V schon bald von der DNA abfällt, wodurch es der exakteren Pol III möglich wird, die Replikation der DNA wieder aufzunehmen.

“=

er

\=n

0

Adenin

14. Die Triphosphatase

zerstört Nucleotide, die die modifizierte Base enthalten, bevor sie bei der Replikation in die DNA eingebaut werden können.

15: Die Desaminierung von 5-Methylcytosin führt zum Thymin.

NH,

N“

|

alte

CH

;

EN,

N

|

CH

:

Kapitel26 1:

(a) Cordycepin ist ein 3’-Desoxyanalogon von Adenosin. (b) Cordycepin wird in eine wachsende RNA-Kette eingebaut und lässt keine weitere Kettenverlängerung in 5’ — 3’-Richtung zu, da diesem Molekül die 3’-OHGruppe fehlt. Der obere Strang ist der Sense-Strang. 5’ CAACGTAACACTTTACAGCGGCGCEGTCATTTGATATGATGCGCCCCECTTCCCEGATA

u

|

|

5-Methyl-C

ar

Da Thymin eine normale DNA-Base ist, können Reparatursysteme nicht erkennen, ob solch ein T oder sein entgegengesetztes G die mutierte Base ist. Deshalb wird nur etwa die Hälfte aller desaminierten 5-Methylcytosine korrekt repariert. 16. (a) dnaB codiert die Helikase DnaB. Der DnaB-Verlust wäre letal, da sie die DNA zur Replikation entwindet.

(b) polA codiert Pol I. Der Pol I-Verlust würde die RNA-Primerexcision verhindern und somit letal sein. (c) ssb codiert SSB, welches die Wiedervereinigung getrennter Einzelstränge verhindert. Der SSB-Verlust wäre ebenfalls letal. (d) recA codiert das RecA-Protein, welches die allgemeine Rekombination und SOS-Antwort vermittelt. Sein Verlust wäre schwerwiegend, aber nicht notwendigerweise letal. 17, E. coli enthält eine geringe Menge an dUTP, welches die

DNA-Polymerase an Stelle von dTTP in die DNA einbaut. Die entstehenden Uracilbasen werden rasch durch die Uracil-N-Glykosylase ausgeschnitten. Die anschließende Nucleotid-Excisionsreparatur verursacht einen vorüberge-

= 5Region

=i0-

Region

Transkriptionsstartpunkt

Sein TATGAT-Segment unterscheidet sich nur in einer Base von der TATAAT-Konsensussequenz der -10-PromotorSequenz. Seine TTTACA-Sequenz unterscheidet sich nur in einer Base von der TTGACA-Konsensussequenz der

-35-Promotor-Sequenz und ist ungefähr 25 Nucleotide in 5’-Richtung, d.h. stromaufwärts von der -10-Sequenz entfernt. Das Anfangsnucleotid G ist das einzige Purin, das sich ca. 10 nt stromabwärts von der -10-Sequenz befindet. Die molekulare Sonde sollte eine Sequenz besitzen, die zur Konsensussequenz der 6 nt langen -10-Sequenz des Promotors komplementär ist: 5’-ATTATA-3’.

Die Promotorelemente für die RNA-Polymerase II schließen Sequenzen an den Positionen -27 (der TATA-Box) und zwischen -50 und -100 mit ein. Das Einfügen von 10 bp würde die Promotorsequenzen um die Distanz trennen, die einer Windung der DNA-Helix entspricht. Dadurch würde die Bindung von Proteinen, die für die Initiation der Transkription benötigt werden, geschwächt. Die Proteinbindungsstellen lägen aber immer noch auf derselben Seite der Helix. Das Einfügen von 5 bp (was einer halben Helixwindung entspricht) würde die Proteinbindungsstellen auf die gegenüberliegenden Seiten der Helix verla-

3

1236

Lösungen zu den Aufgaben

gern und so die Transkriptionsinitiation wesentlich erschweren. . G- C-Basenpaare sind stabiler als A - T-Basenpaare. Daher ist die Bildung eines offenen Komplexes während der Transkriptionsinitiation umso schwieriger, je mehr G - CBasenpaare der Promotor enthält. . Die Transkription eines rIRNA-Gens führt zu einem einzi-

gen RNA-Molekül, das in ein Ribosom eingebaut wird. Im Gegensatz dazu ergibt die Transkription eines Gens für ein ribosomales Protein eine mRNA, die vielfach translatiert werden kann, um so viele Kopien ihres entsprechenden Proteins zu produzieren. Die größere Anzahl an rRNAGenen im Verhältnis zu ribosomalen Protein-Genen stellt die ausgewogene Synthese von rRNA und Proteinen sicher, die für den Aufbau der Ribosomen nötig sind.

. Die Zell-Lysate könnten auf eine Säule aufgetragen werden, an deren Trägermaterial- Poly(dT) immosbilisiert ist. Die Poly(A)-Schwänze der prozessierten mRNAs werden an die Poly(dT)-Reste binden, während die anderen zellulären Komponenten weggewaschen werden. Die mRNAs können durch eine Ermiedrigung der Salzkonzentration eluiert werden, da dies zu einer Destabilisierung der A - T-Basenpaare führt. . (a) Die Phosphatgruppen des Phosphodiesterrückgrats der mRNA werden an allen Stellen markiert werden, an

denen a-[”PJATP von der RNA-Polymerase als Substrat verwendet wird. (b) ”P wird nur an den 5‘-Enden der mRNA-Moleküle auftauchen, die A als ersten Rest haben (dieser Rest behält seine a- und ß-Phosphate). In allen anderen Fällen, in

denen ß-[””PJATP als Substrat für die RNA-Synthese verwendet wird, werden die B- und y-Phosphate als PP; freigesetzt (siehe Abb. 26.6).

(c) In der RNA-Kette wird kein °P auftauchen. Während der Polymerisierung werden die ß- und y-Phosphate als PP; freigesetzt. Das endständige (y-) Phosphat eines A-Rests am 5‘-Ende eines RNA-Moleküls wird während des Cappings entfernt. DNA-Polymerase braucht einen Primer, Poly(A)-Polymerase verwendet die prä-mRNA als Primer: tRNA-NucleotidylTransferase verwendet unreife tRNA als Primer; und RNAPolymerase braucht keinen Primer. Sowohl die DNA- als auch die RNA-Polymerase brauchen eine DNA-Matrize, aber weder Poly(A)-Polymerase, noch tRNA-NucleotidylTransferase verwenden eine Matrize. Die vier Polymerasen verwenden verschiedene Nucleotidsätze: DNA-Polymerase verwendet alle vier dNTPs, RNA-Polymerase verwendet alle vier NTPs; Poly(A)-Polymerase verwendet nur ATP: und tRNA-Nucleotidyl-Transferase verwendet ATP und CTP. 10. Das aktive Zentrum der Poly(A)-Polymerase ist enger, weil

es keinen Matrizenstrang aufnehmen muss.

11. Für die hydrolytische Spaltung durch RNase ist eine freie 2’-OH-Gruppe notwendig, um ein 2’,3’-Cyclophosphat als Intermediat auszubilden (Abschnitt 11.10). Nucleotidreste, denen eine 2’-OH-Gruppe fehlt, wären demnach gegenüber einer RNase-katalysierten Hydrolyse resistent. 12. Die Spleißreaktion der mRNA, die keine Energiezufuhr erfordert und bei der letztlich keine Phosphodiesterbindunist in vitro theoretisch reversibel. Der gen verlorengehen, Abbau der herausgeschnittenen Introns macht die Reaktion in der Zelle jedoch irreversibel. 13. Das Intron muss groß genug sein, um (eine) Spleißosom-

bindungsstelle(n) einzuschließen. 14. Die Inhibition der snRNA-Prozessierung verhindert das Spleißen der mRNA. Das Resultat ist, dass die WirtsmRNA nicht translatiert werden kann und somit die Ribosomen nur virale Proteine synthetisieren werden.

Kapitel 27 1. Durch die Insertion von 4 Nucleotiden würde ein Codon hinzugefügt und das Leseraster des Gens um ein Nucleotid verschoben werden. Das exakte Leseraster könnte durch die Deletion eines Nucleotids wieder hergestellt werden. Die Genfunktion würde jedoch nicht wieder hergestellt, falls (1) die Insertion von 4 Nucleotiden das Codon für

eine

funktionell’ kritische

Aminosäure

unterbrechen

‚würde; (2) die Insertion aus 4 Nucleotiden ein Codon für eine Struktur brechende Aminosäure bilden würde; (3) durch die Insertion aus 4 Nucleotiden im Anfangsbereich des Gens ein Stoppcodon eingeführt würde; (4) die Deletion des einen Nucleotids weit weg von der Insertion aus 4 Nucleotiden erfolgen würde, sodass, obwohl das Leseraster wiederhergestellt wäre, ein langer Bereich einer Leserasterverschiebung die Deletion und die Insertion trennen würde. 2. Die möglichen Codons sind UUU, UUG, UGU, GUU, UGG, GUG, GGU und GGG. Die damit codierten Aminosäuren sind Phe, Leu, Cys, Val, Trp und Gly (Tabelle 27.1).

3. Eine Amber-Mutation entsteht durch eine der Punktmutationen XAG, UXG oder UAX zu UAG. Die XAG-Codons

spezifizieren Gln, Lys und Glu, die UXG-Codons spezifizieren Leu, Ser und Trp; und die UAX-Codons, die keine Stoppcodons sind, spezifizieren Tyr. Somit können einige der Codons, die diese Aminosäuren spezifizieren, eine Punktmutation zu UAG erfahren. 4. (a) Jeder ORF beginnt mit einem Initiationscodon (ATG) und endet mit einem Stoppcodon (TGA): ATGCTCAACTATATGTGA codiert vir-2 und ATGCCGCATGCTCTGTTAATCACATATAGTTGA auf dem komplementären Strang codiert vir-1.

Lösungen zu den Aufgaben

(b) vir-1: MPHALLITYS; vir-2: MLNYM. (c) vir-l: MPHALLIPYS;

vir-2: MLNYMGLTEHAA.

Es liegen vier Exons vor (die durch unterstrichene Basen angegeben sind): TATAATACGCGCAATACAATCTACAGCTTCGCGTA AATCGCAGGTAAGTTGTAATAAATATAAGTGAGT ATGATAGGGCTTTGGACCGATAGATGCGACCCTG GAGGTAAGTATAGATAATTAAGCACAGGCATGCA GGGATATCCTCCAAACAGGTAAGTAACCTTACGG TCAATTAATTAGGCAGTAGATGAATAAACGATAT CGATCGGTTACAGTAGTCTGAT

Die reife mRNA, die eine 5’-Kappe und einen Poly(A)Schwanz trägt, hat deshalb die Sequenz GCGUAAAUCGUAGGCUUUGGACCGAUAGAUG CGACCCUGGAGCAUGCAGGGAUAUCCUCCAAA UAGCAGUAGAUGAAUAAACGAUAUCGAUCGG UUAGGU

Das Startcodon und das Stoppcodon sind fettgedruckt. Das codierte Protein besitzt die Sequenz MRPWSMQGYPPNSSR

Gly und Ala; Val und Leu; Ser und Thr; Asn und Gln; und Asp und Glu.

1237

EF-Tu sehr viel fester, was zeigt, dass sich EF-Tu am Ribo-

som nicht von ihr lösen kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl eine höhere als auch eine niedrigere Bindungsaffinität die Funktionsfähigkeit von EF-TU beeinträchtigen könnte; dies würde die Geschwindigkeit senken, mit der falsch beladene Aminoacyl-tRNA-Moleküle während der Translation an die A-Stelle des Ribosoms binden. 119%, elF2 ist ein G-Protein, das die Initiator-XRNA an die 40S-

Untereinheit des Ribosoms liefert und dann das gebundene GTP zu GDP hydrolysiert. Der Guanin-NucleotidAustauschfaktor eIF2B hilft eIF2, GDP freizusetzen, um GTP zu binden, sodass es an einer weiteren Runde der Translationsinitiation teilnehmen kann. 15: Durch Induktion der gleichen Konformationsänderungen,

die auch bei der korrekten tRNA-mRNA-Paarung auftreten, kann Paromomycin die Gegenwart einer Codon-Anticodon-Fehlpaarung verbergen. Ohne ein Korrekturlesen am Aminoacyl-tRNA-Bindungsschritt synthetisiert das Ribosom ein Polypeptid mit falschen Aminosäuren, das wahrscheinlich nicht funktionsfähig oder für die Zelle toxisch ist. 14. (a) Die

Der Zusammenschluss funktionsfähiger Ribosomen erfordert gleiche Mengen der rRNA-Moleküle, deshalb ist es für die Zelle von Vorteil, wenn sie rRNAs auf einmal synthetisiert.

Transpeptidierung erfordert den nucleophilen Angriff der Aminogruppe der Aminoacyl-{RNA auf den Carbonylkohlenstoff der Peptidyl-{RNA. Wenn der pH-Wert ansteigt, wird die Aminogruppe nucleophiler (weniger wahrscheinlich, dass sie protoniert wird).

(b) Wenn

Ribosomen können doppelsträngige RNA nicht translatieren und somit verhindert die Bindung einer komplementären Antisense-RNA über Basenpaarungen die Translation. Nur neu synthetisierte bakterielle Peptide haben fMet an ihrem N-Terminus. Folglich kündet das Vorkommen von fMet in einem Säugersystem die Gegenwart eindringender Bakterien an. Leukocyten, die den fMet-Rest erkennen, können deshalb diese Bakterien durch Phagocytose bekämpfen. 10. Prokaryotische

Ribosomen können ein Start-Codon auswählen, das irgendwo auf dem mRNA-Molekül sitzt, solange es stromabwärts der Shine-Dalgarno-Sequenz liegt. Im Gegensatz dazu wählen eukaryotische Ribosomen normalerweise das AUG aus, das am nächsten zum 5‘-Ende der mRNA ist. Deshalb können eukaryotische Ribosomen eine Translationsinitiationsstelle auf einer ringförmigen mRNA nicht erkennen.

erwartet binden korrekt beladene tRNA-Moleküle (Ala-tRNA”® und GlIn-tRNA“") mit annähernd gleicher Affinität, deshalb werden sie mit gleicher Effizienz an die A-Stelle des Ribosoms geliefert. Die falsch beladene Ala-tRNA“" bindet an EF-Tu sehr viel lockerer, was zeigt, dass sie sich von EF-Tu ablösen kann, bevor sie das Ribosom erreicht. Die falsch beladene GIn-tRNA”"” bindet an

NE Wie

der pH-Wert steigt, ist es weniger wahrschein-

lich, dass der Rest A2486 protoniert wird und er stabilisiert deshalb mit geringerer Wahrscheinlichkeit das negativ geladene Oxyanion des tetraedrischen Reaktionszwischenprodukts. Der vorgeschlagene Mechanismus widerspricht somit dem beobachteten Effekt. 158 Das Enzym hydrolysiert Peptidyl-t*RNA-Moleküle, die sich

von einem Ribosom ablösen, bevor die normale Translation beendet wird. Weil die Peptidsynthese vorzeitig angehalten wird, ist das resultierende Polypetid -— das immer noch mit der tRNA verbunden ist — wahrscheinlich nicht funktionsfähig. Die Peptidyl-tRNA-Hydrolase ist für die Wiederverwertung der Aminosäuren und der tRNA nötig. 16. Die Aminoacylierung

geschieht über die Pyrophosphatspaltung von ATP, und somit erfordert die Aminoacylierung von 100 tRNA-Molekülen 200 ATP-Äquivalente; die Initiation der Translation erfordert 1 GTP (1 ATP-Äquivalent); 99 Elongationscyclen benötigen 99 GTP (99 ATPÄquivalente) für die Tätigkeit des EF-Tu; 99 ribosomale Translokationscyclen erfordern 99 GTP (99 ATP-Äquivalente) für die Arbeit des EF-G; und die Termination der Translation benötigt 1 GTP (1ATP-Äquivalent); das ergibt einen Gesamtenergieaufwand von 200 +1+99 +99 + 1

= 400 ATP-Äquivalente.

1238

Lösungen zu den Aufgaben

ya

Start Lys dUG AAL

5’-AGGAGCUX,

nd

Pro CCX

6. In Eukaryoten findet Transkription im Kern und Translation im Cytoplasma statt. Dadurch sind die Ribosomen nie in Kontakt mit entstehender mRNA, was für den Attenuierungsprozess in Prokaryoten wichtig ist.

Ala GCX-

sie, sb)

Shine-Dalgarno-Sequenz.

3-10 G : U-Basenpaare

Die Leitpeptidsequenzdeletion von trpL würde die Sequenz 1 des Attenuators eliminieren. Dadurch entstünde eher die 2-3-Haarnadel als die 3 - 4-Terminationshaarnadel. Dadurch würde die Transkription auf das restliche trp-Operon ausgedehnt und könnte dann nur durch den trp-Repressor reguliert werden.

sind erlaubt

Gly

Thr

Glu

Asn

Ser

GGX

ACK

GAR

AAN

UCX oder AGE

STOPP UAA UAG-3’ UGA

Rot-Grün-Blindheit entsteht durch eine Mutation in einem X-Chromosom-gekoppelten Gen; Trägerinnen dieses Gens,

Kapitel 28

die nicht an der Rot-Grün-Blindheit

1. In E. coli kommen praktisch alle DNA-Sequenzen als einzelne Kopien vor, sodass im Renaturierungsprozess

ein-

fach jedes Fragment mit seinem Komplementärstrang wieder assoziiert. Im Gegensatz dazu enthält das menschliche Genom viele repetitive Sequenzen. Die vielen Fragmente mit diesen Sequenzen finden sich zur Assoziation (Renaturierung) viel schneller als die ebenfalls vorhandenen Einzel-DNA-Kopien, woraus eine biphase Renaturierungskurve resultiert.

2. Weil Gene, die Proteine mit verwandten Funktionen codieren, oft in Operons vorkommen, kann die Identifizierung eines oder mehrerer Gene eines Operons auf die Funktion der restlichen hinweisen. 3. (a) O, ist die primäre Repressorbindungsstelle, sodass der lac-Repressor ohne diese Sequenz nicht stabil an den Operator binden kann, und Repression nicht stattfinden kann. (b) O, und O; sind sekundäre Repressor-Bindungssequenzen. Fehlt eine, kann die andere noch funktionieren, wodurch nur wenig Repressoreffektivität verloren geht. (c) Fehlen sowohl O, als auch O;, kann der Repressor nur an O, binden. Das interferiert zwar teilweise mit der Transkription, reprimiert sie aber nicht so, als wenn eine DNA-Schleife gebildet wird (durch die kooperative lac-Repressorbindung an O, und eine der anderen Operatorsequenzen).

4. Fehlt B-Galactosidase (das Produkt des lacZ-Gens), wird Lactose nicht zum Induktor Allolactose umgewandelt. Folglich werden lac-Enzyme, einschließlich Galactosidpermease, nicht synthetisiert.

3. Da Operons im Gegensatz zu lac-Operons ihre Empfindlichkeit auf Glucoseabwesenheit beinhalten, ist der Defekt wahrscheinlich nicht im CAP-codierenden Gen. Wahrscheinlich liegt er im CAP-cAMP-bindenden Teil des lacOperons.

zu leiden scheinen,

haben ein Wildtyp-Gen und ein mutiertes Gen für diese Krankheit. Bei den Placentatieren, wozu auch der Menschen zählt, sind die Weibchen ein Mosaik aus Zellklonen, in denen nur eines der beiden X-Chromosomen transkriptionsaktiv ist. Bei Trägerinnen der Rot-Grün-Blindheit hat somit das transkriptionsaktive X-Chromosom in manchen dieser Klone das Wildtyp-Gen und in anderen das mutierte Gen. Der Netzhautklon des Wildtyps kann rotes von grünem Licht unterscheiden, der Klon mit dem mutierten Gen kann dies hingegen nicht. Offenbar sind diese Netzhautlone so klein, sodass ein dünner Lichtstrahl nötig ist,

um sie getrennt anzusprechen. |

Ä er NH

|

C—=0

Tea |

NH

l.

(CH3)4

„|

.Hs

CH;

CH;

Acetyllysin

Methyllysin

C

H>N

IN

N

CH; Methylarginin

Bei Acetyllysin wurde die kationische Seitenkette von Lys zu einer polaren, aber nichtgeladenen Seitenkette umgewandelt. Bei Methyliysin und Methylarginin maskiert die hydrophobe Methylgruppe teilweise die kationische Natur der Lys- oder Arg-Seitenkette. 10. Die Methylierung der Histone und der DNA erfordert S-

Adenosylmethionin (SAM), das nach Abgabe seiner Methylgruppe zu S-Adenosylhomocystein wird (Abb. 21.18). S-Adenosylhomocystein wird zu Methionin zurückverwandelt, der Vorstufe von SAM; dies geschieht in einer Reaktion, bei der die Methylgruppe vom Folsäurederivat Tetrahydrofolat zur Verfügung gestellt wird (THF; Abb. 21.18). Ist dieser Cofaktor knapp, so schränkt das die Bildung von SAM in der Zelle ein, was eine Untermethylierung der Histone und der DNA zur Folge hat.

R M DR E

Lösungen zu den Aufgaben u Das Produkt ist ein Citrullinrest (Abb. 21.9)

1239

Gen stillzulegen. (Im menschlichen Genom mit 3,2 X 10° Basenpaaren, kommt eine Sequenz mit 16 bp statistisch zumindest einmal vor.)

—N—-CH—CH | I (CH2s0 NH c EN O NH

16. Da es 65 V};-, 27 D- und 6 Ju-Segmente gibt, die zu einer

12 . Transkriptionsaktives Chromatin hat eine offenere Struktur aufgrund der Histonmodifikationen, die dazu beitra-

gen, dass die DNA für Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase sowie für Nucleasen zugänglicher ist.

codierenden Sequenz der variablen Region der schweren Kette zusammengesetzt werden können, kann die somatische Rekombination theoretisch 65 X 27 x 6 = 10.530 Gene für die schwere Kette generieren (die Verbindungsflexibilität würde diese Anzahl noch erhöhen). Da jedes Immunglobulinmolekül zwei identische schwere Ketten und zwei identische leichte Ketten enthält, wäre die mög-

liche Anzahl von Immunglobulinen 10.530 X 2000 = ca. 21 Millionen.

13: Eine Sequenz stromabwärts des Genpromotors (also inner-

halb der codierenden Region) könnte die Genexpression regulieren, wenn sie durch den passenden Transkriptionsfaktor erkannt würde und wenn auf diese Weise der entstehende DNA-Protein-Komplex die RNA-Polymerase zum Promotor rekrutieren würde.

17. Die unpräzise Verbindung der V-, D- und J-Segmente zusammen mit der Nucleotidergänzung oder -beseitigung an der Verbindungsstelle kann ein Stoppcodon generieren (was zu einem verkürzten und somit nicht funktionsfähigen Immunglobulin führt) oder eine Verschiebung im

14. Die Abbauempfindlichkeit der RNA in vivo ermöglicht es,

Leseraster hervorrufen (was zu einem fehlgefalteten und nicht funktionsfähigen Protein führt).

die

Genexpression

durch

die

Geschwindigkeit

des

mRNA-Abbaus zu steuern. Wäre mRNA sehr stabil, könnte sie weiter translatiert werden, auch wenn die Zelle das ent-

sprechende Protein gar nicht mehr braucht. 15% Ein 22-bp-Segment der RNA, das alle vier Nucleotide ent-

hält, hat 4°? oder 1,8 x 10'° mögliche einmalige Sequenzen. Eine halb so lange RNA hätte nur 4'! oder 4,2 x 10° mögliche Sequenzen. Je kürzer die siRNA, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie mit mehr als nur einer komplementären mRNA hybridisieren kann, dadurch wird sie weniger brauchbar, um ein spezifisches

18. Bei Vielzellern minimiert der programmierte

Zelltod beschädigter Zellen den Schaden für den Gesamtorganismus. Bei einem Einzeller ist das Überleben einer genetisch beschädigten Zelle im Darwin’schen Sinne dem Tod vorzuziehen.

19% Das esc-Gen ist offensichtlich

ein maternales Effektgen. Deshalb reicht die richtige Verteilung seines Genprodukts im befruchteten Ei, die maternal spezifiziert ist, aus, um eine normale Embryonalentwicklung zu erlauben, unabhängig von Genotyp des Embryos.

Sachregister A-Stelle, siehe Aminoacyl-Stelle ABO-Blutgruppenantigene 265 ABC-Transporter 343 ff. abgeschlossenes System 19 abortive Initiation 1016 absolute Konfiguration 94 Absorption (A) 110 Absorptionsspektroskopie 110 Absorptionsspektrum 110 Absorptionsvermögen 110 Acetoacetat S1If. Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) 758f. — Isoformen 759 Acetyl-Coenzym A 617ft., 641 767, 819 — Hemmung der Pyruvat-Dehydrogenase 631 — Synthese 617ft. — Transport ins Cytosol 757 N-Acetyl-D-Glucosamin (GlcNAc) 255 N-Acetylmuraminsäure (NAM) 370, 372f. N-Formylmethionin (fMet) 1079 Acidose 40

Alkaptonurie

754

Acyl-CoA-Oxidation

816

Acyl-CoA-Synthetase 741 Acyl-Enzym-Zwischenprodukt Acylphosphat 504 Acylthioester 539

383f., 387

Adenosin-Desaminase (ADA) 907 Adenosindiphosphat (ADP) 48, 414

Adenosinribonucleotide 8I0f. Adenosintriphosphat (ATP) 47, 344, 414, 497 ff., 527f., 530, 545

S-Adenosylmethionin (SAM) 813, 815, 830 Adenylat-Cyclase (AC) 463, 467 — Signalsystem 470 Adenylierung 826 Adipocyt 274, 869 Adiponectin 869f. Adiponectinrezeptor 869 ADP/ATP-Translokator

— Aminosäurederivate in Proteinen

Konsequenzen

651

— Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten

— — — — —

686

88, 90 aromatische Aminosäuren Aspartat-Familie 829f. Biosynthese 636, 824 ff. Desaminierung 798 ff. Einteilung 87ff.

Lehrbuch der Biochemie. Zweite Auflage. Donald ]J. Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt

Cnnvricht

&

?2N1Nn WIITEVUVUFrLI

Varlan

ImAhLI

97ff.

— biologisch aktive Aminosäurederivate 99 Aminosäuren 85ff. — Abbau 807ff. — Aminosäuren mit geladenen polaren Seitenketten 89, 91 — Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten 89, 91

Adrenalin 443, 596 ff., S64f. adrenerger Rezeptor 443f. a-adrenerger Rezeptor 597 B-adrenerger Rezeptor 597 adrenocortikale Steroide 444 aerober Stoffwechsel, physiologische

D.tı

VIA

\acaha:.,

832f.

835 ff.

868 f., 880

822

361 allgemeine Säurekatalyse 361 allgemeiner Transkriptionsfaktor (engl.: general transcription factor, GTF) 1028, 1031 Allopurinol 909, 912 allosterische Kontrolle 495 allosterische Wechselwirkung 212 allosterischer Effektor 419 Alloxanthin 910 alternatives Spleißen 65, 1040 Alzheimer-Krankheit 188, 688 Ames-Test 987 Amine 840 Aminoacyl-Stelle 1060, 1063, 1066, 1068 ff. Aminoacyl-t*RNA 1062 Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) 1062 — Klasse I- Aminoacyl-tRNA-Synthetase 1063 — Klasse II-Aminoacyl-tRNA-Synthetase 1063 — Unterschiede der zwei aaRS-Klassen 1063 a-Aminosäure 86f. Aminosäurederivate 97 ff.

783

827f.

— Metabolismus 793 f£ — Nomenklatur 93 — Produkte des Aminosäurestoffwechsels

— Pyruvat-Familie 831 — Säure-Base-Eigenschaften 92 — Stereochemie 94 — Struktur 85 ff. — Umwandlung in eine Ketosäure 801 — verzweigtkettige Aminosäuren 816ff. Aminozucker 247 Ammonifizierung 847 AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK) 759,

allgemeine Basenkatalyse

Acyclovir 912 Acyl-Carrier-Protein (ACP) 759f. Acyl-CoA:Cholesterin-Acyl-Transferase

(ACAT)

s

Alkohol-Dehydrogenase 550f. alkoholische Gärung 353, 546, 548 ff. Alkylacylglycerophospholipid 773 — Biosynthese 773 Allantoin 909 Allel 73

Aconitase 625 Actin 220, 222, 680 a-Actinin 223

Acyl-CoA-Oxidase

— Glutamat-Familie

Affinitätschromatographie 115 Affinitätsmarkierung 378 Agonist 444 Ahornsirupkrankheit 818 Aktionspotential 331 aktiver Transport 303, 324, 339, 345 aktives Zentrum 354, 378, 388 Akzeptorstamm 1060 Alditol 247 Aldolase 533 ff. Aldolspaltung 533f. Aldonsäure 246 Aldose 242f. Alkalose 40

a

A-DNA 919, 920, 924 — Struktur 921.

— Regulation der Aktivität 869 amphiboler Stoffwechselweg 635 amphiphile Verbindungen 31 Amyloid 187 Amyloidfibrille 190ff. Amyloidose 187 Amylose 254f. Anabolika 445 Anabolismus 485 Anämie

214

Anaerobier 486 anaplerotische Reaktion 636 Androgen 281, 444 Angelman-Syndrom (AS) 1135 Angina pectoris 841 Anionenaustauscher 113 Ankyrin 300f. Annealing 934 Anomer

245

anomerer Kohlenstoff Antagonist

244

444

Antennenchlorophyli 695 Antibiotika 261, 933, 1092 Anticodon 1046, 1055 Anticodonarm 1061 Antifolat 906 Antigen 110, 229 Antigen-Antikörper-Bindung 231 Antikörper 110, 229 ff. — Klassen 230 — konstante Region 231 — Struktur 229 — variable Region 231 Antikörpervielfalt 1146 ff. Antioxidans 688f. antiparallele Helix 51 antiparalleles ß-Faltblatt 149£. Antiport 339 antisense-RNA 1142 antisense-Strang, siehe nicht codierender Strang AP-Endonuclease 989 AP-Stelle

989

apikale Domäne

303

2N E T A ge NE

Sachregister Apoenzym 358 apolare Gruppe 31

Barr-Körperchen

Apolipoprotein 736f. Apoprotein, siehe Apolipoprotein Apoptose 1155 ff. — extrinsischer Weg 1157 — intrinsischer Weg 1156 Appetit 867 ff. Aptamer 1122 Aquaporin 335f. Äquivalenzpunkt 39 Arachidonsäure 285f. Arbeit 13 Archaebakterien 10

Base-flipping 988 Basen-Excisionsreparatur (BER)

Base

Basenstapelungsinteraktion 936 basische Helix-Loop-Helix (bHLH) basische Lösung 34 basolaterale Domäne 303 Beriberi 549

806 aromatische Aminosäuren 832 Arsenvergiftung 623 Arteriosklerose 786 Arzneimittel — Nebenwirkungen 431 — Wechselwirkungen 432 Arzneistoffentwicklung (Drug Design) Aspartam 251, 822

Struktur

biochemische Reaktion

427 ff.

602

675

ATP-Synthese ATPase

672

184, 219, 339 ff., 347

Attenuator 1120f. Attenuierung 1120f. Ausgangskanal 670 Aussalz-Effekt 112 Auswahlfilter 328f. autokatalytische Reaktion 388 Autoimmunkrankheit 234 autoinhibierendes Segment 468 autonome Replikationssequenz (ARS) Autophosphorylierung 448 Autoradiogramm 116 Autoradiographie 72, 398 autotroph 486

B-DNA

918, 920f., 932

— Struktur B-Zelle

921ff.

229

Bacillus anthraciıs Bacitracin Bacteria

478

599 10

Bacteriophaeophytin 700f. Bacteriorhodopsin 292f., 660 Bakterienzellwand

Bakteriophage

259 ff.

57, 945

784, 950

980

Biomoleküle 25, 45 Biopterin 821 Biotin 600 Bioverfügbarkeit 429 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG) 2,3-Bisphosphoglycerat 543 Bisphosphoglycerat-Mutase 543 Bisubstratreaktionen 407 ff. black box 407 Blastoderm 1158 Blut 39 — Puffersystem 40 Blut-Hirn-Schranke 429

742

Carotinoide Carrier

21, 25

Blutgerinnungskaskade 389f. Blutglucosespiegel 874 Bohr-Effekt 209f. Boltzmann-Konstante (kz) 14f., 406 bovine spongiforme Encephalophathie (BSE), siehe Rinderwahnsinn Bradford-Assay 110 braunes Fettgewebe 684 Bromodomäne 1129f. Bronsted-Lowry-Definition 35

697

325

Caspase 1155£. Catecholamin 840 Cathepsin 794 Caveole 304 Caveolin 304 CCAAT-Box

1027

Cdk-aktivierende Kinase (CAK) cDNA-Bibliothek 72 Cellulase 253 Cellulose 252 ff. Centromer

538f.

1118

Carbamoylphosphat 805 Carbamoylphosphat-Synthetase (CPS) 805 2-Carboxyarabinitol-1-phosphat (CA1P) 721f. Carcinogen 987 Carnitin

biochemische Signale 439 ff. Biofilm 257 Bioinformatik 169 ff.

1150

1111

Ceramid 278, 775 Cerebrosid 278, 774 chaotropes Agens 179 Chaperonin 184ff. Chargaff-Regeln 50 chemiosmotische Theorie 671ff. chemische Evolution 4ff. chemische Kinetik 396f. chemische Mutagenese 984 ff. chemische Reaktionen 25 chemisches Gleichgewicht 17ff. chemisches Potential 17, 323 chemolithotroph 486 Chimär 68 chirales Zentrum 94 Chiralität 94 Chitin 253 Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) 1135

Cahn-Ingold-Prelog-System, siehe RS-System Calmodulin (CaM) 473, 593 — Struktur 473f. Calvin-Cyclus 715 ff. — Kontrolle 721f. — Stufen des Calvin-Cyclus 717 CAM-Pflanzen 726

Chlorophyll 695f. Chloroplast 9, 11£., 694 ff., 724 — Aufbau 694 Chloroplasten-ATP-Synthase (CFACFo-Komplex) 714 Cholesterin 280, 779 ff. — anormaler Cholesterintransport 786 — Biosynthese 779ff. — Stoffwechsel 779 ff. — Verwendung 783 Chromatin 951, 954, 956 Chromatin umgestaltender Komplex 1124 Chromatographie 112, 940 ff. Chromodomäne 1131 Chromophor 110 Chromosom 52, 951 Chromosomenstruktur 950 ff. chronische myeloische leukämie (CML) 459 Chylomikron 735f. Chylomikronrestkörper 737 cis-Golgi-Netz (CGN) 308

cAMP

Cistron

c

C-Terminus C,-Pflanzen C,-Pflanzen C-Wert

b

cAMP-Rezeptorprotein (CRP) Capping 983

989

Beugungsmuster 159 B-Beule 156 Beulenpest 461 Bicarbonat 40 Bilirubin 838f. bimolekulare Reaktion 397 Bindungstyp 28 Bindungswechsel-Mechanismus 676f. biochemische Konventionen 14

Aspartat-Transcarbamoylase (ATCase) 419ff., 893 — strukturelle Grundlage der Allosterie 422 — Substratbindungsstelle 421 Aspirin 776 Atemnot-Syndrom 276 Atmen, Proteine 177 ATP-Massenwirkungskoeffizient 683 ATP-Synthase 670, 673 —

cAMP-abhängige Proteinkinase (cAPK), siehe Proteinkinase A

35£., 38, 47

Basenpaar 51 Basenpaarung 935

Arginase 806 Argininosuccinase

Aspartat 829 Aspartat-Aminotransferase-Weg

1124

1241

87 726 725£.

1106

C-Wert-Paradoxon

Ca’*-ATPase

1106

341, 343 ff.

463, 592, 759

1013

1242

_Sachregister

Citrat-Synthase

622 ff.

— Konformationsänderungen 624 — Reaktionsmechanismus 625 Citratcyclus

— — — —

613ff., 648, 686, 854

amphibole Funktionen 635 Enzyme 622ff. Evolution 638 geschwindigkeitsbestimmende Enzyme

— Historie

616

— mit dem Glyoxylatcyclus gemeinsame Schritte 639 ff. — Reaktionen 615 — Regulation 630ff.

— Überblick 614 — verbundene Reaktionen Clathrin 310ff. Clathrin-umhüllte Vesikel Cl-Kanal

D-Arm 1060 D-Kanal 670 Dansylchlorid

Cofaktor 357£. Coffein 471 Cointegrat 1004 Colipase 733 Connexin 336f.

Basenzusammensetzung

346

777 777

Cross-Talk

455, 470 668

Cyanbromid

123f.

Desoxyribonucleotid 46, 897 ff. — Synthese 897 Desoxyzucker 247 Diabetes mellitus 875, 877 ft. -— Typen 875 — Ursachen 877 Dialyse 33 diazotroph 842 dickes Filament 218f., 225 Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) diedrische Symmetrie 174

Digitoxin

215

Cyclin 1150 cyclinabhängige Proteinkinase (engl.: cyclin-

dependent protein kinase, Cdk) cyclische Symmetrie

52, 920f.

Diffusion 32£. diffusionskontrollierte Grenze Digitalis _342

994

Cu,-Zentrum

Cyanose

189f.

1150

174

cyclischer Elektronentransport 714 Cyclooxygenase 776 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) 344

931, 933 918 ff.

69, 964, 974

— Aktivierung durch NAD* und ATP 974 — Reaktionsmechanismus 975 1132 DNA-Methyltransferase (DNA-MTase) DNA-Microarray 517f. DNA-Photolyase 983 DNA-Polymerase 60, 962, 965, 968, 977 ff. — DNA-Polymerase I (Pol I) 965f. —- DNA-Polymerase II (Pol II) 969 - DNA-Polymerase III (Pol III) 969 — Eigenschaften

970, 977

— eukaryotische DNA-Polymerasen 977 — Katalysemechanismus 969 DNA-Protein-Wechselwirkungen 943 ff. DNA-Reparatur 9I61ff., 988 ff. DNA-Replikation 961 ff. — Genauigkeit 976 - in Eukaryoten 976ff.

- Überblick

897,

901

504

34, 36f.

- in Prokaryoten 965 ff. "— Replikationsbeginn 980 — Termination 975

50

986

Desoxyribonucleosiddiphosphat (dNDP)

Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJK) Cristae 649 crossing-over

DNA-Methylierung Flexibilität 924f. Geometrie 918f. Schäden 983

— Struktur

COX-3 777 Coxib 777 CpG-Insel 1107. CPSF (Spaltungs- und Polyadenylierungsspezifitätsfaktor, engl.: cleavage and polyadenylation specificity factor) 1033 Creatin-Kinase

109, 934

Denitrifizierung 847 Dephosphorylierung 425 Depolarisierung 331 Desaminierung 793, 798 Desaturase 764 Desensitivierung 465 Desoxyhämoglobin 210ff., 216 Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) 60f., 505 Desoxyribonucleinsäure (DNA) 44, 46, 54, 917 — — — —

Connexon 337 Corepressor 1120 Cori-Cyclus 861 Corrinring 751

COX-1

DNA-Gyrase

121f. Datenbank 63, 127 ff. degenerierter Code 1054 Deletionsmutation 984, 986, 1055 Denaturierung

29

Disulfidbindung 128, 180 DNA-Amplifikation 74 DNA-Bindungsmotiv 947f. DNA-Datenbank 63 DNA-Glykosylase 989 DNA-Helix

738

Coenzym A 488, 506 Coenzym Q 653, 658, 660, 665

Cotransport

Dissoziationskonstante

DNA-Ligase

codierender Strang, siehe Sinnstrang Codon 1054. Codon-Anticodon-Wechselwirkung 1067, 1085 Coenzym 357f., 487, 512 — Coenzyme des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes 618

357f.

dipolares Ion, siehe Zwitterion Dipol-Dipol-Wechselwirkungen Disaccharid 249 ff.

9 9

d

334

COoX-2

Cytoplasma Cytoskelett Cytosol 9

87

diploid 52

Cytokin 457, 1138

634

CO,-Fixierung 718 Coatamer 310

Cosubstrat

Dipeptid

cystische Fibrose 64 Cytidintriphosphat (CTP) 420 ff. Cytochrom a 668 Cytochrom bs74 661 Cytochrom c 130ff., 667 Cytochrom c-Oxidase, siehe Komplex IV der Elektronentransportkette 632 ff. Cytochrom P450 431ff. Cytochrome 662f., 702, 709

61f.

962 ff.

DNA-Schleifen 955 Dolichol 607£. Dolicholpyrophosphat 607 fk. Domäne 132, 136, 166 Doppelhelix 50ff. Dopgpelschicht 31f. - Struktur 32 Doppelstrangbruch 1001 Doppelverdrängungsreaktion 409 Down-Syndrom 188 Drosophila 1158 ff. — Entwicklung 1158 ff. Dunkelreaktion 694, 715 ff. dünnes Filament 226 dUTP-Diphosphohydrolase (dUTPase) Dystrophin 225

902

404 e

342

Dihydrofolat (DHF) 903 Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)

815, 903,

913

Dihydrolipomamid 620 Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) Dimer 50 2,4-Dinitrophenol (DNP) 682 Dinucleotid-Bindungsfalte, siehe Rossmann-Faltung

533

E-Stelle, siehe Exit-Stelle EC-Klassifizierung 355 Edman-Abbau 123ff. EF-Hand 474 effektorgesteuerter Kanal 330 Eicosanoide 285 Einsalzen 112 Einschlusskörper 108 Einzelnucleotidpolymorphismus (engl.: single nucleotide polymorphism, SNP) 1109

Sachregister Einzelstrang-Bindeprotein (engl.: single-strand binding protein, SSB) 971 Einzelverdrängungsreaktion 408 Eis 27 Eisen-Schwefel-Cluster 657, 659 Eisen-Schwefel-Protein 657 Eisen-Schwefel-Protein (engl.: iron sulfur

protein, ISP) 657, 664

elektrische Potentialdifferenz

509

Enzym

nn Elektro-Blot 942 nn

elektrochemische Zelle 509 elektrochemisches Potential 323 elektrogener Antiport 652 elektromotorische Kraft (EMK) 510 Elektronendichtekarte 160f. Elektronenkristallographie 293 Elektronentransport 546, 647 ff., 652 ff. — Aufklärung der Arbeitsweise 655 — Bakterieller Elektronentransport 674 — Reaktionsfolge 653 — Thermodynamik 652 ff. Elektronentransportsystem 702f. elektronische Komplementarität 356 Elektrosprayionisierung (ESI) 124, 126 elektrostatische Katalyse 367 elektrostatische Wechselwirkungen 175 Elementarreaktion 396 Elongase 764 Elongation 1032 — Bindungsphasen im Elongationscyclus — Transkriptionsfaktor 1032 Elongationsfaktor (EF) 1084 ff., 1089. Eluent 113 Elution 114f. emergente Eigenschaft 480

221

3’-Ende

50

5'’-Ende

50

endergon 16 Endgruppenanalyse 121 Endiolzwischenprodukt 534 Endocytose 304, 311 Endoglykosidase 249 endokrines System 440 Endonuclease 58, 927 Endopeptidase 122 endoplasmatisches Reticulum (ER) Endosom 317, 738 Endosymbiontentheorie 12 endotoxischer Schock 842 energetische Kopplung 670 Energiefluss 20f. energiereiche Verbindungen

Enzymkinetik Enzymologie 1091

9, 300

497 ff.

867 ff. 860

- hormonelle Kontrolle des Metabolismus der

862

F,-Komponente

368

395 ff., 399 ff. 353

Enzymsättigung

Energiestoffwechsel der Säuger 853 ff. — hormonelle Kontrolle 862 ff.

Energieträger

Fo-Komponente 675, 685 — Untereinheiten 675

21

Übergangszustands

Epimer

147ff., 156, 164, 180, 946, 948

Fab-Fragment 230 ff. Faltungstrichter 181 familiäre Hypercholesterinämie (FH) Faraday 510 a/ß-Fass 166, 168, 537, 751f. ß-Fass

400

166, 168, 291, 293, 326

992

— Mechanismus 992 Fe-Mo-Cofaktor 844 [4Fe-4S]-Eisen-Schwefel-Cluster Fenfluramin (Fen) 430

Fett

625

711f., 844

722

274

Fettgewebe

856, 858 Fettleibigkeit 879f. Fettsäure-Synthase 759, 762

Erhaltungsmethylierung 1133 Erkennungsvorgänge 264 erleichterte Diffusion 302 Ernährungsstrategie 486 Erythroblast 837 Erythrocyt 209, 301 Erythrocyten-Geist 299 ES-Komples, siehe Michaelis-Komplex essentielle Aminosäuren 824 — Biosynthese 829 ff. essentielle Fettsäure 765 Euchromatin 1123 Eukarya 10 Eukaryot 8&ff. Evolution 11ff.

— Struktur

- Oxidation 745, 740ff., 769 - Oxidation ungeradzahliger Fettsäuren - Oxidation ungesättigter Fettsäuren — Sättigung 272

— Transport durch die Mitochondrienmembran 742 Fettsäurestoffwechsel 768 ff.

— kurzfristige Regulation — langfristige Regulation — Regulation Fibrin

249 441

Exon-junction protein complex (EJC) Exon-Skipping 1037 Exon-Spleiß-Enhancer (ESE) 1042 Exon-Spleiß-Silencer (ESS) 1042

Exonuclease 58 Exonucleaseaktivität 965 Exopeptidase 122 Expressionsvektor 76 Exprimierte Sequenz Tag (EST)

110

1107

763

Fettsäurebiosynthese 636, 756ff., 761, 769 — Hemmstoff 764 Fettsäuren 272, 767 — Aktivierung 741 — Doppelbindungen 273

exergon 16, 745 Exit-Stelle 1074 Exocytose 313

Extinktionskoeffizient

787

Fc-Fragment 230f. Feedback-Hemmung 419 Fehlpaarungsreparatur (engl.: mismatch repair,

Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase

242

Exoglykosidase exokrine Drüse Exon 1034

ß-Faltblatt

MMR)

110

675, 685

— Untereinheiten 675 — Symmetrie 675 F,Fo-ATPase 673 ff. — Modell 678 o-Faktor 1012, 1015

Ferredoxin

403

Enzym-Substrat-Komplex Epigenetik 1133

454

f

— kovalente katalyse 364 — Säure-Base-Katalyse 361 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) Enzymhemmung 395, 409 ff.

Energiestoffwechsel 731 — Störungen 873ff.

— Regulation Energieträger

extrazellulär signalregulierte Kinase (ERK) extrinsisches System 389f.

— EC-Klassifizierung 355 — Enzymaktivität 402 Eigenschaften 354f. — Nomenklatur 355 Regulation der Enzymaktivität 395, 419 ff. — Synonym 355 — systematischer Name 355 enzymatische Katalyse 353 ff. — Abhängigkeit vom pH-Wert 364 — Katalyse durch Nachbargruppen- und Orientierungseffekte 367 — Katalyse durch Stabilisierung des

Enantiomer 94 (+)-Ende 221

()-Ende

Enhanceosom 1136 Enhancer 1027, 1135 Enolase 542f. Enthalpie 14 Entkoppler 682, 684 Entropie 15 Entzweigungsenzym (engl.: debranching enzyme) 254

1243

1143

770 770

768ff.

389f.

Fibrinogen 136 Filament 219 Fischer-Konvention 95 Fischer-Projektion 95 Flavinadenindinucleotid (FAD) 507f. — prosthetische Gruppe der SuccinatDehydrogenase 629 Flavinmononucleotid (FMN) 657 ff. Fließgleichgewicht 20, 401, 494 Flippase 302 Flip-Flop, siehe Transversaldiffusion

Fluidität 288, 731 Fluoreszenz 699

748 748

1244

_ Sachregister

Fluoreszenzregenerierung nach Bleichen mit Licht (FRAP) 297£. Fluorophor 297 Fluss 338, 494 flüssiger Kristall 288 Flüssig-Mosaik-Modell 296 Folgestrang 964, 972 Folgesubstrat 408 Folsäure 815

Footprinting

1014

Fraktionierungsverfahren 111 Freie Aktivierungsenthalpie 359f., 369 Freie Enthalpie 16f., 21, 369, 500 ff., 633 freies Radikal

653

Freisetzungsfaktor (engl.: release factor, RF) 1092

Fructose

— Stoffwechsel 558ff. Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) 532, 603 Fructose-1,6-Bisphosphatase (FBPase) 556, 603 Fructose-2,6-bisphosphat (F2,6P) 604 Fructoseunverträglichkeit 559 Fumarase (Fumarat-Hydratase) 629 Fumarat

5, 22, 30

Furanose 244 Fusion 298

Fusionspeptid

317

Fusionsprotein

314

8 G-Protein

452f.

G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) — Struktur 464

G-Quartett

463

982

Gehirn

54

Gen-Knockout 79 Gencluster 1109E. Genduplikation 133f. genetische Antizipation 1012 genetische Prägung 1134

1057 ff.

57

361

— Regulation 1105 ff. — Regulation der eukaryotischen Genexpression 1123ff. — Regulation der prokaryotischen Genexpression 1114ff. Genom 52, 56, 63 ff. - Organisation 1105 ff. Genombibliothek 70ff. Genomik 56, 516, 1105 Gentechnik 67 Gentherapie 79 geometrische Komplementarität 356 geometrische Spezifität 356 geordneter Mechanismus 408

Geschlechtshormone 445 geschlossenes System 19 Geschmacksempfindung 84 Geschwindigkeit (v) 396, 400 geschwindigkeitsbestimmender Schritt Geschwindigkeitserhöhung 360 Geschwindigkeitsgleichung 397 Geschwindigkeitskonstante (k) 396

360

931

16

909

— allosterische Effektoren 605 — Regulation 603 Glucose 862 Glucose-Alanin-Cyclus 861. Glucose-Fettsäure-Cyclus 686 Glucose-Katabolismus 525 ff. Glucose-6-phosphat 859 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

336, 347, 868 583

- GLUT4

863f., 868,

(GAPDH)

864, 874

415,

- GLUT1 - GLUT2

Glutamat 827f., 847 Glutamat-Dehydrogenase (GDH) 636, 802 Glutaminase 812 Glutathion 100, 570 Glutathion-Peroxidase 570 Glutathion-Reduktase 570 Glycerin-3-phosphat-Shuttle 651 Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

1141

glatte Enden 59 Gleichgewicht 16 Gleichgewichtskonstante 18 gleichgewichtsnahe Reaktion 493 Gleitfasermodell 219, 222 Globin 134f. Globosid 778 Glucagon 596, 865 Glucocorticoid 281, 444 Glucocorticoid-Response-Element (GRE) 1141 glucogene Aminosäuren 808 Glucokinase 529, 558, 858 — regulatorisches Protein für die Glucokinase 859 Gluconeogenese 527, 575 ff., 598 ff., 635, 854,

855f.

417f.

men

531f.

Glucosestoffwechsel 578 - Kontrolle 590ff. Glucosetransport 345 Glucosetransporter 336

— posttranskriptionale Kontrollmechanis-

Gicht

gekoppelte enzymatische Reaktion 109 gekoppelte Reaktionen 500 Gelbsucht 838 Gelelektrophorese 59 Gelfiltrationschromatograhie 114 gemischte (nicht-kompetitive) Hemmung Gen

Genexpression

Ghrelin 871 Gibbs’sche Freie Energie

1160

Gap junction 336f. Gärung 546 — Energiebilanz 551 Gastrulation 1158 gebogener-Pfeil-Konvention

— Evolution 1059 — Natur des genetischen Codes genetischer Fingerabdruck 73

gesteuerter Rotationsmechanismus GH-Rezeptor (GHR) 446

Gabelwanderung 995 Galactitol 561£. Galactosämie 561 Galactose — Stoffwechsel . 560 ff. Gallensäure 732, 734 Ganghöhe 147 Gangliosid 279, 774 Gap-Gen

Glucosephosphat-Isomerase

1053 ff.

Gerüstprotein 455 Gesamtquantenausbeute 702 gesättigte Fettsäuren 273

821

funktionelle Gruppe

genetischer Code

— Degeneration 1054 — Erweiterung 1069

— Übersicht

570

538ff.

— Enzymmechanismus 540 Glycerolipid 770 Glyceroneogenese 765 Glycerophospholipid 275 ff., 771£f. — Biosynthese 771ff. Glykan 249 Glykoform 264 Glykogen 254, 856 — Abbau 576ff. — Struktur 577 — Strukturoptimierung 589f. — Synthese 585 ff. — Verzweigung 589 Glykogen-Entzweigungsenzym (engl.: glycogen debranching enzyme) 581 -Glykogen-Phosphorylase 560, 577 ff. — allosterische Kontrolle 581 — Konformationsänderungen 579 — kovalente Modifikation 591 — Reaktionsmechanismus 580 Glykogen-Synthase 586ff., 594 — allosterische Kontrolle 590 — kovalente Modifikation 591 Glykogen-Verzweigungsenzym (engl.: glycogen branching enzyme) 588 Glykogenin 588 Glykogenolyse 577, 864 Glykogenspeicherkrankheit 583f. Glykogenstoffwechsel 575 ff. — hormonelle Einflüsse 596 - Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungssysteme 595 Glykogensynthase-Kinase 3ß (GSK3ß) 598 Glykokonjugat 265 Glykolat 723 Glykolipid 247 Glykolyse 492, 525, 648, 686, 854 — Kontrolle 552 ff. — Reaktionsschritte 529 ff.

527f., 538

- Verbindung zum Pentosephosphatweg Glykomik 258 Glykophorin A 290f. Glykoprotein 247, 257 ff. Glykosaminoglykan 255 £. Glykosid 247

569

ee

Sachregister glykosidische Bindung 247f. Glykosylierung 262 Glykosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) 295 Glykosyltransferase 262 Glyoxylatcyclus 635, 639 - mit dem Citratcyclus gemeinsame Schritte

— Regulation

807 Haworth-Projektion 244f. helicale Windungszahl 927 Helicase 970 a-Helix 147ff., 156, 164, 180, 290f., 924 Helix-Capping 158 Helix-Turn-Helix(HTH)-Motiv 944 Henderson-Hasselbalch-Gleichung 37 Heptadische Wiederholung 949 Herzglykoside 342 Herzinfarkt 687 Herzmuskel 858 Heterochromatin 1123 Heterochromatin-Protein 1(HP1) 1132 heterogene nucleäre RNA (hnRNA) 1034 heterologe DNA 995 heterolytische Spaltung 752 Heteropolysaccharid 249 heterotrimeres G-Protein 463, 465f. — Struktur 466 heterotroph 486 heterozygot 214

639 ff.

— Reaktionen 640 Glyoxysom 639 Golgi-Apparat 9 Golgi-Netz

- cis (CGN) 308 - trans (TGN) 308 gramnegativ 259 grampositiv 259 Granathylakoid 694 Grauer Star 878 Greek key motif 165 Grenzflächenaktivierung 733 große Furche S1f. grün fluoreszierendes Protein (GFP)

98f. Grundumsatz-Thermogenese 684 grüne Schwefelbakterien 711 GTPase-aktivierendes Protein (GAP) 453 Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor (engl.: guanine nucleotide exchange factor,

GEF)

Hexokinase

452

Histidin

Guanosinribonucleotide

890f.

243

Halbwertszeit (t,.) Halbreaktion 501 Halbzelle 509 Halobakterien 10 Häm a Häm b Häm c

397

HIV)

978

HIV-Enzyminhibitoren HIV-Protease 416f.

416f.

663

HMG-CoA

663

HMG-CoA-Reduktase 783 — Hemmung 785 HMG-Protein (engl.: high mobility group,

663

Hämabbau 835, 838f. Hämagglutinin (HA) 316 Hämbiosynthese 835f. — Regulation 837 Hämgruppe 198, 662f. Hämin

833f.

Histon 951f., 953f. — kovalente Modifikation 1126 Histon-Acetyltransferase (HAT) 1128 Histon-Code 1128 Histon-Deacetylase (HDAC) 1131 Histon-Methyltransferase (HMT) 1131 Hitzeschock-Protein (Hsp) 184 HIV (engl.: human immunodeficiency virus,

h Haarnadelstruktur 54, 165 Haber-Bosch-Verfahren 846 Halbacetal 243 Halbketal

501f., 529£.

Hilfspigment 697 Hill-Gleichung 204 Hill-Koeffizient 204, 214 His-Tag 116, 679.

HMG)

Hämoglobin

HPLC)

938

173, 198, 423

— — —

anomale Hämoglobinformen 214 fetales Hämoglobin 212 Mechanismus der kooperativen Bindung Sauerstoffbindungskurve 204

—

Struktur

201ff.

hämolytische Anämie 214 hämregulierter Inhibitor (HRI) haploid 53 Harnsäure 803, 886 — Stoffwechsel 909 Harnstoff 806 Harnstoffeyclus 803 ff. — Reaktionen 804 ff.

1126

1145

206

113

hochrepetitive DNA-Sequenz (engl.: short tandem repeat, STR) Höhenanpassug 211 Holliday-Junction 995, 998, 1000 — Röntgenstruktur 996, 998 Holoenzym 358, 1012 Homocitrat 844 Homocystein 813ff. Homocysteinurie

814

homologe Rekombination 1000f. homologes Protein 130 homology modeling 182 homolytische Spaltung 752 Homöodomäne 1163 Homöostase

homöotisches Gen 1162 Homopolysaccharid 249 homozygot 215 Hoogsteen-Geometrie

441, 862

1111

935

Hormon 439ff. Hormon-Response-Element (HRE) hormonsensitive Lipase 740, 768 Hox-Gen

1140

1163

humanes Immundefizienz-Virus (HIV) — Behandlung 416f. humorale Immunität 229 Hungern 873f. Huntington-Krankheit 688 Hyaluronsäure 255 Hybridisierung 934 Hybridzellen 233 Hydratation 29 Hydratationswasser 29, 32 Hyddrolase 355 Hydrolyse 4, 800 hydrolytische Reaktionen 603 Hydroniumion 34 hydrophil 29 hydrophob 29 hydrophobe Chromatographie 113 hydrophober Effekt 30 hydrophober Kollaps 181 Hydrophobizität 175 Hydroxidion 34 Hydroxylapatit 940 Hyperammonämie

802

Hyperbolische Kurve 200 Hypercholesterinämie 785, 787 hyperchromer Effekt 934 Hyperglykämie 877 Hyperhomocysteinämie 814 Hyperlysinämie 820 Hyperlysinurie 820 hypervariable Sequenz 232 hypervariabler Rest 131 Hypoglykämie 560, 583 Hypophyse 281, 440 Hypoxanthin 886 Hypoxie

Hochdurchsatz-Screening-Techniken 428 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: high-performance liquid chromatography,

837

Hammerhead-Ribozym

780

1245

211

i I-Zell-Krankheit 313 Ibuprofen 97, 776 Imaginalscheibe 1158, 1160 Immunfluoreszenzmikroskopie 227 Immunglobulinfaltung 231 Immunoaffinitätschromatographie 115 Immunoassay

Immunoblot Immunsystem

109

116 229

in silico 520 Inaktivator 409, 418 Inaktivierungspeptid

333 indirektes Ablesen 946 induced fit 356, 943 Induktor 1115 induzierbares Enzym 1017 interkonvertierbares Enzym

591

416f.

1246

Sachregister

Inhibitionskonstante (K)) Inhibitor

20S-Kappe . 796. Kappenstruktur 1033 Kassettenexon 1040 Katabolismus 485, 489 Katabolitgen-Aktivierungsprotein (engl.: catabolite gene activator protein, CAP) 1113 Katabolitrepression 1118 Katalase 688f. Katalysator 21, 360, 939 Katalysemechanismen 361ff. katalytische Konstante (k,..) 403 katalytische Perfektion 537 katalytische Triade 381 katalytische Wirksamkeit 403 kataplerotische Reaktion 635 Kationenaustauscher 113 Kehre 151

A11ff.

409, 411ff.

Initiationsfaktoren (IF) 1080 Initiationskomplex 1081, 1083 Inosinmonophosphat (IMP) 887 — Synthese 887 ff. Inr-(Initiator-)Element 1026 Insertionssequenz, siehe IS-Element

Insertionsmutation

984, 986, 1055

Insulin 106, 597, 862 ff. — Entdeckung 876 Insulinresistenz 877 Insulinrezeptor 877 Insulinsignalsystem 476. integrales (intrinsisches) Protein Integrase

289

1004

interkalierende Agenzien 941, 986 Intermembranraum 649 interne Umwandlung 699 intrinsischer Faktor 748 intrinsisches System 389f. Intron

Kernenzym

resonance, NMR)

76, 1034, 1045 f., 1048

130

Ionenaustauschchromatographie Ionengradient 345 Ionenkanal 327, 330. — Steuerung 330ff. Ionenpaar

113

Kettenabbruchmethode Ketteninitiation 1078

Ionenpumpe 340f. Ionenselektivität 329 ionische Wechselwirkungen 27, 936 Ionophor 325 IS-Element 1002 isoakzeptierende tRNA 1095 Isocitrat-Dehydrogenase 626 — Reaktionsmechanismus 626 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 118 isoelektrischer Punkt (pl) 92, 112 Isoenzyme

424, 492

Isoform 424 Isolator 1138 Isomerase 308, 354f., 489 Isomerisierung

746

Isopeptidbindung 100, 795 Isopren 779f. Isoprenoide 283 Isoschizomer 81 isotopenmarkierte Affinitätsmarker Isotopenmarkierung 398

519

311

J Junk-DNA

1039, 1113

k Kanal 325, 327£. Kapillarelektrophorese (engl.: capillary electrophoresis, CE) 19S-Kappe 796£.

Kettentermination KFERQ-Proteine

503 Kinasekaskade

117

60

— anti-Konformation

1015 ff. 794

925

— C3’-endo-Konformation 925 — cis-Konformation 145 — syn-Konformation 924 — trans-Konformation . 145 konjugiertes Redoxpaar 509 konservative Replikation 961 konservative Substituierung 130 konservatives Protein

konstante Region Konstanten

451f., 454

130

231

14

965, 1086

456, 1151f.

BAC)

670

B-Klammer 972 klebriges Ende 59, 931

69

künstliche Hefechromosome (engl.: yeast artificial chromosome, YAC) künstliche Süßstoffe 251 kurze Sequenzwiederholung (engl.: short tandem repeats, STR) 73

kleine Furche 51f. Klenow-Fragment 967 klinische Prüfungen 429. Klonierungstechnik 57, 67 ft. Klonierungsvektor 68 Kohlenhydrate 241ff. — Biosynthesewege 605 Kohlenstoff — a-Kohlenstoff 86 — Oxidationszustände 490 Kollagen 153, 155 — Kollagenerkrankungen 154

Kv-Kanal

331ff.

Kynureninase

820

I L-Zustand 676f., 680 lac-Repressor 1114, 1117 — Struktur 1117 B-Lactamase Lactase

157

kolligative Eigenschaft 32 Kolonie-(in situ-)Hybridisierung 72 kombinatorische Chemie 428 Kompartimentierung 7 kompetitive Hemmung 410ff. kompetitiver Inhibitor 410 komplementäre Basenpaarung 51 komplementäre DNA (cDNA) 72 Komplementarität 6 Komplex I der Elektronentransportkette - Coenzyme 657f.

924f.

- C2’-endo-Konformation

Krebs

Kinase

K-Kanal

760

Konformation

— Antikrebsmedikamente 459 »Krebs-Cyclus, siehe Citratcyclus Kryoelektronenmikroskopie 1071f. künstliche Bakterienchromosome (engl.: bacterial artificial chromosome

1018

Kettenverlängerung

— Quervernetzung

Isozym, siehe Isoenzym

I-Zell-Krankheit

626f.

Ketosäure 801 Ketose 242, 244, 875

176

kondensierendes Enzym

konstitutives Enzym 1017 Konturlänge 950 konvergente Evolution 382 kooperative Bindung 204 Kooperativität 178 Körpergewicht 867. Korrekturlesen (engl.: proofreading) kovalente Katalyse 364f., 377 kovalente Modifikation 419, 496

162, 514

ketogene Aminosäuren 808 Ketogenese 755 a-Ketoglutarat 812f. a-Ketoglutarat-Dehydrogenase Ketonkörper 755f., 875

— Entdeckung 1036 — Introns der Gruppe I 1045f. — Introns der Gruppe II 1045 invarianter Rest

1012

Kern-Overhauser-Spektroskopie (engl.: nuclear Overhauser speciroscopy, NOESY) 162£. Kernspinresonanz (engl.: nuclear magnetic

e

Komplex II der Elektronentransportkette 661 ff. Komplex III der Elektronentransportkette 664. Komplex IV der Elektronentransportkette 667 ff. Kondensationsreaktion 4, 87

261

250

Lactat-Dehydrogenase (LDH) Lactose-Permease 345 ff. Lactoseintoleranz

250

Lactosesynthese 606 Lambert-Beer’sches Gesetz Lanosterin

657 ff.

547

110

782

lansame Faser 552 Lasso-Struktur 1035 Lateraldiffusion 287 LDL-Rezeptor 738 Leben 3ff.

— Ursprung des Lebens

3ff.

69

Sachregister Leber

856, 858

low-barrier hydrogen bond (LBHB) Lungen-Surfactant 275f.

Lectin 265 Leerlaufceyclus 556 Leitbündelscheidenzellen Leitsequenz

725

1120

Leitstrang

964, 972

Leitsubstrat 408 Leitverbindung 427 Leptin

870

Lesch-Nyhan-Syndrom

892

Leseraster 1054 Leucin-Zipper 949

Leucin-Zipper-Proteine mit basischer Region

(bZIP)

949

Leukocyt 265 lichtabsorbierende Pigmente 695 f. Lichtreaktion 694, 699 ff. Lichtsammelkomplex (engl.: light harvesting complex, LHC) 697f. Ligand 115, 200, 449 ligandgesteuerter Kanal 330 Ligase 355, 475 Ligation 69

limitierte Proteolyse 123 LINESs (engl.: long interspersed nuclear elements)

1005

Lineweaver-Burk-(doppelt-reziproke) Auftragung 405, 413, 415 Linker-DNA 952 linksdrehend 95 Lipiddoppelschicht 286 ff. — Beweglichkeit der Lipide 287 — Bildung 286 Lipide 271fk. — Absorption 732ff. — Asymmetrie

300

— biologische Funktionen

— Klassifizierung — Transport

271

272 ff.

732, 735

— Verdauung 732ff. Lipidfloß 303f. Lipidgebundene Proteine 294f. Lipidomik 520 Lipidspeicherkrankheit 776, 778 Lipidstoffwechsel 731ff. Lipogenese

868

Liponamid 620 Lipoprotein 735 Lipoprotein geringer Dichte (engl.: low density lipoprotein, LDL) 735, 737 f., 786, 788 — Rezeptormangel 787 Lipoprotein hoher Dichte (engl.: high density lipoprotein, HDL) 735, 740, 788 Lipoprotein mittlerer Dichte (engl.: intermediate density lipoprotein, IDL) 735, 737 Lipoprotein sehr geringer Dichte (engl.: very low density lipoprotein, VLDL) 735, 737, 860 Liposom

287

Lipoyliysyl-Arm 622 London-Dispersionskräfte 28 Lösungsmittel 28 Lotsen-RNA (engl.: guide, Lotse, gRNA) 1042

Lyase 475 Lymphocyt Lyse 259

385f.

229

Lysophospholipid 275 ff. Lysosom 9, 305, 311, 794 Lysozym 260, 370 ff. — Bedeutung der Spannung 376 — Enzymstruktur 370f. — Katalysemechanismus 374 — katalytisch aktive Reste 374 — Reaktionsmechanismus 375 — Schnittstelle 370 — Substratwechselwirkungen 373

1247

Michaelis-Komplex 401 Michaelis-Konstante (Ku) 401, 403 Michaelis-Menten-Gleichung 400, 403, 415 Mikrodomäne 304 Mikrofilament 227£. Mikroheterogenität 257 Mikronährstoff 486 Mikroradiographie 398

Mikro-RNA (miRNA)

1142

Milchsäuregärung 546f. Milzbrand 478 Mineralien 487£. Mineralocorticoid 281, 444 mitochondriale Matrix

649, 651

Mitochondriale Transportsysteme Mitochondrion

650f.

9, 11f., 724

m

— Struktur

Makronährstoff 486 Malaria 216£. Malat-Aspartat-Shuttle

mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK)

mittelrepetitive DNA-Sequenz 1113 Modifikationsmethyltransferase 58 molekulares Chaperon 183 ff. Molekulargewicht 14 Molekularität 396 Molekül-Dynamik-Simulation 287 Molekülgrafik-Programme 171 molten globule 181 monocistronische mRNA 1013 monoklonaler Antikörper 232f.

651 Malat-Dehydrogenase 630 Malat-Dehydrogenase-Weg 602 Malatenzym 753 maligner Tumor 456 maligne Transformation Maltoporin 326

456

Mannose

— Stoffwechsel 562 Manometrie 526 Massenspektrometrie 124, 377 maternaler Effektgene 1160f. Matize 52 mechanosensitiver Kanal 330 Mediator 1137 mehrprotonige Säure 39 Melanin 822 Membrananker 307 Membranlipide 770ff. — Synthese 770ff. Membranpotential 324 Membranproteine 289ff. Membranstruktur 296 ff. Membrantransport 323 ff. membranumhüllter Virus 314 Membranvesikel 7 Menachinon 700f. Mercaptan

—

Struktur

Monomer 50 Monooxygenase

431 Monosaccharide 241ff. — Einteilung 242 ff. — Konfiguration 243ff. - Konformation 243 ff. Monoubiquitinylierung 796 Morphogen 1161 ac-Motiv

32

165

Baß-Motiv

165

Motorprotein

226

Multidrug-Resistance-Transporter (MDR-Transporter)

343

Multienzymkomplex 617, 627 Multikomponentenprotein 117 multiples Myelom 232 Muskel 856 ff. Muskelkontraktion 217, 225, 857 — Mechanismus 225 — Kontrolle 227

121

Mesophylizellen 725 messenger-RNA (mRNA) 56, 1011 — Edierung 1042 — Prozessierung 1032 metabolisches Syndrom 880 Metabolit 488 Metabolomik 520 Metallchelataffinitätschromatographie Metallionenkatalyse 366 Metalloenzym 366 Metaphase-Chromosom 955f. Methanogene 10 Methylcobalamin 830 Methylmalonyl-CoA-Mutase 751ff. Micellen 31

649ff.

Mutagen 515 Mutase 541 Mutation 11, 56, 983

Mycophenolsäure 890f. Myoadenylat-Desaminase-Mangel Myofibrille 217£.

116

Myoglobin

142, 160, 176, 196, 198 ff., 372

- Funktion 199 — Sauerstoffbindungskurve —

Struktur

908

200

198ff., 220

Myokardinfarkt

786

Myomensin 225 Myosin 219, 222

Myosinleichtkettenkinase (MLCK) Myristoylierung 295

474f.

454

1248

Sachregister

n

N,-Reduktion 845 N-Terminus 87

N-Terminus-Regel 795 Nachbargruppeneffekt 367 NADH

545, 631

- Oxidation 652 nahrungsinduzierte Thermogenese 872 native Struktur 177 natürliche Selektion 6 Necleotidmetabolismus 885 ff. negative Kooperativität 205 Nekrose 1155 Nernst'sche Gleichung 509f. Nervengifte 379 Neuralrohrdefekt 814 Neuroglobin 199 Neuropeptid Y 870 Neurotransmitter 99, 313, 379 neutrale Drift 131 neutrale Lösung 34 nicht codierende RNA (ncRNA) 1109 nicht codierender Strang 1012f. nicht essentielle Aminosäuren 824 — Biosynthese 824ff. nicht ketotische Hyperglycinämie 809 nicht repetitive Struktur 156 Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase (NRTK) 457, 1138 nicht vermittelter Transport 324, 338 nichthomologe Rekombination (engl.: nonhomologous end-joining, NHE]) 993, 1000

nichtkooperative Bindung 205 nichtsteroidale Entzündungshemmer (NSAID) 776 Nick-Translation 967 Nicotinamidadenindinucleotid (NAD*)

nucleophiler Angriff 930 Nucleosid 47 Nucleosid-Phosphorylase 905 Nucleosidase 905 Nucleosiddiphosphat (NDP) 891, 897, 900 Nucleosiddiphosphat-Kinase 891 Nucleosidmonophosphat-Kinase 891 Nucleosidtriphosphate 885, 891 Nucleosom 980, 952 ff. Nucleosomenkernpartikel 952f. Nucleotid 45 ff. — Struktur und Funktion 46ff. Nucleotid-Excisionsreparatur (NER) 990f. Nucleotidabbau 905 ft. Nucleotidderivate 48 Nucleotidrest 50 Nucleotidzucker 605 - Rolle der Nucleotidzucker 606

Nicotinamid-Mononucleotid (NMN') 974 Niere 860 Ninhydrin 119 Nitrat-Reduktase 847f. Nitrifizierung 847 Nitrit-Reduktase 848 Nitrogenase 842 ff. — Redoxzentren 843 — Röntgenstruktur 843 NMD (engl.: nonsense-mediated decay) 1143 Nonsense-Mutation 1094 Nonsense-Suppressor 1094 Noradrenalin 443, 596 Northern-Blot 943 Nuclease 109 Nucleinsäuren 45ff., 917 ff. — Datenbank 171 — einzelsträngige Nucleinsäuren 54 — Fraktionierung 940ff. — Funktion 54ff. — Sequenzierung 57ff. — Struktur 49ff., 917 ff. — Strukturstabilisierende Kräfte 934 Nucleolus 1020 nucleophile Katalyse 364f.

Oxyanion-Loch Oxygenierung

383, 385, 733 199

p P-Cluster

843

P-Stelle, siehe Peptidyl-Stelle P/O-Quatient

681

Pair-rule Gen Palindrom

1160 59

offenes System 19f. Okazaki-Fragment 963. Öl

Pectin

o

O-Zustand 676f., 680 Oberflächenmarkierung 290 Obesitas 557 offener Komplex 1015 offenes Leseraster (engl.: open reading frame, ORF)

65, 1106

274

Oligomer 50, 173 Oligopeptid 87 Oligosaccharide

Onkogen

Penicillin

|

455f.

Operator 945, 1116 Operon 1013

optische Aktivität 94 optische Dichte 110 Organe — Spezialisierung 854ff. — Stoffwechselcyclen zwischen Organen 860f.

Organelle 9, 492 organische Verbindungen 4 Orientierungseffekt 367 Orotacidurie 896 Orotidin-5’-monophosphat (OMP) 893f. orthologe Gene 133 Orthophosphatspaltung 502 ortsgerichtete Mutagenese 77 ortsspezifische Rekombination (engl.: site-specifie recombination) 994 Osmose 32f. osmotischer Druck

Östrogen

256

Pellagra

- strukturelle Effekte 264 471,

— Kontrolle 683 f. Oxidoreduktase 355, 471 Oxoniumion 374, 580 _

Palmitoylierung 295 Pantothensäure 506 Paracetamol 433, 776 paralleles ß-Faltblatt 149f. paraloge Gene 134 Parkinson-Syndrom 688, 840 partielle molare Freie Enthalpie, siehe chemisches Potential passiv vermittelter Transport 324 Pasteur-Effekt 551 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)

- Funktionen 264f. — N-verknüpfte Oligosaccharide 262, 607 - O-verknüpfte Oligosaccharide - 263, 607

507f., 527f.,550, 630

oxidative Desaminierung 802f. oxidative Phosphorylierung 503, 647 ff., 670 ff., 854 — bakterielle oxidative Phosphorylierung 674 — Entkopplung 682

32f.

281, 444

Oxalacetat 598, 601, 630, 811 Oxidation 489 ß-Oxidation 741, 743 ff. Oxidationsmittel 509 Oxidationszahl 490

488 261

Pentosephosphatweg 527, 563 ff. — Kontrollmechanismen 569 — Verbindung zur Glykolyse 569 PEP-Carboxykinase (PEPCK) 599 £., — Reaktionsmechanismus 601 Pepsin 798 Peptid 106 Peptidase 96 Peptidbindung 87 — cis-Peptidbindung 145 Peptidgruppe 144f. Peptidoglykan 259f. Peptidylstelle 1072, 1074 Peptidyl-Transferase 1077 Peptidyl-tRNA 1074, 1077 peripheres (extrinsisches) Protein Periplasma 259 Permease 325 perniziöse Anämie

748

Peroxidase 776 Peroxisom 9, 723f., 754 Peroxisomale B-Oxidation 754 Perutz-Mechanismus 206 PEST-Proteine 796 pH-Gradient 672

pH-Wert 34f., 109 Phänotyp 66 Pharmakogenomik 433 Pharmakokinetik 429 Phenylalanin 515 Phenylketonurie (PKU) ' 822

Philadelphia-Chromosom

459

605

Sachregister Phosphagen 505 Phosphatase 424 Phosphathydrolyse 499 Phosphatidsäure 275 Phosphatidylinositolweg 472 Phosphattransporter 652 Phosphocreatin 504 Phosphodiesterase (PDE) 471f. Phosphodiesterbindung 49 Phosphoenolpyruvat (PEP) 542, 544, 599 — Hydrolyse 545 — Transport ins Cytosol 602 Phosphofructokinase (PFK) 532.6.6 53318, 603, 722

— Hemmung durch ATP 555 — Röntgenstruktur 553 — Strukturelle Basis für die Allosterie 554 Phosphoglucomutase 582 Phosphoglucose-Isomerase (PGI), siehe Glucosephosphat-Isomerase Phosphoglycerat-Kinase (PGK) 539f. Phosphoglycerat-Mutase (PGM) 541f. — Mechanismus 542 Phospholipase 275, 734 Phospholipase C (PLC) 472, 476 Phospholipid-Translokase 302 Phosphoprotein-Phosphatase 1 (PP1) 461, 593 — Regulation 594 5-Phosphoribosyl-a-pyrophosphat (PRPP)

709

Photosystem 703ff., 713 Phycobilin 698 Phycoerythrin 698 Phyllochinon 710 phylogenetischer Stammbaum Phylogenie 10 Ping-Pong-Reaktion 409

Plaque

131, 134

328 293, 326

Porphyrie 837 positive Kooperativität 205 Posphyrie 837f. posttranskriptionale Prozessierung posttranslationale Modifizierung

(PTM)

1135 1029f.

1097

Prenylierung Pribnow-Box

294 1014

primär aktiver Transport

339

primäres Transkript 1032 Primärstruktur 144 Primase 964, I70f.

Prion 188f. Prochiralität 356 Produktinhibition Proelastase 388 Proenzym

Prokaryoten

410

388

8&ff.

ß-Propeller 466 Proprotein 1097 Prostaglandin 285, 776 prosthetische Gruppe 357f. Protease 109, 797

177

— Datenbanken

170f.

— Eigenschaften 107 — Elektrophorese 116 — Evolution 130

744

— Faltung 175, 177 — Faltungsmechanismen 180ff. — fibrilläre Proteine 152ff.

- Löslichkeit

— — — — —

112

orthologe Proteine 133 paraloge Proteine 134 Primärstruktur 105 ff. Proteinfamilien 167 ff. sauerstofftransportierende Proteine Sequenzierung 118ff.

— Stabilisierung

202

108f., 175

— Strukturvergleiche 172 — Strukturvoraussage 182 — thermostabile Proteine 178 — Untereinheiten 109 — Zusammensetzungen 107 Protein-leitender Kanal (engl.: proteinconducting channel, PCC) 1099 279, 424, 460.

Protein-Phosphorylierung 423 ff. Protein-Tyrosinkinase (PTK) 447f., 458f. Protein-Tyrosin-Phosphatase (PIP) 461 Proteinbiosynthese 1053 ff. -— Auswirkungen von Antibiotika 1092 Proteindesign 182 Proteindynamik 177 Proteinkinase 424 — Kaskade 425 Proteinkinase A (PKA) 467, 591. — Aktivierung 468 — Struktur 468 Proteinkinase C (PKC) 475 Proteinreinigung 108 Proteoglykane 258 56

Proteomik 56, 118, 518f. Protomer 173 Protonengradient 345, 671, 673, 681, 708, 712 Protonenleiter 660

Promotor 1013, 1026 — Promotor der RNA-Polymerase I 1026 — Promotoren der RNA-Polymerase II 1026

„Atmen“

197 ff.

— globuläre Proteine 152 — Kristallstruktur 161

Proteom

Primer 60, 964 Primosom 971, 1000

—

68, 76, 1002

Plastocyanin 709 Plötzlicher Kindstod (SINS) polar 26 Polarimeter 94

1032 ff.

306, 1095 ff.

Prader-Willi-Syndrom (PWS) Präinitiationskomplex (PIC) Präproprotein 1097

- Funktion

Protein-Phosphatase

präbiotische Suppe 8 präbiotische Welt 4

— Anordnung der Seitenketten

699

70, 188, 786

Plasmalogen 277, 773 — Biosynthese 773 Plasmid

Porin

Proteasom 796 Protein 85

36f., 39

Planck’sches Gesetz

Pore

Präprotein

833, 887.

Phosphorolyse 424 Phosphorylase-Kinase 592 Phosphorylgruppenübertragung 497 Phosphorylgruppenübertragungspotential 499 phosphorylierte Verbindungen 503 Phosphorylierung 425 Phosphosäureanhydrid 499, 502 photoautotroph 486 Photon 695 Photooxidation 699 Photophosphorylierung 503, 703, 712 Photoreaktivierung 988 Photorespiration 723 ff. Photosynthese 693 ff. Photosynthese-Reaktionszentrum 695, 700f.,

pK-Wert

Poly(A)-bindendes Protein (PABP) 1034 Poly(A)-Bindungsprotein II (PAB II) 1033 Poly(A)-Polymerase (PAP) 1033 Poly(A)-Schwanz 1033 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 116 polycistronische mRNA 1013 Polycythämie 215 Polyelektrolyt 113 Polymer 4 Polymerasekettenreaktion (PCR) 74f. Polymorphismus 73 Polynucleotid 49 Polypeptid 87, 106 ff., 145 Polysaccharide 241, 249 ff. Polysom 1078 polytopes Transmembranprotein 308

1249

164

protonenmotorische Kraft (PMK) Protonenpumpe 660 Protonensprung 34 Prozessierung 262, 309 Prozessierungskörper (P-Körper) prozessives Enzym 951 Prozessivität 965

673

1142

Pruinnucleotid-Phosphorylase (PNP) 907, 913 Pseudogen 135 Pseudouridin (y) 1044 Pterine 821f. Puffer 37 ff. Pufferkapazität 40 Puls-Markierung 963 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFG) 941 Punktmutation 66, 984 Pupurbakterien 697, 700ff., 709 Purin

46, 886

— Katabolismus 905, 907 ff. — Rückgewinnung 892 Purinderivate 912 Purinnucleotideyclus 908 Purinnucleotide 891 — Regulation der Biosynthese

891

1250

Sachregister

Pyridoxin 799

Redoxcofaktor. 661, 821 Redoxpaar 509 Redoxpotential 510 — Messung 510 Redoxreaktion 507 Redoxzentrum 648

Pyrimidin

Reduktion

Purinribonucleotide — Synthese 886. Pyranose

244

Pyridoxal-5’-phosphat (PLP) 579, 799 ff., 810f. Pyridoxamin-5’-phosphat (PMP) 800f.

46

— Biosynthese 896 — Katabolismus 910f.

Pyrimidindimer

984

Pyrimidinnucleotid 895 — Regulation der Biosynthese Pyrimidinribonucleotid 893 — Synthese 893 Pyrophosphatase 502 Pyrophosphatspaltung 502 Pyruvat

895

546, 599, 808

— anaerober Abbau 546 Pyruvat-Carboxylase 599. — Reaktionsablauf 600f.

Pyruvat-Decarboxylase

548f.

— Reaktionsmechanismus 550 Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex 618f.

— kovalente Modifikation

632

— Modell

— Produkthemmung 631 — Regulation 631f. — Strukturelle Organisation 618 Pyruvat-Kinase 501, 544 ff. — Mechanismus 544

q Q-Cyclus

664f.

Quantenausbeute Quantum 699

Quartärstruktur

702

217.

Retrotransposon Retrovirus 1004

R-Zustand

86 206ff., 423, 426, 554

racemisches Gemisch 96 Rachitis 282 Radioimmunoassay (RIA) 110, 442 Radionuclid 398 Ramachandran-Diagramm 146f. Randle-Cyclus, siehe Glucose-Fettsäurecyclus Random coil, siehe Zufallsknäuel Rasterschub-Mutation

(engl.: frameshift mutation)

1054

raues endoplasmatisches Reticulum (rER)

304, 312

Reaktion erster Ordnung

ribosomale RNA (rRNA), 56, 936, 1011 — Prozessierung

396

Reaktion nullter Ordnung 400 Reaktion pseudo-erster Ordnung Reaktion zweiter Ordnung 397 Reaktionskinetik 396 ff. Reaktionskoordinate 359 Reaktionsordnung 396 reaktive Sauerstoffspezies (ROS) rechtsdrehend 95

Rezeptortyp

Ribulose-5-phoshpat (Ru5P)

- Bildung

1148

865

662, 687

664, 666

Rinderpankreeas-Trypsin-Inhibitor (BPTI) 386 Rinderwahnsinn (BSE) 188f. RNA-Erkennungsmotiv (engl.: RNA-recognition

motif, RRM)

1042

RNA-Interferenz (RNAi) — Anwendungen 1144 — Mechanismus 1143 RNA-Polymerase (RNAP)

- eukaryotische RNAP

1142

1011ft.

1020

— Funktion 1021 — Kollision mit DNA-Polymerase

1017

—»Struktur 1012, 1021f. RNA-Welt 939

Röntgenkristallographie Rossmann-Faltung 167 Rotationsmotor 678

159, 372, 377

174

Rubisco-Aktivase 719 Rückgewinnungsweg 892 Rückgrat 145 Rückkopplungsinhibitor 420 Rückkopplungsregulation 901

317, 738f. Ss

Rho-Faktor 1019f. — Röntgenstruktur 1020 Rhodopsin 464f. Ribonuclease (RNase) A 362f. Ribonucleinsäure (RNA) 46, 917, 939 936

— Katalysemechanismus — Reduktion 900 — Regulation 901 Ribose 46 Ribosom 56, 1068 ff. — Dechiffrierungsstelle

718£., 723 — Aktmwität 721 Rieske-Zentrum

Rotationssymmetrie RS-System 96

Saccharopin 819 Saccharose 250 Sarkomer 217f. Sättigung 200, Sättigungsgrad 200

Sauerstoff erzeugendes Zentrum — Modell

669, 897 ff,

913

399

563f.

564

— Epimerisierung 565 — Isomerisierung 565 Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Rubisco)

1004

Ribonucleoprotein 981 Ribonucleotide 46 Ribonucleotid-Reduktase (RNR)

1093

Riboswitch 1122 Ribozym 354, 938, 1087

1111

rezeptorvermittelte Endocytose rheumatoide Arthritis 794

— Struktur

1043

— Sekundärstruktur 1070 Ribosomen-Recycling-Faktor (RRF)

reverse Transkriptase (RT) 75, 416, 978 Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) 448 ff. Rezeptorprotein 439

$

R-Gruppe

489

Reticulocyt 837

144, 173

quergestreifte Muskulatur

1075f.

prokaryotisches Ribosom 1070ff. Struktur des prokaryotischen Ribosoms 1070f.

Replika-Plattierung 72 Replikation 6, 55f., 918 8-Replikation 963 Replikationsfaktor 977 Replikationsgabel 962f., 980 Replikon 980 Replisom 972 Repolarisierung 331 Repressor 944. Resonanzenergietransfer 699f. Restriktionsendonuclease 57ff., 944 Restriktionskartierung 59 Restriktionsmodifikationssystem 57

619

Entropiefalle 1088 eukaryotisches Ribosom

— tRNA-Bindungsstellen 1074ff. ribosomale Proteine 1074

Reduktionsäquivalent 602 Reduktionsmittel 509 Reduktionspotential 656 reduktiver Pentosephosphatcyclus, siehe Calvin-Cyclus reduzierender Zucker 249 reduzierendes Ende 254 Regelkreislauf 441 reguläre Sekundärstruktur 147 rekombinante DNA 67fl. Rekombination 66, 961 ff., 994 F. — Mechanismus 994. Rekombinationsreparatur 993, 999 Rekombinationssignalsequenz (RSS) relative Konfiguration 95 Renaturierung 179, 934 repetitive DNA-Sequenz

617.

— katalysierte Reaktionen

— — — —

898f.

1086 — dreidimensionale Struktur 1071

708

Sauerstoffpartialdruck 200 Sauerstoffschuld 861 Sauerstoffverarmung 687 Säure 35f. saure Lösung 34 Säure-Base-Katalyse

361 Säure-Base-Reaktion 35 Scatchard-Plot 449 Scherung 71, 951 Schiff’sche Base 361, 364f., 811

704ff.

E N

Sachregister

Schlaganfall

687, 786

ßB-Schleife, siehe Kehre Schmelztemperatur T, 934 schnelle Faser 552 schwache Säure 36 schwere kombinierte Immunschwächekrankheit (SCID)

79, 907

Screening 72 Scrunching 1016 SDS(Natriumdodecylsulfat)-PAGE Sedimentationskoeffizient 796

116f.

Sedoheptulose-Bisphospatase (SBPase), Segmentierungsgen

718

1160

Segmentpolaritätsgen 1160 Seife 288 Sekretionsweg 305 sekundär aktiver Transport 339 sekundärer Botenstoff (engl.: second messenger) 439, 463, 471f., 596 Sekundärstruktur 144, 165 Selbstmord-Inhibitor 906 Selectine 265 Selektion 67, 69 Selektionsmarker 70 Selenocystein (Sec) 1069 semidiskontinuierliche Replikation 963. semikonservative Replikation 961 Sense-RNA

1142

Sense-Strang, siehe codierender Strang Sensor 332 septischer Schock 479 sequentielle Reaktion 408 sequentielles Modell 213 Sequenzierung 57ff. — automatische Sequenzierung 62f. — Sequenzierung von Genomen 63ff. Serindehydratase 810 Serinproteasen 378 ff. — aktives Zentrum 378 — evolutionäre Verwandtschaft 382 — Röntgenstrukturen 380ff. SH3-Domäne 452 Shine-Dalgarno-Sequenz 1079 Shotgun-Klonierung 71 Sichelzellanämie 215ff. sigmoide Kurve 204 Signal-Anker-Sequenz 308 Signalerkennungspartikel (engl.: signal recognition particle, SRP) 305, 1098

Signalpeptid 305 Signalpeptidase 306 Signaltransduktion 447 — Stoffe, die die Signaltransduktion beeinflussen 471 Silencer 1135 Sinnstrang 1012. siRNA (engl.: short interferring RNA) 1142 skalare Protonen 670 Skorbut 487 SNARE (engl.: soluble N-ethylmaleimide-sensitivefactor attachment receptor)

313 7#315

snRNA (kleine nucleäre RNA, engl.: small nuclear RNA) 1038

1251

snRNP (kleines nucleäres Ribonucleoprotein, engl.: small nuclear ribonucleoprotein) 1038 Solvatisierung 29 somatische Hypermutation 234, 1146 ff. somatische Rekombination 233, 1146 ff. Sonde 72

Stoffwechselwege 488 ff. — Kartierung 491

Soret-Bande

Stroma 694 -Struktur 962 strukturbasiertes (rationales) Drug Design 428 Strukturbioinformatik 169. — Internetadressen 170 Strukturgen 1013 Strukturgenomik 182 Subklonierung 72 Substrateyclus 496, 555 ff. Substratkettenphosphorylierung 503 Substratspezifität 355, 381 Succinat-Dehydrogenase 629 Succinat-Thiokinase, siehe Succinyl-CoA-Synthetase Succinyl-CoA 812, 815 Succinyl-CoA-Synthetase 627 — Reaktion 628 Sulfonamid 816 superhelicale Windungszahl 927 Superhelix 152, 926, 953 Superoxid-Dismutase (SOD) 688 Superoxidradikal 687 Supersekundärstruktur (Motiv) 165 Superspiralisierung 926, 1016

662 SOS-Antwort 993 Southern-Blot 942 spannungsgesteuerter Kanal 330f., 333 Spectrin 299f. Spezialpaar 701f. Spezifitätskonstante (ku./Ku) 404 Sphigolipide 278 Sphigomyelin 776 Sphingoglykolipid 774 Sphingolipid 770, 774 ff. Sphingolipidspeicherkrankheit 778 Sphingomyelin 278 Spleißen 1034, 1037, 1044 Spleißosom 1038 spontaner Vorgang

15

Squalen 780f. Squelching 1137 SRP-Rezeptor (SR) SR-Protein 1041

306

Standardreduktionspotential 511f. Standardzustand 17f. Stapelwechselwirukung 927 Stärke 253 starke Säure 36 Stärkesynthese 720 Startpunkterkennungskomplex (engl.: oringin recognition complex, ORC) 980 STAT (engl.: signal transducers and activators of transcription) 1138f.

Stomathylakoid 694 Stoppcodon 1041, 1057 Strangpassage 92If. Streptavidin 680

Supressor

1054

Switch-Region 466 Symbiose 11 Symmetriemodell 213

steady state- Annahme 401, 405 stereoelektronische Kontrolle 537

Symport 339 Synapse 313, 379 Syneytium 1158 Synonym 1057 System 13

Stereoisomer

Systembiologie

Statin

785

95

Stereospezifität Steroide

t T-Zustand 206ff., 423, 426, 554, 580, 676f., 680 Tangier-Krankheit 787f.

280ff., 445

Steroidhormon 280 Sterol 280 Sterolregulationselement (SRE)

Stickstoffassimilierung 846 Stickstofffixierung 793, 842 ff. Stickstoffkreislauf 847f. Stickstoffmonoxid 841 Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) Stigmatellin 666 Stoffwechsel — Einführung 485 ff. — Entstehung 7f. Stoffwechsel-Homöostase 867

784

TATA-Bindungsprotein (TBP)

841

Stoffwechselinhibitor 515 Stoffwechselvorgänge 513 — experimentelle Ansätze zur Untersuchung 513

513

1029ff.

TATA-Box 1026 Taurinkonjugat 732

— Regulation 868 Stoffwechselfluss 494 ff. — Kontrolle 494 ff.

— Nachweis

516 ff.

356

Tautomer 50 Tautomerisierung Taxonomie 10

800

Tay-Sachs-Krankheit 279, 778 TBP-assoziierter Faktor (TAF) 1030 Teilreaktion 509, 511 Telomer 981 Telomerase 981, 983 Temperatur 18, 109 Terminationssequenz Terminator 1120

Tertiärstruktur Tetanus

975, 1018

144, 158, 165

315

tetraedrisches Zwischenprodukt 383f., 386f. Tetrahydrofolat (THF) 809, 814, 816, 903

1252

_Sachregister

Tetramer

50 Tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD) 681 Tetraschleife (engl.: tetraloop) 1045 Thalidomid 97 Theobromin 471 Theophyllin 471 therapeutischer Index 432 Thermodynamik 13ff., 19ff., 323, 493 — Erster Hauptsatz der Thermodynamik 13 ff. - Zweiter Hauptsatz der Thermodynamik 15f. Thermogenese 557 Thermophile 10 Thiamin, siehe Vitamin B}

Thiaminpyrophosphat (TPP) Thioester 506 Thiohalbacetal 539 Thioredoxin

548f.

722, 900

Thioredoxin-Reduktase 900 Threading 182 Threonin — Entdeckung 86 Thrombin 389f. Thylakoid 694, 704 Thymidylat-Synthase 903f. — Hemmstoffe 906 Thymin, Bildung 902 Titin

106, 1034

Titrationskurve 38f. Topoisomerase 928 ff. — Inhibitoren 933

— Klassen 928ff. — Mechanismus 930, 932 — Struktur 931f. Topologie 151, 166 Torsionswinkel

Torsteuerung

145f., 162

330

Tor-und-Zaun-Modell 300 Tosyl-r-phenylalaninchlormethylketon

(TPCK)

378

Totenstarre

237.

Toxoplasmose

TyC-Arm

895

1061

Transacetylierung 621 Transaktivierungsdomäne (TAD) 1136 TIransaldolase 566 — Mechanismus 568 Transaminase 799 Transaminierung 605, 798 ff. Transfer-RNA (tRNA) 56, 937, 1011, 1055 — Aminoacylierung 1060 ff. — isoakzeptierende tRNA 1067 — Korrekturlesen 1066 - modifizierte Basen 1061 — Prozessierung 1046f. — Sekundärstruktur 1060 — Struktur 1060 ff. — Tertiärstruktur 1061 Transferase 355 Transformation 55, 69 Iransgen 77 transgener Organismus 77 trans-Golgi-Netz (TGN) 308 Transimimierung 800

Transition 984 Transketolase 566 — Mechanismus 567

UDP-Glucose-Pyrophosphorylase

Transkription 55f., 918, 1011ft. — in Eukaryoten 1020 - Inhibitoren 1022f. — Terminationsstelle 1032 Transkriptionscoaktivator 1129 Transkriptionsfaktor 455, 947 ff., 1028, 1031 Transkriptom 56, 517 Transkriptomik 56, 517 Translation 55f£., 918, 1076 ff. Translokation 1084 — Zwischenstadien 1090 Translokationskomplex 306f. Transmembran(TM-)protein 290 transmissible spongiforme Encephalipathie

umami

(TSE)

Ultraschall

Ultrazentrifugation

189

Transpeptidierung

1084, 1087

Transversion

1004

ungesättigte Fettsäuren _ 745 »

— Doppelbindungen 746 - Oxidation 7458. unimolekulare Reaktion 396

Uniport

339

Unkompetitive Hemmung Uracil

414f.

989.

Uridinmonophosphat (UMP) — Synihese 893. Uridylierung 826 Urobilin 838f.

893#.

246

van’t Hoff-Auftragung variable Region 231

287

984

Tretmühleneffekt (engl.: treadmilling) Triacylglycerin 274, 767 — Synthese 765f. Tricarbonsäurecyclus (TCA-Cyclus), siehe Citratcyclus Tricarboxylat-Iransportsystem 758

228

Triclosan

764 Triggerfaktor 1096 Trigger-Schleife 1025 Trimer

309#. Umrechnungsfaktoren 14

Vakuole 9 van-der-Waals-Abstand 26 van-der-Waals-Kräfte 28

994, 1002

Iransversaldiffusion

Umgebung 13 umhülltes Vesikel

v

Transposition 66, 1002 ff. — mutmaßlicher Mechanismus Iransposon

796, 936, 961

84, 824

Uronsäure

Transportprotein 323, 336 Transposase 1002

585f.

690

variabler Arm 1061 Vektor 67 vektorielle Protonen

324, 338

Verwindungszahl 926 verzweigtkettige-a-Ketosäure-Dehydrogenase » 817 Vesikel

TIrimethoprim 912 Trinucleotid-Repeat 1112 — verursachte Krankheiten 1112 Triosephosphat-Isomerase (TIM) 534, 536. Tripelhelix 153, 155 Tripeptid 87 Triskelen 311 Tropomodulin 225

670

vermittelter Transport

310f.

— Fusion

50

18

313

Viagra 470 virales Fusionsprotein Virulenz

Virus

316

259

8&

Vitamin

A

283

Vitamin B, 548f. Vitamin Bj, 749 — Struktur

750 Vitamin B,,-Mangel

Tropomyosin 223 Troponin 223 Irypsin 122, 386

Vitamin

Trypsin-Inhibitor 386 Irypsinogen 388 Tumor-Nekrose-Faktor-a 870 Tumorsuppressor 1151fk. Tumortherapie 906

Vitamin K

C

Vitamin D

282£.

Vitamin E

284

Vitamine

748

154

284

487f.

— Eigenschaften

487

— wasserlösliche Vitamine Vorstufe 8 Vorwärts-Aktivierung 892

487

u

Übergangstemperatur 288 Übergangszustand 359, 368, 383 Übergangszustandsanaloga 369, 376, 410 Übergangszustandstheorie

Überproduzent 76 Übertragungskoeffizient

406

w Wachstumsfaktor

256

Wachstumshormon (engl.: growth homone, GH) 446

406 Ubiquinon, siehe Coenzym Q

1108 Wärme 13f. Wasser 25f. — chemische Eigenschaften

Ubiquitinylierung

— lonisation

Ubiquitin 794.

794ff.

Waisengen

34

34ff.

Sachregister — kolligative Eigenschaften 32 physikalische Eigenschaften 26ff. - Rolle 25 — Struktur 26ff. wasserspaltendes Enzym 705 Wasserstoffbrücken-Bindung 26, 30 Wassertransport 335 Watson-Crick-Basenpaar 919, 935, 938 Watson-Crick-Struktur 50 Wechselzahl 404 Weiterleitung (channeling) 805 Wendepunkt 38 Western-Blot 943 Wildtyp 77 Wobble-Hypothese 1068

549

zZ

Z-DNA 919, 923 — Struktur 921 ff. Z-Schema 704f. Za-Domäne

hl

Zellcyclus 951, 1149 ff. — Phasen 1149f. ß-Zelle 862 f., 877 Zellkern 8 zelluläre Brennstoffe 613f. — oxidativer Stoffwechsel 613 zelluläre Immunität 229 6ff.

zentrales Dogma der Molekularbiologie Zinkfinger 177, 947 890

Zwitterion 87 Zymogen 388 Zytostatika 933

923

zelluläre Strukturen

x Xanthin-Oxidase (XO) 908f. Xanthosinmonophosphat (XMP) Xenobiotikum 429, 431

Zuckerderivate 246 zufälliger Mechanismus 408 Zufallsknäuel 156 zusammengesetztes Transposon 1003 Zustandsfunktion 17 zweidimensionale (2D-) Gelelektrophorese

y Ylid

Zisterne

308

Zucker

240ff.

55

1253

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PLUS

[Demo Master comase.) 751. ...3 57° 2.

REGEN

[Kaprtei3.NucleotideundNucı =] E23 |

EEG

EEE

EEE

So wie die Tochterstränge der DNA aus freien Desoxynucleotiden synthetisiert werden, die mit den Basen der elterlichen DNA paaren, werden die RNAStrange aus freien Ribonucleotiden synthetisiert, die mit den komplermentären Basen des DNA-Strangs eines Gens paaren. (Die Transkription wird in Kap 4ausführlicher beschrieben ) Die RNA, die zu einem Protein kodierenden Gen gehört, wırd als Messenger-RNA (engl für Boten-RNA) oder mRNA bezeichnet. Sie wandert zum Ribosom, einer Zellorganelle, die selbst größtenteils aus RNA aufgebaut ist (ribosomale RNA oder FRNA). Am Ribosom paart jedes Triplett der mRNA mit drei komplermentären Nucleotiden in anem kleinen RNA-Molekul, der Transfer-RNA oder tRNA (Abb. \1). An jedes

IRNA-Molekül ist eine bestimmte Aminosäure gebunden. Das Ribosom katalysiert die Verknüpfung der Aminosäuren, welche die monomeren Einheiten der

Proteine sind. (Die Synthese von Proteinen wird in Kap. ||detailliert beschrieben.) Die Aminosäuren werden an die wachsende Proteinkette entsprechend der Reihenfolge angefügt, in der das IRNA-Molekül an die mRNA bindet. Da die Nucleotidsequerz der mRNA wiederum die Nucleotidsequenz des Gens widerspiegelt, dirigiert die DNA die Synthese von Proteinen. Folglich können sich auch Veränderungen (Mutationen) des genetischen Materials eines Organismus in Proteinen mit veränderten Strukturen und Funktionen widerspiegeln. wachsende Proteinkette

Boten-RNA

Ribosom

Richtung derRibosomenbewegung entlang der mRNA Abb

».19

Translation.

{RNA-Moleküle, die mit ihrer entsprechenden Aminosäure beladen sind, binden an Trinucleotideinheiten (Tripletts) der mRNA Ribosamen ermöglichen die Anlagerung von IRNA an mRNA und katalysieren die Verknüpfung von Aminosäuren, um eine Polypeptidkette zu synıthetisieren. Wenn eine neue Aminosäure hinzugefügt wird, wird das vorhergehende IRNA-Molekul entfernt, und das Ribosormn bewegt sich entlang der mRNA weiter

8% siehe Gulded Exploration 1, Overniew of Transcription and Translation.

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As

z

Ei

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nn

FE

Thermodynamische Konstanten und Umrechnungsfaktoren

Ein- und Dreibuchstaben-Code für Aminosäuren?

Joule ()

A

Ala

Alanin

B

Asx

C

ee

Asparagin oder Asparaginsäure

D

Asp

1J=1kgm?s”

1J=1CV (Coulomb - Volt)

1J = 1 N m (Newton - Meter)

Kalorie teal)

1 cal erwärmt 1 g H,O von 14,5 auf 15,5 °C 1 cal = 4,184 ]J

E

Avogadro'sche Zahl (N)

N = 6,0221 x 10”° Moleküle mol"

yS

Glu

Asparaginsäure ee

ä

a

un

H

His

Histidin

S

Coulomb (C)

Gyetem

y

En

yo

1 C = 6,241 x 10'° Elektronenladungen

I

Ile

Isoleucin

Faraday (F)

S

1 # = N Elektronenladungen

Ein

eu

L

Leu

1 # = 96.485 C mol” = 96.485 J] V! mol

Leuein

M

Met

Methionin

Absolute Temperatur (K) 223,15.K= 0°C

N

Asn

Asparagin

P

Pro

Prolin

Boltzmann-Konstante (k;)

Q

Gin

Glutamin

R

Arg

Arginin

5

Ser

Serin

213807

% 107 IK"

Allgemeine Gaskonstante (R) R= Nks

e

R = 8,3145 J K’

> mol

” R = 1,9872 cal K”

= mol

ib

Thr

Threonin

v

Val

valın

W

Tıp

Tryptophan

y

Tyr

Tyrosin

Z

Glx

Glutamin oder Glutaminsäure

° Der Code für nicht spezifizierte oder ungewöhnliche (nicht-Standard)-Aminosäuren ist X oder Xaa.

Genetischer Code

Erste Base (5’-Ende)

Zweite Base

Dritte Base (3’-Ende)

U

@

A G

5

U C A G

z

U A

G

AUC

Ile

ACG

'Thr

AAC

Asn

AGC

Ser

C

AUA AUG

Ile Met?

ACA ACG

Thr Thr

AAA AAG

Lys Lys

AGA AGG

Arg Arg

A G

Val Val Val Val

GCU GCC GCA GCG

Ala Ala Ala Ala

GAU GAC GAA GAG

Asp Asp Glu Glu

GGU GGC GGA GGG

Gly Gly Gly Gly

U C A G

1 GUU GUC GUA GUG

a AUG ist sowohl ein Initiationssignal als auch der Code für interne Met-Reste.

Ein echter Voet: Leicht verständliche chemische Grundlagen, brilliante Strukturbilder und eine durchgehende Erklärung biochemischer Phänomene aus den zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen — das sind die Markenzeichen des „Voet“. Wer mit diesem Buch lernt, erfährt nicht nur das „Was?“, sondern immer auch das „Warum?“ Zahlreiche Exkurse in die Molekularbio-

logie, die Biomedizin und in andere verwandte Wissenschaften stellen fachübergreifende Bezüge her und führen gleichzeitig in aktuelle Fragestellungen aus der biochemischen Forschung ein. Stimmen zur ersten Auflage: „Der Titel der Originalausgabe ... Fundamentals of Biochemistry ist verräterisch. Es ist ein Grundlagenlehrbuch, das sich primär

an Studenten aller Fachrichtungen richtet, die einführende Vorlesun-

gen der Biochemie hören. Das Schwergewicht liegt hier weniger auf enzyklopädischer Detailfülle als auf Prinzipien und deren Verständnis. Der Voet/Voet/Pratt ist „Didaktik pur“!

Chemie in unserer Zeit „Das Buch ist sehr ausführlich,

aber trotzdem gut strukturiert geschrieben... Zudem fließen oft aktuelle Forschungsbereiche ein,

so dass es sehr angenehm ist, mit dem Lehrbuch der Biochemie zu arbeiten und zu lernen.“ uni-online

Neu in der zweiten Auflage:

© Ein zusätzliches Kapitel über biologische Signaltransduktion. Hier werden die wichtigsten Signalwege besprochen: Hormonelle Steuerung, Tyrosinkinasen, G-Proteine, und der Phosphoinositolweg. © Über 100 neue hochaufgelöste Protein- und Nucleinsäurestrukturen samt ._ den daraus abgeleiteten Erkenntnissen zu molekularen Mechanismen. © Viele neue Molekularstrukturen, u. a. Chaperoninkomplexe, SNARE-Komplex, spannungsabhängige Ionenkanäle, ABC-Transporter, G-Proteine, Cytochrom c-Oxidase, ATP Synthase, Pyruvatdehydrogenasekomplex, RNA Polymerase II, RNAse P, kleine und große ribosomale Untereinheit. © Neue Exkurse stellen 21 berühmte Biochemiker und ihre bahnbrechenden Entdeckungen vor, darunter Linus Pauling, Otto Warburg, Hans Krebs, Max Perutz, Arthur Kornberg. ° Aktuelle Forschungsschwerpunkte mit direktem Bezug zur Biochemie werden vorgestellt; u. a. Genomsequenzierung, Systembiologie, Metabolomik, Proteindatenbanken, Epigenetik, Biofilme, Prionenkrankheiten, RNA-Interferenz, pharmazeutische Wirkstoffentwicklung, Vesikeltransport, Apoptose, „Riboswitches“. ° 450 Übungsaufgaben mit Lösungen im Anhang stehen zur Lernkontrolle zur Verfügung, darunter mehr als 150 neue. ° Die Multimedia-Unterstützung ist jetzt mit rund 250 Animationen und interaktiven Übungen noch umfangreicher und über das Internet jederzeit frei zugänglich.

N 978-3-527- 32667-9 |

www.wiley-vch.de

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