Minimetrische Methoden der Blutuntersuchung [2., verb. u. vermehrte Aufl. Reprint 2020] 9783111495507, 9783111129297

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Minimetrische Methoden der

Blutuntersuchung Zusammengestellt von

Dr. J. A. Mandel Professor der Chemie, University and Bellevue Hospital Medicai College, New York

und

Dr. H. Steudel a. o< Professor u. Abteilungsvorsteher am physlolog. Institut der Universität In Berlin

Mit v i e r F i g u r e n im T e x t

Zweite, v e r b e s s e r t e und v e r m e h r t e Auflage.

Berlin und Leipzig 1924

W a l t e r d e G r u y t e r & Co. vormals G . J . Göschen'sche Verlagsbandlung - J . Guttentag, Verlagsbuchhandlung Georg Reimer - Karl J . TrGbner - Veit & Comp.

Alle Rechte, einschließlich des Übersetznngsrechts, vorbehalten.

Druok TOB Walter do Gruyter ft Co , Berlin W 10

Vorwort. Im Laufe der letzten Jahre sind die minimetrischen Methoden der Blutuntersuchung auf einen hohen Grad der Genauigkeit ausgearbeitet worden: wenige Kubikzentimeter Blut reichen aus, um in ihnen die wichtigsten und charakteristischen Stoffwechselprodukte quantitativ zu bestimmen. In erster Linie hat sich F o l i n um die Ausarbeitung dieser Methoden verdient gemacht, aber auch eine Reihe anderer Autoren, von denen hier nur v a n S l y k e , B e n e d i c t , Myers, G e t t l e r genannt sein mögen, haben wesentlich zur Vor vollkommnung der Methoden beigetragen. Diese Arbeitsmethoden sind in Deutschland bisher wenig beachtet worden, besonders wohl darum, weil die neuere amerikanische Literatur, in der die Forschungsresultate veröffentlicht sind, jetzt hier wenig zugänglich ist. Wir haben uns nun entschlossen, einige dieser Methoden, und zwar diejenigen, die von dem einen von uns (M.) in langer Praxis als bequem und zuverlässig ausprobiert sind, genauer zu beschreiben und den Fachgenossen und Klinikern in diesem Heftchen vorzulegen. In neueren amerikanischen Lehrbüchern findet man die Methoden durchweg genau be schrieben, z.B. gaben H a w k , G r a d w o h l , U n d e r h i l l , M y e r s und M a t h e w s in ihren Handbüchern eingehend« Beschreibungen. Die Zusammenstellung würde eine große Lücke aufweisen, wenn sie nicht auch die Bestimmung der Acidosis nach v a n S l y k e enthielte. l*

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Vorwort.

Fast alle Methoden sind k o l o r i m e t r i s c h e Methoden; dafür ist natürlich ein gutes Kolorimeter erforderlich, am besten eines nach dem Typus von D u b o s c q . Die Genauigkeit des Instrumentes 1 ) muß häufig durch Vergleichung von Standardlösungen nachgeprüft werden. Ebenso ist großer Wert auf .die Genauigkeit der erforderlichen Lösungen zu legen, denn da die Bestimmungen an sehr kleinen Mengen gemacht werden, können beim Gebrauch ungenauer Lösungen die Fehler sehr groß werden. Kolorimetrische Bestimmungen, scheinbar so leicht und einfach, wollen überhaupt gelernt sein; es dauert eine gewisse Zeit, bis das Auge durch häufige Bestimmungen die nötige Übung in der raschen Beurteilung feiner Farbennuancen erworben hat. Es wird sich häufig ereignen, daß man, auch wenn man scheinbar genau nach den gegebenen Vorschriften arbeitet, anfangs Mißerfolge zu verzeichnen hat. Man lasse sich dadurch nicht beirren und arbeite ruhig weiter. Beherrscht man erst die Methodik mit Sicherheit, so wird man auch die Fehlerquellen vermeiden, lernen und brauchbare Resultate erhalten. Aber auch der Geübte wird vorziehen, um sichere Resultate zu erhalten, Doppelbestimmungen auszuführen und häufig Kontrolluntersuchungen an Lösungen bekannten Gehaltes vorzunehmen. Je schneller man auf die Farbengleichheit einstellen lernt, um so besser werden die Resultate bei dem oft rasch erfolgenden Farbenwechsel der Untersuchungslösungen. Beherrscht man aber erst einmal die Methoden, so hat man ein gutes diagnostisches Hilfsmittel gewonnen, um ohne großen Apparat und komplizierte Laboratoriumseinrichtungen sich schnell über den Zustand des Blutes seiner Patienten l ) Sämtliche Apparate werden genau nach den Vorschriften dieses Heftes von den V e r e i n i g t e n F a b r i k e n f ü r L a b o r a t o r i u m s b e d a r f , Berlin, Lnisenstraße 52 geliefert.

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Vorwort.

unterrichten zu können. In Amerika haben sich die Methoden rasch in den Kliniken und in der Privatpraxis eingeführt. Durch die Bestimmung des Blutzuckers erhält man schnell ein genaues Bild vom Kohlenhydratstoffwechsel, die Bestimmung des Reststickstoffes und der Extraktivstoffe liefert zuverlässige Anhaltspunkte, um den Zustand der Nieren zu beurteilen und ist bei Nephritis ein gutes Prognostikum für das Herannahen einer Urämie. Die Ursache eines Komas, ob diabetisch, traumatisch, urämisch, toxisch aus einem anderen Grunde, oder vasomotorisch, läßt sich durch eine Blutuntersuchung leicht eruieren. Die folgende Tabelle gibt die durchschnittlichen Resultate wieder, die von verschiedenen Untersuchern für die wichtigsten Blutbestandteile erhalten wurden, alles auf 100 ccm Blut bezogen: Normales menschliches Blnt

25 Reststickstoff . Harnstoffstickstoff . 10 1 Harnsäure . . 1 Kreatinin 5 Kreatin u. Kreatinin. . 6 Aminosäure N . Glukose 60 150 Cholesterin. 500 Chloride (NaCl) Organischer und an4 organischer Phosphor Anorganischer Phosphor 3,5 Natrium (Serum). 325 19,2 Kalium ,, 9,5 Kalzium „ Magnesium „ 1,8

Anomales menschliches Blnt

bis

40 mg 18 „ 1 » 3,5 ,, 2 „ ti 6 „ 8 1 1 HO „ 1 i 180 „ 1 > 650 „

,.

5 4 345 >> J 20 5 10,5 2,2 1? )

,, „ „ „ „ „

50 bis 400 30 300 5 25 3 35 7 27,2 8 30 150 400

Vorwort.

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Die geistreiche Methode von v a n S l y k e zur Bestimmung der sogenannten Alkalireserve des Blutes oder des Kohlensäurebindungsvermögens des Plasmas ist von der größten Bedeutung, wenn es sich darum handelt, die Größe der Säurebildung im Stoffwechsel, die Azidosis, zu bestimmen." Die folgende Zusammenstellung gibt einige Durchschnittsresultate :

Zustand:

Bindungsvermögen von 1 ccm Plasma, gemessen durch Ablesung des entwickelten Gasvolumens im Apparat:

Gesunder Erwachsener in Ruhe (äußerste Grenzen) Leichte Azidosis.., Mittlere Azidosis .. Schwere Azidosis . .

0,90 bis 0,65 „ 0,52 „ unter

0,65 ccm 0,52 „ 0,41 „ 0,41 „

Die Ablesung entspricht einer Menge COj, auf 0° und 760 mm reduziert, gebunden alsBicarbonat in 100 ccm Plasma: (Volum %)

77 bis 53 „ 40 „ unter

53 ccm 40 „ 30 „ 30

B e r l i n , im Juli 1923.

J. A. Mandel.

H. Steudel.

Inhalt. Seite

Vorwort . 1. Die Blutentnahme 2. Gewinnung eines eiweiß freien Filtrates aas Blat 3. Bestimmung des Reststickstoffes Gebrauch des Kolorimeters 4. Bestimmung des Harnstoffes 5. Bestimmung der Harnsäure 6. Bestimmung des Kreatinins 7. Bestimmung des Kreatins und Kreatinins (Gesamtkreatinin) . . 8. Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs 9. Bestimmung des Traubenzuckers 10. Bestimmung des Cholesterins 11. Bestimmung der Chloride im Gesamtblut 12. Bestimmung des anorganischen und des säurelöslichen Phosphors 13. Bestimmung des Natriums 14. Bestimmung des Kaliums 15. Bestimmung des Kalziums 16. Bestimmung des Magnesiums 17. Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach v a n S l y k e

3 9 10 12 14 15 19 26 30 31 37 41 42 47 50 51 53 64 55

1.

Die Blutentnahme. In ein trockenes Reagenzglas oder ein kleines Fläschchen von etwa 200 ccm Inhalt mit gut schließendem Korkstopfen gibt man 20 mg feinpulverisiertes, neutrales Natriumoxalat oder Lithiumoxalat *), um das Kalzium des Blutes auszufällen und die Gerinnung zu verhindern. Die Menge des Oxalates reicht für 10 ccm Blut aus. Dann entnimmt man das Blut mit einer sterilen Spritze aus der Vena cubitalis — etwa 7 bis 10 ccm. Es empfiehlt sich, die Innenwand der Spritze mit 2 bis 3 Tropfen gesättigter 20% neutraler Na-Oxalatlösung anzufeuchten. Nach der Entnahme wird das Blut so schnell wie möglich in das vorbereitete Reagenzglas entleert und das Oxalat mit dem Blut dureh ein- bis zweimaliges Umkehren des Reagenzglases gut gemischt. Die Koagulation wird auf diese Weise sicher verhindert. So vorbereitet, ist das Blut, im Eisschrank aufbewahrt, einige Tage haltbar. Die Bestimmung des Traubenzuckers und des Kreatinins nimmt man aber zweckmäßig sobald wie möglich vor, damit nicht sekundäre Zersetzungen im Blut das Bild trüben. ') Lithiumoxalat ist dem Natriumoxalat nach Folin vorzuziehen, weil es bei der Harnsäurebestimmung fällunghindernd wirkt. Ein passendes Oxalattuch kann man sich, wie folgt, machen: 75—80 g Baumwollgaze, die völlig frei von Stärke sein muß, werden in etwa 10 cm breite und 40—50 cm lange Streifen geschnitten. Dann löst man 10 g Lithiumcarbonat und 17 g Oxalsäure in 240 ccm heißem Wasser auf (75 Wenn alles gelöst ist (in wenigen Minuten), taucht man die Gazestreifen in die heiße Lösung und hängt sie dann zum Trocknen auf. 50 mg solcher Gaze verhindern mit Leichtigkeit die Gerinnung von 15 bis selbst 20 ccm Blut.

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Gewinnnng eines eiweißfreien Filtrates ans Bint.

Über die Entnahme von Blut für die Bestimmung der Azidosis nach v a n S l y k e siehe S. 56. Es handelt sich nun zunächst darum, aus dem Blut die geformten Bestandteile und das Eiweiß zu entfernen. Dies geschieht am einfachsten nach der folgenden Methode: 2.

Gewinnung eines eiweißfreien Filtrates aus Blut1). Erforderliche Lösungen: 10% Lösung von wolframsaurem Natrium (Na 2 Wo0 4 2H 2 0\ 2 / 3 -Normal-Schwefelsäure (33,70 g H 2 S0 4 = 18,47 com H 2 S0 4 , sp. G. 1,8400 im Liter). 2-Normal-Schwefelsäure im Tropfgläschen. Ausführung: 5 ccm des Oxalatblutes, mit einer Ost waldschen Pipette genau gemessen, läßt man in ein Kölbchen von etwa 100 ccm Inhalt fließen. Die letzten Anteile Blut entfernt man aus der Pipette durch Blasen. Dann messe man sich in einem kleinen Meßzylinder 35 ccm (das siebenfache Volumen vom Oxalatblut) destilliertes Wasser ab, nehme etwas davon, um damit die Pipette ein- bis zweimal auszublasen und bringe sodann auch den Rest des Wassers in das 100 ccm-Kölbchen. Dann schüttele man gut um. Das Blut wird lackfarben und de etwa in den Blutkörperchen enthaltenen Aminosäuren, Zucker usw. gehen in Lösung. Mit einer anderen 5 ccm Pipette werden nun 5 ccm der 10 % Lösung von wolframsaurem Natrium (karbonatfrei) zu der Mischung hinzugesetzt, umgeschüttelt und mit wieder einer anderen Pipette 5 ccm 2 / 3 n.-Schwefelsäure hinzugemessen. Beim Zusatz der 2 / 3 n.-Schwefelsäure wird das Kölbchen leicht geschüttelt. Nun wird das Kölbchen mit einem gut schließenden, sauberen Gummi- oder Korkstopfen verschlossen und ein paarmal kräftig hin- und hergeschüttelt. Eine gute und richtige Koagulation zeigt sich jetzt dadurch an, daß das Blut n i c h t schäumt, höchstens erscheinen eine Folin und Wu, Journ. Bio]. Chem 38,90 (1919); 41,367 (1920).

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Gewinnnng eines eiweißfreien Filtrates ans Bint.

Über die Entnahme von Blut für die Bestimmung der Azidosis nach v a n S l y k e siehe S. 56. Es handelt sich nun zunächst darum, aus dem Blut die geformten Bestandteile und das Eiweiß zu entfernen. Dies geschieht am einfachsten nach der folgenden Methode: 2.

Gewinnung eines eiweißfreien Filtrates aus Blut1). Erforderliche Lösungen: 10% Lösung von wolframsaurem Natrium (Na 2 Wo0 4 2H 2 0\ 2 / 3 -Normal-Schwefelsäure (33,70 g H 2 S0 4 = 18,47 com H 2 S0 4 , sp. G. 1,8400 im Liter). 2-Normal-Schwefelsäure im Tropfgläschen. Ausführung: 5 ccm des Oxalatblutes, mit einer Ost waldschen Pipette genau gemessen, läßt man in ein Kölbchen von etwa 100 ccm Inhalt fließen. Die letzten Anteile Blut entfernt man aus der Pipette durch Blasen. Dann messe man sich in einem kleinen Meßzylinder 35 ccm (das siebenfache Volumen vom Oxalatblut) destilliertes Wasser ab, nehme etwas davon, um damit die Pipette ein- bis zweimal auszublasen und bringe sodann auch den Rest des Wassers in das 100 ccm-Kölbchen. Dann schüttele man gut um. Das Blut wird lackfarben und de etwa in den Blutkörperchen enthaltenen Aminosäuren, Zucker usw. gehen in Lösung. Mit einer anderen 5 ccm Pipette werden nun 5 ccm der 10 % Lösung von wolframsaurem Natrium (karbonatfrei) zu der Mischung hinzugesetzt, umgeschüttelt und mit wieder einer anderen Pipette 5 ccm 2 / 3 n.-Schwefelsäure hinzugemessen. Beim Zusatz der 2 / 3 n.-Schwefelsäure wird das Kölbchen leicht geschüttelt. Nun wird das Kölbchen mit einem gut schließenden, sauberen Gummi- oder Korkstopfen verschlossen und ein paarmal kräftig hin- und hergeschüttelt. Eine gute und richtige Koagulation zeigt sich jetzt dadurch an, daß das Blut n i c h t schäumt, höchstens erscheinen eine Folin und Wu, Journ. Bio]. Chem 38,90 (1919); 41,367 (1920).

Gewinnung eines eiweißfreien Fíltrales ans Blut.

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bis zwei Luftbläschen, und daß die rote Farbe des Blutes in eine bräunliche umschlägt. Beim Schütteln muß die Flüssigkeit einen metallähnliohen Klang annehmen, als wenn man Quecksilber schüttelt. Tritt der Farbenumschlag nicht ein, so ist dies ein Zeichen, daß nicht genug Säure hinzugesetzt ist, und in diesem Falle gebe man unter kräftigem Schütteln tropfenweise 2n-H 2 S0 4 hinzu. Nach dem Zusatz eines jeden Tropfens lasse man die Flüssigkeit einige Minuten stehen, ehe man weitere 2n-H 2 S0 4 zugibt. Mehr wie 10 Tropfen sollten auf keinen Fall gebraucht werden, bis der Farbenumschlag eintritt und die Koagulation vollständig ist. Die Menge der Säure ist gerade ausreichend, um die Wolframsäure aus ihrem Natrium salz in Freiheit zu setzen; ein Überschuß an Säure ist zu vermeiden. Das Filtrat darf nur neutral oder ganz schwach sauer auf Kongo reagieren. Gelingt die Enteiweißung nicht tadellos, so schütte man die Probe fort und nehme eine neue in Angriff. Es hat keinen Zweck, lange hin und her zu probieren. Das Blut ist jetzt von 5 auf 50 ccm, also zehnfach verdünnt. Wenn eine größere Menge von Blutfiltrat gebraucht wird, so kann man natürlich mehr Blut in Arbeit nehmen, muß dann aber auch die anderen Zusätze im gleichen Verhältnis erhöhen, so daß man zum Schluß ebenfalls eine zehnfache Verdünnung erhält. 5 ccm Blut geben aber genügend Filtrat zur Ausführung aller Bestimmungen. Jetzt wird für die Filtration ein Trichter hergerichtet mit einem trockenen Faltenfilter, das groß genug ist, die ganzen 50 ccm auf einmal zu fassen. Dazu genü gt ein Faltenfilter von 12 cm Durchmesser. Das Filter wird nicht mit Wasser angefeuchtet, sondern mit einigen Tropfen der klaren, über dem Niederschlag stehenden Flüssigkeit aus dem Kölbchen. Man läßt so das Filter sich erst vollsaugen, damit sich die Poren schließen, dann gießt man den ganzen Inhalt des Kölbchens auf einmal aufs Filter. Arbeitet man in dieser Weise, so wird das Filtrat sofort wasserklar ablaufen. Geht das erste Filtrat nicht klar durchs Filter, so gieße man e?

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Bestimmung des ReststickstoSes.

wieder zurück, bis man ein absolut klares Filtrat erhält. Das Filtrat wird in einem kleinen, reinen, trockenen Fläschchen für die Untersuchungen aufbewahrt. Für die folgenden Bestimmungen muß das Filtrat annähernd neutral sein. Man prüfe also einen Tropfen des Filtrates mit Kongopapier. Soll das Filtrat einige Zeit bis zur Verarbeitung aufbewahrt werden, so setze man ein paar Tropfen Toluol hinzu und schließe das Fläschchen mit einem guten Stopfen, um Fäulnis zu verhindern. Für die Zuckerbestimmung nach Folin und Wu kann das Blut 4 Tage und länger, selbst bei 20—33°, aufbewahrt werden, wenn es mit einem (1) Tropfen 40% Formalinlösung auf 5 ccm Blut versetzt wird. 3.

Bestimmung des Reststickstoffes. P r i n z i p der M e t h o d e . Man bestimmt den Reststickstoff, indem man den Stickstoff des Blutfiltrates nach K j e l d a h l in Ammoniak überführt. Das Ammoniak wird kolorimetrisch bestimmt, indem man die Lösung mit N e ß l e r s Reagens versetzt und die Farbe mit der einer Lösung von bekanntem Ammoniakgehalt vergleicht. Erforderliche Lösungen: 1. Ammoniumsulfatlösung von bekanntem Gehalt. Etwa 0,5 g reines Ammoniumsulfat werden bei 100° getrocknet und 0,2830 g davon im 1 1 Meßkolben in Wasser gelöst und auf 1 1 aufgefüllt. 5 ccm der Lösung enthalten 0,3 mg N. 2. Saure Veraschungslösung: 100 ccm conc. H 2 S0 4 werden mit 10 ccm 10% Kupfersulfatlösung und mit 10 ccm Wasser versetzt. 3. N e ß l e r s Reagens. 300 ccm 33% Natronlauge (Kjeldahllauge) werden auf 900 aufgefüllt. Die Lösung hat ein spezifisches Gewicht von 1,152. Ferner werden 150 g reines K J (Kahlbaum) in 100 ccm

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Bestimmung des ReststickstoSes.

wieder zurück, bis man ein absolut klares Filtrat erhält. Das Filtrat wird in einem kleinen, reinen, trockenen Fläschchen für die Untersuchungen aufbewahrt. Für die folgenden Bestimmungen muß das Filtrat annähernd neutral sein. Man prüfe also einen Tropfen des Filtrates mit Kongopapier. Soll das Filtrat einige Zeit bis zur Verarbeitung aufbewahrt werden, so setze man ein paar Tropfen Toluol hinzu und schließe das Fläschchen mit einem guten Stopfen, um Fäulnis zu verhindern. Für die Zuckerbestimmung nach Folin und Wu kann das Blut 4 Tage und länger, selbst bei 20—33°, aufbewahrt werden, wenn es mit einem (1) Tropfen 40% Formalinlösung auf 5 ccm Blut versetzt wird. 3.

Bestimmung des Reststickstoffes. P r i n z i p der M e t h o d e . Man bestimmt den Reststickstoff, indem man den Stickstoff des Blutfiltrates nach K j e l d a h l in Ammoniak überführt. Das Ammoniak wird kolorimetrisch bestimmt, indem man die Lösung mit N e ß l e r s Reagens versetzt und die Farbe mit der einer Lösung von bekanntem Ammoniakgehalt vergleicht. Erforderliche Lösungen: 1. Ammoniumsulfatlösung von bekanntem Gehalt. Etwa 0,5 g reines Ammoniumsulfat werden bei 100° getrocknet und 0,2830 g davon im 1 1 Meßkolben in Wasser gelöst und auf 1 1 aufgefüllt. 5 ccm der Lösung enthalten 0,3 mg N. 2. Saure Veraschungslösung: 100 ccm conc. H 2 S0 4 werden mit 10 ccm 10% Kupfersulfatlösung und mit 10 ccm Wasser versetzt. 3. N e ß l e r s Reagens. 300 ccm 33% Natronlauge (Kjeldahllauge) werden auf 900 aufgefüllt. Die Lösung hat ein spezifisches Gewicht von 1,152. Ferner werden 150 g reines K J (Kahlbaum) in 100 ccm

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Bestimmung des Reststickstoffes.

warmen Wassers unter Schütteln gelöst, dann 200 g Jodquecksilber (Kahlbaum) zugegeben und auf etwa 1 1 aufgefüllt, nach zweitägigem Stehen auf 2 1 gebracht. 750 ccm dieser Lösung werden unter Umrühren in 3500 ccm der Natronlauge gegossen und mit 750 ccm ammoniakfreiem Wasser verdünnt, so daß das Gesamtvolumen 5 1 beträgt. Die Neßlersche Lösung wird durch langes Stehen nur besser. Diese so bereitete Neßlersche Lösung enthält In Ii in 15 ccm genügend Alkali, um 1 ccm der Schwefelsäuremischung zu neutralisieren und um mit Ammoniak eine passende Farbe bei einer Verdünnung i cer; auf 50 ccm zu liefern. Um dies festzustellen, messe I I 35'' man aus einer Bürette 2 ccm der sauren Veraschungslöpung ab, gebe 5 ccm der Vergleichslösung von Ammoniumsulfat hinzu, ferner 55 ccm Wasser und 30 ccm Neßlerlösung, fülle bis 100 ccm auf und sehe zu, ob sich eine tief gelbe bis gelbbraune Färbung entwickelt. Ist dies der Fall, so ist die Neßlerlösung brauchbar; erhält man keine klare, Fig. 1. gelbbraune Farblösung, so enthält die Neßlerlösung Mikroentweder zu wenig Alkali oder ist karbonathaltig. Jglas. Man bekommt dann braunrote, trübe Lösungen, die für kolorimetrische Bestimmungen ganz ungeeignet sind. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm des eiweißfreien Blutfiltrates werden in ein Mikrokjeldahlglas (siehe Fig. 1) pipettiert, 1 ccm Schwefelsäuremischung und 2—3 Glasstückchen hinzugesetzt und die Reaktionslösung auf einer Sparflamme gekocht, bis alles Wasser verdampft ist und sich weiße Dämpfe von Schwefelsäureanhydrid entwickeln. Man erhitzt nun weiter bis zur vollkommenen Farblosigkeit (etwa 3 Minuten), a b e r j a nicht Iängerl Nach dem Erkalten (1 bis 2 Minuten) verdünnt man mit Wasser bis zur Marke 35, kühlt wieder ab, füllt mit N e ß l er scher Lösung bis 50 auf und schüttelt gut um. Nach dem Zusatz des Neßl ersehen Reagens muß unter der Wasserleitung gekühlt werden. Man erhält eine tief-

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w

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Bestimmung des Reststickstoffes.

gelbe klare Lösung. Sollte die Lösung trübe sein, so wird ein Teil der Flüssigkeit zentrifugiert, um den gebildeten feinen Niederschlag zu entfernen. Jetzt wird (ev. während des Zentrifugierens) folgende Vergleichslösung angefertigt: 5 ccm der Ammonsulfatlösung werden in einen 100 ccm Meßkolben pipettiert, 30 ccm Wasser zugesetzt, dann 2 ccm Schwefelsäurelösung, dann 30 ccm Neßlerlösung, auf 100 aufgefüllt und gut umgeschüttelt. Die beiden Lösungen werden nun im Kalorimeter miteinander verglichen. G e b r a u c h des K o l o r i m e t e r s (nach D u b o s c q ) . Man überzeuge sich zunächst, daß der Apparat vollkommen sauber ist und daß die Gummidichtungen der Zylinder gut schließen und fülle dann in die beiden reinen und trockenen Glaszylinder etwas von der Vergleichslösung, stelle die linke Seite z. B. auf 20 ein und stelle nun Farbengleichheit her. Man erreicht dies am leichtesten*, wenn man zunächst rasch hintereinander die Farbe der zu untersuchenden Lösung blasser oder intensiver gegen die Vergleichslösung durch kurzes Drehen der rechten Schraube werden läßt. Durch immer kleiner werdende Bewegungen der Schraube erhält man bald Farbengleichheit. Es muß Wert darauf gelegt werden, daß man die Einstellung auf Farbengleichheit rasch machen kann, weil die Untersuchungslösungen oft schnell ihren Farbenton ändern. Die Ablesungen auf beiden Seiten müssen gleich sein. Ist das nicht der Fall, so ist möglicherweise die Beleuchtung nicht gleichmäßig oder eins von den Prismen hat sich in der Verschraubung etwas gelockert. Ist das Kolorimeter in Ordnung, so lasse man in dem einen Zylinder die Vergleichslösung, den anderen entleere man, spüle ihn mit Wasser mehrmals aus, dann zweimal mit der zu untersuchenden Lösung und fülle ihn dann mit dieser. Die Vergleichslösung wird auf 20 gestellt und nun die unbekannte Lösung, wie oben beschrieben, eingestellt.

Be__„„u rechnung:

Stand der Vereleichslösung , , . * ^—rf Reststickstoff in 100 ccm Blut. °

Stand der zu bestimmenden Lösung

„ ofl __ X 30 = mg

Bestimmung des Harnstoffes.

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Die Berechnung beruht auf folgender Überlegung: Die in Arbeit genommenen 5 ccm des Blutfiltrates entsprechen 0,5 ccm Blut. Diese sind für den kolorimetrischen Vergleich auf 50 ccm aufgefüllt, während die Vergleichslösung auf 100 ccm aufgefüllt wurde. Hätte man nun auch bei der zu bestimmenden Lösung zum Schluß 20 abgelesen, dann würde sie ebenso viel N enthalten haben wie die Vergleichslösung, also 0,3 mg in 100 ccm. Da aber die zu untersuchende Lösung nur auf 50 ccm aufgefüllt ist, so wäre der N-Gehalt nur halb so groß, also 0,15 mg. Die 5 ccm Blutfiltrat, also 0,5 ccm Blut, würde also 0,15 mg N enthalten, 100 ccm Blut demnach 200 X 0,15 mg oder 30 mg. Wäre nun bei der zu bestimmenden Lösung statt 20 z. B. 30 abgelesen, so wäre der Gehalt in 100 ccm Blut = x 30 mg = 20 mg N. Normales Blut enthält in 100 ccm 25 bis 40 mg ReststickstofT. 4.

Bestimmung des Harnstoffes. t. B e s t i m m u n g n a c h v a n S l y k e und Gullen 1 ) P r i n z i p der M e t h o d e : Der Harnstoff im Blutfiltrat wird durch Ureasewirkung in Ammoniumkarbonat verwandelt, das Ammoniak mit überschüssiger Natronlauge in Freiheit gesetzt und durch einen Luftstrom in eine Säure enthaltende Lösung gesaugt, in der es durch Neßlerisieren kolorimetrisch bestimmt wird. Erforderliche Lösungen: 1. Pufferlösung. Eine Lösung, die im Liter l / 3 Grammmolekül NaH 2 P0 4 und z / 3 Grammolekül Na 2 HP0 4 enthält (46,03 g NaH 2 P0 4 + HaO und 238,8 g Na 2 HP0 4 + 12 H 2 0 im Liter). 2. Ureasepulver (von einer zuverlässigen Firma zu beziehen) oder Ureaselösung: Um eine ammoniakfreie ') Van S l y k e u. C a l l e n , Journ. biol. Chem. Bd. 19, S. 211. 1914. — M a r s h a l l , ibid. Bd. 15, S. 487. 1913.

Bestimmung des Harnstoffes.

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Die Berechnung beruht auf folgender Überlegung: Die in Arbeit genommenen 5 ccm des Blutfiltrates entsprechen 0,5 ccm Blut. Diese sind für den kolorimetrischen Vergleich auf 50 ccm aufgefüllt, während die Vergleichslösung auf 100 ccm aufgefüllt wurde. Hätte man nun auch bei der zu bestimmenden Lösung zum Schluß 20 abgelesen, dann würde sie ebenso viel N enthalten haben wie die Vergleichslösung, also 0,3 mg in 100 ccm. Da aber die zu untersuchende Lösung nur auf 50 ccm aufgefüllt ist, so wäre der N-Gehalt nur halb so groß, also 0,15 mg. Die 5 ccm Blutfiltrat, also 0,5 ccm Blut, würde also 0,15 mg N enthalten, 100 ccm Blut demnach 200 X 0,15 mg oder 30 mg. Wäre nun bei der zu bestimmenden Lösung statt 20 z. B. 30 abgelesen, so wäre der Gehalt in 100 ccm Blut = x 30 mg = 20 mg N. Normales Blut enthält in 100 ccm 25 bis 40 mg ReststickstofT. 4.

Bestimmung des Harnstoffes. t. B e s t i m m u n g n a c h v a n S l y k e und Gullen 1 ) P r i n z i p der M e t h o d e : Der Harnstoff im Blutfiltrat wird durch Ureasewirkung in Ammoniumkarbonat verwandelt, das Ammoniak mit überschüssiger Natronlauge in Freiheit gesetzt und durch einen Luftstrom in eine Säure enthaltende Lösung gesaugt, in der es durch Neßlerisieren kolorimetrisch bestimmt wird. Erforderliche Lösungen: 1. Pufferlösung. Eine Lösung, die im Liter l / 3 Grammmolekül NaH 2 P0 4 und z / 3 Grammolekül Na 2 HP0 4 enthält (46,03 g NaH 2 P0 4 + HaO und 238,8 g Na 2 HP0 4 + 12 H 2 0 im Liter). 2. Ureasepulver (von einer zuverlässigen Firma zu beziehen) oder Ureaselösung: Um eine ammoniakfreie ') Van S l y k e u. C a l l e n , Journ. biol. Chem. Bd. 19, S. 211. 1914. — M a r s h a l l , ibid. Bd. 15, S. 487. 1913.

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Bestimmung des Harnstoffes.

Ureaselösung zu erhalten, wendet man das Permutitverfahren an. Man bringt 3 g Permutitpulver in einen 200 ccm fassenden Kolben, wäscht es einmal durch Dekantieren mit 2 % Essigsäure, dann zweimal mit Wasser aus. Dann übergießt man es mit 100 ccm 3 0 % Alkohol (35 ccm 95% Alkohol + 70 ccm Wasser), fügt 5 g Sojabohnenmehl hinzu und schüttelt 10 Minuten. Dann wird filtriert und das Filtrat in 3—4 kleinen Fläschchen von 25 bis 50 ccm Inhalt gesammelt. Ein Kölbchen wird sofort in Gebrauch genommen, die übrigen werden gut verkorkt auf Eis aufbewahrt. Sie sind mindestens 3 bis 4 Wochen lang brauchbar. In Gebrauch genommen, hält sich die Lösung mindestens eine Woche bei Zimmertemperatur, wenn sie vor direktem Sonnenlicht geschützt aufbewahrt wird. 1 ccm der Ureaselösung genügt, um aus 300 mg Harnstoff N in 200 ccm Lösung 37 bis 22 mg N in einer Stunde bei 20° zu liefern. In 18 Stunden ist die Zersetzung vollständig. 3. Neßlers Reagens wie bei 3 3. 4- Vergleichslösung wie bei 3 x . 5. ^ Salzsäure- oder Schwefelsäurelösung. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : Ein weites Reagenzglas, das in den Luftstromdestillationsapparat (siehe Fig. 2) hineinpaßt, wird sorgfältig gereinigt, indem man es erst mit Salpetersäure ausspült und dann gründlich mit Wasser nachwäscht und trocknet. Das Ausspülen mit Salpetersäure ist notwendig, um Spuren von Metallen (Kupfer, Eisen, Quecksilber usw.) zu entfernen, die die Urease vergiften würden. 5 ccm des eiweißfreien Blutfiltrates werden in das Reagenzglas pipettiert, dazu 2 Tropfen der Puffermischung gegeben und eine kleine Messerspitze Ureasepulver oder 0,5 bis 1,0 ccm der oben beschriebenen Ureaselösung. Der Zusatz der Pufferlösung hat den Zweck, die für die Wirkung der Urease günstigste H-Ionenkonzentration herzustellen und zu erhalten. Die Reaktion wird jetzt immer annähernd neutral bleiben. Die

17

Bestimmung des Harnstoffes.

Mischung kommt nun 10 Minuten lang in ein Waaserbad von 40°. Diese Zeit ist genügend, um sämtlichen Harnstoff in Ammoniumkarbonat zu verwandeln. Inzwischen hat man den Destillationsapparat vorbereitet, indem man in die Vorlage 2 ccm HCl gegeben hat, die man auf etwa 20 com verdünnt. Nun gibt man zu der zu untersuchenden Lösung 2 ccm 10% NaOH und 1 bis 2 Tropfen Amylalkohol, um das Schäumen zu verhindern, bringt das Reagenzglas in den Aspirationsapparat und saugt einen flotten Luftstrom 30 Minuten lang mit der Wasserstrahlpumpe durch den Apparat. Dann fügt man zur Vorlage 2,5 ccm Neßlerlösung, füllt auf 25 ccm auf und vergleicht mit folgender Lösung: Vergleichslösung: 5 ccm Ammonsulfatlösung = 0,3 mg N werden in einem 100 ccm Meßkolben mit etwa 80 ccm Wasser verdünnt, dann 10 ccm Neßlerlösung zugesetzt und bis zur Marke aufgefüllt.

Fig. Der Apparat besteht enthält, um die bei d befreien. Der Zylinder

2. Luftstromdestillationsapparat. aus der Waschflasche a, die 10% Schwefelsäure in den Apparat eintretende Luft von Ammoniak, zu b enthält das Reagenzglas mit der zu untersuchenden

Lösung, der Zylinder c enthält 2 ccm

HCl, auf 20 ccm verdünnt, um

das in b sich entwickelnde Ammoniak aufzufangen. Bei f wird der Apparat an die Wasserstrahlluftpumpe gehängt. Die Glas- und Gummiverbindungen sind aus der Figur ersichtlich. Ehe man den Apparat benutzt, prüfe man, ob alle Stopfen usw. gut schließen. M a n d e l u. S t e u d e l , Btatuntersuchungen. 2. Aufl.

2

18

Bestimmung des Harnstoffes.

Berechnung: °

Stand der Vergleichslösung; (20)

15

=

Stand der zu bestimmenden Losung

°

Harnstoff N in 100 ccm Blut. Die Überlegungen sind analog denen bei der Berechnung des Reststickstoffes. Da aber die Vergleichslösung auf 100, die zu untersuchende Lösung nur auf 25 ccm aufgefüllt ist, so muß das Verhältnis Vergleichslösung— ^ u n ( j nicht Zu bestimmende Losung

mit 30 multipliziert werden. Normales Blut enthält etwa 10 bis 18 mg Harnstoff N in 100 ccm. 2. H a r n s t o f f b e s t i m m u n g d u r c h Autoklaven.

Spaltung

im

5 ccm Blutfiltrat kommen in ein weites Reagenzglas, es wird 1 com Normalschwefelsäure hinzugesetzt, die Öffnung des Reagenzglases mit Staniol bedeckt und das Reaktionsgemisch 10 Minuten im Autoklaven auf 150° erhitzt. Der Autoklav muß vor dem Öffnen auf unter 100° abgekühlt sein. Es wird dann das Ammoniak entweder durch die Luftstrommethode oder durch direkte Neßlerisation der Flüssigkeit und Vergleich mit einer Lösung von bekanntem Gehalt bestimmt. 3.

Harnstoffbestimmung. (Direkte Methode Myers 1 ), modifiziert von Gettler.)

nach

P r i n z i p der M e t h o d e : Oxalatblut wird direkt mit Urease behandelt, nach völliger Umwandlung des Harnstoffs in Ammoniumkarbonat werden die Eiweißkörper des Blutes nach der Methode von Folin und Wu entfernt und im Filtrat das Ammoniak nach Neßler bestimmt (siehe S. 13). Ausführung: In einen Erlenmeyerkolben von 100 ccm kommt ein wenig Urease (ungefähr 0,1 g), dann 2 ccm Oxalatblut, mit der Pipette gemessen, endlich 14 ccm Wasser. Nach gründlichem Mischen wird der Kolben für ungefähr 15 Minuten 0 M y e r s , Practical chemical analysis of blood.

1921.

S. 36.

19

Bestimmung der Harnsäure

in ein Wasserbad von 50° gestellt. Jetzt werden 2 com der 10% Lösung von wolframsaurem Natrium hinzugesetzt, dann unter fortwährendem Rühren 2 ccm 2/3 Normalschwefelsäure. Dann wird gut geschüttelt. Die Ausfällung der Eiweißkörper ist vollendet, wenn die Farbe in Braunrot umgeschlagen ist und bei heftigem Schütteln sich kein Schaum bildet, sondern nur ein metallähnlich klingender Ton gehört wird. Ist die Ausfällung unvollständig, so setze man einen oder zwei Tropfen 2 n Schwefelsäure hinzu, bis die eben beschriebenen Bedingungen erreicht sind. Es wird durch ein trockenes Filter filtriert und die zuerst durchgehenden Anteile zurückgegossen, bis ein völlig klares Filtrat erhalten wird. Das Filtrat darf beim Schütteln nicht mehr schäumen. 5 ccm dieses Filtrates kommen in eine Meßflasche von 25 ccm Inhalt, dann 5 ccm von Neßlers Reagenz; das Ganze wird auf 25 ccm aufgefüllt. In einem zweiten Meßkolben von 25 ccm werden 5 ccm der Standardammoniumsulfatlösung (enthaltend 0,10 mg N) und 5 ccm Neßlerlösung abgemessen und auf 25 ccm mit Wasser aufgefüllt. Die beiden Lösungen werden nun im Kolorimeter miteinander verglichen. B e r e c h n u n g : S^nd der Vergleichslösung ^ H a r n °

Stand der Versuchslosung

°

Stoff N in 100 ccm Blut.

5.

Bestimmung der Harnsäure. 1. B e s t i m m u n g

der H a r n s ä u r e . (Direkte Methode nach Folin 1 ).) P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blutfiltrat wird ohne weiteres mit einer besonderen Phosphorwolframsäurelösung versetzt und erhitzt. Die in Gegenwart von Harnsäure gebildete blaue Farbe wird mit einer Farbe verglichen, die eine Vergleichsharnsäurelösung unter denselben Bedingungen liefert. Das Zyannatrium wirkt als Alkali und vertieft die blaue Farbe, während der Zusatz von Lithiumsulfat die ») F o l i n , Journ. Biol. Chem. 54, 153 (1922). 2*

19

Bestimmung der Harnsäure

in ein Wasserbad von 50° gestellt. Jetzt werden 2 com der 10% Lösung von wolframsaurem Natrium hinzugesetzt, dann unter fortwährendem Rühren 2 ccm 2/3 Normalschwefelsäure. Dann wird gut geschüttelt. Die Ausfällung der Eiweißkörper ist vollendet, wenn die Farbe in Braunrot umgeschlagen ist und bei heftigem Schütteln sich kein Schaum bildet, sondern nur ein metallähnlich klingender Ton gehört wird. Ist die Ausfällung unvollständig, so setze man einen oder zwei Tropfen 2 n Schwefelsäure hinzu, bis die eben beschriebenen Bedingungen erreicht sind. Es wird durch ein trockenes Filter filtriert und die zuerst durchgehenden Anteile zurückgegossen, bis ein völlig klares Filtrat erhalten wird. Das Filtrat darf beim Schütteln nicht mehr schäumen. 5 ccm dieses Filtrates kommen in eine Meßflasche von 25 ccm Inhalt, dann 5 ccm von Neßlers Reagenz; das Ganze wird auf 25 ccm aufgefüllt. In einem zweiten Meßkolben von 25 ccm werden 5 ccm der Standardammoniumsulfatlösung (enthaltend 0,10 mg N) und 5 ccm Neßlerlösung abgemessen und auf 25 ccm mit Wasser aufgefüllt. Die beiden Lösungen werden nun im Kolorimeter miteinander verglichen. B e r e c h n u n g : S^nd der Vergleichslösung ^ H a r n °

Stand der Versuchslosung

°

Stoff N in 100 ccm Blut.

5.

Bestimmung der Harnsäure. 1. B e s t i m m u n g

der H a r n s ä u r e . (Direkte Methode nach Folin 1 ).) P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blutfiltrat wird ohne weiteres mit einer besonderen Phosphorwolframsäurelösung versetzt und erhitzt. Die in Gegenwart von Harnsäure gebildete blaue Farbe wird mit einer Farbe verglichen, die eine Vergleichsharnsäurelösung unter denselben Bedingungen liefert. Das Zyannatrium wirkt als Alkali und vertieft die blaue Farbe, während der Zusatz von Lithiumsulfat die ») F o l i n , Journ. Biol. Chem. 54, 153 (1922). 2*

20

Bestimmung der Harnsäure.

Wirkung der Kalisalze abschwächen soll. Die Methode scheint für menschliches Blut sehr gut brauchbar zu sein, für andere Blutarten weniger gut. Erforderliche Lösungen: 1. Harnsäurereagens nach Folin und Denis. In einen Literkolben bringe man 750 ccm Wasser, 100 g reines wolframsaures Natrium und 80 ccm Phosphorsäure (85% H 3 P0 4 ). Die Öffnung des Kolbens wird durch einen Trichter verschlossen, in dem ein kleines Uhrschälchen liegt. Die Lösung wird 2 Stunden lang in gelindem Sieden gehalten und dann auf 1 1 aufgefüllt. Kocht man 24 Stunden anstatt 2, so erhält man ein stärkeres Reagens. 2. Lithiumsulfatlösung. 20 g reines gepulvertes Lithiumsulfat werden in 80 ccm kaltem Wasser aufgelöst und auf 100 ccm verdünnt. Ist die Lösung nicht völlig klar, so muß sie filtriert werden. 3. Natriumzyanidlösung. Es wird eine 15% Lösung von reinem weißen Zyannatrium in 10% Natriumhydroxydlösung gebraucht. Altes Zyannatrium, das durch die Kohlensäure der Luft schon zersetzt ist, darf nicht benutzt werden. Es werden z. B. 100 bis 450 g Natriumzyanid abgewogen, in ein großes Becherglas gebracht, 6,7 ccm w/10 Natronlauge für jedes Gramm Zyanid zugesetzt und gut umgerührt, bis sich alles gelöst hat. Man bringt die Lösung dann in eine Flasche und läßt sie bis zum Gebrauch 2 Wochen und länger stehen. Zyanidlösungen werden besser, je länger sie stehen und es ist zweckmäßig, sich gleich einen Vorrat für mindestens 3 Monate herzustellen. Es ist ratsam, an der Zyanidlösung eine leere Probe in folgender Weise anzustellen: 7 ccm Wasser, 2 Tropfen Lithiumsulfatlösung und 2 ccm Zyanidlösung bringe man in ein Reagenzglas, füge 1 ccm Harnsäurereagens hinzu und lasse 2 Minuten lang stehen. Die Lösung muß farblos bleiben. Jetzt wird im siedenden Wasserbade 60 Sekunden lang erhitzt und dann abgekühlt. Möglicherweise

Bestimmung der Harnsäure.

21

entsteht nun eine leichte Färbung. Um zu entscheiden, ob diese wesentlich ist oder nicht, wird die eben beschriebene Probe in zwei Reagenzgläsern und mit Harnsäurevergleichslösung wiederholt. In das eine Reagenzglas kommen 5 ccm der Harnsäurevergleichslösung, in das andere 3 ccm von ihr und 2 ccm Wasser. Nach dem Erhitzen mit den oben angegebenen Mengen der Reagenzien wird auf 10 ccm verdünnt und im Kalorimeter untersucht. Ist das Zyanid tadellos, so wird jetzt die schwächere Harnsäurelösung die theoretisch verlangte Ablesungszahl ergeben: 33,5 mm, wenn die stärkere Lösung auf 20 mm eingestellt ist. 4. Harnsäurevergleichslösung. 1 g Harnsäure (genau gewogen) werden quantitativ in einen Trichter gebracht, der auf einem Kolben von 300 ccm Inhalt steckt. 0,45 bis 0,50 g Lithiumkarbonat werden in einem Becherglas von 300 ccm in 150 ccm Wasser gelöst, indem unter fortwährendem Rühren bis auf 60° erwärmt wird. Wenn alles Karbonat gelöst ist, wird die heiße Flüssigkeit benutzt, um die Harnsäure in den Kolben zu spülen. Die Harnsäure wird sich fast augenblicklich lösen; man kühle dann unter der Wasserleitung unter dauerndem Schütteln ab, überführe die Lösung in einen Meßkolben von 11, spüle sorgfältig nach und fülle zunächst auf etwa 400 bis 500 ccm auf. Dann werden 25 ccm 40% Formalin zugesetzt, gut umgeschüttelt und die Lösung mit 3 ccm Eisessig angesäuert. Nachdem durch wiederholtes Schütteln der größte Teil der Kohlensäure entfernt ist, wird auf 1 1 aufgefüllt und gründlich durchgemischt. Diese Stammlösung wird auf eine Reihe von kleinen Fläschchen (100—150 ccm) verteilt, die Fläschchen gut mit Korkstopfen verschlossen und an einem dunklen Platz aufbewahrt. Solche Vergleichslösungen halten sich mehrere Monate lang unverändert. Die verdünnte Harnsäurevergleichslösung für die Harnsäurebestimmung im Blut, die 0,02 mg Harnsäure in 5 ccm enthält, wird folgendermaßen hergestellt:

22

Bestimmung der Harnsäure.

1 ccm der eben beschriebenen Harnsäureformalinlösung wird in einen Meßkolben von 250 ccm gebracht, die Hälfte Wasser zugegeben, dann 10 ccm % Normalschwefelsäure (wie sie bei der Enteiweißung des Blutes gebraucht wird), ferner 1 ccm 40% Formalinlösung (nicht mehr), bis zur Marke aufgefüllt und ein Etikett mit dem Datum der Anfertigung an die Flasche geklebt . Verdünnte Vergleichslösungen müssen häufiger hergestellt werden, bis die besonderen Bedingungen des betreffenden Laboratoriums für die Dauer der Halt barkeit festgestellt sind. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutfiltrat und 2 ccm Wasser kommen in ein Reagenzglas, das eine Marke für 25 ccm hat. In ein gleiches Glas kommen 5 ccm der verdünnten Harnsäurevergleichslösung und ebenfalls 2 ccm Wasser. Es werden 2—3 Tropfen 20% Lithiumsulfatlösung zu jeder Probe zugesetzt und aus einer Bürette 2 ccm 15% Natriumzyanidlösung. Jetzt werden in jedes Reagenzglas 1 ccm Harnsäurereagens nach Polin und Denis gebracht, durchgemischt und 2 Minuten stehen gelassen. Dann kommen beide Proben für 60 Sekunden in ein siedendes Wasserbad, darauf werden sie unter der Wasserleitung, ohne zu schütteln, abgekühlt bis zur Marke (25 ccm) aufgefüllt und wie gewöhnlich kolorimetrisch verglichen. B e r e c h n u n g , wenn die Vergleichslösung auf 20 mm 20

eingestellt ist: Stand ^—— = ¡--^— X 4 = mg Harnsäure ° der Versuchslosung in 100 ccm Blut, 2. B e s t i m m u n g der H a r n s ä u r e Isoliermethode1).

nach

Folins

P r i n z i p der M e t h o d e : Die Harnsäure wird als Silberurat direkt aus dem Blutfiltrat niedergeschlagen, der Niederschlag wird durch eine NaCl-Lösung zersetzt und die M Journ. biol Chem. 54. 153 (1922).

Bestimmung der Harnsäure.

23

Harnsäure dann kolorimetrisch nach Zusatz von Harnsäurereagens nach Folin-Denis bestimmt. Erforderliche Lösungen: 1. Silberlaktatlösung. 100 g Silberlaktat werden in ungefähr 700 ccm Wasser gelöst. Ferner werden zu 100 ccm 85% Milchsäure 100 ccm einer 10 prozentigen Natriumhydroxydlösung gegeben; diese teilweise neutralisierte Lösung wird zu der Silberlaktatlösung gefügt, die Mischung auf 11 aufgefüllt, beiseite gestellt, damit sich ein etwaiger Niederschlag absetzen kann. Nur die klare Flüssigkeit wird benutzt. 2. NaCl-Lösung. Gebraucht wird eine 10% Natriumchloridlösung in n/10-Salzsäure. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutfiltrat kommen in ein Zentrifugierröhrchen, dazu mit einer Blutpipette 7 ccm Silberlaktatlösung. Man läßt 1 — 2 Minuten absitzen, dann wird zentrifugiert. Sämtliche Harnsäure befindet sich jetzt im Niederschlag. Die überstehende Flüssigkeit wird soweit wie möglich abgegossen, der Niederschlag mit 1 ccm der NaCl-Lösung behandelt, gründlich mit einem feinen Glasfädchen durchgerührt, 4 ccm Wasser hinzugesetzt, noch einmal durchgerührt und dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, die nicht völlig klar zu sein braucht, wird in ein Reagenzglas mit einer Marke bei 25 ccm gegossen. In ein anderes gleiches Reagenzglas werden 5 ccm der Harnsäurevergleichslösung gebracht, zu dem Inhalt beider Gläser je 2 Tropfen Lithiumsulfatlösung, 2 ccm Natriumzyanidlösung und 1 ccm des Harnsäurereagens. Nach dem Umschütteln läßt man 2 Minuten stehen, erhitzt 60 Sekunden lang im siedenden Wasserbade, kühlt ab, füllt bis zur Marke auf und bestimmt kolorimetrisch wie bei der direkten Methode angegeben. B e r e c h n u n g : Stond der Vergleichslösung 4 Hftpn. °

Stand der Versuchslosung

D

säure in 100 ccm Blut.

Diese Lösungen sind bei der direkten Bestimmungsmethode nach Folin beschrieben.

24

Bestimmung der Harnsäuro.

3. B e s t i m m u n g

der

Harnsäure

nach

Benedict1).

P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blutfiltrat wird direkt mit einer Arsenophosphorwolframsäure und mit Natriumzyanid behandelt. Die dabei entstehende blaue Farbe wird mit der einer Harnsäurevergleichslösung verglichen. Notwendige Lösungen: 1. Reagens auf Harnsäure. 100 g reines wolframsaures Natrium bringt man in einen Literkolben und setzt 600 ccm Wasser hinzu. Wenn die Kristalle sich gelöst haben, fügt man 50 g reines Arsenpentoxyd (AS2OB) hinzu, ferner 25 ccm 8 5 % Phosphorsäure und 20 ccm Salzsäure. Die Mischung wird 20 Minuten lang gekocht, abgekühlt und auf 1 1 aufgefüllt. 2. Natriumzyanidlösung. Eine 5 % Lösung von Zyannatrium, die 2 ccm konz. Ammoniak pro Liter enthält. 3. Harnsäurevergleichslösung. 9 g reines kristallisiertes Dinatriumphosphat (Na 2 HP0 4 ) und 1 g kristallisiertes Mononatriumphosphat (NaH 2 P0 4 ) werden in 20D bis 300 ccm heißem Wasser aufgelöst. Sollte die Lösung nicht völlig klar sein, so muß sie filtriert werden. Dann wird sie mit heißem Wasser auf ungefähr 500 ccm gebracht und noch heiß (aber völlig klar) auf 200 mg Harnsäure gegossen, die sich, in wenig Wasser aufgeschwemmt, in einem Meßkolben zu 1 1 befinden. Man schüttelt einige Minuten, bis sich die Harnsäure völlig gelöst hat. Nach dem Abkühlen setzt man 1 ccm (genau) Eisessig hinzu, verdünnt auf 1 1 und schüttelt gut durch. Endlich fügt man 5 ccm Chloroform zu, um Bakterien- und Schimmelwachstum zu verhindern. 5 ccm dieser Lösung enthalten genau 1 mg Harnsäure. Die Lösung hält sich ungefähr 2 Monate, wenn nicht außergewöhnlich hohe Temperaturen im Laboratorium herrschen. Die verdünnte Vergleichslösung, die 0,02 mg Harnsäure in 5 ccm enthält, wird auf folgende Weise bereitet: ') Journ. biol. Chem 51. 187 (1922):

64. 2 3 3 (1922)

Bestimmung der Harnsäure.

25

10 ccm der obigen Harnsäurephosphatlösung werden in einen 500 ccm Meßkolben abgemessen und zur Hälfte mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Es werden 25 ccm verdünnte Salzsäure (1 Vol. konz. Salzsäure auf 10 Vol. Wasser) hinzugegeben und die Lösung auf 500 ccm aufgefüllt. Diese Lösung muß alle 2 Wochen frisch hergestellt werden. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutfiltrat werden in ein Reagenzglas von 18 bis 20 mm Durchmesser gebracht und 5 ccm Wasser hinzugefügt. 5 ccm der Harnsäurelösung, die 0,02 mg Harnsäure enthalten, kommen in ein zweites Reagenzglas und werden gleichfalls mit 5 ccm Wasser verdünnt. Zu beiden Gläsern fügt man aus einer Bürette 4 ccm Natriumzyanidlösung (giftig!) und dann 1 ccm Arsenophosphorwolframsäurelösung. Der Inhalt der Gläser wird nun durchgemischt, indem man sie einmal sofort nach dem Zusätze des Harnäusrereagens umkehrt, dann werden sie sofort in ein siedendes Wasserbad gesetzt, wo sie 3 Minuten lang bleiben, nachdem das letzte Reagenzglas hineingekommen ist. Die Zeit zwischen dem Einsetzen des ersten und des letzten Glases darf aber nicht mehr wie eine Minute betragen. Nachdem sie 3 Minuten lang erhitzt sind, kommen die Gläser in ein großes Becherglas mit kaltem Wasser für weitere 3 Minuten und dann kann die Ablesung im Kolorimeter stattfinden (am besten innerhalb 5 Minuten, nachdem die Gläser aus dem kalten Wasser genommen sind). Es ist zweckmäßig, nicht mehr wie vier Reagenzgläser zugleich mit einer Vergleichslösung in Arbeit, zu haben. B e r e c h n u n g : Benutzt man die Vergleichslösung, die 0,02 mg Harnsäure enthält, und nimmt 5 ccm des Blutfiltrates 1 : 10, so ist die Berechnung folgende: Stand der Vergieichslösung Stand der Versuchslösung

X 4 = mg Harnsäure in 100 ccm Blut.

Bestimmung des Kreatinins.

26

4. H a r n s ä u r e b e s t i m m u n g , m o d i f i z i e r t von Morris und McLeod1). lOccm Blutfiltrat kommen je in zwei Zentrifugierröhrchen, zu jeder Probe J/a ccm 2,5% Chlorzinklösung und 1/2 ccm 10% Natriumkarbonatlösung. Es wird gut umgeschüttelt und 2 Minuten lang zentrifugiert, dann die überstehende Flüssigkeit sorgfältig dekantiert. Zu dem Niederschlag im Zentrifugierröhrchen kommen nun 2 Tropfen 10% Salzsäure, 2 ccm Wasser und 1 ccm 10% Natriumzyanidlösung. Es wird gut umgerührt und die beiden Lösungen werden in einen Meßkolben von 25 ccm übergeführt. Mit einigen Tropfen Wasser wird nachgewaschen. Vergleichslösung: In einen Meßkolben von 100 ccm kommen 1 ccm Harnsäurevergleichslösung, 60 ccm Wasser, 10 ccm Natriumzyanidlösung, 2 ccm Arsenophosphorwolframsäurelösung; dann wird bis zur Marke aufgefüllt. Zur gleichen Zeit wird zu der zu untersuchenden Lösung 72 ccm Arsenophosphorwolframsäure hinzugefügt und auf 25 aufgefüllt. Kolorimetrische Bestimmung wie gewöhnlich, r, c B e r e c h. n u n g0 : Stand — 3der — Vergleichslösung = — — _ — £ ,x, „2,5 = mg0 rr HamStand der Versuchslosung

säure in 100 ccm Blut.

6.

Bestimmung des Kreatinins2). P r i n z i p der M e t h o d e : Das Kreatinin wird mit Hilfe der Farbenreaktion bestimmt, die es bei der J äff eschen Probe mit alkalischer Pikrinsäurelösung gibt. Die Farbe wird mit derjenigen verglichen, die eine Kreatininlösung von bekanntem Gehalt gibt. Erforderliche Lösungen: 1. Gesättigte wäßrige Pikrinsäurelösung. Die Lösung muß. vor Licht geschützt, aufbewahrt werden, weil sich sonst 2

M o r r i s u. Mc L e o d , Journ. biol. Chem. 5«, 55 (1921) ) F o l i n , Journ biol. Chem. 17, 475 (1914).

Bestimmung des Kreatinins.

26

4. H a r n s ä u r e b e s t i m m u n g , m o d i f i z i e r t von Morris und McLeod1). lOccm Blutfiltrat kommen je in zwei Zentrifugierröhrchen, zu jeder Probe J/a ccm 2,5% Chlorzinklösung und 1/2 ccm 10% Natriumkarbonatlösung. Es wird gut umgeschüttelt und 2 Minuten lang zentrifugiert, dann die überstehende Flüssigkeit sorgfältig dekantiert. Zu dem Niederschlag im Zentrifugierröhrchen kommen nun 2 Tropfen 10% Salzsäure, 2 ccm Wasser und 1 ccm 10% Natriumzyanidlösung. Es wird gut umgerührt und die beiden Lösungen werden in einen Meßkolben von 25 ccm übergeführt. Mit einigen Tropfen Wasser wird nachgewaschen. Vergleichslösung: In einen Meßkolben von 100 ccm kommen 1 ccm Harnsäurevergleichslösung, 60 ccm Wasser, 10 ccm Natriumzyanidlösung, 2 ccm Arsenophosphorwolframsäurelösung; dann wird bis zur Marke aufgefüllt. Zur gleichen Zeit wird zu der zu untersuchenden Lösung 72 ccm Arsenophosphorwolframsäure hinzugefügt und auf 25 aufgefüllt. Kolorimetrische Bestimmung wie gewöhnlich, r, c B e r e c h. n u n g0 : Stand — 3der — Vergleichslösung = — — _ — £ ,x, „2,5 = mg0 rr HamStand der Versuchslosung

säure in 100 ccm Blut.

6.

Bestimmung des Kreatinins2). P r i n z i p der M e t h o d e : Das Kreatinin wird mit Hilfe der Farbenreaktion bestimmt, die es bei der J äff eschen Probe mit alkalischer Pikrinsäurelösung gibt. Die Farbe wird mit derjenigen verglichen, die eine Kreatininlösung von bekanntem Gehalt gibt. Erforderliche Lösungen: 1. Gesättigte wäßrige Pikrinsäurelösung. Die Lösung muß. vor Licht geschützt, aufbewahrt werden, weil sich sonst 2

M o r r i s u. Mc L e o d , Journ. biol. Chem. 5«, 55 (1921) ) F o l i n , Journ biol. Chem. 17, 475 (1914).

Bestimmung des Kreatinins.

27

Körper bilden, die eine der Pikraminsäure ähnliche Färbung liefern. Die Pikrinsäure des Handels ist oft nicht rein genug, dann muß sie aus heißem Wasser sorgfältig umkristallisiert werden. Ihre Reinheit ist eventuell nach der Methode von Fol in und Denis 1 ) zu prüfen. 2. 10% Natronlauge. 3. Kreatininvergleichslösung. 1,61 g Kreatininchlorzink oder 1 g reines Kreatinin werden in 1 1 ^ HCl gelöst. Die Lösung ist gut haltbar. (Enthält 1 mg Kreatinin in 1 com.) 6 ccm dieser Kreatininlösung ( = 6 mg Kreatinin) werden in einem Litermeßkolben mit 10 ccm Normal-HCl versetzt und bis zur Marke aufgefüllt. Dann setze man 5 Tropfen Toluol hinzu. 5 ccm der Lösung enthalten 0,03 mg Kreatinin. Kreatininchlorzink oder Kreatinin gewinnt man nach folgender Vorschrift 2 ): 101 frischer Harn werden mit 180 g Pikrinsäure, gelöst in 450 ccm kochendem Alkohol, versetzt. Man rührt gut um und läßt über Nacht stehen. Dann gießt man die Flüssigkeit vom Niederschlage ab, bringt ihn auf ein Saugfilter, wäscht ihn dort mit kalter, gesättigter Pikrinsäurelösung aus und saugt ihn möglichst trocken. Zu je 100 g dieses Kreatininkaliumpikrates gibt man 60 ccm konz. Salzsäure, rührt die Masse im Mörser 3 bis 5 Minuten lang zu einer gleichmäßigen, dünnen Paste, saugt dann durch ein gehärtetes Filter von der Pikrinsäure ab und wäscht zweimal mit soviel Wasser nach, daß jedesmal gerade der Niederschlag bedeckt ist. Das Filtrat bringt man in einen geräumigen Kolben, neutralisiert es mit einem Überschuß von festem MgO, indem man nach und nach kleine Mengen zugibt und jedesmal unter der Wasserleitung kühlt. Der Niederschlag wird abgesaugt, der Rückstand zweimal mit wenig Wasser gewaschen. Das Filtrat wird nun mit einigen Kubikzentimetern Eisessig bis zur stark sauren Reaktion versetzt, mit ') F o l i n und D e n i s , Journ. biol. Chem. 28, 349 (1916/17). ) B e n e d i c t . Journ. biol. Chem. 18, 183 (1914).

2

28

Bestimmung des Kreatinins.

dem vierfachen Volumen 96% Alkohols verdünnt und nach 15 Minuten langem Stehen an der Saugpumpe abfiltriert. Das neue Filtrat wird mit 30 bis 40 ccm 30% alkoholischer ZnCI2-Lösung versetzt, umgerührt und über Nacht an einen kühlen Ort (Eisschrank) zur Kristallisation gestellt. Die ausgeschiedenen Kristalle werden auf einem Saugfilter gesammelt, einmal kurz mit Wasser gewaschen, dann gründlich mit 50% Alkohol, zum Schluß mit 96% Alkohol und nun getrocknet. Ausbeute 90 bis 95% des überhaupt vorhandenen Kreatinins. Das Salz wird noch einmal umkristallisiert nach folgender Vorschrift: 10 g Kreatininchlorzink werden mit 100 ccm Wasser und 60 ccm Normalschwefelsäure bis zur klaren Lösung gekocht, dann mit etwa 4 g Tierkohle versetzt, noch eine Minute im Sieden gehalten und dann an der Pumpe abgesaugt Man gießt die ersten Anteile zurück auf das Filter, um ein vollkommenes klares farbloses Filtrat zu erhalten. Die Tierkohle wird mit etwas kochendem Wasser ausgewaschen und das noch heiße Filtrat mit 3 ccm Chlorzinklösung und 7 g Kaliumazetat, in wenig Wasser gelöst, versetzt. Nach 10 Minuten wird mit dem doppelten Volumen 96% Alkohol verdünnt und zur Kristallisation in den Eisschrank gestellt. Die ausgeschiedenen Kristalle von Kreatininchlorzink werden zuerst von der Mutterlauge durch Dekantieren getrennt, dann mit dem Doppelten ihres Gewichtes an Wasser durchgerührt, und um das Kaliumazetat zu entfernen, abfiltriert, erst mit kaltem Wasser, dann mit 95% Alkohol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 8 bis 9 g schneeweißes Kreatininchlorzink. Hieraus erhält man Kreatinin folgendermaßen: Die eben erhaltenen Kristalle von Kreatininchlorzink werden fein gepulvert und in einem trockenen Kolben mit dem Siebenfachen ihres Gewichtes an konz. Ammoniak übergössen. Die Flüssigkeit wird erwärmt und vorsichtig geschüttelt, bis alles in Lösung gegangen ist, ohne daß viel Ammoniak entwichen ist. Der Kolben wird mit einem

Bestimmung des Kreatinins.

29

Stopfen verschlossen und auf 1 bis 2 Stunden in den Eisschrank gestellt. Dann kristallisiert das reine Kreatinin in einer Ausbeute von 60 bis 80% aus. Es wird rasch durch ein kleines Filter abgesaugt und einmal mit kaltem destillierten Wasser nachgewaschen. Ist das Produkt noch gelblich gefärbt, so kann man es noch einmal in dem Fünffachen seines Gewichtes an warmem konzentrierten Ammoniak lösen und durch Abkühlen wieder auskristallisieren lassen. Zum Schluß kristallisiert man es aus einer kleinen Menge siedenden Alkohols um. Das gewonnene Produkt ist rein und kann für die kolorimetrischen Bestimmungen des Kreatinins als Vergleichssubstanz gebraucht werden. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : Man bereite sich zunächst eine alkalische Lösung von reiner Pikrinsäure, indem man 25 ccm (oder 50 ccm) gesättigte Pikrinsäurelösung in eine Flasche bringt, 5 ccm (oder 10 ccm) 10% Natriumhydroxydlösung zugibt und gut umschüttelt. 10 ccm Blutfiltrat kommen in einen kleinen Kolben oder in ein Reagenzglas, 5 ccm der Kreatininvergleichslösung in ein anderes, die letzteren werden mit 20 ccm Wasser verdünnt. Zu dem Blutfiltrat werden 5 ccm der frisch bereiteten alkalischen Pikrinsäurelösung gesetzt, zu der Vergleichslösung 10 ccm. Man wartet 8 bis 10 Minuten und macht dann die kolorimetrische Bestimmung in der üblichen Weise. Dabei soll man nie vergessen, sich davon zu überzeugen, daß beide Seiten des Kolorimeters gleichen Stand aufweisen müssen, wenn die beiden Seiten mit der Vergleichslösung gefüllt sind. Die Ablesung soll beendet sein in 15 Minuten, nachdem die alkalische Pikrinsäurelösung zugesetzt wurde. Es ist daher nicht ratsam, mehr wie 3 bis 5 Blutfiltrate auf einmal zu verarbeiten. B e r e c h n u n g : Der Stand der Vergleichslösung in Millimetern (gewöhnlich20) multipliziert mit 1,5;3;4,5oder 6 (je nach der gebrauchten Menge Vergleichslösung) und dividiert durch den Stand der Versuchslösung, in Millimetern, ergibt den Gehalt an Kreatinin in Milligramm in 100 ccm

30

Bestimmung des Kreatins and Kreatinins (Gesamtkreatinin).

Blut. Bei dieser Berechnung sei daran erinnert, daß die Vergleichslösung doppelt so stark verdünnt ist wie die Versuchslösung, so daß je 5 ccm der Vergleichslösung, die 0,03 mg Kreatinin enthalten, 0,015 mg im Blutfiltrat entsprechen. 7.

Bestimmung des Kreatins und Kreatinins (Gesamtkreatinin). P r i n z i p der M e t h o d e : Im Blut ist viel mehr Kreatin wie Kreatinin vorhanden. Um das Kreatin zu bestimmen, wird es in Kreatinin übergeführt. Dies geschieht durch Erhitzen im Autoklaven mit Normalsalzsäure 20 Minuten lang bei 130°. Dann wird das gesamte Kreatinin kolorimetrisch bestimmt. Erforderliche Lösungen: Eine Normal-HCl-Lösung, außer den Lösungen, die in Nr. 6 erforderlich sind. Für diese Bestimmung ist ein Autoklav notwendig, der auf 150° erhitzt werden kann. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutfiltrat werden in ein Reagenzglas aus Jenenser Glas pipettiert. Das Reagenzglas muß 50 bis 75 ccm fassen können und eine Marke für 25 ccm haben. Es wird 1 ccm n-HCl hinzugefügt, die Öffnung des Glases mit Stanniolpapier bedeckt und das Glas dann 20 Minuten auf 130° im Autoklaven erhitzt. Den Autoklaven öffne man erst wieder, wenn die Temperatur unter 100° gefallen ist; man nimmt das Reagenzglas heraus und kühlt es unter der Wasserleitung ab. Dann setzt man 5 ccm alkalische Pikrinsäurelösung hinzu, wartet 8 bis 10 Minuten und füllt bis auf 25 ccm auf. Die Vergleichslösung wird bereitet, indem 10 ccm der Kreatininlösung in einen Meßkolben von 50 ccm gebracht werden. Zu diesen gibt man 2 ccm n-HCl und 10 ccm alkalische Pikrinsäurelösung, läßt 8 bis 10 Minuten lang stehen und füllt bis auf 50 ccm auf.

30

Bestimmung des Kreatins and Kreatinins (Gesamtkreatinin).

Blut. Bei dieser Berechnung sei daran erinnert, daß die Vergleichslösung doppelt so stark verdünnt ist wie die Versuchslösung, so daß je 5 ccm der Vergleichslösung, die 0,03 mg Kreatinin enthalten, 0,015 mg im Blutfiltrat entsprechen. 7.

Bestimmung des Kreatins und Kreatinins (Gesamtkreatinin). P r i n z i p der M e t h o d e : Im Blut ist viel mehr Kreatin wie Kreatinin vorhanden. Um das Kreatin zu bestimmen, wird es in Kreatinin übergeführt. Dies geschieht durch Erhitzen im Autoklaven mit Normalsalzsäure 20 Minuten lang bei 130°. Dann wird das gesamte Kreatinin kolorimetrisch bestimmt. Erforderliche Lösungen: Eine Normal-HCl-Lösung, außer den Lösungen, die in Nr. 6 erforderlich sind. Für diese Bestimmung ist ein Autoklav notwendig, der auf 150° erhitzt werden kann. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutfiltrat werden in ein Reagenzglas aus Jenenser Glas pipettiert. Das Reagenzglas muß 50 bis 75 ccm fassen können und eine Marke für 25 ccm haben. Es wird 1 ccm n-HCl hinzugefügt, die Öffnung des Glases mit Stanniolpapier bedeckt und das Glas dann 20 Minuten auf 130° im Autoklaven erhitzt. Den Autoklaven öffne man erst wieder, wenn die Temperatur unter 100° gefallen ist; man nimmt das Reagenzglas heraus und kühlt es unter der Wasserleitung ab. Dann setzt man 5 ccm alkalische Pikrinsäurelösung hinzu, wartet 8 bis 10 Minuten und füllt bis auf 25 ccm auf. Die Vergleichslösung wird bereitet, indem 10 ccm der Kreatininlösung in einen Meßkolben von 50 ccm gebracht werden. Zu diesen gibt man 2 ccm n-HCl und 10 ccm alkalische Pikrinsäurelösung, läßt 8 bis 10 Minuten lang stehen und füllt bis auf 50 ccm auf.

81

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs „

.

Berechnung: °

Stand der Vergleichslösung ^Ä £ , ... Stand der zu untersuch. Losung

X o = mg

°

Gesamtkreatinin in 100 ccm Blut. Normales menschliches Blut enthält etwa 6 mg Gesamtkreatinin in 100 ccm. 8.

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.l) P r i n z i p der M e t h o d e : Diese Methode beruht auf der Farbenreaktion, die Aminosäuren mit ß - N a p h t h o c h i n o n sulfosäure in alkalischer Lösung geben. Erforderliche Lösungen: 1. Eine frisch bereitete Lösung von 0 , 5 % /?-naphthochinonsulfosaurem Natrium. Darstellung von /?-naphthochinonsulfosaurem Natrium. (Eingehende Beschreibung der Methode von Folin.) Um 75—90 g der reinen Substanz zu erhalten, sind folgende Mengen von Reagenzien nötig: 1000 ccm kalte 1 0 % Schwefelsäure, 100 ccm konz. Salpetersäure, 500 ccm konz. Salzsäure, 300 ccm 1 0 % Natriumhydroxydlösung, 2000 ccm 1 0 % Natriumchloridlösung, 1 ccm Brom, 50 g Natriumnitrit, 100 g Natriumnitrat, 50 g Natriumsulfit, 100 g Natriumbisulfit, 400 g Borax, 100 g reines $-Naphthol, etwa 2000 ccm Alkohol, etwa 200 ccm Äther, 1000 g Eis. a) Man bringt 100 g jS-Naphthol in ein Becherglas von 1 1 Inhalt, setzt 300 ccm 1 0 % Natriumhydroxydlösung hinzu ») F o l i n , Journ. biol. ehem. 61, 377 (1922).

81

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs „

.

Berechnung: °

Stand der Vergleichslösung ^Ä £ , ... Stand der zu untersuch. Losung

X o = mg

°

Gesamtkreatinin in 100 ccm Blut. Normales menschliches Blut enthält etwa 6 mg Gesamtkreatinin in 100 ccm. 8.

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.l) P r i n z i p der M e t h o d e : Diese Methode beruht auf der Farbenreaktion, die Aminosäuren mit ß - N a p h t h o c h i n o n sulfosäure in alkalischer Lösung geben. Erforderliche Lösungen: 1. Eine frisch bereitete Lösung von 0 , 5 % /?-naphthochinonsulfosaurem Natrium. Darstellung von /?-naphthochinonsulfosaurem Natrium. (Eingehende Beschreibung der Methode von Folin.) Um 75—90 g der reinen Substanz zu erhalten, sind folgende Mengen von Reagenzien nötig: 1000 ccm kalte 1 0 % Schwefelsäure, 100 ccm konz. Salpetersäure, 500 ccm konz. Salzsäure, 300 ccm 1 0 % Natriumhydroxydlösung, 2000 ccm 1 0 % Natriumchloridlösung, 1 ccm Brom, 50 g Natriumnitrit, 100 g Natriumnitrat, 50 g Natriumsulfit, 100 g Natriumbisulfit, 400 g Borax, 100 g reines $-Naphthol, etwa 2000 ccm Alkohol, etwa 200 ccm Äther, 1000 g Eis. a) Man bringt 100 g jS-Naphthol in ein Becherglas von 1 1 Inhalt, setzt 300 ccm 1 0 % Natriumhydroxydlösung hinzu ») F o l i n , Journ. biol. ehem. 61, 377 (1922).

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Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.

und rührt mit einem Glasstabe um, bis völlige Lösung erfolgt ist (etwa 10 bis 15 Minuten). b) 50 bis 55 g Natriumnitrit werden in einem Becherglase von 4 1 Inhalt mit 600 com Wasser versetzt und geschüttelt, bis alles gelöst ist (etwa 3 bis 5 Minuten). c) Die alkalische Lösung von ß-Naphthol wird in das Becherglas von 41 Inhalt, das die Nitritlösung enthält, gegossen und mit etwa 100 ccm Wasser nachgespült. d) Zu der Mischung von Naphthol und Nitrit werden 800 g zerkleinertes Eis gegeben. e) 200 ccm kalter, verdünnter (10%) Schwefelsäure werden in einem Meßzylinder abgemessen und langsam an der Seitenwand des Becherglases, das die Reaktionslösung enthält, herabgegossen, indem man während des Eingießens stark und andauernd mit einem starken Glasstabe umrührt. Die Operation dauert etwa 1 bis 2 Minuten. Man setze das Rühren noch etwa 1 bis 2 Minuten lang fort, nachdem die Schwefelsäure zugesetzt ist. Dann füllt man den Meßzylinder ein zweites Mal mit Schwefelsäure und läßt diese in der gleichen Weise zufließen. Der Zusatz von Schwefelsäure, jedesmal 200 ccm, wird solange wiederholt, bis 800 ccm verbraucht sind. Es muß solange Schwefelsäure zugesetzt werden, bis die Mischung im Becherglase eine deutliche und dauernde Reaktion auf Kongopapier gibt (Dauer der ganzen Operation etwa 15 bis 20 Minuten). Beim ersten Zusatz der Säure beginnt sich ein gelber Niederschlag zu bilden, der ständig zunimmt, bis die ganze Reaktionsflüssigkeit sich in eine halbfeste Paste verwandelt hat. Der Niederschlag muß eine leicht grünliche Färbung haben; ist er ausgesprochen grün, so waren die Bedingungen nicht gut getroffen und die Ausbeute wird weniger gut. Man läßt nun nach dem Zusatz des letzten Quantums Säure 1 Stunde lang stehen. Es ist wichtig, dies nicht zu unterlassen, denn ohne das Stehenlassen bleibt viel unverändertes ß- Naphthol in der Reaktionsflüssigkeit zurück und stört, wenn man den Niederschlag in Sulfit auflösen will. Ein längeres Stehenlassen schadet nicht, ist aber überflüssig.

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.

33

f) Es wird nun durch einen Buchnertrichter von 20 cm Durchmesser unter mäßigem Saugen filtriert und mit etwa 1500 ccm kaltem Wasser nachgewaschen. g) Der Niederschlag (Nitroso-/?-Naphthol) wird nun in eine geräumige Abdampfschale gespritzt und 100 g Natriumbisulfit und 50 g Natriumsulfit darüber gestreut; man rührt mit einem Glas- oder Emaillelöffel gut um. Es entsteht eine außerordentlich leicht lösliche Bisulfitverbindung und der Niederschlag geht in Lösung. Es wird sofort durch eine Saugflasche (Filterdurchmesser 12 bis 15 cm) durch eine doppelte Lage von gutem Filtrierpapier filtriert, um einen geringen schwarzen Rückstand zu entfernen und mit wenig Wasser nachgewaschen. h) Das Filtrat und das Waschwasser werden sofort, um starke Färbung zu vermeiden, in einen 5 1-Kolben gebracht oder in eine weithalsige Flasche aus dunklem Glas, die 2000 ccm Wasser und 500 ccm konz. Salzsäure enthält. Man bedeckt mit einem Trichter oder zwei Uhrgläsern und läßt in einem dunklen Raum 36 Stunden lang stehen (24 Stunden ist nicht lange genug). Der ganze Kolben füllt sich mit einem Netzwerk weißer Nadeln, die eine geringe Menge schwarzer und rötlicher Verunreinigung mit niederreißen. Je länger die Reaktionslösung dem Licht ausgesetzt gewesen ist, um so größer ist die Menge der gefärbten Zersetzungsprodukte. Man filtriert durch ein Saugfilter von ungefähr 20 cm Durchmesser unter mäßigem Saugen und wäscht mit ungefähr 2 1 kalten Wassers nach. i) Man spritzt den Niederschlag (l-Amino-2-naphthol-4schwefelsäure) mit wenig Wasser auf ein großes Stück Filtrierpapier und von da in ein Becherglas von 3 bis 4 1 Inhalt. Es werden 100 g Natriumnitrat darüber gestreut. Nun werden 100 ccm konz. Salpetersäure mit 350 ccm verdünnt und die ganze Menge der lauwarmen Flüssigkeit in das Becherglas gegossen. Die Reaktion beginnt sofort unter Entwicklung von Stickoxyd. Ohne zu rühren, überläßt man die Flüssigkeit sich selbst etwa 10 Minuten lang, bis die H a n d e l u* S t e u d e l , Blutuntersnehungen.

2. Aufl.

3

34

Bestimmung des AminosänrenstickstoSs

größte Reaktion vorüber ist. Dann rührt man gründlich einige Minuten lang durch und überläßt dann die Reaktionsmasse weitere 20 bis 30 Minuten sich selbst. Tritt keine sichtbare Reaktion auf den Zusatz der Salpetersäure ein, so liegt der Grund dafür möglicherweise in der Gegenwart von Natriumkarbonat in dem benutzten Natriumnitrat. Ist keine Reaktion eingetreten, so setze man 1 bis 5 ccm konz. Salpetersäure hinzu. Nach Vi Stunde wird durch eine Saugflasche abfiltriert (Durchmesser der Filterfläche 15 cm) und mit etwa 1000 ccm 10% Natriumchloridlösung nachgewaschen. Das schwach-braune Produkt auf dem Filter ist das gewünschte Natriumsalz der 1-2-4-Naphthochinonsulfosäure. Aber es ist noch nicht genügend rein. Es enthält noch schwarz gefärbte Zersetzungsprodukte und Spuren von Ammoniak. Während def Oxydation mit Salpetersäure werden beträchtliche Mengen von Ammoniak gebildet (aus der Amidogruppe), aber wegen der Gegenwart von großen Mengen von Natriumnitrat werden nur geringe Mengen von Ammoniak als Ammoniumsalz des Chinonderivates niedergeschlagen. Durch Umkristallisieren nach den unter k) beschriebenen Bedingungen wird das Produkt von allen Verunreinigungen befreit. k) Der noch feuchte Niederschlag wird in eine geräumige Porzellanschale gebracht und mit 200 g gepulvertem Borax und 450 ccm Wasser versetzt. Man mischt mit einem Pistill durch, bis sich alles bis auf wenige Flocken aufgelöst hat; es wird nun durch ein gutes Filtrierpapier an einer Saugflasche von 10 cm Filterflächendurchmesser vom überschüssigen Borax und von einem geringen schwarzen Rückstände filtriert. Wegen des letzteren darf die Filtration nur unter geringem Saugen ziemlich langsam ausgeführt werden. Es wird mit 100 bis 150 ccm Wasser nachgewaschen. Während der Filtration werden 850 ccm 9 5 % Alkohol und 150 ccm konz. Salzsäure in einen Kolben gebracht. Der Kolbenhals wird mit einem Becherglase bedeckt und dann der Inhalt unter der Wasserleitung gekühlt.

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.

35

Das Filtrat, das das Chinonderivat und Borax enthält, wird in ein Becherglas von etwa 4 1 Inhalt gebracht, dann werden zu dem abgekühlten salzsauren Alkohol einige Tropfen Brom gesetzt und, wenn alles Brom sich aufgelöst hat, wird diese strohgelbe Lösung zu der in dem Becherglase befindlichen Flüssigkeit gegossen und schnell und kräftig einige Augenblicke umgerührt, um völlige Mischung zu erzeugen. Man läßt 5 Minuten lang stehen. Nach Ablauf dieser Zeit ist alles Chinonderivat auskristallisiert. Es wird auf einer Saugflasche (Durchmesser der Filterplatte 15 cm) filtriert und mit 700 bis 800 ccm 10% Natriumchloridlösung nachgewaschen. Diese erste Umkristallisation genügt, um das Präparat gehörig farblos zu erhalten, aber es enthält nun noch etwas Ammoniak, das durch eine nochmalige Umkristallisation entfernt werden muß. Diese letzte Umkristallisation wird in der gleichen Weise wie die erste ausgeführt, nur wird das Auswaschen des Niederschlages auf der Saugflasche mit Natriumchloridlösung unterlassen und durch ein Waschen zuerst mit 300— 400 ccm Alkohol und endlich mit 200 ccm Äther ersetzt . So werden 75 bis 90g absolut reines jß-naphthochinonsulfosaures Natrium erhalten. Der eben beschriebene Reinigungsprozeß beruht auf einer großen Reihe von Versuchen, die angestellt wurden, um ein farbloses Produkt zu erhalten. Die Substanz kann nicht aus Wasser allein umkristallisiert werden, weil bei jeder Auflösung sich immer etwas von der Substanz zersetzt und man zum Schluß dann stärker gefärbte Präparate erhält wie die als Ausgangsmaterial benutzten. Die folgenden Proben auf Reinheit des ß-naphthochinonsulfosauren Natriums sind vielleicht von einigem Nutzen: F a r b e : Man bereite eine 1 % Lösung des Chinonderivates in Wasser und vergleiche sie mit der Farbe einer 0,5 n-Lösung von Kaliumbichromat, wenn die letztere auf 20 mm im Kolorimeter eingestellt ist. Die Chinonlösung muß dann eine Ablesung von 26 bis 27 ergeben. 3*

36

Bestimmung des Aminosäurenstickstoffs.

G e f ä r b t e Z e r s e t z u n g s p r o d u k t e : 2 com frisch bereiteter 1 prozentiger Chinonlösung kommen in ein Reagenz glas und werden auf 25 ccm verdünnt. Dann setzt man hinzu: erstens 1 ccm 5 0 % Essigsäure, sodann 1 ccm 1 5 % Natriumthiosulfatlösung. Die Lösung wird im Laufe weniger Sekunden so ausbleichen, daß man nur eine schwach gelbliche Färbung erkennen kann, wenn man der Länge nach durch das Reagenzglas sieht. A m m o n i a k : 10 ccm der Chinonlösung wie oben bringt man in einen kleinen Kolben, setzt etwa 2 g Permutit hinzu und schüttelt langsam etwa 3 bis 4 Minuten. Man dekantiert und wäscht mit destilliertem Wasser vier- oder fünfmal nach, bis alle gelbe Farbe verschwunden ist. Dann setzt man zu dem Permutitpulver einige Tropfen 1 0 % Natriumhydroxydlösung, 5 ccm Wasser und 5 ccm Neßlers Lösung. Es darf keine gelbe Färbung auftreten. 2. Natriumkarbonatlösung von folgender Konzentration: 50 ccm fast gesättigter Sodalösung werden auf 500 verdünnt. 20 ccm 0,1 norm. HCl werden mit dieser Sodalösung mit Methylrot als Indikator titriert. Die Sodalösung wird nun so verdünnt, daß 8,5 ccm 20 ccm 0,1 norm. Salzsäure entsprechen. 3. Essigsäure-Azetatlösung folgender Konzentration: 100 ccm 5 0 % Essigsäure werden mit dem gleichen Volumen einer 5 % Natriumazetatlösung verdünnt. 4. Natriumthiosulfatlösung: Eine 4 % Lösung des kristallisierten Salzes. 5. Aminosäurevergleichslösung: Eine Lösung von Glykokoll, Leuzin, Phenylalanin oder Tyrosin, die 0,07 mg Stickstoff im Kubikzentimeter enthält. Die Aminosäure wird in j^HCl gelöst und bis zum gewünschten Vo lumen aufgefüllt, nachdem man vorher noch 0 , 2 % Natriumbenzoat zugegeben hat. Die Lösung ist unbegrenzt haltbar. Oft wird es zweckmäßig sein sich eine Vorratslösung herzustellen, die 0,1 mg N im ccm enthält. Die Vergleichslösung für das Blut erhält man

Bestimmung des Traubenzuckers.

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dann, indem man 70 ccm der Vorratslösung mit ^ HCl auf 100 ccm auffüllt. Glykokoll enthält 18,68% N; man muß also 0,5353 g auf 1000 ccm auffüllen, um eine Lösung zu erhalten, die 0,1 mg N in 1 ccm enthält. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 10 ccm Blutfiltrat kommen in ein großes Reagenzglas, das eine Marke bei 25 ccm trägt. In ein anderes Reagenzglas von gleicher Größe mißt man 1 ccm der Aminosäurenvergleichslösung und bringt dann in jedes Reagenzglas 1 Tropfen Phenolphthalein. Zu der Vergleichslösung fügt man nun 1 ccm der Sodalösung von bekanntem Gehalt, zu der zu untersuchenden Lösung setzt man sie tropfenweise, bis sie dieselbe rötliche Farbe hat wie die Vergleichslösung (6 bis 8 Tropfen werden für gewöhnlich ausreichen). Dann kommen 2 ccm der frisch bereiteten 0,5% Naphthochinonsulfosäurelösung zu jeder Probe, es wird gut umgeschüttelt und bis zum nächsten Tage an einem völlig dunklen Platze stehen gelassen. Am anderen Tage werden zunächst 2 ccm Essigsäure-Azetatgemisch und dann 2 ccm der Thiosulfatlösung zugegeben. Hierdurch wird der Überschuß an Reagens entfärbt. Nun wird bis zur Marke 25 aufgefüllt, umgeschüttelt und im Kolorimeter verglichen. Die Vergleichslösung wird auf 20 eingestellt. Berechnung säurestickstoff in 100 ccm Blut. Normales Blut enthält 6—8 mg Aminosäurestickstoff in 100 ccm. 9.

Bestimmung des Traubenzuckers. I. B e s t i m m u n g n a c h F o l i n und Wu 1 )P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blutfiltrat wird gleichzeitig mit einer Vergleichszuckerlösung mit schwach a l k a l i >) F o l i n und Wu. Journ. biol. Chem. 41, 367 (1920).

Bestimmung des Traubenzuckers.

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dann, indem man 70 ccm der Vorratslösung mit ^ HCl auf 100 ccm auffüllt. Glykokoll enthält 18,68% N; man muß also 0,5353 g auf 1000 ccm auffüllen, um eine Lösung zu erhalten, die 0,1 mg N in 1 ccm enthält. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 10 ccm Blutfiltrat kommen in ein großes Reagenzglas, das eine Marke bei 25 ccm trägt. In ein anderes Reagenzglas von gleicher Größe mißt man 1 ccm der Aminosäurenvergleichslösung und bringt dann in jedes Reagenzglas 1 Tropfen Phenolphthalein. Zu der Vergleichslösung fügt man nun 1 ccm der Sodalösung von bekanntem Gehalt, zu der zu untersuchenden Lösung setzt man sie tropfenweise, bis sie dieselbe rötliche Farbe hat wie die Vergleichslösung (6 bis 8 Tropfen werden für gewöhnlich ausreichen). Dann kommen 2 ccm der frisch bereiteten 0,5% Naphthochinonsulfosäurelösung zu jeder Probe, es wird gut umgeschüttelt und bis zum nächsten Tage an einem völlig dunklen Platze stehen gelassen. Am anderen Tage werden zunächst 2 ccm Essigsäure-Azetatgemisch und dann 2 ccm der Thiosulfatlösung zugegeben. Hierdurch wird der Überschuß an Reagens entfärbt. Nun wird bis zur Marke 25 aufgefüllt, umgeschüttelt und im Kolorimeter verglichen. Die Vergleichslösung wird auf 20 eingestellt. Berechnung säurestickstoff in 100 ccm Blut. Normales Blut enthält 6—8 mg Aminosäurestickstoff in 100 ccm. 9.

Bestimmung des Traubenzuckers. I. B e s t i m m u n g n a c h F o l i n und Wu 1 )P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blutfiltrat wird gleichzeitig mit einer Vergleichszuckerlösung mit schwach a l k a l i >) F o l i n und Wu. Journ. biol. Chem. 41, 367 (1920).

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Bestimmung des Traubenzuckers.

scher Kupfertartratlösung gekocht. Dann wird Phosphormolybdänsäure zugesetzt. Diese löst das ausgeschiedene Kupferoxydul auf, das letztere wird oxydiert, während die Phosphormolybdänsäure unter Bildung einer blauen Farbe reduziert wird. Diese blaue Farbe der zu untersuchenden Lösung wird mit der der Vergleichslösung kolorimetrisoh verglichen. Erforderliche Lösungen: 1. Vergleichszuckerlösungen: a) 1% Traubenzuckerlösung in 0,3% Benzoesäurelösung (es werden 100 ccm angefertigt und die Lösung in gut verschlossener Flasche an einem kühlen Ort aufbewahrt). b) 5 ccm dieser Lösung werden mit 0,3% Benzoesäure lösung auf 500 ccm verdünnt und wie a) aufbewahrt (1 mg Traubenzucker in 10 ccm). c) 5 ccm der Lösung a) werden auf 250 ccm mit 0,3% Benzoesäurelösung aufgefüllt und wie b) behandelt (2 mg Traubenzucker in 10 ccm). 2. Alkalische Kupfertartratlösung: 40 g wasserfreies Na2GOs werden in 400 ccm Wasser gelöst und in einen 11-Meßkolben gebracht. Dann setze man 7,5 g Weinsäure und 4,5 g kristallisiertes Kupfersulfat (CuS0 4 5H 2 0) hinzu, löse alles auf und fülle auf 1 1 auf. 3. Phosphormolybdänsäurelösung: 35 g Molybdänsäure werden in einem Becherglase von etwa 1 1 Inhalt mit 5 g wolframsaurem Natrium, 200 ccm 10% Natronlauge und 200 ccm Wasser versetzt und 30 Minuten lang stark gekocht, um etwaige kleine Mengen von Ammoniak zu vertreiben. Nach dem Abkühlen wird die Lösung auf etwa 350 ccm gebracht, mit. 125 ccm sirupöser Phosphorsäure (spez. Gew. 1.71) versetzt, und auf 500 ccm aufgefüllt. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 2 ccm des eiweißfreien Blutfiltrates pipettiert man in ein Folinsches Zuckerreagenzglas (siehe Fig. 3). In ein zweites solches Glas kommen 2 com der Vergleichslösung b) = 0,2 mg

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Bestimmung des Traubenzuckers.

Zucker, in ein drittes 2 com der Vergleichslösung c) = 0,4 mg Zuckei. In jedes Glas bringt man ferner 2 ccm der alkalischen Kupferlösung. Nun setze man die Gläser 6 Minuten in ein kochendes Wasserbad, darauf 3 Minuten in kaltes Wasser. Dabei vermeide man unnötiges Schütteln. Zu jedem Glase gebe man nun 2 ccm Phosphormolybdänsäurelösung. Wenn das Kupferoxydul gelöst ist (meist in 2 Minuten), füllt man auf 25 ccm auf, schließt die Gläser mit einem sauberen Stopfen, schüttelt gut um und wählt zum kolorimetrischen Vergleich nach voller Entwicklung der blauen Farbe (frühestens nach 5 Minuten), spätestens nach 1 Stunde, das der zu bestimmenden Lösung im Farbenton am nächsten stehende Reagenzglas. Die beiden Vergleichslösungen erstrecken sich über einen Spieh'aum von 70 bis fast 400 mg Traubenzucker in 100 ccm Blut. B e r e c h n u n g : Ist zum Vergleich das 0,2 mg Traubenzucker enthaltende Röhrchen genommen, so ergibt sich, wenn die Vergleichslösung auf 20 eingestellt war, folgende einfache Berechnung:

ri

20

Traubenzucker in 100 ccm — X 100 = mg & y

Fig. 3. Folins Zucker-

Blut, wo y den Stand der zu bestimmenden Lösung bedeutet. reagenzglas War die Vergleichslösung c) gewählt, so muß das Resultat noch mit 2 multipliziert werden. Normales Blut enthält etwa 60 bis 110 mg Traubenzucker in 100 ccm. 2. Z u c k e r b e s t i m m u n g n a c h L e w i s und B e n e d i c t 1 ) , modifiziert von Benedict2). P r i n z i p der M e t h o d e : Die rote Farbe, die man *) L e w i s und B e n e d i c t , Journ. biol. Chem. 20, 61 (1915). Andere Modifikationen siehe P e a r c e , Journ. biol. Chem. 22, 525 (1915); M y e r s und B a i l e y , Journ. biol. Chem. 24, 147 (1916). 2 ) Journ biol. Chem. 84, 203 (1918).

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Bestimmung des Traubenzuckers.

erhält, wenn man Glukose mit Pikrinsäure bei sodaalkalischer Reaktion erhitzt, wird als Grundlage für die kolorimetrische Bestimmung benutzt. Erforderliche Lösungen: 1. 36 g trockene Pikrinsäure werden in einem Literkolben mit 500 ccm einer 1 % Lösung von Natriumhydroxyd versetzt und 400 ccm heißes Wasser hinzugegeben. Hat sich alles gelöst, läßt man erkalten und füllt auf 1 1 auf. 2. Vergleichslösung von Pikraminsäure. Diese Lösung wird aus einer Vorratslösung hergestellt, die 100 mg Pikraminsäure und 200 mg Natriumkarbonat im Liter enthält. 126 ccm dieser Lösung werden mit 1 ccm einer 20% Natriumkarbonatlösung und 15 ccm der unter 1 erwähnten Pikrat-Pikrinsäurelösung versetzt und auf 300 ccm mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Diese Lösung besitzt die gleiche Farbe wie 0,64 mg Glukose, wenn sie, wie jetzt beschrieben, behandelt wird und auf 12,5 ccm gebracht wird. Das Bluteiweiß wird mit Pikrinsäure ausgefällt und entfernt. Eine Vergleichslösung kann man sich auch bereiten, wenn man 800 mg reines Kaliumbichromat in 1 1 Wasser auflöst, aber die Farbe hat nicht genau dieselbe Nuance. Endlich kann man noch eine andere Vergleichslösung erhalten, wenn man 0,64 mg Glukose in 4 ccm Wasser mit 4 ccm Pikrat-Pikrinsäurelösung versetzt, 1 ccm der 20% Natriumkarbonatlösung zufügt, 10 Minuten im kochenden Wasserbade erhitzt und dann auf 12,5 ccm auffüllt. 1 Eine 20% Lösung von wasserfreiem Natriumkarbonat. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : Man entnimmt 5 ccm Blut, bringt es in ein Reagenzglas, das etwas fein pulverisiertes Natrium- oder Lithiumoxalat enthält und mischt gut durch. Mit einer Pipette werden jetzt 2 ccm von diesem Blut in einen Meßkolben von 25 ccm oder in ein weites Reagenzglas mit Marken für 12,5 und 25 ccm gebracht. Die Pipette wird zweimal mit destilliertem Wasser

Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut.

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nachgewaschen und diese Waschwässer mit dem Blut vereinigt. Wenn das Blut lackfarben geworden ist, wird die Pikrat-Pikrinsäure bis zur Marke 25 hinzugesetzt und umgeschüttelt. Um Schäumen zu vermeiden, können ein paar Tropfen Alkohol zugegeben werden. Nach 1 bis 2 Minuten wird die Flüssigkeit auf ein trockenes Filter gegossen und das Filtrat in einem Becherglase aufgefangen. 8 ccm (genau) dieses Filtrates werden in ein großes Reagenzglas mit Marken für 12,5 und 25 ccm abgemessen, 1 ccm der 20% Natriumkarbonatlösung zugesetzt, das Reagenzglas mit einem Wattebausch verschlossen und 10 Minuten lang in kochendes Wasser gestellt. Darin wird unter der Wasserleitung abgekühlt und auf 12,5 oder 25 aufgefüllt, je nach der Intensität der Farbe. Dann wird mit einer der oben beschriebenen Vergleichslösungen verglichen. B e r e c h n u n g : Bei genauer Befolgung der gegebenen Vorschriften ist die Berechnung folgende: Stand der Vergleichslösung Stand der Versuchslosung

d i y i d i e r t d u r c h 1Q =

o/

Z u o k e p i n

B l u t

.

War die letzte Verdünnung der Versuchslösung bis 25 statt bis 12,5 gemacht, so muß die letzte Zahl natürlich noch mit 2 multipliziert werden. 10.

Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut1)P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blut wird mit starkem Alkali verseift und dann mit Chloroform extrahiert. Die in dem Extrakt mit Essigsäureanhydrid und Schwefelsäure (Liebermann-Burchardsche Probe) hervorgerufene Farbe wird mit der einer Gholesterinlösung von bekanntem Gehalt verglichen. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 20 ccm einer 25% Kaliumhydroxydlösung bringt man *) Nach L i c h t e n t h a e l e r (Unveröffentlichte Modifikation des Verfahrens von A u t h e n r i e t h und F u n k , Münch, med. Wochenschrift 6 0 , 1243 [1913]).

Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut.

41

nachgewaschen und diese Waschwässer mit dem Blut vereinigt. Wenn das Blut lackfarben geworden ist, wird die Pikrat-Pikrinsäure bis zur Marke 25 hinzugesetzt und umgeschüttelt. Um Schäumen zu vermeiden, können ein paar Tropfen Alkohol zugegeben werden. Nach 1 bis 2 Minuten wird die Flüssigkeit auf ein trockenes Filter gegossen und das Filtrat in einem Becherglase aufgefangen. 8 ccm (genau) dieses Filtrates werden in ein großes Reagenzglas mit Marken für 12,5 und 25 ccm abgemessen, 1 ccm der 20% Natriumkarbonatlösung zugesetzt, das Reagenzglas mit einem Wattebausch verschlossen und 10 Minuten lang in kochendes Wasser gestellt. Darin wird unter der Wasserleitung abgekühlt und auf 12,5 oder 25 aufgefüllt, je nach der Intensität der Farbe. Dann wird mit einer der oben beschriebenen Vergleichslösungen verglichen. B e r e c h n u n g : Bei genauer Befolgung der gegebenen Vorschriften ist die Berechnung folgende: Stand der Vergleichslösung Stand der Versuchslosung

d i y i d i e r t d u r c h 1Q =

o/

Z u o k e p i n

B l u t

.

War die letzte Verdünnung der Versuchslösung bis 25 statt bis 12,5 gemacht, so muß die letzte Zahl natürlich noch mit 2 multipliziert werden. 10.

Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut1)P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blut wird mit starkem Alkali verseift und dann mit Chloroform extrahiert. Die in dem Extrakt mit Essigsäureanhydrid und Schwefelsäure (Liebermann-Burchardsche Probe) hervorgerufene Farbe wird mit der einer Gholesterinlösung von bekanntem Gehalt verglichen. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 20 ccm einer 25% Kaliumhydroxydlösung bringt man *) Nach L i c h t e n t h a e l e r (Unveröffentlichte Modifikation des Verfahrens von A u t h e n r i e t h und F u n k , Münch, med. Wochenschrift 6 0 , 1243 [1913]).

42

Bestimmung der Chloride im Gesamtlnt.

in einen kleinen Erlenmeyerkolben und dazu 2 ccm Blut. Der Kolben kommt auf 5 Stunden in ein kochendes Wasserbad und wird dann erkalten gelassen. Die verseifte Substanz wird in einen Scheidetrichter übergeführt und dreimal mit je 25 ccm Chloroform extrahiert. Die vereinten Chloroformauszüge werden drei- bis viermal mit Wasser gewaschen, dann wird die Chloroformlösung in einen Meßkolben von 100 ccm gebracht und mit Chloroform bis zur Marke aufgefüllt. Von der gut umgeschüttelten Lösung pipettiert man 10 ccm in einen kleinen trockenen Kolben, setzt 4 ccm Essigsäureanhydrid und 0,2 ccm konz. Schwefelsäure hinzu und stellt die Reaktionslösung auf 16 Minuten an einen dunklen Ort. Zu gleicher Zeit werden 10 ccm der schwächeren Vergleichslösung in derselben Weise behandelt wie die Versuchslösung. Für die Vergleichslösung stellt man sich zunächst eirie Lösung von 100 mg Cholesterin in 100 ccm Chloroform her und verdünnt hiervon für die schwächere Vergleichslösung 4 ccm auf 100 mit Chloroform. Zum Schluß erfolgt der Vergleich beider Lösungen im Kolorimeter r,

,

B e r e c h n u n gD :

Stand der Vereleichslösung

. .—^—¡-^—^

Stand

der Versuchslosung

., x

200 = mg

°

Cholesterin in 100 ccm Blut. Normales Blutserum enthält 0,15 bis 0,18% Cholesterin und Gesamtblut etwa 0,14 bis 0,17%. Es ist darauf zu achten, daß die Gläser des Kolorimeters, die die Chloroformlösungen aufnehmen, nicht mit Balsam gekittet sind. 11.

Bestimmung der Chloride im Gesamtblut. P r i n z i p der M e t h o d e : Die Chloride werden aus dem Blutfiltrat mit Silbernitrat in Gegenwart von Salpetersäure niedergeschlagen und der Überschuß von Silbernitrat mit einer Lösung von Schwefelzyanammonium von bekanntem Gehalt bei Gegenwart von Eisenammoninmsulfat als Indikator bestimmt.

42

Bestimmung der Chloride im Gesamtlnt.

in einen kleinen Erlenmeyerkolben und dazu 2 ccm Blut. Der Kolben kommt auf 5 Stunden in ein kochendes Wasserbad und wird dann erkalten gelassen. Die verseifte Substanz wird in einen Scheidetrichter übergeführt und dreimal mit je 25 ccm Chloroform extrahiert. Die vereinten Chloroformauszüge werden drei- bis viermal mit Wasser gewaschen, dann wird die Chloroformlösung in einen Meßkolben von 100 ccm gebracht und mit Chloroform bis zur Marke aufgefüllt. Von der gut umgeschüttelten Lösung pipettiert man 10 ccm in einen kleinen trockenen Kolben, setzt 4 ccm Essigsäureanhydrid und 0,2 ccm konz. Schwefelsäure hinzu und stellt die Reaktionslösung auf 16 Minuten an einen dunklen Ort. Zu gleicher Zeit werden 10 ccm der schwächeren Vergleichslösung in derselben Weise behandelt wie die Versuchslösung. Für die Vergleichslösung stellt man sich zunächst eirie Lösung von 100 mg Cholesterin in 100 ccm Chloroform her und verdünnt hiervon für die schwächere Vergleichslösung 4 ccm auf 100 mit Chloroform. Zum Schluß erfolgt der Vergleich beider Lösungen im Kolorimeter r,

,

B e r e c h n u n gD :

Stand der Vereleichslösung

. .—^—¡-^—^

Stand

der Versuchslosung

., x

200 = mg

°

Cholesterin in 100 ccm Blut. Normales Blutserum enthält 0,15 bis 0,18% Cholesterin und Gesamtblut etwa 0,14 bis 0,17%. Es ist darauf zu achten, daß die Gläser des Kolorimeters, die die Chloroformlösungen aufnehmen, nicht mit Balsam gekittet sind. 11.

Bestimmung der Chloride im Gesamtblut. P r i n z i p der M e t h o d e : Die Chloride werden aus dem Blutfiltrat mit Silbernitrat in Gegenwart von Salpetersäure niedergeschlagen und der Überschuß von Silbernitrat mit einer Lösung von Schwefelzyanammonium von bekanntem Gehalt bei Gegenwart von Eisenammoninmsulfat als Indikator bestimmt.

Bestimmung der Chloride im Gesamtbint.

43

Erforderliche Lösungen: 1. Silbernitratlösung: 4,791 g Silbernitrat werden in Wasser gelöst und die Lösung in einer Meßflasche auf 11 aufgefüllt. 2. Schwefelzyanammoniumlösung: Da die Sulphozyanide hygroskopisch sind, muß diese Lösung mittels Titration bereitet werden. Etwa 3 g KCNS oder 2,5 g NH 4 CNS werden auf 1 1 aufgefüllt. Die Lösung wird so eingestellt, daß 5 ccm davon 5 ccm der Silbernitratlösung unter den unten beschriebenen Bedingungen entsprechen. Es wird gut durchgeschüttelt und die Lösung in einer dunklen Flasche aufbewahrt. 1 ccm entspricht 1 mg Chlor. Als Indikator wird fester Eisenammoniakalaun benutzt, anstatt einer Lösung, um bei einer möglichst hohen Konzentration arbeiten zu können. Der Eisenammoniakalaun muß fein pulverisiert werden. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : Wegen der geringen Schwankungen im Chlorgehalt des Blutes müssen die Verdünnungen bei der Herstellung eines eiweißfreien Blutfiltrates sehr sorgfältig in Meßkolben gemacht werden. 10 ccm des eiweißfreien Blutfiltrates werden in ein Porzellanschälchen pipettiert, dann werden 5 ccm Silbernitratlösung zugesetzt und gut umgerührt. Nachdem man noch 5 ccm konz. Salpetersäure hinzugefügt hat (spez. Gew. 1,42), wird gut durchgemischt und 5 Minuten stehen gelassen, damit sich das Chlorsilber flockig absetzt. Dann gibt man etwas pulverisierten Eisenammoniakalaun (etwa 0,3 g) hinzu und titriert den Überschuß an Silbernitrat mit der Sulfozyanidlösung zurück. Es muß solange titriert werden, bis die lachsrote (nicht gelbe) Farbe des Eisensulfozyanids mindestens 15 Minuten lang auch bei dauerndem Rühren bestehen bleibt. B e r e c h n u n g : 5,00 (ccm gebrauchte Silbernitratlösung) minus x (ccm verbrauchter Sulfozyanidlösung) = mg Chlor pro Kubikzentimeter Blut oder Plasma. Um den Wert in

44

Bestimmung der Chloride im Gesamtblat.'

NaCl auszudrücken, muß der für Chlor gefundene Wert mit 1,65 multipliziert werden. 2. B e s t i m m u n g d e r C h l o r i d e n a c h A u s t i n u n d V a n S l y k e 1 ). P r i n z i p der M e t h o d e : Das Blut wird durch Wasserzusatz lackfarben gemacht und durch Pikrinsäure werden die Eiweißkörper ausgefällt. Im Filtrat werden die Chloride durch Silbernitrat ausgefällt und der Überschuß von Silbernitrat im neuen Filtrat mit Jodkalium und Stärke zurücktitriert. Erforderliche Lösungen: 1. Gesättigte wäßrige Pikrinsäurelösung (wie in Nr. 6 x ). 2. Saure

AgNO a -Lösung. 5,812 g AgNOs und 250 ccm

konz. HN0 3 (spez. Gew. 1,42) werden auf 1 1 aufgefüllt. 3. Zitronensäurestärkelösung. 2,5 g l ö s l i c h e Stärke werden in etwa 500 ccm kochenden Wassers gelöst, 446 g kristallisiertes zitronensaures Natrium (Na3C6H50/ . 5VaH20) und 20 g Natriumnitrit hinzugegeben, nachdem die Stärkelösung einige Minuten gekocht hat. Die Lösung wird, wenn erforderlich, heiß durch Watte filtriert, erkalten gelassen und auf 1 1 aufgefüllt. Unbegrenzt haltbar. 4. KJ-Lösung (1 ccm äquivalent = 1 mg NaCl). 3 g KJ werden in 1000 ccm Wasser gelöst. Diese Lösung wird gegen die Silberlösung (Nr. 2) eingestellt. 5 ccm Silberlösung werden mit 5 ccm Stärkelösung versetzt und bis zur blauen Endreaktion mit KJ-Lösung titriert. Die Jodkaliumlösung wird dann so verdünnt, daß 10 ccm genau 5 ccm der Silberlösung entsprechen. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : In einen kleinen Erlenmeyerkolben von etwa 100 ccm Inhalt messe man mit der Pipette 3 ccm Blut, dann gebe man aus einer Bürette 27 ccm Wasser hinzu, schüttele um, *) A u s t i n und v a n S l y k e , Journ. biol. Chem. 41, 346 (1920); Mc L e a n und v a n S l y k e , ibid. 21, 361 (1916).

Bestimmung der Chloride im Gesamtblat.

45

und lasse sodann 30 com gesättigte Pikrinsäurelösung zufließen, so daß das Gesamtvolumen 60 ccm wird. Man schüttele gut um, lasse 10 Minuten stehen und filtriere durch ein Filter. Zu 40 ccm Filtrat fügt man 10 ccm der Silbernitratlösung und 2 Tropfen Amylalkohol, um lästiges Schäumen zu verhindern. Man mische gründlich und lasse womöglich über Nacht stehen, damit sich das Chlorsilber gut absetzt. Dann gieße man vorsichtig, ohne daß der Niederschlag aufgerührt wird, die klare Flüssigkeit durch ein trockenes Filter und nehme 20 ccm des klaren Filtrates für die Titration. Zu diesen 20 ccm setze man 4 ccm Stärkelösung und lasse nun tropfenweise KJ-Lösung bis gerade zur bestehenbleibenden Blaufärbung zufließen. B e r e c h n u n g : Die für die Titration benutzten 20 ccm Filtrat entsprechen 0,8 ccm Blut. Ferner sind zugesetzt 10 ccm Silberlösung, denen 20 ccm KJ-Lösung entsprechen, für die Endtitration sind aber nur 2/s benutzt, denen 8 ccm KJ-Lösung entsprechen würden, falls kein Chlorsilber niedergeschlagen worden wäre. Die Differenz zwischen 8 und der verbrauchten Anzahl Kubikzentimeter KJ-Lösung zeigt also die Menge Chlornatrium in 0,8 ccm Blut an. Die Zahl muß mit 125 multipliziert werden, um den Prozentgehalt zu bekommen, also: 125 X (8 -r- verbrauchte ccm KJ-Lösung) = mg NaCl in 100 ccm Blut. Der „Schwellenwert" für normales menschliches Blut ist nach Mac L e a n (Journ. exp. Med. 1915. Bd. 22, S. 212 und 366) 5,62 g im Liter. — Rinderblut enthält im Durchschnitt 4,53 mg in 1 g Blut. B e s t i m m u n g der C h l o r i d e ( M e t h o d e v o n V a n S l y k e und D o n l e a v y ) 1 ). E r f o r d e r l i c h e Lösungen-: 1. Silbernitratlösung. 5,812 g Silbernitrat werden in wenig Wasser gelöst und die Lösung auf etwa 250 ccm ver») Journ. biol. Chem. 37, 651 (1919).

46

Bestimmung der Chloride im Gesamtblut.

dünnt, mit 7,5 g Pikrinsäure versetzt und auf 1 1 aufgefüllt. 2. Stärke-Zitratlösung. 2,5 g lösliche Stärke werden in wenig Wasser bis zur völligen Lösung gekocht, abgekühlt, 446 g krystallisiertes zitronensaures Natrium und 20 g Natriumnitrit zugesetzt und auf 1 1 aufgefüllt. 3. Jodkaliumlösung. Es wird eine -Lösung von Jodkalium gebraucht. 1 ccm dieser Lösung ist äquivalent 0,8 mg NaCl. (Dieser Wert wurde wegen der vereinfachten Berechnung gewählt.) Es werden 2,4 g Jodkalium abgewogen und in 1 1 Wasser aufgelöst. Dann werden sie in derselben Weise wie in der vorhergehenden Methode eingestellt. 2,5 ccm müssen 1 ccm Silbernitratlösung entsprechen. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 2 ccm Oxalatblut kommen in einen Meßkolben von 50 ccm, der etwas Wasser enthält. Die Pipette wird noch zweimal mit Wasser vollgesogen und so ausgespült Man setzt jetzt 10 ccm Silbernitratlösung hinzu, füllt bis zur Marke und schüttelt gut um. Dann läßt man mindestens 30 Minuten lang stehen und filtriert durch ein trockenes Filter. 20 ccm des Filtrates werden in einen Erlenmeyer kolben von 100 ccm gemessen, 4 ccm der Stärkezitratlösung zugesetzt und nun läßt man langsam aus einer Bürette die Jodkaliumlösung zulaufen, bis eine bleibende Blaufärbung erreicht ist. B e r e c h n u n g : Jeder verbrauchte ccm der Jodkaliumlösung entspricht 1 mg NaCI pro ccm Blut. 10,15 minus der Anzahl verbrauchter ccm Jodkaliumlösung ist gleich der Anzahl mg NaCl im ccm Blut. (10,15 wird statt 10,0 benutzt, weil 0,15 ccm verbraucht werden, um den Endpunkt der Titration zu erreichen.)

Bestimmung des anorganischen und des säurelöslichen Phosphors. 4 7 12.

Bestimmung des anorganischen und des säurelöslichen Phosphors. 1. M e t h o d e von Bell u n d Doisy P r i n z i p der M e t h o d e : Das Eiweiß des Plasmas oder Serums wird mit Trichloressigsäure ausgefällt und das Filtrat mit Molybdänsäure behandelt. Die dabei gebildete Phosphormolybdänsäure wird mit Hydrochinon reduziert und die entstehende Blaufärbung zur kolorimetrischen Bestimmung benutzt. Erforderliche Lösungen: 1. Molybdänsäurelösung. 50 g reines Ammoniummolybdat werden in 1 1 Normalschwefelsäure, frei von Phosphat, ohne Anwendung von Wärme gelöst. (5 ccm dieser Lösung müssen mit 5 ccm Hydrochinonlösung und nach dem Zusatz von 25 ccm Karbonatsulfitlösung nach 5 Minuten langem Stehen eine absolut farblose Lösung geben.) Ist dies nicht der Fall, so muß eine Reinigung des Ammoniummolybdats vorgenommen werden, die in der Originalmitteilung nachgelesen werden muß. 2. Hydrochinonlösung. 20 g reines Hydrochinon werden in 1 1 phosphatfreiem Wasser gelöst und 1 ccm konzentrierte Schwefelsäure hinzugesetzt. Beim Stehen färbt sich diese Lösung, unter Bildung von Chinon; das hat aber auf die Bestimmung keinen Einfluß, weil es durch den Zusatz der alkalischen Sulfitlösung wieder reduziert wird. Die Lösung wird in einer gut verschlossenen Flasche aufbewahrt. 3. Karbonatsulfitlösung. Zu 2000 ccm einer 20% Natriumkarbonatlösung werden 75 g Natriumsulfit gesetzt, gelöst in 500 ccm Wasser. Die Lösung wird dann filtriert. 4. Stammlösung von Monokaliumphosphat. (KH 2 P0 4 .) Fein pulverisiertes Monokaliumphosphat wird in einem Exsikkator über Schwefelsäure mehrere Tage getrock>) Journ. biol. Chem. 44, 55 C1920).

4 8 Bestimmung des anorganischen und des säurelöslichen Phosphors.

net. 4,394 g dieses trockenen Salzes werden in phosphatfreiem Wasser aufgelöst und die Lösung auf 1 l aufgefüllt. 1 ccm dieser Lösung enthält 1 mg Phosphor. Die Lösung muß in einer gut verschlossenen Flasche aufbewahrt werden und zur Konservierung wird ihr zweckmäßig ein wenig Chloroform zugesetzt. 5. Vergleichsphosphorlösung für Blut. 5 ccm der obigen Vorratslösung werden mit phosphatfreiem Wasser auf 1 1 aufgefüllt. 5 ccm dieser L ö s u n g enthalten 0,025 mg Phosphor. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm Blutplasma oder Serum werden in einem 25 ccm Meßkolben mit 15 ccm Wasser verdünnt, 5 ccm einer 20 % Trichloressigsäurelösung zugegeben und geschüttelt. Nachdem bis zur Marke aufgefüllt ist, läßt man 10 Minuten lang stehen. Nun wird durch ein phosphatfreies (mit Säure gewaschenes) Filter filtriert. Gesamtblut oder phosphatreiches Blutplasma muß auf das lOfache verdünnt werden. Zu 10 ccm des Filtrats, die sich in einem Meßkolben zu 25 ccm befinden, setzt man 1 ccm der Molybdänsäurelösung und 2 ccm der Hydrochinonlösung. Gleichzeitig werden dieselben Mengen Molybdän- und Hydrochinonlösung in einem Meßkolben von ebenfalls 25 ccm zu 10 ccm der Vergleichsphosphorsäurelösung (enthaltend 0,05 mg Phosphor) gesetzt und ferner 1 oder 2 ccm 20 % Trichloressigsäurelösung, je nachdem im Verhältnis 1 : 10 oder 1 : 5 verdünnt worden ist. Nach 5 Minuten werden 10 ccm der Karbonatsulfitlösung zu jedem Meßkolben hinzugefügt, bis zur Marke aufgefüllt und gut umgeschüttelt. Nach weiteren 5 oder 10 Minuten kann die kolorimetrische Ablesung stattfinden. Berechnung: eingestellt, so ist: ö-——^—r—TT.

Stand der Versuchslosung 60 Standj—;—^ der Versuchslosung

Ist die Vergleichslösung auf 20 mm = =

mg °

mg°

Phosphor in

100 ccm

Blut

1

(bei Verdünnung 1 : 10). Phosphor in 100 ccm Blut 1 (bei Verdünnung 1 : 5 ) .

Bestimmung des anorganischen und des säurelöslichen Phosphors. 4 9

Diese Bestimmung gibt den Gehalt an anorganischer Phosphorsäure an. Der gesamte säurelösliche Phosphor wird in ähnlicher Weise bestimmt. 10 ccm vom Trichloressigsäurefiltrat werden in einem Reagensglas aus Jenenser Glas mit 6 bis 8 Tropfen konzentrierter Schwefelsäure bis auf 2 ccm eingeengt unter Zusatz einer Glasperle. 1 ccm konzentrierte Salpetersäure wird jetzt zugegeben und das Erwärmen fortgesetzt, bis alle Salpetersäure vertrieben ist und die zurückbleibende Schwefelsäure völlig klar geworden ist. Der Inhalt des Reagensglases wird jetzt in einem Meßkolben von 25 ccm mit etwa 10 ccm Wasser und in der oben beschriebenen Weise weiterbehandelt. Die zu benutzende Vergleichslösung bestimmt sich aus dem Wert, der für den anorganischen Phosphor gefunden ist. Zu der Vergleichslösung werden 5 bis 6 Tropfen konzentrierte Schwefelsäure gegeben, um dasselbe Verhältnis zu bekommen wie in der Versuchslösung. Trichloressigsäure wird zu der Vergleichslösung nicht hinzugesetzt, weil sie auch aus der Versuchslösung während des Erwärmens völlig vertrieben ist. B e r e c h n u n g : Die Berechnung ist die gleiche wie oben bei der Bestimmung der anorganischen Phosphorsäure. Normales Blutplasma enthält in 100 ccm 3,5 bis 3,9 mg anorganischen Phosphor und 4,0 bis 5,0 mg Gesamtphosphor (organisch + anorganisch). Anmerkung: Denis hat gezeigt, daß Oxalate und Zitrate die Bildung der blauen Farbe beeinträchtigen 2. B e s t i m m u n g

des

a n o r g a n i s c h e n P h o s p h o r s im Blut. (Modification der Methode von Bell-Doisy nach Briggs) 1 ).

Die Bestimmung wird in saurer Lösung statt in alkalischer ausgeführt. Eine abgemessene Menge Blut oder Plasma (2 bis 5 ccm) werden in einem kleinen Erlenmeyerkolben mit dem drei!) Journ. biol. Chem. 53, 13 (1922). Mandel

n

Sten del,

Blutuntersuchungen

2. Aul]

4

50

Bestimmung von Natrium (nach Kramer und Tisdall)

fachen Volumen Wasser verdünnt und 1 Volumen Trichloressigsäure (20 % Lösung) zugesetzt. Der Kolben wird gut verschlossen, einige Sekunden kräftig geschüttelt und 10 Minuten lang beiseite gestellt. Dann wird durch ein trockenes aschefreies Filter filtriert. 5 ccm dieses Filtrates (entsprechend 1 ccm Blut oder Plasma) kommen in einen Meßkolben von 10 ccm. In einen zweiten Meßkolben von 10 ccm bringt man 2 ccm der Vergleichsphosphorsäurelösung. Jetzt gibt man in jeden Kolben 2 ccm der Molybdänlösung und 1 ccm der Hydrochinonlösung, ferner 1 ccm der Natriumsulfitlösung und füllt bis zur Marke auf. Nach 30 Minuten langem Stehen kann man die Flüssigkeiten kolorimetrisch vergleichen. (Zuviel Säure verhindert die Entwicklung der Farbe.) Die erforderlichen Lösungen sind die gleichen wie die bei der Methode von Bell-Doisy benutzten, nur empfiehlt Briggs eine schwächere Hydrochinonlösung (5 g Hydrochinon in einem Liter Wasser, das 5 ccm Schwefelsäure enthält). Ferner benutzt er eine 20 % Natriumsulfitlösung statt der Karbonatsulfitlösung. Anmerkung: Briggs behauptet, daß Oxalate oder Zitrate, die als koagulationshemmende Mittel gebraucht sind, auf die Farbenreaktion keinen Einfluß haben. 13.

Bestimmung von

Natrium (nach Kramer und Tisdall1).

Erforderliche Lösungen: Zu 500 ccm kochendem Wasser in einem Jenenser Kolben gibt man annähernd 10 g Kaliumpyroantimoniat, kocht weitere 5 Minuten und kühlt dann unter der Wasserleitung ab. Dann fügt man 15 ccm einer 10 % Lösung von Kaliumhydroxyd (mit Alkohol gereinigt) hinzu und filtriert in eine paraffinierte Flasche. Ehe Journ. biol Chem. 4 6 , 467 (1921)

50

Bestimmung von Natrium (nach Kramer und Tisdall)

fachen Volumen Wasser verdünnt und 1 Volumen Trichloressigsäure (20 % Lösung) zugesetzt. Der Kolben wird gut verschlossen, einige Sekunden kräftig geschüttelt und 10 Minuten lang beiseite gestellt. Dann wird durch ein trockenes aschefreies Filter filtriert. 5 ccm dieses Filtrates (entsprechend 1 ccm Blut oder Plasma) kommen in einen Meßkolben von 10 ccm. In einen zweiten Meßkolben von 10 ccm bringt man 2 ccm der Vergleichsphosphorsäurelösung. Jetzt gibt man in jeden Kolben 2 ccm der Molybdänlösung und 1 ccm der Hydrochinonlösung, ferner 1 ccm der Natriumsulfitlösung und füllt bis zur Marke auf. Nach 30 Minuten langem Stehen kann man die Flüssigkeiten kolorimetrisch vergleichen. (Zuviel Säure verhindert die Entwicklung der Farbe.) Die erforderlichen Lösungen sind die gleichen wie die bei der Methode von Bell-Doisy benutzten, nur empfiehlt Briggs eine schwächere Hydrochinonlösung (5 g Hydrochinon in einem Liter Wasser, das 5 ccm Schwefelsäure enthält). Ferner benutzt er eine 20 % Natriumsulfitlösung statt der Karbonatsulfitlösung. Anmerkung: Briggs behauptet, daß Oxalate oder Zitrate, die als koagulationshemmende Mittel gebraucht sind, auf die Farbenreaktion keinen Einfluß haben. 13.

Bestimmung von

Natrium (nach Kramer und Tisdall1).

Erforderliche Lösungen: Zu 500 ccm kochendem Wasser in einem Jenenser Kolben gibt man annähernd 10 g Kaliumpyroantimoniat, kocht weitere 5 Minuten und kühlt dann unter der Wasserleitung ab. Dann fügt man 15 ccm einer 10 % Lösung von Kaliumhydroxyd (mit Alkohol gereinigt) hinzu und filtriert in eine paraffinierte Flasche. Ehe Journ. biol Chem. 4 6 , 467 (1921)

Bestimmung von Kalium (nach Kramer und Tisdall).

51

man die Lösung für die Versuche gebraucht, prüfe man sie, indem man feststellt, ob die Lösung an und für sich schon einen Niederschlag mit Alkohol, wie er in der Methode gebraucht wird, gibt. A u s f ü h r u n g der Bestimmung: Man bringt 2 ccm Blutserum in ein Porzellanschälchen oder eine Kasserolle, setzt 10 ccm der Kaliumpyroantimoniatlösung hinzu und ferner 3 ccm 95 % Alkohols tropfenweise unter beständigem Rühren. Nach 45 Minuten langem Stehen wird durch einen Goochtiegel filtriert und mit 8—12 ccm 30 % Alkohol nachgewaschen, dann der Tiegel mit dem Niederschlag eine Stunde bei 110° getrocknet, abkühlen gelassen und gewogen. B e r e c h n u n g : Das Gewicht des Niederschlages, dividiert durch 11,08, ergibt die Anzahl mg Natrium in 2 ccm Serum. Anmerkung: Man benutzt zweckmäßig einen Goochtiegel, durch den schon Natriumpyroantimoniat filtriert ist. Die Poren sind dann schon genügend verschlossen, um den äußerst feinen Niederschlag zurückzuhalten. Das Ammoniak wird auch als Antimoniat niedergeschlagen, aber die Menge in 2 ccm ist so gering, daß sie vernachlässigt werden kann. Das Kalziumphosphat wird auch bei der alkalischen Reaktion mit niedergeschlagen, aber seine Menge übersteigt nicht den Betrag von 0,5 mg, so daß es auch ruhig vernachlässigt werden kann. Normales menschliches Serum enthält 325—345 mg Natrium in 100 ccm. 14.

Bestimmung von Kalium (nach Kramer undTisdall 1 ). Erforderliche Lösungen: 1. Kobaltnitritlösung. Lösung A: 25 g Kobaltnitrat werden in 50 ccm Wasser gelöst und 12,5 ccm Essigsäure !) Journ. biol. Chem. 46, 339 (1921).

Bestimmung von Kalium (nach Kramer und Tisdall).

51

man die Lösung für die Versuche gebraucht, prüfe man sie, indem man feststellt, ob die Lösung an und für sich schon einen Niederschlag mit Alkohol, wie er in der Methode gebraucht wird, gibt. A u s f ü h r u n g der Bestimmung: Man bringt 2 ccm Blutserum in ein Porzellanschälchen oder eine Kasserolle, setzt 10 ccm der Kaliumpyroantimoniatlösung hinzu und ferner 3 ccm 95 % Alkohols tropfenweise unter beständigem Rühren. Nach 45 Minuten langem Stehen wird durch einen Goochtiegel filtriert und mit 8—12 ccm 30 % Alkohol nachgewaschen, dann der Tiegel mit dem Niederschlag eine Stunde bei 110° getrocknet, abkühlen gelassen und gewogen. B e r e c h n u n g : Das Gewicht des Niederschlages, dividiert durch 11,08, ergibt die Anzahl mg Natrium in 2 ccm Serum. Anmerkung: Man benutzt zweckmäßig einen Goochtiegel, durch den schon Natriumpyroantimoniat filtriert ist. Die Poren sind dann schon genügend verschlossen, um den äußerst feinen Niederschlag zurückzuhalten. Das Ammoniak wird auch als Antimoniat niedergeschlagen, aber die Menge in 2 ccm ist so gering, daß sie vernachlässigt werden kann. Das Kalziumphosphat wird auch bei der alkalischen Reaktion mit niedergeschlagen, aber seine Menge übersteigt nicht den Betrag von 0,5 mg, so daß es auch ruhig vernachlässigt werden kann. Normales menschliches Serum enthält 325—345 mg Natrium in 100 ccm. 14.

Bestimmung von Kalium (nach Kramer undTisdall 1 ). Erforderliche Lösungen: 1. Kobaltnitritlösung. Lösung A: 25 g Kobaltnitrat werden in 50 ccm Wasser gelöst und 12,5 ccm Essigsäure !) Journ. biol. Chem. 46, 339 (1921).

52

Bestimmung von Kalium (nach Kramer und Tisdall).

hinzugesetzt. Lösung B: 120 g Natriumnitrit (Merck) werden in 180 ccm Wasser gelöst. Zu der gesamten Lösung A werden 210 ccm der Lösung B gesetzt, ein Luftstrom durch die Flüssigkeit geleitet, bis alle braunen Dämpfe verschwunden sind und die Flüssigkeit im Eisschrank aufbewahrt. Vor dem Gebrauch muß jedesmal filtriert werden. 2. Eine annähernd vierfachnormale Schwefelsäure. 3. 0,02 norm. Kaliumpermanganatlösung. Es wird eine l/10norm. KMn0 4 lösung durch Verdünnen auf 0,02norm. gebracht und gegen eine 0,01 norm. Natriumoxalatlösung wie gewöhnlich eingestellt. Die 0,01n. Natriumoxalatlösung kann aus einer Vorratslösung von einer 0,1 norm. Lösung gemacht werden; für letztere löst man 6,7 g Natriumoxalat (Sörensen) in 1 1 Wasser mit Hilfe von 5 ccm Schwefelsäure. 10 ccm dieser Lösung müssen für die 0,01 norm. Lösung auf 100 ccm verdünnt werden. A u s f ü h r u n g der Bestimmung: 1 ccm Serum bringt man in ein graduiertes Zentrifugierröhrchen, gibt langsam 2 ccm des Kobaltnitritreagens hinzu und mischt gehörig. Nach 45 Minuten setzt man 2 ccm Wasser hinzu, schüttelt gut durch und zentrifugiert eine halbe Stunde lang. Jetzt gießt man sehr vorsichtig die klare Flüssigkeit bis auf 0,3 ccm ab, läßt vorsichtig, ohne den Niederschlag aufzurühren, 5 ccm Wasser zufließen und zentrifugiert noch einmal 5 Minuten. Diese Operation wird viermal wiederholt. Dann fügt man einen Überschuß von 0,02n. KMn0 4 lösung (2 ccm) zu, darauf 1 ccm der ungefähr 4fachnormaIen H 2 S0 4 und mischt gründlich mit Hilfe eines dünnen Glasstabes. Nun erhitzt man im Wasserbade, bis sich die Farbe nicht mehr ändert (1,5 Minuten) und gibt genügend von der 0,01 norm. Natriumoxalatlösung hinzu, bis völlige Entfärbung eingetreten ist. Gewöhnlich genügen 2 ccm. Der Überschuß von Oxalat wird durch Titration mit 0,02 norm. Kaliumpermanganatlösung bis zu rosa Farbe bestimmt. Berechnung:

Die Anzahl verbrauchter

Kubikzenti-

Bestimmung von Calcium (Kramer und Tigdall).

53

meter Permanganatlösung, multipliziert mit 7,1, ergibt die Zahl für den Kaliumgehalt von 100 ccm Serum in mg. Normales menschliches Serum enthält 19,2 bis 20 mg Kalium in 100 ccm. 15.

Bestimmung von Calcium (Kramer und Tisdall1). Erforderliche Lösungen: 1. 0,ln. Natriumoxalatlösung (Sörensen), die 5 ccm konz. Schwefelsäure im Liter enthält. 2. Eine 0,01n. Natriumoxalatlösung. 3. Eine 0,111. Kaliumpermanganatlösung, die gegen die Lösung 1 eingestellt ist. 4. Eine 0,01 n. Kaliumpermanganatlösung, eingestellt gegen Lösung 2. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 2 ccm Serum kommen in ein graduiertes Zentrifugierröhrchen, dazu 2 ccm Wasser und 1 ccm einer gesättigten Ammoniumoxalatlösung. Es wird gut umgeschüttelt und eine halbe Stunde gewartet, dann auf 6 ccm gebracht und wieder gemischt. Nun wird 10 Minuten lang zentrifugiert, dann die über dem Niederschlage stehende Flüssigkeit bis auf 0,3 ccm abgegossen, mit einer 2 % Ammoniaklösung auf 4 ccm aufgefüllt und 5 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird wieder abgegossen bis auf 0,3 ccm, wieder mit Ammoniak aufgefüllt usw. und das ganze Verfahren noch zweimal wiederholt. Jetzt setzt man 2 ccm einer annähernd n. Schwefelsäure hinzu, erhitzt im Wasserbade und titriert bis zur bleibenden (1 Minute lang) rosa Färbung mit 0,01 n. Kaliumpermanganat zurück. B e r e c h n u n g : Die Anzahl verbrauchter ccm Kaliumpermanganat, abzüglich der etwa in einem blinden Versuch verbrauchten, multipliziert mit 0,2 gibt die Anzahl mg Kalzium in der Zahl der zur Analyse gebrauchten ccm Serum. !) Journ. biol. Chem. 47, 476 (1921).

Bestimmung von Calcium (Kramer und Tigdall).

53

meter Permanganatlösung, multipliziert mit 7,1, ergibt die Zahl für den Kaliumgehalt von 100 ccm Serum in mg. Normales menschliches Serum enthält 19,2 bis 20 mg Kalium in 100 ccm. 15.

Bestimmung von Calcium (Kramer und Tisdall1). Erforderliche Lösungen: 1. 0,ln. Natriumoxalatlösung (Sörensen), die 5 ccm konz. Schwefelsäure im Liter enthält. 2. Eine 0,01n. Natriumoxalatlösung. 3. Eine 0,111. Kaliumpermanganatlösung, die gegen die Lösung 1 eingestellt ist. 4. Eine 0,01 n. Kaliumpermanganatlösung, eingestellt gegen Lösung 2. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 2 ccm Serum kommen in ein graduiertes Zentrifugierröhrchen, dazu 2 ccm Wasser und 1 ccm einer gesättigten Ammoniumoxalatlösung. Es wird gut umgeschüttelt und eine halbe Stunde gewartet, dann auf 6 ccm gebracht und wieder gemischt. Nun wird 10 Minuten lang zentrifugiert, dann die über dem Niederschlage stehende Flüssigkeit bis auf 0,3 ccm abgegossen, mit einer 2 % Ammoniaklösung auf 4 ccm aufgefüllt und 5 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird wieder abgegossen bis auf 0,3 ccm, wieder mit Ammoniak aufgefüllt usw. und das ganze Verfahren noch zweimal wiederholt. Jetzt setzt man 2 ccm einer annähernd n. Schwefelsäure hinzu, erhitzt im Wasserbade und titriert bis zur bleibenden (1 Minute lang) rosa Färbung mit 0,01 n. Kaliumpermanganat zurück. B e r e c h n u n g : Die Anzahl verbrauchter ccm Kaliumpermanganat, abzüglich der etwa in einem blinden Versuch verbrauchten, multipliziert mit 0,2 gibt die Anzahl mg Kalzium in der Zahl der zur Analyse gebrauchten ccm Serum. !) Journ. biol. Chem. 47, 476 (1921).

54

Bestimmung von Magnesium (Kramer und Tisdall).

100 com normales Serum enthalten 9,5 bis 10,5 mg Kalzium. 16.

Bestimmung von Magnesium (Kramer und Tisdall1). Erforderliche Lösungen: 1. Ammoniummagnesiumphosphatlösung. 0,102 g lufttrockenes Ammoniummagnesiumphosphat (Mg(NH 4 )P0 4 6H 2 0) werden in 100 ccm 0,1 n. Salzsäure gelöst und auf einen Liter aufgefüllt. Ein ccm dieser Lösung enthält 0,01 mg Magnesium. 2. Ammoniumphosphatlösung. 25 g Ammoniumphosphat (NH 4 HP0 4 ) werden in 250 ccm Wasser gelöst, 25 ccm Ammoniak zugesetzt, über Nacht stehen gelassen, dann filtriert und gekocht, bis das überschüssige Ammoniak entfernt ist. Nach dem Erkalten wird auf 250 ccm aufgefüllt und dann 5fach verdünnt. 3. S c h w e f e l z y a n e i s e n l ö s u n g . Lösung A: 3 g Ammoniumsulfozyanat werden in 1 l Wasser gelöst. Lösung B: 3 g Eisenchlorid werden in Wasser gelöst, einige Tropfen Salzsäure zur völlig klaren Lösung zugesetzt und dann auf 1 1 verdünnt. Eine Stunde vor Gebrauch werden 5 ccm von A mit 5 ccm von B versetzt und auf 40 ccm verdünnt. 4. 100 ccm konz. Ammoniak werden auf 1 1 verdünnt. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm der bei der Kalziumbestimmung erhaltenen Flüssigkeit, die über dem abzentrifugierten Niederschlag stand, siehe Seite 54 (sie entsprechen 1,66 ccm Serum), kommen in ein kleines Becherglas, dazu 1 ccm der Ammomoniumphosphatlösung und 2 ccm konz. Ammoniak. Man läßt über Nacht stehen, filtriert dann durch einen Goochtiegel, wäscht zehnmal mit 5 ccm verdünnten Ammoniak und zweimal mit 95 % Alkohol, den man mit etwas Ammoniak Journ biol. Chem. 47, 476 (1921).

54

Bestimmung von Magnesium (Kramer und Tisdall).

100 com normales Serum enthalten 9,5 bis 10,5 mg Kalzium. 16.

Bestimmung von Magnesium (Kramer und Tisdall1). Erforderliche Lösungen: 1. Ammoniummagnesiumphosphatlösung. 0,102 g lufttrockenes Ammoniummagnesiumphosphat (Mg(NH 4 )P0 4 6H 2 0) werden in 100 ccm 0,1 n. Salzsäure gelöst und auf einen Liter aufgefüllt. Ein ccm dieser Lösung enthält 0,01 mg Magnesium. 2. Ammoniumphosphatlösung. 25 g Ammoniumphosphat (NH 4 HP0 4 ) werden in 250 ccm Wasser gelöst, 25 ccm Ammoniak zugesetzt, über Nacht stehen gelassen, dann filtriert und gekocht, bis das überschüssige Ammoniak entfernt ist. Nach dem Erkalten wird auf 250 ccm aufgefüllt und dann 5fach verdünnt. 3. S c h w e f e l z y a n e i s e n l ö s u n g . Lösung A: 3 g Ammoniumsulfozyanat werden in 1 l Wasser gelöst. Lösung B: 3 g Eisenchlorid werden in Wasser gelöst, einige Tropfen Salzsäure zur völlig klaren Lösung zugesetzt und dann auf 1 1 verdünnt. Eine Stunde vor Gebrauch werden 5 ccm von A mit 5 ccm von B versetzt und auf 40 ccm verdünnt. 4. 100 ccm konz. Ammoniak werden auf 1 1 verdünnt. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : 5 ccm der bei der Kalziumbestimmung erhaltenen Flüssigkeit, die über dem abzentrifugierten Niederschlag stand, siehe Seite 54 (sie entsprechen 1,66 ccm Serum), kommen in ein kleines Becherglas, dazu 1 ccm der Ammomoniumphosphatlösung und 2 ccm konz. Ammoniak. Man läßt über Nacht stehen, filtriert dann durch einen Goochtiegel, wäscht zehnmal mit 5 ccm verdünnten Ammoniak und zweimal mit 95 % Alkohol, den man mit etwas Ammoniak Journ biol. Chem. 47, 476 (1921).

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

55

alkalisch gemacht hat, nach, setzt den Tiegel in ein Becherglas und trocknet einige Minuten bei 80°. Zu dem im Becherglase befindlichen Tiegel setzt man 10 ccm 0,01n. Salzsäure und bringt nach einigen Stunden die Lösung aus dem Becherglase in ein Zentrifugierröhrchen und zentrifugiert. 5 ccm (die Hälfte) des Zentrifugates bringt man nun in ein Kolorimeterglas mit flachem Boden, das eine Marke für 10 ccm trägt. In das Kolorimeterglas hat man vorher 2 ccm Eisensulfozyanatlösung gebracht. Man füllt bis zur 10 ccm-Marke mit 0,01n. Salzsäure auf, mischt gut durch und verschließt das Röhrchen durch einen Gummistopfen. Gleichzeitig werden eine Reihe von Vergleichslösungen mit steigenden Mengen Ammoniumma^nesiumphosphatlösung angesetzt, mit je 2 ccm Ammoniumthiozyanatlösung versetzt und auch auf 10 ccm aufgefüllt. Diese Lösungen werden mit der zu bestimmenden im Kolorimeter verglichen. B e r e c h n u n g : Die Anzahl ccm der Vergleichslösung, die die gleiche Farbe wie die zu bestimmende Lösung hat, X 0,01 x 2 x S

50 =

X 1,2, ist gleich der Anzahl mg

Magnesium in 10 ccm Serum. Normales menschliches Serum enthält 1,8 bis 2,2 mg Magnesium in 100 ccm. 17.

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes (Bestimmung der Alkalireserve) nach van Slyke 1 ). P r i n z i p der M e t h o d e : Die Neutralisation der ins Blut gelangenden Säuren wird hauptsächlich durch N a H C 0 3 besorgt. Werden im Körper nicht flüchtige Säuren produziert und sollen diese auf dem Wege über die Blutbahn ausgeschieden werden, so werden die Säuren — Milchsäure, ') V a n S l y k e und C u l l e n , Journ. biol. Chem.80, 289, 347 (1917) Van S l y k e , Journ. biol. Chem. 30, 347 (1917). V a n S l y k e a n d S t a d i e . Journ biol. Chem 49, 1 (1921)

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

55

alkalisch gemacht hat, nach, setzt den Tiegel in ein Becherglas und trocknet einige Minuten bei 80°. Zu dem im Becherglase befindlichen Tiegel setzt man 10 ccm 0,01n. Salzsäure und bringt nach einigen Stunden die Lösung aus dem Becherglase in ein Zentrifugierröhrchen und zentrifugiert. 5 ccm (die Hälfte) des Zentrifugates bringt man nun in ein Kolorimeterglas mit flachem Boden, das eine Marke für 10 ccm trägt. In das Kolorimeterglas hat man vorher 2 ccm Eisensulfozyanatlösung gebracht. Man füllt bis zur 10 ccm-Marke mit 0,01n. Salzsäure auf, mischt gut durch und verschließt das Röhrchen durch einen Gummistopfen. Gleichzeitig werden eine Reihe von Vergleichslösungen mit steigenden Mengen Ammoniumma^nesiumphosphatlösung angesetzt, mit je 2 ccm Ammoniumthiozyanatlösung versetzt und auch auf 10 ccm aufgefüllt. Diese Lösungen werden mit der zu bestimmenden im Kolorimeter verglichen. B e r e c h n u n g : Die Anzahl ccm der Vergleichslösung, die die gleiche Farbe wie die zu bestimmende Lösung hat, X 0,01 x 2 x S

50 =

X 1,2, ist gleich der Anzahl mg

Magnesium in 10 ccm Serum. Normales menschliches Serum enthält 1,8 bis 2,2 mg Magnesium in 100 ccm. 17.

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes (Bestimmung der Alkalireserve) nach van Slyke 1 ). P r i n z i p der M e t h o d e : Die Neutralisation der ins Blut gelangenden Säuren wird hauptsächlich durch N a H C 0 3 besorgt. Werden im Körper nicht flüchtige Säuren produziert und sollen diese auf dem Wege über die Blutbahn ausgeschieden werden, so werden die Säuren — Milchsäure, ') V a n S l y k e und C u l l e n , Journ. biol. Chem.80, 289, 347 (1917) Van S l y k e , Journ. biol. Chem. 30, 347 (1917). V a n S l y k e a n d S t a d i e . Journ biol. Chem 49, 1 (1921)

56

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

Schwefelsäure, Azetessigsäure und andere Säuren — an das Natrium des NaHG0 3 gebunden und durch die Nieren ausgeschieden. Es findet also in diesen Fällen eine Verminderung der Kohlensäurekapazität statt, die als sicheres Zeichen einer bestehenden Azidosis angesehen werden kann. Sättigt man nun ein bestimmtes Quantum Blut mit Kohlensäure, entgast dann im Vakuum und mißt die Menge der gebildeten Kohlensäure, so kann man aus diesem Werte berechnen, wieviel Alkali im Blute zur Bindung von Säuren vorhanden war. Normales Blut enthält in 100 ccm soviel Bikarbonat, um etwa 65 bis 90 ccm C02-Gas zu liefern, gemessen bei Zimmertemperatur und gewöhnlichem Druck. Man verfährt nun so, daß man eine kleine Menge Oxalatplasma mit Kohlensäure (Ausatmungsluft) sättigt und nun eine gemessene Menge dieses vorbereiteten Plasmas im Apparat von v a n S l y k e entgast. Das Volumen der ausgeschiedenen Kohlensäure wird gemessen. Erforderliche Lösungen: 1. Amylalkohol. 2. 1 % karbonatfreies Ammoniak, etwas Methylorange enthaltend. Gewöhnliches 1 % Ammoniak wird mit wenig gesättigter Ba(OH) 2 -Lösung versetzt. Das Bariumkarbonat wird abfiltriert und im Filtrat das überschüssige Ba durch Zusatz von wenig Ammonsulfat entfernt. 3. 10 % Schwefelsäure. Der für die Bestimmungen erforderliche Apparat ist in Fig. 4 abgebildet. Zur Füllung braucht man etwa 1600 g Quecksilber. A u s f ü h r u n g der B e s t i m m u n g : a) Plasmagewinnung: Etwa 10 ccm Blut werden in ein Zentrifugiergläschen angesaugt, das ungefähr 20 mg Kaliumoder Natriumoxalat und etwas Paraffinöl enthält. Das Blut wird gut mit dem Oxalat gemischt und zentrifugiert, bis man eine genügende Menge klaren Plasmas erhalten hat. b) Sättigung des Plasmas mit ( y 2 .

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

57

Ungefähr 3 ccm Plasma werden in einen sauberen, trockenen Scheidetrichter von etwa 250 ccm Inhalt pipettiert. Dann wird das Ablaufrohr durch einen Gummischlauch mit einer V3 bis */-> mit Glasperlen gefüllten Waschflasche verbunden, der Scheidetrichter horizontal gehalten und durch die Waschflasche hindurch, über die Flüssigkeit im Scheidetrichter hinweg, 12mal Luft geblasen, indem man jedesmal tief, aber nicht forciert ausatmet. Dann wird der Scheidetrichter geschlossen und langsam hin- und hergerollt, so daß die Flüssigkeit sich auf der ganzen Oberfläche völlig ausbreitet und sich Shejlung 1. leicht mit C 0 2 sättigt. Man bringt dann den Scheidetrichter wieder in die horizontale Lage, öffnet beide Hähne und bläst wieder 12mal Luft hindurch. Nachdem man sodann wieder umgeschwenkt hat, ist das Plasma für die Bestimmung vorbereitet. c) Prüfung des Apparates auf guten Schluß. Ehe man nun die Bestimmung macht, sehe man nach, ob der Apparat dicht schließt. Dazu füllt man den ganzen Apparat mit Quecksilber (Stellung 1 der Kugel) und schließt dann den obersten Hahn e. Senkt man jetzt die Vorratskugel für das Quecksilber bei offenstehendem unteren Hahn / (Stellung 3), so wird das Quecksilber im Apparat allmählich fallen und einen luftleeren Raum erzeugen. Man läßt das Quecksilber bis unter den unteren Hahn / fallen. Wenn der Apparat nicht dicht schließt, wird jetzt Luft angesaugt. Um

StEllang3iv Sücm in untsr2. IM

Fig. 4. Apparat nach v a n S l y k e zur Bestimmung der Kohlensäurekapazität. Die Quecksilberkugel wird mit dem Apparat durch etwa 1,5 m Druckschlauch verbunden. Mandel u. Steudel, Blutunterguchnngen. 2. Aull.

58

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

dies festzustellen, lasse man das Quecksilber wieder durch Heben der Kugel bis an den oberen Hahn e steigen. Wenn das Quecksilber jetzt den oberen Hahn wieder erreicht und keinen Luftraum frei läßt, hält der Apparat dicht und ist gebrauchsfertig. Ist der Apparat undicht, so muß man jetzt die Luft durch den oberen Hahn herauslassen, beide Hähne dichten und die Probe auf luftdichten Verschluß wiederholen. d) Die Bestimmung selbst. Um die Bestimmung auszuführen, fülle man den Apparat mit Quecksilber und ebenso die Kapillare b an der rechten Seite des oberen Hahnes e. Dann bringe man in die Glaskammer b rechts über dem oberen Hahn 3 Tropfen 1 % Ammoniak, das etwas Methylorange als Indikator enthält, ferner mit Hilfe einer Pipette unter diese Lösung 1 ccm des vorbereiteten Plasmas. Man lasse dann beides in den Apparat fließen. Mit der gleichen Pipette fügt man sodann 1 ccm Wasser hinzu, das man gleichfalls einfließen läßt; endlich gibt man etwa 1 ccm 10 % Schwefelsäure hinzu und läßt diese gleichfalls vorsichtig einfließen. Nun schließe man sorgfältig den oberen Hahn e, öffne den unteren Hahn / so, daß der Weg durch die weitere rechte Kammer d geht und senke nun die Quecksilberkugel, so daß ein Vakuum entsteht (Stellung 3) und das Quecksilber bis zur 50 ccm-Marke sinkt. Dann wird der untere Hahn / sorgfältig geschlossen, der Apparat aus dem Halter genommen und 8 bis lOmal von oben nach unten umgewendet. Nun wird der Apparat wieder befestigt, die Quecksilberkugel stark gesenkt (Stellung 3) und der untere Hahn / zur rechten Kammer geöffnet, so daß das ganze Quecksilber und fast alle Flüssigkeit in diese rechte Kammer ausfließen kann. Es darf aber keine Kohlensäure mit hineingehen. In diesem Augenblicke sehließe man schnell den unteren Hahn /. Nun erhebe man die Quecksilberkugel (Stellung 2) wieder und lasse das Quecksilber jetzt durch die linke untere schmälere Kammer c wieder emporsteigen. Es wird sich ein gewisses Quantum C0 2 aus dem Blute entwickelt haben. Für die Ablesung

Bestimmung der Eohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke.

59

halte man die Quecksilberkugel so, daß die Menisken des Quecksilbers im Apparat und in der Kugel in derselben Ebene sind. Die Röhre ist in Hundertstel kalibriert. e) B e r e c h n u n g : Von der abgelesenen Zahl ziehe man 0,12 ab (eine Durchschnittskorrektur für Temperatur und Druck). Unter 53 % ist Azidosis und je niedriger das Resultat ausfällt, um so größer die Azidosis und um so schlechter die Prognose. Für die gewöhnlichen klinischen Zwecke ist diese Berechnungsmethode ausreichend. Für eine genauere Berechnung ist es notwendig, außer der Anzahl ccm-C0 2 auch die Temperatur und den Barometerstand zu notieren. Um dann die C0 2 bindende Fähigkeit des Plasmas zu finden, benutze man die Tabelle. Es sind z. B. gefunden 0,60 ccm C0 2 bei 25° und 746 mm, dann ist auf 760 mm reduziert: 0,60 •

= 0,58.

Und für 0,58 findet man für 25° 46,6 als Volumprozent C0 2 im Plasma als Bikarbonat gebunden.

60

Bestimmung der Kohlensäurekapazität des Blutes nach van Slyke. Tabelle

zur Berechnung des C0 2 -Bindungsvermögens des Plasmas. (v = abgelesene ccm-C0 2 . p = abgelesener Barometerstand.)

760

ccm-COa, auf 0° und 760 mm reduziert, als Bicarbonat in 100 ccm Plasma gebunden 15»

0,20 |

9,1

20"

25°

30°

9,9

10,7

11,8

V

' 760

ccm-COj, auf 0° und 760 mm reduziert, als Bicarbonat in 100 ccm-Plasma gebunden 15»

20»

25»

30°

0,60

47,7

48,1

48,5

48,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,30

10,1 11,0 12,0 13,0 13,9 14,9 15,9 16,8 17,8 18,8

10,9 11.8 12,8 13,7 14,7 15,7 16,6 17,6 18,5 19,5

11,7 12,6 13,6 14,5 15,5 16,4 17,4 18.3 19,2 20,2

12,6 13,5 14,3 15,2 16,1 17,0 18,0 18,9 19,8 20,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,70

48,7 49,7 50,7 51,6 52,6 53,6 54,5 55,5 56,5 57,4

49,0 50,0 51,0 51,9 52,8 53,8 54,8 55,7 56,7 57,6

49,4 50,4 51,3 52,2 53,2 54,1 55,1 56,0 57,0 57,9

49,5 50,4 51,4 52,3 53,2 54,1 65,1 56,0 66,9 57,9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,40

19,7 20,7 21,7 22,6 23,6 24,6 25,5 26,5 27,5 28,4

20,4 21,4 22,3 23,3 24,2 25,2 26,2 27,1 28,1 29,0

21,1 22,1 23,0 24,0 24,9 25,8 26,8 27,7 28,7 29,6

21,7 22,6 23,5 24,5 25,4 26,3 27,3 28,2 29,1 30,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,80

68,4 59,4 60,3 61,3 62,3 63,2 64,2 65,2 66,1 67,1

58,6 69,5 60,5 61,4 62,4 63,3 64,3 65,3 66,2 67,2

58,9 59,8 60,7 61,7 62,6 63,6 64,5 65,5 66,4 67,3

68,8 59,7 60,6 61,6 62,5 63,4 64,3 65,3 66,2 67,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,50

29,4 30,3 31,3 32,3 33,2 34,2 35,2 36,1 37,1 38,1

30,0 30,9 31,9 32,8 33,8 34,7 35,7 36,6 37,6 38,5

30.5 31,5 32,4 33,4 34,3 35,3 36,2 37,2 38,1 39,0

31,0 31,9 32.8 33,8 34,7 35,6 36,5 37,4 38,4 39,3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,90

68,1 69,0 70,0 71,0 71,9 72,9 73,9 74,8 75,8 76,8

68,1 69,1 70,0 71,0 72,0 72,9 73,9 74,8 75,8 76,7

68,3 69,2 70,2 71,1 72,1 73,0 74,0 74,9 75,8 76,8

68,0 69,0 69,9 70,8 71,8 72,7 73,6 74,5 75,4 76,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,60

39,1 40,0 41,0 42,0 42,9 43,9 44,9 45,8 46,8 47,7

39,5 40,4 41,4 42,4 43,3 44,3 45,3 46,2 47.1 48,1

40,0 40,9 41,9 42,8 43,8 44,7 45,7 46,6 47,5 48,5

40,3 41,2 42,1 43,0 43,9 44,9 45,8 46,7 47,6 48,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1,00

77,8 78,7 79,7 80,7 81,C 82,6 83,6 84,5 85,5 86,5

77,7 78,6 79,6 80,5 81,5 82,5 83,4 84,4 85,3 86,2

77,7 78,7 79,6 80,6 81,5 82,4 83,4 84,3 85,2 86,2

77,3 78,2 79,2 80,1 81,0 82,0 82,9 83,8 84,8 85,7