Radicales Libres y Estrés Oxidativo. Aplicaciones Médicas

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ADICALES LIBRES

Y ESTRÉS OXIDATIVO .

APLICACIONES

MÉDICAS

EL LIBRO MUERE CUANDO LO FOTOCOPIA AMIGO LECTOR: La obra que usted tiene en sus manos posee un gran valor. En ella, su autor ha vertido conocimientos, experiencia y mucho trabajo. El editor ha procurado una presentación digna de su contenido y está poniendo todo su empeño y recursos para que sea ampliamente difundida, a través de su red de comercialización. Al fotocopiar este libro, el autor y el editor dejan de percibir lo que corresponde a la inversión que ha realizado y se desalienta la creación de nuevas obras. Rechace cualquier ejemplar “pirata” o fotocopia ilegal de este libro, pues de lo contrario estará contribuyendo al lucro de quienes se aprovechan ilegítimamente del esfuerzo del autor y del editor. La reproducción no autorizada de obras protegidas por el derecho de autor no sólo es un delito, sino que atenta contra la creatividad y la difusión de la cultura. Para mayor información comuníquese con nosotros:

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ADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO .

APLICACIONES

MÉDICAS

DRA. MINA KONIGSBERG FAINSTEIN Profesora titular C. Responsable del Laboratorio de Bioenergética y Envejecimiento Celular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa, México, D.F.

ERRNVPHGLFRVRUJ Editor responsable: Dr. Martín Martínez Moreno Editorial El Manual Moderno

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas D.R. © 2008 por Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. ISBN-10: 970-729-321-7 ISBN-13: 978-970-729-321-2 ISBN: 978-607-448-150-1 Versión Electrónica Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. núm. 39 Todos los derechos reservados. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en sistema alguno de tarjetas perforadas o transmitida por otro medio —electrónico, mecánico, fotocopiador, registrador, etcétera— sin permiso previo por escrito de la Editorial. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording or otherwise, without the prior permission in writting from the Publisher.

Konigsberg Fainstein, Mina. Radicales libres y estrés oxidativo : aplicaciones médicas / Mina Konigsberg Fainstein. — México : Editorial El Manual Moderno, 2008. xxiv, 623 p. : il. ; 23 cm. Incluye índice ISBN 978-970-729-321-2 1. Radicales libres (Química). 2. Radicales libres (Química) – Patofisiología. 3. Estrés oxidativo – Patofisiología. 4. Antioxidantes – Mecanismo de acción. I. t. 616.07 KON.r.

Biblioteca Nacional de México

Director editorial: Dr. Alfredo R. Boyd Filós Editora asociada: Lic. Vanessa B. Torres Rodríguez Coordinador de diseño: Esteban Gutiérrez Hernández Diseño de portada: D.G. Jorge Alberto Muñoz Manzo

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OLABORADORES

Dra. Beatriz Aguilar-Maldonado Técnico Académico Titular A, Departamento de Neurociencias, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F. Dr. Héctor Bourges Rodríguez Director de Nutrición, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F. Dr. Alberto Boveris Investigador Superior de CONICET. Profesor Titular de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Dr. Alejandro D. Boveris Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Dra. Leticia Bucio Ortiz Profesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. M. en C. Beatriz Buentello Volante Estudiante de Doctorado, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. ❚V❚

VI • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

M. en C. Noemí Cárdenas-Rodríguez Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM, México, D.F. Dr. Luis F. Covarrubias Robles Investigador Titular C, TC Definitivo. Jefe del Laboratorio de Degeneración y Regeneración Tisular del Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, UNAM, México, D.F. Med. Gin. Dra. Beatriz Cuevas Bahena Deidry Médico Ginecoobstetra, Servicio de Ginecología y Obstetricia, Centro de Especialidades Médicas “Sinaí”, Zacatepec, Mor. México. Dra. Andrea M.G. De Vizcaya Ruiz Investigadora Titular 3A, Sección Externa de Toxicología, CINVESTAV-Zacatenco, México, D.F. Dra. Luz María del Razo Investigadora Titular, Sección Externa de Toxicología, CINVESTAV-Zacatenco, México, D.F. M. en C. Fernando Díaz de León Sánchez Profesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dr. Rafael Díaz Sobac Profesor-Investigador, Instituto de Ciencias Básicas, Programa de Maestría en Ciencias Alimentarias, y Director de la Facultad de QFB. Universidad Veracruzana, Veracruz, Ver. México. M. en C. Blanca Farfán Labonne Estudiante de Doctorado, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Sandra Fernandes Arruda Instituto de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Celular, Laboratorio de Biofísica, Universidad de Brasilia, Brasil. Dr. José C. Fernández-Checa Profesor de Investigación, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de Barcelona, España.

Colaboradores • VII

Dr. José Carlos García Investigador Titular. Académico Titular de la Academia de Ciencias de Cuba, Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, Universidad Médica de La Habana, Cuba. Dra. Carmen García-Ruiz Científico Titular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de Barcelona, España. Dra. Erika Olivia Gómez González Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F. Dr. Luis E. Gómez Quiroz Profesor Titular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Ma. Concepción Gutiérrez Ruiz Profesora Titular C. Responsable del Laboratorio de Fisiología Celular y Coordinadora Divisional de Posgrado, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dr. Wilhelm Hansberg Torres Investigador Titular C, Departamento de Bioquímica, Jefe de Laboratorio, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F. Dra. Elizabeth Hernández Pérez Profesora Titular C. Jefa del Área de Bioquímica y Fisiología Celular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. María de Jesús Ibarra Sánchez Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F. Dr. Josep Maria Lluis Duquez Investigador Asociado, Departamento de Hepatología, Hospital Clínico de Barcelona, Universidad de Barcelona, España.

VIII • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Dra. Norma E. López-Diazguerrero Profesora Titular B, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Rebeca López Marure Investigador Titular, Departamento de Fisiología, Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez, México, D.F. Dr. Egle Machado de Almeida Siqueira Instituto de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Celular, Laboratorio de Biofísica, Universidad de Brasilia, Brasil. Dr. Marcelo Hermes Lima Investigador CNPq 2A, Grupo de Pesquisa em Radicais de Oxigênio (GPRO). Departamento de Biología Celular, Universidad de Brasilia, Brasil. Dra. Helena Gennari Medeiros Marisa Profesor Titular, Grupo de Pesquisa: Radicais livres e lesões em biomoléculas. Instituto de Química, Universidad de Sao Pablo, Brasil. M. en C. Omar Noe Medina-Campos Técnico Titular B, TC, Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM, México, D.F. Dra. Graciela Meza Investigador Titular C, Departamento de Neurociencias, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F. Dra. María del Pilar Milke García Coordinadora de Investigación y Servicio Social en Nutrición, Departamento de Gastroenterología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F. Dr. Luis D. Miranda Gutiérrez Investigador Titular, Departamento de Síntesis Orgánica. Instituto de Química, UNAM, México, D.F. Dr. Albert Morales Muñoz Investigador Asociado, Departamento de Hepatología, Hospital Clínico de Barcelona/IDIBAPS, España.

Colaboradores • IX

M. en C. Marisol Orozco-Ibarra Estudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas, Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM, México, D.F. M. en C. Anadia Osoria Pérez Investigador Agregado, Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, Universidad Médica de La Habana, Cuba. Dr. José Pedraza-Chaverrí Profesor Titular, T.C., Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM, México, D.F. Dr. Leonardo Peraza Reyes Departamento de Bioquímica, Instituto de Fisiología Celular, México. Adscripción actual: Investigador Posdoctoral en Institut de Génétique et Microbiologie, Francia. M. en C. Náyade Pereira Roche Investigador Agregado, Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, Universidad Médica de La Habana, Cuba. Dra. Laura J. Pérez Flores Profesor Titular C, Responsable del Laboratorio de Fisiología Vegetal, Jefa del Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Eva Philipp Alfred-Wegener, Profesor Asociado, Instituto de Investigación Polar y Marina, Alemania. Dr. Enrique Piña Profesor Emérito de Carrera, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM, México, D.F. Dra. Gabriella R. Ramos-Vasconcelos Ansiva, Brasilia, Brasil. Dr. Félix Recillas Targa Investigador Titular. Jefe de Laboratorio, Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F.

X • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Dra. Marisa G. Repetto Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Dr. Fernando Rivera Cabrera Profesor Titular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Rocío Salceda Sacanelles Investigador Titular C, TC, Profesor de Asignatura B. Jefe de Laboratorio, Departamento de Neurociencias, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F. Dra. Yolanda Saldaña Balmorí Profesor Asociado C, TC, Definitivo. Presidenta de la Sociedad Mexicana de Profesores de Bioquímica. Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina, UNAM, México, D.F. Dr. Abel Santamaría del Ángel Investigador en Ciencias Médicas E, TC, Responsable del Laboratorio de Aminoácidos Excitadores, Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía Manuel Velasco Suárez, México, D.F. Dra. Verónica Souza Arroyo Profesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F. Dra. Laura B. Valdéz Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. M. en C. José Luis Ventura Gallegos Técnico Académico, Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Dr. Alexis F. Welker Profesor Asociado, Alfred-Wegener, Instituto de Investigación Polar y Marina, Alemania. Dra. Martha Zentella de Piña Profesor Titular B, TC, Definitivo, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM, México, D.F.

Colaboradores • XI

Dr. Alejandro Zentella Dehesa Investigador Titular, Departamento Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Investigador en Ciencias Medicas, Jefe del Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F.

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Dra. Tania Zenteno Savin Investigador Titular A, Programa de Planeación Ambiental y Conservación, Coordinadora de la Comisión de Ética y Co-coordinadora del Programa de Acercamiento de la Ciencia a la Educación (PACE), Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), La Paz, BCS, México.

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ONTENIDO

Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XVII Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIX Breve introducción histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XXI

Sección I. Química de los radicales libres 1. Química de los radicales libres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

Sección II. El dioxígeno y sus especies reactivas 2. El dioxígeno y sus especies reactivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25

Sección III. Orígenes de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno 3. Cadena respiratoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. Sistemas microsomales de monooxigenasas, citocromo P450 . . . . . . . . . 5. NADPH oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. Xantina oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49 61 73 85

Sección IV. Daño a blancos celulares 7. Daño a proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 8. Daño al DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 9. Daño a lípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 ❚ XIII ❚

XIV • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

10. Concepto epigenético y sus alteraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

Sección V. Antioxidantes 11. Superóxido dismutasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. Catalasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13. Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14. Tiorredoxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15. Hemooxigenasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16. Glutatión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17. Potencial antioxidante de los carotenoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. Potencial antioxidante del ácido ascórbico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19. Potencial antioxidante de los α-tocoferoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. Polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

169 183 201 219 233 253 269 279 291 303

Sección VI. Estrés oxidativo 21. Concepto de estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319 Sección VII. Especies reactivas y enfermedades 22. Hipoxia/reperfusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23. ERO y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24. Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas . . . . . . . . . . . . . . 25. Daño oxidativo y enfermedades hepáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26. Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda . . . . . . . . 27. ERO y disfunción endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28. El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído . . . . . . . . . . . . . . . . 29. Estrés oxidativo y retinopatías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30. ERO, envejecimiento y senescencia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31. Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas asociadas a la contaminación ambiental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sección VIII. Aspectos fisiológicos relacionados a las especies reactivas 32. ERO y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33. ERO y señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34. Especies reactivas de oxígeno en las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35. Vida animal en ambientes extremos, papel de los radicales libres y los antioxidantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36. Estrategias para determinar la relevancia fisiológica de las especies reactivas de oxígeno en animales completos . . . . . . . . . . .

331 347 359 377 395 415 423 435 447 459

477 487 501 525 543

Contenido • XV

Sección IX. Nutrición 37. Aspectos nutriológicos de los carotenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38. Aspectos nutriológicos de la vitamina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39. Aspectos nutriológicos de la vitamina E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40. Actividad física y estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

561 579 595 613

A

Quisiera agradecer a la Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa (UAMI), en particular al Departamento de Ciencias de la Salud, así como al CONACYT, que ha apoyado a la mayor parte de los científicos que participamos en este libro, para que pudiéramos adentrarnos e investigar parte de lo que aquí se ha plasmado. Agradezco a todos los investigadores que accedieron a acompañarme en esta aventura y que escribieron sus capítulos, aun y cuando la publicación de este libro parecía algo inalcanzable, y a sabiendas de que tal vez nunca verían la luz. Muchas gracias por confiar en mí. En particular al Dr. Wilhelm Hansberg Torres, por todas sus sugerencias. Asimismo, y de una manera muy especial, agradezco a los alumnos de mi laboratorio en la UAMI (Laboratorio de Bioenergética y Envejecimiento Celular), por todo su trabajo y dedicación, así como a los alumnos de la licenciatura en Biología Experimental, ya que todos ellos han sido el motor que nos estimula para realizar esfuerzos como éste. Por último, y con todo mi cariño, agradezco a mis padres, a mis hijas Ariela, y Liora, y a mi esposo Samy, por apoyarme, y aguantarme siempre. Dra. Mina Konigsberg Fainstein

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GRADECIMIENTOS

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RÓLOGO

En la actualidad, no existe un libro en español que abarque de una forma clara y completa los temas relacionados a los radicales libres, como para que pueda ser utilizado por estudiantes de pre y posgrado. De manera que el objetivo del este libro titulado: Radicales Libres y Estrés Oxidativo. Aplicaciones médicas, es doble. Por un lado, la idea consiste en tratar de exponer todos los conceptos básicos y generales, relacionados con los radicales y el estrés oxidativo, de un modo sencillo y didáctico, para que los alumnos que cursan las licenciaturas del área de ciencias biológicas y de la salud los entiendan, así como también pueda ser utilizado como libro de texto o consulta. Por otra parte, el hecho de que los capítulos fueron escritos por investigadores expertos en sus respectivos campos, es muy enriquecedor, ya que ellos son la gente que está haciendo ciencia en nuestro país, y en América Latina, esto sirve como ejemplo para que los alumnos se den cuenta de cómo y dónde se aplican los conocimientos que contienen este tipo de libros de texto. Un objetivo implícito de este texto, se relaciona con el hecho de que la mayoría de los capítulos fueron escritos por científicos mexicanos, lo que permitiría que en algún momento los alumnos puedan contactar a los investigadores directamente. Por último, quiero recalcar que el campo de los radicales libres y el estrés oxidativo es un área del conocimiento científico que está tomando mucha relevan-

❚ XIX ❚

XX • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

cia en cuanto al esclarecimiento del mecanismo de acción de una gran cantidad de fenómenos fisiológicos, así como de la explicación etiológica de diversas patologías. Es por ello que esta obra resultará una herramienta útil para los estudiantes e investigadores dentro del campo de las ciencias biológicas y de la salud. Dra. Mina Konigsberg Fainstein Iztapalapa, Ciudad de México, noviembre, 2007

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REVE INTRODUCCIÓN

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HISTÓRICA

Ahora sabemos que el superóxido se produce de manera normal en los organismos vivos expuestos al aire, pero que al mismo tiempo atenta contra su supervivencia. Sabemos que la familia de metaloenzimas llamada superóxido dismutasa (SOD) provee un sistema de defensa esencial y que la deleción de los genes para estas enzimas puede llevar de fenómenos de mutagénesis dependiente de oxígeno, auxotrofias nutricionales hasta la muerte. También sabemos que el superóxido (O2•), puede generar toda una progenie de especies reactivas. Por una reacción de difusión limitada con el óxido nítrico (NO•), el O2• produce peroxinitrito (ONOO–) que es un fuerte oxidante en sí mismo, el cual se homolisa a NO2 y radical hidroxilo (•OH). El O2• también oxida a los centros [4Fe-4S], que son grupos prostéticos de deshidrogenasas como la aconitasa, y al hacerlo desestabiliza la estructura de la enzima liberando Fe(II). Lo cual inactiva a las enzimas, además de que el Fe(II) que se encuentra libre es capaz de reducir al peróxido de hidrógeno (H2O2) generando al anión y al radical hidroxilo (–OH y •OH). Además el O2• puede iniciar la oxidación de un gran número de reductantes por mecanismos en cadena de radicales libres. Todo lo anterior y más, es ahora parte del conocimiento bioquímico establecido y convencional, sin embargo hace algunos decenios, todo lo anterior se habría considerado como un “cuento de hadas”.

❚ XXI ❚

XXII • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

“¿Cómo abrimos esta ventana en el mundo de la biología de los radicales libres? ¿Cómo nos dimos cuenta de estas entidades químicas, que por sus grandes reactividades tienen tan sólo una efímera vida media y existen sólo a concentraciones de muy bajo estado estacionario?” Todo empezó con un interés sobre la acción de la enzima xantina oxidasa que, mientras oxida a sus sustratos verdaderos, puede iniciar la oxidación por radicales libres del sulfito y producir quimioluminiscencia del luminol y de la lucigenina. Posiblemente lo más intrigante de todo, era que la enzima también causaba la reducción del citocromo c de manera dependiente de oxígeno. Esto era sorprendente puesto que en teoría, el oxígeno y el citocromo c deberían ser competidores en aceptar electrones. Una posible explicación podría haber sido que la reducción del citocromo se llevara a cabo por algún producto de la reducción del oxígeno como por ejemplo el peróxido de hidrógeno. Sin embargo, se demostró que el H2O2 no era capaz de reducir al citocromo c. ¿Podría entonces haber un intermediario entre el H2O2 y el oxígeno? Ese intermediario tendría que ser el O2•, que en ese momento sólo era conocido por los químicos dedicados a las radiaciones. Mi alumno de posgrado Joe McCord y yo aprendimos cómo preparar una solución estable de superóxido de terbutilamonio en un solvente no proteínico al asistir a un seminario de química. Rápidamente regresamos a nuestro laboratorio donde realizamos la hidrólisis del bromuro de terbutilamonio en una celda de dos cámaras que tenía un flujo de O2 burbujeando en el compartimiento del cátodo. La solución resultante de la sal del superóxido redujo al citocromo c e inició la oxidación de sulfito. Mientras estudiábamos la reducción del citocromo c por la xantina oxidasa encontramos un potente inhibidor de la reducción del citocromo, pero que al mismo tiempo, no inhibía la reacción de la xantina oxidasa. Este inhibidor, que se activaba en varias preparaciones comerciales del citocromo c, era abundante en eritrocitos, ya que se asilaba a partir de varios litros de sangre bovina. Como ya teníamos a la enzima Cu/ZnSOD, la inhibición de la reducción del citocromo c parecía ser un ensayo conveniente a realizar. Usando ese ensayo como nuestro guía, en poco tiempo aislamos a las enzimas MnSOD y FeSOD de Escherichia coli y a la MnSOD tetramérica de mitocondrias de hígado. Las SOD nos permitieron demostrar la participación del O2• en una gran variedad de reacciones. Mientras realizábamos estos trabajos fuimos objeto de innumerables controversias. Había personas que no aceptaban que el O2• se podía formar por acción de una enzima, y otras que no pensaban que la función real del las SOD pudiera ser la eliminación del radical O2•. Preferían pensar que las SOD eran proteínas almacenadoras de metales que incidentalmente catalizaban la dismutación del O2•. La persona que logró poner

Breve introducción histórica • XXIII

término a esta controversia fue Daniele Touati, quien deletó a la SOD de E. coli y reveló las deficiencias fenotípicas dependientes de oxígeno que aparecían en esta cepa, convenciendo de esta manera de su función. Una búsqueda en la literatura para superóxido dismutasa en 1968 hubiera dado como resultado una sola referencia. Una búsqueda similar el día de hoy arroja al menos 47 000 referencias. Claramente hemos aprendido mucho en los decenios transcurridas y el flujo de nuevos reportes no presenta ningún signo de detenerse, por lo que vendrán más. Los capítulos de este libro servirán como una entrada hacia esta absorbente campo del conocimiento.

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DR. IRWIN FRIDOVICH DUKE UNIVERSITY

S

ECCIÓN

QUÍMICA

DE LOS RADICALES LIBRES

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1. Química de los radicales libres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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I.

3

Q

1

UÍMICA DE LOS

RADICALES LIBRES Luis D. Miranda

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❚ ¿QUÉ

ES UN RADICAL LIBRE?

Las moléculas que constituyen las sustancias o los materiales son un conjunto de átomos unidos entre sí por enlaces químicos. La mayor parte de estos enlaces están constituidos por dos electrones (pares de e–), los cuales mantienen unidos a dichos átomos. Se dice que estos dos electrones están apareados porque cada uno tiene momentos magnéticos opuestos (spin electrónico) que se contrarrestan. Durante las transformaciones químicas se rompe alguno de los enlaces de la molécula y da lugar a la formación momentánea de especies intermediarias inestables que se transforman rápidamente y producen moléculas diferentes a las de partida. Se pueden formar diferentes intermediarios, dependiendo de cómo se rompe el enlace. En una fragmentación en donde sólo uno de los productos se lleva consigo todo el par de electrones del enlace que se rompe, se genera lo que se conoce como iones, y se dice que la reacción procede a través de una fragmentación heterolítica (figura 1-1). En este proceso, la especie que se lleva los dos electrones tendrá un electrón de más, y estará cargada negativamente (anión); por el contrario, la especie que se quedó sin el par de electrones tendrá un electrón de menos y quedará cargada positivamente (catión) (figura 1-1). Por

❚3❚

4 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 1)

A-B

Fragmentación homolítica

A•

+

B•

Reacción vía radicales libres

A-B

Fragmentación heterolítica

A

+

B

Reacción iónica

Figura 1-1. Fragmentación del enlace covalente.

otro lado, cuando en el transcurso de una reacción química se rompe un enlace, y cada uno de los componentes enlazados se lleva uno de los dos electrones que al principio constituía dicho enlace o par de electrones, se forman radicales libres y se dice que la fragmentación es homolítica (figura 1-1). De esta manera, un radical libre se define como un átomo o grupo de átomos que contiene un elec trón desapareado dentro de su estructura, es decir, es la existencia de un electrón que no tiene una pareja con spin opuesto dentro de un átomo o grupo de átomos. Los radicales libres se representan colocando un punto sobre el símbolo del átomo que contiene al electrón desapareado. En la mayor parte de los casos, estas especies son entidades altamente reactivas que tienen un tiempo de vida media menor de 1 μseg, y que se combinan para generar moléculas más estables. Formalmente, los radicales libres son especies neutras, lo cual significa que en su estructura electrónica se encuentra el mismo número de electrones y de protones.

❚ HISTORIA DE

LOS RADICALES LIBRES

Aunque el término “radical” fue utilizado por Lavoisier desde finales del siglo XVII y por algunos otros célebres investigadores durante el siglo XVIII, la historia de los radicales libres como intermediarios reactivos se inicia con los experimentos realizados por Gomberg en 1900. Con base en una serie de observaciones realizadas para la reacción del bromuro de trifenilmetano con plata, Gomberg propuso que el responsable de la coloración amarilla del producto en solución era el radical trifenilmetilo. Como era de esperarse, esta teoría fue completamente rechazada por la comunidad científica de su tiempo. Sin embargo, la evidencia experimental obtenida durante el decenio siguiente fue tan abundante que terminó por aceptarse. A partir de este descubrimiento, se empezaron a estudiar una gran variedad de reacciones químicas que involucraban la formación de radicales libres. De esta manera, se propusieron mecanismos de reacción, vía radicales libres, para la descomposición de los peróxidos orgánicos (R-O-O-R) utilizados ampliamente en la producción de polímeros, industria clave durante la Segunda Guerra Mundial. Mediante estos procesos se manufacturaron materiales que no sólo sustituyeron

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Química de los radicales libres • 5

al caucho natural que se utilizaba, sino que permitieron el desarrollo de nuevos materiales. Muchas de las observaciones realizadas hasta el decenio de 1960-1969 apuntaban a que los radicales libres eran especies de muy alta energía que reaccionaban indiscriminadamente en una reacción y que eran imposibles de controlar. De aquí nació el mito de los radicales libres salvajes y peligrosos. Sin embargo, durante el periodo entre 1950 y 1979, los fisicoquímico orgánicos hicieron grandes avances en la determinación de las constantes de rapidez de un gran número de reacciones radicales, lo cual derivó en una mejor comprensión del comportamiento de estas especies en el transcurso de una reacción. Estas investigaciones fueron aceleradas por el desarrollo de nuevas técnicas espectroscópicas para identificar los compuestos orgánicos. El desarrollo de la resonancia de spin electrónico (EPR, por sus siglas en inglés) ayudó a confirmar de manera precisa la presencia de radicales libres no sólo en reacciones típicamente orgánicas, sino que confirmó su presencia en un número considerable de procesos biológicos y atmosféricos. En ese tiempo, los investigadores empezaron a estudiar la descomposición de las grasas, aceites y algunos otros alimentos en presencia de oxígeno (procesos de autooxidación). De esta manera, se determinó que estos procesos involucran reacciones de radicales libres que se pueden retardar mediante la adición de ciertas sustancias que atrapan radicales; de ahí surgió lo que ahora se conoce como antioxidantes, que ayudan en la conservación de cierto tipo de alimentos. A partir del decenio de 1970-79, se desarrolló un número importante de reacciones, y empezaron a aparecer las primeras aplicaciones sintéticas, inicialmente para preparar moléculas pequeñas, y poco a poco para moléculas más complejas. En la actualidad, la química de radicales libres es un campo muy prolífero en todas sus facetas. Estas reacciones forman parte ya de las herramientas que un químico orgánico tiene para transformar una molécula.

❚ GENERACIÓN

DE RADICALES LIBRES

Un radical libre se forma cuando un enlace se fragmenta homolíticamente, para lo cual se debe suministrar la suficiente energía para disociar el enlace. Existen cuatro maneras de suministrar dicha energía: térmica, fotoquímica, radioquímica y por una reacción de oxidorreducción. Calor R-O-O-R

2-R-O•

Peróxidos

Figura 1-2. Disociación de los peróxidos.

6 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 1)

Térmica Para lograr romper la mayor parte de los enlaces covalentes y obtener radicales libres, es necesario exponerlo a temperaturas mayores a 800 °C. Esto hace pensar que una fragmentación térmica no sería práctica para la generación de radicales libres en un laboratorio experimental. Se puede decir que para que una reacción sea práctica experimentalmente debería realizarse al menos por debajo de los 200 °C. Para que un enlace se fragmente a estas temperaturas deberá tener energías de disociación menores de 30 a 40 kcal/mol. Existen algunos enlaces covalentes muy específicos que se disocian dentro de este rango de energías, entre ellos se encuentran los compuestos azo (adecuadamente sustituidos), peróxidos, ésteres de nitrito, y algunos ésteres de N-hidroxi-2-tiopiridona (figura 1-2).

Fotoquímica La energía de la luz de una longitud de onda entre 600 y 300 nm es de aproximadamente 48 a 96 kcal/mol, la cual es del orden de magnitud de las energías de disociación de los enlaces covalentes. Este rango de energía cae en la región de la luz ultravioleta, por lo que se puede utilizar irradiación de esta frecuencia para fragmentar ciertos enlaces y generar radicales libres. Por ejemplo, las moléculas de halógeno como la de cloro y algunos compuestos carbonílicos se pueden fragmentar irradiando con luz ultravioleta (figura 1-3).

Oxidorreducción Una reacción de oxidación o reducción puede generar radicales mediante la transferencia de un solo electrón. En una primera etapa, la transferencia de un electrón produce un radical cargado, es decir, radicales cationes [R-X]+• o radicales aniones [R-X]•, según sea el caso de una pérdida o la ganancia de un electrón, respectivamente (figura 1-4). Estas especies no son estables y se fragmentan

Cl-Cl

hv

2 Cl• 10

9 R

R O

hv

R

•

+

R•

O

Figura 1-3. Fragmentación por radiación con luz UV.

Química de los radicales libres • 7

R-X

-e-

+ R-X •

R•

+

X+

•

R•

+

X-

+eR-X

R-X

R-O-O-R

+

Fe(II)

R-O-O-R

R-O•

+

•-

+

Fe(III)

R-O

Figura 1-4. Ejemplo de reacciones de oxidación y de reducción.

espontáneamente a un radical R• y a un anión X– o catión X+. Un ejemplo típico de estas reacciones es la descomposición de los peróxidos en presencia de una sal de Fe (II) o Cu (I) (figura 1-4). En este caso, el peróxido R-O-O-R reduce al hierro (II) y forma un radical-anión [R-O-O-R]• que se fragmenta al radical alcoxicarbonilo R-O• y el alcóxido R-O–.

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Radioquímica En la mayor parte de lo casos en que la radiación γ incide sobre una sustancia orgánica, induce fragmentación de enlaces, que generalmente producen radicales libres.

ESTRUCTURA Los radicales libres se representan colocando un punto sobre el símbolo del átomo o grupo de átomos donde se encuentra el electrón desapareado. Sin embargo, queda la pregunta: ¿Cómo es realmente un radical libre? ¿Cómo es la estructura real de estas especies? ¿Cuál es la imagen asociada a la fórmula que se escribe en el cuaderno o que se ve en un libro cuando se representa un radical libre? No hay que perder de vista que lo que se escribe o se dibuja generalmente sólo son símbolos de un lenguaje que representan moléculas o procesos químicos reales. Como ejemplo, se analizará la configuración del átomo de carbono cuando se encuentra como radical libre, observando que tiene siete electrones en

8 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Orbital p atómico

Orbital híbrido

Radical etilo

(Capítulo 1)

Radical trifluorometilo

H3C

Carbono Sp2 trigonal plano

Carbono Sp3 piramidal

F

F

F

Radical alquilo sin grupos Radical alquilo con grupos electronegativos electronegativos

Figura 1-5. Distintas estructuras electrónicas para el átomo de carbono.

su capa de valencia con sólo tres sustituyentes. En realidad, existen dos posibles estructuras electrónicas para esta especie (figura 1-5). En la primera de ellas, el carbono tiene una hibridación sp2, por lo que el radical se encuentra en un orbital atómico p. La segunda posibilidad es cuando el carbono adopta una hibridación sp3, por lo que el radical necesariamente se encuentra en un orbital híbrido sp3. El carbono piramidal generado de esta configuración sufre inversión rápidamente. Algunos cálculos teóricos realizados para radicales sencillos señalan que la diferencia de energía entre estas dos estructuras es muy pequeña, por lo que el carbono puede adoptar cualquiera de las dos sin un costo energético significativo. Una de las consecuencias más importantes de este comportamiento es la formación eficaz de radicales en estructuras rígidas como los biciclos. De esta manera, se pueden formar radicales en los carbonos llamados “cabeza de puente” de una variedad de biciclos; por ejemplo, el radical de norbornano y de adamantano que se muestran en la figura 1-6. En estas moléculas es claro que debido a la rigidez en la estructura, es casi imposible que el carbono radical adopte una conformación trigonal plana, y sin embargo el radical se forma sin problemas. Como se muestra en la figura 1-7, también se pueden generar radicales en dobles y triples ligaduras, en los cuales el electrón desapareado está, ya sea en un

Radical del Norbornano

Radical del Adamantano

Figura 1-6. Estructuras de los radicales norbonano y adamantano.

Química de los radicales libres • 9

orbital sp2 o sp, según sea el caso. Para radicales sobre dobles ligaduras pueden existir radicales vinilo (enlace C=C), o bien fenilo cuando están sobre un sistema aromático e incluso acilo o iminilo cuando se encuentran en el carbono de un enlace doble C=O o C=N, respectivamente. Como se muestra en la figura 1-7, los radicales vinilo pueden sufrir inversión, por lo que la configuración cis/trans de la doble ligadura original se pierde durante la formación del radical. Cabe mencionar que se pueden generar también radicales centrados sobre una gran variedad de átomos, entre los más importantes destacan los radicales centrados sobre oxígeno, nitrógeno y azufre. De manera general, estos radicales son mucho más reactivos que los radicales centrados sobre carbono.

❚

ESTABILIDAD

Existen principalmente dos efectos que determinan la estabilidad termodinámica de un intermediario reactivo (catión, anión o radical libre): los efectos polares y los efectos de resonancia o conjugación. Los efectos polares o mejor conocidos como efectos inductivos, están determinados por la diferencia de electronegatividad entre los átomos que forman un

R

R-C C•

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Radical alquinilo

R1

R1

R1

C•

C

R3

R2

R2

R3

R3

R2

Radical vinilo Estructura del radical vinilo

O R3

N R — O•

•

Radical acilo

R3

•

Radical aminilo

R — N•

R — S•

R1 Radical alcoxilo

Radical aminilo

Figura 1-7. Inversiones de los radicales vinilo.

Radical tiilo

10 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 1)

enlace. Es decir, están directamente relacionados con la atracción que puedan tener los átomos o grupos funcionales por los electrones (polarización de los enlaces). Desde esta perspectiva, los sustituyentes de una especie o intermediario reactivo se clasifican como electrodonadores o electroatractores. Para intermediarios que tienen una carga real, cationes y aniones, el efecto es determinante. Por ejemplo, un carbocatión con deficiencia de carga será más estable teniendo como vecino a un grupo electrodonador, pero mucho menos estable cuando tiene de vecino a un grupo electroatractor. En contraste, es difícil pensar que los efectos inductivos afectan de manera significativa la estabilidad de un radical libre. Por su naturaleza neutra (mismo número de electrones que de protones), el radical no se ve muy afectado por la presencia de grupos electrodonadores o electroatractores. Los efectos de resonancia o conjugación se observan cuando existe la posibilidad del traslape del orbital del átomo donde se localiza la especie reactiva (el carbanión, el carbocatión o el radical libre) con otro orbital de un átomo vecino. Los efectos de conjugación permiten explicar mejor la estabilidad de los radicales libres. Por ejemplo, un radical vecino a una doble ligadura (radical alilo) es relativamente más estables que un radical alquilo simple, ya que en el primer caso existe la posibilidad de traslape entre el orbital que contiene el electrón desapareado y los orbitales π. El traslape de estos dos orbitales da lugar al fenómeno llamado deslocalización del radical, y es lo que en realidad confiere estabilidad adicional a la especie. El término deslocalizar significa que el electrón desapareado se reparte en más de un átomo de la molécula y no se centra sólo en el que lo tenía. De esta manera, no tiene que soportar al electrón desapareado uno solo de los átomos; cuando sucede esto, se dice que el radical está estabilizado por deslocalización.

❚ CARÁCTER

NEUTRO DE LOS RADICALES LIBRES

Por definición, los radicales libres son neutros, lo cual significa que tienen el mismo número de protones que de electrones. Esta característica le da a los radicales libres una serie de propiedades químicas únicas. Entre las más importantes que se pueden mencionar están: 1. Un radical puede reaccionar con otro radical. 2. Un radical no se ve afectado por su ambiente molecular; en otras palabras, no le afecta el cambio de polaridad de los disolventes. 3. Los radicales no se solvatan (es decir, no se rodean de moléculas de disolvente cuando están en solución), por lo que son entidades puntuales (más pequeñas).

Química de los radicales libres • 11

Grupo electroatractor

Traslape

•

•O

O

O •

R3

R3

R

R Radical electrofílico

•

H R3

• C

R3 •

R

R Radical estable por resonancia

Grupo electrodonador R

• •

Par de electrones libres R

•• NR 2

R

• C

•• NR2

C

• NR2

• •• R2

R

R

Radical nucleofílico

R

R2

Radical estable por resonancia

Electrónica

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Figura 1-8. Estructuras de resonancia y esquema de traslape de los orbitales en los radicales libres.

4. Un radical no reacciona con hidrógenos ácidos ni con heteroátomos con pares de electrones no compartidos. 5. Un carbocatión no reacciona con otro carbocatión, de hecho, se repelen electrostáticamente, lo mismo sucede con los carbaniones; debido a su carga formal, un carbocatión y un carbanión son muy influenciados por la polaridad de los disolventes, son especies mucho más voluminosas, ya que no pueden estar sin su esfera de solvatación; los carbaniones reaccionan con hidrógenos ácidos, y los carbocationes con grupos funcionales con pares de electrones no compartidos. Como consecuencia, cuando se realiza una reacción iónica, en la mayor parte de los casos se deben proteger ciertos grupos funcionales para que no se vean afectados durante la reacción. 6. En las reacciones vía radicales libres no son necesarias protecciones de grupos funcionales. Una consecuencia directa de la neutralidad de los radicales es que su estabilidad no se ve afectada por la electronegatividad de los grupos funcionales adyacentes al centro radical. Un radical libre con un grupo electroatractor adyacente puede ser tan estable como aquel que posee un CH4 + Br2

CH3Br + CH2Br2 + CHBr 3 + CBr 4

Figura 1-9. Reacción de halogenación (bromación) del metano.

12 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 1)

fragmentación 2 Br•

Br - Br homolítica

Figura 1-10. Reacción de iniciación.

grupo electrodonador como vecino. En la figura 1-8 se pueden observar las estructuras de resonancia y el esquema del traslape de los orbitales de ambos casos. 7. Un radical libre sí es afectado en su manera de reaccionar por los grupos a los que está unido, es decir, la electronegatividad de los grupos funcionales vecinos afecta la reactividad de un radical, pero no su estabilidad. Los grupos adyacentes dan un cierto carácter electrofílico o nuclefílico a un radical libre. Un radical que tiene un grupo carbonilo vecino es estabilizado por resonancia, como se muestra en la figura 1-8, y tiene un carácter electrofílico por la electronegatividad de dicho grupo. Este radical reacciona más rápido con dobles ligaduras ricas en electrones que con las que son deficientes de electrones. En el caso contrario, en que el radical está cerca de un grupo electrodonador, como lo es una amina, el radical es estabilizado por conjugación del orbital que alberga al electrón con el orbital del par de electrones no compartido del nitrógeno. Este radical tiene un carácter nucleofílico y, por tanto, reacciona más rápido con dobles ligaduras deficientes de densidad electrónica.

❚ MECANISMO

EN CADENA

La mayor parte de las reacciones de radicales libres proceden o se llevan a cabo a través de un mecanismo en cadena. Un mecanismo en cadena es aquel en el cual se genera más de una molécula de producto por cada evento de inicio. Una reacción en cadena se compone de tres etapas principalmente; inicio, propagación y terminación. Para esquematizar este mecanismo se tomará como ejemplo

Br•

•

CH3

H-CH3

Br - Br

• HBr + CH3

CH3Br + Br•

Figura 1-11. Reacción de propagación.

Química de los radicales libres • 13

•

CH3

•

CH3

•

•

CH3

Br

H3C – CH3

H3C – Br

Figura 1-12. Reacciones de terminación.

la reacción de halogenación del metano (CH4). Esta reacción produce una mezcla de productos polihalogenados, como se ve en la figura 1-9. Etapa de inicio Es la primera reacción que toma lugar en el proceso, y es cuando se generan los primeros radicales libres a partir de moléculas estables. El inicio puede ser inducido por cualquiera de las formas mencionadas antes: térmica, fotoquímica, radioquímica o por oxidorreducción. En el caso de la bromación del metano, la etapa de inicio es la fragmentación del bromo inducida con luz ultravioleta que produce radicales bromo (Br•) (figura 1-10).

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Etapa de propagación En estas reacciones, un nuevo radical se genera a expensas de otro, de tal manera que no se pierde en ningún momento el carácter radical y el proceso continúa (figura 1-11). Puede haber más de una etapa de propagación de diferente naturaleza cada una. Como se puede observar, el producto de halogenación se forma en esta etapa. Dado que el radical bromo se está regenerando cada vez que se forma una molécula de producto, la cadena puede seguir transformado al metano sin necesidad de otro evento de inicio. La cadena continuará hasta que el metano escasee o hasta que la misma cadena se rompa por un evento de terminación anticipado.

R• + R •

R–R

Figura 1-13. Reacción de dimerización.

14 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

H R

C

H

H • CH2

+

R

R2

C

(Capítulo 1)

• CH2

R

C

R CH3

+

C R2

CH2

R2

R2

Figura 1-14. Reacción de desproporción.

Etapa de terminación Mediante estas reacciones se consumen radicales y no se generan nuevos radicales, por lo que se pierde el carácter radical en el proceso. Normalmente es cuando dos radicales reaccionan entre sí y forman moléculas estables. Esto ocurre cuando la materia prima escasea y los radicales tienen la oportunidad de encontrarse. En un proceso pueden presentarse varias reacciones de terminación diferentes (figura 1-12). En la halogenación, dos radicales metilo pueden formar una molécula de etano, dos radicales de bromo formarán una molécula de bromo o un radical metilo y uno de bromo formará el bromuro de metilo. Es importante señalar que la reacción de halogenación no sólo genera bromuro de metilo, sino una mezcla compleja de todos los productos polihalogenados posibles. Esto sucede porque, en la medida que la reacción avanza, el radical bromo tiene la oportunidad no sólo de abstraer un hidrógeno del metano, sino también de todos los otros intermediarios formados. Este proceso es parecido a lo que sucede durante el mecanismo de lipoperoxidación (capítulo 4).

❚

REACCIONES

ELEMENTALES

Dimerización Una característica esencial de los radicales libres es que pueden reaccionar entre ellos y lo pueden hacer de dos maneras. Una de ellas es la reacción de dimerización (figura 1-13).

H

R2 H H2C R•

C

C R1

H

R2 • C R1

Figura 1-15. Adición de un radical libre a una doble ligadura.

Química de los radicales libres • 15

R•

X

• R - X + R1

R1

Figura 1-16. Reacción de abstracción radical.

En esta reacción, dos radicales idénticos reaccionan entre ellos generando un nuevo enlace por la combinación de los dos electrones desapareados. Con estas reacciones sólo se pueden generar compuestos simétricos. Desproporción Otra manera de reacción entre dos radicales es la desproporción (figura 1-14). En este proceso dos radicales reaccionan para generar un alcano y una olefina. En realidad, uno de los radicales abstrae un hidrógeno del carbono vecino al carbono radical de otro radical. El radical que abstrae el átomo de hidrógeno se reduce, y el que lo pierde se oxida, según la definición formal de oxidación y reducción en química orgánica.

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Adición a dobles ligaduras Una de las reacciones más importantes de los radicales libres es la adición a una ligadura doble. En esta reacción se genera un enlace carbono-carbono. El proceso es termodinámicamente favorecido cuando el radical se adiciona a un enlace carbono-carbono, ya que se forma un enlace sigma a expensas de un enlace pi más débil (figura 1-15). Abstracción En la mayor parte de los casos, esta reacción sucede cuando la energía de disociación del enlace que se rompe es menor a la del enlace que se forma. Las dos reac-

R 1

R

H • R1

1

5

2

2

4 3

• H

Transposición 1,5 de hidrógeno

5

R1

4 3

Figura 1-17. Transposición de radicales libres.

16 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

• X

R

(Capítulo 1)

X

R• + R1

R1

Figura 1-18. Reacción de β-fragmentación radical.

ciones de propagación de la halogenación del metano son dos ejemplos típicos de este tipo de reacción. Los radicales centrados sobre heteroátomos (como el oxígeno, nitrógeno y halógeno) reaccionan abstrayendo hidrógenos de las moléculas de su alrededor (figura 1-16). Transposición La transposición 1,5 de un radical es una reacción característica de los radicales libres. En esta reacción el radical migra cinco posiciones a través de una abstracción de un hidrógeno (figura 1-17). Cabe mencionar que las transposiciones 1,2 también pueden ocurrir; sin embargo, no son muy comunes. Como se puede anticipar, esta reacción es un equilibrio, el cual estará desplazado hacia la formación del radical más estable. El equilibrio depende de la capacidad de estabilización de R y R1 para el radical. β-fragmentación Las β-fragmentaciones de radicales libres son procesos muy importantes en los procesos biológicos, ya que a través de ellos se degradan una variedad de moléculas. En casi todos estos procesos se fragmenta un enlace carbono-carbono, lo cual produce fragmentos de moléculas más grandes (figura 1-18). Se puede decir que este proceso es la reacción inversa de una reacción de adición de un radical a un enlace doble. Esta reacción cobra importancia cuando el enlace que se forma es más fuerte al enlace que se rompe, o bien cuando a través de una fragmentación

-1 e– R•

Nu R

R-Nu

Figura 1-19. Oxidación de un radical libre.

Química de los radicales libres • 17

+1 e– R•

E R

R-E

Figura 1-20. Reducción de un radical libre.

se generan radicales más estables que los de partida. Las fragmentaciones más comunes suceden cuando el radical inicial está centrado sobre un heteroátomo como el oxígeno y nitrógeno. Oxidación Algunos metales oxidantes como el Fe (III) o Cu (II) pueden oxidar al radical, abstrayendo el electrón convirtiéndolo en un carbocatión (R+). En una secuencia de reacciones este carbocatión puede reaccionar con un nucleófilo y generar productos de naturaleza variada (R-Nu).

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Reducción Cuando un radical gana un electrón, se dice que se reduce y forma un carbanión (R-). El electrón normalmente proviene de un metal de transición. El carbanión puede reaccionar con un nucleófilo y formar el producto final (R-E) (figura 1-20). Como se puede anticipar, las reacciones de oxidación y de reducción son muy importantes, ya que en un solo proceso se puede combinar la química de los radicales libres con la química iónica.

❚

APLICACIONES

DE LAS REACCIONES DE RADICALES LIBRES

Polimerización El desarrollo de los polímeros (por lo general llamados plásticos o materiales sintéticos), fue uno de los adelantos tecnológicos más importantes durante el siglo XX. Estos materiales no sólo reemplazaron al caucho natural que se utilizaba, sino que multiplicaron exponencialmente sus aplicaciones. Con el desarrollo de los polímeros, nuevos y variados materiales salieron al mercado; materiales rígidos o flexibles, transparentes u opacos, quebradizos o duros, entre otros. En la actualidad se producen miles de toneladas de polímeros por año, de las cuales cerca de 75% se manufactura a través de una reacción de polimerización vía radicales

18 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

H Cl

H Ph

C C

*

(Capítulo 1)

*

*

H H n

H CO2Me

C C

*

*

H H n

Policloruro de vinilo (PVC)

C C H H

* n

Polimetilacrilato

Poliestireno

Figura 1-21. Estructuras de los polímeros.

libres. Los polímeros más comunes que se producen mediante una reacción radical son el policloruro de vinilo (PVC), muy utilizado en tuberías de agua; poliestireno, utilizado entre otras cosas para fabricar bolsas y algunas partes de automóviles, y el polimetilacrilato, utilizado para fabricar micas transparentes (figura 1-21). En la figura 1-22 se describe el mecanismo mediante el cual transcurre la reacción de polimerización del estireno. La primera etapa es la fragmentación de un iniciador que genera los primeros radicales, los cuales reaccionan con una molécula de monómero, que en este caso es el estireno. El nuevo radical se adiciona a otra molécula de estireno y genera un nuevo radical, el cual se adiciona a la doble ligadura de otro estireno. Este procesos se repite hasta que el estireno empieza a escasear, cuando ya se han formado cadenas muy largas de monómero al cual que se le llama polímero.

In-In iniciador

In•

•

•

•

In

In• Estirteno In

X X In

•

In

•

In •

n

n

Poliestireno

Figura 1-22. Mecanismo de polimerización del estireno vía radicales libres.

Química de los radicales libres • 19

H2O2 + Fe2+

OH•

Fe3+ + OH– + OH•

+ H-R

R•

+ H2O

Figura 1-23. Principales procesos en la reacción de Fenton.

Reacción de Fenton

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La reacción de Fenton se conoce desde 1894, y es una de las reacciones de oxidación más poderosas que se han descubierto hasta ahora. Esta reacción se utiliza para degradar una variedad de desechos industriales que contienen compuestos orgánicos tóxicos, se utiliza en el tratamiento de aguas residuales provenientes de las zonas urbanas, se pueden degradar algunos desechos de pesticidas, aditivos de madera encontrados en suelos contaminados. La reacción implica la oxidación de Fe (II) a Fe (III) mediada por peróxido de hidrógeno. En la reacción el Fe(II) se regenera constantemente, por lo que se utilizan cantidades catalíticas de la sal de Fe. Esta reacción fragmenta al peróxido en un ión hidróxido (OH–) y un radical hidroxilo (OH•). Este radical hidroxilo es de muy alta energía, y puede oxidar y fragmentar compuestos orgánicos. En principio, el radical hidroxilo reacciona abstrayendo hidrógenos de los compuestos orgánicos (H-R) y generando radicales alquilo (R•) que pueden sufrir diferentes reacciones, una de ellas es reaccionar con oxígeno molecular y generar peróxidos orgánicos que se fragmenten y generarán nuevos radicales que finalmente llevarán a la frag-

Me

Me

•

Me

Me Me

Me

Me

•

Bu3SnH AIBN

H

Me

H

H

Me

H

H 75

74

73

H

• Me

Me Me

Bu3SnH

Me Me

Me H

77

H

H

76

H

Hirsuteno

Figura 1-24. Síntesis del producto natural hirsuteno a través de una reacción de radicales libres.

20 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 1)

mentación de la molécula. Las principales ventajas de este proceso es que no produce compuestos orgánicos tóxicos, ya que si la oxidación es completa, todos los compuestos orgánicos se transforman en CO2 y agua. Síntesis orgánica Las reacciones de radicales libres son utilizadas por los químicos orgánicos para manipular ciertos grupos funcionales o para transformar moléculas simples en moléculas más complejas. La adición de un radical a una doble o triple ligadura genera un enlace carbono-carbono, lo cual, desde el punto de vista sintético, es muy atractivo, y más aún, si la estructura molecular lo permite, se puede formar más de un enlace en una sola operación sintética. Quizá uno de los ejemplos más emblemáticos de esto es la síntesis del producto natural llamado hirsuteno. Para la construcción de esta molécula, Curran y colaboradores diseñaron una reacción de radicales libres utilizando como materia prima el yoduro. Se sabe que en presencia de hidruro de tributilestaño y un iniciador como azabisisobutironitrilo (AIBN) se puede generar un radical libre a partir de un yoduro. Una vez formado el radical, éste reacciona intramolecularmente sobre la doble ligadura y genera un nuevo radical, el cual queda geométricamente muy cerca del triple enlace. La reacción con la triple ligadura genera el tercer anillo de cinco miembros y un nuevo radical vinílico, el cual, al no tener más instauraciones con las cuales reaccionar, abstrae un átomo de hidrógeno del hidruro de tributilestaño y genera el hirsuteno. En el proceso se han generado dos enlaces carbono-carbono, lo cual dio lugar a la formación del sistema triciclito del hirsuteno.

❚

REFERENCIAS

Carey FA, Soundberg RJ: Advanced Organic Chemistry, Part A: Structure and Mechanisms. London: Plenum Press, 1990. Curran DP, Porter NA, Giese B: Stereochemistry of Radical Reactions. VCH, Weinheim, 1996. Fossey J, Lefort D, Sorba J: Free Radicals in Organic Synthesis, Paris, Ed. Wiley, 1995. Giese B: Radicals in Organic Synthesis: Formation of Carbon-Carbon Bonds. Oxford, Pergamon Press, 1986. Huang RL, Goh SH, Ong SH: The Chemistry of Free Radicals. London, Edward Arnold, 1974. March J: Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed. New York: Wiley-Interscience, 1992.

Química de los radicales libres • 21

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Motherwell WB, Crich D: Free Radical Chain Reactions in Organic Synthesis. New York:: Academic Press, 1992. Nonhebel DC, Tedder JM, Walton JC: Radical. Cambridge: Cambridge University Press, 1979. Nonhebel DC, Walton JC: Free-Radical Chemistry. Cambridge: Cambridge University Press, 1974. Samir Z, Zard R: Radical Reactions in Organic Synthesis. Oxford Chemistry Press, Oxford University Press, 2003.

S

ECCIÓN

EL

DIOXÍGENO Y SUS ESPECIES REACTIVAS

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2. El dioxígeno y sus especies reactivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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II.

25

E

2

L DIOXÍGENO

Y SUS ESPECIES REACTIVAS Wilhelm Hansberg Torres

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❚ EL DIOXÍGENO El 21% de nuestra atmósfera es dioxígeno (O2). Prácticamente todo el O2 atmosférico tiene un origen biológico: es producto de la oxidación del agua que lleva a cabo el fotosistema II de las plantas, algas y cianobacterias utilizando la energía luminosa del sol. Por otro lado, la mayoría de los organismos usan el O2 para respirar, esto es, reducen el O2 en agua y la energía de esta reacción, que originalmente provino del sol, la emplean para formar ATP y para transportar iones y metabolitos a través de las membranas celulares. Los organismos que realizan la fotosíntesis sólo necesitan para crecer: la luz solar, el bióxido de carbono y el dinitrógeno (N2) de la atmósfera (en las cianobacterias) y agua con algunas sales disueltas, como el nitrato (NO3–) (en las algas y en las plantas). En cambio, los organismos que respiran requieren de una fuente de electrones para reducir el O2. Esta fuente de electrones es la comida. De ahí la gran competencia que hay entre estas especies por la comida, la cual ha dado origen a las cadenas alimenticias. La fotosíntesis oxigénica y la respiración forman un circuito continuo de oxidación del agua y reducción del O2. Este ciclo no ha cambiado desde hace millo-

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26 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 2)

nes de años. Tampoco la biomasa total de la tierra ha variado. Los que han cambiado en ese tiempo han sido los organismos que llevan a cabo el ciclo. Lo cual nos permite concluir que el aumento explosivo de la población humana, de los animales domésticos y otros animales asociados con las actividades del hombre ha sido a expensas de otras especies que respiran. El O2 de la atmósfera reacciona con algunos metales y los oxida, por ejemplo, cuando un objeto de hierro se encuentra expuesto a la humedad, con el tiempo su superficie se torna rugosa y de color café rojizo que es el color del óxido de hierro (Fe2O3) hidratado. Observamos que algunos compuestos orgánicos también se oxidan, por ejemplo, muchas frutas abiertas cambian de color en contacto con el aire. De hecho, el O2 se combina con casi cualquier otro elemento pero, en la mayoría de los casos, sólo lo hace a temperaturas elevadas. En su estado basal y a la temperatura ambiente el O2 no reacciona o lo hace lentamente con otros compuestos. El O2 es un diradical, es decir, tiene un electrón en cada uno de sus dos orbitales de antiunión π*. Debido a sus dos electrones desapareados el O2 es atraído por un campo magnético, por lo que se dice que es paramagnético. En su estado basal de energía genera tres señales (un triplete) en un campo magnético. Los electrones desapareados tienen el mismo giro (spin) pues así, al mantenerse alejados uno del otro, reducen la repulsión de sus cargas negativas. Estos electrones sólo pueden interaccionar con los electrones de otros elementos y compuestos que estén libres y que tengan el giro opuesto. La razón por la cual el O2 no es muy reactivo a temperatura ambiente se debe a que, en la mayoría de los compuestos, los electrones se encuentran apareados, hay pocos electrones libres y sólo algunos de éstos tienen un giro opuesto a los del oxígeno. Por otro lado, la solubilidad del O2 en el agua es baja y es más baja mientras más sales tenga disueltas el agua y más alta sea su temperatura. La concentración del O2 en el agua destilada, en equilibrio con la atmósfera a nivel del mar a 25°C, es de 258 μM. En la sangre arterial la concentración del O2 es de al rededor de 130 μM y en la venosa de al rededor de 50 μM; en las células es de ≤ 13 μM y de ≤ 1 μM en la mitocondria. Es decir, hay una diferencia de dos órdenes de magnitud entre la concentración del O2 en el sitio de entrada en los pulmones y la concentración del sitio de consumo en las mitocondrias. Las investigaciones que utilizan cultivos de células frecuentemente no toman en consideración la concentración del oxígeno a la que están expuestas las células en condiciones fisiológicas. Esto puede influir en los resultados que se obtienen con estas investigaciones. La solubilidad del O2 es mayor (alrededor de ocho veces) en solventes hidrofóbicos que en el agua. Las membranas celulares, en donde se lleva a cabo la respiración, están compuestas por lípidos que conforman un ambiente hidrofóbico en el cual el O2 es más soluble que en el citosol. Hay que tomar en cuenta que la cantidad de colesterol en la membrana plasmática disminuye la solubilidad del

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oxígeno en las mismas, lo cual puede ser un mecanismo de regulación de la permeabilidad del O2 a las células. La concentración del O2 en una solución en agitación se puede medir mediante el electrodo de Clark. Este electrodo, recubierto con una membrana de teflón que es permeable al O2, tiene un cátodo de platino que reduce el O2, lo cual induce una corriente que es proporcional a su concentración. También hay microorganismos que han sido modificados para que sirvan como sensores de oxígeno cuando éste se encuentra en concentraciones muy bajas. La concentración intracelular del O2 se ha podido determinar con sustancias que cambian su fluorescencia en presencia del O2, generalmente porfirinas, o con compuestos que al reaccionar con el O2 dan una señal característica de resonancia electrónica paramagnética (EPR; por sus siglas en inglés Electron Paramagnetic Resonance). Estando en reposo, los humanos consumimos unos 30 g de O2 cada hora, más de 260 Kg al año. Haciendo ejercicio utilizamos hasta diez veces más O2. Entre el 85 y el 90% de ese O2 se emplea en las mitocondrias para formar ATP. En las mitocondrias se origina aproximadamente el 80% del ATP que requerimos para mantenernos organizados y funcionando. Como el ATP se usa segundos después de haber sido sintetizado, se necesita un suministro continuo de O2 y una fuente de electrones para producir el ATP. El cerebro constituye sólo la quincuagésima parte de la masa corporal pero emplea la quinta parte del O2, es decir, consume diez veces más O2 que el resto de los órganos y tejidos. Por eso la corteza cerebral es el primer tejido que resiente la falta de O2 cuando, por ejemplo, el corazón deja de bombear suficiente sangre debido a un infarto de miocardio o cuando un vaso sanguíneo cerebral se bloquea. En esas condiciones la corteza cerebral no puede generar la cantidad de ATP requerida para conservarse funcionando, produce especies de oxígeno reactivas (véase más adelante) y se destruye en cuestión de minutos. Esta labilidad de la corteza cerebral a la isquemia conduce frecuentemente a un estado en el cual el individuo ha muerto pero la mayoría de sus órganos y tejidos siguen vivos. La mayoría de los animales y muchos microorganismos aerobios no pueden vivir sin el O2. Otros, en cambio, como las plantas y los microorganismos facultativos proliferan en su ausencia. Sin O2 nos morimos debido a que no podemos satisfacer la demanda energética para mantenernos organizados. Pero si bajáramos la demanda energética ¿podríamos vivir sin oxígeno? La naturaleza ha inventado muchas formas de resistencia a diversas condiciones adversas del medio ambiente como, por ejemplo, al calor o al frío extremo o a la sequía prolongada. En estas condiciones se induce una vida latente en los organismos que son capaces de reducir al mínimo su metabolismo celular. Esporas, esclerocios, quistes y semillas son ejemplos de vida inanimada o en estado latente. Dentro del reino animal, algunos peces, sapos y salamandras tienen la capacidad para bajar su metabolismo al mínimo y así sobrevivir al estiaje y algunos mamíferos, como las

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(Capítulo 2)

ardillas del ártico, los osos pardos y los polares, hibernan para sobrevivir el invierno. En dichas condiciones el ritmo cardíaco y respiratorio es casi imperceptible, la temperatura corporal se mantiene 2 o 3 grados por arriba de la temperatura del ambiente y el consumo del O2 es muy reducido. En el gusano Caenorhabditis elegans se ha observado que la anoxia, pero no la hipoxia, induce el estado de resistencia. También, utilizando miméticos del O2, sustancias que compiten por los sitios de unión del O2, como el sulfuro de hidrógeno o ácido sulfhídrico (H2S), es posible provocar la anoxia en ratones, suscitándoles un estado inanimado similar al estado de hibernación y del cual se pueden recuperar sin ningún efecto colateral. Estos experimentos muestran que no es la falta de O2 per se la que nos mata sino el desequilibrio entre la demanda metabólica de O2 y un suministro insuficiente del mismo, condición que resulta muy tóxica para la corteza cerebral. La supervivencia en ausencia del O2 abre la posibilidad para preservar por más tiempo los órganos destinados a ser trasplantados.

❚ ¿POR

QUÉ ES TÓXICO EL

O2?

Por lo general hemos considerado el O2 como sinónimo de vida porque lo necesitamos para respirar, pero el O2 puede ser tóxico, nos puede enfermar e incluso matar. La gran concentración del O2 en la atmósfera y su baja reactividad en condiciones ambientales ha dado la impresión de que el O2 es inocuo. Así, es común que en los hospitales se administre O2 a cualquier paciente, aunque no lo requiera y, por supuesto, se cobre por ello. Al recién nacido invariablemente se le aplica O2 para tornarlo sonrosado cuanto antes, como si no bastara el O2 del aire. Cuando se da en exceso perjudica al niño, causándole, por ejemplo, una fibropatía retrolenticular o problemas respiratorios. El O2 es tóxico a cualquier concentración. Así, por ejemplo, muchos microorganismos se alejan del O2 y se estratifican dentro de un gradiente de O2 según sus requerimientos y capacidades antioxidantes. Las plantas crecen mejor en ausencia del O2 debido a que consumen energía con la fotorespiración, la cual no pueden evitar que ocurra cuando están en presencia del O2. La toxicidad del O2 se aprovecha en el tratamiento de algunos tumores cancerosos suministrando O2 a los pacientes durante su radioterapia, ya que las radiaciones ionizantes son más tóxicas en presencia de una mayor concentración de O2. La toxicidad del O2 se explica debido a la formación de las especies reactivas del oxígeno (ERO). Estas especies de O2 son más reactivas que éste en su estado basal de energía.

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❚ LAS

ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO

Se consideran ERO al oxígeno atómico (O) y al ozono (O3) que se genera con la unión del O al O2, al oxígeno singulete (1O2) que se produce con la excitación de uno de los electrones desapareados del O2 y al superóxido (O2•), al peróxido de hidrógeno (H2O2) y al radical hidroxilo (•OH) que son especies parcialmente reducidas. También el oxígeno forma compuestos con el nitrógeno y éstos pueden ser más reactivos que el O2 en su estado basal de energía. Estas especies son el monóxido de nitrógeno u óxido nítrico (NO•), el dióxido de nitrógeno (NO2•) y el peroxinitrito (ONOO–), y se reconocen como especies reactivas del nitrógeno (ERN). Debido a que la naturaleza ha estado expuesta a las ERO por dos mil millones de años se han seleccionado mecanismos para contender con ellas y también mecanismos que las utilizan en múltiples funciones. Por eso no hay que considerar que las ERO son inevitablemente tóxicas, sino que su toxicidad depende de su concentración y del contexto en el que se producen. En la interacción entre organismos, cualquiera que sea su naturaleza, para matarse o para beneficiarse mutuamente, intervienen las ERO. Bajas concentraciones de ERO estimulan el crecimiento de las células, incluso de las bacterias y de otros microorganismos. El H2O2 y el NO•, y posiblemente otras especies reactivas, funcionan como señales que determinan respuestas fisiológicas de adaptación al medio ambiente. Finalmente las ERO son indispensables para la diferenciación celular y para la muerte celular programada. Algunas de las especies de oxígeno reactivas son radicales, esto es, tienen electrones desapareados. El O2•, el NO2• y el •OH son radicales y el O2 es un diradical. El hecho de ser radical no indica, como se suele suponer, una gran reactividad. La actividad de los radicales puede variar diez órdenes de magnitud. Así, por ejemplo, la ubisemiquinona es un radical muy estable y el O2•, el NO2• y el O2 son radicales que sólo interaccionan con otros radicales. En cambio, el •OH es una de las especies más reactivas que se conocen. Por otro lado, el 1O2 y el O3 no son radicales pero son muy oxidantes. En otras palabras, la reactividad es una característica intrínseca de cada especie de oxígeno que no tiene nada que ver con que la especie sea o no un radical.

El ozono La luz ultravioleta de alta energía (UVC = 250 a 290 nm) y las descargas eléctricas rompen los dos enlaces covalentes en la molécula del O2 originando 2 O. El oxígeno atómico se combina inmediatamente con el O2 para formar el O3. El oxígeno atómico no se produce en los organismos y por lo tanto no es de interés para la biología.

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(Capítulo 2)

El O3 se encuentra en la estratosfera, donde se genera constantemente por efecto de la luz UVC sobre el O2. La máxima concentración de O3 está a unos 25 Km de la superficie terrestre. La absorción de la UVC por el O2 y el O3 de la estratosfera evita que ésta llegue a la superficie terrestre, lo cual hizo posible hace unos dos mil millones de años que la vida se extendiera en el planeta. Como la luz UVC es absorbida por los ácidos nucleicos y los modifica, los organismos primigenios no podían sobrevivir expuestos a la luz solar, lo que les impedía la colonización de la tierra. Actualmente nuestro desarrollo tecnológico e industrial ha afectando peligrosamente esta protección natural de la luz UVC. Los fluoro-clorocarbonos son compuestos gaseosos, sintéticos, muy estables que se utilizan como solventes y refrigerantes y para hacer espumas y aerosoles. Estos compuestos y otros gases halogenados, al llegar a la estratosfera, producen radicales de halógeno que destruyen el O3 que nos protege. La reacción es catalítica, es decir, el radical de halógeno reacciona y se regenera continuamente. Se calcula que un radical Cl• es capaz de descomponer 100 000 moléculas de O3; el radical Br• es 10 a 100 veces más activo que el de cloro. Aunque se ha logrado limitar el uso de los carbonos halogenados, la reacción en cadena que se ha generado en la atmósfera tardará varios decenios en parar. Con el tiempo, el halógeno va formando otros compuestos menos activos que se van eliminando de la estratosfera, por ejemplo, al disolverse en pequeñas gotas de agua y regresar a la tierra con la lluvia, la nieve o el granizo. El O3 también se produce a nivel de la superficie terrestre por efecto de la luz sobre el NO2• que se origina con la combustión de la materia orgánica, principalmente en los automotores. En presencia de algunos hidrocarburos contaminantes del aire, como el gas de uso doméstico y de la gasolina, el NO2• se descompone en NO• y O y este último reacciona con el O2 para formar el O3. El O3 es un gas irritante, de olor penetrante y color azul. Es mucho más oxidante que el O2. En soluciones ácidas es uno de los compuestos más reactivos; sólo el flúor, el O, el 1O2 y el •OH son más oxidantes. El O3 es más estable en soluciones alcalinas. Así la vida media del O3 es de 2 min en 1 N de NaOH a 25°C. El O3 se puede detectar con una solución alcalina de ioduro de potasio y un poco de almidón con lo cual se produce un compuesto azul oscuro. Un método más sensible y específico es medir la pérdida de la fluorescencia de la rodamina B al reaccionar con el O3 o la quimioluminiscencia que se produce al interaccionar el O3 con algunos compuestos como los naftalenos. El O3 reacciona con los ácidos nucleicos, las proteínas, rompe las olefinas en los lípidos insaturados, oxida el NAD(P)H, el ácido ascórbico y el ácido úrico. También forma otras especies reactivas como el •OH. En el aire, a una concentración de más de 0.5 ppm, causa inflamación y muerte celular en los bronquios y los alveolos pulmonares. Las personas mayores y los

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niños resultan más afectados con el O3 del aire que los adultos jóvenes. El O3 activa el factor de trascripción NF-κB e induce la enzima superóxido dismutasa (SOD), la NO• sintasa (NOS), la fosfolipasa A2 y el factor α de necrosis tumoral en las células pulmonares del ratón. Los ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD (Cu/Zn) no presentan los daños que se observan en los ratones silvestres cuando son expuestos al O3. Este efecto es debido, en parte, a que no se genera inflamación en el tejido pulmonar de los ratones transgénicos. Las plantas también son sensibles al O3, ya que éste entra por los estomas y reacciona con los compuestos celulares, causando zonas de necrosis y finalmente senescencia de la planta. El ascorbato constituye la defensa principal contra el O3 en las plantas. La planta del tabaco Nicotiana tabacum es particularmente sensible al O3 por lo que se ha utilizado como indicador del mismo. Recientemente se ha publicado que los anticuerpos tiene la capacidad para formar O3 y que éste contribuye a los microorganismos que invaden nuestro organismo. Estas publicaciones han causado una gran expectativa y a la vez se han puesto en duda. Para producir O3 se requiere una gran energía que difícilmente se puede formar en los organismos. Sin embargo, es posible que los resultados obtenidos se expliquen con la producción del superóxido. A diferencia del O3, el O2• se puede formar fácilmente con el O2 y algún aminoácido del anticuerpo como donador de electrones.

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El oxígeno singulete El 1O2 se origina cuando uno de los dos electrones libres del O2 cambia de giro al captar energía. Teniendo ahora giros opuestos los electrones libres se aparean inmediatamente. Por eso hay dos especies de oxígeno singulete, el 1Σg+, que tiene los dos electrones desapareados pero con giros opuestos, y el 1Δg, en el que estos electrones se han apareado. El primero decae al estado basal tan rápido que para la biología sólo tiene importancia el segundo. El 1Δg puede decaer al estado basal, emitiendo un fotón a 1 268 nm, o reaccionar con cualquier compuesto, pues el 1O acepta electrones apareados y libres, sin importar su giro. 2 Las células tienen varias sustancias coloridas: las flavinas, las porfirinas y sus derivados, como las clorofilas y la vitamina B12 (cianocobalamina) y también son coloridas la vitamina A (retinol), las quinonas y las pterinas. Estos compuestos se excitan con la luz azul (430 a 490 nm) y con el componente A de la luz ultravioleta (UVA = 320 a 400 nm) y pueden transferir su energía de excitación al O2 y formar así el 1O2. Los individuos con porfiria acumulan porfirinas inservibles en la piel. Con la luz solar dichas porfirinas producen 1O2 y éste provoca irritación e inflamación de la piel y de las encías, que adquieren una coloración café. En estos enfermos

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(Capítulo 2)

hay además un aumento en el desarrollo capilar. Los pacientes con porfiria necesitan ingerir carne cruda o sangre para obtener el hemo que requieren para sobrevivir. El mito de los vampiros posiblemente se originó a partir de estos individuos hirsutos que salían de noche a consumir sangre fresca. También cuando el jugo del limón cae en la piel, la furocumarina que contiene éste genera 1O2 con la luz solar y como consecuencia se produce una mancha oscura en la piel. Esto lo deben tener en cuenta los bañistas que consumen alimentos con limón en la playa. Además del limón otras plantas también tienen furocumarinas (psoralenos) que pueden causar una dermatitis por fotosensibilización. El psoraleno, ingerido o untado, seguido de una irradiación con luz UVA se utiliza sin una justificación científica adecuada para tratar el eczema, la psoriasis y el vitíligo y en ocasiones la alopecia. Las furocumarinas, además de ser fotoactivas, son mutágenas porque se intercalan en el DNA e interaccionan con las timinas. La fotoquimioterapia se usa también para combatir el cáncer de la piel o tumores que están cerca de la piel o de las mucosas, generalmente utilizando derivados porfirínicos sensibles a la luz roja, que es la que más penetra en la piel. Las fenotiazinas y las tetraciclinas también son compuestos fotoactivos. La dismutación espontánea del O2• genera 1O2. Asimismo la descomposición del H2O2, por ejemplo, con el ácido hipocloroso (HOCl) que secretan los leucocitos neutrófilos y sobre todo con el hipobromoso (HOBr) que producen los leucocitos eosinófilos, forma 1O2. También la descomposición de los lipoperóxidos puede generar 1O2. El O2• al reaccionar con el NO2• origina peroxinitrito que se descompone en 1O2 y nitrito (2 NO2–). La reacción del O2• con el H2O2 catalizada con trazas de hierro (Haber-Weiss) produce 1O2 y el •OH, pero probablemente esta reacción no ocurre in vivo. La vida media del 1O2 en el aire seco es de unos 90 μseg, en el agua pura de 3 μseg y en la célula, en la que hay muchos compuestos reducidos, es sólo de 0.5 μseg. Por un lado, el 1O2 decae rápidamente y, por el otro, reacciona casi inmediatamente con los compuestos celulares. De ahí que la concentración intracelular del 1O2 sea muy baja, < 1 nM. En óxido de deuterio o agua deuterada (D2O) la vida media aumenta a 68 μseg y por eso a veces se usa agua deuterada en un 90% para estudiar los efectos del 1O2 en las células. El 1O2 se puede detectar por los fotones que emite en el infrarrojo cercano a 1 268 nm pero para ello hace falta un equipo caro y sofisticado. Un método sofisticado pero menos costoso es utilizar un fotomultiplicador para captar la emisión de fotones a 634 y 703 nm que ocurre cuando dos moléculas de 1O2 interaccionan y decaen al estado basal. Esta quimioluminiscencia de baja intensidad que depende del O2 es el método ideal para detectar el 1O2 en condiciones in vivo. Sin embargo, las células deben generar suficiente 1O2 para poder captar la emisión dimol y también contar con un fotomultiplicador que sea muy sensible a la luz roja. El 1O2 también se puede determinar por EPR utilizando atrapadores

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específicos para el 1O2. Un método indirecto es medir una oxidación específica de un compuesto biológico que esté presente en concentraciones adecuadas en la célula. El 1O2 reacciona con la mayoría de compuestos celulares. El producido fuera de las células interacciona con la membrana plasmática; el producido dentro de las células reacciona con los ácidos nucleicos, las proteínas, los lípidos y los carbohidratos, muy cerca del sitio en donde se forma. El 1O2 produce endoperóxidos con los ácidos grasos poliinsaturados que se descomponen en presencia del hierro formando radicales alcoxilo, contribuyendo así a la propagación de la lipoperoxidación. El 1O2 interacciona con las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos, siendo el producto principal la 8-hidroxiguanina, que se puede detectar en un hidrolizado de DNA. La 8-hidroxiguanina también se puede formar con el •OH. Los cambios en las bases nitrogenadas pueden generar mutaciones cuando se duplica el DNA. Por ejemplo, la 8-hidroxiguanina puede hacer puentes de hidrógeno con una adenina en vez de con una citosina y la 8-hidroxiadenina con una guanina en vez de con una timina. Con las proteínas el 1O2 produce derivados principalmente del triptofano, de la tirosina, la histidina, la lisina, la metionina y la cisteína. En la célula el 1O2 se desactiva con los carotenos y los tocoferoles que se encuentran en las membranas plasmáticas. El 1O2 reacciona con los plasmalógenos y se piensa que la unión vinilo éter de estos fosfolípidos es importante para proteger las células del 1O2. En el citosol el 1O2 oxida el glutatión y el ascorbato. El 1O2 interacciona también con el hemo de la catalasa sin inactivar la enzima y esta modificación se puede utilizar para detectar el 1O2 intracelular. Con los lípidos forma hidroperóxidos. La oxidación del colesterol y de los plasmalógenos se ha utilizado también como indicador del 1O2. Cuando se produce 1O2 dentro de la célula se induce la trascripción de muchos genes tales como los de las proteínas del choque térmico, el de la hemooxigenasa-1 que es la proteína del choque térmico HSP32, los de las proteínas reguladas con la glucosa, el de la colagenasa y los de las proteínas de adhesión celular. El mecanismo puede ser a través de la activación de los receptores de citocinas, de algunas proteínas cinasas y de los factores de trascripción como el NF-κB y los AP. La hemooxigenasa-1 que se induce con el 1O2 utiliza el Fe del hemo y O2 para romper el anillo porfirínico y así formar biliverdina, que es antioxidante, y monóxido de carbono (CO), que causa una respuesta antiinflamatoria y antiapoptótica.

El superóxido Cuando el O2 capta un electrón éste se aparea con uno de los dos electrones libres de los orbitales π* y forma así el O2•, que es a la vez un anión y un radical.

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Como el electrón entra en un orbital antiunión, la doble ligadura del O2 se debilita, por lo que la distancia entre los átomos de oxígeno aumenta y corresponde en el O2• a la de una ligadura y media. El O2• se produce principalmente en la cadena respiratoria debido a que una parte de los electrones que pasan por ella es captada por el O2. Esto ocurre principalmente a nivel de la ubiquinona (coenzima Q). La ubisemiquinona y el ubiquinol, que se originan al aceptar uno y dos electrones libres respectivamente pueden ceder con facilidad un electrón al O2. Otro sitio desde el cual los electrones salen de la cadena respiratoria es el complejo I, NADH deshidrogenasa. Aproximadamente el 0.1% del O2 que se consume en la respiración forma O2•. Esta cantidad podría parecer poca, pero hay que considerar que en los animales el consumo de O2 es muy grande. Así, una persona de 70 Kg de peso genera unos doscientos mililitros de O2• al día estando en reposo. Con el ejercicio el consumo de O2 es mayor y por lo tanto la formación del O2• aumenta. Otra fuente importante de O2• es la actividad de las NADPH oxidasas, que tienen la función específica de sintetizarlo. También la xantina oxidasa, la lipooxigenasa y algunas peroxidasas inespecíficas forman O2•. En el hombre el 3% de su hemoglobina se oxida al día originando O2• y metahemoglobina. El O2• también se puede producir en las reacciones de los citocromos P450, que son enzimas que unen hidroxilos a una gran variedad de xenobióticos. Éstos son compuestos extraños que se forman en la célula o que entran en ella y que deben ser desechados. También la autooxidación de compuestos como el gliceraldehído o de las flavinas reducidas, incluso de algunas flavoproteínas, y la autooxidación de las tetrahidropterinas reducidas pueden formar O2• en presencia del O2. La concentración del O2• en la célula está en el intervalo de pico a nanomolar. Al contrario de lo que se ha divulgado de manera irresponsable, el O2• es poco reactivo. Sólo reacciona a una tasa importante con otros radicales: consigo mismo, con el hierro libre o el de los centros hierro-azufre (Fe-S) de varias proteínas, con el NO•, los radicales fenoxilo, las semiquinonas y los quinoles y con los difenoles. Oxida lentamente al glutatión y al ascorbato (105 M-1 seg-1) pero no reacciona con el NAD(P)H, con las bases nitrogenadas del DNA, con los aminoácidos de las proteínas ni con los lípidos. El O2• es tóxico para la célula en parte porque a partir de él se puede originar 1 el O2 y el •OH. El 1O2 se forma con la dismutación espontánea del O2•. Al reaccionar el O2• con los centros [4Fe–4S] de algunas deshidratasas se libera Fe(II) que puede producir •OH con el H2O2. Los ácidos nucleicos unen el hierro libre y con el H2O2 se forma el •OH que puede modificar una base o romper la cadena del DNA. Se piensa que ésta es la razón por la cual en las células sin SOD se generan más mutaciones. Entre las deshidratasas que el O2• inhibe se encuentran la aconitasa y la fumarasa del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs). La inhibición del metabolismo energético acentúa la toxicidad del O2•. Asimis-

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mo, debido a la salida de un Fe(II) de un centro [4Fe-4S], se inhibe la tercera enzima de la vía de síntesis de la isoleucina, la dihidroxiácido deshidratasa. De la misma manera se inhibe una transacetolasa, con lo cual no se produce la eritosa4-P que se requiere para la síntesis de los aminoácidos aromáticos. Además, al inhibir la transacetolasa se sintetiza metilglioxal, que es tóxico. Los aldehidos, como el metilglioxal, son tóxicos porque por tautomerismo forman enolatos que son reactivos. El O2• cancela también la síntesis de los aminoácidos azufrados, por lo que una bacteria que carece de la actividad de SOD secreta compuestos con azufre. En la vía de las pentosas el O2• inhibe la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. La ribonucleósido difosfato reductasa, que produce los desoxiribonucleósidos para la síntesis del DNA, tiene un radical de tirosina en su sitio activo. El O2• puede reducir el radical tirosilo en tirosina con lo cual la enzima deja de ser activa. También el O2• reacciona con una cisteína del sitio activo de la calcineurina, que es una proteína fosfatasa importante para la transducción de señales. La inhibición de estas dos enzimas es reversible por lo que puede tener una función metabólica. La eliminación del O2• es a través de las enzimas SOD. La actividad de las SOD es muy eficiente (109 M-1 seg-1) e independiente del pH. Como el O2• sólo puede atravesar las membranas celulares como radical hidroperoxilo (OHO2•) o a través de los poros aniónicos, es posible que se requiera tener una SOD en cada compartimento celular limitado por una membrana. En las células de mamíferos hay una SOD (Cu/Zn) citosólica y otra extracelular más grande y además una SOD (Mn) en las mitocondrias. En los hongos la situación es similar pero hay una mayor redundancia de estas enzimas. Incluso las bacterias como E. coli disponen de varias enzimas, una SOD (Cu/Zn) periplasmática y dos SOD intracelulares muy parecidas pero que tienen Mn o Fe en el sitio activo. La dismutación espontánea del O2• a pH intracelular ocurre a una tasa tres o cuatro órdenes de magnitud menor que la enzimática. Para ello se requiere que uno de los O2• se protone formando el OHO2•. Por eso la velocidad de la reacción es mayor mientras más ácido sea el medio. Como la reacción ocurre entre un compuesto protonado y otro sin protón, estrictamente hablando, no es una reacción de dismutación. Las NADPH oxidasas son enzimas de la membrana plasmática que tienen la función de producir O2•. Los electrones del NADPH citosólico se transfieren a un FAD de la enzima y de ahí a dos hemo, que se localizan en un cruce transmembranal de la proteína. El hemo más externo cede un electrón al O2 extracelular produciendo O2•. El hombre tiene siete NADP oxidasas, NOX 1-5 y DUOX 1-2. Las DUOX presentan un dominio adicional con probable función de peroxidasa extracelular. Las DUOX y algunas NOX (NOX5) tienen además un dominio intracelular de unión al calcio. De estas enzimas, la NOX2 (gp91 phox) de los neutrófilos ha sido la más estudiada. Esto se debe a que los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica carecen de esta actividad, por lo que

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(Capítulo 2)

no pueden destruir a las bacterias que invaden el organismo, y sucumben con cualquier infección. Las NADPH oxidasas se encuentran en la mayoría de los eucariotas y éstos generalmente tienen más de una. La función de estas enzimas, además de la inmunológica, está relacionada con las vías de señalización, como la de RAS, de MAP cinasas, de JAK-STAT y también con la activación del factor de trascripción NF-κB. Asimismo las NADPH oxidasas se requieren para el crecimiento apical, por ejemplo, del hongo endofítico Epichloë festucae en un pasto perenne y también para el crecimiento del pelo radicular de Arabidopsis thaliana. Finalmente, estas enzimas se han asociado con los procesos de diferenciación y de muerte celulares. Así, las NADPH oxidasas son indispensables para algunos procesos de esporulación en Aspergillus nidulans, N. crassa y Podospora anserina, para la esporulación del amibozoa Dictyostelium discoideum, para endurecer la pared celular de los apresorios de los hongos fitopatógenos, para entrecruzar las proteínas de la matriz extracelular del gusano C. elegans, para confinar en las plantas la apoptosis al sitio de infección de un microorganismo y para la formación de los otolitos vestibulares en los ratones. El O2• se puede detectar por la reducción del citocromo c o de las sales de tetrazolio. Al reducirse el citocromo c se torna de color púrpura y el tetrazolio reducido se polimeriza dando un formazán insoluble de color azul oscuro. También hay sales de tetrazolio que producen derivados coloridos solubles. Estas reacciones no son específicas del O2•. El citocromo c también se puede reducir con el glutatión o el ascorbato y el tetrazolio con el NO• y el ONOO–. Por eso se debe verificar que la producción del color se inhiba con la SOD. Más especifica es la luminiscencia que se produce al reaccionar el O2• con la lucigenina. Sin embargo, la lucigenina se regenera formando a la vez O2• por lo que hay una sobreestimación del mismo. Con el EPR se pueden medir los derivados específicos de sustancias (como el DMPO) que reaccionan con el O2•. El O2• no se detecta con los compuestos de fluoresceína o de rodamina.

El peróxido de hidrógeno El H2O2 o agua oxigenada se forma cuando cada uno de los dos electrones libres del O2 se han apareado con un electrón de giro contrario. Como estos electrones entraron en los orbitales antiunión, en el H2O2 las dos ligaduras del O2 se han reducido a una. El H2O2 es un líquido similar al agua aunque más denso y más viscoso. Es un ácido débil y como base es 106 veces más débil que el agua. Tiene un momento dipolar y una constante dielécrica mayor que el agua, por lo que forma más puentes de hidrógeno y es un mejor disolvente de solutos polares. Sin embargo, a concentraciones por arriba de 70% es explosivo, así que se usa diluido en agua (al 30% o menos).

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El dioxígeno y sus especies reactivas • 37

La reacción de las SOD produce la mayor parte del H2O2 en las células. También proviene de la actividad de algunas oxidasas, como las de xantina, de aminoácidos, de hexosas y de fenoles, entre otras. La concentración intracelular del H2O2 va desde pico a micromolar, dependiendo del organismo y del tejido. En el cristalino del ojo de los mamíferos puede alcanzar 100 μM en las condiciones en que se generan las cataratas. El H2O2 se puede difundir a través de los compartimentos celulares, aunque también puede formar aductos con algunos carbohidratos, aminoácidos y bases nitrogenadas. En Saccharomyces cerevisiae la permeabilidad del H2O2 disminuye con la inclusión del ergosterol en la membrana plasmática. El H2O2 reacciona poco con el ascorbato y con algunos cetoácidos como el piruvato o el α-cetoglutarato. Es aún menos reactivo que el O2• y no interacciona con los compuestos como el NAD(P)H, los ácidos nucleicos, los aminoácidos de las proteínas, salvo algunos tioles particularmente reactivos, ni con los lípidos, incluso a concentraciones milimolares. No obstante, el H2O2 es tóxico a concentraciones intracelulares por arriba de 1 μM debido, en parte, a que puede formar 1O2 y •OH. La toxicidad del H2O2 se debe principalmente a la reacción con algunos metales de transición con los que se produce el radical •OH. El hierro se puede unir de manera inespecífica a las proteínas y a los ácidos nucleicos y con el H2O2 generar el •OH. El •OH interacciona en el sitio donde se forma con lo que ocasiona modificaciones irreversibles en las proteínas y alteraciones en el DNA, las cuales no siempre se pueden reparar. El H2O2 reacciona también con el hierro del hemo y de los centros Fe-S de algunas proteínas y al liberar el hierro se produce el •OH. La descomposición del H2O2 con el HOCl o el HOBr genera 1O2. Se han seleccionado varias maneras para eliminar el H2O2. Las catalasas monofuncionales dismutan el H2O2 en O2 y H2O y lo hacen con una gran eficiencia. Las hemoperoxidasas reducen el H2O2 en H2O utilizando dos electrones suministrados por agentes reductores que pueden donar uno o dos electrones. Las peroxirredoxinas desechan el H2O2 y otros peróxidos a través de un sistema de oxido/reducción de grupos tioles y lo mismo hacen las glutatión peroxidasas. Las hemoperoxidasas no son un grupo monofilético sino que representan tres grupos de enzimas diferentes que convergen en su función, la superfamilia de hemoperoxidasas animales, la de las hemoperoxidasas de plantas, hongos y procariotas y un grupo menor de haloperoxidasas. Las catalasas-peroxidasas, que derivaron de una hemoperoxidasa de plantas, hongos y procariotas, son enzimas capaces de llevar a cabo eficientemente tanto la reacción de catalasa como la de peroxidasa. Se han encontrado haloperoxidasas en algunos hongos, en líquenes y en algas que tienen un vanadato unido covalentemente a una histidina en el sitio activo. También algunas bacterias anaerobias tienen catalasa pero, para que la enzima sea activa, deben importar el hemo, ya que estos microorganismos no

38 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 2)

pueden sintetizarlo. Algunos anaerobios tienen además una seudocatalasa que utiliza dos átomos de Mn en su centro catalítico. Como el H2O2 es una fuente de 1O2 y del •OH, los organismos presentan una gran redundancia de enzimas que desechan el H2O2 y que funcionan a diferentes concentraciones del mismo. Las enzimas menos eficientes son las peroxirredoxinas y las más eficientes son las catalasas; las primeras operan a concentraciones nano o micromolares y las segundas a concentraciones milimolares de H2O2. Las peroxidasas tienen una eficiencia intermedia y funcionan a concentraciones intermedias de H2O2. La Km para el H2O2 puede variar cuatro órdenes de magnitud entre las peroxirredoxinas y las catalasas. El H2O2 reacciona con la cisteína del sitio activo de algunas enzimas, como la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa o la fructosa-1,6-difosfato fosfatasa del cloroplasto. La unión de varios activadores con sus receptores específicos, como la unión de la insulina con su receptor, genera H2O2 y éste reacciona con una cisteína del sitio activo de algunas fosfatasas, inhibiéndolas de manera transitoria. Como las fosfatasas son cien veces más activas que las cinasas se requiere inhibir las primeras para que ocurra la fosforilación de las vías de transducción de señales. Es posible que la actividad de muchas otras proteínas también se regule a través de la oxidación reversible de las cisteínas o de las metioninas. El H2O2 también se emplea en otras funciones muy importantes como en la síntesis de la hormona tiroidea y en la maduración y capacitación de los espermatozoides, así como en la formación de la envoltura de fertilización de los ovocitos fecundados en algunos animales. Utilizando el H2O2 como sustrato la mieloperoxidasa en las células fagocíticas forma HOCl y la bromoperoxidasa de los eosinófilos produce HOBr. Es posible que el HOCl y el HOBr contribuyan a oxidar algunos compuestos de los microorganismos fagocitados. En las plantas el H2O2 se usa para la formación de la lignina y para el entrecruzamiento de los componentes de la pared celular en los sitios de invasión de los microorganismos. En el gusano C. elegans el H2O2, que proviene de una DUOX, se utiliza para rigidizar la matriz extracelular. El H2O2 se puede detectar con una peroxidasa y un sustrato que dé un producto colorido o con fluorescencia diferente. Los sustratos más empleados son la escopoletina, la fluoresceína y la benzidina y sus derivados y también el rojo fenol, entre otros. Es importante tomar en consideración que las peroxidasas aceptan varios sustratos por lo cual la determinación del H2O2 se puede subestimar. Por otro lado el ensayo no debe tener catalasa u otras enzimas que consuman H2O2. El H2O2 también se puede determinar con una mezcla de Fe(II) y tiocianato. El H2O2 oxida el Fe(II) en Fe(III) y éste produce con el tiocianato un compuesto azul. El diacetato de diclorofluoresceína se ha utilizado para medir el H2O2 intracelular. Este compuesto entra a las células en donde pierde los acetatos por lo cual ya no puede salir de ellas con facilidad. Al ser reducido por una

El dioxígeno y sus especies reactivas • 39

peroxidasa se forma un producto fluorescente. Sin embargo, hay que considerar que la reacción del ONOO– y del •OH con la fluoresceína es más rápida que la reacción de peroxidasa. Por eso, el diacetato de diclorofluoresceína se puede usar como indicador cualitativo de una tensión oxidante pero de ninguna manera para medir el H2O2 intracelular.

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El radical hidroxilo y los metales de transición Tanto el O2• como el H2O2 son compuestos que interaccionan poco con los compuestos celulares. Sin embargo, ambos son tóxicos, en parte, porque generan 1O2 y •OH. Cuando el H2O2 acepta un electrón desapareado, por ejemplo, de un metal de transición como el Fe(II) o el Cu(I) entonces se fragmenta y forma el •OH y el ión hidroxilo OH– (reacción de Fenton). Este último se protona para formar agua y el •OH interacciona con cualquier compuesto vecino. La reacción del O2• con el H2O2 catalizada con el hierro (Haber-Weiss) equivale a la estimulación de la reacción de Fenton con el O2•, ya que éste funciona para reducir el Fe(III) en Fe(II) (1.5 x 108 M-1 seg-1). Esta reacción posiblemente no ocurre in vivo, pues hay otros compuestos reductores en la célula, como el glutatión, que están en mucho mayor concentración que el O2• y que pueden reducir el Fe(III). El •OH es uno de los compuestos más reactivos que existen. El •OH no se puede difundir porque interacciona rápidamente (109 M-1 seg-1) casi con cualquier compuesto celular. La urea es uno de los pocos compuestos con los que el •OH reacciona menos rápido (105 M-1 seg-1). El •OH puede oxidar tanto las purinas como las pirimidinas y también la desoxiribosa. Además puede producir rupturas en el DNA. El daño en el DNA se determina midiendo la cantidad de sitios apurínicos, las rupturas en una hebra o la 8-hidroxiguanina en un hidrolizado del DNA. La mayoría de los daños irreversibles en las proteínas son causados por el •OH. El •OH reacciona con cualquier aminoácido en el sitio donde se origina, que generalmente son sitios en donde se encuentra un metal de transición. Así la glutamina sintetasa de N. crassa se inactiva cuando es oxidada por un •OH que se produce por la reacción del H2O2 con un Fe(II) unido a la enzima. En el mismo organismo, la glutamato deshidrogenasa dependiente del NADPH se inactiva cuando es oxidada por un •OH que se genera en la reacción del H2O2 con un Fe(II) unido a un dicarboxilato en el sitio alostérico. La cantidad de proteína oxidada se puede medir determinando los carbonilos que se forman por la oxidación de la prolina y de la arginina en semialdehido de glutamato y también por las rupturas de las cadenas peptídicas. Los carbonilos de las proteínas purificadas se detectan por la formación de la base de Schiff con la difenilhidrazina. El •OH reacciona con la fenilalanina produciendo primero un radical tirosilo y luego la dihidroxifenilala-

40 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 2)

nina; dos radicales tirosilo pueden formar una ditirosina entre dos polipéptidos. Así, otra manera de medir la oxidación de proteínas es determinando la cantidad de ditirosinas en las proteínas. Los ácidos grasos poliinsaturados son más susceptibles a la oxidación con el •OH que los saturados y los monoinsaturados. Esto se debe a que los metilenos entre dos dobles ligaduras pueden perder fácilmente un hidrógeno (hidrógeno alílico). La pérdida de un hidrógeno alílico produce un radical en el carbono. El radical puede migrar de un carbono a otro con lo cual hay un arreglo de las dobles ligaduras. En presencia del O2 se origina un radical peroxilo. El peroxilo a la vez puede tomar un hidrógeno alílico de otro lípido, con lo cual se propaga la reacción de lipoperoxidación. El grado de lipoperoxidación se puede determinar por la cantidad de dienos conjugados, por los carbonilos formados (malondialdehido, 4-hidroxi-2-nonenal) o mediante reacciones que producen compuestos fluorescentes. Como casi todos los compuestos reaccionan rápidamente con el •OH, no hay una manera específica de contender con esta especie reactiva. Sin embargo, es posible que la acumulación de metabolitos como el ascorbato o el glutatión y los llamados solutos compatibles (trehalosa y otros polioles, glicerol, betaína) protejan los ácidos nucleicos y las proteínas del ataque del •OH. Asimismo, algunas proteínas pequeñas, que recubren el DNA de las bacterias en crecimiento estacionario o en las esporas y que unen hierro, pueden tener una función de protección. El •OH se produce principalmente por la reacción de Fenton en la cual un electrón del metal es captado por el H2O2. Algunos metales de transición contienen electrones desapareados, por lo que se consideran radicales libres. El Fe(II) tiene cuatro y el Fe(III) tiene cinco electrones desapareados; el Cu y el Cu(II) tienen un electrón libre; el Cu(I) no tiene electrones desapareados pero acepta fácilmente uno para formar el Cu(II). Por eso, muchos iones de los metales de transición pueden donar o captar electrones. Así, el Fe(II) en solución cede un electrón al O2 formando Fe(III) y O2•. Por el contrario, el Cu(II) y el Mn(II) aceptan un electrón del O2•. En cambio, el Mg(II) y el Zn(II) no participan en reacciones de radicales. Tal vez por eso se utiliza el Zn(II) para estabilizar las cisteínas de algunas proteínas como en la SOD (Cu/Zn), la RNA polimerasa y en los “dedos de cinc” de los factores de transcripción y de otras proteínas. El hierro y el cobre libres pueden catalizar la autooxidación de los compuestos como el NAD(P)H, el ascorbato, los compuestos tioles y las pterinas y flavinas reducidas. La toxicidad del O2• y del H2O2 depende en gran medida de la disponibilidad y la distribución de los metales de transición. La concentración de Mg en una célula como E. coli es de >10 mM; la concentración de Ca, Zn y Fe es diez veces menor (al rededor de 0.1 mM), la de Cu, Mn, Mo y Se es de 1 a 10 μM y la de V, Co y Ni es nanomolar. Además del Fe(II) y del Cu(I), sólo el quelato de Mn(II), el V(V), el quelato de Ni(II), el Co(II), el Cr(V) y el Ti(III) pueden participar en reacciones de radicales.

El dioxígeno y sus especies reactivas • 41

Hay enzimas que oxidan el metal a su estado menos reactivo, por ejemplo, el Fe(II) en Fe(III) y el Cu(I) en Cu(II). La mayor parte de los metales están unidos a las proteínas. Hay proteínas llamadas chaperonas de metales que suministran el metal de manera específica a los sitios de las proteínas que los requieren y, por supuesto, hay proteínas que secuestran un metal, como la ferritina el hierro, y las metalotioneínas el cobre y otros metales de transición. Un tercio de las proteínas que se conocen estructuralmente son metaloproteínas que tienen una gran afinidad por uno o varios metales. La cantidad de sitios de unión en las proteínas para el Zn(II) y el Cu(I) sobrepasa el número de átomos de estos metales que hay en la célula. Por eso se piensa que la cantidad de metales libres en el citosol debe ser extremadamente baja. Para el caso del hierro es posible que sí haya una pequeña fracción de este metal en el citosol o unido de manera inespecífica a diversos compuestos celulares. Por otro lado hay transportadores que sacan los metales de la célula cuando éstos se encuentran en exceso.

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El monóxido de nitrógeno, el peroxinitrito y el dióxido de nitrógeno Hay también otras especies de oxígeno combinadas con el nitrógeno que son importantes en la biología. El NO• es un gas incoloro, moderadamente soluble en agua y muy soluble en solventes orgánicos y por lo tanto en las membranas celulares. En los organismos se forma a través de la NOS a partir del grupo guanidino de la L-arginina. Esta enzima tiene cuatro grupos prostéticos: FAD, FMN, tetrahidropterina y hemo. La reacción requiere cinco electrones que son suministrados por el NADPH. En los mamíferos hay tres NOS, dos son constitutivas y una es inducible, aunque se conocen condiciones en las que también aumenta la actividad de las primeras. Las dos constitutivas se regulan con Ca(II) y calmodulina. La NOS inducible une la calmodulina pero su actividad es independiente del Ca(II). En las plantas y en los microorganismos no se ha encontrado una NOS del tipo de los animales, salvo en Plasmodiun polycephalum. Sin embargo, el NO• sí se produce en estos organismos y una parte proviene de la nitrato reductasa que reduce el NO3– en NO2– y éste puede generar NO•. La concentración fisiológica del NO• es del orden de 1 a 20 nM. La concentración puede ser micromolar en el sitio en el que se produce, pero se diluye debido a que el NO• se difunde rápidamente. El NO• es un radical que se parece al O2• y, a semejanza de éste, no es muy reactivo. Pero, a diferencia del O2•, el NO• no tiene carga y por ello pasa con facilidad las membranas celulares y se difunde. En el aire reacciona con el O2 generando NO2•, un gas café que es mucho más reactivo que el NO•. En el agua el NO• también puede interaccionar con el O2 pero forma nitrito (NO2–) y posible-

42 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 2)

mente NO2• como intermediario. Para producir NO2• en el agua se requiere una alta concentración de NO•. Estas altas concentraciones de NO• y de O2 tal vez sólo pueden ocurrir en las membranas en las que dichas especies son más solubles. El NO• genera rápidamente ONOO– con el O2• (109 M-1 seg-1). Sin embargo, debido a que el NO• se diluye por su difusión y a la presencia de las SOD, sólo una pequeña parte (1%) del O2• que se produce reacciona con el NO• y forma ONOO–. La mayor parte del O2• se transforma en H2O2 con las SOD. El ONOO– se puede protonar a pH fisiológico en ácido peroxinitroso (ONOOH) volviéndose más reactivo, pues se descompone en •OH y NO2•. Sin embargo, esta reacción probablemente no ocurre in vivo debido a que el ONOO– se une rápidamente con el bióxido de carbono (CO2) que normalmente está presente. La interacción del ONOO– con el CO2 es 50 a 100 veces más rápida que su descomposición. Con el CO2 el ONOO– forma el nitrosoperoxocarbonato que es inestable y se descompone: dos tercios en NO3– y CO2 y un tercio en el radical trióxido de carbono o radical carbonato (CO3•) y el NO2•. Los radicales CO3• y NO2• constituyen un sistema nitritante muy efectivo. El CO3• reacciona con algunos aminoácidos como la tirosina, el triptofano y la cisteína; 105 veces más rápido que con la glicina o la alanina. Así, el CO3• interacciona con la tirosina atrayendo un hidrógeno para generar un radical tirosilo con el cual el NO2• reacciona formando un nitrito de tirosina. El NO2• también interacciona con el radical de tirosina que se encuentra en algunas proteínas, por ejemplo, en el sitio activo de la ribonucleósido difosfato reductasa o de la prostaglandina H2 sintasa-1. El NO2• también se puede producir a partir del NO2– con una peroxidasa como la mieloperoxidasa o la bromoperoxidasa. Debido a la concentracion milimolar del glutatión intracelular, éste compite con el CO2 por el ONOO– formando el ácido sulfénico del glutatión y NO2–. El NO2• también reacciona con el glutatión, aún más que con las tirosinas, produciendo un radical tiilo y NO2–. El tiilo de glutatión a la vez genera S-nitrosoglutatión con el NO•. De hecho, es probable que sea el glutatión nitrosilado el que nitrosile los tioles de muchas proteínas, lo cual puede ser un mecanismo de regulación de la actividad de algunas proteínas. Asimismo el CO3• reacciona rápidamente con el glutatión, el NAD(P)H y el ascorbato. No obstante la baja producción del ONOO–, del CO3• y del NO2•, cuando hay tensión oxidante, aumentan los radicales tirosilo de las proteínas y también la nitritación de los mismos. Es probable que las tirosinas que se nitritan dentro de las proteínas no estén accesibles al glutatión y que tiendan a generar radicales tirosilo y a reaccionar con el NO2•. Esto puede ser una manera de regular la actividad de estas proteínas. En cambio, el NO• sólo reacciona lentamente con los tioles formando nitrosotioles, por ejemplo, con el glutatión o la cisteína. Pero para que esta reacción se lleve a cabo in vivo se requiere la interacción de un metal unido al NO• o al tiol. Es probable que algunos tioles de las proteínas sean particularmente sensibles a

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El dioxígeno y sus especies reactivas • 43

la nitrosilación directa con el NO•, por ejemplo, un tiol de la hemoglobina y de la proteína AE1 de los eritrocitos y uno de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. El NO• no es capaz de iniciar una reacción de lipoperoxidación. Por el contrario, siendo un radical, se puede unir con los lipoalcoxilos y los lipoperoxilos y así terminar la reacción en cadena de la lipoperoxidación. La mayoría de los lipoperoxilos nitrosilados se arreglan para formar peroxinitritos estables. Sin embargo algunos de ellos se pueden romper y producir NO2• y un lipoalcoxilo que continuaría la reacción. El NO2• sí es capaz de abstraer un hidrógeno alílico e iniciar el proceso de lipoperoxidación. También se puede unir a una doble ligadura y generar isomerizaciones cis-trans o formar nitritovinilos. El NO2• puede reaccionar con el NO• y producir así el trióxido de dinitrógeno (N2O3), aunque, debido a la concentración de los reactivos, es poco probable que esta reacción ocurra in vivo. El N2O3 es muy oxidante: puede formar lípidos y tioles nitrosilados y NO2–. En resumen, el NO• sólo interacciona con otros radicales, por ejemplo, con los metales de transición, entre ellos el del hemo y los de los centros Fe-S de algunas proteínas, el O2• o los radicales lipídicos. Para reaccionar con otros compuestos, el NO• se debe convertir primero en un compuesto más reactivo, como el NO2•, o el N2O3. En el hombre, la mayor parte del NO• que se genera en los tejidos se une a la hemoglobina o a la mioglobina, produciendo NO3– y metahemoglobina o metamioglobina. El NO3– se elimina con la orina. En los microorganismos el NO• se desecha con la actividad de las flavohemoglobinas, que en realidad son monóxido de nitrógeno oxidasas y forman al NO3–. Estas enzimas se inducen con el NO•. La función del NO• se lleva a cabo a través de su unión al hierro del hemo de algunas proteínas, la nitrosilación de algunos tioles particularmente sensibles, e indirectamente mediante la nitritación de tioles y tirosinas en las proteínas y de los lípidos. La NOS del endotelio de las arterias produce NO• que se difunde y es captado por una cisteína de la hemoglobina. Cuando la hemoglobina no tiene unido O2 transfiere el NO• a una cisteína de la proteína membranal AE1 de los eritrocitos, que a la vez lo libera fuera del eritrocito. El NO• entra a la célula del músculo liso de los vasos sanguíneos, se une al hemo de la guanilato ciclasa y de esta manera la activa. El hemo no participa en la reacción de guanilato ciclasa sino sólo en su regulación. La unión del NO• al hemo es preferentemente pentacoordinado, lo cual deja libre una histidina axial que conduce a la activación de la enzima. El aumento en el GMP cíclico origina una disminución del Ca(II) intracelular con lo cual se relaja el músculo produciendo así una vasodilatación. Otro efecto que tiene el NO• a través del incremento en el GMP cíclico es el de inhibir la adhesión y la fusión de las plaquetas. El GMP cíclico actúa también sobre algunas proteínas cinasas y sobre algunos canales iónicos. La inhibición del

44 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 2)

Cuadro 2-1. Fuente, concentración intracelular, reactividad y eliminación del dioxígeno y de las principales especies de oxígeno reactivas Especie

Fuente

Concentración intracelular1

Reactividad

Eliminación

O2

Externa, catalasa

10 a 20 μM

Hemo, Fe(II), flavinas, pterinas alcoxilos, NO•

O3

Externa

≈0

Ácidos nucleicos, proteínas, Ascorbato lípidos, sacáridos y demás compuestos celulares

1O 2

Fotosensibilización, descomposición H2O2 (HOBr), dismutación espontánea del O2•, peroxilípidos, NO2 + ONOO-

pM, vida ½ 0.1 — 73.0

Cuadro elaborado a partir de los datos publicados por M.J. Davis

Las constantes de velocidad para las reacciones entre las diversas especies reactivas de oxígeno (•OH) y las biomoléculas varían, de aquí que la velocidad total de la reacción, que es el producto de la constante de velocidad por la concentración de la molécula blanco, estará determinada principalmente por la concentración de la molécula blanco, que para el caso de las proteínas es mayor que la de los ácidos nucleicos o de los lípidos. Este dato subraya la dificultad en el diseño de estrategias antioxidantes que puedan competir con éxito con el daño oxidativo que reciben las proteínas, dado que la mayor parte de los antioxidantes están presentes a concentraciones micromolares, comparados con las concentraciones milimolares de las moléculas blanco.

❚ ACUMULACIÓN

DE PROTEÍNAS OXIDADAS

En los capítulos anteriores se describieron los diferentes procesos fisiológicos y del ambiente que llevan a la formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (figura 7-2). Cualquiera de ellos es potencialmente capaz de promover la oxidación de las proteínas, pero también depende, en diversa medida, de otras proteínas presentes en la célula. Por ejemplo, la reacción de Fenton es dependiente de hierro y cobre, los cuales a su vez están determinados por la concentración de metaloproteínas (ferritina, transferrina, lactoferrina y ceruloplasmina, incluidas en la figura 7-2). El nivel tisular de las especies reactivas de oxígeno está relacionado con la concentración de vitaminas (A, C y E) y metabolitos (ácido úrico, albúmina, bilirrubina), que son secuestradores de radicales libres o facilitadores de la regeneración de los metabolitos que hacen eso. Por último, los quelantes de iones metálicos pueden suprimir o aumentar la velocidad de regeneración de las especies reactivas de oxígeno, formando complejos con hierro o cobre, que inhi-

Daño a proteínas

•

101

Prooxidantes Antioxidantes Inflamación

X

Polución atmosférica

UV

Neutrófilos Macrófagos

Proteínas (enzimas) nativas

RH oxidasas +

EOR

–

Envejecimiento Arginina

Proteínas (enzimas)

Superóxido dismutasa Catalasa Glutatión peroxidasa Glutatión reductasa Metionina sulfóxido reductasa Tiol peroxidasa Ceruloplasmina Ferritina Transferrina Albúmina

NOS

Cadena respiratoria micotondrial

Vitaminas A,C y E Bilirrubina Ácido úrico Metabolitos GSH/GSSG y vitaminas NAD(P)H/NAD(P) Zn, Mg, Mn Lipoato

Proteínas oxidadas Carbonilos Aminoácidos oxidados Péptidos

Etanol

Lipoperoxidación Factores reguladores Ubiquitina RSH Metales Transcripción Síntesis

+

Proteasas

–

Proteínas resistentes a proteasas (por entrecruzamiento)

Productos de la glucación y la glicoperoxidación

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Péptidos Aminoácidos

Figura 7-2. Agentes prooxidantes y activadores de proteasas que favorecen la oxidación y degradación de proteínas y agentes antioxidantes que activan la oxidación y degradación de las proteínas en las células.

ben su habilidad para catalizar la formación de dichas especies o alteran los potenciales redox, y por tanto, su habilidad para desarrollar interconversión entre los estados oxidados y reducidos. Respecto a la concentración de proteasas, cabe mencionar que algunas formas de proteínas oxidadas (proteínas con entrecruzamientos modificados por glicación, o por productos de la lipoperoxidación) no sólo son resistentes a la proteólisis, sino que pueden inhibir la habilidad de las proteasas para degradar las formas oxidadas de las proteínas. La acumulación de proteínas oxidadas es la base de un conjunto de posibles problemas para las células y los individuos, y en parte depende de la eficacia de los sistemas responsables para la eliminación de las proteínas modificadas por la oxidación. En el citosol y en el núcleo existen proteosomas, y en la mitocondria son las Lon proteasas las encargadas de degradar las proteínas oxidadas. Las células cuen-

102

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

tan con enzimas específicas para la reparación. La tiorredoxina reductasa es capaz de revertir los productos de oxidación de la cisteína a cistina. La metionina puede oxidarse a su sulfóxido creando un nuevo centro de asimetría con dos estereoisómeros S y R que pueden ser reducidos por metionina sulfóxido reductasas A (MsrA) y B (MsrB), respectivamente. La oxidación de los residuos de metionina sepultados al principio pueden tener efectos consecutivos sobre la estructura proteínica; la flexibilidad de esta cadena lateral también puede permitir cambios locales en la estructura que ocurren más rápido que con grupos más grandes y rígidos, dando cambios más grandes en la estructura total que se requieren para permitir el acceso de la fase acuosa al residuo oxidado.

❚ SITIOS

DE DAÑO PROTEÍNICO: SELECTIVIDAD DEL MISMO

La intensidad del daño va de acuerdo con la selectividad del oxidante; en general, entre más reactivo sea el oxidante, su selectividad será menor y viceversa. Por ejemplo, el radical •OH reacciona con diferentes cadenas laterales de una proteína con una constante de velocidad relativamente pequeña (kca de 10-7 a 10-10 dm3mol-1seg-1), de manera que todas las cadenas laterales se oxidan en menor o mayor grado, aunque las cadenas laterales aromáticas, o las que contienen azufre, se afectarían más rápido. La abstracción de hidrógeno del esqueleto de carbono por radicales hidroxilo ocurre con una kca de velocidad de alrededor de 10-9 dm3 mol-1seg-1; este radical causa consistentemente daño en el esqueleto de carbono y en las cadenas laterales, con la consecuente fragmentación de las proteínas. Como muchas de las especies reactivas de oxígeno generadas en los sistemas biológicos son deficientes en electrones (oxidantes electrofílicos), tienden a reaccionar más rápido con cadenas laterales ricas en electrones, por ejemplo, los residuos de los aminoácidos triptófano, tirosina, histidina, metionina, cisteína y fenilalanina. Los oxidantes menos reactivos son más selectivos para actuar en el sitio que oxidan, por ejemplo, la constante de velocidad para la reacción del radical peróxido sustituido CCl3OO• con las cadenas laterales de un aminoácido varían de kca 9 x 10-7 dm3mol-1seg-1 para residuos de triptófano, hasta más abajo del límite detectable, lo cual es consistente con un daño mucho más selectivo producido por este oxidante. Oxidación del esqueleto de carbono en las proteínas El ataque oxidativo al esqueleto de carbono de un polipéptido por lo general se inicia por el ataque de un •OH que abstrae un átomo de hidrógeno del carbono-

Daño a proteínas

•

103

α de un residuo de aminoácido para formar H2O, dejando en la proteína un radical centrado al carbono (reacción a en la figura 7-3). El radical centrado recién formado reacciona rápido con 1O2 para producir un radical alquilperoxil intermediario (reacción b en la figura 7-3), el cual puede dar lugar al radical alquilperóxido (reacción c en la figura 7-3) seguido de la formación de un alcohoxirradical (reacción d en la figura 7-3), la cual da lugar al derivado hidroxilproteína (reacción e en la figura 7-3). Los pasos de esta secuencia de reacciones están significativamente mediados por interacciones con •OH o con HO•2, aunque también pueden ser catalizados por Fe2+ o por Cu+. Los radicales alquilo, alquilperoxilo y alcohoxilo, intermediarios de esta vía, pueden generar reacciones con otros aminoácidos en la misma o de otra molécula de proteína para producir un nuevo radical centrado al carbono (reacciones tipo 1), capaz de conducir reacciones similares a las ilustradas en figura 7-3. R1 C•

R2 CH

+

R2 C•

+

R1 CH

R2 C•

+

R1 OOH

+

R1 OOH

radical alquilo

R1OO• +

R2 CH

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radical aquilperoxilo

R1 O• +

R2 CH

R2 C•

radical alcohoxilo

Reacciones tipo 1 Más aún, cuando se evita la reacción b de la figura 7-3 en ausencia de oxígeno, el radical centrado al carbono puede reaccionar con otro radical centrado en el carbono y formar un nuevo derivado por el entrecruzamiento proteína-proteína (reacción tipo 2). R3 C•

+

R4 C •

Reacción tipo 2

R3 C

CR4

104

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

Entrecruzamiento de proteínas

R R

O2

a –NH-C-CO– •

–NH-CHCO– • OH

HO 2

–NH-C-CO–

b

O O • Radical alquilperoxil

R adical centrado al carbono (alquilo)

Fe 3+ , • OH Rayos o ray os X

Fe

• HO2

2+

Fe2+ + H + c

O2 H2 O

2 2

Productos de la glucación y la glicoperoxidación R –NH-C-CO–

HO2

O2

3+

Fe

R

R

•

e

Derivado hidroxil proteína

3+

Fe

H O

–NH-C-CO–

Fe2+ + H + Radical

• HO2

H2 O + O 2 d

O • • 3+ alcohoxil Fe + OH

2+

Fe

–NH-C-CO– O O H Radical alquilperóxido

Ruptura de la unión peptídica

Figura 7-3. Oxidación de proteínas mediadas por especies reactivas de oxígeno. En las reacciones en las que participa el Fe2+, éste puede ser sustituido por Cu2+.

La velocidad de reacción entre el esqueleto de carbono de las proteínas y la mayor parte de los oxidantes que no son radicales libres es baja, y por eso el daño es pequeño. En contraste, los radicales libres reaccionan rápido con el esqueleto de carbono de las proteínas mediante la abstracción de un átomo de hidrógeno de carbono-α, el sitio de unión de las cadenas laterales de los aminoácidos, para dar un radical estable, centrado en el carbono (reacción tipo 2; vía electrón deslocalizado por el carbonilo vecino y el grupo funcional nitrogenado).

Daño a proteínas

•

105

Oxidación de las cadenas laterales de los aminoácidos de las proteínas Todos los residuos de aminoácidos son susceptibles a ser oxidados por el radical •OH. Sin embargo, los productos formados en la oxidación de algunos residuos no han sido completamente caracterizados. Las 20 cadenas laterales de los aminoácidos ofrecen una gran variedad de sitios potenciales de reacción y productos de reacción con oxidantes. Para una discusión más fácil se presentarán por separado las reacciones de oxidación de los aminoácidos alifáticos, aromáticos y azufrados, en particular cisteína, cistina y metionina.

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Residuos alifáticos durante la oxidación de proteínas La mayor parte de las reacciones de oxidación de los residuos alifáticos en las proteínas ocurre al reaccionar con los radicales más reactivos, y dan lugar a radicales centrados en el carbono con eliminación del átomo de hidrógeno, pueden suceder en todos los sitios disponibles. Se consideran tres destinos principales de estos radicales centrados en el carbono: la dimerización con otros radicales, en la cual se generan entrecruzamientos dentro de la misma proteína, así como entre polipéptidos y otras proteínas. Esta reacción se ha descrito cuando se someten los tejidos a periodos de anoxia, y se ha reportado que los dímeros tienen un papel importante en la agregación de proteínas. Un segundo destino es hacia la reparación de los radicales centrados en el carbono por medio de tioles, resultando en la formación del radical tiilo (R-S•). Estas reacciones están en equilibrio, por lo que el grado de reparación, en contraste con el de oxidación de la cadena lateral por los radicales tiilo, depende de la naturaleza exacta de cada una de las especies involucradas. El tercer camino de los radicales centrados en el carbono es el que ocurre con más frecuencia en condiciones de oxigenación, estos radicales reaccionan con el 1O2 para producir peroxilo, cuyo destino no está definido por completo, pero en experimentos con modelos de compuestos se sabe que pueden originar la terminación de las reacciones radical-radical que generan ácidos, peróxidos, alcoholes y carbonilos (algunos ejemplos de productos obtenidos con aminoácidos alifáticos y azufrados se incluyen en el cuadro 7-2), aun cuando otra alternativa es la producción de radicales alcohoxilo y 1O2. A su vez, los radicales alcohoxilo, mediante la eliminación de átomos de hidrógeno, generan compuestos carbonilo, o bien constituyen un proceso de propagación de los radicales libres cuyas moléculas blanco con las que reaccionan incluyen DNA, lípidos y otras proteínas.

106

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

Cuadro 7-2. Productos estables formados a partir de la oxidación de aminoácidos alifáticos y azufrados y de las cadenas laterales de dichos aminoácidos en las proteínas Aminoácidos o residuo Arginina

Productos Ácido 5 hidroxi-2-amino valérico Compuestos carbonilo Cistina (disulfuro) Oxiácidos (RSO2H, RSO3H) Sulfonamidas Ácido aminomalónico Alcoholes Compuestos carbonilo Alcoholes Compuestos carbonilo Sulfóxido de metionina Metionina sulfona Alcoholes Ácido 2 hidroxi-5-amino valérico Compuestos carbonilo Alcoholes Compuestos carbonilo

Cisteína

Glicina Isoleucina Lisina Metionina Prolina

Valina

No se incluyeron en la lista los compuestos formados de carácter inestable, los más comunes para la mayor parte de los aminoácidos incluidos fueron hidroperóxidos.

Generación de derivados carbonilos durante la oxidación de proteínas Como se ha hecho notar, la ruptura oxidativa de las proteínas ya sea por vía de la α-amidación (figura 7-4) o por oxidación de las cadenas laterales del Glu (reacción 3), conduce a la formación de dos péptidos: •

R1CONHCHCONHR2

OH, HO2 •, O2

R1CONH2 + CH3 COCONHR2 + COOH + H2O2 COOH

(CH2)2 COOH

Reacción tipo 3 Además, la oxidación directa de los residuos de lisina, arginina, prolina y treonina, pueden producir también grupos carbonilos. Por otra parte, los grupos car-

Daño a proteínas

H O

O

•

107

HO

NH – C- C-NH- C + O=C=N-C-C– O 2

R1

R2

R3

a

H O

• OO

HO

NH – C - C-NH-C-C-NH-C-C–O 2

R1

R2

R3

b

H O

OO

HO

NH –C-C-NH + R2 –C-C-NH-C-C–O 2

R1

R3

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Figura 7-4. Ruptura de la unión peptídica vía formación de una diamina (aa) o vía α-amidación (b b).

bonilos pueden ser introducidos en las proteínas por reacciones con aldehídos (malondialdehído, 4-hidroxi-2-nonenal) producidos durante la lipoperoxidación (figura 7-5). Una reacción muy similar ocurre cuando el 4-hidroxi-2-nonenal (4HNE) es sustituido por el malondialdehído (MDA). Asimismo, se puede incorporar un grupo carbonilo a una proteína al reaccionar residuos de lisina con azúcares reductores o de sus productos de oxidación (reacciones de glucación y glucosilación, figura 7-6). Por tanto, la presencia de grupos carbonilo en las proteínas se ha empleado como un marcador de oxidación de proteínas mediada por especies reactivas de oxígeno, y se han diseñado varios métodos sensibles para detectar y cuantificar los grupos carbonilo en las proteínas, lo que ha permitido establecer que la oxidación de proteínas se asocia al estrés oxidativo, enfermedades y por último al envejecimiento.

108

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

R1

HN HC-CH2-CH2-CH2-NH2- + O=C R2 Lisina de una proteína

3

R

R3

R1

CH CH

HN

CH CH

O

HO

(Capítulo 7)

CH-OH

CH2-CH2-CH2N-CH HC-CH O=C CH2 R2 HC

4-hidroxi-2-nonenal

Proteína con carbonilo

O

Figura 7-5. Introducción de un grupo carbonilo a una proteína. La reacción se ejemplifica aquí con un residuo de lisina, pero puede ocurrir también con el grupo –SH de un residuo de cisteína o con un nitrógeno del grupo imidazol de la histidina. El residuo de alguno de estos aminoácidos en una proteína reacciona con un aldehído, en este caso el 4 hidroxi-2-nonenal, generado por la lipoperoxidación de ácidos grasos poliinsaturados, y el aducto que forman tiene incorporado un grupo carbonilo.

Residuos aromáticos en la oxidación de proteínas Los residuos aromáticos son, entre todos los residuos de los aminoácidos, los blancos preferidos para el ataque por las especies reactivas de oxígeno. Como se muestra en el cuadro 7-3, los residuos de triptófano son rápidamente oxidados a formilquiniurenina y quinurenina y otros hidroxiderivados. La fenilalanina y la tirosina, al oxidarse, producen varios hidroxiderivados, y a su vez los residuos de la histidina dan lugar a 2-oxohistidina, asparragina y ácido aspártico. Con el descubrimiento del óxido nítrico como producto normal del metabolismo de la arginina y como mensajero intercelular, se encontró que reacciona rápido con el O2• para formar peroxinitrito (ONOO–), cuyos efectos biológicos son de suma importancia, sobre todo en la regulación de varias funciones celulares. La metionina y la cisteína son particularmente vulnerables a la oxidación por ONOO–, mientras que la tirosina y el triptófano son blancos selectivos para la nitración por el mismo. La nitración de los residuos de tirosina resulta de suma importancia, ya que impide la habilidad de la tirosina para llevar a cabo la interconversión cíclica entre formas fosforiladas y desfosforiladas, o entre las formas no modificadas y las nucleotidiladas. La demostración de que la nitratación de los residuos de tirosina en sustratos modelos previene la fosforilación de los mismos por la proteína tirosina cinasa, apoya también la posibilidad de que la nitratación participe de manera activa regulando la función. La habilidad del ONOO– para nitratar a los residuos de tirosina y oxidar los de metionina de las proteínas, depende de la disponibilidad de CO2. En ausencia de CO2, el ONOO– está en equilibrio con su forma activa, de estructura desconocida, que reacciona rápido con residuos de metionina para formar sulfóxido de metionina (MeSOX); pero en presencia de CO2, el ONOO– es instantáneamente

Daño a proteínas

•

109

Cuadro 7-3. Productos estables formados a partir de la oxidación de aminoácidos aromáticos y de las cadenas laterales de dichos aminoácidos en las proteínas Aminoácidos Fenilalanina Histidina

Tirosina

Triptófano

Productos 2 hidroxifenilalanina 3 hidroxifenilalanina 2 oxohistidina Alcohol Productos carbonilos Dos tirosinas unidas por un enlace C-C Alcoholes Productos ciclizados N-formil kinurenina Kinurenina 5-hidroxitriptófano 7- hidroxitriptófano Alcoholes Productos ciclizados

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No se incluyeron en la lista los compuestos formados de carácter inestable, fueron hidroxiperóxidos para 3 de los 4 aminoácidos incluidos. Tampoco se anotaron los derivados obtenidos con el tratamiento de agentes oxidantes conteniendo halógenos o nitrógeno en su molécula.

convertido a un derivado (O = NOOCO2 o O2NOCO–2) que puede nitratar compuestos aromáticos. Como tales, la nitratación de la tirosina y la oxidación de residuos de la metionina en las proteínas son procesos mutuamente excluyentes, que están regulados en forma diferencial por la disponibilidad de CO2 (figura 7-7). Oxidación de cisteína y metionina Los residuos de cisteína y metionina son muy sensibles a la oxidación por casi todas las formas de especies reactivas de oxígeno. Bajo condiciones moderadas, la cisteína es convertida a disulfuro, y los residuos de metionina a sulfóxido de metionina. Casi todos los sistemas biológicos contienen tanto disulfuro reductasas como sulfóxido metionina reductasas, que pueden convertir a los residuos oxidados de cisteína y metionina a las formas originales. La facilidad con la que se oxidan la cisteína y la metionina hacen de estos residuos los sitios más susceptibles de oxidación dentro de las proteínas. Dicha oxidación puede suceder vía directa interactuando con el oxidante, o mediante la transferencia de radicales dentro de una proteína después de una oxidación en un

110

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

C=N-P

C-NH-P

(HCOH)n CHO P-NH2 + (HCOH)n (Lis) R

C=O (HCOH)n-1

R O2, Me

(Capítulo 7)

2+

R CH=N-P CHO

P-NH2

C=O

C=O (HCOH)n-1 (HCOH)n-1 R R

Figura 7-6. Formación de proteína carbonilo por glucación o glucoxidación.

sitio lejano. Con la mayor parte de los radicales oxidantes se forman los radicales tiilo (R-S•), cuyo destino puede ser la dimerización para producir el dímero (cistina), o la reacción con oxígeno para formar el radical peroxilo, se trata de procesos competitivos. El destino último del radical peroxilo es la formación de oxiácidos (RSO2H y RSO3H). La formación de disulfuros (R-S-S-R) es una de las pocas “lesiones” por oxidación de las proteínas que pueden ser reparadas con rapidez, ya que la mayor parte de los sistemas biológicos cuentan con reductasas y disulfuro isomerasas que mantienen los residuos de cisteína en su forma reducida. En la actualidad se puede asegurar que la oxidación controlada de los residuos de cisteína y la reducción de la cistina constituyen un mecanismo de alternancia del estado redox que controla la estructura y función de gran número de proteínas clave. La oxidación de los residuos de cistina se ha estudiado menos que la oxidación de los residuos de cisteína, pero también ocurren rápido. La oxidación de tales residuos sucede por varios caminos, y comprende la formación inicial de una especie de aducto y la subsecuente y rápida reacción para formar finalmente especies oxigenadas como el monosulfóxido (RSS[ = O]R). El grupo funcional tioéter (R-S-R) de la metionina es rápidamente oxidado por un gran número de especies debido a su bajo potencial de oxidación. De particular importancia es la facilidad con la que la metionina libre reacciona con el HOCl y el HOBr, lo cual explica el uso común de la metionina como atrapador de estos oxidantes. El principal producto resultante de la oxidación de la metionina en la mayor parte de los péptidos y proteínas es el sulfóxido correspondiente; oxidaciones posteriores de estas especies forman las sulfonas, aunque éstas ocurren en una proporción mucho menor. Es importante anotar que son dos los sulfóxidos gene-

Daño a proteínas

•

111

M et [ONOO*]

MeSOX

CO2 HONOO H+ CO 2

H

+

NO2 -

[ONOOCO 2 - ]

TIR

Tir

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Figura 7-7. La posibilidad del peroxinitrito (PN) para nitratar los residuos de tirosina de las proteínas depende de la disponibilidad de CO2. En ausencia de CO2, el PN está en equilibrio con la forma activa (PN*) de la estructura desconocida, pero reacciona rápido con residuos de metionina para formar metionina sulfóxido. En presencia de CO2, el PN es casi instantáneamente convertido a un derivado (quizá O = NO2CO2– o O2 NOCO2), que puede nitratar compuestos aromáticos.

rados, el D– y el L–. Este hecho tiene repercusiones importantes durante la reparación de las lesiones oxidantes, ya que la reducción es estereoespecífica. La relación de los dos isómeros varía con los diferentes oxidantes, y también con los diferentes residuos de metionina en una proteína; algunas evidencias sugieren que la estructura proteínica, al menos in vitro, es el factor más importante en el control del isómero predominante. Lo anterior resulta evidente en experimentos in vitro; sin embargo, no se dispone de información suficiente para valorar la reparación tal como ocurre in vivo, ya que dicha reparación se sobrepone al recambio de la proteína, con lo cual se afecta a la población. El H2O2 puede oxidar a los residuos de metionina en los sitios activos de varias enzimas, y como consecuencia, de tal oxidación puede resultar una pérdida de la actividad enzimática. Los alquilperóxidos pueden inducir la oxidación de la metionina en algunas proteínas, pero no en todas. Además, los residuos de metionina pueden ser oxidados por algunos péptidos y peróxidos de proteína. También los lipoperóxidos pueden oxidar a la metionina de las proteínas, así como también mezclas de lipoproteínas oxidadas y lipohidroperóxidos en las lipoproteínas de baja y alta densidad.

112

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

❚ CAMBIOS

EN LA MOLÉCULA DE PROTEÍNA PRODUCIDOS POR LA OXIDACIÓN

Dimerización y fragmentación Como puede deducirse de la información previa, la oxidación de las proteínas produce cambios físicos importantes: desde la fragmentación del esqueleto hasta la oxidación de las cadenas laterales de los residuos de los aminoácidos, que a su vez promueven directamente la dimerización o la agregación. El entrecruzamiento directo sucede vía dimerización intermolecular radical-radical, mediante reacciones que permiten entrecruzamientos de dos tirosinas. La dimerización secundaria de dos proteínas se establece a través de numerosas reacciones que incluyen a los residuos que contienen grupos amino (lisina y arginina) con grupos carbonilo procedentes de las reacciones de oxidación. Por otra parte, las reacciones de entrecruzamientos y las especies formadas en algunos casos aún no han sido caracterizadas totalmente. Es de suponerse que algunas de las reacciones donde ocurre la descomposición de los productos formados éstos sean una fuente de radicales, los cuales pueden reaccionar con 1O2, por ejemplo, y producir radicales superóxido y H2O2. A su vez, de estos procesos pueden formarse nuevas especies reactivas de oxígeno, y la oxidación de proteínas puede suceder mediante reacciones “en cadena”. Respecto a la fragmentación de las proteínas, la oxidación de radicales alcohoxilo (figura 7-3, producto de la reacción d) sienta la plataforma para la ruptura de la unión peptídica, ya sea por medio de la diamida (figura 7-4a) o por la α-amidación (figura 7-4b); en ambas vías los extremos N terminal y C terminal son característicos. También puede suceder la ruptura de la unión peptídica en las proteínas vía especies reactivas de oxígeno, que reaccionan con las cadenas laterales de glutamil, aspartil y propil de la propia proteína. Por medio de una reacción de abstracción dependiente de •OH sobre el hidrógeno presente en el átomo de carbono-γ del residuo de glutamil, el proceso químico puede continuar con un conjunto de reacciones análogas, que finalmente llevan a la ruptura de la unión peptídica por un mecanismo en el cual se forma ácido oxálico y el N-terminal del aminoácido del péptido derivado de la porción carboxilo terminal de la proteína que al final será un derivado N del piruvato. Este caso se revisó al tratar la generación de derivados carbonilo durante la oxidación de proteínas (reacción tipo 3). También es posible cuantificar la fragmentación de proteínas con base en la observación de que el número de péptidos formados durante la radiólisis de proteínas es aproximadamente igual al número de residuos de prolina presentes en la proteína, por lo que se propuso que la oxidación de la prolina conduce a la ruptura de la unión peptídica. Esto ha sido verificado en experimentos donde se demuestra que la oxidación de la prolina lleva a la formación de la 2 pirrolidona

Daño a proteínas

•

113

y la ruptura concomitante de la unión peptídica. La hidrólisis ácida de la 2 pirrolidona produce ácido 4 aminobutírico, la presencia de este ácido en hidrolizados de proteínas es una evidencia presumible de la mencionada ruptura de la unión peptídica por la vía de la oxidación de prolina: •

CONHCHCO– R1CON

R2

OH, HO2 •

O + CO2 + H2NCHCO– + H2O

R1CON

R2

Reacción tipo 4

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Desdoblamiento y cambios conformacionales La oxidación de las cadenas laterales de los residuos de los aminoácidos en las proteínas puede provocar desdoblamientos y cambios conformacionales en las propias proteínas, con consecuencias importantes sobre la función biológica desempeñada. Existen estudios en los que se demuestra que la oxidación de tales residuos que se localizan en la superficie de la macromolécula tiene menos influencia sobre la conformación de la proteína que la oxidación de los residuos sepultados en el seno de la misma. Además, estos últimos son más lentos para oxidarse (en ocasiones requieren de condiciones más severas), sobre todo cuando el oxidante iniciador está presente en la fase acuosa donde está embebida la proteína. La mayor parte de los procesos de oxidación que suceden en las cadenas laterales dan como resultado una mayor hidrofilicidad del residuo. Hay excepciones notables, por ejemplo, la descarboxilación del ácido aspártico y del glutámico y la desaminación de la lisina inducida por la descomposición del hidroperóxido y de la cloramina, respectivamente. Muchas uniones C-H de las cadenas hidrofóbicas en los residuos laterales de los aminoácidos se convierten en peróxidos, alcoholes o grupos carbonilo, que tienen momentos dipolo más grandes y pueden participar formando puentes de hidrógeno con las moléculas del solvente. La oxidación de muchos residuos aromáticos también pueden favorecer la incorporación de grupos con carga (hidroxil, peroxil, nitro, cloro y bromo sustituyentes, además de otros). De lo anterior se percibe la existencia de una fuerza generadora de cambios en la conformación de proteínas, resultado de la oxidación de residuos de aminoácidos presentes en la superficie externa de la proteína, la superficie más accesible al agua. La cadena lateral de la metionina es relativamente no polar, por lo general se encuentra sepultada en regiones hidrofóbicas de la estructura proteínica, y su conversión al sulfóxido más polar tiene marcados efectos conformacionales, por lo que no es de sorprender que la oxidación de un residuo de metionina original-

114

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

mente sepultado, pueda tener consecuencias lesivas en la estructura y función proteínica. Mientras que la oxidación de un grupo de metionina en una cadena periférica en la región hidrofílica de la proteína no conlleva cambios en su estructura y función. Por ejemplo, la oxidación del residuo de metionina expuesto sobre la superficie de varias proteínas no tiene ningún efecto sobre su estructura. En contraste, la oxidación de otros residuos internos de metionina puede resultar en cambios detectables en la estructura y en la interacción de otras moléculas. La oxidación de uno de los ocho residuos de la metionina (met 385) en el inhibidor de la proteinasa α-1, resulta en la pérdida de la inhibición de las elastasas por estas especies. Igual sucede con la oxidación de una de las metioninas vecinales (met 146 o met 147) en el dominio C terminal de la calmodulina, donde determina una pérdida de 30 veces en la afinidad por el Ca2+. Sin embargo, no en todos los casos tienen efectos deletéreos; hay varios ejemplos donde la oxidación de los residuos de metionina que pasan a ser sulfóxidos resulta en un aumento de la actividad biológica. La oxidación a sulfóxido del residuo de la met-1-de ubiquitina aumenta 50% su reactividad, mientras que una mayor oxidación la lleva a sulfona, resulta en un descenso en la actividad. Puede anotarse algo más sobre la oxidación de los residuos de metionina. Como en el caso de la oxidación de otras cadenas laterales de aminoácidos, se ha empleado como marcador de la degradación de proteínas por la maquinaria celular. Se ha propuesto que como consecuencia de la modificación oxidativa de las proteínas resulta un aumento en el recambio de la proteína, aunque también se cuenta con datos sobre una disminución de la velocidad de recambio para algunas proteínas muy modificadas. Por ejemplo, al oxidar a la calmodulina en residuos específicos de metionina hay evidencia de una mayor degradación por el proteosoma 20S, en cuyo caso la velocidad de degradación depende del grado de modificación de la proteína. Transferencia del daño proteínico Existe evidencia experimental de que la transferencia del daño proteínico iniciado en las cadenas laterales alcanza la secuencia vertebral de la cadena proteínica para lograr estabilizar el radical carbono-α deslocalizado. Los radicales alcohoxilo formados en el carbono-β (posición C-3) llevan a cabo una rápida escisión para dar un radical carbono-α y la liberación de la cadena lateral como un aldehído o cetona. El radical carbono-α reacciona con el esqueleto de carbono y ocasiona la fragmentación del mismo. De esta manera, se tiene un mecanismo mediante el cual la oxidación inicial de la cadena lateral da lugar a la fragmentación del esqueleto de carbono (figura 7-3).

Daño a proteínas

•

115

Transferencia del daño de una cadena lateral de aminoácidos a otra cadena lateral de aminoácidos ubicada dentro de la misma proteína. La mayor parte de estas transferencias implican reacciones de un electrón. Se han identificado varios procesos en los que se transfiere la oxidación del sitio inicial a los residuos que se oxidan rápido: triptófano, tirosina, histidina, cisteína y metionina. Estas reacciones suceden a gran distancia en las estructuras proteínicas, y son importantes en varias actividades enzimáticas en las que participan. Se ha demostrado que las reacciones de transferencia de electrones suceden desde otros residuos, como tirosina y triptófano, para oxidar por ejemplo a los residuos de metionina en los péptidos y las proteínas. Este proceso con frecuencia también implica a la cisteína y la cistina. La transferencia de especies reductoras a través de proteínas puede suceder después de la adhesión inicial de un electrón.

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❚ REPARACIÓN

DEL DAÑO PROTEÍNICO

Tal como quedó expresado en el tema Acumulación de proteínas oxidadas (véase antes) de este capítulo, cuando las proteínas contienen un daño importante en su estructura no son reparadas por los mecanismos presentes en la célula y su destino es el catabolismo. La excepción parece ser la formación de cistina y disulfuros mixtos, los cuales pueden reducirse rápido por una batería de reductasas o isomerasas y el sulfóxido de metionina. Varias proteínas han sido caracterizadas en E. coli, y por supuesto más tarde en otras células, incluyendo las de los mamíferos, las cuales son capaces de reducir el sulfóxido de metionina al aminoácido original. Algunas de las reductasas del sulfóxido de metionina (Msr, por sus siglas en inglés) son específicas para el sulfóxido de metionina libre, mientras que otras reducen sólo a las especies contenidas en los péptidos o en las proteínas. Estas últimas son intracelulares y algunas isoformas están asociadas a la membrana. La actividad reductora del sulfóxido de metionina no se ha reportado fuera de las células; por lo que la presencia de sulfóxido de metionina en suero se considera un indicador de daño oxidativo presente in vivo. Las isoformas de esta enzima son ésteres específicos, y la forma MsrA sólo reduce al isómero D, y otra forma recién descrita, la MsrB, que reduce el isómero L. La mayor parte de sistemas biológicos contiene reductasas de sulfóxidos (MrSOx-reductasa) que convierten las formas oxidadas de cisteína y metionina a su formas originales no modificadas. Prácticamente son las únicas alteraciones de proteínas que pueden ser reparadas. Con base en la observación de que la oxidación preferencial de varios residuos expuestos en algunas proteínas tiene poco efecto sobre su función biológica, se ha propuesto que los residuos de metionina convertidos en el sulfóxido representan un sistema “amortiguador

116

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

de sacrificio” para proteínas sometidas a una situación excesiva de oxidación. De esta manera se resuelve la etapa transitoria de oxidación excesiva y las enzimas celulares pueden regenerar la proteína nativa sin que ésta pierda su función y sin lesionar irreversiblemente otras proteínas no provistas del amortiguador de sacrificio.

❚ EXPERIMENTOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO

DE LOS AUTORES

En trabajos realizados en el laboratorio de los autores se emplea un modelo de estrés oxidativo mediante la intoxicación aguda con etanol a una dosis alta (5 g/kg peso corporal) VO. Se mide la presencia de grupos carbonilo en las proteínas plasmáticas mediante la técnica de Levine. El objetivo de los trabajos es definir si los antiinflamatorios no esteroideos (AINE: ácido acetilsalicílico, naproxeno, nimesulida y piroxicam) evitan la oxidación de las proteínas séricas. Con sus resultados han demostrado que la mayor carbonilación de las proteínas por la acción prooxidante del etanol es clara. Asimismo, han encontrado que la adición de ácido acetilsalicílico y piroxicam, en ausencia de etanol, también producen un aumento la carbonilación de proteínas. El efecto prooxidante del etanol es bloqueado por cualquiera de los cuatro AINE empleados. Incluso se abate el efecto prooxidante del ácido acetilsalicílico y el piroxicam cuando son aplicados sin etanol. Se desconoce el mecanismo de acción antioxidante de los AINE empleados. Cabe comentar, en relación con los métodos empleados para medir carbonilos, que debe considerarse el tipo de muestras y la procedencia de las mismas; por ejemplo, se ha documentado que en pacientes diabéticos ocurre mayor glucación y glucosilación de las proteínas plasmáticas, lo cual puede arrojar datos erróneos debido a que en este último caso la detección de carbonilos puede corresponder a los carbohidratos unidos a la proteína y no a los carbonilos de los aminoácidos oxidados de la proteína.

❚ CONCLUSIONES Las proteínas son los blancos más abundantes en las células y tejidos para los numerosos agentes químicos y físicos que llegan a producir estrés oxidativo. El daño a proteínas por estrés oxidativo puede afectar tanto las cadenas laterales de los aminoácidos que la integran como la columna vertebral de la proteína. La reacción de especies reactivas de oxígeno menos reactivas con residuos azufrados específicos de aminoácidos (–SH y –S–CH3) en las proteínas produce oxidación

Daño a proteínas

•

117

del residuo, que se acompaña de un cambio en la estructura, función y actividad de la proteína, dicha oxidación es reversible. Las proteínas dañadas por oxidación no reversible son degradadas intracelularmente aun cuando en ocasiones se acumulan en las células y los tejidos; ambos procesos se asocian a numerosas enfermedades humanas, entre otras Alzheimer, síndrome de inmunodeficiencia respiratoria, distrofia muscular, cataratas, artritis reumatoide, progeria, intoxicación alcohólica aguda, diabetes, aterosclerosis, hipertensión arterial, enfermedad de Parkinson, entre otras.

❚ AGRADECIMIENTOS Los experimentos aquí relatados fueron parcialmente apoyados por el donativo IN-224903, de la DGAPA-UNAM, para MZ de P. Agradecemos a Alejandra Palomares Ayala por su excelente trabajo secretarial.

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❚ REFERENCIAS Berlett BS, Stadtman ER: Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem 1997;272:20313-20316. Berlett BS, Friguet B, Yim MB et al.: Peroxynitrite-mediated nitration of tyrosine residues in Escherichia coli glutamine synthetase mimics adenylytation: relevance to signal transduction. Proc Natl Acad Sci 1996;93:1776-1780. Davies MJ: The oxidative environment and protein damage. Biochim Biophys Acta 2005;1703:93-109. Davies KJA, Goldberg AL: Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erytrocytes. J Biol Chem 1987;262:8220-8226. Davies KJA: Protein damage and degradation by oxygen radicals. J Biol Chem 1987;262:9895-9901. Deconila A, Freeman BA, Trujillo M et al.: Peroxynitrite reaction with carbon dioxide/bicarbonate: kinetics and influence of peroxynitrite-mediated oxidations. Arch Biochem Biophys 1996;333:49-58. Grimaud R, Ezraty B, Mitchell JK et al.: Lafitte D. Briand C. Derrick P.J. Barras F. Repair of oxidized proteins. J Biol Chem 2001;276:48915-48920. Halliwell B, Gutteridge JM: Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, 1999. Levine RL, Mosoni L, Berlett BS et al.: Methionine residues as endogenous antioxidants in proteins. Proc Natl Acad Sci 1996;93:15036-15040.

118

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 7)

Moskovitz J: Methionine sulfoxide reductases: ubiquitous enzymes involved in antioxidant defense, protein regulation, and prevention of aging-associated disease. Biochim Biophys Acta 2005;1703:213-219. Schöneich C: Methionine oxidation by reactive oxygen species: reaction mechanisms and relevance to Alzheimer’s disease. Biochim Biophys Acta 2005; 1703:111-119. Surh YJ, Packer L (editors): Oxidative stress, inflammation and health. Taylor & Francis, 2005. Uchida K, Stadtman ER: Covalent attachment of 4-hydroxynonenal to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem 1993;268:6388-6393.

D

8

AÑO AL

DNA

Marisa H. G. Medeiros

© Editorial El

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❚ INTRODUCCIÓN El mecanismo por el cual suceden las reacciones de oxidación dentro de las células, como resultado del metabolismo aeróbico, ha sido objeto de un sinnúmero de estudios en los últimos años, por lo que una gran parte de las reacciones ya ha podido esclarecerse. Se sabe que tanto las especies reactivas de oxígeno como las especies reactivas de nitrógeno, así como otros agentes endógenos o exógenos, pueden modificar al DNA celular (figura 8-1). El daño al DNA tiene consecuencias biológicas serias como mutaciones y transformaciones carcinogénicas, e incluso puede llevar a la muerte celular. Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno están involucradas en los procesos de daño, no sólo porque son capaces de interactuar de manera directa sobre el DNA, sino también porque afectan la transducción de señales, la proliferación celular y la comunicación intercelular. Para asegurar el control normal del crecimiento, así como la precisión en la replicación del DNA, las células han desarrollado una gran cantidad de estrategias para lidiar con el estrés. No obstante, el fracaso de algunos de los mecanismos de defensa celular podría contribuir a la mutagénesis, carcinogénesis, envejecimiento y la muerte celular.

❚ 119 ❚

120

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

Xenobióticos Radiación UV/ ionizante

ERO/ERN

Lesiones a las bases

Aductos DNA

Rompimiento de cadenas

Sitios abásicos

Figura 8-1. Esquema de los factores que conllevan al daño sobre el DNA inducido por estrés oxidativo.

❚ ESTRUCTURA DEL DNA El DNA es una molécula muy larga con apariencia de doble hélice constituida por dos cadenas. Cada una está formada por desoxirribonucleótidos, compuestos de tres diferentes subunidades: una base nitrogenada, una molécula de azúcar (ribosa) y un grupo fosfato. La parte variable de la molécula es su secuencia de bases. El DNA contiene cuatro tipos de pares de bases, dos bases púricas: adenina (A) y guanina (G), y dos bases pirimídicas: citosina (C) y timina (T). El esqueleto del DNA está compuesto de desoxirribosas unidas por enlaces fosfodiéster. El grupo 3’-OH hidroxilo del segmento del azúcar de un desoxirribonucleótido se une con el grupo 5’-hidroxilo del azúcar adyacente por medio de una unión fosfodiéster (figura 8-2). La presencia de varios grupos fosfato le confieren al DNA una carga sustancialmente negativa, dado que los grupos fosfato se encuentran ionizados a pH fisiológico, de modo que los cationes metálicos como Na+, K+, y los iones de hierro y cobre pueden unirse al DNA. En una molécula de DNA, dos cadenas antiparalelas que son complementarias en su secuencia de nucleótidos están apareadas en una estructura de doble hélice con un giro hacia la derecha, formando aproximadamente 10 apareamientos de bases por cada giro helicoidal. Las bases púricas y pirimídicas se encuentran orientadas hacia el lado interior de la hélice, mientras que las unidades de fosfato y de desoxirribosa se orientan hacia el exterior. Las dos cadenas se mantienen unidas gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los pares de base. La adenina se une con la timina median-

Daño al DNA

•

121

Componentes del ácido desoxirribonucléico (DNA) Purinas O

NH 7

NH 1

N

5 6

N

N 8

9

3

N

H2N

N

4

2

N

N

dR (1)

dR (2)

dGuo

dAdo O

OH

HO Pirimidinas

HO

O NH 4

NH CH

5

3

O

2

6

N

O

dR (3)

dR = 2-desoxirribosa

NH

3 1

N dR

(4)

dThd

dCyd

Esqueleto de azúcar-fosfato -O manual moderno Fotocopiar sin autorización es un delito.

Esqueleto de azúcar-fosfato

OH P

© Editorial El

2

O

O

-O

O

Pares de bases O O G

P O

O

-O

O

C.

O

O-

O O

P OH O

OH P

O A

O P

T

O

O-

O O

O P

Puentes de hidrógeno H

O

Figura 8-2. Estructura de los ácidos nucleicos. Arriba: nucleósidos en el DNA (bases nitrogenadas unidas a un azúcar) (1) dGuo, desoxiguanosina; (2) dAdo, desoxiadenosina; (3) dThd, desoxitimidina; (4) dCyt, desoxicitosina; dR, desoxirribosa (el azúcar presente en el DNA). Abajo: uniones de puente de hidrógeno en la estructura del DNA. La adenina se aparea con la timina mediante dos puentes de hidrógeno, y la guanina con la citosina mediante tres puentes de hidrógeno.

122

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

te dos puentes de hidrógeno (A=T), y la guanina con la citosina mediante tres puentes (G≡C). La secuencia u ordenamiento preciso que tienen las bases es lo que confiere la información genética y puede ser traducido para sintetizar proteínas, o puede copiarse (replicación) para heredarse a la siguiente generación celular.

❚ DAÑO AL DNA POR

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y NITRÓGENO

Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que incluyen al radical superóxido (O2•), radical hidroperoxilo (HO2•), peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales hidroxilo (•OH), alcoxilo (RO•), peroxirradicales (RO2•), hidroperóxidos orgánicos (ROOH), óxido nítrico (NO•), peroxinitrito (ONOO–) y el oxígeno singulete (1O2), son producidas en las células a través de diversos procesos normales, como el metabolismo oxidativo y la inflamación, así como por la exposición a diversos agentes físicos como la luz UV, radiación ionizante o los agentes químicos contaminantes o carcinogénicos. El radical superóxido es generado como un producto alterno de la reducción incompleta del oxígeno molecular durante el transporte de electrones en la mitocondria y en el retículo endoplásmico. El O2• se produce también por los macrófagos y neutrófilos como parte del sistema de defensa inmunitario por medio de la reducción de O2 mediada por NADPH. Existen otras fuentes de radical superóxido que incluyen reacciones enzimáticas, como la llevada a cabo por la xantina oxidasa y por la activación metabólica de xenobióticos como el benzapireno. A pesar de que el DNA es un blanco biológico importante para las especies reactivas de oxígeno, el O2• es relativamente poco reactivo con el DNA. Sin embargo, la mayor parte de los radiales O2• sufren un proceso de dismutación dentro de las células. Este proceso, que puede ser de naturaleza química o enzimática, genera H2O2, otra especie reactiva de oxígeno que por sí misma presenta una actividad de oxidación muy baja hacia la mayor parte de las biomoléculas. En presencia de metales de transición reducidos, en particular de Fe2+ o Cu+, el H2O2 es convertido, mediante la reacción de Fenton, en el radical •OH que tiene un poder altamente oxidante. El radical hidroxilo es muy reactivo y tiene la capacidad no sólo de abstraer átomos de hidrógeno de la molécula de DNA, sino también de pegarse a las bases formando aductos, lo cual produce una gran diversidad daños. El •OH se genera también por radiólisis del agua inducida por rayos X o γ. Otra molécula oxidante que puede propiciar daño en el DNA es el peroxinitrito (ONOO–), un producto de la reacción del óxido nítrico (NO•) con el O2•. El óxido nítrico es un radical libre sintetizado durante la oxidación del aminoácido L-arginina. Esta reacción es catalizada por la enzima óxido nítrico sintetasa. Es

Daño al DNA

•

123

importante aclarar que el óxido nítrico y el radical superóxido se producen al mismo tiempo dentro de los macrófagos, generando niveles elevados de ONOO– en células inflamatorias activadas. Algunos autores han sugerido que este mecanismo es un posible nexo entre la inflamación y la inducción de mutaciones. El oxígeno singulete parece tener un papel importante en varios sistemas biológicos, y podría generar daño oxidativo en una variedad de blancos biológicos, incluyendo al DNA. Se ha logrado acumular evidencia que confirma los efectos genotóxicos y carcinogénicos del 1O2; por ejemplo, las consecuencias biológicas de la exposición a la radiación UVA están mediadas, al menos en parte, por la O N

HN H 2N

O

N

• OH

N

N

HN H 2N

N

N OH

dR (1)

dGuo

(5) • OH

-H O 2

O

H 2N

•O • N

HN

N

H OH

H 2N

N

manual moderno Fotocopiar sin autorización es un delito. © Editorial El

H 2N N

N (6)

NH (7)

N

dR reducción

O

N

N N

dR = 2-desoxirribosa

dR

dR

dR

O

2

O

O

H N

HN H 2N

N

NH

FapydGuo

H2 N O

H 2N

N

dR (10)

H N

HN

O

H2N

N

O N (8)

O

NH dR

dR (9)

8-oxodGuo

Figura 8-3. Modificaciones principales sobre los segmentos de guaninas del DNA por radicales hidroxilo. La adición del radical ·OH al C4 del segmento de guanina del DNA (1) genera dos productos de oxidación principales: 2,2-diamino-5-[2-desoxi-b-D-eritro-pentafuranosil amino]5(2H)-oxazolona (8) y su precursor 2-amino-5-[2-desoxi-b-D-eritro-pentafuranosil amino]-4Himidazol-4-ona (7). La adición del radical ·OH al C8 del segmento de guanina conlleva a la formación del 8-oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) (9), así como del 2,6-diamino-5-formamido-4-hidroxipirimidina (FAPY-Gua) (10).

124

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

NH2 H N

N

8

N

O

N dR

(11)

8-oxodAdo

dR = 2-desoxirribosa

Figura 8-4. Uno de los productos principales de la oxidación de la adenosina mediada por el radical hidroxilo.

incidencia de reacciones fotosensibles de tipo II, incluyendo la formación transitoria de 1O2 (capítulo 2). Entre las diversas moléculas afectadas por el estado prooxidante en la célula, el DNA es de singular importancia, ya que esta molécula es la que conlleva la información genética, además de que sólo está presente en una única copia en cada célula. Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno producen diferentes tipos de daños al DNA, como daños a las bases, azúcares, entrecruzamientos de proteínas con DNA, así como rupturas de doble cadena y sencilla, y formación de sitios abásicos, todo ello mediante diversos mecanismos que han sido ampliamente revisados. En este capítulo se tratará de dar un panorama general de algunos de estos mecanismos.

❚ DAÑO A LAS

BASES

La exposición de las células a diversos agentes químicos y físicos como las radiaciones ionizantes y solares, así como a la reacción de Fenton, pueden promover la formación de radicales •OH, de modo que el daño a las bases del DNA ocasionado por este radical ha sido ampliamente revisado. Es importante aclarar que la velocidad de reacción del •OH está determinada por su difusión; como consecuencia, el proceso de oxidación mediado por esta especie reactiva de oxígeno, altamente reactiva y poco específica, se lleva a cabo en los sitios donde se forma. Como se mencionó en el capítulo anterior, entre más reactivo sea un radical, menor especificidad tendrá al reaccionar, y lo hará muy cerca del lugar de su formación. Por otro lado, la guanina es la base nitrogenada que presenta el potencial de ionización más bajo entre los componentes de los ácidos nucleicos, por tanto, es la base más susceptible de ser oxidada por diferentes componentes oxidantes, como los radicales •OH, 1O2 y ONOO–.

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Daño al DNA

•

125

Existen dos vías principales de descomposición de los segmentos de guanina del DNA, que comprenden la adición inicial de un •OH en los carbonos C4 y C8 del anillo de las purinas (figura 8-3). La adición del •OH en C4 de la 2’-desoxiguanosina (1) que proviene de la adición del •OH en el C4, resulta en un radical (5) que se deshidrata en soluciones neutrales dando como resultado un radical neutro (6). En pasos subsecuentes se generan los dos productos principales de la oxidación: 2-amino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-4H imidazol4-ona (7) y 2,2-diamino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-5(2H)oxalozona (8). En otro evento, la adición del •OH en el C8 de 2’-desoxiguanosina produce un radical de aducto-C8-OH que puede llevar a la formación de 8-oxo-7,8-dihidro2’-desoxiguanosina (8-oxodGuo o bien 8OHdG) (9), junto con un 2,6-diamino5-formamido-4-hidroxipirimidina (FAPY-Guo) (10) que proviene de la apertura del anillo de imidazol seguida por la protonación y reducción con un electrón. La química de adenina/adenosina con •OH es similar a la que se describió antes para la guanina. Sin embargo, las lesiones oxidativas en la adenina prevalecen menos en el DNA. Uno de los productos principales de la oxidación de adenosina mediada por el radical •OH es el 8-oxo-desoxiadenosina (8-oxodAdo) (figura 8-4). En cuanto a la timina (3) y la citosina (4), ambas muestran una variedad de reacciones con el radical hidroxilo. Ahora existe una gran cantidad de información sobre el mecanismo de las mismas, de modo que las reacciones más importantes con timina se han resumido en la figura 8-5. El radical •OH se adiciona o se pega de manera preferente al carbono 5 del segmento de pirimidina, formando un radial centrado en C-6 (12). El carbono 6 es un sitio menos favorable para la reacción con el •OH, por lo que esta reacción lleva a la formación de otros radicales (13). A partir de la reacción con O2, los radicales son convertidos en radicales peroxilo o peroxirradicales (14) y (15). Existen, asimismo, reacciones subsecuentes que derivan en la formación de productos oxidados de timina, como (16) (17) (18) y (19). Las especies reactivas de nitrógeno como N2O3, HNO2 y ONOO– pueden nitrar y desaminar al DNA causando rupturas en las cadenas y mutaciones. In vivo, el peroxinitrito tiende a actuar a través de sus radicales derivados, el radical carbonato (CO3•) y el bióxido de nitrógeno (•NO2) debido a las altas concentraciones de CO2 que se encuentran en equilibrio con HCO3– en la mayor parte de los fluidos biológicos. En ambientes donde el pH es bajo, el radical •OH derivado del peroxinitrito llega a tener un papel relevante. Tanto el CO3• como el •NO2 son radicales oxidantes que pueden tener efecto sobre diversos blancos biológicos y convertirlos en sus correspondientes radicales. La presencia de estos dos radicales juntos, producidos a partir de peroxinitrito, es muy eficaz al momento de nitrar residuos de tirosina y guanina mediante la combinación de poder oxi-

126

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

O 5

HN

CH

4

3

3 1

O

2

N

6

R

(3)

R = H, Thy R = 2-desoxirribosa, Thd

• OH 60%

35%

O

O • CH 3

HN

CH

HN

OH O

N

• O

H

R

R

O2 O CH HN

CH

3

HN

OO • OH

N

O

H

R

O2 ,H

R +

(14) .-

+

O CH

HN

3

CH 3

HN

OO H

R

OO • H

O2 ,H

O

N

3

OH N

(15) .-

O

(12) O2

O

O

H

N

(13)

3

OH

OH

N

O

H

OH

R

O

OO H

CH

H HN O

O

CH CH

N R (17)

OH

HN N R (18)

OH H

H

3

OH

3

O

N

O

R

O

O

H N

3

OH

O

(16) N

H

R (19)

Figura 8-5. Modificación principal del segmento de timina en soluciones de DNA aereadas con el radical hidroxilo. El radical •OH se adhiere de manera preferente al carbono 5 del segmento de pirimidinas (en este caso timina) (3) dando como resultado un radical centrado en el C-6 (12). El carbono 6 es un sitio menos favorable para la reacción con el •OH, por lo que esta reacción conlleva a la formación de otro radical (13). Al reaccionar con el O2, los radicales se convierten en los radicales peroxilo (14) y (15). Reacciones subsecuentes generan los productos oxidados de la timina (16), (17), (18) y (19).

Daño al DNA

O

127

O N

HN

H N

HN

N O2 N

N

H2N

•

H 2N

dR

O N

dR

O

(20) 8-nitrodGuo

H 2N

(9)

N

HN N

N

8-oxodGuo

N dR

(1) O2N NH H N 2

N H

dGuo

N

H N

O

H N

N

N

2

dR

(21)

O

2

NH dR

dR = 2-desoxirribosa

(8)

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Figura 8-6. Productos de la oxidación del peroxinitrito con la desoxiguanosina (dGuo) (1); (20) 8-nitro-2’-desoxiguanosina (8-nitrodGuo); (9) 8-oxo-7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxodGuo); (8) 2,2-diamino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-5(2H)-oxazolona; (21) 5-guanidino-4-nitroimidazol.

dativo del CO3• con las reacciones de recombinación de radicales del •NO2. La base guanina en el DNA tiende a ser oxidada y transformada en sus correspondientes radicales mediante radicales derivados de peroxinitrito. La reacción de ONOO– con el DNA produce diferentes lesiones en esta base, entre las que se encuentran la 8-nitroguanina y 8-oxodGuo. La figura 8-6 muestra algunos de los productos resultantes del ataque del peroxinitrito sobre el DNA.

❚ DAÑO A LOS AZÚCARES

DEL

DNA

El esqueleto del DNA, compuesto de azúcares y fosfatos, es muy vulnerable a la oxidación por una gran variedad de especies radicales. El producto inicial de este evento oxidativo es un radical de carbono ubicado en un azúcar, el cual lleva a la degradación de la desoxirribosa y a la generación de una variedad de productos electrofílicos. La reacción de los radicales •OH con los azúcares del DNA ocurre por la abstracción de átomos de hidrógeno unidos a carbonos, principalmente en el C4 y C5. Reacciones subsecuentes de estos radicales de carbono centrados en los azúcares generan varios productos del azúcar, rompimientos de las cadenas del DNA y formación de sitios libres de bases (abásicos) mediante una diversidad de mecanismos ilustrados en la figura 8-7. La abstracción del hidrógeno en el C4 da como

128

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

O

O 4

HN

3

1

R

5'

O

O

P O

3'

O O

P R

HN

2'

R

O 1

5'

P O O

N O . O 1'

3'

2'

O O

P R

O

4

C H3

HN

5

4'

O2

3 2 1

oxidante

1'

4'

O-

C H3 6

N

O 4

5

2 1

O

(Capítulo 8)

3 2 1

6

O R

1

P O O -

5'

O .

O 3'

6

N 1'

4'

+

C H3 5

HO + O

2'

P R

O

-

2

-

2

Figura 8-7. Escisión de las cadenas del DNA por la vía de la abstracción del H-4’.

resultado que se produzcan el residuo del ácido 3’-fosfoglicólico y un aducto propenal en la base. Los radicales de purina y pirimidina, generados por la adición de •OH pueden, a su vez, abstraer al hidrógeno de los segmentos de azúcar.

❚ DAÑO AL DNA POR

OXÍGENO SINGULETE

Otra especie reactiva de oxígeno de importancia biológica es el oxígeno singulete (1O2), el cual puede ser generado por procesos fotosensibles o enzimáticos, como se describió en el capítulo 2. Por ejemplo, se ha visto que el componente UVA de la radiación solar produce efectos dañinos en los cuales el 1O2, en su estado menos excitado (1Δg), parece jugar un papel importante. Las respuestas mutagénicas y genotóxicas observadas cuando el DNA o las células son tratadas con 1O2 podrían entenderse mejor si se identificaran los productos de oxidación generados durante este proceso. Los estudios sobre la oxidación del DNA por 1O2 han demostrado que el aducto 8-oxodGuo es un producto exclusivo encontrado en DNA aislado. La formación de dicho aducto, al parecer, se realiza de manera directa mediante la reacción del DNA con el 1O2 en el medio celular. Se ha demostrado que el 1O2 está involucrado en la citotoxicidad celular asociada con la terapia fotodinámica y con el componente UVA de la radiación solar. La participación del 1O2 se ha relacionado también con la inducción de la expresión génica y con la transducción de señales. Además, el 1O2 es generado en la fagocitosis, donde participa en los mecanismos de defensa contra los virus y las bacterias. En contraste con el radical hidroxilo, las reacciones del 1O2 con el DNA son altamente específicas. La reactividad del 1O2 hacia el DNA aislado se ha estudiado en detalle y se ha encontrado que las bases de guanina son su blanco específico, generando al 8-oxodGuo como el producto principal de oxidación.

Daño al DNA

•

129

O O

O

HN H 2N

1

N

O2

N

N

N

HN H 2N

N

O

dR (1)

H 2N

N O dR

O N

(9)

N

dR 8-oxodGuo

dGuo

O O HN

O NH

N H

HN

N

O

H 2N

dR

N

(b)

N

N dR

OH

H2 O HN

N

N

-H2 O dR = 2-desoxirribosa

O N

OH

(a)

dR

N

HN

N

HN H 2N

O O

N

N dR

OH H N

reductor

O

(22) dSp

O

O N

HN

H2 N

H N

HN

nucleosido = vía a >> vía b DNA = vía a > 99%

N dR

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Figura 8-8. Productos de la oxidación de la reacción de la desoxiguanosina (dGuo) con el oxígeno singulete.

Utilizando fotosensibilizadores tipo II, los productos principales generados en la reacción de 1O2 con la 2-desoxiguanosina libre en una solución acuosa, se identificaron diasteroisómeros de nucleósidos espiroimino-dihidantoínas (dSp) (22). Además, el aducto 8-oxodGuo también fue detectado, pero en un rango relativamente menor comparado con los diasteroisómeros (figura 8-8). Por otro lado, se ha demostrado que el 1O2 reacciona con el aducto 8-oxodGuo, ya sea cuando está como nucleósido libre o bien cuando está formando parte de fragmentos de DNA. Para la identificación cualitativa de los productos predominantes en la oxidación final del 8-oxodGuo mediante el 1O2, se utilizó una técnica de separación muy específica usando un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) acoplado a un detector electroquímico, y un analizador de masas (HPLC-ESI-MS/MS). Los productos principales más estables de la descomposición del 8-oxodGuo fueron 2-amino-5-[(2’-desoxi-β-D-eritro-pentofuranosil) amino]-4H-imidazol-4-ona (dIz),2,2-amino-4-[(2’-desoxi-β-D-eritropentofuranosil) amino]-5-(2H)-oxazolona (dOz), y los diasterómeros dSp (figura 8-9).

130

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

O

O H N

HN H 2N

1

O

O2

H N O

HN

N

N

H 2N

NH H2N

O

H N

O

N

O H 2N

N

O O HN HN

N

NH N H

N

O

dR (22) dSp

dR

H 2O

reductor

H N

O O

N

N dR

OH O H N O

N dR

O

dR = 2-desoxirribosa so

8-oxodGuo

N

O

O

N O dR

N

dR (9)

(Capítulo 8)

H 2N

dOz

OH H N

NH O

N

N

H 2N

O

H N O

H N H

dR

N dR

Figura 8-9. Productos principales de la reacción de la 8-oxodGuo con el oxígeno singulete. La reacción del 1O2 con la 8-oxodGuo (1) da como resultado el 5-hidroperoxido (5-OOH-8-oxodGuo), el cual se descompone en el 2-amino-5-[(2’-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosol) amino]-4H-imidazol-4-ona (dIz), 2,2-diamino-4-[2’-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil) amino]-5-(2H)-oxazolona (dOz), y diasteroisómeros dSp.

❚ FORMACIÓN Y CUENTIFICACIÓN

DE ADUCTOS ETENO EN EL

DNA

El daño sobre el DNA a partir de la peroxidación endógena de lípidos (lipoperoxidación) ha sido reconocido como un factor contribuyente durante carcinogénesis. La lipoperoxidación, como se describirá en el capítulo siguiente, es una reacción en cadena iniciada por los radicales libres sobre los ácidos grasos poliinsaturados que forman las membranas celulares. Su relación con el daño al DNA es importante, puesto que se sabe que los aductos exocíclicos de origen endógeno del DNA pueden ser generados por diversos productos de la lipoperoxidación. Entre ellos se encuentra el 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), trans,-2,4-decadienal (DDE), malonaldehído (MDA), acroleína y el crotonaldehído. Las actividades químicas y biológicas de todos estos aldehídos han sido muy estudiadas, y se ha visto que pueden inducir daño al DNA, ya sea mediante una reacción directa con las bases del DNA, o bien a través de la generación de más compuestos electrofílicos reactivos, como los epóxidos bifuncionales.

Daño al DNA

•

131

Aductos eteno insustituidos

N

N N

N

N

N

N

O

O

OH

OH

OH

OH

dCi d

dAdo O

O N

HN

N

N

N

O

OH 2

N O

OH

N ,3- dGuo

N

N N H

N

N O

OH

OH

2

1 ,N - dGuo

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Figura 8-10. Productos resultantes de la reacción de los aldehídos α,β-insaturados con el DNA. Aductos de eteno no-sustituido1, N 6-Eteno-2’-desoxiadenosina (εdAdo), 3,N 4-eteno-2’-desoxicitidina (εdCyd), N 2,3-eteno-2’-desoxiguanosina (N 2,3-εdGuo), 1,N 2-eteno-2’-deoxiguanosina (1,N2-εdGuo).

En el primer caso, los productos generados son aductos del propano cíclico sustituidos, principalmente la 1-N 2-propano-2’-desoxiguanosina para las reacciones de aldehídos α,β-insaturados y la pirimidopurinona cíclica (M1G) y aductos acíclicos formados con desoxiadenosina (M1A) y desoxicitidina (M1C) para las reacciones de MDA. Los compuestos epoxicarbonilos generados como resultado de la oxidación de aldehídos α,β-insaturados reaccionan con las bases de DNA, formando aductos etano y eteno sustituido, y aductos eteno no sustituidos (figuras 8-10 y 8-11). La habilidad de estos electrófilos reactivos de alquilar las bases de DNA generando las antes mencionadas lesiones promutagénicas respectivas, ha sido considerada como un factor que contribuye a los efectos mutagénicos y carcinogénicos asociados con el proceso de lipoperoxidación, y la consecuente generación de estrés oxidativo.

132

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

Aductos eteno y etano sustituidos H3 C

H3 C H 3C OH

N O

O

N H

HO

N

N

O

OH

OH

N H

N

N

N

N

O

N

N

N

N

N

N

HO

O

O OH

OH

OH

OH HNE- aducto dGuo

HNE-aducto dAdo

H3 C

H 3C

H 3C

OH

O

OH

N

N HO HO

OH

OH

O N

N

HO

N

N

N

N

O N O

O

OH

OH OH

DDE-aducto dAdo

N

N

N

OH

N H

N

N O

OH

OH

DDE-aducto dGuo

Figura 8-11. Aductos eteno y etano sustituidos. Los aductos de la reacción del HNE con dGuo y dAdo. Aductos de la reacción de DDE con dGuo y dAdo.

❚ CONCLUSIONES Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno pueden inducir daño al DNA, incluyendo rupturas de cadenas, entrecruzamientos, sitios abásicos y modificación de las bases. Las lesiones en el DNA se han relacionado con los procesos de cáncer, envejecimiento y muerte celular, por lo que el mejoramiento de los estudios analíticos ha permitido la generación de metodologías precisas para el estudio de los mecanismos que participan en estas reacciones y que permiten la cuantificación de dichos daños in vivo. Además, los mecanismos de reparación tienen que ser evaluados junto con el análisis de los daños al DNA para poder esclarecer el papel exacto que juegan las lesiones inducidas por oxidación a nivel celular y molecular. Ello contribuirá a entender el papel de estas lesiones en pro-

Daño al DNA

•

133

cesos como mutagénesis, carcinogénesis y enfermedades neurodegenerativas, aun así, se requiere mayor información, principalmente de los sistemas in vivo.

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❚ REFERENCIAS Burrows CJ, Muller JC: Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission. Chem Rev 1998;98:1109-1151. Cadet J, Delatour T, Douki T et al.: Hydroxyl radicals and DNA base damage. Mutat Res 1999;424:9-11. Collins AR, Cadet J, Moller L et al.: Are we sure how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from humans cells? Arch Biochem Biophys 2004;423: 57-65. Dedon PC, Tennenbaum SR: Reactive nitrogen species in the chemical biology of inflammation. Arch Biochem Biophys 2004;423:12-22. Halliwell B: Oxygen and nitrogen are pro-carcinogens. Damage to DNA by reactive oxygen, chlorine and nitrogen species: measurement, mechanism and the effects of nutrition. Mutat Res 1999;443:37-52. Loureiro APM, Marques SA, Garcia CCM, Di Mascio P, Medeiros MHP: Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N 2-Etheno-2´-deoxyguanosine in DNA. Chem Res Toxicol 2002;15:1302-1308. Marnett LJ, Plastaras JP: Endogenous DNA damage and mutation. TRENDS Genet 2001;17:214-221. Martinez GR, Loureiro APM, Marques S et al.: Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutat Res 2003;544:115-127. Pouget J-P, Douki T, Richard M-J et al.: DNA damage induced in cells by γ and UVA radiation as measured by HPLC/GC-MS and HPLC-EC and comet assay. Chem Res Toxicol 2000;13:541-549. Pogozelski WK, Tullius TD: Oxidative strand scission of nucleic acids: Routes initiated by hydrogen abstraction from the sugar moiety. Chem Rev 1998;98: 1089-1107. Ravanat J-L, Douki T, Cadet J: Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and its components. J Photochem Photobiol 2001;63:88-102. Ravanat J-L, Saint-Pierre C, Cadet J: One-electron oxidation of the guanine moiety of 2’-deoxyguanosine: influence of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine. J Am Chem Soc 2003;125:2030-2031. Schulte-Frohlinde D, von Sonntag C: Radiolysis of DNA and model systems of oxygen. En: Sies, H. (editor): Oxidative stress, London, Academic Press, 1985: 11-36.

134

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 8)

Tamir S, Tannenbaum SR: The role of nitric oxide (NO•) in the carcinogenic process. Biochim Biophys Acta 1996;128:F31-F36. von Sonntag C, Schuchmann H-P: The radiolysis of pyrimidines in aqueous solution: an updating review. Int J Rad Biol 1986;49:1-34.

D

9

AÑO A LÍPIDOS

Tania Zenteno Savin Yolanda Saldaña Balmori

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❚ INTRODUCCIÓN La rancidez de las grasas y aceites almacenados es un fenómeno que ha preocupado desde la antigüedad, debido a que por ella, las grasas y aceites sufren modificaciones en el sabor, olor, color, viscosidad y solubilidad. Los primeros estudios realizados al respecto fueron llevados a cabo por de Saussure en 1820 cuando mediante el uso de un manómetro pudo ver las diferencias en el consumo de oxígeno en dos muestras de aceite de nuez, una de ellas estaba rancia. El mecanismo por el cual los ácidos grasos insaturados reaccionan con el oxígeno molecular para oxidarse, se estableció hacia 1940 por Farmer en relación a la industria del caucho. A partir de ello, se desarrollaron múltiples estudios relacionados con la preservación de los alimentos, con los polímeros químicos, entre otros, pero fue hasta algunos años más tarde, que se inició el estudio de la lipoperoxidación en el campo biológico y la medicina, la cual fue definida por Tappel como el deterioro oxidativo de los lípidos poliinsaturados. Las grasas presentes en los alimentos, después de ser digeridas y absorbidas, son transportadas como lipoproteínas para ir a desempeñar distintas funciones en el organismo, una muy importante es formar parte de las membranas.

❚ 135 ❚

136

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

Los ácidos grasos participantes de las membranas de las células animales generalmente tienen de 14 a 24 átomos de carbono y la posición de las dobles ligaduras es cis. Un doble enlace en una cadena hidrocarbonada impide la rotación de los grupos unidos a los átomos de carbono, de modo que ellos están forzados a permanecer en un sitio, por ejemplo los 2 hidrógenos unidos por una doble ligadura de un ácido graso (R-CH=CH-R), están obligados a permanecer del mismo lado en una unión cis y a estar en posición distal en una unión trans. Los fosfolípidos contienen ácidos grasos con varias dobles ligaduras, en las membranas de las células animales el principal fosfolípido es la lecitina, las membranas de los organelos como la mitocondria y el núcleo raramente contienen esfingolípidos o colesterol, mientras que la membrana interna mitocondrial contiene cardiolipinas (figura 9-1). Los lípidos de la membrana son moléculas anfipáticas (poseen una parte polar o hidrofílica y una no polar e hidrofóbica), contienen regiones hidrocarbonadas con poca afinidad por el agua y al estar en presencia de ella tienden a agregarse en forma de bicapa exhibiendo su región hidrofílica; esta bicapa es la base estructural de la membrana en la que se insertan diversas proteínas, las extrínsecas o periféricas penden de la superficie de la membrana, mientras que las integrales están embebidas en el interior de la ella, en algunos casos localizadas en el interior de la membrana o atravesándola completamente. La fluidez de la membrana Glucoproteína Proteína peritérica Glucolípido

Poro Canal

Fosfolípidos Cabeza polar (hidrofilica)

Capas lípidas

Colas de acido graso (hidrofóbicas) Citosol

Proteína

Colesterol

Proteína periférica

Proteínas integrales

Figura 9-1. Composición de las membranas.

Daño a lípidos

•

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se debe la presencia de las dobles ligaduras de los ácidos grasos poliinsaturados, cuando hay daño en estos ácidos grasos o cuando disminuye la cantidad de ligaduras dobles, la membrana se vuelve rígida.

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❚ LIPOPEROXIDACIÓN La participación de radicales libres y otras especies reactivas de oxígeno (ERO) con los lípidos de las membranas biológicas ocasiona la producción de diversos compuestos tóxicos, altera su fluidez y permeabilidad, así como la actividad de las proteínas, las enzimas, los receptores o canales iónicos asociados a ellas, situación que compromete la estructura y función celular. Los ácidos grasos saturados o los monoinsaturados que forman parte de la membrana, son poco susceptibles al ataque de las ERO, mientras que los poliinsaturados linoléico, linolénico y araquidónico, son rápidamente atacados debido a la presencia de sus enlaces dobles conjugados, los que debilitan la energía de unión del átomo de hidrógeno presente en el carbono adyacente a los enlaces. Es precisamente esta alta reactividad lo que hace que la peroxidación de los lípidos en los sistemas biológicos, sea un proceso autocatalítico y de propagación. La peroxidación de los lípidos de las membranas puede ocurrir tanto por la vía no enzimática como por la enzimática; durante la peroxidación no enzimática las ERO inician el daño oxidativo en los lípidos de la membrana y los radicales libres de los lípidos resultantes propagan el proceso de la peroxidación. Lo anterior permite la acumulación de hidroperóxidos que finalmente se descomponen en una gran variedad de productos terminales en donde los principales son el malondialdehído (MDA), el hexanal y el 4-hidroxinonenal (4-HNE). Por otro lado, en la lipoperoxidación enzimática los ácidos grasos oxidados son liberados de los lípidos de las membranas por fosfalipasas y otras lipasas. El ácido araquidónico es un ácido graso liberado de las membranas de los fosfolípidos por la fosfolipasa A2 en respuesta a una gran variedad de estímulos, entre otros la participación de agentes proinflamatorios. El metabolismo del ácido araquidónico representa una fuente de ERO que pueden inducir estrés oxidativo, este ácido se metaboliza principalmente por tres rutas: 1. 2. 3.

Por la vía de la lipooxigenasa, que hace posible la formación de derivados hidroxilados y leucotrienos. Por la vía de la ciclooxigenasa, que permite la formación de prostaglandinas. Por la vía catalizada por el citocromo P450, que interviene en los procesos de detoxificación de xenobióticos, además de que conduce a la producción de epóxidos derivados del ácido eicosatrienoico.

138

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

El estudio de la lipoperoxidación se ha dividido en tres etapas: iniciación, propagación y terminación (figura 9-2).

Iniciación La iniciación se desencadena cuando el residuo de un ácido graso poliinsaturado dentro de los lípidos de membrana, es atacado por una ERO que es capaz de abstraer o retirar un átomo de hidrógeno entero (electrón y protón) de un grupo metileno (-CH2-). Al abstraerse el átomo de hidrógeno, el residuo de ácido graso queda como radical libre centrado en el carbono (R• o bien L•), esta reacción se puede inhibir por la participación de algunos secuestradores de radicales libres como el manitol y el formato, moléculas que compiten por el •OH con los lípidos. El carbono que ha perdido el hidrógeno es generalmente estabilizado mediante un rearreglo molecular que da lugar a un dieno conjugado el cual no reacciona con el oxígeno singulete (1O2) sino con oxígeno molecular y forma el radical peroxilo (ROO• o bien, LOO•)(figura 9-3), molécula que tiene el suficiente poder oxidante para atraer un hidrógeno metilénico del ácido graso adjunto para quedar como hidroperóxido, también llamado lipoperóxido (ROOH o LOOH) (figura 9-4). Ésta molécula puede ser tóxica ya que inactiva a algunas enzimas debido a que los residuos de Agente desencadenante Radical libre centrado en carbono

Lipoperoxidación

Iniciación

O2 R•

R-OO- H

Reacción Lipohidroperóxido

en cadena

Propagación

ROO •

R- H

Radical peroxilo H H =

Ácido graso poliinsaturado

Figura 9-2. Esquema de la oxidación de los lípidos iniciada por la abstracción de un átomo de hidrógeno, lo que genera un radical libre centrado en carbono.

Daño a lípidos

139

INICIACION

=

_

Fosfolípidos O

•

H 2 C-O-C

R-H • OH Abstracción

H 2O

del hidrógeno ...

•

R•

Rearreglo molecular •

...

R• O2 -

O• O

-

...

ROO •

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Figura 9-3. Diagrama de la primera etapa de la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

aminoácidos participantes en ellas como la metionina, la lisina, la cisteína y la histidina son oxidados.

Propagación La nueva molécula a la que se le ha abstraído un hidrógeno, hará lo mismo a lo que fue sujeta ella —abstraerle un hidrógeno a la molécula de ácido graso poliinsaturado adyacente—, estableciéndose una reacción en cadena y de esta manera se propaga la lipoperoxidación a través de la membrana (figura 9-5). Existe otro mecanismo que se considera como propagación de la lipoperoxidación, ésta parte de un lipoperóxido (ROOH) que se encuentra presente en la membrana, ya sea de reciente formación, como se describió antes, o bien que se encuentre almacenado en la membrana de un proceso de lipoperoxidación ante-

140

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

CH2N+(CH 3) 3 CH2 CH2 colina

CH2N+(CH 3) 3 CH2 CH2 colina

O O=P-O O fosfato

O O=P-O O fosfato CH2 - CH - CH2 O O glicerol

CH2 - CH - CH2 O O glicerol

C=O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

C=O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

C=O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH C-O-O 2 • CH2 CH2 CH2 CH3

C=O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

Figura 9-4. Representación de la formación del radical peroxilo.

rior. En este caso el ROOH al encontrarse en presencia de un metal de transición (preferentemente Fe o Cu) puede reaccionar y fraccionarse para dar lugar de nuevo al radical peroxilo (ROO•), pero también puede romperse de tal manera que genere al radical alcoxilo (RO•). Ambos tienen la capacidad de abstraer un hidrógeno de un ácido graso poliinsaturado de la cadena vecina y propagar de esta manera la peroxidación lipídica (figura 9-6). La longitud de esta cadena lipoperoxidativa depende de varios factores ya sea la relación de las proteínas y los lípidos en la membrana, la composición del ácido graso, la concentración de oxígeno y la presencia o no de antioxidantes en la membrana.

Terminación La lipoperoxidación puede finalizar cuando el radical lipídico reacciona con otra molécula, la cual puede ser un segundo radical lipídico, para formar un agregado

Daño a lípidos

ROO • ...

141

R-H O +

=

- -

O• O

•

R-O-C

Abstracción del H H O O

- - -

R• O

=

...

R-O-C • ROOH Hidroperóxido

R•

=

O •

R-O-C

O2

...

O• O

ROO •

- -

Propagación

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Figura 9-5. Diagrama de la segunda etapa de la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

o un dímero que queda dentro de la membrana y altera sus funciones, principalmente la fluidez como la permeabilidad. Las reacciones más comunes suelen ser de la siguiente manera: a) ROO• + ROO• b) ROO• + RO• c) RO• + RO•

ROO-OOR ROO-OR RO-OR

Otro mecanismo de terminación es la ciclización, en este proceso las moléculas de oxígeno quedan englobadas dentro de la cadena poiinsaturada. Este tipo de terminaciones son muy poco estables y generalmente culminan en rompimientos del tipo de la β-escisión, la cual se describirá más adelante. Alternativamente, cuando el ROO• encuentra a una molécula antioxidante capaz de donar un átomo de hidrógeno se forma de nuevo el ROOH, terminando así la cadena de reacciones. El α-tocoferol, (vitamina E), y la ubiquinona (CoQ10) son los antioxidantes más relevantes para participar en la fase de terminación de la cadena de reacciones de oxidación de los lípidos en los sistemas

142

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

ROOH Hidroperóxido - - -

... O O H

+3

Fe

OH –

+2

Fe

... - -

-

...

O•

O O•

RO •

ROO •

Propagación Figura 9-6. Propagación de la peroxidación.

biológicos. La vitamina E tiene propiedades antioxidantes porque dona un hidrógeno a la molécula de ROO• para quedar como ROOH, mientras que la vitamina queda como radical alfa-tocoferilo (α-Toc•) que es un radical libre estable ya que su electrón desapareado queda deslocalizado en la molécula, de esta manera se interrumpe la peroxidación de lípidos. El radical α-Toc• se puede regenerar a partir de interacciones con moléculas de la membrana o del citosol, tales como la ubiquinona, el ácido ascórbico o tioles como el GSH. Así, los radicales libres generados en el proceso de la lipoperoxidación pueden ser detoxificados directamente por glutatión reducido (GSH) o a través del efecto que tiene éste sobre la vitamina E. Es importante mencionar que el decremento de los niveles intracelulares de GSH puede favorecer la lipoperoxidación inducida por otros factores (capítulo 10). Por otro lado, durante el proceso también se producen algunos lipoperóxidos intramembranales que para su remoción se requiere de la participación de enzimas específicas, por ejemplo la glutatión peroxidasa, que metaboliza dichos lipoperóxidos a alcoholes, o bien las fosfolipasas que favorecen la disociación de los peróxidos lipídicos de las membranas.

Daño a lípidos

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❚ EFECTOS

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DE LA LIPOPEROXIDACIÓN

Como se ha mencionado anteriormente, cuando reaccionan los radicales libres de ácidos grasos poliinsaturados entre si se pueden formar dímeros por entrecruzamiento o pueden ciclizarse, creando aglomerados que conducen a la disminución de la fluidez y de la permeabilidad de la membrana. La alteración en la permeabilidad de la membrana implica que ésta permite la entrada de diversos solutos a la células sin ningún control, pero principalmente permite la entrada de agua por osmosis, lo cual hincha a la célula hasta el extremo de hacerla reventar y con ello causar su muerte. Este tipo de muerte se conoce como necrosis. Cuando la célula estalla, vacía todo su contenido sobre las células vecinas iniciando de esta manera la respuesta inflamatoria, proceso que se ha asociado a una gran cantidad de patologías. En cuanto a la pérdida de la fluidez, se ha asociado a otro tipo de alteraciones como disminución en la actividad de algunos receptores, por ejemplo la unión de las hormonas proteínicas a sus receptores membranales y alteraciones en los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, entre otras. De modo que la peroxidación de los lípidos puede dañar tanto la estructura como la función de las células y los tejidos, lo que está asociada con diferentes enfermedades entre las que destaca la ateroesclerosis (por la peroxidación de LDL) y el daño tisular causado por infarto de miocardio. Por otro lado y de manera indirecta, los principales productos de la peroxidación de lípidos también pueden reaccionar con otras moléculas y dañar de esta manera a las células. Entre estos productos se incluyen los dienos conjugados, el pentano, etano, etileno, alcanos, polímeros y aldehídos, ya que algunos de éstos pueden reaccionar con los grupos amino de la lisina y de otros grupos aminoácidos constituyentes de las proteínas formando bases de Schiff, que a su vez pueden ser identificados por que producen fluorescencia. Asimismo, algunos iones metálicos permiten que los peróxidos o productos de conjugación se descompongan a temperaturas fisiológicas, por ejemplo si el Fe2+ reacciona con el hidroperóxido de los ácidos linoleico y araquidónico en el quinto átomo de carbono contando desde el extremo del metilo se produce pentano por el proceso denominado β-escisión; mediante el mismo proceso se pueden formar etano y etileno a partir del hidroperóxido del ácido linoleico: CH3-(CH2)4-CHOOH-R + Fe3+

CH3-(CH2)4-CHO•-R + Fe3+

CH3-(CH2)4-CHO•-R

CH3-(CH2)3-•CH + CHO-R

CH3-(CH2)3-•CH + H•

β-escisión

CH3-(CH2)3-CH3

144

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

Otros productos de la peroxidación de lípidos, son los hidrocarburos volátiles que poseen un alto potencial toxigénico. Se ha propuesto que algunas de estas moléculas pequeñas pueden actuar en sistemas biológicos como segundos mensajeros. Por otro lado se sabe que los lipoperóxidos pueden inhibir la actividad de algunas enzimas, los radicales ROO• formados durante el proceso de peroxidación de lípidos tienen la capacidad de inhibir la transcripción del ADN, inclusive cuando aquellos se encuentran a tan bajas concentraciones que no promueven la reacción en cascada de la lipoperoxidación. El gradiente de iones calcio (Ca2+) se altera cuando la enzima calcio-ATPasa pierde su actividad catalítica a consecuencia de la oxidación de los grupos tioles presentes en la molécula. Es posible que ello, aunado a la entrada excesiva de Ca2+, resultante de la pérdida de la permeabilidad selectiva de la membrana, sean los eventos que lleven a la muerte celular observada en casos extremos de daño por peroxidación de los lípidos.

❚ MEDICIÓN

DE LOS PRODUCTOS DE LA LIPOPEROXIDACIÓN

Ya que la peroxidación de lípidos es uno de los principales efectos de las ERO, se han invertido esfuerzos considerables en el desarrollo de métodos que permitan una estimación cuantitativa del daño a las células y los tejidos mediante la determinación de los principales productos de la lipoperoxidación. Existen varios métodos para cuantificar los productos de la peroxidación de lípidos; sin embargo, ninguno que tiene aplicación universal. En la elección del método a emplearse para cuantificar la peroxidación de lípidos se debe tener en cuenta tanto el tipo de muestra empleada, los principales productos esperados, así como las condiciones analíticas. Los peróxidos lipídicos pueden ser detectados y cuantificados mediante la colorimetría, la quimioluminisencia, la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la cromatografía de gases acoplada a detector de masas (GC/MS), y la resonancia spin electrón (ESR). Entre los marcadores usados como indicadores de la peroxidación de lípidos se incluyen la medición del consumo de oxígeno, hidroperóxidos fosfolipídicos, peróxidos de colesterol y peróxidos de ácidos grasos, 4-hidroxinonenal que es un producto altamente reactivo de la peroxidación de los fosfolípidos de membrana y su derivado 2,4-dinitrofenilhidazina. Entre los métodos más frecuentemente empleados son los que miden los productos de la descomposición de los hidroperóxidos lipídicos, tales como el malondialdehído (MDA) y otros dialdehídos que son sustancias que son capaces de reaccionar con el ácido tiobarbitúrico razón por la cual se les designa TBARS. Este método es espectrofotométrico y tiene la desventaja de que no es específico ya que diferentes hidroperóxidos lipídicos generan MDA en cantidades diferentes. La reacción de MDA con grupos amino de proteínas o aminoácidos libres da

Daño a lípidos

•

145

lugar a diversos productos los que pueden ser: fluorescentes, bases Schiff conjugadas, con la estructura general R-N=CH-CH=CH-NH-R’; otra desventaja de este método es que los productos fluorescentes que se unen a las proteínas son insolubles en los solventes orgánicos comunes y sus estructuras, es decir los fluoróforos, pueden ser alteradas en el proceso de extracción de lípidos. Otro método aplicado a tejidos animales cuantifica los ROOH debido a la formación de un complejo Fe2+-xilenol naranja en proporción a la concentración de ROOH presentes. La detección de dienos conjugados no es totalmente confiable ya que los dienos formados son relativamente inestables en membranas biológicas o plasma, especialmente ante la presencia de metales de transición o proteínas con grupos hemo funcionales.

❚ CONCLUSIÓN Los lípidos son blancos importantes para la acción de las especies reactivas de oxígeno y los radicales libres. La peroxidación de ellos es una de las principales razones del daño celular la que puede conducir a la célula a la pérdida de sus funciones y con ello ser responsable de una gran cantidad de patologías.

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❚ REFERENCIAS Acworth IN, Bailey B: The Handbook of Oxidative Metabolism. Chelmsford: ESA, Inc.; 1995. Burton GW, Traber MG: Vitamin E: Antioxidant activity, biokinetics, and bioavailability. Annu Rev Nutr 1990;10:357-382. Baskin SI, Salem H: Oxidants, Antioxidants and Free Radicals. Washington: Taylor & Francis Publ.; 1997. Bird RP, Draper HH: Comparative studies on different methods of malonaldehyde determination. Methods Enzymol 1984;105:299-305. Chihuailaf RH, Contreras PA, Wittwer FG: Patogénesis del estrés oxidativo: Consecuencias y evaluación en salud animal. Vet Méx 2002;33:265-283. Corongiu FP, Milia A: An improved and simple method for determining diene conjugation in autoxidized polyunsaturated fatty acids. Chem Biol Interact 1983;44:289-297. Darley-Usmar V, Halliwell B: Blood radicals: reactive nitrogen species, reactive oxygen species, transition metal ions, and the vascular system. Pharm Res 1996;13:649-662.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 9)

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ONCEPTO EPIGENÉTICO Y SUS ALTERACIONES Félix Recillas-Targa

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❚ INTRODUCCIÓN En el transcurso del último decenio ha habido un desarrollo extraordinario en el área de la regulación epigenética entendida como aquellos procesos hereditarios que llevan a la expresión de un gen sin que ocurran cambios en la secuencia del DNA. En otras palabras, son todos los procesos reguladores que no contemplan cambios drásticos en la secuencia del DNA, como lo son las mutaciones, deleciones, pérdida de la información genética (cromosomas o parte de ellos), translocaciones, entre otros. A pesar de lo anterior, resulta importante señalar que los eventos epigenéticos no pueden llevarse a cabo ni ser comprendidos sin considerar la información genética codificada en la molécula de DNA. Por tanto, la regulación de la expresión necesita tanto a la información genética como a la epigenética para realizar sus funciones celulares normales. Poco se sabe en relación con las especies reactivas de oxígeno, estrés oxidativo y la regulación epigenética. En la actualidad es indiscutible que tanto los procesos genéticos como epigenéticos, normales o anormales, ocurren en el contexto de la cromatina. Por tanto, modificaciones en la organización del genoma en cromatina trae como consecuencia el desarrollo de diversos procesos celulares como

❚ 147 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

la transcripción, duplicación, recombinación y la reparación del daño al DNA. Con base en lo anterior, en este capítulo se pretende justificar que la epigenética, junto con la información genética, tienen una relación estrecha con los efectos que ocasionan las especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo en la integridad del genoma y la fisiología celular.

❚ EL GENOMA EUCARIÓTICO Y LA CROMATINA El contexto en el cual se lleva a cabo la mayor parte de los eventos de regulación tiene una relación estrecha con la estructuración del DNA en la cromatina, cuya función primaria es la de contener el genoma eucariótico en el interior del núcleo. Como consecuencia de lo anterior, se presenta una estructura de la cromatina inaccesible y, por tanto, represora para la expresión génica. La cromatina se forma gracias a las interacciones entre un octámero de histonas, que en su conjunto forman al nucleosoma, y el DNA. A cada nucleosoma se le enrollan 147 pares de bases (pb) de DNA, generando así el nivel mínimo de compactación del genoma. Esta estructuración del genoma en cromatina tiene efectos directos en la expresión regulada de los genes, dado que debe sufrir distintos grados de remodelación para permitir la transcripción coordinada de un gen o grupo de genes en tiempo y espacio. El templado donde ocurre la transcripción necesariamente debe contrarrestar una estructura conocida como la fibra de 30 nm o solenoide, que consiste en un grupo de seis nucleosomas. Ahora se sabe que los grandes ejes de regulación tienen en gran medida que ver con la remodelación de esta organización nucleosómica, y cuando se ven afectados pueden originar procesos tumorales. La estructura del nucleosoma asociado al DNA ha sido cristalizada a una resolución de 2.8 Å, mostrando interacciones entre cada histona y la exposición fuera del nucleosoma de las regiones amino terminales de estos mismos. La relevancia de estas regiones expuestas se estudiará más adelante, ya que son la base de distintas modificaciones postraduccionales, como la acetilación y desacetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinización, sumoilación y ADP-ribosilación (figura 10-1). Todas estas modificaciones de las histonas tienen consecuencias positivas y negativas sobre la expresión génica a través de la remodelación de la estructura de la cromatina.

❚ REGULACIÓN

EPIGENÉTICA

En términos generales, son dos los modelos que explican las modificaciones epigenéticas del genoma con consecuencias en la regulación génica y en su desregu-

Concepto epigenético y sus alteraciones

CH 3 | C=O HAT | Coenzima A

A +

NH3 | CH2 | (CH 2 ) 3 | -X-Lis-X-Histona

N

HDAC

CH3 | C=O | OH

B

SH | Coenzima A

H2O

Ac

K

K

S

4

9

10

N

CH3 | C=O | NH | CH | 2 (CH2 )3 | -X-Lis-X-Histona

Ac

Ac

Ac

P

K

K

K

K

S

14

18

23

27

28

Ac

Ac

Ac

Ac

Me

S

K

1

5

K

K

K

K

8

12

16

20

P N

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N

H3

H4

Ac

S

K

1

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Me

Me Me Ac Ac P

P

•

H2A

5

Ac

Ac

Ac

Ac

K

K

K

K

5

12

15

20

H2B

Figura 10-1. Modificaciones postraduccionales de las histonas. A) Reacción de acetilación y desacetilación de histonas. Esquema del nucleosoma y DNA, resaltando los extremos amino terminales de las histonas. Los números que muestran las “colas” amino terminales corresponden a la posición de los residuos de lisina. B) Esquema de los extremos amino terminales de las histonas, indicando algunas de las modificaciones postraduccionales. Me, metilación; Ac, acetilación, P, fosforilación.

lación en procesos tumorales. Aunque, como se verá más adelante, se han descubierto nuevos componentes que forman parte de la regulación epigenética. El primero de estos modelos tiene a la metilación del DNA como su factor más importante con un efecto directo sobre la estructura de la cromatina. La metilación del DNA afecta la expresión de los genes a través de dos mecanismos: la interferencia directa de la unión de un factor transcripcional a su secuencia blanco en el DNA (figura 10-2) o por medio de la unión de una familia de proteínas que reconocen al DNA metilado, factores que a su vez atraen cofactores que reclutan enzimas remodeladoras de la cromatina, en particular histonas desacetilasas, causando la formación de una estructura de la cromatina altamente compacta y por tanto, represora para la actividad transcripcional.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

FT

(Capítulo 10)

FT X

FT

C

m

FT

FT

pG metilado FT

CpG

X

no-metilado

Figura 10-2. Esquema del modelo de interferencia originado por la metilación del DNA. Los dinucleótidos CpG son el blanco de la metilación; cuando están presentes en el promotor de un gen pueden ser metilados e interferir con el reconocimiento de factores transcripcionales a sus secuencias blanco en el DNA. Son posibles varios escenarios: 1) una alta densidad de CpG metiladas (hipermetilación) puede interferir con la unión de varios factores de transcripción, y 2) existen ejemplos que demuestran que incluso un solo dinucleótido CpG metilado puede ocasionar el silenciamiento del promotor y la inactivación de la expresión del gen. Cabe señalar que no existen reglas generales que permitan predecir un escenario u otro, y es sólo mediante una aproximación experimental que se puede determinar la contribución de la metilación del DNA al silenciamiento de la expresión de un gen.

El segundo modelo contempla cambios en la estructura de la cromatina cuyos efectos sobre la regulación epigenética dependen de distintas modificaciones postraduccionales de las regiones amino terminales de las histonas. Modificaciones que se presentan en diversas combinaciones, por ejemplo, la metilación y acetilación o fosforilación y desacetilación de residuos específicos en los extremos amino terminales de las histonas. Estas combinaciones han llevado a David Allis a proponer el Código de las histonas como una forma de respuesta diferencial de la estructura de la cromatina para lograr eventos de regulación altamente específicos. A continuación se presentarán los principales procesos relacionados con la regulación epigenética. Metilación del DNA La metilación del DNA consiste en la incorporación de un grupo metilo en la posición 5 de la citosina en el dinucleótido CpG. Los péptidos responsables de la metilación del DNA forman una familia de enzimas entre las cuales destacan la Dnmt1, Dnmt3a y Dnmt3b. Estas enzimas son esenciales, y son responsables de

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Concepto epigenético y sus alteraciones

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la metilación conocida como de novo (Dnmt3a y Dnmt3b), y de mantenimiento (Dnmt1). La modificación epigenética mediada por la metilación del DNA es sinónimo de represión o silenciamiento de la expresión génica. Como se mencionó antes, la interferencia es uno de los modelos que explican cómo un DNA metilado puede regular negativamente la expresión de un gen (figura 10-2). Ésta es la visión más sencilla y consiste en la incapacidad por parte de un factor transcripcional crítico para la expresión de un gen, para unirse al DNA en su secuencia de reconocimiento dado que el o los grupos metilo localizados en los dinucleótidos CpGs impiden directamente dicha unión (figura 10-2). Un ejemplo típico es la incapacidad del factor CTCF para reconocer a sus secuencias blanco en el alelo paterno de la región diferencial de metilación del locus Igf2/H19, mientras que en el alelo materno CTCF puede unirse dado que sus secuencias de reconocimiento en el DNA, ricas en CpGs, no se encuentran metiladas (figura 10-4). El segundo modelo es más complejo y participa un grupo de proteínas llamadas MeCP (del inglés, methyl-CpG-binding proteins) con la particularidad de poder unirse al DNA metilado (figura 10-3). Lo anterior implica que no requieren de secuencias específicas de unión al DNA, como por ejemplo los factores de transcripción. La unión de estas proteínas al DNA metilado trae consigo la interacción secuencial de otras proteínas básicamente por contactos proteína-proteína. Uno de los factores relevantes es el correpresor mSin3, el cual a través de otras interacciones tiene la capacidad de reclutar a histonas desacetilasas (HDAC). Toda esta serie secuencial de interacciones tiene como objetivo final inducir una estructura de la cromatina altamente compacta y por tanto, refractaria para la activación transcripcional. Desde un punto de vista clínico, se sabe que defectos en los niveles y regulación de la metilación tienen consecuencias directas en procesos tumorales y por tanto, en el cáncer. La hipometilación del DNA origina la activación anormal de protooncogenes, activación de retrovirus, incremento de rearreglos cromosómicos, inestabilidades cromosómicas y pérdida de la impronta genómica. Por el contrario, la hipermetilación puede provocar en un locus improntado la expresión bialélica anormal, la desregulación por represión de genes que pudieran causar procesos tumorales, como el Rb, p16, entre otros. Impronta génica y expresión monoalélica La metilación del DNA juega un papel central en la regulación de la expresión de uno solo de los dos alelos con los que cuenta una célula (expresión monoalélica) para ciertos loci. A este fenómeno se le conoce como impronta genómica, y tiene que ver con la expresión monoalélica de un gen o un grupo de genes. El

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

A H4

HDAC1

NH –

mSin3A

RbAp48

MeCP2

A H3 NH –

A

x m

C G

m

C G

DNA metilado

Nucleosoma

Figura 10-3. La metilación del DNA reprime la expresión génica mediante la formación de una cromatina compacta. La metilación del DNA se considera como uno de los procesos de regulación epigenética cuyo efecto es represor para la actividad transcripcional. En este modelo, la formación de una estructura de la cromatina “cerrada” se logra mediante la unión de las proteínas que reconocen al DNA metilado (conocidas como MeCP o MBD), cuya responsabilidad es la de atraer contactos moleculares con correpresores como Sin3A; correpresores que a su vez reclutan histonas desacetilasas (HDAC), favoreciendo la compactación de la cromatina.

locus Igf2/H19 constituye probablemente el dominio improntado mejor conocido (figura 10-4). Este dominio de más de 100 kilobases (kb) está compuesto por el gen Igf2, cuyo producto peptídico es necesario durante el desarrollo temprano, en particular en etapas embrionarias, y el gen H19 codifica para un transcrito cuya función se desconoce y aparentemente no genera una proteína madura. En este dominio, la expresión monoalélica se encuentra principalmente regulada por dos potenciadores o enhancers localizados a 7 y 9 kb río abajo del gen H19 (figura 10-4). La pregunta surge cuando se quiere entender cómo estos elementos de control son capaces de diferenciar entre un gen y otro de manera alelo específica. Es aquí donde la metilación del DNA juega un papel clave, dado que se ha demostrado que la región denominada región diferencial de metilación o DMR (por sus siglas en inglés) presente en la mayor parte de los loci improntados, puede metilar de manera diferencial uno solo de los alelos, que en este dominio es el alelo paterno. En este locus, el alelo materno no se encuentra metilado y funge como un bloqueador de las señales provenientes de los potenciadores mediante la unión y actividad de la proteína CTCF, concentrando su función activadora sólo en el gen H19, lo que imposibilita la activación a distancia del gen Igf2 (figura 10-4). Por el contrario, en el alelo paterno, la DMR y regiones aledañas que incluyen al gen H19 se metilan, silenciando y eliminando la función de bloqueo que además depende del factor CTCF, y permitiendo ahora la activación de manera monoalélica del gen Igf2. Desde un punto de vista clínico, se puede inferir la importancia que tiene la metilación del DNA en la regulación de la impronta genómica. Fallas en este tipo

Concepto epigenético y sus alteraciones

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CTCF

Igf2

DMR

H19

metilación

CTCF

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Figura 10-4. Impronta genómica y el locus Igf2/H19. El dominio improntado que representa un paradigma dentro de esta área de estudio es el locus Igf2/H19. El patrón de expresión monoalélica regula la transcripción del gen H19 en el alelo materno, mientras que el Igf2 posee una expresión específica del alelo paterno. El modelo actual propone que la metilación diferencial de la DMR provoca que en el alelo materno la proteína CTCF pueda unirse al DNA, bloqueando la acción de enhancers localizados en el extremo 3’ del dominio. De esta forma, en el alelo materno, el gen distal Igf2 no puede ser activado, y sólo el gen H19 puede ser transcrito. Por el contrario, en el alelo paterno, la región DMR se encuentra hipermetilada, inhabilitando la unión de CTCF causando que los enhancers puedan ahora activar la transcripción del gen Igf2 localizado a más de 70 kb. Mientras tanto, en el alelo opuesto, la hipermetilación de la región DMR se expande invadiendo al promotor y cuerpo del gen H19, induciendo su silenciamiento.

de regulación epigenética trae como consecuencia la expresión bialélica anormal de ciertos genes, incluyendo protooncogenes, supresores tumorales e incluso la generación de diversos síndromes. Modificaciones postraduccionales de las histonas en la epigenética Las histonas forman parte de la organización del genoma en cromatina y participan directamente en la regulación epigenética de la expresión de los genes. Como se mencionó antes, las histonas sufren al menos cuatro diferentes modificaciones postraduccionales en las regiones amino terminales. Las modificaciones más estudiadas y con los efectos más claros son los que tiene que ver con la acetilación específica y diferencial de los residuos de lisina en las regiones amino terminales de las histonas (figura 10-1). Resulta importante recalcar que la acetilación de las histonas debe ser correlacionada directamente con una “abertura” o descompactación de la cromatina, favoreciendo así la actividad transcripcional. Por el con-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

trario, la desacetilación tiene las funciones opuestas y asegura una estructura de la cromatina represora para la actividad transcripcional. Una de las demostraciones más recientes y relevantes de la importancia de las modificaciones postraducionales de las histonas es la metilación de las lisinas 4 y 9 de la histona H3. Este descubrimiento se origina a partir de la identificación del dominio SET conformado por 130 residuos en la proteína SU(VAR)3-9 de Drosophila, esta proteína es un miembro de la familia de supresores de variegación. El término de variegación se tomó de la variación irregular de coloración de parte de las hojas o las flores debido a la supresión del pigmento por silenciamiento génico dado por un virus, y los genes SU(VAR) son los que suprimen la variegación. La proteína homóloga en humanos, la SUV39H1, es una histona metiltransferasa cuya función es la de metilar de manera específica la lisina 9 de la región amino terminal de la histona H3. Esta señal postraduccional trae como consecuencia la interacción de la proteína asociada a heterocromatina HP1, proteína característica de zonas de heterocromatina en el genoma, como lo son las regiones teloméricas y centroméricas, generando de esta manera una estructura de la cromatina altamente compacta (la heterocromatina es la parte de la cromatina que no se transcribe). La relevancia de este descubrimiento vino a partir del estudio del promotor de la ciclina E (proteína relacionada con la progresión del ciclo celular) en el cual se sabe que el factor de transcripción E2F es responsable de reclutar a la proteína retinoblastoma (Rb, también asociada con la progresión del ciclo celular) (figura 10-5). Lo interesante de esta observación es que además de la capacidad de Rb para reclutar histonas desacetilasas, ahora se demuestra que Rb puede interaccionar con SUV39H1, la cual metila la lisina 9 de la región amino terminal de la histona H3, hecho que trae como consecuencia la asociación de la proteína HP1, y a través de un mecanismo estrictamente epigenético, reprime o bloquea la función del promotor de la ciclina E (figura 10-5). En resumen, el papel de la proteína Rb en cuanto a sus funciones reguladoras, está regido por cambios epigenéticos en la estructura de la cromatina de las regiones que controla. Lo anterior sugiere que este tipo de mecanismos se pueden extrapolar a un gran número de genes y sus respectivas regiones de control. Complejos de remodelación ATP dependiente Una alternativa dentro de la regulación epigenética es la acción de los complejos de remodelación dependientes de ATP, y cuya función es la de desplazar, reorganizar y deslizar a los nucleosomas. Como consecuencia de dicha actividad, es posible el acceso a sus secuencias blanco por parte de una variedad importante de factores de transcripción. Los complejos de remodelación poseen varias subu-

Concepto epigenético y sus alteraciones

Rb E2F

SUV39HI HMTasa

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heterocromatina

Me Lis 9 HP1 HP1 HP1 HP1HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1

X

Promotor ciclina E

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Figura 10-5. Regulación epigenética del promotor humano del gen de la ciclina E. Por medio de interacciones proteína-DNA (E2F) y proteína-proteína (Rb-E2F), miembros de la familia de factores E2F, en colaboración con la proteína Rb, reclutan a la histona metiltransferasa (HMTasa) SUV39H1, la cual de manera específica metila a la lisina 9 de la histona H3. Esta modificación postraduccional de la histona H3 es reconocida por la proteína de heterocromatina HP1, induciendo su acumulación y por tanto, la formación de heterocromatina de manera regulada. Éste es un claro ejemplo de la regulación epigenética de un gen, la ciclina E, que participa en el control de la progresión del ciclo celular.

nidades que incluyen en algunos casos 16 componentes, entre los cuales destaca la subunidad con actividad de ATPasa. Datos experimentales muestran que este tipo de complejos pueden actuar de manera sinérgica con otras modificaciones, como la acetilación y desacetilación de histonas, y que su función tiene un orden secuencial específico. Una vez más nos encontramos ante un ejemplo donde sin que ocurran modificaciones genéticas se presenta una regulación de tipo epigenético que va a favorecer o inhibir la actividad transcripcional. Evidencias experimentales recientes sugieren que algunas subunidades de estos complejos de remodelación pueden actuar como supresores tumorales. También pueden participar activando o reprimiendo ciertos oncogenes y/o genes supresores de tumores. Por tanto, estos complejos originalmente asociados sólo a la función de remodelación de la cromatina también tienen relación con procesos tumorales. Otras formas de regulación epigenética: el grupo de proteínas Polycomb/Trithorax, RNA no-codificante y el núcleo celular La investigación de fenómenos ligados a la regulación epigenética ha tenido un desarrollo insospechado, incorporando nuevos elementos epigenéticos como la

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

familia de proteínas moduladoras de la estructura de la cromatina Polycomb (PcG) y Trithorax (TrxG), RNA no-codificantes y la propia dinámica nuclear. Las proteínas Polycomb (PcG) forman complejos represores fomentando la formación de una cromatina cerrada (no hay transcripción de genes). Por el contrario, las proteínas Trithorax (TrxG) favorecen una estructura de la cromatina abierta (hay transcripción de genes). Al principio, las proteínas PcG/TrxG fueron caracterizadas en la mosca de la fruta como reguladores epigenéticos de la expresión diferencial de los genes homeóticos (genes que durante el desarrollo embrionario están relacionados con la lateralidad y organización de varios órganos, en especial el sistema nervioso). Un aspecto relevante surge del estudio de células tumorales, en particular en cáncer de próstata, donde se observó una sobreexpresión del gen EHZ2, un miembro de PcG y que corresponde a una histona metilasa específica para la metilación de la lisina 27 de la histona H3. En esta investigación se demostró por ensayos de expresión global por microarreglos que la sobreexpresión anormal de EZH2 causa la represión de diversos genes, entre los cuales se encuentran genes supresores de tumores, lo que sugiere que su desregulación puede ser causante del desarrollo del cáncer de próstata. Estos resultados demuestran la relevancia de los complejos PcG/TrxG en la regulación epigenética y su participación en procesos neoplásicos. Otro aspecto novedoso dentro de la regulación epigenética es la participación de RNA no-codificante en la formación de heterocromatina. La inducción en la formación de heterocromatina está dada por mecanismos que involucran a la maquinaria del RNA de interferencia (RNAi), que a su vez recluta modificaciones postraduccionales en la histona H3, específicamente a través de la metilación de la lisina 9 de la histona H3, señal que favorece la incorporación de la proteína de heterocromatina HP1 (figura 10-5). Para ciertos organismos, este tipo de fenómenos se ha visto aunado a la metilación del DNA. En el contexto del estrés oxidativo y el efecto que las especies reactivas de oxígeno tienen sobre la estabilidad del genoma y con la intención de especular, se puede pensar que los RNAi pueden inducir la formación de heterocromatina en respuesta a estas señales adversas. Una posibilidad interesante es que este tipo de comportamiento epigenético contribuya a evitar un daño mayor al DNA, o que la formación de heterocromatina fuera un proceso regulado en espera de que la maquinaria de reparación inicie sus funciones. Por último, el núcleo celular parece tener una mayor participación en la regulación epigenética, dado que el núcleo no sólo tiene como función la de contener al genoma eucariótico en su interior, sino que participa de manera activa en la regulación diferencial de los genes (figura 10-6). En particular, la reciente demostración de la organización de los cromosomas en territorios ha apoyado los resultados que demuestran que zonas del genoma se relocalizan al interior del núcleo, induciendo o reprimiendo la expresión de genes. Lo anterior sin conside-

Concepto epigenético y sus alteraciones

Mutaciones Deleciones Amplificaciones Translocaciones

Complejos de remodelaje ATP-dependientes Modificaciones postraduccionales de las histonas

Efecto sobre la secuencia del DNA

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Metilación del DNA Polycomb/Trithorax RNA no-codificantes

Genética

Epigenética

Núcleo

- Memoria celular - Herencia epigenética - Impronta genómica Programación de- células troncales - Reparación del daño al DNA - Senescencia - Envejecimiento

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Figura 10-6. Interdependencia de los procesos genético-epigenético en el control de la expresión génica. La información genética se encuentra codificada en la molécula de DNA, y sus defectos causan trastornos genéticos. Los procesos biológicos que participan en la regulación epigenética son cada vez más numerosos e interdependientes. Con mayor frecuencia, se encuentran fenómenos biológicos y fisiológicos, tanto normales como anormales, que se ven influenciados conjuntamente por la regulación genética y epigenética.

rar que la función y morfología del núcleo de células dañadas por estrés oxidativo o neoplásicas se ven alteradas. En consecuencia, la estructura y dinámica nuclear deben ser consideradas como parte de los componentes epigenéticos de una célula.

❚ EPIGENÉTICA,

DAÑO AL

DNA Y SU

REPARACIÓN

Mantener la integridad del genoma es una necesidad central para la viabilidad celular. Transmitir la información genética y epigenética de una generación celular a otra debe ser uno de los procesos más regulados. Para lograr esto, la célula ha desarrollado sistemas especializados para vigilar y corregir defectos, en particular los asociados al daño causado a la molécula de DNA. Como se ha descrito a lo largo de varios capítulos, el daño al DNA es uno de los principales efectos ocasionados por las especies reactivas de oxígeno o radiación ionizante. Es claro que el daño al DNA, en su contexto in vivo, debe ocurrir en un genoma que se encuentra estructurado en cromatina y donde componentes epigenéticos deben ser alterados para que dicho daño ocurra, y que además en un contexto epigenético ocurra la reparación del DNA.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

Uno de los aspectos más claros en cuanto a la participación de procesos epigenéticos es el de la incorporación de una variante de histonas en respuesta a daño al DNA. Una de las principales fuentes de daño es la radiación ionizante, la cual induce daño oxidativo al DNA, causando el rompimiento de la doble cadena de DNA. Este daño es identificado por distintas enzimas, en particular, cinasas, las cuales fosforilan en la región carboxilo terminal a la variante de histona H2AX. En la actualidad se han caracterizado distintas cinasas con la capacidad de sensar daño al DNA, entre las que se encuentran: ATM, ATR y DNA-PK, las cuales, además de activar una remodelación epigenética de la cromatina de manera local, favorecen, en respuesta al daño en el DNA, la incorporación de la histona H2AX. La incorporación de la histona H2AX, además de contribuir a una remodelación específica de la estructura de la cromatina, induce el reclutamiento de la maquinaria de reparación del DNA. Por si fuera poco, se fomenta una interacción entre H2AX y la ATM cinasa, provocando el arresto en la progresión del ciclo celular, proceso que facilita la incorporación de la maquinaria de reparación del DNA (figura 10-7) . En casos extremos, cuando el daño al DNA es muy extenso y que en cierta medida se vuelve irreversible, toda esta maquinaria activa vías alternas, en particular la que lleva al suicidio de la célula, es decir, a la apoptosis. De esta forma, y mediante componentes propios de la regulación epigenética, se logra una división celular libre de errores, permitiendo así la estabilidad genómica y una transmisión correcta tanto de la información genética como epigenética de generación en generación celular. En su defecto, resulta pertinente recordar que la desregulación de los procesos de reparación llevará a la célula al desarrollo de un proceso tumoral. La célula ha evolucionado permitiendo la selección de diversas estrategias para la detección, remoción y corrección de los distintos tipos de daño causados al genoma, entre los cuales se encuentra la reparación por escisión de nucleótidos (NER; por sus siglas en inglés). La reparación del DNA por escisión de nucleótidos es un claro ejemplo donde la regulación genética y epigenética convergen. El componente central en la reparación tipo NER es el complejo o factor general de la transcripción TFIIH, cuya función es relevante dentro del control del ciclo celular en asociación con su papel en el inicio de la transcripción con su actividad de cinasa fosforilando la región carboxilo terminal de la RNA polimerasa II; fosforilación que constituye una de las señales más importantes para el inicio de la transcripción. TFIIH es un complejo conformado por al menos nueve subunidades peptídicas, las cuales además de realizar las funciones mencionadas participa en la reparación tipo NER y por tanto, corrige daños al DNA, entre los que se encuentra el daño oxidativo. La participación de elementos que intervienen en la regulación epigenética, como los nucleosomas y las modificaciones postraduccionales asociadas a las histonas que los componen, complejos de remodelación ATP dependientes, entre otros, apoyan la relevancia de TFIIH y el proceso de

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reparación por NER para salvaguardar la integridad del genoma. Por ejemplo, entre las subunidades que conforman a TFIIH se encuentran RPA, XPA, y XPC, relevantes para el proceso de reparación, cuya función puede verse comprometida por la organización nucleosómica del genoma. Por tanto, la estructuración del genoma en cromatina debe ser relajada para permitir los procesos de reparación. Esto se ve apoyado por las interacciones entre RPA, XPA y XPC, con componentes de TFIIH y de complejo de remodelación ATP dependiente SWI/SNF, los cuales favorecen el desplazamiento y reposicionamiento de nucleosomas, contribuyendo a la reparación del DNA. Otro componente considerado como miembro de la regulación epigenética y que participa en la reparación del DNA es la proteína MBD4. Esta proteína forma parte de la familia de proteínas que tienen la capacidad de unirse al DNA metilado, implicadas en la formación de una cromatina compacta. Se desconoce su contribución real, pero se ha visto asociada a sitios donde ocurren procesos de reparación del DNA. La propia transcripción también juega un papel, en particular cuando se asocian a la unión de factores transcripcionales y sus cofactores que reclutan de manera local remodeladores de la cromatina, como las histonas acetilasas CREB y p300. Estas enzimas favorecen la acetilación, principalmente de residuos lisina, de las regiones amino terminales de las histonas: proceso epigenético que lleva a relajar la estructura de la cromatina y contribuye a la reparación del daño causado al DNA. Una etapa clave en el ciclo de vida de la célula es cuando, de manera coordinada, debe duplicarse su material genético previo a la división celular. En esta misma etapa resulta importante poder sensar y corregir daños al genoma para Cromatina Epigenética

Cromatina

DSB

H2AX

Apoptosis

ATM M G1

Reparación DSB

Reparación del DNA NER, BER, NHEJ

p53

G2 S Arresto en la progresión del cíclo celular

Figura 10-7. Esquema de la relación entre la reparación del DNA, la incorporación de la variante de histona H2AX y la activación de la ATM cinasa responsable de la activación de distintas vías y de una respuesta al nivel del control del ciclo celular. En este contexto, son tres las respuestas posibles: reparación del DNA, arresto en la progresión del ciclo celular, y el escenario más crítico tiene que ver con la activación de la vía de muerte celular o apoptosis.

160

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

asegurar su estabilidad y descendencia. Por tanto, es durante la fase S del ciclo celular y junto con la maquinaria de duplicación donde también se presentan mecanismos epigenéticos encargados de sensar y corregir daño al DNA. La proteína PCNA es la responsable de aglutinar, en la orquilla de duplicación, múltiples interacciones proteína-proteína y coordinar no sólo la duplicación del DNA, sino también el control del ciclo celular, el ensamblaje de la cromatina de novo y la reparación del DNA. La PCNA puede asociarse con CAF-1 conocida como una chaperona de histonas, ayudando a la incorporación de las histonas H3 y H4 durante el ensamblaje posduplicativo de la cromatina. La PCNA se asocia también con histonas desacetilasas y con la DNA metiltransferasa (Dnmt1), conocida como la metilasa de mantenimiento. De una manera ligada a procesos epigenéticos, la PCNA junto con su asociación con CAF-1, HDAC y la Dnmt1, juegan un papel coordinado en la reparación del DNA. De esta forma, y antes de la división celular, heredar un genoma íntegro con marcas epigenéticas estables constituye una forma de asegurar la estabilidad y segregación correcta del genoma. En resumen, resulta cada vez más evidente que la integridad del genoma depende en gran medida de la convergencia de mecanismos que implican la regulación epigenética. Es importante recordar que el daño al DNA por radiación ionizante es uno de los más estudiados, y que se desconocen los efectos causados por otros tipos de componentes como las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, abriendo un amplio y novedoso campo de investigación.

❚ SENESCENCIA,

MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS Y FORMACIÓN DE HETEROCROMATINA

Estrictamente no se ha establecido una clara relación entre las especies reactivas de oxígeno, reparación del DNA, senescencia y envejecimiento celular. A pesar de ello, la predicción de que en procesos celulares como daño al DNA y senescencia, la regulación epigenética participe activamente es más que realista. Por esta razón, vale la pena presentar descubrimientos recientes que relacionan a la senescencia celular con procesos epigenéticos y que no sería sorprendente una relación con la presencia de radicales libres, estrés oxidativo y envejecimiento. La familia de proteína asociada a Rb, p107 y p130, y el supresor de tumores p53, constituyen reguladores del proceso conocido como senescencia celular. Las células senescentes se caracterizan por un arresto en su ciclo celular acompañado por la interrupción en su capacidad duplicativa. Las células senescentes, además de mantenerse metabólicamente activas, presentan cambios morfológicos, fisiológicos, al igual que en su patrón global de expresión génica. Una característica particular de estas células es la falta de expresión de genes ligados a la proliferación celular. Uno de los parámetros más utilizados para definir a una célula senes-

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Concepto epigenético y sus alteraciones

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161

cente es la actividad SA-βgal (del inglés: senescence-associated β-galactosidase activity). Un estudio reciente demuestra la participación de Rb en el fenómeno de senescencia, promoviendo la formación de heterocromatina que participa en la constitución de un estado senescente permanente de la célula. Diversos estudios moleculares y de inmunocitolocalización demostraron cambios en la forma y contenido de las células senescentes. Además, se puso en evidencia la formación de conglomerados con características propias de secuencias de heterocromatina denominadas SAHF (del inglés: senescence-associated heterochromatin foci). Los SAHF característicos de las células senescentes conglomeran información genética inactiva transcripcionalmente, presentan acumulación de la histona H3 metilada en la lisina 9 y acumulación de la proteína de heterocromatina HP1. Se demostró en este mismo trabajo que la formación de heterocromatina, dependiente de la actividad de la proteína Rb, se presenta asociada en células senescentes a ciertos promotores dependientes de la familia de factores E2F, por lo que la formación de SAHF dependiente de Rb constituye el primer mecanismo descrito para el control y arresto del ciclo celular en una célula senescente, proceso que depende claramente de la vía de Rb y de elementos de control epigenético. Al parecer, Rb no es el único factor involucrado en la formación de células senescentes. Basados en la literatura, resalta la poca consistencia y puntos de acuerdo en cuanto a las funciones de las proteínas p107 y p130. Se ha sugerido que p107 y p130 tienen una función, y responden a funciones específicas de células quiescentes. Por otra parte, existen evidencias que apoyan su función promoviendo la senescencia celular, al igual que Rb, mediante la heterocromatinización de promotores de genes dependientes de los factores de la familia E2F. Por su parte, Blasco et al., han corroborado la participación de la familia de proteína Rb en la formación de heterocromatina por medio del análisis de una triple mutante (RB1, RBL1 y RBL2) en fibroblastos embrionarios de ratón. Como consecuencia de esta triple mutante se manifiesta una clara inestabilidad genómica, coincidente con una pérdida en la metilación del DNA, aumento en la acetilación de la histona H3 y disminución en la trimetilación de la lisina 20 de la histona H4. Todos estos cambios ocurren predominantemente en regiones pericentroméricas y teloméricas. Los autores concluyen que los miembros de la familia Rb contribuyen, en parte, a mantener la estabilidad del genoma mediante la formación de heterocromatina. La relevancia clínica de estos resultados tiene que ver con procesos de inestabilidad genómica observada en aneuploidías, presentes en diversos tipos de neoplasias. Para finalizar, hay que recordar que una célula senescente tiene per se características antitumorales al no permitir su proliferación. Con base en lo anterior, se puede predecir que los mecanismos que llevan a una célula a senescencia pudieran ser activos cuando se presenta daño al DNA por especies reactivas, para de

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 10)

esta forma evitar la segregación de defectos genómicos. En consecuencia, entender los mecanismos de control de la senescencia, que además utiliza en parte procesos epigenéticos, resulta ser un aspecto relevante para entender cómo se desarrolla un proceso tumoral y de qué forma se puede diseñar una estrategia terapéutica.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS En la actualidad aún no se logra una visión integral de los fenómenos que permitan entender procesos tan básicos como la regulación genética y epigenética. Los avances han sido enormes, pero aún quedan muchas interrogantes. El conocimiento generado hasta la fecha asegura que el campo de la epigenética se encuentra en una etapa inicial de gran auge, y que en breve se descubrirán nuevos factores y redes de regulación relacionados con la formación de estructuras represoras de la cromatina. Como se mencionó, las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, el estrés oxidativo y sus efectos a nivel fisiológico, deben tener un componente epigenético que hasta ahora no ha sido demostrado claramente. A pesar de ello, existen indicios que sugieren que la regulación epigenética debe considerarse en los procesos de reparación del DNA, senescencia, programación y reprogramación de células totipotenciales, envejecimiento y regulación génica, abriendo de esta forma un amplio panorama para la investigación básica y biomédica (figura 10-5). Por si fuera poco, estos procesos llevarán a entender mejor los orígenes de ciertos tipos de cáncer. Todo lo anterior debería converger en novedosos protocolos de diagnóstico, y sobre todo de métodos terapéuticos que, junto con la secuencia del genoma humano, permitirá incluso pensar en una medicina predictiva mucho más segura. Finalmente, hay que recordar que la identificación de genes y sus productos peptídicos que conforman al genoma humano no será suficiente, y que la caracterización e identificación de secuencias y elementos de regulación en regiones intergénicas del genoma humano, con mayor frecuencia denominado epigenoma, serán críticas para el entendimiento de los mecanismos de regulación epigenética.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

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Concepto epigenético y sus alteraciones

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S

ECCIÓN

V.

ANTIOXIDANTES

11. Superóxido dismutasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 12. Catalasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 13. Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

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14. Tiorredoxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219 15. Hemooxigenasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 16. Glutatión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 17. Potencial antioxidante de los carotenoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 18. Potencial antioxidante del ácido ascórbico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 19. Potencial antioxidante de los α-tocoferoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 20. Polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

11

S

UPERÓXIDO DISMUTASA Luis Enrique Gómez Quiroz Deidry Beatriz Cuevas Bahena

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❚ INTRODUCCIÓN A lo largo de este libro se ha hablado de la toxicidad de las especies reactivas de oxígeno, siendo el radical anión superóxido (O2•) una de las primeras especies generadas por diversos sistemas celulares. Este radical es altamente tóxico por sí mismo, sobre todo porque daña a las proteínas que contienen centros Fe-S, como la aconitasa, la succinato deshidrogenasa y la NADH-ubiquinona oxidorreductasa, entre otras; sin embargo, también puede ser el generador de otras especies reactivas aún más tóxicas que él mismo. La superóxido dismutasa (SOD) es la enzima encargada de transformar esta especie reactiva en una de menor toxicidad, como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual es posteriormente transformado en agua por otras enzimas.

❚ PANORAMA HISTÓRICO El descubrimiento de la actividad de la SOD fue reportado en 1969 por McCord y Fridovich, aunque la proteína ya había sido descubierta 30 años antes por Mann

❚ 169 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

y Keilin, quienes reportaron el aislamiento y purificación a partir de muestras de sangre e hígado bovino de una proteína que contenía cobre y cuya actividad desconocían. La proteína fue llamada erythrocuprein o hepatocuprein, y más tarde cytocuprein. El O2• también había sido descubierto en el decenio de 1930-39 por Linus Pauling; sin embargo, aún no se reconocía su presencia y participación en los sistemas biológicos, y mucho menos en las patologías. En 1969, Knowles y colaboradores, demostraron que la enzima xantina oxidasa era capaz de producir O2•, y más tarde McCord y Fridovich mostraron que este superóxido podía ser eliminado catalíticamente por la cobre-proteína de Mann y Keilin. Ahora se sabe que esa proteína descubierta por Mann y Keilin es sólo un miembro de la familia de las SOD, y que además une también cinc.

❚ LA FAMILIA DE

LAS

SOD

Las SOD son una familia de enzimas que catalizan eficazmente la dismutación del O2•, como se observa en la siguiente reacción: 2 O2• + 2 H+ → H2O2 + O2 En los mamíferos, esta familia está formada por tres miembros, los cuales se ubican en lugares claramente específicos, dos dentro de la célula y uno extracelular (figura 11-1). La primera enzima es una SOD que tiene en su centro catalítico un cobre y un cinc (SOD1 o Cu/Zn-SOD) y se ubica en el citoplasma; el núcleo, en la membrana externa de la mitocondria, y es justamente la proteína descrita por Mann y Keilin. La segunda enzima está ubicada cerca de la membrana interna mitocondrial. Ésta es una SOD que une manganeso en su centro catalítico (SOD2 o MnSOD); y finalmente existe una más, la cual se localiza fuera de la célula y está asociada a la matriz extracelular. Al igual que la primera SOD, ésta tiene asociado un cobre y un cinc (SOD3 o EC-SOD). Si bien las tres realizan la misma actividad catalítica, guardan grandes diferencias en cuanto a su estructura y organización (cuadro 11-1). La compartimentación de las diferentes SOD se explica en gran medida por el hecho de que el O2• no puede cruzar con facilidad las membranas que separan los compartimientos celulares y mitocondriales. Sin embargo, recientemente se ha reportado que dado que el O2• puede reaccionar con otras moléculas, es capaz de originar especies intermediarias que le faciliten la permeabilidad y puedan, de esta forma, escapar de los efectos protectores de las SOD y ejercer su toxicidad. Un buen ejemplo de ello es la gran facilidad que tiene el O2• para reaccionar con el óxido nítrico (NO•) para formar el peroxinitrito (ONOO–), el cual puede atravesar las membranas lipídicas utilizando algunos canales iónicos.

Superóxido dismutasa

•

171

SOD1

H O 2

Núcleo

H O 2

SOD1

2

O • 2

H O 2

Oxidasas

2

SOD3 O • 2

SOD2

H O 2

2

O • 2

Dominio de unión a heparina Membrana celular

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Figura 11-1. Distribución de las diferentes SOD en los humanos.

Además, en las bacterias existen otros dos tipos de enzimas de la familia de las SOD, una que une hierro en su centro catalítico (FeSOD) y otra que une níquel (NiSOD). Éstas no serán consideradas en el presente capítulo, que se enfocará sólo en las SOD que se expresan en los humanos, aunque son de gran interés por estar involucradas en bacterias patógenas para el ser humano. SOD1 La SOD1 o Cu/ZnSOD se encuentra en el citoplasma, núcleo, peroxisomas, y en la membrana externa mitocondrial. La enzima es un homodímero de 32 kDa con un Cu y un Zn por cada subunidad de 153 aminoácidos. Sólo el cobre tiene importancia catalítica, mientras que el cinc confiere estabilidad a la estructura proteínica; sin embargo, ambos metales están muy conectados por un imidazolato que provee la histidina 63 (figura 11-2). El gen de la SOD1 (sod1) se ubica en el humano en el cromosoma 21, en la región 21q22; está compuesto por 5 exones y 4 intrones, posee cajas TATA, CCAAT y regiones ricas en GC. En su región promotora posee sitios de unión

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

Cuadro 11-1. Características de las SOD en humanos

Nombre SOD1, CuZnSOD

SOD2, MnSOD SOD3, ECSOD

Ubicación Citoplasma, núcleo, peroxisomas y en la membrana externa dela mitocondria Membrana interna de la mitocondria Extracelular, asociada a heparina, sangre, entre otros

Metal en centro catalítico

PES o KDa

Ubicación del gen en humanos

Cu y Zn

32

Cromosoma 21 Símero, 153 aminoácidos por unidad

Mn

89

Cromosoma 6

Homotetrámero

Cu y Zn

135

Cromosoma 4

Glucoproteína tetramérica

Características

para factores de transcripción que regulan su expresión, como NF1, Sp1, AP1, AP2, GRE, HSF y NF-κB, por lo que su expresión es inducida por estímulos mecánicos, químicos y biológicos como el choque térmico, radiaciones ultravioleta (UV), metales pesados y por supuesto, el estrés oxidativo.

SOD2 La mitocondria es, sin duda alguna, el organelo celular sometido a mayor estrés oxidativo, puesto que se estima que alrededor de 4 a 5% de los electrones transportados por la cadena respiratoria son desviados para producir O2•. Por ello, resulta vital la presencia de la SOD2 dentro de la mitocondria; de hecho, esto ha sido probado en ratones a los cuales se les ha modificado el gen sod2, teniendo como resultado neurodegeneración, daño en el miocardio y muerte perinatal. La SOD2 o MnSOD, aunque se localiza en la mitocondria, está codificada en el núcleo, por lo que su expresión está regulada, en gran parte, por el estado redox de la mitocondria. Lo anterior sugiere que existe una respuesta adaptativa al desequilibrio oxidativo mitocondrial. El gen sod2 está situado en el humano en el cromosoma 6 en la región 6q25, y está compuesto de 5 exones y 4 intrones. El promotor carece de las cajas TATA o CAAT, pero posee regiones ricas en GC; además, contiene secuencias regulatorias para NF-κB, SP-1 y AP-2, C/EBP, NF-1. Su

Superóxido dismutasa

•

173

Arg143

Asp 81 His44 His69 His118

Cu

Zn His63

His46

His78

Figura 11-2. Centro catalítico de la SOD1.

expresión es inducida, como se puede deducir, por diversas citosinas y factores de crecimiento tipo proinflamatorios como el TNF-α, IL-1, IL-6, entre otras, así como por inductores de estrés como el lipopolisacárido (LPS) o los metales pesados. La enzima es un homotetrámero con un peso de 22 kDa por subunidad, y posee un Mn+3 por monómero.

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SOD3 La SOD3 o EC-SOD es la única proteína extracelular que puede eliminar el O2•. La SOD3 humana fue purificada en 1982, y se encontró que era una proteína tetramérica de casi 135 kDa y 222 aminoácidos que contenía un átomo de cobre y uno de cinc por subunidad. A diferencia de las otras SOD, la SOD3 presenta una glucosilación en la Asn 89 (figura 11-3). La SOD3 está presente en la matriz extracelular, principalmente unida a la heparina y a las fibras de colágena tipo I de la mayor parte de los tejidos. También se ha encontrado en el plasma y en el fluido linfático y cefalorraquídeo; no obstante, la concentración de SOD3 en la matriz extracelular es 20 veces superior a la presente en el plasma. La SOD3 posee 60% de homología con la SOD1; sin embargo, tiene muy poca homología con la SOD2. El gen humano de la sod3 está organizado en 3 exones y 2 intrones. El promotor del gen contiene varios elementos reguladores, incluyendo al elemento de respuesta antioxidante, a los sitios de unión a los factores de transcripción AP-1 y NF-κB, y a los elementos de respuesta xenobiótica. La enzima puede dividirse estructuralmente en tres dominios funcionales:

174

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

COOH

H N 2

Función de la región

Tetramerización

Actividad catalítica

Unión a MEC y a heparina

Figura 11-3. Relación estructura-función de la SOD3. ■ N-acetil-glucosa; ❍ manosa; … galactosa; š fucosa; ▲ ácido siálico.

1. La región amino terminal (residuos 1 a 95), la cual contiene el sitio de glucosilación, y contribuye a la solubilidad de la enzima. 2. La región intermedia (residuos 96 a 193), que contiene al centro catalítico y exhibe una fuerte homología con la SOD1. 3. La región carboxilo terminal (residuos de 194 a 222), que contiene una secuencia de nueve aminoácidos con carga positiva (3 lisinas y 6 argininas) que le otorga afinidad por la heparina y el sulfato de heparán, permitiéndole la localización extracelular y en la matriz extracelular, este dominio se conoce como dominio carboxilo terminal de unión a heparina (DUH). La purificación de la enzima por cromatografía de afinidad usando heparina acoplada a sefarosa, mostró que existen tres fracciones, una que no tiene afinidad por la heparina (fracción A), otra con afinidad débil (fracción B) y una más con afinidad muy fuerte (fracción C). La mayor parte de la SOD3 que existe en los tejidos es del tipo C. Este tipo de SOD3 está construida con cuatro subunidades que poseen el DUH intacto, mientras que la fracción B es heterogénea y la fracción A carece en sus cuatro subunidades de los DUH. No es difícil pensar que las SOD tipo A y B son especies circulantes, mientras que la tipo C permanece asociada básicamente en endotelios. La remoción del DUH en las SOD3 de las fracciones A y B se lleva a cabo por proteólisis, actividad que se ha atribuido a la tripsina en un proceso extracelular, o a proteasas, del tipo de las furinas, dentro de la célula, las cuales cortan el DUH antes de ser secretadas. Este proceso permanece aún en discusión, lo cierto es que el procesamiento proteolítico que genera los tipos A y B de SOD3 asegura tener una adecuada protección antioxidante en plasma y tejidos. Además de estas modificaciones, la SOD3 puede existir también en dos formas relacionadas con la formación de puentes disulfuro dentro de la proteína.

Superóxido dismutasa

•

175

Una de las formas es enzimáticamente activa (aEC-SOD), mientras que la otra carece de actividad (iEC-SOD). La forma activa contiene puentes disulfuro entre las cisteínas 45 y 190, y otro más entre las cisteínas 107 y 189, que son homólogos a SOD1; por otro lado, la iEC-SOD forma los puentes disulfuro entre las cisteínas 107 y 195, y el otro entre las cisteínas 189 y 190; tal vez este fenómeno representa el primer caso de regulación de la actividad de una enzima por variación intramolecular de los puentes disulfuro.

❚ REACCIÓN

CATALÍTICA DE LAS

SOD

El O2• generado en la mitocondria o en otros sistemas es convertido por las SOD en H2O2, el cual a su vez también es convertido en H2O por la catalasa o por la glutatión peroxidasa GPx (figura 11-4). La reacción enzimática (2 O2• + 2H+ → H2O2 + O2) es llevada a cabo por la SOD en dos pasos, ambas son reacciones enzimáticas de primer orden respecto al O2•: O2 NAD(P)H oxidasa Señalizacion

Ciclooxigenasas

Expresión de

Xantina oxidasa

genes

Cadena respiratoria

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Citocromo P450, etc NO

O2

Daño

•

H2 O2 SOD

Daño

Catalasa GSHPx

ONOO -

Nitracion de proteínas

H2 O

Estrés oxidativo Daño

Figura 11-4. Proceso de destoxificación del radical superóxido y sus posibles interacciones y efectos dentro de la célula.

176

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

Mox + O2• + H+ ↔ Mred (H+) + O2 Mred (H+) + O2• + H+ ↔ Mox + H2O2 donde Mox es el estado oxidado del metal en el centro catalítico (Cu2+Zn2+ o Mn+3), y Mred denota el estado reducido del mismo metal (Cu+ Zn2+ o Mn2+). Tomando a la SOD1 como modelo, el mecanismo de reacción se desarrolla como se explica a continuación: el O2• llega al centro de reacción y se une, por una interacción electrostática, a la arginina 143. El O2• requiere donar su electrón desapareado para poder ser convertido en oxígeno molecular, ya que es ese electrón el que le confiere su naturaleza reactiva y tóxica. El electrón es transferido al Cu2+, que transforma al metal a su estado de menor oxidación, o Cu+. Esta transferencia electrónica genera que el enlace entre el Cu y la histidina 63 se rompa, lo que provoca que el nitrógeno de la histidina 63 se protone. El O2 formado se disocia de la arginina 143 y se libera (figura 11-5). La segunda parte de la reacción se inicia de manera similar a la primera, el O2• llega al centro catalítico, y una vez ahí, se une por una interacción electrostática con la arginina 143, aunado a esto, se genera, en la proximidad del centro catalítico, la protonación de una molécula de agua (H3O+). El electrón que recibió el Cu en la primera parte de la reacción, es ahora transferido al segundo O2•, permitiendo la oxidación del metal a Cu2+. Los dos electrones que posee en este momento el superóxido pueden formar inmediatamente dos enlaces covalentes con dos protones, los cuales son donados, uno por la molécula de agua protonada, y el otro por el nitrógeno de la histidina 63, lo que favorece que se restablezca el enlace que originalmente formaba con el Cu2+. Esto permite la liberación del H2O2 y la regeneración de la enzima, la cual queda preparada para otro ciclo catalítico (figura 11-6). El mecanismo de unión del sustrato a la SOD requiere, como se explicó antes, que el O2• se una a dos versiones diferentes del mismo sitio catalítico; sin embargo, la atracción electrostática es preservada después de la reducción del metal (Cu+) por el acoplamiento de un protón al sitio activo, (histidina 63); de esta forma, si bien la distribución de cargas ha cambiado, la carga total permanece equilibrada. Una pregunta que salta a la vista respecto a la reacción es ¿cómo puede la enzima contrarrestar la repulsión electrostática de dos O2•? La SOD libra este inconveniente de dos formas: primero, el metal catalítico reacciona con un solo O2•, y segundo, la enzima usa la carga negativa del anión para aumentar la especificidad hacia el sustrato y no hacia el producto. Estructuralmente hablando, las SOD tienen un potencial electrostático positivo cerca del sitio activo, causado por el metal del centro catalítico; por otro lado, la carga del metal no es completamente neutralizada por el ligando, esta carga contribuye a la unión del sustrato; de esta forma, la SOD también puede unir otros aniones pequeños; por el contrario, los dos productos son neutros, lo que les impide ser unidos por este mecanismo.

Superóxido dismutasa

•

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Arg143

Cu 2+

Zn His63

Nitrógeno

Arg143

Oxígeno Carbono Hidrógeno Electrón

Cu +

Zn His63

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Figura 11-5. Mecanismo de reacción mediado por la SOD1. Primera parte de la reacción, eliminación del primer superóxido y reducción del cobre.

Otra pregunta que puede surgir es ¿por qué una vez formado el H2O2 no reacciona con el metal (p. ej. Cu+2), siguiendo el modelo clásico de la reacción de Fenton? Primero, como se explicó en el párrafo anterior, una vez formado el H2O2 es repelido del centro catalítico de manera inmediata por su naturaleza neutra. Segundo, el Cu+2 que se regenera en la segunda parte de la reacción es estabilizado de inmediato por su unión a una histidina, que es, de hecho, la que dona un H+ al producto naciente, en el caso de la SOD1 es la histidina 63, la cual puentea a los dos metales. Por último, se sabe que en casos extraordinarios y a velocidades muy bajas, la SOD1 sí puede generar al radical hidroxilo a partir del H2O2, pero dadas las características cinéticas mencionadas, carece de importancia fisiológica o patológica.

178

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

Arg143

Cu +

Zn His63

Arg143

Nitrógeno Oxígeno 2+

Carbono

Cu

Zn His63

Hidrógeno Electrón

Figura 11-6. Mecanismo de reacción mediado por la SOD1. Segunda parte de la reacción; transformación del segundo anión peróxido en peróxido de hidrógeno y regeneración del centro catalítico.

❚ PATOLOGÍAS

RELACIONADAS CON LA DEFICIENCIA DE LAS

SOD

No es difícil imaginar que el mal funcionamiento de las SOD puede generar serios problemas en el organismo, especialmente desórdenes de tipo neurológico o vascular. A continuación se expondrán de manera breve algunas patologías que se han relacionado con las SOD. SOD1 Por la ubicación del gen sod1 en el cromosoma 21, podría pensarse en su posible relación con la trisomía 21 o síndrome de Down. Sin embargo, esta idea sigue siendo cuestionada a pesar de que estos pacientes presentan un incremento de 50% en la actividad de la enzima debido a que existe un aumento en la proteína por

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Superóxido dismutasa

•

179

la presencia triple del gen. Algunos estudios enfocados en la producción de enzimas antioxidantes en la trisomía 21 mostraron que no hay diferencias respecto a los controles en las concentraciones de la SOD1 y de la catalasa, entre otras enzimas antioxidantes, pero sí mostraron una disminución significativa en las enzimas relacionadas con la síntesis del glutatión (GSH), como la GSH sintasa; además de enzimas como la tiorredoxina peroxidasa, la GSH-S-transferasa, lo que indica que la presencia del estrés oxidativo en pacientes con esta patología puede deberse a un decremento en la síntesis de agentes reductores como el GSH y en las enzimas que ayudan a la eliminación del H2O2, más que un incremento en la actividad de la SOD1. Como se mencionó antes, aún se discute si la SOD1 está involucrada de manera significativa en la patología, de hecho varios grupos de investigación han sugerido que el problema principal en esta enfermedad pudiera ser la sobreexpresión de otros genes, que también están codificados en el cromosoma 21, como la proteína β-amiloide. Aún hay mucho que estudiar sobre el síndrome de Down, pero la falta de modelos experimentales adecuados hace que el avance sea lento. Por otro lado, se han identificado más de 105 mutaciones diferentes del gen sod1 que han sido asociadas a la esclerosis lateral amiotrófica, también conocida como enfermedad de Lou Gherig. La mayor parte de estas mutaciones sustituyen un aminoácido en al menos 64 localizaciones diferentes, dando como resultado el corrimiento del marco de lectura, así como interrupciones, inserciones y eliminaciones. La esclerosis lateral amiotrófica es una patología neurodegenerativa mortal, con una prevalencia de 4 a 5 por cada 100 000 personas, la cual se inicia alrededor de los 50 años de edad, aunque se tienen registros en pacientes jóvenes. La enfermedad afecta específicamente a las neuronas motoras ubicadas en el cerebro, en el tallo encefálico y en la médula espinal; el paciente con este trastorno va perdiendo la capacidad de movimiento poco a poco hasta afectar los músculos auxiliares respiratorios, lo que ocasiona un paro y, en consecuencia, la muerte (véase capítulo de Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas). La relación de las mutaciones en el gen sod1 con la esclerosis lateral amiotrófica es clara e indiscutible; sin embargo, aún no se precisa el mecanismo por el cual estas mutaciones ocasionan la patología. Una hipótesis es que las mutaciones generan una proteína defectuosa, lo que permite la acumulación de especies tóxicas. Esta teoría fue rebatida cuando se creó un ratón mutante que sobreexpresaba la mutación G93A, desarrollando la enfermedad a pesar de tener niveles elevados en la actividad de la enzima. Por otro lado, existe otra teoría que propone que las mutaciones en sod1 cambian la afinidad de la proteína para unir al cobre, esto deriva en un incremento en la agregación de SOD1 en las neuronas formando fibras y/o poros parecidos a las amiloides, fenómeno que se presenta en otras enfermedades parecidas como las ocasionadas por priones. El depósito

180

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

de estas fibras genera la pérdida de la funcionalidad de las neuronas motoras que resultan en la muerte celular y la pérdida del movimiento, este fenómeno se puede acompañar de un incremento en el estrés oxidativo por la falta de la actividad catalítica de la SOD1. SOD2 Diversas variaciones genéticas se han observado en el gen sod2, las cuales se han asociado a varias patologías. La sustitución de la alanina 9 por una valina en la secuencia de localización mitocondrial se ha asociado al envejecimiento prematuro y la progeria, así como al incremento en el riesgo de contraer patologías neuromotoras (sobre todo en mujeres) y miocardiopatías, y recientemente en cáncer mamario, pero no se ha correlacionado con la enfermedad de Parkinson o con esclerosis lateral amiotrófica. Por otro lado, se ha observado que en diversos tipos de cáncer la enzima está alterada en comparación con el correspondiente tejido normal. Una reducción significativa en la expresión de la SOD2 en diversos tipos de neoplasias humanas y experimentales ha colocado a la SOD2 como una nueva proteína supresora de tumores. Esto está apoyado también por el hecho de que la expresión de la SOD2 se regula durante el ciclo celular, teniendo una concentración menor en las células que están en la fase G0. En apoyo a esta idea, la inducción de la sobreexpresión de la SOD2 en células derivadas de cáncer mamario en humanos y en fibroblastos de ratón de la línea NIH3T3 genera una disminución en su proliferación, lo que sugiere una relación en el mecanismo entre el contenido intracelular de la SOD2 y la proliferación celular. Más aún, la región cromosómica 6q, que es donde se localiza sod2, se encuentra ausente en los melanomas, y la reexpresión de SOD2 en líneas celulares de melanomas les confiere una disminución en la proliferación y neoplasia, lo que es consistente con la función de una proteína supresora de tumores. Sin embargo, en algunos tipos de tumores, sobre todo pulmonar, cervicouterino, cerebral, gástrico, entre otros, se ha observado que la SOD2 está aumentada, esto podría resultar en contraposición de ser una proteína supresora de tumores; sin embargo, se reconcilia por la actividad general de la SOD2, que es la de ser una enzima antioxidante celular (tumoral) que protege en contra del estrés oxidativo generado por la mitocondria.

SOD3 Existen diversos estudios que relacionan las deficiencias en la SOD3 con algunas patologías, en particular con las enfermedades vasculares, puesto que la SOD3

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Superóxido dismutasa

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181

tiene la capacidad de asociarse al endotelio. La arteriosclerosis es una de ellas, así, se ha encontrado una disminución de la enzima en pacientes que padecen esta patología, lo que contribuye a la disfunción endotelial (véase el capítulo de Estrés oxidativo y disfunción endotelial). La activación de la NADPH oxidasa por la angiotensina II (A-II) genera una gran producción de especies reactivas de oxígeno en vasos sanguíneos, y se ha visto que la hipertensión causada por la A-II puede ser disminuida por el tratamiento con la SOD3. Por otro lado, se ha reportado que A-II incrementa la expresión y la actividad de la SOD3, lo que contrarresta el efecto oxidante de la NADPH oxidasa. La SOD3 también influye en la diabetes. La unión a la heparina de la enzima se modula por concentraciones elevadas de glucosa, que origina la glucosilación de una lisina del DUH, esta modificación resulta en la pérdida de la afinidad a la heparina, pero no en su actividad catalítica. Los pacientes con diabetes presentan una gran cantidad de SOD3 glucosilada en sangre, lo que indica también una disminución de la enzima en la MEC. Algunos estudios han demostrado niveles bajos de la enzima en las arterias de la tibia en pacientes diabéticos, lo que aumenta la susceptibilidad al O2•. En estudios con ratones a los que se les induce diabetes por la destrucción de los islotes pancreáticos con O2•, se ha observado que la regeneración de las células β está retardada en los animales que carecen de la expresión de la SOD3 comparado con los controles que expresan correctamente a la enzima. La SOD3 también se ha visto relacionada en la polineuropatía amiloide tipo 1, los pacientes con esta enfermedad presentan un incremento en los niveles de SOD3 de casi 10 veces el normal. El estudio genético ha revelado que existe una mutación en la Arg213; al parecer, esta mutación no afecta la actividad, pero sí la unión a heparina, lo que explica su incremento en la circulación.

❚ CONCLUSIONES En resumen, el oportuno control del O2• representa para la célula el punto neural en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes, por lo que las SOD juegan tal vez el papel central en este equilibrio. Un exceso de O2• genera toxicidad, pero al mismo tiempo, el O2• y las SOD son generadores del H2O2, el cual tiene funciones muy importantes en la transducción de señales y la activación de genes, por lo que un buen funcionamiento de las SOD aseguran un correcto estado redox, que permite una adecuada actividad celular.

182

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 11)

❚ REFERENCIAS McCord JM, Frederic I: Super oxide disputes: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 1969;244:6049-6055. Mann T, Keilin D: Haemocuprein and hepatocupreinm copper protein compounds of blood and liver in mammals. Proc R Soc Ser B 1938;126:303-315. Pauling L: The discovery of the superoxide radical. Trend Biochem Sci 1979;4: N270-N271. Lynch M, Kuramitsu H: Expression and role of superoxide dismutases (SOD) in pathogenic bacteria. Microbes Infect 2000;2:1245-1255. Valentine JS, Doucette PA, Potter SZ: Copper-zinc superoxide dismutase and amyothrophic lateral sclerosis. Annu Rev Biochem 2005;74:563-593. Fattman CL, Schaefer L M, Oury TD: Extracelular superoxide dismutase in biology and medecine. Free Rad Biol Med 2003;35:236-256. Petersen SV, Enghild JJ: Extracellular superoxide dismutase: structural and functional considerations of a protein shaped by two different disulfide bridge patterns. Biomed Pharmacotherapy 2005;59:175-182. Pani G, Colavitti R, Bedogni B et al.: Mitochondrial superoxide dismutase: A promising target for new anti-cancer therapies Cur Med Chem 2004;11: 1299-1308. Gulesserian T, Engidawork E, Fountoulakis M et al.: Antioxidant proteins in fetal brain: Superoxide dismutase-1 (SOD1) protein is not overexpressed in fetal Down syndrome. J Neural Transm Suppl 2001;61:71-84.

C

12

ATALASA

Leonardo Peraza Reyes

Durante el metabolismo celular de la mayoría de los seres vivos se generan normalmente las especies reactivas de oxígeno, como el superóxido (O2•), peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (•OH). Estas especies tienen una capacidad oxidante mayor que el O2, por lo que su presencia en las células puede generar daños importantes. Las células cuentan con un gran repertorio de mecanismos antioxidantes que permiten su eliminación o previenen su formación. Uno de estos mecanismos consiste en eliminar al H2O2 que, si bien es una de las especies reactivas de oxígeno más estables, puede reaccionar y generar otras especies más reactivas, como se mencionó en el capítulo 2. Así, el principal efecto tóxico del H2O2 consiste en su gran capacidad de difusión, ya que puede atravesar libremente las membranas celulares, y una vez dentro de la célula reaccionar con metales de transición (como Fe2+ o Cu+) para formar al •OH. Este radical es una de las especies químicas más reactivas que se conoce, y su reactividad oxidante parece estar limitada sólo por su nivel de difusión, de manera que en las células reacciona rápido con prácticamente cualquier molécula.

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❚ INTRODUCCIÓN

❚ 183 ❚

184

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ LAS

PEROXIDASAS SON LAS ENZIMAS QUE ELIMINAN AL

(Capítulo 12)

H2O2

Las peroxidasas son las enzimas responsables de eliminar a los hidroperóxidos. Esta descomposición ocurre por medio de una reacción de oxidorreducción que emplea una molécula específica como agente reductor. Las peroxidasas pueden utilizar agentes reductores diferentes para llevar a cabo esta reacción, y pueden tener mecanismos catalíticos distintos. Según el Comité de Nomenclatura de las Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NCIUBMB, por sus siglas en inglés, www.chem.qmul.ac.uk/iubmb), las peroxidasas (EC 1.11.1) se clasifican de acuerdo con su especificidad (cuadro 12-1). Sin embargo, en términos generales, se han agrupado tradicionalmente en catalasas y peroxidasas. Las catalasas son las enzimas que descomponen al H2O2 directamente en O2 y agua (reacción 1). Para ello, emplean dos moléculas iguales de H2O2, una como agente reductor y otra como oxidante. Por su parte, las peroxidasas utilizan una molécula distinta del H2O2 como agente reductor (reacción 2). Es común también que las peroxidasas puedan reducir a hidroperóxidos distintos del H2O2, como los peróxidos orgánicos (reacción 3). 2H2O2 → 2H2O + O2 H2O2 + RH2 (o 2RH) → 2H2O + R (o R-R) R-OOH + RH2 (o 2RH) → R-OH + H2O + R (o R-R)

(1) (2) (3)

❚ PANORAMA HISTÓRICO Louis Jacques Thénard, en 1819, fue el primer investigador que describió lo que hoy se conoce como la reacción de la catalasa. Él demostró que diferentes susCuadro 12-1. Nomenclatura de las peroxidasas de acuerdo con el NC-IUBMB Nomenclatura Peroxidasa

Nomenclatura Peroxidasa

EC 1.11.1.8 EC 1.11.1.9 EC 1.11.1.10 EC 1.11.1.11 EC 1.11.1.12

EC EC EC EC

EC 1.11.1.13 EC 1.11.1.14 EC 1.11.1.15

Ioduro peroxidasa Glutatión peroxidasa Cloruro peroxidasa L-ascorbato peroxidasa Hidroperóxido de fosfolípido glutatión peroxidasa Manganeso peroxidasa Diarilpropano peroxidasa Peroxirredoxina

1.11.1.1 1.11.1.2 1.11.1.3 1.11.1.4

EC 1.11.1.5 EC 1.11.1.6 EC 1.11.1.7

NADH peroxidasa NADPH peroxidasa Ácidos grasos peroxidasa Triptófano peroxidasa (ahora triptófano dioxigenasa, EC 1.13.11.11) Citocromo c peroxidasa Catalasa Peroxidasa

Catalasa

•

185

tancias de origen animal y vegetal tenían la capacidad de transformar al agua oxigenada (H2O2) en agua y oxígeno. Además, sus análisis sobre la descomposición del agua oxigenada fueron los primeros en estudiar una reacción enzimática de manera cuantitativa. En 1901, Loew nombró como catalasa a esta “fuerza vital”, y sugirió que una enzima específica era la responsable de generarla. En 1923, Walburg demostró que dicha enzima se inhibía con cianuro, y concluyó que en su sitio activo tenía asociados átomos de hierro. De modo que la catalasa fue la primera enzima con hierro que se purificó, y en 1936 se demostró que su sitio activo tenía asociada a la protoporfirina IX. Un año después, Sumner y Dounce obtuvieron los cristales de la enzima. En el decenio de 1940-49, el grupo de Britton Chance hizo contribuciones importantes en el entendimiento del mecanismo catalítico de las catalasas, y Herbert y Pinsent describieron la primera enzima procariota en Micrococcus luteus, pero fue hasta 1980 que Vainshtein et al., obtuvieron el primer mapa de la densidad electrónica de una catalasa. En la actualidad, se sabe que las catalasas son ubicuas y se han descrito en microorganismos de los tres grandes dominios de los seres vivos: bacterias, arqueobacterias y eucariotas. Por otra parte, además de estar ampliamente distribuidas en los microorganismos aerobios, estas enzimas también se han encontrado en varios microorganismos anaerobios facultativos e incluso en algunos anaerobios estrictos, lo que sugiere que también estos microorganismos se encuentran expuestos al oxígeno y sus formas derivadas.

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❚ EXISTEN

TRES TIPOS DE ENZIMAS CON ACTIVIDAD DE CATALASA

En un principio, cualquier enzima que fuera capaz de llevar a cabo la reacción de catalasa fue denominada como tal; sin embargo, con el tiempo, fue evidente que existían distintas enzimas con esta capacidad. Estas enzimas diferían en sus propiedades cinéticas, así como en su estructura y sensibilidad ante diferentes inhibidores. La mayor parte de las catalasas eran proteínas que tenían asociado un grupo hemo en sus sitio catalítico; no obstante, en 1961 se describió una catalasa insensible a los inhibidores clásicos de las hemoproteínas, como la azida y el cianuro. A esta enzima se le denominó seudocatalasa. Ahora se sabe que estas enzimas tienen átomos de manganeso en su centro catalítico, y se les ha llamado catalasas de manganeso. Por otra parte, en el decenio de 1980-89 se observó que existían dos grupos de hemocatalasas. Las primeras llevaban a cabo su actividad en un intervalo amplio de valores de pH, y eran altamente estables ante las altas temperaturas y los disolventes orgánicos como el cloroformo y el etanol. Asimismo, se observó que estas enzimas se inactivaban con el 3-amino-1,2,4-triazol, y que su grupo hemo estaba poco expuesto al disolvente, pues era difícil reducirlo con agentes como la

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

ditionita. En contraste, en muchos microorganismos se encontraron catalasas con las características opuestas. Su actividad era más sensible al calor y al pH, y se inactivaban con etanol-cloroformo, pero no con el 3-amino-triazol. Además, su sitio catalítico podía ser reducido con ditionita. Una de las características que resultó más destacada de estas enzimas fue que exhibían una alta actividad de peroxidasa. Por esa razón, a este tipo de catalasa se le denominó catalasa-peroxida sa. La clonación y secuenciación de los genes de las catalasa-peroxidasas y de las manganeso catalasas y su comparación con los de las catalasas, reveló que estas enzimas no están relacionadas, y que representan grupos de enzimas distintos. Esto quiere decir que a lo largo de la evolución surgieron enzimas con actividad de catalasa de manera independiente por lo menos en tres ocasiones. Es importante aclarar que el grupo prostético presente en las catalasas y las catalasa-peroxidasas, conocido como hemo, es sintetizado de manera independiente a la apoproteína, y después se incorpora a ella. El hemo es una molécula de porfirina tetrapirrólica que forma un complejo de quelato con un átomo de hierro (figura 12-1A). El hierro está coordinado por cuatro átomos de nitrógeno que provienen, cada uno de ellos, de cada uno de los anillos pirrólicos. Las dos posicio-

A

Protohemo IX

B III

Enzima (hemo-Fe ) + H 2O2 ·+

Compuesto I (hemo -FeIV = O) + H 2O2 ·+

Compuesto I (hemo -FeIV = O) + RH IV

Compuesto II (hemo-Fe -OH) + RH

·+

IV

Compuesto I (hemo -Fe

= O) + H 2O

III

Enzima (hemo-Fe ) + H 2O + O2 IV

Compuesto II (hemo-Fe -OH) + R + H2 O III

Enzima (hemo-Fe ) + R + H2O

(4) (5) (6) (7)

Figura 12-1. Grupo hemo y el mecanismo de la reacción catalítica de las hemocatalasas. A) Estructura del protohemo-IX representada en bastones y esferas. B) Reacciones del mecanismo catalítico que emplean las catalasas que tienen asociado el grupo hemo.

Catalasa

•

187

nes restantes de coordinación del hierro son perpendiculares al plano de la porfirina. La quinta posición suele estar coordinada por un aminoácido, mientras que en la sexta ocurre la transferencia de los electrones durante la catálisis, en donde el hierro alterna entre sus estados Fe+3 y Fe+4. El grupo hemo por sí solo es capaz de catalizar la misma reacción que la holoenzima, aunque con mucha menor eficacia.

❚ LA FAMILIA DE

CATALASAS

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Catalasas monofuncionales La familia de las catalasas más distribuida es la de las catalasas monofuncionales. Estas enzimas son las que exhiben la actividad de catalasa más elevada, aunque también pueden tener actividad moderada de peroxidasa, pero sólo en presencia de moléculas pequeñas como agentes reductores (como el etanol y metanol). La mayor parte de estas enzimas están formadas por cuatro subunidades idénticas (figura 12-2B y D), aunque puede haber enzimas diméricas. Cada una de las subunidades de la enzima está asociada a un grupo hemo, que en la mayor parte de los casos es el protohemo-IX (hemo-b) (figura 12-1A), aunque se pueden encontrar otras formas de hemo, como el hemo-d, o una mezcla de ambos. El espectro electrónico de las catalasas se caracteriza por la presencia de una banda de absorción alrededor de los 400 nm (banda de Soret), que es debida al hemo. Casi todas las catalasas tienen una masa de 50 a 65 kDa (cerca de 480 aminoácidos) por subunidad (figura 12-2 A y B). Sin embargo, también hay una familia de catalasas denominadas de “subunidad grande”, que tienen una masa de 80 a 95 kDa (casi 700 aminoácidos) por subunidad (figura 12-2 C y D). Estructuralmente, las subunidades de las catalasas se caracterizan por cuatro dominios. El extremo amino terminal comprende los primeros 70 aminoácidos, y a partir de él se extiende una región globular con los otros tres dominios estructurales: barril-β, un dominio de conexión y el dominio α-helicoidal (figura 12-2A). En las catalasas de subunidad grande existe un dominio adicional hacia el extremo C-terminal de casi 150 aminoácidos (figura 12-2C). Se piensa que éste es un dominio de unión de flavinas. El dominio del barril-β es la parte más conservada de la molécula. Su longitud es prácticamente idéntica en todas las catalasas. Incluye una parte de la cavidad del hemo, así como los aminoácidos que lo orientan y el canal que conduce al sitio activo. En el dominio de conexión se encuentra el ligando proximal del hemo, una tirosina conservada que es única de las catalasas. Algunas catalasas pueden unir NADPH en el dominio α-helicoidal, de manera que pueden bloquear una parte del canal del sustrato.

188

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

A

(Capítulo 12)

B

Dominio -helicoidal

Barril-

Extremo N-terminal Dominio de conexión Monómero

Homotetrámero

C

D

Dominio -helicoidal

Dominio C-terminal

BarrilExtremo N-terminal

Dominio de conexió n

Monómero

Homotetrámero

Figura 12-2. Modelo de la estructura tridimensional de las catalasas monofuncionales.. A) Representación en listones del monómero de la catalasa monofuncional de los eritrocitos humanos en la que se ilustra su estructura secundaria. B) Representación en listones del tetrámero de la catalasa monofuncional de los eritrocitos humanos. C) Representación en listones del monómero de una catalasa monofuncional grande del hongo Neurospora crassa. Se ilustra la estructura secundaria igual que en A. D) Representación en listones del tetrámero de la catalasa monofuncional grande de N. crassa. En todas las imágenes se muestra el grupo hemo representado en bastones y esferas. Las coordenadas de los modelos estructurales se obtuvieron de la base de datos del PDB (Protein Data Bank). Números de acceso: 1DGF (catalasa de los eritrocitos humanos) y 1SY7 (CAT-1 de N. crassa). Las imágenes se hicieron con el programa Ribbons. Las coordenadas del modelo del tetrámero en D) las coordenadas fueron generadas por simetría cristalográfica por A. Díaz.

Catalasa

•

189

La similitud en la secuencia de aminoácidos de las catalasas sugiere que sus genes tienen un origen común. Todas las catalasas tienen una región de aproximadamente 360 aminoácidos altamente conservada. Esta región corresponde al dominio del barril-β, así como a una parte del domino de conexión y del N-terminal. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos de los dominios C-terminal adicionales de las catalasas de subunidades-grandes mantienen similitud entre sí. Los análisis filogenéticos revelan la existencia de tres grandes grupos de catalasas que han sido denominados clados 1, 2 y 3. Las enzimas de los animales forman parte del clado 1, mientras que las de las plantas del clado 3. El clado 2 corresponde a las enzimas grandes, y comparte secuencias de bacterias, arqueobacterias, protistas y hongos. Las catalasas pequeñas de los hongos, los protistas y las arqueobacterias se agrupan con las de los animales, mientras que las bacterias tienen enzimas de los tres clados (figura 12-3). Clado 2

N. crassa A. nidulans

Dictyostelium B discoideum Burkholderia cenocepacia E. Coli Methylobacillus flagellatus Pseudomonas syringae Methanosarcina mazei ma ei

Cryptococcus N. crassa Streptomyces coelicolor Psychrobacter Methanosarcina mazei Desulfovibrio Proteus mirabilis

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H. pylori Pseudomonas syringae Lactobacillus B. subtilis 1 Dictyostelium discoideum Methanobrevibacter arboriphilus Methanosarcina barkeri Methanococcoides Mus Canis familiares Bos Homo sapiens Rana rugosa Danio rerio D. melanogaster D. melanogaster

A . nidulans

Clado 3

Pseudomonas syringae Chlamydomonas reinhardtii Zea mays Deinococcus A . thaliana A vicennia marina Nicotiana 2 Streptomyces Strepto yces

Zea mays 2 Zea mays 1 Microccus N. crassa 4 S. pombe S. cerevisiae

A . thaliana Nicotiana 3 Suaeda maritima Nicotiana 1 A . thaliana 1

A . nidulans Toxoplasma gondii

Candida albicans S. cerevisiae Pleurotus Pleurotus

Ascaris C. elegans C. elegans C. elegans

Clado 1

Figura 12-3. Análisis filogenético de las catalasas monofuncionales. Cladograma de las catalasas basado en sus secuencias de aminoácidos. Árbol más parsimonioso, método de máxima parsimonia, búsqueda heurística con una adición de ramas aleatoria (10 réplicas) (PAUP 3.0). Se muestran los tres grandes clados en que se agrupan las catalasas. Todas las secuencias de aminoácidos se obtuvieron de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information).

190

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

Catalasa-peroxidasas La mayor parte de las catalasa-peroxidasas son homodímeros con subunidades que van de 60 a 85 kDa (figura 12-4B); pero también existen enzimas tetraméricas y monoméricas, así como enzimas cuyas subunidades generan dímeros y tetrámeros interconvertibles. Cada subunidad de la enzima une un grupo hemo, que suele ser el protohemo-IX; sin embargo, también se han reportado grupos hemo distintos. El alineamiento y la comparación de la secuencia de aminoácidos de las catalasa-peroxidasas reveló que la proteína está compuesta por dos segmentos que son semejantes entre sí, y cada uno de ellos lo es con la citocromo c peroxidasa (CCPx) de los hongos, una hemo-peroxidasa de la familia de peroxidasas de las plantas y los microorganismos. Estas peroxidasas están formadas por 290 a 350 aminoácidos, mientras que las catalasa-peroxidasas contienen alrededor de 730 aminoácidos por subunidad. Con base en estas observaciones, se ha propuesto que las catalasa-peroxidasas se originaron por la duplicación y fusión del gen de una peroxidasa ancestral de la familia de las plantas y los microorganismos (figura 12-5).

A

B

Extremo N-terminal

Extremo C-terminal Monómero

Homodímero

Figura 12-4. Modelo de la estructura tridimensional de la catalasa-peroxidasa. A) Representación de la estructura del monómero. B) Representación de la estructura del dímero de la catalasa-peroxidasa de Haloarcula marismortui. El modelo estructural se hizo y se ilustra igual que en la figura 12-2. No. de acceso PDB: 1ITK.

Catalasa

•

191

Rhodobacter Synechococcus Vibrio Synecho cystis

Mesorhizobium Sinorhizobium Caulobacter Burkholderia Burkholderia Xylella

E. coli HPI Salmonella Mycobacterium Streptomyces

Neurospora Aspergillus

Bacillus Archaeoglobus

Extremo N-terminal

Yersinia E.coli (plásmido) Legionella Halobacter Haloarcula

Extremo C-terminal Rhodobacter Legionella Yersinia Burkholderia E.coli (plásmido) Haloarcula Halobacterium Mycobacterium

E. coli HPI Salmonella Archaeoglobus Synechocystis Aspergillus Vibrio Neurospora Synechococcus Mesorhizobium Burkholderia 2 Sinorhizobium Xylella Caulobacter

Citocromo c peroxidasas CCPx Saccharomyces

Streptomyces Bacillus

CCPx Neurospora

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Figura 12-5. Análisis filogenético de las catalasa-peroxidasas y las citocromo c peroxidasas. Redes que muestran las relaciones de similitud entre los extremos C- y N- terminales de las catalasa-peroxidasas con las citocromo c peroxidasas (CCPx). Método de matrices de distancias para proteínas, algoritmo Fitch-Margoliash, distancias: Dayhoff PAM 001 (PHYLIP).

La familia de peroxidasas de las plantas y los microorganismos se caracteriza estructuralmente por la presencia de 10 hélices-α conservadas, dentro de las cuales se localiza el hemo. La estructura cristalográfica demostró que tenían un arreglo tridimensional muy parecido al de las peroxidasas. Nueve de las hélices de la CCPx y los residuos catalíticos están conservados en el extremo N-terminal de la molécula; sin embargo, en el extremo C-terminal las hélices están conservadas, pero los residuos de unión del hemo no están presentes, de manera que sólo el extremo N-terminal une el hemo (figura 12-4 A y B). Las catalasa-peroxidasas están ampliamente distribuidas en las bacterias, pero sólo se han descrito en cuatro géneros de arqueobacterias, y en los microorganismos eucariotas sólo se han encontrado en los hongos. La distribución de estas enzimas no sigue el patrón filogenético de los organismos en que se encuentra. Así, parece ser una enzima que se ha perdido en varios linajes y que está presen-

192

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

te en otros, como los hongos, debido a eventos de transferencia horizontal (figura 12-5).

Manganeso catalasas Muchos microorganismos carecen de hemoproteínas, pues son incapaces de sintetizar el grupo hemo; sin embargo, pueden tener enzimas con actividad de catalasa. La primera enzima de este tipo fue caracterizada en Lactobacillus plantarum. En la actualidad también se han caracterizado Mn catalasas en bacterias termófilas y en arqueobacterias, y se han encontrado posibles genes de Mn catalasas en muchos otros linajes procariotas, incluso en especies que pueden sintetizar el grupo hemo. Estas enzimas pueden ser homohexámeros u homotetrámeros, cuyas subunidades de 30 kDa muestran un arreglo de cuatro hélices-α antiparalelas entre las que están inmersos los dos átomos de Mn (figura 12-6). El

A

B

Centro catalítico de dimanganeso

Monómero

Homohexámero

C Enzima (Mn Enzima (Mn

III

) + H O

2 II

2

2

) + H O + 2H +

2

2

2

Enzima (Mn Enzima (Mn

II

) + O

2 III

2

+ 2H +

) + H O

2

2

(8) (9)

Figura 12-6. Modelo de la estructura tridimensional de la manganeso catalasa. A) Representación de la estructura del monómero. B) Representación de la estructura del hexámero de la manganeso catalasa de Lactobacillus plantarum con sus manómeros en distinta tonalidad. C) Reacciones del mecanismo catalítico que emplean las manganeso catalasas.

Catalasa

•

193

sitio activo de dimanganeso se encuentra coordinado por los residuos de histidinas, glutamatos y/o aspartatos provenientes de las cuatro hélices antiparalelas. Los dos átomos de manganeso, a su vez, se encuentran unidos entre sí por un oxígeno y su estado de reducción alterna entre Mn+3-Mn+3 y Mn+2-Mn+2 durante el ciclo catalítico de la enzima. El arreglo de las hélices antiparalelas de las Mn catalasas es semejante al de algunas otras enzimas que tienen centros de dimanganeso, como la ribonucleótido Mn reductasa y a la Mn arginasa. Así, es posible que las Mn catalasas hayan divergido de un ancestro común de alguna de estas dos enzimas.

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❚ CATÁLISIS

DEL

H2O2

La catalasa es una de las enzimas más rápidas que existen. Una molécula de la enzima es capaz de catalizar la transformación de alrededor de 1 x 107 moléculas de sustrato por segundo. Su eficacia catalítica (kcat/Km aproximadamente de 106 - 108 M-1 seg-1) indica que la enzima está limitada sólo por la velocidad de difusión del sustrato (108 - 109 M-1 seg-1); es decir, la enzima debe catalizar una reacción en cuanto se encuentra con una molécula de H2O2. La eficacia catalítica de las Mn catalasas y de las catalasa-peroxidasas es, en términos generales, un orden de magnitud menor, por lo que también son enzimas considerablemente rápidas. La eficacia catalítica de la actividad de catalasa de las demás peroxidasas es mucho menor. La primera reacción en el mecanismo catalítico de las catalasas y las peroxidasas es la misma: la heterólisis o rompimiento del enlace oxígeno-oxígeno del H2O2. En las enzimas que tienen hemo en su sitio activo, como resultado de esta reacción se libera una molécula de agua y un átomo de oxígeno queda unido al Fe del grupo hemo (figura 12-1B, reacción 4). En esta reacción se transfieren dos electrones de la enzima a un oxígeno y se forma agua. Uno de ellos proviene del Fe (Fe+3 → Fe+4) y el segundo de la porfirina. A esta forma de la enzima se le denomina compuesto I, y está formada por un ferroxilo y un radical catiónico porfirínico. El compuesto I puede ser reducido por otra molécula de H2O2, transfiriendo dos electrones simultáneamente (reacción de catalasa, figura 12-1B, reacción 5) o bien, ser reducido por un compuesto que transfiera un solo electrón en dos reacciones secuenciales (rreacción de peroxidasa, figura 12-1B, reacciones 6 y 7). Entre estas dos reacciones se forma un intermediario parcialmente reducido llamado compuesto II (figura 12-1B, reacción 6). La formación del compuesto II en las catalasas es irreversible y en consecuencia, inactiva a la enzima. Las catalasa-peroxidasas pueden reducir de manera eficaz el compuesto I con el H2O2 (figura 12-1B, reacción 5), o bien, a través del compuesto II con agentes reductores univalentes (figura 12-1B, reacciones 6 y 7).

194

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

La actividad de la Mn catalasa también implica la transferencia simultánea de dos electrones de la enzima al H2O2 y viceversa. En este caso, un electrón es transferido a cada uno de los átomos de Mn del centro binuclear de manganeso y, como consecuencia, se liberan dioxígeno y dos protones (figura 12-6C, reacción 8). En la siguiente reacción, el centro binuclear de manganeso se oxida de nuevo y se forman dos moléculas de H2O (figura 12-6C, reacción 9).

❚ FUNCIÓN

DE LAS CATALASAS

Dada la afinidad de las catalasas por su sustrato, se piensa que su función primordial es eliminar las concentraciones altas del H2O2; por el contrario, las enzimas que tienen una afinidad mayor por el H2O2, como las peroxidasas y las peroxirredoxinas, actúan ante el H2O2 en bajas concentraciones. A su vez, las catalasaperoxidasas y las Mn catalasas tienen una afinidad mayor por el H2O2 que las catalasas, por lo que cuando más de una de estas enzimas está presente en un organismo pueden eliminar el H2O2 en un intervalo amplio de concentración. La eliminación del H2O2 por las peroxidasas emplea un agente reductor que se oxida como resultado de la reacción, así, para que la actividad de las peroxidasas continúe, el estado reducido de estos sustratos se debe restablecer, y ello depende del poder reductor celular, principalmente del NAD(P)H. En contraste, la actividad de las catalasas no depende del estado redox de la célula, de manera que son activas aun cuando el poder reductor celular es bajo.

Función de las catalasas en los microorganismos Se sabe que en las bacterias existen catalasas de los tres tipos, mientras que los hongos cuentan sólo con catalasa-peroxidasas y catalasas monofuncionales. En este tipo de organismos, las catalasas desempeñan funciones específicas relacionadas con las diferentes fases del crecimiento en diversos estadios del desarrollo, además de que protegen a las estructuras ya diferenciadas. Por otro lado, puesto que la respuesta de muchos organismos ante los patógenos incluye la formación de especies reactivas de oxígeno como el O2• y el óxido nítrico (NO•), que más tarde pueden reaccionar para formar el H2O2, se ha pensado que las catalasas podrían actuar como factores de virulencia, al contrarrestar la formación de las especies reactivas de oxígeno que produce el sistema inmunitario. Este hecho se ha demostrado para varios microorganismos, tanto patógenos de animales como de plantas. Un ejemplo bien documentado es el de la bacteria Helicobacter pylori, este patógeno humano es capaz de colonizar la mucosa gástrica aun cuando desenca-

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Catalasa

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195

dena un fuerte proceso inflamatorio que conlleva una elevada formación de especies reactivas de oxígeno. Se sabe que esta capacidad infectiva se debe, en buena medida, a la fuerte respuesta antioxidante de la bacteria, de la cual forma parte una catalasa monofuncional. Las cepas de H. pylori que carecen de esta enzima no pueden mantener una infección de largo plazo, y tienen una supervivencia reducida en los fagosomas de los macrófagos. Las catalasa-peroxidasas también se han relacionado con la virulencia de las bacterias. Tal es el caso de Legionella pneumophila, una bacteria que causa neumonía y que tiene dos catalasa-peroxidasas, una de las cuales se requiere para infectar y lisar los macrófagos del sistema inmunitario. Dada la multifuncionalidad de las catalasa-peroxidasas, también pueden eliminar otras de las especies reactivas de oxígeno que se forman en la respuesta de defensa ante los patógenos. Tal es el caso del ácido peroxinítrico (ONOOH), una molécula se forma cuando el O2• y el NO• reaccionan entre sí y se puede difundir rápidamente a través de las membranas celulares. Esta especie reactiva de oxígeno es más tóxica que el O2•, el H2O2 o el NO•, y se piensa que forma parte importante de la respuesta del sistema inmunitario. Se ha demostrado que algunas catalasa-peroxidasas, como la enzima de Mycobacterium tuberculosis, pueden ser peroxinitritasas muy eficaces. También se ha demostrado que las catalasas actúan como factores de virulencia en algunas bacterias patógenas de las plantas. Por ejemplo, la ausencia de la catalasa-peroxidasa de Agrobacterium tumefaciens reduce su capacidad de infectar y causar tumores en las plantas. Las catalasas también actúan como factores de virulencia de los organismos eucariotas. La virulencia de algunos hongos patógenos oportunistas de los animales depende de sus catalasas. Éste es el caso de Candida albicans, que requiere su única catalasa para generar una infección a largo plazo, y Aspergillus fumigatus, cuya capacidad infectiva depende de 2 de sus 4 catalasas (una monofuncional y una catalasa-peroxidasa). Las catalasas también son importantes para proteger a los huéspedes de las especies reactivas de oxígeno que ellos mismos producen en la respuesta de defensa ante los patógenos. Una de las proteínas que es regulada por el sistema inmunitario de Drosophila melanogaster es una enzima que tiene actividad de catalasa. Esta enzima es secretada en el intestino, y sin ella las moscas exhiben una alta mortalidad cuando ingieren microorganismos. Se piensa que la enzima elimina las especies reactivas de oxígeno que se producen en el intestino en respuesta a una infección, y que en su ausencia los daños que generan resultan letales.

Función de las catalasas en las plantas La respuesta antioxidante de las plantas cuenta con un gran número de enzimas antioxidantes, dentro de las que destacan varias catalasas. Todas ellas son mono-

196

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

funcionales y pequeñas. La mayor parte de las angiospermas estudiadas tienen tres genes de catalasa con patrones de expresión semejantes. Los tres genes se expresan en las semillas e inflorescencias. Dos de ellos también se expresan en las hojas y codifican para enzimas peroxisomales, y el tercero codifica para una enzima citosólica (o posiblemente mitocondrial en plantas como el maíz) que es abundante en los tejidos vasculares. La expresión de algunas de estas catalasas además se regula por la luz, y pueden estar sujetas al reloj circadiano de las plantas. Las catalasas protegen a las plantas de diferentes condiciones de estrés que se generan tanto de manera exógena como endógena. Una de las dos enzimas peroxisomales es predominante en las semillas, y es importante durante el metabolismo glioxisomal que ocurre en la germinación (véase la sección de Catalasas y función peroxisomal, más adelante), y la otra es más abundante en las hojas y protege a las plantas de diferentes tipos de estrés, como el estrés salino y el estrés oxidativo que se genera con ozono, H2O2 o paraquat. Esta enzima también es importante en contender con el H2O2 que se genera durante la fotorrespiración. La respuesta de la plantas ante el ataque de los patógenos incluye la formación controlada de especies reactivas de oxígeno, que además de atacar directamente a los patógenos también actúan como moléculas señalizadoras en la respuesta de defensa de las plantas. Se sabe que especies como el H2O2 y el NO• activan, junto con el ácido salicílico, la respuesta de hipersensibilidad de las plantas. Esta respuesta incluye procesos como la limitación de la infección mediante el engrosamiento de las paredes celulares y la inducción de la muerte celular programada de los tejidos infectados, así como la síntesis de metabolitos secundarios y de proteínas antimicrobianas relacionadas con la patogénesis. Las especies reactivas de oxígeno también participan en la respuesta ante el estrés abiótico que deriva en la aclimatación de las plantas, y son capaces de ajustar la expresión génica en respuesta a cambios ambientales y de modular procesos como la apertura de los estomas o la proliferación y expansión celular. Ya que una misma especie reactiva de oxígeno, como es el caso del H2O2, puede generar respuestas distintas en las plantas, se ha sugerido que debe existir un equilibrio muy fino en sus niveles locales y que éste modula distintas vías de señalización. Las catalasas participan modulando los niveles del H2O2 y definiendo la respuesta de la planta.

Función de las catalasas en los animales Al igual que las plantas, los animales cuentan sólo con catalasas monofuncionales pequeñas en sus genomas. La mayor parte de los vertebrados sólo tiene una enzima peroxisomal, pero en algunos invertebrados existe más de una calatasa. La deficiencia de la actividad de catalasa es conocida como acatalasemia, y es

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Catalasa

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197

consecuencia de la ausencia de genes funcionales de catalasa (como la observada en un organismo homócigo cat-/cat-), mientras que la disminución en la actividad de catalasa se conoce como hipocatalasemia, y puede resultar de genes que codifiquen enzimas parcialmente activas o de una condición heteróciga (cat-/cat+). En el genoma de algunos invertebrados se ha encontrado más de un gen de catalasa. El nemátodo Caenorhabditis elegans tiene tres genes de catalasa que codifican para dos enzimas citosólicas (ctl-1 y 3) y una peroxisomal (ctl-2). Un 80% de la actividad de catalasa recae en la enzima peroxisomal, y en su ausencia la esperanza de vida y la capacidad de oviposición de los nemátodos disminuye de manera importante. La mosca de la fruta D. melanogaster también tiene más de una catalasa, y una de ellas es fundamental para su supervivencia. En términos generales, la expresión de la catalasa en los mamíferos es muy elevada en hígado y eritrocitos, alta en el tejido adiposo y riñón, moderada en el páncreas y pulmones y baja en el suero, corazón y cerebro. La catalasa está localizada en los peroxisomas de la mayor parte de estos órganos, pero en los eritrocitos es citosólica y existen evidencias que sugieren que la enzima del corazón de la rata está asociada con sus mitocondrias. Más de 98% de la catalasa de la sangre está en los eritrocitos; sin embargo, también elimina el H2O2 extracelular y el que se genera en los tejidos con niveles bajos de catalasa. Diversos experimentos con células en cultivo acatalasémicas, hipocatalasémicas y que sobreexpresan el gen de la catalasa, han demostrado que la catalasa protege a las células de los mamíferos de la toxicidad generada por el H2O2 y de las condiciones de hiperoxia. En el ser humano se han caracterizado tres tipos de acatalasemia (húngara, japonesa y suiza), y hasta el año 2004 se habían diagnosticado 113 casos en 11 países, México entre ellos. Los pacientes con acatalasemia tienen un fenotipo normal, pero pueden presentar gangrena y ulceraciones orales como consecuencia del H2O2 generado por las células fagocíticas durante las infecciones bacterianas. Asimismo, se ha sugerido que puede haber alteraciones en el metabolismo de los lípidos de estos pacientes que incrementen el riesgo de afecciones coronarias, y que la incidencia de padecimientos como la diabetes puede ser mayor, particularmente diabetes tipo 2. Se piensa que esto es consecuencia de que algunos tipos celulares, como las células pancreáticas productoras de la insulina, se dañan con el incremento de las especies reactivas de oxígeno que se forman en ausencia de la catalasa.

❚ CATALASAS Y FUNCIÓN

PEROXISOMAL

Los peroxisomas son organelos de dimensión pequeña (< 1 μm) que están delimitados por una sola membrana y que contienen en su interior una gran variedad de enzimas que generan H2O2 como consecuencia de su mecanismo catalítico.

198

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

Asimismo, contienen las enzimas antioxidantes responsables de eliminar estas especies reactivas de oxígeno, como la catalasa. Estos organelos fueron descritos al principio por Christian de Duve, y están presentes en la mayor parte de los organismos eucariotas. En ellos ocurren vías metabólicas ubicuas —como la β-oxidación de los ácidos grasos— o específicas —como el ciclo del glioxilato en los hongos y las plantas. Las catalasas de los eucariotas generalmente están asociadas con los peroxisomas, y a pesar de que muchos microorganismos tienen más de una catalasa, la localización de por lo menos una de ellas siempre es peroxisomal. Así, la mayor parte de las enzimas de los eucariotas que pertenecen a los clados 1 y 3 son peroxisomales. En términos generales, las catalasas son sintetizadas en el citosol por ribosomas libres, y los monómeros de la apoenzima son translocados al interior de los peroxisomas. Ahí se incorporan los grupos hemo y se adquiere la estructura cuaternaria. En ocasiones, la catalasa puede ser la proteína más abundante de este organelo. Un ejemplo de la importancia de la catalasa en los peroxisomas se observa en levaduras como Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura puede emplear ácidos grasos como única fuente de carbono gracias a la β-oxidación de los ácidos grasos que ocurre en los peroxisomas. Esta vía metabólica genera grandes cantidades de H2O2, y en ausencia de la catalasa peroxisomal las levaduras son incapaces de utilizar los ácidos grasos como fuente de carbono. Esto se debe a que los niveles de H2O2 que genera esta vía en ausencia de la catalasa resultan letales. La función de las catalasas peroxisomales también puede repercutir en el desarrollo, y se ha observado que la ausencia de estas enzimas (y no las citosólicas) acelera el envejecimiento tanto de algunos hongos (S. cerevisiae) como de animales (C. elegans). Por otra parte, la localización incorrecta de la catalasa también puede tener consecuencias graves. En el ser humano, la mayor parte de las deficiencias de la función peroxisomal genera daños neurológicos que varían en su grado de severidad. La afección más grave se conoce como síndrome cerebrohepatorrenal de Zellweger, y es consecuencia de la ausencia de peroxisomas funcionales. Esta enfermedad se manifiesta desde muy temprana edad, y la mayoría de los pacientes que la presentan fallece en el primer año de vida. Una afección semejante pero menos severa puede presentarse cuando la localización de la catalasa no es peroxisomal sino que es retenida en el citosol. Otro proceso importante en el que participan la catalasa y los peroxisomas es el metabolismo del alcohol. En los mamíferos existen dos vías para la oxidación del alcohol, una de ellas es mediada por la alcohol deshidrogenasa, y la segunda por la catalasa. Esto es posible gracias a la actividad de peroxidasa que tienen las catalasas ante moléculas pequeñas como el etanol y el metanol. Como la catalasa requiere H2O2 para oxidar los alcoholes, la vía dependiente de esta enzima está muy ligada con la función peroxisomal, en donde se genera el H2O2, principal-

Catalasa

•

199

mente en la oxidación de los ácidos grasos. Se piensa que el estado nutricional de los animales define la participación de cada una de las vías implicadas en la oxidación del alcohol, y que la vía dependiente de la catalasa se favorece cuando el metabolismo de los ácidos grasos es elevado, como durante el ayuno o ante dosis elevadas de alcohol.

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❚ CONSIDERACIONES

FINALES

Las catalasas son las enzimas responsables de descomponer el H2O2 en H2O y O2. Se conocen tres tipos de enzimas que llevan a cabo esta reacción de manera eficaz, catalasas típicas, catalasa-peroxidasas y manganeso catalasas, y se sabe que surgieron de manera independiente durante la evolución. Estas enzimas forman parte primordial de la respuesta antioxidante de la mayoría de los seres vivos, ya que evitan la formación de las especies reactivas de oxígeno más oxidantes que se pueden generar a partir del H2O2. Las catalasas pueden eliminar el H2O2 que tiene un origen extracelular y el que se genera durante el metabolismo. El H2O2, además de ser un producto secundario del metabolismo que puede resultar tóxico, desempeña un papel importante como modulador de algunos procesos celulares. Las catalasas, además de mantener el H2O2 en niveles no tóxicos, pueden participar en la regulación de los diferentes procesos del desarrollo en los que está involucrada esta especie reactiva de oxígeno. Recientemente se ha visto que estas especies están implicadas en muchos eventos del desarrollo de los seres vivos, como la proliferación, diferenciación y muerte celular. Asimismo, existen evidencias que sugieren que las catalasas también están involucradas en la modulación de algunos de estos procesos, y esto se ha observado tanto en organismos eucariotas como procariotas.

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200

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 12)

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13

G

LUTATIÓN PEROXIDASAS :

UNA FAMILIA DE ENZIMAS Noemí Cárdenas-Rodríguez Omar Noel Medina-Campos José Pedraza-Chaverrí

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❚ INTRODUCCIÓN La enzima glutatión peroxidasa (GPx) es una selenoproteína antioxidante que fue descubierta en tejidos animales en 1957. El selenio (Se) es un elemento traza esencial que participa en muchos procesos biológicos. La forma de Se con más relevancia biológica es el aminoácido raro selenocisteína (figura 13-1A). Este aminoácido es un análogo de la cisteína (figura 13-1B), pero en lugar del grupo tiol, que contiene azufre, la selenocisteína posee al grupo selenol, que contiene Se. La selenocisteína forma parte de por lo menos 25 selenoproteínas, incluyendo la GPx. Este grupo catalítico se encuentra en el sitio activo, y participa en la catálisis redox. La GPx es una enzima que requiere de un tripéptido de bajo peso molecular, llamado glutatión reducido (GSH) (figura 13-1C), para reducir el peróxido de hidrógeno (H2O2) a agua. El GSH es el donador de equivalentes reductores en dicha reacción; de esta manera, la reducción del H2O2 a agua y la oxidación de glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) (figura 131D) ocurren simultáneamente (figura 13-2): GPx H2O2 + 2GSH

GSSG + 2H2O ❚ 201 ❚

202

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

COO –

COO – H3 N

+

+

H3 N

H

C

(Capítulo 13)

H

C CH 2

CH2

SH

SeH

A

B O H3 N +

O–

N

N

O– O

O

C

Cis

Glu

S

S

O

SH Gli

Gli

CH 2

Glu

Cis

Gli

Cis

Glu

D Figura 13-1. A) Estructura de la selenocisteína. B) Estructura de la cisteína. C) Estructura de glutatión reducido. D) Estructura del glutatión oxidado. El glutatión reducido es un tripéptido que tiene la siguiente secuencia γ-glutamil-cisteinil-glicina y un grupo SH libre. El glutatión oxidado se forma por la unión de dos moléculas de glutatión por medio de un puente disulfuro.

El GSH está presente en animales, plantas y en muchas bacterias aerobias (p. ej., en E. coli); su concentración intracelular es milimolar; además, rara vez se encuentra en bacterias anaerobias, mientras que la GPx prácticamente no se encuentra en plantas superiores ni bacterias, aunque se ha encontrado en algunos tipos de algas y hongos. La GPx también cataliza la reducción dependiente del GSH de los hidroperóxidos de los ácidos grasos, por ejemplo, los productos de la lipoperoxidación de los ácidos linolénico y linoleico, del 7β-hidroperóxido del colesterol y varios hidroperóxidos sintéticos, como el cumeno y los t-butil hidroperóxidos. En todos estos casos el grupo peróxido (ROOH) es reducido a alcohol (ROH): ROOH + 2GSH

GSSG + H2O + ROH

Mediante el marcaje con 75Se y electroforesis en geles de poliacrilamida se han detectado cerca de 30 selenoproteínas en mamíferos. Sin embargo, sólo se han carac-

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

GSSG

2H 2O

GR

GPx H 2O2 2

NADPH

2GSH

•

203

6-fosfoglucono- δ -lactona G6PD

NADP +

Glucosa-6-fosfato

Figura 13-2. Reacciones catalizadas por glutatión peroxidasa (GPx), glutatión reductasa, (GR) y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD).

terizado 10 de estas selenoproteínas en términos de su función y de su secuencia de aminoácidos; cuatro son glutatión peroxidasas (cuadro 13-1). La función de las selenoproteínas como la GPx y la tiorredoxina reductasa (TrxR) en el contexto de su localización endotelial es prevenir eventos oxidativos en las células que pueden iniciar procesos patógenos.

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❚ TIPO

DE ISOENZIMAS

Glutatión peroxidasa es el nombre genérico para una familia de múltiples isoenzimas que se caracterizan por su tríada catalítica compuesta de selenocisteína, glutamina y triptófano. El nombre sistemático de la enzima es E.C. 1.11.1.9: oxidorreductasa glutatión peroxidasa. La actividad de algunas isoenzimas de GPx depende de Se. Existen cuatro isoenzimas mayoritarias en tejidos de mamíferos, todas dependientes de Se: GPx clásica o citosólica (GPx-1 o cGPx), GPx gastrointestinal (GPx-2 o GPx-GI), GPx plasmática (GPx-3 o pGPx) y GPx de fosfolípidos (GPx-4 o PHGPx). Las primeras dos GPx son específicas a sustratos similares, y reducen rápidamente al H2O2 o a los ácidos grasos a hidroperóxidos. La GPx-3 posee una débil actividad para reducir hidroperóxidos de colesterol. En contraparte, la GPx-4 reduce eficazmente los hidroperóxidos de fosfolípidos, pero de manera ineficaz al H2O2. La GPx-4 se describió primero en 1982, y después fue clasificada como selenoproteína cuando se determinó su secuencia de aminoácidos. Estas cuatro isoformas de GPx pueden actuar como una peroxinitrito reductasa, previniendo tanto la reacción de oxidación como la de nitración causada por el peroxinitrito (ONOO–). La GPx inactiva al ONOO– en una reacción catalítica cuya estequiometría ya se conoce (figura 13-3). El sistema de GPx y GSH trabaja catalíticamente de una manera parecida a la destoxificación de hidroperóxidos por GPx a expensas de GSH. El residuo de selenocisteína en el sitio activo de la enzima es oxidado por el ONOO (o ácido peroxinitroso, ONOOH) a ácido selénico (RSeH) y reducido después a selenol (RSeOH) a expensas de dos equivalentes reductores proporcionados por GSH. La constante de reacción de segundo

204

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

Cuadro 13-1. Selenoproteínas de mamíferos: localización y función Selenoproteína

Localización

Función

cGPx, GPx-1

Citosol de casi todos los tejidos

Antioxidante citosólico

GI-GPx, GPx-2

En el citosol de hígado y tracto intestinal en humanos

Antioxidante en tracto gastrointestinal

pGPx, GPx-3

Fluidos extracelulares de varios tejidos, aunque es en riñón donde existe una alta concentración

Antioxidante en fluidos extracelulares y en plasma

PHGPx, GPx-4

En la membrana y citosol de varios tejidos

Antioxidante en membrana celular. Participa en la apoptosis y en la función reproductiva (espermatogénesis)

Desyodasa tipo 1

D1,5’DI

En glándula tiroides, hígado, riñón y glándula hipófisis

Convierte tiroxina (T4) por monodesyodación a 3,5,3’-tri-yodotironina (T3)

Desyodasa tipo 2

D2,5’DII

En cerebro, tejido adiposo oscuro, glándula hipófisis y placenta

Convierte T4 por monodesyodación a T3

Desyodasa tipo 3

D3,5’DIII

En sistema nervioso central, placenta y piel

Convierte T4 por monodesyodación a la forma inversa de T3

Glutatión peroxidasa Clásica o citosólica Gastrointestinal

Plasmática

De fosfolípidos

Abreviatura GPx

Yodotironina desyodasa:

Tiorredoxina reductasas: Tiorredoxina reductasa 1 Tiorredoxina reductasa 2 Selenofosfato sintetasa 2 Selenoproteína P

TrxR TrxR1 TrxR2

SPS2

SP

En el citosol de varios tejidos En la mitocondria celular de varios tejidos En varios tejidos

En glándula tiroides y sangre

Cumplen con múltiples papeles incluyendo la reducción de peróxidos y de tiorredoxina, y mantiene el equilibrio redox de factores de transcripción Síntesis de selenofosfato para la síntesis de seleno proteínas Transporta Se a las proteínas que lo requieren. Antioxidante endotelial

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

ONOO

–

ONO

E-Se – + H +

•

205

–

E-SeOH

GSH

GSSG

E-Se-SG GSH

H O 2

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Figura 13-3. Mecanismo catalítico propuesto para GPx en la reducción de peroxinitrito a nitrito (o ácido peroxinitroso a ácido nitroso).

orden de las GPx tetraméricas (GPx-1, GPx-2 y GPx-3) con el ONOO– es de 8 x 106 M-1seg-1. Este dato sugiere que en el interior celular, las GPx tetraméricas compiten con los grupos tiol para reaccionar con el ONOO–, y además pueden competir con el CO2, cuya constante de reacción de segundo orden con el ONOO– es de 3 x 104 M-1 seg-1. Esto hace que la reacción de la GPx con el ONOO– se considere como un mecanismo de destoxificación biológica eficaz in vivo. También se ha demostrado que la selenoproteína P protege contra el ONOO–, lo que sugiere que sirve como una proteína protectora en circulación. Se ha demostrado que una tercera selenoproteína, la TrxR, puede ayudar en la reducción del ONOO–. Esta enzima usa NADPH para reducir las formas oxidadas de selenocisteína. Las isoformas de GPx están presentes en la mayor parte de los tejidos animales, y son específicas para el GSH como donador del átomo de hidrógeno. Sin embargo, no están distribuidas de manera homogénea en el organismo, como se muestra en el cuadro 13-2, y como se describirá con detalle más adelante.

❚ CARACTERÍSTICAS

ESTRUCTURALES DE LAS ISOENZIMAS

GPX

Las isoformas 1, 2 y 3 de GPx son homotetrámeros, mientras que la GPx-4 es un monómero (cuadro 13- 3); cada una de ellas contiene un átomo de Se en su sitio activo, en forma de selenocisteína. La selenocisteína se incorpora de manera cotraduccional a las proteínas. La incorporación de la selenocisteína requiere un paso novedoso en el proceso de traducción en el cual el codón UGA dirige la

206

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

Cuadro 13-2. Presencia de glutatión y de GPx en diferentes organismos Sistema estudiado Cloroplastos de espinacas Tejidos de rata: Hígado Eritrocito Corazón Pulmones Bazo Riñón Cerebro Músculo esquelético Plasma sanguíneo Tejido adiposo Tejido humano: Hígado Riñón Eritrocitos Sangre Plasma sanguíneo Factor surfactante alveolar

Neurospora crassa E. coli Crecimiento aerobio Crecimiento anaerobio

Concentración de GSH

Relación de GSH/GSSG

Glutatión peroxidasa (GPx)

3.0 mM

> 10/1

Ausente

7 2 2 2 4 4 2

> > > > > > >

a 8 mM mM mM mM a 5 mM mM mM

10/1 10/1 10/1 10/1 10/1 10/1 10/1

Alto Moderado Moderado Moderado — Moderado Moderado

1 mM

> 10/1

Bajo

20 a 30 μM 3.2 μg/106 células

~5/1 > 100/1

Bajo Bajo

4 μmol/ g peso húm. 2 μmol/g 240 μg/mL de sangre ~ 1 mM 1 a 3 μM 40 a 200 μM

> 10/1 > 10/1 > 10/1 > 10/1 varía varía (usualmente > 10/1)

Alto Alto Moderado Alto Bajo Trazas

20 μmol/ g peso seco

150/1

Ausente

27 μmol/g

> 10/1

Ausente

7 μmol/g

inserción de selenocisteína. Como los codones UGA son reconocidos normalmente como señales de terminación de la traducción, se requiere precisar cómo la célula reconoce y distingue un codón selenocisteína UGA de un codón de terminación UGA. La homología en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos entre las isoenzimas de GPx de los primates es de 94%. La estructura primaria de la GPx-1 en humanos consiste de 201 aminoácidos. Los residuos que están envueltos en la

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

•

207

Cuadro 13-3. Isoformas de GPx en mamíferos: localización, peso molecular, estructura y Km Isoenzima

Localización celular

Tipo de estructura

GPx-1

Citosol

homotetrámero

GPx-2

Citosol

homotetrámero

GPx-3

Fluidos extracelulares En citosol y membrana celular

homotetrámero

GPx-4

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1

monómero

Peso molecular (kDa)

Km (μM)1 [GSH] = 1 mM

22 por subunidad (88 en total) 22 por subunidad (88 en total) 23 por subunidad (92 en total) 19.7

12 para H2O2 3 para H2O2 3.3 para H2O2 11 para hidroperóxidos de fosfolípidos

Los valores de Km son para la GPx de humanos.

fijación de Se para esta isoenzima son Gln82 y Trp160, y los residuos del centro catalítico son Arg52, Arg98, Arg179, Arg180 y Lis86. Estas características son idénticas en las GPx-1 de los mamíferos, indicando que las propiedades catalíticas esenciales de GPx-1 son similares entre los primates. La GPx-1 posee en su estructura tres asas que estabilizan la estructura de la enzima. La primera asa está constituida por Asn42-Tir54, la segunda por Leu72Gln82 y la tercera por Trp160-Fen162. Los aminoácidos que conforman estas tres asas están conservados en todas las especies de primates, al igual que los cuatro residuos Asn77, Lis112, Glu114 y Tre143, que también son importantes para la actividad de GPx-1. La GPx-2 en los humanos está constituida por 190 aminoácidos, además, esta enzima tiene una gran similitud estructural con la GPx-1 (en 55.7%). La similitud de la GPx-3 y la GPx-4 con la GPx-1 es baja (en 36.8 y 28.1% para GPx-3 y 4, respectivamente). A partir de la estructura de la GPx-1 se han logrado dilucidar otras características estructurales comunes a todas las isoenzimas de GPx. Se ha demostrado que los residuos de aminoácidos Gln82 y Trp160 se han conservado, puesto que están involucrados en la generación de los puentes de hidrógeno para fijar al Se. La arquitectura electrostática del centro activo está formada por Arg52, Lis86, Arg98, Arg179 y Arg180 en GPx-1. De esos residuos, la Arg180 está presente en todas las GPx. En contraparte, la presencia de los aminoácidos Arg52, Lis86 y Arg179 no es frecuente, lo que sugiere que son aminoácidos menos esenciales para el centro activo. La Asn77 y la Lis112 están presentes en todas las isoenzimas de GPx, mientras que la Arg52 y la Glu114 están sólo en GPx-1 y GPx-2, lo cual indica la gran

208

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

similitud entre las características enzimáticas de estas dos isoenzimas. Las tres asas constituidas por Asn42-Tir54, Tir72-Gln82 y Trp160-Fen162 están presentes en todas las isoenzimas de GPx, lo que muestra la importancia de esas asas en la estructura de la GPx.

❚ JERARQUÍA DE

LAS ISOENZIMAS

GPX

La jerarquía de las isoenzimas GPx se refiere al orden de importancia de cada una de ellas en función de la biodisponibilidad de Se, de la velocidad de síntesis y de la cantidad de cada isoenzima en los organismos. La biosíntesis de las selenoproteínas depende de la disponibilidad de Se. A concentraciones limitantes, el Se es resguardado selectivamente al interior de algunas selenoproteínas, mientras que en otras el resguardo es mucho menor. En consecuencia, algunas selenoproteínas responden rápido a la deficiencia de Se con una pérdida en su actividad, otras permanecen estables con una moderada deficiencia de Se y sólo disminuyen su actividad cuando esta deficiencia es sustancial y prolongada. Por otro lado, las proteínas que responden con lentitud a la deficiencia de Se se restauran rápido después de una suplementación con este mineral. La disminución en la síntesis de ciertas selenoproteínas por deficiencia de Se se acompaña de una disminución en los niveles de los mRNA. En términos cuantitativos, la disminución en el mRNA es menos pronunciada que la disminución en la síntesis de la proteína o de la pérdida de la actividad de la proteína. La estabilidad del mRNA contribuye al resguardo preferencial de Se al interior de algunas selenoproteínas en particular, por ello esta estabilidad en el mRNA es utilizada como un criterio adicional para la jerarquía de las GPx. Los estudios en la estabilidad del RNA han colocado a la GPx-1 como la isoenzima de más baja jerarquía (por la cantidad de esta isoenzima presente en los organismos). En contraste, los niveles de mRNA de la GPx-4 permanecen estables durante la deficiencia de Se. El orden jerárquico de las GPx es el siguiente: GPx-2 > GPx-4 > GPx-1 = GPx-3

❚ PARTICULARIDADES

DE LAS ISOENZIMAS DE DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN

GPX:

GPx-1 o GPx-citosólica a) Distribución. La isoenzima GPx-1 se conoce desde hace más de 40 años, y su distribución se ha estudiado en muchas especies de manera amplia. Bajo concen-

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

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209

traciones adecuadas de Se, todas las células expresan a la GPx-1. Las concentraciones de esta isoenzima se encuentran particularmente altas en tejidos como hígado, riñón, pulmón y eritrocitos sometidos a estrés oxidativo por largo tiempo. Se han encontrado valores bajos de GPx-1 en el testículo de rata. b) Función. Muchas de las evidencias apoyan la función de los hidroperóxidos en la señalización celular, y se basan en los estudios con líneas celulares derivadas de linfocitos a través de la activación del factor de transcripción NF-κB (un complejo multiproteínico que regula una gran variedad de genes relacionados con la inmunidad, inflamación y cáncer). Es posible que la GPx-1 participe en la modulación de la activación del factor NF-κB, ya que su activación se ha visto inhibida en las células suplementadas con Se y facilitada durante la deficiencia de Se. De la misma forma, la GPx-1 está involucrada en la modulación de la muerte celular programada o apoptosis. Durante la apoptosis se eliminan células que ya no son necesarias o están alteradas, por lo que este proceso biológico juega un papel importante durante el desarrollo embrionario, la reparación de un tejido, el desarrollo de la carcinogénesis y durante el equilibrio del sistema de defensa en la célula. Además, se ha observado un incremento en la actividad de GPx-1 cuando la apoptosis es inhibida bajo condiciones en que se producen especies reactivas de oxígeno, lo cual parece demostrar la habilidad de las GPx para modular las respuestas apoptóticas en las células.

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GPx-2 o GPx gastrointestinal a) Distribución. La expresión de GPx-2 parece estar restringida al epitelio del tracto gastrointestinal en las ratas, mientras que en los humanos también se ha encontrado en el hígado. Esta distribución tan inusual en los humanos ha permitido sugerir la hipótesis de que la GPx-2 representa un primer punto de defensa contra los hidroperóxidos lipídicos producidos de la ingesta de lípidos en la dieta. A favor de esta hipótesis se ha encontrado que el GSH reduce la cantidad de hidroperóxidos transportados del lumen a la linfa. En las ratas, el mRNA de la GPx-2 está presente en forma significativa en las células epiteliales de todo el tracto digestivo (desde el esófago hasta el colon distal). Aunque la actividad total de la GPx-2 en el intestino representa sólo la décima parte de lo que representa su actividad en el hígado, se ha concluido que es en el intestino en donde existe un mecanismo más eficaz de destoxificación contra los hidroperóxidos, por ello, la GPx-2 aparece como el mejor sistema antioxidante de defensa en el epitelio intestinal. b) Función. Se ha sugerido un efecto protector de la GPx-2 contra el cáncer de colon. En los estudios epidemiológicos se ha observado la asociación entre la ingesta de Se y la susceptibilidad al cáncer de colon. El tracto gastrointestinal es

210

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

el único sistema que expresa las cuatro isoenzimas de la GPx, aunque la GPx-2 es el sistema de defensa antioxidante más importante en este sitio, pues su papel no sólo consiste en la defensa contra la producción de los hidroperóxidos después de la ingesta de alimentos, sino que también es un sistema de defensa contra el H2O2 en el hígado, ya que esta especie reactiva de oxígeno es un producto secundario del metabolismo oxidativo de agentes xenobióticos (agentes no producidos en los organismos). En ambas funciones, la GPx-2 equilibraría el potencial mutagénico de los hidroperóxidos, por lo que puede ser vista como un instrumento protector contra el inicio y desarrollo de procesos malignos en el aparato gastrointestinal.

GPx-3 o GPx plasmática a) Distribución. La GPx-3 se detectó primero en el plasma sanguíneo. Sin embargo, la concentración del GSH plasmático es tan sólo de 30 μM, por lo que no es suficiente para mantener la actividad de GPx plasmática por un tiempo razonable, razón por la cual aún no se ha comprendido por completo la función de esta isoenzima extracelular. Tal vez ésta es la principal razón por la que la GPx-3 no ha sido tan estudiada como los otros miembros de la familia de la GPx. La fuente más significativa de la GPx-3 es el riñón, ya que es producida por las células epiteliales del túbulo proximal y por las células parietales de la cápsula de Bowman para ser liberada a la circulación sanguínea. El riñón es el órgano que contiene los niveles más altos de mRNA de GPx-3; en concentraciones menores se encuentra en el hígado, músculo esquelético, páncreas, cerebro, pulmones, corazón, epitelio ciliar del ojo, células epiteliales del intestino delgado, epidídimo, placenta y las glándulas mamarias de ratones hembras embarazadas. La GPx-3 es secretada extracelularmente, y se ha encontrado en leche materna, líquido amniótico, líquido pleural y el humor acuoso. Aunque la GPx-3 también es expresada en el epidídimo, no se ha encontrado en la luz de los vasos deferentes. Durante el desarrollo fetal humano, la GPx-3 es sintetizada en las células en la etapa de trofoblasto en la placenta. La posibilidad de expresión durante el desarrollo embrionario se investigó para determinar los sitios de la expresión de esta isoenzima en diferentes estados embrionales y en tejidos adultos de ratón. En ratones preñados se ha encontrado en la piel y vísceras fetales. En tejidos adultos, aparte de los órganos conocidos también se ha encontrado en la piel, vello intestinal y en tejido adiposo. b) Función. La presencia de la GPx-3 en casi todos los puntos de frontera celulares, sugiere que su función es la de ser una barrera contra la transferencia de hidroperóxidos. Sin embargo, todavía no se ha aclarado si la GPx-3 funciona sólo como un antioxidante.

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

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211

GPx-4 o GPx de fosfolípidos a) Distribución. Una de las peculiaridades de la GPx-4 es su distribución poco común. Su actividad por lo general es más baja respecto a la actividad de la GPx1 en todos los órganos, con excepción de los testículos, donde su actividad es más alta. En los testículos de la rata, la GPx-4 es 15 veces más activa que en el hígado y riñón, y 25 veces más que en el corazón y pulmón. b) Función. El resguardo preferencial del Se al interior de la GPx-4 en el aparato reproductor y endocrino, parece indicar que la GPx-4 no sólo tiene funciones antioxidantes, sino que también juega un papel importante en la regulación de los procesos de oxidorreducción, maduración sexual y diferenciación. La GPx4 fue descubierta como un factor contra la prevención de la peroxidación lipídica, además de proteger a las membranas biológicas contra el estrés oxidativo. De la misma forma, también desempeña una función muy importante en la biosíntesis de los leucotrienos, los tromboxanos y las prostaglandinas, así como en la reducción de los hidroperóxidos de las proteínas y las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL y LDL) (figuras 13-4 y 13-5). De acuerdo con los puntos anteriores, la GPx-4 parece tener una función preventiva de la aterogénesis y en el control de la espermatogénesis.

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❚ EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE SE DE LAS GPX SELENODEPENDIENTES

EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

El Se es un micronutrimento esencial para el mantenimiento óptimo del sistema inmunitario. Muchas enfermedades están asociadas a la deficiencia de Se junto con la deficiencia de vitamina E, esta conexión ha permitido proponer la hipótesis de que el Se y la vitamina E tienen una actividad antioxidante similar. Hace tres decenios se demostró que la deficiencia de Se disminuye la actividad microbiROOH Prot-SSG

GSSG

PHGPx-Se -

ROH

PHGPx-SeOH

Prot-SH

GSH

Prot-SH PHGPx-Se-S-Prot

PHGPx-Se-SG GSH Prot-SH

Figura 13-4. Ciclo catalítico de la PHGPx y las posibles reacciones que permiten la modificación de proteínas por hidroperóxidos (ROOH), GSH y PHGPx.

212

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

A

PGG2

GPx

GPx PGH 2

15-OOH-PGF

GPx

B

(Capítulo 13)

GPx PGF2

Ácido araquidónico Lipooxigenasa 12-HEPTE

GPx

12-HETE

8,11,12-THETE

C

15-HPETE

GPx

15-HETE

Prostaciclina sintetasa Prostaciclina

Lipooxigenasa Tromboxano

Figura 13-5. Influencia de GPx-4 en la formación de prostaglandinas A), leucotrienos B) y tromboxanos C). PGG2, PGH2, 15-OOH-PGF y PGF2α: endoperóxidos, 12-HEPTE, 12-HETE, 15-HETE y 8,11,12-THETE: leucotrienos, 15-HPETE: intermediario de la biosíntesis de prostaglandinas Y tromboxanos.

cida de los neutrófilos, los cuales tienen a su vez una disminución de la actividad de las GPx selenodependientes. Este hecho sugiere que las GPx selenodependientes juegan un papel en la modulación de la respuesta inflamatoria. La deficiencia de Se puede asociarse con muchos tipos de cáncer, incluyendo el de esófago, estómago, colon y próstata. Dicha deficiencia también resulta en una pérdida de la actividad de otras selenoproteínas, además de pérdida de la estabilidad de los mRNA y la traducción de las proteínas. De acuerdo con diferentes estudios realizados con ratones knockout para GPx-1 y GPx-2 (ratones que no poseen estas enzimas y se denominan GPx1/2-KO), la deficiencia de Se está ligada a la inflamación en el tracto gastrointestinal. Estos ratones también presentan una severa ileocolitis a temprana edad, y una pérdida completa de la actividad de GPx de la mucosa intestinal a partir de los 11 días de edad. De la misma forma, se encontró que los ratones GPx1/2-KO desarrollaron cáncer en la parte baja del tracto gastrointestinal (restringida a colon e íleon). Por otro lado, en experimentos con células Jurkat cultivadas de en un medio deficiente de Se, se indujo la disminución en la actividad enzimática de la GPx-4 y la GPx-1 a 36% en un periodo

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

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213

de 24 h. Asimismo, la eliminación de Se del medio de cultivo indujo la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (figura 13-6). En conclusión, se ha demostrado que la deficiencia de Se disminuye la actividad de las isoformas de GPx, lo que trae como consecuencia un aumento de la peroxidación lipídica en las membranas y un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que finalmente induce la muerte celular. Estos resultados sugieren que los hidroperóxidos lipídicos tienen una función importante en el daño oxidativo celular inducido por deficiencia de Se. De la misma forma, la deficiencia de GPx incrementa el riesgo de cáncer.

❚ MECANISMO CATALÍTICO SISTEMA GSH/GPX

DE LAS ISOENZIMAS

GPX:

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El sistema del glutatión es un mecanismo central para la reducción de H2O2 y/o peróxidos lipídicos, la responsable de esta reducción es la enzima GPx junto con la oxidación del GSH. Este sistema funciona para proteger a las células del daño oxidativo. La capacidad reductora de las isoenzimas GPx se basa en altas concentraciones de GSH. La molécula de GSH es un tripéptido celular con un grupo sulfhidrilo con capacidad antioxidante, razón por la cual juega un papel muy importante en el metabolismo celular. La molécula de GSH destoxifica de radicales libres y toxinas exógenas, además de ser importante para mantener el equilibrio oxidorreductivo intra y extracelularmente (capítulo 16).

2GSH H2 O2 SOD e– O2

O2

.–

2H 2 O

GPx Se

O2

O 2+ 2H

GSSG

+

NO GPx – ONOO 2GSH

Se

ONO– + H 2O

GSSG

Figura 13-6. Participación del Se en la defensa citosólica contra especies reactivas de oxígeno y nitrógeno.

214

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

Durante el mecanismo catalítico de las GPx, un selenol (proteína Se-) reacciona con peróxido para dar ácido selénico (proteína SeOH): Proteína Se– + ROOH + H+

ROH + Proteína SeOH

El primer-GSH es entonces enlazado: Proteína-SeOH-GSH

H2O + Proteína-Se-SG

El segundo-GSH es enlazado: Proteína-Se-SG-GSH

Proteína-SeH-GSSG

Proteína Se– + H+ + GSSG

La relación entre el glutatión reducido y el glutatión oxidado (GSH/GSSG) en las células normales por lo general es alta, ya que existe un mecanismo para regenerar al GSH (figura 13-3). La molécula de GSSG que se forma durante la reacción enseguida es reducida por la enzima glutatión reductasa, una enzima intracelular que cataliza la siguiente reacción: GSSG + NADPH + H+

2GSH + NADP+

Como se observa en la reacción anterior, la glutatión reductasa utiliza NADPH como cofactor. El NADPH requerido es proporcionado por tejidos animales y vegetales por muchos sistemas enzimáticos, aunque el mejor conocido es la vía de las pentosas fosfato en su fase oxidativa (cuadro 13-4). La primera enzima de esta vía es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que cataliza la primera reacción de la fase oxidativa de la vía de las pentosas fosfato: Glucosa-6-fosfato + NADP+

CO2 + NADPH + H+ + ribulosa-5-fosfato

La vía de las pentosas fosfato es controlada por la concentración de NADP+, el cual es sustrato de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Cuando la glutatión reductasa opera, se disminuye la relación de NADPH/NADP+ (ya que incrementan los niveles de NADPH), por lo que la vía de las pentosas fosfato se hace cada vez más rápida para reemplazar el NADPH. Cabe mencionar que se ha observado que la exposición de las células al estrés oxidativo trae como consecuencia cambios rápidos en las concentraciones de GSH y GSSG, y con ello alteraciones en el ambiente oxidorreductivo. En varias investigaciones se ha observado que existe un rápido incremento de GSH intracelular en respuesta al estrés oxidativo. De acuerdo con lo anterior, la exposición a pirogalol ocasiona una disminución de GSH, seguida de una elevación prolongada en los valores de GSH intracelular. Además, la enzima γ-glutamil cisteína sintetasa (γ-GCS),

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

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215

Cuadro 13-4. Reacciones de producción de NADPH en sistemas biológicos Enzima Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 6-fosfogluconato deshidrogenasa Enzima málica

Reacción Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfoglucono-δ-lactona + NADPH + H+ 6-fosfogluconato + NADP+ → D-ribulosa-5-fosfato + NADPH + H+ Malato + NADP+ ↔ Piruvato + HCO3– + NADPH + H+

Vía metabólica Vía de las pentosasfosfato (fase oxidativa) Vía de las pentosasfosfato (fase oxidativa) —

la cual determina la velocidad de síntesis de GSH, está constituida por una subunidad pesada (γ-GCS-HS) y por una subunidad ligera (γ-GCS-LS). Algunos estudios han demostrado que las especies reactivas de oxígeno incrementan los niveles de GSH a través de la inducción de la γ-GCS. Otras respuestas de protección a estrés oxidativo incluyen el transporte de GSH al interior celular y exportación de GSSG, con una acumulación de esta última forma en el citosol celular.

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❚ ESTUDIOS

EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se han estudiado los cambios de la actividad de la GPx-1 y de la GPx-3 en el daño renal ocasionado por el antibiótico gentamicina el cual induce estrés oxidativo y nitrosativo, y se encontró que la disminución de ambas isoenzimas de GPx se previno por la administración de antioxidantes como dialil disulfuro, dialil sulfuro y S-alilcisteína. De esta manera, la determinación de la actividad de la GPx-3 se puede considerar también como un marcador de daño a los túbulos proximales renales. Asimismo, se estudió el efecto de la deficiencia y la complementación dietaria de Se y vitamina E sobre el desarrollo del síndrome nefrótico experimental inducido por aminonucleósido de puromicina. La dieta deficiente en Se y vitamina E disminuye la actividad de GPx-1, aumenta la peroxidación de lípidos y el daño renal funcional y estructural. Por otro lado, la dieta complementada en Se y vitamina E aumenta la actividad de GPx-1, disminuye la peroxidación de lípidos y el daño renal funcional y estructural. Lo anterior indica la importancia de la actividad de GPx-1 en la modulación del daño renal ocasionado por aminonucleósido de puromicina.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 13)

❚ AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue posible gracias a los donativos del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, 40009-M) y de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA, PAPIIT IN227103) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

❚ REFERENCIAS Arthur J R: The glutathione peroxidases. Cell Mol Life Sci 2000;57:1825-1835. Arteel G, Briviba K, Sies H: Protection against peroxynitrite. FEBS Lett 1999; 445:226-230. Behne D, Kyriakopoulos A: Mammalian selenium-containing proteins. Annu Rev Nutr 2001;21:453-473. Brigelius-Flohe R, Banning A, Schnurr K: Selenium-dependent enzymes in endothelial cell function. Antioxid Redox Signal 2003;2:205-215. Brigelius-Flohe R: Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med 1999;27:951-965. Burk R F, Hill K E, Motley A K: Selenoprotein metabolism and function: evidence for more than one function for selenoprotein P J Nutr 2003;133(5 Suppl 1):1517S-1520S. Chu FF, Esworthy RS, Doroshow JH: Role of Se-dependent glutathione peroxidases in gastrointestinal inflammation and cancer. Free Radic Biol Med 2004; 12:1481-1495. Comhair SA, Erzurum SC: The regulation and role of extracellular glutathione peroxidase. Antioxid Redox Signal 2005;1:72-79. Fukuhara R, Kageyama T: Structure, gene expression, and evolution of primate glutathione peroxidases. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 2005; 141:428-436. Halliwell B, Gutteridge J: Free radicals in biology and medicine, Nueva York: Oxford University Press, 1999. Hirotaka I, Yasuhito N: Biological significance of phospholipid hydroperoxide gluathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Radic Biol Med 2003;2:145-169. Imai H, Nakagawa Y: Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Radic Biol Med 2003;34:145-169. Klotz LO, Kroncke KD, Buchczyk DP et al.: Role of copper, zinc, selenium and tellurium in the cellular defense against oxidative and nitrosative stress. J Nutr 2003;133(5 Suppl 1):1448S-1451S.

Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas

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217

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T

14

IORREDOXINAS

Elizabeth Hernández Pérez Leticia Bucio Ortiz

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❚ INTRODUCCIÓN Las tiorredoxinas (Trx) son una familia de proteínas pequeñas (12 kDa) encontradas en un gran número de especies, tanto de procariotas como de eucariotas. Laurent T.C. en 1963, obtuvo la primera Trx al extraerla de E. coli, pero fue Moore E.C., en 1967, quien describió primero la Trx de mamífero al purificarla de un hepatoma de Novikoff. Más tarde, otros investigadores las han reportado con diferentes nombres como: interleucina-1 (IL-1), citocina producida por el virus de Epstein-Barr, factor derivado de leucemia de células T adultas o factor temprano de embarazo; sin embargo, todas estas proteínas presentan la misma secuencia de aminoácidos, por lo que todas son tiorredoxinas. La Trx está implicada en un gran número de funciones celulares en los mamíferos. Dentro de la célula, su actividad puede analizarse dependiendo de su localización; así, en el citoplasma actúa como antioxidante y cofactor; en el núcleo modula la regulación de la actividad de factores de transcripción, y en la mitocondria desempeña una función importante en la supervivencia celular durante el desarrollo embriogénico. La Trx también puede ejercer su actividad fuera de la célula al estimular el crecimiento celular y la quimiotaxis. Las proteínas de la familia de las Trx presentan un sitio catalítico conservado, en el cual dos cisteínas, la 32 y la 35 se encuentran en forma de ditiol (-SH)2 en

❚ 219 ❚

220

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

la enzima reducida (Trx-[SH]2). Estas cisteínas son las encargadas de experimentar el proceso de oxidación reversible a disulfito de cisteína mediante la transferencia de equivalentes reductores, y generar la especie oxidada de la enzima (Trx-S2). La reacción para regenerar a la Trx reducida (Trx-[SH]2) es catalizada por la enzima Trx reductasa (Trx-R), que es una flavoproteína dependiente de NADPH+H (figura 14-1). El mecanismo de acción de la enzima Trx es el siguiente: la proteína sustrato (X-S2) que se va a reducir, se une a la superficie hidrofóbica de la Trx-[SH]2; en este sitio, en el que hay un ambiente hidrofóbico, el grupo tiol de la Cis32 actúa como un nucleófilo, ya que se combina con el X-S2 de forma covalente (TrxCis32 –S-S-X). Posteriormente, la Cis35 dona su protón y reacciona con la Cis32–SS-X, liberando la proteína sustrato reducida (X-[SH]2), y formando a la Trx oxidada (Trx-[S]2), la cual es entonces reducida por la Trx-R, dependiente de NADPH. El NADPH +H se oxida a NADP+ al ceder los protones a la Trx-[S]2 para regenerarla a la forma Trx-[SH]2 (figura 14-1).

❚ ESTRUCTURA DE

LA

TRX

Existen varios miembros de la familia de las Trx en los mamíferos y en otras especies (figura 14-2), se sabe que la Trx es una proteína globular compacta con cinco cadenas β plegadas que posee un centro hidrofóbico rodeado por cuatro hélices

Trp Cis SH Gli Pro Trx Cis SH (reducida) Lis

Trp Cis S Gli Pro Trx Cis (oxidada) Lis

S

Tr p Cis SH Gli Pro Trx Cis SH (reducida) Lis

+ + X-S2

NADPH+H X(SH)

2

+

NADP

+

Trx-R (Se)

Figura 14-1. Mecanismo de acción de la Trx. La Trx presenta dos cisteínas con grupos tiol en su forma, las cuales al ser oxidadas por la Trx-R formarán un puente disulfuro al ceder los equivalentes de hidrógeno a una proteína blanco (X-S2). Posteriormente, la Trx oxidada será reducida al recibir equivalentes de hidrógeno provenientes del NADPH+H mediante la Trx-R.

Tiorredoxinas

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221

α sobre la superficie externa. Los residuos aminoacídicos del sitio activo son muy conservados: –Trp-Cis32- Gli- Pro-Cis35-Lis-. Se ha visto que sirven para unir la segunda cadena β plegada a la segunda hélice α y formar la primera vuelta de la segunda hélice. Esta estructura terciaria es muy estable y se conoce como la Trx plegada (figura 14-3).

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Trx-1 Se ha clonado la Trx-1 humana, así como la de pollo, ratón, rata y bovino, y se ha encontrado que es una proteína de 104 aminoácidos con un peso molecular de 12 kDa. Una característica es que algunas de ellas presentan a la metionina en el lado N-terminal. La Trx-1 humana y de otros mamíferos contienen, además de los dos residuos de Cis en el sitio catalítico, otros tres residuos de cisteína, las Cis62, Cis69 y Cis73, las cuales pueden conferir propiedades biológicas únicas a la Trx-1 de mamíferos. El gen para la Trx-1 humana se localiza sobre las bandas 9q32 en el cromosoma 9, mientras que el gen de la Trx-1 de ratón se encuentra sobre el segundo cuarto proximal del cromosoma 4, que es homólogo a la localización 9q32 del cromosoma humano. La estructura cristalina de la Trx-1 humana ha revelado una conformación dimérica en la cual los monómeros están unidos a través de un puente disulfuro entre las Cis73 de cada subunidad, mientras que los residuos del sitio activo están reducidos (figura 14-4). El dímero contiene una interfase hidrofóbica grande (100 Å), con cinco puentes de hidrógeno además del enlace disulfuro. En la interfase dimérica se localizan 12 aminoácidos de cada monómero, 10 de los cuales no varían en animales superiores, incluyendo Cis73. La aparente constante de disociación para la formación de dímeros no covalentes bajo condiciones de reducción varía entre 6 y 166 μM a pH de 3.8 y 8, respectivamente. P.M. (kDa)

No. de aa

Trx-1 humana

12

104

Trx-2 humana

18

166

CGPC

TrxL

p32

289

humana

Trx de E.coli. Sitio activo

Figura 14-2. Miembros de la familia de tiorredoxinas.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

Centro hidrofóbico 73

Hélices β

Cis

Hélices α

Cis32 35 Cis Monomeros de Trx

Figura 14-3. Estructura de la Trx. La figura muestra un dímero de Trx, cada monómero está formado por cinco cadenas ß plegadas y cuatro α hélices, el sitio activo se encuentra en el interior de una α hélice, formando un centro hidrofóbico. Se observan las Cis32 y Cis35.

Se desconoce si la formación del dímero ocurre bajo condiciones fisiológicas debido a que la asociación es relativamente débil, y no es claro cuál es el papel del dímero de Trx-1, ya que el sitio activo, al permanecer encerrado, no es un sustrato para la reducción por la Trx-R y no estimula el crecimiento celular. Por otra parte, aún no se ha logrado determinar la concentración local de Trx-1 humana en tejidos, pero se cree que los valores son aproximadamente de 2 a 12 μM.

Trx-2 Se identificó una segunda Trx un poco más larga en las mitocondrias del corazón del cerdo, y se le denominó Trx-2. Esta enzima posee 166 aminoácidos, y pesa 18 kDa. Presenta el sitio catalítico conservado, pero sin los tres residuos extras de Cis encontrados en la Trx-1 de mamíferos. La extensión N-terminal de 60 aminoácidos de la Trx-2 exhibe características consistentes con una señal de translocación mitocondrial. Al parecer, tiene un sitio de probable ruptura, lo que daría dos fragmentos: una proteína de unos 12.2 kDa, y otro fragmento que contendría al sitio catalítico. Se ha demostrado que este fragmento pequeño tiene actividad catalítica y reduce a la insulina, y es reducido a su vez por la Trx-R y NADPH+H.

p32TrxL Un tercer tipo de tiorredoxina es la p32TrxL, formada por una Trx a la que se une una proteína citosólica de 32 kDa, esta Trx fue clonada de una biblioteca de

Tiorredoxinas

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Monomeros de Trx

Figura 14-4. Dímero de Trx-1. Se muestran los dos monómeros.

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cDNA de testículo humano. La proteína tiene una secuencia de 289 aminoácidos, con un dominio Trx N-terminal de 105 aminoácidos, un sitio activo Trx conservado (-Cis-Gli-Pro-Cis-) y un alto grado de homología con la Trx-1 humana. La secuencia del remanente es de 184 aminoácidos en el lado C-terminal, y éste no muestra homología a otras proteínas consultadas en una base de datos. La proteína p32TrxL se expresa en todos los tejidos humanos, con concentraciones más altas en el estómago, testículo y la médula ósea. Sin embargo, ni la longitud completa de p32TrxL ni el fragmento N-terminal de 105 o 107 aminoácidos son reducidos por la Trx-R y NADPH+H, lo que sugiere que no está involucrada en procesos antioxidantes.

Localización subcelular de las Trx La Trx-1 es predominantemente una proteína citosólica, y aunque no tiene una secuencia de localización nuclear, se ha detectado en el núcleo de las células del estroma del endometrio normal, en las células tumorales y en tumores sólidos primarios. El tratamiento de las células con H2O2, PMA (parametoxianfetamina), radiaciones UV, hipoxia y el anticancerígeno cisplatino, causan la translocación de la Trx-1 desde el citoplasma hacia el núcleo. El mecanismo de esta translocación no es bien conocido, pero puede ser una consecuencia de que la Trx-1 sea acarreada y enlazada a otras proteínas con una secuencia nuclear. La Trx-1 también se asocia con membranas celulares o plasmáticas presumiblemente en el lado de la superficie externa. La Trx-2 se encuentra de preferencia en las mitocondrias, mientras que la p32TrxL es una proteína citosólica.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

❚ TIORREDOXINA REDUCTASAS Las tiorredoxina reductasas (Trx-R) son las únicas enzimas conocidas capaces de reducir el sitio activo de las Trx. Las Trx-R de mamíferos son proteínas homodímeras que contienen dinucleótidos de flavina y adenina con un residuo de selenocisteína en el penúltimo C-terminal, un sitio activo -Cis-Val-Asn-Val-Gli-Cis-, y experimentan reacciones de oxidorreducción. La selenocisteína es esencial para la actividad de la Trx-R en mamíferos, aunque la Trx humana puede ser relativamente reducida por la Trx-R bacteriana que no contiene selenocisteína. Dos Trx-R humanas se han clonado en toda su longitud: la Trx-R-1 de 54.4 kDa, la cual es predominantemente citosólica, y la Trx-R-2 de 56.2 kDa, con una extensión de 33 aminoácidos en el lado N-terminal identificada como una importante secuencia mitocondrial.

NADP

NADPH+H

+

Ascorbato (oxidado)

Trx-R (Se) Ascorbato (reducido)

Tr p S Cis Gli Trx Pro (oxidada) Cis

S

Tr p Cis SH Gli Trx Pro (reducida) Cis SH Crecimiento celular

Inhibidor de apoptosis Trx-P (Se)

H2O2

Ribonucleótido reductasa

Transcripción

H2O

ANTIOXIDANTE

SÍNTESIS DE DNA

TRANSCRIPCIÓN DE GENES

Figura 14-5. Reacciones y funciones de la tiorredoxina reductasa.

Tiorredoxinas

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225

Además de las Trx, se ha reportado que también son sustratos de la Trx-R los siguientes: ácido lipoico, hidroperóxidos lipídicos, péptido citotóxico, Lisina-NK, vitamina K3, ácido deshidroascórbico, radical ascorbilo y la proteína supresora de tumores p53. No obstante, el papel fisiológico que desempeña la Trx-R en la reducción de la mayor parte de estos sustratos aún no se conoce. Algunas de las funciones de la Trx-R se indican en la figura 14-5.

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❚ TIORREDOXINA PEROXIDASAS Las tiorredoxina peroxidasas (Trx-P) pertenecen a una familia de proteínas conservadas que tienen funciones antioxidantes a las que se les ha denominado peroxirredoxinas (Prx). Las Prx se encuentran distribuidas en organismos de todos los reinos, y forman parte de 0.1 a 0.8% del total de proteínas solubles. Existen como homodímeros y contienen un residuo de Cis conservado en la región N-terminal, que es el primer sitio de oxidación por el H2O2. En su mecanismo de acción, las Prx utilizan equivalentes de reducción que son suministrados por las proteínas que contienen grupos tiol. Hasta la fecha, se han identificado seis isoformas de Prx en los mamíferos, y se han clasificado en tres subgrupos de proteínas: 2-Cis (Prx I, II, III y IV), 2-Cis atípicos (Prx V) y 1-Cis (Prx VI). En cuanto al subgrupo de 2-Cis, se conoce que la I y II se localizan en el citosol, la III en la mitocondria y la IV en el retículo endoplasmático y el espacio extracelular. La primera Prx en ser identificada fue la proteína antioxidante específica de grupos tiol (TSA, por sus siglas en inglés) en levaduras y mamíferos, la cual protege la actividad de la glutamina sintetasa y la integridad del DNA. En 1994, la Trx fue reconocida como un donador de electrones para la TSA, y fue renombrada como tiorredoxina peroxidasa, la cual pertenece al grupo 2-Cis.

❚ ACTIVIDADES

BIOLÓGICAS DE LAS

TRX

Actividad antioxidante La principal actividad de la Trx es la capacidad de actuar como agente antioxidante debido a que puede funcionar como cofactor manteniendo diversas Trx-P en una forma reducida. Otra propiedad de la Trx resulta de la reducción de la glutatión peroxidasa (GPx), la inducción de la superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD) y de alguna manera, de la reducción directa del H2O2. La S-nitrosilación de la Cis69 de la Trx es una importante modificación postransduccional, lo cual incrementa su actividad antioxidante.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

Además de eliminar al H2O2 en forma directa, la Trx-1 puede donar electrones a la GPx del plasma humano, donde la concentración de Trx-1 es cercana a 6 nM. Sin embargo, no hay que olvidar que el plasma contiene niveles del orden de 1 μM de glutatión reducido (GSH) y de proteínas reducidas que proveen una capacidad amortiguadora adicional a los grupos tiol, por lo que la Trx-1 en el plasma contribuye en menor escala a la actividad antioxidante. La forma reducida de la Trx (Trx-[SH]2) actúa sobre especies oxidantes como el H2O2 y los peróxidos alquílicos, y durante el proceso se forman homodímeros o heterodímeros con otros miembros de la familia a través de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína conservados. Posteriormente, la Trx-R transforma la Trx oxidada a una forma monomérica. Se tienen registros de que células endoteliales humanas transfectadas con Trx-1 presentan una protección contra la citotoxicidad inducida por el H2O2 y la adhesión de monocitos ocasionada por inflamación. Se ha pensado que la Trx-1 ejerce la mayor parte de sus propiedades antioxidantes en las células a través de la Trx-P. Se han encontrado Trx-P como protectores antioxidantes en eritrocitos de sangre humana. Asimismo, la transfección de células leucémicas Molt-4 con la Trx-P–2 las protege de apoptosis inducida por privación de suero, ceramida y etopóside, e inhibe la liberación del citocromo c desde la mitocondria durante la apoptosis. Como se mencionó en el capítulo 13, otro mecanismo para eliminar al H2O2 de células es a través de la glutatión peroxidasa (GPx) que contiene selenocisteína, la cual usa GSH como fuente de equivalentes reductores (figura 14-6). Por lo que se sabe, el sistema redox de GSH y la Trx no están acoplados dentro de la célula, pero el selenio tiene diferentes efectos sobre los sistemas de la Trx y la GPx. El Se incrementa la actividad de la Trx-R, pero no de la Trx-P, mientras que eleva la actividad de la GPx, pero no de la glutatión reductasa (GR). Así, en presencia excesiva de peróxidos, un incremento en la disponibilidad del selenio puede predecir elevados niveles de Trx reducida relativa a GSH.

Factor de crecimiento La Trx-1 actúa como un factor de crecimiento, y es producida por una variedad de células, incluyendo las células B transformadas-EBV, hibridoma de células T MP6 y células de hepatoma. La Trx-1 es secretada por linfocitos, hepatocitos, fibroblastos y una variedad de células cancerosas. Como la Trx-1 no tiene una secuencia guía, el mecanismo por el cual la secreción ocurre parece implicar un camino independiente del realizado a través del retículo endoplasmático-Golgi. Sin embargo, aunque la Trx-1 estimula el crecimiento de linfocitos, fibroblastos normales y una variedad de líneas celulares tumorales, al parecer el mecanismo de estimulación es distinto al de un factor de crecimiento convencional, ya que no

Tiorredoxinas

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227

GR (Se)

GSH

GSSG GPx (Se)

H2 O2

H2 O Trx-P (Se)

Trp Cis SH Gli Trx Pro (reducida) Cis

Trp Cis S Gli Trx Pro (oxidada) Cis

SH

S

Trx-R (Se)

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Figura 14-6. Mecanismos para remover H2O2 en las células. Se muestra el sistema de oxidorreducción tanto del glutatión (GSH) como de la tiorredoxina (Trx).

se han encontrado receptores Trx-1. Por otra parte, la Trx-1 también parece sensibilizar a las células hacia algunos factores de crecimiento producidos por la misma célula. Por ejemplo, en las células de cáncer mamario MCF-7, la Trx-1 evita que proliferen cuando se les administra insulina 1 y el factor de crecimiento epidérmico, mientras que con la IL-2 la proliferación aumenta 1 000 veces y con el factor de crecimiento de fibroblastos básicos, 100 veces. La Trx-1 también incrementa la expresión celular de una variedad de citocinas que incluyen a las interleucinas: IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 y al factor de necrosis tumoral α (TNF-α).

Cofactor En las bacterias, la Trx actúa como cofactor de varias enzimas, ya que interviene en la reducción de equivalentes por la ribonucleótido reductasa, enzima encargada de catalizar la conversión de los nucleótidos en desoxinucleótidos requeridos para la síntesis de DNA. En el caso de la ribonucleótido reductasa de los eucariotas, se conoce poco respecto al papel de la Trx-1 en la reducción de equivalentes, ya que puede haber otras fuentes para ello.

228

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

Regulador de factores de transcripción Se ha reportado que la Trx-1 es capaz de promover la unión de algunos factores de transcripción al DNA. Entre estos factores se ha determinado al factor nuclear κB (NF-κB), el cual, como ya se ha visto a lo largo del libro, es un factor importante en la respuesta celular al estrés oxidativo, a la apoptosis y a los procesos de tumorigenicidad. Otro de los factores de transcripción más estudiados es la proteína activadora 1 (AP-1), que al activarse incrementa el crecimiento celular. Dicha activación se da mediante la reducción de un residuo de Cis, y aunque al parecer la Trx-1 no la reduce directamente, sino a través de otra proteína nuclear (la Ref-1), se ha reportado que las células que sobreexpresan a la Trx-1 incrementan la activación de AP-1. Otros factores en los que se ha determinado que la Trx-1 aumenta su unión al DNA son AP-2, proteína p53, receptor de estrógeno, receptor de glucocorticoides y el factor de transcripción PEBP2/CBF.

Proteína de enlace La Trx-1 se enlaza a una variedad de proteínas celulares (Ref-1, ASK1, PKC α, δ, ε y ζ, NF-κB, receptores de glucocorticoides, p40 phox, lipocalina). El enlace se da con la Trx reducida, pero no con la oxidada; el mecanismo no se conoce del todo, pero implica la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas del sitio catalítico de la Trx y de las otras proteínas.

Inhibición de la apoptosis Se ha encontrado que al agregar a la Trx-1 al medio de células linfoides en cultivo se previene la apoptosis inducida por L-cisteína y el consumo de GSH. También se ha reportado que la Trx-1 protege a las células de leucemia linfocítica crónica tipo B, contra la apoptosis asociada con un incremento en la secreción del factor de necrosis tumoral α (TNF-α), el cual es un factor de crecimiento autócrino para estas células. Además, en células linfoides WEHI7.2 de ratón que sobreexpresan Trx-1 humana se inhibió la apoptosis inducida por agentes como: dexametasona, taurosporina, tapsigargina o etopóside. La inhibición de la apoptosis ocasionada por la transfección con Trx-1 es similar a la ocasionada por la transfección del oncogén antiapoptótico bcl-2; sin embargo, se desconoce cómo se da el mecanismo y sólo se ha establecido que la Trx-1 interactúa con ASK1 y el NF-κB, como ya se mencionó antes.

Tiorredoxinas

❚ FUNCIÓN

DE LA

TRX

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EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS

Trx y cáncer Estudios recientes han demostrado una sobreexpresión de la Trx en algunos tumores cancerosos, en comparación con los tejidos normales. Al parecer, en etapas tempranas del desarrollo del cáncer, la Trx ejerce una acción benéfica, ya que neutraliza el estrés oxidativo, el cual se asocia con los diferentes agentes que promueven el cáncer. Sin embargo, en estados avanzados de esta enfermedad, la Trx promueve el crecimiento celular de los tumores, anulando de esta manera y aun sobrepasando, el efecto benéfico que ejerció en un principio. Además, dado que diversos agentes anticancerígenos actúan induciendo la apoptosis en las células neoplásicas, los efectos antiapoptóticos que ejerce la Trx reducen la efectividad de las estrategias de la quimioterapia. De hecho, actualmente diversos agentes quimioterapéuticos tienen como blanco algunos de los componentes del sistema de las Trx, y se encuentran bajo estudio otros agentes anticancerígenos con actividad inhibitoria sobre las Trx.

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Trx en enfermedades virales La participación de las Trx en enfermedades de origen viral, y en particular en la del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), es compleja. Al igual que en el desarrollo del cáncer, la Trx se presenta como un agente que puede ejercer tanto efectos protectores como efectos que pueden llegar a ser deletéreos. Los individuos infectados por VIH sufren serias alteraciones en el equilibrio redox y en consecuencia, los niveles de estrés oxidativo son altos. Una de las primeras observaciones en relación con los niveles de la Trx en pacientes con VIH fue que disminuyen de manera rápida con una infección aguda. Una posible explicación de este hecho es que los virus evaden las defensas inmunes del huésped y escapan a la eliminación por los macrófagos, ocasionando una pérdida masiva de sulfuro, lo cual altera la síntesis de las proteínas que contienen cisteína. Precisamente, tal es el caso de la Trx y de la Trx-R; sin embargo, y de manera contrastante, en estados avanzados de la infección por VIH, la concentración de la Trx en el plasma se incrementa, ya que el virus induce la expresión de la Trx. Se ha reportado que cerca de 25% de los pacientes con VIH presentan niveles incrementados de Trx-1, en comparación con los encontrados en el plasma de los pacientes control. Las concentraciones elevadas de la Trx podrían inhibir la replicación viral, en parte por cambios en el estado redox y en los enlaces bisulfito de CD4, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que además es un receptor primario para VIH-1. Sin embargo, las altas concentraciones de la Trx en

230

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

pacientes inmunocomprometidos pueden resultar perjudiciales, dado que impiden la función de los neutrófilos, disminuyendo la resistencia a la infección.

Trx en enfermedades cardiacas Existen diferentes estudios respecto a la función de la Trx en diversas patologías cardiacas, como: miocarditis, hipertrofia cardiaca e infarto de miocardio; sin embargo, no existe un consenso sobre el papel de la Trx en estas patologías, ya que su función puede variar. Así, la dicotomía o el efecto dual de la Trx se ponen de manifiesto en el caso de la hipertrofia cardiaca. La actividad antioxidante de la Trx protege al corazón contra el estrés oxidativo. Sin embargo, la Trx también es un mediador esencial en el crecimiento de los cardiomiocitos, contribuyendo de esta manera a la hipertrofia del corazón. Kishimoto et al. (2001), reportaron que las concentraciones de la Trx en el suero se encuentran incrementados en los pacientes con síndromes coronarios agudos, y esto correlaciona de manera positiva con la severidad de la enfermedad, según la clasificación de la asociación para enfermedades cardiacas: New York Heart Association. Estos resultados sugieren una posible asociación entre la secreción de la Trx y la severidad del daño en el corazón.

Trx y envejecimiento El estrés oxidativo se encuentra ligado al proceso del envejecimiento; en consecuencia, los efectos antioxidantes de las Trx, junto con los efectos antiapoptóticos, así como la acción de las Trx en la promoción del crecimiento, parecen ejercer protección contra los cambios celulares relacionados con la edad. Stadman et al. (2003), reportaron que la Trx es responsable de la reducción de la metionil sulfóxido reductasa, enzima que tiene un papel clave en el mantenimiento de la metionina, la cual es activa en su forma reducida. La pérdida de este proceso natural de reducción está asociada con el desarrollo de enfermedades neurológicas como la de Alzheimer.

Trx y sistema nervioso Se ha reportado que la Trx ejerce un efecto citoprotector en el sistema nervioso por un incremento en la acción del factor de crecimiento neuronal (NGF) mediado por la regulación anti-apoptótica, así como por la actividad antioxidante. El NGF tiene profundos efectos en las neuronas, incluyendo la promoción de la vía

Tiorredoxinas

•

231

de señalización de supervivencia y diferenciación. La Trx parece ser un cofactor neurotrófico que incrementa el efecto del NGF en la regeneración y en la diferenciación neuronal. Los individuos con enfermedad de Alzheimer presentan una disminución en las concentraciones de Trx-1, particularmente en la amígdala y en el hipocampo, y al mismo tiempo, la Trx reductasa se incrementa. Se ha sugerido que estos cambios pueden contribuir al aumento del estrés oxidativo y en consecuencia, a la neurodegeneración observada en esta enfermedad.

❚ CONCLUSIONES Aun cuando la familia de las Trx posee un papel importante dentro del sistema de defensa antioxidante de las células, todavía queda mucho por estudiar sobre este tipo de enzimas. En cuanto a su función en las patologías humanas, existe una gran cantidad de estudios que relacionan a la Trx con diversas enfermedades; no obstante, al parecer su papel es dual. La presencia de la Trx en etapas iniciales del desarrollo de la enfermedad tiene efectos benéficos, mientras que en etapas más avanzadas puede incrementar su concentración con consecuencias perjudiciales.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 14)

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H

15

EMOOXIGENASA Marisol Orozco-Ibarra José Pedraza-Chaverrí

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❚ INTRODUCCIÓN La hemooxigenasa (HO, EC 1.14.99.3) es la enzima que cataliza el paso que limita la velocidad de degradación del grupo hemo, donde se produce monóxido de carbono (CO), hierro y biliverdina. En un siguiente paso, la biliverdina reductasa convierte la biliverdina a bilirrubina (figura 15-1). En los mamíferos se ha descrito la expresión de al menos dos isoformas de la HO codificadas por dos diferentes genes, denominadas HO-1 y HO-2. En el cuadro 15-1 se mencionan algunas características de estas enzimas. Además, se había descrito una tercera isoforma, la HO-3, pero recientemente se ha demostrado en la rata que esta isoforma en realidad no existe; pues no se encontraron ni genes funcionales, ni mRNA, ni la proteína HO-3. La HO-2 es constitutiva, y la HO-1 es una isoforma inducible; su similitud en la secuencia de aminoácidos es de 45%. Estas isoformas se regulan y se expresan en tejidos de manera diferencial. La isoforma HO-2 se expresa en el cerebro, testículos, endotelio, hígado y la porción distal de la nefrona. Se piensa que esta isoforma funciona como un regulador fisiológico de las funciones celulares. En cambio, bajo condiciones fisiológicas, en la mayor parte de las células no se detec-

❚ 233 ❚

234

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

Cuadro 15-1. Características de las isoformas de la HO Característica

HO-1

HO-2

PM (kDa) Km1 Vmax1 Expresión Intrones Exones Sitios regulatorios2

32 0.24 μM 3.4 μmol/mg/h Inducible 4 5 NFkB, Nrf2, AP-1, AP-4, C/EBP, USF, MRE, HSE

36 0.67 μM 0.24 μmol/mg/h Constitutiva 4 5 Glucocorticoides

Datos obtenidos usando como sustrato el grupo hemo. proteínas de unión al intensificador CCAAT; USF, factor de estimulación en el extremo 5’; MRE, elemento de respuesta a metales; HSE, elemento de respuesta a choque térmico.

1

2 C/EBP,

ta la expresión de HO-1 o se detecta en niveles muy bajos. La expresión de la HO-1 ocurre como respuesta a una gran variedad de estímulos, entre los que se encuentran el grupo hemo, radiación UV, hipoxia, hiperoxia, hipertermia, isquemia, H2O2 y la eliminación del GSH, entre otros (cuadro 15-2). La hemina (grupo hemo que contiene Fe3+) es un inductor potente de HO-1 que se ha utilizado mucho en diversos estudios. Además, existen compuestos que inhiben la actividad de la HO (cuadro 15-3). Se ha comprobado que el gen de la HO-1 posee sitios de unión a factores de transcripción que se activan como respuesta al estrés oxidativo, como AP-1, AP-2, NF-kB y Nrf2. También se ha encontrado que la actividad del promotor de HO-1 se modula a través de la variabilidad en la longitud de nucleótidos de guanina y timina repetidos (GT)n. Los repetidos cortos de (GT)n presentan mayor susceptibilidad a la inducción de HO-1 que los repetidos largos. Como además se han encontrado evidencias acerca del efecto citoprotector de HO-1 en varios modelos in vitro e in vivo asociados con el estrés oxidativo, la detección de HO-1 se ha usado como evidencia de estrés oxidativo, y se ha sugerido que la HO-1 juega un papel citoprotector en la modulación de la respuesta de los tejidos al daño en varios estados fisiopatológicos.

❚ IMPORTANCIA DEL GRUPO HEMO El grupo hemo es un complejo de Fe2+ con protoporfirina IX, esencial para la función de las células aerobias. Sirve como grupo prostético de numerosas hemoproteínas con funciones biológicas diversas. Por ejemplo, la hemoglobina y la

Hemooxigenasa

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Biliverdina HOOC

COOH

Hemooxigenasa

Reductasa

Fe 2+, CO , H2O NADPH + H

NADP

O2

NADPH + H

+

NH

N

NH

NH

O HOOC

NADP

O HOOC

COOH

+

COOH

Biliverdina H

N Fe

H

N

NH

NH

N

NH

NH

2+

N

O

Grupo hemo

O

Bilirrubina

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Figura 15-1. Reacción que catalizan la hemooxigenasa y la biliverdina reductasa.

mioglobina (transporte de oxígeno), citocromos (transferencia de electrones), oxidasas, peroxidasas y catalasas (metabolismo del oxígeno), óxido nítrico sintasa, guanilato ciclasa y la NADPH oxidasa. En las células dañadas, la producción de especies reactivas de oxígeno podría tener como consecuencia la desestabilización de hemoproteínas, lo que a su vez podría conducir a la liberación del grupo hemo. Cuando se encuentra libre en altas concentraciones, el grupo hemo es un prooxidante lipofílico que promueve la lipoperoxidación de las membranas lipídicas y organelos como la mitocondria y el núcleo, también desestabiliza el citoesqueleto y las proteínas asociadas a la membrana, con lo que compromete la estructura y el transporte. Además, interfiere con la actividad de las enzimas citosólicas y mitocondriales, y activa las enzimas proteolíticas. En experimentos in vitro se ha demostrado que el grupo hemo es capaz de oxidar al DNA. Por otra parte, hay observaciones clínicas que prueban su marcada nefrotoxicidad cuando se administra en dosis elevadas a pacientes con la enfermedad de las porfirias. En las célu-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

Cuadro 15-2. Algunos estímulos que inducen la expresión de la HO-1 Químicos

Generales

(CoPP1,

hemina) Metaloporfirinas Metales pesados (Co, Pb, Cd) Prostaglandinas (NEPP112, 15d-PGJ(2)3) Flavonoides (quercetina, curcumina, ácido cafeico) Lipopolisacárido bacteriano H2O2 SnCl2 NO• y ONOO–

Hipoxia Hiperoxia Hipertermia Isquemia Depleción de GSH4 Radiación UV

Protoporfirina de cobalto. Prostaglandina promotora del desarrollo neurítico-11. 3 Prostaglandina (J)2 15-desoxi-δ (12,14). 4 GSH: Glutatión. 1 2

las dañadas, la inducción de la HO-1 acelera la degradación del grupo hemo liberado de las hemoproteínas, protegiendo así contra la citotoxicidad oxidativa secundaria a dicho grupo.

❚ IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DE

LA

HO-1

Además de su papel clave en el catabolismo del grupo hemo, se ha sugerido que la HO-1 desempeña una función muy importante en la protección contra el estrés oxidativo debido a que la HO-1 responde de inmediato ante una gran variedad de estímulos oxidativos. Asimismo, se ha observado en varios modelos, tanto in vitro como in vivo, que la expresión de esta enzima disminuye el daño celular. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de HO-1 atenúa los efectos tóxicos del grupo hemo en células endoteliales, y que protege al riñón de la nefrotoxicidad por dicromato de potasio. La importancia fisiológica de la HO-1 se demostró de manera contundente por medio de estudios en un paciente con deficiencia congénita de HO-1, y de los estudios con ratones transgénicos deficientes en HO-1. En 1999 se informó de un caso de deficiencia de HO-1 en un niño japonés de 26 meses de edad que sufría de fiebre recurrente y retraso severo en el crecimiento. Este niño presentaba un nivel bajo de bilirrubina (cerca de 0.3 mg/dL, normal 0.2 a 1.3), asociado con anemia hemolítica persistente y concentraciones extremadamente altas de grupo hemo en plasma (490 µM, cuando por lo general no

Hemooxigenasa

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Cuadro 15-3. Compuestos que inhiben la actividad de la HO

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Mesoporfirina de estaño (SnMP) Protoporfirina de estaño (SnPP) Protoporfirina de cinc (ZnPP) Mesoporfirina de cinc (ZnMP) Mesoporfirina de cromo (CrMP)

se detecta o es 3 mg/dL en suero humano) es un compuesto potencialmente tóxico, y cuando se acumula en el suero de neonatos causa ictericia. Si la concentración de bilirrubina es demasiado alta, atraviesa la barrera hematoencefálica y puede causar daño neuronal asociado con kernicterus. El tratamiento más común para la hiperbilirrubinemia es la fototerapia (exposición a luz azul); sin embargo, recientemente se han utilizado inhibidores competitivos de la actividad de HO-1, como la SnMP. Tomando en cuenta este comportamiento dual de los productos de la reacción de la HO-1, se ha sugerido que un nivel apropiado de inducción de HO-1 es benéfico, mientras que una inducción excesiva de HO-1 puede causar daño a tejidos.

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❚ ENFERMEDADES ASOCIADAS

CON

HO-1

La expresión de HO-1 se ha implicado en varios estados patológicos, como aterosclerosis, hipertensión, rechazo al trasplante, daño renal agudo, daño pulmonar agudo inducido por hiperoxia o hipoxia y cáncer, entre otros. En el cuadro 15-5 se describen algunos de los modelos experimentales donde se ha demostrado que la HO-1 ejerce un papel protector. Además, debe destacarse que la expresión de HO-1 modula varios procesos biológicos muy importantes, como la isquemia y reperfusión, inflamación, disfunción inmune y trasplante de órganos. Por tanto, en la actualidad, el estudio de la función de la HO-1 y sus productos es un área de investigación muy activa.

Isquemia y reperfusión La isquemia y reperfusión ocurren cuando se interrumpe la oxigenación de los tejidos (isquemia), y se restablece después de un periodo (reperfusión). Este pro-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

Cuadro 15-5. Modelos asociados con el estrés oxidativo donde la sobreexpresión de HO-1 ha mostrado efecto protector Modelo

Efecto de la HO-1

Nefrotoxicidad por K2Cr2O7 (ratas)

Previene parcialmente la proteinuria y la nitración de proteínas. Previene el aumento de BUN y creatinina Previene la fibrosis túbulo-intersticial Previene el aumento de AST en suero y la expresión de la caspasa-3, aumenta la expresión de Bcl-2 Previene la muerte celular, el incremento de MDA y la disminución de GSH Previene la muerte celular

Nefrotoxicidad por ciclosporina (ratas) I/R en hígado (ratas)

Toxicidad por etanol (hepatocitos) Toxicidad por β-amiloide y H2O2 (células SN56) Toxicidad por glutamato y H2O2 (NGC)

Previene la muerte celular y disminuye la formación de ERO

Abreviaturas. I/R, isquemia-reperfusión; NGC, neuronas granulares del cerebelo; AST, aspartato aminotransferasa; MDA, malondialdehído; GSH, glutatión reducido; ERO, especies reactivas de oxígeno.

ceso conduce a daño celular, que se ha involucrado con la formación de especies reactivas de oxígeno. La HO-1 ha mostrado tener una función protectora en el daño por isquemia y reperfusión en el corazón, riñón, hígado, cerebro y pulmón. El efecto citoprotector de la HO-1 se ha reproducido mediante la administración de CO y bilirrubina, por lo que se ha sugerido que la citoprotección que se ha observado por la sobreexpresión de HO-1 se debe a diversos factores, entre los que se incluyen función antioxidante, mantenimiento de la microcirculación, función antiapoptótica y antiinflamatoria.

Inflamación La inflamación es un sistema de defensa que el organismo utiliza principalmente para protegerse de invasores patógenos, eliminar las células dañadas y prevenir los daños posteriores. Se ha demostrado que la HO-1 juega un papel importante en la respuesta inflamatoria. En algunos modelos de inflamación, la inhibición de HO-1 aumenta significativamente el infiltrado inflamatorio, mientras que por el contrario, la inducción previa de HO-1 reduce de manera notable la inflamación. Por tanto, se ha su-

Hemooxigenasa

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243

gerido que la actividad de HO-1 modula la respuesta inflamatoria. Así, se ha demostrado que la inducción de HO-1 reduce la inflamación del intestino y disminuye el daño de la mucosa en un modelo animal de isquemia del intestino delgado. La importancia de la HO-1 en la inflamación se apoya por el fenotipo proinflamatorio que presentan los animales deficientes en HO-1. Por otra parte, varios mediadores proinflamatorios se activan por la deficiencia o la sobreexpresión de HO-1, y se ha demostrado que algunos de estos mediadores confieren protección a través de sobreexpresión de HO-1. Por ejemplo, la interleucina 10 (IL-10) en un modelo murino de sepsis y la IL-13 en aloinjertos cardiacos. Sin embargo, algunos mediadores proinflamatorios como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), IL-1, lipopolisacáridos (LPS) y los lípidos oxidados, también inducen la expresión de HO-1 en las células endoteliales y en macrófagos. Además, varias moléculas de adhesión que son mediadores clave de la inflamación, como ICAM-1, VCAM-1 y selectina, también son activadas por inductores de la HO-1. Por último, se ha demostrado que la inducción de HO-1 inhibe la adhesión de leucocitos en las células endoteliales vasculares a través de la acción de sus metabolitos bilirrubina y CO.

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Trasplante El trasplante es un procedimiento quirúrgico para extirpar un órgano lesionado o enfermo y reemplazarlo por el órgano sano de un donante. Se llama alotrasplante cuando el órgano procede de un individuo de la misma especie, mientras que el xenotrasplante consiste en trasplantar un órgano de un donante animal a un receptor humano. El área de trasplantes es una de las áreas que ha generado más interés en la investigación de HO-1. La HO-1 se induce en varios modelos de rechazo agudo al trasplante, y se ha localizado predominantemente en células infiltradas. Tal inducción es relevante en el aspecto funcional, ya que la ausencia de HO-1 conduce a un rechazo acelerado del injerto en el alotrasplante y el xenotrasplante. La inducción de HO-1 también atenúa el daño por isquemia y reperfusión que afecta la calidad del órgano donado y el trasplante subsiguiente. Por ejemplo, la inducción de HO-1 con protoporfirina de cobalto (CoPP) o por la transferencia génica adenoviral de HO-1, ha atenuado el daño por isquemia y reperfusión y prolongado la supervivencia después de la isquemia y trasplante de hígado. En un estudio más reciente se encontró que la sobreexpresión de HO-1 por la administración de CoPP atenuó significativamente el rechazo crónico de los aloinjertos renales. La exposición del donador y del injerto a CO confiere un efecto protector hacia el daño por isquemia y reperfusión asociado con el trasplante de corazón.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

Además, el CO (250 ppm) mejora la función de injertos renales y tiene un efecto protector contra el daño inducido por isquemia y reperfusión renal. También se ha demostrado que un péptido derivado de las cadenas pesadas de los antígenos de leucocitos humanos clase I (HLA), denominado RDP1258, posee funciones inmunorregulatorias mediante la modulación de la actividad de HO-1. Estos desarrollos recientes proporcionan nuevos enfoques terapéuticos en el éxito general del trasplante de órganos y la prolongación de la supervivencia del injerto. Así, la modulación de la HO-1 podría servir como un nuevo tratamiento en el trasplante.

Aterosclerosis La aterosclerosis se clasifica como una enfermedad inflamatoria que se ha asociado con depósitos de ácidos grasos, colesterol y calcio, entre otras sustancias, sobre las paredes arteriales. Como resultado, se produce el engrosamiento, endurecimiento y por último, la obstrucción de las arterias. La expresión de HO-1 en la aterosclerosis parece ser una respuesta protectora. Esta aseveración es apoyada por los siguientes hallazgos: en primer lugar, se ha encontrado un aumento de la proteína y del mRNA de HO-1 en las placas ateroscleróticas de humanos, lo cual es una evidencia in vivo de que la expresión de la HO-1 está implicada en la aterosclerosis. Un aumento en la expresión de HO-1 también está presente en las lesiones avanzadas en modelos animales de aterosclerosis. En segundo lugar, la sobreexpresión de HO-1 en la vasculatura de ratones deficientes en apolipoproteína E (apoE) atenúa el desarrollo de la aterosclerosis. En tercer lugar, la inhibición de la actividad enzimática de HO-1 en los conejos hiperlipidémicos Watanabe conduce a una aterosclerosis acelerada. En cuarto lugar, los ratones deficientes de HO-1 y de apoE desarrollan más aterosclerosis que los ratones de tipo silvestre. Por último, las lipoproteínas aterogénicas que han sido implicadas en la patogénesis de la aterosclerosis, como las lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas, son potentes inductores de HO-1 en las células vasculares y en las células epiteliales renales. Aún más importante es que las LDL oxidadas, que median la inducción de HO-1, también inhiben la quimiotaxis, un evento inflamatorio clave de la aterosclerosis. Se ha encontrado que el estímulo más importante de la inducción de HO-1 en la placa aterosclerótica lo constituyen las LDL oxidadas. Más específicamente, el hidroperóxido de linoleilo, que forma parte de dichas LDL, es el que estimula la HO-1 por un mecanismo transcripcional. Se sabe que las LDL oxidadas causan la acumulación nuclear del factor de transcripción Nrf2 (factor 2 relacionado con el factor nuclear de transcripción eritroide p45 NF-E2), el cual, a su vez, activa la HO-1. Esto se debe a que la unión del factor Nrf2 a la secuencia promotora de elementos de respuesta antioxidante con-

Hemooxigenasa

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duce a una sobrerregulación coordinada de genes antioxidantes y destoxificantes controlados por la respuesta antioxidante, entre los que se encuentra la HO-1.

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Reestenosis vascular y otras enfermedades cardiacas Se llama reestenosis al proceso en el que se cierra una arteria que ha sido abierta antes por un procedimiento como la angioplastia. Varias evidencias sugieren que la sobrerregulación de la HO-1 puede ser un factor protector importante después de la angioplastia de globo en las enfermedades cardiovasculares como la reestenosis vascular. Por ejemplo, se ha demostrado que la preinducción de HO-1 atenúa la proliferación de neoíntima vascular después de la angioplastia de globo, mientras que la inhibición de la actividad enzimática de HO empeora la lesión. Por otro lado, los ratones transgénicos deficientes en HO-1 manifiestan una proliferación de neoíntima vascular muy exagerada después del daño inducido por un tubo. Además, se ha sugerido que los efectos antiproliferativos de la rapamicina en las células de músculo liso vascular son mediados a través de la inducción de HO-1. Por tanto, como las endoprótesis cubiertas de rapamicina previenen la reestenosis después de la angioplastia, se ha sugerido que la HO-1 juega un papel fundamental en el efecto benéfico de la rapamicina en el daño vascular. Los estudios que se han enfocado sobre las regiones de repetición polimórfica (GT)n en el promotor proximal de HO-1 de humanos han producido resultados interesantes en la reestenosis vascular. En un estudio de la asociación de la longitud del polimorfismo del promotor del HO-1 de humanos y la reestenosis vascular periférica, se demostró una disminución de la inflamación después de la angioplastia de globo en pacientes con repetidas cortas de (GT)n, en comparación con pacientes con repetidas largas. Estos hallazgos fueron confirmados en la reestenosis de la arteria coronaria, donde los portadores de repetidas largas de (GT)n tuvieron un riesgo de casi cuatro veces mayor de reestenosis comparado con los portadores de repetidas cortas. También se observó una asociación significativa entre el polimorfismo de (GT)n de HO-1 y el aneurisma aórtico abdominal. Sin embargo, no se ha encontrado asociación entre el polimorfismo de las repetidas de (GT)n de HO-1 y la enfermedad de Kawasaki o la vasculitis en niños japoneses.

Enfermedades renales Las enfermedades renales son todos aquellos trastornos que afectan el funcionamiento de los riñones. Los estudios utilizando inductores e inhibidores químicos, así como ratones transgénicos deficientes en HO-1, han demostrado que la expresión de esta enzima es citoprotectora en modelos de daño renal asociados o

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

no con la liberación de grupo hemo. Por ejemplo, en un estudio se encontró que el daño por isquemia y reperfusión en riñón se acompañó de la inducción significativa del mRNA y del aumento de la actividad de HO-1, lo cual se relacionó con un aumento en la concentración del grupo hemo en el retículo endoplasmático. La inhibición de HO con SnMP exacerbó el daño renal y aumentó la concentración del grupo hemo. Por el contrario, el pretratamiento con SnCl2 previno ambos efectos. También se ha observado que el mRNA de HO-1 se induce en el riñón después de la administración del agente antineoplásico conocido como cisplatino, fármaco cuyo efecto colateral es la nefrotoxicidad. Se ha demostrado que la inhibición de la HO-1 agrava el daño renal inducido por cisplatino, mientras que su inducción disminuye claramente dicho daño.

Daño pulmonar La hipoxia se refiere a la falta de suministro de oxígeno, mientras que la hiperoxia es el estado que presenta un organismo sometido a un régimen respiratorio con exceso de oxígeno. Se ha encontrado que la inducción de HO-1 protege del daño pulmonar secundario a la hiperoxia y a la hipoxia. Parece ser que la generación de CO es el mecanismo involucrado en estos modelos, ya que la administración exógena de CO también protege contra el daño pulmonar. Además, en el daño por isquemia y reperfusión pulmonar de ratón, así como en cultivos primarios de células endoteliales de arteria pulmonar de rata, la sobreexpresión de HO-1 atenúa la apoptosis.

Hipertensión La hipertensión se refiere al hecho de que la sangre viaje por las arterias a una presión mayor que la normal. En ratas Dahl sensibles a sal, la expresión arterial coronaria de HO-1 condujo a vasodilatación coronaria y cardioprotección. Usando un inhibidor de HO-1, el cual previene la producción endógena de CO, se demostró que la hipertensión inducida por acetato de desoxicorticosterona (DOCA) y sal está asociada con el aumento en la generación endógena de CO, el cual puede tener una función en la disfunción endotelial. La sobreexpresión de HO-1 conduce a una reducción en la respuesta presora a angiotensina II. Quizá esto se debe al aumento en la generación de uno de los metabolitos de HO-1, posiblemente el CO, el cual tiene la habilidad de inhibir la reactividad vascular a los estímulos constrictores. Varios estudios han documentado la inducción renal, cardiaca y vascular de HO-1 en la respuesta a angiotensina II tanto in vivo como in vitro. También se ha demostrado que el CO derivado de la actividad de HO-1

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juega un papel en la supresión de la respuesta hipertensiva aguda in vivo, y que la hipertensión renovascular y la insuficiencia renal aguda se exacerban en ratones deficientes en HO-1, sugiriendo un papel protector de HO-1 en la hipertensión.

Preeclampsia La preeclampsia es una alteración hipertensiva que se presenta durante el embarazo; se caracteriza por el aumento en la presión arterial, hinchazón en la cara, manos, pies y proteinuria. El desarrollo de esta condición se ha asociado, entre otros factores, con el estrés oxidativo endotelial y la expresión de HO-1. Por ejemplo, se ha encontrado que las concentraciones de HO-1 son significativamente menores en la placenta de mujeres con preeclampsia, en comparación con la placenta de mujeres sanas en el mismo tiempo de gestación. Además, la inducción de HO-1 con TNF-α atenuó de manera significativa el daño celular y la respuesta inflamatoria en explantes vellosos de placenta. También se ha encontrado que la regulación de HO-1 puede modular la expresión de moléculas de adhesión, ya que el tratamiento de células endoteliales con un inhibidor de HO-1 acabó con el aumento en la expresión de las moléculas de adhesión.

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Diabetes La diabetes se caracteriza por la presencia de concentraciones elevadas de glucosa en la sangre, también llamada hiperglucemia, que puede ser producida por deficiencia en la secreción de insulina o por la pérdida de respuesta a la acción de la insulina, o por ambas. Se ha demostrado que la diabetes está asociada con un aumento en el estrés oxidativo y en la expresión de HO-1 en hígado y riñón. También se ha reportado que existe una disminución en la actividad de HO-1 en las etapas tempranas de la diabetes, y un aumento del número de células endoteliales circulantes en las ratas con diabetes inducida por estreptozotocina. La sobreexpresión de HO-1 en ratas diabéticas resultó en un aumento de bilirrubina sérica, reducción en la producción de especies reactivas de oxígeno y disminución del número de células endoteliales en la circulación. Además, la hiperglucemia per se reprime la expresión génica de HO-1, mientras que la disminución de la glucosa la aumenta. Por otra parte, en modelos de trasplante de islotes en roedores, la preinducción de HO-1 protege del estímulo proapoptótico y mejora la función de los islotes. Los estudios realizados en ratones HO-1-/y +/+ diabéticos y no diabéticos han demostrado que los animales que carecen de HO-1 son más susceptibles al daño por isquemia y reperfusión del miocardio, y la presencia de la diabetes empeora el daño. El tamaño del infarto de miocar-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

dio es significativamente mayor en ratones deficientes en HO-1, mientras que la sobreexpresión de HO-1 protege contra el daño al miocardio en ratas diabéticas.

Cáncer Se sabe que la HO-1 se expresa en una gran variedad de tumores, contribuyendo directamente a su crecimiento rápido debido a sus efectos antioxidantes y antiapoptóticos. Se piensa que la acción antiapoptótica de HO-1 se debe a múltiples mecanismos, como la disminución de los niveles de prooxidantes intracelulares y un aumento de los niveles de bilirrubina y de CO. El CO ejerce sus efectos antiapoptóticos inhibiendo la expresión de la proteína supresora de tumores p53 y la liberación de citocromo c mitocondrial. Se ha demostrado que el tratamiento con ZnPP en células de carcinoma de colon humano aumenta la respuesta quimioterapéutica de las células tumorales y reduce el crecimiento de tumores, lo que sugiere que la modulación de HO-1 puede ser un blanco atractivo en las intervenciones quimioterapéuticas. Por otra parte, se ha demostrado en células de carcinoma papilar tiroideo que la inducción de HO-1 reduce de manera notable la sensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos. Esto refuerza la idea de que la HO-1 puede ser un blanco efectivo para el tratamiento anticáncer. En contraste, también se ha demostrado que la inducción de la HO-1 tiene un efecto citoprotector en el cáncer. Por ejemplo, se ha descrito una asociación entre la susceptibilidad al desarrollo de adenocarcinoma de pulmón y el polimorfismo del promotor del gen de HO-1 en fumadores japoneses de sexo masculino. La proporción de la frecuencia de repetidas largas fue mayor en pacientes con adenocarcinoma en comparación con sujetos sanos. Debido a que los alelos tipo largo del polimorfismo (GT)n están asociados negativamente con la expresión de HO-1, se deduce que en estos pacientes la falta de respuesta de HO-1 ante el estrés se relaciona con el cáncer, sugiriendo que la HO-1 tendría un papel anticancerígeno. Esto podría deberse a que la actividad de HO-1 tiene un efecto citoprotector no sólo contra agentes oxidantes, sino contra algunos agentes carcinógenos como el benzopireno, mientras que la bilirrubina puede proteger el DNA del daño causado por el humo de cigarro. Estudios adicionales seguramente delinearán el papel que juega la inducción de la HO-1 en el cáncer y sus mecanismos.

Enfermedades neurodegenerativas La HO-1 también se ha relacionado con evento vascular cerebral o ictus, así como con las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington debido a que se ha demostrado una importante participación de los radicales libres y las espe-

Hemooxigenasa

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cies reactivas de oxígeno en el desarrollo de este tipo de padecimientos (véase capítulo de Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas).

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❚ ESTUDIOS

EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se ha estudiado la expresión y función de la HO1 en la nefrotoxicidad inducida por dicromato de potasio, utilizando SnCl2 como un inductor y ZnPP como un inhibidor de esta enzima. La presencia de HO-1 en el riñón se valoró midiendo su actividad y mediante técnicas de inmunohistoquímica y de western blot. La actividad de la HO-1 se mide espectrofotométricamente en microsomas aislados del homogenado renal; la mezcla reacción contiene, además de los microsomas, hemina, glucosa 6-fosfato, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, NADPH y citosol de hígado de ratón como fuente de biliverdina reductasa. Esta mezcla se incuba sin luz y después se utiliza cloroformo para extraer la bilirrubina formada, la cual se mide realizando un barrido de 550 a 450 nm. Para el cálculo se usa la diferencia de densidades ópticas a 464 nm y 530 nm, y el coeficiente de extinción molar de la bilirrubina (ε=40 mM-1cm-1). Por su parte, la nefrotoxicidad inducida por dicromato de potasio se determinó mediante marcadores de daño renal como la depuración de creatinina, concentración de nitrógeno ureico sanguíneo, excreción urinaria de proteínas totales y de la enzima N-acetil-β-D-glucosaminidasa y mediante análisis histológicos. El estrés oxidativo inducido por el dicromato de potasio se midió por la presencia de proteínas oxidadas, y el estrés nitrosativo mediante la presencia de 3 nitrotirosina. El dicromato de potasio per se indujo un aumento leve en la concentración de HO-1 en el riñón. La inducción previa de HO-1 con SnCl2 antes de la administración del dicromato de potasio previno la nefrotoxicidad y estrés oxidativo y nitrosativo. Además, la administración conjunta del inductor y del inhibidor (ZnPP) evitó el efecto protector del SnCl2, sugiriendo que dicha protección se debe a la inducción previa de HO-1. Además, la inducción de HO-1 al mismo tiempo o después de la administración del dicromato de potasio no pudo mejorar el daño renal inducido por este tóxico. Actualmente, en el laboratorio de los autores se continúa estudiando el papel de la HO-1 en otros modelos experimentales.

❚ CONCLUSIONES La inducción de HO-1 tiene una función importante en la fisiopatología de varias enfermedades, como aterosclerosis, hipertensión, daño renal agudo, daño pulmonar, cáncer, así como otras enfermedades multisistémicas. La sobrerregulación de HO-1 por varios estímulos también modula procesos biológicos clave como la

250

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 15)

inflamación, daño isquémico y rechazo al trasplante. Las implicaciones biológicas de la reacción catalizada por HO-1 han ido más allá de la descripción inicial de su función, como la enzima que cataliza la degradación del grupo hemo. En los últimos años se ha enfatizado la consideración de que los productos de reacción de HO-1 presentan efectos tanto benéficos como potencialmente dañinos. Además, hay una heterogeneidad considerable en la respuesta de los tejidos al daño, y la inducción de HO-1 puede no ser siempre benéfica.

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Hemooxigenasa

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© Editorial El

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G

16

LUTATIÓN

José C. Fernández Checa Carmen García Ruiz

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❚ INTRODUCCIÓN El glutatión (GSH) es uno de los tioles no proteínicos más estudiados a nivel intracelular debido al papel crítico que juega en la fisiología y bioquímica celular. El GSH es un tripéptido que se encuentra en altas concentraciones en todas las células. Se sintetiza a partir de los aminoácidos glutamato, cisteína y glicina. El GSH tiene ciertas características estructurales que son las responsables de su estabilidad, así como de sus funciones biológicas (figura 16-1). Por ejemplo, el enlace peptídico que une el amino terminal del glutamato al residuo de cisteína dentro del GSH es a través del grupo γ-carboxilo del glutamato, y no por el grupo α-carboxilo, que es el que normalmente se une de manera convencional. Este arreglo tan poco frecuente le permite a la molécula resistir la degradación por peptidasas intracelulares y sólo puede ser hidrolizada por una enzima conocida: la γ-glutamiltranspeptidasa (GGT). Por si fuera poco, el segmento del carboxilo terminal de la glicina del GSH protege a la molécula del rompimiento por la enzima γ-glutamilciclotransferasa intracelular. Como consecuencia, el GSH es metabolizado de manera extracelular únicamente por la GGT, que actúa en la cara externa de ciertos tipos celulares, además de que se protege el grupo sulfhidrilo

❚ 253 ❚

254

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 16)

(-SH) de la cisteína, que es requerido para las funciones que realiza el GSH (en particular la regulación de los puentes o enlaces disulfuro de las proteínas y para deshacerse de moléculas oxidantes y electrófilos). A pesar de que el GSH se sintetiza de manera exclusiva en el citosol, esta molécula se distribuye en los organelos intracelulares, incluyendo el retículo endoplasmático y la mitocondria. El GSH se encuentra de manera predominante en su forma reducida (GSH), excepto en el retículo endoplasmático, en donde existe principalmente como glutatión oxidado (GSSG), quizá debido a la necesidad de que exista un ambiente adecuado para el manejo de las proteínas, puesto que de encontrase en su forma reducida, el GSH podría reducir a la enzima isomerasa encargada de formar los puentes disulfuro en las proteínas. En la mitocondria, el GSH por lo general sí se encuentra en la forma reducida, aunque representa una fracción minoritaria del GSH total (10 a 15%). Considerando el volumen de la matriz mitocondrial, la concentración del GSH mitocondrial (GSHm) se considera similar a la concentración de este tripéptido en el citosol (10 a 14 mM). Dada la gran variedad de papeles que juega el GSH en la fisiología celular, los cambios en la homeostasia del GSH se han visto implicados en la etiología y progresión de una gran cantidad de enfermedades humanas. En este capítulo se tratará tanto la regulación como las funciones del GSH, así como su papel en el estrés oxidativo y la muerte celular.

O – C

+NH 3

O H γ-glutamato C O HN Glicina

H

SH

O NH Cisteína

C O – O Glutatión reducido (GSH) -Glutamil-cisteinil-glicina

Figura 16-1. Estructura del GSH y sus aminoácidos constituyentes. El enlace entre el glutamato y la cisteína determina la estabilidad del GSH y su resistencia frente a la hidrólisis, mientras que su efecto antioxidante es determinado principalmente por el grupo SH reducido de la cisteína.

Glutatión

•

255

❚ HOMEOSTASIA DEL GSH Biosíntesis del GSH

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a) Inhibición competitiva por retroalimentación por el GSH. La inhibición por el GSH es no alostérica, e implica la unión del GSH al sitio de la enzima donde se une el glutamato. b) La disponibilidad del precursor de L-cisteína también regula a la GCS. Los valores aparentes de la Km del GCS por el glutamato y la cisteína son 1.8 y 0.1 a 0.3 mM, respectivamente. La concentración intracelular de glutamato es varios órdenes de magnitud mayor que el valor de Km que tiene la GCS, por lo que su disponibilidad no sería un factor limitante, mientras que la concentración intracelular de cisteína se aproxima a los valores aparentes de Km de la enzima para este aminoácido. De modo que, en este caso, tanto la disponibilidad intracelular de la cisteína como la actividad de la enzima influyen en gran medida la tasa de síntesis del GSH.

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El GSH existe en altas concentraciones en todos los tipos celulares, y es sintetizado en el citosol a partir de los aminoácidos precursores. La regulación de la biosíntesis del GSH depende principalmente, y como factor limitante, de la disponibilidad de la cisteína. El hígado tiene características únicas que regulan la síntesis del GSH debido a que los hepatocitos son capaces de convertir a la metionina en cisteína a través de la transulfuración. Además, la velocidad de biosíntesis del GSH en los hepatocitos está regulada por su tasa de exportación, principalmente hacia el plasma y la bilis. La síntesis del GSH se realiza a partir de sus constituyentes aminoacídicos: L-glutamato, L-cisteína y L-glicina, y comprende dos eventos enzimáticos que son dependientes de la hidrólisis de ATP (figura 16-2). El primer paso de la biosíntesis del GSH es el paso limitante, y está catalizado por la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa (GCS), que depende totalmente de Mg2+ o Mn2+. La GCS está compuesta de una subunidad pesada (GCS-HS Mr cerca de 73 000) y una ligera (GCS-LS Mr casi 30 000), que son codificadas por diferentes genes, tanto en el humano como en la rata. La subunidad pesada es la que presenta toda la actividad catalítica de la enzima aislada, y es susceptible de inhibirse por retroalimentación por las concentraciones de GSH. Por otro lado, la subunidad ligera juega un papel importante en la regulación de la función global de la enzima, y permite a la holoenzima ser catalíticamente más eficaz y estar menos expuesta a la inhibición por el GSH que la subunidad pesada sola. La GCS está regulada fisiológicamente por dos factores importantes:

El segundo paso en la síntesis del GSH está catalizado por la enzima glutatión sintetasa (GS) (figura 16-2). Esta enzima no ha sido estudiada de manera tan

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

ATP

ADP+

ATP

-GCS L-cisteína

ADP+

-glutamil -L-cisteína

L-glutamato

(Capítulo 16)

GSH GS

L-glicina

Figura 16-2. Síntesis de GSH. La biosíntesis del GSH requiere de glutamato, cisteína y glicina, los cuales se unen en dos pasos catalizados por las enzimas γ-glutamilcisteína sintetasa (GCS) y glutatión sintetasa (GS). Estas enzimas adicionan la glicina a la γ-glutamilcisteína. Ambas requieren de la energía proveniente de la hidrólisis del ATP, por lo que la síntesis del GSH es un mecanismo consumidor de energía. Además de la presencia de la GCS, que es la enzima limitante, la disposición de la cisteína regula la síntesis del GSH.

exhaustiva como la GCS. Se han usado análogos de los sustratos para determinar los sitios de unión de la enzima, y se ha reportado que las regiones del sitio activo que unen a la glicina y al segmento cisteinil de la γ-glutamilcisteína son altamente específicos. Aunque se ha visto que el segmento L-γ-glutamil puede ser reemplazado por varios análogos moleculares, lo que indica que este sitio de unión no es tan específico. La GS no está sujeta a inhibición por retroalimentación directamente por el GSH. Se ha encontrado que la sobreexpresión de la enzima GS no incrementa los valores de GSH, mientras que la sobreexpresión de GCS sí lo hace; sin embargo, la deficiencia de la enzima GS en los humanos puede tener consecuencias drásticas en el metabolismo, ya que la γ-glutamilcisteína acumulada se convierte en 5-oxoprolina, la cual causa acidosis metabólica severa. Una vez establecido que la disponibilidad de la cisteína es un factor crítico y determinante para la síntesis del GSH, se entiende que los factores que regulan los niveles intracelulares de este aminoácido, regulan la biosíntesis del GSH y por tanto, también a los niveles intracelulares del mismo. Entre estos factores se encuentra el transporte de la cisteína, así como de otros aminoácidos que pueden transformarse en dicho aminoácido, como la cistina (mediante reducción) o la metionina (vía transulfuración en hepatocitos) (figura 16-3). En cuanto a la regulación de la GCS, se sabe que esta enzima puede ser regulada a nivel transcripcional y postranscripcional, y ya se han descrito algunas hormonas que modulan los niveles de GSH hepático mediante su acción sobre la enzima GCS.

Degradación del GSH En contraste con la síntesis del GSH que ocurre a nivel intracelular, la degradación del mismo ocurre exclusivamente en el espacio extracelular y sólo en las

Glutatión

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257

Metionina

Metionina SAM

MAT 1A SAM

S-adenosil-L-metionina, SAM

ALCOHOL (LPS)

SAH

TNF Otras funciones Homocisteína ERO

GSH Cistationina

Cisteína

-glutamilcisteina

GSH

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Figura 16-3. La vía de la transulfuración en los hepatocitos. Si la disponibilidad de cisteína es limitada, la metionina puede convertirse en cisteína para ser usada en la biosíntesis del GSH mediante la transulfuración. Un componente clave en este proceso es el metabolito S-adenosil-L-metionina (SAM), que actúa como un precursor de GSH en los hepatocitos, y además previene la supresión o eliminación del GSH por agentes como el alcohol.

células que expresan a la enzima GGT. Como se mencionó antes, ésta es la única enzima que puede iniciar el catabolismo del GSH, de los conjugados S-glutatión (glutathione S-conjugates) y de los complejos asociados al GSH en condiciones fisiológicas. En particular, la GGT es abundante en la superficie apical de la mayor parte de los epitelios transportadores, incluyendo a las membranas hepáticas canaliculares y los ductos biliares. Debido a que la GGT es una enzima unida a la membrana con su sitio activo expuesto hacia la superficie extracelular de la membrana, la exportación del GSH y sus aductos hacia el espacio extracelular es el paso inicial y quizá el más regulado en su interconversión en las células de los mamíferos. La GGT remueve el segmento que contiene al glutamil del GSH (y de los compuestos que contienen GSH), para dar lugar a la cisteinilglicina o a los conjugados cisteilglicina-S. Posteriormente, estos compuestos son sustratos de dipeptidasas, las cuales hidrolizan el enlace peptídico entre la cisteína y la glicina. Las dipeptidasas también son ectoproteínas, por lo que estas reaccio-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 16)

nes también ocurren en el espacio extracelular. El transporte hepático del GSH hacia el plasma y la bilis contribuyen a su metabolismo extrahepático.

❚ FUNCIONES

BIOLÓGICAS DEL

GSH

Destoxificación de electrófilos de Michael y metales La destoxificación de los xenobióticos o de sus metabolitos es una de las funciones principales del GSH. Siendo el GSH un nucleófilo, tiene como blanco a segmentos electrófilos del tipo de los carbonilos α y β insaturados, o bien electrófilos del tipo de Michael. Estos compuestos forman conjugados con el GSH, ya sea de manera espontánea o gracias a la intervención de algunas enzimas, en reacciones catalizadas por la GSH S-transferasa. Esta reacción da como resultado no sólo la remoción del electrófilo vía su metabolismo subsiguiente o transporte fuera de la célula, sino que también contribuye a la eliminación potencial del GSH, sobre todo si la biosíntesis del GSH no se encuentra en equilibrio con la tasa o velocidad de supresión del electrófilo. El metabolismo de los conjugados del GSH comienza con el rompimiento del segmento γ-glutamil por la enzima GGT, lo que hace que del tripéptido original sólo quede el segmento del conjugado de dos residuos de aminoácidos: cisteinil-glicina. El enlace del dipéptido cisteinil-glicina es roto por la dipeptidasa, resultando en un conjugado cisteinilo, el cual sufre una N-acetilación formando el ácido mercaptúrico. El metabolismo de los conjugados del GSH hasta llegar al ácido mercaptúrico comienza ya sea en el árbol biliar, el intestino o el riñón, pero la formación del conjugado N-acetilcisteína por lo general sólo ocurre en este último tejido. Además de los compuestos exógenos, muchos compuestos endógenos siguen una vía metabólica similar. Algunos ejemplos incluyen al 17β–estradiol, a los leucotrienos y a las prostaglandinas. El GSH también forma complejos con metales mediante reacciones no enzimáticas. Otro papel del GSH está relacionado con el metabolismo de diversos metales, como son mercurio, plata, cadmio, arsénico, plomo, oro, cinc y cobre. Este tripéptido es uno de los ligandos unidores de metales más versátiles, y funciona en la movilización y distribución de los mismos entre sus diversos ligandos, así como en su transporte a través de las membranas celulares. De igual manera, el GSH puede funcionar como agente reductor o cofactor en las reacciones redox que involucran metales. Lo anterior se debe a que el grupo sulfhidrilo del segmento de cisteína tiene una alta afinidad por metales, y puede formar compuestos tipo mercáptidos con los metales antes mencionados. Estos compuestos son termodinámicamente estables, pero cinéticamente lábiles.

Glutatión

•

259

Mantenimiento del estatus de los tioles El GSH es esencial en mantener el equilibrio redox intracelular, y el estatus de los tioles proteínicos esenciales. Para lograrlo, dos moléculas de GSH son oxidadas en una reacción en la que se intercambia el grupo tiol de cada una de las cisteínas por un enlace disulfuro, dando como resultado el glutatión reducido (GSSG). Esta reacción es catalizada por la enzima tiol transferasa de la manera siguiente: Proteína-S-S-proteína + 2 GSH-→ proteína-SH + HS-proteína + GSSG Como esta reacción es irreversible, el equilibrio se determina por el estado redox de la célula, que a su vez depende de las concentraciones del GSH y del GSSG (proporcional al logaritmo de [GSH]2/[GSSG]). Por lo general, el GSSG se mantiene en concentraciones muy bajas ( productos) define la concentración en estado estacionario de A ([A]), de acuerdo con [A] = (-dA/dt)/k × [B]. El espacio intracelular es simplificado y considerado homogéneo, y se utilizan constantes de reacción determinadas en sistemas químicos definidos. Para la vía de Fenton/Haber-Weiss, la velocidad celular de producción de O2• (+ dO2-/dt) se toma como igual a la producción de O2• por las mitocondrias (corazón) o por las mitocondrias y el citosol (hígado). De manera similar, para la vía de Beckman-Radi-Freeman, la velocidad celular de producción de NO• (+ dNO/dt) se toma como igual a la suma de la producción de NO• por las mitocondrias y el citosol. A partir de los estados estacionarios de O2• y de NO• se calculan los estados estacionarios de los otros intermediarios. Los estados estacionarios de algunos intermediarios difusibles como H2O2, NO• y ROOH y del malondialdehído (MDA) pueden determinarse experimentalmente en células aisladas y aportan a la confirmación de los órdenes de magnitud de los niveles calculados. La quimioluminiscencia espontánea de órganos in situ o perfundidos y de células aisladas provee una estimación independiente del estado estacionario del 1O2. El cuadro 21-2 presenta una lista de las concentraciones en estado estacionario de las principales especies químicas que participan de la reacción bioquímica en cadena mediada por radicales libres, y además provee una estimación de los tiempos de vida media de los intermediarios (t½) calculados por ecuaciones cinéticas simples. Es de notar que los t½ indican que estos intermediarios son de rápido recambio y que deben considerarse como especies muy reactivas e inestables en los sistemas biológicos. Con esta concepción global de reacción en cadena y con reacciones individuales de segundo orden, la ley de acción de las masas indica que un aumento en la concentración de cualquiera de los intermediarios aumenta las velocidades de reacción y de todos los intermediarios cuesta abajo. En ese sentido, se ha formulado una definición alternativa al considerar que el estrés oxidativo intracelular es una situación en la que el aumento de la concentración en estado estacionario de uno de los intermediarios incrementa la velocidad de la reacción en cadena y el consumo de los antioxidantes endógenos.

Determinación del estrés oxidativo en seres humanos...

•

323

Cuadro 21-2. Concentraciones en estado estacionario y vida media de intermediarios de la cadena de reacciones de radicales libres en células de mamíferos Especie química

Estado estacionario (M)

Vida media (t1/2) (seg)

10-10 10-11 10-7 10-16 10-7 10-8 10-7 10-10 10-9 10-6 10-15

10-4 10-3 0.1 10-9 10-2 0.5 0.2 10-7 10-5 0.1 10-6

O 2• (intramitocondrial) O2• (citosólico) H2O2 ·OH NO• ONOOUQ• R• ROO• ROOH 1O 2

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❚ ESTRÉS

OXIDATIVO SISTÉMICO

Desde la aceptación del concepto de estrés oxidativo se ha estado buscando una medida simple para determinar estrés oxidativo en seres humanos en situaciones clínicas. En estos casos se habla de estrés oxidativo sistémico o periférico, y las determinaciones se hacen en el plasma. Como siempre, dada la naturaleza comparativa de la situación de estrés oxidativo, es necesario contar con valores de referencia en sujetos normales. Cabe mencionar el extenso trabajo con pacientes llevado a cabo en Sao Paulo por Junqueira y Deucher, que a su vez, permitió establecer valores de referencia para los controles sanos y su dependencia con la edad. En el cuadro 21-3 se presentan los valores de TBARS y α-tocoferol para sujetos humanos sanos. En la actualidad, los niveles plasmáticos de productos de oxidación, derivados de reacciones mediadas por radicales libres, y de antioxidantes se utilizan como indicadores de estrés oxidativo sistémico en seres humanos y en animales experimentales. El producto de oxidación más utilizado es el MDA, determinado en forma algo inespecífica, pero altamente útil, como TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, por sus siglas en inglés) mediante espectrofotometría o espectrofluorometría. Los niveles plasmáticos normales de TBARS son 2 a 3 μM. El MDA puede determinarse de manera específica por HPLC, con niveles normales de 1.5 a 2.2 μM. Se han determinado los hidroperóxidos (ROOH) plasmáticos, pero los ensayos son altamente interferidos y producen resultados controversiales. Productos secundarios menores de la peroxidación lipídica y de las

324

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 21)

Cuadro 21-3. Contenidos de TBARS y de α-tocoferol en el plasma de seres humanos sanos Edad (años) 20 a 29 30 a 39 40 a 49 50 a 59 60 a 69 > 70

TBARS (μM) 2.0 2.3 2.3 2.4 2.5 2.9

± ± ± ± ± ±

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

α-tocoferol (μM) 21.0 26.2 29.0 34.9 30.9 22.2

± ± ± ± ± ±

0.8 1.1 1.2 1.5 1.1 2.1

Datos tomados de Junqueira et al.

oxidaciones celulares, con concentraciones plasmáticas que son órdenes de magnitud menores a las de los TBARS, como el 4-hidroxinonenal, 8-isoprostano, oxo-coleteroles y la 8-hidroxi desoxiguanosina, también se han usado como indicadores plasmáticos de oxidaciones mediadas por radicales libres. Su uso como indicadores de estrés oxidativo sistémico debería acompañarse por la determinación de los productos de oxidación mayoritarios, como los TBARS o el MDA. En cuanto a los antioxidantes plasmáticos, por lo general se determinan α-tocoferol, ácido ascórbico y β-caroteno. Estos antioxidantes plasmáticos se determinan por HPLC, con los valores normales indicados entre paréntesis, el α-tocoferol (20 a 35 μM) y el β-caroteno (0.9 a 1.3 μM) son estables y de fácil manipulación, y el ácido ascórbico (50 a 60 μM) inestable y autooxidable. El ensayo de la quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de terbutilo (BOOH-CL) en eritrocitos humanos requiere una muestra de sangre mínima, y es muy sensible para determinar situaciones de estrés oxidativo sistémico. Se interpreta que la quimioluminiscencia está limitada por el α-tocoferol del estroma de los eritrocitos, el que a su vez está en equilibrio con el α-tocoferol plasmático. La determinación de capacidad antioxidante total del plasma (TRAP) se ha utilizado en forma extendida. La determinación, cuyo punto final es la reacción quimioluminiscente de oxidación del luminol, agrupa en una sola determinación al α-tocoferol, ácido ascórbico, ácido úrico, β-caroteno y bilirrubina, todos componentes plasmáticos con capacidad antioxidante. Por desgracia, la mayor parte (70 a 80%) del TRAP (300 a 320 U Trolox) está dada por el urato plasmático, que es inerte como antioxidante intracelular. Hay dos hipótesis sobre el origen de los oxidantes y prooxidantes que inician la cadena de reacciones en cadena del espacio intravascular: la del origen tisular y la del origen intravascular, aunque es probable el doble origen. En la hipótesis del origen tisular, intermediarios solubles y difusibles como el H2O2, NO•,

Determinación del estrés oxidativo en seres humanos...

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ROOH y el MDA difunden al espacio extracelular y a la sangre. Esta hipótesis recibe el apoyo del aumento de los TBARS plasmáticos en situaciones experimentales de estrés oxidativo localizado principalmente en un órgano, como por ejemplo, el hígado, en la intoxicación por tetracloruro de carbono y en la deficiencia en colina. Además, tiene el interés del aumento de los TBARS plasmáticos en pacientes humanos con enfermedades crónicas. En la hipótesis del origen vascular, la reacción de inicio se da por el •OH proveniente de la homólisis del H2O2 y ONOO– producidos por los fagocitos del espacio extracelular, o de los ROOH absorbidos desde el intestino. Se considera que el proceso de homólisis es catalizado por metales y metaloproteínas del plasma, con los metales involucrados, Fe2+ o Cu2+, en estado reducido. Las lipoproteínas plasmáticas; LDL y HDL, y los quilomicrones, proveen los lípidos insaturados para las reacciones de propagación. También se han llevado a cabo determinaciones de productos de oxidación en la orina, de las que se puede citar a las de 8-hidroxidesoxiguanosina y a la quimioluminiscencia espontánea en medio alcalino, debida a carbonilos excitados generados en la autooxidación de productos metabólicos inestables. Para la determinación o estimación del estrés oxidativo sistémico es aconsejable recurrir a la determinación de más de un indicador. Por ejemplo, el cuadro 21-4 muestra los valores plasmáticos de TBARS y de TRAP, y la BOOH-CL de los eritrocitos en pacientes con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y con demencia vascular. Los valores normales se encuentran alterados 21 a 35% (TBARS), 28 a 39% (TRAP) y 50 a 73% (BOOH-CL).

Cuadro 21-4. Indicadores de estrés oxidativo sistémico en enfermedades neurodegenerativas en humanos Estado/enfermedad Controles sanos (70 ± 1 años) Enfermedad de Alzheimer (72 ± 1 años) Enfermedad de Parkinson (71 ± 2 años) Demencia vascular (73 ± 1 años) Datos tomados de Repetto et al.

TBARS (μM)

TRAP ( μM)

BOOH-CL (cpm/mg Hb)×10 -2

2.9 ± 0.1 344 ± 18

117 ± 7

3.9 ± 0.1 227 ± 12

178 ± 10

3.5 ± 0.2 248 ± 18

202 ± 10

3.5 ± 0.1 210 ± 14

175 ± 8

326

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 21)

❚ DETERMINACIÓN

DE ESTRÉS OXIDATIVO: ¿OXIDANTES, ANTIOXIDANTES O PRODUCTOS DE LA OXIDACIÓN?

A partir del enunciado del concepto de estrés oxidativo como desequilibrio con aumento de oxidantes o disminución de antioxidantes, se mantiene la interrogante acerca de cuál o cuáles son las determinaciones que resultan más prácticas y efectivas para determinar una situación de estrés oxidativo. No existe una respuesta única, y las posibilidades dependen del material biológico experimental y del equipamiento disponible. La naturaleza dinámica y continua de la reacción en cadena mediada por radicales libres plantea la posibilidad de estimar la velocidad del proceso por los niveles de: a) oxidantes e intermediarios de la cadena de reacciones mediada por radicales libres (cuadro 21-1); b) antioxidantes (enzimáticos o no enzimáticos) (cuadro 21-1); y c) productos de oxidación. En cualquier caso, la determinación es comparativa tomando en cuenta los parámetros mencionados en el apartado anterior, y requiere una muestra experimental control, con una situación normal o equilibrada para ser comparada con la muestra experimental incógnita, con una eventual situación desequilibrada de estrés oxidativo.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Después de más de 20 años, el concepto de estrés oxidativo, con su simpleza y aplicabilidad, conserva la misma fuerza y validez original, por lo que habrá que recordar que el concepto de estrés oxidativo en sí mismo no es sinónimo de daño celular, ya que se sabe que varios eventos fisiológicos requieren un aumento en el consumo de oxígeno, como por ejemplo la mitosis, y en consecuencia, se genera un estado de estrés oxidativo temporal o adaptativo que se considera fisiológico, y es compensado por un aumento en la actividad de los sistemas antioxidantes. Es por ello que recientemente se ha comenzado a distinguir entre estrés oxidativo como situación reversible, y daño oxidativo como situación irreversible. Dalton et al., han sugerido que una buena forma de definir estrés oxidativo debe incluir una indicación de la severidad del cambio redox celular y de su duración, lo que pone al estrés oxidativo dentro de la máxima de Paracelso: “la dosis hace al veneno”, y no sólo la concentración, sino la duración en la generación de las especies reactivas de oxígeno. Concretando, la concentración y duración en el fenómeno oxidativo puede conducir a la célula de un estado funcional basal pasando por un proceso fisiológico o adaptativo, hasta la muerte celular por apoptosis o necrosis. De modo que en este libro se considerará el concepto estrés oxidativo como el desequilibrio entre las especies oxidantes y antioxidantes, en el cual abundan las primeras. Para definir las diversas fluctuaciones fisiológicas

Determinación del estrés oxidativo en seres humanos...

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que ocurren en las células o tejidos en cuanto a las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno ocasionadas por diversas funciones, mecanismos y vías de señalización, se utilizará el concepto de estado redox celular. Lo anterior deja claro que el desarrollo de ensayos para evaluar el estrés oxidativo sistémico en pacientes es el desafío del próximo lustro. El tratamiento antioxidante ofrece la posibilidad de mejorar la salud de pacientes con enfermedades crónicas, neurodegenerativas o infecciosas, o que reciben quimioterapia o radioterapia y la determinación que la evaluación del estrés oxidativo sistémico provee al diagnóstico y al control del tratamiento.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 21)

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S

ECCIÓN

ESPECIES

VII.

REACTIVAS Y ENFERMEDADES

22. Hipoxia y reperfusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 23. ERO y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 24. Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas . . . . . . . . . . . . . . 359

26. Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda . . . . . . . . 395 27. ERO y disfunción endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 28. El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído . . . . . . . . . . . . . . . . 423 29. Estrés oxidativo y retinopatías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435 30. ERO, envejecimiento y senescencia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447 31. Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas asociadas a la contaminación ambiental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459

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25. Daño oxidativo y enfermedades hepáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377

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H

IPOXIA Y REPERFUSIÓN Josep Maria Lluis Albert Morales

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❚ INTRODUCCIÓN Vivir en una atmósfera rica en oxígeno tiene varias ventajas, particularmente para la generación de energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa (véase el capítulo de Cadena respiratoria). Sin embargo, en condiciones fisiológicas, la reducción del oxígeno a agua en la cadena respiratoria mitocondrial no es completa, y forma radicales libres muy reactivos que tienen la capacidad de oxidar proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Aunque se sabe que las especies reactivas de oxígeno juegan un papel fisiológico importante, como por ejemplo en la células fagocitarias durante las reacciones de defensa celular frente infecciones microbianas, estas especies han sido consideradas como subproductos del metabolismo aeróbico, lo que ha obligado a las células a desarrollar diferentes estrategias en la defensa antioxidante. Asimismo, se ha descrito el papel de los radicales libres como mediadores o mensajeros secundarios en diversos procesos celulares. Todo ello ha contribuido a que las concentraciones de oxígeno, tanto a nivel sistémico como celular, estén estrechamente reguladas por vías de transducción de señales que incluyen la participación de diferentes factores de transcripción y la expresión de casi 1% de los genes que contiene el genoma.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 22)

El grado de oxigenación de los diferentes tejidos del organismo se mueve en un rango de concentración que incluye desde 21% de O2 (muy cercano al nivel de O2 atmosférico) en el pulmón, a entre 2 a 8% en el cartílago y la médula ósea. Este margen tan amplio en la tensión de oxígeno en los diferentes tejidos hace difícil establecer un valor universal para considerar condiciones hipóxicas (concentraciones bajas de oxígeno). A pesar de ello, una definición más funcional sería que la hipoxia existe cuando el suministro de oxígeno no alcanza la demanda de consumo del tejido. Este desequilibrio en el cociente suministro/demanda puede ocurrir en condiciones fisiológicas cuando el aporte de oxígeno por el torrente sanguíneo no es suficiente para suplir el aumento en su consumo por el músculo en condiciones de actividad física severa, o bien, en condiciones fisiopatológicas, como en el desarrollo del tumor sólido y la enfermedad de la arteria coronaria, donde se produce una reducción en el suministro de oxígeno debido a una vascularización insuficiente. La hipoxia está implicada en el desarrollo de enfermedades con gran impacto para la sociedad, como isquemia cerebral y de miocardio, cáncer, hipertensión pulmonar, retinopatías, enfermedad congénita del corazón, obstrucción crónica pulmonar y hepatopatía alcohólica.

❚ FACTOR

NUCLEAR INDUCTIBLE POR HIPOXIA

Un gran paso para esclarecer los mecanismos involucrados en la homeostasia del oxígeno fue el descubrimiento del factor inducible por hipoxia (HIF) en 1992 por el grupo del Dr. Semenza. Este factor de transcripción, que tan sólo es estable en concentraciones bajas de oxígeno (0 a 5% de O2), representa la unión entre el sensor de oxígeno y los efectores celulares tanto a nivel local como sistémico. El HIF es un factor de transcripción heterodimérico, compuesto por la subunidad constitutiva HIF-1β y la subunidad inducible HIF-1α, donde su estabilidad y actividad transcripcional está regulada por la concentración de oxígeno. Aunque hasta el momento se han identificado tres isoformas de la subunidad α, se le atribuye la mayor parte de la respuesta adaptativa de la célula frente a la hipoxia al factor HIF-1α. De hecho, el ratón con un alelo mutado para el HIF-1α tiene un desarrollo normal, pero muestra una respuesta alterada frente a la hipoxia crónica. La proteína HIF-1α tiene una vida media extremadamente corta (inferior a 5 min), y su nivel basal es indetectable, mientras que durante la hipoxia se almacena en el citosol en función del tiempo, de la exposición y del grado de hipoxia. Las responsables de esta regulación proteolítica del factor HIF-1α, son una nueva familia de enzimas prolil/asparragin hidroxilasas que requieren oxígeno para ejercer su actividad catalítica; por tanto, en la normoxia (condiciones normales de oxígeno), la hidroxilación del factor HIF-1 α es la modificación

Hipoxia y reperfusión

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que permite su ubiquitinación y su posterior degradación por el proteosoma. En cambio, al disminuir la concentración de oxígeno, el factor HIF-1α se acumula en el citoplasma y dimeriza con la subunidad HIF-1β, lo que facilita su translocación al núcleo y la activación de la expresión de sus genes blanco. Entre ellos cabe destacar a la hormona eritropoyetina (EPO), que estimula la producción de glóbulos rojos, y al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), responsable de la formación de nuevos vasos sanguíneos o angiogénesis. Ambos factores tienen la misión de aumentar el aporte de oxígeno al tejido. Por otro lado, la falta de oxígeno provoca que la generación de ATP celular se obtenga a través de la vía glucolítica, en lugar de la respiratoria, siendo el HIF-1α el responsable del aumento de la expresión de transportadores de glucosa y de diferentes enzimas glucolíticas. Por último, este factor nuclear también se ha visto implicado en la expresión de genes involucrados en la proliferación y supervivencia celular, función cardiovascular y homeostasia del hierro.

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❚ SENSOR

CELULAR FRENTE A LA HIPOXIA

A pesar de que se ha aprendido mucho del papel del HIF en el control de la expresión de los genes que participan en la respuesta adaptativa frente a la hipoxia, el mecanismo por el que la célula detecta una disminución en la concentración de oxígeno continúa siendo un tema que se está investigando activamente, dada su importancia tanto en el desarrollo y supervivencia celular como en la tumorogénesis. Desde un punto de vista fisiológico, este sensor celular debe ser sensible a un amplio rango en la concentración de oxígeno, que incluye desde la hipoxia moderada a la anoxia total (0% de oxígeno). Esta capacidad de respuesta frente a una hipoxia moderada es importante porque parte de la respuesta adaptativa consiste en preparar a la célula para afrontar una hipoxia más severa. El hecho de que las enzimas hidroxilasas requieran como cofactor al oxígeno, hace que sean unos de los mecanismos implicados en la transducción de señales frente a la hipoxia. Pero el hecho de que se activen otros factores de transcripción como el factor nuclear κB (NF-κB) o la proteína activadora-1 (AP-1), junto con la posibilidad de que estas hidroxilasas estén reguladas por los radicales libres, indica la presencia de otros sistemas de detección celular frente a los cambios en los niveles de oxígeno. Queda por definir la Km por el oxígeno de estas hidroxilasas, porque aunque está claro que en la anoxia no son activas, se desconoce la concentración mínima de oxígeno a partir de la cual son funcionales. La cuestión que permanece por aclarar en este campo es si existen múltiples sensores en una misma célula, si depende del tipo celular o si un único sensor universal media las respuestas celulares frente a la hipoxia.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 22)

Inicialmente se presentó como sensor la enzima NADPH oxidasa, pero experimentos posteriores mostraron que células deficientes en la subunidad gp91 de la NADPH oxidasa (imprescindible para su funcionalidad), mostraban una respuesta normal frente a la hipoxia. También se involucró al citocromo P450 reductasa, ya que su regulación durante la hipoxia modulaba los niveles de la hormona eritropoyetina. Pero esta hipótesis se descartó al no intervenir ni en la regulación de HIF y VEGF y tras no confirmarse su participación por análisis espectrofotométrico. Se ha especulado sobre la existencia de una proteína con un grupo hemo o un complejo hierro/azufre que pudiera sufrir un cambio conformacional al variar las concentraciones de oxígeno, lo que permitiría la respuesta transcripcional observada durante la hipoxia. Estos modelos justificarían la estabilización del HIF-1α en condiciones de hipoxia química al tratar las células con agentes quelantes del hierro o con el compuesto CoCl2. Sin embargo, hasta la actualidad no se ha identificado ninguna proteína con este papel en células de mamíferos. Por último, diversos grupos independientes concluían que la mitocondria actuaba como sistema de detección frente a los cambios en la concentración de oxígeno. De hecho, células ρo, que tienen el DNA mitocondrial dañado (lo que provoca que no tengan la cadena respiratoria ni la fosforilación oxidativa funcional) no son capaces de estabilizar al factor HIF-1α durante la hipoxia. Para corroborar esta hipótesis se ha utilizado un modelo genético donde se aislaron las células embrionarias de un ratón que mediante mutagénesis dirigida se le había inactivado el citocromo c. Esto tenía como consecuencia que estas células no presentaran ningún tipo de respuesta frente a la hipoxia, indicando el papel de la mitocondria como sensor frente a la hipoxia.

❚ HIPOXIA Y ESPECIES

REACTIVAS DE OXÍGENO

El uso de fluorocromos sensibles al estado redox de la célula como la dicloroflueresceína (DCF), han mostrado un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno en condiciones de hipoxia. Por lo general, el uso de esta sonda se ha utilizado para la detección de los niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2), pero en diversos trabajos se demuestra que también puede detectar la presencia de peroxinitritos (ONOO–). Recientemente se ha utilizado la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, que consiste en el traspaso de energía de una sonda fluorescente a otro fluorocromo en estado basal, situado a una distancia en el rango de los nanómetros (nm). Estos estudios demostraron la producción de radicales libres durante la hipoxia. Con el fin de localizar el origen de estos radicales libres se han utilizado aproximaciones tanto farmacológicas como moleculares.

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Hipoxia y reperfusión

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Las dos posibles fuentes de producción de anión superóxido en la cadena respiratoria mitocondrial son el complejo I y el III (véase capítulo de Cadena respiratoria). Mientras que el primero genera especies reactivas del oxígeno sólo en la matriz mitocondrial, el complejo III es capaz generar el anión superóxido (O2•) tanto en la matriz como en el citosol. En los estudios farmacológicos, el uso de inhibidores específicos del complejo I (rotenona), complejo II (tenoiltrifluoroacetona) y del complejo III (antimicina A), indicaron que estos radicales libres detectados durante la hipoxia, provenían del complejo III de la cadena respiratoria. Además, en una aproximación molecular con el bloqueo de la expresión génica de una subunidad esencial del complejo III, usando la novedosa técnica del RNA de interferencia, muestra un descenso en la generación de especies reactivas de oxígeno y en la estabilización del factor HIF en condiciones hipóxicas. El mecanismo por el cual la hipoxia provoca un aumento en la generación de radicales libres se desconoce, podría involucrar cambios estructurales que prolonguen la vida media de la subunidad ubisemiquinona del complejo III, incrementando la accesibilidad del oxígeno a capturar electrones singulete o que desvíe la producción del radical superóxido de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Por último, experimentos con fibroblastos de pacientes con el síndrome de Leigh´s (mal funcionamiento de la enzima citocromo oxidasa) que mantienen activa la cadena respiratoria pero no la fosforilación oxidativa, son sensibles a la hipoxia, indicando que la fosforilación oxidativa no es necesaria para la mitocondria en su función de sensor frente a la hipoxia. Para determinar si estos radicales libres son necesarios en la respuesta celular frente a la hipoxia se utilizaron los inhibidores de la cadena respiratoria y antioxidantes como el glutatión (GSH). Con el uso de estos compuestos se observó un paralelismo entre la generación de especies reactivas de oxígeno y los niveles del factor nuclear HIF-1α, mostrando que estos radicales libres actúan como segundos mensajeros durante la hipoxia. Los experimentos sobreexpresando la enzima catalasa (CAT), inhibieron la producción de radicales libres, mientras que la inducción de la enzima superóxido dismutasa (SOD) no produjo cambios en la generación de especies reactivas de oxígeno, indicado que el peróxido de hidrógeno, y no el anión superóxido, es la especie reactiva que actúa como segundo mensajero estabilizando el factor HIF-1α. Con todo ello, se puede concluir que en condiciones de un descenso en los niveles de oxígeno, el complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial aumenta el radical O2•, que a través de los canales iónicos pasará al citosol para ser transformado al H2O2 por la SOD y poder actuar sobre la estabilización del factor HIF-1α. Además, esta producción de especies reactivas de oxígeno mitocondriales durante la hipoxia se ha visto implicada como segundos mensajeros responsables

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(Capítulo 22)

de la contracción de los miocitos de la arteria pulmonar, inhibición en la diferenciación de los adipocitos, disminución de la actividad de la bomba Na+, K+-ATPasa en células epiteliales alveolares, activación de NF-κB en hepatocitos y de p38 en cardiomiocitos, y por último, el aumento de la producción de la citosina interleucina 6 (IL-6) en células endoteliales.

❚ HIPOXIA Y HEPATOPATÍA ALCOHÓLICA En condiciones fisiológicas, en el hígado hay un gradiente de oxígeno entre la vena porta (cercano a 16% de O2) y la zona pericentral o centrilobular (casi 10% de O2). Como consecuencia del metabolismo del etanol, la demanda de oxígeno por parte del hígado aumenta debido al estado hipermetabólico del hepatocito, y provoca un aumento de 30% en el gradiente intralobular de oxígeno, alcanzándose estados de hipoxia en la zona centrilobular del hígado. Este efecto se observa a pesar de que el alcohol induce un efecto compensatorio al aumentar el flujo sanguíneo hepático, y por tanto, la disponibilidad de oxígeno en el hígado. El área hipóxica pericentral es la zona más afectada por el consumo crónico de etanol. El hecho de que el agente propiltiouracil que reduce el consumo hepático de oxígeno debido al metabolismo del etanol prevenga el daño hepático inducido por el alcohol, indica que la hipoxia interviene de forma relevante en el desarrollo de la enfermedad hepática alcohólica. Por otro lado, los hepatocitos de la zona pericentral del hígado muestran una disminución selectiva de los niveles de glutatión mitocondrial (GSHm), debido a los efectos del alcohol. La mitocondria presenta diferentes defensas antioxidantes implicadas en la destoxificación de las especies reactivas de oxígeno. Entre ellas cabe destacar tanto a las enzimas antioxidantes como MnSOD, glutatión peroxidasa (GPx), CAT, y la peroxirredoxina, así como las moléculas antioxidantes, principalmente el GSH y la vitamina E. Como las mitocondrias de células hepáticas carecen de la enzima CAT, la destoxificación del H2O2 depende sólo del GSHm y de la actividad de la enzima GPx.

❚ FUNCIÓN DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN LA ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN En diferentes patologías humanas se desencadenan condiciones en las que diversos órganos se encuentran sometidos a un periodo más o menos prolongado de flujo sanguíneo reducido o incluso de flujo nulo llamado isquemia. En el momento en el cual se recupera el riego normal se inicia el proceso de reperfusión. Las células de todos los tejidos son dañadas de forma irreversible al ser privadas de

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Hipoxia y reperfusión

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oxígeno y nutrientes. Sin embargo, pese a ser compartidas las respuestas biológicas a la isquemia por un gran número de tipos celulares, el grado y la cinética del daño isquémico presenta características propias para cada célula específica, incluso dentro de un mismo tejido. Resultaría complicado pretender analizar en este capítulo cada uno de los mecanismos afectados para cada tipo celular en particular, por ello se comentará primordialmente la participación de los radicales libres en esta patología y las vías metabólicas más afectadas por el daño isquémico, centrando la atención en la lesión hepática causada tras su reperfusión. La isquemia de los órganos no sólo es una consecuencia inevitable durante operaciones de trasplante y resecciones quirúrgicas, sino que es además un proceso biológico asociado a patologías producidas por procesos obstructivos del flujo sanguíneo normal o por un cese total debido a un paro cardiaco. En toda célula, inmediatamente después del cese del flujo sanguíneo, la concentración de ATP y el pH disminuyen mientras se produce la transición de un metabolismo oxidativo a glucólisis anaeróbica. En las primeras horas de reperfusión, durante la fase aguda del proceso de daño tisular se produce una sobreproducción de radicales libres que genera estrés oxidativo en los órganos afectados. Aunque históricamente se ha considerado esta elevada generación de radicales como el principal causante de la lesión causada por la isquemia y reperfusión a través de la degradación de lípidos de membrana y/o proteínas, las investigaciones más recientes indican que la oxidación en macromoléculas causada por estos radicales ni alcanzan el nivel necesario para justificar el daño observado, ni coinciden temporalmente con la aparición de éste. Ello no significa que los radicales libres hayan dejado de ser considerados como elemento crítico en el daño causado por isquemia y reperfusión, sino que ahora hay una tendencia a considerar su participación en esta etapa inicial de la lesión como mediadores en transcripción y activación de genes sensibles al estrés con una conocida contribución en las vías de muerte celular. En este sentido, aunque durante años se asumió que todo estrés oxidativo posisquémico causaba muerte celular por peroxidación lipídica, el moderado nivel de peroxidación lipídica contabilizado resulta insuficiente para justificar el daño causado. En contrapartida, los radicales producidos podrían estar inactivando antiproteasas específicas del plasma por el ambiente oxidativo que crean en las inmediaciones de los neutrófilos, permitiendo a las proteasas derivadas de los neutrófilos actuar localmente sin la interferencia de antiproteasas. Asimismo, se ha demostrado una acción citotóxica directa de los radicales después de isquemia y reperfusión en diversos tipos celulares. En particular, las células de Kupffer, macrófagos residentes en el hígado, son activadas con rapidez al iniciarse la reperfusión generando radicales libres y matando hepatocitos próximos por un mecanismo que involucra a la mitocondria y la pérdida de su potencial de membrana. Junto con la acción mediada por antiproteasas y su acción directa, el estrés oxidativo celular causado por isquemia y reperfusión promueve mecanismos de muerte

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 22)

celular a través de la estimulación de factores de transcripción como NF-κB o AP1. Estas proteínas, después de su interacción con secuencias específicas de DNA localizadas en promotores de diversos genes, aumenta la expresión de RNA (mRNA) de gran importancia en la señalización celular, como el TNF-α, interleucina-1β (IL-1β), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), hemooxigenasa-1, CXC quimiosinas o moléculas de adhesión. Durante una fase subaguda, que se podría localizar entre las 6 y 24 h posreperfusión, los radicales libres siguen desempeñando una función crítica en el daño causado por la isquemia y reperfusión. En esta etapa, la producción de radicales observada parece ser básicamente mediada por los elevados niveles alcanzados de citocinas (TNF-α, IL-1β, interferón-γ) y quimiosinas. Existen amplias evidencias que indican que estos mediadores inflamatorios causan la sobreexpresión de moléculas de adhesión en células del endotelio, la formación de gradientes quimiotácticos que promoverían la invasión de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y la liberación de reactivos metabólicos de oxígeno y nitrógeno con elevada capacidad citotóxica. En el caso de la isquemia y reperfusión hepática, se ha caracterizado cómo los PMN se activan después de su interacción con moléculas de adhesión expresadas en las células endoteliales. Tras ello, los PMN metabólicamente activados transmigran a través del sinusoide hepático hasta contactar con los hepatocitos, induciéndoles una generación de radicales libres y la liberación de enzimas extracelulares degradadores de la matriz, como la colagenasa o las metaloproteinasas de matriz, proceso que resulta en la amplificación del daño causado por la inflamación del tejido.

❚ MECANISMOS

POSISQUÉMICOS DE GENERACIÓN DE RADICALES

Después de ser sometidas a bajos niveles de estrés oxidativo, las células tratan de adaptarse. Este proceso es efectivo hasta un determinado límite del estímulo, a partir del cual la célula no puede recuperarse. Este fenómeno se ha demostrado en el caso del daño causado por isquemia y reperfusión, donde se ha observado que breves episodios de isquemia son capaces de activar la respuesta celular antioxidante y proteger al órgano afectado frente a periodos más largos de isquemia ante a los cuales, sin este preacondicionamiento, existiría una elevada mortalidad celular. Análogamente, diversos estudios han indicado el potencial protector de diferentes antioxidantes como la N-acetilcisteína o el GSH, entre otros, en la lesión causada por isquemia y reperfusión, apuntando hacia los radicales libres como uno de los principales y más tempranos responsables del daño isquémico. A pesar de ello, las fuentes intracelulares de este estrés aún son motivo de estudio y controversia.

Hipoxia y reperfusión

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Xantina oxidasa Estudios iniciales mostraron la función de la conversión de la xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa durante la producción posisquémica de radicales libres. La xantina oxidasa se genera como producto de la degradación proteolítica o por oxidación de la molibdeno Fe-S flavina hidroxilasa. Esta enzima, que normalmente participa en las reacciones finales del metabolismo de las purinas, cataliza la conversión de hipoxantina y xantina a ácido úrico utilizando NAD+ como aceptor final de electrones. La xantina oxidasa, en cambio, utiliza el oxígeno molecular como aceptor de electrones produciendo en su acción importantes cantidades de O2• y H2O2, aparentemente después de la proteólisis u oxidación de grupos sulfhidrilos específicos de su estructura (capítulo 6). La detección en el suero de niveles elevados de O2• y H2O2 durante la reperfusión, así como el efecto protector conseguido con el pretratamiento con allupurinol, un inhibidor específico de la xantina oxidasa, apoyan la participación de esta enzima en la generación posisquémica del estrés. Sin embargo, estudios más recientes parecen indicar que esta enzima podría no ser tan crítica, puesto que la cantidad de xantina oxidasa detectada después de la isquemia no parece ser de gran magnitud, y suele observarse en tiempos posteriores a la detección inicial de la lesión. Este hecho tampoco debe ser razón para descartar su participación, ya que como ocurre tras la isquemia hepática, la conversión a xantina oxidasa se produce sólo en unas células determinadas del órgano afectado, las células de Kupffer, fuente de la mayor parte del estrés observado en el hígado después de la reperfusión. Hay que recordar que el tratamiento con cloruro de gadolinio, agente inactivador de las células de Kupffer, protege en gran medida al hígado frente al daño isquémico, por tanto, la xantina oxidasa puede desempeñar una función local, pero importante, en la producción de O2• y H2O2.

Mitocondria Contrario a lo ocurrido con la xantina oxidasa, la función de la mitocondria en la generación de radicales y la inducción de daño causado por la isquemia y reperfusión ha ido incrementándose en los últimos años (véase Cadena respiratoria mitocondrial). La mitocondria, principal fuente celular de generación de radicales libres debido a la pérdida puntual (0.5%) de electrones que transitan por su cadena respiratoria, ve alterado su transporte de electrones incluso después de breves periodos de isquemia. En condiciones normales, en la mitocondria se genera la formación de agua tras el paso por la cadena respiratoria de cuatro electrones hasta su aceptor final, el O2. Sin embargo, la disrupción de este tránsito acaecida con la isquemia contribuye, cuando menos parcialmente, a la produc-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 22)

ción de radicales producida en este organelo por la isquemia y reperfusión. Otra fuente del estrés oxidativo observado desde la mitocondria son los mediadores intracelulares de la acción de ciertas citocinas y quimiosinas. Así, por ejemplo, el TNF-α y IL-1β se han asociado con la producción mitocondrial de radicales libres. Para el TNF-α, en particular, se ha estudiado su señalización intracelular, y se ha podido comprobar la existencia de un dominio citoplasmático de su receptor que activa esfingomielinasas específicas capaces de generar ceramida. La ceramida, considerada durante años un esfingolípido con mera función estructural, ha devenido en el último decenio como un potencial mediador en la señalización de numerosos estímulos proapoptóticos. En su acción intracelular, la ceramida, aparte de participar en la activación de vías proapoptóticas e inhibición de proliferativas, interacciona de forma directa con el complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial generando radicales libres, causando la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la liberación de proteínas apoptogénicas mitocondriales como el citocromo c, Smac/DIABLO o el factor inductor de apoptosis (AIF). Estudios realizados en el laboratorio de los autores utilizando un modelo murino de isquemia y reperfusión hepática han permitido comprobar que inmediatamente después de la reperfusión se observan elevadas concentraciones sanguíneas de TNF y elevación de los niveles de ceramida en hígado. Esta generación de ceramida es responsable, cuando menos en parte, de la muerte a través de un mecanismo mitocondrial. Confirmando estos datos, la inhibición farmacológica o mediante RNA de interferencia de la enzima causante de la acumulación de ceramida, la esfingomielinasa, protege en gran medida del daño ocasionado por la isquemia y reperfusión, aumentando de manera significativa la supervivencia animal en un modelo de isquemia hepática total. La ceramida es uno de los numerosos mediadores intracelulares que en los últimos años se han descrito que interaccionan con la mitocondria y afectan su funcionalidad. Otros potenciales intermediarios de esta acción se han relacionado antes con la inducción de estrés oxidativo. Así, por ejemplo, durante el proceso de reperfusión se ha demostrado la activación de las vías de señalización de p53 y de c-Jun cinasa o la disminución de las concentraciones de las proteínas antiapoptóticas de la familia de Bcl-2 o el aumento de las proapoptóticas como Bax, Bad, Bid o Bim. Aunque la contribución relativa de cada uno de estos mediadores y del efecto directo de la isquemia sobre la cadena mitocondrial resta todavía por establecer, la función clave de la mitocondria en la muerte posisquémica es indudable. Esta importancia se ha manifestado en modelos de ratón con deficiencia en proteínas que participan en el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial o en la expresión de las proteínas de la familia de Bcl-2. Por todo ello, numerosas terapias en desarrollo para controlar los efectos dañinos causados por la isquemia y reperfusión están siendo encaminadas a la actuación frente a mecanismos situados por encima o en la misma mitocondria. Esto ha llevado

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a que muchos investigadores consideren a la mitocondria como el punto de no retorno en el daño posisquémico, pasado el cual la célula está destinada a una muerte segura, independientemente de que lo sea a través de vías señalizadoras apoptóticas o necróticas. Ambos mecanismos, apoptosis y necrosis, parecen ser mediados por la mitocondria en la muerte causada por isquemia y reperfusión, los factores como niveles mínimos de ATP, imprescindible para la muerte apoptótica, o un excesivo estrés celular capaz de inactivar las caspasas efectoras mediante la oxidación de cisteínas específicas, son los que decidirán por qué vía discurrirá la muerte celular. Los tratamientos basados en el uso de antioxidantes, y en especial los que buscan el mantenimiento de la capacidad mitocondrial de eliminación de radicales, permitirían el mantenimiento de la integridad mitocondrial y la reducción del daño causado por isquemia y reperfusión, independientemente del mecanismo, necrótico o apoptótico, por el que cursará.

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NADPH oxidasa Durante la inflamación que aparece en la isquemia y reperfusión también se genera el radical O2•, principalmente desde una NADPH oxidasa unida a la membrana citoplasmática. Esta flavoproteína, presente en los leucocitos fagocíticos (monocitos, macrófagos, neutrófilos) y en las células endoteliales, es capaz de generar grandes cantidades de O2• a través de la reducción de O2 utilizando NADPH como donador de electrones. Tras su estimulación, esta enzima multicomponente libera O2• al espacio extracelular induciendo estrés oxidativo en el tejido adyacente (véase capítulo de NADPH oxidasa). La inexistencia de inhibidores específicos ha dificultado su estudio en modelos in vivo de la isquemia y reperfusión; sin embargo, su participación se ha demostrado en modelos de ratón genéticamente deficiente en una subunidad de la NADPH oxidasa (gp91). Estos animales experimentan una clara protección frente a isquemias largas, no tan evidente en periodos inferiores a 1 h, hecho que parecería indicar que diferentes vías inductoras del daño isquémico podrían activarse en mayor o menor medida en función de la gravedad del estímulo. Otras sustancias que pueden inducir estrés oxidativo celular, como el HOCl– o el óxido nítrico (NO•), también se han involucrado en el daño posisquémico. En el caso del NO•, se le atribuyen efectos tanto benéficos (cuando es generado en dosis bajas) como nocivos (cuando sus niveles sobrepasan un determinado umbral). En el caso del hígado, el NO• se genera a través de dos enzimas: la NO• sintasa constitutiva (eNOS) presente en células endoteliales, y la NO sintasa inducible (iNOS) localizada también en células endoteliales y hepatocitos. El NO• es un potente vasodilatador que puede mantener la microcirculación sanguínea y una fuente de formación de peroxinitritos a través de su reacción con

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Activación del complemento

(Capítulo 22)

Plaquetas Linfocito

TNF Célula de Kupffer Radicales

Receptor de TNF

Ceramida

Caspasa 8 Bid

Radicale Radicales

Fragmentación DNA Caspasa 3 Muerte celular

Citocromo c Caspasa 9

Figura 22-1. Mecanismos de daño hepático por isquemia y reperfusión. Los radicales libres de una forma directa, generados principalmente por las células de Kupffer y los leucocitos polimorfonucleados, o indirectamente, a través de su participación en la señalización intracelular de citocinas como el TNF, tienen un papel crítico en el daño posisquémico. En la mitocondria confluyen diversas vías generadoras de estrés activadas por la isquemia y reperfusión, el equilibrio entre ellas y la capacidad antioxidante mitocondrial determinará su funcionalidad. La pérdida de su potencial de membrana y la liberación de proteínas apoptogénicas conducirá al hepatocito a la muerte. Por ello, se considera a la mitocondria como el punto de no retorno en la señalización de la isquemia y reperfusión.

superóxidos. En general, se asume que el NO• derivado del eNOS es responsable del mantenimiento del flujo de sangre hepático después de isquemia y reperfusión, mientras que la excesiva formación de NO• a través de la inducción de iNOS conduce a daño inducido por peroxinitritos. Estudios realizados con ratones deficientes en estos enzimas parecerían apoyar esta hipótesis.

❚ EXPERIMENTOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Una de las líneas de investigación de los autores se ha enfocado a evaluar la función del GSHm en la supervivencia celular durante la hipoxia. Sus resultados muestran que la hipoxia moderada (5% de O2) puede activar la respuesta adaptativa mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno mitocondriales en hepatocitos primarios de rata y de la línea de hepatoblastoma humano HepG2. Estas especies actúan como segundos mensajeros al incrementar, depen-

Hipoxia y reperfusión

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diendo del tiempo, tanto las concentraciones de los factores HIF-1α y NF-κB en el núcleo celular. Ambos factores no sólo translocan al núcleo, sino que mantienen su actividad al estimular la expresión de sus genes blanco. Pero cuando en condiciones hipóxicas se disminuyeron los niveles de GSHm, encontraron una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno que provocaron una muerte celular predominantemente necrótica. Por tanto, sugieren que en condiciones de hipoxia moderada, dichas especies podrían jugar un papel benéfico al actuar como segundos mensajeros y formar parte de la transducción de señal frente a la hipoxia; en cambio, cuando existe una disminución en el principal sistema antioxidante de la mitocondria (GSHm), el exceso de estas especies podría oxidar a las biomoléculas, ocasionando la muerte celular. Estas observaciones indican que el sinergismo entre el bajo contenido de GSHm y la hipoxia en los hepatocitos perivenosos durante el consumo crónico de alcohol podría contribuir a su susceptibilidad frente a la toxicidad del etanol.

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❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

FUTURAS

La participación de los radicales libres en el daño posisquémico no parece ser objeto de controversia. En cambio, sí es controversial cuáles son sus fuentes intracelulares y sus contribuciones relativas, la participación directa de los radicales o inductores de moléculas señalizadoras, e incluso la capacidad de antioxidantes específicos de controlar su efectos nocivos. Los radicales libres son reconocidos como responsables de la señalización de una importante cantidad de vías celulares. Numerosas evidencias demuestran que, como en el caso del preacondicionamiento antes de la isquemia y reperfusión, la señalización activada por oxidantes puede proteger contra los estímulos nocivos. Por ello, hay que ser cautos en la aplicación de los tratamientos basados en la alteración del delicado equilibrio redox celular, ya que varias funciones celulares críticas están bajo el control de genes inducibles por estrés oxidativo. Entre estas proteínas destacan antioxidantes como la MnSOD, la catalasa, la GPx, así como sistemas protectores como NF-κB, glutarredoxina, receptores de insulina o proteínas de choque térmico. Un buen ejemplo de ello es cómo pueden eliminarse los efectos benéficos del preacondicionamiento (que lo convierten en la más aceptada maniobra clínica para preservar órganos que han someterse a isquemia y reperfusión) por el uso de antioxidantes. Así, varios laboratorios han demostrado que atenuar con antioxidantes la generación de radicales producida después de una breve isquemia (10 a 15 min) elimina la protección que ésta supone frente a una isquemia de mayor duración. Otro aspecto a comentar es la posibilidad de realizar tratamientos basados en el aporte de antioxidantes a órganos isquémicos. Durante la isquemia, el flujo

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 22)

sanguíneo está impedido. Debido a ello, el tratamiento de tejidos isquémicos con fármacos está limitado. De hecho, la mayor parte de tratamientos efectivos con antioxidantes han sido con pretratamientos realizados inmediatamente después del inicio de la reperfusión, procedimiento que dificulta en muchos casos su aplicación clínica. Sin embargo, el progresivo conocimiento de los radicales específicos generados, sus puntos de generación y las localizaciones intracelulares en las que actúan, han de permitir futuros tratamientos efectivos dirigidos hacia radicales y compartimientos subcelulares concretos.

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SPECIES REACTIVAS

DE OXÍGENO Y CÁNCER Luis Enrique Gómez Quiroz

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❚ INTRODUCCIÓN Lo que se conoce comúnmente como cáncer, comprende en realidad a más de 200 enfermedades, que juntas representan 50% de las muertes en los países industrializados; entre éstas se pueden mencionar a los carcinomas de próstata, mamario, pulmón, e intestino como los que presentan mayor mortalidad por año en el mundo. Desde el punto de vista celular y molecular, un tejido canceroso presenta varias características comunes, como son el incremento en la proliferación y autonomía celular, deficiencia en la apoptosis, diferenciación y metabolismo alterado, inestabilidad genómica, inmortalización celular, y por último, metástasis e invasión. Todos estos fenómenos llevan a la pérdida de la funcionalidad normal del tejido y, finalmente, a insuficiencia orgánica y muerte. Los factores de riesgo reconocidos para el desarrollo de las neoplasias incluyen los factores hereditarios o genéticos, y ambientales, así como el tipo de agente carcinógeno de que se trate, sea químico (metales pesados como el cadmio, aflotoxinas, tricloroetileno, asbesto, entre otros), físico (radiaciones ionizantes, luz UVB), biológico (virus de la hepatitis o del papiloma humano, bacterias) o bien

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 23)

alteraciones fisiológicas, como problemas en la replicación del DNA o reacciones metabólicas.

❚ EFECTO DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO SOBRE EL DESARROLLO DE LA PATOLOGÍA Es importante definir que el cáncer es un fenómeno de etapas y funciones múltiples, se han delineado tres estados para el desarrollo de la patología, que son inicio, promoción y progresión del tumor, y en todas ellas los radicales libres juegan un papel importante.

Inicio del proceso neoplásico En la actualidad es bien conocido que la evolución celular a la neoplasia comprende la alteración secuencial de oncogenes y/o genes supresores de tumores, cuyos productos proteínicos participan críticamente en las vías de transducción de señales y en la regulación de la expresión génica, sobre todo de las proteínas encargadas del mantenimiento celular, reparación del DNA, y regulación de apoptosis, entre otras. Los oncogenes por lo general son formas alteradas de genes normales conocidos como protooncogenes. Como la mayor parte de ellos codifica para proteínas que están relacionadas con el control del ciclo celular o la apoptosis, su alteración o su expresión excesiva trae como consecuencia desórdenes en estos niveles fisiológicos que son determinantes para el desarrollo de la patología. Algunos ejemplos de oncogenes son src, myc, Ha-ras, entre otros. Los supresores de tumores son genes que codifican para proteínas que suprimen o inhiben los procesos que favorecen la formación de tumores, por ejemplo, una proliferación excesiva, y también regulan el ciclo celular para que no se salga de control, para los genes que codifican para p16 y Rb. Dentro de este grupo también se encuentran proteínas que se dedican a sensar y activar la reparación del DNA si éste se encuentra dañado (genes BRCA1, MLH1, p53). Los genes supresores de tumores son recesivos, es decir, que para que se altere su función se necesita que los dos alelos o copias del gen se pierdan o muten. Los pacientes con cáncer hereditario son más susceptibles a este fenómeno, ya que con frecuencia presentan uno de los dos alelos mutados. Una de las consecuencias del daño oxidativo a los nucleótidos es la generación de una mutación o bien, la alteración en la expresión de un gen; por esta razón, la célula tiene sistemas que le permiten por un lado prevenir que el daño ocurra, y por otro, una reparación rápida y eficaz. Sin embargo, una frecuencia elevada

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en el daño oxidativo de nucleótidos libres o en el DNA hacen que los sistemas de protección fallen. Ya en el presente libro se ha mencionado de manera clara las modificaciones que inducen los radicales libres sobre las bases nitrogenadas de los nucleótidos, sea en el DNA o como monómeros, y ha quedado bien definido que las especies reactivas de oxígeno pueden dañar significativamente al DNA genómico. Estos daños ocasionan mutaciones, y éstas activan a los oncogenes, y producen la inactivación de genes supresores de tumores y, en consecuencia, el inicio de la neoplasia o del tumor. La etapa de inicio es resultado tanto de una lesión persistente en el DNA como de una remoción deficiente de estas lesiones por los sistemas de reparación. Todo esto sucede antes del inicio de la síntesis del material genético en la etapa S del ciclo celular, lo que genera la introducción de alteraciones mutagénicas en el DNA de las células recién generadas. Así, el proceso carcinógenos surge de la omisión en la reparación de las bases dañadas o como consecuencia de una serie de eventos genéticos de eliminaciones o translocaciones asociadas con rupturas de cadenas del material genético que no fueron reparadas. Las translocaciones están asociadas al inicio de varias neoplasias en humanos a través de la activación de oncogenes, uno de los ejemplos más estudiados es el linfoma de Burkitt, donde el oncogén myc es activado por una translocación entre el cromosoma 2 y 8. Otros ejemplos de oncogenes asociados al inicio de neoplasias por translocación o eliminación son N-ras, Ha-ras, myb, sis, abl, implicados en patologías como neuroblastoma, cáncer mamario y varios tipos de leucemias. Las especies altamente reactivas como el radical hidroxilo (•OH), causan oxidación en el DNA, mientras que el peroxinitrito (ONOO–) causa tanto oxidación como nitración en las bases nitrogenadas. La vida media del •OH es muy corta, por lo que todavía es un enigma el mecanismo exacto por el cual este radical llega hasta el DNA. Necesariamente tendría que generarse cerca del ácido nucleico para lograr oxidarlo, mientras que el ONOO– difunde con facilidad en las membranas, por lo que resulta más comprensible su efecto sobre las bases nitrogenadas, esto aunado a que es una de las principales especies reactivas generadas en procesos inflamatorios. Uno los primeros estudios que demostraron que los radicales libres dañan al DNA proviene de la observación de que el peróxido de hidrógeno (H2O2), en presencia de sulfato de hierro, induce fragmentación de los cromosomas, desde entonces se ha estudiado la interacción de los radicales libres no sólo con el DNA, sino también con las proteínas, los lípidos y el RNA, entre otras biomoléculas. Básicamente, la modificación oxidativa de estas moléculas genera la desregulación de la homeostasia celular, lo que deriva en carcinogénesis; de hecho, la presencia aductos en el DNA como la 8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxodGuo o bien 8OHdG), están considerados como biomarcadores de daño oxidativo y de carcinogénesis debido a su alta mutagenicidad en células humanas. Se han

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 23)

reportado modificaciones oxidativas en prácticamente todos los nucleótidos, tanto polimerizados en ácidos nucleicos, como en sus formas monoméricas libres. Se ha visto que la transversión GC→ TA se relaciona con la presencia de 8-OH-dG en oncogenes como ras y en genes supresores de tumores como p53 tanto en cáncer hepático como de pulmón, algunos autores han propuesto que la simple presencia de 8-OH-dG en el DNA es suficiente para propiciar la formación de tumores. En cuanto a los genes supresores de tumores, se mencionó que para que el producto de dichos genes influya en un proceso carcinógeno es necesario que los dos alelos sufran mutaciones o eliminaciones. Varios grupos de investigación han demostrado que el NO• y sus derivados modifican postraduccionalmente a los residuos funcionales de algunas proteínas como p53, que son fundamentales para conferir la actividad.

Promoción de tumores Una vez que se ha iniciado la modificación oxidativa del DNA, los radicales libres toman mayor relevancia, como moduladores de la promoción de los tumores. Básicamente, la promoción consiste en la activación de las vías de señalización que controlan la proliferación, ciclo celular, apoptosis o la síntesis de proteínas de protección, como las proteínas antioxidantes o las proteínas de choque térmico. Varios agentes promotores de tumores regulan estas vías, entre ellos están las especies reactivas de oxígeno, así como los productos de la lipoperoxidación, como el malondialdehído (MDA) o el 4-hidroxinonenal (4HNE), entre otros metabolitos. El mecanismo molecular por el cual los radicales libres inducen la promoción de tumores no se conoce con exactitud. Se han postulado mecanismos tanto genéticos como epigenéticos (véase capítulo de Concepto epigenético y sus alteraciones). La inducción de un estado celular prooxidante permite la expresión alterada de genes o la deficiente actividad de varias proteínas de señalización debido a una modificación oxidativa en sus grupos sulfhidrilos, los cuales se ubican principalmente en los centros catalíticos, todo esto conduce a un fenotipo celular alterado. Como ejemplo de lo anterior, se puede mencionar a la proteína cinasa C (PKC), la cual media la activación de varias vías involucradas en la proliferación, diferenciación y transformación oncogénica. La PKC puede ser regulada por la oxidación directa de las cisteínas en su centro catalítico; de hecho, este efecto ocasiona que la cinasa sea activada sin el requerimiento fisiológico de Ca2+, o de fosfolípidos. Por otro lado, se ha reportado que el H2O2 induce la redistribución de PKC, lo que modifica sustancialmente su función normal. Otras proteínas que reciben modificación directa por las especies reactivas de oxígeno y que influyen en la progresión de tumores son c-jun y c-fos, ambas componentes del factor de

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Especies reactivas de oxígeno y cáncer

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transcripción AP-1, el cual regula la expresión de genes relacionados con proliferación celular. De hecho, el AP-1 ha sido considerado como uno de los factores de transcripción seriamente modificados en varios tipos de cáncer. Otro factor de transcripción regulado por las especies reactivas de oxígeno y con gran repercusión en el cáncer es el factor nuclear κB (NF-κB), el cual regula la expresión de varias proteínas involucradas en las vías de supervivencia y muerte. Se ha observado en varios tipos de cáncer una activación incrementada del NF-κB, generando un aumento en la síntesis de proteínas antiapoptóticas, como son Bcl-2 y FLIP, entre otras. Es bien sabido que la activación de este factor de transcripción es el responsable de la resistencia a terapias anticáncer en varios tipos de tumores, lo que ha puesto al NF-κB como uno de los principales blancos para el control molecular del cáncer. En gran medida, la promoción y progresión de tumores por las especies reactivas de oxígeno depende de la activación de los sistemas endógenos de generación de estas especies reactivas, como la NADPH oxidasa, óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), xantina oxidasa, y la cadena respiratoria mitocondrial; prácticamente todas ellas se han abordado de manera detallada en el presente libro. Existe suficiente evidencia experimental de la participación de estas enzimas en los procesos carcinógenos. La mayor parte de los sistemas enzimáticos productores de radicales libres están regulados por vías de señalización que los activan o los inhiben según los requerimientos fisiológicos. Además de los sistemas antes mencionados existen otras vías endógenas que también pueden de generar especies reactivas de oxígeno. El sistema de las ciclooxigenasas (COX) está formado por tres enzimas que catalizan la transformación del ácido araquidónico en prostaglandina H2, la cual es al mismo tiempo la molécula precursora de otras prostaglandinas, lo que pone a las COX como enzimas fundamentales en los procesos inflamatorios, sobre todo la isoforma inducible COX-2. En estudios recientes se ha corroborado la participación de la COX en la carcinogénesis, por ejemplo, la inhibición de la COX-2 suprimió la poliposis intestinal, que permite el desarrollo del cáncer de colon. Otro estudio llevado a cabo en ratones genéticamente modificados deficientes de COX-1 y COX-2, (cox1-/-, cox2-/-) mostró una reducción en la diferenciación epidérmica y en la promoción de tumores de piel. Por otra parte, la iNOS produce cantidades micromolares de NO•, y se ha demostrado que es una enzima involucrada también en procesos carcinógenos mediados por inflamación crónica. En la actualidad existe cierta controversia sobre el papel que juega el NO• en los procesos carcinógenos, esto debido a que los efectos del NO• dependen de su concentración, de la interacción con otros radicales libres, metales y proteínas, así como del tipo celular, y de los blancos genéticos que suele afectar. Si bien para muchos investigadores está claro el papel

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 23)

del NO• en procesos angiogénicos, los cuales son fundamentales para la progresión de tumores, este radical libre también puede dañar directamente al DNA por un lado, y al mismo tiempo presentar protección contra citotoxicidad, inhibir o promover la proliferación celular, y puede ser proapoptótico o antiapoptótico. Esto hace que los resultados experimentales de la función del NO• en carcinógenos se evalúen con extremo cuidado debido a la ambigüedad de las funciones que despliega. Aún así, la evidencia experimental obtenida en ratones deficientes en iNOS (iNOS-/-) muestra una clara correlación positiva en la promoción y progresión de tumores. Estos ratones presentaron mayor resistencia al daño en colon inducido por el trinitrobenceno y una menor letalidad, reduciendo la modificación postraduccional de proteínas como la formación de nitrotirosinas, así como la formación de MDA y otros productos de la lipoperoxidación. Al someter a estos animales a una dieta con dextrán sulfato de sodio, el cual genera inflamación en colon y cáncer, se encontró que mostraron menos signos y síntomas de colitis comparados con el grupo control. Por otro lado, la inoculación de los ratones con células de melanoma B16-F1 desarrolló menos tumores que el grupo control, lo que deja claro la participación de iNOS en la progresión de tumores.

Progresión de los tumores Durante el evento de progresión siguen presentes varios de los eventos que se presentaron en la etapa de promoción, pero de manera exacerbada. Las especies reactivas de oxígeno ahora tienen un efecto a nivel del genoma, induciendo el rearreglo de los oncogenes que fueron inicialmente mutados, lo que permite la progresión del tumor. Se ha observado que el tratamiento con antioxidantes como glutatión (GSH) o disulfiram inhiben la progresión maligna de papilomas a carcinoma escamoso invasivo en modelos murinos de cáncer de piel. Por otro lado, el tratamiento con un inhibidor de la síntesis de GSH como el dietilmalato, incrementa significativamente la progresión del tumor, lo que deja claro la participación de los radicales libres en la progresión de tumores.

❚ INFLAMACIÓN,

RADICALES LIBRES Y CARCINOGÉNESIS

El daño crónico generado tanto por agentes infecciosos como por bacterias o virus, así como por irritaciones, inicia una respuesta inflamatoria caracterizada por la infiltración a la zona de daño de células inmunológicas. Como se mencionó en capítulos anteriores, una medida de defensa para eliminar al agente agresor y a las células dañadas es la explosión oxidativa en la que dichas células

Especies reactivas de oxígeno y cáncer

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generan radicales libres de oxígeno y nitrógeno. Sin embargo, el efecto no es totalmente focalizado, y sus secuelas van más allá de la zona afectada, ocasionando daño en las células epiteliales y del estroma de la vecindad. Una vez iniciado el fenómeno de estrés oxidativo, el daño molecular es inminente, presentándose prácticamente en todas las moléculas como en DNA, proteínas y lípidos, los cuales de una u otra forma influyen en el proceso carcinógeno, como ya se ha mencionado a lo largo del libro (figura 23-1). Se ha comprobado que la sobrecarga oxidativa en diversas patologías es la causa principal de la generación de tumores malignos, como ejemplo de ellas se pueden mencionar la hemocromatosis, hepatitis viral B y C en el hígado, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa en el colon, infección por virus del papiloma humano en el cérvix, y la infección por Helicobacter pylori en el estómago, por citar solo algunas (cuadro 23-1). Se ha demostrado que la inflamación crónica contribuye en 25% en los casos totales de cáncer. El cáncer de colon puede ser un buen ejemplo de la carcinogénesis inducida por inflamación crónica. Este cáncer es 30 veces más frecuente que el cáncer de intestino delgado debido a que, en contraste con este último, el colon presenta

Daño, inflamación

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Reclutamiento de células inflamatorias

Explosión oxidativa ERO y ERN Lipoperoxidación Daño a proteínas proteínas de reparación MDA, 4-HNE

Cascada del ácido araquidónico Daño al DNA 8-OH-G Aductos de eteno Rupturas de DNA Otras oxidaciones a bases

Eicosanoides

Proliferación celular

Figura 23-1. Mecanismo de daño molecular en procesos de inicio de tumores en inflamación crónica. MDA, malondialdehído; 4-HNE, 4 hidroxi-nonenal.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 23)

Cuadro 23-1. Cánceres atribuidos a infecciones Agente infeccioso Virus del papiloma humano Virus de hepatitis B o C Virus de Epstein Barr Virus de inmunodeficiencia humana Virus del herpes Helicobacter pylori Schistosoma hematobium Schistosoma japonicum

Cáncer Cervicouterino Hepático Linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin, cáncer nasofaríngeo Sarcoma de Kaposi Sarcoma de Kaposi Carcinoma y linfoma gástrico Cáncer de vejiga Colon

por un lado niveles muy elevados de bacterias fecales y por otro una infiltración de células inmunológicas ocasionada por las primeras. La actividad respiratoria de las bacterias es una fuente muy importante de peróxidos y radical superóxido (O2•) que en presencia de hierro genera •OH, esto se agrava si se toma en cuenta que el hierro derivado de la dieta no se absorbe del todo y se concentra en las heces fecales en niveles 10 veces mayores que en la mayor parte de los tejidos. Los pigmentos biliares, como la bilirrubina y la biliverdina, pueden unir hierro en una forma que es capaz de dirigir la reacción de Fenton.

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P53 Y LAS PROTEÍNAS SUPRESORAS DE TUMORES

Varias de las proteínas que controlan la apoptosis también regulan el ciclo celular, una de ellas es p53. La sobreexpresión de p53 conduce a la célula a entrar en apoptosis, lo que explica que en los procesos tumorales la actividad de p53 está prácticamente inhibida. Esto permite a las células transformadas tener mayor resistencia a la apoptosis y en consecuencia, ser invulnerables a las terapias anticáncer que justamente eliminan a las células malignas por medio de la apoptosis. La proteína p53 es un factor de transcripción que regula la expresión de varios genes cuyos productos resultantes se encargan del mantenimiento de la integridad del genoma. Como es sabido, la translocación de p53 al núcleo es fundamental para la expresión de los genes que controla. En estudios in vitro se ha observado que p53 se transloca al núcleo tras un tratamiento con radiaciones UV en tiempos cortos (1 a 2 h), abandonando el núcleo para localizarse una vez más en él a las 12 h. El pretratamiento con antioxidantes bloquea la localización nuclear temprana, esta evidencia sugiere fuertemente que p53 es requerido bajo condiciones de estrés oxidativo para una eventual reparación al DNA tras el daño por radicales libres. Por otro lado, estos estudios

Especies reactivas de oxígeno y cáncer

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mostraron que el tratamiento con agentes carcinógenos que no generan estrés oxidativo no indujeron la translocación nuclear temprana de p53, sino hasta 12 h después del tratamiento. Como se mencionó antes, los radicales libres pueden modificar postraduccionalmente la actividad de p53, pero también se ha reportado que el gen que codifica para p53 es un blanco común de mutaciones inducidas por radicales libres, lo que conduce a una deficiente o nula producción de la proteína.

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❚ ANTIOXIDANTES Y CÁNCER Tal vez la evidencia más contundente en cuanto a la importancia de la participación de los radicales libres en el cáncer sean los efectos protectores de los antioxidantes. El GSH, N-acetil cisteína, vitamina E y C, y los antioxidantes fenólicos, han demostrado experimentalmente tener una fuerte función en la inhibición del inicio, promoción y propagación de los tumores. Como se mencionó antes, aunque el efecto anticarcinógeno de los antioxidantes es indiscutible, el mecanismo por el cual actúan no está del todo establecido. Se ha sugerido una interacción directa con los agentes iniciadores o promotores de cáncer, o con los metabolitos activados, así como a nivel de la regulación de las vías que promueven el proceso, como aquellas involucradas en la proliferación y ciclo celular, por citar algunas. Los antioxidantes fenólicos hidroxitolueno butílico (BHT) e hidroxianisol butílico (BHA) han tomado particular interés debido a su uso como preservativos en alimentos. Estudios en animales de experimentación que recibieron estos compuestos en la dieta, mostraron que BHT y BHA antagonizaron los efectos carcinógenos inducidos por el 7,12-dimetil benzo (a) antraceno(DMBA) y del benzopireno en el estómago de ratones y en la glándula mamaria de ratas, y previnieron las neoplasias en el pulmón en ratas expuestas agudamente a DMBA. Básicamente, estos compuestos actúan interfiriendo con el metabolismo del agente carcinógeno. Se ha propuesto que otros antioxidantes como la vitamina E y C, disulfiram, selenio, entre otros, actúan de manera similar a los antioxidantes fenólicos. Tal vez el selenio tenga un mecanismo diferente inhibiendo la carcinogénesis químicamente inducida, ya que forma parte de la glutatión peroxidasa (GPx), enzima encargada en la eliminación del H2O2; esta enzima, como se ha explicado en el presente libro, utiliza dos moléculas de GSH para llevar a cabo su efecto.

❚ ESTUDIOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

El autor ha realizado estudios respecto a uno de los sistemas que regulan la homeostasia redox, que es la señalización mediada por el factor de crecimiento

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 23)

de hepatocitos y su receptor c-met. Datos producidos en el laboratorio de carcinogénesis experimental, de los Institutos Nacionales de Salud en EUA (NIH, por sus siglas en inglés) mostraron que la eliminación de la señalización de c-met por la supresión condicional del exón 16 del receptor c-met en hepatocitos incrementa la actividad de la NADPH oxidasa y la producción de especies reactivas de oxígeno por un mecanismo dependiente en la activación de PKC. En este mismo laboratorio reportó que los ratones deficientes en c-met presentan mayor promoción y progresión de tumores hepáticos y mayor inestabilidad genómica cuando son tratados con dietilnitrosamina (DEN) por un mecanismo presumiblemente mediado por estrés oxidativo.

❚ CONCLUSIONES Es importante dejar claro que si bien el presente capítulo trata de la participación de los radicales libres en el inicio, promoción y progresión de los tumores, estas moléculas también pueden presentar efectos positivos en el tratamiento del cáncer. Si bien los radicales libres actúan activando oncogenes y desactivando genes de las proteínas supresoras de tumores, o promoviendo el tumor, también se ha demostrado que el estrés oxidativo puede sensibilizar a las células para entrar en apoptosis o tener un efecto citotóxico en las células transformadas, lo cual es el principio de la radioterapia. Los efectos de los radicales libres están en función de su concentración, así como del tiempo que dure el estrés oxidativo. Es importante señalar que, aunque muchos de los protocolos clínicos donde se han usado antioxidantes para el tratamiento contra el cáncer no han tenido los resultados esperados, se ha confirmado que la estrategia para el control de estas patologías debe ser un tratamiento multifactorial, atacando varias vías que han sido modificadas en las células transformadas, pudiendo ser los sistemas generadores de estrés oxidativo, eliminado el agente iniciador, inhibiendo los procesos angiogénicos, y las vías que promueven la proliferación celular, sin afectar las células normales. Esto pues, refrenda un gran reto aun para las ciencias de la salud.

❚ REFERENCIAS Calvisi D, Thorgeirsson F: Molecular mechanisms of hepatocellular carcinogenesis in transgenic Mouse models of liver cancer. Toxicol Pathol 2005;42:181184. Copeland ES: Free radicals in promotion –a chemical pathology study section workshop. Cancer Res 1983;43:5631-5637.

Especies reactivas de oxígeno y cáncer

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24

AÑO OXIDATIVO

Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS Abel Santamaría del Ángel

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❚ INTRODUCCIÓN Múltiples alteraciones neurodegenerativas en humanos comparten una característica en común: la vulnerabilidad de las células neuronales a las acciones nocivas de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, resultando en el estrés oxidativo y nitrosativo en el tejido nervioso. En la actualidad, se reconoce que tanto el estrés oxidativo como el nitrosativo juegan un papel determinante como factores causales primarios en estas neuropatías, entre las que se encuentran la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica, no sólo debido a que son responsables de alteraciones estructurales y funcionales oxidativas de cualquier biomolécula disponible, sino además como mediadores potenciales de necrosis y apoptosis a través del inicio de cascadas de eventos de muerte celular señalizadas a partir de vías de factores de transcripción y respuestas inflamatorias (figura 24-1). Es de gran importancia el hecho de que diversos grupos de investigación han desarrollado en los últimos decenios una serie de herramientas experimentales para estudiar el impacto de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en el cerebro. Así, hoy se cuenta con un número considerable de toxinas capaces de

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

Tejido Ner vioso

Señales de daño celular y eventos tóxicos (alteraciones bioquímicas y moleculares)

Formación de especies reactivas del oxígeno/nitrógeno

Procesos inflamatorios

Estrés oxidativo/nitrosativo

Activación de factores de transcripción

Degeneración y muer te celular (apoptosis o necrosis)

Figura 24-1. Procesos tóxicos involucrados en el daño oxidativo al sistema nervioso central.

inducir daño celular degenerativo en el sistema nervioso de animales de laboratorio o en cultivos celulares para generar modelos experimentales que reproduzcan las principales alteraciones morfológicas, bioquímicas, moleculares y conductuales de las diferentes neuropatías humanas. En este capítulo se tratará de manera general los eventos involucrados en el daño oxidativo en algunas de las neuropatías degenerativas humanas más frecuentes o más estudiadas, y se revisarán de manera breve sus modelos experimentales y las alternativas terapéuticas emergentes que se están probando a nivel experimental y cuya finalidad es la de reducir los efectos nocivos de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Existen diversas razones por las cuales el sistema nervioso central es particularmente vulnerable a las acciones tóxicas de estas especies. Las tres más importantes se describen a continuación: 1. La primera causa se relaciona con su alto contenido de lípidos, el sustrato más común para la oxidación a través de la acción de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. La alta proporción de lípidos en el cerebro, en comparación con otros órganos, es una cuestión que no sólo obedece a la peculiar citoarquitectura que este órgano presenta (mayor superficie membranal en células más largas que contienen proyecciones neuríticas), sino también a las extensas coberturas lipídicas de las fibras neuronales. Por esta razón, existen algunas regiones cerebrales particularmente enriquecidas con lípi-

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Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas

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dos, como el caudado-putamen y el cerebelo. Resulta evidente que órganos enriquecidos con lípidos, como el cerebro y el hígado, sean más vulnerables a la peroxidación lipídica producida por las especies mencionadas. 2. La segunda causa por la cual el sistema nervioso es más vulnerable a dichas especies tiene que ver con la alta tasa metabólica del cerebro en comparación con otros órganos, dado que el metabolismo aeróbico es la mayor fuente de energía para las células nerviosas. Debido a la amplia distribución de mitocondrias en el interior de las células neuronales (somas, dendritas, axones y particularmente en terminales sinápticas) necesarias para el metabolismo oxidativo y la síntesis de ATP, el riesgo de una pérdida de electrones a lo largo de su cadena de transporte es un evento altamente probable, lo que conduce a la formación de O2• y H2O2. Hoy se sabe que diversos factores exógenos (exposición a radiación, contaminantes, entre otros) y endógenos (déficit energético, alteraciones estructurales y funcionales de biomoléculas, entre otros), predisponen a las células nerviosas a desarrollar estos escenarios anómalos. Entonces, bajo condiciones fisiológicas normales, los sistemas antioxidantes endógenos, ya sean enzimáticos (catalasa SOD, GPx, etc.) o no enzimáticos (GSH, ácido ascórbico, entre otros), son los responsables de una adecuada remoción de estas especies; sin embargo, en condiciones fisiopatológicas que conduzcan a bajos niveles de actividad o expresión de los sistemas mencionados, cantidades crecientes de estas especies se tornan nocivas y sirven como sustratos potenciales para la formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno más tóxicas, como •OH y ONOO–. 3. La tercera causa está relacionada con la aparentemente limitada actividad de algunas enzimas antioxidantes (p.ej., la catalasa) en el cerebro, y el sentido en el cual actúan algunas de las reacciones que implican la generación de especies como el H2O2, que es un subproducto común de la actividad de diferentes enzimas, como la monoaminooxidasa (MAO) y la tirosina hidroxilasa, así como de procesos de autooxidación de catecolaminas y ascorbato, procesos que con frecuencia se llevan a cabo en las células del sistema nervioso. Además, la activación de las fosfolipasas que depende de Ca2+, la liberación del ácido araquidónico y la descomposición de xantina por la xantina oxidasa, son eventos que conducen a la formación de O2•. Más aún, la activación neuronal de la sintasa del óxido nítrico (NOS) dependiente de Ca2+/calmodulina conduce a la formación del NO•, y una vez que el NO• y el O2• se encuentran, reaccionan con alta afinidad y forman la especie altamente reactiva ONOO–, conduciendo así a la posterior formación del •OH. Vale la pena destacar que en los tejidos cerebrales post mortem de pacientes de algunas neuropatías degenerativas, como la enfermedad de Parkinson y la de Huntington, se han encontrado depósitos incrementados de Fe2+, lo

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

que sugiere que éstos, si bien podrían ser el resultado de la liberación del metal desde las células muertas, también podrían haber favorecido en algún momento de la evolución de la neuropatía reacciones tipo Fenton. En general, el costo es alto para las células del tejido nervioso cuando hay una formación masiva de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, e incluye la descomposición oxidativa de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y cualquier otra biomolécula disponible. Los mecanismos por los cuales algunas moléculas específicas son atacadas, así como el papel preciso que juegan diferentes enzimas antioxidantes (formas compartimentalizadas de las proteínas mencionadas) como sistemas de defensa antioxidante en las células, ya se han descrito en los capítulos previos. Por tanto, en este punto sólo se insistirá en la importancia que tienen tanto el aumento en la formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, como la simultánea alteración de los sistemas antioxidantes endógenos para el inicio de procesos de muerte celular, ya sea directa (a través de estrés oxidativo y nitrosativo y daño necrótico temprano) o indirectamente (por activación de cascadas de eventos de muerte celular a través de factores de transcripción y otras moléculas de señalización, conduciendo así a muerte apoptótica). Por ello, este capítulo se centrará sólo en las evidencias de ocurrencia de estrés oxidativo y nitrosativo en algunas enfermedades neurodegenerativas, y la función que algunos agentes antioxidantes representan para su tratamiento.

❚ ENFERMEDAD

DE

PARKINSON

La enfermedad de Parkinson es la neuropatía motora progresiva más común en las personas de la tercera edad, y se caracteriza por temblor, rigidez y bradicinesia. Histológicamente, este trastorno presenta una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas pigmentadas de la sustancia negra (substantia nigra pars compacta) que proyectan sus fibras hacia el caudado-putamen (circuiteria nigroestriatal), y que se acompaña de una marcada disminución en los niveles estriatales de dopamina, así como de cuerpos de Lewy que pueden describirse como una serie de inclusiones intracelulares de la proteína α-sinucleína agregada (cuyo origen quizá obedezca a alteraciones mitocondriales y en la función del sistema ubiquitina-proteosoma). Existen diferentes características neuroquímicas de la enfermedad de Parkinson que implican un alto riesgo de ocurrencia de estrés oxidativo y nitrosativo. Entre éstas destaca el aumento en la descomposición de la dopamina producida por la MAO, lo que resulta en una elevada formación de H2O2, indicando así que los procesos metabólicos controlados por la MAO constituyen una fuente potencial de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. Además, los cerebros de pacientes con este trastorno muestran niveles

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Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas

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disminuidos de actividad de la GPx y del contenido de GSH en la sustancia negra, así como un aumento en los valores de hidroperóxidos lipídicos y bajas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados. También se han reportado alteraciones en la cadena respiratoria mitocondrial a nivel del complejo I, y eventos excitotóxicos mediados por los receptores para aminoácidos excitadores, estos últimos parecen guardar cierta relación con la degeneración de la vía nigroestriatal. Sin embargo, a pesar del evidente progreso que la literatura refleja sobre la investigación en la enfermedad de Parkinson, tanto en la caracterización de sus procesos patógenos como en las alternativas terapéuticas en progreso, la comprensión sobre la naturaleza de esta enfermedad aún es limitada (figura 24-2). En este contexto, la implementación de modelos experimentales en animales (roedores y primates no humanos) y preparaciones biológicas que simulen las diferentes alteraciones de la enfermedad de Parkinson permite a los investigadores hacer inferencias sobre los mecanismos de daño celular y molecular inherentes a esta neuropatía, así como la planeación de estrategias terapéuticas potenciales. Entre estos modelos destacan aquellos transgénicos recién desarrollados y que son producto de manipulaciones genéticas basadas en alteraciones moleculares, como la sobreexpresión y agregación de α-sinucleína, así como otros modelos farmacológicos. De estos últimos sólo se señalarán los más relevantes. La dopamina ha sido propuesta como el modelo clásico de daño oxidativo en la enfermedad de Parkinson debido a que no sólo es el principal neurotransmisor usado por la vía nigroestriatal, sino que además puede actuar como una neurotoxina endógena cuando es sometida a la autooxidación u oxidación mediante la actividad de la MAO, produciendo así un amplio espectro de eventos de estrés oxidativo y nitrosativo. Por su parte, la conocida toxina 6-hidroxidopamina produce un modelo de la enfermedad de Parkinson cuando se inyecta intracerebralmente al ser concentrada en las neuronas dopaminérgicas a través de un transportador de alta afinidad para dopamina, reaccionando con oxígeno molecular para producir especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y el consecuente estrés oxidativo y nitosativo, el cual resulta en el daño selectivo a neuronas dopaminérgicas. Otro modelo de la enfermedad de Parkinson se produce a través de la metanfetamina, la cual genera eventos excitotóxicos y daño selectivo a las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales cuando se administra de manera sistémica a los roedores, disminuyendo las concentraciones de dopamina y la actividad de la tirosina hidroxilasa en procesos mediados por receptores glutamatérgicos tipo N-metil-D-aspartato (NMDA). Sin embargo, el modelo experimental de la enfermedad de Parkinson más estudiado hasta ahora es el producido por 1-metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), un subproducto de la síntesis de la meperidina que reproduce muchas de las características de la enfermedad tanto en humanos (parkinsonismo) como en animales de experimentación. El MPTP afecta la vía nigroestriatal, donde es convertido en su metabolito tóxico 1-metil-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

EP

EA

EH

ELA

• -sinucleina (agregación) •Ciclo nocivo de dopamina •Actividad de MAO alterada •Factores ambientales •Transmisión glutamatérgica

• -amiloide (agregación) •Tau (agregación) •Factores ambientales •Transmisión glutamatérgica

•Huntingtina (agregación) •Transmisión glutamatérgica

•Actividad oxidativa basal •Mutaciones en Cu,Zn-SOD •Transmisión •glutamatérgica

Neurotoxicidad Daño oxidativo

•Daño a neuronas estriatales y de sustancia negra •Vía nigro-estriatal •Temblor y rigidez •Encor vamiento •Transmisión dopaminérgica

•Daño a neuronas cor ticales e hipocampales •Demencia •Pérdida de memoria y aprendizaje •Transmisión colinérgica

•Daño a neuronas estriatales •Demencia •Corea •Transmisión GABAérgica

•Daño a neuronas motoras cor ticales y en médula espinal •Parálisis

Figura 24-2. Factores causales potenciales en diferentes neuropatías degenerativas y sus consecuencias.

4-fenilpiridinio (MPP+), el cual es capturado activamente por las mitocondrias de las neuronas dopaminérgicas y actúa como inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria, generando así una falla en el metabolismo energético, transporte incompleto de electrones, formación de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno y disminución de dopamina. En dicho modelo, el uso de ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD dependiente de cobre y cinc (Cu/Zn-SOD) ha resultado en una resistencia a la toxicidad del MPTP, mientras que en líneas celulares con baja actividad de catalasa hay potenciación del daño por MPP+, fortaleciendo así las evidencias de estrés oxidativo. De particular interés son los prometedores efectos neuroprotectores que agentes antioxidantes como el selenio (Se) y algunos catalizadores de la descomposición del ONOO– han mostrado recientemente en algunos de estos modelos. De hecho, son muy diversos los agentes antioxidantes (entre atrapadores de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, quelantes de metales y agentes que estimulan la actividad de enzimas antioxidantes) y neuroprotectores en general (inhibidores de MAO, agentes neurotróficos y fármacos dopaminérgicos) que han sido probados en los últimos decenios tanto en los modelos de la enfermedad de Parkinson como a nivel preclínico y clínico en pacientes con esta enfermedad. Por

Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas

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mencionar algunos de los más recientes y prometedores como alternativas terapéuticas potenciales, destacan la metalotioneína (atrapador de especies reactivas de oxígeno), el componente del té verde polifenol-epigalocatechin-3-galato (un agente antioxidante y antiapoptótico), inhibidores de proteasas dependientes de calcio o calpaínas, melatonina (atrapador de radical •OH), Ginkgo biloba (EGb761), el antitusivo dextrometorfán, inhibidores de la NOS, antagonistas de los canales del calcio, deprenil, tocoferol, etc. Sin embargo, a pesar de que éstos y muchos otros tratamientos experimentales resultan en efectos neuroprotectores en los diferentes modelos de la enfermedad de Parkinson, a nivel clínico la mayor parte no produce efecto alguno o evoca respuestas positivas moderadas, revelando así las obvias limitaciones de los modelos en relación con la enfermedad idiopática. En consecuencia, se infiere que el conocimiento sobre los mecanismos de esta neuropatía aún es limitado, y por ello, nuevas herramientas experimentales como la genómica, proteómica, imagen cerebral y terapia génica, proveerán las bases para mejorar las perspectivas sobre tratamientos para la enfermedad de Parkinson en un futuro cercano.

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❚ ENFERMEDAD

DE

ALZHEIMER

Típicamente reconocida como una neuropatía demencial, el conocimiento sobre los mecanismos que conducen a las manifestaciones clínicas de esta enfermedad es aún limitado. En la actualidad, la enfermedad de Alzheimer se conoce como la alteración neurodegenerativa relacionada con la edad más común en los humanos, y se caracteriza por disminución progresiva de la capacidad cognitiva y pérdida de la memoria, cursando con frecuencia con otros síntomas psicológicos y conductuales. Aunque fundamentalmente esporádica, cerca de 10% de los casos de dicho trastorno presentan un patrón de herencia autosómico dominante, y entre los blancos comunes de estas mutaciones se incluyen la proteína precursora del péptido amiloide (PPA) y uno de los dos genes conocidos para la presenilina (PS1, PS2). A nivel molecular y celular, la causa primaria del trastorno parece estar relacionada con una acumulación aberrante del péptido β-amiloide (Abeta), producto de la ruptura de PPA. Se asume que Abeta es responsable de las alteraciones en la homeostasia del Ca2+ intracelular, así como de eventos excitotóxicos y oxidativos que resultan en la muerte celular necrótica y apoptótica. Otro factor involucrado en esta neuropatía corresponde a la agregación de la fosfoproteína Tau, la cual es acompañada de alteraciones estructurales del citoesqueleto en las células neuronales, aunque aún no se sabe con certeza cuál es la relación entre los patrones de agregación de Abeta y Tau. Las características bioquímicas de la enfermedad de Alzheimer incluyen anormalidades en las transmisiones colinérgica, glutamatérgica, adrenérgica, serotonérgica y dopaminérgica, así como la ac-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

tivación de vías inflamatorias, oxidativas y hormonales. La disminución de las actividades enzimáticas de la SOD y GPx y bajos niveles cerebrales de GSH acompañan al daño peroxidativo cortical e hipocampal en esta enfermedad. Los marcadores típicos de esta enfermedad en cerebros post mortem son la formación de placas neuríticas y marañas neurofibrilares, particularmente en las áreas cortical e hipocampal. De hecho, dado que la alteración de la vía colinérgica es la característica neuroquímica más relevante en este trastorno, diversos fármacos que afectan la actividad de la colinesterasa (inhibidores de la colinesterasa como donepezil, galantamina y rivastigmina), y que en consecuencia incrementan la biodisponibilidad de la acetil colina en el cerebro, fueron el tratamiento de elección para esta enfermedad. Sin embargo, en vista de que estos fármacos sólo ofrecían una eficacia moderada para atenuar sus síntomas, han surgido un número considerable de estrategias no colinérgicas sobre la base de evidencias experimentales, demostrando los diversos factores involucrados en los procesos patogénicos de la enfermedad de Alzheimer. Entre estas estrategias destaca el uso del antagonista de receptores para NMDA, la memantina, de los antioxidantes Ginkgo biloba y tocoferol, el agente antiinflamatorio no esteroideo indometacina, y estrógenos conjugados. Por desgracia, muchos de ellos no constituyen aún posibilidades terapéuticas viables, y en algunos casos su administración resulta en hallazgos contradictorios, lo que enfatiza la necesidad de una exploración continua de otras alternativas todavía a un nivel experimental. Más aún, dado que este trastorno también es reconocido como una neuropatía que por lo general implica la formación de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, y el consecuente estrés oxidativo y nitrosativo, muchas de estas nuevas estrategias se enfocan en el uso de agentes antioxidantes de fuentes diversas, como la vitamina C, ubiquinona, ácido lipóico, β-caroteno, melatonina y agentes sintéticos. Al respecto, otros productos naturales como los flavonoides, representan terapias antioxidantes prometedoras contra desórdenes demenciales y que están bajo investigación continua. El establecimiento de modelos animales o preparaciones biológicas que reproduzcan las alteraciones observadas en la enfermedad de Alzheimer, constituye una herramienta de gran utilidad para caracterizar los mecanismos nocivos involucrados en esta patología y probar alternativas experimentales para su tratamiento. Sin embargo, dada su complicada naturaleza mecanística, la enfermedad es difícil de modelar. Algunas aproximaciones de modelos incluyen paradigmas tóxicos tan diversos como la exposición a aluminio, fármacos que afectan la transmisión colinérgica, excitotoxinas que lesionan las vías colinérgicas corticales e hipocampales, y la agregación de la proteína Tau para formar complejos con filamentos helicoidales apareados (PHF-Tau), entre otros. En términos de manipulaciones genéticas, algunos modelos incluyen mutaciones en los genes de presenilina (PS), Abeta, y animales transgénicos derivados de la manipulación del metabolismo de la PPA, como ratones que portan transgenes para la PPA huma-

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Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas

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na con o sin mutaciones para la PS, o el modelo inverso producido por ratones knockout para PPA, del cual sus neuronas en cultivo han demostrado ser resistentes a la toxicidad de Abeta y a daño oxidativo. Cabe destacar que otro modelo, el que emplea al péptido Abeta en roedores y en preparaciones biológicas, presenta la obvia ventaja de trabajar con una de las moléculas endógenas directamente implicadas en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. El papel de Abeta en el daño oxidativo y la neurotoxicidad en la enfermedad ha sido ampliamente descrito. Abeta es el resultado del procesamiento proteolítico de la PPA por β- y γ-secretasas, y mientras que la PPA de longitud completa parece jugar un papel fisiológico en el transporte axonal, sus fragmentos conocidos como Abeta 1-40 y Abeta 1-42/43 parecen ser responsable de eventos tóxicos en el cerebro. Sin embargo, ha surgido una interesante hipótesis que sugiere que Abeta, por lo general presente en el líquido cefalorraquídeo y plasma de individuos sanos a lo largo de toda su vida, puede estar mediando un mecanismo homeostático que reduce la transmisión excitatoria en respuesta a la actividad neuronal basal, y que una falla en dicho proceso regulador provocaría una acumulación excesiva del péptido y su consecuente agregación, que a su vez resultaría en la serie de eventos patológicos observados en la enfermedad de Alzheimer. Resultados de estudios in vitro e in vivo con Abeta han demostrado que el fragmento 25 a 35 de Abeta es el responsable de la neurotoxicidad, daño oxidativo, alteración en las funciones mitocondrial y de la citocromo c oxidasa, así como cambios en la señalización celular mediada por calcio a través de mecanismos que involucran la activación de receptores para NMDA y la NOS. Además, se sabe que ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD 1 (Cu/ZnSOD) son resistentes a las acciones tóxicas de Abeta a través del bloqueo de vías apoptóticas. Con base en estas observaciones, se han probado diferentes tratamientos contra la toxicidad de Abeta, e incluso a nivel clínico en la enfermedad de Alzheimer, algunos de éstos agentes son antioxidantes. Aquí se describirán de manera breve algunos de los más recientes y prometedores para la investigación de esta neuropatía: La memantina, un antagonista de los receptores para NMDA atenúa notablemente los síntomas de la enfermedad de Alzheimer y reduce las alteraciones excitotóxicas y oxidativas a nivel experimental. El factor de crecimiento transformante β-1 y el 17-β-estradiol reducen el daño oxidativo y favorecen la actividad de la ATPasa, así como el transporte de glutamato y glucosa afectados por el Abeta. El uso de 2-desoxiglucosa, los estrógenos y los factores neurotróficos diversos, ha resultado en la prevención de daño oxidativo de Abeta. El riesgo de estrés oxidativo y nitrosativo producido por Abeta se demostró a través de la formación de NO• y la disminución de viabilidad celular en cultivos primarios de células corticales, en los cuales los inhibidores de la NOS tipo II L-NIL y 1 400W,

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

el atrapador de NO• carboxi-PTIO y el antioxidante Troxol, disminuyeron la viabilidad celular inducida por Abeta y peroxinitrito. La L-acetil-carnitina, un precursor mitocondrial de la acetil-CoA y preservador de ATP, ha demostrado prevenir la disminución de ATP y atenuar el daño oxidativo producido por Abeta, demostrando así que la toxicidad del péptido involucra un metabolismo energético alterado, como el que se observa en la enfermedad de Alzheimer. Otros antioxidantes cuyos efectos primarios se dan a través de la inactivación de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y que han funcionado en la experimentación contra Abeta (y algunos de ellos parcialmente a nivel clínico) son la melatonina, que mejora las funciones cognitivas y las actividades de enzimas antioxidantes; los flavonoides del extracto de Ginkgo biloba EGb761 y polifenoles del vino rojo (fracción flavonoide CP 205), y el compuesto organosulfurado derivado del extracto madurado del ajo S-alilcisteína (SAC), que posee propiedades antioxidantes y neurotróficas y atenúa el déficit de aprendizaje inducido por el péptido. En conjunto, éstas y otras evidencias enfatizan el papel del estrés oxidativo y nitrosativo como una parte integral y causal del patrón de daño evocado por el Abeta en la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, a pesar de estos prometedores hallazgos, el conocimiento en este punto sobre las alternativas terapéuticas para la enfermedad aún es limitado, y por ello, las investigaciones en este campo continuarán en los siguientes años.

❚ ENFERMEDAD

DE

HUNTINGTON

La enfermedad de Huntington es una neuropatía degenerativa asociada con degeneración selectiva de las neuronas espinosas estriatales en los ganglios basales, y está caracterizada por disartria (alteración de las articulaciones), demencia y movimientos coreiformes involuntarios (tipo danza). Es una enfermedad autosómica dominante, y el gen responsable se ha localizado en el brazo corto del cromosoma 4, el cual contiene repeticiones expandidas del trinucleótido CAG. En la patogénesis de la enfermedad se han implicado tanto un papel activo de la forma aberrante (mutante) de la proteína huntingtina, como eventos excitotóxicos que implican la muerte neuronal por sobreactivación de receptores tipo NMDA. Los cambios neuroquímicos en el caudado-putamen de cerebros post mortem de pacientes con este trastorno incluyen la disminución de GABA, de la glutamato descarboxilasa (GAD), sustancia P, encefalina, acetilcolina y colina acetiltransferasa, así como un aumento en las concentraciones de somatostatina, neuropéptido Y, neurotensina y serotonina, al tiempo que los niveles de dopamina permanecen sin cambio. Histológicamente, la enfermedad de Huntington se caracteriza por serias alteraciones en neuronas que contienen GABA, NADPH-diaforasa, parvaalbúmina y acetil colinesterasa, con marcada reducción en células inmunorreac-

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tivas a encefalina y sustancia P. Como en esta enfermedad se afecta la transmisión inhibitoria por la pérdida de neuronas GABAérgicas, ésta se conoce como una enfermedad típicamente excitatoria en ausencia de su componente inhibitorio regulador. La enfermedad comienza sus manifestaciones en la edad media adulta del individuo (35 a 40 años), y su progreso es de casi 15 a 20 años, inhabilitando al paciente gradualmente hasta que los cuadros de disfagia (incapacidad para deglutir alimentos) son tan severos que la mayoría de los pacientes muere por inanición. En la enfermedad de Huntington, el componente oxidativo es severo, aunque no se ha estudiado de manera tan profunda como otras neuropatías degenerativas. Hasta ahora se sabe que el estrés oxidativo y nitrosativo está involucrado en la degeneración neuronal, dado que diferentes sistemas antioxidantes endógenos se ven afectados desde etapas tempranas de la enfermedad. Entre ellos destacan la disminución en los niveles cerebrales de GSH y el marcado déficit energético celular a través de la alteración de los complejos mitocondriales I y II, lo cual sugiere la formación de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno con resultados devastadores para las neuronas, aunque aún no se sabe con certeza cuál es la relación entre estos eventos de daño oxidativo y la selectividad en la muerte neuronal selectiva. Recientemente, dos evidencias han servido para involucrar más activamente al estrés oxidativo y nitrosativo en la enfermedad de Huntington: la acumulación del pigmento fluorescente de la peroxidación, lipofucsina, y del ácido láctico en cerebros de pacientes vivos con esta enfermedad. Para el manejo y tratamiento de este trastorno se ha probado la administración de agonistas GABAérgicos, agonistas y antagonistas colinérgicos, agentes relacionados con la transmisión dopaminérgica y otros fármacos de acción central, y aun cuando hasta el momento no hay un tratamiento efectivo para la enfermedad, diferentes modelos experimentales que reproducen las características neuroquímicas e histopatológicas de la enfermedad de Huntington están bajo investigación, y ofrecen valiosas aportaciones para el desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos y moleculares. Entre los modelos farmacológicos de la enfermedad predominan los producidos por la infusión intraestriatal a roedores y primates no humanos de diversos análogos de glutamato, como el ácido kaínico (AK), ácido iboténico (AI) y ácido quinolínico (AQ). Otro modelo es producido por la infusión intraestriatal o sistémica de una potente toxina mitocondrial, el ácido 3nitropropiónico (3-NP). Aunque tanto el AK como el AI producen lesiones de neuronas estriatales y reducción en la actividad de la GAD y la colina acetiltransferasa en modelos animales, estas toxinas no reproducen fielmente algunas otras características histológicas y neuroquímicas de la enfermedad de Huntington. En el caso del 3-NP, esta neurotoxina produce atrofia estriatal y reproduce aspectos histológicos y neuroquímicos de la enfermedad, con la ventaja sobre las otras toxinas de que puede ser administrada sistémica o tópicamente debido a su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica; sin embargo, en contraste con el

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AQ, el 3-NP no es una toxina endógena, y está lejos de generar el modelo de la enfermedad de Huntington más apegado a la neuropatía humana, como lo hace el AQ. Una ventaja adicional del AQ, además de su naturaleza endógena como un metabolito derivado del triptófano es su implicación directa como factor causal potencial de la enfermedad, dado que recientemente se ha demostrado que sus niveles corticales y estriatales, así como los de su precursor inmediato, la hidroxikinurenina, se encuentran aumentados de manera significativa en los cerebros de pacientes con la enfermedad en etapas tempranas. Otra línea de investigación que ha surgido sobre la enfermedad de Huntington a nivel experimental se basa en las alteraciones moleculares que conducen a la repetición múltiple de trinucleótidos de CAG en dicho trastorno, lo que ha permitido la generación de modelos transgénicos en levaduras, Drosophila, y particularmente en ratones. En estos últimos, las líneas R6/0, R6/1, R6/2 y R6/5 difieren entre ellas en el número de repeticiones de CAG que contienen. A pesar del hecho evidente de que estos modelos transgénicos constituyen herramientas prometedoras para el estudio de las alteraciones en la enfermedad de Huntington, la información sobre sus características neuroquímicas, conductuales e histológicas es aún limitada y se encuentra en continuo progreso. Mientras tanto, el uso de neurotoxinas aún representa la herramienta más útil para modelar esta enfermedad. A continuación se describirán algunas de las estrategias antioxidantes más empleadas en el modelo farmacológico más cercano a la enfermedad de Huntington, el producido por AQ. El AQ es un ácido dicarboxílico y metabolito endógeno del triptófano que se forma en la vía de la kinurenina. Actúa como agonista glutamatérgico sobre receptores para NMDA, y es una excitotoxina conocida que produce daño oxidativo en el sistema nervioso. Su naturaleza endógena lo ha relacionado con diversas enfermedades neurológicas de tipo inflamatorio e infeccioso. El AQ sobreestimula receptores para NMDA y aumenta la permeabilidad a Ca2+, disminuye la formación de ATP y produce estrés oxidativo y nitrosativo y muerte celular. La selectividad en su patrón neurotóxico evoca las alteraciones de la enfermedad de Huntington en roedores y primates. La capacidad del AQ de modificar los perfiles de algunos antioxidantes endógenos en el cerebro, como el contenido de GSH y la actividad de la Cu/Zn-SOD, así como su capacidad de generar radicales •OH durante sus etapas tempranas de toxicidad, han demostrado su carácter prooxidante. Se sabe que el AQ forma complejos tipo hierro (II)AQ responsables de aumentar la formación del •OH a través de la reacción de Fenton y producir así daño oxidativo al DNA y peroxidación lipídica. Además, se sabe que ratones transgénicos con baja expresión de Cu/Zn-SOD resultan más sensibles a las acciones tóxicas del AQ, mientras que los animales que sobreexpresan la Cu/Zn-SOD son más resistentes. Más aún, la participación activa del ONOO– en la toxicidad del AQ se ha investigado recientemente y permite

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postular al estrés oxidativo como parte integral del patrón neurotóxico de esta molécula. Mientras que diversos agentes que actúan como antagonistas de receptores para NMDA han resultado en neuroprotección en éste y otros modelos farmacológicos de la enfermedad de Huntington, una de las tendencias actuales más sólidas en investigación radica en el uso de antioxidantes dado el carácter inocuo de algunos de ellos, en comparación con los mencionados antagonistas. Entre los primeros destacan el MK-801, ácido fosfonovalérico y ácido kinurénico (el antagonista de receptores tipo NMDA endógeno derivado de la misma vía de síntesis). Otros agentes no antioxidantes, como el factor de crecimiento neuronal y el factor de crecimiento fibroblástico, han generado importantes respuestas de protección y regeneración. Entre los agentes antioxidantes con mejores resultados en la experimentación tanto in vitro como in vivo destacan atrapadores de especies reactivas de oxígeno e inductores de actividad enzimática antioxidante, como la melatonina, deprenil, N-acetil-cisteína, α-fenil-t-butil nitrona, poliaminas como la espermina y la espermidina, vesículas de ascorbil palmitato (aspasomas), quelantes de hierro como la desferrioxamina, glutatión reducido, selenio y selenocompuestos como el ebselen que estimulan la actividad de la GPx, atrapadores sintéticos de radicales, como el OPC-14117, que reducen la señalización proapoptótica mediada por el factor nuclear kappa B (NFκB), el derivado del ajo SAC que estimula la actividad de la Cu/Zn-SOD, y recientemente, inhibidores de la NOS como la L-NAME y la L-NARG, así como metabolizadores de ONOO– como los porfirinatos de hierro Fe(TPFPP) y Fe(TPPS). Aunque todos estos agentes reducen el daño neurotóxico generado por el AQ y otras toxinas a muy distintos niveles celulares, y disminuyen así el estrés oxidativo y nitrosativo asociado al daño excitotóxico en modelos experimentales de la enfermedad de Huntington, es necesario mencionar que no todos los fármacos antioxidantes revierten las alteraciones de estas toxinas, por lo que su uso clínico está sujeto a los resultados de futuras investigaciones y a un adecuado diseño farmacológico.

❚ ESCLEROSIS

LATERAL AMIOTRÓFICA

La esclerosis lateral amiotrófica es una enfermedad que inicia en la edad adulta media, y se caracteriza por una degeneración selectiva y progresiva de las neuronas motoras inferiores de la médula espinal y de las neuronas motoras superiores en la corteza cerebral. La enfermedad afecta casi a 0.05 a 0.1% de la población mundial, e invariablemente conduce a la muerte debido a las múltiples complicaciones de la parálisis. Se sabe que el metabolismo de los aminoácidos excitadores está alterado en los pacientes con esclerosis lateral amiotrófica, dado que las concentraciones de glutamato, aspartato y N-acetilaspartil glutamato

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 24)

están elevadas en el líquido cefalorraquídeo y disminuidas en la médula espinal y la corteza motora, y estos cambios han sido interpretados como alteraciones en el transporte de glutamato y su consecuente disponibilidad para eventos excitotóxicos tempranos de la enfermedad, lo que produciría eventos neurodegenerativos asociados a daño oxidativo a través de sobreactivación de receptores AMPA-kainato. Esta hipótesis se apoya en evidencias experimentales como el hecho de que vesículas sinápticas aisladas de médula espinal y corteza motora post mortem de pacientes que padecieron esclerosis lateral amiotrófica muestran alteraciones en los mecanismos de recaptura para el glutamato. Además, se han identificado al menos 11 mutaciones en el gen que codifica para la Cu/ZnSOD en familias que han padecido la forma autosómica dominante de la enfermedad. Tanto la forma esporádica de la esclerosis lateral amiotrófica como la forma dominante presentan síntomas clínicos y neuropatología similares, aunque esta última constituye sólo 10 % de los casos totales del trastorno. Las mutaciones en la esclerosis lateral amiotrófica dominante afectan regiones críticas de la estructura terciaria de la Cu/Zn-SOD, lo que redunda en una disminución en la actividad de la enzima en estos pacientes, aunque esto no necesariamente ocurre en los pacientes con el trastorno de tipo esporádico o en la forma hereditaria no dominante. Lo que sí ocurre en la esclerosis lateral amiotrófica esporádica es un elevado nivel de oxidación de las proteínas, sugiriendo eventos de estrés oxidativo y nitrosativo, sean éstos dependientes o independientes de la función de la Cu/Zn-SOD. Con base en estas observaciones, se ha propuesto que un aumento en la actividad oxidativa en estos pacientes podría estar involucrado en una hipersensibilización de motoneuronas a una transmisión glutamatérgica basal, o incluso moderadamente aumentada, a través de receptores AMPA-kainato. La generación de modelos experimentales para la esclerosis lateral amiotrófica presenta ciertas dificultades debido a la complejidad de la enfermedad. Dichos modelos comprenderían de manera general los animales portadores de las alteraciones genéticas para la Cu/Zn-SOD y animales knockout para la Cu/Zn-SOD. A nivel farmacológico destacan los estudios con agentes que inhiben el transporte de glutamato, y en consecuencia, producen degeneración de motoneuronas que se previene por antagonistas de receptores para AMPA-kainato, o bien aquellos estudios con la toxina de Lathyrus sativus y que es responsable de latirismo, la β-N-oxalilamino-L-alanina. De manera similar, la β-N-metilamino-L-alanina, una toxina que incluso se ha implicado en el complejo esclerosis lateral amiotrófica-enfermedad de Parkinson-demencia, causa degeneración selectiva de neuronas motoras superiores e inferiores a nivel experimental, y sus efectos también resultan sensibles a la acción de antagonistas para receptores a AMPA-kainato. La terapéutica para la esclerosis lateral amiotrófica aún es muy limitada, y

Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas

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constituye un campo fértil de investigación para el uso de agentes antioxidantes inocuos dada la naturaleza prooxidante de sus eventos patógenos.

❚ EXPERIMENTOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO DEL AUTOR

El autor, junto con su grupo de investigación, ha desarrollado modelos de enfermedades neurodegenerativas y daño neuronal excitotóxico en animales de laboratorio. Destacan los modelos experimentales de la enfermedad de Huntington y de déficit energético evocados por la inyección sistémica y/o tópica de neurotoxinas que estimulan de manera directa o indirecta a los receptores para los aminoácidos excitadores a través de fármacos que inhiben a dichos receptores o agentes antioxidantes. Asimismo, se ha estudiado de manera sistemática la relación de los eventos neurodegenerativos con la formación temprana de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y las posibles alternativas terapéuticas que se generan a nivel experimental para el tratamiento de eventos degenerativos en el cerebro de humanos.

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❚ CONCLUSIONES Diversos factores confluyen en la generación de los eventos tóxicos que culminan en la manifestación de las alteraciones propias de las diversas neuropatías degenerativas. El estrés oxidativo y nitrosativo parece ser, a la luz de las evidencias actuales, un factor determinante en estos procesos. Sin embargo, hasta hoy, contando con todo el conocimiento generado por la comunidad científica, no se puede definir con certeza si la formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en los cerebros de los pacientes con estas enfermedades constituye un factor causal o es sólo una consecuencia de otros eventos previos tendientes a la alteración de la homeostasia celular. Por ello, la atención de diversos grupos de investigación en el futuro deberá centrarse en el esclarecimiento de esta cuestión para la mejor comprensión de la naturaleza patógena de estas enfermedades y su consecuente canalización terapéutica.

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AÑO OXIDATIVO

Y ENFERMEDADES HEPÁTICAS Ma. Concepción Gutiérrez Ruíz Verónica Souza Arroyo Blanca Farfán Labonne

El daño hepático, tanto a nivel agudo como crónico, es una patología común a nivel mundial, caracterizada en su evolución crónica por un proceso progresivo desde esteatosis a carcinoma hepatocelular, pasando por hepatitis crónica, fibrosis y cirrosis. La principal etiología es el abuso del alcohol, la infección viral, principalmente por el virus de la hepatitis B y C, así como enfermedades metabólicas como la enfermedad de Wilson y la hemocromatosis. Otros factores pueden estar simultáneamente presentes, como son la sobrecarga de hierro, la infección por más de un virus, la alteración del metabolismo de carbohidratos y lípidos, entre otros, los cuales pueden exacerbar la enfermedad hepática. Es notorio que, independiente del agente etiológico, en todos los tipos de daño hepático existe evidencia contundente de un incremento de radicales libres y/o una disminución significativa de las defensas antioxidantes. Así, las especies reactivas de oxígeno (ERO) y nitrógeno (ERN) juegan un papel crucial en la inducción y progresión de la enfermedad hepática.

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❚ INTRODUCCIÓN

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ GENERALIDADES

(Capítulo 25)

SOBRE EL HÍGADO Y LA FIBROSIS HEPÁTICA

El hígado es el mayor órgano del cuerpo y es esencial para mantener la homeostasia del organismo. Elimina o neutraliza las sustancias tóxicas, produce agentes inmunitarios para controlar las infecciones y elimina gérmenes y bacterias de la sangre. Produce las proteínas que regulan la coagulación de la sangre y la bilis para ayudar a absorber las grasas y las vitaminas liposolubles, entre otras muchas funciones. El parénquima del hígado normal está organizado como un epitelio modelo, con un componente epitelial que son los hepatocitos, una capa endotelial sinusoidal que se distingue por sus fenestraciones y poros, macrófagos residentes que son las células de Kupffer y pericitos hepáticos específicos, conocidos como células estelares hepáticas. El sinusoide es la unidad microvascular hepática, con un espacio subendotelial denominado espacio de Disse, que separa a los hepatocitos del endotelio sinusoidal. Este espacio contiene una matriz esencial parecida a la de la membrana basal para el mantenimiento de la función diferenciada de todas las células residentes hepáticas y para asegurar el intercambio metabólico óptimo entre el torrente sanguíneo y los hepatocitos (figura 25-1). Los sinusoides hepáticos, originados de las estructuras vasculares (ramas de la vena porta y de la arteria hepática) están incluidos en espacios porta. Los espacios porta son estructuras claves en la arquitectura del hígado e incluyen también conductos biliares, conductos linfáticos y células estromales (miofibroblastos portales y fibroblastos). A medida que se produce la fibrosis en el hígado, se producen cambios tanto cuantitativos como cualitativos en la composición de la matriz extracelular. El contenido total de los componentes tipo colágena y no colagénicas se incremen-

CE Lumen vascular

CK

H CEH

Lumen vascular

Figura 25-1. Morfología del sinusoide hepático: H, hepatocito; CK, células de Kupffer; CEH, células estelares; CE, células endoteliales.

Daño oxidativo y enfermedades hepáticas

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ta de tres a cinco veces, acompañado por un cambio en el tipo de la matriz extracelular en el espacio subendotelial. La matriz de baja densidad tipo membrana basal cambia a una matriz de tipo intersticial con fibras de colágena. Estos cambios en los componentes de la matriz, además de las implicaciones físicas y mecánicas, contribuyen a la formación de un nuevo microambiente bioquímico. La fuente celular de los componentes de tejido conectivo en el hígado fibrótico es en la actualidad todavía controversial. De entre los diferentes componentes involucrados en la producción de la matriz extracelular, las células estelares han recibido mucha atención, principalmente por la facilidad de aislamiento y su posibilidad de estudiarlas in vitro. Gracias a estudios realizados en estas células se conoce una gran parte de los mecanismos que incrementan las proteínas de la matriz extracelular. Las células estelares se activan ante la agresión, cambian fenotípicamente y se vuelven un tipo celular productor de matriz extracelular. Otros tipos celulares involucrados también en la producción de proteínas de matriz extracelular son los fibroblastos y los miofibroblastos de los tractos portales, las células de músculo liso localizadas en los vasos y los miofibroblastos localizados alrededor de la vena centriolobular. En la actualidad, se están realizando grandes esfuerzos para tratar de identificar y caracterizar la participación de todos estos tipos celulares en el proceso fibrogénico.

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❚ ENFERMEDAD

HEPÁTICA ALCOHÓLICA

A la fecha, se han realizado múltiples estudios sobre el mecanismo por el cual el etanol produce daño hepático. Se ha considerado que el etanol ejerce una toxicidad directa en el hígado, órgano principal donde se lleva a cabo el 95% de su metabolismo, asociado con cambios en el estado redox y con el estrés oxidativo. Los cambios en el estado redox están mediados por la alcohol deshidrogenasa (ADH), mientras que el estrés oxidativo es generado principalmente por la actividad del sistema oxidativo microsomal del etanol (MEOS) y su enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1), la cual produce radicales libres. La oxidación del etanol por medio del patrón de la ADH produce acetaldehído, el cual es convertido en acetato. Ambas reacciones producen nicotinamida adenín dinucleótido en su forma reducida (NADH). El exceso de NADH produce algunos desórdenes metabólicos, incluyendo la inhibición del ciclo de Krebs y de la oxidación de los ácidos grasos. A finales del decenio de 1980-89, se estableció que la enzima clave en el MEOS era el CYP2E1, ya que en las biopsias hepáticas de alcohólicos crónicos se encontraba un incremento de 10 veces el contenido de esta enzima, por lo cual se consideró que este sistema enzimático inducible, jugaba un papel importante en la ingesta crónica de etanol y en la tolerancia metabólica que se

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

desarrolla en los alcohólicos. Se ha considerado que el daño temprano como es la esteatosis alcohólica y la esteatohepatitis alcohólica son consecuencia de la inducción del CYP2E1. El CYP2E1 se encuentra inducido en ratas obesas, ya que esta isoforma del citocromo también cataliza la hidroxilación de los famosos ácidos grasos omega 1 y 2 (ω1 y 2). La ingesta de etanol también incrementa la actividad del CYP4A1, el cual cataliza la hidroxilación ω en la terminal carbonilo de los ácidos grasos. Una posterior oxidación de los hidroxiácidos ω y ω1 por el etanol y la ADH resulta en la producción de ácidos dicarboxílicos y oxocarboxílicos. Los ácidos dicarboxílicos juegan un papel regulador en el depósito hepático de los ácidos grasos no esterificados, mediante la activación del receptor α por los proliferadores de peroxisomas, el cual incrementa la transcripción de patrones de disposición de los ácidos grasos como el CYP4A1, la acil coenzima A oxidasa peroxisomal y la proteína unidora de ácidos grasos hepática citosólica (L-FABPc). El resultado es un incremento microsomal de la ω-oxidación, peroxisomal de la β-oxidación y de la síntesis de acilglicerol. Se conoce que hay diferencias en las anormalidades de lípidos inducidas por la ingesta de alcohol y en la vulnerabilidad de la enfermedad hepática alcohólica, dependiendo del género. Se ha reportado que diferencias en la distribución del etanol, la biodisponibilidad, el metabolismo hepático, que lleva a un incremento del acetaldehído y desarreglo en el metabolismo de lípidos, podrían contribuir a la vulnerabilidad de la mujer al daño por la ingesta de etanol. La inducción del CYP2E1 juega un papel importante en la patogénesis del daño hepático alcohólico, incluyendo la esteatohepatitis alcohólica, debido al estrés oxidativo que genera. Más aún, el CYP2E1 está incrementado en pacientes con esteatohepatitis no-alcohólica. Esto se debe a que los ácidos grasos, presentes en cantidades superiores en obesos, lo mismo que las cetonas en los diabéticos, son también sustratos del CYP2E1 y éstos a su vez provocan una sobrerregulación del citocromo. El daño causado por el estrés oxidativo en la esteatohepatitis alcohólica incluye daño mitocondrial, lo cual a su vez exacerba el estrés oxidativo, por lo que se considera que el daño mitocondrial es un componente importante en la enfermedad hepática alcohólica.

Progresión del hígado graso a inflamación y fibrosis El estrés oxidativo causado por la inducción del CYP2E1 y el daño mitocondrial da como resultado la peroxidación de lípidos y la alteración membranal. Además, el acetaldehído producido por la oxidación del etanol tiene efectos tóxicos, inhibiendo la reparación de las nucleoproteínas, disminuyendo la actividad de enzimas y reduciendo la capacidad mitocondrial para reducir el oxígeno durante la respi-

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ración. La oxidación desacoplada de la mitocondria puede interferir con la oxidación del acetaldehído, y esto lleva a un círculo vicioso por la acumulación progresiva del acetaldehído y el aumento del daño mitocondrial. El acetaldehído promueve la muerte celular depletando (abatiendo) la concentración de glutatión reducido(GSH), induciendo lipoperoxidación, e incrementando los efectos tóxicos de los radicales libres. Al unirse a la tubulina de los microtúbulos, el acetaldehído bloquea la secreción de proteínas. El incremento en las proteínas, los lípidos, el agua y los electrólitos, causa que los hepatocitos se agranden, una característica en la enfermedad hepática alcohólica. Los aductos proteína-acetaldehído promueven la producción de la colágena, y pueden actuar como neoantígenos, lo cual estimula la respuesta inmunitaria. Los productos de la lipoperoxidación, como el 4-hidroxinonenal (4HNE) y el malondialdehído (MDA), estimulan la fibrosis, la cual aumenta en la medida en que disminuye la inhibición por retroalimentación de la síntesis de colágena, debido a que el acetaldehído forma aductos con la terminal carboxilo del propéptido de procolágena. El estrés oxidativo promueve la inflamación, la cual se incrementa por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), que es una citocina proinflamatoria secretada por las células de Kupffer. Tanto durante el daño agudo como durante el crónico, las células de Kupffer se activan para producir citocinas y ERO. El etanol induce también la secreción del factor de crecimiento transformador beta (TGF-β) por los hepatocitos, lo cual provoca la estimulación de la síntesis de colágena en las células estelares (figura 25-2). La producción de citocinas proinflamatorias promueve la expresión de la enzima óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). Al producirse óxico nítrico (NO•), éste reduce o incrementa la toxicidad del etanol interfiriendo con algunas de las enzimas encargadas de su metabolismo. El efecto tóxico de NO• depende de las ERO producidas, así como de la cantidad de antioxidantes celulares presentes, principalmente GSH. Cuando hay bajas concentraciones de ERO y alto contenido de GSH, se promueven los efectos protectores del NO•; mientras que condiciones opuestas, producen un incremento en la lipoperoxidación y en la apoptosis. Los hepatocitos contienen aproximadamente el 10% del total del GSH del organismo. Una homeostasia normal de este tripéptido es necesaria para la actividad del CYP450 y de la mitocondria. El GSH también afecta la transcripción de las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias, así como la regeneración hepática mediada por la inducción del factor nuclear kappa B (NF-κB), la biodisponibilidad del NO• y la energía metabólica. Al producirse una disminución del GSH debido a la ingesta de etanol, las ERO inducen estrés oxidativo y reducen también la capacidad de otros antioxidantes. De igual forma, y como consecuencia del daño hepático, puede producirse una reducción de GSH. Un hecho bien documentado es la disminución del GSH en el hígado y a nivel circulatorio, tanto en pacientes con cirrosis alcohólica como de otras etiologías.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Estrés oxidativo Metabolismo del etanol

CYP2E1

Acetaldehído

Promoción de Inflamación Activación de NF B Secreción de citocinas: TNF Alteración sistema antioxidante Inhibe reparación de nucleoproteínas Disminuye actividad de enzimas Disminuye niveles GSH Daño mitocondrial

(Capítulo 25)

Inducción de iNOS Producción de ERO Apoptosis Necrosis Inflamación Respuesta inmunitaria Fibrosis Lipoperoxidación Formación de neoantígenos Promoción de fibrosis

Figura 25-2. Fisiopatología del daño hepático inducido por etanol.

Otros sistemas antioxidantes también están involucrados en la inducción y progresión del daño hepático crónico. El etanol altera significativamente el sistema de glutatión peroxidasa (GPx), contribuyendo a la disfunción mitocondrial. La superóxido dismutasa (SOD), particularmente en presencia de vitamina E, es el mecanismo de defensa primaria contra las ERO, pero en animales modelo se ha probado la presencia de un sistema insensible SOD-catalasa a radicales libres que facilita el daño hepático. El selenio también es un agente protector contra la lipoperoxidación y el daño hepático, sin embargo su contenido en plasma está disminuido en pacientes cirróticos, en los cuales también hay una disminución de retinol sérico (vitamina A), esto se asocia a riesgo de hepatocarcinoma. Recientemente se ha sugerido que la determinación de los niveles plasmáticos de GSH, vitamina A, β-carotenos, SOD, GPx, catalasa y marcadores de lipoperoxidación, pueden representar marcadores útiles para ir evaluando la progresión del daño hepático y la respuesta al tratamiento en pacientes con enfermedad alcohólica y viral hepática. La familia de la enzima glutatión-S-α-transferasa (GST) representa uno de los principales sistemas antioxidantes en los hepatocitos, debido a que este tipo de enzimas unen GSH a gran cantidad de hidroperóxidos y sustancias tóxicas. La GST también regula la apoptosis dependiendo del patrón de lipoperoxidación. Se sabe que el etanol causa la inducción hepática de la GST. Para contrarrestar el estrés oxidativo, el organismo posee diferentes mecanismos de defensa, denominados colectivamente como antioxidantes. Algunos de ellos son sintetizados dentro del cuerpo y otros son obtenidos a partir de la dieta. Hay evidencias contundentes que señalan que la ingesta de etanol altera los sistemas enzimáticos antioxidantes, así como el contenido de algunos antioxidantes que provienen de la dieta como son la vitamina E y C. Reportes recientes señalan que en pacientes con enfermedad hepática alcohólica se incrementa la lipoperoxidación a nivel sérico, determinada como los niveles de MDA, así como el contenido de 4HNE. El incremento de ambos es proporcional al grado de daño del paciente. Asimismo las concentraciones de vitaminas E y C a nivel sérico están disminuidas. Por ello, algunos investigadores consideran que la alteración en

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los sistemas enzimáticos puede deberse a factores etiológicos importantes en la enfermedad hepática alcohólica. Las ERO, en particular el anión superóxido, reaccionan rápidamente con el NO• para formar peroxinitrito (ONOO•). Éste puede actuar como una molécula dañina, ya que al reaccionar con los grupos tioles (–SH) de las enzimas, altera su actividad. Además puede contribuir a la inducción de la lipoperoxidación. La formación del ONOO• puede considerarse como un mecanismo protector debido a que el NO• actúa como un atrapador de ERO. El estrés oxidativo y nitrosativo inicia y regula la transcripción y activación de una gran cantidad de mediadores en todas las células hepáticas, lo cual culmina en un mecanismo común de daño: inflamación, respuesta inmunitaria, fibrosis, isquemia, expresión génica alterada, apoptosis y necrosis. La persistencia o prevalencia de uno o más de estos aspectos puede influenciar la ocurrencia de diferentes tipos de daño hepático. La producción incrementada de ERO y la alteración de la poza de GSH contribuye a programas de muerte por activación de factores de transcripción como el NF-κB, llevando a la sobrerregulación de citocinas pro-inflamatorias, quimiocinas, moléculas de adhesión, ligando Fas, genes de sobrevida, entre otros, los cuales activan la cascada de caspasas (apoptosis) o inducen la liberación de citocromo c y la depleción de ATP a nivel mitocondrial (necrosis) (figura 25-3). El mecanismo dependiente de GSH también es requerido para la expresión de proteínas de señalización protectoras y de factores transcripcionales como los de la familia de Bcl-2. La relación entre el estrés oxidativo y la apoptosis está bien documentada, por su efecto en la inducción del sistema CYP450, la síntesis de citocinas por las células de Kupffer y la infiltración de los neutrófilos, que incrementan la producción de ERO y depletan a los hepatocitos de sus reservas de ATP. De hecho, las ERO generadas por los neutrófilos dañan a los hepatocitos favoreciendo la muerte por necrosis en lugar de por apoptosis. Otra contribución a la muerte celular deriva de la adhesión de linfocitos citotóxicos, ya que al liberar proteasas, tipo granzimas, y perforina de los gránulos citotóxicos, particularmente en presencia de ERO, median la interacción linfocitos-Fas/Fas ligando. En diferentes condiciones clínicas, como la diabetes, la obesidad, la exposición a agentes tóxicos, fármacos, etanol e infección por el virus de la hepatitis C (VHC), el hígado graso representa el primer paso en el daño hepático crónico. La inducción del CYP2E1 y otras formas de CYP incrementan la producción de ERO, el daño membranal lipoperoxidativo y la depleción de ATP, lo que promueve a la progresión de hígado graso a esteatohepatitis, fibrosis y cirrosis. Se conoce, desde hace varios años, que el daño oxidativo es un sustrato de la fibrogénesis. La fibrosis, durante muchos años definida como una enfermedad “pasiva” e irreversible, es en la actualidad considerada como un proceso dinámico y reversible.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

Inicio del daño hepático Sistema P450 CYP2E1

Aductos aldehídicos Lipoperoxidación Alteraciones membranales

ROS Disminución de GSH Disminución de ATP Permeabilidad membranal

Mitocondria

Citosol

ROS

ROS

GSH vit C

Hepatocito

SOD Catalasa

iNOS

GST GSH

Respuesta inmunitaria Acumulación de lípidos Estimulación fibrosis Apoptosis/necrosis

Progresión del daño hepático

Activación de Kupffer por endotoxinas

NF κ B

ROS

IL 10

iNOS

TNF-α iNOS

IL 1, IL 6, IL 8 IFN-γ

APOPTOSIS/NECROSIS

Reclutamiento Neutrófilos ROS Inflamación

Activación de células estelares Expresión de genes de matriz extracelular FIBROSIS CIRROSIS

Figura 25-3. Procesos involucrados en la progresión del daño hepático.

❚ ESTEATOHEPATITIS

NO ALCOHÓLICA

El término esteatohepatitis no alcohólica fue acuñado en 1980, para describir un nuevo síndrome presente en pacientes generalmente obesos, a menudo diabéticos, principalmente de género femenino, en la quinta o sexta década de la vida, con una biopsia hepática con datos de hepatitis alcohólica, pero que no ingerían etanol. La causa de este síndrome era desconocida y no había tratamiento definido. Después de más de dos décadas, este síndrome es poco más entendido, pero aún en la actualidad no hay un tratamiento apropiado. Los pacientes con esteatohepatitis no alcohólica primaria, típicamente tienen resistencia a la insulina, caracterizada por la obesidad, la hiperlipidemia, la hipertensión y en algunos casos anormalidades como síndrome de ovarios poliquísticos. La esteatohepatitis no alcohólica secundaria puede ser causada por fármacos como el tamoxifen, algunos productos petroquímicos y la amiodarona; por una derivación yeyunoileal, así como una pérdida rápida de peso. La causa primaria de la esteatohepatitis no alcohólica es motivo de controversia, pero hay evidencias de que el estrés oxidativo juega un papel inicial, el cual es seguido por un segundo evento capaz de inducir inflamación, fibrosis o necrosis.

Daño oxidativo y enfermedades hepáticas

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La presencia de estrés oxidativo está bien documentada en la esteatohepatitis no alcohólica, ya que se ha reportado la presencia de 3 nitrotirosina, un marcador para estrés oxidativo, en biopsias de pacientes, así como un incremento de los niveles séricos de tiorredoxina. Las fuentes potenciales para las ERO son múltiples, siendo el CYP2E1 y la mitocondria las causas más estudiadas en esta patología. Al principio de este capítulo se menciona que la obesidad puede inducir al CYP2E1, el cual puede disminuir su actividad con una derivación gástrica y una disminución del peso. Asimismo, se ha registrado una disminución en el contenido de GSH y un incremento de aproximadamente 16 veces del daño lipoperoxidativo en animales de experimentación. Se considera que los marcadores de daño oxidativo preceden a la expresión de genes pro-fibróticos y la fibrosis. Los hepatocitos son la fuente de los radicales que llevan a la lipoperoxidación, así como una fuente importante de TGF-β. Puesto que la mitocondria es también una fuente potencial importante de la formación de ERO, se considera que la desregulación del metabolismo de las grasas está asociada a la disfunción mitocondrial, principalmente en tres puntos:

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a) El metabolismo de los ácidos grasos, principalmente durante la β-oxidación. b) El incremento de la síntesis de ácidos grasos libres en el hígado, aunado a la toma de ellos de la sangre. c) El aumento en la velocidad de esterificación de los ácidos grasos libres en el hepatocito, al tiempo de un incremento en la entrada de triglicéridos al hígado. Con respecto al metabolismo de ácidos grasos a nivel de mitocondrial, los estudios se han enfocado a posibles defectos en la β-oxidación. La acumulación de grasa hepática se ha relacionado en parte con la inhibición en la oxidación de estos ácidos grasos. Reportes clínicos indican una actividad respiratoria disminuida, asociada con un incremento de acil carnitina, (la forma en la cual los ácidos grasos de cadena larga son transportados a la matriz mitocondrial) y concentraciones disminuidas de carnitina libre. Una menor actividad respiratoria mitocondrial puede promover una disminución de la oxidación de ácidos grasos. En pacientes con esteatohepatitis no alcohólica, se reporta una disminución de la sintetasa de ácidos grasos de cadena larga ácido-CoA, así como una restitución más lenta de la poza de ATP. Un incremento en la síntesis de ácidos grasos, principalmente a partir de la glucosa, se ha demostrado en los ratones ob/ob (ratones con una mutación que los hace ser obesos). El incremento en el TNF-α puede ser importante en el aumento de la síntesis de ácidos grasos en el hepatocito a través de la activación de acetil-CoA carboxilasa, la cual está involucrada en el paso limitante de la síntesis de novo de ácidos grasos.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

En lo relativo al incremento en la síntesis y depósito de los triglicéridos hepáticos, se sabe que un incremento en la disponibilidad de los ácidos grasos libres, principalmente por una disminución en la β-oxidación y un incremento en la toma de ellos, provoca un aumento en la síntesis de triglicéridos. Una consideración importante en la esteatohepatitis es el metabolismo alterado de las citocinas, principalmente del TNF-α, y esta alteración es muy semejante a la que se presenta en la enfermedad hepática alcohólica.

❚ HEPATITIS

VIRAL

De los tres tipos predominantes de hepatitis viral (A, B y C), la B y la C han incrementado su prevalencia en la población humana. La hepatitis aguda A es debida a la infección por el virus de la hepatitis A humana (VHA) transmitido por vía enteral (contaminación fecal del agua para beber o de la comida). En la infección temprana, el virus se encuentra en la sangre y en las heces. La enfermedad es autolimitante con un periodo de incubación de 15 a 50 días. En los infantes, el 80% de los casos son asintomáticos y anictéricos (sin amarillez en la piel). En sujetos con más edad, la ictericia es mayor y los valores de las enzimas hepáticas están más incrementados. La hepatitis fulminante, aunque es poco frecuente, generalmente está sobrepuesta con infección por el VHB (virus de la hepatitis B humana) o VHC (virus de la hepatitis C humana). El VHA no produce daño crónico ni carcinoma. El HBV es un DNA tipo hepadnavirus con un periodo de incubación de 25 a 180 días. La infección generalmente es asintomática con excepción de los drogadictos y su transmisión es generalmente parenteral por el contacto íntimo de todos los fluidos corporales. De 5 a 20% de los infectados por el VHB puede llegar en la enfermedad crónica a desarrollar cirrosis y hepatocarcinoma. El VHC es un virus de RNA, con un periodo de incubación de 11 a 150 días, se transmite casi siempre por sangre infectada. La fase aguda es generalmente asintomática y del 85 a 90% de los sujetos puede llegar a tener una viremia crónica. La lenta progresión del daño provoca que la cirrosis o el hepatocarcinoma se presente alrededor de 30 años después de la infección por el virus. En las hepatitis virales, el daño celular es determinado predominantemente por la respuesta inmunitaria y aunque la patofisiología es muy compleja, hay un gran número de reportes que demuestran que la persistencia de la infección, la progresión del daño hepático y la carcinogénesis son todos pasos en los cuales están involucrados procesos oxidativos. Los análisis inmunohistoquímicos de las biopsias de los pacientes con hepatitis aguda demuestran aumento en la expresión de las moléculas de adhesión celular vascular como ICAM-1, ELAM-1 y VCAM-1 y el receptor para células T en

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el sinusoide y áreas de necrosis en el parénquima. Este hallazgo apoya la idea de que las citocinas inducen la sobrerregulación de las moléculas de adhesión y el reclutamiento de los linfocitos CD8+ con la subsecuente muerte celular mediada por las células T y la liberación de sustancias tóxicas como perforina y proteasas, o la inducción de las apoptosis mediada por FAS/Apo-1/CD95 y la disfunción mitocondrial. La infección viral promueve la apoptosis. De esta forma el virus puede reducir la respuesta inmunitaria del huésped y así permitir la replicación viral y su propagación. La proteína X del virus VHB y la cubierta del VHC regulan la apoptosis a través del TNF-α, TGF-β, IFN-γ e IL-2; estas citocinas también afectan la progresión del daño hepático hacia la cronicidad. Por el contrario, la respuesta inmunitaria mediada por citocinas Th0/Th1, como son las interleucinas IL-4 y la IL-10, protegen de la persistencia del virus y de la aparición de la fibrosis. In vitro, el antígeno VHB de adhesión depende del estrés oxidativo; los patrones intracelulares que inhiben la expresión y replicación del gen del VHB están mediados por el interferón gamma (IFN-γ) y el TNF-α, los cuales activan la degradación post-transcripcional del RNA viral en el núcleo. Tanto el VHC como el VHB son capaces de influir vía el IFN-γ a la iNOS, la cual media el daño celular a través de la producción de TNF-α e IL-1β. La interacción entre los virus y el etanol afecta significativamente la replicación viral e induce la aparición y progresión del daño hepático vía estrés oxidativo y nitrosativo. Durante la hepatitis C aguda y crónica activa, hay un incremento en la generación de radicales libres y en el daño lipoperoxidativo, tanto a nivel hepático como en células mononucleares periféricas. Se ha asociado también al daño hepático la disminución de GSH, el incremento de la actividad de la caspasas, el incremento de los niveles séricos de MDA y de 4HNE y la reducción de los niveles de cinc en hígado y plasma. La patogénesis y la fibrosis hepática progresan a diferentes velocidades. Las deficiencias en niveles de cinc y de selenio incrementan la propensión hacia la cronicidad y la malignidad debido a que se presentan interferencias en la reparación del DNA y en la inmunidad. En los niños con VHB o VHC crónicos, se han reportado valores disminuidos en la actividad de la catalasa y de la SOD, así como evidencias de un incremento en la lipoperoxidación, lo cual indica una defensa antioxidante inadecuada. Algunos pacientes con VHC presentan valores muy altos de ferritina y de hierro hepático, ya que el hierro cataliza la generación de ERO, se produce un estrés oxidativo severo que explica en ocasiones la resistencia de los enfermos al tratamiento con IFN-γ. Asimismo, se han reportado variaciones en los niveles de GSH y GPx en VHC y se ha encontrado una relación de estos niveles con la actividad de la hepatitis: durante los periodos en que se exacerba la infección, prácticamente no se encuentran estas enzimas. Se sabe que aunque el estrés oxidativo favo-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

rece la replicación viral, ésta se puede inhibir por antioxidantes. El balance redox fluctuante refleja el estado nutricional, enfermedades concurrentes, xenobióticos y medicamentos. La terapia inmunosupresiva y los esteroides favorecen la replicación viral, reducen el cinc y reactivan los virus latentes. Algunos autores reportan reactivación de la infección del VHB en pacientes inmunodeprimidos que se infectaron con el virus de la inmunodeficiencia. Las hepatitis virales y tóxicas son similares histológicamente y el daño hepático es debido al estrés oxidativo, generación de radicales libres y lipoperoxidación, por lo que el manejo de la hepatitis viral, así como el manejo de la hepatitis toxica requiere de la restauración temprana de las concentraciones óptimas de los antioxidantes esenciales en el hígado y en el plasma. El objetivo es limitar el daño, erradicar, restringir o dilatar la replicación viral y maximizar la respuesta inmunológica y reparativa. Debido a que el GSH, el ubiquitol, el cinc, el selenio, la GPx, la catalasa, la SOD, y las vitaminas A, C, E, pueden estar seriamente disminuidas, durante el establecimiento de la hepatitis, sus pozas requieren con urgencia ser repuestas. Así, grandes dosis de antioxidantes primarios deben de ser el tratameinto inicial para restaurar y posteriormente mantener las concentraciones séricas y hepáticas a concentraciones normales. El tratamiento antioxidante puede incluir a las vitaminas A, C, y E combinadas.

❚ DAÑO

HEPÁTICO INDUCIDO POR METALES: ENFERMEDAD DE WILSON Y HEMOCROMATOSIS

El cobre y el hierro son micronutrientes esenciales para el humano. La capacidad de intercambiar electrones en condiciones aeróbicas hace de ellos bio-catalizadores ideales para las reacciones de oxidación y reducción fundamentales para la vida. El hierro está involucrado en la síntesis del DNA y en el transporte de oxígeno, mientras que el cobre, en las defensas antioxidantes, la formación de catecolaminas y la maduración de la hormona peptídico hipofisaria. Ambos metales son esenciales para las enzimas de la cadena transportadora de electrones y de la fosforilación oxidativa en la mitocondria, así como para el metabolismo de colágena. Paradójicamente, su propia química es la base de su toxicidad. Su versatilidad para catalizar reacciones químicas lleva a una producción descontrolada de radicales libres, responsables del estrés oxidativo. El hígado, órgano central en el metabolismo de ambos metales, es también el principal blanco de su toxicidad. La enfermedad de Wilson es un desorden del metabolismo del cobre debido a la disminución de la excreción de este metal por el conducto biliar. A pesar de que el organismo trata de compensar el incremento en la concentración del metal, incrementando la cantidad de cobre excretado por la orina, sigue habiendo un balance positivo del mismo que hace que se deposite cobre en el hígado,

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cerebro y otros tejidos. La enfermedad de Wilson es heredada de forma autosómica recesiva, con una frecuencia estimada entre 1 a 90 y 1 en 400 y la prevalencia de 1 en 30 000. Los estudios moleculares han localizado al gen de la enfermedad de Wilson en el cromosoma 13. A la fecha, se han reportado varias alteraciones en el gen, haciendo difícil el diagnóstico molecular. La gran cantidad de mutaciones explica, en parte, la diversidad de las presentaciones clínicas de la enfermedad. Durante la niñez, el cobre se acumula en el hígado asintomáticamente, de manera principal dentro del citosol de los hepatocitos. Con el tiempo, se empieza a acumular en los lisosomas. En este punto el cobre es liberado al torrente sanguíneo. Si la liberación es gradual, el paciente pasa varios años sin síntomas, sin embargo, puede presentar crisis hemolíticas. De manera similar en el hígado, si la redistribución celular del citosol a los lisosomas ocurre rápidamente, entonces puede haber una necrosis de los hepatocitos y/o una hepatitis crónica activa se puede desarrollar. A medida que más cobre se deposita y se redistribuye, la fibrosis hepática progresa a cirrosis y puede empezar el daño en otros órganos. Generalmente, cuando el paciente presenta síntomas neurológicos, a menudo ya hay daño hepático permanente. En 1889, se reconoció por primera vez a la hemocromatosis hereditaria como la sobrecarga de hierro en el hígado. En 1976, se reportó que el gen de la hemocromatosis estaba asociado a la región HLA del brazo corto del cromosoma 6 y en 1996, el gen fue finalmente identificado y se le denominó HFE. La hemocromatosis secundaria debida a mutaciones en el gen HFE es sólo una de las causas de la acumulación de hierro en el hígado. Sin embargo, la hemocromatosis es el desorden genético más comúnmente identificado en caucásicos, con una prevalencia de 1 en 200. Otras variantes de hemocromatosis genética, que no involucran al gen HFE han sido identificadas, por ejemplo como enfermedad autosómica dominante en las Islas Salomón. La hemocromatosis neonatal parece ser una condición autosómica recesiva, sin embargo hay evidencias que señalan que ésta seguiría una herencia mitocondrial. Existe otra forma de hemocromatosis genética denominada hemocromatosis juvenil, la cual se presenta en pacientes entre los 20 y 30 años, y se debe a lesiones en el cromosoma 1. En la hemocromatosis, el hierro se acumula en el hígado y en otros tejidos debido al incremento en la absorción de este metal a nivel del intestino delgado. El mecanismo exacto por el que el gen HFE contribuye a la sobreabsorción del metal no es conocido. El resultado de dicha absorción es el depósito de hierro en el hígado, el páncreas, el corazón y otros tejidos endócrinos. La patología de la hemocromatosis en el hígado, aunque característica, no es específica. El hierro se acumula en los hepatocitos y puede estar también en células reticuloendoteliales, en los macrófagos y en las células epiteliales del conducto biliar. La sobrecarga de hierro secundaria es común en muchas patologías hepáticas. La cirrosis y el

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

carcinoma hepatocelular son las complicaciones hepáticas que se presentan por la sobrecarga del metal. El mecanismo por el cual el cobre y el hierro producen hepatotoxicidad es semejante, ambos son metales de transición, los cuales tienen electrones desapareados, son excelentes catalizadores y juegan un papel decisivo en la generación de especies muy reactivas a partir de especies menos reactivas, por ejemplo catalizando la formación de radicales hidroxilo (•OH) a partir de formas reducidas de O2. Para evitar el estrés oxidativo y el daño celular, las células han desarrollado sistemas para mantener la concentración de metales adecuada con base en sus necesidades metabólicas. De hecho, el secuestro de los metales por la ferritina o la metalotioneina permite tener las concentraciones fisiológicas de hierro y cobre y así evitar que se lleve a cabo la reacción de Fenton. La mitocondria es el blanco del daño hepático inducido por cobre y hierro. La mitocondria ocupa una posición única dentro de la célula en la producción de energía mediante la fosforilación oxidativa. En este contexto, también representa el principal sitio de generación de ERO por medio de la cadena respiratoria a un nivel dependiente del estado metabólico. Se asume que la desestabilización de uno o más componentes de la cadena transportadora de electrones incrementa el potencial de autooxidación e incrementa la producción de iones superóxido y otras ERO. Hay reportes que muestran que la acumulación crónica de cobre y hierro provoca in vivo lipoperoxidación de la membrana mitocondrial. Este proceso puede verse modificado por el estado de fluidez de la membrana mitocondrial con alteración en el transporte de solutos y de iones. Los productos hidroperóxidos pueden abrir el canal de Ca+2 o incrementar los productos que actúan como ionóforos específicos de Ca+2. La perturbación del transporte de Ca+2 mitocondrial resulta en una pérdida de energía y lleva a un daño mitocondrial serio. En adición a esto, los productos aldehídicos de lipoperoxidación podrían formar aductos con proteínas, inactivándolas. Todos estos eventos tóxicos llevan al desacoplamiento de la función mitocondrial en los hígados de las ratas que tienen una sobrecarga de cobre y hierro, con una disminución del cociente respiratorio. La fosforilación oxidativa mitocondrial es la responsable del 95% del total del ATP requerido por las células eucarióticas, y una consecuencia de la sobrecarga de cobre y hierro es la reducción del contenido de ATP. Al parecer, los cambios en la función mitocondrial podrían contribuir a la disfunción hepática reduciendo la carga energética celular, incrementando la salida de calcio al citosol, o exponiendo a la célula a concentraciones incrementadas de superóxido generadas por la disrupción del flujo de electrones normal. Finalmente, en la toxicología tanto del cobre como del hierro se considera que dañan al DNA y hay genotoxicidad. Mientras que los radicales libre de vida media corta son incapaces de llegar al núcleo, los productos aldehídicos finales de la lipoperoxidación y los aductos de las proteínas sí lo alcanzan. Es posible que

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los complejos de metales asociados al DNA puedan disparar directamente en el sitio la producción de radicales de oxígeno tóxicos durante la sobrecarga de cobre y hierro. En la figura 25-4 se muestra una representación esquemática del mecanismo de toxicidad del cobre y el hierro en los hepatocitos. En humanos con sobrecarga de cobre y hierro, debido a causas genéticas o adquiridas, la fibrosis y la cirrosis son hallazgos comunes. Los patrones moleculares, las células y los principales actores involucrados en la fibrogénesis son comunes con los diferentes agentes etiológicos y han sido descritos en otro de los puntos de este capítulo. Los xenobióticos, las hepatotoxinas y los mecanismos de defensa del huésped pueden modificar la compartamentalización y la especiación de los iones metálicos dentro de la célula e incrementar la fracción activa catalítica potencialmente tóxica. Los pasos críticos en las cascadas de señalización son sensibles a oxidantes y antioxidantes, y muchos eventos básicos en la regulación celular como son la fosforilación de proteínas, y la unión de factores de transcripción a señales consenso en el DNA están manejados por la homeostasia fisiológica de oxidantes-

• Lipoperoxidación de membranas • Inhibición de la cadena de transpor te de electrones e incremento de las ERO

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• Lipoperoxidación de membranas • Disminución en el contenido y actividad de citocromos

• Disminución en el contenido de ATP • Alteraciones en la homeostasia del Ca

++

Fe*/Cu*/LPx

Fe*/Cu*/LPx

Mitocondria Microsoma Hepatocito Fe*/Cu* Lisosoma Fe*/Cu*/LPx

• Disminución de la fluidez membranal • Incremento de la fragilidad • La acumulación de Cu en la enfermedad de Wilson induce necrosis

Núcleo

• Ruptura de las cadenas de DNA y oxidación de las bases • Apoptosis y fragmentación del DNA • Mutagenicidad

Figura 25-4. Mecanismo de toxicidad del cobre y el hierro en los hepatocitos.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 25)

antioxidantes, especialmente por el balance de grupos tioles. Cuando metales activos catalíticamente se incrementan en la célula, como por ejemplo en las de Kupffer, las cuales juegan un papel central en los patrones inflamatorios, inmunológicos y fibrogénicos pueden producir una aceleración y progresión de la enfermedad hepática. Una expansión de la poza de hierro secundaria, además de incrementar ligeramente el contenido hepático del metal, puede estar acompañado de enfermedades hepáticas crónicas como la hepatitis viral, la enfermedad hepática alcohólica o la esteatohepatitis. Así, el hierro puede llegar a ser una potente hepatotoxina y factor profibrogénico que puede actuar como un segundo golpe en el órgano predañado o actuar en forma concomitante con otras hepatotoxinas.

❚ CONCLUSIONES El estrés oxidativo no es una enfermedad específica, pero es un estado patógeno no específico donde hay un desbalance redox causado por las ERO secundarias al metabolismo de los hepatocitos infectados por virus y xenobióticos (individualmente o al unísono), que ocasionan lesiones isquémicas, traumáticas e inflamatorias. El reto en la investigación futura está en desarrollar herramientas terapeúticas capaces de bloquear las alteraciones en el estado redox celular en el inicio de la agresión celular, para evitar la progresión del daño.

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AÑO OXIDATIVO

Y NITROSATIVO EN LA INSUFICIENCIA RENAL AGUDA José Pedraza Chaverrí Omar N. Medina-Campos

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❚ INTRODUCCIÓN Se han acumulado evidencias que sustentan la participación fundamental de los metabolitos de oxígeno, parcialmente reducidos o especies reactivas de oxígeno (ERO), en el daño isquémico, tóxico y mediado inmunológicamente de los tejidos. Además, en los últimos años, ha surgido una nueva clase de oxidantes que influyen en este daño: las especies reactivas de nitrógeno (ERN) derivadas del óxido nítrico (NO•). En este capítulo, se presenta un resumen de las evidencias que involucran a las ERO y ERN en el daño oxidativo y nitrosativo y en la disfunción renal en diversas formas de insuficiencia renal aguda (IRA).

❚ ERO, ERN Y DAÑO

RENAL

La sospecha de que los metabolitos reactivos de oxígeno podrían ser importantes en el proceso de inflamación se originó con una publicación, en 1969, en la cual McCord y Fridovich describieron a la superóxido dismutasa (SOD), que elimina al radical superóxido (O2•). McCord supuso que, como los neutrófilos fago-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

citarios, las células efectoras de la respuesta inflamatoria aguda liberan al espacio extracelular grandes cantidades de O2• y que, como la SOD, una enzima que dismuta al O2•, posee actividad inflamatoria, entonces el O2• y otros metabolitos del oxígeno podrían ser importantes mediadores químicos del proceso inflamatorio. Esta hipótesis ha recibido apoyo considerable de un gran número de estudios en donde se ha examinado en diversos sistemas biológicos. Por otro lado, el NO• regula el tono vascular y el transporte de iones en el riñón. Cuando las células están expuestas a un ambiente prooxidante, la formación de NO• puede conducir a la generación de ERN. El NO• y el O2• reaccionan muy rápidamente entre sí, para generar el anión peroxinitrito (ONOO–) (capítulo 2). La generación de NO• es fundamental para la fisiología normal del riñón. Sin embargo, la excesiva producción de NO• puede trastornar el balance hemodinámico dentro del riñón y afectar a los procesos de filtración, reabsorción y excreción. La expresión de NOS tipo II, la isoforma inducible (iNOS), resulta en la elevada producción de NO•. Normalmente, el riñón es capaz de compensar cambios hemodinámicos moderados. A continuación se describirán algunos modelos de IRA.

❚ LESIÓN

POR ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN

(IR)

La isquemia y reperfusión ocurre cuando se interrumpe la oxigenación de los tejidos (isquemia) y se reestablece después de un periodo (reperfusión). Este proceso conduce a daño celular que se ha involucrado con la formación de ERO.

Fuentes de las ERO en IR del riñón Xantina oxidasa (XO) Se ha observado que la actividad de la enzima XO (véase en el capítulo 6 la generación de ERO por la XO), como productora de radicales libres, aumenta durante la reperfusión en riñones isquémicos, durante la hipoxia-reoxigenación en riñón perfundido aislado y en otros órganos isquémicos. Durante la isquemia, también hay un rompimiento masivo de la reserva de nucleótidos de adenosina a inosina y después a hipoxantina. Así, después de un periodo de isquemia, hay una acumulación de xantina oxidasa (la preexistente y la recientemente convertida) y de su sustrato, la purina hipoxantina. Después de la reperfusión, el oxígeno molecular reingresa a los tejidos y se produce un estallido en la producción de O2•.

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

•

397

Mitocondrias Estos organelos son una de las principales fuentes de ERO en varios órganos bajo condiciones fisiológicas normales y patológicas (véase capítulo Cadena respiratoria). Durante la reperfusión, y como consecuencia de la inhibición de la transferencia de electrones, ocurre un incremento repentino en la producción de O2• por el aumento en la autooxidación de las fuentes principales de O2• de la mitocondria: ubisemiquinona y la flavina semiquinona NADH-deshidrogenasa.

Membranas nucleares y microsomales Las membranas nucleares y microsomales también contienen los sistemas de transporte de electrones citocromo P450 y citocromo b5 que generan ERO (capítulo 4). Aunque existe poca información acerca del papel de los suborganelos como fuente de ERO en el riñón, se ha demostrado que los microsomas renales tienen el potencial de generar O2• durante la IR. Se ha demostrado que el metabolismo del ácido araquidónico, vía la prostaglandina H sintasa y la lipoxigenasa, produce O2• en presencia de NADH y NADPH. La autooxidación de catecolaminas o hemoproteínas como la mioglobina también genera O2• y H2O2.

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Leucocitos Otra fuente importante de ERO son los leucocitos. En efecto, se ha demostrado que los neutrófilos juegan un papel esencial en la lesión por IR de varios órganos como corazón, intestino, hígado y riñón. Sin embargo, la contribución de los neutrófilos a la IRA isquémica es controversial. Por un lado, empleando antisuero antineutrófilos, se ha demostrado que la neutropenia no protege a las ratas de la lesión renal por IR. Por el contrario, en otros estudios se ha demostrado que la infusión de neutrófilos en riñones isquémicos aislados y perfundidos empeora la lesión renal y que la fuga transtubular inducida por la isquemia se reduce en ratones neutropénicos comparados con los controles no neutropénicos. Por ello, se ha propuesto al estrés oxidativo como uno de los mecanismos de daño celular en la lesión por IR en cerebro, corazón, pulmón, intestino y riñón. En el cuadro 26-1 se presenta un resumen de algunas evidencias que apoyan el papel de las ERO en la patogénesis de la lesión por IR. La demostración de que la administración de SOD protege casi por completo contra la lesión inducida por isquemia en el intestino, condujo a la hipótesis de que las ERO juegan un papel importante en la progresión del daño inducido por IR.

398

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

Cuadro 26-1. Evidencias que sugieren la participación de las ERO y de las ERN en la insuficiencia renal aguda renal inducida por isquemia y reperfusión • En modelos in vivo e in vitro se observa un aumento en la generación de ERO, aumento en la actividad de xantina oxidasa y aumento en la conversión de xantina deshidrogenasa a xantina oxidasa • La administración de atrapadores del espín como α-fenil tert-butil nitrona, disminuye el daño renal • El cociente GSSG/(GSH+GSSG) aumenta después de la IR La peroxidación de lípidos que se observa in vivo e in vitro puede ser prevenida por atrapadores de ERO, inhibidores de xantina oxidasa, o quelantes de hierro • Los atrapadores de ERO, antioxidantes, inhibidores de xantina oxidasa y quelantes de hierro protegen contra el daño • Una dieta deficiente en selenio y vitamina E exacerba el daño • La inhibición de la catalasa exacerba el daño y los ratones transgénicos con aumento en la actividad de SOD son menos susceptibles al daño • La actividad en riñón de las enzimas antioxidantes SOD, GPx y catalasa disminuye • La inhibición específica de la actividad de iNOS con L-iminoetil-lisina (L-NIL) o la inhibición de la expresión de iNOS en el riñón con oligonucleótidos antisentido disminuye significativamente el daño • El ebselen, un atrapador de ONOO–, previene el daño renal y la nitración de tirosina • La administración de BH4 previene la disfunción endotelial en el daño por IR

En contraparte, la lesión por IR afecta el sistema enzimático antioxidante de defensa, dando como resultado la disminución significativa de los niveles tanto de SOD, como de catalasa y glutatión peroxidasa (GPx,) en los riñones. Las propiedades de las enzimas antioxidantes en las células tubulares del riñón posiblemente constituyan un importante factor de susceptibilidad a la lesión. Por ejemplo, se ha demostrado que la lesión por IR ocasiona daño en los túbulos proximales, pero no en los túbulos distales, y que la expresión del gen de la SOD aumenta en las células tubulares distales, mientras que disminuye en las células tubulares proximales. Esta diferencia en la distribución y regulación de las enzimas antioxidantes posiblemente contribuye a la susceptibilidad de los túbulos proximales a la lesión por IR. Otros datos que realzan la relación entre el sistema antioxidante enzimático y el daño por IR son las observaciones de que los ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD son menos susceptibles a la lesión por IR mientras que la inhibición de la catalasa exacerba la lesión por IR.

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

•

399

Aunque existe conflicto en los resultados obtenidos por algunos investigadores, se ha encontrado que varios antioxidantes como SOD, dimetiltiourea, catalasa, GSH y atrapadores de electrones como N-acetilcisteína y vitamina E, funcionan como protectores contra la lesión por IR. Además se ha demostrado que una dieta deficiente en vitamina E y selenio exacerba la lesión por IR. La deficiencia de selenio produce una reducción en la actividad de GPx.

Papel del hierro

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Se ha demostrado que el hierro es importante en algunos modelos de lesión tisular, debido su participación en la generación de ERO. En la lesión por IR no hay un cambio significativo en el hierro no hémico o en la ferritina en el riñón, pero hay un incremento notable y específico del hierro detectable con bleomicina (capaz de catalizar la producción de radicales) después de la reperfusión, pero no durante el período isquémico. La ferritina es una proteína que constituye un medio seguro de almacenar hierro intracelular en una forma inerte. A pesar de que una dieta deficiente en hierro provoca una reducción drástica en el contenido de hierro en el riñón, no previene el notable incremento en el hierro catalítico y tampoco protege contra la lesión por IR. Se ha informado un incremento similar en el hierro que se puede quelar con deferoxamina (hierro férrico) en riñones de conejos expuestos a isquemia. Se ha demostrado que los quelantes de hierro, como deferoxamina, protegen al corazón, intestino, riñón y pulmón de la lesión por IR, y contra la lesión inmunitaria y tóxica.

Peroxidación de lípidos Se ha demostrado que la peroxidación de los lípidos, detectada como malondialdehído (MDA) y etano, ocurre durante la reoxigenación o reperfusión en una gran variedad de tejidos isquémicos como corazón, hígado, intestino, pulmón, cerebro y riñón. La peroxidación de los lípidos es un mecanismo autocatalítico que conlleva a la oxidación destructiva de las membranas celulares. A consecuencia de este proceso se pueden liberar metabolitos de aldehídos tóxicos y reactivos entre los que se incluyen al MDA y al 4-hidroxinonenal (4-HNE). Los aductos de MDA y 4-HNE con proteínas pueden ser detectados en el riñón después de sólo 30 minutos de isquemia. Se ha demostrado que inhibidores de la peroxidación de lípidos, tales como lazaroides (21-aminosteroide) y bioflavonoides, reducen la formación de radicales libres, la peroxidación lipídica y la disfunción renal en la lesión por IR.

400

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

Papel del glutatión El cociente GSSG/(GSH+GSSG) se ha considerado como un parámetro para la evaluación del estrés oxidativo debido a que el GSH es oxidado a GSSG durante la reducción del H2O2 y de los hidroperóxidos lipídicos por la GPx; la glutatión reductasa reduce nuevamente el GSSG a GSH. Se ha informado que dicho cociente disminuye durante la isquemia y aumenta durante la reperfusión.

Especies reactivas de nitrógeno El estrés oxidativo hace evidente el potencial tóxico del NO• en el riñón y también puede ser aumentado por medio de la generación de NO• y ERN. Las células epiteliales y endoteliales del riñón no son las únicas fuentes de NO• y ERO. Las células inflamatorias infiltrantes movilizadas al sitio de la lesión también son capaces de generar estas especies y pueden prolongar la exposición del riñón a estos oxidantes. Como se discutió anteriormente, existe mucha especulación sobre la fuente de O2• en el riñón. Se debe destacar que la NOS del túbulo proximal por sí misma es capaz de generar O2• así como NO•. El cociente de generación de O2• a NO• cambia en favor del O2• cuando la concentración de L-arginina disminuye. Es razonable especular que bajo condiciones de flujo sanguíneo reducido (isquemia o choque) la concentración de L-arginina en el riñón posiblemente decaiga lo suficientemente como para favorecer la generación de O2• así como de NO•, y de este modo también se generaría ONOO–. También se ha demostrado que la deficiencia u oxidación de tetrahidrobiopterina (BH4) (figura 26-1), un cofactor de la NOS, también conduce a que esta enzima genere O2•. Cuando la NOS genera O2•, por deficiencia de BH4 o de L-arginina, se dice que esta enzima está “desacoplada”. En estudios recientes se ha demostrado que en los glomérulos de ratas diabéticas la NOS es una fuente principal de O2• como consecuencia de la deficiencia de BH4. El ONOO– es capaz de oxidar a la BH4 y así de “desacoplar” a la NOS. Se han utilizado inhibidores selectivos de la actividad y de la expresión de iNOS para investigar los papeles del NO• y del ONOO– en diferentes modelos de IRA. El modelo que se ha investigado más ampliamente es el de IR renal. La naturaleza de los mediadores de la lesión por IR renal continúa en controversia, pero al parecer las ERN juegan un papel importante (cuadro 26-1). Como se describió previamente, el tratamiento con atrapadores de ERO y antioxidantes, como por ejemplo SOD, dimetiltiourea, alopurinol (un inhibidor de la xantina oxidasa) y deferoxamina, protegen en algunos pero no en todos los modelos de lesión por IR. Los inhibidores mencionados anteriormente tienen otra propiedad en común, todos ellos atrapan o inhiben directamente la formación de ONOO–.

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

•

401

Cuando Noiri y colaboradores bloquearon la expresión de iNOS en el riñón utilizando oligonucleótidos antisentido, se redujeron significativamente los marcadores funcionales y morfológicos de la IRA provocada por IR. Lo mismo sucede cuando se realiza la inhibición selectiva de la actividad de iNOS. Se ha obtenido evidencia de la generación de ONOO– por medio de la inmunodetección de proteínas nitradas en riñón de ratas sometidas a IR. La aparición de proteínas nitradas indica no solamente la cogeneración de O2• y NO• sino también que los mecanismos antioxidantes de defensa no fueron capaces de suprimir totalmente las acciones del ONOO–. En estudios adicionales se ha encontrado que el ebselen (figura 26-1), un compuesto de bajo peso molecular que reproduce los efectos de GPx y que es un catalizador de la descomposición de ONOO–, previno el daño estructural y funcional renal así como la nitración de proteínas y la oxidación de lípidos y de DNA en ratas sometidas a IR.

O H

H N

NH

H

COOH

H

NH

CH

H3 C

3

N H

NH 2

OH OH H2 N

N

N H

6

N -(1-iminoetil)-L-lisina (L-NIL) H

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Tetrahidrobiopterina O

H

N

Ebselen

Cl Pt

H3C H HC N

H

H

H

H

OH

H

NH 2

H H

H

H

H O H HO

O NH2

H

H R

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H

H

H

O NH2

NH 3

Cisplatino

H

OH

3

NH 3

O

L-nitro-arginina-metil-éster (L-NAME)

Se

Cl

N

N

O

N

O

N

H

H

H

H Gentamicina

Figura 26-1. Estructura de diversos compuestos mencionados en el texto.

N H

R’

402

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ LESIÓN

(Capítulo 26)

RENAL INDUCIDA POR LIPOPOLISACÁRIDO

El lipopolisacárido (LPS), un componente de la pared celular de las bacterias gram negativas, es la causa principal del choque séptico. El LPS desencadena la síntesis y la liberación de citocinas y de NO•. La estimulación de la expresión de iNOS causada por LPS contribuye de manera importante al incremento en la producción de NO•. Esto ocurre en la vasculatura y la mayoría de los órganos, incluyendo el riñón. Además de aumentar la síntesis de NO•, el LPS también provoca la síntesis de ERO tales como el O2• en pulmón, hígado y riñón. Dosis altas de LPS (8 a 10 mg/kg) producen IRA en la rata que no es afectada por el tratamiento con SOD, catalasa, dimetiltiourea o deferoxamina. Sin embargo, dosis bajas (5 mg/kg) provocan disminución en la función renal, que puede ser retardada con la administración de SOD o dimetiltiourea. Estos estudios sugieren que el estrés oxidativo juega un papel en el desarrollo temprano de la lesión renal (cuadro 26-2), pero no es la única causa por la cual la lesión conduce a IRA. Se ha examinado in vitro el potencial que tiene la toxicidad directa del LPS en las células renales. El componente biológico activo del LPS, el lípido A, es tóxico para el epitelio tubular de los cultivos celulares (células LLC-PK1), así como para los túbulos proximales aislados de rata. El lípido A causa un incremento rápido en la concentración de calcio intracelular en el túbulo proximal. Esta respuesta es mediada, al menos en parte, por la liberación de las reservas de calcio intracelular. Este evento inicial conduce a estrés oxidativo, a peroxidación lipídica y eventualmente a la muerte celular. La toxicidad es prevenida por la inhibición de la

Cuadro 26-2. Evidencias que sugieren el papel de las ERO y ERN en el daño renal inducido por lipopolisacárido (LPS) • • • • • • •

• •

Los antioxidantes como SOD y dimetiltiourea protegen contra el daño por LPS Los niveles renales de GSH disminuyen en ratas tratadas con LPS La liperoperoxidación renal aumenta en ratas tratadas con LPS La administración de dimetiltiourea y de SOD previene parcialmente el daño renal inducido por LPS La toxicidad del lípido A en las células LLC-PK1 es prevenido por antioxidantes El LPS induce la iNOS en el riñón El LPS es directamente citotóxico en túbulos proximales aislados por medio de una vía de señalización disparada por un aumento en la concentración intracelular de calcio. La citotoxicidad es mediada por oxidantes derivados de NOS La inhibición farmacológica de iNOS reduce el estrés oxidativo y el daño renal La aparición de aductos 3-nitrotirosina-proteína refleja la producción de ERN

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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403

liberación de calcio, por los antioxidantes hidroxitolueno butilado y N,N´-difenil1-fenilenediamina, SOD, deferoxamina, ácido dietilentriaminopentaacético y por el incremento de los niveles intracelulares de GSH. Por lo anterior, es claro que el estrés oxidativo juega un papel en este modelo in vitro. El estrés oxidativo también ocurre in vivo. Los niveles renales de GSH disminuyen y hay evidencia de peroxidación lipídica después de 6 horas del tratamiento de ratas con LPS (3 mg/kg). Se ha estudiado el papel de las ERN derivadas de la iNOS en las ratas usando L-NIL, un inhibidor selectivo de iNOS. La inyección de LPS induce el aumento en la expresión de iNOS y un aumento de 100 veces en la concentración de los nitratos y nitritos (productos del metabolismo de NO• e indicadores de la producción de NO•). También se observa estrés oxidativo y aumento en la nitración de tirosina, sugiriendo la excesiva producción de ERN. El tratamiento con L-NIL previene el estrés oxidativo y atenúa el aumento en la concentración de nitratos y nitritos en plasma. El L-NIL también disminuye la formación de aductos de 4HNE-proteína y 3-nitrotirosina-proteína (figura 26-1). La disminución de los aductos 3-nitrotirosina-proteína no es total, lo que sugiere que otras isoformas de NOS participan en la generación de ERN. Los datos anteriores, en su conjunto, sugieren que el NO• y las ERN participan en el daño oxidativo renal inducido por LPS.

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❚ NEFROTOXICIDAD

POR GENTAMICINA

Una de las principales complicaciones del uso de los antibióticos aminoglicósidos, incluyendo a la gentamicina, que son ampliamente usados en el tratamiento de las infecciones gram negativas, es la nefrotoxicidad, la cual constituye del 10 al 15% de todos los casos de IRA. Aunque el mecanismo o los mecanismos exactos responsables de la nefrotoxicidad por gentamicina (figura 26-1) aún no están claros, en el cuadro 26-3 se presenta un resumen de algunas de estas evidencias. Se ha documentado la capacidad de la gentamicina para alterar la respiración mitocondrial in vivo e in vitro. Esto conduce a que la gentamicina estimule la generación de ERO en mitocondrias de corteza renal. También se ha demostrado que la gentamicina estimula la producción in vivo de H2O2. Los estudios realizados por diversos grupos de investigadores han establecido que la catalasa pura es inactivada por aminotriazol solamente en presencia de H2O2, debido a que el aminotriazol reacciona con un intermediario de catalasa, formando un complejo covalente con la proteína. La inhibición de la catalasa en el tejido por aminotriazol ha sido utilizada como un parámetro cualitativo de la producción de H2O2. Con el uso de este método, la inyección de aminotriazol produce una inhibición de la actividad de catalasa mucho mayor en las ratas tratadas con gentamicina, lo que es una evidencia de la ge-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

Cuadro 26-3. Evidencias que sugieren la participación de ERO en la IRA inducida por gentamicina • La gentamicina aumenta la generación de O2•, H2O2, y •OH en mitocondrias de corteza renal • Hay un aumento en la generación in vivo de H2O2 en la corteza renal de las ratas tratadas con gentamicina • La gentamicina aumenta la liberación de hierro de las mitocondrias de corteza renal • El complejo gentamicina-hierro induce lipoperoxidación in vitro y es un potente catalizador de la formación de radicales libres • Los atrapadores de •OH protegen del daño • Los quelantes de hierro protegen de la formación de •OH inducida por gentamicina en mitocondrias de corteza renal así como del daño inducido in vivo • La suplementación de hierro aumenta el daño • La actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, GPx y SOD disminuyen en corteza renal • La administración de SOD protege significativamente • El pretratamiento con cinc previene el daño al inducir la metalotioneína la cual puede atrapar ERO • La administración de diferentes antioxidantes como vitamina E, vitamina C, selenio, polvo de ajo, extracto de ajo envejecido, S-alilcisteína, S-alilmercaptocisteína, dialilsulfuro y dialildisulfuro previenen el daño • La detección in vivo de aductos 3-nitrotirosina-proteína sugiere la producción de ERN. El efecto protector de antioxidantes como extracto de ajo envejecido S-alilcisteína, S-alilmercaptocisteína y dialildisulfuro está asociado a la prevención de la formación de estos aductos y de la disminución de las enzimas antioxidantes

neración neta de H2O2 en la corteza renal en la nefrotoxicidad inducida por gentamicina. Por otro lado, diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la gentamicina aumenta la generación de H2O2 y la liberación de hierro, posiblemente de la ferritina, lo cual contribuye a la generación de más ERO. Asímismo, los atrapadores de •OH y los quelantes de hierro protegen la función renal en la IRA inducida por gentamicina en la rata, mientras que la administración de SOD o dimetiltiourea protege contra la disfunción renal, la peroxidación de lípidos y el daño tubular en este modelo experimental. También se ha demostrado que la coadministración de diferentes antioxidantes como vitamina E, selenio, melatonina, N-acetilcisteína, etc., protege contra la nefrotoxicidad inducida por gentamicina y previenen la disminución de las enzimas antioxidantes. El papel que las ERN puedan jugar en la nefrotoxicidad por gentamicina no está completamente claro. Los glomérulos aislados de ratas tratadas con gentami-

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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405

cina tienen niveles elevados de GMPc, sugiriendo un aumento en la producción de NO•. La inhibición no selectiva de NOS con NG-nitro-L-arginina-metil ester (L-NAME) empeora la nefrotoxicidad inducida por gentamicina. Sin embargo no se pueden sacar conclusiones de que la producción de NO• protege en este modelo debido a que el L-NAME aumenta la presión sanguínea y puede alterar la filtración glomerular. Se requieren estudios con inhibidores selectivos de iNOS en este modelo. En algunos estudios, se ha encontrado que aumenta la nitración de tirosina y que este incremento es prevenido por diversos antioxidantes, lo que sugiere que la producción de ERN está elevada y puede estar involucrado en el daño renal, en la nefrotoxicidad por gentamicina. Se requieren estudios con atrapadores de ONOO–, como el ebselen (figura 26-1), o con metaloporfirinas que descomponen específicamente al ONOO– para precisar la participación del ONOO–, en este modelo experimental.

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❚ INSUFICIENCIA RENAL AGUDA MIOGLOBINÚRICA Durante la segunda guerra mundial se describió la primera asociación causal entre la IRA y el daño a músculo esquelético, con la consecuente liberación de la mioglobina al plasma (rabdomiolisis). Se estima que alrededor de un tercio de los pacientes con rabdomiolisis desarrollan IRA y que la rabdomiolisis puede constituir cerca del 10% de todos los casos de IRA. El modelo más ampliamente usado de IRA mioglobinúrica es producido por la inyección subcutánea o intramuscular de glicerol. El papel de las ERO en la IRA inducida por daño al músculo se ha estudiado en el modelo de glicerol (cuadro 26-4). Se ha demostrado el aumento en la generación de H2O2, lo cual motivó el estudio del efecto del piruvato, un alfa cetoácido, en este modelo debido a que una característica de una gran variedad de alfa cetoácidos es su capacidad para descomponer H2O2 por medio de una reacción de descarboxilación oxidativa no enzimática. La administración de piruvato previene la disfunción renal y el daño estructural inducidos por la inyección intramuscular de glicerol. También se ha demostrado que la mitocondria es un sitio crítico de la formación de ERO inducida por el grupo hemo. Los quelantes de hierro y los atrapadores de •OH también tienen un efecto protector. Se ha demostrado que el 21-aminoesteroide previene la peroxidación de lípidos y la citotoxicidad inducida por proteínas hemo en células tubulares in vitro y en los riñones in vivo en el modelo de IRA inducida por glicerol. Aunque se ha postulado que la mioglobina del músculo es una fuente importante de hierro en la IRA inducida por glicerol, ya que la mioglobina liberada del músculo es rica en hierro hémico, también existen evidencias de que el citocromo P450 es una fuente significativa de hierro en este modelo experimental.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

Cuadro 26-4. Evidencias que sugieren la participación de ERO y del NO · en la IRA inducida por mioglobina • Se presenta un aumento en la generación in vivo de H2O2 en la corteza renal en ratas con IRA inducida por glicerol • El piruvato, un atrapador de H2O2, protege de la IRA inducida por glicerol • Los atrapadores de •OH protegen de la IRA inducida por glicerol en la rata • La deferoxamina, un quelante de hierro, protege del daño renal en la IRA inducida por inyección intramuscular de glicerol o por inyección intravenosa de hemoglobina • La administración conjunta de deferoxamina y de manitol (un atrapador de •OH) previene el daño renal y del estrés oxidativo inducido en la IRA miohemoglobinúrica (inducida por inyección intramuscular de glicerol) • La administración de GSH mejora y la inhibición de su síntesis con butionina sulfoximina empeora la IRA mioglobinúrica (inducida por inyección intramuscular de glicerol) • La expresión de hemo-oxigenasa-1 aumenta en la IRA inducida por glicerol. La inhibición de esta enzima empeora el daño y la inducción previa de la misma protege del daño en este modelo experimental • Un inhibidor de la peroxidación de lípidos, el 21-aminoesteroide, previene la peroxidación de lípidos inducida por el grupo hemoproteínas in vivo e in vitro • La molsidomina, un donador de NO•, tiene un efecto protector en ratas tratadas con glicerol

Así mismo, se ha demostrado que, en este modelo disminuyen los niveles renales de GSH. La disminución de GSH, inducida por la administración de butionina sulfoximina, exacerba el daño funcional renal, comparado con ratas inyectadas con glicerol. Por el contrario, la administración de GSH a ratas inyectadas con glicerol protege claramente del daño renal funcional y estructural en este modelo experimental. Los datos anteriores en su conjunto sugieren el papel del GSH en la IRA inducida por glicerol. Por otro lado, la mioglobina y la hemoglobina son potentes atrapadores de NO•. Por lo tanto, el aporte de estas proteínas al riñón puede anular la actividad vasodilatadora del NO• en la vasculatura renal, lo cual puede ser parte del mecanismo de vasoconstricción renal asociada con esta enfermedad. De hecho se ha encontrado que en la IRA inducida por glicerol el sustrato para la síntesis de NO•, L-arginina, protege y que la administración de melatonina disminuye los niveles de NO• y empeora el daño y que la administración de L-NAME, un inhibidor no específico de la NOS, también empeora el daño renal en estos animales. Además, se ha encontrado que la molsidomina, un donador de NO•, tiene un efecto protector en las alteraciones funcionales y estructurales así como en la dis-

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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minución de las enzimas antioxidantes y en el aumento de la peroxidación de lípidos inducidos por glicerol. Los datos anteriores sugieren que la deficiencia de NO• está asociada e involucrada en la IRA mioglobinúrica. No hay evidencias de estrés nitrosativo o de daño por ERN en este modelo experimental.

❚ NEFROTOXICIDAD

POR CICLOSPORINA

La ciclosporina A (figura 26-2) es un polipéptido inmunosupresor ampliamente usado en el trasplante de riñón, hígado, corazón y páncreas. El uso de este agente inmunosupresor ha representado uno de los más grandes avances en los pasados 25 años, al reducir el rechazo agudo y aumentar la sobrevida del injerto a largo plazo. La nefrotoxicidad y la hipertensión son los principales efectos secundarios del tratamiento con ciclosporina A, la cual produce contracción glomerular que conduce a una reducción significativa en la filtración glomerular. Diferentes estudios experimentales apoyan el papel de las ERO en la patogénesis de la nefrotoxicidad por ciclosporina A, en modelos in vitro e in vivo. Por CH 3

CH 3 CH 3

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(CH 3 )2 CHCH 2

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HO O

O CH 3

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N

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(CH 3 )2 CHCH 2

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N O

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CH 2 CH(CH )

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H CH 3

O

O

CH 3 CH(CH3 )2

Ciclosporina

Figura 26-2. Estructura de la ciclosporina.

408

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

ejemplo, varios estudios han demostrado la generación de H2O2 por la ciclosporina A en las células mesangiales y aumento en la generación de O2• y de H2O2 en glomérulos. También se ha demostrado que el aumento en la generación de ERO por la ciclosporina A en el riñón puede ser bloqueado por antioxidantes. Hay evidencias que sugieren que el citocromo P450 juega un papel en la generación de oxidantes al funcionar como un donador de hierro, lo cual conduce a la generación de ERO. La ciclosporina A también afecta el sistema antioxidante en el riñón; se ha demostrado que disminuye los niveles de GSH y de vitamina E. Los efectos benéficos de los atrapadores de ERO y de los antioxidantes son evidencias adicionales que apoyan el papel de las ERO en la nefrotoxicidad por ciclosporina A. La administración de SOD o de catalasa previene la disminución de la función renal inducida por ciclosporina A. La administración de vitamina E o lazaroides atenúan la vasoconstricción microvascular renal y la hiperperfusión inducida por ciclosporina, lo que preserva la filtración glomerular. De igual manera, el oxopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa, atenúa las alteraciones estructurales en la mitocondria y la citotoxicidad en las células tubulares renales. La administración de antioxidantes como el GSH y la vitamina E también atenúa la peroxidación de lípidos y la toxicidad renal inducida por ciclosporina A. Además la administración de ciclosporina A a animales deficientes en antioxidantes y la depleción de GSH conducen a un mayor daño renal y peroxidación de lípidos. En el cuadro 26-5 se presentan algunas evidencias del papel de las ERO en la nefrotoxicidad por ciclosporina. Se conoce poco sobre el papel del NO• y de las ERN en el desarrollo de la nefrotoxicidad por ciclosporina A. En algunos estudios se ha sugerido que el NO• puede ser benéfico. La nefrotoxicidad por ciclosporina A se caracteriza por vasoconstricción renal e hipertensión, que puede progresar a daño estructural irreversible. La acción vasodilatadora del NO• puede atenuar el efecto de sustancias vasoconstrictoras como endotelina, angiotensina II y tromboxano, de hecho, se ha demostrado que la ciclosporina A induce la NOS endotelial en el riñón y en células endoteliales de aorta de bovino. El tratamiento con ciclosporina A no induce cambios en el mRNA de iNOS en corteza renal. De acuerdo con la información anterior, un donador de NO•, la molsidomina, tiene un efecto benéfico en este tipo de nefrotoxicidad.

❚ NEFROTOXICIDAD

POR CISPLATINO

El cisplatino (figura 26-1) es un agente quimioterapeútico que es usado en el tratamiento de una gran variedad de tumores sólidos como el de cabeza, cuello, testículo y ovario. Desafortunadamente, además de causar supresión de médula ósea y ototoxicidad, un 28 a 36% de los pacientes que reciben una dosis inicial de cis-

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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Cuadro 26-5. Evidencias que sugieren la participación de ERO y del NO • en la IRA inducida por ciclosporina

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• La ciclosporina A aumenta la generación de H2O2 in vivo e in vitro • La peroxidación de lípidos aumenta y disminuye la NADPH citocromo P450 en microsomas renales, y en el cociente GSH/GSSG en corteza renal, microsomas, o mitocondria in vitro e in vivo • La SOD o la catalasa pueden prevenir la disminución de la función renal inducida por ciclosporina • El oxipurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa, atenúa la citotoxicidad inducida por ciclosporina in vitro • La ciclosporina reduce los niveles de GSH y de antioxidantes y la administración de antioxidantes como GSH o vitamina E produce una marcada atenuación de los efectos tóxicos inducidos por ciclosporina A • La deficiencia de antioxidantes exacerba el daño renal y el estrés oxidativo inducidos por ciclosporina • La peroxidación de lípidos inducida por ciclosporina es bloqueada por un inhibidor de citocromo P450 • El NO• derivado de eNOS puede ser benéfico en la preservación del flujo sanguíneo renal. La ciclosporina no aumenta la expresión de iNOS en corteza renal • La molsidomina, un donador de NO•, tiene un efecto protector en ratas tratadas con ciclosporina

platino desarrollan IRA debido a su acumulación dentro de los túbulos proximales en la médula externa del riñón. Los eventos celulares en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino incluyen disminución en la síntesis de proteínas, peroxidación de las membranas, disfunción mitocondrial y daño al DNA como consecuencia de la generación de radicales libres y la incapacidad para neutralizar dichas moléculas. Aunque el mecanismo fundamental de la nefrotoxicidad por cisplatino no está completamente establecido, hay evidencias del papel de las ERO (cuadro 26-6). En varios estudios in vitro se ha demostrado que el cisplatino aumenta la generación del H2O2 en las células del túbulo proximal de ratón, así como de otras ERO a través de la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial en células del túbulo proximal porcino. El papel de las ERO en la patogénesis de la nefrotoxicidad por cisplatino ha sido apoyado por el efecto benéfico de los atrapadores de estos metabolitos en este modelo de daño renal. Los estudios in vitro han demostrado que la catalasa, un atrapador de H2O2, protege contra la muerte celular inducida por cisplatino y en estudios in vivo se ha demostrado el efecto benéfico de SOD y de dimetiltiourea en la nefrotoxicidad por cisplatino.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

Cuadro 26-6. Evidencias que sugieren la participación de ERO y de ERN en la IRA inducida por cisplatino • El cisplatino aumenta la generación in vitro de H2O2 en las células de túbulo proximal • El cisplatino in vivo aumenta el hierro catalítico en las células LLC-PK1 y los quelantes de hierro protegen in vivo e in vitro • Los atrapadores de ERO, incluyendo la catalasa, y los atrapadores de •OH protegen tanto in vivo como in vitro • El cisplatino aumenta el contenido de citocromo P450 y del hierro que se mide con bleomicina. Los inhibidores de citocromo P450 previenen el aumento en el hierro que se mide con bleomicina y son protectores in vivo e in vitro • El cisplatino induce la peroxidación de lípidos in vivo e in vitro • El cisplatino disminuye los niveles de GSH y de grupos tiol in vitro e in vivo. El GSH protege y la inhibición de la síntesis de GSH y la deficiencia de selenio aumenta la nefrotoxicidad in vivo • Diversos antioxidantes protegen de la nefrotoxicidad inducida por cisplatino • El cisplatino induce a la hemooxigenasa-1. La inhibición de esta enzima exacerba y la sobreinducción disminuye el daño • La administración de FeTPPS, el cual metaboliza la descomposición de ONOO–, previene parcialemnte el daño renal inducido por cisplatino, sugiriendo que el ONOO– participa en el daño renal

También se ha examinado el contenido de hierro catalítico y el efecto de los quelantes de hierro en un modelo in vitro en células LLC-PK1 y en un modelo in vivo en rata, la exposición de las células LLC-PK1 al cisplatino produce un aumento significativo en el hierro capaz de catalizar la producción de radicales libres (hierro medible con bleomicina) liberado al medio, la incubación simultánea de las células LLC-PK1 con quelantes de hierro atenúa significativamente la citotoxicidad inducida por cisplatino. El contenido de hierro detectable con bleomicina también aumenta en las ratas tratadas con cisplatino y la administración de deferoxamina previene el daño renal funcional y estructural inducido con cisplatino. También se ha demostrado en las células LLC-PK1 que la incubación con cisplatino induce un aumento de •OH. De acuerdo con este dato los atrapadores de •OH reducen significativamente la citotoxicidad inducida por cisplatino y protegen contra la IRA inducida por este agente. Los datos anteriores en su conjunto apoyan un papel fundamental del hierro en el daño a tejido por •OH en este modelo de IRA. Se ha estudiado el papel del citocromo P450 como una fuente de hierro catalítico en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino in vivo e in vitro. En el riñón de

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Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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ratas tratadas con cisplatino disminuye el contenido de citocromo P450 y aumenta significativamente el hierro catalítico. La coadministración de un inhibidor de citocromo P450 previene la pérdida de citocromo P450, el aumento en el hierro catalítico en el riñón y las alteraciones estructurales y funcionales inducidas por cisplatino. También se ha demostrado in vitro que los inhibidores del citocromo P450 previenen el aumento de hierro catalítico en las células LLC-PK1 expuestas a cisplatino. Estos datos en su conjunto sugieren que el citocromo P450 puede ser una fuente significativa de hierro catalítico en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. La enzima hemo oxigenasa-1 es inducida por oxidantes y se ha demostrado que dicha inducción tiene una respuesta protectora en el daño renal. El cisplatino induce el mRNA y la cantidad de proteína de hemo oxigenasa-1 y la inhibición de esta enzima aumenta la disfunción renal en la nefrotoxicidad por cisplatino. En experimentos realizados en ratones knockout para hemo oxigenasa-1 (-/-) se ha observado que la administración de cisplatino agrava la nefrotoxicidad, comparada con ratones silvestres para hemooxigenasa-1 (+/+). Resultados similares se han obtenido en estudios in vitro en células de túbulo proximal de origen humano o porcino, en donde también se ha demostrado que la sobreexpresión de la hemooxigenasa-1 previene la citotoxicidad y el aumento en ERO inducidas por cisplatino. El cisplatino produce una reducción del sistema antioxidante que metaboliza las ERO. El cisplatino reduce los niveles de las vitaminas antioxidantes C y E en pacientes con cáncer y la administración de α-tocoferol protege contra la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. En un estudio in vitro se ha demostrado que el cisplatino reduce los niveles mitocondriales de GSH al inhibir a la glutatión reductasa en células incubadas con cisplatino. El papel del GSH, como parte del sistema antioxidante de defensa en este modelo de daño renal, es apoyado también por las siguientes observaciones: a) la administración de GSH tiene un efecto protector, b) la inhibición de GSH por butionina sulfoximina y la deficiencia de selenio aumentan la magnitud de la nefrotoxicidad y c) la administración de selenio previene la nefrotoxicidad por cisplatino. La administración de cisplatino induce la expresión de iNOS en el riñón mientras que la inhibición de la actividad de NOS reduce la peroxidación de lípidos y el daño renal. También se ha observado que las ERN potencian la citotoxicidad por cisplatino en fibroblastos en cultivo y que la administración de FeTPPS, una metaloporfirina sintética que descompone al ONOO– (figura 26-3), reduce sustancialmente el daño estructural y funcional inducido por cisplatino. Estos datos, en su conjunto, apuntan a que el NO• y las ERN son mediadores de la nefrotoxicidad inducida por cisplatino (cuadro 26-6).

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

SO H 3

N HO S 3

N Fe

Cl

SO3 H

N

N

SO3 H

FeTPPS

Figura 26-3. Estructura de 10,15,20-tetrakis-(4-sulfonatofenil)-porfirinato de hierro (III) (FeTPPS), una metaloporfirina sintética que cataliza la descomposición de ONOO–.

❚ ESTUDIOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Se han realizado estudios en diversos modelos de insuficiencia renal aguda como los inducidos por IR, gentamicina y cisplatino. Algunas de las contribuciones realizadas en dichos modelos han sido las siguientes: a) en el modelo de insuficiencia renal aguda por IR demostramos que la administración de un atrapador de radicales libres, α-fenil-tert-butil-nitrona, previene el daño renal, b) en el modelo de nefrotoxicidad por gentamicina demostramos que la administración de diversos compuestos organosulfurados derivados del ajo protegen del daño renal funcional y estructural así como del estrés oxidativo y nitrosativo y c) en el modelo

Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda

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de nefrotoxicidad por cisplatino se demostró que la administración de una metaloporfirina, que descompone ONOO–, FeTPPS, previno el daño estructural y funcional así como la nitración de tirosina en riñón. En este trabajo se demostró, por primera vez, que el ONOO– es un mediador del daño renal inducido por cisplatino.

❚ AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue posible gracias a los donativos del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, 40009-M) y de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA, PAPIIT IN227103) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 26)

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SPECIES REACTIVAS

DE OXÍGENO Y DISFUNCIÓN ENDOTELIAL José Carlos García Piñeiro Náyade Pereira Roche Anaida Osoria Pérez

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❚ INTRODUCCIÓN Al saberse, accidentalmente, que cumple diversas y trascendentes funciones; el endotelio fue redescubierto como un órgano “nuevo”, a finales del milenio pasado. Entre los descubrimientos más relevantes se encuentran los de Robert Furchgott que, en 1980, reportó que el endotelio controla el tono del músculo liso vascular, mediante la liberación de un factor relajador derivado del endotelio (EDRF); posteriormente, en 1987, Salvador Moncada descubrió que el EDRF era el óxido nítrico (NO•). La comprensión de las funciones de este “nuevo” y ubicuo órgano ha permitido desentrañar diversos conocimientos en la biología celular y en la fisiopatología de enfermedades de gran importancia médico-social.

❚ CARACTERÍSTICAS

DEL ENDOTELIO VASCULAR

El endotelio vascular es la primera capa celular de los vasos sanguíneos, está en contacto directo con la sangre y el oxígeno, se orienta en el sentido del flujo san-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 27)

guíneo a lo largo de todo el lecho vascular, desde el corazón hasta los más pequeños capilares. Las células endoteliales poseen alta capacidad proliferativa, se adaptan en número y disposición según los requerimientos locales y pueden formar nuevos capilares de ser necesario. Las células endoteliales sintetizan y liberan sustancias de acción autocrina y paracrina necesarias para la regulación del tono vascular, entre de las que destacan la prostaciclina (PGI2), el óxido nítrico (NO•) y la endotelina-1 (ET-1) (cuadro 27-1). Además, la célula endotelial libera factores de crecimiento bajo circunstancias de daños como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento semejante a la insulina.

❚ FUNCIONES

DEL ENDOTELIO VASCULAR

Actúa como barrera macromolecular Las células endoteliales, íntimamente conectadas entre sí, constituyen una barrera que posee permeabilidad selectiva, con doble transporte activo, lo que permiCuadro 27-1. Principales sustancias producidas por el endotelio vascular y sus funciones Mediador Prostaciclina (PGI2) Constituye la sustancia más importante derivada del ácido araquidónico en el tejido vascular Oxido Nítrico (NO•) Su presencia en la célula endotelial se identificó en la segunda mitad del decenio 1980-89 Anteriormente era conocido como factor relajante derivado del endotelio

Función en el endotelio • Vasodilatador • Regulador de la adhesión y agregación plaquetaria • Inhibidor de la movilización de sitios de fibrinógeno en las plaquetas humanas, in vivo • Aumenta la actividad fibrinolítica • Disminuye el tono vascular • Potente vasodilatador • Inhibidor de la adhesión y la agregación plaquetaria • Inhibidor de la migración y adhesión de monocitos y leucocitos • Disminuye la permeabilidad endotelial • Regula el flujo de lipoproteínas al interior de la pared vascular • Inhibe la proliferación y migración de las células musculares lisas vasculares Endotelina • La sustancia vasoconstrictora más potente que (ET-1), péptido de 21 existe aminoácidos que no se • Induce la proliferación del músculo liso vascular expresa constitutivamente en la subíntima

Especies reactivas de oxígeno y disfunción endotelial

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te el paso de nutrientes de la luz del capilar hacia el subendotelio y metabolitos en dirección contraria.

Proporciona una superficie tromborresistente El endotelio regula la adhesión y agregación plaquetaria con la participación de la prostaciclina y el NO•. Estimula, además, el sistema anticoagulante y modula el sistema fibrinolítico a través de la síntesis y liberación de proteínas fibrinolíticas, dentro de las que destacan la urocinasa, el activador tisular del plasminógeno, los inhibidores del activador del plasminógeno tipos 1 y 2, y el receptor de la urocinasa.

Regula la función del músculo liso vascular La función del músculo liso vascular se regula a través de la síntesis y liberación de sustancias vasoactivas constrictoras, como las endotelinas y la renina-angiotensina, y dilatadoras como el NO•, la prostaciclina, el factor hiperpolarizante derivado del endotelio y la bradicinina.

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❚ EL ENDOTELIO

EN EL PROCESO INFLAMATORIO

El endotelio juega un papel importante en los procesos inflamatorios. En estas condiciones, aumenta la producción de NO• y prostanoides vasodilatadores, por la inducción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la cicloxigenasa 2 (COX-2), en respuesta a la acción de las citocinas proinflamatorias. El factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y la interleucina 1 (IL-1) son, in vivo, mediadores de la inflamación sistémica y de la respuesta inmunitaria, por lo que actúan sobre el endotelio vascular donde potencian la expresión de moléculas de adhesión y de citocinas. El TNF-α se une a su receptor, TNFR1, activando una cascada de señales mediada por proteínas cinasas, que culmina con la translocación del factor de transcripción nuclear NF-κB del citoplasma al núcleo. De esta forma se estimula la transcripción de las moléculas de adhesión selectina-E, ICAM-1, VCAM-1 y las citocinas IL-6 e IL-8. La selectina-E media la interacción inicial de leucocitos con el endotelio, la IL-8 activa la adhesión de los leucocitos cuya unión se produce a ICAM-1 y otros ligandos en la superficie del endotelio. La expresión coordinada de estas moléculas produce una fuerte adhesión leucocitaria seguida de migración de estas células hacia los espacios tisulares. Los leucocitos y las células endoteliales activados liberan gran cantidad de especies reactivas de oxígeno

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 27)

(ERO), mediadores del daño celular. El NO• producido en grandes cantidades inhibe la respiración mitocondrial y daña al DNA, mediante la formación del peroxinitrito (ONOO–). En el endotelio, las ERO producen activación de la p38, la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) con la posterior fosforilación de la proteína de estrés térmico 27 (HSP27), moduladora de la respuesta intracelular del citoesqueleto al estrés oxidativo.

❚ DISFUNCIÓN

ENDOTELIAL

La generación de radicales libres del oxígeno, así como la activación de vías transcripcionales sensibles a oxidantes se ha propuesto como el mecanismo fisiopatológico común en el desarrollo de numerosas e importantes enfermedades vasculares. Se considera que existe disfunción endotelial, cuando se producen trastornos en las funciones constitutivas del endotelio vascular. El funcionamiento de la célula endotelial determina el control adecuado del tono vascular y del flujo sanguíneo local y sistémico. Por lo que la disfunción del endotelio vascular participa, de manera importante, en la génesis y desarrollo de las condiciones anormales en el funcionamiento del sistema cardiovascular (cuadro 27-2). El daño oxidativo constituye un factor de importancia en la fisiopatología de la aterosclerosis y contribuye al proceso del envejecimiento. En situaciones de estrés oxidativo aumentado (hipercolesterolemia, tabaquismo, infección e inflamación agudas o crónicas, entre otras) se activan genes que responden a condiciones oxidativas y se sintetizan factores de crecimiento, citocinas y moléculas de adhesión que aumentan la interacción entre las células endoteliales y los leucocitos, estimulan el crecimiento de las células musculares lisas vasculares y participan en procesos de inflamación vascular y su remodelamiento. La cantidad de ERO aumenta significativamente en el proceso de isquemia/ reperfusión, proceso en el que participa activamente la enzima xantina oxidasa con la generación del radical superóxido (O2•). Otro evento de importancia en la reperfusión es el influjo de neutrófilos, que son secuestrados rápidamente en los pequeños vasos del órgano pos-isquémico, mediante la expresión de moléculas de adhesión en la célula endotelial y los leucocitos. Estos últimos también contribuyen al daño mediante la liberación de oxidantes, proteasas y elastasa, por la activación de fosfolipasas y la liberación del factor activador de plaquetas (PAF) y de los leucotrienos. Una fuente importante de oxidantes es la reacción de Fenton con la participación del hierro liberado debido a la lisis de los eritrocitos y de las células parenquimatosas necróticas. La localización del endotelio, en contacto directo con el flujo sanguíneo, hace que se convierta en blanco potencial de los oxidantes producidos por la propia célula endotelial y los leucocitos polimorfonucleares, que se acumulan durante el

Especies reactivas de oxígeno y disfunción endotelial

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Cuadro 27-2. Trastornos y factores de riesgo relacionados con la disfunción endotelial • • • • • • • • • •

Arterioesclerosis Hipertensión Insuficiencia cardiaca Diabetes Resistencia a la insulina Obesidad Tabaquismo Deficit de estrogenos Hiperhomocistinemia Hipercolesterolemia hereditaria

proceso inflamatorio. Aún en condiciones basales la célula endotelial produce y libera cantidades significativas de peróxido de hidrógeno (H2O2). Durante situaciones anormales niveles los de esta ERO aumentan y contribuyen al daño de la célula por su acción, per se, sobre estructuras celulares y por la generación del radical hidroxilo (•OH), después de su transformación en presencia de metales de transición, el cual puede dañar directamente las proteínas, al DNA y los lípidos de la membrana, lo cual conduce a la muerte celular.

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❚ LAS ERO Y LA MUERTE

CELULAR POR APOPTOSIS EN EL ENDOTELIO

Después del proceso infeccioso-inflamatorio se produce una disfunción endotelial transitoria con desbalance en la producción de sustancias vasopresoras/vasodilatadoras que puede ocasionar vasoespasmo y trombosis. Puesto que el estrés oxidativo ocasiona la pérdida de la capacidad de síntesis de la prostaciclina, que es una sustancia vasodilatadora, inhibidora de la agregación y adherencia plaquetarias, así como un agente citoprotector regulador de la actividad de la ésteres de colesterol hidrolasa e inhibidor de la proliferación de la célula muscular lisa. Por otro lado, el efecto citotóxico de las LDL oxidadas (LDLox) sobre las células endoteliales está involucrado en el proceso de aterogénesis. Se reporta que bajas concentraciones de LDLox son potentes inductores de apoptosis en la célula endotelial. Estos efectos citotóxicos explican, en parte, los cambios morfológicos de las células endoteliales y la pérdida de su alineamiento observada en la superficie de las lesiones ateroscleróticas. Estas alteraciones se asocian con un aumento de la adhesión plaquetaria, la deposición de fibrina y la formación de microtrombos; así como los trastornos en el tono vascular, procesos que producen alteracio-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 27)

Figura 27-1. Modelo de la estructura de la α-cristalina.

nes vasculares locales y eventos trombóticos. Durante estos procesos aumentan los niveles de los productos de la peroxidación lipídica y los isoprostanos. El poder controlar a los factores que conducen al estrés oxidativo, así como la administración de agentes protectores del endotelio vascular reducen, el riesgo de padecimiento de enfermedades cardiovasculares. Se considera que las vitaminas E, C y A, y la CoQ10 son antioxidantes y tienen efecto como protectores endoteliales reduciendo la morbilidad y mortalidad por enfermedades coronarias. Los antioxidantes limitan la progresión de las lesiones ateroscleróticas y mejoran la producción y la acción del NO•. Además, la vitamina E regula la expresión de moléculas de adhesión e inhibe la función plaquetaria.

❚ EXPERIMENTOS

REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se estudia el efecto del H2O2 sobre las células endoteliales de la línea murina H5V. Así mismo se analiza el efecto protector de la proteína α-cristalina en las células endoteliales en contra del estrés oxidativo y daño al DNA. La α-cristalina es la principal proteína del cristalino en los vertebrados, constituye alrededor de 40 a 50 % de su fracción proteínica soluble. Está compuesta por 2 subunidades: aA-cristalina y aB-cristalina, con peso molecular de 20 kDa cada una. Estas subunidades forman agregados no covalentes, dinámi-

Especies reactivas de oxígeno y disfunción endotelial

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cos y heterogéneos, de peso molecular alrededor de 800 κDa (figura 27-1). Actúa como chaperona frente a proteínas modificadas por el estrés térmico, los agentes químicos desnaturalizantes, el daño inducido por oxidación o fotoxidación, como sucede en las condiciones de estrés oxidativo o irradiación ultravioleta. En el lente ocular su actividad chaperona es fundamental para mantener la solubilidad y estabilidad de las otras cristalinas, lo que contribuye al mantenimiento de su transparencia. Asimismo, las proteínas de choque térmico son inducidas bajo situaciones de estrés y protegen a las estructuras celulares de cambios irreversibles, que afectan su funcionamiento. Se ha observado que el aumento de la expresión de las proteínas HSP27 y α-cristalina está relacionado con la protección de la célula, ante agentes inductores de la apoptosis.

❚ CONCLUSIONES Ahora se sabe que las ERO juegan un papel importante en la regulación, así como en el malfuncionamiento de las células endoteliales. Por lo que la búsqueda de nuevos agentes protectores del endotelio vascular, así como el uso de antioxidantes no convencionales, abre un importante campo para la terapéutica de las enfermedades cardiovasculares que constituyen en numerosos países, la primera causa de incapacidad y muerte.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 27)

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L ÓXIDO NÍTRICO Y SU PAPEL EN EL DAÑO EN EL OÍDO Beatriz Aguilar Maldonado Graciela Meza

El óxido nítrico (NO•) es un mediador biológico con una gran variedad de funciones en el organismo, tales como, la relajación muscular, la vasodilatación, la neurotransmisión y la defensa en contra de bacterias y de hongos. El NO• es sintetizado por una familia de enzimas llamadas NO-sintasas (NOS), que catalizan la oxidación del aminoácido L-arginina dando como producto el óxido nítrico y la L-citrulina, con la formación del intermediario N-hidroxil-L-arginina. A la fecha, se han identificado tres isoformas de la NOS, las cuales difieren tanto en su ubicación como en su regulación y en su función fisiológica: la isoforma neuronal (nNOS o NOS-1) que se expresa constitutivamente en las neuronas del cerebro y en el sistema nervioso entérico; la isoforma endotelial (eNOS o NOS-3), la cual también es constitutiva y está confinada a las células endoteliales y plaquetas; por último, la isoforma inducible (iNOS o NOS-2), que se expresa en respuesta a algunos estímulos inflamatorios como productos bacterianos (endotoxinas), citocinas y mediadores lipídicos y no depende de un incremento en la concentración de calcio. Una vez activada, la iNOS puede producir

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❚ INTRODUCCIÓN

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 28)

grandes cantidades de NO• por periodos prolongados; este incremento sostenido en los niveles de NO• funciona como un mecanismo de defensa del organismo; sin embargo, en ciertas situaciones puede tornarse peligroso y causar daño en algunos tejidos. El óxido nítrico parece tener un papel paradójico en el organismo ya que su incremento o disminución puede conducir a un efecto fisiológico normal o patológico, dependiendo de la ubicación y la enzima involucrada en su producción. Se ha sugerido que el NO• generado por la eNOS tiene un papel protector mientras que el inducido por la activación de la iNOS tiene un papel tóxico. Uno de los órganos en los que el óxido nítrico tiene un efecto importante es el oído, a continuación se hará referencia, brevemente, en primer lugar a la anatomía y después al papel del óxido nítrico en la fisiología del oído.

❚ EL OIDO El oído es el órgano responsable de la audición y del equilibrio. Está compuesto por mecanorreceptores que captan las vibraciones y las transforman en impulsos nerviosos que irán hasta el cerebro, donde los estímulos serán interpretados. El oído se divide en tres zonas: externa, media e interna (figura 28-1).

El oído externo Es la parte del aparato auditivo que se encuentra en posición lateral al tímpano o membrana timpánica. Comprende la oreja o pabellón auricular (lóbulo externo del oído) y el conducto auditivo externo.

El oído medio Se encuentra situado en la cavidad, cuya cara externa está formada por la membrana timpánica, o tímpano, que lo separa del oído externo. Incluye el mecanismo responsable de la conducción de las ondas sonoras hacia el oído interno. El oído medio está en comunicación directa con la nariz y la garganta a través de la trompa de Eustaquio, que permite la entrada y la salida de aire del oído medio para equilibrar las diferencias de presión entre éste y el exterior. Hay una cadena formada por tres huesos pequeños y móviles (huesecillos) que atraviesa el oído medio. Estos tres huesos reciben los nombres de martillo, yunque y estribo. Los tres conectan acústicamente el tímpano con el oído interno.

El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído

•

425

Yunque Martillo

Estribo

Conductos semicirculares Ampolla Utrículo Nervio vestibular Meato interno Nervio coclear

Sáculo Cóclea

Perilinfa

Ducto coclear Oído medio Tímpano Meato externo

Trompa de Eustaquio

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Figura 28-1. El oído. Esquema que muestra los principales componentes del oído externo, medio e interno.

El oído interno También llamado laberinto, se encuentra en el interior del hueso temporal y contiene los órganos auditivos y del equilibrio, que están inervados por las fibras del nervio auditivo. Se compone de cinco órganos vestibulares: tres canales semicirculares, un utrículo y un sáculo, los cuales son sensibles a aceleraciones angulares, lineales y de la gravedad y un solo órgano relacionado con la audición, el órgano de Corti. La parte sensitiva de los canales se encuentra en las crestas vestibulares, porción más elevada de un estroma de tejido conectivo que forma un ensanchamiento o ampolla en la parte basal de aquéllos; la de los órganos otolíticos (utrículo y sáculo) en manchas o máculas ubicadas en la pared de éstos. La porción sensitiva de la cóclea la constituye el órgano de Corti, llamado también “órgano espiral” que se encuentra adosado a la membrana basilar, a todo lo largo de la cóclea o caracol, en ella se distinguen una parte basal, otra media y la que se encuentra más elevada o apical (figura 28-2).

•

426

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

A

(Capítulo 28)

Endolinfa

II

I

Terminal eferente

Boton aferente

Cáliz

Perilinfa

Endolinfa

B

Células pilosas externas Membrana tectoria

Limbo espiral

Célula pilosa interna

1

2

3

Células de Deiters Túnel de Corti

Membrana basilar Fibras nerviosas

Células en pilar

Perilinfa

Figura 28-2. A) Esquema del epitelio sensitivo vestibular, se muestran las células pilosas tipo I y II. B) Esquema del epitelio sensitivo coclear, se muestran las células pilosas externas e internas.

El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído

•

427

En el epitelio sensitivo de las crestas y en las máculas se encuentran las células sensitivas pilosas vestibulares que, por su forma, han sido clasificadas en tipo I y II, la primera con forma de botella y la segunda alargada y cilíndrica (figura 28-2). Las células pilosas del órgano de Corti son de dos tipos, las internas y las externas, llamadas así por su localización con respecto al modiolo. La célula pilosa es el receptor sensorial común de los órganos vestibulares y los de la audición. Los estímulos son detectados por estructuras accesorias dentro de cada tipo de órgano, lo que resulta en deflexiones de los haces de pelos sensorios de las células pilosas. Estos pelos sensorios tienen un arreglo anatómico complicado e idóneo para la realización de sus funciones. Una deflexión de ellos cambia las propiedades mecánicas de elementos elásticos que los componen y que se encuentran en el ápice, lo que resulta en un aumento en la probabilidad de apertura de los canales iónicos, llamados canales de transducción. La corriente iónica resultante altera el potencial de membrana de la célula pilosa, lo que a su vez opera canales iónicos sensibles a calcio y a voltaje transformándolo en potencial de receptor. Este último conduce a una comunicación química de naturaleza excitadora con la neurona aferente primaria.

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❚ LOCALIZACIÓN

DE LAS SINTASAS DE ÓXIDO NÍTRICO EN EL OÍDO

Utilizando técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas, se ha demostrado la presencia de las isoformas nNOS (NOS-1) y la eNOS (NOS-3), tanto en la cóclea como en el órgano de Corti de algunos mamíferos. La isoforma eNOS se encuentra ampliamente distribuida en todas las estructuras de la cóclea, mientras que en el órgano de Corti se encontró principalmente la isoforma nNOS. Tanto en el epitelio del vestíbulo como en la mácula del utrículo y del sáculo se han localizado las isoformas nNOS y la eNOS. En el oído interno en condiciones normales no se ha encontrado la presencia de la isoforma iNOS (NOS-2), únicamente bajo condiciones patológicas tales como la inoculación de polisacáridos, de gentamicina o cisplatino, en el envejecimiento o después de una reacción inflamatoria, ha sido posible detectar la expresión de esta isoforma de la NOS, lo que sugiere que juega un papel importante en el daño del oído interno. La detección directa del óxido nítrico en el oído ha coincidido con la localización de la isoforma de la NOS.

❚ IMPORTANCIA FUNCIONAL DEL ÓXIDO

NÍTRICO EN EL OÍDO

Aunque el óxido nítrico es un radical libre, no es tóxico para las células en concentraciones fisiológicas debido a que su modo de acción es relativamente lento

428

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 28)

y puede ser eficientemente inactivado. Sin embargo, su sobreproducción puede llevar a la muerte celular. A nivel del oído, el óxido nítrico tiene un papel muy importante tanto en la regulación de las reacciones fisiológicas como en algunas patologías. A continuación se revisará la información inherente a cada una de las partes del oído.

Oído medio En la otitis media se ha demostrado la presencia de metabolitos del NO• en las secreciones del oído medio, observadas en este tipo de enfermedad. Además, tanto en experimentos in vitro como in vivo se ha encontrado que la producción de mucina se incrementa con la presencia de un donador de NO• (dinitrato de isosorbida, ISDN) y que dicho incremento es bloqueado por la adición de inhibidores de las NOSs como la NG-monometil-L-arginina (L-NMMA) y el Nnitro-L-arginin-metil-éster (L-NAME). Se ha sugerido entonces que, el NO• modifica la permeabilidad de los vasos sanguíneos, la transudación de suero en la mucosa y el movimiento del fluido extracelular a través del epitelio del oído medio. Aunque la evidencia indica que el NO• actúa como un mediador en la inflamación al incrementar la permeabilidad vascular en el oído medio y la secreción de mucina en la otitis media, el papel exacto del NO• en la patogénesis de la inflamación del oído medio y el daño coclear todavía no ha sido determinado. Sin embargo, la modulación de las vías involucradas en la estimulación de la producción de mucina inducida por el NO• podría ofrecer posibilidades terapéuticas en este desorden.

Oído interno Existe suficiente evidencia de la participación de la vía NO•/cGMP en la regulación del flujo sanguíneo de la cóclea. Para ello se han aplicado directamente en la membrana redonda sustancias donadoras de NO•, como la espermina-óxido nítrico (SPNO) y la S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP), observándose un incremento en el flujo sanguíneo coclear. Por otro lado, cuando se aplicó el LNAME, un inhibidor de las NOS, se vio una disminución del flujo sanguíneo en la cóclea. Estos datos sugieren que la producción de óxido nítrico en la vasculatura de la cóclea tiene gran importancia en la regulación del flujo sanguíneo en este sitio. En condiciones fisiológicas, la producción de NO• puede darse también por la estimulación hormonal. En el órgano de Corti, la sobreestimulación de los receptores para glutamato, así como también la isquemia, degeneran las conexiones aferentes a las células pilosas internas resultando en una elevación del umbral

El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído

CPI

G

•

429

CPI

G G

Sobreestimulación acústica

GGG G G 2+

Ca

Sobreproducción de óxido nítrico

GLUR DA

(+)

DA

nNOS NO

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Figura 28-3. Mecanismo propuesto para la excitotoxicidad coclear. El óxido nítrico (NO•) puede mediar la excitotoxicidad causada por el glutamato liberado de las células pilosas internas (CPI). En esta hipótesis, el glutamato (G), liberado después de la estimulación acústica, activa a sus receptores (GLUR) presentes en las dendritas aferentes (DA). El calcio entra a las células y activa a la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) para producir NO•. La sobreestimulación acústica induce una sobreproducción de NO• causando la degeneración de las dendritas aferentes y con ello la excitotoxicidad.

del potencial de acción del nervio auditivo. Estas alteraciones se han adjudicado al incremento en los niveles de NO•, debido a que cuando se aplicó tópicamente un donador de NO• como el nitroprusiato de sodio, se encontraron daños morfológicos en las células pilosas internas y externas de la cóclea. El posible mecanismo por el cual el NO• media la excitotoxicidad en la cóclea se muestra en la figura 28-3. El glutamato es liberado después de una estimulación acústica de las células pilosas internas y activa a los receptores para glutamato presentes en las dendritas aferentes. Luego, hay una entrada de calcio a través de canales de calcio acoplados a receptores para NMDA y activa a la NOS. Una sobreestimulación acústica conduce a una sobreproducción de NO•, la cual puede reaccionar como un radical tóxico en el sitio de su producción y en un momento dado, causar daño celular. Se ha sugerido también que la alteración en el flujo sanguíneo coclear causada por el cambio en los niveles de NO•, contribuye a ciertas formas de pérdida

430

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 28)

auditiva súbita, así como también a otros desórdenes auditivos como el tinnitus y la enfermedad de Ménière.

Vestíbulo A nivel vestibular, se ha sugerido que el NO• tiene un papel importante en el mantenimiento de la endolinfa y la homeostasia iónica. Se han encontrado las isoformas eNOS y nNOS tanto en las células sensitivas como en las células ganglionares y en las células epiteliales. La isoforma inducible de la NOS no ha sido detectada en condiciones fisiológicas, únicamente cuando por ejemplo, se inoculan polisacáridos bacteriales en el órgano vestibular o por aplicación de aminoglucósidos como la gentamicina o también en daño coclear inducido por anoxia local. La iNOS, una vez activada, puede producir grandes cantidades de NO• por tiempos prolongados, lo cual conduciría a daño en el oído interno. Si la activación de mecanismos dependientes de NO• es bloqueada por inhibidores apropiados o por secuestradores de radicales libres, entonces el oído podría ser protegido de algunos procesos degenerativos.

❚ DAÑO

EN EL OÍDO CAUSADO POR AMINOGLUCÓSIDOS

Los aminoglucósidos son antibióticos que fueron desarrollados en el decenio de 1940-49, para tratar infecciones causadas por bacterias Gramnegativas que no respondían a los antibióticos convencionales, como la penicilina. En este grupo se encuentran incluidos la estreptomicina, la kanamicina, la tobramicina, la neomicina, la gentamicina y la amikacina entre otros. Todos ellos muestran cierto grado de ototoxicidad aunque varían en el daño que producen a nivel de la cóclea o el vestíbulo. Se ha postulado que el paso inicial para la ototoxicidad de los aminoglucósidos es la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) que, como punto final, lleva a la muerte celular. En este proceso, se ha observado que los aminoglucósidos forman un complejo con el hierro, el cual reacciona entonces con algunos ácidos grasos insaturados para formar radicales superóxido (O2•), y peróxidos de lípidos. Normalmente, el O2• es convertido a peróxido de hidrógeno (H2O2) por la superóxido dismutasa (SOD) y detoxificado en agua y oxígeno mediante la catalasa. Sin embargo, cuando existen grandes condiciones oxidativas, las vías antioxidantes endógenas se sobrepasan y entonces los radicales libres pueden llegar a ser abundantes (figura 28-4). Los aminoglucósidos como la gentamicina, pueden activar a la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en el tejido del oído interno, causando un incremento en los niveles de NO•. Bajo estas condiciones el

El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído

•

431

AG + Lípidos de Membrana + Fe

2+

AG

AG PIP 2

Fe

2+

Fe

2+

AA

• OH O2

Peroxidación

AG Fe

2+

Radical Carbono

AA + O2 •-

H2 O

O2 H 2 O2

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AA-OO–

Muer te Celular

Muer te Celular

Figura 28-4. Mecanismo propuesto para la muerte celular en la cóclea inducida por los aminoglucósidos. Los aminoglucósidos (AG) forman complejos ternarios con el hierro (Fe2+) y con los lípidos de la membrana celular, incluyendo al fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) y al ácido araquidónico (AA). El complejo AG-PIP2-Fe2+ puede ser oxidado por el oxígeno molecular para producir el anion superóxido (O2•). Este último puede reaccionar con otros componentes celulares o formar peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual al reaccionar con el complejo de Fe2+ puede producir radicales hidroxilo (•OH). Los radicales •OH pueden reaccionar con el AA en el complejo AG-Fe2+ para producir radicales de carbono que pueden directamente iniciar la peroxidación, o combinarse con el O2 para formar radicales peroxilo con el AA.

432

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 28)

O2• puede reaccionar con el NO• presente para formar el peligroso radical peroxinitrito (ONOO–) o puede directamente iniciar la muerte celular. Además, recientemente se ha encontrado evidencia que sugiere que los genes para la expresión de algunas enzimas antioxidantes podrían ser regulados negativamente por los aminoglucósidos; por ejemplo, en cultivos del órgano de Corti expuestos a la gentamicina se observó una reducción de 2 veces en la transcripción del gen de la catalasa. Los aminoglucósidos causan daño preferencialmente en las células pilosas externas del órgano de Corti y en las células pilosas vestibulares tipo I (figura 28-2). De manera interesante, las células de soporte y las pilosas internas del órgano de Corti no resultan frecuentemente afectadas. Esto podría deberse a diferencias en la activación y translocación del factor nuclear NFkB, el cual se ha visto implicado en la señalización celular inducida por la activación de las ERO. La administración sistémica de kanamicina en ratas, mostró un incremento de la peroxidación de lípidos en todos los tipos celulares del órgano de Corti; además, esto fue acompañado por un incremento en los niveles del NFkB en el núcleo de las células pilosas internas y en las células de soporte del órgano de Corti. Sin embargo, el NFkB estuvo ausente en el núcleo de las células pilosas externas, indicando que este factor nuclear es translocado al núcleo de las células resistentes a la kanamicina, pero no en las células sensibles a este antibiótico. Además, la coadministración de salicilatos o 2,3dihidroxibenzoato, facilitó la translocación del NFkB al núcleo de las células pilosas externas y las protegió del daño celular inducido por la kanamicina. Por otro lado, las células pilosas externas tienen una menor capacidad antioxidante comparada con la de otros tipos celulares del órgano de Corti. El nivel de glutatión (GSH) en las células pilosas externas es menor que el observado en otras células del órgano de Corti y además en ellas existe un gradiente del nivel de GSH desde la base al extremo apical de la cóclea. En la porción apical de las células pilosas externas existen niveles mucho más altos de GSH que en la porción basal. Los aminoglucósidos originan daño en estas células en la región basal de la cóclea y puede ser un daño progresivo hacia la porción media o apical de ésta. Se ha postulado que un exceso de ERO puede ocasionar muerte celular por apoptosis, y los aminoglucósidos han sido relacionados de manera directa con este evento.

❚ ESTUDIOS

EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES Y CONCLUSIONES

La estreptomicina (STP) es el antibiótico aminoglucósido antibacteriano más efectivo, pero sus efectos ototóxicos a largo plazo son devastadores. En el laboratorio de los autores, recientemente, se descubrió la presencia de un derivado metabólico de la STP, la estreptidina (STD) (figura 28-5) la cual se produce por

El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído

•

433

NH H2 N NH OH H2 N

NH

OH

HO

H2 N N

HN

O

NH

H

OH

H

O

Hidrolisis H2 N

O O

OH CH 3

H

HN

OH

HO N H

?? NO •

HO

Estreptidina

N

HO

CH 3 HO HO Estreptomicina

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Figura 28-5. La estreptomicina produce estreptidina por hidrólisis en el suero de pacientes tratados con el antibiótico, mediante un mecanismo no conocido todavía. A su vez la estreptidina puede actuar como donador de NO•.

hidrólisis de la primera, quedando libre para actuar en el torrente sanguíneo de pacientes tratados con la STP. Debido a que la STD posee 2 grupos guanidino, se ha sugerido que la STD podría ingresar a las células del oído a través de un acarreador de arginina. De manera interesante, se ha observado que el tratamiento con la STP causa acumulación de STD en las células del oído. Por otro lado, también se ha encontrado que la actividad de la NOS inducible se encuentra incrementada con la administración de aminoglucósidos. Lo anterior puede sugerir que el daño en el oído inducido por este tipo de antibióticos, podría deberse a la formación de NO• derivado de los grupos guanidino de la STD y que dicha reacción podría ser catalizada por la isoforma inducible de la NOS.

❚ AGRADECIMIENTOS Se agradece a la Dra. Yolanda Saldaña Balmori la información proporcionada acerca del metabolismo del óxico nítrico.

434

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 28)

❚ REFERENCIAS Fessenden JD, Schacht J: The nitric oxide/cyclic GMP pathway: A potential major regulator of cochlear physiology. Hearing Reasearch 1998;118:168-176. Granados O, Meza G: Streptidine: A metabolic derivative produced after administration of streptomycin in vivo, is vestibulotoxic in rats. Histology Histopathology 2005;20:357-364. Meza G: Neurobiología de los sistemas sensoriales. México: UNAM, 1995. Meza G, Barba-Behrens N, Granados O et al.: Vestibular histofluorescence could be due to accumulation of both the antibiotic and its derivative, streptidine, after acute streptomycin treatment in guinea pig. Histology Histopathology 2001;16:1143-1148. Moncada S, Higgs A, Furchgott R: XIV. International union of pharmacology nomenclature in nitric oxide research. Pharmacological Reviews 1997;49 (2): 137-142. Nakashima T, Naganawa S, Sone M et al.: Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews 2003;43:17-28. Rybak L P, Whitworth C A: Ototoxicity: therapeutic opportunities. Drug Discovery Today 2005;10:1313-1321. Selimoglu E: Nitric oxide in health and disease from the point of view of the otorhinolaryngologist. Current Pharmaceutical Design 2005;11:3051-3060. Takumida M y Anniko M: Nitric oxide in the inner ear. Current Opinion in Neurology 2002;15:11-15.

E

29

STRÉS OXIDATIVO Y RETINOPATÍAS Rocío Salceda Sacanelles

La visión es uno de los procesos sensoriales de mayor relevancia en los organismos en general, y en el hombre, en particular. Por medio de la visión conocemos el mundo que nos rodea y podemos responder a una variedad de condiciones, por lo que alteraciones en el sistema visual causan incapacidad y pérdida de la productividad. De particular relevancia son las alteraciones que se presentan en la retina, ya que este órgano localizado en el fondo del ojo, recibe la luz y la convierte en señales eléctricas que son procesadas y enviadas al cerebro, en el que se analizan y se construye el mundo visual. El daño iniciado por los radicales libres se ha implicado en la etiología de un gran número de enfermedades inflamatorias y degenerativas, incluyendo las retinopatías. La descripción de la generación de radicales libres y las reacciones que previenen o disminuyen su toxicidad se revisó en los capítulos anteriores, por lo que en se tratará únicamente del daño que ocurre en la retina como resultado del estrés oxidativo.

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❚ INTRODUCCIÓN

❚ 435 ❚

436

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ ASPECTOS

(Capítulo 29)

GENERALES DE LA VISIÓN

La retina La luz entra al ojo a través de la pupila y es enfocada por el cristalino en la retina (figura 29-1). Este órgano es la capa más interna del ojo, se localiza entre los vasos de la coroides y el humor vítreo. La retina está formada por varias capas de células nerviosas comunicadas en circuitos y una monocapa de células epiteliales (epitelio pigmentario de la retina, EPR). Este epitelio recubre el fondo del ojo y mantiene la composición iónica del fluido que rodea a los fotorreceptores, recicla la vitamina A, selecciona y transporta nutrientes de los vasos de la coroides, los cuales yacen inmediatamente atrás del epitelio. El EPR, como su nombre lo indica, contiene gránulos de melanina que absorben el exceso de luz que llega a la retina, favoreciendo la calidad de la imagen en la misma. Los cuerpos o somas de las neuronas forman la capa nuclear externa (células fotorreceptoras), la capa nuclear interna (células bipolares, horizontales, amacrinas e interplexiformes ) y la capa de células ganglionares. Estas neuronas se comunican entre sí en dos capas sinápticas, externa e interna. Los axones de las células ganglionares forman el nervio óptico que se dirige al cerebro (figura 29-2).

Nervio óptico

Pupila

Cristalino

Iris

Coroides

Retina Córnea

Figura 29-1. Esquema general del ojo de los vertebrados.

Estrés oxidativo y retinopatías

•

437

La luz que llega a la retina es capturada por los fotorreceptores, conos y bastones, llamados también células visuales. Los bastones son responsables de la visión en condiciones de luz tenue y los conos en condiciones de luz brillante y la visión de color.

Fotorreceptores Cada fotorreceptor tiene un apéndice llamado segmento externo, el cual contiene proteínas especializadas que absorben la luz y amplifican la señal. El segmento externo de los fotorreceptores está formado por cientos de sacos membranosos aplanados, acomodados uno sobre otro y denominados discos (figura 29-3), los cuales tienen una alta concentración de la proteína rodopsina (pigmento visual).

R R

R

R

R

R

R

R

R Sináptica externa

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H B

B

B

B B

B

A A

G

Sináptica interna

G

G

G

Nervio óptico

Luz

Figura 29-2. Estructura de la retina. Izquierda, esquema que muestra la estructura y células de la retina. Derecha, corte histológico de la retina humana en la que se observa su estructura estratificada. A, células amacrinas; B, células bipolares; G, células ganglionares; H, células horizontales; R, células fotorreceptoras.

438

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 29)

Epitelio pigmentario

Segmento externo

Discos

Segmento interno

Terminal sináptica

Figura 29-3. Esquema que muestra la estructura de las células fotorreceptoras y su relación con el epitelio pigmentario de la retina.

La fototransducción es el proceso por el que la energía luminosa se convierte en un estímulo nervioso. En la oscuridad, la membrana del fotorreceptor se mantiene despolarizada debido a que en su segmento externo existe una corriente catiónica, denominada corriente oscura. Los iones fluyen a lo largo de la célula y son expulsados de la célula en el segmento interno. La luz absorbida por la rodopsina isomeriza a su cromóforo de la forma 11-cis retinal a la todo-trans retinal, lo cual inicia una cascada de señalización que culmina con la disminución de la concentración del monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) el cual modula directamente la corriente oscura. La disminución en la concentración de cGMP cierra los canales catiónicos del segmento externo del fotorreceptor y en conse-

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Estrés oxidativo y retinopatías

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439

cuencia la membrana de la célula se hiperpolariza; esta señal pasa a las siguientes neuronas de la retina. Las membranas de los fotorreceptores están enriquecidas en fosfolípidos compuestos de ácidos grasos poliinsaturados, en especial una alta proporción de ácido docosahexaenoico (22:6, n-3) el cual contiene 22 carbonos y seis dobles ligaduras, n-3 indica la posición del primera doble ligadura a partir del grupo metilo terminal. Este ácido graso es el producto final de una serie de elongaciones y desaturaciones del ácido linolénico(18:2, n-3). Otro ácido graso abundante en los fosfolípidos de los fotorreceptores es el ácido araquidónico (20:4, n-6), éste deriva de otro ácido graso esencial, el linoléico (18:2, n-6) y es precursor de prostaglandinas y leucotrienos. Los segmentos externos de los fotorreceptores son continuamente renovados con nuevos discos membranosos que se adicionan en la base del segmento externo y los extremos distales son fagocitados por el EPR. Los fotorreceptores sintetizan cerca del 10% de su segmento externo cada día. Experimentos de autorradiografía demostraron que amino ácidos radiactivos recién incorporados a la rodopsina, forman una banda discreta en la base del segmento externo y con el tiempo la banda migra hacia la región distal. En contraste a la proteína, los lípidos son renovados por reemplazamiento molecular; el glicerol y los ácidos grasos radiactivos mostraron un marcaje difuso a lo largo de los segmentos externos, resultados que indican que el recambio de lípidos es más rápido que el de las proteínas. Sin embargo, el recambio del ácido docosahexaenoico parece ser muy lento, ya que para disminuir sus niveles en la retina se requiere de una deficiencia prolongada en la dieta. El recambio continuo que ocurre en las membranas de los fotorreceptores incrementa la relevancia de estos lípidos como precursores de la biogénesis de las membranas, ya que sus precursores son secuestrados de la circulación sanguínea y los cambios en esta acumulación pueden contribuir a la degeneración de las células visuales. La retención de estos ácidos grasos depende también de la protección del tejido contra la peroxidación. Los ácidos grasos poli insaturados son muy susceptibles a destrucción por conversión a peróxidos. La retina tiene varios mecanismos que protegen contra el daño oxidativo de los componentes lipídicos de la membrana. Se han demostrado niveles elevados de antioxidantes, como la vitamina E y las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), en la retina de varias especies. Las dobles ligaduras del ácido docosahexaenoico se han asociado a la elevada fluidez de la membrana de los discos de los fotorreceptores. Debido a que en estas células existen otros ácidos grasos con menor número de dobles ligaduras, los cuales aumentan eficientemente la fluidez de la membrana, se considera que el ácido decosahexaenoico puede tener otras funciones adicionales, por ejemplo como precursor de otras moléculas o segundos mensajeros. De hecho se demos-

440

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 29)

tró que en la retina, el ácido decosahexaenoico es substrato de una lipo oxigenasa que produce compuestos hidroxilados llamados docosanoides, que actúan como señales intracelulares de manera semejante a como lo hacen los eicosanoides, formados por lipo oxigenasas que actúan sobre el ácido araquidónico. El tejido retiniano responde a estímulos fisiológicos y patofisiológicos por la activación de fosfolipasas y consecuente liberación de segundos mensajeros. Así, por la activación de la fosfolipasa A2 se forman eicosanoides y un factor activador de plaquetas (PAF) los cuales se acumulan en la retina en respuesta a daño. Los eicosanoides, en particular los prostanoides, el tromboxanoA2 (TXA2) y el PAF se generan abundantemente después del estrés oxidativo y contribuyen al daño neovascular. Éstos inducen directamente la muerte de las células endoteliales y potencialmente pueden contribuir a la patogénesis de retinopatías isquémicas.

❚ ÓXIDO

NÍTRICO

El óxido nítrico (NO•) es un radical libre presente en diversos tejidos, incluyendo la retina, el cual puede combinarse con el anión-radical superóxido (O2•) formando al peroxinitrito (ONOO–). Adicional a la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), se demostró que el NO• juega un papel importante en la retina. La administración intraperitoneal de L-NAME (N-nitro-L-arginina metil ester), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS), protegió a las células fotorreceptoras del daño causado por la luz. Asimismo, se demostró con estudios inmunohistoquímicos que el NO• aumenta en la retina durante la diabetes. La muerte de los fotorreceptores puede atribuirse o exacerbarse por el efecto de radicales de NO• y/o también por su efecto estimulador de la actividad de la guanilato ciclasa en los fotorreceptores, modificando las concentraciones de cGMP y como consecuencia el proceso de fototransducción.

❚ PATOLOGÍAS Los altos requerimentos de oxígeno y constante exposición a la luz, hacen de la retina y particularmente a los fotorreceptores, blancos vulnerables del estrés oxidativo. El estrés oxidativo se ha relacionado con varias alteraciones retinianas tales como el incremento en la permeabilidad vascular, disminución en el flujo sanguíneo y el engrosamiento de las membranas basales. El incremento en la producción de ERO está combinado con una perturbación de las defensas antioxidantes. Efectivamente, la administración de antioxidantes a animales de diversos modelos experimentales, inhibe el desarrollo de las lesiones características de la retinopatía. El radical O2• es de particular interés porque puede reaccionar con el NO•

Estrés oxidativo y retinopatías

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produciendo ONOO–, el cual produce citotoxicidad debido a la peroxidación de lípidos, inactivación de enzimas por la oxidación de los grupos sulfhídrilos, nitración de tirosinas y daño del DNA mitocondrial. En las degeneraciones retinianas, particularmente las hereditarias, ocurre una destrucción de las membranas de los fotorreceptores, que lleva a la alteración de la función de las células visuales y posiblemente a la ceguera. La muerte apoptótica en las células de la retina es un evento común en complicaciones oculares que incluyen retinopatía diabética, glaucoma, degeneración macular y daño isquémico. Asimismo, en los años recientes se ha explicado la cataratogénesis como resultado de un daño oxidativo. La catarata se define como la opacidad del cristalino, el cual es un órgano complejo, avascular, transparente que tiene como función enfocar las imágenes en la retina.

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Daño causado por la luz Se conoce ampliamente que la exposición prolongada a la luz o las altas intensidades luminosas produce muerte de las células visuales. La luz y el oxígeno son esenciales para la visión, pero son también elementos que favorecen la formación de ERO que llevan al daño fotoquímico. Mientras que los mecanismos de fototransducción se han determinado detalladamente, poco se conoce sobre los mecanismos a través de los cuales la luz produce daño. Sin embargo, el daño es menor cuando se administran antioxidantes naturales o sintéticos, por lo que se sugiere que la exposición a la luz genera reacciones oxidativas. Existen estudios que indican que la luz causa daño oxidativo en el DNA, porque los niveles de 8hidroxi desoxi-guanosina (8-oxodGuo o 8-OHdG) se elevaron y el tratamiento con el antioxidante dimetil tiourea, redujo la ruptura del DNA. Los efectos que produce la luz brillante están asociados a un incremento en la peroxidación de lípidos, los cuales causan la apoptosis de los fotorreceptores de la retina del ratón, a través de regular el mRNA y la proteína del factor nuclear kappa β (NF-kβ), así como la vía de la caspasa 1. Una mayor susceptibilidad al daño causado por la luz se observó en una cepa de rata con una mutación autosómica que la hace deficiente en la síntesis del colesterol. Asimismo, una mayor susceptibilidad se ha observado como resultado de mutaciones específicas en el gen de la rodopsina, sin embargo la relación entre la rodopsina y la peroxidación de lípidos no se conoce.

La retinopatía diabética La hiperglucemia se conoce como la principal causa del desarrollo de la retinopatía diabética. Aunque el mecanismo exacto se desconoce, la hiperglucemia puede llevar a complicaciones vasculares que incluyen la fragilidad capilar, resul-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 29)

tando en microangiopatías. Ésta es una de las consecuencias más serias de la diabetes, su gravedad radica en que las modificaciones producidas en la función visual son irreversibles. Varios estudios han reportado un claro incremento en la concentración de ERO en la retina de los animales diabéticos, aumento que se ha correlacionado con una elevación en la peroxidación de lípidos de la membrana. Si bien la retinopatía diabética se caracteriza por un engrosamiento de la membrana basal de los capilares y un aumento de la permeabilidad de los mismos, estudios posteriores han demostrado modificaciones en el registro electrorretinográfico, indicando que las células fotorreceptoras e interneuronas se alteran. Aunque la patogénesis de esta enfermedad aún no se conoce, está relacionada con la formación de radicales libres de oxígeno, los cuales reaccionan preferentemente con lípidos insaturados llevando a la formación de radicales lipoperoxido, induciendo un proceso oxidativo que lleva a la lisis de las membranas, que a su vez lleva a la desorganización de los discos de los fotorreceptores y el daño o muerte de éstos. Para demostrar la participación del estrés oxidativo se han llevado a cabo experimentos en distintos modelos animales de diabetes tipo 1 y 2, caracterizados por la disminución o ausencia de insulina y por resistencia a la misma, respectivamente. Estos estudios han revelado que existen varias fuentes potenciales de radicales libres que pueden ejercer diferentes grados de estrés oxidativo. La glucosilación de proteínas por la vía de Amadori parece incrementar su susceptibilidad al ataque de radicales hidroxilo (•OH). Por una serie de reacciones de reacomodo, los productos de Amadori pueden formar una familia de productos finales de glucosilación avanzada, los que se piensa pueden formarse en proteínas, ácidos nucleicos, membranas y dañar el tejido por entrecruzamiento proteinaproteina, tal es el caso de la opacidad del cristalino.

La retinopatía del prematuro La retinopatía del prematuro es un desorden de la maduración vascular manifestado por una proliferación anormal de los vasos en la retina inmadura de un infante prematuro. La proliferación de nuevos vasos en el vítreo puede llevar a la tracción circunferencial y desprendimiento irreversible de la retina. El daño puede incrementarse por la administración terapéutica de oxígeno en exceso, sin embargo el monitoreo continuo de oxígeno presenta poco beneficio. De manera semejante, la exposición a altas concentraciones de oxígeno resulta en una pronunciada degeneración de las células visuales y la pérdida del electrorretinograma. La vulnerabilidad de los fotorreceptores al oxígeno se estudió en ratas expuestas a diferentes concentraciones de oxígeno (hipoxia, normoxia) y diferentes grados de hiperoxia. Tanto la hipoxia como la hiperoxia causaron muerte de las células fotorreceptoras.

Estrés oxidativo y retinopatías

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La degeneración macular La degeneración macular se caracteriza por la pérdida gradual de la visión central de la retina (fóvea o mácula). Aunque la apariencia de la retina varía, en la mayoría de los casos se acumulan partículas que impiden la visión; en otros casos, nuevos vasos de la coroides penetran al EPR y proliferan o sangran debajo de la fóvea, lo que resulta en una rápida pérdida de la visión. Frecuentemente se asocia a la pérdida de las células del epitelio pigmentario. En la mácula existen pigmentos derivados de los carotenos y las xantofilas, cuya actividad antioxidante es especialmente efectiva a presiones bajas de oxígeno, como es el caso de las neuronas de la retina. Los principales pigmentos son la zeaxantina y luteína, éstos se encuentran concentrados en las fibras nerviosas y la disminución en su concentración se correlaciona con el riesgo de que ocurra la degeneración macular. Estudios recientes demostraron que la luteína ejerce un efecto anti inflamatorio a través de inhibir las señales dependientes de NF-kβ.

❚ ANTIOXIDANTES Y RETINOPATÍAS

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Ascorbato El ascorbato es un antioxidante natural presente en los tejidos y el plasma, esencial en la eliminación de los radiaclaes libres, además de ser un cofactor en el metabolismo de las catecolaminas, en la síntesis de neuropéptidos y de la colágena (véanse los capítulos: Potencial antioxidante del ácido ascórbico y Aspectos nutriológicos de la vitamina C). En la retina, la ausencia de ascorbato o cambios en el estado redox del ascorbato en estadios tempranos de la diabetes son consistentes con modificaciones en los niveles de glutatión (GSH) y la relación GSSG/GSH. Tomando en consideración la capacidad del ascorbato para proteger al α-tocoferol en contra de la oxidación producida por los radicales libres, resulta interesante que en la retina las concentraciones de ascorbato son diez veces mayores que los de la vitamina E, aunque éste parece ser insuficiente para prevenir el aumento en la peroxidación de lípidos. Sin embargo, la incidencia de retinopatía diabética se correlaciona directamente con bajos niveles de ascorbato en el suero. Cierta protección contra el daño causado por iluminación se consigue con suplementación de ascorbato en la dieta.

Vitamina E El papel del α-tocoferol en el metabolismo del oxígeno y su función en las membranas como un protector de la oxidación por radicales libres se ha documenta-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 29)

do ampliamente (véanse los capítulos, Potencial antioxidante del α-tocoferol y Aspectos nutrológicos de la vitamina E). En la retina existen altas concentraciones de vitamina E. Se tiene evidencia que dietas carentes de esta vitamina producen cataratas y muerte de las células visuales y del EPR. Asimismo la administración diaria de esta vitamina causa estabilización de las membranas lisosomales del EPR en ratas RCS, un modelo animal de distrofia retiniana hereditaria, en la que se presenta un defecto en las membranas lisosomales que lleva a la liberación extracelular de enzimas líticas como la catepsina y fosfatasa ácida que rompen las membranas de los fotorreceptores.

Cinc Se considera que el estrés oxidativo juega un papel importante en la patogénesis de la degeneración macular. En estudios clínicos se observó que la administración oral de cinc sólo o suplementado con antioxidantes reduce significativamente el riesgo de la progresión de la degeneración macular. Más aún, es un mejor protector que el β-caroteno y las vitaminas C y E. Estos estudios sugieren una función adicional a la de defensa antioxidante. Se ha propuesto que el cinc ejerce efectos directos e indirectos en la función de los antioxidantes. El cinc puede estabilizar los grupos sulfhídrico de las proteínas por unirse directamente a estos grupos o en sitios adyacentes actuando sobre estos grupos o en otros sitios causando cambios conformacionales que secuestren los grupos sulfhídrico; puede también antagonizar la catálisis de metales de transición como el cobre y el hierro en la vía de las reacciones de Fenton, inhibiendo así la producción de especies reactivas de oxígeno. Asimismo puede inducir enzimas que actúan como antioxidantes tales como la catalasa y las metalotioneinas.

❚ CONCLUSIONES El hecho de que la retina tenga altos requerimientos de oxígeno y sea sumamente sensible a la falta de éste, la hace particularmente vulnerable al estrés oxidativo y al daño por ERO. Aún y cuando no se conoce con exactitud la etilogía de las retinopatías, existen muchos estudios que apoyan la participación de las ERO, sin embargo, todavía deben realizarse más experimentos para esclarecer este tipo de fenómenos. La autora agradece el apoyo de CONACYT, proyecto 45840.

Estrés oxidativo y retinopatías

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❚ REFERENCIAS Anderson RE, LaVail MM, Hollyfield JG: Degenerative diseases of the retina. New York: Plenum Press,1995. Bazan NG, Scott BL: Docosahexaenoic acid metabolism and inherited retinal degenerations. In: Hollyfield JG, Anderson RE, LaVail MM, Degenerative retinal disorders. New York, Alan R. Liss, 1987. Delcourt C, Carriere I, Delage M et al.: Plasma lutein and zeaxanthin and other carotenoids as modifiable risk factors for age-related maculopathy and cataract: The Pola Study. Invest Opthalmol Vis Sci 2006;47:2329-2335. Demontis GC, Longoni B, Marchiafava PL: Molecular Steps involved in lightinduced oxidative damage to retinal rods. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43: 2421-2427. Doly M, Droy-Lefaix MT, Braquet P: Oxidative stress in diabetic retina. In: Emerit I, Chance B. (editores), Free Radicals and Aging. Suiza. Birkhauser, 1992. Dowling JE: Neurons and networks. An introduction to neuroscience. Harvard: University Press, 1991. Ha KN, Chen Y, Cai J, Sternberg P: Incease glutathione synthesis through an ARE- Nrf2-dependent pathway by zinc in the RPE: Implication for protection against oxidative stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:2709-2715. Low PA, Nickander KK, Tritschler HJ: The roles of oxidative stress and antioxidant treatment in experimental diabetic neuropathy. Diabetes 1997;46:S38S42. Organisciak DT, Wang HM, Noell WK: Aspects of the ascorbate protective mechanism in retinal light damage of rats with normal and reduced ROS docosahexaenoic acid. In: Hollyfield JG, Anderson RE, LaVail MM (editors). Degenerative retinal disorders. New York: Alan R. Liss, 1987. Salceda R, Vilchis C, Coffe V, Hernández-Muñoz: Changes in the redox state in the retina and brain during the onset of diabetes in rats. Neurochem Res 1998;23:895-899. Sun H, Nathans J: The challenge of macular degeneration. Scientific American 2001;285:61-67. Stone J, Itin A, Alon T: Development of retinal vasculature is mediated by hypoxia-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression by neuroglia. J Neurosci 1995;15:4738-4747.

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E

L ESTRÉS OXIDATIVO EN EL ENVEJECIMIENTO Norma Edith López Diazguerrero

Una cuestión que siempre ha intrigado a los seres humanos es el hecho de que cada especie tenga un tiempo máximo de vida. Por ejemplo, lo máximo que ha alcanzado a vivir un humano hasta ahora se ha estimado en 121 años. El tiempo de vida de las tortugas es aproximadamente de 150 años, la de un perro doméstico es de 20 años y la de la mosca de la fruta es de 3 meses. De manera natural y previa a la muerte de casi todas las especies animales, se ha visto un proceso de deterioro general, paulatino e irreversible, que comienza después de la madurez reproductiva. A este periodo se le conoce como envejecimiento. Así mismo, se ha observado que no existen patrones de envejecimiento idénticos entre dos individuos de una misma especie. Lo que ha llevado a suponer la existencia de gerontogenes y/o genes de longevidad, que junto con factores ambientales y metabólicos, tanto endógenos y exógenos, influyen sobre el envejecimiento y la longevidad. Entre estos factores se encuentra de manera importante el estrés oxidativo.

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❚ INTRODUCCIÓN

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

❚ ENVEJECIMIENTO El envejecimiento se puede definir como un fenómeno biológico complejo e inevitable que se relaciona con el decaimiento o la pérdida de las capacidades fisiológicas, bioquímicas y estructurales de un organismo. El deterioro progresivo y la reducida capacidad para responder a los estímulos ambientales en el envejecimiento conducen a la morbilidad y finalmente a la muerte. En los últimos años se ha incrementado la expectativa de vida en la población humana, lo que ha traído consigo un aumento relativo en la incidencia de enfermedades asociadas al envejecimiento, como los desórdenes neurodegenerativos, las neoplasias y las enfermedades autoinmunitarias como la artritis reumatoide, entre otras. El estudio del envejecimiento es multidisciplinario y diverso. Actualmente se utilizan modelos de organismos eucariotas, como las levaduras, las nemátodos, las moscas y los ratones, para tratar de elucidar el o los mecanismos participantes en este proceso. Sin embargo, a pesar del avance en las investigaciones en este tema, aún no se conocen las causas primarias. Para tratar de esclarecer a diferentes niveles los mecanismos que pudieran conducir al envejecimiento, se han propuesto varias teorías que no son exclusivas entre ellas. Desde una perspectiva evolutiva, el envejecimiento puede verse como un fenómeno en cual la selección natural de ciertos genes puede afectar la longevidad de una especie. Se han propuesto dos formas en las que actúa la selección natural:

a) Selección pasiva. Llamada así puesto que en este caso se acumulan mutaciones que no son elegidas o “escapan” a la selección natural. Ello debido a que los efectos de dichos genes ocurren después de la etapa de reproducción. b) Selección activa. También conocida como antagonismo pleiotrópico. Se refiere a la selección de un gen que provee un beneficio a corto plazo pero un perjuicio a largo plazo. En los animales de vida silvestre este detrimento difícilmente llegará a manifestarse pues la mayoría de los organismos silvestres no logran sobrevivir para llegar a edades avanzadas por causa de la depredación, la desnutrición, las enfermedades, entre otras. Cuando se habla de genes asociados al envejecimiento existe una discusión sobre la función y la denominación de estos genes. Se ha sugerido que deberían llamarse gerontogenes en el caso de que retrasaran o aceleraran el envejecimiento o genes de longevidad si es que su función fuera la de alargar la vida. Sin embargo, esto es aún una cuestión pendiente. Por otro lado, las teorías sistémicas adscriben el envejecimiento de todo el organismo a un decremento de la función de un sistema clave, como el sistema

El estrés oxidativo en el envejecimiento

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nervioso, endocrino o inmunitario. Las teorías celulares relacionan los cambios que se producen en los elementos estructurales y funcionales de las células, como los lisosomas y las mitocondrias, con el paso del tiempo; todo ello bajo la influencia de factores ambientales. Dentro de las teorías moleculares se encuentra una que cuenta con gran evidencia experimental, y es la teoría propuesta por Denham Harman en 1956. La teoría propone que el envejecimiento es el resultado de la acumulación de daño oxidativo en las biomoléculas, principalmente al DNA, a lo largo de la vida de un organismo y sus orígenes se explican a continuación.

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❚ TEORÍA DEL ENVEJECIMIENTO

POR RADICALES LIBRES

A mediados del siglo pasado, Harman descubrió la generación de radicales hidroxilo (•OH) en la reacción de la radiólisis del agua; este hecho, junto con el conocimiento previo de la presencia endógena del mismo radical en la materia viva, hizo que el investigador sugiriera que las especies reactivas de oxígeno (ERO) se producían de manera endógena como subproductos de la química enzimática redox. Así mismo, se empezó a conocer que las enzimas que participaban en este tipo de reacciones eran aquéllas involucradas en la utilización directa del oxígeno molecular, particularmente las que contenían hierro. Al comparar los efectos producidos por la radiación ionizante con el fenotipo que se manifiesta durante el envejecimiento, observó patrones similares como la presencia de mutagénesis, cáncer y daño celular en general. Poco después, tras el descubrimiento in vivo del anión superóxido (O2•), se encontró que la mitocondria era la principal fuente endógena de oxidantes. Harman sugirió que estos organelos eran participantes activos en el proceso del envejecimiento, y que los radicales libres producidos durante la respiración aeróbica en los organismos eran los que causaban la acumulación del daño oxidativo que contribuía al envejecimiento y a la muerte. Resulta paradójico que la generación intracelular de oxidantes pueda limitar la vida, ya a que desde el punto de vista energético, la utilización del oxígeno molecular como aceptor de electrones en la cadena respiratoria hace posible la síntesis de ATP y por tanto la vida. Aunque no se puede afirmar que el estrés oxidativo sea el único factor que determine la longevidad de un organismo, no hay duda de que está asociado a la patofisiología del envejecimiento. La teoría del envejecimiento por daño oxidativo de Harman comenzó a atraer la atención desde el decenio de 1980-89, y desde entonces cuenta con una gran cantidad evidencia experimental que la sustenta, como son las mediciones fenomenológicas del estrés oxidativo asociado con el envejecimiento, las comparaciones entre especies, la restricción calórica, la manipulación de la tensión de oxigeno en

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

la actividad metabólica, los tratamientos con antioxidantes alimenticios y farmacológicos, entre otros.

❚ ESTRÉS

OXIDATIVO EN EL ENVEJECIMIENTO

Como se ha mencionado a lo largo de este libro, en condiciones metabólicas normales, debe existir un balance entre los eventos oxidantes en donde hay producción de ERO y los sistemas de defensa antioxidante y de reparación del daño oxidativo. Lo anterior, mantiene la homeostasia celular y la regulación del estado redox intracelular, mediante retroalimentaciones positivas y negativas. El equilibrio redox permite un control versátil en la expresión génica y de transducción de señales de las vías relacionadas al crecimiento, la proliferación, la diferenciación y la muerte, entre otras actividades celulares. Pero cuando no se mantiene un balance entre ellos, ya sea por la pérdida y/o la disminución del sistema protector, por un aumento en la producción de las ERO o por ambos eventos simultáneamente, se dice que existe un estado de estrés oxidativo, dando como resultado severas disfunciones metabólicas. Durante el envejecimiento se ha visto que se altera este balance, llevando a las células de organismos viejos a un estrés oxidativo y por consecuencia un mayor daño celular.

Daño oxidativo De acuerdo con la hipótesis de Harman, las células que provienen de animales viejos deben haber acumulado mayor daño oxidativo en el DNA, en comparación con las células provenientes de animales jóvenes. Las principales biomoléculas, blanco de las ERO, son los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos, lesionando así la función y la estructura celular. Existen varias manifestaciones indirectas de daño oxidativo en las células. Tales mediciones incluyen lipoperoxidación, oxidación del DNA con formación de aductos como el 8-oxo-2´-desoxiguanosina (8oxodG), oxidación de las proteínas, y cambio en el estado redox de la pareja tiol/disulfuro, entre otras. Se ha demostrado de manera muy importante, que la acumulación del daño al DNA se asocia con el proceso de envejecimiento. Este daño es trascendente, pues altera la regulación de las funciones celulares. Por ejemplo, se ha encontrado un mayor daño en el DNA nuclear en células de animales viejos que de jóvenes, convirtiéndose, de nuevo, un blanco más vulnerable al ataque de las ERO. A pesar de que existen algunos mecanismos de reparación del DNA nuclear y reparación del DNA mitocondrial (mDNA), los radicales libres causan daños estructurales como mutaciones de pares de bases, rearreglos, deleciones, inserciones y amplifi-

El estrés oxidativo en el envejecimiento

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caciones de secuencia; así como rompimientos de DNA, daño a genes supresores de tumores, como p53, y amplificación de la expresión de protooncogenes. Por ejemplo, en la enfermedad neurodegenerativa de Parkinson hay una alteración de la función mitocondrial y deficiencia de la actividad del complejo I, lo que conlleva a una gran producción de ERO. Así también, en la enfermedad de Alzheimer, el estrés oxidativo es un evento temprano que favorece el depósito de hierro en las placas seniles.

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Sistemas protectores contra las ERO La amenaza continua del daño que causan los radicales libres en la célula, en los tejidos y, en general, en los organismos pluricelulares es contrarrestada por la existencia de sistemas de defensa celular. De hecho, la teoría del envejecimiento por radicales libres ganó credibilidad en 1969, con la identificación de la enzima superóxido dismutasa (SOD). Con tal descubrimiento se obtuvo la primera evidencia de la generación in vivo del anión O2• y las defensas antioxidantes celulares, de las que ya se ha hablado en capítulos anteriores. Sin embargo, a pesar de la eficiencia de los sistemas de defensa antioxidantes, Lu et al. (1999) han sugerido que, durante el proceso del envejecimiento, existe una disminución en las actividades enzimáticas de protección contra las ERO. Por ejemplo, diversos autores han demostrado que las concentraciones de glutatión reducido (GSH) disminuyen con la edad en varios tejidos de origen murino y en algunos insectos. La actividad y la expresión de la glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión-S-transferasa (GST) decaen durante el envejecimiento en todos los tejidos estudiados. La catalasa (CAT) tiene un comportamiento diferente según el tejido del que se trate, sin embargo, existe en general una marcada disminución de esta enzima en las últimas etapas de la vida. Mediante manipulaciones genéticas se creó un transgénico de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster que sobreexpresaba a la SOD1 y CAT, y se observó una sobrevida del 34% comparado con los controles. En otro modelo, los mutantes age1 del nematodo C. elegans presentaron un aumento en los niveles de los antioxidantes endógenos SOD y CAT, lo que les permitió vivir dos veces más que los controles. Sin embargo, al someter a ambos modelos a un estrés oxidativo exógeno, se encontró una protección de manera general, contra el daño, pero no se logró retrasar el proceso de envejecimiento. De manera contraria, al eliminar la producción de GPx, no se observó un fenotipo de envejecimiento prematuro, pero si la presencia de algunas patologías asociadas al envejecimiento. En el caso de los ratones carentes de SOD2 se observó muerte neonatal. Lo anterior demuestra que el balance entre los oxidantes y los antioxidantes es importante para el funcionamiento del organismo y un desequilibrio entre ellos se refleja en la patofisiología del envejecimiento y la longevidad.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

❚ LA TEORÍA DEL ENVEJECIMIENTO POR DAÑO EN EL DNA MITOCONDRIAL A la mitocondria se le considera la central energética de las células. Es en este organelo en donde se lleva a cabo el metabolismo oxidativo de los eucariotas, ya que en la mitocondria se realiza el ciclo del ácido cítrico, la oxidación de los ácidos grasos y están presentes las enzimas y proteínas redox que llevan a cabo el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Se ha estimado que los radicales libres generados en la mitocondria pueden producir daño a la membrana interna del organelo, a los componentes de la cadena de transporte de electrones y al DNA mitocondrial. De esta manera, al dañarse la mitocondria, no sólo produce menos ATP, sino que también incrementa la producción de ERO que consecuentemente produce más daño oxidativo a la mitocondria, creando así un ciclo vicioso (figura 30-1). De modo que se ha propuesto que la mitocondria tiene una participación esencial en diversas patologías, así como en el proceso del envejecimiento, y se ha asociado la duración de la vida de un organismo con el grado de daño oxidativo que presenta este organelo. Miquel et al. (1980) mostraron los primeros apoyos experimentales a la teoría del envejecimiento por daño oxidativo en el DNA mitocondrial (mDNA), en donde se encontró que los niveles de daño oxidativo al mDNA son al menos 10 veces más elevados que los que se encontraban en el DNA nuclear y que las lesiones oxidativas en el mDNA se acumulaban en función de la edad en el cerebro, en el hígado de rata y en la piel humana. Se ha pensado que la causa de la elevada tasa

Estrés oxidativo

Antioxidantes Muerte celular Apoptosis o necrosis

Generación de oxidantes mutagénicos

Daño al DNA nuclear y mitocondrial Células con producción de energía deficiente envejecimiento

Figura 30-1. Círculo vicioso del daño por ERO y el envejecimiento.

El estrés oxidativo en el envejecimiento

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de mutaciones en el mDNA se debe a sus limitados mecanismos de reparación y a la ausencia de histonas que lo protejan. La relación entre los niveles de mutaciones somáticas en el mDNA de mamíferos, la disfunción de la cadena respiratoria y los fenotipos expresados en el envejecimiento se demostraron al utilizar un ratón que expresaba deficientemente la subunidad catalítica de la polimerasa del mDNA. En 1989, Linnane formuló la teoría del envejecimiento por mutaciones en el mDNA inducidas por ERO, se trata de un refinamiento de la teoría de Harman. Linnane menciona que la acumulación de mutaciones en el mDNA, generadas por las ERO sobre las células somáticas a lo largo de la vida, son el principal contribuyente del envejecimiento humano y las enfermedades degenerativas asociadas. Los sustentos sobre los cuales se basa esta hipótesis son:

a) La existencia de numerosas deleciones en el mDNA de los tejidos envejecidos, que además son potencialmente patogénicas. b) Las alteraciones funcionales en el mDNA dependientes de la edad. c) La disminución en la actividad de algunas enzimas importantes de la mitocondria en el músculo humano de edad avanzada. Además, se ha demostrado que la acumulación de mutaciones en el mDNA ocurre en humanos entre los 70 y 100 años de edad, a partir de los 50 años en los chimpancés y entre los 2 y 3 años en el ratón.

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Daño en el mDNA, envejecimiento y longevidad Al parecer, el daño oxidativo en el mDNA hace la diferencia entre el envejecimiento y la longevidad de las especies. Tanto las aves, como los grandes mamíferos, tienen baja producción mitocondrial de ERO, a pesar de que la tasa metabólica en los primeros es alta y baja en los segundos. Sin embargo, ambos organismos presentan un envejecimiento lento. Este fenómeno se ha usado para explicar porqué en algunos casos los antioxidantes endógenos se correlacionan negativamente con el tiempo máximo de vida de las especies, en particular en donde los animales de larga vida tienen bajos niveles de antioxidantes asociados a bajos niveles de ERO y, al parecer, una mayor longevidad. Un estado que presenta un comportamiento similar a lo que ocurre en este tipo de especies de larga vida, está dada por una manipulación experimental que disminuye la tasa de envejecimiento en mamíferos. Este estado se conoce como restricción calórica (RC) y consiste en el consumo de una dieta nutriológicamente balanceada, pero reducida en aporte calórico. La RC disminuye la generación de ERO en la mitocondria, principalmente los que provienen del complejo I. El mecanismo que permite la disminución de ERO, al parecer no se debe a la dis-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

minución en el consumo de oxígeno, sino a que hay disminución en el flujo de electrones dirigidos hacia la formación de ERO. En este estado, aparentemente, no hay modificación en la expresión o actividad de las enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx. Experimentos con ratas, a las que se les redujo en un 50% su aporte calórico, vivieron el doble y retrasaron la aparición de tumores y enfermedades crónicas como en sucede en el envejecimiento. Sin embargo, fueron menos fértiles y 30% más pequeñas que las ratas alimentadas ad libitum. Otro ejemplo del papel del daño al DNA mitocondrial fue aportado por estudios realizados por Tanaka (1998), que revelaron que cerca de las 2/3 partes de los centenarios japoneses presentaban una variante de un gen mitocondrial conocida como Mt5178A que codifica para una subunidad de la NADH deshidrogenasa del complejo I de la cadena respiratoria. Dado que el complejo I es la principal fuente de ERO, puede ser que la variante esté asociada con una disminución en la fuga de radicales libres y por tanto una menor incidencia de mutaciones en el mDNA. Muchas de las personas con esta variante mostraron sólo la mitad de la incidencia de enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Lo anterior sugiere que los cambios en el estado redox en las células parecen regular algunas vías intracelulares críticas de manera específica en cada especie, y se puede pensar que es un parámetro que controla el envejecimiento. Esto ha sido apoyado por estudios con vertebrados, hongos y células en cultivo.

❚ EL DAÑO

OXIDATIVO INDUCE SENESCENCIA CELULAR

Como se ha mencionado, el estrés oxidativo parece tener una participación importante en el daño celular. En células de mamíferos se ha observado que dependiendo de la concentración de los oxidantes, del tipo celular y el estado del ciclo celular en que se encuentra la célula, se pueden desencadenar diferentes respuestas como necrosis, apoptosis, cáncer o senescencia celular. Cómo y porqué las células entran en dichos estados, no está claro, pero se piensa que esas vías podrían compartir algunas moléculas reguladoras. Uno de estos fenómenos, que llama la atención en el envejecimiento, es la senescencia celular. Chen et al. (1995), supusieron que la acumulación del daño oxidativo contribuye a este estado, tanto in vivo como in vitro. Estos investigadores demostraron que las células senescentes contenían 30 % más de 8-oxodG en el DNA que las células no senescentes. Así mismo, un estudio de Allen et al. (1999), confirmó que las células senescentes producían niveles elevados de radicales oxidantes y de H2O2 (figura 30-2). Cabe aclarar que la senescencia sólo se observa en organismos pluricelulares y en células que tienen potencial para el recambio celular. En la senescencia, las células se encuentran deterioradas en general, pero están metabólicamente acti-

El estrés oxidativo en el envejecimiento

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Estrés oxidativo Senescencia celular Interrupción Irreversible del ciclo celular ERO Daño al DNA

Acumulación de células senescentes

30% más de 8-oxodG

Alteración del ciclo celular en células vecinas preneoplásicas

Deterioro asociado al envejecimiento Cáncer

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Figura 30-2. Participación del estrés oxidativo en la inducción de la senescencia prematura (SIPS).

vas. Su ciclo celular permanece detenido irreversiblemente en la fase G1 aun y cuando existan estímulos mitogénicos en el medio. Dependiendo del tipo celular del que procedan, las células senescentes muestran cambios selectivos en la expresión génica que les da un fenotipo alterado. Se sabe que diferentes tipos de señales intrínsecas y extrínsecas de estrés oxidativo, pueden activar genes supresores de tumores como p53, Rb, o ambos, los cuales se han considerado como los principales activadores de la senescencia. La proteína p53 puede ser activada por las vías de señalización de daño al DNA, mediante las proteínas ATM y ATR, o por la proteína p14ARF. Cuando hay un estado de estrés oxidativo, las proteínas p21 y p16 pueden inhibir a las CDK (cinasas dependientes de ciclinas) e impedir la fosforilación de pRb deteniendo la progresión del ciclo celular. De esta manera, las dos proteínas supresoras de tumores pueden actuar como integradoras de señales de estrés y su nivel combinado de activación podría determinar la senescencia como respuesta. Se ha encontrado en estudios in vitro e in vivo que durante el estrés oxidativo que induce senescencia como sucede en el envejecimiento, se encuentra sobreexpresada la proteína Bcl-2. Recientemente se ha descubierto que esta proteína tiene un papel modulador de las ERO para la protección celular, a pesar de que

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

se ha visto que su sobreexpresión también induce la formación de ERO, posiblemente para activar los sistemas antioxidantes como el glutatión intracelular, entre otros. Esta proteína es un elemento importante en el proceso de la senescencia celular, pues se ha observado que su sobreexpresión puede detener el ciclo celular con incremento de los niveles de p27 como de p130.

La senescencia celular contribuye al envejecimiento En 1995, se tuvo la primera evidencia directa de la existencia de células senescentes in vivo en dermis de humano, utilizando un ensayo histoquímico para el marcador de senescencia: la presencia de la enzima β-galactosidasa en altas concentraciones. La acumulación paulatina de las células senescentes en los organismos a lo largo de la vida se ha confirmado en otras especies y en otros tejidos. Se ha propuesto que la senescencia es un mecanismo supresor de tumores en la vida temprana de un individuo. Sin embargo, si existe una acumulación de células senescentes, se altera el microambiente celular lesionando la función e integridad del tejido en el que se encuentran, además de fomentar la desregulación metabólica de las células vecinas incrementando las posibilidades de iniciar enfermedades o patologías comunes en la vejez como el cáncer. Lo anterior, conlleva directamente a relacionar el deterioro producido por la acumulación de las células senescentes en un tejido con el fenómeno del envejecimiento de los organismos. La evidencia que se tiene para sustentar esta hipótesis está basada en una gran cantidad de correlaciones experimentales. Una primera línea de evidencia se basa en que los cultivos primarios, derivados de donadores de edad avanzada, tienden a senescer antes que los cultivos de donadores jóvenes. La siguiente línea de evidencia deriva de algunas comparaciones entre especies. En general, las células derivadas de especies de vida corta inician su etapa de senescencia de manera temprana en comparación que las especies más longevas. En tercer lugar, se encuentran los estudios realizados en tejidos humanos derivados de personas con síndromes de envejecimiento prematuro hereditario, en especial con donadores con síndrome de Werner. En estos casos, se observa que las células de los pacientes senescen de manera prematura con respecto a los controles. Existen otros mecanismos mediante los cuales las células puedan sobrevivir al estrés oxidativo asociado al envejecimiento. Como por ejemplo, la expresión endógena de la proteína antiapoptótica Bcl-2 se ha visto aumentada en organismos viejos y en células senescentes. Lo interesante de esta proteína es que se comporta como una molécula prooxidante, induciendo la generación de ERO que permite encender los mecanismos antioxidantes de la célula, además de detener el ciclo celular para que la célula pueda repararse.

El estrés oxidativo en el envejecimiento

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457

❚ CONCLUSIONES El envejecimiento es un fenómeno natural que constituye uno de los mayores retos para la investigación biológica actual. El estrés oxidativo tiene un papel fundamental en el proceso del envejecimiento y las enfermedades asociadas a él y, junto con otros componentes intrínsecos y extrínsecos, determinan la longevidad de los organismos. La mitocondria es la principal fuente y a su vez blanco de las ERO, y el aumento de estos radicales en el estrés oxidativo, aunado con una disminución en las defensas antioxidantes y de reparación, provocan un daño a las biomoléculas y el deterioro celular asociado al envejecimiento. Recientemente se han encontrado otros sistemas de protección celular, como el que confiere la proteína Bcl-2 que actúa en la protección contra el estrés y el daño oxidativo, permitiendo la sobrevivencia celular. Dependiendo de las concentraciones de oxidantes presentes y el estado del ciclo celular, la célula puede transformarse en senescente, que es un estado alterado, con detención del ciclo celular, pero metabólicamente activa. Se ha observado un aumento de células senescentes por daño oxidativo en organismos viejos, lo que hace suponer que la senescencia contribuye al envejecimiento.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 30)

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AÑO OXIDATIVO Y ENFERMEDADES CRÓNICO DEGENERATIVAS ASOCIADAS A LA CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Andrea M.G. De Vizcaya Ruiz Luz M. Del Razo

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❚ INTRODUCCIÓN La contaminación ambiental se define como cualquier sustancia química, elemento físico u organismo patógeno, presente en el medio ambiente que interfiere de manera adversa con los recursos naturales o la salud humana, animal o de los ecosistemas. Tal escenario plantea una relación estrecha y directa entre la magnitud de la exposición a los contaminantes y el riesgo a las enfermedades. Se ha reconocido que un alto porcentaje de las padecimientos a nivel mundial podría atribuirse a factores ambientales asociados a la degradación de los ecosistemas, como son la exposición a los productos químicos y accidentes tecnológicos. Si actualizamos el concepto de ambiente para incluir a la dieta, así como a los factores de comportamiento social y cultural, entonces el porcentaje de padecimientos atribuibles a los cambios o modificaciones ambientales se eleva considerablemente. Cuando las poblaciones se exponen crónicamente a los contaminantes ambientales, con frecuencia se observa un aumento en la prevalencia de las enfermedades crónico-degenerativas. Estos efectos adversos dañan la salud, disminuyen la calidad y la esperanza de vida, y afectan a la economía de la sociedad, ya que decae su productividad y aumentan significativamente los gastos destinados al tratamiento de las enfermedades. ❚ 459 ❚

460

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

Para entender esta relación, actualmente se realizan estudios que analizan desde la liberación del contaminante al medio ambiente, hasta el desarrollo de las enfermedades en la población. La naturaleza de estos efectos adversos puede ser diversa y afectar a los organismos a distintos niveles, tanto bioquímicos, como celulares y hasta los mecanismos de acción moleculares. Entre estos efectos destacan los procesos de estrés originados por un desbalance entre eventos prooxidativos (incremento de radicales libres, especies reactivas de oxígeno, ERO, y de nitrógeno, ERN) y antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos). Los radicales libres, así como las ERO y ERN, se forman constantemente en el organismo a partir de fuentes endógenas y exógenas. Las fuentes endógenas incluyen a los subproductos de las reacciones metabólicas esenciales, como la generación de energía por la mitocondria o del metabolismo de compuestos tóxicos a través del sistema enzimático del citocromo P450. Las fuentes exógenas que generan radicales libres y ERO son el humo del cigarro, los contaminantes ambientales como las emisiones de los automóviles e industrias, el asbesto y la exposición a radiaciones iónicas, entre otras. Entre los contaminantes ambientales que han sido asociados con enfermedades crónico-degenerativas por estrés oxidativo, están algunos metaloides y metales, los plaguicidas organofosforados y organoclorados, las dioxinas e incluyen diversos contaminantes atmosféricos. En condiciones normales, las defensas antioxidantes protegen a las células en contra del exceso de los radicales libres y las ERO; pero si estas defensas no funcionan adecuadamente se puede provocar daño celular a distintos niveles, como en la molécula del DNA, provocando una oxidación de ácidos nucleicos; también en lípidos membranales, causando una pérdida estructural de la membrana celular u oxidando a las proteínas. El daño oxidativo a nivel celular conlleva disfunciones metabólicas y sistémicas que preceden distintos tipos de padecimientos o efectos adversos a la salud. Los sistemas más afectados por los agentes químicos o contaminantes ambientales incluyen los sistemas inmunitario, neurológico y endócrino. Cuando esta condición persiste durante periodos prolongados, se favorece el desarrollo de las enfermedades crónico-degenerativas como las que se mencionan a lo largo de este capítulo. Es importante considerar que los blancos celulares y moleculares de los distintos compuestos químicos no serán iguales en todos los casos, a pesar de que todos se lleven a cabo a través de procesos de estrés y daño oxidativo, por lo que los efectos adversos a la salud y, en consecuencia, la manifestación de enfermedades crónico-degenerativas dependerá del tipo de compuesto químico de que se trate, así como de la duración de la exposición al mismo. En este capítulo, se describirán los principales compuestos químicos medioambientales, que se han relacionado con la manifestación de enfermedades crónico-degenerativas a causa de procesos de estrés oxidativo.

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❚ CONTAMINANTES AMBIENTALES

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Metales Los metales son sustancias naturales que se han formado por meteorización de minerales y son emitidos al ambiente durante la actividad volcánica. Algunos metales son esenciales para la salud humana y a menudo son componentes importantes de varias enzimas con funciones fisiológicas. Los metales se pueden encontrar en aguas superficiales en sus formas iónicas estables o bien reaccionar con otros iones, para formar compuestos que en ocasiones pueden ser tóxicos. Algunos metales están implicados en las reacciones de transferencia electrónica en las que el oxígeno está presente, lo que favorece la formación de oxiradicales tóxicos. Desde el punto de vista toxicológico, los metales o metaloides más importantes que participan en este tipo de reacciones son el plomo (Pb), el mercurio (Hg), el cromo (Cr), el cadmio (Cd) y el arsénico (As). La mitocondria es uno de los principales blancos celulares de los efectos oxidantes de los metales. Se ha propuesto que algunas especies oxidantes de los metales como As3+, Cr6+, Hg2+, perturben la integridad estructural de la membrana interna mitocondrial, lo cual produce un aumento en la permeabilidad. Esto altera el potencial de membrana y se traduce en el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, favoreciendo la producción de ERO como el superóxido (O2•) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) por la cadena transportadora de electrones, así como de especies reactivas intermediarias, producto de su biotransformación. Tal es el caso del metabolismo intracelular del Cr6+, que produce especies intermedias de Cr4+ y Cr5+, capaces de dañar directamente a las macromoléculas biológicas; o del As3+ que, al oxidarse a As5+, genera H2O2 espontáneamente y durante su biotransformación produce radicales de As, como el peroxil dimetilado de As. Todos estos eventos se traducen en un estrés oxidativo mitocondrial y celular. Otro mecanismo de acción consiste en la inhibición de algunas de las enzimas involucradas en la protección celular contra el estrés oxidativo.

Plaguicidas Se denomina plaguicida a cualquier agente químico, físico o biológico utilizado para eliminar a los organismos animales o vegetales no deseados. Este tipo de agente ha sido ampliamente utilizado durante los últimos 50 años en la agricultura, por lo que actualmente se ha convertido en un contaminante ambiental de gran relevancia. En general, los plaguicidas se agrupan en insecticidas organoclorados y organofosforados, en herbicidas, fungicidas, fumigantes y rodenticidas. Se ha propuesto al estrés oxidativo como uno de los mecanismos plausibles de toxi-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

cidad por la exposición a plaguicidas. Los efectos biológicos causados por los plaguicidas se inician a través de la interacción fisiológica directa entre el agente y las macromoléculas, como son las enzimas, las membranas, las inmunoglobulinas, los ácidos nucleicos, las citocinas, las proteínas y otras estructuras celulares. Asimismo, los sistemas enzimáticos pueden convertir a los plaguicidas en intermediarios altamente reactivos, metabolitos o productos secundarios, como ERO (O2•, H2O2, •OH) y otros radicales libres, como en el caso del herbicida paraquat (PQ) y el diquat (DQ). La toxicidad del PQ y los biperidilos se debe a que son compuestos capaces de iniciar un proceso cíclico de óxido-reducción, a través de la reducción de un electrón por el nicotinamida adenín dinucleótido fosfato reducido (NADPH; fuente más importante de equivalentes para la reducción intracelular del PQ). De esta manera, se forman radicales libres que donan un electrón a una molécula de O2, produciendo así un O2•. Una vez agotado el NADPH, el O2• reacciona consigo mismo, produciendo al radical hidroxilo (•OH), que es tan dañino que puede llevar a la muerte celular (figura 31-1). La exposición del tejido pulmonar in vivo a PQ y DQ, en un microambiente con altas concentraciones de O2, favorece la generación de las ERO, lo que puede provocar una destrucción masiva del tejido epitelial, el cual es reemplazado por tejido fibroso, causando fibrosis pulmonar, hipoxia y muerte. La lipoperoxidación (LPx) puede ser iniciada por radicales reactivos orgánicos, metabolitos de plaguicidas o bien por la interferencia con mecanismos de defensa, que controlan las reacciones de peroxidación. Las interacciones de las ERO con los constituyentes celulares también generan radicales libres secundarios y terciarios derivados de lípidos, aminoácidos y ácidos nucleicos. La figura 31-2 muestra un esquema del metabolismo de plaguicidas y efectos acumulativos de reactividad. Los insecticidas organoclorados, como el DTT y sus metabolitos p’p-DTT, p’pDDE y p’p-DDD, son capaces de generar ERO y causar muerte celular por apoptosis in vitro en células periféricas mononucleares humanas. Asimismo, un estudio comparativo donde se evaluó la toxicidad del lindano, el DTT, el clordano y el endrin, sobre el daño en el hígado de ratas expuestas a estos agentes, mostró un aumento en la inducción de la LPx de las membranas mitocondriales y microsomales, y el rompimiento de las cadenas simples del DNA. Los insecticidas organofosforados como el etil-clorpirifos, pueden causar LPx y alteración de enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx) en eritrocitos de humanos expuestos y de ratas. El hexaclorobenceno es un fungicida estable capaz de inducir al sistema enzimático de los citocromos P450 y a otras enzimas de conjugación, que provoca daño hepático, interfiere con la biosíntesis de los grupos hemo, causando porfiria cutánea tardía, síndrome de daño hepático y fotosensibilidad. Se ha reportado que el daño hepático causado por la exposición a hexaclorobenceno está relacio-

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PQ

Cit c reductasa

++

[paraquat]

O2

+ O2

PQ

++

+

PQ

H2 O2 + O2

CAT (-e)

OH [Radical hidroxilo]

+

PQ + H 2 O 2

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+ O2 [radical anión superóxido]

[radical del paraquat]

SOD (+e)

•

OH + OH + PQ

+ OH

-

+ O2

[Anión hidroxilo]

++

[Paraquat]

Figura 31-1. La interacción fisiológica de los plaguicidas con macromoléculas favorece la generación de intermediarios reactivos, metabolitos y radicales libres de los plaguicidas.

nado con mecanismos de estrés oxidativo, a través de su capacidad de movilizar al Fe endógeno y por ser metabolizado por los citocromos P450. Asimismo, provoca la inducción de la hemooxigenasa (HO-1) en hígado de ratas, una proteína antioxidante que se induce únicamente en condiciones de estrés oxidativo (véase la sección V, Antioxidantes).

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Dioxinas y solventes (CCl4) Los hidrocarburos policlorados, como las dioxinas (2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-pdioxina, TCDD) son compuestos que se caracterizan por la presencia de átomos de cloro, que sustituyen a los átomos de carbono en los anillos aromáticos y otras estructuras, y son considerados como altamente tóxicos. La estabilidad química y física de los compuestos altamente clorados, así como su lipofilicidad (capacidad de disolverse en lípidos), contribuye a la persistencia y bioacumulación en el medio ambiente. A pesar de que las dioxinas no tienen ningún uso comercial o industrial, se encuentran presentes en el medio ambiente, debido a que son un producto inadvertido de la síntesis de plaguicidas clorofenólicos, blanqueadores clorados y otros procesos industriales (ej. metalúrgica, incineración). El TCDD es un compuesto altamente carcinogénico, cuyo mecanismo de acción involucra la interacción con la proteína receptora intracelular arilo-hidrocarbono para TCDD (Ah TCDD-receptora), que subsecuentemente afecta la transcripción génica, incluyendo genes que codifican para varios de los citocromos P450. Se ha observado que la exposición de animales de laboratorio a concen-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

PLAGUICIDAS

(Capítulo 31)

Metabolitos no tóxicos

Eliminación

Sistema activador del metabolismo celular

Metabolismo reactivos/intermediarios

Unión a macromoléculas celulares (enzimas, membrana, receptores, DNA)

Toxicidad (daño tisular, cáncer, cambios fisiológicos)

Reparación celular (reparación DNA, síntesis de proteínas)

Generación de radicales libres, ERO y ERN Alteraciones y/o químicos en la dieta Enzimas Antioxidantes

Antioxidantes sacrificables

LÍPIDOS

DNA

PROTEÍNAS

Metabolismo celular alterado / daño en organelos

Daño celular

Manifestaciones de daño por radicales libres

Daño oxidativo

Lipoperoxidación

Oxidación de tioles, formación de carbonilos

Depleción de GSH

Peroxidación/ activación/ desactivación

Productos estables de la oxidación proteínica

Daño al DNA

Alteración en la expresión genética

Daño membranal Excreción

Figura 31-2. Representación esquemática del daño tisular inducido por radicales libres de plaguicidas.

traciones altas de TCDD causa LPx, como consecuencia del daño oxidativo celular, mientras que la exposición crónica genera la presencia de aductos de DNA como la 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), en hígados de ratas. El TCDD in vitro e in vivo en roedores, es capaz de generar daño genotóxico en células hepáticas y macrófagos, LPx, aumento en la excreción urinaria de malondialdehído, incremento en la producción de O2• por macrófagos peritoneales y una disminución del contenido de GSH y NADPH en el hígado. El mecanismo plausible causal de estos eventos, así como el potencial carcinogénico del TCDD, es el estrés oxidativo, con una importante participación del Fe como catalizador de ERO y

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daño al DNA. Por lo anterior, se propone la evaluación de este tipo de daño en poblaciones expuestas y así ser considerado como un marcador de riesgo. El tetracloruro de carbono (CCl4) es un líquido incoloro, no hidrosoluble, utilizado en la industria como un disolvente orgánico, para eliminar residuos aceitosos o durante los procesos de lavado de textiles en seco (tintorerías). Permanece ubicuo en el medio ambiente, debido a su alta estabilidad química en la atmósfera (30 a 100 años). El CCl4 fue el primer compuesto para el cual se describió que su toxicidad es mediada por mecanismos que involucran la participación de radicales libres. Estudios realizados en animales de experimentación indican que el primer paso en el metabolismo del CCl4 involucra la formación del radical triclorometil (•CCl3), a través de la vía del citocromo P450 (figura 31-3). El •CCl3 se une directamente a lípidos microsomales y a otras macromoléculas celulares, contribuyendo al rompimiento de la estructura membranal por LPx, a la inactivación de varias enzimas e interrumpiendo los procesos energéticos de la célula y la síntesis de proteínas. El •CCl3 puede también experimentar reacciones anaeróbicas (sin presencia de oxígeno), resultando en la formación de otros compuestos tóxicos como el cloroformo (CHCl3), el hexachloroetano (Cl3CCCl3) y el monóxido de carbono (CO). Durante el metabolismo aeróbico (en presencia de oxígeno), el radical •CCl3 puede producir triclorometanol (Cl3COH), un precursor del fosgeno (COCl2), que es hidrolizado para formar CO2. La alta liposolubilidad del CCl4 le permite atravesar las membranas, lo que favorece que una vez ingerido pueda ser distribuido a todos los órganos, aunque sus efectos tóxicos se manifiestan principalmente en el hígado.

Interacción con macromoleculas celulares

Daño celular CHCl 3

P450 CCl 4

CCl 3

Anaeróbico

Cl CCCl 3 3

Ae

ró

bic

CO + HCOO -

o

Cl 3COH

COCl 2

Figura 31-3. Productos del metabolismo del CCl4.

CO2

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

Contaminantes atmosféricos: dióxidos de nitrógeno, ozono, dióxidos de azufre y partículas atmosféricas El ozono (O3), los dióxidos de nitrógeno (NO2) y de azufre (SO2) y las partículas atmosféricas son contaminantes conocidos por inducir daño oxidativo. Durante la combustión de material orgánico, las emisiones vehiculares, las emisiones de plantas de energía y los procesos de combustión, los átomos de nitrógeno presentes reaccionan con el O2 generando dos radicales: el óxido nítrico (NO•) y el dióxido de nitrógeno (NO2•). Los individuos sanos son capaces de tolerar una exposición corta de hasta 4 ppm de NO2•, sin embargo las personas susceptibles, como los asmáticos, son seriamente afectados desde concentraciones de < 0.3 ppm. El NO2• se disuelve en el agua y forma ácido nítrico (HNO3), que puede irritar el tracto respiratorio, y también ácido nitroso (HNO2), que puede causar mutaciones en el DNA. El NO2• puede iniciar procesos de LPx, al sustraer hidrógenos de ácidos grasos no saturados. Se ha observado un incremento en las concentraciones de etano y dienos exhalados en los pulmones de animales expuestos y en los fluidos corporales de humanos. La ausencia de elementos antioxidantes como la vitamina E, el ascorbato, el ácido úrico y los tioles, como el GSH, agudizan el daño pulmonar por la exposición a NO2•. El O3 es un gas altamente irritante, incoloro y que tiene un olor característico y, a pesar de no ser un radical libre, es altamente oxidante. Se forma a partir de reacciones fotoquímicas (presencia de rayos UV) entre óxidos de nitrógeno e hidrocarburos, que pueden provenir de las emisiones vehiculares. Aun las concentraciones bajas (0.5 ppm) pueden provocar daño pulmonar en unas pocas horas, induciendo inflamación, activación de macrófagos alveolares y reclutamiento de neutrófilos. El O3 es capaz de oxidar a las proteínas mediante el ataque de los grupos sulfidrilo (-SH), así como a los residuos aminoacídicos de tirosina, triptófano, histidina y metionina entre otros. Tanto los lípidos, como las proteínas, pueden ser blancos directos del ataque del O3. Debido a que los fluidos nasales de los humanos son particularmente ricos en uratos, reaccionan rápidamente con el O3 y el NO2•, favoreciendo la irritación nasal. Otro contaminante atmosférico relevante es el SO2, un gas sofocante e incoloro formado por la quema de combustibles que contienen azufre, éste es un agente reductor más que oxidante. Debido a que no tiene electrones despareados, no es un radical libre per se, sin embargo, reacciona con moléculas de H2O, formando sulfito y bisulfito, iones que pueden ser oxidados y generar tanto ERO, como radicales sulfito, sulfato y peroxisulfato, los cuales pueden favorecer el daño pulmonar y la broncoconstricción. Existe una relación entre la contaminación del aire, en especial por la exposición a partículas suspendidas en el aire (PM; por sus siglas en inglés Particulate Matter), y la morbilidad y mortalidad por enfermedades cardiorrespiratorias. Las

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PM son mezclas complejas de compuestos orgánicos e inorgánicos que varían en tamaño, origen y composición. Se han sugerido varios mecanismos de daño, que incluyen desde la capacidad que tienen las PM de causar daño directo a las fuentes intracelulares generadoras de ERO, hasta efectos indirectos debidos a la liberación de mediadores intracelulares. Así como la estimulación de los macrófagos por la deposición de las PM en pulmones (figura 31-4). El componente metálico de las PM es un importante generador de ERO, a través de la reacción de Fenton, contribuyendo así a la generación de estrés oxidativo y daño celular. Se ha reportado una relación entre la citotoxicidad, la formación de malondialdehído (producto de la LPx) y la muerte celular por apoptosis con la expresión de enzimas antioxidantes como catalasa y metalotioneína y el factor de transcripción Nrf-2, que ha sido relacionado con el elemento de respuesta antioxidante en epitelio pulmonar de rata expuesto a PM. Otros estudios en ratas han demostrado que la exposición a 5 horas de PM concentra-

Célula epitelial

Mitocondria Macrófago Citoesqueleto

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TNF ERO

Par ticulas atmosféricas

Señalización MnSOD Citocinas

Citotoxicidad Apoptosis Necrosis

ERO

Figura 31-4. Esquema de los posibles mecanismos de daño activados por la exposición a PM en epitelio pulmonar.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

das genera estrés oxidativo en el pulmón y el corazón, asociado al contenido de metales (Fe, Mn, Cu, Zn), así como un incremento en la actividad de la SOD y la catalasa. La exposición a cenizas, partículas de emisiones de diesel, PM y partículas de cuarzo generan ERO, mediante procesos que involucran la respiración mitocondrial y la activación de enzimas de NAD(P)H, así como el estallido respiratorio y la actividad de las óxido nítrico sintasas (iNOS) en macrófagos y fagocitos. Estos procesos tienen como consecuencia citotoxicidad e inflamación, daño al DNA y estimulación de la proliferación celular.

Radiación La radiación iónica es un evento en el que la energía de un fotón excede la energía necesaria para remover un electrón de una molécula, provocando una coalición molecular que genera la formación de iones. La luz visible y la UV no tienen la energía suficiente para ionizar a la mayoría de las biomoléculas, mientras que los rayos-γ, los rayos X, los electrones de alta energía (partículas β), los neutrones de alta energía o los fragmentos de fisión nuclear y las partículas α (iones He2+) pueden producir radiación ionizante. Cuando la radiación ionizante atraviesa un sistema biológico, la energía no es depositada uniformemente sino en paquetes, los cuales varían en tamaño y pueden contener una o varias moléculas excitadas, iones y electrones, y así favorecer la formación de radicales libres, siendo el más abundante el •OH, que es capaz de interactuar con la mayoría de los componentes celulares, produciendo radicales orgánicos. El DNA es un blanco altamente susceptible de este proceso, se generan rompimientos de cadenas simples y dobles, daño de deoxiribosas y modificaciones de bases. En personas expuestas a radiación, como en el caso de la radioterapia, hay un aumento en la concentración 8-OHdG en el DNA de sus linfocitos y en su orina.

❚ ENFERMEDADES

CRÓNICO DEGENERATIVAS Y CONTAMINACIÓN

Las ERO, las ERN y los radicales libres han sido reportados como participantes o causales de múltiples enfermedades como el cáncer, la diabetes, las afecciones cardiovasculares y respiratorias, la disfunción de la respuesta inmunitaria, la disrupción endócrina, neurológica y del metabolismo. Un exceso en la liberación de iones de metales de transición y proteínas hemo, así como el daño mitocondrial, son algunos de los causales del daño oxidativo y tisular, que promueven el desarrollo de enfermedades.

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Cáncer Es bien sabido que la sobreproducción de ERO y ERN, por un periodo prolongado de tiempo, está relacionada con la carcinogénesis. Esto, vinculado a las mutaciones y la modificación en la expresión génica. El daño a bases del DNA que no es reparado puede resultar en una mutación. Esto, sobretodo si se lleva a cabo la replicación celular previa al proceso de reparación de las bases modificadas. Las ERO pueden dañar directamente al DNA produciendo rompimientos de cadena simples o dobles, modificaciones en purinas, pirimidinas o a la desoxiribosa, y entrecruzamientos (véase el capítulo Daño al DNA). La asociación de la exposición a los compuestos inductores de ERO y daño oxidativo sobre las bases del DNA cobra mayor relevancia en situaciones donde la población está expuesta a contaminantes ambientales como son las partículas atmosféricas ultrafinas (> 0.1 µm). Otro evento importante, que se ha establecido como una de las posibles participantes de la carcinogénesis relacionada con la oxidación de DNA nuclear, es el daño al DNA mitocondrial, mutaciones y alteraciones de la función genómica mitocondrial. Por otro lado, las ERO y el estado redox celular, que puede verse afectado por una baja de los elementos los antioxidantes como GSH, TRx, oxidación de NADPH, modulan las vías de señalización transduccionales relacionadas con la regulación del crecimiento celular, proceso complejo que depende del tipo celular y de la forma del oxidante, así como de la concentración de las ERO. La modificación de la expresión génica por las ERO tiene efectos directos en la proliferación celular y en la muerte por apoptosis, a través de la activación de factores de transcripción. Por ejemplo, se han reportado modificaciones en la expresión de algunos reguladores transcripcionales como c-jun y c-fos, inducida por diversos compuestos promotores de tumores contenidos en los plaguicidas, el CCl4, el pentobarbital, el TCDD, el cadmio, o bien las radiaciones ionizante y el asbesto, a través de la generación de ERO, como se describió anteriormente en este capítulo. Otro evento relacionado con la carcinogénesis y el estrés oxidativo es la disminución de las uniones intercelulares por ERO, como el H2O2, en ocasiones a partir de compuestos como el éster de forbol (PMA) y el promotor tumoral 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), PQ, DTT y CCl4.

Diabetes Mellitus El término diabetes mellitus (DM) describe diferentes trastornos metabólicos que resultan de alteraciones en la secreción de insulina, en la respuesta periférica a la misma o en ambas; lo que conduce a un síndrome caracterizado por hiperglucemia crónica (aumento de azúcar en la sangre) y alteraciones del metabolismo

470

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

de los carbohidratos, las proteínas y los lípidos. La gran mayoría de los casos de DM corresponde a las de tipo 1 y a las de tipo 2. En la DM tipo 1, la característica más relevante es la destrucción de las células β pancreáticas, causando la disminución de la secreción de la insulina; mientras que en la DM tipo 2 se presenta la resistencia de los tejidos periféricos a la acción de la insulina. En personas diabéticas, el exceso de ERO generado puede conducir a un estrés oxidativo y a una disminución en la capacidad antioxidante. Las ERO son generadas como consecuencia de la reacción de las proteínas glicosiladas no enzimáticamente con el oxígeno o por la enolización de la glucosa catalizada por metales de transición, con la subsecuente reducción del oxígeno molecular que da lugar a los cetoaldehídos e intermediarios oxidantes. Además de la glicosilación no enzimática de las proteínas, los factores como la autooxidación de la glucosa, los cambios en el metabolismo energético y en la concentración de mediadores de la inflamación y del estado de las defensas antioxidantes también pueden contribuir a la aparición de estrés oxidativo en la DM. Algunos contaminantes orgánicos como los policlorobifenilos (PCB), el TCDD, los compuestos nitrados como los nitratos, los nitritos, y los compuestos N-nitrosos, así como algunos metaloides del tipo del arsénico, han sido considerados como diabetogénicos, ya que su exposición puede causar efectos sobre la secreción de insulina, el metabolismo de la glucosa, la resistencia a la insulina, el daño pancreático u otros posibles signos de DM (figura 31-5).

Daño a células ßeta, por exceso de ERO

Contaminantes ambientales

Grasa

Daño del transp. de glucosa Resistencia a la insulina

Músculo

Páncreas

Daño del transp. de glucosa Resistencia a la insulina

Hígado Inferencia con metabolismo de glucosa

Figura 31-5. Esquema de la influencia de contaminantes ambientales en el desarrollo de DM.

Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas...

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471

Las ERO son una liga entre la hiperglucemia y los signos fisicopatológicos típicos observados en la DM. La generación de ERO puede inactivar las vías de señalización entre el receptor de insulina y el sistema transportador de glucosa (figura 31-6).

Afecciones cardiovasculares y respiratorias Se ha reportado que las ERO y las ERN juegan un papel importante en el desarrollo y el establecimiento de la hipertensión y la ateroesclerosis. El aumento en la presión vascular, llamado hipertensión, es un factor de riesgo para las enfermedades cardiovasculares, de modo que el incremento en la generación del radical O2• que inactiva al NO•, favoreciendo la formación de ONOO• en las paredes de

As III

Insulina

Glucosa

Receptor Insulina P

P P

P

4 GLUT

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As III PIP 2

P IRS

GLUT4

ERO ERO

PI -3K GLUT4

P PKB/Akt

PIP 3

+

PDK P

GLU T4

Metabolismo de carbohidratos

PKC ,

Figura 31-6. Adipocitos expuestos a arsenicales trivalentes formados durante el metabolismo de As, son capaces de inhibir la entrada de glucosa estimulada por insulina debido a la disminución de la fosforilación de PKB/Akt y/o por la interferencia con la translocación de los transportadores GLUT 4 hacia la membrana plasmática.

472

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

los vasos sanguíneos, contribuyendo a la hipertensión. La susceptibilidad a este padecimiento puede ser debida tanto a factores genéticos, como a la exposición a compuestos tóxicos como el humo del cigarro y partículas suspendidas en el aire, entre otros. Se conoce como ateroesclerosis al engrosamiento del endotelio vascular debido a la acumulación de colesterol, minerales, sangre y células musculares; esta acumulación puede convertirse en placas fibrosas que pueden calcificarse o estimular la muerte celular por necrosis. Dicha acumulación hace que la arteria sea más rígida de lo normal y produce un bloqueo parcial o total de la circulación de sangre. Al igual que en la hipertensión, un aumento en la generación de O2• favorece la formación de ONOO–, el aumento mismo de la generación de ERO y ERN por los macrófagos o los monocitos degenerando el endotelio vascular y favoreciendo la acumulación de lipoproteínas de baja densidad (precursoras de la formación de colesterol) que a su vez son susceptibles de ser oxidadas. La implicación del exceso de O2 se vuelve particularmente importante cuando se trata de las vías respiratorias, esto debido a que los pulmones son órganos que están expuestos a una mayor tensión de O2 y a su gran área de superficie, lo que los hace susceptibles a contaminantes en el aire, particularmente aquellos capaces de generar ERO/ERN. La exposición de los pulmones a elevadas concentraciones de O2 y de contaminantes, favorece la generación intracelular de O2• y H2O2. Otra fuente de ERO en los pulmones es la activación de los fagocitos, tanto macrófagos residentes pulmonares como monocitos y neutrófilos reclutados. La presencia de estas células en los pulmones causa daño al tejido pulmonar y favorece que se presente la condición del síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA). Por otro lado, una activación prolongada de células inmunitarias como son los eosinófilos, también generan un aumento en los niveles de H2O2 y NO•, ya que se ha reportado un aumento en estas ERO/ERN en el aliento de niños asmáticos.

❚ CONCLUSIÓN Mientras que en el caso de algunos compuestos químicos (el CCl4 o la radiación) la generación de ERO y ERN es el mecanismo directo de daño tisular, en otros casos (los plaguicidas o los contaminantes atmosféricos), los compuestos químicos juegan un papel precursor de estas especies. Algunos compuestos químicos como los metales contribuyen a la depleción de elementos de la defensa antioxidante como el glutatión, predisponiendo así al daño oxidativo celular. Existe evidencia de que este daño contribuye de manera parcial o total al desarrollo de enfermedades crónico-degenerativas.

Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas...

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 31)

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S

ECCIÓN

ASPECTOS

VIII.

FISIOLÓGICOS RELACIONADOS A LAS ESPECIES REACTIVAS

32. Estrés oxidativo y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477 33. ERO y señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487

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34. Especies reactivas de oxígeno en las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501 35. Vida animal en ambientes extremos, papel de los radicales libres y los antioxidantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525 36. Estrategias para determinar la relevancia fisiológica de las especies reactivas de oxígeno en animales completos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543

E

32

STRÉS OXIDATIVO Y APOPTOSIS

Erika Olivia Gómez González José Luis Ventura Gallegos Rebeca López Marure María de Jesús Ibarra Sánchez Alejandro Zentella Dehesa

La muerte celular y el estrés oxidativo han estado relacionados desde el momento en que fue posible evaluar la presencia de metabolitos oxidados. Sin embargo, a pesar de que existen múltiples estudios, ha resultado difícil definir el papel que juega el estrés oxidativo en el proceso de muerte y así poder distinguir cuándo es causa y cuándo consecuencia de la muerte celular. El estrés oxidativo ahora se reconoce como disparador de la muerte celular, en particular la muerte por apotosis. En algunos casos incluso, ha mostrado ser un elemento indispensable durante la fase de activación del programa de muerte. En especial, los sistemas que generan óxido nítrico (NO•) y las NADPH oxidasa que generan superóxido (O2•) y peróxido de hidrógeno (H2O2), forman parte del repertorio de señales responsables de iniciar y/o modular positivamente la activación de diversos procesos de muerte celular fisiológica y de la apoptosis. Sin embargo, aún se desconoce mucho sobre las reacciones específicas de oxidación implicadas y sobre los sustratos oxidados que participan en las vías de señalización que activan la apoptosis.

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❚ INTRODUCCIÓN

❚ 477 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ ESTRÉS

(Capítulo 32)

OXIDATIVO Y MUERTE CELULAR

La muerte de células, tejidos y órganos en sitios y momentos específicos a lo largo de la ontogenia de los vertebrados ha sido documentada cuidadosamente por estudios embriológicos desde hace más de 150 años. En muchos de estos casos se ha reconocido una estrecha relación entre la muerte celular y la aparición de evidencias bioquímicas de estrés oxidativo, que van desde la presencia de especies que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARs) hasta la detección de aductos oxidados de DNA como la 8-hidroxi-2, desoxi-guanina (8-OHdG). Pero la relación entre el estrés oxidativo y la muerte celular por apoptosis tardó en establecerse, en parte porque la apoptosis apenas cobró vida durante el último cuarto del siglo XX y además porque el gran desarrollo de la bioenergética durante la segunda mitad del siglo XX ha permitido explicar al estrés oxidativo como una consecuencia de la muerte celular. Nuestro conocimiento de la bioenergética reconoce que una célula sana mantiene ambientes oxidantes y reductores separados dentro de la célula. Por un lado, la célula realiza múltiples reacciones de oxidación de sustratos asociadas al ciclo de Krebs, al del glioxalato o la oxidación de xenobióticos por citocromos P450, mismas que se realizan dentro de compartimentos subcelulares como la matriz mitocondrial, la matriz del peroxisomal o dentro de la luz del retículo endoplasmático. Por el otro lado, la célula mantiene un ambiente reductor del citoplasma, gracias a la actividad de la vía de las pentosas. Bajo esta perspectiva, el estrés oxidativo es un resultado natural que se presenta en la interfase de estos dos compartimentos, por ejemplo cuando la ubiquinona, en lugar de ceder sus electrones a los componentes de la cadena respiratoria, los cede al oxígeno en forma prematura generando superóxido (véase el capítulo Cadena respiratoria). Si la célula pierde el control sobre esta compartamentalización o no produce suficiente poder reductor, los procesos oxidativos se salen de regulación generando estrés oxidativo, que de no ser neutralizado, conduce a un incremento de especies reactivas de oxígeno (ERO), metabolitos y moléculas oxidadas e inevitablemente la célula muere por necrosis. Siguiendo este razonamiento, se dio por un hecho que el estrés oxidativo asociado a la muerte es una consecuencia inevitable y tardía de la muerte celular que resulta de la perdida de control de procesos oxidantes como las cadenas de transporte de electrones. Esta visión se fortaleció con una gran variedad de estudios in vivo e in vitro que analizaron la relación entre estrés oxidativo y muerte celular por necrosis.

Estrés oxidativo y apoptosis

❚ NECROSIS

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479

VERSUS APOPTOSIS

El primer proceso de muerte celular descrito tanto a nivel histológico como bioquímico, fue la necrosis. La necrosis suele presentarse como consecuencia de eventos accidentales o patológicos como traumatismos, intoxicación o isquemia, entre otros; y se caracteriza por la pérdida de la organización del citoesqueleto, del tráfico vesicular y de los procesos biosintéticos y de generación de energía. Todo esto resulta en la pérdida de la organización subcelular, hinchamiento y eventual ruptura de la membrana, con el consecuente vaciamiento del contenido intracelular al medio intersticial. El hecho de que el contenido celular esté fuera de la célula induce la activación de una respuesta inflamatoria como un efecto secundario a la exposición de antígenos intracelulares, lo cual suele producir un mayor grado de destrucción tisular. En contraste con la necrosis, durante la muerte celular por apoptosis la célula participa activamente encendiendo una cascada secuencial de endopeptidasas (enzimas que degradan las proteínas celulares) de la familia de caspasas (cistein aspartic acid endopeptidases). Son muchas las diferencias histológicas y bioquímicas que se dan entre necrosis y apoptosis, en el cuadro 32-1 se listan algunas de las diferencias más sobresalientes, incluyendo su relación con el estrés oxidativo.

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Cuadro 32-1. Comparación entre apoptosis y necrosis DNA Núcleo Integridad de la membrana Inflamación asociada Cambios de volumen celular Fragmentación celular

Activación de caspasas Fosfatidil serina en la membrana celular externa Estrés oxidativo asociado

Apoptosis Fragmentación internucleosomal, patrón de escalera Marginación de la cromatina Se preserva No hay Se reduce, “encogimiento” Presente con la formación de “cuerpos apoptóticos”

Necrosis Degradación inespecífica, apariencia de “barrido” Pinosis Se pierde Asociada con frecuencia Aumento, “hinchamiento” u “oncosis” No. Hay lisis celular

Sí

No

Sí

No

Como elemento causal: NO•, O2•, H2O2

Como consecuencia de la muerte: peróxidos

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 32)

La perspectiva catastrofista del proceso de muerte celular cambió en el decenio de 1970-79 con el trabajo de Kerr, Wyllie y Curri que postularon la existencia de un proceso fisiológico de muerte celular bien organizado, al que dieron el nombre de apoptosis (del griego: marchitar de una flor) mismo que quedó definido con base en sus características histológicas que lo distinguen de la necrosis. Las evidencias de un control genético de la apoptosis fueron aportadas por los estudios realizados por Horowitz, Yuan y Hengartner durante el decenio de 198089 con el nematodo Caenorhabditis elegans, donde demostraron de manera incontrovertible que la apotosis es un proceso de muerte controlado activamente por la célula y que resulta de la expresión de genes proapotóticos como ced-3 (miembro de la familia de las caspasas) y antiapoptóticos como ced-9 (miembro de la familia de Bcl-2). La primera correlación entre el estrés oxidativo y la apoptosis se evidenció por una variedad de estudios de expresión de los miembros de esta familia de Bcl-2 iniciados por Korsmeyer en el decenio de 1990-91. Estos estudios mostraron que Bcl-2, y otros miembros de la familia como Bcl-XL, no sólo interfieren con la apoptosis, sino que además inducen mecanismos celulares que neutralizan el daño oxidativo, sugiriendo la existencia de una relación entre estrés oxidativo y apoptosis. No obstante, esta visión ha cambiado al reconocer que la apoptosis de algunas neuronas, en particular la que es inducida por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), requiere de la producción de estrés oxidativo durante etapas tempranas de su activación. En la producción de este tipo de estrés oxidativo, las NADPH oxidasas parecen jugar un papel central. Estudios posteriores han corroborado que la muerte por apoptosis es un proceso con un alto grado de organización y control metabólico, que permite explicar fenómenos como la reabsorción, la involución o la regresión de órganos y tejidos, como la que ocurre con los conductos Müllerianos en los machos durante la organogénesis de los órganos reproductores en los vertebrados. A la luz de toda esta información, es necesario reconsiderar la relación entre el estrés oxidativo y la muerte celular por apoptosis, y reconocer que si bien el estrés oxidativo con mucha frecuencia es una consecuencia de la muerte, también puede fungir como una causa actuando como una señal intra o extracelular celular temprana que activa el proceso de la muerte celular por apoptosis.

❚ LA APOPTOSIS COMO UN MECANISMO DE SELECCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS La selección negativa de células se presenta en etapas posteriores al desarrollo, y depende de la activación de un programa de muerte que hasta este momento se encontraba apagado. Durante dicho mecanismo, en vez de factores tróficos, lo que hay son factores proapoptóticos como el TNF-α, el ligando de FAS o CD95,

Estrés oxidativo y apoptosis

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481

puesto que lo que se trata es inducir la apoptosis en las células que por algún motivo fisiológico deben desaparecer. La figura 32-1 presenta en forma esquemática el progreso de la apoptosis que se inicia con la activación de receptores, como el del factor de necrosis tumoral (TNF-α) o el CD95/FAS. El proceso comienza con la formación de complejos multiproteínicos como el denominado DISC (Death Inducing Signaling Complex) para el caso del receptor de TNF. Estos complejos se caracterizan por el reclutamiento de proteínas acopladoras que presentan dominios de interacción proteínica denominados dominios de muerte, por haber sido identificados en esta vía. Estas proteínas incluyen dos isoformas de la proteína con dominios de muerte asociada al receptor de TNF (TRADD 1 y 2) o la proteína con dominios de muerte asociada a FAS (FADD). A este grupo se suman otras proteínas como la cinasa RIP y el zimógeno de la caspasa 8 denominado originalmente FLICE. Mientras que a partir de RIP se desencadenan vías de transducción que llevan a la activación del sistema NF-kB, la activación del zimógeno (proteína no madura) de la caspasa 8 activa propiamente al proceso de muerte celular por apoptosis. La forma activa de la caspasa 8 procesa a más zimógenos de la misma caspasa

TNF

Esfingomielina

Receptor de TNF Inhibidor del

TRADD Bid

Bid

activo

inactivo

ERO

se

ca

FADD

in

tr

ín

Zim Casp8

Vía extrínseca

Zim

ía

Citocromo c = APAF 2

V

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Ceramida

DISC

receptor de TNF

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Esfingomielinasa

Casp8

Casp 9

APAF 1

Mitocondria APAF 2 Casp9 ERO

Bcl-2

IAPS

Apoptosoma Procesamiento proteínico Casp3 Zim

Fragmentación de DNA

Casp 3

Exposición de fosfatidilserina

ERO

Figura 32-1. Esquema que muestra el progreso de la apoptosis.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 32)

promoviendo su maduración y amplificando la señal. El sustrato proteínico de la caspasa 8 mejor estudiado es la proteína Bid, que al ser escindida genera un péptido que se une a la membrana externa de la mitocondria. La unión de Bid a receptores específicos sobre la membrana mitocondrial provoca importantes cambios en la estructura de la membrana interna y de sus crestas. El cambio más relevante inducido por Bid es la activación del poro de transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, que además de inducir una despolarización transitoria de la membrana interna, permite la salida de citocromo c del espacio intermembranal. El citocromo c liberado, actúa con el factor activador de la apoptosis tipo 2 (APAF2) que unido a APAF1 y al zimógeno de la caspasa 9 procesan y activan a la misma caspasa 9. Ésta a su vez activa al zimógeno de las caspasa 3 activando así al último eslabón en la cascada de endopeptidasas. A partir de esta actividad se inician los cambios en la fisiología celular característicos de la apoptosis descritos en el cuadro 32-1.

TNF, ceramida y estrés oxidativo Como se ha mencionado, existen evidencias de que el estrés oxidativo es un elemento en la señalización temprana de la apoptosis. Durante la inducción de la apoptosis en respuesta al TNF se ha encontrado la presencia de especies moleculares con electrones desapareados que indican un incremento de la tención oxidativa; mientras que la presencia de agentes antioxidantes, agentes reductores o atrapadores de electrones confiere una protección limitada en contra de la muerte celular inducida por el TNF. Sin embargo, lo más importante es que la presencia de estos compuestos retrasa el avance del la apoptosis, siempre y cuando estos compuestos estén presentes antes o al mismo tiempo de añadir el TNF. La adición de estos compuestos 60 minutos después de activar al receptor de TNF, carece de un efecto protector y la apoptosis procede con la misma velocidad a la que avanza en células control que no fueron tratadas con estos compuestos. La existencia de un proceso de estrés oxidativo durante las etapas tempranas de la apoptosis inducida por el TNF ha sido reforzada por el efecto protector enzimas antioxidantes presentes en el medio de cultivo como la catalasa, la superóxido dismutasa o una combinación de ambas. Cabe resaltar que en todos estos casos la presencia de agentes reductores, atrapadores de electrones y enzimas detoxificantes de H2O2 y de O2• sólo retrasa la apoptosis sugiriendo que el estrés oxidativo es un componente temprano, pero, que no es el único y que su anulación no es suficiente para interferir con la apoptosis inducida por el TNF. En este fenómeno, también se activa una esfingomielinasa ácida del retículo endoplasmático, responsable de liberar ceramida al citoplasma y contribuir a la apoptosis. De hecho, la mera adición de ceramida a las células sensibles al TNF, no sólo induce la muerte celular

Estrés oxidativo y apoptosis

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sino que también induce estrés oxidativo. Tanto compuestos antioxidantes, como reductores o atrapadores de electrones retrasan la muerte inducida por la ceramida, en forma semejante a lo que ocurre con el TNF. A pesar de toda esta evidencia indirecta, aún no ha sido posible determinar el origen del estrés oxidativo inducido por el TNF o por la ceramida.

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Desde la caracterización inicial de los genes que controlan la apoptosis en el nematodo Caenorhabditis elegans por el grupo de Horowitz, además de los genes inductores de apoptosis como ced3, también se identificaron genes como ced9 cuya actividad interfiere con este tipo de muerte. El primer gen de mamíferos identificado como ortólogo de ced-9 fue encontrado en un modelo de desarrollo de leucemias de células B (B-cell leucemia gene 2: Bcl-2). Mientras que en el nematodo existe un solo gen con actividad antiapoptótica, en mamíferos se identificaron dos familias representadas por Bcl-2 y por Bax, que tienen efectos antagónicos. Por un lado, Bcl-2 previene el desarrollo de la apoptosis, mientras que Bax la induce. Pero el efecto protector de Bcl-2 va más allá de interferir con la muerte por apoptosis ya que además se asocia a una mayor resistencia a la muerte inducida por una variedad de agentes que inducen estrés oxidativo como el paraquat, el H2O2 o el O2• entre otros. Estos efectos de Bcl-2 fortalecen la idea de que el estrés oxidativo es un componente importante durante la fase de activación de la apoptosis. Bcl-2 es una proteína pequeña con capacidad de formar homo y heterodímeros tanto con otros miembros de la familia de Bcl-2 como con miembros de la familia antagónica Bax. El efecto protector o inductor de apoptosis depende de la titulación entre miembros de ambas familias, así, por ejemplo, un exceso de proteínas Bcl-2 sobre Bax resulta en un incremento del número de homodímeros Bcl-2/Bcl-2 y tiene un efecto antiapoptótico. Cuando el número de monómeros de Bax se incrementa, se forman heterodímeros Bcl-2/Bax y se induce un efecto proapoptótico. A pesar de múltiples estudios, no se ha podido demostrar que en este equilibrio entre homo y heterodímeros participe alguna reacción de oxidorreducción que permitiera explicar el efecto protector contra el estrés oxidativo que confiere la sobreexpresión de Bcl-2 y otros miembros de esta familia como Bcl-X largo (Bcl-XL). Hasta ahora se han propuesto tres teorías para explicar la protección inducida por Bcl-2:

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Bcl-2, apoptosis y estrés oxidativo

1. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir la expresión de mecanismos antioxidantes.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 32)

2. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir un estado prooxidante en la células, sirviendo así como una vacuna que prepara a las células para contender mejor con un estrés oxidativo más intenso. 3. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir la expresión de enzimas que reparan el daño oxidativo. Cualquiera que sea el mecanismo, está claro que Bcl-2 neutraliza el daño generado por el estrés oxidativo y que su efecto protector de muerte se extiende más allá de la apoptosis.

❚ LA APOPTOSIS

COMO UN MECANISMO DE SELECCIÓN POSITIVA DE CÉLULAS

Este fenómeno corresponde a la muerte celular por apoptosis que se presenta durante el desarrollo, donde el programa de muerte y la cascada de caspasas se encuentran constitutivamente activa. En este caso, la presencia de factores de supervivencia o factores tróficos interfieren con la ejecución del programa y por tanto se interrumpe la cascada de activación de caspasas. Tal es el caso de la sinaptogénesis, donde los factores tróficos como el NGF (factor de crecimiento neuronal) secretado por la neuronas blanco, guían a las dendritas que deben establecer una sinápsis funcional. Toda neurona que se aleje del área de influencia del factor trófico generado por la neurona blanco muere, mientras que aquéllas que se le acercan sobreviven. Una vez establecida la sinapsis, el programa de muerte se desactiva y por ende desaparece el mecanismo que induce la muerte.

Apoptosis neuronal y estrés oxidativo En nemátodos el programa de muerte por apoptosis parece estar encendido en forma constitutiva en aquellas células programadas para morir. La muerte de neuronas durante la sinaptogénesis se encuentra en una situación similar, ya que en este caso es la presencia de supervivencia, también denominados factores tróficos, la que interrumpe el progreso del programa de muerte. Una sobre estimulación neuronal también puede evocar la muerte por apoptosis, a este fenómeno se le conoce como excitotoxicidad. Un caso particular de muerte neuronal por excitotoxicidad se presenta in vitro al despolarizar a las neuronas granulares del cerebelo con un pulso de potasio (K+). Este estímulo activa un proceso apoptótico en el que participa una cascada de caspasas y por tanto puede detenerse por medio de inhibidores de caspasas. Sin embrago, duran-

Estrés oxidativo y apoptosis

•

485

te las etapas tempranas de este proceso de apoptosis se ha podido documentar un incremento transitorio de estrés oxidativo asociado al O2• y no a la producción de H2O2. Aún es controversial la fuente de este estrés oxidativo, pero es claro que juega un papel activador de la muerte por apoptosis, ya que al interferir con el estrés oxidativo en etapas tempranas, la activación posterior de caspasas no se presenta. Estas observaciones apoyan la idea de que el estrés oxidativo generado en respuesta a la despolarización es un paso indispensable en la activación del proceso apoptótico.

❚ CONCLUSIONES Como hemos visto el estudio de la relación entre el estrés oxidativo y la apoptosis ha evolucionado. En un inicio se tenía una visión catastrofista en la que el estrés oxidativo era una consecuencia terminal de la pérdida de control de los procesos oxidativos en una célula que muere. Hoy en día, ha quedado claro que existen formas de estrés oxidativo que participan en etapas muy tempranas de la señalización que conduce a la activación de la apoptosis. Este pequeño cambio de posición, del final al principio del proceso de muerte, marca sólo el principio, ya que aún quedan muchas preguntas por resolver como son:

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1. ¿Cuál es la naturaleza bioquímica de las especies reactivas? 2. ¿Cuál es la fuente de los electrones? 3. ¿Cómo se activan estos procesos oxidantes? 4. ¿Cuáles son los blancos sensibles al estrés oxidativo? En cualquier caso, es claro que el estrés oxidativo forma parte de la secuencia de eventos tempranos de la vía de activación de la apoptosis.

33

E

RO Y SEÑALIZACIÓN

Luis Enrique Gómez Quiroz Deidry Beatriz Cuevas Bahena

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❚ INTRODUCCIÓN La definición de los segundos mensajeros es que se generan en el momento en que se activa un receptor, son de corta vida, y actúan específicamente sobre las moléculas efectoras. Para poder clasificar a las especies reactivas de oxígeno (ERO) como segundos mensajeros, habrá que verificar si cumplen con la definición antes expuesta. Las ERO pueden generarse en el momento de la activación del receptor y son también de muy corta vida, sin embargo, es aún difícil demostrar su especificidad. Como se ha venido explicando, el •OH reacciona prácticamente con cualquier molécula con la que se encuentra, por lo que no se puede hablar sobre especificidad en la reacción de este radical libre, por otro lado, las moléculas como el peróxido de hidrógeno (H2O2) o el radical superóxido (O2•) no son tan reactivas como el •OH, y pueden ser producidas de manera endógena por la activación de receptores, y controladas enzimáticamente, por lo que cada vez más se les reconoce como segundos mensajeros. De lo anterior se infiere que las ERO, incluso en situaciones de estrés oxidativo, así como las especies reactivas de nitrógeno (ERN), no son del todo negativas para la célula si su producción es generada bajo condiciones controladas de concentración y tiempo. ❚ 487 ❚

488

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ LA NADPH

(Capítulo 33)

OXIDASA Y LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES

En los últimos años se ha reunido evidencia de que varios factores de crecimiento y citocinas generan la producción de ERO como intermediarias en la señalización. El factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento neuronal (NGF), el factor transformador de crecimiento beta (TGF-β), entre otros, están relacionados estrechamente con la generación de ERO para fines de transducción de señales. Se ha sugerido que estos receptores emplean a la enzima NADPH oxidasa (NOX) para la producción de las ERO. La NOX cataliza la reducción del oxígeno a O2•, reacción mediada por el NADPH. La enzima es un complejo multiproteínico que contiene proteínas citosólicas como la p67PHOX, la p47PHOX, la p40PHOX y la GTPasa Rac, que se translocan a la membrana para unirse a la subunidad gp91. La regulación de la actividad de la enzima está estrechamente vinculada a la actividad de Rac, se ha reportado que varios factores de crecimiento inducen la expresión de Rac, aunque también pueden existir una interacción directa entre la oxidasa y los receptores a estos factores de crecimiento (véase el capítulo NADPH oxidasa). Además de jugar un papel central en las células fagocíticas durante el control de las infecciones microbianas, la NOX no fagocítica tiene cada vez un papel más claro en la transducción de señales, las cuales son fundamentales en células como los hepatocitos, los espermatozoides, los fibroblastos, los cardiomiocitos, las células endoteliales, entre otras. Algunos estudios recientes han mostrado que el empleo de inhibidores de la NOX, como el DPI o el AEBSF, bloquean la producción de las ERO y la transducción de señales. El empleo de estos compuestos, por ejemplo, anuló completamente la apoptosis inducida por el TGF-β en hepatocitos fetales de rata, lo que sugiere que la actividad de la NOX es fundamental en la transducción de la señal.

❚ PROTEÍNAS

SENSORAS DE LAS

ERO

El conocimiento de que las ERO regulan una gran cantidad de actividades celulares no es reciente, sin embargo aún no se conoce completamente como se lleva a cabo el mecanismo de regulación. En los últimos años se ha investigado el papel de los grupos tioles (-SH) de los residuos de cisteína en el control de la señal. La oxidación de estos grupos reactivos en varias proteínas de las rutas de señalización ha pasado a ser el foco de atención en este mecanismo. Estos grupos pueden ser oxidados fácilmente, lo que hace presumir que los sensores de las ERO deben ser proteínas con tioles altamente reactivos. Se han propuesto a varias proteínas como sensoras de estrés oxidativo, como son las proteínas cinasas C,

ERO y señalización

•

489

específicamente la isoforma α (PKC-α), que son activadas rápidamente en presencia de H2O2 en un proceso independiente de fosfolípidos, que involucra la fosforilación de una tirosina en el sitio activo. Algunas otras proteínas que se han sugerido fuertemente como sensores de ERO son, por citar sólo algunas, MEKK1, JNK, Akt, IKK, SAPK, p53, ASK1, entre otras. De manera general, la activación de las rutas de señalización por las ERO requiere de la activación directa de las proteínas sensoras por los radicales libres. Una vez activadas, ellas son las que transducen la señal a otras proteínas en la cascada de señalización o activan directamente a los factores de transcripción que regularán la transcripción de los genes blanco (figura 33-1). Se han identificado al menos tres mecanismos mediante los cuales los fenómenos oxidativos pueden regular la función de una proteína. El primero de ellos se presenta por medio de la oxidación de una cisteína en el dominio de unión al DNA de un factor de trascripción. Esta modificación en la proteína genera pérdida en la afinidad de unión a su elemento de respuesta, lo que origina una deficiencia en la transcripción de los genes blanco (figura 33-2A).

Mitocondria

Receptores de factores de crecimiento(TGF, TNF,PDGF, EGF)

Radiaciones

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ERO

Sensores

Factores de transcripción

Cinasas

Factores de transcripción

Transcripción

Figura 33-1. Cascada de señalización que activa a los factores de transcripción.

•

490

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 33)

A SH

S-Ox Inactivación

SH

S-Ox

B Inactivación

S SH

S

SH

C Activación

Figura 33-2. Mecanismos de regulación dados por los fenómenos oxidativos. A) Oxidación de una cisteína en el dominio de unión al DNA de un factor de trascripción. B) Oxidación de cisteínas en el centro catalítico del factor de transcripción. C) Inactivación de los inhibidores que retienen al factor de transcripción.

Otro mecanismo es mediante la oxidación de cisteínas en el centro catalítico, que deriva en pérdida de la funcionalidad de la proteína. Este es el caso de algunas cinasas y fosfatasas, que se explicará en detalle más adelante (figura 33-2B). Estos mecanismo regulan negativamente la función de las proteínas, pero también existe un mecanismo de regulación positiva que involucra la oxidación de cisteínas y la formación de puentes disulfuro en proteínas inhibidoras asociadas a factores de transcripción o enzimas. Al inactivar a los inhibidores se permite la liberación de la enzima y su activación (figura 33-2C).

❚ FOSFATASAS COMO EJEMPLO DE REGULACIÓN REDOX EN LAS CASCADAS SE SEÑALIZACIÓN Las reacciones de fosforilación y desfosforilación son, tal vez, el principal mecanismo de transducción de señales dentro de la célula. La fosforilación de residuos de tirosina en las proteínas se lleva a cabo por las tirosina cinasas, mientras que la reacción inversa (la desfosforilación), la llevan a cabo las tirosina fosfatasas. El conocimiento de que las fosfatasas son reguladas por reacciones de oxidación va tomando cada vez más relevancia en diversos estudios de señalización celular.

ERO y señalización

A

Activa

Inactiva

Enzima

Enzima

S-

Inactiva

S - OH

B

491

Inactiva

Enzima

x

•

Enzima

x

S - O2 H

S - O3 H

OH HO

S

C

O

=

C

=

C

C

N

C

N Cis 215

C

O

C

N Ser 216

C

C

N

O Ser 216

C

IIIIII

O N

H His 214 N

S

N C=

Acido Sulfenico

C= O Cis 215

Sulfenilamida N

HO

C

X C

N S

X: C

C =

C

C

S C

C

Ser 216 C

N

Cis 215

C

C C

II

= O

N

O H N

N

=

O

Cis 215

O

N Ser 216

C

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O Sulfenilamida

Figura 33-3. Modificaciones oxidativas de cisteínas en centros catalíticos. A) Oxidación del anión tiolato. Ácido sulfénico (-S-OH); ácido sulfínico (-S-O2H) y ácido sulfónico (-S-O3H). B) Oxidación de la cisteína catalítica de la fosfatasa PTP1B. En su estado de menor oxidación o de ácido sulfénico, el sulfuro reacciona con un nitrógeno de una serina vecina formando sulfanilamida o sulfenamida. C) La sulfanilamida se transforma directamente o vía ácido sulfénico a su forma activa de anión tiolato.

Bajo condiciones fisiológicas, las cisteínas en el centro catalítico de las fosfatasas tienen un pKa bajo y se encuentran en un estado de anión tiolato (-S-), lo cual las hace altamente susceptibles de ser oxidadas. La oxidación de estas cisteínas bloquea la actividad de la enzima, lo que origina la pérdida de la capacidad de remover fosfatos, ya que la catálisis está mediada por la transferencia del fosfato del sustrato a la cisteína catalítica, seguida de una hidrólisis del fosfato.

492

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 33)

Experimentalmente se ha observado que las concentraciones fisiológicas de H2O2 pueden generar la oxidación del anión tiolato produciendo un residuo de ácido sulfénico (-S-OH). Esta modificación puede ser reversible por agentes reductores como el glutatión (GSH) sin embargo, bajo estrés oxidativo, el ácido sulfénico puede ser oxidado aún más para generar los ácidos sulfínico (-S-O2H) y sulfónico (-S-O3H), estas modificaciones son irreversibles, por lo que la enzima queda completamente inhibida (figura 33-3A). Existe otra reacción de oxidación en la cisteína catalítica; se ha observado en la fosfatasa PTP1B, que en su estado de menor oxidación o de ácido sulfénico, el sulfuro reacciona con un nitrógeno de una serina vecina formando una estructura cíclica de 5 miembros conocida como sulfanilamida o sulfenamida (figura 33-2B). La formación de esta especie es muy rápida y se ha observado que en dicho estado ya no puede sufrir más oxidaciones. Lo interesante de este intermediario es que, a diferencia de los ácidos sulfínico y sulfónico, puede ser transformado directa o indirectamente, vía ácido sulfénico, a su forma activa anión tiolato (figura 33-3A y 333C). Esta reacción se puede llevar a acabo por nucleófilos como el GSH, el cual puede conjugarse en un intermediario S-glutationilato, el cual puede ser reducido a tiolato por otros agentes reductores. Este mecanismo puede representar una forma de estabilización de las fosfatasas ante condiciones de estrés oxidativo.

❚ FACTORES

DE TRANSCRIPCIÓN QUE RESPONDEN A LAS

ERO

A mediados del decenio de 1980-89, se observó que el H2O2 promueve rápidamente la síntesis de aproximadamente 30 proteínas, de las cuales casi la mitad se expresaban en menos de 10 min. Más tarde se descubrió en bacterias, que la mayoría de ellas eran reguladas por una proteína conocida ahora como OxyR, la cual es un factor de transcripción perteneciente a la familia de las LysR. OxyR puede existir en dos versiones: reducida y oxidada, y es esta última la encargada de activar la transcripción. En los mamíferos aún no se ha encontrado un homólogo de OxyR, y la identificación de proteínas sensoras ha sido una tarea difícil y controversial. Aunque se sabe con mucha certidumbre que varios factores de transcripción en los mamíferos responden de manera similar a OxyR, entre los que podemos destacar a los factores AP1, NF-κB y Nrf2.

AP1 La proteína Activadora 1 (AP1) es un término que se aplica en realidad a toda una familia de factores de transcripción que poseen dominios básicos de cierre de

ERO y señalización

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leucina (bZIP). La familia se compone principalmente de c-Fos, FosB, Fra1, Fra2, c-Jun, JunB,JunD, entre otras. La AP1 se une a una secuencia consenso o elemento de respuesta en el DNA llamada TRE ( Elemento de respuesta al 12-O-tetradecanoil forbol-13- acetato, TPA). Para tener un factor de transcripción activo se requiere que se dimerisen dos miembros de la familia, pueden exisitir varias combinaciones entre las proteínas, sin embargo el dímero más común es el formado por c-Fos y c-Jun. Tomando como ejemplo al heterodímero Fos/Jun, la activación de AP1 se realiza por un proceso dependiente de la fosforilación de la subunidad c-Jun por la cinasa JNK, la cual es activada en citoplasma y translocada al núcleo donde fosforila a c-Jun, que una vez fosforilado se une a c-Fos y el dímero, a su vez, se une a la secuencia regulatoria de los genes blanco. La lista de los genes que se encuentran regulados por AP1 es amplia, y destacan los que codifican para la colágena, la ciclina D, y las citocinas TGFβ, IL-8, TNF-α, entre muchos otros más. Lo que hace que AP1 sea un factor de transcripción de suma importancia para el buen funcionamiento de un organismo, ya que regula básicamente procesos de proliferación, reparación, fase aguda hepática e inflamación. Si bien AP1 puede ser activado por proteínas de la cascada de señalización de las MAPK, de la cual varios de sus miembros se han propuesto como sensores de ERO, existe evidencia de que puede ser activado directamente por modificación en el estado de oxidación de ciertas cisteínas. Por ejemplo, la sustitución de la cisteína 154 en Fos o de la cisteína 272 en Jun por una serina, genera la perdida de la regulación redox de AP1 y de su unión al DNA, lo que representa una regulación negativa de la actividad de AP1 por las ERO dentro del núcleo.

NF-κB El factor nuclear κB (NF-κB) es por mucho el factor de transcripción regulado por radicales libres más estudiado. NF-κB fue identificado en 1986 como un factor de transcripción que se une a un elemento de respuesta en el promotor del gen de la cadena ligera de la inmunoglobulina κ de las células B. Originalmente se pensó que era específico de este tipo celular, pero ahora se sabe que está presente en prácticamente todos los tipos celulares y es capaz de regular fenómenos tanto proliferativos como de apoptosis. El NF-κB bajo condiciones basales se encuentra en el citoplasma, formado por dímeros que resultan de la combinación de proteínas de la familia Rel. En los mamíferos se han identificado 5 miembros de esta familia: p65 (o Rel A), c-Rel, RelB, p52 (y su precursor p100), p50 (y su precursor p105). El dominio Rel, común en todos ellos, se compone de tres regiones funcionales: dominio de dime-

494

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 33)

rización, dominio de localización nuclear y dominio de unión al DNA; dentro de este último, y en el caso de p50, se encuentra la cisteína 62 la cual es crítica para la regulación de unión al DNA mediada por ERO. Si bien todos los miembros de la familia Rel pueden formar homodímeros entre sí (excepto RelB), la forma más abundante es el heterodímero p65/p50, el cual se une con mayor afinidad a secuencia general GGGRNNYYCC, donde R es una purina, Y es una pirimidina y N cualquier otro nucleótido. Se sabe, por estudios en animales mutados, que no todos los NF-κB ejercen la misma función, de hecho sólo p65 es esencial para la sobrevivencia. El factor NF-κB se mantiene en el citoplasma, de manera inactiva, formando un complejo inhibitorio con la proteína IκB. Las IκB son proteínas ricas en repeticiones de ankirina que se unen al dímero del NF-κB y enmascaran su secuencia de localización nuclear. Se han identificado varios miembros de esta familia que incluyen a la IκB-α, -β, -ε, -δ, y Bcl-3. La interacción entre el NF-κB y la proteína IκB se rompe cuando se recibe un estímulo que permite la fosforilación del IκB, normalmente esta señal proveniene de la cinasa específica del NF-κB (IKK); la fosforilación del IkB permite su ubiquitinación en residuos de serina y treonina y su posterior degradación por el proteosoma 26S. Una vez liberado de IκB, el factor NF-κB se transloca al núcleo donde se une a su secuencia regulatoria y estiNADPH oxidasa

Receptores

Mitocondria NIK

MEKK1

ERO Src Ikk

PKC p65 p50

-UB

p65 p50

P

-UB

B B-U

-U

P -UB-UB-UB-UB

p65 p50 26S

Degradación

p65 p50

κB

Núcleo

Figura 33-4. Esquema general de la activación del NF-κB.

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ERO y señalización

•

495

mula la expresión de los genes blanco que dirige, incluyendo la síntesis de IκB-α y β, los cuales ayudan a terminar la respuesta por la formación de un nuevo complejo inactivo IκB/NF-κB que lo exporta al citoplasma. Se han identificado una gran cantidad de genes que son regulados por este factor de transcripción, entre los cuales se encuentran citocinas y factores de crecimiento (IL-2, IL-8, IL-6, IFN-γ, TNF-α), receptores inmunológicos (Fas, MHC clase I ), moléculas de adhesión (E-selectina, I-CAM), óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), proteínas antiapoptóticas (Bcl-xL, Bcl-2, c-IAP, entre otras), entre muchas otras más. Varios receptores de citocinas y factores de crecimiento inducen la activación del NF-κB, no sólo por su ruta canónica mediada por la IKK sino también por medio de las MAPK cinasas, particularmente por la JNK y p38. JNK activa coordinadamente a la IKK e induce la fosforilación de los residuos de serina del IκB-α en respuesta a la estimulación con el TNF-α, MEKK1 activa a la IKK-α y –β dentro del complejo IKK. NIK también puede activar directamente a la IKK-α. Por otro lado, se ha visto que la JNK interactúa con la subunidad c-Rel e induce la activación del factor nuclear, sin embargo, no fosforila directamente a las subunidades. La figura 33-4 muestra un esquema general de la activación del NF-κB. La sobre expresión de Rac induce la activación del NF-κB, y el empleo de antioxidantes disminuye esta activación, lo que deja claro que la producción de ERO por la NADPH oxidasa impacta directamente en la activación de este factor de transcripción. Además de la activación del NF-κB por la fosforilación de las serinas 32 y 36 del IκB, también puede ser activado por la fosforilación de la tirosina 42. Un aspecto que llama mucho la atención es que el tratamiento con pervanadato, un inhibidor de tirosina fosfatasas, activa al NF-κB sin la degradación proteolítica del IκB. Varios receptores tienen asociadas tirosin-cinasas (PTK) como mediadores en la transducción de señales, entre ellas se encuentran Lck y Src, las cuales son activadas por las ERO, estas PTK activan a su vez al NF-κB por medio de la fosforilación de la tirosina 42. Se sabe que se requiere de Src para la activación del factor inducida por la luz ultra violeta o por el TNF-α, también se ha mostrado en estudios con pervanadato o de hipoxia/reoxigenación que la fosforilación de la tirosisna 42 disminuye notablemente en presencia de inhibidores de Src. Mas aún, la presencia de anti-oxidantes como catalasa o glutatión peroxidasa (GPx), pero no de las SOD, disminuye notablemente la fosforilación de la tirosina inducida por Src, lo que sugiere que es un proceso mediado por H2O2. Como se ha mencionado, la fosforilación de la tirosina 42 no conduce a la degradación del IκB, se ha mostrado que la subunidad p85 de la fosfatidil inositol cinasa (PI3K) interactúa con el IκB fosforilado en la tirosina, y que tal vez pudiera ésta facilitar la activación y translocación al núcleo del NF-κB. Al igual que en el caso de la AP1, la presencia de las ERO en el citoplasma regula la activación del NF-κB, sin embargo en el núcleo las ERO tiene un efec-

496

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 33)

to negativo. Bajo condiciones oxidantes la cisteína 62 de p50 es oxidada lo que hace que disminuya su afinidad por su secuencia en el DNA, el óxido nítrico (NO•) también puede tener este efecto por la nitrosilación de ese mismo residuo, de hecho, como se ha mencionado, la activación del NF-κB induce la expresión de la iNOS, la cual aumenta notablemente la produccón del NO•, lo que sugiere que el NO· puede jugar el papel de regulador negativo en la activación del NF-κB.

Nrf2 El factor 2 relacionado con NF-E2 (Nrf2) es otro de los factores de transcripción que se activan por ERO que, si bien se descubrió hace tiempo, ha tomado mucha relevancia en los últimos años. La importancia de Nrf2 reside en su capacidad para controlar la expresión de varias proteínas de defensa anti-oxidante y de destoxificación. Diversos artículos se han publicado en el sentido de que Nrf2 es un factor clave en citoprotección en procesos como carcinogénesis, respuesta inflamatoria, neuroprotección, entre otros. En condiciones normales, Nrf2 se encuentra en citosol unido a Keap1, proteína que le impide su translocación al núcleo. Cuando Keap1 es degradada por el proteosoma 26S, Nrf2 se transloca al núcleo donde se une a la proteína Maf, la

Nrf2

Keap1

Cinasas

ERO Nrf2

Keap1

UB-UB-UB-UBMaf

Keap1

26S

Anti-oxidantes Núcleo

Nrf2

Maf

Proteínas de destoxificación

ARE DEGRADACIÓN

Figura 33-5. Actividad del factor de transcripción Nrf2.

ERO y señalización

•

497

cual es una proteína que también se regula por las ERO, una vez formado el dímero Nrf2/Maf, se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) de los genes que controla (figura 33-5). Keap1 llama particularmente la atención, ya que es una proteína que contiene 27 residuos de cisteína, y varios de ellos son altamente reactivos, lo que la coloca como candidata a proteína sensora de ERO, además que responde rápidamente a los cambios en el estado redox celular. Nrf2 ha sido implicado en la regulación de la NAD(P) quinona reductasa, en genes que regulan destoxificación de fase 2 como UDP-gluconoril-transferasa, Aflotoxina B1 aldehido reductasa y la epoxido hidrolasa microsomal. Dentro de las enzimas antioxidantes que se encuentran bajo el control de Nrf2 están la catalasa, la GPx, la SOD, tiorredoxina, hemooxigenasa 1, ferritina, entre otras (figura 33-6). Como se ha discutido ya en el capítulo referente al GSH, la enzima γ-glutamilcisteina sintetasa es la enzima que regula el paso limitante o de control en la síntesis del tripéptido GSH, esta enzima está también regulada por el Nrf2, lo que involucra directamente al factor de transcripción en la regulación y la disponibilidad del GSH. De hecho, el factor Nrf2 regula tanto la producción basal, como la inducida, de GSH. En algunos tipos celulares, el intercambio entre cisteína y Inductores

Genes activados

Hidroperóxidos

Proteínas antioxidantes

NO •

Enzimas generadoras de GSH

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Metales pesados Proteínas chaperonas

Quinonas Difenoles

Proteínas del proteosoma Nrf2

Prostaglandinas Ezimas destoxificantes de fase 2 Estrés en retículo Disulfuros

Factores de transcripción

Hemo Isotiocianatos

Otros

Otros

Figura 33-6. Moléculas inductoras de Nrf2 y enzimas que se encuentran bajo su control transcripcional.

498

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 33)

glutamato es fundamental para mantener los niveles adecuados de GSH, este transporte de intercambio es mediado por el sistema Xc– el cual estÁ formado por dos proteínas, una de ellas, la xCT está controlada también por el Nrf2. En general, por tecnología de microarreglos se han identificado alrededor de 200 genes que son regulados por el Nrf2, muchos de los cuales, como se ha mencionado, codifican para proteínas antioxidantes y de citoprotección. Se ha observado que la eliminación del Nrf2 incrementa la sensibilidad de las neuronas al estrés oxidativo, reduciendo la expresión basal e inducida de genes de citoprotección. También se observó que los ratones deficientes en este factor presentaron niveles altos de formación de aductos en el DNA después de la exposición de agentes carcinogénicos, como la aflotoxina B1, materia particulada de diesel, entre otros. Mas aún, se observó que las cualidades quimiopreventivas del oltipraz y sulfuraphane son abolidas en los ratones deficientes de Nrf2, lo que sugiere que estos fármacos actúan regulando la actividad de Nrf2.

❚ CONCLUSIONES La visión que se tenía de que las ERO representaban un factor negativo para la célula ha ido cambiando con el tiempo. La regulación de la expresión génica por radicales libres tiene suma importancia tanto en los procesos fisiológicos, como en los patológicos para el organismo. El uso de nuevas tecnologías como el estudio de la expresión de genes por microarreglos ha favorecido que el avance en la identificación de genes que se activan por ERO sea más rápido. Por otro lado, el analisis comparativo de las secuencias promotoras de genes que responden bajo condiciones similares han permitido desenmascarar secuencias regulatorias comunes o que se sobreponen a la expresión de genes que responden a ERO. La regulación de la expresión de genes por las ERO es un tema muy amplio, cada día se descubren nuevas interaciones entre las rutas dirigidas por radicales libres, de modo que lo que presento aquí, es sólo una pequeña parte de un vasto mundo de la regulación de señales dentro de la célula.

❚ REFERENCIAS Cross JV, Templeton DJ: Thiol oxidation of cell signaling proteins: controlling an apoptotic equilibrium. J Cell Biochem 2004;93:104-111. Dalton TP, Shertzer HG, Puga A: Regulation of gene expression by reactive oxygen. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999;39:67-101.

ERO y señalización

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34

E

SPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN LAS PLANTAS Fernando Rivera Cabrera Beatriz Buentello Volante Fernando Díaz de León Sánchez Laura Josefina Pérez-Flores

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❚ INTRODUCCIÓN A partir de la introducción del oxígeno molecular en nuestra atmósfera por los organismos fotosintéticos, hace aproximadamente 2.5 billones de años, las especies reactivas de oxígeno (ERO) han sido los compañeros indeseables de la vida aeróbica. Los intermediarios reactivos de oxígeno o ERO son formas parcialmente reducidas o activadas del oxígeno atmosférico (O2). Generalmente provienen de la excitación del O2 para formar al oxígeno singulete (1O2) o de la transferencia de uno, dos o tres electrones al O2 para formar, respectivamente, al radical superóxido (O2•), al peróxido de hidrógeno (H2O2) o al radical hidroxilo (•OH) (capítulo 2). El 1O2 se forma en las plantas principalmente por la fotoexcitación de la clorofila, puesto que en este caso, un electrón se eleva a un orbital de energía superior, liberando al oxígeno de su estado de spin restringido y favoreciendo su reacción con moléculas orgánicas. Normalmente los carotenoides (agentes fotoprotectores) apagan el estado excitado de la clorofila previniendo así la formación del 1O2. Al igual que en las células de los animales, en las plantas generalmente el O2• es la

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

primera ERO producida por reducción del oxígeno con un electrón, su vida media es inferior a un segundo. Dos moléculas de O2• dismutan rápidamente generando H2O2, ya sea por una reacción no enzimática o por una reacción catalizada por la enzima superóxido dismutasa (SOD). Existen diversos tipos de SOD en plantas, localizadas en distintos compartimientos celulares. Como se ha mencionado en los capítulos anteriores, en presencia de metales de transición como el hierro, el H2O2 produce el •OH mediante las reacciones de Haber-Weiss o de Fenton. En contraste con el O2, que en su estado basal es relativamente poco reactivo, las ERO son altamente reactivas, tóxicas y capaces de oxidar diversas biomoléculas (lípidos de membranas, proteínas y DNA, véase Sección IV) que alteran el metabolismo y pueden llevar a la destrucción oxidativa de la célula. En consecuencia, la evolución de los organismos aerobios ha dependido del desarrollo de mecanismos eficientes de remoción de las ERO para minimizar sus efectos citotóxicos. Debido a que las plantas generan ERO como parte de su metabolismo y a que estos niveles se incrementan en condiciones de estrés, no es sorprendente que las plantas también posean mecanismos antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir que las ERO alcancen niveles destructivos y mantener el balance redox celular. Estos mecanismos son muy importantes ya que en la naturaleza, las plantas están expuestas frecuentemente a distintos tipos de estrés biótico (virus, bacterias, nemátodos, hongos e insectos), abiótico o ambos (cambios climáticos como sequía, frío, intensidad luminosa elevada, entre otros). Se ha sugerido que el aumento en la generación de ERO en respuesta a los diferentes tipos de estrés, podría ayudar a explicar la tolerancia cruzada en plantas. En la tolerancia cruzada, la exposición previa a un estrés moderado aumenta la tolerancia a un estrés posterior más severo.

❚ LAS ERO

COMO MOLÉCULAS DE SEÑALIZACIÓN EN PLANTAS

Además de su papel como subproductos tóxicos del metabolismo aeróbico, recientemente se ha identificado un nuevo papel para las ERO. En bajas concentraciones, estas moléculas actúan como señales reguladoras de procesos biológicos, como el crecimiento y el desarrollo, la muerte celular programada, las respuestas a hormonas y a distintos tipos de estrés bióticos y abióticos. Se han propuesto varios criterios para demostrar el papel de las ERO como señales endógenas en diversos procesos fisiológicos o del desarrollo. Entre éstos se encuentran: a) La inducción o modulación del proceso por la aplicación exógena de las ERO. b) La correlación de la inhibición del proceso con la remoción de las ERO (a través de la inhibición de su síntesis/o de la estimulación de su metabolismo por medios químicos o genéticos).

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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c) Cambios en el proceso analizado que correlacionen con cambios en la sensibilidad a las ERO. d) La correlación de la síntesis/aumento en la concentración de ERO con el proceso analizado.

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El uso de las ERO como moléculas de señalización en las células vegetales sugiere que, durante el curso de la evolución, las plantas adquirieron un alto grado de control sobre la toxicidad de las ERO lo que ha requerido de una gran red de genes denominada “red de genes de oxígeno reactivo”, compuesta en Arabidopsis por al menos 152 genes. En contraste con la señalización de Ca2+, que se controla en las plantas predominantemente por su almacenamiento y liberación, la señalización de las ERO se controla a través de su producción y de su remoción (figura 34-1). Diferentes tipos de señales del desarrollo, así como del ambiente, alimentan la red de señalización de las ERO y perturban su homeostasis de manera celular o compartimiento específicas. La alteración en los niveles de las ERO es percibida por diferentes proteínas, enzimas o receptores, modulando diversas vías metabólicas del desarrollo y de defensa. Las ERO se generan por distintas enzimas con diversas localizaciones celulares y son removidas por enzimas localizadas también en distintos compartimientos celulares (figura 34-1 y cuadro 34-1). La intensidad, duración y localización de las diferentes señales de las ERO están determinadas por la interrelación entre las vías de producción y de remoción de las ERO, y su localización subcelular determina el espectro de respuestas celulares activadas. Además, las vías de remoción de las ERO son también responsables de mantener una línea basal baja de estado estacionario del estrés oxidativo, sobre la cual pueden registrarse estas señales.

❚ PRODUCCIÓN

DE

ERO

EN PLANTAS

Como se mencionó antes, existen muchas fuentes potenciales de ERO en las plantas (figura 34-1). Entre ellas, algunas reacciones involucradas en el metabolismo normal, en concordancia con el concepto tradicional de considerar a las ERO como subproductos indeseables del metabolismo aeróbico. Otras fuentes de ERO corresponden a vías que se incrementan durante distintos tipos de estrés. Los organelos con una actividad oxidante muy alta o con una velocidad intensa de flujo de electrones, como los cloroplastos, las mitocondrias y los microcuerpos, son fuentes importantes de producción de ERO en las células vegetales. En los cloroplastos la reacción de Mehler y los pigmentos antena son las fuentes principales de generación de ERO (figura 34-2). Esta generación se incrementa

504

•

Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Metabolismo aeróbico Fotosíntesis respiración, etc Producción de ERO

Activación de fosfolipasas

(Capítulo 34)

Cascada de MAPK

O2 • , • OH, H2 O2 Estrés abiótico Sequía, salino, estrés por frío. Alta intensidad luminosa. Estrés biótico Ataque por patógenos

Cambios en el estado REDOX

Sensores o blancos

Transducción de estrés

Otros procesos del crecimiento y desarrollo Respuestas a hormonas, gravitropismo, regulación del cierre de estomas MCP en aleuronade semillas, etc

Percepción de ERO

Transducción de la señal

Remoción de ERO

Factores de transcripción sensibles al estado REDOX Efectos directos en proteínas

Oxidación de lípidos

Activación de cascadas de señalización

Ca 2+ Calmodulina Cinasas (CDPK)

Regulación de la expresión génica

Efectos en las células

Figura 34-1. Procesos de producción, remoción y señalización de ERO en plantas. El metabolismo aerobio, los estímulos ambientales y el estrés biótico y abiótico pueden estimular la producción de ERO y éstas a su vez inducir una gran variedad de efectos en las células.

por condiciones limitantes de fijación de CO2, tales como un estrés de sequía, salino o de temperatura, así como por la combinación de estas condiciones con estrés de alta intensidad luminosa. En las plantas C3, las condiciones de limitación de CO2 activan la vía de la fotorrespiración, en la que se genera al H2O2 en los peroxisomas por la enzima glicolato oxidasa. También puede ocurrir la producción de H2O2 en los microcuerpos durante el catabolismo de los lípidos como un subproducto de la oxidación de los ácidos grasos. En las mitocondrias, la sobrerreducción de la cadena de transporte de electrones es la principal fuente de producción de O2• bajo condiciones de estrés específicas. Recientemente se han estudiado las UCP (proteínas desacoplantes) que disipan el gradiente de H+. Las UCP son proteínas transportadoras, miembros de la familia de acarreadores de aniones. Se ha encontrado que estas proteínas provocan un escurrimiento de H+ en la membrana interna mitocondrial que depende de la presencia de O2•. Estos resultados son consistentes con la idea de que las UCP ayudan a mantener la velocidad de transporte de electrones reduciendo la desviación de éstos para la formación de ERO. Otras fuentes adicionales de ERO en las plantas incluyen las reacciones de desintoxicación catalizadas por los citocromos, tanto en el citoplasma como en el retículo endoplasmático. En años recientes se han identificado nuevas fuentes de ERO en las plantas incluyendo a las oxidasas dependientes de NADPH (NOX), a las amino oxida-

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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505

Cuadro 34-1 Localización de las Enzimas que participan en la producción y remoción de ERO en plantas Mecanismo y ERO involucrada Producción (O2•) TE, fotosíntesis y FSI o II TE, respiración (O2•) Glicolato oxidasa (H2O2) Clorofila excitada (1O2) NADPH oxidasa (O2•) β-oxidación de ácidos grasos (H2O2) Oxalato oxidasa (H2O2) Xantina oxidasa (O2•) Peroxidasas (H2O2, O2•) Amino oxidasa (H2O2)

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Remoción Superóxido dismutasa Ascorbato peroxidasa Catalasa Glutatión peroxidasa Peroxidasas Tioredoxina peroxidasa Ácido ascórbico Glutatión α-tocoferol Carotenoides

(O2•) (H2O2) (H2O2) (H2O2, ROOH) (H2O2) (H2O2) (H2O2, O2•) (H2O2) (ROOH, 1O2) (1O2)

Localización Clo Mit Per Clo MP Per Apo Per PC Apo Clo, Cit, Mit, Per, Apo Clo, Cit, Mit, Per, Apo Per Cit PC, Cit, Mit, Vac Clo, Cit, Mit Clo, Cit, Mit, Per, Apo Clo, Cit, Mit, Per, Apo Membranas Clo

Abeviaturas: Apo, apoplasto; Cit, citoplasma; Clo, cloroplasto; ERO, especie reactiva de oxígeno; FS, fotosistema; MP, membrana plásmática; Mit, mitocondria; 1O2, oxígeno singulete; PC, pared celular; Per, peroxisoma; TE, transporte de electrones; Vac, vacuola.

sas y a las peroxidasas de pared celular. Estas enzimas están fuertemente reguladas y participan en la producción de las ERO durante procesos tales como la muerte celular programada y la defensa contra los patógenos. Las NOX de la membrana plasmática de plantas han sido objeto de intensas investigaciones. Se piensa que las NOX de plantas son de forma similar a las NOX5, reguladas por calcio en mamíferos, y tienen un papel clave en la señalización de las ERO. Las enzimas vegetales contienen flavocitocromos que forman una cadena de transporte de electrones capaz de reducir el O2 a O2•. Se ha demostrado que los inhibidores de la NADPH oxidasa de mamíferos bloquean o disminuyen la producción de ERO en plantas durante un estrés biótico o abiótico. Más aún, se han identificado genes homólogos a la subunidad catalítica gp91phox en diferentes genomas vege-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

H O + 2O 2

2

2O • + 2H+ 2

2O • + 2H+ + ½ O 2 HO + O 2

2

(Capítulo 34)

2

2

Figura 34-2. Reacción de Mehler.

tales. Además de las NADPH oxidasas, se ha propuesto que las peroxidasas de pared celular dependientes de pH, las oxalato oxidasas y las amino oxidasas generan ERO en el apoplasto. En condiciones normales de crecimiento, la producción de ERO en las células es baja (240 μM seg-1de O2•, 0.5 μM de H2O2 en cloroplastos), muchos tipos de estrés que rompen la homeostasis celular incrementan su producción (240 a 720 μM seg-1 de O2•, 5 a 15 μM de H2O2 en cloroplastos). Entre estos tipos de estrés se incluyen la sequía y desecación, el estrés salino, el choque térmico, los metales pesados, la radiación ultravioleta, los contaminantes del aire como el ozono y el SO2, el estrés mecánico, la carencia de nutrientes, el ataque de patógenos y el estrés de alta intensidad luminosa. La producción de ERO durante estos tipos de estrés proviene de las NADPH oxidasas y de vías como la fotorrespiración, la fotosíntesis y la respiración. Aunque el aumento en la producción de ERO puede ser usado por las plantas para monitorear el estrés intracelular activando respuestas de defensa, los niveles de ERO deben mantenerse bajo un estricto control, debido a que su sobre acumulación puede producir la muerte celular por daño oxidativo (concepto tradicional de toxicidad y reactividad de ERO). En forma alternativa, los niveles elevados de ERO pueden activar una vía de muerte celular programada (MCP), como se demostró recientemente en tabaco por la inhibición de genes antiapoptóticos inducida por estrés oxidativo. Debido a que las ERO son tóxicas pero también participan en eventos de señalización, las células vegetales requieren de al menos dos mecanismos diferentes de remoción de ERO para regular su concentración: uno para propósitos de señalización que permita la modulación fina (para niveles bajos de ERO), y otro que permita la desintoxicación del exceso de ERO, especialmente durante la presencia de un estrés. Además es importante, el tipo de ERO producido y el balance entre sus niveles de estado estacionario.

❚ COMPONENTES ENZIMÁTICOS DE ERO EN PLANTAS

DE LAS VÍAS DE REMOCIÓN

Los principales mecanismos de remoción de las ERO en las plantas incluyen a las enzimas superóxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APX), catalasa

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Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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(CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y peroxiredoxina (PRXR) (cuadro 34-1). Estas enzimas junto con los antioxidantes ácido ascórbico y glutatión (GSH), proveen a las células con una maquinaria altamente eficiente para la desintoxicación de O2• y del H2O2. El balance entre las actividades de estas enzimas en las células es crucial para determinar el nivel de estado estacionario de O2• y H2O2. Este balance junto con el secuestro de iones metálicos por la ferritina y otras proteínas que unen metales, previenen la formación del •OH, considerado el radical más agresivo. Las principales vías de remoción de las ERO en plantas se muestran en la figura 34-3 e incluyen a la SOD, presente en casi todos los compartimientos celulares, al ciclo agua-agua en los cloroplastos, al ciclo ascorbato-glutatión en el cloroplasto, el citosol, la mitocondria, el apoplasto y los peroxisomas, a la GPx y a la CAT en los peroxisomas. La afinidad por el sustrato, la velocidad de la reacción y la concentración de las enzimas son parámetros importantes para asignar la función relativa de las diferentes enzimas en la desintoxicación de ERO. Las diferentes afinidades por el H2O2 (rango μM) y de la CAT (rango mM), sugieren que la APX es responsable de la modulación fina de ERO para señalización; mientras que la CAT presente en los peroxisomas, participa en la detoxificación de altos niveles de ERO durante el estrés. Además, el estrés oxidativo causa la proliferación de los peroxisomas lo que aumentaría la eficiencia en el secuestro de ERO, especialmente H2O2, el cual difunde libremente desde el citosol a los peroxisomas. El ciclo agua-agua presente en los cloroplastos, toma la energía reductora directamente del aparato fotosintético, por lo que parece ser autónomo con respecto al aporte de energía. El descubrimiento del ciclo ascorbato-glutatión en casi todas las localizaciones celulares probadas (cloroplastos, mitocondrias, apoplastos y peroxisomas), así como la elevada afinidad de APX por H2O2, sugiere que este ciclo tiene un papel crucial en el control de los niveles de ERO en estos compartimientos. A la fecha, no está enteramente clara la fuente de energía reductora para el secuestro de ERO por el ciclo de ascorbato-glutatión durante el metabolismo normal y en particular durante el estrés, cuando el aparato fotosintético podría estar suprimido o dañado. En los animales y las levaduras, la vía de las pentosas fosfato es la fuente principal de NADPH para la remoción de las ERO. Debido a que la CAT no requiere de un aporte de reductores equivalentes para su función, podría ser insensible al estado redox de las células y su función podría no estar afectada durante el estrés a diferencia de los otros mecanismos. Los antioxidantes tales como el ácido ascórbico y el GSH, que se encuentran en altas concentraciones en los cloroplastos y otros compartimientos celulares (5 a 20 mM de ácido ascórbico y 1 a 5 mM de GSH) son cruciales para la defensa de las plantas contra el estrés oxidativo. En consecuencia, tanto las mutantes con niveles suprimidos de ácido ascórbico como las plantas transgénicas con contenidos alterados de GSH son hipersensibles a condiciones de estrés. Las pozas

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

celulares de estos antioxidantes se mantienen en su estado reducido por acción de las enzimas glutatión reductasa (GR), monodehidroascorbato reductasa (MDAR) y dehidroascorbato reductasa (DHAR) usando al NADPH como poder reductor (figura 34-3). Además, los radicales monodehidroascorbato (MDAS) pueden ser reducidos nuevamente a ácido ascórbico por vía de la ferredoxina usando electrones que se desvían del aparato fotosintético en el ciclo agua-agua en los cloroplastos (figura 34-3). El H2O2 puede también ser removido por las peroxidasas vegetales “clásicas” usando diversos reductores. En Arabidopsis estas enzimas están codificadas por una familia de al menos 73 genes y se localizan en el citosol, la vacuola, el apoplasto y la pared celular. El balance global entre los diferentes antioxidantes tiene que estar estrictamente controlado. Por ejemplo, un incremento en la biosíntesis de GSH en los cloroplastos puede resultar en el daño oxidativo a las células más que en su protección, posiblemente por la alteración del estado redox global de los cloroplastos. También se ha sugerido que la relación de las formas oxidadas/reducidas de los diferentes antioxidantes puede servir como una señal para la regulación de los mecanismos de remoción de ERO.

O2 •

O2

Membrana plasmática

H2O2

NOX

Citosol

O2

SOD

Citosol H2O2

GSSG NADPH

NADP Ascorbato DNA AOX MDA

ASC

Complejo ubiquinona

NADPH O2•

H2O H2O2

ASC DHA ASC

Mitocondria

MnSOD

MDA

DHA H2O2

NADPH MDAR NADP 2GSH NADP DHAR, GR GLR GSSG NADPH

SOD

FNR

FD

GSH

NADP

+

H2O2 O2

Cu/Zn APXt

e–

PrxR

Trx

FSI

FSII AOX

O2 H2O

H2O

O2

O2 H2O2

NADPH Estroma

MDA

GPx GPX GR DHAR,GLR H2O

MDAR

H2O

O2

Cata H2O2

lasa

Cloroplasto

Lumen

H2O2 + O2 GSSG NADPH

NADP Ascorbato MDAR MDA

NADPH

GPx GPX DHAR,GLR GR H2O DHA

GSH

NADP

Peroxisoma

Figura 34-3. Producción y remoción de ERO en los distintos compartimientos celulares. Las principales vías de remoción de ERO en plantas incluyen a la SOD, presente en casi todos los compartimientos celulares, al ciclo agua-agua en los cloroplastos, al ciclo ascorbato-glutatión en cloroplasto, citosol, mitocondria, apoplasto y peroxisomas, a la glutatión peroxidasa (GPx) y a la CAT en peroxisomas.

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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509

En las células vegetales, las membranas son muy susceptibles al estrés oxidativo, están protegidas por la GPx específica de fosfolípidos y por α-tocoferol (vitamina E), el cual se mantiene en su estado reducido por el ascorbato reducido.

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❚ COORDINACIÓN DE LAS VÍAS DE PRODUCCIÓN Y REMOCIÓN DE ERO EN DISTINTOS COMPARTIMIENTOS CELULARES En general existen varias enzimas para remover un tipo particular de ERO en cada uno de los distintos compartimientos (p. ej., GPx, y APX en el citosol y en el cloroplasto, y APX y CAT en los peroxisomas) (figura 34-3). Cuando se considera la función relativa de cada enzima en los distintos compartimientos celulares, es importante recordar que algunas ERO, como el H2O2, difunden entre los compartimientos. Asimismo, se sugiere que los transportadores de los compuestos antioxidantes (ácido ascórbico y GSH), son determinantes en los niveles de estos compuestos y el potencial redox en los distintos compartimientos celulares. A la fecha se desconoce el potencial de producción y remoción de ERO de la vacuola y debido a su gran volumen es posible que tenga un papel esencial en el control de las ERO en plantas. Por otra parte, se ha empezado reconocer la capacidad antioxidante y la función en la señalización de ERO del apoplasto y los peroxisomas. Diversos reportes sugieren que en las respuestas de defensa de las plantas hay un elevado y complejo grado de coordinación entre los distintos compartimientos celulares. Por años, se ha considerado a los cloroplastos como la principal fuente de producción de ERO y en consecuencia uno de los blancos potenciales para el daño por ERO durante el estrés. Las mitocondrias son otro sitio importante de producción de ERO y también reguladores clave de la muerte celular programada o apoptosis. Tanto las mitocondrias como los cloroplastos contienen mecanismos de remoción de las ERO. En contraste, se sabe poco acerca de estos mecanismos en el núcleo, el cual contiene factores de transcripción sensibles al estado redox. Debido a que el H2O2 puede difundir a través de las acuaporinas, las ERO producidas en un sitio específico (por ejemplo el cloroplasto durante un estrés abiótico o el apoplasto durante el ataque de patógenos) pueden afectar otros compartimientos celulares, superando su capacidad de remoción de ERO y alterando el patrón de expresión génica. En este sentido, se ha observado que los tipos de estrés que incrementan la producción de ERO en el cloroplasto, inducen mecanismos de remoción de ERO en el citosol y la producción de ERO en el apoplasto induce la producción de proteínas de respuesta a patógenos. Debido a que las mitocondrias y el núcleo vegetal están involucrados en la activación de la apoptosis, los niveles de ERO que alcanzan estos compartimientos durante cualquier tipo de estrés, deben estar estrictamente controlados para prevenir la activación anormal

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

de dicho fenómeno. El citosol, con su ciclo ascorbato-glutatión, y los peroxisomas, con la reacción de la CAT, podrían actuar como zonas amortiguadoras para controlar los niveles globales de ERO que alcanzan diferentes compartimientos celulares durante el estrés y en el metabolismo normal. La importancia de los peroxisomas en el metabolismo de las ERO ha ganado reconocimiento. Los peroxisomas no son solamente el sitio de detoxificación de las ERO por la CAT, sino también un sitio de producción de las ERO. Las principales funciones de los peroxisomas en las plantas son la fotosíntesis, la oxidación de los ácidos grasos, el ciclo del glioxilato y el metabolismo de los ureidos. Una característica importante de los peroxisomas es su plasticidad metabólica, ya que su contenido enzimático puede variar dependiendo del organismo, del tipo de tejido o célula, de la etapa del desarrollo y de las condiciones ambientales. Entre las principales enzimas de los peroxisomas están las del metabolismo de ERO y las de biosíntesis de óxido nítrico (NO•), óxido nítrico sintasa (NOS). El H2O2 se genera en los peroxisomas de la fotorrespiración, de la glicolato oxidasa de la oxidación de los ácidos grasos, de las flavina oxidasas y de la dismutación del O2•. Los peroxisomas pueden liberar varias moléculas de señalización como el H2O2, el O2• y el NO•. El O2• inhibe a la CAT y el NO• inhibe a la CAT y a la APX, las dos principales enzimas que remueven al H2O2 en los peroxisomas vegetales. Además, el aumento en el NO• incrementa la oxidación de ácidos grasos que produce H2O2 en las células animales, lo que genera condiciones tóxicas en la célula. Se ha demostrado que el NO• está involucrado en la muerte celular inducida por ERO en plantas y que es un regulador clave de las respuestas a los patógenos, aunque se sabe poco acerca de su participación en las respuestas a distintos tipos de estrés abiótico. Diversos estudios con mutantes y plantas transgénicas en los que se suprimió la producción de los mecanismos de desintoxicación de ERO, revelaron algunas de las relaciones complejas entre los mecanismos de producción y remoción de ERO. Así, en las plantas que no producen APX, se inducen las enzimas SOD, CAT y GR para compensar la pérdida de APX; mientras que en las plantas con producción suprimida de CAT se inducen las enzimas APX, GPx y la oxidasa alternativa (AOX) mitocondrial. La CAT y la APX no son completamente redundantes en su función, ya que una de ellas no compensa la carencia de la otra, como se demuestra por la mayor sensibilidad de las plantas con niveles reducidos de APX o CAT, a distintos tipos de estrés ambiental y al ataque de patógenos. Por otra parte, resulta interesante que las plantas que carecen de APX o CAT, resulten menos sensibles al estrés oxidativo que las plantas con niveles reducidos de APX o CAT bajo un conjunto definido de condiciones ambientales, presentando una reducción en su actividad fotosintética, un aumento en la producción de AOX en cloroplastos y en la expresión de los genes de la vía de las pentosas fosfato y de MDAR, posiblemente para evitar la producción de ERO, así como para incrementar la remoción de H2O2.

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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Mecanismos para evitar la producción de ERO Evitar la producción de ERO puede ser tan importante como su remoción. Diversas condiciones de estrés incrementan la velocidad de producción de ERO, por lo que evitar o aliviar los efectos de los distintos tipos de estrés en el metabolismo vegetal, reducirá el riesgo de la producción de ERO. Entre los mecanismos para reducir la producción de ERO durante el estrés se encuentran:

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a) Adaptaciones anatómicas (movimiento o enrollamiento foliar, desarrollo de una epidermis refractante, entre otras). b) Adaptaciones fisiológicas (metabolismos C4 y CAM). c) Mecanismos moleculares (rearreglo del aparato fotosintético y pigmentos antena en función de la calidad e intensidad luminosa e incluso la supresión de la fotosíntesis). Estos mecanismos regulan la cantidad de energía luminosa absorbida con la disponibilidad de CO2, evitando la sobre reducción del aparato fotosintético y la transferencia de electrones al O2 en lugar de al CO2. La producción de ERO disminuye también por la canalización alternativa de los electrones de la cadena de transporte de electrones de los cloroplastos y las mitocondrias a un grupo de enzimas denominadas oxidasas alternativas (AOX). Las AOX desvían el flujo de electrones de las cadenas de transporte de electrones y los usan para reducir el O2 a agua. Las AOX disminuyen así la producción de ERO por dos mecanismos, por un lado, previenen que los electrones reduzcan el O2 a O2• y por el otro, reducen los niveles globales de O2 (el sustrato para la producción de ERO). La disminución de la AOX mitocondrial incrementa la sensibilidad de las plantas al estrés oxidativo. Además, la AOX de los cloroplastos es inducida en las plantas transgénicas que carecen de APX y/o de CAT, y en las plantas normales se induce en respuesta a la alta intensidad luminosa.

Regulación de la expresión génica de la red de ERO en la Arabidopsis En años recientes se ha utilizado a la planta Arabidopsis thaliana como modelo para analizar la regulación de la expresión de los genes del metabolismo de las ERO en las plantas mutantes y transgénicas con niveles alterados de las enzimas antioxidantes (APX1 y CAT2) sometidas a diferentes tipos de estrés abiótico (sequía, salinidad, frío o alta intensidad luminosa). Los resultados apoyan dos principios fundamentales de una red de genes: la redundancia y la flexibilidad. La redundancia es evidente por la viabilidad de mutantes en las que se encuentra

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

suprimida la producción de una enzima y la flexibilidad por la respuesta específica a cada uno de los diferentes tipos de estrés a partir de la expresión de un grupo particular de transcritos.

❚ VÍA DE TRANSDUCCIÓN DE LAS SEÑALES DE LAS ERO EN LAS PLANTAS Se sugiere que las células vegetales perciben a las ERO a través de diferentes mecanismos como son las proteínas receptoras (aún no identificadas), los factores de transcripción sensibles al estado redox (NPR1, HSFs, entre otros) y la inhibición directa de las fosfatasas por efecto de las ERO. En estudios recientes se han identificado diversos intermediarios involucrados en la vía de transducción de las ERO, en un evento posterior al de su percepción (figura 34-4). Entre estos intermediarios se han identificado iones Ca2+, proteínas que unen Ca2+ como la calmodulina, proteínas G y segundos mensajeros como el ácido fosfatídico (PA). Asimismo, se ha identificado una proteína cinasa de serina/treonina que al parecer tiene un papel central en la percepción de ERO y en la activación por Ca2+ de proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK). Esta cinasa de serina/treonina se activa por la cinasa dependiente de fosfoinosítidos (PDK1) a través de PA. La activación de la vía de MAPK controla la activación de diferentes mecanismos de defensa. También se ha reportado que las ERO incrementan la expresión de diferentes factores de transcripción (miembros de las familias de WRKY, Zat, RAV, GRAS y Myb) los cuales regulan la expresión de diversos genes (figura 34-4). La existencia de mecanismos de amplificación de la señalización de las ERO que involucran a las NADPH oxidasas se apoya en varios estudios genéticos y farmacológicos. Las NADPH oxidasas se activan por niveles bajos de ERO, incrementando la producción de las señales de ERO en localizaciones celulares específicas. Se considera que la acumulación de las ERO en las células activaría las vías de remoción de las ERO también en localizaciones celulares específicas. En años recientes se ha demostrado que las ERO participan en una gran diversidad de respuestas de las plantas no solamente a distintos tipos de estrés bióticos, abióticos o ambos, sino durante el crecimiento y desarrollo vegetal.

Participación de las ERO en las respuestas de defensa vegetal contra patógenos A lo largo de su vida, las plantas interaccionan con un gran diversidad de patógenos. Ante esta situación, las plantas han desarrollado diversos mecanismos de de-

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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H2O2 Ca2+

Ca2+ ?

Vacuola

H2O2

Ca2+ Ca2+ ? MAPKKK

Histidina cinasa

Ca2+

Proteínas de unión a calcio (CaM)

H2O2

Respuesta MAPKK Fosforilación O2

S-H

NADPH

Oxidación

TF Modificado

NADP

H2O2

S-S

TF

MAPK

NOX

O2 •-

P TF

PP

PK

Núcleo expresión génica

TF

H2O2 Actividades celulares

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Figura 34-4. Vías de señalización de ERO. El peróxido de hidrógeno (H2O2) generado en la célula o que difunde al interior puede oxidar o modular la acción de varias proteínas como fosfatasas (PP), proteína cinasas (PK) como las histidina cinasas de la membrana plasmática y la cascada de las cinasas dependientes de mitógenos (MAPKKK, MAPKK, MAPK) y factores de trascripción sensibles al estado redox (TF).

fensa para evitar su potencial colonización por el patógeno. La primera línea de defensa la constituyen las barreras físicas y químicas preformadas. También existen diversas respuestas inducibles cuya participación depende del reconocimiento exitoso del patógeno por la planta. Este evento de reconocimiento está mediado por la interacción directa o indirecta entre el producto de un gen del patógeno y el correspondiente producto del gen de resistencia de la planta (R). Esta interacción general da por resultado la respuesta hipersensible (RH) que produce un área de muerte celular que rodea al sitio de ingreso del patógeno evitando su propagación. Siguiendo a la RH se encuentra el establecimiento de la inmunidad a infecciones secundarias en tejidos sistémicos, a esta respuesta se le denomina resistencia sistémica adquirida (RSA) que confiere protección contra un amplio espectro de patógenos. Una de las respuestas celulares de defensa más rápidas después del reconocimiento del patógeno, es la denominada explosión oxidativa, que produce ERO (O2• y H2O2) en el sitio de invasión. Durante esta respuesta, las ERO son producidas por

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

las células vegetales vía el aumento en la actividad enzimática de las NADPH oxidasas unidas a la membrana plasmática, las peroxidasas unidas a la pared celular y las amino oxidasas en el apoplasto. La principal enzima responsable de la “explosión oxidativa” en diversas plantas es la NADPH oxidasa (NOX también denominadas Rboh) de membrana plasmática, que es homóloga a la NADPH oxidasa o Rbo que genera O2• durante la explosión respiratoria en los fagocitos de los mamíferos. Se piensa que las ERO producidas durante esta respuesta, difunden dentro de las células y junto con el ácido salicílico (AS) y el NO•, activan muchas de las defensas vegetales, incluyendo la apoptosis o MCP (figura 34-5). Existen evidencias recientes que demuestran la síntesis enzimática de NO• en las plantas. En dicha síntesis participan las enzimas NOS constitutivas de Arabidopsis AtNOS1 y las enzimas NOS inducibles, aunque también se ha descubierto que la nitrato reductasa y la xantina oxidoreductasa producen NO• en las plantas. Durante las respuestas de defensa el AS y el NO• inhiben la actividad de la APX y la CAT. La producción de la APX es suprimida por una regulación postranscripcional y la de la CAT es a nivel del mRNA. Así, la planta produce más ERO y simultáneamente disminuye su capacidad para remover al H2O2, resultando en la sobre acumulación de las ERO y en la activación de la MCP o apoptosis. En la vía de transducción de la muerte celular inducida por ERO y NO• durante la RH, participan el GMP cíclico (GMPc), los canales de calcio, las proteasas, la modificación postraduccional de las proteínas por nitrosilación y la regulación de la expresión de genes. El aumento en la producción de las ERO, además de participar en la RH, aumenta también la resistencia a las enfermedades por otros mecanismos, como por ejemplo a través de efectos tóxicos directos en los patógenos y a través del entrecruzamiento de las proteínas de la pared celular vegetal para hacerla más resistente al ataque de las enzimas del patógeno. H2O2 Reconocimiento del patógeno Ca

2+

O2 •

O2

+

K

NOX NADK

Proteína G

2+

Ca Calmodulina

NADPH

NADP

CDPK PCK

Figura 34-5. Modelo de los eventos de señalización de la respuesta a patógenos en plantas. El reconocimiento del patógeno induce la entrada de Ca2+ que activa la producción de NADPH por la NAD cinasa, el NADPH es entonces usado por la NOX que genera ERO.

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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Como se mencionó anteriormente, la RSA requiere de AS y de la proteína regulatoria positiva NPR1, la cual interacciona con las factores de transcripción miembros de la clase TGA, que regulan la expresión de genes RSA entre los que se encuentran los genes relacionados con la patogénesis (RP). Reportes recientes apoyan la participación del estado redox celular en la señalización de la RSA. Los cloroplastos emergen como fuente importante de ERO en esta respuesta, al parecer la transferencia del ácido linolénico del cloroplasto al exterior activa a la NADPH oxidasa y regula la producción de las ERO. Los últimos estudios demuestran que la actividad de NPR1 y de los factores de transcripción TGA1 y TGA4 se regulan por modificaciones redox de residuos de cisteína inducidas por AS. En ausencia de patógeno o estado no inducido, la proteína NPR1 se encuentra formando un oligómero, que se mantiene por puentes disulfuro intermoleculares y se localiza en el citosol. La reducción de las cisteínas conservadas de NPR1 inducida por AS, lleva a la formación del monómero que se moviliza al núcleo. Para activar la expresión de los genes RP se requiere la localización nuclear de NPR1. A su vez, la reducción de las cisteínas conservadas en TGA1 y TGA4 permite su interacción con NPR1, que actúa como un cofactor sensible al estado redox celular estimulando la unión de TGA al DNA. Aunque se desconoce la identidad de los mediadores redox que regulan a NPR1 y TGA se ha propuesto la participación de tioredoxinas y glutaredoxinas.

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Papel dual de las ERO durante el estrés biótico y abiótico en plantas El papel que tienen las ERO en la MCP en la respuesta a patógenos parece opuesto al papel que tienen durante el estrés abiótico, durante el cual niveles bajos de ERO inducen los mecanismos de remoción de las ERO, tales como las enzimas APX y CAT que disminuyen el nivel de estado estacionario de las ERO en las células. Las diferencias en la función de las ERO entre el estrés biótico y abiótico podrían resultar de la interacción del AS y el NO•, en las respuestas de defensa y del entrecruzamiento entre diferentes vías de señalización o de diferencias en los niveles de estado estacionario de las ERO producidas durante los distintos tipos de estrés (figura 34-6). El aparente conflicto en el metabolismo de las ERO en la respuesta a un estrés biótico y uno abiótico lleva a la pregunta ¿cómo manipulan las plantas su velocidad de producción y de remoción de las ERO cuando se encuentran frente a un ataque biótico durante un estrés abiótico? En este sentido, se encontró que cuando las plantas de tabaco que fueron sometidas previamente a un estrés abiótico y que, en consecuencia, tenían niveles elevados de enzimas antioxidantes, mostraron una velocidad reducida de MCP comparadas con plantas testigo no estresadas. Además, las plantas con sobreproducción de la CAT

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

Estrés Biótico

(Capítulo 34)

Estrés Abiótico

Respuesta de defensa Respuesta de defensa

Mitocondria (O2 )

H 2O 2

Mitocondria (O2 )

O2 ERO

Cloroplastos (O2 )

NADPH NO •

AP X Cat

NO • AS

• O2

ERO A PX Cat

NADP ERO

O2

ERO

O2 Cloroplastos (O2 )

RH

SAR Respuesta a estrés biótico y a biótico

Figura 34-6. Papel de las ERO durante el estrés biótico y abiótico en plantas. Especies reactivas de oxígeno (ERO), oxidasa dependiente de NADPH (NOX), ascorbato peroxidasa (APX), catalasa (CAT), óxico nítrico (NO•), ácido salicílico (AS), respuesta hipersensible (RH), respuesta sistémica adquirida (RSA).

tuvieron una resistencia disminuida a la infección de patógenos.

Participación de las ERO en el cierre de los estomas La regulación del cierre de los estomas involucra la interacción e integración de diversos controles que ayudan a la planta a adaptarse a los ambientes fluctuantes. Las condiciones ambientales desfavorables, como la sequía, la salinidad y las bajas temperaturas, limitan la productividad. En ausencia de estrés, para que los estomas se abran, las células guarda incorporan iones como K+, Cl–, NO3–, etc. que en conjunto con otros solutos elevan la turgencia celular y, debido a la disposición de las microfibrillas de celulosa de la pared celular, ocasionan la apertura de los estomas. Durante un estrés hídrico se acumula ácido abscísico (ABA), hormona vegetal con diversos papeles en la tolerancia de las plantas a la sequía. La acumulación de ABA en las hojas activa la producción de H2O2 en las células guarda a través de dos fuentes, la NADPH oxidasa y los cloroplastos. Al parecer en la formación de las ERO por ABA y por metil-jasmonato interviene la alcalinización de las células guarda. El H2O2 inactiva los canales de entrada de K+, acti-

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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va los canales de entrada de Ca2+ de la membrana plasmática que contribuyen a incrementar la concentración de Ca2+ en el citosol junto con la liberación de Ca2+ de almacenes intracelulares. El aumento de Ca2+ en el citosol participa también en la regulación de los canales de aniones, dando por resultado una reducción en la turgencia de las células guarda y en consecuencia el cierre de los estomas (figura 34-7). Recientemente se ha encontrado que en el cierre de estomas participa el NO• producto de la nitrato reductasa (NR). La actividad de la NR está fuer-

ABA

NOS

NR

O2

abi1 NADPH NO •

NOX O2 •NADP H2O2

H2O2

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Cloroplasto abi2 Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+ Ca2+

Figura 34-7. Participación de las ERO en el cierre de estomas. Modelo del cierre de estomas inducido por el ácido abscísico (ABA). El ABA puede ser percibido por un receptor desconocido o por algunos componentes de la membrana como la oxidasa dependiente de NADPH (NOX). Las ERO producidas en esta señalización activan los canales de Ca2+, además de inducir la expresión de genes como ABI1 y ABI2.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

temente regulada tanto a nivel transcripcional como postraduccional por diversos factores como la luz, la temperatura, la disponibilidad de CO2 y de O2, todos estos factores regulan también el cierre de estomas. Así la NR, al parecer no sólo participa como una enzima clave en la coordinación de la asimilación del N y el C, sino que también es fuente de la molécula de señalización NO• en la red de transducción de señales de cierre de estomas inducido por ABA.

Participación de las ERO en la muerte celular programada en la capa de aleurona de semillas La capa de aleurona se diferencia del endospermo almidonoso de semillas de cereales. La capa de aleurona es un tejido diferenciado que no se divide, no posee cloroplastos funcionales por lo que no realiza la fotosíntesis. Durante la maduración de la semilla, las células del endospermo mueren, pero las de la capa de aleurona permanecen viables. Durante la imbibición que lleva a la germinación, la capa de aleurona sintetiza y secreta a las hidrolasas encargadas de movilizar las reservas del endospermo para el establecimiento de la plántula posterior a la germinación y previa al establecimiento de la autotrofia. La función de la capa de aleurona está regulada por las hormonas giberelinas (GA) y ABA. Después de la síntesis y secreción de las hidrolasas ocurre la MCP de la capa de aleurona. Las GA promueven la MCP en las células de la capa de aleurona mientras que el ABA la inhibe. Estudios con antioxidantes demuestran que en la MCP de estas células participan las ERO. Al parecer la mayor sensibilidad a las ERO de las capas de aleurona tratadas con GA se debe a la síntesis continua o aumentada de las ERO y a la disminución paralela de las enzimas antioxidantes encargadas de removerlas, esta disminución se refleja en los niveles de mRNA, de proteínas y de la actividad de estas enzimas. En las capas de aleurona tratadas con ABA las mitocondrias utilizan a las AOX para minimizar la producción de las ERO y además hay una inducción de las enzimas encargadas de remover las ERO.

Participación de las ERO en el envejecimiento de semillas La capacidad de germinación y el vigor de las semillas se afectan dramáticamente por el envejecimiento que ocurre durante el almacenamiento prolongado. Uno de los factores más importantes del envejecimiento de las semillas es la acumulación de las ERO. Diversos estudios demuestran que, a pesar de la baja humedad durante el almacenamiento de las semillas, pueden ocurrir reacciones de auto oxidación que llevan a la producción de las ERO y a una perdida de la actividad de las enzimas antioxidantes. El almacenamiento prolongado en baja humedad o

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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condiciones inadecuadas de conservación, como temperaturas y humedades relativas elevadas, incrementan estos procesos. Las alteraciones causadas por las ERO se expresan durante la imbibición de las semillas por lo que se considera a la imbibición como un paso crítico.

Participación de las ERO en el gravitropismo de la raíz inducido por las auxinas

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Desde 1926 se descubrió que en la respuesta gravitrópica de la raíz participan las auxinas. El mecanismo propuesto indica que la estimulación gravitrópica es lo que induce el transporte asimétrico de las auxinas, que a su vez provoca la curvatura en el crecimiento denominada curvatura gravitrópica. Se ha descubierto que en esta respuesta participa el mensajero lipídico inositol trifosfato (IP3) que induce la apertura de los canales de Ca2+ intracelulares aumentando el Ca2+ citosólico. En años recientes se demostró la participación de las ERO en la vía de señalización de la respuesta gravitrópica. La aplicación exógena de las auxinas estimula la generación de las ERO en la región tratada y se sugiere que las ERO participan en la redistribución de las auxinas por el estímulo gravitatorio. Se ha demostrado también que las ERO inducen la cascada de fosforilación de MAPK en la raíz. Aunque a la fecha no se sabe cómo se integran las señales de ERO y Ca2+ en la respuesta gravitrópica.

Participación de las ERO en el crecimiento de las células apicales Las células apicales representan un caso extremo del crecimiento polarizado basado en el alargamiento exclusivo del ápice. En las plantas hay dos ejemplos típicos de crecimiento de células apicales: los pelos radiculares y el tubo polínico. Los pelos radiculares deben percibir el ambiente del suelo y crecer para optimizar la toma de agua y nutrientes, también para responder a los estímulos bióticos. El tubo polínico debe comunicar sus propiedades (especie e individualidad) a las células del estigma. En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento de las vías de señalización del crecimiento de las células apicales. Se ha reportado la participación del ácido γ-amino butírico (GABA), un neurotransmisor en animales, del NO•, de señales lipídicas como el PA y la fosfolipasa D (PLD), de los iones Ca2+, K+, Cl– y gradientes de pH. Una nueva área de investigación acerca de la participación de las ERO en esta vía de señalización surgió con el estudio de las mutantes de Arabidopsis rhd2, mutantes defectuosas en el crecimiento de pelos radiculares

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

que se caracterizan por pelos radiculares cortos. La proteína RHD2 mutada es una NADPH oxidasa que tiene alterada la subunidad catalítica y por lo tanto altera la producción de las ERO. Se ha encontrado que las ERO se requieren para estimular la entrada de Ca2+ necesaria para el alargamiento celular. Las señales de las GTPasas ROP, los gradientes iónicos, las señales lipídicas y los nucleótidos cíclicos participan en la vía de señalización afectando al citoesqueleto (figura 34-8). Se piensa que las proteínas que unen actina integran así todo este conjunto de señales modificando el citoesqueleto. Al parecer, todas las proteínas que coordinan la dinámica del citoesqueleto de actina deben estar fuertemente reguladas para que el crecimiento polarizado direccional pueda efectuarse. Entre estas proteínas se encuentran el factor de despolimerización de actina (ADF), que se regula por pH y la profilina cuya actividad es dependiente de Ca2+, además el ADF se inhibe a través de la fosforilación catalizada por una cinasa dependiente de Ca2+ que une lípidos. En los animales y las levaduras se ha demostrado la función relevante que tienen las proteínas de unión a poli L profilina (PLP) como las WASP, las VADP y la formina en la remodelación del citoesqueleto. En Arabidopsis se ha demos-

ERO

PIP Cinasa GTPasa ROP

PIP2

Ca2+ pH

CDPKs

ADF

Formina

Efecto sinérgico Profilia

Proteínas PLP Familia WASP

Complejo Arp 2/3

Remodelación de la actina del citoesqueleto

Crecimiento polarizado

Figura 34-8. Participación de las ERO en la remodelación del citoesqueleto durante el crecimiento de células apicales. Las ERO estimulan la entrada de Ca2+ necesaria para el alargamiento celular. Las GTPasas ROP, los gradientes iónicos, las señales lípidicas y los nucleótidos cíclicos participan en la vía de señalización para la remodelación del citoesqueleto. El factor de despolimerización de actina (ADF) y la profilina son proteínas que coordinan la dinámica del citoesqueleto. En animales y levaduras se ha demostrado la participación de proteínas de unión a poli L profilina (PLP) como las WASP y la formina en la remodelación del citoesqueleto.

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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trado que la sobre expresión de la formina afecta la regulación del crecimiento polarizado del tubo polínico.

Participación de las ERO en las respuestas alelopáticas Las especies vegetales invasoras alteran la integridad de los sistemas naturales desplazando a las comunidades nativas. Un mecanismo propuesto para explicar el éxito de las especies invasoras es la alelopatía que consiste en la liberación de fitotoxinas por las plantas. Recientemente se ha reportado que la especie invasiva Centaura maculosa, que se encuentra entre las más destructivas en Norteamérica, desplaza a las especies nativas mediante la exudación por las raíces de la fitotoxina catequina. En las especies sensibles como Arabidopsis, la catequina provoca la generación de las ERO en el meristemo de la raíz que dispara una cascada de señalización en la que interviene Ca2+ y que modifica la expresión génica y en casos extremos lleva a la muerte del sistema radicular.

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❚ ESTUDIOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES Y TRATAMIENTOS PROTECTORES CONTRA EL DAÑO POR FRÍO Y ERO EN FRUTOS La refrigeración es una de las tecnologías más usadas para extender la vida postcosecha de los productos hortofrutícolas. Sin embargo, los frutos tropicales o subtropicales, como el limón persa (Citrus Latifolia T.) y mexicano (Citrus aurantifolia S.), presentan un desorden fisiológico conocido como daño por frío (DPF) cuando se almacenan por debajo de ciertas temperaturas críticas (10 a 12°C). Este desorden es de suma importancia ya que afecta la aceptación del consumidor, provocando pérdidas comerciales. En cítricos, los síntomas típicos de DPF son: la aparición de manchas en el flavedo (cáscara), el oscurecimiento del albedo (porción blanca) y en casos extremos la producción de aromas y sabores anormales. Algunos autores han sugerido la participación del estrés oxidativo en el desarrollo del DPF en frutas y hortalizas. En el caso de los cítricos se ha reportado que los cultivares tolerantes al DPF poseen un sistema antioxidante más eficiente que los cultivares sensibles. Por lo que la capacidad para remover a las ERO podría estar implicada en la tolerancia al DPF. Durante los últimos años, se ha demostrado la efectividad de algunos tratamientos de acondicionamiento con calor en la resistencia al DPF en cítricos. Actualmente se piensa que los tratamientos de acondicionamiento con calor o frío pueden reducir el DPF en diferentes especies, incluyendo a los cítricos. Este fenómeno se conoce como “tolerancia cruzada”, en el que la exposición a un

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 34)

estrés moderado aumenta la tolerancia a un estrés posterior más severo. Diversos reportes sugieren que la “tolerancia cruzada” podría estar relacionada con un incremento en los sistemas antioxidantes, previniendo así la acumulación y el daño por ERO. En este sentido, el grupo de trabajo se ha enfocado a investigar las bases bioquímicas y moleculares de la “tolerancia cruzada” al DPF y la relación de este desorden fisiológico con el estrés oxidativo, teniendo como modelos biológicos al limón persa (Citrus latifolia T.) y limón mexicano (Citrus aurantifolia S.). En el caso del limón persa se encontró que el acondicionamiento con hidrocalentamiento (inmersión en agua a 53°C por 3 minutos), previo al almacenamiento refrigerado de los frutos en temperaturas inductoras de DPF no indujo tolerancia a esta fisiopatía. Inmediatamente después de aplicado, el acondicionamiento produjo un incremento significativo en la actividad de las enzimas antioxidantes (2.6 veces para PX y 1.7 veces para SOD), aunque esta inducción no se sostuvo durante todo el periodo de almacenamiento. Por otra parte, en el caso del limón mexicano, se exploró la efectividad de un tratamiento de acondicionamiento con frío (13°C por 48 horas), previo al almacenamiento de los frutos en refrigeración, en la protección contra el DPF. El acondicionamiento con frío disminuyó 1.6 veces los síntomas de DPF y produjo un incremento significativo en la actividad de PX (2.2 veces), mientras que la actividad de la SOD se mantuvo durante todo el periodo de almacenamiento. Estos resultados sugieren que la efectividad de los tratamientos de acondicionamiento en la tolerancia al DPF, depende de la capacidad de estos tratamientos de inducir o mantener los sistemas antioxidantes durante todo el periodo de almacenamiento.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Se ha demostrado que las ERO participan activamente en la fisiología de las plantas, pero aún quedan muchas interrogantes por responder. A la fecha no se conoce en detalle la causa de la muerte celular inducida por estrés oxidativo en las plantas, y si es que ésta se debe solamente a la toxicidad de las ERO o a la activación de una vía de MCP por ellas. Por lo que para responder estas preguntas se espera que el futuro se realicen estudios en donde se aplique estrés oxidativo a plantas mutantes deficientes en distintas vías de MCP. Otras preguntas relacionadas con la señalización y el metabolismo de las ERO que permanecen sin respuesta son: 1. ¿Cuáles son los sensores para las ERO en plantas? 2. ¿Qué tan tóxicas son las ERO en las células vegetales?

Especies reactivas de oxígeno en las plantas

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3. ¿Cómo se coordinan las redes de producción y remoción de las ERO en las plantas? 4. ¿Cómo se regula el metabolismo de las ERO durante una combinación de estrés biótico y abiótico o durante múltiples tipos de estrés abiótico? 5. ¿Cuál es la fuente de energía reductora para la reducción de las ERO durante el metabolismo normal y durante el estrés? 6. ¿Cómo afectan la identidad química de una ERO y/o su sitio de producción a la señalización y respuesta generada? 7. ¿Qué factores afectan la especificidad de las actividades biológicas de las ERO? 8. ¿Cuáles son las funciones de la vacuola y el apoplasto en la señalización y metabolismo de las ERO? 9. ¿Cómo se integran las ERO en la red señalización general de la célula? En la actualidad se encuentran disponibles la mayoría de las tecnologías requeridas para responder a muchas de estas preguntas. Se pueden citar como ejemplo, el análisis de la expresión génica usando microarreglos, acoplado con estudios de proteómica y metabolómica siguiendo las diferentes enzimas y compuestos antioxidantes en plantas expuestas a un estrés biótico o abiótico o combinaciones de distintos tipo de estrés, completado con el estudio de mutantes con capacidades alteradas de producción o remoción de las ERO. Además, el desarrollo de marcadores celulares que permitan la cuantificación no destructiva de las diferentes ERO en los distintos compartimientos celulares, profundizará nuestra comprensión del metabolismo y transducción de señales de ERO. Los autores agradecen el financiamiento otorgado por la UAM, CONACyT, SIMORELOS No. 19990301016, CONACYT No. SEP-2003-CO2-45162 y PROMEP CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE PLANTAS, RED DE CUERPOS ACADÉMICOS (UAM-I, UNACH, UC Davis, EUA).

❚ REFERENCIAS Bailly C: Active oxygen species in seed biology. Seed Science Research 2004;14: 93-107. Bais HP, Vepachedu R, Gilroy S et al.: Allelopathy and exotic plant invasion: from molecules and genes to species interactions. Science 2003;301:13771380. Delledone M: NO• news is good news for plants. Current Opinion in Plant Biology 2005; 8: 390-396. Desikan R, Hancock J, Neill S: Reactive oxygen species as signalling molecules. In: Smirnoff N. Antioxidants and reactive oxygen species in plants. Oxford, Blackwell Publishing Ltd 2005:169-196.

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V

IDA ANIMAL EN AMBIENTES EXTREMOS : PAPEL DE LOS RADICALES LIBRES Y LOS ANTIOXIDANTES Alexis F. Welker Gabriella R. Ramos-Vasconcelos Eva Philipp Marcelo Hermes-Lima

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❚ INTRODUCCIÓN Algunas especies de animales viven en situaciones que serían sumamente extremas para el ser humano, logran sobrevivir a periodos de baja o nula oferta de oxígeno, con temperaturas extremadamente bajas (incluyendo situaciones en las que se da congelamiento de los líquidos corporales), de ausencia de alimentos e incluso de agua. Estas condiciones alteran el metabolismo entero y provocan picos de producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) que, tal como fue abordado en capítulos anteriores de este libro, pueden causar daños oxidativos. A pesar de todo, existen decenas de especies de animales que resisten a esa exposición aumentada las ERO, que ocurre en condiciones naturales y fisiológicas, a través de un eficaz sistema antioxidante. Esa capacidad extraordinaria es lograda a través de mecanismos bioquímicos y fisiológicos adquiridos a lo largo del proceso evolutivo. Conocer dichos mecanismos ayuda al hombre a entenderse mejor a sí mismo, a sus procesos patológicos y a proponer tratamientos para algunas enfermedades. Los animales oxidan nutrientes constantemente, produciendo coenzimas y cofactores enzimáticos mitocondriales ricos en electrones. En la cadena respirato-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

ria, el oxígeno recibe los electrones y es convertido en agua; sin embargo una pequeña porción del oxígeno (de 0.1 a 0.5%) no se convierte en agua, sino que es transformado en ERO. Como fue explicado en el capítulo Hipoxia/reperfusión, cuando el tejido de un mamífero común es mantenido en bajas concentraciones de oxígeno se da una acumulación de electrones en la cadena respiratoria, y cuando el oxígeno vuelve a estar disponible ocurre una superproducción de ERO. En las células de los animales expuestos a este fenómeno, pueden ocurrir graves daños oxidativos por la incapacidad del sistema antioxidante de funcionar adecuadamente.

❚ VIVIENDO

SIN OXÍGENO

El incremento de la producción de ERO también se encuentra en animales sometidos a hipoxia (concentraciones de oxígeno disminuidas) o anoxia (0% de oxígeno), y posteriormente reoxigenados. Este es el caso de algunas ranas y tortugas de América del Norte que hibernan bajo del agua durante meses. Con el congelamiento de la superficie de los ríos y lagos, el ambiente acuático se vuelve hipóxico e incluso anóxico. En el caso de la Rana pipiens, fue demostrado que este animal puede vivir varios días en anoxia. Por otro lado, en ciertas tortugas, fue observada una sobrevivencia de hasta 3 meses en anoxia. Uno de los secretos reside en la capacidad de cambiar el metabolismo de oxidativo a fermentativo durante la anoxia, así como reducir la tasa metabólica. Existen otros ejemplos de animales que necesitan vivir en anoxia: peces de ríos y lagos del Hemisferio Norte que se congelan en la superficie. Un ejemplo clásico es el pez Carassius auratus, de origen asiático, conocido popularmente en Brasil como goldfish o pez dorado; peces de lagos amazónicos que pueden permanecer en anoxia durante la noche (causado por el consumo nocturno de oxígeno por la flora y fauna); peces de ríos que pueden quedar periódicamente en hipoxia; invertebrados de respiración branquial de regiones de intermarea y estuarios (incluyendo poliquetos, gastrópodos y crustáceos) que son sujetos a la baja de la marea y a la exposición al aire. Cuando los animales salen de esas condiciones, ocurre una abrupta reoxigenación, que puede resultar en una elevada producción de ERO. Así, en un intento de comprender cómo se defienden esos animales del estrés oxidativo, diversos trabajos han investigado los animales tolerantes a la anoxia e hipoxia.

Preparación para el estrés oxidativo El primer estudio donde se investigó el sistema antioxidante específicamente en respuesta a la anoxia fue realizado a principios de los años 90 por Marcelo Her-

Vida animal en ambientes extremos:...

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mes-Lima y Kenneth Storey, en la Carleton University, en Ottawa, con la serpiente Thamnophis sirtalis parietalis, encontrada en América del Norte y que resiste 48 horas sin oxígeno. Esta adaptación a la anoxia ha sido asociada, en términos ecológicos, a la inundación de los invernaderos hacia el final del invierno. La inducción de anoxia en laboratorio por 10 h (a 5ºC) provocó un incremento de algunos parámetros antioxidantes, tales como la actividad de la enzima antioxidante superóxido dismutasa (SOD) en el músculo esquelético y en el hígado, y de la concentración del antioxidante no enzimático glutatión (GSH) en el músculo esquelético (figura 35-1). Este primer resultado fue sorprendente, tomando en cuenta que en ausencia de oxígeno no se esperaría un incremento en las defensas antioxidantes justamente porque no se podrían formar ERO en esas condiciones. En ese trabajo, publicado en 1993, se propuso que existiría una preparación para el estrés oxidativo en estos animales. Esta hipótesis fue, en años subsiguientes, confirmada también en otros animales que pasan por la situación de anoxia y reoxigenación. Así, el incremento en la producción de antioxidantes endógenos en anoxia sería una defensa anticipada a una superproducción de ERO durante la reoxigenación. Los mecanismos moleculares que regulan los preparativos para el estrés oxidativo siguen siendo un misterio al día de hoy. En un segundo estudio, publicado en 1996, se mostró la respuesta antioxidante del anfibio anuro Rana pipiens, luego de 30 horas en anoxia (a 5ºC). Se encontró un incremento en la actividad de la catalasa (CAT) en el músculo esquelético y en el corazón; así como de la enzima glutatión peroxidasa dependiente de sele-

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Control

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Figura 35-1. Efecto de la anoxia en la actividad enzimática de superóxido dismutasa (SOD) expresada en unidades por miligramo de proteína A) y concentración de glutatión reducido (GSH) nmol/g de peso húmedo en serpiente Thamnophis sirtalis parietalis B). Los valores se muestran como media ± error padrón de la media (SEM). *: significativamente diferente al control respectivo.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

nio (GPx) en el cerebro y el corazón, y también de la glutatión-S-transferasa (GST) en el cerebro. El único antioxidante que mostró una disminución fue la concentración de glutatión total (GSH) en el cerebro. En estos anfibios fue verificado que, luego de 40 horas de recuperación aeróbica, la mayor parte de las alteraciones en las defensas antioxidantes volvía a la normalidad. Los trabajos antes discutidos confirman la hipótesis sugerida, en 1986, por el investigador Evaldo Reischl, acerca de que los vertebrados pulmonados submarinos tolerantes a la hipoxia (y con bajas concentraciones musculares de mioglobina), tenían algún tipo de sistema antioxidante que los protegía de las ERO formadas durante la reperfusión de la sangre oxigenada, al final de una inmersión prolongada. Él observó en la tortuga Phrynops hilarii, que permanece sumergida durante períodos muy largos, una alta concentración de grupos sulfhidrilo presentes las hemoglobina de muchas de esas especies y postuló, en esa época, una función antioxidante para esos sulfhidrilos, capacidad confirmada actualmente. En invertebrados que viven periodos sin oxígeno, también fue demostrado un incremento en el sistema de defensa antioxidante durante la anoxia. El cangrejo Chasmagnathus granulata mantenido por 8 horas en anoxia (a 25ºC) presentó un incremento de actividad de las enzimas catalasa y GST de las branquias posteriores. Por otro lado, se dio una reducción de la actividad de SOD en anoxia. En el caso del poliqueto Heteromastus filiformis, tanto la hipoxia como la anoxia incrementaron la actividad de catalasa, sin cambios en la actividad de la SOD. En el gastrópodo Biomphalaria tenagophila (un cangrejo de agua dulce), también se encontró que después de 24 horas de anoxia, hubo un aumento en la actividad de la enzima GPx dependiente de selenio (GPx-Se) en su glándula digestiva.

Otras adaptaciones antioxidantes Las tortugas Trachemys scripta elegans, que logran permanecer entre 2 a 3 meses sin respirar, presentaron en varios tejidos una reducción de la actividad de algunas enzimas antioxidantes (SOD, GST y gammaglutamil transpeptidasa (γ-GT) en el hígado; la CAT, el GSH y el GST en el corazón; la CAT, GPX y γ-GT en el riñón; CAT y SOD en cerebro) y de la concentración de GSH total (hígado, corazón y riñones) luego de 20 horas de estar sumergidas en agua desoxigenada (la CAT hepática no se vio alterada en este estudio) (a 5ºC). Sin embargo, los investigadores descubrieron simultáneamente que la actividad antioxidante de estos animales es mayor que la de otros animales ectodérmicos. Esta especie presentó una reducción en los indicadores de estrés oxidativo durante la anoxia (peroxidación lipídica). Otros trabajos mostraron que el cerebro de esas tortugas posee una mayor concentración de ácido ascórbico que otros reptiles o anfibios intolerantes a la anoxia.

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Se encontraron respuestas distintas en el gastrópodo marino Littorina littorea, que en general presentó una reducción de la actividad de enzimas antioxidantes en la glándula digestiva y en el músculo del pie luego de 6 días de exposición a la anoxia. En compensación, hubo un incremento en los niveles de GSH total. Recientemente, ese mismo animal fue investigado y la anoxia provocó un incremento en la expresión de la metalotioneína, que tiene propiedades antioxidantes. Esa familia de proteínas se liga a metales, algunos de los cuales (como los iones hierro y cobre) son cofactores para la producción de radicales libres. Un incremento semejante fue encontrado en la síntesis de ferritina, una proteína que se liga a iones hierro, importante en algunas reacciones formadoras de radicales hidroxilo, como la reacción de Fenton.

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Daños oxidativos en la reoxigenación La producción de ERO resulta en daños a varias moléculas cuando el sistema antioxidante no es lo suficientemente eficaz. Varios trabajos reportaron algunos indicadores de este estrés oxidativo en animales sometidos a anoxia y/o hipoxia y luego reoxigenados. En el goldfish, luego de una hora de reoxigenación, hubo un incremento de 114% en los niveles de dienos conjugados (un producto de la peroxidación lipídica) en el hígado, y luego de 14 horas, hubo un incremento de 75% en el cerebro. En cangrejos Chasmagnathus granulata mantenidos 8 horas en anoxia, la reoxigenación por 40 minutos elevó los niveles de peroxidación lipídica (medido en forma de TBARS), a pesar de la relativamente alta actividad de algunas enzimas antioxidantes. Un incremento en los niveles de proteínas carboniladas (indicadores de daños oxidativos en proteínas) fue observado también en el hígado de tilapias (Oreochromis niloticus) en reoxigenación, luego de 3 horas bajo hipoxia; en este caso no se observaron alteraciones en los niveles de TBARS. En la Rana pipiens no se observó un incremento en los niveles hepáticos y musculares de peroxidación lipídica (TBARS) luego de la reoxigenación, lo que puede ser explicado por un eficiente sistema antioxidante. En el caso de la tortuga Trachemys scripta elegans, se encontró una disminución de los niveles de hidroperóxidos lipídicos en riñones y de TBARS en músculo esquelético luego de 24 horas de reoxigenación. En el gastrópodo marino Littorina littorea, luego de una recuperación de 12 a 24 horas por una exposición prolongada de anoxia (6 días), hubo una disminución de los niveles de hidroperóxidos lipídicos. Como se puede apreciar, no existe un patrón en los distintos trabajos realizados, lo que puede ser explicado por el hecho de que algunos exponen a los animales a situaciones ante las cuales no se ven expuestos en la naturaleza, al menos no comúnmente. Además, es posible que realmente se presente estrés oxidativo fisio-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

lógico, y que las defensas antioxidantes tan sólo minimicen el daño oxidativo. Lo más importante es que en todos los casos se presenta la sobrevivencia del animal.

❚ INMERSIÓN

E

HIPOXIA

Varios vertebrados con respiración pulmonar viven gran parte del tiempo sumergidos en el agua marina y/o dulce, como las tortugas, los cocodrilos, las focas, las ballenas y los delfines, presentando algunas adaptaciones fisiológicas. La apnea causada por la inmersión ocasiona una disminución en la concentración sanguínea de O2 y un incremento del CO2, relacionados con cambios fisiológicos como la vasoconstricción periférica y la disminución de la frecuencia cardiaca. Como consecuencia, se presenta hipoxia en los tejidos de los animales que se sumergen (excepto cerebro y arterias coronarias), e incluso anoxia, dependiendo del tiempo de inmersión. El regreso luego de una inmersión prolongada causa una abrupta reperfusión de oxígeno a los tejidos, lo que, como fuera propuesto por R. Elsner et al., en 1998, podría aumentar la generación de ERO y la oxidación de componentes celulares. Semejante estrés oxidativo fisiológico de la inmersión podría ser minimizado con un sistema antioxidante eficazmente evolucionado para ello. En trabajos recientes se compararon los sistemas antioxidantes en la sangre de mamíferos que se sumergen constantemente contra los de mamíferos terrestres. Los animales estudiados que se sumergen fueron: foca Mirounga leonina, manatí del Caribe Trichechus manatus manatus, ballena Balaenoptera acutorostrata y delfines Stenella clymene y Pontoporia blainvillei. Los mamíferos terrestres fueron: mono Cebus apella, hurón Grison vittatus, mapache cangrejero Procyon cancrivorus, oso hormiguero Tamandua tetradáctila y ciervo Ozotocerus bezoarticus. Los autores encontraron una mayor actividad de las enzimas antioxidantes en los animales que se sumergen, como SOD, GSH reductasa (GR) y GPx, así como de GSH. Y confirmando esto, los mamífero acuáticos presentaron menores niveles de TBARS en plasma. Al investigar a la foca Phoca hispida (encontrada en las frías aguas del ártico), el grupo de Tania Zenteno-Savin en La Paz BCS, México, descubrió que la proteína llamada factor inducido por hipoxia-1 alfa (HIF-1α) presenta sólo pequeñas diferencias estructurales respecto de la proteína hallada en ratones. Esta proteína se encuentra presente en altas concentraciones en los tejidos de focas, y parece ser la responsable de inducir los cambios (activación de la transcripción de mRNA y expresión de proteínas) que ayudan a proteger el proceso de isquemia/reperfusión asociado a la inmersión. La misma foca, al ser comparada con cerdos (Sus scrofa), presentó una mayor tasa de producción de superóxido (corazón, músculo e hígado) en condiciones de normoxia. Pero esta diferencia no resulta en un incremento proporcional de daños oxidativos (a pesar de los incre-

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mentados niveles de peroxidación lipídica) en tejidos. La inesperada producción mayor de radicales libres y de TBARS en comparación con los cerdos aún se está investigando. Resultados más recientes mostraron que esa foca (Phoca híspida) tiene una actividad relativamente más alta (respecto de los cerdos) de las enzimas SOD, GPx y GST en corazón, catalasa en hígado, GPx en músculos y SOD y GPx en pulmones. La GST hepática de las focas, responsable por la remoción de productos de la peroxidación lipídica, presentó menor actividad que en los cerdos. Esto podría estar siendo compensado por la alta tasa de CAT en el hígado, minimizando la formación de esos productos.

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❚ SISTEMAS ANTIOXIDANTES Y DESHIDRATACIÓN

SEVERA

La mayor parte de los animales no tolera grandes variaciones en el volumen de agua corporal o en su osmolaridad. Tal es el caso de los seres humanos, que corren un gran riesgo de muerte al perder un 10% de su peso total. No obstante, muchos anfibios sobreviven a pérdidas de 25 a 60% de su agua corporal, sin verse perjudicados luego de la rehidratación. Los anuros del desierto pasan la mayor parte del año estivando en agujeros, y pueden perder más de la mitad de su agua. En el caso de los anuros de regiones templadas, la deshidratación del animal es provocada por vientos fríos y secos. La deshidratación incrementa la viscosidad de la sangre, lo que reduce la oferta de oxígeno a los tejidos, ocasionándoles hipoxia. Durante la rehidratación, se observa un rápido incremento del flujo sanguíneo que, como en el proceso de isquemia/reperfusión, genera un incremento en la producción de ERO. Así, los anfibios que viven en ambientes extremadamente secos (desiertos) también sirven como modelo de investigación. Para relacionar al sistema antioxidante con la deshidratación, se investigó al anuro Rana pipiens, sometiéndolo a 92 horas de severa deshidratación (pérdida de 50% del contenido de agua, a 5ºC). Se halló un incremento de la actividad de las enzimas GPx hepática (74%) y CAT muscular (52%), pero también una reducción de la actividad de SOD y GR musculares (34 a 35%). Esa modulación del sistema antioxidante parece ser eficaz, dado que no fueron encontrados cambios en los niveles de peroxidación lipídica (cuantificado en forma de TBARS), tanto en el músculo como en hígado durante la deshidratación y la rehidratación.

Sistemas antioxidantes y congelamiento Muchos animales (incluyendo insectos, moluscos, anfibios y reptiles) que viven en regiones de clima frío del Hemisferio Norte son tolerantes al congelamien-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

to en invierno, sobreviviendo por semanas, incluso con la mayor parte de su agua corporal congelada y con bloqueo total de los latidos cardíacos y flujo sanguíneo. Esto se logra a través de varias adaptaciones fisiológicas y bioquímicas, como: a) La presencia de compuestos que impiden la formación de cristales nocivos de hielo (proteínas resistentes y altas concentraciones de glucosa o trealosa). b) La utilización del metabolismo fermentativo en el estado congelado (ya que no hay disponibilidad de oxígeno). c) La depresión metabólica, que favorece una gran economía energética durante el congelamiento. En los animales que sobreviven a ese estrés, nunca ocurre congelamiento en el interior de las células a lo largo de los días o semanas que pueden vivir en esta condición de animación suspendida e isquemia total de los órganos. El calentamiento del cuerpo de un animal congelado hace que el flujo sanguíneo vuelva a ser normal (reperfusión), llevando oxígeno a los tejidos. ¿Sería esperable entonces, de un modo similar al proceso de isquemia/reperfusión en mamíferos, una elevada producción de ERO y estrés oxidativo en el descongelamiento? ¿Cuáles serían las adaptaciones del metabolismo de radicales libres de estos animales? Estas preguntas se contestan con la idea antes planteada sobre la preparación para el estrés oxidativo postulada, primeramente por Hermes-Lima y Storey en 1993, con los estudios sobre serpientes. Otros estudios que confirman esta hipótesis se realizaron con la rana Rana sylvatica, que resiste durante días temperaturas por debajo de los – 6ºC. Cuando se expuso – 2.5ºC por 24 se encontró un incremento de la actividad de la GPx en varios tejidos distintos. Esta actividad volvió a la normalidad 24 horas después del descongelamiento. A pesar de haber sido observada una reducción de la actividad de SOD en algunos tejidos, no se verificó un incremento en los indicadores de estrés oxidativo (peroxidación lipídica) durante el congelamiento y descongelamiento. Lo que sugiere que el anfibio también utiliza los anticongelantes endógenos como defensa contra las ERO. Así mismo se han encontrado resultados similares en invertebrados: gastrópodos e insectos.

❚ HIBERNACIÓN

EN MAMÍFEROS Y ESTRÉS OXIDATIVO

Varias especies de mamíferos pequeños hibernan para sobrevivir cuando las temperaturas ambientales son muy bajas y las fuentes de alimentos son escasas o ausentes. La hibernación es un proceso estacional, caracterizado por largos períodos de entumecimiento, en los que hay una reducción de la tasa metabólica de hasta un 5% de lo que habría en un animal activo. Lo cual se refleja como una

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caída de la temperatura corporal a valores cercanos a los 0ºC, una reducción de los latidos cardiacos, así como de la respiración y de la perfusión sanguínea, y alteraciones fisiológicas que ocasionan isquemia severa en los órganos. De esta manera, los animales hibernantes logran economizar su energía para mantenerse vivos. Sin embargo, estos períodos de entumecimiento son interrumpidos periódicamente por el regreso del animal al estado eutérmico (36 a 37ºC). Este regreso ocurre durante pocas horas, pero durante dicho período se da un incremento en el consumo de oxígeno de 100 a 300 veces, lo que consecuentemente sirve como un combustible para la termogénesis, promoviendo el recalentamiento del animal. Considerando que la producción de ERO es directamente proporcional al incremento de la presión parcial de oxígeno (pO2) y a la concentración de mitocondrias funcionales presentes en el tejido, se asume que el potencial para la producción de daños oxidativos durante la hibernación es una consecuencia de la formación periódica de ERO durante los ciclos de hibernación y recalentamiento. Así, la relación entre hibernación y estrés oxidativo es principalmente una consecuencia de las alteraciones fisiológicas que ocurren en la hibernación. Por lo que se cree que los animales que hibernan tienen un buen sistema de defensa antioxidante para reducir la acumulación de productos de daños oxidativos a lo largo de varias semanas de entumecimiento. Aunque es más o menos un consenso en la literatura que los animales se encuentran en hipoxia durante la hibernación por causa de una reducción en el ritmo cardiaco, estudios de la Dra. Drew mostraron que las ardillas del ártico Spermophilus parryii (adaptadas a pasar por variaciones de temperatura corporal, entre 4 a 37ºC durante la hibernación) se encuentran, de hecho, a pO2 alta durante la hibernación. Esto podría explicarse por la baja utilización del oxígeno por los tejidos en depresión metabólica. Así mismo, se encontró un incremento de 3 a 5 veces en las concentraciones plasmáticas del antioxidante ascorbato en el período de hibernación de estas ardillas, mientras que durante el recalentamiento la concentración de ascorbato se reduce rápidamente, al tiempo que el consumo de O2 aumenta. El pico de consumo de O2 también coincide con un pequeño incremento de la concentración de ácido úrico en plasma. El ácido úrico es un producto del metabolismo de las purinas, cuya formación es catalizada por la enzima xantina oxidasa, la que también produce el radical superóxido. Por lo tanto, el incremento del ácido úrico en plasma (al despertar de la hibernación) es consistente con la producción de ERO vía xantina oxidasa. Este mismo patrón de incremento en la concentración de ascorbato plasmático durante la hibernación se ve en ardillas de 13-líneas (Spermophilus tridecemlineatus). El ascorbato también aumenta su concentración durante la hibernación de la ardilla Citellus citellus, así como la actividad de las enzimas SOD y GPx, particularmente en el tejido adiposo marrón, donde la termogénesis es importante durante este periodo.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

En otro trabajo, Hannah Carey, de la Universidad de Winsconsin, examinó a lo largo del año el equilibrio redox de GSH en la mucosa intestinal de ardillas de 13-líneas. Durante la hibernación, hay una reducción del 50% en la actividad de la enzima GR. La cantidad de GSH total fue menor en ardillas durante el despertar, y más alta en los animales durante el “recalentamiento”. La razón entre GSH y GSSG, cuyos valores bajos indican estrés oxidativo, fue 5 veces menor en animales que hibernan comparados con animales activos en el verano, un efecto probablemente causado por el incremento de la concentración de GSSG en la hibernación. La expresión de HSP70 en la mucosa intestinal fue mayor en ardillas al inicio del entumecimiento y durante el recalentamiento, reflejando la inducción de la respuesta al estrés. Los resultados sugieren que la hibernación en estas ardillas está asociada a un cambio en el equilibrio redox del estado de la GSH. En murciélagos Myotis lucifugus, se observó recientemente que hay un incremento de una proteína de la familia de la tioredoxina peroxidasa en el corazón de animales en hibernación cuando se los compara con animales eutérmicos. Algunos marcadores de estrés oxidativo, también aumentan en el corazón y en el músculo esquelético durante la hibernación, como la HSP 27 (incremento de 4.4 veces), aunque se dé una inhibición general de la traducción, como consecuencia de la depresión metabólica. Existen pocos trabajos en los cuales se ha determinado la relación entre la hibernación y los indicadores de daño oxidativo a proteínas y lípidos. Los únicos estudios en este sentido fueron realizados por Kelly Drew, en colaboración de Marcelo Hermes-Lima y estudiantes de Alaska. En ellos se observó un aumento de proteínas oxidadas y TBARS en el tejido adiposo café de las ardillas S. parryii durante el despertar de la hibernación.

❚ ESTIVACIÓN, ANTIOXIDANTES Y ESTRÉS

OXIDATIVO

La estivación es un estado de entumecimiento que se da en los peces pulmonados, algunos gasterópodos y anuros, principalmente en respuesta a la baja disponibilidad de agua en el ambiente. La tasa metabólica puede caer a niveles de un 30% o menos del metabolismo normal. En embriones del camarón Artemia, las tasas metabólicas en determinados períodos son cercanas a cero. La estivación puede ser interrumpida cuando se da un incremento de la humedad en el ambiente, probando que los mecanismos de regulación metabólica que controlan la depresión del metabolismo son rápidamente reversibles. En general, el retorno incluye un rápido incremento de la tasa de ventilación y consumo de oxígeno, momento en que se da la reoxigenación y posiblemente el estrés oxidativo. Corroborando esta propuesta, se puede observar que en el proceso de tran-

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sición entre estivación y despertar de los caracoles terrestres Helix aspersa y Otala lactea se da un incremento en la peroxidación lipídica (determinada por TBRS) de glándula digestiva. En O. lactea sometidas a estivación por 30 días se da un incremento de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD (64%), CAT (62%) y GST (94%) en el músculo del pie, y de SOD y GPx en la glándula digestiva, en relación con aquellos activos por 24 horas. De modo similar, el caracol H. aspersa sometido a 20 días de estivación, presenta un incremento de la actividad de GPx y de niveles GSH total en la glándula digestiva, y de la actividad de GPx en el músculo del pie (comparado con animales despiertos 24 horas antes). Luego de 15 minutos del despertar, se da un incremento transitorio en la razón GSSG/GSH total, indicando un estrés oxidativo de naturaleza fisiológica. El cangrejo acuático Biomphalaria tenagophila, en estivación por 15 días promueve un pequeño (pero significativo) aumento en la actividad de la Se-GPx y una reducción de la SOD en la glándula digestiva. Los incrementos en la actividad de antioxidantes endógenos en los caracoles B. tenagophila, H. aspersa y O. lactea en estivación fueron considerados una preparación para el estrés oxidativo que parece darse en el despertar de la estivación. La modulación de la capacidad antioxidante durante la estivación también fue observada en el sapo de espuela Scaphiopus couchii, animal característico de la región sudoeste de EUA. Estos sapos estivan durante 9 a 10 meses al año, reduciendo su tasa metabólica a un 20 a 30% de la del animal activo, y con una pérdida de aproximadamente un 60% del agua del cuerpo luego de seis meses en estivación. Durante el despertar de la estivación, el sapo tiene un incremento transitorio del consumo de O2. Así, es probable que una gran cantidad de ERO sea producida en ese momento. Luego de 10 días de la salida de estivación en estos sapos (comparados con animales en estivación por 2 meses a 21ºC), se observa una mayor actividad de varias enzimas antioxidantes (p. ej.: GPx, GR, GST y CAT en hígado). O sea, los sapos en estivación, al revés de lo verificado en caracoles, presentaron una disminución de los niveles de enzimas antioxidantes en varios tejidos. Los autores observaron asimismo que la peroxidación lipídica se incrementó entre un 27 y un 168% en casi todos los tejidos de los sapos en estivación, lo que puede ser explicado por la reducida capacidad antioxidante bajo esas condiciones. Tal vez esta menor capacidad antioxidante (en la estivación) ocurra como respuesta a la reducción de la tasa metabólica, y el S. Couchii adopta como estrategia adaptativa una tolerancia a los productos de peroxidación. Tal estrategia podría ser como punto central el ahorro energético, al no realizar la detoxificación de productos aldehídicos (de la peroxidación lipídica) y no sintetizando o degradando nuevas proteínas de función antioxidante.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ ESTACIONALIDAD

(Capítulo 35)

DEL SISTEMA DE DEFENSA ANTIOXIDANTE

Los procesos de hibernación y estivación se encuentran asociados a las variables estacionales, como, por ejemplo, cambios en la insolación y en la temperatura. Y dado que se propone que la modulación del sistema de defensa antioxidante es importante para la supervivencia de estos animales en ambientes extremos, es importante analizar como influye la estacionalidad. Las alteraciones estacionales en el sistema de defensa antioxidante ya han sido descritas en la literatura. Las ardillas Citellus citellus, durante el invierno (época en la cual hibernan) poseen menor actividad de las enzimas antioxidantes que las encontradas en el verano (época de mayor actividad en estos animales). Del mismo modo, el ácido ascórbico y el α-tocoferol son encontrados en menor concentración durante el periodo de invierno que durante el verano. Alteraciones estacionales fueron observadas también en el mejillón Perna perna, conocido como mejillón azul. Un estudio del Brasil mostró que la mayor actividad de las enzimas antioxidantes se encuentra en el verano. Un estudio irlandés mostró en el mejillón azul, durante el invierno, una caída de los niveles de defensa antioxidante en la glándula digestiva y en las branquias. En otro estudio con el molusco Mytilus edulis, en Italia, se demostró la disminución de los niveles/actividades de las defensas antioxidantes en la glándula digestiva durante el invierno (en comparación con las otras estaciones), acompañado por un incremento de TBARS. El caracol terrestre Helix aspersa, una especie originaria de la región del mediterráneo capaz de estivar e hibernar, también presenta un comportamiento estacional del sistema de defensa antioxidante. En un estudio desarrollado en Brasil, en el período de julio a agosto (invierno) se dio un incremento en la actividad de la GPx en la glándula digestiva y en el músculo del pie durante la estivación. Pero durante el periodo de enero a marzo, la estivación provocó una caída en la actividad de las enzimas catalasa y SOD (y un incremento de GPx) en la glándula digestiva de H. aspersa, sin embargo, comparativamente con las actividades de julio a agosto, todas las enzimas antioxidantes tuvieron una actividad basal más elevada en enero a marzo. Así, durante este período, que corresponde al verano en Brasil, estos caracoles presentan un potencial antioxidante mayor. En los meses de julio a agosto, hubo un incremento transitorio en la concentración de TBARS y GSSG durante el despertar (indicando un estrés oxidativo). Este incremento no fue observado cuando los animales despertaban de la estivación en los meses de enero a marzo. Hasta las ratas presentan una variación en su sistema de defensa antioxidante. Un estudio reciente analizó enzimas antioxidantes y daños oxidativos a lípidos en grupos de ratones de distintas épocas del año. Los investigadores observaron que durante el verano, las actividades de la GPx y CAT son mayores en corazón

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e hígado que en el resto del año. Los daños oxidativos a lípidos del corazón fueron mayores durante la primavera que en otras épocas del año. De modo general, la modulación del sistema de defensa antioxidante está relacionada con variaciones de las condiciones ambientales, tales como temperatura, humedad, presión atmosférica, mayor disponibilidad de alimentos, período reproductivo e incluso ciclos circadianos.

❚ INVERTEBRADOS

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MARINOS QUE VIVEN EN EL FRÍO: RADICALES LIBRES Y ENVEJECIMIENTO

El proceso de envejecimiento se define como el deterioro progresivo de las células, tejidos y órganos, asociado con una disminución en la función fisiológica a lo largo del tiempo. El alto potencial de las ERO para ocasionar daño oxidativo llevó a Denham Harman, en 1956, a sospechar que las ERO estaban involucrados en el proceso de envejecimiento (véase capítulo ERO, envejecimiento y senescencia celular). Puesto que gran parte de las ERO son producidos por las mitocondrias, de allí que se crea que estos organelos juegan un rol protagónico en el envejecimiento. En ectotermos marinos, se ha encontrado un aumento en el periodo de vida máxima esperada (MLSP, por sus siglas en inglés) en organismos que viven permanentemente en ambientes fríos, en comparación con especies similares de aguas más cálidas. Esto lleva a la pregunta de ¿Cómo la temperatura ambiental influye en el proceso de envejecimiento en los ectotermos marinos? La temperatura tiene un impacto en las tasas metabólicas y en la intensidad de formación de ERO en especies ectotérmicas. Una menor tasa metabólica estándar (SMR, por sus siglas en inglés) y una menor tasa de generación de ERO podrían, por tanto, ser un factor primordial responsable de un MLSP más largo. Comparando dos especies de almejas de ecotipos similares del Mar del Norte y la Antártida, E. Philipp y colaboradores encontraron SMR aún más bajos, una menor producción mitocondrial de ERO, una mayor capacidad antioxidante (niveles de GSH y actividad de CAT) y una mejor conservación de la función mitocondrial al pasar los años en una especie polar longeva (Laternula elliptica, MLSP de 36 años) comparada con una especie de clima templado más efímera (Mya arenaria, MLSP 13 años). Sin embargo, la temperatura parecería ser sólo uno de los factores relacionado con la configuración del MLSP de la población de una especie. La almeja de Islandia Arctica islandica llega a tener períodos de vida de varias décadas (el registro más longevo es la casi increíble edad de 374 años), mientras que la Mya arenaria del Mar del Norte no alcanza nunca a pasar los 20 años; sin embargo, la temperatura media del hábitat de ambas especies difiere tan sólo en 5 a 10ºC. Actualmente se está investigado cómo la forma de vida específica de las especies y las características ambientales del habitat de las

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

poblaciones (por ejemplo, alimentación, predadores) contribuyen a la modulación de la fisiología animal en relación con la temperatura, incluyendo la formación celular de ERO y capacidad antioxidante, influyendo así en el MLSP de la población de una especie.

❚ INVESTIGACIONES

REALIZADAS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Como se ha descrito a lo largo de este capítulo, los autores son pioneros en este campo de estudio. Además de lo antes mencionado, los autores son de los pocos investigadores que han determinado la relación entre depresión metabólica e indicadores de daños oxidativos a proteínas o lípidos. Los experimentos se realizan con diversas especies que viven en condiciones extremas. La adaptación del metabolismo de radicales libres se investiga también en invertebrados marinos de regiones antárticas y templadas.

❚ CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES

FINALES

Los animales que vivencian cambios constantes y abruptos en la oferta de oxígeno (y/o de la temperatura) presentan respuestas adaptativas (o de preparación) en sus sistemas antioxidantes. Tales respuestas fueron descritas a lo largo del capítulo, y corroboran la hipótesis de la “preparación para el estrés oxidativo”, en la cual existe un incremento de la capacidad antioxidante de los tejidos antes de que haya una elevada producción de radicales libres (seguido de daños oxidativos), tal como se da en la reoxigenación, luego de un periodo de anoxia o hipoxia, bajo deshidraCuadro 35-1. Ejemplos de cambios en los parámetros antioxidantes asociados a la vida animal en situaciones ambientales extremas Animal

Estrés fisiológico

Ejemplos de alteración

Serpiente Thamnophis sirtalis parietalis Anfibio anuro Rana pipiens

Anoxia por 10 h (5ºC)

↑ SOD e GPx (*)

Tortugas Emydoidea blandingii, Chrysemys picta, Malaclemys terrapin, Chelydra serpentina y Trachemys scripta Pez Carassius auratus

↑ catalasa, Se-GPx e GST (*) Anoxia por 16 días (4ºC) ↑ catalasa hepática (*) Anoxia por 30 h (5ºC)

Anoxia por 8 h

↑ catalasa, G6PDH y Se-GPx (*) Continúa...

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...continuación Cuadro 35-1. Ejemplos de cambios en los parámetros antioxidantes asociados a la vida animal en situaciones ambientales extremas Animal

Estrés fisiológico

Ejemplos de alteración

Cangrejo Chasmagnathus granulata Gastrópodo Biomphalaria tenagophila (un caracol de agua dulce)

Anoxia por 8 h

↑ catalasa y GST y ↓ SOD (*)

Anoxia por 24 h (26 a 27ºC) Anoxia por 20 h (5ºC)

↑ Se-GPx y ↓ catalasa (*) ↓↑ algunas enzimas antioxidantes Alta actividad de enzimas y [GSH-eq] ↓ algunas enzimas antioxidantes ↑[GSH] en hepatopáncreas y músculo del pie ↑ expresión de metalotioneína y ferritina (*) Alta [ascorbato] constitutiva en cerebro ↑ catalasa y GPx (*) ↓ protección antioxidante en varios tejidos ↑ actividad de SOD (*) ↑ [Hsp70] en sangre, cerebro y músculo ↑ Se-GPx hepática (3 h de hipoxia) (*) ↑ catalasa (*) Alta [GSH] o [GSHeq] constitutiva en hemáceas Alta actividad de diversas enzimas antioxidantes en hemáceas Muchos agrupamientos sulfhidrilo en hemoglobina

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Tortugas Trachemys scripta elegans

Gastrópodo marino Littorina littorea

Anoxia

Tortuga Trachemys scripta

Resistente a la Anoxia

Pez carpa Cyprinus carpio

Hipoxia por 5 h

Pez Leiostomus xanthurus Pez tilapia Oreochromis niloticus

Hipoxia por 12 h Hipoxia

Poliqueto Heteromastus filiformis Hipoxia Mamíferos que se Focas Phoca hispida, Mirounga leonina, baleia Balaenoptera sumergen acutorostrata, golfinhos Stenella clymene, Pontoporia blainvillei y manatí Trichechus manatus manatus Hipoxia/sumersión Tortuga Phrynops Hilarii

Continúa...

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

...continuación Cuadro 35-1. Ejemplos de cambios en los parámetros antioxidantes asociados a la vida animal en situaciones ambientales extremas Animal

Estrés fisiológico

Ejemplos de alteración

Anuro Rana pipiens

Deshidratación severa por 4 días Congelamiento (24 h)

↑ Se-GPx y catalasa y ↓ SOD y GR (*) ↑ GPx total y ↓ SOD (*) ↑ catalasa y Se-GPx (*)

Anuro Rana sylvatica

Congelamiento (5 h) Serpiente Thamnophis sirtalis parietalis Gastrópode marinho Littorina Congelamiento littorea Larva de insecto Eurosta solidaginis Congelamiento (24 h) Ardillas Spermophilus parryii

Hibernación

Ardilla Citellus citellus

Hibernación

Ardilla Spermophilus tridecemlineatus

Hibernación

Murciélago Myotis lucifugus

Hibernación

Caracol terrestre Otala lactea

Estivación (30 días)

Caracol terrestre Helix aspersa

Estivación (20 días)

Caracol acuático Biomphalaria tenagophila Sapo Scaphiopus couchii

Estivación (15 días) Estivación

↑ expressión de metalotioneína (*) ↑ catalasa (no desconge lamento) ↑ [ascorbato] en plasma y fluido cerebroespinal (*) ↑ algunas enzimas antioxidantes (*) ↑ HSP70 ↓ [GSH-eq] y ↓GR expresión de SOD, GST y Se-GPx(*) ↑ [ascorbato] en plasma y fluido cerebroespinal ↑ expresión de tiorredoxina peroxidasa, Se-HPx, GST y peroxirredoxina (*) ↑ catalasa, Se-GPX, SOD y GST (*) ↑ Se-GPx y ↑[ GSHeq] y ↓ SOD (*) ↑ Se-GPx y ↓ SOD (*) ↑↓ enzimas en varios tejidos y ↓ [GSH]

G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; GPX, glutatión peroxidasa; GPX total, GPX dependiente + independiente de selenio; GR, glutatión reductasa; GSH, glutatión reducida; GSH-eq, glutatión (GSH + GSSG); GST, glutatión-S-transferasa; Hsp70, proteína de choque térmico; Se-GPx, glutation peroxidasa dependiente de selenio; SOD, superóxido dismutasa; (*), preparación para el estrés oxidativo.

Vida animal en ambientes extremos:...

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tación severa, congelamiento, en hibernación y estivación . El cuadro 35-1 es un resumen de las observaciones experimentales que sustentan esta hipótesis. La mejor adaptación antioxidante y menor producción de ERO en animales polares se correlacionó con la vida más larga de los mismos. En este sentido, surge la pregunta ¿Los animales tolerantes a la anoxia e hipoxia también controlan la producción de ERO en la fase de reoxigenación? Resultados recientes, obtenidos con mitocondrias aisladas de goldfish, apuntan hacia esta posibilidad. Los mecanismos moleculares que regulan las respuestas antioxidantes de distintos animales en variadas condiciones extremas aún no se conocen. Por lo que se vuelve importante, entonces, revelar los mecanismos de regulación del sistema antioxidante, lo que permitirá entender mejor el proceso adaptativo de animales que viven en extremos ambientales y, seguramente, ayudará a la comprensión y tratamiento de enfermedades isquémicas que afectan al hombre.

❚ AGRADECIMIENTOS Al Dr. Evaldo Reischl (profesor jubilado de la UFRGS, Brasil) por la revisión de parte de este capítulo, al Programa de Pos-Graduación en Fisiología (USP, Brasil), a la Dra. Mina Konigsberg Fainstein (UAM) por la invitación a participar en este libro, y al CNPq (Brasil) e Instituto do Milênio-CNPq (Redoxoma) y IFS (Suecia) por el apoyo financiero.

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❚ REFERENCIAS Drew KL, Tøien Ø, Rivera PM et al.: Role of the antioxidant ascorbate in hibernation and warming from hibernation. Comp Biochem Physiol C 2002;133: 483-492. Harman D: Aging: a theory based on free radical and radiation biology. J Gerontol 1956;11:298-300. Hermes-Lima M, Storey KB: Antioxidant defenses in the tolerance of freezing and anoxia by garter snakes. Am J Physiol 1993;265:R646-R652. Hermes-Lima M, Zenteno-Savin T: Animal response to drastic changes in oxygen availability and physiological oxidative estrés. Comp Biochem Physiol C 2002;133:537-556. Hermes-Lima M: Oxygen in biology and biochemistry: role of free radicals. In: Storey K.B: Functional Metabolism: Regulation and Adaptation, Hoboken, New Jersey, Wiley-Liss,2004:319-368.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 35)

Morin P Jr., Storey KB: Antioxidant defense in hibernation: cloning and expression of peroxiredoxins from hibernating ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Arch Biochem Biophys 2007;461:59-65. Philipp E, Pörtner HO, Abele D: Mitochondrial ageing of a polar and a temperate mud clam. Mech Ageing Dev 2005;126:610-619. Ramos-Vasconcelos GR, Cardoso LA, Hermes-Lima M: Seasonal modulation of free radical metabolism in estivating land snails Helix aspersa. Comp Biochem Physiol C 2005:140:165-174. Reischl E: Sulphydryl-rich hemoglobins in reptiles: a defense against reactive oxygen species? In Woodhead A: Nonmammalian Animal Models for Biomedical Research, Boca Raton, CRC Press Inc., 1989:309-318. Storey KB: Oxidative estrés: Animal adaptations in nature. Braz J Med Biol Res 1996;29:1715-1733. Storey KB, Storey JM: Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls. Biol Rev 2004;79:207-233. Storey KB: Reptile freeze tolerance: metabolism and gene expression: Cryobiology 2006;52:1-16.

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STRATEGIAS PARA DETERMINAR LA RELEVANCIA FISIOLÓGICA DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN ANIMALES COMPLETOS Luis F. Covarrubias Robles

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❚ INTRODUCCIÓN Es de esperarse que ocurran cambios en la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) asociados a las modificaciones en el metabolismo que acompañan a los diversos procesos del desarrollo embrionario, así como a las funciones específicas de los tejidos y órganos. Por otro lado, se sabe que en respuesta a ciertas señales extracelulares se pueden producir ERO, y que éstas son necesarias para transducir señales que generen respuestas celulares específicas. Los niveles de las ERO no son determinados únicamente por cuánto se produce de cada una de ellas, sino también por qué tanto (y cuáles) son degradadas o inactivadas por los sistema antioxidantes de la célula. Entre los antioxidantes no enzimáticos más utilizados por las células de mamíferos están el glutatión (GSH) y la tiorredoxina (Trx), los que deben ser ayudados por otros compuestos como algunas vitaminas. Los sistemas antioxidantes enzimáticos son también muy diversos y están constituidos por enzimas como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y una variedad de peróxidasas, que fueron descritas ampliamente en los capítulos precedentes. Desde el punto de vista de las posibles consecuencias dañinas que resultan de la reacción de las ERO con distintos componentes celulares, pudiera pensarse que ❚ 543 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

el organismo debe estar luchando siempre por mantener sus niveles bajos; sin embargo, actualmente se conoce que la elevación de las ERO a ciertos umbrales causa efectos celulares que pueden ser esenciales para el desarrollo embrionario o las funciones de tejidos y órganos. Entre estas respuestas está incrementar o disminuir la proliferación celular, inducir la diferenciación, o causar la muerte celular. ¿Cómo determinar si estas respuestas celulares a las ERO son efectivamente esenciales para el organismo en su conjunto, y qué consecuencias pueden resultar si éstas no se llevan a cabo? Los estudios con células en cultivo sólo permiten inferir posibles funciones, pero respuestas que definan la relevancia real de las ERO no puede derivar de este sistema experimental, por lo que es necesario hacer estudios en el organismo completo. Puesto que es de particular interés contestar a estas preguntas en el contexto de los seres humanos, donde es imposible diseñar experimentos controlados, los científicos han acudido a los organismos modelo. Entre estos el ratón representa el modelo de elección para estudiar procesos relevantes para los mamíferos en general, y para el humano en particular.

❚ DETECCIÓN

DE

ERO

IN VIVO

Una primera evidencia que puede indicar una función potencial de las ERO es la correlación entre un proceso biológico y un cambio en los niveles de ERO. Existen muchos datos a este respecto en células en cultivo, pero muy pocos se han obtenido en organismos completos, particularmente durante el desarrollo. Lo anterior se debe esencialmente a la dificultad para realizar estas mediciones de manera confiable.

Directa Para determinar las ERO se pueden utilizar métodos directos basados esencialmente en el uso de colorantes o fluoróforos, donde la aparición de un color o fluorescencia resulta de la oxidación de estos compuestos. Una de las desventajas de estos métodos es que tienen que aplicarse sobre muestras frescas, lo cual se dificulta cuando se trata de tejidos embrionarios o adultos, pues la manipulación (p. ej., disección) puede causar alteraciones en el patrón de las ERO. Una alternativa que reduce significativamente este problema cuando se trata de tejidos complejos, es la detección en la pieza completa fresca; aunque el ensayo en estas condiciones aún permite hacer análisis cuantitativos, éste es más bien cualitativo. De esta forma es posible detectar tejidos específicos o capas celulares que están bajo estrés oxidativo con poca manipulación de la muestra que se está estudiando.

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Uno de los pocos colorantes que permite hacer un análisis sobre el tejido fijado es el dihidroetidio. Este compuesto tiene la propiedad de ser permeable a las células en su forma reducida, pero una vez adentro en caso de haber estrés oxídativo, éste se oxida, se convierte en etidio y se transloca al núcleo donde se une fuertemente al DNA resistiendo el proceso de fijación.

Indirecta El estrés oxidativo al que han estado sometidos los tejidos, se puede detectar de manera indirecta determinando el daño (oxidación) de diversas macromoléculas como los lípidos (lípidos peroxidados), las proteínas (p. ej., carbonilos) y el DNA (8-hidroxi-desoxiguanina). Puesto que, en general, para estos ensayos se requiere hacer extractos de los tejidos, no es posible hacer determinaciones detalladas de tejidos complejos. Un cambio en la concentración de las ERO también puede inferirse por cambios en la expresión o actividad de las enzimas antioxidantes. En respuesta a condiciones de estrés oxídativo, varias enzimas responden incrementando su expresión y actividad.

❚ ALTERACIONES

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EN LA EXPRESIÓN DE GENES QUE REGULAN EL ESTADO REDOX

Si bien las correlaciones son indicios de una posible función para las ERO, la demostración requiere la posibilidad de valorar las consecuencias funcionales cuando las ERO se incrementan en sitios o en momentos donde naturalmente sus niveles son bajos, y cuando los niveles de las ERO se reducen o se eliminan en momentos y sitios donde en condiciones normales las ERO están elevadas. Lograr estas condiciones in vivo es complicado pues la variedad de ERO es diversa y la función de cada especie puede ser específica. Además, los mecanismos que contienden con las ERO son diversos y frecuentemente redundantes. La aplicación de antioxidantes comunes es una vía para reducir las ERO, aunque no siempre lleva a resultados concluyentes, ya sea por su inespecificidad o por los desbalances metabóicos que puede causar. Cabe mencionar el desarrollo de nuevos antioxidantes llamados mimetics que imitan la actividad de la SOD y/o CAT, los cuales son poco tóxicos y muy permeables a las membranas celulares, por tanto, permiten hacer estudios in vivo. Otra manera de lograr estas alteraciones de manera más controlada y dirigida es mediante manipulaciones genéticas de las enzimas involucradas en la producción de las ERO y de las enzimas antioxidantes. Un modelo animal donde esto puede

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

lograrse es el ratón, donde en los últimos 25 años se han desarrollado una serie de tecnologías que permiten modificar la expresión génica de manera precisa y controlada. A continuación se hace una breve descripción de estas técnicas.

Ratones transgénicos Para lograr una ganancia de cierta función, comúnmente se utiliza la tecnología de producción de ratones transgénicos. Desde el punto de vista genético, la ganancia de función significa la activación de un gen de forma ectópica (en lugares distintos a los normales) y/o acrónica (en tiempos distintos a los normales). Para esto inicialmente se genera una construcción con el gen de interés (ttransgén), la cual está constituida por un promotor específico que controla el momento y el sitio donde se expresa el transgén, y las señales necesarias para el procesamiento y traducción de un RNA mensajero maduro (p. ej., sitios de empalme, sitios de poliadenilación). Una vez contando con esta construcción, ésta se inyecta a uno de los pronúcleos del huevo fertilizado. En estas condiciones, frecuentemente el DNA inyectado se integra al genoma antes o poco después de la primera división, de tal forma que la mayor parte de las células del organismo resultante llevarán el transgén; cuando el DNA se incorpora a la línea germinal (el linaje que da lugar a los gametos), se dice que se cuenta con una línea transgénica puesto que el transgén se podrá heredar a su progenie indefinidamente. Mediante esta tecnología también se puede lograr pérdida de función usando formas dominantes negativas (formas del mismo gen que inactivan al gen endógeno) del gen particular.

Mutaciones sitio específicas (gene targeting) La manera más común de lograr la pérdida de función de un gen es mediante la generación de deleciones por recombinación homóloga, estrategia comúnmente denominada como knock out. En este caso, la construcción debe incluir regiones de homología con el locus que se pretende modificar, y debe carecer de la región que se pretende deletar. Esta construcción debe contar además con elementos que permitan seleccionar las células en las cuales ocurrió el evento de homología. Comúnmente se incluye, a cambio de la región que se pretende deletar, el gen de resistencia a neomicina o algún otro antibiótico (diseño de reemplazo). Por otro lado, se incluye un gen de selección negativa que se ubica fuera de las regiones de homología. El gen más frecuentemente utilizado para este propósito es la timidino cinasa (TK) del virus de herpes. Esta enzima, en presencia de sustratos como el aciclovir, genera productos tóxicos que matan a la célula. Así entonces,

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en condiciones donde el medio contiene neomicina y aciclovir sólo deberán sobrevivir las células que hayan integrado el plásmido y que, como consecuencia de la recombinación, hayan eliminado la TK. Las células troncales embrionales (CTE) son la clave para que el procedimiento de recombinación homóloga permita la modificación del genoma de ratones completos. Estas células se pueden cultivar in vitro fácilmente, y por tanto se pueden someter al procedimiento antes descrito. Más importante, estas células se pueden incorporar al embrión, mediante la inyección al blastocele del embrión en etapa de blastocisto o agregación a embriones en etapa de mórula, y derivar en células de todos los tejidos, incluyendo las que conforman la línea germinal. De estos ratones quiméricos, llamados así porque están formados por células tanto donadoras (p. ej., CTE) como del huésped (p. ej., el blastocisto o mórula referido anteriormente), se pueden derivar animales donde todas las células llevan la modificación genética a través de simplemente cruzarlos con animales silvestres; por ejemplo, si el espermatozoide lleva la modificación genética, el huevo fertilizado dará lugar a un ratón donde todas sus células llevan esta modificación genética. Estos animales son heterocigotos (+/-) para la mutación (si bien no siempre, comúnmente la mutación generada es recesiva), por lo que es necesario cruzarlos entre ellos para generar la línea homocigota (-/- ) y así poder analizar el fenotipo resultante. Usando esta misma tecnología también es posible generar ganancia de función mediante la inserción del gen en estudio en un locus particular tal que su expresión ahora dependa de un promotor endógeno. A esta estrategia se le llama knock-in y suele usarse cuando no se cuenta con el promotor que dé el patrón de expresión requerido mediante la tecnología de microinyección al pronúcleo, referida anteriormente.

Alteraciones genéticas condicionales 1. Sistemas inducibles. Estos sistemas permiten activar o reprimir la expresión de un transgén específico mediante la inyección de un inductor que es inocuo al organismo. Para esto, el transgén que se quiere activar o reprimir se une a un promotor cuya actividad depende del factor transcripcional que responde al inductor. Uno de los sistemas más efectivos en los años recientes es el que utiliza las secuencias reguladoras del gen de tetraciclina del transposón bacteriano Tn10 y su correspondiente represor específico (p. ej., se une al operador específico en la secuencia reguladora). La molécula reguladora en este caso es la tetraciclina, sin embargo, este compuesto es tóxico para el ratón por lo que se han derivado análogos (p. ej., doxiciclina) con un muy bajo grado de toxicidad. Por otro lado, el represor ha sido alterado de tal forma que pueda funcionar en células de mamí-

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

fero como represor o como activador transcripcional. Para lograr esto, se fusionó al represor el dominio de activación transcripcional de la proteína VP16 del virus herpes simple; en este caso la presencia de la doxiciclina impide al transactivador (tTA) unirse a su secuencia blanco en el DNA. Posteriormente, otras mutaciones se introdujeron para que la presencia de la doxiciclina sea requisito para que el transactivador (rtTA) se una a su secuencia blanco. Así, con estos elementos se ha desarrollado el sistema Tet-ON, en el cual la presencia de doxiclina activa al transgén, y el sistema Tet-OFF, en el cual la doxiclina reprime al transgén. 2. El sistema Cre-loxP. Este sistema permite generar mutaciones asociadas a un tejido particular y/o a un momento específico del desarrollo embrionario o la vida adulta. El eje de la técnica reside en el control de la expresión sitio y/o tiempo específico de una enzima recombinasa cuya actividad depende de secuencias específicas. La recombinasa más utilizada hasta la fecha es la denominada Cre proveniente del fago bacteriano “P1”. Esta enzima reconoce la secuencia denominada loxP, de manera que, cuando dos secuencias loxP se encuentran en la misma dirección (es decir la secuencia del DNA se lee igual de su extremo 5’ al extremo 3’), el fragmento de DNA entre ellas dos se deleta. Así entonces, la aplicación de esta tecnología requiere que en primera instancia se le inserten secuencias loxP (comunmente en intrones para no alterar la secuencia codificante y el gen siga siendo funcional) flanqueando el fragmento de DNA (comunmente uno o más exones) que se quiere deletar del gen X de interés (alelo loxeado; XloxP). Para mutaciones sitio-específicas (p. ej., en un tejido o tipo celular específico), se producen inicialmente ratones transgénicos (por la técnica clásica de microinyección pronuclear referida anteriormente) que expresen Cre sólo en un tejido o tipo celular determinado (por medio del uso de promotores específicos). Actualmente ya existe una colección disponible de transgénicos donde Cre se expresa de manera restringida en algunos tejidos. El paso siguiente consiste en cruzar estos ratones transgénicos Cre –referidos en inglés como deleters— con los ratones que llevan el alelo ‘loxeado’ del gen de interés (para obtener ratones con el genotipo Cre/+; XloxP/XloxP). La expresión de Cre en el tejido específico (determinado por el promotor elegido) hará que los sitios loxP realicen una recombinación dejando atrás una deleción, y por lo tanto alelos nulos del gen en cuestión. Frecuentemente, para incrementar la eficiencia de obtener células con los dos alelos nulos depués de la acción de la recombinasa, se incorpora un alelo nulo (Cre/+; X-/XloxP), de tal forma que solo un alelo tiene que ser deletado por la recombinasa. En el caso del KO condicional-temporal, se recurre al empleo de promotores que se activan a tiempo específicos o que son inducibles, como el sistema referido en la sección anterior, para controlar la expresión de Cre. Las técnicas descritas anteriormente ofrecen multitud de posibilidades, dejando al ingenio del investigador obtener los resultado deseados. Otras técnicas que

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pudieran acelerar el determinar el fenotipo que se manifiesta en consecuencia de una disminución en la expresión de un gen particular están actualmente en desarrollo. Probablemente las técnicas que tendrán más auge en el futuro cercano son las basadas en el proceso de intereferencia al RNA (iRNA).

❚ GANANCIA Y PÉRDIDA DE FUNCIÓN DE GENES REGULADORES DEL ESTADO REDOX Usando las técnicas descritas anteriormente para alterar la expresión de los genes que codifican para las proteínas asociadas a la producción de las ERO, o a su eliminación, es posible determinar la función de la proteína oxidante o antioxidantes en el desarrollo embrionario o la vida adulta, así como su asociación con enfermedades, algunas de las cuales pudieran presentarse en el humano. Para una mejor evaluación de la función se requiere contar con resultados tanto de ganancia de función p. ej., sobreexpresión del gen) como de pérdida de función (p. ej., mutaciones nulas). A continuación se hace una breve descripción de los efectos que ha resultado de alterar la expresión de proteínas o enzimas antioxidantes.

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Superóxido dismutasa En los mamíferos existen tres tipos de supoeróxido dismutasas, cada una localizada principalmente en compartimentos distintos; la SOD1 es esencialmente citosólica, la SOD2 mitocondrial, y la SOD3 extracelular (véase el capítulo de Superóxido dismutasa). A la fecha se han producido ratones con mutaciones nulas en los tres genes que codifican para las diversas SOD. Los ratones homocigotos para mutaciones nulas en el gen Sod1 (Sod1-/-) o Sod3 (Sod3-/-) nacen sin un fenotipo evidente, lo que indicaría que el desarrollo embrionario puede ocurrir en ausencia de las enzimas codificadas por estos genes. No obstante, aunque cada enzima se localiza en distinto compartimiento celular, es posible que haya un cierto grado de redundancia entre los dos genes, es decir, que la enzima SOD1 sea capaz de compensar las funciones de SOD3 o viceversa. En este sentido, dobles mutantes para los genes Sod1 y Sod3 (Sod1-/-; Sod3-/-) también nacen sin fenotipo evidente, indicando que por lo menos estos dos genes no son redundantes. En edades posnatales los ratones Sod1-/- y Sod3-/- muestran anormalidades moderadas. El mutante en Sod1 tiene una vida corta, pero esto, más que debido al envejecimiento, es consecuencia del desarrollo de carcinomas hepatocelulares. El mutante en Sod3, en cambio, no muestra ningún fenotipo aparente en condiciones normales, pero cuando estos son estresados con alta tensión de oxígeno, mueren prematuramente, lo que no sucede con el mutante en Sod1.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

En contraste con los mutantes anteriores, los ratones con mutaciones nulas homocigotas en el gen Sod2 (Sod2-/-), sí muestran un fenotipo severo que causa su muerte en la etapa perinatal. La muerte parece estar asociada a severas alteraciones neurológicas y cardiacas. Este fenotipo no es compensado por la sobreexpresión de un transgén de Sod1. Puesto que la SOD2 se localiza en la mitocondria y la SOD1 en el citosol, lo anterior pudiera estar indicando que la mitocondria es la principal fuente de superóxido, o los principales blancos de éste están en la mitocondria en condiciones normales. Los ratones transgénicos que sobreproducen las tres enzimas también se han generado. Usando transgenes que codifican para las formas silvestres de las SOD, no se han observado fenotipos en condiciones normales; particularmente la longevidad de estos ratones no parece alterarse, si bien muy altos niveles de SOD2 si parecen reducir su viabilidad y fertilidad. No obstante lo anterior, la sobreproducción de ellas sí lleva a la protección ante insultos. Por ejemplo, se ha observado que la sobreexpresión tanto del gen Sod1 como de Sod2 puede proteger de daño cerebral o al corazón que ocurre después de una isquemia local. Por otro lado, la sobreexpresión de Sod2 o Sod3 protege el desarrollo de los alveolos pulmonares cuando ratones recién nacidos son sometidos a condiciones de hiperoxia. Un caso interesante son los ratones transgénicos que se han generado que sobreexpresan el gen Sod1 humano (hSod1) que incluye alguna de las mutaciones asociadas a la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), enfermedad degenerativa caracterizada por la muerte paulatina de las motoneuronas que inicialmente lleva a parálisis progresiva, y finalmente a la muerte. Los ratones transgénicos que expresan la hSod1ALS desarrollan la enfermedad de manera muy similar a como ocurre en humanos, sin importar que los dos alelos silvestres de Sod1 del ratón se encuentren presentes. Esto significa que la hSod1ALS tiene una función “nueva” dominante, más que una disminución o incremento en la actividad de superóxido dismutasa, pues la enfermedad no se desarrolla en los animales que carecen de Sod1 o en los que sobreproducen la forma silvestre de la enzima.

Catalasa La CAT, en contraste con la mayoría de las peroxidasas de los mamíferos, es la única enzima capaz de mantenerse activa a altas concentraciones de peróxido. A pesar que desde hace muchos años se describieron ratones (y también humanos) acatalasémicos, estos animales en sí, no tienen una pérdida general de la actividad de catalasa, sino más bien una disminución que no siempre afecta igual a todos los tejidos. Usando la tecnología de knockout recientemente se han producido ratones con deleciones en el gen (Cas-/-) que carecen totalmente de la actividad de catalasa. Estos animales nacen sanos y, aparentemente, su vida adul-

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ta transcurre sin anormalidades evidentes; sin embargo, estos animales sí muestran mayor daño oxidativo, y aparente incremento en la sensibilidad a este tipo de daño. Más estudios van a ser necesarios para determinar si la longevidad de los ratones Cas-/- está afectada o si son susceptible a desarrollar alguna enfermedad. Hepatocitos y fibroblastos de ratones transgénicos que sobreexpresan de 2 a 4 veces más Cas que los ratones silvestres, en los mismos tejidos donde normalmente se expresa este gen, son resistentes a dosis letales de peróxido, pero inesperadamente son más sensibles al paraquat y la irradiación gamma. Por otro lado, usando un promotor específico del corazón se logró sobreexpresar Cas exclusivamente en este órgano. En estos ratones transgénicos, la catalasa reduce la miocardiopatía asociada a ratones diabéticos y la cardiotoxicidad por la droga anticancerígena doxorrubicina. La CAT se localiza mayoritariamente en el peroxisoma. La localización de la enzima en este organelo depende de una secuencia en su extremo carboxilo. Eliminando esta secuencia e incluyendo secuencias que determinan la localización de las proteínas en el núcleo o mitocondria, es posible reubicar la CAT en la mitocondria, el núcleo o el citoplasma. Usando esta estrategia se observó que ratones transgénicos que sobreproducen la CAT en la mitocondria, pero no en el núcleo o peroxisoma, de varios tejidos incluyendo el corazón, y el cerebro, incrementan la longevidad en un 20%. Estos resultados son consistentes con la propuesta de que la mitocondria es la fuente más importante de ERO durante la vida de los mamíferos.

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❚ GLUTATIÓN Y GLUTATIÓN

PEROXIDASAS

El GSH junto con la Trx se consideran los agentes reductores que, bajo condiciones fisiológicas, se encargan de mantener el ambiente reductor intracelular de la mayoría de las células. Éstos pueden actuar directamente sobre algunas ERO, interactuar con proteínas diversas y ser sustratos fundamentales de enzimas antioxidantes (véase más adelante). La biosíntesis de glutatión reducido (GSH) se lleva a cabo por dos enzimas: la γ-glutamilcisteína sintetasa (GCS) y la GSH sintetasa. La primera es la enzima limitante en la síntesis y está formada por dos subunidades, una catalítica y una reguladora. Mutaciones homocigotas en el gen que codifica para la subunidad catalítica causan muerte del embrión de ratón a 13.5 días de gestación (la gestación completa del ratón es de aproximadamente 20 días), tiempo en el cual los primordios de todos los órganos ya se han formado. Pudiera ser que la Trx sea la responsable de que se alcancen etapas avanzadas del desarrollo embrionarios en ausencia de GSH. Existen cinco genes que codifican para las glutatión peroxidasas (GPx) y quizá un sexto aún no bien caracterizado. Los ratones que llevan mutaciones nulas en ambos Gpx1, que codifica para la GPx que se expresa en la mayoría de los tipos

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(Capítulo 36)

celulares, y Gpx2, aparentemente se desarrollan normalmente, son fértiles y sólo muestran anormalidades moderadas durante la vida adulta normal, incluyendo sensibilidad incrementada al estrés oxidativo. En cambio, los embriones de ratones que tienen mutaciones en Gpx4 mueren a los 7 días de gestación durante la organogénesis. Estos datos indican que, aunque pudiera haber redundancia entre ciertas GPx, algunas poseen funciones muy especializadas que no pueden ser sustituidas fácilmente. La GPx4 es una enzima muy peculiar en cuanto que es activa como monómero y es la única enzima capaz de reducir los lípidos peroxidados producidos en las membranas celulares. Llama la atención que viva menos un embrión que le falta una peroxidasa, que uno que supuestamente no tiene GSH. Una posible explicación a esta discrepancia es que el embrión recibe cierto aporte de GSH de la madre, lo que le permite extender la vida mas allá de la organogénesis. Este tipo de fenómenos es necesario considerarlos cuando el producto del gen que se ha mutado es un factor difusible. De manera similar a la sobreproducción de otras enzimas antioxidantes en ratones transgénicos, la sobreexpresión de Gpx1 ofrece protección ante isquemia experimental al miocardio o al cerebro, al igual que a otros insultos lo que se asocia a incrementos en la sobrevivencia celular. Un caso especial, es la sobreexpresión de Gpx4 pues en este caso la enzima evita la muerte celular causada por varios agentes que inducen la producción de estrés oxidativo, pero esta parece estar asociada a su localización en la mitocondria, pues el efecto protector se reduce si no se localiza en este organelo. En la mitocondria evita el daño a los fosfolípidos mitocondriales como la cardiolipina, una probable causa de la muerte celular.

Tiorredoxina y peroxirredoxinas Existen dos tipos de Trx en el ratón, la forma citosólica (Trx1) y la forma mitocondrial (Trx2), cada una codificada por un gen específico. Mutaciones nulas en los genes que codifican para las Trx son letales para el ratón haciendo evidente el papel fundamental de estas proteínas para el desarrollo de los mamíferos. Las mutaciones en Trx1 causan la muerte del embrión poco después de la implantación al útero, probablemente asociado a una reducción de la proliferación en la masa celular interna (tejido que dará lugar al embrión como tal), mientras que las mutaciones en Trx2 mueren a la mitad de la gestación mostrando abundante muerte celular y exencefalia. Por otro lado, Trx1, en ratones transgénicos que sobreexpresan su gen, protege a las células de varios insultos que causan estrés oxidativo; por ejemplo, evita la muerte neuronal causada por isquemia o oxitotoxicidad. La actividad de la Trx es controlada por la tiorreodoxin reductasa (TrxR) con el requerimiento de NADPH. Tres genes que codifican para esta enzima: TrxR1,

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para la forma citosólica; TrxR2, para la forma mitocondrial; y TrxR3, para una forma aparentemente específica del testículo. Mutaciones nulas en TrxR1 y TrxR2 son letales observándose en los embriones muerte celular aumentada y afectación en la proliferación celular. Los ratones mutantes TrxR1-/- mueren a la mitad del periodo de gestación donde parecen afectarse todos los tejidos, pero por lo menos, no es esencial para la supervivencia de los cardiomiocitos; en cambio, los ratones TrxR2-/- mueren a los 13.5 días de gestación con anormalidades en el hígado y el corazón, lugares donde hay cantidades abundantes de la enzima. Tanto para los genes que codifican para las TrxR como los que codifican para las Trx, los animales heterócigos para sus correspondientes mutaciones nulas muestran sensibilidad al estrés oxidativo, sugiriendo su relevancia en el organismo adulto. Las peroxirredoxinas (Prx) son pequeñas peroxidasas cuyo sustrato principal es la Trx. En mamíferos existen por lo menos 6 genes que codifican para Prx, de los cuales por lo menos tres se han mutado a la fecha: Prx1, Prx2 y Prx6. Es interesante que ratones Prx1-/- y ratones Prx2-/- muestran un incremento en el daño oxidativo a los componentes de las membranas y la hemoglobina de reticulocitos y eritrocitos, lo que reduce la vida de estos últimos y provoca anemia hemolítica que finalmente lleva a su muerte prematura. Este resultado es consistente con el hecho de que los reticulocitos y eritrocitos están sujetos a una enorme producción de ERO debido a la alta concentración de oxígeno y de hierro del grupo hemo. Mutaciones en otros sistemas antioxidantes suelen generar un síntoma similar, pero al parecer las Prx1 y Prx2 están entre las enzimas antioxidantes más importantes para mantener bajos los niveles de ERO en estas células. Además, los ratones Prx1-/- y Prx1+/- desarrollan tumores que se relacionan con cambios en la actividad de algunos protooncogenes, sugieriendo que la Prx1 actúa como un supresor de tumores. La Prx2 también parece contribuir a incrementar la proliferación celular, pues en su ausencia la actividad mitogénica de PDGF se incrementa notoriamente. De manera paradójica, los fibroblastos provenientes tanto de ratones Prx1-/- como Prx2-/- senescen prematuramente, lo que es un signo de que los animales mutantes envejecen más rápido. La Prx6 se expresa en altos niveles en el pulmón. Ratones transgénicos que sobreexpresan al gen Prx6 en este órgano aumentan la resistencia a daño al pulmón por hiperoxia, mientras que en los ratones nulos en Prdx6 hay más daño al pulmón y mortalidad en respuesta a hiperoxia.

❚ CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

FINALES

El estudio genético de las enzimas involucradas en el metabolismo de las ERO representa una oportunidad para determinar su relevancia fisiológica, y definir cuál es su papel específico en procesos del desarrollo o de la vida adulta. Además,

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

los estudios genéticos pueden ser fundamentales para determinar la participación de las ERO en el desarrollo de enfermedades diversas, e inclusive para identificar la enzima que es más relevante bajo ciertas circunstancias fisiológicas. Los estudios realizados con los genes que codifican para proteínas antioxidantes ya han dado resultados sorprendentes. Como se describió arriba, al ser eliminadas enzimas que se encuentran en muchas de las células del organismo, como las SOD, la CAT, y la GPx1, se demostró que la carencia de algunas de ellas no es esencial para la vida del ratón en condiciones controladas, ya que muchas tienen funciones redundantes; situación similar ocurre para otras enzimas antioxidantes. En contraste, llama la atención que una peroxidasa, la GPx4, sea esencial para la viabilidad del embrión. Por otro lado, en forma esperada, los estudios genéticos refuerzan el papel vital del GSH y la Trx para el embrión y el ratón adulto. En general, es consenso que la ausencia de alguna proteína antioxidante genere sensibilidad a distintos insultos que generan estrés oxidativo, si bien, en algunos casos, se asocia al funcionamiento de un órgano particular, lo que se explica del patrón de expresión del gen que la codifica. En forma contraria, la sobreexpresión de un gen que codifica para una proteína antioxidantes, siempre protege del estrés oxidativo al órgano o tipo celular donde se dirigió la expresión ectópica en el animal transgénico. Una pérdida o ganancia de función del gen que codifica para una proteína antioxidante no sólo afecta la actividad de la proteína antioxidante en sí, sino también, por supuesto, produce cambios en los niveles de ERO específicas, las cuales finalmente son las molécula activas. Es decir, una pérdida de función del gen que codifica para una proteína antioxidante lleva a una ganancia de función representada por la actividad de la ERO específica que no se eliminó. Por el contrario, la ganancia de función o sobreexpresión del gen que codifica para la proteína antioxidante lleva a una pérdida de función, es decir, la desaparición de una ERO específica. Esta situación se ejemplifica muy bien con la sobreexpresión del gen de distintas enzimas antioxidantes que procesan la misma ERO. En este caso la función del gen es secundaria a la función de la ERO, ya que independientemente de cual haya sido el gen que se sobreexprese, la desaparición de la ERO ocurrirá de manera similar. De esta forma obtenemos información de la posible función de la ERO, pero no así de la enzima antioxidante, es decir, no nos dice cuándo ésta es relevante en la degradación de la ERO. Por esta razón, no resulta sorprendente que la sobreexpresión de distintas enzimas antioxidantes tengan un efecto protector similar. Un aspecto que es necesario considerar, particularmente cuando se sobreexpresa un gen, es si todos los componentes que le dan actividad a la proteína son suficientes para generar al complejo molecular activo. Casi todas las enzimas antioxidantes son homocomplejos, por tanto, aparentemente no habría una subunidad proteínica que pudiera limitar su actividad. Sin embargo, algunas proteínas

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Estrategias para determinar la relevancia fisiológica...

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antioxidantes, como las GPx y la TrxR, son selenoproteína a las cuales se les tiene que incorporar la selenocisteína a través de un tRNA específico durante la traducción del RNA mensajero. El tRNA para la selenocisteína puede ser limitante, por tanto, la sobreexpresión del gen de alguna seleno-proteína podría limitarse por la cantidad de ese RNA. Como se mencionó al principio, las ERO no deben considerarse actualmente como simples agentes que dañan componentes celulares, sino también como agentes que pueden actuar como señalizadores intracelulares, necesarios para que ocurran normalmente ciertos procesos celulares. En este sentido, los sistemas antioxidantes son reguladores de estas cascadas de señalización. Por ejemplo, la Trx interacciona con Ref1, lo cual es esencial para la regulación redox de la actividad transcripcional del complejo AP1; Ref1/Trx tiene un efecto similar sobre NFκB. En otro caso, la Prx2 interacciona con el receptor a PDGF y de esta forma regula el incremento en peróxido, proveniente de la actividad de la NADPH oxidasa, que son necesarios para producir sus efectos mitogénicos. Los estudios genéticos pueden permitir evidenciar estas interacciones in vivo mediante el estudio de combinación de mutantes en los genes que codifican para las proteínas en cuestión (la interacción no necesariamente tiene que ser física). Por ejemplo, es de esperarse que mutaciones que mantienen activo al receptor a PDGF (algunas con propiedades oncogénicas) pudieran atenuarse si se sobreexpresa en el mismo ratón la Prx2. De manera similar, la sobreactivación de AP1 (común en algunos tipos de cáncer) pudiera ser atenuada en la ausencia de Trx. Dados los abundantes antecedentes que indican que el daño oxidativo es un factor relevante en el envejecimiento y la longevidad, se ha esperado que animales con mutaciones nulas en el gen de alguna enzima antioxidante envejezcan prematuramente, y animales que sobreexpresan ese gen envejezcan más lentamente y sean más longevos. Sin embargo, pocos estudios genéticos a la fecha han contribuido claramente a esta hipótesis, especialmente debido a efectos en procesos colaterales al envejecimiento que causan la muerte prematura del ratón, o porque el gen de la enzima no se sobreexpresa ubicuamente o en el compartimiento celular adecuado, por lo que los incrementos en la longevidad son sólo moderados. Esta área requiere estudiarse de manera más sistemática para obtener conclusiones definitivas en relación a cada uno de los genes que contribuyen a mantener el estado redox. Multitud de estrategias existen actualmente para modificar la expresión génica en forma controlada en el ratón. No obstante, la función de los genes que participan en el control del estado redox sólo se ha iniciado con las estrategias básicas de transgénesis y mutagénesis dirigida. Por ejemplo, la expresión inducible y la mutación condicional de genes no se han aprovechado ampliamente para estudiar la función de proteínas antioxidantes, lo que contribuiría a elucidar la función de genes como GPx4, Trx, y TrxR, y determinar los tejidos u órganos

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 36)

donde actúan preferencialmente ciertas ERO o enzimas antioxidantes. Por otro lado, mutaciones en enzimas antioxidantes que aparentemente no genera ningún fenotipo anormal, pudieran producir trastornos importantes cuando se combinan con mutaciones en otros genes. Por ejemplo, la tumorigénesis inducida por expresión de oncogenes o mutaciones nulas en genes de supresores tumorales pudiera verse modificada por cambios en la actividad de enzimas antioxidantes. Como se mencionó al principio, sin lugar a dudas, el ratón es el organismo modelo que más semejanzas tiene con el humano. Sin embargo, hay otros organismos modelo que por sus posibilidades experimentales, muchas de ellas asociadas a estudios genéticos, suelen ser convenientes para responder algunas preguntas que en el ratón pudiera ser más difícil o se llevaría más tiempo lograr la respuesta. Entre los vertebrados, se encuentran el Xenopus (un anfibio), el pollo, y el pez cebra. Este último es particularmente interesante para hacer estudios globales de los componentes genéticos que controlan el estado redox en vertebrados, pues los muestreos de mutaciones al azar que afectan el estado redox son mucho más fácil de realizar en este organismo en comparación con el ratón. Aspectos básicos del impacto biológico en animales causado por alteraciones en el estado redox, se pueden realizar en organismo modelo aún más sencillos como Drosophila melanogaster (la mosca de la fruta) o el nematodo Caenorhyabditis elegans. En estos organismos, dado su corto ciclo de vida y la variedad de estrategias genéticas disponibles, ha sido posible estudiar las consecuencias de alterar el estado redox en el envejecimiento y la longevidad. En la presente era posgenómica, cuando se dispone de la secuencia completa de los genomas de todos los organismos modelos mencionados, y cada vez es más evidente que las cascadas de señalización se han conservado de manera sorprendente a lo largo de la evolución, la integración de la información proveniente de todos los organismos modelos es fundamental para que en un menor plazo comprendamos el papel fisiológico de las ERO, y como alteraciones en su metabolismo pueden contribuir al desarrollo de padecimientos que afectan al humano.

❚ REFERENCIAS Huang TT, Raineri I, Eggerding F et al.: Transgenic and mutant mice for oxygen free radical studies. Methods Enzymol 2002;349:191-213. Imai H, Hirao F, Sakamoto T et al.: Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene. Biochem Biophys Res Comm 2003; 305:278-286. Jakupoglu C, Przemeck GK, Schneider M et al.: Cytoplasmic thioredoxin reductase is essential for embryogenesis but dispensable for cardiac development. Mol Cell Biol 2005;25:1980-1988.

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S

ECCIÓN

IX.

NUTRICIÓN

37. Aspectos nutriológicos de los carotenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561 38. Aspectos nutriológicos de la vitamina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579 39. Aspectos nutriológicos de la vitamina E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595

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40. Actividad física y estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613

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37

A

SPECTOS NUTRIOLÓGICOS DE LOS CAROTENOS Héctor Bourges Rodríguez

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❚ INTRODUCCIÓN Se conoce como carotenos a una familia muy amplia de pigmentos de naturaleza lipídica, de color rojo, naranja o amarillo, que están presentes en innumerables especies, desde arqueobacterias hasta algas, hongos, animales y plantas. Su conservación en la evolución sugiere que realizan funciones metabólicas importantes. El nombre carotenos viene del inglés carrot, zanahoria, ya que de este alimento se aisló en 1911 el primero de ellos, el hoy llamado caroteno β. En ese entonces no se le atribuyó ningún papel metabólico, pero en 1930 se descubrió que en el enterocito el caroteno β se convierte en vitamina A (que McCollum y Davis habían descubierto en 1913) por lo que desde esa época se ha considerado a los carotenos como provitaminas A. El término carotenoides se emplea para referirse al conjunto de los carotenos y de algunos de sus derivados cercanos con los que comparten muchas características. Sus funciones en distintos organismos son diversas: a) Se cuentan entre las primeras sustancias en la evolución capaces de captar la luz del sol como fuente de energía y se han conservado, de manera que ❚ 561 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 37)

en las plantas superiores siguen compartiendo este papel con la clorofila como pigmentos accesorios en la fotosíntesis capaces de captar una gama amplia de longitudes de onda. En algunas plantas, las epoxixantofilas reducen el riesgo de daño por luz. b) Dan colorido a las plantas y los animales (de manera notable a flamingos y crustáceos). Además de transmitir belleza al ojo humano, que no es poca cosa, juegan un papel crucial en la reproducción de plantas y animales pues el color de las flores atrae insectos que esparcen el polen y el color de las plumas de las aves marca los ciclos de apareamiento. c) En las halobacterias y los animales, algunos carotenos (alrededor de 50) pueden convertirse en la vitamina A, que a su vez tiene numerosas funciones metabólicas. Aunque casi 50 carotenoides pueden convertirse en vitamina A, sólo el caroteno β, el caroteno α y la criptoxantina tienen importancia práctica en este sentido. d) Aunque pueden también actuar como oxidantes, en los sistemas biológicos predomina su efecto antioxidante y por ello se les considera parte del sistema de protección del organismo contra radicales libres y otros oxidantes (capítulo 17). A la fecha se han identificado entre 600 y 800 carotenoides, aún sin tomar en cuenta los isómeros, hecho que hace difícil revisarlos en forma particular.

❚ ESTRUTURA QUÍMICA Los carotenos son hidrocarburos formados por cadenas poliisoprenoides, casi siempre de 40 carbonos, con un complejo sistema de dobles ligaduras conjugadas. La mayoría muestran simetría interna y a menudo tienen una o dos estructuras cíclicas en los extremos de la cadena. Por ser lipofílicos tienden a incorporarse en las membranas celulares y los liposomas e interactuar con ellos. Los isómeros trans predominan sobre los cis, que son menos estables. Los carotenos que consisten sólo de una cadena de hidrocarburo simple, como son por ejemplo el caroteno α y el caroteno β, pueden tener cada uno cientos de isómeros cis posibles. De los carotenos simples se producen numerosos derivados entre los que cabe destacar: a) Los oxocarotenoides o xantofilas, como las criptoxantinas β y α, la luteína y la zeaxantina. Las xantofilas pueden esterificarse con ácidos grasos y hacerse más hidrofóbicos o combinarse con glúcidos y volverse más polares.

Aspectos nutriológicos de los carotenos

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La luteína y la zeaxantina no se separan claramente en cromatografía por lo que suelen informarse juntas en la mayoría de los estudios. b) Los cetocarotenoides como la cantaxantina y la astaxantina Estos carotenoides pueden formar complejos con proteínas. En la figura 17-2 del capítulo: Potencial antioxidante de los carotenoides, se presenta la estructura de algunos de ellos.

❚ BIOSÍNTESIS

DE CAROTENOS EN LAS PLANTAS Y LOS MICROORGANISMOS

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La biosíntesis de los carotenos se inicia con el ácido mevalónico que se produce a partir de la β-hidroxi-β-metil-glutaril-coenzima A. Los fragmentos de 5 carbonos se condensan sucesivamente a compuestos de 10, 15 y 20 carbonos, y dos de éstos se unen para formar el cis,15,15´fitoeno que se deshidrogena para llegar a neurosporeno. Este intermediario puede deshidrogenarse para formar el licopeno del cual, por formación de anillos en los extremos de la cadena, se derivan los carotenos β y α. Estos dos carotenos se combinan con el oxígeno molecular para formar mono y di hidro carotenoides o xantofilas, que a su vez pueden dar derivados epoxi. El caroteno α se oxigena y produce cetocarotenoides como la cantaxantina. En bacterias, el neurosporeno se metoxila y oxida a cetocarotenos como la esferoidenona que interviene en la fotosíntesis.

❚ FUENTES

EN LA DIETA

Las fuentes de carotenoides más importantes en la dieta humana son la mayoría de los tejidos vegetales de color rojo, naranja, amarillo o verde (puesto que donde hay clorofila hay carotenos), es decir, las verduras, las frutas y algunas semillas. En los alimentos se les encuentra en dos formas principales, como solución oleosa (p. ej., en la palma roja) o como parte de matrices complejas con fibras alimentarias, polisacáridos digeribles y proteínas (en verduras y frutas). Por tratarse de numerosas sustancias diferentes es complicado describir sus fuentes en forma general. En las cuadros 37-1 y 37-2 se presenta respectivamente el contenido de caroteno β y de luteina y zeaxantina en algunos alimentos. En términos generales, las mayores concentraciones se encuentran en: a) Caroteno β. En los chiles secos, el chabacano seco, la zanahoria cocida, el tejocote, la malva, el quelite cenizo, la col china, la calabaza amarilla, la espinaca cocida y el camote, entre otros.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 37)

Cuadro 37-1. Contenido de caroteno β en algunos alimentos (mg/100 g de porción comestible) Chile (seco)1 Chabacano (seco) Zanahoria cocida Tejocote Malva Quelite cenizo Col china Calabaza amarilla Espinaca cruda Cilantro Perejil 1

10.00 a 60.00 17.60 9.80 6.40 6.00 6.00 5.40 5.00 4.10 4.00 4.00

Lengua de vaca 4.00 Xocoyol 4.00 Acelga 300 a 400 Nabo 3.00 Romeritos 3.00 Verdolaga 3.00 Camote 3.00 Melón 3.00

Hojas betabel Mamey Brécol crudo Mango Lechuga Jitomate (jugo enlatado) Jitomate crudo Papaya Maíz amarillo Naranja

2.60 1.50 1.30 1.30 1.20 0.9 0.50 0.10 0.05 0.04

Mulato, pasilla, morita, ancho, guajillo.

b) Caroteno α. En la zanahoria cocida , el maíz amarillo, la calabaza y en menor grado el melón y la naranja. c) Licopeno. En muchos frutos rojos, en especial el jitomate cocido, la sandía, la guayaba y, en menor cantidad, el jitomate crudo, el chabacano seco y la toronja rosada. d) Luteina y zeaxantina. En la col china, la espinaca cocida, las hojas de betabel, el brécol y la lechuga. Aunque no aparecen en el cuadro, también son buenas fuentes el pimiento rojo y la calabaza. e) Criptoxantina . En la papaya, la naranja, el durazno y el mango. La cocción suele elevar la digestibilidad y en algunos casos, la molienda de los alimentos contribuye a liberar los carotenoides de las matrices en que se encuentran.

❚ DIGESTIÓN Y BIODISPONIBILIDAD Las proteasas intestinales liberan a los carotenos de su unión con las estructuras celulares de los alimentos. Los carotenos, en especial el caroteno β y el licopeno, se solubilizan junto con otros lípidos de la dieta en las micelas formadas con las sales biliares. Por su parte, los esteres de xantofilas deben ser hidrolizados para poderse absorber. Las matrices en las que se encuentran los carotenoides en las verduras y frutas no se rompen del todo durante la preparación culinaria ni durante la digestión, lo que hace que la biodisponibilidad sea muy variable; mientras que la de los

Aspectos nutriológicos de los carotenos

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Cuadro 37-2. Contenido de luteína-zeaxantina en algunos alimentos (mg/100g de porción comestible) Col china Espinaca cocida Hojas betabel Brécol crudo Lechuga

16.30 10.20 7.70 1.80 1.80

Maíz amarillo Zanahoria cocida Jugo de jitomate enlatado Jitomate crudo Naranja

0.80 0.30 0.33 0.1 0.01

carotenos en la zanahoria cruda es sólo 10%, en las disoluciones oleosas llega hasta 50%. Las fibras alimentarias, en especial las pectinas, así como la escasez de lípidos en la dieta, la deficiencia de sales biliares, la aclorhidria y otras causas de mala absorción, reducen la biodisponibilidad de los carotenos.

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Absorción No se conoce aún ningún sistema de transporte de carotenos al través de la membrana del enterocito, por lo que se acepta que se absorben por difusión pasiva junto con los monoacil gliceroles y que lo hacen con una eficiencia entre 10 y 50%. La fracción de los carotenos que se absorbe es inversamente proporcional a su aporte dietario. Los más polares se absorben mejor y la luteína se absorbe dos veces más rápido que el caroteno β. El isómero 9 cis del caroteno β se absorbe bien, pero no se transporta, por lo que se supone que se convierte en 9 trans. En el caso del licopeno, algunos isómeros cis (que se pueden producir durante el cocimiento) se absorben mejor que el trans. Los apocarotenales y apocarotenoles β se absorben bien. Los diversos carotenos interfieren entre si, en forma no competitiva, durante la absorción. Así, el caroteno β reduce la absorción de cantaxantina y luteína; por otra parte, la vitamina E reduce la concentración plasmática de los carotenos, por lo que se supone que interfiere con su absorción En este paso, una parte de los carotenos ingeridos se convierte en vitamina A y los que quedan se absorben intactos, pasan a la circulación por vía linfática y se almacenan en el tejido adiposo.

Conversión en vitamina A En este terreno existen aún muchas incógnitas. Desde 1930 se sabe que el caroteno β se transforma en retinal en el enterocito, pero puede hacerlo también en

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 37)

el hígado y otros tejidos. Si se observa la estructura química del caroteno β, se nota que corresponde con la de dos moléculas de retinol unidas por sus carbonos terminales (carbonos 15 y 15’) por lo que teóricamente se podría convertir en una cantidad igual de retinol. En la estructura de los demás carotenos convertibles en vitamina A, sólo una de las dos mitades corresponde con el retinol, por lo que su conversión es 50% menos eficiente. La enzima 15,15’ caroteno dioxigenasa (también presente en el hígado),hidroliza los carotenos en el citosol del enterocito y los convierte en retinal; es todavía incierto si la ruptura ocurre en el centro de la estructura del caroteno o si la ruptura es asimétrica, pero se cree que ésta última es poco probable. A su vez, el retinal se convierte en retinol mediante una aldehído reductasa y en ácido retinóico que se oxida y se excreta. Algunas xantofilas también pueden ser transformadas en retinol, de manera particular las criptoxantinas. La eficiencia de la conversión de carotenos en retinal es, en la práctica, mucho menor que la que se esperaría de acuerdo con su estructura química. El caroteno β en solución oleosa rinde 50% de retinal, pero el que está en verduras fritas rinde sólo 5%. La eficiencia de conversión aumenta si hay deficiencia de vitamina A. Puesto que la eficiencia de conversión es tan variable, y tan difícil de predecir, continúa en uso la regla práctica establecida por la Organización Mundial de la Salud en 1967 de considerar que el holotrans caroteno β rinde 1/6 de retinal y los demás 1/12; en otras palabras, para obtener 1 µg de retinol se requieren en promedio 6 µg de holotrans caroteno β o 12 µg de otros carotenos convertibles.

Unidad de actividad de vitamina A Dado que en la dieta concurren el retinol y los carotenos, con base en la regla de la OMS se ha creado una unidad de actividad de vitamina A llamada microgramo equivalente de retinol (µg Eq o µg ER) con la que se miden los aportes de la dieta y los requerimientos de la vitamina A. Así, un µg ER representa: 1. 1 µg de holo trans retinol o bien. 2. 6 µg de holo trans caroteno β o. 3. 12 µg de otros holotrans carotenos. 4. 3.3 unidades internacionales de vitamina A. 5. Si se desconoce de que carotenos se trata, se considera una eficiencia promedio de biotransformación de 1/8. Hay autores que proponen que en vez de 1/8 se utilice 1/21 como factor suponiendo que para obtener 1 µg ER se necesita hasta 21 µg de carotenoides.

Aspectos nutriológicos de los carotenos

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Las combinaciones posibles son por supuesto muy numerosas. Como ejemplos del cálculo, supóngase: a) Que la dieta de un individuo A contiene 300 µg de retinol y 4 200 µg de caroteno β. En este caso, a la cantidad de retinol (300 µg) se le suma 1/6 de la cantidad de caroteno β (4 200 µg /6= 700 µg), es decir 300+700=1 300 µg ER. b) Que la dieta de un individuo B contiene 360 µg de retinol y 6 400 µg de carotenos sin especificar. En este caso a la cantidad de retinol (360 µg) se le suma 1/8 de la cantidad de carotenos (6 400/8 = 800), es decir 360 + 800 = 1160 µg ER.

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Transporte y distribución Los carotenos y sobre todo las xantinas luteína y zeaxantina se incorporan, junto con los ésteres de retinil, en los quilomicrones y permanecen en los remanentes de quilomicrones que llegan al hígado. No hace mucho se identificó en el hígado una proteína fijadora de caroteno, pero aún no se conoce su importancia. Los carotenos primarios salen del hígado a la sangre en las lipoproteínas de baja densidad y de muy baja densidad, en tanto que las xantofilas se transportan en las de baja y las de alta densidad en cantidades similares. 1. Concentración en el plasma. Durante el ayuno se encuentran en el plasma unos 30 carotenoides diferentes cuyo patrón depende de la dieta previa, así como del intercambio bidireccional entre el plasma y los tejidos, y de su catabolismo. Sin embargo, 60 a 70% del total de carotenos circulantes está representado por la luteína, el licopeno, la zeaxantina, la criptoxantina β, el caroteno β y el caroteno α. El patrón plasmático de carotenos es muy personal, pero muy estable y cambia poco en periodos tan prolongados como un mes. En el cuadro 37-3 se muestra la concentración de varios carotenos en el suero de una muestra de adultos norteamericanos estudiados como parte de la encuesta NHANES III. Es interesante que la concentración de licopeno fue mayor en hombres que en mujeres y lo contrario ocurrió con los carotenos α y β.. El tabaquismo reduce hasta 30% la concentración de carotenoides excepto, por razones desconocidas, la del licopeno. Mediante estudios de carga se ha observado que la curva de concentración de caroteno β en la sangre tiene dos picos, el primero a las 6 h y otro mayor a las 24 h. La vida media difiere dependiendo del carotenoide en cuestión y de la cantidad ingerida. La del licopeno es de 9 a 16 días, la del caroteno β de 10 a 12 días, la del caroteno α de 8 a 17 días, le de luteina/zeaxantina de 12 a 19 días y la de cripoxantina β de 11 a 16 días.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 37)

Cuadro 37-3. Concentraciones de varios carotenoides en el plasma de adultos norteamericanos (μ molas/L) Licopeno Luteína/zeaxantina Criptoxantina β Caroteno β Caroteno α

Varones Varones Varones Varones Varones

0.47 0.35 0.13 0.22 0.065

Mujeres Mujeres Mujeres Mujeres Mujeres

0.41 0.13 0.35 0.28 0.08

2. Concentración tisular. 90% de la poza corporal total de carotenoides se encuentra en los tejidos y sólo 10% en el plasma. La distribución en los tejidos es muy heterogénea; la mayor parte se deposita en el tejido adiposo (65.4%) y, en menor grado, en el hígado (12%), la piel (7.3%) y el músculo (3%). Sin embargo, por cuanto a la concentración que se alcanza por gramo de tejido, destacan las glándulas suprarrenales, el testículo, el páncreas y el cuerpo úteo. Los carotenoides se oxidan a derivados con un número menor de carbonos como el ácido abscísico, la bixina, los apocarotenales β y la crocetina. La luteína se convierte en zeaxantina y el licopeno y la cantaxantina prácticamente no se metabolizan.

❚ PAPEL METABÓLICO Funciones y efectos de los carotenos Su única función es la de convertirse en vitamina A, pero tienen varios efectos, ya que debido a su estructura química, son capaces de extinguir oxígeno singulete y de combinarse con los radicales peroxilo e hidroxilo lo que resulta en la formación de radicales débiles o de no radicales. Por ello se les considera, junto con la vitamina E, la vitamina C, el glutatión, los flavonoides y el selenio, entre los antioxidantes de origen alimentario. No obstante que no hay duda de que los carotenos son antioxidantes, algunos de sus efectos pudieran no tener relación con dicho papel sino, por ejemplo, con su interacción con las membranas celulares a las cuales podrían modular; se podría entonces llamarles moduladores dietéticos más que antioxidantes. La astaxantina, la cantaxantina, la luteina y en menor grado el caroteno β, estimulan y modulan la respuesta inmune in vivo e in vitro, pero las respuestas son muy variables por lo que su significado práctico no es claro. Mientras que los carotenos epoxi estimulan la diferenciación celular. En cultivo de tejidos, los carotenos aumentan la comunicación entre las células. Dado que lo hacen tanto el caroteno β como la cantaxantina (que no forma retinal), este efecto no se relaciona con la formación de vitamina A.

Aspectos nutriológicos de los carotenos

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Asimismo, es posible que modulen algunos aspectos de la reproducción. No se sabe si lo hacen de manera directa o por medio de su conversión en vitamina A, que es claramente indispensable en la reproducción.

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Funciones de la vitamina A Puesto que parte de los carotenos se convierten en vitamina A conviene revisar brevemente las funciones de dicha vitamina. Aunque no están del todo claras desde el punto de vista metabólico, se sabe que interviene en el crecimiento y en la diferenciación celular (como ácido retinoico) y en la reproducción, el mantenimiento de los epitelios, la visión nocturna (como retinal) y la expresión génica. En la visión nocturna, la transmisión de estímulos luminosos ocurre mediante varios pasos que incluyen la transformación de retinal en 11-cis retinal, y su asociación con la opsina, lo cual mantiene abiertos los canales de sodio de los bastones externos. Los cambios del potencial de membrana se transmiten mediante sinapsis hasta el cerebro, donde se integran los impulsos nerviosos. La participación del ácido retinoico en la expresión génica ocurre mediante su unión con el receptor nuclear específico 8RAR9 que regula la iniciación de la trascripción en la región promotora de un gen conocido como RAREs. Por medio de este proceso, el ácido retinoico es indispensable para el crecimiento y la diferenciación celular. La vitamina A interviene en muchos otros procesos fisiológicos, incluyendo la espermatogénesis, el desarrollo fetal, la respuesta inmunológica, el gusto, la audición, el apetito y el crecimiento de linfocitos. La vitamina A parece compartir con las hormonas tiroideas un efecto modulador sobre la actividad de la hormona de crecimiento. A su vez, esta hormona estimula la captación de retinol por los tejidos en crecimiento. La suplementación con vitamina A en poblaciones deficientes, mejora el crecimiento, pero también disminuye la morbilidad y mortalidad por enfermedades infecciosas, lo cual hace difícil distinguir si la mejoría se debe directamente a la vitamina o a la disminución de las infecciones. En niños, la deficiencia de la vitamina eleva la susceptibilidad a infecciones y el riesgo de muerte, particularmente por sarampión y diarrea.

❚ ASOCIACIONES

EPIDEMIOLÓGICAS

La cantidad de carotenos ingerida tiene asociaciones epidemiológicas muy interesantes. Conforme la ingestión de carotenos es mayor, disminuye la incidencia de varias neoplasias (pulmón, cabeza y cuello, esófago, colorrectal, mama, cérvix,

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 37)

piel y próstata). El licopeno, que inhibe la proliferación de células tumorales in vitro y el crecimiento de tumores en ratones y que además es un buen extinguidor de radicales libres, parece tener particular efecto en el caso del cáncer de próstata. También se ha observado que se disminuye el riesgo de las enfermedades coronarias, posiblemente porque los carotenos reducen la oxidación de lipoproteínas de baja densidad que son aterogénicas. Su ingestión aminora las manifestaciones de la porfiria eritropoyética, así como el riesgo de cataratas y de la degeneración macular senil. En la mácula, la luteína y la zeaxantina se encuentran en concentraciones elevadas que indican la existencia de un proceso de depósito específico de estas xantofilas de las que se sabe que protegen de la luz azul. Se ha visto que quienes se encuentran en el quintil más alto de ingestión de carotenoides tienen 43% menos riesgo de degeneración macular que los que se encuentran en el quintil más bajo; la asociación es más alta con el consumo de espinaca y col china que son ricos en xantofilas. Sin embargo no se observa asociación con la concentración de xantofilas en el suero Existen informes del efecto de la suplementación con carotenoides sobre las manifestaciones de la infección por VIH. Como antecedentes cabe mencionar que: 1) En animales y seres humanos el caroteno β y la cantaxantina (que no se convierte en vitamina A) estimulan la respuesta inmune; 2) En pacientes con VIH el caroteno β en cantidades elevadas eleva la relación CD4/CD8 y mejora la respuesta a vacunas; 3) Los pacientes infectados con VIH tienen 50%. menos caroteno β en el suero y la suplementación con carotenos alivia las manifestaciones. En un terreno más firme, se ha informado que la halocintiaxantina, que es un epoxicarotenoide, inhibe en forma bastante especifica la DNA polimerasa dependiente de RNA del virus y tiene por lo tanto un posible efecto sobre la reproducción del virus. Por supuesto, este hallazgo merece confirmación y mayor estudio. En relación con los cánceres y otros padecimientos señalados arriba, cabe notar, sin embargo, que los estudios de suplementación con grandes cantidades (20 a 50 mg) de caroteno β no muestran reducción de su incidencia; en el cáncer de pulmón puede incluso elevar la incidencia o gravedad dado que en gran cantidad y en un ambiente rico en oxígeno tiene efecto pro oxidante. Las razones de que haya asociación estadística pero no haya efecto de la suplementación con caroteno β pueden ser que: 1. La asociación primaria real sea con la cantidad ingerida de las verduras y frutas cuyo color se debe a carotenos. 2. El caroteno β no sea activo o a que sólo lo sea en fases tempranas de las enfermedades.

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3. La suplementación inhiba la absorción de otros carotenos que si tengan efecto. 4. La ingestión del caroteno β sea un marcador inespecífico de mejor salud.

❚ CAROTENOS Y NUTRICIÓN

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a) Sólo serían nutrimentos los casi cincuenta carotenoides que se convierten en vitamina A y no el resto que son la mayoría. b) La conversión en vitamina A es más eficiente en el caso del caroteno beta, pero también ocurre a partir de otros carotenoides de manera que para esta función se pueden sustituir unos con otros. Por consiguiente, no es posible especificar como nutrimento una sola sustancia sino que, a manera de vitámeros, lo sería todo el grupo de carotenoides convertibles. Esto mismo ocurre en el caso de muchas vitaminas como la vitamina E que está constituida por 8 vitámeros, la B6 por 3 vitámeros y la A por 3 vitámeros, por citar ejemplos. c) En la dieta actual del ser humano existe vitamina A preformada en cantidades variables la cual puede sustituir parcial o totalmente a los carotenoides y en este último caso, por lo menos en lo que respecta a esta función, los carotenoides podrían ser sustituidos. Se diría entonces que son nutrimentos dispensables en la dieta. Empero, este no sería el caso si la dieta no contuviera vitamina A preformada o si se comprobaran otras funciones de los carotenoides que no se relacionen con la vitamina A.

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En nutriología se define nutrimento como toda sustancia que proviene de la dieta y cumple una o más funciones en el metabolismo normal. A los nutrimentos se les clasifica en indispensables en la dieta si el organismo no es capaz de sintetizarlos y entonces la dieta es su única fuente y en dispensables en la dieta si tiene capacidad de sintetizarlos y no es absolutamente obligatorio ingerirlos. Los carotenoides provienen de la dieta y tienen funciones metabólicas de manera que cumplen las dos características que definen a un nutrimento y pueden considerarse como tales para el ser humano. Puesto que el ser humano no puede sintetizar ninguno de los carotenoides, en una primera aproximación se les puede considerar nutrimentos indispensables en la dieta. Sin embargo, la situación no es tan clara como pudiera parecer porque la única función metabólica de los carotenoides plenamente aceptada hasta ahora es la conversión de algunos de ellos en vitamina A, situación que obliga a tres consideraciones:

Con respecto a la ausencia de vitamina A preformada en la dieta cabe señalar que:

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(Capítulo 37)

a) Por razones de acceso limitado a los alimentos de origen animal, la mayoría de los seres humanos no ingieren la vitamina o la ingieren en pequeñas cantidades y en cambio ingieren una cantidad importante de carotenoides, de manera que dependen de ellos y en este caso frecuente se les puede considerar nutrimentos indispensables en la dieta. b) Se piensa que es muy probable que, como miembro del orden de los primates, la alimentación natural del ser humano es herbifrugívora obligatoria y que éste es el régimen que sus antepasados han seguido durante millones de años. Si se acepta lo anterior, seguramente durante la mayor parte de su historia la especie humana ingería gran cantidad de carotenos y muy poco o nada de retinol. En este caso, cabe suponer que lo que se descubrió como vitamina A no es sino uno de los derivados metabólicos de algunos carotenoides los cuales tienen las funciones que se asignan a la vitamina A y tal vez alguna otra. Con respecto a que los carotenoides tengan otras funciones, es de suponerse que la de antioxidantes es una de las más factibles. Sin embargo, muy probablemente se trate de una función fisicoquímica más que metabólica y no exclusiva de los carotenoides ya que el sistema antioxidante del organismo tiene numerosos componentes tanto de origen dietético como no dietético. Ante tantas condicionantes, tal vez lo más apropiado sería considerar a los carotenos como nutrimentos indispensables condicionados.

❚ REQUERIMIENTOS Y RECOMENDACIONES Cabe recordar que las recomendaciones que sirven como valores de referencia para propósitos de evaluación y planificación, se establecen con base en la información que se tiene sobre los requerimientos medidos en algunos individuos. Los requerimientos de carotenos no se conocen y su estudio es muy difícil porque sus funciones no están bien establecidas con excepción de su conversión en vitamina A, de manera que a lo más se les puede relacionar con los requerimientos y recomendaciones de dicha vitamina. En cuanto a los requerimientos de la vitamina A, si bien se han estudiado, no son del todo claros debido a que la existencia de reservas hepáticas complica la interpretación de los resultados. Se calcula que las personas sanas utilizan 6.7 μg de retinol/kg de peso corporal/día (465 μg/día para una persona de 74 kg). Para establecer las recomendaciones de vitamina A hay que tomar en cuenta la biodisponibilidad, las reservas hepáticas y la variabilidad interindividual del requerimiento. Se considera que una reserva hepática de retinol de 20 μg/g de tejido hepático, permite mantener la concentración adecuada en el suero (30 μg/dL) y

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Cuadro 37-4. Ingestión diaria sugerida de vitamina A (México 2004) (µg ER/día) Niños de 1 a 3 años Niños de 4 a 8 años Niños de 8 a 13 años Hombres Mujeres Púberes de 14 a 18 Hombres Mujeres Adultos de 19 a 70 años Hombres Mujeres Embarazadas Lactantes

300 µg ER/día 400 µg ER/día 580 µg ER/día 590 µg ER/día 730 µg ER/día 570 µg ER/día 730 570 640 1 100

µg µg µg µg

ER/día ER/día ER/día ER/día

cubrir las necesidades tisulares. A pesar de estas bases, las recomendaciones actuales son sólo tentativas y constituyen una “ingestión diaria sugerida” (IDS). Las IDS Mexicanas 2004 de vitamina. A se presentan en el cuadro 37-4.

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❚ DEFICIENCIA Aunque seguramente se afectan sus funciones, la deficiencia de carotenos no se ha descrito como tal por la dificultad para separar sus funciones de las de la vitamina A y otros antioxidantes. Por supuesto, si la deficiencia de carotenos se acompaña de insuficiente ingestión de vitamina A se observará el cuadro de deficiencia de esta última. Con respecto a la deficiencia de la vitamina A, los signos y síntomas principales son la anorexia, la detención del crecimiento, la gerosis, las geroftalmia, las manchas de Bitot, la ceguera nocturna y el aumento en la frecuencia y gravedad de las infecciones. La anorexia se atribuye a disgeusia por degeneración de las papilas de la lengua. La detención en el crecimiento en los niños afecta tanto al peso como a la longitud. Se conoce como gerosis a la queratinización de la piel y mucosas que adquieren la apariencia de estar secas o viejas. La geroftalmia es la gerosis de la conjuntiva y la cornea; si es grave puede llegar a querotomalacia (reblandecimiento) con perforación y pérdida de la vista ante agresiones que normalmente serían poco graves. La geroftalmia comienza por desorganización del epitelio columnar, queratinización de la superficie y disminución en la secreción de mucina. Cuando la defi-

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(Capítulo 37)

ciencia progresa, aparecen despulimiento conjuntival y corneal y numerosos defectos puntiformes que le dan apariencia de cáscara de naranja. Estas lesiones confluyen hasta formar ulceraciones reversibles. Si la lesión es profunda, la reparación después del tratamiento deja una cicatriz blanquecina en la cornea (leucoma). La queratomalacia es la lesión ocular más grave ya que se puede acompañar de pérdida total de la visión. Las manchas de Bitot no siempre se presentan; son lesiones con apariencia espumosa que aparecen en la conjuntiva sobre la esclerótica. La ceguera nocturna es la incapacidad de ver en condiciones de iluminación pobre y obedece al déficit de resíntesis de rodopsina. De no corregirse, la deficiencia de vitamina A puede causar la muerte que es más temprana si hay infecciones, lo que sugiere alguna función de la vitamina en el sistema de defensa secundario (más allá de la integridad tegumentaria que, obviamente, está afectada). La deficiencia de vitamina A es la deficiencia vitamínica más frecuente en la actualidad y constituye un problema de salud pública en por lo menos 73 países y afecta a alrededor de cinco millones de niños, sobretodo en Asia y África Es la causa principal de ceguera infantil en el mundo. Cerca de 500 000 preescolares desarrollan geroftalmia de manera anual; la mitad de ellos se agravan hasta perder la vista, y cerca de 60% mueren por complicaciones infecciosas. Excepto en Haití, en América Latina, la deficiencia de vitamina A es moderada y concentrada en zonas de extrema pobreza, en las que el consumo dietario es escaso y constituido más por carotenos que por retinol, los lípidos en la dieta son escasos y la exposición a las infecciones es mayor. En México las formas graves no son frecuentes. En el ámbito nacional la prevalencia de geroftalmia está entre 2.5 y 6.6%. En la ciudad de México el consumo de vitamina A parece ser cercano a la recomendación, aún en el estrato socioeconómico marginal. Mediante mediciones de retinol en el suero, en la Encuesta Nacional de Nutrición 1999 se encontró valores de deficiencia (retinol en el suero < 10 μg/dL) en apenas 4% de los niños rurales menores de 2 años. La prevalencia de deficiencia moderada (retinol en el suero > 10 a < 20 μg/dL), fue 25.1% en niños entre 2 y 8 años de edad en áreas rurales, pero sin diferencias entre regiones. En mujeres no se encontró deficiencia, pero sí agotamiento de reservas en 15% de las embarazadas, más en las urbanas que en las rurales, con prevalencia más alta en las regiones centro (28.6%) y norte (15.8%) que en la sur (9%).

❚ TOXICIDAD Mientras que la vitamina A es potencialmente tóxica, los carotenos no parecen serlo aunque, en principio, cualquier antioxidante puede en grandes cantidades

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tener efectos pro oxidantes. El más estudiado es el caroteno β, del que no se ha detectado toxicidad por vía oral. Esto puede deberse a que, como ya se explicó, este caroteno: 1) no se absorbe bien; 2) su absorción intestinal disminuye si la cantidad ingerida aumenta; o 3) su conversión a vitamina A, que sí es tóxica, es lenta. El exceso en la ingestión y absorción de carotenos da origen a la hipercarote nosis que es benigna y se caracteriza por la coloración amarillenta de la piel, en especial en las palmas de las manos y plantas de los pies, que desaparece en algunas semanas si se interrumpe la ingestión excesiva. El diagnóstico diferencial con la ictericia hepática se basa en que la esclerótica del ojo no se pigmenta con carotenos y sí con bilirrubina. Las xantofilas podrían ser más tóxicas que el caroteno β pues se ha visto que el exceso de cantaxantina se precipita en la retina y la afecta aunque en forma reversible. Cabe comentar que en estudios de suplementación con caroteno β en los que se esperaba una reducción de la incidencia de cáncer pulmonar se observó justamente lo contrario. De la vitamina A se ha encontrado toxicidad con dosis de 3 000 ugER ingeridas crónicamente o de 10 000 μg ER administradas de manera aguda. Consiste en alteraciones óseas, hepáticas e hipertensión endocraneana, todas ellas de baja letalidad. Las cantidades tóxicas mencionadas son prácticamente imposibles de alcanzar con una dieta normal, aun cuando sea muy rica en la vitamina y los casos de intoxicación ocurren por ingestión de preparaciones farmacológicas de vitamina A. En animales de experimentación, se ha encontrado teratogenicidad que se explica por la participación del ácido retinoico en la expresión génica. En un estudio de casos y testigos, las mujeres embarazadas que recibieron vitamina A en cantidades mayores a 3 000 μg ER por día tuvieron un riesgo de teratogénesis mayor y por ello, la Sociedad Americana de Pediatría recomienda que las mujeres embarazadas no excedan una ingestión diaria de 3 000 μg ER, especialmente durante el primer trimestre.

❚ CONCLUSIONES Queda claro con lo mencionado a lo largo de este capítulo, que todavía falta por estudiar y entender las funciones de un grupo tan numeroso y diverso de sustancias. En este aspecto es necesario, además, distinguir las funciones propiamente dichas, de los efectos y de las asociaciones epidemiológicas. Aunque estén bien demostrados en un sistema biológico, los efectos no son necesariamente específicos, ni generalizables y no representan una función comprobada. Por su parte, las asociaciones epidemiológicas son hallazgos estadísticos que no prueban causalidad, ya que pueden obedecer a la casualidad o a terceros factores que afecten las

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(Capítulo 37)

dos variables asociadas. No obstante, si son sistemáticos y consistentes, los efectos y las asociaciones pueden ser útiles para generar hipótesis de causalidad. Para concluir puede decirse que es importante considerar a los carotenos como nutrimentos indispensables condicionados, cuya presencia es fundamental en la dieta.

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A

SPECTOS NUTRIOLÓGICOS DE LA VITAMINA C Héctor Bourges Rodríguez

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❚ INTRODUCCIÓN Entre los numerosos intermediarios que se producen en el metabolismo, tanto en las plantas como en los animales, se encuentra el ácido ascórbico, un compuesto hidrosoluble de 6 carbonos, muy parecido a la glucosa, que tiene la capacidad de donar electrones y regresar con facilidad a su estado reducido. Gracias a esta característica, cumple una gran diversidad de funciones como antioxidante y como cofactor enzimático. Sin embargo, hay al respecto excepciones notables. Si bien las plantas y la mayoría de los animales producen ácido ascórbico a partir de la glucosa, las especies que conforman el orden de los primates, incluido por supuesto el ser humano, así como el cobayo, algunos murciélagos y algunas aves, no lo pueden sintetizar por carecer de la gulonolactona oxidasa debido, se supone, a una mutación en el gen correspondiente ocurrida hace unos 30 millones de años. Este error innato del metabolismo hubiera conducido a la extinción de las especies mencionadas de no ser porque el ácido ascórbico abunda en los tejidos vegetales frescos (los que hoy se conocen como verduras y frutas) y porque se absorbe con facilidad en el intestino, de manera que una dieta basada en dichos tejidos puede sustituir de manera eficaz la síntesis. ❚ 579 ❚

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(Capítulo 38)

Así, la respuesta adaptativa a esta grave alteración metabólica fue la adopción de una dieta acorde con dicha alteración, con lo que se reestableció la armonía entre genoma y ambiente. Por supuesto, las especies afectadas se tornaron entonces herbifrugívoras de forma obligatoria; como consecuencia de ello, en los casos en que no disponen de tejidos vegetales frescos, sufren la deficiencia que en su forma extrema se conoce como escorbuto y que, de no corregirse, es mortal. De lo anterior se desprende que para el ser humano el ácido ascórbico es un nutrimento, es decir una sustancia que tiene funciones metabólicas y se obtiene de la dieta. Puesto que el ser humano no lo puede sintetizar, se le clasifica como nutrimento indispensable en la dieta. Dado que hay ocasiones en que, en efecto, no se dispone de tejidos vegetales frescos, el escorbuto ha acompañado a la humanidad desde la más remota antigüedad. Ya el papiro de Ebers y algunos escritos de Hipócrates describen este cuadro y desde entonces muchos textos médicos han hecho referencia al padecimiento. Puesto que, por razones de conservación, los barcos no solían llevar verduras o frutas en sus bodegas, a raíz del inicio de los viajes prolongados por mar en el siglo XV, el escorbuto se convirtió en azote de las tripulaciones, causando más bajas que otros avatares propios de la vida en el mar. En 1497 Vasco de Gama perdió a la mitad de su tripulación en su expedición al Cabo de Buena Esperanza a causa del escorbuto y en su bitácora describe: “muchos de nuestros hombres enfermaron, sus manos y sus pies se hincharon y sus encías se inflamaron por encima de sus dientes al grado de no poder comer”. En 1535, Jacques Cartier informó que, con excepción de tres marineros, toda su tripulación presentó escorbuto y aunque la relación entre esta enfermedad y la dieta era evidente desde mucho antes, fue Cartier el primero en describir un tratamiento rápido a base de una infusión de unas hojas frescas que le ofrecieron los indígenas de Terranova. En 1753, el médico naval escocés James Lind publicó su “Tratado sobre el escorbuto” en el que describe uno de los primeros estudios clínicos controlados que registra la historia de la ciencia. En este estudio se estableció claramente el valor de la frutas frescas (jugo de limones y naranjas) para el tratamiento del escorbuto; sin embargo habrían de pasar varios decenios antes de que la armada inglesa utilizara este conocimiento para establecer la ordenanza de que, en las bodegas de los barcos, se contara con un abasto suficiente de limones para prevenir la enfermedad. En 1907, gracias a un error afortunado, Holst y Fröelich lograron producir escorbuto en cuyos que, como los primates, son incapaces de sintetizar ácido ascórbico; concluyeron que las frutas y verduras frescas tenían un efecto antiescorbútico que se perdía si se las calentaba o cocía. En 1925 Szent-Györgi logró aislar una sustancia cristalina de las glándulas suprarrenales y de algunos cítricos a la que llamó ácido hexurónico y en 1932 los grupos de Szent-Györgi y de King llegaron de manera independiente a la conclusión de que el ácido hexurónico y

Aspectos nutriológicos de la vitamina C

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el agente antiescorbútico son la misma sustancia y le llamaron ácido ascórbico, nombre que viene de la contracción en inglés de “anti-scurvy” En 1933 los grupos de Haworth en Birmingham y Karrer en Zurich lograron, también en forma independiente y casi simultánea, elucidar la estructura del ácido ascórbico. Todos estos descubrimientos ocurrieron en plena “era de las vitaminas” de manera que el ácido ascórbico y su forma oxidada, el ácido deshidroascórbico, quedaron clasificados como vitamina C.

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❚ ESTRUCTURA QUÍMICA El término vitamina C designa a los dos compuestos con actividad antiescorbútica: el ácido L-ascórbico y el ácido L-deshidroascórbico (figura 18-1 del capítulo: Potencial antioxidante del ácido ascórbico). La fórmula molecular del ácido ascórbico es C6H8O6 y la del ácido deshidroascórbico es C6H6O6. El ácido ascórbico es un sólido blanco, inodoro, soluble con facilidad en agua, un poco en etanol y casi nada en disolventes polares. En solución acuosa se oxida con más rapidez a la forma diceto, que es el ácido deshidroascórbico, el cual tamibén se reduce con facilidad para reformar al ácido ascórbico o bien se oxida irreversiblemente a ácido dicetogulónico y se convierte luego en los ácidos oxálico y treónico. El ácido ascórbico es la forma enólica de una α cetolactona de 6 carbonos parecida a la glucosa, dos de cuyos carbonos (2 y 3) ionizables le dan caracter ácido; el carbono 5 es asimétrico y el enantiómero natural es el L. Su nombre químico es 2,3 dideshidro-L-treo-hexano1,4 lactona. En el pasado recibió los nombres de ácido cevitámico, acido hexurónico y ácido L-xiloascórbico. Es una sustancia termolábil y que se oxida fácilmente. Los dos vitámeros se interconvierten fácilmente, pero el deshidroascorbato es menos estable. Se ha propuesto que el ácido semideshidroascórbico es también un vitámero, pero no se ha aceptado. La forma D se conoce como ácido isoascórbico, ácido D-araboascórbico o ácido eritórbico, que es muy empleado como antioxidante en la industria de embutidos y cervecera (en lugar del ácido ascórbico que es más costoso), pero que no tiene actividad vitamínica.

❚ FUENTES

EN LA DIETA

En el cuadro 38-1 se presenta el contenido de vitamina C en algunos alimentos. La vitamina C se encuentra tanto en plantas como en animales, pero la mayor

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

Cuadro 38-1. Contenido de vitamina C en distintos alimentos en crudo 1 (mg/100g de porción comestible) Toronja Guayaba Mango Chile Poblano2 Nopal2 Perejil2 Tomatillo2 Chaya2 Col2 Col Bruselas2 Zapote 1 2

200 a 400 100 a 400 100 a 300 300 ~250 ~250 ~250 150 a 300 100 a 180 100 a 180 50 a 200

Tangerina Naranja Guanábana Marañón Alfalfa Mandarina Capulín Chiles diversos Brécol Espinaca Limón

~150 ~150 ~140 ~150 ~130 ~110 ~100 60 a 150 70 a 160 ~ 80 ~ 70

Coliflor Fresa Piña Tejocote Papaya Durazno Melón Plátano

50 a 90 50 a 90 20 a 50 ~ 50 ~ 50 ~ 40 ~ 30 < 20

Existe gran variación de acuerdo con el estado de madurez, la variedad y la época del año La cocción reduce considerablemente los valores.

parte (90% o más) del ácido ascórbico en la dieta humana proviene de los tejidos vegetales frescos, es decir de las verduras y las frutas, que son las fuentes naturales con mayor concentración. Todas lo contienen aunque se destacan la guayaba, el mango, el chile poblano, el nopal, el tomatillo, la chaya y los cítricos. También se puede encontrar en los productos industrializados a los que se les ha agregado vitamina C como antioxidante. El chile contiene una elevada concentración de ácido ascórbico, pero no suele ser una fuente significativa debido a la pequeña cantidad que por lo general se ingiere de este alimento. En los alimentos, la vitamina C se encuentra fundamentalmente como ascorbato y sólo entre un 10 a 20% como ácido deshidroascórbico. La cantidad de ácido ascórbico presente en un alimento dado es muy variable, a veces hasta por un factor de 10 veces, según la variedad, la época del año y la forma de transportarlo, y prepararlo. La cocción o la exposición al aire (por ejemplo en un alimento rebanado o en jugo) destruye buena parte de la vitamina activa; no obstante, la célebre regla de consumir cinco porciones diarias de verduras o frutas generalmente garantiza un aporte de 200 mg/día, que es muy superior al requerimiento y a la cantidad necesaria para evitar el escorbuto, que en el adulto es 8 a 10 mg/día. Aunque el ácido deshidroascórbico representa apenas 10% en la dieta, su cantidad aumenta con la oxidación que ocurre durante el almacenamiento de los alimentos. Las vísceras como el hígado y los riñones aportan cantidades muy bajas y su cocción casi lo elimina. Las carnes, el huevo y la leche de vaca no contienen ácido

Aspectos nutriológicos de la vitamina C

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ascórbico aunque la leche materna humana sí lo contiene (alrededor de 62 mg/L a los dos meses de lactancia y 42 mg/L a los 120 días posparto con un promedio global cercano a los 40 mg/día) y cubre las necesidades del niño lactante. El contenido de la vitamina C en la leche puede variar dependiendo del estado de nutrición materno en vitamina C. Vega Franco informa un contenido promedio de 50 mg/día en leches de madres mexicanas. En México, de acuerdo con las encuestas de consumo, las fuentes más importantes de vitamina C en orden de importancia son la naranja, el jitomate, el tomate verde, el plátano, el limón, la papaya, la zanahoria, la calabacita y la papa. Existe además consumo estacional de guayaba, mandarina y mango, ricos en vitamina C. Cabe destacar que las familias de mayores recursos económicos consumen más frutas que verduras mientras que las de menos recursos compran más verduras que frutas.

❚ DIGESTIÓN Y BIODISPONIBILIDAD

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Absorción En las especies que no pueden sintetizar a la vitamina (primates, cobayos y otros), los dos vitámeros se absorben en forma eficaz en el intestino delgado, principalmente en el íleon, pero el ácido L-deshidroascórbico se absorbe mejor que el L-ascórbico. Ambos pasan al interior del enterocito mediante un mecanismo de transporte activo, dependiente de sodio y de energía, saturable y sensible a la cantidad ingerida; la proporción de ácido ascórbico que se absorbe es inversamente proporcional a la cantidad ingerida. Así, por ejemplo, si la ingestión es de 30 mg/día, se absorbe casi 100%, pero si es de 180, 1 500 o 12 000 mg/día, la absorción se reduce respectivamente a 80, 50 y 16%. Si la ingestión se fracciona la cantidad total absorbida es mayor. Existe también una forma de transporte pasivo que opera si la cantidad que se ingiere de la vitamina es muy elevada. Una vez en el interior del enterocito, el ácido deshidroascórbico se reduce y se convierte en ácido ascórbico. Si la ingestión es mayor de 200 mg/día, parte del ácido ascórbico se convierte en la luz intestinal en bióxido de carbono que pasa a la circulación y se expulsa en el aire espirado; esta conversión aumenta con la ingestión. El ácido ascórbico que no se absorbe y que se mantiene intacto puede causar diarrea y molestias gastrointestinales. Se ha observado que las dietas altas en cinc o en pectinas disminuyen la absorción de la vitamina C, en tanto que la presencia de extractos naturales de cítricos la incrementa.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

Transporte y distribución Los dos vitámeros se transportan en el plasma a los tejidos en forma libre. En el plasma, igual que en la saliva, la concentración de ácido ascórbico es muy baja y depende de la cantidad ingerida. En un estudio con varones adultos que ingerían 100 mg/día, la concentración plasmática de ácido ascórbico alcanzó alrededor de 1 mg/dL. La saturación plasmática se alcanza alrededor de los 10 a 11 mg/dL (60 μmol/L). El escorbuto aparece clínicamente cuando la concentración plasmática es < 0.2 mg/dL. Aunque se distribuye a todos los tejidos, el ácido ascórbico se concentra de manera particular en la hipófisis, las glándulas suprarrenales, el cristalino, el cerebro, el hígado, el riñón, el páncreas y los leucocitos. Los eritrocitos, linfocitos y neutrófilos lo absorben en forma de ácido deshidroascórbico. El ojo tiene una elevada concentración de ácido ascórbico, lo que es consistente con la hipótesis de que protege el cristalino, la cornea y la retina contra radicales libres generados por fotolisis. La concentración del ácido ascórbico en el semen es hasta 10 veces mayor que la del plasma, por lo que se cree que protege a las proteínas del espermatozoide de la oxidación. Lo mismo que en el enterocito, en los diferentes tejidos el paso de los dos vitámeros al citosol se realiza mediante un mecanismo de transporte activo saturable y el ácido L-deshidroascórbico pasa 10 y 20 veces más rápido que el L-ascórbico. Una vez en el interior de las células, la ácido deshidroascórbico reductasa transforma el ácido L-deshidroascórbico en ácido L-ascórbico en presencia de glutatión reducido (GSH). Se ha visto que la insulina favorece el paso del ácido deshidroascórbico al citosol y que la glucosa lo inhibe, por lo que los pacientes diabéticos pueden tener concentraciones plasmáticas de ácido deshidroascórbico anormalmente elevadas. La poza corporal total de ácido ascórbico en el adulto es de alrededor de 1500 mg o 20 mg/kg de peso corporal; en el caso de que la poza se encuentre en 300 mg o menos (2.8 mg/kg), aparece el escorbuto. El recambio diario es de 3% de la poza corporal total, de manera que si ésta es de 1500 mg se pierden unos 45 mg/día y si la poza es de sólo 300 mg, se pierden 9 mg/día. La vida media del ácido ascórbico es de 16 a 20 días, pero es muy variable e inversamente proporcional a la cantidad ingerida. Por ejemplo, si se ingiere 30 mg/día la vida media es de 40 dias, pero si se ingiere 180 mg/día se reduce a sólo 8 días.

Excreción urinaria El ácido ascórbico que los tejidos no captan permanece en el plasma y llega al riñón que lo reabsorbe eficientemente mediante un sistema de transporte activo depen-

Aspectos nutriológicos de la vitamina C

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diente de Na+. El umbral de reabsorción tubular es del orden de 1.2 mg/dL de plasma de manera que si la concentración plasmática sobrepasa este valor, el ácido ascórbico se excreta intacto en la orina. La relación entre concentración plasmática y urinaria es linear desde 1.2 mg/dL hasta 4.0 mg/dL de plasma y después tiene una cinética sigmoide que conserva la vitamina cuando es escasa y la excreta si es abundante. La excreción obligatoria en el adulto parece ser de menos de 8 mg/día. El ácido deshidroascórbico que no se reconvierte en ácido ascórbico, se transforma irreversiblemente en dicetogulonato que termina formando ácido oxálico, ácido treónico y otros metabolitos.

Homeostasia La combinación del mecanismo intestinal que absorbe al ácido ascórbico en proporción inversa a la cantidad ingerida, con el mecanismo de reabsorción tubular que lo conserva cuando es escaso y lo excreta cuando está en exceso, da lugar a un control homeostático muy fino de su concentración en el plasma y de su contenido corporal total.

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❚ PAPEL METABÓLICO Y FUNCIONES

DEL ÁCIDO ASCÓRBICO

El ácido ascórbico tiene numerosas funciones en el organismo humano, la mayoría de las cuales se basan en su característica de ser un agente reductor reversible que se regenera fácilmente en presencia de GSH o de NADPH. Por ser un eficaz donador de electrones, actúa como antioxidante en muchos sistemas biológicos. Es importante distinguir las funciones propiamente dichas de los efectos y de las asociaciones epidemiológicas. Aunque estén bien demostrados en un sistema biológico, los efectos no son por fuerza específicos ni generalizables; por su parte, las asociaciones epidemiológicas son hallazgos estadísticos que no prueban causalidad, ya que pueden obedecer a la casualidad o a terceros factores que afecten las dos variables asociadas. De cualquier forma, si son sistemáticas y consistentes, las asociaciones pueden ser útiles para generar hipótesis etiológicas. A continuación se agrupan de manera general las funciones del ácido ascórbico y se anotan algunas asociaciones epidemiológicas.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

Antioxidante Aunque todavía no se ha demostrado una relación del tipo dosis respuesta entre la ingestión de la vitamina C y su función como antioxidante en el organismo, es claro por su estructura química, que tiene actividad antioxidante (véase el capítulo Potencial antioxidante del ácido ascórbico) por lo que se acepta que es parte del sistema de extinción de radicales libres ya que: 1. Neutraliza con eficacia a los radicales hidroxilo, peroxilo, superóxido, peróxido reactivo, oxígeno singulete e hipoclorito. 2. Actúa como antioxidante en forma indirecta abasteciendo electrones para regenerar las formas reducidas activas de otros antioxidantes como el glutatión, los tocoferoles y los flavonoides. El ácido ascórbico reduce al glutatión oxidado (GSSG) y el GSH reduce al ácido deshidroascórbico, es decir que glutatión y ácido ascórbico se regeneran mutuamente según sea necesario; es interesante que el GSH alivia algunos síntomas del escorbuto y el ácido ascórbico reduce el progreso de las cataratas por deficiencia de glutatión. 3. Protege a los lípidos plasmáticos y lipoproteínas de baja densidad contra la peroxidación posiblemente mediante la neutralización en fase acuosa del radical peroxilo y la regeneración de tocoferoles reducidos. 4. Se cree que en los neutrófilos elimina los radicales libres que se producen durante su función y el efecto del ácido hipocloroso generado por la mieloperoxidasa durante la inflamación, por lo que la presencia de ácido ascórbico en estas células sería crítica. 5. Protege al ácido fólico contra la oxidación. 6. Protege al DNA contra mutagénesis e inicio de carcinogénesis por daño oxidativo.

Cofactor o cosustrato de enzimas El ácido ascórbico es cofactor o cosustrato de 8 enzimas que participan en la síntesis de la colágena, la carnitina, la noreadrenalina y de otros neuropéptidos, así como en el metabolismo de la tirosina y en la amidación de péptidos. Su función en estos procesos metabólicos es mantener reducidos al hierro o al cobre. 1. En la síntesis de colágena la vitamina C funciona como cofactor reductor de la prolil hidroxilasa y de la lisil hidroxilasa en las reacciones de hidroxilación de prolina y de lisina unidas a péptido, necesarias para estabilizar la triple hélice en la tropocolágena. La prolil hidroxilasa requiere oxígeno molecular y la función del ácido ascórbico es reducir al hierro de férrico a ferroso y, en la

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reacción catalizada por la lisil hidroxilasa, reduce al cobre. También se ha relacionado al ácido ascórbico con la expresión génica de algunos tipos de colágena, con la secreción celular de procolágena y con la síntesis de otros componentes del tejido conectivo como elastina, fibronectina, proteoglicanos, matriz ósea y fibrilina. En estudios in vitro se ha demostrado que la vitamina es capaz de inhibir la síntesis de diversas enzimas involucradas en la degradación de la colágena, particularmente las metaloproteasas de matriz extracelular. 2. En la síntesis de las carnitina la vitamina C participa junto con el hierro. La carnitina se requiere en el transporte de los ácidos grasos al interior de la mitocondria para su oxidación y generación de ATP. Por su parte, la formación de acilcarnitinas posiblemente contribuye a mantener cantidades suficientes de coenzima A no esterificada, que se requiere para el metabolismo oxidativo de una gran variedad de compuestos.

Modulador de la absorción de hierro El ácido ascórbico estimula la absorción duodenal del hierro no hemínico solubilizándolo aun en presencia de taninos y fitatos y reduciéndolo a la forma ferrosa que es la que se puede absorber.

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Otras Funciones El ácido ascórbico participa en: 1. La inactivación de xenobióticos por oxigenasas de función mixta relacionadas con el citocromo P450 y de hormonas lo mismo endógenas que exógenas (como los anticonceptivos orales). 2. El sistema inmunitario, ya que estimula la producción de interferón, la respuesta quimiotáctica y proliferativa de los neutrófilos y la síntesis de algunos anticuerpos. Es posible que ésta sea la razón de que la deficiencia de ácido ascórbico se acompañe de mayor susceptibilidad a infecciones. Por ello, se han probado dosis farmacológicas (por arriba de la dosis de saturación tisular que es 100 mg/día), como profilaxis o tratamiento de padecimientos como el catarro común, pero los resultados en este sentido son contradictorios. 3. La síntesis de AMP y GMP cíclicos. 4. La excreción de colesterol por vía biliar. 5. La sulfatación del tejido conjuntivo. 6. La síntesis de prostaglandinas y posiblemente de serotonina.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

7. La producción de células gliares y de mielina. 8. La inhibición de la liberación de histamina y en el aumento de su degradación, por lo que tiene efecto antihistamínico. Es posible que este efecto sea responsable del prestigio popular de la vitamina en el manejo del catarro común ya que podría reducir algunos síntomas aunque no influya en el padecimiento mismo.

❚ ASOCIACIONES

EPIDEMIOLÓGICAS

Varios estudios sugieren que el ácido ascórbico podría un tener efecto preventivo en contra de las enfermedades en las que se supone que participa la oxidación (ateroesclerosis, cáncer, catarata, entre otras), pero aún hay controversia al respecto. Las asociaciones más notables son: 1. Con el riesgo de cáncer. Se ha mostrado que a mayor consumo de ácido ascórbico se reduce el riesgo de cáncer de la cavidad bucal, esófago, estómago y páncreas; aunque la información es más escasa, parece ser que también se reduce el riesgo de cáncer de pulmón, cervicouterino, del recto y mamario. En cambio no se ha visto que se reduzca el riesgo de cáncer de colón, vesícula, ovario o próstata. Por supuesto, el cáncer es una enfermedad multifactorial en la que la deficiencia de vitamina C sería sólo uno de los posibles factores. 2. Con la enfermedad coronaria. Se ha encontrado asociación entre concentración plasmática baja de ácido ascórbico y mayor riesgo de enfermedades cardiacas e hipertensión, que se atribuye a que la vitamina puede inhibir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) inducida por metales pesados y radicales libres Es interesante que en estudios clínicos se ha observado que, con dosis tan diversas como de 40 a 1 000 mg/día por periodos que de 1 a 4 semanas, puede disminuir la concentración de LBD, así como la concentración de malondialdehído (MDA) y sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, indicadores ambos de peroxidación de lípidos Sin embargo, los resultados que sugieren un papel terapéutico de la vitamina C en estas enfermedades son contradictorios.

❚ REQUERIMIENTOS Y RECOMENDACIONES En el adulto, el escorbuto clínico se evita con la ingestión de 10 o 15 mg/día, pero las recomendaciones diarias en diferentes países son de 45 a 80 mg. Conviene recordar que las recomendaciones que sirven como valores de referencia para

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propósitos de evaluación y planificación, se establecen con base en la información que se tiene sobre los requerimientos que se han medido en algunos individuos.

Requerimientos

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En el caso de la vitamina C se suelen establecer con base en: 1. La ingestión que se necesita para saturar a los leucocitos, en especial a los neutrófilos, ya que esta variable se relaciona con la reserva hepática. Se ha observado que si los neutrófilos están saturados en 80%, pueden evitar la formación de ERO durante la fagocitosis y la activación de los neutrófilos y el organismo cuenta con suficiente cantidad de ácido ascórbico para cubrir sus necesidades metabólicas. Mediante estudios del contenido de la vitamina en neutrófilos y suponiendo que el papel antioxidante de la vitamina C tiene un efecto lineal, se calculó que con una ingestión de 75 mg/día (± 19.4%) se alcanza la saturación de los neutrófilos sin pérdidas urinarias importantes En las mujeres embarazadas, Casanueva et al. han establecido que una concentración leucocitaria menor de 102 nmol/108 células entre las semanas 28 y 32 de la gestación, se asocia con un riesgo significativo mayor de ruptura prematura de las membranas corioamnióticas y que, con un suplemento de 100 mg/día de vitamina C a partir de la semana 20 de gestación, es posible asegurar que la reserva leucocitaria de ácido ascórbico se mantendrá en valores adecuados. 2. La saturación plasmática (11.2 ± 0.2 mg/dL en varones y 9.9 ± 0.5 mg/dL en mujeres) se alcanzó con consumos de vitamina C de 85 mg/día ± 25%.

Recomendaciones Las recomendaciones mexicanas de vitamina C del 2004 se muestran en el cuadro 38-2. El promedio ponderado de acuerdo con la distribución demográfica de la población mexicana es 60 mg/día El tabaquismo eleva en 35 mg/día el recambio de vitamina C en relación con los no fumadores, lo que podría aumentar su riesgo de estrés oxidativo. Por ello, se recomienda a los fumadores una ingestión adicional de por lo menos 35 mg/día. No hay justificación para ingerir cifras mayores que las recomendadas ni para utilizar suplementos de 1 g o más a diario. Por una parte, las recomendaciones contemplan siempre un margen adicional de seguridad y por la otra, si la ingestión es excesiva la absorción se reduce y los excesos en el plasma se eliminan en la orina. Como ya se explicó, no es difícil satisfacer las recomendaciones ya que

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

Cuadro 38-2. Recomendaciones mexicanas de ingestión de vitamina C (2004) (mg/día) Niños de 1 a 3 años Niños de 4 a 8 años Niños de 9 a 13 años Púberes de 14 a 18 años Hombres Mujeres Adultos de 19 a 70 Hombres Mujeres Adultos mayores de 70 años Hombres Mujeres Embarazadas Lactantes

15 25 45 65 57 84 75 80 70 138 128

el consumo diario de 5 porciones de frutas o verduras provee tres veces más ácido ascórbico que lo recomendado y 15 veces más que lo necesario para evitar el escorbuto. No obstante, hay individuos que pueden sufrir la deficiencia, sobre todo la subclínica.

❚ DEFICIENCIA La deficiencia franca de vitamina C, el escorbuto, se presenta cuando la poza corporal total es menor de 2.8 mg/kg de peso y la concentración de vitamina C en el plasma es < 0.2 mg/dL. Este cuadro se caracteriza por fragilidad capilar, cicatrización defectuosa (ambas atribuibles a trastornos en la síntesis de colágena), hiperqueratosis folicular, anemia, engrosamiento de las articulaciones, artralgia, edema, trastornos psiquiátricos (hipocondría, depresión e histeria), debilidad, lasitud, fatiga fácil y mayor susceptibilidad a infecciones. La fragilidad capilar da lugar a equimosis, petequias, inflamación y hemorragia gingival, pérdida de piezas dentarias, hemorragias perifoliculares, hemartrosis y, en los niños, hemorragias subperósticas y osificación inadecuada con la consecuente disminución en el crecimiento. En niños alimentados con leche de vaca (que prácticamente no contiene ácido ascórbico) durante el primer semestre de su vida se puede presentar el síndrome de Moeller-Barlow, que se caracteriza por el engrosamiento de las uniones hueso cartílago particularmente en la caja torácica, dolor en articulaciones, anemia y fiebre.

Aspectos nutriológicos de la vitamina C

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Durante el embarazo la deficiencia marginal de vitamina C se ha asociado con ruptura prematura de membranas corioamnióticas, con mayor mortalidad neonatal y con menores pesos al nacimiento. En México, el escorbuto franco no es frecuente, pero las formas subclínicas de deficiencia de ácido ascórbico podrían serlo particularmente en vista de la disminución que está experimentando el consumo de verduras y frutas. Mediante las concentraciones de ácido ascórbico en el plasma se estima que hay deficiencia (subclínica) en 37% de los menores de 2 años y en casi 50% de las mujeres, con valores similares en localidades rurales y urbanas, pero con mayor prevalencia en las regiones Norte y Sur del país. En embarazadas, la prevalencia tiende a ser mayor en las localidades rurales que en las de las urbanas, pero en las no embarazadas no se encontró diferencia. La prevalencia más alta se encontró en la región Norte.

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❚ TOXICIDAD En condiciones normales, la intoxicación con ácido ascórbico es muy poco probable debido a la fina homeostasia de la concentración plasmática de la vitamina en la que la proporción que se absorbe decrece conforme se eleva la ingestión y los excesos se eliminan en la orina. Así, el ácido ascórbico no es claramente tóxico en dosis hasta de 1 o 2 g/día. Se ha informado que la ingestión de dosis mayores o “megadosis” (≥ 3 a 4 g/día) puede causar gastritis, litiasis urinaria por oxalatos, hiperuricemia y escorbuto por rebote (deficiencia al pasar de las megadosis a cantidades normales). Las molestias gastrointestinales (distensión, dolor abdominal, cólicos, náuseas y diarrea de tipo osmótico) son el único signo que se encuentra consistentemente en seres humanos; estas molestias empiezan a ser notorias a partir de un consumo de 3 000 mg/día de ácido ascórbico y son francamente manifiestas con 4 000 mg/día. El incremento en la excreción urinaria de oxalatos que son productos del metabolismo de ácido ascórbico y en algunas ocasiones formación de cálculos urinarios, puede ocurrir en sujetos susceptibles, por lo que a quienes tienden a formar cálculos renales se les debe prevenir de no consumir megadosis de la vitamina. En concentraciones elevadas, el ácido ascórbico tiene actividad prooxidante e incrementa el estrés oxidativo También se han informado la destrucción oxidativa y la disminución en la absorción de la vitamina B12, el incremento en la absorción del hierro que puede inducir saturación, el incremento en la demanda de oxígeno y la erosión del esmalte dental.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 38)

Cuadro 38-3. Límite superior de consumo de ácido ascórbico (México, 2004) Niños de 1 a 3 años Niños de 4 a 8 años Niños de 9 a 13 años Púberes 14 a 18 años Adultos Embarazadas Mujeres lactantes

1 1 2 2 2

400 650 200 800 000 000 000

mg/día mg/día mg/día mg/día mg/día mg/día mg/día

Límite superior de consumo Aunque se necesitan más estudios para afinar las cifras, las recomendaciones mexicanas del 2004 señalan los límites superiores de consumo diario que se muestran en el cuadro 38-3.

❚ CONCLUSIONES El ácido ascórbico es un nutrimento indispensable en la dieta, cuyas funciones metabólicas se relacionan principalmente con los efectos antioxidantes, además de que puede actuar como cofactor de enzimas y facilitador en la absorción del hierro.

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A

SPECTOS NUTRIOLÓGICOS DE LA VITAMINA E Héctor Bourges Rodríguez

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❚ INTRODUCCIÓN La vitamina E tiene 8 vitámeros; cuatro tocoles y cuatro tocotrienoles (figura 39-1), que si bien no se convierten unos en otros, ni tienen todos el mismo grado de actividad biológica, comparten un buen número de funciones metabólicas. Dado que el ser humano no es capaz de sintetizar estas sustancias, como grupo se les clasifica como nutrimentos indispensables en la dieta. La vitamina E es en varios sentidos especial, pues difiere de otras vitaminas en los siguientes aspectos: 1. La forma en que se le descubrió (véase más adelante Bosquejo histórico). 2. La diversidad de manifestaciones de su deficiencia en animales. 3. La dificultad que ha habido para ubicar su función metabólica y para encontrar su cuadro clínico de deficiencia en seres humanos. 4. La carencia de transportadores específicos en la membrana del enterocito y en el plasma. 5. Su rápido recambio entre el plasma, el hígado y la estabilidad de su concentración en el plasma. 6. La capacidad del organismo para conservarla. ❚ 595 ❚

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

7. Su depósito, aparentemente no funcional, en el tejido adiposo. 8. La discordancia entre la actividad biológica y la actividad fisicoquímica de sus vitámeros.

❚ BOSQUEJO

HISTÓRICO

La mayoría de las vitaminas se descubrieron como resultado del estudio de enfermedades por deficiencia que durante milenios afectaron gravemente a la humanidad como el escorbuto, el beri-beri, la pelagra, la geroftalmia, el raquitismo y la anemia perniciosa, entre otras. En cambio, la vitamina E se descubrió como consecuencia de la búsqueda de vitaminas nuevas mediante la estrategia de emplear modelos animales y usar dietas sintéticas, es decir dietas preparadas con la combinación de ingredientes más o menos purificados que sólo contenían los nutrimentos hasta entonces conocidos. En 1920, en la Universidad de California en Berkeley, Evans y Bishop observaron que las ratas alimentadas con dietas sintéticas en las que la fuente de lípidos era manteca rancia, desarrollaban distrofia muscular y no eran capaces de reproducirse debido a la degeneración espermática en el macho y a la reabsorción fetal en las hembras embarazadas. En 1922 encontraron que ese cuadro se podía prevenir si en la dieta se incluían pequeñas cantidades de levadura, lechuga fresca, alfalfa deshidratada, germen de trigo, avena, carnes o leche y, sobre todo, aceites vegetales comestibles. Puesto que el aceite de hígado de bacalao, fuente bien conocida de las vitaminas A y D, no tenía ese efecto preventivo, para Evans y Bishop era claro que se encontraban ante una vitamina aun no descrita. De los alimentos mencionados antes, estos investigadores lograron extraer, en disolventes orgánicos, la sustancia responsable del efecto preventivo, a la que llamaron primero factor X y poco después vitamina E (dado que las letras A, B, C y D ya habían sido asignadas). En 1936 el propio Evans encontró tres ésteres con actividad de vitamina E (los actuales tocoles α, β y γ) y en 1938 acuñó el término tocoferol, voz derivada del griego tocos (descendencia, parto) y ferein (llevar a ) por lo que significa alcohol que hace posible el parto. El δ-tocol se aisló en 1949 y los tocotrienoles diez años más tarde. A pesar de que se ha buscado en forma insistente el cuadro de deficiencia de vitamina E en el ser humano, e incluso se ha intentado producirlo experimentalmente, hasta hace apenas unos lustros no se había tenido éxito por lo que se hacía referencia a la vitamina E como la vitamina en búsqueda de deficiencia. La anemia en niños con mala absorción de lípidos se describió apenas en 1965 y la neuropatía periférica en 1985. En el caso de otras vitaminas, conforme progresaba el conocimiento, se les encontraron funciones metabólicas específicas. En cambio, la función de la vita-

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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mina E permaneció confusa durante más de 70 años debido a que su principal papel metabólico radica en su capacidad antioxidante, función que afecta infinidad de estructuras anatómicas y vías metabólicas.

❚ ESTRUCTURA QUÍMICA

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Tanto los tocoles como los tocotrienoles están formados por un anillo de cromanol con un grupo hidroxilo o alcohol (-OH) en la posición 6, uno a tres metilos (-CH3) y una cadena lateral de fitilo de 16 carbonos En los tocoles la cadena lateral está saturada mientras que en los tocotrienoles tiene 3 insaturaciones (figura 39-1). En ambas familias se llama α al vitámero 5,7,8 trimetil, β al 5, 8 dimetil, γ al 7, 8 dimetil y δ al 8 monometil. Como en la cadena de fitilo hay 3 centros quirales, los tocoles que la industria farmacéutica obtiene por síntesis tienen 8 estereoisómeros (RRR, RSR, RSS, RRS, SRR, SRS, SSR y SSS). Los estereoisómeros son las moléculas que pueden estar en diferentes disposiciones espaciales, pero que tienen la misma fórmula química. De ellos, los que son imágenes en espejo uno de otro, y que no se puedan sobreponer se llaman enantiómeros. La forma sintética que se utiliza en los suplementos, es una mezcla racémica (mezcla de enantiómeros a la misma concentración) de los 8 estereoisómeros del α−tocoferol y se le conoce como holo rac α-ttocoferol. Su actividad es hasta 3 veces menor que la del RRR α-tocol que es el estereoisómero más activo.

8

CH3

1

7

2

6

3 5

4 Vitamina E

R1

Tocoles

R2

Tocotrienoles

CH2

CH3 ( H ( CH2 - CH2 - C — CH2 — R1 = — 3

CH3 ( H ( CH2 - CH = C — CH2 — R2 = — 3

α = 5, 7, 8-trimetil (forma activa) β = 5, 8-dimetil γ = 7, 8-dimetil δ = 8-metil

Figura 39-1. Estructura química de la vitamina E.

598

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

En la práctica, sólo tienen importancia los tocoles RRR y de ellos la forma principal es el isómero RRR del α-tocol (o α-tocoferol) cuya actividad es la más alta y por ello se le toma como unidad (equivalente de tocoferol). Los demás vitámeros no se convierten en α-tocol pero pueden tener cierta actividad biológica. Por facilidad, el término tocoferoles se aplica a todos los vitámeros y si se usa en singular (tocoferol), en general se refiere al α-tocol.

❚ FUENTES

EN LA DIETA

La vitamina E se encuentra en la fracción lipídica de numerosos alimentos, particularmente en los de origen vegetal ya que sólo las plantas son capaces de sintetizar tocoferoles. En términos generales, la concentración de vitamina E en los alimentos es proporcional a su contenido de ácidos grasos poliinsaturados, lo que sugiere que su presencia en el alimento tiene como propósito proteger dichos ácidos grasos de la oxidación. En el cuadro 39-1 se muestra el contenido de vitamina E de algunos alimentos. Son buena fuente de la vitamina el girasol, las almendras, el germen de trigo, el cacahuate, otras semillas ricas en aceite como las de algodón, cártamo, soya y maíz, así como los aceites extraídos de ellas y sus derivados (mayonesa, aderezos, entre otros) y la espinaca (la vitamina se concentra en los cloroplastos). La proporción en que se encuentran los distintos vitámeros e isómeros difiere de un alimento a otro; así, por ejemplo, el RRR α-tocol que es el estereoisómero más activo, abunda en el aceite de germen de trigo, cártamo y girasol mientras que en los aceites de soya y maíz predominan el γ tocol y los tocotrienoles. Los aceites de algodón y palma contienen α y γ-tocoferoles en cantidades similares, y el de palma también es rico en tocotrienoles. Los tocoferoles que ingieren los animales se depositan en el tejido adiposo y el hígado, por lo que algunos alimentos de origen animal pueden contenerlos. La

Cuadro 39-1. Contenido de vitamina E de algunos alimentos y productos mg/100 g Aceite de germen de trigo Aceite de girasol Almendras Germen de trigo Cacahuate Margarina Mantequilla

192 51 26 18 7 a 13 12 4

Mayonesa Espinaca Huevo Pan integral Verduras y frutas Carnes Leche de vaca

2 1 1 0.9 0.5 0.5 0.1

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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leche humana contiene alrededor de 5 mg/L; suponiendo una producción de 780 mL/día, el aporte diario sería de alrededor de 3.8 mg. Los suplementos vitamínicos contienen ésteres de los isómeros RRR naturales o bien el ya mencionado holo rac α tocol que está formado por los 8 estereoisómeros sintéticos. Para la población mexicana, las fuentes principales de vitamina E en la dieta son los aceites vegetales comestibles (1.3 mg/día), pero la tortilla de nixtamal y los frijoles contribuyen en forma importante.

❚ DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN

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Por su carácter liposoluble, los tocoferoles se ingieren junto con los triacil gliceroles de la dieta. No se conoce en la membrana del enterocito ningún vector específico para absorber tocoferoles, por lo que al parecer se absorben disueltos en los ácidos grasos que se liberan durante la digestión. Este proceso es inespecífico; no distingue entre los vitámeros, por lo que todos se absorben en la misma proporción que oscila entre 15 y 45% de la cantidad ingerida, y disminuye conforme la cantidad que se ingiere es mayor. Así, la absorción de los tocoferoles depende de la digestión adecuada de triacil gliceroles en la que participan la lipasa pancreática, las fosfolípidos, las sales biliares, los ácidos grasos y los monoacilgliceroles que forman las micelas durante la digestión. Los ésteres de tocoferoles ingeridos en suplementos deben ser hidrolizados mediante esterasas. Una vez en el interior del enterocito, los 8 vitámeros se incorporan en los quilomicrones que se expulsan a la circulación linfática.

Transporte y distribución El transporte y distribución de la vitamina E se realizan mediante las lipoproteínas del plasma. Los quilomicrones (Q) contienen los tocoferoles provenientes de la dieta y, cuando por efecto de la lipasa lipoproteínica, pierden lípidos y se convierten en remanentes de quilomicrones (rQ), la mayor parte de los tocoferoles permanece en los rQ y una parte menor se libera al plasma y se incorpora en lipoproteínas de alta densidad (HOL; del inglés, high density lipoprotein). Mediante un mecanismo aún no esclarecido, los rQ son captados por el hígado, que los emplea para sintetizar lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL; del inglés, very low density protein) que pasan a la circulación y se convierten luego en lipoproteínas de baja densidad (LDL; del inglés, low density lipoprotein). Así, la mayor parte del total de tocoferoles, los que vienen en los rQ, llegan al hígado en menos de cinco minutos después de la absorción y ahí se incorporan en

600

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

las VLDL mencionadas. Este proceso es muy complejo y en él interviene la proteína de transferencia del α tocol (α-TTP) que al parecer es exclusiva del hepatocito y la placenta; esta proteína es necesaria para el transporte intracelular de tocoferoles de los liposomas a los microsomas y tal vez participa en la incorporación de tocoferoles en VLDL. El vitámero predominante (> 80%) en las VLDL que salen del hígado a la circulación es el RRR α-tocol por el que α-TPP tiene la preferencia mayor. Se han descrito varios defectos genéticos de α-TPP que son muy raros pero que conducen a un cuadro grave de deficiencia de vitamina E. La vitamina que pasó al plasma directamente y se incorporó a las HDL circulantes, se transfiere a las demás lipoproteínas (LDL y VLDL) y a los tejidos. La transferencia de vitamina E entre lipoproteínas es significativa, llega a representar 10% del total circulante por hora y en ella interviene la proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP plasmática). En resumen, los tocoferoles pueden pasar directamente a las lipoproteínas del plasma sin preferencia por algún vitámero o bien ser incorporados en forma selectiva (preferencia por el RRR α-tocol) en las VLDL que el hígado secreta al plasma más tarde. Como se puede apreciar, la concentración y tipo de tocoferoles en el plasma depende de la secreción selectiva de RRR α-tocol por el hígado, en la que el principal determinante es la α-TPP y no de la absorción intestinal que no discrimina entre los distintos vitámeros. Aunque la vitamina E absorbida por el intestino abandona el plasma en apenas 5 min, el flujo de α-tocoferol desde el hígado hace que la concentración plasmática sea muy estable y sea útil como indicador de deficiencia (se considera deficiencia si la concentración es inferior a 10 nmol o 5 μg de α-tocoferol/mL (o bien 0.8 mg α-tocoferol/g de lípidos totales o 2.8 mg/g de colesterol). El recambio de RRR α-tocol en los tejidos se ha estudiado en ratas y cuyos y se ha visto que difiere mucho de un tejido a otro. Es muy rápido en eritrocitos, hígado y bazo, lento en el corazón, músculo y médula espinal, y sumamente lento en el cerebro que retiene α-tocoferol aún bajo condiciones de agotamiento del tejido nervioso; los nervios periféricos son excepcionales ya que muestran mayor recambio y son sensibles a la suplementación y al agotamiento.

Almacenamiento No se conoce ningún órgano o tejido que retenga y la libere a la vitamina E de acuerdo con las necesidades, es decir que funcione propiamente como almacén. Más de 90% de la vitamina E tisular se encuentra en el tejido adiposo, pero no en las membranas como se esperaría sino en los triacilgliceroles de reserva; se desco-

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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601

noce los posibles mecanismos de liberación de la vitamina E de los tejidos pero se sabe que durante las etapas de pérdida de peso, en las que el tejido adiposo libera ácidos grasos a la circulación, no se libera vitamina E por lo que es incierto qué tan disponible se encuentra la vitamina E en el tejido adiposo. Por otra parte, en individuos con deficiencia, el contenido de α-tocol en el tejido adiposo es bajo. La vitamina E tiene un recambio muy lento en el tejido adiposo, tanto que si se modifica la proporción de los vitámeros en la dieta, el efecto tarda más de 2 años en reflejarse en dicho tejido; por ello, la composición del tejido adiposo constituye un indicador muy adecuado del estado de vitamina E en el largo plazo; en este sentido, se considera deficiencia de vitamina E si la concentración es menor de 100 μg de α-tocol /mg de triacilgliceroles.

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Catabolismo y excreción Debido a que su absorción es relativamente mala, la mayor parte de la vitamina E ingerida se excreta en el excremento. Por su parte, la vitamina absorbida se recicla muy activamente y poco se llega a catabolizar y a excretar por otras vías como la bilis, la orina y tal vez la piel (glándulas sebáceas); la notable capacidad del organismo para conservar la vitamina E explica en buena medida por qué ha sido tan difícil encontrar el cuadro de deficiencia. El producto principal del catabolismo de los tocoferoles es la tocoferil quinona que se puede reducir a hidroxiquinona y conjugarse para formar el glucuronato, el cual se excreta en la bilis o bien se degrada en el riñón a ácido tocoferónico que se excreta en la orina. En estudios empleando cargas (más de 50 mg) se han encontrado dímeros, trímeros y otros derivados que no se observan en condiciones normales, algunos tan interesantes como un compuesto natriurético derivado del γ-tocoferol.

❚ PAPEL METABÓLICO Y FUNCIONES

DE LA VITAMINA

E

La vitamina E es el principal antioxidante de la fase lipídica. Ya desde mediados del siglo XX se había percibido que los tocoles y tocotrienoles son moléculas con capacidad antioxidante y se supuso que esa podría ser su papel metabólico. Aunque sin duda una de las funciones de la vitamina E es formar parte del sistema antioxidante del organismo, también tiene funciones no relacionadas con su actividad antioxidante. A continuación se revisan brevemente unas y otras.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

Función antioxidante La vitamina E tiene la capacidad de interrumpir la cadena de propagación de radicales libres y así previene o reduce el daño oxidativo que éstos causan y que son evidentes en la anemia hemolítica y en la neuropatía periférica. La vitamina E es un neutralizador muy efectivo del radical peróxilo que se produce por auto oxidación en los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que se encuentran en los fosfolípidos de las membranas celulares y subcelulares, en las lipoproteínas plasmáticas y en los tejidos. Al proteger los AGPI intracelulares, la vitamina evita daños estructurales así como sus consecuencias metabólicas en gran cantidad de reacciones. La protección de los AGPI tiene lugar gracias a que el radical peroxilo (ROO•) tiene mil veces más afinidad por la vitamina E que por los AGPI y de esa forma son los tocoferoles los que se oxidan; brevemente, el -OH del núcleo fenólico de la vitamina reduce al ROO• y lo convierte en hidroxiperoxilo (ROOH) y el tocoferol queda convertido en el radical tocoferoxilo•. Este radical pasa de la membrana celular a la fase acuosa donde se regenera al ser reducido por el ácido ascórbico, el GSH o algún otro donador hidrosoluble de electrones. Surge así el concepto de ciclo de la vitamina E ya que la vitamina ejerce su función oxidándose en lugar de que se oxiden los AGPI y regenerándose para seguir cumpliendo su función. Como parte del sistema antioxidante, los donadores hidrosolubles de electrones también se regeneran. En estudios en animales se ha observado que la vitamina E, el selenio y ciertos antioxidantes sintéticos pueden sustituirse entre si parcialmente. Esto se explica porque algunas selenio enzimas forman parte del sistema antioxidante del organismo y por ello la deficiencia de selenio eleva los requerimientos de vitamina E y agrava las manifestaciones de su carencia. Sin embargo, la función de los tocoferoles es insustituible debido a sus características singulares de ser un antioxidante liposoluble que se regenera con facilidad y que el organismo conserva con gran eficacia. Por supuesto, la función antioxidante de la vitamina E es parte de todo un sistema muy complejo y su efecto dependerá del estado de dicho sistema.

Funciones no relacionadas con la actividad antioxidante Las siguientes funciones son específicas para un vitámero en particular. • El α-tocoferol inhibe a la proteína cinasa C interfiriendo con su fosforilación. Esta enzima regula la proliferación del músculo liso de los vasos. • El α-tocoferol inhibe la fosfolipasa A2 que metaboliza el ácido araquidónico hacia eicosanoides y consecuentemente, reduce la agregación plaquetaria.

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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603

• El γ-tocotrienol estimula la degradación de la 3 OH 3 metil glutaril CoA reductasa y tiene por ello efecto hipocolesterolémico; en un estudio se encontró que con la administración de γ-tocotrienol. disminuye el tamaño de la placa carotídea. El α-tocoferol tiene el efecto contrario pues compite con el γ-tocotrienol. • El succinato de α-tocoferol induce apoptosis en células tumorales por lo que tiene potencial como agente anticancerígeno. • Como los β, γ y δ-tocoles pueden nitrarse in vitro se ha especulado sobre la importancia potencial de su reacción con óxido nítrico. Las siguientes funciones son generales (no son específicas para determinado vitámero). La vitamina E: • Modula la actividad de enzimas microsómicas. • Modula la respuesta inmunitaria y es necesaria para la función de los linfocitos T. Junto con el selenio protege a los macrófagos durante la fagocitosis. • Es necesaria para la gestación y el desarrollo fetal. Cabe comentar que la α-TTP transporta α-tocoferol al través de la placenta. • Interviene en la expresión génica. • Promueve la eritropoyesis normal y estabiliza los eritrocitos.

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❚ ASOCIACIONES

EPIDEMIOLÓGICAS

En diversos estudios se ha observado que la cantidad que se ingiere de vitamina E se asocia con menor incidencia, riesgo o gravedad de varias enfermedades por daño oxidativo como: 1. La enfermedad cardiovascular La reducción en el riesgo coronario y en el daño por reperfusión después de isquemia de miocardio se atribuye a que in vitro la vitamina E disminuye la oxidación de LDL y la agregación de plaquetas. 2. Algunas neoplasias. 3. La preeclampsia. 4. Las cataratas. 5. La retinopatía en niños prematuros. 6. La anemia del prematuro por el uso de fórmulas deficientes en α-tocol. 7. La inmunodeficiencia senil. Cabe recordar que las asociaciones epidemiológicas no prueban causalidad pero, si son sistemáticas y consistentes, pueden ser útiles para generar hipótesis al respecto.

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ ACTIVIDAD

(Capítulo 39)

VITAMÍNICA

En el cuadro 39-2 se muestra la actividad biológica y la actividad fisicoquímica, como antioxidantes, de los distintos vitámeros. Como se aprecia, en el caso de los tocoles hay correlación estrecha entre su actividad biológica y su capacidad antioxidante, pero esto no se observa en el caso de los tocotrienoles y de algunos isómeros, es decir que las actividades biológica y fisicoquímica de los distintos vitámeros de la vitamina E no siempre coinciden. Los 8 estereoisomeros sintéticos de holo rac α-tocol tienen la misma capacidad antioxidante, pero difieren en actividad biológica y cabe notar que el análogo tetrametilado del RRR α-tocol tiene la misma actividad bilológica pero es 1.5 veces más antioxidante. Entre las razones de esta discrepancia se encuentran que la vitamina tiene funciones que no se relacionan con su papel antioxidante y que la función biológica depende en alto grado de la afinidad de cada vitámero con la α-TTP y no directamente de su capacidad antioxidante Como se ve en la tercera columna del cuadro 39-2, la actividad biológica de cada vitámero y su afinidad por la α-TTP son semejantes. En preparados farmacéuticos se han usado las unidades internacionales (UI) y las de la farmacopea de los EUA, que no se recomiendan, pero que algunos usan.

Cuadro 39-2. Actividad de la vitamina E (% de RRR α-tocol) Vitámero RRR α-tocol β-tocol γ-tocol δ-tocol α-tocotrienol β-tocotrienol γ-tocotrienol δ-tocotrienol Analogo1 Acetato de α-tocoferil α-tocoferil quinona SRR α-tocol 1

Biológica 100 40 10 a 30% 1 30 ND ND ND 100

Análogo tetrametilado de RRR α-tocol. ND, no detectable.

Fisicoquímica 100 60 25 27 100

Afinidad por α-TTP 100 38 9 2 12

150 2 2 11

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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Una USP equivale a 1mg de acetato de holo rac α-tocol, 0.67 mg de RRR α-tocol o 0.74 de acetato de RRR α-tocol.

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❚ REQUERIMIENTOS Y RECOMENDACIONES Como los tocoferoles no se convierten unos en otros y el α-tocol es el más activo, el requerimiento de vitamina E se refiere en realidad al de α-tocol. Dada la diferente actividad biológica de los distintos vitámeros, los recomendaciones de vitamina E se expresan en términos del miligramo equivalente de α-tocoferol (mgEq) que es igual a 1 mg de RRR α-tocoferol, 2 mg de β-tocoferol, 10 mg de α-tocoferol γ, 3.3 mg de α-tocotrienol o 1.4 mg de α-tocoferol racémico. Puesto que a mayor ingestión de AGPI se necesita más vitamina E para protegerlos, el requerimiento de tocoferoles está íntimamente ligado con la cantidad que se ingiere de AGPI y con la cantidad de otros antioxidantes como el selenio, carotenos y mercapto aminoácidos (que reducen la necesidad de vitamina E). Como las fuentes de vitamina E y de AGPI suelen ser las mismas, es difícil elevar la ingestión de tocoferoles sin elevar la de AGPI. Mediante la cuantificación de la ingestión necesaria para prevenir la hemólisis por peróxido de hidrógeno, se ha encontrado que el requerimiento de tocoferol es 0.4 a 0.8 mgEq/g AGPI y, si se trata de AGPI de cadena larga, aumenta a 1.5 mg/g. En un adulto, 0.4 mg equivalentes de α-tocoferol por gramo de AGPI en la dieta equivale a unos 10 mg/día. Las recomendaciones mexicanas del 2005 para la vitamina E se presentan en el cuadro 39-3. Como se observa, se trata de valores de ingestión diaria sugerida (IDS) debido a que no hay todavía suficiente información para dar IDR.

Cuadro 39-3. Ingestión diaria sugerida (IDS) y límite superior de consumo (LSC) de vitamina E México 2005 Grupo de edad (años) 1a3 4a8 9 a 13 14 a 18 Adultos Mujer embarazada Mujer lactante

IDS mg ET 6 7 11 15 15 15 19

LSC mg ET 200 300 600 800 1 000 800 1 000

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

❚ VALORACIÓN

DEL ESTADO DE NUTRICIÓN EN VITAMINA

(Capítulo 39)

E

Como el cuadro clínico es muy raro y muy tardío, conviene valorar el estado de vitamina E mediante mediciones de tocoferoles en el plasma y en el tejido adiposo y mediante pruebas funcionales (hemólisis, etano o pentano en aire espirado, pruebas neurológicas y electrofisiológicas). Como ya se señaló, se considera que hay deficiencia de la vitamina si la concentración plasmática es inferior a 5 μg de α-tocoferol /mL (o bien a 0.8 mg α-tocoferol /g de lípidos totales o a 2.8 mg/g de colesterol) y si el tocoferol en el tejido adiposo es menor de 100 μg de α-tocol /mg de triacilgliceroles.

❚ DEFICIENCIA Los signos de deficiencia en animales que describieron originalmente Evans y Bishop y que se muestran en el cuadro 39-4, se pueden explicar en parte por peroxidación de los lípidos de las membranas celulares que afecta la función mitocondrial y de transporte y favorece el deterioro celular. En el ser humano la deficiencia clínica es muy poco frecuente. No se encuentran manifestaciones clínicas aun en condiciones experimentales con consumo muy escaso y lográndose valores plasmáticos bajos. En voluntarios alimentados con una dieta pobre en tocoferol durante largo tiempo, a los 2 años los valores en plasma ya eran bajos y los eritrocitos más lábiles a la hemolisis, pero no había anemia ni otras manifestaciones clínicas.

Cuadro 39-4. Signos de deficiencia de vitamina E en animales Rata -

Degeneración del epitelio germinal del testículo Reabsorción de los fetos Distrofia muscular Necrosis hepática Degeneración renal Hemólisis

Otras especies - Pérdida de albúmina plasmática (pollo, guajolote) - Encefalomalacia y diátesis exudativa (pollo) - Esteatitis (pollo, puerco) - Distrofia muscular (aves y roedores)

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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En caso de presentarse, la deficiencia de vitamina E tarda meses en corregirse a pesar del tratamiento. Sus manifestaciones principales se muestran en el cuadro 39-5. La deficiencia en el adulto tiene manifestaciones fundamentalmente neurológicas (hiporreflexia profunda, pérdida de la sensación de posición y de vibración, pérdida del equilibrio, oftalmoplejía y miastenia) En los niños con mala absorción de lípidos, la deficiencia puede ser más grave pues su sistema nervioso es más susceptible. Las causas de deficiencia de vitamina E se resumen en el cuadro 39-6 y a continuación se comenta algunas de ellas.

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Causas genéticas Se han descrito varios defectos genéticos de α-TTP. Aunque son sumamente raros, muestran el cuadro de deficiencia en todo su esplendor. Este cuadro se conoce como ataxia con deficiencia de vitamina E (ADVE) y sólo se logra controlar con megadosis de la vitamina de 800 a 1 000 mg diarios. La apolipoproteína B es necesaria para la absorción de lípidos por lo que en la hipobetalipoproteinemia y en la abetalipoproteinemia éstos no se absorben. Al no formarse quilomicrones tampoco se producen LDL ni LVDL La hipobetalipoproteinemia homocigótica es un defecto que ocasiona recambio acelerado de las lipoproteínas cuya concentración plasmática disminuye. La abetalipoproteinemia es un defecto en una enzima microsomal que no permite la unión de lípidos a la apolipoproteína B y no pasan a la circulación; para manejar esta defecto se requiere suplementar 100 a 200 mg/kg peso, es decir unos 5 a 7 g de tocoferol, ya que sólo se retiene 1% de la vitamina E ingerida. En estas dos enfermedades, durante el primer año vida hay esteatorrea, neuropatía periférica progresiva, reducción del crecimiento, acantocitosis, retinitis pigmentosa y ataxia progresiva.

Cuadro 39-5. Cuadro clínico de deficiencia de vitamina E en el ser humano • Neuropatía periférica • Ataxia espinocerebral • Miopatía del músculo esquelético • Retinopatía pigmentada • Anemia hemolítica

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

Causas alimentarias Las dietas muy bajas en lípidos, como las que se prescriben para el tratamiento de dislipoproteinemias o de obesidad, automáticamente son pobres en vitamina E y además hacen más difícil su absorción. Con frecuencia, estas dietas son relativamente altas en AGPI lo que eleva el requerimiento de vitamina E y empeora la deficiencia. Las fórmulas en las que se utiliza aceite de soya o de maíz como fuente de lípidos son ricas en AGPI y, si bien contienen γ-tocol y toco trienoles, no contienen α-tocol. En consecuencia, cuando representan el total de la dieta como ocurre en la alimentación enteral y paraenteral o en el manejo de recién nacidos pretérmino o pequeños para la edad gestacional, se produce deficiencia de la vitamina. Si además en estos casos se administran suplementos de hierro (que es muy oxidante) se facilita el estrés oxidativo y se observa anemia hemolítica.

Cuadro 39-6. Causas de deficiencia de vitamina E a) Genéticas - Defectos genéticos de α-TTP - Trastornos en el metabolismo de lipoproteínas: hipobetalipoproteinemia y abetalipoproteinemia b) Alimentarias - Dietas muy bajas en lípidos - Uso de fórmulas deficientes en α-tocol o ricas en AGPI en la alimentación de recien nacidos prematuros o pequeños para la edad gestacional, alimentación enteral o parenteral c) Alteraciones en la digestión o en la absorción de lípidos - Enfermedades que causan colestasis crónica (cirrosis biliar primaria, atresia de las vías biliares, estasis de los ductos biliares intrahepáticos, síndrome de Alagille, síndrome de colestasis familiar, hepatitis neonatal idiopática) - Fibrosis quística e insuficiencia pancreática - Síndrome de intestino corto - Enfermedad de Crohn - Trombosis mesentérica - Seudo obstrucción intestinal - Esteatorrea crónica (síndrome de asa ciega, linfangiectasia intestinal, enfermedad celiaca, pancreatitis crónica) d) Desnutrición grave en niños

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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Causas digestivas La deficiencia de vitamina E casi siempre es secundaria a mala digestión o mala absorción de lípidos. Por supuesto, los padecimientos que afectan la digestión de los lípidos y se acompañan de esteatorrea, como la insuficiencia pancreática por pancreatítis o fibrosis quística, el síndrome de intestino corto, la enfermedad celiaca y las hepatopatías colestáticas (al haber insuficiente cantidad de bilis, la digestión y absorción de lípidos se deprime), pueden reducir casi por completo la absorción de la vitamina. La deficiencia secundaria a estos padecimientos tarda varios años, a veces décadas, en presentarse debido a la gran eficiencia con la que el organismo conserva la vitamina, a la existencia de tocoferol en muchos tejidos y a que la dieta no suele ser pobre en vitamina E. Que se presente o no la deficiencia clínica y su grado depende de la ingestión, absorción y recambio de los tocoferoles, del grado de estrés oxidativo, de la cantidad de ácidos grasos poliinsaturados que se ingieran y del estado funcional de la red antioxidante (en la que participan enzimas y nutrimentos).

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❚ TOXICIDAD La vitamina E tiene muy baja toxicidad intrínseca en cantidades hasta cien veces por arriba de la recomendación. Si a ello se agrega que es muy difícil que la dieta humana la contenga en exceso, que la absorción de tocoferoles oscila entre 15 y 45% de lo ingerido y que se reduce aun más conforme aumenta la ingestión, se puede concluir que el exceso de vitamina E por razones dietéticas es prácticamente imposible. Los límites superiores de consumo (LSC) de vitamina E se muestran en el cuadro 39-3. El exceso experimental de la vitamina se acompaña de fatiga, debilidad muscular, cólicos, diarrea y reducción en la coagulación Si bien no hay indicios de que ocurra in vivo, conviene tener presente que in vitro y en ausencia de antioxidantes de fase acuosa, la vitamina E oxidada se convierte en un prooxidante que, además, tiene larga vida.

❚ CONCLUSIONES La vitamina E es un nutrimento indispensable en la dieta ya que es el principal antioxidante de la fase lipídica. La vitamina E neutraliza al ROO• producido en los ácidos grasos poliinsaturados que se encuentran en los fosfolípidos de las membranas celulares y de los organelos, por lo que protege a la células de daños estructurales y diversas consecuencias metabólicas en gran cantidad de reacciones. En el ser

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Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

(Capítulo 39)

humano la deficiencia clínica, así como la ingestión en concentraciones tóxicas es muy poco frecuente; no obstante, es importante estudiar estos efectos en modelos experimentales para lograr una mejor comprensión de esta vitamina.

❚ REFERENCIAS Avila A, Shama T, Chávez A: Encuesta Urbana de Alimentación y Nutrición en la zona metropolitana de la Ciudad de México. Instituto Nacional de la Nutrición, 1995. Bourges RH: Definiciones y conceptos básicos Valores nutrimentales de referencia En: Bourges RH, Casanueva E, Rosado JL. (eds.) Recomendaciones de Ingestión de Nutrimentos para la Población Mexicana; bases fisiológicas, Tomo 1, México: Editorial Médica Panamericana, 2005:1-19. Bourges H: Los alimentos y la dieta. En: Casanueva E, Kaufer M, Pérez Lizaur AB, Arroyo P. (eds.) Nutriología médica. Editorial Médica Panamericana S.A., 2001:469-508. Esterbauer H, Dieber-Rothender M, Striegl G et al.: Role of vitamin E in preventing the oxidation of low-density lipoprotein. Am J Clin Nutr 53 (Suppl): 1991:314S-321S. Food and Nutrition Board. Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium and Carotenoids. Washigton DC National Academy Press, 2000. Kaufer-Horwitz M, Aguilar SC: Vitamina E En: Bourges RH, Casanueva E, Rosado JL (eds.) Recomendaciones de Ingestión de Nutrimentos para la Población Mexicana; bases fisiológicas. Tomo 1 México: Editorial Médica Panamericana, 2005;55-63. Krinsky NI, Sies H (eds.): Antioxidant vitamins and β carotene in disease prevention Am J Clin Nutr 62 (Suppl) 1995;1299S-1540S. Pryor WA: Vitamin E In: Bowman BA, Russell RM (eds.) Present knowledge in nutrition 8th edition Washington DC: ILSI Press, 2001:156-163. Pryor WA: Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials Free Radic Biol Med 2000;28:141-164. Pryor WA: The antioxidant nutrients and disease prevention-what do we know and what do we need to find out? Am J Clin Nutr 1991;53(Suppl):391S-393 S. Rivera-Dommarco J, Shama-Levy T, Villalpando-Hernández S, Gonzáles de Cossío T, Hernández-Prado B, Sepúlveda J: Encuesta Nacional de Nutrición SSA, INSP, INEGI, 1999. Rosado JL, Bourges H, Saint-Martín B: Deficiencia de Vitaminas y Minerales en México: Una revisión critica del estado de la información: II Deficiencia de vitaminas. Rev Salud Pública de México 1995;37:452-461.

Aspectos nutriológicos de la vitamina E

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CTIVIDAD FÍSICA

Y ESTRÉS OXIDATIVO Pilar Milke García

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❚ INTRODUCCIÓN Desde hace algún tiempo, se ha relacionado al estrés oxidativo con la fisiopatología de muchas enfermedades, pero afortunadamente, las células poseen múltiples mecanismos para protegerse del daño causado por los diferentes procesos de oxidación. Algunos componentes de la dieta que se encuentran en las frutas y las verduras particularmente, son fuentes importantes de agentes protectores. Entre ellos, las vitaminas A, C y E, los minerales como el selenio y las sustancias con propiedades antioxidantes como la luteína, los licopenos, la zeaxantina, la quercetina, los isotiocianatos, la catequina, entre otros. No obstante, es importante verificar su seguridad y potencial antioxidante. En los alimentos también pueden encontrarse sustancias que actúan como prooxidantes. Tal es el caso de los ácidos grasos poliinsaturados, algunas toxinas derivadas de plantas y microorganismos, y algunos pesticidas. Como se ha visto a lo largo de este libro, el estrés oxidativo es una alteración en el equilibrio entre la producción de prooxidantes durante el metabolismo aeróbico normal y la síntesis de antioxidantes. Una de las condiciones en las que podría esperarse un incremento de la actividad oxidativa, dada la gran demanda energética y consumo de oxígeno, es el ejercicio. Esto, aunado a las otras causas ❚ 613 ❚

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(Capítulo 40)

de estrés oxidativo que ya se han mencionado como son la radiación, el metabolismo de xenobióticos entre los que se encuentran los contaminantes ambientales y algunos fármacos, así como una función inmunológica anormal. Si esta oxidación sobrepasa la capacidad antioxidante del organismo se produce daño celular (en sus lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) y todo ello puede repercutir en el rendimiento físico. Esta es la base teórica de la suplementación de antioxidantes en el deportista, aunque ciertamente este tema constituye aún un extenso campo de investigación.

❚ ACTIVIDAD

FÍSICA Y ESTRÉS OXIDATIVO

Las reacciones que mantienen un organismo vivo están acopladas de tal manera que las reacciones que producen energía (procesos de oxidación) están compensadas por reacciones que eliminan los subproductos que pueden iniciar el daño en los órganos y a los tejidos. Durante la práctica deportiva, el metabolismo se ve aumentado varias veces, lo que produce una mayor cantidad de especies químicas altamente reactivas (ERO, malondialdehído, isoprostanos) que el organismo debe neutralizar. Se ha calculado que el ejercicio aumenta entre 10 y 20 veces el consumo total de oxígeno en el cuerpo, y que el flujo de este gas en las fibras del músculo esquelético periférico activo puede aumentar entre 100 y hasta 200 veces. Durante el metabolismo oxidativo, del 0.1 al 0.5% del oxígeno consumido durante la respiración no se convierte en agua durante la cadena respiratoria, sino que forma radicales superóxido (véase la sección III). Las principales fuentes de estrés oxidativo son la producción de superóxido mitocondrial, los mecanismos de isquemia-reperfusión y la autooxidación de catecolaminas (véase la sección III). El ejercicio también genera ERO radicales libres en los siguientes casos: 1. Cuando se incrementa la concentración de adrenalina y otras catecolaminas. Se produce ERO durante su metabolismo de inactivación. 2. Durante la producción de ácido láctico en el ejercicio excesivo, ya que en este proceso se puede convertir un radical libre relativamente débil (superóxido) en uno mucho más agresivo (hidroxilo). 3. Cuando se produce una respuesta inflamatoria al daño muscular secundario por efecto del sobreentrenamiento. Es bien sabido que el ejercicio tiene muchos efectos benéficos para la salud, pero el ejercicio intenso aumenta el flujo de oxígeno y produce eventos intracelulares que pueden aumentar la producción de ERO y ERN. Es por eso que el

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estrés oxidativo se asocia a una disminución del rendimiento físico, a la fatiga, daño y dolor muscular, así como a la disminución de la respuesta inmunitaria, a la vulnerabilidad (p. ej., a lesiones) y a los procesos de inflamación. También se ha reportado una recuperación más prolongada después del ejercicio intenso, aún en personas entrenadas. En teoría algunas de las condiciones asociadas al ejercicio intenso, como la hipoxia tisular local, la isquemia-reperfusión, o las temperaturas tisulares muy elevadas y el daño inducido por estiramiento muscular, podrían también aumentar la producción de ERO y producir disfunción mecánica. En el daño por estiramiento, por ejemplo, el estrés oxidativo aumenta la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) y enzimas productoras de radical superóxido, las xantina oxidasas (XO) y superóxido dismutasas (SOD). El daño muscular de inicio tardío posterior al ejercicio prolongado se relaciona parcialmente a la inflamación vía la infiltración fagocitaria causada por las ERO. Sin embargo, las ERO inducen no sólo el daño muscular por el ejercicio y la propagación de una respuesta inflamatoria aguda subsecuente, sino que también favorecen la eliminación del tejido muscular dañado por el propio ejercicio a través de la acción de los neutrófilos, y por eso el potencial papel de los antioxidantes en limitar la respuesta inflamatoria posejercicio puede verse afectada. Así, el entrenamiento a corto plazo podría, en dado caso, proteger al músculo del daño inducido por ejercicio y de la inflamación. Después del ejercicio extenuante se producen los siguientes efectos: 1. En las fibras musculares se genera un metabolismo anaeróbico que favorece la acidosis local, lo que promueve la liberación de oxígeno de la hemoglobina y de hierro de la transferrina. 2. En los eritrocitos se produce autooxidación de la hemoglobina. 3. Se acumulan intermediarios de la peroxidación lipídica en el suero, como el malondialdehído (MAD) y la LDL oxidada. Además, se forman radicales con el óxido nítrico y residuos de la tirosina, y aumenta la concentración y auto-oxidación de las catecolamina. Este fenómeno, a su vez, produce normalmente superóxido y otros radicales. 4. En el endotelio, el ejercicio intenso agota la reserva celular de ATP, y su bomba dependiente de calcio se altera. El aumento intracelular de calcio activa proteasas dependientes de calcio (calmodulina), que escinden un péptido de la xantina deshidrogenasa, convirtiéndola en su forma de oxidasa, la que a su vez genera radicales superóxido e hidroperóxidos. 5. Durante el ejercicio intenso, se incrementa el flujo sanguíneo a los músculos, por lo que el hígado, el riñón y el tracto gastrointestinal reciben menos del 20% del flujo basal. Después del ejercicio, estos órganos se reperfunden y se produce un fenómeno de isquemia-reperfusión, que se caracteriza por una acumulación de ERO en los órganos reperfundidos.

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Por otra parte, aún cuando un exceso de oxidantes daña los tejidos, una baja concentración de éstos actúa como moléculas mensajeras que inician numerosos procesos fisiológicos, y de esta forma es posible que algunos de los efectos benéficos asociados al ejercicio estén realmente mediados por oxidantes.

❚ EJERCICIO Y ANTIOXIDANTES Se ha discutido mucho sobre la importancia real del fenómeno de oxidación en el deporte, de sus efectos en el rendimiento deportivo y de la necesidad de suplementación de antioxidantes, ya que se cree que los antioxidantes del organismo no son suficientes como para neutralizar las especies oxidantes generadas durante el ejercicio excesivo. Sin embargo, a la fecha no hay consistencia en los estudios que intentan asociar el estrés muscular, metabólico, hormonal o inflamatorio inducido por el ejercicio con las concentraciones de antioxidantes, de tal forma que puede no haber evidencia para recomendar la suplementación de antioxidantes a personas físicamente activas por encima de lo que puede aportar una dieta equilibrada.

Antioxidantes en plasma El plasma obtenido de la sangre de humanos contiene enzimas como la catalasa, la superóxido dismutasa (SOD), la glutatión peroxidasa (GPx), además de glutatión (GSH) y pequeñas cantidades de otras moléculas con actividad antioxidante. En cuanto a las vitaminas con función antioxidante, la vitamina C o ascorbato es la más abundante en plasma. Sin embargo, el ascorbato plasmático es uno de los primeros compuestos que se oxidan, y al agotarse se empiezan a oxidar los grupos tiol, la bilirrubina, el ácido úrico y la vitamina E. Otro mecanismo antioxidante es el transporte dentro y fuera de los eritrocitos, ya que en estas células se producen muchos procesos reductivos. En cuanto a las proteínas antioxidantes más importantes en el plasma se encuentran la ceruloplasmina, la albúmina, la transferrina, la haptoglobulina y la hemopexina. Las tres primeras secuestran iones hierro y cobre pero generan radicales hidroxilo.

Antioxidantes enzimáticos Se ha sugerido que, para adaptarse al estrés oxidativo generado por el ejercicio, el organismo aumenta las defensas antioxidantes y disminuye la producción de oxidantes y la fuga de radicales durante la fosforilación oxidativa. De hecho, en

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los últimos años se ha discutido mucho el efecto que causa el ejercicio sobre las concentraciones plasmáticas de antioxidantes y enzimas relacionadas con su metabolismo. Se ha encontrado que cuando el ejercicio es prolongado e intenso, puede haber una reducción transitoria del contenido de algunas vitamina y del estado redox del glutatión (GSH) (esto se discutirá más adelante). Por otro lado, se ha demostrado que con sólo un episodio de ejercicio de suficiente intensidad se estimula la actividad de las enzimas antioxidantes. Así, el ejercicio agudo incrementa la producción de superóxido por parte de los neutrófilos aunque el entrenamiento de resistencia (ejercicio crónico), por el contrario, suprime la inducción del superóxido (disminuye la concentración de SOD extracelular). Esto puede significar que el entrenamiento de resistencia aumenta las reservas de dicha enzima en los tejidos y, de alguna forma, puede considerarse un índice de entrenamiento de resistencia. Retomando la idea de que el entrenamiento de resistencia de alta intensidad disminuye el estrés oxidativo producido por el ejercicio, se entiende que después del entrenamiento aumenta el VO2max (el volumen máximo de oxígeno que el organismo es capaz de utilizar durante el máximo esfuerzo posible en uno a seis segundos. Es una expresión de la máxima capacidad funcional. En la práctica, esto se traduce como la capacidad cardiovascular o cardiopulmonar, uno de los factores más asociados al rendimiento físico, o la capacidad de extraer oxígeno a nivel celular), no cambia la actividad de las enzimas oxidativas (SOD, GPx y catalasa) en los eritrocitos y aparentemente los neutrófilos producen menos anión superóxido. El entrenamiento también disminuye el aumento en la peroxidación en la membrana eritrocitaria. Sin embargo, otros estudios han mostrado que el entrenamiento regular de resistencia promueve un aumento tanto de la SOD como de la GPx de las células musculares activas, al igual que de GSH, sobre todo cuando el ejercicio es de alta intensidad. Las controversias respecto a la inducción enzimática radican en que ésta inducción puede ser específica para algunas enzimas e, incluso, órganos y depende del tipo de ejercicio realizado. Por ejemplo, el entrenamiento puede regular la Cu-Zn SOD en tejidos aeróbicos. Sin embargo, en otros estudios se ha visto que ni el ejercicio de resistencia ni el agudo aumentan la concentración plasmática de CuZn-SOD, pero el ejercicio agudo después de entrenar sí aumenta la Mn-SOD. Igualmente, se ha visto que sólo después del ejercicio agudo aumenta el nivel de peroxidación lipídica, lo que confirma que las personas que realizan ejercicio intenso tienen mayor estrés oxidativo. Esta regulación inducida por el entrenamiento aparentemente se limita a los músculos esqueléticos altamente oxidativos, y al parece no influye tanto en los sistemas antioxidantes del corazón o el hígado. Por otro lado, aparentemente la adaptación al entrenamiento de la Mn-SOD y otras enzimas antoxidantes se produce principalmente en las fibras musculares tipo IIa.

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Todas las enzimas antioxidantes (SOD, catalasa, GPx) requieren elementos traza (Cu, Zn, Mn, Fe, Se) para su biosíntesis o como factores prostéticos, y particularmente cuando la célula se encuentra en estado de estrés oxidativo durante el ejercicio agudo y crónico. Aunque estos elementos no se consideran antioxidantes, su papel en la defensa celular contra el estrés oxidativo es importante, y el ejercicio agudo y crónico altera su metabolismo.

Antioxidantes no enzimáticos (vitaminas y glutatión) La vitamina E es un antioxidante intramembranal y por tanto, un estabilizador de la membrana celular. En los últimos 40 años se ha suplementado con vistas a mejorar el desempeño deportivo, disminuir el daño muscular inducido por ejercicio y maximizar la recuperación. Sin embargo, a la fecha no existen evidencias concluyentes. Aún con dosis varias veces mayores a las recomendadas, las concentraciones tisulares y séricas de vitamina E apenas aumentan moderadamente. De hecho, la mayoría de la evidencia parece no mostrar efectos significativos de la suplementación de vitamina E en el desempeño, entrenamiento o velocidad de recuperación posejercicio ni en deportistas recreativos ni profesionales. La deficiencia de vitamina E, sin embargo, exacerba la producción muscular y hepática de radicales libres y aumenta la lipoperoxidación y disfunción mitocondrial en ratas sometidas a ejercicio. Por otro lado, tampoco se ha visto que el ejercicio altere significativamente la concentración de esta vitamina en suero o tejidos. En cuanto a la vitamina C, tampoco se ha logrado establecer claramente su importancia en la protección contra el estrés oxidativo durante la práctica deportiva. Su principal función es el reciclaje del radical de vitamina E (radical tocoferilo) para formar nuevamente vitamina E (véase Sección V). Aunque su efecto aparentemente es más notable en el corazón que en otros órganos, aún así no evita la disminución en el tiempo de resistencia y alteraciones mitocondriales causadas por la deficiencia de vitamina E. Tanto el ayuno-realimentación como el ejercicio exhaustivo influyen en la concentración de GSH en el hígado y el músculo esquelético, y estos cambios pueden estar controlados por la síntesis hepática de GSH y su liberación debido a una situación hormonal (en ratas ejercitadas la insulina es menor y el glucagón mayor que en las ratas en reposo). El GSH reducido tiene múltiples funciones en el proceso de protección de tejidos del daño oxidativo durante el ejercicio. Reduce a los peróxidos de hidrógeno y orgánicos, secuestra al oxígeno singulete y al radical hidroxilo, y reduce los radicales de tocoferol directa o indirectamente a través del radical semideshidroascorbato, previniendo la lipoperoxidación. El GSH puede reciclarse a expensas de NADPH, una fuente relativamente ilimitada de equivalentes reductores. El 90% del GSH se sintetiza de novo en el híga-

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do, aunque puede movilizarse a otros tejidos como el músculo esquelético, si es que si ve incrementado el estrés oxidativo. El GSH hepático disminuye con el ejercicio, pero el GSH y el glutatión total (GSH más glutatión oxidado, GSSG) aumenta en el músculo ejercitado de acuerdo con la intensidad del ejercicio, aunque hay controversias al respecto. Poco se sabe de las consecuencias de una deficiencia de GSH cuando existe un estado de estrés oxidativo inducido por ejercicio en varios tejidos; sólo se sabe que su depleción aumenta, lógicamente, la producción de ERO, aumentando a su vez la lipoperoxidación y activación de enzimas antioxidantes. Por último, la suplementación con tioles puede ser beneficiosa durante el ejercicio agudo o crónico, y para proteger del daño de isquemia-reperfusión, por lo que se ha utilizado N-acetilcistenína, GSH libre y GSH acetil monoéster. Existen evidencias de que la suplementación de antioxidantes combinada con el tratamiento antitiroideo con metimazol puede ser útil en la disminución del estrés oxidativo. Las discrepancias en los diversos estudios sobre el uso de antioxidantes y vitaminas en la dieta para reducir el daño muscular inducido por el ejercicio reflejan la diversidad de antioxidantes estudiados, la naturaleza (tipos) y tiempos del ejercicio (duración; suplementación antes, durante o después del ejercicio; entrenamiento versus competencia), la edad, la condición física de las personas estudiadas y la metodología para evaluar el estrés oxidativo. Existe evidencia controversial en cuanto a que la suplementación de antioxidantes pueda mejorar el desempeño o rendimiento deportivo, aunque muchos estudios sugieren que los antioxidantes disminuyen el daño inducido por ejercicio, y así la intervención con antioxidantes es más a largo que a corto plazo. En conclusión, la evidencia de que la suplementación dietética con antioxidantes mejora la capacidad de ejercicio es limitada, y además no se ha logrado establecer que el ejercicio vigoroso incremente la necesidad de aumentar el consumo de antioxidantes en la dieta, por lo que existe una clara necesidad de continuar los estudios alrededor de este tema. Los esfuerzos deben dirigirse hacia el establecimiento de las necesidades individuales de los deportistas y para promover una dieta alta en antioxidantes.

❚ MÉTODOS

DE MEDICIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO DURANTE EL EJERCICIO

Poco estudios miden directamente la cantidad de radicales libres generados durante el ejercicio, debido a la vida media tan corta que tienen (típicamente entre 10-6 y 10-12 seg); así como por falta de metodologías sofisticadas para medir este fenómeno. Por ello, los investigadores en este tema utilizan mediciones indi-

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rectas para tratar de establecer al grado de estrés oxidativo al que está sometido un tejido. La determinación de los niveles de peroxidación lipídica se ha utilizado como el principal indicador de radicales libres inducidos por la práctica deportiva, sabiendo que éstos alteran e inactivan los complejos enzimáticos, dañan el DNA y RNA y promueven las mutaciones. El malondialdehído (MDA) en la sangre y el pentano en el aliento son indicadores indirectos de la peroxidación lipídica. Aún así, no todos los estudios demuestran que existe un aumento en estos marcadores, dada la variación intersujeto. Sin embargo, algo claro es que se recomienda utilizar más de un índice de lipoperoxidación durante el ejercicio como los dienos conjugados y lipoperóxidos. En cuanto a la degradación de proteínas, enzimas y ácidos nucleicos, la 8-hidroxi-desoxiguanosina (8-OHdG u 8oxodGuo) urinaria es un marcador estable de DNA sin reparar, elevado de manera importante después de un maratón. La medición de radicales libres, daño a lípidos y DNA, así como el estado redox, por ejemplo, la concentración de glutatión oxidado contra reducido (GSH/GSSG), son también mediciones del estrés oxidativo, al igual que los sustratos reactivos del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la mieloperoxidasa (MPO). El daño tisular e inflamación local pueden detectarse con un ejercicio de alta intensidad (60% del VO2max), observándose leucocitosis (neutrocitosis) y un aumento en la activación neutrofílica.

❚ EJERCICIO Y ENVEJECIMIENTO Desde hace mucho tiempo se sabe que el ejercicio tiene muy variados beneficios físicos, metabólicos y psicológicos. El ejercicio puede también tener un papel profiláctico en la sarcopenia por edad, ya que el estrés oxidativo del músculo en personas mayores está relacionado con la generación de ERO y cambios en el sistema de defensa de antioxidantes. El estrés oxidativo aumenta en corazón e hígado conforme la edad y se sabe que las ERO están implicadas en el proceso del envejecimiento. Los beneficios del ejercicio regular en edades avanzadas incluyen una disminución en el riesgo de enfermedades cardiovasculares, cáncer, osteoporosis y diabetes. Los mecanismos implicados se relacionan con la disminución del tejido adiposo, la alteración de los perfiles lipídicos y hormonales, las adaptaciones de las proteínas receptoras y transportadoras, y el mejoramiento en el acoplamiento mitocondrial. Además como se ha mencionado aquí, existen algunas evidencias (aunque controversiales) de que se podría mejorar el sistema de defensa antioxidante. El ejercicio regular, además, disminuye los signos del envejecimiento (deterioro asociado al envejecimiento) e incrementa la media de la esperanza de vida en ratas, alrededor de un 10%. Algunos tipos de ejercicio también mejoran

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la función del músculo esquelético y promueven la adaptación vascular y el mantenimiento de la masa muscular. Por otro lado, el ejercicio agudo en personas mayores no entrenadas puede aumentar el estrés oxidativo, aunque las sesiones moderadas repetidas inducen adaptaciones que previenen el daño oxidativo masivo. De manera aparente, a pesar de la producción de ERO, el músculo en personas mayores tiene una disminución en la expresión génica de enzimas antioxidantes, quizás por una disminución en la señalización celular. Aunque hay una modificación en la producción de las enzimas antioxidantes durante el envejecimiento, no se ha logrado definir si el ejercicio modifica la expresión de estas enzimas. El ejercicio no exhaustivo tiene, por eso, importantes beneficios, ya que induce un estrés oxidativo ligero que estimula la expresión de ciertas enzimas antioxidantes, aunque siempre se requieren entrenamientos repetidos para lograr este efecto. El envejecimiento disminuye la adaptación natural del organismo al entrenamiento con respecto a las enzimas antioxidantes, y por ello se plantea la necesidad de la suplementación de antioxidantes exógenos en estas circunstancias. El envejecimiento, además, aumenta la incidencia de daño muscular y respuesta inflamatoria y los mecanismos de reparación muscular y regeneración disminuyen. En la actualidad, se piensa que las enzimas hepáticas y miocárdicas antioxidantes disminuyen con la edad, mientras que las enzimas relacionadas con el metabolismo del GSH en el corazón aumentan de manera significativa. No obstante poco es lo que se conoce con respecto al entrenamiento físico en estos sistemas hepáticos o miocárdicos, aunque se ha sugerido que el ejercicio puede causar respuestas adaptativas en la glutatión peroxidasa. Debido a que el ejercicio extenuante aumenta el flujo de oxígeno muscular y produce eventos intracelulares relacionados con el daño oxidativo, se discuten los beneficios del ejercicio extremo o agudo en personas mayores, ya que son más susceptibles al daño oxidativo por cambios estructurales y bioquímicos que facilitan la formación de ERO. Existen aún muchas preguntas críticas por responder: si el ejercicio modula la expresión génica de enzimas antioxidantes en la edad avanzada, si el ejercicio previene la sarcopenia, si se debe suplementar a estas personas cuando son físicamente activos y otras cuestiones.

❚ CONCLUSIONES El ejercicio extenuante se caracteriza por un aumento en el consumo de oxígeno y una alteración en la homeostasia prooxidante-antioxidante que modifica el estado redox celular. Durante el ejercicio se han identificado al menos tres rutas metabólicas como fuentes principales de generación intracelular de radicales libres: la cadena respiratoria mitocondrial, el metabolismo de xantina oxidasa y los polimorfonucleares.

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Aunque se sabe que las ERO disminuyen la reserva de vitaminas antioxidantes y GSH y causan daño oxidativo en el músculo ejercitado o en ejercicio, el efecto del entrenamiento en la inducción de enzimas antioxidantes es diferencial: en algunos músculos aumenta la actividad de ciertas enzimas, mientras que en otros la disminuye. La depleción de los sistemas de antioxidantes aumentan la vulnerabilidad de varios tejidos y componentes celulares a las ERO. Sin embargo, los sistemas enzimáticos y no enzimáticos tienen gran versatilidad y adaptabilidad en respuesta al ejercicio agudo y crónico. Debido a que el ejercicio exhaustivo, agudo y crónico, aumentan el consumo de antioxidantes, se puede suponer que la suplementación de antioxidantes específicos puede ser beneficioso. No obstante, aún se cuestiona si la suplementación con antioxidantes en la dieta en las personas que realizan ejercicio es deseable.

❚ EL FUTURO Se requiere llevar a cabo más investigaciones con respecto a la utilidad de la suplementación antioxidante y su precisión durante la práctica deportiva tanto profesional como recreativa, así como sobre el impacto en la suplementación crónica y sus efectos, tanto positivos como negativos, sobre el estado redox celular, así como sus efectos secundarios o contraproducentes. Hay que ahondar en los beneficios del ejercicio y suplementación de antioxidantes durante el envejecimiento, y finalmente estudiar la interacción de los antioxidantes con los ácidos grasos poliinsaturados y el hierro.

❚ REFERENCIAS Aoi W, Naito Y, Takanami Y, Kawai Y, Sakuma K, Ichikawa H, Yoshida N, Yos hikawa T: Oxidative stress and delayed-onset muscle damage after exercise. Free Radic Biol Med 2004;37:480-487. Aruoma OI: Free radicals and antioxidant strategies in sport. J Nutr Biochem 1994;5:370-381. Banerjee A, Mandal A, Chanda D, Chakraborti S: Mol Cell Biochem 2003; 253:307-312. Brickson S, Hollander J, Corr DT, Ji LL Best TM: Oxidant production and immune response after stretch injury in skeletal muscle. Med Sci Sports Exerc 2001;33:2010-2019. Clarkson PM, Thompson HS: Antioxidants: what role do they play in physical activity and health? Am J Clin Nutr 2000;72(suppl):637S-646S.

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Í

NDICE

NOTA: Los números de página en negritas indican cuadros y en cursivas corresponden a figuras

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A Acantocitosis, 607 Acatalasemia, 196 Aceites, 135 Acetaminofén, 263 Acetato de desoxicorticosterona, 246 Acetil colinesterasa, 369 L-acetil-carnitina, 368 N-acetil-cisteína, 371 N-acetil-β-D-glucosaminidasa, 249 Acetilación, 148, 150, 155, 159 N-acetilcisteína, 338 Ácido(s) abscísico, 516 acetilsalicílico, 116 araquidónico, 69, 78, 143, 361, 397 ascórbico, 30, 279, 287, 294, 324, 508, 579, 581 aspártico, 108, 113 benzoico, 312 cafeico, 304 carboxílicos, 304 cevitámico, 581

cinámicos, 304, 312 cítrico, 452 clorogénico, 305 criptoclorogénico, 305 D-araboascórbico, 581 dicetogulónico, 581 docosahexaenoico, 439 eritórbico, 581 fenólicos, 304 ferúlico, 304 fosfatídico, 512 γ-amino butírico, 519 galacturónico, 304 gálico, 304 glucurónico, 304 D-glucurónico, 306 graso(s), 63, 136 araquidónico, 137 insaturados, 293 linoléico, 137 linolénico, 137 monosaturados, 137 omega, 380 poliinsaturados, 40, 137, 439, 602

❚ 625 ❚

626 • Acilcarnitinas/Apolipoproteína

hexurónico, 580, 581 hidroxicinámico, 305 hipobromoso, 32 hipocloroso, 32, 75, 586 iboténico, 369 isoascórbico, 581 isoclorogénico, 305 kaínico, 369 L-ascórbico, 581 L-deshidroascórbico, 581 L-xiloascórbico, 581 láctico, 614 linoleico, 143, 202 linolénico, 202, 439 lipoico, 281 mercaptúrico, 258 neoclorogénico, 305 nítrico, 466 3-nitropropiónico, 369 nitroso, 466 nucleicos, 30, 34, 37, 100, 124, 460 orgánicos, 304 oxálico, 112 p-cumárico, 304 p-hidroxibenzoico, 304 quinolínico, 369 retinóico, 566, 569 salicílico, 196, 514 shikímico, 306 sináptico, 304 sulfénico del glutatión, 42 sulfhídrico, 28 tiobarbitúrico, 323, 478, 620 tricarboxílicos, 34 úrico, 30, 86, 100, 466 vainillínico, 304 Acilcarnitinas, 587 Acilglicerol, 380 Aclorhidria, 565 Aconitasa, 169 Acroleína, 130 Acuaporinas, 509 Adenina (A), 77, 85, 87, 120, 224, 462 Adenocarcinoma de pulmón, 248 Adrenodoxina, 64 Agliconas-flavonoides, 306 AIBN (azabisisobutironitrilo), 20 AINE (antiinflamatorios no esteroideos), 116 Alanina, 42, 180 Alantoína, 86 Albúmina, 100, 616 Alcanos, 143 Alcoxilo, 122, 275 Aldehídos, 35, 143, 286, 566

(Índice)

Aldehidooxidasa, 85 Alelopatía, 521 Aleurona de semillas, 518 Alilbenceno, 305 S-alilcisteína, 368 Alopurinol, 400 Alquilo, 275 Alquilperóxidos, 111 Amikacina, 430 Amiloides, 179 Aminas, 304 3-amino-1,2,4-triazol, 185 Aminoacídicos, 255 Aminoácidos, 62, 206 alifáticos, 106 azufrados, 106 de proteínas, 105 excitadores, 373 Aminoglucósidos, 430 Aminotriazol, 403 AMPA-kainato, 372 Anemia hemolítica, 236 perniciosa, 596 Aneuploidías, 161 Aneurisma aórtico abdominal, 245 Angiotensina II, 246, 408 Anión, 3 Ankirina, 494 Anoxia, 526 Antiapoptóticos, 238, 480 Antibiótico, 546 Antígenos de leucocitos humanos, 244 Antiinflamatorios, 238 Antimicina, 57, 335 A, 55 Antioxidantes, 33, 181, 211, 230, 238, 271, 319, 320, 352, 586 cáncer y, 355 endógenos, 322, 361 enzimáticos, 326, 616 fenólicos, 355 intracelulares, 324 naturales, 291, 443 no enzimáticos, 326, 618 Antocianidinas, 305, 308 Antocianinas, 306 Anuros, 534 AO (aldehidooxidasa), 85 AOX (oxidasa alternativa), 510 AP1 (proteína activadora 1), 492 Apocarotenales, 565 Apocarotenoles β, 565 Apolipoproteína, 99

Apoptosis/Células • 627

B, 607 Apoptosis, 158, 228, 298, 454, 477 Arabinosa, 304 L-arabinosa, 306 Arginina, 106, 112 L-arginina, 41, 400, 423 Arqueobacterias, 185 Arsénico (As), 461 Arteriosclerosis, 181 Artritis reumatoide, 69 Asbestosis, 275 Ascorbato, 31, 40, 277, 361, 443 Asparragina, 108 Aspartato, 371 Aspartil, 112 Asplenia, 237 Astaxantina, 563, 568 Astrocitos, 281 Ataxia progresiva, 607 Ateroesclerosis, 143, 244, 471 Autooxidación, 361 Auxinas, 519 Azabisisobutironitrilo, 20 Azida, 75

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B Bacterias, 73, 185 anaerobias, 202 Barrera hematoencefálica, 241 macromolecular, 416 Benzidina, 38 Benzopireno, 355 Betaína, 40 BHA (hidroxianisol butílico), 355 BHT (hidroxitolueno butílico), 355 Bilirrubina, 100, 233, 236, 240, 575 Biliverdina, 33, 233, 240 Blastocisto, 547 Bleomicina, 399, 410 Bradicinesia, 362 Bromación, 11 Bromoperoxidasa, 38, 42 Bromuro de trifenilmetano, 4 Broncoconstricción, 466 Burkholderia cepacia, 80 Butionina sulfoximina, 406, 411

C Cadena respiratoria, 50, 331 mitocondrial, 49, 50, 331, 351 Calmodulina, 41, 114, 512, 615

Calpaínas, 365 Cáncer, 248, 332, 454, 469 de próstata, 297 hereditario, 348 mamario, 180, 227, 297 Cantaxantina, 563, 568 CAR (carotenoides), 281 Carbohidratos, 377 Carbonilitos, 6 Carbonilos, 116 Carbono α, 114 alílico, 273 aromático, 304 β, 114 piramidal, 8 Carboxilo, 174 Carcinogénesis, 119, 352, 469 Cardiolipina, 265, 552 Cardiomiocitos, 488, 553 Cardioprotección, 246 Carnitina, 586, 587 Caroteno, 561 α, 562, 564 β, 273, 563 dioxigenasa, 566 Carotenoides, 269, 273, 561 Carotenos, 443 Caspasas, 479 CAT (actividad de la catalasa), 527, 543 Catabolismo de purinas, 86 Catalasas, 37, 183, 184, 235, 398, 402, 497, 506, 550 Catalasas-peroxidasas, 186, 190 Catecolaminas, 361, 397 Catepsina, 444 Catequina, 308, 613 Células aerobias, 234 amadrinas, 436 animales, 136 apicales, 519 β, 181 bipolares, 436 cancerosas, 226 de hepatoma, 226 de Kupffer, 73, 339, 378 del músculo, 82 donadoras, 547 endoteliales, 82, 336, 416 epiteliales, 82, 210 eucarióticas, 390 fagocíticas, 73, 197 fotorreceptoras, 442

628 • Ceramida/Electrodo de Clark

(Índice)

hepáticas, 336, 383 inmunológicas, 352 interplexiformes, 436 linfoides, 228 neoplásicas, 229 nerviosas, 361, 436 neuronales, 359 pilosas, 427 renales humanas, 286 Ceramida, 482 Ceruloplasmina, 100, 284, 616 Cetocarotenoides, 563 Chalconas, 306 Chasmagnathus granulata, 528, 529 Choque térmico, 172 Cianobacterias, 25 Cianocobalamina, 31 Ciclooxigenasas, 137, 351, 417 Ciclosporina, 407 Cirrosis, 265, 377 alcohólica, 381 Cisplatino, 246, 408, 427 Cisteína, 42, 102, 105, 106, 115, 139, 201, 253, 260 L-cisteína, 255 Cisteinil-glicina, 258 Citocina (C), 120, 340 proinflamatoria, 381 Citoplasma, 551 Citosol, 26, 249, 322, 390 Coenzima Q, 34 Colagenasa, 338 Colágena, 586 Colesterol, 63, 202, 244, 472 ésteres del, 296 Colinesterasa, 366 Colorimetría, 144 CoPP (protoporfirina de cobalto), 243 COX (ciclooxigenasas), 351 Criptoxantina, 564 Cromatografía, 144 gaseosa-espectrometría de masas, 285 Crotonaldehído, 130

2’-desoxiguanosina, 125 Desoxiadenosina, 131 Desoxicitidina, 131 2-desoxiguanosina, 129 Desoxiribosa, 469 Dexametasona, 228 DHA (ácido dehidroascórbico), 280 Diabetes, 181, 247 mellitus, 469 Diacetato de fluoresceína, 38 Diacilglicerol, 77, 78 Diasteroisómeros, 129 Dicloroflueresceína, 334 Dicromato de potasio, 236, 249 Dietilmalato, 263 Dietilnitrosamina, 356 Difenilhidrazina, 39 Difenoles, 34 Dihidroetidio, 545 Dihidroxiácido deshidratasa, 35 Dihidroxifenilalanina, 39 Dihidroxilación, 310 Dimetiltiourea, 400, 402, 404 Dinitrato de isosorbida, 428 Dinitrógeno, 25 Dinucleótido adenina nicotinamida, 379 de nicotinamida, 74, 85, 462 Diosmetina, 308 Dioxígeno (O2), 25, 61, 194 Dioxinas, 463 Diquat (DQ), 462 Dislipoproteinemias, 608 Disulfiram, 352 Ditrieritrol, 88 DNA, 119, 127, 150, 450 DOCA (acetato de desoxicorticosterona), 246 Donepezil, 366 Dopamina, 362 Doxiciclina, 547 DTT (ditrieritrol), 88

D

Ecosistemas, 459 Ejercicio agudo, 617 crónico, 617 exhaustivo, 618 físico, 300 regular, 620 Elastosis, 293 Electroatractores, 10 Electrodo de Clark, 27

DCF (dicloroflueresceína), 334 Deferoxamina, 399, 400, 402 Dehidroascorbato reductasa, 508 DEN (dietilnitrosamina), 356 Descarboxilación, 113 Desferrioxamina, 371 Desfosforilación, 490 Deshidroascorbato, 581

E

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Electrorretinograma/Formilquiniurenina • 629

Electrorretinograma, 442 Enatiómeros, 597 Encefalina, 369 Endocitosis, 296 Endotoxinas, 286, 423 Enfermedad(es) alcohólica hepática, 69 cardiacas, 230 celiaca, 609 coronarias, 296 crónico degenerativas, 468 de Alzheimer, 230, 248, 325, 359, 365 de Huntington, 248, 359, 368 de Kawasaki, 245 de Ménière, 430 de Parkinson, 55, 180, 248, 325, 359, 362 de porfirias, 235 de Wilson, 377, 388 del desorden osteogénico de Shionogi, 283 granulomatosa crónica, 35 hepática, 265 alcohólica, 379 isquémicas, 269 neurodegenerativas, 179, 248, 359 de Parkinson, 451 neurológicas, 230 renales, 245 vasculares, 180 virales, 229 Envejecimiento, 119, 447, 537, 620 Eosinófilos, 73 Epicatequinas, 308 Epigenética, 147, 157 Epoxicarotenoide, 570 Epoxixantofilas, 562 ERN (especies reactivas de nitrógeno), 395, 487 ERO (especies reactivas de oxígeno), 137, 395, 487, 501, 525, 543 Esclerosis amiotrófica lateral, 550 lateral amiotrófica, 179, 180, 359, 371 Escorbuto, 584 Espermatogénesis, 211 Espiroimino-dihidantoínas, 129 Esteatohepatitis alcohólica, 380 no alcohólica, 69, 380, 384 Esteatosis, 377 Estereoisómeros, 597 Ésteres gálicos, 308 Esteroides, 63 Estreptidina, 432 Estreptomicina, 430, 432

Estrés, 119 abiótico, 502, 515 biótico, 502, 515 mecánico, 506 oxidativo, 69, 97, 120, 147, 230, 319, 435, 450, 477, 506, 532, 613 envejecimiento y, 447 posisquémico, 337 salino, 506 Etanol, 116, 185, 336, 381, 581 Etileno, 143 Etopóside, 228 Eucariotas, 185 Excitotoxicidad, 484 coclear, 429 Explosión oxidativa, 75, 352, 513

F Factor 2 relacionado con NF-E2, 496 activador de plaquetas, 440 de crecimiento, 226 de fibroblastos, 416 del endotelio vascular, 488 derivado de plaquetas, 416 epidérmico, 488 neural, 230 neuronal, 488 vascular endotelial, 333 de despolimerización de actina, 520 de necrosis tumoral, 68, 228, 263, 480 de transcripción, 228 nuclear, 228 Fenilalanina, 102, 108 Ferredoxina, 508 Ferritina, 100, 238, 284, 399, 497 Fibroblastos, 226, 335, 378, 379, 416, 488 Fibropatía, 28 Fibrosis, 69, 377 hepática, 378, 387 quística, 609 Flavina, 31, 76, 87, 187, 224 hidroxilasa, 339 semiquinona, 397 Flavohemoglobinas, 43 Flavonas, 306, 308, 312 Flavonoides, 305 Flavonoles, 306, 308 Flavononas, 312 Flavoproteínas, 34 Fluoroclorocarbonos, 30 Fluorocromo, 334 Formilquiniurenina, 108

630 • Fosfatidilcolina/Hidroxianisol butílico

(Índice)

Fosfatidilcolina, 78 Fosfatidilinositol-4,5-difosfato, 78 Fosfoinosítidos, 512 Fosfolipasa, 77 D, 519 Fosforilación, 148, 150, 490 oxidativa, 331, 335, 452 Fotoquimioterapia, 32 Fotorrespiración, 28, 504 Fotosensibilidad, 462 Fructosa-1,6-difosfato fosfatasa, 38

S-α-transferasa, 382 sintetasa, 309 GPx (enzima glutatión peroxidasa), 201, 226, 528 Gravitropismo, 519 GSH (glutatión), 201, 253 GSSG (glutatión oxidado), 201 Guanina (G), 85, 120 Gulonolactona oxidasa, 279, 579

G

Halobacterias, 562 Halocintiaxantina, 570 Halogenación, 14 Hemocromatosis, 353, 377, 388 Hemoglobina, 49, 234, 406 Hemooxigenasa, 62, 233, 463 Hemoperoxidasas, 37 Hemopexina, 616 Hemoproteínas, 192, 234, 397 Hepatitis A, 386 alcohólica, 384 B, 353, 377 C, 353, 377 crónica, 377 fulminante, 386 viral, 386 Hepatocarcinoma, 382 Hepatocitos, 255, 378, 381, 488 Hepatoma de Novikoff, 219 Hepatomegalia, 237 Hepatopatía alcohólica, 332, 336 colestática, 609 Hepatotoxinas, 391 Heptametoxiflavona, 313 Herbicidas, 461 Herbifrugívoras, 580 Heteroátomos, 16 Heterocromatina, 160, 161 Heterodímeros, 483 Heterólisis, 193 Hexaclorobenceno, 462 Hexachloroetano, 465 Hexoquinasas, 313 Hexosas, 37 Hibridoma de células T, 226 Hidrocarburos policlorados, 463 Hidrolasas, 313 Hidrólisis ácida, 112 Hidroperóxidos, 113, 122, 137, 184, 323 Hidroxianisol butílico, 355

GABA (ácido γ-amino butírico), 519 D-galactosa, 306 β-galactosidasa, 456 Galantamina, 366 Gamaglutamil transpeptidasa, 528 Gasterópodos, 526, 534 Gen de longevidad, 448 Genoma, 546 eucariótico, 148, 156 heterocromatina en, 154 Gentamicina, 403, 427, 430 Geroftalmia, 573, 596 Gerontogenes, 448 Ginkgo biloba, 365 Glicerol, 40, 406 Glicina, 42, 106, 253 Glucación, 107, 116 Glucagón, 68 Glucógeno, 79 Glucolato oxidasa, 504 Glucosa, 181, 247, 304, 367 Glucósidos, 306 Glucosilación, 107, 116, 174 Glutamato, 253, 262, 367, 371 L-glutamato, 255 Glutamil, 112 γ-glutamilciclotransferasa, 253 γ-glutamilcisteína, 551 γ-glutamiltranspeptidasa, 253 Glutamina, 203 Glutarredoxina, 260, 281, 515 Glutatión, 40, 253, 400, 551 mitocondrial, 260, 264, 336 oxidado, 201, 269 peroxidasa, 142, 201, 336, 355, 398, 451, 507, 551 preoxidasa, 54 reducido, 142, 201, 269, 371, 451 reductasa, 226, 508 S-transferasas, 142, 451, 528

H

Hidróxido/Metaloproteínas • 631

Hidróxido, 19 Hidroxikinurenina, 370 Hidroxilasas, 313, 333 4-hidroxinonenal, 137, 144, 286, 350, 381 Hidroxitolueno butílico, 355 Hidruro de tributilestaño, 20 Hipercarotenosis, 575 Hipercolesterolemia, 418 Hiperglucemia, 441 Hiperglucemia crónica, 469 Hiperlipidemia, 384 Hipermetilación, 150 Hiperoxia, 234, 246 Hiperuricemia, 91 Hipocatalasemia, 197 Hipocondría, 590 Hipometilación, 151 Hiporreflexia profunda, 607 Hipoxantina, 85, 396 Hipoxia, 86, 91, 234, 246, 331, 442, 526 Hirsuteno, 20 Histidina, 102, 115, 139 Histonas, 150, 153 HLA (antígenos de leucocitos humanos), 244 HO (hemooxigenasa), 233 Holoenzima, 255 Homeostasia celular, 450 Homohexámeros, 192 Homotetrámeros, 192

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I Ictericia, 386 IDS (ingestión diaria sugerida), 573, 605 IL (interleucina), 219, 227, 247 Ileocolitis, 212 Inmersión e hipoxia, 530 Inmunoglobulinas G, 74 Inositoltrifosfato, 78 Insecticidas organoclorados, 461 organofosforados, 461 Interleucina, 68, 219, 298, 417 Isocumarinas, 305 Isoenzimas, 203 Isoflavonas, 306, 313 Isoleucina, 35, 106 Isoprostanos, 420 Isotiocianatos, 613 Isquemia, 234, 241, 336 cerebral, 332

L LDL (lipoproteínas de baja densidad), 309

Leucocitos, 397 eosinófilos, 32 neutrófilos, 32 polimorfonucleares, 338 Leucoma, 574 Licopeno, 563, 564, 570, 613 Lindano, 462 Linfadenitis, 80 Lípidos, 100, 135, 377 insaturados, 30 microsomales, 465 oxidados, 243 peroxidación de, 137, 144, 399 peroxidados, 286, 545 poliinsaturados, 135 Lipoalcoxilos, 43 Lipofilicidad, 463 Lipohidroperóxidos, 111 Lipooxigenasa, 34, 137 Lipoperoxidación, 43, 68, 101, 107, 130, 137, 138, 350, 387, 462, 614, 620 Lipoperóxidos, 32, 139, 620 Lipoperoxilos, 43 Lipopolisacáridos, 74, 173, 243, 402 Lipoproteínas, 135 de alta densidad, 211 de baja densidad, 211, 588, 599 de muy baja densidad, 599 oxidadas, 111 Lipoxigenasa, 397 Lisil hidroxilasa, 586 Lisina, 106, 112, 139 Longevidad, 447 LPS (lipopolisacárido), 74, 173, 243 LPx (lipoperoxidación), 462 Luteína, 272, 563, 613

M Macrófagos, 73 Malonaldehído, 130, 286, 322 Malondialdehído, 107, 137, 350, 399, 588, 620 Malonilcoenzima A, 306 Manganeso catalasas, 192 MAO (monoaminooxidasa), 361 MDA (malondialdehído), 107 mDNA (DNA mitocondrial), 450 Melatonina, 365, 371 Memantina, 366 Mesozeaxantina, 272 Metahemoglobina, 34, 43 Metales, 461 Metaloides, 461 Metaloproteínas, 100

632 • Metaloproteinasas/Oligonucleótidos

Metaloproteinasas, 338 Metalotioneína, 529 Metamioglobina, 43 Metano, 11 Metil-jasmonato, 516 N-metil-D-aspartato, 363 Metilación, 148, 150 Metilglioxal, 35 Metimazol, 619 Metionina, 102, 105, 106, 113, 114, 139 oxidación de, 109 sulfóxido reductasas, 102 Miastenia, 607 Micrococcus luteus, 185 Microcuerpos, 503 Micronutrimento, 211 Microorganismos, 27, 194, 563 Mieloperoxidasa, 42, 79, 615, 620 Mimetics, 545 Miocardiopatías, 180, 287 Miocarditis, 230 Miofibroblastos, 379 Mioglobina, 234, 406 Mitocondria, 26, 35, 49, 170, 322, 334, 339, 397, 503 mNOS (óxido nítrico sintetasa mitocondrial), 57 Mo (molibdeno), 85 Molibdeno, 85, 87 MOM (monooxigenasas microsomales), 63 Monoacilgliceroles, 599 Monoaminooxidasa, 361 Monodehidroascorbato, 508 reductasa, 508 Monofosfato de guanosina cíclico, 287, 438 Monooxigenación, 66 Monooxigenasas, 61 microsomales, 63 Monosulfóxido, 110 Monóxido de carbono, 33, 465 de nitrógeno, 29, 41 Mórula, 547 Motoneuronas, 550 MPO (mieloperoxidasa), 615 Msr (metionina sulfóxido reductasas), 102 Mutagénesis, 119 Mycobacteria, 80 Myotis lucifugus, 534 Mytilus edulis, 536

(Índice)

N NADH (nicotinamida adenín dinucleótido reducido), 49 Naftalenos, 30 Naproxeno, 116 Necrosis, 383, 454, 479 Nefrotoxicidad, 236 por ciclosporina, 407 por cisplatina, 408 por gentamicina, 403 Neolignanos, 305 Neuropatía demencial, 365 humana, 360 Neurotoxicidad, 367 Neurotoxinas, 373 Neutrófilos, 73 NGF (factor de crecimiento neuronal), 488 Nicotiana tabacum, 31 Nimesulida, 116 Nitrato, 25, 403 reductasa, 517 Nitritos, 403 4-nitro-β-caroteno, 273 Nitrógeno, 17, 119 especies reactivas de, 57, 400, 487 8-nitroguanina, 127 Nitroprusiato de sodio, 429 Nitrosaminas, 297 Nitrosativo, 359 S-nitrosilación, 225 S-nitrosoglutatión, 42 Nitrosoperoxocarbonato, 42 Nitrotirosinas, 352 NMDA (N-metil-D-aspartato), 363 NO (óxido nítrico), 91 Nocardia, 80 Normoxia, 332, 442 NOS (óxido nítrico sintasa), 91 NOX (enzimas NADPH oxidasas), 73, 488 Nucleoproteínas, 380 Nucleótidos, reparación por escisión de, 158 Nutrición, 291, 571 Nutrimento, 571, 580

O Oftalmoplejía, 607 Olefinas, 30 Oligonucleótidos, 401

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Oncogenes/Porfiria • 633

Oncogenes, 155, 348 Oreochromis niloticus, 529 Organelos, 503 celulares, 172 Ortodihidroxiestructura, 310 Ortodihidroxifenil, 310 Osteoblastos, 281 Otala lactea, 535 Otitis media, 428 Oxidación, 17, 545 de xenobióticos, 478 del ascorbato, 281 productos de la, 326 Oxidantes, 181, 319, 320 electrofílicos, 102 Oxidasa, 235 alternativa, 510 de xantina, 34 Óxido de deuterio, 32 de hierro, 26 nítrico, 29, 57, 69, 91, 122, 287, 396, 415, 440 en el oído, 427 endotelial, 423 inducible, 423 isoforma inducible, 396 sintasa, 91, 423 sintasa inducible, 338, 417 sintetasa endotelial, 287 sintetasa mitocondrial, 57 nítrico, 423 Oxidorreducción, 6, 184 Oxidorreductasa, 313 glutatión peroxidasa, 203 Oxígeno, 17, 119, 319 atmosférico, 501 atómico, 29 especies reactivas de, 29, 73, 334, 347, 487 molecular, 501 singulete, 29, 31, 54, 75, 98, 128 Oxiradicales, 461 Oxitotoxicidad, 552 8-oxo-desoxiadenosina, 125 Oxocarotenoides, 562 8-oxodGuo, 127 2-oxoglutarato, 262 8-oxogua, 285 2-oxohistidina, 108 5-oxoprolina, 256 Ozono, 29, 299, 466

P Pancreatítis, 609 Parametoxianfetamina, 223 Paraquat (PQ), 462 Parkinsonismo, 363 Parvaalbúmina, 369 PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), 488 Penicilina, 430 Peroxidación, 137 lipídica, 140, 286, 321, 528, 529 Peroxidasas, 184, 187, 194, 235 nomenclatura de, 184 Peróxido, 5 de hidrógeno, 29, 36, 54, 75, 122, 169, 183, 334, 335, 419, 487, 501 lipídico, 213 orgánico, 4 Peroxil dimetilado, 461 Peroxinitrito, 29, 41, 57, 91, 108, 122, 125, 170, 203, 334, 342, 349, 368, 383, 418, 432, 440 Peroxiredoxina, 507 Peroxirradicales, 122 Peroxirredoxinas, 194, 336, 552 Peroxisomas, 197, 259, 509, 510 Phorbol myristate acetate, 77 Phrynops Hilarii, 528 Pirimidinas, 469 Pirimidopurinona cíclica, 131 Piroxicam, 116 Pirrolidona, 112 PKC (proteína cinasa C), 295 Plaguicidas, 461 clorofenólicos, 463 Plasmodiun polycephalum, 41 Poliadenilación, 546 Policlorobifenilos, 470 Policloruro de vinilo, 18 Polifenoles, 303 Polifenoles-epigalocatechin-3-galato, 365 Polimerización, 17 del estireno, 18 Polímeros, 18, 143, 306 Polimetilacrilato, 18 Polimorfismo, 245, 248 Polineuropatía amiloide, 181 Polioles, 40 Poliquetos, 526 Porfiria, 31 cutánea, 462

634 • Porfirinas/Reacción

Porfirinas, 31 Preeclampsia, 247 Presenilina, 365 Profilina, 520 Prolactina, 86 Prolil hidroxilasa, 586 Prolina, 106 hidroxilasa, 313, 586 Prooxidantes, 320 Propenilbenceno, 305 Prostaciclina, 416 Proteasas intestinales, 564 Proteína(s) α-sinucleína, 362 activadora 1, 492 β-amiloide, 179 antiapoptótica Bcl-2, 456 antioxidantes, 554 Bid, 482 celulares, 479 cinasa, 78 chaperonas, 41 de estrés térmico, 418 de heterocromatina, 161 desacoplantes, 504 fibrinolíticas, 417 fosfatasa, 295 fragmentación, 112 G heterotriméricas, 77 globular, 220 huntingtina, 368 no madura, 481 nuclear, 228 retinoblastoma, 154 rodopsina, 437 transportadoras, 504 Proteinasa α-1, 114 Proteinuria, 237 Proteosoma 26S, 494 Protohem-IX, 187 Protooncogenes, 348 Provitaminas A, 561 Pterinas, 31 Purinas, 85, 469 hipoxantinas, 396 PVC (policloruro de vinilo), 18

Q Quercetina, 613 Quercitina, 308 Quilomicrones, 567, 599 Quimioluminiscencia, 30, 322 Quimiosinas, 338, 340

(Índice)

Quimiotaxis, 74, 219 Quimioterapia, 327 Quinoles, 34 Quinona, 31 reductasa, 497 Quinurenina, 108

R Rabdomiolisis, 405 Radiación, 468 iónica, 468 ultravioleta, 172 Radical(es) alcohoxilo, 103, 105 alilo, 10 alquilo, 19, 103 alquilperoxilo, 103 aniones, 6 ascorbilo, 277, 280, 281 bromo, 13 carotenoide, 276 cationes, 6 de bromo, 14 de halógeno, 30 del ascorbato, 280 fenoxilo, 34 hidroperoxilo, 35, 122 hidroxilo, 19, 39, 75, 98, 122, 183, 349 libres, 3, 352 reducción, 17 transposición de, 15, 16 lipoperoxilo, 295 metilo, 14 peroxilo, 294 semidehidroascorbato, 294 sencillos, 8 superóxido, 75, 98, 122 tiilo, 105 tocoferilo, 618 triclorometil, 294 trifenilmetilo, 4 vinilo, 9 Radioquímica, 7 Radioterapia, 327 Ramnosa, 304 L-ramnosa, 306 Raquitismo, 596 RC (restricción calórica), 453 Reacción de abstracción radical, 15 de β-fragmentación radical, 16 de catalasa, 193 de desproporción, 14

Redox/Tapsigargina • 635

de dimerización, 13 de Fenton, 19, 39, 75, 79 de Haber-Weiss, 79 de halogenación, 11 de Mehler, 503 de oxidorreducción, 5 de peroxidasa, 193 de polimerización del estireno, 18 óxido-redox, 53 Redox, 53 Reestenosis vascular, 245 Reoxigenación, 529 Repercusión, 526 Reperfusión, 241, 331, 336 Resistencia sistémica adquirida, 513 Resonancia de spin electrónico, 5 electrónica paramagnética, 27 Retículo endoplasmático, 246, 504 Reticulocitos, 553 Retinitis pigmentosa, 607 Retinol, 566, 574 sérico, 382 Retinopatía, 332, 435 Rivastigmina, 366 Rodamina, 36 Rodenticidas, 461 Rodopsina, 574 Rotenoides, 306 Rotenona, 55, 75 RSA (resistencia sistémica adquirida), 513

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S SAC (S-alilcisteína), 368 Saccharomyces cerevisiae, 37 Salud humana, 459 Scaphiopus couchii, 535 Sefarosa, 174 Selenio (Se), 201, 371, 382 Seleno-proteína, 555 Selenocisteína, 201, 224, 555 Selenoenzima tiorredoxina reductasa, 281 Selenol, 201 Selenoproteínas, 201 Semiquinonas, 34 Senescencia, 160, 454 Seudocatalasa, 185 sGC (guanilato ciclasa soluble), 239 SIDA, 311 Síndrome cerebrohepatorrenal, 198 de daño hepático, 462

de distrés respiratorio del adulto, 472 de Down, 178 de intestino corto, 609 de Sjögren, 69 de Werner, 456 de Zellweger, 198 Sistema antioxidante, 69, 531 cardiovascular, 418 Cre-loxP, 548 de defensa antioxidante, 536 fibrinolítico, 417 inmunológico, 298 microsomal, 61 MOM, 63 nervioso entérico, 423 oxidativo microsómico del etanol, 379 protector contra ERO, 451 triciclito del hirsuteno, 20 ubiquitina-proteosoma, 362 visual, 435 SO (sulfitooxidasa), 85 SOD (superóxido dismutasa), 31, 169, 335, 502, 527, 543, 615 Spin, 26 electrónico, 3 STD (estreptidina), 432 STP (estreptomicina), 432 Succinato deshidrogenasa, 52, 169 Sulfanilamida, 492 Sulfato, 306 de heparán, 174 Sulfenamida, 492 Sulfhidrilos, 253, 263, 528 Sulfitooxidasa, 85 Sulfona, 114 Sulfóxido, 113 de metionina, 108, 115 Sulfoxina-butionina, 309 Sulfuro de hidrógeno, 28 Sumoilación, 148 Superóxido, 29, 33, 183, 614 dismutasa, 54, 169, 382, 395, 506, 527, 549 Sus scrofa, 530 Sustancia negra, 362 P, 369 Sustrato la mieloperoxidasa, 38

T Tabaquismo, 299 Tapsigargina, 228

636 • Taurosporina/Xenobióticos

Taurosporina, 228 TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico), 323 Tejidos cancerosos, 347 embrionarios, 544 Tenoiltrifluoroacetona, 335 Teoría del envejecimiento por daño en DNA, 452 por radicales libres, 449 Termogénesis, 533 Tetraciclina, 547 Tetracloruro de carbono, 465 Tetrahidrobiopterina, 287, 400 Tetrahidropterinas, 34 Thamnophis sirtalis parietalis, 527 Timidino cinasa, 546 Timina (T), 32, 120 Tioles, 259, 383, 466 Tiorredoxinas, 219, 260, 385, 497, 515, 543, 552 Tirosina, 42, 102, 108, 115, 586 TNF (factor de necrosis tumoral), 68 Tobramicina, 430 α-tocoferilo, 142 Tocoferoles, 291 α, 291 Tocoles, 597 α, 597 estructura química, 597 Tocotrienoles, 291, 595, 597 Tracto gastrointestinal, 81, 212 genitourinario, 81 Transferasas, 313 Transferrina, 100, 284, 616 Transgén, 546 de Sod1, 550 Translocación, 349 Transposición, 16 TRAP (antioxidante total de plasma), 324 Trehalosa, 40 Tricloroetileno, 347 Triclorometanol, 465 Trióxido de dinitrógeno, 43

(Índice)

Triptófano, 42, 102, 115, 203 Trisomía 21, 179 Trombosis, 419 Tromboxano, 408 Troxol, 368 Trx (tiorredoxina), 219, 543

U Ubiquinol, 34 Ubiquinona, 34 oxidorreductasa, 51 Ubiquitina, 114 Ubisemiquinona, 29, 34, 57, 397 UQ (ubiquinona), 51 Urocinasa, 417

V Vasculitis en niños, 245 Vasodilatación coronaria, 246 Vasoespasmo, 419 VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), 488 Virus de la hepatitis, 347 de la inmunodeficiencia humana (VIH), 229 del papiloma humano, 347 Vitámero, 597 Vitamina A, 31, 382, 562 B12, 31 C, 276, 297, 443, 583 E, 141, 276, 291, 443, 618

X Xanthosoma sagittifolium, 270 Xantina, 85 deshidrogenasa, 85, 615 oxidasa, 85, 122, 170, 339, 351, 396 oxidoreductasa, 85, 514 Xantofilas, 273, 443, 562, 563, 575 XDH (xantina deshidrogenasa), 85 Xenobióticos, 34, 62, 258, 391

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