Мембранная биоэнергетика: Membrane bioenergetics : учебное пособие 9785211058712

Citation preview

УДК 577.23 ББК 28.071 С46

С46

Скулачев В.П., Богачев А.В., Каспаринский Ф.О. Мембранная биоэнергетика: Учебное пособие. — М.: Издательство Московского университета, 2010. — 368 с. ISBN 978-5-211-05871-2 В книге изложены основные сведения о механизмах преобразования энергии в живых организмах. Рассмотрены системы субстратного, фото- и окислительного фосфорилирования, поставляющие всю энергию, необходимую для жизнедеятельности организмов. Описаны пути генерации мембранных форм энергии, а также их использования для синтеза ATP, аккумуляции химических веществ в клетках и органеллах, подвижности бактерий, образования тепла в целях терморегуляции и т.д. В заключение рассмотрены пути практического применения биоэнергетики для отмены программы старения организма. Для студентов и аспирантов биологических факультетов университетов, а также для специалистов в области биоэнергетики, биохимии, биофизики, фармакологии, физиологии и микробиологии. УДК 577.23 ББК 28.071

Skulachev V.P., Bogachev A.V., Kasparinsky F.O. Membrane bioenergetics: Textbook. М.: Moscow University Press, 2010. — 368 p. ISBN 978-5-211-05871-2 This book describes mechanisms of energy conservation in living organisms. The systems of photo- and oxidative phosphorylation are described, processes which produce all energy needed for all vital functions of a living cell. Also the pathways of generation of membranedependent energy forms are described as well as their use as the driving force for ATP synthesis, substrates accumulation in cells and organelles, bacterial motility, heat production for thermoregulation, etc. In conclusion, possible ways for cancelling the senescence program of an organism are considered. The book is suitable for undergraduate and graduate students of biological departments of universities, as well as for specialists in bioenergetics, biochemistry, biophysics, pharmacology, physiology, and microbiology.

ISBN 978-5-211-05871-2

Bioenergetica.indb 4

© Скулачев В.П., Богачев А.В., Каспаринский Ф.О., 2010 © ООО «МАСТЕР-МУЛЬТИМЕДИА», иллюстрации, 2010 © Издательство Московского университета, 2010

26.01.2011 18:01:53

ПРЕДИСЛОВИЕ

Э нергия и жизнь — явления объективной реальности, субъективные по-

нятия и просто слова нашего языка. Философы спорят о сущности этих понятий уже более двух тысяч лет. Веками ученые пытаются всесторонне охарактеризовать их. Десятки лет рекламная индустрия успешно использует положительную эмоциональную окраску этих слов, чтобы привлечь внимание потребителей. А миллионы людей, ежедневно употребляя слова «энергия» и «жизнь», довольствуются иллюзией интуитивного понимания их смысла. В чем же секрет такой популярности? Рискнем предположить, что эволюция человеческого языка определялась преуспеванием индивидуумов, способных привлечь внимание к понятиям, наиболее важным для самого существования общества и отдельных его представителей. Преимущества цивилизации позволяют современным людям избегать множества проблем, c которыми сталкивались обитатели дикой природы. Это создает условия для изменения системы приоритетов. Казалось бы, сегодня «энергия и жизнь» далеко не самое главное для отдельного человека или человеческого сообщества. Закодированная в звуковом ряде языка эмоциональная притягательность может быть низведена до уровня исторической вехи на пути познания людьми окружающей природы и самих себя. Действительно, огромный прогресс в понимании молекулярных механизмов энергообеспечения, достигнутый с 1961 по 1995 г., мог породить иллюзию, что в биоэнергетике все или почти все уже открыто и следующим поколениям биологов лучше выбирать какое-нибудь другое направление исследований. Но вот наступил 1996 г. Появились первые публикации о совершенно новой роли митохондрий, энергопреобразующих органелл клеток животных, растений и грибов в самой судьбе этих клеток. Митохондрии оказались в самом центре событий, приводящих к запрограммированной смерти клетки. Они не только обеспечивают энергией этот процесс (что заставляет по-новому взглянуть на проблему «энергия и смерть», ранее рассматривающуюся в основном применительно к ядерному оружию), но служат мощнейшими умножителями смертоносных сигналов. Актуальным стал вопрос о роли митохондрий в запрограммированной ликвидации участков тканей, органов и даже целых организмов. Это открытие сразу вызвало значительный рост публикаций по митохондриям. Ежегодно таких статей в первую декаду XXI в. было по крайней мере в два с половиной раза больше, если сравнивать с публикациями по годам в последнее десятилетие века ушедшего. Книга, предлагаемая вниманию читателя, претендует на роль учебника по современной биоэнергетике. Большая ее часть — курс лекций по

Bioenergetica.indb 5

26.01.2011 18:01:53

6

ПРЕДИСЛОВИЕ

этому предмету, читаемый одним из авторов студентам МГУ в течение более чем сорока последних лет. В курс вошли фундаментальные сведения о молекулярных механизмах аккумуляции энергии, о ее использовании в мембранах митохондрий, хлоропластов и бактерий. В предыдущем учебнике по биоэнергетике, написанном лектором, эта тема тоже освещалась, но в предлагаемой книге отражен ряд новых ее аспектов, таких, как эволюция биоэнергетических механизмов, токсикология и физиология активных форм кислорода, их роль в явлениях запрограммированной смерти и ряд других. Часть сведений, не включенных в курс, который читается только в течение одного семестра, помещена в раздел «Приложения». Наглядные материалы по курсу «Биоэнергетика» ежегодно совершенствуются и дополняются. Полные наборы иллюстраций и видеолекции публикуются в сети Интернет по адресу: http://www.master-multimedia.ru/ lectures/vps/. Мы надеемся, что знакомство с этими материалами в известной мере заменит читателю прямое общение с лектором и позволит творчески усвоить материал, без чего невозможно формирование личности будущего ученого.

Bioenergetica.indb 6

26.01.2011 18:01:53

Часть первая

ПРИНЦИПЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ ГЛАВА ПЕРВАЯ

ВВЕДЕНИЕ 1.1. Определение понятия «биоэнергетика» и некоторые вехи ее истории

Ч

то связывает энергию и жизнь? В начале XX в. Дж. Холдейн (J. Haldane) определил жизнь как способ существования самовоспроизводящихся структур за счет притока энергии извне. Такой же точки зрения придерживался наш известный биолог Б.М. Медников. Как следует из формулировки, способность к энергообеспечению является одним из двух основных свойств жизни. Однако каким образом энергия позволяет жизни существовать? Мы постараемся ответить на этот вопрос, по возможности не прибегая к помощи сложных формул. Прежде всего определим тему нашего курса. Биоэнергетика (биологическая энергетика) есть совокупность процессов преобразования энергии внешних ресурсов в биологически полезную работу живых систем, а также раздел биологии, изучающий эти процессы. У истоков биоэнергетики — рассуждения античных мыслителей о природе брожения и о роли воздуха в процессах использования пищи живыми организмами. Леонардо да Винчи одним из первых (начало XVI в.) сравнил питание животных с горением свечи. Эта идея была развита голландским естествоиспытателем Иоханнесом Баптиста ван Гельмонтом в 1648 г. в опытах с растениями. До начала ХХ в. основным содержанием биоэнергетики являлось изучение суммарных балансов процессов энергообеспечения живых организмов (дыхания, брожения), а также воздействия различных условий (переход от покоя к работе, изменение окружающей температуры) на энергетический баланс организма. Быстрое развитие биохимии в первую половину ХХ в. способствовало формированию представлений о превращениях энергии в живых клетках. Ключевую роль здесь сыграли работы наших замечательных соотечественников В.А. Энгельгардта и В.А. Белицера, открывших фосфорилирующее дыхание. Однако до формулирования П. Митчелом принципа устройства ключевых механизмов трансформации энергии в живых клетках биоэнергетика еще не существовала как отдельная наука. У каждой из современных отраслей науки есть свой год рождения. Так, отсчет времени молекулярной генетики начался с публикации жур-

Bioenergetica.indb 7

26.01.2011 18:01:53

8

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

налом «Nature» в марте 1956 г. статьи Дж. Уотсона и Ф. Крика о спиральных структурах ДНК, встречающихся у вирусов. Биоэнергетика тоже имеет свою точку отсчета, и это тоже публикация в «Nature», но другого нобелевского лауреата — Питера Митчела (рис. 1.1). В 1961 г. он напечатал статью, где предложил свое объяснение механизма дыхательного и фотосинтетического фосфорилирования (хемиосмотическую Рисунок 1.1. Король Швеции Карл XVI гипотезу). А само слово «биоэнергетиГустав (справа) вручает П. Митчелу ка» было впервые использовано пятью Нобелевскую премию (1978) годами раньше, в 1956, нобелевским лауреатом А. Сент-Дьерди (рис. 1.2), который дал такое название написанной им небольшой брошюре. Это очень странная книжка, изданная на излете карьеры автора, где он позволил себе безудержно фантазировать по поводу того, что такое живое существо. Почти все мысли, в ней высказанные, не подтвердились. А вот слово, вынесенное на титульный лист, вошло в обиход как название новой науки. В 1968 г. в Полиньяно а Маре, маленьком городке на юге Италии, состоялась конференция по окислительному фосфорилированию, на одном из заседаний которой специально обсуждался вопрос, как назвать новую отрасль биологии, посвященную выяснению молекулярных механизмов энергообеспечения живых существ. Одному из авторов Рисунок 1.2. А. Сент-Дьерди этой книги (В.П.С.) посчастливилось участвовать в этой конференции. Его английский язык в то время оставлял желать лучшего и, если доходило до выражения собственного мнения, то получалось это как-то очень уж прямолинейно… Когда начали обсуждать, как ему показалось, громоздкие и неблагозвучные названия, он встал и сказал, что организовал недавно в Московском университете отдел биоэнергетики, и потому предлагает назвать этим именем новую науку. В перерыве один из участников конференции, Карел Ван Дам из Голландии, пожурил В.П. Скулачева за столь резкое выражение своей позиции в присутствии таких корифеев, как Г. Кребс, Л. Эрнстер, Э. Слейтер, но удивительным образом дискуссия привела к тому, что название было принято. Не прошло и нескольких лет, как появились журналы по биоэнергетике, конференции по биоэнергетике, между-

Bioenergetica.indb 8

26.01.2011 18:01:53

Глава 1. Введение

9

народная организация биоэнергетиков со своими отделениями в разных странах. К сожалению, впоследствии экстрасенсы решили узурпировать новый термин. В.П. Скулачев пытался как мог протестовать, выступая в широкой печати и по телевидению, но потерпел фиаско: в настоящее время существуют два понятия — «биоэнергетика научная» и «биоэнергетика паранаучная». Это началось у нас в России, а потом перекинулось за рубеж. В результате в последнем издании Британской энциклопедии уже есть оба значения слова «биоэнергетика». Язык как океан: стихия, с которой нельзя бороться в одиночку… Выделившаяся в отдельную науку биоэнергетика быстро завоевала «место под солнцем». В 1978 г. получил Нобелевскую премию за свою гипотезу ее основатель П. Митчел. В 1988 г. нобелевскими лауреатами стали Х. Михель, Й. Дейзенхофер и Р. Хубер, преуспевшие в рентгеноструктурном анализе комплекса фотосинтетических реакционных центров. В 1997 г. П.Д. Бойер и Дж. Уокер удостоились такой же премии за исследование протонной ATP-синтазы, а вместе с ними и И.-Х. Скоу — за открытие Na+,K+ATPазы. В 2003 г. нобелевскими лауреатами стали П. Агре и Р. МакКиннон, описавшие c атомным разрешением структуру аквапорина и калиевого канала. По-видимому, ждет своей премии открытие Г. Кремером, Д.Д. Ньюмейером и К. Уангом центральной роли митохондрий в запрограммированной смерти клетки. В последнее десятилетие число публикаций на эту тему растет по экспоненте.

1.2. Биоэнергетика в системе биологических наук Классификацию биологических наук можно представить в виде здания, восемь этажей которого соответствуют уровням сложности организации живой материи (рис. 1.3). Самый верхний этаж — исследование биосферы (более высокие этажи пока только проектируются, поскольку неизвестно, есть ли жизнь за пределами нашей планеты). Спускаясь с этажа на этаж, исследователь продвигается от общего к частному. Второй этаж сверху — экология. Эта наука изучает сообщества отдельных организмов, которые образуют экосистемы, формирующие биосферу. Этажом ниже концентрируется группа наук, которые можно объединить под одним названием — «биология видов». Это классические описательные науки биологического профиля, такие, как зоология, ботаника, микология, микроРисунок 1.3. «Здание биологии»: классибиология и вирусология. Они позволяфикация биологических наук ют систематизировать представления о (по В.П. Скулачеву)

Bioenergetica.indb 9

26.01.2011 18:01:55

10

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

видах и популяциях на основании эталонных образцов или статистического анализа совокупности фенотипических признаков. Популяции состоят из индивидов. Их изучением занимаются на четвертом этаже, если считать сверху. Анатомия и физиология позволяют охарактеризовать соответственно строение и функции как целостного индивида, так и его тканей. Ткани состоят из клеток, и можно изучать биологические явления на этом субтканевом уровне — клеточная биология (5-й этаж сверху). Следующий уровень упрощения — субклеточная биология, объектами которой являются органеллы и надмолекулярные комплексы. Здесь объединены работы по исследованию структуры и функций плазмалеммы, цитозоля, клеточного ядра, митохондрий, эндоплазматического ретикулума, лизосом, пероксисом, хлоропластов и некоторых других внутриклеточных органелл. Седьмой этаж сверху исключительно важен: это молекулярная биология. Предметом молекулярной биологии являются те индивидуальные молекулы, из которых состоят живые существа, прежде всего макромолекулы. Именно на этом этаже происходит переход к количественному описанию биологических объектов. Биология молекул хотя и очень сложная, но уже точная наука, претендующая на тот уровень точности, который характерен для химии и физики. Непременным условием здесь является сохранение нативности исследуемых молекул и их комплексов: они должны быть «живыми», т.е. нативными, а не денатурированными, и продолжать во время эксперимента выполнение своей биологической функции. На самом нижнем этаже (8-й сверху) это требование уже может не соблюдаться. Биоорганическая химия исследует структуру и физико-химические свойства чистых индивидуальных макромолекул, а также их компонентов и низкомолекулярных соединений, присутствующих в организме. Некоторые из таких соединений являются неорганическими, однако малочисленность объектов исследования не дает оснований для выделения бионеорганической химии в отдельный «этаж». Классификация биологических наук не ограничивается уровнями сложности. Тот или иной биологический объект может исследовать биолог, химик, физик или математик. Каждый из них обладает совершенно разными методологическими подходами и философией исследования. Иногда даже сами выводы исследователя кардинальным образом зависят от того, в каком методологическом «подъезде» «здания биологии» он трудился. Для математика важно выяснить, какими математическими формулами описывается исследуемый объект. Биофизик, исследующий протекание реакций во времени, хочет наблюдать за ними с высоким разрешением на протяжении всего диапазона времен*. Для химика главное — чистота молекул и гомогенность системы. Биолог не будет в большинстве случаев стремиться к фемтосекундному разрешению, математической точности или химической чистоте. Биолога интересует поведение (регуляция, рождение и смерть) жи* Следует отметить, что в этом направлении весьма преуспевающей оказалась отечественная биофизика: например, в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ к настоящему моменту достигнуто максимальное предельное разрешение в исследовании кинетики процессов, существующих в природе (2 × 10–15 сек).

Bioenergetica.indb 10

26.01.2011 18:01:55

Глава 1. Введение

11

вой системы, а также ее история — филогенез и онтогенез. Авторы этой книги по образованию биологи, и поэтому книга в значительной степени отражает биологический подход. Есть еще один критерий для классификации исследований в биологии, когда в основу положены те биологические функции, которые выполняют исследуемые системы. Существуют четыре основные функции биологических объектов. Одна из них — генетическая, т.е. передача свойств организма по наследству. Наука, изучающая эту функцию, называется генетикой. Энергообеспечение — другое необходимое условие существования живой системы, и этим занимается биоэнергетика. Есть такая функция, как превращение одних веществ в другие. То, из чего мы состоим, — это в основном совсем не те вещества, которые можно найти в окружающей среде. Большинство из них мы для себя сделали сами. Поэтому превращение веществ может быть расценено как специальная биологическая функция. С учетом соблюдения языковых норм можно назвать ее метаболикой. Это неологизм. В принципе, здесь речь идет о биохимии в прежнем понимании данной науки. Однако биохимия родила в свое время науки, занимающие в здании биологии три последних этажа: субклеточную биологию, молекулярную биологию и биоорганическую химию. В то же время биохимию можно понимать как раздел биологии, в котором используется химический подход. И, наконец, сенсорика. Это тоже неологизм, которым, по аналогии с тремя предыдущими, можно определить науку о восприятии и обработке сигналов, поступающих из внутренней или из внешней среды живой системы, а также способность адекватно реагировать на такие сигналы. Следует подчеркнуть, что функциональный подход венчает собой изучение любой биологической системы. В конце концов нам не так уж важно, какая конкретная молекула занимается своим делом, и уж совсем не важно, каким образом мы ее открыли — как биологи, химики, физики или математики. Важно, что именно делает молекула и как ее функция вписывается в общую схему жизнедеятельности исследуемого объекта. Эти четыре функциональные науки — цель биологии. Там, где мы решили задачу в ее функциональном аспекте, можно поставить точку и идти дальше. Вопрос в том, куда идти. Пушкинское «Куда ж нам плыть?..» Возьмем на себя смелость утверждать, что человек, изучив живой мир и себя как один из его компонентов, основной будет считать задачу создания новых существ и усовершенствования своей собственной природы. Раньше подобные аспекты относились к области фантастики, хотя селекция растений и животных существовала испокон веков. Люди отчасти преуспели в создании ряда новых пород животных и сортов растений. Однако процесс этот был крайне медленным, а успех случайным, так как селекцией занималась скорее специальная отрасль производства, чем фундаментальная наука. Углубление наших знаний по всем трем координатам, изображенным на рис. 1.3, открыло возможность создания по плану, придуманному исследователем, новых биологических молекул, новых процессов, а затем и новых, невиданных прежде существ. Вопросы такого рода решаются наукой, получившей название «биоинженерия». В систему, представленную на рис. 1.3, биоинженерия не вписывается, так как «жильцы» «здания биоло-

Bioenergetica.indb 11

26.01.2011 18:01:55

12

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

гии» пытаются познать живое существо, возникшее в результате эволюции, а биоинженерия — это попытка самим создать новое живое существо или его компонент. Это принципиально иной, новаторский подход, и такой подход — будущее биологии, сколько бы мы ни обсуждали, правомерно ли создание новых биологических объектов, этично ли это и чем может грозить человечеству в будущем. Биологи уже вступили на этот путь, и не очень понятно, почему разгораются такие страсти вокруг биоинженерии. Ведь селекция — это тоже попытка создать новое, доселе не известное существо, а ведь никто селекционеров не осуждает. С другой стороны, в биоинженерных исследованиях нужна большая осторожность. Ошибка здесь дорого может стоить человечеству. Например, вполне реально создание суперпатогенных бактерий, которые смогут одновременно вызывать симптомы чумы, холеры, сибирской язвы и т.п. С такими патогенами невозможно будет бороться современными антибиотиками. Подобный монстр может получиться случайно или специально быть создан террористами для того, чтобы угрожать населению Земли. Об этом чрезвычайно опасном аспекте биоинженерных исследований надо помнить, но не для того, чтобы вообще запретить биоинженерию, а для того, чтобы подобные исследования находились под жестким общественным и государственным контролем.

1.3. Законы биоэнергетики На сегодня биоэнергетика достигла такого прогресса в своем развитии, что мы уже можем сформулировать основные ее законы. 1-й закон биоэнергетики. Живая клетка избегает прямой утилизации энергии внешних ресурсов при совершении полезной работы. Сначала она трансформирует эту энергию в конвертируемую форму ATP, или и использует ее затем в различных энергоемких процессах (ур. 1). Апеллируя к нашей повседневной жизни, можно сказать, что клетка предпочитает бартеру денежное обращение. Энергетические ресурсы → ATP,

Рисунок 1.4. Ф. Липман

Bioenergetica.indb 12

или

→ работа

(1.1)

Впервые этот принцип был выдвинут еще в 1941 г. Ф. Липманом (рис. 1.4), который тогда знал о существовании только одной биологической «валюты» — ATP. Действительно, ATP — абсолютно универсальный признак жизни: нет живой клетки, где бы не было ATP. Но оказалось, что существуют еще две биологических «валюты». Это разности электрохимических потенциалов ионов H+ и Na+ ( и ). может существовать в двух формах: (1) электрической и (2) химической. Первая — это трансмембранная разность электрических потенци-

26.01.2011 18:01:55

13

Глава 1. Введение

Рисунок 1.5. Две формы протонного потенциала между отсеками, разделенными мембраной: градиент электрического поля (ΔΨ, А) и градиент кислотности (ΔрН, Б). Вероятное направление протонного тока указано пунктирной стрелкой

алов (ΔΨ), вторая — трансмембранная разность концентраций ионов водорода (ΔрН). Рис. 1.5 иллюстрирует эти два понятия. Если между двумя отсеками, разделенными мембраной, существует разность электрических потенциалов, образованная, например, электрической батареей, то энергетически выгодным оказывается перемещение ионов Н+ из отсека, заряженного положительно, в отрицательно заряженный отсек (рис. 1.5 А). Другой способ достичь той же цели — закислить содержимое левого отсека относительно правого, добавив, например, в левый отсек соляную кислоту. В этом случае протонный ток слева направо также будет идти «под гору», но движущей силой окажется уже не ΔΨ, а ΔрН (рис. 1.5 Б). Потенциальная энергия, накопленная в виде ΔΨ или ΔрН, может быть утилизирована полезным образом, если поместить в мембрану устройство, сопрягающее перенос протона «под гору» с совершением какой-либо полезной работы. Энергия, накопленная в форме Δ H, может быть рассчитана по уравнению (1.2): ,

(1.2)

где ΔΨ — трансмембранная разность электрических потенциалов, R — газовая постоянная, T — абсолютная температура, F — число Фарадея, [H+]p и [H+]n — молярные концентрации ионов Н+ в соответственно положительно заряженном (или более кислом) и в отрицательно заряженном (или более щелочном) отсеках. вычисляется в единицах джоуль × моль–1. Для перевода величины в вольты это значение необходимо разделить на число Фарадея. Полученное частное П. Митчел предложил называть протон-движущей силой (по

Bioenergetica.indb 13

26.01.2011 18:01:57

14

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

аналогии с электродвижущей силой) и обозначил ее символом Δр. Величина Δр может быть рассчитана для 25 °C по уравнению (1.3): Δр =

/F = ΔΨ — 0,06·ΔрН.

(1.3)

Знак вычитания между ΔΨ и ΔрН обусловлен тем, что рН — отрицательный логарифм концентрации водородных ионов. Применительно к рис. 1.5 это обстоятельство иллюстрируется фактом, что будет тем больше, чем выше положительный заряд и чем ниже рН в левом отсеке. Согласно уравнению (1.3) ΔрН, равная 1, эквивалентна ΔΨ, равной 0,06 В, или 60 мВ. Та же величина, выраженная в килоджоулях × моль–1, будет равна 5,7 (1,37 ккал × моль–1). Аналогичные уравнения можно применить также и к натриевой энергетике. В этом случае в уравнение (1.3) вместо надо подставить , а вместо Δр — «натрий-движущую силу», которую можно обозначить как Δs (от лат. sodium): Δs =

/F = ΔΨ — 0,06·ΔрNa.

(1.4)

На рис. 1.6 приведена схема энергетики живых клеток, которые используют в качестве мембранной формы конвертируемой энергии. Согласно схеме свет или энергия субстратов дыхания могут утилизироваться ферментами фотосинтетической или дыхательной редокс-цепей или бактериородопсином. В результате образуется , которая затем используется для совершения работы, в частности для синтеза ATP. Субстратное фосфорилирование служит альтернативным механизмом образования ATP, который не требует . Такое фосфорилирование наблюдается в цепи реакций гликолиза и при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутаровой кислоты. -зависимое образование ATP — главный, но не единственный процесс трансформации в химическую работу. К тому же типу энергетических превращений относятся синтез неорганического пирофосфата, а также перенос восстановительных эквивалентов в направлении более отрицательных редокс-потенциалов (таковы обратный перенос электронов в дыхательной цепи и трансгидрогеназная реакция). Зависящий от транспорт через мембрану различных форм веществ в сторону большей их концентрации представляет собой трансформацию энергии по типу → осмотическая работа, а вращение бактериального жгутика за счет энергии служит примером превращения → механическая работа. Образование теплоты митохондриями животных в ответ на понижение окружающей температуры описывается превращениями типа → теплота. Для немембранных частей клетки также описаны все перечисленные выше типы энергетических превращений. Здесь они поддерживаются энергией ATP или других высокоэнергетических соединений. Существуют системы, специализированные на стабилизации (забуферивании) уровней и ATP. Для эту роль играют градиенты Na+ и + K , для ATP — креатинфосфат.

Bioenergetica.indb 14

26.01.2011 18:01:58

Глава 1. Введение

15

У некоторых бактерий вместо образуется . Источником энергии могут служить дыхание или неокислительное декарбоксилирование карбоновых кислот. Образованная используется для производства химической, осмотической и механической работы. Буфером может служить K+/Н+-градиент (рис. 1.6 Б). Наиболее сложный характер носит энергетика клетки животного. Фактически здесь в ходу три различные энергетические «валюты»: в митохондриях, на внешней клеточной мембране и ATP в прочих частях клетки.

Рисунок 1.6. Схема энергетики клетки, использующей и ATP (А) или и ATP (Б) в качестве конвертируемых форм энергии. (В) Взаимопревращение трех конвертируемых форм энергии

Bioenergetica.indb 15

26.01.2011 18:01:58

16

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

Возвращаясь к первому закону биоэнергетики, нужно сказать, что три его компонента (ATP, , ) неравнозначны. ATP — непременный компонент, а два остальных взаимозаменяемы, и вследствие этого у некоторых организмов может присутствовать либо тот, либо другой компонент. Но один из них должен быть обязательно. Следствием этого является 2-й закон. 2-й закон биоэнергетики. Любая живая клетка располагает хотя бы двуили . Продолжая мя формами конвертируемой энергии — ATP и аналогию с денежным обращением, у клетки в кошельке всегда есть и банкноты, и кредитная карточка. 3-й закон биоэнергетики предполагает взаимопревращение трех конвертируемых форм запасенной энергии. Вот почему клетка может удовлетворить все свои энергетические потребности, если есть возможность получить хотя бы одну из трех конвертируемых форм энергии за счет внешних энергетических ресурсов (рис. 1.6 В). Иными словами, клетке все равно, как расплачиваться за совершенную работу — банкнотами или кредитной карточкой. Описаны клетки, использующие только какой-то один тип энергетических ресурсов. Одни из них живут за счет дыхания или фотосинтеза и образуют только , у них нет гликолиза, поэтому нет возможности прямого синтеза ATP. У других, наоборот, единственным источником энергии служит гликолиз, образующий ATP без посредничества . У некоторых бактерий нет ни гликолиза, ни дыхания, ни фотосинтеза — они накапливают за счет протекания одной из реакций декарбоксилирования, а из делают и ATP, и . Мы обычно не осознаем масштаб событий, сопровождающих энергообеспечение нашего организма. Вот некоторые цифры. Человек за день потребляет в среднем около 140 л кислорода и синтезирует около 40 кг ATP, для чего нужно перекачать через мембраны митохондрий порядка 0,5 кг протонов. При этом генераторы поддерживают напряженность электрического поля на митохондриальной мембране в сотни кВ/см. В науке, которой посвящен наш курс, есть еще много белых пятен. До сих пор не ясны молекулярные механизмы большинства взаимопревращений различных форм энергии. Более того, не факт, что схемы, приведенные на рис. 1.6, описывают все типы биологической трансформации энергии. В них, например, отсутствует образование света. Свет является не только источником энергии. Любое живое существо высвечивает фотоны, образующиеся при свободно-радикальных реакциях, которые всегда протекают в клетке. Неясно, что это — только побочный продукт таких реакций или же клетки как-то используют свет в качестве сигнала. Ярчайшая иллюстрация глубины нашего незнания — история с открытием роли митохондрий в запрограммированной смерти клетки — апоптозе. В самом конце ХХ в. выяснилось, что в межмембранном пространстве митохондрий спрятаны «белки смерти», которые запускают апоптоз, выйдя из митохондрий в цитозоль. Таким образом, митохондрии не только электростанции клетки, но и органеллы, определяющие самую ее судьбу. А про-

Bioenergetica.indb 16

26.01.2011 18:02:00

Глава 1. Введение

17

стейший из цитохромов — цитохром с, которым занималось множество биоэнергетиков, начиная с открывшего его в 1925 г. Д. Кейлина, — оказался мощным инструментом клеточного самоубийства, причем это совершенно другая функция данного белка, не имеющая никакого отношения к его функции переносчика электронов.

1.4. Эволюция биоэнергетических механизмов Как возникли в процессе эволюции те три конвертируемых формы энергии, о которых шла речь в предыдущем разделе? Искать ответа на этот вопрос — задача неблагодарная. Прямого опыта здесь не поставишь, а от палеонтологов удается добиться основанного лишь на косвенных данных мнения, что какие-то следы жизнедеятельности цианобактерий есть в древнейших из дошедших до нас осадочных породах возрастом порядка 3,5 млрд лет. И все же без обсуждения этой проблемы нам не обойтись. Нельзя понять устройство современных живых систем, не представив себе хотя бы в общих чертах прошлое системы, т.е. происхождение и эволюцию. Ниже мы изложим свою гипотезу происхождения биоэнергетических механизмов.

1.4.1. Аденозинтрифосфат Почему эволюция остановила свой выбор на этом веществе? Рассмотрим каждую из трех составных частей ATP. Первая — трифосфатный остаток, где собственно и запасена энергия ATP. Итак, почему АТР? Известно, что если третий атом фосфора заменить на ближайший ему по свойствам атом мышьяка, то образовавшийся ADP-арсенат быстро распадается уже при комнатной температуре и нейтральном рН. Атом мышьяка чуть больше атома фосфора, и этого оказывается достаточно, чтобы облегчить его атаку молекулами воды. К тому же во внешней среде мышьяка значительно меньше, чем фосфора, так что искать мышьяк живому существу было бы по меньшей мере утомительно. Среди биологов бытует миф об ATP как уникальной биологической форме энергии, поскольку это вещество имеет высокоэнергетические (или «макроэргические») связи. Строго говоря, к высокоэнергетическим соединениям можно отнести ATP и все вещества, способные образовывать ATP в ферментативных реакциях переноса групп. Изменение свободной энергии при гидролизе таких соединений всегда не меньше, чем таковое для аденозинтрифосфата, т.е. около 10 ккал × моль–1 (в физиологических условиях; в стандартных условиях эта величина составляет около 7 ккал × моль–1). Следует подчеркнуть, что термин «высокоэнергетические соединения» имеет скорее биологический, чем химический смысл. Эту мысль можно пояснить следующим примером. Креатинфосфат служит высокоэнергетическим соединением у позвоночных, располагающих ферментом креатинфосфокиназой, катализирующим обратимый перенос фосфорила между ATP и креатином. В то же время у некоторых беспозвоночных, где роль буфера для ATP играет аргининфосфат, а креатинфосфокиназа отсутствует,

Bioenergetica.indb 17

26.01.2011 18:02:00

18

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

креатинфосфат уже не высокоэнергетическое соединение, если следовать определению, данному выше. Ошибочное представление, что пирофосфатные связи в ATP какието особенные, породило следующее заблуждение — энергия непременно должна выделяться при гидролизе ATP. В действительности оказалось, что во многих случаях энергия выделяется не при гидролизе этой связи, а при сорбции ATP на белке. Если ATP особым образом «распять» в активном центре белка, то часто он (ATP) теряет «макроэргичность», и потом уже нельзя из этого распятого ATP сделать нормальный, свободный, «макроэргический» ATP, поскольку энергия ATP инвестирована в напряженную конформацию белковой молекулы. В таких случаях свободный ATP можно получить, лишь денатурировав белок. В норме же конформационная энергия белка используется для совершения определенной работы, а последующий гидролиз ATP нужен для получения конечных продуктов реакции (ADP и фосфата), отщепление которых от белка освобождает место для посадки на белок следующей молекулы ATP. Деэнергизация ATP при сорбции на белке не удивительна, поскольку свободный ATP имеет мало общего со связанным ATP, который взаимодействует сразу со многими функциональными группами в активном центре фермента. В результате этих взаимодействий электронные плотности в связанном ATP могут быть распределены совершенно иначе, чем в свободном. Следующая проблема: почему ATP? Это не простой вопрос, так как уже ADP является макроэргом. Существует фермент аденилаткиназа, который может из двух ADP сделать ATP и AMP. Стандартная цена энергии пирофосфатной связи в терминальном фосфате ADP близка к таковой у ATP. Казалось бы, всю энергетику клетки можно построить на гидролизе ADP до AMP. И тем не менее эволюцией был выбран более сложный ATP, а не более простой ADP. Объяснение этому парадоксу следует искать в том обстоятельстве, что существуют два пути гидролиза ATP: ATP + Н2О → ADP + Pi,

(1.5)

ATP + Н2О → ADP + PPi.

(1.6)

Гидролиз терминального фосфата в ATP происходит в тех случаях, когда эндэргонический процесс, движимый расщеплением ATP, требует энергии либо меньшей или равной 10 ккал × моль–1, либо много большей 10 ккал × моль–1. (В этих случаях существует особый механизм, позволяющий использовать энергию многих молекул ATP для совершения одного функционального акта, к примеру актомиозин.) В реакциях, когда потребность в энергии лишь несколько больше 10 ккал × моль–1, ATP гидролизуется до AMP и неорганического пирофосфата. In vivo в клетке выход энергии при гидролизе ATP до AMP и PPi на 4–5 ккал × моль–1 превосходит таковой при его гидролизе до ADP и Pi. Это обусловлено значительно более низкой концентрацией неорганического пирофосфата по сравнению с неорганическим фосфатом, образующимся вследствие необратимого гидролиза PPi пирофосфатазой.

Bioenergetica.indb 18

26.01.2011 18:02:00

Глава 1. Введение

19

Таким образом, использование в качестве конвертируемой «валюты» аденозинтрифосфата, а не аденозиндифосфата сообщает дополнительную гибкость биологической системе энергообеспечения.

1.4.2. Гипотеза об адениновом фотосинтезе Но, пожалуй, самый интригующий вопрос, почему носителем высокоэнергетических фосфатов оказался аденозин, т.е. почему АТР? Все сказанное выше об ATP верно и для неорганического трифосфата. Далее мы попытамся продемонстрировать, что сегодня аденозин в ATP — не более чем родимое пятно эволюции. Есть разные идеи о том, что послужило источником энергии при происхождении жизни на Земле или в космосе. Некоторые считают, что это была энергия электрических разрядов при грозах, другие — что термальная энергия, третьи — энергия окисления древних осадочных пород. Нам кажется, однако, что становление жизни было настолько длительным и мучительным процессом, что первичным энергетическим ресурсом должно было быть нечто не ограниченное какими бы то ни было земными обстоятельствами. Есть только один такой источник энергии, который и сегодня служит первичным энергетическим ресурсом жизни на Земле, — свет Солнца. У солнечного света есть видимая и ультрафиолетовая составляющие. Считается, что во времена происхождения жизни ультрафиолет свободно проходил сквозь атмосферу и достигал поверхности первичного океана, поскольку кислорода было еще слишком мало, чтобы образовать непроницаемый для ультрафиолета озоновый слой. Окрашенных веществ, т.е. тех, которые поглощают видимый свет, очень мало, а вот ультрафиолетовый свет поглощают практически все вещества. Кванты такого света могли развязать множество химических реакций простых веществ, имевшихся в первичном океане и атмосфере древнейшей Земли. Американский биохимик С. Понамперума поставил такие опыты. Он запаял стерильный раствор синильной кислоты в ампулу и затем облучил его ультрафиолетовым светом. Оказалось, что в результате облучения в растворе образовался аденин и другие азотистые основания. Как показал Понамперума, в тех же условиях под действием ультрафиолета синтезировался аденозин, а если в ампулу был добавлен помимо синильной кислоты еще и этилметафосфат, то также AMP, ADP, ATP и аденозинтетрафосфат, причем превращение ADP в ATP шло с достаточно хорошим выходом, гораздо большим, чем синтез АМР и аденозина или АДР из АМР. Моделируя атмосферу древнейшей Земли, К. Саган пришел к выводу о существовании в ней «окна» в области 240–290 нм, прозрачного для ультрафиолетового света, поскольку основные простые компоненты этой атмосферы (Н2О, СН4, NH3, CO2, CO и HCN) поглощают свет короче 240 нм, а формальдегид, также входивший, как полагают, в ее состав, имеет максимум поглощения длиннее 290 нм. Именно в этом «окне» располагаются спектральные максимумы пуринов и пиримидинов.

Bioenergetica.indb 19

26.01.2011 18:02:00

20

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

К. Саган и С. Понамперума приводят следующие доводы в пользу того, что в качестве антенны для ультрафиолетового света аденин имеет преимущества по сравнению с другими пуринами и пиримидинами: (1) наибольшее поглощение света в спектральном «окне», о котором шла речь выше; (2) наибольшая устойчивость к разрушительному действию ультрафиолетового света и (3) большая продолжительность возбужденного состояния, возникающего в ответ на поглощение ультрафиолетового кванта. Расчеты Л.А. Блюменфельда и М.И. Темкина привлекли наше внимание к тому, что величины изменения свободной энергии при нарушении ароматической структуры аденина близки к энергии реакции синтеза ATP из ADP и неорганического фосфата. Приняв во внимание все названные выше обстоятельства, мы предложили следующий механизм фосфорилирования за счет ультрафиолетового света в первичных живых клетках. 1) Адениновая часть ADP поглощает ультрафиолетовый квант, что переводит ее в возбужденное состояние с нарушенной системой двойных связей. При этом аминогруппа аденина, соответствующая в обычном состоянии ароматической, приобретает свойства алифатической, что облегчает ее атаку атомом фосфора неогранического фосфата*. 2) Возбужденный аденин ADP фосфорилируется, давая изомер ATP, третий фосфорил которого находится при аминогруппе аденина. 3) Фосфорил переносится с аденина на конечный (второй) фосфат ADP. Такой перенос облегчен тем, что расстояние между шестичленным циклом в аденине и вторым фосфатом в ADP в точности равно размеру еще одного (третьего) фосфатного остатка (на это обстоятельство обратил внимание еще А. Сент-Дьерди). Перенос фосфорила с адениновой «головы» нуклеотида на фосфатный «хвост» должен сопровождаться его стабилизацией, поскольку весьма лабильный фосфоамид заменяется на менее лабильный фосфоангидрид (рис. 1.7). Стадии (2) и (3) гипотетичны и призваны объяснить механизм синтеза ATP под действием ультрафиолета в опытах Понамперумы. Известно, что аденин и реже другие пурины или пиримидины входят в состав ключевых коферментов и простетических групп ферментов, таких, как никотинамидадениндинуклеотид (NAD+), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP+), флавинадениндинуклеотид (FAD), кофермент А (CoA), тиаминопирофосфат (производное витамина В1), витамин В12. Все эти соединения, как правило, построены по одному и тому же принципу. Они содержат (1) ту или иную функциональную группу, непосредственно участвующую в катализе, (2) пурин или (реже) пиримидин и (3) гибкую связку, позволяющую сблизить две другие части молекулы. Особенно наглядно устройство динуклеотидов: в них плоские остатки никотинамида (в NAD+ и NADP+) или изоаллоксазина (в FAD) лежат на таком же плоском остатке аденина. Продемонстрирован перенос энергии от остатка аденина к остатку никотинамида или изоаллоксазина в ответ на поглощение адени* Другая возможность: фосфат присоединяется к N1 аденина, а не к его аминогруппе. Например, описаны природные соединения NAD+ с рибозой в положении N1.

Bioenergetica.indb 20

26.01.2011 18:02:01

Глава 1. Введение

21

ном ультрафиолетового кванта. Резонно предположить, что исходно аденин, возбуждаясь ультрафиолетовым светом, передавал энергию на функциональную группу кофермента, который использовал эту энергию для проведения энергоемких химических реакций (например, восстановления простых веществ среды до более сложных соединений первичной клетки). В дальнейшем не слишком специфичный и нерегулируемый катализ, осуществляемый низкомолекулярными коферментами, был вытеснен процессами с участием высокомолекулярных катализаторов-ферментов, отличающихся огромной избирательностью в отношении субстратов и возможностью регулировать катализ. По-видимому, первыми ферментами были рибонуклеиновые кислоты — полимеры, составленные из мономеровРисунок 1.7. Схема «аденинового фотонуклеотидов. Можно полагать, что аде- синтеза» — предполагаемого первичного ниновый фотосинтез катализировался механизма запасания энергии в живой комплексами РНК с магниевыми соля- клетке. Квант ультрафиолетового света ми ADP и фосфата. При этом РНК мог- поглощается адениновой частью аденозиндифосфата (ATP), переводя ее в ла бы выполнять также роль антенны, возбужденное состояние. Возбуждение собирающей ультрафиолетовый свет и облегчает присоединение неорганического фосфата (Pi) к аминогруппе аденина. передающей возбуждение на ADP. Два свойства РНК предопредели- В результате образуется PADP, изомер ли, по-видимому, дальнейшую эво- аденозинтрифосфоата (ATP), где третий фосфат присоединен не к пирофосфатлюцию — способность этой молекулы ному «хвосту», а к адениновой «голове» создавать свою копию (реплицировать- ADP. Затем происходит перенос фосфата ся) и способность двух разных РНК от «головы» к «хвосту» с образованием обычного ATP обмениваться участками своих нуклеотидных последовательностей (рекомбинация). А.С. Спирин предположил, что когда-то первичный океан представлял собой гигантский реактор, в котором «варилось» бесчисленное множество непрерывно рекомбинирующих молекул РНК (эдакий Солярис Станислава Лема). Трудно даже представить себе все разнообразие вариантов РНК, возникавшее в такой системе. Надо сказать, что еще и сегодня в определенных (хотя и весьма немногочисленных) случаях биохимические реакции могут катализироваться рибонуклеиновыми кислотами (так называемыми рибозимами). Наиболее важной из них является рибосома, катализирующая синтез белков благодаря участию функциональных групп, прежде всего рибосомальных РНК, в то время как группы, принадлежащие белкам, играют в общем-то вспомогательную роль. Однако несомненно, что каталитические функции совре-

Bioenergetica.indb 21

26.01.2011 18:02:01

22

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

менных организмов, как правило, осуществляются белками, обладающими гораздо большим, чем РНК, разнообразием химических группировок и их сочетаний. Кодирование структуры белков первоначально осуществлялось, повидимому, все теми же рибонуклеиновыми кислотами. Затем функция кодирования была передана более стабильным дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) (отсутствие спиртовой группы в дезоксирибозе стабилизирует сложноэфирную связь в ДНК). Другим важнейшим изобретением биологической эволюции стали жиры и жироподобные вещества, прежде всего фосфолипиды. Замечательной особенностью фосфолипидов является их способность самопроизвольно, без какой-либо помощи извне образовывать тончайшую пленку, непроницаемую для гидрофильных веществ, таких, как нуклеотиды-коферменты, РНК, ДНК, белки и углеводы. Эта пленка (мембрана) представляет собой бислой, образованный двумя рядами молекул фосфолипидов, соприкасающихся своими гидрофобными (углеводородными) «хвостами». При этом гидрофильные «головы» (фосфатные остатки) фосфолипидов оказываются на двух противоположных поверхностях мембраны. Толщина такой мембраны порядка 50 ангстрем. С образованием мембран стало возможным говорить о первичной живой клетке, содержимое которой было отделено от внешней среды достаточно надежным барьером. Появление клетки как обособленного мельчайшего пузырька могло бы сыграть роль в защите от неблагоприятных эффектов ультрафиолетового облучения.

1.4.3. Запасные энергетические ресурсы и гликолиз Ультрафиолетовый свет — обоюдоострое оружие. Он хорош тем, что способен инициировать разнообразные химические реакции, среди которых могут быть полезные, как, например, фосфорилирование адениновой аминогруппы ADP. Но в то же время (и по той же причине!) ультрафиолетовый свет опасен: он может разрушить уже синтезированные молекулы живой клетки. Одним из способов уменьшить «ультрафиолетовую опасность» могли стать запасные вещества — энергетические ресурсы, образуемые на свету, чтобы затем использоваться в темноте. Ультрафиолетовый свет, достигающий поверхности океана, не может проникать на сколько-нибудь значительную глубину из-за мутности и наличия растворенных веществ, поглощающих ультрафиолетовые кванты. Фактически только очень тонкий поверхностный слой подвергается бомбардировке этими квантами. Данное обстоятельство позволяет предположить следующий механизм энергообеспечения первичных живых клеток. Под действием движения слоев жидкости в океане клетки постоянно циркулировали между тонкой верхней пленкой воды, доступной для ультрафиолетового света, и более глубокими слоями, которых он не достигал. При этом вблизи поверхности происходил синтез ATP, использовавшегося для образования резервных соединений, которые затем расщеплялись на глубине, поддерживая ресинтез ATP из

Bioenergetica.indb 22

26.01.2011 18:02:01

Глава 1. Введение

23

Рисунок 1.8. Энергетика первичной живой клетки, основанная на «адениновом фотосинтезе». Предполагается, что ультрафиолетовые кванты, достигая поверхности первичного океана, использовались клеткой для синтеза ATP, который запускал синтез углеводородов (гликонеогенез). Клетка, увлекаемая потоком океанской воды с поверхности на некоторую глубину, оказывалась недосягаемой для ультрафиолетового облучения. Здесь происходило расщепление накопленных углеводов (гликолиз), сопряженное с синтезом ATP, который использовался для совершения клеткой различных типов полезной работы

ADP и Pi, образовавшихся при эндергонических процессах жизнедеятельности. В результате короткие экспозиции на ультрафиолетовом свету чередовались с гораздо более длительными периодами, где ультрафиолетовой опасности уже не было (рис. 1.8). Кроме того резервные вещества помогали клеткам пережить ночь. Хорошими кандидатами на роль энергетического резерва первичных клеток могли бы быть неорганические пиро- и полифосфаты. Они и сегодня играют эту роль у некоторых видов живых существ. Например, в клетках грибов полифосфаты образуются из ATP в условиях избытка энергетических ресурсов и расщепляются, давая ATP, при дефиците источников энергии. Однако в подавляющем большинстве дошедших до нас организмов функцию легко мобилизуемого энергетического резерва выполняют не полифосфаты, а углеводы. Их синтез за счет энергии ATP (гликонеогенез) представляет собой длинную последовательность реакций, намного более сложную, чем синтез полифосфатов из ATP. Преимущество углеводов перед полифосфатами состоит в том, что в них запасена не только энергия, но и «строительный материал». Расщепление углеводов (гликолиз) дает, помимо ATP, различные карбоновые кислоты, такие, как пировиноградная кислота, которая может использоваться клеткой при биосинтезе самых разнообразных соединений. Описаны два основных типа гликолиза. В одном случае (спиртовое брожение) конечными продуктами расщепления углеводов оказываются этиловый спирт и углекислый газ — вещества, легко проникающие через мембрану клетки. Это обстоятельство имеет как преимущества (нет проблемы переполнения клетки конечными продуктами гликолиза), так и недостатки (трудно вернуться назад, к углеводу, если конечные продукты уже вышли из клетки и разбавились в океане внешней среды). Указанный недостаток отсутствует во втором, на сегодня гораздо более распространенном типе гликолиза, когда конечным продуктом оказывается

Bioenergetica.indb 23

26.01.2011 18:02:01

24

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

молочная или какая-либо другая карбоновая кислота. Молочная кислота не проникает через мембрану, не покидает пределы клетки и потому может быть использована клеткой для ресинтеза углеводов, когда возникает такая возможность. Неудачно лишь то, что молекулы молочной кислоты, образуясь, диссоциируют с образованием ионов лактата и водорода. Последние тоже не могут пройти через мембрану, остаются в клетке и закисляют ее содержимое. Закисление, если его не предотвратить, приведет к гибели клетки из-за кислотной денатурации белков. Возможное решение этой проблемы будет описано в следующем разделе.

1.4.4. Протонные каналы и Н+-ATPаза как способы предотврать закисление клетки при гликолизе Проблема проникновения через клеточную мембрану веществ, которые сами по себе не могут сквозь нее пройти, у современных клеток решается с помощью встроенных в мембрану белков-переносчиков. В частности, известны белки-переносчики ионов Н+. Так называемый фактор Fo — белок, входящий в состав Н+-ATP-синтазы, — действует как переносчик Н+ или протонный канал. Можно предположить, что у первичных гликолизирующих клеток фактор Fo функционировал в отсутствие фактора F1, второго (каталитического) компонента Н+-ATP-синтазы, разрешая ионам Н+, образующимся при гликолизе, покинуть пределы клетки. Так предотвращалось закисление внутриклеточной среды, которая оказывалась в равновесии по ионам Н+ с внеклеточной средой. Ограничениями гликолиза в такой ситуации стали закисление внеклеточной среды и генерация мембранного потенциала (ΔΨ) за счет диффузии иона Н+ изнутри клетки наружу, т.е. в клетке возникал избыток отрицательных зарядов (интересно, что все без исключения дошедшие до нас живые клетки имеют ΔΨ со знаком «минус» внутри). Ослабить действие этих ограничений можно было, достроив белок — переносчик ионов Н+ (фактор Fo) — другим белком, называемым фактором F1, Рисунок 1.9. Как первичная клетка могспособным использовать энергию ATP ла избавиться от ионов Н+, образуемых для активной откачки из клетки ионов гликолизом? А — облегченная диффузия + Н+ через фактор Fo. Известно, что Н+ионов Н посредством белка (фактора Fo), ATP-синтаза (комплекс факторов Fo и образующего Н+-проводящий путь сквозь клеточную мембрану; Б — комплекс F1), действуя в обратном направлении, факторов Fo и F1 (Н+-ATPаза), активно способна катализировать вместо синтеоткачивающий из клетки ионы Н+ за счет за ATP гидролиз ATP, сопряженный с гидролиза ATP

Bioenergetica.indb 24

26.01.2011 18:02:02

Глава 1. Введение

25

откачкой ионов Н+. Этот процесс носит название Н+-ATPазной реакции (рис. 1.9). Можно полагать, что с образованием Н+-ATPазы завершилось формирование первичной клетки, использовавшей ультрафиолетовый свет в качестве источника энергии для жизнедеятельности.

1.4.5. Бактериородопсиновый фотосинтез — первичный механизм использования видимого света С течением времени все меньше ультрафиолетовых квантов достигало поверхности Земли. Причиной было образование озонового слоя атмосферы в условиях повышения в ней концентрации кислорода. Первоначально кислород образовывался, по-видимому, вследствие фотолиза паров воды под действием того же ультрафиолетового облучения. Чтобы выжить в новых условиях, древние клетки должны были переключиться с ультрафиолетового света на какой-либо иной источник энергии, все еще доступный для них в новых условиях. Таким источником стал, вероятно, видимый свет. Возможен и другой сценарий эволюции. Возникновение фотосинтеза, использующего видимый свет, произошло еще до помутнения атмосферы, а именно при проникновении жизни в более глубокие уровни океана, лишенные ультрафиолетового света. Замена опасного ультрафиолетового излучения на безопасный видимый свет могла бы стать тем признаком, который лег в основу естественного отбора на данном этапе эволюции. В рамках этой концепции создание озонового слоя имеет биогенную природу, явившись результатом фотолиза воды системой хлорофилльного фотосинтеза зеленых бактерий и цианобактерий. Новый фотосинтез должен был, как и прежде, образовывать ATP, который к тому времени уже прочно занял место в центре метаболической карты как «конвертируемая энергетическая валюта» клетки. Однако аденин уже не мог играть роль улавливающей свет антенны, так как его максимум поглощения находится в ультрафиолетовой, а не в видимой области спектра. До нас дошли два типа фотосинтетических устройств, использующих видимый свет. Антенной в одном из них служит хлорофилл, в другом — производное витамина А, ретиналь, соединенный с особым белком, названным бактериородопсином. Хлорофилл обнаружен у зеленых растений и почти у всех фотосинтезирующих бактерий. Исключение составляют группа соле- и теплоустойчивых архей и некоторые бактерии, содержащие бактериородопсин. Тем не менее именно бактериородопсин выглядит как эволюционно первичный механизм запасания клеткой энергии видимого света. Бактериородопсин — светозависимый протонный насос. Он способен активно откачивать ионы Н+ из клетки за счет энергии видимого света, поглощенного ретиналевой частью его молекулы. В результате световая . Ионы Н+, откачанные бактериородопсином, энергия превращается в могут вернуться в клетку через комплекс факторов Fo и F1 таким образом, что энергия, освобождающаяся при движении протонов «под гору», используется для синтеза ATP. Нетрудно представить себе, как возник фотосинтез ATP, катализируемый бактериородопсином и комплексом FoF1. С появле-

Bioenergetica.indb 25

26.01.2011 18:02:02

26

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

Рисунок 1.10. Бактериородопсиновый фотосинтез. Ионы Н+ откачиваются из клетки бактериородопсином — белком, содержащим ретиналь в качестве хромофора, т.е. группировки, поглощающей видимый свет. Ионы Н+ возвращаются в клетку, двигаясь «под гору» через Н+-ATPазный комплекс FoF1. При этом оказывается, что Н+-ATPаза катализирует обратную реакцию, т.е. синтез ATP, а не его гидролиз

нием бактериородопсина клетка научилась создавать за счет видимого света, а эта , образовавшись, просто развернула вспять Н+-ATPазную реакцию, существовавшую ранее в качестве механизма откачки из клетки гликолитических ионов Н+. Так комплекс FoF1 мог превратиться из ATPазы в ATP-синтазу (рис. 1.10). Устройство бактериородопсина намного проще системы хлорофилльного фотосинтеза. Белковая часть бактериородопсина представляет собой одну полипептидную цепь средней длины, которая не содержит других коферментов и простетических групп, кроме ретиналя. Бактериородопсин чрезвычайно устойчив: без потери активности его можно кипятить в автоклаве при +130 °С, изменять содержание NaCl в омывающем мембрану растворе от нуля до насыщения, в широких пределах изменять рН этого раствора. Более того, можно удалить выступающие из мембраны концевые участки полипептидной цепи и даже расщепить эту цепь в одном месте посередине без ущерба для активности насоса. В то же время эффективность бактериородопсина как преобразователя энергии сравнительно низка: всего . При этом на один по20% энергии светового кванта превращается в глощенный квант через мембрану переносится лишь один ион Н+.

1.4.6. Хлорофилльный фотосинтез Хлорофилльный фотосинтез отличается от бактериородопсинового большей эффективностью использования светового кванта. Он устроен таким образом, что либо на каждый квант переносится через мембрану не один, а два иона Н+, либо помимо транспорта Н+ происходит запасание энергии в форме углеводов, синтезируемых из СО2 и Н2О. Вот поче-

Bioenergetica.indb 26

26.01.2011 18:02:02

Глава 1. Введение

27

му бактериородопсиновый фотосинтез был в ходе эволюции вытеснен с авансцены. Хлорофилльный фотосинтез катализируется ферментной системой, включающей несколько белков. Квант света поглощается хлорофиллом, молекула которого, перейдя в возбужденное состояние, передает один из своих электронов в фотосинтетическую цепь переноса электронов. Эта цепь представляет собой последовательность окислительно-восстановительных ферментов и коферментов, находящихся во внутренней мембране бактерий или хлоропластов растений, где локализованы также белки, связанные с хлорофиллом. Компоненты цепи содержат, как правило, ионы металлов с переменной валентностью (железа, меди или марганца). При этом железо может входить в состав гема (в таком случае белки называются цитохромами). Большую роль играют также негемовые железопротеиды, где ион железа связан с белком через серу цистеина или (реже) азот гистидина. Помимо ионов металлов, роль переносчиков электронов играют производные хинонов, такие, как убихинон, пластохинон и витамины группы К (здесь и далее структурные формулы различных простетических групп и кофакторов ферментов электрон-транспортных цепей см. в Приложении 2). Перенос по цепи электрона, отнятого от возбужденного хлорофилла, завершается по-разному — в зависимости от типа фотосинтеза. У пурпурных бактерий (рис. 1.11) электрон с возбужденного светом хлорофилла переносится на другую сторону мембраны, где присоединяется к хинону (CoQ). Восстановленный CoQ присоединяет протоны, образуя CoQH2. Последний диффундирует на другую сторону мембраны, чтобы вернуть хлорофиллу его электрон. При этом протоны CoQH2 освобождаются в воду в виде ионов Н+, оказавшихся снаружи клетки. Процесс завершается возвращением ионов Н+ в клетку через Н+-ATP-синтазу, образующую при этом АТР.

Рисунок 1.11. Хлорофилльный фотосинтез пурпурных бактерий. Упрощенный вариант. Объяснения в тексте

Bioenergetica.indb 27

26.01.2011 18:02:03

28

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

Рисунок 1.12. Хлорофилльный фотосинтез цианобактерии глеобактер. Упрощенный вариант. Объяснение в тексте. НСОН — компонент глюкозы

Следующим шагом в эволюции фотосинтеза стали, по-видимому, цианобактерии типа глеобактера. В этом случае хлорофилл восстанавливает при участии особых ферментов внутриклеточную углекислоту, превращая ее в глюкозу. При этом поглощаются Н+ ионы из цитозоля. Что касается восстановителя фотоокисленного хлорофилла, то им оказывается внеклеточная вода, расщепляющаяся до О2 и Н+. Обратный поток Н+ внутрь клетки через FoF1 сопряжен с генерацией АТР (рис. 1.12). Таким образом, фотосинтез цианобактерий параллельно с образованием ATP дает углевод — главное резервное вещество современных живых клеток. Нет сомнений, что цианобактерия является эволюционным предшественником хлоропластов — органелл зеленых растений, энергетика которых устроена в основном по той же схеме, что показана на рис. 1.12.

1.4.7. Дыхательный механизм энергообеспечения Побочным продуктом фотосинтеза у цианобактерий и растений служит молекулярный кислород. Нарастание его концентрации в атмосфере привело к появлению ферментов, убирающих этот сильный окислитель, опасный для жизнедеятельности. Вероятно, первой функцией ферментов, восстанавливающих О2 до Н2О, было снижение внутриклеточной концентрации кислорода. Однако в дальнейшем аэробные бактерии научились извлекать пользу из этого процесса, создав дыхательную цепь электронного транспорта, сопряженного с откачкой ионов Н+. Дыхательная цепь представляет собой механизм окисления субстратов дыхания, получающихся, например, из глюкозы, образованной организмами-фотосинтетиками. По существу, ферменты дыхательной цепи выполняют функции, противоположные тем, которые осуществляются при фотосинтезе цианобактерий и хлоропластов. При дыхании происходит

Bioenergetica.indb 28

26.01.2011 18:02:03

Глава 1. Введение

29

Рисунок 1.13. Механизм дыхательного фосфорилирования в аэробных бактериях и митохондриях. Упрощенный вариант. Объяснение в тексте

не синтез, а окисление органических веществ. В результате происходит не окисление Н2О до О2, а восстановление О2 до воды. Что касается синтеза АТР, то он, как и во всех прочих случаях, сопряжен с переносом Н+ «под гору» (рис. 1.13). Подобно тому, как хлоропласты произошли от цианобактерий, митохондрии животных, растений и грибов ведут свое происхождение от аэробных бактерий. Поэтому неудивительно, что митохондриальная дыхательная цепь описывается той же принципиальной схемой, что изображена на рис. 1.13. Завершающим аккордом в создании современной картины энергетики жизни стала, по-видимому, замена H+ на Na+ в ряде биоэнергетических устройств. Натрий имеет два преимущества перед протоном. Во-первых, он гораздо более массовый (в океане 5×10–1 М Na+ против 1×10–7 М Н+). Во-вторых, мембраны более проницаемы для Н+, чем для Na+. Протонакцепторные группы мембранных белков повышают ее Н+-проводимость, чего не происходит в случае с Na+. Создать мембрану, непроницаемую для протона, очень сложно, для Na+ — гораздо проще. Особенно неудобен ион Н+ как сопрягающий ион в щелочной среде, где его концентрация особенно низка. Неудобен он и для жизни при высокой температуре, поскольку с ростом температуры Н+-проводимость мембран увеличивается гораздо сильнее, чем Na+-проводимость. Базируясь на известном принципе, исповедуемом энзимологами, — «белок может все», нетрудно себе представить некий белок, который откачивает ионы Na+ наружу за счет использования того или иного энергетического источника, и другой белок, разрешающий иону Na+ войти в клетку параллельно с синтезом ATP или совершением какой-либо другой работы. Так могли бы возникнуть «натриевые» мембраны, использующие Na+, а не Н+ в качестве сопрягающего иона. Примером «натриевых» мембран могут быть, во-первых, мембраны некоторых морских бактерий, имеющих Na+-транспортирующую дыхательную цепь (или

Bioenergetica.indb 29

26.01.2011 18:02:04

30

ЧАСТЬ I. Принципы биоэнергетики

Na+-декарбоксилазу) и Na+-ATP-синтазу, и, во-вторых, внешняя мембрана животной клетки с ее Na+/K+-ATPазой и Na+-зависимыми белками — транспортерами различных веществ. Следующим этапом эволюции может оказаться возникновение «кальциевой» энергетики. Ионы Ca2+ у большинства организмов выполняют две функции: структурную (входят в состав скелетов) и регуляторную (обратимо меняют свойства множества компонентов внеклеточной и внутриклеточной среды). Разнообразные системы транспорта ионов кальция (Ca2+-АТРазы, Na+/Ca2+-обменники, электрогенные ионные каналы) присутствуют в мембранах всех основных органелл клетки (плазмалеммы, саркоплазматического ретикулума, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи и митохондрий). Часть энергопродукции животной клетки всегда расходуется на обеспечение Ca2+-потоков, регулирующих такие важные процессы, как передача нервного импульса и внутриклеточное проведение гормональных сигналов, инициация сокращения мышц и регулирование клеточного роста, стимуляция анаэробного и аэробного катаболизма, экзоцитоз в секреторных клетках и формирование межмембранных контактов, контроль клеточного старения и смерти и др. Данные одного из авторов (Ф.О. Каспаринского) этой книги, полученные в 1992–2002 гг. при работе с изолированными митохондриями печени крысы, дают основания полагать, что рассеяние трансмембранных градиентов ионов кальция могло бы обеспечивать «аварийное» восстановление ΔΨ на мембранах клетки в условиях дефицита источников свободной энергии, при ингибировании работы -генераторов метаболическими ядами и в прочих экстремальных условиях. Современные данные о пространственной организации тесных контактов между потенциал-зависимыми Ca2+-каналами плазмалеммы, эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями позволяют выдвинуть гипотезу о возможности организации адресной доставки свободной энергии кальциевого градиента в любой клеточный компартмент.

Bioenergetica.indb 30

26.01.2011 18:02:04

Часть вторая

ГЕНЕРАТОРЫ ПРОТОННОГО ПОТЕНЦИАЛА ГЛАВА ВТОРАЯ

ХЛОРОФИЛЛЬНЫЕ ГЕНЕРАТОРЫ ПРОТОННОГО ПОТЕНЦИАЛА

Г енераторы

— это основные преобразователи энергии внешних ресурсов в утилизируемую форму. Для начала рассмотрим светозависимые (фотосинтетические) генераторы. Во-первых, они представляют собой, как мы думаем, исторически первый механизм образования протонного потенциала за счет энергии внешних ресурсов. Во-вторых, и по сей день фотосинтез играет ключевую роль в энергообеспечении биосферы, состоящей в основном из организмов-фотосинтетиков и органотрофов, потребляющих прямо или косвенно продукты фотосинтеза — органические вещества и кислород. Оксигенный фотосинтез, т.е. тот, который образует кислород, присущ зеленым растениям и цианобактериям. Именно он обеспечивает кислородом планету. Можно указать точные географические координаты тех областей Земли, которые за это отвечают. Большая часть кислорода на Земле образуется у нас в стране — в таежных лесах Сибири. Меньший вклад дает Канада, где тоже есть леса умеренной полосы, прежде всего хвойные. Что же касается знаменитых тропических лесов (африканских джунглей и южноамериканской сельвы), а также Мирового океана, то их вклад незначителен просто потому, что там, в отличие от лесов умеренной полосы, есть огромное количество гетеротрофных бактерий, поглощающих тот самый кислород, который выделяют фотосинтетики. По сути дела Сибирь — это легкие планеты. Вот почему если загубить сибирские леса, то аэробной жизни на Земле придет конец. Есть еще одно, чисто техническое, но немаловажное обстоятельство, заставляющее нас начать изложение материала с фотосинтеза. Этот процесс запускается квантом света, что делает возможным применение современных физических приборов для анализа его механизма. Например, используя сверхбыстрый лазер, вы можете подать вспышку света длительностью 2 × 10–14 сек, чтобы изучить кинетику и механизм первичных процессов запасания энергии света.

Bioenergetica.indb 31

26.01.2011 18:02:04

32

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

2.1. Светозависимая циклическая редокс-цепь пурпурных бактерий Мы начнем не с того самого главного (оксигенного) фотосинтеза, о котором шла речь только что, а с более примитивных фотосинтетических механизмов, описанных у фототрофных бактерий, уже упоминавшихся в первой лекции. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий локализован во внутренней, т.е. цитоплазматической, мембране и хроматофорах — пузырьках, отпочковывающихся от этой мембраны. По определению биологическая мембрана — это липидно-белковая пленка толщиной от 50 до 70 ангстрем. По существу — это липидный бислой, в котором плавают пронизывающие его насквозь трансмембранные белки. Другие белки прикрепляются к поверхности бислоя. Как правило, в веществах мембраны преобладают белки, хотя бывают мембраны, где липидов больше, чем белков. Липидным компонентом биомембран обычно служат фосфолипиды, реже сульфо- и гликолипиды. Ключевую роль в фотосинтезе у пурпурных бактерий играет бактериохлорофилл, одно из производных хлорофилла (см. Приложение 2). Во второй половине 1940-х гг. А.А. Красновский (рис. 2.1) открыл реакции фотоиндуцированного окисления и восстановления хлорофилла, что положило начало пониманию механизма действия фотосинтетического аппарата. Известно, что поглощение кванта света Рисунок 2.1. А.А. Красновский видимого диапазона молекулой хромофора вызывает переход электрона с основной орбитали (S0) на одну из синглетных (S1*, S2* …) или триплетную (T) возбужденную орбиталь (рис. 2.2). При этом энергия кванта света тратится на перевод электрона на более удаленную от ядра орбиталь. Так как электрон на возбужденной орбитали связан с ядром относительно слабо, то его довольно легко оторвать от молекулы хромофора, находящейся в возбужденном состоянии, т.е. эта молекула становится хорошим восстановителем. В то же время на основной орбитали после поглощения кванта света образуется «вакансия» для одного электрона («дырка»). Эта «дырка» обладает большим сродством к электрону, т.е. является хорошим окислителем. Время жизни молекулы хромофора в возбужденном состоянии (особенно в синглетном) крайне мало. Неизбежно происходит возврат электрона с возбужденной на основную орбиталь. При прямом возврате электрона с возбужденной на основную орбиталь энергия поглощенного кванта света теряется либо в виде тепла, либо в виде высвеченного кванта (флуоресценция или фосфоресценция). Однако фотосинтезирующие организмы научились использовать эффект перехода хромофора в возбужденное состояние

Bioenergetica.indb 32

26.01.2011 18:02:05

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

33

Рисунок 2.2. Простейшая схема электронных переходов при поглощении хромофором кванта света

для запасания энергии hv в удобной для клетки форме. Так, если за время жизни возбужденного состояния удастся перенести электрон с возбужденной орбитали на какой-то акцептор Х, а вакансию на основной орбитали хромофора заполнить с какого-то донора Y, то часть энергии кванта света может быть запасена в виде разности окислительно-восстановительных потенциалов веществ Х и Y при условии, если редокс потенциал пары Yокис./ Yвосст. положительней потенциала пары Xокис./Xвосст.. Более того, если данную окислительно-восстановительную реакцию организовать таким образом, чтобы электрон с Y на Х переносился поперек мембраны, то еще какая-то часть энергии светового кванта может быть запасена также и в форме . При альтернативном варианте фотосинтеза электрон с возбужденной орбитали можно вернуть именно на основную орбиталь, но не напрямую, а заставив его сначала пересечь мембрану, что приведет к генерации . Именно так обстоит дело у пурпурных бактерий.

2.1.1. Основные компоненты редокс-цепи и принцип их действия Свет поглощается магний-порфирином бактериохлорофилла, связанным с особым белком (этот комплекс называется светособирающей антенной), или дополнительными пигментами — каротиноидами, локализованными в той же мембране и передающими энергию возбуждения на бактериохлорофилл антенн. Следует отметить, что у ацидофильных бактерий ион Mg2+ в бактериохлорофилле заменен на Zn2+, чтобы избежать вытеснения Mg2+

Bioenergetica.indb 33

26.01.2011 18:02:05

34

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 2.3. (А, Б) Структура комплекса реакционного центра (RC) и антенны I (LH-I) пурпурных бактерий. Бактериохлорофиллы показаны в виде ромбов (бактериохлорофиллы антенны I показаны зеленым цветом; (БХл)2 (обозначен как PA) и мономеры бактериохлорофилла (BA и BB) реакционного центра — соответственно красным и синим цветом). Цветными стержнями показаны α-спиральные участки L- (желтым), M- (красным) и H-субъединиц (серым цветом) реакционного центра, а также белков антенны I (синим и розовым цветом). (В) Структурная организация комплекса реакционного центра, антенны I и антенны II у пурпурных бактерий. Показан полипептидный остов белков и молекулы бактериохлорофилла [Hu et al. 1998, PNAS, 95: 5935–5941]

ионами Н+ из комплекса с порфирином, как это происходит в кислой среде. Возбуждение мигрирует по молекулам антенного бактериохлорофилла, пока не достигнет «специальной пары» — димера бактериохлорофилла, связанного с другими белками в комплекс фотосинтетических реакционных центров (рис. 2.3). Этот комплекс содержит, помимо димера, две молекулы мономерного бактериохлорофилла, две молекулы бактериофеофитина (аналога бактериохлорофилла, где ион Mg2+ заменен на два Н+) и две молекулы убихинона (CoQ)*. Количество комплексов реакционных центров обычно во много раз меньше, чем антенного бактериохлорофилла. Возбужденный димер бактериохлорофилла отдает электрон убихинону. Этот процесс ориентирован поперек мембраны и протекает в направлении ее цитоплазматической стороны. Он включает ряд промежуточных этапов, на которых происходит последовательное восстановление и окисление мономера бактериохлорофилла, бактериофеофитина и связанных мена(уби)хинонов. На схеме циклической редокс-цепи (рис. 2.4) эти этапы соответствуют реакциям 1–4. Для восстановления СoQ должен присоединять два электрона и два протона (рис. 2.5). При этом один из электронов поставляется реакцион* Иногда одна молекула убихинона заменена на менахинон (MQ); см. Приложение 2.

Bioenergetica.indb 34

26.01.2011 18:02:06

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

35

Рисунок 2.4. Циклическая редокс-цепь пурпурной фотосинтезирующей бактерии Rhodospirillum rubrum: (БХл)2 и БХл — димер и мономер бактериохлорофиллов реакционного центра; БФео — бактериофеофитин; QA и QB — две молекулы убихинона, связанного с белками реакционного центра; bH и bL — высоко- и низкопотенциальные гемы цитохрома b; FeSIII — негемовый железопротеин; c1 и c2 — соответствующие цитохромы

ным центром, а другой — гемом bH цитохрома b*. Приняв электроны, CoQ присоединяет и протоны, которые черпаются из ближайшей водной фазы (на рис. 2.4 — над мембраной, т.е. в цитозоле; образование СoQН2 описывается реакцией 5 на рис. 2.4 и более подробно — на рис. 2.5). Образовавшись, СoQН2 перемещается в направлении противоположной (периплазматической) стороны мембраны (рис. 2.4, реакция 6). Вблизи этой поверхности мембраны СoQН2 окисляется в семихинонную форму (реакция 7) посредством негемового железосульфопротеина, обозначаемого FeSIII. При окислении СoQН2 теряет два протона, которые затем переносятся в периплазму или внутрь хроматофора (рис. 2.4). Электрон, перешедший с СoQН2 на FeSIII, используется в конечном итоге для восстановления димера бактериохлорофилла, окисленного на * Цитохромами называются гем-содержащие белки, катализирующие окислительновосстановительные реакции (см. Приложение 2). Цитохромы, имеющие идентичные гемы, но разные белковые части, обычно обозначают одной и той же буквой, но разными цифровыми индексами.

Bioenergetica.indb 35

26.01.2011 18:02:07

36

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 2.5. Этапы превращения хинона в гидрохинон

первом этапе цикла. В переносе электрона от FeSIII к (БХл) (реакции 8–10) участвуют цитохромы типа с (у Rh. rubrum это цитохромы с1 и с2). СoQ•−, получающийся из СoQН2 при потере одного электрона и двух протонов, восстанавливает гем bL (реакция 11). Гем bL передает электрон предварительно окисленному гему bH (реакция 12). Цикл завершается диффузией CoQ к верхней поверхности мембраны (реакция 13). Общим итогом процесса оказывается генерация вследствие переноса через мембрану двух ионов Н+ на каждый поглощенный фотон.

Рисунок 2.6. Редокс-потенциалы переносчиков электронов, участвующих в фотосинтетических системах пурпурных бактерий (А) и зеленых серных бактерий (Б). Объяснения см. соответственно в разделах 2.1.1 и 2.2

Bioenergetica.indb 36

26.01.2011 18:02:08

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

37

Энергетика цикла «оплачивается» фотонами, поглощенными бактериохлорофиллом. Последний, перейдя в возбужденное состояние под действием света, резко изменяет свой редокс-потенциал, который становится около –950 мВ (сравни с +440 мВ в невозбужденном состоянии). Все дальнейшие реакции переноса электронов протекают с выделением энергии, будучи направленными в сторону более положительных редокс-потенциалов (рис. 2.6 А). Белки, катализирующие циклический перенос электронов, удается разделить на два комплекса: комплекс реакционных центров и bc1-комплекс.

2.1.2. Комплекс реакционных центров Белковый состав. Комплекс реакционных центров из Rhodospirillum rubrum состоит из трех белковых субъединиц: так называемой тяжелой (H), средней (М) и легкой (L), присутствующих в соотношении 1:1:1. Комплекс реакционных центров Blastochloris (прежнее название Rhodopseudomonas) viridis содержит кроме Н-, М- и L-субъединиц еще и прочно связанный цитохром, имеющий четыре гема С-типа. Молекулярные массы этого цитохрома, Н-, М- и L-субъединиц, полученные посредством электрофореза с додецилсульфатом натрия, оказались, соответственно, 38, 35, 28 и 24 кДа, что и позволило назвать нецитохромные субъединицы «high» (H), «medium» (M) и «low» (L). Однако сделанное впоследствии определение первичной структуры дало величины 40,5; 28,3; 35,9 и 30,6 кДа (336, 258, 323 и 273 аминокислотных остатка), что явно не соответствует принятой ранее номенклатуре. Тем не менее старые названия субъединиц по-прежнему используются в литературе. Построение профиля гидрофобности аминокислотной последовательности М-субъединицы показало, что белок содержит пять очень гидрофобных сегментов, составленных примерно из 20 аминокислот. Каждый из этих сегментов образует трансмембранную α-спираль. Это заключение было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа комплекса реакционных центров из Blastochloris viridis (Х. Михель, Й. Дайзенхофер и Р. Хубер. Нобелевская премия по химии за 1988 г., рис. 2.7). Авторам удалось получить кристаллы диаметром 0,5–1 мм путем высаливания комплек-

Рисунок 2.7. Х. Михель, Й. Дайзенхофер и Р. Хубер

Bioenergetica.indb 37

26.01.2011 18:02:09

38

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

са реакционных центров сульфатом аммония из белкового раствора, содержащего детергент. Рентгеноструктурное исследование кристаллов позволило впервые увидеть трехмерную структуру мембранного преобразователя энергии с разрешением 0,3 нм. Выяснилось, что комплекс длиной 13 нм состоит из двух периферических доменов (один из которых — четырехгемовый цитохром с, а другой — Н-субъединица) и центральной части, образованной главным образом М- и L-субъединицами. Оказалось, что М- и L-субъединицы несут бактериохлорофиллы и бактериофеофитины b-типа, хиноны и атом негемового железа, связанного с имидазолами четырех гистидинов белка. Сопоставление рентгеноструктурных данных с результатами, полученными ранее другими методами, позволяет утверждать, что цитохром с локализован на периплазматической стороне мембраны, Н-субъединица — в основном на цитоплазматической ее стороне, а М- и L-субъединицы интегрированы в гидрофобный слой мембраны. На рентгеноструктурном изображении комплекса реакционных центров удается выявить одиннадцать трансмембранных α-спиральных колонн, направленных перпендикулярно к плоскости мембраны и параллельно длинной оси комплекса. Колонны локализованы в средней (мембранной) его части. Н-субъединица имеет только одну α-спиральную колонну, в то время как М- и L-субъединицы, подобные друг другу по аминокислотным последовательностям и пространственным структурам, содержат по пять таких колонн, расположенных симметрично относительно продольной оси комплекса (рис. 2.8). Единственная гидрофобная α-спираль Н-субъединицы служит как бы якорем, прикрепляющим этот гидрофильный полипептид к мембране. Что касается другой периферической субъединицы — четырехгемового цитохрома с, то она удерживается на мембране взаимодействием с остальными субъединицами, а также двумя жирными ацилами, ковалентно связанными с глицерином, который образует тиоэфирную связь с SH-группой N-концевого остатка цистеина этого цитохрома (рис. 2.9). При рассмотрении упаковки полипептидных цепей субъединиц Н, М и L в мембране обращает на себя внимание полное отсутствие заряженных аминокислот (рис. 2.10 А) и почти полное отсутствие связанной воды (рис. 2.10 Б) в трансмембранных α-спиральных колоннах. Такие аминокислоты и вода сосредоточены на поверхностях мембраны, причем на внешней поверхности больше отрицательно заряженных аминокислот, а на внутренней — положительно заряженных. Это наводит на мысль, что упаковка полипептидов в мембране достигается за счет электрофореза определенных белковых доменов под действием ΔΨ (в условиях энергизации мембраны внутренний объем бактерии заряжен отрицательно). Кристаллизация мембранных белков представляет собой чрезвычайно сложную задачу. Успех опытов по кристаллизации комплекса реакционных центров из Bl. viridis стал, вероятно, следствием того, что центральная гидрофобная часть этого комплекса (М- и L-субъединицы) экранирована гидрофильными полипептидами — четырехгемовым цитохромом с и Н-субъединицей.

Bioenergetica.indb 38

26.01.2011 18:02:09

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

39

Рисунок 2.8. Структура белковых субъединиц реакционного центра Blastochloris viridis: I, II, III и IV — тетрагемовый цитохром с, L-, M- и H-субъединицы по данным рентгеноструктурного анализа; V — общий вид комплекса реакционного центра; VI — расположение α-спиральных колонн (вид сверху, А, B, C, D, Е — пять трансмембранных α-спиральных колонн субъединиц M и L). Заштрихована область, где расположены хромофоры. Все колонны несколько наклонены по отношению к плоскости мембраны — на 38° (колонны D) и < 25° (прочие колонны). При этом колонны сближаются у цитоплазматической стороны мембраны и расходятся вблизи периплазматической ее стороны. На рисунке VI представлен срез, прошедший предположительно через середину гидрофобного слоя мембраны [Deisenhofer et al. 1984, J. Mol. Biol., 180: 385–398]

Расположение редокс-групп. Наиболее важным результатом рентгеноструктурного анализа реакционных центров Blastochloris viridis явилось выяснение расположения окислительно-восстановительных простетических групп. На рис. 2.11 результаты этого анализа представлены таким образом, чтобы были видны только простетичские группы. Четыре гема цитохрома с

Bioenergetica.indb 39

26.01.2011 18:02:09

40

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 2.9. Гидрофобный «якорь» тетрагемового цитохрома с Blastochloris viridis: остатки жирных кислот, связанные через глицерин с SH-груп пой N-концевого цистеина белка

Рисунок 2.10. Структура реакционных центров Blastochloris viridis. А — остатки заряженных аминокислот в этом комплексе. Положительно заряженные аминокислоты показаны оранжевым цветом, а отрицательно заряженные — голубым. Б — Молекулы связанной воды в комплексе реакционных центров Bl. viridis. Видно, что в центральной части комплекса, погруженной в мембрану, нет ни заряженных аминокислотных остатков, ни воды, что должно резко уменьшать диэлектрическую постоянную и рассеивание энергии при переносе электронов через мембрану в этой области комплекса [Deisenhofer et al. 1984, J. Mol. Biol., 180: 385–398]

располагаются друг за другом над димером бактериохлорофилла. Расстояние между атомами железа двух соседних гемов колеблется от 1,4 до 1,6 нм. Атом железа гема, ближайшего к (БХл)2, находится на расстоянии 2,1 нм от ионов магния, входящих в состав (БХл)2. Димер ориентирован параллельно длинной оси комплекса реакционного центра. Он как бы зажат между α-спиральными колоннами D, принадлежащими субъединицам М и L (соответственно DM и DL). Каждая их этих колонн несет остаток гистидина, имидазольная группа которого служит аксиальным лигандом для Mg2+ в (БХл)2. Два мономерных бактериохлорофилла закреплены несколько ниже димера под углом ~ 70° к последнему. Расстояние между ионами Mg2+ в (БХл)2 и БХл равно 1,3 нм. Лигандами Mg2+ в БХл служат имидазолы остатков гистидина, входящих в состав связок между колоннами CM и DМ или СL и DL. Мономеры бактериохлорофилла находятся в контакте с бактериофеофитинами (БФео). Расстояния и углы равны соответственно 1,1 нм и 64°. Фитольные остатки участвуют в образовании такого контакта. На 1,8 нм ниже той из молекул БФео, которая связана с L-субъединицей, видна молекула менахинона, лежащая на остатке Trp-252 M-субъединицы. Симметричное место под другой молекулой БФео, по всей вероятности,

Bioenergetica.indb 40 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:02:11

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

41

предназначено для хиноновой головки СoQ, который менее прочно связан с комплексом реакционных центров (отмывается в процессе выделения и кристаллизации комплекса). Этот CoQ мог бы расположиться на остатке Phe-216 L-субъединицы. На полпути между менахиноном и местом связывания СoQ находится атом негемового железа. Он связан с белком иначе, чем в FeS-протеинах. Четыре лиганда железа были идентифицированы как имидазольные группы гистидиновых остатков колонн DM, EM, DL и EL. Связки между колоннами AM и BM, CM и DM, AL и BL, CL и DL, а также четыре из пяти первых (от N-конца) аминокислотных остатков в субъединице Н участвуют в образовании контакта с тетрагемовым цитохромом с. Tyr-L162 располагается между (БХл)2 и ближай- Рисунок 2.11. Расположение простетишим к нему гемом. Предполагают, ческих групп в комплексе реакционных что он может участвовать в переносе центров из Bl. viridis по данным рентгеэлектронов с этого гема на окислен- ноструктурного анализа. Видны четыре гема (сверху, над мембраной), димер ный (БХл)2. В транспорте протонов из бактериохлорофилла, два мономера бак•− цитоплазмы к СoQ может участвовать териохлорофилла, два бактериофеофетина, Glu-H177, который имеет доступ в по- менахинон (MQ) и негемовое железо (Fe) лость, где предположительно находится [Deisenhofer et al. 1984, J. Mol. Biol., 180: 385–398] СoQ. Удаление Н-субъединицы, несущей этот остаток, резко нарушает функцию СoQ в реакционном центре. Согласно данным, полученным оптическими методами, (БХл)2 закреплен перпендикулярно к плоскости цитоплазматической мембраны Bl. viridis. Вот почему представляется весьма вероятным, что длинная ось комплекса реакционного центра расположена поперек мембраны. Расстояние между атомами Mg в (БХл)2 и менахиноном равно приблизительно 3,0 нм, так что электрон, перенесенный от (БХл)2 к менахинону, должен пересечь большую часть гидрофобного барьера мембраны. В целом система, составленная из бактериохлорофилла, бактериофеофитина и хинонов, выглядит как два параллельных пути переноса электронов. Можно было бы предположить, что один электрон, восстанавливающий СoQ до СoQ•−, транспортируется правой ветвью, т.е. через MQ, а другой электрон, необходимый для восстановления СoQ•−, поставляется левой ветвью, т.е. без участия MQ. Однако опыты показали, что один из путей (левый) вообще не участвует в переносе электронов на СoQ. Рассматривая возможную функцию этого пути, следует иметь в виду, что неподалеку от мономера БХл левой ветви располагается молекула каротиноида, на который «стекает» возбуждение с (БХл)2, если тот не успел окислиться правой ветвью

Bioenergetica.indb 41

26.01.2011 18:02:12

42

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

и перешел из синглетного в более долго живущее триплетное состояние. Что касается возбужденного состояния каротиноида, то оно рассеивается в виде тепла или путем эмиссии светового кванта большей длины волны (флуоресценции). Если все же кислород успевает атаковать возбужденный каротиноид, он окисляется и уходит из комплекса реакционных центров, чтобы замениться другой (интактной) молекулой каротиноида. Таким образом, Рисунок 2.12. Расположение хромофорных комкаротиноид как бы жертвует понентов комплекса реакционных центров Bl. собой, спасая (БХл)2, БХл или viridis (схема В.А. Шувалова и А.А. Асадова, поБФео, окисление которых постулированная в 1979 г. на основании оптических наблюдений) влекло бы необратимую инактивацию всего комплекса. В конце этого раздела следует отметить, что данные рентгеноструктурного анализа фактически подтвердили схему расположения хромофоров (рис. 2.12), постулированную В.А. Шуваловым и А.А. Асадовым (1979) на основании оптических наблюдений. Последовательность реакций переноса электронов. После выяснения пространственного расположения редокс-групп в комплексе реакционных центров можно считать доказанной следующую цепь реакций переноса электронов, включенных между бактериохлорофиллом и СoQ: (БХл)2

(БХл)2* → БХл → БФео → QA → QB,

(2.1)

где применительно к Bl. viridis QA — это MQ, а QB — СoQ. Именно такая последовательность событий была постулирована на основании данных по спектральным изменениям бактериохлорофиллов и бактериофеофитина в ответ на пикосекундную вспышку лазера. Было показано, что вызванное вспышкой окисление (БХл)2 сопровождается восстановлением БХл и БФео. Все эти процессы завершаются в течение 20 пс. Следующий этап — восстановление менахинона посредством БФео — происходит с t1/2 около 230 пс, а t1/2 восстановления до (БХл)2 (в случае Blastochloris viridis) оказывается величиной порядка 270 нс (рис. 2.13). Принципиальным моментом является то обстоятельство, что редокспотенциал димера бактериохлорофилла в невозбужденном состоянии (+440 мВ) резко сдвинут в положительную область по сравнению с потенциалом мономера (около –900 мВ). Это различие нивелируется при возбуждении димера. Его потенциал оказывается порядка –950 мВ, т.е. даже несколько отрицательнее, чем у невозбужденного мономера, и тем более чем у невозбужденного бактериофеофитина (около –750 мВ).

Bioenergetica.indb 42

26.01.2011 18:02:13

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

43

Изучение реакционных центров Bl. viridis, проведенное одним из авторов этой книги (В.П.С.) и сотрудниками, показало, что донором электронов для восстановления служит гем четырехгемового цитохрома с, характеризующийся α-максимумом поглощения при 559 нм и редокс-потенциалом +380 мВ. Можно предположить, что этот гем располагается непосредственно над (БХл)2 в комплексе реакционных центров. Гем559 в свою очередь получает электрон от другого гема (поглощение при 556 нм, редокс-потенциал +310 мВ), а тот — от водорастворимого Рисунок 2.13. Быстрая кинетика изменецитохрома с2. Роль еще двух гемов ци- ний поглощения света (ΔА) модифицитохрома с (редокс-потенциалы +30 мВ рованными комплексами реакционных центров Rhodobacter sphaeroides без одной и –50 мВ) остается неясной. из двух молекул мономера бактериохлороЧрезвычайно высокая скорость филла (БХлМ). Снижение А930 — переход Снижение первичных процессов фотосинтетиче- БХл2 в возбужденное состояние. + ского переноса электронов заслуживает А875 — образование (БХл)2 . Снижение А — восстановление (БХл) . Снижение специального обсуждения. Названные А805 — восстановление БФео.L Возбужде755 процессы представляют собой самые ние достигалось вспышкой лазера (t1/2 = быстрые химические реакции среди всех 0,2 пс). Начальное возрастание поглощеобусловлено переходом известных в биологии. По-видимому, ния при 775 нм (БХл)2 в (БХл)2* [Матвеец и др. 1986, ДАН благодаря столь высоким скоростям СССР, 292: 724–728]. удается предотвратить энергетически более выгодный обратный транспорт электронов по фотосинтетической цепи (так как скорость прямого переноса электрона примерно в 100 раз превышает скорость обратного процесса), а также и окисление возбужденного бактериохлорофилла кислородом. У Bl. viridis анион-радикал MQ•− — первый промежуточный продукт, время жизни которого сравнимо с таковым для интермедиатов большинства ферментативных процессов. Окисление MQ•− связанным CoQ протекает примерно за 0,1 мс. Поэтому MQ часто называют первичным акцептором электронов. В некоторых бактериях эту роль играет не MQ, а СoQ. В таких случаях каждый комплекс реакционных центров содержит две молекулы СoQ: первичный акцептор СoQA и вторичный акцептор СoQB. Перенос электронов между двумя хинонами облегчается присутствием негемового железа. При этом оно не окисляется и не восстанавливается, все время находясь в форме Fe2+. Показано, что Mn2+ вполне успешно заменяет Fe2+. Одна из точек зрения на механизм переноса электронов комплексом реакционных центров состояла в том, что Сo служит конечным продуктом процесса, катализируемого комплексом: + QB → QA +

Bioenergetica.indb 43

.

(2.2)

26.01.2011 18:02:14

44

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Другая, более вероятная возможность сводится к тому, что не только QB, но и восстанавливается посредством (см. уравнение 2.3). В пользу этого варианта свидетельствует тот факт, что в отличие от QB и QBН2 очень прочно связан с L-субъединицей комплекса реакционных центров. Двухэлектронное восстановление СoQB сопровождается присоединением двух протонов: +

+ 2H+ → QA + QBH2.

(2.3)

Механизм генерации . Поскольку цитохром с2 и хинон локализованы на противоположных сторонах мембраны, перенос восстановительных эквивалентов происходит через мембрану в направлении ее цитоплазматической поверхности. Если от цитохрома с2 к хинону переносится электрон, то цитоплазма должна заряжаться отрицательно относительно периплазмы или внутреннего объема хроматофора. Это предположение подтверждено целым рядом опытов, где измеряли генерацию ΔΨ реакционными центрами. С этой целью в нашей группе Л.А. Драчевым, А.Д. Кауленом и А.Ю. Семеновым был разработан метод, позволяющий измерять непосредственно вольтметром генерацию ΔΨ ферментами, встроенными в протеолипосомы. Термин «протеолипосома» был предложен одним из авторов (В.П.С.) в 1973 г. для обозначения замкнутых мембранных пузырьков, образованных самосборкой из фосфолипидов и белков. В обсуждаемых опытах протеолипосомы сорбировали на одной из поверхностей коллодиевой пленки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане. Как показали эксперименты, сорбция протеолипосом происходит таким образом, что содержащийся внутри них раствор не перемешивается с наружным раствором. По-видимому, при сорбции на той стороне протеолипосомы, которая контактирует с пленкой, мембрана растворяется пропитывающим пленку деканом, а на другой ее стороне — сохраняется, отделяя омывающий пленку раствор от раствора внутри протеолипосом. Генерация ΔΨ на мембране сорбированных протеолипосом может быть зарегистрирована двумя электродами, которые помещены по обе стороны коллоидной пленки и соединены с вольтметром. Временное разрешение такой системы составляет 50 нс, что значительно короче времени одно-генератора. Вот почему этим методом кратного срабатывания любого удается следить не только за валовым процессом генерации ΔΨ, но и за его отдельными этапами. Иными словами, можно регистрировать перемещение заряда (например, электрона или протона) внутри молекулы белкагенератора. На рис. 2.14 дана общая схема изучения -генерирующих белков клетки, включающая их очистку и самосборку и завершающаяся прямым измерением преобразования ими световой или химический энергии в электрическую форму. Наш метод позволил измерить генерацию ΔΨ реакционными центрами в нано- или микросекундной шкалах. Оказалось, что основной вклад в генерацию ΔΨ вносит процесс, продолжительность которого больше, чем 50 нс (разрешение измерительной аппаратуры). В цепи событий, происхо-

Bioenergetica.indb 44

26.01.2011 18:02:14

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

45

Рисунок 2.14. Схема очистки и самосборки генераторов и прямого измерения их активности

дящих в реакционных центрах, столь быстрые реакции локализованы между (БХл)2 и QA. Сопоставив это наблюдение с данными по трансмембранному расположению редокс-групп реакционных центров, можно заключить, что перенос электронов от (БХл)2 к QA имеет электрогенный характер, т.е. движение электрона поперек мембраны электрически не компенсировано перемещением какого-либо другого заряда. Г.-В. Триссл и сотрудники измерили электрический ответ клеток Bl. viridis с еще большим временным разрешением, используя разработанный ими же метод светового градиента. Измерение ΔΨ этим косвенным методом дает величины хотя и заниженные (примерно на два порядка), но с разрешением 40 пс. Были выявлены две электрогенные фазы (τ1 ≤ 40 пс и τ2 = 125 пс) примерно одинаковой амплитуды. Первая фаза соответствовала восстановлению БФео посредством (БХл)2, а вторая — окислению БФео менахиноном. Помимо быстрых электрогенных стадий мы выявили три более медленные стадии. Одна из них возникла при добавлении CoQ10 в декановый раствор фосфолипидов, используемый для пропитки коллодиевой пленки. Амплитуда этой стадии составила около 5% от общей ΔΨ, генерируемой на вспышку лазера, а полувремя — около 400 мкс, что несколько медленней, чем скорость восстановления QB. Эффект оказался чувствительным к о-фенантролину, тормозящему восстановление QB. На основании этих данных было сделано заключение, что обнаруженная электрогенная стадия связана с восстановлением QB. По-видимому, декан экстрагирует QB из мембраны хроматофоров или протеолипосом, прикрепленных к пропитанной этим углеводородом коллодиевой пленке, а добавление CoQ10 предотвращает этот эффект. Возможны два различных механизма медленной электрогенной стадии, требующей СoQ10. (1) Перенос электронов с QА на QB имеет электрогенный характер. (2) Существует Н+-проводящий путь от поверхности мембраны к QB; ионы Н+ движутся по этому пути к восстановленному аниону QB и протонируют его с образованием QH2.

Bioenergetica.indb 45

26.01.2011 18:02:14

46

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

усл. ед.

Чтобы сделать выбор между этими вариантами, исследовали эффект двух последовательных лазерных вспышек длительностью 30 нс. Если верен первый вариант, обе вспышки должны вызывать появление медленной электрогенной стадии. В альтернативном случае такая стадия будет возникать только при второй вспышке, так как Сo , образующийся в результате однократного срабатывания реакционного центра под действием первой вспышки, не протонируется при физиологических значениях рН. Протонирование происходит после присоединения второго электрона, для чего необходима вторая вспышка. Как показали опыты (рис. 2.15), только вторая вспышка дает медленную электрогенную стадию. Это означает справедливость второго варианта, предполагающего перенос Н+ из воды к месту локализации QB внутри комплекса реакционных центров. Допустив постоянство диэлектрических свойств гидрофобного барьера мембраны по всей ее толщине, можно определить, какую часть этого барьера проходит Н+. Так как медленная стадия составляет 5% от всего электрического ответа, обусловленного трансмембранным переносом зарядов, можно было бы принять, что протон переносится на 1/20 часть толщины мембраны. Дальнейшее исследование, однако, показало, что реальная ситуация не столь проста (об этом речь пойдет несколько позже). Для оценки вклада четырехгемового цитохрома с были использованы условия, при которых два гема цитохрома с (с556 и с559) восстановлены. СoQ не добавляли, чтобы избежать появления электрогенных стадий, сопровождающих протонирование CoQ2–. Оказалось, что вспышка лазера, вызывающая фотоокисление (БХл)2, приводит к временному окислению этих гемов

Рисунок 2.15. Генерация ΔΨ комплексами реакционных центров Bl. viridis в ответ на две последовательные 15-наносекундные вспышки лазера, произведенные с интервалом 0,5 с. Момент вспышки показан вертикальной стрелкой. Видно, что только вторая вспышка вызывает появление «медленной» (микросекундной) электрогенной стадии (А). На рис. Б эта стадия показана при большем разрешении, где пунктирная и сплошная линии означают соответственно первую и вторую вспышку. СoQ10 был добавлен в раствор для пропитки пленки. Редокс-потенциал среды +240 мВ [Dracheva et al. 1988, Eur. J. Biochem, 113: 213–218]

Bioenergetica.indb 46

26.01.2011 18:02:15

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

47

Рисунок 2.16. Генерация ΔΨ комплексами реакционных центров Bl. viridis: роль высокопотенциальных гемов цитохрома с. Измерение проводилось при редокс-потенциале среды +220 мВ (два высокопотенциальных гема тетрагемового цитохрома с восстановлены, а два низкопотенциальных — окислены), +380 мВ (50% степени восстановленности одного из высокопотенциальных гемов) и при +440 мВ (все четыре гема окислены). Справа (Б) дана часть рис. А более крупным планом [Dracheva et al. 1988, Eur. J. Biochem, 113: 213–218]

(t1/2 около 300 нс для гема с559 и 3 мкс для гема с556). Окисление гемов сопровождается генерацией ΔΨ, которая также носит двухфазный характер. Кинетика каждой из фаз соответствует кинетике окисления гемов. Вклады быстрой и медленной цитохромных электрогенных фаз в общую ΔΨ оказались соответственно 15 и 5% (рис. 2.16). На рис. 2.17 приведена схема, иллюстрирующая структурно-функциональные характеристики реакционных центров Bl. viridis. Расстояния между редокс-группами соРисунок 2.17. Механизм электрогенных стадий в комплексе реакционных центров Bl. viridis

Bioenergetica.indb 47

26.01.2011 18:02:15

48

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

ответствуют данным рентгеноструктурного анализа. Интересно, что перенос Н+ от цитоплазматической поверхности мембраны к CoQ дает всего лишь 5% от общего ΔΨ: то ли путь протона (из воды к СoQ) короче, чем путь электрона (от цитохрома с к СoQ), то ли Н+ переносится через менее гидрофобную часть комплекса. Вероятнее всего, играют роль оба фактора. Подобная ситуация, по-видимому, имеет место на тех этапах, где переносится электрон. Расстояния между QA и (БХл)2, (БХл)2 и с559, с559 и с556 по оси, вертикальной к плоскости мембраны, равны соответственно 2,9, 2,1 и 1,2 нм. Если бы вклад каждой из этих стадий в общий электрогенез определялся только расстоянием между редокс-группами, то вклады относились бы как 1:0,7:0,4. В действительности они относятся как 1:0,2:0,07. Это означает, что вклад тем больше, чем глубже данный этап переноса электрона погружен в мембрану. Такая закономерность становится понятной, если учесть, что величина диэлектрической постоянной в мембране должна возрастать по мере приближения к водной фазе. Когда П. Митчел в 1960-е гг. сформулировал хемиосмотическую гипотезу, он предположил, что электрон, двигаясь от цитохрома с к СoQ через бактериохлорофилл, пересекает гидрофобный барьер мембраны (электронтранспортная «полупетля»). Это предположение, в то время чисто умозрительное, сегодня прямо доказано. Единственный новый момент, выявленный в результате экспериментальной проверки гипотезы, состоит в том, что существует небольшая, но измеримая электрогенная стадия, обусловленная не переносом электрона, а встречным движением протона, необходимого для образования СoQH2 из СoQ.

2.1.3. СoQ-цитохром с-редуктаза СoQ-цитохром с-редуктаза (комплекс bc1) была открыта и детально изучена при исследовании дыхательной цепи митохондрий. Информация относительно молекулярных свойств компонентов этого комплекса у пурпурных фотосинтезирующих бактерий более ограниченна, однако все, что известно, в значительной степени напоминает митохондриальную систему. Поэтому в данном разделе мы лишь вкратце рассмотрим структуру бактериального комплекса bc1, так как более подробно этот -генератор будет разбираться ниже. Комплекс bc1 включает один цитохром b, содержащий два гема: низкопотенциальный bL (синоним — b566, по α-максимуму спектра поглощения) и высокопотенциальный bH (или b560); один негемовый железо-серный центр (FeSIII); один цитохром с и несколько бесцветных белковых субъединиц разной молекулярной массы, не имеющих простетических групп. СoQH2 и цитохром с2 служат соответственно восстановителем и окислителем комплекса bc1. Цитохром с2 — водорастворимый цитохром, подобный цитохрому с. В реконструированных системах митохондриальный цитохром с успешно заменяет цитохром с2. Редокс-потенциалы компонентов комплекса представлены на рис. 2.6.

Bioenergetica.indb 48

26.01.2011 18:02:16

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

49

СoQ-цитохром с-редуктаза представляет собой самый медленный компонент фотосинтетической редокс-цепи. Максимальная скорость его работы in situ обычно не превышает 10 мс. По аналогии с митохондриями можно предположить, что генерация этой системы отчасти обусловлена переносом электронов поперек мембраны от гема bL к bH, как показано на рис. 2.4. Этот процесс направлен в сторону цитоплазматической поверхности бактериальной мембраны. Установлено, что электрон, перемещаясь от гема bL к гему bH, пересекает 35–40% толщины мембраны. Можно полагать, что остальную часть пути проходят протоны, двигаясь в направлении, противоположном электрону (см. рис. 2.4). Остается неясным: СoQ, СoQ•− либо они оба служат акцепторами электронов для bH. Если такую роль выполняет только какой-то один из этих двух компонентов, то образование полностью восстановленной формы убигидрохинона (СoQH2) должно включать реакцию дисмутации (2СoQ•− + 2H+ ↔ СoQ + СoQH2). Другим источником электронов для восстановления СoQ до СoQH2 служит комплекс реакционных центров. Для устойчивой работы системы необходимо, чтобы из каждых двух молекул СoQ, восстановленных до СoQH2, одна образовывалась за счет переноса электронов с реакционных центров, а другая — с гема bH. В любом случае ионы водорода, необходимые наряду с электронами для превращения СoQ в СoQH2, черпаются из цитоплазмы. Образовавшись, СoQH2 пересекает большую часть гидрофобного барьера мембраны, чтобы окислиться железосульфопротеином. В результате образуется СoQ•−, восстановленный FeSIII и 2Н+. Затем ионы Н+ переносятся через оставшуюся часть гидрофобного барьера, чтобы оказаться в периплазме или внутреннем пространстве хроматофора. В случае Rh. rubrum и Rhodobacter sphaeroides перенос электрона с FeSIII на (БХл)2 через цитохромы с1 и с2 завершает цикл, как показано на рис. 2.4. У Bl. viridis четырехгемовый цитохром с включен в перенос электронов от цитохрома с2 к . Последовательность процессов, катализируемых СoQ-цитохром с-редуктазой (рис. 2.4), по существу представляет собой конкретный вариант Q-цикла, постулированного П. Митчелом в 1975 г. Ключевое положение этой схемы: пути каждого из двух электронов, приходящих на СoQ или уходящих с СoQH2, оказываются различными. Сегодня это твердо доказано, по крайней мере для окисления СoQH2. Установлено, что роль СoQH2-оксидазы играет FeSIII, а СoQ•−, образующийся из СoQH2, окисляется затем гемом bL цитохрома b. Существует чисто химическая предпосылка того, что СoQH2 и СoQ•− окисляются разными ферментами: редокс-потенциалы гидрохинона и семихинона существенно различны. По мнению ряда авторов, связывание CoQH2 и FeSIII происходит таким образом, что гидрохиноловая «головка» оказывается вблизи некоторой положительно заряженной группировки (предположительно Fe3+). Это вызывает сдвиг рК гидрохинола в кислую сторону, что облегчает его депротонирование. Потеряв протон, CoQH2 превращается в СoQH−, который и окисляется посредством FeSIII. Депротонирование необходимо для окисления CoQH2,

Bioenergetica.indb 49

26.01.2011 18:02:16

50

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

так как редокс-потенциал пары CoQH2/CoQH2•+ выше +850 мВ, а пары СoQH−/CoQH• около +190 мВ, что отрицательнее, чем у FeSIII. В митохондриях перенос электронов с убихинола на FeSIII и далее через цитохром с1 на цитохром с катализируется III комплексом дыхательной цепи, известным также как комплекс bc1, или убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза. Этот комплекс найден у целого ряда бактерий и во многих отношениях сходен с пластохинол-пластоцианин-оксидоредуктазой тилакоидов (комплексом bf). Окислительно-восстановительные группы комплекса bc1 включают железо-серный [2Fe–2S] кластер, находящийся в белке Риске (Rieske), 2 гема b-типа, находящихся на отдельном полипептиде, и гем цитохрома с1. Железо-серный кластер [2Fe–2S] белка Риске присоединен к полипептиду связями одного из атомов железа с двумя остатками цистеина, а другого — с двумя остатками гистидина. Полипептидная цепь с железо-серным кластером внутри глобулярной структуры заякорена в мембране гидрофобной N-концевой спиралью и выдается над липидным бислоем в водную фазу, положительно заряжающуюся в процессе работы комплекса III. Цитохром с1 имеет сходный с белком Риске глобулярный домен и гидрофобный якорь, отличающийся размещением на С-конце белка. Субъединица цитохрома b имеет 8 трансмембранных α-спиралей. Четыре консервативных гистидиновых остатка располагаются попарно на каждой из двух спиралей таким образом, чтобы служить аксиальными лигандами для гемов.

2.1.4. Пути использования

, образованной циклической редокс-цепью

В хроматофорах протонный потенциал, образованный циклической редокс-цепью, может использоваться для совершения четырех видов химической работы. Среди них: 1) образование ATP из ADP и неорганического фосфата посредством Н+-ATP-синтазы; 2) образование неорганического пирофосфата из двух молекул фосфата под действием Н+-пирофосфат-синтазы; 3) катализируемый NADH-СoQ-редуктазой обратный перенос восстановительных эквивалентов от доноров водорода с редокс-потенциалов около нуля к NAD+; 4) восстановление NADP+ посредством NADH под действием трансгидрогеназы. NADH-СoQ-редуктаза представляет собой первый из трех -генераторов, включенных в дыхательную цепь. Действуя в обратном направлении (СoQH2 → NAD+), этот фермент в хроматофорах становится потребителем , образуемой фотосинтетической редокс-цепью. Он делает возможным восстановление NAD+ (редокс-потенциал –320 мВ) за счет таких доноров водорода, как Н2S (редокс-потенциал около 0). Образующийся NADH затем используется в восстановительных биосинтезах. Один из путей использования NADH — восстановление NADP+ в трансгидрогеназной реакции. Фермент трансгидрогеназа служит потребителем . Он локализован, в частности, в мембране хроматофоров. Трансгидрогеназа, потребляя , резко увеличивает редокс-потенциал пары NADPH/NADP+, что благоприятствует тем восстановительным синтезам, где используется NADPH в качестве донора водорода.

Bioenergetica.indb 50

26.01.2011 18:02:16

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

51

Рисунок 2.18. Пути трансформации энергии света в цитоплазматической мембране пурпурных фотосинтезирующих бактерий (1–9). В хроматофорах тех же бактерий действует упрощенная схема, где отсутствуют пути 4, 5 и, по-видимому, 3

В темноте NADH-СoQ-редуктаза может действовать в прямом направлении (NADH → СoQ), генерируя . Образуемый СoQH2 окисляется комплексом bc1 с восстановлением цитохрома с2. Последний восстанавливает цитохром о, который переносит электроны на О2 и образует . Таким образом, пурпурные фотосинтезирующие бактерии располагают дыхательной цепью с тремя -генераторами. В цитоплазматической мембране фотосинтезирующих бактерий существует целый ряд дополнительных потребителей , отсутствующих в хроматофорах. Среди них: 1) Н+-моторы, вращающие бактериальные флагеллы; 2) Н+, метаболит-симпортеры, обеспечивающие накопление метаболитов в бактериальной клетке; 3) системы транспорта Na+ и K+, ответственные за поддержание асимметричного распределения этих катионов между клеткой и средой. Градиенты ионов Na+ и K+ действуют как -буфер. Аналогичную роль может, по-видимому, играть и пирофосфат. Общая схема превращения энергии света в различные типы работы мембраны пурпурных фотосинтезирующих бактерий приведена на рис. 2.18.

2.2. Нециклическая светозависимая редокс-цепь зеленых серных бактерий В предыдущем разделе было упомянуто, что пурпурные фотосинтезирующие бактерии могут восстанавливать NAD+ посредством Н2S за счет энергии света, которая предварительно превращена в циклической редокс-цепью. Зелеными фотосинтезирующими бактериями-анаэробами ис-

Bioenergetica.indb 51

26.01.2011 18:02:16

52

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

пользуется другой механизм. Он устроен таким образом, что свет одновременно вызывает а) генерацию и б) восстановление NAD+ сероводородом. Это простейший вариант так называемой нециклической фотосинтетической редокс-цепи. Схема обсуждаемого механизма приведена на рис. 2.19. Комплекс реакционных центров в данном случае подобен комплексу фотосистемы 1 хлоропластов и цианобактерий (см. ниже, раздел 2.3.2). Он составлен из димера бактериохлорофилла, двух мономеров бактериохлорофилла, витамина К1 (филлохинона) и трех FeS-кластеров (FeSX, FeSA и FeSB), включенных последовательно в редокс-цепь. Акцептором электронов комплекса служит водорастворимый железо-серный белок ферредоксин (Fd), расположенный на цитоплазматической поверхности мембраны. От Fd электроны переносятся на флавопротеид, простетической группой которого, по-видимому, служит FAD, и далее на NAD+. Фотоокисленный восстанавливается донорным сегментом редокс-цепи, берущей начало от H2S. Этот участок содержит флавопротеин с FMN в качестве простетической группы, менахинон и два цитохрома. Редокс-потенциалы основных компонентов цепи зеленых бактерий были указаны выше (см. рис. 2.6). Показана светозависимая генерация ΔΨ мембранными фрагментами зеленых бактерий, сорбированных на плоской фосфолипидной мембране. Природа этого эффекта объясняется, как и в случае других хлорофиллсодержащих -генераторов, переносом электронов поперек мембраны. Перенос электронов, показанный на рис. 2.19, должен приводить к освобождению ионов водорода во внешнюю среду из-за окисления H2S до элементарной серы электрон-донорным сегментом редокс-цепи, который

Рисунок 2.19. Нециклическая фотосинтетическая редокс-цепь зеленых серных бактерий. Объяснения в тексте

Bioenergetica.indb 52

26.01.2011 18:02:17

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

53

расположен вблизи внешней поверхности цитоплазматической мембраны. На противоположной (внутренней) стороне мембраны должно происходить поглощение ионов Н+, так как NAD+ восстанавливается бактериохлорофилльной системой, транспортирующей электроны, но не протоны. Чтобы образовать NADH из NAD+, присоединение двух электронов должно сопровождаться присоединением одного протона. Итак, на внешней поверхности мембраны зеленой бактерии происходит следующий процесс: H2S → S + 2H+ + 2 ,

(2.4)

в то время как события, происходящие на внутренней стороне мембраны, описываются как: NAD+ + Н+ + 2 → NADH.

(2.5)

Таким образом, схема переноса электронов у зеленых серных бактерий , и восстановление NAD+ осуществляются предполагает, что и генерация одной и той же светозависимой редокс-цепью. Следует отметить, что схема, представленная на рис. 2.19, применима лишь к анаэробным зеленым серным бактериям. В то же время известно, что зеленые несерные бактерии типа Chloroflexus, относящиеся к факультативным аэробам, имеют циклическую редокс-цепь, напоминающую редокс-цепь пурпурных бактерий.

2.3. Нециклическая светозависимая редокс-цепь хлоропластов и цианобактерий Нециклическая светозависимая редокс-цепь цианобактерий и хлоропластов до известной степени аналогична цепи зеленых бактерий. В обоих случаях свет используется для генерации и восстановления NAD(P)+ посредством донора электронов с более положительным, чем у NAD(P)+, редокс-потенциалом. Главное отличие цианобактерий и хлоропластов от зеленых бактерий в том, что донором электронов для первых служит не сероводород, а вода. Разность редокс-потенциалов между NAD(P)+ и Н2О составляет около 1,2 В, что намного больше, чем разность потенциалов между NAD+ и H2S, используемых зелеными бактериями (0,3 В). Поэтому транспорт одного электрона по редокс-цепи хлоропластов (цианобактерий) сопряжен с поглощением двух фотонов, а не одного, как у зеленых бактерий. Рисунок 2.20. Структура хлоропласта

Bioenergetica.indb 53

26.01.2011 18:02:17

54

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 2.21. Нециклическая светозависимая редокс-цепь хлоропластов (по Бланкеншипу и Принсу): СРВ — система расщепления воды; Z — остаток тирозина в одном из белков фотосистемы 2; (ХлII)2 — димер хлорофилла фотосистемы 2, PQA и PQB — пластохиноны, связанные с фотосистемой 2; PQ — свободный пластохинон; bH и bL — высоко- и низкопотенциальные гемы цитохрома b6; f — цитохром f; Пц — пластоцианин; (ХлI)2 — димер хлорофилла фотосистемы 1; K1 — витамин K1; FeSX — первичный стабильный акцептор электронов фотосистемы 1; FeSA, FeSB — два железосерных кластера, прочно связанные с фотосистемой 1; Fd — ферредоксин. А — рисунок составлен с учетом расположения редокс-центров в мембране тилакоида. Б — переносчики восстановительных эквивалентов расположены в соответствии с их редокспотенциалами; пунктиром показан перенос электронов от ферредоксина к b6f-комплексу, циклизующий фоторедокс-цепь

Bioenergetica.indb 54

26.01.2011 18:02:18

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

55

В растительных клетках фотосинтетическая редокс-цепь локализована во внутрихлоропластных мембранах, в основном в тилакоидах — замкнутых сплющенных мембранных пузырьках, собранных в пачки (граны) (рис. 2.20). Тилакоиды обнаружены также у многих цианобактерий.

2.3.1. Принцип действия На рис. 2.21 показана светозависимая редокс-цепь в тилакоидной мембране хлоропластов. Цепь содержит два типа реакционных центров (они называются фотосистемами 1 и 2), а также несколько ферментов, катализирующих темновые реакции окисления воды, Q-цикла и восстановления NADP+. Процесс начинается поглощением фотона хлорофиллом антенны. Возбуждение мигрирует от хлорофилла антенны к хлорофиллу одной из фотосистем. Если это димер хлорофилла фотосистемы 2 (максимум поглощения при 680 нм), он окисляется мономером хлорофилла II, после чего электрон оказывается на феофитине. От феофитина электрон переносится на связанный пластохинон (PQA). Затем электрон достигает другой молекулы связанного пластохинона (PQB). Как и в бактериальном фотосинтезе, этот процесс катализируется негемовым железом, связанным с четырьмя имидазолами гистидинов белка. Катион-радикал окисленного димера хлорофилла (ХлII) принимает электрон от одного из тирозинов белка, который, в свою очередь, восстанавливается электроном, отнятым у молекулы Н2О посредством довольно сложной марганец-содержащей системы расщепления воды (СРВ). При расщеплении воды наряду с электронами образуется молекулярный кислород и протоны. Последние высвобождаются в раствор внутри тилакоидов. Восстановленный PQ окисляется PQH2-пластохинонредуктазой, или комплексом b6f (это хлоропластный аналог комплекса bc1). Комплекс b6f включает трехгемовый цитохром b (гемы bL, bH и сi), FeS и цитохром f, который функционально аналогичен цитохрому с1. Комплекс b6f катализирует Q-цикл, подобный тому, который описан у пурпурных бактерий и митохондрий. В результате перенос одного электрона с PQ на цитохром f оказывается сопряженным с транслокацией одного заряда через мембрану тилакоида, поглощением двух Н+ из стромы и высвобождением двух Н+ во внутритилакоидное пространство. Поглощение протонов происходит на внешней поверхности мембраны тилакоида, их выделение — на внутренней. От цитохрома f электрон движется к медь-содержащему белку пластоцианину (ПЦ), который восстанавливает катион-радикал димера хлорофилла фотосистемы 1 (максимум поглощения этого хлорофилла — 700 нм). (ХлI) образуется при окислении возбужденного (ХлI)2*. Электрон, отнятый от (ХлI)2*, переносится через мономеры хлорофилла (ХлI и ХлI′) и витамин K1 (филлохинон) на железосерный центр FeSX, играющий роль первичного стабильного акцептора электронов в фотосистеме 1. На следующих этапах электрон транспортируется на другие железосерные кластеры (FeSB, FeSA, ферредоксин) и далее на флавопротеин, содержащий FAD в качестве простетической группы. От FAD восстановительные эквиваленты поступают на NADP+. Образованный в результате NADPH

Bioenergetica.indb 55

26.01.2011 18:02:19

56

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

окисляется водорастворимой системой ферментов, восстанавливающих СО2 до сахара. Согласно схеме, представленной на рис. 2.21, эффективность нециклической редокс-цепи хлоропластов и цианобактерий должна составлять 6Н+ на 4hν, что соответствует отношению Н+/ , равному 1,5 (имеется в виду отношение количества протонов, перенесенных через мембрану, к количеству электронов, прошедших весь путь от Н2О до СО2). Таким образом, редокс-генератора: фотосистему 1, фотосицепь тилакоидов содержит три стему 2 и комплекс b6f.

2.3.2. Фотосистема 1

Рисунок 2.22. Полипептидный остов фотосистемы 1 из хлоропластов гороха. Четыре белка антенны (Lhca 1–4) показаны зеленым. Красным даны элементы структуры хлоропластной фотосистемы 1, отличные от фотосистемы 1 цианобактерий, а серым — совпадающие у хлоропластов и цианобактерий. Железо-серные кластеры FeSX, FeSA и FeSB, имеющие состав Fe4S4, показаны как черные (Fe) и синие (S) жирные точки. А — вид сверху со стороны стромы хлоропласта. Указаны субъединицы F, G, H и K. Б — вид сбоку со стороны белков антенны. N-концевые домены субъединиц F и D, специфичные для хлоропластов, указаны красным. Рентгеноструктурный анализ Нельсона и Бен-Шема [Nelson & Ben-Shem 2004, Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 971–982]

Bioenergetica.indb 56

Фотосистема 1 из хлоропластов включает 14 различных полипептидов. Два из них с молекулярными массами 83,2 и 82,5 гомологичны друг другу (45% идентичности аминокислотных последовательностей). Остальные субъединицы гораздо мельче. (ХлI)2, ХлI, ХлI′, витамин K1 (филлохинон) и FeSX связаны с крупными субъединицами, а FeSA и FeSB — с одной из мелких гидрофобных субъединиц. В отличие от фотосистемы 1 цианобактерий, в хлоропластную фотосистему 1 интегрированы четыре белка, несущие хлорофиллы антенны (Lhca 1–4). Если посмотреть на мембрану тилакоида сверху, то окажется, что антенные белки формируют полукольцо вокруг остальных субъединиц, образующих комплекс реакционных центров фотосистемы 1 (рис. 2.22). Перенос энергии возбуждения от хлорофиллов антенны на (ХлI)2 чрезвычайно эффективен: почти каждый квант света, поглощенный антенной, вызывает окисление (ХлI)2. С внутренней стороны мембраны тилакоида расположен поверхностный медь-содержащий белок пластоцианин (см. ниже), входящий в состав фотосистемы 1, а с внешней — другой поверхностный белок ферредоксин (11 кДа).

26.01.2011 18:02:19

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

57

Последний содержит [Fe–S]-кластер и служит переносчиком электронов с фотосистемы 1 на флавопротеин, восстанавливающий NADP+ (34 кДа). Комплексы реакционных центров фотосистемы 1 в мембране тилакоидов цианобактерий образуют тримеры. В хлоропластах высших растений фотосистема 1 находится в мономерной форме. Как тримеры цианобактерий, так и мономеры хлоропластов были очищены, закристаллизованы и подвергнуты рентгено-структурному анализу. Результаты такого анализа применительно к хлоропластам показаны на рис. 2.22 и 2.23. Как видно на рис. 2.23, существуют две ветви переноса электронов через (ХлI)2* на FeSX, каждая из которых содержит одни и те же редокс-группы (ХлI, ХлI′ и витамин K1). Обе ветви способны к переносу электронов, но Рис. 2.23. Расположение простетических групп в фотосистеме 1 одна делает это в десять раз быстрее другой. хлоропластов по данным рентгеноПервичный светоиндуцированный ре- структурного анализа (по Нельсону докс-процесс, происходящий в фотосистеме и Бен-Шему) [Nelson & Ben-Shem 1, — перенос электрона от (ХлI)2* (редокс- 2004, Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 971–982] потенциал –1,2 В) к ХлI (редокс-потенциал около –1 В). Затем электрон попадает на ХлI′ и далее на витамин K1 (редокс-потенциал –0,8 В). Следующий переносчик электронов — FeSX (–0,7 В). Он представляет собой кластер, содержащий четыре иона железа и четыре иона сульфида. Кроме этого компонента в фотосистеме 1 находят еще два кластера [4Fe–4S], а именно FeSA и FeSB. Их редокс-потенциалы равны соответственно –0,58 и –0,53 В. Последовательность реакций в этой части редокс-цепи следующая: FeSX → FeSА → FeSВ. Последний компонент служит восстановителем ферредоксина, водорастворимого белка, содержащего кластер [2Fe–2S]. Другой водорастворимый переносчик электронов играет роль восстановителя фотоокисленного . Это медь-содержащий белок пластоцианин. В первичной структуре пластоцианина обнаружена гомология с субъединицей II цитохромоксидазы — конечного фермента дыхательной цепи, содержащего медь и железо (см. ниже, раздел 4.4). Восстановителем пластоцианина является цитохром f, принадлежащий комплексу b6f. Этот комплекс осуществляет перенос электронов от фотосистемы 2 к фотосистеме 1 (см. ниже, раздел 2.3.3). Существует альтернативный способ функционирования фотосинтетической редокс-цепи в хлоропластах — циклический перенос электронов с участием фотосистемы 1 и комплекса b6f, но без фотосистемы 2. Такой механизм in vitro можно продемонстрировать, блокируя фотосистему 2 диуроном и добавив какой-либо искусственный переносчик электронов. В определенных условиях циклический перенос электронов можно наблюдать и in vivo.

Bioenergetica.indb 57

26.01.2011 18:02:20

58

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

В этом случае восстановительные эквиваленты каким-то неизвестным еще образом транспортируются от ферредоксина не к NADP+, а назад к . В этом процессе принимают участие пластохинон и комплекс b6f. Предполагают, что ферредоксин восстанавливает PQ, так что фотосистема 2 становится ненужной для регенерации (ХлI)2 из . Подобный механизм аналогичен циклической светозависимой редокс-цепи пурпурных бактерий, образующей без фотолиза воды и восстановления NADP+. . ПоказаНет сомнений, что фотосистема 1 способна генерировать но, что пластоцианин, восстанавливающий фотосистему 1, расположен на внутренней стороне мембраны тилакоида, а ферредоксин и ферредоксинNADP+-редуктаза, окисляющие фотосистему 1, обращены наружу. Поэтому транспорт электронов через фотосистему 1 должен быть направлен поперек мембраны. Комплекс фотосистемы 1 был встроен в протеолипосомы, которые на свету генерировали ΔрН. Чтобы включить циклический перенос электронов, в инкубационную среду добавили искусственный переносчик электронов феназинметасульфат и донор электронов аскорбат. Включение очищенной Н+-ATP-синтазы в те же протеолипосомы давало систему, катализирующую фотофосфорилирование. Механизм генерации фотосистемой 1, по всей вероятности, подобен таковому в бактериальных реакционных центрах. Наносекундная вспышка лазера вызывает генерацию ΔΨ с τ < 100 нс, что много быстрее всех процессов, происходящих в фотосистеме 1, кроме переноса электронов на этапе (ХлI)* → FeSX. Эта ΔΨ составляет большую часть электрогенного ответа, так что все прочие этапы переноса электронов в фотосистеме 1 могут внести лишь сравнительно малый вклад в трансформацию энергии на этом участке фотосинтетической редокс-цепи.

2.3.2. Фотосистема 2 Фотосистема 2 в зависимости от объекта и метода очистки состоит из полипептидов около 30 различных типов, часть которых кодируется ядерной, а часть — хлоропластной ДНК. Фотосистема 2 образует димеры. Структура фотосистемы 2 и расположение редокс-центров по данным рентгеноструктурного анализа показаны на рис. 2.24. Хлорофиллы фотосистемы 2 (как и фотосистемы 1) относятся к группе хлорофиллов а и имеют α-полосу поглощения при 680 нм (в фотосистеме 1 при 700 нм). В состав фотосистемы 2 входят субъединицы D1 и D2 массой 39,5 и 39 кДа, похожие на М и L-субъединицы комплекса реакционных центров пурпурных бактерий. Подобно этим субъединицам, они ответственны за связывание (ХлII)2, двух ХлII, двух феофитинов, первичного и вторичного хинонов (в этом случае PQA и PQB), негемового железа, связанного с четырьмя гистидинами, а также двух хлорофиллов антенны (ХлZ). 39-кДасубъединица специфически связывает гербициды. Характерной чертой фотосистемы 2 является наличие 12 очень маленьких субъединиц (3–5 кДа). Субъединицы 9,5 и 4,5 кДа образуют цитохром типа b с максимумом α-пика при 559 нм (цитохром b559). Каждая из на-

Bioenergetica.indb 58

26.01.2011 18:02:20

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

59

Рисунок 2.24. Структура фотосистемы 2. A — вид сбоку димера фотосистемы 2: субъединицы D1 и D2 показаны темно-синим цветом, хлорофилл-связывающие белки антенны CP43 и CP47 — красным цветом, цитохром b559 — светло-синим цветом, периферические субъединицы — оранжевым и желтым цветом, остальные субъединицы — розовым цветом. Б — пространственное расположение простетических групп фотосистемы 2: хлорофиллы показаны темно-зеленым цветом, марганцевый кластер — светло-синим цветом, гемы и негемовое железо — красным цветом, хиноны — фиолетовым цветом. Стрелками указан путь переноса электронов [Nelson & Ben-Shem 2004, Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 971–982]

званных субъединиц содержит остаток гистидина, имидазол которого образует координационную связь с гемом. Роль цитохрома b559 остается невыясненной. То же относится к цитохрому типа с (с550), расположенному на внутренней (обращенной во внутритилакоидное пространство тилакоила) стороне мембраны (этот цитохром есть у цианобактерий и отсутствует в хлоропластах). Что касается цитохрома b559, то он находится ближе к противоположной стороне мембраны. Отличительной чертой фотосистемы 2 является очень высокий редокспотенциал основного состояния димера хлорофилла, т.е. пары (ХлII)2/(ХлII) .

Bioenergetica.indb 59

26.01.2011 18:02:21

60

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Он равен +1,1 В. Вот почему (ХлII) может служить акцептором электронов для воды (редокс-потенциал пары Н2О/О2 при нейтральном рН равен +0,82 В). В то же время редокс-потенциал возбужденного (ХлII)2* находится в отрицательной области (менее –0,6 В). Первичный стабильный акцептор электронов является пластохиноном (PQA). Еще одна молекула связанного хинона (PQB) участвует в дальнейшем переносе электронов по фотосинтетической редокс-цепи. Как и у пурпурных бактерий, этот этап ускоряется негемовым железом, хелированным четырьмя гистидинами, и блокируется о-фенантролином. Первичным донором электронов для (ХлII) служит один из остатков тирозина белка. Он восстанавливает (ХлII) за время порядка 50–500 нс. В качестве восстановителя радикала тирозина, возникающего при окислении этой аминокислоты посредством (ХлII) , используется специфическая система расщепления воды (СРВ). Она действует таким образом, что расщепление двух молекул воды приводит к восстановлению четырех молекул (ХлII) , образованию одной молекулы О2 и четырех ионов Н+. СРВ состоит из четырех полипептидов, один из которых содержит четыре иона Mn2+. Последние принимают непосредственное участие в переносе электронов от воды к радикалу тирозина. Механизм генерации фотосистемой 2 может быть описан по аналогии с уже рассмотренным выше комплексом центров пурпурных бактерий. Здесь также происходит трансмембранный светозависимый перенос электронов от возбужденного димера хлорофилла к QA, расположенному по другую сторону гидрофобного барьера, причем функционирует только одна из двух цепей, содержащих ХлII и феофитин.

2.3.3. Комплекс b6f В хлоропластах и цианобактериях система реакций Q-цикла катализируется комплексом b6f. Комплекс содержит четыре более крупных (18–32 кДа) и четыре более мелких субъединицы. Из крупных три снабжены редоксцентрами. Это цитохром f (32 кДа), трехгемовый цитохром b6 (23 кДа) и FeSбелок (20 кДа). Четвертая крупная субъединица (18 кДа) прямо не участвует в переносе электронов. Комплекс образует димер массой 217 кДа. Цитохром b6 уникален, так как содержит два гема b и гем ci (рис. 2.25). Оба гема b в цитохроме b6 характеризуются спектральным α-максимумом при 563 нм. Они отличаются по редокс-потенциалам. Гемы bL и bH имеют среднеточечные потенциалы (Em) соответственно –30 и +150 мВ. В хлоропластном цитохроме b6 гем ci ковалентно связан только с одним цистеином, а не с двумя, как во всех прочих цитохромах типа с. Другая отличительная черта гема ci — отсутствие аксиальных лигандов, представленных функциональными группами белка. Гем ci расположен рядом с гемом bH, как бы экранируя его от PQ. Вероятно, PQ может служить одним из аксиальных лигандов гема ci. Можно предположить, что такая конфигурация PQ-редуктазного центра комплекса b6f облегчает двухэлектронное восстановление PQ за счет электронов гемов ci и bH и уменьшает время жизни семихинонной формы пластохинона (PQ•−), опасной своей способностью превращать О2 в O . Опасность такого пре-

Bioenergetica.indb 60

26.01.2011 18:02:21

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

61

Рис. 2.25. Редокс-центры димера комплекса b6f из хлоропластов зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. А — атомы железа гемов ci, bH и bL цитохрома b, Fe2S2 кластера белка FeSIII и цитохрома f. Б — окружение гемов ci и bh. Зеленым показаны потенциальный аксиальный лиганд железа гема ci (по-видимому, пластохинон) и две молекулы воды, связанные вблизи гемов ci и bH (по Д. Стрёбелю и др.)

Bioenergetica.indb 61

26.01.2011 18:02:21

62

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

вращения особенно велика в клетках с оксигенным фотосинтезом, где высока внутриклеточная концентрация О2 (она не может быть ниже концентрации О2 в растворе, находящемся в равновесии с воздушной средой). Сравнение аминокислотной последовательности цитохрома b6 из хлоропластов шпината и цитохромов b из митохондрий животных, растений и грибов выявило сходство в первых (считая от N-конца) 200 остатках. В то же время существует и явное различие, состоящее в том, что цитохром b6 гораздо короче (211 остатков), чем митохондриальные цитохромы b (330–385 остатков). При этом обнаруживается гомология между субъединицей 18 кДа комплекса b6f и остатками 260–353 митохондриального цитохрома b. Поэтому можно полагать, что некая функция, присущая С-концевой части митохонРисунок 2.26. Трансмембранное расположение двух гемов (выделены вертикальдриального цитохрома b, в хлоропластах ными жирными линиями) цитохрома b6. выполняется субъединицей 18 кДа. Верхний и нижний гемы — соответственно Цитохром b6 содержит пять остатbL и bH, показана возможная стабилизация ков гистидина, из них четыре участвуют отрицательно заряженных (–) пропионатных групп гемов наиболее консервативныв координировании гемов bL и bH. Эти ми аргининовыми остатками (+) остатки в положениях 82, 96, 283 и 198 (в митохондриальном цитохроме b — 197) полностью консервативны, т.е. встречаются как в цитохроме b6, так и во всех цитохромах b митохондрий из разных царств живых организмов. Все четыре гистидина, упомянутые выше, всегда локализованы в гидрофобных сегментах полипептидной цепи. Именно они принимают участие в связывании гемов bL и bH, играя роль аксиальных лигандов и определяя расположение гемов перпендикулярно поверхности мембраны. Каждый гем b содержит два отрицательно заряженных остатка пропионата. Эти группы находятся напротив консервативных остатков аргинина, заряженных положительно (рис. 2.26). Расстояние между краями гемов, согласно модели, равно 1,2 нм, а между атомами железа — 2,0 нм. Следовательно, электрон, чтобы переместиться с гема bL на гем bH, должен пересечь около половины гидрофобного слоя мембраны. Партнером цитохрома b6 в реакции окисления PQH2 служит железосерный белок комплекса b6f, который функционально аналогичен компоненту FeSIII дыхательной цепи. FeSIII содержит два атома Fe и два атома S. Следующий переносчик электронов — цитохром f. Последовательность из 285 аминокислот, образующих цитохром f, содержит фрагмент Cys-X-YCys-His, характерный для места ковалентного связывания гемов в цитохро-

Bioenergetica.indb 62

26.01.2011 18:02:22

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

63

мах типа c. Он расположен в области 21–25 от N-конца. His-25 и Lys-145 или Lys-222 служат лигандами железа, входящего в гем. Гем локализован в большом N-концевом домене (остатки 1–250), экспонированном в водное пространство внутри тилакоида. Остатки 251–270 имеют выраженный гидрофобный характер и образуют α-спиральную колонну, которая, пересекая мембрану, играет роль «якоря». Остальные 15 аминокислот от С-конца локализованы на внешней поверхности тилакоидной мембраны и могут быть удалены протеазами. Участок 190–249 богат кислыми аминокислотами, обращенными внутрь тилакоида. Они участвуют, как полагают, во взаимодействии с кластером основных аминокислот цитохрома b6. Десять консервативных основных аминокислот на отрезке 58–154, вероятно, участвуют в связывании следующего переносчика электронов — пластоцианина. Спектр цитохрома f имеет α-максимум при 555 нм. Редокс-потенциал этого цитохрома равен +365 мВ. Средний диаметр комплекса b6f составляет величину порядка 8,5 нм. В природной мембране комплекс существует в виде димера. Следует отметить, что комплекс b6f — медленное и наиболее уязвимое звено фотосинтетической редокс-цепи. Вход в Q-цикл от фотосистемы 2 блокируется мощным гербицидом дихлорфенилдиметилтиомочевиной (диуроном). Определенные этапы Q-цикла чувствительны к дибромтимохинону и N-оксиду 2-гептил-4-оксихинолина. Последние два яда тормозят Q-цикл также в митохондриях и бактериях. Ингибиторный анализ редокс-цепи тилакоидов осложняется существованием путей переноса электронов, альтернативных главной нециклической цепи. Это циклический перенос электронов вокруг фотосистемы 1 (а также, возможно, и фотосистемы 2).

Рисунок 2.27. Три генератора в мембране тилакоида цианобактерий (по Куризу и др.). Чтобы упростить картину, белки, связанные с поверхностью мембраны, т.е. пластоцианин (Пц), ферредоксин (Fd) и ферредоксин-NADP+-редуктаза (FNR), вынесены в водные пространства внутри или снаружи тилакоида

Bioenergetica.indb 63

26.01.2011 18:02:22

64

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

На рис. 2.27 показаны три генератора оксигенного фотосинтеза. Данные получены в результате рентгеноструктурного анализа фотосистем 1 и 2 и комплекса b6f цианобактерий. Аналогично выглядит система оксигенного фотосинтеза хлоропластов.

2.3.4. Судьба

, образованной фотосинтетической редокс-цепью хлоропластов

Тилакоиды хлоропластов выполняют лишь две функции — восстановление NADP+ и синтез ATP, опосредованный образованием и использованием . При этом энергия количественно превращается в энергию ATP посредством Н+-ATP-синтазы. Для тилакоидов нет необходимости совершать осмотическую работу по транспорту метаболитов, поскольку внутритилакоидное водное пространство является, по существу, «энзиматически пустым». Единственный значительный процесс, происходящий на внутренней поверхности тилакоидной мембраны, — фотолиз воды с образованием молекулярного кислорода. Мембрана не может быть барьером ни для субстрата этой реакции (Н2О), ни для ее продукта (О2). Что касается превращения ADP и Pi в ATP, а также NADP+ в NADPH, то оба эти процесса локализованы на внешней поверхности тилакоида. Обратный перенос электронов против градиента редокс-потенциала в тилакоидах отсутствует, поскольку проблему генерации «восстановительной силы» они решают, образуя NADPH нециклической цепью. В хлоропластах не описано таких потребителей , как Н+-моторы, вращающие флагеллы бактерий.

Рисунок 2.28. Превращение энергии в мембранах тилакоидов

Bioenergetica.indb 64

26.01.2011 18:02:23

Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала

65

Коль скоро в тилакоидах есть только одна -зависимая функция, отпадает необходимость стабилизировать в той степени, как это обычно происходит у бактерий. Тем не менее тилакоиды располагают возможностью забуферить до известной степени уровень . Дело в том, что их мембрана проницаема для ионов Cl–, K+ и Mg2+. Транспорт этих ионов -генераторами, приводит к по электрическому градиенту, образуемому превращению ΔΨ в ΔрН. Поскольку в форме ΔрН можно запасти намного больше энергии, чем в ΔΨ, переход ΔΨ → ΔрН повышает общее количество «мембранной» энергии в системе. Такой эффект может стабилизировать скорость синтеза ATP хлоропластами в условиях колебаний освещенности, что часто происходит в природных условиях. Общий план энергетики тилакоида представлен на рис. 2.28. Последний существенный момент, который следует отметить при рассмотрении энергетики хлоропластов, состоит в том, что Н+-ATP-синтаза может отсутствовать в тех областях, где мембраны двух соседних тилакоидов тесно прилегают друг к другу. Такой эффект возникает при условии, что тилакоиды находятся в ненабухшем состоянии, т.е. имеют дисковидную форму. В этом случае между тилакоидами остается лишь очень узкая щель. Показано, что в данном состоянии молекулы Н+-ATP-синтазы сконцентрированы на самых краях диска, обращенных в сторону хлоропласта, и (главным образом) в мембранах ламелл, далеко выступающих из гран в строму. Ламеллы представляют собой, в сущности, продолжение некоторых из тилакоидов. Ламеллы содержат фотосистему 1, в то время как в тилакоидах есть обе фотосистемы. Создается впечатление, что ламеллы специализированы на синтезе ATP, сопряженном с циклическим переносом электронов вокруг фотосистемы 1, и не способны к фотолизу воды и восстановлению NADP+ (эти два процесса протекают в тилакоидах). Чтобы образовать ATP, генерируемая тилакоидом должна быть передана вдоль мембраны в ламеллу, где локализована большая часть молекул Н+-ATP-синтазы. Если тилакоиды находятся в набухшем состоянии, то молекулы Н+ATP-синтазы диффундируют из ламелл в тилакоиды и равномерно распределяются по всей системе внутрихлоропластных мембран. Все эти соображения могут быть отнесены и к тилакоидам цианобактерий, являющихся эволюционными предшественниками хлоропластов. В этом случае необходимо лишь дополнить схему на рис. 2.27 дыхательной цепью, которая у цианобактерий находится в той же тилакоидной мембране, что и фотосинтетическая редокс-цепь (у растений дыхательная цепь вынесена в митохондрии). Взаимодействие дыхательной и фотосинтетической цепей, обслуживаемых на средних участках одними и теми же компонентами Q-цикла, будет рассмотрено в одной из последующих глав (см. разд. 4.3).

Bioenergetica.indb 65

26.01.2011 18:02:24

ГЛАВА ТРЕТЬЯ

ОРГАНОТРОФНАЯ ЭНЕРГЕТИКА

Д

анная глава нашей книги будет посвящена краткому обзору метаболизма гетеротрофных организмов, причем в основном той его части, в ходе которой происходит обеспечение клетки необходимой энергией. Преполагается, что читатель уже хорошо знаком с общим курсом биохимии. Основной материал этой главы будет изложен в очень краткой форме, лишь иллюстрирующей биоэнергетическое описание метаболических процессов.

3.1. Субстраты органотрофной энергетики Органические вещества являются источниками энергии (субстратами) для подавляющего большинства гетеротрофных организмов. При окислении субстратов кислородом выделяется большое количество энергии, которая может быть преобразована в удобную для клетки форму (в частности, в ATP). Что за субстраты используются в этих процессах? В первую очередь это углеводы, жиры и белки. Полисахариды, жиры и особенно белки исключительно разнообразны, так что организму приходится иметь дело со многими тысячами различных соединений. На первом этапе метаболизма этих субстратов происходит их деполимеризация, т.е. расщепление полимеров и сложных соединений до отдельных мономеров. Углеводы на этом этапе расщепляются до моносахаридов (основных моносахаридов меньше десяти). При расщеплении жиров получаются глицерин и жирные кислоты (которых тоже около 10). При расщеплении белков образуется 20 различных аминокислот. В целом из тысяч биополимеров пищи получается ограниченный набор (нескольких десятков) веществ — мономеров (см. рис. 3.1). Таким образом, уже на первом этапе метаболизма происходит значительная унификация используемых субстратов.

3.2. Краткий обзор метаболизма сахаров На втором этапе происходит дальнейшая унификация соединений для их последующего окисления молекулярным кислородом. Рассмотрим этот процесс на примере наиболее распространенного сахара — глюкозы. При

Bioenergetica.indb 66

26.01.2011 18:02:24

Глава 3. Органотрофная энергетика

67

Рисунок 3.1. Схема унификации «топлива» (восстановительных эквивалентов) при органотрофной энергетике. Зеленым показаны пути переноса атомов водорода, красным — реакции синтеза ATP (GTP), черным — метаболические пути унификации «топлива», широкими стрелками — перенос электронов по дыхательной цепи

Bioenergetica.indb 67

26.01.2011 18:02:24

68

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 3.2. Основные пути метаболизма глюкозы: А — гликолиз, Б — цикл Кребса

окислении глюкозы кислородом выделяется очень большое количество энергии (2850 кДж/моль), которую необходимо преобразовать в удобную для клетки форму (ATP): C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O.

(3.1)

Как следует из уравнения 3.1, для полного окисления одной молекулы гексозы от нее необходимо отнять 24 электрона и перенести их на шесть молекул О2. Конечно же, это невозможно сделать за один этап, поэтому данное окисление происходит в несколько последовательных этапов, объединенных в те или иные метаболические пути. При переносе электронов на кислород выделяется большое количество энергии. Ее запасание в виде ATP является сложным процессом, требующим функционирования ферментных комплексов дыхательной цепи. Чтобы попасть в дыхательную цепь, электроны отнимаются от мономеров и переносятся на молекулы специфических кофакторов — никотинамидадениндинуклеотида (NAD+)* или (реже) убихинона (CoQ). Образованные в ходе этих реакций NADH и CoQH2 окисляются комплексами дыхательной цепи, а затем уже молекулярным кислородом. Таким образом, с точки зрения биоэнергетика, основ* Обычно перенос электронов с органических субстратов на NAD+ не связан с запасанием энергии, поэтому данный процесс может быть осуществлен за счет действия довольно просто устроенных ферментов.

Bioenergetica.indb 68

26.01.2011 18:02:24

Глава 3. Органотрофная энергетика

69

ным итогом начальных этапов метаболизма глюкозы и других соединений является окисление этих веществ и унификация полученных восстановительных эквивалентов в виде всего лишь двух соединений, а именно NADH и CoQH2. Посмотрим, как протекает этот процесс, если мы имеем дело с глюкозой. Чаще всего окисление глюкозы происходит за счет последовательного функционирования гликолиза и цикла Кребса (схему этих метаболических путей см. на рис. 3.2). Вначале глюкоза фосфорилируется за счет ATP с образованием глюкозо-6-фосфата. Как было указано выше, основной функцией метаболизма сахаров является обеспечение клетки энергией. Однако, как видно, уже на первой стадии Рисунок 3.3. Г. Кребс гликолиза клетка затрачивает энергию, которая идет на образование сложноэфирной связи между сахаром и остатком фосфорной кислоты. При этом большая часть энергии расщепляемого ATP рассеивается в виде тепла, что делает данный процесс необратимым. Последнее должно обеспечить надежную регуляцию гликолиза. Чаще всего контроль над протеканием какого-то метаболического пути осуществляется за счет регуляции его первой реакции. Очевидно, что такая регуляция упростится, если регулируемый процесс необратим. По-видимому, в первой реакции гликолиза клетка за счет энергии ATP обеспечивает необратимую активацию молекулы глюкозы и, таким образом, создает благоприятные условия для тщательного контроля над этим метаболическим путем. В то же время затрат ATP нет, если субстратом служит не глюкоза, а гликоген, так как источником фосфорила при образовании глюкозофосфата является неорганический фосфат (реакция фосфоролиза гликогена катализируется ферментом гликогенфосфорилазой). В этом случае присоединение фосфата к сахару происходит за счет энергии связей между остатками глюкозы в гликогене. Далее глюкозо-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6-фосфат. Фруктозо-6-фосфат снова фосфорилируется за счет ATP с образованием фруктозо-1,6-дифосфата, т.е. в третьей реакции гликолиза снова происходит трата энергии. Скорее всего, это опять же необходимо для регуляции данного метаболического пути, потому в особенности, что глюкозо-6-фосфат помимо гликолиза может еще вовлекаться в пентозофосфатный путь или потребляться для синтеза гликогена и других углеводов. Неудивительно, что именно за счет стадий, катализируемых гексокиназой и фосфофруктокиназой, осуществляется основной контроль над протеканием гликолиза. Однако за это приходится платить, рассеивая большую часть энергии гидролиза двух молекул ATP. В ходе следующей стадии фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется на 3-фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонфосфат. Фосфоглицериновый альдегид, а через него и диоксиацетонфосфат далее в ходе нескольких

Bioenergetica.indb 69

26.01.2011 18:02:26

70

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

реакций (ниже мы рассмотрим их более подробно) окисляются с образованием двух молекул 3-фосфоглицериновой кислоты. На этом этапе происходит первая окислительная стадия в цепи метаболизма глюкозы. В результате от каждой из двух частей исходной молекулы сахара отнимаются по два электрона, которые переносятся на две молекулы NAD+. Фосфоглицериновая кислота превращается в фосфоэнолпируват и, далее, в пируват. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием ацетил-CоА. При этом по два электрона с каждой молекулы пирувата переносятся на NAD+. Далее в ходе протекания цикла Кребса ацетил-CоА конденсируется с щавелевоуксусной кислотой в лимонную кислоту. Из лимонной кислоты образуется изолимонная кислота, которая при последующем окислительном декарбоксилировании (сопровождающемся переносом электронов на NAD+) превращается в α-кетоглутаровую кислоту. α-Кетоглутарат снова подвергается окислительному декарбоксилированию (опять-таки с переносом электронов на NAD+) и в две стадии превращается в янтарную кислоту. Янтарная кислота окисляется до фумаровой кислоты. Однако окислительновосстановительный потенциал пары сукцинат / фумарат (+30 мВ) значительно положительней потенциала пары NADH/NAD+ (–320 мВ), и в этом случае электроны с органического субстрата переносятся не на NAD+, а на переносчик электронов с более положительным редокс-потенциалом, а именно убихинон (СоQ). Фумаровая кислота подвергается гидратированию с образованием яблочной кислоты, окисляющейся (с переносом электронов на NAD+) до щавелевоуксусной кислоты, которая готова к реакции конденсации со следующей молекулой ацетил-CоА. Таким образом, в ходе гликолиза и цикла Кребса происходит полное окисление молекулы глюкозы до углекислого газа, а отнятые от субстрата электроны используются для образования NADH и убихинола (CoQH2): C6H12O6 + 10NAD+ + 2CоQ + 6H2O → → 6CO2 + 2CоQH2 + 10NADH +10H+.

(3.2)

NADH и CoQH2 могут быть далее окислены молекулярным кислородом за счет активности дыхательной цепи: 10NADH +10H+ + 2CоQH2 + 6O2 → 10NAD+ + 2CоQ + 12H2O. (3.3) Как мы увидим далее, именно при окислении NADH и убихинола кислородом (т.е. при протекании реакции 3.3) выделяется большая часть энергии реакции 3.1. Однако и реакция 3.2 также является экзергоничной. Хотя количество выделяющейся здесь энергии и не очень велико, но и она может быть частично запасена в виде ATP. Рассмотрим, в чем состоит механизм этого преобразования энергии, называемого субстратным фосфорилированием, на примере окисления 3-фосфоглицеринового альдегида (ФГА) до 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК) в цепи реакций гликолиза.

Bioenergetica.indb 70

26.01.2011 18:02:26

Глава 3. Органотрофная энергетика

71

3.3. Механизм субстратного фосфорилирования Окислительно-восстановительный потенциал пары ФГА/ФГК (–550 мВ) значительно отрицательней потенциала пары NADH/NAD+ (–320 мВ), поэтому при переносе электронов от ФГА на NAD+ выделяется большое количество энергии (43 кДж/моль), достаточное для обеспечения синтеза одной молекулы ATP из ADP и Pi. Для этого нужно лишь сопрячь протекание этой экзергонической реакции с реакцией фосфорилирования ADP неорганическим фосфатом. Однако, с точки зрения химии, такое сопряжение двух реакций (энергодающей и энергопотребляющей) крайне непростая задача. Посмотрим, какие механизмы были выработаны природой для реализации данного сопряжения. В клетке сопряженное с синтезом ATP окисление ФГА до ФГК осуществляется за счет работы двух ферментов — глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткиназы. Последовательность событий изображена на рис. 3.4, и ее можно разделить на три этапа. 1) Вначале дегидрогеназа глицеральдегидфосфата связывает ФГА и образует с ним ковалентную связь за счет взаимодействия SH-группы собственного остатка цистеина с альдегидной группировкой ФГА (таким образом, образуется так называемый тиополуацеталь). Важно отметить, что данная реакция обратима, т.е. на нее не нужно затрачивать энергию. В результате первого этапа без затраты энергии молекула субстрата присоединяется к реакционно-способной группировке.

Рисунок 3.4. Механизм синтеза ATP при гликолитическом окислении глицеральдегид-3-фосфата. Макроэргические связи выделены красным

Bioenergetica.indb 71

26.01.2011 18:02:26

72

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 3.5. Схема окислительного декарбоксилирования пирувата и α-кетоглутарата

2) На втором этапе происходит энергетически выгодное окисление альдегидной группы до карбоксильной группы за счет переноса двух электронов на молекулу NAD+. Однако так как в реакцию вступает тиополуацетальное производное альдегидной группы, то в результате образуется не карбоксильная группа, а ее тиоэфир. При этом свободная энергия окисления ФГА не рассеивается в виде тепла, а запасается в виде напряженной тиоэфирной связи. В результате второго этапа за счет окисления субстрата (а именно — за счет окисления его углеродного атома, связанного с реакционной группировкой) значительно повышается энергия разрыва связи между ним и реакционной группировкой. 3) На третьем этапе производится фосфоролиз тиоэфирной связи с образованием фосфоангидрида карбоксильной группы субстрата. При этом происходит регенерация исходного фермента с сохранением энергии тиоэфирной связи в виде фосфоангидридной связи. Далее этот фосфатный остаток, характеризующийся высокой энергией разрыва связи, легко может быть перенесен на молекулу ADP с образованием ATP (последняя реакция катализируется уже следующим ферментом — фосфоглицераткиназой). Таким образом, в ходе третьего этапа энергия разрыва связи между окисленным субстратом и реакционной группировкой запасается в форме ATP. Данный тип механизма запасания энергии получил название фосфорилирования на уровне субстрата или субстратного фосфорилирования. Кроме описанной выше реакции механизм субстратного фосфорилирования используется и на некоторых других этапах гликолиза и цикла Кребса, а именно при превращении 3-фосфоглицерата в пируват, а также при окис-

Bioenergetica.indb 72

26.01.2011 18:02:27

Глава 3. Органотрофная энергетика

73

лительном декарбоксилировании пирувата и α-кетоглутарата. Во всех этих случаях (с небольшими вариациями) также возможно применить описанную выше схему событий. При окислительном декарбоксилировании пирувата и α-кетоглутарата (см. рис. 3.5) на первом этапе в качестве реакционной группировки выступает кофактор тиаминпирофосфат, на этой стадии также происходит декарбоксилирование субстрата. Далее полуальдегидная форма субстрата при ее переносе на окисленную форму липоевой кислоты окисляется в ацильную с образованием уже хорошо нам знакомой тиоэфирной связи. На третьей стадии происходит перенос ацетильной (или сукцинильной) группы с липоевой кислоты на SH-группировку СoA. Далее следует фосфоролиз тиоэфирной связи с образованием ацетилфосфата (или сукцинилфосфата) и перенос фосфатной группировки на молекулу ADP (или GDP). Следует отметить, что у большинства организмов (за исключением некоторых бактерий) энергия тиоэфирной связи ацетил~S-СoA не используется для синтеза ATP, а применяется либо для запуска первой реакции цикла Кребса, либо для осуществления разнообразных синтезов в анаболических процессах. Пожалуй, наиболее просто устроен механизм запасания энергии при гликолитическом превращении 2-фосфоглицерата в пируват. Здесь нет необходимости в присоединении к субстрату какой-либо реакционной группировки, так как 2-фосфоглицерат уже несет на себе остаток фосфорной кислоты (тот самый фосфат, который был перенесен на сахар в ходе гексокиназной или фосфофруктокиназной реакции). Таким образом, для синтеза ATP необходимо всего лишь каким-то образом дестабилизировать фосфоэфирную связь в 2-фосфоглицерате, т.е. повысить потенциал переноса этой фосфатной группировки. Такую функцию выполняет энолаза, катализирующая отнятие воды от 2-фосфоглицерата с образованием фосфоэнолпирувата. При гидролизе фосфоэнолпирувата образуется энольная форма пирувата, которая за счет кето-энольной таутомерии сразу же превращается в кето-форму пировиноградной кислоты. Данное обстоятельство значительно повышает энергию разрыва фосфоэфирной связи, так что ее оказывается более чем достаточно для переноса фосфатного остатка на молекулу ADP (последняя реакция катализируется следующим ферментом гликолиза — пируваткиназой). Казалось бы, механизм субстратного фосфорилирования в данном случае принципиально отличается от описанных выше реакций, так как при образовании фосфоэнолпирувата отсутствует стадия окисления субстрата. Однако дегидратацию 2-фосфоглицерата также можно рассматривать как окислительно-восстановительную реакцию. Только в данном случае электроны перераспределяются не между молекулой субстрата и молекулой редокс-активного кофактора, а внутримолекулярно, т.е. между различными атомами одной и той же молекулы субстрата (в данном случае за счет окисления второго атома углерода 2-фосфоглицерата происходит восстановление его третьего атома углерода). Такое энергетически выгодное диспропорционирование различных атомов углерода и является источником энергии для синтеза ATP в ходе превращения 2-фосфоглицерата в пируват.

Bioenergetica.indb 73

26.01.2011 18:02:28

74

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Итак, мы рассмотрели основные метаболические реакции, сопровождающиеся синтезом ATP за счет субстратного фосфорилирования. В качестве основного достоинства данного механизма запасания энергии можно отметить его относительную простоту, а стало быть, и надежность этого процесса. Как мы увидим далее, механизм окислительного фосфорилирования (т.е. синтеза ATP за счет энергии окисления субстратов дыхания молекулярным кислородом) значительно сложнее. Почему же субстратное фосфорилирование не получило более широкого распространения? Или, иными словами, в чем же недостатки механизма субстратного фосфорилирования? Во-первых, энергию окисления далеко не каждого соединения можно с помощью данного механизма запасти в виде ATP. По чисто химическим причинам это, по-видимому, удается сделать лишь с ограниченным набором довольно реакционно-способных веществ (прежде всего с альдегидами и кетонами). Еще один недостаток заключается в строгой стехиометрии данного процесса запасания энергии: на каждую молекулу окисленного субстрата может быть синтезирована ровно одна молекула ATP. Это жесткое соотношение накладывает определенные ограничения на применение данного механизма и снижает его эффективность. Ведь если энергия окисления субстрата намного превышает энергию гидролиза ATP, то весь этот избыток будет потерян в виде тепла. А если энергия окисления субстрата меньше энергии гидролиза ATP, то энергию этой реакции вообще нельзя запасти с помощью механизма субстратного фосфорилирования. Как мы увидим далее, механизм окислительного фосфорилирования в дыхательных и фотосинтетических цепях переноса электронов лишен этих недостатков и поэтому играет более важную роль в обеспечении клетки необходимой энергией.

3.4. Брожение Несмотря на то что в ходе гликолиза на каждую потребленную молекулу глюкозы синтезируются лишь две молекулы ATP, для некоторых организмов этот метаболический путь является единственным источником энергии для жизнедеятельности клетки. К таким организмам прежде всего относятся различные бактерии и низшие эукариоты, растущие в анаэробных условиях. Из-за отсутствия кислорода и других акцепторов электронов эти организмы не могут осуществлять дыхательное фосфорилирование и вынуждены довольствоваться лишь небольшим количеством энергии, запасающейся при субстратном фосфорилировании. Такой тип метаболизма принято называть брожением. Выше были изложены основные реакции метаболизма сахаров. Однако этого недостаточно для понимания различных типов брожения. Как видно на рис. 3.2 А, в ходе гликолиза на каждую метаболизированную глюкозу образуются две молекулы NADH. У аэробных организмов NADH впоследствии окисляется кислородом, и, таким образом, осуществляется регенерация NAD+, необходимого для протекания гликолиза (да еще при этом запасается большое количество энергии). Но этот путь регенерации NAD+

Bioenergetica.indb 74

26.01.2011 18:02:28

Глава 3. Органотрофная энергетика

75

совершенно недоступен для анаэробных организмов. Необходимо было найти какой-то другой акцептор электронов для осуществления данного процесса. Таким акцептором электронов могут служить различные молекулы продуктов гликолиза или цикла Кребса. Таким образом, основным ограничением различных типов брожения и пригодных для них субстратов является необходимость соблюдения строгого окислительно-восстановительного баланса реакций. Иными словами, в ходе реакций брожения количество образованных молекул NADH должно быть в точности равно количеству молекул NAD+, полученных при восстановлении конечных продуктов метаболизма. В качестве основного примера рассмотрим наиболее простой тип брожения — молочнокислое брожение. Данный тип брожения прежде всего характерен для различных молочнокислых бактерий, а также используется в скелетных мышцах животных при кратковременной, но интенсивной физической нагрузке. В ходе этого метаболического пути глюкоза вовлекается в гликолиз, и из нее образуются две молекулы пировиноградной кислоты. В ходе гликолиза образуются также две молекулы ATP (они и являются единственным источником энергии для молочнокислых бактерий) и две молекулы NADH, которые необходимо окислить для дальнейшего протекания реакций гликолиза. При молочнокислом брожении окисление NADH достигается за счет восстановления пирувата до молочной кислоты. Таким образом, суммарная схема молочнокислого брожения выглядит следующим образом (см. рис. 3.6). Из этой схемы видно также, насколько важно соблюдение полного окислительно-восстановительного баланса брожения. При использовании более восстановленного по сравнению с глюкозой соединения (например, сорбитола) или более окисленного соединения (например, глюконовой кислоты) уже невозможно соблюсти этот баланс. Поэтому такие столь похожие на глюкозу соединения, как сорбитол или глюконат, не являются сбраживаемыми субстратами для молочнокислых бактерий. Попробуем ответить на вопрос, откуда же берется энергия для синтеза ATP в ходе молочнокислого брожения. Дело здесь в том, что в молекуле глюкозы все атомы углерода находятся в средней степени восстановленности (содержат при себе либо гидроксильную, либо карбонильную группировку). При этом восстановление одних атомов углерода глюкозы за счет окисления других ее углеродных атомов является энергетически выгодным. Именно это и происходит при молочнокислом брожеРисунок 3.6. Схема молочнокислого нии. Как видно на рис. 3.6, распределение брожения атомов углерода по степени восстановлен-

Bioenergetica.indb 75

26.01.2011 18:02:28

76

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

ности в молекуле лактата уже совсем иное, чем в глюкозе: произошло окисление первого углеродного атома за счет восстановления третьего атома углерода. Итак, в ходе молочнокислого брожения зарабатывается 2 молекулы ATP на одну потребленную молекулу глюкозы. Подобная стехиометрия наблюдается и в хорошо известном спиртовом брожении. А можно ли как-то увеличить энергетический выход брожения? Оказывается, это возможно, нужно лишь увеличить диспропорционирование электронов между различными атомами углерода в продуктах брожения. Рассмотрим это на примере смешанного брожения энтеробактерий. Будем описывать этот тип брожения, опираясь на наши знания о различных путях метаболизма глюкозы. Как было сказано выше, в ходе гликолиза на каждую метаболизированную глюкозу образуются две молекулы пирувата, а также 2 молекулы NADH и 2 ATP. Было бы крайне соблазнительно не восстанавливать пируват до лактата (как в молочнокислом брожении), а получить из него ацетил~CоА и, далее, ацетат и ATP (как было описано выше при изложении механизма окислительного декарбоксилирования пирувата). При этом мы бы получили 4 молекулы ATP на каждую потребленную глюкозу. Однако в данном случае у нас бы не осталось возможности окислить 2 молекулы NADH, полученные при гликолизе. Более того, при работе пируватдегидрогеназного комплекса образуются еще две дополнительные молекулы NADH, что делает невозможным соблюдение окислительно-восстановительного баланса брожения. Поэтому энтеробактерии пошли несколько иным путем. При брожении вместо пируватдегидрогеназного Рисунок 3.7. Схема пируват-формиат-лиазной комплекса они используют друреакции гой фермент — пируват-формиатлиазу (см. рис. 3.7). Данный фермент из пирувата образует ацетил~CоА и формиат, или муравьиную кислоту (а не ацетил~CоА, СО2 и NADH, как делает это пируватдегидрогеназный комплекс). Таким образом, с этим ферментом уменьшается количество образованных молекул NADH, однако образуется в качестве продукта брожения очень токсичное соединение — формиат*. Далее судьба двух образованных (из одной глюкозы) молекул ацетил~CоА различна. Одна из них подвергается фосфоролизу с последующим образованием ATP и ацетата. Другая молекула ацетил~CоА дважды восстанавливается за счет NADH (происходит полное окисление образованного в ходе гликолиза NADH) с получением этанола и свободного CоА. Таким образом, на одну молекулу глюкозы в ходе описанного выше процесса может быть синтезировано не две, а три молекулы ATP. А как бы выглядело идеальное (с точки зрения энергетического выхода) брожение? Очевидно, происходило бы максимально возможное диспропор* С помощью формиатдегидрогеназного комплекса муравьиная кислота может быть преобразована в безопасные углекислый газ и водород (HCOOH → CO2 + H2).

Bioenergetica.indb 76

26.01.2011 18:02:28

Глава 3. Органотрофная энергетика

77

ционирование электронов между различными атомами углерода в продуктах брожения, т.е. следующий процесс: C6H12O6 → 3СО2 + 3CН4.

(3.4)

Некоторые сообщества микроорганизмов способны осуществить эту реакцию (метаногенез), однако механизм запасания энергии при метаногенезе довольно сложен. Он будет вкратце описан в главах, посвященных дыхательным цепям бактерий, а также натриевой энергетике.

3.5. Карнозин Основной недостаток брожения — очень низкий энергетический выход данного типа метаболизма. Из этого следует, что для обеспечения клетки необходимой энергией нужно потреблять очень большое количество сбраживаемых субстратов, что приведет к значительному накоплению продуктов брожения, многие из которых могут быть токсичными. Даже такие соединения, как молочная, уксусная, янтарная, пропионовая и масляная кислоты, накапливаясь в больших количествах, угнетают жизнедеятельность клетки, так как эти продукты брожения, являясь кислотами, сильно понижают внутриклеточный рН. Данное обстоятельство может иметь особое значение при интенсивной работе скелетных мышц. В этих условиях в мышцах кончается кислород и накапливается большое количество молочной кислоты, что ведет к закислению цитоплазмы и инактивации всех мышечных ферментов. Посмотрим, как организм решает эту проблему. Речь пойдет о дипептидах, содержащихся в мышцах. История о пептидах — занимательная глава биохимии. Пептиды — регуляторы разнообразных процессов в нашем организме. Они являются важнейшим компонентом нашего тела. Сейчас мало кто уже помнит, что первый пептид был открыт в России точно на рубеже XIX и XX вв. — в 1900 г. — Владимиром Сергеевичем Гулевичем. Это вещество, являющееся Рисунок 3.8. В.С. Гулевич β-аланил-гистидином (рис. 3.9), было названо карнозином. У карнозина есть аналог, у которого в гетероцикле гистидина водород замещен на метильную группу (β-аланил-метилгистидин, или ансерин). Эти два вещества находятся во многих мышцах в очень больших количествах. Их общая концентрация в цитоплазме иногда достигает 50 миллимолей на литр. В самом начале XX в., за 30 лет до открыРисунок 3.9. Карнозин (протонированная форма) тия АТР, многие метаболиты не были известны,

Bioenergetica.indb 77 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:02:28

78

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

и каждый год открывались все новые и новые вещества биологического происхождения. Шли годы, большинство веществ обретало свое место на метаболической карте, а функции карнозина и ансерина оставались неизвестными. И когда Гулевич уже завершал свой жизненный путь, он завещал своему любимому ученику Сергею Евгеньевичу Северину выяснить функцию этих веществ. С.Е. Северин остался верен заветам своего учителя: он положил жизнь на то, чтобы открыть физиологическую роль карнозина и ансерина. И действительно, в 1952 г., через много лет после смерти Гулевича, функция мышечных дипептидов была выяснена его учеником. Однако функция эта оказалась столь простой и, по мнению С.Е. Северина, примитивной, что он просто Рисунок 3.10. С.Е. Северин не поверил своим глазам. И дальше, до конца своей долгой жизни (С.Е. Северин прожил более 90 лет), он продолжал искать ответ на уже исследованный вопрос, какое значение для жизнедеятельности имеют карнозин и ансерин. А опыт, который в дальнейшем вошел в физиологию как «феномен Северина», состоял вот в чем. Изолированная мышца лягушки возбуждалась электродами и начинала сокращаться. Спустя некоторое время наступало утомление — и сокращения прекращались. Однако когда в среду, которая омывала эту мышцу, добавили карнозин, оказалось, что она может работать часами без всякого утомления. Это был крайне яркий эффект. Сотрудники С.Е. Северина упорно разбирались, что же произошло в мышцах, измеряли самые разные параметры, и оказалось, что в основном все без изменений, кроме одного: в присутствии карнозина мышца в состоянии накапливать колоссальные количества лактата. Отсюда простое объяснение: по-видимому, карнозин связывает образующиеся при гликолизе протоны. Еще в 1939 г. Бэйт-Смит определил значения рKa азотов имидазола гистидинового остатка в мышечных дипептидах. Оказалось, что рKa карнозина равно 6,95, а ансерина — 7,05, т.е. эти вещества обладают pH-буферными свойствами как раз при физиологических значениях рН. Таким образом, конечными продуктами гликолиза в анаэробной мышце являются лактат и протонированный карнозин. Протонированный карнозин — вещь безобидная, и поэтому мышца способна работать, пока не будут запротонированы все молекулы карнозина и ансерина. Бэйт-Смит предсказал, что, может быть, функция этих веществ заключается лишь в том, чтобы забуферить рН в нейтральной области. С.Е. Северин не согласился с такой интерпретацией его результатов, считая буферную функцию слишком простой и даже какой-то убогой. Казалось бы, по сравнению с функциями АТР, NADH, коэнзима А эта функция не выдерживает сравнения по значимости. А дальше произошло следующее. Наблюдение Сергея Евгеньевича было напечатано по-русски, оно не получило резонанса, сам автор не придал

Bioenergetica.indb 78

26.01.2011 18:02:29

Глава 3. Органотрофная энергетика

79

значения открытому им эффекту. Он очень любил этот свой опыт, рассказывал о нем студентам на лекциях, но вновь и вновь пытался найти какие-то другие, альтернативные функции карнозина. Может быть, карнозин действует на нервно-мышечную передачу? Или фосфорилируется, и фосфорилированный карнозин используется в мышцах как макроэрг? Или он как-то влияет на митохондрии? Оказывалось, что почти в каждом случае карнозин как-то себя проявлял… Такого яркого эффекта, который был описан в 1952 г., Сергей Евгеньевич уже никогда больше не увидел, но обнаруживались какие-то небольшие воздействия карнозина, и всегда в хорошую сторону. Это стимулировало интерес исследователя, он перебрал шаг за шагом почти весь обмен веществ, внедряя туда карнозин. К концу своей жизни С.Е. Северин стал одним из самых разносторонне образованных биохимиков мира. Большинство биохимиков России училось у него, прямо или косвенно. А через 30 лет после открытия феномена Северина его опыт был повторен за рубежом с использованием ТРИС-буфера вместо карнозина. Было описано колоссальное увеличение работоспособности мышц под действием этого вещества, и тут уж его объяснили буферным эффектом без всяких ссылок на С.Е. Северина. Карнозин метаболически инертен, что является важным его свойством как специализированного рН-буфера. Карнозин может без проблем протонироваться и депротонироваться, что никак не скажется на ходе различных метаболических процессов. Важно и то, что карнозин — это не простой дипептид. В его состав входит необычная β-аминокислота. По-видимому, это еще один способ сделать данное вещество более инертным, в том числе вывести его из-под контроля обычных пептидаз. Другое важнейшее свойство карнозина — он подвижный pH-буфер, что облегчает выравнивание рН во всей огромной мышечной клетке. В то же время гистидиновые остатки белков, также вносящие вклад в забуферивание рН в нейтральной области, малоподвижны или вовсе неподвижны, как, например, актин и миозин. Как показал расчет, неподвижные pH-буферы лишь усугубляют опасность локального закисления участков клетки. Кроме того, протонирование белков почти всегда сказывается на их биологической функции (вспомним, что практически все ферменты имеют выраженный pH-оптимум). В итоге оказалось, что рН-буферная функция карнозина не единственная. В частности, карнозин является прекрасным хелатором ионов меди и железа, а это отнюдь не безразлично для клетки, поскольку эти катионы — мощные катализаторы превращения перекиси водорода в радикал ОН•, сильнейший метаболический яд (см. главу XV). Оказалось также, что карнозин — наш защитник от повреждающего действия альдегидов на белки и ДНК. По-видимому, при больших концентрациях именно карнозин спасает нас от отравления формальдегидом, а также другими альдегидами. Альдегиды, конечно же, портят карнозин, но он «дешевый» — это всего лишь дипептид. Оказалось, что карнозин каким-то образом защищает клетку и от накопления амилоидных фрагментов, а также от неправильных белок-

Bioenergetica.indb 79

26.01.2011 18:02:29

80

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

белковых взаимодействий и т.д. Однако все эти функции — дополнительные, так как не объясняют, почему природа выбрала дипептиды, которые стоят насмерть на рубеже рН = 7, и почему в больших концентрациях они встречаются только в мышцах. На этом мы завершим небольшое отступление от сугубо биоэнергетических вопросов и перейдем к описанию механизма работы дыхательной цепи.

Bioenergetica.indb 80

26.01.2011 18:02:29

ГЛАВА ЧЕТВЕРТАЯ

ДЫХАТЕЛЬНАЯ ЦЕПЬ

Т ермин «дыхательная цепь» означает последовательность реакций, ответ-

ственных за перенос атомов водорода или электронов от субстратов дыхания к молекулярному кислороду. Различают два типа дыхательных цепей: сопряженные с трансформацией энергии и не сопряженные с ней. Биологическое значение дыхания первого типа стало ясным благодаря работам В.А. Энгельгардта, открывшего в начале 1930-х гг. дыхательное фосфорилирование. Что касается дыхания второго типа, то первые указания на его активную роль были получены почти на 30 лет позже. Концепция, предполагающая, что несопряженное дыхание может быть биологически полезным, была сформулирована одним из авторов этой книги в 1960 г. Данная глава будет посвящена описанию сопряженной с трансформацией энергии дыхательной цепи митохондрий и аналогичным ей дыхательным цепям бактерий. В клетках эукариот дыхание, сопряженное с трансформацией Рисунок 4.1. В.А. Энгельгардт энергии, локализовано во внутренней мембране митохондрий. У дышащих бактерий тот же процесс обнаруживается в цитоплазматической мембране, мезосомах или тилакоидах.

4.1. Принцип действия Как было изложено в разделах, посвященных фотосинтезу, основным источником энергии для жизни на Земле является энергия солнечного света. Такие автотрофные организмы, как цианобактерии и растения, используют энергию квантов света для осуществления двух одновременно протекающих процессов, а именно — для запасания энергии в виде (с последующим ее преобразованием в форму ATP) и для разложения воды и переноса полученных электронов на NADP+. В ходе последнего процесса также запасается значительное количество энергии, но уже в виде разности окислительно-

Bioenergetica.indb 81

26.01.2011 18:02:29

82

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

восстановительных потенциалов, так как потенциал пары NADP+/NADPH (E0′ = –320 мВ) значительно более отрицателен по сравнению с парой О2/ Н2О (E0′ = +820 мВ). Образованные в ходе фотосинтеза ATP и NADPH используются для процессов фиксации углекислого газа. Во время этих реакций образуются углеводы, а далее жиры, аминокислоты, нуклеотиды, т.е. весь необходимый материал для построения клетки. Гетеротрофные организмы обычно не способны напрямую использовать энергию света, и поэтому основным доступным для них источником является энергия, накопленная растениями в виде разности окислительновосстановительных потенциалов. Значит, гетеротрофные организмы в первом приближении просто обращают реакции фотосинтеза. Сначала они (как было описано в главе III) при протекании реакций гликолиза и цикла Кребса окисляют углеродные атомы углеводов, жирных кислот и аминокислот до СО2, а полученные таким образом электроны используют для образования NADH. Далее NADH окисляется молекулярным кислородом с образованием воды. Как было сказано выше, NADH-оксидазная реакция характеризуется очень большим количеством свободной энергии (порядка 1,1 электрон-вольта при переносе одного электрона с NADH на кислород), которая может быть запасена дыхательной цепью в виде . Величина протон-движущей силы на биологических мембранах обычно составляет около 200 мВ, так как при больших величинах электрического потенциала возможен пробой липидного бислоя и утрата запасенной энергии. Таким образом, нетрудно подсчитать, что для запасания энергии NADH-оксидазной реакции перенос каждого электрона с NADH на кислород должен быть сопряжен с транслокацией не менее пяти протонов через мембрану, а полный процесс, т.е. восстановление молекулы кислорода до воды, должен сопровождаться трансмембранным переносом 20 протонов*. В то же время трудно себе представить фермент, способный переносить через мембрану сразу 20 протонов в ходе одного каталитического акта. По-видимому, необходимость такой высокой стехиометрии Н+/О2 заставила природу пойти иным путем: NADH-оксидазная реакция была разбита на несколько этапов (в митохондриях животных таких этапов три). Сначала два электрона с NADH переносятся на убихинон NADH-CоQредуктазой (комплексом I), затем полученный убихинол окисляется цитохромом с посредством CoQH2-цитoхpом с-редуктазы (комплекса bс1, или комплекса III), и в завершение восстановленный цитохром с окисляется молекулярным кислородом под действием цитохром с-оксидазы (комплекса IV). Активность всех этих трех ферментных комплексов сопряжена с генерацией мембранного потенциала. Как видно на рис. 4.2, разница окислительно-восстановительных потенциалов между субстратами и продуктами реакции в случае с комплексом I равна ~380 мВ, в случае с комплексом III ~190 мВ, для комплекса IV * Если пользоваться электротехнической терминологией, то можно сравнить работу дыхательной цепи с функционированием понижающего трансформатора.

Bioenergetica.indb 82

26.01.2011 18:02:29

Глава 4. Дыхательная цепь

83

~570 мВ*. Принимая значение мембранного потенциала равным приблизительно 200 мВ, легко подсчитать, что комплексы I, III и IV при транспорте одного электрона могут соответственно переносить 2, 1 и 2–3 Н+. Экспериментальным путем было установлено, что комплекс I переносит 2 Н+/ , комплекс III — 1 Н+/ , а комплекс IV — 2 Н+/ . При сопоставлении потенциалов и стехиометрии Н+/ становится очевидным, что комплексы I и III практически всю энергию перепада окислительно-восстановительных потенциалов Рисунок 4.2. Схема переноса запасают в виде . В то же время перепад электронов и генерации энергии на последнем участке гораздо больше, в дыхательной цепи митохондрий высших животных чем на предыдущих, а стехиометрия Н+/ для цитохромоксидазы такая же, как и в случае с комплексом I (два Н+ на один ). Таким образом, значительная часть энергии на последней стадии рассеивается в виде тепла, и она, в отличие от реакций, происходящих на остальных стадиях, имеет необратимый характер. Благодаря большому энергетическому перепаду последняя стадия как бы тянет за собой все сопряженные реакции дыхательной цепи, а с ними и весь аэробный метаболизм клетки. Как показано на рис. 4.3 А, последовательность реакций дыхательной цепи начинается окислением NADH. В процессе участвует несколько редокс-центров NADH-СoQ-редуктазного комплекса: FMN и группа [Fe–S] кластеров. NADH-СoQ-редуктаза восстанавливает СoQ. Полученный СoQH2 окисляется системой Q-цикла, включающей [Fe–S] кластер комплекса III (Fe–SIII Риске), цитохром с1 и два гема цитохрома b (высокопотенциальный bH и низкопотенциальный bL). Непосредственным акцептором электронов для CoQH2 служит Fe–SIII. От Fe–SIII электроны поступают на цитохром c1 и далее на цитохром с. Последний используется как восстановитель конечного фермента дыхательной цепи — цитохромоксидазы, имеющей в своем составе два гема (а и aз) и три атома меди. Цитохромоксидаза восстанавливает кислород до воды. Процесс окисления NADH кислородом сопряжен с переносом 10 протонов из митохондриального матрикса (у бактерий — из цитоплазмы) в межмембранное пространство митохондрий (у грамотрицательных бактерий — в периплазму, а у грамположительных — во внешнюю среду). Образованный мембранный потенциал далее расходуется на синтез ATP при помощи так называемого комплекса V (протонной ATP-синтазы) либо на совершение некоторых других типов полезной работы. * Важно отметить, что в тексте и на рис. 4.2 приведены значения стандартных окислительно-восстановительных потенциалов (E0′). В клетке из-за разницы в концентрациях соответствующих окисленной и восстановленной форм редокс-соединений значения их окислительно-восстановительных потенциалов могут существенно отличаться от E0′.

Bioenergetica.indb 83

26.01.2011 18:02:29

84

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 4.3. А — митохондриальная дыхательная цепь. АН2 — субстрат дыхания, восстанавливающий NAD+. Перенос электронов показан черными стрелками, а трансмембранный перенос протонов — синими стрелками. Ингибиторы даны красным. Б — значения среднеточечных потенциалов различных переносчиков электронов дыхательной цепи митохондрий

Bioenergetica.indb 84

26.01.2011 18:02:30

Глава 4. Дыхательная цепь

85

Описанное выше многокомпонентное устройство дыхательной цепи, помимо обеспечения высокой стехиометрии Н+/О2, имеет еще ряд дополнительных преимуществ. Прежде всего это придает ей известную гибкость в использовании субстратов с разными окислительно-восстановительными потенциалами. Восстановительные эквиваленты могут поступать в дыхательную цепь на различных ее уровнях в зависимости от редокс-потенциала окисляемого субстрата. Если этот потенциал оказывается меньше, равен или лишь немногим больше –320 мВ (редокс-потенциал пары NADH/ NAD+), то в окислении такого субстрата может участвовать вся дыхательная цепь. Именно так окисляется большинство субстратов дыхания. Рисунок 4.4. А.Л. Ленинджер Если редокс-потенциал субстратов окисления намного отрицательней такового пары NADH/NAD+, то, как описано в предыдущей главе, в систему переноса электронов может быть включен специальный механизм накопления энергии еще до дыхательной цепи. Такого типа реакции относят к разряду процессов трансформации энергии на уровне субстрата, или субстратного фосфорилирования (см. выше, разд. 3.3). Если редокс-потенциал субстрата значительно более положительный, чем у пары NAD+/NADH, то восстановительные эквиваленты с такого суб-

Рисунок 4.5. Шкала окислительно-восстановительных потенциалов различных соединений, имеющих отношение к функционированию дыхательной цепи

Bioenergetica.indb 85

26.01.2011 18:02:31

86

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

страта переносятся на средний или конечный участок дыхательной цепи. Так окисляется один из субстратов цикла Кребса — сукцинат (редокс-потенциал +30 мВ), а также ацил-СоА — субстрат первой оксидоредукции в системе β-окисления жирных кислот. И сукцинат, и ацил-СоА-дегидрогеназы подают электроны в дыхательную цепь, минуя комплекс I, т.е. переносят электроны сразу на убихинон. В очень редких случаях редокс-потенциал окисляемого субстрата более положителен, чем даже у СoQ. Тогда восстановительные эквиваленты входят в цепь на уровне цитохрома с, так что только цитохромоксидазный -генератор участвует в трансформации энергии. Примером может служить окисление аскорбиновой кислоты у животных или окисление метанола, ионов Fe2+ или нитрита у различных бактерий. На рис. 4.5 приведены окислительно-восстановительные потенциалы некоторых компонентов, имеющих отношение к дыхательной цепи (потенциалы полувосстановления (Е0′) представлены в вольтах и измерены при рН 7,0).

4.2. NADH-CoQ-редуктаза Как было описано выше, NADH-CoQ-редуктаза (комплекс I) катализирует перенос электронов с NADH на хинон, и эта реакция сопряжена с транслокацией четырех протонов через мембрану. Данный ферментативный комплекс является начальным этапом работы дыхательной цепи. К сожалению, комплекс I — наименее изученный компонент этой цепи. Очень сложное строение комплекса I (огромное количество субъединиц и редокскофакторов), его чрезвычайная лабильность при выделении и отсутствие данных с высоким разрешением о трехмерной структуре полного комплекса крайне затрудняют изучение этого фермента.

4.2.1. Белковый состав комплекса I По субъединичному составу комплекс I является наиболее сложным компонентом дыхательной цепи. Сегодня считается, что у млекопитающих данный фермент состоит из 45 разных полипептидов, каждый из которых имеется в одном экземпляре. Общая масса комплекса оказывается порядка 980 кДа. Комплекс I из митохондрий низших эукариот, по-видимому, устроен несколько проще. Но и он состоит не менее чем из 30 субъединиц (так, для комплекса I дрожжей Yarrowia lipolytica на сегодняшний день идентифицировано 37 субъединиц). В то же время дыхательные цепи многих бактерий содержат комплекс I (в этом случае используют также название NDH-1), состоящий всего из 14 субъединиц*. При этом такой упрощенный фермент с весом всего в 530 кДа успешно выполняет свою главную функцию: он переносит два * У энтеробактерий NDH-1 состоит из 13 субъединиц, но не за счет отсутствия одного из основных полипептидов, а за счет слияния генов двух субъединиц (nuoC и nuoD) в один удлиненный ген (nuoCD).

Bioenergetica.indb 86

26.01.2011 18:02:32

Глава 4. Дыхательная цепь

87

Рисунок 4.6. Пространственная организация комплекса I из бактерии Escherichia coli (желтым цветом — периферический домен и синим — мембранный домен) и комплекса I из митохондрий гриба Neurospora crassa (голубая штриховка) [Guenebaut et al., 1998, J. Mol. Biol., 276: 105–112]

электрона с NADH на хинон, и этот процесс сопряжен с транслокацией 4-х протонов через мембрану. Вот почему 14-субъединичный бактериальный фермент считается минимальной формой комплекса I. Субъединицы бактериального комплекса I весьма консервативны, поскольку их аналоги присутствуют во всех известных на сегодняшний день Н+-транслоцирующих NADH:хинон-оксидоредуктазах. Далее для простоты изложения мы будем рассматривать структуру и функции комплекса I в основном на примере более простого бактериального фермента. При этом остается неясным следующий вопрос: если аналоги 14 основных (бактериальных) субъединиц достаточны для функционирования комплекса I, то в чем же заключается роль остальных субъединиц (их тридцать одна) митохондриального фермента? Считается, что, скорее всего, они могут принимать какое-то участие в процессе сборки комплекса I и регуляции его активности. Здесь уместно отметить, что наличие дополнительных субъединиц характерно и для других ферментов дыхательной цепи митохондрий, если сравнить с их бактериальными аналогами. 14 генов, кодирующих субъединицы комплекса I, в геномах большинства прокариот объединены в один оперон. Данные гены чаще всего называют nuo (от NADH: ubiquinone oxidoreductase) в алфавитном порядке в соответствии с их последовательностью в опероне (эта последовательность генов в nuo-опероне является консервативной для разных бактерий). Семь из этих белков (NuoA, H, J, K, L, M, N) исключительно гидрофобны. Они являются интегральными мембранными полипептидами и в сумме, по-видимому, образуют 54 трансмембранные α-спирали. Остальные семь субъединиц относительно гидрофильны и крепятся к мембране в основном за счет белок-белковых взаимодействий с гидрофобными субъединицами. В случае с комплексом I эукариот аналоги семи гидрофобных бактериальных субъединиц кодируются в митохондриальном геноме и синтезируются митохондриальными рибосомами. Остальные 37 субъединиц кодируются в ядре, синтезируются в цитоплазме и оказываются в митохондриях лишь после транспортировки через две митохондриальные мембраны*. * Хотелось бы отметить, что эта закономерность (т.е. то, что митохондриальный геном содержит лишь гены наиболее гидрофобных субъединиц) характерна и для других компонентов дыхательной цепи. По-видимому, транспорт столь гидрофобных полипептидов через цитоплазму и внешнюю мембрану митохондрий крайне затруднен. Вот почему соответствующие гены были оставлены в геноме митохондрий, а не перенесены вместе подавляющим большинством генов других митохондриальных белков в ядро. Так можно объяснить сохранение генома у этой уникальной органеллы.

Bioenergetica.indb 87

26.01.2011 18:02:32

88

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Как было сказано выше, на сегодняшний день еще не удалось провести рентгеноструктурный анализ полного комплекса I и, следовательно, определить его трехмерную структуру с атомным разрешением. Однако общая конфигурация этого комплекса была установлена с помощью электронной микроскопии. Было показано, что комплекс I имеет L-образную форму с двумя доменами, расположенными под прямым углом друг к другу (см. рис. 4.6). Один из доменов расположен в мембране, а второй, периферический домен выступает из нее в матрикс митохондрий (или цитоплазму бактерий) приблизительно на 150 Å. Именно в периферическом домене расположено большинство редокс-центров фермента.

4.2.2. Кофакторный состав комплекса I Уже на ранних этапах изучения комплекса I было установлено, что в качестве редокс-кофакторов этот фермент содержит нековалентно связанный FMN и ряд [Fe–S] кластеров. С помощью ЭПР-спектроскопии было определено, что [Fe–S] кластеров в ферменте по крайней мере пять. Два из них (N1a и N1b) являются кластерами [2Fe–2S] типа, а остальные (N2, N3 и N4) — [4Fe–4S] типа. Однако при анализе аминокислотной последовательности субъединиц комплекса I выяснилось, что этот фермент теоретически может нести на себе до 8 [Fe–S] кластеров (см. табл. 4.1). По-видимому, именно эта цифра соответствует действительности, но ЭПРсигналы от некоторых кластеров оказываются крайне уширенными из-за сильных диполь-дипольных взаимодействий между собой и поэтому не могут быть идентифицированы с помощью ЭПР-спектроскопии (например, к таким кластерам относятся два [4Fe–4S] центра N6a и N6b в субъединице NuoI). Недавно методом рентгеноструктурного анализа гидрофильной части комплекса было прямо продемонстрировано, что в состав комплекса I входят 8 [Fe–S] кластеров (см. ниже, рис. 4.9). В комплексе I присутствует также прочно связанный убихинон, который, по-видимому, тоже может функционировать в качестве редокс-кофактора этого белка.

4.2.3. Субфрагменты комплекса I При обработке хаотропными агентами комплекс I удается разделить на три составные части (субфрагменты). Один из них, названный флавопротеином (FP), содержит две субъединицы этого белка и включает по крайней мере два [Fe–S] кластера (N1a и N3), FMN, а также NADH-связывающий участок. FP способен окислять NADH искусственными гидрофильными акцепторами электронов (например, феррицианидом), но не природными гидрофобными убихинонами. Второй субфрагмент комплекса I, названный железопротеидом (IP), несет в своем составе пять субъединиц и содержит несколько [Fe–S] кластеров. Этот фрагмент полностью лишен ферментативных активностей. В сумме FP и IP образуют периферический домен комплекса I. Третий субфрагмент (гидрофобный субкомплекс, или HP) включает семь субъединиц комплекса I и, так же как и IP, не проявляет фермента-

Bioenergetica.indb 88

26.01.2011 18:02:32

89

Глава 4. Дыхательная цепь Таблица 4.1. Свойства 14 субъединиц бактериального комплекса I Субъединица

Принадлежность к субкомплексам

Молекулярный вес, кДа

NuoA

HP

19

NuoB

IP

28

Связывание простетических групп

[4Fe–4S] (N2)

NuoC

IP

25

NuoD

IP

65

NuoE

FP

18

[2Fe–2S] (N1a)

NuoF

FP

45

NADH, FMN, [4Fe–4S] (N3)

NuoG

HP

90

[4Fe–4S] (N4), [4Fe–4S] (N5), [2Fe–2S] (N1b)

NuoH

HP

32

NuoI

IP

23

NuoJ

IP

23

NuoK

HP

10

NuoL

HP

45

NuoM

HP

40

NuoN

HP

38

[4Fe–4S] (N6a), [4Fe–4S] (N6b)

тивной активности. Важно отметить, что HP не содержит флавина и [Fe–S] кластеров, и, таким образом, все известные редокс-кофакторы комплекса I (за исключением хинона) расположены в периферическом домене этого белка. Разделение комплекса I на субфрагменты помимо задачи изучения топологии этого фермента имеет также некоторое значение для понимания эволюционного происхождения столь сложного белка. По-видимому, такой исключительно большой и сложный ферментативный комплекс мог быть сконструирован в ходе эволюции лишь за счет комбинирования и объединения в одно целое частей различных предсуществующих ферментов. При сравнении первичных последовательностей субъединиц комплекса I с другими известными белками выяснилось, что основная часть субфрагмента IP ведет свое происхождение от водорастворимой [Ni-Fe]-гидрогеназы, катализирующей перенос электронов на ионы H+ с образованием молекулярного водорода. Мембранная часть комплекса I (HP) имеет сходство с мультисубъединичным комплексом Mrp алкалофильных бацилл, предположительно являющимся Na+(K+)/H+-антипортером. Объединение этих двух ферментативных модулей, по-видимому, позволило создать белок, сопрягающий перенос электронов от [Fe–S] кластеров на хинон с трансмембранным транспортом протонов. Третья часть комплекса I — FP — играет роль адаптора и обеспечивает субстратную специфичность этого фермента по отношению к донору электронов. Интересно отметить, что у ряда прокариот есть ферменты, гомологичные комплексу I, которые, однако, вместо субфрагмента FP содержат другие, негомологичные NuoE и NuoF субъе-

Bioenergetica.indb 89

26.01.2011 18:02:32

90

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

диницы. Такая замена привела к изменению субстратной специфичности. Например, есть основания полагать, что у некоторых архей подобный ферментативный комплекс окисляет не NADH, а особый кофактор — F420H2; у цианобактерий и хлоропластов — NADPH, а у бактерии Helicobacter pylori (способной вызывать у человека язву желудка) — ферредоксин.

4.2.4. Ингибиторы комплекса I На сегодняшний день описано огромное количество ингибиторов комплекса I. Весь этот широкий спектр соединений можно разделить на две группы по месту их действия: практически все известные ингибиторы комплекса I препятствуют взаимодействию фермента либо с NADH, либо с хиноном. К наиболее известным ингибиторам NADH-дегидрогеназного участка фермента относятся реин и ADP-рибоза, а к ингибиторам хинонредуктазного участка — ротенон, пирицидин А, амитал, капсаицин и многие другие. Места связывания ингибиторов хинон-редуктазного участка находятся между железо-серным кластером N2 и CoQ. Прежде всего это структурные аналоги CoQ, а также многие гидрофобные соединения, которые вытесняют жирный изопреноидный «хвост» CoQ из участка его связывания в комплексе I. Некоторые гидрофобные ингибиторы имитируют хиноновую «головку» CoQ. Одним из первых обнаруженных ингибиторов был амитал из класса барбитуратов. Вскоре было установлено, что диапазон его эффективных концентраций находится в миллимолярной области и ингибиторный эффект обусловлен неспецифическими гидрофобными взаимодействиями с ферментом. Противоядием по отношению к амиталу является водорастворимый витамин K3, который способен шунтировать перенос восстановительных эквивалентов через участок фермента, чувствительный к барбитуратам. Использование обходного пути ухудшает эффективность работы комплекса, однако позволяет избежать фатальных последствий при избытке барбитуратов. Очень интересный опыт был поставлен Б. Чансом и его коллегами, которые исследовали митохондрии из мышц девочки, страдавшей сильной мышечной слабостью. Ребенок не мог передвигаться без инвалидной коляски. Сначала Чанс проанализировал влияние физической нагрузки на уровень креатинфосфата в мышцах. Оказалось, что креатинфосфат быстро снижается на фоне мышечной активности, а при отдыхе патологически медленно восстанавливается. С точки зрения биоэнергетика, самым простым объяснением такого эффекта могло быть понижение скорости образования ATP в сравнении с нормой. Для проверки этого предположения была сделана биопсия мышц, выделены митохондрии миоцитов и проанализирована активность комплексов Рисунок 4.7. Б. Чанс дыхательной цепи. В результате было обнаружено

Bioenergetica.indb 90

26.01.2011 18:02:33

91

Глава 4. Дыхательная цепь

сильное ингибирование переноса электронов между I и III комплексами дыхательной цепи. После введения витамина K3 (в смеси с аскорбиновой кислотой) произошло чудесное исцеление пациентки: уже через час девочка почувствовала возвращение сил и встала с инвалидной коляски. Хотя для поддержания нормальной мышечной активности было необходимо возобновлять инъекции витамина K3 через каждые шесть часов, девочка рассталась с инвалидной коляской, поступила в колледж и успешно закончила его, вышла замуж и смогла прожить полноценную жизнь. Самым популярным среди биоэнергетиков ингибитором комплекса I можно считать ротенон, известный еще под названием «рыбий яд», поскольку это соединение использовали для того, чтобы избавиться от «сорной» рыбы в водоеме, прежде чем заселить его промысловыми видами рыб. Необходимо уточнить, что для прочих животных ротенон — такой же яд, как и для рыб. Другим интересным примером ингибиторов комплекса I является капсаицин. Именно это соединение придает жгучий вкус красному перцу. Капсаицин ингибирует комплекс I лишь при относительно высоких концентрациях, однако к данному веществу чувствительны все известные представители этого класса ферментов. Таким образом, капсаицин часто используется для идентификации комплекса I в дыхательных цепях различных организмов. Важно отметить, что многие детергенты (в том числе и широко используемые в быту) являются мощными ингибиторами комплекса I и поэтому далеко небезопасны. Например, подобным действием обладают додецилсульфат и Тритон Х-100.

4.2.5. Возможные механизмы генерации

комплексом I

Прежде чем подойти к описанию возможных механизмов генерации протонного потенциала комплексом I, остановимся вкратце на том, как вообще окислительно-восстановительные реакции могут быть сопряжены с транслокацией протонов через мембрану. В электрон-транспортных цепях возможны два принципиально разных способа генерации . Первый из них основан на переносе через мембрану восстановительных эквивалентов в форме электронов. При этом переносчиками служат такие редокс-кофакторы и простетические группы, как хлорофиллы, цитохромы, [Fe–S] кластеры, ионы меди, витамин K1 и т.д. Этот механизм был предложен П. Митчелом и получил название «Митчеловой петли». Как видно на рис. 4.8 А, в ходе функционирования такой петли с внутренней стороны мембраны (в случае митохондрий — со стороны, обращенной в матрикс) поглощается два протона, на внешней стороне мембраны выделяются два протона, а через всю толщу мембраны переносятся два электрона в сторону матрикса митохондрий. Этот процесс эквивалентен переносу двух ионов Н+ из матрикса во внешнюю среду, хотя нетрудно заметить, что в данном случае такого непосредственного трансмембранного переноса протонов не происходит. Данный механизм с неизбежностью подразумевает стехиометрию Н+/ при генерации равную 1. Именно по такой схеме происходит образование протонного потенциала в описанных

Bioenergetica.indb 91

26.01.2011 18:02:33

92

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

в главе II фотосинтетических электронтранспортных цепях. Второй возможный механизм гебыл выдвинут С. Папой нерации (S. Papa) и, независимо от него, одним из авторов этой книги (В.П.С.). Он получил название «протонной помпы». В данном случае энергия окислительно-восстановительных реакций должна быть сопряжена с конформационными изменениями в белке и изменением значений рK различных протон-акцепторных групп. За счет этого происходит непосредственный трансмембранный перенос ионов Н+ (рис. 4.8 Б). Такой процесс уже не должен иметь жесткой стехиометрии Н+/ = 1. Количество «помпированных» протонов теоретически может быть различным. Более того, в данном случае Н+ может быть заменен какимлибо другим ионом, например ионом Рисунок 4.8. Схема генерации транснатрия. мембранного протонного потенциала по Попробуем теперь рассмотреть, камеханизму Митчеловой петли (А) или протонной помпы (Б) ким образом генерируется протонный потенциал в случае с комплексом I. Сначала многие исследователи предполагали, что данный фермент может функционировать по механизму Митчеловой петли. Высказывались гипотезы, что FMN или хиноны этого белка переносят через мембрану атомы водорода, а многочисленные [Fe–S] кластеры формируют трансмембранный путь транспорта электронов. Однако существуют очень серьезные трудности в реализации таких механизмов. Прежде всего напомним, что стехиометрия Н+/ для комплекса I равна 2, т.е. необходимо обеспечить функционирование сразу двух Митчеловых петель во время работы этого фермента. Более того, как мы уже отмечали выше, оказалось, что практически все кофакторы комплекса I (кроме хинонов) расположены в периферическом домене этого фермента, т.е. вынесены на значительное расстояние из мембраны. Поэтому они вряд ли способны осуществить трансмембранный перенос атомов водорода или электронов. Таким образом, наиболее вероятно, что комплекс I генерирует протонный потенциал по механизму протонной помпы. Однако остается неясным, каким образом протоны переносятся через мембрану и как их транспорт сопряжен с катализируемыми комплексом I редокс-реакциями. Можно лишь предполагать, какие именно этапы переноса электронов в комплексе I могли быть сопряжены с транслокацией протонов. Для этого важно отметить, что значения Em′ для FMN и большинства [Fe–S] кластеров находятся в

Bioenergetica.indb 92

26.01.2011 18:02:33

Глава 4. Дыхательная цепь

93

Рисунок 4.9. (A) Трехмерная структура периферического домена комплекса I из T. thermophilus. Красно-оранжевым цветом указано расположение [Fe–S] кластеров. Стрелкой указан карман в структуре белка, являющийся, по-видимому, местом связывания убихинона. (Б) Расположение [Fe–S] кластеров в комплексе I из T. thermophilus. Расстояние между центрами кластеров, а также (в скобках) между их краями указано в ангстремах [Sazanov & Hinchliffe 2006, Science 311: 1430–1436]

диапазоне от –370 до –240 мВ, т.е. не очень отличаются от потенциала пары NAD+/NADH. И лишь среднеточечный потенциал [Fe–S] кластера N2 более положителен (в зависимости от объекта исследования от –20 до –150 мВ). Совсем недавно в группе Л. Сазанова методом рентгеноструктурного анализа была определена трехмерная структура периферического домена комплекса I из термофильной бактерии Thermus thermophilus (рис. 4.9 А). В этой работе удалось надежно продемонстрировать количество [Fe–S] кластеров и их взаимное расположение в белке (рис. 4.9 Б). Восемь основных железо-серных кластеров* образуют в периферическом домене электронпроводящую цепь, вытянутую вдоль всего белкового комплекса. Место связывания FMN расположено между кластерами N1a и N3. Приняв во внимание эти данные, можно было бы предположить следующую последовательность переноса электронов в этом белке. Сначала NADH передает два электрона на FMN. Далее с FMNН2 дважды происходит перенос одного электрона по цепочке, построенной из изопотенциальных [Fe–S] кластеров (N3, N1b, N5, N4, N6a и N6b). Здесь * Комплекс I из T. thermophilus по сравнению с другими гомологичными белками этого семейства содержит дополнительный [4Fe–4S] кластер (N7). Однако этот кофактор не является консервативным и, по-видимому, не принимает участия в переносе электронов от NADH к хинону, а играет какую-то другую роль.

Bioenergetica.indb 93

26.01.2011 18:02:34

94

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

важно отметить роль флавина в процессе окисления NADH. Как известно, NADH является переносчиком гидрид-иона (Н–), т.е. он может быть донором двух (и только двух!) электронов. В то же время [Fe–S] кластер обычно может принять на себя только один электрон. А вот особенностью флавинов является то, что они могут выступать в качестве как двух-, так и одноэлектронных переносчиков (в последнем случае с образованием флавосемихинонной формы). Таким образом, флавин в комплексе I (а также и во многих других белках) выступает в роли адаптора между двух- и одноэлектронными редокс-кофакторами. На сегодняшний день еще непонятна роль кластера N1а. По-видимому, этот кофактор не входит в электронтранспортную цепь, так как он расположен «выше» места связывания флавина и имеет более отрицательный, чем флавин, редокс-потенциал. Кластер N1а, скорее всего, необходим для временного окисления семихинона FMN, если этот кофактор по каким-то причинам не может отдать второй электрон в электрон-проводящий путь тотчас после первого электрона. Это должно значительно уменьшить время жизни флавосемихинона и, стало быть, скорость генерации активных форм кислорода комплексом I, так как (1) флавосемихинон очень легко восстанавливает О2 до O и (2) FMN, находясь в NADH-связывающем участке комплекса I, должен быть доступен для такой маленькой молекулы, как О2. Из-за того, что между NADH и изопотенциальной группой [Fe–S] кластеров нет значительного перепада редокс-потенциалов, считается, что перенос электронов от NADH до N6b не сопровождается генерацией . А вот при переносе электрона от N6b на N2, а также от N2 на хинон высвобождается достаточное количество энергии для трансмембранного переноса протона. Вот почему полагают, что именно эти реакции могут быть сопряжены с генерацией протонного потенциала. Важно отметить, что в отличие от большинства других [Fe–S] кластеров среднеточечный потенциал кластера N2 является рН-зависимым (сдвигается на 60 мВ при изменении значений рН на одну единицу). Это означает, что его восстановление сопровождается протонированием, а окисление — депротонированием какого-то аминокислотного остатка. Если этот остаток находится внутри трансмембранного протон-проводящего пути, то перенос электрона через кластер N2 мог бы сопровождаться генерацией протонного потенциала.

4.3. CoQH2-цитохром с-редуктаза NADH-CoQ-Редуктаза восстанавливает CoQ, который в свою очередь передает электроны на следующий сегмент дыхательной цепи, называемый CoQН2-цитохром с-редуктазой (комплекс bс1, или комплекс III). Комплекс III переносит электроны с хинола на цитохром с, и данная реакция сопряжена с генерацией со стехиометрией, равной 1 Н+/ .

Bioenergetica.indb 94

26.01.2011 18:02:34

95

Глава 4. Дыхательная цепь

4.3.1. Структурные аспекты bс1-комплекса В настоящее время удалось получить кристаллы CoQH2-цитохром с-редуктаз из митохондрий быка, курицы и дрожжей, а также определить трехмерную структуру этого белка с разрешением в 2,3 Å. Определение трехмерной структуры с хорошей степенью разрешения значительно упростило изучение этого фермента, и, в отличие от описанного выше комплекса I, нам уже, по-видимому, известны основные аспекты функционирования bс1-комплекса. Полипептидный состав комплекса III из митохондрии сердца быка приведен в табл. 4.2. Комплекс III дыхательной цепи является гомодимерным мультисубъединичным ферментом. Каждый из мономеров bс1-комплекса содержит три каталитические субъединицы, несущие на себе четыре редоксцентра: это низко- и высокопотенциальные гемы bL и bH, связанные с цитохромом b; негемовый железосерный кластер [2Fe–2S] типа, включенный в соответствующий апопротеин (FeSIII, или белок Риске; другое название «фактор Слейтера»); и гем С, присоединенный к апопротеину цитохрома c1. Наряду с переносчиками восстановительных эквивалентов в состав CoQН2-цитохром с-редуктазы митохондрий входят еще восемь полипептидов, лишенных простетических групп. Один из них (субъединица VI) связывает CoQ. Он состоит из 110 аминокислотных остатков и содержит большое количество (около 50%) α-спиральных участков. Существуют данные, что субъединица Х связывается с цитохромом c1 и облегчает его взаимодействие с цитохромом с. В этой субъединице 27% всех аминокислотных остатков составляют глутамат и глутамин, причем вблизи N-конца расположен кластер из восьми следующих друг за другом остатков глутамата. По всей вероятности, именно этот отрицательно заряженный участок белка взаимодействует с цитохромом с, который содержит много положительно заряженных аминокислотных остатков. Самые крупные субъединицы I и II — так называеТаблица 4.2. Субъединицы комплекса bc1 из митохондрий сердца быка Субъединица

Молекулярная масса, кДа

Название

I

49,5

Сердцевинный белок I

II

47,0

Сердцевинный белок II Неизвестна

III

44,0

Цитохром b

Связывает гемы bL и bH

Bioenergetica.indb 95

Функция

Неизвестна

IV

28,0

Цитохром с1

Связывает гем с1

V

21,5

Белок Риске

Связывает [2Fe–2S] кластер

QIII-белок

Связывает CoQ

VI

13,5

VII

9,5

–

Неизвестна

VIII

9,0

–

Неизвестна

IX

8,0

–

Неизвестна

X

7,0

–

Связывает цитохром с

XI

6,5

–

Связывает белок Риске

26.01.2011 18:02:35

96

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

мые сердцевинные белки (core proteins). Это неудачное название было придумано в те годы, когда еще ничего не было известно о пространственной структуре комплекса III. Ошибочное представление об этих белках как о центрах структурной организации bс1-комплекса подтверждалось, казалось бы, тем, что они крупнее других субъединиц комплекса и в их составе нет редокс-групп. Впоследствии оказалось, что эти белки занимают в ферменте периферическое положение. Самая маленькая субъединица комплекса III (XI) участвует в связывании белка Риске. Что касается других полипептидов, не имеющих редокс-центров, их функции остаются неясными. Лишь один белок из 11 полипептидов, входящих в состав bс1-комплекса эукариот, а именно цитохром b, кодируется в митохондриальном геноме. Гены остальных белков находятся в клеточном ядре. Интересно отметить, что дыхательная цепь многих бактерий также содержит фермент, гомологичный bс1-комплексу эукариот. Однако как и бактериальные Н+-транслоцирующие NADH:хинон-оксидоредуктазы, bс1комплексы прокариот устроены значительно проще своих митохондриальных аналогов. Эти ферменты состоят всего лишь из трех полипептидов, гомологичных трем каталитическим субъединицам митохондриального комплекса III (цитохрому b, цитохрому с1 и белку Риске). Как было изложено ранее (см. разд. 2.3.3), в хлоропластах растений функционирует очень близкий аналог bс1-комплекса — b6f-комплекс. Он принимает участие в работе фотосинтетической электрон-транспортной цепи, где его основная роль заключается в передаче электронов от фотосистемы II на фотосистему I. По своей структуре и механизму функционирования b6f-комплекс является практически полным аналогом митохондриального комплекса III. Однако интересно отметить, что b6f-комплекс содержит ряд дополнительных кофакторов. Наиболее интересным отличием является то, что в его состав входят не два, а три гема. Дополнительный гем, названный ci, расположен рядом с гемом bH. Его функции на сегодняшний день неизвестны.

4.3.2. Рентгеноструктурный анализ III комплекса На рис. 4.10 приведены результаты рентгеноструктурного анализа комплекса III. Более узкая часть этого фермента пронизывает мембрану, а более широкие его части выступают в матрикс митохондрий и в межмембранное пространство. Центральный гидрофобный домен bс1-комплекса сформирован восемью трансмембранными α-спиралями цитохрома b. В трехмерном пространстве α-спирали могут образовать «хоровод», в котором поблизости оказываются трансмембранные участки с удаленными порядковыми номерами. К примеру, оказалось, что соседом 2-го α-спирального столба является 5-й (см. рис. 4.10), причем каждая из этих α-спиралей содержит пару остатков гистидина. Данные остатки служат для перекрестного хелатирования двух гемов. Расстояние между атомами железа гемов bL и bH равно 21 Å (что составляет около половины от толщины мембраны). Существует и дополнительный способ крепления каждого гема к белку при помощи связи

Bioenergetica.indb 96

26.01.2011 18:02:35

Глава 4. Дыхательная цепь

97

Рисунок 4.10. Трехмерная структура дрожжевого комплекса III. А — гомодимерный комплекс, состоящий из каталитических субъединиц цитохрома b (голубой цвет), белка Риске (зеленый цвет) и цитохрома c1 (желтый цвет) с соответствующими простетическими группами (черный цвет), а также из восьми дополнительных субъединиц, шесть из которых показаны отдельными цветами: сердцевинный белок I (фиолетовый), сердцевинный белок II (сине-зеленый), субъединица VI (синий), VII (красный), VIII (розовый) и IX (серый). Б — каталитические субъединицы одного мономера. QP и QN — места связывания хинона в комплексе III [Hunte et al., 2003, FEBS Lett., 545: 39–46]

между карбоксильными группами пропионатных остатков гема и протонированными аминогруппами лизиновых остатков полипептида. Цитохром с1 и белок Риске связаны с мембраной за счет одиночных трансмембранных спиралей, а их каталитические домены обращены в межмембранное пространство митохондрий. При этом «сердцевинные белки» находятся в широкой части фермента со стороны матрикса митохондрий. Как уже было отмечено выше, комплекс III является гомодимером. Рентгеноструктурный анализ выявил удивительную особенность такой пространственной организации. Оказалось, что [Fe–S] кластер белка Риске прилегает к телу соседнего мономера и обслуживает именно его электрон-переносящие пути. Выяснилось также, что каталитический домен [Fe–S] белка обладает очень высокой подвижностью. В зависимости от степени восстановленности bс1-комплекса он может занимать два разных положения — либо рядом с гемом bL, либо рядом с гемом c1. Таким образом, [Fe–S] кластер белка Риске мог бы функционировать в качестве мобильного переносчика электронов между хинолом и цитохромом c1. Эта уникальная особенРисунок 4.11. Э.К. Слейтер

Bioenergetica.indb 97

26.01.2011 18:02:35

98

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

ность каталитического домена [Fe–S] белка понадобится нам далее при описании механизма функционирования bс1-комплекса. С помощью рентгеноструктурного анализа удалось также выявить два места связывания CoQ в bс1-комплексе. Они получили название центров P и N, так как находятся на разных границах гидрофобного слоя мембраны с ее положительно (positive) и отрицательно (negative) заряженных сторон соответственно. Другое название — центры o (out) и i (in).

Рисунок 4.12. Расположение простетических групп в гомодимерной форме комплекса III. Группы левого мономера обозначены (*)

На схеме (см. рис. 4.12) представлены расстояния между электронтранспортыми центрами комплекса III. Видно, что, исходя из расстояний, кроме переноса электронов внутри определенного мономера возможен также обмен электронами между мономерами внутри гомодимера.

4.3.3. Функциональная модель комплекса III Схема функционирования митохондриальной CoQH2-цитохром с-редуктазы была приведена выше (см. рис. 4.3). Интересно отметить, что механизм генерации протонного потенциала этим ферментом был предсказан П. Митчелом еще в 1975 г. В настоящее время эта элегантная схема полностью подтверждена как разнообразными структурными данными, так и многими биофизическими экспериментами. Еще раз напомним, что ключевой постулат этой схемы, названной Q-циклом, состоит в том, что пути каждого из двух электронов, уходящих с СoQH2, оказываются различными. Сегодня это предположение твердо доказано. Установлено, что окисление хинола происходит в центре P, при этом два протона высвобождаются в межмембранное пространство митохондрий. В ходе окисления хинола пер-

Bioenergetica.indb 98

26.01.2011 18:02:36

Глава 4. Дыхательная цепь

99

вый электрон переносится на [Fe–S] кластер белка Риске, а второй электрон передается на низкопотенциальный гем bL цитохрома b. Дальнейшая судьба этих электронов оказывается различной. Электрон с [Fe–S] кластера переносится на цитохром с1, далее — на цитохром с и цитохром с-оксидазу. В то же время электрон с гема bL переносится на высокопотенциальный гем bH и далее используется для восстановления молекулы хинона в центре N с образованием семихинона. При окислении в центре P второй молекулы хинола еще два протона высвобождаются в межмембранное пространство митохондрий, образуется еще одна молекула восстановленного цитохрома с, а убисемихинон в центре N восстанавливается до хинола. Для образования хинола в ценре N два протона захватываются из матрикса митохондрий. Образованный в центре N хинол отсоединяется от фермента и диффундирует на другую сторону мембраны, чтобы снова окислиться в центре P. Перенос электрона от центра N к цитохрому с происходит вдоль мембраны, поэтому этот процесс не приводит к запасанию энергии. А вот перенос электрона от центра P к центру N является трансмембранным, что ведет к генерации электрического потенциала. Таким образом, генерация протонного потенциала комплексом III происходит с использованием механизма Митчеловой петли. Редокс-потенциалы переносчиков электронов, присутствующих в СoQH2-цитохром с-редуктазе, хорошо согласуются со схемой Q-цикла. Для гемов bL и bH они равны соответственно –40 и +40 мВ, для [Fe–S] кластера +280, а для цитохромов c1 и с — соответственно +220 и +250 мВ. Важно, что редокс-потенциал гема bH заметно положительней, чем редокс-потенциал гема bL, так что перенос электронов с bL на bH должен сопровождаться высвобождением энергии. Эта энергия запасается в виде ΔΨ, поскольку оксидоредукция bH → bL направлена поперек мембраны. Перенос электронов от [Fe–S] Риске к цитохрому c1 и далее к с вдоль мембраны происходит без существенных изменений редокс-потенциала и, следовательно, без выделения энергии. Суммарная реакция реакция комплекса III может быть записана в следующем виде: 2CoQH2 + 2цит. c(ox) + CoQ + 2H+in → → 2CoQ + 2цит. c(red) +CoQH2+ 4H+out + 2q. (4.1) Или после сокращения: CoQH2 + 2цит. c(ox) + 2H+in → CoQ + 2цит. c(red) + 4H+out + 2q. (4.2) Таким образом, перенос двух электронов с убихинола на цитохром с сопровождается захватом двух протонов из матрикса митохондрий, выбросом четырех протонов в межмембранное пространство и переносом двух зарядов (обозначено в уравнениях 4.1 и 4.2 как q) через всю толщину липидного бислоя. В первом приближении данный процесс эквивалентен генерации протонного потенциала со стехиометрией 1 Н+/ . Небольшое отличие от истинной стехиометрии 1 Н+/ заключается в различном количестве протонов, поглощенных из матрикса митохондрий и выделенных в межмембран-

Bioenergetica.indb 99

26.01.2011 18:02:36

100

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

ное пространство. Эта разница обусловлена тем, что цитохром с, в отличие от убихинола, является переносчиком электронов, а не молекул водорода. Как вы увидите далее, это расхождение в количестве протонов будет впоследствии «исправлено» при работе цитохромоксидазы. Для функционирования bс1-комплекса важно, чтобы пути переноса двух электронов при окислении хинола были разными. При перевосстановлении гемов цитохрома b возможно, что и второй электрон из центра P уйдет на цитохром с, потому что этот процесс термодинамически более выгоден по сравнению с восстановлением гема bL. По-видимому, описанная выше мобильность каталитического домена белка Риске позволяет предотвратить этот процесс, так как отошедший от центра P FeS кластер уже просто стерически не способен перенести также и второй электрон. Свойства митохондриальной СoQН2-цитохром с-редуктазы во многом сходны с таковыми гомологичных ферментных комплексов в фотосинтетических редокс-цепях хроматофоров пурпурных бактерий и тилакоидов цианобактерий или хлоропластов. Показана даже взаимозаменяемость комплексов bс1 митохондрий и хроматофоров. Комплекс bс1 из митохондрий млекопитающего был реконструирован в протеолипосомах с комплексом фотосинтетических реакционных центров из хроматофоров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Полученная «химера» катализировала циклический фотоперенос электронов, сопряженный с транслокацией Н+ через мембрану протеолипосомы. Описана уникальная природная система, где одна и та же РQН2-цитохром с-редуктаза участвует в темноте в дыхательной цепи, а на свету — в фотосинтетической. Это мембрана тилакоидов цианобактерий. При освещении пластохинон, комплекс b6f, цитохром с и пластоцианин обеспечивают связь фотосистем 1 и 2. В темное время суток те же компоненты принимают участие в дыхательной цепи между NADН-пластохинон-редуктазой и цитохромоксидазой.

4.3.4. Ингибиторы комплекса III Сегодня известно довольно большое количество ингибиторов bс1комплекса с различным механизмом действия, что значительно облегчило процесс изучения этого фермента. Токсические антибиотики антимицин А и поликруазин препятствуют связыванию хинона в центре N. Миксотиазол и муцидин ингибируют окисление хинола в центре P. По-видимому, железо-серный кластер Риске как таковой является мишенью для ионов Zn2+ и британского антилюизита (β-меркаптопропанола). Стигмателлин блокирует путь электронов от железо-серного кластера Риске к цитохрому c1.

4.4. Цитохром с-оксидаза Цитохромоксидаза катализирует окисление цитохрома с молекулярным кислородом. Эта реакция сопряжена с генерацией со стехиометрией 2Н+/ .

Bioenergetica.indb 100

26.01.2011 18:02:36

Глава 4. Дыхательная цепь

101

4.4.1. Цитохром с Связующим звеном при передаче восстановительных эквивалентов от III к IV комплексу служит цитохром c, который локализован в межмембранном пространстве митохондрий. Этот водорастворимый белок с молекулярной массой 12 кДа состоит всего из 104 аминокислотных остатков. Пространственная структура цитохрома с была установлена на основании результатов рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,5 Å (рис. 4.13). На протяжении многих лет казалось, что об этом переносчике электронов известно все. Тем поразительнее было открытие, совершенное в середине последнего десятилетия ХХ в. Оказалось, что цитохром c является одним из «белков смерти», участвующих в самоубийстве клетки (апоптозе). Об этом мы расскажем в одной из последних глав (глава XV), а сейчас уделим особое внимание канонической функции цитохрома c. Большую роль в функционировании цитохрома с играют остатки His-18 и Met-80, которые являются аксиальными лигандами атома железа в геме и своими координационными связями закрепляют гем с двух разных сторон. Как у всех подобных цитохромов, мезогем типа «С» ковалентно присоединен к сульфгидрильным группам цистеиновых остатков белка (Cys-14 и Cys-17). Это отличает цитохромы типа с от цитохромов других типов (a, b, d, o и др.), где гемы связаны нековалентно. Высказывалось предположение, что прочная связь гема С с апоцитохромами обусловлена тем, что подавляющее большинство цитохромов с-типа расположено на внешней стороне мембраны митохондрий или бактерии. Нековалентно связанный гем мог бы диссоциировать и разбавиться цитозолем (у митохондрий) или периплазмой, а затем и внешней средой (у бактерий). Пространственная структура цитохрома c напоминает варежку, удерживающую гем, который доходит почти до поверхности белка. На концах «варежки» находится венчик из положительно заряженных аминокислотных остатков: Lys-13, Lys-72, Lys-79 и Lys-86. Лизиновые остатки служат для прикрепления цитохрома c к своим партнерам — цитохрому с1 и цитохромоксидазе. К примеру, у цитохромоксидазы есть три отрицательно Рисунок 4.13. Пространзаряженных аминокислоты, которые, подобно ственные структуры цитохромов с из митохондрий магнитному замку, обеспечивают электростатичемышц тунца (А) и бактерии ское притяжение цитохрома с и его фиксацию в Paracoccus denitrificans (В), а правильном положении. Окисление и восстановтакже цитохрома с2 из бактеление цитохрома с не сопровождаются значительрии Rhodospirillum rubrum (Б). Красным показан гем ными изменениями его конформации.

Bioenergetica.indb 101

26.01.2011 18:02:36

102

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Аминокислотная последовательность цитохрома c была установлена задолго до начала попыток его рентгеноструктурного анализа. Исключительная стабильность, небольшие размеры и относительная простота очистки цитохрома с оказались предпосылками для быстрого накопления информации о структуре этого белка у разных организмов. Сопоставляя аминокислотные последовательности цитохромов c, выделенных из разных источников, геносистематики начали строить свои первые эволюционные деревья. Теперь известно, что у человека и шимпанзе первичная структура цитохрома с одинакова. При сопоставлении с человеческим цитохромом с у макакирезуса обнаруживается одна аминокислотная замена, у лошади — 12 замен, у курицы –13, у тунца — 21, у пшеницы — 35, а у гриба нейроспоры — 44.

4.4.2. Комплекс IV (цитохром с-оксидаза) Цитохромоксидаза обладает молекулярной массой около 200 кДа. У эукариот комплекс IV состоит из 13 полипептидов. Первые три из них гидрофобны, кодируются митохондриальным геномом и считаются основными каталитическими субъединицами фермента. Данные SDS-электрофореза отчасти не совпадают с принятой нумерацией субъединиц: I (57 кДа), II (26 кДа), III (30 кДа). Следует отметить, что цитохромоксидазы бактерий обычно состоят всего из трех субъединиц, гомологичных трем гидрофобным субъединицам комплекса IV эукариот. Остальные субъединицы цитохромоксидазы эукариот невелики: их молекулярные массы варьируют от 17 до 5 кДа. Цитохромоксидаза митохондрий содержит четыре редокс-кофактора: два гема А-типа (а и a3) и два редокс-центра, содержащих атомы меди (СuA и СuB). В дополнение к ним комплекс IV включает также несколько редоксинертных ионов металлов — Mg2+, Zn2+, а в ряде случаев также еще и Ca2+ или Na+. Функции этих ионов в составе оксидазы пока неизвестны. Все редокс-кофакторы цитохромоксидазы локализованы на субъединицах I и II. CuA находится на субъединице II, на этой субъединице расположено также место связывания цитохрома с (на второй субъединице есть упомянутое выше кольцо из отрицательно заряженных аминокислот: это Asp-136, Asp187 и Glu-227; все они участвуют в присоединении цитохрома с к комплексу IV). Субъединица I содержит остальные редокс-центры фермента: гем a, гем a3, а также CuB. Гем a3 и медь СuB в цитохромоксидазе расположены очень близко друг к другу (на расстоянии в 4,5 Å между атомами металлов), образуя так называемый гем-медный биядерный центр. Этот центр служит местом связывания молекулы О2 и ее восстановления. Третья каталитическая субъединица не несет редокс-кофакторов, и ее функции на настоящий день неизвестны. Более того, в случае с бактерией P. denitrificans потеря субъединицы III при выделении цитохромоксидазы, по-видимому, не сказывается на функциональных свойствах этого белка. Рассмотрим редокс-кофакторы цитохромоксидазы подробнее. Центр СuB представляет собой ион меди, присоединенный к белку координаци-

Bioenergetica.indb 102

26.01.2011 18:02:36

Глава 4. Дыхательная цепь

103

онными связями с тремя остатками гистидина (через атомы азота имидазольного кольца). Этот ион может находиться в двух состояниях валентности: +1 и +2. Таким образом, СuB функционирует в качестве переносчика одного электрона. Центр СuА состоит из двух атомов меди, расположенных очень близко друг к другу. Однако центр СuА, так же как и СuB, является переносчиком только одного электрона (Cu2+Cu1+ ↔ Cu2+Cu2+). Кроме атомов меди цитохромоксидаза митохондрий содержит два гема: а и a3. Прежде чем перейти к описанию этих кофакторов, остановимся вкратце на общих свойствах гемов. Ионы железа в комплексных соединениях (к каким относятся и гемы) могут образовывать шесть координационных связей с лигандами. В цитохромах четыре координационные связи с железом обеспечиваются 4 атомами азота порфиринового кольца (см. приложение 2), и эти связи располагаются в плоскости данного кольца. Две оставшиеся связи предоставляются, как правило, аминокислотными остатками белка (чаще всего в такой роли выступает гистидин, реже — метионин). Такие лиганды называют аксиальными, и их связи с железом находятся по разные стороны порфиринового кольца и перпендикулярны ему. Гемы, где у железа реализованы все шесть координационных связей, называются низкоспиновыми (так как они имеют равновесную электронную конфигурацию, соответствующую нижнему энергетическому уровню с минимальным спином s = 1/2). Такие гемы обычно функционируют в роли простых переносчиков электрона, к ним относятся все описанные в предыдущих главах цитохромы, а также гем а цитохромоксидазы. В то же время у некоторых гемов, например у гема а3, один из аксиальных лигандов отсутствует. Такие гемы имеют спин s=5/2 и называются высокоспиновыми. Если в среде присутствуют небольшие нуклеофильные соединения (например, О2, NO, СО, H2S, CN– и т.п.), то они могут связаться с высокоспиновым гемом, выступая в качестве его второго аксиального лиганда. В случае с кислородом такая связь может сопровождаться переносом электрона от гема к О2, и, таким образом, будет осуществляться кислород-редуктазная активность. Итак, высокоспиновые гемы могут функционировать не только как переносчики электрона, но и как место связывания небольших лигандов (например, кислорода в миоглобине и гемоглобине или NO в гуанилатциклазе) либо как место их восстановления (например, восстановление кислорода в цитохромоксидазе или NO в NO-редуктазе).

4.4.3. Рентгеноструктурный анализ комплекса IV Рентгеноструктурный анализ кристаллов цитохромоксидазы был проведен параллельно двумя группами исследователей: в Японии (в группе С. Йошикавы) на комплексе IV из сердца быка и в Германии (под руководством нобелевского лауреата Х. Михеля) на ферменте из бактерии P. denitrificans. В результате этих исследований была определена трехмерная структура цитохромоксидазы с высоким разрешением (на настоящий момент — 2,3 Å). Важно отметить, что в случае с ферментами из эу- и прокариот структура

Bioenergetica.indb 103

26.01.2011 18:02:37

104

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 4.14. Структура двух основных субъединиц цитохром c-оксидазы из P. denitrificans. Субъединица I показана зеленым цветом, субъединица II — фиолетовым, гем a — красным, гем a3 — черным; атомы меди представлены в виде светло-синих сфер, атомы железа — розовых сфер, а молекулы воды — темно-синих мелких сфер [Ostermeier et al., 1997 PNAS, 94: 10547–10553]

Рисунок 4.15. Схема строения K- и D-каналов в бычьей цитохром c-оксидазе. Мелкие светло-синие сферы — молекулы воды

Bioenergetica.indb 104

основных каталитических субъединиц оказалась практически идентичной. Как видно на рис. 4.14, цитохромоксидаза почти полностью погружена в мембрану и в поперечном сечении напоминает собой трапецию. Единственной частью белка, вынесенной из толщи мембраны (в межмембранное пространство), оказывается медь-связывающий домен субъединицы II. Этот домен несет на себе центр СuA и закреплен в мембране за счет гарпуноподобной структуры, состоящей из двух гидрофобных трансмембранных α-спиралей. Субъединица I образует 12 трансмембранных спиралей, а субъединица III — семь. Как было сказано выше, субъединица I несет на себе три кофактора — гемы a, a3 и медь CuB. Как видно на рис. 4.14 и рис. 4.15, эти центры расположены примерно на одной линии, параллельной плоскости мембраны (сами гемы перпендикулярны мембране), находясь ближе к ее внешней поверхности (на расстоянии 15 Å от этой поверхности). Рентгеноструктурный анализ выявил любопытную особенность строения биядерного центра цитохромоксидазы. Оказалось, что один из остатков гистидина, служащих лигандами меди CuB (His-240), образует ковалентную связь с фенольной группой близлежащего остатка тирозина (Tyr-244). Впоследствии выяснилось, что данная ковалентная связь образуется автокаталитически при работе фермента. Такой тип посттрансляционной модификации белка крайне необычен и найден пока только в оксидазах. Анализ трехмерной структуры комплекса IV позволил также выявить два возможных канала для транспорта протонов из матрикса митохондрий к биядерному центру (см. рис. 4.15). Эти пути состоят из консервативных остат-

26.01.2011 18:02:37

105

Глава 4. Дыхательная цепь

ков полярных аминокислот и прочно связанных молекул воды. По названиям аминокислот, расположенных во входной части этих путей, они были названы K- и D-каналами (соответственно остатки Lys-354 и Asp-124). В то же время трехмерная структура не позволяет четко выявить пути переноса протонов от биядерного центра к межмембранному пространству. Однако эта часть белка не столь гидрофобна, расстояние от биядерного центра до внешней поверхности мембраны составляет всего 15 Å, и, возможно, для переноса протона здесь нет необходимости в организации специального канала.

4.4.3. Путь переноса электронов в комплексе IV На схеме (4.3) представлена последовательность переноса электрона в цитохромоксидазе. Вначале электрон от цитохрома с переходит на двумедный центр СuA. Впоследствии электрон переносится от СuA к гему а и далее к биядерному гем-медному центру [a3-СuB)], на котором происходит восстановление О2: Цитохром с→ СuA → гем а → [гем a3 СuB]

2H2О.

(4.3)

Однако такая простая схема (4.3) недостаточна для описания процесса переноса электронов в цитохромоксидазе. Напомним, что для восстановления молекулы О2 до воды необходимы четыре электрона, тогда как цитохром с является переносчиком лишь одного . Значит, требуется специальный механизм для накопления электронов на оксидазе и восстановления О2 без образования свободных радикалов. Посмотрим, каким образом это происходит (см. рис. 4.16). I. Окисление первой молекулы цитохрома с приводит к переносу электрона с него на СuA и далее к перераспределению электрона между центрами а, а3 и СuB. При этом фермент переходит из окисленной формы (О) в 1-электронно-восстановленную форму (Е). Эта форма (Е) еще не способна связать кислород. Точная локализация первого электрона на ферменте еще неизвестна; мы для простоты изложения будем считать, что биядерный центр фермента находится при этом в состоянии (Fe3+ Cu1+). II. Окисление второй молекулы цитохрома с запускает целую последовательность событий: 1) оба электрона (с цитохрома с и с гема а) могут перейти на биядерный центр и восстановить его (состояние биядерного центра Fe2+ Cu1+, данная форма фермента получила название R). 2) Перенос двух электронов на биядерный центр приводит к тому, что он получает способность связать кислород. Таким образом форма R переходит в форму А (состояние биядерного центра Fe2+–О2 Cu1+). 3) Связывание кислорода сопровождается переносом на него электронов с цитохромоксидазы. Вначале предполагали, что на этой стадии происходит двухэлектронное восстановление О2 с образованием перекисного мо-

Bioenergetica.indb 105

26.01.2011 18:02:38

106

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 4.16. Схема процесса восстановления молекулярного кислорода в биядерном центре цитохром c-оксидазы. Y — предположительно тирозин-244 субъединицы I

стика между атомами железа и меди биядерного центра (Fe3+–О–О–Cu2+). Эта форма получила название перекисной, или формы P. Однако впоследствии выяснилось, что уже на этой стадии происходит четырехэлектронное восстановление кислорода (хотя все равно за этой формой в силу исторических причин закрепилось название P). Конечно же, возникает вопрос, каким образом может осуществиться четырехэлектронное восстановление О2, когда на ферменте до этого было всего 2 электрона? Оказалось, что один дополнительный электрон берется с железа гема а3, при этом оно переходит в очень необычное феррильное состояние Fe4+. Второй дополнительный электрон (и, по-видимому, протон) поступает с остатка какой-то близрасположенной ароматической аминокислоты с образованием из него соответствующей радикальной формы (Y•)*. Кроме того, поглощается один ион H+, а медь оказывается связанной с анионом гидроксила. Таким образом, на сегодняшний день считается, что форма P цитохромоксидазы представляет собой следующее состояние: Y• Fe4+=О –НО-Cu2+. Следует отметить, что редокс-потенциалы пар Y•/Y и Fe4+/Fe3+ крайне высоки (≥ +0,7 В). Итак, восстановление кислорода до воды происходит уже на этой стадии. В дальнейшем нужно лишь вернуть фермент в исходное состояние, что и происходит при окислении следующих двух молекул цитохрома с. III. При окислении третьей молекулы цитохрома с электрон с него переносится на радикал, а также происходит захват еще одного протона из водной фазы. При этом происходит образование феррильной (F) формы фермента (Fe4+ = О Cu2+) и первой молекулы H2O. * Считается, что радикальная форма Y• образуется из остатка Tyr-244. Образование такого необычного и крайне реакционно-способного радикала, по-видимому, и приводит к формированию описанной выше ковалентной связи между Tyr-244 и близлежащим His-240. Данная ковалентная связь, возможно, впоследствии позволяет стабилизировать радикальную форму и избежать дальнейшего повреждения белка.

Bioenergetica.indb 106

26.01.2011 18:02:38

Глава 4. Дыхательная цепь

107

IV. Окисление четвертой молекулы цитохрома с приводит к образованию второй молекулы H2O и регенерации исходной окисленной (О) формы фермента (Fe3+ Cu2+), т.е. замыкается каталитический цикл цитохромоксидазы.

4.4.4. Механизм генерации

цитохром c-оксидазой

Как уже было сказано выше, цитохромоксидаза генерирует со стехиометрией 2 H+/ . При описании предыдущих компонентов дыхательной цепи мы постулировали существование двух принципиально разных механизмов генерации протонного потенциала — Митчеловой петли и протонной помпы. При функционировании цитохромоксидазы реализуются сразу оба эти механизма. 1) Митчелова петля Транспорт электронов от цитохрома с на биядерный центр сопровождается переносом отрицательного заряда (электрона) от межмембранного пространства вглубь мембраны на расстояние порядка 1/3 ее толщины (см. рис. 4.14). В то же время для восстановления кислорода до воды необходимы протоны. Для обеспечения этого процесса происходит транспорт протонов через K- или D-каналы, т.е. перенос положительных зарядов от матрикса к биядерному центру. В сумме двух этих процессов осуществляется генерация со стехиометрией 1 H+/ . 2) Протонная помпа Еще в 1977 г. М. Викстремом было показано, что окисление цитохрома с комплексом IV сопровождается закислением межмембранного пространства митохондрий, чего не должно быть в случае с Митчеловой петлей. Таким образом, было продемонстрировано, что в дополнение к механизму петли цитохромоксидаза генерирует еще и как протонная помпа с суммарной эффективностью этого процесса, равной 2 H+/ . Несмотря на значительный прогресс в изучении данного явления, механизм «помпирования» протонов цитохромоксидазой еще неизвестен. На сегодняшний день существует несколько инРисунок 4.17. М. Викстрём тересных теоретических моделей этого процесса. Однако их изложение выходит за рамки данной книги. Здесь мы лишь вкратце расскажем о том, каким образом помпирование протонов связано с протеканием каталитического цикла цитохромоксидазы. При рассмотрении энергетики каталитического цикла цитохромоксидазы выяснилось, что реакции O→E и E→R характеризуются небольшим изменением свободной энергии. Этой энергии едва хватает для генерации Δψ при переносе электрона от СuA до а3. А вот переходы P→F и F→O

Bioenergetica.indb 107

26.01.2011 18:02:38

108

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

(восстановление таких крайне высокопотенциальных соединений, как Y• и Fe4+) сопровождается большим выделением энергии. Поэтому первоначально предполагалось, что переходы O→E и E→R не сопряжены с помпированием протонов, а вот при реакциях P→F и F→O происходит трансмембранный перенос Н+ с удвоенной стехиометрией. Однако впоследствии выяснилось, что перенос каждого из четырех электронов от цитохрома с на цитохромоксидазу сопряжен с помпированием одного протона. Понимание механизма этих реакций требует дальнейших исследований.

4.5. Ингибиторы цитохромоксидазы Как уже было упомянуто выше, высокоспиновые гемы могут связывать небольшие нуклеофильные соединения, такие, как СО, NO, CN–, H2S, N3–. Присоединение этих лигандов переводит высокоспиновый гем в низкоспиновое состояние и препятствует его взаимодействию с таким относительно слабым лигандом, как О2. Поэтому все эти соединения являются мощными ингибиторами цитохромоксидазы. Важно отметить, что многие из таких ингибиторов, появляясь во внешней среде, действуют как сильные отравляющие вещества.

Bioenergetica.indb 108

26.01.2011 18:02:39

ГЛАВА ПЯТАЯ

СТРОЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ЦЕПЕЙ ПРОКАРИОТ, А ТАКЖЕ МИТОХОНДРИЙ ПРОСТЕЙШИХ, РАСТЕНИЙ И ГРИБОВ

В предыдущей главе мы рассмотрели строение дыхательной цепи мито-

хондрий высших животных. Эта цепь характеризуется довольно высокой эффективностью запасания энергии (высоким значением коэффициента H+/O2), а также тем, что путь переноса электронов от NADH к кислороду носит линейный характер. В то же время строение дыхательных цепей бактерий и архей, а также митохондрий простейших, растений и грибов имеет ряд существенных отличий от электрон-транспортной цепи митохондрий животных. К основным отличительным особенностям этих цепей можно отнести следующие: 1) Каждый из трех участков дыхательной цепи может осуществляться не одним ферментом (соответственно комплексами I, III и IV), как в случае митохондрий животных, а несколькими альтернативными ферментами с различными функциональными свойствами. 2) Некоторые участки дыхательной цепи могут быть «шунтированы» за счет транспорта электронов через альтернативные ферменты с пониженным коэффициентом H+/ или вовсе без сопряжения с трансмембранным переносом протонов. 3) Некоторые ферменты дыхательных цепей бактерий используют ион натрия вместо протона в качестве первичного сопрягающего иона (на этой особенности бактерий мы остановимся более подробно в главах XII–XIV). 4) Бактерии также способны использовать значительно более широкий набор соединений как в качестве доноров, так и акцепторов электронов для дыхательной цепи. Например, многие микроорганизмы, помимо кислорода, могут также восстанавливать такие вещества, как NO3–, NO2, NO, N2O, различные органические S-оксиды и N-оксиды, фумарат и т.п. Наряду с NADH, сукцинатом, жирными кислотами и глицерофосфатом бактериальные дыхательные цепи могут непосредственно окислять молекулярный водород, формиат, малат, лактат, глюкозу, некоторые аминокислоты, Fe2+, NO2–, S2O32– и т.п. 5) Состав дыхательной цепи может варьироваться в зависимости от условий роста, а в случае с многоклеточными организмами он может быть также и тканеспецифичным. Эти различия, по-видимому, связаны с разными условиями функционирования дыхательной цепи митохондрий животных по сравнению с ды-

Bioenergetica.indb 109

26.01.2011 18:02:39

110

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

хательными цепями бактерий и митохондрий простейших, грибов и растений. Митохондрии животных функционируют при постоянных условиях внешней для них среды, т.е. цитозоля этих клеток. В то же время условия функционирования митохондрий простейших, растений и одноклеточных грибов и в особенности условия роста бактерий могут претерпевать значительные изменения за относительно короткие промежутки времени. Вот почему строение дыхательных цепей этих организмов имеет более сложный характер и может значительно изменяться в зависимости от внешних условий. Такого рода электрон-транспортные цепи обычно отличаются меньшей эффективностью запасания энергии (меньшим значением коэффициента H+/O2) по сравнению с дыхательной цепью митохондрий животных. По-видимому, основным фактором отбора при эволюции этих электронтранспортных цепей была не эффективность запасания энергии (как у митохондрий животных), а надежность работы и способность адаптироваться к меняющимся в неблагоприятную сторону условиям внешней среды.

5.1. Дыхательная цепь митохондрий простейших, растений и грибов Электрон-транспортные цепи митохондрий этих организмов содержат все те же ферментативные комплексы, которые функционируют в митохондриях животных, т.е. NADH-СоQ-редуктазу, СoQH2-цитохром с-редуктазу и цитохром с-оксидазу. Комплексы I, III и IV митохондрий простейших, растений и грибов демонстрируют высокое сходство со своими гомологами из митохондрий животных, отличаясь от них лишь несколько иным набором

Рисунок 5.1. Схема строения дыхательной цепи митохондрий простейших, растений и грибов

Bioenergetica.indb 110

26.01.2011 18:02:39

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 111

дополнительных субъединиц. В то же время митохондрии этих организмов содержат ряд ферментов, отсутствующих в митохондриях животных. Схема строения дыхательной цепи митохондрий простейших, растений и грибов представлена на рис. 5.1. Как видно, NADH матрикса этих митохондрий может окисляться не только комплексом I, но и дополнительным альтернативным ферментом — NDin. Этот периферический мембранный белок устроен значительно проще комплекса I. Он состоит только из одного полипептида (с молекулярной массой 40–50 кДа) и содержит всего один кофактор (FAD). Ферментативная активность NDin, в отличие от комплекса I, не сопряжена с транслокацией протонов через мембрану, т.е. вся энергия NADH:убихинон-оксидоредуктазной реакции при работе NDin теряется в виде тепла. Митохондрии животных не способны к прямому окислению цитоплазматического NADH. Для осуществления этого процесса они используют различные челночные схемы (они будут подробно описаны далее в разд. 11.1). В то же время митохондрии простейших, растений и грибов в присутствии ионов Ca2+ окисляют внемитохондриальный NADH (а иногда и NADPH) с довольно высокими скоростями. Данный процесс осуществляется за счет функционирования в этих митохондриях еще одной NADH:убихинон-оксидоредуктазы — NDex. Этот фермент по первичной последовательности и основным свойствам похож на NDin. Однако в его аминокислотной последовательности содержится другой адрес, направляющий этот белок не в матрикс, а в межмембранное пространство митохондрий. Таким образом, NDex прикреплен не к внутренней, а к внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и поэтому окисляет не внутримитохондриальный, а цитоплазматический NADH. Как и в случае NDin, активность NDex не сопряжена с генерацией . В отличие от NDin, первичная последовательность NDex содержит участки, ответственные за связывание ионов Ca2+. Таким образом, в дыхательной цепи митохондрий простейших, растений и грибов первый пункт сопряжения может быть шунтирован за счет работы двух несопряженных ферментов — NDin и NDex. В ранних исследованиях митохондрий растений было установлено, что эти органеллы, в отличие от митохондрий животных, могут осуществлять цианид-устойчивое потребление кислорода. Позднее выяснилось, что данная активность связана с присутствием в митохондриях простейших, растений и грибов особого фермента — альтернативной цианрезистентной терминальной оксидазы (AОХ)*. Этот белок состоит всего из одного полипептида с молекулярной массой около 40 кДа. Как и NDin, альтернативная оксидаза является периферическим мембранным белком (т.е. не содержит трансмембранных α-спиралей) и прикреплена к внутренней стороне внутренней мембраны митохондрий. Гены, кодирующие все альтернативные * Недавно альтернативная терминальная оксидаза была обнаружена у некоторых круглых и кольчатых червей, у моллюсков и даже у низших хордовых, т.е. AOХ, повидимому, может функционировать и в митохондриях отдельных представителей царства животных.

Bioenergetica.indb 111

26.01.2011 18:02:39

112

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

ферменты дыхательной цепи митохондрий (AОХ, NDin и NDex), расположены в ядерном геноме. Первичная последовательность AОХ имеет сходство с последовательностями различных монооксигеназ, и, как и эти ферменты, альтернативная оксидаза содержит лишь два атома негемового железа в качестве редокскофакторов. Эти атомы образуют биядерный центр (наподобие гем-медного биядерного центра комплекса IV), который, по-видимому, и является местом восстановления О2. AOХ отличается от комплекса IV целым рядом других важных особенностей. Так, донором электронов для альтернативной оксидазы является не цитохром с, а непосредственно убихинол (т.е. AOХ является не цитохром с-оксидазой, а хинолоксидазой). Далее, работа альтернативной оксидазы не сопряжена с трансмембранной транслокацией протонов. Таким образом, как и в случае NDin и NDex, вся энергия катализируемой AOХ реакции выделяется в виде тепла. Следовательно, функционирование AOХ приводит к шунтированию второго и третьего пунктов сопряжения дыхательной цепи. Важно отметить, что активность альтернативной оксидазы находится под контролем целого ряда параметров клеточного метаболизма. Прежде всего высокая активность AOХ растений наблюдается лишь в присутствии различных α-кетокислот, таких, как пируват или α-кетоглутарат. Кроме того, активность AOХ в значительной степени зависит от уровня восстановленности СoQ. В отличие от bc1-комплекса, активность альтернативной оксидазы наблюдается лишь при очень высоком соотношении СoQH2/СoQ. Таким образом, при работе AOХ используется лишь избыток убихинола, который в силу каких-либо обстоятельств не может быть окислен за счет активности «канонической» дыхательной цепи. Итак, митохондрии простейших, растений и грибов наряду с обычной «сопряженной» дыхательной цепью (аналогичной дыхательной цепи митохондрий животных) содержат альтернативную, полностью не сопряженную электрон-транспортную цепь, пересекающуюся с «канонической» цепью лишь на уровне убихинона. В чем же состоит физиологический смысл функционирования альтернативной дыхательной цепи, ведь ее активность не приводит к запасанию энергии, а лишь к ее рассеиванию в виде тепла? Одна из возможностей состоит в том, что такая несопряженная цепь используется для теплопродукции (например, в соцветиях термогенных растений, о чем пойдет речь далее при описании механизмов термогенеза). Однако альтернативная дыхательная цепь присутствует не только в термогенных, но и в других растениях, а также у многих простейших и грибов. Важно отметить, что отсутствие трансмембранной транслокации протонов позволяет несопряженным ферментам избежать лимитирования скорости переноса электронов генерируемым протонным потенциалом, т.е. эффекта дыхательного контроля. Поэтому возможно, что несопряженная альтернативная ветвь дыхательной цепи применяется для ускорения дыхания, а это, в свою очередь, может быть использовано не только для теплопродукции, но и для понижения внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков, понижения продукции активных форм кислорода

Bioenergetica.indb 112

26.01.2011 18:02:40

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 113

или каких-либо других функций. Тем не менее сегодня приходится признать, что физиологическая роль несопряженной дыхательной цепи еще до конца не определена.

5.2. Строение дыхательных цепей прокариот Дыхательные цепи бактерий крайне многообразны, и довольно трудно привести в качестве показательного примера электрон-транспортную цепь какого-нибудь одного микроорганизма. Поэтому мы вкратце остановимся на дыхательных ферментах нескольких наиболее изученных бактерий и опишем основные принципы их функционирования.

5.2.1. Дыхательная цепь Paracoccus denitrificans P. denitrificans относится к α-протеобактериям и является наиболее близким «родственником» митохондрий среди свободно-живущих микроорганизмов. Строение его дыхательной цепи имеет много общего с митохондриями, что сделало эту бактерию излюбленной моделью для изучения окислительного фосфорилирования. P. denitrificans содержит белки, гомологичные комплексам I, III и IV митохондрий, т.е. Н+-транслоцирующую NADH-CоQ-редуктазу, bc1-комплекс и цитохром с-оксидазу аа3-типа. Эти комплексы P. denitrificans отличаются от своих митохондриальных аналогов лишь значительно меньшим количеством субъединиц. Однако в отличие от митохондрий восстановление кислорода у P. denitrificans может осуществляться не только «канонической» оксидазой аа3-типа, но и двумя дополнительными ферментами — цитохром с-оксидазой cbb3-типа и хинолоксидазой ba3-типа (см. схему на рис. 5.2). Оба эти фермента гомологичны аа3-оксидазе, они имеют в своем составе гем-медный биядерный центр и являются протонными помпами (соотношение H+/ для них равно 2). Од-

Рисунок 5.2. Схема строения дыхательной цепи почвенной бактерии P. denitrificans. Объяснения в тексте

Bioenergetica.indb 113

26.01.2011 18:02:40

114

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

нако у этих ферментов есть ряд особенностей, отличающих их от оксидазы аа3-типа. Так, ba3-оксидаза окисляет не цитохром с, а непосредственно убихинол. Таким образом, при ее функционировании шунтируется второй пункт сопряжения дыхательной цепи. Структура этой оксидазы сходна со структурой фермента аа3-типа — за тем лишь исключением, что в составе ba3 отсутствует редокс-кофактор CuA, а его роль, по-видимому, выполняет молекула субстрата — хинола. Цитохром с-оксидаза cbb3-типа хотя и катализирует ту же реакцию, что и фермент аа3-типа (т.е. является Н+-транслоцирующей цитохром с-оксидазой), однако ее первичная последовательность имеет лишь отдаленное сходство с последовательностями «канонических» оксидаз. В то же время оксидаза cbb3-типа гомологична NO-редуктазам, т.е. одному из ферментов анаэробного переноса электронов. Это обстоятельство указывает на возможные пути эволюционного происхождения ферментов аэробного обмена. P. denitrificans является почвенной бактерией, и основной экологической нишей этого микроорганизма, по-видимому, служат происходящие в почве процессы денитрификации, т.е. восстановление окисленных форм азота до N2. Этот процесс является важным этапом круговорота азота в природе и, к сожалению, приводит к истощению почвенных источников связанного азота. Денитрификация может быть описана следующей цепочкой превращений: NO3– → NO2– → NO → N2O → N2.

(5.1)

В дыхательной цепи P. denitrificans присутствуют ферменты, катализирующие все реакции данного процесса. Первый этап денитрификации (восстановление нитрата до нитрита) осуществляется двумя разными нитратредуктазами (Nap и Nar, см. рис. 5.2). Белок Nar является мембранным ферментом и включает в свой состав необычный кофактор, содержащий атом молибдена. Донором электронов для Nar является хинол. Данный фермент является генератором с использованием механизма Митчеловой петли со стехиометрией 1 H+/ . Вторая нитратредуктаза (Nap) расположена в периплазме, и активность этого фермента не сопряжена с образованием протонного потенциала. Три следующие стадии денитрификации осуществляются соответственно нитритредуктазой, NO-редуктазой и N2O-редуктазой. Донором электронов для этих ферментов служит цитохром с. Активности нитритредуктазы, NO-редуктазы и N2O-редуктазы не сопряжены с образованием . Однако, окисляя цитохром с, данные ферменты делают возможной генерацию протонного потенциала в анаэробных условиях на первых двух пунктах сопряжения дыхательной цепи (т.е. комплексами I и III). Таким образом, эти ферменты вносят косвенный вклад в увеличение эффективности использования энергии при анаэробном росте P. denitrificans. В целом процесс денитрификации может служить примером анаэробного переноса электронов, т.е. использования бактериями других, отличных от О2 терминальных акцепторов электронов для дыхательной цепи.

Bioenergetica.indb 114 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:02:40

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 115

5.2.2. Дыхательная цепь Escherichia coli Аэробная дыхательная цепь E. coli значительно упрощена по сравнению с электрон-транспортной цепью митохондрий (рис. 5.3). Она не содержит bc1-комплекса и каких-либо цитохромов типа с, т.е. в ней функционируют лишь два пункта сопряжения (NADH:хинон-оксидоредуктазный и хинолоксидазный). Окисление NADH в дыхательной цепи E. coli осуществляют два разных фермента. Один из них (NDH-1) является гомологом митохондриального комплекса I*. Ферментативная активность NDH-1 сопряжена с генерацией . В то же время в дыхательной цепи E. coli присутствует альтерна- Рисунок 5.3. Схема строения дыхательной цепи и генерации мембранного потенциативная NADH:хинон-оксидоредуктаза ла у энтеробактерии Е. coli (NDH-2). Этот белок и по первичной последовательности, и по основным своим свойствам близок к NDin митохондрий растений. NDH-2 состоит из одного полипептида, содержит один редокс-кофактор (FAD), и активность этого фермента не сопряжена с трансмембранной транслокацией протонов. Хинол, образованный посредством NDH-1 и NDH-2, окисляется в дыхательной цепи Е. coli за счет активности двух альтернативных терминальных оксидаз — хинолоксидазы bo-типа и хинолоксидазы bd-типа. Фермент bd-типа является основной оксидазой дыхательной цепи Е. coli при росте клеток этого микроорганизма в микроаэробных условиях (т.е. при низкой концентрации О2), тогда как bo-оксидаза превалирует при обычной концентрации О2 в среде роста. Хинол-оксидаза bo-типа состоит из трех субъединиц и содержит три редокс-кофактора: медь CuB и два гема — низкоспиновый гем B и высокоспиновый гем O. Гем O и CuB образуют биядерный центр, служащий, как и в других гем-медных оксидазах, местом связывания и восстановления кислорода. Несмотря на то что bo-оксидаза является хинолоксидазой, ее первичная последовательность и особенно ее трехмерная структура очень похожи на цитохром с-оксидазу аа3-типа. Неудивительно, что bo-оксидаза является протонной помпой и генерирует со стехиометрией 2 Н+/ (см. схему на рис. 5.4 А). В то же время вторая терминальная оксидаза Е. coli (цитохром bd) является необычным ферментом. Этот белок не гомологичен ни оксидазам с геммедным биядерным центром (митохондриальным цитохром с-оксидазам и сходным бактериальным ферментам), ни цианид-резистентным оксидазам с железо-железным биядерным центром (альтернативным оксидазам митохондрий растений, простейших и грибов, а также сходным ферментам из некоторых бактерий и хлоропластов растений). Таким образом, хинолоксидаза bd-типа является представителем третьего класса терминальных оксидаз. Данный фермент из Е. coli состоит из двух субъединиц и имеет в своем * Свойства этого белка были подробно описаны в предыдущей главе.

Bioenergetica.indb 115

26.01.2011 18:02:40

116

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 5.4. Схема функционирования терминальных оксидаз bo-типа (А) и bd-типа (Б) у энтеробактерии Е. coli

составе три простетические группы: низкоспиновый гем b558 и два высокоспиновых гема — гем b595 и хлориновый гем d. Высокоспиновые гемы b595 и d расположены в белке очень близко друг к другу, и они, по-видимому, формируют гем-гемный биядерный центр наподобие гем-медного или железо-железного биядерных центров остальных оксидаз*. Предполагается, что простетические группы bd-оксидазы расположены в гидрофобной части белка параллельно плоскости мембраны и ближе к ее периплазматической поверхности (рис. 5.4 Б). По-видимому, электроны с хинола вначале переносятся на гем b558, а далее — на биядерный центр, где и происходит восстановление кислорода. Оксидаза bd-типа не является протонной помпой, и данный фермент генерирует лишь по механизму Митчеловой петли. Образующиеся при окислении хинола протоны высвобождаются в периплазму, в то время как протоны, необходимые для образования воды, захватываются из цитоплазмы. Этот процесс приводит к формированию протонного потенциала со стехиометрией Н+/ = 1. Интересно отметить, что из-за расположения электрон-транспортного пути параллельно поверхности мембраны электрический мембранный потенциал в данном случае образуется не за счет трансмембранного переноса электронов (как, например, в фотосинтетических реакционных центрах), а практически полностью за счет транспорта двух протонов с разных сторон мембраны. Итак, в дыхательной цепи Е. coli присутствуют как ферменты, гомологичные белкам дыхательной цепи митохондрий животных (NDH-1 и хинолоксидаза bo-типа), так и ферменты либо с пониженной эффективностью запасания энергии (bd-оксидаза), либо вовсе не сопряженные с транслокацией протонов (NDH-2). Снова возникает вопрос, в чем же состоит физиологический смысл функционирования альтернативных ферментов дыхательной цепи? Однозначного ответа на настоящий момент нет, но можно полагать, * Подобное устройство кислород-редуктазных центров является интересным примером конвергенции при независимом эволюционном происхождении различных типов терминальных оксидаз.

Bioenergetica.indb 116

26.01.2011 18:02:41

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 117

что у Е. coli низкий к.п.д. дыхания компенсируется большей устойчивостью данной бактерии к ядовитым веществам. Дело в том, что комплексы III и особенно I наиболее подвержены ингибиторному действию гидрофобных ксенобиотиков. Для Е. coli такие вещества не токсичны по тем причинам, что комплекс I можно шунтировать посредством NDH-2, а комплекса III нет вовсе. Этот пример иллюстрирует некий общий биологический принцип, когда эффективность биологической системы приносится в жертву ее большей устойчивости. Чуть ниже мы проиллюстрируем это обстоятельство на другом примере — энергетике азотофиксирующей бактерии Azotobacter vinelandii. Клетки Е. coli могут расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В отсутствии кислорода у кишечной палочки индуцируются дополнительные ферменты дыхательной цепи, способные использовать некоторые отличные от О2 акцепторы электронов. Так, клетки Е. coli могут восстанавливать NO3– до NO2–. Эта активность осуществляется нитратредуктазой — ферментом, сходным с описанной выше нитратредуктазой P. denitrificans. Он генерирует со стехиометрией Н+/ = 1. Наряду с нитратом, Е. coli может восстанавливать различные органические N-оксиды (например, триметил-N-оксид) до соответствующих аминов или различные органические S-оксиды (например, диметилсульфоксид) до соответствующих сульфидов. Кроме того, клетки Е. coli в анаэробных условиях способны восстанавливать фумарат до сукцината за счет окисления хинола*. Все эти реакции не сопряжены с трансмембранным переносом протонов, однако, окисляя хинол, данные ферменты делают возможной генерацию протонного потенциала в анаэробных условиях при восстановлении хинона в первом пункте сопряжения дыхательной цепи. Восстановление фумарата до сукцината встречает определенные сложности, если использовать убихинон в качестве переносчика электронов от NDH-1 к фумаратредуктазе. E0′ пары убихинон / убихинол (+60 мВ) более положителен, чем у пары фумарат / сукцинат (+30 мВ), что не может не затруднять протекание фумаратредуктазной реакции. Поэтому при анаэробном росте у Е. coli происходит замена убихинона на менахинон (витамин K). E0′ пары менахинон / менахинол составляет –80 мВ, что обеспечивает достаточную движущую силу для процесса восстановления фумарата. Это обстоятельство делает также наш симбионт Е. coli потенциальным источником витамина K для человеческого организма.

5.2.3. Восстановление фумарата в митохондриях аскариды Многие бактерии способны использовать фумарат в качестве конечного акцептора электронов. Однако существует пример, когда подобный механизм применяется и в митохондриях животного. Речь идет об имаго аскариды — гельминта, паразитирующего в анаэробных участках кишечника * Этот процесс катализируется хинол-фумаратредуктазным комплексом, который подобен (но не идентичен) сукцинат-CoQ редуктазному комплексу (другие названия: сукцинатдегидрогеназа и комплекс II).

Bioenergetica.indb 117

26.01.2011 18:02:41

118

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 5.5. Схема дисмутации малата в митохондриях аскариды

млекопитающих. Для биологов оказалось сюрпризом, что клетки аскариды содержат большое количество митохондрий: аскарида живет в анаэробных участках кишечника, и митохондрии с их дыхательной цепью им вроде бы не нужны. Исследование показало, что в митохондриях аскариды активность конечных участков дыхательной цепи действительно очень низка, но ее начальный сегмент весьма активен. Ферменты цикла Кребса, ответственные за превращение трикарбоновых кислот, отсутствуют, в то время как ферменты, метаболизирующие дикарбоновые кислоты, имеются в большом количестве. Впоследствии выяснилось, что запасание энергии митохондриями аскариды обусловлено восстановлением фумарата. Как сам фумарат, так и атомы водорода, необходимые для его восстановления, образуются за счет дисмутации малата (рис. 5.5). Источником малата служит цепь реакций гликолиза, образующая пируват из глюкозы. Малат может быть получен из пирувата путем его карбоксилирования. Перенос восстановительных эквивалентов от NADH к хинону катализируется комплексом I. На этом этапе происходит запасание энергии в виде . Образованный хинол окисляется фумаратредуктазой. Интересно отметить, что в митохондриях имаго аскариды, как и в анаэробной дыхательной цепи E. coli, также происходит замена убихинона на его аналог с более отрицательным редокс-потенциалом. Однако в данном случае используется не менахинон, а еще одно производное хинона — родохинон (см. Приложение 2). Личинки аскариды, живущие в аэробных условиях (в крови), располагают митохондриями с обычной дыхательной цепью и полным набором ферментов цикла Кребса.

5.2.4. Дыхательная цепь Azotobacter vinelandii A. vinelandii является почвенной азотфиксирующей бактерией (т.е. бактерией, способной осуществлять восстановление молекулярного азота до ионов аммония). Большинство азотфиксирующих бактерий не могут ассимилировать N2 в условиях высокого содержания кислорода в окружающей среде, так как нитрогеназный комплекс, ответственный за восстановление азота, необратимо инактивируется при взаимодействии с О2. A. vinelandii является исключением из этого правила: этот микроорганизм способен эффективно фиксировать молекулярный азот даже при высоких концентрациях О2 в среде роста. Однако нитрогеназный комплекс A. vinelandii так же чувствителен к кислороду, как и у других бактерий. Таким образом, должен существовать какой-то специальный механизм, позволяющий A. vinelandii защищать нитрогеназу от инактивации кислородом.

Bioenergetica.indb 118

26.01.2011 18:02:41

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 119

Рисунок 5.6. Схема строения дыхательной цепи и генерации мембранного потенциала у почвенной азотфиксирующей бактерии A. vinelandii [Bertsova et al., 2001; J. Bacteriol., 183: 6869–6874]

В 1969 г. Дальтон и Постгейт выдвинули гипотезу, объясняющую способность Azotobacter к фиксации N2 даже при высоких концентрациях кислорода. Они предположили, что клетки A. vinelandii за счет значительного увеличения скорости дыхания снижают концентрацию О2 в цитоплазме до такого низкого уровня, при котором нитрогеназа уже не инактивируется. Действительно, было установлено, что при высоких концентрациях кислорода клетки A. vinelandii имеют такие большие скорости дыхания, которые оказываются максимальными среди всех исследованных бактерий. Какие же особенности дыхательной цепи A. vinelandii позволяют этой бактерии дышать так быстро и, таким образом, осуществлять механизм «дыхательной защиты» нитрогеназного комплекса? Как видно из схемы, представленной на рис. 5.6, дыхательная цепь A. vinelandii в основном состоит из уже хорошо знакомых нам компонентов — двух NADH:хинон-оксидоредуктаз (NDH-1 и NDH-2), bc1-комплекса и по крайней мере двух терминальных оксидаз (цитохром с-оксидазы cbb3-типа и хинолоксидазы bd-типа)*. Как видно из этой схемы, при росте в условиях низкой концентрации кислорода и избытка связанного азота дыхательная цепь A. vinelandii преимущественно состоит из ферментов с высокой эффективностью сопряжения, а именно: NDH-1, bc1-комплекса и цитохром с-оксидазы cbb3-типа. Общая эффективность генерации протонного потенциала при этом составляет, как и у митохондрий, 5 Н+/ . В то же время в условиях повышенной аэрации и особенно в условиях дефицита связанного азота дыхание катализируется в основном несопряженными ферментами или ферментами с пониженной эффективностью запасания энергии, а именно: NDH-2 и хинолоксидазой bd-типа. Суммарная эффективность сопряжения для такой цепи составляет всего лишь 1 Н+/ . Таким образом, индукция этих ферментов приводит к пятикратному снижению эффективности генерации протонного потенциала полной дыхательной цепью. Такая низкая эффективность приводит к тому, что при необходимости осуществления дыхательной защиты нитрогеназного комплекса активность электрон-транспортной цепи A. vinelandii не лимитируется генерируемым протонным потенциалом. Кроме того, NDH-2 и хинолоксидаза bd-типа имеют очень высокие значения удельной активности. Так, в случае NDH-2 из E. coli удельная активность этого фермента как минимум на 2–3 порядка выше, чем активность NDH-1. Очевидно, такая высокая активность NDH-2 * Свойства всех этих ферментов были подробно изложены в разделах, посвященных дыхательным цепям E. coli и P. denitrificans.

Bioenergetica.indb 119

26.01.2011 18:02:41

120

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

и хинолоксидазы bd-типа связана прежде всего с отсутствием активности протонных помп у этих ферментов. За кинетические преимущества дыхательной цепи, состоящей из NDH-2 и хинолоксидазы bd-типа, A. vinelandii вынужден «платить» очень низкой эффективностью запасания энергии при дыхании, что приводит к крайне низкому к.п.д. (прирост биомассы, нормированный на количество потребленных субстратов), характерному для этого микроорганизма при росте в условиях высокой аэрации и в отсутствии связанного азота.

5.2.5. Окисление дыхательными цепями бактерий субстратов с положительным редокс-потенциалом Примером энергетики такого типа служит бактерия Thiobacillus ferrooxidans. В качестве единственного энергетического ресурса Th. ferrooxidans может использовать ион закисного железа (Fе2+), который она окисляет до иона окисного железа (Fе3+) кислородом воздуха. Редокс-потенциал пары Fe2+/Fe3+ равен +770 мВ. Редокс-потенциал пары Н2О/О2 при нейтральном рН оказывается равным +820 мВ. Таким образом, разность потенциалов между окислителем и восстановителем составляет мизерную величину порядка 50 мВ, что недостаточно для генерации , необходимой для образования ATP посредством H+-ATP-синтазы (около 180 мВ). Решение этого вопроса было найдено, когда приняли во внимание зависимость редокс-потенциала пары Н2О/О2 от рН. Так как ионы водорода участвуют в образовании воды из О2 (О2 + 4 + 4Н+ → 2Н2О), этот редокс-потенциал становится более положительным по мере закисления среды, которое сдвигает вправо равновесие реакции восстановления кислорода. Количественно этот сдвиг равен 60 мВ на единицу рН. Таким образом, например, при рН = 3 редокс-потенциал пары Н2О/О2 будет 820 мВ + (4 × 60 мВ) = 1060 мВ. Это на 290 мВ положительнее, чем редокспотенциал пары Fе2+/Fе3+, который не зависит от рН, ибо в окислении закисного железа ионы H+ не участвуют. Такая разность потенциалов уже вполне достаточна, чтобы синтезировать ATP. Вот почему железобактерии живут только при кислых значениях рН (оптимум рН для Th. ferrooxidans находится между 3 и 1). Синтез ATP — лишь одна из проблем, которые приходится решать Th. ferrooxidans. Другая проблема — как использовать донор электронов с положительным редокс-потенциалом для обеспечения биосинтезов восстановительными эквивалентами. Th. ferrooxidans — хемолитотрофная бактерия. Она может образовывать все свои компоненты из СО2, Н2О, NH3 и минеральных солей. Чтобы достичь этого, необходим какой-то механизм восстановления NAD(P)+ посредством Fe2+. Такое восстановление требует затрат энергии, так как значение редокс-потенциала для пары NAD+/NADH (–320 мВ) гораздо отрицательнее, чем значение потенциала пары Fe2+/Fe3+. Чтобы преодолеть подобное затруднение, бактерия использует обратный перенос электронов в средних и начальных сегментах дыхательной цепи. Этот термодинамически невыгодный транспорт электронов от высокого

Bioenergetica.indb 120

26.01.2011 18:02:42

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 121

Рисунок 5.7. Схема окисления Fe2+ дыхательной цепью Th. ferrooxidans

редокс-потенциала к низкому осуществляется за счет энергии , образуемой в конечном сегменте дыхательной цепи. Схема энергообеспечения железобактерий предполагает, что электроны, отобранные от Fe2+, поступают в цитохромоксидазную систему, которая переносит электроны на кислород сопряженно с генерацией . Образуемый протонный потенциал затем используется не только для синтеза ATP, но и для обеспечения всех прочих видов работы, присущих бактериутилизируется, чтобы развернуть вспять альной мембране. Кроме того, CoQН2-цитохром с-редуктазную и НАДН-CoQ-редуктазную реакции, которые из -генераторов становятся потребителями (рис. 5.7). Опыты, проведенные с двумя видами железобактерии М.И.X. Алимом и сотрудниками, а в нашей группе Г. В. Тихоновой, показали, что Fe2+ действительно может восстанавливать NAD+ посредством обратного переноса электронов, который поддерживается энергией, продуцируемой в конечном сегменте дыхательной цепи. В соответствии с этой схемой было также установлено, что Th. ferrooxidans содержит огромные количества цитохромов с и цитохромоксидазы, в то время как компоненты среднего и начального сегментов цепи представлены в гораздо меньших количествах. Такая гипертрофия цитохромоксидазной системы объясняет исключительно высокую скорость потребления кислорода на 1 мг белка, которая оказалась в семь раз выше, чем у митохондрии сердца быка. Этот факт становится вполне понятным, если учесть, что железобактерии располагают только одним -генератором, поставляющим необходимую энергию для всех функций клетки. Fe2+ не единственный донор электронов с положительным редокспотенциалом, утилизируемый бактериями рода Thiobacillus. Они способны окислять также тиосульфат в сульфат через цитохром с и цитохромоксидазу: S2O32– + 2O2 + H2O → 2SO42– + 2H+.

(5.2)

Процесс сопряжен с синтезом ATP, причем разобщители-протонофоры блокируют этот синтез. Ситуация, аналогичная таковой у Thiobacillus, наблюдается также в случае Nitrobacter, окисляющего нитрит. Электроны, отобранные у нитрита, который превращается в нитрат (редокс-потенциал +420 мВ), переносятся на цитохромоксидазу, а затем на О2. Этот процесс поставляет энергию для синтеза ATP и переноса электронов от NO2– к NAD+.

5.2.6. Дыхательная цепь цианобактерий Дыхательная цепь цианобактерий имеет уникальное строение. Основной особенностью цианобактерий является то, что в тилакоидных мембранах этих организмов одновременно функционируют две электрон-

Bioenergetica.indb 121

26.01.2011 18:02:42

122

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

транспортные цепи — фотосинтетическая и дыхательная. Более того, эти две цепи имеют несколько общих компонентов, а именно — bc1-комплекс, пластохинон и цитохром с6 (или пластоцианин). Дыхательная цепь цианобактерий состоит из уже хорошо известных нам белков: нескольких NAD(P) H:хинон-оксидоредуктаз NDH-1* и NDH-2 типа, bc1-комплекса и цитохром с-оксидазы aa3-типа. Наряду с «каноническим» комплексом IV, некоторые цианобактерии также содержат хинолоксидазу bd-типа или альтернативную цианид-резистентную оксидазу. Важно отметить, что единственным хиноном дыхательной цепи цианобактерий является пластохинон. Фотосинтетическая и дыхательная цепи в клетках цианобактерий имеют несколько разную локализацию. Компоненты дыхательной цепи расположены как в цитоплазматической, так и в тилакоидной мембранах, в то время как фотосинтетическая цепь функционирует только в тилакоидной мембране.

5.2.7. Дыхательная цепь хлоропластов Поглощение кислорода хлоропластами (хлородыхание) было описано более 40 лет назад. Однако молекулярные основы этого процесса были установлены лишь в самое последнее время. Оказалось, что хлоропласты могут содержать отдельные компоненты дыхательной цепи, сходные с таковыми у цианобактерий. Было установлено, что мембраны хлоропластов некоторых (но далеко не всех) растений содержат NAD(P)H:пластохинон оксидоредуктазу NDH-1 типа. Там же, возможно, присутствуют и NAD(P) H:пластохинон-оксидоредуктазы типа NDH-2. Более того, в этих органеллах была обнаружена и оксидаза, гомологичная цианид-резистентной оксидазе цианобактерий**. Таким образом, в хлоропластах может функционировать дыхательная цепь, состоящая из хинон-редуктазного и хинол-оксидазного участков. Активность дыхательной цепи хлоропластов невелика, и перенос электронов по ней составляет менее 1% от переноса электронов по фотосинтетической цепи. Считается, что основной ролью этой дыхательной цепи является не обеспечение хлоропластов энергией, а участие в регуляции активности фотосинтетической цепи. Так, активность дыхательной цепи в хлоропластах может влиять на уровень восстановленности пластохинона, а одновременное функционирование фотосистемы I и NDH-1 (NDH-2) может приводить к циклическому переносу электронов вокруг этой фотосистемы. В то же время функционирование дыхательной цепи в других пластидах, отличных от хлоропластов (например, в этиопластах), может быть важно и с точки зрения их энергообеспечения за счет дыхания, так как в этих случаях NDH-1 может оказываться единственным энергопреобразующим ферментом данных органелл. * Как было упомянуто в предыдущей главе, NDH-1 цианобактерий содержит необычный FP-фрагмент, и этот белок, по-видимому, является NADPH:пластохиноноксидоредуктазой. ** Интересно отметить, что цианрезистентная оксидаза хлоропластов более похожа на AOX цианобактерий, нежели на AOX митохондрий тех же растений.

Bioenergetica.indb 122

26.01.2011 18:02:42

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 123

5.3. Электрон-транспортная цепь метаногенных архей Как было упомянуто в главе 3, при анаэробных условиях бактерии способны обеспечивать себя энергией за счет процессов брожения. При этом глюкоза может сбраживаться до ацетата, СО2 и Н2 (5.3), реже — до лактата, этанола, сукцината, пропионата, формиата и т.п. Глюкоза + 2Н2О → 2СН3СООН + 2СО2 + 4Н2,

(5.3)

ΔG0′ = –216 кДж/моль. Эта реакция сопровождается выделением энергии, которая в ходе брожения может быть запасена в виде АТР, как правило, с использованием механизма субстратного фосфорилирования. Однако продукты сбраживания глюкозы еще потенциально содержат достаточно большое количество утилизируемой энергии. Энергетически максимально выгодным был бы следующий процесс: Глюкоза → 3СО2 + 3CН4,

(5.4)

ΔG0′ = –418 кДж/моль. Однако сегодня не известен ни один микроорганизм, способный осуществлять реакцию (5.4). Тем не менее данный процесс активно реализуется во многих анаэробных нишах земной биосферы, но он осуществляется не каким-нибудь одним организмом, а целыми бактериальными сообществами, где каждый из участников специализируется на проведении отдельных стадий расщепления глюкозы до углекислого газа и метана. Вначале глюкоза сбраживается бактериями и некоторыми одноклеточными эукариотами до таких соединений, как ацетат, этанол, формиат, СО2, Н2 и т.п. Далее эти соединения метаногенами преобразуются в метан. Необходимо отметить, что метаногенез играет исключительно важную роль в круговороте углерода в земной биосфере. Считается, что в ходе метаногенеза образуется более 109 тонн метана в год. Большая часть этого газа впоследствии попадает в аэробные слои Земли, где метан может быть окислен молекулярным кислородом в клетках различных метилотрофных бактерий (этот процесс также очень важен для биосферы, так как СН4 является мощным парниковым газом). Небольшая часть образованного метана накапливается в подземных месторождениях. Именно она интенсивно используется человеком в качестве одного из основных видов топлива. Метаногены могут осуществлять следующие основные виды реакций: 4Н2 + CО2 → СН4 + 2H2О,

(5.5)

ΔG0′ = –131 кДж/моль;

Bioenergetica.indb 123

26.01.2011 18:02:42

124

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

CН3ОН + Н2 → СН4 + H2О,

(5.6)

ΔG0′ = –113 кДж/моль. Иными словами, метаногены способны восстанавливать молекулярным водородом одноуглеродные соединения с образованием метана и воды. Кроме того, метаногены могут метаболизировать некоторые продукты брожения бактерий без использования Н2: СН3СООН → СН4 + СО2,

(5.7)

ΔG0′ = –36 кДж/моль; 4НСООН → СН4 + 3СО2 + 2Н2О,

(5.8)

ΔG0′ = –145 кДж/моль; 4СН3ОН → 3СН4 + СО2 + 2Н2О,

(5.9)

ΔG0′ = –107 кДж/моль. При этом происходит энергетически выгодное диспропорционирование либо различных атомов углерода в С2-соединениях (так, один из С-атомов ацетата может окислиться до СО2 за счет восстановления второго атома до СН4), либо различных молекул С1-соединений (одна молекула метанола может окислиться до СО2 за счет восстановления трех других молекул метанола до метана). Метаногены являются высокоспециализированными организмами и способны использовать в качестве субстратов для роста лишь ограниченное число субстратов: ацетат, Н2, СО2 и некоторые С1-соединения (формиат, метанол, метиламин и метилтиолы). Все известные на сегодняшний день метаногены относятся к царству архей, и, как мы увидим далее, они обладают уникальным набором ферментов и кофакторов, практически не встречающихся в хорошо уже известных нам бактериях и эукариотах. Энергия, выделяющаяся в ходе реакций 5.5–5.9, может быть запасена метаногенными бактериями в виде АТР. Однако, в отличие от реакций брожения, АТР в данном случае синтезируется не за счет реакций субстратного или в качестве интерфосфорилирования, а при использовании медиата. Значит, как и в случае с дыхательным фосфорилированием, вначале за счет энергии некоторых реакций метаногенеза происходит трансмембранный перенос ионов Н+ (Na+). Далее протонный (натриевый) потенциал может быть потрачен для осуществления синтеза АТР за счет активности АoА1-АТР-синтазы — архейского аналога FoF1-ATP-синтазы бактерий и эукариот (см. ниже, разд. 7.1). Рассмотрим вкратце, каким образом энергия реакций метаногенеза запасается в виде (или ). Реакции метаногенеза можно условно разделить на два этапа — на «окислительную» и «восстановительную» фазы этого процесса.

Bioenergetica.indb 124

26.01.2011 18:02:42

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 125

5.3.1. Окислительная фаза метаногенеза Данная стадия заключается в переносе электронов с уникального кофактора метаногенов HS–CоМ на атом углерода с образованием окисленного CоМ и молекулы метана. Кофермент М (CoM, 2-меркаптоэтансульфонат) содержит реакционную сульфгидрильную группу, и этот кофактор на начальных стадиях окислительной фазы окисляется до метил-S-CоМ (рис. 5.8).

Рисунок 5.8. Пути образования CH3–S–CoM из ацетата, CO2 и некоторых восстановленных C1 соединений (CH3–X), таких, как метанол, метилтиол и метиламин

В случае использования метанола, метиламина и метилтиолов происходит прямой перенос метильной группы на CоМ. При росте на ацетате или СО2 образование CH3–CоМ осуществляется в несколько стадий. В частности, метильная группа вначале переносится на особый кофактор H4MPT (тетрагидрометаноптерин). Далее метильная группа с CH3–H4MPT переносится на CоМ: CH3–H4MPT + HS–CоМ → H4MPT + CH3–S–CоМ.

(5.10)

Эта экзергоничная реакция сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов натрия, т.е. выделяющаяся в ходе данной реакции энергия может быть запасена в виде (эта реакция будет более подробно описана в разд. 12.3). Таким образом, в окислительной части метаногенеза при использовании ацетата или СО2 (но не метанола, метиламина и метилтиолов) присутствует реакция, сопряженная с запасанием энергии*. Далее CH3–S–CоМ взаимодействует еще с одним специфическим кофактором метаногенов, содержащим –SH группировку, — коферментом B (меркаптогептаноил-треонинфосфатом): CH3–S–CоМ + НS–CоB → CH4 + CоМ–S–S–CоB.

(5.11)

В ходе этой реакции происходит высвобождение метана и образование гетеродисульфида CоМ–S–S–CоB. Реакция 5.11 сопровождается значительным выделением энергии. Однако, насколько известно, эта реакция ( ), ни с синтезом АТР. В то же не сопряжена ни с образованием * Однако следует отметить, что на начальных этапах метаногенеза для активации молекул СН3СООН и СО2 используется соответственно энергия гидролиза АТР и энергия трансмембранного натриевого потенциала. Таким образом, окислительная часть метаногенеза в целом не приводит к запасанию энергии.

Bioenergetica.indb 125

26.01.2011 18:02:43

126

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

время высвобождающаяся на этой стадии энергия может быть фактором, сдвигающим в сторону образования продуктов равновесие последующих эндэргонических стадий восстановительной части метаногенеза.

5.3.2. Восстановительная фаза метаногенеза Восстановительная фаза метаногенеза заключается в окислении различных субстратов, сопряженном с восстановлением гетеродисульфида до CоМ–SН + CоB–SН. Эти реакции реализуются несколькими мембранными ферментами, организованными в своеобразную энергозапасающую электрон-транспортную цепь, где гетеродисульфид играет роль конечного акцептора электронов. В качестве первичного донора электронов для этой цепи может использоваться либо молекулярный водород (если метаногены осуществляют реакции 5.5–5.6), либо восстановленная форма специфического кофактора архей — F420* (при осуществлении реакций 5.8–5.9). Рассмотрим, каким образом может запасаться энергия при восстановлении гетеродисульфида молекулярным водородом. Данная реакция осуществляется в две стадии. Вначале особый фермент — F420-независимая гидрогеназа — окисляет Н2 и переносит электроны на липофильный кофактор архей метанофеназин (MP), являющийся функциональным (но не структурным) аналогом хинонов дыхательных цепей бактерий и эукариот. Гидрогеназа состоит из трех субъединиц, содержащих два гема B, железосерный кластер и особую простетическую группу, состоящую из негемового железа и атома никеля. Как видно на рис. 5.9, на центре [NiFe] происходит окисление Н2, далее электроны через [Fe–S]-кластер переносятся на цитохром b, где происходит восстановление метанофеназина. Образующиеся при окислении Н2 протоны выделяются во внешнюю среду, а при образовании MPН2 из MP протоны поглощаются из цитоплазмы. Таким образом, гидрогеназа генерирует протонный потенциал со стехиометрией 1 H+/ по механизму Митчеловой петли. Образованный MPН2 может быть окислен следующим ферментом электрон-транспортной цепи метаногенов — гетеродисульфидредуктазой. Этот фермент состоит из двух субъединиц и содержит два [Fe–S]-кластера и два гема B (редокс-потенциалы гемов в случае с Methanosarcina barkeri составляют –180 и –23 мВ). На цитохромной субъединице гетеродисульфидредуктазы происходит окисление MPН2. При этом протоны выделяются во внешнюю среду, а электроны трансмембранно переносятся через гемы B на [Fe–S]-кластеры и далее — на гетеродисульфид с образованием CоМ–SН и CоB–SН. В ходе последней реакции происходит поглощение двух протонов из цитоплазмы. Таким образом, гетеродисульфидредуктаза, как и гидрогеназа, генерирует протонный потенциал по механизму Митчеловой петли со стехиометрией 1 H+/ . В ходе этих двух стадий энергия Н2:гетеродисульфид. оксидоредуктазной реакции запасается в виде Если метаногены используют для роста различные С1-соединения в отсутствие Н2 (т.е. если они осуществляют реакции 5.8–5.9), в этом случае * F420 является производным дезазофлавина.

Bioenergetica.indb 126

26.01.2011 18:02:43

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших... 127

Рисунок 5.9. Пример электрон-транспортной цепи метаногенных архей

основным донором электронов для электрон-транспортной цепи служит восстановленная форма кофактора F420 (E0′ = –360 мВ). У архей F420 служит гидрофильным переносчиком гидрид-иона. Данный кофактор восстанавливается при окислении С1-соединений* и окисляется электрон-транспортной цепью. Таким образом, у метаногенов F420 оказывается функциональным аналогом NAD+. Окисление восстановленного F420 катализируется F420Н2-метанофеназиноксидоредуктазой. Как показано в предыдущей главе, этот фермент гомологичен комплексу I дыхательной цепи митохондрий и его активность (как и активность комплекса I) сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов Н+. Затем образованный MPН2 (как и в случае использования Н2) окисляется гетеродисульфидредуктазой. Итак, реакции восстановительной фазы метаногенеза сопряжены с генерацией . Образованный в ходе реакций протонный потенциал может быть далее использован для синтеза ATP за счет активности A0A1-ATP-синтазы. Эти реакции являются основным источником энергии для жизнедеятельности метаногенных архей. * F420Н2 может образовываться и при окислении Н2 за счет активности F420-зависимой гидрогеназы.

Bioenergetica.indb 127

26.01.2011 18:02:43

ГЛАВА ШЕСТАЯ

БАКТЕРИОРОДОПСИН

6.1. Принцип действия

В

1971 г. Д. Остерхельт и В. Стокениус открыли в мембранах экстремально галофильной археи Halobacterium salinarium (первоначально эта архея была ошибочно определена как H. halobium) новый ретиналь-содержащий белок — бактериородопсин. В дальнейшем было продемонстрировано, что он позволяет клеткам этого микроорганизма преобразовывать энергию солнечного света в , т.е. функционирует как светозависимая Н+-помпа. А.А. Ясайтисом в нашей лаборатории было доказано, что , генерируемый бактериородопсином на мембране H. salinarium, может поддерживать синтез ATP. За последующие годы был достигнут большой прогресс в определении механизма светоиндуцированного трансмембранного переноса протона посредством бактериородопсина. Бактериородопсин обладает целым набором особых свойств, которые в значительной мере облегчают его изучение. Это удобные спектральные свойства данного белка в видимой области; возможность запуска трансмембранного переноса протона лазерной вспышкой; способность бактериоро-

Рисунок 6.1. Д. Остерхельт (слева) и В. Стокениус (справа)

Bioenergetica.indb 128

Рисунок 6.2. А.А. Ясайтис

26.01.2011 18:02:44

Глава 6. Бактериородопсин

129

допсина образовывать как двумерные кристаллы в пурпурных бляшках, так и трехмерные кристаллы в искусственной кубической фазе липидов; возможность использования метода сайт-специфического мутагенеза; небольшой размер и исключительная стабильность белка в широчайшем диапазоне концентраций органических растворителей, значений рН, температуры, давления и многое другое. На сегодня бактериородопсин является наиболее изученной протонной помпой, а полная идентификация механизма работы этого белка должна способствовать определению механизмов функционирования и других протон-переносящих ферментов. Бактериородопсин представляет собой одиночный полипептид с мас-гесой 26 кДа, что значительно меньше, чем у всех других известных нераторов. Обычно молекулы бактериородопсина in vivo образуют тримеры (однако и в мономерной форме этот белок может работать как протонный насос). Бактериородопсин локализован в специальных областях цитоплазматической мембраны Н. salinarium — так называемых пурпурных бляшках, достигающих 0,5 мкм в диаметре. Пурпурные бляшки практически насыщены бактериородопсином, этот белок составляет около 75% вещества данной мембраны (остальное — фосфо- и сульфолипиды, а также каротиноиды). Бактериородопсин характеризуется регулярной (кристаллической) упаковкой в мембране пурпурных бляшек. Других белков в этих бляшках нет, так что данные мембранные образования представляют собой своеобразные двумерные кристаллы бактериородопсина. Такие процессы, как межмолекулярный перенос окислительновосстановительных эквивалентов или гидролиз ковалентных макроэргических связей, протекающие в других -генераторах, в бактериородопсине не обнаружены. Согласно современной точке зрения, механизм действия бактериородопсина состоит в следующем. Поглощение фотона остатком ретиналя, ковалентно связанным в молекуле бактериородопсина посредством альдиминной связи с ε-аминогруппой остатка лизина, вызывает изомеризацию ретиналя по типу «полностью транс → 13-цис» (рис. 6.3). Этот процесс сопровождается очень резким «кислым сдвигом» рKа иминного азота Шиффова основания, который в темновой форме бактериородопсина протонирован.

Рисунок 6.3. Светозависимая «полностью транс → 13-цис» изомеризация остатка ретиналя в бактериородопсине

Bioenergetica.indb 129

26.01.2011 18:02:45

130

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

В результате Шиффово основание депротонируется, и высвобождающийся протон выделяется в водную фазу снаружи бактериальной клетки. Затем рKа Шиффова основания сдвигается к исходному значению, т.е. сродство основания к протонам вновь возрастает. В результате Шиффово основание протонируется, причем для этой цели используется Н+, поступающий изнутри клетки. Далее ретиналь возвращается в свою исходную конформацию (переход «13-цис → полностью транс»). Таким образом, вызванное светом циклическое превращение бактериородопсина оказывается сопряженным с транспортом иона Н+ через цитоплазматическую мембрану Н. salinarium.

6.2. Структура бактериородопсина Бактериородопсин оказался хронологически первым -генератором, для которого удалось выяснить первичную структуру. Это было сделано Ю.А. Овчинниковым, Н.Г. Абдулаевым и сотрудниками (1978), а позднее X.Г. Кораной и его коллегами (1979). Оказалось, что белок состоит из 248 аминокислотных остатков, образующих семь гидрофобных последовательностей (по 24–28 аминокислот каждая), чередующихся с более короткими гидрофильными участками. Кроме того, на С-конце молекулы белка находится гидрофильная последовательность, включающая около 20 аминокислот. В 1975 г. Р. Хендерсон и П. Ануин опубликовали пространственную модель бактериородопсина с разрешением порядка 7 Å (впоследствии разрешение этого метода было увеличено до ~3 Å). Данные авторы использовали уникальное свойство бактериородопсина образовывать in vivo двумерные кристаллы в пурпурных бляшках. Используя электронный микроскоп и метод анализа дифракции электронов, авторы получили изображения бактериородопсина, приведенные на рис. 6.6 АБ. Оказалось, что полипептидная цепь бактериородопсина семь раз пересекает мембрану, формируя семь α-спиральных колонн (обозначенных буквами алфавита от A до G), об-

Рисунок 6.4. Ю.А. Овчинников (слева) и X.Г. Корана (справа)

Bioenergetica.indb 130

Рисунок 6.5. Р. Хендерсон

26.01.2011 18:02:45

Глава 6. Бактериородопсин

131

Рисунок 6.6. Пространственная организация бактериородопсина. А — карта распределения электронной плотности в пурпурной бляшке (проекция на плоскость мембраны); одна из молекул бактериородопсина обведена пунктиром, ячейка двумерного кристалла — сплошной линией; Б — вид сбоку модели одной молекулы бактериородопсина, реконструированной на основе карт распределения электронной плотности; В — вероятное расположение семи α-спиральных колонн в молекуле бактериородопсина

разованных в основном гидрофобными аминокислотами. Каждая из колонн высотой порядка 3,5 нм. На рис. 6.6 Б отсутствуют гидрофильные вставки, связывающие гидрофобные колонны, так как разрешение метода слишком низко, чтобы их увидеть. N- и С-концы полипептидной цепи бактериородопсина находятся по разные стороны цитоплазматической мембраны: N-конец обращен наружу, а С-конец — внутрь клетки. Впоследствии трехмерная структура бактериородопсина была определена и методом рентгеноструктурного анализа (с разрешением до ~1,4 Å). Эта более детальная структура белка позволила выявить некоторые важные

Bioenergetica.indb 131

26.01.2011 18:02:46

132

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Рисунок 6.7. Структура бактериородопсина с указанием основных функциональных аминокислотных остатков [Lanyi 2004, Annu. Rev. Physiol. 66: 665–688]. Wat402 (зеленый шарик в центре мембраны) — молекула связанной воды в области Asp-85 и Asp-212

элементы, указывающие на возможный механизм работы бактериородопсина. Было установлено, что остаток ретиналя в молекуле бактериородопсина связан с Lys-216, локализованным в колонне G. Шиффово основание находится в сердцевинной гидрофобной части белка (см. рис. 6.7), чуть ближе к внешней поверхности мембраны. Вблизи Шиффова основания находятся два остатка аспарагиновой кислоты — Asp-85 и Asp-212. Остаток аспартата Asp-85 связан с внешней средой протон-переносящим путем, состоящим из остатков Arg-82, Glu-194 и Glu-204, а также 7–8 прочносвязанных молекул воды. Таким образом, депротонирование Шиффова основания во время фотоцикла бактериородопсина может приводить к выбросу образующегося протона во внеклеточную среду. В то же время в бактериородопсине между Шиффовым основанием и цитоплазматической поверхностью мембраны почти нет остатков полярных аминокислот. В этой части белка расположен лишь один остаток аспартата — Asp-96. Однако расстояния от цитоплазматической поверхности мембраны к Asp-96 и далее от Asp-96 до Шиффова основания (10–12 Å) слишком велики для прямого переноса протонов. Та-

Bioenergetica.indb 132

26.01.2011 18:02:47

Глава 6. Бактериородопсин

133

ким образом, для осуществления репротонирования Шиффова основания во время фотоцикла должны происходить значительные конформационные изменения, приводящие к образованию узкой обводненной щели, ведущей из цитоплазмы к Asp-96 и дальше к Шиффову основанию. Некоторые структурные особенности бактериородопсина указывают на вероятный механизм таких перестроек. Так, колонны B, C и F имеют изгибы за счет присутствия в этих α-спиралях остатков пролина. Колонна G также обладает мобильным структурным элементом. Ход α-спирали в этой колонне с цитоплазматической стороны прерван одним витком π-спирали («π-выступом»). Этот элемент образуется за счет того, что карбонильные атомы кислорода в пептидной группировке остатков Ala-215 и Lys-216 образуют водородные связи не с атомами водорода последующих пептидных группировок (как в α-спиралях), а с молекулами воды. Таким образом, в этом элементе возможен π ↔ α переход, вероятно приводящий к значительным структурным изменениям в цитоплазматической части бактериородопсина и к осуществлению репротонирования Шиффова основания.

6.3. Фотоцикл бактериородопсина Поглощение фотона бактериородопсином вызывает ряд превращений, замкнутых в цикл (рис. 6.8). Каждое из них может быть прослежено по характерному спектральному сдвигу. Уже в 1971 г. Д. Остерхельт и В. Стокениус описали ключевой интермедиат бактериородопсинового фотоцикла, поглощающий свет при гораздо более короткой длине волны (412 нм), чем исходная форма бактериородопсина bR (568 нм). Поскольку этот спектральный сдвиг подобен переходу родопсин → метародопсин II (МII) в зрительном родопсине, коротковолновый интермедиат бактериородопсина был назван M412. В последующих работах были выявлены два интермедиата между bR568 и M412 в фотоцикле. Они были обозначены буквами алфавита, предшествующими М. Образование M412 стали описывать следующей схемой: bR568 → K600 → L550 → M412. Превращение M412 в bR в темновой фазе фотоцикла также включает два промежуточных продукта (M412 → N560 → О640 → bR568). В дальнейшем при анализе кинетики образования и распада формы M412 выяснилось, что на этой стадии фотоцикла образуется несколько разных интермедиатов со сходными спектральными свойствами (названных MI412 MII412 и MIII405), что привело к дальнейшему усложнению схемы фотопревраще- Рисунок 6.8. Схема фотоцикла бактериородопний бактериородопсина (рис. 6.8). сина с указанием основных его стадий

Bioenergetica.indb 133

26.01.2011 18:02:48

134

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Хранение бактериородопсина в темноте приводит в минутной шкале времени к так называемой темновой адаптации. При этом бактериородопсин превращается в новый компонент, поглощающий свет при 548 нм и содержащий 13-цис ретиналь. Темно-адаптированный bR548 неактивен как протонный насос, но освещение вызывает быстрый переход bR548 → bR568 (световая адаптация) в обычную активную форму бактериородопсина.

6.4. Светозависимый транспорт протонов бактериородопсином Прогресс в понимании функциональной активности бактериородопсина связан прежде всего с разработкой быстрых спектральных и электрометрических методов, а также с использованием очень коротких вспышек лазера для запуска фотоцикла этого белка. Спектральные измерения в максимумах интермедиатов фотоцикла позволяют следить за образованием и распадом последних. Чувствительные рН-индикаторы дают возможность наблюдать выделение и поглощение ионов Н+ молекулами бактериородопсина, одновременно запущенными вспышкой света. Прямое измерение смещений зарядов в бактериородопсине, сорбированном на коллодиевой пленке, дает информацию о переносе Н+ или каких-либо иных заряженных компонентов внутри молекулы этого -генератора. Л.А. Драчевым и А.Д. Кауленом были измерены следующие три параметра: 1) образование и распад М412 (по изменению поглощения света при 412 нм); 2) изменение рН в среде (по поглощению света рН-индикатором — р-нитрофенолом) и 3) генерация и разрядка ΔΨ, обусловленная смещением зарядов в бактериородопсине (по показаниям вольтметра, соединенного с двумя электродами, погруженными в растворы электролита по обе стороны коллодиевой пленки). Одновременное однократное срабатывание молекул бактериородопсина вызывали вспышкой лазера (t1/2 вспышки 15 нc). При измерениях сдвигов рН и поглощения при 412 нм использовали суспензию пурпурных бляшек. Для измерения ΔΨ те же бляшки сорбировали с одной стороны на коллодиевом фильтре. Как показали измерения, кинетика образования и распада М412 совпадает соответственно с выделением и поглощением бляшками Н+. Поскольку процессы образования М412 и выделения Н+ оказались намного быстрее (t1/2 около 250 мкс), чем распад М412 и поглощение Н+ (t1/2 порядка 30 мс), то их можно было легко соотнести с двумя основными электрогенными процессами, наблюдавшимися в системе бляшки-коллодиевая пленРисунок 6.9. А.Д. Каулен (слева) и Л.А. Драчев ка (приведенные выше величины

Bioenergetica.indb 134

26.01.2011 18:02:48

Глава 6. Бактериородопсин

135

t1/2 относятся к t°=5°С). Образование М412 и выброс Н+ коррелировали с электрогенной фазой, развивающейся в микросекундной временной шкале. Соответственно распад М412 и поглощение Н+ коррелировали со второй (миллисекундной) электрогенной фазой. Соотношение амплитуд микро- и миллисекундных фаз генерации ΔΨ оказалось равным 1:4. Микро- и миллисекундные электрогенные стадии имеют направление, соответствующее переносу положительных зарядов от цитоплазматической к внешней поверхности мембраны. В дальнейшем была описана цепочка молекулярных событий, приводящая к светозависимой трансмембранной транслокации протона. Это удалось осуществить при анализе различных мутантных форм бактериородопсина с замененными отдельными аминокислотными остатками. Наиболее важные данные были получены, когда удалось определить с хорошим разрешением трехмерную структуру не только исходной формы бактериородопсина bR548, но и некоторых интермедиатов его фотоцикла. Попробуем вкратце описать последовательность событий при трансмембранном переносе протонов этим белком. В бактериородопсине можно выделить три протон-донорные (протонакцепторные) группы, являющиеся ключевыми участниками этого процесса. Это азот Шиффова основания и два остатка аспартата — Asp-85 и Asp-96 (находящиеся соответственно с внешней и с цитоплазматической стороны от Шиффова основания, см. рис. 6.7). В исходной форме bR548 атом азота Шиффова основания находится в протонированной форме (рKа этой группы > 12), Asp-85 — депротонирован (рKа = 2,5), а Asp-96 — протонирован (рKа = 10). Остаток ретиналя в исходной форме bR548 находится в виде полностью транс изомера. При поглощении света бактериородопсином происходят следующие основные события: 1. Переход bR570 → K590 За счет энергии светового кванта остаток ретиналя в бактериородопсине изомеризуется из полностью-транс в 13-цис. В растворе подобная фотоизомеризация ретиналя приводит к значительному изменению формы этой молекулы, которая становится более изогнутой по сравнению с полностью транс изомером. Однако на первой стадии фотоцикла бактериородопсина изогнутая конформация 13-цис ретиналя не может быть реализована из-за структурных ограничений, накладываемых на эту простетическую группу ретиналь-связывающим центром белка. Поэтому в интермедиате K590 остаток 13-цис ретиналя находится в так называемой «скрученной» конформации. Таким образом, на первой стадии фотоцикла энергия поглощенного кванта света запасается в виде напряженной конформации остатка ретиналя*. * Спектроскопия с субпикосекундным разрешением позволила выявить два предшественника K590 в фотоцикле бактериородопсина, а именно «истинно первичный» интермедиат I480 и следующий сразу за ним J625, образующийся из I480 за 700 фемтосекунд (7 × 10–13 сек).

Bioenergetica.indb 135

26.01.2011 18:02:49

136

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

2. Переход K590 → L550 На следующей стадии остаток 13-цис ретиналя переходит из напряженной конформации в релаксированную изогнутую конформацию. Это происходит за счет того, что остаток скрученного ретиналя «расталкивает» аминокислотные остатки белка и переводит молекулу бактериородопсина в новую напряженную конформацию (т.е. на этой стадии происходит передача энергии от ретиналя к белку) с измененным центром, связывающим ретиналь. 3. Переход L550 → M412I В новой конформации белка Шиффово основание и Asp-85 из-за еще неизвестных причин изменяют свои протон-донорные (акцепторные) свойства таким образом, что их рKа смещаются приблизительно к 8. Это приводит к переносу протона с Шиффова основания на Asp-85. 4. Переход MI412 → M412II На этой стадии осуществляется депротонирование остатка Glu-204 на внешней поверхности бактериородопсина, и, таким образом, осуществляется выброс протона во внешнюю среду. 5. Переход M412II → M405III Далее в молекуле бактериородопсина происходят значительные конформационные изменения. Здесь, по-видимому, меняется структура мобильных элементов α-спиралей этого белка (см. выше) и происходит образование щели между колоннами бактериородопсина в цитоплазматической его части. За счет этих изменений вода проникает в пространство между Asp-96 и Шиффовым основанием, что облегчает перенос протона между этими двумя группами. 6. Переход M405III → N560 Изменение окружения остатка аспартата Asp-96 приводит к сдвигу его рKа до значения ~7. Следствие этого — перенос протона от Asp-96 к Шиффову основанию. Таким образом, на данной стадии происходит репротонирование простетической группы бактериородопсина. 7. Переход N560 → О640 На данной стадии происходит обратная изомеризация 13-цис ретиналя в энергетически более выгодное состояние полностью-транс. На этой стадии осуществляется также репротонирование остатка Asp-96 за счет захвата протона из цитоплазмы и закрывается щель на цитоплазматической стороне бактериородопсина. 8. Переход О640 → bR568 На последней стадии происходит перенос протона от Asp-85 на Glu-204 и, таким образом, завершается фотоцикл бактериородопсина.

Bioenergetica.indb 136

26.01.2011 18:02:49

Глава 6. Бактериородопсин

137

В итоге поглощение одного кванта света молекулой бактериородопсина приводит к переносу одного протона через мембрану. Необходимо отметить, что, несмотря на значительный прогресс в определении механизма транслокации протона бактериородопсином, некоторые ключевые реакции этого процесса еще остаются невыясненными. Пожалуй, наиболее важным неясным моментом является определение природы молекулярной «защелки», переключающей доступность Шиффова основания от внешнего к внутреннему (цитоплазматическому) протон-переносящему пути. Все еще не известен ответ на вопрос, почему репротонирование Шиффова основания осуществляется за счет переноса протона от Asp-96, а не за счет простого возврата Н+ от Asp-85.

6.5. Другие ретиналь-содержащие белки 6.5.1. Галородопсин При исследовании Н. salinarium было установлено, что мембраны этого микроорганизма в дополнение к бактериородопсину содержат еще одну светозависимую ионную помпу — галородопсин. Галородопсин (hR) представляет собой ретиналь-содержащий белок, транспортирующий ионы С1– из среды в клетку Н. salinarium за счет энергии света. Это мембранный белок с молекулярной массой 27 кДа, т.е. того же порядка, что и у бактериородопсина. Включение галородопсина в протеолипосомы позволяет получить пузырьки, способные к светозависимому транспорту ионов хлора. Будучи сорбированными на плоской мембране, протеолипосомы генерируют фототок, обусловленный электрогенным транспортом ионов С1–. В мембране Н. salinarium галородопсин локализован вне пурпурных бляшек, и его содержание в клетке примерно в 100 раз меньше по сравнению с бактериородопсином. По аминокислотным последовательностям эти два ретиналь-содержащих белка различаются примерно на 70%; наибольшее сходство наблюдается в составе α-спиральных колонн, число которых в галородопсине, как и в бактериородопсине, равно семи. Как и в бактериородопсине, остаток ретиналя присоединен к галородопсину с помощью альдиминной связи с ε-аминогруппой остатка лизина. Трехмерная структура галородопсина была определена с помощью рентгеноструктурного анализа, и она оказалась очень близкой к структуре бактериородопсина. Наиболее важным отличием галородопсина является то, что этот белок не содержит в своем гидрофобном ядре остатков заряженных аминокислот, соответствующих ключевым остаткам аспартата (Asp85 и Asp-96) бактериородопсина. Фотоцикл галородопсина в общих чертах сходен с фотоциклом бактериородопсина и в качестве первого этапа включает в себя изомеризацию полностью-транс ретиналя в 13-цис изомер. Однако в процессе всего фотоцикла галородопсина Шиффово основание постоянно остается в протонированном состоянии.

Bioenergetica.indb 137

26.01.2011 18:02:49

138

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

Механизм действия галородопсина совершенно неясен. Основываясь на трехмерной структуре этого белка, можно сказать, что в темновой форме галородопсина ион С1– связан вблизи положительно заряженного протонированного Шиффова основания (приблизительно в том месте, где в бактериородопсине расположен остаток Asp-85). Возможно, что светоиндуцируемая изомеризация остатка ретиналя вызывает перемещение Шиффова основания вместе с электростатически связанным с ним ионом С1– от входного к выходному С1–-проводящему пути. Следует отметить, что в галородопсине (так же как и в бактериородопсине) между Шиффовым основанием и цитоплазматической поверхностью мембраны почти нет остатков полярных аминокислот. Таким образом, в цитоплазматической части галородопсина во время фотоцикла должны происходить значительные конформационные изменения, приводящие к образованию щели, постулированной и для структуры некоторых интермедиатов фотоцикла бактериородопсина. Тем не менее до сих пор непонятно, каким образом два белка со сходными структурами и свойствами (бактериородопсин и галородопсин) обладают специфичностью к столь разным ионам (каковыми являются Н+ и С1–), да еще при поглощении света переносят их в противоположных направлениях. Биологическая функция галородопсина состоит прежде всего в том, чтобы возвращать в клетку ионы С1–, электрофоретически удаляемые из цитоплазмы, которая заряжена отрицательно относительно внешней среды благодаря работе -генераторов (бактериородопсина и дыхательной цепи). Определенная утечка С1– неизбежна, если учесть, что ΔΨ на мембране галофильных архей достигает 200 мВ, а концентрация С1– в цитоплазме очень высока (до 4 М). Галородопсин ответственен за возврат меньшей части теряемых клеткой ионов хлора. Большая их часть возвращается посредством С1–, Н+-симпортера, локализованного в той же мембране. Обе эти системы могут также обеспечивать увеличение количества ионов С1– при возрастании объема клетки перед делением. Интересно отметить, что другая галофильная архея Natronomonas pharaonis не содержит бактериородопсина, и галородопсин является единственной светозависимой ионной помпой этого организма. Таким образом, по-видимому, галородопсин может использоваться не только для возврата ионов хлора в цитоплазму, но и для запасания энергии света в виде Δ Cl–. Скорее всего, в дальнейшем трансмембранный потенциал ионов хлора конвертируется в за счет активности описанного выше С1–,Н+-симпортера.

6.5.2. Распространенность бактериородопсина и его аналогов у различных живых организмов Присутствие бактериородопсина (галородопсина) в мембране некоторых галофильных архей позволяет им использовать солнечный свет в качестве источника энергии. На настоящий момент у живых организмов известны два принципиально разных способа запасать энергию квантов света в

Bioenergetica.indb 138

26.01.2011 18:02:49

Глава 6. Бактериородопсин

139

виде : это различные типы хлорофиллсодержащих фотосистем и бактериородопсин (галородопсин). Поглощение света хлорофилл-содержащими фотосистемами цианобактерий и растений приводит к разделению зарядов и к дальнейшему трансмембранному переносу электронов от субстрата с положительным редокс-потенциалом к продукту с отрицательным редокс-потенциалом. При этом энергия квантов света запасается как в виде (с эффективностью 1,5 Н+/hν), так и в виде разности окислительновосстановительных потенциалов субстрата и продукта этой реакции. В то же время при поглощении кванта света бактериородопсином данный белок просто переносит через мембрану протоны (с эффективностью 1 Н+/hν). Таким образом, бактериородопсин характеризуется меньшей эффективностью преобразования энергии по сравнению с хлорофилл-содержащими фотосистемами растительного типа*, и при работе данного белка энергия квантов света запасается только в виде . Известно, что для автотрофного типа метаболизма (прежде всего для фиксации углекислого газа) необходима не только энергия в виде АТР ( ), но и источник восстановительных эквивалентов с отрицательным редокс-потенциалом — NAD(P)H. Следовательно, функционирование бактериородопсина само по себе не способно обеспечить автотрофный тип метаболизма. Так, клетки H. salinarium не способны фиксировать СО2 и нуждаются в органических субстратах. Поэтому долгое время считалось, что в ходе эволюции бактериородопсин проиграл конкурентный отбор хлорофиллсодержащим фотосистемам и остался лишь в качестве реликта у представителей наиболее древних организмов, сохранившихся только в экстремальных нишах Земной биосферы, — H. salinarium и близкородственных ему видов галофильных архей. Однако недавно было установлено, что ген сходного бактериородопсину белка присутствует и у каких-то некультивируемых морских протеобактерий. При экспрессии этого гена в клетках E. coli в присутствии ретиналя синтезировался белок (названный протеородопсином), способный к светозависимой трансмембранной транслокации протонов. И оказалось, что белки семейства бактериородопсина распространены намного более широко, чем считалось ранее, и, возможно, играют более существенную роль в биосфере Земли. Однако если даже считать, что ретиналь-содержащие белки как преобразователи энергии света у большинства организмов проиграли конкурентный отбор в ходе эволюции, то все равно они нашли несколько иное, но важное применение: такие белки используются как рецепторы света и в этом качестве очень широко распространены среди живых организмов. Рассмотрим вкратце некоторые сенсорные ретиналь-содержащие белки. * Хлорофиллсодержащие фотосистемы также обладают лучшими светопоглощающими свойствами, особенно с учетом функционирования светособирающих антенн, отсутствующих в случае работы бактериородопсина (правда, совсем недавно было обнаружено, что гомолог бактериородопсина из бактерии Salinibacter ruber содержит в своем составе молекулу каротиноида, выполняющую, пусть и примитивно, функцию светособирающей антенны). В любом случае, хлорофиллсодержащие белки не только более эффективно преобразуют энергию света, но и намного эффективнее ее улавливают.

Bioenergetica.indb 139

26.01.2011 18:02:49

140

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

6.5.3. Сенсорный родопсин и фобородопсин Галофильные археи воспринимают красный свет как аттрактантный сигнал, а синий — как репеллентный. При низких интенсивностях света аттрактантное и репеллентное его действие обеспечивается двумя ретиналь-содержащими пигментами, названными сенсорным родопсином (sR) и фобородопсином (pR). Эти белкирецепторы демонстрируют определенное сходство с бактериородопсином. Так, sR и pR содержат семь трансмембранных колонн. Остаток ретиналя связан в них посредством альдиминной связи с ε-аминогруппой остатка лизина колонны G. Сенсорный родопсин имеет максимум поглощения при 590 нм, который сдвигается к 370 нм под действием света, вызывающего переход полностью транс ретиналя в 13-цис ретиналь. Освещение sR370 вызывает регенерацию формы sR590. В темноте это превращение также происходит, но требует около 1 с, что примерно в 100 раз медленнее, чем аналогичный процесс в бактериородопсине и галородопсине. По-видимому, образование долгоживущего продукта необходимо для того, чтобы включить цепь событий, приводящих к усилению аттрактантного сигнала. Как показали опыты, слабый длинноволновый свет сенсибилизирует клетки Н. salinarium к репеллентному действию коротковолнового света. Этот эффект был объяснен в рамках предположения о том, что sR370, получающийся из sR590, служит сенсором репеллентного (синего) света. Дальнейшие исследования показали, что галофильные археи располагают четвертым ретиналь-содержащим белком, не идентичным bR, hR и sR и участвующим, наряду с sR, в осуществлении репеллентного эффекта коротковолнового света. Его спектральный максимум располагается при 480 нм. Пигмент, названный фобородопсином (pR), при освещении превращается в интермедиаты с максимумами при 450 и 360 нм. Последний живет около 0,5 с. Вероятно, он и посылает репеллентный сигнал в систему таксиса. Интересно, что все четыре ретиналь-содержащих белка Н. salinarium используют один и тот же первичный светозависимый механизм — полностью транс → 13-цис изомеризацию ретиналя. Концентрация и локализация sR и, по-видимому, pR в мембране подобны таковым для hR: это минорные компоненты, находящиеся в тех областях мембраны, где нет бактериородопсина. Как показали расчеты, сенсорные родопсины должны быть связаны с какой-то мощной системой усиления сигнала, поскольку для аттрактантного эффекта достаточно всего 20 квантов света, а для репеллентного и того меньше — 1–2 кванта. Удивительным образом оказалось, что у Н. salinarium аттрактантное действие красного света обеспечивается не только сенсорным родопсином sR, но и обычным бактериородопсином. В лаборатории одного из авторов (В.П.С.) этого учебника К. Льюисом было показано, что при большой интенсивности красного света его аттрактантный эффект в основном обусловлен протон-транспортной активностью бактериородопсина. Ингибирование не зависящих от света -генераторов (дыхания цианидом, Н+-ATPазы

Bioenergetica.indb 140

26.01.2011 18:02:49

Глава 6. Бактериородопсин

141

ДЦКД) резко увеличивает ответ галофильных архей на интенсивный красный свет. По данным, полученным в той же лаборатории С. И. Бибиковым, этот эффект отсутствует у штамма, лишенного бактериородопсина, но наблюдается у содержащих бактериородопсин штаммов, лишенных sR и pR. Механизм данного явления состоит, по всей вероятности, в следующем: на свету бактериородопсин образует , а повышение регистрируется клеткой посредством «протометра» — особой сенсорной системы, измеряющей протонный потенциал. Предполагается, что протометр посылает аттрактантный сигнал Н+-моторам жгутиков, если растет. Таким образом, бактериородопсин, не являясь специализированным фотосенсором, тем не менее участвует в восприятии света как аттрактантного стимула, когда интенсивность света достаточно велика, чтобы привести в действие большое количество молекул бактериородопсина и тем самым повлиять на . Существенно, что в этих условиях, т.е. на сильном свету, изуровень мерение света посредством sR оказывается неудобным из-за слишком высокой чувствительности sR. Иными словами, у прокариот бактериородопсин и сенсорный родопсин играют ту же роль, что соответственно колбочки (зрение на сильном свету) и палочки (сумеречное зрение) в нашем глазу.

6.5.4. Родопсин животных Родопсин животных, или зрительный родопсин, открытый за сто лет до бактериального, служит светочувствительным пигментом фоторецепторных клеток глаза. Он ответственен за поглощение световых квантов и включение системы обработки светового сигнала. Родопсин быка содержит 348 аминокислотных остатков, что на сто остатков больше, чем у бактериородопсина. Аминокислотная последовательность этого белка, расшифрованная Ю.А. Овчинниковым и сотрудниками, резко отличаясь от таковой бактериородопсина, тем не менее хорошо подходит для формирования структуры с семью α-спиральными колоннами, пронизывающими мембрану. Семь гидрофобных последовательностей той же протяженности, что и в бактериородопсине, связаны гидрофильными последовательностями разной длины. Дополнительные сто аминокислот, упомянутые выше, локализованы в более длинных, чем у бактериородопсина, концевых последовательностях, а также в связках между колоннами. Особенно велика петля между пятой и шестой колоннами. Кроме «семиколонной» организации мембранной части белка, родопсины архей и животных имеют целый ряд общих структурных особенностей. В частности, в обоих случаях ретиналь присоединен к белку через ε-аминогруппу остатка лизина (у бактериородопсина это Lys-216, а у родопсина животных — Lys-296), локализованного в ближайшей к С-концу седьмой (G) α-спирали, а Шиффово основание в темноте протонировано. Животный родопсин, подобно бактерио- и галородопсину, оказался способным к генерации ΔΨ за счет энергии света. Первые этапы фотоцикла в двух родопсинах также похожи. В обоих случаях были описаны следующие последовательные спектральные сдвиги:

Bioenergetica.indb 141

26.01.2011 18:02:49

142

ЧАСТЬ II. Генераторы протонного потенциала

1) очень быстрый (пикосекунды) длинноволновый сдвиг; 2) его обращение в микросекундной шкале и 3) более медленный сдвиг в коротковолновую область спектра. Как в бактериальном, так и в животном родопсинах происходит светозависимая изомеризация ретиналя, однако вместо «полностью транс → 13-цис» изомеризации, описанной у галофильных архей, в случае зрительного пигмента наблюдается переход из 11-цис в полностью транс форму. Функциональные различия пигментов животных и архей связаны главным образом с судьбой коротковолнового интермедиата (соответственно МII и М412). 1. Образование этого интермедиата, в обоих случаях сопровождающееся депротонированием Шиффова основания, приводит к выделению Н+ в воду бактериальным (но не животным) родопсином. 2. В случае животного родопсина интермедиат МII «живет» несколько минут. Время жизни бактериородопсинового М412 измеряется миллисекундами. 3. МII не может спонтанно превращаться в исходную форму родопсина. Он распадается на свободный полностью транс ретиналь и опсин, который требует 11-цис ретиналя, чтобы регенерировать родопсин. 4. Родопсин, превратившись в МII, приобретает способность специфически взаимодействовать с другим белком, названным трансдуцином. Такое взаимодействие приводит к замене GDP, связанного с трансдуцином, на GTP, что вызывает следующие процессы. Комплекс трансдуцинGTP активирует фосфодиэстеразу, расщепляющую cGMP. В результате снижается концентрация cGMP и закрываются Nа+-каналы плазматической мембраны, требующие cGMP в качестве активатора. Закрытие каналов повышает сопротивление этой мембраны, что в свою очередь ведет к повышению ΔΨ. Последняя постоянно генерируется Nа+/K+-ATPазой плазматической мембраны фоторецепторных клеток. При работе этой системы происходит умножение светового сигнала: 1) одна молекула долгоживущего интермедиата МII способна заменить GDP на GTP в сотнях молекул трансдуцина; 2) одна молекула активного тройного комплекса фосфодиэстераза-трансдуцин-GTP успевает расщепить сотни молекул cGMP, пока связанный GTP не гидролизуется до GDP и фосфата, что приведет к распаду комплекса. Приняв во внимание эти обстоятельства, можно объяснить, каким образом клетке палочки удается отвечать возбуждением на такую минимальную порцию световой энергии, как одиночный фотон. Однако усиление сигнала становится ненужным и даже вредным, когда световой сигнал содержит не один, а, например, миллион фотонов. В этом случае более адекватной была бы система, линейно отвечающая на изменение светового потока. Следует отметить, что электрический потенциал, генерируемый родопсином в плазматической мембране колбочек, оказывается того же направления, что и генерируемый Nа+/K+-ATPазой (знак «минус» внутри клетки). Это означает, что способность родопсина образо-

Bioenergetica.indb 142

26.01.2011 18:02:49

Глава 6. Бактериородопсин

143

вывать ΔΨ под действием света, в принципе, может быть использована для восприятия внезапного и резкого увеличения освещенности, причем это будет гораздо более быстрый ответ, чем при использовании громоздкой системы усиления светового сигнала в палочках при низких интенсивностях света. Другая его особенность в том, что ответ на сильный свет будет самопроизвольно исчезать во времени, так как родопсин — фотоэлектрический генератор однократного действия: поглощение им кванта ведет к отщеплению остатка ретиналя, и для регенерации исходной формы белка требуется вновь присоединить к нему 11-цис ретиналь.

Bioenergetica.indb 143

26.01.2011 18:02:49

Часть третья

ПОТРЕБИТЕЛИ ГЛАВА СЕДЬМАЯ

ХИМИЧЕСКАЯ РАБОТА ЗА СЧЕТ

О

писано пять ферментных систем, которые можно рассматривать в качестве потребителей , совершающих химическую работу: Н+-ATP-синтаза; + Н -пирофосфат-синтаза; Н+-трансгидрогеназа; обратная NADH-СoQ-редуктаза; обратная СoQН2-цитохром с-редуктаза. В первых двух случаях энергия утилизируется для образования макроэргической фосфоангидридной связи (синтеза ATP из ADP и Pi или PPi из Pi), в трех других — для переноса восстановительных эквивалентов против градиента редокс-потенциала. Среди всех этих систем особенно важной представляется Н+-ATP-синтаза, ответственная за взаимопревращение ) и основных «конвертируемых валют» живой клетки — мембранной ( водорастворимой (ATP). Вот почему на сегодня Н+-ATP-синтаза относится к числу наиболее интенсивно изучаемых ферментов.

7.1. Н+-ATP-синтаза Н+-ATP-синтаза — фермент, катализирующий обратимое фосфорилиро. Обнаружен в мивание ADP неорганическим фосфатом за счет энергии тохондриях, хлоропластах, дышащих и фотосинтезирующих бактериях. Как будет подробно описано в конце данной главы, во многих анаэробных бактериях, таких, как, например, Lactococcus casei или Enterococcus hirae, очень похожий фермент осуществляет обратный процесс (ATP → ADP + Pi + + ). Эта функция рассматриваемой системы, единственная у L. casei и E. hirae, играет подчиненную роль у аэробных и фотосинтезирующих клеток или органелл.

7.1.1. Субъединичное строение Н+-ATP-синтазы Несмотря на значительное разнообразие встречающихся в живых организмах первичных генераторов (см. предыдущие главы), Н+-ATPсинтазные комплексы, выделенные из разных источников, имеют весьма сходное строение. Каждый из них может быть разделен на два субкомплекса,

Bioenergetica.indb 144

26.01.2011 18:02:49

145

Глава 7. Химическая работа за счет

один из которых отвечает за трансмембранный транспорт протонов (Fo), а другой — за синтез или гидролиз ATP (F1)*. Для Н+-АТР-синтазы Е. coli известен субъединичный состав, аминокислотная последовательность и структура оперона. У этой бактерии фактор F1 состоит из пяти типов субъединиц (α–ε), а фактор Fo — из трех (а–с) (табл. 7.1) в следующей стехиометрии: 3α : 3β : γ : δ : ε : а : 2b : 10c**. Молекулярные массы F1, Fo и комплекса FoF1 оказались для Е. coli равными соответственно 381, ~145 и ~525 кДа. Комплекс FoF1 Е. coli кодируется одним опероном (ипс, или atp). Его размер около 7 тыс. пар нуклеотидов. Порядок генов соответствует трансляции матричной РНК, кодирующей субъединицы I, а, b, с, δ, α, γ, β и ε, где символом I обозначен гипотетический белок с неизвестными функциями, который отсутствует в очищенном FoF1. Митохондриальная Н+-ATP-синтаза также состоит из субкомплекса F1 (шесть типов основных субъединиц), субкомплекса Fo (три типа основных субъединиц) и еще нескольких дополнительных субъединиц. При этом фактор F1 содержит субъединицы 3α, 3β, γ, δ, ε и белок OSCP. Крупные субъединицы (α и β) очень напоминают таковые Е. coli. Так, в β-субъединицах фактора F1 из митохондрий сердца быка, дрожжей, Е. coli и хлоропластов содержание консервативных последовательностей составляет около 70%. Подобная ситуация наблюдается и в случае α-субъединицы. Таблица 7.1. Субъединичный состав Н+-ATP-синтазы Е. coli Комплекс Субъедини- Аналог субъединицы Е. coli ца Е. coli в митохондриях

F1

Fo

Молекулярная масса, кДа

Количество аминокислотных остатков

Количество субъединиц на один FoF1

α

α

55,0

513

3

β

β

50,0

459

3

γ

γ

31,5

287

1

δ

OSCP

19,5

177

1

ε

δиε

15,0

138

1

a

a

30,0

271

1

b

b

17,0

156

2

c

c

8,0

79

10

Сравнение остальных субъединиц факторов F1 из Е. coli и митохондрий животных показало, что субъединицы γ у этих организмов похожи, а δ и ε — отличны (см. также рис. 7.5). В первом приближении митохондриаль* Кроме ATP-синтаз FoF1-типа в живых организмах встречаются также весьма сходные с ними ATP-синтазы (ATPазы) VoV1- и A0A1-типа, описанию которых мы посвятим последние разделы данной главы. ** Количество входящих в фактор Fo субъединиц типа с будет подробно рассмотрено далее.

Bioenergetica.indb 145

26.01.2011 18:02:50

146

ЧАСТЬ III. Потребители

ные субъединицы δ и ε в сумме соответствуют ε-субъединице Е. coli. Митохондриальный фактор F1 содержит дополнительный полипептид, так называемый белок, обусловливающий чувствительность к олигомицину (oligomycin sensitivity conferring protein, или OSCP). Этот компонент в основном гомологичен δ-субъединице Е. coli, но имеет несколько большую молекулярную массу (21 кДа по сравнению с 19,3 кДа δ-субъединицы E. coli), содержит гидрофобный участок вблизи N-концевой последовательности и несколько протяженных отрезков, гомологичных не δ-, а b-субъединице Е. coli. Фактор Fo из митохондрий животных имеет строение, сходное с Е. coli, и его основными субъединицами являются полипептиды а, b и с. Однако субъединица b из митохондрий животных несколько видоизменена по сравнению с бактериями, и в состав фактора Fo животных входит, по-видимому, лишь один полипептид типа b, а не два. На сегодняшний день принята следующая стехиометрия основных субъединиц в ATP-синтазе животных — 3α : 3β : γ : δ : ε : OSCP : а : b : 8с. В Н+-ATP-синтазе митохондрий находят несколько дополнительных полипептидов, которые отсутствуют у бактерий. Это субъединица A6L фактора Fo; фактор F6 (9 кДа); белковый ингибитор фактора F1 с массой 9,5 кДа, субъединица d с массой 18,5 кДа, которая наряду с F6 и OSCP необходима для правильного связывания F1 с Fo, и некоторые другие субъединицы. У животных и дрожжей все субъединицы фактора F1 закодированы в ядерном геноме и синтезируются в цитоплазме. Среди компонентов фактора Fo дрожжей митохондриальным геномом кодируются субъединицы а, с и A6L. Все прочие субъединицы имеют соответствующие гены в ядре. В геноме митохондрий животных присутствуют два перекрывающихся гена, кодирующих субъединицы а и A6L фактора Fo; все остальные субъединицы (в том числе и с) кодируются в ядре. Субъединичный состав Н+-ATPсинтазы хлоропластов, обозначаемой CFoCF1, в основном подобен таковым бактерий. Фактор F1 имеет субъединичный состав 3α : 3β : γ : δ : ε. При этом ε-субъединица представляет собой полипептид бактериального типа. В то же время фактор CFo содержит не три, а четыре типа основных субъединиц — а, b, b′ и с (субъединица b′ является близким гомологом субъединицы b) в предРисунок 7.1. Структура каталитической + полагаемой стехиометрии — а : b : b′ : части Н -ATP-синтазы: изолированный фактор F1 из митохондрий сердца быка 14с. Отметим, что в состав CFo входит (негативный контраст); электронноне гомодимер субъединиц b, а гетеромикроскопические фотографии 379 продимер из двух разных (но довольно поекций пяти основных типов суммированы хожих) субъединиц b и b′. с использованием системы анализа изображений

Bioenergetica.indb 146

26.01.2011 18:02:50

Глава 7. Химическая работа за счет

147

7.1.2. Трехмерная структура и расположение в мембране +

Н -ATP-синтазный комплекс так велик, что выдается в воду на довольно большое расстояние с одной стороны мембраны. Выступающая часть, которая представляет собой фактор F1, обращена в цитоплазму бактерий, матрикс митохондрии или строму хлоропласта. Негативное окрашивание вывернутых субмитохондриальных пузырьков выявляет грибовидные выросты диаметром около 9 нм, располагающиеся по всей поверхности мембраны. Как показал Э. Ракер, выросты исчезают после сильного механического перемешивания суспензий пузырьков в растворе, содержащем этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) — комплексон на ионы Mg2+. Этот процесс сопровождается потерей способности пузырьков синтезировать и расщеплять ATP, а также появлением в растворе сферических частиц диаметром 9 нм, обладающих ATPазной активностью. Реконструкция сферических частиц с мембраной пузырьков возвращает последним ATP-синтазную и ATPазную активности. Из этих наблюдений Э. Ракер заключил, что выступы представляют собой каталитическую часть Н+-ATPсинтазы, т.е. фактор F1. После отщепления фактора F1 в мембране остается часть Н+-ATP-синтазы, ответственная за перенос ионов Н+ (фактор Fo), что приводит к значительному увеличению протонной проводимости этой мембраны. Результаты компьютерного анализа электронных микрофотографий фактора F1 суммированы на рис. 7.1. Фронтальная проекция фактора F1 имеет диаметр порядка 10 нм.

Рисунок 7.2. Э. Ракер

Bioenergetica.indb 147

Рисунок 7.3. Дж. Уокер

26.01.2011 18:02:51

148

ЧАСТЬ III. Потребители

В настоящий момент трехмерная структура основной части митохондриального фактора F1 определена с высоким разрешением (2,4 Å) методом рентгеноструктурного анализа. Эта работа была удостоена Нобелевской премии в 1997 г. (Дж. Уокер, рис. 7.3). Как видно на рис. 7.4, большая часть F1 построена из субъединиц α, β и γ в стехиометрии 3:3:1. Эти субъединицы образуют сферическую глобулу. Центральная часть этой глобулы состоит из очень длинных α-спиральных участков γ-субъединицы, вокруг которой, попеременно чередуясь, расположены субъединицы α и β (это расположение часто сравнивают с положением долек в апельсине). Важно отметить, что γ-субъединица в центре глобулы занимает несколько асимметричное положение, по-разному взаимодействуя Рисунок 7.4. Структура основной части с различными субъединицами α и β. + фактора F1 митохондриальной H -ATPСубъединица γ значительно выступасинтазы. Различные субъединицы выделены следующими цветами: α — красный, ет за пределы 3α:3β-глобулы с одной β — желтый, γ — синий, δ — зеленый, из ее сторон. Эта выступающая часть ε — фиолетовый [Stock et al., 2000; Curr. γ-субъединицы вместе с субъединицаOpin. Struct. Biol., 6: 672–679] ми δ и ε образует «стержень» фактора F1, связывающий его с фактором Fo. Интересно отметить: α- и β-субъединицы содержат в своем составе по одному центру для связывания нуклеотидов. Нуклеотид-связывающий домен обнаружен также и в составе γ-субъединицы. Однако при физиологических условиях этот домен, по-видимому, не способен к связыванию нуклеотидов и выполняет чисто структурную роль. О трехмерной структуре остальной части ATP-синтазы имеются лишь косвенные сведения, полученные с помощью дифракции электронов, ЯМР и за счет анализа первичных последовательностей субъединиц и различных возможностей их кросс-сшивок в составе FoF1-комплекса. Комплекс FoF1 схематично изображен на рис. 7.5. Трехмерная структура с-субъединицы E. coli в гидрофобном растворителе была определена методом ЯМР. Эта субъединица состоит из двух трансмембранных α-спиральных колонн, соединенных между собой с цитоплазматической стороны мембраны петлей из полярных аминокислотных остатков (см. рис. 7.6). С-концевая α-спиральная колонна содержит в своем составе (где-то на уровне середины гидрофобного слоя мембраны) консервативный остаток аспартата (Asp-61), играющий ключевую роль в процессе трансмембранного транспорта протонов. В составе фактора Fo присутствует олигомер, состоящий из 8–14 субъединиц типа с. Совсем недавно строение этого

Bioenergetica.indb 148

26.01.2011 18:02:52

Глава 7. Химическая работа за счет

149

Рисунок 7.5. Схематическое изображение современных представлений о структуре FoF1- ATPсинтазы из митохондрий эукариот (слева) и бактерий (справа) [Stock et al., 2000; Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 672–679]. Две β-субъединицы (желтый цвет) в основном прикрыты α-субъединицами, третья β-субъединица не показана. Не показаны также субъединица A6L и другие мелкие субъединицы митохондриального фактора Fo, отсутствующие у бактерий [Stock et al., 2000; Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 672–679]

с-олигомера Na+-ATP-синтазы бактерии Ilyobacter tartaricus было изучено с помощью рентгеноструктурного анализа. Как видно на рис. 7.7, с-субъединицы образуют в мембране «хоровод», как бы состоящий из двух вложенных колец. Внешнее кольцо состоит из С-концевых α-спиральных колонн с-субъединиц, а внутреннее кольцо — из их N-концевых α-спиральных колонн. Предполагается, что количество с-субъединиц может варьировать в ATP-синтазах из различных организмов, а возможно, даже и в одном организме при различных условиях его функционирования. Так, считается, что в состав ATP-синтазы митохондрий животных входит 8 с-субъединиц, митохондрий дрожжей — 10 с-субъединиц, в состав ATP-синтазы хлоропластов — 14 с-субъединиц, а в состав натриевой ATP-синтазы I. tartaricus — 11. Как мы увидим далее, переменная стехиометрия с-субъединиц может иметь существенное физиологическое значение, приводя к переменному соотношению Н+/ATP.

Bioenergetica.indb 149

Рисунок 7.6. Структура с-субъединицы FoF1-ATP-синтазы E. coli в гидрофобном растворителе, определенная методом ЯМР, для депротонированной (зеленый цвет, рН 8) и протонированной (желтый цвет, рН 5) форм [Rastogi & Girvin 1999, Nature, 402: 263–268]

26.01.2011 18:02:53

150

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 7.7. Структура с-олигомера натриевой ATP-синтазы I. tartaricus. (A) вид перпендикулярно мембране, (Б) вид параллельно плоскости мембраны. Разные с-субъединицы указаны разным цветом. Синие сферы — связанные ионы натрия [Meier et al., 2005; Science, 308: 659–662]

Как видно на рис. 7.8, в составе FoF1-комплекса олигомер с-субъединиц соединен с фактором F1 посредством стержня ATP-синтазы. Важно отметить, что стержень занимает асимметричное положение относительно с-олигомера, взаимодействуя с полярными петлями лишь шести из его субъединиц. О структуре остальных субъединиц фактора Fo сегодня известно крайне мало. Исходя из анализа первичных последовательностей, предполагают, что а-субъединица гидрофобна и образует пять α-спиральных трансмембранных столбов, в которых имеется несколько консервативных остатков заряженных аминокислот (в случае с E. coli это Arg-210, His-245, Glu-196 и Glu-219). Не исключено, что эти остатки участвуют в формировании трансмембранного протонпереносящего пути, образуемого за счет взаимодействия субъединиц а и с. Субъединица b более гидроРисунок 7.8. Стереоизображение F1-c10 комплекса фильна и в случае с E. coli переиз митохондрий S. cerevisiae. Вид сбоку (a) и вид секает мембрану, по-видимому, снизу (b). Справа внизу изображены схемы с указатолько один раз. Основная нием расположения субъединиц [Stock et al., 2000; функция этой субъединицы, Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 672–679]

Bioenergetica.indb 150

26.01.2011 18:02:54

Глава 7. Химическая работа за счет

151

скорее всего, заключается в формировании так называемой периферической ножки, также связывающей факторы Fo и F1 (см. рис. 7.5). Предполагается, что у E. coli в состав периферической ножки наряду c двумя b-субъединицами входит также δ-субъединица. В митохондриальной ATP-синтазе периферическая ножка сформирована, по-видимому, из субъединиц b, OSCP, d и F6 в стехиометрии 1:1:1:1.

7.1.3. Гидролиз ATP изолированным фактором F1 Фактор F1, будучи отделен от мембранного сектора Н+-ATP-синтазы, сохраняет способность гидролизовать ATP до ADP и фосфата. Реакция протекает с очень большой скоростью и утрачивает чувствительность к олигомицину, диэтилстильбестролу и низким концентрациям ДЦКД, отличаясь в этом отношении от АТРазной активности нативного комплекса FoF1. Показано, что гидролиз ATP фактором F1 происходит путем прямой атаки молекулой воды ангидридной связи ATP. Этот процесс протекает без образования ковалентных интермедиатов. Об этом свидетельствуют как данные опытов по изотопному обмену, так и тот факт, что гидролиз ATP фактором F1 устойчив к ванадату, гидроксиламину и другим реагентам на ацилфосфат. Как было отмечено в предыдущем разделе, установлено, что в факторе F1 присутствуют шесть потенциальных нуклеотид-связывающих центров: по одному на каждую α- и β-субъединицу*. Из биохимических экспериментов известно, что F1 может связывать шесть молекул адениннуклеотидов. Однако лишь центры на β-субъединицах обменивают связанные и свободные нуклеотиды со скоростями, сопоставимыми со временем оборота данного фермента. Исходя из этого считается, что в факторе F1 лишь три центра на β-субъединицах выполняют каталитические функции, в то время как нуклеотидные центры на α-субъединицах выполняют структурную роль (связывают между собой α- и β-субъединицы), а также, возможно, участвуют в регуляции активности ATP-синтазы. Удивительной особенностью фактора F1 является то, что три каталитических центра этого фермента обладают различной аффинностью к нуклеотидам. Один из центров («Т-центр», от английского tight) обладает исключительно высоким сродством к ATP или к ADP + Pi с константой связывания для них в диапазоне от 10–12 до 10–8 M. Два других центра («L-» и «O-» центры, от loose и open соответственно) связывают нуклеотиды лишь при высокой их концентрации (Ks = 10–6–10–3 M) и, по-видимому, обладают различной избирательностью по отношению к ATP и ADP (см. рис. 7.9). Различие каталитических центров фактора F1 связано с разными конформационными состояниями, в которых находятся различные α- и β-субъединицы этого белка. По-видимому, это обусловлено асимметрич* Необходимо отметить, что на самом деле все нуклеотид-связывающие центры расположены в области контактов α- и β-субъединиц. Однако для простоты изложения мы будем полностью приписывать эти центры тем субъединицам, большее число аминокислотных остатков которых вовлечено в формирование соответствующих центров.

Bioenergetica.indb 151 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:02:55

152

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 7.9. Схема каталитических сайтов F oF 1-ATP-синтазы. Сайт L связывает субстраты ATP-синтазной реакции (ADP + Pi). Сайт T обладает очень высоким сродством к ATP или ADP + Pi и катализирует их энергонезависимое взаимопревращение. В сайте O происходит высвобождение синтезированного ATP (или связывается ATP при его гидролизе)

Рисунок 7.10. А.Д. Виноградов

Bioenergetica.indb 152

ным расположением γ-субъединицы внутри 3α:3β-глобулы. При низкой концентрации меченого ATP, т.е. в условиях, когда заполняется только один центр связывания нуклеотидов (Т-центр), гидролиз ATP32 фактором F1 идет очень медленно (так называемый одноцентровьй катализ). При добавлении к этой смеси избытка немеченого ATP происходит связывание «холодного» ATP в L-центре, что вызывает многократное ускорение реакции гидролиза ATP32, обусловленного увеличением скорости высвобождения продуктов ATPазной реакции (ADP и Pi32) из Т-центра. Таким образом, при связывании второй молекулы ATP в L-центре Т-центр меняет сродство к нуклеотидам и переходит в состояние О (другими словами, между различными центрами фактора F1 наблюдается отрицательная кооперативность в связывании нуклеотидов, но положительная кооперативность в осуществлении катализа). По-видимому, гидролиз ATP сопровождается последовательным изменением конформации нуклеотид-связывающих центров: O→T→L... Так, в ходе катализа все три центра проходят через идентичные конформационные состояния, но в любое фиксированное время все три центра находятся в разных конформациях. Было выдвинуто предположение, что подобный механизм гидролиза ATP фактором F1 может быть достигнут при последовательном изменении положения γ-субъединицы относительно разных α- и β-субъединиц; например, при ее вращении внутри 3α:3β-глобулы. Гидролиз ATP FoF1-комплексом находится под регуляторным контролем различных параметров энергетического статуса клетки. Как показали А.Д. Виноградов и сотрудники, гидролиз ATP изолированным митохондриальным фактором F1 сильно тормозится

26.01.2011 18:02:55

Глава 7. Химическая работа за счет

153

одним из продуктов реакции — ADP. Этот эффект значительно усиливается в присутствии азида и предотвращается в присутствии сульфита. Установлено, что для удаления ADP из ингибированного фактора F1, находящегося в составе мембранного FoF1-комплекса, требуется . Это означает, что торможение посредством ADP может развиваться только в том случае, если снижен, т.е. именно тогда, когда есть опасность исчерпания фонда ATP в клетке за счет обращения Н+-ATP-синтазной реакции. В митохондриях ту же функцию, что и ADP, может выполнять особый полипептид — белковый ингибитор. Подобно ADP, белковый ингибитор подавляет ATPазную активность изолированного фактора F1, а также комплекса FoF1 в мембране в условиях, когда снижен.

7.1.4. Синтез связанного ATP изолированным фактором F1 В 1982 г. Р. Фелдмэн и Д. Сигмэн показали, что очищенный фактор CF1, полученный из хлоропластов, может синтезировать ATP из прочно связанного ADP в ответ на добавление в раствор неорганического фосфата. Синтезированный ATP оставался связанным с CF1 и мог быть переведен в раствор только путем денатурации фермента. Позднее появились данные о синтезе связанного ATP из ADP и Pi, добавленных к раствору митохондриального фактора F1. Теоретический расчет, сделанный в лаборатории одного из авторов, показывает, что константа равновесия гидролиза ATP в Т-центре фактора F1 не превышает 100 и по всей вероятности близка к единице. Это означает, что синтез связанного ATP в Т-центре требует гораздо меньше энергии, чем синтез свободного ATP в растворе (или, другими словами, сродство Т-центра к ATP значительно выше, чем к ADP + Pi). Дело в том, что электронная структура ангидридной связи в связанном АТР сильно отличается от свободного АТР из-за взаимодействия с группами белка (см. рис. 7.12). Можно предположить, что (как это было впервые отмечено П.Д. Бойером в 1973 г.) при синтезе ATP энергия тратится не на стадии синтеза фосфоангидридной связи, а на стадии высвобождения ATP из каталитического центра. Соответственно при гидролизе ATP энергия выделяется не при разрыве фосфоангидридной связи, а при связывании ATP Рисунок 7.11. П. Бойер с Т-центром.

Bioenergetica.indb 153

26.01.2011 18:02:57

154

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 7.12. Структура ADP и Pi в активном центре фактора F1. Цифры у пунктирных прямых — расстояние в Å

7.1.5. Проведение протонов через фактор Fo Удаление фактора F1 из тилакоидов, хроматофоров, суббактериальных или субмитохондриальных пузырьков приводит к появлению протонной проводимости через фактор Fo. Протеолипосомы с фактором Fo также характеризуются высокой проводимостью для протонов. Эффект снимается добавлением специфического блокатора Fo дициклогексилкарбодиимида (ДЦКД). Реконструкция фактора Fo с фактором F1 также подавляет утечку протонов. В опытах с бактериями показано, что мутация по любой из трех субъединиц фактора Fo приводит к потере его способности проводить протоны. По-видимому, основную роль в транспорте протонов играют субъединицы а и с, и трансмембранный протон-переносящий путь формируется в месте контакта этих субъединиц. В с-субъединицах фактора Fo из различных организмов содержится остаток аспартата или глутамата, абсолютно необходимый для переноса протонов (для Е. coli это Asp-61). Он располагается на расстоянии 1,8 нм от поверхности мембраны, т.е. примерно в середине гидрофобного барьера. Его замена на Asn или Gln полностью прекращает как транспорт Н+, так и синтез ATP за счет . Трансмембранные α-спиральные колонны субъединицы а также содержат несколько консервативных остатков заряженных аминокислот (Arg-210, His-245, Glu-196 и Glu-219). Предполагается, что эти остатки участвуют в формировании протон-проводящего пути.

Bioenergetica.indb 154

26.01.2011 18:02:58

Глава 7. Химическая работа за счет

155

Характерной чертой фактора Fo является его чувствительность к ДЦКД. ДЦКД является ковалентным модификатором карбоксильных групп в их протонированной форме, и при низких его концентрациях он избирательно присоединяется к Asp-61 с-субъединиц ATP-синтазы. Данная модификация Asp-61 полностью ингибирует Н+-проводящую функцию Fo. Интересно отметить, что для полной инактивации фермента, по-видимому, достаточно модифицировать лишь один с-полипептид из олигомера этих субъединиц. Митохондриальный фактор Fo наряду с ДЦКД также ингибируется олигомицином. Выделены мутанты дрожжей, у которых Н+-проводимость через Fo резистентна к этому антибиотику. Ответственными за резистентность оказались два локуса в субъединице а. Оба они консервативны у человека и мыши. В то же время в а-субъединице Е. coli обнаружен только один из консервативных локусов, что согласуется с наблюдением о слабом эффекте олигомицина на ATP-синтазу этой бактерии. Фактор Fo вряд ли представляет собой просто пору, так как зависимость скорости переноса Н+ через Fo имеет сложную форму с оптимумом при рН 7–9. Эти данные указывают на наличие нескольких мест связывания иона Н+. Таких мест в факторе Fo, по-видимому, два, и они расположены с разных сторон мембраны. Наибольшие значения Рисунок 7.13. Схема возможного мехаН+-проводимости были получены для низма транспорта протонов фактором Fo. фактора Fo хлоропластов и фотосинте- Субъединицы a и c показаны соответзирующих бактерий: ~6000 Н+ в секун- ственно зеленым и желтым цветом [Junge et al., 2001; FEBS Lett., 504: 152–160] ду на один.Fo при ΔΨ = 100 мВ. Однако даже эта величина, вероятно, слишком низка для Н+-проводящего механизма типа канала. Для объяснения перечисленных выше структурных особенностей Fo, кинетических характеристик транспорта протонов этим фактором, а также его инактивации под действием ДЦКД была предложена модель функционирования фактора Fo, представленная на рис. 7.13. Данная модель основана на постулировании существования в факторе Fo двух протонных полуканалов с разных сторон мембраны. Перенос протонов между этими полуканалами происходит параллельно поверхности мембраны за счет переноса протонированного остатка аспартата (глутамата) субъединицы с. Такое движение карбоксильной группы может быть достигнуто за счет вращения с-олигомера относительно субъединицы а. При этом данная карбоксильная группа должна депротонироваться при взаимодействии с субъединицей а и протонироваться при выходе из этого контакта. Таким образом, при функционировании рассматриваемого механизма транспорт протонов через фактор Fo должен быть сопряжен с вращением с-олигомера.

Bioenergetica.indb 155

26.01.2011 18:02:59

156

ЧАСТЬ III. Потребители

7.1.6. Возможный механизм преобразования энергии FoF1-ATP-синтазой Основные принципы функционирования ATP-синтазы уже были нами вкратце описаны в предыдущих разделах этой главы. Прежде всего, повидимому, ADP и фосфат, связанные с фактором F1, могут образовать связанный ATP без какого-либо притока энергии извне, а энергия требуется для освобождения связанного ATP из активного центра фактора F1 в воду. То, что освобождение ATP, связанного фактором F1, действительно , показано в опытах, когда изучали торможеподдерживается энергией ние ATPазы субмитохондриальных пузырьков негидролизуемым аналогом ATP — 5-аденилилимидодифосфатом (AMPPNP). Короткая предынкубация пузырьков с AMPPNP в среде с сукцинатом в аэробных условиях полностью снимала торможение ATPазной активности, если ее измеряли в присутствии разобщителя, добавленного после сукцината. Если же разобщитель был добавлен в среду с субмитохондриальными пузырьками до сукцината, то в этом случае торможение сохранялось. Именно такого эффекта можно было ожидать, если , генерируемая при окислении сукцината, удаляет AMPPNP из каталитического центра. Встает вопрос, каким же образом энергия может быть потрачена для изменения сродства каталитических центров ATP-синтазы к нуклеотидам? Напомним, что транспорт протонов осуществляется в факторе Fo, в то время как нуклеотид-связывающие центры расположены в факторе F1. Таким образом, для совершения химической работы энергия протонного потенциала должна передаться в белке на большое расстояние. Для осуществления данного сопряжения природой был изобретен очень необычный механизм, напоминающий функционирование электромотора. Энергия протонного потенциала вначале преобразуется в механическую энергию (во вращение ротора FoF1-ATP-синтазы), которая затем тратится на совершение химической работы (изменения сродства каталитических центров ATPсинтазы к нуклеотидам), что в итоге приводит к -зависимому синтезу ATP. Рассмотрим более подробно, как устроено подобное сопряжение. Как было отмечено выше, γ-субъединица в центре 3α:3β-глобулы занимает асимметричное положение, по-разному взаимодействуя с различными субъединицами α и β. Это, по-видимому, приводит к различию свойств трех (T, O и L) каталитических центров ATP-синтазы. Так как гидролиз ATP сопровождается последовательным изменением конформации нуклеотидсвязывающих центров, было бы логично предположить, что гидролиз ATP может быть сопряжен с вращением γ-субъединицы внутри 3α:3β-глобулы. Эта гипотеза (выдвинута впервые П.Д. Бойером, за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1997 г.) была впоследствии подтверждена серией очень изящных прямых экспериментов. Так, например, японским исследователем М. Йошидой был выделен упрощенный вариант бактериального фактора F1, состоящий лишь из трех субъединиц (α, β и γ) в стехиометрии 3α:3β:γ. Предварительно молекулярно-генетическими методами из этих субъединиц были удалены все остатки цистеина, а один остаток этой аминокислоты был искусственно внесен в домен γ-субъединицы, образую-

Bioenergetica.indb 156

26.01.2011 18:02:59

Глава 7. Химическая работа за счет

157

Рисунок 7.14. Схема эксперимента по визуализации вращения γ-субъединицы фактора F1 при катализе им гидролиза ATP. Субъединицы фактора F1 выделены следующими цветами: α — розовый, β — оранжевый, γ — зеленый (по М. Йошида)

щий стержень ATP-синтазы. Кроме того, к N-концу β-субъединицы была добавлена последовательность из шести остатков гистидина, связывающая с высоким сродством ионы никеля. Далее, как показано на рис. 7.14, данный белок был прикреплен за эту полигистидиновую «ручку» к предметному стеклу, покрытому ионами никеля, а к единственному остатку цистеина на γ-субъединице с использованием биотин-связывающего белка стрептавидина был пришит очень длинный актиновый филамент, несущий флуоресцентную метку (остатки флуоресцеина). При добавлении к такому препарату субстратов ATPазной реакции можно было наблюдать под микроскопом вращение флуоресцирующего актинового филамента в направлении против часовой стрелки. Полный поворот на 360° складывался из трех шаговых движений с поворотом на 120°. Вращение наблюдалось только в присутствии ATP и Mg2+ и было чувствительно к ингибиторам ATPазной реакции. Так было прямо показано, что при функционировании фактора F1 энергия гидролиза ATP может быть преобразована в механическую энергию вращения γ-субъединицы. В то же время в составе полного FoF1-комплекса γ-субъединица взаимодействует не только с 3α:3β-глобулой, но и с олигомером с-субъединиц. При этом стержень занимает, как уже отмечалось, асимметричное положение относительно с-олигомера, взаимодействуя с полярными петлями лишь шести из этих субъединиц. Есть указания на то, что транспорт протонов через фактор Fo сопряжен с вращением с-олигомера, а значит, и с вращением связанного с ним стержня. Таким образом, посредством вращательного механизма транспорт протонов может быть сопряжен с синтезом (или гидролизом) ATP этим ферментом. При этом олигомер с-субъединиц фактора Fo вместе с субъединицами γ и ε*, образующими стержень фактора * В случае с ферментом бактериального типа, в митохондриальном ферменте в состав стержня входят субъединицы γ, δ и ε.

Bioenergetica.indb 157

26.01.2011 18:02:59

158

ЧАСТЬ III. Потребители

F1, формируют ротор этого мотора, в то время как остальные субъединицы служат статором (см. рис. 7.5). Если исходить из этой гипотезы, станет понятна роль периферической ножки, связывающей также факторы Fo и F1. По-видимому, эта дополнительная связь между двумя факторами необходима, чтобы прикрепить 3α:3β-глобулы к мембранной части фермента и не допустить вращения 3α:3β-глобулы вместе со стержнем. Следует подчеркнуть, что многие вопросы функционирования FoF1ATP-синтазы еще очень далеки от разрешения. Прежде всего, неизвестно, каким образом транспорт протонов в факторе Fo сопряжен с вращением олигомера с-субъединиц. Предполагается, что в данном процессе ключевую роль может играть электростатическое притяжение депротонированного аниона Asp-61 на субъединице c (т.е. роторе) и катиона одного из положительно заряженных остатков аминокислот субъединицы a (т.е. статора).

7.1.7. Стехиометрия Н+/ATP Твердо установлено, что для синтеза одной молекулы ATP необходимо перенести через мембрану более одного протона. Такое заключение базируется на данных по измерению и концентраций ATP, ADP и фосфата. Общепринято, что при физиологических концентрациях субстратов и продуктов ATP-синтазы образование ATP «стоит» не менее 44 кДж × моль–1 (10,5 ккал × моль–1). Эта величина соответствует , равной 455 мВ при условии, что стехиометрия Н+/ATP = 1. Указанное значение как минимум вдвое больше измеренного экспериментально, и если предположить, что рассматриваемое соотношение выражается целым числом, то минимальная стехиометрия H+/ATP может быть равна двум. Экспериментальное определение стехиометрии H+/ATP в основном базируется на измерении так называемого отношения Р/О на митохондриях при окислении ими различных дыхательных субстратов. Это отношение представляет собой количество синтезированного ATP (или эстерифицированного фосфата), нормированное на количество потребленного кислорода (АТP/О или Р/О). Критерий Р/О был предложен в 1939 г. В.А. Белицером и Е.Т. Цыбаковой. Для митохондрий животных, окисляющих NAD+зависимые субстраты или сукцинат, экспериментально измеренные величины Р/О, как правило, оказываются соответственно около 2,7 и 1,6. Так как при окислении NADH и сукцината ферменты дыхательной цепи переносят через мембрану соответственно 10 и 6 Н+ (см. главу IV), то, исходя из измеренных величин Р/О, можно определить количество протонов, потребляемых ATP-синтазой для Рисунок 7.15. В.А. Белицер синтеза одной молекулы ATP. Легко подсчи-

Bioenergetica.indb 158

26.01.2011 18:03:00

159

Глава 7. Химическая работа за счет

тать, что стехиометрия H+/ATP в этом случае будет приблизительно равна 4. Однако необходимо учесть, что в митохондриях, фосфорилирующих потреблявнешний (внемитохондриальный) ADP внешним фосфатом, ется не только ATP-синтазой, но также и ATP4–/ADP3–-антипортером и Н2РО4–,Н+-симпортером. В результате обмен внешних ADP и фосфата на внутренний ATP сопровождается импортом в митохондрию одного иона Н+. Таким образом, стехиометрия Н+/ATP собственно комплекса FoF1 должна составлять 4–1=3. Если верна гипотеза о вращательном механизме функционирования этого фермента, то поворот ротора FoF1 на 360° должен сопровождаться синтезом трех молекул ATP (так как в данном ферменте присутствуют три каталитических нуклеотид-связывающих центра). С другой стороны, поворот ротора митохондриального FoF1 на 360° должен приводить к трансмембранному переносу восьми протонов (так как в случае с митохондриями животных в состав с-олигомера входят 8 с-субъединиц). Таким образом, структурные данные указывают на то, что стехиометрия Н+/ATP для ATPсинтазы из митохондрий животных должна быть равна 8/3 = 2,7, что довольно хорошо согласуется с экспериментальными данными. Этот пример иллюстрирует и важность такого параметра, как количество субъединиц, входящих в состав с-олигомера. Действительно, стехиометрия с-субъединиц должна иметь исключительно важное физиологическое значение, так как она определяет такой существенный параметр клетки, как отношение Н+/ATP. Как было указано ранее, в состав ATP-синтазы хлоропластов входят, по-видимому, 14 с-субъединиц*, а в состав натриевой ATP-синтазы I. tartaricus — 11. Таким образом, различные организмы, исходя из особенностей своего метаболизма, могут варьировать такой исключительно важный параметр, как «обменный курс» двух энергетических валют клетки — и АТР. Интересно отметить, что, если исходить из механистических представлений о стехиометрии Н+/ATP (признать, что она должна выражаться целым числом), можно ожидать, что количество с-субъединиц в ферменте должно быть кратно трем. Однако практически во всех исследованных случаях наблюдается нарушение 1:3-симметрии, что должно приводить к дробным величинам отношения Н+/ATP.

7.2. Н+-ATPазы — вторичные

-генераторы

В данном разделе мы рассмотрим функционирование различных ATPаз в качестве генераторов протонного потенциала. Наиболее распространенные -генераторы используют энергию света или дыхания, чтобы об* Эти данные хорошо согласуются с экспериментально измеренной стехиометрией Н+/ATP для ATP-синтазы хлоропластов. У растений фотофосфорилирование ADP происходит на внешней стороне мембраны тилакоидов. Полученный ATP используется преимущественно в строме хлоропласта при синтезе глюкозы. В этом процессе портеры не участвуют, а соотношение Н+/ATP приблизительно равно четырем протонам на одну молекулу ATP.

Bioenergetica.indb 159

26.01.2011 18:03:00

160

ЧАСТЬ III. Потребители

разовать протонный потенциал. ATP не участвует в этом процессе. Однако иногда путь от использования энергетических ресурсов к оказывается более сложным: энергия сначала превращается в ATP и лишь затем используется для генерации посредством Н+-ATPаз. Последние могут быть объединены термином «вторичные -генераторы». Как правило, Н+-ATPазы оказываются необходимыми, когда ни свет, ни энергия дыхания не доступны для мембраны, совершающей некоторую работу, связанную с расходом . Примером такой системы могут быть анаэробные бактерии, получающие энергию исключительно с помощью субстратного фосфорилирования (брожения). У таких бактерий ATP, образованный ферментами гликолиза, может утилизироваться Н+-ATPазой, находящейся в цитоплазматической мембране. , генерируемая Рисунок 7.16. Схема одного из путей преоб+ Н -ATPазой, используется для соразования энергии у анаэробных бактерий, вершения осмотической (аккумулясинтезирующих ATP исключительно с помощью субстратного фосфорилирования ции метаболитов при участии Н+, метаболит-симпортеров, рис. 7.16) и механической (вращение жгутика) работы. Кроме роли Н+-ATPаз в совершении осмотической или механической работы, следует отметить еще одну их функцию, а именно регуляцию внутриклеточного рН. Формально любой фермент, способный генерировать за счет энергии ATP, может рассматриваться как Н+-ATPаза. Выше мы уже отмечали, что Н+-ATP-синтаза, обычно используемая для образования ATP за счет энергии , обладает Н+-ATPазной активностью, т.е. может гидролизовать ATP и создавать . По этой причине данный фермент часто называют Н+-ATPазой. Однако, по нашему мнению, более уместно употреблять название «Н+-ATPаза» только в тех случаях, когда основной биологической функцией фермента служит гидролиз, а не синтез ATP. Введя такое ограничение, к Н+-ATPазам можно будет отнести несколько типов ферментов (относящихся к классам FoF1, V0V1 и E1E2), отличающихся по структуре и механизму действия, но имеющих общую функцию (см. табл. 7.2). Рассмотрим эти типы ферментов более подробно.

Bioenergetica.indb 160

26.01.2011 18:03:01

161

Глава 7. Химическая работа за счет Таблица 7.2. Вторичные Фермент

Н+-ATPаза

-генераторы

Локализация

Механизм

Цитоплазматическая мембрана облигатно-анаэробных бактерий

FoF1 и V0V1

Функции, поддерживаемые образованной

Накопление веществ и регуляция рН в клетке

-х-

Внешняя мембрана растений и грибов

E1E2

То же

-х-

Тонопласт растений и грибов

V0V1

Накопление веществ и регуляция рН в вакуоли

-х-

Внешняя мембрана клеток некоторых животных

E1E2 и V0V1

Секреция Н+; накопление веществ в клетке

-х-

Мембраны секреторных пузырьков, эндосом, лизосом, аппарата Гольджи; мембрана эндоплазматического ретикулума

V0V1

Накопление веществ и регуляция рН во внутриклеточных пузырьках

FoF1

Накопление веществ и регуляция рН в клетке, вращение флагелл при отсутствии О2 и света

Внутренняя мембрана митохондрий

FoF1

Транспорт веществ в митохондрии при отсутствии О2

Внешняя мембрана клеток эпителия желудка

Е1Е2

Секреция Н+

Цитоплазматическая мембрана Н+-ATPсинтаза (об- дышащих или фотосинтезируюращенная) щих бактерий -х-

Н+/K+ATPаза

7.2.1. Н+-ATPазы FoF1-типа Данные Н+-ATPазы функционируют в цитоплазматической мембране большинства анаэробных бактерий. Как по набору входящих в их состав субъединиц, так и по своим структурным и функциональным свойствам они очень близки к описанным выше Н+-ATP-синтазам FoF1-типа. Более того, в мембранах, содержащих Н+-ATP-синтазу, возможна генерация за счет гидролиза ATP вследствие обращения реакции, катализируемой этим ферментом. Такой эффект наблюдается, например, у некоторых бактерий, использующих как энергию дыхания или света, так и энергию гликолиза. Н+-ATPазы могут быть легко разделены на два субкомплекса: протонпроводящий фактор FO и каталитический фактор F1. Гидролиз ATP ферментами этого типа чувствителен к азиду, ДЦКД, ауровертину и некоторым другим ингибиторам Н+-ATP-синтаз. Катализируемая Н+-ATPазами реак-

Bioenergetica.indb 161

26.01.2011 18:03:01

162

ЧАСТЬ III. Потребители

ция обратима. Так, эти ферменты способны осуществлять синтез ATP за счет энергии ΔΨ, искусственно созданной при выходе из бактерий ионов K+ в присутствии валиномицина. К наиболее изученным представителям этого класса ферментов можно отнести Н+-ATPазы таких анаэробных бактерий, как Lactobacillus casei и Enterococcus hirae.

7.2.2. Н+-ATPазы V0V1-типа Н+-ATPазы V0V1-типа очень близки к описанным выше Н+-ATPсинтазам (Н+-ATPазам) FoF1-типа, однако отличаются от них целым рядом структурных и функциональных свойств, что позволяет выделить их в особый класс данных ферментов. Примером фермента V0V1-типа может быть Н+-ATPаза тонопласта — мембраны, ограничивающей вакуоли клеток растений и грибов. К этому же типу Н+-ATPаз относятся ферменты, обнаруженные в различных мембранных органеллах эукариот, таких, как секреторные пузырьки, эндосомы, лизосомы и мембраны аппарата Гольджи. Н+-ATPазы V0V1-типа иногда также функционируют в плазмалемме некоторых эукариотических клеток, а также в цитоплазматической мембране небольшого количества облигатно анаэробных прокариот (например, у некоторых клостридий). ATPазы V0V1-типа состоят из двух субкомплексов, один из которых в составе полного фермента отвечает за трансмембранный транспорт протонов (V0), а другой — за гидролиз ATP (V1). Однако, в отличие от ATP-синтаз FoF1типа, при диссоциации ATPаз V0V1-типа субкомплексы V0 и V1 теряют способность к осуществлению своих частных активностей. В случае вакуолярной V0V1-ATPазы V1 состоит из восьми субъединиц (A–H). Субъединицы A и B несут в своем составе нуклеотид-связывающие центры* и образуют 3A:3B-глобулу наподобие 3α:3β-глобулы ATP-синтаз FoF1-типа. Субъединицы С, E, F и H (в стехиометрии 1:1:1:1) образуют, по-видимому, Рисунок 7.17. Сравнительное изображестержень фермента V0V1-типа, тогда ние структуры ATPаз V0V1-типа (слева) и как субъединицы D и G (в стехиомеFoF1-типа (справа) [Lolkema et al., 2003; трии 1D: 2G) — периферическую ножJ. Bioenerg. Biomembr., 35: 323–335] ку (рис. 7.17)**. Фактор V0 состоит из пяти субъединиц a, d, c, c′ и c″. Субъединицы c, c′ и c″ гомологичны друг другу. Они демонстрируют значительное сход* Каталитические центры находятся только в субъединицах А. ** По последним данным таких ножек в V0V1-ATPазе две.

Bioenergetica.indb 162

26.01.2011 18:03:02

Глава 7. Химическая работа за счет

163

ство с субъединицей с ATP-синтаз FoF1-типа. Однако субъединицы c и c′ фактора V0 в два раза больше субъединицы с фактора Fo, представляя собой дуплицированный вариант этой субъединицы. Они содержат в своем составе не 2, а 4 трансмембранные α-спирали. Что касается субъединицы c″, то она приблизительно в 2,5 раза больше субъединицы с фактора Fo и содержит в своем составе 5 трансмембранных колонн. Существенно, что во всех c-субъединицах фактора V0 сохранилось лишь по одному консервативному остатку глутамата (аспартата). Ранее считалось, что с-олигомер фактора V0 содержит приблизительно такое же количество трансмембранных α-спиралей, как и с-олигомер фактора Fo. Если это так, то из-за уменьшенного в два раз количества активных карбоксильных групп V0V1-ATPаза должна обладать в два раза более низкой стехиометрией H+/ATP по сравнению с ферментом FoF1-типа. Выдвигалось предположение, что за счет дупликаций и слияний c-субъединиц с потерей одного из остатков карбоксилата природой был получен фермент, характеризующийся пониженной стехиометрией H+/ATP и потому более приспособленный для осуществления Н+-ATP-синтазной реакции в обратном направлении, т.е. функционирующий in vivo исключительно в качестве Н+-ATPазы. Однако совсем недавно с помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что натриевая V0V1-ATPаза из Enterococcus hirae содержит олигомер, состоящий из 10 с-субъединиц, т.е. соотношение Na+/ATP для этого фермента должно быть таким же, как соотношение H+/ATP у Н+-ATP-синтазы E. coli. Транспорт Н+ и ATPазная активность ферментов V0V1-типа подавляются уникальным набором ингибиторов, включающим нитрат, N-этилмалеимид, триалкил-олово и высокие концентрации ДЦКД. Олигомицин и ДЦКД в низких концентрациях (ингибиторы Н+-ATP-синтазы FoF1-типа) не влияют на Н+-ATPазу тонопласта.

7.2.3. Н+-ATPазы E1E2-типа Н+-ATPазы E1E2-типа представляют собой очень длинный полипептид (порядка 100 кДа), которому может сопутствовать меньшая субъединица, имеющая скорее регулярные, чем каталитические функции. Реакция начинается с фосфорилирования одного из остатков аспартата большой субъединицы, что вызывает ее конформационный переход, обозначаемый Е1→Е2. Этот переход сопровождается снижением свободной энергии гидролиза фосфориласпартата. Последующее дефосфорилирование фермента регенерирует исходную форму Е1. Описанный механизм подобен такому Nа+/K+ATPазы и Са2+-ATPазы (см. разд. 12.5.2). E1E2-ATPазы описаны для внешних клеточных мембран растений и грибов. Такая же структура обнаружена у Н+/K+-ATPазы эпителия желудка. Активность E1E2-ATPаз чувствительна к ванадату, гидроксиламину и диэтилстильбэстролу, но устойчива к основным ингибиторам ATPаз FoF1- и V0V1-типа (олигомицину, азиду, нитрату и т.д.).

Bioenergetica.indb 163

26.01.2011 18:03:02

164

ЧАСТЬ III. Потребители Рисунок 7.18. Схема работы Н+-ATPазы E1E2-типа. H+i и H+o — соответственно ионы H+ внутри и снаружи клетки

7.2.3.1. Н+-ATPаза внешней клеточной мембраны растений и грибов Во внешней клеточной мембране растений и грибов (плазмалемме) находится фермент, откачивающий ионы Н+ из клетки за счет энергии ATP. Транспорт Н+ носит электрогенный характер. Н+-ATPаза, о которой идет речь, относится к E1E2-типу. В процессе реакции возникает аспартилфосфатный интермедиат, чувствительный к ванадату и гидроксиламину. Ингибиторами служат также диэтилстильбэстрол и ДЦКД. Очистка Н+-ATPазы показала, что это одиночный полипептид с массой несколько больше 100 кДа. Его содержание во внешней мембране достигает 15% от общего количества белка. Механизм реакции Н+-ATPазы внешней мембраны, по-видимому, аналогичен таковому других E1E2-ATPаз (см. разд. 12.5.2, рис. 7.18). Н+-ATPазы из мембран грибов и растений были реконструированы в протеолипосомы. В этой системе была показана обратимость гидролиза ATP, когда ΔΨ, искусственно созданная диффузией K+, использовалась для синтеза ATP. Определенный биологический смысл имеет то обстоятельство, что Н+ATPаза внешней мембраны характеризуется оптимумом рН между 6 и 7. При рН выше 7,0 активность фермента резко падает. Создается впечатление, что Н+-ATPаза, откачивая ионы Н+ из цитоплазмы, используется клеткой, чтобы предотвратить закисление внутриклеточного объема. Вероятно, регуляция внутреннего рН есть одна из функций Н+-ATPазы плазмалеммы. В то же время очевидна и другая функция этого фермента: образуемая им используется для концентрирования в клетке различных веществ, которые транспортируются туда вместе с протонами (см. главу 9). 7.2.3.2. Н+/K+-ATPаза слизистой желудка Особая ATPаза, образующая , была обнаружена во внешней мембране клеток слизистой желудка. Фермент осуществляет электронейтральный обмен внутриклеточного Н+ на внешний K+, тем самым закисляя среду в желудке. Он был назван H+/K+-ATPaзой. Н+/K+-ATPаза очищена и реконструирована в протеолипосомы.

Bioenergetica.indb 164

26.01.2011 18:03:02

Глава 7. Химическая работа за счет

165

Рисунок 7.19. Схема работы H+/K+-ATPaзы

Установлено, что H+/K+-ATPаза принадлежит к E1E2-типу; фермент содержит полипептид массой около 100 кДа. Гидролитическая реакция протекает с образованием фосфорилированного интермедиата. Активность тормозится ванадатом и гидроксиламином. В то же время структуре Н+/K+ATPазы присуща специфическая особенность. Этот фермент, по-видимому, построен из трех подобных, но не идентичных субъединиц с молекулярными массами порядка 100 кДа. Механизм работы H+/K+-ATPaзы состоит в следующем. Комплекс K+ и фермента в E1-конформации связывает ATP и Н+ на цитоплазматической поверхности плазмалеммы, окружающей клетку слизистого эпителия желудка. При этом K+ высвобождается в цитоплазму. В тройном комплексе (E1• ATP • Н+) фосфорил с ATP переносится на одну из карбоксильных групп фермента. В результате образуется интермедиат H+·E1~P. Затем происходит конформационный переход (E1 →E2), сопровождающийся переброской иона Н+ через гидрофобный барьер мембраны. Полученный комплекс H+·E2-Р не способен фосфорилировать ADP. Замена Н+, связанного с E2-Р, на внеклеточный K+ приводит к выделению Н+, который оказывается в просвете желудка. Кроме того, связывание иона K+ вызывает гидролиз E2-Р. Следующий за этим переход E2→E1 завершает цикл (см. рис. 7.19). Аналогичный фермент был также описан и в эпителии толстой кишки.

7.2.4. Соотношение функций Н+-ATPаз Н+-ATPазы обычно выполняют две основные функции: энергизацию мембраны и создание нужного рН в одном из двух отсеков, разделенных мембраной. У анаэробных бактерий, живущих за счет гликолиза, гликолитический ATP гидролизуется Н+-ATPазой, чтобы образовать и затем использовать ее при аккумуляции веществ среды внутрь клетки. В то же время нельзя не учитывать роль Н+-ATPазы, откачивающей ионы Н+ из клетки, в борьбе с закислением цитоплазмы, тенденция к которому всегда существует в бактериях-анаэробах, сбраживающих нейтральные сахара до кислых конечных продуктов. Последняя функция присуща также

Bioenergetica.indb 165

26.01.2011 18:03:04

166

ЧАСТЬ III. Потребители

и Н+-ATPазе плазмалеммы растений и грибов, которая активируется при падении цитоплазматического рН ниже 7,0. По-видимому, при кислых рН для совершения осмотической работы, а откачка проне генерация тонов становится ведущей функцией этой Н+-ATPазы. Функцией группы Н+-ATPаз животных тканей является закисление среды внутри пузырька. Именно это происходит в лизосомах, эндосомах и, может быть в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме. В этих случаях ΔΨ, генерируемая Н+-ATPазой, превращается в ΔpH посредством электрофоретической аккумуляции какого-либо аниона, например Сl–. В лизосомах закисление внутренней среды создает оптимальный рН для работы литических ферментов. По сути дела, лизосомальные ферменты не активны при нейтральных рН, типичных для цитозоля. В результате компоненты цитозоля не могут быть переварены каким-либо лизосомальным ферментом, если он выйдет из лизосомы. Вероятно, кислый рН необходим также для работы эндосом и некоторых других цитоплазматических включений, располагающих Н+-ATPазами. Иную роль играют Н+-ATPазы плазматических мембран некоторых типов клеток в почках и эпителии мочевого пузыря. Они участвуют в трансклеточном переносе кислотных эквивалентов. Для выполнения этой функции также необходим переход ΔΨ → ΔpH. В случае Н+/K+-ATPазы слизистой желудка, тоже специализированной на функции транспорта кислотных эквивалентов, проблема решается за счет электронейтрального эквивалентного обмена Н+ на K+. По-видимому, эта ATPаза переносит только один ион Н+ на каждую молекулу ATP, что открывает возможность создания очень больших (согласно термодинамическим расчетам — до 7 единиц рН) градиентов концентрации водородных ионов между цитоплазмой и внеклеточной средой. В хромаффинных гранулах и некоторых других секреторных пузырьках -генерирующая функция Н+-ATPазы является ведущей, так как аккумуляция секретируемых веществ поддерживается энергией протонного потенциала. В заключение хотелось бы отметить, что в большинстве эукариотических клеток одновременно функционируют Н+-ATPазы (Н+-ATP-синтазы) всех трех вышеперечисленных типов. Так, в митохондриях и хлоропластах присутствуют FoF1-Н+-ATP-синтазы, в остальных мембранных органеллах клетки — V0V1-Н+-ATPазы, тогда как в плазмалемме функционирует ATPаза E1E2-типа.

7.3. Н+-Пирофосфат-синтаза (Н+-Пирофосфатаза) Как описано в разд. 1.4.1, при необходимости затратить большее количества энергии, чем может быть получено при гидролизе ATP до ADP и Pi, в ходе различных метаболических процессов (таких, как синтез ДНК, РНК, полипептидов, при активации жирных кислот, глюкозы и т.д.) происходит гидролиз ATP до AMP и пирофосфата (PPi):

Bioenergetica.indb 166

26.01.2011 18:03:05

Глава 7. Химическая работа за счет

синтез РНК: синтез ДНК: синтез белков:

167

(NMP)n + NTP → (NMP)n+1 + PPi ; (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi ;

аминокислота + тРНК → аминоацил-тРНК + PPi ;

синтез гликогена и крахмала: глюкозо-1-фосфат + ATP → → ADP-глюкоза + PPi ; активация жирных кислот: R–COOH + HS-CoA + ATP → → R–CO~S-CoA + AMP + PPi . Образованный в ходе этих реакций пирофосфат в клетках большинства организмов необратимо гидролизуется растворимой пирофосфатазой: PPi +H2O → 2Pi . Эта реакция необходима для того, чтобы удерживать концентрацию пирофосфата на очень низком уровне и тем самым «тянуть за собой» ATP-зависимые биосинтезы, сопровождающиеся образованием PPi. Однако существуют исключения из правила, согласно которому пирофосфат немедленно расщепляется растворимой пирофосфатазой. В клетках растений и некоторых микроорганизмов растворимая пирофосфатаза либо отсутствует, либо ее активность находится на крайне низком уровне. В этих случаях стационарная концентрация пирофосфата в цитоплазме может быть довольно высока (так, у высших растений цитоплазматическая концентрация PPi приблизительно равна 0,3 мМ), и энергия гидролиза PPi может быть потрачена на совершение какой-нибудь работы. Действительно оказалось, что в тонопласте растительных вакуолей содержится особый фермент — мембраносвязанная Н+-транслоцирующая пирофосфатаза, катализирующая сопряженный с гидролизом пирофосфата трансмембранный перенос протонов. Между вакуолью и цитозолем существуют значительные градиенты рН, ионов и метаболитов. Основным феркак движущую силу для этого транспорта веществ ментом, создающим в сторону большей их концентрации, является Н+-ATPаза V0V1-типа. Однако наряду с данным ферментом в тонопласте растений действует еще один протонный насос — Н+-пирофосфатаза. Более того, в некоторых тканях растений активность этого фермента может быть существенно выше активности V-ATPазы. Очень похожий фермент был также обнаружен у некоторых прокариот (как у бактерий, так и у архей). Еще в 1966 г. М. Балчевски и сотрудники описали образование неорганического пирофосфата хроматофорами Rhodospirillum rubrum под действием света. Позднее было найдено, что в темноте пирофосфат, подобно ATP, энергизует мембрану хроматофоров. В хроматофорах был также показан протонный контроль пирофосфатазной активности, которая возрастала в восемь раз при рассеивании . Опыты в группе одного из авторов (В.П.С.) показали, что гидролиз пирофосфата генерирует ΔΨ на мембране хроматофоров, а также протеолипосом, содержащих

Bioenergetica.indb 167

26.01.2011 18:03:05

168

ЧАСТЬ III. Потребители

очищенную пирофосфатазу Rh. rubrum. Таким образом, мембраносвязанная Н+-транслоцирующая пирофосфатаза (Н+-пирофосфат-синтаза) катализирует обратимое взаимопревращение энергии между и пирофосфатом. Казалось бы, функция Н+-пирофосфат-синтазы в клетках Rh. rubrum должна была состоять в синтезе пирофосфата за счет энергии света (или дыхания) либо в генерации за счет гидролиза пирофосфата. Однако в первом случае не ясна дальнейшая судьба образованного пирофосфата, который, в отличие от ATP, отнюдь не является универсальным источником энергии в клетке. Скорее всего, у Rh. rubrum пирофосфат играет роль энергетического буфера по отношению к и ATP (эта функция будет подробно расРисунок 7.20. М. Балчевски смотрена нами в разд. 11.3). В любом случае Н+пирофосфат-синтаза Rh. rubrum должна обладать важной биологической функцией. Ее активность в хроматофорах довольно высока, составляя 12–15% по отношению к активности H+-АТР-синтазы. Первичная последовательность Н+-пирофосфатазы была определена как для большого количества растений, так и для различных прокариот. Несмотря на то что Н+-пирофосфат-синтаза катализирует очень сходную реакцию по сравнению с Н+-ATP-синтазой ( -зависимое образование фосфоангидридной связи), эти два фермента не обладают сколь-нибудь заметной гомологией по отношению друг к другу. Более того, в отличие от Н+-ATPазы Н+-пирофосфатаза является относительно простым белком. Во всех исследованных случаях данный фермент состоит всего из одного полипептида с молекулярной массой около 70 кДа (хотя предполагается, что in vivo Н+-пирофосфатаза функционирует в виде гомодимера). Данный полипептид является исключительно гидрофобным, он содержит в своем составе 14–16 потенциальных α-спиральных трансмембранных колонн, соединенных очень короткими гидрофильными последовательностями. Мембраносвязанная Н+-пирофосфатаза не имеет также высокой гомологии и с растворимыми пирофосфатазами. Определенное сходство между этими двумя ферментами наблюдается лишь в области гидрофильной петли между V и VI трасмембранными колоннами Н+-пирофосфатазы, являющейся, по-видимому, местом связывания MgPPi. Н+-пирофосфатаза проявляет свою активность лишь в присутствии ионов магния (большинству этих ферментов требуются также и ионы калия). Известен набор ингибиторов, подавляющих данную пирофосфатазную активность. Это Ca2+, фторид, имидодифосфат, N-этилмалеимид и антибиотик Дио-9. Олигомицин не влияет на фермент. ДЦКД снижает активность пирофосфатазы в хроматофорах и подавляет генерацию ΔΨ этим ферментом в составе протеолипосом. Механизм действия фермента и его молекулярные свойства остаются неясными. Данный белок на сегодняшний день является, пожалуй, наиме-

Bioenergetica.indb 168

26.01.2011 18:03:05

Глава 7. Химическая работа за счет

169

нее изученной протонной помпой. Не найдено фосфорилированных интермедиатов H+-пирофосфатазной реакции. Предполагается, что стехиометрия Н+/PPi для этого фермента равна всего 1 (хотя цифры 0,5 и 2 также рассматриваются в литературе). Столь низкая (по сравнению с Н+-ATP-синтазой) стехиометрия объясняется, по-видимому, тем, что внутриклеточная [Pi] много больше [PPi], тогда как внутриклеточная [ADP] много меньше [ATP]. Это означает, что для синтеза пирофосфата в реальных условиях (например, в бактериальной клетке) требуется значительно меньше энергии, чем для синтеза ATP. Действительно, у мембран из анаэробной бактерии Syntrophus gentianae был показан чувствительный к протонофорам синтез ATP за счет энергии гидролиза пирофосфата, а также синтез PPi за счет энергии гидролиза ATP. При этом для синтеза одной молекулы ATP было необходимо провести гидролиз приблизительно трех молекул пирофосфата, а для синтеза трех молекул пирофосфата оказалось достаточно гидролизовать одну молекулу ATP. Такая низкая стехиометрия Н+/PPi для Н+-пирофосфатсинтазы, по-видимому, и объясняет относительно простое устройство этого фермента по сравнению со столь сложным белковым комплексом, каковым является FoF1-ATP-синтаза с ее стехиометрией Н+/ATP=2,7 (см. выше).

7.4. Н+-Трансгидрогеназа NAD(H) и NADP(H) являются основными переносчиками восстановительных эквивалентов в цитоплазме клеток большинства живых организмов. Структурно эти два кофактора отличаются между собой всего лишь на один фосфатный остаток. Однако из-за этого небольшого отличия NAD(H) и NADP(H) в клетке метаболически изолированы друг от друга и выполняют различные функции. За редкими исключениями, NAD+ используется для окисления субстратов в реакциях катаболизма, тогда как NADPH чаще всего применяется для восстановительных процессов в ходе анаболических реакций. Поэтому в клетке NADP(H) обычно находится в сильно восстановленном состоянии ([NADP+] [лактат]нар). Выход лактата из клетки катализируется (лактат, nН+)-симпортером, где п = 2 при низких значениях [лактат]нар и [Н+]нар. Коэффициент п понижается до 1, когда уровни лактата и Н+ в среде возрастают. Это означает, что совместное действие гликолиза и симпортера защелачивает цитоплазму и заряжает ее отрицательно, если концентрации лактата и Н+ снаружи клетки низки: глюкоза → 2(лактат–)внут + 2Н+внут

(9.8)

2(лактат–)внут +4Н+внут → (лактат–)нар + 4H+нар.

(9.9)

Аккумуляция лактата и Н+ в среде модифицирует этот механизм таким образом, что количества лактата и ионов Н+, выходящих из клетки, уравновешиваются и, следовательно, генерация прекращается. Подобная регуляция предотвращает накопление в клетке избытка молочной кислоты.

Bioenergetica.indb 191

26.01.2011 18:03:14

192

ЧАСТЬ III. Потребители

9.5.

-зависимые транспортные каскады

Описано несколько систем, в которых используется для создания градиента определенного компонента (S1), а этот градиент затем утилизируется для транспорта другого вещества (S2). В бактериях роль S1 часто выполняют ионы Na+. В этом случае энергия потребляется при откачке Na+ из клетки посредством электронейтрального Na+/Н+-антипортера или электрогенного Na+/пН+-антипортера. Образованная ΔpNa используется для аккумуляции различных метаболитов при помощи (Na+,метаболит)симпортеров. Этот вид осмотической работы оказывается основным у алкалофильных, галофильных и многих морских микроорганизмов. В митохондриях многоступенчатый -зависимый каскад описан при исследовании механизмов переноса фосфата и интермедиатов цикла Кребса. Процессом, запускающим каскад, служит образование ΔΨ дыхательной цепью. Затем ΔΨ превращается в ΔpH посредством электрофоретического обмена ATP4–внут / ADP3–нар (а также унипорта Са2+, K+ и т.д.). Полученная ΔpH используется для Рисунок 9.2. Транспортный каскад внутренней создания Δp (фосфат) при помощи митохондриальной мембраны. Дыхательная симпорта Н2РО4– и Н+, направленцепь (1) откачивает ионы Н+ из матрикса; (H2PО4–,Н+)-симпортер (2) и (ATP4–/ADP3–)- ного снаружи внутрь митохондрии. антипортер (3) переносят фосфат и ADP в Δp (фосфат) утилизируется для накоматрикс в обмен на ATP; (HPО42–/малат2–)- пления малата при помощи HPО 2–/ 4 антипортер (4) катализирует выход малата; малат2–-антипортера (тот же перенос(малат2–/цитрат3– + Н+)-антипортер (5) вычик транспортирует некоторые другие зывает накопление в матриксе цитрата дикарбоновые кислоты). Последний этап каскада — импорт митохондриями цитрата. Процесс осуществляется переносчиком, обменивающим малат2– на цитрат3– и Н+ (рис. 9.2). Вся эта сложная система открывает возможность создания целой иерархии регулирующих воздействий на метаболизм митохондрий.

9.6. Карнитин как пример трансмембранного переносчика химической группировки В некоторых случаях через мембрану переносится не вся молекула транспортируемого вещества, а только ее часть. Примером может служить транспорт остатков жирных кислот (жирных ацилов), опосредованный участием карнитина.

Bioenergetica.indb 192

26.01.2011 18:03:14

Глава 9. Осмотическая работа за счет

193

Рисунок 9.3. Карнитин и ацилкарнитины в депротонированной (цвиттерионной) и протонированной (катионной) формах. R — остаток жирной кислоты (ацил)

Исследования карнитина имеют длинную историю, поучительную для всех, кто занимается проблемой транспорта метаболитов. Карнитин (рис. 9.3) был открыт в 1905 г. в России В. Гулевичем и Р. Кримбергом. В то время биохимические журналы пестрели сообщениями о новых веществах биологического происхождения, поэтому описание еще одного органического соединения в мышцах вряд ли было оценено по достоинству. В 1930-е гг., когда прогресс в понимании биологических функций низкомолекулярных соединений был особенно впечатляющим, структурное подобие карнитина и холина стимулировало ряд исследований, однако никакой метаболической функции карнитина обнаружить не удалось. В 1940-х гг. весьма популярными были работы по поиску новых витаминов, и здесь наконец-то был достигнут первый успех в изучении роли карнитина. Оказалось, что он служит одним из ростовых факторов для мучного червя Tenebrio molitor. Авторы, обнаружившие этот эффект, назвали карнитин витамином Вт (Т от Tenebrio). Позднее было установлено, что в условиях дефицита по карнитину и голодания черви умирают «жирными», будучи не в состоянии утилизировать свои жировые запасы. К несчастью для исследователей карнитина, все попытки показать витаминную функцию этого вещества на объектах иных, чем мучной червь, дали отрицательный результат. Работа по витамину Вт оказалась не в состоянии стимулировать интерес к функции карнитина просто потому, что человечество, не заинтересованное в процветании мучных червей, было не слишком озабоченно витаминностью их пищи. К середине века, когда подавляющее большинство низкомолекулярных компонентов клетки уже нашло свое место на метаболической карте, функция карнитина все еще оставалась неясной. В 1955 г., т.е. ровно полвека спустя после открытия карнитина, С. Фридман и Г. Френкель выяснили, что карнитин обратимо ацетилируется посредством ацетил-СоА. Ацетил-СоА занимает ключевое место в метаболизме, так что можно было надеяться, что ацетилкарнитин служит интермедиатом переноса ацетильных остатков с ацетил-СоА на какой-либо акцептор. Ничего подобного, однако, не оказалось. Единственной реакцией утилизации ацетилкарнитина осталось его превращение обратно в карни-

Bioenergetica.indb 193

26.01.2011 18:03:15

194

ЧАСТЬ III. Потребители

тин с ацетилированием свободного СоА. То же верно и для ацилкарнитина, второго представителя соединений этого типа, который вместо ацетила содержит ацильный остаток жирной кислоты. Складывалось впечатление, что ацилирование карнитина представляет собой метаболический тупик. В том же 1955 г. И. Фритц отметил стимулирующее действие карнитина на окисление жирных кислот гомогенатом печени. Подобный эффект представлялся довольно неожиданным для вещества, стоящего в стороне от главных путей метаболизма, так что наблюдение Фритца в течение некоторого времени оставалось необъясненным. В 1960-е гг., когда начались обширные работы по биомембранам, эффект Фритца попал в поле зрения. Обнаружилось, что он как-то связан с митохондриями. Фритц выдвинул гипотезу об участии карнитина в транспорте жирных кислот через митохондриальную мембрану. Эта мысль получила подтверждение, когда выяснились следующие два факта. Во-первых, карнитинацилтрансфераза, катализирующая перенос ацильной группы между СоА и карнитином, локализована на обеих сторонах внутренней мембраны митохондрий. Во-вторых, ацилкарнитин (но не ацил-СоА) способен проникать через митохондриальные мембраны. На основе названных наблюдений была сформулирована схема участия карнитина (Сn) как переносчика жирных ацилов, суммированная уравнениями 9.10–9.12: Ацил-СоАнар + Сnнар→ ацил-Сnнар +СоА,

(9.10)

Ацил-Сnнар→ ацил-Сnвнут,

(9.11)

Ацил-Сnвнут+СоАвнут→ ацил-СоАвнут + Сnвнут.

(9.12)

Два вопроса оставались неясными в рамках данной концепции. 1) Почему такая гидрофильная молекула, как карнитин, была отобрана эволюцией в качестве переносчика жирных ацилов? 2) Какова судьба Сnвнут? (Сам по себе он не может выйти из митохондрий, так как внутренняя мембрана, как было показано, непроницаема для карнитина.) Обе проблемы были решены в 1970-е гг. Для биоэнергетиков этот период ознаменовался борьбой вокруг хемиосмотической гипотезы Питера Митчела, завершившейся его триумфом. В частности, было найдено, что любой процесс аккумуляции ионов или метаболитов в митохондриях поддерживается энергией . Вот почему в 1970 г. один из авторов этой книги (В.П.С.) предположил, что роль карнитина как-то связана с использованием протонного потенциала. Так как жирные кислоты представляют собой гидрофобные анионы, они могли бы откачиваться из митохондрий под действием ΔΨ. Протонированные формы жирных кислот способны входить обратно в митохондрии, двигаясь по ΔpH. Циркуляция жирных кислот (разобщению в мембране митохондрий должна приводить к рассеянию процессов дыхания и аккумуляции энергии). В то же время ни карнитин, ни ацилкарнитин не могут быть анионами. В депротонированной форме они представляют собой цвиттерионы (суммарный заряд равен нулю), а в протонированной — катионы. При этом цвиттерионные формы более гидрофильны. Эти данные позволяют предположить, что жирные кислоты,

Bioenergetica.indb 194

26.01.2011 18:03:16

Глава 9. Осмотическая работа за счет

195

соединяясь с карнитином, утрачивают свою разобщающую активность и приобретают способность накапливаться внутри митохондрий, где происходит их β-окисление. Транспорт в целом может быть описан симпортом жирных ацилов и ионов Н+ в митохондриальный матрикс под действием : общей Ацил-Сnнар + H+нар→ ацил-Сn-H+нар,

(9.13)

Ацил-Сn-H+нар→ ацил-Сn-H+внут,

(9.14)

Ацил-Сn-H+внут → ацил-Сnвнут + H+внут.

(9.15)

В соответствии с предсказанием этой схемы, Д.О. Левицкий обнарув митохондриях разобщитежил в нашей лаборатории, что рассеяние лем резко тормозит окисление пальмитоилкарнитина, добавленного после разобщителя. В то же время разобщитель стимулирует окисление, будучи добавленным через 3 мин после пальмитоилкарнитина. По-видимому, количества пальмитоилкарнитина, накопленного энергизованными митохондриями за три минуты инкубации, было достаточно для активного дыхания в течение всего периода полярографического опыта. Так был получен ответ на вопрос, почему карнитин был выбран в качестве переносчика жирных ацилов. Зная функцию карнитина, можно лишь поражаться целесообразности устройства этой небольшой молекулы. Все три функциональные группы карнитина необходимы для выполнения им его роли: гидроксильная группа нужна для соединения с жирным ацилом, карбоксильная — для обратимого связывания протона, четвертичный азот — для сообщения молекуле переносчика положительного заряда. Представленная концепция оставляет без ответа второй из вопросов, поставленных выше: что происходит с карнитином, освободившимся внутри митохондрии в реакции с СоАвнут? Эта проблема была решена в 1976 г. С. Панде и Р. Парвином и, независимо от них, Р. Рамсеем и П. Таббосом, обнаружившими стехиометричный карнитин / ацилкарнитин-антипорт между инкубационной смесью и митохондрией. Общая схема транспорта внемитохондриальных ацилов жирных кислот в матрикс представлена на рис. 9.4. Процесс начинается во внешней митохондриальной мембране, где локализована ацил-СоА-синтаза — фермент, эстерифицирующий СоА свободными жирными кислотами за счет энергии ATP (реакция 1). В межмембранном пространстве или на внешней поверхности внутренней мембраны ацил-СоА атакуется внешней карнитинацилтрансферазой, в результате чего жирный ацил переносится с СоА на карнитин (реакция 2). Образующийся ацилкарнитин протонируется ионами Н+нар. Фонд Н+нар пополняется дыхательными -генераторами, откачивающими протоны из матрикса в межмембранное пространство (реакции 3 и 4). Протонированный ацилкарнитин пересекает внутреннюю мембрану, (реакция 5), и депротонируется в мадвигаясь под действием общей триксе (реакция 6). Там ацилкарнитин ацилирует внутримитохондриальный СоА под действием внутренней ацилкарнитинтрансферазы (реакция 7). Вы-

Bioenergetica.indb 195

26.01.2011 18:03:16

196

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 9.4. Карнитин-зависимый транспорт ацилов жирных кислот в матрикс митохондрий: 1 — ацил-СоА-синтаза, 2 — внешняя карнитинацилтрансфераза, 3 — -генераторы дыхательной цепи, 4 — протонирование карбоксильной группы ацилкарнитина, 5 — -зависимый вход ацилкарнитина, 6 — депротонирование карбоксильной группы ацилкарнитина, 7 — внутренняя карнитинацилтрансфераза, 8 — карнитин-ацилкарнитин-антипортер

свобождающийся при этом карнитин обменивается с внешним ацилкарнитином посредством карнитин / ацилкарнитин-антипортера (реакция 8). Интересной чертой этой системы является то, что уровень карнитина в матриксе регулирует распределение потока ацилкарнитина в митохондрию между -зависимым (т.е. связанным с энергетическими затратами) путем 5 и энергонезависимым антипортом 8. Вероятно, -зависимый путь преобладает в тот момент, когда жирные кислоты начинают окисляться, сменяя другие субстраты дыхания. В этих условиях концентрация свободного карнитина в матриксе еще слишком мала, чтобы насытить антипортер, имеющий довольно низкое сродство к карнитину (Km около 1 мМ). На данной стадии затрата оправданна, поскольку это форсирует накопление жирных кислот в митохондриях и тем самым способствует переводу митохондрий на окисление жирных кислот. Массированное поступление ацилкарнитина в матрикс с последующей утилизацией жирных ацилов в системе β-окисления приводит к накоплению карнитина в матриксе митохондрий в количествах, достаточных для активации антипортера. Теперь система мона транспорт жирных ацилов, так как работа жет обойтись без затраты антипортера сама по себе не требует протонного потенциала. Приведенную выше логику нельзя применить к ацетилкарнитину, который слишком гидрофилен для проникающего катиона. Было постулировано, что главная функция ацетилкарнитина состоит в забуферивании уровня ацетил-СоА подобно тому, как креатинфосфат забуферивает уровень ATP. Это не исключает также и электрофоретического накопления протонированного ацетил-Cn в митохондриях, если допустить существование особого белка-переносчика такого катиона. Кстати сказать, переносчик очень не помешал бы и транспорту протонированного ацил-Cn, концентрация которого и проникающая способность при нейтральном рН для искусственных мембран очень малы.

Bioenergetica.indb 196

26.01.2011 18:03:16

Глава 9. Осмотическая работа за счет

197

9.7. Некоторые примеры -зависимых белков-переносчиков Образование концентрационных градиентов того или иного вещества за счет энергии , в принципе, может происходить и без специального энергопреобразующего устройства. Как уже упоминалось выше, ацетат должен накапливаться в митохондриях, а аммиак — откачиваться во внемитохондриальное пространство под действием ΔpH без всяких переносчиков просто потому, что мембрана проницаема для СН3СООН и NН3. В такой ситуации включение переносчика может лишь ускорить процесс транспорта. Однако переносчик оказывается совершенно необходимым, если транспортируемое вещество или химическая группировка сами по себе не могут двигаться через мембрану в нужном направлении. Живая клетка всегда стремится избежать спонтанных событий, предпочитая иметь дело с процессами, катализируемыми белками. В этом случае может быть получена высокая специфичность в отношении субстрата и регулируемая в широких пределах скорость реакции. Данный принцип применим и к -зависимой осмотической работе. Огромное большинство транспортных механизмов обслуживается специальными белками-переносчиками. В некоторых случаях переносчик может быть устроен достаточно просто, как, например, карнитин. Такие антибиотики-пептиды, как грамицидин, образующий канал, проницаемый для K+, Na+ и Н+, калиевый унипортер валиномицин, K+/H+-aнтипopтep — нигерицин, Na+/Н+-антипортер — моненсин также выглядят сравнительно простыми веществами рядом с белковыми молекулами. Однако следует помнить, что и карнитин, и антибиотикиионофоры выполняют, в общем-то, примитивные функции. В случае карнитина — это включение процесса транспорта, который затем, набрав необходимый темп, переходит на другие «рельсы», где уже безусловно требуется белок-переносчик (карнитин / ацилкарнитинантипортер). Что касается антибиотиков, то их роль, по всей видимости, сводится к повреждению мембраны клеток конкурирующих видов. Если функция переносчика более сложна, то это всегда белок. Белки-переносчики — это трансмембранные полипептиды, которым при их работе иногда «ассистируют» периферические или водорастворимые белки. Здесь уместно вспомнить хорошо изученную систему транспорта аминокислот в E. coli (см. табл. 9.1). Показано, что транспортные белки 1, 2, 5, 7, 8 и 14 действуют без водорастворимых белков-помощников. Другие системы, перечисленные в той же таблице, используют растворимые белки. В случаях 3, 4 и 6 такие белки играют роль буферов, стабилизирующих уровень соответствующих аминокислот в периплазме. Они обратимо связывают аминокислоты, которые поступают из внешней среды, и высвобождают аминокислоты, когда концентрация последних в периплазме падает из-за активности белков-переносчиков, локализованных в цитоплазматической мембране. Благодаря этим эффектам стабилизируется скорость импорта аминокислот в цитоплазму.

Bioenergetica.indb 197

26.01.2011 18:03:17

198

ЧАСТЬ III. Потребители

Иная ситуация описана для систем 9 и 10. Здесь белки-помощники необходимы для транспорта как такового. Связав аминокислоту в периплазме, белок-помощник образует комплекс с одним из интегральных белков цитоплазматической мембраны, который играет роль собственно переносчика. Белок-помощник в системах 9 и 10 обусловливает специфическое сродство переносчика к транспортируемому веществу. Ниже будут рас-зависимые транспортные системы, исследованные досмотрены две статочно детально.

9.7.1. (Лактоза,Н+)-симпортер из Е. coli (Лактоза,Н+)-симпортер из Е. coli — наиболее изученный переносчик бактериального происхождения. Он был открыт в 1955 г. Ж. Коэном и Г. Рикенбергом. Спустя восемь лет П. Митчел предположил, что лактоза симпортируется с протоном под действием . В 1970 г. И. Уэст показал, что поглощение лактозы клетками Е. coli действительно сопровождается поглощением ионов H+. В то же время было выяснено, что продуктом гена lacY является какой-то мембранный белок. В 1978 г. Р. Титер и сотрудники клонировали ген lacY, что позволило выяснить аминокислотную последовательность симпортера, амплифицировать ген и синтезировать белок in vitro. В 1980 г. очищенный симпортер был встроен в протеолипосомы. В опытах с интактными бактериями, вывернутыми суббактериальными пузырьками и протеолипосомами было продемонстрировано, что перенос лактозы сторону ее более низкой концентрации приводит к появлению . При этом положительно заряжался и закислялся тот отсек, где концентрация лактозы была ниже. Образуемая тормозила перенос лактозы, а разобщители-протонофоры снимали это торможение. В то же время транспорт лактозы в сторону большей концентрации , образуемой дыханием, тормозился разобщителями. за счет энергии Первоначально этот эффект был показан на интактных клетках кишечной палочки, а затем и на протеолипосомах, содержавших симпортер и цитохром bо из Е. coli. (Лактоза, Н+)-симпортер на протяжении многих лет является классической моделью для изучения механизма функционирования белковпереносчиков. Это очень гидрофобный белок с массой 46,5 кДа, состоящий из 417 аминокислотных остатков. В ходе исследований было получено огромное количество мутантных форм данного фермента и подробно исследованы последствия таких замен. Удивительной особенностью (лактоза, Н+)-симпортера является то, что лишь 6 его аминокислотных остатков оказались абсолютно незаменимыми. Для одной из таких мутантных форм (Cys154Gly) белка совсем недавно были получены кристаллы, что позволило определить трехмерную структуру этого переносчика с высокой степенью разрешения. Как видно на рис. 9.5, (лактоза, Н+)-симпортер образует 12 трансмембранных α-спиральных столбов. Структура этих спиралей необычным образом искривлена, что приводит к оригинальной «воронкообразной» форме белка. В структуре этого симпортера наблюдается очень большая гидро-

Bioenergetica.indb 198

26.01.2011 18:03:17

Глава 9. Осмотическая работа за счет

199

Рисунок 9.5. Структура (лактоза, Н+)-симпортера (LacY) из Е. coli в комплексе с аналогом субстрата (показан черным цветом) [Abramson et al., 2003, FEBS Lett., 555: 96–101]. A — вид сбоку (параллельно поверхности мембраны). Б — вид сверху (со стороны цитоплазмы)

фильная полость, на дне которой (где-то на уровне середины липидного бислоя) расположены места связывания лактозы и протона. Как было сказано выше, трехмерную структуру удалось определить лишь для мутанта (лактоза, Н+)-симпортера Cys154Gly. Данная мутантная форма как бы «заморожена» в одной из возможных конформаций этого белка, что и обеспечило успех при ее кристаллизации. Однако ранее было установлено, что во время переноса лактозы (лактоза, Н+)-симпортер претерпевает значительные конформационные перестройки, сопровождающиеся изменением доступности к воде различных аминокислотных остатков с разных сторон мембраны. Это указывает на то, что гидрофильная полость со связанной лактозой может быть открыта в зависимости от конформационного состояния белка либо в сторону цитоплазмы (конформация, в которой всегда находится мутант Cys154Gly), либо в сторону периплазмы (рис. 9.6). На основе этих данных была предложена модель переноса лактозы через мембрану, изображенная на рис. 9.7.

Рисунок 9.6. Структурные изменения в (лактоза, Н+)-симпортере между открытой внутрь (А) и открытой наружу (Б) конформациями этого белка. Аналог субстрата показан черным цветом [Abramson et al., 2003, FEBS Lett., 555: 96–101]

Bioenergetica.indb 199

Рисунок 9.7. Механизм действия (лактоза, Н+)-симпортера: 1–6 — последовательность стадий процесса; СН и С– — протонированнная и депротонированная формы симпортера, L — лактоза

26.01.2011 18:03:17

200

ЧАСТЬ III. Потребители

9.7.2. Митохондриальный ATP/ADP-антипортер Среди митохондриальных транспортных систем наиболее изученным считается ATP/ADP-антипортер (синонимы: адениннуклеотидтранслоказа, переносчик адениннуклеотидов). Антипортер осуществляет обмен одной молекулы ADP на одну молекулу ATP между внеи внутримитохондриальными пространствами. Как было показано М. Клингенбергом и Г. Роттенбергом, катализируемое антипортером перераспределение ATP и ADP зависит от величины ΔΨ. Валиномицин, разряжая ΔΨ, уравнивает соотношение адениннуклеотидов снаружи и внутри митохондрий и меняет кинетику антипорта, в то время как нигерицин, снимающий ΔpH, не влияет на указанные параметры. Все эти факты свидетельствуют об электрогенном характере обмена ATP/ADP. В отличие от подавляющего большинства других нуклеотид-связывающих белков, ATP/ADP-антипортер присоединяет не магниевые комплексы ATP и ADP, а только их свободные формы. Так как в отсутствие магния ATP при нейтральном рН несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и направление Рисунок 9.8. М. Клингенберг ΔΨ в митохондриях благоприятствует выбросу анионов, авторы заключили, что ATPвнут4– обмениваются на ADPнар3–. Этот вывод был подтвержден в опытах с протеолипосомами. Число оборота антипортера довольно мало (около 25 в 1 с). В то же время количество молекул антипортера в мембране очень велико: оно составляет от 5 до 12% от общего белка внутренней мембраны. Специфическими ингибиторами антипортера служат глюкозиды атрактилат и карбоксиатрактилат, а также бонгкрековая кислота. Антипортер необходим для откачки из митохондрий в цитоплазму того ATP, который образуется при окислительном фосфорилировании. Электрофоретический характер антипорта нуклеотидов через мембрану энергизованных митохондрий облегчает выход ATP из митохондрий и вход в них ADP. Кроме того, повышается цена энергии гидролиза ATP в цитозоле изза роста отношения ATP/ADP в этом отсеке клетки. Последнее сдвигает все ATP-зависимые процессы в сторону использования ATP. Значит, появляется возможность совершить дополнительную работу. Если окислительное фосфорилирование выключено, например анаэробиозом, то тот же самый механизм антипорта предотвращает истощение гликолитического ATP посредством Н+-ATP-синтазы, действующей в обратном (ATPазном) направлении. Чтобы войти в митохондрию, внешний ATP должен двигаться против поля, создаваемого Н+-ATPазной реакцией. Интересно сравнить субстратную специфичность ATP/ADP-антипортера и Н+-ATP-синтазы. Первый взаимодействует только с адениннуклеотидами, вторая также и с гуаниннуклеотидами. Поэтому GTP, образованный внутри

Bioenergetica.indb 200

26.01.2011 18:03:19

201

Глава 9. Осмотическая работа за счет

митохондрий при окислительном фосфорилировании GDP, в отличие от ATP, не может быть немедленно откачан антипортером в цитозоль. Сначала требуется передать фосфорил с GTP на ADP посредством нуклеозиддифосфаткиназы, и лишь затем полученный ATP подлежит обмену на цитоплазматический ADP. Это относится и к субстратному фосфорилированию при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутарата, при котором образуется GTP. Данная субстратная специфичность антипортера замедляет использование GTPвнут внемитохондриальными потребителями энергии, что должно способствовать протеканию в митохондриях синтеза белка, поддерживаемого энергией GTP. Структура и механизм работы ATP/ADP-антипортера ATP/ADP-антипортер — гидрофобный мембранный белок с массой 32 кДа, состоящий (в случае с ферментом из быка) из 297 аминокислотных остатков. Анализ первичной последовательности этого фермента показывает, что он состоит из трех повторяющихся последовательностей, каждая из которых представляет собой две гидрофобные α-спирали, соединенные протяженной гидрофильной петлей (т.е. в полном белке присутствуют 6 трансмембранных α-спиралей). Гомологичные повторы в структуре этого переносчика указывают на то, что он, по-видимому, возник в ходе эволюции за счет трипликации какого-то гена-предшественника. In vivo данный антипортер функционирует в виде гомодимера. Недавно трехмерная структура ATP/ADP-антипортера была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа. Как видно на рис. 9.9, шесть трансмембранных столбов этого белка образуют в липидном бислое достаточно компактную структуру. Все эти α-спирали значительно наклонены по отношению к направлению, перпендикулярному поверхности мембраны. Каждая вторая α-спираль где-то на уровне середины бислоя имеет острый излом за счет присутствия в этом месте остатков пролина. Как и в случае пермеазы лактозы, в структуре ATP/ADP-антипортера имеется очень большая гидрофильная воронка (рис. 9.10). Она «выстлана» изнутри остатками положительно заряженных аминокислот (Arg79, Arg104, Arg137, Arg234, Arg235 и Arg279; а также Lys22, Lys32, Lys91, Lys95 и Lys106), которые, по-видимому, обеспечивают узнавание, освобождение от магния и связывание ATP4– и ADP3–. Место связывания этих нуклеотидов расположено на самом дне этой положительно заряженной полости (т.е. где-то Рисунок 9.9. Трехмерная структура ATP/ADPна уровне середины липидного антипортера [Pebay-Peyroula et al., 2003, Nature, 426: 39–44]

Bioenergetica.indb 201

26.01.2011 18:03:20

202

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 9.10. Заряд поверхности ATP/ADP-антипортера (вид со стороны межмембранного пространства). Положительные и отрицательные заряды указаны соответственно синим и красным цветом [Pebay-Peyroula et al., 2003, Nature, 426: 39–44]

бислоя). В этом месте молекулы белка есть необычная последовательность (Arg234Arg235Arg236 Met237Met238Met239), что служит характерной особенностью первичной структуры ATP/ADP-антипортеров, не встречающейся в других переносчиках. По-видимому, механизм обмена нуклеотидов ATP/ADP-антипортером сходен с механизмом работы описанного выше (лактоза, Н+)-симпортера. Этот механизм мог бы заключаться в значительных конформационных перестройках белка во время работы, приводящих к открытию гидрофильной полости либо в сторону матрикса (причем данная форма белка должна иметь повышенное сродство к ATP), либо в сторону межмембранного пространства (с одновременным понижением сродства к ATP и увеличением аффинности к ADP). Важно отметить, что ATP/ADP-антипортер, по-видимому, обменивает нуклеотиды лишь в форме гомодимера. Таким образом, возможный механизм работы этого белка заключается в кооперативной смене конформаций мономеров, находящихся в димере в таких состояниях, когда их гидрофильные карманы открыты на противоположные стороны мембраны. ATP/ADP-антипорт может происходить не только на внутренней мембране митохондрий, но и в некоторых других ситуациях. Указание в пользу присутствия ATP/ADP-антипортера в хлоропластах было впервые получено Дж. Уолдегиоргисом и сотрудниками. Обмен нуклеотидов в хлоропластах оказался чувствительным к бонгкрековой кислоте, но устойчив к карбоксиатрактилату. Доказано, что антипортер пластид функционирует в обратном направлении по сравнению с митохондриями, т.е. он обменивает ATP цитоплазмы на ADP органеллы, что обеспечивает жизнедеятельность хлоропластов в темноте. Особая система переноса адениннуклеотидов обнаружена в цитоплазматической мембране бактерии Rickettsia prowazekii, внутриклеточного па-

Bioenergetica.indb 202

26.01.2011 18:03:21

Глава 9. Осмотическая работа за счет

203

разита эукариот, вызывающего эпидемический тиф и являющегося ближайшим из всех изученных на сегодняшний день бактерий «родственником» митохондрий. Этот микроорганизм располагает дыхательной цепью и с ее на своей мембране. Однако ATP, образуемый помощью поддерживает клеткой хозяина, также может служить энергетическим ресурсом для R. prowazekii за счет присутствия в этом микроорганизме особого ATP/ADPантипортера. Данный белок обеспечивает вход ATP в бактерию и выход из нее ADP, т.е. транспорт нуклеотидов имеет направленность процесса, противоположную таковому в митохондриях. Это объясняет, почему, несмотря на эволюционную близость R. prowazekii и митохондрий, ATP/ADPантипортер этой бактерии намного более схож с антипортером хлоропластного типа, нежели со своим митохондриальным аналогом. Импорт ATP был обнаружен также у Bdellovibrio bacteriovorus. Эта мелкая бактерия — рекордсмен по скорости движения среди прокариот. Плывя очень быстро, Bd. bacteriovorus убивает другие микроорганизмы, сталкиваясь с ними и пробивая их клеточную стенку. Оказавшись внутри клетки, Bd. bacteriovorus поглощает ATP своей жертвы.

9.8. Роль

в транспорте макромолекул

Одна из наиболее интригующих проблем мембранологии и биоэнергетики состоит в том, каким образом биологические макромолекулы, а именно белки и нуклеиновые кислоты, переносятся через гидрофобный барьер сопрягающих мембран, непроницаемый для такой небольшой частицы, как ион Н+. Твердо установлено, что в этих случаях процессы транспорта макромолекул происходят без нарушения целостности мембраны, поскольку найдено, что они обеспечиваются энергией или одной из ее составляющих. Скорость транспорта некоторых макромолекул очень высока. Если обсуждать транспорт белков через сопрягающие мембраны, то здесь наиболее изучены две модели: импорт в митохондрии (хлоропласты) белков, синтезируемых в цитозоле, и экспорт из бактериальной цитоплазмы белков, предназначающихся для периплазмы и внешней мембраны. С проблемой транспорта белков тесно связан вопрос о механизме встраивания в мембрану вновь синтезированных трансмембранных белков. Чтобы расположиться нужным образом в липидном бислое, определенные домены этих белков должны пересечь гидрофобный барьер.

9.8.1. Транспорт митохондриальных белков. Биогенез митохондрий Подавляющее большинство (не менее 98%) белков митохондрии кодируется ядерным геномом. Это означает, что белки, как правило, синтезируются в цитоплазме, а затем каким-то образом доставляются в соответствующий отсек митохондрии (в матрикс, в межмембранное пространство, во внешнюю или во внутреннюю мембрану).

Bioenergetica.indb 203

26.01.2011 18:03:21

204

ЧАСТЬ III. Потребители

Чаще всего импортируемые в митохондрии белки синтезируются в цитоплазме в виде несколько более крупных предшественников, содержащих добавочную аминокислотную последовательность с N-конца полипептидной цепи. Эта последовательность является «адресом», направляющим белок в митохондрии. Она называется лидерной последовательностью и чаще всего состоит из 10–30 аминокислотных остатков, способных образовывать амфипатическую α-спираль. Половина поверхности этой спирали гидрофобна, тогда как вторая половина гидрофильна и положительно заряжена за счет того, что обычно обогащена остатками лизина и аргинина. Достигнув места назначения, белок-предшественник становится объектом действия специфического протеолитического фермента — лидер-пептидазы. Лишившись лидера, предшественник превращается в зрелый белок. В некоторых случаях импортируемые в митохондрии белки не содержат лидерной последовательности. Это продемонстрировано, в частности, для многих переносчиков внутренней митохондриальной мембраны (например, для ATP/ADP-антипортера) и для всех белков внешней митохондриальной мембраны (например, для порина). Информация, необходимая для направления таких белков в митохондрии, заключена где-то внутри их первичной последовательности. Несмотря на то что у имеющих внутренний адрес митохондриальных белков размер зрелого белка такой же, как и у соответствующего белка-предшественника, белок-предшественник все же имеет иную конформацию, нежели зрелый белок. Во многих случаях показано, что митохондриальные белки могут синтезироваться на свободных полисомах. Транспорт этих белков обеспечивается необходимой энергией на каких-то посттрансляционных этапах. Рассмотрим транспорт митохондриальных белков на примере матриксного митохондриального фермента, обладающего лидерной последовательностью. Прежде всего такой белок должен проникнуть через внешнюю мембрану этих органелл. Данный процесс обеспечивается TOM-комплексом (от английского «translocase of the outer mitochondrial membrane»), состоящим из семи различных полипептидов. Рецепторные субъединицы TOM-комплекса (Tom20, Tom22 и Tom70) связывают лидерную последовательность, после этого белок-предшественник проникает через внешнюю мембрану с помощью белка Tom40, образующего в ней крупную пору. Транспорт белков через внутреннюю мембрану осуществляется TIMкомплексом («translocase of the inner mitochondrial membrane»), состоящим из трех различных субъединиц: Tim50, Tim23 и Tim17. Вначале лидерная последовательность связывается в межмембранном пространстве с Tim50, и далее эта последовательность проникает сквозь внутреннюю мембрану через канал, образуемый субъединицей Tim23. Последний процесс происходит за счет электрофоретического переноса положительно заряженных аминокислотных остатков лидера, т.е. осуществляется за счет энергии ΔΨ. Отсутствие ΔΨ на внутренней мембране митохондрий полностью предотвращает транспорт матриксных митохондриальных белков. Попав в матрикс, лидерная последовательность связывается с шапероном mtHsp70, выполняющим в комплексе с дополнительными белками сра-

Bioenergetica.indb 204

26.01.2011 18:03:22

Глава 9. Осмотическая работа за счет

205

зу две функции. Этот шаперон за счет энергии гидролиза ATP «затаскивает» в матрикс оставшуюся часть белка-предшественника, а затем обеспечивает правильную сборку зрелого митохондриального белка. Таким образом, для транспорта белков в матрикс митохондрии необходима энергия как в виде ΔΨ, так и в виде ATP. В то же время при транспорте белков из цитоплазмы во внутреннюю мембрану митохондрий используется лишь энергия ΔΨ. Существует очень мало данных о встраивании во внутреннюю мембрану тех белков, которые кодируются митохондриальным геномом и синтезируются в матриксе митохондрий. К белкам этого типа относится небольшое количество очень гидрофобных полипептидов — 7 субъединиц NADHСоQ-редуктазы, 1 субъединица СоQH2-цитохром с-редуктазы, 3 субъединицы цитохромоксидазы и 2 субъединицы Н+-ATP-синтазы*. Все они образуются сразу в зрелой форме и встраиваются в мембрану специальным комплексом, отличным от TIM-комплекса. Механизм данного процесса в настоящее время остается неизвестным. Важный вывод из изложенных выше данных состоит в том, что митохондрия не может образоваться самосборкой из составляющих ее компонентов. Она происходит только от другой митохондрии подобно тому, как клетка происходит от клетки. Необходимым условием для биогенеза митохондрий служит наличие ΔΨ на ее внутренней мембране. Поскольку ни один из ферментов, образующих ΔΨ, не может быть синтезирован самой митохондрией, вся популяция этих органелл в клетке обречена на гибель, когда митохондрии потеряют свой последний ΔΨ-образующий фермент, даже если в цитозоле будет избыток всех белков-предшественников. Вот почему дрожжи, оказавшись в анаэробных условиях, сохраняют замкнутые мембранные пузырьки («промитохондрии»), которые не содержат дыхательной цепи, но способны к генерации ΔΨ посредством обращения Н+-ATP-синтазы, присутствующей там, хотя и в малом количестве.

9.8.2. Транспорт бактериальных белков Белки бактерий, локализованные в периплазме или внешней мембране, должны пересечь внутреннюю мембрану, чтобы прибыть по назначению. Кроме того известно, что бактерии экскретируют некоторые ферменты во внешнюю среду. Все эти процессы напоминают импорт белков митохондриями и требуют наличия ΔΨ на внутренней бактериальной мембране. В обоих случаях транспортируемый полипептид содержит дополнительную сигнальную последовательность. Эта последовательность расположена на N-конце транспортируемого белка и представляет собой один или несколько положительно заряженных аминокислотных остатков, после которых следуют гидрофобные остатки, способные к образованию трансмембранной α-спирали. После осуществления транспортировки белка сигнальная последовательность может быть удалена с помощью специальной пептидазы. * Эти данные приведены для митохондрий высших животных.

Bioenergetica.indb 205

26.01.2011 18:03:22

206

ЧАСТЬ III. Потребители

Необходимость энергизации мембраны специально исследовали применительно к периплазматическим белкам, связывающим лейцин, изолейцин, валин и мальтозу, а также к β-лактамазе и некоторым белкам внешней мембраны. Во всех этих случаях была показана абсолютная зависимость транспорта белков от наличия ΔΨ на внутренней бактериальной мембране.

9.8.3. Роль

в транспорте белков и их укладке в мембране

Оказывается, что во многих случаях ΔΨ необходима для правильного встраивания белка в мембрану. По-видимому, простейшим примером такого рода явления может быть ΔΨ-зависимое образование каналов в плоской фосфолипидной мембране при добавлении пептидного антибиотика аламетицина. В этом случае ΔΨ необходима для электрофоретического перемещения заряженных групп аламетицина в мембране. Асиалогликопротеиновый рецептор из печени и мелиттин, активное начало пчелиного яда, встраиваются в плоскую мембрану, только если на нее подано напряжение более 20 мВ. Мелиттин — короткий полипептид (26 аминокислотных остатков), так что нетрудно представить механизм ΔΨ-зависимого встраивания в мембрану, включающий трансмембранный электрофорез определенных участков этой молекулы. Присутствие ΔΨ на липидном бислое позволяет не только обеспечить энергией процесс встраивания белков, но и придать векторный характер этому процессу, т.е. осуществить функциональную асимметричность биологических мембран. Существует правило, что положительно заряженные домены мембранного белка локализуются на отрицательно заряженной стороне мембраны, а отрицательно заряженные домены — на противоположной, положительно заряженной стороне мембраны.

9.8.4. Транспорт бактериальной ДНК Нет сомнений, что должен существовать особый молекулярный механизм, транспортирующий ДНК через мембрану бактериальной клетки. Этот процесс может быть исключительно быстрым. Так, скорость переноса ДНК при инфицировании бактерии фагом Т4 достигает 3 × 103 нуклеотидных остатков в 1 с, т.е. один нуклеотид за 330 мкс. Перенос ДНК при конъюгации и генетической трансформации происходит несколько медленней: соответственно 600 и 55 нуклеотидных остатков в 1 c, что все равно больше, чем скорость переноса нуклеотидов ATP/ADP-антипортером (25 нуклеотидов/с). Транспорт ДНК часто сопровождается переносом особых «пилотных» белков. Это означает, что мембрану пересекают большие молекулярные массы. В некоторых случаях ДНК переносится в виде двойной спирали. Роль и ATP в транспорте ДНК была изучена Л.Л. Гринюсом и его сотрудниками. Установлено, в частности, что истощение фонда внутриклеточного ATP при инкубации с арсенатом не тормозит ни генетической трансформации, ни способности бактерий инфицироваться фагом Т4. С дру-

Bioenergetica.indb 206

26.01.2011 18:03:22

Глава 9. Осмотическая работа за счет

207

гой стороны, конъюгация тормозилась арсенатом. При этом оказалось, что необходима во всех трех случаях транспорта ДНК. В частности, это было показано для трансформации В. subtilis, инфицирования Е. coli фагом Т4 и конъюгации. Позднее эти наблюдения были подтверждены в других лабораториях. Так, Б. Бремер и сотрудники выяснили, что вызывающий трансформацию , перенос ДНК в клетки В. subtilis или Haemophilus influenzae зависит от причем эффективны и ΔΨ, и ΔpH. Б. Лабедан и сотрудники подтвердили, что необходим для инфицирования фагом Т4, но, по их мнению, действующим компонентом служит ΔΨ, а ΔpH не эффективен. Группе Б. Лабедана не удалось показать необходимость для инфицирования фагом Т5. Транспорт ДНК фага λ в Е. coli также оказался энергонезависимым процессом. Складывается впечатление, что бактерии располагают различными механизмами переноса фаговой ДНК через мембрану. В процессах, когда необходима, она может служить либо движущей силой транспорта, либо его регулятором, определяющим, например, правильную ориентацию транспортируемой ДНК или ДНК-белкового комплекса.

Bioenergetica.indb 207

26.01.2011 18:03:22

ГЛАВА ДЕСЯТАЯ

КАК ИСТОЧНИК ЭНЕРГИИ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ ТЕПЛОТЫ

10.1. Три способа превращения метаболической энергии в теплоту

Н екоторые живые организмы (прежде всего млекопитающие и птицы)

способны к поддержанию значительного градиента температуры между своим телом и окружающей средой. Этот процесс требует затраты очень большого количества энергии. Понятно, что в любых нефотосинтезирующих тканях основным первичным источником энергии для термогенеза может быть только окисление дыхательных субстратов молекулярным кислородом, так как только при этих реакциях выделяется достаточное ее количество. В живой клетке теплота может выделяться тремя основными способами: 1) при гидролизе ATP, синтезированного за счет окислительного фосфори→ ATP→ тепло); 2) при рассеивании протонлирования (дыхание → ного потенциала, образованного протон-транслоцирующими ферментами дыхательной цепи (дыхание → → тепло); 3) при окислении субстратов дыхания ферментами, не сопряженными с запасанием энергии (дыхание → тепло). В механизмах первого типа участвует дыхание, сопряженное с фосфорилированием, в то время как во втором и третьем случаях — дыхание, соответственно разобщенное или первично не сопряженное с запасанием энергии. Чтобы отличить последние два механизма от систем первого типа, где путь от субстрата дыхания к выделению теплоты весьма сложен и требует образования и утилизации ATP, удобно использовать понятие «свободное окисление», объединяющее как разобщенные, так и первично не сопряженные дыхательные системы. У разных организмов для теплопродукции могут применяться различные из перечисленных выше типы механизмов термогенеза, а также всевозможные их комбинации. Тот факт, что дыхательные системы как-то вовлечены в терморегуляцию, был выяснен в ранних физиологических исследованиях, показавших сильное увеличение поглощения кислорода млекопитающими и птицами, помещенными в холодные условия. Обычно такое усиление дыхания (достигающее 2,5 раз) происходит без пропорционального увеличения основных функций организма. Создалось впечатление, что на холоде физиологические функции осуществляются менее эффективно: чтобы совершить одну и ту же работу, в холодных условиях необходимо потребить больше пищи и кислорода, а значит, выделить больше теплоты. Возможно и другое объ-

Bioenergetica.indb 208

26.01.2011 18:03:22

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

209

яснение данного эффекта: при охлаждении эффективность функций как таковых остается неизменной, а усилившиеся дыхание и теплопродукция обусловлены активацией каких-то специализированных механизмов образования теплоты. Второе объяснение выглядит более рациональным, поскольку оно соответствует задаче, решаемой терморегуляторной системой организма, — сделать физиологические функции независимыми от температуры окружающей среды.

10.2. Терморегуляторная активация свободного дыхания у животных 10.2.1. Бурый жир В организме млекопитающих содержится особая ткань — бурый жир, специализирующаяся на выработке добавочной теплоты при снижении окружающей температуры. Бурый жир составляет не более 1–2% массы тела. Тем не менее стимуляция этой ткани симпатической нервной системой при охлаждении животных, предварительно адаптированных к холоду, повышает теплопродукцию бурого жира в такой степени, что она может достигать одной трети всей дополнительно образованной в организме теплоты. В этих условиях бурый жир способен выделять до 400 Вт теплоты на 1 кг массы, что на несколько порядков больше обычной термогенной способности тканей млекопитающих (человек в состоянии покоя образует около 1 Вт теплоты на 1 кг массы). В организме бурый жир сосредоточен в верхней части спины, ближе к шее. Он окружает кровеносные сосуды, питающие кровью мозг. Вот почему теплопродукция в буром жире может иметь огромное значение для выживания организма на холоде. Эта ткань наиболее развита у новорожденных, и ее удельное содержание в организме быстро снижается с возрастом животного. Первые научные публикации о буром жире датируются XVII в., но лишь недавно была понята его функция. В 1959 г. Б. Иоханссон написал первый подробный обзор о метаболизме бурого жира. Основываясь на скудной фактической информации тех лет и некоторых предварительных данных, он выдвинул гипотезу, что бурый жир может некоторым образом участвовать в терморегуляции. Благодаря последующим работам Р.Э. Смита и ряда других исследователей стало ясно, что основной физиологической функцией бурого жира является образование дополнительной теплоты в условиях, когда теплоотдача организма значительно возрастает. Своим цветом бурый жир обязан митохондриям, содержащимся в огромных количествах в клетках этой ткани. Митохондрии бурого жира оказались хорошо оснащенными именно для образования теплоты. Содержание дыхательных ферментов в них намного превышает таковое Н+-ATP-синтазы. Но, пожалуй, важнее всего то, что в их внутренней мембране содержится особый разобщающий белок UCP (от uncoupling protein), также называемый термогенином.

Bioenergetica.indb 209

26.01.2011 18:03:22

210

ЧАСТЬ III. Потребители

Рисунок 10.1. Индуцированный холодом термогенез в митохондриях бурого жира. Знаками + и – обозначены соответственно стимуляция и торможение

Bioenergetica.indb 210

26.01.2011 18:03:22

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

211

Термогенин экспрессируется исключительно в буром жире и составляет до 15% общего белка митохондрий этой ткани. UCP способен вызывать разобщение окислительного фосфорилирования, таким образом рассеивая всю энергию протонного потенциала в виде тепла (термогенез с использо→ тепло). Молекулярная масса UCP ванием механизма: дыхание → равна 33,2 кДа. Этот белок состоит из трех повторяющихся последовательностей, каждая из которых включает две трансмембранные α-спирали, соединенные между собой протяженной гидрофильной петлей. Считается, что UCP функционирует в виде гомодимера. Аминокислотная последовательность термогенина напоминает таковую ATP/ADP-антипортера и некоторых других анионных переносчиков митохондрий (глутамат / аспартатного антипортера и переносчика дикарбоксилатов). Функционирование UCP регулируется на нескольких уровнях. Так, при охлаждении животного происходит резкое увеличение транскрипции гена этого белка (значительное увеличение содержания соответствующей мРНК в клетках бурого жира наблюдается уже через 15 мин после начала охлаждения). Регулируется также и ферментативная активность UCP. Различные пуриновые нуклеотиды (GDP, ADP, GTP и ATP) ингибируют протонную проницаемость митохондрий из бурого жира, тогда как свободные жирные кислоты в микромолярной концентрации необходимы для повышения этой проницаемости. Эксперименты, проведенные на животных in vivo, ткани бурого жира in situ, адипоцитах и митохондриях in vitro, позволили выявить следующую цепь событий, включенных в термогенный ответ этой ткани на понижение температуры среды. 1. Холодовые рецепторы кожи активируются и посылают сигнал в мозг, а именно — в терморегуляторный центр гипоталамуса. 2. Из гипоталамуса сигнал поступает в бурую жировую ткань через симпатические нейроны. Из нервных окончаний в пространство между адипоцитами выделяется норадреналин. 3. Норадреналин связывается с β-адренорецепторами, локализованными на внешней стороне плазматической мембраны клеток бурого жира (это и все дальнейшие события проиллюстрированы на рис. 10.1). 4. β-Адренорецепторы, связав норадреналин, активируют аденилатциклазу. Синергистом норадреналина служит глюкагон, а антагонистом — инсулин. Каждый гормон действует через свой рецептор. 5. Аденилатциклаза образует cAMP из ATP. 6. cAMP включает протеинкиназный каскад, приводящий к активации липазы. 7. Липаза расщепляет содержащиеся в жировых каплях триацилглицериды до жирных кислот и глицерина. 8. Образованные таким путем жирные кислоты выполняют две функции: они служат субстратами дыхания и одновременно вторичными (внутриклеточными) медиаторами гормонального сигнала. Как субстраты жирные кислоты претерпевают обычный цикл катаболитических превращений. Они активируются во внешней мембране митохондрий, давая ацил-СоА. Полученные жирные ацилы транспортируются посредством карнитино-

Bioenergetica.indb 211

26.01.2011 18:03:24

212

ЧАСТЬ III. Потребители

вой системы в митохондриальный матрикс, где под действием ферментов β-окисления расщепляются, давая СО2 и атомы H. 9. Атомы H, поставляемые в дыхательную цепь при β-окислении жирных кислот и окислении в цикле Кребса ацетильных групп, переносятся к О2, что сопряжено с образованием протонного потенциала дыхательными -генераторами. В результате ионы водорода откачиваются из матрикса в межмембранное пространство митохондрий. 10. Ионы Н+ возвращаются в матрикс за счет функционирования UCP, связавшего жирные кислоты (сигнальная функция жирных кислот). Этот завершающий этап сопровождается выделением теплоты. В настоящее время предложены два альтернативных гипотетических механизма разобщающего действия UCP. Согласно одному из них, связывание жирных кислот с этим белком приводит к открытию в нем канала, способного к осуществлению трансмембранного переноса Н+. Второй механизм, предложенный одним из авторов данной книги (В.П.С.), состоит в том, что термогенин является переносчиком анионной формы свободных жирных кислот. Облегчение трансмембранного перемещения анионов (RCOO–) может иметь принципиальное значение для разобщенного действия жирных кислот, поскольку их анионные формы задерживаются на поверхности раздела мембрана / вода, ориентируясь карбоксильной группой в сторону воды, а жирным «хвостом» — в сторону липида. Поэтому, несмотря на то что липидный бислой хорошо проницаем для нейтральных (протонированных) жирных кислот (RCOOH), мембраны очень плохо проводят их анионные формы. Из-за этого сами по себе жирные кислоты не являются протонофорами. Однако если UCP может переносить RCOO–, то это обстоятельство должно резко повысить эффективность жирных кислот как разобщителей. Перенос RCOO– UCP и ATP/ADP-антипортером мог бы осуществляться при помощи взаимодействия этого аниона с положительно заряженными Arg и Lys в нижней части воронки этих белков (см. выше рис. 9.10). Чтобы пересечь гидрофобный барьер мембраны, RCOO– достаточно было бы обратимо связаться с Arg234, 235 или 236, которые находятся в части белка, образующей дно воронки. Другая весьма важная характеристика разобщения жирными кислотами состоит в том, что здесь не требуется специального механизма для прекращения разобщающего эффекта. Разобщение исчезает само по себе, как только скорость поступления жирных кислот в митохондрии станет меньше скорости их окисления. Именно такие соотношения возникают при повышении окружающей температуры, когда отключаются холодовые рецепторы кожи, а с ними прекращается действие регуляторного каскада, обеспечивающего образование жирных кислот из триацилглицеридов. С прекращением подачи жирных кислот в митохондрию их запас быстро исчерпывается мощной системой β-окисления. В итоге уровень жирных кислот падает и разобщение, вызванное жирными кислотами, исчезает. Интересно, что не только охлаждение, но и, по крайней мере, еще три состояния организма, связанные с повышением поглощения кислорода и

Bioenergetica.indb 212

26.01.2011 18:03:24

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

213

выделения тепла, сопровождаются разобщением в бурой жировой ткани. Одно из таких состояний — появление на свет новорожденного. При родах молодой организм из комфортных изотермических условий внезапно попадает в гипотермическую окружающую среду. Эта проблема значительно осложняется небольшими размерами новорожденного (т.е. высоким соотношением поверхность / объем), что значительно увеличивает потери тепла. Показано, что бурый жир играет ключевую роль в термоадаптации детенышей млекопитающих при родах. Приведенные выше данные объясняют, почему эта ткань наиболее развита у новорожденных и ее удельное содержание в организме постепенно снижается с возрастом параллельно увеличению размера тела и понижению соотношения поверхность / объем. Еще одним примером функционирования бурого жира является пробуждение животного от зимней спячки. Показано, что бурый жир не атрофируется у зимоспящих животных, адаптированных к термонейтральным условиям. Холодовая акклиматизация повышает количество термогенина в митохондриях бурого жира зимоспящих животных, но не в такой степени, как, например, у крыс или кроликов. Пробуждение хомяков от спячки сопровождается разобщением, которое, по-видимому, особенно важно для разогрева крови, притекающей к мозгу. Из-за локализации бурого жира в области сосудов, идущих к голове, теплопродукция в этой ткани прежде всего вызывает повышение температуры мозга, который переходит в активное состояние сразу же вслед за разогревом бурого жира. Другая модель — термогенез, обусловленный избыточным потреблением пищи. Н. Ротуел и М. Сток поставили следующий опыт. Взрослым крысам скармливали «ресторанную диету», т.е. разнообразную и вкусную пищу. Потребление животными этой пищи оказалось на 80% больше, чем в контрольной группе, получавшей обычный корм. При этом масса животных за три недели увеличилась только на 27%. Измерение газообмена показало, что хорошо питавшиеся крысы потребляли на 25% больше кислорода, чем в контроле. Эта надбавка исчезала после введения животным пропанолола — антагониста норадреналина. Масса бурого жира за те же три недели опыта возросла более чем втрое; в митохондриях увеличилось количество UCP. Оказалось также, что мутация, вызывающая ожирение, сопровождается снижением уровня UCP у мышей. Роль UCP в термоадаптации была недавно прямо подтверждена с помощью молекулярно-генетических подходов. Б. Кэннон и Я. Недергардом была получена линия мышей с нокаутированным геном UCP. Оказалось, что эти мыши чувствительны к понижению температуры. Рисунок 10.2. Б. Кэннон (слева) и Я. Недергард (справа)

Bioenergetica.indb 213

26.01.2011 18:03:24

214

ЧАСТЬ III. Потребители

10.2.2. Скелетные мышцы Как описано выше, бурый жир является специализированной тканью млекопитающих, ответственной за термоадаптацию при понижении температуры. Однако удельный вес этой ткани относительно невелик (особенно у взрослых животных с большой массой тела), и ее активность не может объяснить большей части дополнительного термогенеза, наблюдаемого при охлаждении животных. Важно отметить, что такие теплокровные животные, как птицы, вообще не содержат бурого жира. Сказанное означает, что другие ткани теплокровных животных и прежде всего те ткани, которые богаты митохондриями и обладают значительным удельным весом в организме (например, скелетные мышцы), также должны принимать участие в теплопродукции при охлаждении. В то же время известно, что ген UCP экспрессируется исключительно в буром жире. Поэтому механизм теплопродукции в других тканях теплокровных животных может отличаться от механизма термогенеза в буром жире. Один из механизмов термогенеза скелетных мышц нам хорошо известен по собственному опыту — это мышечная дрожь при охлаждении организма. Она поддерживается, как любое сокращение мышцы, гидролизом цитоплазматического ATP. Регенерация последнего происходит за счет транспорта ATP из митохондрий ATP/ADP-антипортером. В митохондриях , генерируемую ATP образуется Н+-ATP-синтазой, которая потребляет дыхательной цепью (т.е. осуществляется термогенез по типу дыхание → → ATP → тепло). Однако также известно и то, что этот путь термоадаптации используется лишь при краткосрочном охлаждении. Вероятно, данный механизм — слишком длинный и медленный, чтобы резко увеличить продукцию теплоты в условиях внезапного понижения температуры среды. Кроме того он связан с сильной активацией мышечного сокращения, т.е. со специфической функцией данной ткани (потребление кислорода организмом при резком охлаждении приближается к таковому при тяжелой мышечной работе). Таким образом, главный принцип терморегуляции — сделать функции независимыми от температуры — в данном случае остается нереализованным применительно к самой массовой ткани организма, мышечной. Вот почему мышечная дрожь уменьшается по мере адаптации к холоду. Можно предположить, что при длительном охлаждении в мышцах активируется какой-то дополнительный механизм образования тепла. Интересно, что роль митохондрий в термогенезе была впервые доказана именно на скелетных мышцах животных. Работы по исследованию действия кратковременного охлаждения животного на митохондрии были начаты в 1960 г. одним из авторов книги (В.П.С.) совместно с С.П. Масловым в лаборатории С.Е. Северина. Опыты проводили на голубях, которых предварительно остригали, чтобы исключить физическую терморегуляцию. Клетку с животным помещали в холодильник на –20 °С и включали вентилятор. Голубь, впервые помещенный в эти жестокие условия, выдерживал 15–20 мин, после чего наступало резкое снижение температуры тела. Одна-

Bioenergetica.indb 214

26.01.2011 18:03:27

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

215

ко при повторном охлаждении, которому подвергали голубя на следующий день, животное лишь несколько снижало температуру своего тела, после чего она стабилизировалась, и голубь мог выдерживать охлаждение часами. Изучение митохондрий, выделенных из грудной мышцы голубя, охлаждавшегося впервые, показало снижение коэффициента Р/О в 1,6 раза по сравнению с неохлаждавшимися животными. Второе охлаждение вызывало снижение Р/О в шесть раз, т.е. наступало почти полное разобщение дыхания и фосфорилирования. Дальнейшее исследование этого эффекта показало, что степень разобщения достигает максимума уже через 15 мин после повторного помещения животного на холод. Разобщение мышечных митохондрий было продемонстрировано не только у птиц, но и у млекопитающих (мышей). Было показано также, что концентрация высокоэнергетических соединений возрастает при первом охлаждении и падает при втором. Этот факт по меньшей мере свидетельствовал о том, что мышцы некоторым образом вовлечены в исследуемый терморегуляторный ответ. Измерение дыхания in vivo выявило его стимуляцию как при первом, так и при повторном охлаждении животного. В первом случае стимуляция сменялась прогрессирующим торможением дыхания, в то время как во втором случае торможения не наступало. Именно таких соотношений можно было ожидать, если животное, охлаждаясь впервые, не успевало в должной степени разобщить дыхание и фосфорилирование и избыточное потребление кислорода приводило к избыточному синтезу ATP и торможению дыхательной цепи по механизму протонного контроля. При повторном действии холода происходило сильное разобщение, предотвращавшее накопление ATP и исчерпание ADP, так что состояние дыхательного контроля не наступало. Но если эта логика верна, то введение животному искусственного разобщителя-протонофора при первом охлаждении могло бы спасти организм от скоропостижной холодовой смерти. Опыты, поставленные С.П. Масловым, подтвердили это предсказание. Инъекция 2,4-динитрофенола, являющегося токсичным для животных, тем не менее значительно увеличивала продолжительность жизни мышей, впервые подвергнутых охлаждению, на холоде. В других опытах было показано, что дыхание интактной мышцы диафрагмы крысы активируется при повторном охлаждении животных. Одновременно снижается степень стимуляции дыхания ткани динитрофенолом. Эффект, подобный охлаждению, мог быть вызван инъекцией животному норадреналина. Как выявило дальнейшее исследование, концентрация жирных кислот значительно возрастает в мышцах животных, подвергнутых повторному воздействию холода. Было получено несколько независимых свидетельств роли свободных жирных кислот в качестве медиаторов терморегуляторного разобщения в мышцах. 1. Связывание жирных кислот при промывании митохондрий раствором предварительно обезжиренного сывороточного альбумина повышало Р/О в митохондриях из мышц охлажденных животных. 2. Фракция жирных кислот, выделенная из мышц охлажденных животных и добавленная к митохондриям контрольных животных, вызывала разобщение.

Bioenergetica.indb 215

26.01.2011 18:03:27

216

ЧАСТЬ III. Потребители

3. Пальмитиновая кислота в концентрации всего 1 × 10–5 М заметно стимулировала дыхание мышечных митохондрий в состоянии дыхательного контроля. Таким образом, в мышцах, как и в буром жире, жирные кислоты служат медиаторами терморегуляторного разобщения в митохондриях. Однако, как было сказано выше, мышечные митохондрии не содержат специального разобщающего белка UCP. Как же в этом случае реализуется разобщающее действие жирных кислот? В нашей группе Е.Н. Моховой было установлено, что разобщение мышечных митохондрий низкими концентрациями жирных кислот подавляется 5 × 10–7 М карбоксиатрактилатом, специфическим ингибитором ATP/ ADP-антипортера. ADP, добавленный как с олигомицином, так и без него, также уменьшал стимуляцию дыхания малыми дозами пальмитата. С другой стороны, жирные кислоты тормозили ATP/ADP-антипорт. На основе этих данных был сделан вывод, что разобщение мышечных митохондрий жирными кислотами в их физиологической концентрации опосредуется ATP/ ADP-антипортером. Следует еще раз отметить, что UCP во многом подобен по аминокислотной последовательности и доменному строению ATP/ADPантипортеру. Перенос Н+ UCP также активируется жирными кислотами и тормозится пуриновыми нуклеотидами (см. выше). Поэтому можно полагать, что как в мышцах, так и в буром жире жирные кислоты служат медиаторами терморегуляторного разобщения в митохондриях, однако в первом случае мишенью жирных кислот оказывается ATP/ADP-антипортер, а во втором — специальный белок, по-видимому представляющий собой особую модификацию антипортера*. То обстоятельство, что жирные кислоты не только повышают проводимость внутренней мембраны митохондрий для Н+, но и конкурируют с адениннуклеотидами за ATP/ADP-антипортер, должно страховать клетку от истощения фонда внемитохондриального ATP в условиях разобщения, когда Н+-ATP-синтаза начинает действовать в обратном (гидролитическом) направлении. Истощение ATP, помимо всего прочего, могло бы блокировать окисление жирных кислот, служащих не только регулятором сопряжения, но и основным субстратом дыхания на холоде. Как отмечалось выше, активация жирных кислот путем их соединения с CоА за счет энергии ATP происходит во внешней мембране митохондрий. Изучение разобщения митохондрий в тканях, отличных от бурого жира, в недавнее время получило довольно неожиданное продолжение. Выяснилось, что геном млекопитающих, наряду с геном термогенина (UCP), также содержит еще четыре дополнительных гена, близких его гомологов. Продукты этих генов получили названия разобщающих белков UCP2, UCP3, UCP4 и UCP5, а термогенин теперь в современной литературе именуется как UCP1. Более того, разобщающие белки были обнаружены у большин* В рамках этой гипотезы UCP представляет собой монофункциональный вариант ATP/ADP-антипортера, утратившего основную (нуклеотид-транспортную) функцию и специализирующегося на дополнительной функции — разобщении жирными кислотами посредством транспорта их анионов.

Bioenergetica.indb 216

26.01.2011 18:03:27

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

217

ства исследованных животных (как теплокровных, так и холоднокровных) и даже у многих растений. Существуют указания на то, что какие-то UCP, возможно, функционируют также у грибов и у простейших. Столь широкое распространение этих белков, по-видимому, предполагает какую-то фундаментальную роль UCP в метаболизме всех эукариот. Экспрессия генов новых разобщающих белков млекопитающих тканеспецифична. UCP2 экспрессируется во многих тканях, UCP3 — в буром жире и скелетных мышцах, тогда как UCP4 и UCP5 специфичны для мозга. Открытие целого семейства UCP у млекопитающих навело многих исследователей на мысль, что основной функцией этих белков является осуществление теплопродукции в иных, чем бурый жир, тканях. Это заключение подтверждалось наблюдением увеличения экспрессии генов UCP2 и UCP3 в ответ на охлаждение животного (удивительно, но подобная индукция холодом также характерна и для некоторых растительных UCP). Однако впоследствии было установлено, что индукция разобщающих белков наблюдается не только при охлаждении, но и во многих других условиях, в том числе и в тех, которым никак не может способствовать уменьшение эффективности запасания энергии (например, при голодании). Скорее всего, повышенная экспрессия генов разобщающих белков коррелирует не с температурными условиями, а с ускорением в организме метаболизма жиров. Более того, оказалось, что мутантные мыши с нокаутированными генами различных альтернативных разобщающих белков (UCP2–UCP5) не демонстрируют каких-либо отличий в адаптации к холоду по сравнению с контрольными мышами. Таким образом, на сегодняшний день считается, что если UCP2–UCP5 и участвуют в разобщении митохондрий при холодовом стрессе, то их роль в этом процессе относительно невелика. Ф. Гольей и одним из авторов этой книги (В.П.С.) было высказано предположение, что новые UCP служат переносчиками анионов перекисей жирных кислот и ответственны за откачку этих опасных соединений из внутреннего во внешний полумембранный слой внутренней мембраны митохондрий. Так можно было бы объяснить многочисленные указания на роль новых UCP в антиоксидантной защите митохондрий, а также тот факт, что их количество очень невелико по сравнению с таковым UCP1 (точно так же, как количество перекисей жирных кислот всегда гораздо меньше количества интактных жирных кислот).

10.3. Терморегуляторная активация свободного окисления у растений Согласно широко распространенной догме терморегуляция представляет собой функцию, присущую только высшим млекопитающим и птицам. Однако природа не столь догматична, как ее исследователи, и иногда преподносит им свои сюрпризы. Проблема лишь в том, что люди зачастую склонны игнорировать подобные подарки. В 1778 г. Ж.-Б. Ламарк обратил внимание на то, что температура в основании распустившегося цветка лилии рода Arum заметно выше, чем в

Bioenergetica.indb 217

26.01.2011 18:03:27

218

ЧАСТЬ III. Потребители

других частях того же растения. Позднее было установлено, что феномен существенного разогревания цветка (соцветия) встречается у многих видов, входящих в различные семейства примитивных цветковых растений, таких, как Araceae, Nelumbonaceae, Nymphaeaceae, Aristolochiaceae, Arecaceae, Cyclanthaceae, Annonaceae, Magnoliales и Cycadaceae. Гиперпродукция тепла длится в течение 12–48 ч, что необходимо для испарения имитирующих гнилостный запах пахучих веществ (обычно аминов или индолов), привлекающих насекомых-опылителей. Теплопродукция делает процесс цветения независимым от температуры окружающей среды. При этом разница температур между цветком и воздухом может достигать 35 °С, а величина удельной теплопродукции — 1000 Вт на 1 кг ткани (см. рис. 10.3). Все эти наблюдения побудили многих исследователей усиленно изучать термогенез растений. Еще в 1851 г. Гарэ показал хорошее соответствие между потреблением кислорода и продукцией теплоты в цветах ароидной лилии. Впоследствии выяснилось, что снижение окружающей температуры приводит к сильной активации дыхания (традиционно считали, что такой эффект — прерогатива теплокровных животных). Например, снижение температуры среды с +15 до +5 °С ускоряет в 3,5 раза скорость дыхания цветков восточной капусты. Цветение термогенных растений сопровождается исключительно мощным усилением дыхания (настолько мощным, что оно получило название «метаболического взрыва»). Максимальная скорость дыхания достигает 40 мл О2 × г–1 × ч–1, что является исключением в мире растений и близко к наивысшим скоростям дыхания животных тканей. Каким

Рисунок 10.3. Стадии цветения термогенного растения Symplocarpus renifolius (A–В). Г — фотография стадии В в инфракрасном диапазоне. Д, Е и Ж — увеличенное изображение фотографий Б, В и Г. Шкала температуры для фото Г и Ж показана справа внизу, масштаб 1 см [Onda et al., 2008, Plant Physiol., 146: 636–645]

Bioenergetica.indb 218

26.01.2011 18:03:28

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты

219

же образом в термогенных растениях происходит преобразование энергии окисления дыхательных субстратов в тепло? Как было изложено в разд. 5.1, дыхательная цепь растительных митохондрий, в отличие от митохондрий животных, содержит ферменты альтернативного пути окисления, не сопряженного с запасанием энергии. Это две несопряженные NADH:хинон оксидоредуктазы (NDin и NDex, окисляющие соответственно митохондриальный и цитоплазматический NADH) и несопряженная цианрезистентная хинолоксидаза (AOХ). Данное отличие позволяет растениям использовать путь прямого преобразования энергии окисления дыхательных субстратов в тепло, минуя промежуточные стадии образования протонного потенциала или ATP. Одним из авторов этой книги (А.В.Б.) было установлено, что митохондрии термогенных растений перед цветением имеют обычное дыхание, чувствительное к цианиду, миксотиазолу и ротенону, и эта дыхательная активность сопряжена с фосфорилированием (коэффициент Р/О для окисления малата составляет порядка 2,7). Однако в день цветения дыхание соцветия разобщается и утрачивает чувствительность к вышеперечисленным ингибиторам. Было также установлено, что митохондрии соцветий термогенных растений характеризуются исключительно высоким содержанием NDin, NDex и AOХ, активность которых не сопряжена с генерацией протонного потенциала. Вклад же сопряженных митохондриальных ферментов (комплексов I, III и IV) в общий процесс дыхания в этих соцветиях не превышает 5%. Таким образом, в этих митохондриях за счет активности NDin и NDex шунтирован первый пункт сопряжения, а за счет активности AOХ шунтируются также второй и третий пункты сопряжения (рис. 10.4). Так реализуется механизм прямого превращения энергии дыхания в тепло.

Рисунок 10.4. Схема дыхательной цепи митохондрий термогенных растений. Превалирующие при термогенезе пути переноса электронов выделены жирными стрелками

Это означает, что механизмы теплопродукции у растений и теплокровных животных принципиально различны. В чем же состоит причина этих различий? По-видимому, еще на начальных этапах эволюции животных ферменты альтернативного несопряженного пути дыхания были утеряны, поэтому при последующем возникновении теплокровности они были вынуждены использовать такие более сложные пути термогенеза, как рассеивание энергии, уже запасенной в виде протонного потенциала или ATP.

Bioenergetica.indb 219

26.01.2011 18:03:29

Часть четвертая

ВЗАИМОСВЯЗЬ И РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНЕРАТОРОВ И ПОТРЕБИТЕЛЕЙ ПРОТОННОГО ПОТЕНЦИАЛА ГЛАВА ОДИННАДЦАТАЯ

РЕГУЛЯЦИЯ, ТРАНСПОРТ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ПРОТОННОГО ПОТЕНЦИАЛА

11.1. Регуляция

Ф

ерменты, образующие и потребляющие , могут контролироваться, подобно другим энзиматическим системам, всем набором регулирующих воздействий, которым располагают клетка и организм. Ряд примеров такого рода регуляции был описан в предыдущих главах этой книги. В данной главе будут обсуждаться особые механизмы, специально изобретенные живой природой, чтобы регулировать . Некоторые аспекты этой проблемы уже рассмотрены в предыдущей главе применительно к функции свободного окисления в терморегуляции. В следующем разделе будет показано, что процессы свободного окисления, часто в комбинации с сопряженным окислением, имеют гораздо более широкое значение, чем образование теплоты.

11.1.1. Альтернативные функции дыхания Когда в 1932 г. К. Окунуки описал цианид- и СО-устойчивое дыхание пыльцы одного из лилейных, это произошло почти одновременно с открытием В.А. Энгельгардтом (1930) фосфорилирующего дыхания в эритроцитах птиц. Поэтому неудивительно, что Окунуки не уточнил, сопряжен ли с фосфорилированием открытый им новый путь окисления. Огромный успех направления исследований, начало которым положил В.А. Энгельгардт, привело, как это часто бывает, к появлению догмы, переоценивавшей роль фосфорилирующего окисления. Биологически полезным стали считать только то дыхание, которое сопряжено с образованием ATP.

Bioenergetica.indb 220

26.01.2011 18:03:29

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

221

Если кто-либо обнаруживал дыхание, не связанное с фосфорилированием, это наблюдение списывали на счет артефакта in vitro или патологии in vivo. В 1958 г. этой догме была противопоставлена противоположная точка зрения, согласно которой клеточное дыхание in vivo в норме происходит не только сопряженно с запасанием энергии, но и без такого сопряжения (этот второй тип дыхания был назван свободным). Было высказано предположение, что свободное дыхание участвует в терморегуляторном образовании теплоты, в образовании или разрушении метаболитов, детоксикации ксенобиотиков и даже (косвенно) в запасании энергии. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы исследовали образование теплоты в организме теплокровных, подвергнутых воздействию холода. Как уже отмечалось выше, оказалось, что свободное окисление действительно активируется в скелетных мышцах. Впоследствии подобный эффект был описан другими исследователями в буром жире и цветах некоторых растений. Что касается неэнергетических функций свободного окисления, то наиболее наглядным примером могут служить системы, обеспечивающие разрушение конечных продуктов метаболизма и токсичных веществксенобиотиков. В 1962 г. один из авторов данной книги (В.П.С.) и его сотрудники обнаружили, что коэффициент Р/О при окислении лактата кислородом в мышцах оказывается значительно ниже, чем при использовании других субстратов дыхания, окисляющихся через NAD+. Позднее было показано, что окисление лактата в митохондриях дрожжей идет в обход начальных и средних участков фосфорилирующей дыхательной цепи. В обходном пути свободного окисления участвует цитохром b2, заключенный в межмембранном пространстве, а также цитохромоксидаза. NAD+ не нужен для окисления лактата дрожжевыми митохондриями. По данным А. Ф. Броди и сотрудников, клетки Mycobacterium phlei окисляют лактат быстрее, чем другие субстраты, но без фосфорилирования. Впечатляющий прогресс был достигнут при изучении систем свободного окисления, ответственных за детоксикацию ксенобиотиков. В мембране эндоплазматического ретикулума клеток печени были обнаружены особые дыхательные цепи, включающие цитохром Р-450 в качестве конечной оксидазы и NADPH-цитохром Р-450-редуктазу или NADH-цитохром b5-редуктазу и цитохром b5. Эти цепи участвуют в окислении множества ксенобиотиков. Образующие их ферменты находятся в клетке в большом количестве. Например, концентрация цитохрома Р-450 в определенных условиях может превышать таковую любого другого цитохрома в печени. Свободное дыхание, катализируемое цитохромом Р-450, участвует не только в деструктивных, но и в некоторых конструктивных процессах, которые обычно локализованы в эндоплазматическом ретикулуме. Однако, пожалуй, наиболее демонстративный пример — это митохондрии коры надпочечника. Показано, что начальный и конечный этапы образования стероидных гормонов (кортизона и альдостерона) осуществляются двумя видами цитохрома Р-450, находящимися во внутренней мембране этих митохондрий. Там же существует особая редокс-цепь, восстанавливающая цитох-

Bioenergetica.indb 221

26.01.2011 18:03:29

222

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

ром Р-450. Она окисляет внутримитохондриальный NADPН посредством NADPН-адренодоксин-редуктазы — флавопротеина, содержащего FAD. Последний восстанавливает адренодоксин — негемовый железопротеин, служащий донором электронов для митохондриального цитохрома Р-450. , которая Все эти окислительные реакции не сопряжены с генерацией образуется обычной фосфорилирующей дыхательной цепью, локализованной в той же самой мембране. Интересный пример мощной активации свободного дыхания описан в лейкоцитах, атакующих бактериальную клетку. В этом случае особые внутриклеточные пузырьки сливаются с внешней клеточной мембраной лейкоцита. Такой эффект имеет следствием вспышку свободного дыхания, в котором участвует цепь окисления NADPH, включающая флавопротеины и самоокисляющийся цитохром типа b. Цитохром b катализирует одноэлектронное восстановление О2 до супероксидного радикала O , который реагирует с Сl– под действием миелопероксидазы с образованием радикальной формы хлора. Последняя, будучи чрезвычайно токсичной, убивает бактерии. Существенно, что NADPH окисляется флавином на внутренней поверхности плазматической мембраны лейкоцита, а кислород восстанавливается цитохромом b на внешней ее поверхности. Поэтому ядовитый продукт образуется снаружи лейкоцита, что уменьшает вероятность его повреждения. Нетрудно объяснить, почему перечисленные выше процессы поглощения кислорода не сопряжены с генерацией . Энергетическое сопряжение неизбежно усложнило бы выполнение деструктивных или конструктивных функций всеми этими ферментными системами, которые имеют жизненно важное значение для организма. Итак, мы рассмотрели четыре главные функции окислительных процессов: 1) запасание энергии в утилизируемой форме ( ), 2) рассеивание энергии в виде теплоты, 3) образование полезных соединений и 4) расщепление вредных веществ. Можно было бы думать, что первая из перечисленных функций непосредственно обеспечивается сопряженным, а три другие — свободным дыханием. Однако такой взгляд слишком упрощает реальную ситуацию. Сопряженное дыхание участвует в некоторых случаях в осуществлении функций 2–4. Так, мышечная дрожь при первом охлаждении животного в качестве механизма срочной теплопродукции требует образования , а затем и ATP, используемого актомиозином в качестве субстрата. Ясно также, что большинство конструктивных процессов нуждается в энергии ATP, образуемого сопряженным дыханием. Что касается деструктивных реакций, то они, как правило, обходятся без ATP, хотя и здесь есть ряд важных исключений. Достаточно вспомнить цикл синтеза мочевины из аммиака, использующий энергию ATP. На первый взгляд, свободное дыхание по определению не может участвовать в запасании энергии. Парадоксально, что существуют случаи, когда это не так. Известно, что начальный участок сопряженной дыхательной цепи — самый медленный и наиболее уязвимый. Широкий круг гидрофобных ксенобио-

Bioenergetica.indb 222

26.01.2011 18:03:29

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

223

тиков блокирует дыхание именно в этом пункте цепи. Шунтировав заторможенное место цепи свободным окислением, можно вновь активировать дыхательный синтез ATP, хотя, конечно, со сниженным КПД. Такой эффект особенно актуален для митохондрий в печени — органе, специализирующемся на аккумуляции гидрофобных ксенобиотиков с целью их последующего разрушения при помощи микросомального цитохрома Р-450. Шунтирование заторможенной NADН-СoQ-редуктазы может достигаться десорбцией цитохрома с в межмембранное пространство или добавлением витамина K3 (менадиона) либо викасола, которые активируют дикумарол-чувствительную ДТ-диафоразу. Не ясно, однако, стимулируется ли эта система, описанная in vitro, гидрофобными ксенобиотиками при интоксикации in vivo. В то же время показано, что искусственное введение менадиона оказывает выраженный благоприятный терапевтический эффект при наследственном нарушении среднего участка дыхательной цепи (подробнее см. разд. 4.2.4).

11.1.2. Регуляция потоков восстановительных эквивалентов между цитозолем и митохондриями Если два пути окисления — свободный и энергетически сопряженный — сосуществуют в одной и той же клетке, возникает проблема, как предотвратить утилизацию всех восстановительных эквивалентов по тому из них, который термодинамически более выгоден. Без сомнения, пространственное разграничение (компартментализация) метаболических процессов играет ведущую роль в решении этой проблемы. Например, дегидрогеназы основных субстратов локализованы в матриксе, так что восстановительные эквиваленты, питающие дыхательную цепь, образуются непосредственно внутри митохондрий и потому сами по себе недоступны для внешних систем свободного окисления. Кроме того во внутренней митохондриальной мембране содержится несколько -зависимых переносчиков, ответственных за аккумуляцию в матриксе тех субстратов, чьи дегидрогеназы имеются не только в митохондриях, но и в цитозоле. Если же дегидрогеназа данного субстрата локализована исключительно в цитозоле, то используются особые челночные механизмы, переносящие восстановительные эквиваленты из цитозоля в матрикс. На рис. 11.1 показан малат-аспартат-глутаматный челнок. Действие этой системы приводит к окислению внемитохондриального NADH посредством NAD+ матрикса. В процессе участвуют два фермента, локализованные по обе стороны внутренней мембраны митохондрий, а именно малатдегидрогеназа и аспартат:глутамат-аминотрансфераза. Кроме того необходимы два переносчика: антипортер дикарбоновых кислот и глутамат / аспартат-антипортер. Последний использует энергию , так как он катализирует обмен аспартат– / (глyтaмaт–+H+). В результате перенос гидрид-иона от NADНнар к NAD+внут оказывается сопряженным с перемещением одного иона Н+ из цитозоля в матрикс под действием .

Bioenergetica.indb 223

26.01.2011 18:03:30

224

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

Рисунок 11.1. Челночная система для окисления цитозольного NAD+ митохондриальной дыхательной цепью: NADНнар восстанавливает оксалоацетат (ОА) посредством обращения реакции, катализируемой цитозольной малатдегидрогеназой (1). Образованный таким путем малат (Mal) переносится в матрикс в обмен на α-кетоглутарат (α-KG) при участии антипортера дикарбоксилатов (2). В матриксе малат восстанавливает NAD+ митохондриальной малатдегидрогеназой (3). Полученный оксалоацетат переаминируется с глутаматом, давая аспартат и α-кетоглутарат (4). Внутренний аспартат обменивается на внешние глутамат и Н+ при помощи аспартат– / (глyтaмaт–+H+)-антипортера с использованием энергии (5). Внешний аспартат переаминируется с внешним α-кетоглутаратом, регенерируя внешний оксалоацетат (6). , потребляемая в реакции (5), возобновляется дыхательной цепью (7), которая окисляет гидрид-ион, отщепленный от NADНвнут

Другой челночный механизм использует две глицерофосфатдегидрогеназы: цитозольную, зависящую от NAD+, и митохондриальную, восстанавливающую СoQ без участия NAD+. Челночные системы тканеспецифичны. Например, малатный челнок очень активен в печени, но отсутствует в сердце, где митохондрии лишены дикарбоксилатного антипортера. Глицерофосфатный челнок резко активизируется тироидными гормонами. Другим примером пространственного разделения окислительного обмена могут быть пероксисомы. Эти органеллы окружены мембраной, напоминающей по проницаемости внешнюю митохондриальную мембрану. Она непроницаема для белков, но легко пропускает низкомолекулярные вещества. Поглощение кислорода пероксисомами обусловлено действием уратоксидазы, оксидазы D-аминокислот и оксидазы α-кетокислот. Оксидазы пероксисом не конкурируют с ферментами сопряженного дыхания митохондрий, поскольку субстраты этих оксидаз окисляются без участия NAD(P)+ и дыхательной цепи. Токсический продукт реакции — перекись водорода — немедленно разлагается внутри пероксисом каталазой, самым массовым белком этих органелл.

Bioenergetica.indb 224

26.01.2011 18:03:30

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

225

11.1.3. Взаимопревращение ΔΨ и ΔpH Без сомнения, взаимопревращения ΔΨ и ΔpH могут иметь регуляторное значение. Такого типа эффект должен влиять на соотношение ΔΨ- и ΔpHзависимых транспортных систем, количество энергии, запасенной мембраной, и значение рН по крайней мере с одной стороны мембраны. Чтобы превратить ΔΨ в ΔpH, достаточно электрофоретически перенести через мембрану любой ион, кроме Н+. В митохондриях есть только один крупномасштабный процесс такого рода — ATP4–внут/АDP3–нар-антипорт, питающий Н+-ATP-синтазу одним из ее субстратов. Однако в условиях, когда митохондрии синтезируют ATP, этот антипорт всегда сопровождается ΔpH-зависимым стехиометрическим симпортом Н2РО4– и Н+, который поставляет в митохондрию фосфат — второй субстрат реакции образования ATP. В результате, как правило, митохондрия поддерживает в основном в форме ΔΨ. Тем не менее иногда ΔΨ снижается, а ΔpH возрастает. Такой эффект наблюдал, в частности, Р. Кауппинен, измерявший ΔΨ и ΔpH в митохондриях перфузированного сердца in situ. Л.Б. Чен и сотрудники окрашивали метилродамином митохондрии клеток в культуре ткани. Катион метилродамина электрофоретически накапливается в митохондриях и потому прокрашивает только те из них, которые имеют ΔΨ, но не ΔpH. Был описан случай, когда из двух соседних клеток, не отличающихся по морфологии, только в одной митохондрии накапливали метилродамин. Добавление нигерицина, превращающего ΔpH в ΔΨ путем обмена Н+ на K+, вызывало окрашивание митохондрий также и во второй клетке. Существует ряд данных, что митохондрии располагают собственным K+/Н+-антипортером, который обычно находится в латентной форме. Одним из факторов, вызывающих переход ΔΨ в ΔpH, может быть унипорт Са2+ в митохондрии. Однако этот процесс, как правило, имеет ограниченное значение из-за очень низкого (10–7–10–6 M) уровня Са2+ в цитозоле. Что касается K+, концентрация которого в цитозоле составляет около 0,1 M, его массовый унипорт в митохондрии должен быть запрещен, так как распределение K+ по ΔΨ привело бы к накоплению KОН в матриксе. Импорт K+ служит, по-видимому, главным механизмом превращения ΔΨ в ΔpH у бактерий, существующих при гораздо более низкой концентрации K+ снаружи, чем у митохондрий. В хлоропластах находится в основном в форме ΔpH из-за высокой проницаемости мембраны тилакоидов для С1–, K+ и Mg2+.

11.1.4. Отношение системы контроля к основным регуляторным механизмам эукариот В организмах эукариот надклеточные регуляторы, например гормоны, передают свои команды при помощи внутриклеточных медиаторов, называемых вторичными посредниками. Среди них наиболее часто используются Са2+, циклические нуклеотиды, и продукты расщепления фосфатидилино-

Bioenergetica.indb 225 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:03:30

226

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

зитдифосфата: трифосфоинозит и диацилглицерин. В последнее время биохимики все большее внимание уделяют такому регулятору с множественным действием, как ион Н+. Иногда в качестве вторичных посредников действуют метаболиты, регулирующие пути своего собственного превращения в клетке. Подобная ситуация была описана при рассмотрении терморегуляторного разобщения (см. разд. 10.2.1). Жирные кислоты выступают не только как субстраты окисления, но и как разобщители этого окисления и ингибиторы ATP/ ADP-антипортера. Описан еще один регуляторный эффект жирных кислот. Оказалось, что они вызывают десорбцию гексокиназы, связанной с внешней мембраной митохондрий. Это может облегчить жирным кислотам конкуренцию с глюкозой за ATP в реакциях образования ацил-CоА и глюкозо6-фосфата. Оба эти процесса могут происходить на поверхности внешней митохондриальной мембраны. Жирные кислоты, сорбируясь на мембране, повышают отрицательный заряд, что приводит к разрушению комплекса гексокиназы с ее рецептором. Роль последнего выполняет порин. Что касается «классических» вторичных посредников, то применительно к митохондриям особенно тщательно изучены ионы Са2+. Накапливаясь в митохондриях, они превращают ΔΨ в ΔpH. Кроме того они активируют фосфолипазу А2. Последняя образует жирные кислоты, вызывающие все те эффекты, о которых шла речь выше. Другой продукт действия фосфолипазы — лизофосфолипиды — также влияет на некоторые параметры митохондрий. cAMP может, по-видимому, воздействовать на функции митохондрий не только через жирные кислоты, но и более прямо. На внешней стороне внутренней мембраны митохондрий дрожжей находится белок массой 45 кДа с очень высоким сродством к cAMP (Kd = 10–9 М). Можно предположить, что этот белок служит специфическим рецептором, ответственным за описанное ранее действие cAMP, добавленного к клеткам дрожжей, — стимуляцию синтеза митохондриями субъединиц I–III цитохромоксидазы и ускорение дыхания. Нет сомнений, что ион Н+ также может быть использован в качестве вторичного посредника. Совершенно очевидно, что рН-регуляция очень важна при работе Н+-ATPазы внешней мембраны клеток растений и грибов. Как было показано в разд. 7.2.3.1, этот фермент начинает активно откачивать ионы Н+ из цитоплазмы во внешнюю среду, если возрастает внутриклеточная концентрация Н+. Действие растительных гормонов ауксинов, по всей вероятности, связано с закислением цитоплазмы, вызывающим активацию Н+-ATPазы и, как следствие, повышение ΔΨ на внешней мембране клетки.

11.1.5. Контроль

у бактерий

Как уже отмечалось, многие бактерии располагают параллельными электрон-транспортными путями, одни из которых сопряжены с накоплением энергии, а другие нет. Кроме того, свободное и сопряженное окисления могут быть последовательно включены в одну и ту же дыхательную цепь.

Bioenergetica.indb 226

26.01.2011 18:03:31

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

227

Интересный пример механизма, поддерживающего высокую по принципу саморегуляции, был выявлен в опытах с подвижными бактериявосприними. Выяснилось, что искусственно вызванные изменения маются бактерией как сигнал, регулирующий ее движение. Так, добавка разобщителя или исчерпание кислорода служат репеллентным сигналом, вызывающим изменение направления движения бактерии. Соответственно добавление О2 оказывается аттрактантным стимулом, благоприятным для линейного движения. Отмечено, что влияние кислорода на поведение бактерий (аэротаксис) проявляется лишь в тех случаях, когда концентрация О2 в среде влияет на . Простейшее объяснение этих данных в том, что бактерия располагает устройством, которое измеряет и посылает соответствующий сигнал флагеллярному мотору, регулируя таким способом направление вращения жгутика: направление изменяется на противоположное, если снижается, и сохраняется неизменным, если она растет. В результате клетка движется туда, где она может поддерживать более высокую . Гипотетический механизм подобного типа, названный одним из авторов этой книги (В.П.С.) протометром, позволяет интегрировать множество благоприятных и неблагоприятных воздействий, отражающихся на энергетическом состоянии мембран. Недавно функционирование протометра было прямо продемонстрировано в системе таксиса Н. salinarium (см. выше, разд. 6.5.3). Описан механизм, согласующий работу двух фотосистем в хлоропластах и тем самым оптимизирующий продукцию и NADPH. Если фотосистема II работает слишком быстро, это приводит к восстановлению редокспереносчика (предположительно PQ), расположенного между двумя фотосистемами. Такой эффект некоторым способом активирует протеинкиназу, фосфорилирующую белок, который несет на себе хлорофилл антенны. Названный белок в его нефосфорилированном состоянии локализуется в основном в тилакоидах, упакованных в граны. Фосфорилирование увеличивает отрицательный заряд белков антенны, которые диффундируют из тилакоидов в мембраны стромы, где в основном локализована фотосистема I. В итоге фотосистема I получает больше хлорофилла антенны, а следовательно, и больше фотонов, чем фотосистема II. Активация фотосистемы I вызывает окисление PQH2, а значит, и торможение протеинкиназы. Непрерывно действующая протеинфосфатаза дефосфорилирует белок антенны и прекращает его дальнейшую утечку из тилакоидов в ламеллы стромы.

11.2. Транспорт энергии вдоль мембран в форме 11.2.1. Общие положения Обычно мембраны рассматривают как структуры, отделяющие цитоплазму от окружающей среды или один отсек клетки от другого. Без сомнения, такое свойство присуще любой биологической мембране. Однако ясно также, что разделительная функция всегда имеет следствием и определен-

Bioenergetica.indb 227

26.01.2011 18:03:31

228

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

ные интегративные эффекты. Например, цитоплазматическая мембрана не только отграничивает цитоплазму от внеклеточной среды, но и объединяет разнообразные внутриклеточные компоненты в единую систему. Как должно быть ясно из всего предыдущего изложения, , подобно ATP, служит конвертируемой энергетической «валютой» многих бактерий, растений, грибов, митохондрий и хлоропластов. В главах 12–14 будет показано, что роль мембранной формы энергии в цитоплазматической мембране ряда бактерий и во внешней мембране животной клетки играет . Обязательное свойство любой «валюты» — ее транспортабельность. Как , так и отвечают этому требованию. В частности, представляется вполне очевидным, что и ΔΨ-, и ΔpH-составляющие протонного потенциала, возникнув на той или иной точке мембранной структуры, немедленно распространяются по мембране во все стороны. Так как среды по обе стороны мембраны представляют собой водные растворы электролитов, электропроводность их очень высока. В то же время электропроводность самой мембраны очень низка. Это означает, что ΔΨ, образованная данным -генератором, не может избежать быстрой иррадиации по всей поверхности мембраны. То же относится и к ΔpH в связи с высокой скоростью диффузии Н+ в воде и большой концентрацией подвижных рН-буферов, еще более увеличивающих эту скорость. Эти факты означают, что , образованная -генератором в определенной области мембраны, может передаваться вдоль мембраны и превращаться в работу в другой области той же мембраны. Основываясь на приведенных выше соображениях, один из авторов этой книги (В.П.С.) выдвинул в 1969 г. концепцию, согласно которой сопрягающие мембраны могут играть роль электрического кабеля, действующего в пределах клетки или даже на надклеточном уровне. Ниже будут рассмотрены эта и ряд других интегрирующих функций биологических мембран.

11.2.2. Перенос , образуемой светозависимыми -генераторами, вдоль мембран галобактерий и хлоропластов Как было показано в разд. 6.1, перенос вдоль мембраны должен быть обязательным этапом утилизации световой энергии бактериями Н. salinarium. У этих микроорганизмов более 50% площади цитоплазматической мембраны может быть занято пурпурными бляшками диаметром до 0,5 мкм. , образуемая бактериородопсином, должна использоваться потребителями протон-движущей силы в областях той же мембраны, иных, чем пурпурные бляшки, поскольку других белков, кроме бактериородопсина, в бляшках нет. По меньшей мере два процесса транспорта энергии вдоль мембран существуют в хлоропластах и цианобактериях. Хорошо известно, что фотоны в основном поглощаются хлорофиллом антенны. Затем энергия электронного возбуждения мигрирует в плоскости мембраны между мо-

Bioenergetica.indb 228

26.01.2011 18:03:31

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

229

лекулами хлорофилла антенны, пока не достигнет хлорофилла реакционного центра. Перенос энергии вдоль мембраны хлоропласта, но уже в форме , должен иметь место, когда , поставляемая фотосистемой II (которая локализована в тилакоидах), используется для синтеза ATP Н+-ATP-синтазой, сосредоточенной в ламеллах стромы хлоропласта.

11.2.3. Трансклеточный перенос энергии в трихомах цианобактерий В галобактериях и хлоропластах передача энергии осуществляется на расстояния не более 1 мкм. В то же время транспорт ΔΨ может быть эффективным на расстояние порядка 1 мм, как это показал сделанный нами расчет потерь, сопровождающих такую передачу энергии (потери рассчитывали по уравнению электрического кабеля). Первый пример передачи на столь большое расстояние был описан И.И. Севериной в группе одного из авторов при изучении трихомов нитчатых цианобактерий Phormidium uncinatum. Трихом цианобактерий представляет длинную цепочку соединенных друг с другом клеток. Число клеток может достигать тысячи, а длина трихома — нескольких миллиметров. Существуют данные, что клетки, объединенные в трихом, могут быть связаны друг с другом микроплазмадесмами — короткими и очень тонкими трубочками, пересекающими межклеточное пространство. Если микроплазмадесмы имеют высокую электропроводность, то ΔΨ, образованная, например, вблизи одного конца трихома, может передаваться вдоль трихома вплоть до его противоположного конца и там совершать полезную работу. И.И. Севериной было установлено, что освещение около 5% трихома сфокусированным пучком света вызывает генерацию ΔΨ, распространяющуюся по всей длине трихома. Амплитуда и кинетика распространения ΔΨ соответствовали таковым, рассчитанным на основании предположения о кабельных свойствах трихома. Вывод о кабельных свойствах трихомов цианобактерий можно экстраполировать на ткани растений, в которых клетки соединены между собой плазмадесмами, хорошо проницаемыми для ионов, в том числе для Н+. Возможное значение трансклеточной передачи для растительных организмов — интересный предмет будущих исследований.

11.2.4. Структура и свойства нитчатых митохондрий и митохондриального ретикулума Догма о мелких митохондриях. В переводе с греческого митохондрия означает нить-зерно. Это название было предложено цитологами, использовавшими световой микроскоп. Первые исследователи митохондрий всегда подчеркивали, что данные органеллы существуют в двух основных формах: нитчатой и сферической (или эллипсоидной). С введением электронной микроскопии и техники тонких срезов подобное мнение изменилось: нитчатые митохондрии стали рассматривать

Bioenergetica.indb 229

26.01.2011 18:03:32

230

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

как весьма редкое исключение, в то время как сферическая форма была признана канонической. Подобное изменение взгляда на митохондрии оказалось следствием того обстоятельства, что микроскопист, рассматривающий одиночную электронную микрофотографию, по существу имеет дело с двумерным изображением клетки. На одиночном срезе и клубок ниток можно ошибочно принять за россыпь мелких зерен. Истинная картина возникает только при реконструкции структуры по многим серийным срезам, прошедшим строго параллельно друг другу. Догма о размере и форме митохондрий приобрела особую популярность среди молодого поколения биохимиков, никогда не видевших толком митохондрии в световой микроскоп. Чтобы наблюдать митохондрии этим старым способом, нужна известная сноровка, поскольку митохондрии находятся на грани разрешающей способности световой микроскопии. Проще было поверить на слово электронным микроскопистам, развившим новый физический метод с несравнимо большим разрешением. , ограниченная отдельной мелкой митохондриЯсно, что передача ей сферической формы, не может служить механизмом транспорта энергии в масштабах клетки. Но если все же старые морфологии были правы, помещая «митос» на первое место в названии этих органелл, и митохондрии обычно (или хотя бы иногда) имеют вид длинных нитей, то их функция в качестве внутриклеточного протонного кабеля представляется вполне реальной. Гигантские митохондрии и Reticulum mitochondriale. Три методических подхода поколебали догму о мелких митохондриях: 1) реконструкция трехмерной структуры клетки по сериям тонких срезов; 2) высоковольтная электронная микроскопия, позволившая увеличить толщину исследуемого препарата, и 3) окрашивание митохондрий флуоресцирующими проникающими катионами, что сделало возможным возврат к прижизненному изучению клетки под световым микроскопом. Метод серийных срезов был применен прежде всего в работах на одноклеточных эукариотах. Уже самые первые исследования этих объектов вы-

Рисунок 11.2. Единая митохондриальная сеть в клетке жгутикового Polytomella agilis: А — срез через клетку (микрофотография может быть ошибочно интерпретирована как свидетельство того, что в клетке находится много мелких митохондрий); Б и В — вид спереди и сбоку модели единой митохондриальной системы P. agilis, реконструированной по серийным срезам

Bioenergetica.indb 230

26.01.2011 18:03:32

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

231

явили очень крупный размер и сложное строение митохондрии. Например, М. Бертон и Дж. Мур, работая с Polytomella agilis, обнаружили в клетке этого простейшего из группы жгутиковых всего одну (!) митохондрию, выглядевшую как перфорированная сфера, располагающаяся сразу под внешней клеточной мембраной. Цитоплазма и ядро лежали внутри этой сферы, «как в авоське» (рис. 11.2). Одиночная гигантская митохондрия была описана в клетках некоторых дрожжей, а также хлореллы и других одноклеточных водорослей. Несколько очень крупных сетчатых митохондрий, иногда объединяющихся в одну, было обнаружено у хламидомонад, эвглены, трипаносом и некоторых грибов. Нитевидные митохондрии длиной около 10 мкм найдены в экзокринных клетках поджелудочной железы. Сперматозоиды содержат цепь длинных митохондрий, состыкованных конец в конец. В печени выявлены два типа митохондрий: мелкие сферические и крупные разветвленные. Подобная картина наблюдается в клетках асцитного рака и у водоросли Polytoma papillatum. В последнем случае было проанализировано 228 параллельных срезов через клетку водоросли. Оказалось, что клетка содержит 246 отдельных мелких сферических митохондрий, две крупные и разветвленные и еще одну очень большую, образующую полый перфорированный шар. Одним из наиболее интересных объектов для изучения возможных механизмов передачи энергии являются клетки мышечной ткани. Многоядерные клетки мышц (мышечные волокна) достигают огромных размеров. Их энергетические потребности чрезвычайно высоки. В тяжело работающей мышце должны возникать градиенты кислорода и субстратов между периферией и сердцевиной клетки, что ограничивает объем выполняемой рабоот краев мышечной клетки к ее центру могла бы решить ты. Передача проблему. Но для этого мышечные митохондрии должны быть очень велики по размеру. В летательных мышцах насекомых обнаружены митохондрии, имеющие вид пластин, которые тянутся от края к центру клетки. Их длина около 10 мкм, т.е. того же порядка, что и радиус мышечного волокна. Первые указания на то, что в мышцах высших животных митохондрии могут достигать значительных размеров, были получены в 1960-е гг. Г.Д. Бубенцером и Ж.Ф. Готье при исследовании одиночных срезов. В нашей группе Л.Е. Бакеева и Ю.С. Ченцов предприняли систематическое исследование серийных срезов мышцы диафрагмы крысы и установили, что митохондрии в этой ткани имеют вид сети, пронизывающей мышечное волокно в изотропной области вблизи Z-дисков. Сети связаны между собой колоннами, расположенными параллельно миофибриллам. Кроме того имеются ветви, связывающие сети с митохондриальными кластерами по краям мышечного волокна (рис. 11.3). Вся эта система, названная одним из авторов этой книги (В.П.С.) митохондриальным ретикулумом (Reticulum mitochondriale), характерна для диафрагмы взрослых животных. Ее нет в диафрагме крысиных эмбрионов и новорожденных крысят. Иногда составляющие ретикулум митохондриальные филаменты образуют, соприкасаясь, особые контактные зоны. Эта структура, открытая Л.Е. Бакеевой и сотрудниками при исследовании мышцы диафрагмы, за-

Bioenergetica.indb 231

26.01.2011 18:03:32

232

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

тем была детально изучена в той же группе на примере сердечной мышцы, где митохондриальные контакты особенно многочисленны. Оказалось, что митохондрии в этой ткани также образуют трехмерную систему, но вместо сети из тонких ветвящихся трубчатых митохондриальных тяжей, описанных в мышце диафрагмы и скелетных мышцах, в сердце содержится множество толстых эллиптической формы митохондрий с малым количеством отростков; все они связаны друг с другом контактами (рис. 11.4). Зона контакта представляет собой диск диаметром от 0,1 до 1 мкм. В этой зоне как мембраны, так и межмембранное пространство характеризуются повышенной электронной плотностью. Две внешние мембраны контактирующих митохондрий максимально сближены друг с другом подобно тому, как это происходит в плотных контактах внешних клеточных мембран (рис. 11.4). Каждая митохондрия связана с соседними несколькими такими контактами. В сердце трехдневного крысенка контакты отсутствуют. Еще более сложная контактная структура обнаружена в зоне нексуса (межклеточного щелевого контакта). Иногда можно видеть, что митохондрии, локализованные в двух соседних кардиомиоцитах, плотно прилегают к внешней клеточной мембране в области щелевого контакта. В результате образуется шестимембранный контакт, составленный из двух клеточных и четырех митохондриальных мембран. Нитчатые митохондрии. Если изучаемый объект имеет не столь высокую электронную плотность, как мышечное волокно, истинные форма и размер митохондрий без труда могут быть выявлены посредством высоковольтной электронной микроскопии. Такого рода исследования обнаружили длинные нитевидные митохондрии в клетках самых различных типов. Однако указанный метод имеет два существенных ограничения. Вопервых, он не позволяет наблюдать митохондриальные контакты. Поэтому не удается ответить на вопрос, что является объектом наблюдения — одна

Bioenergetica.indb 232

26.01.2011 18:03:32

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

233

Рисунок 11.3. Митохондриальный ретикулум в мышцах диафрагмы двухмесячной крысы. А — продольный срез, Б — поперечный срез через изотропную область. В–Д — реконструкция митохондрий мышц диафрагмы (В — вид сбоку, Г — вид сверху, Д — вид сбоку) [Bakeeva et al., 1981, Eur. J. Cell Biol., 25: 175–181]

Bioenergetica.indb 233

26.01.2011 18:03:32

234

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

Рисунок 11.4. Продольный срез кардиомиоцита. Стрелками показаны митохондриальные контакты [Bakeeva et al., 1981, Eur. J. Cell Biol., 25: 175–181]

Рисунок 11.5. Фибробласт человека: окраска этилродамином [Драчев, Зоров 1986, ДАН СССР, 287: 1237–1238]

протяженная митохондрия или множество органелл, связанных друг с другом контактами. Во-вторых, подобно любой другой методике, использующей электронный микроскоп, при высоковольтной микроскопии исследователь имеет дело с фиксированным материалом, что не позволяет прямо следить за функционированием митохондрий. Чтобы преодолеть последнее затруднение, мы решили вернуться к световому микроскопу. Работая этим методом в проходящем свете, в принципе, можно увидеть митохондрии в живой клетке, но тонкие митохондриальные филаменты и сети часто ускользают от наблюдения из-за низкого разрешения этого метода. Такого рода ограничение снимается, если работать не с поглощением, а с эмиссией света. Когда эмиссия достаточно интенсивна, источник света можно увидеть в темноте, даже если его не удается наблюдать как тело, задерживающее свет (поэтому звезды на небе видны только ночью). Исследования, проведенные Л.Б. Ченом и сотрудниками в США и Д.Б. Зоровым в лаборатории В.П. Скулачева, показали, что производные флуоресцирующего проникающего катиона родамина специфически накапливаются в митохондриях. Было также установлено, что митохондрии в живой клетке достаточно часто представляют собой филаменты длиной в десятки микрометров (рис. 11.5). Иногда митохондриальные филаменты имеют такую большую протяженность, что могут связывать периферию и центр клетки или даже пересекать клетку от края до края вдоль длинной ее оси. В ряде типов клеток был выявлен митохондриальный ретикулум. Типичный

Bioenergetica.indb 234

26.01.2011 18:03:36

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

235

вариант состоит в том, что в клетке сосуществуют две популяции митохондрий — длинные нитчатые и мелкие овальные. Применение прижизненной флуориметрии митохондрий подтвердило отрывочные наблюдения, которые были сделаны ранее традиционными методами, свидетельствовавшими, что обратимый переход нить-зерно есть универсальное свойство этих органелл. Демонстративный пример такого рода был описан Л. Фойсснером, который показал превращение митохондрий нителлы в филаменты длиной до 30 мкм при торможении фотосинтеза диуроном или снижением интенсивности света, а также при блокировании дыхательной цепи в среднем или конечном сегментах. В то же время тормодинитрофенолом жение NADH-CoQ-редуктазы ротеноном или снятие не влияли на размер митохондрий. Удлинение митохондрий предотвращалось при торможении синтеза белка. Примечательно, что только некоторые митохондрии (не более 20% от их общего числа) превращались в нити, как если бы они несли какую-то дополнительную функцию, отличную от той, которая может быть выполнена мелкими митохондриями. Случай другого рода был описан К. Танакой и сотрудниками, заметившими, что при вхождении клеток дрожжей Candida albicans в стадию почкования отдельные митохондрии объединяются в одну гигантскую, которая фрагментируется при митозе. Затем (перед цитокинезом) вновь образуется гигантская митохондрия, впоследствии разделяющаяся на две части. Образование митохондриальных филаментов в клетках дрожжей Endomyces magnusii, выращиваемых в гипоксических условиях, было отмечено М.Н. Мейселем и сотрудниками еще в 1964 г. Мнтохондрия как внутриклеточный протонный кабель. Результаты, изложенные в предыдущем разделе, свидетельствуют о том, что многие клетки эукариот располагают очень длинными митохондриями, иногда объединенными в сеть. Протяженные митохондрии часто сосуществуют с популяцией мелких митохондрий, традиционно считающихся типичным примером митохондриальных структур. Если нитчатая митохондрия представляет собой континуум как внешней, так и внутренней мембраны, то должна распространяться по всей ее длине. Если же эта нить составлена из многих мелких митохондрий или митопластов, состыкованных конец в конец, то возможны два варианта: 1) митохондриальный филамент подобен трихому цианобактерий, у которых все его составляющие (клетки) соединены друг с другом микроплазмадесмами, имеющими высокую электропроводность (см. разд. 11.2.3); 2) между двумя соседними митохондриями нет электрического контакта. В предыдущем разделе уже был описан межмитохондриальный контакт — особая структура, локализованная на стыках двух митохондрий. Проблема в том, чтобы установить, проводящий ли это контакт, подобно микроплазмадесмам цианобактерий либо щелевым контактам внешних мембран животных клеток, или же, напротив, его сопротивление так же высоко, как и в других участках внутренней мембраны митохондрий. С точки зрения предполагаемых кабельных свойств длинных митохондрий первый случай идентичен митохондриальному континууму. Во втором случае при-

Bioenergetica.indb 235

26.01.2011 18:03:37

236

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

ходится предполагать, что обмен энергией между соседними митохондриями обеспечивается не диффузией протонов, а диффузией ATP, перемещающегося через область контактов. Очевидное предсказание гипотезы, рассматривающей нитевидную митохондрию в качестве кабеля, состоит в том, что локальное повреждение такой митохондрии в любой точке должно вызывать деполяризацию мембраны по всей ее длине. Это предсказание получило свое прямое подтверждение: в группе автора (В.П.С.) В.А. Драчевым был сконструирован специальный прибор, состоящий из лазера и флуоресцентного микроскопа. Используя это устройство, Д.Б. Зоров облучил одиночный митохондриальный филамент в клетке культуры фибробластов человека, прокрашенной этилродамином. Облучение производили сфокусированным пучком лазера, так что диаметр светового пятна был соизмерим с поперечником филамента. Облучение привело к исчезновению свечения родамина по всей длине (40 мкм) филамента; существенно, что при этом другие митохондриальные филаменты в той же клетке сохраняли свою флуоресценцию. Следовательно, наблюдаемый эффект нельзя объяснить неспецифическим повреждением всей клетки лазером. Фазовоконтрастная и электронная микроскопия не выявила заметных повреждений в структуре облученной лазером и прекратившей светиться митохондрии. Аналогичное исследование было проведено на кардиомиоцитах. Облучение одиночной митохондрии вызывало тушение кластера, состоящего из многих митохондрий. Электронное микроскопирование обнаружило, что погасшие митохондрии связаны с облученной межмитохондриальными контактами. Что касается митохондрий, сохранивших флуоресценцию, то здесь контактов с облученной органеллой найти не удалось. Простейшее объяснение всех этих данных состоит в следующем. В кардиомиоците содержится несколько независимых митохондриальных кластеров, образованных многими митохондриями (грозди митохондрий, или Streptio mitochondriale). Митохондрии, формирующие гроздь, соединены друг с другом митохондриальными контактами. Эти контакты характеризуются высокой электропроводностью. Гигантские митохондрии как пути транспорта веществ. Не только Н+ (рис. 11.7), но и другие ионы, метаболиты и т.п. могли бы транспортироваться по нитчатым митохондриям. Например, любое вещество, концентрирующееся в матриксе, будет переноситься по митохондриальному филаменту, как по трубопроводу. В частности, ионы Са2+, попавшие из межклеточного пространства в приграничный слой цитозоля, должны сначала аккумулироваться посредством ΔΨ-зависимого Са2+-унипортера в окончаниях митохондриальных филаментов, а затем диффундировать по матриксу к противоположным концам этих филаментов, расположенным в центральных участках клетки. Если предположить, что в этих последних активирован Са2+/Н+-антипортер, то нитевидные митохондрии одним своим концом могли бы поглощать ионы Са2+ на периферии клетки, а другим — выделять их в глубинных ее частях. Подобную логику можно применить к любому компоненту, способному обратимо аккумулироваться в митохондриальном матриксе.

Bioenergetica.indb 236

26.01.2011 18:03:37

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

237

Рисунок 11.6. В.А. Драчев (слева) и Д.Б. Зоров (справа)

Другой вариант использования протяженных митохондрий состоит в переносе жирорастворимых веществ. На первый взгляд, транспорт веществ по мембранам должен происходить медленнее, чем по водной фазе клетки. Бытует мнение, что вязкость мембраны гораздо выше, чем вязкость цитоплазмы, а следовательно, для любого вещества, растворимого и в воде, и в липиде, водный путь предпочтительнее. Однако цитозоль и митохондриальный матрикс — это не водные растворы низкомолекулярных веществ, а, скорее, коллоидные растворы, к тому же пересеченные нерастворимыми структурами — мембранами и компонентами цитоскелета. Как показал опыт, когда измеряли движение низкомолекулярного спин-меченого соединения с коэффициентом распределения в системе липид / вода, близким к 1, в клетках самых различных типов это соединение предпочтительно движется не по воде, а по липиду. Такое предпочтение должно быть еще более выражено, если коэффициент распределения вещества в пользу липида, как это имеет место, например, для жирных кислот и их эфиров с карнитином или CоА. В частности, мембранный путь был постулирован для ацил-CоА (М. Сампером и Дж. Тройбле). Ацилкарнитин, по-видимому, приспособлен для выполнения этой функции даже лучше, чем ацил-CоА, так как по массе он значительно меньше. Интересная проблема — транспорт молекулярного кислорода по мембранам. Можно указать по крайней мере четыре обстоятельства, благоприятствующие транспорту О2 по внутренней мембране митохондрий. 1. Растворимость О2 в липиде примерно в пять раз выше, чем в воде. 2. Цитохромоксидаза — главный фермент, поглощающий кислород, — локализована во внутренней мембране. Она имеет очень высокое сродство к кислороду (Km цитохромоксидазы гораздо ниже концентрации О2 в воде, уравновешенной с воздушной фазой), что может способствовать образова-

Bioenergetica.indb 237

26.01.2011 18:03:37

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

межмитохондриальный контакт

238

Рисунок 11.7. Схема транспорта энергии в форме скелетных мышц

по митохондриальной сети

нию локальных областей низкой концентрации О2 во внутренней митохондриальной мембране. 3. Скорость диффузии О2 в углеводородах в 10–100 раз выше, чем это следует из данных по макровязкости; ее величина оказывается того же порядка, что и величина скорости диффузии О2 в воде. Она резко замедляется холестерином, которого, как известно, нет во внутренней мембране митохондрий. 4. В таких тканях, как мышечная, внутренняя митохондриальная мембрана составляет большую часть мембранного материала клетки. Однако даже в сердечной мышце, где митохондрий особенно много, митохондриальные мембраны занимают малую часть общего объема клетки. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы решить, какой путь транспорта кислорода является главным: по мембранам или через цитозоль. Интересная проблема — перенос электронов вдоль мембран. Этот процесс локализован, по-видимому, в эндоплазматическом ретикулуме и внешней митохондриальной мембране, где он обеспечивается NADH-цитохром b5редуктазой (флавопротеином Фп5) и цитохромом b5. Названная система найдена в печени, почках, мозге и некоторых других тканях. Как Фп5, так и цитохром b5 состоят из двух неравных частей: большей гидрофильной, содержащей флавин или гем, и меньшей гидрофобной, требующейся для заякоривания белка в мембране. Подобно челноку, Фп5 и цитохром b5 могут перемещаться по поверхности мембраны, встречая сравнительно небольшое сопротивление. Поскольку редокс-потенциал Фп5 близок к редокс-потенциалу восстановителя (NADH), этот флавопротеин, двигаясь вдоль мембран, может вы-

Bioenergetica.indb 238

26.01.2011 18:03:39

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

239

равнивать градиенты редокс-потенциалов в области –0,3 В в различных частях клетки. Цитохром b5 способен выполнять ту же функцию, но на уровне редокс-потенциалов, близких к нулю. Еще одна функция цитохрома b5 была обнаружена автором этой книги (В.П.С.) совместно с А.И. Арчаковым. Установлено, что пузырьки эндоплазматического ретикулума или митохондрии печени способны восстанавливать цитохром b5 протеолипосом, не содержащими других белков, кроме этого цитохрома. В качестве восстановителя использовали NADH. Поскольку эффект не снижался многократными промываниями эндоплазматического ретикулума, был сделан вывод, что Фп5, или цитохром b5, или они оба могут катализировать межмембранный перенос электронов без помощи каких-либо водорастворимых посредников. Дальнейшие опыты показали, что данное свойство присуще только цитохрому b5. Пузырьки эндоплазматического ретикулума обрабатывали проназой при 4°С, что приводило к разрушению цитохрома b5. При этом активность Фп5 сохранялась на вполне измеримом уровне. Такие пузырьки полностью утрачивали способность к межмембранному переносу электронов. Интересное наблюдение было сделано С. Грингат и М. Роузмэном, исследовавшими количество цитохрома b5 в протеолипосомах, диаметр которых варьировал в 1,5 раза (от 21 до 35 нм). Выяснилось, что содержание цитохрома b5 на мг липида было по крайней мере в 20 раз больше в пузырьках меньшего диаметра. Это означает, что цитохром b5 может накапливаться в изогнутых участках мембраны, например в концах митохондриальных филаментов. На рис. 11.8 представлен возможный механизм переноса электронов через щель между двумя соседними митохондриальными филаментами. Предполагается, что молекулы цитохрома b5 диффундируют в плоскости мембраны вдоль филаментов посредством броуновского движения, сканируя мембрану в поисках окислителя. В области, где два соседних мембранных тяжа находятся на расстоянии не более удвоенного диаметра гидрофильной головки цитохрома b5, цитохром более восстановленного филамента передает электрон цитохрому более окисленного филамента. Эта реакция облегчается вследствие концентрирования цитохромов b5 в изогнутых окончаниях филаментов, что может быть частным случаем сформулированного авторами более общего принципа о «таксисе» мембранных ферментов к их субстратам.

11.3.

-Буферы

11.3.1. Градиенты Na+ и K+ как

-буфер у бактерий

Если протонный потенциал действительно играет роль конвертируемой «валюты», то количество энергетических эквивалентов, накопленных в виде , должно быть достаточно велико, чтобы гасить, забуферивать колебания скоростей -образующих и -потребляющих процессов.

Bioenergetica.indb 239

26.01.2011 18:03:40

240

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

Зная электрическую емкость и площадь мембраны, например бактериальной клетки, можно рассчитать, сколько ионов водорода будет откачано порядка 250 мВ (верхний из цитоплазмы бактерии при образовании предел , поддерживаемой в энергизованных условиях). Если принять емкость за 1 мкф х см–2, то получается количество Н+, равное всего 1 мкмоль х г белка–1, что соизмеримо с содержанием мембранных ферментов. Чтобы запасти энергию в «субстратных» количествах, необходимо разрядить мембрану потоком любых ионов, за исключением Н+. При этом снижение ΔΨ будет сопровождаться переносом новых порций ионов Н+ до тех пор, пока ΔрН не возрастет до величины, эквивалентной 250 мВ. рН-Буферная емкость цитоплазмы примерно на два порядка превышает электрическую емкость цитоплазматической мембраны, так что порция энергии, накопленной в ΔpH, оказывается гораздо большей, чем в ΔΨ. Дальнейшее увеличение количества «мембранной» энергии может быть достигнуто, если образованная таким способом ΔpH затем используется, например, катион/Н+-антипортером, заменяющим ΔpH на Δp(катион). Включение такого антипортера, обменивающего внутренний Na+ на внешний Н+, по существу равносильно увеличению концентрации рН-буфера, как это впервые было отмечено П. Митчелом еще в 1968 г. При этом Митчел игнорировал роль другого массового одновалентного катиона, а именно K+. По его мнению, накопление K+ под действием ΔΨ есть нежелательный, хотя и неизбежный побочный эффект. В 1978 г. один из авторов этой книги (В.П.С.) предположил, что вход K+ используется бактериальной клеткой с целью превращения ΔΨ в ΔpH и ΔpK. Образуемая ΔpK забуферивает ΔΨ. Что касается ΔpH, то она утилизируется Na+/Н+-антипортером для образования ΔpNa. В результате ΔpNa оказывается буфером ΔpH. Согласно этой концепции бактерия аккумулирует K+ и выбрасывает Na+ в условиях избытка энергетических ресурсов. Энергетический дефицит меняет направление ионных потоков: снижается ΔΨ, и K+ начинает выходить из клетки, двигаясь по градиенту своей концентрации; следовательно, снижение ΔpH приводит к входу Na+ (рис. 11.9).

Рисунок 11.8. Перенос электронов с конца одного мембранного тяжа на начало другого тяжа посредством цитохрома b5; стрелками показан электронный транспорт

Bioenergetica.indb 240

26.01.2011 18:03:40

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

241

Гипотеза -буфера позволила объяснить ряд наблюдений, относящихся к энергетике бактерий. В частности, было известно, что K+ может электрофоретически накапливаться в бактериальных клетках. Что же касается Nа+/Н+-антипорта, то он был описан в 1974 г. И. Уэстом и П. Митчелом у Е. coli. Впоследствии его наличие было продемонстрировано у многих видов бактерий. Взаимодействие ΔΨ-зависимого импорта K+ и ΔpH-зависимого экспорта Na+, в принципе, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к -буферу. Na+ — наиболее массовый катион. Его концентрация в морской воде около 0,5 М. Поэтому клетка, откачивая Na+ из цитоплазмы, может легко создать большой градиент ионов Na+. Kонцентрация [K+]нар обычно гораздо ниже, чем [Na+]нар, так что большая -Зависимое образовеличина ΔpK может быть получена за Рисунок 11.9. + + счет аккумуляции K+ внутри клетки. вание градиентов Nа и K на цитоплаз-+ матической мембране бактерий. Ион Н + В то же время [K ]нар не столь мала, откачивается из клетки -генераторами чтобы затруднить поиск этого катиона (1). Образованная при этом ΔΨ вызывает во внешней среде. Ведь K+ — второй электрофоретический вход ионов K+ (2), по массовости катион морской воды. который разряжает ΔΨ, превращая ее в + + + Замена внутриклеточного Na+ на K+ ΔpH. Na /Н -антипортер откачивает Na из клетки за счет ΔpH (3). Снижение ΔΨ вряд ли должна сильно сказаться на и ΔpH обращает ионные потоки, которые метаболизме и структуре клетки, по- некоторое время поддерживают ΔΨ и ΔpH скольку свойства этих ионов во многом в отсутствие внешних энергетических подобны, тем более что ни K+, ни Na+ ресурсов прямо не участвуют в биохимических реакциях. Опыты по проверке гипотезы о -буфере, проведенные в нашей группе И.И. Броуном, показали, что бактерии действительно образуют Na+/ K+-гpaдueнты при избытке энергии и используют их для совершения полезной работы при нехватке энергетических ресурсов. Наиболее существенны следующие наблюдения. 1. Предобразованные градиенты ионов Na+ и K+ после исчерпания энергетических ресурсов клетки могут поддерживать такую -зависимую функцию, как движение галофильной археи Halobacterium salinarium, морской бактерии Vibrio harveyi, а также Е. coli. У пресноводной Phormidium uncinatum был эффективен градиент K+, но не Na+. 2. Градиенты Na+ и K+ стабилизируют уровень ΔΨ и ATP в условиях энергетического дефицита.

Bioenergetica.indb 241

26.01.2011 18:03:41

242

ЧАСТЬ IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного...

3. Емкость Na+/K+-бyфepa прямо пропорциональна концентрации соли в среде обитания бактерий, снижаясь в ряду Н. salinarium > V. harveyi > Е. coli > Ph. uncinatum. Градиенты Na+ и K+ у Н. salinarium, предынкубированной на свету, все еще поддерживают движение прокариот спустя более чем 8 ч после прекращения освещения и исчерпания О2. Это означает, что галофильная архея в течение дня способна вложить в Na+/K+-градиент столь значительную порцию энергии, что ее хватает практически на всю ночь. Взаимодействие K+-унипорта и Na+/H+-aнтипopтa — простейший, но не единственно возможный механизм стабилизации градиентами одновалентных катионов. У некоторых бактерий, по крайней мере в щелочной среде, имеет место электрогенный (Na+/nH+)-антипорт. Кроме того, накопление K+ может катализироваться K+,Н+-симпортером. В подобных случаях ΔpNa стабилизирует не только ΔpH, но и (в меньшей степени) ΔΨ. Соответственно ΔpK стабилизирует и ΔΨ, и ΔpH, причем эффект более выражен в отношении ΔΨ. Вероятно, стабилизация необходима прежде всего в мембранах, располагающих сразу многими путями образования и использования . Такова, например, цитоплазматическая мембрана дышащих или фотосинтезирующих бактерий, где имеются дыхательные (фотосинтетические) -генераторы, Н+-ATP-синтаза, -зависимые переносчики и Н+-моторы. В то же время у анаэробных неподвижных бактерий, живущих гликолизом, проблемы стабилизации может и не быть. В их цитоплазматической мембране содержится только один тип -генераторов (Н+-ATPаза, использующая гликолитический ATP) и один тип потребителей (H+,метаболит-симпортеры). В этой группе микроорганизмов можно найти представителей, у которых содержание Na+ внутри клетки оказывается выше, чем снаружи. Та же логика справедлива применительно к внутриклеточным пузырькам и органеллам, специализированным на -зависимом синтезе ATP (хроматофоры бактерий-фотосинтетиков, митохондрии и хлоропласты). Они используют упрощенные варианты механизма стабилиза. ции

11.3.2. Другие системы стабилизации Обычно биологическая мембрана делит некий объем на две неравные части. Поэтому активный транспорт ионов H+ через мембрану изменяет рН главным образом (или даже исключительно) в меньшем отсеке. Если в этом отсеке нет ферментов, то механизм стабилизации может быть упрощен таким образом, что его натриевый компонент попросту отсутствует. Наиболее демонстративный пример — тилакоиды хлоропластов. Здесь ионы H+, транспортируемые через мембрану, высвобождаются во внутритилакоидное пространство, представляющее собой очень узкую щель, размеры поперечника которой имеют тот же порядок, что и толщина мембраны. В этой щели практически нет ферментов, поэтому нет риска, что закисление внутритилакоидного пространства инактивирует какойлибо ферментативный процесс. Как было показано выше (см. разд. 2.3.4),

Bioenergetica.indb 242

26.01.2011 18:03:46

Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала

243

стабилизация происходит за счет перехода ΔΨ → ΔpH, сопровождающего перенос K+, Mg2+ и С1– через мембрану тилакоидов. Поскольку внутритилакоидное пространство очень мало по сравнению с объемом стромы хлоропласта, ΔpH образуется почти исключительно за счет закисления среды внутри тилакоида, рН которой может быть на три единицы ниже, чем в строме. Некоторая стабилизация необходима хлоропласту из-за колебаний интенсивности света, всегда происходящих в естественных условиях. Вероятно, по этой причине хлоропласт превращает ΔΨ в ΔpH. Та же проблема существует и в бактериальных хроматофорах; у Rhodospirillum rubrum она может быть решена посредством Н+-пирофосфат-синтазы. Этот весьма активный фермент использует , чтобы образовать пирофосфат из фосфата. Путей утилизации пирофосфата, соизмеримых по скорости с Н+пирофосфат-синтазой, для этой бактерии описано не было. Один из авторов этой книги (В.П.С.) предположил, что главный путь превращения пипри обращении рофосфата у Rh. rubrum — его гидролиз с образованием Н+-пирофосфат-синтазной реакции. Синтез ATP есть основная функция хроматофоров. Существенно, что пирофосфат стабилизирует на уровне, достаточном для синтеза ATP (см. разд. 7.3). Вероятно, внешняя мембрана клеток высших растений стабилизирует тем же путем, что и тилакоиды. Протоны, откачиваемые из клетки Н+-ATP-синтазой, оказываются в узком межклеточном пространстве, где рН может быть на две единицы ниже, чем в цитоплазме. У пресноводных цианобактерий ΔpNa «правильного» направления не -буфера может быть образована из-за низкой [Na+]нар. Здесь емкость невелика, поскольку используется только одна его составляющая — ΔpK. Для митохондрий проблема -буфера стоит не так остро, как для бактерий и хлоропластов, поскольку уровень дыхательных субстратов колеблется, как правило, в меньшей степени, чем уровень света. Поэтому в митохондриях представлена главным образом в неудивительно, что виде ΔΨ. Среди возможных претендентов на роль -буфера здесь можно назвать унипорт K+, а в тканях с сильно меняющейся активностью, типа мышечной, — объединение митохондрий в митохондриальный ретикулум.

Bioenergetica.indb 243

26.01.2011 18:03:47

Часть пятая

НАТРИЕВЫЙ МИР П

рогресс биоэнергетических исследований в конце ХХ в. стимулировал интерес к ионам натрия. Оказалась поколебленной догма о Н+ как о единственном сопрягающем ионе. Выяснили, что роль Na+ не ограничивается его функцией в системе -буферов и у некоторых живых организмов Na+ прямо вовлечен в превращения энергии, заменяя собой протоны в этих реакциях. Значительное таксономическое разнообразие видов, использующих Na+, а не Н+ в качестве первичного сопрягающего иона, указывает на всеобщее распространение вновь открытого типа мембранной энергетики. Возникает впечатление, что наряду с миром живых существ, чья энергетика базируется на циркуляции протонов, существует достаточно обширная область, которую можно было бы назвать «натриевым миром».

ГЛАВА ДВЕНАДЦАТАЯ

ГЕНЕРАТОРЫ 12.1. Декарбоксилазы, транспортирующие Na+

В

1980 г. П. Димрот сообщил об открытии первичного -генератора, откачивающего Na+ из цитоплазмы бактериальной клетки без участия или АТР. Было показано, что энтеробактерия Klebsiella aerogenes, растущая в анаэробных условиях, декарбоксилирует оксалоацетат в пируват и CO2 только в присутствии ионов натрия, и декарбоксилирование сопряжено с переносом Na+ из клетки во внешнюю среду против концентрационного градиента: НООС–СН2–СО–СООН + пNa+внут → → СН3–СО–СООН + СO2 + nNa+нар ,

(12.1)

где п, вероятнее всего, равно двум. Указанный процесс показан как в интактных клетках, так и в вывернутых субклеточных пузырьках, а также в протеолипосомах. Реакция, катализируемая биотиновым ферментом, локализованным в цитоплазматической мембране, протекает в два этапа: 1) перенос карбоксила с оксалоацетата на биотиновую простетическую группу и 2) высвобождение CO2 из карбоксилированного биотина с регенерацией исходной формы фермента. Для второго этапа требуется Na+. При транспорте Na+ внутренний объем вывер-

Bioenergetica.indb 244

26.01.2011 18:03:47

Глава 12. Генераторы

245

Рисунок 12.1. Схема сбраживания цитрата у K. aerogenes и K. pneumonia. Объяснения в тексте

нутых субклеточных пузырьков заряжается положительно, что свидетельствует об электрогенном характере этого процесса. ΔΨ и ΔpNa были равны 65 и 50 мВ, т.е. общая составляла 115 мВ. Оксалоацетатдекарбоксилаза K. aerogenes состоит из α-, β- и γ-субъединиц с молекулярными массами соответственно 65, 34 и 12 кДа. α-Субъединица — периферический белок, в то время как β- и γ-субъединицы — интегральные мембранные белки, переходящие в раствор только в присутствии детергента. Биотин ковалентно связан с консервативным остатком лизина α-субъединицы. Функционирование у Nа+-транспортирующей декарбоксилазы K. aerogenes позволяет этой бактерии сбраживать такой необычный для анаэробного роста субстрат, как цитрат (рис. 12.1). Вначале цитрат захватывается клеткой с помощью Nа+-зависимого переносчика этого аниона (CitS). Далее цитрат разлагается цитрат-лиазой (CL) на оксалоацетат и ацетат. Оксалоацетат декарбоксилируется с образованием пирувата соответствующей декарбоксилазой, откачивающей Na+ из клетки, т.е. энергия этой реакции запасается в виде . Пируват под действием пируват-формиат-лиазы (PFL) превращается в ацетил-СoA с высвобождением формиата. Энергия разрыва тиоэфирной связи ацетил-СoA может быть запасена в виде ATP, этот процесс осуществляют ферменты фосфотрансацетилаза (PTA) и ацетат-киназа (AK). Токсичный для клетки формиат разлагается на CO2 и H2 под действием формиатдегидрогеназы (FHL), электроны с H2 переносятся на NAD(P)+ гидрогеназой. Таким образом, в ходе данного брожения с помощью субстратного фосфорилирования образуется 1 моль ATP на моль потребленного субстрата, а также некоторое количество энергии дополнительно запасается в виде . ΔрNa-Составляющая натриевого потенциала может быть использована для транспорта цитрата и других метаболитов,

Bioenergetica.indb 245

26.01.2011 18:03:47

246

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

а ΔΨ, по-видимому, утилизируется H+-ATP-синтазой для синтеза добавочного количества ATP. Дальнейшие исследования показали, что K. aerogenes — не единственный микроорганизм, располагающий Nа+-транспортирующей декарбоксилазой. На сегодняшний день у разных бактерий описано четыре класса данных ферментов, использующих для декарбоксилирования различные субстраты. 1) Nа+-транспортирующая оксалоацетатдекарбоксилаза обнаружена у таких энтеробактерий, как K. aerogenes, K. pneumoniae и Salmonella typhimurium. 2) У микроорганизмов Acidaminococcus fermentans, Peptococcus aerogenes, Clostridium symbiosum и Fusobacterium nucleatum присутствует Nа+-транспортирующая глутаконил-СoA декарбоксилаза, которая декарбоксилирует глутаконил-СoA (интермедиат сбраживания глутамата до ацетата и бутирата) в кротонил-СoA сопряженно с транспортом Na+. 3) У строго анаэробной бактерии Veillonella alcalescens, превращающей лактат в ацетат и пропионат, и у Propionigenium modestum, утилизирующей сукцинат с образованием пропионата, декарбоксилирование метилмалонилСoA в пропионил-СoA также поддерживает транспорт Na+. Перед декарбоксилированием сукцинат превращается в метилмалонил-СоA, декарбоксилирование которого, собственно, и сопряжено с переносом Na+. 4) У бактерии Malonomonas rubra описана Nа+-транспортирующая декарбоксилаза малоната, образующая из этого соединения ацетат и СО2. При чтении бактериальных геномов было обнаружено, что гены, гомологичные известным генам Nа+-транспортирующих декарбоксилаз, присутствуют у большого количества бактерий и архей. Субстратную специфичность этих предполагаемых Nа+-транспортирующих ферментов предстоит выяснить в будущих исследованиях.

12.2. Na+-транспортирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза В 1977 г. Т. Унемото с соавторами показали, что NADH-оксидазная реакция, катализируемая суббактериальными частицами из Vibrio alginolyticus и V. costicola, специфически стимулируется ионами натрия. Другие катионы были неэффективны. В тех же условиях NADН-оксидазная реакция дыхательной цепи Е. coli не требовала Na+ для достижения максимальной активности. Дальнейшие исследования той же группы ученых выявили, что Nа+-зависимая стадия дыхательной цепи вибрионов локализована между NADН-дегидрогеназой и убихиноном, в то время как цитохромный сегмент цепи активен и без Na+. Более того, оказалось, что Na+-зависимость окисления NADH у V. alginolyticus связана не с какой-либо аллостерической регуляцией NADH:хинон-оксидоредуктазы, а с тем, что активность этого фермента сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов натрия. В 1982 г. X. Токуда и Т. Унемото продемонстрировали сопряженный с дыханием экспорт Na+ из клеток V. alginolyticus. Затем авторам удалось выделить Na+-транс-

Bioenergetica.indb 246

26.01.2011 18:03:48

247

Глава 12. Генераторы

портирующую NADН:хинон-оксидоредуктазу (Na+–NQR) и встроить ее в липосомы. Окисление NADH протеолипосомами сопровождалось накоплением в них ионов Na+. Исключение Na+ из состава среды инкубации в 15 раз тормозило скорость окисления NADH. Был сделан вывод, что NADH:хиноноксидоредуктаза V. alginolyticus является первичной натриевой помпой.

12.2.1. Первичная структура субъединиц Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазы В 1994 г. В группах Т. Унемото и П. Рича была определена последовательность оперона, кодирующего Na+–NQR. Этот оперон содержит шесть генов (nqrA–F), соответствующих шести субъединицам, формирующим Na+–NQR комплекс. Три субъединицы (NqrB, NqrD и NqrE) очень гидрофобны, в то время как остальные три — относительно гидрофильны (см. табл. 12.1). Субъединица NqrF оказалась гомологичной многим белкам, осуществляющим окислительно-восстановительные реакции. C-концевой домен этой субъединицы сходен с некоторыми ферредоксин:NADP+оксидоредуктазами. В его первичной структуре содержатся участки, ответственные за связывание NADH и FAD. N-концевой домен NqrF гомологичен ферредоксинам, содержащим [2Fe–2S] кластер. Его послеТаблица 12.1. Физико-химические свойства субъединиц Na+–NQR на примере фермента из V. harveyi и их возможная роль при осуществлении ферментативной активности Субъединица Молекулярная Na+–NQR масса, кДа

Предполагаемое количество трансмембранных α-спиралей

Связывание кофакторов и возможная роль в ферментативной активности

NqrA

48,4

0

NqrB

45,4

8

Ковалентно связанный остаток FMN, возможно, формирует хинон-редуктазный центр фермента

NqrC

27,5

1–2

Ковалентно связанный остаток FMN

NqrD

22,7

6

Возможно, участвует в трансмембранной транслокации ионов натрия

NqrE

21,5

6

Возможно, участвует в трансмембранной транслокации ионов натрия

NqrF

45,2

1

Место связывания NADH, содержит нековалентно связанный FAD и [2Fe–2S] кластер. Ответственна за осуществление NADH-дегидрогеназной активности

Bioenergetica.indb 247

?

26.01.2011 18:03:48

248

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

довательность включает четыре консервативных остатка цистеина, принимающих участие в формировании этого железо-серного кластера. Таким образом, NqrF представляет собой полипептид, объединяющий в своем составе NADH:ферредоксин-оксидоредуктазу и ферредоксин. Остальные пять субъединиц Na+–NQR (NqrA–E) не обладают сколь-нибудь существенной гомологией по отношению к другим белкам с известными функциями. Важно отметить, что Na+–NQR полностью отлична как от ферментов класса протон-транслоцирующих NADH:хинон-оксидоредуктаз (NDH-1 или Комплекс I), так и от ферментов класса несопряженных NADH:хиноноксидоредуктаз (NDH-2). Таким образом, белки типа Na+–NQR составляют третий класс NADH:хинон-оксидоредуктаз дыхательных цепей, который возник в ходе эволюции независимо от двух других классов этих ферментов. Интересно отметить, что гены, гомологичные nqrA–F из V. alginolyticus, впоследствии были обнаружены в геномах многих бактерий. Таким образом, Na+–NQR широко распространен среди прокариот, в частности, этот белок содержится и у различных патогенных микроорганизмов, таких, как V. cholerae, K. pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas gingivalis и т.д.

12.2.2. Простетические группы Na+–NQR В 1986 г. Токуда и Унемото выделили Na+–NQR из V. alginolyticus и показали, что она содержит лишь флавины в качестве кофакторов, а именно — один нековалентно связанный FAD и один нековалентно связанный FMN. Однако при анализе первичных структур субъединиц Na+–NQR было установлено, что лишь в одной из них (в субъединице NqrF) присутствует мотив для нековалентного связывания флавина. Более того, Х. Д. Пфеннингер-Ли и П. Димрот показали, что в очищенном препарате Na+–NQR содержится лишь один нековалентно связанный флавин, а именно — FAD. Позднее данное противоречие в результатах было разрешено. Оказалось, что Na+–NQR наряду с нековалентно связанным FAD содержит дополнительно еще две молекулы FMN, ковалентно связанные с субъединицами NqrB и NqrC. В обоих случаях остатки FMN присоединены к остаткам треонина субъединиц посредством фосфоэфирной связи*. Ковалентный тип связи флавина с белком подразумевает какой-то другой, отличный от классического мотив первичной структуры флавин-содержащего домена, а также невозможность использования обычно применяемой методики экстракции для его обнаружения. Изучение флавиновых кофакторов Na+–NQR получило неожиданное продолжение в самое последнее время. В группе Б. Баркуэры было показано, что данный белок наряду с FAD и FMN содержит также и нековалентно связанный рибофлавин. Рибофлавин обычно используется живыми организмами лишь как предшественник для синтеза FAD и FMN, и, за исключением Na+–NQR, неизвестны случаи его функционирования в качестве редокс-активной простетической группы фермента. Согласно последним * Такой тип ковалентной связи флавина с белком является уникальным и, кроме Na+–NQR, не встречается в других изученных ферментах.

Bioenergetica.indb 248

26.01.2011 18:03:48

Глава 12. Генераторы

249

данным наряду с флавинами Na+–NQR содержит также [2Fe–2S] кластер и молекулу прочно связанного убихинона-8. Таким образом, сегодня принято считать, что Na+–NQR в качестве кофакторов содержит нековалентно связанный FAD, два ковалентно связанных остатка FMN, рибофлавин, [2Fe–2S] кластер и убихинон-8. При функционировании in vivo Na+–NQR окисляет NADH и переносит два электрона на молекулу убихинона с образованием убихинола. Данная окислительно-восстановительная реакция сопряжена с векторным переносом двух ионов натрия через мембрану, т.е. соотношение Na+/ для Na+–NQR равно 1. Значит, эффективность запасания энергии Na+транслоцирующими NADH:хинон-оксидоредуктазами в грубом приближении в два раза меньше по сравнению H+-транслоцирующими NADH:хиноноксидоредуктазами, когда стехиометрия H+/ равна 2: NADH + H+внут + CoQ + 2Na+внут → NAD+ + CoQH2 + 2Na+нар.

(12.2)

Так как ионы натрия являются обязательными участниками катализируемой Na+–NQR реакции, ее скорость зависит от концентрации Na+ и данный процесс практически полностью отсутствует в средах, истощенных по этому иону. При физиологических значениях ионной силы Kм для ионов натрия у Na+–NQR из различных вибрионов находятся в миллимолярной области концентраций. Na+–NQR абсолютно специфична по отношению к Na+. Все другие исследованные ионы не способны вызывать подобного активирующего действия на реакцию 12.2. Na+–NQR даже в отсутствие ионов натрия не способна к транслокации протонов. Транспорт натрия ферментом сопровождается генерацией трансмембранного электрического потенциала (ΔΨ). Показано, что протоны, высвобождающиеся при окислении NADH, выделяются в цитоплазму, а протоны, необходимые для образования убихинола, также поглощаются с цитоплазматической стороны мембраны (см. реакцию 12.2). Таким образом, Na+–NQR является первичной электрогенной натриевой помпой и не катализирует Na+,H+-обмена. Na+–NQR имеет рН-оптимум между 8,0 и 9,0. Она специфически тормозится ионами Ag+, а также очень низкими концентрациями N-окиси 2-гептил-4-окси-хинолина (HQNO) и антибиотика корормицина. Механизм генерации натриевого потенциала при работе Na+–NQR еще не известен. Однако уже установлена стадия каталитического цикла этого фермента, специфически активирующаяся ионами натрия. По данным А.В. Богачева и М.И. Верховского, это перенос электронов от FAD к ковалентно связанным остаткам FMN.

12.3. Na+-транспортирующий метилтрансферазный комплекс метаногенных архей Как было изложено в разделе 5.3, метаногенные археи обладают уникальным набором мембранных белков, способных к запасанию энергии при протекании реакций анаэробного образования СН4. Еще на ранних этапах

Bioenergetica.indb 249

26.01.2011 18:03:48

250

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

исследования метаногенеза было отмечено, что метаногенным археям необходимо присутствие в среде роста ионов натрия (более 1 мМ). Позднее удалось выяснить, что Na+ специфически активирует окислительную фазу метаногенеза. При восстановлении метаногенами разнообразных одноуглеродных соединений молекулярным водородом с образованием метана и воды активация натрием наблюдается лишь для таких субстратов, как формальдегид+Н2 или СО2+Н2, но не при восстановлении водородом метанола (см. разд. 5.3.1). При анализе этих данных было установлено, что одной из натрий-зависимых стадий метаногенеза является перенос метильной группы с метил-тетрагидрометаноптерина (СН3–H4MPT) на 2-тиоэтансульфонат (СоМ): CH3–H4MPT + СоМ → H4MPT + CH3–СоМ ΔG0’ = –30 кДж/моль.

(12.3)

+

Эта реакция катализируется мембранным Na -транспортирующим метилтрансферазным комплексом, и свободная энергия данной экзергоничной . Метилтрансферазный комплекс состоит реакции запасается в виде из 8 разных субъединиц (MtrA–H), являющихся продуктами восьми генов оперона mtrA–H. Данный белок содержит 5-оксибензимидазолилкобаламин (кобаламин — кофактор, содержащий атом кобальта, см. Приложение 2) в качестве простетической группы, связанной с субъединицей MtrA. В ходе метилтрансферазной реакции метильная группа с CH3–H4MPT вначале переносится на кобаламин: CH3–H4MPT + кобаламин(Co+1) → H4MPT + CH3-кобаламин(Co+3). (12.4) Далее метильная группа с метилкобаламина переносится на СоМ: CH3-кобаламин(Co+3) + СоМ → кобаламин(Co+1) + CH3–СоМ. (12.5) Именно последняя реакция специфически активируется Na+ и сопряжена с трансмембранным электрогенным транспортом этих ионов. Считается, что на каждую перенесенную метильную группу фермент транслоцирует через мембрану 2 Na+. Механизм генерации натриевого потенциала метилтрансферазным комплексом еще не известен.

12.4. Na+-транспортирующая формилметанофурандегидрогеназа метаногенных архей Второй натрий-зависимой стадией окислительной фазы метаногенеза является окисление формилметанофурана (формил-MFR*) до метанофурана (MFR) и углекислого газа, катализируемое формилметанофурандегидрогеназой: * Метанофуран (MFR) является уникальным коферментом метаногенных архей, играющим ключевую роль в реакциях фиксации и восстановления СО2, а также в реакциях окисления органических молекул, сопровождающихся выделением СО2. Редокс-потенциал пары формил-MFR/MFR+CO2 составляет –530 мВ.

Bioenergetica.indb 250

26.01.2011 18:03:49

Глава 12. Генераторы

формил-MFR → CO2 + MFR + 2H ΔG0′ = –16 кДж/моль.

251 (12.6)

В настоящий момент неизвестно, какой из переносчиков восстановительных эквивалентов выполняет роль акцептора электронов для этой реакции. Формилметанофурандегидрогеназа является электрогенной натриевой помпой и на каждую образованную молекулу СО2 переносит через мембрану 2–3 иона Na+. Окисление формил-MFR происходит в качестве одной из стадий при превращении формиата или метанола в метан и углекислый газ: 4НСООН → СН4 + 3СО2 + 2Н2О,

(12.7)

4СН3ОН → 3СН4 + СО2 + 2Н2О.

(12.8)

В разных метаногенных бактериях могут функционировать формилметанофурандегидрогеназы, относящиеся к двум различным типам, а именно ферменты, содержащие молибден или вольфрам. Все они являются мультисубъединичными железосерными белками. Наряду с [Fe–S] кластерами они содержат особую простетическую группу — молибдоптерингуанидиндинуклеотид (или вольфрамоптерин гуанидиндинуклеотид). Механизм работы формилметанофурандегидрогеназ на настоящий момент неизвестен, и, пожалуй, этот фермент является наиболее загадочным биоэнергетическим компонентом метаногенных архей.

12.5. Вторичные -генераторы: Na+-транспортирующие ATPазы и Na+-пирофосфатаза 12.5.1. Бактериальные Na+–ATPазы В 1982 г. Д. Хифнер и Ф. Харольд представили убедительные свидетельства существования Na+-транспортирующей ATPазы у анаэробной бактерии Enterococcus hirae (в то время этот микроорганизм именовался Streptococcus faecalis). Было показано, что добавка Na+ к вывернутым субклеточным пузырькам из E. hirae стимулирует их ATPазную активность. Радиоактивный Na+ накапливался в пузырьках сопряженно с гидролизом ATP. В дальнейшем выяснилось, что при росте E. hirae в обычных условиях (при нейтральных значениях рН и при невысоких концентрациях ионов натрия) в ней функционирует в основном «каноническая» Н+-транслоцирующая ATPаза FoF1-типа. Однако при повышении концентрации Na+ в среде роста, а также при щелочных значениях рН или при росте в присутствии протонофоров у E. hirae превалирует альтернативный фермент — Na+-транспортирующая ATPаза VoV1-типа. Данный фермент, как и другие ATPазы V-типа, устойчив к действию азида и ванадата, но чувствителен к нитрату и N-этилмалеимиду. Активность этого белка специфически активируется ионами натрия (с двумя кажущимися Kм, равными 20 мкм и 4 мМ), из других катионов лишь ионы

Bioenergetica.indb 251

26.01.2011 18:03:49

252

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

лития обладают подобным действием (с Kм равными 60 мкм и 3,5 мМ)*. Подобно Na+-транспортирующей NADH:хинон-оксидоредуктазе V. alginolyticus, Na+-ATPaзa E. hirae наиболее активна в щелочной среде (рН 8,0–9,0). Как было отмечено в разд. 7.2.2, гидролиз одной молекулы ATP Na+-транспортирующей ATPазой E. hirae должен быть сопряжен с трансмембранным транспортом 3,3 ионов натрия. Скорее всего, биологическая функция Na+-ATPaзы E. hirae состоит в энергизации мембраны этой гликолизирующей бактерии в условиях, когда невозможно использовать обычную цепь реакций, приводящих к накоплению метаболитов и к совершению других типов мембранной работы (см. реакцию 12.9): Глюкоза → ATP → При отсутствии

→ мембранная работа.

(12.9)

реализуется альтернативный механизм:

Глюкоза → ATP →

→ мембранная работа,

(12.10)

где второй и третий этапы катализируются соответственно Na+-ATPазой и Na+-зависимыми транспортерами.

12.5.2. Na+/K+-ATPаза и Na+-ATPаза животных Na+/K+-ATPаза была описана Й.-Х. Скоу в 1957 г. Сорок лет спустя это открытие было отмечено Нобелевской премией по химии. Фермент локализован во внешней мембране животной клетки. Он ответствен за генерацию ΔΨ, ΔpNa и ΔpK на этой мембране. Такой эффект достигается путем обмена 2K+нар на 3Na+внут, сопряженного с гидролизом одной молекулы ATP. Na+/ K+-ATPаза состоит из двух субъединиц (α и β) с молекулярными массами соответственно 100 и 40 кДа. По данным Ю.А. Овчинникова, Н.Н. Модянова и сотрудников, полученным посредством электронного микроскопирования двухмерных кристаллов фермента (разрешение 2 нм), вертикальный размер αβ-протомера составляет около 10 нм, что существенно больше толщины липидного бислоя. β-Субъединица содержит короткий цитоплазматический (N-концевой) участок, одну трансмембранную α-спираль и большой гликозилированный экстраклеточный домен. α-Субъединица содержит 10 трансмембранных α-спиралей. По данным, полученным в опытах с химической модификацией и антителами, почти две трети α-субъединицы находятся вне мембраны, причем цитоплазматический домен втрое больше того, который выступает снаружи клетки. α-Субъединица сужается в своей центральной части, погруженной в мембрану. Nа+/K+ATPаза может быть встроена в протеолипосомы, способные к ATP-зависимому антипорту Na+ и K+. Как показал метод травления за* Интересно отметить, что Li+ хотя и способен транспортироваться ATPазой E. hirae, однако, в отличие от Na+, повышение концентрации ионов лития в среде роста не вызывает увеличения экспрессии генов этого фермента.

Bioenergetica.indb 252

26.01.2011 18:03:49

Глава 12. Генераторы

253

мороженных образцов, протеолипосомы содержат частицы размером 9–12 нм, что примерно соответствует размеру комплекса со стехиометрией α2β2. N-концевой домен α-субъединицы обращен в цитоплазму. Карбоксильная группа одного из остатков аспартата, локализованного в этом домене и входящего в консервативную последовательность DKTGT, фосфорилируется посредством функциониATP при образовании фосфофермента в Рисунок 12.2. Механизм рования Nа+/K+-ATPазы процессе ATPазной реакции. Механизм Nа+/K+-ATPазы описывается в рамках общей схемы работы E1E2-ATPаз (рис. 12.2). Согласно этой схеме ионы Na+внут необходимы для фосфорилирования фермента. Фосфофермент претерпевает конформационное изменение (E1 → E2) и распадается на E2 и фосфат в присутствии ионов калия (K+нар). Затем E2 релаксирует в E1. Состояние E2P фиксируется оуабаином. Наблюдается положительная кооперативность в связывании 3Na+ и 2K+. Rb+, Cs+, NH4+, T1+, Li+ и Na+ могут, хотя и в разной степени, заменять ион K+. Что касается иона Na+, то его роль более специфична. Среди перечисленных катионов только Li+ может быть использован вместо Na+, причем в этом случае скорость гидролиза ATP снижена, а сродство фермента к Li+ гораздо меньше, чем к Na+. Интересно, что Na+ можно заменить ионом водорода, причем Н+ имеет по крайней мере на два порядка большее сродство к Na+/K+-ATPазе, чем Na+. Тот факт, что фермент в физиологических условиях переносит Na+, а не Н+, обусловлен гораздо большей концентрацией Na+, чем Н+ в цитоплазме. Однако в более кислых средах (рН 5,7) удается наблюдать Н+/K+-антипорт и ATPазную активность без Na+. Другая Na+-транспортирующая ATPаза была описана Ф. Провербио и коллегами в эпителии тонкого кишечника и проксимальных почечных канальцах. Она отличается от Na+/K+-ATPaзы прежде всего тем, что K+ не нужен для активности, а оуабаин не влияет на фермент.

12.5.3. Na+-пирофосфатаза Как описано в разд. 7.3, в клетках растений и некоторых микроорганизмов содержится особый фермент — мембраносвязанная Н+-транслоцирующая пирофосфатаза, катализирующая сопряженный с гидролизом пирофосфата трансмембранный перенос протонов. Однако совсем недавно сотрудник нашего института А.А. Байков и его коллеги из университета г. Турку Р. Лахти, А. Малонен и Г. Белогуров выяснили, что мембраносвязанные пирофосфатазы архей Methanosarcina mazei и Moorella thermoacetica, а также термофильной бактерии Thermotoga maritima используют в качестве сопряга-

Bioenergetica.indb 253

26.01.2011 18:03:49

254

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

Рисунок 12.3. Р. Лахти, А. Малонен, Г. Белогуров и А.А. Байков (слева направо)

ющего иона Na+, а не H+. Эти пирофосфатазы похожи на обычные мембраносвязанные Н+-транслоцирующие пирофосфатазы и отличаются от них лишь измененной субстратной специфичностью. Каталитическая активность мембраносвязанных пирофосфатаз из Methanosarcina mazei, Moorella thermoacetica и Thermotoga maritima проявляется лишь в присутствии Na+, и данная активность сопряжена с электрогенной трансмембранной транслокацией этого иона.

Bioenergetica.indb 254

26.01.2011 18:03:49

ГЛАВА ТРИНАДЦАТАЯ

УТИЛИЗАЦИЯ ПЕРВИЧНЫМИ

, ОБРАЗУЕМОЙ -ГЕНЕРАТОРАМИ

13.1. Осмотическая работа, поддерживаемая 13.1.1. (Na+,метаболит)-симпортеры

У алкалотолерантной Vibrio alginolyticus, располагающей Na -NADH:xинoн+

+

оксидоредуктазой, обнаружены (Na ,метаболит)-симпортеры, ответственные за аккумуляцию 19 аминокислот и сахарозы. Показано также, что накопление K+ в клетках V. alginolyticus при щелочных рН поддерживается энергией ΔΨ, генерируемой Na+–NQR. Na+-зависимое накопление метаболитов в алкалофильных бациллах было описано в ряде сообщений. Однако остается неясным, как эти алка. лофилы образуют Нейтрофильные бактерии, живущие при низких или умеренных концентрациях NaCl, обычно используют Н+, а не Na+ в качестве симпортируемого иона (см. разд. 9.7). Однако известны и исключения из этого правила. Так, пролин транспортируется вместе с Na+ в клетки Mycobacterium phlei, Salmonella typhimurium и E. coli. Интересный «дуалистический» механизм импорта метаболита описан у E. coli. Оказалось, что эта бактерия использует альтернативно Н+ или Na+ в качестве сопрягающего катиона при аккумуляции мелибиозы. Поглощение цитрата бактериями Klebsiella pneumoniae осуществляется переносчиком, обеспечивающим симпорт цитрата3–, 2Na+ и 2Н+. Это означает, что движущей силой процесса должны быть ΔΨ, ΔpNa и ΔpH. А. Броди и сотрудникам удалось выделить (Na+,пролин)-симпортер из М. phlei, который оказался белком массой в 20 кДа. Очищенный симпортер был реконструирован с фосфолипидами. Полученные протеолипосомы транспортировали пролин за счет ΔΨ, образованной диффузией ионов K+. Аккумуляция пролина тормозилась ионофорами, снижавшими ΔΨ, а также сульфгидрильными реагентами. Описана частичная очистка и реконструкция (Na+,аспартат)-симпортера из галофильной Halobacterium halobium. Вообще морские и галофильные микроорганизмы, подобно алкалофильным, обычно используют Na+, а не Н+ как симпортируемый ион. Это верно также и для внешней мембраны клеток высших животных, омываемой раствором с высокой концентрацией NaCl. Данное обстоятельство — еще одно свидетельство справедливости мнения

Bioenergetica.indb 255

26.01.2011 18:03:49

256

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

о том, что кровь — «частичка океана в нашем теле». Генератором на плазмалемме животных клеток служит Na+/K+-ATPaзa (в некоторых слуутилизируется различнычаях также и Na+-ATPаза). Образованная ми переносчиками, транспортирующими в клетку аминокислоты, сахара, жирные кислоты и другие соединения. Ряд (Na+,метаболит)-симпортеров выделен и встроен в протеолипосомы. Некоторые животные клетки содержат Н+-ATPазу во внешней мембране (см. разд. 7.2). В этих клетках также найдены (Н+,метаболит)-симпортеры.

13.1.2. Ионы Na+ и регуляция внутриклеточного рН Бактерии весьма успешно решают проблему гомеостаза внутриклеточного рН. Как было показано в группе Р.М. Макнаба, у Е. сoli этот гомеостаз наблюдается при рНнар 5,5–9,0. В указанном интервале рНнар величина рНвнут описывается уравнением: pНвнут = 7,6 + 0,1·(рНнар – 7,6),

(13.1)

так что значения рНвнут при рНнар 5,5 и 9,5 равны соответственно 7,4 и 7,8. При понижении рНнар закисление цитоплазмы может быть предотвращено посредством импорта K+, разменивающего образуемую -генератором ΔΨ на ΔpH нужного направления (цитоплазма щелочнее внешней среды) (рис. 13.1 А). При нейтральном рНнар единственная задача — вернуть в цитоплазму ионы Н+, теряемые клеткой из-за работы -генераторов. Проблема может быть решена посредством электронейтрального Na+/Н+-антипорта (рис. 13.1 Б). Электронейтральный Na+/Н+-антипорт эффективен в поддержании рНгомеостаза только при условии, что рНнар ≤ рНвнут. Механизмы закисления цитоплазмы оказываются иными, если рНнар выше, чем рНвнут. Бактерия сталкивается с этой проблемой, когда среда роста становится щелочной. Теперь электронейтральный Na+/Н+-антипортер уже не может обеспечивать вход Н+ в клетку, так как градиенты рН и pNa неблагоприятны для такого процесса. Один из способов предотвратить защелачивание цитоплазмы при высоком рНнар — сделать Na+/Н+-антипортер электрогенным (например, обмен одного иона Na+ на два иона Н+). Если при этом ΔΨ, образуемая -генератором, достаточно высока, чтобы перекрыть неблагоприятное действие ΔpH и ΔpNa, то взаимодействие -генератора и Na+/2H+-антипортера будет поддерживать рНвнут < рНнар (рис. 13.1 В). Альтернативная возможность показана на рис. 13.1 Г. Здесь первичный -генератор заряжает мембрану, а Н+-унипортер облегчает электрофорез ионов Н+ под действием образованной ΔΨ. Ионы Na+ участвуют также в рН-гомеостазе животных и растительных клеток. Для животных твердо установлено, что именно Na+/Н+-антипортер ответственен за постоянство внутриклеточного рН. У растений Na+/ H+-антипорт происходит как во внешней мембране клетки, так и в тонопласте.

Bioenergetica.indb 256

26.01.2011 18:03:49

Глава 13. Утилизация

, образуемой первичными

-генераторами

257

Рисунок 13.1. Возможные механизмы стабилизации pH в цитоплазме бактерий. А — pHНАР < pHВНУТ; -генератор выбрасывает ионы Н+ из клетки и образует ΔΨ (реакция 1). Эта ΔΨ разряжается потоком K+ в клетку (реакция 2), так что образуется ΔpH нужного знака (цитоплазма защелачивается); Б — pHНАР ≈ pHВНУТ; потеря клеткой ионов Н+ из-за работы -генераторов (реакция 1) компенсируется входом H+НАР в обмен на Na+ВНУТ (реакция 2); В, Г — pHНАР > pHВНУТ; В — Н+-помпа откачивает H+ из цитоплазмы, генерируя ΔΨ (реакция 1). Эта ΔΨ используется Na+,2H+-антипортером, обменивающим один Na+ВНУТ на два H+НАР (реакция 2); Г — первичная Na+-помпа заряжает мембрану, откачивая Na+ во внешнюю среду (реакция 1). Унипорт Н+ в клетку разряжает ΔΨ и подкисляет цитоплазму (реакция 2)

Bioenergetica.indb 257

26.01.2011 18:03:50

258

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

13.2. Механическая работа Существует по крайней мере один пример, когда механическая работа совершается за счет , образуемой первичным Na+-насосом. Как было показано в нашей группе П.А. Дибровым, движение V. alginolyticus (1) наблюдается только в присутствии Na+; (2) может поддерживаться искусственно созданной ΔpNa (но не ΔpH), причем моненсин снимает этот эффект; (3) происходит, хотя и со сниженной скоростью, в присутствии высокой концентрации протонофора. В 100 раз меньшая концентрация протонофора полностью подавляет движение, если добавить моненсин. При отсутствии ХКФ моненсин лишь слегка снижает скорость движения, поддерживаемого дыханием. Было сделано заключение, что флагеллярный мотор V. alginolyticus использует энергию , а не . Движение вибрионов в морской воде осуществляется за счет функционирования единственной гигантской полярной флагеллы (см. рис. 13.2). Этот натриевый мотор может вращаться с частотой до 1700 оборотов в секунду и двигать клетку со скоростью, достигающей 60 мкм/с. Структура базального тела в общих чертах сходна с таковой у обычных латеральных Н+-зависимых флагелл (см. главу 8). Как и следовало ожидать, основные отличия Na+-зависимого мотора от своих Н+-движимых аналогов приходятся на элементы статора этих органелл. Белки MotA и MotB натриевых флагелл значительно отличаются по своей первичной структуре от соответствующих субъединиц протонных моторов. Более того, статор натриевого мотора содержит также два дополнительных белка MotX и MotY, отсутствующих в случае с Н+-флагеллами. Интересно отметить, что замена у вибрионов собственных белков MotA, MotB, MotX и MotY на белки MotA и MotB E. coli приводит к изменению специфичности мотора: в этом случае для своего вращения он уже использует энергию протонного, а не натриевого градиента. Недавно было продемонстрировано, что при выращивании в жидких средах V. alginolyticus движется за счет работы единственной полярной натриевой флагеллы (как было описано выше). Однако при росте в очень вязких средах клетки V. alginolyticus экспрессируют добавочные флагеллы меньшего размера, которые расположены латерально, т.е. по всей поверхности бактерии. Оказалось, что вращение латеральных флагелл V. alginolyticus поддерживается энергией не натриевого, а протонного потенциала. Таким образом, эта бактерия для совершения механической работы в зависимости от условий роста может использовать энергию как , так и . Натриевое движение было описано и для других морских вибрионов, в частности для V. cholerae. Известно, что Рисунок 13.2. Полярная флагелла V. cholerae образует токсин, вызываюV. parahaemolyticus

Bioenergetica.indb 258

26.01.2011 18:03:50

Глава 13. Утилизация

, образуемой первичными

-генераторами

259

щий выброс соли из тканей в кишечник. Возможно, эта соль необходима V. cholerae для Nа+-энергетики этого вибриона. Na+-зависимое движение показано также у алкалофильных бацилл: Bacillus sp. YN-1 и Вас. pseudofirmus. На Вас. sp. YN-l, изученной более детально, показано, что Na+ необходим для движения, которое лишь частично тормозится протонофором. Продемонстрировано также, что ΔpNa и ΔΨ, генерируемые энзиматически, эквивалентны друг другу в качестве источников энергии для движения.

13.3. Химическая работа Еще в 1966 г. И. Глин и П. Гаррахан доказали принципиальную возможность того, что ΔpNa (вместе с ΔpK) способна повернуть вспять реакцию гидролиза ATP, катализируемую ион-транспортной ATPазой. Авторы описали синтез ATP эритроцитами в условиях, когда [Na+]внут > [Na+]нар и [K+]внут < [K+]нар. Однако такая реакция вряд ли происходит in vivo из-за противоположной направленности ионных градиентов.

13.3.1.

-Зависимый синтез ATP у анаэробных бактерий

Некоторые указания на превращение энергии → ATP в естественных условиях были получены П. Димротом и его коллегами, изучавшими Propionigenium modestum — строго анаэробную бактерию, описанную в 1982 г. Б. Шинком и Н. Пфенигом. Единственным источником полезной энергии для Р. modestum служит декарбоксилирование сукцината в пропионат: –

ООС–СН2–СН2–СОО– + Н2О → СН3–СН2–СОО– + НСО3– ΔG0’ = –21 кДж/моль. (13.2)

Энергетический выход этой реакции примерно вдвое ниже, чем цена энергии синтеза ATP из ADP и фосфата при физиологических условиях*. Ясно, что механизмы субстратного фосфорилирования не могут быть использованы Р. modestum, так как все они предполагают образование одной молекулы ATP на одну молекулу утилизированного субстрата. Решением или при декарбоксилировапроблемы могла бы быть генерация нии сукцината, если предположить, что на каждый декарбоксилированный сукцинат из клетки откачивается пН+ или nNa+, а синтез одной молекулы ATP сопряжен с переносом 2nН+ (2nNa+) назад в клетку. По данным П. Димрота и сотрудников декарбоксилирование метилмалонил-CоА (интермедиата превращения сукцината в пропионат) сопряжено с откачкой ионов Na+ из цитоплазмы Р. modestum (см. разд. 12.1), и это декарбоксилирование в субклеточных пузырьках Р. modestum может поддерживать синтез ATP. Образованная при декарбоксилировании используется для синтеза ATP путем обращения Na+-ATPaзы, которая была * Это послужило поводом для Б. Шинка и Н. Пфенига дать видовое название вновь открытому микробу modestum, т.е. умеренный (в смысле энергетических потребностей).

Bioenergetica.indb 259

26.01.2011 18:03:51

260

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

обнаружена в больших количествах в мембране Р. modestum (рис. 13.3). Эта Na+-ATPаза как по субъединичному составу, так и по чувствительности к ингибиторам похожа на обычные ATPазы FoF1-типа, отличаясь от них лишь измененной субстратной специфичностью. При нейтральных и слабощелочных значениях рН ATPазная активность фермента из Р. modestum сопряжена с транслокацией ионов натрия через мембрану, однако при низких значениях рН и при отсутствии ионов Na+ фермент способен транспортировать и протоны. Еще предстоит выяснить, как один и тот же фермент в разных условиях способен к транслокации столь непохожих ионов, как Na+ и H+. Кроме ионов натрия и протонов, ATPаза Р. modestum способна также транспортировать и Li+, однако с намного меньшим сродством к этому иону. В соответствии с предсказаниями ионная специфичность Na+-ATPазы определяется фактором Fo. Так, химерный фермент, включающий F1 из Р. modestum и Fo из E. сoli, демонстрирует свойства типичного Н+-насоса. Кроме Р. modestum, Na+-ATP-синтазы описаны у таких бактерий, как Acetobacterium woodii и Ilyobacter tartaricus. Вообще, эти ферменты, повидимому, довольно широко распространены среди микроорганизмов (в частности, у метаногенных архей).

13.3.2. Потребители , совершающие химическую работу у метаногенных архей Как описано выше, два фермента метаногенных архей — метилтрансферазный комплекс и формилметанофурандегидрогеназа — являются первичными натриевыми помпами. Однако в некоторых условиях эти ферменты способны катализировать обратные реакции, т.е. использовать энергию для совершения химической работы (для переноса метильной группы с метил-СоМ на H4MPT и для восстановления СО2 до формил-MFR).

Рисунок 13.3. Предполагаемый механизм энергообеспечения анаэробной бактерии P. modestum: сукцинат входит в клетку, где превращается в сукцинил-CoA посредством переацилирования с пропионил-CoA. Из сукцинил-CoA образуется метилмалонил-CoA. Последний декарбоксилируется до пропионил-CoA и СО2, что сопряжено с выбросом из клетки ионов Na+. Эти ионы Na+ возвращаются в цитоплазму через Na+-ATP-синтазу, образующую ATP из ADP и фосфата

Bioenergetica.indb 260

26.01.2011 18:03:51

Глава 13. Утилизация

, образуемой первичными

-генераторами

261

При таких метаногенных процессах, как: СН3СООН → СН4 + СО2,

(13.3)

CО2 + 4Н2 → СН4 + 2H2О,

(13.4)

H2CО + 3Н2 → СН4 + 2H2О.

(13.5)

+

Na -транспортирующий метилтрансферазный комплекс функционирует в качестве генератора натриевого потенциала, однако при диспропорционировании молекул метанола в метан и углекислый газ: 4СН3ОН → 3СН4 + СО2 + 2Н2О

(13.6)

тот же фермент катализирует обратную реакцию и выступает в качестве по. требителя Na+-транспортирующая формилметанофурандегидрогеназа функционирует в качестве генератора натриевого потенциала при превращениях формиата или метанола в метан и углекислый газ: 4НСООН → СН4 + 3СО2 + 2Н2О,

(13.7)

4СН3ОН → 3СН4 + СО2 + 2Н2О.

(13.8)

Однако при восстановлении углекислого газа до метана молекулярным водородом: CО2 + 4Н2 → СН4 + 2H2О

(13.9)

этот фермент является уже потребителем . Важно отметить, что в тех метаногенных процессах, где один из двух натрий-зависимых ферментов выступает в роли потребителя натриевого потенциала, второй натрий-транспортирующий фермент обязательно является натриевой помпой и, таким образом, обеспечивает генерацию для совершения химической работы.

Bioenergetica.indb 261

26.01.2011 18:03:51

ГЛАВА ЧЕТЫРНАДЦАТАЯ

СООТНОШЕНИЕ ПРОТОННОГО И НАТРИЕВЫХ МИРОВ

14.1. Как часто используется Na+-цикл живыми клетками?

Р

исунок 14.1 иллюстрирует тот факт, что обычного направления может эффективно использоваться только при кислых или нейтральных значениях рН внешней среды. В этих условиях откачка протонов из цитоплазмы поддерживает ΔΨ и ΔpH «правильного» знака, т.е. благоприятного для входа Н+ обратно в клетку. При щелочных значениях рН тот же процесс генерирует «правильную» ΔΨ на фоне обратной ΔpH. Концентрация ионов Н+ в клетке алкалофилов должна поддерживаться на более высоком уровне, чем снаружи, чтобы избежать щелочной инактивации внутриклеточных ферментов. В результате ион Н+, откачанный из цитоплазмы, не может произвести полезной работы, так как, возвращаясь назад в клетку, он движется по ΔΨ, но против ΔpH. Замена сопрягающего иона (H+ на Na+) может решить проблему, как это оказалось в случае Vibrio alginolyticus. Другие алкалотолерантные и алкалофильные бактерии также, по-видимому, могут энергизовать цитоплазматическую мембрану без участия протонного потенциала. Мутант Enterococcus hirae, лишенный Н+-ATPазы, а также дикий штамм того же микроба, выращенный в присутствии протонофора, могут служить примерами, когда развитие натриевой энергетики не связано с жизнью в щелочной среде (см. разд. 12.5.1). Это же имеет место у некоторых анаэробов, а также у Salmonella typhimurium, использующих Na+-транспортирующие декарбоксилазы. Например, Propionigenium modestum растет при рН 6,5–8,4 с оптимумом между 7,1 и 7,7. Интересно, что отдельные компоненты Nа+-цикла можно найти у такого нейтрофила, как Е. coli, которая накапливает определенные метаболиты в симпорте с Na+. Этот способ совершения осмотической работы является основным для многих морских и галофильных бактерий, а также для внешней мембраны животных клеток (см. разд. 13.1). Здесь также очевидно, что использование натриевой энергетики обусловлено причинами иными, чем приспособление к щелочным условиям среды.

Bioenergetica.indb 262 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:03:51

Глава 14. Соотношение протонного и натриевых миров

263

Рисунок 14.1. Роль при различных значениях pH среды обитания бактерий: может эффективно использоваться ацидо- и нейтрофилами, но не алкалофилами, где электрический потенциал и градиент Н+ направлены в противоположные стороны

14.2. Возможные эволюционные отношения между протонным и натриевым мирами Можно предположить, что эволюционно первичным сопрягающим ионом был Н+. Нетрудно представить, как примитивная живая клетка могла бы «изобрести» -генератор, устроенный по типу редокс-петли Митчела. Механизм редокс-петли предполагает, что некий акцептор атомов водорода (например, хинон Q) восстанавливается донором электронов (например, цитохромом Fe2+). Если такой процесс протекает вблизи одной из поверх-

Bioenergetica.indb 263

26.01.2011 18:03:51

264

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

ностей мембраны (допустим, левой), ионы водорода должны поглощаться из воды, омывающей эту поверхность: Q + 2Fe2+лев + 2 H+лев → QH2+ 2Fe3+лев.

(14.1)

Образованный QH2 диффундирует в сторону своей меньшей концентрации к противоположной стороне мембраны и там окисляется акцептором электронов, например другим цитохромом Fe3+. В результате ионы водорода высвобождаются в воду справа от мембраны: QH2 + Fe3+прав → Q + 2Fe2+прав + 2H+прав.

(14.2)

Эти две реакции и диффузия QH2 образуют «полупетлю», переносящую атомы водорода. Другая «полупетля» представляет собой перенос электронов через мембрану, направленный справа налево (см. также рис. 4.8). Тот факт, что редокс-петля образует разность электрохимических потенциалов ионов водорода, есть прямое и неизбежное следствие химизма окислительной реакции, поставляющей энергию. Схема редокс-петли была однозначно доказана для фотосинтетических редокс-центров пурпурных бактерий, а также для фотосистем I и II хлоропластов и цианобактерий (см. главу 2). Редокс-циклы, включенные в механизмы генерации дыхательной цепью, можно рассматривать как усложненный вариант редокспетли. В то же время существуют -генераторы, использующие энергию без участия системы Н+/ -антипорта. Таковы, в частности, трансгидрогеназа (см. разд. 7.4) и бактериородопсин (см. главу 6). В этих случаях поставляющий энергию процесс сопряжен с генерацией не прямо, как в редокспетле, а каким-то иным, более изощренным способом (см. также рис. 4.8). Системы такого типа уже не предполагают с неизбежностью участие Н+ в качестве сопрягающего иона. Поэтому неудивительно, что непрямые механизмы сопряжения используются для транспорта и других ионов. Так, бактериородопсин переносит Н+, а близкий к нему по пространственной и первичной структуре галородопсин транспортирует Сl– (см. разд. 6.5.1). Генераторы натриевого потенциала с очевидностью попадают в разряд непрямых преобразователей энергии и потому могут рассматриваться как эволюционно более поздние изобретения природы. В тех случаях, когда поглощение и выделение ионов Н+ уже не есть следствие химизма процесса, замена Н+ на Na+ имеет известные преимущества. 1. Как уже указывалось, это сообщает клетке устойчивость к средам с низкой [Н+]. 2. Проводимость липидной мембраны для Н+ по крайней мере в 106 раз выше, чем для Na+. Эта величина окажется еще большей, если липидный бислой содержит включения белков, располагающих протон-акцепторными группами, которые могут облегчить эстафетный механизм Н+-проводимости. В то же время [Н+] в среде обычно в ~106 раз ниже, чем [Na+]. Соотношение этих двух параметров может приводить к тому, что клетка легче удерживает градиент Na+, чем Н+. По-видимому, названное соотношение становится неблагоприятным для Nа+-энергетики только у экстремальных галофилов,

Bioenergetica.indb 264

26.01.2011 18:03:52

Глава 14. Соотношение протонного и натриевых миров

265

живущих в насыщенном растворе NaCl. Возможно, именно по этой причине они используют Н+, а не Na+ в качестве первичного сопрягающего иона, несмотря на высокую [Na+] нар. 3. Последний и, может быть, самый важный момент состоит в том, что внутриклеточные ферменты гораздо чувствительней к изменению концентрации Н+, чем Na+, особенно если снижение [Na+]внут компенсируется повышением [K+]внут. Поэтому клетка, откачивающая из цитоплазмы Na+, выглядит биологически более совершенной, чем та, которая откачивает Н+. В такой клетке рНвнут становится независимым от скорости мембранных процессов преобразования энергии, и, в свою очередь, эти процессы перестают контролироваться цитоплазматическим рН. Следуя подобной логике, можно понять, почему такая эволюционно молодая мембрана наиболее прогрессивного царства живых существ, как плазмалемма животной клетки, использует Na+ в качестве сопрягающего иона. Как уже отмечалось, слишком высокая [Na+]нар может оказаться неблагоприятной для натриевой энергетики. Однако [Na+]нар не должна быть и слишком низкой, иначе не удастся создать Na+-градиент нужного направления, т.е. [Na+]внут < [Na+]нар. Это требование выполняется как для клеток животных, так и для микроорганизмов, за исключением пресноводных (V. alginolyticus и Р. modestum, служащие наиболее яркими примерами натриевой энергетики, найдены в море). Чтобы выявить таксономические связи между живыми существами, использующими Н+ или Na+ в качестве сопрягающих ионов, был проведен поиск генов, кодирующих Н+ и Na+-зависимые ферменты, среди большого числа прочитанных на сегодняшний день бактериальных геномов. Широкое распределение видов, использующих , среди разнообразных таксономических групп указывает, что Na+-цикл был «открыт» бактериями достаточно давно. Б. Розен даже предположил, что натриевая энергетика появилась до протонной, которая пришла на смену Nа+-циклу, когда бактерии поднялись из моря в реки, т.е. перешли из соленой воды в пресную, характеризующуюся низкой [Na+]. Эту гипотезу (ее недавно поддержал А. Мулкиджанян) трудно исключить, как и многие другие построения эволюционистов. Однако соображения, изложенные в начале настоящего раздела, делают, как нам кажется, более вероятной альтернативную точку зрения: первичным сопрягающим ионов был Н+. Если принять, что сначала возникла протонная энергетика, можно представить возможный путь становления натриевого цикла. Первым этапом могло быть использование градиентов Na+ и K+ как -буферов (см. разд. 13.1). Следующей стадией эволюции стало, по-видимому, прямое использование , образованной совместным действием -генератора и Nа+/Н+-антипортера, для совершения осмотической работы (Na+,метаболит)-симпортерами. Создание Na+-цикла завершилось с появлением первичных -генераторов, не требующих для образования натриевого потенциала.

Bioenergetica.indb 265

26.01.2011 18:03:52

266

ЧАСТЬ V. Натриевый мир

Большинство этих событий произошло, вероятно, на достаточно ранних этапах эволюции жизни, так что теперь отдельные компоненты Nа+цикла обнаруживаются в самых различных таксонах: Vibrio, Propionigenum, Salmonella, Clostridium, Streptococcus, в метанобразующих археях и, наконец, в животных клетках. Возможно, даже «классическая» Е. coli имеет представителей натриевого мира среди своих далеких предков, иначе трудно понять, почему эта бактерия накапливает некоторые метаболиты за счет .

14.3. Превращение энергии в биомембранах без участия Н+ и Na+ Рассматривая соотношение протонного и натриевого миров, уместно задаться вопросом, нет ли и еще одного (третьего) мира, где ни Н+, ни Na+ не участвуют в энергетическом сопряжении. Сегодня ответ на этот вопрос однозначен и отрицателен. Сказанное не означает, что среди всего многообразия процессов превращения энергии в мембранах нельзя найти такие, которые обходятся без Н+ и Na+. Однако все это исключительные случаи, не складывающиеся в единую энергетическую систему, подобную протонной или натриевой энергетике. Рассмотрим, например, биоэнергетические функции ионов K+. Как уже отмечалось в разделе 11.3.1, у бактерий ΔpK может возникать за счет ΔΨсоставляющей протонного (или натриевого) потенциала, образуемого ( )-генераторами. Если Е. coli растет в среде с очень низким содержанием K+, то индуцируется K+-ATPаза Е1Е2-типа (система Kdp), аккумулирующая в клетке ионы K+ за счет энергий ATP. Функции образуемой ΔpK ограничены стабилизацией ΔΨ, внутреннего рН и осмотического давления. В животных тканях K+-градиент, как правило, образуется Nа+/K+ATPазой. Роль K+ в этом случае сводится к функции противоиона для Na+, который откачивается из клетки с целью образования — конвертируемой «валюты» внешней мембраны животной клетки. В разделе 7.2.3.2 была рассмотрена K+/Н+-ATPаза эпителия слизистой желудка высших животных. Здесь K+ служит противоионом для Н+, откачиваемого из клетки для подкисления желудочного сока. В эпителии некоторых насекомых электрогенная K+-ATPаза катализирует транспорт массовых количеств K+ от базальной к апикальной стороне эпителиальной клетки. Этот процесс важен для движения жидкости через эпителий. K+-ATPаза насекомых, в отличие от Nа+/K+-ATPазы и K+/Н+ATPазы, откачивает K+ из клетки. Она локализована в апикальной области плазматической мембраны. K+-ATPаза образует грибовидные выросты размером около 10 нм, внешне напоминающие фактор F1. Ее активность устойчива к оуабаину и специфически тормозится инсектицидом δ-эндотоксином из Bacillus thuringiensis.

Bioenergetica.indb 266

26.01.2011 18:03:53

Глава 13. Утилизация

, образуемой первичными

-генераторами

267

В эпителии кишечника одного из червей K+-ATPаза откачивает K+ из клетки, создавая ΔΨ, которая используется для удаления ионов Н+ из просвета кишечника. В результате рН в кишечнике поддерживается на уровне 10–11. Δ K+ или одна из ее составляющих, по-видимому, служит движущей силой аккумуляции аминокислот в клетках эпителия посредством (K+, аминокислота)-симпортера. В мембране эндоплазматического ретикулума и внешней клеточной мембране животных (а также в цитоплазматической мембране бактерий) имеется Са2+-ATPaзa Е1Е2-типа, которая переносит Са2+ из цитозоля в просвет ретикулума или в межклеточное пространство. Нет прямых свидетельств тому, что образуемая Δ Ca2+ может использоваться для совершения полезной работы. По всей вероятности, единственной функцией Са2+-ATPазы служит регуляция [Са2+] в цитозоле. Известно несколько примеров транспорта анионов, независимого от и . В разделе 6.5.1 был рассмотрен один из них — галородопсин, транспортирующий ионы Cl– в клетки Н. salinarium за счет энергии света. Эта помпа возвращает в клетку ионы Cl–, которые постоянно ею теряются электрофоретически, перемещаясь через мембрану в направлении изнутри наружу. У моллюска Aplysia californica подобная функция выполняется Cl–ATPазой, локализованной во внешней клеточной мембране. Фермент чувствителен к ванадату. Солончаковое растение Limonium vulgaris выделяет соль на поверхность листьев посредством особой железы, состоящей из клеток, во внешней мембране которых обнаружена С1–-ATPаза. Предполагают, что этот фермент электрогенно откачивают ионы С1– из клетки, а образуемая ΔΨ (внутри клетки знак «+») используется для электрофоретического переноса ионов Na+ вслед за С1–. Некоторые вещества аккумулируются бактериями за счет энергии ATP или фосфоенолпирувата. Наиболее разработанным примером такого рода является фосфоенолпируваттрансферазная система, катализирующая одновременно два процесса — фосфорилирование глюкозы фосфоенолпируватом и аккумуляцию этого сахара в виде глюкозо-6-фосфата некоторыми бактериями. При этом разность в величинах свободной энергии фосфоенолпирувата и глюкозо-6-фосфата используется для создания большого градиента сахара между клеткой и средой. В заключение следует подчеркнуть, что все перечисленные выше системы представляют собой особые механизмы, совершающие осмотическую работу. Огромное большинство процессов концентрирования веществ поддерживается энергией или . Что же касается мембранной работы химического и механического типов, то здесь во всех без исключения описанных случаях движущей силой служит либо протонный или натриевый потенциал, либо АТР.

Bioenergetica.indb 267

26.01.2011 18:03:53

Часть шестая ОПЫТ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ БИОЭНЕРГЕТИКИ: АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ОТМЕНЫ ПРОГРАММЫ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА И терпентин на что-нибудь полезен. Козьма Прутков

В

этой части нашей книги мы предпримем попытку применить изложенные выше сведения об энергетике биологических мембран к решению в общемто прикладной проблемы. Однако это один из тех практических вопросов, которые имеют общечеловеческое значение и потому перестают быть просто прикладными. Речь пойдет о возможности отмены старения людей. Вот основные пункты нашей концепции. 1) Старение живых организмов — последний этап реализации программы онтогенетического развития. 2) Старение — один из механизмов, ускоряющих биологическую эволюцию. Небольшие благоприятные признаки, не существенные для сильного молодого организма, могут оказываться жизненно важными (и потому стать объектом естественного отбора) у организмов, ослабленных старением. 3) Человек давно уже не полагается на черепаший темп своей эволюции. Он не приспосабливается к окружающей среде, а сам приспосабливает ее для своих целей. Поэтому применительно к человеку старение (как любой другой механизм эволюции) есть атавизм, который надо попытаться отменить ввиду его очевидной вредности для нашего организма. 4) Увеличение уровня активных форм кислорода (АФК) внутри митохондрий есть один из необходимых этапов на пути реализации программы старения. АФК вызывают запрограммированную смерть клеток, которых в результате с возрастом становится все меньше и меньше в жизненно важных органах и тканях. Это ведет к ослаблению отдельных функций организма и, как следствие, к старческим болезням и смерти. 5) Программу старения можно прервать, почистив от избытка АФК «самое грязное место в клетке» — внутренность митохондрий. Для достижения такого эффекта следует нагрузить митохондрии катионными производными антиоксидантов многократного действия, свободно проникающими через митохондриальную мембрану и потому электрофоретически накапливающимися внутри митохондрий, заряженных отрицательно. Такими антиок-

Bioenergetica.indb 268

26.01.2011 18:03:53

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 269

сидантами могут быть вещества, составленные из природных хинонов и «молекул-электровозов» — синтетических катионов, заряд которых сильно делокализован по их гидрофобной молекуле. До недавнего времени уже самый первый пункт концепции, изложенной выше, представлялся абсолютно диссидентским подавляющему большинству геронтологов. Однако в последние несколько лет ситуация начала быстро меняться, так что в конце 2005 г. нам даже удалось опубликовать в таком престижном и респектабельном журнале, как Nature, статью под названием «Запрограммированное альтруистическое старение»*. В том же году мы начали обширный инвестиционный проект по практическому использованию проникающих катионных антиоксидантов, финансировавшийся О.В. Дерипаской. «Сверхзадачей» проекта была заявлена попытка отменить программу старения.

ГЛАВА ПЯТНАДЦАТАЯ

ПРЕДПОСЫЛКИ ПРОЕКТА ПО АНТИОКСИДАНТАМ, АДРЕСОВАННЫМ В МИТОХОНДРИИ

15.1. Природа АФК и пути их образования в клетке

П очти весь кислород, поглощаемый живыми организмами, превращается в такое безобидное вещество, как вода. Это происходит в результате реакции молекулы О2 с 4 и 4H+. Однако небольшая доля поглощенного О2, обычно не превышающая 1–2%, дает вместо воды анион супероксида (одноэлектронное восстановление О2 до радикала O ) или Н2О2 (двухэлектронное восстановление О2). Этот, казалось бы, незначительный в общем балансе дыхания процесс играет важнейшую роль в регуляции физиологических функций организма и даже его судьбе. Дело в том, что анион супероксида и Н2О2 могут превращаться в АФК, а именно в радикалы пергидроксила (НО2•) или ОН•, а также пероксинитрит (ONOO–), способный давать •ONOO, синглетный кислород (1O2) или все тот же ОН• (рис. 15.1). В свою очередь АФК атакуют самые различные компоненты клетки, включая ДНК, РНК, белки и липиды. Некоторые из АФК настолько агрессивны как окислители, что даже небольшой их доли в общем потреблении кислорода хватает для проявления вредоносного действия, последствия которого могут оказаться

* Longo V.D., Mitteldorf J., Skulachev V.P. Programmed and altruistic ageing // Nature Review Genetics. 2005. № 6. P. 866–872.

Bioenergetica.indb 269

26.01.2011 18:03:53

270

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Рисунок 15.1. Пути восстановления кислорода в организме. Четырехэлектронное восстановление О2 до Н2О происходит в мембранах митохондрий или бактерий и обычно сопряжено с переносом внутримитохондриальных (внутрибактериальных) ионов Н+ наружу митохондрии (бактерии). Одноэлектронное восстановление О2 дает анион супероксида, который при кислых рН протонируется, а при нейтральных восстанавливается до О22–(в реакции дисмутации 2O → О22– + О2) или соединяется с NO•, давая анион пероксинитрита. О22– протонируется в Н2О2 или восстанавливается до О23–, который затем превращается в Н2О и радикал ОН•

трагическими для митохондрии, клетки и даже для организма в целом. Ведь если 1% от тех 400 л О2, которые поглощает в день взрослый человек среднего веса, пойдут на образование не воды, а АФК, то это будет означать продукцию 4 л супероксида в день. Нетрудно представить себе последствия, если учесть, что такой продукт дальнейшего превращения супероксида, как радикал гидроксила, может соперничать по токсичности с «хлоркой», применяемой при дезинфекции. Первоначально считалось, что образование АФК — неизбежная «расплата» за аэробный образ жизни, поскольку мелкие, незаряженные и довольно гидрофобные молекулы О2, свободно проникающие через мембраны и даже накапливающиеся в них, чисто химически (неферментативно) могут окислять редокс-группы белков, способные к одноэлектронному восстановлению кислорода. К таким группам относят полувосстановленные (семихинонные) формы убихинона, пластохинона, менахинона, флавинов, а также [Fe–S]-кластеры негемовых железопротеидов с редокс-потенциалами, близкими к таковому пары супероксид / кислород*. Однако многочисленные публикации последних лет убедительно свидетельствуют о том, что если даже АФК и служат побочными продуктами метаболизма, то тем не менее их образование и уборка тщательно контролируются организмом. В результате концентрация АФК в организме может варьировать на порядки в результате действия специальных регулирующих систем. * Стандартный потенциал пары O /O2 около –0,3 В. Реальный потенциал хотя и несколько положительнее из-за превышения [O2] над [O ], все еще располагается в отрицательной области шкалы редокс-потенциалов.

Bioenergetica.indb 270

26.01.2011 18:03:53

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 271

В случае наиболее мощных генераторов АФК, таких, как комплексы I и III (а также комплекс II, дегидрогеназы дигидролипоата и цитохрома Р450), образование O выглядит как «преждевременная утечка» электронов, которые вместо переноса по дыхательной цепи (или применительно к цитохрому Р450 — участия в оксигенации субстрата) захватываются кислородом в процессе его одноэлектронного восстановления. Ввиду колоссальных объемов кислорода, поглощаемых дыхательной цепью, даже очень небольшая их «утечка» должна привести к образованию таких количеств АФК, которые значительно больше тех, что генерируются ферментами, специализированными на восстановлении О2 до O или Н2О2, т.е. моноаминооксидазой внешней митохондриальной мембраны, NADPH-оксидазой плазмалеммы, оксидазами пероксисом, ксантиноксидазой и некоторыми другими ферментными системами (табл. 15.1). Большему вкладу дыхательной цепи в общую генерацию АФК организмом соответствует и значительное количественное преобладание ферментов этой цепи над другими оксидазами и оксигеназами. Ферменты дыхательной цепи — один из основных компонентов внутренней мембраны митохондрий, общая площадь которой в организме человека равна примерно 14 тыс. м2. Прямые измерения распределения АФК в разных участках живой клетки показали, что, например, вспышка образования АФК при самоубийстве дрожжевой клетки первоначально происходит в ее митохондриях (см. ниже рис. 15.9 А).

15.2. Как живые системы защищаются от АФК? 15.2.1. Вещества-антиоксиданты Традиционно в качестве защиты от АФК рассматривают прежде всего вещества-антиоксиданты, убирающие ядовитые формы кислорода. Результат взаимодействия АФК и антиоксидантов состоит в том, что АФК инактивируются, а антиоксиданты, как правило, портятся, теряя свои защитные свойства. Антиоксидант гибнет, как бы прикрывая собой другие, более важные биомолекулы, такие, как ДНК, РНК, белки, фосфолипиды и т.п. Иногда возможна регенерация окисленного антиоксиданта в исходную активную форму. Антиоксиданты принято делить на водорастворимые, действующие в гидрофильных областях клетки (аскорбиновая кислота, SH-глутатион, цистеин и др.), и жирорастворимые, призванные защищать мембранные структуры (СoQ, пластохинон, витамины A, D, E и K). Например, СoQH2 может восстанавливать свободнорадикальные формы липидов, окисляясь в СoQ•–. Полученный СoQ•– регенерирует в исходный СoQH2, восстанавливаясь комплексом I, II или III.

15.2.2. Снижение внутриклеточной концентрации кислорода В последнее время все больше внимания уделяется биологическим механизмам защиты от АФК, снижающим продукцию активных форм кислорода в клетке, а не убирающим уже образовавшиеся АФК.

Bioenergetica.indb 271

26.01.2011 18:03:54

272

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы... Таблица 15.1. Генераторы АФК в живой клетке

Фермент

Тип АФК

Чем является образование АФК?

Предполагаемый вклад в общую продукцию АФК организмом

Локализация

Комплекс I

O

Результатом утечки на О2

Наибольший

Внутренняя часть внутренней мембраны митохондрий

Комплекс III

O

«

Довольно большой

Внешняя часть внутренней мембраны митохондрий

Комплекс II

O

«

Малый

Внутренняя часть внутренней мембраны митохондрий

Дегидрогеназа дигидролипоата

O

«

«

Матрикс митохондрий

Цитохром Р450

O

«

«

Эндоплазматический ретикулум печени, внутренняя мембрана митохондрий печени и коры надпочечника

NADPHоксидаза

O

Одним из основных продуктов реакции

«

Внешняя мембрана клетки

Моноаминоксидаза

Н2О2

«

«

Внешняя мембрана митохондрии

Оксидазы мочевой кислоты, D- и L-аминокислот

Н2О2

«

«

Пероксисома

Ксантиноксидаза

O , Н2О2

«

«

Молоко; цитозоль клетки

Все аэробные организмы располагают глубокоэшелонированной системой защиты от АФК путем предотвращения самой их генерации. Простейшим приемом служит снижение внутриклеточной концентрации кислорода. Дело в том, что цитохромоксидаза и другие терминальные оксидазы, восстанавливающие О2 до Н2О, сохраняют максимальную активность вплоть до концентрации кислорода, составляющей всего несколько процентов от той, которая имеется в воде при нормальном давлении кислорода в воздухе. В то же время скорость восстановления О2 до O в митохондриях линейно зависит от [O2] во всем диапазоне концентраций кислорода. Вот почему снижение в 10–20 раз уровня [O2] внутри клетки ведет к резкому торможение продукции O без существенного торможения цитохромоксидазной реакции, а значит, и без уменьшения скорости дыхания и сопряженного

Bioenergetica.indb 272

26.01.2011 18:03:54

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 273 Рисунок 15.2. Ферментативное (четырехэлектронное) и неферментативное (одноэлектронное) восстановление О2 как функция от концентрации кислорода [O2]. Концентрация O2, обеспечивающая полумаксимальную скорость ферментативного восстановления (О2 → Н2О), считается равной 3 × 10–7М. Принято также, что скорость неферментативного восстановления (О2 → O ) линейно повышается с ростом концентрации О2. Скорость поглощения О2 при уровне О2, соответствующем атмосферному давлению кислорода (0,22 мМ), взята за 100%. При этом следует помнить, что абсолютная скорость поглощения О2, принятая за 100% для реакции О2 → Н2О, обычно по крайней мере на два порядка больше, чем для реакции О2 → O [Skulachev, Quart. Rev. Biophys., 1996, 29: 169–202]

с ним синтеза ATP. И действительно, измерения [O2] в тканях животных показали, что эта величина примерно на порядок ниже, чем в воде, насыщенной воздухом, т.е. лежит в области В на рис. 15.2. Эта область выгодно отличается как от области А (где [O2] слишком мала для поддержания высокой скорости цитохромоксидазной реакции), так и от области С (где повышение [O2] приводит к развязыванию одноэлектронного восстановления кислорода без какого-либо выигрыша для цитохромоксидазы). В любой ткани, кроме легких, [O2] поддерживается на уровне существенно более низком, чем в равновесии с воздухом, только потому, что в покое скорость доставки О2 от легких к другим органам специально удерживается в области значений, весьма далеких от максимально возможных. Эта скорость резко возрастает при переходе от покоя к интенсивной работе. Улучшается вентиляция легких, усиливается работа сердца, растет скорость кровотока, расширяются кровеносные сосуды. Параллельно повышается потребление кислорода цитохромоксидазой из-за появления свободного ADP (см. выше, разд. 7.1). Но и в новых условиях соотношение скоростей потребления кислорода в тканях и его доставки оказываются отрегулированными таким образом, что [O2] в клетках не увеличивается выше 10% от насыщения на воздухе. При этом организм отслеживает концентрацию АФК в крови с помощью особых сенсоров, которые вызывают сужение сосудов в ответ на рост [O ]. Стратегия, описанная выше, невозможна для одноклеточных. Так, даже азотобактер, имеющий рекордную среди живых существ скорость дыхания (см. разд. 5.2.4), не в состоянии, как показал наш расчет, существенно понизить внутриклеточную [O2] из-за слишком короткой дистанции между цитозолем бактериальной клетки и средой: поглощение О2 цитохромоксидазой тотчас компенсируется потоком О2 извне. Здесь на помощь приходит полисахаридная «шуба», окружающая клетку азотобактера. «Шуба» исключает конвекцию жидкости, омывающей непосредственно бактериальную стенку, что резко замедляет движение О2 из среды к бактерии. Проблема защиты от кислорода стоит для азотобактера особенно остро в средах, не содержа-

Bioenergetica.indb 273

26.01.2011 18:03:55

274

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

щих солей аммония. В этом случае азотобактеру, чтобы выжить, приходится восстанавливать молекулярный азот до аммиака, чем занимается специальный фермент — нитрогеназа. Последняя чрезвычайно чувствительна к О2, даже следы которого ее быстро инактивируют. Неудивительно, что именно в условиях фиксации N2 азотобактер включает особую упрощенную дыхательную цепь, поглощающую кислород гораздо быстрее, чем делает это «каноническая» цепь, составленная из комплексов I, III и IV. Простая цепь, получившая название цепи дыхательной защиты, состоит всего из двух ферментов: 1) несопряженной NADH-дегидрогеназы II с ее единственным редокс-центром (FAD), которая восстанавливает CoQ посредством NADH, и 2) bd-хинолоксидазы, окисляющей полученный CoQH2 кислородом. Эта вторая реакция генерирует с эффективностью H+/ = 1, т.е. вдвое меньшей, чем у комплекса IV (см. разд. 5.2.4). В итоге цепь дыхательной защиты транспортирует всего 2Н+ на каждую молекулу окисляемого NADH вместо 10Н+ в случае «канонической» цепи. Следовательно, азотобактеру в условиях дыхательной защиты приходится окислять в 5 раз больше NADH, чтобы получить столько же АТР, сколько синтезирует обычная дыхательная цепь (см. рис. 5.6). Иной путь защиты от кислорода избрала бактерия E. coli. Как было показано в нашей лаборатории Е.О. Будрене, эти бактерии в ответ на появление в среде Н2О2 собираются в кластеры, каждый из которых состоит из тысяч отдельных клеток. Сигналом к движению бактерий навстречу друг другу служит градиент аттрактанта — аспарагиновой кислоты, которую они начинают выделять в среду при добавлении перекиси водорода. В результате на чашке с полужидким агаром образуется множество скоплений (кластеров) бактериальных клеток, каждое из которых состоит из большого количества отдельных бактерий. Кластеры могут образовывать правильные структуры различной формы (рис. 15.3), по-видимому отражающие неравномерное распределение аспартата в агаре. Можно полагать, что внешние слои бактерий в кластере поглощают кислород, тем самым понижая его концентрацию в глубинных слоях кластера. В результате бактерии во внешних слоРисунок 15.3. Кластеры, образованные ях жертвуют собой, прикрывая тех, кто скоплениями клеток E. coli на чашках Пеоказался внутри кластера. три с полужидким агаром. Каждая светлая В известном смысле аналогичная точка — кластер, состоящий из множества стратегия применяется в очень крупных бактерий (по Е.О. Будрене)

Bioenergetica.indb 274

26.01.2011 18:03:55

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 275

мышечных клетках. Здесь митохондрии скапливаются непосредственно под внешней клеточной мембраной (сарколеммой). От этих скоплений вглубь клетки уходят длинные митохондриальные тяжи, связывающие субсарколеммальные митохондрии с межфибриллярными, локализованными внутри мышечного волокна, т.е. между пучками актомиозиновых нитей. Предполагается, что кислород, поступающий в мышечную клетку, потребляется субсарколеммальными митохондриями, дыхательная цепь которых образует . Образованная передается затем по митохондриальным тяжам к межфибриллярным митохондриям, которые делают АТР за счет энергии, поступающей туда в виде (см. рис. 11.7).

15.2.3. Уменьшение генерации АФК дыхательной цепью Мягкое разобщение служит, по-видимому, одним из механизмов, снижающих продукцию АФК комплексами I и III. Как было показано в нашей лаборатории А. А. Старковым и соавторами, генерация перекиси водорода изолированными митохондриями сердца, окисляющими сукцинат, очень сильно зависит от величины разности электрических потенциалов (ΔΨ) на митохондриальной мембране (рис. 15.4). В тех же опытах было установлено, что ингибитор комплекса I ротенон тормозит образование Н2О2 на 80%, ингибитор комплекса III миксотиазол — на 15%, а разобщитель-

Рисунок 15.4. Пороговая зависимость образования перекиси водорода окисляющими сукцинат митохондриями от величины мембранного потенциала (ΔΨ). Мембранный потенциал снижали: 1) разобщителем SF6847, стимулирующим дыхание путем повыщения Н+-проводимости митохондриальной мембраны (черные квадраты); 2) малонатом, тормозящим поступление электронов в дыхательную цепь (красные квадраты), или 3) аденозиндифосфатом, стимулирующим дыхание посредством включения механизма синтеза АТР (зеленый треугольник) [Korshunov et al., FEBS Lett., 1997, 416: 15–18]

Bioenergetica.indb 275

26.01.2011 18:03:55

276

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

протонофор — на 95%. Эти результаты позволили заключить, что 80% Н2О2 образуется путем энергозависимого обратного переноса электронов комплексом I от сукцината (редокс-потенциал пары фумарат / сукцинат +0,03 В) к О2 (редокс-потенциал пары О2/ O –0,3 В). Еще 15% от общего количества перекиси водорода возникает в Q-цикле при реакции семихинонной формы убихинона (CoQ•–) с О2 в условиях дыхательного контроля, когда высокая ΔΨ блокирует перенос электронов от гема bL к гему bH и тем самым предотвращает окисление CoQ•– посредством гема bL (см. разд. 4.3). Как тот, так и другой механизмы, согласно рис. 15.5, выключались, если ΔΨ несколько снижалась разобщителем, ингибиРисунок 15.5. Два места образотором сукцинатдегидрогеназы малонатом вания АФК в дыхательной цепи или включением процесса окислительного митохондрий фосфорилирования добавкой ADP. Есть основания полагать, что такого рода снижение ΔΨ in vivo может быть вызвано небольшим («мягким») разобщением дыхания и фосфорилирования жирными кислотами. Такое разобщение может опосредоваться АТР/ADPантипортером, аспартат / глутамат-антипортером а также некоторыми другими митохондриальными переносчиками анионов, транспортирующими не только анионы своих специфических субстратов (нуклеотидов, аминокислот и т.д.), но и анионы жирных кислот (см. разд. 10.2.2). Инактивация аконитазы супероксидом может быть следующей линией обороны митохондрий от АФК. Показано, что супероксид вызывает окисление одного из четырех ионов негемового железа, имеющихся в аконитазе — ферменте, катализирующем первую реакцию цикла Кребса. Такое окисление ведет к потере этого иона и обратимо инактивирует фермент. Неактивная аконитаза реактивируется, связывая ион Fe2+. Выключение аконитазы супероксидом блокирует цикл Кребса в самом его начале. Поскольку именно цикл Кребса служит главным поставщиком электронов при дыхании, его блокада опустошает дыхательную цепь. Все ее электронные переносчики переходят в окисленную форму и уже не могут восстанавливать О2 ни до Н2О, ни до O . В итоге тормозится генерация O , первичного предшественника митохондриальных АФК. Торможение аконитазы имеет еще одно следствие: в клетке накапливается цитрат — субстрат этого фермента. Цитрат — трехзарядный анион, образующий комплексы с Fe2+ и Fe3+. Комплекс цитрат3–-Fe2+ способен к самоокислению посредством О2, превращаясь в еще более прочный комплекс цитрат3–-Fe3+. Поэтому в аэробных условиях накопление цитрата должно способствовать уменьшению концентрации ионов Fe2+, которые служат наилучшим донором электронов для восстановления иона пероксида (О22–), завершающегося образованием радикала ОН• — наиболее опасной формы

Bioenergetica.indb 276

26.01.2011 18:03:56

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 277 Рисунок 15.6. Торможение аконитазы посредством АФК и некоторые последствия этого события. Объяснения в тексте

ингибирование цикла Кребса

АФК (см. выше, рис. 15.1). Таким образом, выключив аконитазу, митохондрия достигает, во-первых, уменьшения образования O и, стало быть, всех АФК, служащих производными супероксида, и, во-вторых, торможения генерации ОН• (рис. 15.6).

15.2.4. Митоптоз Митоптоз (или самоубийство митохондрий) под действием АФК — последний эшелон защиты клетки от тех митохондрий, которые образуют слишком много АФК. Митоптоз, включаемый активными формами кислорода, может осуществляться несколькими способами. Один из них — открытие пор во внутренней митохондриальной мембране. Наиболее вероятный сценарий

Bioenergetica.indb 277

26.01.2011 18:03:57

278

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

этого события состоит в следующем. АФК окисляют обращенные в сторону матрикса SH-группы АТР/ADP-антипортера (или какого-то другого митохондриального переносчика анионов), что приводит к вскрытию того участка антипортера, который образует барьер между обводненной «воронкой» антипортера и противоположной поверхностью мембраны (см. выше рис. 9.9–9.10). Так образуется довольно крупная пора, проницаемая для веи всех градиществ с массой менее 1,5 кДа, что приводит к рассеянию ентов низкомолекулярных компонентов между матриксом и межмембранным пространством митохондрии. Такая митохондрия неизбежно «пойдет ко дну», как корабль с открытыми кингстонами. Гибель митохондрии, открывшей поры, будет вызвана не только выходом NAD+, NADP+ и других кофакторов, необходимых для нормального функционирования органеллы, но и из-за прекращения такого важнейшего репаративного процесса, как замена старых, испорченных белков новыми, активными. Один из этапов импорта белков-предшественников из цитозоля в митохондрию (а таких белков насчитывается около шести сотен), как правило, осуществляется электрофоретически: положительно заряженная «лидерная» последовательность белка под действием ΔΨ движется в сторону отрицательно заряженного матрикса). Этот процесс оказывается невозможным при открытых порах, когда ΔΨ равен нулю. Даже те 13–15 белков, которые кодируются митохондриальной ДНК, не могут быть правильно уложены в мембране, так как здесь также требуется ΔΨ. Еще одно следствие избыточной продукции АФК в митохондрии, — по существу, гибельное для органеллы, — состоит в том, что АФК инактивируют аконитазу, в норме связанную с митохондриальной ДНК. Инактивация понижает сродство аконитазы к ДНК. В результате ДНК обнажается и становится беззащитной к повреждающему действию АФК и других неблагоприятных воздействий. Дело в том, что митохондрия лишена гистонов, выполняющих защитную функцию применительно к ядерной ДНК, а аконитаза, по данным Р. Бутова, служит одним из белков, выполняющих функцию гистонов в митохондриях. Следует подчеркнуть, что открытие пор и окисление аконитазы суть прямые следствия повышения уровня АФК в митохондриях. Оба эти события не требуют каких-либо внемитохондриальных факторов и осуществляются теми АФК, которые образовались внутри данной митохондрии. Сказанное означает, что мы имеем здесь дело с самоубийством митохондрии, не справившейся с задачей поддержания своих АФК на безопасном уровне. Подобное явление, названное нами митоптозом, представляет собой механизм очистки митохондриальной популяции от митохондрий, ставших опасными для клетки из-за ускорения генерации (или замедления уборки) активных форм кислорода. Появление таких аномальных органелл может быть, например, следствием мутаций в митохондриальной ДНК. «Трупы» погибших митохондрий обычно убираются посредством автофагии. В этом процессе ключевую роль играют автофагосомы — органеллы, окруженные, наподобие митохондрий, двумя мембранами, но их внутренняя мембрана, в отличие от митохондриальной, не образует впячиваний

Bioenergetica.indb 278

26.01.2011 18:03:57

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 279

(крист). Автофагосомы могут быть специфичными к поглощаемым ими органеллам. Различают митофагию (уборку митохондрий) и пероксифагию (уборку пероксисом). Органеллы, попавшие внутрь автофагосомы, частично перевариваются, после чего автофагосома сливается с лизосомой, где процесс переваривания завершается*. Митоптоз должен быть полезен для клетки, пока он представляет собой «очистку стада от немногих паршивых овец». Хуже, если эпидемия суперпродукции АФК охватила всю митохондриальную популяцию клетки или хотя бы большую ее часть. Тогда гибнущие митохондрии увлекают с собой в небытие и саму клетку. Это происходит не только потому, что в подавляющем большинстве типов нормальных клеток, в отличие от раковых, гликолиз слишком слаб, чтобы эффективно заменить дыхание в качестве источника энергии, а также не потому, что помимо выполнения чисто энергетических функций митохондрии играют жизненно важную роль в обмене веществ. Смерть клетки при массовой дисфункции митохондрий наступит намного раньше, чем в ней кончится АТР или какие-то метаболиты, образуемые митохондриями. В этом случае мы имеем дело с частным проявление действия особого биологического закона: Живые организмы стремятся избежать спонтанных, нерегулируемых процессов. Они делают все возможное, чтобы поставить все происходящие в них события под контроль. Наиболее драматичное среди этих событий — смерть. Поэтому неудивительно, что клетка стремится контролировать собственную гибель, предпочитая покончить с собой еще до того, как нарушения ее структуры и функций достигнут уровня, несовместимого с жизнью. Как говаривал один из героев Мольера, незадачливый лекарь мсье Баис: «Лучше умереть по всем правилам, чем выздороветь вопреки этим правилам». Нетрудно представить, какие преимущества дает организму такая стратегия. Агония клетки, гибнущей «не по правилам», могла бы нарушить работу клеток-соседей, а если речь идет, например, о клетках, вырабатывающих какие-либо регуляторные факторы, то и всего организма. Последствия могут быть еще более трагичными, если агонизировавшая клетка все-таки выживет. В процессе агонии, вызванной, например, избытком АФК, клетка вряд ли может гарантировать надежную защиту своей ДНК от АФК. В ре* Механизм митоптоза, описанный выше, является, по всей вероятности, не единственным способом, каким клетки избавляются от «неправильных» митохондрий. Недавно Б.В. Черняком, К.Г. Лямзаевым и др. в нашей группе было обнаружено, что клетка способна собирать такие митохондрии вблизи ядра, окружать мембраной и выбрасывать полученное таким образом «митоптическое тельце», содержащее множество митохондрий, во внеклеточное пространство. Такого рода эффект возникал при культивации раковых клеток линии HeLa в присутствии разобщителя и ингибитора дыхательной цепи, т.е. агентов, превращающих митохондрии из продуцентов АТР в потребители. Так раковые клетки, располагающие мощным гликолизом, предотвращали расщепление митохондриями гликолитического АТР. Можно предположить, что созревание эритроцитов и клеток хрусталика глаза, сопровождающееся исчезновением митохондрий, происходит способом, описанным выше. Это объяснило бы, почему превращение эпителиальных клеток в клетки хрусталика происходит даже тогда, когда выключена автофагия.

Bioenergetica.indb 279

26.01.2011 18:03:57

280

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

зультате выжившая клетка может оказаться безнадежным мутантом, опасным для организма. Таковы, по-видимому, раковые клетки. Поэтому неслучайно апоптоз как форма запрограммированной клеточной смерти служит одним из основных барьеров на пути злокачественного перерождения.

15.2.5. Апоптоз Запрограммированная смерть клетки и, в частности, апоптоз, вызванный активными формами кислорода, в силу причин, изложенных выше, может рассматриваться как следующая линия защиты от АФК. Термин «апоптоз» заимствован у древнеримского ученого и врача Галена. Гален обратил внимание на то, что сломанная ветка уходит в зиму, не сбросив листья, которые жухнут, но не опадают. Поэтому листопад — это активный процесс, а не гибель листьев от холода, как считалось до Галена. У римлян научным языком был греческий, и свое наблюдение Гален определил как «апоптозис» (от греческих слов «апис» — лист и «птозис» — опадание). Когда в 1972 г. Дж.Ф. Керр и сотрудники предположили, что смерть клетки во многих случаях запрограммирована ее геномом, то это явление было обозначено как «apoptosis» (по-русски — «апоптоз»). В 2002 г. Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Х.Р. Хорвицу, Дж.Э. Салстону и С. Бреннеру за открытие генов, управляющих онтогенезом, среди которых оказались и гены запрограммированной смерти клеток. Апоптоз представляет собой длинную цепь событий, в которых, как правило, митохондрии играют центральную роль. Одним из индукторов апоптоза служат АФК. При этом роль АФК состоит главным образом в том, что они нарушают барьерную функцию внешней митохондриальной мембраны и позволяют выйти в цитозоль митохондриальным белкам, локализованным в межмембранном пространстве. Некоторые из этих белков обладают способностью индуцировать апоптоз. К ним относятся, как это ни неожиданно, цитохром с, а также apoptosis-inducing factor (AIF), белок smac, протеаза omi и эндонуклеаза G. Каждый из названных выше белков по-своему стимулирует апоптоз. Так, AIF, открытый в начале 1996 г. парижским биологом Г. Кремером, отправляется, выйдя из митохондрий, в клеточное ядро, где связывается с ДНК. В этом, по-видимому, участвуют 28 положительно заряженных аминокислотных остатков AIF, вынесенных на поверхность белковой глобулы и связывающихся с анионами фосфатных остатков ДНК. В результате ДНК теряет нативную конформацию и становится объектом нуклеаз. Одна из них (эндонуклеаза G) также приходит из митохондрий и вызывает межнуклеосомные разрывы ДНК. У некоторых животных AIF комплексуется с эндонуклеазой G, повышая ее активность. В том же 1996 г., но на несколько месяцев позже Г. Кремера, К. Уанг и сотрудники (и независимо от него в начале 1997 г. Д.Д. Ньюмейер) в США показали, что давно известный биоэнергетикам цитохром с имеет, наряду с дыхательной, также и другую, зловещую функцию — запускает целый каскад процессов, приводящих к запрограммированной гибели клетки. Выйдя

Bioenergetica.indb 280

26.01.2011 18:03:57

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 281

из митохондрий, цитохром с связывается с белком, названным «фактором, активирующим апоптическую протеазу» (apoptosis protease activating factor 1, или Apaf-1). Полученный комплекс присоединяет АТР (лучше dАТР) и превращается в частицу, названную апоптосомой. Апоптосома сорбирует на своей поверхности несколько молекул белка, известного как прокаспаза 9. Сблизившись, молекулы прокаспазы 9 активируют друг друга (переход прокаспаза 9 → каспаза 9). Активные каспазы 9 атакуют прокаспазу 3 и отщепляют часть ее полипептидной цепи, в результате чего получается активная каспаза 3. Объектом действия этой протеазы оказывается целая группа внутриклеточных белков. Все они занимают ключевые позиции на метаболической карте или играют важнейшую роль в структурной организации клетки. Одним из результатов всех этих событий становится межнуклеосомное расщепление ядерной ДНК. Роль smac и omi, двух других проапоптозных белков, также освобождающихся, подобно цитохрому с, AIF и эндонуклеазе G, из митохондрий в цитозоль, состоит в дополнительной активации каскада, запускаемого цитохромом с. Существуют, по меньшей мере, еще два пути индукции апоптоза посредством АФК. Один из них — модификация порина, белка внешней митохондриальной мембраны. В норме этот белок образует поры, проницаемые только для низкомолекулярных веществ. Однако под действием супероксида молекулы порина объединяются в олигомеры, пропускающие также и более крупные молекулы белков. Этот эффект, по-видимому, усиливается белком Bax. В результате белки межмембранника выходят в цитозоль, причем этот процесс уже не требует открытия пор во внутренней мембране. Еще один путь от АФК к внешней мембране митохондрии опосредован протеинкиназой JNK. Этот фермент фосфорилирует Bax, чем вызывает его активацию. Кроме того, JNK фосфорилирует и при этом инактивирует белки Bcl-2 и Bcl-XL, ингибирющие Bax. Остается неизвестным, каким именно образом АФК активируют протеинкиназу JNK. На рис. 15.7 показаны все три пути запуска апоптоза при помощи АФК. Однако было бы ошибочным думать, что схема, представленная на рисунке, исчерпывает все варианты индукции запрограммированной смерти под действием АФК. Дело в том, что помимо апоптоза существует еще один тип программ, смертоносных для клетки, — некроз.

15.2.6. Некроз Традиционно некроз противопоставляют апоптозу. Считалось, что некроз, в отличие от апоптоза, не запрограммирован, представляя собой смерть клетки в условиях, несовместимых с жизнью. Ошибочность этого утверждения стала очевидной, когда выяснилось, что некроз, подобно апоптозу, требует энергии в виде АТР и участия определенных ферментов*. * При полном истощении АТР клетка гибнет неким способом, признаки которого отличаются от таковых как апоптоза, так и некроза (так называемая энергетическая катастрофа).

Bioenergetica.indb 281

26.01.2011 18:03:57

282

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Рисунок 15.7. Как АФК могут активировать апоптоз?

Bioenergetica.indb 282

26.01.2011 18:03:57

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 283

По-видимому, на ранних этапах апоптоз и некроз могут использовать одни и те же механизмы. В случае АФК — это окисление SH-групп АТР/ ADP-антипортера и, как следствие, открытие поры во внутренней мембране митохондрий. Существует и альтернативный путь запускаемого АФК некроза — через JNK. Принципиальное отличие некроза от апоптоза состоит в том, что только при некрозе происходит разрушение внешней мембраны клетки, так что внутриклеточное содержимое выплескивается во внеклеточное пространство. При апоптозе сохраняются барьерные свойства внешней клеточной мембраны, а гибель клетки сопровождается уменьшением ее объема без появления внутриклеточных макромолекул в межклеточнике. При апоптозе клетка как бы не афиширует акт своего самоубийства, в то время как некроз можно сравнить с самосожжением на людной площади. Апоптозная клетка не привлекает к себе внимания других клеток за исключением могильщиков-макрофагов, которые узнают ее по появлению фосфатидилсерина в наружном слое фосфолипидов внешней мембраны (сигнал «съешь меня!»). Напротив, некрозная клетка, лопнув, освобождает в окружающую среду множество веществ, отсутствующих там в норме и провоцирующих образование цитокинов другими клетками. В итоге возникает очаг воспаления. Не случайно, что одно и то же воздействие может вызывать как апоптоз, так и некроз в зависимости от силы этого воздействия. Так, в наших опытах на раковых клетках линии HeLa обнаружилось, что трехкратное снижение уровня внутриклеточного АТР в течение трех часов воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу, а в течение пяти часов — уже к некрозу. Создается впечатление, что клетка-самоубийца выбирает апоптоз, если причиной смерти оказываются какие-то преходящие обстоятельства, и некроз, если речь идет о более опасных факторах, действующих в течение более длительного времени. Девизом апоптозной клетки могло бы быть: «Я не справилась и потому ухожу, не прощаясь», а некрозной: «Смотрите! Грядет катастрофа, смертельно опасная не только для меня, но и для всех нас!»

15.2.7. Феноптоз Митоптоз как запрограммированная самоликвидация неправильно функционирующих митохондрий может быть механизмом митохондриальной селекции, посредством которой «вредные» митохондрии выбраковываются из внутриклеточной популяции этих органелл. Соответственно апоптоз и некроз выполняют ту же роль применительно к популяции клеток в ткани (клеточная селекция). В этой связи закономерен вопрос: действует ли данный принцип также и на уровне организма, т.е. существуют ли способы самоликвидации индивида, функционирующего ошибочно, с точки зрения семьи, сообщества или популяции индивидов? Гипотетический механизм самоликвидации организма мы назвали феноптозом по аналогии с апо- и митоптозами. Феноптозные механизмы могли бы предохранять сообщество организмов от появления зловещих монстров, способных разрушать это сообщество или даже всю популяцию, подобно

Bioenergetica.indb 283

26.01.2011 18:03:58

284

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

тому, как апоптоз предохраняет ткань от злокачественного перерождения, выбраковывая раковые клетки. В случае феноптоза, как и апоптоза, речь может идти о поддержании стабильности («чистоты») генома. Применительно к сложным организмам, отдельные виды которых существуют сотни тысяч и даже миллионы лет, стабильность генома есть главный гарант сохранения видовой индивидуальности. Поэтому было бы неудивительным, если бы организмы, не справившиеся с проблемами защиты или своевременной репарации своих геномов, выбраковывались путем включения каких-то механизмов феноптоза, т.е. биохимического самоубийства. К явлениям феноптоза могут быть отнесены многочисленные примеры запрограммированной смерти бактерий и одноклеточных эукариот. В данном случае самоликвидация клетки есть не что иное, как самоубийство организма, коль скоро этот организм — одноклеточное существо. Интересен ответ бактерий на повреждение их ДНК. Степень повреждения отслеживается специальным белком, индуцирующим сначала ферменты репарации ДНК, а если они не справляются — арест деления клетки. Если и в этом случае повреждение сохраняется, то активируется фермент автолизин, расщепляющий вещества клеточной стенки, — и бактерия гибнет. Аналогичный механизм описан и у дрожжей. Если повреждение ДНК, о котором идет речь, вызвано АФК, то механизм феноптоза, описанный выше, можно рассматривать как способ защиты популяции одноклеточных от ядовитых форм кислорода. В.Н. Манских и, независимо от него, А.В. Лихтенштейном была выдвинута гипотеза, что рак есть не что иное, как феноптозная программа, очищающая популяцию от особей с нестабильным геномом. Одной из причин, вызывающих такую нестабильность, могут быть АФК. Завершая рассмотрение механизмов эшелонированной защиты живых систем от АФК (табл. 15.2), мы сформулировали на этом примере некоторую общебиологическую закономерность, которую можно было бы назвать Самурайским законом биологии: «Лучше умереть, чем ошибиться». В более развернутой форме закон звучит так: сложные биологические системы (от митохондрий до организма) располагают механизмами самоуничтожения. Эти механизмы включаются в тех случаях, когда данная система оказывается опасной или даже просто ненужной для систем, занимающих более высокое положение в биологической иерархии. Таблица 15.2. Рубежи эшелонированной защиты живых систем от АФК

1) 2) 3) 4) 5) 6)

Антиоксиданты. Уменьшение концентрации О2 в клетке. Уменьшение продукции АФК дыхательной цепью вследствие (а) мягкого разобщения и (б) блокады цикла Кребса на уровне аконитазы. Выбраковка митохондрий, образующих избыток АФК (митоптоз). Выбраковка клеток, образующих избыток АФК (апоптоз и некроз). Выбраковка организмов, не справившихся с защитой ДНК от АФК (феноптоз).

Bioenergetica.indb 284

26.01.2011 18:03:58

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 285

15.3. Биологические функции АФК По-видимому, исходно АФК были для живых существ только ядом, а первичная функция дыхания состояла в превращении потенциально ядовитого О2 в безвредную воду. Однако с течением времени организм не только научился жить в присутствии небольших количеств АФК, неизбежно образовывавшихся при одноэлектронном восстановлении кислорода дыхательными ферментами и коферментами, но и начал использовать в своих целях саму ядовитость АФК. Так АФК стали «биологическим оружием», применяемым живой клеткой для борьбы с патогенами, а затем и «самурайским мечом», которым пользуются митохондрии, клетки и, по-видимому, организмы, чтобы свести счеты с жизнью. Наилучшим примером применения клеткой АФК как биологического оружия может служить NADPH-оксидаза внешней клеточной мембраны. Данная оксидаза окисляет NADPH на внутренней стороне этой мембраны. Электроны, отнятые от NADPH, переносятся посредством флавина и особого цитохрома b на противоположную (внешнюю) сторону мембраны, чтобы восстановить О2 до O . Полученный таким образом супероксид выделяется во внеклеточную среду, чтобы превратиться там в более агрессивные формы АФК, убивающие бактерии. Что касается АФК, образуемых внутри клетки (прежде всего в митохондриях), то именно они являются мощными стимуляторами апоптоза и некроза у млекопитающих и феноптоза у одноклеточных. Так, Ф.Ф. Севериным и сотрудниками нашей группы было показано, что смерть дрожжей, вызываемая дрожжевым феромоном, требует генерации АФК в митохондриях гибнущих клеток (рис. 15.8 А). Другой пример — апоптоз раковых клеток (карциномы HeLa), вызванный цитокинами (фактором некроза опухолей, или TNF, рис. 15.8 Б). Поражает размах изменений концентрации АФК: если в норме при использовании данного метода их практически не видно и картина напоминает знаменитый «Черный квадрат» Казимира Малевича, то в условиях индукции феноптоза или апоптоза клетки, прокрашенные на АФК, светятся, как фонари. Недаром в этих случаях говорят о «взрывном» характере образования АФК. Интересно, что антиоксиданты блокируют феноптоз у дрожжей, но не апоптоз клеток HeLa при добавлении к ним избытка TNF. Анализ этих соотношений в нашей группе Б.В. Черняком и сотрудниками показал, что АФК, будучи необязательными для самоубийства конкретной клетки под действием TNF, служат как бы «черной меткой» — смертоносным сигналом (индуктором апоптоза) — для других клеток, не получивших TNF. Посредником в межклеточной передаче апоптозного сигнала оказалась перекись водорода. Такого рода эффект мог бы участвовать в защите ткани от вирусной инфекции, когда зараженная клетка не только сама уходит в апоптоз, но и стимулирует самоубийство соседних клеток — наиболее вероятных потенциальных реципиентов вируса. В результате вокруг зараженной клетки образуется мертвая зона, что блокирует дальнейшее распространение вирусной инфекции. Образование таких зон было прямо продемонстрировано на линии табака, сверхчувствительной к вирусу табачной мозаики. В норме коллективный апоптоз применяется для ликвидации участков ткани и це-

Bioenergetica.indb 285

26.01.2011 18:03:58

286

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Рисунок 15.8. . Генерация АФК в процессе феноптоза дрожжей (А) и апоптоза клеток HeLa (карциномы эпителия шейки матки человека) в культуре (Б). А — ответ дрожжей на амиодарон, включающий феромонный каскад феноптоза на одном из ранних его этапов. Видна колокализация митохондрий (окраска митотрекером оранжевым) и АФК (окраска дихлордигидрофлуоресциндиацетатом, DCF) в клетках № 1–3 [Poznyakovsky et al., J. Cell Biol. 2005, 168: 257–269]. Б — ответ клеток HeLa на добавление фактора некроза опухолей (TNF). Верхний ряд — световая микроскопия; нижний ряд — световая флуоресцентная микроскопия (окраска DCF) [Shchepina et al., Oncogene 2002, 21: 8149–8157]

лых органов в процессе онтогенетического развития организмов. Наглядный пример был описан при исследовании механизма исчезновения хвоста у головастика. Известно, что этот процесс запускается тироидными гормонами. Он может быть изучен на отрезанных хвостах, помещенных в среду определенного состава. Оказалось, что добавление тироксина в этом случае резко повышает продукцию NO и уровень АФК, в частности перекиси водорода. Последняя вызывает массовую гибель (апоптоз) клеток хвоста, раз-

Bioenergetica.indb 286

26.01.2011 18:03:58

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 287

мер которого уменьшается в часовой шкале. Это явление можно определить как органоптоз, вызываемый активными формами кислорода. Описаны случаи, когда АФК служат сигнальными молекулами с не столь мрачными функциями, как «черная метка». Это относится прежде всего к роли активных форм кислорода в мобилизации систем защиты от самих этих форм. Так, увеличение продукции супероксида воспринимается специальными рецепторами, запускающими процесс сужения сосудов, что уменьшает аэрацию тканей, снижает концентрацию О2 в клетке и, стало быть, скорость образования супероксида (см. выше, рис. 15.2). Внутри клеток уменьшение [O2] тормозит гидроксилирование транскрипционного фактора HIF-1. В результате, во-первых, предотвращается инактивация HIF-1 и, во-вторых, тормозится его расщепление в протеосомах. В свою очередь, повышение активности и количества HIF-1 стимулирует работу ряда генов, кодирующих ферменты антиоксидантной защиты. Тем самым клетка страхуется от парадоксального эффекта, когда гипоксия вызывает окислительный стресс. Механизм этого стресса может состоять в закислении ткани за счет активации гликолиза при торможении дыхания ввиду нехватки О2. Закисление ведет к протонированию O с образованием гораздо более агрессивного HO2•. Кроме того, гипоксия и особенно аноксия способствуют восстановлению ионов Fe3+ до Fe2+, запускающего реакцию Фентона (Н2О2 → ОН•, см. рис. 15.1). Оба эти эффекта не так опасны до тех пор, пока отсутствует кислород. Однако реоксигенация («кислородный удар») после гипоксии немедленно приводит к образованию HO2• и ОН• со всеми вытекающими отсюда последствиями. Не исключено, что та же логика объясняет, почему АФК стимулируют ангиогенез — прорастание в ткани новых сосудов. Нехватка О2 провоцирует циклические переходы «гипоксия — реоксигенация» и вызывает повышение уровня АФК по механизмам, описанным выше. В свою очередь, возрастание АФК воспринимается как стимул для мобилизации антигипоксических мер и, в частности, ангиогенеза. К сказанному следует добавить, что небольшие концентрации АФК способствуют пролиферации клеток. Причина такого эффекта остается на сегодня во многом загадочной, хотя уже ясно, что АФК увеличивает уровень циклинов — регуляторных белков, необходимых для осуществления клеточного цикла. Суммируя все сказанное в этом разделе, мы можем заключить, что АФК не только зло, но и необходимый компонент нормальной жизнедеятельности. Показательно наблюдение Н.И. Гольштейна, продемонстрировавшего, что дыхание воздухом, полностью освобожденным от отрицательных аэроионов (т.е. от O ), губительно для животных: мыши умирают через 18 дней, а крысы — через 23 дня.

Bioenergetica.indb 287

26.01.2011 18:04:01

288

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

15.4. Старение как медленный феноптоз, вызываемый повышением уровня АФК 15.4.1. Определение понятия «старение» и краткая история проблемы Старение организма можно определить как согласованное ослабление с возрастом жизненных функций, приводящее к постепенному увеличению риска смерти. Ключевой вопрос в том, что является причиной такого ослабления функций. Вот уже более ста лет в биологии соперничают две точки зрения на эту проблему — оптимистическая и пессимистическая. Первая предполагает, что старение есть конечный этап нашей онтогенетической программы и поэтому может быть отменено путем выключения данного этапа. Вторая рассматривает старение как неизбежный результат функционирования сложной живой системы: накопления ошибок и повреждений в составляющих их биомолекулах, истощения «жизненной силы», функционирования некоторых генов, которые в молодости были полезными, а с возрастом стали вредными и т.д. Совершенно очевидно, что если справедлива пессимистическая гипотеза, то попытки борьбы со старением людей обречены на неудачу: все мы в конце концов должны сломаться, как старый автомобиль. Один из корифеев геронтологии ХХ в. А. Комфорт как-то заметил, что трудно поверить, чтобы лошадь и телега старели одинаково. Тем не менее подавляющее большинство геронтологов до сих пор не разделяют мнение о том, что старение запрограммировано. И лишь совсем недавно были получены факты, прямо свидетельствующие в пользу оптимистической концепции и позволяющие понять, почему в процессе биологической эволюции могли возникнуть активирующиеся с возрастом биохимические механизмы ослабления жизненных функций. Первым, кто указал на возможность запрограммированной смерти организма, был Альфред Рассел Уоллес, вошедший в историю с тем, что одновременно с Дарвином сформулировал идею естественного отбора. Вот что писал Уоллес в одном из своих писем на рубеже 1860–1870-х гг.: «Родители, произведя достаточное количество потомства, становятся помехой для этого потомства, конкурируя с ним за пищу. Естественный отбор выбраковывает родителей и во многих случаях дает преимущество тем расам, представители которых умирают почти сразу же после того, как произвели потомство». Позднее (в 1881 г.) этот принцип был независимо выдвинут и детально развит другим великим биологом — Августом Вейсманом: «Отработанные индивиды не только бесполезны, но даже и вредны, занимая место тех, кто дееспособны… Я рассматриваю смерть не как первичную необходимость, но как нечто приобретенное вторично в качестве адаптации» (выделено авторами). Вейсман был немедленно обвинен современниками в антидарвинизме, хотя сам Дарвин прекрасно отдавал себе отчет в ограниченности своей гипотезы (эволюция происходит только в тех направлениях, которые благо-

Bioenergetica.indb 288

26.01.2011 18:04:01

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 289

приятны для индивида), когда речь шла о половом подборе и групповой адаптации. Вот что писал Дарвин в своей второй знаменитой книге «Происхождение человека»: «Не подлежит сомнению, что сообщество организмов, включающее много членов, всегда готовых прийти на помощь друг другу и пожертвовать собой ради общего дела, одержит победу над большинством других сообществ, и это будет естественным отбором». Сегодня критики Вейсмана обычно цитируют П.Б. Медавара, предположившего, что старение, даже если оно полезно для популяции, не могло возникнуть как механизм, выработанный эволюцией. Медавар утверждал, что в природных условиях подавляющее большинство организмов умирает еще до того, как они постарели. Сегодня ошибочность этого утверждения уже совершенно очевидна. Старение начинается задолго до того, как оно может стать непосредственным поводом для смерти индивида. В то же время оно может опосредованно способствовать этой смерти. Так, прогрессирующее с возрастом ослабление организма безусловно повышает вероятность его смерти при атаке хищниками, патогенами и т.п. Недавно А. Лойсон с коллегами и, независимо от них, Р. Бондурянский и К. Брассил прямо показали, что в естественных условиях как долгоживущие млекопитающие, так и короткоживущие насекомые страдают от старения. Такой результат неудивителен, если учесть, что, например, снижение с возрастом мышечной силы начинается сравнительно рано — в период завершения роста организма, а старение иммунной системы — еще раньше (у человека — между 10 и 15 годами жизни). Гипотеза о том, что смерть может быть следствием реализации некой записанной в геноме программы, была впервые прямо доказана на уровне клеток (мы имеем в виду апоптоз и некроз). В самое последнее время пришло понимание того, что явления запрограммированной смерти прослеживаются на суб- и надклеточных уровнях: были открыты митоптоз, коллективный апоптоз, органоптоз и феноптоз (см. выше). Среди явлений феноптоза важно различать случаи запрограммированной смерти индивида, зависящие и не зависящие от стадий жизненного цикла организма. К последним можно отнести, например, альтруистическую гибель индивида (одно- или многоклеточного), зараженного патогеном. Таким образом может предотвращаться распространение инфекции в популяции. Подобные явления, молекулярный механизм которых уже хорошо изучен на бактериях, могут рассматриваться как прецедент самого существования запрограммированной смерти на уровне организма и биологического смысла такого явления. Однако в аспекте проблемы старения интереснее случаи, когда запрограммированная смерть приурочена к определенному этапу индивидуальной истории жизни существа.

15.4.2. Феноптоз организмов, размножающихся однократно Как было впервые отмечено Уоллесом, у подобных видов организм устроен таким образом, что само это устройство предопределяет гибель живого существа вскоре после размножения. Например, имаго поденки живет всего пару дней, потому что не может есть: у нее нет функционирующего

Bioenergetica.indb 289

26.01.2011 18:04:01

290

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

рта, а кишечник заполнен воздухом. У одного из видов клеща потомки выводятся внутри тела матери и прогрызают себе путь на волю, тем самым убивая мать. У некоторых кальмаров самец гибнет тотчас после того, как перенесет свой сперматофор под кожу самке. Самка одного из видов осьминога полностью теряет аппетит и гибнет с голоду после того, как маленькие осьминоги вылупятся из кладки яиц, которые она отложила и затем ревностно охраняла. Трагического для самки события не произойдет, если у нее удалить обе так называемые оптические железы. Такая операция вчетверо продлевает жизнь животного. Семяизвержение у самца богомола становится возможным только после того, как его обезглавит самка в конце полового акта. А самцы австралийской сумчатой мыши гибнут через две недели после гона под действием избытка собственных феромонов (ср. с феноптозом дрожжей, вызванным феромоном, о котором уже шла речь выше). Поразительные наблюдения были сделаны при изучении лососей. Тихоокеанский лосось Oncorhynchus keta (кета) умирает вскоре после того, как вымечет икру. Смерть наступает в результате ускоренного старения (прогерии), развивающегося, когда рыба покидает океан и плывет по реке к ее верховьям. Традиционное объяснение этого явления состояло в том, что животное тратит слишком много энергии, двигаясь долгое время против течения. Однако эта точка зрения оказалась ошибочной, потому что, вопервых, старение и смерть не наступают, если у лосося удалить гонады или надпочечники, и, во-вторых, прогерия развивается даже в тех случаях, когда рыба нерестится в верховьях совсем коротких речек со слабым течением. Сравнили две популяции тихоокеанского лосося, одна из которых нерестилась в верховьях Амура (реки, длина которой свыше двух тысяч км), а другая на Сахалине, в маленьком ручейке длиной всего в 200 метров. В обоих случаях нерестящаяся рыба имела все признаки преждевременного старения, приводившего к смерти. По-видимому, сигналом к развитию старения служил переход из морской воды в пресную. В данном случае биологический смысл самоубийства состоит в том, что трупы отнерестившихся рыб служат отличной пищей для речных беспозвоночных, которые в свою очередь поедаются мальками лососей. В какой мере закономерности ускоренного старения лосося применимы к медленному старению других животных? С.Н. Аустад считает, что эти два явления совершенно различны по своей природе и механизму: прогерия есть программа, а медленное старение — накопление случайных ошибок. Однако такому взгляду противоречит тот очевидный факт, что прогерии лосося сопутствует множество признаков, присущих обычному процессу старения: остеопороз, снижение иммунной защиты, опухоли, утончение кожи, уменьшение числа мышечных клеток (саркопения) и т.д. Недавно в мозгу нерестящегося лосося обнаружили пептиды амилоидных бляшек, которые возникают у пожилых людей, страдающих болезнью Альцгеймера. Одна из функций явлений феноптоза, описанных выше, состоит в увеличении разнообразия потомства. Реализация феноптозной программы у осьминожихи приводит к тому, что она размножается только раз в жизни. Поэтому среди произошедших от нее осьминогов не будет младших или

Bioenergetica.indb 290

26.01.2011 18:04:01

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 291

старших братьев и сестер. Это значит, что в прямом родстве друг с другом будет состоять только клон осьминогов, произошедший из яиц одной и той же кладки. Иной смысл имеет феноптоз бамбука. Бамбуковая рощица размножается вегетативно в течение 15–20 лет, после чего переходит на половое размножение, зацветает, образует семена и тотчас засыхает в самый разгар лета. Так растения-родители освобождают жизненное пространство растениямпотомкам (рис. 15.9).

Рисунок 15.9. Феноптоз бамбука. Ботанический сад в Гетеборге, начало июля

15.4.3. Старение — медленный феноптоз? Приняв, что старение запрограммировано, нам прежде всего придется ответить на следующие два вопроса: (1) каков возможный биологический смысл старения как медленного угасания биологических функций и (2) как можно себе представить такой механизм программы старения, который не будет выбраковываться естественным отбором? Ведь потерявшие его и потому не стареющие мутантные организмы должны, казалось бы, иметь неоспоримые преимущества перед стареющими. Отвечая на первый из этих вопросов, можно предположить, что медленный процесс старения служит одним из механизмов, необходимых для успешной эволюции. Давайте рассмотрим следующий умозрительный эксперимент. Два молодых зайца, — один поумней, другой поглупей, — встретив лису, имеют практически равные шансы удрать от врага просто потому, что бегают гораздо быстрей лисы. Однако с возрастом умный заяц получит преимущество перед глупым, и это преимущество может оказаться решающим, когда скорости бега зайцев снизятся из-за старения до скорости бега лисы. Теперь у умного зайца, который, увидев лису, тотчас пустится наутек, будет гораздо больше шансов спастись, чем у глупого, который замешкается, а значит, только умный будет продолжать плодить зайчат. В результате заячья популяция поумнеет. Существенно, что молодая (т.е. более многочисленная и интенсивнее размножающаяся) часть популяции не будет участвовать в таком эксперименте, служа гарантией стабильности всего того, что уже достигнуто эволюцией. В то же время стареющая часть популяции может себе позволить несколько изменить генотип, инициировав отбор какого-то нового свойства. Если это свойство окажется действительно полезным, то оно будет закреплено в потомстве. Если же у нового признака окажутся неблагоприятные побочные эффекты, потенциально разрушительные для вида, признак не пройдет сито отбора, а сам эксперимент вряд ли будет иметь серьезные последствия для вида, поскольку старых особей не так уж много, размножаются они не так активно и вскоре просто вымрут.

Bioenergetica.indb 291

26.01.2011 18:04:01

292

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Описанный выше благоприятный для эволюции эффект старения предполагает, что мозг стареет не быстрее, чем мышцы, и мышечная сила ослабевает, когда еще возможно размножение. Эти условия, по-видимому, выполняются, по крайней мере если речь идет о людях. У человека первые признаки атрофии мышц заметны уже в возрасте около 25 лет. В начале этот процесс развивается медленно. В наше время значительное уменьшение мышечной силы начинается в 50-летнем возрасте у шведских мужчин и в 40-летнем у мужчин Саудовской Аравии. С другой стороны, в начале XIX в. снижение того же параметра было заметно уже у 25-летних (исследовали бельгийских мужчин). Такая динамика легко объясняется улучшением уровня жизни за последние два века. В любом случае, как отмечает Т. Голдсмит, «из-за того, что даже небольшое ухудшение вызывает статистически значимое увеличение смертности, следует ожидать, что эволюционный эффект старения у диких животных начинается в сравнительно молодом возрасте». В известных пределах укорочение жизни может благоприятно сказаться на темпе эволюции благодаря сопутствующему этому процессу ускорению смены поколений. Вот почему оказывается выгодным отрегулировать «реостат», определяющий скорость реализации программы старения, на более короткую жизнь, если внешние условия ухудшились. И наоборот, прорвавшись на новые рубежи, т.е. лучше приспособившись к внешним условиям, популяция может позволить себе снизить темп эволюции, другими словами — увеличить продолжительность жизни. Так произошло с позвоночными, когда им удалось завоевать воздушный океан: птицы и летучие мыши живут в несколько раз дольше, чем наземные млекопитающие того же размера. При этом интенсивность метаболизма у птиц в 2,5 раза больше, чем у наземных млекопитающих того же веса. Продолжительность жизни летучей мыши в 17 раз больше, чем у похожей на нее по размеру землеройки, питающейся, как и летучая мышь, насекомыми. Среди птиц есть такие, возраст которых достигает 100 и даже более лет, причем у долгожителей не удается обнаружить каких-либо признаков старения. Что касается наземных позвоночных, то и среди них максимальную продолжительность жизни имеют те, у которых практически нет врагов. Таковы гигантские черепахи. Одна из них, помеченная еще Дарвином, живет до сих пор, получая корм из рук служителей зоопарка. Дело в том, что вес панциря долгожителя оказался слишком большим для мышечного аппарата животного, которое потеряло подвижность и в дикой природе было бы обречено на смерть от жажды. Не описано признаков старения у гренландского кита. Максимальная продолжительность жизни этого животного — более двух веков. Примерно столько же может жить алеутский ерш — северный вид очень крупного морского окуня. Интересно, что среди видов этого рода хищных рыб есть и короткоживущие (максимальная продолжительность жизни не более 12 лет). Можно полагать, что короткоживущие виды обитают в менее благоприятных условиях конкурентной борьбы с другими видами, чем долгоживущие. В любом случае уже то, что виды одного рода могут в 20 раз отличаться по продолжительности жизни, указывает на наличие программы старения, которое

Bioenergetica.indb 292

26.01.2011 18:04:02

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 293

у таких видов вряд ли можно объяснить простым накоплением случайных ошибок. Скорее, виды, лучше приспособившиеся к среде, могут позволить себе отключить программу старения и эволюционировать медленнее. Замечательный пример, иллюстрирующий наличие программы старения, имеющей какой-то весьма важный биологический смысл, продемонстрировали недавние работы на мелких африканских рыбках рода зубастого карпика Nothobranchius. Оказалось, что продолжительность жизни отдельных видов этого рода варьирует в пять раз в зависимости от того, где обитает данный вид в дикой природе. Так, N. furzeri из пересыхающих водоемов в Зимбабве живет всего 3 месяца, что соответствует периоду дождей в этой стране. N. rachovii и N. kuhntae из Мозамбика, где выпадает вчетверо больше осадков, живут 9,5 месяцев, а N. guentheri из Занзибара (влажный климат с двумя дождливыми сезонами) — более 16 месяцев. У рыбок самого короткоживущего вида N. furzeri рост и половое созревание завершаются за месяц, после чего самки многократно нерестятся в течение оставшихся двух месяцев, пока водоем не пересохнет. Из икры, благополучно пережившей засуху, на следующий год вылупятся мальки. Поразительно, что за два последних месяца жизни рыбка успевает состариться, демонстрируя весь набор старческих признаков (замедление движений, потеря «исследовательского» поведения в открытом пространстве, остеопороз (горбатость), накопление липофузциновых гранул в печени, резкое увеличение β-галактозидазной активности в фибробластах кожи и т.д.). У более долгоживущих видов того же рода завершение роста и половое созревание наступает гораздо позднее. Следовательно, позже начинают увеличиваться и биомаркеры старения. Существенно, что указанные различия сохраняются при аквариумном содержании животных, т.е. предопределены генетически и уже не зависят от сиюминутных условий существования. Создается впечатление, что рыбки короткоживущего вида стремятся успеть постареть за тот короткий период жизни, который им отпущен на воле. Важно также, что программа старения имеет сходные проявления у самых отдаленных классов позвоночных — рыб и млекопитающих. Этот консерватизм — безусловное свидетельство древности данной программы. Интересный эксперимент был поставлен самой природой в верховьях рек Оропучо и Ярра (Тринидад). Как обнаружил Д.Н. Резник с коллегами, верховья рек, о которых идет речь, отрезаны от их низовий порогами, непреодолимыми для хищных рыб (прежде всего щук), питающихся гуппи. В результате оказалось, что гуппи в верховьях рек живут практически без своего главного врага, а гуппи в низовьях непрерывно испытывают опасность быть съеденными щукой. Исследователи отловили гуппи из рек выше и ниже по течению относительно водопадов и стали размножать их в аквариумах, где никаких врагов не было. Оказалось, что рыбки второй аквариумной генерации, ранее сосуществовавшие со щуками, (1) живут до 35% дольше, причем исключительно за счет увеличения репродуктивного периода жизни, (2) размножаются вдвое быстрее и (3) почти в полтора раза быстрее стартуют в ответ на появление опасности (совсем как умный заяц в приведенном выше примере с лисой). Нетрудно понять, что первые два

Bioenergetica.indb 293

26.01.2011 18:04:02

294

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

параметра увеличивают плодовитость стаи в условиях постоянных потерь в численности из-за атак хищников, а третий уменьшает такие потери. В целом приведенные данные противоречат одному из ключевых постулатов классической геронтологии — увеличить плодовитость можно лишь за счет сокращения продолжительности жизни*. Анализируя результаты этого природного эксперимента, трудно избежать заключения, что плодовитость и продолжительность жизни регулируются как бы двумя реостатами, иногда по-разному реагирующими на изменение условий внешней среды. Такая регуляция используется популяцией не только для того, чтобы выжить, но и для изменения темпа своей эволюции: в плохих условиях эволюция ускоряется путем увеличения плодовитости, а значит, и разнообразия потомков. Параллельно может сокращаться продолжительность жизни под действием как давления внешней среды, так и внутренних факторов организма. Причем дело здесь не в том, что вся жизненная сила особи уходит на производство потомства и ее не хватает на собственное долгожительство, как полагают Т. Кирквуд и С.Н. Аустад. Если бы оказались правы эти авторы, результаты, полученные Резником, были бы просто необъяснимы. В известных пределах сокращение продолжительности жизни может благоприятно сказаться на темпе эволюции благодаря ускорению смены поколений, сопутствующему этому процессу. Вот почему оказывается выгодным отрегулировать «реостат», определяющий скорость реализации программы старения, на более короткую жизнь, если внешние условия ухудшились. Прорвавшись на новые рубежи, т.е. лучше приспособившись к внешним условиям, популяция может себе позволить снижение темпа эволюции. Случай с гуппи, сброшенными водопадом, так сказать, прямо в щучью пасть, — особый. Когда популяция оказалась перед угрозой немедленного уничтожения, ей, чтобы выжить, пришлось задействовать все имеющиеся ресурсы, увеличив и плодовитость, и продолжительность репродуктивного периода жизни.

15.4.4. Мутации, продлевающие жизнь Если существует генетическая программа старения, то должны быть мутации, продлевающие жизнь. У одного из аскомицетов, мицелиевого гриба Podospora anserina, мутация в одной из субъединиц цитохромоксидазы блокирует активность этого фермента, что индуцирует альтернативную оксидазу, окисляющую CoQH2 кислородом без выделения АФК. Это приводит, вопервых, к резкому снижению уровня АФК и, во-вторых, к переключению с полового размножения на вегетативное в результате действия какого-то еще неизвестного механизма. Такое переключение сопровождается исчезновением морфологических признаков старения и более чем двадцатикратным * Д.Н. Резник был настолько уверен в том, что продолжительность жизни «в аду» должна быть гораздо короче, чем «в раю», что, затевая свой многолетний проект, имел неосторожность предсказать в печати именно такой результат. В последней свой работе Резник с коллегами уже не цитируют своих ошибочных предсказаний.

Bioenergetica.indb 294

26.01.2011 18:04:02

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 295

продлением жизни (с 25 дней до многих месяцев). Подобный результат достигается и другими мутациями (или добавлением соответствующих ингибиторов), инактивирующими главную дыхательную цепь митохондрий (рис. 15.10), а также блокированием гена, кодирующего динамин-подобный белок. Этот белок необходим для одной из ранних стадий апоптоза, опосредованного митохондриями, а именно фрагментации протяженных митохондрий на мелкие. В последнем случае удалось проследить не только резкое замедление той ста- Рисунок 15.10. Дыхательные цепи пододии жизни гриба, которая сопровожда- споры дикого типа (слева) и ее долгоживущего мутанта (справа) ется суперпродукцией АФК, но и явное уменьшение его чувствительности к апоптогенному действию Н2О2. Следует подчеркнуть, что переключение программы, предполагающей короткую продолжительность жизни, на долгожительство может быть достигнуто и без мутаций или ингибирования дыхательной цепи, а именно выращиванием подоспоры в жидкой среде. С. Хекими и сотрудники добились увеличения в 5,5 раза продолжительности жизни нематоды Caenorhabditis elegans. Это происходило в результате мутации в генах инсулинового рецептора Daf-2 и фермента, катализирующего конечный этап биосинтеза CoQ. С. Кэньон и ее коллеги достигли еще большего (в семь раз) эффекта, выключив синтез Daf-2 и белков, ответственных за половое размножение. При этом не было отмечено никаких отличий в жизнедеятельности животных-долгожителей. Дж. Пеличчи с сотрудниками обнаружили, что мутант мышей по гену белка p66shc живет на 30% дольше, а полученные из таких животных фибробласты не отвечают на перекись водорода включением программы апоптоза*. Следующая цепь событий была выявлена у мышей дикого типа: АФК → повреждение ДНК → р53 → стабилизация p66shc → [p66shc]↑ → комплекс цитохрома с и p66shc → O → открытие пор во внутренней митохондриальной мембране → апоптоз. Наиболее интересно для нас комплексообразование p66shc и цитохрома с, которое, по-видимому, придает этому цитохрому способность реагировать с О2, образуя супероксид. In vivo нокаут гена p66shc вызывает понижение степени окислительного повреждения как митохондриальной, так и ядерной ДНК в легких, печени, селезенке, коже, скелетных мышцах и почках, но не в мозге и сердце. Это коррелирует с содержанием «белка старения» в различных органах, которое * Ср. с данными Т. Кирквуда и его сотрудников, показавших существование положительной корреляции между продолжительностью жизни различных млекопитающих и устойчивостью их фибробластов к окислительному стрессу.

Bioenergetica.indb 295

26.01.2011 18:04:03

296

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

оказалось наиболее низким в мозге и сердце, т.е. в органах, стареющих, как правило, в последнюю очередь. В 1971 г. российский геронтолог В.М. Дильман постулировал, что старение находится под гормональным контролем, причем инсулин играет роль фактора, стимулирующего старение. Позже эта мысль получила подтверждение в работах на эукариотах самого различного таксономического положения. Как установил М. Блюхер с соавторами, нокаут инсулинового рецептора в адипоцитах продлевает жизнь мышей на 18%. Независимо от него, М. Хольценбергер с коллегами показали, что мыши, гетерозиготные по рецептору инсулин-подобного фактора первого, живут на 26% дольше, чем дикий тип. Эффект сопровождается понижением [p66shc] на 50%. Среди других участников системы, сокращающей жизнь мышей, были идентифицированы белок Ras и Akt/PKB — протеинкиназа, фосфорилирующая белки по серину и треонину. Указания на сокращение продолжительности жизни инсулин-подобными факторами были получены также на мухах и нематодах. У C. elegans мутация в гене daf-2 удлиняет жизнь в 2–3 раза. У тех же животных, как выяснилось, NAD+-зависимая деацетилаза гистонов (белок SIR2.1) подавляет один из инсулиновых регуляторных каскадов и увеличивает продолжительность жизни. Повышение дозы гена sir2 у дрожжей продлевает им жизнь. В. Лонго и его сотрудники отмечали 2–3-кратное повышение продолжительности жизни дрожжей путем делеции генов Ras2 и аналога гена Akt. Существуют многочисленные свидетельства того, что повреждение митохондриальной ДНК специфически участвует в регуляторном каскаде, который обусловливает старение как дрожжей, так и животных. Совсем недавно это положение было прямо подтверждено в элегантных опытах, выполненных в лабораториях Н.-Г. Ларшона, Т.А. Проллы и Г. Зассенхауза. Исследователи нашли, что экспрессия мутантной митохондриальной ДНКполимеразы, сохранившей способность синтезировать ДНК, но утратившей возможность корректировать ошибки при этом синтезе, ведет к сильному увеличению частоты мутаций митохондриальной ДНК, особенно в области цитохрома b, значительному сокращению продолжительности жизни и появлению многих типичных признаков старения. Группе Зассенхауза, модифицировавшей ДНК-полимеразу только в сердечной мышце, удалось предотвратить эффект мутации, введя животному циклоспорин А, ингибитор пор во внутренней мембране митохондрий.

15.4.5. АФК и старение Полвека тому назад Д. Хармэн в США и вслед за ним Н.М. Эммануэль в России выдвинули предположение, что старение есть результат повреждения биополимеров (в первую очередь ДНК) посредством АФК. С тех пор было обнаружено множество свидетельств в пользу справедливости этого постулата, причем создалось впечатление, что первичной мишенью АФК при старении служит ДНК митохондрий. Уже нет сомнений, что с возрастом баланс систем генерации и обезвреживания АФК сдвигается таким образом, что возрастает как уровень

Bioenergetica.indb 296

26.01.2011 18:04:03

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 297

Рисунок 15.11. Д. Хармэн (слева) и Н.М. Эммануэль (справа)

АФК, так и степень повреждений, вызываемых АФК. Подобная ситуация приводит к тому, что постепенно увеличивается число клеток, ушедших в апоптоз. Погибшие клетки не заменяются в полной мере новыми, и в результате уменьшается общее количество клеток в тех или иных органах и тканях. Последнее ведет к снижению жизненных функций — основному признаку старения организма. Главная беда старения не в том, что каждая наша клетка работает все хуже, а в том, что клеток этих становится все меньше и меньше. Типичный пример — старческая саркопения, т.е. уменьшение числа клеток в скелетных мышцах*. По данным некоторых исследователей, генерация Н2О2 митохондриями различных тканей птиц существенно ниже, чем млекопитающих того же веса. По данным группы С.Н. Аустада подобные различия наблюдаются также и между летающими и наземными млекопитающими — летучей мышью и землеройкой. В лабораториях Р.С. Сохала, Г. Бархи и М. Бранда было независимо показано, что продолжительность жизни теплокровных тем короче, чем выше скорость генерации АФК при обратном переносе электронов через комплекс I митохондриальной дыхательной цепи. Такой корреляции не наблюдалось, если измеряли генерацию АФК при прямом переносе электронов через тот же участок цепи. Особенно обстоятельной оказалась работа * Интересно, что эта особенность механизма старения была подмечена еще древними греками, приписывавшими богу врачевания Асклепию (у римлян он стал Эскулапом) мысль о том, что «старение есть повреждение всего тела при полной неповрежденности его частей». Сказанное не означает, что в конце концов «части» организма не приходят в негодность, но это терминальная стадия, наступающая гораздо позже того момента, когда включилась программа старения.

Bioenergetica.indb 297

26.01.2011 18:04:03

298

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

группы М. Бранда, исследовавшей 12 видов различных млекопитающих (от мыши до бабуина и коровы) и птиц (от перепелки до голубя). 11 видов отлично легли на прямую, описывающую продолжительность жизни как обратную функцию от скорости генерации АФК. И только один вид оказался явным исключением из правила. Это был так называемый голый землекоп — африканский грызун размером с мышь, живший почти в 10 раз дольше мыши, но образовывавший АФК быстрее, чем мышь. Однако это тот случай, когда исключение лишь подтверждает правило. Дело в том, что голый землекоп оказался единственным нестареющим существом в исследованной выборке видов.

15.4.6. Голый землекоп Голый землекоп, по-английски naked mole-rat, латинское название Heterocephalus glaber (Rodentia: Bathyergidae), — вид мелких грызунов, продолжительность жизни которых в лабораторных условиях достигает 28 лет. Многие заболевания, такие, как рак, атеросклероз, иммунодефициты, а также некоторые виды боли у этих животных не обнаружены. Они живут большими сообществами, состоящими из 200–300 «солдат», «царицы» и нескольких ее сексуальных партнеров. Только «царица» и ее «мужья» принимают участие в размножении. В лабораторных условиях голые землекопы умирают в возрасте 25–28 лет по неизвестным причинам. Уровень их смертности не зависит от возраста, как будто программа старения у этих животных отсутствует. Отключение программы происходит, по-видимому, на этапах, следующих за образованием АФК, так как уровень образования АФК при обратном переносе электронов и степень окисленности биополимеров у этих животных выше, чем у мышей. Приведенные наблюдения неудивительны, если учесть, что активности супероксиддисмутазы и каталазы у этих двух видов — одного порядка величины, а активность третьего антиоксидантного фермента, глутатионпероксидазы, у голого землекопа в 70 раз ниже, чем у мыши. Ключ к пониманию этой парадоксальной ситуации дает наблюдение, показавшее, что клетки голого землекопа чрезвычайно устойчивы к апоптозу, вызванному H2O2. Этим голый землекоп напоминает долгоживущих мышей с мутациями в генах, кодирующих белок p66shc, фермент, участвующий в синтезе CoQ (mClk1), или киназу фактора эдонгации-2. Их клетки резистентны и к апоптозу, вызванному перекисью водорода или другим прооксидантом — менадионом. Возможный механизм исчезновения функции, ставшей ненужной в процессе эволюции голого землекопа, был недавно описан Парк и др. Было установлено, что у этих грызунов отсутствует небольшой 11-членный пептид, который называется субстанцией Р и участвует у других животных в передаче некоторых видов болевых сигналов (в частности, болевого ответа на капсаицин). Капсаицин, как и некоторые другие индукторы боли, не вызывает поведенческого ответа на боль у голого землекопа. Чувствительность к капсаицину можно восстановить, если ввести ДНК, кодирующую субстанцию Р, в ногу животного. Такая процедура не сказывается на чувстви-

Bioenergetica.indb 298

26.01.2011 18:04:04

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 299

тельности к боли других ног. Вполне возможно, что «царица» голых землекопов и ее «мужья» в природе не сталкиваются с внешними источниками боли. В таком случае мутация, нарушающая процесс передачи сигнала от болевых рецепторов кожи, будет нейтральной и избежит элиминации в процессе естественного отбора. Аналогичным образом могла быть отключена и программа старения, которая, согласно нашей гипотезе, дает эволюционные преимущества под давлением естественного отбора лишь при наличии врагов. А у царицы, единственной особи, приносящей потомство и, стало быть, участвующей в эволюционном процессе, врагов практически нет. От них ее защищают жизнь в обширных подземных лабиринтах, охраняемых армией многочисленных солдат, которые в естественных условиях живут не более 3 лет и гибнут в борьбе со змеями, заползающими в их норы. Похоже, что «реостатом», регулирующим продолжительность жизни, служит скорость образования АФК внутри митохондрий. Такой вывод хорошо согласуется с цитированными выше данными Н.Г. Ларшсона и других о прогерии, вызываемой нескорректированными ошибками при синтезе митохондриальной ДНК. Итак, можно полагать, что реализация программы старения включает запрограммированное в геноме усиление образования АФК митохондриями. Губительный эффект АФК может также усиливаться с возрастом запрограммированным ослаблением систем защиты от АФК в митохондриях и других частях клетки. Наблюдения в пользу такого сценария развития событий при старении можно найти в геронтологической литературе. Возникает вопрос, почему в эволюции именно АФК были выбраны в качестве инструмента старения? Нет сомнений, что АФК все еще представляют проблему для современных аэробных форм жизни. Быть может, именно поэтому старение как специализированный механизм эволюции устроено таким образом, чтобы способствовать усовершенствованию антиоксидантной системы организма. В известном смысле АФК действуют наподобие лисы в приведенном выше примере улучшения заячьей породы, но отбор идет не на лучший интеллект, а на лучшую систему защиты от кислорода. Это обстоятельство является прямым следствием участия АФК в осуществлении программ самоликвидации митохондрий, клеток, органов и организмов. Что же запускает программу старения? Нет сомнений, что такой запуск происходит сравнительно рано, скорее всего, в момент прекращения роста организма или даже еще раньше — при завершении полового созревания. Простейший вариант состоит в том, что «хронометр», отсчитывающий годы и дающий сигнал на прекращение роста, не только выключает программу роста, но и запускает программу старения. Характерно, что такие нестареющие животные-долгожители, как жемчужница, щука, крупные крабы, черепахи и киты, растут всю жизнь. Следующий вопрос — где находится «хронометр» и что он собой представляет? Если годы наш организм отсчитывает тем же способом, что и дни, то «хронометр» старения надо искать в супрахиазматическом ядре гипоталамуса, которое ответственно за поддержание суточного ритма млекопитающих. У птиц ту же функцию исполняет эпифиз. Эта железа играет роль

Bioenergetica.indb 299 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:04:04

300

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

в суточном ритме и у млекопитающих, но здесь ее работа запускается супрахиазматическим ядром. В клетках супрахиазматического ядра выявлены периодические биохимические реакции, имеющие следствием появление циклов возбуждения и торможения этих клеток в суточном ритме. Эти циклы передаются нейронами в эпифиз, отвечающий на данный стимул колебаниями продукции гормона мелатонина, который выделяется клетками эпифиза и с кровью переносится во все органы и ткани. Суточные колебания мелатонина в крови суть медиатор суточного ритма функционирования организма. Мелатонин — сам по себе антиоксидант и, Рисунок 15.12. Гипотетическая схема зачто еще важнее, индуктор синтеза мнопрограммированного старения организма гих белков антиоксидантных каскадов. (см. ст. В.П. Скулачева: Рос. хим. журнал. Интересно, что амплитуда суточных 2009. № 53. С. 125–140) колебаний концентрации мелатонина в крови резко снижается при старении, причем это снижение служит, повидимому, самым ранним признаком старения, проявляясь у людей с семилетнего возраста. В целом гипотетическую программу старения организма млекопитающих можно представить себе следующим образом (рис. 15.12). «Хронометр»

15.4.7. Парадокс белка р53 Как прервать программу старения человека, если она действительно существует? Можно было бы нокаутировать гены, в которых эта программа записана, но как их найти и как избежать возможных неблагоприятных последствий такого вмешательства? Показателен пример с белком р53. Л. Донехауэр и его сотрудники обнаружили, что мутация, повышающая активность белка р53, приводит к исключению рака из списка причин смертности животных. Поскольку обычно почти каждая вторая старая мышь умирает от рака, можно было бы ожидать, что исследуемая мутация значительно увеличит мышиную продолжительность жизни. К вящему изумлению исследователей жизнь мутантов, вместо того чтобы удлиниться, в действительности сократилась на 20%. Впоследствии И. Гарсия-Као с коллегами, также получившие активацию р53, но, по-видимому, не столь значительную, как Донехауэр, наблюдали уменьшение случаев злокачественных опухолей с 45 до 17%, но не обнаружили статистически достоверного изменения продолжительности жизни. Этот результат, в общем-то, согласуется с данными Донехауэра, поскольку столь заметное снижение частоты заболеваний раком должно было бы продлить жизнь, чего в действительности не наблюдалось.

Bioenergetica.indb 300

26.01.2011 18:04:04

Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 301

Недавно Г. Скрэйбл и его сотрудники активировали р53 еще одним, вероятно, наиболее эффективным способом, так что продолжительность жизни мышей снизилась втрое. Белок р53 известен как «страж генома». Он ответственен за стимуляцию репарации ДНК, арест клеточного цикла и апоптоз в ответ на увеличивающуюся степень повреждения ДНК. Кроме того, как ясно из опытов Донехауэра и других, р53 стимулирует старение. Сказанное означает, что мутанты, утратившие ген р53, которые, казалось бы, должны победить в процессе естественного отбора как «вечно молодые», в действительности проигрывают из-за появления брешей в эшелонированной системе защиты генома и, стало быть, антираковой защите. В полном соответствии с этой логикой мутанты без р53 жили гораздо меньше, чем дикий тип, погибая исключительно от рака. Простейшее объяснение прогерического эффекта р53 состоит в следующем. По-видимому, этот белок выбраковывает клетки с нарушениями в геноме, но выполняет такую функцию слишком рьяно. В итоге от апоптоза гибнут не только клетки, вступившие на путь малигнизации, но также и те, что могли бы еще жить и жить без всякого злокачественного перерождения. Как прямое следствие этого обстоятельства старение стимулируется на стадии 2 (см. схему, приведенную выше). Итак, сегодня мы могли бы ответить на вопрос, так мучивший Вейсмана много лет назад: «Не может быть никаких сомнений, что высшие организмы устроены таким образом, что содержат в себе семена смерти. Вопрос лишь в том, как они, эти семена, могли возникнуть».

15.4.8. Снижение митохондриальных АФК как возможный способ торможения программы старения Очевиден один из подходов к тому, чтобы прервать программу старения. Если необходимым этапом такой программы служит появление с возрастом избытка АФК в митохондриях, давайте уберем этот избыток. На первый взгляд, подобный эффект могли иметь природные вещества-антиоксиданты, такие, например, как витамин Е, накапливающийся в мембранах. Однако никому не удавалось радикально замедлить старение людей и животных такими антиоксидантами. По-видимому, попытка отменить старение (как и любую другую биологическую программу) наталкивается на противодействие организма, упорно пытающегося эту программу выполнить. Так, оказалось, что повышение потребления витамина Е ведет к индукции в печени особой формы цитохрома Р450, который разрушает избыток витамина Е, поступающего в организм. Вот почему в качестве инструмента для отмены программы старения лучше использовать синтетические антиоксиданты, причем специфически адресованные в митохондрии, коль скоро их мишенью должны быть, прежде всего, внутримитохондриальные АФК. Вопрос состоит в том, как адресовать антиоксидант в митохондрии. В конце 1960-х гг. нами совместно с группой Е.А. Либермана были описаны гидрофобные катионы и анионы, заряд которых сильно делокализован («размазан») по достаточно большой органической молекуле. Впоследствии

Bioenergetica.indb 301

26.01.2011 18:04:05

302

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

американский биоэнергетик Д. Грин назвал подобные вещества ионами Скулачева (Sk+ и Sk–). В силу своей низкой гидратации (диполи воды не могут образовать «водную шубу» вокруг иона, если его заряд делокализован) Sk+ и Sk– легко проникают через мембраны, распределяясь между двумя разделенными мембраной отсеками в соответствии с законом Нернста (10-кратный градиент концентрации иона на каждые 60 мВ ΔΨ). Ввиду логарифмической зависимости ионного градиента от ΔΨ, митохондрия, имеющая ΔΨ = 180 мВ (внутри знак минус), способна поддерживать 1000-кратный градиент Sk+. В качестве примера проникающих ионов мы исследовали катион тетрафенилфосфония и анион тетрафенилбора. Позже С.Е. Северин, Л.С. Ягужинский и один из авторов этой книги (В.П.С.) Рисунок 15.13. Е.А. Либерман выдвинули предположение, что ионы типа Sk+ могут быть «молекулами-электровозами»: если необходимо доставить некоторое вещество Х в митохондрии, достаточно присоединить к нему Sk+. Такое предположение основывалось на том, что матрикс митохондрий — это единственное ограниченное мембраной пространство внутри клетки, заряженное отрицательно относительно цитозоля. Подобная логика была использована нами для объяснения роли катионной группы карнитина в транспорте в митохондрии остатков жирных кислот, а затем М. Мерфи и Р. Смитом — для конструирования антиоксидантов, адресованных в митохондрии. В большинстве работ Мерфи использовалось вещество под названинем MitoQ, где в качестве антиоксиданта был выбран убихинон, а в качестве Sk+ — катион децилтрифенилфосфония. Мы подтвердили способность микромолярных концентраций MitoQ накапливаться в митохондриях и защищать их от окислительного стресса. Однако, как показал в нашей группе М.Ю. Высоких, даже небольшая передозировка этого вещества ведет к изменению знака эффекта: MitoQ становится мощным прооксидантом, катализируя генерацию H2O2 митохондриями с рекордной скоростью (того же порядка, что скорость дыхания митохондрий в отсутствие АDР). Такие же наблюдения были сделаны и в трех других лабораториях, в том числе и в группе Мерфи.

Bioenergetica.indb 302

26.01.2011 18:04:05

ГЛАВА ШЕСТНАДЦАТАЯ

ПРОЕКТ ПО АНТИОКСИДАНТАМ, АДРЕСОВАННЫМ В МИТОХОНДРИИ

16.1. SkQ тормозит программу старения

К огда стало очевидным, что MitoQ вряд ли является реальным кандидатом

на роль антиоксиданта, адресованного в митохондрии с целью затормозить программу старения, мы обратились к пластохинону — переносчику электронов, действующему вместо убихинона в фотосинтетических электронтранспорных цепях хлоропластов растений и цианобактерий. В процессе эволюции возможной причиной замены убихинона, участвующего в дыхательной цепи митохондрий, на пластохинон в хлоропластной фотоцепи той же растительной клетки могли быть именно лучшие антиоксидантные свойства пластохинона по сравнению с убихиноном, описанные В.А. Рогинским в химических опытах на модельных системах. Фактически образующий кислород хлоропласт всегда находится в условиях гораздо более сильного окислительного стресса по сравнению с митохондриями, поглощающими этот кислород. Пластохинон в отличие от убихинона имеет метильные группы вместо метоксильных, а метильная группа убихинона заменена на водород (рис. 16.1). Оказалось, что такие замены резко повышают антиоксидантную активность полученного соединения в биологических системах. Если для

—

Рисунок 16.1. Структурные формулы тетрафенилфосфония и антиоксиданта SkQ1

Bioenergetica.indb 303

26.01.2011 18:04:05

304

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Рисунок 16.2. Прооксидантная (верхняя панель) и антиоксидантная (нижняя панель) активности SkQ и его аналогов на выделенных митохондриях. Прооксидантную активность измеряли по ускорению образования митохондриями H2O2. Антиоксидантную активность измеряли по торможению накопления малонового диальдегида в митохондриях. Отрезки прямых под осью абсцисс показывают размер «окна» между концентрациями, при которых соответствующие производные хинонов вызывают 20% анти- и 20% прооксидантный эффекты [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: 437–461]

Bioenergetica.indb 304

26.01.2011 18:04:06

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

305

MitoQ концентрации, вызывающие анти- и прооксидантные эффекты, различаются менее, чем вдвое (300 и 500 нМ), то для пластохинонового производного децилтрифенилфосфония, названного SkQ1, это различие возросло до 400 раз (2 и 800 нМ, см. рис. 16.2). С получением этого результата стало ясно, что в наших руках оказался уникальный по своей эффективности антиоксидант, действие которого специфически направлено на митохондрии и не осложнено побочным прооксидантным действием. В связи с этим следует указать, что наши работы по SkQ финансировались в 2003–2005 гг. в основном благотворительным фондом «Паритет» (позже «Вольное дело») О.В. Дерипаски, а с 2005 по 2008 г. — им же, но теперь в рамках инвестиционного проекта. В 2008 г. Дерипаска прервал финансирование проекта в связи с кризисом. В течение семи очень трудных месяцев проект поддерживался управляющей компанией В. В. Перехватова «Иконтри». С мая 2009 г. финансирование взяла на себя компания «Исток» А.В. Чикунова. В сентябре 2010 г. к финансовой поддержке проекта присоединилась госкорпорация Роснано (генеральный директор А.Б. Чубайс). Все это время гарантом «непотопляемости» проекта служила наша Alma Mater — МГУ и ее ректор В.А. Садовничий, председатель наблюдательного совета проекта (научным руководителем является один из авторов книги — В.П. Скулачев, а его заместителями — сотрудники МГУ М.В. Скулачев и Б.В. Черняк). За годы, прошедшие с начала проекта, был проведен широкий круг экспериментов — от синтеза новых веществ до их испытаний in vivo на различных живых организмах. Экспериментальные данные, полученные в этих исследованиях, изложены в 10 статьях, опубликованных в 2007–2010 журналами «Биохимия», J. Membr. Biol., FEBS Lett., Biochim. Biophys. Acta, Aging и Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Результаты «мегапроекта», в котором были задействованы сотрудники Института физико-химической биологии им А.Н. Белозерского и ряда факультетов МГУ, а также более 30 других исследовательских институтов в России, Швеции и США, можно суммировать следующим образом. Прежде всего была выполнена работа, которую можно определить как нанобиоинженерию: синтезировали серию небольших (размером около 2 нм) «молекул-электровозов», конъюгированных с различными хинонами. В этих веществах в качестве Sk+ использовали децил- или амилтрифенилфосфоний (соответственно SkQ1 и SkQ5), децилродамин 19 (SkQR1), децилметилкарнитин (SkQ2), децилтрибутиламмоний (SkQ4), а также аналогичные производные метилпластохинона (SkQ3), убихинона (MitoQ), дезметоксиубихинона (DMQ) и ряд других (Г.А. Коршунова и сотр.). На искусственной бислойной фосфолипидной мембране (БЛМ) оценена проникающая способность этих веществ, которая уменьшалась в ряду: SkQR1 > SkQ1, SkQ3, MitoQ > SkQ5 > SkQ4 (И.И. Северина, Ю.Н. Антоненко и сотр.). Антиоксидантные свойства, проверенные в водных растворах, на БЛМ, липосомах, мицеллах линолевой кислоты и митохондриях, оказались следующими: SkQR1, SkQ1 > SkQ3, DMQ > MitoQ. В противоположном порядке изменялись прооксидантные свойства исследованных соединений, которые оказались максимальными у MitoQ (М.Ю. Высоких, Э.К. Рууге,

Bioenergetica.indb 305

26.01.2011 18:04:07

306

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

Рисунок 16.3. Совпадение локализации SkQR1 (флуоресцентное производное SkQ) и флуоресцирующего белка медузы YFP, содержащего пептид с митохондриальным адресом 8-й субъединицы цитохромоксидазы. Клетки HeLa трансфецировали плазмидой, кодирующей Mito-YFP, и инкубировали с 100 нM SkQR1 в течение 15 мин. [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: 437–461]

Ю.Н. Антоненко, В.А. Рогинский и сотр.). Исходя из этих данных для дальнейших опытов были выбраны SkQ1 и его флуоресцирующее производное с большей проникающей способностью — SkQR1. На сердечных митохондриях in vitro было показано, что SkQ1 может восстанавливаться дыхательной цепью, т.е. служить возобновляемым антиоксидантом многократного действия. Местом восстановления оказался гем bH комплекса III, расположенный вблизи внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий (то место, которое атакуется антимицином, см. выше, рис. 4.3 А; М.Ю. Высоких и сотр.). Используя SkQR1, мы выяснили, что вещества класса SkQ, добавленные к клеточной культуре, избирательно накапливаются в митохондриях (Б.В. Черняк и сотр., рис. 16.3). Далее оказалось, что исследованные вещества тормозят апоптоз клеток HeLa и фибробластов человека, вызванный Н2О2 (активность: SkQR1 > SkQ1 > MitoQ; рис. 16.4). Некроз, индуцированный АФК, также был чувствителен к SkQ (Б. В. Черняк и сотр.). На грибе Podospora anserina, рачке Ceriodaphnia affinis, дрозофиле, зубастом карпике Nothobranchius furzeri и мышах SkQ1 увеличивал медианную продолжительность жизни (на мышах — до двух раз; рис. 16.5; М.Ю. Высоких, О.Ф. Филенко, Е.Г. Пасюкова, К.А. Шидловский и В.Н. Анисимов). Во всех случаях SkQ1 особенно эффективно уменьшал смертность на ранних стадиях старения (первые 20% смертей), но слабо влиял на максиРисунок 16.4. Взаимодействие SkQ1, SkQR1 и MitoQ с человеческими клетками в культуре. A — кинетика накопления SkQR1 в клетках HeLa и его выхода из клеток. В начальный момент времени к клеткам добавляли 50 нM SkQR1. Там, где указано, добавлен разобщитель (10 мкM FCCP). Накопление и выход SkQR1 измеряли флуориметрически с помощью проточного цитометра. Б — предынкубация фибробластов человека в течение 7 дней с 20 нM SkQ1 предотвращает апоптоз, вызванный H2O2. Апоптозные клетки подсчитывали через 24 ч после добавки H2O2. Добавки: 1 мкM FCCP, 400 мкM H2O2. В — SkQ1 и SkQR1 предотвращают H2O2-зависимый апоптоз человеческих фибробластов более эффективно, чем MitoQ. Условия как в Б. Г — SkQ1 (20 нM, 7 дней) предотвращает накопление H2O2 в клетках HeLa, обработанных внешним H2O2 (200 мкм, 45 мин). Клетки окрашивали 4 мкм DCF в течение 15 мин и анализировали с помощью проточного цитометра. Д — SkQR1, SkQ1 и MitoQ предотвращают фрагментацию

Bioenergetica.indb 306

26.01.2011 18:04:07

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

307

митохондрий, вызванную H2O2. Фибробласты человека предынкубировали с SkQR1, SkQ1 или MitoQ в течение 2 ч и затем обрабатывали 400 мкM H2O2 в течение 3 ч. Е — SkQ1 предотвращает некроз, вызванный фотодинамической обработкой клеток HeLa, окрашенных митотрекером красным. Клетки освещали 15 мин зеленым светом (545 нм) так, что освещенность составляла 34,8 Дж/см2. Некроз измеряли через 5 ч после освещения. Клетки обрабатывали 1 мкM SkQ1, смесью 1 мкM тетрафенилфосфония (TPP) и 1 мкM децилпластохинона (DPQ), 20 мM N-ацетилцистеина (NAC) или 1 мM тролокса за 1 ч до освещения [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: 437–461]

Bioenergetica.indb 307

26.01.2011 18:04:08

308

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы... Рисунок 16.5. SkQ1 увеличивает продолжительность жизни мышей SHR. На рисунке суммированы данные двух экспериментов на 200 самках. В каждом опыте анализировали 4 группы мышей по 25 животных в каждой группе [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: 437– 461]

мальную продолжительность жизни (последние 10% смертей). В результате наблюдалась ректангуляризация (увеличение наклона) кривых смертности. На мышах, содержавшихся в нестерильном виварии, SkQ1, добавленный в питьевую воду (0,5–5 нмоль/кг в день), резко уменьшал смертность от инфекционных заболеваний, но слабо влиял на смертность от рака на поздних возрастах (В.Н. Анисимов и сотр.). На мышах и крысах было показано, что SkQ1 замедляет развитие таких признаков старения, как инволюция тимуса* и фолликулярной области селезенки, уменьшение соотношения лимфоцитов и нейтрофилов в крови, остеопороз, горбатость, катаракта, ретинопатия, глаукома, облысение, поседение, исчезновение эстральных циклов у самок и полового влечения у самцов, гипотермия, оцепенение и т.д. (Н.Г. Колосова, В.Н. Анисимов, Н.И. Дризе, А.Г. Рязанов, Б. Кэннон и сотр.; рис. 16.6, 16.7). На фибробластах, изолированных из мышей, получавших или не получавших SkQ в течение всей жизни, было показано, что SkQ1 предотвращает появление с возрастом β-гликозидазной активности и фосфорилирование гистона Н2АХ. На этой же модели удалось наблюдать возрастное увеличение спонтанного апоптоза и его стимуляцию добавленной перекисью водорода, причем эти эффекты полностью снимались SkQ1 (И.М. Спивак, В.М. Михельсон и сотр.). Существенно, что SkQ1 не полностью прекращал апоптоз, а лишь предотвращал его трехкратное усиление у старых мышей. Именно такого результата можно было ожидать, исходя из нашей схемы старения организма (см. выше, рис. 15.12). В ряде случаев удалось наблюдать, как SkQ тормозит развитие ускоренного старения (прогерии). Это было показано на крысах OXYS, страдающих от постоянного окислительного стресса, где прием SkQ1 с пищей (250 нмоль/кг) не только предотвращал (и даже обращал) ранние катаракту * Исчезновение тимуса с возрастом — один из наиболее демонстративных примеров запрограммированности старения. Этот эффект, конечно же, не может объясниться накоплением каких-то ошибок в стареющем организме. Несомненно, инволюция тимуса — органа, образующего Т-лимфоциты, одного из центральных типов клеток иммунной системы организма, — ведет к ослаблению иммунитета. Данные изменения усугубляются протекающей параллельно инволюцией фолликул селезенки, где образуются B-лимфоциты — другой важнейший тип иммунных клеток. Оба эти явления тормозятся (но не отменяются полностью) посредством SkQ1. Так, по данным Л.А. Обуховой, объем тимуса у 14-месячных крыс составил 27 ± 7 мм3 в контроле и 44,5 ± 5 мм3, если животные получали SkQ. У 2-месячных крыс этот параметр был равен 180 ± 20 мм3.

Bioenergetica.indb 308

26.01.2011 18:04:08

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

309

и ретинопатию, но и препятствовал накоплению в тканях окисленных липидов и белков (Н.Г. Колосова, Р.А. Зиновкин и сотр.). В случае катаракты и дистрофии сетчатки удалось показать, что глазные капли 2,5 ⋅ 10–7М SkQ1 вылечивают уже развившееся заболевание за 1,5 мес. Оказалось также, что подобная терапия эффективна в отношении катаракты у обычных крыс линии Вистар. Что касается дистрофии сетчатки, то крысы линии Вистар редко доживают до нее, так что пришлось сменить объект исследования. Как показала работа, проведенная сотрудниками Ветеринарной Академии им. К.И. Скрябина Е.П. Копенкиным и Л.Ф. Сотниковой, капли SkQ1 помогают при ретинопатиях у собак, кошек и лошадей. Всего SkQ1 получало 271 животное, причем для всех традиционные способы лечения оказались неэффективны. Особенно яркий положительный эффект был обнаружен при врожденной диспла- Рисунок 16.6. Мыши SHR в возрасте 630 зии сетчатки (радикальное улучшение в дней, получавшие 0,5 нмоль SkQ1/кг в (вверху) и не получавшие препара67% случаев) и при ее вторичной деге- день та (внизу). Видны признаки старения у нерации (54%). При прогрессирующей мыши без SkQ1 (горбатость, отсутствие дегенерации сетчатки SkQ1 был менее вибрисс, облысение на щеках, плеши эффективен (29%). В 89 случаях нашими на боку). У мыши, получавшей SkQ1, пациентами оказались недавно ослеп- эти признаки отсутствуют [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: шие животные. В 67 случаях они прозре437–461] –7 ли после курса капель 2,5 ⋅ 10 М SkQ1 в течение двух-шести недель. Эти положительные результаты контрастируют с неудачей сотрудников группы Мерфи, пытавшихся лечить посредством MitoQ врожденные ретинопатии мышей. По-видимому, все дело в том, что эффективные концентрации MitoQ, вызывающие антиоксидантное действие, находятся слишком близко от таковых, вызывающих прооксидантный эффект. На другую возможность указывают авторы статьи: может быть, исследованные ретинопатии принципиально не лечатся антиоксидантами. В завершение этой серии исследований мы обратились к глазным болезням животных, вызванным искусственно, а именно к экспериментальным увеиту (И.И. Сенин и сотрудники) и глаукоме (В.П. Еричев и сотрудники). Обе эти болезни, как известно, связаны с сильнейшим окислительным стрессом, и в обоих случаях капли SkQ1 оказывали лечебный эффект. Особенно показательны оказались опыты с увеитом. Это аутоиммунное заболевание вызывали иммунизацией кроликов арестином — белком фоторецепторных клеток. Болезнь приводила к слепоте, после чего в один глаз капали

Bioenergetica.indb 309

26.01.2011 18:04:09

310

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

2,5 ⋅ 10–7 М SkQ1 четырежды в день. Спустя несколько дней животные начинали видеть, но только тем глазом, который получал SkQ1. Та же процедура предотвращала развитие увеита, если капли давали в период иммунизации. При этом успех достигался в 100% случаев как при предотвращении увеита, так и при лечении уже развившегося заболевания. Возвращаясь к прогерии у Рисунок 16.7. SkQ1 предотвращает развитие катаракты крыс OXYS, отметим, что на и ретинопатии у крыс OXYS. Электроретинограммы этой модели SkQ1 предотвратрех крыс возрастом (1) 3 месяца (красный), (2) 24 щал уменьшение с возрастом месяца без SkQ1 (черный) и (3) 24 месяца с 250 нмоль количества клеток тимуса и SkQ1/кг × день (зеленый) [Skulachev et al., Biochim. первичных фолликул селеBiophys. Acta 2009, 1787: 437–461] зенки, ответственных за образование соответственно Т- и В-лимфофитов, играющих ключевые роли в работе иммунной системы (опыты Л.А. Обуховой, Н.Г. Колосовой и сотр.). При прогерии, вызванной облучением, SkQ1 снимал такой эффект старения, как поседение (в опытах использовали черных мышей; А.Г. Рязанов, США). Чрезвычайно интересными оказались результаты, полученные на мутантных мышах, где прогерию вызывали заменой 257-го аспартата на аланин в корректорском домене митохондриальной ДНК-полимеразы γ (эти мутанты уже обсуждались выше в связи с ролью митохондрий в старении организма). Введение таким мутантам SkQ1 с питьем вызвало увеличение продолжительности жизни и, что еще более важно, продлило период молодости: мыши с SkQ1 умирали без целого букета старческих болезней, которые наблюдались у погибающих мутантов, не получавших SkQ1: остеопороза (горбатости), облысения на щеках и на теле, оцепенения, снижения температуры тела, исчезновения эстральных циклов и т.д. Эффект SkQ1 на смертность от инфекционных заболеваний в этих опытах не исследовался, так как мыши содержались в стерильных условиях (Б. Кэннон и сотр., Швеция). Как показали дальнейшие опыты, введение животному SkQ1 или SkQR1 резко снижает неблагоприятный эффект ишемии и последующей реперфузии на ритм сердца, уменьшает зоны инфаркта миокарда и инсульта головного мозга. Оба эти препарата предотвращали гибель крыс, у которых была удалена одна почка, а другую подвергли 90-минутной ишемии (группы В.И. Капелько и Д.Б. Зорова; рис. 16.8). На р53–/– мышах SkQ1 или неадресованный антиоксидант N-ацетилцистеин (NAC) тормозили развитие лимфом, снижали уровень АФК в селезенке и продлевали жизнь, причем SkQ1 достаточно было вводить в количестве 5 нмоль/кг в день. Для такого эффекта требовалось 6 ммоль NAC/кг в день, т.е. в 1,2 млн раз больше, чем SkQ1 (группа Б.П. Копнина). Еще меньшие количества SkQ1 оказались активны при борьбе с сердечной аритмией крыс и при увеличении про-

Bioenergetica.indb 310

26.01.2011 18:04:10

311

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии Рисунок 16.8. Выживание крыс с одной почкой, подвергнутых 90-минутной ишемии с последующей реперфузией. SkQ1 или SkQR1 были инъецированы внутрибрюшинно за сутки до ишемии [Skulachev et al., Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787: 437–461]

должительности жизни мышей: 0,05 и 0,5 нмоль (что соответствует 0,025 и 0,25 нг) на кг веса животного в день. Эффективность столь малых количеств SkQ объясняется несколькими обстоятельствами. (1) SkQ1 электрофоретически накапливается в цитозоле клеток примерно в 10-кратном избытке по сравнению с концентрацией снаружи клетки. Это происходит под действием разности электрических потенциалов на внешней клеточной мембране (Δψ около 60 мВ). (2) Еще более значительное (тысячекратное) накопление имеет место в митохондриях (Δψ порядка 180 мВ). (3) Коэффициент распределения в системе октанол / вода для SkQ1 оказался около 13 000. Поэтому концентрация SkQ1 во внутреннем полумембранном слое внутренней мембраны митохондрий должна быть в 10 × 103 × 1,3 × 104 = 1,3 × 108 раз больше, чем во внеклеточном пространстве. Что касается механизма антиоксидантного действия SkQ, то он может быть двояким. Во-первых, SkQН2, накапливаясь во внутреннем полумембранном слое митохондриальной мембраны, способен гасить пероксильные радикалы полиненасыщенных жирных кислот (LO2•) фосфолипидов, находящихся в этом слое (прежде всего кардиолипина). Тогда LO2• превращается в перекись жирной кислоты (LOOH), и прерывается цепная реакция окислительного повреждения липидов митохондрий: LO2• + SkQH2 → LOOH + SkQH•.

(16.1)

•

Полученный SkQH восстанавливается цитохромом bH комплекса III дыхательной цепи вблизи внутренней поверхности мембраны с регенерацией исходного SkQH2: SkQH• + цитохром bH2+ + Н+ → SkQH2 + цитохром bH3+. Что касается остатка перекиси жирной кислоты (LOOH), то он отщепляется от кардиолипина и переносится из внутреннего во внешний полумембранный слой в виде аниона перекиси жирной кислоты с последующим расщеплением при участии цитохрома с или особой глютатионпероксидазы, способной использовать перекиси липидов в качестве субстратов. При

Bioenergetica.indb 311

26.01.2011 18:04:12

312

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

этом роль переносчиков могли бы играть либо минорные разобщающие белки (UCP2, UCP3, UCP4 или UCP5, см. выше разд. 10.2.2), либо все тот же SkQ(H2). Как недавно было показано в нашей группе И.И. Севериной, Ф.Ф. Севериным, Ю.Н. Антоненко, М.Ю. Высоких и сотр., SkQ и его аналог, не содержащий пластохинона (С12ТРР), могут служить переносчиками анионов жирных кислот в искусственных и митохондриальных мембранах. Эта дополнительная активность SkQ позволяет рассматривать его как разобщитель, адресованный в митохондрии. Замечательно, что SkQ, в отличие от классических протонофоров типа динитрофенола, должен действовать как «мягкий» разобщитель. Сбрасывая Δψ, SkQ предотвращает свое собственное накопление в митохондриях, и потому максимальный протонофорный эффект можно ожидать только при высоких значениях Δψ. Именно такое «мягкое» разобщение является оптимальным механизмом, предотвращающим генерацию АФК митохондриями: небольшое снижение Δψ резко тормозит образование АФК, но не препятствует синтезу АТР. Наши данные можно сопоставить с недавними результатами В.И. Падалко и А. Ковалтовски о продлении жизни дрозофил и мышей и предотвращении окисления биополимеров при старении малыми дозами разобщителя динитрофенола. В табл. 16.1 суммированы наши результаты, полученные при исследовании воздействия SkQ1 и SkQR1 на животных in vivo. Как видно из таблицы, 26 различных признаков старения отступают под действием SkQ, что позволяет определить наши вещества как мощные геропротекторы. Подытоживая сказанное выше, мы можем заключить, что соединения класса SkQ представляют собой наиболее активные из известных геропротекторов, снижающих смертность на ранних и средних этапах старения и предотвращающих появление большой группы старческих дефектов. Иными словами, SkQ способен продлить молодость экспериментальных животных*. В какой мере подобный эффект возможен, если речь пойдет о людях, должны показать клинические испытания SkQ1, которые уже начались. * Говоря о продлении молодости, мы хотели бы подчеркнуть, что отмена программы старения как ослабления с возрастом основных жизненных функций еще не означает для индивида личного бессмертия. Если рассматривать программу старения как биологический механизм, ускоряющий эволюцию, то вряд ли увеличение максимальной продолжительности жизни должно быть непременным следствием отмены такой программы. Вклад долгожителей-«аксакалов» в общую продуктивность популяции невелик из-за их малочисленности. Более того, с возрастом могут накапливаться повреждения генома не только под действием запрограммированного повышения уровня АФК, но и по другим причинам, действие которых продолжается всю жизнь. Это обстоятельство особенно опасно для самок: ДНК их яйцеклеток должно сохраниться интактным на протяжении всей жизни особи. Поэтому неудивительно, что начиная с некоего возраста самки теряют способность к размножению. Наступает менопауза, которая особенно продолжительна у людей и китов, но есть даже у мушки дрозофилы. Не случайно на ранних и средних стадиях старения вклад в смертность соответствующей программы велик, а ее отмена посредством SkQ заметно повышает продолжительность жизни. Однако с возрастом появляются другие причины смерти, как правило не зависящие от программы старения и, стало быть, не отменяемые SkQ. Среди этих причин главной служит рак, который тоже является феноптозной программой, но иной функциональной направленности: в этом случае речь, по-видимому, идет о выбраковке индивидов, допустивших перегрузку генома ошибками.

Bioenergetica.indb 312

26.01.2011 18:04:12

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

313

Таблица 16.1. SkQ тормозит осуществление программы старения животных (медленного феноптоза) и гибели животных после кризиса (острого феноптоза) Результат

Виды

Тип воздействия

1 Увеличение средней продолжительности жизни

Гриб Podospora anserina

Добавление SkQ1 к среде роста

2 Увеличение средней продолжительности жизни

Ракообразное Ceriodaphnia affinis

Добавление SkQ1 к аквариумной воде в течение всей жизни

3 Увеличение средней продолжительности жизни

Насекомое Drosophila melanogaster

Добавление SkQ1 к пище в течение всей жизни

4 Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни

Рыба Nothobranchius furzeri

Добавление SkQ1 к аквариумной воде в течение всей жизни

5 Увеличение средней продолжительности жизни

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

6 Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни

«Мутаторные» мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

7 Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни

p53–/– мыши Прием SkQ1 с пищей в или бестимус- течение всей жизни ные мыши с привитой цервикальной карциномой шейки матки SiHa

8 Снижение уровня пероксидов в крови

Крысы

Ежедневное вливание раствора SkQ1 в защечные мешочки в течение 14 дней

9 Снижение в крови количества 8-окси-2’-дезоксигуанозина

Крысы

Ежедневное вливание раствора SkQ1 в защечные мешочки в течение 14 дней

10 Уменьшение хромосомных аббераций

Крысы

Ежедневное вливание раствора SkQ1 в защечные мешочки в течение 14 дней

11 Уменьшение перекисного окисления липидов и карбонилирования белков

Крысы линии OXYS

Прием SkQ1 с пищей в течение всей жизни

12 Предотвращение уменьшения уровня кардиолипина

«Мутаторные» мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

13 Предотвращение уменьшения соотношения в кардиолипине ненасыщенных и насыщенных жирных кислот

«Мутаторные» мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

Bioenergetica.indb 313

26.01.2011 18:04:12

314

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы... Продолжение табл. 16.1 Результат

Виды

Тип воздействия

14 Предотвращение возрастзависимого апоптоза фибробластов, вызванного окислительным стрессом

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

15 Предотвращение возрастзависимого увеличения β-галактозидазы в фибробластах

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

16 Предотвращение возрастзависимого увеличения фосфорилирования гистона Н2АХ в фибробластах

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

17 Предотвращение возрастзависимого миелоидного сдвига формулы крови

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

18 Замедление возрастзависимого повреждения гематопоэтической системы

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

19 Снижение смертности от инфекций

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

20 Замедление возрастзависимой инволюции тимуса и фолликулов селезенки у крыс OXYS

Крысы линии OXYS

Прием SkQ1 с пищей в течение всей жизни

21 Замедление возрастзависимого остеопороза

Крысы линии OXYS

Прием SkQ1 с пищей в течение всей жизни

22 Предотвращение возрастзависимого лордокифоза

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

23 Предотвращение возрастзависимого снижения скорости заживления ран

Крысы

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

24 Предотвращение возрастзависимого исчезновения эстральных циклов у самок

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

25 Предотвращение снижения половой мотивации у самцов

Крысы линии OXYS

26 Предотвращение возрастзависимых изменений в поведении

Крысы

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

27 Предотвращение возрастзависимого облысения и потери усов

Мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение всей жизни

Bioenergetica.indb 314

Прием SkQ1 с пищей в течение всей жизни

26.01.2011 18:04:12

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

315

Окончание табл. 16.1 Результат

Виды

Тип воздействия

28 Предотвращение развития возраст-зависимой катаракты и ретинопатий

Крысы линии OXYS

Прием SkQ1 с пищей в течение всей жизни

29 Обращение развития возрастзависимой катаракты и ретинопатий

Крысы линии OXYS

Прием SkQ1 с пищей либо закапывание SkQ1 в глаза в течение 1,5 месяцев

30 Обращение развития возрастзависимых ретинопатий

Собаки, кошки, Закапывание SkQ1 в глаза в лошади течение 1–3 месяцев

31 Предотвращение поседения после γ-радиации

Черные мыши

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение 1 месяца

32 Предотвращение гибели после почечной ишемии

Крысы с одной Однократная инъекция почкой SkQ1 или SkQR1 за день до ишемии

33 Частичная нормализация содержания в крови креатинина, диуреза и резорбции Ca2+ после почечной ишемии

Крысы с одной Однократная инъекция почкой SkQ1 или SkQR1 за день до ишемии

34 Нормализация работы почек при рамбдомиолизе

Крысы

Инъекция SkQR1 через 1, 12, 24 и 36 часов после индукции рамбдомиолиза

35 Уменьшение зоны повреждения головного мозга и предотвращение локомоторной дисфункции после ишемии

Крысы

Однократная инъекция SkQR1 до индукции ишемии мозга

36 Уменьшение зоны повреждения сердца после ишемии

Крысы

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение 2–3 недель до индукции ишемии

37 Снижение аритмии после индукции ишемии сердца

Крысы

Прием SkQ1 с питьевой водой в течение 2–3 недель до индукции ишемии

38 Предотвращение или обращение развития экспериментального увеита

Кролики

Закапывание SkQ1 в глаза в течение 1–2 месяцев

39 Частичное предотвращение экспериментальной глаукомы

Кролики

Закапывание SkQ1 в глаза в течение 1–2 месяцев

40 Предотвращение экспериментального артрита

Крысы

Добавление SkQ1 в пищу с момента индукции заболевания

Bioenergetica.indb 315

26.01.2011 18:04:12

316

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

16.2. Сравнение эффектов SkQ и временного ограничения питания Лучшим доказательством справедливости гипотезы о программе старения была бы успешная попытка ее отменить. Есть основания полагать, что такая попытка впервые дала положительный результат еще в 1934 г., когда К.М. МакКей и сотрудники сообщили об увеличении продолжительности жизни крыс посредством некоторого ограничения их питания. Это ограничение, введенное на ранних этапах жизни, вначале приводило к задержке роста животных. Затем ограничение питания снималось, животные быстро увеличивались в размерах до нормы, но жили на 70% (самцы) и 48% (самки) дольше, чем те, что всю жизнь получали пищу ad libitum. Среди причин смерти резко уменьшался вклад легочных болезней, а также некоторых опухолей. Авторы отмечали, что животные-долгожители выглядели проворными и молодыми независимо от возраста. При этом их пульс снижался до 340 ударов в минуту, что было примерно на 100 ударов ниже контроля. В дальнейшем благоприятное действие некоторого ограничения питания на продолжительность жизни было продемонстрировано на самых разных видах эукариот: от дрожжей до макак-резусов и людей. С появлением гипотезы Хармэна о роли АФК в старении все эти эффекты принято было объяснять уменьшением объема пищи, окисленной кислородом, а значит, и снижением сопутствующей продукции АФК и вызываемого ими повреждающего действия. Несостоятельность такого допущения была ясна еще из ранних работ по ограничению питания, когда в той же группе МакКея и др., выяснилось, что теплопродукция на кг веса тела в опытной когорте крыс была даже выше, чем в контроле. Дальнейшие исследования прямо опровергли общепринятую точку зрения. Во-первых, выяснилось, что для дрозофилы достаточно двух дней жизни впроголодь, чтобы превратить ее в «долгожителя» в той же степени, как если бы муха была ограничена в питании в течение всей своей жизни. Далее оказалось, что не только избыток пищи, но даже сам ее запах снижают геропротекторный эффект ограничения питания дрозофилы. Все эти обстоятельства — вряд ли специфика дрозофилы. На мышах-альбиносах Т.Б. Робертсон и др. еще в 1934 г. обнаружили, что пост в течение 2-х дней в неделю вполне достаточен для продления жизни на 50–60%. Наблюдая мышей, К.Дж. Карр и др. убедились, что способность к деторождению, исчезавшая к концу первого года жизни животных при неограниченном кормлении, сохранялась по крайней мере до 21-го месяца жизни, если мыши были ограничены в пище в первые 11–15 месяцев, а затем получали ее ad libitum. По данным чешских авторов (Е. Стучликовой и др.) крысы, мыши и золотистые хомячки, ограниченные на 50% в питании в течение 2-х лет, жили на 20% дольше, чем в контроле. Ограничение в течение одного только первого года жизни давало эффект на 40–60%, а в течение только второго года — на 30–40%. Как показали дальнейшие исследования, в эффект ограничения питания вносят вклад как углеводный, так и белковый его компоненты. При

Bioenergetica.indb 316

26.01.2011 18:04:12

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

317

этом за действие белков отвечает одна-единственная аминокислота, а именно метионин. Метионин относится к группе аминокислот, названных незаменимыми, так как они не могут синтезироваться в организме млекопитающего, всецело зависящего от их поступления с пищей. Оказалось, что не только продление жизни, но и уменьшение генерации АФК митохондриями и окислительного повреждения митохондриальной ДНК имитируется диетой, где белок заменяли смесью аминокислот, из которой исключен метионин. Интересно, что ограничение питания никак не сказывается на окислении ядерной ДНК, которого можно было бы ожидать, если исходить из принятой гипотезы о старении как неспецифическом возрастном повреждении биополимеров клетки посредством АФК и его предотвращении при снижении калорийности питания. По нашему мнению, ограничение питания воспринимается организмом как весьма тревожный сигнал о нехватке пищи. Даже частичное голодание, как известно, влечет за собой уменьшение плодовитости. А это, в свою очередь, ставит под вопрос само существование популяции. Чтобы хотя бы частично воспрепятствовать такому повороту событий, достаточно отменить программу старения, продлив тем самым продолжительность репродуктивного периода индивида, т.е. увеличив общее количество его потомства. Иными словами, действие ограничения питания на продолжительность жизни лишь косвенно связано с АФК, представляя чисто регуляторный эффект. Это прежде всего биология, а не химия. Вот почему такие явно сигнальные эффекты, как кратковременный пост (или, наоборот, запах пищи), а не только нехватка (или избыток) пищи в течение всей жизни оказывают мощное влияние на параметры жизненного цикла. Не случайно временное ограничение питания (пост) лучше, чем постоянное. Сигнал может быть подан за сравнительно короткий срок, а вообще-то длительный период жизни впроголодь сам по себе ничего хорошего организму принести не может*. Обжорство свойственно скорее некоторым людям, чем животным, которые не склонны наедаться впрок, если пищи всегда вдоволь. Сигнальный характер эффекта ограничения питания хорошо объясняет опыты с метионином. По-видимому, организм определяет количество доступной пищи и прежде всего незаменимых аминокислот, нужных для биосинтеза его белков, отслеживая количество одной из них — метионина. Существенно, что ограничение питания не только увеличивает среднюю продолжительность жизни, но продлевает молодость, как уже было отмечено первооткрывателем этого явления МакКеем. Отступают старческие недуги, и само поведение и даже внешний вид старых животных становится неотличимым от поведения и внешности молодых. Показательна только что опубликованная работа группы Р. Уэйнбраха с приматами. Двадцатилетний опыт на 76 макаках убедил, что длительное ограничение питания на 30% (в опыт были взяты уже взрослые животные в возрасте от 7 до 14 лет) * Возможно, религиозные посты — это способ продления жизни путем кратковременных периодов ограничения питания. Известно, что верующие люди, как правило, живут дольше атеистов.

Bioenergetica.indb 317

26.01.2011 18:04:12

318

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

приводит к 1) резкому уменьшению зависящей от возраста смертности (за 30 лет 20% против 50% у животных в контроле, которые получали пищу ad libitum), 2) исчезновению из списка причин смерти диабета, 3) уменьшению вдвое частоты смертей от рака (у макак это в основном аденокарцинома кишечника), 4) уменьшению частоты смертей от сердечно-сосудистых заболеваний, 5) снижению остеопороза, 6) предотвращению развития таких старческих признаков, как саркопения, уменьшение массы серого вещества головного мозга, облысение, поседение и ряд других. К 30 годам оставшиеся в живых контрольные макаки в 80% случаев демонстрировали какиелибо признаки старения, в то время как в опытной группе они наблюдались лишь у 20% животных. Опыт на обезьянах еще далеко не закончен, поэтому мы не можем ничего сказать о действии ограничения питания на максимальную продолжительность жизни приматов. Однако в случае с грызунами такие данные имеются. Они свидетельствуют, что у мышей, крыс и хомячков медианная (50% умерших) продолжительность жизни увеличивается гораздо сильнее, чем максимальная. Наиболее простое объяснение механизма этого явления — отмена (или значительное торможение) программы старения. При этом могут замедляться и другие онтогенетические программы, прежде всего рост организма. Это происходит при достаточно сильном и продолжительном голодании. Однако более умеренное ограничение питания может удлинять жизнь и без задержки роста. Есть много общего между эффектами ограничения питания и SkQ. Как в том, так и в другом случае происходит ректангулизация кривых смертности, резко уменьшается ранняя смертность, а средняя продолжительность жизни увеличивается намного больше, чем максимальная. Их эффект не столько в продлении жизни как таковой, сколько в продлении здоровой, молодой жизни. Оба воздействия эффективны применительно к живым существам, очень сильно различающимся по своему систематическому положению (ограничение питания — на дрожжах, насекомых, млекопитающих, SkQ — на мицелиевом грибе, ракообразном, насекомом, рыбе и млекопитающих). Действие как того, так и другого носит ярко выраженный плеотропный характер, т.е. на них отвечает сразу множество физиологических систем организма, причем в большинстве случаев это одни и те же системы. Отступают болезни сердечно-сосудистой системы, остеопороз, нарушения зрительного аппарата, некоторые типы рака, нет поседения и выпадения волос, старческой депрессии. Противоречивые данные получены по саркопении и иммунным ответам при ограничении питания. Ряд авторов указывает на то, что это воздействие ослабляет как мышечную систему, так и иммунитет*. С другой стороны, Р. Уэйнбрах и сотр. отмечают отсутствие саркопении у обезьян, а МакКей и сотр. — устойчивость к легочным заболеваниям у крыс, * Как отмечает Дж. Фернандес и сотр., ограничение питания, особенно в молодом возрасте, уменьшает выделение интерлейкинов макрофагами в ответ на бактериальные полисахариды. Это в свою очередь снижает устойчивость животных к сепсису и перитониту. По данным Э.М. Гарднер, частичное голодание уменьшает устойчивость животных к вирусу гриппа.

Bioenergetica.indb 318

26.01.2011 18:04:12

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

319

посаженных на ограниченную диету (ср. с резким уменьшением смертности от инфекционных болезней и торможением возраст-зависимой инволюции тимуса и фолликулярных отделов селезенки у крыс под действием SkQ). В то же время противоположным оказалось действие ограничения питания и SkQ на заживление ран: жизнь впроголодь тормозила, а SkQ1, напротив, стимулировал заживление. Ограничение питания снижало температуру тела и замедляло рост животного, чего не наблюдалось с SkQ. Все это свидетельствует против такой тривиальной трактовки наших данных, как допущение, что SkQ1 уменьшает потребление животным пищи, например снижая аппетит. Прямые измерения потребления пищи мышами, получавшими SkQ1, показали, что SkQ1 не влияет на этот параметр. В ухудшении ряда жизненных показателей при ограничении питания нет ничего удивительного. Как уже отмечалось выше, животные не склонны переедать, даже когда их не ограничивают в пище. Обычно они съедают столько, сколько требует их организм. Поэтому длительное снижение питания ведет к тем или иным нарушениям жизнедеятельности. Понятно также, что такие нарушения будут тем вероятней, чем длительнее голодание. Как уже отмечалось выше, геропротекторный эффект ограничения питания вовсе не требует долгого и непрерывного голодания. Отсюда и противоречивость данных по действию ограничения питания на продолжительность жизни и состояние организма. Там, где ограничение питания было не слишком большим и не слишком долгим, преобладали благоприятные эффекты, а там, где геронтологи перебарщивали с этим ограничением, возникали неблагоприятные побочные последствия. Так, принято считать, что длительное ограничение питания снижает частоту эстральных циклов (иногда вплоть до их полного исчезновения), но еще в 1949 г. К.Дж. Карр и сотр. показали, что временное ограничение с последующим его снятием, наоборот, продляет циклы и способствует их сохранению вплоть до глубокой старости. Напомним, что подобное продление наблюдается и в случае с SkQ. В принципе нет никакой необходимости голодать всю жизнь, если голодание есть сигнал к продлению жизни путем отмены программы старения. Однако существует опасность, что слишком короткое, слишком слабое или запоздалое ограничение питания приведет лишь к частичному торможению программы и геронтологический эффект окажется небольшим. Такой опасности, по-видимому, нет с SkQ1, который действует на старение в столь малых концентрациях, что каких-либо неблагоприятных эффектов пока что обнаружено не было. Еще одно серьезное ограничение надо иметь в виду, рассматривая недоедание как геропротектор для человека. Ведь если это ограничение — сигнал опасности голодной смерти, то ответом организма должно быть не только увеличение продолжительности жизни, призванное компенсировать уменьшение рождаемости в голодные годы. Весьма вероятны и другие ответы, причем какие-то их них могут оказаться далеко не столь привлекательными, как продление здоровой жизни. Замечено, например, что в состоянии недоедания мышь, попав в «беличье колесо», не хочет покидать его, пробегая за ночь от 6 до 8 км (при нормальном питании это расстояние

Bioenergetica.indb 319

26.01.2011 18:04:13

320

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

всегда меньше 1 км). Подобный эффект уже никак нельзя объяснить истощением и мышечной слабостью при голодании. Скорее, налицо еще один ответ на сигнал голода: крайняя обеспокоенность, попытка сканировать как можно большее пространство в поисках пищи. Перефразируя повесть Стругацких «Понедельник начинается в субботу», здесь мы имеем дело с мышью, «не удовлетворенной желудочно». Если бы подобный эффект был присущ SkQ, мы заметили бы, что животные, получавшие SkQ, поглощали больше пищи, чего в действительности не наблюдалось. Создается впечатление, что введение SkQ — более «чистый» способ отменить программу старения, не отягощенный нежелательными побочными эффектами.

16.3. От «человека разумного» к «человеку разумному и освободившемуся» Существует по меньшей мере еще один аспект, в котором ограничение питания вряд ли сможет заменить собой SkQ. Материал, рассмотренный выше, свидетельствует, что SkQ1 — весьма перспективный агент для создания нового поколения лекарств, действующих на процессы старения, — антиоксидантов, специфически адресованных в митохондрии. При этом очевидно, что действие SkQ не ограничивается его геропротекторным эффектом (см. табл. 16.1, п. 1–30). Опыты по сердечной аритмии, инфарктам сердца и почек, инсульту и ряд других были поставлены на молодых животных (см. табл. 16.1, п. 32–40). Можно, конечно, предположить, что SkQ просто «чистит самое грязное место в клетке», следствием чего оказывается некий неспецифический благоприятный эффект на самые различные аспекты ее жизнедеятельности. Однако такое объяснение вряд ли справедливо. В этом случае остается неясным, почему в процессе своей эволюции растения, синтезирующие в отдельности пластохинон и проникающий катион берберин, не создали их комбинации, способной почистить от АФК внутренность растительных митохондрий, подвергающихся «кислородной опасности» в большей степени, чем животные митохондрии, из-за насыщенности цитозоля кислородом, образуемым хлоропластами. Альтернативная возможность состоит в том, что прием, используемый для запуска старения как медленного феноптоза, применяется также и в некоторых других смертоносных программах, вызывающих быстрый, или острый, феноптоз. Здесь мы приходим к фундаментальному вопросу биологии: как вообще могут существовать генетические программы, контрпродуктивные для индивида? Ч. Дарвин, А.Р. Уоллес и А. Вейсман еще в XIX в. предположили, что смерть особи может быть альтруистичной, т.е. полезной для семьи или сообщества. В 1964 г. У.Д. Гамильтон опубликовал серию из двух статей под названием «Генетическая эволюция социального поведения». А в 1976 г. вышла в свет книга Р. Докинза «Эгоистичный ген», где автор развил и популяризировал мысль Гамильтона, заключив, что «основной единицей отбора служит не индивид, а ген». По существу, здесь речь идет

Bioenergetica.indb 320

26.01.2011 18:04:13

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

321

уже не о благополучии сообщества, а о диктатуре генома, единственной самовоспроизводящейся биологической структуры, сохранение, развитие и экспансия которой приобрела в процессе эволюции приоритетное значение по сравнению с благополучием индивида или группы индивидов. Организм в рамках этой концепции — лишь устройство, машина, обеспечивающая интересы генома. Некоторое время тому назад мы сформулировали принцип, названный самурайским законом биологии: «лучше умереть, чем ошибиться». В сочетании с концепцией о диктатуре генома этот закон означает, что любое критическое состояние организма, когда он уже не гарантирует сохранность своего генома и в случае выздоровления может произвести потомство с измененным геномом, может стать сигналом к самоликвидации организма, т.е. быстрому феноптозу. Представляется вполне возможным, что механизм быстрого феноптоза, как и механизм медленного феноптоза (старения), использует в качестве интермедиата на ранних этапах процесса внутримитохондриальные АФК. Если это допущение справедливо, то благоприятное действие SkQ не только при старении, но и при самых разнообразных острых патологиях как молодых, так и старых организмов могло бы объясняться нейтрализацией этих АФК. Не исключено, что SkQ может послужить оружием в «восстании машин» — попытке Homo sapiens покончить с тиранией генома и отменить те из диктуемых геномом программ, которые выгодны для эволюции генома, но невыгодны для индивида. Отмена их символизировала бы превращение человека в Homo sapiens liberatus (по-латыни liberatus — освободившийся), что могло бы стать величайшим достижением медицины XXI в.

Авторы благодарят свои семьи за терпение и поддержку, которые облегчали работу над материалами книги во время отпусков на протяжении нескольких лет. Общий графический стиль создан Ф.О. Каспаринским. Оригинальные иллюстрации принадлежат ООО «МАСТЕР-МУЛЬТИМЕДИА» (www.master-multimedia.ru).

Bioenergetica.indb 321

26.01.2011 18:04:13

322

ЧАСТЬ IV. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы...

В.А. Садовничий, председатель наблюдательного совета проекта, руководитель математической группы

М.В. Скулачев, заместитель научного руководителя проекта

Б.В. Черняк, заместитель научного руководителя проекта, лидер группы клеточной биологии

И.И. Северина, лидер группы БЛМ

Рисунок 16.9 (часть 1). Участники проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

Bioenergetica.indb 322

26.01.2011 18:04:13

Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

323

Ф.Ф. Северин, лидер группы биоэнергетики дрожжей

Л.С. Ягужинский, лидер группы митохондриологии

В.Н. Анисимов, лидер группы геронтологии млекопитающих

Н.Г. Колосова, лидер группы изучения прогерии

Рисунок 16.9 (часть 2). Участники проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии

Bioenergetica.indb 323

26.01.2011 18:04:17

Приложения ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ЭНЕРГИЯ, РАБОТА И ЗАКОНЫ ТЕРМОДИНАМИКИ

Э

нергия (от греч. enérgeia — действие, деятельность) в обобщенном понимании — это свойство материальной системы, характеризующее возможность производить изменения в окружающем мире (работу). Величина этой работы (W) возрастает по мере приумножения общего количества материи в системе, увеличения неравномерности распределения частиц материи в пространстве и усиления их движения. Физические процессы взаимодействия частиц материи в системе сопровождаются взаимной трансформацией различных видов энергии (механической, тепловой, электромагнитной, гравитационной, ядерной, химической). Каким образом жизнь обеспечивается энергией? Законы термодинамики позволяют получить количественный ответ на этот вопрос, не прибегая к помощи мистики. Превращения энергии в живых самовоспроизводящихся материальных системах (организмах) подчиняются законам термодинамики. Примечательно, что первое начало термодинамики (закон сохранения и превращения энергии) было исходно сформулировано в 1841 г. немецким физиком и врачом Ю.Р. Майером в результате изучения энергетических процессов в организме человека, а потом стало широко применяться к системам технической энергетики. Термодинамика исследует три типа систем: изолированные, закрытые и открытые. Гипотетические изолированные (адиабатические) системы полностью автономны, их граница не допускает обмена материей, энергией и информацией с окружающей средой. Закрытые системы материально самодостаточны, но энергетически и информационно открыты. Иными словами, через границы закрытых систем происходит обмен энергией и информацией, но не материей. Многие неживые системы технической энергетики устроены именно таким образом. Живые организмы — открытые системы, постоянно обменивающиеся с внешней средой веществом, энергией и информацией. Иными словами, энергообмен организмов с окружающей средой может осуществляться как непосредственно, так и вместе с потоками материи. В качестве меры энергии, переходящей от одного тела к другому, в термодинамике используется понятие количества теплоты (Q). Энергия, полученная системой, расходуется на совершение работы над внешними

Bioenergetica.indb 324

26.01.2011 18:04:21

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики

325

телами и окружающей средой, а также на переходы между альтернативными состояниями компонентов системы. Изменение количества работы термодинамической системы (ΔW) может быть вычислено как произведение давления (Р) на бесконечно малое приращение объема (ΔV): ΔW = PΔV. Количество возможных состояний термодинамической системы характеризует энтропия (S), которая часто ассоциируется с мерой беспорядка. Понятие энтропии (от греч. entropía — поворот, превращение), введенное в 1865 г. немецким физиком Р. Клаузиусом, теперь широко используется в физике, химии, биологии и теории информации. Связь между изменением общих количеств теплоты и энтропии при обратимых процессах описывается уравнением: ΔQ = TΔS, где T — абсолютная температура. Второе начало термодинамики, сформулированное в 1851 г. английским физиком У. Томсоном (лордом Кельвином), помогает прогнозировать возможность совершения работы над внешними телами, связывая направление переноса энергии (теплоты) и информации через границу системы с понятием энтропии. Обратимые процессы в изолированных системах не приводят ни к росту энтропии, ни к осуществлению полезной работы. Необходимые для совершения работы неравновесные превращения в изолированных системах неразрывно связаны с приближением к состоянию термодинамического равновесия, при котором энтропия максимальна. После достижения равновесия полезная работа в изолированных системах уже не может осуществляться. Энтропия в закрытых и открытых системах возрастает при совершении ими работы над внешними телами и в результате получения информации извне. Рост количества возможных альтернативных состояний системы уменьшает вероятность ее пребывания в работоспособной (нативной) конформации, что снижает эффективность ее работы. Опыт использования закрытых систем технической энергетики показывает, что их приходится регулярно реставрировать. Живые системы стремятся сами минимизировать рост собственной энтропии, ведущей к гибельному для них равновесному состоянию. Они поддерживают достигнутую в ходе эволюции стационарную организованность своих составляющих за счет увеличении энтропии окружающей среды. Существование стационарных состояний открытых систем, соответствующих минимальному производству энтропии, было теоретически обосновано будущим лауреатом Нобелевской премии по химии И.Р. Пригожиным, который в 1947 г. доказал основополагающую теорему термодинамики неравновесных процессов. Очевидно, что сложность термодинамических описаний систем возрастает при уменьшении степени их изоляции. Простые уравнения классической равновесной термодинамики не могут быть непосредственно применены к открытым системам, поскольку поток материи через их границы препятствует установлению истинного равновесия. Однако живые организмы можно рассматривать как совокупность взаимодействующих подсистем

Bioenergetica.indb 325

26.01.2011 18:04:21

326

ПРИЛОЖЕНИЯ

(органов, тканей, клеток, органелл, молекул), что позволяет облегчить понимание сути энергетических процессов. В большинстве случаев отдельные реакции между компонентами подсистемы можно рассматривать как закрытые системы и применять к ним уравнения равновесной термодинамики. Из этих уравнений следует, что для любой системы потенциальная способность совершать работу определяется степенью отклонения ее компонентов от состояния равновесия. Чтобы использовать на практике приблизительные количественные оценки поведения открытых систем, следует понять природу равновесного состояния для конкретной химической реакции и оценить смещение равновесия реальной реакции относительно состояния равновесия, предсказанного уравнениями классической равновесной термодинамики. Именно это отклонение от равновесия определяет количественную способность реакции производить полезную работу. Кроме того, математический аппарат равновесной термодинамики можно эффективно использовать для выявления «невозможных» реакций. Самопроизвольно (без притока энергии в систему извне) могут протекать только процессы, приводящие к росту энтропии и уменьшению запаса энергии.

Термодинамические потенциалы Согласно второму началу термодинамики, не вся энергия системы является «полезной», т.е. может быть использована для осуществления работы. Для оценки количества полезной энергии в 1878 г. американский физик и математик Дж.У. Гиббс разработал теорию «фундаментальных функций», которые характеризовали состояние термодинамической системы в зависимости от ее основных свойств: числа частиц (N), объема (V), давления (P), температуры (Т), энтропии (S) и химического потенциала компонентов (μ). В настоящее время «фундаментальные функции» известны как «термодинамические потенциалы». Последний термин, предложенный в 1884 г. французским философом-физиком П. Дюгемом, вытеснил первоначальный благодаря более точному соответствию сути дела. Потенциал (от лат. potentia — сила) — источники, возможности, средства, запасы, которые могут быть использованы для решения какой-либо задачи, достижения определенной цели. Разные термодинамические потенциалы оптимизированы для облегчения характеристики систем с различными наборами постоянных и переменных свойств (макроскопических параметров): • внутренняя энергия (U), функция энтропии (S) и объема (V); • энтальпия (H), функция энтропии (S) и давления (P); • свободная энергия Гельмгольца (F), функция температуры (T) и объема (V); • потенциал Гиббса (G), функция температуры (T) и давления (P); • потенциал Ландау, или большой термодинамический потенциал (Ω), функция температуры (T), объема (V) и химического потенциала переносимых частиц (μ). Внутренняя энергия системы (U) — полная энергия этой системы за вычетом кинетической энергии системы как целого (энергии движения в окружающей среде) и потенциальной энергии системы во внешнем поле

Bioenergetica.indb 326

26.01.2011 18:04:21

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики

327

сил (при взаимодействии с другими системами). В применении к биоэнергетике внутренняя энергия складывается из кинетической энергии хаотического движения молекул, потенциальной энергии взаимодействия между ними и внутримолекулярной энергии. В соответствии с первым началом термодинамики полная энергия системы равна разнице между количеством теплоты (Q), переданным системе, и максимально полной работой (W), совершенной над внешними телами и окружающей средой: U = Q — W. Для идеализированных процессов, состоящих из непрерывно следующих друг за другом состояний равновесия, изменения (Δ) внутренней энергии системы с постоянным количеством частиц при совершении работы описываются уравнением: ΔU = δQ — δW = TΔS — PΔV. Для характеристики количества теплоты, переданной системе для совершения работы, применяется термодинамический потенциал H, или энтальпия (от греч. enthálpō — нагреваю), изменения которой связаны с внутренней энергией системы следующим образом: ΔH = ΔU + Δ(PV) = TΔS — PΔV + PΔV + VΔP = TΔS + VΔP. При постоянном давлении изменение энтальпии равно количеству теплоты, переданной системе для совершения полезной работы, поэтому энтальпию часто называют тепловой функцией, или теплосодержанием. Энтальпией системы удобно пользоваться в тех случаях, когда в качестве независимых переменных, определяющих состояние системы, выбирают давление P и температуру Т. При исследовании биологических систем теплосодержание можно определить непосредственными калориметрическими измерениями теплового эффекта реакции: –ΔH = ΔQ. Второе начало термодинамики запрещает полное превращение внутренней энергии в работу, поскольку часть внутренней энергии неизбежно расходуется на увеличение энтропии (S). Доля полной энергии, которая может быть израсходована системой для совершения максимально полной работы над внешней средой и находящимися в ней телами (системами), называется свободной энергией Гельмгольца (F), или изохорно-изотермическим потенциалом: ΔF = ΔU — Δ(TS) = TΔS — PΔV — TΔS — SΔT = — PΔV — SΔT. Из этого уравнения следует, что свободная энергия Гельмгольца убывает при возрастании объема и температуры. Однако часть полной работы расходуется на бесполезное изменение внешней среды вследствие вариаций объема системы. Работа системы над внешними телами, не приводящая к изменению внешней среды, называется полезной работой. Максимально полезная рабо-

Bioenergetica.indb 327

26.01.2011 18:04:22

328

ПРИЛОЖЕНИЯ

та системы численно равна уменьшению энергии Гиббса (G), или изобарноизотермического потенциала, который вычисляется следующим образом: ΔG = ΔH — Δ(TS) = ΔU + Δ(PV) — Δ(TS) = = TΔS + VΔP — TΔS — SΔT = VΔP — SΔT. Согласно уравнению, энергия Гиббса уменьшается с ростом температуры, но увеличивается с ростом давления в системе. Для характеристики физических процессов используется свободная энергия Гельмгольца, а для химических и физико-химических — потенциал Гиббса. Разность потенциалов Гельмгольца и Гиббса характеризует количество энергии, затраченной системой на непродуктивное изменение внешней среды: ΔF — ΔG = — PΔV — VΔP. Следует подчеркнуть, что в биологической литературе потенциал Гиббса часто называется «свободной энергией Гиббса» или просто «свободной энергией», что может привести к смешению с потенциалом Гельмгольца. В приложении к биологическим системам разницей между этими потенциалами часто пренебрегают, поскольку при большинстве биохимических превращений изменения объема незначительны. Биохимические реакции протекают при постоянном давлении и температуре, значит, формулу для вычисления изменений потенциала Гиббса можно упростить следующим образом: ΔG = ΔH — TΔS. Характер изменения энергии Гиббса позволяет судить о принципиальной возможности осуществления процесса. При ΔG < 0 процесс может протекать самопроизвольно, если ему не препятствуют кинетические факторы. К примеру, отрицательная величина изменения энергии Гиббса не препятствует переносу электронов с молекулы NADH на кислород без каких-нибудь посредников. Однако молекула NADH в одной реакции отдает 2 электрона, а молекула кислорода способна принять только один. В результате самопроизвольное окисление NADH кислородом запрещено из-за несоответствия правилу четности Шеффера, которое требует совпадения количества отданных и принятых в одной реакции электронов. Молекулы-посредники, способные принимать и отдавать разные количества электронов, помогают обойти кинетические ограничения термодинамически разрешенных процессов. Если ΔG = 0, то система находится в состоянии химического равновесия и валовые превращения компонентов системы не происходят. Осуществление процесса, характеризующегося ΔG > 0, возможно только при поступлении энергии извне. К примеру, образование глюкозы из воды и углекислого газа в процессе фотосинтеза сопряжено с увеличением энергии Гиббса и осуществляется за счет поступления в систему энергии квантов света. Определить изменение энергии Гиббса для биохимических реакций можно несколькими способами: из константы равновесия реакции, величин стандартных окислительно-восстановительных потенциалов, калориметрическим определением теплового эффекта реакции, а также путем суммиро-

Bioenergetica.indb 328

26.01.2011 18:04:22

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики

329

вания известных из таблиц стандартных величин ΔH0 и TΔS0 образования компонентов реакции из соответствующих простых элементов. Термодинамические потенциалы, описывающие гомогенные системы без переноса частиц (растворы), проще потенциалов для расчета энергетики содержащих мембраны гетерогенных систем. Если энергетические процессы в системе сопряжены с переносом материи (частиц) через ее границу (мембрану) во внешнюю среду (другую систему), все уравнения термодинамических потенциалов дополняются слагаемым (+μΔN), количественно равным изменению энергии Гиббса в системе за счет добавления в нее количества молекул N с химическим потенциалом μ. Химический потенциал (μ) компонента равен энергии, которую необходимо затратить для того, чтобы добавить в систему бесконечно малое молярное количество этого компонента (одну частицу). Иными словами, химический потенциал — это удельный потенциал Гиббса (на одну частицу или 1 моль молекул, если под N подразумевается не количество частиц, а число молей молекул):

μ = ΔG/ΔN. Оценка химических потенциалов помогает охарактеризовать реакции, связанные с перераспределением частиц (молекул) между фазами или отсеками, разделенными мембраной. Частицы могут самопроизвольно перемещаться из отсека (фазы) с более высоким химическим потенциалом в отсек (фазу) с более низким химическим потенциалом. Это понижает общую свободную энергию системы и приближает ее к равновесию, при котором химические потенциалы частиц в обоих отсеках (фазах) равны. Следует обратить внимание на исторически сложившееся различие в понимании термина «градиент» у специалистов из разных областей науки. Под термином «градиент» (от лат. gradiens — шагающий) биохимики часто подразумевают направление уменьшения концентрации частиц, тогда как математики и физики имеют в виду направление возрастания некоторой величины, значение которой меняется от одной точки пространства к другой. Если частицы, перемещающиеся через границу раздела фаз, имеют электрический заряд (например, ионы), возникают условия для появления трансмембранной разности электрических потенциалов (ΔΨ). Для оценки вероятного перераспределения ионов применяется электрохимический потенциал ( ), о котором было рассказано подробно в разделе «Законы биоэнергетики». Для статистического ансамбля состояний системы с переменным количеством (N) частиц и равновесным химическим потенциалом может быть определен «большой термодинамический потенциал», или потенциал Ландау (Ω), который связывает свободную энергию Гельмгольца с химическим потенциалом: Ω = А — μN = — PV, ΔΩ = — SΔT — PΔV — NΔμ.

Bioenergetica.indb 329

26.01.2011 18:04:22

330

ПРИЛОЖЕНИЯ

Свободная энергия Гиббса и обмен веществ в биологических системах Откуда живые организмы получают свободную энергию Гиббса? Поскольку биологическая эволюция была направлена на увеличение не столько эффективности, сколько надежности систем энергообеспечения, живые системы не используют атомные, тепловые и механические источники энергии. Для совершения работы в организмах применяется энергия химических реакций, света и ионных градиентов. Внешние ресурсы поглощаются организмами и вовлекаются в обмен веществ (метаболизм). Конструктивная ветвь метаболизма (анаболизм, или ассимиляция) объединяет реакции синтеза органических полимеров (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты), которые входят в состав организма. Источником углерода у автотрофов является углекислый газ, а у гетеротрофов — органические вещества. Органические полимеры в ходе подготовительных реакций энергетической ветви метаболизма (катаболизм, или диссимиляция) расщепляются до низкомолекулярных соединений (мономеров), которые в дальнейшем оказываются субстратами анаболических реакций. Экзергонические реакции катаболизма сопровождаются освобождением энергии Гиббса, запас которой используется для осуществления термодинамически невыгодных реакций анаболизма. В подавляющем большинстве случаев запасание энергии Гиббса связано с переходом одного или двух электронов от вещества-донора к веществу-акцептору, отличающемуся более высоким сродством к электрону; при этом исходно восстановленный донор окисляется, а окисленный акцептор — восстанавливается. Первичными донорами электронов у литотрофов служат неорганические соединения (соединения серы, двухвалентное железо, аммиак и его соли, нитриты, водород и угарный газ), а у органотрофов — органические вещества (белки, углеводы, липиды и продукты их частичного расщепления). Акцептором электронов у аэробных организмов является кислород, а у анаэробных — нитраты, нитриты, сульфаты, углекислый газ и некоторые органические вещества. Для количественной оценки сродства веществ к электронам служит шкала стандартных окислительно-восстановительных (редокс) потенциалов, исчисляемых в вольтах (В). Доноры имеют более отрицательный редокспотенциал, чем акцепторы. Значения редокс-потенциалов низкомолекулярных веществ, участвующих в биоэнергетических превращениях, находятся в пределах от –0,7 В (α-кетоглутарат / сукцинат) до +0,8 В (кислород / Н2О). Законы термодинамики допускают возможность использования для получения и последующего запасания энергии любой донорно-акцепторной пары, обеспечивающей разницу редокс-потенциалов не менее 0,2 В. Такая разность потенциалов позволяет конвертировать свободную энергию разнообразных ресурсов в унифицированную форму аденозинтрифосфорной кислоты, или АТР (см. главу VII), применяемую для совершения разных видов работы. Обсуждаемое количественное ограничение отражает квантовый принцип передачи свободной энергии в биологических системах.

Bioenergetica.indb 330

26.01.2011 18:04:22

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики

331

Ассимиляционная сила и ее источники Электроны, полученные от доноров с высоким восстановительным потенциалом, могут быть использованы для связывания молекул в ходе анаболических реакций. Такие электроны часто называются восстановительными эквивалентами. Совокупность восстановительных эквивалентов и свободной энергии Гиббса, полученная в ходе катаболических реакций, называется ассимиляционной силой. Каковы источники ассимиляционной силы для биологических систем? Жизнедеятельность хемотрофов зависит от наличия в окружающей среде сильных неорганических или органических восстановителей. Фототрофы восстанавливают молекулы собственных акцепторов (см. главу II) электронами, полученными от слабых восстановителей за счет энергии квантов света. Борьба за энергетические ресурсы могла быть движущей силой эволюционного процесса при освоении новых экологических ниш. Распределение внешних источников углерода и ассимиляционной силы между организмами привело к появлению восьми вариантов биоэнергетики. Хемотрофной биоэнергетикой (см. главу V) пользуются хемоорганоавтотрофы (некоторые метилотрофные прокариоты); хемоорганогетеротрофы (большинство прокариот и две группы эукариот: животные и грибы); хемолитоавтотрофы и хемолитогетеротрофы (многие прокариоты). Светозависимую энергетику (см. главы II и VI) применяют фотоорганоавтотрофы и фотоорганогетеротрофы (прокариоты), фотолитоавтотрофы (растительные эукариоты) и фотолитогетеротрофы (прокариоты). В экологических системах продукты жизнедеятельности одних организмов могут являться ресурсами для других. Следствием донорно-акцепторных взаимодействий в биосфере и ее биогеоценозах является биогенная миграция химических элементов. К примеру, фотолитоавтотрофные цианобактерии и растения, потребляя углекислый газ и воду, производят глюкозу и кислород, которые преобразуются аэробными хемоорганогетеротрофами снова в углекислый газ и воду. Лишь 5–20% энергии Гиббса аккумулируются в образованной биомассе гетеротрофов, а остальная часть рассеивается в виде тепла и расходуется на поддержание жизнедеятельности. Фотолитоавтотрофы, являющиеся основными продуцентами биомассы в большинстве экосистем, используют около 1% доступной световой энергии для анаболизма.

Транспорт ассимиляционной силы У многоклеточных гетеротрофов подготовительные реакции катаболизма происходят, в основном, в полостях пищеварительной системы и в запасающих тканях, а окислительные — в клетках. Доноры и акцепторы электронов поступают в организм многоклеточных сквозь поверхность тела или через специальные структуры (устьица растений, жабры, пищеварительный тракт и легкие животных), после чего переносятся к клеткам при помощи проводящих систем (ситовидные трубки, трахеиды и трахеи растений; кровеносная система животных), а также через межклетники и полости тела. Эффективность транспорта акцепторов к местам их использования часто

Bioenergetica.indb 331

26.01.2011 18:04:22

332

ПРИЛОЖЕНИЯ

увеличивается за счет дыхательных пигментов (гемоглобин и др.) и специальных клеток-переносчиков (эритроциты). Внутриклеточными посредниками между донорами и акцепторами являются белковые ферменты класса оксидоредуктаз. Для перемещения восстановительных эквивалентов оксидоредуктазы используют вещества небелковой природы (кофакторы и простетические группы): никотиновые и флавиновые нуклеотиды, хиноны, металло-порфирины и железо-серные кластеры. Элементы электрон-транспортных цепей располагаются в порядке возрастания сродства к электрону, что помогает снизить активационный барьер суммарной оксидоредуктазной реакции. Перенос восстановительных эквивалентов в растворах осуществляют никотинамидные коферменты, структура которых препятствует их прямому окислению кислородом. В катаболических превращениях в основном участвует NAD+, а в реакциях анаболизма — его фосфорилированный аналог NADP+. Окисление доноров или восстановление акцепторов часто сопровождается освобождением или соответственно присоединением 1–2 ионов водорода (Н+). Участие Н+ в этих превращениях позволяет увеличивать разницу редокс-потенциалов донорно-акцепторной пары, изменяя кислотность среды в направлении, определяемом уравнением В. Нернста и законом действующих масс. Свободная энергия Гиббса может накапливаться и передаваться в форме ионных градиентов (см. главы 9 и 11), а также в молекулах веществ, содержащих группы с высоким потенциалом переноса, которые В.А. Энгельгардт в 1945 г. назвал «макроэргами». Наиболее известной молекулой такого рода является АТР, водорастворимая «энергетическая валюта» клетки (см. главу 7). В физиологических условиях структура АТР обеспечивает сочетание высокого потенциала переноса каждой из двух концевых фосфорильных групп на молекулу акцептора (термодинамическую нестабильность) с кинетической устойчивостью (при температуре тела и нейтральном рН АТР самопроизвольно не гидролизуется). Показано, что АТР расходуется при совершении разнообразных видов работы: химической (биосинтезы), электрической (создание разности электрических потенциалов на биомембранах), осмотической (образование градиентов концентраций незаряженных веществ) и механической (сокращение актомиозиновых комплексов мышц). Свободная энергия Гиббса, запасенная в потенциале переноса групп АТР (фосфорильный потенциал), при помощи специальных ферментов (нуклеозидди- и монофосфаткиназ) может перераспределяться между различными нуклеозидтри- и дифосфатами, обеспечивая протекание специфических биосинтезов. Фосфорильный потенциал у большинства животных стабилизируется посредством равновесной реакции обратимого переноса фосфорила на креатин. У некоторых ракообразных буфером фосфорильных групп является фосфоаргинин, а у грибов — полифосфаты. Помимо «водорастворимой валюты», клетки всегда располагают хотя бы одной, а часто двумя «мембранными валютами» — трансмембранными разностями электрохимических потенциалов ионов H+ и Na+ (соответственно Δ H+ и Δ Na+).

Bioenergetica.indb 332

26.01.2011 18:04:22

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики

333

Хранение ассимиляционной силы Для долговременного хранения ассимиляционной силы используются полимеры углеводов (крахмал у растений, гликоген у животных и грибов), липиды (масла у бактерий, растений и грибов, жиры у животных), белки (вителлин ооцитов и др.) и полифосфаты (у некоторых бактерий и грибов). Углеводы отличаются высокой скоростью мобилизации, а липиды — наибольшей энергоемкостью. Резервные углеводы у растений размещаются в запасающих органах (клубни и др.), а у животных — в печени, мышцах, мозге и некоторых других тканях. Специальная жировая ткань у животных служит местом депонирования липидов. Доступность акцепторов для клеток хемогетеротрофов часто является ограничивающим экологическим фактором. Поэтому такой акцептор электронов, как О2, у аэробных животных может аккумулироваться специальным дыхательным пигментом мышц (миоглобином). Периоды ограниченной доступности внешних ресурсов некоторые организмы могут пережидать в состоянии анабиоза или спячки (гибернации). Определенные биологические ассимиляционные запасы могут использоваться технической энергетикой. Полагают, что масла ископаемых диатомовых водорослей послужили источником для образования нефти; целлюлоза древних плаунов и хвощей превратилась в черный и бурый каменный уголь, а деятельность архей-метаногенов способствовала возникновению запасов природного газа.

Bioenergetica.indb 333

26.01.2011 18:04:22

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

СТРУКТУРНЫЕ ФОРМУЛЫ РАЗЛИЧНЫХ ПРОСТЕТИЧЕСКИХ ГРУПП И КОФАКТОРОВ ФЕРМЕНТОВ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ ЦЕПЕЙ

Рисунок 1. Структурные формулы различных гемов, входящих в состав основных ферментов электрон-транспортных цепей

Bioenergetica.indb 334

26.01.2011 18:04:22

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Структурные формулы различных простетических групп...

335

Рисунок 2. Хлорофиллы фотосинтетических электрон-транспортных цепей прокариот и растений

Bioenergetica.indb 335

26.01.2011 18:04:23

336

ПРИЛОЖЕНИЯ

Рисунок 3. Производные хинона, участвующие в ферментативных окислительновосстановительных процессах: число изопреновых остатков (n) варьирует у разных видов от 6 до 10; уби- и менахиноны найдены в мембранах бактерий и митохондрий, пластохинон — в мембранах тилакоидов хлоропластов и цианобактерий, родохинон — в дыхательной цепи митохондрий имаго аскариды

Рисунок 4. Структурные формулы никотинамидных кофакторов. В NAD(H) R является гидроксильной группой, а в NADP(H) — фосфатной

Рисунок 5. Структурные формулы рибофлавина, FMN и FAD, а также механизм их двухэлектронного восстановления

Bioenergetica.indb 336 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Рисунок 6. Основные железосерные кластеры FeS-протеинов: [Fe–S]-центр, [2Fe–2S]- и [4Fe–4S]-кластеры (сверху вниз). Кластер, содержащий один атом Fe (показан красным), был описан в различных рубредоксинах и родственных им белках. Однако, как правило, атомов железа больше — два, три, четыре и т.д. В рубредоксине все атомы серы принадлежат остаткам цистеина белка (показаны серым). В остальных кластерах в образовании комплекса наряду с остатками цистеина участвуют также атомы серы в форме сульфида (S2–, показаны желтым)

26.01.2011 18:04:23

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Структурные формулы различных простетических групп...

337

Рисунок 7. Структурные формулы тиаминпирофосфата (1), дигидролипоевой кислоты (2) и кофермента А (3)

Рисунок 9. Тетрагидрофолат и тетрагидрометаноптерин (метаногенные археи)

Рисунок 8. Кобаламин (витамин B12)

Bioenergetica.indb 337

Рисунок 10. Структурные формулы метил-кофермента М, кофермента B и CoM-S-S-CoB гетеродисульфида (метаногенные археи)

26.01.2011 18:04:24

338

ПРИЛОЖЕНИЯ

Рисунок 11. Структурные формулы различных вариантов кофермента F420 (метаногенные археи)

Рисунок 12. Метанофеназин и дигидрометанофеназин метаногенных архей

Bioenergetica.indb 338

Рисунок 13. Структурные формулы метанофурана (MFR), формил-метанофурана и карбокси-метанофурана (метаногенные археи)

26.01.2011 18:04:25

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

ПРИРОДНЫЙ ВОЗОБНОВЛЯЕМЫЙ АНТИОКСИДАНТ, АДРЕСОВАННЫЙ В МИТОХОНДРИИ

В последней главе нашей книги речь шла о том, что SkQ1 — искусствен-

ный антиоксидант многократного действия, адресованный во внутреннюю митохондриальную мембрану. В 2008 г. появилось сообщение Б. Моосмана и сотр. о естественном возобновляемом антиоксиданте, локализованном в той же мембране. Поразительно, что ради достижения этой цели митохондрии пошли на изменение своего генетического кода. Как показали авторы цитированной работы, белки, кодируемые митохондриальной ДНК, у многих видов эукариот содержат гораздо больше метионина, чем их аналоги у других видов эукариот. Оказалось также, что у видов, бедных метионином, эта аминокислота кодируется в митохондриях одним кодоном (AUG), а у богатых метионином — не только AUG, но также еще AUA (у бедных метионином AUA — один из трех кодонов изолейцина). Как правило, кодон AUA кодирует метионин вместо изолейцина, когда речь идет о видах с высоким аэробным обменом (позвоночные, насекомые, ракообразные, круглые черви), в то время как у видов с низким аэробным обменом (иглокожие, губки, плоские ленточные черви, книдарии) AUA кодирует в митохондриях изолейцин точно так же, как это имеет место в случае с белками, кодируемыми ядерной ДНК. Замечательное разнообразие демонстрируют грибы. Среди группы Saccharomycotina одни (в частности, Saccharomyces cerevisiae) используют AUA для кодирования метионина, а другие — изолейцина (к последним относятся также Schizosaccharomyces pombe). Существенно, что как изолейцины, так и метионины, кодируемые AUA, обычно расположены на поверхности белков внутренней мембраны митохондрий, причем часть из них обращена в сторону интерфазы мембрана / вода, а часть находится в сердцевине мембраны, т.е. в ее гидрофобной области. Демонстративен следующий пример. По количеству поверхностных метионинов в митохондриальном цитохроме b пчела Melipona bicolor в десять раз превосходит морскую звезду Florometra serratissima (33 остатка против 3). В результате у насекомого вся молекула цитохрома b прямо-таки покрыта снаружи метионинами (рис. 1). По мнению Б. Моосмана и его коллег, ключ к пониманию подобной ситуации дает антиоксидантная активность метионина. Это единственная аминокислота, способная реагировать практически со всеми природными АФК, включая даже сравнительно инертную Н2О2. При этом АФК обезвреживаются, а метионин превращается в стабильный и безобидный метио-

Bioenergetica.indb 339

26.01.2011 18:04:26

340

ПРИЛОЖЕНИЯ

Рисунок 1. Остатки метионина (показаны красным) в цитохроме b из митохондрий морской звезды (Florometra serratissima) и пчелы (Melipona bicolor) [Bender et al., PNAS 2008, 105: 16496–16501]

нинсульфоксид (ср. с другой серосодержащей аминокислотой — цистеином, которая тоже реагирует с АФК, но образует при этом весьма агрессивный радикал*). Кроме того, очень важно, что метионинсульфоксид способен регенерировать в исходный метионин, восстанавливаясь электронами дыхательной цепи: NADPH → тиоредоксинредуктаза → тиоредоксин → → метионинсульфоксидредуктаза → метионин. Таким образом, метионин белков, кодируемых митохондриальной ДНК, оказывается аналогом SkQ1, будучи возобновляемым антиоксидантом, локализованным во внутренней мембране митохондрий (рис. 2). Существенно, что добавочные метионины, появляющиеся в результате изменения генетического кода в митохондриях, располагаются на периферии белковой молекулы, встречая АФК на пути к активным центрам ключевых белков окислительного фосфорилирования. Подобное расположение метионинов обусловлено тем, что ранее те же места занимали остатки такой гидрофобной аминокислоты, как изолейцин. Белки, о которых идет речь, встроены в мембрану, как кирпичи в стену, а поверхностные гидрофобные аминокислоты цементируют их связи с партнерами внутри мембраны. Совсем недавно антиоксидантная роль метиониновых остатков в белках была подтверждена Луо и Левиным в опытах на E. coli. Бактерии росли на среде со смесью аминокислот, в которой метионин был заменен на норлейцин. Поскольку система биосинтеза белков E. coli может использовать норлейцин вместо метионина, со временем в среде роста накапливалось все больше клеток с белками, в которых метионин заменен на норлейцин. Когда процент подобных замен достиг 40, клетки отмыли от свободного * Неудивительно, что существует обратная корреляция между продолжительностью жизни организма и количеством остатков цистеина в белках, кодируемых в митохондриях.

Bioenergetica.indb 340

26.01.2011 18:04:26

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Природный возобновляемый антиоксидант, адресованный...

341

Рисунок 2. SkQ и метионин как возобновляемые антиоксиданты, защищающие митохондрии от АФК. АФК — активные формы кислорода, НФК — неактивные формы кислорода, SkQH2 — восстановленная форма SkQ, SkQ•− — анион-радикал SkQ, bH2+ — восстановленный цитохром bH, bH3+ — окисленный цитохром bH, метионин и метионин-сульфоксид — соответствующие аминокислотные остатки в белках, кодируемых митохондриальной ДНК, TrxВ — восстановленный тиоредоксин, TrxO — окисленный тиоредоксин. Показано, что дыхание регенерирует bH2+ и TrxВ, восстанавливая bH3+ и TrxO

норлейцина и добавили метионин. В результате количество свободного метионина и S-аденозилметионина в клетках E. coli нормализовалось, а количество метионина в белках осталось сниженным. Как выяснилось, такие клетки оказались гораздо чувствительней, чем в норме, к токсическому действию Н2О2. При всем сходстве в антиоксидантном действии белковых метионинов и SkQ1 между ними есть и существеннейшее отличие, касающееся применимости двух этих механизмов для терапии старения. Не вмешиваясь в геном митохондрий, мы не можем искусственно усилить метиониновую систему, увеличив количество метионина в митохондриальных белках. В то же время не составляет труда варьировать силу воздействия SkQ1, просто меняя его количество, вводимое в организм пациента. Существенно также, что метионин — самая токсичная из аминокислот, избыток которой в диете ведет к множеству патологических последствий для организма.

Bioenergetica.indb 341

26.01.2011 18:04:26

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Автофагия 278, 279 Аденилатциклаза 211 Аденозиндифосфат (ADP) 17, 18 – ингибирование FoF1-ATPазы 152, 153 Аденозинмонофосфат (AMP) 18 Аденозинмонофосфат циклический (cAMP) 211, 226 Аденозинтрифосфат (ATP) 12, 17, 18 Аденозинтрифосфатаза (ATPаза) 159, 160 – Ca2+ 267 – Cl– 267 – H+ 159 – 164 – – в анаэробных бактериях 160 – – в плазмалемме клеток 162 – – классификация 160, 161 – – типа E1E2 163 – – типа FoF1 161, 162 – – типа VoV1 162, 163 – K+ 164, 165, 188 – Na+ 251–253 – Na+/K+ 30, 252, 253 Аденозинтрифосфатсинтаза (ATP-синтаза) – в хлоропластах 146 – механизм 151–158 – митохондриальная 145, 146 – отношение H+/ATP 158, 159 – субъединичный состав 145, 146 – трехмерная структура 147–151 – Na+ 259, 260 – E. coli 145 Аконитаза 68, 276–278, 284 Аксиальный лиганд 40, 50, 60–62, 101 – определение 103 Активные формы кислорода (АФК) 268–288, 294–301, 306, 310, 312, 316, 317, 320, 321, 339–341 Алкалофилы 89, 192, 255, 259, 262, 263 Альтернативная (цианидрезистентная) оксидаза (AOX) 111, 112, 115, 122 Альцгеймера болезнь 290 Аминокислот транспорт 187, 255, 256 Антенна светособирающая 20, 21, 25, 33, 34, 55, 56, 58, 59, 139, 227–229 Антимицин 100, 306 Антипортер – ATP/ADP 200–204, 206, 211, 212, 214, 216, 276, 278, 283 – глутамат/аспартат 211, 223, 276

Bioenergetica.indb 342

– дикарбоксилатов 211, 223, 224 – карнитин/ацилкарнитин 195–197 – сахароза/H+ 191 – K+/H+ 89, 197, 225, 253 – Na+/H+ 192, 197, 240–242, 256 – HPO42-/малат2- 192 Апоптоз 16, 101, 280–286, 289, 295, 297, 298, 301, 306, 308, 314 Арсенат 17, 206, 207 Аскарида 117, 118 Аскорбат 58, 86, 91, 271 Атрактилат 200 Аттрактанты 140, 141, 227, 274 Ацетил-CoA 70, 193, 196, 245 Ацетилфосфат 73 Ацидофилы 33, 256 Бактериородопсин – аминокислотная последовательность 130 – в аттрактантном эффекте света 140, 141 129, 130, 134–137 – генерация – двумерные кристаллы 129 – квантовый выход 139 – конформационные изменения 133, 136 – принцип функционирования 129, 130 – сдвиг рК Шиффова основания 129, 130 – темновая адаптация 134 – трехмерная структура 130–133 – фотоцикл 133 – электрогенные стадии 134, 135 Бактериофеофетин 34, 35, 38, 41, 42 Бактериохлорофилл 32–36, 38–43, 48, 52 – димер 34, 35, 39, 41, 42, 52 Белок – ингибитор F1 153 – протеинкиназы 211, 227, 281, 296, 298 – Риске 50, 83, 95–97, 99, 100 – транспорт через мембрану 203–206 – p53 295, 300, 301, 310, 313 – p66shc 295, 296, 298 Бислойная мембрана 305 Биотин 157, 244, 245

26.01.2011 18:04:27

Предметный указатель Биоэнергетика – определение 7 – отношение к другим биологическим наукам 9–12 – эволюционные аспекты 17–30 Биядерный центр 102, 104–107, 112, 113, 115, 116 Бонгрековая кислота 200, 202 Британский антилюизит 100 Брожение 7, 74–77, 123, 124, 160, 245 Бурый жир 209–214, 216, 217, 221 14, 51, 64, 168, 239–244, Буферы 265 Валиномицин 162, 187, 188, 197, 200 Ванадат 151, 163, 164, 251, 267 Витамин А 25, 271 Витамин B1 20 Витамин B12 20, 250 Витамин E 271, 301 Витамин К1 27, 52, 54–57, 91, 117, 271 Витамин К3 27, 90, 91, 117, 223, 271 Вольфрам 251 Высокоэнергетическое соединение, определение 17–18 Галородопсин 137–141, 264, 267 Галофилы 128, 138–142, 187, 192, 241, 255, 262, 264 Гексокиназа 69, 226 Гем – высокоспиновый 103, 108, 115 – низкоспиновый 103, 116 – хлориновый 116 – bH 35, 36, 48, 49, 54, 55, 60–62, 83, 95, 96, 99, 276, 306, 311, 341 – bL 35, 36, 48, 49, 54, 55, 60–62, 83, 95–97, 99, 100, 276 Гемоглобин 103, 332 Генератор – вторичный 159–161 – первичный 31–141 – соотношение Н+/ 55, 83, 91, 92, 94, 99, 100, 115–117, 119 2-Гептил-4-оксихинолин-N-оксид (HQNO) 249 Гидрогеназа 89, 126, 127, 245 Гидроксиламин 153, 163, 164 Гипоксия 235, 287 Глаукома 308, 310, 315 Гликолиз 14, 16, 22–24, 26, 68–76, 78, 82, 118, 160, 161, 165, 175, 182, 191, 200, 242, 252, 279, 287

Bioenergetica.indb 343

343

Глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) 68, 71, 223 Глицерин 38, 40, 66, 211 Глутатион 271 Глюкоза 28, 66, 68–70, 74–76, 109, 118, 123, 159, 166, 169, 186, 191, 226, 252, 267, 331 Грамицидин D 197 Гуанилатциклаза 103 Гуанозиндифосфат (GDP) 73, 142, 201, 211 Гуанозинмонофосфат циклический (cGMP) 142 Гуанозинтрифосфат (GTP) 67, 142, 200, 201, 211 Движение – бактерий 174–181 – простейших 174, 184, 185 – сперматозоидов 174 Девесковинида 184, 185 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) 8, 22, 58, 79, 166, 206, 207, 269, 271, 278–281, 284, 295, 296, 299, 301, 310, 312, 317, 339–341 Декарбоксилаза – глутаконил-CoA 246 –метилмалонил-CoA 246, 259 –Na+-зависимая 244–246 –оксалоацетата 244, 245 2,4-p-Динитрофенол 182, 215, 235, 312 N,N-Дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД) 141, 151, 154, 155, 161, 163, 164, 168, 182, 183 Диурон 57, 235 Диэтилстильбестрол 151 Дыхательный контроль 112, 215, 216, 276 Дыхательная цепь 81–122 Железа двухвалентного ион как донор электронов 120, 121 Жирные кислоты – как терморегуляторные разобщители 211, 212, 215, 216 – ковалентное связывание с белком 38, 40 – β-окисление 86, 195, 196, 212 – транспорт 192–196, 212 Жирный ацилкарнитин 193–197 Жирный ацил-CoA 86, 194, 195, 211, 226, 237

26.01.2011 18:04:27

344

Предметный указатель

Зеленые фотосинтезирующие бактерии 51–54 Зимняя спячка 213 Калий-транспортирующая система 188 Кальция ион – аккумуляция в митохондриях 30, 187, 188, 190, 192, 225, 236 – активация фосфолипазы А2 226 – как вторичный посредник 111, 225, 226 Капсаицин 90, 91, 298, 299 Карбоксиатрактилат 200, 202, 216 Кардиолипин 311, 313 Карнитин 192–197, 211, 237, 302, 305 Карнозин 77–79 Каротиноиды 33, 41, 42, 129, 139 Каспаза 281 Каталаза 224 α-Кетоглутарат 14, 70, 72, 73, 112, 201, 224, 330 α-Кетоглутаратдегидрогеназа 68, 72 Кобаламин, см. витамин B12 250 Комплекс I – бактериальный 87, 89, 90 – в митохондриях 86 92–94 – генерация – перенос электронов 93, 94 – редокс-центры 88 – соотношение Н+/ 83, 92 – субъединичный состав 86, 87 – трехмерная структура 87, 93 Комплекс II см. Сукцинатдегидрогеназа Комплекс III (CoQH2:цитохром с редуктаза) – в бактериальной фото-редокс цепи 48–50 – в дыхательной цепи 94–100 – редокс-центры 98, 99 – субъединичный состав 95, 96 – трехмерная структура 96–98 Комплекс IV См. Цитохромоксидаза Комплекс bc1 См. Комплекс III Комплекс b6f 60–63 Комплекс фотосинтетических реакционных центров (бактериальный) 44–48 – генерация – последовательность переноса электронов 42–44 – расположение редокс-групп 38–42 – субъединичный состав 37, 38 – трехмерная структура 38–41

Bioenergetica.indb 344

Кофермент А (CoA) 20, 86, 167, 193–196, 211, 260 Кофермент B (CoB) 125, 126 Кофермент F420 90, 126, 127 Кофермент Q (CoQ) – в дыхательной цепи 82, 83 – в комплексе фотосинтетических реакционных центров 27, 34 Кофермент М (CoM) 125, 126, 250, 260 Креатинфосфат 14, 17, 18, 90, 197, 332 Ксенобиотики 117, 221–223 β-Лактамаза 206 Лактат 24, 76, 78, 82, 109, 123, 191, 221, 246 Лидер-пептидаза 204 Лизосома 10, 161, 162, 166, 279 Лизофосфолипиды 226 Липаза 211, 226 Липоевая кислота 72, 73 Липопротеины 38, 40, 179 Липосома 247, 305 Липофильные (проникающие) ионы 230, 234, 268, 269, 302, 320 Малат 68, 109, 118, 192, 219, 224 Малат-аспартат-глутаматный челнок 223, 224 Малатдегидрогеназа 68, 223, 224 Медь 27, 55–57, 79, 82, 91, 102–107, 112–115 Мелатонин 300 Мелибиоза 255 Менадион, см. витамин К3 Менахинон (MQ) 42, 40–42, 45, 52, 117, 118, 270 Метан 123–125, 250, 251, 261, 333 Метаногенез 77, 123–127, 249–251, 260, 261, 333 Метанофеназин 126, 127 Метанофуран 250, 251, 260, 261 Метионин 103, 317, 339–341 Метиламин 124, 125 Метилмалонил-CoA 246, 259 Миксотиазол 100, 219, 275 Митоптоз 277–280, 284, 290 Митохондриальный ретикулум 229, 231, 233, 234, 243 Митохондрия – биогенез 205 – внешняя мембрана 87, 195, 203, 204, 211, 216, 224, 226, 232, 238, 271, 280, 281

26.01.2011 18:04:27

Предметный указатель – внутренняя мембрана 81, 111, 171, 190, 192, 194, 195, 200, 202–205, 209, 216, 217, 221, 223, 226, 235, 237, 238, 271, 272, 277, 278, 283, 295, 296, 306, 311 – гигантская 230–232 – контакт 231, 232, 234–236 – латеральный транспорт 235–239 – нитчатая 232–235 – окраска родамином 225, 234, 236 – транспорт Ca2+ 30, 187, 188, 190, 192, 225, 236 – форма 229–235 – эволюционное происхождение 203 Молибден 114, 251 Моненсин 258 Муцидин 100 Мягкое разобщение 276, 284, 312 Надпочечник 191, 272, 290 Негемовое железо – в альтернативной оксидазе 112 – в комплексе реакционных центров 41 – в фотосистеме II 58–60 Негемовые железосерные белки – в комплексе I 88, 89 – в нециклической фото-редокс цепи 52 – в комплексе III 36, 50, – в фотосистеме I 57 Некроз 281, 283–286, 289, 306, 307 Нигерицин 197, 200, 225 Никотинамидадениндинуклеотид (NAD(H)) 20, 50–53, 68–71, 74–76, 78, 81–83, 85–90, 93, 94, 109, 111, 115, 118, 120, 121, 127, 158, 169–173, 219, 221, 223, 224, 239, 246, 247, 249, 274, 278, 328, 332 Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP(H)) 20, 50, 55–58, 63–65, 81, 82, 90, 111, 122, 169–173, 221, 222, 227, 247, 271, 272, 278, 285, 332 Нистатин 184 Нитрат – ингибитор V0V1-ATPазы 163 – как окислитель редокс-цепи 114, 117, 121, 330 – редуктаза 114, 117 Нитрит 86, 114, 121, 330 Норадреналин 211, 213, 215 Нуклеозиддифосфаткиназа 201, 332

Bioenergetica.indb 345

345

Обратный перенос электронов 120, 121, 173 Ожирение 213 Оксалоацетат 68, 70, 224, 244–246 Олигомицин 144, 155, 163, 168, 216 Органоптоз 287, 289 Осмотическая работа, определение 186 Остеопороз 290, 293, 308, 310, 314, 318 Отношение P/O 158, 159 Оуабаин 253, 266 Пальмитоилкарнитин 195 Пероксисома 10, 224, 271, 272, 279 Пептидоглюкан 159 Пиерицидин 90 Пирофосфат неорганический (PPi) 14, 18, 51, 144, 166–169 Пирофосфат-синтаза (пирофосфатаза) 18, 50, 166–169, 243, 253 Пируват 68, 70, 72, 73, 75, 76, 112, 118, 244, 245 Пируватдегидрогеназный комплекс 68, 72, 76 Пируват-формиат-лиаза 76, 245 Плазмадесма 229, 235 Плазмалемма 10, 30, 162–166, 186, 256, 265, 271 Пластохинон (PQ) 27, 54, 55, 57, 60, 61, 100, 122, 270, 271, 303, 305, 320 Пластоцианин 54, 56–58, 63, 100, 122 Плотный контакт 232 Прогерия 290, 299, 301, 308, 310 Пропионат 77, 123, 246, 259 Пропионил-CoA 246, 260 Протеинфосфатаза 227 Протеолипосома 44, 45, 58, 100, 137, 154, 164, 167, 168, 170, 198, 200, 239, 244, 247, 252, 255, 256 Протометр 141, 227 Протон-движущая сила (Δp) 13, 14 Протонная помпа 92, 107, 113, 115, 116, 120, 128, 129, 168 Протонофор 121, 169, 182–184, 198, 212, 215, 251, 258, 259, 262, 276, 312 Пурпурные бляшки 129–131, 134, 137, 228 Пурпурные фотосинтезирующие бактерии 27, 32–36, 51, 53, 55, 58, 60, 100, 264 Разность pH (ΔpH) – забуферивание 240–242 – определение 12, 13

26.01.2011 18:04:27

346

Предметный указатель

Разность электрических потенциалов (Δψ) – в распределении мембранных белков – определение 12, 13 – превращение в ΔpH 240–242 Разность электрохимических потенциалов ) ионов H+ ( – забуферивание 14, 239–243 – как конвертируемая энергетическая валюта 12–14 – определение 12, 13 – перенос 227–239 Разность электрохимических потенциалов ) 12, 14–16, 244 ионов Na+ ( Разобщение терморегуляторное – в буром жире 209–214 – в мышцах 214–217 Разобщитель См. Протонофор Регуляция pH в цитоплазме 161, 164, 226, 256, 257 Редокс-петля (петля Митчела) 48, 91, 92, 99, 107, 114, 116, 126, 263, 264 Репелленты 140, 176, 227 Ретиналь 25, 26, 128–130, 134–143 Рибозим 21 Рибонуклеиновая кислота (РНК) 21, 22, 145, 166, 167, 211, 269, 271 Рибофлавин 248, 249 Родамин 225, 234, 236, 305 Родопсин – аминокислотная последовательность 141 – генерация Δψ 142, 143 – каскад cGMP 142 – расположение в мембране 141 – фотоцикл 142 Родохинон 118 Ротенон 90, 91, 219, 235, 275 Саркопения 290, 297, 318 Свободное дыхание 81, 208–219, 221– 223, 226 Секреторные пузырьки 161, 162, 166 Сенсорный родопсин 140, 141 Симпортер – Лактат, H+ 191 – Лактоза, H+ 191, 198, 199, 202 – Cl–, H+ 138 – H2PO4–, H+ 192 – K+, H+ 188, 242 – H+, метаболит 186, 187 – Na+, метаболит 255, 256

Bioenergetica.indb 346

Система расщепления воды хлоропластов и цианобактерий 54, 55, 60 Скулачева ионы 302 Соотношение Н+/ 55, 83, 91, 92, 94, 99, 100, 115–117, 119 149, 158, 159, Соотношение Н+/ATP 163, 169 Сопрягающий ион 13, 29, 109, 244, 255, 263–265 Сперматозоид 174, 231 Специальная пара бактериохлорофилла, См. бактериохлорофилла димер Старение 268, 269, 288–321 Стероидные гормоны 221 Субклеточные бактериальные пузырьки 154, 198, 244, 246, 251, 259 Субмитохондриальные пузырьки 147, 154, 156, 169, 170 Сукцинат 68, 70, 77, 86, 109, 117, 123, 156, 158, 188, 190, 246, 259, 260, 275, 276, 330 Сукцинатдегидрогеназа 68, 117, 276 Сукцинил-CoA 260 Сульфит 153 Супрахиазматическое ядро 300 Таксис бактериальный 140, 176, 227 Термогенез сократительный 214, 222 Термогенин (UCP1) 209, 211, 213, 216 Терморегуляция 208–217, 221 Термофилы 93, 253 Тетрагидрометаноптерин (MPT) 125, 250, 260 Тетрафенилборат 302 Тетрафенилфосфоний 302, 303, 305, 307 Тиаминпирофосфат 20, 73 Тилакоид 50, 53–56, 58, 63–65, 81, 100, 121, 122, 154, 159, 189, 225, 227, 229, 242, 243 Тимуса инволюция 308, 314, 319 Тиосульфат 121 Тироидные гормоны 224, 286 Тонопласт 161–163, 167, 183, 186 Трансгидрогеназа 50, 144, 169–173, 264 Трансдуцин 142 Убихинон см. Кофермент Q Увеит 310, 315 Унипорт K+ – в бактериях 188, 225, 242 – в митохондриях 192, 243

26.01.2011 18:04:27

Предметный указатель Фактор некроза опухоли (TNF) 285, 286 Фактор Fo – определение 144, 145 – проводимость для H+ 154, 155 – расположение в мембране 147 – субъединичный состав 145, 146 – трехмерная структура 149, 150 – чувствительность к олигомицину 155 – эффект ДЦКД 154, 155 Фактор F1 – гидролиз ATP 151–153 – ингибирование ADP 153 – каталитические центры 151 – одноцентровый гидролиз ATP 152 – определение 144, 145 – отделение от мембраны 147 – связывание нуклеотидов 148, 151 – синтез связанного ATP 153 – субъединичный состав 145, 146 – трехмерная структура 148, 159 Фактор F6 146, 151 Феназинметосульфат 58 о-Фенантролин 45, 60 Феноптоз 283–291, 312, 313, 320, 321 Фентона реакция 287 Феофитин 55, 58, 60 Ферредоксин 54–58, 63, 90, 247, 248 Феррицианид 88 Флавинадениндинуклеотид (FAD) 20, 52, 55, 111, 115, 222, 247–249, 274 Флавинмононуклеотид (FMN) 52, 83, 88, 89, 92–94, 247–249 Флагелла – бактериальная 14, 51, 64, 141, 160, 161, 174–184, 227, 258 – эукариотическая 174, 184 Флагеллин 176, 177 Фобородопсин 140 Формиат 76, 109, 122, 124, 245, 251, 261 Формиатдегидрогеназа 245 Фосфатидилинозит 225 3-Фосфоглицеральдегид 68, 71 2-Фосфоглицерат 68–73 Фосфодиэстераза 142 Фосфолипаза 226 Фосфоенолпируват 68, 70, 73, 186, 267 Фосфотрансферазная система 267 Фоторецептор 140–142, 310 Фото-редокс цепь – нециклическая 33, 51–60

Bioenergetica.indb 347

347

– – в зеленых серных бактериях 51–53 – – в хлоропластах и цианобактериях 53–60 – циклическая 33–50, 57, 58 – – в пурпурных бактериях 33–50 – – в хлоропластах и цианобактериях 57, 58 Фотосистема I – локализация в ламеллах стромы 65 58 – механизм генерации – механизм переноса электронов 57 – субъединичный состав 55 – трехмерная структура 56, 57 Фотосистема II – локализация в тилакоиде 65 60 – механизм генерации – механизм переноса электронов 59, 60 – субъединичный состав 58 – трехмерная структура 59 Фототаксис 140, 141 Фотофосфорилирование 58, 159 Фторид 168 Фумарат 68, 70, 109, 116–118, 276 Фумаратредуктаза 68, 117, 118 Хемиосмотическая теория 8, 48, 194 Хинолоксидаза – ba3-типа 113, 114 – bd-типа 115, 116 – bo-типа 115, 116, 119, 120, 122, 274 Хинон 27, 35 Хлорида транспорт 64, 138, 267 m-Хлорокарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ) 258 Хлоропласт – вращение 183 64, 65 – забуферивание – структура 53 – фото-редокс цепь 53–63 Хлорофилл 25, 27, 28, 32, 55, 56, 58–60, 91, 139, 227–229 – димер 54, 55, 58–60 Холестерин 184, 238 Хроматофор 32, 36, 44, 45, 49–51, 100, 154, 167–170, 173, 242, 243 Хромаффинные гранулы 166, 191 Цианид 19, 103, 108, 141, 219, 220 Цианобактерии 17, 25, 28, 29, 31, 52, 53, 55, 56, 58, 60, 63, 65, 81, 90, 100, 121, 122, 139, 182–185, 228, 229, 235, 243, 303

26.01.2011 18:04:27

348

Предметный указатель

Цикл Кребса 68–70, 72, 73, 75, 82, 86, 118, 169, 173, 192, 212, 276, 284 Циклоз 183 Цинк 33, 100, 102 Цитохром – определение 36, 103 – тетрагемовый с-типа 37, 39–41, 47 – b 35, 36, 48, 49, 50, 55, 61, 62, 83, 96, 97, 99, 100, 285, 296, 339 – b5 221, 238–240 – b559 58, 59 – с 17, 36, 38, 39, 41, 43, 46, 48, 49, 58, 82, 83, 86, 94, 95, 99–108, 112–115, 121, 223, 280, 281, 295, 311 – c1 36, 49, 50, 55, 83, 95–97, 99, 101 – f 54, 55, 57, 60, 62, 63 – P-450 221–223, 271, 272, 301 Цитохромоксидаза 107, 108 – механизм генерации – соотношение Н+/ 107 – субъединичный состав 102 – последовательность переноса электронов 105–107 – редокс-центры 102, 103 – трехмерная структура 103–105

Bioenergetica.indb 348

– aa3-типа 102–108, 122 – cbb3-типа 113, 114, 119 Цитрат 68, 70, 169, 192, 245, 255, 276 Черная мембрана см. Мембрана, плоский бислой Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) 88 Эндоплазматический ретикулум 10, 30, 161, 166, 221, 238, 239, 267, 272 Эндосома 161, 162, 166 N-этилмалеимид 163, 168, 251 Ядро 10, 58, 87, 96, 112, 146, 203, 231, 279, 280 Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 148, 149 Na+-движущая сила (Δs) 14 Na+/K+-градиент как буфер 242 Na+-мотор 258, 259 Na+-цикл 262–266 Q-цикл 276

239–

49, 55, 60, 63, 65, 83, 98, 99,

26.01.2011 18:04:27

ИМЕННОЙ УКАЗАТЕЛЬ

Абдулаев Н.Г. 130 Агре П. (Agre P.) 9 Адлер Дж. (Adler J.) 175, 176 Алим М.И.X. (Aleem M.I.H.) 121 Анисимов В.Н. 306, 308, 323 Антоненко Ю.Н. 305,306, 312 Ануин П.Н. (Unwin P.N.) 130 Арчаков А.И. 239 Асадов А.А. 42 Аустад С.Н. (Austad S.N.) 290, 294, 297 Байков А.А. 253, 254 Бакеева Л.Е. 231 Балчевски М. (Baltscheffsky M.) 167, 168 Баркуэра Б. (Barquera B.) 248 Барха Г. (Barja G.) 297 Белицер В.Н. 7, 158 Берг Г.К. (Berg H.C.) 176, 180, 181 Бертон М. (Burton M.) 231 Берцова Ю.В. 119 Бибиков С.И. 141 Блюменфельд Л.А. 20 Богачев А.В. 249 Бойер П.Д. (Boyer P.D.) 9, 153, 156 Бондурянский Р. 289 Бранд М.Д. (Brand M.D.) 297, 298 Брассил К. (Brussil C.) 289 Бремер Б. (Bremer B.) 207 Бреннер С. (Brenner S.) 280 Броди А.Ф. (Brodie A.F.) 221, 255 Броун И.И. 241 Бубенцер Г.Д. (Bubenzer H.J.) 231 Будрене Е.О. 274 Бэйт-Смит Е.К. (Bate-Smith E.C.) 78 Ван Дам К. (Van Dam K.) 8 Вейсман А. (Weismann A.) 288, 289, 320 Верховский М.И. 249 Викстрём М. (Wiksröm M.) 107 Виноградов А.Д. 152 Винчи Леонардо да (Vinci Leonardo da) 7 Высоких М.Ю. 302, 305, 306, 312 Гален К. (Galenus) 280 Гарднер Э.М. (Gardner E.M.) 318 Гаррахан П. (Garrahan P.) 259 Гарсия-Као И. (Garsia-Kao I.) 300 Гельмонт И.Б. ван (Helmont J.B. van) 7

Bioenergetica.indb 349

Глин И. (Glynn I.) 159 Голдсмит Т. (Goldsmith T.) 292 Гольштейн Н.И. 287 Голья Ф. (Goglia F.) 217 Грин Д. (Green D.) 302 Грингат С. (Greengut S.) 239 Гринюс Л.Л. 206 Гулевич В.С. 77, 78, 193 Дайзенхофер Й. (Deisenhofer J.) 37 Дальтон Х. (Dalton H.) 119 Даниэльсон Л. (Danielson L.) 169 Дарвин Ч. (Darwin C.R.) 288, 289, 292, 320 Дейзенхофер Й. (Deisenhofer J.) 9 Дерипаска О.В. 269, 305 Дибров П.А. 258 Дильман В.М. 296 Димрот П. (Dimroth P.) 244, 248, 259 Докинз Р. (Dowkins R.) 320 Донехауэр Л. (Donehower L.) 301 Драчев В.А. 234, 236, 237 Драчев Л.А. 44, 134 Дризе Н.И. 308 Еричев В.П. 310 Зассенхауз Г. (Zassenhaus H.P.) 296 Зиновкин Р.А. 309 Зоров Д.Б. 234, 236, 237, 310 Иоханссон Б. (Johansson B.) 209 Йошида М. (Yoshida M.) 156, 157 Йошикава С. (Yoshikawa S.) 103 Капелько В.И. 310 Каплан Н. (Kaplan N.) 169 Карр К.Дж. (Carr C.J.) 316, 319 Каспаринский Ф.О. 30, 321 Каулен А.Д. 44, 134 Кауппинен Р. (Kauppinen R.) 225 Кейлин Д. (Keilin D.) 17 Керр Дж.Ф. (Kerr J.F.) 280 Кирквуд Т. (Kirkwood T.B.L.) 294, 295 Кливленд Л.Р. (Cleveland L.R.) 184 Клингенберг М. (Klingenberg M.) 200 Коловик С. (Colowick S.) 169 Колосова Н.Г. 308–310, 323 Комфорт А. (Comfort A.) 288

26.01.2011 18:04:27

350

Именной указатель

Копенкин Е.П. 309 Копнин Б.П. 310 Корана X.Г. (Khorana H.G.) 130, 132 Коршунова Г.А. 305 Коэн Ж.Н. (Cohen G.N.) 198 Красновский А.А. 32 Кребс Г.А. (Krebs H.A.) 8, 69 Кремер Г. (Kroemer G.) 9, 280 Крик Ф. (Crick F.) 8 Кримберг Р. 193 Кэннон Б. (Cannon B.) 213, 308, 310 Кэньон С. (Kenyon C.) 295 Лабедан Б. (Labedan B.) 207 Ламарк Ж.-Б. (Lamarck J.-B.) 217 Лани Я.К. (Lanyi J.K.) 132 Ларшсон Н.-Г. (Larsson N.G.) 296 Либерман Е.А. 170, 302 Лихтенштейн А.В. 284 Липман Ф. (Lipmann F.) 12 Лойсон А. (Loyson A.) 289 Лонго В. (Longo V.D.) 269 Льюис К. (Lewis K.) 140, 175, 180 Лямзаев К.Г. 279 Маккей К. М. (McCay C.M.) 316, 318 Маккиннон Р. (MacKinnon R.) 9 Макнаб Р.М. (Macnab R.M.) 256 Манских В.Н. 284 Маслов С.П. 215 Медавар П.Б. (Medawar P.B.) 289 Медников Б.М. 7 Мейсель М.Н. 235 Мерфи М. (Murphy M.P.) 302, 309 Метлина А.Л. 178 Митчел П. (Mitchell P.) 8, 9, 13, 48, 49, 91, 98, 170, 175, 194, 198, 240, 241 Михель Х. (Michel H.) 9, 37 Михельсон В.М. 308 Моосман Б. (Moosmann B.) 339 Мохова Е.Н. 216 Моценок Е.X. 183 Мулкиджанян А. 265 Мур Дж. (Moore J.) 231 Ньюмейер Д.Д. (Newmeyer D.D.) 9, 280 Обухова Л.А. 308, 310 Овчинников Ю.А. 130, 132, 141, 252 Окунуки К. (Okunuki K.) 220 Остерхельт Д. (Oesterhelt D.) 128, 133

Bioenergetica.indb 350

Панде С. (Pande S.) 195 Папа С. (Papa S.) 92 Парвин Р. (Parvin R.) 195 Пасюкова Е.Г. 306 Пеличчи Дж. (Pelicci P.G.) 295 Перехватов В.В. 305 Понамперума С. (Ponamperuma S.) 19, 20 Постгейт Дж. Р. (Postgate J.R.) 119 Провербио Ф. (Proverbio F.) 253 Пролла Т.А. (Prolla T.A.) 296 Пфениг Н. (Pfennig N.) 259 Пфеннингер-Ли (Pfenninger-Li X.D.) 248 Ракер Э. (Racker E.) 147 Рамсей Р. (Ramsay R.) 195 Резник Д.Н. 293, 294 Рикенберг Г.В. (Rickenberg H.V.) 198 Рич П.Р. (Rich P.R.) 247 Робертсон Т.Б. (Robertson T.B.) 316 Рогинский В.А. 306 Розен Б. (Rosen B.) 265 Роттенберг Г. (Rottenberg H.) 200 Ротуел Н. (Rothwell N.) 213 Роузмэн М. (Roseman M.) 239 Рууге Э.К. 305 Рязанов А.Г. 308, 310 Саган К. (Sagan C.) 19, 20 Садовничий В.А. 305, 322 Сазанов Л.А. 93 Салстон Дж.Э. (Sulston J.E.) 280 Сампер М. (Sumper M.) 237 Северин С.Е. 78, 79, 214, 302 Северин Ф.Ф. 285, 312, 323 Северина И.И. 182, 229, 305, 312, 322 Семенов А.Ю. 44 Сенин И.И. 310 Сент-Дьерди А. (Szent-Gyorgyi A.) 8, 20 Сигмэн Д. (Sigman D.) 153 Скоу Й.-Х. (Skou J.-Ch.) 9, 252 Скрэйбл Г. (Skrable G.) 301 Скулачев В.П. 8, 9, 234, 300, 305 Скулачев М.В. 305, 322 Слейтер Э. (Slater E.C.) 8, 97 Смит Р. (Smith R.A.) 209, 302 Сотникова Л.Ф. 309 Сохал Р. (Sohal R.) 297 Спивак И.М. 308 Спирин А.С. 21

26.01.2011 18:04:27

Именной указатель Старков А.А. 275 Сток М. (Stock M.) 148–150, 213 Стокениус В. (Stoeckenius W.) 128 Стучликова Е. (Stuchlikova E.) 316 Таббс П. (Tubbs P.) 195 Тамм С.Л. (Tamm S.L.) 184 Танака К. (Tanaka K.) 235 Темкин М.И. 20 Титер Р.М. (Teather R.M.) 198 Тихонова Г.В. 121 Токуда X. (Tokuda H.) 246, 248 Триссл Г.-В. (Trissl H.-W.) 45 Тройбле Дж. (Träuble H.) 237 Уанг Кс. (Wang X.) 9, 280 Унемото Т. (Unemoto T.) 246–248 Уокер Дж. (Walker J.) 9, 147, 148 Уолдегиоргис Дж. (Woldegiorgis G.) 202 Уоллес А.Р. (Wallace A.R.) 288, 289, 320 Уотербери Дж. (Waterbury J.) 182 Уотсон Дж. (Watson J.) 8 Уэйндрах Р. (Weindruch R.) 317, 318 Уэст И. (West I.) 198, 241 Фелдмэн Р. (Feldman R.) 153 Фернандес Дж. (Fernandes J.) 318 Филенко О.Ф. 306 Фойсснер Л. (Foissner L.) 235 Фритц И.Б. (Fritz I.B.) 194

Bioenergetica.indb 351

351

Хармэн Д. (Harman D.) 296, 297, 316 Харольд Ф. (Harold F.M.) 251 Хекими С. (Hekimi S.) 295 Хендерсон Р. (Henderson R.) 130, 132, Хифнер Д. (Heefner D.) 251 Холдейн Дж. (Haldane J.) 7 Хольценбергер М. (Holzenberger M.) 296 Хорвиц Х.Р. (Horvitz H.R.) 280 Хубер Р. (Huber R.) 9, 37 Цыбакова Е.Т. 158 Чанс Б. (Chance B.) 90 Чен Л.Б. (Chen L.B.) 225, 234 Ченцов Ю.С. 231 Черняк Б.В. 279, 285, 305, 306, 322 Чикунов А.В. 305 Шидловский К.А. 306 Шинк Б. (Schink B.) 259 Шувалов В.А. 42 Эйзенбах М. (Eisenbach M.) 176 Эммануэль Н.М. 296, 297 Энгельгардт В.А. 7, 81, 220 Эпстайн В. (Epstein W.) 188 Эрнстер Л. (Ernster L.) 8, 169, 170 Юнге В. (Junge W.) 155 Ягужинский Л.С. 302, 323

26.01.2011 18:04:27

УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИЙ ОРГАНИЗМОВ

Acetobacterium woodii 260 Acidaminococcus fermentans 246 Aplysia californica 267 Arum sp. 217 Azotobacter vinelandii 117–120, 273, 274 Bacillus pseudofirmus 259 Bacillus sp. YN-1 259 Bacillus thuringiensis 266 Bacillus subtilis 175, 207 Bdellovibrio bacteriovorus 175, 203 Blastochloris (Rhodopseudomonas) viridis 37–49 Caenorhabditis elegans 295, 296 Candida albicans 235 Ceriodaphnia affinis 306, 313 Chara sp. 183 Chloroflexus sp. 53 Chlamydomonas reinhardtii 61 Clostridium symbiosum 246 Endomyces magnusii 235 Enterococcus hirae 144, 162, 163, 191, 251, 252, 262 Escherichia coli 87, 115–119, 139, 145, 146, 148, 150, 151, 154, 155, 163, 171, 174–176, 178, 181, 186–188, 197–199, 207, 241, 242, 246, 255, 258, 262, 266, 274, 340, 341 Haemophilus influenzae 207, 248 Halobacterium halobium 255 Halobacterium salinarium 128–130, 137, 139, 140, 227, 228, 241, 242, 267 Helicobacter pylori 90 Heterocephalus glaber 298 Homo sapiens 321 Florometra serratissima 339, 340 Fusobacterium nucleatum 246 Ilyobacter tartaricus 149, 150, 159, 260 Klebsiella aerogenes 244–246 Klebsiella pneumoniae 246, 248, 255

Bioenergetica.indb 352

Lactococcus casei 144, 162 Limonium vulgaris 267 Malonomonas rubra 246 Melipona bicolor 339, 340 Methanobacterium thermoautotrophicum 188 Methanosarcina barkeri 126 Methanosarcina mazei 253 Mixotricha paradoxa 184 Moorella thermoacetica 253, 254 Mycobacterium phlei 221, 255 Natronomonas pharaonis 138 Neisseria gonorrhoeae 248 Neisseria meningitidis 248 Nitrobacter sp. 121 Nitella sp. 183, 235 Neurospora crassa 87 Nothobranchius furzeri 293, 306, 313 Nothobranchius guentheri 293 Nothobranchius kuhntae 293 Nothobranchius rachovii 293 Oncorhynchus keta 290 Paracoccus denitrificans 102–104, 113, 114, 117, 119 Peptococcus aerogenes 246 Phormidium uncinatum 182, 229, 241, 242 Podospora anserina 294, 306, 313 Polytomella agilis 230, 231 Polytoma papillatum 231 Porphyromonas gingivalis 248 Propionigenium modestum 246, 259, 260, 262, 265 Pseudomonas aeruginosa 248 Rhodospirillum rubrum 35–37, 49, 101, 167, 168, 170, 171, 173, 175, 243 Rickettsia prowazekii 202, 203 Saccharomyces cerevisiae 95, 97, 145, 146, 149, 150, 155, 205, 221, 226, 231, 271, 284–286, 290, 296, 316, 318, 340 Salinibacter ruber 139

26.01.2011 18:04:27

Указатель латинских названий организмов

Salmonella typhimurium 176, 177, 255, 262 Schizosaccharomyces pombe 339 Spiroplasma sp. 182 Symplocarpus renifolius 218 Synechococcus sp. 181–183 Syntrophus gentianae 169 Tenebrio molitor 193 Thermotoga maritima 253, 254 Thermus thermophilus 93 Thiobacillus ferrooxidans 120, 121, 173

Bioenergetica.indb 353

353

Veillonella alcalescens 246 Vibrio alginolyticus 246–248, 255, 258, 262, 265 Vibrio cholerae 248, 258, 259 Vibrio costicola 246 Vibrio harveyi 241, 242, 247 Vibrio parahaemolyticus 258 Yarrowia lipolytica 86 Yersinia pestis 248

26.01.2011 18:04:27

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК БЛМ БХл (БХл)2 (БХл)2*

Фео ЭПР ЯМР

— — — — — — — — — — — — — — —

активные формы кислорода бислойная фосфолипидная мембрана бактериохлорофилл димер бактериохлорофилла возбужденный димер бактериохлорофилла катион-радикал димера бактериохлорофилла бактериофеофетин, капсаицин — 8-метил-N-ваниллил-6-ноненамид пластоцианин хлорофилл димер хлорофилла возбужденный хлорофилл катион-радикал хлорофилла феофетин электронный парамагнитный резонанс ядерный магнитный резонанс

AMP ADP AOX ATP cAMP CCCP CoQ CoQH2 CoQH• CoQ•− dNADH Em FAD FMN Fd GDP GTP HQNO Н+/

— — — — — — — — — — — — — — — — — — —

аденозин-5′-монофосфат аденозин-5′-дифосфат альтернативная цианрезистентная оксидаза аденозин-5′-трифосфат циклический аденозин-3′,5′-монофосфат м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон убихинон убихинол нейтральный убисемихинон анионный убисемихинон восстановленный никотинамид гипоксантин динуклеотид среднеточечный окислительно-восстановительный потенциал флавинадениндинуклеотид флавинмононуклеотид ферредоксин гуанозин-5′-дифосфат гуанозин-5′-трифосфат 2-гептил-4-гидроксихинолин N-оксид нормированное на количество электронов количество протонов, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи 10-(6′-убихинонил)децилтрифенилфосфоний менахинон никотинамидадениндинуклеотид восстановленный никотинамидадениндинуклеотид никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат Na+-транслоцирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза нормированное на количество электронов количество ионов натрия, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи внешняя NADH:хинон-оксидоредуктаза митохондрий растений

БФео ПЦ Хл (Хл)2 (Хл)2*

MitoQ — MQ — NAD+ — NADH — NADP+ — NADPH — Na+-NQR — Na+/ — NDex

Bioenergetica.indb 354

—

26.01.2011 18:04:27

Список сокращений

355

NDH-1 — бактериальная Н+-транслоцирующая NADH:хинон оксидоредуктаза, гомолог митохондриального комплекса I NDH-2 — бактериальная несопряженная NADH:хинон оксидоредуктаза NDin — внутренняя несопряженная NADH:хинон-оксидоредуктаза митохондрий растений Pi — неорганический фосфат PQ — пластохинон PQH2 — пластохинол PQ•− — анионный пластосемихинон PPi — пирофосфат SkQ — производное пластохинона, соединенное с делокализованным катионом посредством децильного или амильного линкера SkQ1 — 10-(6′-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний SkQR1 — 10-(6′-пластохинонил)децилродамин 19 Δψ — трансмембранная разность электрических потенциалов — трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода — трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов натрия ΔрН — трансмембранная разность значений рН

Bioenergetica.indb 355

26.01.2011 18:04:27

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие................................................................................................................

5

Часть I. Принципы биоэнергетики Глава 1. Введение ..................................................................................................... 1.1. Определение понятия «Биоэнергетика» и некоторые вехи ее истории ....... 1.2. Биоэнергетика в системе биологических наук............................................... 1.3. Законы биоэнергетики ..................................................................................... 1.4. Эволюция биоэнергетических механизмов .................................................... 1.4.1. Аденозинтрифосфат .................................................................................. 1.4.2. Гипотеза об адениновом фотосинтезе..................................................... 1.4.3. Запасные энергетические ресурсы и гликолиз ....................................... 1.4.4. Протонные каналы и Н+-ATPаза как способы предотвратить закисление клетки при гликолизе ........................................................... 1.4.5. Бактериородопсиновый фотосинтез — первичный механизм использования видимого света ................................................................ 1.4.6. Хлорофилльный фотосинтез .................................................................... 1.4.7. Дыхательный механизм энергообеспечения ...........................................

7 7 9 12 17 17 19 22 24 25 26 28

Часть II. Генераторы протонного потенциала Глава 2. Хлорофилльные генераторы протонного потенциала ............................... 31 2.1. Светозависимая циклическая редокс-цепь пурпурных бактерий ................ 32 2.1.1. Основные компоненты редокс-цепи и принцип их действия .............. 33 2.1.2. Комплекс реакционных центров ............................................................. 37 2.1.3. СoQ-цитохром с-редуктаза ....................................................................... 48 2.1.4. Пути использования , образованной циклической редокс-цепью 50 2.2. Нециклическая светозависимая редокс-цепь зеленых серных бактерий .... 51 2.3. Нециклическая светозависимая редокс-цепь хлоропластов и цианобактерий 53 2.3.1. Принцип действия .................................................................................... 55 2.3.2. Фотосистема 1 ........................................................................................... 56 2.3.2. Фотосистема 2 ........................................................................................... 58 2.3.3. Комплекс b6f ............................................................................................. 60 2.3.4. Судьба , образованной фотосинтетической редокс-цепью хлоропластов 64

Bioenergetica.indb 356

26.01.2011 18:04:27

Оглавление

357

Глава 3. Органотрофная энергетика ......................................................................... 3.1. Субстраты органотрофной энергетики ........................................................... 3.2. Краткий обзор метаболизма сахаров .............................................................. 3.3. Механизм субстратного фосфорилирования ................................................ 3.4. Брожение ........................................................................................................... 3.5. Карнозин ...........................................................................................................

66 66 66 71 74 77

Глава 4. Дыхательная цепь ....................................................................................... 4.1. Принцип действия ............................................................................................ 4.2. NADH-CoQ-редуктаза ...................................................................................... 4.2.1. Белковый состав комплекса I ................................................................. 4.2.2. Кофакторный состав комплекса I .......................................................... 4.2.3. Субфрагменты комплекса I .................................................................... 4.2.4. Ингибиторы комплекса I ........................................................................ 4.2.5. Возможные механизмы генерации комплексом I ........................ 4.3. CoQH2-цитохром с-редуктаза .......................................................................... 4.3.1. Структурные аспекты bс1-комплекса ..................................................... 4.3.2. Рентгеноструктурный анализ III комплекса ......................................... 4.3.3. Функциональная модель комплекса III ................................................. 4.3.4. Ингибиторы комплекса III ..................................................................... 4.4. Цитохром с-оксидаза ........................................................................................ 4.4.1. Цитохром с ............................................................................................... 4.4.2. Комплекс IV (цитохром с-оксидаза) ...................................................... 4.4.3. Рентгеноструктурный анализ комплекса IV .......................................... 4.4.3. Путь переноса электронов в комплексе IV ...........................................

81 81 86 86 88 88 90 91 94 95 96 98 100 100 101 102 103 105

4.4.4. Механизм генерации цитохром c-оксидазой ................................ 4.5. Ингибиторы цитохромоксидазы ....................................................................

107 108

Глава 5. Строение дыхательных цепей прокариот, а также митохондрий простейших, растений и грибов ........................................................................... 5.1. Дыхательная цепь митохондрий простейших, растений и грибов .............. 5.2. Строение дыхательных цепей прокариот ...................................................... 5.2.1. Дыхательная цепь Paracoccus denitrificans ............................................... 5.2.2. Дыхательная цепь Escherichia coli............................................................. 5.2.3. Восстановление фумарата в митохондриях аскариды .......................... 5.2.4. Дыхательная цепь Azotobacter vinelandii ................................................... 5.2.5. Окисление дыхательными цепями бактерий субстратов с положительным редокс-потенциалом .................................................... 5.2.6. Дыхательная цепь цианобактерий .......................................................... 5.2.7. Дыхательная цепь хлоропластов ............................................................. 5.3. Электрон-транспортная цепь метаногенных архей ....................................... 5.3.1. Окислительная фаза метаногенеза ......................................................... 5.3.2. Восстановительная фаза метаногенеза ....................................................

Bioenergetica.indb 357

109 110 113 113 115 117 118 120 121 122 123 125 126

26.01.2011 18:04:28

358

Оглавление

Глава 6. Бактериородопсин ....................................................................................... 6.1. Принцип действия ............................................................................................ 6.2. Структура бактериородопсина ......................................................................... 6.3. Фотоцикл бактериородопсина ......................................................................... 6.4. Светозависимый транспорт протонов бактериородопсином ........................ 6.5. Другие ретиналь-содержащие белки ............................................................... 6.5.1. Галородопсин ........................................................................................... 6.5.2. Распространенность бактериородопсина и его аналогов у различных живых организмов..................................................................................... 6.5.3. Сенсорный родопсин и фобородопсин .................................................. 6.5.4. Родопсин животных .................................................................................

128 128 130 133 134 137 137 138 140 141

Часть III. Потребители Глава 7. Химическая работа за счет ................................................................ + 7.1. Н -ATP-синтаза ................................................................................................ 7.1.1. Субъединичное строение Н+-ATP-синтазы ........................................... 7.1.2. Трехмерная структура и расположение в мембране ............................. 7.1.3. Гидролиз ATP изолированным фактором F1 ......................................... 7.1.4. Синтез связанного ATP изолированным фактором F1 .......................... 7.1.5. Проведение протонов через фактор Fo .................................................. 7.1.6. Возможный механизм преобразования энергии FoF1-ATP-синтазой ... 7.1.7. Стехиометрия Н+/ATP ............................................................................. -генераторы ................................................... 7.2. Н+-ATPазы — вторичные 7.2.1. Н+-ATPазы FoF1-типа................................................................................ 7.2.2. Н+-ATPазы V0V1-типа ............................................................................... 7.2.3. Н+-ATPазы E1E2-типа ............................................................................... 7.2.3.1. Н+-ATPаза внешней клеточной мембраны растений и грибов ... 7.2.3.2. Н+/K+-ATPаза слизистой желудка ................................................. 7.2.4. Соотношение функций Н+-ATPаз........................................................... 7.3. Н+-Пирофосфат-синтаза (Н+-Пирофосфатаза) ............................................. 7.4. Н+-Трансгидрогеназа ........................................................................................ 7.5. Другие системы обратного переноса восстановительных эквивалентов .....

144 144 144 147 151 153 154 156 158 159 161 162 163 164 164 165 166 169 173

Глава 8. Механическая работа за счет

: движение бактерий ..........................

174

вращает ротор флагеллярного мотора .................................................... 8.1. 8.2. Структура флагеллярного мотора бактерий ................................................... 8.3. Возможный механизм Н+-мотора ...................................................................

175 176 180

-зависимая подвижность прокариот, не содержащих флагелл, а также внутриклеточных органелл эукариот ............................................................. 182 8.5. Подвижные симбионты эукариот и прокариот ............................................. 184

8.4.

Bioenergetica.indb 358

26.01.2011 18:04:28

Оглавление

359

Глава 9. Осмотическая работа за счет ............................................................ 9.1. Определение и классификация ....................................................................... 9.2. ΔΨ как движущая сила ..................................................................................... 9.3. ΔpH как движущая сила ................................................................................... как движущая сила ...................................................................... 9.4. Общая -зависимые транспортные каскады ......................................................... 9.5. 9.6. Карнитин как пример трансмембранного переносчика химической группировки ...................................................................................................... -зависимых белков-переносчиков ....................... 9.7. Некоторые примеры 9.7.1. (Лактоза,Н+)-симпортер из Е. coli .......................................................... 9.7.2. Митохондриальный ATP/ADP-антипортер ........................................... в транспорте макромолекул ........................................................... 9.8. Роль 9.8.1. Транспорт митохондриальных белков. Биогенез митохондрий .......... 9.8.2. Транспорт бактериальных белков .......................................................... в транспорте белков и их укладке в мембране .................... 9.8.3. Роль 9.8.4. Транспорт бактериальной ДНК ..............................................................

186 186 187 189 190 192

Глава 10.

как источник энергии для образования теплоты .............................

208

10.1. Три способа превращения метаболической энергии в теплоту ................... 10.2. Терморегуляторная активация свободного дыхания у животных ................ 10.2.1. Бурый жир ................................................................................................. 10.2.2. Скелетные мышцы .................................................................................... 10.3. Терморегуляторная активация свободного окисления у растений ..............

208 209 209 214 217

192 197 198 200 203 203 205 206 206

Часть IV. Взаимосвязь и регуляция генераторов и потребителей протонного потенциала Глава 11. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала ............... 220 .................................................................................................. 220 11.1. Регуляция 11.1.1. Альтернативные функции дыхания ......................................................... 220 11.1.2. Регуляция потоков восстановительных эквивалентов между цитозолем и митохондриями ...................................................................................... 223 11.1.3. Взаимопревращение ΔΨ и ΔpH ................................................................ 225 к основным регуляторным 11.1.4. Отношение системы контроля механизмам эукариот ................................................................................ 225 у бактерий ........................................................................ 226 11.1.5. Контроль ......................................... 227 11.2. Транспорт энергии вдоль мембран в форме 11.2.1. Общие положения ..................................................................................... 227 , образуемой светозависимыми -генераторами, вдоль 11.2.2. Перенос мембран галобактерий и хлоропластов ................................................... 228 11.2.3. Трансклеточный перенос энергии в трихомах цианобактерий ............ 229 11.2.4. Структура и свойства нитчатых митохондрий и митохондриального ретикулума ................................................................................................. 229

Bioenergetica.indb 359

26.01.2011 18:04:28

360

Оглавление

11.3. -Буферы...................................................................................................... -буфер у бактерий................................... 11.3.1. Градиенты Na+ и K+ как 11.3.2. Другие системы стабилизации ........................................................

239 239 242

Часть V. Натриевый мир Глава 12. Генераторы

.................................................................................................... +

244

12.1. Декарбоксилазы, транспортирующие Na ...................................................... 12.2. Na+-транспортирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза .............................. 12.2.1. Первичная структура субъединиц Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазы ............................................................... 12.2.2. Простетические группы Na+–NQR ......................................................... 12.3. Na+-транспортирующий метилтрансферазный комплекс метаногенных архей 12.4. Na+-транспортирующая формилметанофурандегидрогеназа метаногенных архей................................................................................................................... 12.5. Вторичные -генераторы: Na+-транспортирующие ATPазы и + Na -пирофосфатаза ......................................................................................... 12.5.1. Бактериальные Na+–ATPазы ................................................................... 12.5.2. Na+/K+-ATPаза и Na+-ATPаза животных .............................................. 12.5.3. Na+-пирофосфатаза...................................................................................

251 251 252 253

Глава 13. Утилизация

-генераторами ...........

255

13.1. Осмотическая работа, поддерживаемая ............................................... 13.1.1. (Na+,метаболит)-симпортеры ................................................................... 13.1.2. Ионы Na+ и регуляция внутриклеточного рН ....................................... 13.2. Механическая работа........................................................................................ 13.3. Химическая работа ........................................................................................... 13.3.1. -Зависимый синтез ATP у анаэробных бактерий.......................... 13.3.2. Потребители , совершающие химическую работу у метаногенных архей .................................................................................

255 255 256 258 259 259

Глава 14. Соотношение протонного и натриевых миров .......................................... 14.1. Как часто используется Na+-цикл живыми клетками? ................................. 14.2. Возможные эволюционные отношения между протонным и натриевым миром ................................................................................................................. 14.3. Превращение энергии в биомембранах без участия Н+ и Na+ ....................

262 262

, образуемой первичными

244 246 247 248 249 250

260

263 266

Часть VI. Опыт практического применения биоэнергетики: активные формы кислорода и возможные пути отмены программы старения организма Глава 15. Предпосылки проекта по антиоксидантам, адресованным в митохондрии 15.1. Природа АФК и пути их образования в клетке............................................. 15.2. Как живые системы защищаются от АФК? ................................................... 15.2.1. Вещества-антиоксиданты .........................................................................

Bioenergetica.indb 360

269 269 271 271

26.01.2011 18:04:28

Оглавление

361

15.2.2. Снижение внутриклеточной концентрации кислорода ......................... 271 15.2.3. Уменьшение генерации АФК дыхательной цепью ................................ 275 15.2.4. Митоптоз ................................................................................................... 277 15.2.5. Апоптоз ...................................................................................................... 280 15.2.6. Некроз ........................................................................................................ 281 15.2.7. Феноптоз .................................................................................................... 283 15.3. Биологические функции АФК ........................................................................ 285 15.4. Старение как медленный феноптоз, вызываемый повышением уровня АФК 288 15.4.1. Определение понятия «старение» и краткая история проблемы.......... 288 15.4.2. Феноптоз организмов, размножающихся однократно .......................... 290 15.4.3. Старение — медленный феноптоз? ........................................................ 291 15.4.4. Мутации, продлевающие жизнь .............................................................. 295 15.4.5. АФК и старение ........................................................................................ 297 15.4.6. Голый землекоп......................................................................................... 298 15.4.7. Парадокс белка р53 ................................................................................... 300 15.4.8. Снижение митохондриальных АФК как возможный способ торможения программы старения ........................................................... 301 Глава 16. Проект по антиоксидантам, адресованным в митохондрии .................... 16.1. SkQ тормозит программу старения ................................................................. 16.2. Сравнение эффектов SkQ и временного ограничения питания .................. 16.3. От «человека разумного» к «человеку разумному и освободившемуся» ......

303 303 316 320

Приложения ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Энергия, работа и законы термодинамики ...........................

324

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Структурные формулы различных простетических групп и кофакторов ферментов электрон-транспортных цепей ................................

334

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Природный возобновляемый антиоксидант, адресованный в митохондрии ......................................................................................................

339

Предметный указатель ...............................................................................................

342

Именной указатель ....................................................................................................

349

Указатель латинских названий организмов ..............................................................

352

Список сокращений ...................................................................................................

354

Bioenergetica.indb 361

26.01.2011 18:04:28

TABLE OF CONTENCE

Preface

....................................................................................................................

5

Part I. Principles of bioenergetics Chapter 1. Introduction ................................................................................................ 1.1. Definition of “bioenergetics” and some of its historical landmarks .................... 1.2. Bioenergetics in the hierarchy of biological sciences .......................................... 1.3. Laws of bioenergetics .......................................................................................... 1.4. Evolution of bioenergetic mechanisms ................................................................ 1.4.1. Adenosine triphosphate ............................................................................... 1.4.2. Hypothesis on adenine photosynthesis ........................................................ 1.4.3. Reserve energetic resources and glycolysis .................................................. 1.4.4. Proton channels and Н+-ATPase prevent acidification of a cell during glycolysis...................................................................................................... 1.4.5. Bacteriorhodopsin photosynthesis — initial mechanism of visible light energy conservation ..................................................................................... 1.4.6. Chlorophyll-dependent photosynthesis ........................................................ 1.4.7. Respiratory mechanism of energy conservation ...........................................

7 7 9 12 17 17 19 22 24 25 26 28

Part II. Generators of proton potential Chapter 2. Chlorophyll-containing generators of proton potential ............................... 2.1. Light-driven cyclic redox chain of purple bacteria.............................................. 2.1.1. Main components of the redox chain and their operation mechanism ....... 2.1.2. Reaction center ........................................................................................... 2.1.3. СoQ-cytochrome с-reductase ...................................................................... 2.1.4. Utilization of formed by cyclic redox chain ...................................... 2.2. Noncyclic light-driven redox chain of green sulfur bacteria ............................... 2.3. Noncyclic light-driven redox chain of chloroplasts and cyanobacteria ............... 2.3.1. Operation mechanism.................................................................................. 2.3.2. Photosystem 1 ............................................................................................. 2.3.2. Photosystem 2 ............................................................................................. 2.3.3. Complex b6f ................................................................................................ 2.3.4. Utilization of formed by photosynthetic redox chain of chloroplasts

Bioenergetica.indb 362

31 32 33 37 48 50 51 53 55 56 58 60 64

26.01.2011 18:04:28

Table of contence

363

Chapter 3. Organotrophic energetics ......................................................................... 3.1. Substrates of organotrophic energetics ............................................................... 3.2. Brief survey of sugar metabolism......................................................................... 3.3. Mechanism of substrate phosphorylation ........................................................... 3.4. Fermentation....................................................................................................... 3.5. Carnosine ............................................................................................................

66 66 66 71 74 77

Chapter 4. Respiratory chain ...................................................................................... 4.1. Operation mechanism ......................................................................................... 4.2. NADH-CoQ-reductase ....................................................................................... 4.2.1. Subunit composition of complex I ............................................................. 4.2.2. Prosthetic groups of complex I ................................................................. 4.2.3. Subfragments of complex I ........................................................................ 4.2.4. Complex I inhibitors .................................................................................. 4.2.5. Probable mechanisms of generation by complex I ........................... 4.3. CoQH2-cytochrome с-reductase ......................................................................... 4.3.1. Structural aspects of bс1-complex ............................................................... 4.3.2. Structural analysis of complex III .............................................................. 4.3.3. Operation mechanism of complex III ........................................................ 4.3.4. Complex III inhibitors ................................................................................ 4.4. Cytochrome с-oxidase ......................................................................................... 4.4.1. Cytochrome с .............................................................................................. 4.4.2. Complex IV (cytochrome с-oxidase) ......................................................... 4.4.3. Structural analysis of complex IV ............................................................... 4.4.3. Electron transfer pathway in complex IV ...................................................

81 81 86 86 88 88 90 91 94 95 96 98 100 100 101 102 103 105

4.4.4. Mechanism of generation by cytochrome с-oxidase ....................... 4.5. Inhibitors of cytochrome с-oxidase ....................................................................

107 108

Chapter 5. Respiratory chains of prokaryotes as well as of mitochondria of protists, plants, and fungi .................................................................................................... 5.1. Respiratory chains of mitochondria of protists, plants, and fungi ...................... 5.2. Respiratory chains of prokaryotes ...................................................................... 5.2.1. Respiratory chain of Paracoccus denitrificans ............................................. 5.2.2. Respiratory chain of Escherichia coli ........................................................... 5.2.3. Fumarate reduction in mitochondria of ascarides ...................................... 5.2.4. Respiratory chain of Azotobacter vinelandii .................................................. 5.2.5. Oxidation of substrates with high redox potential by respiratory chains of prokaryotes .............................................................................................. 5.2.6. Respiratory chain of cyanobacteria ............................................................ 5.2.7. Respiratory chain of chloroplasts ................................................................ 5.3. Electron transport chain of methanogenic archaea ............................................. 5.3.1. Oxidative part of methanogenesis ............................................................... 5.3.2. Reductive part of methanogenesis ...............................................................

Bioenergetica.indb 363

109 110 113 113 115 117 118 120 121 122 123 125 126

26.01.2011 18:04:29

364

Table of contence

Chapter 6. Bacteriorhodopsin ...................................................................................... 6.1. Operation mechanism ........................................................................................ 6.2. Structure of bacteriorhodopsin ........................................................................... 6.3. Bacteriorhodopsin photocycle ............................................................................ 6.4. Light-driven proton pumping by bacteriorhodopsin............................................ 6.5. Other retinal-containing proteins ........................................................................ 6.5.1. Halorhodopsin ............................................................................................ 6.5.2. Distribution of bacteriorhodopsin and its homologs among different living organisms..................................................................................................... 6.5.3. Sensory rhodopsin and phoborhodopsin...................................................... 6.5.4. Animal rhodopsin .......................................................................................

Часть III.

128 128 130 133 134 137 137 138 140 141

consumers

Chapter 7. Chemical work driven by ................................................................... + 7.1. Н -ATP-synthase ................................................................................................ 7.1.1. Subunit composition of Н+-ATP-synthase ................................................. 7.1.2. 3D-structure and arrangement in membrane ............................................. 7.1.3. ATP hydrolysis by isolated factor F1 .......................................................... 7.1.4. Synthesis of bound ATP by isolated factor F1 ............................................. 7.1.5. Proton transfer trough factor Fo ................................................................ 7.1.6. Proposed mechanism of energy transduction by FoF1-ATP-synthase .......... 7.1.7. Stoichiometry Н+/ATP .............................................................................. -generators ......................................................... 7.2. Н+-ATPases — secondary 7.2.1. Н+-ATPases of FoF1-type ............................................................................ 7.2.2. Н+-ATPases of V0V1-type ............................................................................ 7.2.3. Н+-ATPases of E1E2-type ............................................................................ 7.2.3.1. Н+-ATPase of plants and fungi plasmalemma ................................... 7.2.3.2. Н+/K+-ATPase of mucous coat of stomach....................................... 7.2.4. Relation of functions of Н+-ATPases ......................................................... 7.3. Н+-Pyrophosphate-synthase (Н+-Pyrophosphatase) ........................................... 7.4. Н+-Transhydrogenase.......................................................................................... 7.5. Other systems of reversed electron transport .......................................................

144 144 144 147 151 153 154 156 158 159 161 162 163 164 164 165 166 169 173

Chapter 8. Mechanical work driven by

: bacterial motility ..................................

174

spins rotor of bacterial flagellar motor ....................................................... 8.1. 8.2. Structure of bacterial flagellar motor................................................................... 8.3. Proposed mechanisms of Н+-motor ....................................................................

175 176 180

-dependent motility of flagellum-less prokaryotes and intracellular organelles of eukaryotes ..................................................................................... 8.5. Mobile symbiotes of eukaryotes and prokaryotes ................................................

182 184

8.4.

Bioenergetica.indb 364

26.01.2011 18:04:29

Table of contence

365

Chapter 9. Osmotic work driven by .................................................................... 9.1. Definition and classification .............................................................................. 9.2. ΔΨ as driving force.............................................................................................. 9.3. ΔpH as driving force ........................................................................................... as driving force............................................................................... 9.4. Overall -dependent transport cascades ..................................................................... 9.5. 9.6. Carnitine as an example of transmembrane carrier of a chemical group ............ -dependent membrane transporters .............................. 9.7. Some examples of 9.7.1. (Lactose,Н+)-symporter from Е. coli ......................................................... 9.7.2. Mitochondrial ATP/ADP-antiporter ........................................................... 9.8. function in transport of macromolecules .................................................... 9.8.1. Transport of mitochondrial proteins. Mitochondrial biogenesis ................. 9.8.2. Transport of bacterial proteins ................................................................... 9.8.3. Role of in protein transport and their folding in membranes ............ 9.8.4. Transport of bacterial DNA .......................................................................

186 186 187 189 190 192 192 197 198 200 203 203 205 206 206

as energy supply for thermogenesis .................................................

208

10.1. Three pathways for conversion of metabolite energy into heat ........................... 10.2. Thermoregulatory activation of free respiration in animals ................................. 10.2.1. Brown fat..................................................................................................... 10.2.2. Skeletal muscles........................................................................................... 10.3. Thermoregulatory activation of free respiration in plants....................................

208 209 209 214 217

Chapter 10.

Part IV. Intercoupling and regulation of generators and consumers of proton potential Chapter 11. Regulation, transport, and stabilization of proton potential ...................... ............................................................................................. 11.1. Regulation of 11.1.1. Alternative functions of respiration ............................................................. 11.1.2. Regulation of flows of reducing equivalents between cytosol and mitochondria ............................................................................................... 11.1.3. Interconversion of ΔΨ and ΔpH .................................................................. in the system of eukaryotic regulatory mechanisms ......... 11.1.4. Control of 11.1.5. Control of in bacteria ......................................................................... ........................ 11.2. Lateral energy transport along membranes in the form of 11.2.1. General ideas............................................................................................... , created by light-dependent -generators, 11.2.2. Lateral transport of along membranes of halobacteria and chloroplasts .................................... 11.2.3. Transcellular energy transport in cyanobacterial trichomes ......................... 11.2.4. Structure and properties of filamentous mitochondria and mitochondrial reticulum ..................................................................................................... -Buffers........................................................................................................ 11.3. -buffers in bacteria ................................ 11.3.1. Gradients of Na+ and K+ as 11.3.2. Other systems of stabilization ............................................................

Bioenergetica.indb 365

220 220 220 223 225 225 226 227 227 228 229 229 239 239 242

26.01.2011 18:04:29

366

Table of contence

Part V. Sodium world Chapter 12. Generators

.................................................................................................

+

244

12.1. Na -translocating decarboxylases ........................................................................ 12.2. Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase ............................................. 12.2.1. Subunits of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase .................. 12.2.2. Redox centers of Na+–NQR ....................................................................... 12.3. Na+-translocating methyltransferase complex of methanogenic archaea............. 12.4. Na+-translocating formylmethanofuran dehydrogenase of methanogenic archaea 12.5. Secondary -generators: Na+-translocating ATPases and Na+-pyrophosphatase ......................................................................................... 12.5.1. Bacterial Na+–ATPases ............................................................................... 12.5.2. Na+/K+-ATPase and Na+-ATPase of animals............................................. 12.5.3. Na+-pyrophspohatase ..................................................................................

251 251 252 253

Chapter 13. Utilization of

-generators ......................

255

13.1. Osmotic work driven by ........................................................................... 13.1.1. (Na+,metabolite)-symporters ....................................................................... 13.1.2. Na+ ions in regulation of intracellular pH................................................... 13.2. Mechanical work driven by ..................................................................... 13.3. Chemical work driven by .......................................................................... 13.3.1. -Dependent ATP synthesis in anaerobic bacteria ............................... 13.3.2. Chemical work driven by , in methanogenic archaea .........................

255 255 256 258 259 259 260

Chapter 14. Relation of proton and sodium worlds ...................................................... 14.1. How frequently is Na+-cycle employed by living cells? ...................................... 14.2. Possible evolutionary relationships between proton and sodium worlds ............ 14.3. Energy conservation in biomembranes without Н+ and Na+ transport ...............

262 262 263 266

, created by primary

244 246 247 248 249 250

Part VI. Trial of practical application of bioenergetics: reactive oxygen species and possible ways for cancelling the senescence program of an organism Chapter 15. Prerequisites of the project for antioxidants targeted into mitochondria . 15.1. ROS nature and pathways of their generation in a cell ..................................... 15.2. How living systems defend against ROS?............................................................ 15.2.1. Antioxidants compounds ............................................................................. 15.2.2. Lowering of intracellular oxygen concentration .......................................... 15.2.3. Lowering of respiratory chain dependent ROS generation .......................... 15.2.4. Mitoptosis.................................................................................................... 15.2.5. Apoptosis ..................................................................................................... 15.2.6. Necrosis ....................................................................................................... 15.2.7. Phenoptosis ................................................................................................. 15.3. Biological functions of ROS ...............................................................................

Bioenergetica.indb 366

269 269 271 271 271 275 277 280 281 283 285

26.01.2011 18:04:29

Table of contence

367

15.4. Senescence as a slow phenoptosis caused by increasing ROS level ................... 15.4.1. Definition of the “senescence” concept and brief history of the question .. 15.4.2. Phenoptosis of once-breeding organisms ..................................................... 15.4.3. Senescence — slow phenoptosis? ................................................................ 15.4.4. Mutations that prolong lifespan................................................................... 15.4.5. ROS and senescence ................................................................................... 15.4.6. Naked mole-rat ........................................................................................... 15.4.7. Paradox of р53 protein ................................................................................ 15.4.8. Lowering of mitochondrial ROS as possible way to slow the senescence program ......................................................................................................

288 288 290 291 295 297 298 300

Chapter 16. Project for antioxidants targeted into mitochondria .................................. 16.1. SkQ slows down the senescence program ........................................................... 16.2. Comparison of effects of SkQ and temporal calorie restriction .......................... 16.3. From Homo sapiens to Homo sapiens discatenatus ...............................................

303 303 316 320

301

Supplements SUPPLEMENT 1. Energy, work, and thermodynamics lows .....................................

324

SUPPLEMENT 2. Structure of the coenzymes and prosthetic groups of enzymes of electron transport chains ........................................................................................

334

SUPPLEMENT 3. Natural renewable antioxidant targeted into mitochondria .........

339

Subject Index ...............................................................................................................

342

Names Index ...............................................................................................................

349

Organisms Index .........................................................................................................

352

Abbreviations ...............................................................................................................

354

Bioenergetica.indb 367

26.01.2011 18:04:29

Учебное издание СКУЛАЧЕВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ, БОГАЧЕВ АЛЕКСАНДР ВАЛЕРЬЕВИЧ, КАСПАРИНСКИЙ ФЕЛИКС ОСВАЛЬДОВИЧ

МЕМБРАННАЯ БИОЭНЕРГЕТИКА Зав. редакцией Г.С. Савельева Редактор Е.А. Певак Художественный редактор Ю.М. Добрянская Художник В.А. Чернецов Технический редактор Н.И. Матюшина Верстка Л.В. Тарасюк

Подписано в печать 20.12.2010 г. Формат 70 × 100 1/16. Бумага офсетная № 1. Физ. печ. л. 23,0. Уч.-изд. л. 27,27. Усл. печ. л. 20,02. Тираж 1000 экз. Изд. № 9141. Заказ . Ордена «Знак Почета» Издательство Московского университета. 125009 Москва, Б. Никитская, 5/7. Тел.: (495) 629-50-91. Факс: (495) 697-66-71. (495) 939-33-23 (отдел реализации). E-mail: [email protected] Сайт Издательства МГУ: www.msu.ru/depts/MSUPubl2005 Интернет-магазин: http://msupublishing.ru Адрес отдела реализации: Москва, ул. Хохлова, 11 (Воробьевы Горы, МГУ). E-mail: [email protected]. Тел.: 939-33-23.

Bioenergetica.indb 368 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

26.01.2011 18:04:30