Acta Biotechnologica: Volume 1, Number 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112543429, 9783112543412

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1 • 1981 • Volume 1

Biitechnologica Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin Acta Biotechnologica 1 (1981) 1, 1 - 1 0 3 31007 EVP 3 0 , - M ISSN 0138-4988

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ISSN 0138 - 4988

Ada BliteduUiica Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Edited at Institute of Technical Chemistry of the Academy of Sciences of the G.D.R., Leipzig and Institute of Technical Microbiology, Berlin by M. Ringpfeil, Leipzig and G. Vetterlein, Berlin

Editorial boärd: P. Mohr, Berlin P. Moschinski, Lodz L. D. Phai, Hanoi W. Plötner, Leipzig H. Sahm, Jülich W. Scheler, Berlin R. Schulze, Kothen B. Sikyta, Prague G. K. Skrjabin, Moscow M. A. Urrutia, Havana J. E. Zajic, El Paso

1981

M. E. Beker, Riga H. W. Blanch, Berkeley S. Eukui, Kyoto H. G. Gyllenberg, Helsinki J. Hollo, Budapest M. V. Iwanow, Pushchino F. Jung, Berlin H. W. D. Katinger, Vienna K. A. Kalunjanz, Moscow J. M. Lebeault, Compiegne P. Lietz, Berlin D. Meyer, Leipzig

Volume 1

Redaction:

L. Dimter, Leipzig

Number 1

AK AD E M I E - V E R LAG

•

BERLIN

"Acta Biotechnologica" publishes reviews, original papers, short communications and reports out of the whole area of biotechnology. The journal shall promote the foundation of biotechnology as a new, homogeneous scientific field. According to biotechnology are microbial technology, biochemical technology and technology of synthesyzing and applying of bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guarenteed thereby that microbial, biochemical, chemical and physical contributions must show definitely the technological relation.

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Acta Biotechnologica Herausgeber: Institut für technische Chemie der AdW, DDR - 7050 Leipzig, Permoserstr. 15 (Direktor: Prof. Dr. Manfred Ringpfeil) und Institut für Technische Mikrobiologie DDR -1017 Berlin; Alt-Stralau 62 (Direktor: Dipl.-Ing. G. Vetterlein). Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1080 Berlin, Leipziger Straße 3—4; Fernruf: 2236221 und 2236229; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Konto-Nr.: 6836-26-20712. Redaktion: Dr. Lothar Dimter (Chefredakteur), Martina Bechstedt (Redakteur), DDR - 7050' Leipzig, Permoserstr. 15; Tel.: 6861255. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1671 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckhaus „Maxim Gorki", DDR-7400 Altenburg. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift „Acta Biotechnologica" erscheint jährlich in einem Band mit 4 Heften. Bezugspreis eines Bandes 120,— M zuzüglich Versandspesen; Preis je Heft 30,— M. Bestellnummer dieses Heftes: 1094/1/1. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission from the publishers. © 1981 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 42133

Acta Biotechnologica 1 (1981) 1, 3 - 8

Study of direct oxygen transfer in a submerged culture M. SOBOTKA, J . VOTEUBA, A. PROKOP Institute of Microbiology, Czechoslovak Academy of Sciences, 14220 Prague 4, Czechoslovakia

Zusammenfassung Auf der Basis der Flotationstheorie der festen Partikel wurde in der Submerskultur der Mechanismus des direkten Sauerstoffübergangs in die Zelle unter den Bedingungen gegenseitiger Beeinflussung des Mikroorganismus mit der gasförmigen und der flüssigen Phase quantifiziert.

Introduction The rate of oxygen transfer in a fermentation process plays often a crucial part in the biosynthesis of products and biomass. Our preceding studies concerned the problem of evaluation of aeration capacity kLa from data measured in industrial devices [1, 2], The processing of data from cultivations limited by oxygen at high biomass concentrations and high intensity of respiration showed that the rate of absorption obtained from the gaseous phase balance increased even though the concentration of dissolved oxygen, as measured by oxygen electrode, was practically nil. The resulting values of the aeration capacity kLa were then about double the values corresponding to the magnitude of the physical coefficient of mass transfer determined from engineering correlations. Respiration rate measured by the balance method is higher than that obtained by the dynamic method. These phenomena were observed not only during cultivations of the yeast C. utilis on ethanol, but also with the yeast C. lipolytica [3, 4], the mold A. niger [5], and may be encountered in virtually all oxygen-limited cultivations. The increase in absorption rate under the conditions of oxygen limitation is at variance with the model concept of the mechanism of oxygen transfer in fermentations. The oxygen from the gaseous phase is assumed to pass through the interface into liquid phase and to diffuse in the liquid towards the outer surface of the cell. Since the rate of absorption under the conditions of oxygen limitation rises, we may conclude that another route must exist for the transmission of oxygen between gaseous phase and the cell surface. In this connection, literature sources [6, 7, 8, 9] point to the possibility of the so-called direct transfer between gas and the cell (Fig. 1). Our study represents a quantification of this mechanism of transfer, based on the notion of the mutual interaction of the solid, liquid and gaseous phases in an aerated apparatus. One of the possibilities offering themselves for the quantification of interaction of cells with gas in a liquid medium is the use of theory of solid phase flotationThe theoretical basis of flotation have been developed for devices destined ore enrich. 1*

4

M. SOBOTXA, J. VOTBUBA, A. PROKOP

ment, purification of waste waters from solid substrates, or for so-called suspension catalytic reactors. The basio concept rests on the description of a single bubble behaviour in a liquid where solid phase is dispersed [10, 11, 12]. The attachment of a solid particle to an air bubble has a stochastic character and the process may thus be described by a probalistic model of adsorption and desorption of a particle onto and from the surface. Microphotographs have shown that the adsorption takes place in the upper part of the bubble from where it is entrained due to a pressure difference between the bubble surface and the fluid relative to which the bubble moves at a certain velocity depending on the bubble volume. The rate of adsorption of a solid particle is thus given by the probabibility of a collision of the bubble and the particle. It is thus practically proportional to the contact time of the bubble with particles and to the concentration of liquid

^

film

liquid

Fig. 1. Oxygen transfer mechanism. I — route via liquid, 2 — route via direct uptake

solid particles, which, in the case of oxygen-limited cultivation, is rather high, e.g. for C. vtiVis culture it may be about 10% by volume at 40 g/1 biomass dry weight. The rate of desorption of the solid particle from the gaseous phase is, on the other hand, inversely proportional to the contact time of bubble with the medium, or directly proportional to the size of the bubble. The direct oxygen transfer may thus be expected to become prominent in cases when the bubble size is relatively small owing to physico-chemical factors, whereas with large bubbles possessing a considerable ascending velocity the transfer of oxygen to the cells will be predominantly via the liquid phase. The practical calculations of flotation devices and the evaluation of flotation efficiency are aided by a formula describing the so-called partition coefficient of a solid phase between a gaseous and a liquid phase; the formula was derived from the notion of the adsorption and desorption of solid particles [12]:

K

f

=

2\.j>

= 1 - exp [(fc2Xr - k,) r] ,

(1)

where XG is the amount of solids at the interface area, XT is the total concentration of solid phase, constant kx characterizes the rate of adsorption of a solid particle on the bubble and k2 describes the rate of desorption from the interface, x is the contact time between the bubble and the suspension. In the case of fermentation devices with a constant aeration rate this parameter may be approximated by the mean gas residence time in the device:

where VR is the reactor volume, VG is the gas flow rate of air, and s is the global gas hold-up. Relations (1) and (2) imply that the direct transfer will be prominent in the devices under the conditions of a high biomass concentration, high gas hold-up and a

5

Study of direct oxygen transfer

relatively small gas flow rate. This corresponds practically to devices of the columntype and to a large mechanically stirred reactors during fermentations making use, by way of substrates, of alcohols, organic acids, and other surface active substances. Theory The oxygen balance for the gaseous and liquid phase in a perfectly-mixed reactor and the growth rate may be defined by the following relationships: Growth rate: dX

= fiGKFXT + /uL{ 1 — Kf) Xt

(3)

Gas phase balance: e

PM dy2 RT dt

PMVi RTV,

yI l~2/i

— kLa

2/2 ,1 — 2/2.

y2 — 0£j —

Yx,0[iGXTKF,

(4)

where fiL is the growth rate during consumption of oxygen from liquid, ftp, is the growth rate during consumption from the gaseous phase, both functions assumed to be of the Monod-type equations, dependent on the dissolved and equilibrium oxygen concentration, respectively. Liquid phase balance: dC ~dt

=

h a

IP VH

y2

~

Gl

\ ) ~

Y x

^lXt{1 -

Kf)

•

(5)

The terms of the left-hand sides of equations (4) and (5) represent accumulation. The first right-hand term of equation (4) is the oxygen feed into the device minus the amount of oxygen leaving the device, the second term is the rate of transfer into liquid and the third term is the consumption of oxygen by cells adsorbed at the interface, i.e. consumption via direct transfer. The first term in equation (5) represents oxygen feed due to absorption, the second term stands for oxygen consumption by microorganisms dispersed in the liquid. If the flotation rate is nil, the value of KF in the model of oxygen transfer may be put equal to zero, yielding the classical model used for the transfer without a direct oxygen consumption [1, 2], Experimental conditions Fed-batch cultivation of the yeast C. utilis A-49 was performed under the same consitions as in studies 1 and 2. Discussion and results Both models, i.e. the model omitting the direct oxygen transfer (KF = 0) and the one taking into account the direct transfer, in which KF was assessed by means of equation (1), served to process the results of cultivations of C. utilis on ethanol. The measurements were performed under high biomass concentrations, where the concentration of dissolved oxygen dropped to zero. The model omitting the direct transfer, when fitted to

6

M . SOBOTKA, J . VOTRUBA, A . PROKOP

experimental data (Fig. 2), shows discrepancies in both the course of biomass concentration and the concentration of oxygen in the outlet gas. On the other hand, application of the direct transfer mode (Fig. .3) led to a very satisfactory agreement of data with all the quantities under consideration during the whole experiment. The course of calculated

t(hr) F i g . 2. T i m e course of p a r a m e t e r s — m o d e l w i t h o u t d i r e c t u p t a k e . • — o x y g e n in o u t l e t gas, o — b i o m a s s c o n c e n t r a t i o n , x

— dissolved o x y g e n

biomass concentration at the interface, XG (Fig. 3) shows the course of gradual attachment of microorganisms at the interface. Essentially, since the 6th hour of fermentation ( X T about 15 g/1), both the oxygen limitation and the XG concentration reach a plateau. The direct transfer of oxygen thus occurs during flotation throughout the interaction of the cell with the bubble or during the motion of the cell from the upper part

t(hr ) F i g . 3. T i m e course of p a r a m e t e r s — m o d e l w i t h d i r e c t u p t a k e . N o t a t i o n s a m e as in F i g . 2, XG

— biomass concentration a t the interface

to the lower part of the bubble. The results indicate that increasing biomass concentration at the interface leads to an increase in the overall rate of oxygen absorption up to the moment when the interface area is fully occupied.

7

Study of direct oxygen transfer

The calculation of the models was done with the following parameters: kLa = 300 h _ 1 (fixed value of the physical k a as derived from its dynamic measurements), Y j — g/g, K s ( 0 2 ) = 0.5 g/1 (assumed equal for both the uptake from gaseous and liquid phases). The calculation was performed on an IBM-370 computer with the aid of a system of programs BIOKIN-version 79. The parameters were evaluated by the method of adaptive identification based on the continuous gradient method ; numerical integration was carried out using/L numerically stable method [13] ensuing the numerical integration of stiff differential systems. If the aeration capacity of the device is calculated with the aid of thé model neglecting the direct transfer (on applying the dynamic method [Ref. 14]), the resulting values are always lower than those obtained by the balance method [1, 2] (k L a = 632 hr 1 ) since the rate of oxygen absorption is enhanced by the direct transfer between gas bubbles and the f'lotating microorganisms. The experimental substantiation of the model via the elementary physico-chemical event — flotation — is in progress. L

0

Nomenclature C

L

H K p

KA O T ) K k2 k

a

L

M P R t T V'

m

Ve

vR

X

G

X f

2/I 2/2 Y

xjo

Hg P L E T

dissolved oxygen concentration H E N R Y ' S gas constant partition coefficient half-saturation constant for oxygen adsorption rate constant desorption rate constant volumetric oxygen transfer coefficient molecular weight of oxygen mean pressure gas constant time absolute temperature air flow rate related to inert gas gas flow rate reactor volume biomass concentration at the interface total biomass concentration oxygen concentration in the inlet gas oxygen concentration in the outlet gas oxygen yield growth rate based oxygen in the gas phase growth rate based on oxygen in the liquid phase global gas hold-up mean gas residence time

Eingegangen: 30. 1. 1980

References [ 1 ] VOTRUBA, J . , SOBOTKA, M . , PROKOP, A . : B i o t e c h n o l . B i o e n g . 1 9 ( 1 9 7 7 ) [2]

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PROKOP, A . , VOTRUBA, J . , SOBOTKA, M . , PANOS, J . : B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 0 ( 1 9 7 8 )

[ 3 ] PROKOP, A . , SOBOTKA, M . , PANO§, J . , P E C K A , K . : F o l i a M i c r o b i o l . 1 9 ( 1 9 7 4 ) 1 2 5 .

[4] SOBOTKA, M.: PhD thesis, Institute of Microbiology, Prague, 1975.

1523.

X

8

M. SOBOTKA, J . VoTRUBA, A. PROKOP

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[12] TIKHOMIROV, V. K.: Peny. Teoriya i praktika ikh polucheniya i razrusheniya, Khimiya, Moskva, p. 113, 1975. [13] VOTRUBA, J . : Proc. 5th Symp. Computers in Chemical Engineering, KUBICEK, M., NÜMEC, J., KRIVSKY, Z. (Eds.), October 5 — 9, The High Tatras, Czechoslovakia, Dim techniky CVTS, Üsti n. L., p. 69, 1977.

[14] SOBOTKA, M., VOTRUBA, J . : Coll. Czech. Chem. Commun., 45 (1980) 2266.

Acta Biotechnologica 1 (1981) 1, 9—15

Paraffinübergang aus der Kohlenwasserstoffphase zur Hefezelle E . STICHEL, F . GLOMBITZA, U . I S K E

Akademie der Wissensehaften der DDR Institut für technische Chemie Leipzig 7010 Leipzig, Permoserstr. 15

Summary The capability of the yeast Lodderomyces elongisporus to utilize solved paraffins in fermentation brothes could be demonstrated. The growth rate of this microorganism in the case of utilization of solved paraffins is higher as the most known dates. The saturated concentrations of solved hydrocarbons in the fermentation brothes are higher as in real solvent systems. The part of the solved hydrocarbon is a function of the power input, the diameter of oil drops, the fermentation conditions and the length of the paraffin chain. The organism growth rate depends on the solved paraffin concentration in the fermentation broth. This fact is one of the reasons for the variability of the consumption coefficients by utilization of paraffins with different chain lenghts. The results confirm the assumption that the transport of the paraffins from the oil drops to the cells takes place over water soluble phase.

I. Einleitung Die Entwicklung der industriellen Proteinsynthese aus Paraffinkohlenwasserstoffen des Erdöls in den sechziger Jahren ist mit dem Versuch der Aufklärung des Paraffintransports aus der Kohlenwasserstoffphase zur Zelle verbunden. Dieses Problem hat durch die Forderung nach einer vollständigen Substratumsetzung, ausgelöst durch die Verknappung der fossilen Kohlenstoffquellen und die Entwicklung von Hochleistungsfermentoren mit großem Sauerstoffeintrag, in den siebziger Jahren an Bedeutung gewonnen. Erst die Kenntnisse der Gesetzmäßigkeiten des Paraffinüberganges bilden die Grundlage für eine gezielte Intensivierung der Raum-Zeit-Ausbeute. Die umfangreichen experimentellen und theoretischen Arbeiten führten zu keiner einheitlichen Meinung. t Die vorhandenen Vorstellungen können zu 3 Mechanismen zusammengefaßt werden: 1. Die Aufnahme der Paraffine erfolgt direkt aus dem Kohlenwasserstofftropfen [1, 2, 3]. Grundlage dafür bildet die Annahme der geringen Paraffinwasserlöslichkeit und die beobachtete Belegung der Kohlenwasserstofftropfen mit Mikroorganismen. 2. Es werden die im wäßrigen Fermentationsmedium gelösten Paraffine aufgenommen [4, 5],

10

E . STICHEL, F . GLOMBITZA, U . ISKE

3. Die Paraffine sind im wäßrigen Fermentationsmedium solubilisiert und werden von den Mikroorganismen aufgenommen [6, 7, 8, 9], Diese Systeme können dabei wie echte Lösungen oder wie Emulsionen reagieren. Eine Vielzahl von Ergebnissen deutet auf die Richtigkeit dieses Transportmechanismus. Dieser erklärt die Abhängigkeit der Zellbildungsgeschwindigkeit vom Energieeintrag und der Fermentationszeit, da die Konzentration der utilisierbaren Kohlenwasserstoffe in der Nährlösung vom Energieeintrag zur Mischung beider Phasen und den während der Fermentation gebildeten Solubilisatoren abhängig ist [10, 11, 12, 13, 14]. Die in den letzten Jahren durchgeführten Arbeiten hatten deshalb zum Ziel: — die Aufklärung des Mechanismus, der dem Transport der Kohlenwasserstoffe zur Zelle zugrunde liegt. — die Bestimmung der Konzentrationsbereiche gelöster Paraffinkohlenwasserstoffe in wäßrigen Medien — die Ableitung von Einflußfaktoren auf den Fermentationsprozeß, die sich aus dem Mechanismus ergeben. Die Arbeiten wurden mit dem Hefestamm Lodderomyces elongisporus und einem Erdöldestillat mit den Siedegrenzen 240—360 °C und 10—20 Ma-% Paraffine der Kettenlänge von 10—20 C-Atomen sowie Modellsubstraten, die aus reinen Paraffinen oder Paraffingemischen bestanden, durchgeführt.

II. Die Aufnahme der Paraffine

Um Aussagen über die Fähigkeit der Hefe zur Utilisation gelöster Paraffine zu erhalten, wurde die Trennung zwischen der Kohlenwasserstoffsättigung der Nährlösung und dem Ort der Utilisation in einer Fermentationseinrichtung durchgeführt [15]. Dazu wurde eine zellfreie Nährlösung kontinuierlich in eine mit Kohlenwasserstoffen gefüllte Extraktionskolonne gefördert. Nach dem Passieren einer Beruhigungszone zur Phasentrennung konnte eine klare, von Kohlenwasserstofftropfen freie Nährlösung erhalten und den Mikroorganismen zugeführt werden. Aus dem Kultivationsgefäß wurde die Nährlösung zellfrei abgezogen und erneut in die Extraktionskolonne eingespeist. Durch diese Experimente konnte festgestellt werden: — Die Hefen nutzen die auf diese Weise angebotenen Paraffine und vermehren sich (Abbildung 1). — Die Konzentration der zugewachsenen Hefemenge ist von der in einer Zeiteinheit zugeführten Nährlösungsmenge und der Paraffinkonzentration der Kohlenwasserstoffphase abhängig (Abbildung 1, Tabelle 1). — Die maximale Wachstumsgesclfwindigkeit liegt mit 0,6 h _ 1 über den bisher bestimmten Werten von ca. 0,33 h" 1 [16] (Abbildung 2). Sie wurde aus dem exponentiellen Teil der Wachstumskurve ermittelt, die durch ein Überschußangebot von Paraffinen durch hohe Nährlösungszufuhrgeschwindigkejten und geringe Anfangszellkonzentrationen möglich geworden ist [15]. ' — Die Konzentration der Kohlenwasserstoffe in der Nährlösung liegt über den von F R A N K S angegebenen Sättigungskonzentrationen und betrug 1—3 mg/1, obwohl die kohlenwasserstoffgesättigte Nährlösung nicht wie eine Emulsion reagierte (Tabelle 2).

Paraffinübergang aus der Kohlenwasserstoffphase

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Tabelle 1. Organismenzuwachs auf kohlenwasserstoffgesättigtem Nährmedium bei unterschiedlicher n-C 16 -Konzentration im E D und konstantem Nährlösungsangebot n-C 16 -Konzentration im E D [ % ]

20

Organismenzuwachs [mg/1]

50

0,25

100

0,6

1,5

'21/h

/

/

11/h

/

6 7 Zeit [hl

g

/

8

/

B

u o frH ' P

ft

fi

S ® .ß 6 0 o CS N ß SJ 3 ß ^ fl

eigene Werte 10

ITO U. a. [ 3 5 ]

12

eigene Werte

6(?)

BRADLEY [ 2 7 ]

?

RIMA und STEENSMA [ 3 0 ]

12

RAUTENSTEIN U. a. [ 3 6 ]

Der Phage PZ-B (Abbildungen 4 und 5) ähnelt den virulenten Phagen S P O l [13], SP82G [14], 0 2 5 [15] und SP8 [16]. Der Kopf ist ein regelmäßiges Ikosaeder. Die Kopfhülle muß relativ kompakt sein, denn DNA-enthaltende und DNA-freie Kopfhüllen besitzen gleiche Abmessungen und gleiche Gestalt. An leeren Köpfen sind acht Capsomeren/Kante beobachtbar, woraus sich ein Capsomer-Durchmesser von ca. 6,5 nm errechnen läßt. Der Schwanz weist neben dem starren Schwanzstift („Core") eine kontraktile Hülle, die im gestreckten Zustand ein typisches Muster („cross striation") erkennen läßt, eine Halsregion mit einem ringförmigen Kragen und eine Basalplatte mit anhängenden Schwanzfäden auf.

tOQnm Abb. 3. Partikelstruktur des Bacillus subtilis-Phagen PZ-A (Schema, ohne Kopffäden)

Der Aufbau der Basalplatte ist noch nicht vollständig geklärt. Bei DNA-enthaltenden Partikeln sind nur abgespreizte und unregelmäßig gelagerte Schwanzfäden erkennbar, die eine kleine Basalplatte verdecken können. Bei Partikeln mit leeren Köpfen und kontrahierten Schwanzhüllen ist dagegen eine Doppelplatte sichtbar, deren distaler Teil von nadeiförmigen Gebilden („Spikes") überragt wird. Es ist nicht bekannt, ob während Adsorption und Kontraktion der Schwanzhülle die Doppelplatte durch ein unterschiedliches Zurückziehen von Hülle und Basalplatte entsteht sowie gleichzeitig eine regelmäßige Ausrichtung der Schwanzfäden erfolgt, deren Endabschnitte die Nadeln bilden. Denkbar wäre ein Mechanismus, der nach dem „Regenschirm-Prinzip" funktioniert.

22

R . GBUNOW, M . SCHÖNHERR, U . TAUBENECK, I . ZIMMERMANN.

Abb. 4. Elektronenmikroskopische Aufnahme des Bacillus saiii/is-Phagen PZ-B

Der Phage PZ-C (Abbildungen 6 und 7) besitzt einen oktaedrischen Kopf, der von einer relativ dünnen Membran begrenzt wird. DNA-freie Köpfe sind von unregelmäßiger Gestalt, erscheinen oft eingedellt oder geknickt. Der kontraktile Schwanz ist über eine kragenlose Halsregion mit dem Kopf verbunden. Die gestreckte Schwanzhülle besteht anscheinend aus spiralig angeordneten Untereinheiten, so daß in der Aufsicht .45—55 „Scheiben" erkennbar sind. An der Spitze des nichtkontrahierten Schwanzes sind 12 Anhänge vorhanden, die aus einem kurzen Fädchen und einer kugeligen Endstruktur auf-

Struktur von Bakteriophagen

23

Abb. 6. Elektronenmikroskopische Aufnahme des Bacillus subtilis-Phagen PZ-C

100nm

Abb. 7. Partikelstruktur des

Bacillus subtilis-Fh&gen PZ-C (Schema)

gebaut sind. Bei kontrahierten Schwänzen gibt es die schon beschriebene Doppelplatte (vgl. PZ-B). Die Anordnung der Spikes ist auf in der Abbildungsebene liegenden Basalplatten erkennbar. Dabei sind je sechs Spikes auf zwei konzentrischen Kreisen um den Schwanzstift gleichförmig und regelmäßig angeordnet. Die Partikel des Phagen PZ-F (Abbildungen 8 und 9) sind außergewöhnlich groß und von hoher Komplexität. Sie entsprechen strukturell den pseudolysogenie-hervorrufenden Bacillus subtilis-Phagen PBS1 [17], PBS2 [18], 3NT [19], 110 [19] und AR9 [20], Die Gestalt des Kopfes ist am besten mit einem 48-Flächner vereinbar, dessen Begrenzungsflächen von gleichseitigen Dreiecken gebildet werden. Der kontraktile Schwanz besitzt eine mit einem Kragen versehene Halsregion und endet in einer Basalplatte, an der neben drei helical gewundenen, relativ kompakten Fäden eine zahlenmäßig nicht näher bestimmbare Anzahl von sehr zarten Filamenten befestigt ist. Diese Struktur, die bereits von den o. g. Phagen bekannt ist, läßt vermuten, daß der primäre Adsorptionsort von PZ-F die Geißeln der Bacillus-ZeWe sind [21, 22, 23].

24

R . GBTJNOW, M . SCHÖNHERR, U . TAUBENECK, I . ZIMMERMANN

Abb. 8. Elektronenmikroskopische Aufnahme des Bacillus subtilis-~Phagen PZ-F

Abb. 9. Partikelstruktur des Bacillus stt&iiiis-Phagen PZ-P (Schema)

Induzierbare Phagenpartikel aus nichtinfizierten

Bacillus-Zellen

Nach Infektion mit PZ-F konnten häufig DNA-freie Phagenpartikel („ghosts") beobachtet werden, die PI-1 (Abbildungen 10 und 11) genannt wurden. An den oktaedrischen Kopf (90 X 85 nm) schließt ein bemerkenswert langer (355 X 8 nm), flexibler Schwanz an, der in einer 25 nm breiten Basaltplatte endet. An dieser sind insgesamt fünf Spikes befestigt, von denen sich der Zentralspike von den vier randständigen Spikes (25 nm lang) durch seine Größe unterscheidet. Nach Induktion mit Mitomycin C sind fast immer einzelne Bestandteile von Phagenpartikeln (Kopfhüllen, komplette Schwänze, Schwanzhüllen, Basalplatten) zu beobachten. Daneben konnten zwei Partikeltypen gefunden werden.

Struktur von Bakteriophagen

25

Abb. 10. Elektronenmikroskopische Aufnahme von Ghosts des Bacillus subtilis-~Ph&gen PI-1

Der Phage PI-2 (Abbildungen 12 und 13) verfügt über einen ikosaedrischen Kopf, dessen Umriß ein regelmäßiges Hexagon (Kantenlänge 60 nm) dargestellt. Der hüllenlöse, flexible Schwanz (Länge 290 nm) endet in einer ca. 20 nm breiten Basalplatte, an der acht Spikes zu finden sind. Phagenpartikel mit ähnlicher Struktur und ähnlichen Dimensionen wurden von THORNE und KOWALSKI [24] für Bacillus licheniformis beschrieben. Der Phage PI-3 (Abbildungen 14 und 15) entspricht strukturell den Partikeln der seit langem gut bekannten Gruppe der „defektiven Phagen" oder „Killer-Partikel" [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Der hexagonale Umriß des Kopfes weist eine Kantenlänge von 25 nm

26

R . GRUNOW, M . SCHÖNHERR, U . T A U B E N E C K , I . ZIMMERMANN

100 nm

Abb. 12. Elektronenmikroskopische Aufnahme des temperenten Bacillus subtUis-Vhagen PI-2 Abb. 13. Struktur des temperenten Bacillus subtilis-Phagen PI-2 (Schema)

100nrn

Abb. 14. Elektronenmikroskopische Aufnahme des defektiven Bacillus subtilis-Phagen PI-3

Abb. 15. Struktur des defektiven Bacillus subtilis-Phagen PI-3 (Schema)

auf. Der kontraktile Schwanz ist 210—220 nm lang und beginnt mit einer kragenlosen Halzregion (ca. 12 nm lang). Eine Basalplattenstruktur ist nicht erkennbar, wohl aber sind im kontrahierten Zustand 7—8 Spikes auffindbar, die unmittelbare Fortsätze der Schwanzhülle zu sein scheinen.

Struktur von Bakteriophagen

27

Diskussion Die Phagenpartikel, die als Infektionen aus Fermentationsansätzen isoliert werden konnten, differieren stark in den Abmessungen und in der Struktur. Sie gehören damit unterschiedlichen Gruppen von Bacillus-Vh&geii an, die von H E M P H I L L und W H I T E L E Y [2] unterschieden werden. Von Interesse ist, daß nicht nur Partikel, die dem bekannten Prototyp eines virulenten Phagen am ehesten entsprechen (z. B. PZ-B), als virulent auftreten können. Das können auch solche großen und komplex aufgebauten Partikel (z. B. PZ-F), die als Vertreter von generalisiert transduzierenden Phagen zur Genkartierung benutzt werden [32, 33]. Von besonderer Bedeutung scheinen die 029-ähnlichen Phagen (z. B. PZ-A und PZ-E) zu sein, die wegen ihrer geringen Dimensionen und ihres niedrigen Gesamtgewichts besonders geeignet sind, in Fermentationsanlagen eindringen zu können. Praktische Konsequenzen ergeben sich für die Auslegung von Membran-Filtrationseinrichtungen, die zur Sterilisation in Erwägung gezogen werden können und deren Porenweiten den Dimensionen von potentiell virulenten Phagen angepaßt sein müssen. Ein Größenvergleich zwischen ausgewählten Bacillus svbtilis-Phagen ist als Schema in Abb. 16 versucht.

Abb. 16. Größenvergleich, verschiedener Phagen von Bacillus subtilis (Schema) virulente Phagen 6 SPOl 7 SP8 8 PZ-B 9 029, PZ-A, PZ-E 10 PZ-C 11 SP50 pseudotemperente Phagen 1 AR-9 2 SP15 3 PBS1, PZ-F 4 3 NT 5 110 11 SPIO temperente Phagen 12 SPß 14 SP02, (PI-2) 15 0105 defektive Phagen 16 PBSX, PI-3

28

R . GRUNOW, M . SCHÖNHERR, U . TATJBUNECK, I . ZIMMERMANN

Welche Gefahrenquelle die bei Bacillen intrazellulär weit verbreiteten inkompletten Phagengenome darstellen, läßt sieh schwer beurteilen. Über Möglichkeiten, daß ihre Genome Rekombinationspartner für die Genome anderer infizierender Phagen sein können, läßt sich nur spekulieren. Bedeutsamer scheint jedoch zu sein, daß geringe Infektionsquoten mit anderen Bacillen, die als Substratkonkurrenten des Produktionsstammes zahlenmäßig vielleicht vernachlässigbar wären, dann ein größeres Ausmaß erreichen können, wenn solche nichtvermehrungsfähigen Teilchen als „Killer-Partikel" volle Aktivität entfalten. Für die räumliche Struktur der Phagenköpfe erscheinen zwei Parameter wesentlich. Einer ist der Füllungsgrad des Kopfinnenlumens, der vom Molekulargewicht und von der Packungsdichte (im nativen Partikel) des enthaltenen DNA-Moleküls determiniert wird. Der andere Parameter ist die Flexibilität der Kopfmembran, die vom chemischen und strukturellen Aufbau abhängt und durch die relative Stärke (im Vergleich zum Kopfdurchmesser) symbolisiert wird. Folgt man diesen Überlegungen, so wird der zur Elektronenmikroskopie vorbereitete Kopf um so eher die Gestalt eines einfacheren geometrischen Körpers annehmen, je geringer das Molekulargewicht bzw. die Packungsdichte des DNA-Moleküls und je größer die Flexibilität der Kopfmembran, ausgedrückt durch die Membranstärke, sind. Bei einem Vergleich der in Tabelle 1 gemachten Angaben und der Voraussetzung, daß die Köpfe nativer Phagenpartikel Kugelform haben, erscheint die Annahme folgender Reihenfolge vernünftig, deren Bestätigung jedoch weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben muß: PZ-F > PZ-A > PZ-B > PZ-C 48-Flächner > Ikositetraeder > Ikosaeder > Oktaeder Eingegangen: 1. 4. 1980

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Acta Biotechnologica 1 (1981) 1, 31—40

Production of Xylanase by Streptomyces xylophagus nov. sp. S . K I S H E N TANGNU, H . W . BLANCH, CH. R . W I L K E

Department of Chemical Engineering and Lawrence Berkeley Laboratory, University of California, Berkeley, California 94720

Zusammenfassung Die Xylanaseproduktion durch Streptomyces xylophagus nov. sp. wurde im Schüttelkolben und in einem 14-Liter-Laborfermentor in diskontinuierlicher und in kontinuierlicher Kultur untersucht. Die maximale Enzymausbeute wurde auf l%igem handelsüblichen Xylanmedium bei 30 °C durch 7,5%ige Überimpfung einer 5 Tage alten Xylankultur erreicht, wobei dem Medium im Schüttelkolben 0 , 8 % und dem Submersfermentor 0 , 3 % Bactopepton zugesetzt wurden. Die maximale Xylanaseproduktion wurde bei pH 7,4 erreicht. Eine Hitzbehandlung bis zu 200 °C wirkte sich nicht hemmend auf die Xylanaseproduktion aus. Die Gleichgewichtsparameter für di^ Zellmasse, lösliches Protein und die Xylanaseaktivität wurden in Abhängigkeit der Verdünnungsraten von 0,02 bis 0,04 h - 1 bestimmt, wobei Xylan (wood gum xylan) als Kohlenstoffquelle diente. Die maximale Enzymaktivität und Produktivität von 7,2 X.U. (1 xylanase unit, X.U. -A- 1 mg reduzierter Zucker, der aus 1 ml Enzym in 15 Minuten bei 50°C gebildet wird) und 0,194 X.U./h wurden bei einer Verdünnungsrate von 0,027 h- 1 beobachtet. Die maximale Zellkonzentration und Produktivität von 7,2 g/1 und 0,245 g/lh wurden bei einer Verdünnungsrate von 0,34 h _ 1 beobachtet.

Summary Xylanase production by Streptomyces xylophagus nov. sp. was studied in shake flask and in a 14-liter laboratory fermentor in batch and in continuous culture. The maximum yield of enzyme on 1 % commercial xylan at 30°C was attained using a 7 . 5 % inoculum of a 5-day old xylan culture including 0.8 and 0 . 3 % bactopeptone in the medium in shake flask and submerged fermentations, respectively. A pH of 7.4 was optimum for maximum xylanase production. Heat treatment of xylan up to 200 °C was found not to be inhibitory for xylanase production. Steady-state values of cell mass, soluble protein and xylanase activity were determined over a range of dilution rates from 0.02 to 0.04 hr - 1 using wood gum xylan as a carbon source. Maximum enzyme activity and productivity of 7.2 X.U. (1 xylanase unit, X.U. A 1 mg of reducing sugar produced from 1 ml of an enzyme in 15 minutes at 50 °C) and 0.194, X.U. hr - 1 were observed at a dilution rate of 0.027 hr - 1 . Maximum cell concentrations and productivity of 7.2 g • l - 1 and 0.245 g • I - 1 hr - 1 were observed at a dilution rate of 0.034 hr - 1 .

Introduction The utilization of biomass to provide a source of liquid fuels, such as ethanol, requires the conversion of all available sugars to ethanol. As most agricultural waste and woods contain 15—30% hemicellulose in the form of pentose polymers, it is clear that their

32

S. KISHEN TANGNIT, H. W. BLANCH:, Ca. R. WILKE

depolymerization and subsequent fermentation is necessary to develop economical use of biomass. This depolymerization ni^y be affected by mild acid hydrolysis or enzymatic hydrolysis. Acid hydrolysis may result in the formation of pentose degradation products, and involves later neutralization of the acid solution. For these reasons an enzymatic hydrolysis is preferable. The predominant pentose, xylose, so formed finds application in foods or confectionary, as an auxiliary agent in the treatment of diabetes, and may be converted to alcohol, 1,4 butanediol or acetic acids. Various molds, such as Aspergillus foetidus [1], Asp. oryzae [2], Fusarium oxysporum [3], Trichoderma viride [4] and Chaetomium trilaterale [5] have been reported as sources of xylanases. Some of these xylanases are reported to hydrolyze xylan to xylose, while other hydrolyze only xylobiose or xylooligosaccharides.

Materials and Methods Microorganism

and Stock Culture

Streptomyces xylophagus nov. sp selected as a xylanase producing bacterium was uséd. This strain was kindly supplied by Professor H . IIZUKA at the Science University of Tokyo, Tokyo. Stock cultures were maintained on an agar-solidified mineral salts medium (Table 1) containing larchwood xylan (0.5%). Table 1. Xylanase Production Medium [6] Constituents

Concentration (g • l - 1 )

xylan KaHPO« MgS0 4 • 7 H 2 0 KC1 FeSOj Bacto-peptone Tap water

10 1 0.05 0.1 0.01 0.3—0.18 to 1 liter

Medium The xylanase production medium (Table 1) was the medium of IIZUKA and KAWAMINAMI [6]. The medium was autoclaved at 218 °C for 30 minutes to 1 hour depending upon the liquid volume. The inoculum was prepared by seeding 200 ml of fermentation medium with organism in 500 ml shaking flasks. This culture was incubated for 5 days at 30 °C on an oribital shaker at 210 rpm and then added as inoculum (7.5% by volume) to the production vessel. Fermentor A standard 14-liter (New Brunswick) fermentor assembly provided with pH, temperature, agitation, dissolved oxygen and antifoam monitoring and control accessories was used for batch and continuous fermentation.

Production of Xylanase

33

Analytical Xylanase

Activity

0.1 ml of enzyme solution (fermentation broth) was mixed with 0.5 ml (0.5%) xylan and incubated at 55 °C for exactly 15 minutes. The reaction was stopped with the addition of 1.5 ml of DNS reagent and equivalent reducing sugar concentration was converted to total mg produced by 1 ml of the enzyme and recorded as the xylanase activity. Soluble

Protein

Protein was determined without precipitation using folin copper reagent described by L AW R Y

[7].

Xylan The larchwood xylan used as substrate for the assay of xylanase activity was purchased from Sigma Chemicals. Prior to use, the xylan was subjected to the following treatment. A 1% suspension of xylan in de-ionized water was steamed for 10 minutes at 228 °C. After cooling the suspension to room temperature, insoluble matter was removed by centrifugatior> followed by filtration. To precipitate xylan, 125 ml of ethyl alcohol were added to 100 ml of filtrate. The precipitate was collected by centrifugation, followed by evaporation of residual alcohol in a water bath, and lyophilized under vacuum to obtain purified xylan. The purified xylan was stored as 1.0% xylan in a mixture of 0.17 M K H 2 P 0 4 and 0.388 M NaOH. Prior to use, the 1.0% xylan solution was mixed with an equal volume of 0.35 M HC1, which had been calibrated so that the mixture of equal volumes produced a solution containing 0.5% xylan in 0.086 M phosphate buffer at pH 6.25. Continuous

Fermentation

A 14-liter fermentor with an operating volume of 10 liters was equipped with medium storage and product tanks. A volume of inoculum equal to 7.5% of the working volume of the fermentor was added and then allowed to grow as batch culture for 4 days to permit initial cell growth and enzyme production. After 4 days the feed of the fresh medium into the fermentor was started employing finger pumps (Sigma Motors), attached to the calibrated timer. A similar pumping arrangement was provided at the exit end of the fermentor to allow the homogeneous suspension of cells in broth to flow out without any clogging. The temperature of cultivation was maintained at 30° and the pH was automatically controlled at 7.4 by the addition of 2 N NaOH or 2N H 4 S0 4 . The dissolved oxygen was automatically controlled at a level greater than 40% of the saturation value for the medium, by varying the agitation rates in response to changes in the dissolved oxygen. In most cases "one-sided control" was used. Results and discussion Culture Streptomyces xylophagus nov. sp. grows rapidly on simple media and has no special need for growth factors. In shake flasks, it grows in pellet form, being very fine and largest being about 1 mm in diameter. As pellets grow, the color of the broth changes from 3

Acta Biotechnol., Bd. 1, H. 1

34

S. KISHEN TANGNU, H . W . BLANCH

CH. R . W I L K E

milky white to brown. Before sterilization of the medium, the p H of the broth was adjusted to 4.0. Temperature was kept at 30 °C and 1% commercial larchwood xylan was used unless otherwise mentioned. Shake Flask Studies {Temp. 30°C) Heat Treatment of Xylan Commerical larchwood xylan was subjected to dry heat treatment for 40 minutes at various constant temperatures (50 to 200 °C). The objective was to find the effect of heat treatment on xylanase activity, soluble protein and dry weight. Up to 200 °C, heat treatment of xylan before the sterilization appeared not to be inhibitory to xylanase biosynthesis. Bacto-peptone Concentration Two concentrations (0.3% and 0.8%) of bacto-peptone were used in order to study their effect on xylanase biosynthesis. Wood gum xylan seemed to show higher xylanase activity in both the experiments. The xylanase activity attained within 3 days (Fig. 1) of fermentation with 0.8% bacto-peptone was greater than that obtained after 5 days with 0.3% bacto-peptone (Fig. 2). Bacto-peptone concentration or pH, or both, can be the controlling factor.

0

1 1

2

1 days

3

1

1

4 - 5

Fig. 1. Time course of batch shake flask fermentations using 1% xylan and 0.8% bacto-peptone

Wheat Bran Concentration Thoroughly washed wheat bran (3.5% and 7.0%) was taken as the substitute for commercial xylan. The xylanase activity attained after 5 days with 3.5% wheat bran was not significantly different to that obtained using 7.0%. The reason for low activity with 7% substrate may be because of oxygen transfer limitations, or enzyme deactivation by adsorption on the surface of the wheat bran.

35

Production of Xylanase

Soluble Xylan 1% commercial wood gum xylan was autoclaved for 15 minutes at 121 °C in tap water. After cooling to room temperature, insoluble matter was removed and the soluble xylan retained for further studies. There was no increase in enzyme activity after 48 hours of fermentation on the soluble fraction indicating substrate was removed as insoluble matter.

OO0 laret)wood xylan

0

1

Z

3 days

4-

5

Fig. 2. Time course of batch shake flask fermentations using 1% xylan and 0.3% bacto-peptone

Stirred Tank Fermentation Studies {Temp. 30°C) Protein Supplement The yield of xylanase in a xylan culture was reduced unless a second more readily metabolized substrate was added. Bacto-peptone was an excellent additive with an optimum concentration of 0.3% in the 1.0% xylan mixture (Figure 3). The xylanase activity attained within 5 days of fermentation with 0.8% bacto-peptone did not increase with increasing peptone additions. When the medium was devoid of peptone, there was no increase in enzyme activity, but once peptone at 0.3% (shown in Figure 3 at point " A " ) was added to the medium there was a sharp increase in activity. Effect of pH The optimal p H for xylanase production was found to be pH 7.4, although at higher pH's more soluble protein was excreted than at p H 7.4. Like variation in overall xylanase activity occurs, between pH 7.4 and p H 8.4.

36

S . K I S H E N TANQNC, H . W . BLANCH, CH. R . W I L K E

10 r

I

? 4 bado-peptone addition (3g l~1)

x T

Fig. 3. The effect of bacto-peptone concentration on xylanase biosynthesis

Wheat Bran Concentration Three levels (1.75, 3.5 and 7.0%) of the thoroughly washed wheat bran were studied at 30 °C and p H 7.4 for xylanase biosynthesis. I t was found t h a t with 3.5% concentration of wheat bran a maximum activity of 9.35 X . U within 3 days of fermentation was reached as compared to 9.2 X.U with 7%. Although the substrate concentration was

Fig. 4. Xylanase production with 1.75%, 3.5% and 7.0% washed wheat bran substrate levels

37

Production of Xylanase

increased by two-fold (1.75 to 3.5%) the xylanase activity was increased only by 1.6 units. The reason for relative small increase in activity may be attributed to oxygen transfer limitations, substrate inhibition or enzyme adsorption on the wheat bran. The batch growth curves are given in Figure 4. Operating Conditions Table 2 gives the optimum operating conditions for maximum xylanase production using Streptomyces xylophagus nov. sp. Table 2. Optimum operating conditions for xylanase production Control Variables

Values

1

pH temperature (°C) substrate conc. (g • l - 1 ) commerical xylan wheat bran (washed) Bacto-peptone (g • 1_1)

Continuous Xylanase

7.4 30 10 3

Production

Continuous fermentations at pH 7.4 and 30 °C were run at dilution rates ranging from 0.02 to 0.04 hr - 1 . The course of a typical fermentation was for 3 days as a batch and then as a continuous fermentation. Figure 5 shows the time course of a continuous fermentation at D = 0.02 hr - 1 , using 1% wood gum xylan. Xylanase activity increased up to the 8th day of fermentation and then dropped slightly and remained at a steady state value of around 6.75 X.U. In contrast to enzyme activity there was a sharp decrease in cell dry weight after two i

Ô rS-

& S:

a

i

i

batch feed at 0.02 h r

N '

I1

a

i

a £ *

i

r

*o~^___activity

O

O

celi dry wt.

y

• background

S

î

•6

solub/e • protein (ECP)

-o

i i

S

ìi

Ç

1.0

sugar

-•

4 o

6 8 10 fermentation time (days)

•

asÇ,

•

12

\ o

Fig. 5. Continuous culture of Streptomyces xylophagus at D = 0.02 hr -1 , with 1% xylan and pH 7.4

38

S . K I S H E N TANGNU, H . W . BLANCH, CH. K . W I L K E

residence times to a level between 5 and 5.5 g • l - 1 . In an analogons manner the background sugar also showed a sharp decrease in concentration and remained well below 0.4 g • l - 1 throughout the course of fermentation. There was no appreciable change in soluble protein concentratión. .-o S

'D ' increased 3sedtoU'O.OZ/hr to D '0.027Ar " '1 c • A -o / ot N ,A

1

-o

*

Ì

activity

—o —

#

T

1

o-z— o

A- — * "

cell dry wt.

o

^

background sugar • 1.0 5

t

4

•S IT

It 1

Salicin

® ®

L-Arabinose

Control

Streptomyces Isolate

isolated from

I-Inosit(

Table 2. Utilization of carbon compounds by antibiotic producing Streptomyces malted and unmalted millet

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

+

+

Discussion The rapid increase in the frequency of isolation of some molds and bacterial types from the unmalted stage to the malted stage during millet beer production (Table 1) is expected partly because of the humid conditions during malting, and partly because of the heat generated during the germination of the grains. All the fungi isolated appear to have been on the grains during harvest and storage. This points to the importance of the fungi during subsequent malting. The occurrence of these amylolytic fungi on the grains provides the enzymatic activity necessary to convert the bulk of the starch in the millet to sugars during the native production of the millet beer. It is suspected that these amylolytic fungi act together with the inherent amylase activity of the millet malts to convert the complex carbohydrates to sugars. The occurrence of amylolytic molds on cereals has been reported. WEBB [11] found that the amylolytic activities of molds on sorghum and maize produced the bulk of the sugar required for subsequent fermentation of kaffir beer. FAPABUSI et al [2] also found that most of the organisms present in sorghum malts used during burukutu production have diastatic ability to convert the carbohydrates of the germinating grains to sugars. The same workers also found several types of yeasts present in the sorghum malts including Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Candida kruskei, Hansenula anomala and Kloeckera apiculata. In contrast, the only type of yeast observed in millet malts was Saccharomyces cerevisiae (Table 1). During the production of millet beer, the mash is extracted by boiling the ground malt in water for 1,5 hr. This may partly account for the absence of fungal types in both the

46

E . J . NKANGA

fermented and aged product. If this is the total absence of the bacterial type should also occur. There are possibly two stages in which the bacteria are introduced. Firstly, they originate from the stored grains. These are killed during boiling. Secondly, they are introduced from the starter added during the fermentation and possibly the unsanitary conditions'existing after boiling. Acetobacter did not appear until during aging. This is not surprising as they utilize the ethanol to produce acetic acid and especially since they require oxygen which is not present in the fermentation tank until aging. The beer achieves a slight sour or sauerkraut taste at the end of fermentation and becomes vinegary at the end of maturation. The sauerkraut taste may be due to the presence of film yeast (such as Candida kruskei) while the vinegary taste may be due to the presence of acetic acid bacteria. There was also some turbidity produced in the beer probably due to film yeast in the presence of the lactic acid bacteria. During the production of millet beer, the cooled wort is normally uncovered for 24 hr. This would allow air-borne lactic acid bacteria into the beer, which could produce a sour at the end of fermentation. Lactobacillus was recovered in both the fermented beer 4.5 X 107/ml and the aged beer 2.4 X 107/ml. They can completely convert sugars to lactic acid and give definite sour effect. These organisms require little or no oxygen for growth, hence an ideal environment for growth already existed for it in the fermentation tank. The activities of the lactic bacteria are responsible for the drop of the pH of the native millet beer to about 3.8 after fermentation and also accounted for the bulk of the acid (0.43%) found at the end of the fermentation. Faparusi et al [2] found similar results for burukutu. The presence of antibiotic producing Streptomyces sp. on cereal malts has not been reported. Some of the Streptomyces sp. isolated from the millet were antibiotically active and all the antibiotically active ones appear, to be Streptomyces aureofaciens. They all displayed a wide spectrum of activity against most gram negative and gram positive bacteria and some fungi. Preliminary work showed that there were two antibiotics, one, a class I and the other, a class IV according to B E T I N A [10]. Future work will deal with the identification of the antibiotics. From this investigation, it appears there are two distinct stages of introduction of micro-organisms into the native millet beer during its production. The bulk of the micro-organisms carrying out the saccharolytic activity, along with the inherent millet enzymes, originated from the unmalted millet grains and were probably killed during boiling. The bulk of the micro-organisms responsible for the fermentation of the sugars to alcohol came from the introduction of the starter. However, Acetobacter did not start showing up until during maturation. They may have been introduced along with the starter but could not grow because of the limitations which existed in the fermentation tank. This agrees with the conclusions of F A P A R U S I et al [2] who also showed that the micro-organisms responsible for the maturing stage were different from the original ones on the grain during burukutu production.

Acknowledgements This work was carried out with National Biosciences support grant administered through University of Benin, Benin City, Nigeria and Oregon State University support grant in Biosciences administered through Oregon State University, Corvallis, Oregon, 97331, U.S.A. I also wish to thank President MCVICAR and Professor A . W . ANDERSON both of Oregon State University for the use of laboratory facilities of the Department of Microbiology. Eingegangen: 25. 5. 1980

Mikrobiology of 'Oyokpo'

47

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Institut für die Gärungs- und Getränkeindustrie 1017 Berlin, Alt-Stralau 54/55

Zusammenfassung Auf der Grundlage von hydrodynamischen und reaktionstechnischen Voraussetzungen wird ein dreiphasiges Stoffsystem mit mikrobieller Reaktion auf quasi-homogene Modelle zurückgeführt. Mit Hilfe der Michaelis-Menten-Kinetik werden Geschwindigkeitsgleichungen für die autokatalytische Reaktion des wachstumsverbundenen Substratabbaues hergeleitet, die sich bis auf die Monod-Kinetik zurückführen lassen. Es wird bewiesen, daß die Geschwindigkeitsgleichungen der mikrobiellen Katalyse denen der heterogenen Gaskatalyse analog sind.

Pe3ioMe Ha 0CH0Be rHApoAHHaMHiecKHx H peaKuiiOHHO-TexHHiecKiix npeflnocturoK Tpexa3HaH CHCTeMa BemecTB c MHKpoÖHOJiomiecKoft peaKiiuefi conpamaeTcn «O KBaawroMoreHHbix MOffejieü. C nOMOmbK» KHH6THKH Muxa3JlUca-MeHm3H(l BblBOHHTCH ypaBHeHHH CKOpOCTHflJIHaBTOKaTajIHTHiecKoft peaKqHH pacmenneHHH cyöcTpaTa, BusuBaeMoro POCTOM 0praHH3M0B, KOTopue MOWHO coKpaTHTb «o KHHeTHKH M0H0«a. ITpHBOflHTCH H0Ka3aTejibCTB0 Toro, HTO ypaBHeHHH CKOpOCTH MHKpo6HOJiorwqecKoro KaTajmaa aHanorHHHH ypaBHeHHHM CKOpOCTH reTeporeHHOro raaoBoro KarajiHaa.

Grundlagen zur Herleitung der kinetischen Gleichungen Mikrobiologische Prozesse sind mindestens dreiphasig. Unter nachfolgenden Voraussetzungen können sie wie quasieinphasige Prozesse behandelt werden und gestatten bei kinetischen Untersuchungen die Anwendung quasihomogener Modelle: 1. Die Strömungsform im Reaktor muß bezüglich der flüssig-festen Phase im Übergangs- oder vollturbulenten Regime liegen (Re S; 800 bzw. 22 40000) 2. Der Anteil der gasförmigen und "festen Phase ist klein und beeinflußt die Turbulenz nicht zu stark. Die flüssige Phase ist homogen verteilt 3. Gasblasen und Mikroorganismen sind klein gegenüber dem Makromaßstab der Turbulenz (dB, d z 2-Steroid-DH

„Secoketol", z. T. Skelettabbau

15, 16

Mycob. globiforme Cortisol und Riickreaktion Arth, simplex Cortisol

Prednisolon

278

Prednisolon

1,

Noe. rhodo.

Androst-1,4-dien3,17-dion

Androstendion

Mycob. globiforme Cortisol Steroid-Multi (u. a. AM-DH + 20ß-Keto-Red.)

Prednisolon + dessen 20ßHydroxyderivat

39, 84, 153, 156, 162, 163, 272, 294, 313, 316 272, 324 131

90

R . BERGER

Enzym

MO

Steroid-Multi (u. a. AM-DH)

Substrat

Produkt

Literatur

Mycob. globiforme Cortisol Cortison Cortexolon Ps. test. Cortexolon

Prednisolon Prednison A 1 ' 2 -Cortexolon A'^-Cortexolon

10, 11, 59

Steroid-Multi (u. a. A».2-DH + 3ß-Est + 3ßOxidase + 20ßKeto-Red.)

My cob.-Species Arth.-Species Noc.-Species

16a,17a-Isoproyliden-dihydroxy-pregnenolon, Pregnenolon, 3-Pregnenolonacetat, Progesteron, 16a-Methylcortexolon, 17 a-Methylandrost5-en-3,17-diol

die entspr. A1>4-3Keto-Derivate, z. T. deren 200HydroxyDerivate, z. T. Skelettabbau

12

Multi (GOD + Gluconat-DH)

Serr. marces.

Glucose

2-Keto-gIuconsäure

157, 162, 163, ;

Multi

Glue, melan.Ps. putida — Gemisch

Sorbose

2-Keto-Lgulonsäure

63, 293

90

Multi S. carlsb. (z. T. mit zusätzl. S. cer. Diacetyl-Red.) ng

kontinuierliche Bierherstellung (z. T. mit Entfernung von Diacetyl)

Multi

A. wentii (Sp.)

Stärkehydrolyse

Multi

S. uvarum S. cer. S. cer. S. carlsb. Champagnefhefe Schizos. pombe

Saccharose Saccharose Glucose Glucose Glucose Glucose + Äpfelsäure ub

Ethanol Ethanol Ethanol Ethanol Ethanol Ethanol

327 68, 107 13, 68, 125, 283 203 330 68

Ethanol

127

Molke

Milchsäure

331

Milchsäure Milchsäure Milchsäure Milchsäure

107 68 14, 68, 275 89

L. ub Arth, oxydans ng

Saccharose Glucose Äpfelsäure Nährmedium + Nikotinsäure ub ub ng

Milchsäure Milchsäure Milchsäure

172 80 330

Acet. Acet. Prop, Prop, Prop,

Malz würze Ethanol Glucose, Stärke, Lactose oder Milchsäure

Malzessig Essigsäure Essigsäure + Propionsäure + Brenztraubensäure

320 240, 313 19, 64 64 64

ub Multi- bzw. Äpfelsäure-DC

Multi

Kefir-Mischkultur Rhiz. oryzae L. delbrueckii L. casei L. arabinosus

ub ng shermanii technicum arabinosum

121, 208 121 197, 295 191

ïftimobilisierung mikrobieller Zellen

91

Enzym

MO

Substrat

Produkt

Literatur

Multi

A. niger

Saccharose

Citrat -fIsocitrat

107, 313 5 4 - 5 6 , 323

Glucose

G. lipol. (Smycop.

lipol.)

Multi

P. roqueforti (Sp.) Fettsäureoxydation, Käseherstellung Ciad, butyrì (Sp.) Aromabildung

169, 191 169

Multi

Streptoc. L. bidg.

therm.

Milch

68 68

Multi

Streptoc.

faecalis

Argininkatabolismus (Arginin Ornithin)

3, 58

Multi

Coryn. glutami Coryn. Hinim

Glucose

24, 159, 163

Multi

S. cer.

Glutamat + Glycin Glutathion + Cystein + + Ethanol Glucose + NAD + Phosphat

Multi

Umb.

Multi

C. lipol. C. tropic.

pustul.

Multi

Joghurt

Glutaminsäure

162, 313 100

Evernsäure

Orcin

26

Paraffine

Fettsäuren

65 65

(NADP

NADPH)

119

Multi (u. a. Pyridoxin5'-phosphatoxidase + Katalase)

Ps. polycolor Kloeckera — Gemisch

ub

Pyridoxin-5' phosphat

70

Multi

Brevib. artimon.

Pantothensäure oder Pantothensäurederivate + A T P + Cystein

Coenzym A

38

261

Sarcina lutea Multi

Azotobacler vinelandii

(N 2 -Fixierung aus der Luft) Acetylen Ethylen

194

Multi (Nitrit-NitratRed.-System)

Anacystis

Reduktion von Nitrit und Nitrat, z. T. bis zu N H ,

313 167, 168 13 68, 308 198 68 329, 330

Microc. denitrif. Chlorella fusca Ps. aerug. Ps. ng Hyphomicr. W. C. MO-Gemisch ni Multi

Phenobac-Bact. G. tropic.

Phenolabbau

199 48, 76, 269, 300, 333

92

R. BERGER

Enzym

M0

Substrat

Multi

Fus.

Multi

B. ub

Multi

P.

Multi

Streptoc.

Multi

solani

Produkt

Literatur

Beseitigung von CN

145, 186

Stärke-BouillonMedium

Bacitracin

103, 318

Spiculisporinsäure

207

Kulturmedium

Nisin (Malariaantibiotikum)

92

Str. griseus

Glucose

Candicidin

313

Multi

Str.

Nährlösung

107

Str. griseus

Nährlösung

Dihydrostreptomycin Streptomycin

Multi

P.

Glucose Penicillin G + Ammoniumsulfat + Phosphatpuffer + Phenylacetat Penicillin ub

spiculisporum Nährlösung mit Saccharose lactis

humidus

chrysogenum

P. notatum Multi

Serr.

B.

marces

subtilis

E. coli — P.s. dacunhae Gemisch Multi

Glucose + Harnstoff + Threonin + K2HP04; ohne Threonin Glucose + NH4C1 + Na-aspartat

+ K2HPO4

—

NH 4 -fumarat

Wasser Anacystis nidulans Anabaena cyl. Rhodosp. rubrum Malat Gl. butyr. Glucose Abwasser

107 18, 318, 32

214

L-Isoleucin

166

L-Histidin L-Arginin

166 166

L-Alanin

166

H2, 02

313

H2 H2 H2

271 119 51, 72, 81 82

Multi

Boden-Äzci. ng BOD-Wert-Bestimmung in Abwasser Gl', butyr Gl. butyr. — Abwasserreinigung, H 2 Abwasser — MO (ng) — Gemisch

69, 81 81 82

Multi

Mhod. mucilaginosa

105

Acetophenon

1-Phenyl-Ethanol

Caran-2,5-dion, Caran-2-on-5-ol, 3-Caren-2-on-5-ol, 3-Caren-5-on-2-ol 1-Acetyl-naphthalin l-(l-Naphthyl)Ethanol Androstenolon Androst-5-en-3ß,17ßdiol 3-Caren-2,5-dion

93

Immobilisierung mikrobieller Zellen Enzym

MO

Substrat

Produkt

Literatur

Multi

Leucon. oenos

Malat

Lactat

305

Multi

B. subtilis

Nährmedium

a-Amylase

318, 326

Multi

Methylomonas rubra Methylococcus therm.

Methan- bzw. EthanoXydation

292 292

Multi

Klebsiella

pnewn. N 2

Multi

Bact. ni

Methanolanalytik

309

Multi

Trichosporon brassicae

Ethanolanalytik

309

Multi

Trichosporon brassicae

Essigsäureanalytik

306

Multi

S. cer.

Nystatin (Antibiotikum)-Analytik

307

ub

Ps. aerug.

Entfernung von Schwermetallen (Pu) aus Abwasser

308, 313

ub

Mortierella vinacea

Oligosaccharidhydrolyse in Sojamilch

340

ub

P.

ub

Isoascorbinsäure

67

ub

Chlorella

ub

ub

155

cyaneofvlvum

NHJ (N a -Fixierung) 313

Literatur Bei den Patentangaben wurden die offiziellen Länderabkürzungen für Patentschriften verwendet. E.: Adv. Bioehem. Eng. 6 ( 1 9 7 7 ) 1 2 5 (Edit.: G H O S E , T , K . , F I E C H T E R , N. — Springer-Verag, Berlin— Heidelberg —New York). [ 2 ] C H I B A T A , I . , T O S A , T . : Adv. Appi. Microbiol. 2 2 ( 1 9 7 7 ) 1 (Edit.: P E R L M A N , D . - Academic Press, New York —San Francisco —London). [3] F R A N K S , N. E.: Biotechnol. Bioeng. Symp. 3 (1972) 327. [ 4 ] V I E T H , W . R . , W A N G , S . S . , S A I M , R . : Biotechnol. Bioeng. 1 5 ( 1 9 7 3 ) 5 6 5 . [ 5 ] A B B O T T , B . J . : Adv. Appi. Microbiol. 2 0 ( 1 9 7 6 ) 2 0 3 (Edit.: P E R L M A N , D . - Academic Press, New York—San Francisco—London). [ 6 ] S K R J A B I N , G. K . , K O S H C H E E N K O , K . A., S Ü R O V T S E V , V . I . : Dokl. Akad. Nauk S S S R 2 1 5 [1] JACK, T . R . , ZAJIC, J .

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Acta Biotechnologica 1 (1981) 1, 103

BOOK

REVIEW

BOHUMIL SIKYTA

„Methoden der technischen Mikrobiologie" Prag 1978, Verlag für technische Literatur (Tschech.) 328 Seiten, 174 Abbildungen, 38 Tabellen In übersichtlicher Form werden die allgemein geltenden Methoden der technischen Mikrobiologie auf dem Gebiet von Forschung und Entwicklung bei der Gewinnung von Antibiotika, Hormonen, Enzympräparaten und ähnlichen mikrobiellen Produkten beschrieben. Nach einer Einführung in das Arbeitsgebiet und seine Perspektiven befassen sich einzelne Abschnitte mit den Vorrichtungen zur Kultivierung der Mikroorganismen im Labor- und Versuchsanlagenmaßstab, den Grundlagen und technischen Möglichkeiten zur Sterilisation der Nährböden bzw. Nährmedien sowie der Luft, der Theorie und den Bestimmungsmethoden zur Belüftung bzw. Durchmischung der Substrate, der Charakterisierung der für mikrobiologische Prozesse eingesetzten Rohstoffe, Nährsalze und Hilfsstoffe, der Beschreibung der Kinetik der diskontinuierlichen und kontinuierlichen Fermentationsverfahren mit deren spezifischen Phasen und charakteristischen Parametern, der Genetik der industriell eingesetzten Mikroorganismen und den typischen Arbeitsmethoden dieses Wissenschaftsgebietes, den Möglichkeiten und Problemen bei der Ausarbeitung und den Verlauf von mikrobiellen Prozessen, der Beschreibung der erforderlichen Meßund Regeltechnik für die prozeßbestimmenden und -charakterisierenden physikalischen und chemischen Parameter (einschließlich dem Einsatz von automatischen Analysengeräten und der modernen Rechentechnik in diesen Verfahren) und den technischen Möglichkeiten zur Abtrennung der auf mikrobiologischem Wege erzeugten Produkte. Jedem dieser Abschnitte ist ein umfangreiches Verzeichnis der wichtigsten internationalen Literatur nachgestellt. Das Buch trägt durch seinen Übersichtscharakter und die Vielzahl von Abbildungen und Tabellen sowie die verständliche Formeldarstellung vor allem der Ausbildung von Studenten an Lehreinrichtungen, die sich ljiit Pharmazie, Biotechnologie, Lebensmitteltechnologie und Chemie beschäftigen, Rechnung. Es ist jedoch ebenso für Praktiker in der mikrobiologischen Produktion und der entsprechenden angewandten Forschung gut geeignet. W. KAUBTTFF

Michael Theile / Siegfried Scherneck

Zellgenetik (Wissenschaftliche

Taschenbücher,

Reihe

Biologie)

1978. 282 Seiten - 70 Abbildungen auf 11 Tafeln — 13 Tabellen — kl. 8° — 12,50 M Bestell-Nr. 7623520 (7201)

Die Verfasser • stellen die in vitro kultivierte somatische Säugerzelle als Objekt der genetischen Forschung in den Mittelpunkt ihrer Betrachtungen • beschreiben das Spektrum der gegenwärtigen verfügbaren Säugerzellmutanten, ihre Entstehung, ihren Nachweis und Möglichkeiten ihres Einsatzes • untersuchen die Bedeutung der DNA-Reparatur für die Zelle in ihrem Zusammenhang mit anderen molekular-genetischen Mechanismen • befassen sich mit der malignen Transformation tierischer Zellen, mit der Wirkungsweise und Bedeutung daran beteiligter Prozesse • behandeln die Hybridisierung tierischer somatischer Zellen und ihre weitreichenden Anwendungen • geben einen Überblick über die Bedeutung des Gentransfers bei tierischen somatischen Zellen • schildern die erstaunlichen Möglichkeiten bei der Anwendung von Restriktionsendonukleasen in der Zellbiologie und daraus erwachsende Konsequenzen

Bestellungen durch, eine Buchhandlung

erbeten

AKADEMIE-VERLAG DDR - 1080 Berlin, Leipziger Str. 3 - 4

Contents

M. SOBOTKA, J. VOTETJBA, A. PBOKOP : Study of direct oxygen transfer in a submerged culture

3

E . STICHEL, F . GLOMBITZA, U . ISKE : P a r a f f i n ü b e r g a n g aus der K o h l e n w a s s e r s t o f f -

phase zur Hefezelle

9

R . GRUNOW, M . SGHÖNHERR, U . TATJBENEOK, I . ZIMMERMANN : Z u r Struktur v o n

Bakteriophagen aus enzymproduzierenden Bacillus-Kulturen S. KISHEN TANGNTT, H . W . BLANCH, CH. R . W I L K E : P r o d u c t i o n of X y l a n a s e

17 by

Streptomyces xylophagus noc. sp

31

E. J. NKANGA: The microbiology of Oyokpo, a traditionally fermented millet beer in Bendel state of Nigeria

41

A. BETXBLER, K.-H. WOLF: Mathematische Grundlagen der Kinetik der autokatalytischen Reaktion des wachstumsverbundenen Substratabbaues

49

P. SOHEEER, H. SAHM: Effect of tface elements and vitamins on the growth of Methanosarcina barkeri

57

W. KAUKTJTF: Erfahrungen und Ergebnisse bei der wissenschaftlich-technischen Prognostizierung auf dem Gebiet der Biotechnologie

67

R. BERGER: Immobilisierung mikrobieller Zellen und deren Nutzung zur Substratwandlung — Eine Literaturstudie

73

Book review

103