Acta Biotechnologica: Volume 4, Number 2 [Reprint 2021 ed.] 9783112539064, 9783112539057

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Acta BiMiHiica •

_ J. ^

Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0138-4988 Acta Biotechnol., Berlin 4 (1984) 2, 8 1 - 1 9 2 EVP 3 0 , - M

Volume 4 • 1984 • Number 2

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Acta HltKtaMllliCI Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Edited at Institute of Technical Chemistry of the Academy of Sciences of the G.D.R.; Leipzig and Institute of Technical Microbiology; Berlin by M. Ringpfeil, Leipzig and G. Vetterlein, Berlin

Editorial Board: P. Moschinski, Lodz A. Moser, Graz M. D. Nicu, Bucharest Chr. Panajotov, Sofia L. D. Phai, Hanoi H. Sahm, Jülich W. Scheler, Berlin R. Schulze, Kothen B. Sikyta, Prague G. K. Skrjabin, Moscow M. A. Urrutia, Habana J . E. Zajic, El Paso

1984

M. E. Beker, Riga H. W. Blanch, Berkeley S. Fukui, Kyoto H. G. Gyllenberg, Helsinki G. Hamer, Zürich J . Hollo, Budapest M. V. Iwanow, Pushchino F. Jung, Berlin H. W. D. Katinger, Vienna K. A. Kalunjanz, Moscow J . M. Lebeault, Compiegne D. Meyer, Leipzig P. Mohr, Berlin

Number 2

Redaction:

L. Dimter, Leipzig

Volume 4

A KAD E M I E -VE R L A G

•

B E R L I N

"Acta Biotechnologica" publishes reviews, original papers, short communications and reports out of the whole area of biotechnology. The journal shall promote the foundation of biotechnology as a new, homogeneous scientific field. According to biotechnology are microbial technology, biochemical technology and technology of synthesyzing and applying of bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guaranteed thereby that microbial, biochemical, chemical and physical contributions must show definitely the technological relation.

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Solid-State (Solid-Substrate) Food/Beverage Fermentations Involving Fungi K . H . STEINKKAUS

Institute of Food Science Cornell University Geneva, N. Y. 14456 U.S.A. P. O. Box 462

Summary "Solid-substrate" fermentation developed in the Orient is a very useful fermentation method. I t is presently used to produce a variety of foods, beverages and related products. Solid-substratè fermentation products utilizing fungi including soy sauce, miso and tempe, ontjom, sake, and bread have been produced for centuries at the home and village level. They are examples of economical methods of preserving and improving the flavor, texture and nutritive values of cereal/ legume substrates. "Solid-substrate" fermentation is also applied to animal products such as milk to produce Roquefort and Camembert cheeses which diversify the food flavors available to man. "Solid-substrate" fermentation has certain advantages. The substrate is concentrated; the product can be extracted with relatively small quantities of solvent; the product can be easily dehydrated; moisture level can be controlled favoring the desired organisms; enzyme concentration is generally higher than in submerged fermentation; product concentration is generally higher than in submerged cultures; it is the only technique that yields true mushroom fruiting bodies and it can be used not only for production of crude enzyme concentrates (koji) but also for raising the protein content of high starch substrates. I t also can be used to increase the content of vitamins at low cost. Disadvantages of "solid-substrates" from the modern industrial processing view point are the greater difficulty of handling solid substrate and the greater difficulty of controlling the fermentation parameters, temperature, pH and oxygen, and rate of microbial growth compared with liquid submerged fermentations.

Introduction World population, presently about 4 billion, is expected to reach 6 billion b y t h e year 2 0 0 0 , and to finally level off a t about 8 to 12 billion people in t h e 21st century. At present, t h e m a j o r i t y of t h e people in t h e developing world are vegetarians for economic reasons. On a world-wide basis, a b o u t 4 0 0 pounds of cereal grains are available per person per year [1]. I n t h e developing world, cereal grains are consumed b y humans. I n t h e United S t a t e s a b o u t 2 0 0 0 pounds of cereal grains are available per person per year. Of this, a b o u t 2 0 0 pounds are consumed directly in foods such as bread, cereals etc. I n t h e affluent Western world, m o s t of t h e cereal grains and legumes are fed to animals and transformed into animal products a t efficiencies ranging from 3 1 % (milk) to 2 7 % (eggs) to 1 8 % (chicken broilers) to 9 % (pork) to 6 % (beef) [2]. W i t h an estim a t e d 1 billion of the world's people presently undernourished, it is an important que1*

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stion how long in the f u t u r e we will be able to feed the limited supplies of cereal grains and legumes to animals, not to mention millions of pets, to produce eggs, milk, chicken, and steaks t h a t we love to eat. Western food industry appears to believe t h a t the time is limited as millions of dollars have been spent developing processes for manufacturing meat analogues (substitutes) directly from cereal/legume proteins. Three basic processes have been developed: 1) Soybean protein (above 90% purity) is spun into fibers and combined with meat flavors and f a t to produce meat-like products 2) Soybean protein is combined with other cereal proteins, meat flavors and fats a n d extruded to produce chewy-gel-meat-like nuggets t h a t can be used to replace meat in many canned products and 3) Edible mold mycelium is grown on low-cost starch substrates, collected by filtration and formulated with meat flavors and f a t s to yield meat-like products. The mold mycelium provides the texture. The methods are all sophisticated, relatively expensive technology, but the products are going to be important in the diets of all of us in the f u t u r e [3, 4].

Oriental Food Fermentations The Indonesians centuries ago without the benefit of the sciences of chemistry and microbiology developed a product called tempe with a meat-like texture from soybeans as a "solid-substrate" fermentation using mold mycelium to provide the texture [5]. Soybeans are soaked (during which time they go through an acid fermentation), dehulled, partially cooked, and inoculated with molds belonging to genus Rhizopus. Incubated, wrapped in banana leaves or other containers, such as the perforated plastic bags used more recently, the soybean cotyledons are knitted into a firm cake t h a t can be sliced thinly and deep fried or cut into chunks and used in place of meat in soups. Indonesian tempe was largely unknown in the United States until the late 1950's. Now there are over 30 companies producing tempe in the United States and tempeburgers can be purchased on the E a s t and West coasts today [6]. Tempe is a principal proteinrich meat substitute on the island of J a v a . I t can be produced by simple, lowcost technology. I t is likely to become an important meat substitute in the Western world. The Indonesians also developed tempe-like processes in which by-products of the food industry such as peanut press-cake, the residue after pressing out peanut oil, can be converted to textured meat substitutes, called ontjom, using either the tempe-mold or another edible mold, Neurospora intermedia, to provide the mycelium t h a t knits the particles into a firm cake. The Orientals centuries ago also showed the world how to produce meat-like flavors from vegetable proteins by means of solid-substrate fermentations using molds and relatively low-cost simple technology. The product Chinese soy sauce (Japanese shoyu) is made by overgrowing soaked, thoroughly cooked soybeans coated with ground roasted wheat with a mold, Aspergillus oryzae. When the beans are completely overgrown with the mold mycelium, they are covered with 18% salt brine. Fermentation continues with the mold enzymes solubilizing the proteins, producing amino acid/peptide mixtures with a meat-like flavor and also solubilizing the f a t s and other soybean/wheat components. The end result when filtered some months later is soy sauce used as a nutritious condiment in the Orient for centuries and now found in almost every American kitchen as well. Japanese miso is a soy-sauce flavored, rice/barley soybean paste. I t is produced by growing the mold Aspergillus oryzae as a "solid-substrate" fermentation on steamed or rice barley or directly on soybeans, as in the soy sauce process. After the rice/barley is covered with the mold mycelium rich in enzymes, called a koji in J a p a n , it is ground

STEINKRAUS,

Solid-State Fermentation

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and mixed with soaked, cooked soybeans and 6 to 12% salt to yield a paste. The enzymes convert the protein to amino acid/peptide mixtures with a meat-like flavor. Miso is used to make traditional miso soup in J a p a n and the miso serves the same purposes in the diet t h a t bouillon cubes and meat extracts do in the Western world. In addition to Indonesian tempe, Indonesian ontjom, Chinese soy sauce (Japanese shoyu) and Japanese miso, "solid-substrate" food/beverage fermentations include Japanese hamanatto in which soaked, cooked soybeans are overgrown with the mold Aspergillus oryzae (actually the first stage of soy sauce manufacture) and then processed directly to food Without a brine fermentation; sufu, Chinese cheese, in which soybean curd (tofu) is overgrown with a mold Actinomucor elegans and then digested in an acidified 12% salt brine with sake rice wine added at a level of 10% ethanol; cocao bean fermentation; African dawadawa; leavened and sour-dough breads; most cheeses including Roquefort or blue and Camembert cheese; Japanese sake (rice wine); Chinese red rice (Ang Kak); Japanese natto in which Bacillus natto overgrows hydrated, cooked soybeans; Indonesian tape ketan and tape ketella; sweet/sour, alcoholic foods made from polished glutinous rice or cassava tubers respectively; growth of edible mushrooms on ligno-cellulosic waste; and possibly (depending on definition) Philippine nata de pina and nate de coco in which an organism Acetobacter xylinum forms a gellike layer about 1 inch (2.5 cm thick) on the surface of coconut and pineapple wastes (following an initial alcoholic fermentation). I t is worth noting that it was the Japanese shoyu, miso and sake solid-substrate fermentations all based upon the koji principle that lead to development of the huge international enzyme, mono-sodium glutamate and nucleotide industries. I t has become accepted practice to classify fermentations as either "solid-state" (actually solid-substrate) with no free liquid or "submerged" in free-flowing liquids. Solid state fermentations have been defined by H E S S E L T I N E [ 7 ] as "growth of microorganisms on solid materials not in the liquid phase". R A L P H [ 8 ] defined solid substrate fermentations as "any fermentation process in which the substrate is not liquid". C A N N E L and M O O - Y O U N G [9] specified that in its correct usage solid state fermentation "refers to the growth of microorganisms on solid materials without the presence of free liquid". They recognized t h a t moisture is necessary but said that "it exists in an absorbed or complexed form within the solid matrix". C A N N E L and M O O - Y O U N G specifically ruled-out fermentation of solid substrates in a liquid medium and fermentation of slurries i.e., liquids with high levels of insoluble solids as "solid-substrate" fermentations. Actually a number of sub-categories are necessary to adequately describe food/beverage fermentations. Among these are the following: — — — — — —

Solid-Substrate (Solid-State) (no free moisture) Solid-Substrate-Submerged (Substrate solid but submerged in liquid) Semi-Solid Substrate (Paste-like substrate) Semi-Solid Substrate-Submerged (Substrate is in suspension and flowable) Pulverized Substrate-Submerged (Cereal/legume flours fermented as slurries) Liquid Substrate-Submerged (Substrate is in solution)

The most familiar "submerged" fermentations are those yielding modern wines and beers, antibiotics, organic acids, ethanol etc. In "solid-state" fermentations there is generally no visible free moisture; there is microscopic free moisture. The amount of moisture t h a t a substrate can hold without visible free water depends upon the absorbancy of the substrate. Lignocellulosic waste will absorb about 75% water. Water activity (a w ) is the ratio of the vapor pressure of the substrate to the vapor pressure of pure water a t the same temperature. I n a closed system, the aw of a substrate is the measured relative humidity (R. H.) divided

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by 100. Most bacteria will not grow below an aw of 0.91; most yeasts will not grow below an aw of 0.88 and most molds will not grow below an aw of 0.62 to 0.65 [10—12]. In "submerged" fermentations, the substrate(s) are generally in solution and the fermenting organisms develop in the liquid. Relatively small quantities of inoculum can be adequately dispersed throughout a submerged substrate. Submerged fermentation is generally accomplished in stirred tanks (fermenters) which insure good contact between the organisms and the substrate, permit precise control of temperature, p H and oxygen tension by means of probes and can be computer controlled if desired. In "solid-state" fermentations, the substrate may be fixed (tionagitated) or tumbled in a rotating drum fermenter or periodically mixed with mechanical mixing devices. Relatively large amounts of inoculum are required to insure that every substrate particle is inoculated with the essential microorganisms. Temperature generally tends to rise above the incubator temperature depending upon the rate of metabolism of the fermenting organisms, the adequacy of oxygen supply and the rate at which heat is dissipated by conduction from the substrate. Oxygen is generally supplied by diffusion among the substrate particles; but forced aeration with humidified air is possible. Since the microbial growth rate tends to vary in a "solid-substrate" and air diffusion is not likely to be uniform, the rate of growth of the organisms, the amount of heat produced, the rate of fermentation and the amount of enzymes produced also vary at various points within a "solid-state" fermentation. On a small scale, the temperature can be adequately controlled by limiting the physical dimensions of the fermentation chambers and the substrate mass. Substrate depth can be adjusted to allow adequate oxygen diffusion based upon particle size etc. On a large industrial scale, the processes must be very carefully engineered to achieve a high quality consistently. The inoculum is generally a dried, pulverized inoculum mechanically mixed with the substrate or is sprayable as a liquid suspension that will not leave an excess of free water on the substrate. Although Indonesian tempe is classified as "solid-substrate", the first phase is a submerged lactic acid fermentation that occurs during soaking of the soybeans in the tropics. The second phase is "solid-state" in which the dehulled, hydrated, partially cooked soybeans become knitted into a firm cake by mycelium produced by the mold Rhizopus oligosporus and vitamin B 12 is produced by a bacterium Klebsiella 'pneumoniae. Therefore the tempe fermentation would be better described as "solid-substrate-submerged" (first phase)/"solid-substrate" (second phase.) Soy sauce on the other hand would be better described as "solid-substrate" (first phase) during which time the hydrated, thoroughly cooked soybeans coated with ground roasted wheat are overgrown with the mold Aspergillus oryzae and "solid-substrate submerged" (second phase) when the mycelia covered beans are covered with 18% w/v salt brine and undergo hydrolysis of their protein, starch, lipid and other components to produce eventually the typical salty, meat-flavored condiment. Japanese miso on the other hand is "solid-substrate" throughout the fermentation. Japanese miso begins as a "solid-substrate" fermentation in which a crude mixture of the essential amylases, lipases and proteases are produced by growing the mold Aspergillus oryzae on steamed rice or barley. The crude enzyme mixture called koji is then mixed and ground with hydrated thoroughly cooked soybeans and 6 to 12% salt. The mixture undergoes subsequent fermentation by lactobacilli and Saccharomcyes rouxii as a thick paste developing either a sweet, bland or a salty, bouillon-flavor useful in soups in place of meat. Japanese sake (rice wine) also begins as a "solid-substrate" fermentation in which strains of Aspergillus oryzae are grown on steamed rice to produce a crude mixture of amylases and proteases needed for subsequent saccarificatiori of the starch in a steamed rice substrate with which the koji is combined. As the amylases convert the starch to fermentable sugars a;nd the yeast Saccharomyces cerevisiae converts the sugars to

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ethanol, the substrate becomes more liquid eventually yielding rice wine. Thus sake fermentation starts as "solid-substrate" but gradually becomes "semi-solid-submerged". Indonesian tape ketan is a sweet/sour alcoholic rice produced as a "solid-substrate" fermentation by overgrowing the steamed rice with a mold Amylomyces rouxii and Endomycopsis burtonii or closely related yeasts. The organisms produce amylases that convert part of the rice starch to glucose/maltose and then convert the sugars to ethanol and organic acids yielding the typical flavor. On dry solids basis, protein content doubles (mainly because of the utilization of starch), lysine the first limiting amino acid increases by 15% and thiamine increases by 300% [13]. Millions of the world's poor t r y to subsist on cassava which contains less than 1% protein. The tape fermentation applied to cassava utilizes a portion of the starch and overall protein content doubles or triples. The tape fermentation is a method for raising the protein content of high starch substrates by "solid-substrate" fermentation. Southeast Asian rice wines utilize the same microorganisms as Indonesian tape in their fermentation. The major difference is that water is added to the fermenting rice making the fermentation "solid-substrate-submerged" and the product is a cloudy, effervescent, alcoholic mixture of residual solids, yeasts and liquid. "Solid-substrate" fermentation is a very useful method for producing crude enzymes for particular purposes using the koji principle as developed by the Japanese for shoyu, miso and sake. "Solid-substrate" fermentation has certain advantages: (1) The substrate is concentrated (compared with submerged liquid fermentations) and a given volume of fermenter capacity can bp more productive than the tanks used for submerged fermentations. (2) If the product must be extracted, less solvent is required. (3) If the product needs to be dried, there is a minimum of moisture to remove. (4) The relatively low moisture (with a proper aw) can be utilized to favor, for example, mold growth in tempe where the mold is the most essential microorganism or mold and yeast growth in t h e Indonesian tape fermentation. (5) The concentration of enzymes tends to be higher in solid substrates than in submerged cultures. (6) The concentration of fermentation products tends to be higher in "solid-substrates" fermentations. For example, in the Japanese sake fermentation, ethanol content can reach 23% v/v. (7) "Solid-substrate" fermentation is the only way true mushroom fruiting bodies have been produced. (8) "Solid-substrate" fermentation can be used to raise the protein content of high starch substrates via the Indonesian tape fermentation. (9) Solid-substrate fermentation can be used to raise the vitamin content of substrates at relatively low cost. Eingegangen: 4. 4. 1983

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Zur Maßstabsübertragung von aeroben mikrobiologischen Prozessen Teil I. Stofftransport F.

KUDREWIZKI

Institut für Technische Mikrobiologie 1017 Berlin, Alt-Stralau 62

Summary Because the interior scale of turbulence in reinforced bioreactors is essentially greater than the particles of bacteria or yeasts, the mass transfer occurs at the particles only in consequence of the molecular diffusion and depends on the concentration of the soluted material only. As a decided criterion for the transmission of scale in such processes is considered the volumetric oxygen transfer coefficient KLa. This article practises a theoretical analysis of the characteristic hydrodynamic conditions in bubble columns and in agitators: the content of gas, the specific area of mass transfer and the coefficient of mass transfer KL. These conditions are joined with the evaluation of the KLa value. Resultant the data of calculation hence it follows a computational determination of the KLa value by means of the physical matter values, the construction of devises and the process conditions.

Zusammenfassung Da in bewährten Bioreaktoren der innere Turbulenzmaßstab wesentlich größer als die Bakterienoder Hefeteilchen ist, verläuft der Stofftransport an den Teilchen nur infolge der molekularen Diffusion und hängt dabei nur von der Konzentration der gelösten Stoffe ab. Als ein bestimmendes Kriterium für die Maßstabsübertragung solcher Prozesse soll der volumetrische Sauerstoffübergangskoeffizient KLa betrachtet werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine theoretische Analyse der mit der Abschätzung des KLa-Wertes verbundenen charakteristischen hydrodynamischen Bedingungen in Blasensäulen und in Rührkesseln — des Gasgehaltes — der spezifischen Stoffübergangsfläche und — des Stoffübergangskoeffizienten durchgeführt. Als Ergebnis werden die Berechnungsunterlagen angeboten, die eine Ermittlung des KLa-Wertes ausgehend von — den physikalischen Stoffwerten, — der Apparatekonstruktion und — den Prozeßbedingungen gestatten.

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Die Kulturlösungen in den Bioreaktoren sind in der Regel feine Dispersionen in der flüssigen Nährbodenphase. Als die Hauptbedingungen f ü r die Vermehrung und eine erfolgreiche Existenz der Mikroorganismen gelten deren Versorgung mit den notwendigen Nährbodenkomponenten und die Abführung der Produkte des Stoffaustausches. Dieser Stoffaustausch (Nährbodenkomponente — Zelle — Stoffwechselprodukte) ist ein Membranprozeß auf molekularem Niveau in der flüssigen Phase. Deswegen liegt die Hauptaufgabe der Maßstabsübertragung darin, im großtechnischen Maßstab solche Stofftransportgeschwindigkeiten an den Mikroorganismen zu realisieren, die eine Limitation durch diese Vorgänge ausschließen. Eine Scherbeanspruchung von Mikroorganismen ist meistens nur bei Pilzen von Bedeutung, deren Größe mit dem Mikromaßstab der Turbulenzpulsationen der Flüssigkeitsströmung vergleichbar ist. Diese Fälle werden aber an anderer Stelle behandelt. Uns interessiert die Maßstabsübertragung mikrobieller Prozesse mit Bakterien oder Hefen, deren Größen zwischen 0,001 bis 0,015 mm liegen. Diffusionstransport an der Zelle Die Intensität des konvektiven Stofftransportes bei der Umströmung fester Teilchen hängt von ihrer Größe und der Umströmungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit ab. Ausgangspunkt f ü r die theoretische Behandlung von Mischproblemen ist die Annahme isotroper Turbulenz, das heißt die Gleichverteilung der dispergierten Teilchen im Behälterraum. Entsprechend der Theorie der lokalen Struktur der isotropen Turbulenz von Kolmogobow [1] wird der innere Turbulenzmaßstab Ä0 durch die Abhängigkeit A0 ss (r^/s) 1 ' 4

(1)

bestimmt. In Abb. 1 ist die graphische Darstellung dieser Beziehung zu sehen. Daraus geht hervor, daß die Werte des inneren Turbulenzmaßstabes bei den in belüfteten BehälN tern auftretenden Größen der Energiedissipation in wäßrigen Medien e = — sa 400 bis 4000 Wt/m 3 im Bereich von

= 0,022—0,04 mm liegen. Sie sind wesentlich größer

Abb. 1. Innerer Turbulenzmaßstab in Abhängigkeit von der eingetragenen Leistung

KUDREWIZKI, M a ß s t ä b s ü b e r t r a g u n g

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als die Mikroorganismen. Unter diesen Bedingungen werden die Turbulenzpulsationen die Mikroorganismen nicht beeinflussen. Deshalb kann als Maß ihrer Relativgeschwindigkeit nur die Absatzgeschwindigkeit angenommen werden. Da die Teilchendichte fast immer in der Nähe der Mediendichte liegt, kann diese Absatzgeschwindigkeit als nahe Null angenommen werden, das heißt die Pe-Zahl für diese Fälle ist: Pe

0

(2)

Daraus folgt, daß der Diffusionsstrom auf die Teilchen mit Gleichung (3) [2] beschrieben wird: . D-Ac Aus dieser Sicht wird deutlich, daß im realen Bereich der in belüfteten Apparaten eingetragenen mittleren spezifischen Energien, die Mediumsturbulenz keinen unmittelbaren Einfluß auf den Stofftransport an der Zelle hat. Der Stofftransport verläuft nach den Gesetzmäßigkeiten der molekularen Diffusion infolge von Konzentrationsgradienten der Komponenten zwischen der Zelle und dem umgebenen Medium. Unter den wirklichen Bedingungen mikrobieller Prozesse ist die Geschwindigkeit der Molekulardiffusion von den physikalischen Eigenschaften des Nährmediums abhängig, das von der Prozeßtechnologie vorgegeben wird. Deshalb besteht das wesentliche Ziel der Maßstabsübertragung darin, in den großen Apparaten solche Bedingungen zu realisieren, die gewährleisten, daß eine ähnliche Konzentrationsverteilung der Nährbodenkomponenten erreicht wird wie im kleineren Apparat. Bei aeroben Prozessen ist der Sauerstoff eine der wichtigsten und am intensivsten verbrauchten Komponenten des Nährmediums. Andererseits hat er aber eine sehr niedrige Absorptionsgeschwindigkeit. Die Menge des eingetragenen Sauerstoffes wird durch den Konzentrationsgradienten zwischen der Gas- und Flüssigkeitsphase multipliziert mit dem volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten KLa bestimmt, der die Absorptionsgeschwindigkeit des Sauerstoffes in die Flüssigkeit und den weiteren Transport innerhalb der Flüssigkeit infolge der Turbulenzdiffusion berücksichtigt. Wie die Analyse zeigt [3, 7], ist die Absorptionsgeschwindigkeit um einige Ordnungen niedriger als die Geschwindigkeit der Turbulenzdiffusion in der flüssigen Phase. Da durch die Turbulenzdiffusion der Transport aller anderen Elemente der Nährlösung realisiert wird (Analogieschluß), kann die Geschwindigkeit der Sauerstoffabsorption als limitierender Faktor aerober mikrobieller Prozesse betrachtet und als entscheidendes Kriterium für die Maßstabsübertragung angenommen werden. Dabei wird davon ausgegangen, daß der KLa-Wert die entscheidende Größe ist, da der Sauerstoffkonzentrationsgradient sich leicht ermitteln läßt. Diese Meinung steht nicht im Widerspruch zu den Aussagen einiger Untersuchungen [9, 11], die auch zeigen, daß der KLa-Wert in belüfteten Systemen mit der Vergrößerung des Apparatevolumens sinkt. Diese Erscheinung wird durch die Koaleszenz der.- Blasen erklärt. Da die Koaleszenztheorie noch unzureichend entwickelt ist [9], scheint* es noch nicht möglich zu sein, alle negativ wirkenden Effekte, die bei der Maßstabs Vergrößerung eine große Rolle spielen können, abzuschätzen. Das alles zusammen kariri iri vielen Fällen die Maßstabsübertragung sehr erschweren. Diese Schwierigkeiten können zum großen Teil mittels einer der folgenden Methoden überwunden werden: 1. durch Zugabe koaleszenzhemmender Stoffe (diese sind in der Regel in den Reaktionsmedien schon enthalten) und 2. durch die Sicherung einer bekannten, für die Erzeugung entsprechender Blasengrößen notwendigen Turbulenz, über die Höhe des Reaktors.

Bei dem angegebenen Vorgehen wird es möglich, die Größenordnung der Blasen abzuschätzen [3,6, 12] und folglich eine theoretische Ermittlung des KLa- Wertes in Abhängig-

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keit von den physikalischen Eigenschaften der Medien und den hydrodynamischen Bedingungen vorzunehmen. Auf dieser Grundlage ist es schwer, den Pessimismus in bezug auf die Möglichkeit der theoretischen Abschätzung des KLa-Wertes wegen der noch unzureichenden Kenntnisse zum Koaleszenzverhalten der Blasen [9] zu teilen. Dieser Pessimismus [9] ist um so mehr unberechtigt, wenn es um Systeme geht, in denen keine Blasen vorhanden sind, das heißt, der Sauerstofftranport durch die Flüssigkeitsoberfläche erfolgt [7]. Im industriellen Maßstab werden die mikrobiellen Prozesse in zwei Haupttypen von Apparaten durchgeführt: 1. in Rührkesseln und 2. in Blasensäulen. Das Problem der Vorausberechnung des KLa-Wertes in diesen Apparatetypen wird uns weiterhin beschäftigen. Dafür wird eine Beschreibung des hydrodynamischen Zustandes benötigt. Gasgehalt Der Gasgehalt (hold up) ist ein wichtiger Prozeßparameter. E r beeinflußt sowohl den Füllgrad des Apparates als auch die Stoff transportfläche. Für die Ableitung einer Beziehung wird wieder davon ausgegangen, daß sich das Gas-Flüssigkeits-Gemisch im turbulenten Bereich der Mischung im quasiisotropen Zustand befindet. Aus der Bilanz der potentiellen Energie des Gases und der kinetischen Energie der Flüssigkeit erhält man: rr,

1

1 — 9?

17/2/3

(4)

2 {g • Z)1/3 q — g'

Die einzige unbekannte Größe in dieser Gleichung ist der Pulsationsmaßstab l, der dem Blasendurchmesser etwa gleich angenommen werden kann: Irvd

(5)

Im allgemeinen ist der Makromaßstab der Turbulenz dem Apparatedurchmesser proportional : L ^ ^ d ,

(6)

Für die Fälle, wo der Blasendurchmesser kleiner als der Makromaßstab der Pulsationen ist, das heißt, für d

-i- dlt wird der Gasgehalt mit der Formel (7) bestimmt:

2 (g • d)1*

1 -KHJiH, HTO KJIGTKH pacmenjiHioT lacTii CHHTe3Hp0BaHH0ii A T O , HTOSH HMeTb 3anac MOIHHOCTH A T P - n p 0 H 3 B 0 A H m H x MGxaHH3MOB Ha cjiyqati pe3Koro nOBHmeHHH Heo6xoRHMOCTH KJIGTOK B HonoJiHHTeJibHoit 3HeprHH. 9TH ?Ke aBTopH npeflnojioHinjin, ITO 3aTpaTH cy6cTpaTa Ha TO, ITO y Hac o6o3HaneHo KaK I I K C ) ^ , cKjia^HBaioTCH H3 IIOCTOHHHOÌÌ cocTaBJiHiomeii H cocTaBJiHiomeii nporiopijjioHajibHoii yfleJibHoii CKopocTH pocTa : w5 =

ws0 +

msllu

(10)

B TepMHHax MaTepiiajibHo-SHepreTHHecKoro SajiaHca STO npennojio?KeHHe onHCHBaeTCH cjie^yioiuHM ypaBHGHHeM : Xm =

X o+XiV>

(11)

128

A c t a Biotechnol. 4 (1984) 2

rfle X» HMeeT paaMepHOCTt 3KB. M 9 C / 3 K B . RO HAJIHIHOII SiioiviaccH B q a c , T. e . n a c - 1 a xo, NO^oÔHO BKB. MBC/BKB. BO (T. e . 6 e 3 p a 3 M e p H o ) . Tor.ua a j i h HMeeM: me

=

meo

m

+

(12)

e i

r«e

VpCp

m

« =

+

Vres(l

—

Cp —

Cox)

— — T T — , — t ~ \ VpCp + V r e 3 ( l — Cp — Cox)

— COOTBeTCTBeHHO IIOCTOHHHaH COCTaBJIHIOIHaH 3aTpaT RO Ha N K O F L H K03(|»(|)HHHeHT HX B03PACTAHHH C YBEJIHIEHHEM ¡I. YPABHEHIIE (5) n p i i o ö p e T a e T BHJ;: 1

=

n

+

(15)

Vm

ft

r«e —

= —

Vm

+ mel

Va

MaKCHMajiLHMH n o

¡J.

(16)

aHepreTHHecKHH BHXOJJ ô n o M a c c u . GOOTBGTCTBGHHO ieckne napaMeTpti pocTa Hansenula KynbTHBHpoBaHHH Ha pa3HHx cyScTpaTax.

pólymorpha

D L - 1 npw

CyScTpaT: aTaHOJi

«

x V m

0,650 0,0111 0,373 0,0193

msa ( l a c - 1 ) Vm m e 0 (qac- 1 )

rjii0K03a ± ± ± ±

0,006 0,0005 0,004 0,0009

0,522 0,0214 0,585 0,0190

± ± ± ±

MGTaHOJI

0,005 0,0005 0,006 0,0004

0,425 0,0230 0,312 0,0310

± ± ± ±

0,012 0,0040 0,009 0,0050

O 3aBHCHMOCTH HJIH He3aBHCHM0CTH OT BHeiIIHHX yCJIOBHH H, B HaCTHOCTH, OT ití. noCTaBJien Hawñojiee K0ppeKTH0. B OTJiHHHe o t % m , BejiHHHHa m e 3aBHCHT He t o j i b k o o t caMoro n p o n ; e c c a nonflepjKaHHH, h o h o t n p o i ; e c c o B nonyHeHHH M 3 C H3 pe;;0KC0H0B cyScvrpaTa, n o c K O J i t K y m e BKJiiOHaeT b c c 6 n xapaKTepHCTHKy o k m c .ji m t e Ji b 11 o r o (|»oc«j)opHJiHpoBaHHH y r e s =

— P / O , cyScTpaT¿i Horo'(|)oc(J)opHJiHpoBaHHH ipp h K03t|>HiíHeHTOB noflAepJKaHHH — a j i h rjiioK03H H aTaHOJia 0flHHaK0Bbi — OKOJIO 0 , 0 2 q a c - 1 . B TO ?Ke BpeMH a j i h MeTaHOJia m e 0 = 0 , 0 3 i a c _ 1 , HTO B 1 , 5 p a 3 a Btrnie npeHHflymero 3HaqeHHH. OSiHCHeHHe 3TOÍÍ pa3HHu;bi, Ha Hani B3rjiHfl, COCTOIIT B cneAyiomeM: OKHCJieHne MeTaHOJia B (JopMaJiLflerHA y npojKHteií npoH3Bo^HTCH MeTaHOJioKCHflasoii [ 2 3 , 2 4 ] , .neñcTBHe KOTopoñ, c o r j i a c H o coBpeMtHHtiM npeACTaBJieHHHM, He CBH3aHo c 0 6 p a 3 0 B a H n e M A T P . C o r n a c H o ypaBHeHHio OKHCJieHHH 2 C H 3 O H + 0 2 - > 2 C H a O + 2 H 2 0 , ^ B a peaoKCOHa MeTaHOJia H3 rnecTH B p e 3 y j i b T a T e BTOH peaKi^HH BHepreTHiecKH o6ecii;eHHBaioTCH. OTCio^a Coz = Cp =

-5- • KoJiHnecTBO opraHHqecKHx nposyKTOB b o B c e x c j i y i a a x 6bijio MaJio, T a n qTO O 0 . T o r ^ a , c o r j i a c H o ( 1 3 ) , Ha OTaHOJie h n a r j i i 0 K 0 3 e : —

(19)

Xm/fiest

a Ha MeTaHOJie Ko

=

XmlbPres (1 ~

Cw)]

(20)

( 3 A e c b npHHHMaeTCH, h t o Xm H Vres b o B c e x c n y i a n x oanHaKOBu). OTHomeHne KoatJnJ)i^HeHTa noflAepJKaHHH a j i h MeTaHOJia k b t o í í »te bcjiu^iuho jt,jih 9TaH0Jia h r j n o K o a H miQ' p a B H o : 1 1 -

3 ío.

2

(21)

TeopeTHiecKoe OTHOHieHHe ( 2 1 ) c o B n a a a e T c aKcnepHMeHTajitHHM, nojiyieHHBiM b flaHHoñ paooTC. 9 t o bo b c h k o m c j i y i a e aoKastiBaeT, i t o 0TH0meHHe nocTonHHoro cjiaraeMoro cKopocTH pacxona A T P

Ha noflflepJKaHHe

k ai|)(|)eKTHBH0CTH oKHCJiHTejibHoro «Joc-

133

M y T A f O B , MHHKEBHH H Rp., 9(|)eKTHBH0CTb pOCTa

(|»OpHJIHpOBaHIIH iiocKOJibiîy

A

^)RES (T. e .

Xohrts)

noflAepHîaHHe

H a

BHmeyKaaaHHBix

B C e x

KJIGTOK H

OKiicjiHTejibHoe

cy6cTpaiax

ojpiHaKOBO.

oci|)opHJiHpoBaHHe

—

coBep-

meHH.o p a 3 H b i e n p o q e c c b i , TO MaJiOBepoHTHO K o p p e j i n p o B a H o e H3MGHGHHG H % M , H IPRES.

H.

CjiGflOBaTeJiBHO, MOHÎHO, H a H a n i B s r j i H H , C^EJIATB BLIBOA O TOM, I T O y K y j i t T y p t i morphe*Ta pocTa,

lacTb

oflHHaKOBa n p n

HTO n a c T O

B

HMeeT

ÔHOMaccH

Ha

A T P

nonsepjKaHHe, KOTopan

He 3 a B n c n T OT

p o c T e Ha r j i i 0 K 0 3 e , 9TaHOJie H MeTaHOJie;

06pa30BaHHH

8(J)(J)6KTHBHocTb

RO

pacxoflOB

MecTO

y

B

A T P

,n;po?K?Keii,

nHxaTejibHoö TO

yres = 1

n,enH.

H

o/jHHaKOBa T a K w e

ECJIH n o j i o i K H T b P / O

%0 = 0 , 0 2

nac-1

(MOJib

JiHTepaType

BCTpenaeTCH e m e

m y i o 3aTpaT A T P

H 2,

ATP/SKB.

o/jHa o i j e H K a 3 a T p a T

H a noiCTepsKaHHe —

w

abyb

A T P

(MOJib

cocTaBJiHio-

Ha I I K c D f l . C o r j i a c H O [9],

»»ATP =

(22)

Xo

=

1 , 8 (TRÓJI. 2 ) , H a x o j j H M n n a

A T P / r i a c . 9TO cooTBeTCTByeT

^aHHOii

KyjibTypbi:

mATP =

3

HHîKHeMy n p e a e j i y m A T P , c o r j i a c n o s u a i e H H H M ,

B p a o o T e [4] ( c T p . 88). CjiejiOBaTCJiBHO, K y j i b T y p a OpraHH3MâM

=

B nac).

A T P / r Ô H O M a c c H B n a c ) [ 4 ] . OTOBHAHO, 3TH nwifipbi O T p a a t a i O T n o c T O H H H y i o

rioflCTaBJiHH

poly-

CKopooTH

C HHTeHCHBHOCTbK)

npOIjeCCOB

H.polymorphe/,

nOHnepjKaHHH,

MMOJtb ^aHHbiM

iipMHaaJieîKiiT K M i i K p o -

ÖJIH3KOH

K

M M H H M a JIL11G H

( e c j i H HMeTb B B H f l y nocTOHHHyK) c o c T a e j i n i o i n y r o 3THX n p o u ; e c c o B ) .

3.

PHC.

3aBHCHMOCTb Bbixo^a

CTpaTa

(r/r)

ÖHOMaccH

OT yflejibHOii CKopooTH

H. polymorpha

pocTa

113

opraiiHiecKoro

npH BHpamHBaHHH Ha rnioKcme

cy6(•)

H 3TAHOJIE ( o ) ,

H H 3 K A N HHTEHCHBHOCTB 3 A T P A T HA n o / M E P W A H I I E n p o H B J i n e T C H B TOM, I T O HX BJIHHHHE H a BHXOJJ G n o M a c c H OÔHAPYÎKHBAETCH JIMITIB B oÖJiacTw BECBMA HH3KHX 3HANEHHH CKOpOOTH p O C T a fi, ( p H C . 3 ) . O ï M e T H M , I T O C 3THM CBH3aHH 3 a T p y R e H H H n p H 3 K C n e p H M e H T a j I b HOMonpe^ejieHHfi w

j 0

H»,

0

n o onncaHHOËMeTOjjHKe. B c a M O M ; j e j i e , y î K e n p n l a =

B e j i H q H H a B H x o ^ a M a j i o OTJUMAETCH OT C B o e r o M a K c i i M a n t H o r o PaccMOTpHM 3aHHyio

Tenepb

flaHHHM

MaKCHMajibHyio

BHepreTtwecKyio

MHKp00praHH3M0M Ha T p e x

3(|)f|ieKTHBHOCTb

pasjiHMHbix

p o c T a r¡m,

cyÔOTpaTax.

Ha

cooTBeTCTByromeñ

a

Ha

MeTaHOJie

BHepreTHiecKHMH

BHXony

no

Macee

Ys =

STAHOJIE MaKCHMaJibHHii em;e

HHJKe

(r\ m =

CBOiicTBaMH

0,312).

0,50—0,53,

KOTopnä

AHEPRETHNECKHÖ CooTHomemie

MeTa6ojiH3Ma

aaHHtix

qacTO

BeramHH

cyôcTpaTOB.

flJiH

r¡m

0,6—0,65,

jjocTHraeTCH

BHXOJI; HHTTÎE (r¡m STHX

noKa-

rjii0K03e

0 , 5 8 5 . 9 T O 6JIH3KÛ K H a H Ô o j i b H i e f t p e a j i b H O HOCTHRAYTOH B o i i b i T a x BEJIHIHHE

Ha rjiK»K03e. H a

0,ltiac^1

sua^eira«.

=

0,372),

o6î>HCHHeTCH cooTBeTCTByio-

134

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

mero aHamraa B0cn0Jib3yeMCH 3aK0H0MepH0CTHMH BHyTpuKjieTOiHoro MaTepiiajiLHOBHepreTHHecKoro GajiaHca. B o B c e x c j i y i a n x p o c T K y j i b T y p u He conpoBOwt^ajicH CHHTe30M 3aMeTHoro

KOJiniecTBa

opraHHiecKHX npoflyKTOB, ITO oaHanacT: = 0 . Ftpn pocTe Ha rjii0K03e H 9TaHOJie, corjiacHO 6HOXHMHH6CKHM ,n,aHHLiM, 0KCH,NA3H H OKCHREHA3M HMBKOMOJieKyjinpHbix MeTaSonHTOB He iirpaiOT 3aMeTHoft pojtn B MaTepiiajitHOM ôajiaHce flpoHíJKeñ. IIooTOMy AJÍ H rjiK)K03i>i H 3TaH0Jia Cox =

Vg =

0. C o r j i a c H o (6),

fTZ Vres + Wb

(23)

T o r n a H3 (16): ±

=

f

I

i

± n

l

+

m

e

i

=

1

Vres

Vm

+

n i

t

(24)

Wves

rfle Vb = Wb +

yres

(25)

KajKymnecH 3aTpaTH A T P Ha KOHCTpyKTHBHHft oöivieH npn pocTe Ha 3TaHOJie H rjii0K03e. Ms (24) : Wb = Vres f — -

lì

(26)

K a n yme roBopnjiocb, ajih MeTaHOJia Cox = -5- • Tor.ua, corjiacHo (6) h (16): ó r¡ a = 1

=

»?m i?,=

~ íox) Vres + Wb Vres + Wb Vres(l ~ tox)

(27) m

i =

"

Vres + W

^

Vres(l ~ Cox)

~ y , Vres + Vi)

(29)

y r e , ( 1

r«e Vf>" = V¡> + KasKymnecH

3ATPATBI

m

ATP

e l Vres (1 — Cox) HA K O H C T P V K T H B H L I Ü

Wb" = Vres ( — — M \ Vm /

(30) oßsieH npn pocTe

HA METAHOJIE.

H3 (28): (31)

3HaqeHHe tp rts , Kan j m e roBopnjiocb, MOSKHO npHHHTb paBHUM 1. T o r n a , Hcnojib3yH (26) H (31), MOJKHO BHHHCJIHTb KaHíymHeCH 3aTpaTHATP Ha CHHTe3 ÖHOMaCCH H3 rjiioK03H H 3TaH0Jia h H3 MeTaHOJia ipb". 3aTeM I H nonHTaeMCH cpaBHHTb STH BejiHiHHH Ha ocHOBe naHHbix o MeTa6oJiH3Me cooTBeTCTByiomHx cyßcTpaTOB. fljiH TJIIOK03H yi¡,' = 0 , 7 1 , «jih aTaHOJia y>t,' = 1 , 7 0 , hjih MeTaHOJia = 1,14. PacciHTaHHHe CTAYTXAMEPOM [25] 3aTpaTH A T P Ha CHHTe3 BemecTBa ÖHOMaccH h3 rjiioK03bi nocjie nepecieTa Ha penoKcoHH naioT ^¡> = 0 , 2 [9], T o r n a H3 (25) nojiyiaeM, TTO «JIH pocTaH.polymorphaHa rjii0K03e mel = 0 , 5 1 , m e = 0 , 0 2 + 0 , 5 1 fi. ü p n ¡i = 0 , 1 n a c r 1 3 a T paTH Ha noHnepœaHHe, 3aBHCHMLie OT CKopoera pocTa (meif¿) B 2 , 5 pasa npeBHiiiaioT nocTOHHHHe 3aTpaTH m e 0 . IlpH 6ojiee B H C O K H X fi STO OTHOiueHHe eme 5ojiee B03pacTaeT. Pa3yMeeTCH, nocTOBepHOCTb 3HaieHHH m e l 3aBncnT OT A0CT0BepH0CTH ônoxHMHiecKHx pacieTOB, naiomnx BejiHiHHy ipb.

MyTAon, MHHKEHH'I H Ap., 9ij>eKTHBH0CTb pocTa

135

^ J I H METAHOJIA, K a K BHAHO H3 ( 2 9 ) , B e j i n i H H a rj m HHHIE, NEM «JIH r j i r o K 0 3 H , B O - n e p B H x ,

H3-3a noTepn 1/3 SHepruw B METAHOJIOKCHFLASNOH peaKijHH, H, BO-BTOPHX, H3-3a Toro, HTO BeitHHHHa FF," npeBHinaeT . CFLEJIAEM nonHTKy oijeHHTb pa3JiHine IPB Ha r.nroK03e H ipb" Ha MeTaHOJie Ha 0CH0BaHHH jT,aHHHx o MeTa6ojiH3Me MeTaHOJia. Y apoHUKett po,na Hansenula KOHCTpyKTiiBHLiii OÖMGH Ha MeTaHOJie nocjie HecKOJitKux HaiajibHHX peaKipift n p H x o f l H T K TEM 5KE n y T H M , HTO H RJIH rjii0K03H: (FIOPMAJIT^ERMJ], n p e B p a m a e T C H B WIM-

u;epajibnerHfl(j)00(|iaT G A P no cxeMe [26]: 3HCHO +

3ATP -> GAP +

MooieKyjia H C H O CONEPJKHT 4 RO

3ADP +

3Pi

H 3aTpaTH A T P Ha 1 RO

B STOH peaKijirii p a B H H 0 , 2 5 .

H a rjiK>K03e me 3ATPATH A T P HA NYTH OT C 6 H 1 2 0 6 FLO G A P COCTABJIHIOT 1 MOJIL A T P HA MOJib

rni0K03H, T. e. Ha 24 RO,

paccHHTaeM

y>t," ( c y M M a p H t i e

HJIK OKOJIO 0 , 0 4 A T P / A ' O .

3aTpaTH Ha

Mcnojib3yH STH ijHpbi,

KOHCTpyKTHBHHft ooivieH

H 3aBHCHMoe

/j, noHAepiKaHHe Ha MeTaHOJie), i i c r i o j i b s y f i aHaJiorHHHyio B e j i n i H i i y Ha rJiK>K03e n p c f l n o j i a r a n , I T O XI HMÖGT B OÖOHX o i y i a n x 0,71 +

0,25 — 0,04 =

O^HO H TO ate a H a i e m i e .

OqeHKa

OT H y>b":

0 , 9 2 . BEJIHIHHA 0,92 OTHOCHTEJIBHO 6JIH3KA K HAFTNEHHOMY B H m e

3HaieHHio 1,14, H 9TO MOJKHO paccMaTpnBaTb KaK a p r y M e H T B n o j i b a y CACJiauHtix BUine NPE^NOJIOSKEHHH H pacieTOB. OöiHCHeHHe

BEJIHHHHBT y>b' =

1 , 7 0 JIJIH 3TAH0JIA HBJIHGTCH Haußojiee TpyuHHM.

npHHHTb ßJiH m e l Ty Hie BejiHHHHy 0 , 5 1 , a HJIH y>Tes = I T O HCTHHHHE 3ATPATBI A T D 8KB. RO. ifb =

HA 6HOCHHT63, ipb, PABHH 1,70 — 0,51 ^

1,2 3KB. A T P /

P a c i e T , cnenaHHbift B ( 2 5 ] SJIH yKcycHOii KHCJIOTLI, nocjie nepec^eTa n a

0,6 [9],

ECJIH npeflnojio>KHTb, HTO 3aTpaT£i A T P

ROaaeT

Ha KOHCTpyKTHBHHft oÖMeH Ha

3TAH0JIE H HA yKcycHOii KHCJIOTE 0,N,HHAK0BH, TO HA ATAHOJIE m e l = BOBMOJKHO HBOHKOe OÖtHCHGHHG BGJIHHHHH xpb =

ECJIH

1, TO corjiacHO (25) nojiyqaeTCH,

1,70 — 0,6 =

1,1.

1,70.

1) y>b fleHCTBHTenbHO paBHO 1,2. ^BOftHoe n p e B H i n e H H e 3TOM B e j i n i H H H Haj], 3HaieHHeM tpb flJIH yKcycHOii KHCJIOTH, B03M0JKH0, CBH3aH0 C yCHJIGHHHM OÖM6HOM C 0 2 MeJKfly KJieTKOH H cpe^OH, KOTopuH HM6GT MecTO Ha CHJibHo BoccTaHOBJicHHtix cyßcTpaTax ( H a n p H M e p , y r j i e B O f l o p o f l a x ) . K a K H3BecTHO, p e a K i j H H KapßoKCHjmpoBaHMH ii^yT c saTpaTOii 2 A T P Ha MOJib C 0 2 . 2) O y T H J i b H a « flHCcnnaijHH Ha 3TaH0Jie y s e j i H ^ e H a n o cpaBHeHHio c « p y THMH cyßcTpaTaMH. 0 6 a oöiHCHeHHH HOCHT rnnoTeTHHecKHii x a p a K T e p H HyjKRaiOTCH B CTporoM ÖHOXHMHHecKOM oßocHOBaHHH.

B JIIOÖOM cJiyiae BEJIHQHHA y b

KjiroqoM K noHHMaHHio

MHornx

Toro,

noieiviy

y

MHKP00PRAHH3M0B

MOHteT ÖHTb

anepreTHqccKiiii

BLixofl Ha aTaHOJie 3aMeTH0 HH?Ke, neM Ha y r i i e B O ^ a x . I l p H B e n e H H H e B H i n e pe3yjibTaTH noKa3HBaioT, HTO MaTepnajibHO-aHepreTHqecKHe n o K a 3aTejiH MeTa6oJiH3Ma MO?KHO p a 3 « e j i H T b Ha «BE r p y n n H . 0 « H a H3 HHX, H a n p H M e p , 3aTP A T H A T P HA CHHTE3 BEMECTBA 6NOMACCH H3 CYÖCTPATA, 3ABHCHT OT XIIMH^CCKOM n p i i p o f l H cyöcTpaTa. ^ p y r n e me He 3aBHOHT OT c y ß c i p a T a H MoryT paccMaTpHBaTbcs KaK yHHBepcanbHHe (j)H3HOJiorHiecKHe KOHCTaHTti. K n o c j i e « H H M npHHaflJiesKHT He CBHaaHHa« co CKopocTbio pocTa KOHCTaHTa p a c x o f l a A T P Ha n o j w e p j K a H n e KTOTOHHOH ßnoMaccbi. CoBMecTHHß aHajiH3 AAHHHX, n o J i y i e H H H X

B ßnoxHMnqecKHx

HCC.neaoBaHHHX H n p n

KyjibTHBHpoBaHHH MHKp00praHH3M0B, CTaa B03M0?KeH Ha 0CH0Be MeTOfla MaTepnajibHo3HepreTHiecKoro ßaJiaHca.

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4

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2, 1 3 7 - 1 4 1

Untersuchungen zur Anreicherung von Ubichinon-9 aus Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktionen mittels Sephadex LH-20 B . VOIGT 1 ), H . REUTGEN 2 ), M. WOBBS 1 ) u n d I . SESSER 2 ) Akademie der Wissenschaften der DDR 1 ) Institut für technische Chemie Leipzig 7050 Leipzig, Permoserstraße 15 Forschungsinstitut für Lungenkrankheiten und Tuberkulose2) 1115 Berlin-Buch, Karower Straße 11

Summary Sephadex LH-20 was tested for a potential application in the enrichment of ubiquinone-9 from a lipid-hydrocarbon-extract. The lipid-hydrocarbon-extract was isolated from yeast grown on gas oil (b. p. 240 to 380 °C) as carbon-source. The main components of the lipid-hydrocarbonextract were phosphatides, glycerides, fatty acids, and hydrocarbons of gas oil. By use of Sephadex LH-20 and CHC1 3 /CH 3 0H (2:1) as eluent it is possible to concentrate the whole ubiquinone-9 in a special fraction both directly from the lipid-hydrocarbon-extract and from the aceton-soluble part of the extract. The concentration of ubiquinone in the special fraction was ten times higher than in the rawmaterial and the hydrocarbons were separated completely. Ubiquinone-9 can be obtained by a simplified separation from the enriched fraction.

Ubichinone sind in aerob kultivierten Mikroorganismen im Vergleich zu anderen biologischen Ausgangsmaterialien in relativ hoher Konzentration enthalten [1]. Nach Shimizu u. a. ist für die Ubichinonbildung ein Kohlenwasserstoff-Substrat besonders günstig. So wiesen sie bei Kultivierung von .Candida tropicalis pK 233 auf Kohlenwasserstoff den 3fachen Ubichinongehalt gegenüber einem Wachstum auf Glukose nach [2]. Die aus kohlenwasserstoff-utilisierenden Mikroorganismen gewonnenen Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktionen stellen somit ein gutes Ausgangsmaterial für die Gewinnung der Ubichinone dar [3]. Dieser Tatsache steht gegenüber, daß eine Isolierung der Ubichinone aus Lipid-Kohlen Wasserstoff-Fraktionen durch den hohen Anteil an Unverseifbarem — bedingt durch die Kohlenwasserstoffe — besonders aufwendig ist. Stellen die Kohlenwasserstoffe n-Alkane dar, dann ist ihre einfache Abtrennung aus dem Unverseifbaren vor der säulenchromatographischen Reinigung durch Ausfrieren aus Aceton möglich [4]. Setzen sich die Kohlenwasserstoffe jedoch aus den verschiedenen Stofftypen des Erdöldestillats zusammen, dann ist eine Abtrennung nicht mehr in dieser einfachen Weise möglich. Wir suchten deshalb nach einer Methode, die die Anreicherung der Ubichinone unter Ausschluß von Stoffwandlungsprozessen bei gleichzeitiger weitgehender Abtrennung der Kohlenwasserstoffe gestattet. Sephadex LH-20 wird sowohl zur Fraktionierung von neutralen Lipiden [5] als auch von Erdöldestillatfraktionen [6] herangezogen. Da die Trennwirkung von Sephadex LH-20 vorzugsweise auf Unterschieden in der Molekülgröße und -struktur beruht, wurde eine Anreicherung von Ubichinon-9 aus Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktionen, die sich aus Lipiden und Kohlenwasserstoffen des Erdöldestillats im Molekulargewichtsbereich von 150—800 (Tab. 1) zusammensetzen, an diesem Trennmaterial untersucht.

138

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

Tab. 1. Zusammensetzung der Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion (isoliert aus Lodderomyces elongisporws IMET H 128) Stoffgruppe

qualitative Zusammensetzung innerhalb der Stoffgruppen

Molekulargewichts-Bereich

Erdöldestillat-Fraktion

n-Paraffine, iso-Paraffine, Naphthene, Aromaten, Heterocyclen u. a.

150-300

Phosphatid-Fraktion

Phosphatidylcholin, -serin, -ethanolamin, Lysophosphatide u. a.

550-800

Fettsäure-Fraktion

Kettenlänge C12—C18

200-300

Glycerid-Fraktion

Triglyceride Diglyceride Monoglyceride

~ ~

Sterol-Fraktion

Ergosterol Ergosterolester

~ 400 ~ 600

Ubichinon-Fraktion

Ubichinon-9

~

800 600

~ 300

800

Material und Methoden Für die Untersuchungen wurde eine Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion eingesetzt, die aus Biomasse des n-Alkane utilisierenden Hefestammes Lodderomyces ebngisporus IMET H 128 (gezüchtet auf Erdöldestillat der Siedelage 2 4 0 - 380°C) gewonnen wurde [3], Der acetonlösliche Anteil wurde aus der Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion durch Behandlung mit dem doppelten Volumen Aceton isoliert. Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion und acetonlöslicher Anteil wiesen die in Tab. 2 angegebene chemische Zusammensetzung auf. Tab. 2. Quantitative Zusammensetzung von Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion und acetonlöslicher Fraktion

Kohlenwasserstoffe Phosphatide freie Fettsäuren und Glyceride Ergosterol (Esteranteil < 10%) Ubichinin-9

LipidKohlenwasserstoffFraktion

Acetonlösliche Fraktion

44,0 Gew.-% 37,0 Gew.-% 18,0 Gew.-% 0,7 Gew.-% 0,16 Gew.-%

65,0 Gew.-% 5,5 Gew.-% 29,0 Gew.-% 0,94 Gew.-% 0,25 Gew.-%

F ü r die Säulenchromatographie wurde eine Chromatographiesäule mit 400 ml Säulenvolumen (2,6 X 75,0 cm) verwendet. Als Säulenfüllung wurde Sephadex LH-20 (Fa. Pharmacia Fine Chemicals Uppsala), als Elutionsmittel CHC1 3 /CH 3 0H (2:1) eingesetzt. Bei einer Tropfgeschwindigkeit von 3—4 ml/12 min erfolgte die Detektion mit einem Uvicord der Fa. LKB-Produkter AB, Stockholm, bei 254 nm. Die chromatographische Auftrennung wurde bei 10°C durchgeführt. Die analytische Charakterisierung der isolierten Fraktionen erfolgte dünnschichtchromatographisch an Kieselgel/Kieselgur 50/50. Als Laufmittel wurde Benzen/CHC1 3 1:1, als Sprühreagens 70%ige H 2 S0 4 verwendet.

139

VOIGT, REIJTGEN e t al., A n r e i c h e r u n g v o n U b i c h i n o n - 9

Ubichinon-9 wurde nach alkalischer Hydrolyse des Probematerials aus dem unverseifbaren Anteil über die Farbreaktion mit Cyanessigsäureethylester im alkalischen Milieu photometrisch bestimmt [7]. Ergebnisse und Diskussion An Sephadex LH-20 wurde mit dem Elutionsmittel CHC1 3 /CH 3 0H (2:1) eine Auftrennung der Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion sowie des acetonlöslichen Anteils der LipidKohlenwasserstoff-Fraktion vorgenommen. Die Abtrennung der acetonunlöslichen Phosphatide vor der säulenchromatographischen Fraktionierung wurde für zweckmäßig gehalten, da die Phosphatide dem Ubichinon-9 im Molekulargewicht (Tab. 1) am nächsten stehen und einfacher durch Acetonfällung als durch ein säulenchromatographisches Verfahren abgetrennt werden können. Letztere Annahme wurde durch die Ergebnisse der Auftrennung bestätigt. Bei der Fraktionierung des acetonlöslichen Anteils wurde im Vergleich zur Fraktionierung der Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion ein einfaches Chromatogramm erhalten (Abb. 1, 2). Die dünnschichtchromatographische f \

E 2Si

JI

S M

100

150

IV

1

ZOO 250 E/ufionsyolumen im/1

300

Abb. 1. Fraktionierung einer Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion an Sephadex LH-20

Etutionsrolumen (/71U

Abb. 2. Fraktionierung einer acetonlöslichen Fraktion an Sephadex LH-20.

140

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

Untersuchung ergab, daß bei beiden Versuchen Ubichinon-9 lediglich in Fraktion I I nachgewiesen werden konnte (Tab. 3, 4). Dieses Ergebnis wurde durch die quantitative Bestimmung bestätigt. I n Fraktion I I wurde das gesamte Ubichinon-9 wiedergefunden. Die Anreicherung betrug dabei ca. den lOfachen Wert gegenüber dem Ausgangsprodukt. Wesentlich war neben dieser Anreicherung die Tatsache, daß in der ubichinonhaltigen Fraktion keine Kohlenwasserstoffe nachweisbar waren. Die Anwendung Tab. 3. Stoffliche Zusammensetzung der an Sephadex LH-20 aufgetrennten Lipid-Kohlenwasserstoff-Fraktion (vgl. Abb. 2) Fraktion

Komponenten

I

Phosphatide

II

Ubichinon-9, Phosphatide, Triglyceride

III

Diglyceride, Fettsäuren, Phosphatide, Wachse, Kohlenwasserstoffe

IV

Ergosterol (Hauptmenge), Diglyceride, Monoglyceride, Kohlenwasserstoffe

V

Ergosterol (geringe Menge), Kohlenwasserstoffe

VI

Kohlenwasserstoffe

von Sephadex LH-20 bietet damit die Möglichkeit, Ubichinone anzureichern und gleichzeitig vollständig von den Kohlenwasserstoffen abzutrennen. Da die Ergebnisse bei Verwendung des acetonlöslichen Anteils besonders günstig waren, wurden weitere Untersuchungen nur noch auf die Anreicherung von Ubichinon-9 aus dieser Fraktion konzentriert. Dazu wurden neben Methanol noch verschiedene Chloroform/MethanolGemische in den Verhältnissen 1:2, 1:1 und 2:1 eingesetzt und eine Mehrfachaufgabe des acetonlöslichen Anteils vorgenommen. Diese Untersuchungen brachten jedoch keine Verbesserung der Resultate. Wir versuchten deshalb, durch weitere Auftrennung von Peak I I eine höhere Ubichinonanreicherung zu erhalten. F ü r diese Untersuchungen wurden neben dem acetonlöslichen Anteil noch Lipidfraktionen eingesetzt, bei denen Tab. 4. Stoffliche Zusammensetzung der an Sephadex LH-20 aufgetrennten acetonlöslichen Fraktion (vgl. Abb. 1) Fraktion I II III

Hauptkomponenten Phosphatide Ubichinon-9, Triglyceride, Phosphatide Kohlenwasserstoffe, Ergosterol, Diglyceride, Monoglyceride, Fettsäuren

nach der Abtrennung der Phosphatide ein Teil der Kohlenwasserstoffe und leichtflüchtigen Lipide destillativ (p = 10 Pa, t = 160 °K) entfernt wurden und Ubichinon bereits in angereicherter Form vorlag. Diese Verfahrensweise wählten wir, um bei höheren Ubichinongehalten den Anreicherungseffekt deutlicher als bei den sonst verwendeten Proben herauszustellen (Tab. 5). Die wiederholte Chromatographie von Peak I I zeigte bei allen Proben, daß durch weitere Fraktionierung keine höhere Ubichinonanreicherung erreicht werden kann. Wir schlußfolgerten aus diesem Ergebnis, daß mit den in Abb. 1 und 2 dargestellten

141

VOIGT, REUTGEN e t al., A n r e i c h e r u n g v o n U b i c h i n o n - 9

Tabelle 5. Auftrennung der ubiohinonhaltigen Fraktion (Peak II) an Sephadex LH-20 Elutionsmittel: CHC1 3 /CH 3 0H (2:1) Einsatzprodukt

Ubichinonhaltige Fraktion (Peak II)*)

Ubichinonhaltige Fraktion nach Fraktionierung

Aufgabemenge (mg)

Ubichinonfraktion (mg)

Acetonlösliche Fraktion 330 (Ubichinon-Gehalt 0,25%)

Ubichinongehalt

(mg)

(%)

6,9

2,1

Ubichinongehalt (mg)

(%)

305

6,8

2,2

Acetonlösliche Fraktion nach tw. Kohlenwasserstoff-Abtrieb (Ubichinon-Gehalt 1,3%)

480

24,6

5,1

I II**) III

133 112 249 494

2,6 6,3 12,0 20,9

1,9 5,6 4,8 0 4,3

Acetonlösliche Fraktion nach tw. Kohlenwasserstoff-Abtrieb (Ubichinon-Gehalt 2,0%)

420

26,4

6,4

I II**) III

172 138 72 382

12,0 4,7 5,7 22,4

7,0 3,4 7,9 0 5,9

*) Sammelproben von Peak I I nach Elution mit CHC1 3 /CH 3 0H (2:1) **) Zwischenfraktion

Anreicherungen von Ubichinon-9 die Trennwirkung von Sephadex LH-20 f ü r eine Auftrennung von Lipid-Kohlen Wasserstoff-Fraktionen bzw. des daraus isolierten acetonlöslichen Anteils unter den gegebenen Trennbedingungen ausgeschöpft ist. Die Anreicherung des Ubichinons bei gleichzeitiger vollständiger Entfernung der Kohlenwasserstoffe bietet die Möglichkeit, kohlenwasserstofffreie Lipidfraktionen mit Ubichinon-Konzentrationen > 2 % zu erhalten. Aus dem Unverseifbaren k a n n anschließend säulenchromatographisch an Silicagel oder durch Verwendung verschiedener Lösungsmittelkombinationen direkt aus der Lipidfraktion [8] Ubichinon-9 gewonnen werden. Eine Gewinnung von Ubichinon-9 im Biochemikalienmaßstab ist damit auf der Basis der dargelegten Ergebnisse möglich. Eingegangen: 17. 11. 1982

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Acta Biotechnol. 4 (1984) 2, 142

Book Review L . P . W H I T E u n d L . G.

PLASKETT

Biomass as Fuel Academic Press, London, 1981, 211 Seiten Die Autoren gehen davon aus, daß Biomassen als sogenannte erneuerbare Rohstoffe in Z u k u n f t als alternative Energiequelle weiter an Bedeutung gewinnen. Mit der vorliegenden Monographie möchten sie eine Lücke in der Fachliteratur schließen, indem sie den Versuch unternehmen, eine umfassende Darstellung der prinzipiellen Möglichkeiten der Nutzung von Biomassen in reiner F o r m bzw. als Bestandteil von Abfällen f ü r die Gewinnung von Energie u n d Energieträgern zu geben. Das Buch ist in 10 Kapitel gegliedert. Darin werden nacheinander Probleme der Verfügbarkeit von Biomassen, allgemeingültige Grundlagen der wichtigsten Technologien des Gebrauches u n d der Konversion von Biomassen sowie die Anwendbarkeit dieser Verfahren auf unterschiedliche Biomasse-Substrate (Pflanzenabfälle, tierische Abfälle, spezielle landwirtschaftliche Kulturen, Holz, industrielle und kommunale Abfälle, Meerespflanzen etc.) unter dem Gesichtspunkt der Grundeffektivität der damit verbundenen Nutzungsstrategien und unter Beachtung der in der Praxis bestehenden Limitationen behandelt. Dabei beziehen sich die Verfasser hauptsächlich auf die in den westeuropäischen Industrieländern Großbritannien, B R D , Frankreich und Italien bestehenden Verhältnisse. Am Schluß wird ein Ausblick auf perspektivisch zu erwartende Trends in Verbindung mit der Diskussion der betreffenden nationalen Entwicklungsprogramme der fortgeschrittensten kapitalistischen Staaten und einiger Entwicklungsländer gegeben. Als wesentliche Varianten der N u t z u n g und Konversion von Biomassen f ü r die Produktion von Energie und Energieträgern werden die direkte Verbrennung, thermisch-chemische und biologische Konversionen betrachtet und einander gegenübergestellt. Eine etwas umfassendere Analyse der potentiellen Möglichkeiten der biologischen Konversionsreaktionen auch unter dem Aspekt der Kopplung solcher Prozesse untereinander oder mit thermisch-chemischen Verfahren h ä t t e den Wert dieses Buches sicherlich noch weiter erhöht. Unabhängig davon k a n n jedoch festgestellt werden, daß diese Abhandlung einen beträchtlichen Informationsgehalt besitzt und sowohl f ü r den Fachm a n n auf Grund der umfangreichen Angaben zu Originalarbeiten als auch f ü r den gebildeten Laien wegen der Übersichtlichkeit und der leicht verständlichen F o r m der Darstellung von Interesse sein dürfte. K . RICHTER

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2, 1 4 3 - 1 5 1

Rechnergestützte Führung von Fermentationsprozessen Teil 2 M . P B A U S E , H . - J . SCHULZ, D . W A G L E R

Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für technische Chemie 7050 Leipzig, Permoserstr. 15

Summary In the first part of the publication [1] an algorithm for the adaptation of the static optimum was represented. This part demonstrates the application of this algorithm to a specific problem. The problems, which are connected with the application of the choice of the object function, of making the process model available and of the realizable economic effects are elaborated. The example of the tested on-line control of a stirred tank reactor shows the advantages and disadvantages of the used algorithm.

6. Zielfunktion und Prozeßmodell

Zur Veranschaulichung der Nachführung des statischen Optimums ist es zweckmäßig, von der Vorstellung eines optimal ausgelegten stationären Arbeitspunktes auszugehen. Die Festlegung des nachzuführenden Arbeitspunktes ist Ergebnis der Lösung einer definierten Optimierungsaufgabe. Für die Formulierung dieser Aufgabe sind mindestens zwei Probleme zu klären: Die Wahl einer geeigneten Zielgröße und die konkrete Formulierung der Zielfunktion. Da bei Auslegung und Steuerung in jedem Fall eindeutige (optimale) Entscheidungen erforderlich sind, ist folglich eine skalare Zielgröße erforderlich, deren Extremierung in einem zu definierenden Sinn gesellschaftlich sinnvoll sein muß. Ökonomische Zielgrößen der allgemeinen Form z

' = ~jr

+ h) [MM

(13)

wobei Z' A' I b c

Min!

— Jahresausstoß — Investkosten — Betriebsaufwand — modifizierter Abschreibungssatz

können diese Forderungen erfüllen, wenn wie im vorliegenden Fall die Qualität des Produktes (Gebrauchswert) als unveränderlich angesetzt werden kann [4], Solche

144

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

Zielgrößen bilden eine relevante Menge gesellschaftlicher Teilziele in den eindimensionalen Raum ab. Für die konkrete Formulierung der Zielfunktion müssen die Terme im Ausdruck (13) in Abhängigkeit von den Steuergrößen dargestellt werden. Deshalb erscheinen als Nebenbedingungen des Optimierungsproblems die Prozeßmodelle. Bei der Erarbeitung der Prozeßmodelle müssen folgende Forderungen berücksichtigt werden: — der Modellierungsaufwand soll möglichst klein sein (im Idealfall optimal) — die Modelle müssen die im Sinne der gewählten Zielgröße wesentlichen Kompromißsituationen gut beschreiben. Ein Modellsystem, das für die kontinuierliche SCP-Produktion diese Forderungen hinreichend gut erfüllt oder zumindest als einfache praktikable Modellhypothese vorerst anzusetzen und gegebenenfalls zu überprüfen ist, kommt auf folgende Weise zustande: ^

= 0u(Ci,

cLc • - j r = D - (cf Í> Í X Ci t p.

Z*

d. h. man realisiert hier nach der Optimierung den geforderten Ausstoß bei kleineren Zielfunktionswerten. Im Gebiet II, in dem eine Verbesserung der Prozeßbedingungen vorliegt, gilt immer: Ä > A*

und

Zj < Z*

da eine negative Bewertung von höherem als gefordertem Ausstoß nicht vorgenommen wurde.

Abb. 7. Darstellung möglicher Steuereffekte nach Tab. 1 5*

148

Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

Unter den berechneten Bedingungen, d. h. bei Verschlechterung der Prozeßbedingungen, ist es möglich, durch Steuermaßnahmen die Zielgröße um 3,5% zu senken und den Ausstoß um 17% zu erhöhen. Danach kann eine Neuoptimierung mit anschließender Neueinstellung der Steuergrößen nach einer Prozeßstörung als ökonomisch sinnvolle Aufgabe betrachtet werden. Die Sicherung dieser Aussage erfolgt, falls möglich, über eine umfassende Störsignalbeschreibung, in der Angaben zu Störamplitude, -frequenz und mittlerer Stördauer enthalten sein sollen [5], 8. Beispiel einer on-line-Steuerung am Rührreaktor Die in [1] Pkt. 4 gegebenen allgemeinen Hinweise zur praktischen Realisierung der Modellnachführung müssen weiter konkretisiert werden. Es sind Aussagen zur Quantifizierung der „lokalen Bereiche" der Gültigkeit der Modelle und zum Beginn und Ende der Modellnachführung und Optimierung erforderlich. Wird davon ausgegangen, daß aktive Versuche an einer Produktionsanlage nicht realisiert werden, kann der notwendige Informationszuwachs nur aus der Steuerung, d. h. nach Lösung der Optimierungsaufgabe, kommen. Dies ist insofern ein schwieriges Problem, als die ersten Schritte der Nachführung an einem Arbeitspunkt realisiert werden müssen, wobei die Modelleingänge (als Meßgrößen) von zufälligen Fehlern überlagert sind. Um nicht nur auf den Störanteil im Meßsignal zu reagieren, sind spezielle Maßnahmen nötig: — Erhöhung der Stabilität der Schätzung durch geeignete Wahl von P0, w und c, die zu den angegebenen Startwerten des Versuches führte. — Beschränkung des zulässigen globalen Steuerbereiches, die eine signifikante Eingangsgrößenänderung ermöglicht und für den Fall eines schlechten (bis falschen) Modells keine zu große Umsteuerung erlaubt. Eine solche Beschränkung kann aus der Statistik des Prozesses abgeleitet werden. Wenn

Figure 8 shows the comparison of the two models wit the experimental data. Model 2 is closer in presenting the actual kinetics for product formation. Based on the results of this" study, the mathematical model for ethanol production kinetics of Z. anaerobia ATCC 29501 is summarized as follows: dp ~dt ~

12.15 (1 (1 -

0.001 • Sp) (1 -

0.003 • S0) (1 -

0.002 • S0)

0.002 • S0) (1 -

p/102)

dx_ "df

(18)

Conclusion The production of ethanol was found to be growth associated. The growth yield coefficient was found to be a function of both the initial glucose and mean ethanol concentrations, whereas the ethanol yield was found to be a function of the initial glucose concentration in the medium. For quantification and modeling purpose, the applied formal kinetics on macroscopic level represent an adequate approach in bioprocess engineering. Eingegangen: 26.4.1983

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Acta Biotechnol. 4 (1984) 2, 1 6 3 - 1 7 0

Utilization of Cellobiose and Production of ß-Clucosidase by Nine Yeast Species D . K . SANDHU, D . MONDAL a n d M . S . SIDHU

Department of Biology, Guru Nanak Dev University, Amritsar-143005, India.

Summary A comparative study of 9 yeasts namely, Candida blankii, C. humicola, C. ishiwadae, C. rhagii, C. tropicalis, Hansenula subpelliculosa, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon cutaneum and Tr. pullulans was carried out for the production of extracellular and cell bound /J-glucosidase using cellobiose as the substrate. Trichosporon cutaneum was found to be the best extracellular as well as cell bound /3-clucosidase producer and the former activity was more than the latter. In the rest of the yeasts most of them showed more cell bound /?-gIucosidase as compared to the extracellular.

Introduction

Microbial enzymes are being used in a variety of ways in many biotechnological systems. The /5-glucosidases are important in the degradation of cellulosic material as these catalyse the final step from cellobiose to glucose. However, many cellulolytic organisms including Trichoderma species, which are favoured sources of cellulases are deficient in /?-glucosidase [1, 2]. Thus in many cellulolytic fungi /?-glucosidase may be a limiting factor in both biodégradation and biomass production. Recent interest in the genus Trichosporon has resulted in evidence of significant cellulase, xylanase and pectinase activities in yeasts [3]. The comparable cellulase and xylanase activities of Tr. pullulans and T. viride grown under the same conditions may suggest future application of yeasts to a direct cellulose conversion process [4], Cellobiose assimilation is a rather common characteristic among yeasts [5, 6] which are unable to degrade cellulose. However, available data on the mechanisms regulating the synthesis of /5-glucosidase and other enzymes involved in the catabolism of cellobiose are limited [7], Among the yeasts, the /9-glucosidase has been studied mainly in Saccharomyces species [8—10]. The /9-glucosidases of Rhodotorula minute, Sacch. fragilis, Sacch. dobzhanskii and Sacch. lactis have been shown to be similar in nature being intracellular, high molecular weight proteins [10]. The objective of the present study was to screen cellobiose utilizing yeasts for the production of /S-glucosidase.

6*

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Acta Biotechnol. 4 (1984) 2

Materials and Methods Microorganisms and growth conditions Nine cellobiose utilizing yeasts which included 5 species of Candida, 2 of Trichosporcm and one each of Hansenula and Saccharomyces, isolated from flower nectar, pollinating bees and fermented foods [11] were tested. The cultures were maintained on yeast extract-malt extract agar at 4°C and subcultured whenever required. The inoculum was prepared by suspending yeast growth from 3 days old yeast extractmalt extract agar slants in sterile distilled water. Cell counting was done with a haemocytometer and the final count in all the experiments was approximately 2 X 10s cells/ml. Erlenmeyer flasks of 500 ml capacity, each containing 150 me of basal medium (yeast nitrogen base [12] with 0.5% cellobiose in 0.05 M phosphate buffer, p H 7.4) were inoculated with different yeasts and incubated at 28°C on a rotary shaker (220 rpm) for the required period. Duplicate flasks were used for each yeast and aliquots were withdrawn at 24 h intervals for measurement of pH, growth and enzyme estimation. Growth was measured in terms of number of cells per ml and p H was recorded with Beckman p H Meter. Estimation of /l-glucosidase (EC 3.2.1.21) After desired period of incubation, 10 ml of suspension was withdrawn from each flask aseptically. The cells were separated by centrifugation at 10,000 rpm for 20 min at 4°C. The supernatant was tested for extracellular enzyme. The cell pellet was washed twice with sodium acetate buffer (0.2 M, p H 5) and finally suspended in 2 ml of the buffer. This was used for the assay of /?-glucosidase associated with cell envelope. Extracellular [1-glucosidase The /3-glucosidase activity was measured according to the method of Ghose [13]. To 0.5 ml of 0.2 M sodium acetate buffer (pH 5) were added 0.5 ml of p-nitrophenyl-/?-Dglucopyranoside (pNPG, 1 mg/ml) as the substrate and 1 ml of crude extracellular enzyme. The blanks were prepared either without pNPG or the enzyme and these were replaced by an equal volume of buffer. The mixtures were incubated at 37 °C for one hour and the reaction was terminated by adding 4 ml of 0.2 M glycine-NaOH buffer (pH 10.6). The p-nitrophenol liberated was determined by measuring the absorbance at 420 nm and compared with the standard curve. Cell envelope (3-glucosidase Out of the 2 ml washed cell suspension (as described above), 0.5 ml were used for the cell envelope /3-glucosidase assay as in the case of extracellular enzyme. After the termination of reaction the suspension was centrifuged at 10,000 rpm for 20 min at 4°C and the supernatant was used to measure enzyme activity. The unit of /S-glucosidase activity was calculated in terms of fi moles of p-nitrophenol released m l - 1 min - 1 . The specific activity has been defined as units /S-glucosidase/108 cells. In the text the /5-glucosidase unit refers to the value 1 X 103.

SANDHTJ, M O N D A L

et al., Utilization of Cellobiose

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Results Growth pattern All the 9 yeast species studied were able to utilize cellobiose as the carbon source and produced extracellular and cell bound (cell envelope) /?-glucosidase the results of which are presented in Figs. 1—9. The growth pattern showed the usual lag, log and stationary phases. In Candida ishiwadae (Fig. 3) lag phase was negligible whereas in C. humieola, C. tropicalis and Saccharomyces cerevisiae the lag phase extended from 3—4 days (Figs. 2, 5, 7). On the other hand, lag phase of C. blankii, C. rhagii, Hansenula subpelliculosa, Trichosporon cutaneum and Tr. pullulans were comparatively shorter usually being less than 24 h (Figs. 1, 4, 6, 8, 9). Similarly there was variation regarding the log phase, for example, C. ishiwadae had a very early log phase and achieved maximum growth on the first day, whereas in C. humieola, C. tropicalis and Sacch. cerevisiae the growth was still progressing when the experiment was terminated on the fifth day. In rest of the yeasts, except Tr. cutaneum the maximum growth was recorded on third day whereas Tr. cutaneiCm had the peak on fourth day. Initial pH in the beginning of the experiment was set at 7—7.2 for all the yeasts. Most of the yeasts showed a drop in pH up to 6.5 in their exponential phases of growth. Extracellular ß-glucosidase Generally, the /9-glueosidase activity made its appearance early in the growth and was related to the growth pattern in most of the cases. The maximum enzyme activity either preceded or followed closely the peak for growth. Candida ishiwadae showed the maximum activity after 24 h while in the rest it varied from 2—5 days depending on the growth pattern (Figs. 1—9). The enzyme production was also delayed in those cases where there was a prolonged lag phase e.g. C. tropicalis and Sacch. cerevisiae (Figs. 5, 7). In some yeasts like C. humieola, H. subpelliculosa, Sacch. cerevisiae, Tr. cutaneum and Tr. pullulans (Figs. 2, 6—9) the extracellular enzyme production showed a depresssion or a stable pattern corresponding to the exponential phase of growth which can also be related to the maximum p H drop at this stage. In most of the yeasts the extracellular enzyme production declined after attaining its peak but in C. rhagii (Fig. 4) the maximum activity was maintained for more than one day. Among the nine species studied Tr. cutaneum was the best, showing extracellular ßglucosidase activity up to 20.5 units (Fig. 8) within two days. It, was followed by Tr. pullulans (Fig. 9) having an activity of 11.25 units. Among the Candida species, C. tropicalis (Fig. 5) was the best. Minimum activity was observed in Sacch. cerevisiae• (Fig. 7) and C. ishiwadae (Fig. 3) showing extracellular ß-glucosidase activity of 0.5 and 0.8 units, respectively. While in the rest, it varied from 1.25 to 2.3 units. The specific /9-glucosidase activity followed more or less the same pattern as the total activity with some exceptions as in C. blankii, C. humieola, C. tropicalis and H. subpelliculosa (Figs. 1, 2, 5, 6). Generally the specific activity was less than the total activity excepting in C. ishiwadae and C. tropicalis where it was more (Figs. 3, 5). Specific activity was also highest in Tr. cutaneum (11.9 units) followed by Tr. pullulans (7.8 units) and C. tropicalis (6.1 units) (Figs. 5, 8, 9). Minimum specific activity was observed in the case of Sacch. cerevisiae (0.36 units) and C. rhagii (0.55 units) (Figs. 4, 7). Specific activity in a few cases such as Sacch. cerevisiae, Tr. cutaneum and Tr. pullulans showed double peaks with a depression corresponding to the maximum growth period of the yeasts and a drop in pH of the medium (Figs. 7—9).

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Acta Biotechnol. 4 (1984) 2 Candida blank11 OA r

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