Acta Biotechnologica: Volume 8, Number 1 1988 [Reprint 2021 ed.] 9783112581742, 9783112581735

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Acta BiotocliMhiica •

Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0136-4988 Acta Biotechnol., Berlin 8 (1988) 1 , 1 - 1 1 2

Volume 8 • 1988 • (slumber 1

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Ada Biiteduoloiia Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Edited by the Institute of Biotechnology of the Academy of Sciences of the G.D.R., Leipzig and by the Kombinat of Chemical Plant Construction Leipzig—Grimma by M. Ringpfeil, Berlin and G. Vetterlein, Leipzig

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1988

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Number 1

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L. Dimter, Leipzig

Volume 8

A K A I) E M I E - V E R L A G

B E R L I 2s

"Acta Biotechnologica" publishes original papers, short communications, reports and reviews from the whole field of biotechnology. The journal is to promote the establishment of biotechnology as a new and integrated scientific field. The field of biotechnology covers microbial technology, biochemical technology and the technology of synthesizing and applying bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guaranteed by the fact that papers on microbiology, biochemistry, chemistry and physics must clearly have technological relevance. Terms of subscription for the journal "Acta Biotechnologica" Orders can be sent — in the GDR: to Postzeitungsvertrieb or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, D D R -1086 Berlin; — in the other socialist countries: to a bookshop for foreign languages literature or to the competent news-distributing agency; — in the FRG and Berlin (West): to a bookshop or to the wholesale distributing agency Kunst und Wissen, Erich Bieber OHG, Wilhelmstr. 4 - 6 , D-7000 Stuttgart 1; — in the other Western European countries: to Kunst und Wissen, Erich Bieber GmbH, General Wille-Str. 4, CH-8002 Zürich; — in other countries: to the international book- and journal-selling trade, to Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der DDR, P F 160, DDR - 7010 Leipzig, or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, DDR -1086 Berlin. Acta Biotechnologica Herausgeber: Institut für Biotechnologie der AdW der DDR, Permoserstr. 15, D D R - 7 0 5 0 Leipzig (Prof. Dr. Manfred Ringpfeil) und VEB Chemieanlagenbaukombinat Leipzig—Grimma, Bahnhofstr. 3 - 5 , D D R - 7 2 4 0 Grimma (Dipl.-Ing. Günter Vetterlein). Verlag: Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 , P F 1233, DDR -1086 Berlin; Fernruf: 2236201 und 2236229; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Konto-Nr.: 6836-26-20712. Redaktion: Dr. Lothar Dimter (Chefredakteur), Martina Bechstedt, Käthe Geyler (Redaktion), Permoserstr. 15, D D R - 7 0 5 0 Leipzig, Tel.: 2392255. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1671 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckhaus „Maxim Gorki", D D R - 7 4 0 0 Altenburg. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift „Acta Biotechnologica" erscheint jährlich in einem Band mit 6 Heften. Bezugspreis eines Bandes 192,— DM zuzüglich Versandspesen; Preis je Heft 32,— DM. Der gültige Jahresbezugspreis für die DDR ist der Postzeitungsliste zu entnehmen. Bestellnummer dieses Heftes: 1094/8/1. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translation into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission form the publishers. © 1981S by Akademie-Verlag Berlin. Printed m the German Democratic Republic. AN (EDV) 18320 03000

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 3 - 2 0

Biotechnologische Produktion mikrobieller Wirkstoffe: ein Beispiel für die Nutzung des Adaptationspotentials von Mikroorganismen (Vortrag, gehalten auf der Generalversammlung der Biologischen Gesellschaft der DDR, Rostock, 2 6 . - 2 9 . 1. 1987) GRÄFE, U .

Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Akademie der Wissenschaften der DDR, Beutenbergstraße 11, Jena, 6900 DDR

Summary The role of the microbial secondary metabolism in the cytodifferentiation of producer strains and in the ecological system is reviewed. The production of bioactive metabolites such as antibiotics seems to play a role in long-term strategies of adaptation to environmental changes. This is reflected by characteristic features of regulation of the secondary metabolism such as catabolite repression, lack of uniform regulatory mechanisms and limited specificity of enzymes involved. The examples given may show that advantages have been taken from the knowledge of special regulatory features with regard to strain improvement and the designing of the metabolite spectrum.

Einleitung Mikroorganismen werden seit mehr als 40 Jahren f ü r die biotechnologische Produktion von Antibiotika, Alkaloiden und anderen Produkten ihres Sekundärmetabolismus genutzt. Damit wurde ein bedeutender Beitrag zur Entwicklung der modernen Biowissenschaften geleistet. Von Anbeginn dieser Entwicklung an waren praxisorientierte Fragestellungen, etwa zur Leistungssteigerung von Wirkstoffbildnern auf das engste mit der Erforschung der genetischen und biochemischen Grundlagen des Sekundärmetabolismus verknüpft. Nach einer so langen Zeit der Bearbeitung zeichnen sich dessen Bedeutung als Träger der Wirkstoffproduktion und seine Rolle in Strategien der mikrobiellen Adaptation etwas klarer ab, als zu Beginn der Antibiotikaära. Die zunächst nur unbewußte, später gezielter ansetzenden Manipulationen des Sekundärstoffwechsels der Mikroben aufgrund von Erkenntnissen über dessen genetische und biochemische Determinanten bilden zugleich ein Beispiel für die Nutzung natürlicher Anpassungsmechanismen bei der Entwicklung biotechnologischer Prozesse.

Natur des mikrobiellen Sekundärstoffwechsels als Träger der Wirkstoffproduktion Der aus der Pflanzenphysiologie stammende Begriff Sekundärstoff Wechsel verdeutlicht, daß dieser Stoffwechselbereich in erster Näherung keine direkte Funktion in der vegetativen Entwicklung hat, also lediglich ,sekundäre' Bedeutung besitzt. [1] Der Sekundärstoffwechsel entnimmt Vorstufen(,Präkursoren')aus dem normalen Bausteinstoffwechsel 1*

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der Zelle, wie z. B. Glucose-phosphate, Acyl-Coenzyme A, Aminosäuren und ihre Vorstufen, Mevalonsäure oder Nukleoside. Durch ihren Einbau in Sekundärmetabolite wird formal die Bildung funktionaler Zellbestandteile (Polysaccharide, Proteine, Nukleinsäuren usw.) beeinträchtigt. Was soll also die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, wenn sie keinen Nutzen für den betreffenden Mikroorganismus mit sich bringt [2, 3, 4]? Die exzessive Länge vieler Biosynthesewege ist ein weiteres Charakteristikum. Bei der Biogenese des bekannten Chlortetracyclins sind beispielsweise mehr als 200 Gene direkt oder indirekt beteiligt [5], Welchen Sinn hat, so muß man auch an dieser Stelle fragen, die Erhaltung von aufwendigen Reaktionssequenzen, wenn weder der Gesamtvorgang noch das Endprodukt irgend einen Vorteil für den betreffenden Bildner bewirken? Häufig tritt der antibiotische Wirkstoff gemeinsam mit einer größeren Anzahl chemisch verwandter bioaktiver aber auch inaktiver Metabolite (Kongenoren) auf, die über Seitenzweige komplexer Biosynthesewege gebildet werden. Vielfach werden mehrere verschiedenartige Wirkstoffe parallel über unabhängige Biosynthesewege koproduziert. Ein Beispiel für die Entstehung von Produktgemischen im Sekundärstoffwechsel vermittelt die Biogenese der in Abb. 1 gezeigten Makrolidstrukturen durch Streptomyces hygroscopicus [6, 7], Man sieht sich auch hier zu der Frage veranlaßt: weshalb diese Vielfalt der Strukturen und Biosynthesesequenzen? A c e t y l - C o A , Propionyl - C o A , Methyl- malonyl-CoA ,Malonyl-CoA, Butyryl-CoA

1

3-0-Acyl-Turimycine \

3-0-Acyl-Platenolidglykoside U.-OHPlatenolidglykoside CH 2 CH 3 R-| =H R 2 =0H

R3=

CH3q TURIMYCIN Komplex

|

OH

COCH3

TDP-6-Keto-6-desoxyglucose

Abb. i. Verzweigter Biosyntheseweg von Makroliden in Streptomyces hygroscopicus [6, 7]

Sekundärmetabolismus: ein Teil der mittel- und langfristigen Strategien der Adaptation an Veränderungen der Umwelt Allgemein akzeptiert scheint heute, daß der mikrobielle Sekundärmetabolismus als Teil der mittel- und langzeitlichen Adaptation vom Mikroben an Milieuveränderungen von Nutzen ist. Während des Wachstums (Substratüberschuß) werden durch ein System von Grob- und Feinregulationen kurzzeitige Anpassungen des Stoffwechsels ermöglicht.

GRÄFE,

U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

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Als mittel- und langfristige Anpassungsstrategien bestehen am Ende eines Zellzyklus zwei Möglichkeiten : — Zellteilung und Beginn neuer Entwicklungszyklen bzw. bei Eukaryoten auch sexuelle Rekombination. — Differenzierung, d. h. Spezialisierung der Zellfunktion durch Morphogenese, deren äußeres Zeichen u. a. die Bildung von Dauerformen wie Sporen, Conidien usw. ist [8—11].

Viele Befunde sprechen dafür, daß der Sekundärmetabolismus in Prozesse der Zytodifferenzierung integriert ist und hier gegebenenfalls sogar Funktionen erfüllt. Äußeres Zeichen der Integration der mikrobiellen Wirkstoffproduktion in Entwicklungsphänomene ist die Katabolithemmung (Katabolitrepression und -inhibition) der Antibiotikaproduktion durch leicht verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoff quellen sowie Uberschuß an anorganischem Phosphat im Medium. Dieses Phänomen ist die Ursache f ü r die häufig inverse Korrelation zwischen spezifischer Wachstumsrate und Antibiotikaproduktion (Trophophase/Idiophase-Beziehung). Die Biosynthese von Peptidantibiotika durch Bacilltis spec. setzt erst dann ein, wenn die spezifische Wachstumsrate infolge Substratlimitation absinkt (Abb. 2) [12]. Dieser Zeitpunkt ist gewöhnlich mit dem Einsetzen der Sporulation korreliert. Ähnliche, wenn auch nicht immer so deutliche Verhältnisse werden auch bei Streptomyces- und Penicilliumfermentationen angetroffen.

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Abb. 2. Wachstum und Edeinbiosynthese in Kulturen von Bacillus spec. (•— Biomasse; • — Edein; • — D-Glucose)

Zeit [hJ

Die Beherrschung der Katabolitregulation ist ein Hauptanliegen prozeßkinetischer und genotypischer Optimierungsstrategien. Fermentative Produktion von Sekundärmetabolitbildnern bedeutet zumeist gezielte Einhaltung bestimmter Nährstofflimitationen, d. h. den Erhalt der Wachstumsrate in einem f ü r die Produktbildung günstigen submaximalen Bereich, z. B. durch Zufütterung (feeding) geeigneter Substrate [13]. Ältere Arbeiten verstehen Sekundärmetabolitbildung als Luxurieren des Stoffwechsels, als Mittel zur Beseitigung metabolischer Ungleichgewichte und der dabei angestauten toxischen Metabolite [4], Modernere Auffassungen sehen eine Funktion von Sekundärstoffwechselprodukten als — Trigger spezieller Ereignisse der Zelldifferenzierung bzw. als Vermittler der zellulären Kompetenz zur Beantwortung von Milieuveränderungen mit bestimmten Adaptationsmustern, — als ökologischer Faktor der Regulation von Phänomenen der metabolischen Konkurrenz, aber auch der Kooperation in natürlichen Heteropopulationen und — als Signal der genetischen Rekombination, speziell bei eukaryotischen Mikroben [4, 14].

Diese .Funktionen' sind allerdings nicht allgemein, sondern treten nur bei bestimmten Gattungen und Arten, sowie unter bestimmten Umständen bzw. ökologischen Situationen in Erscheinung, wobei sie aber dann einen entscheidenden Selektionsvorteil bedeu-

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Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

ten. Das erklärt den Erhalt des Sekundärmetabolismus im Verlauf der Evolution. Andererseits schließt die eingeschränkte, nur auf bestimmte Stadien der Entwicklung oder ökologische Situationen beschränkte Rolle von Sekundärmetaboliten ein, daß nur ein relativ geringer Selektionsdruck vorhanden ist [2], einschließlich aller Folgen, wie den Erhalt nicht mehr benötigter Biosynthesesequenzen, Bildung eines breiten Spektrums von Produkten oder dem Pehlen einheitlicher Organisations- und Regulationsprinzipien. So ist der Ausfall des Sekundärstoffwechsels ja keinesfalls letal für einen Mikrobenstamm, sondern beeinträchtigt nur in bestimmten Situationen bzw. kann sogar durch alternative Entwicklungsabläufe und Differenzierungsmuster ersetzt werden. Daß ca. 70% aller bekannten mikrobiellen Wirkstoffe durch Actinomyceten gebildet werden, erscheint als kein Zufall, nimmt man eine ,Funktion' ihres Sekundärmetabolismus in der Zelldifferenzierung an, sind sie doch durch eine besonders hohe morphologische Vielfalt gekennzeichnet [8]. Einige Sekundärmetabolite können als ,Autoregulatoren' in Differenzierungsphänomene eingreifen [15, 16]. Der Schutz der saphrophytischen Entwicklung von Luftmyzelien auf der Basis von Nährstoffen lysierender Substrathyphen gegen konkurrierende Mikroorganismen liefert eine weitere ökologische Begründung für die reichhaltige Wirkstoffproduktion durch Actinomycetales und Fungi im-perjecti. Beispiele für die endogene Signalfunktion von Sekundärmetaboliten in der Zytodifferenzierung Siderophore sind Sekundärmetabolite, die eine essentielle Funktion in der Entwicklung pro- und eukaryotischer Mikroben erlangt haben, indem sie den Eisentransport aus dem Medium in die Zelle absichern. Sie werden bei Eisenlimitation sekretiert, und ihre Produktion ist ebenso wie die der spezifischen Membranrezeptoren und Transportproteine auf der epigenetischen Ebene streng geregelt [3, 17], Die Fähigkeit zur Produktion von Siderophoren bildet einen wesentlichen, die Virulenz pathogener Bakterienstämme bestimmenden Faktor (Konkurrenz mit Lactoferritin/Transferritin der Säugerzelle). So sind Siderophore unter extremen Fe-Mangelsituationen von Nutzen, indem sie die Aneignung des essentiellen Schwermetalls mittels des hochaffinen Systems Siderophor/Transportprotein gewährleisten. Bei Eisenüberschuß sind sie dagegen funktionslos und werden nicht mehr produziert. Siderophore gehören zu unterschiedlichen chemischen Gruppen. Vor allem sind es Hydroxamate wie Ferrimycin A (I) und Catechole wie Enterochelin (II). Es spricht für die Bedeutung der Siderophore, daß eine Anzahl unterschiedlicher struktureller Lösungen für Fe-Chelatoren in der Evolution der Mikroben entwickelt wurden. Zahlreiche Antibiotika chelatisieren ebenfalls essentielle Spurenelemente. Der sogenannte A-Faktor ( I I I ) ist ein Beispiel für einen Sekundärmetaboliten, der von vielen Streptomyceten unterschiedlichster Arten, ja sogar von Bacillus und einigen Eukaryoten gebildet wird, aber offenbar nur in wenigen Streptomycesarten eine regulatorische Bedeutung als Induktor der Luftmycel- und Antibiotikumbildung erlangt hat [18, 19], Auch Antibiotika wie Pamamycin aus Streptomyces alboniger [20] oder einige Peptidantibiotika aus Bacillus sind als Effektoren von Zelldifferenzierungsprozessen ihrer Produzenten wirksam [21],

Sekundärmetabolite als Effektoren der genetischen Rekombination In Eukaryoten (Pilze), aber auch in einigen Prokaryoten erfüllen Produkte des Sekundärmetabolismus als Sexualpheromon Funktionen in der sexuellen (bzw. parasexuellen) Rekombination. Eines der gut bekannten Beispiele ist die Rolle der Trisporsäure in der Regulation der Zygosporenbildung bei Mucorales [14],

GRÄTE, U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

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ökologische Funktionen von Sekundärmetaboliten Eine ökologische Funktion von Sekundärmetaboliten beim Schutz der Mikrobe bzw. ihrer Dauerformen vor physikochemischen Faktoren wie UV-Strahlung, Temperaturänderungen, Austrocknung usw. gilt als wahrscheinlich. Aber spielen Antibiotika auch eine Rolle bei der Regulation des Zusammenlebens unterschiedlicher Mikroben im Ökosystem, bei der Regulation der metabolischen Konkurrenz und Kooperation in natürlichen Heteropopulationen? Gibt es dabei eine Koevolution der Mikroben, die eine Koevolution ihres Sekundärmetabolismus einschließt? Das Fehlen von Beweisen für die Anwesenheit von Antibiotika im Boden steht nicht zu entsprechenden Hypothesen im Widerspruch. So kann die Wirkstoffproduktion im betreffenden Ökosystem unterbleiben, rasche Inaktivierung kann durch vorhandene Enzyme erfolgen bzw. können ungenügend empfindliche Nachweismethoden oder kolloidale Absorption an anorganische Materialien den Nachweis erschweren [22, 23, 24]. Die Vielzahl modifizierter chemischer Strukturen neben dem eigentlichen Wirkstoff (Antibiotikum) könnte als Folge einer hypothetischen Wechselwirkung von Produzent und Substratkonkurrent im Ökosystem interpretiert werden (Abb. 3). Durch Pilze und Actinomyceten gebildete Antibiotika unterliegen häufig der Inaktivierung durch resistente Baktierien. Andererseits bilden Antibiotikaproduzenten Hemmstoffe inaktivierender Enzyme ebenso wie Potentiatoren und Synergisten der antibiotischen Wirkung von Sekundärmetaboliten. Ein Modellfall ist die Koproduktion von Cephamycin (IV) und Clavulansäure (V) durch Streptomyces clavuligerus als Inhibitor von /3-Lactamasen. Dieses natürliche Prinzip der antibiotischen Wirkungsverstärkung wurde inzwischen in die antibakterielle Chemotherapie durch Anwendung von Kombinationspräparaten (Amoxycillin/Clavulansäure) eingeführt [25].

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1 Wirkstoff

Wirkstoffbildner (Actinomycet,

Pilz I

l

^

Substratkonkurrent ¡Hemmung I

Antibiotikum]

Evolution der Wirkortstruktur lUnempfindlichkeit)

Evolution der Wirkstoffstruktur

__

Bildner eines strukturell modifilierten Wirkstoffs

Mikrobe mit modifiziertem Wirkort

Abb. 3. Hypothetische Vorstellungen zur Koevolution von Wirkstoffbildner und Substratkonkurrenten

(ö-D-AAA)

OMe i H ! I S Q ^ Y ^ ^ O C O C H S

COOH

H H (IV)

ÇH2OH "COOH

(V)

Die evolutionäre Bedeutung der /?-Lactamstruktur als Selektionsvorteil für das langzeitige Überleben von Mikroben zeigt sich vielleicht auch darin, daß verschiedenartige grampositive und gramnegative Prokaryoten sowie Pilze in verschiedenen Varianten /S-Lactamstrukturen produzieren. Neben den bekannten Penicillinen und Cephalosporinen gibt es Spielarten wie die Carbapenems (Thienamycin u. a.), Oxapenams (Clavulanate u. a.) oder die monozyklischen /3-Lactame (Nocardicin A, Sulfazecin u. a.) [25], Verschiedene Lösungswege wurden also für die Synthese des gleichen Hemmprinzips der bakteriellen Zellwandsynthese im Verlauf der mikrobiellen Evolution entwickelt. Weshalb dieser Aufwand, wenn /Î-Lactame für den Produzenten keinerlei Bedeutung besitzen würden? Zahlreiche Wirkstoffe aus Mikroorganismen sind Inhibitoren von Säugerenzymen und werden bereits als Pharmaka eingesetzt. Beispielsweise blockieren Compactin oder Mevinolin aus Monascus ruber die Umwandlung von Hydroxymethylglutaryl-CoA in Mevalonsäure als Schlüsselreaktion der Sterolbiosynthese von Pilzen und Säugern. Sie sind deshalb als Antihypercholesterämikum von Wert. Lediglich Sterol-produzierende Pilze bilden derartige Hemmer, nicht jedoch Prokaryoten, die selbst keine Sterole in ihrer Zytoplasmamembran benötigen. Spekulationen über eine ,ökologische Rolle' oder eine autoregulatorische Funktion werden dadurch gefördert, daß bei Pilzen verschiedene Abbauwege für Compactin und Mevinolin (Hydroxylierung, Ringöffnung) aufgefunden wurden, die zu weniger aktiven Produkten führen (Abb. 4) [26]. Es würde eine nichtangebrachte Einschränkung bedeuten, die Begriffe Koexistenz und Koevolution ausschließlich auf Wechselwirkungen Mikrobe/Mikrobe beschränken zu wollen [23, 24], Die Produktion von Phytotoxinen durch phytopathogene Mikroben und die Abwehr derartiger Infektionen durch ein breites Spektrum antibiotisch wirksamer Phytoalexine liefert weitere Hinweise auf die Evolution ökologischer Signalketten [24], In der Rhizosphäre gelten möglicherweise saphrophytische Mikroben (Pseudomo-

GRÄFE,

U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

9 X

HO,

^v.COOH

0 Mikrowelle Biotransformation

x 0 P0 3 H 2 :

Hydrolyse, Hydroxylierung, Phosphorylierung R= H, Compactin (Monascus ruber) R= Me Mevinolin

HOOC'0,0"CO HO Me

C O A

\

N

STEROLE Hydroxymethylglutaryl-CoAReduktase ( Produzent, Substratkonkurrent)

Abb. 4. Hypothese zur Signalfunktion von Hemmstoffen der Hydroxyme-thyl-glutaryl-Coenzym A-Reduktase (x: Partialstrukturen, die durch mikrobiellen Abbau entstehen) nas, Bacillus, Streptomyces) ihren symbiontischen Vorteil gegenüber dem Wirt (Pflanze) durch die Kontrolle Wurzel-infizierender Pilze mittels produzierter Antibiotika ab. Schließlich haben in der Symbiose Mikrobe/Tier Sekundärmetabolite regulatorische Funktionen erlangt [23]. Der Wirkstoffkomplex der Avermectine (VI) aus Streptomyces avermitilis hemmt spezifisch y-Aminobuttersäure-sensible Rezeptoren des Nervensystems von Helminthen und Insekten, besitzt dagegen selbst keine antibiotische Aktivität gegenüber Mikroorganismen [27], Ist diese Verbindungsklasse etwa aus der Symbiose von Insekten bzw. Helminthen und Actinomycet entstanden? Diese und ähnliche Fragen können nicht direkt beantwortet werden, und der Nutzen derartiger Diskussionen ist vor allem in den neuen Gesichtspunkten zu sehen, die sie f ü r die Suche nach originellen Wirkstoffbildnern und neuen Wirkstoffen unter Berücksichtigung spezieller Ökosysteme ergeben [22], OMe

H

ORi

(VI)

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Genetische Mechanismen der Evolution und Koevolution des Sekundärstoffwechsels Die genetischen Mechanismen der Koevolution von Mikroben, Wirkstoffbildner und Kohabitanten, Substratkonkurrenten oder Symbionten, beginnen durch Erkenntnisse über die Rolle transponibler genetischer Elemente (Plasmide, IS-Elemente, Transposons) verständlicher zu werden. In Antibiotikum-resistenten Bakterien werden vielfach die gleichen Resistenzmechanismen nachgewiesen, die auch den Antibiotikumbildner vor einem Suizid durch den eigenen Sekundärmetaboliten bewahren. Heterologer Gentransfer könnte sowohl die Resistenzdeterminanten des Bildners als auch Strukturgene der Wirkstoffbiosynthese auf andere Gattungen und Arten übertragen (Abb. 5) [17]. Chromosom

Wirkstoffbildner

A

Biosynthesegene Resistenz gene

-

heterologe Rekombination I Übertragung Wirtej

Hemmwirkung gegen originalen Wirkstoffbildner durch modifizierte chemische Struktur

in

heterologe

Transformierte

Mikroben

;

im Vergleich zum Ausgangs stamm resistent gegen den betreffenden Wirkstoff und Synthese modifizierter Wirkstoffstrukturen

Abb. 5. Hypothese zur Koevolution der Biosynthesewege durch heterologen Gentransfer

Daß derartige Mechanismen unter Selektionsdruck wirksam sind, zeigt die bekannte Übertragung von Resistenzgenen von einer Spezies gramnegativer Baktierien auf andere. Durch Integration plasmidaler Informationen in das Bakterienchromosom entstehen unterschiedliche Varianten des betreffenden Mikrobenstammes. Nach Übertragung Transposon-tragender Plasmide in eine andere Mikrobe (B, Abb. 6) [28] ist eine Expression in unterschiedlicher Kopiezahl oder Integration in das Genom möglich. Solche Mechanismen der genetischen Umordnung erklären die übliche Aufspaltung von Mikrobenstämmen in unterschiedliche Subpopulationen von Genotypen. Über Viren ist sogar die Übertragung pflanzlicher Gene auf Bakterien möglich [24], und Plasmide aus Agrobacterium tumefaciens integrieren umgekehrt in das Genon der Wirtspflanze [29], Daß genetische Rekombinationen zur Evolution von Wirkstoffstrukturen und zur Verbreitung der Resistenz gegen Antibiotika beitragen, bestätigt schließlich auch die Entwicklung der Gentechnik, die die prinzipielle Möglichkeit der gezielten Konstruktion von Hybridantibiotika aufgezeigt hat. Durch Übertragung des Actinorhodin-Genklusters

GRÄFE,

U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

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Stamm 8

Stamm A

Stamm C

Abb. 6. Mögliche Mechanismen der genetischen Veränderungen in Sekundärmetabolitbildnern und des heterologen Gentransfers. Stamm A: Elternstamm. Durch Integration plasmidaler Gene an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms entstehen neue Klone als Subpopulation (AI). Stamm B : Plasmid-freier Rezipientenstamm. Durch Übertragung des Plasmids a aus Stamm A entsteht der transformierte Stamm C. Verschiedene Klone werden durch Integration des Plasmids in das Chromosom erhalten (Bl). (Nichthomologe Rekombination). a u s Streptomyces coelicolor in Bildner ähnlicher Antibiotika (Medermycin (VII); Granaticin) wurden Hybridstrukturen (Mederrhodin (VIII), Granatirhodin) als Derivate der originalen Wirkstoffe erhalten [30]. N-(CH3)2

oh

0

CHj'^'O-S: 0

H

COOH

(VII)

(VIII)

Z u s a m m e n f a s s e n d ergeben sich folgende Aussagen zur Natur und F u n k t i o n des mikrobiellen Sekundärstoffwechsels : — Er erleichtert die langzeitige Adaptation durch Förderung der Zytodifferenzierung als Lieferant von Signalen und Effektoren sowie ökologisch wirksamen Stoffen. — Seine Erhaltung im Verlauf der Evolution bietet Vorteile f ü r das Fortbestehen der betreffenden Art. — Seine ,Funktionen' sind auf bestimmte Entwicklungsstadien bzw. bestimmte Situationen beschränkt. — Durch den geringen Selektionsdruck besteht ein relativ großer evolutionärer Spielraum.

Entwicklung genotypischer Optimierungsstrategien und Überproduktion mikrobieller Wirkstoffe D i e Steigerung der Biosyntheseleistung von Antibiotikumbildnern von wenigen mg/1 in W i l d s t ä m m e n bis zu heutigen Spitzenwerten v o n mehr als 4 0 g/1 (Bsp. Penicillinfermentation) gelang durch s y s t e m a t i s c h e Selektion produktiverer M u t a n t e n und die E n t w i c k lung geeigneter Fermentationsregimes auf der Grundlage empirisch erkannter Zusamm e n h ä n g e [25, 31]. D a die Wirkstoffproduktion für die v e g e t a t i v e E n t w i c k l u n g des mikrobiellen Produzent e n selbst ohne Belang ist, gibt es auch keine geeigneten Selektionsdrücke, die Anti-

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biotika-überproduzierenden Stämmen einen direkten Selektionsvorteil verschaffen könnten. Die Auswahl optimierter Bildner kann daher lediglich unter Orientierung auf solche Eigenschaften vorgenommen werden, die entsprechend den stammspezifisch gesammelten Erfahrungen indirekt mit Veränderungen der Sekundärmetabolitproduktion gekoppelt sind. Entsprechende Selektionsstrategien sind z. B. die Suche nach morphologischen Varianten, nach Stämmen mit unterschiedlicher Pigmentierung, unterschiedlichem Koloniedurchmesser (Wachstumsrate), Resistenz gegen toxische Antibiotika (auch gegen den eigenen Sekundärmetaboliten) und Schwermetalle [32, 33]. Weder die genetischen noch die biochemischen Grundlagen f ü r eine Überproduktion von Antibiotika sind heute bis in alle Einzelheiten bekannt. Zumeist wurden im Nachhinein, aus dem Vergleich charakteristischer Merkmale wenig produktiver Wildstämme mit hochproduktiven Derivaten, Schlußfolgerungen über die Ursachen der im eigentlichen Sinne ,unphysiologischen' Ausweitung des Sekundärstoffwechsels gezogen [4]. Einige Vorbedingungen f ü r eine exzessive Sekundärmetabolitproduktion, wie Überproduktion von Vorstufen der betreffenden Antibiotika durch einen deregulierten Intermediärstoffwechsel, erhöhte Selbstresistenz gegen das toxische Produkt, Limitation alternativer Biosynthesesequenzen des Primär- und des Sekundärstoffwechsels, Aufhebung negativer Kontrollphänomene in der Expression des Sekundärmetabolismus usw. wurden erkannt, ohne daß daraus allgemein anwendbare Selektionskriterien für optimierte Stämme abgeleitet werden konnten [32, 33], Das ist einmal dem Fehlen universaler für sämtliche Mikroben gültiger Regulationsprinzipien des Sekundärstoffwechsels zuzuschreiben. Zum anderen ist es unmöglich, als notwendig erkannte Stoffwechselveränderungen mittels klassischer Mutagenesemethoden und spezifischer Selektionsdrücke zu realisieren. Die Vielfalt der zellulären Adaptationsmechanismen, die durch genetische Umordnungsprozesse unter Selektionsdruck ermöglicht werden, kommt u. a. in der Selektion unterschiedlich an Stress angepaßter Klone einer Population zum Ausdruck. Die Adaptation an bestimmte langzeitig wirksame Selektionsdrücke kann dabei ggf. durch verschiedenartige zelluläre Veränderungen bewirkt werden. Beispielsweise wird Resistenz gegen eine Noxe sowohl durch fehlende Aufnahme in die Zelle als auch durch raschen enzymatischen Abbau oder durch metabolische Kompensation verursacht. Anstelle eines einzigen Klones wird so eine Kollektion streßresistenter Selektanten erhalten, die sich in ihren metabolischen Charakteristika und so auch in ihrem Sekundärstoffwechsel unterscheiden. Zusätzliche Probleme ergeben sich dadurch, daß durch Stresselektion erhaltene Stämme zum Wildtyp revertieren, sobald der Selektionsdruck nicht mehr vorhanden ist. Einen rationalen und bequemen Weg zur Selektion Antibiotika-produzierender Hochleistungsstämme gibt es nach wie vor nicht, und auf die mühsame Strecke der schrittweisen semiempirischen Auswahl höherleistender Klone kann bis heute nicht verzichtet werden. Bis zur Anwendung gentechnischer Methoden (in vitro und site-directed mutagenesis) auf die Steigerung der Biosyntheseleistung führt offenbar noch ein weiter Weg über die Analyse der Genomstruktur- und -Organisation. Beispiele belegen jedoch bereits den potentiellen Nutzen gezielter Veränderungen, wie z. B. von Genamplifikation im Falle der Actinorhodinbiosynthese durch Streptomyces coelicolor [31]. Probleme sind in bezug auf die Actinomyceten insbesondere durch die Existenz positiver und negativer Kontrollsequenzen, durch ineinander ,verschachtelte' Gene (überlappende Leserahmen) und übergeordnete Kontrolle durch pleiotrope Gene zu erwarten. Während f ü r einige prokaryotische Wirkstoffbildner geeignete Wirts-Vektorsysteme entwickelt werden konnten, ist das Problem der gentechnischen Manipulation pilzlicher Produzenten bisher noch nicht befriedigend gelöst worden. Für vielfach berichtete positive Korrelationen zwischen Antibiotikaresistenz und erhöhter Sekundärmetabolitproduktion bestehen genetisch determinierte Hintergründe (benachbarte Loci, gleiche Kontrolleinheiten für Resistenz- und Biosynthesegene), die

GRÄFE, U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

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gewisse Erfolge bei Anwendung der Resistenzselektion erbrachten. Leistungssteigerungen wurden ferner durch Selektion Antimetabolit-resistenter Stämme erzielt, die Präkursoren im Überschuß produzieren. Beispielsweise bildeten 2-S-Aminoethyl-L-cysteinresistente Stämme des Cephamycinbildners Streptomyces clavuligerus mehr Lysinpräkursor infolge der aufgehobenen feedback-Regulation der Aspartokinase und damit auch mehr Antibiotikum (Abb. 7) [34], Welche wichtige Rolle ein deregulierter Vorstufenstoffwechsel spielen kann, wurde u. a. auch am Beispiel der Penicillinbiosynthese durch P. chrysogenum gezeigt. Hochleistungsstämme sind durch fehlende negative feedbackRegulation der Valinbiosynthese und eingeschränktes Lysin-feedback der L-a-Aminoadipinsäurebildung gekennzeichnet. Ferner fehlt die Lysinrepression der HomocitratSynthase und der Tripeptid-Synthetase. Zellwand

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Aspartat

AEC

— DDP—• L-DAP-^mDAP—Lysin +© • Aspartylsemi\ AEC + © aldehyd ! I Ala •

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• Cephamycin

OMe H i HS 5-(D-cx-AAA)N——> COOH Abb. 7. Überprodutkion von Cephamycin durch Aminoethyl-cystein (AEC)-resistente Mutanten von Streptomyces clavvligerus (DAP: Diaminopimelinsäure, DDP: Diaminodipicolinat)

Anstau von Präkursoren wird übrigens auch durch partielle Substratlimitation beim Übergang von der Wachstumsphase zur Idiophase der Kultivierung verursacht und trägt damit zur Induktion des Sekundärstoffwechsels bei. Das limitationsbedingte metabolische Ungleichgewicht bedingt die Entstehung eines relativen Uberschusses an Metaboliten, die als Präkursoren in den Sekundärstoffwechsel einfließen. Neben den o. g. Kriterien wurden als Auswahlprinzipien für Hochleistungsstämme ferner Unempfindlichkeit gegen Katabolitregulation und Phosphathemmung, veränderte Substrat Verwertung (Exoenzymsekretion usw.) oder eine Veränderung des Erhaltungsstoffwechsels mit mehr oder weniger Erfolg praktiziert. Katabolitregulation und phänotypische Optimierung Glucose oder Ammonium als alleinige C- bzw. N-Quellen ergeben zumeist geringere Antibiotikumtiter als die alleinige oder anteilige Verwendung komplexer Substrate. Ähnüch hemmt Phosphatüberschuß im Medium die Biogenesen vieler mikrobieller Sekundärmetabolite [35], Ein gezieltes Vorgehen bei der Gewinnung unempfindlicher Mutanten ist aufgrund der geringen Kenntnisse über die zellulären Hintergründe der Katabolitregulation zumeist nicht möglich. Zwecks Beseitigung der Katabolitregulation über genetische Maßnahmen müssen daher indirekt wirkende Strategien, wie z. B. Selek-

14

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

tion Arsenat-resistenter Stämme bei der Gewinnung Phosphat-unempfindlicher Klone herangezogen werden. [36]. . Erschwerend auf die Ursachenermittlung der Katabolitregulation wirkt sich die Komplexität der Stoffwechsel Vernetzung aus, die viele synchrone Veränderungen bei Uberschuß an leicht verwertbaren Substraten wie Glucose, N H 3 und P 0 4 3 - zuläßt. Wenig Erfolg hatten bisher Versuche, die Katabolitregulation von Antibiotikafermentationen mit Veränderungen zellulärer ,Alarmonspiegel' (cAMP, ppGpp) zu erklären. Auch in bezug auf die Phänomene der Katabolitregulation des Sekundärstoffwechsels fehlen offensichtlich einheitliche, f ü r alle Bildner zutreffenden Regulationsprinzipien, wie Untersuchungen zur /?-Lactambiosynthese auf enzymatischer Ebene gezeigt haben [38, 39], Benzylpenicillin, Cephalosporin C und Cephamycin werden bei Pilzen (Penicillium, Acremonium) und Streptomyceten (S. clavuligerus, S. lactamdurans) über einen in den Startreaktionen gemeinsamen Biosyntheseweg produziert. Aus Vorstufen wie L-«Aminoadipinsäure, L-Cystein und L-Valin wird in einem Initialschritt durch TripeptidSynthase LLD-ACV-Tripeptid synthetisiert (Abb. 8). In Penicillium chrysogenum und Streptomyces lactamdurans unterliegt das Enzym der Katabolitrepression bei Glucoseüberschuß im Medium, nicht jedoch im Cephalosporinbildner Acremonium chrysogenum und bei S. lactamdurans. [39], Ähnliche Unterschiede in der Katabolitrepression wurden bei der Isopenicillin-NSynthase (Zyklase), der Epimerase (Penicillin-N-Synthese durch Isomerisierung von Isopenicillin N) und der Expandase (Desacetoxy-cephalosporin C-Synthase) festgestellt [32, 33]. Diese Enzyme unterliegen scheinbar regellos und stammspezifisch der Katabolitregulation (Abb. 8). Prozeßkinetische, auf empirischen Beobachtungen fußende Maßnahmen sind daher das geeignete Mittel, Katabolitregulation unter den Fermentationsbedingungen zu minimieren und zur vollen Expression der genetischen Potenz eines Stammes hinsichtlich Sekundärmetabolitproduktion beizutragen. Auf einen allgemeinen Nenner gebracht werden dabei folgende Strategien angewandt: Die Anfangskonzentration reprimierend wirksamer Substrate (Glucose, NH 3 , P 0 4 3 ) wird niedrig gehalten und das weitere Wachstum nach Erreichen der partiellen Substratlimitation unter limitierender Zufütterung (feeding) von C-, N- oder P-Quellen ermöglicht. Ein maximaler & p -Wert wird unterhalb des ßmAX erzielt. Durch die Fortdauer eines limitierten Wachstums wird der Anteil der produktiven Zellen im Verhältnis zu den noch nicht und den nicht mehr produzierenden konstant gehalten oder vergrößert, so daß eine Verlängerung der Produktbildungsphase bei fi und k p = konstant eintritt. Während Nährstoffzufütterung nachteiligerweise mit Volumenzunahme verbunden ist, wird dieser Nachteil bei dem sog. zyklischen fed-batch vermieden. Hierbei wird nach dem Erreichen der Produktionsphase ein Teil der Kultur geerntet und durch Zugabe kontrollierter Mengen an frischem Medium ein erneutes limitiertes Wachstum eingeleitet. Zur Kontrolle der Katabolitregulation sind folgende prozeßkinetische Maßnahmen ebenfalls geeignet: — Einsatz komplexer Substratquellen, die eine ratenlimitierte Nachlieferung reprimierend wirksamer Substrate im Vorlauf der Fermentation erlauben. — Kontrolle des Substratkatabolismus über den p0 2 , die Temperatur und den pH-Wert.

Ob Zielsetzungen wie maximales k p bei hoher Zeitkonstanz durch eine der o. g. Taktiken erreicht, werden können, hängt im wesentlichen von empirischen Vorarbeiten ab, die die Grundlagen f ü r die Konzipierung entsprechender Vorgehensweisen liefern. Vielfach stellt sich bei erfolgreicher Realisierung einer Leistungssteigerung auf der Laborstufe d a n n noch das Problem der Maßstabvergrößerung, die heutzutage bei Antibiotikafermentationen bis in den Bereich von 200 m 3 hineinreicht.

15

GRÄFE, U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe a-L-Aminodipinsäure

+

L-Cystein +

L-Valin

Tripeptid-Synthase

Tripeptid

1 : C ; 2 : - ; 3 : C, N ; 4 :

-

(Ö-L-a-AAA-L-Cys-D-Val) Isopenicillin-NSynthase (Zyklase)

Isopenicillin N

1: C; 2 : - ; 3 : N ; 4 : N

• Benzylpenicillin (Pénicillium, Isomerase (Epimerase) in Cephalosporinbildnern

chrysogenum)

1 : entf. ; 2 : — ; 3 : N ; 4 : —

Penicillin N (mit D-a-AAA-Seitenkette)

•V

Desacetoxy-cephalosporin-C-Synthase (Expandase)

1: entf.; 2 : C, N ; 3 : C, N, P ; 4 : —

Descetoxy-cephalosporin C Desacetyl-cephalosporin C Cephalosporin C Abb. 8. Einzelschritte der /J-Lactambiosynthese durch Pénicillium chrysogenum (1), Acremonium chrysogenum (2) und Streptomyceten, wie S. clavuligerus (3) oder S. lactamdurans (4) C: C-Katabolitrepression der Enzymbildung durch Glucoseüberschuß ; N : N-Katabolitrepression der Enzymbildung durch NH 3 -Überschuß; P : Phosphatrepression durch Phosphatüberschuß im Medium, (entf.: entfällt)

Entscheidend für die Übertragbarkeifc von Labordaten ist die Fermentorgeometrie mit entsprechenden Konsequenzen für den Sauerstoffpartialdruck, den hydrostatischen Druck, die auf die Zellen einwirkenden Scherkräfte, Wärme- und Stoffübergänge u. a. Parameter. Gegebenenfalls sind geeignete Mutanten mit optimaler Eignung für den großtechnischen Maßstab (z. B . niedriger spezifischer 0 2 -Verbrauch und Erhaltungsstoffwechsel, Resistenz gegen Scherkräfte) zu selektieren. Obwohl die Vorgehensweisen für Antibiotikaverfahrensentwicklungen inzwischen bekannt sind, liegen die Schwierigkeiten in der Anwendbarkeit allgemeiner Erkenntnisse in Abhängigkeit von den stammspezifischen Erfordernissen und den hierzu notwendigen aufwendigen empirischen Untersuchungen.

Qualitative Optimierung der Wirkstoflproduktion durch Mikroorganismen Als Folge des geringeren Selektionsdruckes im Bereich des Sekundärstoffwechsels weisen viele Syntheseenzyme eine breitere Substratspezifität auf als solche des essentiellen Bausteinstoffwechsels. Ein Ergebnis ist die Bildung von Metabolitgemischen, der durch die Selektion geeigneter Mutanten mit Monokomponentenproduktion begegnet werden muß [2, 3],

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

16

Andererseits wird die Unspezifität von Enzymen der Wirkstoffproduktion auch ganz bewußt im Rahmen von Optimierungsstrategien genutzt, die unter Bezeichnungen wie ,gerichtete Biosynthese' (directed biosynthesis), Mutä- und Hybridbiosynthesen oder in Form der enzymatischen Biosynthese mit synthetischen Synthons als Substrate realisiert werden [40, 41]. Bei der gerichteten Biosynthese werden Strukturanaloga natürlicher Vorstufen bzw. Bausteine des Sekundärmetaboliten zum Medium im Überschuß zugegeben und anstelle des natürlichen Bausteins in das Endprodukt eingebaut. Auf diese Weise wurde inzwischen eine Palette verschiedenartiger Strukturanaloga von Antibiotika synthetisiert [42], Ein Beispiel bieten modifizierte Echinomycine, die durch Zufütterung von Chinoxalincarbonsäuren zur Kultur von Streptomyces echinatus erhalten wurden [41, 34] (Abb. 9).

biosynthetisch

modifizierte Antibiotika

Abb. 9. Gerichtete Biosynthese modifizierter Echinomycine durch Zufütterung echinatus modifizierter Chinoxalincarbonsäuren zu Kulturen von Streptomyces (directed biosynthesis)

Bei der sog. Mutasynthese wird mit Blockmutanten gearbeitet, die die natürliche Vorstufe bzw. einen Teil des Wirkstoffs nicht mehr selbst bilden (Bsp. 2-Desoxystreptaminnegative Stämme des Neomycinbildners Streptomyces fradiae). Werden anstelle des fehlenden Bausteins zu Kulturen derartiger Mutanten Strukturanaloga (Synthons) zugefüttert, so entstehen Analoga der natürlichen Wirkstoffe (S. fradiae: Hybrimycine). In einer Variante dieser Technik, der Hybridbiosynthese (Abb. 10), gibt man strukturanaloge Produkte zu, die aus Blockmutanten-Kulturen anderer Antibiotikaproduzenten gewonnen werden. Gleichzeitig wird durch den Einsatz spezifisch einzelne Biosyntheseschritte hemmender metabolischer Inhibitoren (Bsp. Cerulenin) die Biosynthese des natürlichen Bausteins blockiert [43]. Bei weiterer Entwicklung und Anwendung der Gentechnik sind schließlich nach den o. g. Musterbeispielen Mederrhodin und Granatirhodin neue Hybridantibiotikastrukturen durch Übertragung von Synthesegenen in heterologe Wirkstoffbildner herstellbar

GRÄFE, U., Produktion mikrobieller Wirkstoffe

17

Mutasynthese Vorstufen

(Präkursoren) genetischer Zwischenstufe

Block

B

lufütterung chemosynthetisch hergestelltes Analogon (Mutasynthon B')

Terminale Biosyntheseschritte

originärer Wirkstoff

mutasynthetisch AB

modifizierter Wirkstoff

Abb. 10a

AB'

Hybridbiosynthese Wirkstoffbildner

A

Wirkstoffbildner

8

IBIockmutante) Vorstufen

Intermedial

IPräkursoren)

A

\

originares Antibiotikum

Vorstufen i

Präkursoren)

Block durch Emymhemmer Intermedial

AB

B

Intermediai

B'

Hybridantibiotikum AB'

Abb. 10 b

Abb. 10. Schematische Darstellung der Mutasynthese (10 a) und der Hybridbiosynthese (10b). Durch Zufütterung von chemo- oder biosynthetisch hergestellten Analoga des natürlichen Intermediats B (Zwischenstufe B) zu Blockmutanten, die B nicht mehr produzieren (Mutasynthese) oder zu Stämmen der Biosynthese durch Hemmstoffe wie Cerulenin spezifisch geblockt wurde (Hybridbiosynthese) entstehen modifizierte Wirkstoffmoleküle A B '

[31]. Biologische Techniken der Wirkstoffmodifikation haben sich inzwischen neben chemosynthetischen Methoden einen festen Platz im Rahmen der allgemeinen Bemühungen um Optimierung von Struktur-Wirkungsbeziehungen (drug designing) erobert. Ihre Anwendung in biotechnologischen Produktionsverfahren erscheint aber nur dann als sinnvoll, wenn das betreffende Produkt (Hybridantibiotikum) bisher vorliegenden natürlichen Verbindungen in seinen Wirkstoffeigenschaften überlegen ist. Obwohl mehr als 40 neue Hybrid-Antibiotika bisher mutasynthetisch hergestellt wurden, hat keines Eingang in die Praxis gefunden, da eine verbesserte Eignung als Pharmakon nicht nachgewiesen werden konnte. Fortschritte der Enzymisolierung bis hin zur Klonierung entsprechender Gene ermöglichen schließlich in Zukunft die Anwendung enzymtechnischer Verfahren bei der Gewinnung neuer Antibiotika. In einer Art von ,in-vitro-Mutasynthese' werden hierbei chemosynthetisch erzeugte unnatürliche Substrate enzymatisch umgesetzt. Ein Beispiel ist die Zyklisierung C- und N-terminaler Analoga des natürlichen Tripeptids LLD-ACV durch Isopenicillin-N-Synthase, das zweite Enzym der Biogenese von Penicillinen und Cephalosporinen [25] (Abb. 11). Im Penicillinbildner P. chrysogenum wird die natürliche 2 * Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

18

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

Umsatz chemosynthetischer Substratanaloga durch Isopenicillin-N-Synthase Penicillium chrysogenum Natürliche Tripeptid vorstuf e des Isopenicillins—N

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(1984) 10, 24. [19] Ctapocthha H. T., JlycTA K. A., Ohxte B. A.: 3auiHTHoe j^göctbhg aHTHOKCHAaHTOB Ha Escherichia coli npii HMMo6HJiH3auHH kjigtok b n0JiHaKpHJiaMHAH0M tgjig, MhkpoöhojiorHH 54 (1985) 5, 730. [ 2 0 ] ®EO$HJIOBA E . n . , Ky3HEI^BA JI. C . : BjIHHHHG npHpO«HbIX H CHHTGTHHGCKHX aHTHOKCHAaHTOB Ha POCT H JIHIIHA006pa30BaHH6 MHKpOCKOnHHGCKHX rpHÖOB, BHOaHTHOKCHAaHT: T63. AOKJI. II BCGC0H)3H0ft KOH(j). — HGpHOrOJIOBKa, 1986. — T. I, C. 46. [21] nOBEffUMCKHii fl. r., BHHAPOB A . KD., MHHrAJIEEBA 3. III., CmHPHOB B. H.: CTHMyjIHIiHH pocTa apoHtMteti-npoAynenTOB K0pM0B0r0 6GJiKa CHoaHTiioKCHjiaHTaMH: Tg3. rokji. Ha 7 BC6C0K)3H0M CT>e3fl6 MHKpOÖHOJIOrHMGCKOrO OÖIIJGCTBa. — AjiMa-ATa, 1985, — T. 4, 90. [22] nOEGAHMCKHß fl. I\, P e U I E T H H K O. A., EyPJIAKOBA E. B., IIIhiiikhha JI. H., Bhhapob A . 10., MHHrAJIEEBA 3. III.: EHOXHMHMGCKaH pGryjIHlJHH pOCTa APOWJKeÜ-npOflyiiGHTOB KOpMOBOTO 6eJIKa aHTHOKCHAaHTaMH: T63 AOKJI. Ha 5 Bc6COK)3HOM ÖHOXHMHHGCKOM CLG3Ae. - Khgb, 1986, - t. 2, 166. COÖHOCTH MHKpOÖHHX KJIGTOK B B03AyXG, } K y p H . MHKpOÖHOJI. 9nHAGMH0JI.

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Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 70

Book Review H . J . HINZ

Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology

Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 1986, 456 p., 56 Fig., 132 Tables, 2 9 8 . - DM

The book includes contributions of 21 experts in t h e field of biophysical chemistry. I t summarizes physical chemical d a t a especially thermodynamic ones relating to molecules and to equilibrium properties of systems involving such molecules. Knowledge of the partial specific or molar volumes, heat capacities and compressibilities of molecules of biological interest is frequently important, both in the planning of experiments and in understanding molecular interactions. I m p o r t a n t topics are: — — — — — — — — — — — — — —

partial molar volumes of biochemical model compounds in aqueous solution, specific volumes of biological macromolecules and some other molecules of biological interest, partial molar compressibilities of organic solutes in water, heat capacities of biological macromolecules, thermodynamics of carbohydrate monomers and polymers in aqueous solution, thermodynamic d a t a for protein-ligand interaction, thermodynamics of protein-protein association, gas-liquid and solid-liquid phase equilibria in binary aqueous systems of nonelectrolytes, thermodynamic parameters of biopolymer-water systems, formation of micelles, reversible unfolding of proteins, thermodynamics of conformation transitions in polynucleotides, methods for obtaining thermodynamic d a t a on oligonucleotide transitions, thermodynamics of enzymatic reactions.

The book will help scientists in basic and applied research to choose correct d a t a in a special field t h a t m a y not be their own. B. HEITSRITZ

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 7 1 - 7 6

Monitoring Microbial Product Synthesis by Measurement of the Dehydrogenase Activity GRÜNDIG, B., BEHRENS, U . , KERNS, G., THIERSCH, A .

Academy of Sciences of the G.D.R. Institute of Biotechnology Permoserstraße 15, Leipzig, 7050 G.D.R.

Summary A method for the photometric measurement of dehydrogenase activities with the redox dye phenazine methosulphate at a fixed biomass concentration was applied for the investigation of idiophasic product synthesis. It was found that in citric acid fermentation by Yarrowia lipolytica which is characterized by a well defined separation into tropho-and idiophase the magnitude of product synthesis rates corresponds to the level of dehydrogenase activity at the end of the trophophase. In cellulase production by Trichoderma reesei the tropho-and idiophase are not well defined but a rise of dehydrogenase activity in the course of the idiophase is likely to correspond to an increase of the cellulase formating rate. The significance of the relation of dehydrogenase activity to production rates for monitoring industrial fermentations is discussed.

Introduction It is well known in the practice of aerobic microbial product synthesis that the intensity of growth is related to the course of the following idiophasic product synthesis. For that reason such-like conditions of fermentation are observed in order to obtain a microbial culture that is as "active" as possible. Mostly fermentations are controlled empirically. A quantification of the activity of microorganisms with regard to their capacity to synthesize products was studied in few cases only. Thus for citiic acid fermentation by yeasts it was found that high activities of TCC enzymes, attained in the phase of growth cause a high rate of product synthesis [1], An enzymatic method for a rational and reliable approach in assessing the metabolic activity of microorganism is the determination of dehydrogenase activity (DH activity). Dehydrogenases are essential enzymes of the electron transport system of the cell. The D H activity determination is based on the ability of intact cells to reduce — in absense of the natural acceptor oxygen — artifical dyestuffs such as methylene blue, phenazine methosulphate (PMS) or tetrazolium salts [2, 3, 4], The reduction of the dye is connected with a colour change which can be photometrically determined. The reduction rate is proportional to the activity of dehydrogenases involved in this "overall" reaction". In many fields of applied and environmental microbiology DH activity determination has found consideration. Preliminary works by B T J C K S T E E G and T H I E L E [ 5 ] and L E N A R D et al. [6] in the field of wastewater treatment indicated that DH activity reflects the microbial oxidative capacity of the activated sludge. P A C K A R D et al. [ 7 ] used DH acti-

72

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

vity determination to characterize the respiration potential. The authors have found that DH activity correlates with the oxygen consumption in aerobic cultures and with nitrate reductase activity in anaerobic cultures of a marine denitrifying bacterium. TREVORS [ 8 ] and DENCHEV et al. [ 9 ] have determined the portion of viable respiring cells in batch cultures of Saccharomyces cerevisiae by D H measurements. LOSEV et al. [ 1 0 ] used D H activity of mycelia as a criterion for estimation of inoculum quality in biosynthesis of gentamycin. Generally D H activity measurements were performed by using tetrazolium salts as artifical acceptors. It was shown that the Tetrazolium salt method [6] cannot be applied immediately for process control because the procedure is so time-consuming. Moreover, the sensitivity of tetrazolium salts is relatively slow compared with some other redox dyes such as PMS, 1-methoxyPMS, Meldola blue, or toluidine blue [11], Therefore a convenient and fast discontinuous method for process control was developed, based on the reduction of PMS at fixed biomass concentration. It is the aim of this work to present correlations between the magnitude of DH activities and the product-forming rates for citric acid fermentation by the yeast Yarrouria lipolytica and cellulase fermentation by the fungus Trichoderma reesei. Materials and Methods Microorganisms: Citric acid producing strain of Yarrowia (syn. Saccharomycopsis, Candida) lipolytica, thiamine auxotrophic. Cellulase complex forming strain of Trichoderma reesei, partly reduced resistence to catabolite repression (ZIMET 43803). Media and Cultivation: For citric acid production: mineral salt media with trace elements and supplemented with thiamine, NH 4 + as growth limiting N source, as reported elsewhere [1], Glucose as C source 100 g • l - 1 . The fermentations were performed in a 2 1 stirred fermenter, working volume 1.21, T 30 °C, p H 5.0 regulation by a 20% NaOH solution. For cellulase production: MANDELS medium [12] modified as follows (g • l - 1 ): K H 2 P 0 4 3.0, (NH 4 ) 2 S0 4 4.8, MgS0 4 • 7 H 2 0 0.4, CaCl2 0.3, Tween 80 1.0, peptone 1.5, trace elements. Lactose as sole carbon source and inducer. The fermentation was performed in a 301 stirred fermenter, working volume 151, T 30 °C, p H 3.5, dissolved oxygen greater than 20% of air saturation. The p H was regulated by a 12% ammonia solution. Lactose as limiting substrate was gradually added (20% solution) in the course of fermentation after assaying the C0 2 concentration. When the C0 2 concentration in the exhaust air decreases below 70% of the maximum C0 2 evolution measured at the end of the growth phase, lactose solution was fed.

Analytics Biomass: dry weight; citric acid (plus traces of isocitric acid): potentiometric titration as reported elsewhere [13]; ammonia: Micro-KJELDAHL method; filter paper (FP) cellulase activity: as described by GHOSE [14] (1 mole m i n - 1 reducing sugar formed at 5 0 ° C represents 1 U F P activity); lactose: measured as reducing sugars, for calibration lactose was used [14]; DH activity: as described elsewhere [11], the sample was diluted with Na 2 HP0 4 /NaH 2 P0 4 -buffer solution (pH 7.4) in order to obtain a biomass concentration of 0.5 g l - 1 by a photometric method (A = 660 nm), T 37 °C, after removing air by nitrogen the PMS solution was added. The reduction of the redox dye was measured continuously at X = 388 nm. The D H activity is defined as moles dye reduced m i n - 1 l - 1 related to 0.5 g 1 _1 biomass.

GRUNDIG, B., BEHRENS, U. U. a., Monitoring Microbial Product Synthesis

73

Results and Discussion The course of the D H activity in relation to the NH 4 + concentration the biomass and citric acid production are represented in Fig. 1. During the replicatory growth, corresponding to the consumption of the N source, DH activity rises sharply, reaching a maximum when the N source is exhausted. Biomass increases continues due to the production of reserve material as carbohydrates and lipides [1], Between the beginning of the N source limitation and the increase of reserve material and citric acid synthesis, respectively, a small discontinuance of the growth curve was observed. The end of replicatory growth nearly coindides with the start of extracellular citric acid accumulation [15].

I 0

I I G I I I 10 20 30 W

I

I I I I I I I I I I I L 50 60 70 80 90 100

Tlhl Fig. 1. Courses of DH activity, biomass, NH 4 + concentration and citric acids during a citric acid fermentation with a strain of Yarrowia lipolytica on glucose DH activity (related to 0.5 g • 1_1 biomass) A — NH,+ concentration o— citric acids X — biomass

The point of N source exhaustion is characterized by maximum oxygen consumption rate [16], maximum C0 2 evolution rate (THIERSCH, unpublished results) and a maximum of D H activity. For A. niger KTJBICEK et al. [17] assume for this period of the citric acid fermentation a nearly uncontrolled uptake of the C source as opposed to a restricted protein synthesis caused by growth limitation. This situation leads to an increase of oxidative metabolism avoiding energy overproduction. Though substantial synthesis of reserve material occurs during the first 30 hours after the end of the replicatory growth, the citric acid production rate is the highest. In this first phase of vigorous citric acid production the DH activity declines sharply, reaching a slowly decreasing level of about 30—20% of its maximum activity. Similarly a decreasing level of TCC enzymes [1] and oxygen uptake rates [16] in this period has been found. Further fermentations performed in the same way but with varying aeration intensity resulted in similar kinetic relations, however, the extent of DH activity is influenced by the oxygen supply. It was found that the magnitude of product synthesis rates corresponds to the extent of DH activity at the end of the trophophase, that means the higher the DH activity the higher is the citric acid production rate (Fig. 2).

74

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1 0,K -

* 0,10

0.08 0.06 0.04 -

0.02 -

W

60 80 100 120 HO DH activity C/umoles min~1]

Pig. 2. Relation between level of DH activity maximum at the end of growth and the rate of specific product synthesis within the first 30 hours resulted from citric acid fermentations with a strain of Yarrowia lipolytica In contrast to the well-defined separation into tropho- and idiophase observed in citric acid fermentation by yeasts the extracellular formation of cellulase by Trichoderma starts after logarithmic growth and proceeds at slow growth rates. Furthermore an inducer is needed. Lactose serves both as C source and inducer. As shown in Fig. 3 two maxima of D H activity were found. After logarithmic growth D H activity increases up to

Fig. 3. Courses of DH activity, mycelium, cellulase activity and lactose during a cellulase fermentation of Trichoderma reesei (ZIMET 43803) on lactose f l start of the fed batch period by gradually adding lactose controlled by C0 2 concentration in the exhaust gas # — DH activity (related to 0.5 g 1 - 1 biomass) O — PP activity A — lactose X — mycelium

75

GRÜNDIG, B., BEHRENS, U. U. a., Monitoring Microbial Product Synthesis

a first maximum coinciding with the decrease of lactose. Further gradual addition of lactose controlled by C0 2 development results in a rise in biomass concentration at slow growth rates and induces further synthesis of the cellulase complex. The increased formation rate of cellulase, assayed as F P activity, is reflected by a rise of D H activity. When lactose concentration becomes to high the synthesis of cellulase is repressed, the formation rate decreases. Consequently the D H activity declines and reaches the level attained before. Obviously the level of lactose concentration may be controlled by determination of D H activity, whereby higher rates of cellulase formation are ensured.

Conclusions The results of the study support the view that D H activity reflects essentially the level of the oxidative metabolism of the cell which is a main criterion for characterizing a general "cell activity". Consequently it was found that D H activity is related in different ways to the intensity of aerobic idiophasic product syntheses of citric acids and cellulase. The highest rates of product syntheses within the first 30 hours were obtained with the highest D H activity. This observation is particularly important since D H activity can be influenced by various process parameters such as availability of oxygen, nutrients and supply of a carbon source and inducer, respectively. Applying D H activity for process control the courseof an idiophasic productfermentation can be performed in an optimum manner, obtaining a culture with high product formation capacity. The findings lead to the assumption that D H activity measurement is a method both for research and the control of industrial fermentations.

Acknowledgement We thank Dr. sc. STOTTMEISTER and Mrs. W E I S S B R O D T for providing fermentation samples and experimental data of four citric acid fermentations. Received January 13, 1987

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Microbiol.

Biotechnol. 9 (1980), 101.

Book Review C . P . H O L L E N B E R G , H . SAHM

BIOTEC 1 Microbial Genetic Engineering and Enzyme Technology Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1987, 142 S., 5 8 , - DM

Mit der rasanten Entwicklung der Biotechnologie in den letzten Jahren setzte eine Informationsflut ein, die kaum noch überschaubar ist. Internationale Konferenzen, Symposien und Ausstellungen zur Biotechnologie sind an der Tagesordnung. Das vorliegende Buch ist eine Zusammenfassung einer Tagung, die im Rahmen der BIOTEC 85 — Düsseldorf abgehalten wurde. Die Tagung war auf zwei zentrale Themen der Biotechnologie ausgerichtet, und zwar auf — die mikrobielle Gentechnologie und — die Enzymtechnologie. Die Organisatoren dieser Tagung, gleichzeitig auch Editoren dieses Buches, erreichten durch die Einbeziehung renomierter Fachleute eine gute Darstellung des aktuellen Standes der Forschung auf diesem Gebiet bei gleichzeitiger Einschätzung der ökonomischen Verwertung der Ergebnisse sowie der zukünftig noch zu lösenden Probleme. Durch diese Synthese und den Übersichtscharakter der Beiträge gelingt es, einen breiten Interessentenkreis anzusprechen und damit einen wichtigen Beitrag zur Propagierung dieser Schlüsseltechnologie zu leisten. Die einzelnen Beiträge sind instruktiv und anschaulich geschrieben; der Informationswert durch eingefügte Tabellen, Schemata und Bildmaterial verstärkt. Die teilweise festzustellenden Überschneidungen, insbesondere in den ausgeführten Beispielen, sind auf den Charakter der Veranstaltung zurückzuführen; wirken aber keinesfalls störend auf den Leser. Alles in allem handelt es sich um eine lesenswerte Zusammenfassung des aktuellen Entwicklungsstandes auf den genannten Gebieten und ist sowohl für den Fachmann von Interesse als auch allen anderen biotechnologisch orientierten Interessenten zu empfehlen. A.STEUDEL

76

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

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[16] STOTTMEISTER, U., BEHRENS, U., GÖHLER, W . : Z. Allg. Microbiol. 21 (1981), 677. [ 1 7 ] KUBIZEK, C. P . , ZEHENTGRUBER, 0 . , EL-KALAK, H . , RÖHR, M . : E u r . J . A p p l .

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Book Review C . P . H O L L E N B E R G , H . SAHM

BIOTEC 1 Microbial Genetic Engineering and Enzyme Technology Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1987, 142 S., 5 8 , - DM

Mit der rasanten Entwicklung der Biotechnologie in den letzten Jahren setzte eine Informationsflut ein, die kaum noch überschaubar ist. Internationale Konferenzen, Symposien und Ausstellungen zur Biotechnologie sind an der Tagesordnung. Das vorliegende Buch ist eine Zusammenfassung einer Tagung, die im Rahmen der BIOTEC 85 — Düsseldorf abgehalten wurde. Die Tagung war auf zwei zentrale Themen der Biotechnologie ausgerichtet, und zwar auf — die mikrobielle Gentechnologie und — die Enzymtechnologie. Die Organisatoren dieser Tagung, gleichzeitig auch Editoren dieses Buches, erreichten durch die Einbeziehung renomierter Fachleute eine gute Darstellung des aktuellen Standes der Forschung auf diesem Gebiet bei gleichzeitiger Einschätzung der ökonomischen Verwertung der Ergebnisse sowie der zukünftig noch zu lösenden Probleme. Durch diese Synthese und den Übersichtscharakter der Beiträge gelingt es, einen breiten Interessentenkreis anzusprechen und damit einen wichtigen Beitrag zur Propagierung dieser Schlüsseltechnologie zu leisten. Die einzelnen Beiträge sind instruktiv und anschaulich geschrieben; der Informationswert durch eingefügte Tabellen, Schemata und Bildmaterial verstärkt. Die teilweise festzustellenden Überschneidungen, insbesondere in den ausgeführten Beispielen, sind auf den Charakter der Veranstaltung zurückzuführen; wirken aber keinesfalls störend auf den Leser. Alles in allem handelt es sich um eine lesenswerte Zusammenfassung des aktuellen Entwicklungsstandes auf den genannten Gebieten und ist sowohl für den Fachmann von Interesse als auch allen anderen biotechnologisch orientierten Interessenten zu empfehlen. A.STEUDEL

Acta Biotechnol. 8 (1988) i, 7 7 - 8 6

Zum zeitlichen Verlauf von Substratkonzentrationsprofilen in einer Enzymträgerkugel CARL, S .

Technische Hochschule „Carl Schorlemmer" Leuna-Merseburg, Sektion Mathematik Otto-Nuschke-Straße, Merseburg, 4200

Summary In this paper the time evolution of substrate concentration profiles in spherical particles with homogeneous enzyme distribution is investigated. It turns out that the concentration S = S(x, t) is monotone increasing in the time variable t against the uniquely defined steady state 8 — S(x). Explizit formulas are derived for the estimation of the difference between the steady state S and the presteady state S, that hold for all t Sr 0, i.e., it is not only determined the order of magnitude of the convergence for sufficiently large t.

Einleitung D a s Modell, welches unseren B e t r a c h t u n g e n z u g r u n d e liegt, besteht aus einem kugelförmigen porösen P o l y m e r (K R ) m i t homogener E n z y m Verteilung, das in eine Lösung kons t a n t e r S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n S0 eingetaucht wird. D a s S u b s t r a t d i f f u n d i e r t von der Lösung in d a s Trägerteilchen u n d wird d o r t über eine irreversible R e a k t i o n umgesetzt, wobei die R e a k t i o n d u r c h die M I C H A E L I S - M E N T E N K i n e t i k , RG(S) = vS/k + S, beschrieben wird. Die Massenbilanz f ü r das S u b s t r a t i n n e r h a l b eines beliebigen Teilvolum e n s Q der E n z y m t r ä g e r k u g e l liefert die Gleichung (1)

wobei 8Q die Oberfläche des Gebietes Q u n d 8[8n die Normalableitung (nach außen) b e d e u t e n sollen. Die Gleichung (1) besagt, d a ß die Ä n d e r u n g des S u b s t r a t e s S pro Zeiteinheit innerhalb des Teilvolumens Q gleich ist dem F l u ß von 8 durch die Oberfläche d ü m i n u s der Menge des Substrats, die durch R e a k t i o n im Gebiet Q verschwindet. Die Anwendung des GAixss'schen Satzes auf das Oberflächenintegral von (1) liefert schließlich folgende Modellgleichung f ü r d e n zeitlichen Substratkonzentrationsverlauf S = S(x, t) innerhalb der Trägerkugel KR m i t d e m R a d i u s R: (2)

78

A c t a B i o t e c h n o l . 8 (1988) 1

Da zum Zeitpunkt t = 0 die Substratkonzentration innerhalb der Trägerkugel Null ist und für alle t 2; 0 außerhalb derselben die konstante Substratkonzentration S0 vorhanden sein soll, ergeben sich folgende Rand-Anfangsbedingungen: £(z,0)=0

für

xeKR,

S(x, t) =S0

für

{x, t)

(3)

e 3Kr

X (0, T)

(4)

wobei T > 0 beliebig aber fest sei. Die in die Modellgleiehung (2) eingehenden Konstanten sind alle positiv und haben die nachstehende Bedeutung: D — Diffusionskoeffizient v — maximale Enzymreaktionsgeschwindigkeit K — MICHAELIS-MENTEN Konstante des immobilisierten Enzyms. Das dem Problem (2) —(4) entsprechende stationäre Problem lautet: in

S(x)=S0

auf

8KR.

In dieser Arbeit wird zunächst die Existenz und Eindeutigkeit der Lösung sowohl für das instationäre als auch für das stationäre Problem nachgewiesen. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt jedoch in der Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der Konzentrationsprof ile S = S(x, t) und ihre Annäherung an den stationären Zustand S = 8(x). Im Gegensatz zu sonst üblichen Untersuchungen des asymptotischen Verhaltens für hinreichend großes t (vgl. [10]) wollen wir eine Abschätzung des Unterschiedes von instationärem und stationärem Zustand für alle t 0 herleiten. Darüber hinaus sollen alle in die Abschätzung eingehenden Konstanten und Funktionen explizit angegeben werden, was für eine praktische Verwendung besonders wichtig ist. Das Modell (2) —(4) wurde in [11] aufgestellt. Die dort durchgeführte Analyse bezieht sich allerdings lediglich auf eine linearisierte Form der Modellgleichung (2). Den biochemischen Hintergrund des Modells betreffend verweisen wir auf [11] und die dort zitierte Literatur. Allgemeines Modell und mathematische Methoden Bevor wir das konkrete Modell aus der Einleitung behandeln, werden wir die von uns benutzten mathematischen Methoden an einem hinlänglich allgemeinen Modell vorstellen. Wir betrachten zu diesem Zweck folgendes Rand-Anfangswertproblem (RAWP abgekürzt) : du — — DAu et

=f(x,

u(x,0)= 0, (ii)

ü(x, 0) S: 0)

ncfwdx^nf^y

k

f ( u )

=

S0 — m

+

S

0

für

S „

für

S

>

u

-

(15)

u ) ,


0 so zu wählen sind, daß folgende Ungleichungen erfüllt werden:

' i - ^ - F T ^ Ü{x,0)^S0

ü{x,t)^

in

0

6

0

" «'

KR,

auf

(19)

r,

(20)

mit Q : = KR X (0, oo) und / " : = 8KR X (0, oo). Die Ungleichung (20) ist trivialerweise erfüllt. Wir setzen den Ansatz (17) in die linke Seite von (18) ein und schätzen nach unten ab, wobei wesentlich für u 0 die folgende zweiseitige Abschätzung der Ableitung dfjdu benutzt wird: v ^ 8f ^ k - du-

vk (k + S0)2'

Für die Abschätzung nach unten erhält man dt

AB-

-

k -f- S0 — u

(21)

Wir wählen für den Parameter X bzw. die Funktion ip den kleinsten positiven Eigenwert bzw. die dazugehörige positive auf 1 normierte'Eigenlösung des Eigenwertproblems (22) y>(x) = 0

auf

wobei B 2: B. Bei dieser Wahl folgt aus der Abschätzung (21) unmittelbar die Ungleichung (18). Um die verbleibende Ungleichung (19), d. h. ü(x, 0) = u{x) + &ip(x) Si S0, zu erfüllen, wählen wir B > B. Die Eigenlösung Y>, für die in K-^ die Ungleichung f(x) S: 0 gilt, besitzt in KR ein positives Minimum m. Wegen ü(x) 2g 0 wird die Ungleichung (19) befriedigt, falls am Sg S0 ausfällt. Die letzte Ungleichung liefert eine untere Schranke für den Parameter a, der über m von der Wahl des Radius B > B abhängt. Die Lösung des Eigenwertproblems für die Kugel kann man Standardwerken der mathematischen Physik (z. B. [17]) entnehmen. Für das Eigenwertproblem (22) ergeben sich damit für den kleinsten Eigenwert X bzw. die dazugehörige Eigenlösung y> folgende Formeln:

y>(r) = — (sin rV 7ir \ B I

mit

r = \x\.

(24)

85

CARL, S., Substratkonzentrationsprofil

Da die Funktion ip gemäß (24) i m Intervall [0, i?] monoton von i/>(0) = 1 auf rp(R) = 0 fällt, erhält man für das Minimum m der Funktion f = y(r) in der Kugel KR die Beziehung m = y>(B) und damit für «

2: ( i i i ) Wählt man die Konstanten X und nach Formel (24), dann ist u ( x , t ) = ü ( x ) -f- txip(x) e~M Oberlösung des R A W P (12) —(14) f ü r alle t ^ 0, d. h. ü(x, t) ^ u(x, t). Ergebnis

(iv) Beachtet man (ii) von Ergebnis 1, dann erhält man für alle t ¡g 0 die Ungleichung 0

u ( x , t) —

ü(x)

< :

ü ( x , t)

- ü(x)


+

p f

= 0

ip =

0

in auf

K

n

,

8KIt

genommen. Für hinreichend nahe bei B gelegenes R ist ,u allerdings kleiner als der von uns angegebene Wert 1 (Formel (23)). Die Berücksichtigung der streng negativen Ableitung d f j d u im Eigenwertproblem (22) durch den Term — v k j ( k + S 0 ) 2 bedeutet also eine Konvergenzbeschleunigung. 4: Analytische Näherungslösungen für das stationäre Problem wurden in [2, 3] berechnet (man vergleiche auch [7]). Die Berechnungsmethode basiert dabei auf einer möglichst guten Einschachtelung der nichtlinearen Funktion / durch einfache (lineare) Funktionen flt / 2 und einer Anwendung der Methode von Ober- und Unterlösung bzw. der ihr zugrunde liegenden Maximumprinzipien. Die Lösungen uu u2 der entsprechenden Randwertprobleme mit den rechten Seiten / 1 ; / 2 können dabei explizit, analytisch berechnet werden. Unter gewissen Voraussetzungen an die nichtlineare rechte Seite / erhält man aus ^ / ^ / 2 die Einschachtelung der Lösung iL in der Form Bemerkung

«x

^

ü

^

u2.

Eingegangen: 18. 2. 1987

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Acta Biotechnol. 8 (1988) i , 8 7 - 9 2

Mikrobiologische Kohleentschwefelung BECK, D . , HEINRITZ, H . - J . , WORBS, M.

Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für Biotechnologie Permoserstr. 15, Leipzig, 7050 DDR

Summary S0 2 emissions arising by burning of coal represent an important ecological problem. Therefore, in international scale it is worked today in the development of techniques for solving this problem. A possibility consists in the microbial conversion of sulphur compounds of coal before its burning into compounds which not produce S0 2 by burning. Sulphur is bound in inorganic and organic form in coal. The composition may strongly differ in dependence on the kind of coal and its deposit. For the bioconversion of different sulphur compounds specific microorganisms were used. The paper gives an overview about the situation and the tendencies of the research in this field and also some informations of our own research.

International wird in breitem Umfang nach Möglichkeiten einer Entschwefelung fossiler Brennstoffe, insbesondere auch unter Einsatz von Mikroorganismen geforscht. Die Ursache dafür besteht in der Bildung von S0 2 bei der energetischen Nutzung dieser Rohstoffe mit den bekannten negativen Begleiterscheinungen. Die Minderung von S0 2 -Emissionen bei der Verbrennung von fossilen Energieträgern ist auf 2 Wegen möglich: — Entfernung des S0 2 aus den gebildeten Abgasen nach der Verbrennung (Abgasentschwefelung) — Entschwefelung der Kohle vor der Verbrennung Die bekannten Verfahren zur Abgasentschwefelung beruhen vorzugsweise auf der Bindung des gebildeten S0 2 an basische Stoffe. Auf Grund der Spezifik dieser Verfahren ist ihre Anwendung vor allem f ü r größere Feuerungsanlagen (z. B. Kraftwerke) vorgesehen. Die Anwendung dieser Technologien ist ausnahmslos durch sehr hohe Invest- und Betriebskosten gekennzeichnet, außerdem in Abhängigkeit Vbm Verfahren mit Deponieproblemen behaftet. In diesem Beitrag soll ein kurzer Überblick über den internationalen Stand der Arbeiten zur mikrobiologischen Entschwefelung der Kohle vor der Verbrennung und Informationen über eigene Arbeiten gegeben werden. Schwefel kommt in der Kohle in Form von anorganischen und organischen Verbindungen sowie in geringen Mengen elementar vor (Tab. 1). Der Gesamtschwefelgehalt und die Mengen an einzelnen Schwefelverbindungen differieren nicht nur zwischen Braunkohle und Steinkohle. Sie hängen sehr stark von der Genese der Lagerstätten ab. An anorganischen Verbindungen sind insbesondere der Gehalt an FeS 2 (Pyrit, Markasit) sowie Vor-

88

Acta Biotechnol. 8 (1988) i Tab. 1. Qualitative Zusammensetzung der Schwefelverbindungen in der Kohle S in der Kohle anorganisch

organisch

FeS 2 (Pyrit, Markasit) Sulfate (Ca, Mg, u. a.) Schwermetallsulfide

Thiole Sulfide Disulfide Thiophene

kommen weiterer Sulfide und als Sulfat gebundener Schwefel zu nennen. In OhioKohle und New-Mexiko-Kohle z. B. liegen 60—90% des Gesamtschwefels als Pyrit vor [1], Die organischen Schwefelverbindungen sind integrierter Bestandteil der Kohlestruktur und liegen in Form von Thiol-, Thioäther- sowie Thiphenstrukturen vor [2], Die DDR-Braunkohle enthält mit 60—80% (bezogen auf Gesamtschwefelgehalt) den Hauptanteil als organisch gebundenen Schwefel, während der Pyritschwefel nur eine untergeordnete Rolle spielt. Der Schwerpunkt der Arbeiten zur mikrobiologischen Konvertierung von sulfidischen Verbindungen lag und liegt international noch auf dem Gebiet der Steinkohleeritschwefelung, vor allem der Oxydation des Pyrites mit dem Ziel, ihn in wasserlösliche Verbindungen zu überführen und durch Wasch- bzw. Laugungsprozesse aus der Kohle zu entfernen. Bereits in den 60iger Jahren wurde mit ersten Untersuchungen zur mikrobiellen Entschwefelung von Kohle begonnen, die in den letzten 10 Jahren, bedingt durch zunehmende Umweltschutzauflagen für S0 2 -Emissionen durch Brennstoffe, intensiviert wurden. Für die Entfernung des pyritisch gebundenen Schwefels der Kohle wurden mesophile und thermophile Mikroorganismen verwendet (Tab. 2). Der am häufigsten eingesetzte Mikroorganismus ist Thiobacillus ferrooxidans, ein obligat autotrophes Bakterium. Thiobacillus ferrooxidans ist nicht in der Lage, organische Schwefelverbindungen abzubauen. Weitere Thiobacillus spezies wie T. organoparus, T. perometabolis, T. acidophilus u. a. wurden ebenfalls für die Entfernung des Pyritschwefels aus Kohle eingesetzt. Häufig Tab. 2. Einige ausgewählte Mikroorganismen für die Oxydation von S-Verbindurigen in der Kohle Pyrit:

Thiobacillus — Reinkulturen T. ferrooxidans T. organoparus T. acidophilus u. a. Sulfolobus S. brierleyi S. acidocaldarius Mischkulturen T. ferrooxidans! T. thiooxidans u. a.

org. S-Verbindungen Sulfolobus acidocaldarius Pseudomonas Thiobacillus ferrooxidans T H 1 Arthrobacter u. a.

B E C K , D . , HEINRITZ, H . - J . U.

89

a., Kohleentschwefelung

wurden Mischkulturen von T. ferrooxidans und T. thiooxidans verwendet, wobei die Effektivität höher war als bei Verwendung einer Reinkultur von T. ferrooxidans. Des weiteren kamen Mischkulturen von T. thiooxidans und Leptospirillum ferrooxidans sowie andere nicht näher charakterisierte Kulturen zum Einsatz. Neben diesen mesophilen autotrophen Bakterien wurden eine Reihe thermophiler autotropher als auch fakultativ autotropher Mikroorganismen selektiert. Während die aus sauren heißen Quellen und schwefelreichen Böden isolierten autotrophen Thiobacüli für die Pyritoxydation der Kohle bisher wenig Bedeutung erlangten, wurden die fakultativ autotrophen Mikroorganismen vom Typ Sulfolobus häufig verwendet. Die Untersuchungen konzentrieren sich auf die Stämme S. brierleyi und S. acidocaldarius, die einen Temperaturbereich von 60—80°C und einen pH-Bereich von 1—4 bevorzugen. Sie sind in der Lage, neben anorganischen auch einfache organische Verbindungen (z. B. Glucose) als Energiequelle zu nutzen. Gegenüber mesophilen Mikroorganismen bieten thermophile einige Vorteile: — Arbeiten bei hohen Tempraturen reduziert die Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination — gestattet hohe Zell- und Kohlekonzentrationen ohne Kühlsystem und bewirkt eine — Erhöhung der Geschwindigkeit der chemischen Oxydation des Pyritschwefels durch Fe 3+ . Bereits in den 60iger Jahren beschäftigte sich S I L V E K M A N mit der Oxydation von Pyritschwefel und schlug 2 Mechanismen vor — den direkten und indirekten Oxydationsmechanismus. Er wird heute allgemein anerkannt als das Schema, das den tatsächlichen Reaktionsabläufen am nächsten kommt (Tab. 3). Die meisten Verfahrensvorschläge beinhalten ein Arbeiten mit Kohlesuspensionen. Als optimale Kohlekonzentration in der Suspension zur Entpyritisierung mit S. acidocaldarius wurden Werte von 20% (20 g Kohle/100 ml Suspension) ermittelt. Vergleichende Untersuchungen zur Pyritentfernung aus Steinkohle unter Verwendung von T. ferrooxidans und 8. acidocaldarius zeigten eine deutliche Überlegenheit thermophiler gegenüber mesophilen Mikroorganismen [3]. Während mit T. ferrooxidans in 113 Tagen bei 28 °C eine 50%ige Entschwefelung festgestellt wurde, konnten mit S. acidocaldarius in 6 Tagen 90% Pyrit-S entfernt werden. Tab. 3. Mechanismen der Pyritoxidation Direkte Oxidation: 2 FeS2 + 2 H 2 0 + 7 0 2

T ferrooxidanä

'

2 FeS0 4 + H 2 S0 4 + 1/2 0 2 2 FeSa + H 2 0 + 7 1/2 0 2

> 2FeS0 4 + 2 H 2 S0 4

T ferrooxidans

'

terrooxidan6

(1)

y Fe 2 (S0 4 ) 3 + H 2 0

(2)

> Fe 2 (S0 4 ) 3 + H 2 S0 4

(3)

Indirekte Oxidation: FeS2 + F2(SO,)3

3 FeSO., + 2 S

2 S + 3 02 + 2 H20

T f

' ™ i d a n a > 2 H2SO,

Gesamtreaktion (direkt und indirekt): FeS2 + 3 1/2 0 2 + H 2 0 -> FeS0 4 + H 2 S0 4

(4) (5)

90

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

Die überwiegende Anzahl der Untersuchungen wurde in Labor-, Rühr- bzw. Perkulationsreaktoren durchgeführt, deren verfahrenstechnische Relevanz nicht gegeben ist. Im Hinblick auf eine praktische Anwendung wurde von K A K G I und C E R V O N I [4] ein Airlift-Fermentor für 3-Phasensysteme im allgemeinen und die Kohle im besonderen entwickelt (Abb. 1). Das Airlift-System ist energetisch günstiger als mechanisch gerührte Fermentoren, da f ü r die Belüftung und Umwälzung nur Druckluft erforderlich ist. In Folge niedriger Scherkräfte wird das Ablösen der Mikroorganismen von den Partikeloberflächen reduziert.

Abb. 1. Schema des Air-Lift-Systems nach

KARGI

und

CERVONI

1 — Kondensator, 2 — Kondensatauffanggefäß, 3 — Fermentor, 4 — Wasserbad, 5 — Glasfrittenbelüfter, 6 — Luftanfeuchter, 7 — Kochplatte, 8 — Luftfilter, 9 — Rotameter, 10 — Luft.

In jüngerer Zeit wird auch über Versuche zur Konvertierung organischer Schwefelverbindungen der Kohle berichtet. Da der organisch gebundene Schwefel integrierter Bestandteil der Kohlestruktur ist, ist seine mikrobielle Entfernung weitaus komplizierter als die von Pyrit. Spezielle Mikroorganismen müssen dafür zur Verfügung stehen (siehe Tab. 2). Modellversuche wurden häufig unter Anwendung einer organischen Schwefelverbindung durchgeführt, deren Vorkommen in fossilen Brennstoffen wie Kohle oder Erdöl typisch ist. Eine solche Verbindung ist Dibenzothiophen. Mit Sulfolobus acidocaldarius wurde z. B. bei 70 °C innerhalb von 28 Tagen eine Oxydation von 65% des eingesetzten D B T beobachtet [5], Die Übertragung der Ergebnisse dieser Modelluntersuchungen auf Kohle, die keinen anorganischen Schwefel enthielt, führte zu einer Umwandlung von 20—40% des organischen Schwefels. Allerdings sind die Entschwefelungsgeschwindigkeiten sehr klein, f ü r die Inkubation werden 6—8 Wochen benötigt. Die erforderlichen Reaktorvolumina f ü r die Oxydation organischer Schwefelverbindungen der Kohle sind extrem hoch, so daß der Prozeß ökonomisch nicht tragbar ist. Daher sind zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeiten die weitere Untersuchung und Optimierung der vorhandenen und vor allem die Isolierung neuer Stämme erforderlich.

B E C K , D . , H E I N R I T Z , H . - J . U. a . ,

ai o

91

Kohleentschwefelung

CH2CH2COOH

CT

CH=CHCOOH

I

COOH

COOH OH OH OH

1 C0 2 + H 2 0

Abb. 2 . Möglicher mikrobieller Abbau von Dibenzothiophen nach FINNERTY [6]

Während die Mechanismen der Pyritoxidation gut untersucht sind, bestehen bezüglich organischer S-Verbindungen lediglich Vorstellungen zum mikrobiellen Abbauweg von Dibenzothiophen (Abb. 2). Gemessen am internationalen Stand befinden sich unsere eigenen Arbeiten zur mikrobiellen Kohleentschwefelung noch am Anfang. Bei unseren Untersuchungen gingen wir von folgender Grundkonzeption aus: — Der überwiegende Anteil der zu konvertierenden Verbindungen ist der pyritische Anteil. — Eine Technologie analog der Steinkohleentschwefelung ist nicht möglich, da Braunkohle im Rohzustand ein kolloidales System darstellt und Wassergehalte bis 6 0 % aufweist, d. h. technologische Prozesse wie Peinvermahlung, Aufschlämmung und nachfolgende Entwässerung aus ökonomischen Gründen nicht in Frage kommen. Ziel ist nicht — eine Biotransformation der sulfidischen Verbindungen in wasserlösliche, aus der Kohle entfernbare Verbindungen sondern deren Umwandlung in thermisch schwer zersetzbare Verbindungen durch Reaktion mit anorganisch-mineralischen Kohlebestandteilen. — E s erfolgte von vornherein eine Orientierung auf Brikettkohle, um einen evtl. gegebenen mikrobiologischen Prozeß im technologischen Prozeß der Kohlegewinnung und Verarbeitung einpaßbar zu gestalten.

Entsprechend dieser Konzeption bestand das Ziel zunächst in der Selektion pyritoxydierender Mikroorganismen. Auf der Basis eines umfangreichen Probematerials wurden von verschiedenen natürlichen Standorten (Boden-, Kohle- und Gewässerproben) eine Reihe von acidophilen, mesophilen Mischkulturen isoliert. In den leistungsfähigsten selektierten Kulturen wurde T. ferrooxidans als dominierender Mikroorganismus nachgewiesen. Erste vergleichende Untersuchungen unter Verwendung von Pyrit und einer Thiobacillus /errooxiliaw.s-Reinkultur sowie einer von uns selektierten Mischkultur führten zu nahezu gleichen Ergebnissen bezüglich des Entpyritisierungsgrades (Abb. 3). Die aus einem Braunkohlebergbau selektierte Mischkultur, die noch näher zu charakterisieren ist, bestand überwiegend aus stäbchenförmigen Zellen unterschiedlicher Größe. Bemerkenswert bei diesen Versuchen war die Tatsache, daß bereits geringfügige Abweichungen der Prozeßparameter, wie Temperatur, pH-Wert, 0 2 - und C0 2 -Versorgung oder die Zusammensetzung des Nährmediums, erhebliche Schwankungen der Pyritabbauraten zur Folge hatten.

92

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

Zeit [d] Abb. 3. Oxidation von Pyrit unter Verwendung verschiedener Kulturen

Die Verwendung der von uns selektierten Kulturen sowie auch von Reinkulturen von T. ferrooxidans f ü r Versuche zur Pyritoxidation in Braunkohle führten nicht zu adäquaten Ergebnissen. Die Hauptursache besteht in dem geringen Pyritgehalt der Braunkohle der DDR. Auf Grund der im Laufe der Bearbeitung gewonnenen Erkenntnisse über die Zusammensetzung der Braunkohle der D D R besteht der Schwerpunkt der weiteren Arbeiten in der Isolierung heterotropher, thermoacidophiler Mikroorganismen, die in der Lage sind, den Gehalt an organischen Schwefelverbindungen der Braunkohle zu reduzieren. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie, Moskau wurden 3 heterotrophe Reinkulturen gewonnen, deren genaue Identifizierung bisher noch nicht erfolgt ist. Der Nachweis der Konvertierung organischer Schwefelverbindungen durch diese Kulturen wurde an Hand von Modellsubstanzen (Dibenzylsulfid) erbracht. Versuche zur Übertragung dieser Ergebnisse auf die Entschwefelung von Braunkohle sind Bestandteil laufender Arbeiten. Gegenwärtig wird mit der Selektion thermoacidophiler Mikroorganismen aus verschiedenen Umwelten begonnen. Eingegangen: 8. 1. 1987

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Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 93—98

Use of the Luciferin-Luciferase Assay of ATP for Measuring the Bacterial Growth: Application to Escherichia coli KAHRTJ, A., VILTJ, R .

Institute of Chemical Physics and Biophysics of the Estonian Academy of Sciences, Akadeemia tee 23, Tallinn 200026, USSR.

Summary The relative constancy of ATP content per unit of dry biomass in different microorganisms enables to use the specific, sensitive and quick luciferin-luciferase method for ATP assay for indirect quantitation of microbial biomass by measuring the ATP content in biomass samples. The aim of this work was to investigate the feasibility of using theATP concentration for the monitoring of the growth of Escherichia coli K 12 W 3350 in different cultivation conditions. Statistically significant high correlation coefficients (r > 0.9) between the ATP content (ATP/ml) and the other growth characteristics examined showed that the ATP content of the culture is as suitable characteristic as the optical density of the culture, total cell number per ml or total cell volume per ml for the monitoring of the growth of E. coli in batch culture in mineral medium with glucose at different growth temperatures (27—42°C) as well as in fed-batch culture.

Introduction In 1952 S T R E H L E E and T O T T E R [1] first demonstrated that the firefly luciferin-luciferase system can be used for specific and sensitive estimation of ATP or rates of various processes synthesizing or consuming ATP. ATP is ubiquitously distributed in biological material, it can be easily extracted from the cells and assayed [2], Moreover, ATP content on a dry weight basis does not change very much in different cell types. In different bacteria the ATP content varies from 2 to 10 nmoles/mg dwt [3, 4], This has provided a basis for the use of luciferin-luciferase method for indirect quantitation of bacterial biomass by extraction and assay of the ATP content. The method has been applied to estimation of bacterial content in ocean water [5], in clinical specimens [6, 7, 8], in raw milk [9], in activated sludge [10] etc. The aim of this work was to investigate the feasibility of using the ATP concentration for the monitoring of the growth of Escherichia coli K 12 W 3350 in different conditions of cultivation. Material and Methods Microorganism and culture conditions. Escherichia coli K12 W 3350 was used throughout. Both inocula and experimental batch cultures at different temperatures (from 27 to 42 °C) were grown in mineral medium with glucose (2 g/1) on a water-bath rotary shaker

94

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

as described previously [11], Theinocula were pregrown overnight at the corresponding temperature. At each temperature two parallel experiments were performed. Bacterial growth was monitored by measuring the optical density of the culture at 540 nm. An extinction of 1.0 was equivalent to 0.7 mg dwt of bacteria per ml of culture. The maximum specific growth rate (/zmax, h _ 1 ) of E. coli at each temperature was determined from semilogarithmic plots of OD versus time for the exponential phase of growth by linear regression. ATP samples were fixed and analyzed as described below. Fed-batch cultivation of E. coli was carried out in the fermenter (Ultroferm 1601, L K B ) with an initial volume of 3.5 l. x Initial composition of the growth medium was following (per 1): NH4C1 — . 1 g; K H 2 P 0 4 - 1.5 g; Na 2 HP0 4 • 1 2 H 2 0 - 8 g, MgS0 4 - 0.5 g. glucose-4 g. The feeding solution contained glucose — 200 g/1, NH4C1 — 50 g/1 and microelements (mg/1): CaCl2 - 1000, MnS0 4 • 5 H 2 0 - 150, ZnS0 4 • 7 H 2 0 - 50. CuS0 4 • 5 H 2 0 - 10, CoCl2 • H 2 0 - 10, Na 2 Mo0 4 • 2 H 2 0 - 10. Feeding was started at the end of logarithmic growth phase (8th h of cultivation). Bacteria were cultivated at 37°C, pH was controlled at pH = 6.8. p 0 2 was automatically held at p 0 2 = 30%. Two parallel experiments were performed. Growth of E. coli was evaluated by measuring glucose and NH4C1 concentrations in the growth medium, optical density of the culture (OD was measured at 540 nm and at 850 nm, in the latter case the OD was registered automatically by the OD measuring unit of ANKUM-fermenter (USSR)), total volume of the cells per ml, cells number per ml, and the amount of ATP per ml. Assays. For the extraction of adenylates a 1.0 ml volume of culture was added to 1.0 ml of ice-cold trichloroacetic acid/EDTA solution (10%/4mM). This procedure was completed within 5—7 seconds. The fixed samples were held at + 4 ° C and analyzed within 24 h. Adenine nucleotide concentrations were assayed with luciferin-luciferase as described previously [12] using a LKB-Wallac Luminometer 1251. As our preliminary experiments with this strain of E. coli showed that the amount of extracellular ATP during the growth of bacteria was negligibly small, in the experiments described here the amount of extracellular ATP was not determined. Cell number and cell volume was measured with Coulter Counter (Coultronix, France) using a capillary with the diameter of 30 (im. Glucose concentration in the culture medium was determined enzymatically with hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase [13] and NH4C1 concentration in the growth medium was determined with the N E S S L E R reagent. Statistical treatment of the experimental data. At the 95% confidence level the relative error of the determinations of ATP with luciferin-luciferase was calculated to be 5%. The relationships between different growth characteristics were evaluated from the respective linear correlation coefficients. Statistical significance of the calculated correlation coefficients (r) was estimated at different confidence levels (P) and designated as following: * - |r| > 0 at P = 90%, * * - at P = 95%, * * * - at P = 99%, respectively. Results and Discussion Tab. 1 shows the relationship between the two biomass growth characteristics — amount of ATP per ml of culture and optical density (OD) — in batch culture of E. coli growing on mineral medium with glucose at various temperatures (from 27 to 42 °C). The relationship is characterized by linear correlation coefficients (r) between cultural optical density (OD 540 ) and ATP content (ATP/ml) at various temperatures (for the calculation of r values were used lag- and log-phase OD and ATP data) (Tab. 1) Maximum specific growth rate (/i max , h - 1 ) of bacterial population at different temperatures (at every temperature two parallel experiments were performed) was calculated by the method of linear regression from semilogarithmic plots of OD versus time: /i max increased from

95

Kahru, A., Viltj, R., Luciferin-Luciferase Assay

0.26 to 0.63 h - 1 with increasing temperature of cultivation from 27°C to 42°C (Tab. 1). As a rule, the calculated r values were high, r > 0.9, and statistically significant at P = 99% at all growth temperatures (growth rates) examined (Tab. 1). On Fig. 1 the growth curve of E. coli in fed-batch culture is presented. Feeding was started at 8-th h of cultivation (at the end of the logarithmic growth phase, when the glucose and NH4C1 (C- and N-source, respectively) from the culture medium were exhausted) (Fig. 1A). Bacterial growth was estimated by measuring various characteristics: OD540, OD850 (Fig. 1A), total cell volume/ml, total cell number/ml and ATP content/ml (Fig. IB). The growth curve of E. coli in fed-batch culture may be divided Tab. 1. Correlation coefficients (r) between the amount of bacterial biomass (mg dwt/ml)and cultural ATP content (nmol/ml) during lag- and log-phases of batch cultures of Escherichia coli growing on mineral medium with glucose at different temperatures. Data of two parallel experiments at each temperature are presented. Temperature (°C)

No of pairs correlated

¡¿max ( h _ 1 )

27

0.98 0.89

13 13

0.26

30

0.99 0.97

9 9

0.32

32

0.99 0.99

13 13

0.47

35

0.99 0.99

7 7

0.43

37

0.99 0.99

5 5

0.49

38

0.94 0.98

7 7

0.45

40

0.91 0.91

10 10

0.53

12

0.99 0.99

6 5

0.63

into three parts: lag-phase (0—4h of cultivation), exponential growth phase (4—8 h) and substrate feeding phase (8—16 h) (Fig. 1). Maximum specific growth rate (fimax, h _1 ) values for exponential growth phase (4—8 h), estimated by the method of linear regression from semilogarithmic plots of different growth characteristics versus time values were 0.62 h" 1 for total cell number/ml, 0.52 h" 1 for OD510, 0.49 h" 1 for total cell volume/ml, 0.46 h - 1 for ATP/ml and OD580. Correlation coefficients between different pairs of above mentioned parameters during the exponential growth phase were close to 1 (r > 0.97) (not shown). Correlation coefficients (r) between the ATP content (nmol/ml) and the rest of the measured growth characteristics presented on Fig. 1 during the entire cultivation (i.e. for 0—16 h) are presented in Tab. 2 (data set B). As an illustration on Fig. 2 the correlation between ATP content (ATP/ml) and the cultural optical density (OD540) of E. coli is shown (r = 0.98***) (see also Tab. 2). In Tab. 2 are also given data of the other (parallel) fed-batch experiment with E. coli (data set A). All r values presented in Tab. 2 are high, r > 0.9 and statistically significant at P = 99%. In routine laboratory practice the microbial growth can be monitored by using conventional methods: by measuring the optical density (OD) or dry weight (dwt) of the culture,

96 4

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1 7 65

3 21

bl Y

J y -a /

10

12

U

Time [hi

16 18 20

0

2

4

6

8 10 12 Ik- 16 18 20 lime [hi

Fig. 1 A and B. Growth of Escherichia coli in fed-batch culture. A •— In of the culture optical density at 540 nm (OD- 10 ); • — In of the culture optical density at 850 nm (OD 850 ); A — glucose concentration in the growth medium (g/1); x — NH,C1 concentration in the growth medium (g/1). B. •— amount of ATP per ml of culture (nmol/ml); •— In (cell number X 10~9 per ml); A — In (total cell volume X 10~9 per ml) (/¿3 x 10" 9 /ml)

Tab. 2. Correlation coefficients (r) between ATP content in the culture (ATP/ml) and different growth characteristics during the fed-batch cultivation of E. coli. Data of two parallel experiments (A and B) are presented, r values were calculated from the entire growth curve data. Data of one parallel experiment (B), from which one set of r calues (set B) was calculated are presented on Fig. 1. Cell number and total cell volume was determined with Coulter Counter (see Methods). Pair of characteristics

A

R***

ODMO-ATP

OD 850 -ATP Total cell Nr-ATP Total cell volume-ATP

B

No of pairs

No of pairs

0.96

29

0.96

26

27

28

0.98 0.98 0.98

0.90 0.99

27

28

0.97

23

23

by direct counting the cells under the microscope, by electronic counting the cells with Coulter Counter, by plating out the diluted culture samples onto the agar plates etc. However, some of these methods (outplating, direct counting under the microscope, dry weight determination) are time-consuming, some of them under certain experimental conditions lack exactness: optical density and dry weight measurements are not accurate if the medium contains insoluble growth substrates, OD measurements are considerably complicated when the1 cultivated microorganisms are morphologically complicated (mycelial microorganisms etc.). Statistically significant high correlation coefficients (r > 0.9) (see Tab. 1 and 2) between the ATP content (ATP/ml) and the other growth characteristics examined show that the ATP content of the culture is as suitable characteristic as the OD, total cell number or total cell volume to estimate the rowth of E. coli in batch culture. We have previously shown [12] that during the growth of mycelial microorganism Thermoactinomyces vulgaris in batch culture the ATP content of the culture (ATP/ml) increases proportionally to the dry weight of the culture (dwt/ml).

KAHRU, A., VILU, R., Luciferin-Luciferase Assay

97

r = 0.9B

45

6

7.5 9 00 540

10.5 12 13.5 15

Fig. 2. Correlation between culture optical density (ODr,10) and the amount of ATP per ml of culture (nmol/ml) during fed-batch cultivation of Escherichia coli. Correlation coefficient r between OD and ATP/ml being 0.98***. Data are plotted from Fig. 1.

Therefore, our data give additional evidence of practical use of the specific, sensitive and quick luciferin-luciferase method of ATP assay for the quantitation of microbial biomass in laboratory-scale fermentations or in various biotechnological applications where microorganisms are cultivated. The extraction and measurement of ATP content from the cells can be relatively easily automated, i.e. continuous flow systems designed. An example of a system of that type was shown by S I R O et al. [ 1 4 ] for a baker's yeast. The luciferin-luciferase method of ATP measurement was also shown to be appropriate for the evaluation of the growth of Trichoderma viride [15] and Trichoderma reesei [16] on cellulose. In addition, the ATP concentration in the culture was found to be an excellent growth parameter for Spiroplasma citri (a representative of Mollicutes) [17]. Received March 3, 1987

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Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 99—102

Acid-Base Solar Biobattery Exploiting Water Plants NESPÙRKOVA, L., RYBOVA, R . , JANAÒEK,

K.

Czechoslovak Academy of Sciences Institute of Microbiology 14220 Prague, 4, Czechoslovakia

Summary A biobattery of a new type in which pH difference between two media serves as a source of free energy is described. The ability of some algae and other water plants to change markedly the pH of their surroundings according to the light conditions can be used to maintain two solutions at widely differing pH values. Electrical energy may be obtained from this source as a by-product to biomass production.

Introduction The biobatteries proposed up to now were all of a redox type; in those working with intact organisms bacteria (e.g., Rhodospirillum rubrum, Proteus vulgaris, Micrococcus cerificans, Escherichia coli,Alcaligehes eutrophus), various Cyanophyta or algae (Chlorella) were used at their bioanodes and/or biocathodes [1—4]. In such biobatteries an added organic substrate undergoes an anodic oxidation or cathodic reduction as a result of bioelectrochemical processes taking place in living organisms. The electrode processes properly proceed on platinum electrodes with glucose as the usual substrate. The mechanisms of reactions occurring at the electrodes are not yet completely understood. Two possibilities by which living organisms catalyze the electrode processes are considered: (1) a direct involvement of the biochemical apparatus in the redox reactions or (2) the composition of the medium in the vicinity of the electrode is modified (e.g., by oxygen consumption). The acid-base principle has not yet been exploited in construction of biobatteries. It has long been known that some algae (coenocytes such as Hydrodictyon reticulatum, or Cladophoraceae such as Cladophora glomeraia or Rhizoclonium hieroglyphicum) alkalize their surroundings up to p H 10 or even more when exposed to light. Plants submerged in water mostly prefer to utilize bicarbonate instead of free C0 2 as the carbon source for photosynthesis, the observed uptake of HCO r being accompanied by appearance of O H - outside the cells. The biophysical mechanism of alkalization in Hydrodictyon reticulatum was already discussed in some detail [5]. On the other hand, some water plants floating on the water surface bring about a slight acidification of the medium in the light (e.g., Lemna gibba [6]). 7*

100

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

Methods and Discussion A conductive connection of two reservoirs with different p H by means of a bridge and two pH-sensitive electrodes (or by means of a pH-sensitive partition and two reference electrodes) represents a source of electromotive force and is generally used when assessing pH. Glass electrodes, now exclusively used in p H measurements, are unsuitable for drawing current from p H differences because of their high ohmic resistance. Antimony or tellurium electrodes, or electrodes of inert metal (or an alloy of tin and lead) covered with a layer of manganese dioxide, which were formerly used for determination of p H (e.g. [7]) have a substantially lower resistance. pH1 >

• AS

pH2

SbE

Fig. 1. Battery arrangements with pH-sensitive electrodes. AS — algal suspension, SbE — antimony electrodes, C — Cuprophane membrane pH, >

pH2 SbP

AS

X/fF,

Fig. 2. Battery arrangement with a pH-sensitive element. AS — algal suspension, RE — reference electrodes, SbP — antimony partition

Two basic arrangements of the biobattery circuits are shown in Figs. 1 and 2. In our experiments antimony or tellurium rods were used as p H sensors. In Fig. 1 the alkaline and acid media are separated by Cuprophane (a cellulose membrane modified by copper) which functions as a low resistance bridge with a negligible or no junction potential. In Fig. 2 the two media differing in p H are separated by a pH-sensitive element (e.g., by an antimony rod traversing a rubber partition and behaving exactly as a pH-sensitive membrane) and the current is conducted by suitable, e.g., silver-silver chloride electrodes, which can be regenerated easily by exchanging their position from time to time. The alkaline medium was created by a light-exposed suspension of the alga Hydrodictyon reticulatum in a sort of artifical pond water (1.0 mM KCl, 0.1 mM NaCl and 0.1 mM CaCl2), whereas the acid medium was represented by the same simple solution in a spontaneous equilibrium with the air carbon dioxide. To increase the buffering capacity of the acid saline it would be better to use a cell suspension of Hydrodictyon reticulatum,

N e s p C r k o v a , L., R y b o v a , R . , Acid-Base Solar Biobattery

101

well shaded from light, which maintains under such conditions pH around 6.0. The pH changes in the algal suspension under changed light conditions are shown in Fig. 3. Another possibility would be to use a light-exposed suspension of Lemna gibba as the acid medium.

Fig. 3. Light-induced pH changes in the suspension of Hydrodictyon reticulatum

/

200 -

/

I

/ i

i

i

i

i

6

7

8

9

10

pH

Fig. 4. Cell electromotive force as dependent on pH of the algal suspension

102

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1

The electromotive force of the cell, after exposing the algal suspension to light for about 20 minutes, was near to 180 mV, the current at maximum efficiency (i.e., when the external resistance was close to the internal one) was 5.5 • 10~7 A cm 2 of the electrode surface, the energy output thus being 4 • 10"8 W c m - 2 of the electrode surface. The dependence of the electromotive force of the battery on the p H of the suspension is shown in Fig. 4. An increase of the electromotive force as well as a reduction of the internal resistance are prerequisites for practical applicability of the biobattery. Voltage may be increased arbitrarily by a cascade arrangement of individual cells. On the other hand, a parallel arrangement of cells does not appear to. be of much assistance in achieving a decrease in the battery internal resistance. Better results are expected from catalyzing the reactions a t the electrode surface and increasing the salt'content in the solutions used. When the algal suspension was replaced by common buffers the resistance decreased markedly, and the efficiency of the battery was then comparable to the efficiencies of redox biobatteries proposed as far or of non-biological solar cells. Received March 5, 1987

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Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 1 0 3 - 1 1 0

High Performance Liquid Chromatography and Biotechnological Application of Several Oxidoreductases Kovift, J-t Department of Biochemistry, Purkynje University, KotMrska 2, 611 37 Brno, Czechoslovakia

Summary This paper describes our experience with the use of high performance liquid chromatography in the analysis and preparation of several NAD-dependent dehydrogenases and oxygen-dependent oxidases. The chromatographic materials tested were from Pharmacia (Sweden), LKB (Sweden) and Lachema (Czechoslovakia), the columns were attached to the fast protein liquid chromatographic (FPLC) system from Pharmacia. The preparative use of high performance ion exchange, molecular sieve and hydrophobic interaction chromatographies as well as of chromatofocusing made it possible to prepare tens of milligrams of completely pure enzymes in several hours. In most cases a combination of two high performance methods was sufficient to yield a homogeneous enzyme. The purified enzymes were used as analytical reagents for determining the concentrations of several metabolites and activities of some enzymes. A biotechnological application of immobilized alcohol dehydrogenase for the production of reduced nicotineadenine dinucleotide from the oxidized form of the coenzyme is discussed in a greater detail.

Introduction Oxidoreductases belong to the enzymes which are important from the viewpoint of processes occurring in the living cells as well as in biochemical practice [1—3]. Many of them are used as reagents in clinical biochemistry and other branches of analytical biochemistry [3] or serve as specific catalysts in biotechnological processes (e.g. in enzyme reactors and in enzyme sensors) [2]. The traditional preparation methods for these enzymes involve several large-scale procedures (such as homogenization, extraction, centrifugation, ammonium sulphate fractionation, heat denaturation etc.) followed by some chromatographic steps (on ion exchangers, molecular sieves, affinity resins etc.) [1]. The main disadvantage of these currently used chromatographies on traditional materials such as substituted celluloses, agaroses and Sephadexes is their relatively low resolution and long duration which may lead to the denaturation of enzymes in some cases and which are inconvenient as regards the economy of the purifications. High performance liquid chromtography (HPLC) of proteins is a rapidly developing scope of the chromatographic science, it is promising as for the reduction of the time required for the separation. Moreover, the decreased duration of the separation process is accompanied with an essential increase in the separation efficiency. Usual high performance liquid chromatography attains its high performance using a high pressure

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(the abbreviation H P L C is often understood as high pressure liquid chromatography). On the other hand, fast protein liquid chromatography (FPLC) developed by Pharmacia (Sweden) requires medium pressure only. The values up to 4 MPa are entirely sufficient [4, 5], An excellent resolution and high flow rate is attained using uniform materials (such as MonoBeads with 10 ¡xm particle size) which are appropriate for the separation of biopolymers. The products of several other corporations (especially Ultropac TSK gels delivered by L K B , Sweden, and MicroSpherons produced by Lachema, Czechoslovakia) are also suitable as high performance materials for enzyme purifications [6]. The F P L C instrumentation (supplied from Pharmacia) is also designed to meet all the requirements of biochemists interested in the separations of enzymes and other labile biomolecules [4, 5], The F P L C instruments consist of three basic parts: the eluant delivery system, the gradient controller and sample distribution valves. An UVdetector and a high quality fraction collector are used for the evaluation of the data and for collecting the eluted active samples. As H P L C techniques have become more interesting for biopolymer separations, many researchers have reported the negative effects of metal ions on enzyme activities and the effects of halide and other buffers on the stainless steel components of usual H P L C instruments [7—9]. Many enzymes have denatured by traces of metals and the damage t h a t halides cause to stainless steel affects maintenance costs and reproducibility. The use of glass, fluoroplastics and inert polymers in the wetted materials of the F P L C system have eliminated these problems and increased the overall solvent compatibility [4]. The goal of this paper is to present our experience with the above-mentioned chromatographic materials and the F P L C system for an analytical control and purification of several oxidoreductases and to show some examples of their application in analytical biochemistry and biotechnology. Analytical Control of 3-Hydroxybutyrate Dehydrogenase from

Paracoccus

dentrificans

3-Hydroxybutyrate dehydrogenases can be employed for the determination of acetoa c e t a t e a n d 3-hydroxybutyrate concentrations in biological materials [10]. These metabolites are monitored in blood sera in the case of diabetes and some disorders of the metabolism of lipids. 3-Hydroxvbutyrate dehydrogenase is present in relatively large quantities in the cells of Paracoccus denitrificans and other bacteria which use polyhydroxybutyrate as an intracellular reserve material [11]. This enzyme was purified using traditional chromatographic techniques (separation on DEAE-cellulose, Matrex Gel Blue A, which contains Cibacron Blue as the affinant, and Sephadex G-200) [12]. Chromatography on a Polyanion SI column (5 X 50 mm i.d., Pharmacia) was used as an analytical method for checking the purity of the enzyme samples during the largescale preparative steps. Polyanion SI is a weak anion exchanger applicable for rapid and high resolution separations of proteins, peptides, oligonucleotides and other biomolecules [13]. I t is based on porous silica with a stable protective coating of cross-linked polyethyleneimine. I t contains chiefly protonated tertiary amino groups as charge carriers [13]. This material is relatively solvent resistant and appropriate for enzyme separations due to the fact t h a t the silica matrix is covered with a layer of an organic polymer. In the case of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase purification, the analytical chromatography on this material proved very useful for a control of the enzyme purity [12], I t showed t h a t the final purification step (chromatography on Sephadex G-200) did not remove all impurities and F P L G can be used to obtain small amounts of homogeneous enzyme. However, the sample after the chromatography on Sephadex G-200 was devoid of any interfering enzyme activity and could be used for the determination

K o v a S , J . , High Performance Liquid Chromatography

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of 3-hydroxybutyrate and acetoacetate concentrations in biological materials. Using appropriate reaction conditions [3] and the oxidized (NAD) and reduced (NADH) coenzyme, respectively, the amounts of these substrates could be determined from the observed changes in absorbance at 340 nm upon addition of the partially purified enzyme. This bacterial enzyme could be prepared in relatively large quantities and could be stored for sufficiently long periods of time since its stability was shown to be quite good' Purification and Analytical Application of Malate Dehydrogenase and Lactate Dehydrogenase from Beef Heart These two enzymes are widely used in analytical biochemistry as specific reagents. They can be employed for the determination of their substrates, i. e. malate, oxalacetate, lactate and pyruvate, and of other important metabolites (e.g. acetate, acetyl-CoA and citrate) [14—16] and for measuring the activities of several enzymes [17,18]. Their use in enzymatic assays for aminotransferases (aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase) can be considered for their most important analytical application. The activities of aminotransferases are increased in the case of several diseases (e.g. acute hepatitis) [19]. We proposed simple and rapid methods for the purification of these dehydrogenases from beef heart, the introduced methods are based on salting-out of the tissue homogenate with ammonium sulphate and hydrophobic interaction chromatography (HIC) on an unsubstituted MicroSpheron (a glycolmethacrylate polymer) [20, 21]. This material shows moderate hydrophobic properties and can be employed for the separation of slightly hydrophobic proteins [22]. It is convenient for a large-scale separation of these enzymes since it has a high loading capacity (more than 0.2 g of proteins can be injected onto a column of 10 X 100 mm i. d.) and it brings about negligible losses of enzyme activities in the separated samples. Malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase from beef heart differ slightly in their hydrophobicity (as well as in their solubility in concentrated ammonium sulphate solutions), this can be utilized in their nearly complete separations using these two separation steps. If a completely pure enzyme is required a subsequent chromatography on an ion exchanger is to be performed as the final high performance purification step. In the case of malate dehydrogenase, homogeneous mitochondrial isoenzyme (which is essentially more active than that occurring in the cytosol) could be obtained in a single run on a Mono S column (5 X 50 mm i. d., Pharmacia). The two dominant isoenzymes of lactate dehydrogenase (i.e. the H 4 and MH 3 isoenzymes) could be separated from each other and from the remaining contaminants on a Mono Q column (5 X 50 mm i. d., Pharmacia) — cf. Table 1. These two ion exchangers are based on monodispersed MonoBeads developed Tab. 1. Purification of malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase from beef heart Enzyme

Specific activity in units per milligram of protein (Yield in each step in per cent) Starting material

After HIC 3

After ionex chromatography

Malate dehydrogenase (mitochondrial isoenzyme)

5.4 1

53 (94)

915 4 (88)

Lactate dehydrogenase (H 4 isoenzyme)

8.2 2

32 (85)

310 5 (90)

1 2 3

Starting material: the fraction salted out with ( N H 4 ) 2 S 0 4 between 40 and 75% saturation. Starting material: the fraction salted out with ( N H 4 ) 2 S 0 4 between 40 and 60% saturation. Column: MicroSpheron, 4 Column: Mono S, 5 Column: Mono Q.

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by Pharmacia, Mono S is a strong cation exchanger containing — S0 3 ~ groups, whereas Mono Q is an anion exchanger with quaternary amino groups [23, 24]. These high performance ion exchangers of the MonoBead type represent one of the most significant developments in liquid chromatography of biopolymers in recent years. With an average particle size of 10 (j.m they create very homogeneous beds with high efficiencies and low resistance to flow. The resulting columns operate a t moderate pressures and with high performance. Even small columns (5 X 50 mm i. d.) have excellent loading capacities — up to 30 mg of proteins and can therefore be used in semi-preparative runs. As each run lasts 10—30 minutes, more than 100 mg of proteins can be separated in less than two hours. The solvent resistance and stability of these materials are very good. The results of the separations of malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase from beef heart are shown in Table 1. A combination of hydrophobic interaction chromatography and ion exchange chromatography yields homogeneous enzymes with high specific activities and in high recoveries in both cases. Especially the separation of mitochondrial malate dehydrogenase on a Mono S column was very good, this was due to the fact that this isoenzyme has a relatively high isoelectric point and most of the contaminants remaining in the sample after HIC do not bind to this ion exchanger under the conditions of the separation (pH 7). The pure isoenzyme can be eluted with a gradient of sodium chloride. The puritiy of the isoenzymes of malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase is sufficient for the most sophisticated enzymologic measurements. For the analytical use of these enzymes, however, the purity achieved after HIC is satisfactory. I t was shown that the enzyme preparations only purified by ammonium sulphate fractionation and HIC were applicable for the determination of aminotransferases activities in blood sera and other materials. They contained negligible aminotransferases activities — when the required amounts of partially purified dehydrogenases were added into the reaction mixtures for aspartate aminotransferase and alanine aminotranferase activity determination, the blank values of these activities represented less than 10% of their values found in normal (reference) human blood sera [19, 20].

Purification and Application of Ceruloplasmin and Diamine Oxidase These two copper containing oxidases are oxygen-dependent enzymes, the first one is typical for mammalian blood, the second enzyme occurs mainly in plant tissues [25, 26]. Ceruloplasmin oxidizes aminophenols and aromatic diamines [25], diamine oxidase acts specifically on aliphatic diamines [26]. These enzymes can also be used in analytical biochemistry, especially for the construction of enzyme sensors. For this purpose, these enzymes are immobilized in enzyme-containing membranes coating oxygen sensitive electrodes and serve for a specific amperometric determination of their substrates in biological materials. The high performance purification of these enzymes started with partially purified samples [25, 26]. Crude ceruloplasmin was fractionated with ammonium sulphate from porcine blood plasma and further purified by a large-scale chromatography on a DEAE-cellulose column [25], Diamine oxidase from pea seedlings was partially purified using the described treatment with rivanol and heat [26]. As initial high performance chromatographic steps the separations on a Ultropac TSK 3000 SWG column (LKB, Sweden) was chosen. This preparative molecular sieve (GPC) column (22 X 600 mm i. d.) is suitable for the separation of proteins according to their molecular weights, its capacity being approx. 100 mg of proteins in a single run [27]. The resolution attained with this silica-based material is very good and surpasses t h a t of Sephadex or Ultrogel, its only disadvantage is its limited stability in alkaline media. The purifications of the crude preparations of both oxidases on this column were outstanding, the eluted enzymes were immediately suitable for the final high performance ion exchange

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KovÄft, J., High Performance Liquid Chromatography

chromatography (salts and other contaminants with molecular weights differing from those of these enzymes were completely removed [28, 29]). The last step, i. e. the ion exchange chromatography, was different in the case of ceruloplasmin and diamine oxidase. It was selected according to the isoelectric points of these enzymes. The value for isoelectric point of ceruloplasmin is below 7, whereas diamine oxidase has its isoelectric point in a slightly alkaline pH range [29]. The final chromatographic steps using the separations on Mono Q and Mono S columns, respectively, yielded homogeneous enzymes with high specific activities, the recoveries being quite good (cf. Table 2). The purified enzymes could be used for either exact enzymological measurements [29] or for the immobilization in the membranes coating oxygen sensitive electrodes serving for the determination of aminophenols, i aromatic and aliphatic diamines as well as of other compounds (cf. refs. [25, 26]). Tab. 2. Purification of ceruloplasmin and diamine oxidase using high performance liquid chromatography Enzyme

Specific activity in units per milligram of protein (Yield in each step in per cent) Starting material

After molecular sieve 3

After ionex chromatography

Ceruloplasmin

0.21 1

0.65 (85)

1.25 4 (89)

Diamine oxidase

1.82

9.5 (84)

45 5 (86)

1

2 3

Starting material : crude preparation from porcine blood plasma obtained with ammonium sulphate fractionation and marco-scale chromatography on DEAE-cellulose. Starting material : crude preparation from pea seedlings after the treatment with rivanol and heat. Column: Ultropac TSK 3000 SWG, 4 Column: Mono Q, 6 Column: Mono S.

Purification and Biotechnological Application of Alcohol Dehydrogenase Two materials serve for the preparation of commercially available alcohol dehydrogenases, these enzymes are currently prepared from either yeasts or horse liver [30]. Alcohol dehydrogenase can be used in analytical biochemistry (e. g. for the determination of blood alcohol [31] or of NAD and NADH) as well as in preparative biochemistry, e. g. in enzyme reactors [32, 33]. In the latter case, the enzyme is immobilized to a suitable carrier and can be applied for a stereospecific reduction of some compounds with oxo groups or for the production of NADH from NAD. High performance chromatographic purification of yeast alcohol dehydrogenase started from the material which was partially purified with ammonium sulphate fractionation and crystallization from a (NH 4 ) 2 S0 4 solution [34]. Chromatofocusing on a Mono P column (5 X 200 mm i. d., Pharmacia) was found to be very suitable as the main chromatographic step in the purification of this enzyme [34]. Chromatofocusing, a relatively new technique for protein separation, was first described by S L U Y T E E M A N in 1976 (ref. [35]). It separates proteins on the basis of their charge differences close to their isoelectric points. Mono P operates on the same principle, but using the high performance MonoBead medium results in an essentially shorter separation time (approx. 30 minutes) and higher resolution than the conventional chromatofocusing materials [36]. Using the separation on a Mono P column, alcohol dehydrogenase was obtained as nearly homogeneous main isoenzyme [34]. More than 100 mg of the crude sample could be separated in repeated runs in

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A c t a Biotechnol. 8 (1988) 1

approx. two hours. Entirely pure enzyme was obtained using a subsequent molecular sieve chromatography on an Ultropac T S K 3000 SW column (7.5 x 600 mm i.d., an analytical variant of the above-mentioned 3000 SWG column, with approx. 10 mg of proteins loading capacity) [34], The results of the semi-preparative purification of alcohol dehydrogenase are shown in Table 3. The purified enzyme was tested successfully in the assay for blood ethanol and it was immobilized to several carriers. It was possible to bind alcohol dehydrogenase to several supports, the most convenient material was Sepharose activated with cyanogen bromide or various derivatives of Spheron. The details on the immobilization of alcohol dehydrogenase are given in refs. [33, 38]. Immobilized alcohol dehydrogenase found its application in biotechnology, it could be used in a column system for the production of N A D H from NAD. N A D is commercially available at essentially lower prices than NADH, the oxidized coenzyme can be prepared from yeasts in large quantities. The reduced nicotineadenine dinucleotide is a substantial T a b . 3 Purification of y e a s t alcohol dehydrogenase by means of high performance liquid chromatography Fraction

Protein [mg]

Specific activity [units/mg protein]

Yield in each step [%]

First crystals 1 After chromatofocusing 2 After molecular sieve 3

150 25 9

27 160 395

49 90 88

1

2 3

This material was obtained after a m m o n i u m sulphate precipitation and crystallization of the e x t r a c t from baker's yeast. Column: Mono P, Column: Ultropac T S K 3 0 0 0 SW.

component of many assays for enzymes and metabolites in clinical biochemistry and in other branches of analytical biochemistry [39]. The proposed system consisted of three columns: the first column contained a carrier with immobilized alcohol dehydrogenase, the second column was packed with a modified Spheron containing reactive hydrazide groups and the third column contained an anion exchanger (e.g. D E A E cellulose or DEAE-Spheron) [32, 33]. This system was used at a laboratory scale (the dimensions of the columns were in the range of 10—15 times 50—80 mm). The reaction mixture (10—40 ml) contained a relatively large amount of ethanol (its concentration was approx. 0.1 mol/1, higher concentrations cause an inhibition of alcohol dehydrogenase) and of N A D (3—5 mmol/1). This solution was passed several times through the above-mentioned system of three columns, a photometer with a flow-through cell was placed between the first and the second column. The reaction, i.e. the conversion of N A D to NADH, proceeded during the passage of the solution through the first column with the immobilized enzyme. The p H value of the reaction mixture was approx. 9 (using a buffer with a low ionic strength), higher p H values are favourable as for the conversion of NAD to NADH, however, they cause a non-negligible degradation of the coenzyme. The amount of the reduced coenzyme formed in each cycle was analyzed photometrically at 340 nm. This analysis showed that the NAD - > N A D H conversion in a single passage was approx. 25%. The second column served for the binding of acetaldehyde (the second product of the enzymatic reaction), the removal of this compound from the reaction mixture was nearly complete. The third column was able to bind practically all N A D H formed and a negligible amount of NAD under the condi-

KovÄft J . , High Performance Liquid Chromatography

109

tions of the experiment. The reaction mixture eluted from the third column only contained NAD and ethanol (in decreased concentrations), the reaction products were absent. The described process could be recycled and the reaction mixture could be again applied to the above-mentioned system of three columns. The whole procedure was repeated several times until a sufficient NAD - » NADH conversion (approx. 70%) was attained. The third column was then removed, washed with water and the reaction product (NADH) was eluted with a concentrated salt solution (the use of NH 4 HC0 3 was preferable since this salt could be removed from the reaction product by freeze-drying). The obtained N A D H was chromatographically pure and convenient for usual enzymatic assays requiring this reduced coenzyme. The first column with immobilized alcohol dehydrogenase could be used repeatedly (up to 50 cycles were possible without any substantial deterioration of its properties), the second column with a carrier containing hydrazide groups could be regenerated by washing with an acid which removed the bound acetaldehyde, the third column (anion exchanger) could be easily regenerated by usual methods and again equilibrated with the starting buffer for the use in new working cycles. The details on this biotechnological procedure for the preparation of N A D H from N A D are described in refs. [32, 33]. Received December 19, 1986

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Book Review Downstream Processing in Biotechnology Recovery and Purification ol Bioproducts EFB-Working Party F r a n k f u r t am Main, D, 1986 Herausgegeben von D. BEHRENS, Dechema, F r a n k f u r t am Main 1986, 77 S., 30,— DM

Die Einführung moderner Technologien der Aufarbeitung von Bioprodukten ist von entscheidender Bedeutung f ü r die weitere Entwicklung der Biotechnologie. Dieser Anspruch wird in konzentriertester Form in der vorliegenden Dechema-Ausgabe als Ergebnis einer Beratung international anerkannter Experten ausgewiesen. Die persönliche Handschrift der im einzelnen nicht namentlich genannten Spezialisten ist bei der Darstellung und Einschätzung der wesentlichsten derzeit im Einsatz bzw. in der Entwicklung befindlichen Methoden vielfach nicht zu übersehen. Von besonderer Bedeutung sind die am Schluß jeden Kapitels gegebenen Entwicklungstendenzen und Empfehlungen. Die von den Herausgebern gewollte Begrenzung der inhaltlichen Aussage ist offensichtlich — es handelt sich nicht um ein wissenschaftliches Nachschlagewerk f ü r biotechnologische Aufarbeitungs- bzw. Rückführprozesse insbesondere f ü r Produktsynthesen — sondern um eine Entscheidungshilfe f ü r die Aufnahm© von innovationsorientierten Forschungs- und Entwicklungsarbeiten, Investionsvorbereitungen und f ü r den Aufbau von Kooperationsbeziehungen zwischen Wissenschaft und Industrie. Der potentielle Interessentenkreis ist damit breit gefächert, eine sorgfältige Durcharbeitung f ü r auf diesem Gebiet direkt oder indirekt Tätigen sehr zu empfehlen. D . BECK

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Book Review Downstream Processing in Biotechnology Recovery and Purification ol Bioproducts EFB-Working Party F r a n k f u r t am Main, D, 1986 Herausgegeben von D. BEHRENS, Dechema, F r a n k f u r t am Main 1986, 77 S., 30,— DM

Die Einführung moderner Technologien der Aufarbeitung von Bioprodukten ist von entscheidender Bedeutung f ü r die weitere Entwicklung der Biotechnologie. Dieser Anspruch wird in konzentriertester Form in der vorliegenden Dechema-Ausgabe als Ergebnis einer Beratung international anerkannter Experten ausgewiesen. Die persönliche Handschrift der im einzelnen nicht namentlich genannten Spezialisten ist bei der Darstellung und Einschätzung der wesentlichsten derzeit im Einsatz bzw. in der Entwicklung befindlichen Methoden vielfach nicht zu übersehen. Von besonderer Bedeutung sind die am Schluß jeden Kapitels gegebenen Entwicklungstendenzen und Empfehlungen. Die von den Herausgebern gewollte Begrenzung der inhaltlichen Aussage ist offensichtlich — es handelt sich nicht um ein wissenschaftliches Nachschlagewerk f ü r biotechnologische Aufarbeitungs- bzw. Rückführprozesse insbesondere f ü r Produktsynthesen — sondern um eine Entscheidungshilfe f ü r die Aufnahm© von innovationsorientierten Forschungs- und Entwicklungsarbeiten, Investionsvorbereitungen und f ü r den Aufbau von Kooperationsbeziehungen zwischen Wissenschaft und Industrie. Der potentielle Interessentenkreis ist damit breit gefächert, eine sorgfältige Durcharbeitung f ü r auf diesem Gebiet direkt oder indirekt Tätigen sehr zu empfehlen. D . BECK

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Book Review A. S.

MUJUMDAR

Drying '86 Vol. 1 and 2 Proceedings of the Fifth International Symposium on Drying held on the Campus of the Massachusetts Institute of Technology, Cambridge MA, Aug. 13—15, 1986 Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag, 1986, 920 S., 100 Abb., 3 5 8 , - DM

The significant growth in Research and Development activity related to drying and dewatering in the past decade was no doubt triggered by the energy crunch and the rising cost of energy. The recent fall in the world price of oil will not soften the industrial as well as academic interest in drying and dewatering technologies, because developments are not always motivated by energy considerations alone but also by needs related to increased productivity, better product quality, safer and environmentally superior operations new products and processes. The contents of these both volumes show us a wide range of all aspects, fundamental as well as applied, of drying of solids. The authors represent most parts of the world. Publication of these processings will contribute to rapid information, in a multidisciplinary and inter-industry scientific and engineering matter. Even it will favour as a positive outcome an subsequent collaboration between disciplines and various industries facing important drying problems. In the following is given a look at the main topics of both volumes: — drying theory and modelling — spray draying; superheated steam drying — drying of granular materials, paper and products, foodstuffs, biomaterials, agricultural products and grains — industrial drying systems and novel dryers — use of solar energy in drying — measurement and control of humidity and moisture — dewatering W . BECHSTEDT

Acta Biotechnol. 8 (1988) 1, 112

Book Review G.

W . H O F F M A N N U. T . H R A B A

(Herausg.)

Immunology and Epidemiology Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer Verlag 1985, 242 S. D M 3 6 . -

Band 65 der Reihe Lecture Notes in Biomathematics (Herausgeber: S. LEVIN) enthält eine Auswahl von 11 Beiträgen eines internationalen Workshops, welcher vom 18. —25. Februar 1985 in Mogilany, VR Polen, s t a t t f a n d . Das Anliegen dieser Konferenz, die Erarbeitung einer Übersicht zum Stand der Einbeziehung mathematischer Methoden in die Immunologie, wurde durch die Publikation der aktuellsten Beiträge nachträglich weiter aufgewertet. Am Anfang geben die Herausgeber einen Überblick über die Struktur der mathematischen Immunologie. Teil 2 behandelt die mathematische Modellierung der Regulatiom der I m m u n a n t w o r t , insbesondere die T-Zell-Spezifität, Proliferationskontrolle und immunologische Toleranz. G. W. HOFFMANN und M. CHOW stellen ihr neues Konzept der 2. Symmetrie des Immunsystems vor, diskutieren die Bedeutung f ü r die Transplantationsimmunologie und als Beitrag zum Verständnis des I-J-,.Paradoxons". Mit einer weiterentwickelten mathematischen Modellierung der antiviralen I m m u n a n t w o r t , stochastischen Modellen des Tumor Escape und einem dynamischen Modell von Makrophagen-T-ZellInteraktionen im Falle der Tumorabwehr befassen sich die Beisräge im 3. Teil. Es folgen modellierte Betrachtungen, mit welchen Möglichkeiten der Kontrolle parasitärer Wurmerkrankungen, Vaccinisierungsstrategien gegen Infektionen im Kindesalter in geburtenreichen Ländern und Risikofaktoren in heterogenen Populationen abgewogen werden können. Die letzten Beiträge befassen sich mit der Modellierung der Zirkulation und der Analyse der Migration von Lymphozyten, einem Computerprogramm f ü r die Bewertung eines Liquid Phase Radioimmunoassays zur Bestimmung von Immunkomplexen im Serum und der Anwendung mathematischer Modelle zur Bewertung elektrophysiologischer Prozesse an Membranen von Makrophagen. Das Buch trägt den Charakter von Proceedings und stellt damit keine in sich geschlossene Behandlung eines Wissensgebietes dar. Es demonstriert aber eindrucksvoll und überzeugend die Leistungsfähigkeit der Mathematik f ü r die Modellierung komplizierter immunologischer und epidemiologischer Vorgänge als Grundlage des theoretischen Verständnisses und zur rechentechnischen Aufbereitung der verschiedenen Ebenen der immunologischen Regulation. Mit dieser besonderen Auszeichnung ist es sowohl f ü r theoretische als auch klinische Immunologen, Epidemiologen, Biomathematiker und interessierte Studenten der genannten Fachrichtungen als kreative, anregende Loktüre zu werten. H . - D . GRIMMECKE

Ada Biotechnologica Volume 8

Number 1

1988

Contents GRÄFE, U.: Biotechnology of Bioactive Microbial Metabolites: an Example Illustrating the Microbial Potential of Adaptation and its Utilization (in German)

3

R. H.; ZIMMERMANN, E.; BABEL, W.: A Fad-Batch Cultivation Method for the Simultaneous Utilization of Glucose and Formate by Yeasts 21 MÜLLER,

RICHTER, K.; BECKER, U.: Effects of Temperature on Microbial Ethanol Production III. The Influence of the Temperature on the Relation existing between the Specific Ethanol Formation Rate of the Yeast Saecharomycea cereviaiae Sc 5 and the Ethanol Concentration in the Culture Medium 29 AKT*AN,

I.; IKENEBOMEH, M. J.; OBUEKWE, C. O.: Production of Ethanol from Cassava Whey 39 J.; KOLABZ, B. N.; WOJCIL, A.; WOJACZYNSKA, M.; TROcmMcztTK, A.; BLASZ-

LOBABZEWSKI,

OZYNSKA, T.: Immobilization of Fungal Peroxydase on Alkylaminated Organic and Inorganic Porous Supports 47 POBEDIMSKI, D . G . ; VINABOV, A . Y u . ; RESHETNIK, O . A . ; MINGALEEVA, Z . S h . ; GUTMAN, A. Sh.; SHISTTKTNA, L. N.: Influence of Antioxidants on the Growth of Microorganisms (in

Russian)

GRÜNDIG,

B.; BEHRENS, U.; K E R N S , G.; TIEBSCH, A.: Monitoring Microbial Product Synthesis

55

by Measurement of the Dehydrogenase Activity

71

CARL, S.: On the Time Evolution of Substrate Concentration Profiles in Spherical Enzyme Supports (in German)

77

BECK,

D.;

HEINRITZ,

H.-J.;

WORBS,

M.: Microbial Coal Deralfuration (in German) . . . .

KAHRU, A.; VILU, R.: Use of the Luciferin-Luciferase Assay of ATP for Measuring the Bacterial Growth: Application to Escherichia coli NESPÜRKOVI,

Plants

L.;

RYBOVI,

R.; JANÄÖEK, K.: Acid-Base Solar Biobattery Exploiting Water

87 93 99

KOVIB, J.: High Performance Liquid Chromatography and Biotechnologioal Application of Several Oxidoreductase 103 Book Reviews

28, 46, 54, 70, 76, 110, 111, 112

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