Железо и микроорганизмы: Iron and microorganisms : [монография] 9785906244888

Citation preview

В. В. Леонов, A. Ю. Миронов

Железо и микроорганизмы

МИРОНОВ Андрей Юрьевич – профессор, доктор медицинских наук, академик РАМТН, руководитель отдела микробиологии ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и  микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора. Основные направления научной деятельности – клиническая микробиология, биология и экология условно-патогенных микроорганизмов и их роль в  патологии человека, облигатные анаэробы, возбудители социально значимых инфекций, молекулярные маркеры патогенов. Автор более 400  научных работ, в том числе 13  учебников, выдержавших два и более изданий, более 20 учебных пособий, 3 руководств для врачей, 12  монографий, 8 изобретений и 13 рационализаторских предложений. Зам. главного редактора журнала «Клиническая лабораторная диагностика», член редколлегии журнала Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». Сертифицированный врач-бактериолог и врач клинической лабораторной диагностики. Лауреат премии имени Чижевского РАМТН. Кавалер «Золотой звезды Вернадского» международного межакадемического союза. Награжден двумя серебря­ ными медалями ВДНХ СССР.

В. В. Ле еонов, A. Ю. Мирон М нов

В. В. Леонов, A. Ю. Миронов

ЛЕОНОВ Вадим Вячеславович – доцент, кандидат технических наук, старший научный сотрудник проб­лемной научно-исследовательской лаборатории БУ  «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия». Основные направления научной деятельности – экология возбудителей инфекций и инфектология. Интересы сконцентрированы в области изучения микробных биопленок и инфектологических функций факторов патогенности микроорганизмов. Автор более 40 научных и учебно-методических работ, в том числе 4 патентов РФ на изобретения. Активно осуществляет педагогическую деятельность на  кафедре биологии с курсом микробиологии БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», преподает дисциплины «Микробиология, вирусология» и «Иммунология». Результаты исследований В. В. Леонова, представленные на выставках инноваций «Архимед», отмечены дипломом и серебряной медалью.

Ж ЖЕЛЕЗО ЖЕЛЕЗО И МИК КРОО ОРГА АНИЗ ЗМЫ И МИКРООРГАНИЗМЫ H2N

O N N NH O H NH

O

O

O NH

N NH O

H NH O O

O Fe

O

NH NH H O OH O

COOH

O N

N

NH NH R

O

ЖЕЛЕЗО И МИКРООРГАНИЗМЫ IRON AND MICROORGANISMS

KHANTY-MANSIYSK STATE MEDICAL ACADEMY

V. V. Leonov, A. Yu. Mironov

IRON AND MICROORGANISMS

KHANTY-MANSIYSK – MOSCOW, 2016

ХАНТЫ-МАНСИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

В. В. Леонов, A. Ю. Миронов

ЖЕЛЕЗО И МИКРООРГАНИЗМЫ

ХАНТЫ-МАНСИЙСК – МОСКВА, 2016

UDK 616.9 – 022.579.22:579.26 BBK 52.64 L 47 Referee N. V. Rudakov – Director of the Omsk Research Institute of natural focal infections, Head of microbiology, virology and immunology department at the Omsk State Medical University, doctor of medical science, professor. A. R. Mavzyutov – Head of fundamental and applied microbiology department at the Bashkir State Medical University, Honored worker of science of republic of Bashkortostan, doctor of medical science, professor. Leonov V. V., Mironov A. Yu. Iron and microorganisms. – Khanty-Mansiysk: OOO «Pechatniy mir g. Khanty-Mansiysk», 2016. – 178 p. This monograph is dedicated to role of iron in biology and infectology of opportunistic pathogens. Ways of get the iron in organism of host have been presented. The modern data about of iron homeostasis of mammalians have been generalized. Mechanisms of change of sensitivity to infection of host organism in depend on homeostasis of iron have been described. Iron-depending mechanisms of regulation of factors virulence and intermicrobial interactions of opportunistic pathogens have been reviewed. The possibility of using iron-depending properties of microorganisms in the laboratory diagnosis are presents. This monograph is addressed to microbiologist, specialists on infectious disease, laboratory workers and clinical of different specialties, as also students of biological and medical faculties.

ISBN 978-5-906244-88-8

© V. V. Leonov, A. Yu. Mironov, 2016 © Khanty-Mansiysk State Medical Academy, 2016

УДК 616.9 – 022.579.22:579.26 ББК 52.64 Л 47 Р е ц е н з е н т ы: Н. В. Рудаков – директор ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет», доктор медицинских наук, профессор. А. Р. Мавзютов – заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», заслуженный деятель науки РБ, доктор медицинских наук, профессор. Леонов В. В., Миронов А. Ю. Железо и микроорганизмы. – Ханты-Мансийск: ООО «Печатный мир г. Ханты-Мансийск», 2016. – 178 с. Монография посвящена роли железа в биологии и инфектологии условно-патогенных микроорганизмов. Приведены способы получения железа микроорганизмами в организме хозяина. Обобщены современные данные по гомеостазу железа млекопитающих. Обсуждаются механизмы изменения инфекционной чувствительности организма хозяина в зависимости от гомеостаза железа. Рассмотрены железозависимые механизмы регуляции вирулентности и межмикробных взаимодействий условно-патогенных микроорганизмов. Представлены возможности использования железозависимых свойств микроорганизмов в лабораторной диагностике. Монография адресована микробиологам, инфекционистам, специалистам лабораторной службы, клиницистам различных специальностей, а также студентам биологических и медицинских факультетов.

ISBN 978-5-906244-88-8

© В. В. Леонов, А. Ю. Миронов, 2016 © БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», 2016

ВВЕДЕНИЕ За последние десятилетия накопилось много данных, свидетельствующих о том, что наиболее важным микроэлементом, влияющим на состояние иммунной системы и определяющим исход взаимодействия микро- и макроорганизма, является железо. Корректность данного заключения очевидна, поскольку чувствительность организма к инфекционным патогенам изменяется в зависимости от количества железа в организме и связана не только с изменением реактивности, но и с модификацией биологических свойств микроорганизмов. Это особенно актуально на сегодняшний день, когда инфекционная патология вышла на новый рубеж своего развития – классические инфекции, вызываемые облигатными патогенами, отступают, их течение становится стертым и на смену им приходят оппортунистические инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами. Результатом взаимодействия микро- и макроорганизма не всегда является развитие инфекционной болезни, патоген может быть элиминирован из организма или начать персистировать с последующим формированием микробоносительства. Исход взаимодействия зависит от состояния иммунной системы организма хозяина и биологических свойств патогена. Современному читателю доступно большое количество публикаций о биологических функциях и гомеостазе железа у микроорганизмов и млекопитающих и совсем мало работ, рассматривающих роль железа на уровне системы «хозяин – микропаразит». Учитывая, что эта система развивалась параллельно в эволюции, подобный подход кажется нам вполне логичным и позволяет выявить патогенетические механизмы инфекционного процесса на фоне 6

адаптивных перестроек гомеостаза железа организма хозяина. С этой целью нами предпринята попытка обобщить имеющиеся в литературе данные, привести результаты собственных исследований о роли железа в межмикробных отношениях и взаимодействии на уровне системы «хозяин – микропаразит», а также наметить возможные направления дальнейших исследований феррозависимых свойств микрои макроорганизма. Мы надеемся, что десятилетний опыт изучения данной проблемы дает нам право на попытку такого анализа литературных данных и результатов собственных исследований. Авторы выражают искреннюю признательность за содействие в выполнении работы ректору Ханты-Мансийской государственной медицинской академии, профессору Ф.  И.  Петровскому, а также благодарность за помощь в сборе коллекции культур микроорганизмов, на которых проведены основные исследования, представленные в монографии, заведующей лабораторией клинической бактериологии Окружной клинической больницы г. Ханты-Мансийска Н. А. Гималовой. Работа выполнена при финансовой поддержке Департамента образования и молодежной политики Ханты-Мансийского автономного округа – Югры по проекту «Изучение особенностей краевых паразитарных и инфекционных болезней, закономерностей морфогенеза в онтогенезе и эксперименте при действии факторов различной природы».

7

Глава1 СПОСОБЫ ДОБЫВАНИЯ ЖЕЛЕЗА МИКРООРГАНИЗМАМИ 1.1. ЖЕЛЕЗО, ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ Железо является необходимым микроэлементом для обеспечения большинства жизненно важных функций живых организмов, таких как транспорт кислорода, синтез ДНК, участие в эффекторных механизмах иммунитета и др. Микроорганизмы также нуждаются в железе. Потребляя из окружающей среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, получают преимущество в конкурентной борьбе. Исследования широкого спектра патогенных бактерий свидетельствуют, что экспрессия многих генов, отвечающих за патогенность, регулируется железом [Миронов, Леонов, 2016]. Эти свойства железа делают его незаменимым фактором роста для бактерий, которые должны получать его из окружающей среды. Наиболее часто в природе железо встречается в двух степенях окисления Fe+2 и Fe+3, однако валентность железа, как и степень его окисления, может изменяться от -2 до +4. Стандартный окислительно-восстановительный потенциал при рН = 7 соединений железа в разных степенях окисления также изменяется в широких пределах от -750 до +1150 мВ, что делает соединения железа незаменимым катализатором многих окислительно-восстановительных превращений. Железо входит в состав гемов цитохромов, необходимых для функционирования дыхательной цепи, фотосинтеза; железосерные кластеры (Fe-S) играют ведущую роль в окислительно-восстановительных реакциях с участием гидрогеназ 8

и нитрогеназ; железо является кофактором для многих металлопротеинов. В окружающей среде железо Fe2+ окисляется кислородом воздуха или ферментативным путем до Fe3+. В водных растворах при нейтральных значениях рН ион Fe3+ легко ги3+ 3+ ниях ион легко гидролизуется, поскольку имеет высокий заряд и суниях рНрНион FeFe легко гидролизуется, поскольку имеет заряд и судролизуется, поскольку имеет высокий заряд ивысокий существует + + 2+ 2+ 2+ + ществует ввиде видеионов ионов Fe(OH) и Fe(OH) с константой диссоциации в видев ионов Fe(OH) и Fe(OH) с2константой диссоциации ществует Fe(OH) и Fe(OH) диссоциации (Кд(К ) д) 2с константой 2 -9 -9 -9(К ) ~10 М. При увеличении рН происходит образование Приувеличении увеличении происходит образование нерастворимого ~10 д М.При М. рНрНпроисходит образование нерастворимого и и ~10 нерастворимого и очень устойчивого гидроксида -18 -18 железа очень устойчивого гидроксида железа OКсд~10 Кд~10 М М [Griffiths, Wilочень устойчивого гидроксида железа FeFe O23OnH [Griffiths, Wil3 nH 2O2с Fe2O3·nH2O с Кд~10-18 М [Griffiths,2Williams, 1999; Chipperfield, 2+ и гидролиз ионов liams, 1999;Chipperfield, Chipperfield, Ratledge, 2000]. Feионов и гидролиз liams, 1999; Ratledge, 2000]. Fe2+ Ratledge, 2000]. Окисление Fe2+Окисление иОкисление гидролиз Fe2+ионов 3+3+ 2+ 2+ 3+ -9 -9 -18 -18 FeFe ведут ведут уменьшению концентрации ионов ведут ккуменьшению концентрации ионов железа до FeFeи  и иFe к уменьшению концентрации ионов железа до железа 10 10 1010М. М. -9 -18 2+ до 10 ÷10 М. Несмотря на 2+ процессы, ионы Fe , при2+эти Несмотря эти процессы, ионы , присутствующие в растворах в низкой Несмотря нана эти процессы, ионы FeFe, присутствующие в растворах в низкой сутствующие в растворах в низкой концентрации, являются концентрацииявляются являютсяопасными опаснымикатализаторами. катализаторами. При концентрации При взаимодействии с с опасными катализаторами. При взаимодействии с взаимодействии пероксипероксидом водорода образуется гидроксильный радикал (реакция Фентона), пероксидом водорода образуется гидроксильный радикал (реакция Фентона), дом водорода образуется гидроксильный радикал (реакция 3+ 3+ 3+ Фентона), как показано вИоны уравнении (1). Ионыснова Fe после после реакции восстанавликак (1). Ионы FeFe после реакции снова восстанавликакпоказано показанов вуравнении уравнении (1). 2+ реакции снова восстанавливаются до Fe в результате взаи­ 2+ 2+ ваются взаимодействия с супероксидным радикалом в в ваютсядодоFeFe в врезультате результате взаимодействия с супероксидным радикалом модействия с  супероксидным радикалом в соответствии соответствии с уравнением (2)(2) [Haber, Weiss, 1932; Barb et al., 1949]: соответствии с уравнением [Haber, Weiss, 1932; et al., 1949]: с уравнением (2) [Haber, Weiss, 1932; Barb etBarb al., 1949]: 2+ 2+ 3+ 3+ - ,(1), (1) FeFe +Н О22О FeFe + ОН + ОН + 2Н + ОН + ОН (1), 2 - 3+ 3+ 2+ 2+ FeFe +О FeFe +О (2). (2) +2О +2О 2  2 .(2).

Гидроксильный радикал, образующийся в реакции (1),

Гидроксильный радикал, образующийся реакции, (1)(1) весьма цитотокГидроксильный радикал, образующийся в реакции, весьма весьма цитотоксичен для мембран в клеток [Bergamini etцитоток-

al.,для 2004] и способен приводить кal., разрывам цепейприводить ДНК сичен мембран клеток et et al., 2004] и способен к к сичен для мембран клеток[Bergamini [Bergamini 2004] и способен приводить

[Toyokuni, ДНК Sagripanti, 1992; Cadet et al., Cadet 2003]. В процесразрывам Sagripanti, 1992; et et al., 2003]. В проразрывамцепей цепей ДНК[Toyokuni, [Toyokuni, Sagripanti, 1992; Cadet al., 2003]. В просе эволюции аэробные микроорганизмы приспособились

цессе эволюции аэробные микроорганизмы приспособились к защите от токцессе эволюции микроорганизмы приспособились к защите к  защите от аэробные токсического действия кислорода путем ней- от токсического действия путем нейтрализации егоего эффектов ферментатрализации егокислорода эффектов ферментами антиоксидантной засического действия кислорода путем нейтрализации эффектов фермента-

щиты  – супероксиддисмутазой, пероксидазой, каталазой. мимиантиоксидантной защиты – супероксиддисмутазой, пероксидазой, каталаантиоксидантной защиты – супероксиддисмутазой, пероксидазой, катала+2 Прооксидантные свойства Fe являются для развития резой. являются важным механизмом киллинга зой.Токсические Токсическиесвойства свойстважелеза железа являются важным механизмом киллинга спираторного взрыва, возникающего при фагоцитозе и обе-

патогенов заза счет развития респираторного возникающего припри фагопатогенов счет развития респираторного взрыва, возникающего фагоспечивающего киллинг патогенов. взрыва, цитозе. 9 цитозе. В Ворганизме ионы железа недоступны длядля микрооргаорганизмемлекопитающих млекопитающих ионы железа недоступны микроорганизмов, находятся в связанном состоянии с различными белками. низмов,поскольку поскольку находятся в связанном состоянии с различными белками.

В организме млекопитающих ионы железа недоступны для микроорганизмов, поскольку находятся в связанном состоянии с различными белками. Около 2/3 всего железа организма входит в состав гемопротеидов, таких как гемоглобин. Основным депо железа в организме является ферритин (Fr), который содержит 4 500 ионов Fe3+, что составляет 30% всего железа организма. Циркуляция железа в организме осуществляется за счет транспортных белков трансферрина (Tf) и лактоферрина (Lf). Оба эти белка имеют два сайта связывания железа, с константой связывания 1020÷1024 М-1. Таким образом, железо играет важную роль в обеспечении жизненно важных функций организма хозяина. С одной стороны, потенциальная токсичность железа и его способность повышать вирулентность патогенов привели к необходимости возникновения систем ограничения доступности железа для обоих процессов в организме хозяина. С  другой стороны, в процессе эволюции это ограничение стало выгодным для тех патогенов, которые выработали собственные способы получения железа [Raymond et al., 2003; Miethke, Marahiel, 2007]. Известны пять способов получения железа (рис. 1.1): 1. Прямое поглощение ионов Fe2+; 2. Восстановительное поглощение Fe3+; 3. Связывание трансферринов; 4. Синтез гемолизинов (цитолизинов) и поглощение гема/гемопротеинов; 5. Синтез сидерофоров. Эти способы реализуют микробную стратегию добывания железа в организме хозяина. Все способы получения железа микроорганизмами хорошо изучены [Welch, 1991; Neilands, 1995; Wandersman, Stojiljkovic, 2000; PerkinsBalding et al., 2004; Miethke, Marahiel, 2007; Андреева-Ковалевская и др., 2008]. Первый и второй способы заключают10

ся в непосредственном поглощении свободных ионов Fe2+ и Fe3+; третий путь – ионов Fe3+, связанных с железосвязывающими белками – Tf, Lf, Fr и др. Недостатком, ограничивающим распространение этих способов, является наличие ионов Fe2+, которые практически отсутствуют в окружающей среде (способ 1), мембранных ферриредуктаз, восстанавливающих Fe3+ (способ  2), рецепторов на поверхности клеток микроорганизмов для железосвязывающих белков (способ 3). Fe(OH)3. nH2O Fe3+ Гем Гемоглобин Гемопексин

Лактоферрин Трансферрин

4

3

Fe3+

Сидерофоры

5

4

Гемолизины/гемофоры

Сидерофоры Цитоплазма

Цитоплазма Цитоплазматическая мембрана Клеточная стенка

1

O2 Fe2+

2 Fe3+

Fe(OH)3 . nH2O

Рис. 1.1. Способы получения железа микроорганизмами. Рис. 1.1 Способы получения железа микроорганизмами.

Примечание. (1) – прямое поглощение ионов Fe2+; (2) – восстановительное Примечание. (1) – прямое поглощение ионов Fe2+; (2) – восстановительное поглощение 3+ поглощение Fe ; (3) – связывание трансферринов; (4) – синтез гемолизинов Fe3+; (3) – связывание трансферринов и ферритина; (4) – синтез гемолизинов (цитолизи(цитолизинов) и связывание гема/гемопротеинов; (5) – синтез сидерофоров. нов) и связывание гема/гемопротеинов; (5) – синтез сидерофоров.

11 Способность микроорганизмов синтезировать гемолизины делает доступным для поглощения гем/гемопротеины из разрушенных клеток (путь 4). Ещѐ одним способом получения железа является синтез низкомолекулярных 12

Способность микроорганизмов синтезировать гемолизины делает доступным для поглощения гем/гемопротеины из разрушенных клеток (способ 4). Еще одним способом получения железа является синтез низкомолекулярных хелаторов Fe3+ – сидерофоров (способ 5). Данный путь является наиболее распространенным, обнаружен у широкого круга прокариотических и эукариотических микроорганизмов [Ермилова, 2007], поскольку позволяет использовать для получения железа разнообразные субстраты, независимо от их природы. 1.2. ПРЯМОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ Fe2+ В аэробных условиях в растворе железо присутствует в виде трехвалентного иона Fe3+, в анаэробных и микроаэрофильных условиях железо сохраняется в виде двухвалентного иона Fe2+. Микроорганизмы для усвоения Fe2+ используют Feo транспортную систему, схематичное изображение этой системы приведено на рис. 1.2.1. Впервые Feo система описана у E. coli. Данная система состоит из двух или трех белков [Kammler et al., 1993; Hantke, 2003]: 1) FeoB, большой интегральный мембранный белок, выступающий в качестве компонента пермеазы, а N-терминальный G-домен работает как GTF-аза при активном транспорте Fe2+ [Marlovits et al., 2002]; 2) FeоА, маленький цитозольный белок, активирующий GТF-гидролазную активность FeoB; 3) FeoC, небольшие гидрофильные белки, выступающие в качестве транскрипционного репрессора [Cartron et al., 2006], имеются только у γ-протеобактерий. FeoB-опосредованное поглощение железа из желудочно-кишечного тракта способствует колонизации Campylobacter jejuni [Naikare et al., 2006] и Helicobacter pylori [Velayudhan et al., 2000], а также внутриклеточной персистенции Legionella рneumophila [Robey, Cianciotto, 12

2002]. FeoB-опосредованный транспорт Fe2+ теоретически может работать согласованно с механизмами транспорта Fe3+, сопряжение двух механизмов происходит через поверхностно расположенные ферриредуктазы микроорганизмов, восстанавливающие Fe3+ в Fe2+ [Schroder et al., 2003; Vartivarian, Cowart, 1999]. Ферриредуктазы обнаружены не у всех бактерий. На примере Listeria monocytogenes показано, что у патогенов внеклеточная восстановленная редукция Fe3+ является важной стратегией в отборе железа у Tf в анаэробных условиях [Barton, Friedman, 1987].

Рис. 1.2.1. Поглощение Fe2+ микроорганизмами. Примечание. НМ – наружная мембрана; ПГ – пептидогликан; ПП – периплазматическое пространство; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана; НАК – низкоаффинный канал.

13

1.3. СИДЕРОФОРЫ Сидерофоры (от греч. sideros – железо и phoros – несущий) – низкомолекулярные вещества хелатирующие ионы Fe3+, выделяемые микроорганизмами и растениями при дефиците ионов железа в окружающей среде. Основная функция сидерофоров заключается в переводе железа, связанного с белками или водонерастворимыми соединениями, в доступную для микроорганизмов ионную форму Fe3+. Активное изучение сидерофоров началось в 90-х годах ХХ века, с тех пор выделены и охарактеризованы сидерофоры разных групп микроорганизмов. Большинство аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов синтезируют хотя бы один сидерофор. Доказана связь сидерофоров с вирулентностью микроорганизмов, разрабатываются подходы для их клинического применения [Neilands, 1995]. В зависимости от химической природы сидерофоры можно разделить на пять классов – катехолаты и феноляты («арильные кэпы»), гидроксаматы (α-оксикарбоновые кислоты), карбоксилаты и трикарбоновые кисоксикарбоновые кислоты),(дикарбоновые карбоксилаты (дикарбоновые и трикарбоновые лоты), сидерофоры смешанного типа. Сидерофоры смешанкислоты), сидерофоры смешанного типа. Сидерофоры смешанного типа по ного типа по своей структуре соответствуют одновременно своей структуре соответствуют одновременно двум классам, поэтому их выдвум классам, поэтому их выделили в отдельный класс. Хиделили в отдельный класс. Химические структуры разных классов сидерофомические структуры разных классов сидерофоров представров представлены на рис. 1.3.1. лены на рис. 1.3.1. КАТЕХОЛАТНЫЙ ТИП Катехолатный тип OH

OH

OH O O O O

O

O

H N O

O

OH

O

OH

N

H N

O

O O

NH

HO

HO HO

Энтеробактин Энтеробактин (энтеробактерии, Streptomyces spp.) (энтеробактерии, Streptomyces spp.)

HO

14 ФЕНОЛЯТНЫЙ ТИП

OH

HO

N

N

NH

O

HO

OH

O

OH

S N

N

N

O OH

Вибриобактин

Вибриобактин (Vibrio cholerae) (Vibrio cholerea)

OH

S N

O

HO HO

HO

HO HO

HO HO

Энтеробактин Энтеробактин (энтеробактерии, (энтеробактерии,Streptomyces Streptomycesspp.) spp.)

OHOH

ФФ ЕНОЛЯТНЫЙ ЕНОЛЯТНЫЙТИП ТИП Фенолятный тип

OH OH

SS NN

NN HH

S S

Вибриобактин Вибриобактин (Vibrio (Vibrio cholerea) cholerea)

OO

NN

OH OH

OH OH

SS

SS NN

O O OH OH

N N

SS

Иерсиниобактин Иерсиниобактин Иерсиниобактин (Yersinia pestis, (Yersinia pestis, Y.Y.enterocolitica) (Yersinia pestis,Y. enterocolitica) enterocolitica)

Пиохелин

Пиохелин Пиохелин (Pseudomonas aeruginosa) (Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa) aeruginosa)

ГГ ИДРОКСАМАТНЫЙ ИДРОКСАМАТНЫЙТИП ТИП

Гидроксаматный тип

NN OHOH OO OHOH OO HNHN O O

OO

HH 2N 2N

NH NH

[CH ] [CH 2]26 6

HOHO O O OHOH

NN HH OO

NN

Алкалигин Алкалигин Алкалигин (Alcaligenes (Alcaligenes denitrificans, (Alcaligenes denitrificans, denitrificans, B. pertussis, pertussis, bronchiseptica) B.B. pertussis, B.B.bronchiseptica)

O O

HH NN

[CH2]22]2 [CH

[CH22]]66 [CH NN HHOO

OO

[CH22]]22 [CH

H H N N

[CH22]6 [CH N N HO O H

OO

O O

Десферриоксамин Десферриоксамин В Десферриоксамин ВВ (Streptomyces pilosus) (Streptomyces pilosus) (Streptomyces pilosus)

B. bronchiseptica) 1313 ККарбоксилатный АРБОКСИЛАТНЫЙ ТИП тип КАРБОКСИЛАТНЫЙ ТИП

NH O

O

COOH COOHH NH N

COOH COOH HO OH COOH

H

ON

OO COOH COOH

HO

OH HOOC HOOC

COOH

HOOC

HH NN

O O O

HOOC

O

Стафилоферрин А А Стафилоферрин Стафилоферрин А spp.) (Staphylococcus (Staphylococcus (Staphylococcus spp.) spp.)

OHOH N NH OH

O O COOH COOH

OO

HOOC

HOOC

HH N N

O

O COOH

COOH

O

O

Ахробактин Ахробактин Ахробактин (Erwinia chrysanthemi)

(Erwinia (Erwiniachrysanthemi) chrysanthemi)

СМЕШАННЫЕ ТИПЫ Смешанные типы Катехолат-гидроксаматные Фенолят-гидроксаматные

СМЕШАННЫЕ ТИПЫ Катехолат-гидроксаматные Фенолят-гидроксаматные

Катехолат-гидроксаматные H HO

HO

O N

O

N

N

O O

H N

N H

O

N H

N O H

NH2

N H

NH2

O Фенолят-гидроксаматные

O

O

HO

OH

OH

OH

HO

Heterobactin HeterobactinB B OH (Rhodococcus (Rhodococcuserythopolis) erythopolis)

Heterobactin B (Rhodococcus erythopolis) Цитрат-катехолатные

N

N R1 OHO

O N

O

O

N H

N H O Mycobactin

O

NH

N

NH

OH

H N O

H N

O

OH

O

Mycobactin TT O O (Mycobacterium tuberculosis) (Mycobacterium tuberculosis) 15

OH

O

O

Mycobactin T (Mycobacterium tuberculosis) Цитрат-гидроксаматные

OH O Цитрат-катехолатные H

N O R1 OH

HO

N O Цитрат-гидроксаматные COOH O

NH

OH

HO

N

OH

Heterobactin B (Rhodococcus erythopolis)

O

N H

O

Цитрат-гидроксаматные Цитрат-гидроксаматные OH

O HO O

NH

H N

HO

OH

O

NH

HO

COOH NH

N H

NH O

O

Mycobactin T (Mycobacterium tuberculosis)

Цитрат-катехолатные Цитрат-катехолатные O

N

O

O

OH

COOH

N

O

N

O

NH COOH NH COOH HO

OH

Петробактин Аэробактин Петробактин Аэробактин (Bacillus anthracis, spp., Escherichia coli, coli, (Bacillus anthracis,B.B.cereus, cereus, (Enterobacter (Enterobacter spp., Eschericha Marimobacter Shigella flexneri) Marimobacter sp.) Shigella flexneri)

Рис. 1.3.1. Химические структуры сидерофоров. Рис. 1.3.1. Химические структуры сидерофоров.

Ионы Fe3+ имеют координационное число шесть и явкоординационное число поэтому шесть и являются жесткими Ионыжесткими Fe3+ имеют кислотами ляются Льюиса, в водном растворе Льюиса, сильно сольватированы воды, шекислотами поэтому в водном шестью растворе молекулами сильно сольватированы 3+ образуя октаэдрический аквакомплекс Fe[(H O) ] . Сидеростью молекулами воды, образуя октаэдрический аквакомплекс Fe[(H2O)6]3+. 2 6 форы образуют прочные комплексные соединения с Fe3+ за 14 счет электронодонорных атомов, которые способны вытеснять молекулы воды из внутренней сферы аквакомплекса. При условии, что одна молекула сидерофора предоставляет шесть электронодонорных атомов, необходимых для комплексообразования, образуется октаэдрический комплекс состава FeL. В случае если одна молекула сидерофора содержит менее шести электронодонорных атомов, участвующих в комплексообразовании, то образуются комплексы другого состава, например, для родоторуловой кислоты (Rhodotorula mucilaginosa) – Fe2L3, пиохелина (Pseudomonas aeruginosa)  – FeL и FeL2, цепабактина (Burkholderia cepacia) – FeL3 [Carrano, Raymond, 1978; Tseng et al., 2006]. Комплексы Fe3+ с сидерофорами отличаются высокой термодинамической устойчивостью, несмотря на отсутствие 16

стабилизации со стороны поля лигандов, так как атомы кислорода являются жесткими основаниями Льюиса. Помимо ионов Fe3+сидерофоры могут связывать в менее прочные комплексы другие катионы металлов, особенно трехвалентные катионы алюминия. Однако галлий способен образовывать более прочные комплексы с сидерофорами, чем железо. На примере P. aeruginosa показано, что внесение в  среду галлия блокирует сидерофоры и популяция бактерий уменьшает свою вирулентность и ростовую активность. Данный факт открывает новые горизонты для антимикробной химиотерапии, так как служит подтверждением теории эволюции – если мишенью для действия антимикробного лекарственного препарата является общественный продукт, то в таком случае резистентность у микроорганизмов к этому препарату не развивается [Ross-Gillespie et al., 2014]. Двухвалентные катионы металлов связываются сидерофорами менее предпочтительно. В рамках теории жестких и мягких кислот и оснований Льюиса это объясняется ислотами Льюиса и предпочитают взаимодействовать с мягкими основани тем, что двухвалентные катионы являются мягкими кисломи, такимитами какЛьюиса азот и исера. Ионы Fe2+взаимодействовать также не образуют достаточно проч предпочитают с мягкими 2+ основаниями, такими как азот и сера. Ионы Fe также не ых комплексов с сидерофорами, что объясняется не только их принадлеж образуют достаточно прочных комплексов с сидерофорами, что объясняется не только их принадлежностью к мягким величины остью к мягким основаниям Льюиса, но и низким отношением основаниям Льюиса, но и низким отношением величины зааряда к ионному радиусу,радиусу, что вносит дополнительный вклад в дестабилиза ряда к ионному что вносит дополнительный вклад в дестабилизацию структурыCarrano, комплекса [Raymond, Carrano, ию структуры комплекса [Raymond, 1979]. 1979]. Количественная оценка прочности комплексных соединений Количественная оценка прочности комплексных со- осуществ единений осуществляется с помощью констант нестойко() яется с помощью констант нестойкости (Кн) и связывания/устойчивости сти (Кн) и связывания/устойчивости (β): mМ+L=M mМ + L = MmmL, L, ,;

Кн = 17

.

Чем выше , тем прочнее комплекс и наоборот. Константы устойчивост

mМ+L=MmL, Кн =

; ..

Чем выше β, тем прочнее комплекс, и наоборот. Кон-

3+ Чем выше , тем прочнее комплекс и наоборот. Константы устойчивост станты устойчивости комплексов сидерофор-Fe могут до-

3+ 10 и более. Для удобства в расчетах пользуются веомплексовстигать сидерофор-Fe могут достигать 1032 и более. Для удобства в ра 32

личиной lgβ. Величины lgβ определены для большого круга сидерофоров и изменяются в широкихlg пределах 22,5÷49,0. ѐтах пользуются величиной lg. Величины определены для большог 3+ Значения констант устойчивости комплексов Fe -L для неруга сидерофоров и изменяются в широких пределах 22,549,0. Значени которых сидерофоров микроорганизмов, железосвязывающих белков млекопитающих онстант устойчивости комплексов Feи3+этилендиаминтетрауксусной -L для некоторых сидерофоров ми кислоты (ЭДТА) приведены в таблице 1.3.1. оорганизмов, железосвязывающих белков млекопитающих этилендиамин Таблицаи1.3.1 устойчивости lgβ комплексов Fe3+-L етрауксуснаой Константы кислоты (ЭДТА) приведены в таблице 1.3.1. [Harris et al., 1979; Aisen, Leibman, 1972] Таблица 1.3 Лиганд (L) lgβ 22,5 Аэробактин Е. coli 3+ КонстантыЭнтеробактин устойчивости [Harris et al., 1979; Aisen Е. lg coli комплексов Fe -L49,0 Феррихром А 29,0 Leibman, 1972] Ферриоксамин Е 32,0 Лиганд (L) Трансферрин 20,0-23,0 lg 20,0-24,0 22,5 Аэробактин Лактоферрин Е. coli ЭДТА 25,0 49,0 Энтеробактин Е. coli таблице, Феррихром А Из сравнения значений lgb, приведенных в 29,0 3+ следует, что одним из самых слабых хелаторов Fe Ферриоксамин Е 32,0является аэробактин Е. coli. Железосвязывающие белки, такие рансферрин 20,0-23,0 как Tf и Lf, имеют lgβ = 22-24, что на несколько порядков Лактоферрин 22,0-24,0 меньше β большинства микробных сидерофоров. Разность ЭДТА 25,0 в значениях констант устойчивости делает термодинамичеИз сравнения значений lg,железа приведѐнных в таблице следует, ски возможным отбор у железосвязывающих белков что одни млекопитающих сидерофоров. Например, coli з самых слабых хелаторовс помощью Fe3+ является аэробактин Е. coli.Е.Железосвязыв синтезирует два сидерофора разной химической природы: 1 энтеробактин (энтерохелин) и аэробактин. После поглощения комплекса Fe3+-энтеробактин/аэробактин энтеробактин 18

разрушается, в отличие от аэробактина. Метаболически менее затратный путь – синтез аэробактина. Несмотря на это, один и тот же штамм Е. coli может синтезировать одновременно аэробактин и энтеробактин. Синтез двух сидерофоров не выгоден для клетки микроорганизма и функции этих двух сидерофоров различны. Исходя из сравнительного анализа значений рβ, энтеробактин может быть задействован при отборе железа у белков-переносчиков (Tf, Lf), а  аэробактин отбирает железо у белков, запасающих железо в клетках (Fr, гемосидерин), что подтверждено экспериментально [Brock et al., 1991]. Синтез определенного сидерофора, скорее всего, зависит от условий окружающей среды. На продукцию сидерофоров влияет рН, способность сидерофоров образовывать прочные комплексы с ионами Fe3+ сильно зависит от величины рН среды, в которой происходит комплексообразование. Протоны водорода могут конкурировать с ионами Fe3+ за электронодонорные атомы, поэтому в определении истинных значений β комплексов сидерофор-Fe3+ необходимо учитывать рН среды. При физиологических значениях рН полного депротонирования электронодонорных групп молекулы сидерофора не происходит, поэтому для характеристики истинной железосвязывающей способности сидерофоров предложена константа рFe = -lg[Fe3+], где [Fe3+] – концентрация свободного железа, не связанного в комплекс. рFe по договоренности определяют при [Fe3+]  =  10-6 М, а [L]  = 10-5 М и фиксированном значении рН. Например, в сыворотке крови рН = 7,4, что соответствует рFe (энтеробактин)  = 35,5 и рFe (аэробактин) = 23,4, при сравнении этих значений со значениями lgβ (табл. 1.3.1) следует, что железосвязывающая способность энтеробактина и аэробактина в зависимости от рН среды отличается более чем на 10 порядков, однако общая тенденция сохраняется [Dertz, Raymond, 2004]. 19

Используя справочные значения констант кислотности рКа электронодонорных групп сидерофоров, можно прогнозировать эффективность их железосвязывающей способности при данном значении рН. Сидерофоры катехолатного типа имеют рКа ОН-групп от 6,5 до 11,5, гидроксаматного типа от 8,0 до 9,0, карбоксилатного типа от 3,5 до 5,0. Из сравнения значений рКа следует, что в кислых средах ОН-группы сидерофоров катехолатного и гидроксаматного типа не диссоциируют, а значит, эффективность связывания ионов Fe3+ сидерофорами данного типа в кислых средах будет низкой. Микроорганизмы, живущие в кислых средах, для мобилизации железа используют сидерофоры карбоксилатного типа со значениями рКа < 7 [Dertz, Raymond, 2003; Miethke, Marahiel, 2007]. Несмотря на важность прогнозирования свойств сидерофоров в зависимости от строения, значения β большинства комплексов сидеро­фор-Fe3+ неизвестны. 1.3.1. Синтез и транспорт сидерофоров Биосинтез сидерофоров протекает двумя путями: нерибосомальный пептидный синтез (NRPS, от англ. nonribosomal peptide synthesis) и NRPS-независимый путь (NIS). NRPS-путь ведет к сборке пептидных сидерофоров, в состав которых входят непротеиногенные аминокислоты и их производные, сборка таких сидерофоров происходит без использования РНК-матрицы [Crosa, Walsh, 2002]. Образующиеся в результате пептиды обычно короткие олигомеры от 2 до 48 аминокислотных остатков. По NRPS-пути происходит синтез многих сидерофоров: иерсиниобактина, энтеробактина, вибриобактина, антибиотиков – пенициллина и ванкомицина. Синтез и модификация сидерофоров по NRPS-пути осуществляются поэтапно на мультимодальной NRP20

синтетазе. Функциональную роль доменов NRP-синтетазы можно определить следующим образом: 1) активация аминокислот для пептидного синтеза через образование тиоэфиров; 2) образование пептидной связи в РСР-домене (от англ. peptidyl carrier protein – белок-носитель пептида); 3)  модификация аминокислот, например, эпимеризация, приводящая к изомеризации L-аминокислоты в D-энантиомер; 4)  переэтерификация пептидной цепи с последующим освобождением зрелых метаболитов путем гидролиза или макроциклизации [Kohli et al., 2001]. NIS-путь синтеза сидерофоров осуществляется в результате конденсации различных элементов, как правило, дикарбоновых кислот (сукцинат, цитрат, α-кетоглутарат) с  диаминами, аминоспиртами, спиртами [Challis, 2005]. По  NIS-пути происходит синтез аэробактина, ахромобактина, ризобактина, вибриоферрина и др. NIS синтетазы не гомологичны синтетазам NRPS-пути они в первую очередь катализируют образование амидных и эфирных связей между органическими кислотами и аминогруппами/гидроксильными группами субстратов. Для использования сидерофоров микроорганизмы имеют регуляторные системы, включающие в себя ферменты и транспортные системы, которые согласуют процессы их биосинтеза, секреции, связывания и освобождения железа. После связывания сидерофора с Fe3+ осуществляется транспорт захваченного иона железа в цитоплазму клетки микроорганизма. Транспорт может быть осуществлен двумя путями, либо комплекс сидерофор-Fe3+ диссоциирует на поверхности клетки и тогда ион Fe3+ проникает одиночно, либо комплекс не диссоциирует и ион Fe3+ транспортируется в цитоплазму закомплексованным. У грамотрицательных бактерий комплекс сидерофор3+ Fe должен преодолеть две мембраны – наружную клеточ21

ной стенки и цитоплазматическую. В силу того, что комплекс сидерофор-Fe3+ достаточно крупный и содержится в  среде в низкой концентрации, он не может проникнуть в клетку через пориновые каналы или путем простой диффузии. Для переноса через мембраны грамотрицательные бактерии имеют специализированные белки-рецепторы, связывающие комплекс сидерофор-Fe3+ и осуществляющие его активный транспорт в периплазму против градиента концентрации. Наиболее хорошо изучены белки FepA, FecA, FhuA, FpvA, FptA, являющиеся рецепторами для энтеробактина, цитрата, феррихрома E. coli, пиовердина и пиохелина P. aeruginosa [Locher et al., 1998; Buchanan et al., 1999; Yue et al., 2003; Cobessi et al., 2005a,b]. Белки-рецепторы наружной мембраны имеют различное сродство к комплексам сидерофор-Fe3+. Если рецептор специфичен к одному лиганду, как FepA E. coli к Fe3+энтеробактину, то такой рецептор связывает свой комплекс сидерофор-Fe3+ с высокой аффинностью. Если рецептор способен узнавать разные по природе сидерофоры, например, рецептор Cir уропатогенных штаммов E. coli может узнавать комплекс Fe3+-сальмохелин Salmonella enterica, то такие рецепторы связывают комплексы сидерофорFe3+ с  низкой аффинностью [Hantke et al., 2003; Miethke, Marahiel, 2007]. В целом структуры этих белков-рецепторов схожи и имеют два функционально различных домена: цилиндрический, сформированный из 22 β-цепей, и N-концевой глобулярный, включающий до 150 аминокислотных остатков. Глобулярный домен располагается внутри цилиндрического и формирует «пробку» или «штепсель» для внутреннего канала β-цилиндра. Удаление глобулярного домена приводит к открыванию канала, необходимого для взаимодействия рецептора с белковым комплексом, состоящим из трех бел22

ков цитоплазматической мембраны – ExbB, ExbD и богатого пролином белка TonB, прикрепленного к цитоплазматической мембране своим N-концом. TonB взаимодействует с ExbB и ExbD в следующих стехиометрических соотношениях – 1(TonB):7(ExbB):2(ExbD) [Higgs et al., 2002]. С помощью своего С-конца TonB взаимодействует с консервативной последовательностью, содержащейся на N-концах всех сидерофороспецифичных рецепторов. Функция TonB заключается в переносе энергии, создаваемой на цитоплазматической мембране, на рецептор наружной мембраны клеточной стенки, в результате чего последний претерпевает конформационные изменения, необходимые для процесса активного транспорта комплексов сидерофор-Fe3+ через наружную мембрану (рис. 1.3.2).

Рис. 1.3.2. Поглощение Fe3+ грамотрицательными бактериями.

Примечание. НМ – наружная мембрана; ПГ – пептидогликан; ПП – периплазматическое пространство; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана; ССБ – субстратсвязывающий белок. 23

По сути дела происходит процесс энергетического сопряжения двух мембран и за счет электрохимического потенциала цитоплазматической мембраны осуществляется активный энергозависимый транспорт через наружную мембрану клеточной стенки [Ермилова, 2007; Miethke, Marahiel, 2007]. Доставка ионов Fe3+ в цитоплазму осуществляется с помощью системы периплазматических белков АВС-транспортеров. У грамотрицательных бактерий выделяют четыре подтипа АВС-транспортеров, участвующих в поглощении комплексов сидерофор-Fe3+, отдельно выделяют пятый подтип, предложенный для транспорта Fe3+сальмохелин. Первый подтип наиболее распространенный и состоит из четырех белков: субстрат-связывающего белка, который имеет внецитоплазматическую локализацию, двух интегральных мембранных белков, формирующих гетеродимерный трансмембранный канал, и цитоплазматического АВС-белка, который своими субъединицами взаимодействуют с сайтами цитоплазматической мембраны. Примером данного подтипа являются транспортеры FepBDGC Fe3+-энтеробактин и FecBCDE Fe3+-дицитрат E. coli. Схожее строение имеет FhuDCB транспортер E. coli, однако его трансмембранный компонент состоит из одной полипептидной цепи FhuB, которую можно рассматривать как слияние двух «обычных» трансмембранных субъединиц. FhuDCB представляет собой второй подтип АВС-транспортеров комплексов сидерофор-Fe3+. Третий подтип АВС-транспортеров состоит из трансмембранных липопротеинов, встречается у грамположительных бактерий и некоторых грамотрицательных бактерий (Vibrio spp., Campylobacter spp.) [Actis et al., 1995; Wyckoff et al., 1999]. Четвертый подтип выявлен у иерсиний и предназначен для транспорта комплекса Fe3+-иерсиниобактин, включает в себя белки YbtP и YbtQ, соответственно YbtPQ-транспортер, од24

нако исследования, проведенные на непатогенном штамме Y. enterocolitica NF-O, показали, что для осуществления транспорта комплекса Fe3+-иерсиниобактин дополнительно необходим периплазматический белок [Brem et al., 2001; Ермилова, 2007]. Пятым, предполагаемым подтипом АВСтранспортера является четырехдоменный белок IroC. Показано, что fepB мутанты E. coli могут использовать сальмохелин в качестве источника железа, и поскольку IroC единственный цитоплазматический белок, закодированный в iroA локусе, сделано заключение, что он и ответственен за транспорт комплекса Fe3+-сальмохелин [Zhu et al., 2005]. У грамположительных бактерий отсутствуют периплазматическое пространство и наружная мембрана клеточной стенки, поэтому процесс транспорта железа начинается с взаимодействия комплекса сидерофор-Fe3+ с закрепленным в цитоплазматической мембране субстрат-связывающим белком (рис. 1.3.3). Транспорт через цитоплазматическую мембрану осуществляют АТP-зависимые транспортеры. Известны два подтипа АТP-зависимых транспортеров грамположительных бактерий. Первый подтип представлен липид-модифицирующими белками, расположенными на внешней стороне цитоплазматической мембраны. Второй подтип АТР-зависимых транспортеров недавно обнаружен у M. tuberculosis и предназначен для переноса комплекса карбоксимикобактин-Fe3+ [Rodriguez, Smith, 2006; Ермилова, 2007]. У эукариот не обнаружено транспортеров АВС-типа, поэтому транспорт комплекса сидерофор-Fe3+ имеет отличия от прокариот. Основными транспортерами комплекса Fe3+-сидерофор являются белки суперсемьи MFS (от англ. major facilitator superfamily – суперсемья мембранных транспортеров). MFS является большой группой вторичных транспортеров, осуществляющих транспорт по механизмам 25

унипорта, симпорта, антипорта. У Saccharomyces cerevisiae выделяют четыре транспортера: Arn1p для Fe3+-феррихром, Taf1p (Arn2p) для Fe3+-триацетилфузаринина (TAFC, от англ, triacetylfusarinine), Sit1p (Arn3p) для Fe3+-ферриоксамин В, Enb1p (Arn4p) для Fe3+-энтеробактина [Heymann et al., 1999; 2000a,b; Yun et al., 2000; Kosman, 2003].

Рис. 1.3.3. Поглощение Fe3+ грамположительными бактериями.

Примечание. ПГ – пептидогликан; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана; ТК – тейхоевые и липотейхоевые кислоты; ССБ – субстрат-связывающий белок.

Мицелиальные грибы и дрожжи имеют набор мембраносвязанных феррисидерофорных редуктаз, вследствие этого они могут реализовывать транспорт железа восстановительным путем. У S. cerevisiae обнаружены мембранные ферриредуктазы Fre1p и Fre4p, принадлежащие к суперсемье флавоцитохромов, которые участвуют в восстановительном поглощении комплекса 26

сидерофор-Fe3+, а функции двух гомологов Fre5p и Fre6p пока еще не выяснены, но известно, что они активируются при дефиците железа. Основными транспортерами железа у S. cerevisiae являются ферриредуктазы Fre1p и Fre2p, которые могут поглощать ионы Fe3+, связанные с цитратом, ферриоксамином В, феррихромом, TAFC, родоторуловой кислотой. Ферриредуктаза Fre3p в 40 раз менее эффективна в использовании данных сидерофоров. Fre1p и Fre2p могут поглощать бактериальные сидерофоры, например, комплекс Fe3+-энтеробактин [Schroder et al., 2003; Yun et al., 2001]. Активность Fre увеличивается в кислой среде, что связывают с генерацией протонного градиента. Fre1p и Fre2p способны также транспортировать с редукцией ионы Cu2+, которые затем переносятся через цитоплазматическую мембрану транспортерами CTR1 и CTR3 [Georgatsou et al., 1997]. Как и S. cerevisiae, C. albicans имеет сходные пути транспорта железа, связанного с сидерофорами. Arn1p (CaArn1p) системы транспортируют феррихромы. Установлено, что этот транспортер является необходимым для инвазии в эпителий человека, но не является необходимым для развития генерализованной инфекции у мышей [Heymann et al., 2002]. Эволюционно сложилось, что не только грибы, но и  многие бактерии, помимо собственных (гомологичных) сидерофоров, могут использовать сидерофоры, синтезируемые другими микроорганизмами (гетерологичные). У  бактерий выявлено достаточно большое количество генов, кодирующих системы транспорта гетерологичных сидерофоров, только у E. coli охарактеризованы 13 генов, а у P. aeruginosa – 35 генов [Ермилова, 2007]. Возможность использования микроорганизмами гетерологичных сидерофоров позволяет микроорганизмам лучше адаптироваться к  условиям окружающей среды. Данный механизм наиболее важен для патогенных микроорганизмов, поскольку 27

ионы железа являются регуляторами синтеза многих факторов вирулентности. Существует ряд экспериментальных доказательств того, что сидерофорный транспорт железа является фактором роста и вирулентности микроорганизмов в естественных условиях. Действительно, потеря способности синтезировать сидерофоры коррелирует с потерей вирулентности, что показано на бактериях многих видов – Erwinia chrysanthemi [Enard et al., 1988], P. aeruginosa [Cox, 1982; Meyer et al., 1996], Vibrio anguillarum [Crosa, 1980], Y. enterocolitica [Heesemann et al., 1993], E. coli [Williams, 1979] и др. В данном случае способность использовать гетерологичные сидерофоры повышает конкурентоспособность патогенных микроорганизмов в организме хозяина. Основными конкурентами патогенов за железо в организме хозяина являются железосвязывающие белки. Способность сидерофоров связывать железо с более высокой аффинностью, чем железосвязывающие белки, приводит к отбору железа у организма хозяина в пользу патогена. 1.4. ПРЯМОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ТРАНСФЕРРИНОВ Основное внеклеточное железо в организме сосредоточено в трансферринах сыворотки крови, лимфе, секретах – Tf и Lf. Все трансферрины могут оказывать микробостатический эффект на грамположительные, грамотрицательные бактерии и грибы. Микробостатический эффект трансферринов обусловлен тем, что, связывая железо, они лишают патогены жизненно важного для них микроэлемента, ингибируя рост и экспрессию факторов вирулентности. Бактерицидным эффектом обладает только Lf. Бактерицидное действие Lf обусловлено прямым взаимодействием белковой молекулы с поверхностью бактерий. Lf повреждает наружную мембрану клеточной стенки грамотрицательных бактерий посредством связывания с ли28

пидом А липополисахарида [Ellison et al., 1988] (рис. 1.4.1). Положительно заряженный N-конец белка препятствует взаимодействию липополисахарида с катионами Ca2+ и Mg2+ наружной мембраны клеточной стенки бактерий, вызывая высвобождение липида А, с последующим повреждением наружной мембраны и гибелью бактерии. Взаимодействие Lf с липополисахаридом усиливает действие таких природных антибактериальных агентов, как лизоцим [Schryvers, Morris, 1988]. Действие Lf против грамположительных бактерий основано на связывании положительно заряженного белка с анионными молекулами поверхности бактериальной клетки, такими как липотейхоевые кислоты (рис. 1.4.1). Лактоферрин

Лизоцим

Липополисахарид Тейхоевые кислоты

Порины

Цитоплазматическая мембрана Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии

Рис. 1.4.1. Антибактериальное действие Lf [Schryvers, Morris, 1988; Pintor et al., 1993]. В результате отрицательный заряд клеточной стенки уменьшается, способствуя взаимодействию лизоцима с пептидогликаном и расщеплению последнего. Помимо лизоцима описано синергетическое действие Lf с различны29

ми антибиотиками [Ellison et al., 1988] и бактериофагами [Zimecki et al., 2008]. Многие патогенные бактерии в процессе эволюции выработали стратегию непосредственного получения железа из трансферринов млекопитающих. Данная стратегия реализуется путем их прямого связывания и дальнейших превращений с участием поверхностных рецепторов. Лучше всего данная стратегия изучена у Neisseria spp.

Рис. 1.4.2. Поглощение Fe3+ из Tf и Lf у N. meningitidis [Perkins-Balding et al., 2004].

Примечание. НМ – наружная мембрана; ПГ – пептидогликан; ПП – периплазматическое пространство; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана.

Представители рода Neisseria имеют два поверхностно расположенных белка-рецептора Тbp и Lbp, взаимодействующих с Tf и Lf организма хозяина соответственно. Экспрессия этих рецепторов увеличивается в железодефицитных условиях. Tbp белок, состоящий из двух субъединиц – TbpA, 30

ранее Tbp1 (93-98 кДa), и TbpB, ранее Tbp2 (68-85 кДa), TbpA встречается у всех штаммов N. meningitidis (рис. 1.4.2) [Schryvers, Morris, 1988; Griffiths et al., 1990; Ferreiros et al., 1991; Pintor et al., 1993]. Белок Lbp также существует в виде двух субъединиц – LbpА (98 кДa) и LbpВ (84 кДa), ранее IroA и IroB [Schryvers, Morris, 1988; Pettersson et al., 1994; Quinn et al., 1994]. В целом белки TbpA и LbpA гомологичны и родственны рецепторам сидерофоров в наружной мембране клеточной стенки грамотрицательных бактерий и являются Ton-зависимыми рецепторами [Cornelissen, 2003]. Показано, что TbpA взаимодействует с С-доменом Tf, который является наиболее железонасыщенным [Zak, Aisen, 1986; Alcantara et al., 1993]. Это взаимодействие не зависит от наличия олигосахаридных цепей Tf и протекает по типу белок-белкового взаимодействия [Padda, Schryvers, 1990]. Домены Lf, взаимодействующие с LbpA, до сих пор не определены, однако предполагается, что Lf, в отличие от Tf, взаи­модействует со своим рецептором Nи C-доменами [Wong, Schryvers, 2003]. Точная роль TbpB и LbpB в поглощении Tf и Lf N. meningitidis остается неясной. Известно, что по своей природе это липопротеины, закрепленные N-липидным концом в наружном слое наружной мембраны клеточной стенки. Считается, что эти субъединицы увеличивают аффинность рецепторов и определяют способность рецепторов дифференцировать содержащие и не содержащие железо трансферрины. TbpA способен только извлекать железо из Tf [Gomez et al., 1998], однако TbpB может выступать в  качестве посредника в этом процессе [Anderson et al., 1994]. Анализ LbpA и LbpB показывает, что оба белка могут независимо связывать Lf, однако LbpAмутанты N. meningitidis не способны использовать железо из Lf [Pettersson et al., 1998]. Система переноса ионов железа через наружную мембрану, как и в случае сидерофоров, 31

контролируется комплексом TonB/ExbB/ExbD. Ион Fe3+, полученный от Tf или Lf, связывается в периплазме с белком Fbp (от англ. ferric-binding protein), который доставляет его к АВС-пермеазе в цитоплазматической мембране, осуществляющей дальнейший перенос иона железа в цитоплазму (рис. 1.4.2) [Gomez et al., 1998; Ермилова, 2007]. Периодически появляются сообщения о связывании трансферринов клеточной стенкой грамположительных бактерий, в частности стафилококками [Hartford et al., 1993; Modun et al., 1994; Taylor, Heinrichs, 2002]. Детальные механизмы данного процесса не описаны, не приведены убедительные доказательства, основанные на молекулярногенетических исследованиях. Возможно, что грамположительные бактерии связывают трансферрины с помощью неспецифических факторов адгезии. 1.5. ГЕМОЛИЗИНЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЖЕЛЕЗА ГЕМОПРОТЕИНОВ Благодаря большому разнообразию и высокому содержанию в организме хозяина гемосодержащих белков они потенциально являются ценным источником железа для микроорганизмов. Внутриклеточные возбудители могут использовать гем непосредственно внутри клетки, тогда как внеклеточные возбудители могут усваивать гем только после его освобождения из клетки [Wandersman, Stojiljkovic, 2000]. Освобождение гема, как правило, происходит при повреждении тканей, часто инициируемом микроорганизмами с помощью специализированной стратегии – синтеза гемолизинов (цитолизинов). Гемолизины – молекулы с мембраноповреждающим эффектом. Гемолизины лизируют эритроциты, однако данное определение нельзя понимать буквально, так как цитотоксичность гемолизинов не ограничивается лизисом 32

эритроцитов, распространяясь на другие типы клеток, а эритроциты лишь удобная модель для изучения цитолитического эффекта. По характеру действия выделяют три типа гемолизинов – порообразующие, поверхностно-активные, ферментативные [Welch, 1991]. По своей природе гемолизины являются цитотоксическими белками, основной мишенью которых являются цитоплазматические мембраны клеток. К порообразующим гемолизинам относят бактериальные токсины, которые формируют посредством вставки в цитоплазматическую мембрану хозяина функционирующие трансмембранные поры (каналы), приводящие клетку к лизису [Tablot et al., 1991]. Такие гемолизины классифицируют по типу пороформирующей структуры в плоскости клеточной мембраны на α- и β-пороформирующие [Андреева-Ковалевская и др., 2008]. Гемолизины α-пороформирующие встраиваются в мембраны клеток с помощью своего гидрофобного домена, в результате образуется пора. Такие токсины продуцируют многие грамположительные и грамотрицательные бактерии – E. coli, Bordetella spp., Proteus spp., Actinobacillus spp., Pasteurella hemolytica, Morganella morganii и др. Данный тип гемолизинов часто называют RTX-семейством (от англ. repeats in toxin) из-за наличия в их молекулах большого количества нанопептидных тандемных повторов Gly-Asp [Melton-Celsa, 1996]. Данные гемолизины секретируются в виде мономера, имеют молекулярную массу 65–160 кДа, являются кальцийзависимыми. Связывание кальция осуществляется с помощью С-домена, содержащего His-859. Комплексообразование с кальцием является необходимым условием для конформационных изменений молекулы гемолизина и формирования поры в мембране клетки [Cortajarena et al., 2002]. Рецептором для RTX-гемолизинов 33

является гликофорин мембраны эритроцитов. Гемолизин связывается с рецептором с помощью С-концевого домена [Cortajarena et al., 2003]. При достаточно высокой концентрации гемолизина он может привести к образованию поры без участия рецептора. RTX-гемолизины не имеют в своем составе аминокислотной последовательности, соответствующей сигнальному пептиду, поэтому для их секреции существуют специальные белки [Welch, 1991]. Гемолизины β-пороформирующие встраиваются в  мембраны с помощью своих β-складчатых доменов, а  амфипатические шпильки образуют мембраносвязанную структуру типа бочки (β-бочка). Механизм действия хорошо изучен на примере α-токсина S. aureus, рассматриваемого как прототип олигомеризующегося пороформирующего цитотоксина [DeRycke et al., 1990]. α-Токсин синтезируется как прекурсорная молекула из 319 аминокислот, содержащая N-концевую последовательность из 26 аминокислот. Секретируемый бактерией «зрелый» токсин (протомер) является гидрофильной молекулой с молекулярной массой 33 кДa, утратившей цистеиновые остатки [Wick, Iglewski, 1990]. Протомер «узнает» клетку-мишень по высокоаффинным рецепторам или неспецифически адсорбируется на участках цитоплазматической мембраны, содержащих фосфатидилхолин или холестерин. На мембране семь протомеров собираются в  пору, формируя грибоподобный гептамер (232 кДа), включающий три различных домена [Nair, Takeda, 1998]. Шляпка и ободочная область гептамера α-токсина располагаются на поверхности цитоплазматической мембраны, в то время как ножка (β-бочка) служит трансмембранным каналом (рис. 1.5.1). Образовавшаяся пора позволяет маленьким молекулам и ионам двухстороннее движение, что в конечном итоге приводит клетку к вздутию и гибели от осмотического шока [Wandersman, 34

Stojiljkovic, 2000]. Токсин-α действует цитолитически в отношении различных типов клеток. При образовании пор запускаются вторичные процессы, которые также могут обусловливать развитие патологических последствий. Эти процессы включают активацию эндонуклеаз, увеличение экзоцитоза тромбоцитов, высвобождение цитокинов и медиаторов воспаления, выделение эйкозаноидов. На примере нескольких экспериментальных моделей на животных показано, что α-токсин является фактором вирулентности S. aureus [Bhakdi S., Tranum-Jensen, 1991; Bhakdi et al., 1996], однако его точная роль в развитии стафилококковых заболеваний у человека остается неясной.

Рис. 1.5.1. Механизм действия пороформирующих гемолизинов на примере α-гемолизина S. aureus [Андреева-Ковалевская и др., 2008].

Примечание. Водорастворимый мономер (α1) связывается с мембраной через краевой домен (α1*), что сопровождается формированием пре-поры (α7*), и в конечном итоге образуется гептамерная пора (α7).

Помимо α-гемолизина S. aureus к β-пороформирую­ щим гемолизинам относят листериолизин О  Listeria 35

monocytogenes, стрептолизин О  Streptococcus pyogenes, пневмолизин S. pneumoniae, перфринголизин Clostridium perfringens и многие другие [Андреева-Ковалевская и др., 2008]. Внутри группы β-пороформирующие токсины можно классифицировать по субстратам мембраны клетки, необходимым для связывания токсина. Выделяют холестерин- (L. monocytogenes) и тиолзависимые (Klebsiella spp.) гемолизины. Холестеринзависимые гемолизины формируют крупные поры с внутренним диаметром 30–50 нм. Это достаточно крупные поры, через которые могут проходить не только отдельные ионы, но и белки, потеря которых ведет к осмотическому лизису эритроцита. Тиолзависимые гемолизины содержат в своем составе несколько остатков цистеина. SH-группы цистеина необходимы для связывания гемолизина с мембраной эритроцита. SH-блокаторы подавляют цитолитическую активность таких токсинов [Андреева-Ковалевская и др., 2008]. Гемолитическая активность таких токсинов проявляется в присутствии тиолов, например, β-меркаптоэтанола. К поверхностно-активным гемолизинам относятся вещества, продуцируемые микроорганизмами, способные встраиваться и дезинтегрировать мембрану клетки. Данный тип гемолизинов является веществами-детергентами, не имеющими избирательного механизма действия. К ферментативным гемолизинам относятся ферменты, которые повреждают фосфолипидный бислой цитоплазматической мембраны клеток хозяина. Субстратом при этом часто служит фосфолипид лецитин (фосфатидилхолин). Такие ферменты называют лецитиназами или фосфолипазами С. Данные гемолитические субстанции нельзя относить к токсинам, так как их литический эффект на мембраны клеток является лишь частным случаем проявления их фермен36

тативной активности. К этой группе можно отнести большую часть ферментов агрессии и инвазии – коллагеназу, гиалуронидазу, нейраминидазу и др. [Lottenberg et al., 1994; Harrington, 1996; Songer, 1997]. Цитолитическая активность патогенных микроорганизмов ведет к формированию пор или просто разрушению мембран клеток. Электролиты и другие низкомолекулярные вещества покидают клетку через пору, сформированную токсином, происходит нарушение клеточного гомеостаза. В  соответствии с мембранным равновесием Доннона по градиенту концентрации в клетку начнет активно поступать вода, в результате возникает осмотический шок и клетка разрушается. Эволюционные особенности гемолизинов тесно связаны с проблемой выживания микроорганизмов. С  одним или двумя гемолизинами микроорганизм имеет очевидное преимущество в адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Синтез гемолизинов в организме хозяина ведет к освобождению внутриклеточных веществ, которые необходимы патогену как питательный субстрат или фактор роста. Гемолизины обеспечивают бактериям дополнительный источник железа в виде гемоглобина из разрушенных эритроцитов. Поэтому синтез гемолизинов является одной из стратегий получения железа патогенами в организме хозяина. Как правило, цитотоксины синтезируются в ответ на определенный сигнал, конститутивный синтез цитолитических молекул требует больших энергетических затрат и может быть опасным для самого продуцента. Это означает, что синтез и деградация гемолизинов должны находиться под жестким контролем. Известно, что системы поглощения железа индуцибельны, их компоненты не синтезируются бактериями, растущими в питательной среде с высоким содержанием железа, очевидно, что недостаток железа должен 37

стимулировать экспрессию гемолизинов. На Vibrio cholerae показано, что при недостаточном содержании железа в культуральной жидкости увеличивается концентрация гемолизина и вибриобактина [Patel, 1999]. Аналогичные результаты получены на токсигенных и нетоксигенных штаммах V. cholerae eltor ctx+ и ctx- [Меньшикова и др., 2004]. Известно, что экспрессия многих факторов патогенности, в том числе и гемолизинов, менингококками, гонококками и клостридиями стимулируется добавлением железа в питательную среду [Баснакьян, 2003]. Из представленных данных очевидно, что экскреция гемолизинов микроорганизмами железозависима, может стимулироваться и ингибироваться в зависимости от концентрации железа в питательной среде и природы микроорганизма. 1.5.1. Поглощение гема и гемопротеинов Благодаря большому разнообразию и высокому содержанию в организме хозяина гемосодержащих белков они потенциально являются ценным источником железа для микроорганизмов. Внутриклеточные возбудители могут использовать гем непосредственно внутри клетки, тогда как внеклеточные возбудители могут усваивать гем только после его освобождения из клетки [Wandersman, Stojiljkovic, 2000]. Освобождение гема, как правило, происходит при повреждении тканей, часто инициируемом микроорганизмами. Благодаря своей гидрофобности гем может фиксироваться в липидном бислое мембран клеток и реагировать с Н2О2, образуя гидроксильные радикалы, которые приводят к повреждению тканей [Sadrzadeh et al., 1984]. Для обеспечения сохранности в организме имеются механизмы удаления внеклеточного гема с помощью гликопротеинов (гаптоглобина, гемопексина) и липопротеинов [Camejo et al., 1998; Evans et al., 1999]. 38

Гем – железосодержащее соединение из группы порфиринов. Состоит из четырех ядер пиррола, составляющих порфириновое кольцо (порфирины), в центре которого находится атом двухвалентного железа. Структура гемов различна, у млекопитающих гем существует в форме β-гема, это плоская молекула, состоящая из четырех гетероциклических колец (протопорфирин IX) с четырьмя центральными атомами азота, координирующими один атом Fe2+ с помощью двух ковалентных и двух координационных связей (рис. 1.5.2). Координационное число атома железа в геме равно 4, поэтому он может образовывать еще две координационные связи, дополняя свое окружение до октаэдрического путем взаимодействия с различными лигандами, например, молекулой кислорода, воды и др. CH3

CH CH2 H3C

N

CH3

CH CH2 CH CH2

N

H3C

CH CH2

N

N Fe2+

H 3C

N

N H3C

CH3 CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

COOH

N

N CH3

CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

COOH

а б Рис. 1.5.2. Структура протопорфирина IX (а) и гема (б). Формально для обозначения ионов железа, связанных в комплекс с протопорфирином IX, используют термины гем и гемин. Термин гем указывает на валентность закомплексованных с протопорфирином IX ионов железа: Fe+3 – гемин, Fe+2 – гем. Несмотря на эти различия, термины гем и гемин часто используются как эквивалентные. 39

Рис. 1.5.3. Механизмы поглощения гема микроорганизмами [Lewis et al., 1999]. Примечание. НМ – наружная мембрана; ПП – периплазматическое пространство; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана.

Чтобы использовать гем, связанный с белками хозяина, микроорганизмы имеют специализированные системы захвата и транспорта. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий является барьером для транспорта субстратов с молекулярной массой более 600 Да [Braun, Killmann, 1999]. Гем имеет молекулярную массу чуть больше, чем 600 Да, так как в растворе находится в виде смеси мономеров и димеров, поэтому димеризация гема в растворе делает невозможным его транспортировку через пориновые каналы наружной мембраны. Поглощение гема и гемопротеинов у бактерий чаще всего осуществляется с помощью рецепторов наружной мембраны клеточной стенки. После связывания гема или гемопротеинов хозяина со специфическими рецепторами гем транспортируется в клетку, для 40

осуществления транспорта необходима энергия. Энергия для транспорта гема через наружную мембрану обеспечивается белком TonВ, сопряженным с белками ExbB и ExbD [Braun, 1995]. Транспортировка гема в цитоплазму осуществляется с помощью пермеазного транспортера АВС-типа (рис. 1.5.3). В аминокислотной последовательности всех известных рецепторов гема и гемопротеинов имеется существенное сходство с рецепторами для сидерофоров, что предполагает наличие общих механизмов действия этих белков. Гем прочно связан с белками-переносчиками и пока неясно, каким образом рецепторные молекулы извлекают гем из белков-переносчиков и гемофоров. Большинство рецепторов, специализирующихся на поглощении гема и гемопротеинов, идентифицированы, определены константы связывания гема. Для V. cholerae генетическими и биохимическими методами показана роль белка наружной мембраны HutA как обязательного компонента системы поглощения гема [Occhino et al., 1998]. HutA функционирует вместе с белками, кодируемыми локусом hutBCD для транспортировки гема. НutBCD является частью оперона, который включает в себя гены tonB1, exbВ1, exbD1, необходимые для обеспечения энергией транспорта гема в клетку. Среди других рецепторов гема можно выделить HmbR Neisseria spp., HgbA Haemophillus spp. и др. Возможность использования комплекса гем-гемопексин в качестве источника железа известна только для Haemophillus spp. и осуществляется с помощью рецептора HxuA [Cope et al., 1998]. Рецепторы к гемоглобину широко распространены у микроорганизмов, только у N. meningitidis идентифицированы два гемоглобиновых рецептора – HmbR и HpuB, предполагается, что HpuB связывает комплекс гемогло41

бин-гаптоглобин через гаптоглобин, роль hmbR в использовании гемоглобина подтверждена генетическим анализом [Stojiljkovic et al., 1996; Lewis et al., 1998]. N. gonorrhoeae связывает гем через HpuB/HpuA системы, транспортировка гема у нейссерий происходит без участия HmbR и HpuB/ HpuA, однако специфические рецепторы гема не идентифицированы до сих пор [Chen et al., 1998]. У H. influenzae и H. ducreyi идентифицированы три типа рецепторов HgpA, HgpB, HgpC, наличие любого из этих трех рецепторов обеспечивает рост гемофиллов на питательной среде с  комплексом гемоглобин-гаптоглобин в качестве единственного источника гема [Elkins et al., 1995; Morton et al., 1999]. Некоторые грамотрицательные бактерии производят внеклеточные гемин-/гемоглобин-/гемопексин-связывающие белки, которые захватывают и транспортируют гем через специфические рецепторы наружной мембраны (рис. 1.5.3). Эти секретируемые белки называют гемофорами, они функционируют путем извлечения гема из гемоглобина или гемопексина. Гемофор-опосредованная система транспорта гема осуществляется мембранными белками. Лучше всего гемофорная система транспортировки гема изучена у Scerratia marcescens, которая секретирует гемофор HasA и имеет к нему рецептор HasR в наружной мембране [Létoffé et al., 1998]. Ген, кодирующий внеклеточный аналогичный гемин-связывающий белок (HasAp), имеется у P. aeruginosa и P. fluorescence. HasA связывает одну молекулу гема с высоким сродством, в результате происходит изменение конформации НasA [Létoffé et al., 1999, 2000]. В лабораторных условиях гем, связанный с альбумином, является хорошим источником гема для бактерий. Альбумин-специфические рецепторы бактерий не идентифицированы. Предполагается, что комплекс гем-альбумин узнается гемоглобиновыми рецепторами, через которые 42

и осуществляется транспорт гема в клетку [Wandersman, Stojiljkovic, 2000]. Дополнительным механизмом приобретения гема из гемопротеинов являются внеклеточные протеазы – гемоглобиназы, которые ослабляют связь гема с белками организма хозяина (рис. 1.5.3). Биохимические и генетические исследования подтвердили, что Porphyromonas gingivalis имеет лизин-цистеиновые протеиназы, которые могут как связывать, так и разрушать гемоглобин, а также гемопексин, гаптоглобин, Tf сыворотки крови человека [DeCarlo et al., 1999]. E. coli EB1 имеет гемин-связывающий белок HBP (от англ. haemoglobin binding protein), который также может разрушать гемоглобин. НВР разрушает ≈300 пмоль гемоглобина за 4 ч [Otto et al., 1998]. Тем не менее, патогенетическая роль гемоглобиназ неизвестна, так как в сыворотке крови присутствует множество ингибиторов протеаз. Среди грамположительных бактерий системы узнавания гемопротеинов и поглощения гема описаны у Bordetella pertussis и B. brochiseptica. Транспорт гема охарактеризован у Corynebacterium diphtheriae [Hirotsu et al., 2004]. Внеклеточный гем у этих бактерий связывается с внешним доменом липопротеина, закрепленного в цитоплазматической мембране, и затем с помощью АВС-транспортера переносится в цитоплазму, где железо высвобождается из комплекса под действием гемоксигеназы [Ермилова, 2007]. Несмотря на разнообразие путей усвоения гема, после доставки в цитоплазму происходит его деградация гемоксигеназами до биливердина, монооксида углерода и железа (рис. 1.5.4). Гемоксигеназы обнаружены у разных организмов. Три изоформы гемоксигеназ зарегистрированы у млекопитающих, но только две, гемоксигеназа-1 (HO-1) и гемоксигеназа-2 (HO-2), играют важную роль в катаболизме гема [Colas, Ortiz de Montellano, 2003]. Обнаружены несколько ва43

роль в системе защиты против окислительного стресса и внутриклеточном сигналинге [Ермилова, 2007].

риантов бактериальных гемоксигеназ: HemO, HmuO, IsdG/I, Микроорганизмы имеют большой спектр возможностей использования BphO, PigA [Zhu et al., 2000]. Большинство из этих гемокгема из гемопротеинов хозяина. усвоения гема микроорганизсигеназ бактерий организма превращают гемДля в α-биливердин, железо, мымонооксид должны сначала его освободить из гемоглобина. Этот процесс, скорее углерода. PigA из Pseudomonas spp. отличается тем,осуществляется что превращает гем в γ-биливердин, а не α-биливердин всего, специализированными протеазами. Однако роль этих [Wegele et al., 2004]. Как бактерии гемоглобина используютв этом биливердин протеаз, а также структурные превращения процессе не и монооксид углерода, пока неясно; у эукариот эти молекупоказаны. Развитие специализированных систем усвоения гема, полы играют важную роль в системе защиты против окисливидимому, тесно связано с конкретными потребностями в питании возбудительного стресса и внутриклеточном сигналинге [Ермилова, телей, а также их экологической нишей. 2007]. H2C

CH3

CH3

CH2

H3C

N

N

CH2

H3C

N

N

NADPH, O2

Fe

N

CH3

O

N CH3

H3C

OH

O

N Fe

N

H3C

HO

OH

H2C

HO

гемин

O

O

αа-мезо-гидроксигемин O2

H2C

CH3

H2C

OO H3C

NH

N

CH2 NH

NH

O

O

CH3

O H3C

N

CH2 N

Fe N

Fe (II)

CH3

CO +

NADPH, O2

H3C

HO

OH

N CH3

H3C

OH

HO

O

биливердин

O

OH

вердогемин

Рис.Схема 1.5.4.деградации Схема деградации гемина гемоксигеназами Рис. 1.5.4. гемина гемоксигеназами [Donghak et al., 2006]. [Donghak et al., 2006]. 39

44

Микроорганизмы имеют большой спектр возможностей использования гема из гемопротеинов организма хозяина. Для усвоения гема микроорганизмы должны сначала его освободить из гемоглобина. Этот процесс, скорее всего, осуществляется специализированными протеазами. Однако роль этих протеаз, а также структурные превращения гемоглобина в этом процессе не показаны. Развитие специализированных систем усвоения гема, по-видимому, тесно связано с конкретными потребностями в питании возбудителей, а также их экологической нишей. 1.6. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ГОМЕОСТАЗА ЖЕЛЕЗА У МИКРООРГАНИЗМОВ Исследования широкого спектра патогенных бактерий свидетельствуют о том, что экспрессия целого ряда генов, отвечающих за вирулентность и персистенцию, регулируется ионами железа. Снижение концентрации железа в окружающей среде является главным сигналом для экспрессии генов, контролирующих активность стратегии получения железа. Экспрессия этих генов имеет большое значение для выживания патогена в организме хозяина. На транскрипционном уровне регуляцию гомеостаза железа в бактериальной клетке опосредуют белки семейства FUR (от англ. ferric uptake repressors) или DTXR (от англ. diphtheria toxin regulator) [Hantke, 2001]. Белки Fur встречаются у прокариот повсеместно. Известно 10 000 последовательностей, принадлежащих 4 091 виду различных бактерий и архей [Fillat, 2014]. Fur является глобальным регулятором гомеостаза железа у многих грамотрицательных бактерий (Enterobacteriaceae) и грамположительных бактерий с низким содержанием GC (Bacillus spp.). Впервые ключевая роль Fur-белка в гомеостазе железа предложена для S. typhimurium [Ernst et al., 1978], а механизм описан на 45

примере E. coli [Hantke, 1981]. DtxR выполняет аналогичную роль, но у грамположительных бактерий с высоким содержанием GC (Corynebacterium spp., Mycobacterium spp.). Обычно у бактерий Fur-белок регулирует только гомеостаз железа, а Dtx-подобные белки могут регулировать транспорт ионов марганца. Несмотря на отсутствие очевидного сходства по аминокислотным последовательностям, структурные характеристики металлсвязывающих доменов данных белков очень похожи [Pohl et al., 1999; 2003]. Количество известных Fur-регулируемых генов только у E. coli превышает 90, большую часть из которых составляют гены, ответственные за транспорт ионов железа с помощью сидерофоров и гема. Около 13 генов кодируют такие факторы вирулентности, как гемолизин, колицины, шига-подобные токсины [Козырев, Васинова, 2004]. Ионы Fe2+ выполняют функцию корепрессора, они связываются со своим сайтом в белке Fur, после чего происходит его димеризация и он приобретает способность связываться с Fur-боксами ДНК [Pecqueur et al., 2006]. Сайт связывания Fe2+ состоит из пяти аминокислотных остатков (два остатка His, два остатка Asp, один остаток Glu) и одной молекулы воды, что свидетельствует об октаэдрическом расположении лигандов. Fur-боксы первоначально обнаружены у Е. coli в промоторной области аэробактина и в промоторной области гена fur, кодирующего Fur-репрессор [Bagg, Neilands, 1987; De Lorenzo et al., 1987, 1988]. Присоединение комплекса Fur-Fe2+ к Fur-боксам ДНК блокирует транскрипцию генов в средах, богатых железом. В железодефицитных средах апо-Fur не может связаться с ДНК, в результате чего происходит транскрипция генов одной или нескольких стратегий добывания железа. Не все гены, экспрессия которых зависит от белка Fur, индуцируются при недостатке железа. На E. coli показано, что гены acnA, fumA, fumB, sodB, bfr, 46

ftnA, кодирующие железосодержащие ферменты (аконитаза, фумараза, каталаза, супероксиддисмутаза и др.), наоборот индуцируются железом. Анализ последовательностей генов показал отсутствие у них специфического Fur-бокса, что может свидетельствовать о косвенной регуляции этих генов белком Fur [Andrews, 1998; Ермилова, 2007]. Помимо глобальной системы регуляции гомеостаза железа, обусловленной Fur-белком, у бактерий существуют транскрипционные регуляторные системы более низкой иерархии, участвующие в регуляции использования сидерофоров. Данные системы функционируют путем прямого или косвенного зондирования наличия вне- или внутриклеточного комплекса сидерофор-Fe3+, обеспечивая дополнительный уровень контроля регуляции синтеза и транспорта сидерофоров. Эти регуляторы можно сгруппировать в отдельные классы – альтернативные σ-факторы, двухкомпонентные сенсорные системы трансдукции, регуляторы AraC-типа и  другие типы транскрипционных регуляторов. Наиболее изученными являются альтернативные σ-факторы. Альтернативные σ-факторы являются представителями внецитоплазматических σ-факторов из семейства ECF (от англ. extracytoplasmic factors). FecI E. coli регулирует гены транспортной системы fecABCDE путем зондирования комплекса Fe3+-дицитрат в окружающей среде через рецептор наружной мембраны FecA. Передача сигнала осуществляется через цепь белок-белковых взаимодействий. Сначала FecA связывается с цитратом, претерпевает конформационные превращения и передает сигнал через свой N-терминальный периплазматический домен на трансмембранный белок-регулятор FecR. FecR также претерпевает конформационные изменения и взаимодействует через свой N-концевой домен с σ-фактором FecI. FecI в составе РНК-полимеразы связывается с промоторами транспорт47

ных генов, кодирующих синтез соответствующего АВСтранспортера и FecA [Enz et al., 2000]. Еще одним примером регуляции синтеза и транспорта сидерофоров, контролируемых альтернативными σ-факторами, является транспортная система для пиовердина P. aeruginosa. При дефиците железа в среде P. aeruginosa сначала синтезирует σ-фактор PvdS, который стимулирует синтез пиовердина, а после связывания комплекса Fe3+-пиовердин с рецептором FpvA начинается синтез второго σ-фактора FpvI [Ермилова, 2007]. Бактерии, как правило, имеют одновременно несколько систем транспорта железа. Временное разделение синтеза σ-факторов, контролирующих синтез и деятельность этих систем, позволяет бактериальной клетке экономить свои ресурсы, так как происходит «включение» только тех генов, которые необходимы им в данных условиях. Двухкомпонентная сенсорная система трансдукции PfeR-PfeS, необходимая для использования гетерологичных сидерофоров, обнаружена у P. aeruginosa. PfeR-PfeS индуцирует транскрипцию генов pfeA, кодирующих синтез рецептора для комплекса Fe3+-энтеробактин [Dean et al., 1996]. AraC-подобный транскрипционный регулятор представлен протеинами АraC-типа c ДНК-связывающими и  субстрат-связывающими доменами, последние взаимодействуют с комплексом сидерофор-Fe3+, выступающим в качестве корегулятора [Miethke, Marahiel, 2007]. *** Эволюционно микроорганизмы, существующие в условиях дефицита железа, выработали разнообразные способы его получения. Совокупность всех способов получения железа позволяет микроорганизмам реализовать свою стратегию добывания железа. Молекулярные механизмы этих способов хорошо изучены, выявлены системы их генети48

ческого контроля. Железо играет важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Системы поглощения железа индуцибельны, их компоненты не синтезируются бактериями, растущими в среде с высоким содержанием железа, недостаток железа активирует стратегию его добывания. Несмотря на важность железа для микроорганизмов, до сих пор не проведена оценка роли микробной стратегии добывания железа в формировании микробных ассоциаций и межмикробных взаимодействиях. Логично предположить, что микроорганизмы могут объединяться в микробные ассоциации для удовлетворения своих потребностей в железе. В этом случае микробные способы получения железа можно рассматривать как один из системообразующих факторов, определяющих формирование и устойчивость микробных ассоциаций, играющих важную роль в функционировании нормомикробиоценозов и патологических микробиоценозов организма хозяина. Вызывает интерес изучение межмикробных взаимодействий с позиции взаимодействия системы QS (от англ. quorum sensing – чувство кворума) и микробного гомеостаза железа. QS представляет собой механизм «общения» микроорганизмов посредством диффузии низкомолекулярных веществ-индукторов QS [Fuqua et al., 1994; Fuqua, Greenberg, 2002]. Железо, как и индукторы системы QS, регулирует вирулентность бактерий, поэтому очевидно существование связи между этими системами. На данный момент расшифрована структура многих индукторов системы QS, они представляют собой гомосеринлактоны, индол, производные хинолина и др. [Шпаков, 2009 а,  б]. Одним из синтезируемых микроорганизмами индукторов QS являются мембранотропные алкилоксибензолы (АОБ), образующие специфическую систему ауторегуляции роста и развития микроорганизмов. Данная система однотипна по 49

мосеринлактоны, индол, производные хинолина и др. [Шпаков, 2009 а, б]. Одним из синтезируемых микроорганизмами индукторов QS являются мембранотропные алкилоксибензолы (АОБ), образующие специфическую систе-

характеру действия для микроорганизмов различных му ауторегуляции роста и развития микроорганизмов. Данная система таксоодно-

номических групп [Эль-Регистан, 2005]. АОБ присутствуют в культурах микроорганизмов в виде смесей изомеров ских групп [Эль-Регистан, 2005]. АОБ присутствуют в культурах микрооргаи гомологов, различающихся положением заместителей в низмов в виде смесей изомеров и гомологов, различающихся положением ароматическом кольце и длиной алкильного радикала. Назаместителей в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала. Накапкапливаясь в развивающихся культурах микроорганизмов ливаясь развивающихся культурах микроорганизмов до порогового уровня, в до впорогового уровня, АОБ вызывают переход культуры роста, а при дальнейшем АОБстационарную вызывают переходфазу культуры в стационарную фазу, а при повышении дальнейшем концентрации – образование покоящихся форм,устойчивых устойчивых повышении концентрации – образование покоящихся форм, к к повреждающим воздействиям [Колпаков и др., 2000; Эльповреждающим воздействиям [Колпаков и др., 2000; Эль-Регистан, 2005]. Регистан, 2005]. Еще одной важной функцией АОБ являетЕще одной важной функцией АОБ является их действие как антиоксидантов. ся их действие как антиоксидантов. За счет способности к За счет способности к многостадийному окислению алкилоксибензолы многостадийному окислению алкилоксибензолы функцифункционируют ловушек активных форм кислорода онируют вв качестве качестве «ловушек» активных форм[Вострокнукислорода това [Вострокнутова и др., 1983; Kozubek,иTuman, 1999]. Kozubek, Tuman, 1999]. др., 1983; типна по характеру действия для микроорганизмов различных таксономиче-

OH

OH

HO

OH

HO

HO

HO

O

CH CH2 NH2

(CH2)n CH3

HO CH (CH2)n

HO

N O N

N

H N

O

O

H3C CH CH3

HO

OH

OH

O

NH

HO HO

Норадреналин Норадреналин

Факторы d1 Факторы

Вибриобактин d1 Вибриобактин Рис. 1.6.1.Рис. Химическая норадреналина, факторов d1 P. carboxydo1.6.1. структура Химическая структура норадреналина, факторов d P. cereus, carboxydoflava B. cereus, сидерофора flava и Bacillus сидерофора икатехолатного типа 1 катехолатного типа (вибриобактин V. cholerae). (вибриобактин V. cholerae). Интерес к мембранотропным ауторегуляторам в аспекте стратегий поИнтерес к мембранотропным ауторегуляторам в аспек-

те микробной стратегии получения железа обусловлен лучения железа обусловлен их химической структурой. Норадреналин и ад-их

химической структурой. и адреналин стиреналин стимулируют рост KlebsiellaНорадреналин pneumoniae, P. aeruginosa, Enterobacter

мулируют рост K. pneumoniae, P. aeruginosa, Enterobacter 44 cloacae, Shigella sonnei, S. aureus без и в присутствии трансферрина in vitro [O’Donnel et al., 2006; Леонов и др., 2014]. 50

Ростостимулирующий эффект зависит от дозы инокулюма и объясняется структурным сходством норадреналина с сидерофорами катехолатного типа (рис. 1.6.1). Норадреналин способствует перераспределению железа между молекулами Tf, в результате чего доступность железа для энтеробактина E. coli повышается [Freestone et al., 2003]. Учитывая универсальность системы регуляции с участием АОБ у микроорганизмов, а также их функции как адаптогенов, представляет интерес исследование влияния АОБ на микробную стратегию получения железа. Возможно, что АОБ путем взаимодействия с железосвязывающими белками будут изменять их конфирмацию и облегчать сидерофор-опосредованный отбор железа. Полученные результаты могут иметь значение для понимания механизмов межмикробных взаимоотношений с участием ауторегуляторов и связи системы QS с микробным гомеостазом железа.

51

Глава2 СТРАТЕГИЯ ДОБЫВАНИЯ ЖЕЛЕЗА В РЕГУЛЯЦИИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ В данной главе мы покажем способы добывания железа отдельными группами микроорганизмов и их роль в регуляции межмикробных взаимодействий, складывающихся при формировании естественных и патологических микробиоценозов организма человека. Интерес к условно-патогенным микроорганизмам объясняется тем, что для проявления своих патогенных свойств они нуждаются в определенных условиях окружающей среды и часто объединяются в ассоциации. Накопившиеся к настоящему моменту данные свидетельствуют, что одним из таких условий является эволюционно выработанная организмом хозяина стратегия ограничения представителей авто- и аллохтонной микробиоты в способности добывать железо, необходимое для экспрессии вирулентных свойств. Поэтому в норме хозяин сосуществует со своей индигенной микробиотой в условиях дефицита железа и лишение потенциальных патогенов возможности в удовлетворении своих потребностей в железе можно рассматривать как важный механизм колонизационной резистентности. Известно, что люди, страдающие нарушениями со стороны гомеостаза железа, склонны к развитию инфекционных заболеваний, вызываемых оппортунистическими патогенами [Козырев, Васинова, 2004; Миронов, Леонов, 2016]. Для понимания механизмов этого явления рассмотрим способы добывания железа приоритетными в инфекционной патологии человека условно-патогенными микроорганизмами – Staphylococcus spp., P. aeruginosa, С. albicans, а также влияние железа на биологические свойства молочнокислых бактерий, как наименее 52

патогенных для человека микроорганизмов, входящих в состав его микробиоценозов. 2.1. ЖЕЛЕЗО И СТАФИЛОКОККИ Стафилококки – условно-патогенные представители нормальной микробиоты организма человека, могут представлять серьезную угрозу как возбудители оппортунистических инфекций человека и животных. Инфекции могут варьировать от локализованных (например, карбункулы) до тяжелых генерализованных (например, сепсис, септикопиемия, эндокардит, остеомиелит). Разнообразность и тяжесть стафилококковых инфекций связана как с многообразием факторов патогенности: поверхностные белки, которые связываются с тканями организма хозяина (например, фибронектином и коллагеном), экзотоксины (например, токсин синдрома токсического шока и гемолизины), так и  с иммунным статусом индивидуума [Миронов, Воробьев, 2000; Миронов и др., 2011]. Наибольшую опасность в неинфекционной клинике из-за широкого арсенала факторов патогенности и распространения штаммов с  множественной антибиотикорезистентностью, в том числе к  метициллину, представляет S. aureus. Метаболически стафилококки реагируют на лимит железа в питательной среде стимуляцией гликолиза и снижением интенсивности цикла трикарбоновых кислот, крайнее уменьшение концентрации железа в питательной среде ведет к инактивации цепи переноса электронов. Цикл трикарбоновых кислот функционирует благодаря множеству ферментов, которые используют железо в качестве кофактора [Somerville et al., 2002]. Гликолиз генерирует АТР независимым от дыхания путем и ведет к накоплению пирувата и лактата. Лактат способствует закислению окружающей среды, что может способствовать освобождению железа 53

из Tf и Lf [Friedman et al., 2006]. Многие факторы патогенности стафилококков находятся под контролем Fur-белка. Комплекс Fur-Fe2+ координирует метаболизм железа у стафилококков, подавляя синтез гемолизинов и других цитотоксинов. С другой стороны, Fur-Fe2+ положительно влияет на модулины, такие как суперантигены, протеин А, ингибиторы хемотаксиса и комплемента. Fur-мутанты S. aureus менее опасны для мышей в эксперименте с пневмонийной инфекцией [Torres et al., 2010]. инфекцией [Torres et al., 2010]. Ранее считалось, что в железодефицитных средах S. aureusсредах продуцирует Ранее считалось, что в железодефицитных aureus продуцирует четыре стафилоферчетыреS.  сидерофора: стафилоферрин A (479сидерофора: Дa) [Konetschny-Rapp et al., 1990], рин A (479 Дa) [Konetschny-Rapp et al., 1990], стафилоферстафилоферрин В (449 Да) [Haag et al., 1994], ауреохелин (577 Да) [Dale et al., рин В (449 Да) [Haag et al., 1994], ауреохелин (577 Да) [Dale 2004], стафилобактин (822 Да) [Courcol al., 1997]. Способность к синтезу et al., 2004], стафилобактин (822et Да) [Courcol et al., 1997]. к синтезу первых трех сидерофоров показана из разпервыхСпособность трех сидерофоров показана на большом количестве штаммов на большом количестве штаммов из различных коллекций, личных коллекций, но без использования молекулярно-генетических метоно без использования молекулярно-генетических методов. дов. Современные исследования позволили выявить только два возможных Современные исследования позволили выявить только два возможных NIS-пути sfa и sbn) и один NIS-пути (локусы sfa и sbn) и (локусы один NRPS-путь (гены aus),NRPS-путь закодированные в (ген aus), закодированные в геноме S. aureus для синтеза сигеномедерофоров. S. aureus для синтеза сидерофоров. O

O

O HO

NH

OH O O

OH O HO

NH

NH

NH

O

O OH

O

NH

OH NH2

O OH



OH

HO

O

OH OH

O

O

O

Стафилоферрин А Стафилоферрин В Стафилоферрин В Рис. 2.1.1. Сидерофоры стафилококков.

Стафилоферрин А

Рис. 2.1.1. Сидерофоры стафилококков.

Стафилоферрин А (рис. 2.1.1) впервые выделен из супернатантов буль54

онных культур S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков (КОС) [Konetschny-Rapp et al., 1990; Lindsay et al., 1994]. Все секвенированные по-

Стафилоферрин А (рис. 2.1.1) впервые выделен из супернатантов бульонных культур S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков (КОС) [Konetschny-Rapp et al., 1990; Lindsay et al., 1994]. Все секвенированные последовательности геномов стафилококков содержат два локуса sfaABC и sfaD, которые кодируют две NIS синтетазы, hts оперон кодирует липопротеиновый рецептор и пермеазы АВС-транспортера. Биосинтетические пути синтеза стафилоферрина А недавно воспроизведены на рекомбинантных штаммах E. coli, экспрессирующей белки SfaD и SfaB. SfaD конденсирует молекулу цитрата с δ-аминогруппой D-орнитина, присоединение второй молекулы цитрата осуществляется по α-аминогруппе с помощью белка SfaB [Cotton et al., 2009]. Стафилоферрин В впервые выделен и очищен из супернатантов S. hyicus, используемые для синтеза NIS синтетазы включают SbnC, SbnE, SbnF, закодированные в опероне sbnABCDEFGHI, который ранее считался ответственным за синтез стафилобактина, молекулярно-генетический анализ показал, что стафилобактин и стафилоферрин В это одно и то же соединение [Haag et al., 1994]. Подвергается сомнению способность КОС синтезировать стафилоферрин В, поскольку при секвенировании генома большого количества штаммов КОС sbn оперон не обнаружен, а способность S. hyicus синтезировать стафилоферрин В обнаружена по ошибке. Таким образом, способностью к синтезу стафилоферрина В обладает только S. aureus [Dale et al., 2004]. Биосинтез стафилоферрина В (рис. 2.1.2) начинается с конденсации молекул цитрата и L-2,3-диаминопропионовой кислоты (L-Dap) с участием SbnE, в результате образуется цитрат-Dap. SbnH декарбоксилирует остатки L-Dap, образуя цитрат-диаминоэтан, далее SbnF присоединяет вторую молекулу L-Dap на оставшийся свободный прохиральный 55

зал, что стафилобактин и стафилоферрин В это одно и то же соединение [Haag et al., 1994]. Подвергается сомнению способность КОС синтезировать стафилоферрин В, поскольку при секвенировании генома большого количества КОСостатка sbn оперон не обнаружен, а способностьSbnC S. hyicus синтеатомштаммов углерода цитрата. В заключение конден-

зировать В обнаружена по ошибке. Стафилоферрин В синтесирует стафилоферрин α-кетоглутарат с цитрат-диаминоэтаном через сво-

бодную аминогруппу зирует только S. aureus [Dale диаминоэтанола. et al., 2004].

H2N

OH

O

O

+

OH NH2

HO O

HN

SbnE

OH

Mg2+ ATP

O

OH

O

AMP, PPi

H2N

OH

AMP, PPi

NH

O

OH

NH

CO2

O

NH2

O

OH

OH

O

H2N цитрат-диаминоэтан [4] [M-H]- = 233.09

NH2 NH

HO OH

NH

Mg2+ ATP

PLP

[M-H]- = 277.08

OH

OH

O

SbnH

HO

O O

O

O

[M-H]- = 191.03

SbnF

OH

цитрат-L-2,3-диаминопропио новая кислота [3]

лимонная кислота [2] [M-H]- = 103.06

O

OH

SbnC Mg2+ ATP, aKG

O

AMP, PPi

OH

OH

O O

O

O

O

HN OH

H2N

NH

O

L-2,3-диаминопропионил-цитратдиаминоэтан [5]

стафилоферрин В

[M-H]- = 319.13

[M-H]- = 447.14

Рис. 2.1.2. Биосинтез стафилоферрина В [Cheung et al., 2009].

Рис. 2.1.2. Биосинтез стафилоферрина В [Cheung et al., 2009]. Биосинтез стафилоферрина В (рис. 2.1.2) начинается с конденсации мо-

Ауреохелин стафилококков является лекул цитрата и L-2,3-диаминопропионовой кислотынаименее (L-Dap) с изученучастием

ным сидерофором, его структура и пути биосинтеза до сих пор не расшифрованы, по данным ЯМР-спектроскопии он L-Dap, образуя цитрат-диаминоэтан, далее SbnF присоединяет вторую молеотносится к сидерофорам смешанного фенолят-катехолаткулу L-Dap на оставшийся свободный прохиральный атом углерода остатка ного типа [Courcol et al., 1997]. 49 S. aureus может использовать гетерологичные сидерофоры гидроксаматного типа: аэробактин, феррихром, десферриоксамин В. Осуществлено клонирование и охарактеризован локус из трех генов (fhuC, fhuB, fhuG), ответственных за поглощение комплекса Fe3+-гидроксамат [Sebulsky et al., 2000]. Открытие возможности использования десферриоксамина В S. aureus имеет важное прикладное значение, поскольку введение десферриоксамина (торSbnE, в результате образуется цитрат-Dap. SbnH декарбоксилирует остатки

56

говое название Desferal®) в плазму широко используется для лечения расстройств, связанных с перегрузкой организма железом, возникающих при талассемии и гемохроматозах. Поэтому применять Desferal® следует с большой осторожностью, так как это может привести к развитию стафилококкового сепсиса. Вторым распространенным способом получения железа стафилококками – синтез гемолизинов. Стафилококки синтезируют четыре типа β-пороформирующих гемолизинов – α, β, γ, δ. Среди них наиболее патогенетически значимым является α-гемолизин. По природе α-гемолизин стафилококков представляет собой водорастворимый мономерный полипептид [Bhakdi, 1985]. Механизм действия α-гемолизина соответствует β-пороформирующим цитолизинам. [Ратгауз, 1970; Panchal, 1995; Galmiche, 2001]. Графически кривая гемолиза имеет S-образный вид с латентным периодом, предшествующим гемолизу (прелитическая лаг-фаза) и последующим периодом быстрого линейного освобождения гемоглобина [Иванов, Бриль, 1984]. Цитоплазматические мембраны эритроцитов сохраняют целостность, обнаруживаясь при микроскопии в виде «теней» эритроцитов, что составляет важный диагностический признак при определении α-гемолизина [McDevitt, 1994]. Небольшое количество молекул токсина, связываясь с мембранными рецепторами, оказывает влияние на соседние незанятые рецепторные участки, делая их неспособными связывать свободный токсин. В целом α-гемолизин весьма токсичен и малоизбирателен, вызывает лизис эритроцитов как теплокровных, так и холоднокровных животных. Различают несколько видов биологической активности α-гемолизина – летальная, дермонекротическая, цитолитическая [Бургасов, Румянцев, 1985; Красильников, 1985]. 57

Вторым по значимости гемолизином стафилококков является β-гемолизин (сфингомиелиназа С). β-гемолизин обладает ферментативными свойствами, гидролизует мембранный липид фосфатидилинозитол, вызывая полное растворение мембраны эритроцитов. По сравнению с  α-гемолизином, β-гемолизин менее токсичен и обладает замедленным действием; активен в отношении эритроцитов человека, барана, быка, кролика [Дерябин, 2000]. Гемолизин-γ стафилококков состоит из двух компонентов – НγI и НγII, при этом НγI активирует, а НγII повреждает мембрану эритроцитов. Гемолизин-γ неспецифичен относительно эритроцитов и может вызвать лизис лейкоцитов. Наиболее активен γ-гемолизин в отношении эритроцитов человека, обезьян, барана, козы, собаки, кошки, морской свинки, мыши, но не действует на эритроциты лошади, цыпленка, голубя [Bhakdi, Muhly, 1985]. Гемолизин-δ представляет собой липид, который кроме гемолитического проявляет антимикробное действие [Бургасов, Румянцев, 1985]. δ-Гемолизин ведет к образованию в мембране эритроцитов больших пор, через которые происходит утечка не только ионов, но и аминокислот и нуклеотидов. По сравнению со всеми α, β, γ-гемолизинами, δ-гемолизин эволюционно более древний, о чем свидетельствует его полифункциональность и простое строение. Наиболее активен δ-гемолизин в отношении эритроцитов человека, кролика, лошади, крысы, барана, но не эффективен в отношении эритроцитов цыпленка и голубя [Бургасов, Румянцев, 1985]. Помимо β-гемолизина еще одним гемолизином стафилококков с ферментативными свойствами является лецитиназа. Лецитиназа гидролизует фосфодиэфирные связи лецитина, приводя к лизису мембран эукариотических клеток, способствуя развитию геморрагий в тканях, их изъязвле58

нию, некротизации. Активность лецитиназы среди штаммов S. aureus обнаружена у 88% культур [Акатов, Зуева, 1983]. Поглощение гема S. aureus опосредовано через Isd систему клеточной стенки и мембранные белки [Mazmanian et al., 2003]. Распознавание гемопротеинов происходит на наружной поверхности клеточной стенки с помощью рецепторов гемопротеинов (гемоглобина, гаптоглобина-гемоглобина, гемопексина). Это белки – IsdA, IsdB, IsdH, которые распределяются в клеточной стенке с помощью сортазы А [Dryla et al., 2003; Torres et al., 2006]. После взаимодействия гемопротеинов с рецептором происходит высвобождение гема по неизвестному на настоящий момент механизму. Гем переносится через клеточную стенку к цитоплазматической мембране с помощью белков IsdC и IsdA. В цитоплазматической мембране под действием белков-переносчиков IsdE и IsdF, формирующих АВС-транспортер, гем доставляется в цитоплазму. Освобождение железа из гема происходит путем его деградации монооксигеназами IsdG и IsdI до монооксида углерода, биливердина, свободных ионов железа [Skaar et al., 2004]. Значительный вклад Isd системы в вирулентность стафилококков продемонстрирован на животных при экспериментальной инфекции [Torres et al., 2006; Pishchany et al., 2009], что свидетельствует о ее важности для обеспечения S. aureus железом. Экспрессия рецептора IsdB на поверхности клетки резко увеличивается при дефиците железа в окружающей среде, что делает его кандидатом в создании антистафилококковой вакцины. Стафилококки имеют два способа получения железа – синтез сидерофоров и гемолизинов. Вирулентность КОС регулируется наличием в окружающей среде гема/ гемоглобина. В этом случае Isd система получения железа может являться определяющей при формировании патоло59

гических микробных ассоциаций КОС с гемолизирующими микроорганизмами. Появление в окружающей среде гема/ гемоглобина будет способствовать реализации вирулентного потенциала КОС. Отсутствие в окружающей среде гема/ гемоглобина является фактором, сдерживающим вирулентный потенциал КОС в большей степени, чем S. aureus. 2.2. ЖЕЛЕЗО И ПСЕВДОМОНАДЫ Псевдомонады патогенны для широкого круга хозяев, включая растения, насекомых, холодно- и теплокровных животных, человека. Патогенное действие осуществляют через комплекс экзопродуктов – пигментов, ферментов, токсинов. Наибольшую значимость в инфекционной патологии человека имеет P. aeruginosa. Начиная с 1970-х годов P. aeruginosa – один из основных возбудителей местных и генерализованных форм гнойно-воспалительных заболеваний человека. Многофакторная природа патогенности P. aeruginosa обеспечивает этим бактериям неуязвимость практически против любых защитных систем организма хозяина, как естественных (тканевые барьеры, гуморальный и клеточный иммунитет), так и искусственных (иммунопрепараты, антибиотики, дезинфектанты) [Рожавин, 1988; Русанова и др., 2008]. Экспрессия многих факторов патогенности P. aeruginosa регулируется концентрацией железа в окружающей среде [Bjorn et al., 1978; Cox, 1985]. Синтез сидерофоров играет важную роль в вирулентности патогенных видов Pseudomonas, таких как P. aeruginosa [Meyer et al., 1996] и флуоресцентные ризосферные псевдомонады [O’Sullivan, O’Gara, 1992; Lemanceau et al., 1992]. Основная часть исследований по сидерофорам псевдомонад проведена на P. aeruginosa, Р. putida, P. fluorescens, хотя сидерофоры синтезируют практически все представители рода Pseudomonas [Poole, McKay, 2003]. 60

P. aeruginosa синтезирует два сидерофора – пиовердин [Cox, Adams, 1985] и пиохелин [Meyer, Hornsperger, 1978], однако может использовать широкий спектр гетерологичных сидерофоров и их предшественников (рис. 2.2.1) – аэробактин, энтеробактин, псевдобактин других псевдомонад, сидерофоры грибов – копроген и др. [Meyer, 1992], синтетические и природные хелаторы железа (например, нитрилотриуксусная кислота и цитрат) [Cox, 1980; Harding, Royt, 1990]. Многие из флуоресцирующих псевдомонад и Burkholderia cepacia (ранее P. cepacia) синтезируют салициловую кислоту, которая связывает железо и способствует его поглощению [Ankenbauer, Cox, 1988], хотя, будучи предшественником пиохелина, предполагается, что салициловая кислота не предназначена для использования в качестве сидерофорной молекулы [Chipperfield, Ratledge, 2000]. Пиовердины также называют псевдобактинами (у ризосферных псевдомонад), разделяют на группы, для них характерно наличие дигидроксихинолинового хромофора, присоединенного к дикарбоновой кислоте (или ее моноамиду) и пептидной цепи, длина которой варьирует от 6 до 12 аминокислот (рис. 2.2.2). Различие в аминокислотном составе пиовердинов обеспечивает специфичность некоторых ризосферных псевдомонад по отношению к собственному пиовердину [Meyer, 2000]. Пиовердин P. aeruginosa эффективен при добывании железа из Tf [Meyer et al., 1996; Wolz et al., 1994] и Lf [Xiao, Kisaalita, 1997], что имеет первостепенное значение для патогенеза синегнойной инфекции. Мутанты P. aeruginosa, не способные синтезировать пиовердин или транспортировать комплексы пиовердин-Fe3+ в клетку, становятся авирулентны для животных при экспериментальной инфекции [Takase et al., 2000]. Пиовердин проявляет цитотоксическое действие на клетки из-за своей 61

способности стимулировать образование активных форм кислорода [Becerra et al., 2001]. Определены гены, ответственные за синтез пиовердина [Visca et al., 1994; Merriman et al., 1995; Poole, McKay, 2003]. В геноме P. aeruginosa расположен локус pvd, синтез хромофора происходит в другом месте с участием pvcL гена. Считалось, что биосинтез пиовердина протекает по NRPS-пути, однако участие в синтезе хромофорной части пиовердина гена pvdL побуждает пересмотреть этот вопрос [Stintzi et al., 1996, 1999]. Мутации в генах цитохромов негативно влияют на синтез пиовердина [Poole, McKay, 2003]. Пиохелин представляет собой продукт конденсации салицилата и двух остатков цистеина, который связывает ионы Fe3+ в стехиометрическом соотношении 2:1 и обладает довольно низким сродством к железу в водных растворах (Кд ~5·105 М-1) по сравнению с другими сидерофорами [Cox, Graham, 1979]. Несмотря на низкое значение константы диссоциации, пиохелин может эффективно отбирать железо у Tf [Sriyosachati, Cox, 1986]. Это может быть связано с его способностью сильно уменьшать рН окружающей среды, что благоприятно для отбора железа у  Tf и оказывает цитотоксический эффект на ткани организма хозяина. Пиохелин способен связывать и другие катионы переходных металлов – Мо(IV), Ni(II), Со(II) [Visca et al., 1992; Poole, McKay, 2003]. Гены биосинтеза пиохелина выявлены и находятся в двух отдельных оперонах, pchDCBA, участвуют в синтезе салицилата [Serino et al., 1995, 1997] и pchEFGHI [Reimmann et al., 1998, 2001], pchHI считается ответственным за экспорт, а не синтез пиохелина [Ankenbauer, Quan, 1994; Poole, McKay, 2003]. P. aeruginosa вырабатывает минимум два вещества с гемолитической активностью: кислый гликолипид и термолабильную фосфолипазу С. Кислый гликолипид 62

по химическому составу представляет собой два схожих рамнолипида, отличающихся содержанием рамнозы и β-гидроксидекановой кислоты [Liu, 1979; Kozo et al., 1988]. Считается, что димеры β-гидроксидекановой кислоты этих гликолипидов ответственны за гемолитическую активность. Данные гликолипиды устойчивы к нагреванию, по механизму действия относятся к поверхностно-активным гемолизинам. При изучении кинетики гемолиза показано, что лизин необходим для эффективного гемолиза эритроцитов, увеличение его концентрации в питательной среде сокращает ность индукционного периода на кривой гемолиза Boese-Marrazzo, длительность индукционного периода на [Johnson, кривой гемолиза [Johnson, Boese-Marrazzo, 1980]. 1980]. OH CH3 N

CO 2 H

N

S

S

Пиохелин OH

O NH

NH

O

O H

HO HN O

HO NH

HO

H 3C O

HO H 3C

O

NH

NH

H

O NH

NH O H 3C

N H OH

OH O OH O CH 3

O

Пиовердин (группа I) OH

63 O NH

O N NH

NH

O

N

NH NHR

H 3C

NH

O N H OH

O H 3C

CH 3

O

Пиовердин (группа I) OH

O

O N NH

NH

NH O

HO H3C

O N

N

H O

OH

N

HO

O

HO

O

O

NH

NH

HO

NH

O

OH

NH

NHR

N OH

Пиовердин (группа II) 56

H3C

O

O O HO

NH

N

NH

H3C

NH H

H N

O

HO

O

HO

OH

N H

NH

HOOC

N

O

N

NH

HO

NHR

OH

NH O

O

N H

Пиовердин (группа III) Рис. 2.2.1. Структура пиохелина ипиохелина пиовердинов Рис. 2.2.1. Структура и Pseudomonas пиовердиновspp. [Poole,

Pseudomonas spp. [Poole, McKay, 2003]. McKay, 2003]. OH

O OH

O

NH

NH

OH

H 3C

Салицилат

H3 C

HO

O NH

NH

OH O O

HO N

64

N O

OH

O

H

CH3

H

Пиовердин (группа III) Рис. 2.2.1. Структура пиохелина и пиовердинов Pseudomonas spp. [Poole, McKay, 2003]. OH

O OH

O

NH

H 3C

Салицилат

NH

NH

OH

HO

O NH

CH3

OH O O

HO N H3 C

N

OH

O

H

O

Орнибактин O CH3

H3C H3C

OH

O

OH

N OH

Цепабактин

O

Квинолобактин

Рис. 2.2.2. гетерологичных сидерофоров исидерофоров их предшественников, Рис.Структура 2.2.2. Структура гетерологичных

которые может использовать которые P. aeruginosa [Poole, McKay, 2003]. и их предшественников, может использовать P. aeruginosa [Poole, McKay, 2003]. P. aeruginosa имеет две фосфолипазы С: PLC-N и PLC-H, кодируемые

генами plcN и plcH соответственно [Chin,фосфолипазы Watts, 1988; Richard, 1993]. Эти P. aeruginosa имеет две С: PLC-N

и  PLC-H, являются кодируемые генами plcNполностью и plcH соответственно фосфолипазы термолабильными, инактивируются при [Chin, Watts, 1988; Richard, 1993]. Эти фосфолипазы явля57 ются термолабильными, полностью инактивируются при 100°С [Altenbern, 1965], имеют высокую степень гомологии до 40% по аминокислотному составу (прежде всего N-конца). Целесообразность существования двух фосфолипаз P. aeruginosa объясняют их субстратной специфичностью. PLC-N гидролизует фосфатидилинозитол и лизофосфатидилинозитол [Doery et al., 1965], а PLC-H гидролизует фосфатидилхолин, лизофосфатидилглицерол, сфингомиелин [Ostroff et al., 1990; Berka et al., 1981]. Гемолитические свойства присущи 95–100% клинических штаммов P. aeruginosa. Гемолизины P. aeruginosa раз65

рушают эритроциты человека и некоторых млекопитающих, оказывают цитотоксическое действие на полиморфно-ядерные лейкоциты периферической крови человека [Рожавин, 1988]. P. aeruginosa может использовать гем гемопротеинов в качестве источника железа. Описаны две системы поглощения гема, закодированные в локусах phy и has [Ochsner et al., 2000]. Гены phy включают ген phuR, кодирующий рецептор наружной мембраны клеточной стенки, и phuSTUVW, кодирующий транспортер АВС-типа. Деятельность обоих генов строго регулируется Fur-белком. Удаление phuR или phuSTUV значительно угнетает рост P. aeruginosa на питательной среде с гемином или гемоглобином в качестве единственного источника железа, хотя полной остановки роста не происходит, что связано с продуктами hasRA оперона [Ochsner et al., 2000]. Ген hasА кодирует гемсвязывающий гемофор, облегчающий усвоение гемоглобина, hasR кодирует еще один рецептор для гема [Letoffe et al., 1998; Wandersman, Stojiljkovic, 2000]. Оба гена регулируются Furбелком и их удаление значительно уменьшает способность P. aeruginosa к использованию гемина в качестве источника железа [Ochsner et al., 2000]. P. aeruginosa имеет ряд способов получения железа в  организме хозяина. Способы получения железа P. aeruginosa дублируются – два сидерофора, два гемолизина, два пути усвоения гема/гемоглобина. С позиции экологии дублирование способов получения железа обеспечивает высокий адаптивный потенциал P. aeruginosa для выживания в  окружающей среде. P. aeruginosa редко вступает в  симбиотические отношения с другими микроорганизмами, так как все необходимое, в том числе и железо, получает самостоятельно. Известны случаи формирования ассоциаций P. aeruginosa с C. albicans и S. aureus [Шаталова, Бель66

ский, 1998], в которых P. aeruginosa выступает в качестве доминантного микроорганизма. Механизм формирования данных ассоциаций не изучен и, с нашей точки зрения, состоит в сочетанном использовании способов получения железа ассоциантами. 2.3. ЖЕЛЕЗО И CANDIDA SPP. Candida spp. является представителем фунгиальной микробиоты человека, размножаясь в кишечнике, влагалище, ротовой полости, на коже, создает прецедент оппортунистических инфекций. Перестал быть исключением сепсис, вызванный кандидами, особенно в отделениях, где проводятся операции онкологическим больным, и в отделениях трансплантации [Козлов, 2006]. К факторам патогенности грибов рода Candida относят гидролитические ферменты, маннопротеин клеточной стенки, гифообразование и др. Вирулентность разных видов кандид может резко отличаться для человека и животных. Наиболее вирулентным для человека признан вид C. albicans, на втором месте – С. tropicalis, затем C. krusei [Реброва, 1989]. Первые исследования о роли железа в биологии Candida spp. показали его важную роль в регуляции патогенных свойств, высказано предположение о производстве сидерофоров для удовлетворения потребностей в  железе [Holzberg, Artis, 1983]. В культуральной жидкости C. albicans обнаружены сидерофоры гидроксаматного и фенолятного типа [Ismail et al., 1985; Sweet, Douglas, 1991]. Эти исследования не воспроизведены другими авторами, так же как не выделены сидерофоры в чистом виде. На настоящий момент считается, что Candida spp. не производит собственных сидерофоров, однако имеет транспортеры для использования гетерологичных [Heymann et al., 1999; Ardon et al., 2001; Santos et al., 2003]. Первый эукариотический транс67

портер сидерофоров SIT1 выявлен у S. cerevisiae [Lesuisse et al., 1998], гомологичный ген sit1 (CaSIT1/CaARN1) идентифицирован и охарактеризован у C. albicans, показано, что он ответственен за транспорт сидерофоров феррихроматного типа [Ardon et al., 2001; Lesuisse et al., 2002]. Поглощение гетерологичных сидерофоров не единственный механизм поступления железа в клетку. Для C. albicans характерно поглощение железа восстановительным путем с помощью ферриредуктазы Cfl95/CaFre1 цитоплазматической мембраны и CaFtr1, CaFet3 компонентов пермеазно-оксидазного комплекса. Нокаутированные по гену сaftr1 штаммы C. albicans становятся авирулентны для мышей при генерализованной инфекции [Ramanan, Wang, 2000]. Обе описанные системы активируются при недостатке железа в синтетической питательной среде, а при культивировании в сыворотке индуцируется только система поглощения гетерологичных сидерофоров [Ardon et al., 2001]. Данное наблюдение показало, что C. albicans может адаптировать свою стратегию получения железа к условиям организма хозяина. Третий способ получения железа Candida spp., вызывающий много споров на сегодняшний день, – синтез гемолизинов. Считалось, что гемолизин является важным фактором патогенности C. albicans, обуславливающим патогенез кандидоза, поскольку его секреция сопровождается интенсивным гифообразованием. Однако зависимость гемолитической активности от гифообразования не подтверждена в опытах на гифоотрицательном виде C. glabrata [Odds, 1998]. В исследовании гемолитической активности на кровяном агаре показано, что C. аlbicans, С. dubliniensis, С. kefyr, C.  krusei, C. zeylanoides, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae дают после 24 ч инкубации α-, а через 48 ч 68

β-гемолиз. C. famata, С. guilliermondii, С. rugosa, C. utilis даже после 48 ч дают только β-гемолиз, что позволило предположить наличие у Candida spp. двух гемолитических субстанций [Luo et al., 2001]. Природа гемолизинов так и не выяснена. Возможно, что за α-гемолиз несет ответственность перекись водорода, способность к продуцированию которой показана на C. albicans [Danley et al., 1983]. Предполагают, что β-гемолизином у С. albicans является маннопротеин клеточной стенки [Watanabe et al., 1999]. Однако 6 из 14 видов Candida spp., протестированных на наличие β-гемолитической активности, не дали характерных β-гемолитических зон на кровяном агаре, хотя маннопротеин является обязательным компонентом клеточной стенки Candida spp. [Watanabe et al., 1999]. Возможно, что одной из гемолитических субстанций Candida spp. является фосфолипаза. Изучение гемолитической активности, проведенное на штаммах C. glabrata, показало, что способность лизировать эритроциты человека не зависит от наличия фосфолипазы [Watanabe et al., 1999]. C. albicans имеет семь фосфолипазных генов (pla, plb1, plb2, plc1, plc2, plc3, pld1), только четыре из них хорошо изучены и описаны (plb1, plb2, plc, pld1) [Samaranayake et al., 2006; Tsang et al., 2007], роль остальных в патогенезе кандидозов полностью остается неясной. Очевидно, что транскрипция фосфолипазных генов, ответственных за синтез гемолитически активной фосфолипазы, происходит при определенных условиях окружающей среды. Природа гемолизинов Candida spp. остается неисследованной, как не исследована роль гемолитической активности Candida spp. как способа получения железа. Тем не менее, показана способность C. albicans использовать гем/ гемоглобин в качестве источника железа. Рост C. albicans в сыворотке крови человека подавляется Tf, который свя69

зывает железо и снижает его концентрацию до уровня, не поддерживающего рост грибов [Howard, 1981]. Добавление гемина или гемоглобина восстанавливает рост C. albicans в сыворотке крови [Moors et al., 1992]. Связывание гемоглобина поверхностными рецепторами C. albicans тормозится в присутствии гаптоглобина и не зависит от концентрации ионов железа [Bozzini et al., 1992]. Гемоксигеназа, разрушающая внутри клетки гем до α-биливердина, СО, железа, выполняет важную роль в процессе усвоения гема C. albicans. Гемоглобин, но не гемин, индуцирует транскрипцию гена гемоксигеназы (СаНМХ1). Мутантный штамм S. cerevisiae, дефектный по гену hmx1, гомологичному гену  cahmx1 С.  albicans, не способен расти на питательной среде с ионами железа, что свидетельствует об участии СаНМХ1 в усвоении неорганических источников железа и подтверждает важную роль гемоглобина как источника железа [Sizhuang et al., 1996]. Скорее всего, количество гемоглобин-регулируемых генов не ограничивается СаНМХ1 и наличие гемоглобина в окружающей среде может регулировать вирулентность кандид. S. cerevisiae имеет схожие с C. albicans стратегии получения железа, однако ген гемоксигеназы НМХ1 не является гемоглобин-регулируемым и S. cerevisiae не может использовать гемоглобин в качестве источника железа [Hostetter, 1994]. Регулирование гемоксигеназной деятельности гемоглобином характерно для условно-патогенного комменсала млекопитающих Candida spp. и не характерно для сапрофита S. cerevisiae. C. аlbicans может использовать Tf в качестве источника железа. Холо-Tf, добавленный в питательную среду, стимулирует рост C. аlbicans на железодефицитной среде, в то время как добавление апо-Tf не оказывает влияние на рост. Использование Tf в качестве источника железа осущест70

вляется по восстановительному пути через пермеазу Ftr1 и ферриредуктазу Fre10 [Knight et al., 2005]. Известны четыре пути получения железа Candida spp. – поглощение гетерологичных сидерофоров, восстановительное поглощение железа, использование Tf, синтез гемолизинов и поглощение гема/гемоглобина. Наличие одновременно четырех путей получения железа дает адаптивные преимущества Candida spp. Способность использовать Tf в качестве источника железа делает возможным рост в сыворотке крови. Возможность использования гетерологичных сидерофоров повышает конкурентноспобность Candida spp. в микробных ассоциациях. Неоднозначен вопрос о природе и функциях гемолитической активности Candida spp. при получении железа. Кажется странным наличие способности использовать в качестве источника железа гемоглобин, но не иметь собственных гемолизинов. Однако Candida spp. часто вступают в симбиотические отношения с другими микроорганизмами-комменсалами, которые могут продуцировать гемолизины, обеспечивая необходимый источник железа для Candida spp. Появление в окружающей среде гема/ гемоглобина способствует реализации вирулентного потенциала Candida spp. Экспериментальные исследования роли гемоглобина и других источников железа в вирулентности Candida spp. не проводились, так же как не оценивалась роль способов получения железа в вирулентности и формировании микробных ассоциаций. 2.4. ЖЕЛЕЗО И МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ Молочнокислые бактерии исторически определяют как группу микроаэрофильных, грамположительных микроорганизмов, сбраживающих гексозы преимущественно до молочной кислоты. Эта функциональная классификация включает в себя множество родов, входящих в состав 71

нормальной микробиоты организма человека: Lactococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и др. Молочнокислые бактерии доминируют в составе индигенной микробиоты различных биотопов организма хозяина. В микробиоценозе толстого кишечника и влагалища доминантными микроорганизмами являются молочнокислые бактерии рода Bifidobacterium и Lactobacillus соответственно [Gomes, Malcata, 1999; Kiss et al., 2007]. Основная функция доминантных микроорганизмов состоит в обеспечении колонизационной резистентности биотопа, в связи с этим молочнокислые бактерии часто вступают в симбиотические отношения с ассоциативной микробиотой. До недавнего времени молочнокислые бактерии рассматривались как редкая группа бактерий, не нуждающаяся в железе [Bruyneel et al., 1989; Weinberg, 1997]. Показано, что добавление железа, как и его отсутствие в питательной среде, не влияет на рост молочнокислых бактерий. Безуспешны были попытки выделить и идентифицировать сидерофоры [Pandey et al., 1994; Imbert, Blondeau, 1998]. В геноме Lactococcus lactis обнаружен ген, ответственный за синтез пептида, связанного с продукцией сидерофора [Crosa, Walsh, 2002; Siezen et al., 2008], но это пока не доказано экспериментально. Выделен штамм B. longum DJO10A, который оказывал бактериостатическое действие на культуры L.  lactis, Clostridium difficile, C. perfringens за счет продукции сидерофора [O’Sullivan, 2004; O’Sullivan et al., 2004]. С помощью электронной микроскопии и ионной масс-спектрометрии показана возможность использования Lactobacillus sakei в качестве источников железа миоглобина, гемоглобина, гемина, Tf [Duhutrel et al., 2010]. Эта спо72

собность обеспечивала L. sakei продолжительное сохранение постоянной скорости роста. В свете новых данных непонятны механизмы аэротолерантности молочнокислых бактерий. Считалось, что молочнокислые бактерии ауксотрофны по гему, не имеют цитохромов и гемопротеинов (например, каталазы) и используют гемин как источник протопорфирина IX, а не железа. Это объясняло применение геминсодержащих питательных сред для их культивирования. Гемин, гемоглобин, Fe3+ не влияют на образование, но стимулируют деградацию перекиси водорода вагинальными лактобациллами. Железо из гемина используется в качестве кофактора пероксидазы и ведет к стимуляции деградации перекиси водорода лактобациллами [Bryon et al., 1990]. Деградация перекиси водорода ведет к образованию гидроксильных радикалов по реакции Фентона, которые обладают более сильным антимикробным эффектом, чем перекись водорода, что препятствует размножению ассоциативной микробиоты [Бухарин и др., 2013]. Анализ генома молочнокислых бактерий показал, что некоторые виды лактобацилл имеют системы транспорта железа [Siezen et al., 2008]. В геноме L. sakei обнаружены гены транскрипционных регуляторов, принадлежащих к семейству Fur-белков, цитохрома b и мутировавших генов цитохрома Р450, следовательно, гем может быть использован L. sakei как источник железа. Изучено действие апо- и холо-Lf на разные группы микроорганизмов, в том числе молочнокислые стрептококки, и показано, что S. mutans, S. salivarius, S. mitis чувствительны к апо-Lf, а холо-Lf даже стимулирует их рост [Arnold et al., 1980]. Аналогичные результаты получены на бифидобактериях и лактобациллах. Механизм, раскрывающий данный эффект, представлен в работах W. S. Kim с соавт. Установ73

лено, что в белковой фракции экстрактов мембран бифидобактерий и лактобацилл находятся Lf-связывающие белки: у лактобацилл молекулярная масса белков составляет 27, 41, 67 кДa, у бифидобактерий – 67–69 кДa. У штамма B. lobgum АТСС 15707 Lf-связывающие белки не обнаружены, поэтому холо-Lf не оказывает влияния на рост этого штамма [Kim et al., 2002, 2004]. Полученные результаты свидетельствуют, что стимуляция роста нормальной микробиоты Lf благоприятна для организма хозяина и связана со способностью данной группы микроорганизмов экспрессировать Lf-связывающие белки [Валышева, 2005]. Современные данные о роли железа в биологии молочнокислых бактерий позволяют пересмотреть положение о железонезависимости молочнокислых бактерий и  по-новому рассмотреть вопросы, связанные не только с их аэротолерантностью, но и с межмикробными взаимоотношениями, складывающимися при формировании с их участием микробиоценозов организма хозяина. Большая часть молочнокислых бактерий нуждается в железе, но их потребность в нем значительно меньше, чем других микроорганизмов, что позволяет им доминировать в некоторых железодефицитных биотопах организма хозяина. Наличие Lf-связывающих белков, а также влияние гема/гемоглобина на биологические свойства молочнокислых бактерий позволяет высказать предположение о важной роли этих молекул в регуляции взаимоотношений внутри микробиоценоза. На сегодняшний день данный вопрос остается практически неизученным. Неизученным остается вопрос о распространенности Lf-связывающих белков среди молочнокислых бактерий – представителей нормомикробиоты человека в условиях нормы и при дисбиозах.

74

*** Подводя итоги, следует отметить, что на сегодняшний день в литературе имеется достаточно информации о потенциальных возможностях реализации стратегии добывания железа отдельными группами микроорганизмов. Частота встречаемости конкретного способа получения железа среди разных групп микроорганизмов не изучалась, не проводилась оценка взаимосвязи микробных стратегий получения железа с биотопом организма хозяина. Данные о биологических свойствах условно-патогенных микроорганизмов позволяют предполагать важную роль гема/гемоглобина и Lf в регуляции вирулентности и межмикробных взаимодействий условно-патогенных микроорганизмов. Появление этих железосодержащих субстратов в окружающей среде способствует удовлетворению микроорганизмами своих потребностей в железе и регулирует экспрессию факторов вирулентности (реализовать стратегию добывания железа). Рассматривая микробное сообщество как систему, можно утверждать о существовании равновесия (баланса) между ассоциативными и доминантными микроорганизмами, сохраняемого с помощью внешних факторов, создаваемых организмом хозяина. Одним из таких факторов является гомеостаз железа, стратегия которого направлена на ограничение микроорганизмов в доступном для усвоения железе. Равновесие в микробном сообществе динамично и при изменении параметров (внешних условий) может смещаться. Возможность реализации стратегии добывания железа условно-патогенными микроорганизмами происходит в присутствии индуктора – субстрата (холотрансферринов, гемопротеинов). Удовлетворение потребностей в  железе ведет к увеличению их вирулентности. Появление в окружающей среде гема/гемоглобина и холо-Lf может способствовать увеличению антагонистической активности доми75

нантной микробиоты в отношении ассоциативной. Исход этого «сражения» зависит от наличия у микроорганизмов определенных биологических свойств, например, антилактоферриновой активности [Валышева, 2005], и состояния организма хозяина. Необходимо дальнейшее исследование микробной стратегии получения железа. Интерес представляет исследование ее роли в сохранении и нарушении колонизационной резистентности организма хозяина. Это позволит выявить механизмы, обуславливающие толерантность организма хозяина к его нормальной микробиоте, и уточнить на молекулярном уровне механизмы участия способов получения железа в формировании естественных и патологических микробиоценозов организма.

76

Глава3 ЖЕЛЕЗО И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ОРГАНИЗМА ХОЗЯИНА С МИКРОПАРАЗИТАМИ 3.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГОМЕОСТАЗЕ ЖЕЛЕЗА ОРГАНИЗМА ХОЗЯИНА В последнее время достигнут значительный успех в области изучения гомеостаза железа человека – показаны молекулярные механизмы его всасывания, экспорта, транспорта, рециркуляции и регуляции, позволяющие по-новому пересмотреть механизмы возникновения патологии гомеостаза железа. В данной главе, прежде чем перейти к рассмотрению роли гомеостаза железа во взаимоотношениях «хозяин – микропаразит», мы обобщили результаты значительного количества современных исследований, проведенных в этой области за последние 20 лет. 3.1.1. Всасывание железа В организме взрослого мужчины содержится около 4 г железа, из которых около 2,5 г находится в гемоглобине, 1 г хранится в гепатоцитах, макрофагах печени и селезенки, остальное количество рассредоточено в миоглобине, цитохромах, других гемопротеинах. Лишь около 1–2 мг/сут. теряется из организма преимущественно через незначительную потерю крови. В норме эти потери железа восстанавливаются за счет всасывания железа в кишечнике. Человек ежедневно получает около 15 мг железа, и только около 5–10% из этого количества всасывается. Железо содержится во многих продуктах растительного и животного происхождения. Высока концентрация его в  мясе, печени, почках, а из продуктов растительного происхождения – в бобах сои, петрушке, горохе, шпинате, 77

черносливе, изюме. Значительное количество железа содержится в рисе и хлебе. Имеет значение не количественное содержание железа в продукте, а его биодоступность. Железо, находящееся в мясе, птице, рыбе, доступнее железа, находящегося в растениях (табл. 3.1.1) [Halberg, Howard, 1958]. Это легко объясняется химическими свойствами железа. Таблица 3.1.1 Усвоение железа из различных продуктов [цит. по Баркова и др., 2001] Содержание Процент Пищевой продукт железа усвоения мечено(мг/100 г) го железа, % Говядина 4,1 20,0 Свинина 3,1 15,0 Печень 10,0 4,5 Куриное мясо 2,4 14,0 Рыба 1,5 18,0 Яйцо 2,2 3,8 Хлеб 1,8 4,8 Бобовые (соя, горох и др.) 4,0 6,1 Овощи (капуста, карто6,4 10,0 фель, салат, морковь) Очевидно, что основная часть железа растений является негемовым и в щелочной среде кишечника образует нерастворимые гидроксиды и не может всасываться. Некоторая часть негемового железа все же всасывается в двенадцатиперстной кишке, где значения рН среды увеличивают растворимость его гидроксидов. Биодоступность негемового железа зависит от присутствия в пище стимуляторов (белки животного происхождения, витамин С) и  ингибиторов всасывания (полифенолы, кальций) [цит. по Баркова и др., 2001]. Железо мяса в основном гемовое, т. е. закомплексовано и не может образовывать нерастворимых гидроксидов 78

в щелочной среде кишечника и окисляться кислородом воздуха, что увеличивает его биодоступность по сравнению с негемовым. Всасывание негемового железа происходит в клетках эпителиального слоя дуоденального отдела кишечника – энтероцитах [Hunt J.R., Roughead, 2000]. Апикальная мембрана дифференцированного энтероцита обращена в просвет кишечника и «специализируется» на транспорте гема и Fe2+ в клетку. Всасывание железа зависит от его валентности. Железо абсорбируется зрелыми энтероцитами в основном в виде ионов Fe2+, поэтому большая часть ионов Fe3+, поступающих с пищей, подвергается восстановлению до Fe2+ на апикальной поверхности ворсинчатого эпителия под воздействием мембраносвязанной ферриредуктазы дуоденального цитохрома b щеточной каймы энтероцита (Dcytb) [Ma et al., 2006]. Небольшая часть ионов Fe3+ импортируется в  энтероцит без предварительного восстановления, путем взаимодействия с муцином и β3-интегрином. Транспорт Fe2+ из дуоденального содержимого в цитоплазму зрелых энтероцитов осуществляется при помощи растворимого белка двухвалентного транспортера металлов 1 (DMT1, от англ. divalent metal transporter) [Ma et al., 2006], иногда этот белок обозначают как Nramp. Данный белок кодируется геном nramp, который может экспрессировать две мРНК, различающиеся в своих 3′-нетранслируемых участках. Этот ген кодирует две изоформы белка Nramp: Nramp1, Nramp2. DMT1 представляет собой интегральный мембранный гидрофобный гликопротеин и не является специфичным только к ионам железа, также он может переносить множество двухвалентных ионов, в том числе токсичные для организма металлы [Andrews, 1999, 2002; Abboud, Haile, 2000; Conrad, Umbreit, 2002; Ganz, 2003]. Уровень экспрессии транспор79

тера DMT1 в энтероцитах крипт зависит от обеспеченности железом организма в целом. Помимо DMT1 поглощение железа может быть опосредовано внеклеточно расположенным шапероном кальретикулин-подобного мобилферрина (белок, 56 кДа) [Roy, Enns, 2000; Simovich et al., 2003]. При реализации этого пути поглощения железа мобилферрин, располагающийся на внутренней поверхности клетки, связывается с поверхностным гетеродимерным β3-интегрином и поступает в клетку посредством клатрин-зависимого эндоцитоза, в составе эндосомы железо связано в большой белковый комплекс с молекулярной массой 520 кДа. Основными компонентами этого комплекса являются β-интегрины, мобилферрин, флавинмонооксигеназа и NADP. Данный комплекс обладает ферриредуктазной активностью и восстанавливает Fe3+ до Fe2+. Этим путем поглощаются растворимые комплексные соединения железа, например, цитрат железа [Conrad et al., 1990, 1993; Conrad, Umbreit, 1993]. Механизм поглощения гемового железа до сих пор остается загадкой, несмотря на важность гема для организма млекопитающих. Считается, что в просвете кишечника металлопорфириновое кольцо отсоединяется от глобина и в таком виде транспортируется через мембрану энтероцита [Conrad et al., 1966]. Процесс поглощения гемового железа также осуществляется апикальной мембраной энтероцитов двенадцатиперстной кишки, которые захватывают гем путем эндоцитоза и доставляют его в цитоплазму [Parmley et al., 1981], однако белки, участвующие в транспорте, до сих пор не идентифицированы. Постулируется участие в  этом процессе НСР1 (от англ. haem carrier protein 1) и белка Abcg2 (от англ. ATP-binding cassette sub-family G memeber 2), так как они экспрессируются практически на всех типах клеток, участвующих в гомеостазе железа [Rouault, 2005; Gladys et 80

al., 2006]. После доставки в цитоплазму гем может быть далее транспортирован без химической модификации или происходит его превращение гемоксигеназами до биливердина, монооксида углерода, железа. Как и в случае негемового железа, двенадцатиперстная кишка является основным местом всасывания гема. Вообще градиент всасывания гемового и негемового железа слизистой оболочкой кишечника одинаков и распределяется следующим образом: двенадцатиперстная кишка > тощая кишка > подвздошная кишка. Объединенная схема всасывания и экспорта гемового и негемового железа в энтероците приведена на рис. 3.1.1.

Рис 3.1.1. Схема всасывания и экспорта гемового и негемового железа в энтероцитах [Шафран и др., 2012]. 3.1.2. Экспорт и транспорт железа По мере созревания энтероцита железо перемещается к базолатеральной мембране и транспортируется в плазму 81

крови. Экспорт железа из энтероцита в плазму осуществляют белок ферропортин 1 (FEP1, от англ. Ferroportin 1; также MTP1, Ireg1, SLC11A3; SLC40A1) и гефестин (HEPH, от англ. hephestin). FEP1 осуществляет непосредственный транспорт негемового железа через базолатеральную мембрану в плазму крови и ткани [Eisenstein, Blaming, 1996]. FEP1 может взаимодействовать только с Fe2+, а Tf c более высокой аффинностью связывает Fe3+ ионы. Биологическая целесообразность этого процесса очевидна, так как ионы Fe2+ являются прооксидантами, поэтому сначала происходит их феррооксидазное окисление до Fe3+ на базолатеральной поверхности энтероцита, а затем экспорт в плазму. За феррооксидазную активность базолатеральной поверхности энтероцита отвечает НЕРН, который является структурным и функциональным аналогом церулоплазмина (Ср). С-терминальная часть HEPH имеет мембранносвязанный домен, который осуществляет направленное феррооксидазное действие на поверхности клеток или в просвете везикул, тем самым регулируя концентрацию экспортируемого железа из клетки в плазму крови [Vulpe et al., 1999]. За феррооксидазную активность плазмы крови отвечает Ср. Ср – медьсодержащий белок плазмы крови. Ранее считалось, что его основные функции связаны с транспортом меди и окислительными процессами, в которых он выступает как антиоксидант. Обнаружение феррооксидазной активности Ср позволило предположить, что данный фермент является связующим звеном между обменом железа и меди. При недостаточном поступлении меди в организм животных через некоторое время наступает уменьшение концентрации сывороточного железа и меди эритроцитов, затем резко снижается количество эритроцитов в крови [Lahey et al., 1952]. Главным подтверждением зависимости 82

обмена железа от Ср является то, что мутация в гене Ср, ведущая к потере участка белковой цепи, формирующей активный центр, вызывает гемосидероз с массивными отложениями железа в тканях различных органов [Harris et al., 1995; Yoshida et al., 1995]. Феррооксидазная активность Ср важна для метаболизма железа, она обеспечивает встраивание Fe3+ в апотрансферрины. Измерение скорости встраивания Fe3+ в апотрансферрины может быть использовано для количественной оценки оксидазной активности Ср [Osaki et al., 1966]. Ср формирует комплексы с трансферринами как в щелочных растворах (8,3–8,8), так и при физиологических значениях рН 7,0 [Пулина, 2004]. Окисляя ионы Fe2+, Ср способствует встраиванию железа и в ферритины. Феррооксидазная активность Ср возрастает в присутствии Fr, а ионы железа в присутствии Ср связываются с Fr более эффективно [Guo et al., 1996]. Доставка железа тканям осуществляется в основном по Tf-TfR-пути и в меньшей степени по Lf-LfR-пути. Tf человека имеет молекулярную массу 75,6 кДа, состоит из 679 аминокислотных остатков, содержит две олигосахаридные цепи, фиксированные в положении 413 и 611 вблизи С-конца молекулы [MacGuillivray et al., 1983]. Обе олигосахаридные цепи заканчиваются сиаловой кислотой, что предохраняет связывание Tf с рецепторами клеток печени, которые активно удаляют из кровотока гликопротеины с  олигосахаридными цепями, заканчивающимися остатками галактозы [Bates, Schlabach et al., 1973]. N- и C-концевые последовательности Tf формируют два структурно-гомологичных домена, стабилизация молекулы Tf осуществляется многочисленными дисульфидными связями (рис. 3.1.2). Каждый домен может связать с высокой аффинностью (β ~ 6·1023 М-1) один ион Fe3+. Центр связывания Fe3+ образует петлю из четырех аминокислот Asp-63, Tyr-95, Tyr-188, 83

ч после синтеза Tff немедлеенно секреетируетсяя в кровь.. В плазмее крови человека с т 2,5 мг/м мл, в плаззме он нааходится в виде ап потранссодержаание Tf составляет феррин на и компллексов Fee3+-трансф феррин. Tf T плазмы ы у здороввых лиц насыщен н железом м ~30%, насыщенн н ность Tf ниже 20% % являетсся клиничческим по оказате-

His-249 (нумерация для N-домена). С этими аминокислоталем деф фицита ж По омимо пеечени Tf синтезиру с уют лимф фатически ие узлы, ми ион Fe3+ железа. образует четыре координационные связи, пятая тимус, сселезенка а, костный й мозг, Т--лимфоци иты, макр рофаги. и шестая координационная связь образуется с карбонат-ио2- а обнаруж Lf человека живает в высокую гомологи ию с Tf человекаа (около нами CO3 [Anderson et al., 1987]. синтезируется в организме человека печенью –е ос60%), аTf также с Lf короввы, мыши и, свиньи (около 70%). 7 Lf, как и все трансновной после синтеза Tf немедленно секретируферрин ны, источник, состои ит из двух х глобуля ярных дом менов – N-домен N ((1–332 ам минокисется в кровь. В плазме крови человека содержание Tf солотныхх остатка)) и С-дом мен (333–6691 амин нокислотн ных остаттка), кото орые составляет 2,5 мг/мл, он находится в виде апо-Tf и комплексов единены ы α-спирральным участком у (333–344 4 аминок кислотныхх остаткаа). ОлиFe3+-Tf. Tf плазмы у здоровых лиц насыщен железом ~30%, госахарридные цепи ц олекуле Lf предсставляют собой пполисахар риды Nнасыщенность Tfв мо ниже 20% является клиническим покатипа, αα-1,6-фуко ацетилллактозами инного железа. озилирова анныеTf ппо остаттку Nзателем дефицита Помимо печени синтезируацетилг глюкозам ми N-глик каны, исоединеенные чер рез Asn-1 137, 490. . Сайты ют лимфатические узлы,при тимус, селезенка, костный мозг, Т-лимфоциты, макрофаги. гликози илировани ия рассея ны по повверхности и белково ой глобуллы.

б а а б Lf с разр Рис. 3.1.2. Прост транствен нная струуктураструктура железонасы ыщенного решениРис. 3.1.2. Пространственная железонасыщенем 2,88 Е орзенковаа и др.,2,8 20 10]; струк ктура жел лезосвязы о сайта ного Lf(а)с [Бо разрешением Е (а) [Борзенкова и ывающего др., 2010]; 74 структура железосвязывающего сайта N-доли Lf (б) [Baker, Baker, 2004]. Lf человека обнаруживает высокую гомологию с Tf человека (около 60%), а также с Lf коровы, мыши, свиньи (около 70%). Lf, как и все трансферрины, состоит из двух долей, представленных глобулярными доменами – два N-домена (1–332 аминокислотных остатка) и два С-домена (333–691 аминокислотных остатка), которые соединены 84

α-спиральным участком (333–344 аминокислотных остатка). Олигосахаридные цепи в молекуле Lf представляют собой полисахариды N-ацетиллактозаминного типа, α-1,6-фукозилированные по остатку N-ацетилглюкозами N-гликаны, присоединенные через Asn-137, 490. Сайты гликозилирования рассеяны по поверхности белковой глобулы. Lf способен более прочно связывать железо (β~1024М-1), чем Tf, однако также обратимо. Lf может удерживать железо даже в присутствии конкурирующих лигандов (например, цитрата) вплоть до рН 3,0, в то время как Tf высвобождает железо уже при рН 5,5. Различное поведение Lf и Tf может быть объяснено тем, что при связывании ионов Fe3+ наблюдается кооперативность действия доменов. Так, присоединение иона Fe3+ на N-концевом домене облегчает присоединение второго иона Fe3+ на С-концевом домене [Aisen et al., 1978]. По-видимому, в этом играет роль С-концевая α-спираль, которая контактирует с N-долей. Отсутствие этого явления в Тf может быть объяснено различием в структуре пептида, соединяющего две доли. Во всех охарактеризованных Lf этот пептид образует α-спираль, в то время как в Тf он имеет гибкую, распрямленную, нерегулярную структуру. Жесткость α-спирали обеспечивает более тесное взаимодействие двух долей, которое стабилизирует связывание железа в N-доле, сдвигая начало высвобождения железа до низких значений рН. На различие в поведении Lf и Тf влияет наличие в молекуле Тf двух остатков лизина, Lys-206 и Lys-296, которые образуют необычную водородную связь. В Lf человека эта пара заменена остатками Arg-210 и Lys301. В Lf коровы, буйвола, лошади, верблюда в эквивалентных Тf позициях также присутствуют два остатка лизина, Lys-210 и Lys-301. Однако связь между этими остатками не образуется и белки ведут себя как типичные Lf [Baker, Baker, 2004]. 85

Lf синтезируется эпителиальными клетками слизистой оболочки различных млекопитающих (человека, коровы, козы, лошади, собаки, грызунов). Белок найден в секретах практически всех экзокринных желез, включая слезную жидкость (2 мг/мл; 0,4 мг/мл) [Van Snick et al., 1974], слюну (0,013 мг/мл), назальные и бронхиальные секреты, желчь (0,0042 мг/мл), панкреатический сок, семенную жидкость (0,518 мг/мл), мочу (0,00005 мг/мл), пот (0,0025 мг/мл). Lf в большом количестве содержится в молоке (1,28 мг/мл), молозиве (7 мг/мл; 3,2 мг/мл), являясь наиболее распространенным белком в молоке после казеинов. В системе кроветворения Lf экспрессируется в развивающихся нейтрофилах в ходе стадии созревания миелоцитов и запасается во вторичных гранулах нейтрофилов [Ward et al., 2005], содержание белка в них составляет 15 мкг/106 нейтрофилов. Lf обнаружен в плазме крови (0,001 мг/мл) и амниотической жидкости (0,006 мг/мл). Концентрация Lf в плазме составляет около 1 мкг/мл, однако может возрастать до 200 мкг/мл при воспалительном процессе [Van Snick et al., 1974]. Функции трансферринов, особенно Lf, разнообразны и не ограничиваются только влиянием на гомеостаз железа. К функциям трансферринов, в основе которых предположительно лежит их комплексообразующая способность, относятся бактериостатическое, бактерицидное, фунгицидное, противовирусное, детоксицирующее действие и транспорт железа. Существуют два рецептора Tf, а именно TfR1 и TfR2. TfR1 с более высокой аффинностью связывает железо и экспрессируется на большинстве клеток, в то время как TfR2 экспрессируется в основном на гепатоцитах. К локализованному на цитоплазматической мембране клетки-мишени TfR посредством физико-химических взаимодействий присоединяется железонасыщенный Tf (холо-Tf). Количе86

ство TfR на поверхности клетки зависит от потребностей клетки-мишени в железе. Связывание холо-Tf с TfR является сигналом для образования клатриновых везикул внутри клетки [Ponka, Lok, 1999]. Комплекс холо-Tf-TfR поглощается клеткой посредством клатрин-зависимого эндоцитоза, образуется первичная эндосома, которая сливается с лизосомой, что ведет к  образованию вторичной эндосомы. Во вторичной эндосоме происходит высвобождение железа из Tf; процесс является энерго- и температурно-зависимым и требует вовлечения механизма, обеспечивающего непрерывное закисление среды. Поступление протонов в эндосому осуществляется за счет АТР-зависимой протонной помпы [Morgan, 1981]. Роль протонной помпы выполняет трансмембранный транспортер DMT1, одновременно осуществляющий перенос ионов железа через эндосомальную мембрану в  цитозоль клетки [Gunshin et al., 1997]. Апо-Tf остается связанным с TfR при рН 5,5 эндосомы, возвращается к поверхности клетки и только при рН 7,4 внеклеточной среды связь апо-Тf с TfR становится непрочной и апо-Tf возвращается в кровоток. После поступления в клетку железо оказывается в митохондриях и включается в биосинтетические процессы. Каким образом железо доставляется в митохондрии, пока точно не известно, есть предположение, что в этом процессе также участвует белок DMT1. Особенности связывания холо-Lf с LfR макрофагов и последующего освобождения железа, в отличие от Tf, изучены плохо. Гемовое железо, экспортируемое в плазму крови из энтероцитов, связывается с гемопексином, альбуминами, липопротеинами низкой и высокой плотности (ЛПНП и ЛПВП) [Camejo et al., 1998]. Константы связывания гема некоторыми из этих белков приведены в табл. 3.1.2. Из значений β видно, что первоначально гем связывают ЛПНП, ЛПВП и альбуминами, данная связь непродолжительна 87

и  далее гем связывается гемопексином. Гемопексин обеспечивает транспорт гема в печень и возвращается обратно в кровоток [Hunt et al., 1987; Miller, Shaklai, 1999; Hvidberg et al., 2005]. Таблица 3.1.2 Константы связывания (β) гема и гемина белками Белок Гем/гемин β, М-1 Гемоглобин А Гем >1016 Гемоглобин А Гемин >1013 Гемопексин Гемин 1,0·1013 Человеческий сывороточный Гемин 1,1·108 альбумин Бычий сывороточный Гемин 1,0·106 альбумин ЛПНП Гемин 2,0·107 ЛПВП Гемин 3,4·106 Освобождаемый в результате лизиса эритроцитов гемоглобин может подвергаться окислительной деструкции до гема или необратимо связывается с апо-гаптоглобином. Гаптоглобин представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, его концентрация в сыворотке у взрослых составляет ~1,2 мг/мл, что достаточно для связывания свободного гемоглобина. Макрофаги экспрессируют на своей поверхности рецептор CD163 к комплексу гемоглобин-гаптоглобин. Этот рецептор является членом большого семейства рецепторов-мусорщиков SRCR класса, богатых цистеином [Law et al., 1993; Hogger et al., 1998; Kristiansen et al., 2001; Fabriek et al., 2005]. Связывание гема и гемоглобина очень важно для предотвращения индуцируемых ими оксидативных поражений клеточных мембран. 3.1.3. Железо запасов В процессе физиологического разрушения эритроцитов ежедневно освобождается 40–80 мг железа, которое 88

в основном откладывается в организме про запас (в первую очередь в печени и селезенке) и вновь используется костным мозгом для биосинтеза гемоглобина. Убыль железа организм восполняет за счет пищи. Железо, не востребованное на нужды организма, сохраняется в составе других железосвязывающих белков – Fr и гемосидерине. Fr – растворимый в воде комплекс ферригидроксифосфата железа Feo-OPO3H2(FeOOH)8 с белком апоферритином, имеющий молекулярную массу 450 кДа. Молекула Fr образована Н- и L-типами субъединиц (от англ. Н – heavy и L – light). У человека аминокислотные последовательности Н и L субъединицы идентичны на 54% [Munro, Linder, 1978; Harrison, Arosio, 1996]. Ферритины, изолированные из тканей млекопитающих, гетерогенны и состоят из смеси изоферритинов, различающихся по составу субъединиц и содержанию железа. Выделяют 25  изоферритинов – Н24L0, H23L1, H22L2… H0L24, но в  основном спектр распределения субъединиц в изоферритинах заключен в  пределах H22L2Н2L22 [Arosio et al., 1978]. Субъединицы ферритинов содержат небольшое число углеводородов. Состав и количество сахаров сильно варьируют в зависимости от тканевой принадлежности и составляют 2,4% массы апоферритинов печени и селезенки и около 5% у сердечных изоформ [Shinjyo et al., 1975]. Fr с преобладанием L-субъединиц способны связывать больше ионов железа Fe3+ (в среднем 4  500 атомов), чем ферритины с преобладанием Н-субъединиц (в среднем 1  500 атомов), поэтому ферритины, богатые Н-субъединицами, характерны для органов, запасающих железо (печень и селезенка) [Stefanini et al., 1982]. Fr выполняет в организме двойную функцию. Он запасает в клетках растворимое железо, которое при необходимости может быть легко задействовано для синтеза различных веществ. В то же время Fr защищает организм 89

от  токсического действия ионов металлов. Обновление белковой части Fr, необходимое для длительного хранения железа, осуществляется следующим образом. Fr из цитоплазмы поступает в лизосомы, где происходят протеолиз белковой части и частичная деградация железосодержащего ядра. Образовавшиеся структуры носят название сидеросомального Fr. Затем железо освобождается от связавших его хелаторов и постепенно заключается в новую, интактную молекулу апо-Fr. Главным фактором, влияющим на метаболизм Fr, является количество железа в организме. В условиях избытка железа способность клеток синтезировать Fr истощается. При этом частично железо остается в слабоструктурированной форме хранения – сидеросомальном Fr, а также подвергается дальнейшей деградации до нерастворимого гемосидерина. Название отражает источник содержащегося в нем железа – гемоглобин, но в гемосидерине железо находится не в форме гема. Помимо железа, синтез Fr регулируется другими веществами – гормонами (эстрогены, тироид-стимулирующий гормон, инсулин), цитокинами (IL-1, IL-6, TFN-α), сАМР, гемом, перекисью водорода и др. [Hirayama et al., 1993; Гамцемлидзе и др., 2006]. Гемосидерин – гидроксид трехвалентного железа, соединенный с белками, гликозаминогликанами, липидами [Гамцемлидзе и др., 2006]. Гемосидерин обнаруживается в  фагоцитирующих макрофагах и их производных – макрофагах костного мозга, селезенки, звездчатых ретикулоэндотелиоцитах печени. Иммунологически гемосидерин идентичен ферритину. Гемосидерин, как и Fr, используется в качестве белка запаса, однако ферритин расходуется значительно быстрее, чем гемосидерин [Yoshino et al., 1986].

90

3.1.4. Рециркуляция железа Из 4–5 г железа, которое находится в организме, 20% составляет резервное железо, а остальное – функционально активное. Из этого количества в состав гемоглобина эритроцитов входит 62–70%, 5–10% содержится в миоглобине скелетных мышц. Остальное железо находится в тканях, где оно принимает участие во многих метаболических процессах. Основным потребителем железа плазмы крови является костный мозг. Эритроидные клетки содержат наибольшее количество TfR в организме. При созревании ретикулоцитов до эритроцитов TfR на поверхности клеток разрушаются. Плазма крови содержит небольшое количество TfR, которые представляют собой растворимые фрагменты из внеклеточного домена рецептора. Определение их концентрации представляет диагностическую ценность, поскольку их уровни коррелируют с общей массой незрелых эритроидных клеток [Ponka, Lok, 1999]. Каждые сутки для обеспечения эритропоэза из плазмы в костный мозг поступает около 25 мг железа, что составляет 3/4 всего железа плазмы крови. Около 20–25 мг/сут. железа гемоглобина повторно используется [Andrews, 2008] и только 1–2 мг железа в день теряется организмом и должно быть восстановлено за счет усвоения из пищи. Большая часть железа, поступающего в плазму, обнаруживается в циркулирующих эритроцитах в течение 14 дней. Основную часть необходимого железа организм получает не за счет всасывания в кишечнике, а путем повторного возвращения в рециркуляцию железа, освободившегося при фагоцитозе стареющих эритроцитов [Knutson, Wessling-Resnick, 2008]. 3.1.5. Регуляция гомеостаза железа Гомеостаз железа в организме должен быть тщательно сбалансирован, чтобы обеспечить необходимый уровень железа для нужд организма и избежать проявлений его ток91

сических свойств, связанных с избыточным накоплением. Регуляция гомеостаза железа – это высокоорганизованный процесс, который осуществляется как на клеточном, так и системном уровне. На клеточном уровне в регуляции гомеостаза железа принимают участие белки IRP (от англ. iron regulator protein) и HFE белок наследственного гемохроматоза, которые контролируют всасывание железа из пищи в тонком кишечнике и рециркуляцию железа из макрофагов [Roy, Enns, 2000]. Белки, участвующие в гомеостазе железа (FEP1, DMT1, TfR и др.), имеют в своем составе железорегулируемые участки (IRE, от англ. iron responsive elements). IRE ориентированы на взаимодействие с IRP1 и IRP2 белками. Эти белки с высокой аффинностью связываются с IREучастками. IRE-участки могут располагаться в пределах 3′- и 5′-нетранслируемой области (3′-UTR и 5′-UTR соответственно) мРНК белков, участвующих в гомеостазе железа. Например, DMT1 имеет в своем составе IRE в пределах своей 3′-UTR, а в мРНК FEP1 этот элемент находится в 5′-UTR области. Связывание IRP с 3′-UTR мРНК стимулирует трансляцию, а связывание IRP с 5′-UTR мРНК ингибирует трансляцию железорегулируемого белка. В условиях дефицита железа в клетках связывание IRP с IRE в положении 5′-UTR ингибирует трансляцию мРНК Lи H-цепей Fr, тогда как связывание IRP с IRE в положении 3′-UTR мРНК TfR ведет к увеличению периода ее полураспада [Garate, Nunez, 2000]. Происходит увеличение экспрессии ТfR в дуоденальной крипте и, соответственно, всасывание железа в кишечнике при низких запасах. Аналогичные механизмы посттранскрипционного регулирования справедливы для мРНК DMT1 и FEP1. Связывание IRP с мРНК FEP1 при низком внутриклеточном содержании железа в 5′-UTR зоне, уровень FEP1 в кишечнике снижается, умень92

шая тем самым выход железа в плазму крови [Fleming, 2001]. При высоких запасах железа IRP не связывается с IRE, синтез TfR уменьшается и железо не всасывается. HFE – трансмембранный белок, принадлежащий к семейству HLA I класса, локализован в эндосоме базальной стороны предшественника энтероцита. HFE, связываясь TfR с более высокой аффинностью, чем Tf, регулирует процессы доставки железа тканям. Мутации этого белка ведут к появлению ложного сигнала о наличии низкого содержания железа в организме. В результате происходит неограниченное взаимодействие Tf с TfR, увеличивается выработка DМT1 в ворсинках энтероцитов, что ведет к избыточному накоплению железа в тканях – гемохроматозу [Казюкова и др., 2002]. Поскольку абсорбция железа, его рециркуляция, хранение и утилизация являются процессами связанными, но дистанционно удаленными, естественно предположить существование системного регулятора этих процессов [Левина и др., 2008]. В 2001 году открыт белок гепсидин (Нр, от англ. hepcidin), который в настоящий момент считается универсальным гормональным регулятором гомеостаза железа в организме позвоночных. Нр является 25-аминокислотным циклическим гетеродетным пептидом, богатым цистеином, с четырьмя дисульфидными мостиками, который синтезируется в печени. Человеческий Нр образуется из С-терминальной части 84-аминокислотного предшественника. Пропептид Нр кодируется мРНК, генерируемой из третьего экзона гена usf2, расположенного на хромосоме 19. Структура молекулы Hp установлена и приведена на рис. 3.1.3 [Hunter et al., 2002].

93

Рис. 3.1.3. Первичная и вторичная структура Нр человека [Ganz, 2003]. Этот пептид представляет собой «шпильку», у которой две «руки» связаны дисульфидными мостиками в лестницеподобной конфигурации. Необычной чертой молекулы гепсидина является присутствие дисульфидных связей между двумя соседними цистеинами неподалеку от поворота «шпильки», что является характерным химическим признаком стрессовой ситуации и может иметь высокую реактивность, что и позволило предположить его гормональную функцию. Нр регулирует гомеостаз железа через способность связываться с мембранным экспортером FEP1, располагающимся на поверхности энтероцитов и макрофагов. Комплекс Нр-FEP1 интернализируется в цитоплазму и разрушается [Gunshin et al., 1997; Takeshi Nakanishi, 2011]. Увеличение концентрации Нр уменьшает кишечное всасывание железа за счет протеасомной деградации белка транспортера DMT1, не изменяя экспрессии FEP1 на энтероцитах [BrasseLagnel et al., 2011]. При дефиците железа уменьшается экспрессия гена Нр, что ведет к увеличению захвата железа из макрофагов и кишечника, аналогично происходит при гипоксии (рис. 3.1.4). Подавление синтеза Нр наблюдается как 94

при дефиците железа, так и при гемолитических анемиях. Супрессивный эффект гемолитической анемии можно объяснить тем, что требование эритропоэза в железе является более сильным сигналом, чем избыток железа, который должен был бы вызвать индуцированный синтез Нр [Yoon et al., 2006; Левина и др., 2008]. Эта иерархия эффектов объясняет, почему при гемолитических анемиях развивается гемосидероз. Так как в подобных случаях уменьшение выработки Нр ки», что является характерным химическим признаком стрессовой ситуации ведет к перегрузке организма железом и только хелаторная и может иметь высокую реактивность, что и позволило предположить его терапия может уменьшить содержание железа [Papanikolaou гормональную et al., 2005;функцию. Deicher, Horl, 2006]. Низкие концентрации Нр: железо экспортируется через FEP1 в межклеточное пространство

Высокие концентрации Нр: FEP1 разрушается, железо аккумулируется внутри клетки

Рис.3.1.4 Регуляциягомеостаза гомеостаза железа с помощью Нр. Рис. 3.1.4. Регуляция железа с помощью Нр.

Нр регулирует гомеостаз железа через способность связываться с мем-

В целом Нр диктует баланс железа, ограничивая всасывание в кишечнике и освобождение железа макрофагами. и макрофагов. Комплекс Нр- FEP1 интернализируется в цитоплазму и разруУвеличение количества железа в организме ведет к стимушается et al., 1997; Nakanishi, 2011]. Увеличение ляции[Gunshin синтеза Нр, чтоTakeshi снижает всасывание железа концентрав кишечции Нр уменьшает кишечное всасывание железа за счѐт протеасомной дегранике и уменьшает его экспорт в циркуляцию. Уменьшение дации белка транспортера не изменяя экспрессии FEP1 на энтероцивсасывания железа вDMT1, кишечнике ведет к угнетению синтеза бранным экспортером FEP1, располагающимся на поверхности энтероцитов

тах [Brasse-Lagnel et al., 2011]. При дефиците железа уменьшается экспрессия 95 гена Нр, что ведѐт к увеличению захвата железа из макрофагов и кишечника, аналогично происходит при гипоксии (рис. 3.1.4). Подавление синтеза Нр наблюдается как при дефиците железа, так и при гемолитических анемиях.

Нр печенью и, по принципу обратной связи, восстановлению захвата железа из пищи и кишечника [Park et al., 2001; Филимонов и др., 2012]. Гомеостаз железа представляет собой цикл, включающий два процесса. Первый связан с разрушением старых эритроцитов и освобождением гема, второй – с использованием железа для биосинтеза гемоглобина. Эти процессы находятся в динамическом равновесии, а именно скорость всасывания железа должна быть равна скорости его выведения из организма. Как и любой равновесный процесс, гомеостаз железа не статичен и равновесие может смещаться в зависимости от внешних факторов, что приводит к возникновению состояний недостатка или избытка железа в организме – гипосидерозов (железодефицитная анемия – ЖДА) и гемосидерозов соответственно. ЖДА развивается при значительном снижении тканевого, транспортного и гемоглобинового фондов железа, может быть вызвана недостаточным поступлением железа с пищей, нарушением усвоения гема, кровопотерями различного генеза и др. До сих пор ЖДА относится к наиболее распространенным заболеваниям человека с разнообразными клиническими проявлениями – как латентными, так и тяжелыми прогрессирующими состояниями, способными вызывать повреждения тканей и органов. Гемосидероз может быть следствием чрезмерного поступления железа с пищей, парентеральной перегрузки организма железом, талассемии и др. Чаще всего гемосидероз является результатом генетического заболевания (гемохроматоз) – мутация гена, кодирующего образование белка HFE. Избыток железа способствует образованию активных форм кислорода, обладающих цитотоксическим действием, и коррелирует с повышением риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, болезни Паркинсона, Альцгеймера, 96

некоторых видов онкологических заболеваний [Smith, Perry, 1995]. 3.2. ЖЕЛЕЗО И ИНФЕКЦИОННАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Нарушение гомеостаза железа как в сторону избыточного накопления железа, так и развития его дефицита угнетает клеточное и гуморальное звено иммунитета, приводя к изменению его инфекционной чувствительности. Инфекционная чувствительность – индивидуальная восприимчивость организма хозяина к патогену, вызывающему болезнь [Миронов и др. 2000]. Основная причина повышения инфекционной чувствительности к патогенам при нарушении гомеостаза железа связана с его влиянием на врожденный иммунитет. Избыточное накопление железа при серповидноклеточной анемии, β-талассемии и гемохроматозе также увеличивают инфекционную чувствительность организма человека к патогенам [Forbes, Gros, 2001; Pietrangelo, 2006], своеобразным маркером гемосидерозов являются абсцессы печени и бактериемия, вызванные Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis [цит. по Козырева, Казакова, 2006; Le Gall et al., 2004]. Установлено, что среди детей с ЖДА заболеваемость респираторными инфекциями в 2–4 раза, а кишечными – в 2 раза выше [Бисярина, Казакова, 1979]. Уже при латентном дефиците железа заболеваемость респираторными вирусными инфекциями повышается в 1,5–2 раза. Процент бактериальных осложнений после респираторных вирусных инфекций у детей с ЖДА в 2 раза выше, чем у здоровых. Имеется мнение, что инфекции при ЖДА возникают не чаще, чем у здоровых [Малаховский и др., 1983; Баркова и др., 2001]. Интересные результаты получены при исследовании инфекционной чувствительности к возбу97

дителям малярии беременных женщин Гамбии и Папуа  – Новой Гвинеи. Обнаружено снижение инфекционной чувствительности к Plasmodium falciparum среди беременных женщин с  дефицитом железа по сравнению с беременными женщинами, имеющими нормальный гомеостаз железа [Oppenheimer et al., 1986; Menendez et al., 1994]. Более поздние исследования, проведенные среди детей в Занзибаре, показали, что среди группы детей, получавших препараты железа и фолиевую кислоту, инфекционная чувствительность к малярийному плазмодию увеличивается на 16%, по сравнению с группой детей, которые не получали препарат железа и фолиевую кислоту [Oppenheimer et al., 1986; Sazawal et al., 2006]. С нашей точки зрения, противоречия объясняются разными условиями эксперимента и неоднородностью сравниваемых клинических групп. В частности, для оценки показателей фагоцитоза, бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК) разными авторами используются не только разные штаммы, но и виды микроорганизмов, не учитывается железозависимость их вирулентных свойств. Показатели врожденного иммунитета доноров мужского пола с 0 (I) Rh (+) группой крови в возрасте от 20 до 35 лет с разными вариантами нарушений гомеостаза железа приведены в табл. 3.2.1 [Леонов, Миронов 2016]. Как следует из табл. 3.2.1, при исследовании сывороток доноров мужского пола с латентным дефицитом железа (ЛДЖ) концентрация сывороточного железа и Fr достоверно меньше контрольной группы (р > 0,05), а ОЖСС соответственно увеличивалась. При ЖДА концентрация сывороточного железа и Fr уменьшалась в 2,9 и 5,0 раза соответственно, а ОЖСС увеличилась в 1,5 раза относительно контрольной группы (р > 0,05). В группе доноров с ЖДА наблюдались изменения со стороны общих показателей кро98

ви. Обнаружены повышение величины СОЭ и изменения в формуле периферической крови: повышается количество лимфоцитов и снижается число моноцитов и ацидофилов. Таблица 3.2.1 Исследуемые показатели у обследуемых доноров с ЛДЖ и ЖДА (М±m) КонтрольГруппа Группа с ЖДА Показатель ная группа с ЛДЖ (n=23) (n=20) (n=15) Нb, г/л 162±0,6 135±0,3* 108±0,5* ОЖСС, мкМ 52,2±0,2 63,4±0,8* 77,3±0,3* [Fe2+]сыв., мкМ 25,3±0,1 12,7±0,6* 8,8±0,2* Fr, нг/мл 66,5±0,2 25,1±0,3* 13,4±0,7* ИЗФ 1,8±0,01 1,2±0,2 0,8±0,01* ФЧ 5,20±0,02 4,52±0,03* 4,1±0,01* НСТ сп, % 25,2±0,8 21,3±0,7* 13,1±0,5* НСТ ст, % 59,4±1,1 38,2±0,6* 22,4±1,5* БАСК, % 83,3±2,6 77,2±3,4* 62,4±3,1* Активность комп­ 40,7±1,1 33,3±1,8* 27,4±0,2* лемента, СH50 *обозначены достоверные отличия от показателей контрольной группы (р  100,0 мкМ – нежелезозависимые. Результаты определения константы сродства E. coli к ионам Fe2+ показывают, что она изменяется от 3,0 до 211,3 мкМ, для S. aureus от 3,0 до 110,8 мкМ, для P. aeruginosa от 3,0 до 108,8 мкМ. Доля штаммов E. coli, у которых отмечается признак железозависимости, составляет (90,1 ± 6,3)% (р < 0,05). Доля штаммов S. aureus, у которых отмечался признак железозависимости, составляет (60,0 ± 7,3)% (р < 0,05), тогда как все штаммы P. aeruginosa были отнесены к железозависимым. Значения Кs C. аlbicans, как можно было ожидать, сильно отличаются от Кs бактерий. Значения Кs C. аlbicans изменяются от 179,5 до 1 863,3 мкМ. По результатам определения Кs все штаммы C. аlbicans можно разделить лишь на две группы. Штаммы с Кs < 1000 мкМ отнесены к железозависимым, с Кs ≥ 1000 мкМ к слабо железозависимым. Доля штаммов C. аlbicans, у которых отмечается признак железозависимости, составила 100% (р < 0,05). На рис. 4.7 приведены средние значения Ks в зависимости от источника выделения микроорганизмов. Из всех изученных микроорганизмов наибольшей железозависимостью обладают штаммы P. aeruginosa и E. coli, наименьшей С. albicans. При сравнении значений Ks в зависимости от источника выделения обнаружено, что гемокультуры обладают более низкими значениями Ks по сравнению с культурами, изолированными из других источников. В среднем у  бактериальных штаммов, изолированных из крови, значения Ks на уровне 15,5 мкМ, у С. albicans на уровне 250,0 мкМ. 132

Суммарно из 60 исследованных штаммов микроорганизмов, выделенных из крови, 35 штаммов отнесены к сильно железозависимым, 23 – к слабо железозависимым, 2 – к нежелезозависимым.

Рис. 4.7. Зависимость константы сродства к железу (Ks, мкМ) микроорганизмов в зависимости от источника выделения. Среди исследованных условно-патогенных микроорганизмов низкие значения Ks коррелируют с уровнем экспрессии их АЛА (r  =  0,75), БПО (r  =  0,65), АК (r  =  0,68). В отношении ГА (r = 0,51) и АКА (r = 0,43) исследованных микроорганизмов установлена слабая и незначительная корреляционная связь с Ks соответственно. Анализ частоты распространения признака железозависимости среди госпитальных и негоспитальных вариантов исследованных бактерий показал, что все госпитальные штаммы относятся к сильно и слабо железозависимым. Полученные результаты кажутся нам вполне логичными, так как наиболее частой причиной сепсиса/бактериемии являются госпитальные штаммы условно-патогенных микроорганизмов. Основной средой обитания и эволюции госпитальных штаммов микроорганизмов является организм человека, и в отличие 133

от негоспитальных штаммов они лучше приспособились к условиям конкурентной борьбы за железо с организмом хозяина. а)

б)

Рис. 4.8. Кинетика потребления ионов железа Fe2+ для штаммов S. aureus (а) и E. coli (б).

Примечание. Железозависимые штаммы 4888 и 499, нежелезозависимые штаммы 25923 ATCC и 35218 АТСС.

На рис. 4.8 показано потребление ионов Fe2+ в процессе роста S. aureus и E. coli. Изменение [Fe2+] в питательной среде имеет вид перевернутого купола для всех изученных штаммов микроорганизмов и не зависит от их таксономической принадлежности. В период от 0 до 9 ч культивиро134

вания концентрация железа практически не изменяется в течение 9 ч роста, на кривой роста этот период соответствует лаг- и начальной лог-фазам роста. После 9 ч начинается фаза активного потребления железа, концентрация железа в питательной среде достоверно уменьшается, эта фаза соответствует поздней логарифмической и стационарной фазам роста. Именно в этот момент происходит экспрессия железозависимых свойств микроорганизмов. Максимальное потребление железа происходит через 15 ч культивирования для всех изученных бактерий. После 15 ч культивирования концентрация железа в среде начинает увеличиваться, что связано с освобождением железа, не задействованного в метаболизме, а также с высвобождением внутриклеточного железа за счет естественного отмирания части клеток популяции микроорганизмов. Из приведенных на рис. 4.8 зависимостей следует, что в среднем все штаммы исследованных бактерий потребляют железа, однако штаммы, выделенные из организма больного, потребляют больше железа, чем эталонные. В  среднем эталонный штамм S. aureus 25923 АТСС потребляет 0,85  мкМ Fe2+, а изолированный из организма больного штамм S. aureus 4844 потребляет 1,05 мкМ Fe2+. Аналогичные результаты получены для штаммов E. coli – 1,70 мкМ для эталонного штамма 35218 АТСС и 2,00 мкМ для штамма, изолированного из организма больного 499. Результаты позволяют предложить использовать константу Ks для характеристики железозависимости биопрофиля возбудителя (АЛА, АКА, БПО, АК, антибиотикорезистентность). Определение Кs может быть рекомендовано для использования в качестве маркера гемокультур/сепсисогенных штаммов для прогнозирования генерализации инфекционного процесса при условии отсутствия нарушений 135

со стороны гомеостаза железа – гемо- и гипосидерозов различного генеза. Приведем примеры использования железозависимости свойств возбудителя и его биопрофиля для характеристики гемокультур и прогноза осложнений. Пример 1. Больной П., 27 лет, госпитализирован с диагнозом: гнойная рана правого предплечья, межмышечная флегмона передней поверхности левого предплечья. При бактериологическом исследовании из очага воспаления выделен и идентифицирован S. aureus. Составлен биопрофиль штамма и определены константы его железозависимости: АЛА = 3,35 ± 0,2 мкг/мл ед. опт. пл.; БПО = 3,8 ± 0,01 ч-1; АК  =  2,92  ±  0,35 ммоль/л·мин; штамм продуцировал β-лактамазы; Кs = 30,3 мкМ. В совокупности анализ биопрофиля выделенного возбудителя (высокие значения всех показателей биопрофиля, а также низкие значения Ks для данного штамма S. aureus) позволил прогнозировать неблагоприятное течение заболевания с развитием осложнений. Послеоперационный период у больного П. протекал неблагоприятно, наблюдались местные признаки распространяющегося гнойного процесса, через несколько суток возбудитель выделен из крови. Пример 2. Больной С., 37 лет. Госпитализирован с термическим ожогом 2 степени, с поражением 25% площади тела, на 7 сутки, несмотря на интенсивную терапию, на фоне гранулирующей ткани увеличилось количество гнойного отделяемого, имеющего сине-зеленый цвет. При бактериологическом исследовании мокроты выделена и идентифицирована Р. aeruginosa. АЛА = 5,01 ± 0,01 мкг/мл ед. опт. пл.; БПО = 4,5 ± 0,03 ч-1; АК = 3,51 ± 0,11 ммоль/л·мин; штамм обладал множественной резистентностью к антибиотикам; Кs = 15,1 мкМ. 136

В совокупности анализ биопрофиля выделенного возбудителя (высокие значения всех показателей биопрофиля, а также низкие значения Ks для данного штамма Р.  aeruginosa) позволил прогнозировать неблагоприятное течение заболевания с развитием осложнений. У больного С. восстановительный период протекал неблагоприятно, возбудитель неоднократно выделен из крови. Пример 3. Больная К., 57 лет, диагноз «Пневмония». При бактериологическом исследовании мокроты выделена и идентифицирована Р. aeruginosa. Составлен анализ биопрофиля данного штамма и определены константы его железозависимости: АЛА = 4,21 ± 0,05 мкг/мл ед. опт. пл.; БПО = 4,9  ±  0,02  ч-1; АК  =  3,25  ±  0,15 ммоль/л∙мин; Кs = 41,2 мкМ. В совокупности анализ биопрофиля выделенного возбудителя (низкие значения всех показателей биопрофиля, а также высокие значения Ks для данного штамма Р. aeruginosa) позволили прогнозировать благоприятное течение заболевания. Дальнейшее течение заболевания подтвердило правильность прогностического заключения. *** Железозависимость патогенных свойств микроорганизмов может быть однозначно оценена по константе сродства микроорганизмов к железу – Ks. Проведенное исследование позволяет использовать железозависимые свойства микроорганизмов как критерий распознавания гемокультур оппортунистических патогенов – и предложить алгоритм дифференциации гемокультур и прогнозирования развития генерализованных осложнений, часто имеющих место при оппортунистических инфекциях различной локализации.

137

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время произошли кардинальные перемены в инфектологии. По-новому интерпретируются результаты многих исследований. На первое место вышли проблемы, связанные с условно-патогенными микроорганизмами, по-другому рассматриваются механизмы взаимодействия микроорганизмов с организмом хозяина. Большое значение придается роли организма хозяина в исходе инфекционного процесса, а конкретно его иммунной системе. Давно известно, что нарушения гомеостаза железа оказывают системное влияние на жизненно важные функции организма, особенно иммунной системы, и изменяют чувствительность макроорганизма к инфекционным патогенам. В этом отношении наиболее интересны внеклеточные оппортунистические патогены, которым и уделена большая часть данной монографии. Гомеостаз железа представлен ключевым механизмом, сдерживающим вирулентный потенциал условно-патогенных микроорганизмов, входящих в состав нормальной микробиоты организма хозяина, и увеличивающим антагонистическую активность доминантных аутохтонных микроорганизмов в отношении патогенной транзиторной микробиоты, попадающей в организм из окружающей среды. Выделены факторы патогенности условно-патогенных микроорганизмов, экспрессия которых железозависима, и предложено их использование для характеристики патогенности оппортунистических микроорганизмов. Обобщение современных исследований позволило выявить молекулярные механизмы всасывания, транспорта, рециркуляции и регуляции гомеостаза железа, теоретически обосновать возможность микроорганизмов изменять гомеостаз железа для реализации собственной стратегии получе138

ния железа. Представленные в монографии результаты исследований и литературных данных позволили рассмотреть некоторые механизмы взаимодействия оппортунистических микроорганизмов с организмом хозяина в условиях дефицита, вариантов нормы и избытка железа. Представленные в монографии материалы об изменении гомеостаза железа организма хозяина при инфекции, а также железозависимых свойств микроорганизмов открывают перспективы дальнейшего развития исследований в области инфектологии. Изучение железозависимости биопрофиля возбудителя по его ростовой активности под действием лимита железа позволяет понять многие инфектологические механизмы взаимодействия оппортунистических патогенов с организмом хозяина и решить вполне практические задачи дифференциации гемокультур от штаммов, выделенных из других биотопов. На конкретных примерах рассмотрены возможности использования биопрофиля возбудителя для прогнозирования возникновения септических осложнений. Некоторые выдвинутые в книге положения, возможно, вызовут критические замечания, на основании которых может возникнуть полезная дискуссия, к которой авторы с интересом присоединятся.

139

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

256 с.

Акатов А. К., Зуева В. С. Стафилококки. М.: Медицина, 1983.

Андреева-Ковалевская Ж. И., Солонин А. С., Синева Е. В., Терновский В. И. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды // Усп. биол. химии. 2008. Т. 48. С. 267–318. Баркова Э. Н., Жданова Е. В., Курлович Н. А. Хронофизиология и хронопатология обмена железа. Екатеринбург: Полиграфист, 2001. 239 с. Баснакьян И. А. Стресс у бактерий. М.: Медицина, 2003. 136 с. Бисярина В. П., Казакова Л. М. Железодефицитные анемии у детей раннего возраста. М.: Медицина, 1979. 175 с. Борзенкова Н. В., Балабушевич Н. Г., Ларионова Н. И. Лактоферрин: физико-химические свойства, биологические функции, системы доставки, лекарственные препараты и биологически активные добавки (обзор) // Биофармацевтический журнал. 2010. Т. 2 (3). С. 3–19. Бургасов П. Н., Румянцев С. Н. Антимикробный конституциональный иммунитет. М.: Медицина, 1985. 256 с. Бухарин О. В. Персистенция бактерий. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. 365 с. Бухарин О. В., Брудастов Ю. А., Дерябин Д. Г. Изучение антикомплементарной активности стафилококков. Клиническая лабораторная диагностика. 1992. № 11–12: 68–71. Бухарин О. В. Черкасов С. В., Сгибнев А. В., Забирова  Т. М., Иванов Ю. Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538  P. БЭБИМ. 2000. Т. 130 (7). С. 80–82. Бухарин О. В., Гинцбург А. Л., Романова Ю. М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. 367 с. Бухарин О. В., Сгибнев А. В., Черкасов С. В. Сравнительная характеристика антимикробных эффектов гидроксильных радикалов и пероксида водорода // Дезинфекционное дело. 2013. № 3. С. 38–42. Бухарин О. В., Скоробогатых Ю. И., Курлаев П. П. Экспериментальное обоснование эффективности сочетанного применения ципрофлоксацина с окситоцином // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 5. С. 70–73. 140

Бухарин О. В., Стадников А. А., Чернова О. Л. и др. Биологическое значение антикарнозиновой активности бактерий // Журн. микробиол. 2000. № 4. С. 56–59. Валышева И. В. Антилактоферриновая активность микроорганизмов: Дис. канд. биол. наук, Оренбург: НИИ клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, 2005. 140 с. Вострокнутова Г. Н., Капрельянц А. С., Светличный В. В. и др. Мембраноактивные свойства препарата из культуральной жидкости бактерий, обладающего ауторегуляторным действием // Прикл. микробиология и биохимия. 1983. Т. 19. Вып. 4. С. 547–551. Гамцемлидзе К. И., Бурлев В. А, Мурашко Л. Е. Ферритин – маркер железодефицитных состояний // Акушерство. 2006. № 2. С. 45–48. Головин А. А., Соколова Т. Ф. Состояние и причины изменения иммунологической реактивности у больных железодефицитной ане­ мией // Гематол. и трансфузиология. 1992. Т. 37. № 7/8. С. 17–20. Дерябин Д. Г. Стафилококки. Экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. 238 с. Ермилова Е. В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2007. 299 с. Ермилова Е. В., Залуцкая Ж. М., Лапина Т. В., Матвеева Т. В. Количественный анализ экспрессии генов. Учебное пособие. СПб.: ТЕССА, 2010. 104 с. Иванов Н. Р., Бриль Г. Е. Молекулярно-клеточные аспекты гемолитического действия стафилококкового α-токсина // Журн. микробиол. 1984. № 9. С. 3–9. Казакова Л. М., Гараничев В. С., Комарова М. А. и др. Некоторые неспецифические факторы защиты при дефиците железа у детей // Педиатрия. 1984. № 9. С. 31–33. Казюкова Т. В., Самсыгина Г. А., Левина А. А. Проблемы терапии железодефицитной анемии у детей // Педиатрия. 2002. № 6. С. 4–10. Киргизова С. Б., Миронов А. Ю., Михайлова Е. А., Кшнясева С. К., Махалова Г. О. Диагностика и профилактика стафилококкового носительства среди студентов медицинского вуза // Клиническая лабораторная диагностика. 2015. № 7. С. 89. Козлов В. К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии. СПб.: Диалект, 2006. 304 с. Козырев Д. П., Васинова Н. А. Роль железорегулируемых генов в патогенности бактерий // Цитология. 2004. Т. 46. № 5. С. 465–472. Козырева H. B., Казакова Л. М. Наследственный гемохроматоз // Педиатрия. 2006. № 6. С. 96–102. 141

Колпаков А. И., Ильинская А. Н., Беспалов М. И. и др. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 224–230. Красильников О. В., Ташпулатов А. Ш., Мусаев Ю. М. Изучение гемолитического действия стафилотоксина // Вопросы мед. химии. 1985. Т. 31 (6). С. 64–67. Левина А. А., Казюкова Т. В., Цветаева Н. В. и др. Гепсидин как регулятор гомеостаза железа // Педиатрия. 2008. Т. 87. № 1. С. 67–74. Леонов В. В. Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте // Клиническая лабораторная диагностика. 2012. № 10. С. 57–59. Леонов В. В., Булатов И. А., Миронов А. Ю. Рост и  экспрессия факторов вирулентности условно-патогенных микроорганизмов в сыворотке крови при разных вариантах гомеостаза железа // Клиническая лабораторная диагностика. 2016. Т. 61 (8). C. 498–501. Леонов В. В., Костерина В. В., Варницына В. В., Тимохина Т. Х., Курлович Н. А. Железозависимый синтез гемолизинов Staphylococcus aureus // БЭБИМ. 2012. Т. 153 (1). С. 49–51. Леонов В. В., Курлович Н. А., Леонова Л. В., Фатеева Н. М. О возможности влияния микроорганизмов на гомеостаз железа в организме хозяина (обзор литературы) // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. 2014. Т. 1. № 95. С. 120–125. Леонов В. В., Леонова Л. В., Деревянко Л. Н. и др. Влияние эпинефрина на патогенность госпитальных стафилококков // Вестник Ивановской медицинской академии. 2014. Т. 19. № 4. С. 23–26. Леонов В. В., Миронов А. Ю. Биопленкообразование оппортунистических микроорганизмов в плазме крови в зависимости от содержания железа // Клиническая лабораторная диагностика. 2016а. Т. 61. № 1. C. 52–54. Леонов В. В., Миронов А. Ю. Восприимчивость организма к патогенам в зависимости от гомеостаза железа // Курский научный вестник «Человек и его здоровье». 2016б. № 2. C. 69–73. Леонов В. В., Молчанова Т. Н. Влияние железа на ростовые характеристики условно-патогенных бактерий // Медицинская наука и образование Урала. 2011. Т. 12. № 4. С. 41–43. Малаховский Ю. Е., Манеров Ф. К., Чернов О. М. и др. Иммунный ответ и заболеваемость некоторыми инфекциями у детей с железодефицитной анемией // Педиатрия. 1983. № 8. С. 28–31. 142

Меньшикова Е. А., Миронова А. В., Подосинникова Л.  С. и др. Роль ионов железа в продукции гемолизина токсигенными и нетоксигенными холерными вибрионами различных серогрупп // Журн. микробиол. 2004. № 3. С. 78–81. Миронов А. Ю., Воробьев А. А. Патогенные кокки. М.: Издательский дом «Русский врач», 2000. 64 c. Миронов А. Ю., Воробьев А. А., Несвижский Ю. В., Нечаев Д. Н. Учение об инфекции. М.: Издательский дом «Русский врач», 2000. 82 c. Миронов А. Ю., Леонов В. В. Железо, вирулентность и межмикробные взаимодействия условно-патогенных микробов // Успехи современной биологии. 2016. T. 136. № 3. С. 285–294. Миронов А. Ю., Харсеева Г. Г., Клюкина Т. В. Основы клинической микробиологии. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ, 2011. 248 c. Михайлова Е. А., Сетко Н. П., Миронов А. Ю., Харсеева Г. Г., Жеребятьева О. О., Воронина Л. Г. Выявление маркеров неблагоприятного течения урогенитальных микробных заболеваний // Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 6 (243). С. 29–30. Пулина М. О. Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина: дисс. ... канд. биол. наук. СПб., 2004. 105 с. Ратгауз Г. Л. Об образовании и секреции α-токсина патогенным стафилококком // Журн. микробиол. 1970. № 10. С. 37–41. Реброва Р. Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. М.: Медицина, 1989. 132 с. Рожавин М. А. Исследование патогенности Pseudomonas aeruginosa // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988. № 3. C. 106–112. Русанова Е. В., Нестерова М. В., Ворожцов А. А., Миронов А. Ю. Pseudomonas aeruginosa при гнойно-воспалительных заболеваниях кожи и мягких тканей // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2008. № 3. С. 64–68. Филимонов В. И., Тихоновская М. А., Бессараб Г. И. и др. // Запорожский медицинский журнал. 2012. № 4 (73). С. 54–59. Чеботарь И. В. Аспартат протеазы грибов рода Candida – потенциальная мишень для антивирулентной терапии // Клиническая дерматология и венерология. 2012. № 1. С. 33–38. Шаталова Е. В., Бельский В. В. Смешанные инфекции ожоговой травмы. Курск: КГМУ, 1998. 94 с. Шафран Л. М., Пыхтеева Е. Г., Шитко Е. С. Система транспорта железа в клетках: физиология и токсикология поглощения из пищи 143

энтероцитами кишечника // Сучаснi проблеми токсикологii. 2012. № 2. С. 5–16. Шпаков А. О. Пептидные аутоиндукторы бактерий // Микробиология. 2009а. Т. 78. № 3. С. 291–303. Шпаков А. О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы QS-типа // Микробиология. 2009б. Т. 78. № 2. С. 163–175. Эль-Регистан Г. И. Покой как форма адаптации микроорганизмов. М.: Медицина, 2005. С. 11–129. Abboud S., Haile D. J. A novel mammalian iron-regulated protein involved in intracellular iron metabolism // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 19906–19912. Actis L. A., Tolmasky M. E., Crosa L. M., Crosa J. H. Characterization and regulation of the expression of FatB, an iron transport protein encoded by the pJM1 virulence plasmid // Mol. Microbiol. 1995. V. 17. P. 197–204. Aisen P., Leibman A. Lactoferrin and transferrin: a comparative study // Biochim Biophys Acta. 1972. V. 257 (2). P. 314–323. Aisen P., Liebman A., Zweier J. Stoichiometric and site characteristics of the binding of iron to human transferrin // J.Biol.Chem. 1978. V. 253 (6). P. 1930–1937. Alcantara J., Yu R. H., Schryvers A. B. The region of human transferrin involved in binding to bacterial transferrin receptors is localized in the C-lobe // Mol. Microbiol. 1993. V. 8. P. 1135–1143. Altenbern R. A. Formation of haemolysin by strains of Pseudomonas aeruginosa // Can. J. Microbiol. 1965. V. 12. P. 231–241. Anderson B. F., Baker H. M., Dodson E. J. et al. Structure of human lactoferrin at 3.2-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 4 (7). P. 1769–1773. Anderson J. E., Sparling P. F., Cornelissen C. N. Gonococcal transferrin-binding protein 2 facilitates but is not essential for transferring utilization // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 3162–3170. Andrews N. C. Forging a field: the golden age of iron biology // Blood. 2008. V. 112. Р. 219–230. Andrews N. S. The iron transporter DMT1 // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31. P. 991–994. Andrews N.C. Metal transporters and diseas // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. V. 6. P. 181–186. Andrews S. C. Iron in bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1998. V. 40. P. 281–351. 144

Ankenbauer R. G., Cox C. D. Isolation and characterization of Pseudomonas aeruginosa mutants requiring salicylic acid for pyochelin biosynthesis // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 5364–5367. Ankenbauer R. G., Quan H. N. FptA, the Fe(III)-pyochelin receptor of Pseudomonas aeruginosa: a phenolate siderophore receptor homologous to hydroxamate siderophore receptors. // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 307–319. Ardon O., Bussey H., Philpott C. et al. Identification of a  Candida albicans ferrichrome transporter and its characterization by expression in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 43049–43055. Arnold R. R., Brewer M., Gauthier J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms // Infec. Immun. 1980. V. 28 (3). P. 893–898. Arosio P., Adelman T. G., Drysdale J. W. On ferritin heterogeneity. Further evidence for heteropolymers // J. Biol. Chemistry. 1978. V. 253. P. 4451–4458. Bagg A., Neilands J.B. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5471– 5477. Baker H. M., Baker E. N. Lactoferrin and iron: structural and dynamic aspects of binding and release // BioMetals. 2004. V. 17. P. 209–216. Barb W. G., Baxendale J. H., George P., Hargrave K. R. Reactions of ferrous and ferric ions with hydrogen peroxide. // Nature. 1949. V. 163. P. 692–694. Barnewall R. E., Ohashi N., Rikihisa Y. Ehrlichia chaffeensis and E. sennetsu, but not the human granulocytic ehrlichiosis agent, colocalize with transferrin receptor and up-regulate transferrin receptor mRNA by activating iron-responsive protein 1 // Infect Immun. 1999. V. 67. P. 2258–2265. Barton L. L., Friedman A. D. Impetigo: a reassessment of etiology and therapy // Pediatr. Dermatol. 1987. V. 4. P. 185–188. Bates G. W., Schlabach M. R. The reaction of ferric salts with transferrin // J. Biol. Chem. 1973. V. 248 (9). P. 3228–3232. Becerra C., Albesa I., Eraso A. J. Leukotoxicity of pyoverdin, production of reactive oxygen species, and effect of UV A. radiation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 285. P. 414–418. Bergamini C. M., Gambetti S., Dondi A., Cervellati C. Oxygen, reactive oxygen species and tissue damage. // Curr. Pharm. Des. 2004. V. 10. P. 1611–1626. 145

Berka R. M., Gray G. L., Vasil M. L. Studies of phospholipase C (heatlabile haemolysin) in Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1981. V. 34. P. 1071–1074. Bhakdi S. Decomplementation antigen, a possible determinant of staphylococcal patogenicity // Infect. Immun. 1985. № 1. P. 41–46. Bhakdi S., Bayley H., Valeva A. et al. Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin O and Escherichia coli hemolysm: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins // Arch. Microbiol. 1996. V. 165. P. 73–79. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus // Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 733–51. Bjorn M., Iglewski B.H., Sadoff J., Vasil M.L. Effect of iron on yields of exotoxin A in cultures of Pseudomonas aeruginosa PA103 // Infect. Immun. 1978. V. 19. P. 785–791. Bozzini S., Visa L., Pignatti P., Petersen T. E., Speziale  P. Multiple binding sites in fibronectin and the staphylococcal fibronectin receptor // Eur. J. Biochem. 1992. V. 207. P. 327–333. Brasse-Lagnel C., Karim Z., Letteron P. et al. Intestinal DMT1 cotransporter is downregulated by hepcidin via proteasome-internalization and degradation. Gastroenterology. 2011. V. 140. P. 1261–1271.e1. Braun V. Energy-coupled transport and signal transduction through the Gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptor proteins. // FEMS Microbiol. Rev. 1995. V. 16. P. 295–307. Braun V., Killmann H. Bacterial solutions to the iron-supply problem // Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24. P. 104–109. Brem D., Pelludat C., Rakin A., Jacobi C.A., Heesemann J. Functional analysis of yersiniabactin transport genes of Yersinia enterocolitica // Microbiology. 2001. V. 147. P. 1115–1127. Brock J. H., Williams P. H., Liceaga J., Wooldridge K. G. Relative availability of transferring bound iron and cell-derived iron to aerobactinproducing and enterochelin-producing strains of Escherichia coli and other microorganisms // Infect. Immun. 1991. V. 59. P. 3185–3190. Bruyneel B., Vandewoestyne M., Verstraete W. Lactic acid bacteria: microorganisms able to grow in the absence of available iron and copper // Biotechnol. Lett. 1989. V. 11. P. 401–406. Bryon W., Petschow R. Talbott D. Biosynthesis and degradation of H2O2 by vaginal lactobacilli // J. Clin. Microbio. 1990. V. 76 (2). P. 287–292. Buchanan S. K., Smith B. S., Venkatramani L. et al. Crystal structure of the outer membrane active transporter FepA from Escherichia coli // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 56–63. 146

Cadet J., Douki T., Gasparutto D., Ravanat J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features // Mutat. Res. 2003. V. 531. P. 5–23. Camejo G., Halberg C., Manschik-Lundin A. et al. Hemin binding and oxidation of lipoproteins in serum: mechanisms and effect on the interaction of LDL with human macrophages // J Lipid Res. 1998. V. 39. P. 755–766. Camejo G., Halberg C., Manschik-Lundin A. et al. Hemin binding and oxidation of lipoproteins in serum: mechanisms and effect on the interaction of LDL with human macrophages. // J. Lipid. Res. 1998. V. 39. P. 755–766. Carrano C. J., Raymond K. N. Coordination chemistry of microbial iron transport compounds: rhodotorulic acid and iron uptake in Rhodotorula pilimanae // J. Bacteriol. 1978. V. 136. P. 69–74. Cartron M. L., Maddocks S., Gillingham P., Craven C. J., Andrews S. C. Feo-Transport of ferrous iron into bacteria // Biometals. 2006. V. 19. P. 143–157. Challis G. L. A widely distributed bacterial pathway for siderophore biosynthesis independent of nonribosomal peptide synthetases // Chembiochem. 2005. V. 6. P. 601–611. Chen C. J., Elkins C., Sparling P.F. Phase variation of hemoglobin utilization in Neisseria gonorrhoeae // Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 987– 993. Cheung J., Beasley F.C., Liu S., Lajoie G.A., Heinrichs D.E. Molecular characterization of staphyloferrin B biosynthesis in Staphylococcus aureus // Mol. Microbiol. 2009. V. 74. P. 594–608. Chin J. C., Watts J. E. Biological properties of phospholipase C purified from a fleecerot isolate of Pseudomonas aeruginosa // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 2567–2575. Chipperfield J. R. Ratledge С. Salicylic acid is not a bacterial siderophore: a theoretical study. // Biometals. 2000. V. 13. P. 165–168. Clemens D. L., Horwitz M. A. The Mycobacterium tuberculosis phagosome interacts with early endosomes and is accessible to exogenously administered transferrin // J Exp. Med. 1996. V. 184. P. 1349–1355. Cobessi D., Celia H., Folschweiller N. et al. The crystal structure of the pyoverdine outer membrane receptor FpvA from Pseudomonas aeruginosa at 3.6 angstroms resolution // J. Mol. Biol. 2005а. V. 347. P. 121–134. Cobessi D., Celia H., Pattus F. Crystal structure at high resolution of ferric-pyochelin and its membrane receptor FptA from Pseudomonas aeruginosa // J. Mol. Biol. 2005b. V. 352. P. 893–904. Cohen M. S., Britigan B. E., Hasset D. J. et al. Phagocytes, O2 reduction, and hydroxyl radical // Rev. Infect. Dis. 1988. V. 10. P. 1088. 147

Colas C., Ortiz de Montellano P. R. Autocatalytic radical reactions in physiological prosthetic heme modification // Chem. ReV. 2003. V. 103. P. 2305–2332. Conrad M. E., Weintraub L. R., Sears D. A., Crosby W. H. Absorption of hemoglobin iron // Am. J. Physiol. 1966. V. 211. P. 1123–1130. Conrad M. E., Umbreit J. N., Peterson R. D. A. et al. Function of integrin in duodenal mucosal uptake of iron // Blood. 1993. V. 81. P. 517–521. Conrad M. E., Umbreit J. N. Iron absorption – The mucin mobilferrin integrin pathway. A competitive pathway for iron absorption // Am. J. Hematol. 1993. V. 42. P. 67–73. Conrad M. E., Umbreit J. N. Pathways of iron absorption  // Blood Cells Mol. Dis. 2002. V. 29. P. 336–355. Conrad M. E., Umbreit J. N., Moore E. G. et al. A newly identified iron binding protein in duodenal mucosa of rats. Purification and characterization of mobilferrin // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 5273–5279. Cope L. D., Thomas S. E., Hrkal Z., Hansen E. J. Binding of hemehemopexin complexes by soluble HxuA protein allows utilization of this complexed heme by Haemophilus influenzae // Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 4511–4516. Cornelissen C. N. Transferrin-iron uptake by Gram-negative bacteria // Front. Biosci. 2003. V. 8. P. 836–847. Cortajarena A. L., Goni F. M., Ostolaza H. A receptor-binding region in Escherichia coli alpha-haemolysin // J. Biol. Chem., 2003. V. 278. P. 19159–19163. Cortajarena A. L., Goni F. M., Ostolaza H. His-859 is an essential residue for the activity and pH dependence of Escherichia coli RTX toxin alpha-hemolysin // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 23223–23229. Cotton J. L., Tao J., Balibar C. J. Identification and characterization of the Staphylococcus aureus gene cluster coding for staphyloferrin A. // Biochem. 2009. V. 48. P. 1025–1035. Courcol R. J., Trivier D., Bissinger M., Martin G. R., Brown M. W. Siderophore Production by Staphylococcus aureus and Identification of IronRegulated Proteins // Infec. Immun. 1997. V. 65. № 5. P. 1944–1948. Cox C. D. Effect of pyochelin on the virulence of  Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1982. V. 36. P. 17–23. Cox C. D. Iron uptake with ferripyochelin and ferric citrate by Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1980. V. 142. P. 581–587. Cox C. D., Adams P. Siderophore activity of pyoverdin for Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1985. V. 48. P. 130–138. 148

Cox C. D., Graham R. Isolation of an iron-binding compound from Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1979. V. 137. P. 357–364. Cox C.D. Iron transport and serum resistance in Pseudomonas aeruginosa // Antibiot Chemother. 1985. V. 36. P. 1–12. Crosa J. H. A plasmid associated with virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum specifies an iron-sequestering system // Nature. 1980. V. 284. P. 566–568. Crosa J. H., Walsh C. T. Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. V. 66. P. 223–249. Dale S. E., Doherty-Kirby A., Lajoie G., Heinrichs D. E. Role of siderophore biosynthesis in virulence of Staphylococcus aureus: identification and characterization of genes involved in production of a siderophore // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 29–37. Danley D. L., Hilger A. E., Winkel C. A. Generation of hydrogen peroxide by Candida albicans and influence on murine polymorphonuclear leukocyte activity // Infect. Immun. 1983. V. 40. P. 97–102. De Lorenzo V., Herrero M., Giovannini F., Neilands J. B. Fur (ferric uptake regulation) protein and CAP (catabolite-activator protein) modulate transcription of fur gene in Escherichia coli // J. Biochem. 1988. V. 173. P. 537–546. De Lorenzo V., Wee S., Herrero M., Neilands J. B. Operator sequences of the aerobactin operon of plasmid ColVK30 binding the ferric uptake regulation (fur) repressor // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 1624–2630. Dean C.R., Neshat S., Poole K. PfeR, an enterobactin-responsive activator of ferric enterobactin receptor gene expression in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 5361–5369. DeCarlo A. A., Paramaesvaran M., Yun P.L., Collyer C., Hunter N. Porphyrin-mediated binding to hemoglobin by the HA2 domain of cysteine proteinases (gingipains) and hemagglutinins from the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 3784–3791. Deicher R., Horl W. H. New insights into the regulation of iron homeostasis // Eur. J. Clin. Inv. 2006. V. 36. P. 301–308. Dertz E. A., Raymond K. N. 2003. Siderophores and transferrins, p.  141–168. In L. Que, Jr., and W. B. Tolman (ed.), Comprehensive coordination chemistry II, vol. 8. Elsevier, Ltd., Philadelphia, PA. Dertz E. A., Raymond K. N. 2004. Biochemical and physical properties of siderophores, p. 3–17. In J. H. Crosa, A. R. Mey, and S. M. Payne (ed.), Iron transport in bacteria. ASM Press, Washington, DC. 149

DeRycke J, Gonzalez E. A., Blanco J. et al. Evidence for two types of cytotoxic necrotizing factor in human and animal clinical isolates of Escherichia coli. // J Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 694–699. Doery H. M., Magnusson B. J., Gulasekharam J., Pearson J. E. The properties of phospholipase enzymes in staphylococcal toxins // J. Gen. Microbiol. 1965. V. 40. P. 283–296. Donghak K., Erik T. Yukl, Pierre Moe¨nne-Loccoz, Paul  R. Ortiz de Montellano Fungal Heme Oxygenases: Functional Expression and Characterization of Hmx1 from Saccharomyces cereVisiae and CaHmx1 from Candida albicans // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 14772–14780. Dryla A., Gelbmann D., von Gabain A., Nagy E. Identification of a novel iron regulated staphylococcal surface protein with haptoglobinhaemoglobin binding activity // Mol. Microbiol. 2003. V. 49. P. 37–53. Duhutrel P., Bordat C., Wu T. et al. Iron Sources Used by the Nonpathogenic Lactic Acid Bacterium Lactobacillus sakei as Revealed by Electron Energy Loss Spectroscopy and Secondary-Ion Mass Spectrometry // Applied And Environmental Microbiology. 2010. V. 76 (2). P. 560–565. Eisenstein R. S., Blaming K. P. Iron regulatory proteins, iron responsive elements and iron homeostasis // J. Nutr. 1996. 128. Р. 2295–2298. Elkins C., Chen C. J., Thomas C. E. Characterization of the hgbA locus encoding a hemoglobin receptor from Haemophilus ducreyi // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 2194–2200. Ellison 3rd, R. T., Giehl T. J., La Force F. M. Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin // Infect. Immun. 1988. V. 56. P. 2774–2781. Enard C., Diolez A., Expert D. Systemic virulence of Erwinia chrysanthemi 3937 requires a functional iron assimilation system // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 2419–2426. Enz S., Mahren S., Stroeher U. H., Braun V. Surface signaling in ferric citrate transport gene induction: interaction of the FecA, FecR, and FecI regulatory proteins // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 637–646. Ernst J. F., Bennet R. L., Rothfield L. I. Constitutive expression of the iron-enterochelin and ferrichrome uptake systems in a mutant strain of Salmonella typhimurium // J Bacteriol. 1978. V. 135. P. 928–934. Evans R. W., Crawley J. B., Joannou C., Sharma N. Iron proteins In Iron Infection // Chichester: John Wiley & Sons. 1999. Fabriek B. O., Dijkstra C. D., van den Berg T. K. The macrophage scavenger receptor CD163 // Immunobiology. 2005. V. 210. P. 153–160. 150

Fallon K., Bausch K., Noonan J. et al. Role of aspartic proteases in disseminated Candida albicans infection in mict // Infect. Immun. 1997. V. 65. P. 2: 551–556. Ferreiros C. M., Criado M. T., Pintor M., Ferron L. Analysis of the molecular mass heterogeneity of the transferrin receptor in Neisseria meningitidis and commensal Neisseria. // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 67. P. 123–136. Fillat M. F. The FUR (ferric uptake regulator) superfamily: diversity and versatility of key transcriptional regulators. // Arch. Biochem. Biophys. 2014. V. 546. P. 41–52. Fleming R. E., Sly W. S. Ferroportin mutation in autosomal dominant hemochromatosis: loss of function, gain in understanding // J. Clin. Invest. 2001. V. 108. P. 521–524. Forbes J. R., Gros P. Divalent metal transport by Nramp proteins at the interface of host-pathogen interactions // Trends Microbiol. 2001. V. 9. P. 397–403. Freestone P. P., Haigh R. D., Williams P. H., Lyte M. Involvement of enterobactin in norepinephrine-mediated iron supply from transferrin to enterohemorrhagic Escherichia coli // FEMS Microbiol. Lett. 2003. V. 222. P. 39–43. Friedman D. B., Stauff D. L., Pischany G. et al. Staphylococcus aureus redirects central metabolism to increase iron availability // PLoS Pathog. 2006. V. 2. P. 777–789. Fuqua W., Winans S., Greenberg E. P. Quorum sensing in bacteria: the Lux R – Lux I family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 1994. V. 176 (2). P. 269–275. Fuqua W.C., Greenberg E. P. Listening in on bacteria: acyl-gomoserin lacton signaling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. V. 3. P. 685–695. Galmiche A. Toxines bacteriennes. Facterus de virulence et outiles de biologie cellulaire // Med. Science. 2001. V. 17. № 6–7. Р. 691–700. Ganz T. Hepcidin, a key regulator of iron metabolism and mediator of anemia of inflammation // Blood. 2003. V. 102. P. 783–788. Garate M., Nunez M. Overexpression of the ferritin Iron-responsive element decreases the labile iron pool and abolishes the regulation of iron absorption by Intestinal epithelial (Caco-2) Cells // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 1651–1655. Georgatsou E., Mavrogiannis L. A., Fragiadakis G. S., Alexandraki D. The yeast Fre1p/Fre2p cupric reductases facilitate copper uptake and are regulated by the copper-modulated Mac1p activator. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 13786–13792. 151

Gladys O. Latunde-Dada, Robert J. Simpson, Andrew  T. McKie Recent advances in mammalian haem transport // TRENDS in Biochemical Sciences. 2006. V. 31 (3). Р. 182–188. Gomes A. M. P., Malcata F. X. Bifidobacterium spp. and Lactococcus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics // Trends Food Sci. Technol. 1999. V. 10. P. 139–157. Gomez J. A., Criado M. T., Ferreiros C. M. Cooperation between the components of the meningococcal transferrin receptor, TbpA and TbpB, in the uptake of transferrin iron by the 37-kDa ferric-binding protein (FbpA) // Res. Microbiol. 1998. V. 149. P. 381–387. Greg S. Martin M. D., David M. et al. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 trought 2000 // N Engl J Med. 2003. V. 348. P. 1546–1554. Griffiths E. Williams P. The iron-uptake systems of pathogenic bacteria, fungi and protozoa, In J. J. Bullen and E. Griffiths (ed.), Iron and infection, 2nd ed. John Wiley and Sons, Ltd., New York. 1999. P. 87–212. Griffiths E., Stevenson P., Ray A. Antigenic and molecular heterogeneity of the transferrin-binding protein of Neisseria meningitidis. // FEMS Microbiol Lett. 1990. V. 57. P. 31–36. Gunshin H., Mackenzie B., Berger U. V. et al. Cloning and characterization of a mammalian protoncoupled metal-ion transporter // Nature. 1997. V. 388. P. 482–488. Guo J.-H., Abedi M., Aust S. D. Expression and Loading of Recombinant Heavy and Light Chain Homopolymers of Rat Liver Ferritin // Arch. Biochem. Biophys. 1996. V. 335 (1). P. 197–204. Haag H., Fiedler H. P., Meiwes J. et al. Isolation and biological characterization of staphyloferrin B, a compound with siderophore activity from staphylococci // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 115. P. 125–130. Haber F., Weiss J. On the catalysis of hyperoxide // Naturwissenschaften. 1932. V. 20. P. 948–950. Halberg F., Howard R. B. 24h periodicity and experimental medicine. Examples and interpretation // Postgrad. Med. 1958. V. 24. P. 349–358. Hantke K. Iron and metal regulation in bacteria // Curr. Opin. Microbiol. 2001. V. 4. P. 172–177. Hantke K. Is the bacterial ferrous iron transporter FeoB a living fossil? // Trends Microbiol. 2003. V. 11. № 5. P. 192–195. Hantke K. Regulation of ferric iron transport in Escherichia coli K-12: isolation of a constitutive mutant // Mol Gen Genet. 1981. V. 182. P. 288–292. 152

Hantke K., Nicholson G., Rabsch W., Winkelmann G. Salmochelins, siderophores of Salmonella enterica and uropathogenic Escherichia coli strains, are recognized by the outer membrane receptor IroN // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 3677–3682. Harding R. A., Royt P. W. Acquisition of iron from citrate by Pseudomonas aeruginosa // J. Gen. Microbiol. 1990. V. 136. P. 1859–1867. Harrington D. J. Bacterial collagenases and collagen degrading enzymes and their potential role in human disease // Infect. Immun. 1996. V. 64. P. 1885–1891. Harris W. R., Carrano C. J., Raymond K. N. Coordination chemistry of microbial iron transport compounds. 16. Isolation, characterization and formation constants of ferric aerobactin // J. Am. Chem. Soc. 1979. V. 101. P. 2722–2727. Harris Z. L., Takahashi Y., Miyajima H. et al. Acemloplasminemia: Molecular characterization of this disorder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 2539–2343. Harrison P.M., Arosio P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. V. 1275. P. 161–203. Hartford T., O’Brien S., Andrew P. W., Jones D., Roberts I. S. Utilization of transferrin-bound iron by Listeria monocytogenes  // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 108. P. 311–318. Heesemann J., Hantke K., Vocke T. et al. Virulence of Yersinia enterocolitica is closely associated with siderophore production, expression of an iron-repressible outer membrane polypeptide of 65,000 Da and pesticin sensitivity // Mol. Microbiol. 1993. V. 8. P. 397–408. Heymann P., Ernst J. F. Winkelmann G. Identification of a fungal triacetylfusarinine C siderophore transport gene (TAF1) in Saccharomyces cerevisiae as a member of the major facilitator superfamily // Biometals. 1999. V. 12. P. 301–306. Heymann P., Ernst J. F., Winkelmann G. A gene of the major facilitator superfamily encodes a transporter for enterobactin (Enb1p) in Saccharomyces cerevisiae // Biometals. 2000a. V. 13. P. 65–72. Heymann P., Ernst J. F., Winkelmann G. Identification and substrate specificity of a ferrichrome-type siderophore transporter (Arn1p) in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Lett. 2000b. V. 186. P. 221– 227. Heymann P., Gerads M., Schaller M. et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome153

type siderophores and is required for epithelial invasion // Infect. Immun. 2002. V. 70. P. 5246–5255. Higgs P. I., Larsen R. A., Postle K. Quantification of known components of the Escherichia coli TonB energy transduction system: TonB, ExbB, ExbD and FepA // Mol. Microbiol. 2002. V. 44. P. 271–281. Hirayama M., Kohgo Y., Kondo H., Niitsu Y. Regulation of iron metabolism in HepG2 cells: a possible role for cytokines in the hepatic deposition of iron // Hepatology. 1993. V. 18. P. 874–880. Hirotsu S., Chu G., Unno M., Lee D. et al. The crystal structures of the ferric and ferrous of the heme complex of HmuO, a heme oxygenase of Corynebacterium diphtheriae // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 11937–11947. Hogger P., Dreier J., Droste A., Buck F., Sorg C. Identification of the integral membrane protein RM3/1 on human monocytes as a glucocorticoidinducible member of the scavenger receptor cysteine-rich family (CD163) // J Immunol. 1998. V. 161. P. 1883–1890. Holzberg M., Artis W. M. Hydroxamate siderophore production by opportunistic and systemic fungal pathogens // Infect. Immun. 1983. V. 40. P. 1134–1139. Hostetter M. K. Interaction of Candida albicans with eukaryotic cells // ASM News. 1994. V. 60. P. 370–374. Howard D. H. Mechanisms of resistance in the systemic mycoses // Immunology of human infection. Plenum Press, New York, N. Y. 1981. P. 475–494. Howe D., Mallavia L. P. Coxiella burnetii infection increases transferrin receptors on J774A. 1 cells // Infect Immun. 1999. V. 67. P. 3236– 3241. Hunt J. R., Roughead Z. K. Adaptation of iron absorption in men consuming diets with high or low iron biovavailability. Amer. J. Clin. Nutr. 2000. 71: 94–102. Hunt L. T., Barker W. C., Chen H. R. A domain structure common to hemopexin, vitronectin, interstitial collagenase, and a collagenase homolog // Protein Seq Data Anal. 1987. V. 1. P. 21–26. Hunter H. N., Fulton D. B., Vogel H. J. The solution structure of human hepcidin, a antibicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 37597–37603. Hvidberg V., Maniecki M. B., Jacobsen C. et al. Identification of the receptor scavenging hemopexin-heme complexes // Blood. 2005. V. 106. P. 2572–2579. Imbert M., Blondeau R. On the iron requirement of lactobacilli grown in chemically defined medium // Curr. Microbiol. 1998. V. 37. P. 64–66. 154

Ismail A., Bedell G. W., Lupan D. M. Siderophore production by the pathogenic yeast, Candida albicans // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V. 130. P. 885–891. Johnson M. K., Boese-Marrazzo D. Production and Properties of Heat-Stable Extracellular Hemolysin from Pseudomonas aeruginosa // Infec. Immun. 1980. V. 29 (3). P. 1028–1033. Kammler M., Schön C., Hantke K. Characterization of the ferrous iron uptake system of Escherichia coli // J Bacteriol. 1993. V. 175. P. 6212–6219. Kemna E., Pickkers P., Nemeth E. et al. Time-course analisis of hepcidin, serum iron and plasma cytokine levels in humans injected with LPS // Blood. 2005. V. 106 (5). P. 1864–1866. Kim W. S., Ohashi M., Tanaka T. et al. Growth-promoting effects of lactoferrin on Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. // Biometals. 2004. V. 17 (3). P. 279–283. Kim W. S., Tanaka T., Kumura H., Shimazaki K. Lactoferrin-bindind proteins in Bifidobacterium bifidum // Biochem. Cell. Biol. 2002. V. 80 (1). P. 91–94. Kiss H., Kogler B., Petricevic L. et al. Vaginal Lactobacillus mirobiota of healthy women in the late first trimester of pregnancy // Intern. J. Obstet. Gynaecol. 2007. V. 114 (11). P. 1402–1407. Knight S. A. B., Gaston V., Lesuisse E., Dancis A. Iron Acquisition from Transferrin by Candida albicans Depends on the Reductive Pathway // Infec. Imun. 2005. V. 73. № 9. P. 5482–5492. Knutson M., Wessling-Resnick M. Iron metabolism in the reticuloendothelial system // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 38. P. 61–88. Kohli R. M., Trauger J. W., Schwarzer D., Marahiel M. A., Walsh C. T. Generality of peptide cyclization catalyzed by isolated thioesterase domains of nonribosomal peptide synthetases // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 7099– 7108. Konetschny-Rapp S., Jung G., Meiwes J., Zahner H. Staphyloferrin A: a structurally new siderophore from staphylococci // Eur. J. Biochem. 1990. V. 191. P. 65–74. Kosman D. J. Molecular mechanisms of iron uptake in fungi. // Mol. Microbiol. 2003. V. 47. P. 1185–1197. Kozo F., Toyoaki A., Hajime Y. Characteristics of Heat-Stable Extracellular Hemolysin from Pseudomonas aeruginosa  // Infec. Immun. 1988. V. 56 (5). P. 1385–1387. 155

Kozubek A., Tuman N. Resorcinol lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev. 1999. V. 99 (1). P. 1–31. Kristiansen M., Graversen J. H., Jacobsen C. et al. Identification of the haemoglobin scavenger receptor // Nature. 2001. V. 409. P. 198–201. Lahey M. E., Gubler C. J., Chase M. S. et al. Studies in copper metabolism II. Hematologic manifestation of copper deficiency in swine // Blood. 1952. V. 7. P. 1053–1073. Law S. K., Micklem K. J., Shaw J. M. et al. A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily // Eur J Immunol. 1993. V. 23. P. 2320–2325. Le Gall J. Y., Jouanolle A. M., Fergelot P. Genetics of hereditary iron overload // Bull. Acad. Natl. Med. 2004. V. l88 (2). P. 247–262. Lemanceau P., Bakker P. A., De Kogel W. J., Alabouvette  C., Schippers B. Effect of pseudobactin 358 production by Pseudomonas putida WCS358 on suppression of fusarium wilt of carnations by nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2978– 2982. Lesuisse E., Knight S. A., Camadro J.M., Dancis A. Siderophore uptake by Candida albicans: effect of serum treatment and comparison with Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 2002. V. 19. P. 329–340. Lesuisse E., Simon-Casteras M., Labbe P. Siderophoremediated iron uptake in Saccharomyces cerevisiae: the SIT1 gene encodes a ferrioxamine B permease that belongs to the major facilitator superfamily // Microbiology. 1998. V. 144. P. 3455–3462. Létoffé S., Nato F., Goldberg M. E., Wandersman C. Interactions of HasA, a bacterial haemophore, with haemoglobin and with its outer membrane receptor HasR. // Mol. Microbiol. 1999. V. 33. P. 546–555. Létoffé S., Omori K., Wandersman C. Functional characterization of the HasA (PF) hemophore and its truncated and chimeric variants: determination of a region involved in binding to the hemophore receptor // J.  Bacteriol. 2000. V. 182. P. 4401–4405. Letoffe S., Redeker V., Wandersman C. Isolation and characterization of an extracellular haem-binding protein from Pseudomonas aeruginosa that shares function and sequence similarities with the Serratia marcescens HasA haemophore // Mol. Microbiol. 1998. V. 28. P. 1223–1234. Lewis J. P., Dawson J. A., Hannis J. C., Muddiman D., Macrina F. L. Hemoglobinase activity of the lysine gingipain protease (Kgp) of Porphyromonas gingivalis W83. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 4905–4913. 156

Lewis L. A., Sung M. H., Gipson M., Hartman K., Dyer, D. W. Transport of intact porphyrin by HpuAB, the hemoglobin-haptoglobin utilization system of Neisseria meningitidis // J Bacteriol. 1998. V. 180. P. 6043–6047. Lindsay J. A., Riley T. V., Mee B. J. Production of siderophore by coagulase-negative staphylococci and its relation to virulence // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. V. 13. P. 1063–1066. Liu P. V. Toxins of Pseudomonas aeruginosa. // Academic Press, Inc., New York. 1979. Р. 6388. Locher K. P., Rees B., Koebnik R. et al. Transmembrane signaling across the ligand-gated FhuA receptor: crystal structures of free and ferrichromebound states reveal allosteric changes // Cell. 1998. V. 95. P. 771– 778. Lottenberg R., Minning-Wenz D., Boyle M. D. Capturing host plasmin(ogen): a common mechanism for invasive pathogens? // Trends Microbiol. 1994. V. 2. P. 20–24. Luo G., Samaranayake L. P., Yau J. Y. Y. Candida species exhibit differential in vitro hemolytic activities // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 39 (8). P. 2971–2974. Ma Y., Yeh M., Yeh K. Y., Glass J. Iron Imports. V. Transport of iron through the intestinal epithelium // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006. V. 290 (3). P. 417–422. MacGuillivray R. T., Mendez E., Shewale J. G. et al. The primary structure of human serum transferrin. The structures of seven syanogen bromide fragments and the assembly of the comlete structure // J. Biol. Chem. 1983. V. 258 (6). P. 3543–3553. Marlovits T. C., Haase W., Herrmann C., Aller S. G., Unger V. M. The membrane protein FeoB contains an intramolecular G protein essential for Fe(II) uptake in bacteria // PNAS. 2002. V. 99. P. 16243–16248. Mazmanian S. K., Skaar E. P., Gaspar A. H. et al. Passage of hemeiron across the envelope of Staphylococcus aureus. // Science. 2003. V. 299. P. 906–909. McDevitt D. Molecular characterization of the clumping factor of Staphylococus aureus // Mol. Microbiol. 1994. № 2. Р. 237–248. Melton-Celsa A. R., O’Brien A. D., Darnell S. C. Activation of Shigalike toxins by mouse and human intestinal mucus correlates with virulence of enterohemorrhagic Escherichia coli O91:H21 isolates in orally infected, streptomycin-treated mice // Infect. Immun. 1996. V. 64. P. 1569–1576. Menendez C., Todd J., Alonso P.L. et al. The effects of iron supplementation during pregnancy, given by traditional birth attendants, on 157

the prevalence of anaemia and malaria // Trans R Soc Trop Med Hyg. 1994. V. 88. P. 590–593. Merriman T. R., Merriman M. E., Lamont I. L. Nucleotide sequence of pvdD, a pyoverdine biosynthetic gene from Pseudomonas aeruginosa: PvdD has similarity to peptide synthetases // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 252–258. Meyer J.-M. Exogenous siderophore-mediated iron uptake in Pseudomonas aeruginosa: possible involvement of porin OprF in iron translocation // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 951–958. Meyer J.-M. Pyoverdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species // Arch. Microbiol. 2000. V. 174. P. 135–142. Meyer J.-M., Hornsperger J. M. Role of pyoverdinePf, the ironbinding fluorescent pigment of Pseudomonas fluorescens, in iron transport // J. Gen. Microbiol. 1978. V. 107. P. 329–331. Meyer J.-M., Neely A., Stintzi A., Georges C., Holder I. A. Pyoverdin is essential for virulence of Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1996. V. 64. P. 518–523. Miethke M., Marahiel M. A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2007. V. 71 (3). P. 413–451. Miller Y. I., Shaklai N. Kinetics of hemin distribution in plasma reveals its role in lipoprotein oxidation // Biochim Biophys Acta-Mol Basis Dis. 1999. V. 1454. P. 153–164. Modun B., Kendall D., Williams P. Staphylococci express a receptor for human transferrin: identification of a 42-kilodalton cell wall transferrinbinding protein // Infect. Immun. 1994. V. 62. P. 3850–3858. Moors M. A., Stull T. L., Blank K. J., Buckley H. R., Mosser D. M. A role for complement receptor-like molecules in iron acquisition by Candida albicans // J. Exp. Med. 1992. V. 175. P. 1643–1651. Morgan E. H. Transferrin: biochemistry, physiology and clinical significance // Mol. Aspects Med. 1981. V. 4. P. 1–123. Morton D. J., Whitby P. W., Jin H., Ren Z., Stull T. L. Effect of multiple mutations in the hemoglobin-and hemoglobin-haptoglobin-binding proteins, HgpA, HgpB, and HgpC, of Haemophilus influenzae type b // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 2729–2739. Munro H. N., Linder M. C. Ferritin structure, biosynthesis, and function // Physiological Reviews. 1978. V. 58. P. 317–396. Naikare H., Palyada K., Panciera R., Marlow D., Stintzi A. Major role for FeoB in Campylobacter jejuni ferrous iron acquisition, gut colonization, and intracellular survival // Infect. Immun. 2006. V. 74. P. 5433–5444. 158

Nair G. B., Takeda Y. The heat-stable enterotoxins // Microb. Pathog. 1998. V. 24. P. 123–131. Neilands J. B. Siderophores: Structure and Function of Microbial Iron Transport Compounds // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 (45). P. 26723–26726. Nemeth E., Rivera S., Gabajan V. et al. IL-6 mediates hypoferremia inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin // J. Clin. Inv. 2004. V. 113 (9). P. 1271–1276. O’Sullivan D. J., Troy D., Beresford T. et al. Genomic approaches for functional food cultures // Thinking beyond tomorrow: a safe and nutritious food chain for the consumer. Dublin: Teagasc Publications, 2004. P. 19–27. Occhino D. A., Wyckoff E. E., Henderson D. P., Wrona T. J., Payne S. M. Vibrio cholerae iron transport: haem transport genes are linked to one of two sets of tonB, exbB, exbD genes // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 1493–1507. Ochsner U. A., Johnson Z., Vasil M. L. Genetics and regulation of two distinct haem-uptake systems, phu and has, in Pseudomonas aeruginosa // Microbiology 2000. V. 146. Р. 185–198. Odds F. C. Candida and candidosis: a review and bibliography. London: Bailliere Tindall, 1998. 124 p. O’Donnel P. M., Aviles H., Lyte M., Sonnenfeld G. Enhancement of In Vitro Growth of Pathogenic Bacteria by Norepinephrine: Importance of Inoculum Density and Role of Transferrin // Applied and environmental microbiology. 2006. V. 72 (7). P. 5097–5099. Oexle H., Kaser A., Most, J. et al. Pathways for the regulation of interferongamma-inducible genes by iron in human monocytic cells // J. Leukoc. Biol. 2003. V. 74. P. 287–294. Oogai Y., Matsuo M., Hashimoto M. et al. Expression of virulence factors by Staphylococcus aureus grown in serum // Appl Environ Microbiol. 2011. V. 77. P. 8097–8105. Oppenheimer S. J., Gibson F. D., Macfarlane S. B. et al. Iron supplementation increases prevalence and effects of malaria: report on clinical studies in Papua New Guinea // Trans R Soc Trop Med Hyg. 1986. V. 80. P. 603–612. Oppenheimer S. J., Macfarlane S. B., Moody J. B., Harrison C. Total dose iron infusion, malaria and pregnancy in Papua New Guinea // Trans R Soc Trop Med Hyg. 1986. V. 80. P. 818–822. Osaki S., Johnson D. A., Frieden E. The possible significance of the ferrous oxidase activity of ceruloplasmin in normal human serum // J.Biol. Chem. 1966. V. 241. P. 2746–2751. 159

Ostroff R. M., Vasil A. I., Vasil M. L. Molecular comparison of a nonhaemolytic and a haemolytic phospholipase C from Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 5915–5923. O’Sullivan D. J. Bifidobacteria and siderophores produced thereby and methods of use // US Patent № 6.746.672. 2004. O’Sullivan D. J., O’Gara F. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 662–676. Otto B. R., van Dooren S. J., Nuijens J. H., Luirink J., Oudega B. Characterization of a hemoglobin protease secreted by the pathogenic Escherchia coli strain EB1 // J. Exp. Med. 1998. V. 188. P. 1091–1103. Padda J. S., Schryvers A. B. N-linked oligosaccharides of humantransferrin are not required for binding to bacterial transferrin receptors // Infect. Immun. 1990. V. 58. P. 2972–2976. Pan X., Tamilselvam B. J., Hansen E. S. Modulation of iron homeostasis in macrophages by bacterial intracellular pathogens // BMC Microbiology. 2010. V. 10 (64). Р. 2–13. Panchal R. G. Interactions between residues in staphylococcus alphahemolysin revealed by reversion mutagenesis // J. Biol. Chem. 1995. № 39. P. 272–276. Pandey A., Bringel F., Meyer J. M. Iron requirement and search for siderophores in lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 40. P. 735–739. Papanikolaou G., Tzilianos M., Christakis J. I. Hepcidin in iron overload disorders // Blood. 2005. V. 10. P. 4103–4105. Park C .H., Valore E. V., Waring A. J., Ganz T. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver // J. Biol. Chem. 2001. V. 276 (11). Р. 7806–7810. Parmley R. T., Barton J. C., Conrad M. E., Austin R. L., Holland R. M. Ultrastructural cytochemistry and radioautography of hemoglobin–iron absorption // Exp. Mol. Pathol. 1981. 34. Р. 131–144. Patel M. The effect of iron of the toxigenicity of Vibrio cholerae // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999. V. 60. № 3. P. 392–396. Pecqueur L., D’Autreaux B., Dupuy J. et al. Structural changes of Escherichia coli ferric uptake regulator during metal-dependent dimerization and activation explored by NMR and X-ray crystallography // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 21286–21295. Perkins-Balding D., Ratliff-Griffin M., Stojiljkovic I. Iron Transport Systems in Neisseria meningitides // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. № 1. P. 154–171. 160

Pettersson A., Klarenbeek V., van Deurzen J., Poolman  J.  T., Tommassen J. Molecular characterization of the structural gene for the lactoferrin receptor of the meningococcal strain H44/76 // Microb. Pathog. 1994. V. 17. P. 395–408. Pettersson A., Prinz T., Umar A., van der Biezen J., Tommassen J. Molecular characterization of LbpB, the second lactoferrin-binding protein of Neisseria meningitidis // Mol. Microbiol. 1998. V. 27. P. 599–610. Pietrangelo A. Hereditary hemochromatosis // Annu. Rev. Nutr. 2006. V. 26. P. 251–270. Pintor M., Ferreiros C. M., Criado M. T. Characterization of the transferrin-iron uptake system in Neisseria meningitidis. // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 112. P. 159–165. Pishchany G., Dickey S. E., Skaar E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB // Infect. Immun. 2009. V. 77. P. 2624–2634. Pohl E., Haller J. C., Mijovilovich A. et al. Architecture of a protein central to iron homeostasis: crystal structure and spectroscopic analysis of the ferric uptake regulator // Mol. Microbiol. 2003. V. 47. P. 903–915. Pohl E., Holmes R. K., Hol W. G. Crystal structure of the irondependent regulator (IdeR) from Mycobacterium tuberculosis shows both metal binding sites fully occupied // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 1145–1156. Ponka P., Lok C. N. The transferrin receptor: role in health and disease // Int J Biochem Cell Biol. 1999. V. 31 (10). P. 1111–1137. Poole K., McKay G. A. Iron acquisition and its control in Pseudomonas aeruginosa // Many roads lead to rome frontiers in bioscience. 2003. V. 8. P. 661–686. Pou S., Cjnen M. S., Brigan B. E. et al. Spin trapping and human neitrophilis. Limits of defection of hydroxyl radical // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 12299–12302. Quinn M. L., Weyer S. J., Lewis L. A., Dyer D. W., Wagner P. M. Insertional inactivation of the gene for the meningococcal lactoferrin binding protein // Microb. Pathog. 1994. V. 17. P. 227–237. Ramanan N., Wang Y. A high-affinity iron permease essential for Candida albicans virulence // Science. 2000. V. 288. P. 1062–1064. Raymond K. N., Carrano C. J. Coordination chemistry and microbial iron transport // J. Am. Chem. Soc. 1979. V. 12. P. 183–190. Raymond K. N., Dertz E. A., Kim S. S. 2003. Enterobactin: an archetype for microbial iron transport // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 3584–3588. 161

Recalcati S., Pometta R., Levi S., Conte D., Cairo G. Response of monocyte iron regulatory protein activity to inflammation: abnormal behavior in genetic hemochromatosis // Blood. 1998. V. 91. P. 2565–2572. Reimmann C., Patel H. M., Serino L. et al. Essential PchG-dependent reduction in pyochelin biosynthesis of Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 813–820. Reimmann C., Serino L., Beyeler M., Haas D. Dihydroaeruginoic acid synthetase and pyochelin synthetase, products of the pchEF genes, are induced by extracellular pyochelin in Pseudomonas aeruginosa // Microbiology. 1998. V. 144. P. 3135–3148. Richard W. Titball Bacterial Phospholipases C // Microbio. Rev. 1993. V. 57 (2). P. 347–366. Robey M., Cianciotto N. P. Legionella pneumophila feoAB promotes ferrous iron uptake and intracellular infection // Infect Immun. 2002. V. 70. P. 5659–5669. Rodriguez G. M., Smith I. Identification of an ABC transporter required for iron acquisition and virulence in Mycobacterium tuberculosis // J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 424–430. Ross-Gillespie A., Weigert M., Brown S. P., Kümmerli R. Galliummediated siderophore quenching as an evolutionarily robust antibacterial treatment // Evol Med Public Health. 2014. V. 2014. № 1. Р. 18–29. Rouault T. A. The intestinal heme transporter revealed // Cell. 2005. V. 122 (5). P. 649–651. Roy C. N., Enns C. A. Iron homeostasis: new tales from the crypt // Blood. 2000. V. 96. P. 4020–4027. Sadrzadeh S. M., Graf E., Panter S. S. et al. Hemoglobin. A biologic fenton reagent // J Biol Chem. 1984. V. 259. P. 14354–14356. Samaranayake Y. H., Dassanayake R. S., Cheung B. P. K. et al. Differential phospholipase gene expression by Candida albicans in artificial media and cultured human oral epithelium // APMIS. 2006. V. 114. P. 857– 866. Santos R., Buisson N., Knight S. et al. Haemin uptake and use as an iron source by Candida albicans: role of CaHMX1-encoded haem oxygenase  // Microbiology. 2003. V. 149. P. 579–588. Sazawal S., Black R. E., Ramsan M. et al. Effects of routine prophylactic supplementation with iron and folic acid on admission to hospital and mortality in preschool children in a high malaria transmission setting: community–based, randomised, placebo-controlled trial // Lancet. 2006. V. 367. P. 133–143. 162

Schroder I., Johnson E., de Vries S. Microbial ferric iron reductases // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27. P. 427–447. Schryvers A. B., Morris L. J. Identification and characterization of the human lactoferrin-binding protein from Neisseria meningitidis // Infect. Immun. 1988. V. 56. P. 1144–1149. Sebulsky M. T., Yohnstein D., Hunter M. D., David E. Heinrichs Identification and Characterization of a Membrane Permease Involved in IronHydroxamate Transport in Staphylococcus aureus // Journal of bacteriology. 2000. V. 182. № 16. P. 4394–4400. Serino L., Reimmann C., Baur H. et al. Structural genes for salicylate biosynthesis from chorismate in Pseudomonas aeruginosa // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 249. P. 217–228. Serino L., Reimmann C., Visca P. et al. Biosynthesis of pyochelin and dihydroaeruginoic acid requires the iron-regulated pchDCBA operon in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 248–257. Shinjyo S., Abe H., Masuda M. Carbohydrate composition of horse spleen ferritin // Biochim Biophys Acta. 1975. V. 411. P. 165–167. Siezen R. J., Starrenburg M. J. C., Boekhorst J. et al. Genome-scale genotype-phenotype matching of two Lactococcus lactis isolates from plants identifies mechanisms of adaptation to the plant niche // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 424–436. Simovich M., Hainsworth L. N., Fields P. A., Umbreit J. N., Conrad M. E. Localization of the iron transport proteins Mobilferrin and DMT-1 in the duodenum: the surprising role of mucin // Am. J. Hematol. 2003. V. 74 (1). P. 32–45. Sizhuang Y., Ne`Gre E., Jo Anne Cashel et al. Specific induction of fibronectin binding activity by hemoglobin in Candida albicans grown in defined media // Infection and Immunity. 1996. V. 64. № 8. P. 2930–2935. Skaar E. P., Gaspar A. H., Schneewind O. IsdG and IsdI, hemedegrading enzymes in the cytoplasm of Staphylococcus aureus // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 436–443. Smith M. A., Perry G. Free radical damage, iron and alzheimer’s disease // J. Neuro. Sci. 1995. V. 134 (suppl.). P. 92–94. Somerville G. A., Chaussee M. S., Morgan C. I. et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential phase growth and enhances stationary-phase survival. // Infect. Immun. 2002. V. 70. P. 6373–6382. Songer J. G. Bacterial phospholipases and their role in virulence // Trends Microbiol. 1997. V. 5. P. 156–161. 163

Sriyosachati S., Cox C. D. Siderophore-mediated iron acquisition from transferrin by Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1986. V. 52. P. 885–891. Stefanini S., Chiancone E., Arosio P., Antonini E. Structural heterogeneity and subunit composition of horse ferritin // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 2293–2299. Stintzi A., Cornelis P., Hohnadel D. et al. Novel pyoverdine biosynthesis gene(s) of Pseudomonas aeruginosa PAO. // Microbiology. 1996. V. 142. P. 1181–1190. Stintzi A., Johnson Z., Stonehouse M. et al. The pvc gene cluster of Pseudomonas aeruginosa: role in synthesis of the pyoverdine chromophore and regulation by PtxR and PvdS // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 4118–4124. Stojiljkovic I., Larson J., Hwa V., Anic S., So M. HmbR outer membrane receptors of pathogenic Neisseria spp. iron-regulated, hemoglobin-binding proteins with a high level of primary structure conservation // J Bacteriol. 1996. V. 178. P. 4670–4678. Sweet S. P., Douglas L. J. Effect of iron concentration on siderophore synthesis and pigment production by Candida albicans // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 64. P. 87–91. Tablot J. A., Nielse K., Corbeil L. B. Cleavage of proteins of reproductive secretions by extracellular proteinases of Tritrichomonas foetus // Can. J. Microbiol. 1991. V. 37. № 5. Р. 384–390. Takase H., Nitanai H., Hoshino K., Otani T. Requirement of the Pseudomonas aeruginosa tonB gene for high-affinity iron acquisition and infection // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 4498–4504. Takeshi Nakanishi, Yukiko Hasuike, Yoshinaga Otaki et al. Hepcidin: another culprit for complications in patients with chronic kidney disease? // Nephrol Dial Transplant. 2011. V. 26. P. 3092–3100. Taylor J. M., Heinrichs D. E. Transferrin binding in Staphylococcus aureus: involvement of a cell wall-anchored protein // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 1603–1614. Thomma B. P., Cammue B. P., Thevissen K. Plant defensins // Planta. 2002. V. 216 (2). P. 193–202. Torres V. J., Attia A. S., Mason W. J. et al. Staphylococcus aureus fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia // Infect. Immun. 2010. V. 78. P. 1618–1628. Torres V. J., Pishchany G., Humayun M., Schneewind O., Skaar E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization // J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 8421–8429. 164

Toyokuni S., Sagripanti J. L. Iron-mediated DNA damage: sensitive detection of DNA strand breakage catalyzed by iron // J. Inorg. Biochem. 1992. V. 47. P. 241–248. Traber K. E., Lee E., Benson S. et al. Agr function in clinical Staphylococcus aureus isolates // Microbiology. 2008. V. 154. P. 2265–2274. Tsang C. S. P., Chu F. C. S., Leung W. K. et al. Phospholipase, proteinase and haemolytic activities of Candida albicans isolated from oral cavities of patients with type 2 diabetes mellitus // Journal of Medical Microbiology. 2007. V. 56. P. 1393–1398. Tseng C. F., Burger A., Mislin G. L. et al. Bacterial siderophores: the solution stoichiometry and coordination of the Fe(III) complexes of pyochelin and related compounds // J. Biol. Inorg. Chem. 2006. V. 11. P. 419–432. Van Snick J. L., Masson P., Heremans J. The involvement of lactoferrin in the hyposideremia of acute inflammation// J.  Exp. Med. 1974. V. 140. P. 1068–1084. Vartivarian S. E., Cowart R. E. Extracellular iron reductases: identification of a new class of enzymes by siderophore-producing microorganisms // Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 364. P. 75–82. Velayudhan J., Hughes N. J., McColm A. A. et al. Iron acquisition and virulence in Helicobacter pylori: a major role for FeoB, a high-affinity ferrous iron transporter // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. P. 274–286. Visca P., Ciervo A., Orsi N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5oxygenase in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 1128– 1140. Visca P., Colotti G., Serino L. et al. Metal regulation of siderophore synthesis in Pseudomonas aeruginosa and functional effects of siderophoremetal complexes // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2886–2893. Vulpe C. D., Kuo Y. M., Murphy T. L. et al. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue implicated in intestinal iron transport, is defective in the sla mouse // Nature Genet. 1999. V. 21. P. 195–199. Wandersman C., Stojiljkovic I. Bacterial heme sources: the role of heme, hemoprotein receptors and hemophores // Curr Opin Microbiol. 2000. V. 3. P. 215–220. Ward P. P., Paz E., Conneely O. M. Multifunctional roles of lactoferrin: a critical overview// Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 2540–2548. Watanabe T., Takano M., Murakami M. et al. Characterization of a haemolytic factor from Candida albicans // Microbiology. 1999. V. 145. P. 689–694. 165

Wegele R., Tasler R., Zeng Y., Rivera M., Frankenberg-Dinkel N. The heme oxygenase(s)-phytochrome system of Pseudomonas aeruginosa // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 45791–45802. Weinberg E. D. The Lactobacillus anomaly: total iron abstinence // Perspect. Biol. Med. 1997. V. 40. P. 578–583. Weiss G., Werner-Felmayer G., Werner E. R. et al. Iron regulates nitric oxide synthase activity by controlling nuclear transcription // J. Exp. Med. 1994. V. 180. P. 969–976. Welch R. A. Pore-forming cytolysins of gram-negative bacteria // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. № 3. P. 521–528. Wick M. J., Iglewski B. H. ADP-ribosylating toxins and G proteins // Washington: Am Soc Microbiol. 1990. P. 11–43. Williams P. H. Novel iron uptake system specified by ColV plasmids: an important component in the virulence of invasive strains of Escherichia coli // Infect. Immun. 1979. V. 26. P. 925–932. Wolz C., Hohloch K., Ocaktan A. et al. Iron release from transferrin by pyoverdin and elastase from Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1994. V. 62. P. 4021–4027. Wong H., Schryvers A. B. Bacterial lactoferrin-binding protein A binds to both domains of the human lactoferrin C-lobe // Microbiology. 2003. V. 149 (Pt7): 1729–1737. Wyckoff E. E., Valle A. M., Smith S. L., Payne S. M. A multifunctional ATP-binding cassette transporter system from Vibrio cholerae transports vibriobactin and enterobactin. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 7588–7596. Xiao R., Kisaalita W. S. Iron acquisition from transferrin and lactoferrin by Pseudomonas aeruginosa pyoverdin // Microbiology 1997. V. 143. P. 2509–2515. Yoon D., Pastore Y. D., Divoky V. et al. Hypoxia-inducible factor-1 deficiency results in dysregulated erythropoiesis signaling and iron homeostasis in mouse // J. Biol. Chem. 2006. V. 281 (35). P. 25703–25711. Yoshida K., Furihata K., Takeda S. et al. A mutation in the ceruloplasmin gene is associated with systemic hemosiderosis in humans // Nature Genet. 1995. V. 9. P. 267–272. Yoshino Y., Shinjo S., Shimada K. et al. Chemistry and function of ferritin and hemosiderin // Acta Haemotol. Jpn. 1986. V. 49 (8). P. 178–185. Yue W. W., Grizot S., Buchanan S. K. Structural evidence for ironfree citrate and ferric citrate binding to the TonB-dependent outer membrane transporter FecA // J. Mol. Biol. 2003. V. 332. P. 353–368. Yun C. W., Bauler M., Moore R.E., Klebba P.E., Philpott C. C. The role of the FRE family of plasma membrane reductases in the uptake of 166

siderophore-iron in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 10218–10223. Yun C. W., Tiedeman J. S., Moore R. E., Philpott C. C. Siderophoreiron uptake in Saccharomyces cerevisiae. Identification of ferrichrome and fusarinine transporters // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 16354–16359. Zak O., Aisen P. Nonrandom distribution of iron in circulating human transferrin. // Blood. 1986. V. 68. P. 157–161. Zhu M., Valdebenito M., Winkelmann G., Hantke K. Functions of the siderophore esterases IroD and IroE in iron-salmochelin utilization. // Microbiology. 2005. V. 151. P. 2363–2372. Zhu W., Wilks A., Stojiljkovic I. Degradation of heme in gram-negative bacteria: the product of the hemO gene of Neisseriae is a hemeoxygenase // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 6783–6790. Zimecki M., Artym J., Kocieba M. et al. The concerted action of lactoferrin and bacteriophages in the clearance of bacteria in sublethally infected mice // Postepy Hig. Med. Dosw. 2008. V. 62. P. 42–46.

167

РЕЗЮМЕ В монографии систематизированы накопленные за последние годы материалы о роли железа в биологии условно-патогенных микроорганизмов, данная проблема рассмотрена в рамках системы «хозяин – микропаразит» и межмикробных взаимодействий. В главе 1 представлены сведения о химических свойствах и биологической роли железа. Классифицированы и  описаны микробные способы получения железа в окружающей среде и организме хозяина. Приведена классификация сидерофоров по химической структуре, рассмотрены механизмы синтеза и транспорта сидерофоров грамположительными, грамотрицательными бактериями и грибами. На основании структурной аналогии сидерофоров с мембранотропными ауторегуляторами анабиоза микроорганизмов и  нейротрансмиттерами млекопитающих высказано предположение о возможности их участия в транспорте и регуляции гомеостаза железа микроорганизмов. Описан способ получения железа за счет прямого связывания трансферринов млекопитающих наружной мембраной грамотрицательных бактерий. Особое внимание уделено антимикробным функциям лактоферрина. Рассмотрена функция гемолизинов в получении железа микроорганизмами в организме хозяина, приведена классификация цитотоксинов и рассмотрены механизмы их действия. Приведены механизмы поглощения и превращений гема и гемопротеинов микроорганизмами. Рассмотрены транскрипционные механизмы регуляции микробного гомеостаза железа с помощью Furбелка и транскрипционных альтернативных σ-факторов. В главе 2 представлены данные об участии железа и способов его получения в регуляции межмикробных взаи168

модействий условно-патогенных микроорганизмов. Охарактеризованы способы получения железа стафилококками, псевдомонадами, кандидами. Продемонстрировано влияние железосодержащих субстратов – лактоферрина, гема, гемоглобина на регуляцию вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. Выявлены возможные механизмы объединения микроорганизмов в ассоциации с целью удовлетворения своих потребностей в железе. Описаны способы получения железа и их влияние на биологические свойства молочнокислых бактерий. Показано, что появление в окружающей среде лактоферрина, гема, гемоглобина увеличивает антагонистическую активность некоторых молочнокислых бактерий в отношении ассоциативной микробиоты. Глава 3 посвящена влиянию гомеостаза железа организма хозяина на взаимоотношения с инфекционными патогенами. В первой части главы приведены современные представления о гомеостазе железа. Показаны механизмы всасывания, экспорта, транспорта, запасания, рециркуляции железа. Обсуждены механизмы регуляции гомеостаза организма хозяина на клеточном и системном уровне. Во второй части главы представлены данные о влиянии гомеостаза железа на врожденный иммунитет и инфекционную чувствительность организма хозяина к возбудителям оппортунистических инфекций. Особое место в главе уделено механизмам участия гепсидина в регуляции взаимоотношений хозяина с микробами-паразитами. В третьей части главы приведены сведения о влиянии количества железа организма и нарушений гомеостаза железа на экспрессию факторов вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. В главе 4 рассмотрены вопросы практического использования железозависимости биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов для характеристики гемокультур и прогноза развития инфекционных осложне169

ний. Охарактеризованы биологические свойства гемокультур в сравнении со штаммами, выделенными из других источников. Описан алгоритм определения константы железозависимости микроорганизмов, показана связь железозависимости микроорганизма с биологическими свойствами возбудителей инфекций кровотока. Приведены примеры использования анализа биопрофиля и железозависимости патогена для характеристики гемокультур и прогноза развития септических осложнений.

170

SUMMARY There are systematized materials about role of iron in biology of opportunistic pathogens in the last years. This problem was consider within of system “host – microparasite” and intermicrobe interactions. In materials of Chapter 1, data on chemical and biological properties of iron have been given. Everything microbes ways of getting of iron in the environment and host organism have been classified and described. Classification by chemical structure of siderophores, mechanisms biosynthesizes an transport siderophores gram-positive and gram-negative bacteria and fungi have been reviewed. On the basis of structural analogies of siderophores with membranotropic autoregulators anabiosis microorganisms and mammalian neurotransmitters have been suggested the possible ways of their participation in transport and regulation of iron homeostasis of microorganisms. The way of getting of iron from transferrins mammalians by direct binding of outer membrane gram-negative bacteria have been described. A special place in the chapter has been devoted to antimicrobial functions of lactoferrin. The function of hemolysins as way of getting of iron from haemoproteins in host organism, classification cytolysins and mechanisms of action have been considered. Mechanisms uptake and degradation of haem and haemoproteins have been described. Transcriptional mechanisms regulation of microbial iron homeostasis by Fur protein and alternative σ-factors of transcription are being considered. In Chapter 2, data on role of iron and ways of getting in regulator of intermicrobes interaction of opportunistic microorganisms have been given. Ways of getting of iron by staphylococci, pseudomonades and Candida spp. have been characterized. The influence iron-containing substrates – lactoferrin, 171

haem, haemoglobin on regulation of virulence of opportunistic microorganisms have been demonstrated. The possible mechanisms integrate of microorganisms in associations for getting of iron are being discuss. Ways of getting of iron and their influence on biological properties lactic-acid bacteria have been described. The appearance in the environment of lactoferrin, heme, hemoglobin increases antagonistic activity of some lactic-acid bacteria in the relation of associatives microbiota have been discuss. Chapter 3 is devoted to influence homeostasis of iron on relationship organism of host with infection agents. Modern of date on homeostasis of iron have been presented in the first part of the chapter. Mechanisms uptake, export, transport, storage and recirculation of iron have been showed. Mechanisms of regulation of homeostasis of the host organism at the cellular and systemic level have been discuss. Data on influence iron of homeostasis on innate immunity and of sensitivity to opportunistic infection of organism of host have been presented in the second part of the chapter. A special place in the chapter has been devoted to hepcidin mechanisms in regulation of interaction of host and microparasites. Data on influence concentration of iron in organism host and disturb of iron homeostasis on expression of virulence factors by opportunistic microorganisms have been given in the third of the chapter. In Chapter 4 questions of practical usage of the irondepending of biological properties of opportunistic microbes for diagnostics hemoculture and prognostication of infectious complications. The biological properties of hemoculture in compare to strains isolate from others sources have been characterized. Algorithm for determinate of constant of irondepending and feedback of constant of iron-depending of the microorganism with biological properties of pathogens 172

bloodstream infections have been showed. The concrete examples of the use and analysis of biological properties and iron-depending pathogens for diagnosis hemocultures and prognostication of the development of septic complications.

173

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ�����������������������������������������������������������������������������6 ГЛАВА 1. СПОСОБЫ ДОБЫВАНИЯ ЖЕЛЕЗА МИКРООРГАНИЗМАМИ����������������������������������������������������8 1.1. Железо, химические свойства и биологическая роль����8 1.2. Прямое поглощение Fe2+������������������������������������������������12 1.3. Сидерофоры���������������������������������������������������������������������14 1.4. Прямое связывание трансферринов������������������������������28 1.5. Гемолизины и использование железа гемопротеинов�32 1.6. Механизмы регуляции гомеостаза железа у микроорганизмов����������������������������������������������������������������45 ГЛАВА 2. СТРАТЕГИЯ ДОБЫВАНИЯ ЖЕЛЕЗА В РЕГУЛЯЦИИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМО­ ОТНОШЕНИЙ���������������������������������������������������������������������52 2.1. Железо и стафилококки��������������������������������������������������53 2.2. Железо и псевдомонады�������������������������������������������������60 2.3. Железо и Candida spp.����������������������������������������������������67 2.4. Железо и молочнокислые бактерии������������������������������71 ГЛАВА 3. ЖЕЛЕЗО И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ОРГАНИЗМА ХОЗЯИНА С МИКРОПАРАЗИТАМИ���77 3.1. Современные представления о гомеостазе железа организма хозяина������������������������������������������������������������������77 3.2. Железо и инфекционная чувствительность������������������97 3.3. Железо и вирулентность микроорганизмов����������������109 174

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЖЕЛЕЗО­ ЗАВИСИМЫХ СВОЙСТВ МИКРО­ ОРГАНИЗМОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОКУЛЬТУР�����������������������������������������������������������������122 ЗАКЛЮЧЕНИЕ������������������������������������������������������������������138 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ�������������������������������������������������140 РЕЗЮМЕ�����������������������������������������������������������������������������168

175

CONTENS

INTRODUCTION�������������������������������������������������������������������6 CHAPTER 1. WAYS OF GETING THE IRON OF MICROORGANISMS�������������������������������������������������������������8 1.1. Iron, chemical properties and biological role���������������������8 1.2. Direct uptake of Fe2+���������������������������������������������������������12 1.3. Siderophores���������������������������������������������������������������������14 1.4. Direct binding of transferrins��������������������������������������������28 1.5. Hemolysins and uptake of iron/haem from haemoproteins��������������������������������������������������������������������������32 1.6. Mechanisms of regulation homeostasis of iron of microbes�����������������������������������������������������������������������������������45 CHAPTER 2. STRATEGY OF GETTING THE IRON IN INTERMICROBIAL INTERACTIONS������������52 2.1. Iron and staphylococci������������������������������������������������������53 2.2. Iron and pseudomonades���������������������������������������������������60 2.3. Iron and Candida spp.�������������������������������������������������������67 2.4. Iron and lactic-acid bacteria����������������������������������������������71 CHAPTER 3. IRON AND INTERACTION BETWEEN ORGANISM OF HOST AND MICROPARASITES�������������������������������������������������������������77 3.1. Modern data on of iron homeostasis of host organism�����77 3.2. Iron and sensitive to infection�������������������������������������������97 3.3. Iron and virulence of microorganisms����������������������������109 176

CHAPTER 4. APPLICATION OF IRONDEPENDING PROPERTIES OF MICRO­ ORGANISMS FOR DIAGNOSTICS OF HEMOCULTURE������������������������������������������������������122 CONCLUSION��������������������������������������������������������������������138 REFERENCES���������������������������������������������������������������������140 SUMMARY��������������������������������������������������������������������������168

177

Научное издание Вадим Вячеславович Леонов Андрей Юрьевич Миронов ЖЕЛЕЗО И МИКРООРГАНИЗМЫ Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом Ханты-Мансийской государственной медицинской академии. Протокол № 13 от 30.09.2016. Технический редактор В. В. Леонов Компьютерная верстка Е. Ю. Захарова Корректор И. Х. Ачибакиева Рисунки Е. О. Авдеева, С. В. Суконина

Подписано в печать 30.09.2016. Формат 60´90 1/16. Бумага офсетная № 1, плотность 80 г/м2. Печать офсетная. Усл. печ. л. 11,13. Тираж 300 экз. Заказ № 1191