Guia Practica De Microbiologia En Agua Y Alimentos

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Guía Práctica de Microbiología en Agua y Alimentos

INDICE CAPITULO I: GENERALIDADES DEL MUNDO MICROBIANO 1. Consideraciones previas y Objetivos del Libro. 2. Conceptos sobre Microbiología. a. Bacterias b. Hongos c. Alimentos y Microbiología 3. Metabolismo microbiano y factores que inciden en su normal desarrollo. Ecología de los microorganismos de los alimentos. Crecimiento. Supervivencia y muerte.

CAPITULO II: EL LABORATORIO DE ALIMENTOS Y OTROS CONCEPTOS 1. Laboratorio Microbiológico de Alimentos: Instalaciones y Control de

Calidad.

2. Planes de Muestreo: diferentes opciones. Métodos de muestreo, toma y preparación de la muestra. Diluciones decimales. 3. Criterios y Riesgos Microbiológicos. 4. Epidemiología de los principales patógenos microbianos transmitidos por los alimentos.

CAPITULO III: CONCEPTOS GENERALES DE INVESTIGACIÓN CLÁSICA 1. Medios de Cutivo: Generalidades. Composición de los medios de cultivo. Tipos de medios de cultivo. Preparación de medios de cultivo. 2. Técnicas generales de Siembra en el Laboratorio de Alimentos. Crecimiento. Supervivencia y muerte. Preparación de muestras. Métodos de recuento y determinación de viables. Siembra en masa y. Siembra en superficie. Filtración de membrana. Recuento en tubo. 3. Marchas Clásicas de Investigación de Patógenos: Generalidades a. Agua. b. Alimentos: Cárneos, lácteos y huevos.

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CAPITULO IV: MARCHAS BÁSICAS EN PATÓGENOS ALIMENTARIOS 1. Enterobacterias y Escherichia coli 2. Aerobios mesófilos totales 3. Enterococos 4. Salmonella y Shigella 5. Staphilococus aureus 6. Bacillus cereus 7. Flora micótica total: Mohos y Levaduras 8. Clostridios Sulfito Reductores

CAPITULO V: TIPIFICACIÓN BIOQUÍMICA Y MISCELÁNEAS 1. Pruebas Bioquímicas de Tipificación Bacteriana. a. Prueba de la Oxidasa b. Prueba de la Catalasa c. Prueba de OR - HL d. Prueba de la utilización de los carbohidratos e. Prueba de la β galactosidasa f. Prueba del Indol g. Prueba de RM y VP h. Prueba del Citrato i. Prueba de la Urea j. Prueba de la DNAsa k. Prueba de la Descarboxilasa l. Prueba de la Lisina Hierro ll. Prueba del Manitol y la Movilidad m. Prueba de la reducción del Nitrato n. Prueba del Agar TSI ñ. Prueba de la Fenilalanina o. Prueba de la Gelatina p. Prueba de la hidrólisis del Almidón q. Prueba de la Coagulasa r. Prueba del Caldo Malonato s. Enterotube t. API 20 E 2. Misceláneas. a. Control Microbiológico de Alimentos y Agua en el marco de una Misión de Paz de la ONU (BATALLON CONJUNTO ARGENTINO 1 “HAITI” – 20042005)

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b. Placas PETRIFILM de 3M c. Medios Cromogénicos y Fluorogénicos d. Método rápidos de Diagnóstico en Alimentos: Métodos inmunológicos. Anticuerpos monoclonales y recombinantes. Enzimoinmunoanálisis (EIA). Radioinmunoanálisis (RIA). Métodos moleculares. PCR. Biochips y biomatrices. Biosensores en detección de patógenos.

BIBLIOGRAFIA GENERAL

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Capítulo I: Generalidades del mundo microbiano

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Un simple análisis macroscópico y organoléptico no nos pueden dar una idea acabada de la potencial contaminacion del alimento o del agua; para ello está la Microbiología de los mismos, quien se encargará de determinar cuál es el patógeno que puede desencadenar una Enfermedad Transmitida por Alimentos (ETA)

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1. CONSIDERACIONES PREVIAS y OBJETIVOS del LIBRO

Tener conocimientos generales sobre la microbiología de los alimentos y el agua; sobre la ecología de los microorganismos; las principales ETA; los microorganismos alterantes y los patógenos asociados a cada tipo de alimento. Conocer los métodos básicos oficiales del Laboratorio de Alimentos. Entender las técnicas de muestreo y el significado del riesgo microbiológico, interpretando los resultados obtenidos y elaborando un informe final. Pretende este Libro, ser asequible para todos los niveles del aprendizaje: Titulados Universitarios, Diplomados Universitarios y Técnicos de Formación Profesional, así como alumnos próximos a su egreso. Se basa en un texto sencillo y accesible a todos los niveles profundizando en la dificultad a través de cada Capítulo. El agua que bebemos y el alimento que elaboramos y consumimos, es una responsabilidad de todos los que integramos la gran cadena de la Inocuidad o Seguridad Alimentaria, desde el productor de la materia prima al consumidor final. Nuestra propuesta es brindar la herramienta del conocimiento y los fundamentos necesarios para comprender cuales son los escalones de la empinada escalera de la seguridad en los alimentos: Conocer al patógeno y aislarlo, para comprender la morbilidad que causa. Al final de esa escalera, estarán las evolucionadas herramientas de los Sistemas HACCP y sus Normas Internacionales, las Auditorías de fondo y todo el control de conjunto para la certificación final. La salud de todos nosotros depende en su mayor parte de esa escalera, para lograr y desarrollar alimentos inocuos en el mundo. Componente fundamental de los cimientos del desarrollo humano ha sido es y será su alimentación, cuya base fundamental es el alimento cada vez más sujeto a transformaciones que acompañan al crecimiento y las necesidades crecientes de las poblaciones. 6

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La salud pública está íntimamente relacionada con estos procesos, reconocer y entender causas y efectos es una necesidad primordial que acompaña a todo proceso de evolución. Ver a la Bromatología más allá de lo legal y del simple exámen macroscópico y organoléptico, ha sido el fin de todo análisis de agua para consumo o del alimento, tanto en materia prima como elaborado. La Microbiología de los mismos es escencial para ver y palpar lo invisible y muchas veces, patógeno. Un simple análisis macroscópico y organoléptico no nos puede dar una idea acabada de la potencial contaminacion del alimento o del agua; para ello está la Microbiología, quien se encargará de determinar cuál es el patógeno que puede desencadenar una ETA (Enfermedad Transmitida por Alimentos). Este libro de Microbiología de Alimentos, pretende se una base real y consistente para el profesional que recién comienza a transitar por el laboratorio de alimentos, o constituírse en una herramienta de consulta en el bagaje intelectual del especialista. Juntos transitaremos por el ABC de los microorganismos que contaminan a los alimentos y daremos las bases sencillas para su aislamiento e identificación, conforme a la Normativa Mundial en vigencia, como ICMSF, ISO, EN, AFNOR y CENAN. En definitiva, estableceremos el "deber hacer" para que la tecnica pueda ser desarrollada en un simple Laboratorio antes de llegar a algún centro especializado y pondremos en valor el conocimiento de lograr aislar la urgencia del patógeno o el control de los mismos en la rutina diaria.

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2. CONCEPTOS SOBRE MICROBIOLOGIA La Microbiología, el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Para mucha gente la palabra microorganismo le trae a la mente un grupo de pequeñas criaturas que no se encuadran en ninguna de las categorías de la pregunta clásica: ¿es animal, vegetal o mineral? Los microorganismos son diminutos seres vivos que individualmente son demasiado pequeños como para verlos a simple vista. En este grupo se incluyen las bacterias, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscópicas. Normalmente tendemos a asociar a estos pequeños organismos con infecciones, enfermedades como el SIDA, o el deterioro de los alimentos. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos contribuyen de una forma crucial en el bienestar de la Tierra ayudando a mantener el equilibrio de los organismos vivos y productos químicos en nuestro medio ambiente. Los microorganismos del agua dulce y salada son la base de la cadena alimentaria en océanos, lagos y ríos; los microorganismos del suelo destruyen los productos de desecho e incorporan el gas nitrógeno del aire en compuestos orgánicos, así como reciclan los productos químicos en el suelo, agua y aire; ciertas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosíntesis, que es un proceso que genera nutrientes y oxígeno a partir de luz solar y CO2 siendo un proceso crítico para el mantenimiento de la vida sobre la Tierra; los hombres y algunos animales dependen de las bacterias que habitan en sus intestinos para realizar la digestión y síntesis de algunas vitaminas como son la K y algunas del complejo B. Los microorganismos también tienen aplicaciones industriales ya que se utilizan en la síntesis de productos químicos como son acetona, ácidos orgánicos, enzimas, alcohol y muchos medicamentos. El proceso de producción de acetona y butanol por bacterias fue descubierto en 1914 por Chaim Weizmann, un polaco que trabajaba en Inglaterra para Winston Churchill. Cuando estalló la primera guerra mundial en agosto de ese año, la producción de acetona era esencial en el proceso de fabricación de las municiones, por lo que el descubrimiento de Weizmann jugó un papel determinante en el desarrollo de la guerra. La industria alimentaria también usa microorganismos en la producción de vinagre, bebidas alcohólicas, aceitunas, mantequilla, queso, yogurt y pan. Además, las bacterias y otros microorganismos ahora pueden ser manipulados para producir sustancias que ellos normalmente no sintetizan.

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A través de esta técnica, llamada Ingeniería Genética, las bacterias pueden producir importantes sustancias terapéuticas como insulina, hormona de crecimiento humana e interferón. Actualmente sabemos que los microorganismos se encuentran en todas partes; pero hace poco, antes de la invención del microscopio, los microorganismos eran desconocidos para los científicos. Miles de personas morían en las epidemias cuyas causas no se conocían. El deterioro de los alimentos no se podía controlar siempre y muchas familias enteras morían debido a que no existían vacunas y antibióticos disponibles para combatir las infecciones. Aunque los microorganismos se originaron hace aproximadamente 4.000 millones de años, la microbiología es relativamente una ciencia joven. Los primeros microorganismos se observaron hace 300 años y sin embargo pasaron unos 200 años hasta que se reconoció su importancia. La microbiología surgió como ciencia tras el descubrimiento, gracias al perfeccionamiento del microscopio, de los microorganismos. El naturalista holandés Antonio van Leeuwenhoek fue el primero en describir, en 1683, estos organismos (a los que bautizó como “animáculos”), que observó con la ayuda de un microscopio construido por él mismo. Ya en 1546 Girolano Fracastoro había sugerido que las enfermedades podían deberse a organismos tan pequeños que no podían verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes específicos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a través del estudio del carbunco, infección grave de los animales domésticos que es transmisible al hombre. La demostración concluyente de la causa bacteriana o etiología del carbunco la proporcionó en 1876 Roberto Koch, un médico rural alemán. Koch empezó a estudiar el mundo microbiano después de que su mujer le regalara por su 28 cumpleaños un microscopio. Seis años después Koch anunció al mundo que había encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente él y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. Esta serie de experimentos se ajustaban a los criterios necesarios para poder establecer la relación causal entre un organismo específico y una enfermedad específica. Estos criterios se conocen como los postulados de Koch:

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1. El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad. 2. El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el laboratorio. 3. La enfermedad específica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se inocula a un hospedador susceptible sano. 4. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado experimentalmente. Louis Pasteur fue un químico y biólogo francés que fundó la ciencia de la microbiología. Comenzó investigando los procesos de fermentación del vino y la cerveza y descubrió la existencia de las bacterias que interferían en este proceso. Aplicó sus conclusiones al estudio de la causa y el desarrollo de las enfermedades y demostró la teoría de los gérmenes como causantes de las mismas. También desarrolló vacunas que consiguieron salvar miles de vidas. Pasteur observó que, en la fabricación de la cerveza y el vino, a veces los dos líquidos resultaban buenos y otros agrios. Decidió estudiar el proceso con el microscopio y descubrió que cuando la fermentación era normal participaban las pequeñas células de la levadura. En cambio, cuando resultaban agrios era porque en el proceso participaban organismos como las bacterias. A finales del siglo XIX y comienzos del XX, diversos microbiólogos como el ruso Serguei Winogradsky, considerado el fundador de la ecología microbiana moderna, emprendieron las investigaciones sobre el metabolismo de las bacterias (estudios iniciados por Pasteur). Winogradsky estableció que las bacterias funcionan según dos modelos: la aerobiosis, que se basa en el consumo de oxígeno; y la anaerobiosis, que permite a las bacterias vivir en un ambiente desprovisto por completo de oxígeno. Winogradsky descubrió las bacterias quimiosintéticas, puso de manifiesto la participación de los microorganismos en el ciclo de la urea y fue uno de los primeros en estudiar las bacterias simbióticas.

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El estudio de los virus se desarrolló especialmente en el primer tercio del siglo XX. En efecto, a pesar de que en el año 1905 varios microbiólogos habían demostrado que las enfermedades víricas conocidas se debían a agentes patógenos minúsculos y no a las toxinas, los virus siguieron siendo invisibles; y su naturaleza, desconocida, hasta la década de 1930. En 1935 el bioquímico estadounidense Wendell Stanley logró aislar y cristalizar un virus: el del mosaico del tabaco. En 1938 se observaron por primera vez los virus gracias a la invención del microscopio electrónico. Después, en las décadas de 1960 y 1970 se descubrieron numerosos virus y se determinaron sus características físicas y químicas.

Posteriormente, las investigaciones microbiológicas se sirvieron de diversas técnicas innovadoras, como el microscopio electrónico de barrido o las técnicas de secuenciación del ácido desoxirribonucleico (ADN). Gracias a todos estos avances, los microorganismos se clasificaron en función de su estructura molecular, incluyéndolos en tres reinos. De este modo, las bacterias forman el conjunto de los procariotas, es decir, organismos en los que el material genético, en forma de ADN, se encuentra libre en el citoplasma y no incluido en un núcleo: pertenecen al reino Móneras. Los restantes organismos unicelulares se clasifican como eucariotas (en los que el genoma está incluido en el núcleo celular). Entre estos eucariotas unicelulares se distinguen los que pertenecen al reino Protistas (grupo que engloba a los protozoos y algas unicelulares) y los que pertenecen al reino Hongos (las levaduras). Los virus constituyen un mundo aparte, ya que no pueden reproducirse por sí mismos, sino que necesitan parasitar una célula viva para completar su ciclo vital. Por último, el descubrimiento de los priones por Stanley Prusiner y su equipo en 1982 ha abierto una vía de estudio dentro de la microbiología. Los priones, simples proteínas desprovistas de material genético, suscitan numerosos interrogantes sobre su funcionamiento y modo de transmisión, cuyo ejemplo típico en la EEB (Encefalopatía Espongiforme Bovina) o Mal de la vaca loca. Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. 11

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Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. La esterilización es un proceso esencial en el cual se deben utilizar todos los instrumentos quirúrgicos, implantes y muchos otros dispositivos absolutamente esterilizados. La desecación y la congelación eliminan muchas especies de bacterias, pero otras simplemente permanecen en estado vegetativo.

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El calor seco o húmedo elimina todas las bacterias combinando adecuadamente factores como la temperatura a la que se someten y el tiempo de exposición. Se puede esterilizar por calor seco en estufas a más de 160°C durante media hora, o por calor húmedo en autoclaves a 120°C durante 20 minutos y a presión superior a la atmosférica. La ebullición a 100°C no elimina todos los gérmenes patógenos (entre los que no sólo están incluidos las bacterias sino también virus y levaduras). Otro medio habitual de esterilización, utilizado para objetos no resistentes al calor, son los medios químicos: el ácido fénico, iniciador de la era de la antisepsia (véase Fenol), el ácido cianhídrico, el óxido de etileno, la clorhexidina, los derivados mercuriales, los derivados del yodo (especialmente la povidona yodada) y muchas otras sustancias. El alcohol etílico no produce esterilización completa. Otro medio de esterilización actual son las radiaciones ionizantes (beta, gamma). La Pasteurización es un proceso de calentamiento de un líquido, en particular de la leche, hasta una temperatura que oscila entre 55 y 70°C para destruir las bacterias perjudiciales, sin producir cambios materiales en la composición, en el sabor, o en el valor nutritivo del líquido. El proceso se llama así en honor del químico francés Louis Pasteur, quien lo ideó en 1865 con el fin de inhibir la fermentación del vino y de la leche. La leche se pasteuriza al calentarla a 63°C durante 30 minutos, luego se enfría con rapidez, y se envasa a una temperatura de 10°C. La cerveza y el vino se pasteurizan al ser calentados a unos 60° C durante unos 20 minutos; también se hace, según un método más reciente, calentando a 70° C durante 30 segundos y envasando en condiciones estériles. Los desinfectantes son un arma clave para protegernos de los microorganismos ya que estos se encuentran en casi todas partes por eso los desinfectantes van destruyendo los microorganismos o impidiendo su desarrollo y asimismo protegen el área donde actúan durante un lapso de tiempo. Basado en los hallazgos del fisiólogo alemán Theodor Schwann y del bioquímico francés Louis Pasteur, Lister desinfectaba las heridas quirúrgicas y accidentales con una solución de ácido carbólico, y en cinco años redujo la tasa de mortalidad de las amputaciones importantes de un 45 por ciento a un 12 por ciento. Los desinfectantes cumplen un papel muy importante en el campo de la salud ya que si no fuera por estos por una simple herida podrían amputar cualquiera de nuestros miembros. Los antisépticos, son agentes físicos o químicos que evitan la putrefacción, infección o cambios similares, de los alimentos y tejidos vivos, destruyendo los microorganismos o impidiendo su desarrollo. Desde la antigüedad los alimentos se han conservado gracias al empleo de agentes antisépticos como el calor durante la cocción, la sal y el vinagre en la salazón y adobo, y el humo de la madera (que contiene creosota, un compuesto similar al ácido carbólico) en el ahumado de las carnes. 13

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En la actualidad, los principales agentes antisépticos en la conservación de los alimentos son el calor y el frío utilizados en procesos como el enlatado, la pasteurización y la refrigeración. La irradiación es otro medio de conservación de los alimentos.

a BACTERIAS

Una bacteria simplificada está formada por tres capas externas que envuelven las estructuras internas; la capa pegajosa protege la pared celular rígida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable. El flagelo es un medio de locomoción y los pelos que se extienden por fuera de la cápsula ayudan a la bacteria a sujetarse a las superficies. El material genético está contenido en el ADN que forma el nucleoide. Los ribosomas que flotan en el citoplasma intervienen en la síntesis de proteínas. El material genético de la célula bacteriana está formado por una hebra doble de ADN circular. Muchas bacterias poseen también pequeñas moléculas de ADN circulares llamados plásmidos, que llevan información genética, pero, la mayoría de las veces, no resultan esenciales en la reproducción. Muchos de estos plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra mediante un mecanismo de intercambio genético denominado conjugación. Otros mecanismos por los cuales la bacteria puede intercambiar información genética son la transducción, en la que se transfiere ADN por virus bacterianos (Bacteriófagos), y la transformación, en la que el ADN pasa al interior de la célula bacteriana directamente desde el medio. Las células bacterianas se dividen por fisión; el material genético se duplica y la bacteria se alarga, se estrecha por la mitad y tiene lugar la división completa formándose dos células hijas idénticas a la célula madre. Así, al igual que ocurre en los organismos superiores, una especie de bacteria origina al reproducirse sólo células de la misma especie. 14

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Algunas bacterias se dividen cada cierto tiempo (entre 20 y 40 minutos). En condiciones favorables, si se dividen una vez cada 30 minutos, transcurridas 15 horas, una sola célula habrá dado lugar a unos mil millones de descendientes. Estas agrupaciones, llamadas colonias, son observables a simple vista. En condiciones adversas, algunas bacterias pueden formar esporas, que son formas en estado latente de la célula que permiten a ésta resistir las condiciones extremas de temperatura y humedad. La clasificación taxonómica más utilizada divide a las bacterias en cuatro grandes grupos según las características de la pared celular. La división Gracilicutes incluye a las bacterias con pared celular delgada del tipo Gram negativas; las bacterias de la división Firmicutes tienen paredes celulares gruesas del tipo Gram positivas; las de la Tenericutes carecen de pared celular y las de la cuarta división Mendosicutes tienen paredes celulares poco comunes, formadas por materiales distintos a los típicos peptidoglucanos bacterianos. Entre las Mendosicutes se encuentran las Arquebacterias, un grupo de organismos poco comunes, que incluyen a las bacterias metanogénicas, anaerobias estrictas, que producen metano a partir de dióxido de carbono e hidrógeno; las halobacterias, que necesitan para su crecimiento concentraciones elevadas de sal, y las termoacidófilas, que necesitan azufre y son muy termófilas. Se ha discutido sobre la conveniencia de que las Arqueobacterias se incluyeran en un reino aparte, ya que estudios bioquímicos recientes han mostrado que son tan diferentes de las otras bacterias como de los organismos eucariotas (con núcleo diferenciado englobado en una membrana). Estos cuatro grandes grupos de bacterias se subdividen además en unas 30 secciones numeradas, alguna de las cuales se dividen a su vez en órdenes, familias y géneros.

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b. HONGOS La mayoría de los hongos están constituidos por finas fibras que contienen protoplasma, llamadas hifas. Éstas a menudo están divididas por tabiques llamados septos. En cada hifa hay uno o dos núcleos y el protoplasma se mueve a través de un diminuto poro que ostenta el centro de cada septo. No obstante, hay un filo de hongos, que se asemejan a algas, cuyas hifas generalmente no tienen septos y los numerosos núcleos están esparcidos por todo el protoplasma. Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La proliferación de hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio. Cuando el micelio se desarrolla puede llegar a formar grandes cuerpos fructíferos, tales como las setas. Otros tipos de enormes estructuras de hifas permiten a algunos hongos sobrevivir en condiciones difíciles o ampliar sus fuentes nutricionales. Las fibras, a modo de cuerdas, del micelio de la armilaria color de miel (Armillaria mellea), facilitan la propagación de esta especie de un árbol a otro. Ciertos hongos forman masas de micelio resistentes, con forma más o menos esférica, llamadas esclerocios. Éstos pueden ser pequeños como granos de arena, o grandes como melones. La mayoría de los hongos se reproducen por esporas, diminutas partículas de protoplasma rodeado de pared celular. El champiñón silvestre puede formar doce mil millones de esporas en su cuerpo fructífero; así mismo, el pedo o cuesco de lobo gigante puede producir varios billones. Las esporas se forman de dos maneras. En el primer proceso, las esporas se originan después de la unión de dos o más núcleos, lo que ocurre dentro de una o de varias células especializadas. Estas esporas, que tienen características diferentes, heredadas de las distintas combinaciones de genes de sus progenitores, suelen germinar en el interior de las hifas. Los cuatro tipos de esporas que se producen de esta manera (oosporas, zigosporas, ascosporas y basidiosporas) definen los cuatro grupos principales de hongos. Las oosporas se forman por la unión de una célula macho y otra hembra; las zigosporas se forman al combinarse dos células sexuales similares entre sí. Las ascosporas, que suelen disponerse en grupos de ocho unidades, están contenidas en unas bolsas llamadas ascas.

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Las basidiosporas, por su parte, se reúnen en conjuntos de cuatro unidades, dentro de unas estructuras con forma de maza llamadas basidios. A pesar de que en muchos textos se emplean sistemas de clasificación relativamente complicados, los micólogos utilizan por lo común un sistema sencillo, que tiene la ventaja de ser cómodo de usar. Según este sistema, los cuatro filos principales son: Oomicetes, Zigomicetes, Ascomicetes y Basidiomicetes y sus respectivos individuos forman oosporas, zigosporas, ascosporas y basidiosporas. Una gran variedad de especies se coloca, de forma arbitraria, en un quinto filo: Deuteromicetes, también llamados hongos imperfectos. Se incluyen en este grupo aquellos hongos en los que sólo se conocen procesos de multiplicación vegetativa. Sin embargo, la mayoría de esas especies están emparentadas con los ascomicetes.

c. ALIMENTOS y MICROBIOLOGÍA Hay varios mecanismos empleados para proteger a los alimentos contra los microbios y otros agentes responsables de su deterioro para permitir su futuro consumo. Los alimentos en conserva deben mantener un aspecto, sabor y textura apetitosos, así como su valor nutritivo original. Hay muchos agentes que pueden destruir las peculiaridades sanas de la comida fresca. Los microorganismos, como las bacterias y los hongos, estropean los alimentos con rapidez. Las enzimas, que están presentes en todos los alimentos frescos, son sustancias catalizadoras que favorecen la degradación y los cambios químicos que afectan, en especial, la textura y el sabor. El oxígeno atmosférico puede reaccionar con componentes de los alimentos, que se pueden volver rancios o cambiar su color natural. Igualmente, dañinas resultan las plagas de insectos y roedores, que son responsables de enormes pérdidas en las reservas de alimentos. No hay ningún método de conservación que ofrezca protección frente a todos los riesgos posibles durante un periodo ilimitado de tiempo. Los alimentos enlatados almacenados en la Antártida cerca del polo sur, por ejemplo, seguían siendo comestibles al cabo de 50 años, pero esta conservación a largo plazo no puede producirse en el cálido clima de los trópicos. Además del enlatado y la congelación, existen otros métodos tradicionales de conservación como el secado, la salazón y el ahumado. La desecación por congelación o liofilización es un método más reciente. Entre las nuevas técnicas experimentales se encuentran el uso de antibióticos y la exposición de los alimentos a la radiación nuclear. La congelación conserva los alimentos impidiendo la multiplicación de los microorganismos. Dado que el proceso no destruye a todos los tipos de bacterias, aquellos que sobreviven se reaniman en la comida al descongelarse y a menudo se multiplican mucho más rápido que antes de la congelación. 17

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La congelación impide la multiplicación de los microorganismos (bacterias y hongos microscópicos). Por el contrario, las enzimas, cuya actividad degrada los alimentos, sí se mantienen activas en condiciones de congelación, aunque su actividad es mucho más lenta. Por eso las legumbres frescas suelen blanquearse o hervirse antes de congelarlas, con el fin de inactivar estas sustancias e impedir que el sabor se degrade. También se ha propuesto blanquear el pescado para destruir las bacterias resistentes al frío que viven en las escamas. Los métodos de congelación de los productos cárnicos dependen del tipo de carne y del corte. El cerdo, por ejemplo, se congela justo después del sacrificio, mientras que el buey se cuelga durante varios días dentro de una cámara fría para hacerlo más tierno. Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos. Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas.

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Otro requisito importante es la facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar. Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100.000 descriptas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos. Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos. Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre.

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Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

En contra de la idea de que todos los microorganismos son dañinos, los yogures y los quesos son ejemplos de alimentos a los que se añaden éstos para, por ejemplo, agriar la leche y producir yogur, u obtener la cubierta blanca característica del queso Brie o el color azul del queso Roquefort. De un tamaño más o menos similar es el sector de frutas y verduras, en el que los productos pueden no haber sufrido ninguna alteración o estar enlatados, congelados, refrigerados o fritos. Actualmente, existen muchos otros productos químicos que se obtienen por fermentación (un término técnicamente restringido a los procesos que ocurren en ausencia de aire, como la producción de alcohol por levaduras, aunque este término a menudo se utiliza de forma más amplia). Estos productos incluyen el ácido oxálico utilizado en tintes y colorantes, el ácido propenoico (ácido acrílico) utilizado como intermediario en la producción de plásticos, o el ácido láctico empleado para acidificar alimentos y como anticongelante. 20

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Los microorganismos se han usado, así mismo, en la obtención de diferentes enzimas utilizadas para aplicaciones tan diversas, como la eliminación de manchas en los tejidos (gracias a la incorporación de enzimas en los detergentes que atacan proteínas y ácidos grasos), o la conversión de harina de maíz en sirope (utilizado para endulzar refrescos, galletas y pasteles).

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3. METABOLISMO MICROBIANO y FACTORES QUE INCIDEN EN SU NORMAL DESARROLLO

Las bacterias que pueden presentarse en el agua de consumo y en los alimentos crudos y/o cocidos, son microorganismos de una organización celular simple y se encuentran solos o agrupados; constan de una pared rígida que además de otorgar una forma característica para cada familia bacteriana, le permitirá a las mismas colorearse o no con determinadas substancias que nos orientarán a priori sobre qué género de bacteria está contaminando la muestra. Dichos contaminantes, bajo condiciones favorables de pH, temperatura y nutrientes, desarrollan un crecimiento explosivo. Amplios grupos de microorganismos, pueden atacar a alimentos mono y disacáridos y además casi todos desarrollan en estrechos rangos de pH que van entre los 6,60 a los 7,50 como valores extremos promedio, excepto los mohos y levaduras que prácticamente abarcan la escala de 0 a 14.

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Un alimento capaz de soportar el desarrollo de gérmenes tiene una composición microbiana constante, únicamente, cuando ha intervenido un factor externo (por ejemplo, congelación o deshidratación) o cuando se han agotado todos los elementos nutritivos (alcanzando una alteración completa) o, una vez que, la acumulación de productos metabólicos finales ha llegado a un nivel que determina la inhibición de todo crecimiento, por ejemplo, fermentación o adobado). Una población uniforme, después de alcanzada su estabilización, comienza a decrecer. Un estudiante de Microbiología diría que esta descripción corresponde exactamente al perfil de la curva de crecimiento bacteriano.

Hasta que se llega a la etapa de estabilización, la composición cualitativa y cuantitativa de la microflora está cambiando constantemente. Cada alimento tiene, en un momento dado, un perfil microbiano característico, comenzando por la "flora inicial", correspondiente a la recolección o sacrificio, que va aumentando a lo largo del transporte, elaboración y almacenamiento. El microambiente específico de cada alimento, en particular y, las acciones estimuladoras o inhibidoras, que ejercen unos microorganismos sobre otros, influirán en el resultado final. Existen ciertas condiciones que favorecen el desarrollo de microfloras específicas e inhiben la presencia de otras; estas condiciones se traducen en factores intrínsecos, de elaboración y extrínsecos. Las bacterias responsables de las Enfermedades Transmitidas por los Alimentos tienen una temperatura óptima de crecimiento de 37º C. Pese a todo, pueden crecer a una velocidad considerable en un rango de temperatura que se halla entre los 5º C Y 65º C. Fuera de este rango su capacidad reproductora se ve muy disminuida. A 100º C (ebullición) las bacterias comienzan a morir y por debajo de 5º C (refrigeración) su crecimiento es más lento; a los 0° C (congelación) quedan en estado latente pero no mueren. Los psicrótrofos: crecen a Tª de refrigeración (- 5° C) y a óptimas de 20 – 30° C (Cl. botulinum). Los psicrófilos crecen a Tª de refrigeración con óptimas de 10 – 15° C (Psicrobacter sp). Los mesófilos crecen entre los 30 y 40ºC (Enterobacterias). Los termótrofos crecen entre 42 y 50° C (Escherichia coli). Los termófilos crecen entre 50 y 90° C (Bacilo estearotermófilo).

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Las bacterias como todos los seres vivos, necesitan alimentarse para poder desarrollarse. Prefieren alimentos con un alto contenido de proteínas y humedad tales como carnes rojas, pollos, pescados o productos lácteos. La humedad del agua en algunos alimentos va de fuera a dentro o al revés.

Si la humedad relativa atmosférica es igual a la del alimento se conserva inalterado. Si la humedad relativa del alimento es < que la humedad relativa atmosférica el alimento se seca (EJ: Jamón de York o Jamón cocido). Si la humedad relativa atmosférica es > que la humedad relativa del alimento: se humedece el alimento y pueden crecen hongos (galletas, pan). Para preservar la contaminación de los alimentos; guardar bajo condiciones ambientales restrictivas. Cuando se almacenan bajo condiciones restrictivas se retrasa el deterioro del alimento al reducirse el crecimiento microbiano. Los factores intrínsecos son inherentes a los alimentos e influyen en el crecimiento microbiano. Corresponden a características químicas, físicas y bioquímicas (nutrientes, factores antimicrobianos naturales, pH, Aw y Eh). Sus efectos combinados determinaran la selección de la porción de la flora inicial capaz de sobrevivir o crecer; los microorganismos que no pueden competir en ese ambiente, son eliminados gradualmente. Por ejemplo, la mayor parte de las bacterias gram-negativas, que originalmente se encuentran en gran cantidad en las plantaciones, no sobreviven en los frutos cítricos, debido al pH claramente desfavorable. Por lo tanto, su alteración está producida por mohos, levaduras o microorganismos gram – positivos, que únicamente se encontraban, en la flora inicial, en proporciones menores. Los nutrientes se han de encontrar en forma que puedan ser utilizables o degradables por los microorganismos. Algunas estructuras son resistentes al ataque microbiano y solamente pueden ser degradadas por microorganismos con enzimas específicos.

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La mayoría de los microorganismos alterativos no son exigentes en cuanto a sus nutrientes. Se ha venido considerando que, la alteración de los alimentos ricos en proteínas es el resultado del ataque de los enzimas bacterianos proteolíticos, que liberan aminas y péptidos de bajo peso molecular; pero actualmente se sabe que, el desarrollo microbiano en carne conservada en condiciones aeróbicas, no da lugar a una descomposición proteica significativa, hasta que no se alcanza un avanzado estado de alteración. El crecimiento bacteriano inicial se produce a expensas de la glucosa y ribosa y, continúa utilizando los lactatos y aminoácidos. Únicamente, ciertos grupos de microorganismos especiales tienen un potencial enzimático suficiente para atacar estructuras biológicas complejas y dar lugar a alteraciones. Por ejemplo, los estados de degradación iniciales de muchos tejidos vegetales, sólo pueden ser producidos por microorganismos que segregan celulasas o pectinasas. Estos enzimas despolimerizan los polisacáridos de la pared celular y liberan compuestos metabolizables de peso molecular bajo, que pueden ser utilizados por otros microorganismos. Ciertas proteínas (queratina o elastina) son muy resistentes a la degradación por enzimas microbianos. Otras, como el colágeno, son descompuestas por la colagenasa, que sólo la producen muy pocos microorganismos (Pseudomonas sp, Clostridium perfringens y otros clostridios patógenos). Las proteínas y péptidos solubles se degradan mucho más fácilmente. Como resultado de este proceso de degradación se puede llegar a establecer un patrón particular de aminoácidos libres. Una vez que las proteínas han sido fragmentadas por la flora proteolítica, en elementos de peso molecular bajo, estos son fácilmente utilizados por la flora restante. Algunas especies liberan aminoácidos, que pueden ser asimilados por otros microorganismos, de tal modo que, llegan a establecerse asociaciones de dependencia. Otros producen péptidos de carácter estimulante. Por ejemplo, Streptococus thermophilus da lugar, en el yogur, a péptidos, que utiliza Lactobacillus bulgaricus. Muchos microorganismos alterativos (Pseudomonas y Bacillus sp), así como la mayor parte de los mohos y algunas levaduras y enterobacterias producen enzimas lipolíticas, que hidrolizan las grasas.

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La proteólisis y glucólisis son actividades metabólicas esenciales de muchos organismos alterativos, mientras que, la lipólisis es menos frecuente. Existen dos razones que avalan esta idea. Primera, la proteólisis y glucólisis se llevan a cabo mucho más rápidamente, porque los sustratos de proteínas y carbohidratos son, casi siempre, solubles y, por lo tanto, más fácilmente accesibles a los enzimas microbianos intra y extracelulares. Segunda, las grasas son relativamente insolubles, por lo que las porciones directamente accesibles a los enzimas extracelulares de los microorganismos alterativos son generalmente muy pequeñas, estando inicialmente limitadas a la superficie de la monocapa de las partículas grasas. En algunas emulsiones alimentarias "agua en aceite", la distribución de los microorganismos en las gotitas grasas aisladas está hecha de tal forma que, la mayor parte del lípido no es accesible a los enzimas microbianos. De hecho, el deterioro oxidativo de las grasas está originado principalmente por factores físicos y químicos, siendo raro el enranciamiento microbiano. No obstante, la lipólisis lenta, efectuada por los microorganismos, contribuye a la obtención de los típicos sabores de ciertos quesos (Roquefort, Gorgonzola) y de algunos productos cárnicos desecados y fermentados de forma natural, como el salame. La actividad lipásica es importante, en relación con las modificaciones del sabor, sólo como una primera etapa de una serie de reacciones. No existe correlación entre la producción de lipasas y la actividad oxidativa de los microorganismos. El contenido vitamínico de los alimentos no constituye un factor importante que pueda influir en la presentación de alteraciones, por lo que la pérdida de vitaminas en los alimentos, raramente, evita o retrasa su deterioro. No obstante, existen excepciones. Así, en los huevos los mecanismos antimicrobianos incluyen la unión de la biotina a la avidina, que disminuye la capacidad alterativa de los microorganismos. Todos los alimentos contienen minerales en cantidades excesivas, en relación con los que los microorganismos requieren para su crecimiento. En sustratos totalmente exentos de minerales no es posible el crecimiento de microorganismos y los zumos de frutas, completamente desmineralizados por intercambio iónico, son más resistentes a las levaduras que los productos no tratados.

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Ciertos alimentos contienen constituyentes microbianos; estos constituyentes se han encontrado en algunos tejidos vegetales, como especias, cebollas, ajos, berros y perejil, así como frutas (uvas). Las frambuesas contienen ácido salicílico, las bayas del fresno, ácido sórbico, y los frutos cítricos, aceites antibacterianos. Existen actividades antimicrobianas en alimentos de origen animal, sobre todo en la sangre (complemento, properdina, lisozima, histona, protamina y hematina).

El calostro, leche, saliva, leucocitos y algunos otros fluidos y tejidos tienen un sistema antimicrobiano eficaz, en el que la peroxidasa ("lactoperoxidasa" de la leche) cataliza la peroxidación de sustancias de bajo peso molecular (como el tiocianato) para formar productos que inactivan a los microorganismos. Los huevos de gallina contienen lisozima, que lisa ciertas clases de bacterias. El crecimiento y multiplicación de los microorganismos están influidos por la estructura o estado físico de los alimentos; por ejemplo, el estado líquido o congelado del agua tisular, la distribución de la fase acuosa de las emulsiones y la presencia de barreras biológicas (cáscara y membranas de los huevos, escamas del pescado y piel de las aves). La actividad antimicrobiana de los enzimas tisulares se reduce o, incluso se destruye, por tratamiento térmico. La congelación puede liberar importantes cantidades de lisozima de los tejidos animales e inhibir el crecimiento de los microorganismos, utilizados para detectar residuos de antibióticos u otras sustancias innibidoras, en la inspección de carnes. En consecuencia, se pueden obtener resultados positivos falsos. Frecuentemente, se sobrevalora la importancia de muchas actividades antimicrobianas de los alimentos.

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En la mayor parte de los casos, sus efectos quedan limitados a determinados grupos de microorganismos. Algunos componentes pueden anular los efectos de otros. En este sentido, ciertos cationes divalentes contrarrestan los efectos inhibidores de los ácidos grasos de cadena larga. Todos los factores que influyen en la colonización, supervivencia y crecimiento microbiano durante la preparación de los alimentos, se denominan factores de elaboración. Estos factores pueden inhibir o, incluso destruir, parte o la totalidad de la población. Por otro lado, los componentes individuales de la flora están, en ciertos aspectos, de tal modo favorecido que producen cambios en el perfil microbiológico. Los factores extrínsecos, están representados por factores ambientales, como temperatura de almacenamiento, presión de vapor del agua y presiones parciales de los gases de almacenamiento, que seleccionan una flora particular. El desarrollo microbiano determina la alteración o la enfermedad de origen alimentario que es, a su vez, una combinación de factores intrínsecos, de elaboración y extrínsecos, que son independientes. El desarrollo del Clostridium botulinum tipo A, a pH 7 y 37ºC, tiene lugar a aw de 0,94, mientras que a pH 5,3, el límite de aw para que haya crecimiento es de 0,99. Las salmonelas proliferan a pH 5,8 y a aw de 0,971, pero si el pH es de 5, el valor de aw tiene que ser de 0,986 o superior. Para Staphylococcus aureus se ha señalado una interdependencia similar.

Aspergillus glaucus, a pH 5 es capaz de multiplizarse a aw, de 0,73, pero a pH 3 precisa valores de aw de 0,77 o superiores (Lubienieckivon Schelhorn, 1972-1974). Generalmente, la inhibición está causada por una combinación de efectos desfavorables. La combinación de pH, ClNa (aw) y NO2Na, que impide el crecimiento de S. aureus (cepa productora de enterotoxina A) a 35 y 15ºC, y la acción del calor, que a 65ºC determina una supervivencia del 0,1 % pueden ser ilustraciones del efecto inhibitorio adicional del calor, cuando se combina con una incubación a temperatura reducida.

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Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y E. coli son más sensibles al NO2Na, en presencia de ClNa a 10ºC, que a 15 – 35ºC. Con C botulinum tipos A y B (inóculo de esporos) incubados durante 6 meses, se observa un incremento similar de la sensibilidad frente a NO2Na, en presencia de CINa. A 20 – 25ºC el crecimiento y la producción de toxina era similar, a 17,5ºC menos evidente y, a 15ºC no existía crecimiento durante 2 – 3 meses. En todas las combinaciones de ClNa y NO2Na, el desarrollo continuaba aumentando hasta los 6 meses. En estado natural, la mayoría de los alimentos, como carnes, pescados y productos vegetales, son ligerarnente ácidos. La mayor parte de las frutas son bastante ácidas y solo algunos alimentos, como la clara de huevo por ejemplo, son alcalinos. Para preservar los alimentos, durante miles de años se ha venido aumentando su acidez, bien de manera natural, por fermentación, o artificial, por adición de ácidos débiles, con lo que se consigue inhibir la proliferación microbiana. La acidez puede ser un factor básico en la preservación. como en el caso de algunos alimentos fermentados tales como el yogur, la col fermentada o los pepinillos en vinagre, o tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con el de otros factores tales como conservadores químicos, calor o actividad de agua (aw). La concentración de iones de hidrógeno está representada en la definición de pH de la forma que sigue:

pH = -1og10 [H+] ó pH = 1og10(1/[H+]) Así pues, el pH es el logaritmo negativo de la concentración de protones o iones hidrógeno. En alimentos, las sustancias ácidas que interesan son casi siempre ácidos débiles (HA) que se disocian dando lugar a H+ y aw. En equilibrio, la relación entre [H+] [A-] y [HA] es una constante (Ka), siendo Ka = [H+] [A-] / [HA]. Lo que también se puede expresar como: [H+] =Ka [HA] / [A-], y obteniendo el logaritmo negativo de ambos términos de la ecuación, -log H+=-log Ka -log[HA] + Iog [A-] ó pH= pKa + log[A-]/[HA].

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Si [A-]y [HA] son iguales, el logaritmo de su cociente es cero, y el pH = pKa. En otras palabras, pKa = pH, cuando la concentración del ácido disociado es igual a la del ácido no disociado. En los manuales de física y química, están tabulados los valores de Ka y pKa de diversos ácidos. Conociendo la concentración del ácido, el pH y el pKa ó Ka, se puede calcular la cantidad de ácido no disociado presente en una solución. Los ácidos fuertes tienen valores de pKa muy bajos, esto es, están casi totalmente disociados cuando estan en solución. Esto supone que aportan una [H+] proporcionalmente mayor que un ácido débil. Por ejemplo, el pH (a 25ºC) de una solución 0,1 N de HCl es 1,08, mientras que el de una solución también 0,1 N de ácido acético es 2,87. El título de acidez es la cantidad de álcali standard (habitualmente 0,1 N NaOH) que se necesita para neutralizar una solución ácida. Mide la cantidad de ion hidrógeno libre y la de ion hidrógeno liberado a partir del ácido no disociado durante la titulación. El pH de un alimento es uno de los principales factores que determinan la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos durante el procesado, el almacenaje y la distribución. Como el efecto de algunos otros factores, de los que se habla en este volumen, depende en parte del pH y es a veces difícil separar el efecto del pH per se y el de otros factores influidos por el pH. Así, por ejemplo, los microorganismos se ven afectados por el nivel de iones H+ libres (o sea, el pH per se) y además, por la concentración de ácido débil no disociado, la cual a su vez depende del pH. Los aniones de algunos ácidos débiles (del ácido acético o láctico, por ejemplo) son metabolizados dentro de la célula bacteriana, liberando H+ que acidifica el interior de la célula hasta alcanzar niveles inhibitorios. Otros aniones no son metabolizados y por tanto no acidifican el interior de la célula. El pH se determina normalmente con un pHmetro electrónico, obteniendo una precisión de aproximadamente ± 0,01 unidades de pH dentro del rango de 0 a 14. El pHmetro puede venir equipado con un electrodo de membrana de vidrio y otro electrodo de referencia, o bien con un único electrodo combinado, lo que es cada vez más frecuente.

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El electrodo de referencia suele ser de calomelano, con puente salino de solución saturada de cloruro potásico. Se ha hecho un estudio comparado de los diversos métodos aplicables para determinar mediante pHmetro el pH de alimentos de humedad intermedia. Todos estos métodos vienen a dar resultados sinulares. El de la AOAC, que utiliza un electrodo de lectura directa, resultó en el estudio comparativo ser tan fiable como cualquier otro, siempre que el alimento fuera lo suficientemente plástico como para permitir el contacto con el extremo sensor del electrodo. Las características físicas del producto determinan cual ha de ser en cada caso el procedimiento más adecuado para preparar la muestra y medir su pH. Para alimentos líquidos o semilíquidos de consistencia homogénea, basta con sumergir en la muestra el extremo del electrodo y asegurarse de que el contacto sea completo. Los alimentos que contienen partículas sólidas han de ser homogeneizados antes de tomar la muestra, para poder medir el pH global. Algunos alimentos no son homogéneos y presentan gradientes de pH entre la superficie y el centro de la pieza o partícula (es el caso, por ejemplo, de algunos productos vegetales durante el proceso de encurtido). Las diferencias de pH en distintos puntos de la muestra son reflejo de su naturaleza y tamaño. Para medir el pH de una superficie húmeda (como la de filetes de carne o pescado, por ejemplo) basta con aplicar los dos electrodos con suficiente presión como para obtener una lectura en el pHmetro; la medida corresponde al pH existente en la superficie del electrodo de vidrio, mientras que el electrodo de calomelano sirve sólo para establecer contacto eléctrico. En determinadas circunstancias, por ejemplo, cuando se trata de alimentos muy ácidos o fuertemente tamponados, el título de la acidez puede ser más útil que el empleo del pHmetro. Una proporción sustancial del ácido débil en solución se encuentra en forma no disociada, por lo que no contribuye directamente al pH, que sólo indica concentración de protones, no concentración total de ácido.

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Como la acción bacteriostática de los ácidos débiles depende básicamente de la concentración de molécula no disociada, es necesario primero estimar el pH del alimento y después, valorar la concentración total de ácido, lo que normalmente se hace mediante titulación con 0,1 N NaOH. Durante la titulación, la dilución del ácido y el drenaje de iones H+ provocan la disociación gradual del ácido inicialmente no disociado, liberando los iones H+ restantes, que pueden así ser titulados. Muchos microorganismos pueden crecer dentro de un amplio rango de pH. Cabría suponer pues, que estas células disponen de métodos eficaces para estabilizar su pH interno. Sin embargo, se ha comprobado que el pH interior puede verse considerablemente afectado por el pH del medio exterior. Se ha estudiado esta cuestión a base de seguir el paso, a través de la membrana celular, de un ácido débil, la 5,5dimetil-2,4-oxazolidindiona (DMO). Hay una serie de ácidos débiles que, a pH igual o inferior a su valor de pKa, han resultado ser potentes inhibidores del transporte de aminoácidos en Penicillium chrysogenum. Entre los compuestos que han mostrado este efecto, están el ácido sórbico, el benzoico y el propiónico; se ha sugerido que la forma no disociada de estos ácidos débiles podría difundirse libremente a través de la membrana celular, e ionizarse dentro de la célula, dando lugar a protones que acidificasen el medio interno de este organismo, que es normalmente alcalino. Efectos parecidos se han observado en diversos organismos y la eficacia práctica como conservadores de distintos ácidos no disociados, se conoce desde hace muchos años. Existen dos tipos de conservadores ácidos: 1. Los ácidos fuertes (como el clorhídrico o el fosfórico), cuyo efecto consiste en bajar considerablemente el pH, proporcionando una concentración externa de protones muy elevada, que determina la acidificación del medio interno celular. Tales condiciones son normalmente inaceptables en alimentos, pero permisibles en bebidas carbónicas, en las que se emplea el ácido fosfórico como acidulante. 2. Los ácidos débiles lipofílicos, que provocan la entrada de protones a través de la membrana celular, acidificando el interior de la célula e inhibiendo el transporte de nutrientes. Algunos ácidos se disocian dando lugar a aniones (lactato o citrato, por ejemplo) que la célula es capaz de transportar y cuya presencia por tanto no inhibe el metabolismo energético. Otros ácidos, como el acético o el fórmico, son eficaces conservadores debido a que no sólo son buenos conductores de protones, sino que además pueden dar lugar a concentraciones intracelulares de sus aniones que ejercen acción inhibitoria.

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Los iones potenciadores de ácidos, tales como el sulfito o el nitrito (las sales de ácidos minerales débiles), que resultan altamente inhibitorios a pH bajo. Las células de diferentes especies microbianas muestran muy distinta tolerancia a la acidificación interna o a la acumulación de aniones y sus membranas presentan distintas características en cuanto a permeabilidad de ácidos lipofílicos. A partir de una flora mixta, la acidez puede actuar como agente selector de un componente de la población inicial que sea particularmente tolerante. Las levaduras y los lactobacilos resultan a menudo seleccionados por efecto de los pHs bajos.

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Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (Aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentración de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extracción del agua o mediante la adición de solutos. Algunas moléculas del agua se orientan en tomo a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por los componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en una forma que es menos reactiva. La deshidratación es un método de conservación de los alimentos basado en la reducción de la aw,lo que se consigue eliminando el agua de los productos. Durante el curado y salazonado, así como en el almíbar y otros alimentos azucarados son los solutos los que, al ser añadidos, descienden la aw.

Un pequeño descenso de la aw es a menudo suficiente para evitar la alteración de los alimentos siempre que esta reducción sea potenciada por otros agentes tal como ocurre con los nitritos en muchas carnes curadas y con los componentes del humo en los alimentos ahumados, salazonados y desecados. La aw de un alimento o solución se define como la relación entre la presión de vapor del agua del alimento (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura.

aw = p/po A medida que una solución se concentra. la presión de vapor disminuye y la aw va descendiendo a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares o fuerzas de adsorción). La aw está relacionada con el punto de congelación y con el de ebullición, así como con la humedad relativa en equilibrio (ERH) y la presión osmótica. Los primeros estudios sobre la respuesta de los microorganismos frente a la humedad se describieron en términos de ERH o presión osmótica. La ERH, como la aw, es la relación entre la presión de vapor de la solución y la del agua pura pero expresadas en porcentaje.

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Por ello, ERR (%) = aw 100. La ERH se refiere estrictamente a la atmósfera en equilibrio con una solución o alimento y constituye una expresión menos apropiada que la aw como forma de medir el agua disponible. Sin embargo, los solutos nunca son ideales. De una parte, las interacciones entre las moléculas pueden reducir el número efectivo de partículas en la solución, mientras que, de otra, la disociación puede incrementar realmente dicho número. Tales factores conducen a desviaciones del sistema ideal que son realmente grandes para los no electrolitos a concentraciones superiores a 1 molal y para los electrolitos a cualquier concentración. Los datos ofrecidos anteriormente permiten predecir la aw de una solución sencilla de composición conocida pero la relación entre la composición de un alimento y su aw es mucho más compleja. Para conocer estas relaciones lo habitual es determinar los valores de la aw del alimento a diferentes concentraciones de agua, los que se representan gráficamente con el fin de obtener la isoterma de sorción de agua. Los factores que reducen la presión de vapor de agua en los alimentos y, por tanto, la aw son los siguientes: la adsorción de las moléculas de agua a las superficies, las fuerzas capilares y las sustancias disueltas que se han mencionado anteriormente. Normalmente se acepta que la primera subida de la isoterma representa la adsorción del agua que forma una monocapa de moléculas en los lugares de adsorción del producto sólido. Al anadir más agua, la isoterma aumenta rápidamente de nuevo a medida que los solutos se disuelven y se llenan los espacios capilares.

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Estos fenómenos se solapan y algunos, realmente, pueden no estar representados en la isoterma. En estos casos puede no evidenciarse la monocapa en los alimentos que contengan poco material estructural al mismo tiempo que las fuerzas capilares pueden tener poca influencia. Para muchos alimentos, la isoterma obtenida por adsorción de agua a un producto seco difiere de la hallada secando un alimento húmedo. Este efecto se denomina histéresis y la parte divergente de las isotermas se le llama "espacio" de histéresis.

En la práctica, la mayoría de los alimentos con una baja aw se preparan por desorción del agua, es decir, deshidratándolos. Por ello, la isoterma de desorción es la más importante y la histéresis no presenta problema alguno. Sin embargo, la situación puede ser más complicada cuando se formulan ciertos alimentos, los que poseen un grado de humedad intermedio (aw = 0,60 - 0,90) en los que se mezclan ingredientes con valores de aw distintos. En los alimentos que muestran un marcado grado de histéresis a altos niveles de aw, los microorganismos pueden crecer más rápidamente, a iguales aw, en los sistemas ajustados por desorción que en aquellos preparados por un proceso de adsorción. La actividad de agua depende de la temperatura dado que ésta influye también sobre la presión de vapor de agua de las soluciones pero el efecto es pequeño con la mayoría de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas. En tales casos, las cantidades de algunas sustancias de la solución, y por tanto la aw, pueden variar marcadamente con la temperatura. A temperaturas inferiores a las del punto de congelación de una solución o alimento, la presión de vapor del agua líquida disminuye al descender la temperatura. La aw de una solución o alimento congelados es función de la temperatura presentando un valor de 0,953 a -5ºC; de 0,907 a -10ºC; de 0,864 a -15ºC y de 0,823 a -20ºC. Scott (1962) ha estudiado los límites del crecimiento microbiano en un medio congelado en relación con la temperatura y la aw.

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La determinación de la aw se realiza habitualmente en el laboratorio mediante higrómetros eléctricos o de cabello que se encuentran en el mercado o por interpolación gráfica. En este último método, las muestras del alimento se mantienen a temperatura constante en envases (preferentemente evacuados) que contienen soluciones (con frecuencia saturadas) de aw conocidas. Las variaciones de peso sufridas por las muestras en un período de varias horas se representan gráficamente respecto a la aw de la solución control. La aw a la que la gráfica indica que no ha habido variación en el peso es la aw del alimento. El hombre ha aprendido a lo largo de los siglos, por vía empírica, a explotar las temperaturas extremas para la conservación de sus alimentos. Observó que enfriándolos se retrasaba su alteración; que manteniéndolos en estado congelado se conservaban durante largos periodos de tiempo; que el calentamiento eliminaba los agentes de la alteración de origen microbiano y que, si se evitaba la recontaminación mediante un envasado adecuado, los alimentos térmicamente tratados podían con servarse incluso a la temperatura ambiente. Del mismo modo, averiguó que algunos alimentos, mantenidos a la temperatura ambiente, sufren modificaciones de sus propiedades organolépticas, pero siguen siendo aptos para el consumo y se tornan considerablemente más estables. Así se fue desarrollando una amplia variedad de alimentos fermentados, muchos de ellos asociados en su origen a una determinada raza y a los alimentos frescos localmente disponibles. La sociedad moderna consume cientos de productos fermentados que, pese a que un buen número de ellos se han visto favorecidos por la aplicación de los conocimientos científicos, recientemente descubiertos, siguen siendo esencialmente idénticos a los que se consumían hace varias generaciones. Las fermentaciones generalmente implicadas son la láctica y la alcohólica, o una combinación de ambas. Si el alimento original contiene un azúcar fermentescible y se encuentra moderadamente salado es probable que se produzca una fermentación láctica Si su sabor es ácido, lo esperable es una fermentación alcohólica. En cualquier caso, para conseguir las características deseadas en el producto fermentado de que se trate, resulta esencial el control de la temperatura, generalmente un ambiente frío. 37

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A lo largo de milenios de la historia de la humanidad, sólo las dos o tres últimas generaciones han sido capaces de capitalizar para la conservación y las fermentaciones de los alimentos los principios científicos en que estos procesos se basan. El control y la manipulación de la temperatura se encuentran entre los factores más críticos precisos para el logro de un suministro alimenticio que reuna las propiedades sanitarias organolépticas etc. correctas. Describiremos los principios científicos relacionados con la explotación de la temperatura en el control de los microorganismos que de ordinario pueden encontrarse en los alimentos consumidos por el hombre. Probablemente sea la temperatura el más importante de los factores ambientales que afectan a la viabilidad y el desarrollo microbianos. Aunque el crecimiento microbiano es posible entre alrededor de -8 y hasta +90º C, el rango de temperatura que permite el desarrollo de un determinado microorganismo rara vez excede de los 37º C. Dentro de este rango, la temperatura afecta a la longitud de la fase de latencia, a la velocidad de crecimiento, al número final de células, a las necesidades nutritivas y a la composición química y enzimática de las células.

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Cualquier temperatura por encima de la máxima de crecimiento de un determinado microorganismo resulta letal para el mismo, y cuanto más elevada sea la temperatura en cuestión tanto más rápida será la pérdida de viabilidad. Sin embargo, la letalidad de cualquier exposición a una determinada temperatura por encima de la máxima de crecimiento depende de la termorresistencia que es fundamentalmente una característica del microorganismo considerado. Los microorganismos sobreviven a temperaturas inferiores a la mínima de crecimiento. Los efectos letales de la refrigeración y la congelación dependen del germen considerado, del microambiente y de las condiciones de tiempo y temperatura de almacenamiento. Algunos microorganismos permanecen viables durante largos periodos de tiempo si se mantienen congelados a temperaturas suficientemente bajas. Tras un periodo de ajuste o adaptación al ambiente (fase de latencia) comienza el crecimiento que se acelera hasta alcanzar una etapa de multiplicación rápida y constante, de crecimiento exponencial, denominada fase logarítmica o exponencial. La deplección de nutrientes y el acúmulo de metabolitos tóxicos termina frenando la velocidad de crecimiento hasta que alcanza un punto en el que muertes y divisiones celulares se igualan, permaneciendo así la población constante durante un periodo al que se conoce con el nombre de fase estacionaria. A esta fase en la que la población es máxima, sigue otra en la que va progresivamente decreciendo a causa de las muertes celulares.

La influencia de la temperatura sobre la actividad microbiana es más acusada en los alimentos húmedos, es decir a actividades de agua (aw) superiores a 0,85. La mayor parte de las bacterias son incapaces de seguir creciendo a actividades de agua inferiores. A las temperaturas más elevadas, hay un rango en el que la velocidad de crecimiento, tiempo de generación, se mantiene relativamente estable (óptimo de crecimiento); este rango se halla en torno a 20 – 30º C para los psicrótrofos y 35 – 45° C para los mesófilos. A temperaturas sólo ligeramente superiores a las que son precisas para un crecimiento óptimo se da una inhibición del mismo. Las bacterias termófilas responden de un modo similar, pero su gráfica de crecimiento se encuentra sustancialmente desplazada hacia la derecha. La naturaleza de la respuesta a cualquier temperatura dada se ve profundamente afectada por el tiempo de exposición a la misma. El crecimiento en un ambiente confinado, incluso a la temperatura óptima, cesa llegado un momento determinado a causa del gradual agotamiento de nutrientes.

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En atención a sus rangos de temperatura de crecimiento, pueden distinguirse cuatro grupos fisiológicos fundamentales de bacterias: termófilas, mesófilas, psicrófilas y psicrotrofas. Los microorganismos mesófilos, muchos de origen humano o animal incluyendo los patógenos y numerosos tipos de los que alteran los alimentos prefieren temperaturas moderadas; ofrecen un óptimo que generalmente se encuentra entre los 30 y 45º C y una temperatura mínima de crecimiento que suele hallarse entre 5 y 10º C. En un medio favorable, el tiempo de generación de muchos mesófilos a la temperatura óptima es de 0,5 horas, o aún menos. En los termófilos la totalidad de la gráfica que relaciona el crecimiento con la temperatura se halla desplazada hacia el rango de temperatura más alto. La temperatura para un crecimiento óptimo suele hallarse entre 55 y 65º C y en algunos casos es de hasta 75 – 90º C; la mínima se encuentra hacia los 35º C. Todavía persiste cierta confusión con respecto al término psicrófilo. Utilizando los mismos criterios que nos han servido para definir los microorganismos mesófilos y termófilos, es lógico definir los psicrófilos en términos de su temperatura óptima de crecimiento, que debe ser claramente distinta de las de los dos citados grupos. Muchos autores, sin embargo, han clasificado como psicrófilos a todos aquellos microorganismos que son capaces de crecer a 0º C, sin tener en cuenta cual sea su temperatura óptima. Otros distinguen a los microorganismos que toleran las bajas temperaturas en psicrófilos obligados, con óptimos inferiores a 20º C y psicrófilos facultativos con temperaturas óptimas más altas. Reclama más consistencia en la definición que estima debe estar basada en la temperatura óptima; así denomina psicrófilos a los microorganismos que tienen una temperatura óptima de crecimiento alrededor de, o inferior a 15ºC y una máxima de alrededor de 20ºC o menos. Los auténticos psicrófilos abundan en los ambientes fríos más de lo que al comienzo se pensaba, especialmente en aquellos lugares en los que se mantiene constantemente una temperatura baja. De hecho, el ambiente predominante de la biosfera es frío, dado que las regiones polares y los oceanos (95 % en volumen por debajo de 5ºC) representan el 14 y el 71 % de la superficie del planeta, respectivamente. Al aislar psicrófilos es preciso cuidar de un modo especial de evitar la exposición a temperaturas superiores a 10ºC. Al olvido o al desconocimiento de este hecho se deben pasados fallos en la detección de un gran número de psicrófilos. En la Tecnología de los Alimentos los microorganismos psicrófilos son menos importantes que los psicrotrofos, en virtud de su mayor sensibilidad a las temperaturas elevadas. Los auténticos psicrófilos son generalmente de origen marino siendo en este hábitat en el que mayor interés cobran y comprenden solo unos pocos géneros. A los microorganismos capaces de crecer en las proximidades de 0º C, pero que no reunen los requisitos de temperaturas óptima y máxima para su clarificación como psicrófilos se les conoce como psicrótrofos.

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Como crecen mejor a temperaturas moderadas, pueden considerarse como un subgrupo de los mesófilos capaz de desarrollarse a temperaturas inferiores a la mínima tolerada por la mayoría de los mesófilos. Entre los psicrótrofos se incluyen bacterias Gram positivas y Gram negativas; aeróbicas, anaeróbicas, y anaeróbicas facultativas; carentes y provistas de movilidad; esporuladas y no esporuladas. El grupo comprende numerosas especies pertenecientes a no menos de 27 géneros. También se encuentran cepas psicrótrofas de levaduras y mohos pertenecientes a géneros tan importantes como Penicillium y Aspergillus. Temperaturas de refrigeración son aquellas próximas, pero superiores, al punto de congelación de los alimentos, habitualmente se consideran como tales las incluidas en el rango - 1 +7ºC. El efecto de la refrigeración sobre la microflora de un determinado alimento depende de la temperatura y el tiempo de almacenamiento, así como de las características fisiológicas de los microorganismos implicados. A medida que la temperatura desciende por debajo del óptimo, el crecimiento se hace más lento y finalmente se detiene. En el rango próximo a la temperatura de crecimiento, aumenta rapidamente la fase de latencia, tanto más cuanto más baja sea la temperatura, aproximándose finalmente a infinito. En el Ciadosprium herbanm, un hongo extremadamente tolerante a las bajas temperaturas, la fase de latencia oscila entre un día a la temperatura ambiente y 18 días a -5º C. Se han citado periodos de latencia de hasta 414 días, pero es dudoso que a lo largo de un periodo tan prolongado se haya llevado un cuidadoso control de la temperatura. En el rango de temperaturas que permite tanto el crecimiento de los mesófilos típicos como el de los psicrotrofos la fase de latencia de estos últimos es mucho más corta. La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura; por debajo del óptimo, el crecimiento es más lento y en los rangos inferiores por debajo de 0º C) el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas. Las bajas temperaturas tienen una importante acción selectiva sobre las floras mixtas constituidas por mesófilos y psicrotrofos y pueden afectar a la composición de la carga inicial de un alimento determinado, además de conducir a modificaciones instanciales de la flora desarrollada a lo largo del tratamiento tecnológico o el almacenamiento.

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Así, por ejemplo, una carne vacuna refrigerada obtenida en un clima semitropical ofrece un periodo de vida útil, en condiciones de refrigeración, más largo que el de una carne similarmente tratada procedente de zonas más frías. Esta diferencia es debida al efecto de terminología hoy habitual, este último debe clasificarse como psicrotrofo. De acuerdo con la temperatura sobre la proporción de microorganismos tolerantes de las bajas temperaturas en la carga inicial procedente del suelo y la piel del animal; la carne de bóvido de las áreas mas frías tiene una proporción más elevada de psicrotrofos. La temperatura de almacenamiento ejerce una poderosa influencia sobre la microflora de la leche. La leche cruda mantenida a unos 10º C desarrolla una flora en la que dominan los estreptococos acidolácticos, en tanto que si es mantenida en las proximidades de 0º C la flora dominante está constituida principalmente por bacterias Gram negativas psicrotrofas. El enfriamiento rápido de las bacterias mesófilas, desde una temperatura normal de crecimiento hasta 0º C, causa la muerte o lesiona un cierto porcentaje de las células que componen el cultivo. Las bacterias Gram negativas, como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosas, P. fluorescens, diversas especies de Salmonella y Enterobacter aerogenes, parecen ser más susceptibles al frío que los microorganismos Gram positivos, aunque también se haya observado el shock del frío en Bacillus subtilis y Clostridium perfringens. Staphylococcus aureus es resistente al shock del frío, pero un cultivo de este microorganismo en caldo tripticasa soja incubado a 5º C, manifestó un incremento en la sensibilidad al agar manitol salado evidenciando así su lesión. Los microorganismos psicrotrofos parecen ser menos sensibles al frío.

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El descenso diferencial de las actividades de los enzimas a bajas temperaturas puede alterar las rutas metabólicas y sus productos finales. Por ejemplo, los microorganismos que sintetizan pigmentos de fenacina y carotenoides tienden a rendir tasas más altas de estos productos a bajas temperaturas, lo que tiene cierta trascendencia en la alteración de los alimentos. La producción de dextranos extracelulares por Leuconostoc y pediococos se ve favorecida por las temperaturas inferiores a las óptimas de crecimiento de estas bacterias. La producción de lipasa y proteinasa por Pseudomonas y otros géneros ocurre preferentemente a bajas temperaturas. Algunos de estos enzimas son termorresistentes y pueden persistir después del tratamiento térmico. Muchos de los procesos reguladores del metabolismo celular son sensibles a las temperaturas inferiores a la óptima, de modo que la exposición a las bajas temperaturas puede provocar desequilibrios metabólicos y el cese del crecimiento. La incubación a bajas temperaturas puede alterar igualmente la composición lipídica de las células microbianas. El contenido lipídico final de las bacterias es independiente de la temperatura de crecimiento, pero el de las levaduras aumenta ligeramente al descender la temperatura. Tanto las bacterias como las levaduras experimentan un incremento en la proporción de acidos grasos insaturados a medida que disminuyen las temperaturas de crecimiento; en las bacterias se producen además menos ácidos grasos que contienen el anillo del ciclopropano. También se han citado incrementos en la insaturación de los alcoholes de las ceras producidos por las cepas mesófilas de Acinetobacter crecidas a bajas temperaturas. El incremento de la proporción de ácidos grasos no saturados al descender la temperatura se cree esencial para que las membranas cumplan su función, dado que la alteración provocada desciende la temperatura a que los lípidos de la membrana "se congelan". La proporción de ácidos grasos no saturados puede ser responsable de la capacidad de las células que soportan del frío, pero en los auxotrofos de. E coli para los ácidos grasos la distribución de estos en los lípidos de la membrana (siempre que en el medio de cultivo se hallen presentes tasas mínimas de ácidos grasos saturados y no saturados) puede variar dentro de amplios límites sin que aparentemente se vea afectada la capacidad del microorganismo para crecer a bajas temperaturas. Los alimentos pueden alterarse bajo la acción de microorganismos pertenecientes a los cuatro grupos en que se han clasificado en virtud de su respuesta a la temperatura: psicrofilos, mesófilos y psicrotrofos. Sin embargo, si los alimentos han sido refrigerados y mantenidos a las temperaturas de refrigeración adecuadas (inferiores a 7º C) la alteración sólo será causada por los psicrotrofos.

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Aunque los tiempos de generación de los psicrotrofos parezcan muy prolongados, los largos periodos de almacenamiento a refrigeración utilizados en muchos alimentos permiten que la población psicrotrófica alcance tasas de muchos millones por gramo en unos pocos dias, lo que frecuentemente resulta en la aparición de alteraciones desagradables en el olor, el gusto y la textura. Deben evitarse las fluctuaciones en la temperatura de almacenamiento porque la velocidad de crecimiento aumenta rapidamente con ella. La mayor parte de los patógenos son mesófilos y, con pocas excepciones, su crecimiento no constituye un problema en los alimentos refrigerados. Las salmonelas no crecen a temperaturas inferiores a unos 6º C (Matches y Liston, 1968) y en un caldo rico la fase de latencia a 10º C de la S. typhimurium es de aproximadamente 12 horas y su tiempo de generación de unas 8 horas. El crecimiento en los alimentos puede ser mucho más lento. Así, por ejemplo, tanto la Salmonella senftenberg como la S. ententidis y la S. manhattan son incapaces de crecer a 10º C en ensalada de jamón o natillas, aunque crezcan a 7º C en pollo "a la King" se observó que, en carne de vaca picada y cruda, no crecían a 7º C inóculos de cinco serotipos de salmonella multiplicandose, en cambio por 300 en cinco días a 12,5º C. Clostridium perfringens puede crecer a temperaturas entre 12 y 50º C, pero su desarrollo es muy lento por debajo de 15º C. Las celulas vegetativas del Clostridium perfringens son sensibles a las bajas temperaturas y el almacenamiento prolongado de los alimentos a temperaturas de refrigeración es probable que resulte en su destrucción lenta si las contienen. Los esporos no se ven afectados en el mismo grado por las acciones de las bajas temperaturas. La velocidad de crecimiento se ve afectada además por el pH y la composición del medio, de modo que el crecimiento del C. perfingens es más lento en un medio a pH 5,8 que en otro de 7,2 y se ha observado la germinación de esporos de clostridios a 5º C, es decir, por debajo de la temperatura mínima de crecimiento. Staphylococcus aureus es capaz de soportar las bajas temperaturas y de crecer hasta a unos 7º C. Pero el límite inferior para la producción de toxinas es algo más elevado. Se han detectado, por ejemplo, enterotoxinas en alimentos mantenidos a 10º C pero por debajo de 20º C su producción es lenta. 44

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Alcanzar niveles detectables de toxina (1 mg/ml) a 13º C exigió en una cepa 158 horas. Otras cepas crecen a 13º C pero son incapaces de producir toxina a menos de 19º C. En un medio rico, a pH 7, el tiempo necesario para la producción de toxina en cantidades mensurables osciló entre 78 – 98 horas a 19º C y 14 – 16 horas a 26º C. Bajo condiciones menos favorables, la producción de toxina fue más lenta. Aunque se alcancen poblaciones abundantes de S. aureus, la producción de enterotoxina puede inhibirse mediante las acciones independientes e interactivas de la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno, la actividad de agua y el desarrolo competitivo de otros microorganismos (Tatini, 1973). Vibrio parahaemolyticus es sensible a las bajas temperaturas y las intoxicaciones alimentarias producidas en Japón por este microorganismo suelen acaecer en los meses más cálidos del año. En la superficie del pescado marino al crecimiento parece cesar a temperaturas inferiores a 5 – 8ºC, aunque el microorganismo puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo. El Vibrio parahaemolyticus puede multiplicarse hasta alcanzar niveles peligrosos al almacenar ostras a temperaturas de 10º C durante una semana. La temperatura de crecimiento más baja publicada para el V parahaemolyticus en medios de cultivo es de 5º C; pero, el crecimiento a esta temperatura se ve fuertemente influido por el pH. Bacillus cereus crece en el rango de temperatura de 7º a 45º C y el Bacillus subtllis entre 12 y 55º C. No se han encontrado pruebas de que el E. coli enteropatógeno crezca a temperaturas inferiores a las mínimas de los demás E. coli. El número de E. coli enteropatógenos recuperables de los quesos blandos aumenta durante el almacenamiento a 4º C, pero no está claro en las experiencias en que se hizo esta observación si tal incremento era debido a la multiplicación del microorganismo o a la recuperación después del shock térmico. Se estudió el comportamiento de seis cepas de E. coli enteropatógeno en el queso Camembert a lo largo de un proceso de maduración de 7 semanas a 10º C y se observó un marcado descenso de las tasas de cuatro de ellas; en las otras dos las tasas aumentaron ligeramente durante la primera semana y decrecieron rapidamente en los seis restantes. Se han aislado microorganismos similares a la Yersinia enterocolitica en carne envasada a vacío y mantenida a 1 – 3º C. También se ha comprobado la producción de aflatoxina, oclaratoxina A y tremortinas A y B a 4 – 5ºC en diversos alimentos.

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Mientras que el pH de los alimentos se mide con facilidad y se comprende la significación de su medida, mucho más difícil resulta medir la repetibilidad del potencial de oxidación – reducción (Potencial Redox), sobre todo entre laboratorios diferentes, y además no está clara la significación que en la microbiología del producto tienen los valores hallados. Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. Las diferencias observadas en los productos finales del metabolismo, discernibles por el consumidor por diferencias de color o sabor, pueden ser en algunos casos la consecuencia de diferencias redox. En los alimentos picados (productos cárnicos) o en los productos no homogéneos (emulsiones), el potencial redox puede variar considerablemente de una parte a otra debido a altas concentraciones localizadas de diversos pares redox o de nutrientes como glucosa, fumarato o malato. Cuando se encuentra restringida la difusión gaseosa hacia el centro del alimento pueden existir gradientes de potencial redox desde la atmósfera hasta las partes profundas del alimento.

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El potencial redox indica las relaciones de oxígeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energía y sintetizar nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular. Los microorganismos aerobios necesitan para crecer valores redox positivos mientras que los anaerobios frecuentemente requieren valores redox negativos. En diferentes cultivos microbianos el valor redox puede oscilar dentro de un rango comprendido entre una cifra anaeróbica inferior a unos -420 milivoltios (mV) hasta una cifra aeróbica de aproximadamente +300 mV. Los procesos de oxidación y de reducción se definen en términos de migraciones electrónicas entre compuestos químicos. La oxidación es la pérdida de electrones mientras que la reducción es la ganancia de electrones. Cuando se oxida una sustancia (libera electrones) siempre se reduce simultáneamente otra (o sea, capta los electrones liberados). Este concepto electrónico ha sugerido el desarrollo de métodos para estudiar cuantitativamente los procesos de oxidación-reducción reversibles que son vitales para las células vivas. La medida del potencial de electrodo permite determinar el grado de reducción o de oxidación de una sustancia alimenticia determinada. Esta medida sugiere la posibilidad de clasificar los sistemas oxidantes y reductores de los alimentos en base a su intensidad. Todo proceso redox reversible puede expresarse así:

[oxidante] + [H+] + ne = [reductor] expresión en la que ne es el número de electrones transferidos en el proceso. El potencial redox (Eh) de tal proceso viene dado por la ecuación concebida y desarrollada originalmente por Nernst en 1975:

Eh = Eo + (RT/nF) ln [oxidante]/[reductor] en la que Eo es el potencial redox estándar a pH 0 pero en presencia de otros solutos a concentración 1 M (normalmente se mide como el potencial redox del punto medio a pH 0 y se supone que su valor es igual al valor teórico de los pares redox en solución acuosa diluida), R es la constante del gas molar, T la temperatura en ºK, F la cantidad Faraday de electricidad, n el número de electrones transferidos en el proceso y ln el logaritmo natural. En muchos alimentos es difícil obtener la verdadera medida del potencial redox. Para que el potencial redox de una muestra represente fielmente el del alimento de que fue tomada es esencial que se mantenga inalterado el ambiente gaseoso tanto si el alimento está envasado a vacío, envasado bajo una atmósfera anóxica o envasado en contacto con el aire. Puesto que el potencial redox desciende a consecuencia de la actividad metabólica, el transporte de la muestra deberá realizarse bien en condiciones de refrigeración (0 – 4º C) o a la temperatura de almacenamiento del alimento. 47

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La temperatura. y el tiempo del transporte deberán especificarse para ser consideradas en la interpretación de los resultados. El oxígeno es el principal agente que interfiere la medida del potencial redox. En general no deben usarse en la determinación del potencial redox muestras extraídas porque el oxígeno puede penetrar en la muestra durante el muestreo. Para evitar que el oxígeno contamine las muestras deberá quitarse la capa superior de la muestra de alimento bajo gas inerte para efectuar la medida. Puesto que los valores de potencial medidos dependen del pH, cada medida de potencial redox deberá ir acompañada de la medida del pH. El pH puede cambiar el potencial redox real, pero también para el mismo valor Eh el pH puede crear condiciones favorecedoras de diferentes tipos de metabolismo. El concepto de rH se introdujo para eliminar por cálculo ésta dependencia del pH. Mientras que el rH puede calcularse exactamente cuando todos los iones hidrógeno están completamente disociados a todos los valores pH, cuando el grado de disociación es alterado por el pH se producen inexactitudes. Además, los ácidos monovalentes alteran el potencial redox 30 mV por unidad pH, los ácidos divalentes 57,7 mV y los ácidos de valencia superior hasta 120 mV. El potencial redox se mide con un electrodo de metal inerte (normalmente platino) en un circuito con un electrodo de referencia. Alternativamente pueden utilizarse colorantes que cambian de color a determinados potenciales redox si bien estos indicadores pueden interactuar con los microorganismos y los alimentos obteniéndose falsos valores. El electrodo de platino responderá a cualquier sistema que produzca una reacción electroquimicamente reversible en la superficie del electrodo, siempre que la velocidad de reacción sea rápida en comparación con la captura o liberación de electrones del electrodo medidor. Con los modernos sistemas de medida de alta impedancia (1013 ohmios) pueden medirse potenciales verdaderos a partir de pares redox que producen corrientes de cambio muy bajo. Para la medida potenciométrica del potencial redox de muestras de alimentos líquidos se usan los electrodos de platino estandar y de calomelano. Para medidas sobre alimentos sólidos se necesita utilizar electrodos especiales con punta de platino afilada, que tengan escaso diámetro y gruesa pared y puentes de CIK-agar en tubos con punta rellena de fibras de asbestos fundido. A diferencia de los electrodos de pH, los electrodos redox requieren cierto tiempo (dependiente del tipo de muestra) para revelar el potencial redox. El potencial redox de los alimentos depende de las cantidades relativas de sustancias oxidadas y reducidas que contengan. Los alimentos que tienen grandes cantidades de tales sustancias son resistentes a los cambios del potencial redox y se llaman "fuertemente tamponados". 48

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De aquí que no sea fácil la interpretación de la lectura arrojada por un electrodo redox insertado en un alimento, puesto que el alimento puede estar o no fuertemente tamponado. En los alimentos débilmente tamponados una pequeña población microbiana (< 105/g) posiblemente puede causar un cambio del potencial redox, mientras que en los alimentos fuertemente tamponados una población microbiana grande (> 108/g) apenas puede afectar al potencial redox. Para poder juzgar la significación de cualquier cambio del potencial redox de un alimento hay que tener en cuenta el potencial metabólico y el tamaño de la población microbiana en relación con la capacidad tampón redox del alimento. Las medidas redox tienen la máxima utilidad cuando existen pares reversibles de componentes conocidos que se encuentran en equilibrio. Todo alimento puede contener pares redox pero algunos no se encuentran en equilibrio y otros son irreversibles. Se ha sugerido que la sonda redox puede ser un monitor adecuado de alteraciones o cambios deseables durante el almacenamiento de alimentos envasados a vacío, bajo atmósferas de gas anóxico o enlatados. Se ha visto que indica con exactitud tales cambios profundos en la carne en post rigor mortis, donde se encuentran muchas relaciones empíricas reproducibles entre los eventos metabólicos y el potencial redox. En tales circunstancias los principales sustratos o productos microbianos muestran alta actividad con el electrodo y pueden enmascarar todas las reacciones colaterales o interferentes de forma tal que el potencial redox medido es la verdadera representación del estado del par redox dominante. En presencia de oxígeno todos los pares redox de los alimentos tienden hacia el estado totalmente oxidado. Aunque el oxígeno disuelto no influye en la sonda de platino en presencia de agua pura, en presencia de soluciones salinas (incluyendo alimentos tales como el jamón y las verduras encurtidas) se producen reacciones electrolíticas que pueden sensibilizar la sonda al oxígeno disuelto haciendo que indique valores redox artificialmente altos positivos). En tales circunstancias el potencial redox aparente será función del logaritmo de la concentración del oxígeno disuelto y por tanto grandes cambios del potencial redox representarán pequeños cambios de la tensión del oxígeno disuelto. El potencial redox y el pH se pueden controlar en los medios de cultivo, y probablemente en los alimentos, ajustando la concentración de O2 gaseoso y de CO2. Aunque en teoría puede alcanzarse un equilibrio estable entre las concentraciones en las fases de gas y de agua (relativas a la solubilidad de los gases en el medio de cultivo y la temperatura), la captación de O2 y la liberación de CO2 por los cultivos microbianos excederá con frecuencia de tales concentraciones.

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El potencial redox puede reducirse rapidamente durante la germinación y crecimiento de los esporos puesto que, aunque inicialinente sólo germina una pequeña proporción de los esporos, los esporos que germinan y crecen producen nicotinamida adenín dinucleótido reducido (NADH) y otros reductores que reducen la concentración de oxígeno a un nivel no inhibidor para los esporos remanentes. Esta reducción del nivel de oxígeno y la mayor tensión de H2 producida por el metabolismo celular se traduce en una gran caída del potencial redox. Los ambientes creados en los alimentos pueden categorizarse a groso modo como aquellos en los que el acceso de oxígeno está restringido y en los que no está restringido. En los que el acceso de oxígeno es limita do los microbios que se desarrollan producen CO2 + H2O como principales productos finales; aunque la producción de productos finales tales como ácidos orgánicos no son significativa, entre los metabolitos secundarlos pueden incluirse aminas, etc. Cuando el acceso al oxígeno es restringido ocurre la fermentación y pueden impartirse cambios de aroma al alimento antes de que se altere. Antes de que tales cambios sean detectables por el consumidor tiene que alcanzarse un alto número de microorganismos (> 106 /gm). Algunos microorganismos, como los aerobios estrictos y los anaerobios, sólo poseen un sistema metabólico terminal para obtener energía y en consecuencia sólamente son activos dentro de un margen de potencial redox relativamente estrecho. Otros, como los anaerobios facultativos, tienen sistemas alternativos que pueden ser puestos en marcha o paro por el potencial redox o la presencia o ausencia de oxígeno.

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Con respecto a las sales de curado, el método en sus comienzos, se desarrolló para conservar ciertos alimentos mediante la adición de cloruro sódico. Una impureza de la sal, el nitrato sódico, se vio que era el responsable de la aparición del pigmento rosa – rojizo de la carne, el llamado color de carne curada. Más tarde se comprobó que el compuesto responsable de la aparición del color era el nitrito y no el nitrato que se originaba por reducción bacteriana del último. En la actualidad se consideran sales del curado al cloruro sódico y al nitrito o nitrato de sodio o de potasio. Aunque el curado constituía originalmente un mecanismo de conservación por salazón, se han desarrollado simultáneamente con aquél varios miles de procesos adicionales principalmente fermentación, ahumado, desecación y aplicación de calor. En los últimos cincuenta años se han ideado una serie de productos curados que solo permanecen estables en condiciones de refrigeración. De hecho la mayoría de los productos cárnicos curados deben mantenerse en refrigeración para que conserven su inocuidad y salubridad y durante las últimas dos décadas hasta el envasado de muchos tipos de productos curados ha supuesto un factor importante para prolongar el tiempo durante el que el producto mantiene su salubridad. Además de las sales del curado y de los procesos con ellas relacionados, ya mencionados, en muchos productos cárnicos curados se emplean aditivos conocidos colectivamente como adyuvantes. En ellos se incluyen ascorbatos, fosfatos, glucono lactona y azúcares. Los adyuvantes se emplean fundamentalmente para alcanzar o mantener ciertos cambios deseables; los ascorbatos en relación con el color y los demás con respecto al pH, textura y en ciertos casos aroma. Los adyuvantes también pueden afectar a la sanidad del producto. El término de "curado" se utiliza mucho en varias industrias siempre en relación con un cambio deseable, por ejemplo en la preparación de cuero, fabricación de acero, endurecimiento de mortero y también en la conservación de alimentos. Sin embargo, incluso en la industria de los alimentos, la denominación de curado se relaciona unicamente con ciertos productos cárnicos y de pescado y con los quesos.

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Hasta en estos alimentos la palabra "curado" puede tener distintas connotaciones: a la carne se le adicionan siempre sal y nitrito o nitrato; al pescado, también se le añade siempre sal, mientras que el nitrato se le adiciona en muy raras ocasiones y en el queso, que siempre contiene sal y rarísimamente nitrato, el término curado se aplica a la producción de cambios proteolíticos y lipoliticos deseables. De hecho, el significado de "curados", incluso en la industria de los alimentos depende de la costumbre; por ejemplo, tanto la mantequilla como ciertas hortalizas adobadas necesitan sal como parte de su sistema conservador, pero nunca se les denomina productos curados. Las sales del curado, los adyuvantes y los procesos con ellos relacionados, ya citados, modifican el alimento base; entre tales modificaciones se incluyen las del color, aroma, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano; éste, dependiendo del producto, puede ser deseable, causar alteración u originar una toxiinfección alimentaria. La historia del curado comenzó hace miles de años cuando el hombre aprendió a conservar la carne por salazón. La presencia de nitrato en la sal común es responsable del enrojecimiento de este alimento. Sin embargo, el nitrato como tal se utilizaba incluso antes de la era cristiana en las antiguas civilizaciones de China e India. Los escritores romanos describen el curado de la carne por salazón, ahumado y acidificación.

Hacia finales del siglo XIX se sabía que las bacterias reducían el nitrato a nitrito durante el curado de la carne y que el responsable del enrojecimiento era el nitrito y no el nitrato. Sin embargo, hasta 1923 no se permitió en EE. UU. la adición de nitrato a la carne. Actualmente en la mayoría de las carnes curadas se tiende a emplear solamente sal y nitrito, si bien en ciertos productos se utilizan todavía el nitrato o las mezclas de nitrato y nitrito.

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El nitrato se ha empleado en Europa desde hace unos ciento cincuenta anos en la elaboración de quesos salazonados mediante inmersión en salmuera. La concentración de cada uno de los agentes del curado depende de la naturaleza de los alimentos y de la tecnología empleada en cada país; en donde se dispone de refrigeración suficiente los productos cárnicos más corrientes son los ligeramente salados que necesitan mantenerse en refrigeración. Por el contrario, en climas cálidos y en donde no se dispone de suficiente refrigeración los productos más corrientes son los fermentados e intensamente salados (autoestables). En consecuencia, los productos curados reflejan las economias y climas nacionales, constituyendo parte de las culturas nacionales y hasta regionales. De aquí que haya amplias diferencias entre los embutidos curados preparados en países distintos. Una afirmación similar puede hacerse para el pescado y quesos curados. No obstante, el resto de este capitulo se dedicará fundamentalmente al curado tal y como se aplica a la carne. Las carnes curadas pueden dividirse, de forma bastante amplia, en tres grupos: sin calentar, calentadas ligeramente (pasteurizadas hasta una temperatura en su centro de 65 – 75º C) y tratadas a temperaturas altas (autoestables, después de un calentamiento de l00 – 120º C). En general sólo unos pocos productos sin calentar (ciertos tipos de jamón y embutidos, bacon y costillar ligeramente salado) necesitan almacenarse en refrigeración, mientras que la mayoría de los calentados ligeramente deben someterse a refrigeración después de tratados por el calor; sin embargo, los que se someten a temperaturas altas en climas templados y en recipientes herméticamente cerrados son indefinidamente estables. Cuando se incorpora nitrito a un sistema alimentario se suceden una serie compleja de reacciones cuya naturaleza depende de las características físico-químicas del sistema. Se desconocen muchas de las reacciones. El nitrito adicionado a la carne se convierte en una mezcla en equilibrio de NO-3, NO- 2 y NO, dependiendo del pH y del Eh. El nitrito desaparece como resultado de sus reacciones químicas con los componentes de la carne o de la actividad metabólica de los microorganismos. Unos pocos componentes de la carne (cisteina e histidina) y los aditivos ascorbato e isoascorbato parece que son los responsables de las pérdidas mayores de nitrito; los agentes reductores median en la conversión del nitrito en óxido nítrico, pero se desconoce el papel de la histidina. Parte del nitrito se convierte en nitrato mediante diversas reacciones químicas especialmente en presencia de ascorbato y en curaciones prolongadas, con tal que exista oxígeno o algún otro aceptor adecuado de hidrógeno. Si el nitrito de los productos enlatados esté en cantidades excesivas, durante el tratamiento térmico puede dar lugar a la liberación de óxidos de nitrógeno gaseosos que pueden causar abombamiento.

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La velocidad a que desaparece el nitrito de los productos cárnicos tratados por el calor depende del pH y de la temperatura; a medida que desciende el pH y sube la temperatura se acelera la velocidad a que desaparece. Por ejemplo, la vida media en horas a un pH de 6 y a varias temperaturas será: a 100º C, 1,8; a 77º C, 6,7; a 24º C 126 y a 7º C 376. Algunos microorganismos también contribuyen a la desaparición del nitrito al utilizarlo como aceptor de hidrógeno. Las levaduras y las bacterias pueden llevar a cabo esta operación en las carnes curadas envasadas al vacío en plásticos impermeables al oxígeno; el desarrollo de ciertas bacterias reductoras del nitrito persiste en este ecosistema hasta que se agota todo el nitrito. En la carne curada enlatada el nitrato sirve de aceptor de hidrógeno de las bacterias aerobias, por ejemplo, Bacillus spp y micrococos; generalmente en ausencia de aquél no se multiplican. La reducción microbiana del nitrato o del nitrito a N2O y N2 puede producir abombamiento. Los principales agentes del curado y adyuvantes que afectan al aroma son la sal, el azúcar, el humo y el nitrito. El azúcar se utiliza en bastante cantidad en ciertos tipos de bacon y jamones, pero su contribución al aroma en otros productos es todavía objeto de controversia; el humo, como aromatizante, se estudiará más tarde. El nitrito reacciona con los componentes de la carne, especialmente de la de cerdo, modificando su aroma y este aroma modificado se acepta más que el de la carne de cerdo curada exclusivamente con sal. La concentración óptima oscila entre 15 y 150 ppm de nitrito, dependiendo del producto. Se desconoce el fundamento químico del aroma del curado a pesar de las numerosas investigaciones realizadas, pero se ha sostenido la hipótesis de que parte del aroma a curado se debe a la ausencia de productos de la degradación oxidativa de los lípidos insaturados.

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La sal y el hierro aceleran la oxidación y ésta es más rápida en la carne de cerdo que en la de bóvidos ya que posee más lípidos insaturados que la última. El nitrito retarda la velocidad de la oxidación; por lo tanto, la diferencia entre la carne con y sin nitrito estriba en que en la primera la oxidación de los lípidos es menor. Se han hecho algunos trabajos con salchichas frankfurt de cerdo y de vacuno elaboradas con y sin nitrito que apoyan esta afirmación: las fabricadas con carne de cerdo sin nitrito o con niveles de nitrito bajos fueron organolépticamente menos aceptables que las de vacuno. Las especias y el ahumado pueden mejorar la aceptación organoléptica de los productos elaborados sin nitrito. En la carne que ha sido tratada por el calor y refrigerada se ha observado un defecto conocido como "aroma a sobrecalentado" ("warmed over" flavor (WOF)). Se debe al aumento, favorecido por el hierro, de los lípidos oxidados tales como heptanal,n-nona-3,6-dienal y otros compuestos semejantes. El nitrito previene o disminuye la producción de WOF, defecto qúe también se evita al producirse antioxidantes durante un calentamiento intenso, o adicionando algunos antioxidantes (hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) y galato de propilo). Todo ello está en favor de la hipótesis de que el aroma a curado se debe, al menos en parte, a la inhibición de la oxidación de los lípidos. La adición de nitrito a la carne transforma los pigmentos cárnicos, en especial la mioglobina y en menor extensión la hemoglobina, en un pigmento rojo, insoluble en agua, la oxido nitrico mioglobina. El calentamiento transforma este pigmento en otro rosa, el nitrosil-hemocromo que se estabiliza con los ascorbatos.

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Los pigmentos de carne curada pueden originarse por reacciones químicas, bioquímicas o enzimáticas, dependiendo de que se caliente la mezcla carne-nitrito y del tiempo transcurrido entre la adición de nitrito y el calentamiento (Móhier, 1973). La reacción del curado la aceleran el pH bajo, las condiciones reductoras y las temperaturas altas (Fox y Ackerman, 1968); en condiciones óptimas la adición de 15 ppm de nitrito sódico produce el máximo color en los productos picados y emulsionados y unas 50 ppm dan el máximo color al bacon de los flancos. Estas concentraciones de nitrito tienen escaso o ningún efecto antibacteriano; las bacterias no ejercen otro papel fundamental en la producción del color salvo reducir el nitrato a nitrito y en ciertos productos bajar el Eh y el pH. El Eh desciende también bajo la acción del calentamiento y del ascorbato y el pH bajo el efecto de la glucono-dlactona y del pirofosfato ácido de sodio. La reacción principal parece ser la formación de un intermediario nitroso reductor entre el nitrito y los diversos agentes reductores y la escisión del intermediario para liberar óxido nítrico. Entonces el óxido nítrico producido reemplaza al agua unida al hierro en la porción hemo de la mioglobina o hemoglobina. En la carne hay muchas reacciones que compiten por los ascorbatos. Los ascorbatos tienen interés como aceleradores del desarrollo y estabilizadores del pigmento de la carne curada. Influyen además en la actividad anticlostridial del nitrato en las carnes pasteurizadas enlatadas, cuyo efecto aumenta si existe una proporción adecuada de ascorbato disminuye cuando su concentración es excesiva. Sus principales efectos beneficiosos en las interacciones quimicas que tienen lugar en las carnes curadas son: (1) como agentes reductores y (2) como quelantes. Los ascorbatos como agentes reductores actúan como consumidores de oxígeno; disminuyen el Eh; participan en la reducción de la metamioglobina a mioglobina; reaccionan con el nitrito para aumentar la producción de óxido nítrico que reacciona entonces con la mioglobina para dar óxido nítrico rnioglobina. Los ascorbatos secuestran a prooxidantes tan activos como el cobre y el hierro; la quelación del hierro puede ser una de las razones por las que aumenta la actividad antibotulínica del nitrito.

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Con respecto al conjunto de radiaciones potencialmente utilizables para su aplicación en los alimentos, es necesario distinguir dos categorías diferentes. La primera, es la radiación de frecuencia relativamente baja y de longitud de onda más larga que la de la luz visible, aproximadamente de 107 a 1010 Hz* (*Hz = Hertz, 1 Hz = 1 ciclo por segundo; frecuencia (en Hz) n longitud de onda (en metros) = 3 n 108 ), o sea,las que van desde la onda corta de la radio (10 megaciclos) pasando por la longitud de onda del radar, e inclúyendo los infrarrojos aproximadamente 1012 - 1014 Hz. Estas radiaciones poseen un bajo poder energético y por lo general su acción sobre las moléculas produce frotamiento con elevación térmica. A pesar de algunos trabajos en los que se señala una acción específica sobre los microorganismos, la mayoría de los publicados indican que los efectos letales para los mismos, sólo se debe a dicho calentamiento,por lo que no se toman en consideración en este lugar.

En la segunda categoría, están las radiaciones de longitud de onda más corta que las de la luz visible, con frecuencias de aproximadamente 1015 Hz o más, las cuales poseen el suficiente poder energético para excitar o modificar las moléculas orgánicas y por tanto son capaces de desarrollar una acción letal específica. Las radiaciones de más baja frecuencia y energía, en la zona ultravioleta (UV) del espectro, sólo son capaces de excitar a las moléculas y son las que se van a estudiar en este capítulo. Aquellas otras de más alta frecuencia, desde 1018 Hz y más, tienen la suficiente energía para romper las moléculas en partes con cargas distintas llamadas iones y a estas radiaciones se les llama “Ionizantes” La zona UV del espectro se extiende por debajo de la longitud de onda de 450 nm. La longitud de onda más eficaz para la destrucción de microorganismos está alrededor de 260 nm. con un cuanto de energía aproximadamente de 4,9 electrón voltios (eV). Longitudes de onda inferiores a 200 nm. no son eficaces porque se absorben muy rápidamente por el oxígeno atmosférico. Las longitudes de onda desde 360 a 450 nm. se les suele llamar "onda larga ultravioleta", "luz negra" o "ultravioleta próxima".

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Se utilizan frecuentemente para producir fluorescencia, así por ejemplo, para demostrar la presencia de pigmentos de Pseudomonas en huevos, mediante lámparas ultravioletas. Estas ondas atraviesan fácilmente el cristal y tienen efectos limitados sobre los microorganismos. Las radiaciones ultravioletas se encuentran en algunas fuentes luminosas de temperatura alta por ejemplo, en la luz solar o en lámparas de arco voltaico), y en ciertos tubos fluorescentes. En la práctica, la fuente habitual de UV es la lámpara de vapor de mercurio de baja presión, que emite varias longitudes de onda específicas, algunas de luz visible, pero alrededor del 80 % del total, es emisión UV a 254 nm., la cual tiene sólo el 85 % de la actividad biológica que correspondería a los 260 nm. Esta lámpara debe estar construida con un cristal especial que absorba las radiaciones por debajo de 200 nm. las cuales, si son absorbidas por el oxígeno atmosférico, producen ozono, lo que no es conveniente. Las lámparas de mercurio de alta presión que se utilizan para la iluminación, tienen poco poder germicida. Están empezando a utilizarse ahora, las lámparas laser activadas, de mucho más rendimiento. La intensidad de irradiación* (*irradiación es el proceso por el que se aplica energía radiante sobre un objeto, tal como un alimento), se mide por la energía absorbida por la unidad de superficie, generalmente en ergs/seg µW/cm2 (107 ergs/srg = 1 vatio). Una lámpara de vapor de mercurio a baja presión de 50-vatios proporciona una intensidad efectiva de aproximadamente 100 µW/cm2 a una distancia de 1 m. La "dosis" de irradiación absorbida se mide por la energía total (o sea, que con una intensidad dada, el producto del tiempo por la intensidad, como se ha definido más arriba) expresada como ergios o µW seg/cm 2. Las dosis utilizadas contra los microorganismos, por encima de 105 µW por seg., representan cantidades de energía demasiado pequeñas para producir una elevación significativa de la temperatura (4.2 · l07 ergs = 1 caloría). Debido a su bajo cuanto de energía, la irradiación UV es totalmente absorbida por las moléculas expuestas. La molécula se excita por la energía absorbida y puede suceder entonces que se produzcan reacciones anormales que provoquen su destrucción, con posibles efectos letales sobre los gérmenes. Existe una absorción marcadamente preferente por determinadas sustancias, como por ejemplo, por los ácidos nucleicos. La longitud de onda con efectos más letales, alrededor de los 260 nm., es la que en su mayoría se absorbe por las bases de los ácidos nucleicos y existen numerosos datos que indican igualmente que los ácidos nucleicos son el blanco principal de la radiación UV. Sin embargo, por lo que se refiere a los alimentos, es igualmente absorbida al instante por varias sustancias de importancia.

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Ya se ha señalado la absorción por el oxígeno de las longitudes de onda más cortas. La absorción por el agua está en razón de su transparencia, en el agua pura, la intensidad de absorción se reduce aproximadamente dos tercios por cada 5 cm. de profundidad, pero en agua de río, se absorben dos tercios de energía solamente en 1 cm. de profundidad. Su actividad se ve también afectada por determinados iones, como por ejemplo, Fe+++. Proteínas y bases también absorben la radiación UV de manera importante, así que en la leche, por ejemplo, una capa de aproximadamente 0,1 mm. de espesor es capaz de absorber el 90 % de la energía incidente. La absorción es aproximadamente proporcional a la concentración de las sustancias citadas, aunque puede decirse que la penetración es siempre menor en los alimentos sólidos. Puesto que la penetración de la radiación UV es pequeña en los líquidos e insignificante en los alimentos sólidos, su principal aprovechamiento reside en la destrucción de microorganismos suspendidos en el aire o que se encuentren sobre las superficies. Sin embargo, los gérmenes pueden ser también resistentes si se encuentran cubiertos por capas de sustancias protectoras, tales como aerosoles o sobre superficies húmedas o de alimentos grasientos. La intensidad de radiación de distintas longitudes de onda, se puede medir por métodos físicos, pero no se conoce un método sencillo para determinar la dosis efectiva, la cual se debe apreciar teniendo en cuenta el tiempo y la distancia de una determinada lámpara. Son confusos los intentos para medir directamente los efectos sobre los microorganismos, debido a la gran influencia de los factores extrínsecos e intrínsecos. Cuando una población uniforme de células microbianas, esporos, o conidios se irradia a una intensidad constante, el número de supervivientes disminuye exponencialmente con el tiempo (o sea, con la dosis total de la radiación aplicada). De aquí se deduce que conviene expresar la resistencia de una especie de microorganismos, como la dosis necesaria para reducir el número de supervivientes a un décimo (esto es, 90 % de letalidad), una cantidad que es virtualmente independiente del número absoluto de microorganismos implicados y de la clase de dosis.

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Esta cantidad, como sucede en situación semejante con el tratamiento por el calor, se la puede llamar valor D o "dosis de reducción decimal", Valores D específicos son: Serratia marcescens, 1500 µW seg; Escherichia coli, 2000 µW seg; esporos de Bacillus mesentertcus, 10.000 µW seg. Para establecer cada valor D con la radiación UV, se necesita mucho más cuidado que con las radiaciones ionizantes, hay que tener en cuenta la absorción de la radiación por el medio, como se ha indicado anteriormente. El valor D depende también de la fisiología y otras características específicas de las células. Existe una falta de información precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiación UV. Diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta, y la comparación de los datos obtenidos por técnicos diferentes, dan lugar a errores, por haber trabajado con condiciones de irradiación no superponibles, distinta edad de los microorganismos, etc. Consecuentemente, existen discrepancias manifiestas en la literatura disponible. Hablando de una manera amplia, se ha afirmado que los bacilos no esporulados gram-negativos son los que se destruyen más facilemtne con la radiación UV; los estafilococos y los estreptococos necesitan una dosis aproximadamente cinco veces mayor; los esporos bacterianos alrededor de 10 veces; las esporas de los hongos (sin agua) alrededor de 50 veces, y los virus todavía más (Sykes, 1958). La mayoría de las bacterias gram positivas y los esporos son menos resistentes que lo señalado en estas indicaciones de tipo general. No obstante, en términos amplios, el orden de resistencia a la radiación UV entre las bacterias, guarda cierta semejanza con el que presentan a las radiaciones ionizantes. Esto es bastante diferente en otras agrupaciones más heterogéneas; así las levaduras son aproximadamente tan resistentes como las bacterias a la radiación UV, mientras que los hongos lo son todavía mucho más; con las radiaciones ionizantes sucede todo lo contrario. La radiación UV de la clase e intensidad descritas aquí, durante su utilización práctica, posee un peligro inmediato para los obreros, para su piel y especialmente para sus ojos. Son esenciales los exámenes periódicos y/o las limitaciones en el tiempo de exposición.

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Mientras que se ha divulgado mucho aquéllo que se refiere a los efectos mutagénicos de las radiaciones ionizantes, poco se ha dicho sobre el peligro de tales mutaciones cuando se utillízan radiaciones UV, quizás se debe a que una larga experiencia sin precauciones especiales, y sin efectos nocivos, ha demostrado que el riesgo es insignificante. Si la lámpara ultravioleta produce una emisión por debajo de 200 mn., existe la posibilidad de que se produzca ozono, el cual, favorece además la oxidación de las grasas, siendo tóxico para el

hombre en concentraciones no detectables aún por su olor. El mayor valor del tratamiento con radiaciones UV se encuentra en el saneamiento del aire, por lo que se utiliza ampliamente con ese objeto. También puede aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. En los laboratorios de microbiología de los alimentos, las lámparas ultravioleta se utilizan para esterilizar el aire en aquéllas zonas que contienen cultivo,este uso puede tener un valor especial, cuando las condiciones industriales producen atmósferas fuertemente contaminadas. Igualmente, la luz UV puede servir para controlar en las panaderías el crecimiento sobre el pan de las esporas de los hongos, o para el control de la propagación de los microorganismos en la superficie, pero no en el interior, de los pasteles de crema. En jarabes de azúcar concentrados contenidos en depósitos grandes, por otro lado microbiológicamente estables, la condensación en la zona superior tiende a que la concentración de azúcar se diluya y sea menor en la superficie del jarabe, lo que permite en la misma, el crecimiento de los hongos que se encuentran en el aire. Esto se puede prevenir instalando lámparas UV sobre la zona superior de los depósitos. 61

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Debido a la limitada penetración de la radiación UV, los líquidos se deben exponer en capas delgadas para facilitar su absorción. Aunque en principio, la luz UV es excelente para el tratamiento del agua, la necesidad de exponerla solamente en capas no mayores de 1 cm. de grosor, da lugar a que el equipo sea complejo y costoso, teniéndose además que clarificar primero el agua. Para destruir una cifra importante de microorganismos, se necesitan tiempos de exposición relativamente largos, así que el rendimiento es bajo. Estas limitaciones hacen este procedimiento menos práctico que la cloración. Para el tratamiento de la leche se necesita exponerla en capas muy finas bajo la fuente de irradiación, haciendo que el control sea difícil y el rendimiento muy bajo. Este tratamiento facilita la oxidación de la grasa y la formación de olores anormales. Por ésto, aunque en condiciones apropiadas se puede reducir el número de bacterias en 90 – 99 %, el procedimiento no tiene valor práctico.

La irradiación ultravioleta puede efectivamente destruir los microorganismos de una superficie, por sólo si la superficie previamente se ha limpiado bien y si ha sido sometida a la exposición un tiempo suficiente. Es normal, que sólo estas superficies irradiadas directamente así, se sanean, porque incluso el cristal corriente es relativamente opaco a las longitudes de onda germicidas. La irradiación ultravioleta se puede utilizar para esterilizar envases donde otros métodos como el calor, no se pueden aplicar. Generalmente los envases deben estar abiertos para permitir que penetre la irradiación, como por ejempío, en el tratamiento del material utilizado para los envases de llenado aséptico de la leche uperizada (UHT). Sólo si el material es transparente para la radiación UV como por ejemplo, algunas bolsas de plástico delgado, se puede tratar el interior sin abrir el envase. El azúcar utilizado en las conservas puede contener esporos termófios, los cuales son difíciles de destruir, excepto por radiaciones UV.

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Aproximadamente 10 esporos de Bacillus stearotermophilus por gramo de azúcar se pueden destruir con una exposición de unos 30 minutos, actuando sobre capas de azucar de 4 mm. de espesor, esta penetración quizás esté ayudada por reflexiones múltiples de las superficies de los cristales. El tiempo de exposición se puede acortar si la capa de azúcar se remueve, pero se alarga mucho si el azúcar tiene terrones. El azúcar se altera poco por la luz UV. Otra aplicación en la industria alimentaria, es en las cámaras de refrigeración utilizadas para almacenamiento de la carne con objeto de impedir el crecimiento de microorganismos en la superficie. La disminución de la contaminación procedente del aire parece ser poco importante. Aunque la energía que se aplica actualmente a la superficie de la carne es más bien baja, y los microorganissnos son numerosos e íntimamente incrustados en ese substrato protector, existen sin embargo datos frecuentes asegurando que su utilización permite aumentar el tiempo de almacenamiento. Se puede decir de forma general, que los microorganismos se ven afectados, solo cuando la exposición a la radiación ultravioleta incide directamente sobre estas superficies sólidas. Sin embargo, la producción de ozono o la reflexión de los rayos UV pueden tener un efecto menor sobre los microorganismos que se encuentran sobre superficies no directamente expuestas. El problema a resolver aquí, no obstante, no es la esterilización, sino más bien el frenado de la multiplicación microbiana; en este caso la radiación se aplica de una forma continuada. Con un microorganismo multiplicándose a razón de 10 escisiones en un periodo de 104 - 105 seg. aproximadamente, y a una dosis de reducción decimal de 10 - 103 µW seg. En efecto los periodos de frenado son así más largos, los factores de crecimiento más bajos, y el máximo de concentración celular más pequeño, incluso con intensidades de irradiación tan bajas se consiguen estos efectos en la superficie de la carne.

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Por ejemplo, sometiendo carne que contiene Pseudomonas causantes de alteración a irradiación UV, se reduce su factor de crecimiento al 85 % aproximadamente, comparando con una carne testigo no irradiada y utilizando una intensidad en la superficie de 2 µW/cm 2 y de 24 µW/cm2 para aproximadamente el 75 %. Para retrasar la reproducción en la superficie de la carne de los hongos procedentes del aire, es suficiente con una intensidad de 0,2 µW/cm2 e igualmente eficaz para restringir la propagación de colonias bacterianas. Lo anterior se consigue actuando a 0º C y en una atmósfera semisaturada [equilibrio de la humedad relativa (EHR) 0,993]; con un EHR de 0,985 se redujo más el crecimiento. La apariencia de mejoramiento fue mayor de lo que realmente se había conseguido, debido a que la irradiación actuó eliminando sólo el crecimiento de la superficie de la carne. Una intensidad de 2 µW/cm2 detuvo la formación de las hifas de los hongos, y 24 µW/cm2 relegaron el crecimiento bacteriano a las zonas capilares por debajo de la superficie de la carne. Las colonias formadas fueron dificilmente visibles y muchas de las bacterias desarrolladas tenían formas largas filamentosas. El costado "iluminado" de una canal situada a 2 m. de una lámpara sencilla de 25 vatios, puede absorber una intensidad aproximada de 0,2 µW/cm2, dosis que puede ser significativa, e incluso se puede incrementar esta dosis si la habitación tiene paredes con superficies reflectantes. La eliminación de los olores de la alteración por la radiación UV puede engañar al comprador, haciéndole creer que el alimento está fresco y en buenas condiciones. Este efecto no podría conseguirse por la introducción, en su lugar, del ozono. La radiación ultravioleta es inadecuada para su utilización en ciertos alimentos ricos en grasas, especialmente grasas insaturadas, puesto que acelera enormemente la formación de olores a rancio debido a su fuerte acción catalítica sobre la oxidación de los lípidos (manteca expuesta a la luz del sol). Por ésto, debe restringirse su utilización con productos lácteos, y es mucho más eficaz en las cámaras de refrigeración, para tratar carne de cordero o de vaca que para la de cerdo. La radiación UV produce daños en verduras, formando manchas decoloradas en las hojas.

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Existen algunos datos que afirman que la radiación UV tiene menos efecto sobre microorganismos en substrato seco que sobre aquéllos que se encuentran en medio húmedo, pero experiencias efectuadas con microorganismos suspendidos en el aire a diferentes humedades relativas, puede que no hayan tomado en cuenta los efectos "clumping", existiendo por ésto, gran discrepancia en el asunto. Se ha señalado que la resistencia en "seco es mas de diez veces superior, comparada con la de atmósferas húmedas, y existen informes sobre un cambio relativamente repentino en la resistencia con humedades relativas cercanas al 60 %. No se conoce información en este caso sobre lo que afecta a los alimentos. La temperatura, dentro de la escala normal de 0ºC a 40ºC, apenas tiene efecto sobre la sensibilidad para las radiaciones UV. Microorganismos expuestos a la radiación UV se muestran después más sensibles al calor y viceversa, como ocurre también con las radiaciones ionizantes. Los efectos letales de la radiación UV, a diferencia de los de la radiación ionizante, no se incrementan mucho con la presencia de oxígeno. Como la radiación ionizante, la ultravioleta, inhibe la división celular antes de que alcancen el tamaño adecuado; por ésto, las dosis subletales dan lugar a la formación de células filamentosas, las cuales más tarde o reanudan la división celular normal o mueren. Las condiciones que se presentan después de la irradiación tienen una gran influencia en la recuperación de las células irradiadas. Aunque el tema es extenso, poco ha sido lo que se ha encontrado importante para su aplicación en los alimentos; lo más digno de tenerse en cuenta son los efectos revitalizadores de la luz visible ("fotorreactivación") y las indicaciones de que la recuperación de la facultad de crecer tiene lugar mejor en medios sencillos y a temperaturas por debajo de las consideradas como óptimas.

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Existe, además, otro tipo de radiación ionizante que se caracteriza por poseer un alto contenido de energía, gran poder de penetración, y acción letal debida a su liberación a nivel celular. Hasta hace poco, las aplicaciones principales de la radiación ionizante han sido en el campo de la medicina, en técnica industrial y como procedimiento para estudios genéticos, así como la función y estructura de los microrganismos. La aplicación práctica de la radiación ionizante para destruir microorganismos en productos comerciales (principalmente farmaceuticos) solo se ha desarrollado en las últimas dos décadas. La letalidad para los microorganismos de las radiaciones "alfa", ß, "gamma" y de los rayos X se conocía ya a principios de siglo. Con la excepción de los rayos X, los métodos para la producción de radiaciones ionizantes de una forma económica y controlada y teniendo la intensidad precisa para poderlas utilizar en la industria en gran escala, no estuvieron a punto hasta después de la Segunda Guerra Mundial, cuando los intensos estudios sobre la fisión atómica para fines militares, tuvieron como resultado una más amplia y clara comprensión de las fuentes y de los orígenes de la radiación ionizante, además de una gran acumulación de conocimiento técnico en este campo. La atención pública se concentró en los usos pacíficos de la energía atómica, y trabajos sobre la conservación de los alimentos por este procedimiento, se iniciaron en varios países durante la pasada década del 50 y han continuado desde entonces con intensidad variable. Inicialinente, sólo se interesaron los pocos países que poseían tecnología atómica, como Estados Unidos, el primero en este campo, pero en los últimos años, el interés sobre la irradiación de alimentos se ha extendido a muchos otros países. Los primeros trabajos establecieron claramente la utilidad en potencia de la irradiación como un procedimiento de conservación de los alimentos e indicaron desde un punto de vista práctico, que los dos mejores métodos utilizables, serían un dispositivo-generador de electrones (radiación ß) y las radiaciones y originadas en la desintegración de isótopos radiactivos (como el 60Co) formado como un subproducto en el funcionamiento del reactor. Durante la década de 1960 algunos Gobiernos permitieron la utilización de la radiación ionizante para tratar un número limitado de alimentos. Posteriormente, esta autorización fue anulada en Estados Unidos, debido a que los trabajos de experimentación, indicaron que la irradiación podría inducir a la formación de compuestos potencialmente mutagénicos, teratogénicos, o cancerígenos, en determinados alimentos. Investigadores de varios países, están estudiando la inocuidad de diversos alimentos irradiados en experiencias con animales, por tests de mutagenicidad sobre células y de teratogenicidad (mutaciones letales) con extracto del producto. Por el momento, los resultados confirman la inocuidad del procedimiento, y parece probable que la irradiación podría aprobarse de nuevo como un método de tratamiento de los alimentos.

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La radiación ionizante presenta algunas ventajas en comparación con otros procedimientos en lo que se relaciona con la destrucción de bacterias en los alimentos: 1. Es altamente letal, pero la dosis puede ajustarse para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes. 2. A niveles bajos (< 0,5 Mrad), no produce cambios organolépticos detectables en el producto. 3. Incluso con dosis altas (> 1 Mrad) son pequenos los cambios químicos totales producidos en el alimento. 4. No deja residuos que no pertenezcan al alimento. 5. Se produce muy poco calor, por lo que los productos crudos mantienen las características del alimento fresco, pudiéndose incluso tratar los alimentos previamente congelados. 6. La penetración de la radiación es instantánea, uniforme y profunda, permitiendo un control preciso del procedimiento (en contraste con el calor). Existen no obstante ciertos inconvenientes: 1. Normalmente no son inactivados los enzimas cuando se utilizan dosis bactericidas, por lo que pueden permanecer activos en los alimentos durante el almacenamiento. 2. Los cambios químicos, aunque pequenos en su totalidad, pueden dar lugar a alteraciones organolépticas inaceptables en ciertos alimentos sensibles o en alimentos que se han sometido a dosis altas. Estos cambios se asocian generalmente con la presencia de radicales libres, los que a su vez pueden actuar también como un factor bactericida secundario. 3. Algunos estudios han sugerido que la irradiación de alimentos puede inducir a la formación de factores mutagénicos, teratogénicos, cancerígenos o simplemente tóxicos, aunque juicios recientes y autorizados, sugieren que tales afirmaciones eran muy infundadas (Comité de Expertos FAO/OIEA/OMS, 1977).

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4. Las dosis utilizadas para destruir microorganismos son varias veces superiores que las precisas para matar a un hombre y por lo tanto deben tomarse medidas de seguridad muy estrictas para proteger a los obreros y a los manipuladores de alimentos. Esto obliga a utilizar una fuerte protección alrededor de la fuente radiactiva y a controlar continuamente al personal y a la zona de trabajo. La radiación a los niveles de energía utilizados para los alimentos (< 2 MeV) no producen radiactividad inducida. Sin embargo, puede producirse radiactividad inducida con radiaciones de alta energía que pasen de 10 MeV, lo que resulta impropio para el tratamiento de alimentos. Las radiaciones ionizantes se caracterizan por atravesar instantaneamente la materia estando en relación este dato con la clase de radiación y la densidad del material a tratar. Para una energía determinada, la radiación gamma es mucho más penetrante que los electrones. La radiación ß con energía de 3 MeV tiene una capacidad de penetración en el agua de 1 cm aproximadamente y se comporta de forma semejante en alimentos líquidos o sólidos de una densidad similar, mientras que la radiación y con energía de 1,1 MeV procedente del 60Co penetra en un alimento alrededor de 20 cm pero sin embargo la frena una plancha de plomo de parecido grosor. Con ambas clases de irradiación, simultáneamente, es posible conseguir una absorción lo suficientemente uniforme para que llegue a todos los puntos de un alimento que sea aproximadamente el doble de grueso. Además, estableciendo una "geometría" adecuada y normalizando las formas, la distribución de la dosis por todas las partes del alimento puede llegar a ser casi uniforme. Cuando el daño molecular tiene lugar en una parte vital de una célula viva, esta célula muere, y existe una gran evidencia que indica que ocurre esto en la alteración del núcleo o el material nuclear. En una pequeña proporción de casos la alteración da lugar a una mutación. Los organismos mayores mueren con dosis de radiación ionizante mucho más pequeñas, por tanto, cuando se utilizan dosis de 100 Krad con objeto de destruir bacterias, la radiación debe actuar de forma que no pueda llegar hasta los operarios. La dosis se mide normalmente mediante dosímetros, mientras que la fuente se regula con monitores en cámaras de ionización modificadas. Los dosímetros que se utilizan más corrientemente son cristal de cobalto, sulfato ferroso, o sulfato ceroso.

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El cristal de cobalto cambia de color proporcionalmente a la dosis que recibe. Las sales ferrosas y cerosas son oxidadas a sales férricas o céricas como resultado de la interacción con radicales hidroxílicos producidos por la radiación del agua. En un paquete con alimentos expuesto a una fuente de radiación ionizante, la distribución de la dosis no puede ser uniforme. Se encuentra comunmente unas variaciones entre 100 y 125 % y esto se debe conocer anticipadamente para calcular el tratamiento a que tienen que someterse los alimentos. El cálculo de la dosis letal para los microorganismos está en relación con el número de supervivientes y los cálculos matemáticos son en cierto modo similares a los utilizados en el tratamiento térmico. La muerte de los microorganismos es una consecuencia de la acción ionizante debida a la radiación de alta energía. La mayoría de los estudios indican que una causa primordial de letalidad es la alteración sufrida por el ADN microbiano, lo que da lugar a una pérdida de la capacidad reproductora, pero la alteración de otras moléculas sensibles e importantes (p.e. en las membranas) puede tener lugar también. Las dosis letales para los microorganismos no inactivan a la mayoría de los enzimas, ni tienen lugar cambios importantes en las proteínas y otras moléculas grandes. Se forman radicales libres y otras moléculas reactivas, particularmente en el agua, aunque no está claro hasta donde llega la ionización primaria ("golpes directos") y hasta donde los efectos secundarios como responsables de las alteraciones letales en los microorganismos. En los alimentos irradiados, la alteración subletal puede impedir la revitalización de ciertas bacterias. Los microorganismos difieren mucho en lo que se relaciona con su sensibilidad a la irradiación. En sentido general la muerte de microorganismos de poblaciones expuestas a las radiaciones ionizantes es de naturaleza logarítmica.

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Por tanto, si un cultivo o una suspensión de una cepa pura de un microorganismo se expone a la acción constante de la irradiación ionizante letal, una fracción constante de la población microbiana morirá a intervalos de tiempo iguales, con independencia del número total. En la práctica, esto significa, que un gráfico del logaritmo de los supervivientes frente a las dosis, es una línea recta en casi toda su longitud. En algunos casos puede aparecer al comienzo de la curva un pequeño "hombro". Esto puede deberse a fenómenos no relacionados con la sensibilidad real a la irradiación de los microorganismos, como puede ser la agrupación de células, o a que existen por lo menos dos zonas sensibles en la célula, las cuales es necesario que se inactiven antes de que dichas células pierdan su viabilidad. Desde el punto de vista matemático, la situación es semejante a la muerte producida por calentamiento, y el valor D (tiempo de reducción decimal) concepto de los termobacteriológicos, se aplica igualmente a la muerte por irradiación. El valor D, se define como la dosis necesaria para reducir la población microbiana a una décima parte (log 10 1). Luego un tratamiento 2D equivaldría a una dosis suficiente para reducir la población microbiana a la centésima parte. La resistencia de los microorganismos a los efectos letales de la irradiación, aumenta en ausencia de oxigeno, lo que sugiere que tienen importancia las reacciones de oxidación que se originan como consecuencia de la irradiación. También aumenta resistencia de microorganismos a radiación ionizante ausencia de agua.

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En substratos completamente deshidratados, se requieren dosis 2 a 3 veces más altas para obtener efectos microbicidas equivalentes a las precisas en substratos hidratados, ésto se debe a que se aminora la ionización secundaria, así como también a los efectos de los radicales libres que se citan más adelante. Congelando, con lo que efectivamente se inmovilizan las moléculas de agua, se producen efectos protectores similares, debidos posiblemente a la inmovilización de las moléculas reactivas retenidas por la malla de cristales de hielo hasta que se deshacen. Debe señalarse que el efecto es menor en los esporos, presumiblemente debido al secuestro del agua en la estructura de los mismos. El sustrato influye en la sensibilldad a la irradiación. Por esto, pueden necesitarse dosis distintas para conseguir efectos microbicidas semejantes en alimentos diferentes. Además, los alimentos pueden producir condiciones anaeróbicas localizadas, incluso cuando el oxígeno está presente en el exterior, y esto puede influir de una forma importante en la resistencia a la irradiación. La sensibilidad a la radiación de los microorganismos difiere según las especies e incluso según las cepas, aunque las diferencias de resistencias entre cepas de una misma especie son generalmente lo suficientemente pequeñas para no tenerlas en cuenta a efectos prácticos. Las bacterias gram-negativas, incluyendo los microorganismos causantes de alteración de los alimentos (Pseudomonas) y las especies entéricas, incluyendo las patógenas (p.e. Salmonella, Shigella), son generalmente más sensibles a la irradiación que las bacterias gram-positivas. El estreptococo fecal es bastante resistente, los esporos bacterianos son todavía más resistentes, y el Micrococcus radiodurans es excepcionalmente resistente.

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Los ácidos orgánicos y sus ésteres se hallan muy difundidos en la naturaleza. Se encuentran con frecuencia en frutas; por ejemplo, el ácido cítrico de los frutos cítricos, el ácido benzoico en arándanos agrios y las ciruelas verdales, el ácido sorbico en la fruta del fresno. El ácido láctico se encuentra en los tejidos animales; el galato de metilo en las hojas de diversos géneros de plantas y en las especias se encuentran varios ácidos orgánicos. Muchos de ellos constituyen metabolitos intermediarios y productos finales del metabolismo microbiano y se encuentran en grandes cantidades en muchos productos lácticos, cárnicos y vegetales fermentados. Nuestros antepasados descubrieron que los cambios deseables desarrollados sobre el aroma y la textura de estos productos y la acidez provocada por la formación de ácidos orgánicos constituía un medio valioso para retrasar o evitar la alteración proteolítica. Ello permitió conservar almacenados muchos alimentos perecederos y hacer la dieta más variadada. Hoy en día muchos fabricantes utilizan ciertos ácidos orgánicos para ayudar a la conservación de diversos productos. Sin embargo, la concentración y el tipo de ácidos orgánicos permitida son cuidadosamente controlados por los organismos gubernamentales responsables de la Sanidad, y las concentraciones permitidas son generalmente pequeñas, comparadas con las de los ácidos orgánicos en muchas frutas y productos fermentados.

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Por su solubilidad, sabor y baja toxicidad los ácidos orgánicos de cadena corta, tales como el acético, benzoico, cítrico, propiónico, y sórbico son muy utilizados como conservadores o acidificantes. Al considerar la posible utilización como conservadores de otros ácidos orgánicos es conveniente recordar que la actividad antimicrobiana de estos compuestos suele ser superior a medida que se alarga la longitud de su cadena molecular. Sin embargo, los ácidos alifáticos de más de diez u once átomos de carbono poseen muy poca aplicación potencial debido a su muy baja solubilidad en agua. Los métodos de análisis de los ácidos orgánicos en los alimentos se basan generalmente en una destilación en corriente de vapor, o por solventes, seguido de una valoración del tipo y proporción del ácido (o ácidos) en cuestión presentes en el destilado mediante espectrofotometría o cromatografía. La actividad antimicrobiana de un ácido orgánico o su éster se debe a las moléculas no disociadas de este compuesto. Algunos ácidos orgánicos en su estado no disociado son muy solubles en las membranas celulares. Unicamente los ácidos orgánicos lipófilos muestran actividad antimicrobiana. Según una hipótesis, estos compuestos inhiben el crecimiento de los microorganismos, o los matan, por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento en el transporte de sustratos y en la fosforilización oxidativa del sistema transportador de electrones. Los ácidos orgánicos saturados, como el ácido sórbico y los ésteres del ácido parahidroxihenzoico, también inhiben el sistema de transporte de electrones. Este fenómeno da lugar a la acidificación del contenido celular, que es probablemente la principal causa de la inhibición y muerte de los microorganismos. El pKa (pKa = al pH en el cual el 50 % del ácido se halla no disociado) de los ácidos orgánicos empleados como conservadores se halla en el rango de pH de 3,5. Al bajar el pH de un alimento, aumenta la proporción de las moléculas no disociadas de un determinado ácido orgánico, aumentando de esta forma su efectividad como agente antimicrobiano. Estas consideraciones limitan la utilidad de los ácidos orgánicos a aquellos alimentos de pH inferior a 5.5. Los ácidos orgánicos se utilizan principalmente como agentes micostáticos.

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Sin embargo, a concentraciones elevadas, resultan muy eficaces frente a diversos microorganismos (incluidos los virus): por ejemplo, cuando sus concentraciones son superiores al 1% en frutas y productos fermentados con microorganismos, o cuando se acidifica hasta pHs de 4,0 o valores inferiores. Los efectos observados en cultivos mixtos o en alimentos almacenados en los que un microorganismo ejerce un efecto sinérgico o antagónico sobre otro, se cree que, en muchos casos, se debe a la formación "in situ" de ácidos orgánicos como productos secundarios del crecimiento microbiano. La mayor parte de los ácidos orgánicos son muy poco eficaces como inhibidores del crecimiento microbiano a pHs de 5,5-5,8 en los que crecen la totalidad de las bacterias causantes de toximfecciones y la mayor parte de las causantes de alteración. Constituyen una excepción los ésteres del ácido paraludroxibenzoico, con un pKa = 8,5, que muestran actividad antimicrobiana a pHs próximos a la neutralidad, y los ácidos propiónico y sórbico que también poseen cierta actividad a pH = 6,0 ó 6,5. Existen muchas publicaciones en la literatura científica y muchas patentes que atribuyen un espectro amplio de actividad antimicrobiana a una gran variedad de ácidos orgánicos de cadena recta ramificada, saturados o insaturados. Un cierto número de ácidos orgánicos saturados de cadena más larga son muy eficaces como inhibidores, tanto de las bacterias Gram positivas como Gram negativas, pero la actividad frente a las gramnegatigas cae rapidamente en aquellos con más de ocho átomos de carbono.

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La refrigeración aumenta la actividad bactericida de los ácidos nonanoicos y decanoicos frente a Eschenchia coli. Los ácidos grasos no saturados de cadena larga son particularmente eficaces contra las células vegetativas de las bacterias Gram-positivas y evitan también la germinación de los esporos de las especies de Bacillus. Los cis-isomeros son más eficaces que los transisomeros y la actividad de un compuesto con determinado tamaño molecular aumenta con el grado de insaturación de la molécula. Por lo general, la utilización de ácidos orgánicos es compatible con la de otros conservadores o sistemas de conservación y de hecho muchas combinaciones poseen un efecto sinérgico. Por ejemplo, muestran mayor eficacia como inhibidores microbianos a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento y mayor como microbicidas a medida que la temperatura aumenta. Determinados cationes pueden también aumentar de una manera significativa la eficacia de los ácidos orgánicos aumentando la solubilidad del ácido en la membrana de la célula microbiana. Algunos microorganismos parecen poseer un sistema de transporte de ácidos orgánicos desde la célula, que es inducible y funciona mediante un aporte energético, lo que permite su crecimiento en presencia de elevadas concentraciones de ácidos. La formación de peróxidos y otros productos resultantes de la oxidación de los ácidos grasos puede aumentar la eficacia antimicrobiana de ciertos ácidos grasos insaturados. Sin embargo, los ácidos orgánicos, al igual que la mayor parte de inhibidores microbianos, suelen ser más eficaces en condiciones anaeróbicas, que aeróbicas. Existen varias limitaciones al valor como inhibidores microbianos de los ácidos orgánicos en los alimentos: 1. Suelen resultar ineficaces cuando los niveles iniciales de microorganismos son elevados. 2. Muchos microorganismos utilizan los ácidos orgánicos como fuente metabolizable de productos carbonados. 3. Existe una variabilidad inherente en cuanto a la resistencia de determinadas cepas. 4. En determinadas condiciones de utilización, pueden resultar seleccionados tipos de microorganismos resistentes. El ácido acético y sus sales son muy eficaces como acidificantes y conservadores y son muy utilizados para estos propósitos. Unicamente los Ácetobacter sp., algunas bacterias lácticas y algunos mohos y levaduras muestran cierto grado de resistencia a este compuesto. La presencia de 1-2 % de ácido acético no disociado en carne, pescado, o vegetales suele inhibir o matar todos los microorganismos presentes, aunque, en condiciones normales de utilización, especialmente en malas condiciones higiénicas, pueden sobrevivir los microorganismos más acidotolerantes.

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Esta concentración de ácido puede reducirse significativamente si se trata de productos refrigerados o con una elevada concentración de sal o azucar. El crecimiento de la mayor parte de las bacterias causantes de toxiinfecciones y de las esporulantes, se inhibe con concentraciones de 0,1 %, y el de los mohos micotoxigénicosa concentraciones de 0,3 %. El ácido benzoico se usa esencialmente como agente micostático. Muchas levaduras y mohos se inhiben a concentraciones de 0,05 – 0,1% de ácido no disociado. Las bacterias esporulantes y causantes de toxi-infecciones se inhiben generalmente con concentraciones de 0,01-0,02 % pero la mayor parte de las bacterias causantes de alteraciones son mucho más resistentes y no debe, por tanto, confiarse en el ácido benzoico para la conservación de los alimentos capaces de permitir el crecimiento bacteriano. Los ácidos cítrico y láctico, tienen por lo general, solamente una actividad antimicrobiana moderada y excepto a bajos valores de pH, no resultan eficaces como inhibidores. Sin embargo, una concentración de ácido cítrico no disociado de 0,001 % inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus en condiciones anaeróbicas. Tanto el ácido cítrico como el láctico parecen inhibir específicamente la formación de aflatoxinas y sterigmatocystina. Los antibióticos, producidos por microorganismos o sintéticamente, inhiben a los microorganismos a grandes diluciones. Los antibióticos como "medicamentos maravillosos" para combatir las enfermedades del hombre y de los animales no se estudiarán aquí. Durante cierto tiempo se emplearon en los alimentos para inhibir las bacterias alterantes, pero por causas diversas que se estudiarán en este capítulo los organismos encargados del control alimenticio prohiben ahora su adición a los alimentos. Incluso los pequenos residuos existentes en los alimentos procedentes de los animales tratados con antibióticos se consideran actualmente inaceptables. Los microorganismos de los alimentos pueden convertirse en antibiótico resistentes y colonizar el intestino del hombre y de los animales; sus residuos pueden asimismo ejercer una acción selectiva favoreciendo a la flora resistente ya existente en el intestino; en estas condiciones los antibióticos empleados terapéuticamente pueden resultar ineficaces. Una de las más importantes razones de la persistencia de bacterias resistentes es el empleo indiscriminado de medicamentos antimicrobianos en el hombre y en el ganado.

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Los microorganismos antibiótico resistentes carecen de interés en los alimentos procesados térmicamente, debido a que, en general, hay que esperar que se destruyan durante el tratamiento; sin embargo, pueden encontrarse en los alimentos crudos y llevar a cabo la contaminación de otros alimentos. Como consecuencia del gran éxito terapéutico de los antibióticos en las enfermedades bacterianas, era natural que se ensayasen como conservadores frente al deterioro microbiano de los alimentos. Estos ensayos se realizaron entre 1945 y 1960 y la mayoría de los antibióticos se comprobaron en múltiples alimentos perecederos de todas las formas imaginables. A medida que fue aumentando el miedo a los microorganismos antibióticoresistentes fue disminuyendo el empleo de los antibióticos como conservadores de los alimentos. Además las industrias que procesaban carne de aves observaron el desarrollo de bacterias resistentes a los antibióticos corrientemente utilizados; se seleccionaron facilmente microorganismos alterantes muy antibiótico-resistentes. Por lo tanto se vio muy pronto que el empleo corriente de antibióticos como conservadores alimenticios podía convertirlos en ineficaces debido a que se habían seleccionado floras alterantes antibiótico-resistentes. Los dos antibióticos más importantes empleados en muchos países con fines conservadores alimenticios son la natamicina y la nisina, ninguno de los cuales se utiliza en terapéutica. La tilosina (un antibiótico macrólido), entre los antibióticos poco resistentes se emplea todavía como aditivo de los piensos. Este antibiótico ocupa una posición intermedia ya que se utiliza algo, principalmente en Japón, como conservador alimenticio; su empleo al parecer, ha sido abandonado.

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La natamicina es un antibiótico macrólido originado por Streptomyces natalensis; su prmcipal efecto es antifungico y su empleo está perrnitido en ciertos países. In vitro inhibe el desarrollo de hongos productores de aflatoxinas en los cacahuetes crudos triturados. Ello constituye una ventaja considerable, lo que para algunos expertos seria suficiente para superar cualquier objeción acerca del empleo de este antibiótico en los alimentos. Hay varias publicaciones sobre el empleo de la natamicina para inhibir el desarrollo fúngico de los embutidos. Por ejemplo, con concentraciones de natamicina de unas 1000 ppm se conservaron bien, sin sufrir ataques fúngicos, embutidos holandeses. El antibiótico puede aplicarse con salmuera, baños o en forma de "spray" y el embutido puede incluirse en diferentes tipos de tripas.

Este tratamiento determinó una concentración superficial de 2 ppm/cm2 que se consideró que no tenía importancia toxicológica. Probablemente la aplicación más importante de la natamicina es para tratar la corteza del queso, tanto blando como duro, mediante la sumersión de aquél en baños, o rociandolo con suspensiones de 500 ppm de natamicina. El antibiótico puede detectarse en la corteza; su penetración varía de acuerdo con el tipo de queso. También se ha empleado la natamicina en las películas de envolver queso; su efecto conservador se pierde si se aplica después de desarrollado el micelio. Ciertos mohos, (p. ej. Áspergillus flavus) producen enzimas en cantidad que inactivan la natamicina. La nisina es un antibiótico originado por estirpes de la bacteria que normalmente corta la leche, el Streptococcus lactis; se presenta naturalmente en la leche ácida y en el queso de granja por lo que es muy posible que desde que se domesticaron las vacas se hayan ingerido pequeñas cantidades de este antibiótico. La nisina es un polipéptido que lo inactivan fácilmente los enzimas proteolíticos a pH = 8, por lo que es fácilmente digerido.

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El empleo de la nisina como conservador de alimentos "debería considerarse aceptable siendo la ingesta media diaria incondicional de 0 – 33.000 U/Kg de peso". Actualmente se elabora nisina en la URSS, Polonia y Reino Unido y su empleo está permitido en unos 20 países. La nisina posee un pequeño espectro antibacteriano afectando sólo a los gérmenes gram positivos. Puesto que las bacterias gram negativas no son afectadas el empleo de la nisina como conservador de alimentos no puede contrarresar a una mala higiene; su escaso espectro antibacteriano y su estabilidad ácida determinan unas condiciones de aplicación especiales. Sólo puede emplearse eficientemente cuando los microorganismos alterantes nisina sensibles son prácticamente los únicos presentes en el alimento. Este es el caso por ejemplo, de los clostridios que originan hinchamiento en el queso suizo. No obstante y por otras razones, este proceso apenas se utiliza en la práctica; el antibiótico es también termoestable especialmente en condiciones de acidez; de aquí que la nisina se pueda emplear como adyuvante del tratamiento térmico. El calor aplicado puede reducirse a sólo el necesario para destruir Clostridium botulinum que es el anaerobio esporulado más nisina-resistentes. Este menor tratamiento térmico mejora la calidad del producto alimenticio; además estos productos presentan mejores condiciones de almacenamiento, especialmente a temperaturas ambientales altas. En el proceso combinado calor-nisina, esta evita el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico. Sin embargo a las concentraciones corrientemente utilizadas, 100 U/g, la nisina no parece que sea esporicida; por lo tanto, el proceso debe planificarse de forma que quede suficiente cantidad de nisina después del tratamiento térmico y durante el almacenamiento para asegurar la continúa inhibición del crecimiento de las esporas. Cuando la legislación lo permite la nisina no sólo se emplea para prevenir el abombamiento de los botes sino también para conservar el queso procesado y el chocolate con leche. Otras industrias alimenticias la emplean para conservar guisantes, alubias en salsa y "capsuts". Pronto se puso de manifiesto la preocupación por el desarrollo de resistencia de la microflora de los animales a los que se suministraban antibióticos. No obstante, el aumento de la incidencia de microorganismos antibiótico-resistentes ha causado preocupación. La existencia de microbios resistentes se conoce desde el trabajo pionero de Paul Erlich a comienzos de siglo; pensó que estas bacterias se convertían en resistentes por una mutación cromosómica espontánea o por la selección, en presencia del agente quimico terapéutico, de las bacterias resistentes ya existentes en la población microbiana.

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La resistencia de tipo cromosómico es específica de un grupo de antibióticos relacionados entre sí. Un nuevo desarrollo en la historia de la resistencia bacteriana fue el descubrimiento de los investigadores japoneses de resistencia múltiple a fines de los '50; las bacterias pueden convertirse en resistentes simultáneamente a varios grupos de antibióticos no relacionados entre sí. La resistencia múltiple se adquiere por transferencia desde un microorganismo resistente a otro sensible, de un elemento genético, llamado plásmido; existe independientemente del cromosoma bacteriano y en un mismo microorganismo puede haber uno o varios tipos diferentes de plásmidos. El relacionado con la antibiótico – resistencia microbiana se ha llamado también factor de resistencia (factor R) y la bacteria que lo posee suele de-nominarse R+.

Los plásmidos, como los cromosomas, se componen de moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA); los plásmidos R más grandes representan el 1 – 2 % de la información genética total de las bacterias. La transferencia puede tener lugar entre miembros de especies distintas; por ello los factores R son especialmente importantes en las enterobacterias en las que existe la posibilidad de que se transfiera antibiótico resistencia de un Escherichia coli no patógeno a una Salmonella patógena. Todos los géneros de enterobacterias pueden contener factores R. También poseen plásmidos de resistencia las pseudomonas y los estafilococos y estreptococos. Es posible que tal transferencia de factores R ocurra en condiciones naturales entre las bacterias que pertenecen a la misma familia. Se admite ahora generalmente que la mayoría de las "resistencias" de las bacterias de tipo salvaje se deben a factores R y no son del tipo cromosómico.

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Quizá las más importantes sean el Comité Swabb del Reino Unido y la Task Force de la Administración de Alimentos y Medicamentos (departamento de Salud, Educación y Bienestar de los EEUU. FDA., US. Department offlealth, Education and Welfare). En general ambas comisiones estudian el problema bajo los mismos puntos de vista, pero las recomendaciones y la legislación de ambos países difieren apreciablemente. Ni el comité Swann, ni la Task Force encontraron pruebas que demostrasen que los residuos de antibióticos de los productos originados por animales que habían recibido con el pienso cantidades subterapéuticas de antibióticos fuesen tóxicos para el consumidor. Además tampoco pudieron comprobar que tales productos contribuyesen a las reacciones alérgicas de personas que se hubieran sensibilizado previamente a los mismos. De otra parte ambas comisiones se mostraron preocupadas porque las formas antibióticoresistentes de las bacterias patógenas del hombre pudieran presentarse en los animales y de éstos pasar a la especie humana. Un informe de la OMS (World Health Organizacion) hace énfasis en que los beneficios del suministro de concentraciones bajas de antibióticos son demasiado grandes como para considerar su retirada del empleo ganadero. No obstante, dado que los antibióticos son indispensables para la terapéutica humana y animal, el citado informe los ha ordenado de acuerdo con su mayor peligro. La Comunidad Económica Europea (CEE) reconoció en la década de 1970 el riesgo de suministrar antibióticos que pudieran seleccionar los microorganismos resistentes que albergan plásmidos y desaconsejó el empleo como aditivos del pienso de tetraciclinas, estreptomicina y antibióticos relacionados con ellas.

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Se prohibió el empleo de la penicilina por el amplio uso que se hace de este antibiótico en medicina humana y animal. En la CEE nunca se han utilizado con fines nutritivos el cloranfenicol, polimixina, ampicilina, cefalosporinas, ni sulfamidas; sin embargo, algunas de éstas siguen utilizandose como coccidiostático en avicultura. Continuan los comentarios sobre si el empleo de los macrólidos, incluida la lincomicina, debería prohibirse en terapéutica animal y en los piensos; algunos antibióticos pueden excluirse de su empleo animal.

Muchas personas que nunca se han tratado con antibióticos poseen Escherichia Coli aparentemente estable señalaron que los plásmidos autotransferibles aislados de las enterobacterias del hombre y de los animales presentaban DNA con una gran homología, demostrando que estos plásmidos eran identicos en todos sus aspectos importantes.

El envasado preserva la calidad de los alimentos y los protege de los daños que pudieran producirse durante el almacenamiento, el transporte y la distribución. La protección ejercida puede ser de tres tipos: 1. Química. El envasado puede impedir el paso del vapor de agua, del oxígeno y de otros gases, o actuar de forma selectiva, permitiendo sólo el pasó de algunos de los gases. 2. Física. El envasado puede proteger de la luz, el polvo y la suciedad, de las pérdidas de peso y de los daños mecanicos. 3. Biológica. El envasado puede impedir el acceso al alimento de microorganismos e insectos, afectar el modo o velocidad de la alteración, o la supervivencia y crecimiento de los gérmenes patógenos que pudiera haber en el alimento. Los envases pueden ser rígidos (latas, papel, cartón, vidrio, plástico) o flexibles (plásticos, hoja de aluminio). Mediante diversas combinaciones de materiales y técnicas de procesado, es posible producir envases con cualquiera de las propiedades funcionales que se consideren deseables.

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Los componentes e impurezas de los materiales de envasado y sus adhesivos, no deben poner en peligro la salud humana ni reaccionar con el alimento o adulterarlo. El material de envasado no debe contener microorganismos patógenos que puedan introducir un riesgo para el consumidor. Por ejemplo, la presencia de salmonellas en un material de envasado que vaya a usarse para un plato precocinado y congelado, sería inaceptable. Sin embargo, no habría razón para preocuparse excesivamente por la presencia de unos cuantos esporos de Clotridium perfringens en el material utilizado para envasar especias deshidratadas, porque de cualquier manera, es fácil que existan esos mismos esporos en la misma especie. Tampoco debe el material de envasado introducir cantidades importantes de microorganismos causantes de alteracion. Se ha desarrollado un procedimiento que mediante un sencillo chorro de vapor, sirve para descontaminar los recipientes empleados para cocer jamones. Muchos países imponen standards microbiológicos para controlar la contaminación superficial de botellas y otros recipientes reutilizabIes; una contaminación superficial de sólo 10 microorganismos por 100 cm2 equivale a "muy limpio". En papel sin tratar, se ha podido observar que predomina el género Bacillus y a veces los micrococos, a niveles normalmente inferiores a los 200/gramos, aunque aveces se llega hasta 2800/g; en otro estudio similar, se encontraron mohos y levaduras a niveles de hasta 10 por 100 cm2.

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En Estados Unidos, el papel para envasado de alimentos no debe sobrepasar los 250 organismos por gramo y los recipientes y tapas para leche, no más de uno por cm2 (U .S. Department of Health, Education and Welfare). Se ha propuesto un método standard para la determinación del recuento de bacterias, mohos, levaduras y gérmenes coliformes en materiales de envasado no absorbentes. Los niveles de bacterias en la superficie de hojas de aluminio utilizadas para el envasado de alimentos, son aun menores. Los tubos y películas de plástico suelen tener entre 1 y 20 microorganismos por cada 1000 cm2 y normalmente no llegan a los 10. En los vasitos de plástico, los valores encontrados son del mismo orden. Sin embargo, se observó que algunos de los microorganismos sobreviven incluso a la extrusión a 220ºC de los plásticos. A veces, se presta demasiada importancia a la contaminación microbiana aportada por el material de envasado; en general, los niveles de microorganismos contenidos en el producto son varios órdenes de magnitud mayores de los que existen en el material de envasado. Al no poder ser degradados por la acción microbiana, el poliestireno y otros plásticos, son más higiénicos que el papel prensado u otros derivados de la madera para el envasado de huevos. Algunos plásticos tienen propiedades antibacterianas; es el caso de los que contienen alquido-barnices, resinas fenólicas, cloruro de polivirlilo o poliacetal. Sin embargo, antes de escoger un material de envasado por sus propiedades antimicrobianas, conviene asegurarse de que no va a adulterar el alimento. El material de envasado debe impedir la entrada de los microorganismos; las botellas, latas y la mayoría de las películas de plástico actualmente en el mercado, cumplen esta función. Se produce penetración cuando falla el sellado o se perfora el envase; por eso, el material ha de tener la suficiente resistencia mecánica como para impedir que se produzcan daños durante el procesado y la manipulación posterior. El mismo contenido puede también dañar el envase: es el caso de los huesos afilados de aves y otras cames, y de las fibras de músculo o trozos de piel en alimentos muy desecados o ahumados.

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Una prueba biológica es lo mejor de determinar si una película resistirá a la penetración; se sumerge una porción estéril de un medio nutritivo empaquetada con el material en cuestión y sellada, en un baño que contenga el microorganismo concreto que interese (por ejemplo, Enterobacter) o una mezcla de microorganismos. La presencia de gas o la turbidez en el medio indicará que se ha producido penetración. Para el ensayo de laminados de plástico y aluminio resistentes al calor, la "prueba de ebullición en agar", en la que los envases se hierven durante 45 minutos en agar al 2 %. Antes de que se enfríe el agar, se añaden esporos de Bacillus stearothermophilus y durante el enfriado, el medio inoculado pasa a través de los puntos de penetración. Varios autores han demostrado que algunos microorganismos pueden atacar los materiales de envasado sintéticos y, en condiciones favorables, pueden atravesar una película no dañada previamente. En algunos casos, se requiere una exposición prolongada a los enzimas bacterianos para que sea posible la entrada. Por ejemplo, los microorganismos productores de celulasa, sobre todo los mohos, no atraviesan las tripas de hidrato de celulosa de los embutidos, mas que al cabo de mucho tiempo a temperaturas relativamente altas. Las películas de plástico tienen muy variada permeabilidad a los gases. La exclusión del oxígeno disminuye la velocidad de oxidación del producto, hace más lento el crecimiento de muchos tipos de bacterias y levaduras e impide el crecimiento de los microorganismos aerobios estrictos (como los mohos, por ejemplo).

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La alta permeabilidad al oxígeno del poliestireno y las poliolefinas, puede ser reducida combinando estos polímeros con otros materiales mediante barnizado, encolado, recubrimiento o superposición con una capa del otro material o por coextrusión de ambos materiales. de forma análoga, se puede reducir la permeabilidad al vapor de agua de un material; la alta permeabilidad del hidrato de celulosa, por ejemplo, puede reducirse mediante barnizado. El factor más importante de la microbiología de los alimentos envasados es la permeabilidad relativa del material de envasado para el oxigeno, el dióxido de carbono y el vapor de agua, particularmente si los espacios con aire en el producto original han sido evacuados o rellenados con gases preservantes en el momento de cerrar el envase, y sobre todo, si se trata de productos perecederos, tales como aves, carnes y pescados. Los envoltorios permeables al vapor de agua y a los gases, o más permeables al oxígeno que al dióxido de carbono y aquellos que no se ajustan a la superficie del producto, pueden evitar la entrada de microorganismos contaminantes, pero no afectan al crecimiento de los microorganismos que previamente se encontraban en el alimento. Las condiciones intrínsecas de un alimento envuelto en un material muy permeable, son similares a las del producto sin envolver. Por ejemplo, las películas de celulosa permeables al oxígeno no impiden que crezcan las Pseudomonas en la carne picada, mientras que las películas impermeables a los gases lo hacen imposible. Las películas de materiales que como el politeno, son impermeables a la humedad y permeables al oxígeno, sirven para proteger de la contaminación y de las pérdidas de agua, pero más que frenar, estimulan el crecimiento en superficie de la flora normalmente causante de alteración. El crecimiento y la actividad de los microorganismos dentro de un envase depende de: a) la idoneidad del alimento como medio de cultivo, b) la temperatura, c) la aw, d) el pH, e) la naturaleza de los gases retenidos dentro del envase y f) la competencia entre microorganismos. Desde hace muchos años se sabe que diversos gases y vapores naturales, o artificialmente producidos, destruyen o inhiben a los microorganismos. Algunos de ellos se han estudiado para conocer su capacidad potencial de aumentar la vida útil de los alimentos. De estos, sólo se discutirán con detalle los que se han utilizado comercialmente: dióxido de carbono, óxido de etileno, óxido de propileno, dióxido de azufre y ozono. El nitrógeno y el oxígeno se utilizan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de alimentos pero su fin primario no es la inhibición de los microorganismos. El nitrógeno líquido, cuando se utiliza en los alimentos como un agente frigorífico, inhibe o destruye indirectamente a los microorganismos por congelación o refrigeración. 86

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El oxígeno se utiliza en atmósferas controladas para mantener el estado fisiológico de las frutas, hortalizas y verduras y el caracteristico color rojo de la carne fresca, pero no se aplica con el fin de inhibir los microorganismos responsables de la alteración. Diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con éxito en la desinfección de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo pero no se han aplicado a los alimentos. Entre ellos están la ß – propiolactona, la clorpicrina, el glicilaldehído, el glutaraldehido y el ácido peracético. Aunque el bromuro de metilo se ha utilizado eficazmente, como fumigante, en las frutas y granos infestados por insectos, no se ha empleado específicamente para controlar los microorganismos en los alimentos. El formaldehido se ha utilizado como fumigante en la desinfección de gallineros y huevos para incubadoras, pero igualmente no directamente para el control de los microorganismos en los alimentos. El formaldehido realmente ejerce una acción letal sobre los microorganismos de la carne y del pescado durante el ahumado pero como el calor y la desecación están también implicados en el proceso, su contribución real a la inhibición de los microorganismos es desconocida. Investigaciones recientes han mostrado que el monóxido de carbono y el acetaldehído son potencialmente útiles para su uso en los alimentos. Un uno por ciento de monóxido de carbono prolonga el color de la carne fresca y tiene un efecto inhibidor sobre las bacterias psicrotrofas, similar al del dióxido de carbono.

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Los vapores de acetaldehído al 0,5 % en la atmósfera inhiben, de una forma acusada, los mohos y levaduras aumentando el tiempo de conservación de las frutas, hortalizas y verduras. El dióxido de carbono, gas a las temperaturas normales de almacenamiento, es incoloro, inodoro e incombustible. No es tóxico para el hombre a concentraciones inferiores a un 10 % pero por encima de este nivel una exposición prolongada a la acción del mismo da lugar a la pérdida del sentido, lo que es importante tener en cuenta cuando se utilice a altas concentraciones en los grandes almacenes y vehículos de transporte. No deja residuos tóxicos ni su aplicación presenta serios problemas mecánicos. El gas se comercializa habitualmente, en forma líquida, en bombonas de acero a una presión de 58 Kg/cm2 (830 lb/pulgada2) aproximadamente o en forma sólida como nieve carbónica. A presión atmosférica, la forma sólida se transforma en gas sin pasar por el estado líquido, sublimándose a -78,5ºC a la presión normal. Para la manipulación de la nieve carbónica deben utilizarse guantes ya que el contacto momentáneo con la piel a 78,5ºC puede causar quemaduras por congelacion y ampollas. El dióxido de carbono se disuelve bien en agua (1,71 ml CO2/ml H2O a 760 mm de presión y a 0ºC) y, por tanto, en los zumos de frutas pero la absorción parece ser un fenómeno totalmente físico que implica una unión no más intensa que la del ácido carbónico. Cuando se absorbe en los alimentos, el pH baja de acuerdo con la cantidad de ácido carbónico que se forma y con la capacidad tampón del alimento pero de nuevo aumenta cuando el CO2 se elimina por exposición al aire o por un calentamiento suave del producto. El dióxido de carbono destruye, estimula, inhibe o no tiene efecto alguno de resaltar sobre los microorganismos, dependiendo de los microorganismos, de la concentración de dióxido de carbono, de la temperatura de incubación, de la edad de las células microbianas en el momento de aplicar el CO2 y de la actividad de agua del alimento o medio de cultivo. De todos estos efectos, los de mayor importancia en relación con el procesado y conservación de los alimentos son, sin duda, los destructivos e inhibidores. Existe una cónsiderable variación en lo referente a la sensibilidad al CO2 a nivel de género, especie y cepa.

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Por ejemplo, el CO2 al 100 % destruye totalmente, tras una exposición de 4 días a temperatura ambiente, a algunos cultivos de Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium y Micrococcus mientras el efecto es nulo o escaso sobre Proteus spp., Clostridium perfringens y algunos tipos de Lactobacillus. Por tanto, aunque la acción del CO2 sobre los microorganismos es selectiva, la mayoría de las levaduras, mohos y algunas bacterias son inhibidos por concentraciones comprendidas entre 5 y 50 % (viven la fase gaseosa) pero no son destruidos o inhibidos totalmente. Concentraciones inferiores a aquellas no tienen efecto alguno o realmente estimulan el crecimiento. La inhibición aumenta de una forma casi lineal cuando se incrementa la concentración de CO2 desde un 5 % hasta el 25 - 50 %, dependiendo siempre del alimento y de la flora implicada. A concentraciones superiores a ésta el incremento de la inhibición es escaso o nulo. Aunque el grado de inhibición varía con los microorganismos y el alimento, con un 10 % se logra habitualmente una inhibición del orden del 50 % sobre la base del recuento total después de un determinado tiempo de incubación. El efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos en los alimentos parece mayor a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento según se deduce del aumento relativo de la vida útil del alimento al descender la temperatura de almacenamiento. Sin embargo, cuando los efectos de la temperatura y del CO2 se estudian por separado, se observa que la acción del CO2 se incrementa al aumentar la temperatura. El efecto inhibidor del CO2 se manifiesta, tanto en las bacterias como en los hongos, por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generación durante la fase logarítmica.

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No obstante, a concentraciones comprendidas entre el 5 y el 20%, el efecto mayor se logra en la fase de latencia. La aplicación de gas una vez que las células microbianas han empezado a adaptarse al medio, o cuando ya están en la fase logarítmica, el efecto del CO2 se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en estudios realizados con cepas psicrotrofas del género Pseudomonas y del grupo Acinetobacter – Moraxella se comprobó que si se retrasa la aplicación del CO2 (20 %) hasta 1 ó 2 días después de la inoculación sobre la superficie de la carne, el efecto inhibidor es menor. Sin embargo, si la concentración de CO2 era del 40 % el momento en que se expone el producto a la atmósfera de CO2 tiene una influencia menor. La velocidad de crecimiento en atmósfera de CO2 no aumenta con el tiempo, es decir, la inclinación de la curva de crecimiento no cambia. Esto indica que el sistema metabólico no se adapta durante la fase de exposición al CO2 ni existe, en este caso, una selección de los microorganismos CO2-resistentes. La reducción de la actividad de agua del medio aumenta el efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos. El mecanismo de inhibición de los microorganismos por el CO2 no se conoce todavía con claridad. Sin embargo, ya en 1889 se observó que se debía a la presencia real de dióxido de carbono y no a la ausencia de oxígeno y que el efecto es reversible, ya que los microorganismos tratados recuperan la velocidad de crecimiento normal cuando se dejan de exponer a la atmósfera de CO2.

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No obstante, en el caso de los microorganismos que alteran la carne, permanecen efectos inhibidores residuales cuando el gas se ha dejado de aplicar. El efecto directo del gas sobre las células microbianas se confirmó muchos años más tarde en experimentos realizados con Pseudomonas aeruginosa. El descenso del pH debido a la formación de ácido carbónico en el medio tiene un efecto perjudicial sobre ciertos microorganismos; por ejemplo, una atmósfera de CO2 al 20 % puede hacer bajar el pH, si el medio no está tamponado, en un valor de hasta una unidad de pH.

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Capítulo II: El Laboratorio de Alimentos y otros conceptos 92

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Un simple análisis macroscópico y organoléptico no nos pueden dar una idea acabada de la potencial contaminacion del alimento o del agua; para ello está la Microbiología de los mismos, quien se encargará de determinar cuál es el patógeno que puede desencadenar una Enfermedad Transmitida por Alimentos (ETA)

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1. LABORATORIO MICROBIOLOGICO de CONTROL de los ALIMENTOS

Los objetivos del laboratorio deben definirse claramente y expresarse con la mayor simplicidad posible. La claridad de la definición es de importancia fundamental, porque en ella se basan todas las actividades del laboratorio. El director del laboratorio debe definir los objetivos después de recabar las opiniones que estime oportunas, y según las instrucciones que haya podido recibir de sus superiores. En la definición debe figurar una referencia a la calidad de los resultados, su puntualidad y su rentabilidad. Los objetivos pueden exponerse en una serie de declaraciones distintas. Deben incluirse todos los aspectos esenciales para el funcionamiento del laboratorio, evitando no obstante los pormenores. El principal objetivo de un laboratorio es producir resultados fiables, por lo que ésta es la actividad que debe recibir mayor atención. Un laboratorio cuyos resultados no sean suficientemente fiables no es probable que sea aceptado en ningún mecanismo gubernamental. La garantía de calidad de estos resultados no es una carga adicional o una actividad suplementaria que pueda tomarse o dejarse, sino que constituye uno de los instrumentos fundamentales de administración para el director y su personal, con miras a alcanzar los objetivos fijados. Los objetivos de calidad han de ser tan realistas como cualquier otro objetivo. El objetivo general del laboratorio puede definirse como sigue: producir datos analíticos de precisión y fiabilidad suficientes en un plazo aceptable y a un costo admisible. El objetivo de calidad puede definirse como la seguridad, en la medida de lo posible, de que se ha obtenido la respuesta aproximadamente correcta. Este punto precisa aclaraciones. ¿Qué se entiende por "seguridad en la medida de lo posible"?

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Se entiende un grado de seguridad tal que, de demostrarse posteriormente que los resultados estaban equivocados, ello no afecte a la integridad, probidad o competencia técnica del personal del laboratorio. ¿Y qué significa "aproximadamente" ? Significa obtener un resultado que sea suficientemente adecuado para la finalidad a la que se destina. Si una muestra resulta gravemente deficiente en un determinado analito, no es probable que las proporciones precisas de la deficiencia sean muy importantes para, digamos, un litigio ante los tribunales o el rechazo de envío. A medida que las proporciones del analito se aproximan al límite legal, la precisión del análisis adquiere mayor importancia, hasta que se llega a un punto en que el resultado se acerca más al límite que la precisión del método. Así, tanto la exactitud como la precisión han de ser mayores para las muestras marginales que para aquellas cuyos resultados distan mucho de cualquier norma o límite. La garantía de la calidad (GC) es la función de administración que garantiza la calidad de los resultados. Es una función que debe llevarse a cabo en la medida en que sea necesaria, ni más ni menos, y ha de formar parte integrante del cometido cotidiano de los administradores. Es importante tener en cuenta que esta función consiste no sólo en obtener la respuesta correcta, sino también en ser capaz de demostrar que se ha obtenido la respuesta correcta, y proporcionar la prueba documental de ello. La primera introducción de procedimientos escritos de GC en un laboratorio requiere un considerable cambio de las actitudes. Si se introduce adecuadamente, la GC surte efectos positivos en la moral del personal, que adquiere mayor confianza en los resultados y siente que es capaz de demostrar la veracidad de esos resultados. La garantía de la calidad centra la atención en los aspectos pertinentes de las actividades diarias y las necesidades de capacitación, y ayuda al personal a mejorar sus conocimientos y promover su carrera.

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Aunque no parece que el término "garantía de la calidad" requiera mayores explicaciones, con frecuencia se confunde con "control de calidad", o se emplea en vez de éste. Garfield define el control de calidad como "un sistema planeado de actividades cuya finalidad consiste en proporcionar un producto de calidad". En el caso de un laboratorio de control de los alimentos, este producto de calidad sería un resultado analítico válido. Este mismo autor define la garantía de la calidad como "un sistema planeado de actividades cuya finalidad consiste en proporcionar la garantía de que el programa de control de calidad da resultados efectivos". El objetivo de un programa de garantía de la calidad estriba en reducir los errores a niveles aceptables y dar seguridades en el sentido de que los datos reúnen muchas probabilidades de ser de calidad aceptable. Intervienen aquí otros dos conceptos: "control de calidad", que se define como "el mecanismo establecido para controlar errores", y "estimación de la calidad", que es "el mecanismo para verificar que el sistema funciona dentro de límites aceptables". Hay aún otro término, el "sistema de calidad", definido como "las estructuras, responsabilidades, actividades, recursos y eventos de organización que proporcionan en conjunto procedimientos y métodos organizados de ejecución para garantizar la capacidad de la organización de reunir los requisitos de calidad". Según el grupo de trabajo, el sistema de calidad abarca todos los elementos del control y la garantía de la calidad. Así pues, el control de calidad puede considerarse una combinación de sistemas, procedimientos, actividades, instrucciones e inspecciones de la administración para controlar y mejorar la calidad de la labor efectuada. En cambio, la garantía de calidad es el sistema de actividades que da a la administración la confianza en que los sistemas de control de calidad están instalados y son capaces de producir resultados analíticos de la máxima calidad. Un programa de garantía de la calidad es un mecanismo destinado a garantizar que los datos producidos por un laboratorio son de la máxima calidad. Esta garantía se consigue asegurándose de que todas las operaciones del laboratorio se llevan a cabo del modo previsto. Además, la documentación existente permite actualizar los datos según sea menester. Para preparar un programa de garantía de la calidad, debemos considerar antes sus diversos elementos. El National Institute for Occupational Safety and Health (Instituto Nacional de Seguridad y Sanidad del Trabajo) de los EE.UU. ha identificado más de 20 elementos que pueden formar parte de un programa de garantía de la calidad: 96

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a) Declaración de objetivos b) Declaraciones de políticas c) Organización d) Planificación de la calidad e) Procedimiento operativo estándar f) Registros g) Procedimientos de custodia h) Medidas correctivas i) Capacitación en materia de calidad j) Control de documentos k) Calibración de instrumentos 1) Mantenimiento preventivo m) Reactivos y normas de referencia n) Adquisición y control o) Identificación y control de muestras p) Análisis y control de laboratorio q) Programas de ensayos inter et intralaboratorios r) Manejo, almacenamiento y entrega de muestras s) Control de la calidad estadística t) Validación de datos u) Inspecciones del sistema. El Procedimiento Operativo Estándar o Normal (POE o PON) es un documento en el que se describe cualquier procedimiento que no sea un método de análisis. Puede tratarse de un procedimiento administrativo rutinario, un procedimiento no analítico de laboratorio, como la puesta en funcionamiento de un instrumento, o cualquier otro procedimiento aplicado en el laboratorio. De ordinario el POE describe una actividad con el detalle suficiente para que pueda llevarse a cabo sin supervisión, y en algunos casos sin capacitación previa. Un método de análisis puede redactarse en el formato de un POE, pero es preferible que se le considere un tipo distinto de documento. La garantía de calidad abarca todas las actividades operativas de un laboratorio, y no sólo el análisis.

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Todas esas actividades son controladas (y sólo pueden serlo) si existe un registro escrito de las mismas, o tal vez un registro informatizado, que normalmente va acompañado también de un registro escrito. Este registro escrito es el Procedimiento Operativo Estándar. Debido a la diversa naturaleza de los laboratorios de control de los alimentos, un solo programa uniforme no puede abarcar todas las actividades del laboratorio. Un programa de garantía de la calidad debe adaptarse a las funciones del laboratorio en el que se aplique, aunque no es necesario que sea tan específico que sólo pueda utilizarlo un laboratorio. Un buen programa de garantía de calidad ha de ser suficientemente flexible para que pueda adaptarse, con ligeras modificaciones, a las actividades de diferentes laboratorios que realicen tareas esencialmente similares. Un programa eficaz de garantía de la calidad es sencillo. Su redacción ha de ser clara, concisa y sin complicaciones, evitando las exposiciones aburridas o demasiado largas y la proliferación de detalles innecesarios o anodinos. Un programa demasiado complejo suscitará probablemente la hostilidad de los analistas, con la consiguiente perdida de interés. Un programa eficaz de garantía de la calidad ha de ser práctico desde el punto de vista del tiempo de análisis y los costos. Si hace falta dedicar una proporción excesiva de la jornada laboral de los analistas para llevarlo a cabo, el programa no está suficientemente equilibrado. Un programa eficaz debe redundar en un ahorro del tiempo y los costos de análisis, ya que pocas veces hará falta repetir éstos. No todos los 21 elementos mencionados son menester para la preparación de un programa de garantía de la calidad. Cada elemento debe recibir su propia prioridad en el programa correspondiente. Garfield ofrece una formulación algo más simple de un programa de garantía de la calidad, proponiendo tres elementos esenciales: a) Prevención, que precisa un programa ordenado de planificación y una serie de medidas positivas antes de los análisis o durante éstos, para asegurarse de que todos los sistemas analíticos funcionan adecuadamente (calibración y mantenimiento de los instrumentos, utilización de cultivos microbiológicos estándar, y capacitación). b) Evaluación, forma de control que comprende comprobaciones periódicas del rendimiento de los analistas (análisis de muestras seleccionadas y validación de la metodología). c) Corrección, medida adoptada para determinar las causas de los defectos de calidad y restablecer el funcionamiento adecuado de las operaciones analíticas (reparación de máquinas averiadas, reevaluación de metodologías y capacitación de reciclaje).

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La forma final que adopte el programa de garantía de la calidad es una decisión a la vez científica y de administración. Las operaciones cotidianas de análisis del laboratorio de control de los alimentos deben determinar los elementos que hagan falta en el programa. A renglón seguido la administración deberá establecer las prioridades de esos elementos y determinar la medida en que se asignarán al programa los recursos destinados al análisis. Cada laboratorio que aplique un programa de garantía de la calidad debe disponer de un manual que documente sus operaciones. Un manual típico podría componerse de lo siguiente: a) Portada, con las firmas de todos los oficiales certificadores. b) Indice. c) Estructura de organización y lugar exacto que corresponde al laboratorio en esa estructura. d) Objetivos del programa de garantía de la calidad. e) Inclusión de elementos esenciales del programa de garantía de la calidad, según se han indicado anteriormente. f) Formularios de documentación. g) Rendimiento y frecuencia de las inspecciones. h) Medidas correctivas y de seguimiento. Además de una declaración de política general, en el manual aparecen declaraciones específicas de política, como por ejemplo la definición de las responsabilidades de los diversos niveles de gestión en la aplicación del programa, una lista de laboratorios (independientemente de su emplazamiento) a los que se aplica el programa de garantía de la calidad, referencias a la metodología recomendada de laboratorio, titularidad de los derechos de propiedad de los datos del laboratorio, y cualesquier excepciones a las declaraciones de políticas. Aunque el diseño final del laboratorio lo hacen los arquitectos e ingenieros, el personal de análisis debe participar en algunas de las decisiones que afectarán, finalmente, a su medio de trabajo y las condiciones en que éste se desarrolle.

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El laboratorio de control de alimentos puede desempeñar diversas funciones: análisis de los alimentos para la detección de oligometales, aditivos, nutrientes y toxicantes, y microbiología básica de los alimentos. La disposición del laboratorio debe diseñarse con criterios de eficiencia. Por ejemplo, la distancia que deba recorrer el personal para llevar a cabo las distintas fases de los procesos analíticos ha de ser lo más corta posible. El diseño debe prever espacio para los servicios auxiliares. Entre éstos ha de figurar un taller, salvo que pueda recurrirse a contratistas externos para todos los aspectos de mantenimiento del laboratorio, como la fontanería, los suministros eléctricos y el servicio de los aparatos electrónicos y eléctricos no relacionados con los análisis. Hacen falta despachos para los administrativos, baños y aseos y una cantina, por sencilla que sea. Hay que prever un almacén para las muestras, el equipo, los productos químicos y el instrumental de vidrio. El depósito de las muestras ha de estar protegido contra los parásitos.

En condiciones ideales, el laboratorio de microbiología no debe ocupar una sola sala polivalente, sino más bien una serie de habitaciones dedicadas al almacenamiento del instrumental de vidrio y de los medios deshidratados, la preparación y esterilización de los medios, los animales vivos (de haberlos), la descontaminación de materias patógenas o peligrosas, y el personal. Los laboratorios reglamentarios necesitan zonas separadas para el almacenamiento de las muestras que todavía no se han analizado, y las muestras ya analizadas que pasan a la reserva. No obstante, en realidad este requisito no siempre puede cumplirse, y ha de optarse por una solución intermedia. Muchos laboratorios de microbiología pueden consistir en una sola habitación que contenga un banco central de trabajo en el que se preparen los medios y se efectúen los análisis microbiológicos. Esta sala podría contener también áreas de almacenamiento de diversos tamaños para los medios y los instrumentos de vidrio. 100

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Sin embargo, hay otras funciones, como la descontaminación de materias patógenas, el almacenamiento de las muestras recién llegadas, el almacenamiento de las muestras de reserva y el mantenimiento de animales, que no pueden efectuarse en una sola habitación. Los medios, los reactivos y los instrumentos de vidrio que deban almacenarse en la misma habitación en que se llevan a cabo los análisis microbiológicos habrán de guardarse en envases herméticamente cerrados, y todos los artículos deberán almacenarse en armarios limpios de polvo, preferiblemente con puertas corredizas de vidrio. Estas puertas deben estar permanentemente cerradas, salvo cuando haya que acceder a los armarios. Un autoclave de carga lateral es quizás el instrumento más costoso para muchos laboratorios de microbiología. Aún así, es recomendable utilizar autoclaves distintas para la esterilización de los soportes y para la descontaminación de materias patógenas, a fin de reducir al mínimo las posibilidades de contaminación mutua. Idealmente los dos autoclaves deberían estar en habitaciones distintas o, por lo menos, a bastante distancia el uno del otro, si están en la misma habitación. Mientras que en los grandes laboratorios de microbiología el instrumental de vidrio se envía a lavar a un servicio completamente centralizado e independiente del laboratorio, en los laboratorios pequeños puede suceder que el personal se encargue de lavar su propio instrumental. Si ello es así, los instrumentos de vidrio pueden lavarse en la misma habitación en que se encuentra la autoclave de descontaminación de materias patógenas o, si es necesario, en la habitación donde están los dos autoclaves, el destinado a esterilizar los soportes y el que sirve para descontaminar las materias patógenas. Debe considerarse la conveniencia de prever una habitación propia para el personal, por pequeña que sea, ya que ello no sólo proporciona un mayor grado de seguridad al personal del laboratorio, sino que además contribuye a asegurar la integridad de las muestras.

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Comer, beber o fumar suele desaconsejarse, y a menudo prohibirse, en los locales del laboratorio propiamente dicho; corresponde a la administración prever otros locales con estos fines. Para facilitar una rápida evacuación en caso de incendio o cualquier otra emergencia, deben preverse por lo menos dos en iradas/salidas en cada habitación, siempre que sea posible. Las entradas han de ser de forma que reduzcan al mínimo el tránsito de personas. Cuando se diseñe un nuevo laboratorio debe tenerse en cuenta la posible expansión del personal y las actividades. En la mayor parte de laboratorios que se han trasladado a un nuevo emplazamiento y han reanudado las operaciones, los locales parecen quedarse pequeños enseguida. Así pues, los administradores deben tener presentes las proyecciones de la plantilla para el futuro, el número y tipo de muestras y las necesidades de equipo. Los muros deben pintarse con una pintura impermeable y a prueba de moho, que proporcione una superficie lisa e impenetrable de fácil limpieza. En muchos laboratorios de microbiología no se aprovecha suficientemente el espacio de las paredes. De ser posible, las paredes deberían utilizarse para colocar estanterías adicionales, protegidas por puertas corredizas de cristal para almacenar los soportes, productos químicos y otras materias en un lugar exento de polvo. Dado que los microbiólogos pueden tener que permanecer de pie durante varias horas en una jornada normal de trabajo, los suelos han de ser relativamente cómodos. Baldosines resistentes, lisos y que puedan fregarse rápidamente son muy recomendables. Para mayor comodidad, podrán colocarse felpudos de goma en diversos lugares estratégicos del laboratorio. Las placas de linóleo sobre el cemento no son recomendables, porque los intersticios no pueden limpiarse del todo. Con el tiempo el propio linóleo se agrieta, creando hendiduras donde proliferan las bacterias. De ser posible, el laboratorio de microbiología debe estar alejado de cualquier lugar en que haya emanaciones de gases o humos de los edificios. El laboratorio de microbiología tiene problemas únicos de contaminación, y conviene que esté equipado con aire acondicionado. El aire acondicionado central ofrece varias ventajas.

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En primer lugar, el aire que entra es filtrado, con lo que se reduce el peligro de contaminación ambiental del laboratorio. En segundo lugar, las ventanas cerradas reducen al mínimo las corrientes de aire, que pueden causar contaminación. En tercer lugar, las ventanas cerradas también impiden la entrada de moscas y otros insectos voladores que contaminan las muestras o las superficies del laboratorio. En cuarto lugar, el aire acondicionado controla la humedad (un 50 por ciento es óptimo), lo que atenúa los problemas con los soportes higroscópicos y los productos químicos, sobre todo en los países de clima tropical. Además, una humedad excesiva durante un período prolongado puede provocar el crecimiento de mohos en las superficies del laboratorio. Las esporas pueden hacerse aéreas, lo que afectaría a los resultados de los análisis. Por último, el aire acondicionado estabiliza la temperatura de la habitación, lo que permite un funcionamiento más eficaz de las incubadoras. Como muchas incubadoras de aire no tienen un sistema incorporado de refrigeración, sólo pueden mantener temperaturas al mismo nivel que la temperatura ambiente, que por lo general es de 21-23°. Sin embargo, en los países tropicales las temperaturas ambiente pueden ser de más de 30°, o incluso de 35°, y las incubadoras no funcionan bien si la temperatura de la habitación es de más de 23°. Cuando no se mantiene una temperatura ambiente relativamente constante ello puede afectar al rendimiento o causar un funcionamiento deficiente de los medidores de pH. Una temperatura elevada puede provocar un cambio en la composición o la integridad de medios o reactivos sensibles al calor, o una pérdida de viabilidad de los cultivos de base mantenidos normalmente a 21-23°. Los ventiladores no son un sustituto recomendable de un sistema eficiente de ventilación, porque levantan polvo y pueden ser una causa importante de contaminación en el laboratorio de microbiología. Incluso con un sistema central de aire acondicionado, el hollín y otras partículas finas se introducen a través de los orificios de salida del sistema de ventilación, por lo que conviene colocar filtros en esas aberturas. 103

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Estos filtros deben cambiarse por lo menos una vez al año, o con más frecuencia si es necesario. El personal del laboratorio deberá llevar un registro escrito que indique cuando han de sustituirse los filtros. Cuando participen en el diseño del laboratorio, los microbiólogos podrán considerar la conveniencia de instalar una campana de ventilación o cualquier otro sistema de extracción de humos. Cada campana debe tener su propio suministro de gas, agua, aire comprimido y electricidad. Los ácidos fuertes, los solventes y otras materias semejantes deberán emplearse bajo una campana de este tipo. Para obtener un máximo de eficiencia, la compuerta de la campana deberá bajarse hasta el nivel indicado por el fabricante.

La eficiencia del sistema de ventilación debe verificarse todos los años por un representante de la fábrica o por el personal de mantenimiento del edificio. No obstante, el personal del laboratorio deberá llevar un registro escrito de las operaciones de mantenimiento. Las campanas no deben emplearse para el almacenamiento a largo plazo de los materiales. Bajo la campana sólo deberá almacenarse el equivalente de tres días de suministro de productos químicos. Aunque pueden muy bien preverse algunas ventanas en el diseño del laboratorio, los medios, productos químicos y reactivos deben almacenarse en zonas protegidas contra la exposición directa a la luz del sol, que podría modificar los resultados. Los análisis tampoco deben efectuarse directamente a la luz del sol, porque ello podría alterar las conclusiones. El banco de trabajo es el centro de la actividad del laboratorio de microbiología. Debe mantenerse despejado para los análisis microbiológicos y no ha de emplearse para almacenar equipo de laboratorio, soportes u otros instrumentos.

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De ser posible, tampoco debe hacerse servir como soporte de estanterías. El banco debe estar hecho de material no poroso, impermeable y exento de intersticios, empalmes visibles u otras zonas defectuosas en las que puedan crecer los microorganismos. El espacio debajo del banco podrá utilizarse para colocar armarios y estanterías, pero debe preverse un espacio libre de por lo menos 90 cm, para que el analista esté más próximo al banco cuando trabaje sentado. El banco debe estar equipado adecuadamente de grifos de gas, aire enrarecido a presión subatmosférica, aire comprimido, enchufes eléctricos y grifos de agua destilada y de agua corriente, fría y caliente. Además del banco principal, y separados de éste, deberá haber uno o más bancos laterales auxiliares. Algunas piezas del equipo de laboratorio, como por ejemplo el baño maria, generan vibraciones y por consiguiente no deben colocarse en el mismo banco en el que se coloquen instrumentos delicados, como microscopios o balanzas de análisis. Hay que vigilar el medio ambiente en el que se encuentran las muestras, sus extractos, el personal y el equipo, para que la calidad de los resultados no se vea afectada. Para ello se comprobarán los registros con miras a determinar que: 1. Las muestras se reciben, almacenan, manejan y analizan en condiciones ambientales que no afecten desfavorablemente a los análisis. 2. Los controles de la temperatura, la humedad y la luz son adecuados en las zonas sensibles, para proteger las muestras, sus extractos, el personal y el equipo. 3. Se llevará un registro de los resultados del muestreo ambiental en los locales. De ordinario la vigilancia microbiológica del medio ambiente requiere análisis de las superficies y el espacio aéreo del laboratorio, para detectar la presencia de microorganismos. El control de las superficies del laboratorio permitirá determinar la limpieza de una misma zona de trabajo durante un período prolongado, o de diferentes zonas en un momento determinado, la frecuencia necesaria de las operaciones de limpieza, la eficacia de los desinfectantes en los bancos de trabajo y la frecuencia necesaria de la desinfección de éstos, y la eficiencia de la campana de flujo laminar.

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La vigilancia del aire sirve para verificar la eficacia de los filtros de aire y la frecuencia con que deben cambiarse, así como cualquier fuente posible de contaminación ambiental de las muestras. La enumeración de los microorganismos en las superficies del laboratorio puede efectuarse bien por el método de frotación o bien por el método de contacto directo del agar en el organismo replicado. El método RODAC es especialmente apto para el muestreo de superficies planas e impermeables. No debe emplearse en superficies irregulares, o en las que presenten intersticios o grietas.

Da el mejor resultado en superficies planas que hayan sido limpiadas y desinfectadas, o esterilizadas. Las superficies altamente contaminadas provocan una proliferación orgánica en las placas de RODAC. La calidad microbiológica del aire ha de verificarse por lo menos dos veces a la semana, para asegurarse de que el medio ambiente del laboratorio no es una fuente importante de contaminación. Un sistema sencillo pero eficaz de verificar la calidad del aire es el denominado procedimiento de sedimentación o técnica de la placa de polvo residual. En varios lugares del laboratorio se exponen placas de un soporte no selectivo, como por ejemplo el agar, a la acción del medio ambiente. La elección de los lugares depende de factores tales como el tránsito de personas o la magnitud relativa de la actividad de análisis. Después de un período de exposición de 15 minutos, las placas se encierran en la incubadora a 35° durante 48 + 2 horas. A continuación, se procede al recuento de las placas y los resultados se anotan en un libro de registro, de tapas duras. Más de 15 colonias en las placas es una indicación de que la calidad microbiológica del aire puede no ser apta para la realización de análisis de laboratorio. En tal caso, deberá suspenderse la actividad del laboratorio, desinfectarse todas las superficies, y evaluar de nuevo la calidad microbiológica del aire antes de reanudar las operaciones normales del laboratorio.

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Para los laboratorios que deseen un procedimiento más perfeccionado existen varios tipos de instrumentos de muestreo del aire ambiental, como tamices de muestreo, muestreadores divididos y muestreadores centrífugos. Los suelos, bancos y otras superficies del edificio deben limpiarse regularmente. También hay que limpiar las campanas extractoras de humo, los aparatos de extracción de polvo, el equipo y el instrumental de vidrio. Los congeladores y refrigeradores deben vaciarse y limpiarse de vez en cuando, sin poner en peligro la integridad del contenido. Puede ocurrir que el personal de limpieza, que no dispone de formación técnica, vacile en limpiar el equipode análisis, por miedo a averiarlo. Por este mismo motivo, a los analistas quizás no les guste una limpieza muy escrupulosa. En este caso, la administración deberá disponer que los analistas se ocupen de la limpieza de su equipo, mientras que el personal de limpieza se encargará del resto del edificio. Así pues, deberá preverse un turno de limpieza para los analistas, y otro para el personal de limpieza. Todas las superficies deben frotarse frecuentemente con un trapo húmedo. La ausencia de polvo en las estanterías es señal de una limpieza bien hecha. Los suelos deben fregarse con una bayeta húmeda y desinfectarse regularmente para evitar la acumulación de residuos, en los que puedan sobrevivir y proliferar las bacterias. El encerado regular da lugar a la acumulación de cera sucia, sobre todo en las tablas de rodapié, y por consiguiente no es recomendable. Deben llevarse registros de las operaciones de limpieza, que permitirán verificar la observancia del programa de limpieza del edificio. Asimismo, deberá efectuarse de vez en cuando una comprobación directa del estado de limpieza del laboratorio. Si se enceran los bancos de madera, la cera deberá rasparse periódicamente para evitar la acumulación de suciedad. Hace falta un programa preventivo de desinsectación para combatir las moscas, cucarachas y otros insectos. Estos insectos se sienten atraídos en particular por grandes cantidades de alimentos almacenados.

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El almacenamiento prolongado de alimentos a granel, aunque en general no se recomienda, puede ser inevitable en los laboratorios reglamentarios que quizás deban retener durante largos períodos las muestras de un caso litigioso. La desinsectación puede correr a cargo del personal del laboratorio, o encargarse a una empresa comercial. Debe llevarse un registro escrito con indicación de las fechas de las operaciones de desinsectación.

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2. PLANES de MUESTREOS y sus OPCIONES La inspección de alimentos utilizando planes de muestreo es un criterio para decidir si un lote o lotes de productos cumplen o no, con un requisito de calidad y sanitario establecido. Los planes de muestreo tienen como propósito garantizar el uso de procedimientos justos y válidos cuando se analicen alimentos para comprobar si se ajustan o no a legislación vigente. Para que la toma de decisión sea la correcta, se necesita obtener una muestra representativa del lote evaluado y además asegurar su integridad hasta el momento de ser analizada. Por lo expuesto gran parte del éxito o fracaso de la vigilancia o control dependerá de la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, debido a que la muestra puede verse afectada si no se maneja adecuadamente y por consiguiente el resultado analítico podría no ser confiable. La mayoría de los procedimientos de muestreo comprenden la selección de una o varias muestras de un lote, la inspección o el análisis de las muestras y la clasificación del lote (como “aceptable” o “no aceptable”) a partir del resultado de la inspección y el análisis de la muestra. La definición precisa de un procedimiento de muestreo de aceptación requerirá por lo tanto:

⇒ Material objeto del muestreo (tipo de alimento a inspeccionar) ⇒ La característica que debe medirse.

⇒ El tamaño del lote (N). ⇒ Un plan por atributos o por variables. ⇒ El nivel de calidad aceptable (NCA) ⇒ El nivel de inspección (NI). ⇒ El tamaño de la muestra (n). ⇒ Los criterios para la aceptación o el rechazo del lote. Pondremos como ejemplo al Dulce de Batata; Característica a Evaluar: Sólidos Solubles y Plan de Muestreo: Atributos (para la toma de decisiones rápidas). Nota: Si bien, correspondería la aplicación del plan de muestreo por variables por ser los sólidos solubles una característica de composición, se aplica el plan de muestreo por atributos para la toma rápida de decisiones. En este caso, cada valor obtenido se tomo como una variable discreta. Nivel de Inspección: Normal Por el tipo de característica y alimento a muestrear: Alimento Clase III –NCA 2,5 Tamaño del lote (N): 1000 unidades Tamaño de la muestra (n): 5 unidades Criterio de aceptación: 0

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Instrucción de muestreo (n-c): 5-0 Sólidos Solubles (Método Refractométrico), según Código Alimentario Argentino, mínimo 60. Es decir, de acuerdo a la instrucción de muestreo, todas las unidades sometidas a análisis deberían dar un valor de 60 o más. Aceptación/Rechazo del lote: Si: x ≤c, aceptar el lote Si: x>c, rechazar el lote Resultados obtenidos Muestra Sólidos Solubles en Brix

X: 1

X: 2

X: 3

X: 4

X: 5

55

62

60

61

62

Daremos algunas definiciones para que haya una mayor comprensión: MUESTREO: Procedimiento empleado para tomar o constituir una muestra. PLAN DE MUESTREO: Procedimiento planificado en el que se determina el número de elementos que deben tomarse y el número de elementos defectuosos que se requieren en una muestra para evaluar el grado de cumplimiento de un lote.

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ALIMENTOS CLASE I: Son aquellos destinados a poblaciones de riesgo, y los que en caso de detectarse en ellos defectos, podrían representar un riesgo grave para la salud de los consumidores, con evidencias documentadas de muerte o consecuencias adversas severas en la salud. ALIMENTOS CLASE II: Se aplica a aquellos alimentos en los que existe una probabilidad razonable de contaminación con consecuencias adversas temporarias y reversibles en la salud de las personas al consumirlos. ALIMENTOS CLASE III: Son aquellos alimentos que no representan un riesgo apreciable para la salud de los consumidores, pero un defecto podría constituir una infracción. LOTE (N): Es el conjunto de artículos de un mismo tipo, procesados por un mismo fabricante o fraccionador, en un espacio de tiempo determinado bajo condiciones esencialmente iguales. IDENTIFICACIÓN DEL LOTE: Todo rótulo deberá llevar impresa, grabada o marcada, una indicación en clave o lenguaje claro, que permita identificar el lote a que pertenece el alimento de forma que sea fácilmente visible, legible e indeleble. El lote será determinado en cada caso por el fabricante, productor o fraccionador del alimento, según sus criterios. Para la indicación del lote se podrá utilizar: a) un código clave precedido de la letra “L” b) la fecha de elaboración, envasado o de duración mínima, siempre que la(s) misma(s) indique(n) por lo menos el día y el mes o el mes y el año claramente y en el citado orden, según corresponda. REMESA: Es la cantidad de un producto entregada en un momento determinado. Puede ser una parte de un lote o también una serie de lotes. No obstante, cuando se trata de una inspección estadística, la remesa se considera como un nuevo lote a efectos de interpretar los resultados. Si la remesa es una parte de un lote, cada parte se considerará como un lote para la inspección. MUESTRA (n): Es una porción de elementos tomada aleatoriamente de un lote con el propósito de evaluar sus características. NIVEL DE INSPECCIÓN (NI): El nivel de inspección pone en relación el tamaño de la muestra con el tamaño del lote. En relación con un Nivel de Calidad. Aceptable (NCA) determinado, cuanto menor sea el número del nivel de inspección, mayor será el riesgo de que se acepten lotes de baja calidad. Se distinguen tres niveles de inspección: nivel de inspección reducido (1), el nivel de inspección normal (2) y el nivel de inspección reforzado (3). La autoridad competente, establecerá el nivel de inspección. A no ser que se indique otra cosa, se aplicará el nivel de inspección normal (2). NIVEL DE CALIDAD ACEPTABLE (NCA): La inspección de un lote mediante un plan de muestreo por atributos o por variables permitirá la adopción de una decisión acerca de la calidad del lote. El nivel de calidad aceptable (NCA) es el número máximo de elementos defectuosos por cada 100 unidades. Este dato constituye un objetivo de calidad establecido por la autoridad sanitaria. La selección de un valor para el NCA depende de la característica específica examinada y su relevancia. Podrá realizarse un análisis del riesgo para evaluar la probabilidad y la gravedad de las repercusiones negativas en la salud pública, debidas, por ejemplo, a la presencia en alimentos de: contaminantes, residuos, toxinas o microorganismos patógenos.

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Las características que pueden relacionarse con defectos críticos (riesgos sanitarios) se asociarán a un NCA bajo de 0,1% Alimentos Clase I a 0,65% Alimentos Clase II, mientras que las características de composición, como el contenido de grasa o de humedad, se asociarán a un NCA de 2,5% Alimentos Clase III. CRITERIO DE ACEPTACIÓN (c): Es la cantidad máxima de unidades defectuosas que se permite en la muestra para que se acepte el lote. DEFECTOS: Un defecto ocurre en un elemento cuando una o varias características de calidad no satisfacen las especificaciones de calidad establecidas. Un elemento defectuoso es el que presenta uno o varios defectos. La calidad del lote debe evaluarse de acuerdo al porcentaje aceptable de elementos defectuosos. DEFECTOS CRITICOS: Los defectos críticos forman una categoría especial. Es imposible elegir algún valor para estos defectos Se encuentran dentro de esta categoría aquellos defectos que pongan en riesgo la inocuidad del producto. Si se encuentra un defecto critico, significa que el lote entero será rechazado. CARACTERÍSTICA: Es una propiedad que permite identificar los elementos de un determinado lote o diferenciarlos entre si. La característica puede ser cuantitativa o cualitativa. VARIABLE: Es todo aquello que puede asumir diferentes valores, desde el punto de vista cuantitativo o cualitativo. VARIABLE CONTINUA: Se consideran variables continuas a aquellas características de composición determinadas en forma analítica por ejemplo humedad, materia grasa y que por lo tanto puede tomar un valor numérico.

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Las abreviaturas más utilizadas, son: Prom estim: Promedio estimado de las determinaciones. s: Desviación estándar de las determinaciones individuales de la muestra. NCA: Nivel de calidad aceptable N: Tamaño del lote n: Tamaño de la muestra c: criterio de aceptación x: Unidades defectuosas k: factor de aceptación El plan de muestreo por atributos, consiste en examinar una unidad de producto o una característica y clasificarla como “buena” o “defectuosa”. La acción a tomar se decide contando el número de unidades defectuosas encontradas.

El plan de muestreo por variables, consiste en realizar una o más mediciones sobre el producto de tal manera que la decisión se toma sobre la base de cálculos realizados con las mediciones. La elección de este plan requiere conocer de antemano como se distribuye en la muestra la característica a analizar.

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Tipo de característica Defectos de producto: Características que pueden expresarse mediante dos posibilidades excluyentes, tales como apto/no apto, sí/no, deteriorado/no deteriorado (variables discretas). Por ej. en defectos visuales, tales como pérdida de color, error de clasificación, materias extrañas, etc.) Características de composición: características que pueden expresarse mediante variables continuas. Pueden estar distribuidas de forma normal. (La mayoría de las características de composición determinadas en forma analítica, como el contenido de humedad, materia grasa, etc.)

Propiedades relacionadas con la salud (los peligros microbiológicos, los contaminantes, químicos de presencia irregular, etc.)

Tipo de Plan de Muestreo Plan de Muestreo por Atributos

Plan de Muestreo por variables con desviación estándar desconocida (en caso de distribución normal) y Plan de Muestreo por Atributos en el caso de características cuya distribución se desvía de manera significativa de lo normal. NOTA: Para la toma rápida de decisiones las variables continuas podrán discretizarse y utilizar el Plan de Muestreo por Atributos Planes de muestreo específicos según lo descripto en la legislación vigente

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El muestreo es imprescindible porque, por regla general, no es posible analizar microbiológicamente un lote completo. Los resultados obtenidos con la parte del lote analizada, la muestra, se usan para extraer conclusiones acerca del lote completo. En condiciones ideales, lote es una cantidad de alimento o unidades de alimentos producida y manipulada bajo condiciones uniformes. Esto implicaría la homogeneidad de todo el lote, que, en condiciones prácticas y considerando los niveles y distribución de los microorganismos ocurren en contadas ocasiones en la práctica. En la mayor parte de los casos, la distribución de los microorganismos dentro de los “lotes” es heterogénea. Es útil persuadir a los suministradores qeue asignen números de identificación a los lotes de alimento producidos en un tiempo corto (por ejemplo, un día o parte de un día). La elección del sistema de codificación variará dependiendo del tipo de proceso y el grado de homogeneidad del lote. Si una partida compuesta por una mezcla de lotes de producción se trata como un único lote, el riesgo del productor (es decir, el riesgo de que un lote aceptable se rechace) puede ser alto. El muestreo aleatorio es el método reconocido universalmente para evitar subjetividades y proporciona mejores resultados que intentar recoger de forma consciente unidades de muestra de varias partes del lote. El método de muestreo aleatorio más comúnmente aceptado es el uso de la tabla de números aleatorios. El factor principal no es la proporción del lote tomada como muestra sino más bien el tamaño total de las muestras aleatoriamente elegidas (número y tamaño de las unidades de muestra) entre la población y los criterios de aceptación y rechazo. Una muestra de 100 unidades de 5 g es prácticamente igual de eficaz para un lote de 500000g que para uno de sólo 10000 g. Si se quieren obtener los mejores resultados con los recursos disponibles, no todos los alimentos pueden recibir la misma atención. A los alimentos y lotes más importantes se les deparará la mayor parte del tiempo y esfuerzo, lo que significa que se someterán a un muestreo más intenso. ¿Qué factores gobiernan esta decisión?: • • • • •

Riesgo Uniformidad Estratificación Historial Limitaciones prácticas

Con mucha frecuencia, el organismo receptor de los productos alimenticios conoce nada o muy poco del método mediante el cual el alimento fue procesado o del historial del fabricante. Bajo estas circunstancias deben aplicarse los programas de atributos.

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Los programas de muestreo de variables, que dependen de la naturaleza de la distribución de las frecuencias de los microorganismos en los lotes de alimentos, solo pueden aplicarse cuando se conoce el historial del producto. El Programas de atributos de dos clases, viene definido por dos números. El primero está representado por la letra n y se define como el número de unidades de muestra requeridas para realizar el análisis. El segundo, representado por c es el número máximo permisible de unidades de muestra que pueden ofrecer resultados insatisfactorios en el análisis, por ejemplo, la presencia de un microorganismo o un recuento superior a una concentración preestablecida, definida por la letra m y que, en un programa de atributos de dos clases sirve de frontera entre la calidad aceptable y la defectuosa. El rigor de los programas de muestreo depende de n y de c. Los Programas de atributos de tres clases, fueron ideados para las situaciones en las que la calidad de un producto puede dividirse en tres categorías o clases de atributos dependiendo de la concentración de microorganismos en las unidades de muestra. Un recuento por encima de un límite M en cualquier a de las unidades de muestra es inaceptable, por lo que si cualquier recuento de las n unidades de muestra sobrepasa el límite M, el lote se rechaza. Los recuentos por encima de m que en un programa de atributos de tres clases separa la calidad buena de una calidad provisionalmente aceptable y menores de M no son deseables pero puede aceptarse alguno, siendo c el límite permitido. Los programas de muestreo son independientes del tamaño del lote siempre que el lote sea lo suficientemente grande en comparación con el tamaño de la muestra. La severidad de un programa de muestreo debe basarse en el riesgo que represente el consumo de un alimento por el consumidor por la presencia de microorganismos patógenos, de sus toxinas y metabolitos tóxicos o por la de microorganismos capaces de deteriorar la calidad del alimento hasta un estado inaceptable. 116

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Para la elección de un programa se deben tener en cuenta: (i) el tipo y la calidad del riesgo que conllevan las especies microbianas que se están analizando y (ii) las condiciones previsibles de manejo y consumo a las que el lote se someterá tras el muestreo.

El plan de muestreo es uno de los componentes del criterio microbiológico y comprende: el procedimiento de toma de muestra y el criterio de decisión a aplicar en el lote de alimentos. El plan de muestreo debe ser económicamente factible. Existen dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente, definidos por la ICMSF: el plan de dos clases (por ejemplo: n=5, c=0 / n=5, c=2, m=) y el de tres clases (por ejemplo: n=5, c=2, m=103, M=104) donde: n = número de muestras examinadas de un lote; m = límite microbiológico que , en un plan de dos clases, separa la calidad aceptable de la rechazable y en un plan de tres clases separa la calidad aceptable de la marginalmente aceptable. M = límite microbiológico que en un plan de tres clases separa la calidad marginalmente aceptable de la rechazable c = número máximo permitido de unidades de muestra defectuosas (plan de dos clases) o marginalmente aceptables (plan de 3 clases). El plan de dos clases es utilizado generalmente para patógenos, mientras que el plan de tres clases es utilizado frecuentemente para el análisis de indicadores de higiene donde es posible la cuantificación (en unidades de masa o de volumen) de los microorganismos. Es importante tener presente que en la práctica ningún plan de muestreo puede asegurar la ausencia de un microorganismo determinado. 117

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El número de microorganismos encontrado en la muestra analizada puede ser distinta en una parte no muestreada del lote o de alimento. La representatividad de los resultados de laboratorio en microbiología de alimentos depende del número de muestras recolectadas, de si la distribución de los patógenos en el lote es homogénea o no y de si el muestreo es realizado de manera aleatoria / dirigida. La confiabilidad de los resultados obtenidos depende de la técnica seleccionada para realizar el análisis (sensibilidad y especificidad). Los análisis microbiológicos de los productos alimenticios, como así también las demás prácticas de laboratorio, deben estar respaldadas por los datos de pruebas de seguridad de una calidad, de un rigor y de una reproductibilidad suficientes. Los Principios de Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) se han elaborado para promover la calidad y la validez de los datos de análisis que sirven para establecer la inocuidad de los alimentos. Se trata aquí de un concepto de gestión que abarca la totalidad del proceso de organización, así como las condiciones en las cuales los estudios de laboratorio se planifican, se aplican, se verifican, se registran y se informan. Las Normas ISO 9001 y 17025, regulan internacionalmente las acreditaciones de cada laboratorio y de sus funcionamientos en particular.

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3. CRITERIOS y RIESGOS MICROBIOLÓGICOS En la elaboración de un alimento se pueden identificar una serie de pasos en los que puede producirse la contaminación del alimento por microorganismos o en los que los microorganismos ya presentes en el alimento pueden multiplicarse con mayor facilidad. Estos pasos del proceso se denominan “puntos críticos” y sobre ellos hay que actual a la hora de mejorar las características microbiológicas del alimento en cuestión. Un producto tiene buena calidad microbiológica cuando sus cargas microbianas son reducidas y constantes (esto es, no presentan variaciones estacionales o de cualquier otro tipo de periodicidad que impiden que el producto sea homogéneo a lo largo del tiempo). Para lograr un aumento de la calidad microbiológica de un alimento lo que hay que hacer es determinar en la Industria cuáles son los críticos del proceso y evitarlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribución del alimento (BPE). La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiológica y no en comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relación costo – beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el desarrollo de las BPE hay que hacer un análisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnológicos. Este riesgo depende de la DMI (Dosis Mínima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asimismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el número de raciones o partes consumidas por la población en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la fórmula:

l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiológica del producto disminuyen y el análisis microbiológico es más consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE. El análisis microbiológico de alimentos no tiene carácter preventivo, sino que simplemente es una inspección que permite valorar la carga microbiana. La prevención se logra como se indicó anteriormente. Puesto que el control microbiológico es un proceso analítico es necesario seguir una serie de criterios sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales.

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En este sentido, es necesario considerar: 1) la distribución desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos; 2) que el número de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe limitarse al mínimo necesario para así poder aumentar el número de análisis y 3) que los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento. Un protocolo de análisis de alimentos correcto debe considerar: 1) la heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, 2) el proceso de transporte de las muestras del sitio de recolección al laboratorio evitando la multiplicación de los microorganismos presentes o la inactivación de algún microorganismo; 3) que es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora ésta inocua, utilizando medios selectivos; 4) los tratamientos tecnológicos pueden producir daños subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, volver a ser sometidos rigurosamente a medios selectivos y es necesaria la utilización de medios de recuperación y 5) que, en cualquier caso, es necesario realizar una evaluación sistem·tica de los medios de cultivo para prevenir la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo. El planteamiento del muestreo del alimento es diferente si se trata de un muestreo único (caso de una partida que llega por primera o única vez al centro de control microbiológico) del muestreo repetido. Cuando hay que hacer un muestreo de una partida única de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboración y conservación del alimento. Ningún muestreo único puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento y, como norma general, es conveniente analizar un número de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. En el caso de un muestreo repetido, un sistema basado en el análisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligará al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.

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En la rutina de trabajo del laboratorio no siempre es práctico; pensemos en lo engorroso que sería tomar el 10 % de un universo de 1000 latas de conserva, por ejemplo (100 latas). Cada MUESTRA estará constituida por la unidad muestral indicada en la tabla correspondientes a un mismo lote (constará de 250g o ml) y se las embalará en forma individual, según Código Alimentario Argentino. Numero de envases ó unidades del lote Numero de envases ó unidades que deben tomarse De 1 a 25, 1 envase ó unidad. De 26 a 100, 2 envases ó unidades. Mayor de 100, 5 envases ó unidades. Ahora bien, al llegar al lugar de trabajo, la muestra obtenida (muestra madre), debe fraccionarse en dos partes (muestras de trabajo): en un frasco estéril pesaremos higiénicamente 10 grs de dicha muestra a los que añadiremos 90 ml de solución buffer de fosfato de sodio 9 N, diluída 1 ml de la misma, en 100 ml de agua destilada estéril. De no contar con éste tampón, se aconseja el uso de agua destilada estéril o de solución fisiológica estéril y no otras soluciones o diluyentes. Obtenemos así una dilución de la muestra madre de 1:10 y de allí partimos para investigar todos los microorganismos indicadores y patógenos. Para la investigación del género Salmonella, debemos partir de una muestra de trabajo de 25 grs de la muestra madre, diluída en 225 de buffer fosfato o agua destilada estéril. NUNCA debemos desechar la muestra madre, la que se mantendrá convenientemente refrigerada hasta terminar con las marchas investigativas. Analizaremos ahora cómo y porqué se aplica el témino de “criterio microbiológico” y daremos ejemplos de la realización de un plan de muestreo. Un criterio microbiológico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos basándose en la ausencia o presencia o el número de microorganismos y/o la investigación de sus toxinas por unidad de masa, volumen o área. Un criterio microbiológico, según se detalla en "Principios para el Diseño y la Aplicación de Criterios Microbiológicos Para Alimentos" Codex Alimentarius Commission, consiste en:

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• •

Señalar el alimento al que se aplicará el criterio, elección de microorganismos y/o sus toxinas / metabolitos a identificar y la razón de la elección para el producto, • un plan de muestreo indicando el número de muestras a tomar, el tamaño de la misma y las características de la unidad analítica, • los métodos para su detección y/o cuantificación, • los límites microbiológicos considerados apropiados para el alimento en el punto indicado de la cadena alimentaria, • el número de unidades analíticas donde se debe verificar el cumplimiento de dichos límites.

Al establecer un criterio microbiológico se tienen que tener en cuenta los siguientes factores: • Evidencia epidemiológica de que el alimento en cuestión es un vehículo significativo de enfermedad. • Susceptibilidad del alimento a ser contaminado por patógenos. • Probabilidad de crecimiento microbiano en el alimento durante su manufactura, almacenamiento, distribución y preparación. • Tratamiento que recibe el alimento antes de ser consumido (proceso de cocción, etc.). • La susceptibilidad de los probables consumidores a agentes patógenos y toxinas. Para establecer un criterio microbiológico se debe definir previamente cual será el propósito del mismo, éste puede comprender la evaluación de: • La inocuidad del alimento: para este propósito se requiere la determinación de microorganismos patógenos y/o toxinas y en algunos casos la utilización de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un patógeno). • El cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). • La utilidad de un alimento como ingrediente para un propósito determinado. • La vida útil de un alimento a fin de determinar su fecha de vencimiento.

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La evaluación que se hace de la inocuidad de los alimentos y de su aptitud para el consumo humano a través del cumplimiento con el criterio microbiológico designado para el producto en cuestión, puede referir a ausencia de patógenos o a la demostración de la aplicación de Buenas Prácticas de Higiene. La comparación entre los resultados de laboratorio obtenidos y los criterios microbiológicos establecidos puede brindar información importante tanto para el productor / elaborador como para los servicios de inspección en lo referente a la aceptabilidad del producto y / ó proceso. No basta con los criterios microbiológicos para lograr este objetivo, sino que es de suma importancia verificar la aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura u otros sistemas (por ejemplo, HACCP) para asegurar que los microorganismos indeseables sean eliminados o minimizados a un nivel tal que no puedan ocasionar daño a los seres humanos. En Argentina, el Código Alimentario Argentino establece dos categorías principales en cuanto a los criterios a seguir para la elaboración de patrones microbiológicos (provenientes de la Resolución M. S. y A. S. N° 003 del 11.01.95- de "Principios Generales Para El Establecimiento De Criterios Y Patrones Microbiológicos Para Alimentos MERCOSUR" - GMC RES Nº 059/93): •

Criterio Obligatorio: se utiliza para referirse a los microorganismos considerados patógenos y/o sus marcadores, considerados de importancia en salud pública y de acuerdo con la clase de alimento. En este caso su hallazgo constituye razón suficiente para imputar la infracción y proceder en consecuencia, en forma preventiva o represiva, imponiendo las sanciones que correspondan. •

Criterio Complementario (Recomendatorio): a diferencia del anterior es el criterio relativo a la evaluación del proceso tecnológico utilizado para la obtención de un producto. Puede orientar al fabricante, aconsejarlo acerca de puntos sin control, y su seguimiento permitirá inferir o determinar la "falla", que se demuestra en los protocolos analíticos. No tiene por finalidad la inspección final, con lo que se indica que de su incumplimiento no derivarán sanciones. En ese momento se destacará la idoneidad del inspector actuante, quien sugerirá las acciones correctivas y se pondrá a prueba la responsabilidad del elaborador, a quien de de manifiestarse remiso a adecuarse, sí se le aplicará la sanción correspondiente. Cuando se evalúa el riesgo microbiológico asociado a un alimento específico todos los microorganismos transmisibles a través de los alimentos deben ser considerados incluyendo bacterias, virus, hongos, levaduras, algas y parásitos.

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Los riesgos asociados como las toxinas/ metabolitos producidos por estos organismos y algunas propiedades intrínsecas (por ejemplo, la resistencia a antibióticos) deben también ser considerados en la evaluación. La presencia de algunos microorganismos en los alimentos no es necesariamente un índice de riesgo para el consumidor. Vegetales y animales son la principal fuente de los alimentos que comemos y se encuentran naturalmente asociados a microorganismos, lo que implica que los alimentos que de ellos se obtengan también estarán asociados naturalmente a microorganismos. Los microorganismos elegidos para la elaboración del criterio deben ser relevantes para el alimento y circunstancias particulares (producto crudo o listo para consumir, perfil del consumidor del producto). Si el criterio establece la búsqueda de microorganismos indicadores, su propósito debe ser detallado claramente (por ejemplo, detectar higiene inadecuada, indicar posible presencia de patógenos). Es importante tener presente que, mientras para un alimento cocido o listo para consumir la tolerancia para un determinado microorganismo es cero, sí se puede permitir la presencia del mismo en el alimento crudo – dentro de ciertos niveles- si éste fuera sometido a un tratamiento previo a su consumo por el cual se eliminará dicho microorganismo (por ejemplo, cocción). En este mismo sentido, la interpretación del resultado es diferente según se trate de producto crudo o producto cocido o listo para consumir. Dentro de los microorganismos que componen un criterio microbiológico se pueden distinguir dos tipos: a. Organismos indicadores: para la evaluación de la inocuidad microbiológica de los alimentos, la utilización de organismos indicadores es muy frecuente. El análisis microbiológico de alimentos para la búsqueda de estos microorganismos suele utilizar técnicas sencillas y accesibles que permiten evaluar: Calidad de la materia prima, problemas de almacenamiento, abuso de temperatura, vida útil (Recuento de aerobios mesófilos). Potencial contaminación fecal o posible presencia de patógenos (Escherichia coli, Coliformes fecales) Contaminación por manipulación humana (Staphylococcus aureus coagulasa positiva) Contaminación post tratamiento térmico (coliformes, enterobacterias, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, estreptococos fecales) Productos metabólicos de patógenos que indican un peligro para la salud (termonucleasa) Se utilizan para relevar las condiciones a las que ha sido expuesto el producto que pudieran implicar un posible peligro, no necesariamente presente en la muestra analizada, pero que podría hallarse en muestras paralelas.

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b. Organismos patógenos: aquellos que pueden encontrarse en el alimento en cuestión que pueden convertir al alimento en un potencial vehículo de enfermedad a quien lo consuma. Los métodos de laboratorio utilizados para la detección o recuento de microorganismos forman parte del criterio microbiológico. La elección del método a utilizar debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados y de alta sensibilidad que hayan sido validados por organismos internacionales/ nacionales de referencia. (Código Alimentario Argentino, Art. 1413 y 1414). En los últimos años ha habido avances significativos en el desarrollo de nuevas tecnologías para la detección y la separación de microorganismos de los alimentos. El desarrollo de técnicas moleculares (PCR) e inmunológicas (ELISA) brinda ventajas sobre los métodos tradicionales, específicamente en lo que refiere a velocidad, pero su uso todavía no se ha generalizado. En general, las decisiones a tomar cuando el límite microbiológico establecido en el criterio designado para el alimento en cuestión es excedido, dependerán de los motivos que fundamentaron el establecimiento del criterio. Los límites microbiológicos del criterio pueden ser utilizados para definir la aceptabilidad de materias primas, la adecuación de medidas higiénicas, la posibilidad de contaminación ambiental, la presencia de ‘nichos’ microbianos en los equipos o la aceptabilidad del producto terminado. En la mayoría de los casos cuando se analiza el producto final se sabe que los límites se han excedido se tiene cuando ya es tarde. Si se aplican los criterios microbiológicos en determinados puntos del proceso de elaboración para el monitoreo de las condiciones de procesado, cuando se obtienen los resultados, éstos sirven como disparador de acciones correctivas apropiadas en beneficio del producto final. Si alguno de los límites que componen el criterio es excedido, las decisiones deben tomarse según el tipo de peligro que involucre el límite excedido y debe realizarse, en todos los casos, en el contexto de una evaluación integral del proceso. Si bien en la teoría cualquier alimento perecedero poco ácido puede constituirse en un peligro potencial a la salud si es manipulado incorrectamente, que se desarrolle una enfermedad transmitida por el alimento y la velocidad a la que esto ocurra dependerá de la cantidad y el tipo de contaminante presente.

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Cantidades pequeñas de Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus pueden hallarse en los alimentos sin constituir un peligro directo para la salud del consumidor. Sin embargo, si los alimentos con bajos recuentos de S. aureus, B. cereus o C. perfringens son manipulados de manera incorrecta (deficiente refrigeración, por ejemplo) se permitirá el crecimiento de cualquiera de los tres microorganismos pudiendo así constituirse en un peligro directo para la salud: altos recuentos de S. aureus o de B. cereus puede resultar en la producción de enterotoxinas en los alimentos antes de ser consumidos, mientras que altos recuentos de C. perfringens en el alimento previo a su consumo, puede llevar a la producción de la toxina in vivo en el consumidor. Como bajos recuentos de S. aureus, B. cereus y C. perfringens pueden ser hallados en alimentos producidos aplicando las Buenas Prácticas de Manufactura, los criterios para estos microorganismos generalmente reconocen cierta tolerancia ya que el límite establecido en el criterio es tal que incluso si es excesivamente superado, no existe riesgo directo para la salud del consumidor. Sin embargo, debemos tener presente que sí podría existir peligro dada la posibilidad de que por crecimiento previo o manipulación incorrecta del alimento que no se refleje en dichos recuentos (toxina preformada, por ejemplo) que sí constituye un peligro directo para la salud. Si los ensayos para las toxinas preformadas son negativos, debe asegurarse que las condiciones de manipulación sean las adecuadas. Si son positivos, el alimento debe ser destruido. Si el límite excedido corresponde a un criterio recomendatorio (no existe peligro directo para la salud), el alimento no necesariamente ha perdido su inocuidad. Este criterio permite un margen de discrecionalidad. Sirve para alertar sobre deficiencias en el proceso, distribución, almacenamiento o comercialización. En este punto, debe analizarse una serie de variables, no existiendo linealidad en este proceso, sino que la integración de las mismas y el criterio del investigador determinarán la decisión a tomar. Debe realizarse inmediatamente una investigación integral de las BPM, pudiendo incluirse un nuevo muestreo y poniendo especial énfasis en las prácticas de higiene del establecimiento.

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Los datos recolectados en este procedimiento serán la base de la toma de decisión: si existe evidencia de que un punto crítico del proceso no se encuentra bajo control, debe generarse acción inmediata. La evidencia puede referir a las materias primas, a las condiciones microbiológicas de los equipos de proceso, a deficiencias en la manipulación del alimento, a falta de control de temperaturas de almacenamiento / cocción, al hallazgo de microorganismos indeseables en el ambiente de proceso o la condición microbiológica del producto terminado. (Por ejemplo, si el punto que se detectó que no se encuentra bajo control son las materias primas no listas para consumo, el ingrediente no debería ser usado. Si ya ha sido utilizado, su influencia en la inocuidad del alimento debe ser evaluada y medidas apropiadas deben tomarse). La situación es diferente si tenemos evidencia de que existe un peligro directo para la salud, es decir que el criterio obligatorio ha sido excedido. Nunca debe ser excedido el criterio obligatorio, si esto sucediera requiere de la acción inmediata de la Autoridad de aplicación. Las medidas a tomar pueden ser, según la situación particular, la destrucción, reprocesamiento, redestinación. Los productos involucrados son retirados del mercado generalmente de manera voluntaria por el elaborador (las dimensiones del retiro y la forma de darle publicidad dependerán de la evaluación del riesgo, del tipo de producto, de peligro, entre otros. De todas maneras, si el retiro no es voluntario, la Autoridad Sanitaria debe iniciar el sumario administrativo correspondiente. La legislación provee alternativas a la destrucción si el producto, por el tratamiento que sufre durante su procesado, al momento de su consumo es inocuo. Cuando se consideran decisiones sobre el destino de alimentos que poseen un peligro directo para la salud, las alternativas diferentes a la destrucción total deben ser analizadas cuidadosamente. El reprocesamiento del producto está permitido y debería ser considerado si el peligro puede ser eliminado de esta manera (por ejemplo, reconstitución y repasteurización de leche en polvo usada como ingrediente alimentario).

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Frecuentemente, los productos que son considerados no aptos para consumo humano pueden ser destinados para consumo animal (por ejemplo, carne, pollo, huevos o lácteos que resultan no aptos para consumo humano son usados como ingredientes en alimento balanceado para mascotas). Este accionar es adecuado sólo si ello no resulta en la perpetuación del problema para la población humana. A continuación se tratará de ejemplificar la teoría antes expuesta: Interpretación de resultados microbiológicos en carne picada y alimentos a base de carne picada vacuna, porcina y de aves listos y no listos para su consumo según Criterio Microbiológico en CAA Alimentos involucrados (no listos para su consumo y listos para su consumo): o hamburguesas de carne vacuna, porcina y de aves, o salchichas frescas, o chorizos frescos y o alimentos elaborados a base de carne picada. Criterio Obligatorio Los alimentos que se incluyen en este criterio deben hallarse libres de Salmonella spp y de Escherichia coli O157:H7/NM. La determinación es ausencia/ presencia en la cantidad indicada de producto porque ambas bacterias, especialmente la E. coli O157, puede ocasionar enfermedad en pequeñas dosis. Criterio Complementario La evaluación de la inocuidad de los alimentos no debe realizarse basándose en el análisis de los microorganismos indicadores meramente, sino que es en el contexto de una evaluación integral de los procesos desde el campo hasta la mesa, que se obtienen las herramientas necesarias para asegurar que se ha alcanzado la inocuidad del producto deseada. Se recomienda que al hallar recuentos superiores al límite microbiológico considerado en el criterio complementario -Recuento de Aerobios Mesófilos, Recuento de Escherichia coli, Recuento de coliformes y Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva, se coloque al pie del protocolo analítico una leyenda con las recomendaciones correspondientes. Por ejemplo: "El valor del recuento de Escherichia coli indicaría prácticas de higiene deficientes en la elaboración y /o conservación inadecuada del producto, se sugiére la revisión de las Buenas Prácticas de Manufactura".

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Recuento de Aerobios Mesófilos: En este tipo de producto, se utiliza para monitorear la implementación de Buenas Prácticas de Manufactura. El recuento refleja: contenido microbiano de materiales crudos e ingredientes, la eficiencia del procedimiento de elaboración / proceso, la condición de higiene del equipo y utensilios y la relación tiempo temperatura de almacenamiento y distribución. Alimentos perecederos manipulados correctamente pueden desarrollar RAM elevados y perder calidad si son almacenados por un período de tiempo prolongado. En este caso, el RAM no se encontraría elevado por la condición de higiene del producto, sino por la vida útil del mismo. Por ello es que la utilidad del indicador depende de la historia del producto y el momento de la toma de muestra. En el uso o la interpretación del recuento de aerobios mesófilos hay ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta: Este recuento es sólo de células bacterianas vivas. Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboración, por ejemplo proceso térmico, pueden enmascarar productos con altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Además, el almacenamiento prolongado en congelación o con pH bajo resulta en la disminución del recuento y este recuento no diferencia tipos de bacterias. Recuento de Staphilococcus aureus coagulasa positiva: Los estafilococos se encuentran en las fosas nasales, la piel y las lesiones de humanos y otros mamíferos. Se los utiliza como componentes de criterios microbiológicos para alimentos cocidos, para productos que son sometidos a manipulación excesiva durante su preparación y para aquellos que son sometidos a manipulación después del proceso térmico. Generalmente, los estafilococos se eliminan durante la cocción. Altos recuentos en alimentos sometidos a procesos térmicos se deben a contaminación posterior a este tratamiento (manipulación, contacto con equipo o aire contaminados y/ o conservación inadecuada del mismo o falta de refrigeración).

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La presencia de S. aureus puede indicar un riesgo potencial para la salud. Un número elevado de estafilococos puede indicar la presencia de toxinas termoestables, no obstante, un recuento bajo no significa ausencia de las mismas, ya que una población numerosa pudo haberse reducido a un número más pequeño debido a una etapa del proceso, por ejemplo, calentamiento o fermentación. Recuento de Escherichia coli: El hábitat natural de este microorganismo es el intestino de los animales vertebrados. Los criterios microbiológicos que incluyen E. coli son de utilidad en casos en que se desea determinar contaminación fecal. La contaminación de un alimento con E. coli implica el riesgo de que puedan encontrarse en el mismo patógenos entéricos que constituyan un riesgo para la salud. Sin embargo, la ausencia de E. coli no asegura la ausencia de patógenos entéricos. En muchos productos crudos de origen animal, bajos recuentos de E. coli pueden ser esperados dada la asociación cercana de estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de la contaminación de las carcasas, reses, etc. con materia fecal animal durante la faena. E. coli se puede eliminar fácilmente mediante procesos térmicos, por consiguiente, la presencia de la misma. en un alimento sometido a temperaturas elevadas significa un proceso deficiente o, lo que es más común, una contaminación posterior al proceso atribuible al equipo, manipuladores o contaminación cruzada. Sin embargo, si el objetivo del análisis es controlar la contaminación post tratamiento térmico, los organismos seleccionados deberían ser las bacterias coliformes en lugar de E. coli. Recuento de Coliformes: La presencia de bacterias coliformes en los alimentos no significa necesariamente que hubo una contaminación fecal o que hay patógenos entéricos presentes. Las bacterias coliformes son particularmente útiles como componentes de criterios microbiológicos para indicar contaminación postproceso térmico. Algunos coliformes (E. coli) son comunes en las heces del hombre y otros animales, pero otros (Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia) comúnmente se encuentran en el suelo, agua y semillas. Generalmente, en la leche cruda, vegetales, carne, aves y otros alimentos crudos se encuentran recuentos bajos de bacterias coliformes naturalmente por lo que presentan poco o ningún valor para el monitoreo de los mismos.

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Estos organismos se eliminan fácilmente por tratamiento térmico, por lo cual su presencia en alimentos sometidos al calor sugiere una contaminación posterior al tratamiento térmico o que éste ha sido deficiente. Esto debería generar la determinación del punto del proceso donde se produjo la contaminación. Si se obtiene un recuento elevado en alimentos que han sufrido un proceso térmico, debe considerarse que existieron fallas (ausencia o deficiencia) en la refrigeración post-cocción. Los coliformes se estresan subletalmente por congelación, por lo que el recuento de coliformes en alimentos freezados debe ser interpretado con cuidado. El uso del recuento de coliformes como indicador requiere un conocimiento amplio del proceso que al alimento ha sufrido (producción, procesamiento, distribución, etc.)y del efecto que él ha tenido en las bacterias coliformes. Texto de los artículos 156 tris, 255 y 302 del Código Alimentario Argentino (según la modificación / inclusión por la Resolución Conjunta SPyRS / SAGPyA Nº 79/04 y 500/04): "Art 156 tris: Los productos preparados a base de carne picada, tales como chacinados frescos embutidos o no embutidos, y otras preparaciones a base de carne picada (albóndigas, empanadas, pasteles, arrollados o similares) precocidas o no, una vez cocidos y listos para consumir, ya sea que se dispensen inmediatamente después de finalizada la cocción, en el establecimiento elaborador o sean enviados a domicilio, deberán responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:” Criterio complementario Determinación

Resultados

Método de Análisis

Recuento de Aerobios Mesófilos/g

n=5 c=2

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicos- Parte II- Enumeración de microorganismos aerobios mesófilosMétodos de Recuento en Placa

Recuento de Coliformes /g

m=104 M= 105

n=5 c=2 m=100 M= 500

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicos- Parte IIBacterias coliformes

E. coli /g

Ausencia/ g

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis

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microbiológicos- Parte IIBacterias coliformes Recuento de S. aureus coagulasa positiva/g

n=5 c=1 m< 100 M=500

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicos- Parte II-S. aureus- Recuento de estafilococos coagulasa positiva

Criterio obligatorio Determinación

Resultados

Método de Análisis

E. coli O157:H7/NM

n= 5 c=0

USDA-FSIS

Ausencia /65 g

Guía de Laboratorio de Microbiología- capítulo 5 –Detección, aislamiento e identificación de E. coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente

Salmonella spp.

n= 5 c=0 Ausencia/ 25 g

Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente

Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario. "Art. 255: Con la designación de carne triturada o picada, se entiende la carne apta para consumo dividida finamente por procedimientos mecánicos y sin aditivo alguno. Debe prepararse en presencia del interesado salvo en aquellos casos en los que por la naturaleza del establecimiento o volumen de las operaciones sean autorizados expresamente por la autoridad competente”. La carne picada fresca deberá responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:

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Criterio complementario Determinación

Resultados

Método de Análisis

Recuento de Aerobios Mesófilos/g

n=5 c=3

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte II- Enumeración de microorganismos aerobios mesófilosMétodos de Recuento en Placa

m=106 M= 107

Recuento de E. coli/ g

n=5 c=2 m=100 M= 500

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte IIBacterias coliformes

Recuento de S. aureus coagulasa positiva/g

n=5 c=2 m=100 M= 1000

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte II-S. aureusRecuento de estafilococos coagulasa positiva

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Criterio obligatorio Determinación

Resultados

Método de Análisis

E. coli O157:H7/NM

n= 5 c=0

USDA-FSIS

Ausencia /65 g

Guía de Laboratorio de Microbiologíacapítulo 5 –Detección, aislamiento e identificación de E. coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente

Salmonella spp

n= 5 c=0 Ausencia /10 g

Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente

Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.

"Art. 302: Se entiende por chacinados , los productos preparados sobre la base de carne y/ o sangre, vísceras u otros subproductos animales que hayan sido autorizados para el consumo humano, adicionados o no con substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados frescos deberán responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:” Criterio complementario 134

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Determinación

Resultados

Método de Análisis

Recuento de Aerobios Mesófilos/g

n=5 c=3

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte II- Enumeración de microorganismos aerobios mesófilosMétodos de Recuento en Placa

m=106 M= 107

Recuento de E. coli/ g

n=5 c=2 m=100 M= 500

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte IIBacterias coliformes

Recuento de S. aureus coagulasa positiva/g

n=5 c=2 m=100 M= 1000

ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol ITécnicas de análisis microbiológicosParte II-S. aureusRecuento de estafilococos coagulasa positiva

Criterio obligatorio Determinación

Resultados

Método de Análisis

E. coli O157:H7/NM

n= 5 c=0

USDA-FSIS

Ausencia /65 g

Guía de Laboratorio de Microbiologíacapítulo 5 –Detección, aislamiento e identificación de E. 135

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coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente Salmonella spp

n= 5 c=0 Ausencia /10 g

Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente

Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.

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4. EPIDEMIOLOGIA de los PRICIPALES PATOGENOS BACTERIANOS TRANSMITIDOS por los ALIMENTOS

Pueden ser endógenos (ya estan presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmitibles al hombre y enfermedades vegetales no transmitibles al hombre) o exógenos (se incorporan al alimento durante su manipulación y procesado). Pueden ser agentes patógenos o alterantes (saprófitos). Los agentes endógenos o son inócuos (patógenos de plantas) o son eliminados en mataderos (amimales enfermos) o durante el procesado (pasteurización). Hay que diferenciar entre infecciones e intoxicaciones y entre infecciones con DMI (dosis mínima infectiva) o DI50 (dosis infectiva que produce la enfermedad en el 50 % de la población) bajas o altas. En muchos casos no está totalmente claro si el proceso es intoxicativo o infectivo. La DMI varía entre las personas dependiendo de su estado general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la higiene). En general las enfermedades tienen un tiempo de incubación corto (2-10 hs.) y suelen cursar con síndromes gastrointestinales. Solo se declara un 10 % de las toxiinfecciones por lo que la incidencia real de estas enfermedades no está clara.

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En general hay un doble fallo: Contaminación del alimento seguido de abuso de temperatura que permite que los microorganismos proliferen. Los alimentos afectados con más frecuencia son los animales (90 %) y las fuentes de contaminación suelen estar en los establecimientos donde fueron servidos más que en las plantas de procesado. Normalmente son enfermedades breves, autolimitantes y de buen pronóstico. cursan tras 2 – 10 hs de incubación con síndrome gastroinestinal (dolor intestinal, diarrea, vómitos). En general no tienen complicaciones salvo en poblaciones de riesgo.

Salmonelosis Producidas por algunos serotipos. Su incidencia va en aumento asociada al incremento de animales portadores. Los diferentes serotipos requieren DMI diferentes, aunque hay un gran número de ellos que son patógenos. El origen de las salmonelas puede ser endógeno (animales portadores asintomáticos) o exógeno; las prácticas ganaderas favorecen la infección a través de los piensos que pueden generar portadores asintomáticos y del manejo de los animales en el matadero (aves, cerdos, terneros). En cualquier caso, los números inicales suele ser pequeños y la contaminación aparece si el alimento no es tratado correctamente desde el punto de vista térmico. Las medidas profilácticas se dirigen al control de animales portadores, procesamiento de alimentos (pasteurización) y reducción de las posibilidades de contaminación exógena. Puede ser invasiva o toxigénica.

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Shigelosis o Disentería Bacilar Microorganismos productores de cuadros de disentería. Las shigelas son de origen humano y los animales no son reservarios de ellas, por lo que las contaminaciones se producen por vía de la manipulación humana del alimento. La DMI varía mucho dependiendo de si se ingiere la bacteria con alimentos sólidos (alta) o líquidos como leche o agua (baja). Las medidas de prevención se basan en reducir e higienizar la manipulación humana y evitar el desarrollo del microorganismo con una correcta refrigeración. Es invasiva.

Gastroenteritis por Escherichia coli enteropatógeno La mayoría de los serotipos de E. coli son inócuos; pero hay algunos enteropatógenos (enterotoxigénicos no invasivos productores de una enterotoxina termolábil de alto peso molecular, TS; y enteroinvasivos que penetran en la mucosa intestinal) productores de enfermedades en niños y adultos y en animales. Para los adultos las vías de contagio son alimentos y agua. No está clara la patogenicidad de las cepas enteropatógenas de animales para el hombre y se supone que la principal vía de contaminación es la exógena. Las medidas profilácticas se dirigen a la eliminación de animales enfermos, control de la contaminación por manipulación humana y refrigeración adecuada para evitar el crecimiento de las bacterias presentes.

Enteritis por Yersinia enterocolitica Yersimia enterocolitca en una bacteria psicrotrofa que probablemente causa zoonosis y puede transmitirse a través de alimentos animales infectados. Produce una enfermedad con posibles complicaciones reumatoides. Las medidas profilácticas son similares a las de Salmonella, aunque en este caso no sirve la conservación a baja temperaturas por el carácter psicrotrofo.

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Diarreas por Vibrio parahaemolyticus V. parahaemolyticus es un bacilo Gram-negativo presente en las aguas marinas, halotolerante. Produce al ingerirlo una gastroenteritis febril en la que las heces aparecen teñidas de sangre. Se ingiere con productos marinos crudos o no bien tratados. Otras especies próximas aparecen en salmueras y salazones. La profilaxis se centra en su eliminación por cocción, prevención de la recontaminación y prevención de su multiplicación mediante refrigeración o congelación.

Enteritis por Campylobacter Bacteria presente en el intestino de ganado vacuno, perros, aves y ovejas. Causa una infección entérica con vómitos, dolor agudo y diarrea explosiva. Es un organismo microaerófilo. Se puede transmitir a través de los mismos alimentos que Salmonella o Yersinia (carne cruda de cerdo o ave, leche cruda). Produce una infección invasiva del epitelio intestinal. La profilaxis se centra en eliminar la bacteria del alimento, prevenir la recontaminación y conservar adecuadamente.

Gastroenteritis producidas por otras bacterias entéricas La patogenicidad de muchas enterobacterias se debe a la presencia de plásmidos transmisibles a otras bacterias del grupo que no son habitualemtne patógenas. Las formas de propagación, ditribución y proliaxis frente a éstas son las generales para las enterobacterias.

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Gastroenteritis bacterianas transmitidas por alimentos de etiología dudosa Los alimentos, con excepción de los fermentados y madurados, que tienen altos recuentos de microorganismos han de considerarse en pricipio, peligrosos, aunque no se detecte en ellos ningún microrganismo patógeno.

Enteritis producidas por Bacillaceae Producidas por Clostridum perfringens o por Bacillus cereus. Se requieren altos números de bacterias (105 bact gr-1) y pueden producirse en alimentos tratados térmicamente e, incluso, protegidos frente a la recontaminación. En C. perfringens los alimentos vehículo son carnes frías o recalentadas y platos a base de carne; en B. cereus arroz y pastas. Patológicamente ambas enteritis son diferentes: la de perfringens se produce porque se ingieren muchas bacterias que al esporular reformadas (se trata de una intoxicación), mientras que en B. cereus se trata de una intoxicación por una toxina preformada. Las esporas de C. perfringens son ubícuas y pueden producir problemas en todo tipo de alimentos, sobre todo carnes, piezas grandes y alimentos precocinados. La prevención pasa por enfriar rápidamente el alimento cocinado que no vaya a ser consumido para evitar el desarrollo de las formas vegetativas de la bacteria. Dentro de las Intoxicaciones Alimentarias Agudas, encontramos a aquellas enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano:

Botulismo: intoxicación por Clostridium botulinum C. botulinum produce una intoxicación mediante bajas dosis de una neurotoxina muy potente que produce al esporular. Es una bacteria anaerobia que puede crecer en conservas de alimentos de pH relativamente alto (>4.5) que no se han tratado térmicamente de forma adecuada. Se ha detectado un tipo de bofulismo infantil producido por la ingestión de esporas que germinan y vuelven a esporular en el intestino produciendo de nuevo la toxina. Profilaxis: tratamiento térmico adecuado de las conservas usando tratamiento 12 D u otros agentes coadyuvantes (sal, nitratos) para alimentos con pH > 4.5. La toxina botulínica es termolábil y se destruye si se calienta la conserva. 141

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Intoxicación estafilocócica Producida por la ingestión de alimentos en los que ha crecido una cepa patógena de Staphylococus aureus productora de enterotoxina termorresistente. La principal reserva de S. aureus es la piel, y cavidad buconasal de operarios que pueden contaminar los alimentos cuyo contenido en agua es bajo (productos de pastelería, jamon curado) porque a mayor aw otra flora sobrecrece a S. aureus. La enfermedad es muy rápida con vómitos y dolor aguado, suele durar menos de 30 horas. Las medidas profitácticas van encaminadas a dismisnuir la contaminación y el desarrollo de las bacterias mediante tratamientos térmicos adecuados; la destrucción de las toxinas es muy difícil dada su termorresistencia.

Intoxicación por Bacillus cereus

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B. cereus como C. perfingens, una bacteria ubícua y su ingestión en bajas cantidades es inócua. Produce dos tipos de síndromes: intoxicación diarréica (asociada a una toxina termosensible similar a la de C. perfingens que se produce durante el crecimiento exponencial y que está asociada a alimentos como sopas de ave, carne, salsas) y una forma emética (asociada a una toxina termorresisitente similar a la de S. aureus y asociada a arroz, y otros alimentos ricos en almidón cocinados). Profilaxis: dada la termorresistencia de las esporas hay que procurar enfriar muy rápidamente los alimentos cocinados ricos en almidón, y conservarlos a baja temperatura, para evitar el crecimiento de las formas vegetativas.

Síndromes causados por bacterias productoras de aminas vasopresoras

Muchas bacterias son capaces de decarboxilar activamente aminoácidos produciendo aminas vasopresoras causantes de manchas rojas en la piel, mareos y, a veces, dificultades respiratorias. La relacción dosis - efecto varia mucho de unos individuos a otros. Asimismo, podemos enumerar a las Micotoxicosis, que son provocadas por mohos productores de toxinas activas por vía oral. Muchos mohos son productores de substancias protéicas de bajo peso molecular y acción tóxica conocidas como micotoxinas. Elevadas ingestiones de micotoxinas pueden producir cuadros agudos facilmente detectables; pero estos casos son raros, es más frecuente la intoxicación por bajas dosis de micotoxinas que pueden producir intoxicaciones crónicas con efectos oncogénicos o inhabilitantes en diferentes órganos (hígado, riñon, cerebro). Las micotoxinas pueden ingerirse por contaminación con mohos de alimentos de baja actividad de agua (queso, mermelada, alimentos curados, cereales) o por piensos, en el caso de animales con intoxicaciones crónicas pueden transmitir las toxinas a través de sus productos (huevos, leche).

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Debido al bajo peso molecular las micotoxinas suelen ser muy termorresistentes y pueden difundir grandes distancias en los alimentos por lo que tratamientos térmicos suelen ser inefectivos y la simple eliminación del moho no evita la micotoxina. Existe una gran preocupación por la actividad toxigénica de los mohos considerados beneficiosos presentes en algunos alimentos (queso, embutidos). Las profilaxis se centran en evitar la contaminación por hongos de los alimentos y piensos (quesos, pan, harinas, cereales, frutas y mermeladas) no solo por razones estéticas sino también sanitarias.

Hay también enfermedades transmitidas por alimentos que no presentan el cuadro de gastroenteritis típico. En este caso es necesaria la ingestión de un número muy reducido de micoorganismos (bacteria, virus o parásitos). En el caso de bacterias, cuando estas se ingieren en agua o entre comidas pueden provocar los síndromes con múmeros mucho menor debido a que pasan rápidamente por el estómago y el ácido gástrico no puede producir en ellas efecto: Enfermedadades del aparato respiratorio transmitidas por los alimentos: Tanto la difteria, producida por Corynebacterium diphteriae, como la faringitis, producida por Staphylococus pyogenes, pueden ser transmitidas por los alimentos. Ambos microorganismos son termosensibles y un tratamiento térmico adecuado y medidas higiénicas para evitar la posterior contaminación del alimento son suficientes para evitarlo. Otras enfermedades transmitidas por los alimentos: Históricamente la leche de vacas mastíticas ha sido una vía de contagio de tuberculosis producida por Mycobacterium bovis, sin embargo, las prácticas de pasteurización habituales han eliminado esta vía de contagio.

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Más relevantes son las bacterias del género Brucella. B. melitensis provoca la fiebre de malta y se transmite por la leche de cabra u oveja, B. abortus se transmite por la leche de vaca. Ambos tipos de bacterias pueden destruirse con los tratamientos térmicos habituales de la leche o de la nata o crema. En este sentido es especialmente relevante la utilización de leche pasteurizada en la produccción de quesos de cabra u oveja para evitar la transmisión de la brucelosis.

3. Enfermedades entéricas bacterianas transmitidas principalmente por el agua: Como se ha comentado, algunos microorganismos tienen DMI muy bajas cuando se ingieren con agua y el estómago está vacio. Salmonella y Shigella pueden producir toxiinfecciones de esta forma. Asimismo, Vibrio cholerae se transmite a través del agua. Por consiguiente, es necesario hacer tratamientos de higienización del agua para llegar a valores de número de microorganismos muy bajos.

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Capítulo III: Conceptos generales de Investigación clásica 146

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Un simple análisis macroscópico y organoléptico no nos pueden dar una idea acabada de la potencial contaminacion del alimento o del agua; para ello está la Microbiología de los mismos, quien se encargará de determinar cuál es el patógeno que puede desencadenar una Enfermedad Transmitida por Alimentos (ETA)

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1. MEDIOS de CULTIVO: Generalidades

Se entiende por medios de cultivos a los alimentos o nutrientes en el que crecen los microorganismos, en este caso bacterias. Para conseguir un medio de cultivo óptimo es necesario tener condiciones adecuadas de temperatura, grados de humedad, presión de oxigeno, grados de acidez o alcalinidad. Debe tener como mínimo carbono, hidrógeno, oxigeno y sales inorgánicas. Los medios de cultivos se pueden clasificar de acuerdo a su consistencia en líquidos, sólidos y semisólidos, y según su composición nutricional en enriquecidos, de enriquecimiento, sintéticos, generales, entre otros. Los medios de cultivos, además deben de tener ciertos requisitos o condiciones para poder permitirle a los microorganismos su desarrollo, de ahí que la constitución de estos debe tener los suficientes nutrientes y sustratos que le brinden condiciones para realizar sus funciones metabólicas Las técnicas de cultivos bacterianos, nos permiten aislar un tipo de bacteria específico de una fuente natural, incrementar su numero de poblaciones o mantener en condiciones estables el cultivo, así como cuantificar el numero de bacterias que se encuentran en el material de estudio. 148

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Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: consistencia adecuada del medio, luz ambiental, esterilidad del medio, temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La clasificación de los medios es: Según su consistencia Sólidos: que llevan una sustancia que se llama agar, que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5%, da consistencia sólida y va a ser el soporte de los compuestos necesarios en la nutrición de las bacterias. Semisólidos: tienen menos agar, una proporción de 0.1% a 0.5%. Líquidos: se llaman caldos. Según su composición Medios sintéticos o químicamente definidos: que son medios de cultivo de composición conocida o definida, llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus), se utilizan muy poco y suelen hacerse para cultivar una especie de bacterias determinada. Medios generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias, tienen una composición en la que crecen la mayor parte de los microorganismos. (Agar Sangre, Schaeadler, PCA, APHA, etc)

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Medios enriquecidos: Son medios generales a los que se les añade sustancias que aumentan su poder nutritivo, además enlentecen / suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Medios selectivos (de moderada o de alta selectividad): Se le adicionan al agar nutritivo, sustancias que inhiben el crecimiento de un grupo de microorganismos, sin aceptar el desarrollo de otras. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Variando las sustancias añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina). Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento. Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia, pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Medios de enriquecimiento: Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. Medios para identificación Medios diferenciales: Formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración, sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados y por medio de los reactivos que llevan nos permiten diferenciar entre todos las bacterias crecidas unas de otras. (Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa + de lactosa -) Medios de caracterización: Se utilizan para identificar bacterias, dan lugar a una respuesta concreta al metabolismo bacteriano. Medios aislamientos especializados: Formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

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Medios de transporte y mantenimiento: Se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras microbiológicas. Son medios no nutrientes (los microorganismos se mantienen pero no se multiplican), semisólidos, que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos laterales de la oxidación (Stuart).

Todos los medios llevan agua, peptonas (compuestos intermedios de hidrólisis de las proteínas), extracto de carne (se prepara a partir de carne de vaca troceada y macerada, suministra componentes nitrogenados, también no nitrogenados y alguna vitamina), extracto de levadura (se somete la levadura a una extracción con agua y se evapora, luego a sequedad y tiene la misma función que el extracto de carne pero es mucho más barata), gelatina (agente solidificante, se prepara hidrolizando colágeno en agua hirviendo, se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación), agar (componente para dar consistencia a los medios, se extrae de esta alga, la Gelidium corneum. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él), cloruro sódico (para mantener la presión osmótica), sustancias inorgánicas (Na, K).

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En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes, productos fermentables (monosacáridos, disacáridos y tienen dos funciones: producir energía y para la identificación y clasificación de los microorganismos). También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. El Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas). En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la preparación de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo liofilizado, disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante y esterilizar la disolución, previa comprobación y corrección del pH si es necesario. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios líquidos se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o erlenmeyers) y se tapan; en ningún caso la altura del líquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si se trata de un medio que contenga agar (sólido o semisólido) suele ser preciso calentarlo (al baño María o al microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se reparte, en caliente, en erlenmeyers o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esteriliza. Finalizada la esterilización en el autoclave: - los medios líquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente. - los medios sólidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adopten la forma de agar inclinado (slant o pico de flauta), si tal es su finalidad. - la preparación de los medios sólidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas con el medio estéril fundido y atemperado a unos 50ºC en ambiente estéril. El ambiente estéril se consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campana de siembra adecuada.

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DILUCIONES DECIMALES Primero se prepara el macerado inicial. El procedimiento más frecuentemente empleado para este fin consiste en la utilización de un homogenizador de paletas tipo "Stomacher" en el cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una suspensión más o menos homogénea de alimento y microorganismos que permite la preparación posterior de las oportunas diluciones que posteriormente serán utilizadas en los diversos métodos de recuento. Para ello se pesan asépticamente 10 g del alimento. La pesada suele realizarse en bolsa de plástico para Stomacher.

Se añaden a la bolsa 90 ml de diluyente estéril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2 minutos. Así conseguimos el macerado inicial que es la dilución 1:10, y de esta Solución Madre partiremos para realizar todos los aislamientos de potenciales patógenos excepto para Samonella, en donde pesaremos 25 g de alimento y añadiremos 225 ml de diluyente estéril y procederemos como en el caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos. Para preparar las “Diluciones Decimales”, añadir 1 ml de macerado inicial (también llamado dilución madre o dilución 1:10) a un tubo con 9 ml de diluyente, homogenizar usando un agitador excéntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando manualmente. De esta forma hemos preparado la dilución 1:100 ó 10-2. Repetir la operación anterior transfiriendo 9 ml de la dilución 1:100 a un tubo con 9 ml de diluyente para preparar la dilución 1:1000 ó 10-3. Repetir la operación anterior tantas veces como sea necesario hasta conseguir el número de diluciones deseado. El número de diluciones que se necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que se sospecha un número alto de microorganismos/g hay que hacer más diluciones que de uno poco contaminado.

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Para los métodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones decimales, éstas se utilizan para los métodos de contaje.

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2. TÉCNICAS GENERALES de SIEMBRA

En microbiología se entiende por "siembra" la operación que consiste en depositar un germen asépticamente en un medio de cultivo. Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales: 1. Practicarla en medios de cultivo favorables y previamente esterilizados. 2. Emplear instrumentos asépticos. 3. No contaminar ni destruir el inóculo. 4. Depositarla asépticamente en los medios elegidos. 5. Esterilizar los instrumentos empleados antes y después de cada operación. Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos, y estar contenidos en tubos, placas o frascos. La técnica general de las siembras variará según el estado físico del material a sembrar y del medio de cultivo. Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o, en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente de aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras partículas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminación del medio de cultivo. El asa o pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inóculo, o el medio de cultivo.

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a) Siembra en profundidad o por vertido en placa Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en el interior de la masa del agar. Se deposita 1 ml de la muestra (si es líquida) o de cada dilución en placas estériles, vacías. Se agrega a cada placa 15 a 20 ml del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 47ºC. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inóculo con el agar. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora) y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos varía según el tipo de microorganismos). Se debe tener en cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinéresis (condensación) antes de efectuar dicha operación. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipación y dejarlas invertidas a temperatura ambiente. Pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido dentro del agar (en la masa del agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilución que presenten un número de entre 30 y 300 colonias / placa (esto proporciona una precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer). Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lápiz de tinta indeleble. El número de unidades formadoras de colonia o UFC/g (o ml en muestras líquidas) de la muestra original será: Número de UFC/g = Número de colonias x factor de dilución.

b) Siembra en superficie por estrías y por trazo Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte, luego mover el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. En la siembre por trazo, introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presión para que no se rompa el medio. 156

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Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en la superficie del agar. Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introducción del asa con la carga de microorganismos, iniciándose la estría en el borde del medio más alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira ésta 180 º y se continúa realizando otra estría de la misma manera. Para estriar en cuadrantes, se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.

c) Siembra en superficie por agotamiento con Espátula de Drigalsky Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo solidificado (unos 15 ml/placa). Se deposita en la superficie del agar 0,1 ml de la muestra o de cada dilución. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un asa o espátula de Drigalsky estéril. Esperar 2 ó 3 minutos a que se seque el inóculo. Se llevan las placas a incubar y una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmación. Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario. La espátula se introduce inmediatamente después de su uso en un recipiente para su esterilización en autoclave o en formaldehído al 5 %. Si hacemos diseminación con hisopo, se sumerge el mismo en el caldo de cultivo, se escurre el exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se estrían ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90º y se estrían nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45º y se estrían ambas mitades.

d) Siembra en superficie y profundidad por punción El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente. Para para la siembra en tubos con agar inclinado, pero con mucho fondo (pico de flauta), se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta. 157

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3. MARCHAS CLÁSICAS en el LABORATORIO de ALIMENTOS a. AGUA El agua es un componente de nuestra naturaleza que ha estado presente en la Tierra desde hace más de 3.000 millones de años, ocupando tres cuartas partes de la superficie del planeta. Su naturaleza se compone de tres átomos, dos de hidrógeno y uno de oxígeno, y que unidos entre si forman una molécula de agua (H2O), la unidad mínima en que ésta se puede encontrar. La forma en que estas moléculas se unen entre sí determinará la forma en que encontramos el agua en nuestro entorno; como líquidos, en lluvias, ríos, océanos, como sólidos en témpanos y nieves o como gas en las nubes. El agua es una sustancia muy sencilla, pero posee un conjunto de propiedades que la hacen única lo que, unido a su abundancia, le otorgan una gran importancia en el ciclo biológico del planeta. Entre sus notables propiedades se encuentran: 1) El agua puede encontrarse en la naturaleza en sus tres estados, sólido, líquido y vapor, pudiendo existir en un momento dado en equilibrio entre sus tres formas. 2) El hielo tiene una densidad inferior a la del agua líquida, (0,92 veces) y flota, lo que tiene gran importancia para la vida en mares, lagos, etc. 3) El calor específico del agua es muy alto (1 cal/gr.ºC). 4) El calor latente de vaporización del agua es muy grande: a 20º C hay que comunicar 585 cal. para evaporar un gramo de agua. 5) La conductividad térmica del agua es la mayor de todos los líquidos, con la única excepción del mercurio.

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6) La estructura molecular del agua es un dipolo: su constante dieléctrica es muy alta, mayor que para cualquier otro líquido, lo que le confiere la propiedad de disolver cualquier sustancia aunque sea en cantidades extremadamente pequeñas. Ello hace que el agua no sea nunca químicamente pura, llevando siempre diversas sustancias, como gases, sales o grasas, disueltas. 7) El agua es débilmente ionizable, conteniendo siempre algunos iones hidrógeno, dando un pH próximo a 6. La concentración de iones en el agua es muy importante para los organismos. Veremos a continuación un esquema que ejemplifica de manera sencilla el complejo ciclo del agua el la naturaleza:

La calidad del agua, es un estado de ésta, caracterizado por su composición físico – química y biológica. Este estado deberá permitir su empleo sin causar daño, para lo cual deberá reunir dos características: 1. Estar exenta de sustancias y microorganismos que sean peligrosos para los consumidores. 2. Estar exenta de sustancias que le comuniquen sensaciones sensoriales desagradables para el consumo (color, turbiedad, olor, sabor). El criterio de potabilidad del agua depende fundamentalmente del uso al que se la destina (humano, industrial, agrícola, etc). Agua potable es el agua, ya sea de superficie o subterránea, tratada y el agua no tratada por no estar contaminada.

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La definición de agua potable se ha ido adaptando al avance del conocimiento científico y a las nuevas técnicas, en especial a las relacionadas con el análisis de contaminantes. La mala calidad del agua afecta a infinidad de actividades vitales, es un bien tan preciado que en la exposición de la Carta Europea del Agua comienza con “Sin agua no hay comida, no hay bebida, ni luz, ni calor, ni lluvia. ¡Sin agua no hay vida posible!” Hasta hace unas decenas de años la calidad de un agua destinada a un abastecimiento se centraba principalmente en que el agua estuviera exenta de sabores, olores, no fuera muy dura y no contuviera bacterias patógenas, confiándose en gran medida en que el poder autodepurador de los embalses o ríos, y la protección de las zonas de captación eran suficientes para lograr una aceptable calidad que se completaría con un tratamiento simple de decantación, filtración y desinfección, así como hacer determinadas comprobaciones generalmente bacteriológicas del agua en la red, ausencias de sabores y olores y presencia de ligeras concentraciones del desinfectante empleado. Hoy día y más aún de cara al futuro, y como consecuencia de la polución creciente y los mayores avances de la técnica y la ciencia hay que considerar además otros caracteres que inciden de forma perjudicial en la salud del consumidor (pesticidas, detergentes, subproductos de la desinfección y otras sustancias orgánicas e inorgánicas, así como protozoos, virus, bacterias). El análisis del agua en su origen, nos proporciona los primeros datos respecto a su calidad, orientándonos en la selección de su captación y facilitando el tratamiento que hemos de aplicarle posteriormente. Un agua potable destinada al consumo humano, debe cumplir ante todo con una calidad sanitaria apta, tanto inmediatamente después de su proceso de tratamiento, como presentar una estabilidad biológica en la red de distribución. Definición de “AGUA POTABLE”, según el Código Alimentario Argentino Actualizado - Artículo 982 - (Res MSyAS N° 494 del 7.07.94)

Con las denominaciones de Agua potable de suministro público y Agua potable de uso domiciliario, se entiende la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud. Deberá presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente.

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A nivel mundial, el 80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales y una tercera parte de las defunciones causadas por éstas se deben al uso y consumo de agua insalubre. La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en países en desarrollo. El agua y los alimentos contaminados se consideran como los principales vehículos involucrados en la transmisión de bacterias, virus o parásitos. Los organismos transmitidos por el agua habitualmente crecen en el tracto intestinal y abandonan el cuerpo por las heces. Dado que se puede producir la contaminación fecal del agua (si ésta no se trata adecuadamente) al consumirla, el organismo patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador. Como el agua se ingiere en grandes cantidades, puede ser infecciosa aun cuando contenga un pequeño número de organismos patógenos. Los microorganismos patógenos que prosperan en los ambientes acuáticos pueden provocar cólera, fiebre tifoidea, disenterías, poliomelitis, hepatitis y salmonelosis, entre otras enfermedades. El agua y alimentos contaminados tienen una gran importancia en la transmisión de patógenos causantes del síndrome diarreico, por lo que se hace necesario tener estrategias que permitan un manejo adecuado de ella. La OMS calcula que la morbilidad (número de casos) y mortalidad (número de muertes) derivadas de las enfermedades más graves asociadas con el agua se reduciría entre un 20 y un 80 por ciento, si se garantizara su potabilidad y adecuada canalización. El agua hace posible un medio ambiente saludable, pero, paradójicamente, también puede ser el principal vehículo de transmisión de enfermedades. Las enfermedades transmitidas por el agua son enfermedades producidas por el "agua sucia" (agua que se ha contaminado con desechos humanos, animales o químicos). Mundialmente, la falta de servicios de evacuación sanitaria de desechos y de agua limpia para beber, cocinar y lavar es la causa de más de 12 millones de defunciones por año. Se estima que 3.000 millones de personas carecen, por ejemplo, de servicios higiénicos. Más de 1.200 millones de personas están en riesgo porque carecen de acceso a agua dulce salubre.

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En lugares que carecen de instalaciones de saneamiento apropiadas, las enfermedades transmitidas por el agua pueden propagarse con gran rapidez. Esto sucede cuando excrementos portadores de organismos infecciosos son arrastrados por el agua o se lixivian hasta los manantiales de agua dulce, contaminando el agua potable y los alimentos. La magnitud de la propagación de estos organismos infecciosos en un manantial de agua dulce determinado depende de la cantidad de excremento humano y animal que éste contenga. Dado que se puede producir la contaminación fecal de los abastecimientos de agua, si el agua no se trata adecuadamente, el patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador, al consumirla. Las enfermedades diarreicas, las principales enfermedades transmitidas por el agua, prevalecen en numerosos países en los que el tratamiento de las aguas residuales es inadecuado. Los desechos humanos se evacuan en letrinas abiertas, canales y corrientes de agua, o se esparcen en las tierras de labranza. Las afecciones que se propagan por el agua se conocen como "enfermedades transmitidas por el agua". Sus agentes patógenos son biológicos, más que químicos, y los males que provocan casi siempre son contagiosos. Por lo general, los agentes patógenos pertenecen al grupo de los microorganismos, que se transmiten en las heces excretadas por individuos infectados o por ciertos animales. De forma que estas enfermedades se suelen contraer al ingerirlos en forma de agua o de alimentos, contaminados por esas heces (vía fecal – oral). Los patógenos humanos transmitidos por el agua incluyen muchos tipos de microorganismos tales como: bacterias, virus, protozoos y, en ocasiones, helmintos (lombrices), todos ellos muy diferentes en tamaño, estructura y composición. A causa de las enfermedades de origen hídrico y el interés de controlarlas, los estudios bacteriológicos del agua se han orientado, en su mayor parte, hacia sus aspectos sanitarios. Uno de los criterios, utilizado para determinar la calidad sanitaria del agua, es la clase y número de bacterias que se encuentran presentes. En general, los métodos utilizados están diseñados para detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de microorganismos indicadores más que para la determinación de patógenos. Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los microorganismos patógenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de números altos de otros microorganismos, o tienen una distribución irregular en el producto.

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Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han hecho que se utilicen grupos de microorganismos de detección y cuantificación más fáciles y cuya presencia en cierto número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos y/o permitir la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de microorganismos se denominan “indicadores”. Éstos son organismos habitualmente asociados al tracto intestinal, cuya presencia en el agua indica que el agua ha recibido una contaminación de origen intestinal. Caldo BRILA sin sembrar (Obsérvese la campana de Durham invertida)

Caldo BRILA sembrado y en Baño María para llevar a 45° C

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bacilos Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 37º C. Incluye a los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros géneros. En la práctica, los organismos coliformes son siempre miembros del grupo de las bacterias entéricas. Estas bacterias son adecuadas como indicadores porque son habitantes comunes del tracto intestinal, tanto de las personas como de los animales de sangre caliente, donde están presentes en grandes cantidades.

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También interesa la determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes presentes en intestinos y materias fecales del hombre o animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto proporciona información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente. Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el Número Más Probable (NMP), aunque se han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de análisis, con el objetivo de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión, hasta el punto que se ha llegado a aceptar como método estándar. Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas a partir de lactosa a 37ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos roscados de Caldo Mac Conkey que contiene lactosa, y agregando una campana de Durham o tubo de fermentación invertido, que permite recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se realiza con base en el hecho de que pueda producir gas desde lactosa, en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no (Caldo BRILA: Verde Brillante Bilis Lactosa).

Caldo Mac Conkey sembrado: a la izquierda, un resultado (+) con formación de gas, y a la derecha, uno negativo

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También es utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, que puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y con el que se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Las bacterias coliformes dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 h de incubación a 37ºC. Caldo Mac Conkey sembrado y (+); obsérvese el gas en la campana de fermentación

La determinación de coliformes fecales se hace a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medios selectivos e incubando a 44,5ºC.

Diferentes medios líquidos lactosados sembrados, con resultados (+) y (-).

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Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimático. En este caso, el grupo de coliformes totales incluye todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza un sustrato cromogénico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad betaglucuronidasa, que rompe el sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorógeno. Este método permite llevar a cabo tanto recuentos como ensayos de ausencia/presencia. También se usa como indicador de contaminación fecal la presencia de Enterococcus faecalis. El hábitat normal de Enterococcus faecalis es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto, son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ríos, etc.

La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas en cuanto a sus posibles huéspedes. Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colífagos, que son bacteriófagos de coliformes, es decir, se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo con estudios de correlación entre números de colifagos y coliformes en agua, se podría utilizar el índice de colífagos como índice de calidad sanitaria del agua. Además, como son más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección que estos últimos. Las materias fecales del hombre y de los animales contienen una gran variedad de microorganismos enteropatógenos como Campylobacter, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Pasteurella, Francisella, Leptospira, Vibrio, protozoarios y varios grupos de virus. Cuando estos microorganismos son descargados en aguas naturales, su presencia denota contaminación fecal y constituyen un riesgo de trasmisión de enfermedades para la población humana. Las bacterias enteropatógenas por lo general aparecen en cantidades bajas en aguas naturales, razón por la cual su detección en el laboratorio se logra con cierta dificultad.

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Por otro lado, las técnicas de cultivo para su aislamiento son complejas y laboriosas. Estas desventajas han llevado a diseñar técnicas microbiológicas para el análisis de agua basadas en la detección de otros microorganismos presentes en las materias fecales y que puedan servir de indicadores. Aunque los Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Enterococos y Escherichia coli son utilizados como indicadores de contaminación fecal, su uso ha presentado algunas desventajas, ya que han sido reportados casos de enfermedades entéricas por consumo de agua en la cual no se había detectado coliformes. Además, ninguno de estos microorganismos sirve como indicadores de contaminación viral. Por esto los virus de Escherichia coli conocidos como colifagos pueden ser mejores indicadores de contaminación fecal. La presencia de colifagos en heces humanas y desagües es constante y su detección es fácil y rápida). Los colifagos son virus que infectan células de E. coli y han sidoaisladas fácilmente de aguas contaminadas conjuntamente con los coliformes totales y termotolerantes. Además de ser indicadores de contaminación fecal son también considerados como indicadores de la presencia de enterovirus en aguas naturales y tratadas. Estudios sobre aguas han sugerido el uso de los colifagos como indicadores de la eficacia del proceso de remoción microbiana en plantas de tratamiento durante la potabilización del agua. Esto se debe a la capacidad de estos virus de ser más resistentes al proceso de tratamiento del agua que las bacterias indicadoras convencionales. El método de cuantificación se basa en la formación de placas de lisis. Los colífagos (bacteriófagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y la liberación de partículas virales que infectarán las células bacterianas adyacentes. A medida que las bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada, determinando las conocidas como “placas de lisis”. La cepa utilizada en los ensayos es una E. coli sensible a la infección por colífagos (ATCC 13706). La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en los países en desarrollo. 167

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Los procedimientos sanitarios pueden aplicarse bien para evitar la contaminación del agua o bien para destruir el patógeno que ya se encuentre presente en ella. Los programas de depuración de agua han sido responsables de la disminución de las infecciones transmitidas por agua. La eliminación de la turbidez del agua por filtración, proporciona un significativo descenso en la carga microbiana del agua. Pero la filtración, por sí sola, tiene sólo un valor parcial, porque muchos organismos son filtrables. A diferencia del tratamiento con cloro que ha demostrado ser eficaz en la disminución de la incidencia de enfermedades transmitidas por agua. El agua puede contaminarse en la fuente de suministro, por el ingreso de contaminantes durante la distribución del agua y dentro de la vivienda, por el uso de recipientes mal protegidos o por la manipulación insalubre del agua, aún cuando la fuente se encuentre razonablemente protegida. Por ello, para ayudar a prevenir las enfermedades transmitidas por agua, deberían tomarse algunas medidas sencillas como: Hervir el agua hasta que comience a evaporarse, desinfectar el agua colocando dos gotas de cloro por litro de agua, durante media hora, antes de su consumo y lavarse las manos después de ir al baño y antes de manipular alimentos. La investigación microbiológica de la potencial contaminación del Agua Potable de bebida se centraliza en tres exámenes de rutina a saber, NORMATIZADAS en el Código Alimentario Argentino Actualizado: 1) Recuento de Aerobios Mesófilos, por siembra en profundidad. 2) Recuento de Coliformes totales y fecales por técnica del NMP. 3) Presencia de Pseudomona sp. por siembra en superficie. Los criterios microbiológicos para los tres ensayos, serán, los siguientes: 1) Aerobios Mesófilos a 37° por 24 horas: hasta 300 ufc/ml, en Agar para recuento en placa. 2) Coliformes: hasta 3 / 100ml según MNP a 37° C por 48 hs en Caldo Mac Conkey.

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3) Pseudomona sp: Ausencia en 100 ml, en Agar Cetrimide a 37° C por 48 hs. 4) Escherichia coli: Ausencia en 100 ml, en Caldo Brila a 44° C por 48 hs, repicado en EMB de Levine y cotejado por Pruebas INViC. Las muestras de agua para análisis bacteriológico siempre deben ser tomadas en envases esterilizados. El procedimiento para tomar las muestras de agua es el siguiente: • Obtener un envase estéril que puede ser el utilizado para urocultivo, o en su defecto, un frasco de vidrio de boca ancha y con tapa roscada. • Elejir el grifo de agua fría del cual se va a tomar la muestra. Quitar filtros y oxigenadores si los tuviere, así como cualquier otro adminículo, como mangueras, etc. No tomar muestras de: un grifo de agua caliente, un grifo que mezcle agua fría y agua cliente; un grifo que gotee; cualquier grifo que entregue agua suavizada, filtrada o de otra manera tratada; o de una manguera conectada a un grifo. • Esterilizar la superficie interna del grifo con la llama de un hisopo de algodón embebido en alcohol (un encendedor de gas butano desechable también sirve). No limpiar el grifo después de esterilizarlo. • Lavarse las manos antes de tomar la muestra. • Dejar correr el agua a chorro abierto por 5 minutos, aproximadamente, para evacuar la tubería y hacer correr el agua fresca. • Reduzca el caudal del agua al tamaño de un lápiz para tomar la muestra. • Abrir el envase esterilizado con cuidado. Sostener la tapa en una mano y el envase en la otra (mantener la tapa en la mano y no tocar la superficie interior de la tapa o del envase). Llenar la botella completamente sin que se derrame el agua y no dejar que el agua pase encima de su mano al entrar en el envase. • Tapar el envase inmediatamente después de tomada la muestra. • Refrigerar la misma y llevar al laboratorio, en una cubeta con hielo, tan pronto como sea posible (dentro de seis horas es recomendado, pero se puede tardar hasta 30 horas, refrigerando sin congelar). Para obtener resultados confiables en las pruebas microbiológicas, tomarse muestras estériles: 1. Cuando se toma agua de un grifo hay que limpiar primero el grifo con un paño y dejar que el agua salga con toda su fuerza por uno o dos minutos. 2. En seguida se debe esterilizar el grifo, por ejemplo, con un hisopo de algodón empapado en alcohol.

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3. Luego se debe abrir de nuevo el grifo, esta vez en forma moderada.

4. La boca del frasco debe protegerse contra el polvo cubriéndola con un pedazo de papel de aluminio y una cuerda.

5. Con el tapón hacia abajo para evitar la entrada del polvo, que podría contener microbios, se llena la botella inmediatamente.

6. Se debe dejar un pequeño espacio de aire para facilitar la agitación antes del análisis.

7. Por último, se tapa de nuevo la botella con el papel y el elástico.

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1) Recuento de Aerobios Mesófilos Totales o Recuento de Heterótrofos en Placa Se obtiene la muestra tomada de un grifo previamente flameado, se llevan a un frasco estéril 10 ml de esta muestra y 0,1 de peptona y se realizan diluciones seriadas de 10-1, 10-2 y 10-3 (´esto en el caso de no ser agua de red domiciliaria oficial). Se procede a realizar la siembra en profundidad: se colocan en la placa de Petri y con pipeta estéril 0,1 ml de cada dilución y luego se vierte Agar para Recuento en Placa (PCA) a 45° - 50° C. incubándose a 37° C por 24 a 48 hs. El CAA determina un criterio microbiológico de hasta 300 ufc (Unidades formadoras de colonia) x ml para agua potable y de hasta 105 para aguas minerales. 2) Recuento de Coliformes Totales Aquí utilizamos la Técnica del Número más Probable (NMP) que es una combinación estadísticamente probada de tubos con Caldo Mac Conkey (simple y doble concentración) versus cantidades igualmente ya estimadas del agua problema a analizar. Estas combinaciones aparecen eln las Tablas de MNP y de allí obtenemos el resultado estimado de cuántos coliformes tenemos por 100 ml de agua a estudiar luego de 48 hs. de incubacion a 37° C. Personalmente utilizo la siguiente combinación: 1 tubo con 10 ml de Caldo mac Conkey concentración doble más 10 ml de agua problema; 3 tubos con 10 ml de Caldo Mac Conkey concentración simple con 1 ml de agua problema cada uno y 1 tubo con 10 ml de Caldo Mac Conkey simple concentración, mas 0,1 ml de agua a estudiar. Toda esta batería ex por cada muestra a analizar. Los tubos son roscados y con campana de Durham, y serán (+) los que desarrollen gas, viren el color púrpura del medio a marillo o ambas cosas. Por supuesto, luego pasamos a medios selectivos de identificación bacteriana y finalmente a las pruebas INViC, que nos darán el nompre y el apellido del coliforme presente. 171

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Asimismo, se siembran de cada muestra, 10 ml de agua problema en tubos roscados con capana de Durham, conteniendo 10 ml de Caldo Brila, los cuales se llevan en un Baño María a 44° C por 48 hs. Se sigue con los (+) el mismo procedimiento o marcha que con los tubos de Agar Mac Conkey. Arriba: Agar Mac Conkey sembrado con tubos (+) a la izquierda y (-) a la derecha. Abajo: Caldo BRILA preparado para su incubación.

Cuando no hay formación de gas en 48 horas de incubación la prueba se considera negativa en ambas temperaturas: 37° C y 44° C. Si hubiese tubos (+) se hara el siguiente paso: a) De la batería del NMP, se tomará el tubo (+) que contenga más concentración de agua problema, y se sembrará en una placa de Agar Mac Conkey en estrías (en superficie), incubándola 24 hs a 37° C. Esto debe hacerse con cada batería en donde existan tubos (+), identificando correctamente cada muestra.

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Placa de Agar Mac Conkey con desarrollo de un cultivo de Escherichia coli.

Diversos desarrollos y utilización de lactosa en otras tantas placas de Agar Mac Conkey

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b) Con respecto al o a los tubos (+) de Caldo Brila, el proceso será similar a 1), pero se cambiará el medio sólido utilizado anteriormente por Agar EMB de Levine.

Placa de Agar EMB de Levine sin inocular

Espectaculares y típicos desarrollos de Eschericia coli en distintas placas de EMB de Levine

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Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos peritricos que desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de lactosa y a veces también de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos. Para enjuiciar la calidad de las aguas se recurre a parámetros físicos, químicos y biológicos. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos; es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coliformes y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de E. coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producción de gas y ácido. Las bacterias coliformes suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombre y animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino. Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaeróbios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a grandes abundancias en medios corrientes, como caldo y agar. Las colonias de E. Coli que desarrollan en Agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) de Levine, tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Asimismo, se deben realizar las llamadas Pruebas de Identificación Bioquímica o Pruebas IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Voges – Proskauer (V.P.) y Citrato). La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli (+ + - ), significa que produce Indol, es positivo al rojo de metilo y negativo al V.P. y al Citrato. Hay 16 combinaciones posibles de resultados prueba negativa y positiva. Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de muestra Nº de tubos positivos

Índice NMP/100ml

Límite de confianza de 95 % Inferior

Superior

0

< 2,2

0

6

1

2,2

0,1

12,6

2

5,1

0,5

19,2

3

9,2

1,6

29,4

4

16

3,3

52,9

5

> 16

8

infinito

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TABLA DEL NMP EN 100 ml DE MUESTRA CON HASTA 3 DILUCIONES Número

COMBINACIÓN UTILIZADA PARA LA SIEMBRA

de Cultivos Positivos 10 1 0,1 0-0-5 ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3

0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 2 0 0 1

1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 0 0 1 0

220 51 920 1600 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

0-1-4

0-2-3

0-3-2

0-4-1

1-1-3

1-2-2

1-3-1

2-1-2

2-2-1

3-1-1

74 150 240 340 130 330 700 1400 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

45 91 140 -----57 120 190 280 200 450 1100 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

32 65 ----------38 77 120 -----98 160 230 280 710 -----------------------------------------------------------------------------------------------------

25 ---------------28 57 ----------67 100 -----130 190 370 ------------------------------------------------------------------------------------------------

9 17 27 -----9 19 28 38 ------------------------------22 80 170 260 150 430 1100 -------------------------------------------------------------

8 17 ----------8 17 26 -----18 27 36 ---------------17 48 95 -----61 130 210 240 700

7 ---------------8 16 ----------17 25

5 9 ----------5 10 15 -----------------------------------7 13 21 -----14 21 30 ---------------29 87 180 180 700

4 ---------------4 9 ----------10 14 --------------------6 12 ----------13 20 -----21 29 -----24 52 -----66 140 300 ----------------

3 ---------------3 6 ----------------------------------------4 8 ----------8 12 --------------------10 16 -----17 24 -----33 95 240

----------------------------------------------

26 35 14 36 -----42 81 100 170 340 ----------------------------------------------

----------------

COMBINACIONES UTILIZADAS RUTINARIAMENTE

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3) Investigación de Pseudomona sp Los procesos productivos en organizaciones de bienes o servicios, generan diferentes residuos de tipo sólido, líquido o gaseoso, que, según el proceso, pueden contener algunas sustancias químicas que contribuyen a la contaminación del medio ambiente. En el caso de los residuos líquidos, también llamados vertimientos, que regularmente son descargados a las líneas de alcantarillados como disposición final y otras veces, a sitios de almacenamiento o tanques antes de su eliminación, hecho que propicia condiciones ambientes especiales para que ecosistemas microbianos tengan condiciones especiales para su crecimiento y conservación. Entre estos ecosistemas, se encuentran las bacterias del género Pseudomonas (antiguamente llamadas Bacilos piociánicos), que tienen alta adaptabilidad a utilizar una gran variedad de sustancias químicas como fuente de carbono, nitrógeno y energía. Esta adaptación, es un proceso catabólico que implica la producción de enzimas degradativas que han sido codificadas por genes adquiridos y por procesos de transferencia horizontal, muy común en las bacterias Gram negativas, y en donde interviene el DNA extracromosomal como son los plásmidos o por mecanismos genómicos como son los transposones. Agar Cetrimide es un medio sólido específico para el crecimiento de Pseudomona aeuroginosa al tener componentes que favorecen su aislamiento y al estar en los laboratorios como medio de uso común para la recuperación de este microorganismo y otras especies, se pretende ver si se pueden aislar directamente de estas muestras ambientales, teniendo en cuenta el número de células que haya o la concentración de sustancias químicas que tenga. Se siembra desde el tubo de la muestra problema en superficie, y en estrías, incubando la placa por 24 hs a 37° C. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa. Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 37º C por otras 24 horas. y a partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado. Para la prueba de la oxidasa, en una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa.

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Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva. Otras pruebas que se pueden investigar son: Prueba de reducción del nitrato, Prueba de licuefacción de la gelatina, Prueba del gluconato y Prueba del Citrato. Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, oxidasa positiva, móvil, produce dos tipos de pigmentos (piocianina y fluoresceína), aunque existen clases no pigmentadas, reduce nitratos a nitrito y produce gas (esto último no siempre es positivo), licúa la gelatina en forma rápida, reduce el gluconato.

Bacteria

Gram

Oxidasa

Nitrato

Gluconato

Gelatina

Pseudomona aeruginosa

-

+

+

+

+

Clásico desarrollo de Pseudomona aeruginosa en Agar Cetrimide, con colonias de color verde manzana y olor sui-generis. Cultivo de 24 hs a 37° C.

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4) Técnica de Filtración de Membrana para microbiología de agua de consumo A manera de miscelánea del control microbiológico del agua de consumo, describiré someramente la Técnica de Filtración de Membrana, procedimiento más rápido y ventajoso (resultados en 24 hs) y utilizados por el autor de éste Curso, en el marco de la misión a Haití en 2004- 2005 (ONU – MINUSTAH) y dentro del Batallón Conjunto Argentino 1 “Haití”. A pesar de que hasta el repliegue del Batallón la logística de la ONU proveyó semanalmente agua mineral embotellada para todo el personal, una antigua perforación fue recuperada y sanitizada, a efectos de proveer de agua potabilizada al sector de la cocina general de la base, y para rellenar los botellones de los distintos dispensadores de agua. A partir del 01 Dic 04, el agua potable para beber, es producida por el Grupo Ingenieros de Agua, para lo cual se reunieron 70 bidones de 20 litros que eran utilizados como envases de agua mineral en los dispensadores. Se los desinfecta mediante el empleo de cloro y una máquina hidrolavadora. Se procesaron 65 muestras de agua (de pozo y mineral) a través de la técnica de Filtración de Membrana, lo que significó un poco más de 650 determinaciones entre análisis físico químicos y microbiológicos. El método utilizado, por las características tan especiales de trabajo (a campo), reemplazó con éxito al método tradicional de recuento de coliformes en agua como el del Número Mas Probable (NMP). Se utilizaron materiales descartables con medios listos para su uso, a saber: Medio Endo (Coliformes), Agar para recuento en placa (Aerobios totales) y Agar Cetrimide (Pseudomonas). Laboratorio de Agua y Alimentos en un contenedor de 40 pies

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Aunque se han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de análisis, con el objetivo de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión, se ha llegado a aceptar como método estándar. En cambio, el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales, fecales, aerobios totales y pseudomonas, es un método altamente reproducible, que puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y con el que se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Las bacterias coliformes dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 h de incubación a 37º C. La determinación de coliformes fecales se hace a partir de las colonias desarrolladas en Endo e incubando a 44, 5º C. Las ventajas del uso de filtro de membrana para los análisis de agua son: rapidez en la obtención de resultados, ahorro de mano de obra, medios, material de vidrio, y costos de los materiales; asimismo, pueden exponerse los organismos a medios de enriquecimiento muy fácilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente. Los inconvenientes de su uso, se establecieron como: falta de formación de gas (algunas aguas tienen gran cantidad de organismos fermentadores de la lactosa sin producción de gas capaces de crecer en el medio); la filtración por membrana es inadecuada para aguas con mucha turbidez y bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua suficiente; y cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes verdaderos.

De izquierda a derecha y de arriba abajo: Medios ya listos para incubar: ARP, Cetrimide y Endo

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A la derecha, observamos crecimiento de colonias de aerobios totales en Agar para recuento en placa

En la placa de abajo, crecimiento de Desarrollo de Coliformes Totales coliformes en Agar en agar Endo a Endo. la derecha y abajo, Pseudomonas en una placa de Agar Cetrimide, incubadas ambas 24 hs a 37° C

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MISCELÁNEA: TECNICA DE ANALISIS DE AGUA POR FILTRACION DE MEMBRANA (MISION MINUSTAH HAITÍ - 2004 / 2005) 1. En agua filtrada por osmosis inversa, solo hacemos: pH, Conductividad y Dureza Total como análisis físico – químicos además de bacteriología. 2. Utilizar un mínimo de 100 ml de la muestra de agua problema para cada placa sembrada. 3.

Esquema del sistema de filtración por membrana (ver foto):

C A

E B D

4. La tapa “blanca” plástica con virola azul oscuro va por arriba (A) y la “amarilla” con virola celeste, abajo (B). La primera tiene un embudo (C) por donde se vuelca la muestra, la cual cae a (D) a través de un vacío practicado por la bomba (E).

El porta membrana, tiene una membrana estéril o pad que se coloca a razón de una por cada patógeno a ser analizado, a saber: Recuento total de mesófilos, Coliformes totales y Pseudomona aeruginosa.

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Despiece del filtro de membrana, mostrando sus partes, medio Endo preparado, pads y placas de Petri estériles y descartables

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5. Son en total tres Placas de Petri de plástico descartables, esterilizadas por oxido de etileno, las cuales se utilizan para cada estudio a realizar (ver foto). 6. Los medios de cultivo ya preparados (Agar para recuento en placa, Agar Endo y Agar Cetrimide) se conservan en heladera sin congelar. 7.

El portamembranas de conserva en alcohol de 95 grados.

8.

Todo el dispositivo se lava con alcohol y luego con agua destilada estéril.

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9. La pistola de la bomba de vacío, se manipula hasta que pasen los 100 ml, se quita luego el vacío y se desenrosca la parte superior (A) para quitar la membrana con una pinza estéril y con mucho cuidado. Se coloca el pad dentro de cada placa y se le vierte sobre el mismo el medio de cultivo ya preparado.

10. La cara “corrugada” del portamembrana debe ir siempre para arriba.

11. Las tres placas se incuban a 37 grados centígrados por 24 hs y luego se leen las colonias desarrolladas.

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b. METODOS GENERALES de ANALISIS MICROBIOLOGICO de ALIMENTOS (Fundamentos de las técnicas utilizadas) Volver

Hay una serie de razones que justifican la necesidad de analizar los alimentos para determinar cualitativa o cuantitativamente sus microorganismos. los principales objetivos del analisis microbiológico son asegurar: (1) que el alimento cumple ciertas normas estatutarias; (2) que se ajusta a normas internas establecidas por la compañia procesadora y a las externas exigidas por el comprador; (3) que las materias alimenticias que llegan a la factoría para ser procesadas cumplen las normas exigidas y las pactadas con el productor; (4) que se mantienen el control del proceso y la higiene de la línea de fabricación. Los métodos del examen microbiológico utilizados para controlar la calidad del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran parte, del alimento que va a ser analizado. Conviene estudiar los análisis bajo los siguientes encabezamientos: 1. Estimación del número total de microorganismos. 2. Estimación del número de microorganismos indicadores. 3. Examen o estimación del número de microorganismos alterantes de los alimentos y de otros grupos especiales.

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4. Examen o estimación del número de microorganismos productores de toxiinfecciones alimentarias y de los microorganismos patógenos transportados por los alimentos. 5. Análisis de los productos metabólicos de los microorganismos; a menudo requieren técnicas más sofisticadas de las que sólo disponen los laboratorios mejor dotados.

Uno de los mayores problemas del análisis microbiológico de los alimentos es determinar el número de muestras de un lote o de un día de trabajo que deben analizarse para asegurar que el producto o material alimenticio cumple la norma exigida. Obviamente cuanto mayor sea el número de muestras tomadas, mayor será la confianza en los resultados, pero puesto que el alimento empleado con fines analíticos representa un gasto no recuperable, debe alcanzarse un compromiso entre la exactitud de los resultados y la economía del análisis. los esquemas de muestreo, actualmente en uso, implican el análisis de cinco o diez muestras por lote, o de la raíz cuadrada del número de envases por lote; sin embargo, podría arguirse que una cantidad tan grande de muestras está totalmente injustificada cuando se obtienen resultados concordantes buenos. Por lo tanto, las fuentes microbianas disponibles deben usarse prudentemente y el muestreo será máximo con los alimentos que se sabe que son microbiológicamente peligrosos y con los que dan resultados erráticos; el muestreo será también grande con los que se han sometido a un cambio de procesado y siempre que haya tenido lugar un fallo en la línea de procesado. También debe tenerse en cuenta que el número de análisis se ve afectado por la razón o causa que lo motiva; así, se necesitan menos pruebas confirmar un estándar, que cuando el fin perseguido es la eliminación de un producto no satisfactorio.

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Cualquier esquema de muestreo digno debe tener una base estadística y a los lectores que necesiten mayor información sobre tales esquemas les recomiendo la lectura de Microorganismos de los alimentos, Vol. 2 (Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos, ICMSF, 1974. Esta obra ha sido publicada en español por EDITORIAL ACRIBIA, S. A., Zaragoza) en donde encontrarán todos los datos que precisen. La Comisión Internacional (ICMSF), citada en el punto anterior, define a la “muestra representativa” como aquélla cuyo estado es tan parecido como sea posible a la del lote (o partida) del que se tomó. Por lo tanto, es necesario evitar todo tipo de perjuicio y asegurarse de que se toman suficientes muestras. Como mejor se realiza esto es mediante el muestreo al azar, utilizando tablas de números aleatorios según recomienda la Comisión. Sin embargo, debe tenerse en cuenta el posible aumento de microorganismos en el equipo y por lo tanto en el alimento, durante la producción de una partida; el producto suele contener muchos menos microorganismos al comienzo que a la terminación del trabajo de la fábrica, lo que deberá tenerse presente en cualquier esquema de muestreo. De otra parte, si el equipo se ha limpiado mal, los alimentos pueden contaminarse mucho al iniciarse el trabajo. En consecuencia, puede ser ventajoso retirar los productos a intervalos de tiempo regulares; ello no supone una depreciación del muestreo al azar y se emplea frecuentemente. Otras dificultades del muestreo derivan de la consistencia heterogénea del producto alimenticio y si el alimento no es homogéneo se requiere un muestreo más frecuente. Como ejemplos extremos se pueden citar la leche, de la que sólo se requiere una pequeña muestra del alimento bien mezclado y algunos de los productos actuales, compuestos de múltiples ingredientes, lo que puede hacer imposible obtener la cantidad requerida de cada uno para contar con una muestra representativa; consecuentemente debe hacerse un análisis por separado de cada componente. Cuando los microorganismos se limitan a zonas específicas del alimento el muestreo es en ocasiones deliberadamente desequilibrado, por ejemplo, en alimentos como la carne, el pescado y la fruta la mayoría de sus microorganismos se localizan en las superficies externas y son éstas, por lo tanto, las que constituyen las principales regiones de muestreo.

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Los alimentos líquidos no presentan problemas y corrientemente se muestrean con pipetas después de mezclarse bien. Los alimentos sólidos los presentan a menudo, por lo que para superar las dificultades de la toma de muestras se utilizan diversas técnicas. En alimentos cuyas unidades son relativamente manejables, como aves y pescado, la canal entera se lava con agitación en un medio de muestreo líquido, si bien se admite que con tal tratamiento sólo se recupera una parte de la flora; se obtienen recuentos mayores si se incluyen en la solución de lavado abrasivos, como arena estéril. Durante muchos años se han usado mucho para el muestreo de superficies las torundas de algodón húmedo, pues tienen la ventaja de ser de fácil manejo y cuando se utilizan conjuntamente con una lámina metálica, dotada de ventana, permiten la toma de muestra de un área superficial equivalente; después de frotada dicha área, el soporte de la torunda se rompe y aquélla se separa y deja caer en un diluyente agitándose entonces para separar los microorganismos del algodón. Las recuperaciones alcanzadas con estas técnicas de la torunda son pobres, debido a la adherencia de los microorganismos a la superficie del alimento y a su retención en la torunda, pero pueden mejorarse, si al área muestreada vuelve a frotarse con otra torunda seca. los métodos del agar de contacto, en los que un medio estéril sólido a base de agar se presiona contra la superficie a muestrear, dan recuentos todavía menores que los de las técnicas de la torunda, pero constituyen el sistema de muestreo de uso más sencillo ya que el medio puede someterse a incubación directamente. Representación esquemática del método de recuento por «vertido en placas»

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En el caso de carnes, pescados y aves, los recuentos más altos se obtienen con el llamado «muestreo destructivo». Pueden tomarse muestras con sacabocados preesterilizados, lo que tiene la ventaja de que se analiza un área superficial conocida que varía con el diámetro del sacabocados utilizado. Escalpelos y cuchillas también son bastante populares, pero con tales instrumentos la relación área superficial/volumen es imposible de controlar. También pueden tomarse muestras de áreas conocidas empleando un escarificador dérmico y un cilindro metálico estéril que contiene el diluyente. Las carnes picadas y los alimentos graniformes, como guisantes y harina, son más fáciles de muestrear ya que pueden tomarse pesos conocidos. Algunas de las técnicas de muestreo microbiano estudiadas más atrás sirven también para el examen del equipo de procesado de los alimentos, por ej., el lavado con un volumen conocido de agua o de diluyente, el empleo de torundas, posiblemente con lámina metálica y los métodos del agar de contacto. Excepto cuando se emplean torundas o lavados, se toma un peso conocido de la muestra del alimento (por ej., 10 ó 25 g). El alimento se adiciona a un diluyente estéril adecuado, como solución de Ringer diluida al 1/4 o agua de peptona al 0,1 % y se trata a continuación de forma que se liberen en el diluyente los microorganismos del alimento. El tratamiento implica un mezclado mecánico o un pase por el Stomacher. En esta última técnica, muy popular actualmente, la muestra, junto con un volumen conocido de diluyente, se coloca en una bolsa de plástico estéril que es golpeada por una especie de paletas en el interior del Stomacher. El volumen de diluyente utilizado generalmente es nueve veces mayor que la muestra (por ej., 25 g de guisantes en 225 ml de diluyente) de forma que se obtenga un homogeneizado 10-1, a partir del cual se preparan las correspondientes diluciones (10-2, 103 , 10-4, etc.) dependiendo de la calidad microbiológica del alimento o superficie objeto del análisis.

Se pesan 10g del alimento

Se licuan 10g del alimento en 90 ml de peptona 0.1%

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Se hacen diluciones pasando 1ml a 9ml de peptona 0.1%

Frasco con 90 ml peptona 0.1% o solución salina estéril

Antes de sembrar y al hacer diluciones se debe homogenizar

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Una de las pruebas microbiológicas más corrientes llevadas a cabo en los alimentos es el recuento viable total, conocido también como recuento estándar en placa y recuento aeróbico en placa. Para ello se siembran diluciones adecuadas de una muestra de los alimentos en medios de agar que contienen nutrientes suficientes para permitir el crecimiento del mayor número posible de microorganismos. los nutrientes de que se compone, por ejemplo, el agar nutritivo, (Nutritive Agar, Oxoid) son: extracto de carne, extracto de levadura y peptona (un hidrolizado enzimático de carne fresca que contiene diversas sales inorgánicas, factores de crecimiento y péptidos). El pH del medio se ajusta generalmente a 7 – 7,4 para recuperar las bacterias y no los mohos y levaduras. Las células bacterianas individuales, transferidas a la placa con el diluyente, se multiplican normalmente durante la incubación. Así puede hacerse una estimación del número total de células viables (es decir, células capaces de crecer en el medio de recuperación) en la dilución sembrada, calculando después de la incubación el recuento del número total de colonias bacterianas que se desarrollan; naturalmente en las condiciones aerobias normales crecerán las aerobias obligadas y las aerobias facultativas.

Método de aislamiento por siembra por estría en placa. Para obtener un cultivo axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. 192

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Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. Las temperaturas de incubación seleccionadas dependen del alimento que va a examinarse. Las temperaturas corrientemente utilizadas son 45º C para las termófilas, 37º C para las mesófilas y 20º C para mohos y levaduras. Mientras la última temperatura es conveniente para las bacterias psicrótrofas y también para muchas mesófilas, para una estimación más exacta de las psicrótrofas se utilizan a veces temperaturas más bajas (por ej., 1 – 7º C); debe recordarse siempre que ninguna temperatura de incubación excluye por completo a todos los microorganismos de otro grupo.

Son muchas las técnicas en placa empleadas para la enumeración del número total de bacterias viables, de las que describiremos brevemente cinco. La enumeración de las colonias se lleva a cabo tradicionalmente de forma manual, con el empleo de un contador de colonias iluminado, con cuya ayuda el laborante cuenta cada colonia individual (véase más abajo). Esta operación puede ser tediosa e inexacta, salvo que en el medio de cultivo haya crecido un número adecuado de colonias (idealmente menos de 300, si bien por razones estadísticas se requieren también como mínimo 30 colonias). En los últimos años se han ideado una serie de instrumentos de recuento automático de colonias que permiten obtener en pocos segundos recuentos exactos. En el método de vertido en placa, se vierten en una serie (o mejor dos series) de placas de Petri alicuotas de 1 ml de las diluciones apropiadas del alimento. A continuación, se adicionan a cada placa unos 10 – 15 ml de agar nutritivo fundido, enfriado a 45º C, y se mezcla cuidadosamente con la alícuota correspondiente. Después de solidificado el agar, se incuban las placas a la temperatura requerida durante un tiempo (por ej., 1 – 2 días a 37º C, 3 – 4 días a 20º C y 7 – 10 días a 5º C). 193

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Después de la incubación se contarán las colonias de las placas que contienen entre 30 y 300 colonias; a partir de este recuento puede calcularse fácilmente el número de bacterias viables por gramo (o por cm2) de alimento. En el método de extensión en placa, se vierte previamente el medio en placas de Petri y se deja solidificar; a continuación, se extienden uniformemente por la superficie alicuotas de 0,1 ml de las correspondientes diluciones mediante el empleo de varillas de vidrio estériles en forma de L (Espátula de Drigalsky). Las placas se incuban como antes. Las ventajas de esta técnica son: primero que las células bacterianas termosensibles (esto es las psicrótrofas) no se destruyen por el agar fundido, lo que podría ocurrir, en cierta extensión con el método anterior, si la temperatura del agar es demasiado alta; segundo, todas las colonias crecen en la superficie del agar y pueden observarse y picarse fácilmente si fuera necesario, mientras que en el método de vertido en placa muchas colonias se desarrollan incrustadas en el agar, teniendo menor tamaño y siendo más difíciles de subcultivar. Con esta técnica de la gota en placa, también se emplea un medio de agar solidificado. Se utilizan pipetas especialmente calibradas que vierten 0,02 ml por gota. En la superficie de la placa se dejan caer cinco gotas separadas (o sea 0,1 ml) que se dejan secar antes de la incubación. Sólo deben con tarse las placas cuyas diluciones producen 20 colonias por gota. Puesto que los métodos citados además de requerir bastante tiempo son caros en material, se ha desarrollado otro más rápido que utiliza menores cantidades, es el método de la «gotita de agar». En esta técnica las diluciones se preparan con agar fundido y las colonias se desarrollan en las gotas solidificadas (0,1 ml) durante la incubación. El recuento de las colonias se facilita empleando un visor de proyección que amplía las gotitas unas diez veces aproximadamente. Otro método semiautomático, cada vez más popular, es el de la placa en espiral (Gilchrist et al, 1973) en el que una máquina vierte continuamente un volumen conocido de muestra en la superficie de una placa de agar que gira. La cantidad de muestra depositada disminuye a medida que el tubito dosificador se desplaza desde el centro a la periferia de la placa girante; de esta forma durante la incubación las colonias bacterianas se desarrollan siguiendo un trazo en espiral. El recuento puede realizarse manualmente empleando una red de contaje o mediante contadores de colonias basados en rayos láser, especialmente diseñados para su empleo con esta técnica. 194

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A medida que los microorganismos se multiplican en un medio de crecimiento, acaecen diminutos cambios de impedancia que pueden medirse haciendo pasar por el medio una pequeña corriente eléctrica. A una concentración concreta de microorganismos tiene lugar un cambio marcado de impedancia y como es lógico, con una carga bacteriana inicial más alta esta concentración umbral se alcanza antes. Así puede estimarse el número de microorganismos inicialmente presentes en el alimento; para ello se registra el tiempo requerido (tiempo de detección) para alcanzar el umbral, empleando muestras del alimento diluidas en un medio de crecimiento. Se ha demostrado que hay una buena concordancia entre los recuentos viables convencionales y los tiempos de detección. Además los tiempos requeridos para los análisis son normalmente de unas 5 horas lo que permite estimar rápidamente la calidad. En ocasiones puede necesitarse obtener el número total de microorganismos (esto es, células viables y muertas) de nuestros alimentos como, por ejemplo, alimentos enlatados y leche pasterizada. En portaobjetos de vidrio se hacen extensiones de la muestra, generalmente diluida, que se tiñen con un colorante adecuado. Se cuenta el número total de células microbianas de un número dado de campos microscópicos y del recuento obtenido puede calcularse aproximadamente el número total de microorganismos por gramo de alimento. El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias patógenas es impracticable en la mayoría de los laboratorios, bien porque estén inadecuadamente dotados, bien porque el tamaño de la muestra impediría su manejo convenientemente. Por ello se ha convertido en práctica corriente investigar en los alimentos la existencia de bacterias que indican la posibilidad de la presencia de las productoras de toxiinfecciones alimentarias o de otras patógenas. Por ello se les denomina «microorganismos indicadores» y se catalogan frecuentemente como de gran importancia al establecer la seguridad y calidad microbiológica de los alimentos. Las principales bacterias empleadas como indicadores son coliformes, enterococos y, más recientemente, enterobacteriáceas. En ocasiones resultan una buena guía los recuentos viables totales a 37º C, si bien su relación con la seguridad de los alimentos es más bien débil. Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos. 195

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El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos – diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso. Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales.

En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.

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Los medios complejos, se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denomina caldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa – peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseina. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilizacion de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos. Un medio selectivo favorece el crecímiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes.

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Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun. Los medios diferenciales se utilizan para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemolisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo – diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo seran. Un medio de cultivo se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambien es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado.

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Capítulo IV: Marchas básicas en patógenos alimentarios

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Un simple análisis macroscópico y organoléptico no nos pueden dar una idea acabada de la potencial contaminacion del alimento o del agua; para ello está la Microbiología de los mismos, quien se encargará de determinar cuál es el patógeno que puede desencadenar una Enfermedad Transmitida por Alimentos (ETA)

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1. ENTEROBACTERIAS y ESCHERICHIA COLI Los alimentos para que se consideren de buena calidad higiénica deben estar exentos de microorganismos peligrosos, pero en general no es posible examinar los productos o alimentos para investigar la presencia de todos y cada uno de tales organismos. Esto se puede resolver determinando organismos indicadores, como coliformes y enterococos. Por lo que se refiere a los coliformes, la presencia de E. coli en un alimento indica generalmente una contaminación de origen fecal. Así E. coli es un indicador clásico de la presencia de patógenos entéricos en agua, moluscos, productos lácteos y otros alimentos. De la muestra madre a anlizar, debidamente homogeneizada, se siembra en una placa de Petri estéril, 1 ml de ésa solución (siembre en profundidad), y luego se coloca una capa de Agar VRBG o VRBL a 45° C. Cuando solidifica se le coloca una segunda capa del mismo agar sobre la anterior (siembra en doble capa). Se incuba por 24 hs a 37° C y se cuentan las colonias de coliformes totales que serán rosadas por ser éste un medio específico para contaje de las mismas. Se aplicará el factor de dilución utilizado y el criterio microbiológico para cada alimento, según lo normatizado en el CAA. Para determinar la presencia de Escherichia coli, se sembrarán 10 ml del homogeneizado primario en 10 ml de Caldo BRILA, incubándose 48 hs a 44° C.

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Si hay formación de gas y viraje del color verde del medio al amarillo, se presume la presencia de E. coli, la cual debe confirmarse repicando en siembra por estrías y en superficie sobre una placa de Agar EMB de Levine que se incubará por 24 hs a 37° C (las colonias de E. coli son de 2 - 3 mm de diámetro de color oscuro y con un brillo verde metálico muy característico en Levine). Asimismo se reconfirmarán las colonias, tipificándolas con las pruebas bioquímicas de rigor. Las principales bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. La primera se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal del hombre y de los animales y raramente aparece en otro lugar, mientras que E. aerogenes se asocia normalmente con la vegetación y solo ocasionalmente aparece en el intestino. En el análisis del agua E. coli es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos. Hay una relación directa entre el número de E. coli e intensidad de la contaminación fecal, cuanto mayor es el número, mayor es la contaminación; esto es así porque los microorganismos no se multiplican en el agua y su número disminuye lentamente, a no ser que acaezca una nueva contaminación. En los alimentos la presencia y concentración de E. coli es de menor significado y su presencia, incluso en mayor número, no implica necesariamente una contaminación fecal intensa reciente. Su número está influenciado por muchos factores como crecimiento actual en el alimento, equipo deficientemente limpiado y contaminación a partir de las personas. Por lo tanto, todo lo que puede concluirse con muchos alimentos es que la contaminación fecal, directa o indirecta, tuvo lugar en alguna fase de su obtención y que la seguridad sanitaria del alimento es cuestionable. La detección y enumeración de E. coli se lleva a cabo en tres fases. La primera, recuento presuntivo de coliformes, implica la enumeración de coliformes, tanto fecales como no fecales, en medios selectivos que pueden describirse brevemente como medios nutritivos que contienen agentes selectivos, como antibióticos, colorantes o productos químicos que suprimen el crecimiento de muchos microorganismos, pero permiten crecer a los organismos seleccionados, resistentes a los agentes citados.

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Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que éste ha tenido contacto con, y por tanto está contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios no entéricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes. La identificación del grupo coli – aerogenes se hace mediante la detección de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 44º C en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta (Caldo BRILA). En alimentos tratados también conviene comprobar la presencia de coli – aerogenes mediante la producción de gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no indica claramente contaminación fecal debido a los múltiples orígenes de las bacterias de este grupo. No es recomendable el uso del concepto de «coliformes fecales» definido por las que crecen en presencia de sales biliares a 44º C porque el grupo no está definido taxonómicamente y las diferencias experimentales en los procesos de detección son muy críticas. Las bacterias de este grupo pueden entrar en un proceso de autoesterilización debida a la producción de ácidos en sus procesos de fermentación, ácidos que terminan por matarlas. Por ello es necesario utilizar medios tamponados.

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En muchos casos es necesario hacer un tratamiento de recuperación de los microorganismos dañados en los procesos de preparación del alimento. E. coli es un buen índice mientras que las coliformes en general sólo son buenos índices si los números son inaceptablemente altos. Esto es debido a que el origen de E. coli es únicamente intestinal, mientras que las coliformes pueden tener muchos otros orígenes. La detección de E. coli es muy importante en el análisis de aquellos alimentos compuestos en los que el tratamiento de cada una de las partes haya sido diferente. A partir de 1920, se introdujo la utilización del grupo total de las bacteria del grupo coli – aerogenes o coliformes como marcadores en análisis microbiologico de la leche pasteurizada y de los helados, basándose en el principio de que un tratamiento térmico adecuado habría de eliminar todas las bacterias presentes en este grupo y de que el envasado debería impedir la recontaminación del producto. Para resolver estos problemas, el científico, Ingram; recomendó la distinción de dos grupos de microorganismos marcadores ("marker. organisms"). En primer lugar, el grupo cuya presencia en un alimento indica la posible presencia simultanea de microorganismos patógenos ecológicamente relacionados.

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Tales organismos marcadores son denominados índices. Desde entonces como índice de posible presencia de microorganismos patógenos de procedencia entérica (entre ellos, Salmonella) en el agua y en los alimentos. Mucho mas tarde, se introdujeron ciertos grupos de bacterias con el propósito de poner de manifiesto deficiencias en la calidad microbiología de un determinado alimento en términos mas generales. Por supuesto que un determinado marcador puede funcionar como índice o indicador, incluso en un mismo alimento. Por ejemplo, la presencia de números significativos de ufc de E. coli en camarones o gambas precocidos y congelados pone de manifiesto: a) Un tratamiento de inocuidad inadecuado, por lo tanto, función indicadora, b) Presencia posible de indicadores de microorganismos patógenos de procedencia enterica, función de índice para microorganismos significativos en cuanto a la salud, riesgo derivado de las industrias donde los camarones fueron procesados. En el momento actual, es posible la determinación directa de casi todos los microorganismos patógenos entericos. No obstante, existe todavía en la microbiología moderna analítica de los alimentos para pruebas o determinaciones adecuadamente diseñadas de microorganismos marcadores, a demás de buscar o aislar microorganismos patógenos. Damos algunas razones que lo justifican: •

El fallo en la determinación de entorobacterias patógenas concretas tienen un significado alto (limitado), debido a la frecuente distribución muy irregular de estos microorganismos en los alimentos y a la falta de fiabilidad de las tecnicas de aislamiento. •

Por otro lado, no es posible en un laboratorio no especializado detectar la presencia en los alimentos de ciertos agentes patógenos entericos, tales como el virus de la Hepatitis A, y los helmintos. •

Además, aun cuando falten en efecto todos los agentes patógenos entericos en una alicuota adecuada de una partida de alimentos este resultado tiene únicamente significado de lo que se refiere a partida o lote en cuestión. La familia de las enterobacterias comprende muchos géneros de los que unos se caracterizan porque fermentan la lactosa (Escherichia y Enterobacter) y otros por no hacerlo (Proteus no enteropatógeno, Serratia, Salmonella y Shigella). Hay una estrecha correlación entre los recuentos totales de enterobacterias y el grado de contaminación fecal, sobre todo por salmonelas; debido a las muchas discrepancias encontradas cuando se utilizaron otras pruebas más convencionales para coliformes, sugirieron que sería mejor emplear el recuento total de enterobacterias.

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Las discrepancias observadas con las pruebas para coliformes fueron: (1) si el producto sólo contuviera Salmonella sp., los resultados obtenidos serían falsos; (2) en ocasiones predominan las estirpes de E. coli no fermentadoras; (3) a veces las cepas no producen gas aunque ataquen a la lactosa; (4) en todo caso la definición de coliformes es demasiado inconsistente y por lo tanto está justificada la nueva prueba. La prueba, implica un enriquecimiento en BGBB de las muestras del alimento homogeneizadas (la razón de este enriquecimiento se da en la sección siguiente); el BGBB empleado en esta prueba es una modificación del empleado para confirmar los coliformes, en el sentido de sustituir la glucosa por la lactosa ya que por definición todos los miembros de las enterobacteriáceas, atacan a la glucosa con producción de gas. La incubación tiene lugar a 37º C durante 24 horas, lo que va seguido normalmente de siembras de los caldos con crecimiento (esto es, turbios) en placas de agar de MacConkey modificado o en Agar rojo violeta bilis (VRBG o VRBL); la modificación consiste en la sustitución del azúcar. Todas las colonias que muestran un color característico rojo o púrpura se consideran enterobacteriáceas. Es necesario insistir en que la presencia, incluso de un número sustancial, de microorganismos indicadores no significa con certeza que haya ocurrido la contaminación fecal de los alimentos procesados; también puede indicar un procesado inadecuado, una contaminación posterior o unas condiciones de procesado antihigiénicas, especialmente si los alimentos se han almacenado a temperaturas que permiten el crecimiento microbiano. El empleo de las enterobacterias (coliformes y no coliformes) como microorganismos indicadores se basa en que estas bacterias son destruidas por los tratamientos de pasteurización, térmicos o clorado de las aguas con gran facilidad. Por esto, la presencia de altos valores de enterobacteriáceas en los alimentos es síntoma de fallos en el proceso de elaboración o de conservación que pueden acarrear riesgos para el consumidor. Su empleo como indicadores es preferible al simple análisis de coliformes (bacterias lactosa positivas) porque la frecuencia de estos últimos puede ser menor, su determinación incierta (caso de cepas de Escherichia coli fermentadoras lentas o caso de cepas no fermentadoras en Enterobacter) y a la menor sensibilidad de las pruebas para coliformes.

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El desarrollo de métodos específicos para la detección de enterobacteriáceas totales puede ser una buena estrategia en función de la relación costo / beneficio. Esta detección puede ser la única que se lleve a cabo en regiones con pocos recursos analíticos. Siempre que sea posible hay que completar el estudio con el análisis específico de enteropatógenos y hay que valorar los riesgos de la presencia de "falsos positivos" (altos valores de enterobacteriáceas sin presencia de enteropatógenos, lo que apoya su utilización como indicadores en vez de como índices) y de "falsos negativos" (presencia de Salmonella spp. cuando los valores de enterobacteriáceas son bajos). En la mayoría de los casos estudiados se ha comprobado que el recuento de enterobacteriáceas supone una garantía suficiente para el consumidor.; en cualquier caso, los resultados son más fiables que cuando se utilizan como indicadores sólo los recuentos de coliformes porque éstos últimos suelen ser más bajos y, por lo tanto, más sujetos a error. Los métodos generales son el uso del Agar con Cristal Violeta, Rojo Neutro, Bilis y Glucosa como medio selectivo y, como medio de enriquecimiento, Caldo tamponado con Cristal Violeta, Bilis y Glucosa. En estos medios, la Bilis supone el agente selectivo principal ayudado por el colorante Cristal Violeta; el rojo neutro es indicador de pH para detectar la fermentación. Hay que tener en cuenta la posible presencia de organismos dañados por la situación biológica del alimento (baja aw, bajo pH), por las condiciones desfavorables de almacenamiento (caso de microorganismos no esporulantes, frío, congelación) o por el tratamiento por calor. Hay que distinguir tres niveles de identificación: 1º Fase de presunción o probabilidad (detección de microorganismos que crecen en Agar-Cristal-Violeta-RojoNeutro-Bilis-Glucosa o microorganismos productores de gas en caldo con Verde Brillante); 2º Fase de confirmación (detección de microorganismos con respuesta positiva en medio de MacConkey); y 3º, Fase de determinación (pruebas finales de fermentación de la glucosa y prueba de la oxidasa). La muestra se procesa igual que en RAM (Recuento de aerobios mesófilos). El medio empleado es el Violeta Rojo Bilis Agar. Se observan colonias coliformes color fucsia rojizo

Se observan las típicas colonias de enterobacterias (Fucsia-violeta) y no coliformes (rosadas claras)

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Se observa una serie de diluciones de enterobacterias. La primera caja viró a amarillo debido a la alta producción de ácido en el medio por la población numerosa de coliformes

Se observan la distribucion homogénea de la muestra, y la congruencia de las diluciones

Este medio (Cromocult) es selectivo para entericos, y permite diferenciar entre Coliformes totales y E. coli. Se observan colonias rosadas que corresponden a coliformes. E. coli crece color violeta (no mostrado)

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2. AEROBIOS MESOFILOS Son todas aquellas bacterias aerobias o anaerobias facultativas, mesófilas o psicrófilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se investigan por el método de recuento en placa con siembra en profundidad, que se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido (Agar para recuento en placa o PCA), donde se ha sembrado un volumen conocido de la solución madre o sus diluciones (1 ml) , incubadas a 37° C durante 24 hs. Se deberán contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado más de una dilución se seleccionará la que proporcione entre 30 y 300 colonias, descartando las demás. El recuento no se efectuará en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en aquellas sembradas con solución sin diluir. Los recuentos "totales" expresan el número por gr o ml de UFC (Unidades Formadoras de Colonias), de alimentos obtenido en determinadas condiciones de cultivo en medio sólido incubado en aerobiosis. No existe una relación directa entre la flora aerobia y la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de procedencia intestinal, ni tampoco de otros agentes de infecciones e intoxicaciones alimentarias de diversas procedencias. En realidad, un recuento alto de UFC en un alimento indica que, probablemente, ha estado conservado en condiciones de tiempo y temperatura que han permitido el desarrollo de microorganismos. La simplicidad de la técnica hace que el recuento de la placa en flora aerobia viable sea un paso inicial frecuente en el análisis microbiológico de los alimentos. Es importante primero, elegir adecuadamente la temperatura de incubación. En segundo lugar, ha de utilizarse un medio de cultivo adecuado. En alimentos no obtenidos por fermentación, conviene un agar infusión que permitirá incluso el crecimiento de los microorganismos de cultivo más difícil, por ejemplo, el medio de uso múltiple con tween 80 ("all purpose tween= APT) ó el agar tamponado glucosa treptona peptona de soya con extracto de levaduras. 209

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En alimentos congelados y en los conservadores en refrigeración, los recuentos de la flora bacteriana psicrotrofa pueden relacionarse con las condiciones de conservación y son indicativos de la calidad bacteriológica en estos productos. En algunos alimentos tales como, los envasados al vacío, esta indicado el recuento de la flora anaerobia mesófila, no debe utilizarse el tioglicolato sódico en los medios para el recuento de anaerobios. Los resultados de este análisis permiten: a. Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección. b. Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas. c. Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos. d. Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte. e. Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos. f. Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos. El análisis de los alimentos para determinar la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo, ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. El recuento en placa con siembra en profundidad es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento, pero deben hacerse en función de uno de los siguientes factores: - método de muestreo utilizado - distribución de los microorganismos en la muestra - naturaleza de la microflora del alimento - naturaleza del alimento - antecedentes del alimento - adecuación nutricional del medio de cultivo - temperatura y medio de incubación - pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio - tipo de diluyente utilizado - número relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. 210

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Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminación de la materia prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto El recuento de mesófilos, por lo tanto, y esto es lo más importante: NOS INDICA LAS CONDICIONES DE SALUBRIDAD DE ALGUNOS ALIMENTOS Tenemos en cuenta como Métodos normalizados, los de ISO 4833 y el Método AF V 08051. Se basan en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido con una cantidad determinada de suspensión madre. El análisis de los alimentos para determinar la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de microorganismos: Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables, Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables, Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora y Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no viables.

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Para llevar a cabo el análisis microbiológico de los microorganismos aerobios totales, se utiliza un medio general para que puedan crecer todos los microorganismos que interesan. Existen medios generales como el PCA (Plate Count Agar), TSA (Triptosa Soja Agar) o AN (Agar Nutritivo) en los que se encuentran todos los nutrientes necesarios para que crezcan la inmensa mayoría de los microorganismos. En este caso, el análisis se realiza con PCA y se suele llevar a cabo con una dilución del orden de 10-5 aunque es variable según el tipo de alimento. En primer lugar, se toman 10 g de una muestra representativa del producto total si es que éste es sólido, y se añade 90 ml de agua peptonada en una bolsa estéril de Stomacher, y tras someterlo a homogenización, ya tenemos lista la dilución 10-1 de la muestra. A continuación, se realiza tantas diluciones como sean necesarias tomando 1 ml. de la dilución anterior y anadiéndola a un tubo de ensayo que contenga 9 ml. de solución fisiológica y así sucesivamente. Es muy importante que antes de que se tomen las muestras para verterlas bien en otro tubo de ensayo o bien en una placa de petri, se homogenice bien la muestra ya que los microorganismos tienden a concentrarse en la parte baja del habitáculo donde se encuentran por sedimentación. Se toman tantas pipetas estériles como diluciones sea preciso realizar. En el caso de la siembra en masa, se vierte el ml de muestra en la placa de petri y a continuación se vierten unos 15 ml de PCA líquido que está contenido en un erlenmeyer que está en baño maría para que se mantenga a temperatura superior a su punto de fusión. A continuación, se homogeniza moviendo la placa de petri en el sentido de las agujas del reloj y al contrario, y en forma de cruz. Y a continuación se deja reposar hasta que se solidifique el agar por disminución de su temperatura a la del ambiente. Finalmente, se invierte la placa para que no se produzca condensación y se introduce en una estufa a 30ºC que es la temperatura óptima de crecimiento para lo que pretendemos determinar durante 24, 48 y 72 horas. Pasado este tiempo, se saca la placa de la estufa y se hace un recuento de las colonias. Cuando se ha vertido el ml. de muestra sobre la placa de petri, en ella están contenidos un número determinado de microorganismos que no son apreciables a la vista. Sin embargo, una vez que se les incubado a su temperatura óptima de crecimiento, pasado el tiempo se ha dado crecimiento bacteriano por lo que a partir de cada microorganismo individual se obtiene una colonia compuesta por millones de microorganismos que sí que se pueden contar a simple vista (las colonias). Por ello, cuando se dan los resultados de la muestra, se dice UNIDAD FORMADORA DE COLONIA ya que cada microorganismo ha formado una colonia. En el caso de la siembra en superficie, primero se vierte el PCA en la placa de petri y se deja solidificar. Una vez ha solidificado el agar se vierte 1 ml. ó 0,1 ml de muestra y se extiende con un Ansa de Drigalski por el agar hasta que éste lo absorbe y entonces es cuando la placa ya está lista para ser incubada. Se toma 1ml de la dilucion a sembrar

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Se coloca el inoculo en una placa estéril

Se alista el medio caliente (PCA)

Se vierten aproximadamente 20ml y se homogenizan con el inoculo haciendo forma de 8 suavemente en ambas direcciones. Luego se deja solidificar y se lleva a incubar

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Despues de incubar 24 a 48 hs a 37° C, sSe hace el recuento en ufc / g de alimento y se observan colonias de diferentes morfologias

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3. ENTEROCOCOS

Como antes se ha indicado los enterococos comprenden dos especies encontradas en los intestinos humanos y animales, concretamente Streptococcus faecalis y S. faecium. El primero se encuentra fundamentalmente en el intestino humano, mientras que el segundo se encuentra tanto en el hombre como en los animales. Los enterococos se emplean a veces como indicadores de contaminación fecal en el análisis del agua; una de las ventajas sobre E. coli es que mueren más lentamente y uno de los inconvenientes que se encuentran con más frecuencia que aquel en ambientes no fecales y por lo tanto su aislamiento no indica tan claramente contaminación fecal. Se ha señalado con frecuencia que en los alimentos los enterococos constituyen una mejor indicación del estado sanitario que E. coli; generalmente se recuperan antes que los coliformes, sobre todo en los alimentos congelados y en los deshidratados, así como en los que han sufrido un tratamiento térmico moderado. Sin embargo, esta mayor capacidad de recuperación rebaja su valor como microorganismos indicadores, ya que su presencia, por ejemplo, en los alimentos tratados por el calor, tiene poco valor si otros microorganismos patógenos menos termoestables, como las salmonelas, se han destruido durante el tratamiento térmico. Se dispone de muchas técnicas para el aislamiento y enumeración de enterococos que generalmente se basan en el empleo de la azida de sodio como agente selectivo y a menudo en temperaturas de incubación altas (44º C).

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Ejemplo de medio corrientemente utilizado es el KF Streptococcus agar (Difco) que, además de los nutrientes corrientes, contiene también cloruro de tetrazol, ingrediente que da a las colonias color rojo; la incubación se realiza a 37º C durante 48 horas. Como alternativa puede utilizarse caldo de glucosa azida, incubando a 44º C y llevando a cabo el recuento con la técnica del MPN y tablas de probabilidad. Los tubos en los que se aprecia producción de ácido se consideran positivos (los enterococos no originan gas a partir de la glucosa). Generalmente no se necesita la identificación de la especie ni de la estirpe. La enumeración de bacterias o grupos de bacterias indicadoras de contaminación fecal es utilizada para valorar la calidad sanitaria de alimentos, sedimentos y aguas destinadas al consumo humano, la agricultura, la industria y la recreación. No existe un indicador universal, por lo que los especialistas deben seleccionar el apropiado para la situación específica en estudio. Dentro del rango de los indicadores se encuentra el grupo de bacterias coliformes, E. coli, colifagos, Bifidobacterium sp., Clostridium perfringens y el grupo estreptococos fecales. Los microorganismos mencionados anteriormente se encuentran formando parte de la flora intestinal del tracto gastrointestinal del hombre y en los animales de sangre caliente; son excretados en sus heces, de ahí que su presencia en el ambiente indique contaminación de origen fecal y el riesgo de aparición de gérmenes patógenos. Los estreptococos fecales han sido utilizados por las autoridades sanitarias de diferentes países para evaluar la calidad sanitaria de sus recursos naturales.

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En el pasado, el principal papel de este grupo de microorganismos fue la utilización de la proporción coliforme fecal/estreptococo fecal como un indicador de la naturaleza de la fuente fecal; sin embargo, factores como: las diferencias de los rangos de muerte en el ambiente entre estos dos indicadores, la supervivencia variable de los grupos de especies de estreptococos fecales y los métodos para la determinación de estos últimos, hizo que su empleo fuera cuestionable. El término enterococos fue utilizado por primera vez en 1899 por Thiercelin para describir diplococos grampositivos de origen intestinal que formaban pares o cadenas cortas. Estos microorganismos fueron clasificados dentro del género Streptococcus como Streptococcus faecalis por Andrewes y Horder en 1906. Un segundo microorganismo fecal, Streptococcus faecium, que presentaba características similares al anterior fue descripto por Orla – Jensen en 1919. El género Streptococcus es un grupo heterogéneo de bacterias grampositivas con gran significación para la medicina y la industria, son esenciales en procesos industriales y lácteos y como indicadores de contaminación. Varias especies son importantes desde el punto de vista ecológico como parte de la flora microbiana normal del hombre y los animales, otras pueden ser causa de infecciones que varían en un rango de subagudas a agudas hasta crónica. Sherman en 1937, propuso un sistema de clasificación que separaba este género en cuatro divisiones: pyogenes, láctico, viridans y enterococo. Este esquema se correlacionó con el propuesto sobre bases serológicas por Lancefield en 1933, quien designó los grupos como A, B, C, D, etc. donde los enterococos reaccionaban con el antisuero grupo D. Aunque en la actualidad es evidente que los términos estreptococos fecales, enterococos y estreptococos grupo D no poseen igual significado, han sido utilizados como sinónimos en la bibliografía especializada. Los estreptococos fecales incluyen a los estreptococos de origen fecal; el grupo enterococo generalmente se refiere a S. faecalis y sus variedades y S. faecium; mientras que en los estreptococos del grupo D se incluyen todos lo estreptococos que poseen el antígeno grupo D significativamente enterococos, además de S. bovis y S. esquinus. En 1984, Schleifer y Kilpper Balz demostraron con evidencias genéticas basadas en estudios de hibridización DNA-DNA y DNA – rRNA que S. faecalis y S. faecium debían ser transferidos a un género diferente y la taxonomía de Streptococcus varió sustancialmente al ser dividido en tres géneros: Lactococcus, Streptococcus y Enterococcus.

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Se clasificaron las especies antes mencionadas en este último género. Desde el establecimiento del género Enterococcus con los estudios quimiotaxonómicos y filogenéticos realizados, se han transferido y descrito nuevas especies en este género por lo que su complejidad aumenta y la diferenciación de algunas de estas especies resulta problemática debido a la coincidencia de características fenotípicas. Los enterococos son cocos grampositivos, catalasa negativa, inmóviles, anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cápsulas. Entre las características fisiológicas que distinguen al género Enterococcus se encuentra la habilidad para crecer en presencia de 6,5 % de CLNa; a 10° C y 45° C y pH 9,6. Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis y poseen la enzima pyrrolidonyl arylamidasa. Desafortunadamente, no existe una característica de las mencionadas que sea única para este género; las cepas de bacterias en forma de cocos, Gram positivos y catalasa negativa de los géneros Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc y Lactobacillus pueden mostrar una o más de las características típicas del Enterococcus. El género Enterococcus se ha revelado como causa de infecciones nosocomiales y de una variedad de infecciones adquiridas en la comunidad, además de ser intrínsecamente resistentes a un número de agentes antimicrobianos. Entre las especies de mayor importancia clínica se destacan, Enterococcus faecalis que constituye el 85 – 90 % de los aislamientos en la mayoría de los laboratorios y Enterococcus faecium del 5 – 10 % de las cepas detectadas clínicamente. Las especies de origen fecal o intestinal pertenecen principalmente a dos géneros: Enterococcus y Streptococcus. Se propone que sea adoptado el término «enterococos y estreptococos intestinales» como principal grupo indicador de riesgo para la salud pública. Existen 14 especies de los géneros Enterococcus y Streptococcus que se consideran de origen fecal o intestinal. En un ensayo comparativo realizado a gran escala en 1995 se redujo a cuatro especies: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans y Enterococcus hirae en un intento para reducir la variabilidad. A causa de los cambios en la taxonomía de Streptococcus y Enterococcus hay una pérdida de información sobre el recobrado de las diferentes especies de enterococos y estreptococos intestinales en los medios de cultivos ampliamente utilizados para el monitoreo de rutina. Los métodos para la enumeración de estreptococos fecales en muestras de aguas fueron desarrollados antes de estos cambios, por lo que es necesario evaluar el valor de cada una de las especies como indicador de contaminación fecal y estudiar cómo estos microorganismos crecen en los medios usados comúnmente en el análisis higiénico de las aguas. Por lo general, los procedimientos empleados en aguas consisten en el enriquecimiento en medio líquido de acuerdo con el método del número más probable y la técnica de filtración por membrana.

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En el primero se ha determinado que los medios que contienen azida de sodio producen los mejores resultados; en cuanto al segundo, más de 70 medios han sido propuestos para la determinación de estreptococos fecales por dicha técnica. No ha sido posible obtener un medio completamente selectivo para todos los estreptococos y enterococos. Los medios selectivos usualmente están constituidos por un agente como la azida de sodio, un antibiótico (con frecuencia gentamicina o kanamicina) o sales biliares y un indicador que puede ser esculina o tetrazolium. La incubación a temperaturas elevadas (44° C) tiene también un efecto selectivo para algunos enterococos. La composición de los medios selectivos más comunes no es la más adecuada para el recobrado de Streptococcus sp. Hay diversidad de opiniones en cuanto al valor de los estreptococos fecales como indicador de contaminación fecal. En investigaciones realizadas en países tropicales se plantea que estas bacterias pueden estar presentes de forma natural en las corrientes y no reflejan necesariamente el grado de contaminación de dichas aguas por lo que se considera la hipótesis de que la fuente de la alta concentración de bacterias indicadoras en las corrientes es el suelo. Por otra parte, los riesgos asociados con las actividades en aguas naturales destinadas a la recreación en los que se incluyen enfermedades del tracto respiratorio superior y enfermedades gastrointestinales, infecciones del oído e infecciones de la piel han ocasionado que algunos investigadores de Canadá recomienden como el indicador más apropiado en aguas marinas el grupo enterococo, porque sobreviven en ellas más que los coliformes fecales, también son elegidos cuando hay un tiempo o distancia considerable entre la fuente de contaminación fecal y el área de baño. Además, existe una correlación positiva entre la enfermedad gastrointestinal y los niveles de enterococos en aguas marinas, aunque la ausencia de ellos no indique carencia de riesgo.

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La Organización Mundial de la Salud (OMS) plantea que el valor principal de los estreptococos fecales en el examen de la calidad del agua potable es como indicadores adicionales de la eficiencia del tratamiento, además de ser valiosos para los controles corrientes después del tendido de nuevas cañerías maestras o cuando se reparan los sistemas de distribución, para detectar contaminación de las aguas subterráneas o de superficie por las escorrentías. La relativa resistencia de los enterococos a condiciones adversas como la tolerancia a condiciones extremas de temperaturas, pH y salinidad, es ventajosa cuando se determina la historia sanitaria de alimentos moderadamente calentados, congelados, salados u otro alimento o bebida en los cuales los coliformes pueden no haber sobrevivido. Sin embargo, a causa de la habilidad de los enterococos para crecer en ambientes lejanos de la fuente original de contaminación fecal se recomienda precaución y discreción en atribuirle una significación al número y tipo de enterococos y estreptococos fecales presentes en los alimentos. La presencia de algunas especies en el género Enterococcus que al parecer no tienen relación con la materia fecal, disminuye el interés por los enterococos como indicadores de la inocuidad de los alimentos, por lo que se revisa su utilidad en el control de la higiene y la calidad de los alimentos. En estudios futuros resulta necesario determinar si las especies de enterococos y estreptococos intestinales reportadas en los últimos años se encuentran solamente asociados con contaminación fecal o se presentan en forma natural, con el objetivo de valorar la importancia de este grupo de bacterias como indicador para evaluar la calidad sanitaria de muestras ambientales en países tropicales.

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4. SALMONELLA y SHIGELLA El aislamiento e identificación de Salmonella sp. es un proceso complejo que consta de varias fases; el recuento generalmente no se practica. Una vez tomada la muestra del alimento (25 g, según lo normatizado en el CAA) se mezcla con un medio de preenriquecimiento, como el caldo lactosado en una cantidad de 225 ml. Este paso podría llegar a obviarse con aquellos alimentos que ya contengan lactosa en su composición (farináceos, pastelería, etc). El caldo se incuba entonces unas pocas horas (8) a 37 ºC para facilitar la recuperación de las salmonelas lesionadas. La segunda fase implica la siembra de una muestra de caldo en un medio de enriquecimiento que favorezca el crecimiento de las salmonelas a la vez que restringe o inhibe por completo el desarrollo de microorganismos competidores, como los coliformes. El término enriquecimiento selectivo se usa con carácter general para indicar que a un microorganismo o a un grupo de ellos se le permite crecer mientras que se inhiben los competidores; en esencia en esta fase se busca que aumente la proporción del microorganismo(s) requerido(s) respecto a todos los competidores.

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Los dos medios de enriquecimiento corrientemente utilizados con las salmonelas son el Caldo de Selenito – Cistina y el Caldo Tetrationato. El primero contiene selenito sódico, como agente inhibidor, aunque la hidrólisis de la lactosa que también forma parte del medio y que llevan a cabo muchas de las bacterias entéricas presentes, da lugar a una caída del pH que favorece el crecimiento de las salmonelas. El caldo de tetrationato contiene varios agentes inhibidores como sales biliares, verde brillante y tetrationato que, en combinación, permiten que crezcan las salmonelas mientras que se inhiben eficazmente la mayoría de sus competidores. La incubación de estos caldos se realiza a 37º C durante 24 horas. Después del enriquecimiento los caldos se emplean como inóculo de placas de medios selectivos, habiéndose empleado con este fin, tanto Agar SS como Agar-rojo violeta-bilis. No obstante, ahora se usan generalmente agar de MacConkey-verde brillante y agar desoxicolato-citrato; ambos contienen diversos agentes selectivos, los nutrientes usuales, lactosa y un indicador de pH. Las salmonelas al no fermentar la lactosa forman en estos medios después de una incubación de 24 horas a 37º C, colonias verdes e incoloras, respectivamente y por lo tanto se distinguen fácilmente de las colonias rojas originadas por los microorganismos fermentadores de la lactosa. Desgraciadamente muchos otros microorganismos dan en estos medios colonias indistinguibles de las de Salmonella sp., por lo que se necesitan otras pruebas antes de confirmar su aislamiento. La confirmación se realiza picando las colonias sospechosas y después de comprobada su pureza se resiembran en medios para comprobar la fermentación de otros carbohidratos, la producción de ácido sulfhídrico, la descarboxilación de la lisina y la motilidad.

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Con tal que estas pruebas de tamizado (screening) produzcan los debidos resultados, las bacterias aisladas pueden considerarse como salmonelas, llevando a cabo la confirmación final con pruebas serológicas. La caracterización del serotipo específico puede hacerse con los correspondientes antisueros H y O, si bien para la confirmación suele ser suficiente con el empleo de antisueros polivalentes H y O (que son representantes de todos los serotipos que generalmente cabe esperar). Es probable que los concentrados de muestras necesiten ser enriquecidos previamente en agua de peptona amortiguada, para luego ser enriquecidos en caldo que contenga ya sea tetrationato, selenito, cloruro de magnesio o verde de malaquita. Estos, a su vez, pueden ser sometidos a subcultivo en medios como el verde brillante, sulfito de bismuto, agar de desoxicolata xilosa-lisina (DXL), citrato de desoxicolata o agar de MacConkey, examinándose luego las colonias sospechosas tanto bioquímica como serológicamente. Entre las pruebas de depuración bioquímica se deberá incluir: agar triple de azúcar y hierro, producción de indol, decarbosilasa y actividad de ß-galactosidasa. En las pruebas serológicas se incluirá la aglutinación con sueros polivalentes anti-o, anti-H y antiVi. Es imprescindible la eliminación previa de cepas autoaglutinables. Cuando el análisis se realiza para detectar las S. typhi , el medio de cultivo aconsejado es la selenita F. El procedimiento de los tubos múltiples se utilizará para calcular el número de Salmonella presentes en el agua. Debido a que las bacterias coliformes y la mayoría de cepas de Proteus vulgaris son antagónicas a la Shigella, es aconsejable elegir medios enriquecidos selectivos que reduzcan al mínimo las acumulaciones de compuestos volátiles y de los subproductos obtenidos a partir de estos microorganismos antagónicos. Se puede usar caldo nutriente con un pH ajustado de 8,0 (es el nivel de pH que menos favorece el crecimiento de bacterias coliformes). También es posible obtener un buen enriquecimiento de Shigella con un medio de cultivo autocitotóxico con base en caldo de tripticasa de soja conteniendo 1 mmol/litro de 4-cloro- 2-ciclopentilfenil ß-Dgalactopiranosida, 2,5 g/litro de lactosa y sustancia amortiguadora de citrato a un pH de 6,2. La incubación debe hacerse durante 6-18 horas, a una temperatura de 35°C.

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Estríense las culturas en agar DXL cuando hayan transcurrido 6 y 18 horas. Sométanse las colonias sospechosas a pruebas de selección bioquímica y confírmese las colonias sospechosas con antisueros de Shigella (sueros polivalentes y de tipo. La presencia en alimentos de cualquier serotipo de Salmonella es potencialmente peligrosa como fuente de enfermedad para el hombre, bien por consumo de los alimentos o por contaminación secundaria de utensilios y equipo para el tratamiento e industrialización de otros productos. La norma microbiológica vigente para diversos alimentos (jamón cocido, fiambre de jamón, paleta cocida, fiambre de paleta, magro de cerdo cocido, fiambre de magro de cerdo, gelatinas comestibles, huevo entero pasterizado refrigerado o congelado, yema pasterizada refrigerada o congelada, huevo entero desecado, yema desecada, clara desecada, leche y productos lácteos, nata, etc.) exige la ausencia de Salmonella en 25 g. a) Enriquecimiento en medio líquido no selectivo. Homogeneizar 25 g de la muestra con 120 ml de agua de peptona estéril, e incubar a 37ºC durante 12-24 horas. b) Enriquecimiento en medio líquido selectivo. Pasar 10 ml del homogeneizado anterior a un frasco que contenga 100 ml de caldo tetrationato (Müller-Kauffmann). Incubar a 37ºC durante 24 horas. Para detectar ciertos serotipos que pueden no crecer adecuadamente en las condiciones anteriores, puede realizarse un enriquecimiento selectivo complementario en otro medio (generalmente caldo selenito cistina) incubando y también a una temperatura distinta (43ºC).

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c) Siembra en medios sólidos selectivos. Pasar un asa de siembra del caldo de enriquecimiento a sendas placas de medio selectivo (agar SS Salmonella-Shigella y agar XLD) y extender el inóculo. Incubar a 37ºC durante 24 horas. d) Estudio de las colonias sospechosas. En agar SS las colonias típicas son incoloras y el medio vira a amarillo, en agar XLD son rojas y transparentes. Algunas cepas dan colonias con el centro negro.

e) Uilización de glucosa y lactosa. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Kliger incubándose a 37ºC durante 24 horas. La coloración amarilla en el fondo indica la utilización de glucosa, mientras que la de la superficie indica la de lactosa. El fondo negro refleja la presencia de H2S. f) Utilización de manitol. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Manitol incubándose a 37ºC durante 24 horas. La coloración amarilla indica la utilización de ese azúcar. g) Ureasa. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Urea incubándose a 37ºC durante 24 horas. La presencia de color rosa indica resultado positivo.

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Se consideran Salmonella las colonias glucosa + y lactosa - en los tubos de agar hierro de Kliger (con o sin fondo negro), manitol + y que además sean negativas a las otras pruebas bioquímicas. Salmonella pertenece a la Familia Enterobactereaceae, al Género Salmonella. Salmonella y Arizona por la homología de su DNA; la nomenclatura y clasificación no está establecida definitivamente. Bacilo GRAM (-) aerobio y anaerobio facultativo, producen ácido a partir de la glucosa y son generalmente aerogénicos.Se distinguen 7 distintos subgrupos, cada cual con su fenotipo definido y son serotipificados por antígeno O somático,Vi de superficie y antígenos flagelares fase I y II. Según ultima clasificación, se establece la siguiente nomenclatura estimándose que el 99% de los aislamientos en clínica corresponde a al subgrupo I. Clasificación: Designación por formulas antigénicas. Esquema de Kauffman White. 1997

S.entérica Subsp entérica 1.435 II- S.entérica Subsp salamae. III a- S.entérica Subsp arizonae. III b S.enterica Subsp diarizonae IV.- S.enterica Subsp houtenae VI.- S.entérica Subsp indica 11 V.- S.bongori 20 Total de Serovariedades

485 94 321 69

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Los miembros del grupo Salmonella son gérmenes patógenos causantes de síntomas clínicos en humanos y en animales. No todos los serotipos son igualmente patógenos para humanos y animales por lo que desde el punto de vista de salud publica es importante su identificación final. La naturaleza de la enfermedad varía de acuerdo al serotipo y es así que S.Typhi y S.Parathyphi producen cuadros septisémicos y fiebres entéricas y otros serotipos producen síntomas como nauseas vómitos, dolor abdominal, fiebre y diarrea. El período de incubación de la enfermedad es desde las 6 hasta 48 hrs dependiendo de la dosis infectante la que puede ser desde 15 a 20 UFC para algunos serotipos. No todos los serotipos son patógenos para el hombre y animales. La incidencia de salmonelosis se ha visto incrementada en los ultimos 20 años estimándose que los casos anuales van desde 740.000 a 5.000.000 de los cuales no más del 1% es detectado. Los factores más importantes para su control pasan por una adecuada educación al consumidor y por la implementación y mantención de adecuados controles de calidad por parte del laboratorio de la industria de alimentos la que preferentemente utiliza métodos rápidos para realizar screening en sus productos mediante kits rápidos los que son eficientes en detectar partidas negativas, pero en el caso de reacciones presumiblemente positivas se debe confirmar con los métodos convencionales. 227

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Una de las fuentes principales son los alimentos contaminados con éste microrganismo especialmente los alimentos de origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas. Los alimentos se analizan para pezquizar Salmonella por las siguientes razones: a. Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria. b. Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Salmonella. Es la segunda causa más común de enfermedades transmitidas por alimentos. Es responsable de millones de casos al año de enfermedades transmitidas por alimentos; Origen: huevos crudos y mal cocidos, pollos y carnes mal cocidas, productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales. Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son: -carne (vacuno, cerdo, pollo), -productos cárneos (jamón, salame, vienesas), -ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo), -productos de pastelería (cremas) y -productos lácteos (queso, queso de cabra, etc).

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Los métodos para su detección en alimentos están basados fundamentalmente en que generalmente su presencia está en un menor número que el de la flora acompañante que es muy diversa. En el laboratorio de alimentos, los métodos convencionales para su recuperación consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de: -preenriquecimiento -enriquecimiento -siembra en agares selectivos, -pruebas bioquÍmicas y -serotipificación Existen Métodos Rápidos que han sido aprobados por AOAC y algunos han sido reconocidos por el FDA como buenas alternativas a los métodos convencionales. Sin embargo, los resultados positivos de estos métodos deben confirmarse con el método convencional. La metodología que se emplea en el laboratorio para el aislamiento de Salmonella difiere del método empleado en muestras clínicas debido a varios factores entre los cuales estarían: - El Nº de células es usualmente más bajo que en muestras clínicas - Los procesos tecnológicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria. - La constitución propia del alimento: nutrientes, pH, aw influyen en la sobrevivencia o en su multiplicación. - La presencia en los alimentos de substancias tóxicas para las bacterias. Dependerá del grado de injuria o estrés de las células, lo cual está relacionado con los procesos tecnológicos aplicados. (deshidratación, congelación, calor etc.) y en aquellos alimentos en que se espera un bajo número de bacterias. El preenriquecimiento es realizado en medios líquidos (agua peptonada, caldo nutritivo, caldo lactosado etc ) que son medios no inhibidores del resto de la flora acompañante.sin embargo es importante que en la elección del medio a utilizar se considere el grado de injurias subletales derivadas del proceso tecnológico.

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En el caso del agua peptonada tamponada (ph7.2) ésta asegura la mantención del pH durante 24horas, lo que sumado al período de incubación permite el incremento de células que son sensibles a la disminucion del pH. A éstos medios se les puede adicionar sustancias que contraresten las subtancias inhibidoras que están presentes en algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella. El enriquecimiento selectivo está destinado a inhibir la flora acompañante. Al estar adicionados de substancias químicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura de incubación óptimas permite su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos o por otras pruebas de identificación. Normalmente el rango de Tº de incubación vá de 35ºC a 43ºC por períodos de 16 a 24 h. Comúnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verde brillante, tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesioverde malaquita de RappaportVassiliadis (RV). La detección en agares selectivos cuyos agentes principales de inhibición son sales biliares, desoxicolato, verde brillante, bismuto de sulfito y antibióticos, la diferenciación de Salmonella de otros microorganismos es usualmente determinado por los cambios de color del indicador que se detecta por cambio de pH y que corresponde a la fermentación de lactosa o sacarosa; asimismo la producción de H2S o la descarboxilación de lisina y de la ornitina. En microbiología alimentaria comúnmente se utiliza agares como xilosa-lisina dexocicolato (XLD), bismutio sulfito, verde brillante con o sin sulfadiazina, Hecktoen, MacConkey, desoxicolato citrato y Salmonella-Shigella (SS). Se deberían estandarizar para uso, dos de estos medios dada la complejidad y variedad de serotipos, los que presentan diversidad en su fisiología y a la variedad de flora acompañante presente en los alimentos. En los procedimientos de identificación final es recomendable que los cultivos con colonias poco aisladas o con variedad de flora realizar un reaislamiento en un agar nutritivo y posteriormente sembrar en TSI y LIA además de MIO.

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En general Salmonella es negativa a las pruebas de,ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a las pruebas de descarboxilación de lisina y ornitina, así como generalmente producen H2S, pero existen variantes atípicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilación de lisina. La serotipificación es importante sobre todo desde el punto de vista epidemiológico en que además el estudio se completa con determinación de biovariedades y fagotipificación. Ademas de pruebas de sensibilidad a bacteriocinas o resistencia a antibióticos y plasmidios.

Limites para el crecimiento de Salmonella cuando otras condiciones (por ej: temperatura, pH, aw) son óptimos. Esta tabla muestra las condiciones óptimas de temperatura, pH y aw que favorecen el desarrollo de Salmonella. Efectos sinérgicos y antagónicos así como condiciones inherentes a la serovariedad pueden influir para modificar los valores. Debido a que el período de incubación es más largo a bajas temperaturas es recomendable monitorear durante el almacenaje a 100 células /g o ml. Se aplica la técnica NMP en productos en los cuáles el número de S. aureus es bajo, como por ejemplo en alimentos deshidratados o congelados. También es útil en alimentos que contengan una gran población de especies competitivas. Aunque el género Staphylococcus está integrado por un amplio número de especies con posibilidad de producir enterotoxinas es indudable que S. aureus es con mucho la que presenta un mayor porcentaje de cepas enterotoxigénicas y por lo tanto productoras de intoxicaciones por alimentos. La presencia de estafilococos en alimentos puede deberse a una procedencia endógena como consecuencia de infecciones de origen animal, o exógena, a partir de manipuladores fundamentalmente. La investigación de los brotes de intoxicación estafilocócica diagnosticadas en los últimos años señala que la procedencia humana de estos procesos es más frecuente que la animal. Procedimiento: Preparar un homogeneizado del alimento (10 g) en agua de peptona (90 ml) como se ha descrito para los recuentos de microorganismos viables. Pipetear 0,1 ml del homogeneizado inicial (1/10) y de la dilución 1/100 y depositarlo en la superficie de sendas placas de Petri con el medio de Baird-Parker solidificado. Extender con varilla de vidrio previamente esterilizada por inmersión en alcohol y posterior flameado. Incubar a 37ºC durante 24 – 48 h y contar el número de colonias que aparecen en las placas. Se consideran estafilococos sospechosos de ser enterotoxigénicos los que dan colonias de color negro, convexas y rodeadas de un halo más claro en el medio de BairdParker.

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Pruebas confirmativas para estos microorganismos son la prueba de la DNAsa y la de la coagulasa. La desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patógenas de S. aureus. A partir de las colonias típicas crecidas sobre Baird-Parker se siembra una estría sobre la superficie del agar DNAsa. Se incuba durante 24 horas a 37ºC. Sobre el crecimiento se vierte HCl 1N y se espera unos minutos a que se produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente alrededor del crecimiento. En un tubo de 10x75 mm se vierten 0,3 ml de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se le añade una colonia típica y se observa a partir de los 30 minutos. La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.

S. aureus, por ser telurito positivo origina unas colonias negras. Se siembran las diluciones en superficie del medio ya solidificado (0.1ml) S. aureus, por ser telurito positivo origina unas colonias negras. Se siembran las diluciones en superficie del medio ya solidificado (0.1ml)

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Se observan las colonias negras con los halos opacos de lipólisis, y los halos claros de protéolisis típicos de S. aureus.

La producción de coagulasa por parte de una cepa de S. aureus sugiere la producción de enterotoxinas. Se observa el coágulo adherido al fondo del tubo

Algunas cepas no producen el coagulo que se adhiere al fondo del tubo, sin embargo, la aglutinación del plasma se considera como positiva. Solo estas cepas productoras de coagulasa son de interés en alimentos

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Una característica típica de S. aureus y que lo diferencia de S. epidermidis es la beta hemólisis. Se observa el halo beta hemolítico alrededor de las colonias de S. aureus en agar sangre

Por lo general, las cepas de S. aureus presentan un pigmento amarillo que es observable en Agar nutritivo o en SPC

Aqui se observa un Staphylococcus manitol (-) en el medio Vogel Jhonson. S. aureus se caracteriza por ser manitol positivo

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6. BACILLUS CEREUS

En los alimentos sospechosos sólo se requiere la determinación cuantitativa de B. cereus que, para tener importancia, debe alcanzar valores grandes. Los medios selectivos empleados para el recuento de este microorganismo (Holbrook y Anderson, 1980) llevan frecuentemente polimixina ya que Bacillus sp., no es afectado por este antibiótico. A menudo se les incorpora un sistema indicador a base de yema de huevo y posiblemente manitol, junto con un indicador de pH. B. cereus se identifica, de forma presuntiva, por la zona opaca que rodea las colonias después de 24 horas de incubación a 37º C, zona que es igual a la observada en S. aureus cultivado en medios con yema de huevo. B. cereus no fermenta el manitol por lo que sus colonias son pálidas, con una coloración púrpura del agar que las rodea, mientras que las bacterias fermentadoras del manitol dan unas colonias amarillas.

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• • •

Son bacterias Gram positivas, familia bacillaceae Aerobio y anaerobio facultativo Esporulado: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta. • Crecen entre los 10° - 48º C, la temperatura óptima es entre 28° - 35º C. • Generalmente son móviles con flagelos perítricos. • Poseen antígenos somáticos y flagelares y de esporas. • Las reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan reacciones cruzadas con otros géneros. • Los antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias esporas • pH = 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95. • Para la germinación en el momento que se agota el medio, al final de la fase exponencial ocurre la esporulación porque son menos exigentes. La germinación de las esporas es a 30º. Las esporas son moderadamente resistentes al calor. Resisten 100º durante 5-10 minutos. Entre las enzimas y toxinas producidas por ésta bacteria, podemos encontrar: Lecitinasa (fosfolipasa), se puede detectar porque estos microorganismos dan lugar a una reacción típica de precipitación cuando crecen en medios con yema de huevo. Es una sustancia que puede estar relacionada con efectos necróticos de células intestinales. Hemolisina, produce la lisis de glóbulos rojos Factor letal, produce la muerte de conejos cuando se inyectan por vía endovenosa. Factor de permeabilidad vascular, produce alteraciones en vasos sanguineos ya que altera su permeabilidad. Toxina necrótica, relacionada con la lecitina y produce necrosis de las células del epitelio intestinal Toxina emética, produce vomitos. Toxina estable a 126º durante 90 minutos. Estable a pH 2 y 11 durante 2 horas, puede sobrevivir en los alimentos. Factor del asa ileal de conejo, origina diarrea y salida de líquido en experimentación. Todas estas sustancias se producen a lo largo de la fase exponencial o al final de la misma por las células vegetativas El Bacillus cereus, es: • • • •

Ubicuo Se puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e industrializados Cuando se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica aparente Se empezo a asociar a alimentos en los años 50.

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•

En los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados, pero si se dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas, conviene enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración. • En la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no son esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la posterior germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser detectado. • Alimentos que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras, sopas, salsas, ensaladas, arroz hervido. Como cuadro clínico clásico de intoxicación, tendremos: Síndrome emético, nauseas y vomitos se producen al cabo de 1 – 5 horas, la diarrea no es tan frecuente. Síndrome diarreico, período de incubación de 8 a 10 horas, dolor abdominal y diarrea, la clínica desaparece a las 12 – 24 horas. En un brote de intoxicación va a ser fácil identificarla, mientras que cuando se encuentra en número bajo es más complicado por acciones competitivas. En agar manitol, las colonias aparecen rodeadas de un halo de precipitación blanco sobre fondo rosa-rojo-violeta, las que fermentan el manitol de color amarillo, a las 24 horas las colonias son circulares y lisas, a las 48 horas grandes y rugosas con estrías, nº de colonias x factor de dilución = nº U.F.C. / g. Las colonias sospechosas se trnasfieren a un agar nutritivo y se incuba. Sembramos en agar para anaerobios sin glucosa ni indicador, sembramos en picadura, se añade parafina, incubamos a 31º 24 hora, si hay crecimiento es Bacillus cereus.

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Caldo glucosa sin fosfato, prueba de Voges Proskaguer (VP+), detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y añadir cristales de creatina para que la reacción sea más rápida. Agar nutritivo glucosa, incubar a 31º 24-48 horas, se realiza la tinción con fuschina y el polihidroxibutirato (material de reserva) no se tiñe. Caldo nitrato, la prueba es positiva si hay transformación del nitrato en nitrito. Movilidad, se siembra en agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo es movil crece por todo el medio. Se puede calcular el NMP cuando se sospecha que el alimento tenga menos de 10 UFC/ml. A partir de diluciones decimáles se siembran en: caldo tripticasa a 31º durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se confirma. Como medidad de prevención y control, observaremos: • • • •

Evitar que se multipliquen en los alimentos Cocinar los alimentos antes de servirlos Enfriarlos rapidamente y refrigerar Control en los platos preparados

Se homogenizan 10g del alimento en 90ml peptona 0.1%

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Se hacen las diluciones necesarias en tubos con 9ml de peptona 0.1%

Se siembra en superficie 0.1ml en la superficie del agar Se siembra en superficie 0.1ml en la superficie del agar, incubandose 24 hs a 37° C (Agar para B. cereus)

Se observan las colonias típicas de B. cereus: cerosas, con halo de lecitinasas y manitol negativo en este medio

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7. FLORA MICÓTICA TOTAL (Mohos y Levaduras) Levaduras y mohos, constituyentes de la flora micótica total a investigar, generalmente se han cultivado en medios de pH bajo (3,5 - 5,5) y a temperaturas de 20° - 30º C si bien muchas bacterias crecen en estas condiciones. Para inhibir las bacterias se utilizan antibióticos de «amplio espectro» que incorporados a los medios de cultivo inhiben el crecimiento de aquéllas. Un medio típico es el agar oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura, que lleva como agente selectivo oxitetraciclina y entre otros nutrientes glucosa y que se ajusta a un pH relativamente alto, aproximadamente 6,5. Los métodos de ensayo de las aflatoxinas difieren algo, dependiendo del alimento. Generalmente el alimento se pica suficientemente y a continuación se extrae con un solvente adecuado, como el cloroformo. Se purifica el extracto y la fase siguiente de detección implica algún tipo de cromatografía, generalmente en capa fina. Con el empleo de solventes que separan netamente las toxinas, se pueden comparar cualquier tipo de manchas que den fluorescencia bajo la luz UV con los correspondientes estándares.

Aspergillus sp. Conidióforo con abundantes conidios insertados en la porción terminal engrosada

Saccharomyces cerevisiae Célula de levadura en gemación

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El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no sólo del potencial de los mohos para deteriorar los alimentos, sino también del potencial de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre es sensible, así como su capacidad para provocar infecciones e incluso, reacciones alérgicas a personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. En cuanto al significado para la salud del consumidor, la acción de las levaduras es meramente infectiva. De todo esto se deduce que existe un riesgo potencial en la contaminación fúngica de los alimentos y, por ello, para conocer la calidad microbiológica de diversos productos, se procede a la evaluación de su tasa de contaminación por mohos y levaduras. Después del recuento se puede realizar una identificación aproximada de las colonias de levaduras y mohos que aparecen en la placa. La identificación de las levaduras conlleva una serie de pruebas fisiológicas y bioquímicas, por lo que la metodología en este punto se aproxima, en cierta medida, a los sistemas clásicos de identificación bacteriana. Las técnicas de identificación de mohos se encaminan, casi exclusivamente, al estudio de la morfología, tanto macroscópica como microscópica: crecimiento, aspecto de las colonias, características de las hifas, formación de exudado, pigmentos, micelio, esporas, etc. La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa. A partir de la serie de diluciones decimales se añade 1 ml de la dilución 1/10 y 1/100 en sendas placas de Petri vacías en las que se añade medio Rosa de Bengala con cloranfenicol (20 ml/placa aproximadamente) atemperado a 45 - 47ºC. Las placas se incuban, SIN INVERTIRLAS, a 24ºC durante 4 - 5 días. El recuento se realiza en la placa que presente un crecimiento entre 0 - 50 colonias. El crecimiento de mohos y levaduras se caracteriza por el aspecto algodonoso y cremoso de sus colonias, respectivamente. Para la identificación de mohos se coge un trozo periférico de una colonia y se homogeneiza en un porta sobre el que previamente se ha añadido una gota de lactofenol. Se protege la preparación con un cubre evitando que queden burbujas de aire. Se le añade una gota de aceite de inmersión y se observan al microscopio las esporas, los cuerpos fructíferos, el micelio, etc.

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MOHOS Y LEVADURAS EN AGAR ESPECIFICO (AGAR YGC CON CLORAMFENICOL)

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8. CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES

Contrariamente a lo que sucede con las salmonelas el aislamiento de un pequeño número de C. perfringens a partir de los alimentos no significa necesariamente que exista peligro de toxiinfección alimentaria; sólo cuando hay un gran número existe verdadero peligro, por lo que con este microorganismo las técnicas de recuento son imprescindibles. Se emplean las siembras (en placa, por vertido o «en superficie») de diluciones de homogeneizados del alimento, junto con medios selectivos. Se han desarrollado muchos de estos medios para C. perfringens: la mayoría a base de agar, al que se incorporan los nutrientes más convenientes, sistemas indicadores y agentes selectivos. La ICMSF ha estudiado comparativamente los métodos de enumeración de C. perfringens de los alimentos y ha concluido que el agar sulfito-cicloserina proporciona las mayores recuperaciones de esta bacteria, además del número más bajo de falsos positivos (Hauschild et al., 1977). 256

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Este medio contiene cicloserina, un antibiótico, y además un sistema indicador que se basa en que C. perfringens, como otros muchos clostridios, reduce el sulfito o sulfuro, dando colonias negras en presencia de una sal de hierro. Después de la incubación de las placas en anaerobiosis a 37 ºC durante 24 horas, las colonias sospechosas se inoculan en un medio confirmativo, observando la movilidad (C. perfringens es inmóvil) y la capacidad de reducir los nitratos a nitritos. Otra prueba confirmatoria consiste en sembrar las colonias sospechosas en placas de agar yema de huevo, a una de cuyas mitades se le añade antitoxina de C. perfringens. Después de la incubación las colonias crecidas en la mitad de la placa carente de antitoxina, están rodeadas de una zona opaca (reacción de Nagler), mientras que las de la otra mitad no muestran cambios ya que la reacción ha sido específicamente neutralizada por la antitoxina. C. botulinum corrientemente no se enumera en los alimentos y las pruebas que con él se emplean implican generalmente la detección de toxinas botulínicas en el alimento y el aislamiento de C. botulinum, seguido de la detección de sus toxinas. Debe tenerse un cuidado extremo al analizar los alimentos sospechosos y es necesario el consejo de un experto antes de embarcarse en tales análisis. Si se dispone de buen laboratorio los homogeneizados de alimentos se pueden examinar directamente al microscopio poniendo de manifiesto la presencia de células enteras y de esporas con ayuda de las técnicas de tinción fluorescente.

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También deben sembrarse en estría muestras de alimentos en agar sangre, preferiblemante con yema de huevo para que se obtenga después de una incubación de 3 días a 30º C en anaerobiosis la típica reacción de color de C. botulinum (esto es, una zona opaca alrededor de la colonia y una «capa perlácea» en la superficie). Las colonias sospechosas se siembran después en caldo de carne cocida y en el líquido sobrenadante se investiga la presencia de toxina botulínica después de un tiempo de incubación suficiente. (el ensayo de la toxina se realiza a veces en caldo de carne inoculado directamente con muestras del alimento sospechoso). Finalmente en los extractos del alimento original puede intentarse el ensayo directo de la toxina.

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En esencia los ensayos implican la inoculación de los extractos del alimento o de los sobrenadantes de los cultivos a ratones, de los que algunos se han protegido con antitoxinas A, B o E mientras que otros no lo han sido. Los ratones inoculados se observan algunos días y si mueren los que no se protegieron con las correspondientes antitoxinas con los signos típicos de botulismo, mientras que viven los que lo fueron con la antitoxina específica, la prueba es positiva al correspondiente tipo de C. botulinum. Antes se han descrito los métodos de aislamiento de Clostridium botulinum, C. perfringens y Bacillus cereus, pero puede necesitarse la enumeración del número total de microorganismos esporulados del alimento. Como medida preliminar, las muestras o diluciones que los contengan deberán calentarse a 80º C durante 10 minutos para destruir todas las células vegetativas, después se enfrían y siembran. El calentamiento estimula la germinación de las esporas (choque térmico), proceso que frecuentemente es difícil de iniciar sin un estímulo adecuado. Para el recuento de Bacillus sp. se utilizan medios nutritivos estándar, incubándose aeróbicamente. Obviamente los miembros de este grupo que se encuentran en forma vegetativa en los alimentos, no se incluyen en el recuento. Para los clostridios se necesita incubar en jarras cerradas cuyo aire es sustituido por hidrógeno. los clostridios anaerobios obligados requieren la inclusión en la jarra de un catalizador, como el paladio que convierte el oxígeno residual en agua, al combinarse con el hidrógeno. A veces se realiza un preenriquecimiento preliminar de la muestra, diluida en un medio de carne cocida, sin embargo, para verificar el recuento, es preferible la siembra directa en un medio sólido, nutritivamente complejo. Generalmente se emplea el medio diferencial reforzado para clostridios (Differential Reinforced Clostridial medium) de Gibbs y Freame, que, aunque líquido presenta muchas ventajas. los recuentos son mayores que en medios sólidos y no se requieren jarras anaeróbicas. No pueden hacerse recuentos exactos, pero si se inoculan diluciones decimales se obtienen cifras que se encuentran en un rango de valores que difieren en un factor de diez (por ej., > 1.000 pero