Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz: Band 16, Heft 6 [Reprint 2022 ed.] 9783112654781

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ISSN 0323-5408 A K A D E M I E DER

LANDWIRTSCHAFTSWISSENSCHAFTEN

DER DEUTSCHEN D E M O K R A T I S C H E N REPUBLIK

ARCHIV FÜR

PHYTOPATHOLOGIE UND

PFLANZENSCHUTZ 2t—i

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W i—i S 03 ¡4 «5

HEFT 6 • 1980 • BAND 16 * •M

Aich. PhytopathoL u. Pflanzenichutz . Berlin 18 (1980) 6, S. 361-429

EVP 5,- M

31057

Inhalt HAHN, WERNER

Verbesserte Diagnose des Feuerbrandes amylovora (Burr.) Winsl. et al.)

(Krwinia

OTTO, D I E T E R ; BEHNISCH, INUEBORG; P F E I F F E R , G E R D ; D E D E K , W O L F G A N G ; GEOROI, W O L F G A N G

361

BÖTTCHER, INGEBORG ; B E I I R , L O T H A R

Fusarium spp. als Erreger des Wurzelbrandes und einer Seitenwurzelkrankheit der Zuckerrübe . . . . 369 J A c o f c , U T E ; Z O T T , ALBRECHT

Die Dünnschichtchromatographic als Methode zur Bestimmung von Phoma exigua Desm. var. foveata (Foister) Boerema 381' S T E L T E R , H E L M U T ; TROMMER, R E I N H A R D

Bin Verfahren zum Nachweis der Verseuchung und zur Schätzung der Populationsdichte yon Olobodera rostochiensis Wollenweber, P a t h o t y p 1, in Bodenproben 387

Metabolismus von Trichlorfon in sensiblen und resistenten Fliegen Musca äomestica L 397 E B E R T , W E R N E R ; SCHWÄHN, P E T E R

Ein operatives Ü b e r w a c h u n g - und Prognose system auf EDV-Basis für Sohaderreger der landwirtschaftlichen Pflanzenproduktion (II. T e i l : Bestandesüberwachung) 413 MOLL, ECKAHD

Zu Skalen von Bolle und anderen mit nichtäquidistanter Einteilung sowie Bemerkungen zur Auswertung von Wertzahlen 423

CoflepjKaHneXaH Bi ycoBepuieiicTBOBaHiiwß MeTon anarnocTiiKii 6aKTepHa^bHoro omora Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al«,) 361

OTTO B a n um H . , 114)ati$ij)ep J"., XleneK B., T e o p r H B. MeTa6ojiH3M TpHX.iopi])Ona B HyuCTmiTe.'ii.Hux h ycTottHHBWx urraMMax Musca domestica L 397

E e T x e p I I . , B s p JI. Fusarium spp. — B036yanTejib aaH0MMi(03H0ii rim.au H aaSojieBaHHH SOKOBMX Kopueit caxapHoii CBeKJiM 369

3 6 e p T B . , UIB3H

N.

OnepaTHBHan rnCTOMa yne/ra, KOHTPOJIH H nporHoaa B036ynnTejieit aaöojieBaHHö cejibCKOxoa«itCTBeuHtix KyJibTyp Ha 6aae BBM (2-an qacTb:

yqeT H Koirrpojib COCTOHHHH noceBOB)

H K O 6 y . , IIOTT A .

ToHHoc.iroftUaH xpoMaTOrpaiinn — MCTOH onpeAejieHHH Phoma exigua Desm. var. foveata (Foister) Boerema. 381 UlTejibTep X., TpoMMep P. MeTon BUHBJIEHHH aapameunn N oueHKii IIJIOTHOCTH nonyjiBUHU Olobodera rostochiensis Wollenweber, naTOTHii 1, B noMBCiniwx npoGax 387

413

Mojijib 3 O uihaJiax Boji.ie H NP. c TieaKBHjiHCTamiHOHiibiM aejicimeiu H 3ameqaHHH K oueHne nonaaaTe-. jieit 423

Contents OTTO, D I E T E R ; BEHNISCH, INGEBORG; P F E I I Y E R , G E R D ; D E D E K , W O L F G A N G ; GEOEGI. WOLFGANG

HAHN, WERNER

Improved diagnosis of fire blight (Erwinia lovora (Burr.) Winsl. et al.)

amy-

361

BÖTTCHER, INGEBORG ; B E H R , L O T H A R

Fusarium spp. as causal agents of blackleg and secondary-root disease of sugar beet 369 JACOB, U T E ; Z O T T , A L B R E C H T

Thin-layer chromatography - an approach .to dentifying Phoma exigua Desm. var. foveata (Foister) Boerema 381 S T E L T E R , H E L M U T ; TROMMER, R E I N H A R D

A method for detecting infestation and estimating the population densityof Olobodera rostochiensis Wollenweber, p a t h o t y p e l , in soil samples . . . 387

Metabolism of trichlorfon in susceptible and resistant houseflies (Musca domestica L . ) 397 EBERT, W E R N E R ; SCHWAHN, P E T E R

A N operative computer-based system f o r pest monitoring and forecasting in agricultural crop production (Part I I - Stand monitoring at field level) 413 MOLL, ECKARD

On scales of BOLLE and others with non-equidistant division, and remarks on the interpretation of scores 423

ISSN 0323-5408 Aren. Phytopathol. u. Pflanzenschutz, Berlin 16 (1980) 6, S. 3 6 1 - 3 6 7

Zentrales Staatliches Amt für Pflanzenschutz und Pflanzenquarantäne Potsdam beim Ministerium für Land-, Forst- und liahrungsgüterwirtschaft WERNER

HAHN

Verbesserte Diagnose des Feuerbrandes (Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al.) Eingegangen: 3. 4. 1980

1.

Einleitung

Der sich seit etwa 20 J a h r e n in Nordeuropa ausbreitende Feuerbrand, hervorgerufen durch Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al., stellt eine große Gefahr f ü r den Obstbau dar. E s hat daher nicht an Bemühungen u m eine schnelle u n d sichere Diagnose als Voraussetzung f ü r gezielte Gegenmaßnahmen gefehlt. D a m i t die Diagnose auch unter Praxisbedingungen durchgeführt werden kann, ist ein möglichst einfach zu handhabendes Nachweisverfahren wünschenswert. U n t e r geringem A u f w a n d lassen sich Feuerbrandinfektionen mittels „ B i r n e n t e s t " , insbesondere nach der Verbesserung durch K L E I N H E M P E L u. a. (1975), nachweisen. Dieser Test ist jedoch n u r solange praktikabel, wie unreife Birnen zur Verfügung stehen. Bei Kühllagerung der Birnen kann er noch bis J a n u a r durchgeführt werden. F ü r die darauffolgende Zeit schufen die genannten Autoren ein Testverfahren, bei dem sich der Feuerbranderreger über Tetrazolium-Thiuram-Agar isolieren u n d anschließend serologisch nachweisen läßt. Bei unseren Untersuchungen konnten wir feststellen, d a ß der Tetrazolium-ThiuramAgar zwar eine starke H e m m u n g auf Pilze ausübte, doch auch das Bakterienwachst u m merklich beeinflußte. Daher b e m ü h t e n wir uns, ein geeigneteres Medium zur Isolierung des Feuerbranderregers zu entwickeln. 2.

Material u n d Methode

2.1.

Reinkulturen

Die routinemäßig auf F e u e r b r a n d zu untersuchenden Gehölzproben waren vorwiegend von Pilzen der G a t t u n g e n Aspergillus (As), Altemaria (AI), Trichoderma (Td), Trichothecium (Tt), Penicillium (Pe), Mucor (Mu) u n d Ulocladium (Ul) sowie von wuchsfreudigen Bakterien (im folgenden als B y u n d B 2 bezeichnet) besiedelt. Von diesen wurden Reinkulturen angelegt u n d zur P r ü f u n g der H e m m w i r k u n g der verschiedenen Medien verwendet. J e ein Isolat von Erwinia amylovora (E. a.) und Pseudomonas syringae van Hall (P. s.)1 dienten als Kontrolle. F ü r die Versuche wurden die Pilze auf Malzagar und die Bakterien auf Kartoffel-Dextrose-Agar vermehrt. 2.2.

Infiziertes Pflanzenmaterial

Zum Nachweis von E. a. im Pflanzengewebe wurden ca. 30 cm lange Triebe von Crataegus oxyacantha L. in Wasser gestellt u n d in Triebmitte nach Einstich E. a.1 Das Pseiidomonas-lsolat sowie das Antiserum von Erwinia amylovora wurde uns vom Institut für Phytopathologie Aschersleben zur Verfügung gestellt.

24

Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz, Band 16, Heft 6

362

HAHX: Verbesserte Diagnose

Suspension injiziert. Sie verblieben zwischen 3 Tagen u n d 2 Monaten bei Zimmert e m p e r a t u r unter Folienabdeckung. D a n a c h wurden aus unterschiedlichen Regionen ober- u n d unterhalb des Einstiches Gewebeproben e n t n o m m e n u n d parallel auf die zu testenden N ä h r b ö d e n ausgebracht sowie in unreife Birnen der Sorte 'Alexander Lucas' implantiert. I n einem Fall stand ein natürlich infizierter Crataegus-Zweig zur Verfügung. Die Untersuchungen wurden in der Zeit von Juli bis Oktober durchgeführt. 2.3.

Nährböden

Ausgehend vom Tetrazolium-Thiuram-Agar (TTA) wurde die Thiuramkonzentration im N ä h r b o d e n variiert bzw. das Thiuram durch andere Stoffe teilweise oder völlig ersetzt. E s k a m e n vornehmlich solche Chemikalien zum Einsatz, die auch in den staatlichen Einrichtungen des Pflanzenschutzes verfügbar sind. Daneben wurde untersucht, ob auf einige im TTA enthaltene Nährstoffe verzichtet werden k a n n . Die in größerem U m f a n g getesteten N ä h r b ö d e n u n d deren Zusammensetzung sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Das W a c h s t u m von R e i n k u l t u r e n wurde a u ß e r d e m auf Kartoffel-Dextrose-Agar (KDA) vergleichend untersucht. Tabelle 1 Verwendete Selektivnährböden und deren Zusammensetzung

jjeöLfcuiuLeuu Nähragar I* Saccharose Glukose Hefeextrakt W o l f e n - T h i u r a m 85 Nystatin Crotothane Benlate Pol-Terrafun 0,5%ige TTC-Lösung** aqua dest. pl[

Nährboden TTA

TT50A

TTNA

TCBPA

37g

37 g 100 g

37 g 100 g

37 g 100 g

100 g

5g 5g

5g 5g

5g 5g

250 m g

50 m g

—

—

—

—

—

—

10 m l 11

50 m g 250 m g —

—

—

in m l 11

(5 g) (5 g)

10 m l 11

—

—

50 50 250 10 1

mg mg mg ml 1

6,8 bis 7 , 2 ; Zugabe v o n H e m m s t o f f e n und TTC-Lösung nach Abkühlung des Nährbodens auf 6 0 ° C .

* Fertigmedium v o m Staatlichen Institut für Immunpräparate und Nährmedien Berlin-Weißensee ** 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid

2.4.

Versuchsdurchführung

Mit den Reinkulturen wurden 3 Beimpfungen je N ä h r b o d e n p l a t t e vorgenommen u n d das Koloniewachstum in verschiedenen Zeitabständen registriert. Das Anwachsergebnis einzelner Keime von E. a. auf künstlichem Substrat ließ sich nach Ausspateln von Verdünnungsreihen beurteilen. Das infizierte Pflanzenmaterial wurde in ca. 2 m m lange Stücke geschnitten u n d jede dieser P r o b e n entsprechend der Anzahl der vergleichend zu testenden Substratvarianten geteilt. Auf jede N ä h r b o d e n p l a t t e k a m e n 10 Gewebestücke. F ü r den „Birn e n t e s t " wurden die Birnen geviertelt u n d in jedes Viertel n u r 1 Gewebestück implantiert. Eine äußerliche Desinfektion erfolgte wegen der anzustrebenden praxisnahen u n d zeitsparenden Arbeitsweise nicht. Der Erreger galt als nachgewiesen, wenn sich

363 auf dem Nährboden rotgefärbte erhabene Bakterienkolonien entwickelten, die im Agglutinationstest mit E. «.-Antiserum reagierten, bzw. an Birnen milchiger Schleim austrat. 3.

Ergebnisse

Mit der Verringerung der Thiuram-Konzentration im Tetrazolium-Thiuram-Agar nahm auch das Wachstum der Saprophyten zu (Abb. 1). Bei 50 ppm Wolfen-Thiurani 85 (TT 60 A) war eine deutliche Hemmwirkung nur noch gegen Alternaría spec. und Trichoderma spec. zu beobachten. Wurden zusätzlich 250 ppm Nystatin dem Nährboden zugegeben, ließ sich auch die Entwicklung der übrigen Pilzisolate unterdrücken (Tab. 2).

im Abb. 1: Aliswachsen von Erwinia amylovora und diversen Pilzen aus infizierten Gewebeproben bei Verwendung von 3 Selektivnährböden (links — T T A , Mitte — T T N A . rechts - TT 5 0 A) nach 3 tägiger Bebrütung Tabelle 2 W a c h s t u m von Bakterien und Pilzisolaten auf verschiedenen Nährböden nach 2tägiger Bebrütung bei 28 °C (Erklärung im T e x t ) Isolat

Nährboden i

TTA TT 5 0 A TTNA TCBPA KDA

Ext. \ P. . ]

6 6 6 9

2 6 5 6 10

9 13 11 14 11

As I AI

Tt

Pe

— Koloniedurchmesser (mm) 2 0 0 0 1 8 9 24 1 4 12 0 1 0 5 0 0 2 0 0 19 20 19 50 16

2 2 0 0 7

B,

Td

I Mu 0 50 0 0 50

Ul 0 6 0 1 14

In weiteren Nährbodenvarianten kamen nur fungizide Pflanzenschutzmittel zur Anwendung. Dabei wurde Thiuram durch 50 bzw. 250 ppm Benlate, Crotothane, Dithane M-45, Euparen, bercema-Maneb 80, Orthocid 50, Pol-Terrafun und bercemaZineb 80 ersetzt. Die Zugabe eines dieser Mittel brachte keine befriedigenden Ergebnisse. Erst durch die Kombination von Crotothane, Benlate und Pol-Terrafun im •24'

364

IIAHN: V e r b e s s e r t e D i a g n o s e

Nährboden ( T C B P A ) wurde eine hohe selektive Wirkung erreicht. Außer den Pilzisolaten konnte sich auch das Bakterienisolat B 2 nicht entwickeln. E. a. und P. s. zeigten ebenso wie auf T T N A ein gutes W a c h s t u m (Tab. 2). I n Versuchen, bei denen Glukose und H e f e e x t r a k t fehlten, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. D a s Vereinzeln von E. « . - K e i m e n nach der Ausspatelungsmethode erfolgte auf T T A , T T N A sowie T C B P A mit bzw. ohne Glukose und H e f e e x t r a k t . W ä h r e n d bei der niedrigsten Verdünnung der Suspension auf T T A keine B a k t e r i e n anwuchsen, konnte auf den übrigen Nährböden noch bei einer Verdünnung von 1 0 - 4 B a k t e r i e n w a c h s t u m beobachtet werden. Innerhalb von 2 Tagen h a t t e n sich sowohl auf T T N A als auch auf T C B P A üppige Kolonien gebildet (Abb. 2). Auf letzterem wuchsen aber wesentlich

Abb. 2: Durch Ausspateln erhaltene Kolonien von Erwinia 2tägiger Bebi'üiung auf TC. PA

TTNA TCBPA" TCBPA1' Nährboden

3?

amylovora

nach

b8 72 96 Inkubationszeit (hl

Abb. 3: Entwicklung von Erwinia amylovora nach Vereinzelung auf verschiedenen Nährböden. A : Anzahl angewachsener Bakterien (relativ), B : Koloniewachstum ]) Nährboden mit Glukose und Hefeextrakt 2) Nährboden ohne Glukose und Hefeextrakt

365

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, H e f t 6, 1980, Band 16

mehr Keime an, wobei sich das Fehlen von Glukose u n d H e f e e x t r a k t im Nährboden positiv auf die Entwicklung von E. a. auswirkte (Abb. 3). F ü r den Feuerbrandnaehweis im künstlich infizierten Pflanzengewebe wurde T T N A bzw. TCBPA parallel zum Birnentest u n d T T A untersucht (Tab. 3). I n der ersten Versuchsserie ließen sich mit T T N A 91 % aller registrierten Infektionen nachweisen, während es beim Birnentest 6 1 % u n d mit Hilfe von TTA n u r 8 % waren. Die Untersuchung eines natürlich infizierten Crataegus-Zweiges bestätigte diese B e f u n d e : Auf T T N A wurden 10, auf T T A dagegen n u r 1 Probe positiv ausgewiesen. Tabelle 3 Feuerbrandnachweis mittels Birnentest u n d verschiedener an vergleichend untersuchten Gewebeproben

Versuchsserie

Inkubationst e m p . (°C)

Anzahl positiver Proben/in K l a m m e r n : d u r c h s c h n i t t l i c h e I n k u b a t i o n s z e i t in T a g e n gesamt

Birnentest

513

20 28

19 ... 20

Selektivnährböden

Nährbodentest TTA

TTNA

314 (6,9)

40 (2,5)

467 (1,5)

82

52 (6,2)

13 (5,9)

92

53 (3,8)

35 (5,7)

nicht geprüft nicht geprüft

TCBPA nicht geprüft 67 (2) 84 (1,7)

I n der zweiten Versuchsserie wurde TCBPA anstelle von T T N A geprüft, u n d zwar gleichzeitig bei 20 u n d 28 °C. I m Mittel der T e m p e r a t u r v a r i a n t e n schnitt T C B P A mit 8 7 % ebenfalls günstig a b ; auf den Birnentest und TTA entfielen 60 bzw. 2 8 % an nachweisbaren Infektionen. Durch Einsatz von T T N A u n d TCBPA verringerte sich die Inkubationszeit u n d somit die Dauer des Feuerbrandnachweises beträchtlich. Die meisten E. a.-Kolonien k o n n t e n bereits nach 1 bis 2 Tagen e r k a n n t u n d serologisch getestet werden. Wie aus der zweiten Versuchsserie hervorgeht, scheint sich auch eine Verkürzung der Inkubationszeit bei 28 °C gegenüber 20 °C abzuzeichnen. Beim Feuerbrandnachweis mittels T C B P A wurde z. T. auf Glukose u n d H e f e e x t r a k t im N ä h r b o d e n verzichtet, wodurch aber keine merkliche Beeinflussung des Wachst u m s von E. a. oder S a p r o p h y t e n eintrat. E s war zu beobachten, d a ß sowohl auf TTNA- als auch auf T C B P A - P l a t t e n die Begleitflora der Gehölzproben meist n u r eine geringe Entwicklungschance h a t t e (Abb. 1). 4.

Schlußfolgerungen

Sowohl die Versuche mit Reinkulturen als auch mit infiziertem Pflanzenmaterial haben gezeigt, daß T T N A u n d TCBPA ein gutes W a c h s t u m von E. a. ermöglichen u n d die an Gehölzproben a n h a f t e n d e n saprophytischen Keime in ihrer Entwicklung weitestgehend unterdrücken. Im Vergleich zum TTA, der n u r f ü r die Zeit von J a n u a r bis J u n i als Selektivmedium empfohlen wird, stellen die neuen Medien eine beachtliche Verbesserung dar. Sie sind wesentlich empfindlicher gegenüber E. a., wodurch der Feuerbrandnachweis sicherer wird. Die hohen Anwachsraten von E. a.-Keimen

HAHN: Verbesserte Diagnose

366

nach Ausspateln unterstreichen dieses Ergebnis. Auf Grund des raschen E. «.-Wachstums ist auch eine frühere Befallsaussage als bei Einsatz von TTA möglich (vgl. Tab. 3). Die neuen Nährböden waren sogar dem Birnentest in der Empfindlichkeit und Frühdiagnose überlegen. Ihre Verwendung, verbunden mit der serologischen Prüfung, macht somit den Feuerbrandnachweis von Birnenfrüchten unabhängig, ohne auf Genauigkeit verzichten zu müssen. Der Birnentest wird jedoch wegen der einfachen Durchführung, vor allem in Einrichtungen mit geringer labortechnischer Ausrüstung, nicht an Bedeutung verlieren. Obwohl sich TTNA als auch TCBPA gut für die Feuerbranddiagnose eignen, ist letzterem infolge strengerer Selektivität und höherer Empfindlichkeit der Vorzug zu geben. Da Hefeextrakt und Glukose keinen wesentlichen Einfluß auf die Ergebnisse haben, kann auf deren Zugabe zum Nährboden verzichtet werden. Eine Unterscheidung vom Erreger des Bakterienbrandes der Obstgehölze, P. syringae, der ebenfalls auf diesen Medien gut wächst, ist anhand der flacheren Kolonieform, der Antiserumreaktion sowie des Pathogenitätstests (vgl. K L E I N H E M P E L u. a., 1 9 7 5 ) möglich. Vergleichende Untersuchungen mit anderen Selektivmedien für P. syringae wurden jedoch nicht durchgeführt. 5.

Zusammenfassung

Für die Isolierung des Feuerbranderregers, Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al., wurde ein Nährboden entwickelt, der 37 g Nähragar, 100 g Saccharose, 50 mg Crotothane, 50 mg Benlate, 250 mg Pol-Terrafun, 10 ml 0,5%ige TTC-Lösung und 1 1 aqua dest. enthält. E r zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit und gute Selektivität aus, wodurch eine frühzeitige Diagnose unter Einbeziehung des serologischen Nachweises möglich wird. Pe3I0MC

Ha3BanHe paßoTbi: ycoBepmencTBOBaHUbift MCTOH nnarHOCTHKH ßaKTepnajibiioro OJKora (Erwinia amylovora ( B u r r . ) W i n s l . et al.) XIJIH H30J1HUHH B036ynHTejibH 6aKTepnajibH0r0 OJKOra, Erwinia amylovora ( B u r r . ) W i n s l . et a l . , ÖHJia pa3pa6oTaHa rmTaTejibHa« c p e n a , coaepwcaman 37 r miTaTejibHoro a r a p a , 1 0 0 r caxapo3bi, 5 0 Mr Kp0T0TaHa, 50 Mr öeHJiaTa, 2 5 0 Mr noji-TeppayHa, 10 MJI 0 , 5 % Horo p a c T B o p a T T X n 1 JI NECTHJUINPOBAHHOß BOHM. O n a OTJiMnaeTCH BHCOKOH nyBCTBHTejibiiocTbio H x o p o i n e ß H36HpaTejibHOCTbK>, wio B ccweTamiH c cepojiorimecKHM MCTOJXOM HHeiITH$HKaUHH n03B0JIHeT npOBeCTH paHHHM HHarH03.

Summary Title of the paper: Improved diagnosis of fire blight (Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al.) A culture medium was developed for isolating the causal agent of fire blight, Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. et al. The medium contains 37 g nutrient agar, 100 g saccharose, 50 mg Crotothane, 50 mg Benlate, 250 mg Pol-Terrafun, 10 ml 0 . 5 % TTC solution, and 1 1 distilled water. I t is highly susceptible and shows good selectivity, thus allowing early diagnosis including serological detection.

367

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, H e f t 6, 1980, Band 16

Literatur KLEINHEMPEL, H . ;

Diagnose von S. 19-29

WOLF, G.;

BEYME, D.;

Obstbakteriosen.

SCHAEFER, H . - J . ;

Aroh.

Phytopathol.

Anschrift des Verfassers: Dr. W .

HAHN

Zentrales Staatliches Amt für Pflanzenschutz und Pflanzenquarantäne 1500 Potsdam Hermannswerder 20 A

FIOKE, W . :

Methoden

u. Pflanzenschutz

der

(1975),

Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz, Berlin 16 (1980) 6, S. 396 — 380

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Sektion Pflanzenproduktion Lehrstuhl Phytopathologie und Pflanzenschutz INGEBORG BÖTTCHER u n d LOTHAR

BEHR

Fusarium spp. als Erreger des Wurzelbrandes und einer Seitenwurzelkrankheit der Zuckerrübe Eingegangen: 12. 2. 1980

1.

Einleitung

Der Wurzelbrand der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) wird bekanntlich von mehreren samen- u n d bodenbürtigen Pilzen verursacht. E s ist jedoch sehr schwierig, allein vom Schadbild her (Einschnürung u n d Verbräunung des Hypokotyls, Verfärbungen u n d Absterbeerscheinungen der Keimwurzel) auf den eigentlichen Krankheitserreger zu schließen. Häufig rufen verschiedene Wurzelbranderreger gleichartige oder ähnliche K r a n k h e i t s s y m p t o m e hervor. So ist b e k a n n t , d a ß sowohl Aphanomyces cochlioides Drechsler als auch Pythium- u n d Fusarium-Äxten die Seitenwurzeln wachsender Zuckerrüben während der gesamten Vegetationsperiode befallen können, ohne äußerlich sichtbare S y m p t o m e erkennen zu lassen ( A G A T A E V u n d I L Y A L E T D I N O V , 1976; BARTELS, 1971; BARTELS u n d WINNER, 1971; WINNER u n d SCHAUFELE, 1968;

VESELY,

1976; M C D O N A L D u n d L E A C H , 1976a, b). Unsere Untersuchungen richteten sich auf die Frage, welche Bedeutung den FusariumArten als Wurzelbranderreger der auflaufenden Zuckerrübe sowie als Erreger einer Seitenwurzelkrankheit der wachsenden R ü b e beizumessen ist. 2.

Material u n d Methoden

2.1.

Die Isolation von Fusarium wurzeln älterer R ü b e n

spp. aus Rübenkeimpflanzen u n d aus Seiten-

I n den J a h r e n 1976 bis 1978 wurden jeweils im F r ü h j a h r aus Parzellen versuchen wurzelbrandkranke Rübenkeimpflanzen u n d Pflanzen im ersten L a u b b l a t t s t a d i u m entnommen. Nach Reinigung unter fließendem Wasser und nachfolgender Sterilisation in Natriumhypochlorit (1 ... 2 min) legten wir ca 1 cm große Hypokotylstückchen auf Kartoffeldextroseagar-Platten aus. Zum Nachweis der Pilze in den Rübenseitenwurzeln wurde deren Isolation n a c h Bestandesschluß E n d e Juli/Anfang August vorgenommen. Die Pflanzen e n t s t a m m t e n ebenfalls den o. g. Parzellenversuchen. Auffallend viele R ü b e n wiesen eine starke Seitenwurzelbildung auf. W ä h r e n d zahlreiche Wurzeln bereits abgestorben waren, konnte m a n bei anderen — je nach Befallsstärke — neben gesunden P a r t i e n hellbraune bis schwarzbraune Verfärbungen erkennen (Abb. 1). Solchen, äußerlich sterilisierten und auf Nährboden ausgelegten Wurzelstückchen entwuchsen zumeist Pilze der Gattungen Pythium u n d Fusarium. Das geschah aber auch beim Auslegen völlig gesund erscheinender Wurzelpartien.

370

Böttcher: Behr:

Fusarium

spp. als Erreger

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S c h l e c h t . , F. oxysporum var. redolens (Wollenw.) Gordon, F. moniliforme Sheldon, F. moniliforme v a r . subglutinans Wollenw. et R e i n k . , F. concolor R e i n k . , F. solani var. coeruleum

(Sacc.) Booth n. comb. H F. trichothecioides Wollenw.

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Summary Title of the paper: Thin-layer chromatography — an approach to identifying Phoma exigua Desm. var. foveata (Foister) Boerema. Phoma exigua Desm. var. foveata (Foister) Boerema differs from other tuber rot pathogens in that it develops anthraquinone pigments which can be identified by means of thin-layer chromatography. I t is the merit of thin-layer chromatography that it allows under relatively simple conditions to quickly identify P. exigua var. foveata immediately from the source material. Tuber-rot tissue and fungal cultures on artificial medium can be used for analysis. The pathogen is unambiguously identified in mixed rots. The great variability of pigmentation intensity of various strains of P. exigua var. foveata must be taken into account when choosing optimum quantities of material for analysis. The method is not sensitive enough for identifying the but small inoculum in naturally infested soils. Literatur Observations on the relative occurrance of Phoma exigua var. foveata on weed hosts and potatoes. P o t a t o Res. 17 (1974), S. 349 — 350 ALCOCK, N. L . ; FOISTER, C. E . : A fungus disease of stored potatoes. Scott. J . Agric. 19 (1936), S. 2 5 2 - 2 5 7 ADAM, J . W . ; TODD, J . M . :

38G

J A C O B ; ZOTT:

Dünnschichtchromatograpliie

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Humboldt-Universität Berlin Sektion Gartenbau W B Pflanzenschutz 1129 Berlin Dorfstr. 9

Arch. P h y t o p a t h o l . u. P f l a n z e n s c h u t z , B e r l i n 1 6 ( 1 9 8 0 ) C, S . 3 8 7 - 3 9 5

I n s t i t u t f ü r Ivartoffelforschung Groß Lüsewitz und Institut für Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow Bereich Eberswalde der A k a d e m i e der L a n d w i r t s c h a f t s w i s s e n s c h a f t e n der D e u t s c h e n D e m o k r a t i s c h e n R e p u b l i k

HELMUT

STELTEE und

REINHAKD

TROMMEK

Ein Verfahren zum Nachweis der Verseuchung und zur Schätzung der Populationsdichte von Globodera rostochiensis Wollenweber, Pathotyp 1, in Bodenproben E i n g e g a n g e n : 12. 2. 1 9 7 9

1.

Einleitung

Die in letzter Zeit erfolgte Differenzierung innerhalb der Gattungen Heterodera und Globodera war Anlaß, die für den Nachweis dieser Arten und Pathotypen in Bodenproben angewendeten Methoden hinsichtlich ihrer Aussagefähigkeit zu überprüfen. Mit den heute größtenteils verwendeten mechanischen Nachweisverfahren (z.B. Fenwickkanne) werden die Zysten wohl aus dem Boden gewonnen; für die Bestimmung der Arten- und Pathotypenzugehörigkeit sind jedoch weitere Arbeitsgänge erforderlich, für die zudem umfassende systematische Kenntnisse Voraussetzung sind. Hiermit ist ein für praxisbezogene Untersuchungen nicht vertretbarer Aufwand verbunden. E s mußte eine den praktischen Erfordernissen angepaßte Untersuchungstechnik mit ausreichender Sicherheit in der Bestimmung der zu erwartenden Arten und Pathotypen entwickelt werden. Hierfür bot sich als praktikable Lösung der Biotest an. Über dieses einfache, arbeitssparende und in dem erforderlichen Maße informativ gehaltene Verfahren, das für die routinemäßige Bodenuntersuchung zum Nachweis der Pathotypen von Globodera rostochiensis Wollenweber und G. pallida (Stone) anwendbar ist, wird berichtet. Die Brauchbarkeit des Verfahrens wurde an folgenden Kriterien geprüft: — Kartoffelnematoden (G. rostochiensis, G. pallida) vorhanden — Populationen mit höherer Virulenz als Pathotyp 1 vorhanden (oder Pathotyp x vorhanden)

ja/nein

ja/nein

— Verseuchungsdichte von Pathotyp 1 unterhalb (oberhalb) einer vorgegebenen Toleranzgrenze ja/nein 2.

Das Verfahren des Biotestes

I m Boden vorhandene infektions- und entwicklungsfähige weiblich determinierte Larven entwickeln sich in den Wurzeln von Wirtspflanzen zu Zysten. Anhand dieser Zysten kann das Vorhandensein der (s) betreffenden Parasiten nachgewiesen werden.

388

STELTER; TROMMER: V e r f a h r e n z u m N a c h w e i s

A u s f r ü h e r e n U n t e r s u c h u n g e n ist b e k a n n t , d a ß besonders bei niedrigen Verseuchungen, enge Beziehungen zwischen der A n z a h l lebensfähiger L a r v e n u n d der sich d a r a u s e n t w i c k e l n d e n Z y s t e n z a h l bestehen. Auf dieser E r k e n n t n i s basiert das V e r f a h r e n : Die v o m F e l d e n t n o m m e n e n B o d e n p r o b e n ( T R O M M E R u n d S T E L T E R , 1 9 7 8 ) werden n a c h gründlicher D u r c h m i s c h u n g in 7 - c m - T o n t ö p f e gefüllt, in d e n e n d e m Versuchsziel e n t s p r e c h e n d e W i r t s p f l a n z e n k u l t i v i e r t werden. N a c h einer a u s r e i c h e n d e n E n t wicklungszeit, w e n n die Z y s t e n sich d u r c h ihre F ä r b u n g (gelb = G. rostochiensis, weiß = G. pallida) g u t von d e m U n t e r g r u n d a b h e b e n , werden die sich a n der Topfballenoberfläche entwickelten Z y s t e n gezählt. Mit d e m B i o t e s t wird die im B o d e n v o r h a n d e n e N e m a t o d e n p o p u l a t i o n also n i c h t direkt, sondern von der n ä c h s t e n Z y s t e n g e n e r a t i o n a u s g e h e n d , nachgewiesen. Der S c h ä t z w e r t f ü r die P o p u l a t i o n s d i c h t e wird in L a r v e n je 100 cm 3 B o d e n a u s g e d r ü c k t . 2.1.

Versuchsgefäße

Bei der W a h l der Versuchsgröße w a r e n folgende G e s i c h t s p u n k t e e n t s c h e i d e n d : — Die E n t w i c k l u n g möglichst vieler Z y s t e n a n der Oberfläche des Wurzelballens a u s einer B o d e n e i n h e i t . — E i n e pflegeleichte A n z u c h t der P f l a n z e n u n d eine möglichst b e q u e m e H a n d h a b u n g der T ö p f e v e r b u n d e n m i t geringem Stellplatz. Mit der Größe der Versuchsgefäße ist der D u r c h w u r z e l u n g s r a u m festgelegt. I n kleinen G e f ä ß e n wird die A u ß e n s e i t e des T o p f b a l l e n s frühzeitiger u n d schneller d u r c h w u r z e l t als in g r ö ß e r e n T ö p f e n u n d das V e r h ä l t n i s Oberfläche z u m V o l u m e n ist z u g u n s t e n der Oberfläche verlagert. Die Z y s t e n b i l d u n g a n der Oberfläche des W u r z e l b a l l e n s b e g i n n t in kleineren T ö p f e n eher als in größeren. I n größeren T ö p f e n w i e d e r u m k a n n eine größere B o d e n m e n g e u n t e r g e b r a c h t u n d d a m i t die V o r a u s s e t z u n g eines h ö h e r e n Wurzelbefalls e r w a r t e t werden. Kleinere T ö p f e erfordern eine geringere Stellfläche, sie sind j e d o c h meist a u f w e n d i g e r in der Pflege der P f l a n z e n . N i c h t glasierte T o n t ö p f e sind wegen ihrer R e s o r p t i o n s f ä h i g k e i t f ü r Gas u n d W a s s e r nachweislich besser geeignet als P l a s t e t ö p f e . A u f g r u n d der E r f a h r u n g e n in den l a n g j ä h r i g e n U n t e r s u c h u n g e n m i t G. rostochiensis entschieden wir u n s f ü r 7 - c m - T o n t ö p f e . A n z u c h t u n d Pflege der P f l a n z e n bereiten in diesen T ö p f e n keine Schwierigkeiten. E t w a 9 0 % der W u r z e l m a s s e entwickeln sich a n der A u ß e n s e i t e des Topfballens. 2.2.

Testpflanzen

B e s t i m m e n d f ü r d a s E r g e b n i s ist die W a h l der W i r t s p f l a n z e n (Testpflanzen). Geht es z . B . u m die A l t e r n a t i v e : N e m a t o d e n v o r h a n d e n oder n i c h t v o r h a n d e n , so wird lediglich ein f ü r alle P a t h o t y p e n anfälliger W i r t b e n ö t i g t . Sollen dagegen P a t h o t y p e n u n t e r s c h i e d e n werden, so sind die e n t s p r e c h e n d e n D i f f e r e n t i a l w i r t e zu verwenden. F ü r orientierende U n t e r s u c h u n g e n in einem R o u t i n e t e s t wird e m p f o h l e n , m i t zwei unterschieldich reagierenden W i r t e n zu a r b e i t e n ( T a b . 1): einem W i r t , der gegenüber allen P a t h o t y p e n anfällig reagiert (vorgeschlagen wird die K a r t o f f e l s o r t e 'Libelle') u n d einem W i r t , der v o n P a t h o t y p 1 nicht befallen wird (vorgeschlagen wird die

389

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, Band 16

Tabelle 1 Testpflanzen für Routineuntersuchungen im Biotest und deren Wirtseignungen Wirtseignung für Testpflanzen

anfällig für alle Pathotypen 'Libelle' für Pathotyp 1 resistent 'Xenia' +

= Zystenbildung;

Pathotyp 1

von Pathotyp 1 abweichende Pathotypen

+

+

—

+

— = keine Zystenbildung

Kartoffelsorte 'Xenia'). Damit sind zwei bezüglich des Vorkommens quantifizierbare Aussagen möglich: 1. Nematoden vorhanden, ja oder nein 2. Nematoden mit höherer Virulenz als Pathotyp 1 vorhanden, ja oder nein Werden neben Pathotyp 1 noch weitere Pathotypen festgestellt (Befall der Sorte 'Xenia') so kann, wenn die Notwendigkeit besteht, mit einem hierfür geeigneten Testsortiment ( E N G E L und S T E L T E R , 1 9 7 7 ) eine weitere Differenzierung erfolgen. Für den Nachweis weitere Globodera- oder Heterodera-Arten wird sinngemäß verfahren. 2.3.

Entnahme der Bodenproben und Zahl der Wiederholungen

Die Probenentnahme ( T K O M M E R und S T E L T E R , 1978) und der Biotest sind aufeinander abgestimmt. Die zur Beurteilung eines Schlages bzw. einer Untersuchungseinheit erforderliche Bodenmenge für einen Test wurde auf 3 1 Boden festgelegt. Diese Menge reicht aus, um 15 bis 17 7-cm-Tontöpfe zu füllen. Für jeden zusätzlichen Test (Cr. rostochiensis, Pathotyp 1 weitere Pathotypen bzw. G. pallida) sind weitere 3 1 Boden erforderlich, d. h. die Gesamtbodenmenge je Schlag bzw. Untersuchungseinheit muß auf 6 1, 9 1 usw. erhöht werden. Vor der Probenentnahme ist zu entscheiden, auf welche Nematodenarten bzw. Pathotypen der Test ausgedehnt werden soll. 2.4.

Untersuchungszeitraum, Versuchsdauer

Die Durchführung des Biotests ist auf den Zeitraum begrenzt, in dem die Kultivierung der Testpflanzen im Gewächshaus keine Schwierigkeiten bereitet und eine hohe Vermehrung der Nematoden erwartet werden kann. I n Mitteleuropa ist dies in der Regel die Zeit von Ende November bis etwa Mitte Mai. Für die im November und Dezember begonnenen Versuche müssen die Knollen in Keimstimmung gebracht werden, anderenfalls ist mit verzögertem und ungleichem Auflauf der Pflanzen zu rechnen.

390

STELTER; TKOMMER : V e r f a h r e n z u m N a c h w e i s

Die Versuchsdauer k a n n in der Regel — optimale Wasserversorgung u n d Temperat u r e n zwischen 12 u n d 22 °C vorausgesetzt — mit acht Wochen veranschlagt werden. N a c h dieser Zeit sind die von eventeull vorhandenen Bodenpopulationen entwickelten Zysten von G. rostochiensis gelb gefärbt u n d heben sich gut vom U n t e r g r u n d ab. Vorteilhaft ist es, mit einigen stark verseuchten Kontrolltöpfen den günstigsten Auswertungstermin zu bestimmen. I n der Zeit von November bis F e b r u a r ist eine Zusatzbeleuchtung f ü r die Pflanzen wünschenswert (16 S t u n d e n mit 400 W H Q R G - L a m p e n / m 2 haben sich bewährt), aber nicht unbedingt erforderlich. 3.

Ergebnisse

3.1.

Befall der Testpflanzen

N a c h Ablauf der Entwicklungszeit erfolgt die Auszählung der an den Wurzeln a n der Außenseite der Topfballen entwickelten Zysten. Hierzu werden die Topfballen mit einem leichten Schlag auf den n a c h u n t e n gerichteten T o p f r a n d aus dem Topf entnommen. Eine Berücksichtigung der Zysten, die sich im I n n e r n des Topfballens entwickelt haben, bringt keine Vorteile. Die Masse der Wurzeln befindet sich außen am Topfballen (ca. 90%) u n d damit auch die Masse der Zysten. Bei schwachen Bodenverseuchungen werden im Topf ballen selten Zysten gefunden und bei hohen Verseuchungen wird das Ergebnis mit Berücksichtigung dieser Zysten nicht zuverlässiger, aber immer ist das Auffinden von Zysten im Topfballen zufällig, denn beim Öffnen entgeht eine unkontollierbare Zystenzahl der Beobachtung. Das Auszählen großer Zystenmengen an den Wurzeln ist zeitaufwendig, e r m ü d e n d und das Ergebnis mit hohen Fehlern belastet. Eine obere Begrenzung der zu zählenden Zysten h a t sich als vorteilhaft erwiesen. E s wird vorgeschlagen, bis 50 Zysten je Topfballen zu zählen u n d den darüber hinausgehenden Befall mit 50 + zu bezeichnen. Die Einzelwerte der Wiederholungen werden summiert u n d der errechnete Mittelwert der Beurteilung zugrunde gelegt. Mit 5 0 + beurteilte Topfballen gehen in die Summe mit 50 Zysten ein, wenn ihre Zahl ein Drittel der Gesamtzahl der Wiederholungen (bei 15 Töpfen nicht mehr als 5) nicht überschreitet. Werden mehr als ein Drittel der Töpfe mit 5 0 + beurteilt, so wird der Mittelwert auf 5 0 + festgelegt. Beurteilungsfehler entstehen durch diese Verfahrensweise nicht. I n solchen Fällen handelt es sich meist u m Bodenpopulationen von > 1 0 0 0 L./100 cm 3 . 3.2.

Vergleich der Ergebnisse des Biotestes mit denen des S t a n d a r d v e r f a h r e n s

Vergleichende Untersuchungen zwischen dem Biotest u n d dem gebräuchlichen S t a n d a r d v e r f a h r e n (Fenwick-Kanne — Aceton-Methode) erfolgten an 260 Bodenproben vornehmlich zur Bestimmung der Beziehungen zwischen der Zystenzahl je Topfballen (Biotest) u n d der Larvenzahl je 100 cm 3 Boden (Standardverfahren). Von jeder gründlich durchmischten Bodenprobe verwendeten wir 3 1 Boden f ü r den Biotest u n d 7 X 200 cm 3 Boden f ü r das S t a n d a r d v e r f a h r e n . Bei den verwendeten Probeflächen handelte es sich um Versuchsflächen mit langjährig b e k a n n t e m Verseuchungsniveau u n d um Flächen nicht bekannter Verseuchungssituation.

391

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, B a n d 16

Von den insgesamt zur Verfügung stehenden 260 Wertepaaren nutzten wir 128 zu einer Ermittlung quantitativer Abhängigkeitsbeziehungen. Die verbleibenden Wertepaare konnten aus folgenden Gründen nicht berücksichtigt werden: Zahl der Wiederholungen geringer als vorgeben

: 24 Wertepaare (In Abb. 1 jedoch berücksichtigt)

In beiden Untersuchungen lebensfähige Larven nicht nachgewiesen

: 34 Wertepaare

Durchschnittsbefall im Biotest > 5 0 Zysten je Topf ballen

: 60 Wertepaare

Lebensfähige Larven nur in einem Untersuchungsverfahren nachgewiesen

: 14 Wertepaare

In den zuletzt aufgeführten 14 Versuchen entwickelten sich meist im Biotest einige Zysten, während mit dem Standardverfahren lebensfähige Larven mit Sicherheit nicht nachgewiesen werden konnten. Der umgekehrte Fall war selten. Die quantitative Abhängigkeitsbeziehung zwischen den Ergebnissen beider Untersuchungsverfahren wurde mit Hilfe von Regressionsmodellen untersucht (Tab. 2, Abb. 1 und 2). Zur Schätzung der Larvendichte y (Larven/100 cm 3 ) mit Hilfe der aus dem Biotest ermittelten durchschnittlichen Zystenzahl je Topf x erwies sich der Modellansatz lg y = a + b lg x am geeignetsten. Tabelle 2 Parameter der Kegressionsfunktionen (1) und (2)

Kegressionskoeffizient a Kegressionskoeffizient b Bestimmungsmaß B bezogen auf Igy Streuung um die Regressionsfunktion bezogen auf Igy

(1)

(2)

1,585 0,666

1,073 1,085

0,538

0,366

0,433

0,285

In Abbildung 1 sind die n = 128 Wertepaare als Punkteschwarm und die daraus berechnete Regressionsfunktion (1) auf halblogarithmischem Papier dargestellt. Da der Logarithmus der Larvendichte niedriger Werte von x(x < 10) wesentlich stärker streut als im Bereich hoher Werte von x, gibt die mittlere Streuung um die Regressionsfunktion sR für kleine x einen zu niedrigen und für große x einen zu hohen Wert an. Aus diesem Grunde wurde anhand von n = 3 0 Wertepaaren mit x > 10 eine weitere Regressionsfunktion (2) nach dem gleichen Ansatz berechnet, die eine kleinere Streuung sR aufweist und deren Schätzwert y für die Larvendichte außerdem für x > 20 höher sind als nach Regressionsfunktion (1) (Abb. 2). Für die Regressionfunktion (2) wurden mit Hilfe der Streuung sR die untere und obere Toleranzgrenze Yu, Y0 berechnet zur Toleranzwahrscheinlichkeit 8 0 % (zweiseitig) bzw. 90% (einseitig).

392

STELTER; TROMMER: V e r f a h r e n z u m

Nachweis

1000

%

x

10

~i \ i r 2 4 6 8 10 12 U 16 18 20 Abb. 1 Regressionstechnik (1)

1000

e

30 x Zysten / Topf

Abb. 2: Regressionsfunktion (1) und (2) und Toleranzgrenzen Yu, Yo berechnet für (2) Sie sind wie folgt zu interpretieren: E r g i b t der Biotest eine durchschnittliche Zystenzahl je Topf von x = 10, dann ist damit zu rechnen, daß in 8 0 % aller Versuche (Schläge, Untersuchungseinheiten) die Larvendichte zwischen 57 und 360 liegt bzw. in 9 0 % aller Versuche oberhalb 57 oder

A r c h i v f ü r P h y t o p a t h o l o g i e und P f l a n z e n s c h u t z , H e f t 6, 1 9 8 0 , B a n d 16

393

unterhalb 360. Bei einer Zystenzahl von beispielsweise x = 40 sind die entsprechenden Toleranzgrenzen Yu = 264 und Y0 = 1586 Larven (Abb. 2). Nach diesem Verfahren ist eine zahlenmäßige Schätzung von Bodenpopulationen im Bereich bis etwa 1000 L./100 cm 3 möglich. Höhere Populationen können in dem vorgegebenen Rahmen nicht mehr differenziert werden. Die Darstellung der Versuchsergebnisse in den Abbildungen 1 und 2 und die berechneten Toleranzgrenzen machen deutlich, daß mit dem zur Verfügung stehenden Datenmaterial eine sehr präzise Schätzung der Larvendichte y mit Hilfe der Zystenzahl x nicht möglich ist. Auch die Verwendung anderer Regressionsansätze sowie die Erhöhung der Topf zahl je Versuch kann die Präzision der Schätzung nicht merklich verbessern, wie entsprechende Berechnungen ergeben haben. Die Ursachen für die starke Streuung der Versuchsergebnisse sind vielmehr in Fehlern zu suchen, mit denen die beiden Verfahren (Biotest und Standardverfahren) noch behaftet sind. E s muß daher das Ziel zukünftiger Untersuchungen sein, nach diesen Fehlern zu suchen, um eine präzise Schätzung der Larvendichte zu erreichen.

4.

Diskussion

Die Verwendung von Wirtspflanzen zum Nachweis zystenbildender Nematoden ist nicht neu. Erste Anfänge sind in den Staudenkontrollen im Bestand zu sehen. Ein erstes routinemäßiges biologisches Verfahren zum Nachweis von H. schachtii entwickelte D U G G A N (1957). E r verwendete Glasröhrchen zur Aufnahme von 200 cm 3 Boden. B E H R I N G E R (1967a, b) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von G. rostochiensis in dafür entwickelten Spezialgefäßen (Vierkammergefäß). Vorteile dieser biologischen Nachweisverfahren sind in der einfachen Technik und vornehmlich in der Differenzierung der Bodenpopulation zu sehen ( B E H R I N G E R , 1976a, b, c; S C H L Ü T E R , 1976). T A Y L O R (1971) vermerkt dies Verfahren in seinem Methodenkatalog. Unabhängig von den verwendeten Materialien (Glasröhrchen, Tontöpfe) und den Anforderungen an die zu untersuchenden Bodenproben sind diese Untersuchungen darauf abgestimmt festzustellen, ob bestimmte Nematodenarten vorkommen oder nicht. Darüber hinausgehende Aussagen werden nicht erwartet. Lediglich B E H R I N G E R (1967 b) spricht in Abhängigkeit von der Anzahl der in den Kammern neugebildeten Zysten von schwachen und von starken Bodenverseuehungen. Mit der hier beschriebenen Variante des Biotestes wird über eine Umrechnung die Nematodenpopulation in Larven/100 cm 3 Boden ausgedrückt. Diese Bezugsgröße, mit der in großer Näherung das tatsächliche Infektionspotential ausgedrückt wird, bietet Vorteile gegenüber anderen Kriterien, z . B . für die Festlegung von Toleranzgrenzen, für die Beachtung von Quarantänemaßnahmen und die Durchführung von Bekämpfungsmaßnahmen. Gleichzeitig ist mit den Werten des Biotestes bei vorgegebenen Aubaufolgen eine Voraussage über den Verlauf der Populationsentwicklung und damit eine langfristige Planung im Kartoffelanbau möglich. Der Biotest bietet eine Reihe von Variationsmöglichkeiten. In Abhängigkeit von den Anforderungen kann der Test für den Nachweis einer Art oder mehrerer Arten bzw. eines oder auch mehrerer Pathotypen verwendet werden. Dies hat Konsequenzen für die Entnahme der Bodenproben. Ein Verfahren, das diesen Erfordernissen Rechnung trägt, wurde von T R O M M E R und S T E L T E R (1978) vorgeschlagen. 26

A r c h . P l i y t o p a t h o l . u . P f l a n z e n s c h u t z , B d . 16, H e f t 6

394 5.

Zusammenfassung

In dem von der Probeentnahme anfallenden Boden eines Feldes wird in 7-cm-Tontöpfen (15 Wiederholungen) eine Testpflanze kultiviert und die Zahl der am Wurzelballen entwickelten Zysten ermittelt. Vom Mittelwert der Zystenzahl einer Serie ausgehend kann anhand einer Grafik die Zahl der Larven/100 cm 3 Boden geschätzt werden. Das Verfahren wurde zum Nachweis von Globodera rostochiensis, Pathotyp 1, entwickelt. Mit der Verwendung von Differentialwirten für Pathotypen von G. rostochiensis (Wollenweber) und G. pallida (Stone) kann die Aussagefähigkeit dieses Biotestes erweitert werden. Pe3i0Me H a 3 B a n n e paßoTbi: MCTOH B H H B J I C H H H 3apa?«eHHH H OIJCHKH IIJIOTHOCTH nonyjumnH Olobodera rostochensis (Wollenweber), naTOTim I , B noHBcmibix n p o o a x B noHBe, nojiyneHHOH npH B3HTHH npoö c n o j i n , BbipauiHBaeTCH TecTpacTeHHe B ropniKax HHaMeTpoM 7 C M / 1 5 noBTopHOCTeft/ H onpeuejiHeTCH HHCJIO U H C T , 06pa30BaBumxcH B KOMe 3eMjno. H c x o a a H3 cpenHero HHCJia UHCT OJJHOH ceprai, MOJKHO c noMombio rpac{)HKa OUeHHBaTb HMCJIO J1HHHHOK B 1 0 0 CM 3 nOHBbl. 3 T O T M e T O f l 6bIJI pa3paÖ0TaH HJIH BbIHBJieilHH Olobodera rostochensis (Wollenweber), naTOTHn I. C noMombio X03HeB-ji;H(j)(j)epeHUHaT0p0B HJIH naTOTHriOB O. rostochiensis m O. pallida (Stone) MOJKHO yjiymiiHTb pe3yjibTaTHBHOCTI, 3T0r0 ÖHOTeCTa.

Summary Title of the paper: A method for detecting infestation and estimating the population density of Globodera rostochiensis Wollen weber, pathotype 1, in soil samples. One test plant each is cultivated in 7-cm clay pots (15 replications) filled with soil sampled from a field. The number of cysts on the root ball is then determined. Starting out from the mean number of cysts of a series, it is possible by means of a chart to estimate the number of larvae per 100 ccm of soil. The method was developed for detecting Globodera rostochiensis, pathotype 1. The indicativeness of that bioassay can be further improved by using differential hosts for pathotypes of G. rostochiensis Wollen weber and G. pallida (Stone). Literatur Lebenduntersuchung auf K a r t o f f e l n e m a t o d e n in Einweggefäßen. Nachrichtenbl. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 19 ( 1 9 6 7 a ) , S. 21 — 23 BEHRINGER, P . : Der B i o t e s t — Nematodennachweis mit Zukunft. K a r t o f f e l b a u 18 ( 1 9 6 7 b ) , S. 1 6 8 - 1 6 9 BEHRINGER, P . : D e r „Nematodenkontrollierte Z u c k e r r ü b e n b a u " — Notwendigkeit, Durchführung, Vorteile. Ges. Pflanze 28 ( 1 9 7 6 a ) , 1 8 4 - 1 8 6 BEHRINGER, P . : Möglichkeiten der E r f a s s u n g und B e k ä m p f u n g des R ü b e n n e m a t o d e n . Zucker 29 ( 1 9 7 6 b ) , S. 6 7 9 - 6 8 4 BEHRINGER, P . : Zur B e k ä m p f u n g des K a r t o f f e l n e m a t o d e n in B a y e r n . K a r t o f f e l b a u 27 ( 1 9 7 6 c ) , S. 1 7 2 - 1 7 3 DUGGAN, J . J . : Testing soil samples for beet root eelworm. E c o n . P r o c . R . Dublin Soc. 4 (1957), S. 8 3 - 8 9 ENGEL, K . - H . ; STELTER, H . : E i n Vorschlag zur Nomenklatur der P a t h o t y p e n von Globodera rostochiensis und G. pallida. B i o l . R u n d s c h . 15 (1977), S. 3 1 1 — 3 1 4 BEHRINGER, P . :

395

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, Band 16

SCHLÜTER, K . : The potato cyst eelworm Heterodera rostochiensis Woll. in Morocco: its distribution and economic importance. Z. Pflanzenkrankh. u. Pflanzenschutz 83 (1976), S. 4 0 1 - 4 0 6 TAYLOR, A. L . : Estimating nematode densities in soil and roots. FAO Manual 1971, 3.. 1. 4/1 - 3. 1. 4/5 TROMMER, R . ;

STELTER, H . :

Untersuchungen

zur

Rationalisierung

der

Entnahme

von

Bodenproben zum Nachweis von Olobodera rostochiensis Woll., 1923, auf Ackerflächen. Arch. Phvtopathol. u. Pflanzenschutz 14 (1978), S. 123 — 136

Anschriften der Verfasser: H.STELTER

Institut für Kartoffelforschung Groß Lüsewitz der A d L der D D R 2551 Groß Lüsewitz Dr. R .

TROMMER

Institut für Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow, Bereich Eberswalde der A d L der D D R 1300 Eberswalde-Finow 1 Schicklerstr. 5

Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz, Berlin 16 (1980) 6, S. 3 9 7 - 4 1 1

Institut für Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der Deutschen Demokratischen Republik, Forschungsstelle für chemische Toxikologie Leipzig der Akademie der Wissenschaften der Deutschen Demokratischen Republik und V E B Fettchemie Karl-Marx-Stadt Bereich PSM-Forschung

DIETER

OTTO, INGEBOEG BEHNISCH,

u n d WOLFGANG

GERD

PFEIFFER,

WOLFGANG

DEDEK

GEORGI

Metabolismus von Trichlorfon in sensiblen und resistenten Fliegen Musca domestica L . Eingegangen: 29. 1. 1980

1.

Einleitung

Der insenktizide Wirkstoff Trichlorfon (TCF) ( = Trichlorphon, TCP, Dipterex, Chlorofos, Foschlor, Neguvon, Metrifonat; = 0,0-Dimethyl-(l-hydroxy-2,2,2-trichlorethyl)-phosphonat) zeichnet sich durch folgende Eigenschaften aus, die seinen Anwendungsbereich bestimmen: Trichlorfon gehört mit einer toxikologischen Selektivitätskonstante von K

=

LD 5 0 Maus - LD 6 0 Fliege

-

=

660 mg/kg 2,7 ¡ig/g

B

=

244

(SCHRÄDER,

1963b)

zu den mindertoxischen Insektiziden und findet deshalb auch im veterinärmedizinischen und im Hygienesektor bevorzugte Anwendung. Besonders ist der Einsatz zur Bekämpfung von Ektoparasiten und von Stubenfliegen zu nennen. Die an sich ausgezeichnete Wirksamkeit auf Musca domestica L. wird durch Resistenzbildung bei intensiven Bekämpfungsprogrammen z . B . in großen Stallanlagen beeinträchtigt (BALASZ u n d ENESCU,

1 9 7 4 ; R O S L A V C E V A U. a . , 1 9 7 5 ; K E I D I N G ,

1975; MÜLLER,

1977;

und E S T H E R , 1 9 7 7 ) . Im Pflanzenschutz wird die Fraßgiftwirkung des TCF und die Eigenschaft, rasch und tief in das Pflanzengewebe einzudringen und so auch versteckt lebende und minierende Schädlinge zu treffen, genutzt. Als Grundlage für eine gezielte Suche nach Möglichkeiten zur Wirkungsverbesserung, Einsatzerweiterung und Einsatzsicherung des Wirkstoffes wurde eine Analyse der Faktoren in Angriff genommen, die die Wirkungsentfaltung im Inaekt begrenzen. Um grundsätzliche Vorstellungen und Erkenntnisse über Penetrationsgeschwindigkeit Metabolisierungsgeschwindigkeit und Metabolitenbildung zu bekommen, wurden vergleichende Untersuchungen mit 14 C-markierten TCF an sensiblen und resistenten Individuen von M. domestica vorgenommen. Für den biotischen Abbau des TCF sind die in Abbildung 1 dargestellten Mechanismen und Wege bekannt. Das Schema basiert auf Angaben von A R T H U R und C A S I D A (1957), H O D G S O N und C A S I D A (1962), Z A Y E D U. a. (1965a, b), H A S S A N U. a. (1965a, b, 1966), RUPES,

1976;

REINHRADT

398

OTTO U. a.: Metabolismus von Trichlorfon

Abb. ] : Abbauwege des Trichlorfon D E D E K ( 1 9 6 6 ) , SAWICKI ( 1 9 7 3 ) , D E D E K u n d GEORGI ( 1 9 7 8 ) u n d GEORGI ( 1 9 7 9 ) . B e i d e n

untersuchten Warmblütlern, Insekten und Mikroorganismen waren unterschiedliche Abbauwege dominierend ( H A S S A N U. a., 1 9 6 6 ; G E O R G I , 1 9 7 9 ) . Es gibt nur wenige Untersuchungen zum TCF-Metabolismus bei Insekten. Nach H A S S A N u. a. (1965 a) wird in der Noctuiden-Larve von Prodenia litura F. TCF zu etwa 7 0 % durch Demethylierung und zu etwa 3 0 % durch Spaltung der P-C-Bindung entgiftet. Nach diesen Autoren soll es auch zur Abspaltung der zweiten Methylgruppe und damit zur Bildung der 2,2,2-Trichlor-l-hydroxy-ethyl-phosphonsäure führen. Ein solcher Befund ist in der Literatur nicht noch einmal beschrieben worden und muß bezweifelt werden, da bisher bei keinem insektiziden Alkylphosphat ein derartiger Abbauweg bestätigt werden konnte; entweder sind die entstehenden DemethylVerbindungen stabil gegenüber einer weiteren metabolischen Abspaltung der zweiten Methylgruppe oder sie zerfallen infolge chemischer Instabilität unter Bildung anderer Bruchstücke, wie beim Demethyl-Trichlorphon nachgewiesen werden konnte ( S C H N E I D E R und F I S C H E R , 1977). S A I T O (1969) wies bei 7 Insektenarten folgende wasserlösliche Metaboliten des Trichlorfon nach: Dimethylphosphorsäure (15 ... 56%), DemethylTCF (0,5 ... 18%), Demethyl-DDVP (2 ... 34%), Monomethylphosphorsäure (1 ... 13% Phosphorsäure (5 ... 37%) und einen nicht identifizierten Metabolit (10 ... 35%). Bei M. domestica dominierte Demethyl-DDVP mit 34,2%, gefolgt von Demethylphosphorsäure (15,3%), Phosphorsäure (9,2%), Monomethylphosphorsäure (4,1%), DemethylTCF (2,7%). 34,5% machte der nicht identifizierte Metabolit aus.

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, Band 16

399

W ä h r e n d die durch Demethylierung und P-C-Spaltung entstehenden Metabolite nicht mehr insektizid wirksam sind, besitzt das Acetylcholinesterase inhibierende D D V P ( = Dichlorvos; 0,0-Dimethyl-0-(2,2-dichlorvinyl)-phosphat) etwa 6- bis lOfach stärkere insektizide Wirkung als TCF. Trichlorfon LD

5 O ((¿g/Fliege) t o p i k a l

L D 5 0 ((xg/Fliege) t o p i k a l LD50 (mg/kg R a t t e ) oral cutan J50 ( F l i e g e n - A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e bei IJH = 8

DDVP

0,285

0,033

0,32

0,03

560-630 2000 10-"

56-80 75-107 2,7 • 1 0 " 8

(PFEIFFER, 1980) (SCHRÄDER, 1963a) (SCHRÄDER, 1963a) SCHRÄDER, 1963a) (PILZ, 1980)

Die F r a g e der insektiziden Wirkung von Trichlorfon ist zur Zeit noch nicht eindeutig geklärt; seine Cholinesterase-Hemmwirkung in vitro ist stark p H - a b h ä n g i g (ABTHUR u n d CASIDA, 1957) u n d n i m m t mit steigendem p H - W e r t schnell zu, ebenso wie die Bildung von D D V P aus Trichlorfon (SCHRÄDER, 1963a); damit liegt die V e r m u t u n g nahe, d a ß Trichlorfon seine insektizide Wirkung ausschließlich oder bevorzugt durch Bildung von D D V P entfaltet, wobei der p H - W e r t des jeweiligen physiologischen Milieus sowie die enzymatisch determinierte Geschwindigkeit des metabolischen Abbaus den Konzentrationsverlauf an D D V P u n d damit die insektizide Wirkung bestimmt. Die Bildung von D D V P aus TCF in wäßrigen abiotischen Medien etwa ab p H >• 5,5 (bei 37°C) ist lange bekannt (SCHRÄDER, 1963 a) u n d findet natürlich auch in biologischen Medien s t a t t ( D E D E K , 1 9 6 6 ; D E D E K u n d SCHWARZ, 1 9 6 6 ; SCHENK, 1 9 6 7 ; B U L L u n d ) RIDGWAY, 1 9 6 9 ; SUGIYAMA, 1 9 6 6 ; BEITZ U. a . , 1 9 6 9 ; GEORGI, 1 9 7 9 ; D E D E K u . a . ,

1979. Der Einfluß enzymatischer Prozesse auf diese Umwandlung eines Phosphonsäure- in einen Phosphorsäure-Ester ist noch nicht geklärt; es gibt lediglich einen Hinweis von SUGIYAMA und SHIGEMATSU ( 1 9 6 9 ) auf eine enzymatische Dehydrochlorierung von Trichlorfon durch die Verdauungssäfte des Seidensjiinners Bombyx niori L. U n t e r in-vivo-Bedingungen sind nur wenige Prozent ( < 5 % ) von D D V P relativ zum Trichlorfon im Gleichgewicht des Metabolismus zu erwarten ( D E D E K , 1 9 6 6 ; D E D E K und SCHWARZ, 1 9 6 6 ; BEITZ u. a., 1 9 6 9 ) ; NORDGREN U. a. im Druck). METACALE u. a. (1959) fanden nach oraler A u f n a h m e von 3 2 P-TCF an Stubenfliegen nach dem E x i t u s 5 % des 3 2 P als D D V P . 2.

Material und Methoden

F ü r die Untersuchungen zum TCF-Metabolismus standen im I n s t i t u t f ü r Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow zwei gegen diesen Wirkstoff hochresistente S t ä m m e (R, J) u n d ein normalempfindlicher Vergleichsstamm (S) zur Verfügung: S = SRS-Stamm aus dem I n s t i t u t f ü r Hygiene und Epidemiologie P r a g (RUPES

400

OTTO U. a.: Metabolismus von Trichlorfon

u n d P I N T E R O V A , 1 9 7 5 ) , von der W H O als R e f e r e n z s t a m m empfohlen ( W H O 1964) LD 5 0 (topikal) u m 0,3 ¡x/$ R = R K T - S t a m m seit März 1974 ständig mit T C F selektiert seit 42. Generation RT >

700

LD5O (topikal) um 230 ¡xg/? J = JUI-Stamm

Soldep-(Trichlorfon) resistenter S t a m m a u s Stallungen der Gemeinde J i v o v a (Kreis, Olomouc, CSSR) u n d gehalten im I n s t i t u t f ü r H y g i e n e u n d Epidemiologie P r a g (Dr. RUPES). Seit 1975 erfolgt ständige Selektion mit T C F im I n s t i t u t f ü r P f l a n z e n s c h u t z f o r schung Kleinmachnow, ohne weitere V e r s t ä r k u n g der Resistenz zu erreichen. Ri > 700, LD 5 0 (topikal) u m 230 [ig/?

Detaillierte Angaben über die S t ä m m e finden sich bei T C F w u r d e als

14

PFEIFFER

(1980).

C H 3 0 - m a r k i e r t e s P r ä p a r a t e i n g e s e t z t (DEDEK u n d GRAHL, 1 9 7 3 ) m i t

einer spezifischen A k t i v i t ä t von 1,8 X 10 5 dpm/fig = 81 mCi/g. Die A u f b e w a h r u n g erfolgt in Benzen bei —25 °C. E i n e DC-Reinheitsprobe ergab eine Z u s a m m e n s e t z u n g von 9 0 % TCF, 1 % D D V P u n d 9 % polare U m s e t z u n g s p r o d u k t e . Die S u b s t a n z wurde topikal auf die T h o r a x t e r g i t e als T r o p f e n acetonischer L ö s u n g von 100 ng bzw. 200 ng in 1 fil p r o Fliege appliziert oder d u r c h I n j e k t i o n von 60 ng bzw. 100 ng Wirkstoff in 1 [xl physiologischer Lösung ( p H = 6,8) in den T h o r a x . P r o V e r s u c h s v a r i a n t e u n d Wiederholung w u r d e n jeweils 20 oder 25 Fliegenweibchen gleichartig u n d gemeinsam verarbeitet, so d a ß p r o Analysenprobe 2 bis 4 fig (topikal) bzw. 1,2 bis 2,4 ¡ig (percutan) m a r k i e r t e r Wirkstoff in einer A k t i v i t ä t von 2,1 bis 7,2 X 10 6 dpm eingesetzt wurde. N a c h der gewünschten Wirkungszeit wurde die R e a k t i o n d u r c h schnelles A b k ü h l e n bei —25 °C gestoppt. Anschließend erfolgte die E x t r a k t i o n des Wirkstoffes u n d der Metaboliten aus dem H o m o g e n a t mit Chloroform u n d Methanol (1:2) in einer Kühlzelle bei 0 °C. Topikal aufgesetzter, nicht eingedrungener Wirkstoff wurde vor dem Homogenisieren f ü r eine gesonderte Messung mit Aceton abgewaschen. Auch vom A u f e n t h a l t s g e f ä ß f ü r die Fliegen u n d dem d a r i n ausTabelle

1 :

D i e I t j - W e r t e d e r T r i c h l o r f o n - M e t a b o l i t e n auf 0,3 m m d i c k e r K i e s e l g e l s c h i c h t (n. STAHL, T y p 60, M e r c k ) i n v e r s c h i e d e n e n L a u f m i t t e l s y s t e m e n Laufmittel Substanz

TCF DDVP Demethyl-DDVP Demethyl-TCF Dimethylphosphorsäure Monomethylphosphorsäure

Chloroform/ Methanol

Chloroform/ Methanol

Acetonitril/ Wasser

95/5

50/50

85/15

0,4

0,8

0,6

0,7 0 0 0

0,8 0,65 0,47 0,22

0,43 0,16 0,03

0

0,02

0,03

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, Band 16

401

gelegten F i l t e r b l a t t w u r d e eine W a s c h l ö s u n g (Chloroform + Methanol) zur Bestimm u n g der E x k r e t i o n gewonnen. Z u r Messung von A u f n a h m e - ( P e n e t r a t i o n - ) u n d Exkretionsgeschwindigkeit d i e n t e n Messungen der G e s a m t a k t i v i t ä t im Szintillations-Spektrometer T r i c a r b ( P a c k a r d ) . D a z u w u r d e die in 45 fxl M e t h a n o l gelöste P r o b e in einen Szintillator folgender Zus a m m e n s e t z u n g e i n g e b r a c h t : 0,1 g P O P O P + 2,0 g P P O in 1 1 Toluen. Die q u a n t i t a t i v e B e s t i m m u n g der Metaboliten erfolgte mittels DC-Technik n a c h D E D E K ( 1 9 6 6 ) u n d GEORGI ( 1 9 7 9 ) . Tabelle 1 b r i n g t eine Übersicht über die R^-Werte der M e t a b o l i t e n beim E i n s a t z der verschiedenen L a u f m i t t e l s y s t e m e . Die q u a n t i t a t i v e A u s w e r t u n g des C h r o m a t o g r a m m e s erfolgte mit d e m D ü n n s c h i c h t s c a n n e r I I (BERTHOLD). Die in d e n Tabellen u n d A b b i l d u n g e n ausgewiesenen M e n g e n a n g a b e n der Monomethyl-Verb i n d u n g e n stellen den gemessenen A k t i v i t ä t s w e r t in P r o z e n t zur eingesetzten A k t i v i t ä t d a r . F ü r die A u s w e r t u n g ist zu berücksichtigen, d a ß sich die 1 4 C - M a r k i e r u n g a m C - A t o m der M e t h o x y - G r u p p e b e f i n d e t u n d sich somit mit der A b s p a l t u n g einer M e t h y l g r u p p e v o m E s t e r die spezifische A k t i v i t ä t verringert. 3.

Ergebnisse Penetrationsgeschwindigkeit

100 ng T C F in 1 (xl Aceton gelöst u n d den T h o r a x - T e r g i t e n aufgesetzt, sind n a c h 30 min zu m e h r als 7 5 % in den Fliegenkörper eingedrungen. Zwischen 1 u n d 2 h sind 9 0 % a u f g e n o m m e n . E i n e R e s t a k t i v i t ä t in der G r ö ß e n o r d n u n g von ca. 5 bis 1 0 % ist a u c h n a c h längerer Zeit ( g e p r ü f t bis zu 24 h) n o c h a b w a s c h b a r , wobei die q u a l i t a t i v e Analyse im Scanner ergab, d a ß es sich hierbei vor allem u m wasserlösliche B e i m e n g u n gen des P r ä p a r a t e s h a n d e l t , die die K u t i k u l a nicht d u r c h d r i n g e n . I n A b b i l d u n g 2 sind die P e n e t r a t i o n s w e r t e bei sensiblen u n d den resistenten S t ä m m e n angegeben. D e r Versuch w u r d e mit 100 ng TCF/Fliege, 20 F l i e g e n / V a r i a n t e u n d in jeweils 3facher W i e d e r h o l u n g d u r c h g e f ü h r t . Die W e r t e sind d u r c h Abzug des Anteiles a n polaren, wasserlöslichen Beistoffen korrigiert, d. h. sie sind a u s d e m A k t i v i t ä t s a n t e i l e r m i t t e l t , der vom aufgesetzton T C F s t a m m t . Die A u f n a h m e ist bei den resistenten Fliegen v e r l a n g s a m t , i n n e r h a l b der 1. S t u n d e sind d u r c h s c h n i t t l i c h 10 bis 2 0 % des a u f g e s e t z t e n T C F weniger eingedrungen. Mit der N ä h e r u n g a n die m a x i m a l mögliche E i n d r i n g m e n g e in der 2. S t u n d e n ä h e r n sich d a n n zwangsläufig die A u f n a h m e w e r t e f ü r die 3 S t ä m m e . PEKEGUDA u n d ZOLOTAREV (1979) weisen ähnlich große Geschwindigk e i t s u n t e r s c h i e d e f ü r die T C F - P e n e t r a t i o n zwischen resistenten u n d empfindlichen F l i e g e n s t ä m m e n aus. Die V e r s u c h e w u r d e n in einer weiteren Versuchsreihe öfach je Zeitstufe u n d S t a m m wiederholt, wobei m i t 200 ng die doppelte Menge pro Fliege a u f g e t r a g e n wurde. D a s E r g e b n i s ist in A b b i l d u n g 3 dargestellt. I m S ä u l e n d i a g r a m m sind die statistischen 95 % V e r t r a u e n s b e r e i c h e f ü r die Mittelwerte eingezeichnet. E s zeigt sich wiederum eine P e n e t r a t i o n s v e r z ö g e r u n g bei den resistenten S t ä m m e n . Sie ist zwar n u r relativ gering, aber s t a t i s t i s c h signifikant (t-Test, P = 0,05). N a c h A b b i l d u n g 2 u n d 3 ist sie beim J - S t a m m s t ä r k e r a u s g e p r ä g t als b e i m -R-Stamm. D a der Resistenzgrad beider resistenter S t ä m m e von R j > 700 auf < 10 sinkt, wenn das T C F u n t e r die K u t i k u l a injiziert a n s t a t t topikal a u f g e t r a g e n wird (PFEIFFER, 1980), waren allerdings s t ä r k e r e P e n e t r a t i o n s u n t e r s c h i e d e e r w a r t e t worden.

402

OTTO U. a . : Metabolismus von Trichlorfon

%k 1009080 70 -

SO -

50-

40 -

30-

20 -

10I

0

I

0,5

I

• FR

1

2t(h)

Abb. 2: Die Aufnahemgeschwindigkeit von 100 ng topikal aufgetragenem Trichlorfon bei sensiblen (S) und resistenten ( I i , J) Fliegen Metabolisierungsdynamik in der normal empfindlichen Fliege bei topikaler Applikation U m die Metabolisierung des eingedrungenen T C F qualitativ und q u a n t i t a t i v zu verfolgen, wurden j e Zeitvariante 20 sensiblen Fliegen j e 200 ng T C F topikal appliziert. Diese Menge entspricht der L D 2 5 des sensiblen S t a m m e s . Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. E s läßt sich folgendes erkennen: — T C F penetriert in diesen Versuchen mit etwa der gleichen Geschwindigkeit wie in den voranbeschriebenen. Ebensoschnell reichert es sich zunächst im K ö r p e r an, aber nur, bis es in 30 bis 60 min ca. J / 3 der eingesetzten Menge erreicht. D a n n überwiegen die Abbau- und Ausscheidungsprozesse, so daß die aus dem K ö r p e r extrahierbare TCF-Menge nach 1 h wieder geringer wird. Schon nach 15 min läßt sich eine Ausscheidung unveränderten Wirkstoffes im K o t nachweisen. Innerhalb 1 h sind ca. 2 0 % der eingesetzten Menge unverändert wieder mit den E x k r e m e n ten ausgeschieden. D a n a c h findet allerdings k a u m noch eine T C F - E x k r e t i o n s t a t t . — D a s insektizide D D V P k o n n t e im K ö r p e r e x t r a k t und in den E x k r e m e n t e n nicht nachgewiesen werden; vermutlich wird es sofort an der Acetylcholinesterase gebunden, anderenfalls schnell metabolisiert. D a ß D D V P intermediär entsteht, geht daraus hervor, daß sein durch Demethylierung entstehendes Abbauprodukt D e m e t h y l - D D V P in relativ hohem Anteil nachweisbar ist. Dieser Metabolit k a n n sich n a c h

SCHNEIDER u n d FISCHER ( 1 9 7 7 ;

s. a u c h DEDEK U. a . , 1 9 7 9 ) n u r a u s

403

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1980, Band 16

100 90 80

\

70 60

50

30

20 SRS

m

M

sus m

w 30min

1h

m

m

m

m

t

A b b . 3 : Die Aufnahmegeschwindigkeit von 200 g topikal aufgetragenem chlorfon bei sensiblen (S) und resistenten (2?, J) Fliegen

Tri-

DDVP, nicht aber aus Demethyl-TCF bilden. Bei den Versuchstieren des S-Stammes tritt Demethyl-DDVP vorübergehend im Körper auf und erscheint ab 1 h im K o t ; nach 6 h sind 15% der eingesetzten Aktivität als Demethyl-DDVP ausgeschieden. — Das demethylierte TCF tritt in der sensiblen Fliege nach topikaler Begiftung nicht auf. — Die Monomethylphosphorsäure reichert sich vorübergehend im Körper an. Sie wird z. T. ausgeschieden, z. T. weiter zur Phosphorsäure abgebaut. Da von den möglichen Vorstufen (vgl. Abb. 1) das Demethyl-TCF nicht nachweisbar ist, ist es wahrscheinlich, daß sich dieser Metabolit aus einer Esterspaltung des DemethylDDVP herleitet. Auch dieser Befund zeigt an, daß primär in größerem Umfang TCF in DDVP umgesetzt wird. — Dimethylphosphorsäure ist ab 2 h in nur geringen Mengen (1 ... 4 % ) im Kot nachweisbar. Seine Entstehung ist durch Spaltung der P-C-Bindung des TCF oder aber durch Esterspaltung des DDVP denkbar. Dieser Entgiftungs- und Abbauweg ist in unserem S-Fliegenstamm nur schwach ausgeprägt. Als Endstufe dieser Metabolisierungswege müßte Dimethylphosphat sonst stärker im Kot angereichert sein. S A I T O (1969) konnte bei M. domestica 15% des eingesetzten TCF als Dimethylphosphorsäure nachweisen. Nach optikaler Applikation einer LD 2 5 von TCF auf sensible Fliegen ergibt sich folgender Hauptweg: TCF —>- DDVP -»- Demethyl-DDVP -> Monomethylphosphorsäure Phosphorsäure

404

OTTO U. a.: Metabolismus von Trichlorfon

Abb. 4 : Die Metabolisierungsdynamik von Trichlorfon in der sensiblen Fliege nach topikaler Applikation von 200 ng T C F Metabolisierungsunterschiede zwischen resistenten und sensiblen Fliegen B e i topikaler Applikation unter Verwendung einer TCF-Menge von ebenfalls 200 ¡ig/ Fliege — einer für die resistenten Fliegen toxisch bedeutungslosen Dosis — lassen sich nur geringe Unterschiede zwischen den S t ä m m e n nachweisen. E s deutet sich lediglich an, daß das D e n i e t h y l - D D V P geringfügig etwas eher und zeitweise stärker auftritt, was eine schnellere und intensivere E n t g i f t u n g des D D V P bedeutet und daß beim R - S t a m m in geringem Umfang (bis zu 4 % ) auch D e m e t h y l - T C F erscheint, was eine direkte E n t g i f t u n g des T C F durch Demethylierung enzeigt. F ü r die Abspaltung der Methoxy-Gruppen könnten Esterasen oder Oxidasen der m.f.o-Gruppe oder auch glutathionabhängige Alkyltransferasen verantwortlich gemacht werden. I n Versuchen mit definierten Enzyminhibitoren als Synergisten konnten wir die Trichlorfon-Empfindlichkeit der resistenten S t ä m m e erhöhen, und zwar gering ( F a k t o r 7 ... 9) mit m.f.o.-Inhibitoren, stark ( F a k t o r as 24) mit Esterasei n h i b i t o r e n (PFEIFFER U. a., 1979; PFEIFFEE, 1980). Unter der Voraussetzung ausreichender Spezifität der verwendeten Inhibitoren ist damit wahrscheinlich gemacht, daß die Demethylierung vorwiegend auf einer hydrolytischen Esterspaltung beruht. Dies wird b e s t ä r k t durch den B e f u n d , daß beim diskelektrophoretischen Vergleich der B a n d e n a-Naphthylphosphat-spaltender Hydrolasen beim / ¿ - S t a m m E n z y m bezirke erhöhter Phosphorester-spaltender A k t i v i t ä t nachweisbar sind PFEIFFEE U. a., 1979). Zur besseren Erfassung der Metabolisierungsunterschiede zwischen den S t ä m m e n wurde der A b b a u einer injizierten Dosis von 60 ng 1 4 C - T C F vergleichend untersucht.

Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, H e f t 6, 1980, Band 16

405

D a m i t wurde eine definierte Startdosis gegeben, während bei topikaler Applikation die Abbauprozesse von den zeitabhängigen Aufnahmeprozessen überlagert u n d damit komplizierter zu analysieren sind. Obwohl der Resistenzgrad bei subkutaner I n j e k t i o n nur gering ist (PFEIFFEE, 1980), zeichnen sich doch einige deutliche Unterschiede im Metabolisierungsverhalten der S t ä m m e a b : F ü r die Abbaugeschwindigkeit des T C F konnten auf diese Weise Halbwertzeiten ermittelt werden. Sie sind in der Graphik der Abbildung 5 dargestellt. Z u m A b b a u

A b b . 5: H a l b w e r t z e i t e n f ü r den A b b a u des Trichlorfon n a c h I n j e k t i o n in d e n Fliegenkörper bei den sensiblen u n d resistenten F l i e g e n s t ä m m e n

einer TCF-Menge (der eingesetzten Größenordnung) auf jeweils die halbe Menge benötigt der (S-Stamm 47 min der i?-Stamm 24 min der ./-Stamm 25 min D a s schnellere Verschwinden von T C F bei Resistenz k a n n nicht auf ein verstärktes Ausscheiden unveränderter T C F zurückgeführt werden, wie Tabelle 2 zeigt. E s erscheint bei den Resistenten sogar weniger unverändertes TCF im K o t , was auf eine intensivere Metabolisierung hinweist. Dem schnelleren TCF-Abbau bei den resistenten S t ä m m e n entspricht ein verstärktes A u f t r e t e n an untoxischen Metaboliten (Tab. 3). Bei dieser Zusammenstellung m u ß t e allerdings die reine Phosphorsäure unberücksichtigt bleiben, da diese bei der 14 C-Markierung nicht erfaßbar war. N u r bei den beiden resistenten S t ä m m e n t r i t t markierte Dimethylphosphorsäure auf (Tab. 4). Die E s t e r s p a l t u n g des D D V P und/oder die P-C-Spaltung des T C F sind demnach eine Fähigkeit nur der resistenten Stämme. Die Menge deckt sich größenordnungsgemäß mit dem von SAITO (1969) an M. domestica ermittelten W e r t . Die hydrolysebeständige Dimethylphosphorsäure ist E n d s t u f e des Abbauweges, sie wird nicht weiter zu Monomethylphosphorsäure oder Phosphorsäure abgebaut (O'BRIEN, 1967; HASSAN U. a., 1965b). Auch in unseren Versuchen wurde die Dimethylphosphor-

406

OTTO U. a . : M e t a b o l i s m u s v o n Triclilorfon

Tabelle 2 D i e A u s s c h e i d u n g v o n u n v e r ä n d e r t e m T r i c h l o r f o n (in P r o z e n t d e r i n j i z i e r t e n Menge) bei sensiblen u n d r e s i s t e n t e n F l i e g e n Zeit n a c h der Injektion

1 0 0 1,6 2,8 2,9 6,3 7,4

0 15 m i n 30 m i n 1 h 2 h 4h 6 h

S-Stamm Wiederholungen | 2 3 0 0 3,0 4,9 9,9 6,3 9,0

1

X

0 0 0 0 0,8 ! 1,8 2,2 3,3 5,6 4,1 5,9 6,2 5,5 1 7,3

R-Stamm Wiederholungen 1 2 3 0 0 1 3,9 4,1 4,3 4,0

0 0,5 0,9 0,9 6,6 3,4 5,5

0 0 0 0 2,0 2,0 1,0

X

0 0,2 0,6 1,6 4,2 3,2 3,5

J-Stamm Wiederholunge n 1 2 3 0 0 0,4 0,7 1,8 3,3 2,5

0 0 0,8 3,2 4,5 4,2 6,8

0 0 0 3,2 3,2 3,4 3,1

X

~0 0 0,4 2,4 3,2 3,6 4,1

säure sofort ausgeschieden, sie k o n n t e n u r in den E x k r e m e n t e n nachgewisen werden. I m Gegensatz zur topikalen Applikation k o m m t es bei Injection von T C F zu einem direkten TCF-Abbau durch Bildung des Monomethyl-TCF (Abb. 6). Beim .ß-Stamm ist dieser Abbauweg etwa 3- bis 4fach stärker als beim Ä-Stamm ausgeprägt. I m Mittel von 3 Wiederholungen sind n a c h 6 h bei S 4,6%, bei R dagegen 15,2% der eingesetzten A k t i v i t ä t als Monomethyl-TCF vorhanden. Beim J - S t a m m zeigt ein schnelles u n d anfänglich starkes A u f t r e t e n dieses Metaboliten eine etwa gleich starke Fähigkeit zur Demethylierung a n wie beim i?-Stamm. D a n n scheinen aber weitergehende Metabolierungsschritte (vgl. Abb. 1) zu überwiegen, so daß es zu keiner A k k u m u l a t i o n sondern zu einer A b n a h m e k o m m t . D D V P ist auch nach I n j e k t i o n des TCF nicht oder nur in Spuren nachweisbar. Sein A b b a u p r o d u k t Monomethyl - D D V P findet sich jedoch in allen S t ä m m e n . Dabei erscheint im J - S t a m m etwa doppelt so viel als beim S- u n d i i - S t a m m (Abb. 7). I m Mittel von 3 Versuchen lassen sich nach 6 h bei S 16,8%, bei B 15,7%, bei J dagegen 31,5% der eingesetzten A k t i v i t ä t in F o r m von Monomethyl-DDVP nachweisen. 30 • %

20 -

A b b . 6 : N a c h w e i s v o n m a r k i e r t e m M o n o m e t h y l - t r i c h l o r f o n (in P r o z e n t d e r inj i z i e r t e n T C F - M e n g e ) in K ö r p e r u n d E x k r e m e n t e n d e r sensiblen u n d r e s i s t e n t e n Fliegen

Archiv f ü r Phytopathologie und Pflanzenschutz, Heft 6, 1080, Band IG

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