Acta Biotechnologica: Volume 5, Number 2 1985 [Reprint 2021 ed.] 9783112580561, 9783112580554

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Acta Blotechiolooica •

_

Volume 5 • 1985 • Number 2

Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0138-4988 Acta Biotech noi., Berlin 5 (1985) 2, 115-222 EVP 3 0 , - M

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Atti Biotedueliglca Journal of b y microbial, biochemical and bioanalogous technology

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1985

A. A. Bajev, Moscow M. E. Beker, Riga H. W . Blanch, Berkeley S. Fukui, Kyoto H. G. Gyllenberg, Helsinki G. Hamer, Zurich J. Holló, Budapest M. V. Iwanow, Pushchino F. Jung, Berlin H. W . D. Katinger, Vienna K . A. Kalunjanz, Moscow J. M. Lebeault, Compiegne D. Meyer, Leipzig

Number 2

Managing Editor:

L. Dimter, Leipzig

Volume 5

A K A D E M I E - V E R L A G

B

E R L I N

"Acta Biotechnologica" publishes original papers, short communications, reports and reviews from the whole field of biotechnology. The journal is to promote t h e establishment of biotechnology as a new and integrated scientific field. The field of biotechnology covers microbial technology, biochemical technology a n d t h e technology of synthesizing and applying bioanalogous reaction systems. The technological character of t h e journal is guaranteed b y the f a c t t h a t papers on microbiology, biochemistry, chemistry and physics must clearly have technological relevance.

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Acta Biotechnol. 5 (1985) 2, 117 — 127

Lysis and "Cryptic" Growth in Wastewater and Sludge Treatment Processes HAMEE, G.

Institutes of Aquatic Sciences and Biotechnology Swiss Federal Institute of Technology, Zurich UeberlandstraBe 133, CH-8600 Diibendorf, Swizerland

Summary The primary objectives in biological wastewater and sludge treatment processes are to procedure a minimum quantity of solid, stable residues and a maximum quantity of carbon dioxide from the biodegradable matter undergoing treatment, and also achieve destruction of any pathogenic organisms present in the process feeds. As far as minimizing solids production in activated sludge type processes is concerned, endogenous activity in the recycled biomass is usually considered to be the most important mechanism. However, increased understanding of the growth characteristics of mixed microbial cultures suggests that lysis and "cryptic" growth are probably dominant mechanisms. For pathogen destruction in treatment processes, death and subsequent lysis of pathogens are clearly events that must be promoted. Here, the kinetics for death, lysis and "cryptic" growth in aerobic wastewater treatment and aerobic sludge stabilization processes are examined.

Introduction I n all processes involving the growth of microbes, endogenous metabolism is judged to be a significant factor affecting the microbial biomass concentration, and hence, the overall biomass yield coefficient, particularly in those culture systems operating at low growth rates. Traditionally, endogenous metabolism is explained on the basis of the maintenance functions of microbes [1], i.e., turn-over of cell materials, osmotic work to maintain concentration gradients between the cell and its exterior and cell mobility. However, in wastewater treatment and sludge digestion processes the term endogenous metabolism is used rather more loosely and is considered to embrace several additional phenomena that are clearly outside the traditional definition of endogenous metabolism. These include situations, where either adsorbed/absorbed substrates or entrapped particulate substrates associated with activated sludge floes are utilized, where intra-cellular storage products that form in microbial cells under specific nutrient limitations are utilized, where nutrient pulses result in uncoupling of growth and respiration, and where microbial death, lysis and "cryptic" growth occur. In monospecies culture, the possibilities for "cryptic" growth are restricted, but in complex mixed culture systems of the type encountered in biological wastewater treatment and sludge digestion processes, "cryptic" growth is a most important mechanism 1*

118

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

affecting process performance. For example, the role of protozoa in reducing the biological suspended solids in activated sludge type biotreatment process discharges is widely acknowledged, but more subtle "cryptic" growth processes such as those encountered in sludge digestion and the extended aeration variant of the activated sludge process are either ignored or, at best, subjected to only cursory examination. The "cryptic" growth of protozoa on suspended bacteria involves direct ingestion of whole bacterial cells, but other "cryptic" growth processes involving bacteria first require the cells to die and lyse, two processes that can be either simultaneous or sequential. Cell lyses results from either autolytic processes or lytic enzyme action. In activated sludge type biotreatment processes, process intensity and potential oxidative capacity are enhanced by settling and recycling of the microbial biomass such that biomass residence times in the process are several days compared with hydraulic residence times of several hours. Because of the recycle mode of operation, growth rates' in such biotreatment process are low, i.e., conditions exist where endogenous metabolism should be significant. In sludge digestion processes, irrespective of whether they are aerobic or anaerobic, mesophilic or thermophilic, the growth of a mixture of bacterial species on particulate matter, including significant concentrations of microbes, is an essential process feature, as the primary objective of such processes is the destruction of biodegradable solids, including any potentially pathogenic organisms present in the sludge undergoing stabilization. Virtually, all processes operate under conditions that favour the growth of the process microbes, but that are markedly adverse to either the growth or even the survival of microbes present in the process feed.

Activated Sludge Process Evaluation Until recently, most applications of continuous culture theory to activated sludge type biotreatment processes have been unsatisfactory, because obvious characteristics of activated sludge processes have been ignored. However, it has been clearly demonstrated that continuous culture theory can be modified to take account of such characteristics [2, 3]. The steady state equations that apply to an ideal, completely mixed, continuous flow bioreactor, without biomass recycle, when endogenous metabolism is taken into account are x = 7(s 0 - 5)

(1)

KS(D + kd) t*m—(D+ kd) and D T 77 ' " (D + kd)

(3) (3)

where x is the steady state microbial biomass concentration, s, the steady state limiting substrate concentration, s 0 , the inlet limiting substrate concentration, D, the dilution rate, Ks, the saturation constant, kd, the specific endogenous decay constant, Y, the observed biomass yield coefficient, Yg, the biomass yield coefficient in the absence of endogenous metabolism, and ¡im, the maximum specific growth rate constant. The predicted relationships for x, s and Y with respect to D, for the values of the constants listed, are shown in Fig. 1. In such an approach, the rate of endogenous decay is considered to be unaffected by the rate of growth. However, reference to the very restricted

119

HAMER, G. : L y s i s a n d " C r y p t i c " G r o w t h in W a s t e w a t e r 1

& "X

3.5 8 S 3.0 _O -Q 2.5 J5 *-S O 2.0 O S 1.5 I: •51 1.0 Ï 0.5 "O

0.35 £

Y ~~

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Y

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12 "c Qj - 0.30 2 O 10 00. Letzteres stimmt auf keinen Fall mit den experimentell ermittelten Befunden überein, wonach die Ethanolbildung bereits bei endlichen Zuckerkonzentrationen eingestellt wird. Das Modell erklärt auch nicht die Tatsache, daß die spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit den Wert Null annehmen kann im Ergebnis einer simultanen Wirkung von Substrat- und Produktinhibierung, ohne daß die Konzentration einer der beiden Substanzen ihren Maximalwert erreicht. Weiterhin wurde für den Stamm Candida pseudotropicalis No 513 ein exponentielles Modell der Substrat- und Produktinhibierung abgeleitet [5], das im Prinzip eine Modifizierung der von A I B A et al. [6] formulierten Gleichung V = fmax • e-" P

(4)

für den Bereich höherer Substratkonzentrationen darstellt. Auf den von uns benutzten Hefestamm Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 läßt sich jedoch auch dieses Modell nicht anwenden. Das Ziel dieser Arbeit bestand deshalb darin, eine mathematische Beziehung zu finden, die die Hemmwirkung von Substrat und Produkt auf die Ethanolbildungsaktivität des o. g. Stammes exakt widerspiegelt.

Material und Methoden Bei allen Untersuchungen wurde der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 eingesetzt. Seine Vorkultivierung erfolgte unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 33 °C und einem pH-Wert von 5,0 mit Melasse als Substrat. Die frisch geernteten Zellen wurden vor ihrer Weiterverwendung mit Leitungswasser gewaschen. Die Versuchsdurchführung, die eingesetzten Fermentationseinrichtungen und die benutzte Nährlösung, ein mit 5 g/1 Hefeextrakt versetztes Mineralsalzmedium, entsprachen den bereits früher [1] gemachten Angaben. Zur Ermittlung des Substrateinflusses auf die Ethanolbildung kam Saccharose als Substrat im Konzentrationsbereich von 80—470 g/1 zum Einsatz. Bei allen diskontinuierlichen Gäransätzen wurde die komplette Nährlösung im Fermentor vorgelegt. Die Bestimmung der Hefetrockensubstanz geschah gravimetrisch. Der Anteil der lebenden Zellen ergab sich durch Auszählen nach dem Anfärben mit Methylenblau. F ü r die Ermittlung der Ethanolkonzentration im Medium wurde ein Gaschromatograph (GCH F 18. 3 . - 4 . , V E B Chromatron Berlin, P E G (10%) auf Porolith als Säulenfüllung, Säulenlänge: 3 m, Aceton als innerer Standard) verwendet. Die Ermittlung der Saccharosekonzentration erfolgte durch Bestimmung der reduzierenden Wirkung des Zuckers gegenüber Fehlingscher Lösung nach dem sauren Aufschluß der Proben [7]. Zur Versuchsauswertung diente die in [1] und [2] beschriebene Methodik.

Resultate und Diskussion Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Gärversuche mit einigen ausgewählten Substratanfangskonzentrationen sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Die Abb. 3 zeigt die aus den experimentell ermittelten Wertepaaren P und x berechneten Kurven der Funktion v = f(P) für die einzelnen Gäransätze. Es ist deutlich zu sehen, daß fast alle eingezeichneten Kurven Bereiche durchlaufen, die jeweils auf einer durch die Punkte v0 = 1,58 und P" = 107 g/1 gezogenen Geraden liegen. Diese Kurvenabschnitte entsprechen den Versuchszeitpunkten, während der die spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit nur durch die Produktinhibierung beeinflußt wurde. Das für

RICHTER, K . , BECKER, U . :

Ethanolbildungsgeschwindigkeit

Zeit

147

Chi

Abb. 1. Zeitlicher Verlauf der Änderung der Ethanolkonzentration (A, A, • , v, o) und der Biomassekonzentration (w, m., #) bei der diskontinuierlichen Gärung mit dem Stamm Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 für unterschiedliche Substratanfangskonzentrationen S0 (pH = 4,5; T = 33 °C): C7 w w So = 100 g/1 m. Ä S0 = 1.50 g/1 • • • • So = 200 g/1 & A • A So = 260 g/1 • • • • So = 300 g/1 V V • T So = 375 g/I O O So = 400 g/1

•

•

diesen Stamm ermittelte Modell [1] v = 1,58 - 0,014 766P

(5)

wird also auf diese Weise erneut bestätigt. Da bei der diskontinuierlichen Gärung die Konzentration des Substrates ständig abnimmt und die des Ethanols entsprechend ansteigt, wird die Charakteristik der aus Batch-Daten ermittelten Kurven v = f(P) wesentlich durch Substratinhibierung und Substratlimitation bestimmt. Beide Effekte sind auch in der Abb. 3 deutlich erkennbar. So ist das vorzeitige Abknicken der Kurven aus Versuchen mit geringer Substratanfangskonzentration (S0 200 g/1) als Folge einer Substratlimitation zu werten, die im Vergleich zur Geraden v0P" mit geringerem Neigungswinkel verlaufenden Geraden3

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

f iAJ Abb. 2. Zeitlicher Verlauf der Abnahme der Saccharosekonzentration bei der diskontinuierlichen Gärung mit dem Stamm Sc 5 bei verschiedenen Substratanfangskonzentrationen (Zeichenerklärung siehe Abb. 1).

Abb. 3. Änderung der spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeit v0 des Stammes Sc 5 im Verlauf des diskontinuierlichen Gärprozesses (pH = 4 , 5 ; T = 33 °C) bei verschiedenen Substratanfangskonzentrationen (Zeichenerklärung siehe Abb. 1).

Richter, K., Becker, U.: Ethanolbildungsgeschwindigkeit

149

abschnitte der Funktion v = f(P) bei höheren Substratkonzentrationen (>S0 j> 200 g/l) sind hingegen das Resultat einer Substratinhibierung. Die Schnittpunkte dieser verlängerten Geraden mit der Ordinate repräsentieren die allein durch die jeweilige Substratanfangskonzentration S0 bewirkte Inhibierung der Ethanolbildung unter der Bedingung, daß P = 0 ist. Trägt man die auf eine solche Weise erhaltenen Werte für Av = v0 — v in einem Koordinatensystem gegen die entsprechenden Substratanfangskonzentrationen S 0 auf, so erhält man eine Gerade, die die Abszisse bei einem Wert S0 = 100 g/l schneidet (Abb. 4).

•5 1,5 •"3 / 1,0

/ s

O. C 0,5 ' -5

JL

Av*Vo-v=0,00U362 IS-100)

y

300 h00 500 5 [g/l] Abb. 4. Aktivitäts Verluste Av des Stammes Sc 5 in Abhängigkeit von der Substratkonzentration unter Ausschluß der Produktinhibierung (P = 0). 100

200

Tab. 1. Einfluß der Substratkonzentration auf die spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit des Stammes Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 bei vernachlässigbarer Produktinhibierung (P = 0) Substratkonzentration [g/l Saccharose]

100,0 112,0 127,6 135,0 141,5 150,0 177,0 180,0 200,0 208,0 225,0 260,0 288,0 300,0 312,0 351,0 375,0 400,0 3*

spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit [g/gh] graphisch ermittelt aus experimentellen Werten

berechnet nach Gleichung (6)

1,572 1,540 1,453 1,400 1,364 1,380 1,247 1,262 1,170 1,122 1,031 0,900 0,760 0,740 0,638 0,483 0,360 0,270

1,579 1,527 1,459 1,428 1,399 1,363 1,245 1,232 1,145 1,110 1,036 0,884 0,761 0,709 0,657 0,487 0,383 0,274

150

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Das bedeutet, daß Saccharosekonzentrationen von 8 ^ 100 g/1 keine Inhibierung der Ethanolbildung bewirken. Der Einfluß der Substratkonzentration auf die spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit kann daher in vorliegendem Falle durch folgende Beziehungen ausgedrückt werden: v

=

v

°

V = v0

A

fÜr

' + 8

K

f S

8

+

-

0

c(8 -

g^1 ^

,S

100)

' ^

100

für

g/1

((5)

8 > 100 g/1.

Durch Regression der experimentell ermittelten Daten konnte die Gültigkeit der Gleichung (6) bestätigt werden, wobei sich für die Konstante c ein Wert von 0,00436 ergab. Wie Tab. 1 zeigt, besteht eine gute Übereinstimmung zwischen den gefundenen und den berechneten Gäraktivitäten (Standardabweichung: 0,0199, Bestimmtheitsmaß: 0,997 bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,05, Korrelationskoeffizient: 0,998.). Der Wert von Ks' wurde vorher zu 0,58 g/1 bestimmt. Bei der diskontinuierlichen alkoholischen Gärung wirken jedoch Produkthemmung und Substrathemmung über größere Zeiträume gleichzeitig, d. h., die aktuelle spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit resultiert aus der simultanen Minderung ihres Maximalwertes um die durch das gebildete Ethanol und das vorgelegte Substrat bewirkten Aktivitätsverluste der Hefezellen: v = v0-aP

-

c{S -

100)

für

8 > 100 g/1.

(7)

Tab. 2. Vergleich der für ausgewählte Prozeßzustände in diskontinuierlichen Gäransätzen gefundenen aktuellen spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeiten des Stammes S. cerevisiae Hansen Sc 5 mit den nach Gleichung (7) berechneten Werten aktuelle Substratkonzentration [g/1]

130,0 158,6 172,6 175,0 178,0 187,7 196,0 197,0 208,0 225,0 231,0 258,6 261,0 320,0 334,0 341,8 370,0 381,0 399,5

aktuelle Ethanolkonzentration [g/1]

57,80 14,75 4,75 68,41 37,70 81,10 60,16 58,96 75,10 14,40 47,72 33,33 40,34 25,12 8,00 16,47 12,70 6,37 2,62

spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit [g/gh] experimentell ermittelt

berechnet nach Gleichung (7)

0,572 1,097 1,200 0,266 0,705 0 0,323 0,269 0 0,818 0,282 0,377 0,244 0,248 0,479 0,248 0,245 0,257 0,267

0,596 1,107 1,193 0,243 0,683 0 0,273 0,286 0 0,822 0,312 0,396 0,282 0,249 0,441 0,282 0,215 0,260 0,235

RICHTER, K . , B E C K E R , U . :

Ethanolbildungsgeschwindigkeit

151

Mit Hilfe dieses Modells ist es möglich, die jeweiligen Anteile der Inhibierung, die durch das Ethanol bzw. durch das Substrat verursacht werden, exakt voneinander zu trennen. Bei Kenntnis der beiden Konstanten a und c läßt sich so die aktuelle spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von den aktuellen Substratund Ethanolkonzentrationen berechnen. In der Tab. 2 sind die auf diese Weise aus S, P-Wertepaaren berechneten spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeiten den entsprechenden experimentell ermittelten Werten gegenübergestellt. Die Übereinstimmung ist recht gut, was als Bestätigung der Gleichung (7) zu werten ist.

t

[hl

Abb. 5. Additives Verhalten von Substrat- und Produktinhibierung bei der diskontinuierlichen Gärung mit dem Stamm So 5 ( S0 = 400 g/1, pH = 4,5, T = 33 °C): O O Substratkonzentration • • Ethanolkonzentration A A durch das gebildete Ethanol bewirkte Minderung der spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeit Avx & A durch das Substrat bewirkte Minderung der spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeit AV2 • • aktuelle spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit im Verlauf des diskontinuierlichen Prozesses (berechnet mit Hilfe der Gleichung v = »o — aP - c(S - 100)). 1- aktuelle spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit im Verlauf des diskontinuierlichen Prozesses (experimentell ermittelte Werte)

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152

Das Modell erklärt auch die besonders bei hohen Substratkonzentrationen (S 400 g/1) beobachtete Tatsache, daß unter diskontinuierlichen Prozeßbedingungen die maximale Ethanolendkonzentration P" nicht mehr erreicht werden kann (Abb. 3). Dies kommt ganz einfach dadurch zustande, daß sich die durch das Substrat und durch das Produkt bewirkten Aktivitätsverluste der Zellen additiv verhalten. Eine stark erhöhte aktuelle Substratkonzentration führt bereits zu einer so umfassenden Inhibierung der Ethanolbildung, daß. v den Wert Null bereits bei Ethanolkonzentrationen P < P" annehmen muß. Das additive Verhalten der durch Substrat- und Produktinhibierung verursachten Aktivitätsminderung der Hefezellen wird in der Abb. 5 an Hand eines ausgewählten diskontinuierlichen Gärverlaufes demonstriert. Die während des gesamten Prozesses experimentell ermittelten spezifischen Ethanolbildungsgeschwindigkeiten stimmen sehr gut mit den auf der Grundlage des Modells berechneten Werten überein. Aus den vorgenannten Befunden ergibt sich die Schlußfolgerung, daß bei dem von uns untersuchten Stamm Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 ein synergistischer Effekt im Sinne einer Verstärkung der Substratinhibierung durch Ethanol nicht existiert. Symbolverzeichnis v v0 a 8 80 K/ co k vml, P P" c

spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit spezifische Ethanolbildungsgeschwindigkeit bei P = 0 • dv Konstante, Differentialquotient— Substratkonzentration Substratanfangskonzentration in diskontinuierlichen Gäransätzen Saturationskonstante der Ethanolbildung Konstante Konstante maximale spezifische Fermentationsrate Ethanolkonzentration im diskontinuierlichen Prozeß erreichbare maximale Ethanolkonzentration dv Konstante, Differentialquotient —— für 8 > 100 g/1

[g/gh] [g/gh] D/gh] [g/1] [g/1] [g/1] [¡¿Z C0 2 /mgh] [g/1] [g/1] [gl/gh • g]

Eingegangen: 5. 9. 1983

Literatur [1] RICHTER, K., BECKER, U.: Acta Biotechnol. 6 (1985) 1, 9. [2] RICHTER, K., BECKER, U.: 3. Symposium der sozialistischen Länder über Biotechnologie, B r a t i s l a v a , 2 5 . - 2 9 . 4. 1983. [ 3 ] L E E , J . H . , WILIHIAMSON, D . , ROGERS, P . L . : B i o t e c h n o l . L e t t . 2 ( 1 9 8 0 ) 4 , 8 3 . [ 4 ] GHOSE, T . K . , TYAGI, R . D . : B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 1 ( 1 9 7 9 ) , 1 4 0 1 .

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Inhibierungserscheinungen bei der alkoholischen Gärung III. Der Einfluß des osmotischen Druckes auf die Lebensfähigkeit von Saccharomyces cerevisiae RICHTEB, K . u n d BECKER, U .

Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für technische Chemie Leipzig DDR-7050 Leipzig, Permoserstraße 15

Summary The influence of the osmotic pressure on the viability of yeast cells was studied in batch processes. It could be found, that the viability is a function of the total osmotic pressure obtained by adding the partial osmotic values of the principal ingredients saccharose, ethanol and salts dissolved in the medium. At optimum process conditions (pH, T, etc.) the cells can tolerate the osmotic pressure up to fixed value n^ Above the viability decreases linearly and upward of a second threshold value TIz nonlinearly. In the case of the used strain Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 the values of the both points are n x = 25 atm and n 2 = 47 atm.

Einleitung Das Absterben der Hefezellen bei der diskontinuierlichen Gärung wurde bereits von verschiedenen Autoren mit der Substrat- und der Ethanolkonzentration im Medium in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht [1—6]. Tatsächlich kann man eine Stabilisierung der Lebensfähigkeit und damit auch eine verbesserte Ethanolproduktion dadurch erreichen, daß man das Substrat nicht auf einmal, sondern semikontinuierlich dem Prozeß zuführt [1, 3]. Für diel etale Wirkung hoher Substrat- und Ethanolkonzentrationen werden in der Literatur verschiedene Effekte verantwortlich gemacht, wie z. B. — die Inhibierung von Enzymaktivitäten [7 — 10], — die Denaturierung von Proteinen [9], — die Deformierung der Zellmembranen [11, 12]. Als ausschlaggebend für die stets miteinander gekoppelten Wirkungen werden der polare Lösungsmittelcharakter des Ethanols [12] und der osmotische Druck [3, 13] angesehen. Jedoch wurden dazu bisher keine umfassenden quantitativen Aussagen über die dabei bestehenden Relationen gemacht. Das Ziel dieser Arbeit bestand deshalb darin, den ursächlichen Zusammenhang zwischen dem osmotischen Druck und der Lebensfähigkeit der Hefezellen exakt nachzuweisen und zu quantifizieren.

154

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Material u n d M e t h o d e n Bei allen Untersuchungen wurde der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae Hansen Sc 5 eingesetzt. Seine Vorkultivierung erfolgte unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 33 °C u n d einem pH-Wert von 5,0 mit Melasse als Substrat. Die frisch geernteten Zellen wurden vor ihrer Weiterverwendung mit Leitungswasser gewaschen. Die Versuchsdurchführung, die eingesetzten Fermentationseinrichtungen und die benutzte Nährlösung entsprachen den früheren Angaben [14]. Als Substrat k a m Saccharose im Konzentrationsbereich von 130 — 450 g/1 zum Einsatz. Eine zweite Versuchsserie verlief unter Zusatz verschiedener Mengen an wasserfreiem Natriumsulfat (0—100 g/1). Bei allen diskontinuierlichen Gäransätzen wurde die komplette Nährlösung im Fermentor vorgelegt. Die Bestimmung der Hefetrockensubstanz geschah gravimetrisch. Der Anteil der lebenden Zellen ergab sich durch Auszählen nach dem Anfärben mit Methylenblau. Die Ermittlung der partiellen osmotischen Drücke der im Medium enthaltenen Ethanol- und Saccharoseanteile war möglich durch die Nutzung der von KOPPEJTSTEINER [15] angegebenen Diagramme. Die osmotischen Drücke der reinen Salzlösungen wurden dagegen aus den gemessenen Gefrierpunktserniedrigungen errechnet. F ü r die quantitative Ethanolbestimmung erwies sich der Gaschromatograph GCH F 18.3-4 der Firma V E B Chromatron Berlin als sehr gut geeignet (PEG (10%) auf Porolith als Säulenfüllung, Säulenlänge: 3 m, Aceton als innerer Standard). Die Saccharosekonzentration ließ sich an H a n d der reduzierenden Wirkung des Zuckers gegenüber Fehlingscher Lösung nach dem sauren Aufschluß der Proben ermitteln [16].

Resultate und Diskussion U n t e r s u c h u n g e n m i t d e m S t a m m Sc 5 e r g a b e n , d a ß die L e b e n s f ä h i g k e i t der Mikroo r g a n i s m e n bei E t h a n o l k o n z e n t r a t i o n e n v o n P1 iS 4 2 , 5 g/1 s t e t s e i n e n k o n s t a n t e n W e r t v o n e t w a 9 6 % beibehielt, w e n n eine I n h i b i e r u n g durch d a s S u b s t r a t a u s g e s c h l o s s e n w e r d e n k o n n t e . I n d i e s e m F a l l e n a h m der A n t e i l der l e b e n d e n Zellen i m M e d i u m erst o b e r h a l b des P u n k t e s Pl linear m i t der a n s t e i g e n d e n A l k o h o l k o n z e n t r a t i o n a b (Abb.l). D i e W i e d e r h o l u n g dieses V e r s u c h e s u n t e r d e n g l e i c h e n B e d i n g u n g e n , aber m i t j e w e i l s e r h ö h t e n S u b s t r a t - A n f a n g s k o n z e n t r a t i o n e n , z e i g t e , d a ß bei S a c c h a r o s e k o n z e n t r a t i o n e n z x {%] ig/U 100-50

Pl I ^ "•-» z

0

25

50 P Cg/ll

Abb. 1. Die Abhängigkeit der Lebensfähigkeit Z und der Biomassekonzentration x von der Ethanolkonzentration unter diskontinuierlichen Prozeßbedingungen (Stamm Sc 5, p H = 4,5, T = 33°C, S0 = 150 g/1 Saccharose).

155

RICHTER, K., BECKER, U . : Alkoholische Gärung

bis zu S0 = 200 g/1 noch keine wesentliche Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen eintritt, daß jedoch bei einer weiteren Erhöhung von S0 eine deutliche Steigerung der Sterberate zu verzeichnen ist. In der Abb. 2 wird der in diskontinuierlichen Gäransätzen gefundene Verlauf des Rückganges der Lebensfähigkeit der Hefezellen mit steigender Ethanolkonzentration bei verschiedenen Saccharose-Anfangskonzentrationen gezeigt.

i

0

i

25

50

i

Ptg/iJ

75

i_

100

Abb. 2. Die Abnahme der Lebensfähigkeit der Hefezellen mit steigender Ethanolkonzentration in diskontinuierlichen Gärprozessen mit unterschiedlichen SaccharoseAnfangskonzentrationen. 1: • 2: T 3: A 4: O 5: + 6: •

•

S0 S0 So S0 So s„

T A O

+

•

= = = = = =

150 200 300 375 400 450

g/1 g/1 g/1 g/1 g/1 g/1

Daraus kann man folgendes erkennen: 1. Mit steigenden $ 0 -Werten nimmt die ursprünglich lineare Beziehung zwischen dem Anteil der lebenden Zellen und der Ethanolkonzentration im Medium in zunehmendem Umfang einen nichtlinearen Charakter an. Oberhalb von S0 = 400 g/1 gilt für den gesamten Prozeßverlauf Z =

Z

0

-

a i

" .Pb",

(1)

wobei Z0 dem prozentualen Anteil der lebenden Zellen in der Kultur zu Beginn des Versuches entspricht. Die Größen ax" und b" sind Konstanten. 2. Die bei Ausschluß der Substratinhibierung beobachtete Konstanz der Lebensfähigkeit bei Alkoholkonzentrationen von P < 42,5 g/1 geht mit steigender SubstratAnfangskonzentration verloren, d. h., der Punkt P x wandert unter den genannten Bedingungen zur Ordinate hin. 3. Mit steigender Substrat-Anfangskonzentration sinkt die Ethanolkonzentration, bei der die gesamte Kultur abstirbt. Aus dem Dargelegten kann entnommen werden, daß der während der Versuchsserie beobachtete Vitalitätsverlust der Kultur das Resultat der gemeinsamen Wirkung von Substrat und Produkt sein muß. Diese Vermutung wird noch bestärkt, wenn man

156

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

die Lebensfähigkeit gegen den Substratverbrauch (AS — S0 — St) aufträgt. Diese Darstellungsweise (Abb. 3) erlaubt folgende Feststellungen: 1. Bei allen untersuchten Substrat-Anfangskonzentrationen tritt während der ersten Prozeßphase (Substratabbau bis zu AS — 100 g/1) keine signifikante Abnahme der lebenden Zellen ein. Dies geschieht erst später, wenn der Hauptteil des Zuckers bereits umgesetzt worden ist. Der letale Effekt kann also nicht allein durch die Anwesenheit der zu Beginn des Prozesses vorgelegten Substratmengen erklärt werden. 2. Mit zunehmendem Substratverbrauch nimmt die Lebensfähigkeit erst linear und dann nichtlinear ab, wobei nun auch deutliche Unterschiede im Verlauf der Kurven sichtbar werden, die aus Versuchen mit unterschiedlichen Substrat-Anfangskonzentrationen stammen. Ersteres ist sicherlich auf die im Medium anwachsende Ethanolkonzentration und letzteres auf die jeweils verschiedenen Restzuckerkonzentrationen zurückzuführen.

0

50

100

150

200

250

[g/l] Abb. 3. Die Abnahme der Lebensfähigkeit der Hefezellen mit steigendem Substratverbrauch in diskontinuierlichen Gärprozessen bei unterschiedlichen Saccharose-Anfangskonzentrationen (Symbole wie in Abb. 2).

Das bedeutet, daß ein Zusammenhang zwischen den im Medium gelösten Mengen an Ethanol und Substrat und der Lebensfähigkeit der Zellen bestehen muß. Der Beweis dafür wäre erbracht, wenn es gelänge, beide Größen über eine dritte in einen direkten Zusammenhang mit der Zellvitalität zu bringen. Zu diesem Zweck wurden aus dem vorliegenden Datenmaterial die zusammengehörigen aktuellen Ethanol- und Saccharosekonzentrationen ermittelt, bei denen der Übergang von der linearen zur nichtlinearen Vitalitätsabnahme erfolgt. Das sich daraus ergebende Kurvenpaar zeigt die Abb. 4. Deutlich ist der gegenläufige Charakter der beiden Funktionen zu sehen. Eine genaue Analyse dieser Werte unter Zuhilfenahme des von K O P P E N S T E I N E E [15] angegebenen jr/c-Diagrammes erbrachte den Nachweis, daß für alle auf diesen Kurven befindlichen Wertepaare die Summe der durch sie bewirkten osmotischen Drücke konstant ist. Bei jedem der untersuchten Beispiele betrug der summarische Diffusionsdruck n = 47 atm (Tab. 1). Wenn man davon ausgeht, daß der durch alle anderen im Medium gelösten Substanzen verursachte osmotische Druck im Verlauf des Prozesses nahezu konstant bleibt und

157

RICHTER, K . , BECKER^ U. : Alkoholische Gärung

5„ [g./l ] Abb. 4. Die bei der diskontinuierlichen Gärung mit unterschiedlichen SaccharoseAnfangskonzentrationen 8 0 beobachteten P/IS'-Wertepaare, bei denen die Punktion Z = / ( P ) einen nichtlinearen Charakter annimmt.

nur von untergeordneter Größe ist, so kann geschlußfolgert werden, daß die Hauptursache für den zum Teil sehr beträchtlichen Rückgang der Lebensfähigkeit der Zellen tatsächlich im osmotischen Druck zu suchen ist, zu dem sowohl das Ethanol als auch das Substrat die Hauptanteile liefern. Die Tatsache, daß selbst bei hohen Substratkonzentrationen von S 0 = 400—500 g/1 zu Beginn des Prozesses zunächst keine merklichen Vitalitätsverluste auftreten, steht damit nicht in Widerspruch. Unter diesen Bedingungen wird der nichtlineare Abfall der Lebensfähigkeit der Zellen nur dadurch verzögert, daß die Mikroorganismen für eine kurze Zeit noch in der Lage sind, diese hohen osmotischen Drücke durch eine schnelle Zuckeraufnähme etwas zu mildern. Erst die darauffolgende verstärkte Ausschüttung von Ethanol läßt den osmotischen Druck dann deutlich über den kritischen Wert ansteigen. Die eingangs getroffene Feststellung, daß die Lebensfähigkeit bei Ausschluß einer Substratinhibierung bis zu einer Ethanolkonzentration von P j = 42,5 g/1 konstant bleibt und erst danach linear abfällt, läßt sich nunmehr auch als eine Wirkung des osmotischen Druckes erklären. Das steht in voller Übereinstimmung mit dem Befund, daß der Punkt Pl keine Konstante ist, sondern bei Erhöhung der Substrat-Anfangskonzentration zur Ordinate hin verschoben wird. Die in vorliegendem Fall für diesen Punkt ermittelten P/$-Wertepaare entsprachen alle einem summarischen osmotischen Druck von n — 25 atm. Tabelle 1. Die aus diskontinuierlichen Prozeßverläufen (Stamm Sc 5) entnommenen Wertepaare P/S, bei denen der Übergang von der linearen zur nichtlinearen Vitalitätsabnahme einsetzt, und die ihnen entsprechenden summarischen osmotischen Drücke SaccharoseAnfangskonzentration Ä. [g/1]

Ethanolkonzentration

P/$-Wertepaare Substratkonzentration

osmotischer Druck [atm]

P[g/1] '

S [g/1]

Tip

7ts

Hp

200 260 300 375 400

82,5 76,5 70,0 43,8 0

9 74 120 244 400

45,8 42,0 38,0 23,0 0

0,5 5,2 9,6 24,0 47,5

46,3 47,2 47,6 47,0 47,5

+

KS

158

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Zur weiteren Überprüfung des Sachverhaltes wurde eine analoge Versuchsserie analysiert, bei der dem Medium unterschiedliche Mengen an Na 2 S0 4 zugesetzt worden waren. Wenn der osmotische Druck tatsächlich der Hauptverursacher des Zelltodes ist, hätte sich dieser Effekt anteilig auf die Komponenten Ethanol, Saccharose und Salz aufteilen lassen müssen. Die aus diesen Untersuchungen resultierenden Vitalitätskurven werden in der Abb. 5 dargestellt. Man kann auch hier in Abhängigkeit von der jeweiligen Ethanolkonzentration entweder eine Konstanz oder eine lineare

100

90

J 80 o"fSj •

70 60 0

10

20

P [g/1]

30

¡*0

50

Abb. 5. Die Abnahme der Lebensfähigkeit der Hefezellen mit steigender Ethanolkonzentration in diskontinuierlichen Gärprozessen bei Zusatz unterschiedlicher Mengen an N a 2 S 0 4 .

•

•

1 : 2: A 3: •

A

V

V

+

-b

O

O

4: 5 :: 6:

•

Og/1

10 g/1 20 g/1 35 g/1 50 g/1 100 g/1

bzw. nichtlineare Abnahme der lebenden Zellen erkennen. Die für die dazwischenliegenden Übergänge charakteristischen P/ «2") b" und der Einwirkungsdauer dieser hohen Diffusionsdrücke auf die Mikroorganismen ein funktioneller Zusammenhang. Wie die Abb. 7 zeigt, nimmt die Neigung der linearen und die Krümmung der nichtlinearen Kurvenabschnitte mit dem Ausmaß der osmotischen Belastung der Zellen zu Beginn der Versuche zu.

Schiaßbemerkungen Die Autoren möchten an dieser Stelle Herrn Dr. V . T E N C K H O F F für die Unterstützung bei der Ermittlung der Lebensfähigkeit der Hefezellen danken.

Symbolverzeichnis S S0 P P1 n % n2 Tip ns nSaiz Z Z0 °i"> aä">

Substratkonzentration [g/1] Substratkonzentration zu Beginn des Prozesses [g/1] Ethanolkonzentration [g/1] Ethanolkonzentration im Punkt [g/1] osmotischer Druck [atm] osmotischer Druck, bei dem die Lebensfähigkeit der Zellen linear abzunehmen beginnt, wenn der osmotische Druck weiter ansteigt [atm] osmotischer Druck, bei dem der nichtlineare Abfall der Lebensfähigkeit der Zellen einsetzt [atm] partieller osmotischer Druck des im Medium enthaltenen Ethanolanteils [atm] partieller osmotischer Druck des im Medium gelösten Substratanteils [atm] partieller osmotischer Druck des im Medium gelösten Salzanteils [atm] prozentualer Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellzahl [%] Wert von Z zu Beginn des Versuches [%] empirisch erhaltene Hilfsfunktionen

Eingegangen: 3. 11. 1983

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RICHTER, K . , BECKER, U . : A c t a B i o t e c h n o l . 5 ( 1 9 8 5 ) 1, 9. KOPPENSTEINER, G . : Z . N a t u r f o r s c h . 2 5 b ( 1 9 7 0 ) , 6 0 6 . BEYTHIEN, A . , DIEMAIR, W . — I n : L a b o r a t o r i u m s b u c h

Dresden, Leipzig: Verlag Theodor Steinkopff, 1970. S. 19.

für den

Lebensmittelchemiker.

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2, 162

Book Reviews DONALD L . WISE

(Editor)

Organic Chemicals from Biomass The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. London/Amsterdam/Don Mills, Ontario/Sydney/Tokyo, 1983 81 Abb., 96 Tab., 465 S. I n "Organic Chemicals from Biomass" werden, gegliedert in 12 Kapitel, von 21 n a m h a f t e n Wissenschaftlern historischer Hintergrund, gegenwärtiger Entwicklungsstand und Potenzen des "genetic engineering" f ü r die biotechnische Erzeugung von Chemikalien behandelt. E s handelt sich u m eine moderne Darstellung, in die thermodynamische Betrachtungen u n d die Biochemie wichtiger Verbindungen bzw. von Prozessen sowie ökonomische Abschätzungen u n d Vergleiche eingeschlossen sind. Schon klassisch zu nennende Verbindungen der Biotechnologie wie organische Säuren, Aminosäuren und Ethanol werden aus dieser Sicht „bewertet", die Aceton/Butanol-Gärung und andere anaerobe Prozesse erfahren eine Renaissance. E s wird auf die Möglichkeit der biochemischen (mikrobiellen) Produktion von Hormonen, Pestiziden, Ribonucleotiden, Carotinoiden u. a. u n d die Anwendung von Enzymen, z. B. Oxygenasen, eingegangen. Die Darstellung ist außerordentlich informativ. Das jedem Kapitel angefügte Literaturverzeichnis hilft tiefer in die unterschiedlichsten Gebiete einzudringen. E s wird hier ein Buch in die H a n d gegeben, das bei dem Grundlagenforscher Interesse u n d Anerkennung finden wird, von (Bio)Ingenieuren mit Gewinn gelesen werden wird und auch auf dem Gebiet der Biotechnologie weniger Erfahrenen und Studenten wärmstens empfohlen werden kann. W , BABEL

H. U.

(Editor-in-Chief) M. Graßl (Editors)

BERGMEYER

J . BERGMEYER,

Methods of Enzymatic Analysis Yol. V. "Enzymes 3: Peptidases, Proteinases and Their Inhibitors" 3rd. Edition. Weinheim — Deerfield Beach, Florida — Basel: Verlag Chemie, 1983. 598 S., 235 DM (wenn alle Bände), 270 DM (Einzelband) I n diesem, die Enzymbestimmungsmethoden abschließenden B a n d wird die gravierende Erweiterung und Modernisierung der vorliegenden 3. Auflage des „BERGMEYER'S" besonders deutlich. Der Band ist in 4 Abschnitte mit insgesamt 31 Kapiteln gegliedert. I m Abschnitt über Peptidasen und deren Inhibitoren werden insgesamt 16 Methoden zur Bestimmung von 8 Enzymen sowie verschiedener Inhibitoren von 4 dieser Enzyme ausführlicher beschrieben. Bei den Proteinasen und deren Inhibitoren werden gar 43 Methoden zur Bestimmung von 19 Enzymen, Pepsinzymogen, einem Elastase-04-Proteinaseinhibitorkomplex und verschiedenen Inhibitoren f ü r 6 dieser Enzyme ausführlicher behandelt. Neu aufgenommen wurden die Abschnitte über die „Blutkoagulationsfaktoren" und über die „Komplementenzyme". I m abschließenden Abschnitt über die Komplementenzyme werden der klassische u n d der alternative Aktivierungsweg des Komplementsystems, die Endsequenz und die biologische Rolle der Komplementaktivierung sowie Bestimmungsmethoden vorgestellt. Bezüglich der Aktualität der Literaturhinweise, Qualität und Quantität des fachlichen Inhalts und der.Qualität von Papier, Einband und Druck gilt das bereits mehrfach bei den Besprechungen der Bände I —IV geäußerte, sehr positive Urteil. R . BERGER

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2, 1 6 3 - 1 7 2

Der Laborkleinfermentor LF2 — Physikalische Kenndaten, Beurteilung der Originalkonfiguration und Charakterisierung spezieller Ausrüstungsvarianten GROSSE, H . H . 1 , REICHENBACH, P . 2 u n d BOCKEK,

1

2

H.1

Akademie der Wissenschaften der DDR Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11 VEB Jenapharm DDR-6900 Jena, Otto-Schott-Straße 13

Summary The stirred laboratory scale fermenter LF2 is a powerful device for fermentations with up to 3 liters culture broth [1], It was designed in the Academy of Sciences of the C.S.S.R and has found a rather wide application in a great number of organizations working in the fields of biotechnological education, research and industry in the G.D.R. and the C.S.S.R. The LF2-fermenter is well suitable for carrying out a broad manifold of aerated biotechnological works without contaminations in basic research and process development. The mechanic and electronic design gives a lot of room for the realization of special equipment variants like special-shaped reactor vessels or special electronic moduls for automatic control.

1. Einleitung Die ingenieurwissenschaftliche Komponente der Biotechnologie umfaßt in der Hauptsache folgende Aspekte [2]: — Zweckbestimmte Gestaltung und vereinheitlichte reaktoren einschließlich Ableitung von Kriterien zur — Meß-, Steuer- und Regeltechnik zur Quantifizierung von Bioprozessen, — technologische Abläufe der Prozeßführung bis zum

Charakterisierung der BioMaßstabsübertragung, und optimalen Durchführung aufgearbeiteten Endprodukt.

Diese Problemstellungen sind für Entwickler und Betreiber von Fermentationsananlagen [3] von gleichermaßen zentraler Bedeutung; der reaktortechnische Typenschein für einen Bioreaktor entsteht als Synthese der verfügbaren bzw. sinnvoll einsetzbaren technologischen Lösungsmöglichkeiten und der Palette der aus mikrobiologischen Gründen zu realisierenden Anwenderforderungen. Gegenwärtig ist die Charakterisierung von Bioreaktoren durch Angabe physikalischer Kenndaten in Anlehnung an die chemische Verfahrenstechnik üblich. Diese werden meist unter Verwendung von Modellmedien (Wasser, wäßrige Salzlösungen) ermittelt und geben gute Hinweise für eine möglichst optimale Reaktor-Konstruktion. Zentrale Bedeutung haben der Sauerstoffeintrag, das Mischverhalten und die bei der Herrn Prof. Dr. F. Bergter zum 60. Geburtstag gewidmet 4

Acta Bioechnol. 5 (1985) 2

164

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Umwälzung auftretenden Scherkräfte als biologischer Streßfaktor. Die biologische Relevanz der Scherkraftproblematik legt es u. a. nahe, die physikalische Charakterisierung eines Reaktors durch die Charakterisierung mit biologischen Testsystemen zu erweitern, um die Eignung f ü r stark schäumende Medien, die Fähigkeit zur Verhinderung von Wandwachstum, die Wirkung von Scherkräften usw. quantitativ zu erfassen [4], Die vorliegende Arbeit bleibt im wesentlichen auf die physikalische Charakterisierung des Laborkleinfermentors L F 2 beschränkt, wobei jedoch zur Quantifizierung von Scherkräften ein allgemein anwendbares Abriebkonzept bzw. der Einsatz kantenfreier Rührer zur Scherkraftverminderung diskutiert wird. Zum Sauerstoffeintrag und zum Mischverhalten werden experimentelle Daten angegeben. Weiterhin erfolgt eine Einschätzung der handelsüblichen LF2-Grundkonfiguration hinsichtlich Vollständigkeit, Zweckerfüllung und Zuverlässigkeit, bevor weiterführend spezielle mechanische und elektronische Ausrüstungsvarianten als Weg zur Verbreiterung des Einsatzspektrums diskutiert werden [5]. Bezüglich der verwendeten Untersuchungsmethoden und Bezeichnungen stellt die Monografie von MOSEK [6] und die dort zitierte Literatur den Bezugspunkt dar. Sauerstoifeintrag Die Sauerstofftransportrate (OTR) wurde in diskreter Abhängigkeit von der Drehzahl mittels der stationären Methode der Sulfitoxidation in Verbindung mit der Messung der Sauerstoffkonzentration in der Abluft unter folgenden experimentellen Bedingungen ermittelt: a)

Fermentor-Füllvolumen Modellmedium Rührung Belüftungsverhältnis Temperatur Schikane Drehzahlmessung

2,5 1 und 3 1 Wasser von oben, Original-6-Blatt-Rührer 1 1 Luft/1 1 Medium/1 Minute 25 °C und 28 °C 3 Prallbleche (180 mm x 2 0 mm) in 120°-Anordnung von der Gefäßwandung zum Zentrum orientiert — Spezialanfertigung — Anzeigewerte des Drehzahl-Einschubs im Steuerschrank

Die Abb. 1 und 2 zeigen die ermittelten OTR-Werte als Funktion der Drehzahl f ü r die beiden Füllvolumina und Temperaturen. Zur Abhängigkeit der Sauerstoff transportrate von der Wahl des Modellmediums (Zugabe von Zucker, Gelatine, Sojamehl, Stärke zu Wasser) wurden von R E I C H E N B A C H [ 7 ] Messungen durchgeführt. Diese machen insbesondere deutlich, daß die Anwesenheit von Sojamehl (60 g/1) im Modellmedium zu einer Verringerung der OTR um den Faktor 3 führt. Ähnliche Ergebnisse ergeben sich bei OTR-Untersuchungen an Kulturen von Penicillium chrysogenum, mit einem Sojamehl-Startgehalt des Fermentationsmediums von 60 g/1. Dabei stellt die Biomassekonzentration der Brühe allerdings einen weiteren wichtigen Einflußfaktor dar. b)

Fermentor-Füllvolumen Modellmedium Zusatzrührer nach Art des Original-6-BlattRührers auf der Originalrührwelle Belüftungsverhältnis Temperatur

31 Wasser 1 bzw. 2 Stück 1 I Luft/1 1 Medium/1 Minute 25 °C

GROSSE, H . H . , REICHENBACH, P . , BOCKER, H . : Laborkleinfermentor L F 2 Schikane

165

3 Prallbleche (120 mm x 2 0 mm) in 120°-Anordnung von der Gefäßwandung zum Zentrum orientiert, Prallbleche oben wandungsseitig abgeschrägt — Spezialanfertigung — Anzeigewerte des Drehzahl-Einschubs im Steuerschrank

Drehzahlmessung

Drehzahl

[min'1]

Abb. 1. Sauerstofftransportrate ( O T R ) als F u n k t i o n der Drehzahl bei Füllung m i t 2,5 1 Wasser, Belüftungsverhältnis 1 : 1 : 1 und 2 5 ° C bzw. 2 8 °C.

200 4*

400

600 Drehzahl

800 [min'1]

1000

Abb. 2. Sauerstofftransportrate ( O T R ) als F u n k t i o n der Drehzahl bei Füllung m i t 3 1 Wasser, B e lüftungsverhältnis 1 : 1 : 1 und 2 5 °C bzw. 28 °C.

166

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Die Abb. 3 zeigt den Vergleich der Sauerstofftransportraten bei verschiedenen Rühreranzahlen in Abhängigkeit von der Drehzahl. Es wird deutlich, daß die Steigerung der Rühreranzahl eine beträchtliche Erhöhung des OTR-Wertes insbesondere für Drehzahlen oberhalb 600 m i n - 1 bewirkt. Damit zeigt sich, daß der Laborkleinfermentor L F 2 mittels Ergänzung der Rührer-Schikanen-Ausstattung für die Untersuchung von Fermentationen mit hohem Sauerstoffbedarf geeignet ist. Die Begrenzung gibt der verfügbare elektrische Leistungseintrag bei Drehzahlen um 1000 min - 1 . Bei Verzicht auf Schikanen läßt sich auch der Bereich niedriger OTR-Werte gut einstellen.

Abb. 3. Sauerstoff transportrate (OTR) als Funktion der Drehzahl mit der Rühreranzahl als Parameter; Füllung mit 3 1 Wasser, Belüftungsverhältnis 1 : 1 : 1 , T = 25 °C, Sonderschikane im Fermentorgefäß eingebaut. U00 600 800 Drehzahl [min}

1000

Mischverhalten Allgemein besteht das Ziel des Mischens darin, den Mikroorganismen in allen Reaktorzonen möglichst optimale Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Substratkonzentrationen und Gelöstsauerstoffkonzentration bei Beachtung der auftretenden Scherkräfte zu verschaffen. Als quantitatives Maß für die Mikrovermischung im Fermentor dient die Mischzeit tm bei vorzugebender Mischgüte m [6]. Für den Laborkleinfermentor L F 2 wurde die Mischzeit als Funktion der Drehzahl bei der Mischgüte von m — ± 5 % mittels Leitfähigkeitsmessung unter folgenden experimentellen Bedingungen bestimmt: Fermentor-Füllvolumen Modellmedium Rührung Belüftungsverhältnis Schikane Leitfähigkeitsmessung

Meßort der Leitfähigkeitsmeßsonde

2,51 Wasser von oben, Original-6-Blatt-Rührer 1 1 Luft/1 1 Medium/1 Minute, ohne Luft Originalschikane (8 Prallbleche) Zugabe von 10 ml 2 molarer NaCl-Lösung von oben und Registrierung der Leitfähigkeits-Zeitkurve mit y—¿-Schreiber (Aufzeichnung des Signals einer Leitfähigkeitsmeßbrücke) unmittelbar über dem Fermentorboden

GROSSE, H . H . , REICHENBACH, P . , BOCKER, H . : L a b o r k l e i n f e r m e n t o r

LF2

167

I n Abb. 4 ist der Zusammenhang der Mischzeit tm und der Rührer-Drehzahl unter den angegebenen Bedingungen der Sondenpositionierung und der Art der Zugabe der Markierungssubstanz dargestellt. Es wird deutlich, daß der Blasentransport bei Belüftung des Mediums als Konkurrenzeffekt f ü r geringe Mischzeiten wirkt. F ü r n — 600 m i n - 1 ist angedeutet, daß die Mischzeit in einem Sojamehl und Stärke enthaltenden Medium ansteigt. Totzonen f ü r die Durchmischung wurden bei der beschriebenen Konfiguration nicht festgestellt. Die gefundenen kurzen Mischzeiten stehen in Einklang mit dem verzögerungsfreien Ansprechen der Meßsonden (pH, p02) und den vorgesehenen Pausenzeiten für die Zugabe von Säure, Lauge, Antischaummittel im Regelbetrieb. 10 -

?

8 6

^

S '

\

4 s

Brühe mit 11g/l Sojamehl, i 30g/l Kartoffelstärke mit Belüftung ohne Belüftung

k

H20,

?

0

HjO, ohne

200

400 Drehzahl

600 [min'1

mit Belüftung Belüftung

800 ]

Abb. 4. Mischzeit tm (bei der Mischgüte von m — ± 5 % ) als Punktion der Drehzahl; Füllung mit 2,5 1 Wasser, Belüftungsverhältnis 1 : 1 : 1 ; Tendenzverhalten von tm bei Medien mit Sojamehl und Stärke.

Scherkräfte Die Umwälzung der Kulturbrühe im Fermentor ist ursächlich mit dem Auftreten von Scherkräften verknüpft. Diese Scherkräfte wirken in der Endkonsequenz als hemmender Faktor auf Wachstum bzw. Produktbildung. Vom Anwenderstandpunkt sind die zahlreichen Ansätze zur Quantifizierung der Scherkraftwirkungen mittels diffiziler biochemischer oder morphologischer Untersuchungen zur Schädigung der Mikroorganismen [8, 9] wegen des hohen präparativen oder analytischen Aufwands wenig praktikabel. Vielmehr besteht ein handliches physikalischmechanisches Modellkriterium in der Untersuchung des Abrieb- bzw. Bruchverhaltens von granulierten oder fädigen Testmaterialien infolge der Rührerwirkung im Zusammenspiel mit der Gestaltung des Kulturgefäßes samt Einbauten [5], F ü r diesen Zweck eignet sich als Testmaterial z. B. das granulierte Wofatit-Adsorberharz Y55 vom VEB Chemisches Kombinat Bitterfeld. Unter folgenden experimentellen Bedingungen wurde der Abrieb durch das Wirken zweier verschiedener Rührer verglichen: Fermentor-Füllvolumen Modellmedium Belüftungs Verhältnis Adsorber

2,51 Wasser 1 1 Luft/1 1 Medium/1 Minute 100 g/1, minimaler Kugeldurchmesser 0,3 mm

168

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

Abriebbestimmung Drehzahl Laufzeit Schikane Rührer

Siebung der Brühe, Bestimmung des Gewichtsverlusts bezogen auf die Adsorber-Einsatzmenge 600 min"1 96 Stunden mit/ohne Originalschikane (8 Prallbleche) Original-6-Blatt-Rührer, kantenfreier diskusförmiger Rührer mit radialem Wellenprofil an Ober- und Unterseite, 0 7 cm, Wellenamplitude 0,3 cm, Rührung von oben.

'

Der relative Vergleich der Abriebwirkung durch die beiden eingesetzten Rührer f ü r die Fälle mit und ohne Schikane fällt, wie in Abb. 5 dargestellt, aus. Die Verringerung des Abriebs bei Verwendung der Schikane ist dadurch bedingt, daß die im schikanefreien Experiment infolge Kreisströmung langen Reibungswege der Adsorberkügelchen an der Gefäßwandung verkürzt werden.

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Abb. 5. Relativer Vergleich der Scherkraftwirkungen des Blattrührers und eines kantenfreien Rührers.

WR WR ohne

mit

Schikane

Im Zusammenhang mit der Abriebmethode ist die on-line-Messung von Partikelgrößenverteilungen in Flüssigkeiten [10] von Nutzen. I m Anhang wird eine Quantifizierungsvariante f ü r die Beschreibung der Eigenschaften kantenfreier Rührer mit zum Zentrum amplitudenmäßig abfallendem Sinusprofil vorgestellt, die insbesondere die Interpolation zwischen der glatten Rührerscheibe und dem Blattrührer ermöglichen soll.

Einschätzung der handelsüblichen LF2-Grundkonfiguration Die Erfahrungen aus dem Dauerbetrieb von sechs Anlagen zeigen, daß der Laborkleinfermentor L F 2 mit breiter Variabilität und guter Zuverlässigkeit f ü r biotechnologische Untersuchungen verwendet werden kann. Dabei ist es für den Betreiber zur Gewährleistung einer hohen Einsatzzuverlässigkeit je nach Anwendungszweck von Vorteil, kleine Ergänzungen vorzunehmen bzw. die verschleißbedingten Hauptfehlerquellen zu beachten. Beim Einsatz in der Antibiotikaforschung haben sich als günstige Ergänzungen der Einbau eines mechanischen Schaumzerschlägers, die Verwendung von Tiefenfiltern f ü r die Zuluft, die Vergrößerung des Durchmessers der Probenahmeolive im Fermentorboden und die Verwendung von Dosierpumpen anstelle der vorgesehenen Magnetventile als Dosierungsstellglieder erwiesen.

GROSSE,

H.

H . , REICHENBACH,

P.,

BOCKER,

H.: Laborkleinfermentor LF2

169

Hinsichtlich verschleißbedingter Funktionsstörungen stehen die Antriebsbaugruppe (Wellendurchführung) und der Antriebsmotor im Vordergrund: Bei Rührung von oben ist die Dichtheit des den Antrieb gefäßseitig abschließenden Simmerings f ü r die Reproduzierbarkeit der eingetragenen Luftmenge entscheidend und deshalb vor jedem Experiment zu überprüfen. Das trifft auch f ü r die Dichtheit des Antriebs nach außen zu, da die Hitzesterilisation des Kulturgefäßes eine starke Beanspruchung der kompletten Simmeringanordnung darstellt. Weiterhin ist die regelmäßige Kontrolle des Ritzelmitnehmerstiftes im Antrieb angeraten. F ü r eine langzeitig störungsfreie Funktion des 90W-Antriebsmotors ist es notwendig, die Kugellager regelmäßig zu kontrollieren und abzuschmieren sowie auf den einwandfreien Zustand der Kohlen und des Kollektors (Einschleifungserscheinungen, Brandstellen) zu achten. Zur Gewährleistung reproduzierbarer Versuchsbedingungen ist es insbesondere bei Parallelexperimenten sinnvoll, die Drehzahl unabhängig vom Signal des internen Tachometer-Generators zu messen. Als Ansatzpunkt f ü r die Automatisierung ist die bislang lediglich visuell anstehende und manuell zu quittierende Überlastanzeige zu nennen.

Spezielle Ausrüstungsvarianten Mechanische

Varianten

Die Grundkonfiguration des Laborkleinfermentors L F 2 läßt sich wegen der vorliegenden Montagekonzeption als Glas-Bundrohr mit Edelstahl-Verschlußflanschen sehr gut f ü r spezielle Zwecke abwandeln. Einfache Maßnahmen sind: — Verwendung eines Glas-Bundrohrs mit Seitenstutzen f ü r die Anbringung von Meßsonden, die nicht als Sonderfertigung mit Überlänge verfügbar sind, — Einsatz verlängerter Glasgefäße zur Vergrößerung des Arbeitsvolumens bis auf 5 1 in Verbindung mit einer verlängerten Rührwelle und mehretagigen Rühreranordnungen (vgl. Abschnitt „Sauerstoffeintrag"). Größeren Aufwand erfordert die Umrüstung zum Vibrationsfermentor oder zum Air-Lift-Fermentor. Beide Agitationssysteme können aber ohne Änderung der Deckelflansche als modulare Zusatzeinheiten ausgelegt werden. Bei der Umrüstung zum Vibrationsfermentor wird die Antriebsbaugruppe demontiert und an ihre Stelle t r i t t das Halteelement f ü r die im Kulturgefäß angeordnete Membrantrommel. Durch die Membran wird der Vibratorstab mit unten angesetztem Umwälzorgan gehalten und der umweltseitige Abschluß gewährleistet. Am Fermentorstativ befindet sich der Antriebsmotor in abgeänderter Lage, ergänzt durch eine Exzenteranordnung. Diese ist so gestaltet, daß die Verbindung mit dem Vibratorstab leicht hergestellt und getrennt werden kann. Vibrationshub und -frequenz sind variabel. Für den Einsatz als Air-Lift-Fermentor sind als zentrale Zusatzbaugruppen die Strömungsleiteinrichtung, das Lufteintragssystem und das Verschlußteil f ü r den Deckelflansch nach Demontage der Antriebsbaugruppe notwendig. Das Lufteintragssystem wird in die Zentralöffnung des Bodenflanschs eingesetzt. Elektronische

Varianten

Die elektronische Konzeption des Fermentor-Steuerschranks k a n n hinsichtlich der Ergänzung durch externe Steuermodule als ideal bezeichnet werden. Von besonderem Vorteil ist die Betriebsart „ P r o g r a m m " der einzelnen Regeleinheiten und der Umstand,

170

Acta Biotechnol. 5 (1985) 2

daß ein Ausgangssignal zur Stellgliedansteuerung für die p0 2 -Sollwertregelung zur Verfügung steht. Die Stellglied-Ansteuerungssignale können über externe Potentiometer-Relais-Kombinationen dazu benutzt werden, um mittels wechselnder Widerstandsbeschaltung der „Programm"-Eingänge die Werte geeigneter Steuergrößen so abzuändern, daß hinsichtlich der Regelgröße der gewünschte Verlauf eingestellt wird. Von grundsätzlicher Wichtigkeit ist die derartige Verkettung der Größen Drehzahl und p0 2 -Wert: Der Drehzahleinschub arbeitet im „Programm"-Betrieb; über ein Potentiometer P I wird die Grunddrehzahl vorgegeben, solange p02 f>02-Sollwert gilt. Für p 0 2 < f>02-Sollwert bewirkt das 24V-Signal am Ausgang „Ventil" die Überbrückung von P I und Aktivierung von P 2 durch Relaisumschaltung. Die Aktivierung von P2 bringt eine zu Prozeßbeginn gewählte höhere Drehzahl zur Wirkung. Auf diese Weise erfolgt die p0 2 -Sollwertregelung durch diskrete Drehzahlveränderung. Analoge Verkettungen sind prozeßspezifisch für andere Größen möglich, beispielsweise zwischen j?0 2 -Wert und pH-Wert. Anhang Zur Einführung geeigneter Parameter für die Zuordnung von Sauerstoffeintrag, Mischverhalten und Scherkräften bei kantenfreien Rührern mit Vermittlerstellung zwischen der glatten Rührerscheibe und dem Blattrührer ist ein zielführender Ansatz gegeben, geht man vom sinusmodulierten Kreis mit dem Radius R und zum Zentrum abfallender Amplitude a = a0 • f j mit / = 1 für r = R aus. Die Raumkurve mit dem Abstand R vom Zentrum wird durch die Koordinaten x = R • cos q> y = R .

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208

A c t a Biotechnol. 5 (1985) 2

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