Elektrophorese: Theorie und Praxis [Reprint 2010 ed.] 9783110819427, 9783110149944

Citation preview

Budin Michov Elektrophorese Theorie und Praxis

Budin Michov

Elektrophorese Theorie und Praxis

w DE

G

Walterde Gruyter · Berlin · New York 1996

Dr. Dr. Budin M. Michov Albrecht-Dürer-Straße 13 90403 Nürnberg

Gedruckt auf säurefreiem Papier, das die US-ANSI-Norm über Haltbarkeit erfüllt.

Die Deutsche Bibliothek — CIP-Einheitsauf nähme Michov, Budin M.: Elektrophorese : Theorie und Praxis / Budin Michov. - Berlin ; New York : de Gruyter, 1995 ISBN 3-11-013660-Okart. ISBN 3-11-014994-X Pp.

© Copyright 1995 by Walter de Gruyter & Co., D-10785 Berlin Dieses Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Printed in Germany. Druck: Gerike GmbH, Berlin. - Buchbinderische Verarbeitung: Lüderitz & Bauer GmbH, Berlin. - Einbandentwurf: Hansbernd Lindemann, Berlin.

Meinen Söhnen Michail und Budin gewidmet

Vorwort Die Elektrophorese (dieser Begriff bezieht sich auch auf die isoelektrische Fokussierung) hat große Bedeutung für die Untersuchung der Serum-, Liquor-, Harn-, Bakterien- und Membranproteine, der Hämoglobine, Immunglobuline, Enzyme, des Blutgerinnungs- und Komplementsystems, der Hormone, Histone, Nukleinsäuren, Viren, Phagen und verschiedenster anderer Bioobjekte. Was stellt die Elektrophorese dar - eine Methode oder eine Wissenschaft? Woher kommt ihre weite Verwendbarkeit? Was geschieht im Laufe der Elektrophorese? Die Antwort dieser und vieler anderen Fragen können in diesem Buch gefunden werden. Sein Ziel ist es, die Mechanismen der elektrophoretischen Methoden zu erklären, die Theorie mit der Praxis zu verbinden, zu zeigen, daß die Basis der Elektrophorese die physikalischen, chemischen und biologischen Wissenschaften bilden. Besondere Aufmerksamkeit ist auf die Elektrophorese im Polyacrylamid- und Agarosegel gerichtet, die am weitesten verbreitet ist. Ausführlich sind ebenso die neuesten Trends der Elektrophorese beschrieben, z.B. die Verwendung von dünnen Horizontalgele sowie von Fertiggelen (nassen oder rehydratisierbaren) und Fertigkits. Neben den elektrophoretischen Methoden für die Forschung wird auch über elektrophoretische Techniken für die klinische Diagnostik berichtet - die Elektrophorese der Serum-, Lipo-, Immun-, Liquor- und Urinproteine, der Hämoglobine, Kreatinkinase, LactatDehydrogenase, alkalischen Phosphatase. Das Buch enthält unterschiedliche Beiträge des Autors, die auf die Elektrophorese Bezug nehmen: die Theorie der beiden Radien eines geladenen Teilchens, den Parameter der lonenmobilität, die Charakterisierung einer neuen Komplexverbindung im weit verbreiteten TRIS-Borat-Puffer, die Disk-Elektrophorese in einem Puffer bei zwei pHWerten, ein neues Puffersystem für die SDS-Elektrophorese der Proteine und Nukleisäuren u.a. Das Buch stellt das notwendige theoretische und praktische Rüstzeug für die elektrophoretische Arbeit der Chemiker, Biochemiker, Biologen oder Mediziner, der Doktoranden, Studenten und Laboranten. Es ist mir ein Vergnügen, Herrn Dr. Burckhard Kraska meinen besten Dank für sein kritisches Durchlesen von Teilen des Manuskriptes auszusprechen. Meine Verehrung und besondere Dankbarkeit möchte ich Herrn Dr. Bernhard Seitner ausdrücken, der mir bei der Arbeit am Buch viel geholfen und mich in schlimmsten Zeiten unterstützt hat. Nürnberg, im Mai 1995

BudinMichov

Inhaltsverzeichnis Abkürzungen Wörterbuch der elektrophoretischen Termini

XVII XXI

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese 1.1 Die Elektrophorese und ihre Systematik 1.1.1 Überblick über die Elektrophorese Auflösung der Elektrophorese Vergleich zwischen der Elektrophorese und anderen Trennmethoden 1.1.2 Wichtigste elektrophoretische Methoden Zonenelektrophorese Isotachophorese Isoelektrische Fokussierung Kombinationen zwischen den wichtigsten elektrophoretischen Methoden Blotting 1.2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt 1.2.1 Elektrolyte Konzentrationsdissoziationskonstante und lonenstärke 1.2.2 Puffer Pufferkapazität 1.2.3 Puffer, die bei der Elektrophorese häufig verwendet werden 1.3 Die Proteine und Nukleinsäuren bilden in Lösung Polyionen 1.3.1 Elektrische Doppelschicht eines geladenen Teilchens Modell von Helmholtz Modell von Gouy-Chapman Theorie von Debye-Hückel Modell von Stern 1.3.2 Struktur und Konformation der Proteine und Nukleinsäuren Struktur der Proteine Struktur der Nukleinsäuren 1.3.3 Massen und Ladungen der Proteine und Nukleinsäuren Massen und Ladungen der Proteine Isoelektrischer Punkt eines Proteins Massen und Ladungen der Nukleinsäuren 1.3.4 Native und denaturierte Proteine und Nukleinsäuren Denaturierung der Proteine Denaturierung (Schmelzen) der Nukleinsäuren 1.4 Die Polyionen bewegen sich in einem elektrischen Feld .4.1 Gleichung von Smoluchowski .4.2 Gleichung von Hückel .4.3 Funktion von Henry .4.4 Gleichung von Onsager .4.5 Gleichung von Robinson-Stokes .4.6 Parameter der lonenmobilität .4.7 Quadratische Gleichung der lonenmobilität 1.5 Theorie der Elektrophorese 1.5.1 Wovon hängt die Polyionenmobilität ab? Einfluß der Natur des Polyions Einfluß des Puffers Einfluß des Trägers

l l 4 4 5 6 9 10 10 10 12 12 12 16 18 19 22 22 22 23 23 24 25 25 27 30 30 32 33 33 33 34 36 37 37 38 38 39 39 40 45 45 46 47 49

Inhaltsverzeichnis

1.5.2 Wovon hängt die Stärke des elektrischen Feldes ab? 1.5.3 Theorie der isoelektrischen Fokussierung Auflösung der isoelektrischen Fokussierung IEF mit Trägerampholyten 1EF in immobilisierten pH-Gradienten 1.5.4 Entwicklung Joulescher Wärme während der Elektrophorese 1.6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte 1.6.1 Elektrophoretische Kammern Horizontalkammern Vertikalkammem 1.6.2 Stromversorger 1.6.3 Thermostate 1.6.4 Densitometer Optik eines Densitometers 1.6.5 Gelgießsystem Gießkassette Gradientenmischer 1.6.6 Puffermischer 1.6.7 Blotter 1.6.8 Geräte für halbautomatische Elektrophorese 1.6.9 Geräte für präparative Elektrophorese 1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt 1.7.1 Papier und Dünnschichten 1.7.2 Acetylcellulose und Cellogel - Struktur und Eigenschaften Acetylcellulose-Folien und Cellogel-Streifen 1.7.3 Gele 1.7.4 Stärkegel - Struktur und Eigenschaften 1.7.5 Agarosegel - Struktur und Eigenschaften Herstellung von Agarosegelen 1.7.6 Polyacrylamidgel - Struktur und Eigenschaften Der Trennbereich hängt von der Polyacrylamidkonzentration ab - Ferguson-Plots ... Dünne und ultradünne Polyacrylamidgele Herstellung von homogenen foliengestützten Polyacrylamidgelen Kassettentechnik Klapptechnik Schiebetechnik Herstellung von Gradienten-Polyacrylamidgelen auf Haftfolien Lineare Gradientengele Exponentielle Gradientengele Herstellung von netzgestützten Polyacrylamidgelen Herstellung von Polyacrylamidgelen mit erhöhter Polyolkonzentration Herstellung von rehydratisierbaren Polyacrylamidgelen Aufgaben l

50 51 51 53 54 55 56 56 57 57 58 58 59 59 60 61 61 62 62 63 64 65 65 65 65 66 66 66 67 68 72 73 74 74 76 77 77 79 80 80 80 81 85

2 Elektrophorese der Proteine Papier- und Dünnschicht-Zonenelektrophorese Stärkegel-Zonenelektrophorese 2.1 Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese der Proteine 2.1.1 Acetylcellulose-Zonenelektrophorese AcetyIcellulose-Zonenelektrophorese von Serumproteinen 2.1.2 Cellogel-Zonenelektrophorese Problemlösungen

87 87 88 88 88 90 92

Inhaltsverzeichnis 2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine 2.2.1 Agarosegel-Zonenelektrophorese von Serumproteinen Probenvorbereitung Elektrophoretische Trennbedingungen 2.2.2 Immunelektrophorese Immundiftusions-Elektrophorese nach Grabar und Williams Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell Gegenstrom-Immunelektrophorese nach Estela und Heinrichs Immunfixation Immunprinting 2D-Immunelektrophorese 2.2.3 Affinitätselektrophorese Problemlösungen 2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine Probenvorbereitung 2.3.1 Homogengel-Zonenelektrophorese 2.3.2 Gradientengel-Zonenelektrophorese Effekt des Molekülsiebes 2.3.3 Ermittlung der Radien und Massen von nativen Proteinen 2.3.4 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese von ladungsund massenisomeren Proteinen Problemlösungen 2.4 Isotachophorcse der Proteine 2.4.1 "Beharrliche" Funktion von Kohlrausch 2.4.2 Gleichungen eines diskontinuierlichen Puffersystems Problemlösungen 2.5 Kapillarelektrophorese der Proteine 2.5.1 Injektion 2.5.2 Trennung 2.5.3 Detektion 2.5.4 Anwendungsbeispiele Problemlösungen 2.6 Disk-Elektrophorese der Proteine 2.6.1 Disk-Elektrophorese nach Ornstcin und Davis Puffer-Gel-Systeme für die Disk-Elektrophorese nach Ornstein und Davis 2.6.2 Disk-Elektrophorese nach Allen et al Effekt von Hjerten 2.6.3 Disk-Elektrophorese in einem Puffer bei zwei pH-Werten Problemlösungen 2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine Vertikale und horizontale SDS-Elektrophoresc 2.7.1 SDS-Zonenelektrophorese Nichtreduzierende Probenvorbereitung Reduzierende Probcnvorbereitung Reduzierende Probcnvorbereitung mit Alkylierung 2.7.2 SDS-Disk-Elektrophorese - die verbreitetste elcktrophoretische Methode SDS-Disk-Elektrophorese in homogenen Gelen SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Chlorid-Glycinat-Puffersystem SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRJS-Formiat-Taurinat-Puffersystem SDS-Disk-Elektrophorese in Gradientengelen SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Acetat-TRICINat-Puffersystem 2.7.3 Färbung der Protcinbanden 2.7.4 Blotting nach der SDS-Elektrophorese

XI 94 94 95 95 98 98 99 100 101 104 104 105 106 109 109 110 112 112 115 117 118 121 121 125 127 129 131 131 131 132 133 135 135 137 140 140 141 146 149 152 152 154 155 155 156 156 156 158 163 163 165 166

XII

Inhaltsverzeichnis

2.7.5 Bestimmung der Molekülmassen von SDS-denaturierten Proteinen Problemlösungen 2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese 2.8.1 Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten Eigenschaften der Trägerampholyte IEF mit Trägerampholyten in Polyacrylamidgelen Dünne und ultradünne Polyacrylamidgele für IEF mit Trägerampholyten Rehydratisierbare Polyacrylamidgele für IEF mit Trägerampholyten IEF mit Trägerampholyten in Agarosegelen Dünne und ultradünne Agarosegele für IEF Durchführung der IEF in Gelen mit Trägerampholyten 2.8.2 Isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten Eigenschaften der Immobiline Dünne und ultradünne IPG-Gele Rehydratisierbare IPG-Gele Durchführung der IEF in IPG-Gelen Problemlösungen 2.9 Free-Flow-Elektrophorese der Proteine Theorie der Free-Flow-Elektrophorese 2.9.1 Free-Flow-Zonenelektrophorese 2.9.2 Free-Flow-Isotachophorese 2.9.3 Free-Flow-Isoelektrische-Fokussierung 2.9.4 Detektion Problemlösungen 2.10 Die Proteine können in zwei Richtungen getrennt werden die zweidimensionale Elektrophorese 2.10.1 Isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension Herstellung von Polyacrylamidgelen mit Trägerampholyten oder IPG-Gelen für die isoelektrische Fokussierung Probenvorbereitung für die erste Dimension Isoelektrische Fokussierung 2.10.2 SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension Herstellung von Gelen für die SDS-Elektrophorese SDS-Äquilibrierung der IEF-Gelstreifen für die zweite Dimension SDS-Elektrophorese 2.10.3 Nachweis der Proteine und Auswertung der 2D-Pherogramme Problemlösungen 2.11 Präparative Elektrophorese der Proteine 2.11.1 Elution der Proteine während der Elektrophorese 2.11.2 Elution der Proteine nach der Elektrophorese Problemlösungen 2.12 Präparative isoelektrische Fokussierung 2.12.1 Präparative IEF mit Trägerampholyten in granulierten Gelen Herstellung eines granulierten Gels Einlegen einer Probe ins granulierte Gel Isoelektrische Fokussierung Isolieren und Elution der Proteine Rezyklisierende isoelektrische Fokussierung 2.12.2 Präparative IEF in immobilisierten pH-Gradienten Präparative IEF in dicken IPG-Gelen Kanalfokussierung Problemlösungen

167 169 174 175 175 178 179 180 181 182 182 189 189 190 195 196 198 206 206 208 209 210 211 212 213 215 215 216 216 218 218 219 220 221 222 227 227 229 230 233 233 233 235 236 236 238 239 239 240 242

Inhaltsverzeichnis 2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme Fixieren Färben Entfärben Trocknen 2.13.1 Coomassie-Färbung 2.13.2 Silberfärbung der Proteine 2.13.3 Glykoproteinfärbung 2.13.4 Lipoproteinfarbung 2.13.5 Enzymfärbung 2.13.6 Immunologische Nachweismethoden 2.13.7 Autoradiographie und Fluorographie der Proteine 2.13.8 Dokumentation der Protein-Pherogramme Problemlösungen 2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie 2.14.1 Grundlagen der Densitometrie 2.14.2 Auflösung eines Densitometers 2.14.3 Basislinie und Bandenintegration 2.14.4 Auswertung eines Densitogramms 2.14.5 Zweidimensionale Densitometrie 2.14.6Densitometriefehler Problemlösungen 2.15 Blotting der Proteine - Western-Blotting 2.15.1 Blotmembranen 2.15.2 Transfer Elektroblotting der Proteine Tankblotting Semidry-Blotting Transferbedingungen 2.15.3 Blockierung 2.15.4 Detektion durch Sonden und Farbstoffe Problemlösungen 2.16 Fertiggele und -kits für Protein-Elektrophorese 2.16.1 Fertigkits für Acetylcellulose-Zonenelektrophorese 2.16.2 Agarose-Fertiggele und-kits Fertiggele und -kits für Agarosegcl-Zonenelektrophorese der Proteine Fertiggele und -kits für Immunfixation und Affinitätselektrophorese 2.16.3 Polyacrylamid-Fertiggele und -kits Fertiggele und -kits für Disk-Elektrophorese der Proteine Fertiggele und -kits für SDS-Disk-Elektrophorese der Proteine Fertiggele und -kits für isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten Fertiggele und -kits für isoelektrische Fokussierung mit Immobilinen Fertigkits für Blotting der Proteine Problemlösungen 2.17 Klinische Anwendungen der Protein-Elektrophorese 2.17.1 Serumprotein-Elektrophorese Albumin Alpha rGlobuline Alpha2-Globuline Beta-Globuline Gamma-Globuline 2.17.2 Lipoprotein-Elektrophorese Alpha-Lipoproteine

XIII 245 245 245 246 246 246 250 254 254 255 256 257 258 259 262 262 264 265 266 266 267 268 270 270 271 271 271 272 274 275 275 279 282 282 282 282 283 283 284 285 286 286 287 287 290 290 290 291 293 293 294 295 296

XIV

Inhaltsverzeichnis

Präbeta-Lipoproteine Beta-Lipoproteine Chylomikronen Hyperlipoproteinämien 2.17.3 Immunglobulin-Elektrophorese Struktur und Funktion der Immunglobuline 2.17.4 Hämoglobin-Elektrophorese Normale Hämoglobine Anomale und pathologische Hämoglobine Sichelzellanämie Thalassämien Durchführung der Hämoglobin-Elektrophorese 2.17.5 Elektrophorese der Kreatin-Kinase Isoenzyme der Kreatin-Kinase und ihre klinische Bedeutung 2.17.6 Elektrophorese der Lactat-Dehydrogenase Isoenzyme der Lactat-Dehydrogenase Klinische Bedeutung der LDH-Isoenzyme 2.17.7 Elektrophorese der alkalischen Phosphatase Isoenzyme der alkalischen Phosphatase 2.17.8 Liquorprotein-Elektrophorese Serumprotein-ähnliches Pherogramm Permeabiltäts-Pherogramm Gamma-Globulin-Pherogramm Laboruntersuchungen bei der multiplen Sklerose Degeneratives Pherogramm 2.17.9 Urinprotein-Elektrophorese Proteinurien Problemlösungen Aufgaben 2

296 296 296 296 298 299 300 301 302 302 303 305 306 306 308 308 309 310 311 313 313 313 313 314 314 314 315 316 323

3 Elektrophorese der Nukleinsäuren 3.1 Submarine-Zonenelektrophorese der Nukleinsäuren 3.1.1 Puffer für Submarine-Zonenelektrophorese 3.1.2 Herstellung von Agarosegelen für Submarine-Elektrophorese 3.1.3 Probenvorbereitung 3.1.4 Elektrophoretische Trennbedingungen 3.1.5 Ermittlung der Molekülmassen von DNA-Bruchstücken größer als l Kilobase 3.1.6 Pulsfeld-Zonenelektrophorese 3.1.7 Elution der DNA aus Agarosegelen Problemlösungen 3.2 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Nukleinsäuren 3.2.1 Vertikal-Zonenelektrophorese 3.2.2 Horizontal-Zonenelektrophorese 3.2.3 Elution der DNA aus Polyacrylamidgelen Problemlösungen 3.3 Disk-Elektrophorese der Nukleinsäuren 3.3.1 Disk-Elektrophorese von PCR-Produkten Problemlösungen 3.4 SDS-Elektrophorese der Nukleinsäuren Problemlösungen 3.5 Temperaturgradientengel-Elektrophorese der Nukleinsäuren Problemlösungen

325 326 327 328 328 329 329 331 332 335 335 336 340 340 344 344 347 351 351 354 356

Inhaltsverzeichnis 3.6 Auswertung der Nukleinsäure-Pherogramme 3.6.1 Fluoreszenz-Nachweismethode 3.6.2 Silberfärbung der Nukleinsäuren 3.6.3 Autoradiographie der Nukleinsäuren Problemlösungen 3.7 Blotting der Nukleinsäuren - Southern-und Northern-Blotting 3.7.1 Transfer Diftusionsblotting Kapillarblotting Vakuumblotting Elektroblotting der Nukleinsäuren 3.7.2 Blockierung 3.7.3 Detektion mit Sonden und Farbstoffen Problemlösungen 3.8 Fertiggele für die Nukleinsäure-Elektrophorese 3.8.1 Agarose-Fertiggele 3.8.2 Polyacrylamid-Fertiggele Problemlösungen Aufgaben 3

XV

:

359 359 360 361 362 364 364 364 365 365 366 366 367 367 369 369 369 370 372

4 Gegenwart und Zukunft der Elektrophorese 4.1 Worauf ist bei der Elektrophorese zu achten? Gefahr durch Objekte, die zur Untersuchung anstehen Gefahr durch das Trennmedium Gefahr durch vor- oder nachelektrophoretische Behandlungen Gefahr durch elektrophoretische Bedingungen 4.2 Tendenzen in der Entwicklung der Elektrophorese Freie oder Träger-Elektrophorese? Vertikal-oder Horizontalelektrophorese? Welche Gele werden bevorzugt? Selbstproduzierte Gele und Kits, oder Fertiggele und -kits? Wird die Elektrophorese beschleunigt und automatisiert? Welche elektrophoretische Methoden haben eine Zukunft? Werden neue Auswertungsmethoden entwickelt? Wird die Bedeutung des Blottings steigen? Wird die Elektrophorese mit nichtelektrophoretischen Methoden verknüpft?

373 373 373 3 74 374 375 375 375 375 375 375 376 376 376 376

Anhang Chronologie der Elektrophorese SI-Einheiten und physikalische Konstanten für die Elektrophorese Lösung der Aufgaben

Stichwortverzeichnis

379 384 387

397

Abkürzungen

Mi' [ ]

[ [

Dynamische Viskosität Elektrokinetisches Potential eines Ions, in V lonisationsgrad eines Elektrolyten; dimensionslos Absolute Mobilität des Ions /, in m2/(sV) Mobilität des Ions /', in nr/(sV). [Es gibt keinen Unterschied zwischen den Termini Mobilität und elektrophoretischer Mobilität] Effektive Mobilität des Ions /, in m2/(sV) Gleichgewichtskonzentration des Stoffes B, in mol/dm3 (mol/1), kmol/m3 Gleichgewichtskonzentration des Protons, in mol/dm3 (mol/1), kmol/m3 Dimensionslose Protonenkonzentration. [H+] = [H+]/[H+]0, wobei [H+]0 die Protonenstandardkonzentration von l mol/dm3 ist Gleichgewichtskonzentration des Hydroxid-Ions, in mol/dm3 (mol/1), kmol/m3 Dimensionslose Konzentration des Hydroxid-Ions; [OH"] = [OH"]/[OH']0, wobei [OH~] die Hydroxidionenstandardkonzentration von l mol/dm3 ist

Ammediol APS ATP3'

Adenin N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure Adenosindiphosphat Elektrokinetischer Radius des Ions / (Polyions pi) 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol Ammoniumperoxodisulfat Adenosintriphosphat

BAC BES BICIN BIS BISTRIS bp

Borat-Ion N,N-Bisacryloylcystamin N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-amino-€thansulfonsäure N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-glycin , '-Methylenbisacrylamid, N,N'-Methylendiacrylamid Bis-(2-hydroxyethyl)-amino-tris-(hydroxymethyl)-methan Basenpaare

C C CAPS CHAPS CHES c i CTAB

Cytosin Vernetzungsgrad (crosslinking) 3-(Cyclohexylamino)-l-propansulfonsäure 3 - [ (3 -Cholamidopropy l)-dimethy lammonio] -propansulfonat 2-(Cyclohexylamino)-ethansulfonsäure Volumenkonzentration des Ions /, in mol/dm3 (mol/1), kmol/m3 N-Cetyl-N,N,N-trimethy)ammoniumbromid

DEAE DIPSO Disk DMSO DNA DTE DTT

Diethylaminoethyl N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxy-propansulfonsäure Diskontinuierlich Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäuren 1,4-Dithioerythritol 1,4-Dithiothreitol

A ACES ADP2°i(pi)

2D-Elektrophorese Zweidimensionale Elektrophorese Ethylendinitrilotetraacetat (Ethylendiamintetraacetat) EDTA

Abkürzungen

XVIII

G G' GABA Gl. Gly-Gly

Guanin Glycinat-Ion 4-Aminobuttersäure Gleichung(en) Glycylglycin

HB HOL HEPES HEPPS HEPPSO HG

Borsäure High density lipoproteins 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1 - propansulfonsäure 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1 -(2-hydroxy-propansulfonsäure Glycin

IEF Ig '» IPG IPG-Dalt Iso-Dalt

lonenstärke, in mol/kg oder mol/dm3 (mol/1) Dimensionslose lonenstärke. / = 7//0, wobei L die Standardionenstärke von l mol/dm3 ist Volumenionenstärke, in mol/dm3 (mol/1) Isoelektrische Fokussierung Immunglobulin Massenionenstärke, in mol/kg Immobilisierte pH-Gradienten 2D-Elektrophorese: IPG / SDS-Elektrophorese 2D-Elektrophorese: IEF / SDS-Elektrophorese

K K

Kap. kb

Thermodynamische Gleichgewichtskonstante; unterschiedliche Dimensionen Dimensionslose thermodynamische Gleichgewichtskonstante. K = K/K0, wobei K.0 die thermodynamische Standardgleichgewichtskonstante ist, die die Dimension von AT hat Kapitel Kilobasen Konzentrationsgleichgewichtskonstante; unterschiedliche Dimensionen Dimensionslose Konzentrationsgleichgewichtskonstante; Kc = K-JK^ wobei K0 die Konzentrationsstandardgleichgewichtskonstante ist. Dimensionen von Retardationskoeffizient lonenprodukt des Wassers, in (mol/dm3)2, (mol/1)2

LDL

Low density lipoproteins

MES «i MOPS MOPSO

2-Morpholino-ethansulfonsäure Massenkonzentration (Molalität) des Ions i, in mol/kg 3 -Morpholino-propansulfonsäure 3-(N-Morpholino)-2-hydroxy-propansulfonsäure Relative Molekülmasse (Ionen-, Polyionenmasse). Sie stellt das Verhältnis zwischen der Masse eines Teilchens und 1/12-tel der Masse eines Atoms des KohlenstofFisotops 12C dar; dimensionlos

NAP Nonidet

Nucleic acid purifier Nichtionisches Detergens (non-ionic detergent)

ÖD

Optische Dichte

PAGE PAS

Polyacrylamidgel-Elektrophorese Periodacid-Schiff s reagent

XIX

Abkürzungen

PGM pH , pl

pK PMSF PVC PVDF

Phosphoglucomutase Wasserstoffexponent (pondus, potentia hydrogenii) - negativer Zehnerlogarithmus von [H+]; dimensionslos Isoelektrischer Punkt (pondus isoelectricus); dimensionslos Negativer Zehnerlogarithmus von ; dimensionslos Negativer Zehnerlogarithmus von K', dimensionslos Negativer Zehnerlogarithmus von Kc, dimensionslos Phenylmethansulfonylfluorid Polyvinylchlorid Polyvinylidendifluorid

RNA

Molekülradius Relative Mobilität Relative Laufstrecke (ratio to front) Geometrischer Radius des Ions / (Polyions pi) Ribonukleate Ribonukleinsäuren

s SDS

Zahl der lonenarten in der Lösung; dimensionslos Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)

S?

Polyacrylamidkonzentration, Gesamtmonomerkonzentration (total concentration) Thymin N- [ Tri s(hydroxy methy l)-methyl ] -3 -amino-propansulfonsäure TAPS N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-3-amino-2-hydroxy-propansulfonsäure TAPSO TRIS-Borat-EDTA TBE Trichloressigsäure (trichloroacetic acid) TCA N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-2-amino-ethansulfonsäure TES TMEDA (TEMED) , , ', '-tetramethylethylendiamin, l,2-Bis(dimethylamino)-ethan TMPTM A 1,1,1 -Trimethylolpropantrimethacrylat TRICIN N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-glycin TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UV

Ultraviolettes Licht

VLDL

Very low density lipoproteins Protonenladungszahl (Elektrovalenz) des Ions /'; dimensionslos

NB! Um logarithmische Werte aus den lonisationskonstanten abzuleiten, verwendet man dimcnsionslose lonisationskonstanten. Sie können als Brüche aus den lonisationskonstanten und einer Standardkonstante betrachtet werden, die l mol/dm3 oder l mol/1 entspricht. Dementsprechend sollten dimensionslose Konzentrationen von H + (oder anderen Ionen) definiert werden. Diese Größen können auch als Brüche aus den Konzentrationen von H + (oder anderen Ionen) und einer Standardkonzentration von H+ (oder anderen Ionen) definiert werden, die auch l mol/dm3 oder l mol/1 wäre. Dasselbe gilt für die lonenstärke.

Wörterbuch der elektrophoretischen Termini (Celluloseacetat-Zonenelektrophorese) Acetylcellulose (Celluloseacetat) Acetylcellulose-Zonenelektrophorese Affinitätselektrophorese

Agarosegel

Agarosegel-Zonenelektrophorese Ampholyt Analytische Elektrophorese Autoradiographie

Zonenelektrophorese in Acetylcellulose-Folien. Acetylierte Cellulose, die in Form von Folien als elektrophoretischer Träger verwendet wird. Zonenelektrophorese in einem Gel, gewöhnlich Agarosegel, das spezifische Liganden enthält. Somit werden die Polyionen noch präziser elektrophoretisch separiert. Ein natürliches Polymer, das aus D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose aufgebaut ist. Das Agarosegel wird als Trennmedium bei unterschiedlichen Elektrophorese-Methoden verwendet, besonders in der klinischen Routine. Zonenelektrophorese in einem Agarosegel. Eine Verbindung, die saure sowie basische Eigenschaften hat. Elektrophorese, bei der die im Trennmedium getrennten Polyionen als Banden nachgewiesen werden können. Die Bildung von entsprechenden Schwärzungen auf einem Röntgenfilm durch die Bestrahlung von mit Isotopen markierten Polyionen, die mittels einer Gel-Elektrophorese voneinander getrennt sind.

Base

Ein Protonenfänger. Die Base wirkt in Anwesenheit einer Säure. "Beharrliche" Funktion von Kohlrausch Ein elektrochemischer Effekt, wonach die Konzentration eines Ions von seiner Mobilität abhängt. Wenn bestimmte Voraussetzungen erfüllt werden, bewegen sich das Leit- und Folgeion mit gleicher Geschwindigkeit. Ein Gerät, in dem Transfer (gewöhnlich Elektrotransfer) Blotter durchgeführt wird. Eine Methode, bei der die elektrophoretisch getrennten Blotting Banden auf eine Membran übertragen werden, wo sie für unterschiedliche unspezifische oder spezifische Reagenzien frei zugänglich werden. Das Blotting ist eine Nachweismethode, keine Elektrophorese. Densitometrie

Desoxyribonukleate Disk-Elektrophorese DNA (Desoxyribonukleinsäuren)

Effekt des Molekülsiebes Effekt von Hjerten Elektrische Doppelschicht Elektroblotting

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von elektrophoretisch getrennten Banden durch Messung ihrer optischen Dichte mit Hilfe eines Licht- oder Laserstrahls. Polyionen der DNA. Kombination zwischen einer Isotachophorese und einer Zonenelektrophorese, die in einem Puffersystem stattfindet. Polynukleotide, die aus spezifisch angeordneten Desoxyribonukleotidresten bestehen. In einer Lösung sind sie negativ geladen. Trennung der Polyionen in einem Gel, abhängig von ihren Volumina und Konformationen. Die Konzentrierung der Polyionen an der Grenze zur Lösung mit höherer lonenstärke. Eine elektrische Schicht, die aus einer geladenen Oberfläche und ihrem (ihren) Gegenion (Gegenionen) besteht. Blotting, das in einem elektrischen Feld durchgeführt wird.

XXII

Wörterbuch der elektrophoretischen Termini

Elektrolyt Elektrophorese

Eine Verbindung, die in einer Lösung Ionen bildet. Trennung von gelösten, elektrisch geladenen Teilchen in einem elektrischen Feld.

Fertiggele

Auf Haftfolie oder Haftnetz gegossene Polyacrylamid- oder Agarosegele, die bei der Elektrophorese eingesetzt werden. Sätze, die Fertiggele, Fertiglösungen (Puffer, Fixierlösung, Färbelösung etc.) und andere Materialien (Applikationsschablonen, Löschpapiere etc.) enthalten. Gewöhnlich unlösliche Proteine, deren Polypeptidketten längere Fäden bilden. Die Bildung von entsprechenden Schwärzungen auf einem lichtempfindlichen Film, die durch sichtbares Licht verursacht werden, das durch Bestrahlung einer fluoreszierenden Substanz von mit Isotopen markierten Polyionen emittiert wird, die mittels einer Gel-Elektrophorese getrennt sind. Elektrophorese in einem fließenden Puffer, die als Zonenelektrophorese, Isotachophorese oder isoelektrische Fokussierung durchgeführt werden kann.

Fertigkits

Fibrilläre Proteine Fluorographie

Free-Flow-Elektrophorese

Gel Globuläre Proteine

Gradientengel Gradientengel-Elektrophorese Gradientenmischer Haftfolie Haftnetz Henderson-Hasselbalchsche Gleichung

Homogenes Gel Homogengel-Elektrophorese Immunelektrophorese

lonenstärke lonisationskonstante

Isoelektrische Fokussierung

Ein poröses Polymer. Lösliche Proteine, deren Polypeptidketten kugelförmig zusammengefaltet sind. Ein Gel, dessen Konzentration sich linear oder exponentiell verändert. Elektrophorese in einem Gradientengel. Ein Gerät zum Gießen von Gradientengelen. Eine chemisch vorbehandelte Folie, gewöhnlich aus Polyester, an der ein gegossenes Gel haftet. Ein chemisch vorbehandeltes Netz, gewöhnlich aus Polyester, an dem ein gegossenes Gel haftet. Eine Gleichung, die den Zusammenhang zwischen dem pHWert, einerseits, und dem p/Tc-Wert und dem Verhältnis zwischen den konjugierten Säure und Base, andererseits, darstellt. Ein Gel mit gleicher Konzentration. Elektrophorese in einem homogenen Gel. Zonenelektrophorese in einem Agarosegel, das Immunglobuline enthält oder erhält. Dadurch nehmen die elektrophoretisch getrennten Polyionen in zusätzlichen Präzipitationsreaktionen teil. Ein mathematischer Begriff, der die Elektrovalenz und die lonenkonzentrationen berücksichtigt. Eine Konstante, die eine Elektrolytenreaktion charakterisiert. Sie verbindet die Gleichgewichtskonzentrationen der Reaktanten und der Produkte bei einer bestimmten Temperatur und Druck. Elektrophorese in einem pH-Gradienten, bei der die Polyionen ihre Wanderung an ihren isoelektrischen Punkten einstellen.

Wörterbuch der elektrophoretischen Termini Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten

Isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten

Isoelektrischer Punkt

Isotachophorese

Kapillarelektrophorese Kataphorese

Papier-Elektrophorese Polyacrylamidgel

Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese Polyion

Präparative Elektrophorese Protein

Protolyt Puffer (Pufferlösung) Pufferkapazität

Pulsfeld-Elektrophorese

Rehydratisierbares Gel

Relaxation

Ribonukleate

XXIII

Isoelektrische Fokussierung in einem pH-Gradienten, der mittels freier Trägerampholyte während der Elektrophorese gebildet wird. Isoelektrische Fokussierung in einem pH-Gradienten, der mittels am Polyacrylamidgel gebundener Immobiline hergestellt wird. Der pH-Wert (bei einer bestimmten lonenstärke und Temperatur), bei dem die Summe der elektrischen Ladungen eines Polyions gleich Null ist. Elektrophorese, die in einem Puffersystem von zwei oder mehreren Puffern durchgeführt wird, wobei wandernde lonengrenzen zwischen diskontinuierlichen elektrischen Feldern entstehn. Elektrophorese (Isotachophorese, Zonenelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung) in Kapillaren. Die Bewegung der lonenatmosphäre gegen das geladene Teilchen, wodurch seine Mobilität verlangsamt wird. Zonenelektrpphorese in Papier. Ein Polymer, das gewöhnlich aus Acrylamid- und Bisacrylamidresten besteht. Das Polyacrylamid, ein Gel ohne Elektroosmose, ist als elektrophoretisches Trennmedium am weitesten verbreitet. Zonenelektrophorese in homogenen Polyacrylamidgelen. Ein im Prinzip großes Teilchen, z.B. Nukleat oder Proteinat, das viele negative, positive oder gleichzeitig negative und positive Ladungen besitzt. Quantitative Elektrophorese, bei der die Polyionen in separaten Lösungen aufgetrennt werden. Ein Makromolekül, das aus einer oder mehreren Polypeptidketten aufgebaut ist. In Lösung besitzt es viele und unterschiedliche Ladungen. Ein Elektrolyt, der in Lösung ein oder mehrere Protonen abgibt oder aufnimmt. Die Lösung einer Base und ihrer konjugierter Säure, die den pH-Wert konstant hält. Die Fähigkeit eines Puffers den pH-Wert konstant zu halten, wenn die Lösung verdünnt wird oder Basen bzw. Säuren zugegeben werden. Eine Art von Submarine-Zonenelektrophorese, die zur Trennung von Chromosomen verwendet wird. Ein getrocknetes Gel, gewöhnlich aus Polyacrylamid, das mit bestimmten Lösungen wieder in eine nasse elektrophoretisch einsetzbare Form umgewandelt werden kann. Die Dislokation der elektrischen Ladungen eines Teilchens in einem elektrischen Feld, wodurch seine Mobilität verlangsamt wird. Polyionen der RNA.

XXIV

Wörterbuch der elektrophoreti sehen Termini

RNA (Ribonukleinsäuren)

Polynukleotide, die aus spezifisch angeordneten Ribonukleotidresten bestehen. In Lösung tragen sie viele negative Ladungen.

Säure

Ein Protonenspender. Die Säure wirkt in Anwesenheit einer Base. Disk-Elektrophorese, dessen Puffersystem das denaturierende Agens SDS enthält.

SDS-Disk-Elektrophorese SDS-Zonenelektrophorese Stärkegel Stärkegel-Zonenelektrophorese

Submarine-Zonenelektrophorese

Zonenelektrophorese, dessen Puffer das denaturierende Agens SDS enthält. Ein natürliches Polymer, das aus D-Glucoseresten besteht. Zonenelektrophorese in einem Stärkegel. Heutzutage wird sie von der Elektrophorese in einem Polyacrylamid- oder Agarosegel ersetzt.

Agarosegel-Zonenelektrophorese zur Trennung von Nukleaten, die unter einem Puffer durchgeführt wird.

Trägerampholyte

Synthetisierte Ampholyte, die in einem elektrischen Feld ihre isoelektrischen Punkte erreichen und dadurch einen pH-Gradienten bilden.

Zonenelektrophorese

Elektrophorese, die in einem Puffer bei einer kontinuierlichen Stärke des elektrischen Feldes verläuft. Eine Kombination zwischen isoelektrischer Fokussierung mit Trägerampholyten oder in immobilisierten pH-Gradienten, und SDS-Disk-Elektrophorese. Ein Ion, das gleichzeitig eine positive und eine negative Ladung trägt.

Zweidimensionale Elektrophorese

Zwitterion

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese l. l Die Elektrophorese und ihre Systematik Die Elektrophorese existiert schon Dutzende von Jahren, aber ihre Entwicklung hat erst nach den Erfindungen von Tiselius einen starken Impuls bekommen. Heute erfreut sie sich einer vielseitigen Verwendung in der Forschung und Diagnostik, wo ihr Anwendungsbereich alle biologische Objekte umfa t: Peptide, Proteine, Nukleins uren, Viren, Chromosomen, Zellmembranen (Plasmamembran, lysosomale und Kernmembran), Zellorganelle (Mitochondrien, Ribosomen), Zellen (Erythrozyten, Leukozyten, Gewebezellen, Parasiten). Diese Objekte k nnen direkt getrennt werden, wenn sie sich in einer l slichen Form befinden - wie die Serumproteine, oder indirekt, nachdem sie zuerst in eine gel ste Form umgewandelt werden - wie die Zellmembranen.

1.1.1

berblick ber die Elektrophorese

Das Wort Elektrophorese setzt sich aus den altgriechischen W rtern ηλεκτρον (Bernstein), der vom Altertum her mit der Elektrizit t verbunden wird, und φορηιν (tragen) zusammen und bedeutet in freier bersetzung Bewegung von geladenen Teilchen. Heute wird die Elektrophorese als Trennung von gel sten und geladenen Teilchen in einem elektrischen Feld definiert, die durch ihre unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Wechselwirkungen mit dem Trennmedium verursacht wird (Abb. 1.1-1).

Θ

t

t OO0 OO t

θ Abb. 1.1-1 Elektrophorese von zwei Polyionen.

Es gibt Methoden, bei denen die elektrophoretische Wanderung der geladenen Teilchen ebenfalls vorhanden ist, z.B. die Nachweismethode Blotting. Dabei handelt es

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

sich aber nicht um elektrophoretische Verfahren, weil sie zu keiner Trennung fuhren. Dasselbe gilt auch für die lonophorese, die zum Einnehmen von Arzneimitteln verwendet wird. Die elektrophoretische Trennung findet in einem elektrophoretischen System statt, das gewöhnlich aus einem Trennmedium und einem Siromversorger besteht. Das Trennmedium setzt sich aus einem Puffer und einem Träger (z.B. Gel) zusammen. Es wird in der Regel in eine elektrophoretische Kammer eingelegt, wo seine Enden Kontakt mit der Anode und Kathode des Stromversorgers erhalten. Die Elektroden können direkt auf den Träger gelegt werden (Abb. 1.1-2) oder sich in zwei voneinander getrennten Elektrodentanks befinden. Anode Stromversorger

Kathode R Abb. 1.1-2 Elektrophoretisches System.

Die Probe wird auf das Trennmedium aufgetragen. Sie enthält geladene Teilchen, z.B. Proteine oder Nukleinsäuren, die wir als Polyionen bezeichnen. Die Proteine bestehen aus Aminosäureresten. Die Aminosäurereste enthalten basische sowie saure Gruppen, deswegen verhalten sich die Proteine in einer Lösung amphoter in sauren Lösungen als Polykationen, in alkalischen Lösungen als Polyanionen. Bei einem bestimmten pH-Wert wird die Zahl der positiven und negativen Ladungen des Protein-Polyions gleich, daß es keine Gesamtladung mehr trägt. An diesem pH-Wert, bezeichnet als pH(I)- oder pl-Wert, wandert das Protein-Polyion in einem elektrischen Feld nicht mehr. Die Nukleinsäuren bestehen aus Mononukleotidresten, wobei jeder von ihnen eine negative Ladung in neutralen oder alkalischen Lösungen hat. Deswegen verhalten sie sich als Polyanionen. In einem elektrischen Feld wandern sie immer in Richtung Anode. Die elektrophoretische Geschwindigkeit v eines Polyions ist direkt proportional zu seiner Mobilität und der Stärke des elektrischen Feldes E. Die Mobilität befindet sich in direkt proportionaler Abhängigkeit zur gesamten elektrischen Ladung des Polyions und in umgekehrt proportionaler Abhängigkeit zur Viskosität des Trennmediums. Die Größe der elektrischen Ladung wird vom pH-Wert des Puffers bestimmt, während die Viskosität des Trennmediums hauptsächlich von seiner Struktur und der Temperatur abhängt. Die Feldstärke ergibt sich aus dem Verhältnis zwischen der elektrischen Spannung und dem Abstand zwischen den beiden Elektroden. Da der Abstand während der Elektrophorese konstant bleibt, hängt die Polyionen-Geschwindigkeit nur von der

l. l Die Elektrophorese und ihre Systematik

3

elektrischen Spannung ab. Die Bewegung der Ionen und Polyionen im Trennmedium bestimmt die Stärke (Größe) des elektrischen Stroms. Die Teilchen, die in ihrer nativen Form geladen sind, können ohne jegliche Strukturänderungen elektrophoretisch getrennt werden, z.B. die Serum-, Liquor- oder Harnproteine sowie die Desoxy- oder Ribonukleate. Andere Teilchen, die sich in einer ungelösten Form befinden, müssen vor der Elektrophorese aufgelöst werden. Ein Beispiel dafür ist die Bildung von Mizellen zwischen Membran-Lipoproteinen und dem Detergens SDS bei der SDS-Elektrophorese. Um den Endpunkt der Elektrophorese festzustellen, läßt man Farbstoffe mit den Polyionen laufen, die die Polyionen allmählich überholen. Bei negativ geladenen Proteinen werden am meisten Bromphenolblau oder Orange G verwendet, bei positiv geladenen Proteinen Bromkresolgrün oder Methylenblau. Der Nachweis der getrennten Polyionen erfolgt entweder direkt im Trennmedium durch nichtspezifische oder spezifische Färbung, Enzym-Substrat-Reaktionen, Immunpräzipitation, Autoradio- und Fluorographie, oder indirekt durch Immunprinting oder nach dem Blotting. Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt. Sie müssen über eine gewisse Pufferkapazität verfügen. Die Pufferkapazität hängt von zwei Faktoren ab - von den pÄT-Werten der puffernden Elektrolyten und von ihren Konzentrationen, die in der Puffer-Ionenstärke festgelegt sind. Je näher die pK-Werte am pH-Wert liegen und je höher die Konzentrationen sind, desto größer ist die Pufferkapazität. Die Puffer-Ionen wandern während der Elektrophorese, genauso wie die Polyionen.

Auflösung der Elektrophorese Die wichtigste Charakteristik einer elektrophoretischen Methode ist ihre Auflösung, die von ihrem Trennvermögen und ihrer Trennschärfe abhängt. Als Trennvermögen wird die Fähigkeit der Elektrophorese bezeichnet, zwei Probenkomponenten voneinander zu trennen. Die Trennschärfe wird mit dem reziproken Wert der Bandenbreite berechnet bei schmalen Banden ist die Trennschärfe hoch, und umgekehrt. Das Trennvermögen und die Trennschärfe hängen vom Trennmedium, von den Eigenschaften der zu trennenden Polyionen und von anderen Bedingungen, z.B. der Temperatur, ab. Die erhöhte Temperatur erhöht die Diffusion, was der elektrophoretischen Auflösung schadet. Um dies zu verhindern, wird die Elektrophorese bei relativ niedrigen Temperaturen durchgeführt - hauptsächlich bei 10-15 °C. Das gewöhnlich nach einer Färbung entstandene Muster mit elektrophoretisch getrennten Polyionen-Banden wird als Pherogramm bezeichnet.

Vergleich zwischen der Elektrophorese und anderen Trennmethoden Im Vergleich zu anderen analytischen und präparativen Trennmethoden zeigt die Elektrophorese bestimmte Eigenschaften, die als Vorteile oder Nachteile beurteilt werden können. Die Elektrophorese hat gegenüber den konkurrierenden Methoden Ultrazentrifügation und Chromatographie (Dünnschicht-Chromatographie; HPLC, von high performance

4

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

liquid chromatography; und FPLC, von fast protein liquid chromatography) wichtige Vorteile. Bei der Ultrazentrifugation, wie bei der Elektrophorese, gibt es nur eine stationäre Phase. Die Trennung der Probenkomponenten wird aber von einem Gravitationsfeld verursacht und hängt nur von ihren Massen ab. Bei der Chromatographie verteilen sich die Komponenten zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Die Elektrophorese dagegen verfugt lediglich über eine stationäre Phase - ihr Trennmedium. Die Elektrophorese, besonders die isoelektrische Fokussierung, zeichnet sich durch eine sehr hohe Auflösung aus. Solche Auflösung kann nur noch mit der Chromatofokussierung erreicht werden. Bei der Elektrophorese können Enzymaktivitäten oder immunologische Identifizierungen der Proteine direkt im Gel oder indirekt auf einer Blotmembran nachgewiesen werden. Vergleichbare Möglichkeiten gibt es bei keiner der konkurrierenden Trennmethoden. Nach der Elektrophorese werden keine teuren Detektoren zum Nachweis der getrennten Polyionen benötigt, wie es bei der Chromatographie der Fall ist. Außerdem wird die Auswertetechnik (Densitometer, Computer) während der Elektrophorese nicht blockiert. Solche Möglichkeit gibt es nur bei der Dünnschicht-Chromatographie. Die Elektrophorese zeigt aber auch Nachteile: ihre Trennmedien, mit Ausnahme der Kapillar- und Free-Flow-Elektrophorese, können nur einmal verwendet werden, während eine chromatographische Säule vielfach eingesetzt werden kann.

1.1.2 Wichtigste elektrophoretische Methoden Die Systematik der Elektrophorese läßt sich nach unterschiedlichen Kriterien gliedern: nach der Nativität der zu trennenden Polyionen; der Struktur des Trennmediums; der Position des Trennmediums und den Volumina der getrennten Polyionen-Lösungen. Elektrophorese von nativen und denaturierten Polyionen. In Abhängigkeit von den Polyionennativität gibt es zwei Arten von Elektrophorese: Elektrophorese von nativen Polyionen, d.h. von Polyionen mit intakter Struktur und biochemischen Eigenschaften, und Elektrophorese von denaturierten Polyionen, d.h. von Polyionen mit veränderter Struktur und biochemischen Eigenschaften. Die erste Elektrophorese wird als native Elektrophorese bezeichnet, die zweite als denaturierende Elektrophorese. Trägerfreie und Träger-Elektrophorese. Die Elektrophorese von nativen oder denaturierten Polyionen kann in flüssigen oder festen Trennmedien durchgeführt werden. Die flüssigen Trennmedien stellen Pufferlösungen dar, die oft Glycerin, D-Sorbitol, Saccharose oder andere Chemikalien enthalten, die viskose Lösungen bilden. Die Elektrophorese in flüssigen Trennmedien heißt Träger-freie Elektrophorese und wird zur Trennung von größeren Teilchen eingesetzt, wie Viren, Bakterien und Zellen. Bei ihr hängt die Trennung ausschließlich von den Ladungen der Polyionen ab und wird stark von der Diffusion beeinflußt.

1.1 Die Elektrophorese und ihre Systematik

5

Die festen Trennmedien enthalten auch Pufferlösungen, die aber die Poren eines Trägers, meist eines Gels, ausfüllen. Bei dieser Methode, bekannt als TrägerElektrophorese, können die Polyionen nicht nur nach ihren elektrischen Ladungen, sondern auch nach ihren Volumina (Massen) getrennt werden. Somit funktioniert der Träger wie ein Sieb, was zur Erhöhung der elektrophoretischen Auflösung fuhrt. Es sind unterschiedliche Gele bekannt - aus Stärke, Agarose, Polyacrylamid. Das Polyacrylamidgel ist heutzutage das gebräuchlichste elektrophoretische Trennmedium, weil die Größe seiner Poren berechnet werden kann und somit bestimmte ProteinPolyionen nach ihren Volumen (Massen) "durchsiebt" werden können. Außerdem enthält es fast keine geladenen Gruppen, die, wie z.B. beim Agarosegel, Elektroosmose verursachen. Die Verwendung der Stärkegele hat nach der Einführung der Polyacrylamidgele stark nachgelassen und wird heute nur zur Trennung von Enzymen verwendet [1]. Bei der trägerfreien Elektrophorese unterliegen die zu trennenden Polyionen der Diffusion und Konvektion, die die elektrophoretische Auflösung stören. Die trägerfreien Trennmedien werden aber bevorzugt, wenn größere Teilchen (Viren, Bakterien, Zellen) getrennt werden sollen. Bei der Träger-Elektrophorese sind die Diffusion und Konvektion im Puffer bzw. Puffersystem verringert. Der Träger kann unterschiedlich sein: Papier, AcetylcelluloseFolie, Stärke-, Agarose- oder Polyacrylamidgel. Die Acetylcellulose-Zonenelektrophorese wird gewöhnlich in der klinischen Diagnostik verwendet. Sie ist eine routinemäßige Trennmethode, die wichtige analytische Vorinformation liefern kann. Gel-Elektrophorese. Die Träger-Elektrophorese in Gelen hat eine wachsende Bedeutung gegenüber der Elektrophorese in anderen Trägern, weil sich die Porengröße bestimmen läßt. Heutzutage sind das Agarose- und Polyacrylamidgel am meisten verbreitet. Das Polyacrylamid gilt als das beste elektrophoretische Gel, weil es keine Ladungen hat, im Gegensatz zum Agarosegel, das störende elektroosmotische Effekte verursacht. Die elektrophoretischen Methoden können in nichtrestriktiven oder restriktiven Gelen durchgeführt werden. In den nichtrestriktiven Gelen trennen sich die Polyionen der Proteine, Enzyme oder Nukleinsäuren abhängig von ihren elektrischen Ladungen, in den restriktiven Gelen trennen sie sich entsprechend ihren elektrischen Ladungen sowie ihren Volumina (Massen). Nichtrestriktive Gele sind das Agarosegel oder ein Polyacrylamidgel mit niedriger Konzentration, restriktive Gele sind Polyacrylamidgele mit hoher Konzentration. Falls die Poren eines restriktiven Gels mit den Polyionenvolumina vergleichbar sind, funktioniert das Gel wie ein Sieb, was die Auflösung der Elektrophorese erhöht. Das Agarosegel hat sehr große Poren. Deshalb beeinflußt nicht die Geschwindigkeit der Polyionen - die elektrophoretische Trennung wird nur von Ladungsunterschieden bestimmt. Das ist der Grund dafür, daß das Agarosegel zur Trennung von Desoxyribonukleaten eingesetzt wird. Die Gel-Elektrophorese kann in Rund- oder Flachgelen durchgeführt werden. Die Flachgele, besonders die dünnen und ultradünnen Flachgele, haben wichtige Vorteile gegenüber den Rundgelen.

6

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Vertikal- und Horizontalelektrophorese. In Abhängigkeit von der Gelposition werden Vertikal- und Horizontalelektrophorese unterschieden. Die Vertikalelektrophorese kann in Rund- oder Flachgelen durchgeführt werden, während die Horizontalelektrophorese nur in Flachgelen stattfindet. Die Horizontalelektrophorese bietet zahlreiche Vorteile gegenüber der Vertikalelektrophorese: einfachere Handhabung, Verwendung von mit Puffer getränkten Elektrodenstreifen statt Tankpuffer, Auswahl der Auftragsstelle (wichtig für die Nativelektrophorese und die isoelektrischen Fokussierung), freier Zugang zur Geloberfläche während der Elektrophorese etc. Während die Vertikalelektrophorese in Rund- sowie Flachgelen durchgeführt werden kann, findet die Horizontalelektrophorese nur in Flachgelen statt. Analytische undpräparative Elektrophorese. Die meisten Elektrophoresen zählen zu den analytischen Verfahren. Es sind auch Methoden bekannt, die die präparative Trennung der geladenen Teilchen ermöglichen. Die isoelektrische Fokussierung kann ebenfalls analytisch oder präparativ durchgeführt werden. Die wichtigste Charakteristik eines elektrophoretischen Systems sind die verwendeten Puffer. Abhängig davon können alle elektrophoretischen Verfahren generell nach einer der folgenden Hauptmethoden gegliedert werden: der Zonenelektrophorese, Isotachophorese und der isoelektrischen Fokussierung. Zusätzlich gibt es Kombinationen zwischen den elektrophoretischen Hauptmethoden (Tab. 1.1-1).

Zonenelektrophorese Die Zonenelektrophorese wird nur in einem Puffer durchgeführt, also in einem elektrischen Feld kontinuierlicher Stärke. Kontinuierlich bleibt auch der pH-Wert des Puffers während der Elektrophorese. Die Zonenelektrophorese ist ebenso unter den Namen kontinuierliche oder konventionelle Elektrophorese bekannt. Tiselius-Zonenelektrophorese. Bei der klassischen Tiselius-Zonenelektrophorese [2] (Methode der wandernden Grenzschichten) handelt es sich um eine freie Zonenelektrophorese. Bei ihr werden die zu trennenden Teilchen mit einem Puffer gemischt, in ein U-Rohr aus Glas eingefüllt und in den beiden Schenkeln des Rohrs mit dem Puffer überschichtet. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes trennen sich die Polyionen in einige Schichten auf (Abb. 1.1-3).

1.1 Die Elektrophorese und ihre Systematik

Tab. 1.1-1 Systematik der wichtigsten elektrophoretischen-Methoden. Puffer und Trennmedien

Zonenelektrophorese

TiseliusZonenelektrophorese KapillarZonenelektrophorese Free-FlowZonenclektrophorese Puffer in einer AcetylcelluloseA cetylcellulose-Folie Zonenelektrophorese Puffer in einem Agarosegel AgarosegclZonenelcktrophorese SubmarineZonenelektrophorese PulsfeldZonenelektrophorese Puffer und Immunglobuline in Immunelektrophorese einem Agarosegel Puffer und Liganden in einem AffinitätselektroAgarosegel phorese Puffer in einem PolyacrylamidgelPolyacrylamidgel Zonenelektrophorese Puffer in einem Gradientengel GradientengelZonenelektrophorese Puffer und SDS in einem SDSPolyacrylamidgel Zonenelektrophorese Puffersystem in einem flüssigen Trennmedium

Jsotachophorese

Isoelektrische Fokussierung

Puffer in einem flüssigen Trennmedium

Trägerampholyte in einem Polyacrylamidgel Trägerampholyte in einem Agarosegel

KapillarIsotachophorese Free-FlowIsotachophorese IEF mit Trägerampholyten Kapillar-IEF Isoelektrische Fokussierung in einem Agarosegel Free-Flow-IEF

Trägerampholyte in einem flüssigen Medium Immobiline in einem IEF in immobilisierten Polyacrylamidgel pH-Gradienten Puffersystem in einem Disk-Elektrophorese Polyacrylamidgel Puffersystem in einem Gradientengel-Disk-Elektrophorese Gradientengel Puffersystem und SDS in SDS-Disk-Elektrophorese einem Polyacrylamidgel Trägerampholyte (oder Zweidimensionale Elektrophorese Immobiline) und SDS in einem Polyacrylamidgel

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Abb. 1.1-3 Tiselius-Zonenelektrophorese der Anionen A", B" und C". Nach der Elektrophorese sind vier Zonen (Schichten) zu unterscheiden: über dem anodischen Ende der Probenlösung befinden sich eine reine Zone aus dem Anion A'und eine gemischte Zone aus den Anionen A" und B"; über dem kathodischen Ende der Probenlösung eine reine Zone aus dem Anion C" und eine gemischte Zone aus den Anionen B" und C".

Die Tiselius-Zonenelektrophorese wird heute hauptsächlich zur Messung von lonenmobilitäten verwendet. Free-Flow-Zonenelektrophorese. Bei der Free-Flow-Zonenelektrophorese [3] fließt ein Puffer senkrecht zu einem elektrischen Feld, wobei die getrennten Fraktionen unten separat gesammelt werden. Sie wird zur Trennung von Polyionen sowie Zellorganellen und Zellen eingesetzt. Es sind ebenso Free-Flow-Isotachophorese und Free-FlowIsoelektrische-Fokussierung bekannt. Acetylcellulose-Zonenelektrophorese. Die Acetylcellulose-Zonenelektrophorese [4, 5] (Celluloseacetat-Zonenelektrophorese) ist das einfachste Elektrophoreseverfahren, das heute verwendet wird. Sie wird immer mehr von den Zonenelektrophoresen in Agaroseund Polyacrylamidgelen verdrängt. Da die Acetylcellulose-Folien und die verwandten Cellogel-Streifen großporig sind, ist die elektrophoretische Trennung nur ladungsabhängig. Agarosegel-Zoneneleklrophorese. Die Agarosegel-Zonenelektrophorese [6, 7] ist sehr verbreitet. Sie wird mit gleichem Erfolg zur Trennung von Proteinen sowie Nukleaten eingesetzt. Submarine-Zoneneleklrophorese. Die Submarine-Zonenelektrophorese ist eine horizontale Agarosegel-Zonenelektrophorese, die unter einem Puffer durchgeführt wird dadurch trocknet die Geloberfläche nicht aus. Sie wird als Standardmethode zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von DNA- und RNA-Fragmenten [8, 9] verwendet.

l. l Die Elektrophorese und ihre Systematik

9

Pulsfeld-Zonenelektrophorese. Die Pulsfeld-Zonenelektrophorese [10] ist eine modifizierte Submarine-Zonenelektrophorese. Sie wird zur Trennung von Chromosomen eingesetzt. Immunelektrophorese. Als Immunelektrophorese wird die Kombination zwischen einer Zonenelektrophorese in einem Agarosegel und einer oder mehreren Immunreaktionen bezeichnet. Die Immunglobuline können auf die Oberfläche eines Agarosegels aufgetragen werden oder sich in einem anderen Agarosegel oder einer Acetylcellulose-Folie befinden, die zusätzlich aufgelegt wird. Die erste Methode ist als Immunfixation, die zweite als Immunprinling bekannt. Afflnilätseleklrophorese. Die Zonenelektrophorese, die in einem Liganden-haltigen Agarosegel durchgeführt wird, wird als Affinitätselektrophorese bezeichnet [11, 12]. Sie beruht auf Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Liganden und ihren spezifischen komplexbildenden Verbindungen. Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese. Die Polyacrylamid-Zonenelektrophorese [13, 14] wird heute überwiegend zur Trennung von Nukleinsäuren verwendet. Gradientengel-Zonenelektrophorese. Eine Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese kann in homogenen oder Gradientengelen durchgeführt werden. Die Gradientengele wirken wie ein Molekülsieb, das die Polyionen nach ihren Volumina (Massen) und Konformation [15, 16] trennt. Es werden lineare oder exponentielle Gradientenpolyacrylamidgele verwendet. SDS-Zonenelektrophorese. Die SDS-Zonenelektrophorese wird in einem Polyacrylamidgel durchgeführt, das SDS (von sodium dodecylsulfate = Natriumdodecylsulfat) enthält. SDS denaturiert die Polyionen und lagert sich so an, daß sie stark negativ geladen werden. Da die Proportion Ladung/Masse bei allen Polyionen ähnlich wird, trennen sich die Polyionen nur abhängig von ihren Massen.

Isotachophorese Die Isotachophorese verläuft in einem Puffersystem aus zwei oder mehreren Puffern. Zwischen den Puffern bilden sich wandernde lonengrenzen, an den sich die Polyionen konzentrieren. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Elektrophorese verteilt sich die Stärke des elektrischen Feldes diskontinuierlich und der pH-Wert verändert sich während der Elektrophorese. Die Isotachophorese ist auch als die Moving-Boundary-Elektrophorese bekannt. Kapillar-Elektrophorese. Die Kapillar-Elektrophorese [17, 18] wird auch als HPCE (high performance capillary electrophoresis) bezeichnet. Sie kann eine hochauflösende freie Isotachophorese darstellen, bei der die konzentrierten Polyionen durch Spacer voneinander getrennt werden können. Neben der Kapillar-Isotachophorese existieren ebenso Kapillar-Zonenelektrophorese und Kapillar-Isoelektrische-Fokussierung.

10

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Isoelektrische Fokussierung Die isoelektrische Fokussierung verläuft in einem künstlich gebildeten pH-Gradienten und wird zur Trennung der Protein-Polyionen nach ihren isoelektrischen Punkten verwendet. Die pH-Gradienten können aus mobilen (freien) Zwitterionen-Ampholyten (Trägerampholyteri) oder immobilen (unfreien) Zwitterionen-Ampholyten (Immobilinen) bestehen. Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten. Die Trägerampholyte bewegen sich in einem elektrischen Feld bis sie ihre Ladungen an ihren isoelektrischen Punkten verlieren. Dabei bilden sie einen pH-Gradienten. Isoelektrische Fokussierung in Agarosegelen. Das Agarosegel stellt eine Alternative zum Polyacrylamidgel für die isoelektrische Fokussierung [ 19, 20] dar, weil es, wenn auch in niedrigen Konzentration, ein festes Trennmedium mit großen Poren ist. Isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten, Die Immobiline sind Acrylamid-Derivate mit puffernden Gruppen. Sie werden in das Polyacrylamidgel einpolymerisiert, so daß ein immobilisierter pH-Gradient (IPG) noch vor Beginn der Elektrophorese entsteht.

Kombinationen zwischen den wichtigsten elektrophoretischen Methoden Durch Kombinationen zwischen den wichtigsten elektrophoretischen Methoden ist eine Palette von zahlreichen elektrophoretischen Verfahren entstanden, die sich einer vielseitigen Verwendung erfreuen. Disk-Elektrophorese. Die Disk-Elektrophorese stellt eine Kombination zwischen einer Isotachophorese und einer Zonenelektrophorese dar. Die Proteine konzentrieren sich zuerst in einem Sammelgel nach dem Prinzip der Isotachophorese, danach trennen sie sich voneinander in einem Trenngel nach dem Prinzip der Zonenelektrophorese. SDS-Disk-Elektrophorese. Die SDS-Disk-Elektrophorese ist eine Disk-Elektrophorese, die in einem SDS-haltigen Gel-Puffer-System durchgeführt wird. Sie ist zur Zeit die am häufigsten verwendete Elektrophorese. Zweidimensionale Elektrophorese. Die zweidimensionale Elektrophorese [21, 22] besteht aus einer isoelektrischen Fokussierung und einer SDS-Disk-Elektrophorese, die nacheinander in zwei aufeinander senkrechten Dimensionen durchgeführt werden.

Blotting Wie erwähnt, ist das Blotting keine Elektrophorese, sondern eine Nachweismethode, die ebenfalls in einem elektrischen Feld durchgeführt werden kann. Es erweitert die analytischen Möglichkeiten der Elektrophorese. Das Blotting beginnt mit dem Transfer der elektrophoretischen Banden auf eine adsorptionsfähige Membran aus Nitrocellulose oder anderen Polymermembranen.

1.1 Die Elektrophorese und ihre Systematik

11

Danach werden die freien Stellen der Membran mit Blockier-Reagenzien abgedeckt und die geblotteten Banden mit hochmolekularen Liganden (Sonden), z.B. Antikörpern, Antigenen, Lectinen oder Nukleinsäuren, nachgewiesen.

Literatur [ l ] Harris H, Hopkinson DA, Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, North Holland, Amsterdam (1976) [2] Tiselius A, Trans Faraday Soc, 33, 524 (1937) (3) Hannig K, Heidrich HG, Free-Flow Electrophoresis, GIT, Darmstadt (1990) [4J Kohn J, Clin Chim Acta, 2, 297 (1957) |5) Leslie P, Bonner R, Vandevalle I, Olsson R, Electrophoresis, 4, 318 (1983) [6] Hjerten S, Biochim BiophysActa, 53, 514 (1961) [7] Hjerten S, Biochim BiophysActa, 62, 445 (1962) [8] Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S. 150 (1982) [9] Rickwood D, Harnes B (Hrsg.), Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1982) [10] Schwartz DC, Cantor CR, Cell, 37, 67 (1984) [11] Swallow DM, inlsozymes: Curr Top Biol Med Res, 1, 159(1977) [12] Takeo K, Electrophoresis, 5, 187 (1984) [13] Raymond S, Weintraub L, Science, 130, 711 (1959) [14] Hjerten 'S,, Arch Biochem Biophys, Supp! 1, 147 (1962) [15] Margolis J, Kenrick KG, Anal Biochem, 25, 347 (1968) [16] Mahadik SP, Korenovsky A, Rapport MM, Anal Biochem, 76, 615 (1976) [17] Hjerten S,JChromat, 270, 1 (1983) [18] Ewing AG, Wallingford RA, Olefirowicz TM, Anal Chem, 61, 292 (1989) [19] Rosen A, Ek K, Aaman P, J Immuno! Methods, 28, 1 (1979) [20] Saravis CA, O'Brien M, Zamcheck N, JImmunolMethods, 29, 91 (1979) [21] O'Farrell PH,JBiol Chem, 250, 4007 (1975) [22] Klose J, Humangenetik, 26, 231 (1975)

l .2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt Alle elektrophoretisehen Methoden inkl. der isoelektrischen Fokussierung benötigen Puffer. Bevor die Puffer als ein unentbehrlicher Faktor für die Elektrophorese beschrieben werden, wird kurz das Wissenswerte über die Elektrolyte berichtet.

1.2.1 Elektrolyte Elektrolyte sind Verbindungen, die in Lösung elektrischen Strom leiten, da sie Ionen bilden. Elektrolyte sind z.B. die Basen und Säuren, die öfters Protolyte genannt werden [l, 2]. Nach der Theorie von Brönsted kann jede Base als ein Protonenfänger definiert werden und jede Säure als ein Protonenspender. Dem entsprechend sind das Acetat-Ion (CH3CC>2~) und Ammoniak (NH3) Basen, während die Essigsäure (CF^CC^H) und das Ammonium-Ion ( 4+) Säuren sind. Das Maß für die Affinität der Basen und Säuren zu Protonen ist ihre Dissoziationskonstante (lonisationskonstante), die in mol/kg oder öfters in mol/dm3 (mol/1) definiert wird.

Konzentrationsdissoziationskonstante und lonenstärke Die Säure HA, die nach dem Gleichgewicht HA H+ + Adissoziiert, wird durch die Konzentrationsdissoziationskonstante

[H+] [A'] Kc =

(1.2-1)

[HA] charakterisiert, wobei [H+], [A"] und [HA] die Gleichgewichtskonzentrationen, in mol/dm3 oder mol/1, des Protons, der Base A" und der Säure HA sind. Die letzte Gleichung kann ebenso in einer Zehnerlogarithmus-Form beschrieben werden und zwar als

[A'] PH

= pKc + \og

.

(1.2-2)

[HA] Die Konzentrationsdissoziationskonstante hängt von der Temperatur und der lonenstärke der Lösung ab.

1.2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt

13

Die Temperatur übt auf die Konzentrationsdissoziationskonstante einen gegenläufigen Einfluß aus. Einerseits labilisiert Temperatur die Bindung zwischen dem Proton und dem Molekülrest und unterstützt dadurch den Dissoziationsprozeß, andererseits löst sie teilweise die Hydratationshülle um die Protolyt-Moleküle auf und unterdrückt dadurch den Dissoziationsprozeß. Die lonenstärke stellt den Einfluß der lonenkonzentrationen und der Zahl der lonenladungen auf die Konzentrationsdissoziationskonstante eines Protolyse-Prozesses dar. Es werden zwei Arten von lonenstärken unterschieden: 7C (Volumenkonzentrationslonenstärke) und 7m (Massenkonzentrations-Ionenstärke). Sie werden durch folgende Gleichungen definiert: 1 s 7C = — I z B 2 C B

(1.2-3)

2 B=l

und 1 s 7 m = — Iz B 2 W ß ,

(1.2-4)

2 B=l

wobei s die Zahl der von Verbindung B gebildeten lonenarten ist, ZB die Zahl der Protonenladungen (die Elektrovalenz) des Ions B, CB die Volumenkonzentration des Ions B in mol/dm3 oder mol/1, und mB die Massenkonzentration (die Molalität) des Ions B, in mol/kg. Von den beiden lonenstärken hat 7m einen präziseren Wert, da aber ihre Berechnung komplizierter ist, wird gewöhnlich die lonenstärke 7C (kurz 7) verwendet. Bei 7 —» 0 wird die Dissoziationskonstante als thermocfynamische Dissoziationskonstante K bezeichnet. Die thermodynamische Dissoziationskonstante hängt nur von der Temperatur der Lösung ab. Die pK-Werte bei niedrigeren Temperaturen liegen in der Regel höher als bei höheren Temperaturen. Die Abhängigkeit zwischen K und Kc wird mit folgender Gleichung angegeben: /1/2 ,

(1.2-5)

wobei pK und pKc die Zehnerlogarithmen von K bzw. Kc sind und / das Verhältnis zwischen der lonenstärke und die Standardionenstärke, die gleich l mol/1 ist. Bei Elektrolyten, die in zwei unipolare Ionen dissoziieren, wie z.B. CtLjCC^H, vereinfacht sich Gl.( 1.2-5) zu 7 l/2

(1.2-6) V '

14

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Wenn der Ausdruck in den Klammern von Gl. (1.2-5) einen negativen Wert hat, ist pK > pKc. Wenn beiden Seiten des Gleichgewichtsprozesses dieselbe Ladung vorliegt, z.B. bei der Dissoziation des Ammonium-Ions in Proton und Ammoniak, ist pK = pKc. In Tab. 1.2-1 sind die pA^-Werte mehrerer Protolyte aufgelistet, die für die Elektrophorese von Bedeutung sind. Von den pA"-Werten können mit Hilfe von Gl. (1.2-5) bzw. (1.2-6) die pÄTc-Werte bei unterschiedlichen lonenstärken ausgerechnet werden. Dies ist bei der Herstellung von Puffern notwendig. Tab. 1.2-1 Struktur und p/T-Werte von Protolyten, die für die Elektrophorese von Bedeutung sind. Protolyte

Chemische Formeln

Oxonium-Ion

H3O+

Histidinium-Ion

"^llf-J

* LH 2

U

Mr

11 1

i" " " LH

r^n H TT LU 2

pl{.Qas·*

pK.jtjQC'

19 ,02

-1,74

1 ^7 ,16

1,78

151,12

2,02

NHj

H

Asparaginium-Ion

H2NCOCH2CH(+H3N)CO2H

Phosphorsäure

H3PO4

98 ,00

2,06

2,15

Glycinium-Ion

+H3NCH2CO2H

76 ,07

2,44

2,35

Alaninium-Ion

+

90 ,09

2,51

2,43

Glycylglycinium-Ion

+

ß-Alaninium-Ion

+

Ameisensäure

H3NCH(CH3)C02H

H3NCH2CONHCH2CO2H

3,12

133 ,12 90 ,09

3,65

3,55

HCO2H

46 ,03

3,78

3,75

Milchsäure

CH3CHOHCO2H

90 ,08

3,88

3,84

4-Aminobuttersäure-Ion (GABA-Ion)

+

104 ,12

4,09

4,03

Essigsäure

CH3CO2H

60 ,05

4,78

4,76

Propionsäure

CH3CH2CO2H

74 ,08

4,90

4,87

Pyridinium-Ion

s"^^^^

80 ,10

5,50

5,21

1 JÖ,16

6,35

6,04

195,20

6,45

6,16

210,24

6,88

6,50

H3NCH2CH2CO2H

H3NCH2CH2CH2CO2H

U H Histidinium-Ion

+

/"»

P

/~*

f*/~\~

H

MES O BISTRIS-Ion

+

NH CH2CH2SO3

(HOCH2CH2)2NH+C(CH2OH)3

15

1.2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgef hrt

Tab. 1.2-1. (Fortsetzung). Protolyte

Chemische Formeln

ACES

H2NCOCH2NH2+CH2CH2SO3·

Imidazolium-Ion

+HN

.

LJi

Mr

pK-o°C

P^2S°C

182,21

7,38

6,84

69,08

7,46

6,99

97,00

7,32

7,20

H

Dihydrogenphosphat-Ion

H2PO4"

TES

(HOCH2)3NH2+CH2CH2SO3"

229,24

8,00

7,48

HEPES

/ HOC H,CH,NH+

238,30

7,89

7,52

Triethanolaminium-Ion

(HOCH2CH2)3NH+

150,19

8,35

7,80

OH

184,19

8,40

7,98

Barbital (Veronal)

\ NCH,CH,SO;

/~V/ C H 2 C H 3

o-

\, N

/^CH 0 CH 2 37 (\ X OH

TR]S-Ion

(HOCH2)3CNH3+

122,14

8,84

8,07

TR1CIN

(HOCH2)3CNH2+CH2C02·

179,17

8,64

8,09

Glycylglycin

+

132,12

8,98

8,25

163,17

8,78

8,34

88,12

8,85

8,60

106,14

9,56

8,83

150,12

9,04

8,86

H3NCH2CONHCH2C02' +

BICIN

(HOCH2CH2)2NH CH2CO2'

Morpholinium-Ion

f~ O \

Ammediolium-Ion Asparagin Histidin

\ Ν»2

HOCH2(+H3N)C(CH3)CH2OH +

H2NCOCH2CH(NH3 )C02· ^n

Μ IN

/-,n

,·>,-.-

155.16

8,97

^^^ · Vl ^^

Λ Taurin

+

Bors ure

125,14

9,74

9,06

H3B03

61,83

9,50

9,24

Ammonium-Ion

NH4 +

18,03

10,12

9,29

Ethanolaminium-Ion

+

62,08

10,35

9,54

Alanin

+

H3NCH(CH3)CO2'

89,09

Glycin

+

H3NCH2CO2·

75,07

H3NCH2CH2SO3"

H3NCH2CH2OH

9,69 10,50

9,78

16

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Tab. 1.2-1. (Fortsetzung). Chemische Formeln

Protolyte

PK2S°C

89,09

ß-Alanin

10,19

4-Aminobuttersäure (GABA)

103.12

11,37

10,56

Prolin

115.13

11,33

10,64

18,02

16,63

15,74

^ Wasser

1.2.2 Puffer Die elektrophoretische Trennung der Polyionen, mit Ausnahme der isoelektrischen Fokussierung, erfordert konstante pH-Werte. Nur unter diesen Bedingungen bleiben die elektrischen Ladungen der Polyionen unverändert, was für die Elektrophorese eine hinreichende Voraussetzung ist. Die konstanten pH-Werte werden durch Puffer (Pufferlösungen) ermittelt. Nach dem Konzept von Brönsted stellen die Puffer Lösungen von schwachen Basen und ihren konjugierten Säuren dar. Ihre Titrationskurven zeigen einen Plateau-Bereich (Pufferzone), der bis zu 1,5 pH-Einheiten umfaßt (Abb. 1.2-1). In der Pufferzone verändert sich der pH-Wert des Puffers unbedeutend, wenn zusätzliche Basen oder Säuren hinzugefugt werden oder die Pufferlösung verdünnt wird. 0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

c _ l(c

0,2

0

c

A

HA

+ c _) A

pH 14

12 10 8 P*

6

-

Pufferbereich 2

.

1,0

HA 0,8

0,6

0,4

Abb. 1.2-1 Titrationskurve der Essigsäure (HA).

HA

l(c

HA

+ c

A

.)

1.2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt

17

Die Puffer gehorchen der Gleichung von Henderson-Hasselbalch [Base] (1.2-7) [Säure] Durch diese Gleichung, die eine Verallgemeinerung der Gl. (1.2-2) darstellt, können die pH- Werte eines Puffers ausgerechnet werden, wenn pKc der puffernden Säure und die Gleichgewichtskonzentrationen der Base und ihrer konjugierten Säure bekannt sind, z.B. [NH3] und [NH4+], oder [CH3CO2·] und [CH3CO2H]. Falls pH = pK ist, sind die Konzentrationen der Base und der Säure gleich, d.h. die Hälfte des Protolyten ist ionisiert. Um die Funktion eines Puffers zu erklären, können wir vom Gleichgewichtsprozeß HA · H+ + A-

ausgehen, der bei jedem Puffer angenommen wird. Wenn eine starke Säure hinzugefugt wird, findet der Gleichgewichtsprozeß A' + H+ HA,

statt, was mit der Gleichung

[A'] - [H+] pH = pKc + log [HA] + [H+]

( l .2-8)

beschrieben wird. Wenn eine starke Base zugegeben wird, findet der Prozeß HA + OH' A' + H2O,

statt, was mit der Gleichung

[A'] + [H+] [HA] - [H+]

(1.2-9)

ausgedrückt wird. Aus den letzten zwei Gleichungen folgt, daß der pH-Wert eines Puffers sich kaum verändert, wenn die Konzentration der zugefügten Base oder Säure niedriger als die Konzentrationen der puffernden Base [A~] und puffernden Säure [HA] ist. Falls die Pufferlösung verdünnt wird, vermindern sich die Konzentrationen der Base [A~] und der Säure [HA], aber nicht das Verhältnis [A']/[HA]. Deswegen ändert sich der pH-Wert fast nicht.

18

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Pufferkapazität Die wichtigste Eigenschaft eines Puffers ist seine Pufferkapazität ß. Die Pufferkapazität läßt sich mit der Konzentrationsänderung der Pufferbase bzw. Puffersäure bei der entsprechenden pH-Änderung des Puffers messen:

P=

(1.2-10)

i/pH

wobei CA die Basen-Konzentration ist. Sie hängt also von der Gesamtkonzentration c des puffernden Elektrolyten und vom pH-Wert des Puffers ab (Abb. l .2-2). ,

/1

0,32 0,28 0,24 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0 0

1

2

3

Abb. 1.2-2 Abhängigkeit der Pufferkapazität pH-Wert und der Gesamtpufferkonzentration c. a) c = 0,1 mol/1; b)c = 0,2 mol/1; c) c = 0,4 mol/1.

4

5

6

7p

H

des Acetat-Puffers (C^CO^VO^CG^H) vom

Nach einer Umwandlung von Gl. (1.2-10) ergibt sich der Ausdruck

[A'] [HA] (1.2-11)

= In 10

[A'] + [HA] Da [A"] = c und [HA] = c (l - a) ist, wobei a den Dissoziationsgrad darstellt, kann die letzte Gleichung in:

ß = ln!0a(l-a)c. vereinfacht werden. Falls pH = pKc, also bei = In 10 0,25 c.

(1.2-12) = 0,5, ergibt sich die Formel (1.2-13)

1.2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgeführt

19

Wie erwähnt, ist die Pufferkapazität optimal, wenn pH = pKc ist. Deswegen sollte der pÄTc-Wert des puffernden Elektrolyten dem gewünschten pH-Wert gleich sein oder nahe kommen. Ist dies nicht der Fall, darf die Differenz zwischen den Werten von pH und pKc 0,75 nicht übersteigen, d.h. | pH - pKc \ < 0,75. Wenn z.B. ein Puffer den pH-Wert von 4.3 haben muß, sollte kein Acetat-Puffer verwendet werden, sondern ein Benzoat-Puffer, da pA:C6H5C02H = 4>20 ist> während pKcHiCOm = 4>76 beträgt. Mit Hilfe der abgeleiteten Gleichungen können alle Pufferlösungen vorbereitet werden. Die Ausgangsposition dafür sind die Gesamtkonzentration des Puffers und sein pH-Wert. Die biologischen Puffer werden in intra- und extrazelluläre Puffer geteilt. Der wichtigste intrazelluläre Puffer ist der Hydrogenphosphat-Puffer (HPO42"/H2PO4·), der oft nicht korrekt als Phosphat-Puffer bezeichnet wird. Seine maximale Pufferkapazität liegt bei pH = 6,7. Neben dem Hydrogenphosphat-Puffer enthält die Zelle andere Puffer von begrenzter Bedeutung, z.B. den Glucose-6-Phosphatund Adenosintriphosphat-Puffer. Der wichtigste extrazelluläre Puffer ist der Hydrogencarbonat-Puffer HCO3~/H2CO3, bekannt auch als Bicarbonat-Puffer. Seine Kohlensäure steht im Gleichgewicht mit dem gelösten Kohlendioxid CC^dis), das seinerseits im Gleichgewicht mit dem Atmosphärenkohlendioxid CO2(atm) ist Diese Prozesse sowie die Dissoziation der Kohlensäure können folgendermaßen ausgedrückt werden: CO

2(atm) + H2° «-» CO2(dis) + H2° ° H2CO3 O H+ + HCO3·.

Der pÄTc-Wert der Kohlensäure ist gleich 3,8, aber die höchste Pufferkapazität des Hydrogencarbonat-Puffers liegt bei pH = 6,3. Diese "fehlende" Übereinstimmung zwischen der Theorie und Praxis läßt sich folgendermaßen erklären: Das Gleichgewicht zwischen der Kohlensäure und dem gelösten Kohlendioxid ist stark in Richtung Kohlendioxid verschoben - nur 0,0026 des gelösten Kohlendioxids existiert als Kohlensäure. Infolgedessen wird der pH-Wert eines Hydrogencarbonat-Puffers nicht nur vom Verhältnis HCO3"/H2CO3 bestimmt, sondern auch von der Reaktion C02 o H2CO3. Der p£-Wert der Gesamtreaktion ist gleich 6,3. Das Gleichgewicht zwischen dem gelösten Kohlendioxid und der Kohlensäure erklärt auch den Einfluß des Atmosphärenkohlendioxids auf den pH-Wert des Hydrogencarbonat-Puffers: Nach dem Gesetz von Henry hängt die Konzentration eines gelösten Gases nur von seinem Partialdruck ab. Wenn also der Partialdruck des Kohlendioxids in der Atmosphäre erhöht wird, sinkt der pH-Wert des Puffers, und umgekehrt.

1.2.3 Puffer, die bei der Elektrophorese häufig verwendet werden Für die Elektrophorese werden saure, neutrale oder alkalische Puffer verwendet (Tab. 1.2-2). Die alkalischen Puffer sind am meisten verbreitet, da die meisten Proteine sauer sind.

20

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Tab. 1.2-2 Häufig verwendete Puffer bei der Elektrophorese. Konzentrationen

Herstellung

Acetat-Puffer 10 x, pH = 5,3

0,60 mol/1 Na-Acetat

49,22 g Na-Acetat wasserfrei mit l mol/1 Essigsäure auf pH = 5,3 einstellen Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Chlorid-Puffer 4x, pH = 6,8

0,5 mol/1 TRIS HC1

6,05 g TRIS in 800 ml dest. Wasser mit HC1 auf pH = 6,8 titrieren Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Citrat-EDTA-Puffer 10 x, pH = 7,2

0,25 mol/1 TRIS 0,01 mol/1 NajEDTA

30,29 g TRIS 3,72 g NajEDTA-HjO mit 2 mol/1 Zitronensäure auf pH = 7,2 einstellen Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Hydrogenphosphat-Puffer 10 x, pH = 7,3

0,004 mol/1 0,007 mol/1 NajHPO,,

1,36 g/l KH2PO4 und 1,78 g/l Na2HPO4 im Verhältnis 435 : 565 (V/V) mischen

TRIS-HydrogenphosphatEDTA-Puffer, 10 x, pH = 7,7

0,35 mol/1 TRIS 0,35 mol/1 NaHjPC^ 0,01 mol/1 NajEDTA

42,40 g TRIS 15,5 ml 85 % Phosphorsäure 3,72 g NajEDTA-HjO Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Formiat-Puffer lOx, pH = 7,8

l,29 mol/1 TRIS 1,00 mol/1 Ameisensäure

156.27 g TRIS 37,73 ml Ameisensäure Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-HydrogenphosphatEDTA-Puffer, 10 x, pH = 8,0

0,80 mol/1 TRISHydrogenphosphat 0,02 mol/1 NajEDTA

108,0 g TRIS 15,5 ml 85 % Phosphorsäure 7,44 g NajEDTA-HjO Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Acetat-EDTA-Puffer, 50 x, pH = 8,3

2,00 mol/1 TRIS 0,05 mol/1 Na2EDTA

242.28 g TRIS mit Essigsäure auf pH = 7,2 einstellen IS.OlgNajEDTAHjO Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Borat-EDTA-Puffer, 10 x, pH = 8,3

0,89 mol/1 TRIS 0,82 mol/1 Borsäure 0,02 mol/1 NajEDTA

107,81 g TRIS 50,70 g Borsäure 7,44 g Na2EDTA H2O Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Puffer und pH Saure Puffer

Neutrale Puffer

Alkalische Puffer

21

l .2 Die Elektrophorese wird in Puffern durchgerührt Tab. 1.2-2. (Fortsetzung). Konzentrationen

Herstellung

TRIS-Taurinat-Puffer,2 pH = 8,5,/=2xO,10mol/l

0,564 mol/1 TRIS 0,782 mol/1 Taurin

68,32 g TRIS 97,86 g Taurin Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Barbitalat-Puffer 10 x, pH = 8,6

0,015 mol/1 5,5-Diethylbarbitur-

2,76 g 5,5-Diethylbarbitursäure 15,46gNatrium-5,5diethylbarbiturat Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Puffer und pH Alkalische Puffer

säure 0,075 mol/1 Natrium-5,5diethylbarbiturat

TRIS-TRICINat-Puffer pH = 8,6

0,324 mol/1 TRIS 0,096 mol/1 TRICIN

Michaelis-Puffer pH = 8,6

39,250 TRIS 17,20 TRICIN Dest. Wasser ad 1000,0 ml 5,4 g Natrium-5,5-diethylbarbiturat und3,5gNaCH 3 C0 2 3H20 in 500 ml dest. Wasser lösen und mit l mol/1 HC1 auf pH = 8,6 einstellen. Dann mit dest. Wasser ad 11 auffüllen

TRIS-Chlorid-Puffer 4x, pH = 8,8

1,5 mol/1 TRIS HC1

181,71 g TRIS in 800 ml dest. Wasser mit HC1 auf pH = 8,8 titrieren Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TRIS-Borat-EDTA-Puffer 10 x, pH = 8,8

0,58 mol/1 TRIS 0,29 mol/1 Borsäure 0,02 mol/1 N^EDTA

70,26 g TRIS 17,93 g Borsäure 7,44 g NajEDTA-HjO Dest. Wasser ad 1000,0 ml

TR1 S-Taurinat-Puffer 4x, pH = 9,0, / = 0,8

l,96 mol/1 TRIS 0,54 moi/1 Taurin

237,43 g TRIS 67,73 g Taurin Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Glycinat-PufTer 10 x, pH = 10,5

0,20 mol/1 Glycin

15,01 g Glycin mit 0,1 mol/1 NAOH auf den gewünschten pH-Wert einstellen Dest. Wasser ad 1000,0 ml

Literatur [1] Hulanicki A, Reaktionen der Säuren und Basen in der analytischen Chemie, in russ., Mir, Moskau (1975) [2] Jander G, Jahr KF, Maßanalyse, 15. Aufl., fortgeführt von Schulze G und Simon J, Walter de Gruyter, Berlin - New York (1989)

l .3 Die Proteine und Nukleinsäuren bilden in Lösung Polyionen Die Elektrophorese wird am häufigsten zur Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren verwendet. Diese Verbindungen dissoziieren in einer Lösung in Protonen (die sauren Proteine und die Nukleinsäuren) oder binden Protonen (die alkalischen Proteine). Infolgedessen verwandeln sie sich in geladene Teilchen (Polyionen), wobei die negativ geladenen Proteine als Proteinate, die positiv geladenen Proteine als Protein-Kationen und die negativ geladenen Nukleinsäuren als Nukleate bezeichnet werden können.

1.3.1 Elektrische Doppelschicht eines geladenen Teilchens Alle geladenen Teilchen stehen in elektrostatischen Wechselwirkungen mit entgegengesetzt geladenen Ionen (Gegenionen). Die Gegenionen bilden lonenatmosphären. Die Oberfläche eines geladenen und solvatierten (hydratierten) Ions oder Polyions und seine lonenatmosphäre bauen eine elektrische Doppelschicht auf [l, 2].

Modell von Helmholtz Das erste Modell der elektrischen Doppelschicht wurde von Helmholtz [3] und Perrin [4] entwickelt. Nach diesem Modell, bekannt als Helmholtzsches Modell, befinden sich die Gegenionen in einem bestimmten Abstand zu der geladenen Oberfläche. Infolgedessen ähnelt die elektrische Doppelschicht einem Kondensator, dessen elektrisches Potential linear mit der Entfernung von der geladenen Oberfläche sinkt (Abb. 1.3-1). lonenatmosphäre

a

b

Abb. 1.3-1 Modell der elektrischen Doppelschicht nach Helmholtz (a) und Gouy-Chapman (b).

1.3 Die Proteine und Nukleins uren bilden in L sung Polyionen

23

Nach diesem Modell kann ein geladenes Teilchen als ein Kugelkondensator betrachtet werden, der aus zwei konzentrischen Sph ren besteht. Das elektrische Potential der Oberfl che des geladenen Teilchens (das innere elektrische Potential von Helmholtz) ist gleich ,

(1-4-3)

wobei/der Reibungskoeffizient (in Js/m2) ist und v^ die Geschwindigkeit des geladenen Teilchens (in m/s) in einer unendlich verdünnten Lösung, d. h. im Lösungsmittel. Sphärische Teilchen verhalten sich entsprechend dem Gesetz von Stokes /=6

·,

(1.4-4)

wobei die dynamische Viskosität des Lösungsmittels (in Pa s) ist, und r der Radius des geladenen Teilchens (in m). Aus Gl. (1.4-1) - (1.4-4) ergibt sich die Gleichung ze = 6nr\r — . E

(1-4-5)

Es ist ebenso bekannt, daß VQC

— = E

,

(1-4-6)

wobei ^ die absolute Mobilität des Teilchens, in m2/(sV), ist, d. h. ihre Mobilität in einer unendlich verdünnten Lösung. Aus Gl. (1.4-5) und (1.4-6) ergibt sich, daß

1.4 Die Poyionen bewegen sich in einem elektrischen Feld

37

(1.4-7) 6nr\r Das geladene Teilchen bewegt sich aber nicht in einer unendlich verdünnten Lösung, sondern zusammen mit dem auf seiner Oberfläche gebundenen Teil der lonenatmosphäre (Kap. 1.3.1). Deswegen wird auf dem geladenen Teilchen nicht das absolute Potential 0 gemessen, sondern das elektrokinetische Potential , unter dem die meisten Wissenschaftler das Potential an der Grenze zwischen dem Teilchen mit den adsorbierten Gegenionen und dem diffusen Teil der lonenatmosphäre verstehen. Deswegen vermindert sich die Mobilität des Ions i, analog zu Gl. (1.4-6), in: v i — = E

(1.4-8)

1.4.1 Gleichung von Smoluchowski Smoluchowski [l, 2] stellte fest, daß die Mobilität folgender Gleichung ausgedrückt werden kann =

,

eines geladenen Teilchens mit

(1-4-9)

wobei die (Di)elektrizitätspermeabilität des Lösungsmittels (des Wassers) ist, die ein Produkt aus ihrer relativen (Di)elektrizitätspermeabilität er und der (Di)elektrizitätskonstante 0 (8,854 187 817 l O"12 F/m) darstellt.

1.4.2 Gleichung von Hückel Später bewies Hückel [3], daß die lonenatmosphäre die absolute Mobilität (l + reduziert, nach der Gleichung

«,

= 1+

=

,

) mal

(1.4-10)

1,5

wobei der Reziprokwert der Dicke der lonenatmosphäre (l/ ) ist, und a der Radius des geladenen Teilchens. Wenn die Konzentration der Lösung (des Puffers) steigt, vermindert sich die Dicke der lonenatmosphäre, also, vergrößert sich die Summe (l + ). Dies bedeutet, daß das -Potential sowohl von der Ladung des Teilchens, als auch von der Konzentration der Lösung (des Puffers) [4] abhängt.

38

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

l .4.3 Funktion von Henry Wenn die Gleichungen von Smoluchowski (1.4-9) und Hückel (1.4-10) verglichen werden, ergibt sich, daß die Mobilität im ersten Fall 1,5 mal höher erscheint als die Mobilität im zweiten Fall. Um zu zeigen, daß beide Gleichungen Grenzfälle zutreffen, fugte Henry [5, 6] in die Gleichung von Hückel die von ihm abgeleitete komplexe Funktion/(Ka) und erhielt

=

/(

(1.4-11)

).

1,5

Entsprechend der Funktion von Henry hängt die Ionen- bzw. Polyionenmobilität nicht nur von der lonenstärke der Lösung, die im Parameter vorhanden ist, sondern auch vom Radius des geladenen Teilchens ab. Wenn —» >, dann /( ) —> 1,5 und die Gl. (1.4-11) umwandelt sich in die Gleichung von Smoluchowski (1.4-9); wenn —» 0, dann /( ) -» 1,0 und die Gl. (1.4-11) geht in die Gleichung von Hückel (1.4-10) über.

l .4.4 Gleichung von Onsager Onsager [7, 8] schlußfolgerte, daß die Mobilität eines Ions bzw. Polyions von den Phänomenen Kataphorese und Relaxation beeinflußt wird. Die Kataphorese entsteht während der diffuse Teil der lonenatmosphäre sich in einem elektrischen Feld gegen das Polyion bewegt und zusätzliche Reibung verursacht. Als Relaxation wird die Umstrukturierung des Komplexes Polyion-Ionenatmosphäre in einem elektrischen Feld bezeichnet: während der Elektrophorese bewegen sich das Polyion und seine lonenatmosphäre in entgegengesetzte Richtungen, was zur Polarisierung des Komplexes und damit zur zusätzlichen Verringerung der Polyionenmobilität führt (Abb. l .4-1).

© F

Abb. 1.4-1. Einfluß der kataphoretischen (F^) und Relaxationsstärke (Fr) auf die Mobilität eines Polyions.

1.4 Die Poyionen bewegen sich in einem elektrischen Feld

39

Der Einflu der Kataphorese und der Relaxation auf die Mobilit t des Teilchens wird von der Onsagerschen Gleichung beschrieben:

μι = μοοϊ - (v-kai + μΓει) = μ«» - ^ *ι im>

Ο 4-12)

wobei μ^ die absolute Mobilit t des Ions / (Polyions) ist, μ^ι bzw. μκ1 seine Kataphorese- bzw. Relaxationsmobilit t, Zj die Zahl seiner Protonladungen (die Elektrovalenz), η die Steigung der Onsagerschen Eichgeraden, und / die lonenst rke der L sung (des Puffers).

l .4.5 Gleichung von Robinson-Stokes Die Onsagersche Gleichung kann nur bei niedrigen lonenst rken verwendet werden. Bei h heren Werten der lonenst rke (bis 0, l mol/1) guter bereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen gibt die Gleichung von Robinson-Stokes [9] jj 71/2

l +κα

(1-4-13)

Dieser Gleichung entsprechend werden die Ionen und Polyionen nicht als Punktladungen, wie in der Theorie von Onsager, sondern als r umlich ausgedehnte geladene Teilchen betrachtet. Deswegen wird 71/2 durch die Summe (l + κα) dividiert, wobei der Radius α des geladenen Teilchens unterschiedliche Werte haben kann, abh ngig von den experimentellen Bedingungen.

l .4.6 Parameter der lonenmobilit t Die lonenmobilit t kann auch nach der Gleichung μϊ = μοοί-Ρί,

(1.4-14)

berechnet werden, wobei p\ der Parameter der lonenmobilit t [10] ist, gleich Z^K

6πη

(1-4-15)

Der Parameter der lonenmobilit t wird aus dem Verh ltnis zwischen dem geometrischen Radius η und dem elektrokinetischen Radius a; des Ions / [ l l ] fl^riO+icrj) und der Stokeschen Gleichung abgeleitet.

(1.4-16)

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

40

l .4.7 Quadratische Gleichung der lonenmobilität Wenn Gl. (1.4-16) in die Gleichung von Robinson-Stokes (1.4-13) eingesetzt wird und der entstehende Ausdruck vereinfacht wird, erhalten wir folgende quadratische Gleichung in 71/2 (71/2 wird in der Größe enthalten):

l +

(1.4-17)

+ K2r2

Die experimentellen Werte der lonenmobilität werden sowohl durch die quadratische Gleichung als auch durch die Gleichung von Robinson-Stokes gut wiedergegeben. Im Gegensatz zur Verwendung der kontextabhängigen Größe a in der Gleichung von Robinson-Stokes wird in der quadratischen Gleichung der klar definierte geometrische Radius des Ions benutzt. Es ist einfacher, wenn die Mobilitätswerte aus der Gleichung von Onsager oder aus der linearen Gl. (1.4-14) berechnet werden. Die Mobilitätswerte, kalkuliert nach der Gleichung von Onsager, sind aber bei /> 0,01 mol/dm3 weit von den experimentellen Werten entfernt (Abb. l .4-2). , S m2/ kmol

S m / kmol

12,6 12,2 11,8 11,4 11,0 10,6

—

0,1

0,2

0,3

0,4 /" 2 , (mol/dm3 )m

13,6 13,2 12,8 12,4 12,0 11,6 11,2 10,8 10,4 10,0 9,6 0,1

0,2

0,3

0,4 / 1 / 2 , (mol/dm 3 ) tn

Abb. 1.4-2. Leitfähigkeit der Lösungen von NaCl (links) und CaCl2 (rechts) bei 25 °C, berechnet nach der Gleichung von Robinson-Stokes, bei a gleich 4 10'10 m für 1-1 bzw. 4,31 10'10 m für 1-2 Elektrolyte und nach der quadratischen Gleichung (die gestrichelten Kurven); nach der Gleichung von Onsager (die punktierten Geraden); und nach der linearen Gleichung mit dem Parameter der lonenmobilität (die punktiert-gestrichelten Geraden). Es wird angenommen, daß + = 51,93 10~9, - = -79,13 "9 und 1/2 ^.^ = 61,67 · "9 m2/(sV). Die experimentellen Ergebnisse werden durch die durchgezogenen halbfetten Kurven repräsentiert.

Am isoelektrischen Punkt eines Proteins geht seine Nettoladung und damit seine Mobilität gegen Null. In Tab. 1.4-1 sind die absoluten Mobilitäten von Ionen aufgelistet, die eine Bedeutung für die Elektrophorese haben:

41

1.4 Die Poyionen bewegen sich in einem elektrischen Feld Tab. 1.4-1. Absolute Mobilit ten, in m2/(sV), von unterschiedlichen Ionen bei zwei Temperaturen.

Ha lQ9 (Q°C) ι*4l*(2S-Q

Ionen

Chemische Formeln

Hydronium-Ion

H3O+

248,74

362,56

Ammonium-Ion

NH4+

40,32

76,23

39 ,57

76,18

27,40

51,92

23 ,92

47,59

,65

43,74

23 ,92

42,30

20,69

40,37

Kalium-Ion

K

+

Natrium-Ion

Na

Ethanolaminium-Ion

+

Imidazolium-Ion

+

+

H3NCH2CH2OH

HN ^X.vfX·

26

Ί J

H

Pyridinium-Ion

χ·*^^^"*

/ wird nach der Gleichung vpi = Hpi£,

(1-5-1)

berechnet, wobei mit vpi und μ^ die Geschwindigkeit bzw. die Mobilit t des Polyions, und mit E die St rke (Intensit t) des elektrischen Feldes bezeichnet wird. Diese Gleichung zeigt, da die Elektrophorese von jenen Faktoren abh ngt, die die Polyionenmobilit t und die Feldst rke beeinflussen.

1.5.1 Wovon h ngt die Polyionenmobilit t ab? Die Polyionenmobilit t wird durch die Gleichung μρί= - /Μ 1,5η

(1.5-2)

ausgedr ckt, wobei ζ-Potential (in V) die elektrische Doppelschicht des Polyions charakterisiert, und ε die (Di)elektrizit tspermeabilit t des L sungsmittels (des Wassers) (Kap. 1.4), η die dynamische Viskosit t des L sungsmittels (in Pas) und /(κτ) eine Funktion [1] ist. Die Funktion /(κτ) hnelt der Henryschen Funktion /(κα) (Kap. 1.4) und wird durch die Gleichung (1.5-3) 1+κτ ρί beschrieben, wobei κ der Parameter von Debye-H ckel [2] ist, und a p j bzw. rpj der elektrokinetische bzw. der geometrische Radius des Polyions. Aus Gl. (1.5-2) und (1.5-3) ergibt sich, da ζε 1,5η

l + καρί —· l+K/- p i

0.5-4)

Unseren Vorstellungen nach [3] existiert zwischen dem elektrokinetischen und dem geometrischen Radius eines Polyions die Beziehung: tfpi^pi + K) 2 ,

(1-5-5)

wobei TJ der geometrische Radius des Gegenions ist. Wenn die letzte Gleichung im zweiten Term der Gl. (1.5-4) integriert wird, ergibt sich folgender Ausdruck:

46

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

l + KTpj + ( ^ Hpi =

1,5

1+KTpj

·

(1.5-6)

Die Mobilität eines Polyions hängt von seinen Eigenschaften und vom Puffer ab.

Einfluß der Natur des Polyions Das elektrokinetische Potential und der geometrische Radius rp, werden von der Natur des Polyions bestimmt (Kap. 1.3). Dabei ist das -Potential sowohl von der elektrischen Ladung des Polyions, als auch von seinem geometrischen Radius abhängig. Im Unterschied zu den Proteinen ändert sich die Zahl der Ladungen der Nukleinsäuren nicht in neutralen oder alkalischen Puffern. Infolgedessen bleibt das Verhältnis Ladung/Masse bei allen DNA- und RNA-Polyionen und dadurch ihre Mobilität immer gleich [4]. Die Mobilität hängt nur von der lonenstärke und dem Zustand der Polyionen ab - z.B. die Mobilität der nativen DNA von Kalbsthymus ist bei einer lonenstärke von 0,1 mol/1 15,1 l (T9 m2/(sV) und bei 0,01 mol/1 21,7 l O'9 m2/(sV) (für die denaturierten DNA von Kalbsthymus bzw. 13,3 10'9 und 19,0 l O'9 m2/(sV)). Deswegen wird die Trennung der DNA-Polyionen in Trägern nur von ihrem Volumen (Masse) und ihrer Konformation, aber nicht von ihren Ladungen bestimmt. Wird mit einem restriktiven Gel gearbeitet, werden die größeren Nukleat-Polyionen bei ihrer Wanderung einem größeren Widerstand entgegengesetzt, was zur Verminderung ihrer Mobilität fuhrt. Die erhöhte Temperatur verlangsamt ebenso ihre Mobilität, da sie eine Denaturierung verursacht und dadurch ihr Volumen vergrößert. Es gibt zwei Theorien, die die Mobilität der Nukleat-Polyionen in einem Träger beschreiben: die Theorie von Ogston und die Theorie der Kriechenwanderung. Bei den beiden Theorien wird der Träger als ein zufälliges Netz betrachtet, deswegen sind sie für Agarose- sowie Polyacrylamidgele verwendbar. Nach der Theorie von Ogston [5, 6] ist =

7 0*-** ',

(1.5-7)

wobei und 0 die Mobilität der Nukleat-Polyionen im Träger bzw. im Puffer sind, und Kfr und T der Retardationskoeffizient bzw. die Konzentration des Gels. Für niedermolekulare DNA wurde dieses Verhältnis experimentell bewiesen. Der Koeffizient ÄTR hängt vom Radius der Polyionen ab, die durch die Gelporen wandern. Nach der Theorie der Kriechenwanderung [7, 8] hängt die Nukleat-Mobilität von der serpentinenartigen Wanderung der Nukleat-Polyionen im Gel ab. Sie erklärt die Wanderung der größeren Nukleat-Polyionen besser. In dieser Theorie werden die Nukleinsäuren nicht als stabile, sondern als flexible Strukturen betrachtet. Ihr entsprechend tritt das Nukleat-Polyion zuerst mit dem einen Ende (Leitende) in die Gelpore ein, danach "kriecht" sein Rest hinterher. Dadurch wird die experimentell bestätigte Abhängigkeit der Nukleat-Mobilität von der Kettenlänge [9] erklärt. Das Verhältnis zwischen der Mobilität, der Kettenlänge N und der Feldstärke E wird mit folgender Gleichung [10] beschrieben:

1.5 Theorie der Elektrophorese

=

l (— +bE2), N

47

(1.5-8)

wobei K eine Konstante ist, die die Ladung und die Reibungsstärke wiederspiegelt, und b die Porenstruktur des Gels darstellt.

Einfluß des Puffers Der Puffer beeinflußt die elektrischen Ladungen eines Polyions vorwiegend durch seinen pH-Wert und seine lonenstärke, die die Größe des elektrokineti sehen Potentials beeinflussen. pH-Wert des Puffers. Für starke Elektrolyte, die praktisch vollständig ionisiert werden, übt die Protonenkonzentration, also der pH- Wert keinen Einfluß auf die lonenmobilität aus. Bei schwachen Säuren und Basen, die in den Puffern vorhanden sind, sowie bei Ampholyten bzw. Polyionen, ist aberdie lonenmobilität eine Funktion des Dissoziationsgrades des Elektrolyten und dadurch des pH- Wertes nach der Gleichung '( )=

u

O·5'9)

i(pi)

In dieser Gleichung ist i(pi) die effektive Mobilität des Ions / (Polyions/?/), in m2/(s V); der Dissoziationsgrad; und ( ) die Mobilität des Ions (Polyions) bei vollständiger Dissoziation (Assoziation) des schwachen Protolyten. Mögen wir nun gedanklich das zu trennende Teilchen (das Makromolekül) als eine schwache monobasische Säure betrachten, ignorieren wir also seine zahlreichen ionisierbaren Seitengruppen. Wenn wir das Makromolekül als HPi bezeichnen, dann ergibt sich aus Gl. (1.5-9) und der Definition des Dissoziationsgrades das Verhältnis

[Pi-] [HPi] + [Pi~]

(1.5-10)

wobei [Pi~] die Konzentration des Makroanions Pi", in mol/1, ist, und [HPi] die Konzentration der nichtdissoziierten Makromoleküle, auch in mol/1. Die letzte Gleichung läßt sich mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes in

[H+] + Kc umwandeln. In dieser Form zeigt sie, daß die effektive Mobilität eines Polyions vom pHWert abhängig ist. Wenn der Wert der H+-Konzentration viel kleiner als der Wert der Konzentrationsdissoziationskonstante ist, geht der Bruch in Gl. (1.5-9) gegen l und ' ; —» . Wenn der Wert der H+-Konzentration viel größer als der Wert der Konzentrationsdissoziationskonstante ist, geht der Bruch in derselben Gleichung gegen 0 und ' —> 0.

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

48

In Wirklichkeit stellt sich die obige Abhängigkeit viel komplizierter dar, besonders· wenn es sich um Ampholyte, z.B. Trägerampholyte, handelt, die viele ionisierbare Gruppen mit unterschiedlichen pÄTc-Werten haben. Um das Verhalten eines Ampholyten, z.B. eines Proteins richtig zu verstehen, müssen wir erwähnen, daß die Mobilität eine skalare Größe ist - sie kann positive oder negative Werte haben. Wenn bei einem bestimmten pH-Wert (beim pl-Wert) die Summe dieser Mobilitäten, also seine Gesamtmobilität, gleich 0 wird, bewegt sich das Zwitterion nicht weiter. Mit seiner wichtigsten Eigenschaft - den pH-Wert der Lösung unverändert zu halten ist der Puffer die hinreichende Voraussetzung zur Durchführung jeder Elektrophorese. Je näher der pA"-Wert des puffernden Elektrolyten dem pH-Wert liegt und je höher seine lonenstärke ist, desto höher ist die elektrophoretische Auflösung. Die graphische Darstellung der Abhängigkeit der effektiven Mobilität vom pH-Wert hat einen sigmoidalen Verlauf (Abb. 1.5-1), der der Titrationskurve einer schwachen Säure ähnelt.

0

2

4

6

8

10

12 14

pH

Abb. 1.5-1 Die effektive Mobilität eines Ions in Abhängigkeit vom pH-Wert bei einer schwachen Säure (a), einem Ampholyten (b) und einer schwachen Base (c).

lonenstärke des Puffers. Die Abnahme der Polyionenmobilität mit steigender lonenstärke des Puffers läßt sich mit den von uns eingeführten Begriffen geometrischer und elektrokinetischer Radius erklären (Kap. 1.4.6 und Gl. 1.5-5). Wenn die lonenstärke steigt, wird das Produkt größer, wodurch sich der elektrokinetische Radius des Polyions, apj, vergrößert und das elektrokinetische Potential verkleinert. Beides verringert die Mobilität des Polyions (Abb. 1.5-2). Das Umgekehrte folgt, wenn die lonenstärke niedriger wird - dann verkleinert sich der elektrokinetische Radius des Polyions und das elektrokinetische Potential vergrößert sich.

49

1.5 Theorie der Elektrophorese

-10 9, m /(sV) -50

-40 -30 -20

0 0

0,005

0,010

0,015

0,020

/, mol/1

Abb. 1.5-2 Abhängigkeit der Mobilität eines Polyions von der lonenstärke des Puffers.

(Di)elektrizitätspermeabilität des Puffers. Die relative (Di)elektrizitätspermeabilität er des Lösungsmittels (des Wasser) bleibt während der Elektrophorese konstant. Sie hängt nur von der Temperatur ab - z.B. ist er bei 0 °C gleich 88,00, und bei 25 °C gleich 78,64. Additive, wie z.B. Detergenzien, verändern die relative (Di)elektrizitätspermeabilität und dadurch die Mobilität der Polyionen. Temperatur des Puffers. Die Temperatur beeinflußt die (Di)elektrizitätspermeabilität des Lösungsmittels und die dynamische Viskosität . Der Einfluß der Temperatur auf die (Di)elektrizitätspermeabilität des Lösungsmittels ist noch nicht völlig geklärt. Bezüglich der dynamischen Viskosität des Lösungsmittels hat man festgestellt, daß sie mit steigender Temperatur stark abnimmt. Für viele Puffer gilt mit guter Näherung die Gleichung

=

e bIT

(1.5-12)

wobei A und b empirische Konstanten sind. Empirische Untersuchungen deuten an, daß eine Erhöhung der Temperatur von l K eine Zunahme der Mobilität um ca. 3 % verursacht.

Einfluß des Trägers Der Träger beeinflußt die Elektrophorese aufgrund seiner dynamischen Viskosität und gegebenenfalls durch die Elektroosmose. Dynamische Viskosität des Trägers. Im Gegensatz zur Elektrophorese in einem Puffer (trägelfreien Elektrophorese) tritt bei Verwendung von festen Trägern (TrägerElektrophorese) eine zusätzliche dynamische Viskosität auf, die die Polyionenmobilität weiter vermindert. Diese zusätzliche dynamische Viskosität läßt sich mit der porösen Struktur des Trägers erklären und verursacht, daß das geladene Teilchen nicht gerade auf dem

50

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

kürzesten Weg 5 wandert, sondern im Zickzack auf einem längeren Weg s'. Das Verhältnis kann folgendermaßen dargestellt werden: (1.5-13) wobei m die Mobilität in einem pufferhaltigen Träger und die Mobilität in einem Puffer ist. Die dynamische Viskosität des Trägers hängt ihrerseits von der Temperatur ab. Elektroosmose. Als Elektroosmose (Elektroendoosmose) wird die Bewegung des Lösungsmittels (Wassers) durch einen geladenen Träger bezeichnet, der sich in einem elektrischen Feld befindet. Die Elektroosmose ist typisch für das Agarosegel. Es besitzt saure Gruppen, die in neutralen und alkalischen Puffern negative Ladungen erhalten. Da das Agarosegel unbeweglich ist (stationäre Phase), wandert es nicht zur Anode. Seine Gegenionen aber, die positiv geladen sind, wandern, zusammen mit ihren Hydrathüllen, zur Kathode (mobile Phase). Infolgedessen nimmt der kathodische Gelpol Wasser auf (hydratisiert), während der anodische Gelpol es verliert (dehydratisiert). Die Elektroosmose stellt einen störenden Faktor für die Elektrophorese und die isoelektrische Fokussierung dar, da das Wasser gegen die Richtung der wandernden Polyionen fließt. Um das zu vermeiden, wurden in den letzten Jahren chemisch gereinigte Agarose-Arten auf den Markt gebracht, die viel weniger saure Gruppen enthalten. Das Polyacrylamid zeigt in der Regel keine Elektroosmose, da es frei von dissoziierenden Gruppen ist.

1.5.2 Wovon hängt die Stärke des elektrischen Feldes ab? Wenn zwischen zwei Elektroden elektrische Gleichspannung angelegt wird, ergibt sich die Feldstärke

U £=— ,

(1.5-14)

wobei (/die elektrische Spannung, in V, ist, und / der Abstand zwischen den Elektroden, in m. Der Abstand bleibt in der Regel während der Elektrophorese unverändert. Deswegen hängt die Stärke des elektrischen Feldes nur von der elektrischen Spannung ab. Die Feldstärke kann auch durch den Ausdruck

J E=— beschrieben werden, wobei J die Stromdichte, in A/m2, und keit des Puffers, in S/m, ist (Kap. 1.4).

(1.5-15) die spezifische Leitfähig-

1.5 Theorie der Elektrophorese

51

l.5.3 Theorie der isoelektrischen Fokussierung Zwischen der Elektrophorese, im engen Sinne des Wortes, und der isoelektrischen Fokussierung gibt es viele Gemeinsamkeiten. Die Elektrophorese sowie die isoelektrische Fokussierung sind elektrokinetische Phänomene, da sie von den elektrischen Ladungen der Polyionen verursacht werden. Während aber die Elektrophorese bei einem konstanten pH-Wert durchgeführt wird, benötigt die isoelektrische Fokussierung einen pH-Gradienten, in dem die amphoteren Polyionen ihre Nettoladungen allmählich verlieren, bis sie an ihren isoelektrischen Punkten (Kap. 1.3) zum Stillstand kommen (Abb. 1.5-3).

pH 10 9 8

t

7 6

i

5 4

L

Abb. 1.5-3 Schema der isoelektrischen Fokussierung von zwei Proteinen mit pH(I)-Werten von 8,6 bzw. 5,0. Bei pH-Werten über den pH(I)-Werten sind die Carboxylgruppen negativ geladen (CO2"), die N-haltigen Gruppen (-NH2) tragen aber keine Ladungen. Dadurch haben die Protein-Polyionen negative Nettoladungen. Bei pH-Werten unter den pH(I)-Werten tragen die Carboxylgruppen (-CO2H) keine Ladungen, die N-haltigen Gruppen sind aber positiv geladen (-NH3+). Infolgedessen haben die ProteinPolyionen positive Nettoladungen. An den isoelektrischen Punkten werden die Nettoladungen gleich Null.

Auflösung der isoelektrischen Fokussierung Die Theorie der isoelektrischen Fokussierung wurde von Svensson [11, 12,] (er nannte sich später Rilbe) auf der Basis-Information von Kolin [13] entwickelt. Es gelang ihm die Auflösung der isoelektrischen Fokussierung in mathematischer Form auszudrücken. Nach seiner Theorie ist die Breite einer Proteinbande

~

D

(1.5-16)

52

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

wobei die Standardabweichung ist (ungefähr 1/4 der Bandenbreite, in (Vm)1/2), D der Diffüsionskoeffizient des Proteins (in m2/s), / die Mobilitätssteigerung am pH(I)-Wert (in m2/(sV)) und dpWctx der Anstieg des pH-Gradienten an der Bande (in m"1). Später leitete Svensson eine andere Gleichung ab, die die Auflösung zwischen zwei Proteinen beschreibt. Für zwei benachbarte Zonen mit gleicher Proteinkonzentration, Gaußscher Verteilung und einem Abstand zwischen den Peaks, der dreimal größer als der Abstand vom Peakmaximum zum Wendepunkt ist, läßt sich die Auflösung nach der Gleichung

berechnen. Dabei ist ( ) der benötigte Unterschied zwischen den pH(I)-Werten beider Proteine, um sie voneinander zu trennen, und E die Stärke (Intensität) des elektrischen Feldes bei den pH(I)- Werten, in V/m. Durch diese Gleichung wird die Auflösung der isoelektrischen Fokussierung als die kleinste pI-Differenz zweier Ampholyte definiert, die voneinander getrennt werden können. Die Formel zeigt auch, daß sich die Auflösung erhöht, wenn der Diffusionskoeffizient vermindert wird und die Feldstärke ansteigt. Demnach wird die Auflösung um so größer, d.h. ( ) um so kleiner, je höher die angelegte Feldstärke und je kleiner die pH-Differenz innerhalb der Trennstrecke ist. Es ist festgestellt worden, daß die Differenz zwischen den pl-Werten mindestens 0,02 pH-Einheiten betragen sollte. Die Peakkapazität n einer isoelektrischen Fokussierung, d.h. die maximale Zahl der auftrennbaren Polyionen, läßt sich nach der Gleichung [14]

RT

·

berechnen, wobei / die Länge der Trennstrecke (in m), F die Faradaysche Konstante (in C/mol), Q die Ladung (in C), R die molare Gaskonstante [in J/(mol K)], und T die absolute Temperatur (in K) ist. Die Peakkapazität wird dadurch über die Länge der Trennstrecke, die Feldstärke und die Steilheit des Ladungs- bzw. pH-Gradienten bestimmt. Mittels isoelektrischer Fokussierung können Protein-Polyionen getrennt werden, deren isoelektrische Punkte sich um 0,0025 pH-Einheiten [15] voneinander unterscheiden. Deshalb wird diese Methode für die Phänotypisierung der otpAntithrypsine [16, 17], die Trennung der Hämoglobine [18, 19] und die Analyse der Lipoproteine [20] und vieler anderer Ampholyte verwendet. Die Größe der Feldstärke hat eine entscheidende Bedeutung für die isoelektrische Fokussierung, da die Breite einer Proteinzone umgekehrt proportional zur Quadratwurzel der Feldstärke ist (Gl. 1.5-17). Die Geschwindigkeit v der Proteine ist proportional zur Feldstärke E nach folgender Gleichung:

1.5 Theorie der Elektrophorese

= £= — ,

53

(1.5-19)

wobei / die hintergelassene Trennstrecke für die Zeit / ist. Es gibt zwei Möglichkeiten pH-Gradienten zu bilden - unter Verwendung von Trägerampholyten oder von Immobilinen.

IEF mit Trägerampholyten Die Trägerampholyte stellen ein Gemisch von Ampholyten mit unterschiedlichen pl-Werten dar. In einem elektrischen Feld ordnen sie sich nach ihren pl-Werten an und bauen auf diese Art einen pH-Gradienten auf. Für die gute Qualität des pH-Gradienten sind die Pufferkapazität, die elektrische Leitfähigkeit, die Zahl und die Massen der Trägerampholyte von Bedeutung. Die Trägerampholyte müssen über eine möglichst hohe Pufferkapazität an ihren isoelektrischen Punkten verfugen. Nur dann können sie den pH-Gradienten in Anwesenheit von höheren Proteinkonzentrationen beibehalten. Im Prinzip aber haben die Trägerampholyte ihre niedrigste Pufferkapazität in und um ihre pH(I)-Punkte. Um diesen Nachteil zu verringern, müssen die p/fj- und pÄ^-Werte jedes einzelnen Trägerampholyten sehr nahe liegen. Svensson stellte fest, daß die Differenz [pH(I) - pKc] kleiner als 0,5 pH-Einheiten sein sollte. Aus diesem Grund sind fast alle Aminosäuren als Trägerampholyte ungeeignet. Die elektrische Leitfähigkeit entlang des pH-Gradienten muß möglichst niedrig und gleichmäßig verteilt sein, obwohl der pH-Gradient aus einer Mischung von Hunderten von Trägerampholyten gebildet wird. Wenn in einem Punkt des pH-Gradienten eine niedrigere Leitfähigkeit vorhanden ist, entwickelt sich eine höhere elektrische Spannung an diesem Punkt. Infolgedessen erhöht sich die Temperatur an demselben Punkt, was und fuhrt zur Entwicklung eines hot spots im Gel fuhrt, wo die Proteine denaturiert werden können. Gleichzeitig erniedrigt sich die Feldstärke im Restteil des pH-Gradienten, was die isoelektrische Trennung verlangsamt. Die gleichmäßige Pufferkapazität und elektrische Leitfähigkeit des pH-Gradienten hängen von der Zahl der Trägerampholyte ab, die den pH-Gradienten bilden. Je größer sie ist, um so "glatter" der pH-Gradient ist. Optimale pH-Gradienten werden von Trägerampholyten gebildet, die relative Molekülmassen zwischen 300 und 1000 haben. Trägerampholyte mit Massen, kleiner als 300, bilden einen instabilen pH-Gradienten, während die Trägerampholyte mit größeren Massen sich schwer von den zu trennenden Proteinen unterscheiden. Obwohl Svensson (Rilbe) alle nötigen Anforderungen an Trägerampholyten vorhersagte, konnte er keine geeigneten Trägerampholyte finden. Er überprüfte Aminosäuren, synthetische Peptide und hydrolysierte Proteine [21], das Problem aber blieb offen. Die erste erfolgreiche Synthese der Trägerampholyte wurde von Vesterberg [22] durchgeführt, einem Mitarbeiter von Svensson. Ihm gelang es, aus Resten von Carbonsäuren und Polyethylenaminen eine Mischung von Trägerampholyten zu synthetisieren, die kommerziell eingesetzt werden konnten.

54

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

IEF in immobilisierten pH-Gradienten Die immobilisierten pH-Gradienten sind im Gegensatz zu den pH-Gradienten mit Trägerampholyten chemisch mit dem Gel verbunden. Deswegen sind sie während der IEF stabil und verhalten sich resistenter gegenüber äußeren Faktoren, z.B. gegenüber höheren lonenstärken der Proben oder Additiven.

1.5.4 Entwicklung Joulescher Wärme während der Elektrophorese Der Puffer bzw. das Puffersystem setzt der lonenstromstärke / den Widerstand R entgegen, was zur Bildung von Joulescher Wärme fuhrt. Als Joulesche Wärme wird die Volumendichte des Wärmestroms w im Verlauf der Elektrophorese bezeichnet. Sie wird in W/m3 gemessen und nach folgender Gleichung berechnet:

P w= — = V

RP-

UI

=

V

.

(1.5-20)

V

In dieser Gleichung ist P die elektrische Leistung in W, V das Volumen in m3, U die elektrische Spannung in V, / die Stärke des elektrischen Stroms (lonenstroms) in A und R der elektrische Widerstand in . In konzentrierten Puffern liegt die Joulesche Wärme höher, da sie einen größeren elektrischen Strom leiten, und umgekehrt. Die Joulesche Wärme senkt einerseits den Widerstand des Trennmediums und vermindert dadurch seine dynamische Viskosität. Dies erhöht die Diffusion der Polyionen. Andererseits verursacht sie die Verdunstung des Trennmediums, was zur Konzentrierung der Ionen fuhrt und dadurch die Mobilität der Polyionen vermindert. Diese Änderungen sind unerwünscht, da sie die Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen Untersuchungen stören. Mit der Steigerung der lonenstärke des Puffers verbessert sich die Auflösung, steigt aber die Produktion der Jouleschen Wärme, was die Auflösung verschlechtert. Es ist a priori festgestellt worden, daß optimale elektrophoretische Ergebnisse bei einer lonenstärke zwischen 0,01 und 0,15 mol/1, am besten 0,05-0,10 mol/1, erzielt werden, ohne wesentliche Erwärmung des Trennmediums.

1.5 Theorie der Elektrophorese

55

Literatur [1] Michov BM, Electrophoresis, 9, 199 (1988) [2] Debye P, Hückel E, Phys Z, 24, 185 (1923) [3] Michov BM, Electrophoresis, 10, 16(1989) [4] Olivera BM, Baine P, Davidson N, Biopolymers, 2, 245 (1964) [5] Ogston JA, Trans Faraday Soc, 54, 1754 (1958) [6] Rodbard D, Chrambach A, Proc NacAcadSci USA, 65, 970 (1970) [7] Lerman LS, Frisch HL, Biopolymers, 21, 995 (1982) [8] Lumpkin OJ, Zimm BH, Biopolymers, 21, 2315 (1982) [9] Southern EM, Anal Biochem, 100, 319 (1979) [10] Grossman, PD, Menchen S, Hershey D, GATA, 9, 9 (1992) [11] Svensson H, Ada Chem Scand, 15, 325 (1961) [12] Svensson H,Acta Chem Scand, 16, 456 (1962) [13] Kolin A, in Methods of Biochemical Analysis, Click D (Hrsg.), Interscience Publishers Inc, New York - London, Bd. 4, S. 259 (1958) [14] Giddings JC, Dahlgren H, Separation Sei, 6, 345 (1971) [15] Allen RC, Harley RA, Talamo RC, Am J Clin Path, 62, 732 (1974) [16] Allen RC, Oulla PM, Arnaud P, Baumstark JS, in Electrofocusing and Isotachophoresis, Radola BJ, Graesslin D (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin - New York, S. 255 (1977) [17] Jeppsson JO, in Electrofocusing and Isotachophoresis, Radola BJ, Graesslin D (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin - New York, S. 273 (1977) [18] Jeppsson JO, Application Note 307, LKB-Produkter AB, Stockholm (1977) [19] Basset P, Beuzard Y, Garel MC, Rosa J, Blood, 51, 971 (1978) [20] Utermann G, Hees M, Steinmetz A, Nature, 269, 604 (1977) [21] Svensson H, J Chromat, 25, 266 (1966) [22] Vesterberg O, Acta Chem Scand, 23, 2653 (1969)

l .6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte Zur Durchführung der Elektrophorese werden mindestens zwei Geräte benötigt: eine elektrophoretische Kammer (Trennkammer) und einen Stromversorger. Ein modernes Elektrophoreselabor verfugt zusätzlich über einen Thermostat, ein Densitometer mit Computer und Drucker, Gießkassetten, einen Gradientenmischer, einen Blotter u.a. Geräte (Abb. 1.6-1).

Abb. 1.6-1 Moderne Elektrophoreseapparatur. 1. Trennkammer; 2. Stromversorger; 3. Thermostat; 4. Densitometer; 5. Computer.

1.6.1 Elektrophoretische Kammern Die elektrophoretische Trennung wird in einer elektrophoretischen Kammer durchgeführt. Sie besteht aus isolierenden Materialien - PVC, Polycarbonat, Piacryl, Plexiglas, Glas, Keramik. Als Elektroden werden 0,3-0,5 mm Platindrähte oder Graphitstäbe verwendet. In den meisten Fällen wird der elektrische Strom beim Öffnen der Kammer automatisch unterbrochen. Die elektrophoretischen Kammern für Flachgele werden gegenüber den elektrophoretischen Kammern für Rundgele bevorzugt, da die Flachgele einfach densitometrieren werden können und für die Immunelektrophorese und Autoradiographie geeignet sind. Außerdem werden die getrennten Polyionen schneller gefärbt und können in den getrockneten Gelen als Beweismaterial aufbewahrt werden. Die Rundgele haben an Bedeutung verloren. Es gibt zwei Ausführungen von Trennkammern für Flachgele: für Horizontal- und Vertikalelektrophoresen.

l .6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte

57

Horizontalkammem Die wichtigsten Bestandteile einer Horizontalkammer sind die Kühlplatte und die Kontaktelektroden, die auf beweglichen Elektrodenhaltern befestigt sind (Abb. 1.6-2). Die Horizontalkammer erlaubt die Durchführung der nativen und SDS-Elektrophorese, der analytischen und präparativen isoelektrischen Fokussierung, der Immun- und Affinitätselektrophorese. Der Kühlblock einer Horizontalkammer stellt eine mit Teflon beschichtete Metallplatte, eine Glasplatte oder eine Keramikplatte dar. Die beste Wärmeleitfähigkeit haben Metallplatten. Glasplatten bieten aber eine größere Sicherheit gegen einen Kurzschluß. Keramikplatten verfugen über die Vorteile der Metall- und Glasplatten und werden deswegen bevorzugt. Vielseitig sind Horizontalkammern, die außer einer Kühlplatte zwei Puffertanks enthalten. Bei diesen Kammern kann man nicht nur Elektrodenstreifen mit Puffer, sondern auch Pufferlösungen verwenden, die in die Puffertanks eingegossen werden.

Abb. 1.6-2 Elektrophoretische Kanuner für horizontale Elektrophorese. 1. Nivellierbares Gestell; 2. Kühlplatte; 3. Schlauch zum Thermostat; 4. Gel; 5. Elektrodenstreifen; 6. Elektrode; 7. Beweglicher Elektrodenhalter; 8. Sicherheitsdeckel.

Trennkammern werden von verschiedenen Firmen angeboten, z.B. von Pharmacia Biotech, Uppsala; Desaga, Heidelberg; -Rad, Richmond, Ca. u.a. Es gibt auch Firmen, die die elektrophoretische Kammer und den Stromversorger in einem Gerät liefern, z.B. Beckman Instr., Brea, Ca.

Vertikalkammern Obwohl die Kammern für die Horizontalelektrophorese viele Vorteile haben, sind die Kammern für die Vertikalelektrophorese immer noch weit verbreitet. Eine vertikale Trennkammer wird z.B. für die manuelle DNA-Sequenzierung verwendet (Kap. 3.2.1). Diese Kammer zeichnet sich durch eine längere Trennstrecke aus und ist mit einer thermostatisierten Kühlplatte ausgerüstet. Zu den Vertikalkammern, die für Elektrophorese in Flachgelen vorgesehen sind, gehört das Protean-II-System der Firma -Rad, Rieh., Ca. u.a.

58

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

1.6.2 Stromversorger Die wichtigste Voraussetzung für die Elektrophorese ist, daß sich die Polyionen in einem elektrischen Feld befinden. Das elektrische Feld ist durch seine Feldstärke E (in V/m) charakterisiert. Diese ist direkt proportional zur elektrischen Spannung U (in V) und umgekehrt proportional zum Abstand zwischen den Elektroden d (in m):

U E=—. d

(1-6-1)

Da der Abstand während der Elektrophorese konstant bleibt, kann die Feldstärke nur durch die Spannung geändert werden. Das Produkt aus der elektrischen Spannung und der Stärke des elektrischen Stroms / (in A) wird als elektrische Leistung P (in W) bezeichnet, also P =UI.

(1.6-2)

Während die Stromstärke proportional zum Querschnitt des Trennmediums (z.B. des Gels) ist, ist die Leistung proportional zu seinem Volumen. Die angegebenen Verhältnisse sind in den unterschiedlichen Arten von Stromversorgern vorhanden. Es gibt z.B.: 1. Einfache Stromversorger, die nur über die Spannung geregelt werden können. 2. Stromversorger, die konstante Spannung oder konstante Stromstärke erzeugen können. 3. Stromversorger, die die elektrische Spannung, den elektrischen Strom oder die elektrische Leistung konstant halten können. 4. Stromversorger, an denen ein Volt-Stunden-Integrator angeschlossen werden kann. 5. Programmierbare Stromversorger mit einem Mikroprozessor, über den gewünschte Trennbedingungen abgerufen werden können. Ein Stromversorger, der für alle Elektrophoresearten verwendbar sein sollte, muß Gleichspannungen von 50 V bis zu 5 000 V und elektrischen Strom von 5 mA bis zu 100 m A erzeugen können. Für die Pulsfeld-Elektrophorese wird an den Stromversorger ein Steuergerät angeschlossen, das alternierend die Elektroden in Nord/Süd- und Ost/West-Richtung ansteuert. In den Elektroden sind Dioden eingebaut, damit die nicht eingeschalteten Elektroden das Feld nicht beeinflussen können. Stromversorger werden von den Firmen Pharmacia Biotech, Uppsala; Desaga, Heidelberg; -Rad, Richmond, Ca. u.a. angeboten.

1.6.3 Thermostate Bei der Elektrophorese wird die elektrische Energie (das Produkt aus der elektrischen Leistung und der Zeit) teilweise in Wärme umgewandelt. Wenn die freigesetzte Wärme

1.6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte

59

eine hohe Stufe erreicht, wirkt sie sich schädlich auf die elektrophoretisehen Ergebnisse aus. Deshalb muß die Trennkammer oft gekühlt werden. Die Kühlung einer elektrophoretischen Kammer wird mit Hilfe der Thermostate durchgeführt. Die Thermostate arbeiten in der Regel nach folgendem Prinzip: sie temperieren eine Flüssigkeit bis zu einer gewünschten Temperatur und pumpen sie durch die Trennkammer. Dadurch wird die Temperatur in der elektrophoretischen Kammer konstant gehalten. Die meisten Elektrophoresen werden bei Temperaturen zwischen 5 und 25 °C durchgeführt, gewöhnlich bei 10-15 °C. Es gibt auch elektrophoretische Verfahren, die höhere Temperaturen benötigen. Die Kühltemperaturen sind für die SDS-Elektrophorese und die isoelektrische Fokussierung eine unverzichtbare Bedingung. Thermostate sind bei den Firmen Pharmacia Biotech, Uppsala; Desaga, Heidelberg; -Rad, Richmond, Ca. u.a. erhältlich.

1.6.4 Densitometer In vielen Fällen reicht es, die Anwesenheit oder das Fehlen der Banden bzw. der Flecke der getrennten Polyionen mit bloßem Auge zu erkennen. Dadurch ist es aber unmöglich die genauen Unterschiede zwischen den Intensitäten (Konzentrationen) der gefärbten Banden festzustellen. Dies kann mit Hilfe von Densitometern durchgeführt werden. Ein Densitometer stellt ein bewegliches Photometer dar, mit dem die Polyionenbanden gescannt werden können. Was man in einem Pherogramm mit bloßem Auge nicht erkennen kann, wird auch vom Densitometer nicht aufgezeichnet. In den Densitogrammen können die Banden exakter verglichen werden als in den Pherogrammen. Außerdem können Banden, die sehr dicht hintereinander folgen und sich deshalb mit bloßem Auge schwer voneinander unterscheiden lassen, mit Hilfe eines hochauflösenden Densitometers erfaßt und mit einem Computer vergrößert werden. Ein modernes Densitometer ist an einen Computer und Drucker angeschlossen. Mit Hilfe eines Computers können die densitometrischen Daten gespeichert und verarbeitet werden.

Optik eines Densitometers Wenn Licht durch ein Medium dringt, wird ein Teil des Lichtes absorbiert. Die Absorption wird durch die Extinktion dargestellt. Die Extinktion stellt die Differenz zwischen der Intensität des fallenden Lichtes und des transmittierten Lichtes und kann mit einer Photozelle gemessen werden. Für das Licht einer bestimmten Wellenlänge ist die Extinktion nach dem Lambert-Beer sehen Gesetz proportional zur Konzentration der gelösten Substanz (Kap. 2.14). Jede Substanz hat ihre spezifische Absorption, d.h. die Extinktion des Lichtes hängt von der Wellenlänge ab. Als Maß für die Farbintensitäten nimmt man die Extinktion der von einer Lichtquelle (konventionelles Licht oder Laser) erzeugten Strahlung an dem zu vermessenden Objekt (der Bande, dem Fleck). Die Extinktionswerte werden entweder aus der reflektierten oder transmittierten Strahlung ermittelt, je nachdem, ob die Messung an einer Oberfläche oder in einer lichtdurchlässigen Schicht erfolgt. Die Densitometer für elektrophoretische

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

60

Zwecke arbeiten in der Regel im Transmissionsmodus, da in der Regel lichtdurchlässige Schichten (nasse oder getrocknete Gele, Blotmembranen, Autoradiogramme) untersucht werden (Abb. 1.6-3).

Licht

III 11 l II II III l l l l l II l Detektor

Gel

7

Abb. 1.6-3 Schema eines Densitometers.

Als Lichtquelle dient das weiße Licht oder das Laserlicht. Das weiße Licht kann mit geeigneten Filtern auf gewünschte Wellenlängen eingestellt und dadurch höhere Empfindlichkeit erreicht werden. Der Laser hat eine fixierte Wellenlänge. Densitometer und komplette Datenauswertungssysteme sind bei den Firmen Desaga, Heidelberg, Camag, Schweiz, Shimadzu, Japan, u.a. erhältlich.

1.6.5 Gelgießsystem Das Gelgießsystem besteht aus einer oder mehreren Gießkassetten und einem Gradientenmischer.

Gießkassette Eine Gießkassette ist aus zwei Glasplatten und einem U-fbrmigen Abstandhalter aufgebaut, die mit Klammern zusammengehalten werden (Abb. 1.6-4).

1.6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte

61

Abb. 1.6-4 Zusammenbau einer Gießkassette zum Gießen von dünnen und ultradünnen Gelen. 1. Untere Glasplatte; 2. Haftfolie; 3. U-fbrmiger Abstandhalter; 4. Obere Glasplatte (Deckplatte).

Der Abstandhalter besteht aus Gummi oder Silikon. Er kann an einer der Glasplatten angeklebt werden. Es sind auch Gießkassetten mit angeklebten 0,5 mm dicken Dichtungen im Handel erhältlich (Desaga, Heidelberg). Der Abstand zwischen den Platten kann auch durch aufeinandergelegte Parafilmschichten (eine Parafilmschicht ist 0,12 mm dick) bestimmt werden.

Gradientenmischer Um die Auflösung zu erhöhen, wird die Elektrophorese oft in Polyacrylamidgelen mit steigender Konzentration (Kap. 2.3.2) oder in immobilisierten pH-Gradienten durchgeführt. Zur Herstellung dieser Konzentrationsgradienten sind verschiedene Gradientenmischer entwickelt worden. Ein einfacher und sehr verbreiteter Gradientenmischer besteht aus zwei miteinander kommunizierenden Zylindern - Mischkammer und Reservoir, die sich auf demselben Niveau befinden (Abb. 1.6-5).

62

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

4 -

Abb. 1.6-5 Gradientenmischer.

1. Mischkammer; 2. Reservoir; 3. Rotierender Magnetstab; 4. Multifunktionsstab; 5. Auslaßklemme; 6. Zwischenhahn.

In der Mischkammer und im Reservoir befindet sich ein rotierender Magnetstab bzw. ein Multifunktionsstab. Der Magnetstab wird durch einen Motor angetrieben. Das Volumen des Multifunktionsstabs gleicht das Volumen des Magnetstabs und das während der Magnetstabdrehungen steigende Volumen in der Mischkammer aus. Es wurde ein einfaches System von Zylindern beschrieben, das zum Erzeugen von linearen, exponentiellen und anderen Konzentrationsgradienten verwendet wird [1].

1.6.6 Puffermischer Während der Elektrophorese treten Veränderungen in der lonenzusammensetzung und dem pH-Wert der Elektrodenpuffer ein, die die Geschwindigkeit der Polyionen beeinflussen. Um die Zusammensetzung der Elektrodenpuffer in den beiden Elektrodentanks im Laufe der Elektrophorese auszugleichen, werden Puffermischer angeboten (Pharmacia Biotech, Uppsala; -RAD Lab., Hercules, Ca.; u.a.). Die meisten Puffermischer arbeiten nach dem gleichen Prinzip: eine Pumpe saugt Puffer aus einem Elektrodentank ein und pumpt ihn in den anderen Elektrodentank, woraus er, nach der Mischung, in den ersten Elektrodentank zurückkehrt usw. Es wurde auch ein wassergetriebener Puffermischer beschrieben [2],

1.6.7 Blotter Es gibt unterschiedliche Blotter, die zur Durchführung diverser Blotting-Verfahren verwendet werden, z.B. Kapillar-, Vakuum-, Tank- oder Semidry-Blotter (Kap. 2.13 und 3.6).

l .6 Die Elektrophorese benötigt spezielle Geräte

63

l .6.8 Geräte für halbautomatische Elektrophorese Außer den klassischen Elektrophoresegeräten wurden halbautomatische Elektrophoresesysteme entwickelt. Die wichtigsten Vorteile eines halbautomatischen Systems sind die schnelle und reproduzierbare Ermittlung von Trennergebnissen, die Arbeitsersparnis und das praktische Dokumentieren der Ergebnisse durch Einlegen der gefärbten und getrockneten Gele in Diarahmen. Das verbreitetste halbautomatische Elektrophoresesystem ist das PhastSystem [3] (Pharmacia Biotech, Uppsala). Es besteht aus einer Horizontalkammer mit einem integrierten Thermostat, einem programmierbaren Stromversorger und eine Kammer zur Färbung der Gele. Der elektrische Strom, die Temperaturen für die Trennung und die Färbung können programmiert werden. Die Färbekammer kann bis zu 50 °C temperiert und mit Hilfe einer Membranpumpe mit Färbelösungen gefüllt oder entleert werden. Zusätzlich enthält sie eine Vorrichtung zum Drehen der Gele in den Lösungen. Für den elektrophoretischen Transfer gibt es auch einen Blottingeinsatz mit Graphitelektroden (Abb. 1.6-6).

Abb. 1.6-6 PhastSystem. 1. Trennkammer; 2. Tastatur zur Programmierung der Trenn- und Nachbehandlungsbedingungen; 3. Entwicklungskammer; 4. Behälter für Nachbehandlungslösungen.

Die Proben werden automatisch mit multiplen Auftragskämmen aufgetragen. Für das PhastSystem sind foliengestützte Fertiggele (mit den Maßen 50 40 0,3-0,4 mm) für die native Elektrophorese, SDS-Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung sowie Tabletten für die Coomassie-Färbung und ein Silberfärbungs-Kit erhältlich. Die elektrophoretische Trennung und die Färbung wird schnell durchgeführt, z.B. die SDS-Elektrophorese in einem Gradientengel und die zusätzliche Silberfärbung dauern ca. 1,5 h.

64

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

1.6.9 Geräte für präparative Elektrophorese Es sind auch Geräte für die präparative Elektrophorese entwickelt worden [4]. Mit Hilfe dieser Geräte werden die elektrophoretischen Fraktionen in separaten Lösungen gesammelt (Kap. 2.11). Somit ergibt sich die Möglichkeit, die getrennten Polyionen zusätzlich zu untersuchen. Andere Laborgeräte und Vorrichtungen, die für die Elektrophorese verwendet werden, sind: Bechergläser, Erlenmeyerkolben, Meßzylinder, Reagenzgläser, Glasstäbe, Heizblöcke für Reaktionsgefäße, Pipetten, automatische Pipetten, Peleusbälle oder Pipettenpumpen, Meßpipetten, Heizrührer, Magnetrührer, Magnetkerne, höhenverstellbare Laborplattform (Laborboy), Laborschüttler, Laborzentrifugen, Scheren, Spatel, Mikrowellenherd, Trocken- oder Brutschrank, UV-Lampe, Ventilator, Wasserstrahlpumpen, Papierschneidemaschine.

Literatur [1] Michov BM, Anal Biochem, 86, 432 (1978) [2] Michov BM, Biotech Bioeng, 21, 2147 (1979) [3] Olsson I, Axiö-Fredriksson ÜB, Degerman M, Olsson B, Electrophoresis, 9, 16 (1988) [4] Chrambach A, The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis, VCH, Weinheim - Deerfield Beach (1985)

l .7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt Die heute am häufigsten verwendeten Träger für die Elektrophorese sind Polyacrylamidund Agarosegel. Acetylcellulose ist in der klinischen Routine weit verbreitet. Das Papier und die Dünnschicht als Träger haben vor allem eine historische Bedeutung.

l .7. l Papier und Dünnschichten Papier und Dünnschichten aus Silikagel (Kieselgel), Aluminiumoxid, Cellulosepulver u.a. auf Glas- oder Kunststoffplatten sind heute völlig vom Agarose- und Polyacrylamidgel verdrängt worden. Nur zur Analyse von hochmolekularen Polysacchariden und Lipopolysacchariden werden immer noch horizontale Kieselgel-Dünnschichtplatten verwendet [1].

1.7.2 Acetylcellulose und Cellogel - Struktur und Eigenschaften Die Acetylcellulose (Celluloseacetat) ist ein Derivat der Cellulose, ein Ester zwischen den freien Hydroxylgruppen der Cellulose und der Essigsäure. Das Cellulose-Molekül ist aus Glucoseresten aufgebaut, die miteinander durch Anhydridbindungen verknüpft sind, wobei jeder Glucoserest ß-glykosidisch mit der Hydroxylgruppe am C-4-Atom des nächsten Glucoserest verbunden ist. Auf diese Weise entstehen fadenförmige Moleküle, die untereinander durch Wasserstoff-Bindungen vernetzt sind. Acetylcellulose besitzt sehr große Poren, die keine Siebwirkung auf die wandernden Polyionen ausüben. Deswegen erfolgt die elektrophoretische Trennung nur nach elektrischen Ladungen.

Acetylcellulose-Folien und Cellogel-Streifen Acetylcellulose-Folien (AC-Folien)werden hauptsächlich bei der klinischen Elektrophorese verwendet. Sie wirken kaum der Diffusion entgegen, so daß die Auflösung der Elektrophorese niedrig ist. Acetylcellulose-Folien (Sartorius, Göttingen) werden in trockenem Zustand geliefert und gewöhnlich in Abmessungen von 140 57 mm, 145 57 mm oder 145 70 mm verwendet. Das Cellogel ist eine gelförmige Acetylcellulose, die auf einer Folie fixiert ist (Chemetron, Mailand). Die Cellogel-Schichten werden meist in Abmessungen von 300 110 0,2 mm hergestellt und in methanolischer Lösung aufbewahrt, da sie nicht austrocknen dürfen. Für die Zonenelektrophorese werden die Cellogel-Schichten in Streifen mit einer Länge von 145 mm und einer Breite von 25 oder 75 mm geschnitten.

66

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

1.7.3 Gele Es sind verschiedene Gele bekannt - Stärke-, Agarose-, Polyacrylamidgel. Sie haben einen wichtigen Vorteil gegenüber den anderen Trägern - ihre Porenstruktur läßt sich entsprechend der Anwendung einstellen. Mit der Optimierung der Elektrophorese haben sich überwiegend die Agarose- und Polyacrylamidgele durchgesetzt. Sie können als Rund- oder Flachgele bzw. nichtrestriktive oder restriktive Gele verwendet werden (Kap. 1.1).

1.7.4 Stärkegel - Struktur und Eigenschaften Stärkegele wurden 1955 von Smithies [2, 3] eingeführt. Sie waren das erste Trennmedium, bei dem der Siebeffekt während der Elektrophorese beobachtet wurde [4, 5], Stärkegele aus teilweise hydrolysierter Kartoffelstärke werden in einer Konzentrationen von 8-15 g/dl als 5-10 mm dicke Schichten gegossen. Das Stärkegel, als ein Naturprodukt, stellt ein enzymfreundliches Trennmedium dar. Deswegen wird es immer noch für die Zonenelektrophorese von multiplen Enzymen in der Human- [6] und Populationsgenetik [7, 8] verwendet. Ansonsten ist heute das Stärkegel, wegen seiner variierenden Eigenschaften, was zu mangelnder Reproduzierbarkeit fuhrt, fast völlig vom Agarose- und Polyacrylamidgel verdrängt worden.

1.7.5 Agarosegel - Struktur und Eigenschaften Die Agarose ist eine der beiden Hauptkomponenten des Agars, das aus den roten Meeresalgen gewonnen wird [9, 10]. Sie ist aus Polysaccharid-Ketten aufgebaut, die ihrerseits aus jeweils ca. 400 Resten des Agarobiose-Monomers bestehen. Agarobiose enthält eine 1,3-verknüpfte ß-D-Galaktopyranose und eine 1,4-verknüpfte 3,6-Anhydroct-Galaktopyranose [11, 12] (Abb. 1.7-1). Die Agarose-Polymere haben von 100 000 bis zu 200 000 [13], Im Vergleich zum Agar besitzt die Agarose viel weniger ionisierte chemische Gruppen, wie z.B. Sulfat-, Pyruvat- und Carboxylgruppen.

HO

O1 Abb. 1.7-1 Struktur der Agarobiose.

Die Agarosegele sind nicht toxisch, chemisch inert und ihre Herstellung benötigt keine Katalysatoren. Ihre Struktur erweist sich als sehr stabil im pH-Bereich 4-9, obwohl ihre Poren sehr groß sind - z.T. über 10 nm [14, 15]. Solche Poren üben keine restriktive

l .7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

67

Wirkung auf die Wanderung der Polyionen aus. Daher sind sie für die Elektrophorese von Protein-Polyionen mit sehr hohen Massen, von Nukleaten, Chromosomen und Viren geeignet. Die chemisch unbehandelte Agarose löst sich im Wasser bei 90-100 °C und geliert beim Abkühlen bei über 40 °C. Bei diesem Vorgang bilden die Agarose-Polysaccharidketten Doppelhelices mit einer relativen Molekülmasse MT von 120 000 [16], die sich danach in Fäden zusammenlagern. Agarose wird gewöhnlich in Konzentrationen von 0,05 bis 2,0 g/dl verwendet. Bei einer Konzentration von 0,16 g/dl hat das Agarosegel Poren mit einem Durchmesser von 500 nm, bei einer Konzentration von 0,075 g/dl erreicht der Durchmesser 800 nm [17]. Für Protein- und DNA-Trennungen werden in der Regel l g/dl Gele verwendet, die einen Porendurchmesser von ca. 150 nm besitzen. Agarosegele mit einer Konzentration über l g/dl zeigen hohe Elektroosmose. Deswegen werden sie selten verwendet. Wie erwähnt, ist die Elektroosmose typisch für die Agarosegele, was auf ihre geladenen Gruppen zurückzufuhren ist. Um die Elektroosmose zu verhindern, wurden in den letzten Jahren unterschiedliche chemisch modifizierte Agarose-Arten auf den Markt gebracht, die viel weniger saure Gruppen tragen. Die ladungsfreien Agarosen [18, 19] haben eine unterschiedliche Reinheit und Trenneigenschaften, die sich durch ihre Schmelztemperaturen (35-95 °C) und den Grad der Elektroosmose (mr-Wert) unterscheiden lassen.

Herstellung von Agarosegelen Die Agarosegele werden hergestellt, nachdem die Agarose in einem Puffer suspendiert und aufgekocht und dann auf eine horizontale Haftfolie oder in eine vorgewärmte Gießkassette gegossen wird. Das Gießen in eine Kassette wird folgendermaßen durchgeführt (Abb. 1.7-2):

Abb. 1.7-2 Gießen einer Agaroselösung in eine vorgewärmte Gießkassette.

68

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

• Auf einer mit etwas Wasser übergossenen Glasplatte wird eine Haftfolie für Agarose mit der hydrophoben Seite nach unten gelegt und mittels eines Fotorollers fest gewalzt. Dadurch entsteht ein dünner Wasserfilm, der durch Adhäsion und die Haftfolie mit der Glasplatte bindet. • Eine andere Glasplatte derselben Maße wird gereinigt und unter dem Abzug mittels eines Kosmetiktuches, getränkt mit einigen ml Repel-Silan (s.u.), hydrophobisiert. • Auf die Ränder der Haftfolie wird eine 0,5 mm dicke U-förmige Gummidichtung gelegt und mit der zweiten Glasplatte bedeckt. • Die auf diese Weise gebildete Gießkassette wird mit Klammern befestigt und zusammen mit einer 10 ml Meßpipette aus Glas im Trockenschrank auf 75 °C erwärmt. • Während der Erwärmung wird die Agarose (sie muß trocken gelagert werden, da sie hygroskopisch ist) in einer Saugflasche abgewogen und in einem Puffer gelöst. Die entstandene Suspension wird in einem Mikrowellenherd auf der niedrigsten Heizstufe oder auf einem Heizrührer unter langsamem Drehen des Magnetkerns aufgekocht, bis sich die Agarose vollständig auflöst. Danach läßt man die Lösung unter ständigem Rühren etwa 10 min kochen. • Die heiße Agaroselösung wird entgast und bei Raumtemperatur auf 70-75 °C abgekühlt. • Die Gießkassette wird aus dem Trockenschrank entnommen und vertikal gestellt. • Die Agaroselösung wird mit der vorgewärmten Meßpipette in die Spalte der Gießkassette gegossen und bei Raumtemperatur belassen. • Nach 1-2 h werden die Klammern von der Gießkassette entfernt und das Agarosegel entnommen. Das Gel ist schon verwendungsfähig, aber seine mechanische Festigkeit verbessert sich, wenn es, bedeckt mit einer Polyethylenfolie ohne Falten im Kühlschrank bei 4-8 °C über Nacht gelagert wird. Erst dann bildet sich die endgültige Agarosegel-Struktur aus. Das Gel darf nicht eingefroren werden. Manchmal müssen Agarosegele Vertiefungen zum Probenauftrag haben. Diese können durch Negativformen erzeugt werden. Dafür kann man z.B. eine Lage 250 dickes Klebeband verwenden, das luftblasenfrei auf der Deckplatte festgeklebt und mit einem Skalpell zurechtgeschnitten wird.

1.7.6 Polyacrylamidgel - Struktur und Eigenschaften Polyacrylamidgel (PAA-Gel) ist heutzutage der beste elektrophoretische Träger. Es hat, den anderen Trägern gegenüber, zwei wichtige Vorteile: 1. Polyacrylamidgel tritt in keine Wechselwirkungen mit den zu trennenden Polyionen, da es chemisch inert ist und keine elektrischen Ladungen trägt, die Elektroosmose verursachen. 2. Es kann einen SiebefFekt ausüben, der eine zusätzliche Trennung nach Massen möglich macht. Das Polyacrylamidgel, erstmals 1959 von Raymond und Weintraub [20] für die Elektrophorese eingesetzt, stellt ein Copolymer zwischen dem Monomer Acrylamid und dem Comonomer , '-Methylen-bis-acrylamid (BIS, Bisacrylamid, N,N'Methylendiacrylamid) dar. Das Acrylamid und BIS werden oft als Monomere bezeichnet und ihre Gesamtlösung - als Monomerlösung.

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

69

Das stark neurotoxische Acrylamid (Abb. 1.7-3) kristallisiert in weißen Kristallen, die in Wasser, Methanol, Glycerin, Aceton, Trichlormethan und anderen Lösungsmitteln löslich sind. Sein Siedepunkt liegt bei 84,5 ± 0,3 °C. Beim längeren Aufbewahren polymerisiert Acrylamid spontan. In polymerisiertem Zustand ist das Gel nicht giftig, falls es keine Reste von Acrylamid enthält. Der Vernetzer , '-Methylendiacrylamid (Abb. 1.7-3) ist eine mindergiftige weiße Substanz, die in Wasser gut löslich ist. Es schmilzt bei 185 °C und polymerisiert auch spontan bei längerem Aufbewahren. Außer BIS gibt es auch andere Vernetzer [21] (Tab. 1.7-1): DATO [22], BAP [23], AcrylAide® (FMC, Rockland, Me.). Diese Vernetzer haben aber unterschiedliche Nachteile, deswegen ist BIS immer noch das am häufigsten verwendete Comonomer. Tab. 1.7-1 Alternative Vernetzer. Vernetzer DATO ( , '-Diallyltartar-

Chemische Formel

Mr O II

O II

228,25

H2C = CH- CH2- NH- C - CH- CH- C - NH- CH2~ CH= CH2

BAP (1,4-Bis-acryloyl-

O ||

/

piperazin)

H2C=CH-C-N

DHEBA (N,N'-(l,2-Dihydroxyethylen)-bisacrylamid)

, ^

H N ^

BAC ( , '-Bis-acryloylcystamin

\

O ||

194,23

N-C-CH=CH2

°H O l II J\j/^^ OH H

200,20

H

260,38

M

O

H

Es gibt auch Vernetzer, die für die Solubilisierung des Polyacrylamidgels verwendet werden (Tab. 1.7-1): bei DHEBA [24] wird sie durch Oxidation mit Periodsäure erreicht, bei BAC [25] mittels Thiolen, welche die Disulfid-Bindungen von BAC aufspalten. Somit wird es möglich, das Gel nach der Elektrophorese zu verflüssigen oder großporig zu machen und die aufgetrennten Proteine zu entfernen. Die Solubilisierung wird aber in der Regel von starker Protein-Denaturierung begleitet. Es wurde auch ein dem Polyacrylamid ähnliches Gel vorgeschlagen [26, 27], das aus dem Monomer NAT (N-Acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethan entsteht. Die Copolymerisation des Acrylamids und BIS verläuft in zwei Etappen: zuerst verbinden sich die Vinyl-Gruppen des Acrylamids in Polymerketten, dann werden sie von BIS vernetzt. Auf diese Weise entsteht die räumliche Struktur des Polyacrylamidgels, die mit der eines Schwammes verglichen werden kann [28] (Abb. 1.7-3).

70

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese Acrylamid CH=CH

BIS +

I

CH=CH

+

1

c=o

c=o

1 NH

1 NH 1 CH

2

,

1

CH=CH 1 CO 1 NH 2

CH- CH - CH - CH - CH- CH 2 2 2 1 1 1

c=o

c=o

c=o

1 NH

1 NH 1

1 NH 2

2

CH 2

2

NH 1

NH 1

1

C=O 1

c=o CH=CH 1

+

CH=CH

+-

CH=CH

1

CH- CH - CH - CH - CH - CH 2 2 2 1 1

c=o

c=o

c=o

C=O

1

1

1 NH

NH

1

Abb. 1.7-3 Copolymerisation von Acrylamid und BIS in Polyacrylamidgel.

Die Konzentrationen des Monomers und Comonomers bestimmen die Porengröße des Polyacrylamidgels. Sie werden mit von Hjerten [29] eingeführten Formeln ausgedrückt, die wir folgenderweise modifizieren: die Gesamt-Monomerkonzentration T (von total) wird als T=a + b (g/dl, g/l)

(1.7-1)

dargestellt, der Vernetzungsgrad C (von crosslinking) als C= - (dimensionslos), a +b

(17-2)

wobei a und b die Konzentrationen von Acrylamid bzw. BIS in g/dl oder g/l sind. Die Copolymerisation der Monomere hängt ab von: l . der Konzentration des Katalysator-Initiator-Systems und der Inhibitoren; 2. der Temperatur und dem pH-Wert; 3. der Reinheit der Chemikalien. Das Katalysator-Initiator-System bildet freie Radikale, die die Copolymerisation zwischen Acrylamid und BIS katalysieren [30]. Als optimal hat sich das TMEDA-APSSystem erwiesen (Abb. 1.7-4). Das tertiäre Amin TMEDA (TEMED, , , ', '-Tetramethyl-ethylendiamin, l,2-Bis(dimethylamino)-ethan) ist der meist gebrauchte Katalysator, der in Konzentrationen von 2-4 mmol/1 (0,02-0,06 ml/dl) verwendet wird. Der Initiator APS (Ammoniumperoxodisulfat) wird ebenso in Konzentrationen von 2-4 mmol/1 (0,04-0,09 g/dl) eingesetzt. Er wird gegenüber den anderen Oxydationsmitteln bevorzugt, da er keinen molekularen Sauerstoff freisetzt, der die Gelpolymerisation inhibiert. TMEDA und APS werden oft als Katalysatoren bezeichnet.

l .7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt CH,

o

O

H ? N — O— S — O — O— S —

\ CH

71

3

II

—

,

II

Abb. 1.7-4 Strukturformeln von TMEDA (a) und APS (b). Zu den Inhibitoren der Gelpolymerisation zählen Sauerstoff und Peroxide, die bei ihrer Abspaltung Sauerstoff bilden. Sauerstoff verlangsamt den Prozeß, da er ein Radikalfänger ist. Deswegen soll die Gelpolymerisation unter Luftabschluß erfolgen. Die Temperatur und die Hydroxid-Ionen beschleunigen den Copolymerisationsprozeß. Umgekehrt, bei Temperaturen unter 20 °C und bei niedrigen pH-Werten wird seine Kinetik verlangsamt. Die Chemikalien, die für die Copolymerisation des Acrylamids und BIS verwendet werden (das Monomer, Comonomer und die Katalysatoren), müssen extrem rein sein. Acrylamid und BIS sollten in dunklen Behältern im Kühlschrank aufbewahrt und bei Bedarf umkristallisiert werden. Ein quantitatives Maß für die Reinheit der Chemikalien geben die Konzentrationen der Katalysatoren: je niedriger sie sind, desto reiner sind die Chemikalien. Die häufigste Verunreinigung einer Monomerlösung ist die Acrylsäure, die bei der Spontanhydrolyse des Acrylamids entsteht. Die Acrylsäure wird bei der Copolymerisation an das Gel gebunden, das somit negative elektrische Ladungen erhält. Ein solches Polyacrylamidgel ist nicht mehr inert, sondern zeigt während der Elektrophorese elektroosmotische Effekte. Sehr wichtig ist es, daß das ganze Acrylamid polymerisiert ist. Wenn das nicht der Fall ist, bilden die nichtpolymerisierten Acrylamid-Moleküle während der Elektrophorese kovalente Produkte mit den Proteinen [31]. Die Viskosität, Elastizität und Festigkeit eines Polyacrylamidgels hängen vom Verhältnis zwischen der Länge der Polyacrylamidketten und der Häufigkeit ihrer Vernetzung ab, d.h. vom Verhältnis zwischen den Molarkonzentrationen des Acrylamids und BIS [32]: Wenn das Verhältnis zwischen den Molarkonzentrationen des Acrylamids und BIS über 200:1 (zwischen den Massenkonzentrationen 100:1) ist, wird das Gel elastisch, weich und durchsichtig, da es aus langen Polyacrylamidketten besteht. Wenn das Verhältnis unter 20:1 (zwischen den Massenkonzentrationen 10:1) ist, wird das Gel zerbrechlich, spröde und trüb, da es aus kurzen Polyacrylamidketten aufgebaut ist. Ein Polyacrylamidgel eignet sich optimal für die Elektrophorese, wenn das Verhältnis zwischen den molaren Konzentrationen 40-90 : l (zwischen den Massenkonzentrationen 20-45 : l) liegt. Polyacrylamidgele mit niedriger Gesamtkonzentration (7' = 4-5 g/dl, C = 0,03) üben auf die Polyionen fast keine restriktive Wirkung aus. Mit der Erhöhung der Gesamtkonzentration (T= 7-20 g/dl und mehr) oder des Vernetzungsgrades (C auf 0,05) nimmt die restriktive Wirkung zu Polyacrylamidgele mit C > 0,05 sind schon spröde und relativ hydrophob.

72

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Bei den Gradientengelen steigt die Gesamtkonzentration T linear bei konstantem Vernetzungsgrad C, der mittlere Porenradius nimmt aber exponentiell ab. Der maximale Porenradius rmax = a- Tb, wobei und b empirische Konstanten sind [33]. Außer in Wasser können die Monomere in Lösungen mit Glycerin, Ethylenglycol, Saccharose, Harnstoff oder anderen Chemikalien Copolymerisieren. Da die zusätzlichen Chemikalien höhere Viskosität haben, beschleunigt sich der Copolymerisationsprozeß, ohne daß sich die Gel-Eigenschaften verändern [34].

Der Trennbereich hängt von der Polyacrylamidkonzentration ab Ferguson-Plots Ferguson [35] zeigte, daß die Mobilität eines Polyions in einem Polyacrylamidgel seine Molekülmasse widerspiegelt. Wenn unterschiedliche Polyionen unter denselben Bedingungen getrennt werden (in identischen Puffern, bei gleicher Temperatur und gleicher elektrischer Feldstärke), jedoch bei unterschiedlichen Gel-Konzentrationen, ergeben sich unterschiedliche Laufstrecken, die als relative Mobilitäten berechnet werden können. Die relative Mobilität wird als der Quotient zwischen der Wanderungsstrecke einer Bande und der wandernden Grenze definiert, bei mindestens drei unterschiedlichen Gel-Konzentrationen, nach der Gleichung

= — , Mo

(1.7-3)

wobei bzw. 0 die Mobilität bzw. die freie Mobilität des Polyions ist, die nach der Extrapolation von T auf 0 ermittelt werden kann. Die Steigung der Geraden wird als Retardationskoeffizient KR bezeichnet. Wenn der Zehnerlogarithmus von als Funktion der Gel-Konzentration bei konstantem Vernetzungsgrad C angegeben wird, erhält man in 2,5-40 g/dl Polyacrylamidgelen (üblicherweise bei T = 5-15 g/dl) folgende lineare Abhängigkeit: lo g H r = -* R 7\

(1.7-4)

Sie wird durch Geraden beschrieben, die als Ferguson-Plots bekannt sind (Abb. 1.7-5). Mathematisch werden die Ferguson-Plots von der erweiterten Ogston-Theorie abgeleitet, die die Wanderung eines Moleküls (Teilchens) in einem verzweigten und inerten Fasernetzwerk nach dem Zufallsprinzip erklärt.

73

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

100 Ig (100

) 200 175 150 125 100

10

12

14

, g/dl

Abb. 1.7-5 Ferguson-Plots - die elektrophoretische Mobilität der Polyionen als Funktion der Polyacrylamidgel-Konzentration T. Die Steigung der Geraden wird vom Ä^-Koeffizient bestimmt, der der Molekülmasse proportional ist. a) Ein Polyion mit großer Masse und kleiner Ladung; b) Ein Polyion mit großer Masse und großer Ladung; c) Ein Polyion mit kleiner Masse und kleiner Ladung; d) Ein Polyion mit kleiner Masse und großer Ladung; e) Ein Polyion mit mittlerer Masse und mittlerer Ladung (typischer Fall); LDHj und LDH2 - Lactat-Dehydrogenase-Isoenzyme, die gleiche Massen, aber unterschiedliche Ladungen haben.

Der Koeffizient A^R wird vom pH-Wert, der lonenstärke, Temperatur u.a. Faktoren beeinflußt, so daß bei Änderung eines Parameters neue Ferguson-Plots ermittelt werden müssen. Er spiegelt die hydrodynamischen Eigenschaften der Polyionen, z.B. die der SDS-Protein-Komplexe wider (Kap. 2.7), die ihrerseits von der Peptidkettenlänge abhängig sind. Aufgrund der Ferguson Plots können die Ä^-Werte von unterschiedlichen Proteinen berechnet werden. Bei den globulären Proteinen existiert ein lineares Verhältnis zwischen dem Ä^-Wert und dem Molekülradius r (Stokesschem Radius) des Polyions, also der Protein-Molekülmasse Mr, für den Bereich von 10000 - 100000. Dadurch können aus den Steigungen der Ferguson-Geraden die Proteinradien berechnet werden (Kap. 2.3.3 und 2.7.5). Nachdem der Radius und die Mobilität eines Proteins bekannt sind, kann daher seine Ladung ermittelt werden [36]. Aufgrund der Lage der Geraden können folgende Aussagen gemacht werden: • Wenn die Geraden parallel sind, haben die Polyionen identische Massen, aber unterschiedliche Ladungen, wie es bei den Isoenzymen der Fall ist. • Wenn zwei nicht parallele Geraden sich nicht kreuzen, ist das Protein der oberen Gerade kleiner und höher geladen als das Polyion der unteren Gerade. • Wenn sich die Geraden kreuzen, ist das Protein, dessen Gerade die _y-Achse weit oben schneidet, größer aber niedriger geladen. • Wenn sich mehrere Geraden in einem Punkt kreuzen, handelt es sich um Monomere und Polymere desselben Proteins.

Dünne und ultradünne Polyacrylamidgele Die Verwendung dünner und ultradünner Horizontalgele [37], die auf Haftfolie oder Haftnetz gegossen sind, hat es ermöglicht, zur vorteilhaften Horizontalelektrophorese zurückzukehren. Die dünnen Gele sind 0,5-1,0 mm dick, die ultradünnen dünner als

74

l Theorie und Grandlagen der Elektrophorese

0,5 mm. Für den täglichen Gebrauch haben sich die Gele mit einer Dicke von 0,2 bis 0,5 mm, meistens 0,5 mm durchgesetzt. Die dünnen und ultradünnen Gele zeichnen sich durch folgende Vorteile gegenüber den dicken Vertikalgelen aus [38]: der Temperaturgradient zwischen den beiden Geloberflächen ist schwach ausgebildet, da die Wärmeableitung besser ist; die Proben werden unkompliziert und in geringeren Probenvolumina auf gewünschte Stellen des Gels aufgetragen; es ist möglich, daß Elektrodenstreifen verwendet werden; die Nachweismethoden, z.B. die Färbe- und Entfärbeprozeduren werden schnell durchgeführt; die Elektrophorese kann automatisiert werden. In der Regel werden die Gele auf Haftfolie oder seltener auf Haftnetz gegossen. Die Haftfolien sind dünne behandelte Polyesterfolien, die in der Lage sind, Gele zu binden. Es gibt Haftfolien sowohl für Polyacrylamidgele als auch für Agarosegele. Die foliengestützten Gele haben gegenüber den Gelen, die auf Glasplatten gegossen sind, zwei wichtige Vorteile: sie können in Streifen geschnitten werden und lassen sich in trockenem Zustand einkleben oder abheften. Bei der Elektrophorese werden entweder homogene oder Gradienten-Polyacrylamidgele verwendet.

Herstellung von homogenen foliengestützten Polyacrylarnidgelen Es gibt drei Techniken zum Gießen von dünnen und ultradünnen homogenen Polyacrylamid- und Agarosegelen: Kassetten-, Klapp- und Schiebetechnik. Kassettentechnik. Die Kassettentechnik [39] wird am meisten verwendet. Bei ihr werden dünne sowie ultradünne Polyacrylamidgele in Gießkassetten gegossen. Die Gießkassette (Kap. 1.6.5) besteht aus zwei 4 mm dicken Glasplatten, die mittels eines U-förmigen Abstandhalters in bestimmter Distanz zueinander gehalten werden. Auf die eine Platte wird eine Haftfolie aufgelegt, die andere Platte wird mit Repel-Silan (Pharmacia Biotech, Uppsala) oder Dichlordimethylsilan (Merck, Darmstadt) beschichtet. Repel-Silan (Abb. 1.7-6) hydrophobisiert die Glasoberfläche. Dadurch wird verhindert, daß das Gel an der Glasplatte haftet und beim Öffnen der Gießkassette zerreißt. Glas . .·. OH

Cl \

+ OH

Cl

/

Si

/

CH,3

\ CH3

fe^

O \ K- O

/

Si

/

\

CH3 + 2HC1 CH^

Abb. 1.7-6 Chemische Formel von Dichlordimethylsilan (Repel-Silans) und seine Reaktion mit der Glasoberfläche.

Die Silanisierung wird folgenderweise durchgeführt: Unter dem Abzug wird die Glasplatte mit einem mit 2 ml/dl Repel-Silan in Chloroform oder mit 2 ml/dl Dichlordimethylsilan in l, l, l-Trichlorethan getränkten Kosmetiktuch, Watte- oder Zell-

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

75

stoffbausch eingerieben (Gummihandschuhe tragen). Danach wird die Platte an der Luft getrocknet, bis das Lösungsmittel verdunstet ist. Schließlich wird sie mit fließendem und am Ende mit destilliertem Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Beim Waschen wird die Salzsäure entfernt, die sich bei der Silanisierung bildet. Die Haftfolie (z.B. GelBond PAGfilm, FMC, Rockland, Me.) verbindet das Gel chemisch und stützt es dadurch mechanisch. Die Montage der Haftfolie auf eine Glasplatte wird folgenderweise durchgeführt: Die Glasplatte wird aufgelegt und mit ein bißchen Wasser bedeckt. Darauf wird die Haftfolie gelegt, mit der hydrophoben Seite nach unten, und mit einem Fotoroller gewalzt (Abb. 1.7-7). Dadurch entsteht zwischen der Glasplatte und der Haftfolie ein dünner Wasserfilm, der durch Adhäsion beide festhält. Das austretende überschüssige Wasser wird mit Filterpapier abgesaugt.

Abb. 1.7-7 Aufwalzen einer Haftfolie.

Die Kassettentechnik umfaßt folgende Schritte: • Entlang der Ränder der hydrophobisierten Glasplatte wird ein U-fbrmiger SilikonAbstandhalter aufgeklebt, so daß das Gel eine Dicke von 0,1 bis zu 0,5 mm erhält. • Die Glasplatte mit der Haftfolie und die silanisierte Glasplatte mit dem U-fbrmigen Abstandhalter werden aufeinander gelegt und zusammengeklammert. Danach wird die Gießkassette im Kühlschrank bei 4 °C vorgekühlt, um den Start der Polymerisation zu verzögern. • Die Monomerlösung, ohne die Katalysatoren, wird 3 min mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe entlüftet. • Die Katalysatoren werden zugegeben und das Gemisch wird 10-15 s geschwenkt. • Die Monomerlösung wird mit einer Spritze oder Pipette blasenfrei in die Gießkassette eingeführt (vergl. Abb. 1.7-2) und mit destilliertem Wasser überschichtet. • Die Polymerisation findet bei Raumtemperatur in 60 min statt, danach wird das überschichtete Wasser abgegossen. • Die Kassette wird zerlegt, das Gel entnommen und mit einer Deckfolie abgedeckt. Das Gel kann entweder sofort verwendet oder in einer Haushalts-Gefrierfolie eingeschweißt und im Kühlschrank bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden. Mit der Kassettentechnik können Polyacrylamidgele unterschiedlicher Konzentrationen hergestellt werden (Tab. 1.7-2). Eine Gießkassette mit Innenmaßen von 120 250 0,5 mm benötigt ca. 15 ml Monomerlösung. Zur Monomerlösung können auch nichtionische Detergenzien (Triton X-100, Nonidet P 40) in Konzentrationen 0,5-4 ml/dl

76

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

oder ionische Detergenzien (SDS) in Konzentrationen von 0,1-0,5 g/dl beigemischt werden. Tab. 1.7-2 Rezepturen zum Gießen von homogenen Polyacrylamidgelen mit unterschiedlichen Konzentrationen. T, g/dl

4

5

6

7

8

9

10

11

12

25,00 25,00 25,00 25,00 25, 00 25,00 25,00 25,00 25,00 Puffer, 4x, ml 8,0 10,0 12,0 14,0 24,0 Monomerlösung 20,0 22,0 16,0 18,0 (T = 50 g/dl, C = 0,03, ml) 0,46 0,46 0, 46 10,0 ml/dl TMEDA, ml 0,46 0,46 o,46 0,46 0,46 0,46 0,46 0,46 0,46 0,46 10,0 g/dl APS, ml o,46 o,46 0,46 0,46 0,46 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100;,00 100,00 100,00 100,00 Dest. Wasser, ml, ad T. g/dl

13

14

75

16

17

18

19

25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25, 00 25,00 Puffer, 4x, ml 26,0 28,0 30,0 32,0 38,0 Monomerlösung 34,0 36,0 ( = 30 g/dl, C = 0,03, ml) 0, 46 0, 46 0,46 0,46 0,46 0,46 0,46 10,0 ml/dl TMEDA, ml 0,31 0,31 0,31 0,31 0, 31 0, 31 0,31 10,0 g/dl APS, ml 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Dest. Wasser, ml, ad

20

21

25,00 40,0

25,00 42,0

0,46 0,31 100,00

0,46 0,31 100,00

Klapptechnik. Die Klapptechnik [40] eignet sich zur Herstellung von ultradünnen Polyacrylamidgelen mit einer Dicke von 0,05-0,20 mm, auch wenn sie 40 20 cm groß sind. Sie wird folgendermaßen durchgeführt: • Auf eine nivellierte 4 mm dicke Glasplatte werden 1-2 ml Wasser gegossen, eine Haftfolie mit der hydrophoben Seite nach unten gelegt und mit einem Fotoroller fest gewalzt. • Eine weitere 4 mm dicke Glasplatte wird mit Repel-Silan beschichtet. • Auf die langen Ränder der silanisierten Seite werden jeweils zwei schmale 0,15-0,20 mm dicke Klebebandstreifen aufgeklebt. • Zu entlüfteter Monomerlösung werden die Katalysatoren gegeben, das Gemisch wird 10-15 s geschwenkt und am weiteren Rand der Haftfolie gegossen (Abb. 1.7-8). Zum Gießen eines Gels mit Maßen von 110 240 0,2 mm werden ca. 6 ml Monomerlösung benötigt. • Die obere Glasplatte wird mit den Klebebandstreifen nach unten vorsichtig auf die untere Glasplatte mit der Haftfolie abgesenkt, so daß sich die Monomerlösung blasenfrei und gleichmäßig zwischen den Platten ausbreitet. • Der entstandene Glasplatten-Monomerlösung-Sandwich wird von oben beschwert und die Polymerisation findet bei Raumtemperatur in 30-60 min statt. Bei Verwendung einer beheizten Unterlage können nach dieser Technik auch ultradünne Agarosegele hergestellt werden.

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

77

Abb. 1.7-8 Klapptechnik zur Herstellung ultradünner Gele. 1. Untere Glasplatte; 2. Haftfolie; 3. Obere Glasplatte; 4. Dichtung; 5. Flasche mit entgaster Monomerlösung.

Schiebetechnik. Die Schiebetechnik [41] ähnelt der Klapptechnik. Der Unterschied besteht darin, daß die Glasplatte nicht geklappt, sondern über Teflon-Abstandhalter geschoben wird. Die Schiebetechnik erlaubt die Herstellung von großen dünnen und ultradünnen Gelen, z.B. von 0,1 bis 0,5 mm Gelen mit 60 cm Trenndistanz für die Analyse von DNA und RNA. Die Schiebetechnik benötigt eine spezielle Vorrichtung, z.B. das Ultramould von Pharmacia Biotech, Uppsala (Abb. 1.7-9).

Abb. 1.7-9 Schiebetechnik. 1. Untere Glasplatte; 2. Haftfolie; 3. Abstandhalter; 4. Obere Glasplatte; 5. Flasche mit entgaster Monomerlösung; 6. Monomerlösung auf der Haftfolie.

Herstellung von Gradienten-Polyacrylamidgelen auf Haftfolie Die Gradienten-Polyacrylamidgele (Porengradienten-Polyacrylamidgele) wurden erstmals von Margolis und Kenrick [42] eingeführt. Sie zeichnen sich dadurch aus, daß ihre Konzentration sich von einem zum anderen Gelende kontinuierlich verändert, was zu einer

78

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

kontinuierlichen Veränderung ihrer Porendurchmesser fuhrt [43, 44]. Üblicherweise werden Konzentrationsgradienten im -Bereich von 4 bis 28 g/dl verwendet. Während der Elektrophorese gelangen gleiche Polyionen an einen Punkt im Gradientengel, wo sie wegen ihres Volumens (Masse) zurückgehalten werden. Durch Vergleich mit den Banden von Polyionen bekannter Molekülmassen (Eichpolyionen) lassen sich die Molekülmassen von unbekannten Polyionen ermitteln. Die Gradientengele werden mit einem Gradientenmischer (Kap. 1.6.5) hergestellt. Beim Gießen in eine Gießkassette von oben wird die Mischkammer mit einer Monomerlösung niedriger Konzentration gefüllt, die Glycerin in hoher Konzentration (z.B. von 25-30 g/dl) enthält. Diese Lösung wird als schwere Lösung bezeichnet. Das Reservoir wird dagegen mit einer hochkonzentrierten Monomerlösung gefüllt, die Glycerin in einer niedrigen Konzentration enthält - leichte Lösung. Der schweren Lösung wird kontinuierlich die leichte Lösung zugemischt, so daß die Acrylamid-Konzentration in der Gießkassette linear oder exponentiell von unten nach oben zunimmt. Auf diese Weise ergibt die schwere Lösung den weitporigen Teil des Gradienten und die leichte Lösung seinen engporigen Teil. Dieses Gießverfahren hat Vorteilen: • Die erhöhte Glycerin-Konzentration im Bereich des weitporigen Teils des Gradientengels, wo die Proben aufgetragen werden, verhindert das Austrocknen des Gels und verringert die negativen Effekte durch die lonenstärke in den Proben. • Die Lösung mit erhöhter Monomerkonzentrazion stört nicht die Bildung des Gradientengels, weil sie im oberen Teil des Gels verteilt ist und dadurch keine Wärmekonvektion im unteren Teil des Gels verursacht. In Tab. 1.7-3 ist die Herstellung von drei Monomerlösungen angegeben, die für ein homogenes Sammelgel mit T = 5 g/dl und einen Gradienten-Trenngel mit T = 8-20 g/dl geeignet sind. Die Konzentration von Glycerin ist in der Superschweren Lösung 40 g/dl, in der schweren Lösung 20 g/dl, in der leichten Lösung 0 g/dl. Tab. 1.7-3 Zusammensetzung unterschiedlicher Monomerlösungen. Zusammensetzung

Puffer, 4x, ml Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, ml 10 g/dl APS, ml Dest. Wasser, ml, ad

Superschwere Lösung T = 5g/dl, C = 0,03

Schwere Lösung T = 8g/dl, C = 0,03

Leichte Lösung T = 20g/dl, C = 0,03

2,00 ml 0,80 ml

2,00 ml 1,28 ml

2,00 ml 3,20 ml

3,00 ml 0,04 ml 0,04 ml 8,00 ml

1,50ml 0,04 ml 0,04 ml 8,00 ml

0,04 ml 0,04 ml 8,00 ml

Die Vertiefungen für den Probenauftrag auf der Oberseite der Vertikalgele werden mit Hilfe eines Kammes zwischen den Glasplatten einpolymerisiert. Die Proben werden in die Vertiefungen unter den oberen ElektrodenpufFer unterschichtet. Ein Zusatz von 10-20 g/dl Glycerin zu den Proben verhindert, daß sie beim Auftragen herauswirbeln. Bei der Horizontalelektrophorese werden die Proben üblicherweise in die Schlitze eines

l .7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

79

Applikationsstreifens aus Silikon oder einer Applikationsschablone aus Polyester aufgetragen. Die meist verwendeten Gradientengele haben lineare Konzentrationen. Seltener werden auch exponentielle Konzentrationsgradienten eingesetzt. Lineare Gradientenge IQ. Ein lineares Gradientengel wird erzeugt, wenn sowohl die Mischkammer als auch das Reservoir des Gradientenmischers während des Gelgießens offen sind. Damit bleiben die beiden Lösungen immer auf dem gleichen Niveau. Das Gießen eines linearen Gradientengels in eine Standard-Kassette wird folgenderweise durchgeführt (Abb. 1.7-10):

Reservoir Multifunktionsstab

Mischkammer lasfe

Magnetkern

Abb. 1.7-10 Gießen eines linearen Gradientengels.

• Eine gekühlte Gießkassette wird mit der Mischkammer verbunden, so daß sich der Gradientenmischer ca. 5 cm über der Kassettenoberkante befindet. Mit der Vorkühlung wird eine Verzögerung der Polymerisation erzielt, die zum horizontalen Ausgleich des Dichtegradienten fuhrt. • Der Zwischenhahn und die Auslaßklemme des Gradientenmischers werden geschlossen. • Der Auslaßschlauch wird in die mittlere Kerbe der Glasplatte eingeführt. Wenn es keine Kerbe gibt, wird er in die Mitte zwischen den Kassettenoberkanten aufgesetzt und fixiert. • In das Reservoir werden 8,0 ml leichte Lösung und Katalysatoren und in die Mischkammer 8,0 ml schwere Lösung und Katalysatoren einpipettiert. • Der Magnetrührer wird eingeschaltet, um die schwere Lösung umzurühren. Das Volumen des Magnetrührers in der Mischkammer wird durch das Volumen des Multifunktionsstabs im Reservoir kompensiert. Dadurch bleiben die Niveaus der beiden Lösungen auf derselben Ebene und die Lösung in der Mischkammer fließt nicht in das Reservoir zurück.

80

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

• Der Zwischenhahn und die Auslaßklemme werden nacheinander geöffnet. Die Monomerlösung beginnt, aufgrund der Gravitation, durch den Auslaßschlauch in die Gießkassette zu fließen. • Nachdem die Gradientenlösung in der Gießkassette eine Höhe von ca. l cm unterhalb ihrer Oberkante erreicht hat, wird sie mit 0,5 ml dest. Wasser überschichtet, damit das obere Ende des Gradientengels vor dem Luftsauerstoff geschützt und glatt wird. • Der Gradientenmischer wird mit Wasser ausgespült. • Die Polymerisation findet in 60 min bei Raumtemperatur statt. Exponentielle Gradientengele. Ein exponentielles Gradientengel wird hergestellt, wenn das Lösungsvolumen in der Mischkammer des Gradientenmischers während des Gießvorgangs konstant bleibt. Für diesen Zweck kann die Mischkammer mit einem Stöpsel dicht verschlossen werden - dann fließen aus dem Reservoir und durch den Auslaßschlauch Lösungen mit gleichem Volumen. Man kann zwei Arten von exponentiellen Gradientengelen herstellen - konkaven oder konvexen.

Herstellung von netzgestützten Polyacrylamidgelen Polyacrylamidgele, die auf Haftfolien oder Glasplatten polymerisiert sind, eignen sich nicht für das Elektroblotting. Eine Alternative bieten die netzgestützten Gele [45]. Außerdem werden ihre Banden schneller gefärbt, da der Farbstoff von beiden Seiten ins Gel eindringt und schneller das Gel verläßt. Die Netzgewebe bestehen aus Polyamid-, Polyethylen- oder am häufigsten aus Polyesterfasern. Ihre Poren haben einen Durchmesser von 10-60 [46]. Die hydrophilisierten Polyestergewebe haften am Gel fest und mit den Polyionen in keinen hydrophoben Wechselwirkungen treten. Die Herstellung der netzgestützten Polyacrylamidgele ähnelt im allgemeinen dem Gießen der foliengestützten Gele.

Herstellung von Polyacrylamidgelen mit erhöhter Polyolkonzentration Die Elektrophorese, besonders die isoelektrische Fokussierung, kann auch in Polyacrylamidgelen mit erhöhten Konzentrationen von Polyolen durchgeführt werden, z.B. in 30-60 g/dl Glycerin [47], Polyacrylamidgele mit erhöhter Polyolkonzentration bieten manche Vorteile: • Sie tolerieren erhöhte Salzkonzentrationen in den Proben, z.B. 0,3-0,6 mol/1 NaCl, was zu keiner Bildung von Bandenverzerrungen fuhrt. • Sie beseitigen teilweise die Effekte der Elektroosmose - das Gel bleibt trocken. • Sie ertragen höhere Feldstärken. • Die Auflösung der Elektrophorese bzw. der isoelektrischen Fokussierung steigt wegen der verlangsamten Diffusion.

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

81

Herstellung von rehydratisierbaren Polyacrylamidgelen Die Gelpolymerisation, insbesondere in Gegenwart von Trägerampholyten und Additiven oder bei extremen pH-Werten, verläuft sehr langsam oder überhaupt nicht. Außerdem stören die verbliebenen Reste der Monomere, TMEDA und APS die Auftrennung der Polyionen und inaktivieren die Enzyme. Zusätzlich verringern die erwähnten Verbindungen, besonders die Trägerampholyte, die Haftfähigkeit der Haftfolie bzw. des Haftgewebes - solche Gele können sich bei Färbung in säurehaltigen Lösungen von der Haftfolie völlig oder teilweise lösen. All diese Komplikationen wurden mit der Einführung der rehydratisierbaren Gele [48, 49] überwunden. Die rehydratisierbaren Gele werden ohne jegliche Zugaben (Trägerampholyte, Harnstoff etc.) hergestellt und dreimal je 20 min unter Schütteln in bidestilliertem Wasser gewaschen. Das letzte Waschwasser muß 5 ml/dl Glycerin enthalten. Dann werden sie an der Luft über Nacht getrocknet, in Folie eingeschweißt und im Kühlschrank bzw. Tiefkühlschrank aufbewahrt. Zu einer späteren Zeit werden die rehydratisierbaren Gele mit entsprechenden Lösungen rehydratisiert (gequellt, rekonstituiert). Die rehydratisierbaren Gele haben gegenüber den nassen Gelen einige Vorteile: • Sie enthalten, wie erwähnt, keine Restmonomere (Acrylamid und BIS) und keine Restkatalysatoren (TMEDA und APS), die die isoelektrische Fokussierung stören. • Sie lassen sich in getrockneter Form sehr lange (bei -20 °C praktisch unbegrenzt) lagern und können bei Bedarf in gewünschten Maßen zugeschnitten werden. Die nassen Polyacrylamidgele hydrolysieren dagegen nach einer gewissen Zeit, falls der pH-Wert über 8,8 ist. • Rehydratisierbare Gele können mit beliebigen Lösungen rehydratisiert werden, z.B. mit Lösungen, die Trägerampholyte, Detergenzien (Triton X-100 u.a.) oder Harnstoff enthalten. Rehydratisierbare Gele haben auch Nachteile: • Das Waschen, Trocknen und Rehydratisierung kosten Zeit. • Das Rehydratisieren benötigt entsprechende Lösungen. • Die rehydratisierten Gele neigen zur Wasserabscheidung auf der Geloberfläche. Die Rehydratisierung eines rehydratisierbaren Gels verläuft nach folgendem Schema: • Ein rehydratisierbares Gel wird aus dem Tiefkühlschrank genommen und 10 min lang bei Raumtemperatur belassen. • Eine Rehydratationskassette wird wie eine Gießkassette montiert (Kap. 1.7.6), jedoch wird anstelle einer Haftfolie das rehydratisierbare Gel mit der Gelseite nach oben und der Haftfolie nach unten aufgelegt. Danach wird das Gel vorsichtig mit einem Fotoroller gewalzt. Es können auch einzelne Gelstreifen rehydratisiert werden (Abb. 1.711). Um das Haften der Geloberfläche am Glas zu verhindern, muß die gegenüberliegende Glasplatte vorher mit Repel-Silan beschichtet werden. Die rehydratisierbaren Gele werden in Rehydratationskassetten rekonstituiert, damit die Gelschicht gleichmäßig und bis zu einer bestimmten Dicke quillt.

82

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

Abb. 1.7-11 Rehydratisierungskassette. 1. Gelstreifen; 2. U-fbrmige Dichtung; 3. Klammer.

• Die Rehydratisierungslösung wird mit einer Spritze oder Pipette in die Quellkassette eingefüllt. Sie enthält meistens 8-9 mol/1 Harnstoff, die nichtionischen Detergenzien Triton X-100 oder Nonidet NP-40 in einer Konzentration von gewöhnlich 0,5-2 ml/dl, 10 mmol/1 1,4-Dithiothreitol (DTT) und 20 ml/dl Glycerin (10 g/dl Sorbit oder 10 g/dl Saccharose). • Bei ultradünnen Gelen (0,05-0,10 m) erfolgt die Rehydratisierung in einigen min, bei dünnen Gelen (0,5 mm) in 1-2 h. Wenn die Rehydratisierungslösung zusätzliche Chemikalien enthält, z.B. Harnstoff oder nichtionische Detergenzien (Nonidet NP-40), muß die Rehydratisierungszeit über Nacht [50, 51] verlängert werden. • Nach der Rehydratisierung des Gels wird die Quellkassette geöffnet und das gebrauchsfertige Gel entnommen. Die Rehydratisierungslösung sollte vom Gel aufgenommen werden. Wenn dies nicht der Fall ist, muß die Geloberfläche mit einem fusselfreien Filterpapier abgetrocknet werden. Reinigung des Acrylamids. Die Reinigung des Acrylamids wird durch Umkristallisieren durchgeführt, nach folgendem Schema: • 100 g Acrylamid werden bei 60 °C in 200 ml Chloroform aufgelöst und filtriert; • Die filtrierte Lösung wird auf 22 °C abgekühlt, wobei Acrylamid kristallisiert; • Das Lösungsmittel wird in einem Büchner-Trichter mit Hilfe einer Vakuumpumpe abgezogen; und • Das gereinigte Acrylamid wird in einem dunklen Gefäß gelagert.

1.7 Die Elektrophorese wird in unterschiedlichen Trägern durchgeführt

83

Literatur [1] Scherz H, Elektrophoresis, 11, 18(1990) [2] Smithies O, Biochem J, 61, 629 (1955) [3] Smithies O, Connell GE, Dixon GH, Am JHum Genet, 14, 14 (1962) [4] Kunkel HG, Slater RJ, Proc Soc Exp BiolMed, 80, 42 (1952) [5] Peterson RF, J Dairy Sei, 4, 1163 (1963) [6] Harris H, Hopkinson DA, Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, North Holland Publishing Comp, Amsterdam - Oxford, American Eisevier Publ Comp Ine, New York (1976) [7] Ferguson KA, Biochemical Systematics and Evolution, Blackie & Son, Bishopbriggs, Glasgow G 642NZ(1980) (8) Conkle MT, Proceedings of the Symposium on "Isozymes of North American Forest Trees and Forest Insects", Pacific Southwest Forest and Range Experiment Station, PO Box 245 (1979) [9] Araki C, J Chem Soc Japan, 58, 1338 (1937) [10] Mon,T,AdvCarbohydrChem,S, 115(1953) [11] Araki C, in Carbohydrate Chemistry of Substances of Biological Interest, Proc. of the 4th International Congress of Biochemistry, Wolfram MC (Hrsg.), Bd. l, S. 15 (1958) [12] Griess G A, Guiseley KB, Serwer P, BiophysJ, 65, 138 (1993). [13] Kirkpatrick FH, Dumais MM, White HW, Guiseley KB, Electrophoresis, 14, 349 (1993). [14] Serwer P, Methods Enzymol, 130, 116 (1986) [15] Hahn E, Wurts L, Tietz D, Chrambach A, Electrophoresis, 9, 243 (1988) 116] Hickson TGC, Poison A, Biochim BiophysActa, 168, 43 (1965) [17] Serwer P, Biochemistry, 19, 3001 (1980) [18] Saravis CA, Zamcheck N, J Immunol Methods, 29, 91 (1979) [19] Rosen A, Ek K, Aman P, J Immungene t, 28, l (1979) [20] Raymond S, Weintraub L, Science, 130, 711 (1959) [21] Righetti PG, in Isoelectric Focusing. Theory, Methodology and Applications, Work TS, Burdon RH (Hrsg.), Eisevier Biomedical Press, Amsterdam, S. (1983) [22[ Anderson LE, McClure WO, Anal Biochem, 51, 173 (1973) [23] Hochstrasser DF, Patchornik A, Merril CR, Anal Biochem, 173, 412 (1988) [24] O'Connell PBH, Brady C], Anal Biochem, 76, 63 (1976) [25] Hanson ^, Anal Biochem, 76, 37 (1976) [26] Kozulic M, Kozulic B, Mosbach K, Anal Biochem, 163, 506 (1987) [27] Kozulic B, Mosbach K, Pietrzak M, Anal Biochem, 170, 478 (1988) [28] Riichel R, Steere RL, Erbe EF, J Chromat, 166, 563 (1978)

84

l Theorie und Grundlagen der Elektrophorese

[29] Hjerten S, Arch Biochem Biophys, Suppl l, 147 (1962) [30] Gordon AH, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work TS, Work E (Hrsg.), North Holland Publ. Co., Amsterdam - London, Bd. l, Teil l (1975) [31] Bonaventura C, Bonaventura J, Stevens R Millington D, Anal Biochem, 222, 44 (1994) [32] Ornstein L,Ann N YAcadSci, 121, 321 (1964) [33) Rothe GM, Electrophoresis, 9, 307 (1988) [34] Rauch-Puntigan H, in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl, Thieme, Stuttgart, Bd. 14, Nr. l, S. 1026 (1961) [35] Ferguson KA, Metabolism, 13, 985 (1964) [36] Hedrick JL, Smith M, Arch Biochem Biophys, 126, 155 (1968) [37] Görg A, Postel W, Westermeier R GITLabor Med, \, 32 (1979) [38] Görg A, Postel W, Westermeier R Gianazza E, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 3, 273 (1980) [39] Görg A, Postel W, Westermeier R, Anal Biochem, 89, 60 (1978) [40] Radola BJ, Electrophoresis, l, 43 (1980) [41] Ansorge W, De Meyer L, J Chromat, 202, 45 (1980) [42] Margolis J, Kenrick KG, Biochem Biophys Res Comm, 27, 68 (1967) [43] Wright GL Jr, Farrell KB, Roberts DB, Biochim Biophys Acta, 295, 396 (1973) [44] Mahadik SP, Korenovsky A, Rapport MM, Anal Biochem, 76, 615 (1976) [45] Nishizawa H, Murakami A, Hayashi N, lida M, Abe Y, Electrophoresis, 6, 349 (1985) [46] Kinzkofer-Peresch A, Patestos NP, Fauth M, Kögel F, Zok R, Radola BJ, Electrophoresis, 9, 497 (1988) [47] Patestos NP, Zok R, Radola BJ, in Electrophoresis Forum '89, Radola BJ (Hrsg.), Technische Universität München, München, S. 368 (1989) [48] Robinson HK, Anal Biochem, 49, 353 (1972) [49] Frey MD, Kinzkofer A, Atta MB, Radola BJ, Electrophoresis, 7, 28 (1986) [50] Gelfi C, Righetti PG, Electrophoresis, 5, 257 (1984) [51] Altland K, Rossmann U, LKB Application Note 346

Aufgaben l 1.1 Berechnen Sie die lonenstärke einer Lösung, die 0, l mol/1 CH3CO2Na und 0,2 mol/1 NaCl enthält. 1.2 Bei 25 °C ist der pK-Wert des Dihydrogenphosphat-Ions (H2PO4~ H+ + HPO42") gleich 7,20. Berechnen Sie seinen p£c-Wert bei 7 = 0,1 mol/1. 1.3 Die Gesamtkonzentration des Kohlendioxids in destilliertem Wasser CO2^dj^ erreicht an der Luft 10"4 mol/1, wobei nur 0,0026 des gelösten Kohlendioxids als Kohlensäure existiert. Berechnen Sie den pH-Wert des destillierten Wassers, wenn die Dissoziationskonstanten der Kohlensäure p/Ccl = 3,8 und pKc2 = 10,3 sind. 1.4 Ein Puffer enthält bei 25 °C 0,1 mol/1 CH3CO2H und 0,1 mol/1 CH3CO2Na. Berechnen Sie seinen pH-Wert, wenn 0,01 mol/1 HC1 bzw. 0,01 NaOH hinzugefügt wird. Der p£c-Wert der Essigsäure ist bei dieser lonenstärke 4,64. 1.5 Berechnen Sie die Konzentrationen von CH3CO2Na und CH3CO2H (P^cCH3COzH = 4,64) in einem Acetat-PufTer, wenn sein pH-Wert gleich 5,50 und die Gesamtkonzentration seiner Elektrolyte gleich 0,2 mol/1 ist. 1.6 Berechnen Sie die Zusammensetzung eines Carbonat-Puffers mit pH = 10,00 und = 0,3 mol/1. Die Konzentrationsdissoziationskonstante des Hydrogencarbonat-Ions p£cHCO3- ist 10,33. 1.7 Berechnen Sie die Pufferkapazität eines Puffers mit pH = 5,21 bei 25 °C, der 0,1 mol/1 Pyridin und 0,1 mol/1 HC1 enthält. Der p£c-Wert des Pyridinium-Ions ist 5,21. 1.8 Berechnen Sie das Verhältnis zwischen den Pufferkapazitäten von zwei Lösungen bei 25 °C, die aus CH3CO2Na und CH3CO2H zusammengesetzt sind. In der ersten Lösung ist pH = pÄ"c = 4,62, in der zweiten Lösung ist pH = 5,50. Die Gesamtpufferkonzentration beträgt in beiden Fällen 0,2 mol/1. 1.9 Berechnen Sie die Mobilität des TRIS-Ions bei 0 °C und 25 °C bei lonenstärken von 0,01 und 0,07 mol/1. Die absolute Mobilität des TRIS-Ions bei 0 °C ist 12,75 10"9 m2/(sV), bei 25 °C 27,86-10"9 m2/(sV). Verwenden Sie bei der Berechnung die lineare Gleichung mit dem Parameter der lonenmobilität (Kap. 1.4). 1.10 Der pH(I)-Wert des Pepsins (ein Enzym im Magensaft) ist ca. 1. Aus welchen Aminosäureresten ist es aufgebaut?

2 Elektrophorese der Proteine Wie in Kap. 1.7 erwähnt, kann die Elektrophorese in flüssigen oder festen Trennmedien durchgeführt werden. Ein festes Trennmedium besteht aus einem Träger, der einen oder mehrere Puffer enthält. Die am meisten verbreiteten Träger sind das Papier, Dünnschichten, das Stärkegel, die Acetylcellulose-Folien und vor allem das Agarose- und Polyacrylamidgel.

Papier- und Dünnschicht-Zonenelektrophorese Die Papier- und Dünnschicht-Zonenelektrophorese wurden in den letzten Jahrzehnten völlig von der Agarose- und Polyacrylamidgel-Elektrophorese abgelöst. Die meisten Papiere für die Papier-Zonenelektrophorese [1,2] bestehen aus Cellulose. Um die Adsorptionserscheinungen auszuschalten, die die Trennung der Polyionen stören, können auch Papiere aus Glasfasern verwendet werden. Das Glasfaserpapier ist jedoch alkalisch, was eine starke endoosmotische Strömung verursacht. Die Dünnschicht-Zonenelektrophorese benutzt dieselben Träger wie die DünnschichtChromatographie (Kap. 1.7). Heute wird sie nur zur Analyse von hochmolekularen Polysacchariden und Lipopolysacchariden auf horizontalen Kieselgel-Dünnschichtplatten durchgeführt, die mit Elektrodenpuffer Kontakt haben [3]. Die elektrophoretische Kammer für die Papier- und Dünnschicht-Zonenelektrophorese ist eine einfache Horizontalkammer, die zwei Elektrodentanks enthält. Sie wird mit einem Deckel verschlossen, der den Anschluß an das elektrische Netz erlaubt. Die Kammer benötigt keine Kühlung Die Papierstreifen werden in den Elektrodenpuffer eingetaucht, dann zwischen zwei Filterpapierbogen abgetrocknet. Bei der Dünnschicht-Zonenelektrophorese wird der Puffer auf die Dünnschicht aufgesprüht. Die Proben können strich- oder punktförmig auf das Papier, bzw. die Dünnschicht aufgetragen werden, wobei das erste Verfahren vorgezogen wird. Die Auswertung der getrennten Polyionen erfolgt in der Regel mit Hilfe der Farbstoffe, die auf die Ergebnisse besprüht werden. Eine densitometrische Auswertung nach einer Papier-Zonenelektrophorese erfordert die Transparenz des gefärbten und getrockneten Pherogramms, was durch Benzylalkohol, Methylsalicylat oder Anisol erzielt werden kann.

Stärkegel-Zonenelektrophorese Die Stärkegel-Zonenelektrophorese wurde 1955 von Smithies [4] eingeführt. Die Stärkegele werden aus teilweise hydrolysierter Kartoffelstärke in Konzentrationen von 10-15 g/dl hergestellt und in 5-10 mm dicken Schichten gegossen. Die Porengröße der Gele wird durch die Stärkekonzentration eingestellt. Bei der Stärkegel-Zonenelektrophorese wird in der Regel der gleiche Puffer im Gel wie in den Elektrodentanks verwendet, wobei der Elektrodenpuffer gegenüber dem Gelpuffer konzentrierter ist. Die lonenstärke des Elektrodenpuffers kann z.B. 10 mal höher als die des Gelpuffers sein.

88

2 Elektrophorese der Proteine

Die Stärkegel-Zonenelektrophorese wurde wegen der stark variierenden Eigenschaften der Stärke, der mangelnden Reproduzierbarkeit der Methode und der unpraktischen Handhabung der Stärkegele fast völlig von der PolyacrylamidgelElektrophorese abgelöst. Die Stärkegele aber, als ein Naturprodukt, sind ein enzymfreundlicher Träger. Deswegen werden sie immer noch zur Trennung von Enzymen in der Human- [5] und Populationsgenetik [6, 7] verwendet.

2. l Acetylcellulose- und CellogelZonenelektrophorese der Proteine Die Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese sind die einfachsten und schnellsten Elektrophoreseverfahren, die vor allem in der Diagnostik zur Untersuchung von Serumproteinen und zur Analyse von Isoenzymen verwendet werden. Sie zeichnen sich durch einfache Handhabung, kurze Trennzeiten, geringe Probenvolumina sowie schnelles Färben und Entfärben aus. Außerdem finden die Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese in einfach konstruierten Horizontalkammern statt, die keine Kühlung benötigen. Die Acetylcellulose-Folien und Cellogel-Streifen (Kap. 1.7), die für diese Elektrophoresetechniken verwandt werden, sind sehr großporig und üben dadurch keine Siebwirkung auf die Proteine aus - die elektrophoretische Trennung ist nur ladungsabhängig. Gleichzeitig wirken Acetylcellulose und Cellogel kaum der Diffusion entgegen, so daß die Auflösung gering ist.

2.1.1 Acetylcellulose-Zonenelektrophorese Vor der Elektrophorese wird eine Acetylcellulose-Folie in eine mit Puffer gefüllte Schale eingetaucht, wo sie sich innerhalb von 2-3 min vollsaugt. Der überschüssige Puffer auf der Folie wird zwischen zwei Filterpapierbogen abgetrocknet und die AcetylcelluloseFolie wird in einem Kunststoffrahmen (Folienbrücke) aufgespannt. Der Rahmen mit der Folie wird in eine Horizontal-Elektrophoresekammer eingesetzt, wobei die Folienenden in die Elektrodenpuffer eintauchen, und die Kammer mit dem Kammerdeckel verschlossen. Durch Öffnungen im Kammerdeckel werden 8-10 Proben auf die AcetylcelluloseFolie aufgetragen und die Elektrophorese gestartet. Die Auflösung der Proteine in einer Acetylcellulose-Folie hängt vor allem vom pH-Wert und der lonenstärke des Puffers ab.

Acetylcellulose-Zonenelektrophorese von Serumproteinen Bei der Zonenelektrophorese in Acetylcellulose-Folien können in kürzester Zeit die fünf Hauptbanden (Hauptfraktionen) der Serum-, Urin- und Liquorproteine getrennt werden. Es sind auch Acetylcellulose-Kits erhältlich, die alle Lösungen zur Durchführung der Acetylcellulose-Zonenelektrophorese enthalten: trockene Acetylcellulose-Folien,

89

2. l Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese der Proteine

Elektrodenpuffer, Ponceau-S-Färbelösung, Entfärbelösung, Klärlösung, Folienfilterpapiere und Glasplatten (Kap. 2.16.1). Die Serumproben werden unverdünnt oder doppelt verdünnt aufgetragen. Ist die Gesamt-Proteinkonzentration in den Urin- oder Liquorproben unter l g/dl, müssen sie konzentriert werden, bis eine Konzentration von 2-3 g/dl vorliegt. In der Routine hat sich der 5,5-Diethylbarbiturat-Puffer von Longsworth [8] als brauchbar erwiesen, der auch als Barbitalat- oder Veronalat-Puffer bekannt ist und einen pH-Wert von 8,0 bis 9,0 hat. Da dieser Puffer aber ein Derivat der Barbitursäure (eines Betäubungsmittels) ist, sollte er durch Puffer, die keine Barbiturate enthalten, ersetzt werden. Ein solcher Puffer ist z.B. der TRIS-Taurinat-Puffer [9]. Die Acetylcellulose-Zonenelektrophorese umfaßt folgende Prozeduren: • Die Elektrophoresekammer und eine Schale werden mit dem Elektrophoresepuffer gefüllt. Eine Acetylcellulose-Folie wird für 2-3 min in der Schale untergetaucht, dann zwischen 2 Filterpapierbogen kurz abgetrocknet, auf der Folienbrücke aufgespannt und in die Elektrophoresekammer eingesetzt. • Der Kammerdeckel wird auf die elektrophoretische Kammer aufgesetzt und die Proben mit einem Auftragsstempel auf der Kathodenseite der Acetylcellulose-Folie aufgetragen. • Die Elektrophorese wird bei 200-250 V im Laufe von 25-40 min durchgeführt. Es liegt üblicherweise eine elektrische Stromstärke von ca. 3 mA pro Folie an. • Nach der Elektrophorese wird die Acetylcellulose-Folie für 5 min in eine Ponceau-SFärbelösung gelegt und danach 2-3 mal mit l g/dl Trichloressigsäure gespült, bis ein klarer Folienhintergrund zu sehen ist. • Eine trockene Schale wird mit einer Klärlösung gefüllt und die Folie wird drinnen 2 min lang untergetaucht. • Mit Hilfe eines Fotorollers wird die Acetylcellulose-Folie luftblasenfrei auf eine saubere Glasplatte bzw. einen Objektträger aufgezogen und in einem Trockenschrank für 20 min bei 100 °C transparent gemacht. Die Auswertung der rotgefärbten Proteinbanden kann visuell, gegen ein Kontrollpherogramm, oder mit einem Densitometer bei 530 nm erfolgen. Im zweiten Fall können auch die Relativkonzentrationen der Serumproteine berechnet werden (Abb. 2.1-1). Relative Konzentration

1

2

3

4

5

6

Albumin Alpha-1-Globuline Alpha-2-Globuline Beta-Globuline

60,0-70,0 % 1,0- 4,0% 5,0-10,0% 8,0-12,0%

Gamma-Globuline

10,0-18,0%

7

Abb. 2.1-1 Acetylcellulose-Zonenelektrophorese von Serumproteinen.

Albumin C

= 1,5-2,5 Globuline

90

2 Elektrophorese der Proteine

2. l .2 Cellogel-Zonenelektrophorese Die Cellogel-Bogen werden gewöhnlich in Abmessungen von 300 110 0,2 mm hergestellt und in methanolischer Lösung aufbewahrt - sie dürfen nicht austrocknen. Für die Elektrophorese werden die Bogen in kleinere Streifen mit einer Breite von 25 oder 75 mm und einer Länge von 140 mm geschnitten, da die Laufstrecke ca. 90 mm beträgt. Die rechte untere Ecke jedes Streifens wird abgeschnitten, um die permeable Oberseite von der impermeablen Unterseite zu unterscheiden. Vor der Elektrophorese werden die Cellogel-Streifen zwischen Filterpapierbogen getrocknet und für 5-10 min im Elektrophoresepuffer äquilibriert, bis sie unter die Pufferoberfläche sinken. Danach werden sie nochmals zwischen Filterpapierbogen abgetrocknet und auf einer Kunststoffbrücke aufgespannt (Abb. 2.1-2). Die Brücke wird in eine mit dem Puffer gefüllte Elektrophoresekammer eingesetzt. 2(1

Probenauftragsstelle

Abb. 2.1-2 Brücke für Cellogel-Streifen. Beim Einsetzen der Brücke in die Elektrophoresekammer tauchen die Enden der Folien in den Puffer ein.

Die Cellogel-Streifen werden für 5 min einer Vorelektrophorese ausgesetzt, die bei einer Feldstärke von 15 V/cm stattfindet. Der Probenauftrag von ca. 5 Serum erfolgt mit einer Mikroliterspritze oder mit einem speziellen Applikator vor dem Kathodenrand des Streifens. Der Applikator besteht aus zwei parallel gespannten Metalldrähten, zwischen denen ein gewisses Probenvolumen aufgenommen wird. Beim Auftragen sollte die Streifenoberfläche nicht verletzt werden. Die Elektrophorese wird bei 15-20 V/cm (2,5 mA/Streifen) durchgeführt und nach 30-90 min beendet. Die Cellogel-Streifen können nach der Elektrophorese für Proteine, Lipoproteine, Enzyme usw. gefärbt werden (Tab. 2.1-1). Immunologische Nachweise sind auch möglich. Nach dem Färben der elektrophoretischen Banden sollten die Cellogel-Streifen transparent werden, damit eine densitometrische Auswertung möglich wird (s.o.).

2. l Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese der Proteine

91

Tab. 2.1-1 Verschiedene Anwendungen der Cellogel-Zonenelektrophorese. Elektrophorese von Serumproteinen. Färbung mit Ponceau S Probenvolumen Elektrophoresepuffer Dauer der Elektrophorese Färbung Entfärbung Klärung

Dokumentierung Normales Pherogramm

1,5 Serum. TRIS-Taurinat-Puffer (pH = 9,0, I = 0,05 mol/1) oder Michaelis-Puffer, pH = 8,6 (Kap. 1.2.3). 35 min bei 200 V. 5 min in 0,5 g/dl Ponceau S in 5 g/dl Trichloressigsäure. 3 mal in 5 ml/dl Essigsäure. l min in Methanol, danach l min in Methanol-Essigsäure-Glycerin (85:15:0,1, V\V) oder in Dioxan-Isobutanol (7:3, V:V) einlegen. Auf einer Glasplatte für 4 min auf 70 °C erhitzen. Densitometrie bei 525 nm. 5 Banden.

Elektrophorese von Serumproteinen. Färbung mit Coomassie Brillantblau R 250 Probenvolumen Elektrophoresepuffer Dauer der Elektrophorese Färbung Entfärbung Klärung Dokumentierung Normales Pherogramm

0,5 Serum. TRIS-Taurinat-Puffer (pH = 9,0, / = 0,05 mol/1). 75 min bei 200 V. 10 min in 0,5 g Coomassie-Brillantblau R 250 in Methanol-EssigsäureWasser (3:1:6, V:V). 3 mal in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V;V). 3 min in Diacetonalkohol-Wasser (3:7, V: V), danach auf einer Glasplatte für 15 min auf 50 °C erhitzen. Visuell. 9 - 1 3 Banden.

Elektrophorese von Harn- und Liquorproteinen Probenvolumen

Elektrophoresepuffer Dauer der Elektrophorese Färbung Entfärbung Dokumentierung

Harn: 150, 50 oder 25 (entsprechende Proteinkonzentration 0,1-1, 1-3 bzw. 3-6 g/l). Liquor: 150 (0,1-1 g/l Protein). TRIS-Taurinat-Puffer (pH = 9,0, / = 0,05 mol/1) oder TRIS-GlycinatPuffer (pH = 9,5, / = 0,025 mol/1). 2-3 h bei 240 V. 10 min in Coomassie-Brillantblau R 250 in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V). 3 mal in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:l:6, V:V). Visuell.

Enzyme, die mittels der Cellogel-Zonenelektrophorese nachgewiesen werden können, sind die alkalische Phosphatase, Lactat-Dehydrogenase, Kreatin-Kinase, LeucinAminopeptidase, Malat-Dehydrogenase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, Glucose-1-Phosphat-Uridyltransferase [10, 11]. Der Enzymnachweis sowie andere Acetylcellulose- oder Cellogel-Verfahren werden heute von der Agarosegel-Zonenelektrophorese verdrängt (Kap. 2.2).

92

2 Elektrophorese der Proteine

Problem lösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Das Abtrocknen der Folie bzw. des Streifens dauerte zu lange.

Das Trocknen verkürzen.

Vor der Elektrophorese Die Oberfläche der Acetylcellulose-Folie bzw. des Cellogel-Streifens ist fleckig.

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig Strom.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Es bestehet schlechten Kontakt zwischen den Folien bzw. Streifen und dem Elektrodenpuffer.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die Auflage der Folie bzw. des Streifens überprüfen.

Nach der Elektrophorese Es gibt keine Proteinbanden in der Folie bzw. im Streifen.

Die Proteinbanden sind sehr schwach.

Die Proteinbanden bildeten Schweife.

Die Proben aus den benachbarten Spuren liefen ineinander.

Die Proteine haben die Folie bzw. den Streifen verlassen.

Den Lauf der Farbstoffront beachten.

Das Protein präzipitierte an der Auftragsstelle. Die Proteinkonzentration war zu gering. Die Proteine in der Probe waren nicht vollständig gelöst.

Die Elektrophorese in anderem Puffer mit anderem pH-Wert laufen lassen. Die Probe konzentrieren oder größeres Volumen auftragen. Die Probe mit Ultraschall behandeln, bei Trübungen zentrifugieren. Additive verwenden, um die Proteine zu lösen. Anderen Puffer mit anderem pH-Wert

Die Proteine befanden sich an ihren pl-Werten. Die Probe enthielt zuviel Protein. Die Probe enthielt feste Bestandteile. Das Probenvolumen war zu groß.

verwenden. Kleineres Probenvolumen auftragen oder die Probe verdünnen. Vor dem Auftrag die Probe zentrifugieren. Die Proben konzentrieren und geringeres Volumen auftragen.

2. l Acetylcellulose- und Cellogel-Zonenelektrophorese der Proteine

93

Literatur [1] Wieland T, Fischer E, Natunvissenschaßen, 35, 29 (1948) [2] Cremer HD, Tiselius A, Biochem, 2320, 273 (1950) [3] Scherz H, Elektrophoresis, 11, 18 (1990) [4] Smithies O, Biochem J, 61, 629 (1955) [5] Harris H, Hopkinson DA, Handbook of Enzyme Elecirophoresis in Human Genetics, North Holland Publishing Co., Amsterdam - Oxford, American Eisevier Publishing Co., New York (1980) (6] Ferguson KA, Biochemical Systematics and Evolution, Blackie & Son, Bishopbriggs, Glasgow (1980) [7] Britton-Davidian J, Methods Enzymol, 224, 98 (1993) [8| Longsworth LG, Chem Rev, 30, 323 (1942) [9] Michov BM, Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines TRlS-Formiat-Taurinat-Puffersystems und daßir geeignete homogene Elektrophoreseplatten, Deutsches Patent, 4127546, 20.08.1991 [10] Meera Khan P,Arch Biochem Biophys, 145, 470 (1971) [11] Van Someren H, Van Henegouwen HB, Los W, Wurzer-Figurelli E, Poppel B, Verloet M, Khan PM, Humangenetik, 25, 185 (1974)

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine In Agarosegelen kann eine Zonenelektrophorese oder eine Immun- bzw. Affinitätselektrophorese durchgeführt werden. Die Agarosegel-Zonenelektrophorese [l, 2] in horizontalen Gelen ist eine Standardmethode für Proteintrennungen in der Forschung und besonders in der Diagnostik.

2.2.1 Agarosegel-Zonenelektrophorese von Serumproteinen Die Agarosegel-Zonenelektrophorese wird routinemäßig zur Trennung von Serum-, Liquor- und Urinproteinen verwendet. Dies hängt damit zusammen, daß die Agarosegele, gegenüber den Polyacrylamidgelen, auch zur Trennung von Proteinen mit sehr hohen Massen geeignet sind, daß ihre Herstellung einfacher und schneller als die der Polyacrylamidgele ist, daß sie nicht toxisch sind und daß die Trennzeiten in Agarosegelen sehr kurz sind - üblicherweise 20-40 min. Die Agarosegele werden in der Regel in einer Konzentration von 0,7-1,0 g/dl verwendet, da sie bei einer höheren Konzentration trüb werden und starke Elektroosmose zeigen. In l g/dl Agarosegelen können kugelförmige Teilchen mit Mr bis 50 l O6 getrennt werden, was einem Radius von 30 nm entspricht. Dies ist weitaus genug, da die Radien der meisten Polyionen 5-10 nm betragen. Die großen Porenradien in den Agarosegelen erlauben, neben einfachen Proteinen auch hochmolekulare Membranproteine [3] und Viren [4, 5] trennen zu können. Es sind verschiedene Puffer für die Agarosegel-Zonenelektrophorese bekannt [6]. Ein Borat-Puffer bildet mit der Agarose Komplexverbindungen, deshalb sollte er nicht eingesetzt werden. Wie bei der Acetylcellulose-Zonenelektrophorese (Kap. 2.1) wird die Agarosegel-Zonenelektrophorese am häufigsten in einem Barbitalat-Puffer (VeronalatPuffer) durchgeführt. Die Verwendung von Barbitursäure-Derivaten ist aber seit mehreren Jahren durch das Arzneimittelgesetz eingeschränkt worden [7]. Deswegen werden Puffer empfohlen, die keine Barbitursäure-Verbindungen enthalten. Ein solcher Puffer ist der TRIS-Taurinat Puffer [8], mit dem ausgezeichnete Ergebnisse erhalten werden: TRIS-Taurinat-Puffer, TRIS Taurin NaN3 Dest. Wasser ad

pH = 8,5,1 = 0,10 mol/l 34,16g 48,96 g 0,10g 1000,0 ml

Die Vorbereitung eines Agarosegels kann folgendermaßen durchgeführt werden: 1,0 g trockene Agarose wird in 100 ml Puffer suspendiert und im Mikrowellenherd bei niedrigster Stufe aufgekocht, bis sie schmilzt. Die heiße Agaroselösung wird danach auf eine Haftfolie gegossen, die sich in einer Gießkassette befindet (Kap. 1.7) oder auf einem Tisch liegt. Beim zweiten Verfahren wird der Tisch mit Hilfe einer Libelle horizontal

95

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

eingestellt, eine Haftfolie für Agarose mit der hydrophilen Seite nach oben aufgelegt und mit einem Rahmen bedeckt, und die Agaroselösung auf die Haftfolie gegossen. Die gelierten Agarosegele können anschließend in einer feuchten Kammer eines Kühlschranks aufbewahrt werden, wobei sich ihre Struktur stabilisiert (Kap. 1.7). Bei der Agarosegel-Zonenelektrophorese wirkt die Elektroosmose den wandernden Proteinen entgegen. Deshalb befinden sich nach der Elektrophorese die ct\-, 0.2- und ß-Globuline, von der Auftragsstelle her gesehen, näher an der Anode, während die -Globuline in Richtung zur Kathode zum Stillstand kommen (Kap. 2.17). Während die Elektroosmose ein störender Faktor bei den üblichen Anwendungen, z.B. bei der Serumprotein-Elektrophorese ist, stellt sie eine notwendige Voraussetzung für die Gegenstrom-Elektrophorese nach Estela-Heinrichs dar (s.u.).

Probenvorbereitung Die Serumproben werden gewöhnlich 4-fach verdünnt, indem l Volumen Serumprobe mit 3 Volumina dest. Wasser vermischt wird. Somit wird die Proteinkonzentration in den Proben auf 10-20 mg/ml eingestellt. Wenn die Konzentration des Gesamtproteins im Liquor oder Urin unter 4 mg/ml liegt, müssen die Proben konzentriert werden. Das Auftragsvolumen bei allen Proben sollte 3-5 betragen.

Elektrophoretische Trennbedingungen Die Elektrophorese wird nach folgendem Schema durchgeführt: • Das Agarosegel wird aus seiner Verpackung entnommen und seine Oberfläche mit einem Filterpapier abgetrocknet; • Eine Schablone wird auf das Gel gelegt, so daß sich ihre Schlitze 2-3 cm vor dem negativen Gelende befinden (Abb. 2.2-1). Die Schablone sollte leicht mit den Fingern gedrückt werden, um eventuelle Luftblasen zu entfernen; Agarosegel

Schablone

;·.;-."! 0

1

;' 2

· r.rn rr:; m er; rr::; rr.j ;: 3

4

5

6 7

9

10

Abb. 2.2-1 Agarosegel mit einer aufgelegten Auftragsschablone.

Schlit/e

96

2 Elektrophorese der Proteine

Auf die Schlitze trägt man mit einer automatischen Pipette jeweils 3-5 der Proben auf und läßt sie für 10 min in das Gel diffundieren. Es ist auch möglich, daß die Proben in Gelvertiefungen einpipettiert werden, falls es solche gibt. Die nicht diffundierten Proben werden mit einem Filterpapier abgetupft, danach werden die Schablone und das Filterpapier verworfen. Das Gel wird, mit der Gelseite nach unten, auf die Gelbrücke einer Trennkammer gehängt. Die Elektrodentanks der Trennkammer werden mit Elektrodenpuffer aufgefüllt und die Gelbrücke mit dem Gel in die Trennkammer gestellt. Somit bekommt das Gel einen direkten Kontakt mit dem Elektrodenpuffer (Abb. 2.2-2). Falls es keine Gelbrücke gibt, wird die Kühlplatte einer Trennkammer mit Kerosen oder Silikonöl DC 200 beschichtet und das Agarosegel mit der Haftfolie nach unten auf die Kühlplatte gelegt. Danach werden 8 Lagen Papier beiderseitig auf das Gel gelegt und in die Elektrodenpuffer eingesetzt. Die Papierelektrodenbrücke sollte mindestens l cm des Gels bedecken.

Abb. 2.2-2 Direkter Kontakt zwischen einem gebogenen Agarosegel und den Elektrodenpuffern. 1. Elektrophoretische Kammer; 2. Brücke; 3. Elektrodenpuffer; 4. Agarosegel; 5. Haftfolie.

• Die Trennkammer wird geschlossen und der Stromversorger eingeschaltet. Die Trennbedingungen hängen von der Geldicke und der lonenstärke des Puffers ab. Die Elektrophorese wird gewöhnlich im Laufe von 20-30 min bei 100 V durchgeführt. Färbung der Proteinbanden. Der Nachweis der getrennten Proteinbanden kann mit Coomassie Brillantblau R 250 oder Silber durchgeführt werden (s. auch Kap. 2.14.1 und 2.14.2). Die Coomassie-Färbung kann folgenderweise durchgeführt werden: Fixieren L Trocknen

Färben Entfärben 2. Trocknen

Das Gel mit einem Filterpapier abtrocknen und 20 min in Methanol-EssigsäureWasser (3: l :6, V: V) fixieren. 3 Lagen Filterpapier auf das Agarosegel legen und mit einer Glasplatte beschweren. Nach 10 min die Filterpapiere abnehmen und das Agarosegel im Trockenschrank trocknen. 10 min in 1,0 g/dl Coomassie-Brillantblau R-250 in Methanol-EssigsäureWasser (3:1:6, V:V). In Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V) bis der Hintergrund klar wird. Im Trockenschrank oder an der Luft.

97

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

Wenn die Coomassie-Färbung nicht ausreichend ist, kann man die getrockneten Gele zusätzlich mit Silber nachfärben [9, 10]. Somit erhöht sich die Empfindlichkeit des Proteinnachweises um das 10-100-fache: Silberfärbung Lösungen

Lösung A: 5 g/dl Lösung B. 0,2 g/dl NH4NO3, 0,2 g/dl AgNO3, 1,0 g/dl Wolframatokieselsäure und 0,5 g/dl Formaldehyd.

Sensibilisierung und Entwicklung Stoppen der Silberfärbung Trocknen

35 ml Lösung/] wird mit 65 ml Lösung B gemischt und das Agarosegel wird in die entstandene weißliche Suspension eingetaucht und geschüttelt. In 0,05 mol/1 Glycin. An der Luft.

Die Auswertung der Proteinbanden kann visuell (bei Verwendung eines Kontrollpherogramms) oder mit einem Densitometer bei 605 nm erfolgen. Bei Gebrauch eines Densitometers können die Relativkonzentrationen der Proteinbanden berechnet werden. Die Normalwerte sind in Kap. 2.1.1 angegeben. Mit der AgarosegelZonenelektrophorese werden ungefähr doppelt so viel Serumproteinfraktionen erhalten als mit der Acetylcellulose-Zonenelektrophorese (Abb. 2.2-3). Präalbumin -— Albumin -Saures Glycoprotein -Antitrypsin a-Lipoprotein a 2 -Makroglobulin a. -Antichymotrypsin Transferrin Haptoglobinc ' ß-Lipoprotein C3

Fibrinogen IgA IgM IgG

Abb. 2.2-3 Pherogramm nach einer hochauflösenden Agarosegel-Zonenelektrophorese.

Bei der Immun- bzw. Affmitätselektrophorese binden die Probenproteine ihre spezifischen Liganden, z.B. Immunglobuline, während einer Agarosegel-Zonenelektrophorese oder danach. Deswegen werden die beiden Elektrophoresetechniken als LigandenElektrophorese bezeichnet.

98

2 Elektrophorese der Proteine

2.2.2 Immunelektrophorese Die Immunelektrophorese stellt eine Kombination zwischen einer Agarosegel-Zonenelektrophorese und Antigen-Antikörper-Reaktionen dar [11, 12]. Bei einem bestimmten Antigen-Antikörper-Verhältnis bilden sich am Äquivalenzpunkt große netzförmige unlösliche Immunkomplexe (Immunpräzipitate) im Gel (Abb. 2.2-4). Sie werden als weiße Banden sichtbar. Wegen ihrer Größe bleiben die Immunpräzipitate beim Auswaschen im Gel, während die nichtpräzipitierten Proteine sich auswaschen lassen. Mit einer zusätzlichen Färbung werden somit nur die Immunpräzipitate nachgewiesen. Die Immunelektrophoresen lassen sich in unterschiedliche Methoden unterteilen: Immundiffiisions-Elektrophorese nach Grabar und Williams, Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell, Gegenstrom-Immunelektrophorese nach Estella und Heinrichs, Immunfixation, Immunprinting und 2D-Immunelektrophorese. Antikörper (Immunglobulin) Antigen

a Abb. 2.2-4 Hypothetische Struktur der löslichen Immunkomplexe (a, b) und der unlöslichen Immunkomplexe - Immunpräzipitate (c). Das Verhältnis zwischen den Molarkonzentrationen der Antikörper und Antigene ist wie folgt: bei (a) 1:2, bei (b) 1:1, bei (c) 3:1.

Immundiffusions-Elektrophorese nach Grabar und Williams Die Immundiffusions-Elektrophorese nach Grabar-Williams [13] stellt eine Kombination zwischen einer Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine (Antigene) und einer Diffusion ihrer Antikörper dar: nach der Zonenelektrophorese diffundieren die Antikörper, die in eingestanzte Rinnen eingeführt werden, gegen die Antigenbanden und bilden mit ihnen Präzipitatbogen (Abb. 2.2-5).

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

99

Antikörper

o Abb. 2.2-5 Immundiffusions-Elektrophorese nach Grabar-Williams.

Die Immundiffusions-Elektrophorese nach Grabar-Williams wird folgendermaßen durchgeführt: • Mit Hilfe einer Lochschablone werden an der Kathodenseite eines Agarosegels Löcher für die Proben ausgestanzt; • Zwischen den Löchern und parallel zu den Seitenrändern des Gels werden mit einem Skalpell Gelstreifen ausgeschnitten. Die Gelstreifen verbleiben während der Elektrophorese in den Rinnen; • Die Proben und die Kontroilösung, die Spuren vom Bromphenolblau enthalten sollten, werden in die Löcher alternativ einpipettiert und anschließend wird die Elektrophorese gestartet. Trennbedingungen bei der Grabar-Williams-Immunelektrophorese Feldstärke Temperatur Laufzeit

10 V/cm 10 °C ca. 45 min - bis Bromphenolblau den gegenüberliegenden Rand erreicht.

• Nach der Agarosegel-Zonenelektrophorese werden die Gelstreifen aus den Rinnen entfernt und eine Antikörperlösung einpipettiert. Diese läßt man 15 h bei Raumtemperatur diffundieren. Dadurch bilden sich Präzipitatbogen aus.

Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell Die Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell [14] stellt eine Zonenelektrophorese von Proteinen (Antigenen) in einem Agarosegel dar, das Antikörper in einer bestimmten Konzentration enthält. Der Puffer im Gel wird auf pH = 8,6 eingestellt, damit nur die Antigene wandern, während die meisten Antikörper sich bei diesem pH-Wert an ihren isoelektrischen Punkten befinden und sich elektrophoretisch nicht bewegen können. Zu Beginn der Rocket-Immunelektrophorese existiert ein Antigenüberschuß, der zur Bildung von löslichen Antigen-Antikörper-Komplexen führt. Im Laufe der Elektro-

100

2 Elektrophorese der Proteine

phorese binden die Antigene zusätzliche Antikörper und bilden am Äquivalenzpunkt Immunpräzipitate. Die Immunpräzipitate ähneln raketenfbrmigen Figuren, deren eingeschlossene Flächen (Höhe) proportional zu den Antigenkonzentrationen sind (Abb. 2.2-6). Zur Auswertung vermißt man lediglich ihre Höhen. Antikörper

Antigene Abb. 2.2-6 Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell.

Die Rocket-Immunelektrophorese nach Laurell wird in folgenden Schritten durchgeführt. • Beim Gießen des Agarosegels wird eine Antikörperlösung zugegeben; • Eine Lochschablone wird auf das Gel aufgelegt und Löcher für die Proben ausgestanzt; • Die Proben werden in die Löcher einpipettiert und anschließend wird die Elektrophorese gestartet. Laufbedingungen bei der Laurel-Immunelektrophorese Feldstärke Temperatur Laufzeit

10 V/cm 10 °C 3h

Gegenstrom-Immunelektrophorese nach Estela und Heinrichs Für die Gegenstrom-Immunelektrophorese nach Estela-Heinrichs [15] sind Agarosegele mit hoher Elektroosmose geeignet, die einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 enthalten. Bei diesem pH-Wert tragen die Antigene negative elektrische Ladungen, während die meisten Antikörper ungeladen sind. Die Antigene werden am kathodischen Gelende, ihre Antikörper am anodischen Gelende aufgetragen. Bei der Elektrophorese laufen die geladenen Antigene in Richtung Anode, während ihre Antikörper durch den elektroosmotischen Fluß in Richtung Kathode transportiert werden. Bei ihrem Zusammentreffen präzipitieren die Antigene und ihre Antikörper in Form von unlöslichen Immunkomplexen (Abb. 2.2-7).

101

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

Antikörper

Antigene

Elektroosmose

t

Elektrophorese

Abb. 2.2-7 Gegenstrom-lmmunelektrophorese nach Estela-Heinrichs.

Färbung nach einer Immunelektrophorese nach Grabar-Williams, Laurell und EstelaHeinrichs. Die Färbung der Immunpräzipitate nach einer Immunelektrophorese erfolgt erst, nachdem die nicht präzipitierten Antigene ausgewaschen wurden. Danach kann die Färbung nach folgendem Schema mit Coomassie Brillantblau oder Silber durchgeführt werden: Trockenpressen des Gels

Trocknen des Gels Färben und Entfärben

Das Gel wird 20 min lang zwischen Filterpapierbogen eingelegt. Der Filterpapierbogen auf dem Agarosegel sollte in physiologischer Kochsalzlösung (0,9 g/dl NaCl) angefeuchtet sein mit einer Glasplatte bedeckt und schließlich beschwert werden. Zwischen trockenen Filterpapierbogen. S.u.

Immunfixation Bei der Immunfixation (Immunfixations-Elektrophorese) [16, 17] werden die Antikörper nach einer Agarosegel-Zonenelektrophorese auf die Geloberfläche aufgetragen. Danach werden die löslichen Proteine mit physiologischer Lösung abgewaschen und nur jene Proteinbanden gefärbt, die mit den Antikörpern Immunpräzipitate gebildet haben. Die Immunfixation wird nach folgendem Schema durchgeführt: Probenvorbereitung • Die Serumproben mit Puffer verdünnen: 1:4 (somit wird die Proteinkonzentration auf 10-20 mg/ml eingestellt) für die Serumprotein-Elektrophorese (SPE-Referenz) an der 1. Position, und 1:10 für die Immunfixations-Elektrophorese (IFE) an den 2. bis 6. Positionen (Abb. 2.2-8). Frisch gewonnenes Serum ist zu bevorzugen, das Serum kann aber auch bei 2-8 °C bis zu 72 Stunden aufbewahrt werden. • Die Urinproben auf 8-10 mg/ml konzentrieren, danach die SPE-Referenz sowie die anderen Proben unverdünnt auftragen. • Die Liquorproben auf 1-2 mg/ml konzentrieren, danach die SPE-Referenz sowie die anderen Proben ebenso unverdünnt auftragen.

102

2 Elektrophorese der Proteine

SPE

IgG

IgA

IgM

Abb. 2.2-8 Auflegen der Applikationsschablone.

Probenapplikation • Die Oberfläche eines Agarosegels mit einem Filterpapier abtrocknen. • Eine Applikationsschablone in der Position beider Justierungszeiger auf das Gel auflegen (Abb. 2.2-8) und vorsichtig gegen die Geloberfläche andrücken, um die Luftblasen zu entfernen. • Je 3 bis 5 der Proben auf die SPE- und IFE-Positionen auftragen. • 5 min abwarten, bis die Proben in das Gel diffundieren. • Die überschüssigen Probenvolumina mit Filterpapier abtupfen, danach das Papier und die Applikationsschablone vom Gel entfernen. Elektrophorese • Das Gel, mit der Gelseite nach unten, auf die Gelbrücke einer Trennkammer hängen. • Die Tanks der Trennkammer mit dem gebrauchsfertigen Elektrodenpuffer auffüllen und die Gelbrücke mit dem Gel in die Trennkammer stellen. Damit tritt das Gel in direkten Kontakt zu dem Elektrodenpuffer. • Die Trennkammer mit dem Deckel schließen und den Stromversorger einschalten. • Die Elektrophorese bei konstantem elektrischem Strom und Raumtemperatur nach folgendem Elektrophoreseprogramm durchführen: Gelmaße (mm)

80 (77, 85)

100

Strom (mA)

Spannung (V)

Trenndauer (min)

15-30

80-100

40

Immunpräzipitation • Nach der Elektrophorese die Oberfläche des Agarosegels mit einem Filterpapier abtrocknen. • Eine Antiserumschablone nach den vier Punkten auf dem Gel justieren und vorsichtig gegen die Geloberfläche andrücken (Abb. 2.2-9).

103

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

··

•@

1

1 2

Gel

»

1 2

3 4

3 4 5 6 7

5 6 7

SPE

• ^> V^>

l

II

IgG

[gA

IgM

K

*

...

Abb. 2.2-9 Justierung der Antiserumschablone.

• 80 Fixierlösung (Methanol-Essigsäure-Wasser, 3:1:6, V.V) in die SPE-Rinne geben. • 80 des entsprechenden Antiserums (G, A, M, und ) in die restlichen Rinnen geben (Die Oberfläche des Gels mit der Pipettenspitze nicht berühren!). • Das Gel mit den Antiseren für 30 min bei Raumtemperatur auf einem befeuchteten Filterpapier inkubieren. • Nach der Inkubation die Antiserumschablone entfernen und die Geloberfläche mit einem Filterpapier abtrocknen. • Das Gel 2 mal jeweils 15-20 min trockenpressen: mit einem in physiologischer Lösung (0,9 g/dl NaCl) angefeuchten Filterpapier bedecken, trockene Filterpapiere und eine Glasplatte darauflegen und beschweren (Abb. 2.2-10). • Das Gel in einem Trockner oder an der Luft trocknen.

Obere Glasplatte Trockene Filterpapiere Filterpapier mit Kochsalzlösung Agarosegel Haftfolie Untere Glasplatte

Abb. 2.2-10 Trockenpreßverfahren.

104

2 Elektrophorese der Proteine

Färbung der Proteinbanden • Das Gel 10 min in einer Mischung aus gleichen Volumina von 1,0 g/l CoomassieBrillantblau R 250 in Methanol-Wasser (6:4, V:V) und 20 ml/dl Essigsäure färben. • 2-3 mal je 2-3 min in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V'.V) entfärben, bis der Hintergrund klar wird. • Im Trockenschrank trocknen. Auswertung Die Auswertung wird durch Vergleich der Präzipitationsbanden in den IFE-Positionen mit den Proteinbanden in der SPE-Referenz durchgeführt. Die untere Nachweisgrenze für monoklonales IgG, IgA, IgM und -Ketten liegt bei 0,5 bis 1,5 mg/ml, und für -Ketten bei 1-2 mg/ml. Proben mit hohem Titer von Rheumatoid-Faktor oder anderen Immunkomplexen können Präzipitationsbanden noch nach der Zentrifugation zeigen.

Immunprinting Beim Immunprinting [18] wird zuerst eine Agarosegel-Zonenelektrophorese von Antigenen (Proteinen) durchgeführt und danach wird auf das Gel ein Antikörper-haltiges Agarosegel oder eine Antikörper-haltige Acetylcellulose-Folie aufgelegt. Die getrennten Antigene, die in der Regel relativ klein sind, diffundieren zu den Antikörper-haltigen Trägern und bilden dort Immunpräzipitate.

2D-Immunelektrophorese Bei der 2D-Immunelektrophorese werden die Antigene (Proteine) zuerst in einem Agarosegel getrennt. Danach wird vom Gel ein Streifen mit den Antigenbanden abgeschnitten und auf ein zweites Agarosegel gelegt, das Antikörper gegen die getrennten Antikörper enthält. Nun werden die Antigene in einer zweiten Richtung getrennt, die senkrecht zur ersten Wanderungsrichtung ist. Dadurch bildet jede Antigenbande eine Präzipitatfläche, die zur Antigenmenge proportional ist (Abb. 2.2-11). Die 2D-Immunelektrophorese kann auch in Acetylcellulose-Folien durchgeführt werden (Kap. 2.1).

t Abb. 2.2-11 2D-Immunelektrophorese. 1. Agarosegel-Streifen mit Proteinbanden nach der Elektrophorese in der ersten Dimension; 2. Präzipitatsflächen nach der Elektrophorese in der zweiten Dimension.

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

Die 2D-Immunelektrophorese der Serumproteine wird nach folgendem durchgeführt: Probenvolumen Elektrophoresepuffer Dauer der Elektrophorese in der l. Dimension

Dauer der Elektrophorese in der 2. Dimension Färbung Entfärbung Trocknen

105

Schema

0,5 Serum, das Bromphenolblau enthält. TRIS-Taurinat-Puffer, pH = 9,0. 60 min bei 200 V. Nach der l D-Elektrophorese einen Gelstreifen abschneiden, um 90° drehen, auf die Oberfläche eines neuen Agarosegels mit Antikörpern legen und die 2. Dimension der Elektrophorese durchführen. 12-15 h bei 120 V. Das Agarosegel 10 min in 0,9 g/dl NaCl waschen, zweimal je 10 min trockenpressen und 10 min mit Coomassie-Brillantblau R 250 färben. 1-2 mal in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V). Im Trockenschrank oder an der Luft.

2.2.3 Affinitätselektrophorese Die Affmitätselektrophorese [19, 20] ist eine Zonenelektrophorese in einem Gel, üblicherweise Agarosegel, seltener Polyacrylamidgel, das spezifische biologische Makromoleküle (Liganden) enthält. Die Affinitätselektrophorese geht auf die Affinitätschromatographie zurück, die Liganden hier sind aber gewöhnlich nicht an die Matrize gebunden. Die Affinitätselektrophorese erlaubt, gegenüber der Affinitätschromatographie, daß mehrere Proben gleichzeitig getestet werden können und daß der Nachweis schneller durchgeführt wird [21]. Kommt es zu einer spezifischen Wechselwirkung, binden die Liganden bestimmte wandernde Polyionen, wodurch sich Komplexe im Gel bilden, während die ungebundenen Polyionen weiter wandern. Die Komplexe bilden spezifische Banden (Präzipitate), die später gefärbt werden können. Solche Wechselbeziehungen gibt es z.B. zwischen Enzymen und ihren Substraten oder Inhibitoren, bzw. Cosubstraten oder Cosubstratanalogen, zwischen Antikörpern und Antigenen, zwischen Lectinen und Kohlenhydraten sowie Nukleinsäuren. Die Immunelektrophorese kann auch als eine Art der Affinitätselektrophorese betrachtet werden. Die Affinitätselektrophorese eignet sich insbesondere für die Untersuchung der Isoenzyme, z.B. der Lactat-Dehydrogenase [22], Alkohol-Dehydrogenase [23] und des Plasminogens [24]. Eine verbreitete Anwendung der Affinitätselektrophorese sind die Isoenzyme der alkalischen Phosphatase: Bei der einfachen Agarosegel-Zonenelektrophorese laufen die Leber- und Knochen-Isoenzyme als eine Bande (Fraktion). In einem Agarosegel mit Weizenkeimlectin aber wird das Knochen-Isoenzym, ein Glykoprotein, vom Lectin unmittelbar vor der Applikationsstelle gebunden, wo sich eine zahnfbrmige Bande bildet, während das Leber-Isoenzym ungestört weiter zur Anode wandert (Kap. 2.17).

106

2 Elektrophorese der Proteine

Problem lösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Agarose-Konzentration war zu niedrig. Die Gelierzeit war zu kurz.

Die Agarose-Konzentration erhöhen.

Vor der Elektrophorese Die Konsistenz des Agarosegels ist zu weich.

Es gibt Luftblasen im Agarosegel.

Das Gel löst sich von der Haßfolie und haftet an der Glasplatte.

Die Glasplatte oder die Haftfolie waren unsauber.

Die Glasplatten oder die Agaroselösung waren zu kalt - die Agaroselösung erstarrte beim Gießen. Eine falsche Haftfolie wurde verwendet. Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen. Die Glasplatte war zu hydrophil.

Die Gelierzeit muß mindestens 60 min bei Zimmertemperatur oder besser über Nacht bei 4 °C dauern. Vor der Benutzung die Glasplatte gründlich waschen. Die hydrophile Seite der Haftfolie nicht mit den Fingern berühren. Die Glasplatten auf 60-70 °C vorheizen, die Temperatur der Agaroselösung kontrollieren. Die Haftfolien für Polyacrylamid- und Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen, vorher die Seiten mit Wasser überprüfen. Vor dem Gießen die Glasplatte mit Repel-Silan behandeln.

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig Strom. Das Gel "dampft" (der Deckel der Trennkammer wird mit Kondenswasser bedeckt).

Eine der Stromverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Die elektrische Spannung ist zu hoch.

Die Kühlung ist ungenügend.

Das Gel "schwitzt" (wird während der Elektrophorese mit Wassertropfen bedeckt).

Die Geloberfläche wurde nicht abgetrocknet.

Es gibt starke Elektroosmose.

Alle Stromverbindungen überprüfen.

Die elektrische Spannung reduzieren.

Die Kühltemperatur überprüfen. Die Kühlblöcke sollen aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein. Vor der Elektrophorese die Geloberfläche mit Filterpapier abtrocknen.

Zum Agarosegel 20 g/dl Glycerin oder 10 g/dl Sorbit zufügen.

107

2.2 Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Das Gel funkt und brennt.

Es gibt dünne Stellen im Gel; die Haftfolie lag beim Gelgießen nicht fest auf der Glasplatte. Schlechter Kontakt zwischen dem Gel und den Elektrodenbrücken.

Die Haftfolie an der Glasplatte der Gießkassette festwalzen.

Die Elektrodenbrücken parallel zu den Gelrändern auflegen und mit einer Glasplatte beschweren.

Nach der Elektrophorese Es gibt keine Proteinbanden im Gel. Die Proteinbanden sind sehr schwach.

Die Proteinbanden sind unscharf oder ziehen Schweife nach sich.

Die Proteine haben das Gel bereits verlassen. Die Proteinkonzentration oder das Probenvolumen waren zu gering. Die Probe war nicht vollständig gelöst. Festbestandteile in der Probe.

Die Probe enthielt zu viel Protein. Es gab Diffusion. Die benachbarten Proben laufen ineinander.

Das Probenvolumen war zu groß. Die Auftragsschablone lag nicht dicht auf dem Gel.

Den Lauf der Farbstoffront beachten. Die Proben konzentrieren, mehr und in schmaler Spur auftragen. Die Probe mit Ultraschall behandeln, bei Trübungen zentrifugieren. Vor dem Auftragen die Probe zentrifugieren. Das Auftragsvolumen reduzieren oder die Probe verdünnen. Nach der Fixierung der Proteine das Agarosegel trocknen, dann färben. Die Proben konzentrieren und geringere Volumina auftragen. Nach dem Auflegen die Auftragsschablone leicht an das Gel andrücken, um keine Luftblasen zwischen der Schablone und dem Gel zuzulassen.

Literatur [1] Hjerten S, Biochim BiophysActa, 53, 514 (1961) [2] Hjerten S, Biochim BiophysActa, 62, 445 (1962) [3] Johansson KE, Blomquist J, Hjerten S,JBiol Chem, 250, 2463 (1975) [4] Serwer P, Allen JC, Hayes SJ, Electrophoresis, 4, 232 (1983) [5] Serwer P, Moreno ET, Hayes JI, Berger P, Langham M, Toler RW, Electrophoresis, 5, 202 (1984) [6] BuzasZ, Chrambach A, Electrophoresis, 3, 121 (1982)

108

2 Elektrophorese der Proteine

[7) Susann J, The Valley of the Dolls, Corgi Publ, London (1966) [8] Michov BM, Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystems und dafür geeignete homogene Elektrophoreseplatten, Deutsches Patent, 4127546, 20.08.1991 [9] Budowle B, Electrophoresis, 5, 174 (1984) [10] Willoughby EW, Lambert A, Anal Biochem, 130, 353 (1983) [11] Clarke MHG, Freeman T, Clin Sei, 35, 405 (1968) [12] Axelsen NH, Kroll J, Wecke D, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis. Methods and Applications, Blackwell Scientific Publications, Oxford - London - Edinburgh - Melbourne (1973) [13] GrabarP, Williams CA, Biochim BiophysActa, 10, 193 (1953) [14] Laurell CB, Anal Biochem, 15, 45 (1966) [15] Estela LA, Heinrichs TF, Am J Clin Path, 70, 239 (1978) [16] Wilson A"T,J Immunol, 92, 431 (1964) [17] Alfonso E, Clin ChimActa, 10, 114 (1964) [18] Cotton RGH, Milstein C, J Chromat, 86, 219 (1973) [19] Takeo K, Fugimoto M, Suzuno R, Kuwahara A, Physicochem Biol, 22, 139 (1978) [20] Takeo K, Electrophoresis, S, 187 (1984) [21] Rothe GM, Maurer WD, in Gel Electrophoresis of Proteins, Dunn, MJ (Hrsg.), Wright, Bristol, S. 37 (1986) [22] Mosbach K, in Methods in Enzymology, Jakoby WD, Wilchek M (Hrsg.), Academic Press, New York, Bd. 24, Part B, S. 595 (1974) [23] Andersson L, Jörnvall H, Akeson A, Mosbach K, Biochim BiophysActa, 364, l (1974) [24] Castellino FJ, Sodetz JM, Sietring GE, in Isozymes, Markert CL (Hrsg.), Academic Press, New York, Bd. l, S. 245 (1975)

2.3 PolyacrylamidgelZonenelektrophorese der Proteine Die Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese wird in homogenen oder in Gradientengelen durchgeführt, die horizontal oder vertikal orientiert werden können. Die VertikalgelZonenelektrophorese kann in Flachgelen, z.B. mit Maßen von 80 80 0,8-2,0 mm, oder Rundgelen durchgeführt werden, die einem kurzen Bleistift ähneln, während die Horizontalgel-Zonenelektrophorese nur in Flachgelen stattfindet. Bei der Vertikalelektrophorese werden die Gele zusammen mit den Gießkassetten bzw. Gießröhrchen in die Kammern eingesetzt. Während der Elektrophorese haben sie einen unmittelbaren Kontakt zu den beiden Puffern, was den Gebrauch von Elektrodenbrücken überflüssig macht. Bei den Flachgelen werden Proben unter den oberen Elektrodenpuffer in Vertiefungen auf dem Polyacrylamidgel pipettiert. Die Vertiefungen werden während des Polymerisationsprozesses durch einen Kamm zwischen den Glasplatten geformt. Die Proben sollen 10-20 g/dl Glycerin oder Saccharose enthalten, um nicht im Elektrodenpuffer zu diffundieren. Die Gele für die Horizontalelektrophorese werden üblicherweise auf einer Haftfolie aufpolymerisiert. Die Proben werden mit Hilfe von Silikongummischablonen direkt auf die Geloberfläche oder in entsprechenden Geltaschen aufgetragen. Die Horizontalelektrophorese in dünnen homogenen oder Gradientengelen, die auf Haftfolien aufpolymerisiert sind, hat sich durchgesetzt, weil sie über viele Vorteile gegenüber der Vertikalelektrophorese verfugt [1]: einfache Handhabung während der Elektrophorese, Verwendung von PufFerelektrodenstreifen, Gebrauch von geringen Probenvolumina, gute Kühlung der Gele, schnelle Färbung der getrennten Banden und Automat!sierbarkeit (Kap. 1.7).

Probenvorbereitung Die Proben für die Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese müssen den gleichen Puffer enthalten, der die Puffertanks erfüllt. Außerdem muß ihre lonenstärke der des Trennpuffers entsprechen. Falls sie wesentlich niedriger als die des Trennpuffers ist, verteilt sich die elektrische Spannung diskontinuierlich, wobei sie höhere Werte zwischen den beiden Seiten der aufgetragenen Probe erreicht. Dies führt zur Temperaturerhöhung im Bereich der Probe, wodurch die Proteine denaturieren können. Folglich kann sich eine falsche Bande an der Auftragsstelle bilden. Bei der Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese in alkalischen Puffern wird Bromphenolblau zu den Proben gegeben, bei der Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese in sauren Puffern Fuchsinrot. In der Regel sollte die Elektrophorese erst beendet werden, nachdem der Farbstoffront das gegenüberliegende Gelende erreicht hat.

110

2.3.l

2 Elektrophorese der Proteine

Homogengel-Zonenelektrophorese

Die Verbindung zwischen dem Elektrodenpuffer in den Elektrodentanks und dem Polyacrylamidgel kann über Filterpapierbrücken erfolgen, die mit dem Elektrodenpuffer getränkt sind (Abb. 2.3-1). 4 3 2 l

Abb. 2.3-1 Filterpapierbrücken als Verbindung zwischen einem Gel und einem Elektrodenpuffer. 1. Trennkammer; 2. Filterpapierbrücke; 3. Kühlblock; 4. Gel.

Um auszuschließen, daß Verunreinigungen aus dem Papier in das Gel gelangen, kann eine Vorelektrophorese zur Papierreinigung durchgeführt werden: Das Filterpapier wird im Elektrodenpuffer getränkt, auf den Kühlblock der Trennkammer aufgelegt und 1-2 Stunden lang einer Elektrophorese unterworfen. Bei der Gel-Elektrophorese ist darauf zu achten, daß die Kanten der Filterpapierbrücken in l cm breiten Kontaktflächen auf den Gelenden und parallel zueinander und zu den Proben-Vertiefungen aufgelegt werden. Eine Alternative besteht darin, anstelle der Papierelektrodenbrücken Elektrodenstreifen zu verwenden. Sie enthalten den ganzen Elektrodenpuffer in einem Gel (Polyacrylamidgel oder Agarosegel) oder einem Filterpapier. In diesem Fall, der ein Trend in der modernen Elektrophorese ist (Kap. 4.2), werden die Elektroden direkt auf die Elektrodenstreifen gelegt (Abb. 2.3-2). Die Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese kann in alkalischen sowie in sauren Puffern durchgeführt werden (Kap. 1.2.3). In alkalischen Puffern wandern die Proteine zur Anode, da sie negativ geladen sind; in sauren Puffern zur Kathode, da sie positive Ladungen tragen. Die Probe wird dementsprechend auf die Kathoden- bzw. Anodenseite des Gels aufgetragen. Die Konzentration des Elektrodenpuffers kann der des Trennpuffers entsprechen, aber auch ein mehrfaches betragen.

111

2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine

5 4 3 2 l

Abb. 2.3-2 Elektrodenstreifen als Verbindung zwischen dem Gel und den Elektroden. 1. Trennkammer; 2. Elektrodenstreifen; 3. K hlblock; 4. Gel; 5. Elektrode.

Die Herstellung der Polyacrylamidgele unterschiedlicher Konzentrationen f r die Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese ist in Tab. 2.3-1 angegeben. Tab. 2.3-1 Rezepturen f r die Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese in d nnen Homogengelen mit unterschiedlichen Polyacrylamid-Konzentrationen T, aber gleichen Ma en (120 χ 250 χ 0,5 mm). L sungen Puffer-Gel-System

Konzentrationen

= 5g/dl

T = 12,5 g/dl

T = 20 g/dl

0,2 mol/1

4,0ml

4,0ml

4,0ml

0,375 mol/1

4,0ml

4,0ml

4,0ml

7*= 5 g/dl

1,6ml

ir saure Proteine

TRIS-Glycinat Puffer, 4x (0,8 mol/1, pH = 8,3) oder TRIS-Chlorid-Puffer, 4x (1,5 mol/1, pH = 8,8) Monomerl sung (T = 50 g/dl, C = 0,03)

T =12,5 g/dl

87 % Glycerin 10 ml/dl TMEDA 10 g/dl APS Dest. Wasser ad 16,0 ml

T =20 g/dl 0,2 mol/1 0,4 mmol/1 0,2-0,1 5 mmol/1

4,0ml

2,8ml 73,6 μΐ 73,6 μΐ 7,5ml

2,8ml 73,6 μΐ 73,6 μΐ 5,1 ml

6,4ml 2,8ml 73,6 μΐ 55,2 μΐ 2,7ml

112

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.3-1. (Fortsetzung). Lösungen

Konzentrationen

T = 5 g/dl

T = 12,5 g/dl

T = 20 g/dl

Puffer-Gel-System för alkalische Proteine Acetat-Puffer, 4x (0,8 mol/1, pH = 4,7) Monomerlösung (T = 50 g/dl, C = 0,03)

0,2 mol/1

4,0 ml

T = 5 g/dl

1,6ml

T =12,5 g/dl

87 % Glycerin 10 ml/dl TMEDA 10 g/dl APS Dest. Wasser ad 16,0 ml

T = 20 g/dl 0,2 mol/1 0,4 mmol/1 0,2-0,15 mmol/1

4,0 ml

4,0 ml

4,0ml

2,8 ml 73,6 73,6 7,5 ml

2,8 ml 73,6 73,6 5,1 ml

6,4ml 2,8 ml 73,6 55,2 2,7 ml

Die elektrophoretischen Bedingungen hängen von der Pufferzusammensetzung sowie von der Dicke der Gele ab. Die Spannung sollte in der Regel zwischen 200 und 500 V betragen und sich während der Elektrophorese nicht ändern. Dies ist gewährleistet, wenn die Kapazität des Elektrophoresepuffers ausreichend ist. Als Kühltemperatur wird 10 °C empfohlen. Wenn es erforderlich ist, können die Gele bis auf 2-3 °C gekühlt werden. Für Proteine mit sehr hohen Molekülmassen (größer als 15-104) sind die Polyacrylamidgele meist zu restriktiv, deswegen wandern die Proteine zu langsam oder überhaupt nicht. In solchen Fällen sollte man Agarosegele verwenden.

2.3.2 Gradientengel-Zonenelektrophorese Die Gradientengel-Zonenelektrophorese wird oft als Elektrophorese nach MargolisKenrick [2] bezeichnet. Sie wird in Gradienten-Polyacrylamidgelen durchgeführt und zur Ermittlung von Molekülradien der nativen Proteine eingesetzt [3]. Dies wird durch Vergleich zwischen den Geschwindigkeiten der getesteten Proteine und denen der Proteine mit bekannten Radien (Eichproteinen) erreicht. Das Gradientengel hat gewöhnlich eine Konzentration von T = 4-30 g/dl (0,5-4,22 mol/1). Das Gel und die Elektrodentanks enthalten den gleichen Puffer. Die Auflösung ist hoch, aber die Trennung dauert ziemlich lange. Nebenbei treten Schwierigkeiten beim Behandeln des Gels auf- es deformiert sich beim Trocknen.

Effekt des Molekülsiebes Das "Durchsieben" der Polyionen mittel eines Trägers wird als Effekt des Molekülsiebes bezeichnet [4, 5]. Er erlaubt die Auftrennung von Polyionen mit gleichen effektiven Ladungen aber unterschiedlichen Volumina und Konformationen und erhöht damit die elektrophoretische Auflösung.

2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine

113

Der Siebeffekt wird auch bei homogenen Polyacrylamidgelen beobachtet, ist aber viel stärker in Polyacrylamidgelen mit steigender Konzentration, d.h. in Gradientengelen, vertreten [6, 7]. Wegen des Siebeffektes bewegen sich die größeren Polyionen mit niedrigeren Geschwindigkeiten, und umgekehrt. In Gradientengelen wandern die Proteine so weit, bis sie, entsprechend ihren Molekülvolumina an bestimmten Stellen im enger werdenden Polyacrylamid-Netzwerk stecken bleiben, so daß sich Banden gleicher Molekülvolumina ergeben. Auf diese Weise wirken die Gradientengele der Diffusion entgegen. Margolis und Kenrick benutzen TRIS-Borat-EDTA-Puffer mit pH = 8,3 in den Gradienten-Polyacrylamidgelen sowie in den Elektrodentanks. Diese Art der Elektrophorese kann auch in TRIS-Glycinat-, Natrium-Barbitalat- sowie in anderen Puffern durchgeführt werden (Kap. 1.2.3). In Tab. 2.3-2 sind manche Rezepturen zur Herstellung von Gradientengelen angegeben. Tab. 2.3-2 Rezepturen für die Zonenelektrophorese in dünnen Gradientengelen mit T = 4-20 g/dl und Maßen von 120 250 0,5 mm. Lösungen

Konzentration

Reservoir (7 ml Mischung)

Mischkammer (10 ml Mischung)

0,2 mol/1

1,8 ml

2,5 ml

0,375 mol/1

1,8ml

2,5ml

Reservoir (T = 20 g/dl) Mischkammer ( = 4 g/dl) Reservoir (0 mol/1) Mischkammer (0,2 mol/1) 0,4 mmol/1 0,2-0,15 mmol/1

2,8 ml

Puffer-Gel-System für saure Proteine TRIS-Glycinat Puffer, 4x (0,8 mol/1, pH = 8,8) oder TRIS-Chlorid-Puffer, 4x (1,5 mol/1, pH = 8,8) Monomerlösung (T = 50 g/dl, C = 0,03)

87 % Glycerin

10 ml/dl TMEDA 10 g/dl APS Dest. Wasser

0,8 ml

1,7 ml 73,6 73,6 0,5 ml

73,6 55,2 2,9 ml

2 Elektrophorese der Proteine

114

Tab. 2.3-2

(Fortsetzung).

L sungen

Konzentration

Reservoir (7 ml Mischung)

Mischkammer (10 ml Mischung)

0,2 mol/1

1,8ml

2,5ml

Reservoir (7·= 20 g/dl) Mischkammer (T1 =4 g/dl)

2,8ml

Reservoir (0 mol/1) Mischkammer (0,2 mol/1) 0,4 mmol/1 0,2-0,15 mmol/1

-

Puffer-Gel-System f r alkalische Proteine Acetat-Puffer, 4x (0,8 mol/1, pH = 4,7) Monomerl sung (T =50 g/dl, C = 0,03)

87 % Glycerin

10 ml/dl TMEDA 10 g/dl APS Dest. Wasser

0,8ml

3,3ml

73,6 μΐ 73,6 μΐ 2,3ml

73,6 μΐ 55,2 μΐ 3,3ml

Die Abb. 2.3-3 zeigt die Margolis-Kenrick-Elektrophorese in zwei Gradientengelen. T, g/dl

a

b

20

15

a / 10

0

0,25

0,50

0,75

1,00 Relative Distanz

Abb. 2.3-3 Proteine, getrennt in einem linearen (a) und einem exponentiellen (b) Gradienten. Die Konzentration vom Polyacrylamidgel Γ ist 5-20 g/dl.

Die getrennten Banden k nnen im Trennmedium durch F rben, Enzym-SubstratReaktionen, Immunpr zipitation, Autoradiographie und Fluorographie, oder au erhalb des Trennmediums durch Blotting-Methoden oder Immunprinting nachgewiesen werden.

115

2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine

2.3.3 Ermittlung der Radien und Massen von nativen Proteinen Die maximale Wanderungsstrecke smax eines Proteins in einem Gel wird mit seinem Radius r ber die Gleichung In r = -a

In smax + In b,

(2.3-1)

verkn pft, wobei α und b Konstante sind. Dieser Gleichung entsprechend erh lt man eine Eichgerade beim Auftragen des Logarithmus der maximalen Wanderungsstrecke des Proteins gegen den Logarithmus seines Radius. Um die maximale Wanderungsstrecke zu ermitteln, ist es n tig, da lineare Gradientengele mit T = 3-30 g/dl mit konstanter Konzentration des Vernetzers (BIS) ber das gesamte Gel konstant verwendet werden. Nach einer einfachen Gleichung [8] wird die Wanderungsstrecke s (in mm) eines Proteins zweimal logarithmiert [In (In s)] und gegen die Kehrwerte aus den Quadratwurzeln der dazugeh rigen Zeiten l / V / (/ in h) aufgetragen, woraus sich Geraden ergeben. Der Schnittpunkt (Achsenabschnitt) einer Geraden mit der Ordinatenachse gibt die maximale Wanderungsstrecke an, wenn t —» oo (Abb. 2.3-4). Die Gleichung lautet: In (In s) = -m—f= + [In (In s)] max

(2.3-2)

V/

wobei m die Steigung der Geraden und [In (In s)]max die Ordinate ist. In (Ins) 1,5

1,0

OVA RSA LDH ΚΑΤ

0,5

PER

0

-0,5

JHY

ο

0,5

1,0

l A/T

Abb. 2.3-4 Bestimmung der maximalen Wanderungsstrecke von Proteinen in linearen GradientenPolyacrylamidgelen durch Auftragen der doppelt logarithmierten Wanderungsstrecken gegen ι/^7. OVA - Ovalbumin; RSA - Rinderserumalbumin; LDH - Lactat-Dehydrogenase; ΚΑΤ - Katalase; PER Ferritin; THY - Thyreoglobulin.

Der Radius r eines globul ren Proteins ist mit seiner relativen Molek lmasse Μτ ber die Gleichung r = εΜΤ 1/3

(2.3-3)

116

2 Elektrophorese der Proteine

verknüpft, wobei die Gerade

eine Konstante ist. Aus dieser Gleichung und Gl. (2.3-1) ergibt sich

In Mr = - c · In smax + In ,

(2.3-4)

wobei c = 3« und = (i/ )3 sind [9]. Man erhält eine Gerade, wenn der Logarithmus der maximalen Wanderungsstrecke der Eichproteine gegen den Logarithmus ihrer Molekülmasse aufgetragen wird. Aus der Eichgeraden und der maximalen Wanderungsstrecke kann man die relative Molekülmasse eines Proteins berechnen (Abb. 2.3-5). In 5

mal

5,0 '

4,5 4,0 3,5 3,0

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0 In M

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

In r

Abb. 2.3-5 Eichgeraden zur Bestimmung des Radius bzw. der relativen Molekülmasse von Kohlensaure-Anhydratase aus Säugetiererythrozyten.

In der Praxis verläuft die Ermittlung der Masse eines Proteins in zwei Schritten [10]. Im ersten Schritt wird durch den Bezug zwischen der Wanderungsstrecke eines Proteins und seiner Trenndauer seine maximale Wanderungsstrecke berechnet. Im zweiten Schritt werden die maximalen Wanderungsstrecken der Eichproteine in Bezug zu ihrem Volumen gesetzt (Eichgerade). Aus der maximalen Wanderungsstrecke und der Eichgerade wird abschließend die relative Molekülmasse sowie der Radius des Proteins berechnet (Tab. 2.3-4). Tab. 2.3-4 Elektrophoretisch bestimmte relative Molekülmassen A/r, Radien r und Reibungskoeffizienten/^ von unterschiedlichen Proteinen [11). Proteine Ribonuklease Cytochrom c Lysozym Trypsin Myoglobin vorn Pferdeherz a-Chymotrypsinogen Trypsinogen Carboxypeptidase B vom Schwein

12640 12670 13900 15 100 16890 12825 23560 34280

r, nm

flfo

1,64 1,70 1,91 1,96 1,86 2,09 2,20 2,63

1,08 1,11 1,22 1,21 1,11 1,12 1,22 1,24

117

2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine Tab. 2.3-4 (Fortsetzung). r, nm

Proteine ß-Lactoglobulin Concanavalin B der Pferdebohne Ovalbumin a-Amylase Präalbumin (Transthyretin) Rinderserumalbumin Hämoglobin Serumalbumin vom Menschen Alkohol-Dehydrogenase aus der Leber Transferrin vom Menschen Lactat-Dehydrogenase vom Schwein Phosphoglycerat-Mutase von Hefe Alkohol-Dehydrogenase von Hefe ß-Amylase Ceruloplasmin vom Menschen Aldolase Phosphorylase a Fumarat-Hydratase vom Schwein Glycerin-Kinase Adenylat-Desaminase Cytochrom c vom Rinderherz Apoferritin Urease ß-Galactosidase Hämocyanin vom Tintenfisch a2-Makroglobulin vom Menschen Glutamat-Dehydrogenase ß-Lipoprotein vom Menschen Hämocyanin von Helix pomatia Hämocyanin von Paludia vivipara

35830 42470 43500 48580 61000 66200 67360 69000 80050 81000 109000 112000 150000 152000 152000 164500 200000 204000 251000 320000 370500 473 450 478600 518 150 611 800 797 750 1 007000 2 663 000 4310000 8 699 000

2,73 2,90 3,05 3,17 3,36 3,53 3,13 3,50 3,50 3,67 3,60 4,05 4,58 4,97 4,42 4,81 5,15 5,47 5,10 5,70 6,50 7,40 6,15 6,90 7,65 9,60 8,40 12,40 15,20 30,20

1,26 ,26 ,32 ,32 ,29 ,32 ,16 ,29 ,23 ,28 ,14 ,27 ,31 ,42 1,25 ,33 ,34 ,40 ,23 ,27 1 ,38 1 ,40 ,19 ,30 ,36 ,56 1 ,27 ] ,36 1 ,41 ] ,50

2.3.4 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese von ladungsund massenisomeren Proteinen Ladungsisomere bzw. massenisomere Proteine sind solche Proteine, die bei unterschiedlichen Massen gleiche Nettoladung bzw. bei gleichen Massen unterschiedliche Nettoladung aufweisen [12]. Die ladungsisomeren Proteine wandern bei der GradientengelZonenelektrophorese zunächst gleich schnell (T < 5 g/dl) dann bilden sie zwei oder mehrere Banden. Die Aufspaltung einer zunächst einheitlichen Bande kann jedoch auch dadurch begründet sein, daß die Moleküle die gleiche Masse haben, sich aber in ihrer Konformation unterscheiden. Die massenisomeren Proteine wandern zu Beginn mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, da bei geringen Gelkonzentrationen die Wanderungsgeschwindigkeit nur durch die Nettoladung der Proteine bestimmt wird. Die Wanderungsgeschwindigkeit aller massen-

118

2 Elektrophorese der Proteine

isomeren Moleküle wird jedoch bei derselben Gel-Konzentration Null, d.h. sie alle streben mit unterschiedlicher Geschwindigkeit der gleichen limitierenden GelKonzentration zu. Die Unterscheidung von ladungs- bzw. massenisomeren Isoenzymen erfolgt über die Bestimmung ihrer Wanderungsgeschwindigkeiten in verschieden konzentrierten Polyacrylamidgelen. Das Verfahren ist allerdings auf Gelkonzentrationen von T< 12 g/dl begrenzt. Man bestimmt den Logarithmus der Proteinmobilität in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit des Bromphenolblau. Dieser Wert wird gegen die Polyacrylamid-Konzentration aufgetragen. Erhält man nichtparallele Linien, die sich bei T = 0 g/dl schneiden, handelt es sich um ladungsisomere Proteine. Resultieren dagegen parallele Linien, handelt es sich um massenisomere Proteine.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung ist zu niedrig.

5 ul 10 g/dl APS und mindestens 5 10 ml/dl TMEDA pro l ml Monomerlösung verwenden. Die 10,0 g/dl APS ist zwei Wochen haltbar. Neue APS-Lösung verwenden; die APS-Lösung im Kühlschrank lagern. Das Gel bei 20-25 °C gießen.

Vor der Elektrophorese Die Monomerlösung polymerisiert nicht oder zu langsam.

Die APS-Lösung ist zu alt oder unsachgemäß gelagert. Die Raumtemperatur ist zu niedrig. Es gibt zu viel Sauerstoff in der Monomerlösung. Der pH-Wert zur Gelpolymerisation ist nicht optimal. Die Hälfte des Gels ist nicht oder ist unvollständig polymerisiert. Das Gel polymerisiert zu schnell. Es entstehen Luftblasen beim Gießen der Monomerlösung.

Die APS-Lösung hat sich nicht gut in der Monomerlösung verteilt - am häufigsten in der schweren Monomerlösung. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung ist zu hoch. Die Glasplatte ist unsauber.

Die Haftfolie war unsauber.

Die Monomerlösung an einer Wasserstrahlpumpe entlüften. Bei Polymerisation in Puffern mit niedrigen pH-Werten die Konzentration von TMEDA verdoppeln. Nach der APS-Zugabe den Magnetrührer kurzweilig drehen, danach gießen.

Die Konzentrationen von TMEDA oder APS reduzieren. Vor der Benutzung die Glasplatte mit Geschirrspülmittel und Ethanol waschen. Die hydrophile Seite der Folie nicht mit den Fingern berühren.

119

2.3 Polyacrylamidgel-Zonenelektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Es gab Luftblasen im Auslaßschlauch des Gradientenmischers.

Die Auslaßschläuche sauber und trocken halten. Die eventuellen Luftblasen in der Gießkassette durch heftiges Anklopfen auf die Gießkassette, hinausschieben. Die Haftfolien für Polyacrylamid- und Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel nur auf die hydrophile Seite einer Haftfolie gießen, vorher mit Wassertropfen die Seite prüfen. Die Monomerlösung entlüften und nach dem Gießen die Monomerlösung mit dest. Wasser überschichten. Vor dem Gießen die Glasplatte mit Repel-Silan beschichten.

Das Gel löst sich von der Haßfolie.

Eine falsche Haftfolie wurde verwendet. Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen.

Die Gelkanten sind ungenagend polymerisiert.

Der Luftsauerstoff hat die Polymerisation der Geloberkante inhibiert. Die Glasplatte ist zu hydrophil.

Das Gel haftet nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte. Es bildet sich Flüssigkeit auf der Geloberflüche.

Das Polyacrylamidgel hydrolysiert in alkalischen Puffern.

Die Polyacrylamidgele mit alkalischen Puffern im Kühlschrank lagern.

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu •wenig Strom.

Das Gel "dampft" (der Deckel der Trennkammer •wird mit kondensiertem Wasser bedeckt).

Das Gel funkt und brennt.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Schlechter Kontakt an den Elektrodengelen oder -streifen. Die Kühlung ist ungenügend.

Die elektrische Spannung ist zu hoch. Es gibt dünne Stellen im Gel beim Gelgießen lag die Haftfolie nicht fest auf der Glasplatte.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die gleichmaßige Auflage der Elektroden überprüfen, eventuell mit Glasplatten beschweren. Die Kühltemperatur überprüfen. Die Kühlblöcke sollen aus Glas, emailliertes Metall oder am besten aus Keramik sein. Die elektrische Spannung reduzieren. Die Haftfolie an der Glasplatte der Gießkassette festwalzen.

Nach der Elektrophorese Keine Proleinbanden im Gel.

Die Proteinbanden sind sehr schwach.

Die Proteinbanden sind unscharf.

Die Kathode und Anode waren vertauscht. Die Proteine haben das Gel verlassen. Die Proteinkonzentration oder das Probenvolumen war zu gering. Die Probe war nicht vollständig gelöst. Die Probe enthielt zu viel Protein.

Die Verbindungen zwischen der Trennkammer und dem Stromversorger überprüfen. Den Lauf der Farbstoffront beachten. Die Proben konzentrieren, mehr auftragen, empfindlicher nachweisen. Die Probe mit Ultraschall behandeln, bei Trübungen zentrifugieren, Additive verwenden, um die Probe zu lösen. Geringeres Volumen auftragen oder die Probe verdünnen.

120

2 Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Proteinbanden bilden Schweife. Die Proben aus den benachbarten Spuren laufen ineinander.

Es gab Festbestandteile in der Probe. Die Auftragsschablone lag nicht dicht auf dem Gel.

Das Gel rollt sich ein.

Das Gel zieht sich in allen Richtungen zusammen.

Vor dem Auftragen die Probe zentrifugieren. Nach Auflegen die Auftragsschablone leicht an das Gel andrücken, um keine Luftblasen zwischen die Schablone und das Gel zuzulassen. 5-10 g/dl Glycerin in die letzte Waschlösung geben.

Literatur [1] Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG,J Biochem Biophys Methods, 3, 273 (1980) [2] Margolis J, Kenrick KG, Anal Biochem, 25, 347 (1968) [3] Rothe GM, Purkhanbaba M, Electrophoresis, 3, 33 (1982) [4] Smithies O, Biochem J, 61, 629 (1955) [5] Smithies O, Adv Protein Chem, 14, 65 (1959) [6] Raymond S, Nakamichi M, Anal Biochem, 7, 225 (1964) [7] Slater GG, Anal Chem, 41, 1039 (1969) [8] Rothe GM, Maurer WD, in Gel Electrophoresis of Proteins, Dunn MJ (Hrsg.), Wright, Bristol, S. 37 (1986) [9] Rothe GM, in Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden, Wagner H, Blasius E (Hrsg.), Springer, Berlin - Heidelberg - New York - London - Paris - Tokyo, S. 21 (1989) [10] Rodbard D, Kapadia G, Chrambach A, Anal Biochem, 40, 135 (1971) [11] FdgenhauerK,Hoppe-Seyler'sZPhysio!Chem,

355, 1281 (1974)

[12] Hedrick JL, Smith AJ, Arch Biochem Biophys, 126, 155 (1968)

2.4 Isotachophorese der Proteine Die Isotachophorese wird seit den 60er Jahren als eine hochauflösende elektrophoretische Methode in Kapillaren angewandt [l, 2]. Sie beruht auf den theoretischen Grundlagen von Kohlrausch, die er Ende des vorigen Jahrhunderts entwickelte. Der Terminus Isotachophorese stammt aus den altgriechischen Wörtern (gleich), (Geschwindigkeit) und (tragen). Er bedeutet die Wanderung von Ionen mit gleicher Geschwindigkeit, wobei sie eine oder mehrere lonengrenzen bilden, an denen sich die zu untersuchenden Polyionen in Abhängigkeit von ihren effektiven Mobilitäten hintereinander anordnen und konzentrieren. Die wichtigste Voraussetzung für eine isotachophoretische Trennung ist ein diskontinuierliches Puffersystem, das aus einem Leit- und einem Folgeelektrolyten besteht. Sollen beispielsweise Polyanionen getrennt werden, muß das Anion des Leitelektrolyten eine höhere Mobilität (Leition) haben und das Anion des Folgeelektrolyten - eine niedrigere Mobilität (Folgeion). Das gesamte System enthält in der Regel ein gemeinsames Gegenion.

2.4. l "Beharrliche" Funktion von Kohlrausch 1897 untersuchte Kohlrausch [3] zwei Lösungen von starken Elektrolyten, die übereinander gegossen waren, wobei die Lösung mit dem schnellen Ion (der Leitelektrolyt) sich unter der Lösung mit dem langsamen Ion (dem Folgeelektrolyten) befand und unter dem Leitelektrolyten der gegenpolare Pol. Er stellte fest, daß wenn durch das Lösungssystem elektrischer Strom geleitet wird, sich im Laufe der Zeit eine scharfe lonengrenze zwischen den beiden Lösungen bildet, an der die beiden Ionen mit gleicher Geschwindigkeit wandern. Kohlrausch bezeichnete dieses Phänomen als "beharrliche" Funktion und leitete für, die lonenkonzentrationen an der lonengrenze eine elektrochemische Gleichung ab. 1964 dehnte Ornstein [4] die "beharrliche" Funktion von Kohlrausch auch auf Lösungen von schwachen Elektrolyten (Puffern) aus, wobei er die Mobilität des Gegenions berücksichtigte. Analysieren wir nun ein Puffersystem, das aus einem Leitpuffer (a) und einem Folgepuffer (b) besteht. Der Leitpuffer enthält den starken Elektrolyten HA, der Folgepuffer den schwachen Elektrolyten HB. Die Elektrolyte dissoziieren in die Ionen A" bzw. B", wobei die Mobilität des Ions A", dem Betrag nach, höher als die des Ions B" ist, d.h. | -| > | -| ist. Beide Puffer enthalten die gleiche Base B, die bei der Assoziation eines Protons das Gegenion HC+ bildet (Abb. 2.4-1).

122

2 Elektrophorese der Proteine

HC+

B

Folgepuffer

I

lonengrenze

A"

Leitpuffer

(b)

t HC+

(a)

1 Abb. 2.4-1 Schema des Puffersystems der Isotachophorese. A" - Leition; B" - Folgeion; HC+ - Gegenion; pHa und pHb - die pH-Werte des Leit- und Folgepuffers.

Stellen wir nun fest, unter welchen Bedingungen sich die Ionen A" und B" mit gleicher effektiver Geschwindigkeit v' bewegen werden, d.h. unter welchen Bedingungen (2.4-1)

V A- = V R- .

Es ist bekannt (Kap. 1.4), da die effektive Geschwindigkeit eines Ions dem Produkt seiner effektiven Mobilit t μ' und der St rke des elektrischen Feldes E gleich ist, d.h. α

ΗΑ(ΗΒ)

A-(B->

(2.4-2)

wobei otHA(HB) der Dissoziationsgrad der S ure HA (HB) ist (ct^ = l, da HA eine starke S ure ist), μΑ-(Β") die Mobilit t des Ions A" (B"), in m2/(sV), und £a(M die St rke des elektrischen Feldes im Leitpuffer (Folgepuffer). Die St rke des elektrischen Feldes ergibt sich durch die Gleichung

J (2.4-3) wobei J die Dichte des gesamten lonenstroms, in A/m2, und sche Leitf higkeit des Leitpuffers (Folgepuffer), in S/m, ist. Aus den Gleichungen (2.4-2) und (2.4-3) folgt, da U

Yb

B-

α

ΗΑ

die spezifische elektri-

(2.4-4)

Ya

Wie es in Kap. l .4 hervorgehoben wurde, ist die spezifische Leitf higkeit gleich

2.4 Isotachophorese der Proteine

Ya(b) = F

123

C

A-(B-) ZA-(B') ^A~(B-) >

(2-4-5)

wobei cA-(ß-) die Konzentration des Ions A" (B~), in mol/1, und ZA~(B-) die Zahl der Protonladungen (die Valenz) des Ions A" (B") ist. Aus Gl. (2.4-4) und (2.4-5) ergibt sich die Gleichung -

~

=

,(2.4-6)

wobei CQ,^) die Konzentration der Base C, in mol/1, im Leitpuffer (FolgepufFer) ist. Nach dem Gesetz der elektrischen Neutralität einer chemischen Lösung ist a

HA(HB) CHA(HB) zA~(ß-)

+a

Ca(b) cCa(b) ZHC+ = ° ·

(2.4-7)

Damit kann Gl. (2.4-6) in die Gleichung von Ornstein

Z

B-

- - l

HP0' l > l aHB

•I

(2.4-10)

gelten soll, wobei mit Pn* die Polyionen bezeichnet werden. Soll z.B. das Protein-Polyion H20P [effektive Mobilität bei 0 °C 2 - = -5 l O'9 m2/(sV)] bei einer Front von ChloridIonen [ - = -37 l O'9 m2/(sV) bei 0 °C] und gegen TRIS-Ionen [ ^ = 9 l O'9 m2/(sV) bei 0 °C] konzentriert werden, ist die "beharrliche" Funktion von Kohlrausch gleich (-1)(-5·10- 9 )(-3710- 9 -9·10- 9 ) C

HC1

(-20) (-37 10'*) (-5- 10',-9v - 910'*)

= 0,022.

Dies bedeutet, daß bei einer Konzentration der Salzsäure von 0,06 mol/1 die Proteinkonzentration folgenden Wert erreicht: 0,022-0,06 = 0,0013 mol/I. Bei Anionenpuffersystemen wird am häufigsten Chlorid-, Phosphat- oder Sulfat-Ion als Leition verwendet, bei Kationenpuffersystemen Kalium-Ion. Als Gegenionen werden Kationen schwacher Basen bzw. Anionen schwacher Säuren eingesetzt.

2.4 Isotachophorese der Proteine

125

Nach der Ornsteinschen Gleichung folgt, daß alle Konzentrationen an der lonengrenze, einschließlich der zu trennenden Polyionen, sich nach der Konzentration des Leitelektrolyten richten. Je höher seine Konzentration ist, um so mehr werden die Polyionen konzentriert. Dabei ist die Konzentration jeder Zone in der Regel proportional zu ihrer Länge. Dadurch wird es möglich, die Quantifizierung der Polyionenkonzentrationen über die Messung der Zonenlänge durchzuführen. Bei der Isotachophorese konzentrieren sich die Polyionen in extrem dünnen Zonen. Solche Konzentrierung ist bis heute bei keiner anderen Methode bekannt, außer bei der isoelektrischen Fokussierung. Die direkt hintereinanderfolgenden Polyionzonen können mit Hilfe der Trägerampholyte zusätzlich voneinander separiert werden. Aus den obigen Gleichungen ist zu ersehen, daß die Geschwindigkeit der wandernden lonengrenze konstant bleibt, wenn die Stromdichte J innerhalb des Puffersystems konstant ist. Deswegen wird die Isotachophorese bei konstanter Stromstärke 7 durchgeführt. Die Isotachophorese erfolgt hauptsächlich in Teflonkapillaren [5, 6] und seltener in Quarzkapillaren. Die elektrische Spannung erreicht dabei bis zu 30 kV bei sehr niedriger Stromstärke (Kap. 2.5).

2.4.2 Gleichungen eines diskontinuierlichen Puffersystems Der Terminus diskontinuierliches Puffersystem wurde zum erstenmal 1957 von Poulik [7] eingeführt, nachdem er gefunden hat, daß die elektrophoretische Auflösung steigt, wenn das Gel bei einer Stärkegel-Elektrophorese einen Citrat-Puffer enthält und die Elektrodentanks einen Borat-Puffer. Heute wird ein Puffersystem als diskontinuierlich definiert, wenn es aus zwei oder mehr Puffern besteht. Unserer Ansicht nach kann als ein diskontinuierliches Puffersystem auch nur ein Puffer bezeichnet werden, falls seine Zusammensetzung in seinen unterschiedlichen Teilen verschieden ist, wodurch diese auch unterschiedliche pH-Werte und lonenstärken aufweisen (Kap. 2.6). Wenn die Konzentration des Leitelektrolyten, z.B. der Leitsäure, gegeben ist, kann aus der Gleichung von Ornstein (s.o.) die Konzentration des Folgeelektrolyten, z.B. der Folgesäure, berechnet werden. Dafür ist es notwendig, die Mobilitäten des Leit-, Folgeund Gegenions zu kennen. Danach können die pH- Werte sowie die Konzentrationen der Base in beiden Puffern bestimmt werden. Um den pH-Wert des Folgepuffers zu berechnen, sollte man den Dissoziationsgrad der Säure HB bestimmen. Dafür wird die Gleichung


ln'pn-l >

-bl

(2.6-6)

beachtet werden. Unter dieser Bedingungen ordnen sich die Polyionen in der stationären Grenze an, bis die Gleichung

c

HnP - CHA a

z

n

HnP P -

(2 6-

144

2 Elektrophorese der Proteine

erfüllt wird. Hier entspricht c^^p der Konzentration des konzentrierten Polyions, seinem lonisationsgrad und zpn- seiner Elektrovalenz. Aus den Werten der effektiven Mobilitäten des Ions A' im Trenn- und Elektrodenpuffer, bzw. -3 und » können die Werte von ajjAa und aHAb berechnet werden, danach die Konzentration der Base CB im Trenn- und Sammelgel. Der Wert von kann aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung kalkuliert werden. Als Beispiel für die abgeleitete Theorie wird ein Puffersystem vorgeschlagen, das zur Trennung von Serumproteinen bei 25 °C geeignet ist. Es ist bekannt, daß bei 25 °C und pH > 8,0 die effektiven Mobilitäten der ProteinPolyionen zwischen |15-10-9| und |1,2-10-9| m2/(sV) liegen. Da aber der Wert von l·1 Pn~(max) 'm Trenngel auf ungefähr 1 0-1 0"9 m2/(sV) sinkt, kann angenommen werden, daß ' -3 -10 '9 m2/(sV) und ' , - '9 m2/(sV) betragen sollten. Diesen Bedingungen entspricht der TRIS-Glycinat-Puffer. Er besteht aus der schwachen Base TRIS (T) und der schwachen Säure Glycin (HG). Da bei 25 °C und einer lonenstärke von 0,1 mol/1 die absolute Mobilität des Glycinat-Ions - = -27,87· '9 m2/(sV) ist [14], folgt aus den obigen Gleichungen, daß a^a = 0,3588 und a^o, = 0,0359. Wenn 7a = 0,10 mol/1, sollte CHG = 0,2787 mol/1 und 7b = 0,01 mol/1 betragen. Bei 25 °C ist der Wert von pA:HG = 9,78 und der Wert von pÄ^ = 8,07. Deswegen kann ebenfalls aus den abgeleiteten Gleichungen berechnet werden, daß pA^jGa = 9,54, P^HGb = 9>69> P%r+a = 8 > 31 und P^HT+b = 8,16, wobei p^HGa(b) bzw P^HT+a(b) die negativen Zehner-Logarithmen der Konzentrations-Ionisationskonstante von Glycin und TRIS-Ion im Trenn- bzw. Elektrodenpuffer sind. Daraus ergibt sich, daß pHa = 9,29, pHb = 8,26, aTa = 0,0952 und otjb = 0,4420, und daß die Konzentrationen von TRIS im Trenn- und Elektrodenpuffer cTa = 1,050 mol/1 bzw. c-j^ = 0,023 mol/1 betragen sollten. In Tab. 2.6-2 ist die Herstellung der Lösungen l und 2 beschrieben, die den doppelt konzentrierten Trenn- bzw. Elektrodenpuffer darstellen. Zum Gießen des Sammel- und Trenngels wird ebenso die Lösung 3 verwendet, wo die Gesamt-Monomerkonzentration T = 50 g/dl und der Vernetzungsgrad C = 0,03 ist. In Tab. 2.6-3 ist die Zusammensetzung der unterschiedlichen Puffer und Gele angegeben, die für diese Methode benötigt werden. Tab. 2.6-2 Lösungen fur Disk -Elektrophorese in einem Puffer bei zwei pH- Werten.

TRIS Glycin Acrylamid BIS Dest. Wasser ad

Lösung 1 pH = 9,3

Lösung 2 pH = 8,3

Lösung 3

12,72 g 2,09g 100,0 ml

2,79g 20,92 g 1000,0 ml

. 48,50 g 1,50g 100,0 ml

2.6 Disk-Elektrophorese der Proteine

145

Tab. 2.6-3 Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Glycinat-Puffer bei zwei pH-Werten. Elektrodenpuffer pH = 8.3 Lösung 1 Lösung 2 Lösung 3 Glycerin Bromphenolblau 10 ml/dl TMEDA 10 g/dl APS Dest. Wasser ad

Sammelgel Trenngel T=4 g/dl, pH = 8,3 T =7 g/dl, pH = 9,3

. 500,00 ml

50,00ml 8,00 ml 30,00 ml

1000,00 ml

0,40 ml 0,80 ml 100,00 ml

Probenpuffer pH = 8,3

.

50,00ml

-

50,00ml -

14,00 ml 10,00 ml

-

0,001 g

-

0,40ml 0,46 ml 100,00 ml

100,00 ml

Die APS-Lösung muß frisch vorbereitet und zuletzt hinzugefugt werden. Wir schlagen vor, daß ihre Konzentration (in g/dl) nach der Formel 0,32 (g/dl)2/r berechnet wird, wobei T die Gesamt-Monomerkonzentration in g/dl ist. Die Disk-Elektrophorese in einem Puffer bei zwei pH-Werten dauert l bis 2 h, dann werden die Proteinbanden in einem Gemisch von 1,0 mol/1 (16,34 g/dl) TrichJoressigsäure und 0,2 mol/1 (5,08 g/dl) 5-Sulfosalicylsäure-Dehydrat 30 min fixiert und noch 30 min in filtriertem 0,001 mol/1 (0,17 g/dl) Coomassie Brillantblau R 250 gefärbt, das in der Entfärbelösung gelöst ist. Die Entfärbelösung enthält Methanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis 3: l :6, V/V. Nach der Färbung wird der Gelhintergrund mehrmals in frischen Entfärbelösungen entfärbt (Abb. 2.6-6).

*

'.·"«·*·«>

Abb. 2.6-6 Serumproteine, getrennt in einem flachen Polyacrylamidgel mit T = 7 g/dl. Färbung mit Coomassie Brillant Blau R 250.

146

2 Elektrophorese der Proteine

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung ist zu niedrig. Die APS-Lösung ist zu alt oder unsachgemäß gelagert. Die Raumtemperatur ist zu niedrig. Die Konzentration von Acrylamid oder BIS in der Monomerlösung ist zu niedrig. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu niedrig. Die APS-Lösung ist zu alt

Die Rezeptur für die Zusammensetzung der Monomerlösung überprüfen.

Vor der Elektrophorese Die Monomerlösung polymerisiert nicht oder zu langsam.

Das Polyacrylamidgel ist klebrig.

oder unsachgemäß gelagert. Der Luftsauerstoff inhibiert die Polymerisation der Geloberkante. Die Monomerlösung polymerisiert zu schnell.

Es entstehen Luftblasen im Gel.

Die Konzentration von APS in der Monomerlösung ist zu hoch. Die Raumtemperatur ist sehr hoch. Die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kommt, ist unsauber. Die Haftfolie ist unsauber.

Eine neue APS-Lösung verwenden. Die APS-Lösung im Kühlschrank lagern. Das Gel bei 20 - 25 °C gießen. Die Rezeptur für das Gelgießen überprüfen.

4 ul 10 g/dl APS und mindestens 5 ul 10 ml/dl TMEDA pro l ml Monomerlösung verwenden. Die Haltbarkeit von 10 g/dl APS beträgt 2 Wochen. Die APS-Lösungen im Kühlschrank lagern. Die Monomerlösung an einer Wasserstrahlpumpe entlüften und nach dem Gießen die Monomerlösung mit dest. Wasser überschichten. Die Konzentration von TMEDA oder APS verringen. Das Gel bei 20 - 25 °C gießen. Vor der Benutzung die Glasplatte mit Geschirrspülmittel und Ethanol waschen.

Das Gel löst sich von der Haftfolie.

Es wurde eine falsche Haftfolie verwendet. Das Gel ist auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen.

Das Gel haftet nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte.

Die Glasplatte ist zu hydrophil.

Die hydrophile Seite der Folie nicht mit den Fingern berühren. Die Haftfolien für Polyacrylamid- und Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen, vorher mit Wassertropfen die Seite prüfen. Die Glasplatte mit Repel-Silan beschichten.

Das Gel ist zu lange in der Gießkassette verblieben.

Nach der Polymerisation das Gel der Gießkassette entnehmen.

147

2.6 Disk-Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig Strom.

Das Gel "dampft" (der Deckel der Trennkammer wird mit kondensiertem Wasserdampf bedeckt).

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Schlechter Kontakt an den Elektrodengelen oder -streifen. Die Kühlung ist ungenügend.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die gleichmäßige Auflage der Elektroden auf den Elektrodengelen oder -streifen überprüfen, eventuell mit Glasplanen beschweren. Die Kühltemperatur überprüfen. Die

Kühlblöcke sollen aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein. Kerosen zwischen den Kuhlblock und der Haftfolie

geben. Das Gel funkt und brennt.

Die elektrische Spannung ist zu hoch. Es gibt dünne Stellen im horizontalen Gel. Schlechter Kontakt zwischen dem Gel und den Elektrodenstreifen

Die elektrische Spannung reduzieren. Die Haftfolie an der Glasplatte der Gießkassette fest walzen. Die Elektrodenstreifen parallel zu den Gelrändern auflegen und mit Glasplatten beschweren.

Nach der Elektrophorese Keine Proteinbanden im Gel.

Die Proteinbanden sind zu schwach. Die Proteinbanden sind unscharf.

Die Proteinbanden bilden Schweife.

Die benachbarten Proben laufen ineinander.

Das Gel rollt sich ein.

Die Proteinkonzentration war niedrig.

Mehr Probenvolumen auftragen oder die Probe konzentrieren.

Die Nachweisempfindlichkeit

Andere Nachweismethode verwenden,

der Färbemethode ist zu gering. Die Kathode und die Anode waren vertauscht. Die Proteinkonzentration oder das Probenvolumen war gering. Proteolytischer Abbau der Proteine in der Probe. Diffusion nach der Trennung.

z.B. Silberfärbung Die Verbindung mit dem Stromversorger überprüfen Die Proben konzentrieren oder größeres Probenvolumen auftragen. Die Proben mit Protease-Inhibitoren (EDTA u a.) mischen. Das Gel sofort nach der Elektrophorese fixieren. Die Probe vor dem Auftrag zentrifugieren. Weniger Probe auftragen oder sie verdünnen. Die Proben konzentrieren und geringere Volumina auftragen. Die Auftragsschablone leicht an das Gel andrücken, um keine Luftblasen zwischen ihr und dem Gel zuzulassen. 5-10 g/dl Glycerin in die letzte Lösung geben.

Es gab Präzipitate oder feste Bestandteile in der Probe. Die Probe enthielt zu viel Protein. Die Probenvolumina waren zu groß. Die Auftragsschablone lag nicht dicht auf dem Gel. Das Gel zieht sich in allen Richtungen zusammen.

148

2 Elektrophorese der Proteine

Literatur [1] OmsteinL, Ann N YAcadSci, 121, 321 (1964) [2] Davis BJ, Ann N YAcadSci, 121, 404 (1964) [3] Hedrick JL, Smith M, Arch Biochem Biophys, 126, 155 (1968) [4] Jovin TM, Biochemistry, 12, 871 (1973) [5] Reisfeld RA, Lewis VJ, Williams DE, Nature, 195, 281 (1962) [6] Allen RC, Moore DJ, Dilworth RH, J Histochem Cytochem, 17, 189 (1969) [7] Allen RC, Budowle B, Gel Electophoresis of Proteins and Nucleic Acids, Walter de Gruyter, Berlin-New York (l994) [8] Hjerten S, Jerstedt S, Tiselius A, Anal Biochem, 11, 219 (1965) [9] Maurer HR, Allen RC, Z Klin Chem, 10, 220 (1972) [10] Michov BM, Electrophoresis, 10, 686 (1989) [11] Jovin ΎΜ,Αηη Ν YAcadSci, 209, 477 (1973) [12] Chrambach A, Jovin TM, Svendsen PJ, Rodbard D, in Methods of Protein Separation, Catsimpoolas N (Hrsg.), Plenum Press, New York, Bd. 2, S. 27 (1979) [13] Michov BM, Electrophoresis, 11, 289 (1990) [14] Michov BM, Electrophoresis, 6, 471 (1985)

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine Biologische Membranen, Zellen und Gewebe beinhalten viele Lipoproteine (Kap. 1.3.2). Die meisten Lipoproteine sind in Wasser unlöslich, deswegen können sie elektrophoretisch nicht getrennt werden. Sie müssen zuerst solubilisiert werden, d.h. in eine lösliche aber denaturierte Form überfuhrt werden. Als Denaturierung wird der Übergang von einer nativen Polyionenkonformation zu einer Zufallsknäuel-Konformation bezeichnet (Kap. 1.3.4). Sie wird von der Zerstörung der hydrophoben Wechselwirkungen in den Lipoproteinen begleitet. Die Denaturierung führt in der Regel zum Verlust der biologischen Eigenschaften der Proteine, z.B. der Enzymaktivität oder der Bindungsfähigkeit der Rezeptoren [1]. Die elektrophoretische Trennung der denaturierten Proteine - die denaturierende Elektrophorese - findet in Anwesenheit von Detergenzien statt. Die Detergenzien vermindern die Oberflächenspannung einer Lösung, deshalb werden sie auch als Tenside bezeichnet (von tensio = Spannung). Detergenzien sind wirksam, wenn sie sich in mizellärer Form befinden. Die Struktur dieser Form hängt von der kritischen Mizellbildungskonzentration und der Aggregationszahl der Tenside ab. Die kritische Mizellbildungskonzentration (critical micelle concentration, CMC) ist diejenige Konzentration eines Detergens, bei der es Mizellen bildet. Je niedriger der CMC-Wert ist, desto größer ist die Stärke des Detergens. Die Aggregationszahl (N^ ist die durchschnittliche Zahl der Tensidmoleküle, die eine Mizelle bilden. Sie ist ein Kriterium für die Mizellgröße. Je kleiner der ^-Wert ist, desto weniger wird die Lipoproteinmasse vergrößert. Die kritische Mizellbildungskonzentration und die Aggregationszahl werden durch den pH-Wert, die Temperatur und die lonenstärke beeinflußt. Die Detergenzien gliedern sich, abhängig von ihren elektrischen Ladungen, in anionische, kationische oder zwitterionische. Außerdem gibt es Detergenzien, die keine elektrischen Ladungen haben - nichtionische Detergenzien (Tab. 2.7-1). Tab. 2.7-1 Detergenzien, die für die Elektrophorese von Bedeutung sind. Detergenzien

Chemische Formeln

Eigenschaften

An ionische Detergenzien SDS (Natriumdodecylsulfat)

'SO3 Na

Lithiumdodecylsulfat (LOS)

'SO3 Li

Natriumcholat

CO 2 Na

HO

Mr = 288,38 = 8,1 I NH, ^^

2

+

HI

NH,,

Abb. 2.7-4 Alkylierung einer Thiolgruppe mit lodacetamid. Die Polypeptidkette ist als eine dicke Linie dargestellt.

Nachdem die Probe mit den reduzierten Proteinen abgekühlt ist, wird 20 g/dl lodacetamid hinzugefugt. Nach 30 min Inkubation bei Zimmertemperatur wird die Probe

156

2 Elektrophorese der Proteine

zentrifiigiert. Die Alkylierung funktioniert am besten bei pH um 8,0. lodacetamid verhindert nebenbei das Auftreten von Artefaktlinien bei der Silberfarbung, weil es das überschüssige DTT abfängt.

2.7.2 SDS-Disk-Elektrophorese die verbreitetste elektrophoretische Methode Die Bedeutung der SDS-Zonenelektrophorese ist wesentlich geringer als die der SDSDisk-Elektrophorese. Deswegen wird unter SDS-Elektrophorese gewöhnlich SDS-DiskElektrophorese verstanden. Die SDS-Disk-Elektrophorese wurde 1970 von Laemmli [26] beschrieben, der das 1964 von Ornstein [27] und Davis [28] entwickelte diskontinuierliche Puffersystem benutzte. Diese SDS-Disk-Elektrophorese zeichnet sich durch eine wandernde Zonengrenze zwischen dem Chlorid-Ion als Leition und dem Glycinat-Ion als Folgeion gegen das TRIS-Ion als Gegenion aus. Während die Grenze die Proteine überholt, konzentrieren sie sich, danach trennen sie sich voneinander. Dasselbe Puffersystem verwenden Heukeshoven und Dernick [29] in ihrer SDS-Methode. Bei der SDS-Disk-Elektrophorese werden die Proteine entweder in homogenen Gelen oder in Gradientengelen getrennt. Die Gradienten-Fertiggele haben unterschiedliche Nachteile gegenüber den homogenen Gelen: die Fixierung der Proteine nach der Elektrophorese, ihre Färbung und die Entfärbung der Gele verlaufen unregelmäßig, die Gradientengele verbiegen sich oft beim Trocknen und vor allem ist ihre Herstellung vergleichsweise schwieriger.

SDS-Disk-Elektrophorese in homogenen Gelen Zur Zeit sind zwei Puffersysteme zur Durchführung der SDS-Disk-Elektrophorese verbreitet: das TRIS-Chlorid-Glycinat-Puffersystem und das TRIS-Formiat-TaurinatPuffersystem. SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRlS-Chlorid-Glycinat-Puffersystem. Die SDSDisk-Elektrophorese im TRIS-Chlorid-Glycinat-Puffersystem nach Laemmli wurde ursprünglich in zylindrischen Gelen durchgeführt. Das Laemmli-System ist für SDSdenaturierte Proteine mit relativen Molekülmassen von 15-150 l O3 verwendbar. Die Monomerlösungen für das Trenn- und Sammelgel polymerisierten in Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 3-5 mm und einer Länge von 7-12 cm. Das Trenngel war ca. 10 cm lang, das Sammelgel l cm. Die mit Gel gefüllten Röhrchen standen senkrecht und hatten auf beiden Seiten Kontakt zu den Elektrodenpuffern. Die Probe bestand aus 0,0625 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit pH = 6,8, 2 g/dl SDS, 10 ml/dl Glycerin, 5 g/dl 2-Mercaptoethanol und 0,001 g/dl Bromphenolblau und enthielt 0,2-0,6 mg/ml Protein. 10-50 der Probe wurde auf dem Sammelgel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit einer Stromstärke von 3 mA pro Röhrchen durchgeführt, bis die Bromphenolblau-Bande das untere Gelende erreichte (Tab. 2.7-3).

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

157

Tab. 2.7-3 Das Laemmli-System f r die SDS-Disk-Elektrophorese von Proteinen. Puffer-Gel-System

Herstellung

Sammelpuffer, pH = 6,8 (0, 125 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit lg/1 SDS)

Eine Monomer-Stamml sung mit T = 50 g/dl und C = 0,02 wird aus 49,0 g/dl Acrylamid und 1,0 g/dl BIS; eine Monomer-Stamml sung mit T = 50 g/dl und c = ο ω aus 485 ^ Aciylamid ^

,τ r n η·>« (7= 3 g/dl, C= 0,026)

1,5 g/dl BIS vorbereitet. Trennpuffer. pH = 8,8 (0,375 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit l g/l SDS) _ .

Der Trennpuffer (4-fach konz., pH = 8,8) wird aus 18,18 g TRIS, 0,4 g SDS und dest. Wasser ad 80 ml vorbereitet. Danach

(T =ΓΐΟ oder 15 g/dl, C = 0,026) *" ™< < ""f1 «*«* PH = 8>8 titriert 1. ' . .· j τ ι τ n j ι · und auf 100 ml aufgef llt. Die Konzentration des Trenngels T mu den relativen ° Molek lmassen A/r angepa t werden, bei einem C-Wert von 0,02 bis 0,04: f r MT ber 100 000 wird T = 7,5 g/dl empfohlen, f r Λ/Γ von 50 000 bis 100 000 T = 12,5 g/dl und f r A/r weniger als 50 000 T = 20 g/dl. Elektrodenpuffer, pH = 8,3 (0,025 mol/1 TRIS und 0,192 mol/1 Glycin mit l g/l SDS)

Der Elektrodenpuffer (ΙΟ-fach konz., pH = 8,3) enth lt 30,28 g TRIS, 144 g Glycin und 10 g SDS in l 000 ml dest. Wasser.

Das Laemmli-System kann auch zum Gie en von flachen SDS-Gelen verwendet werden (Tab. 2.7-4). Tab. 2.7-4 Rezepturen zum Gie en von flachen Gelen (120 χ 250 χ 0,5 mm) f r die SDS-DiskElektrophorese nach Laemmli. Komponenten

Konzentration

Sammelgel (6ml)

Trenngel (U ml) _

TRIS-Chlorid-Puffer (0,5 mol/1, pH = 6,8)

0,1 25 mol/1

1,50 ml

TRIS-Chlorid-Puffer (1,5 mol/1, pH = 8,8)

0,375 mol/1

.

2,75 ml

0,48 ml

2,75 ml

20,0 ml/dl

1,37ml

2,53 ml

20 g/dl SDS

0,1 g/dl

0,03 ml

0,055 ml

10 ml/dl TMEDA

0,05 ml/dl

0,03 ml

0,06 ml

10 g/dl APS

0,05 g/dl

0,03 ml

0,06 ml

1,70 ml

.

Monomerl sung (T = 50 g/dl, C = 0,03)

87 % Glycerin

Dest. Wasser

Sammelgel: 7= 4 g/dl Trenngel: T= 12,5 g/dl

158

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.7-4 Fortsetzung. Komponenten im Elektrodenpuffer TRIS-Glycinat-Puffer (0,25 mol/1, pH = 8,3) oder TRIS-Chlorid-Puffer (1,5 mol/1, pH = 8,8) Monomerlösung (T = 50 g/dl, C = 0,03) 20g/dlSDS Dest. Wasser

Konzentration im Elektrodenpuffer 0,025 mol/1

12,0 g/dl 0,1 g/dl

Elektrodenbrücken

200,0 ml

10,0ml

Elektrodengel

30,0 ml

7,20ml 0,15ml

1800,0 ml

Ein SDS-Flachgel nach Laemmli kann folgenderweise gegossen werden: • Eine Gießkassette (Kap. l .6.5) auf eine nivellierte Unterlage stellen; • Die Monomer-SDS-Lösung für das Sammelgel filtrieren, die Katalysatoren hinzugeben und für 10-15 s mischen; • 5 ml der Monomerlösung mit einer Spritze oder Pipette blasenfrei in die Gießkassette einfüllen und 5-10 mm hoch mit dem gleichen Puffer überschichten; • Die Lösung 30 min polymerisieren lassen, danach den überschichteten Puffer absaugen; • Die Monomer-SDS-Lösung für das Trenngel filtrieren, die Katalysatoren beimischen und 10-15 s mischen; • 10 ml der Lösung mit einer Spritze oder Pipette blasenfrei in die Gießkassette einfüllen und 2-3 mm hoch mit Wasser überschichten; • Nach einer Polymerisationsdauer von 60 min bei Zimmertemperatur oder bei 40 °C im Trockenschrank das über schichtete Wasser abgießen. Die Geschwindigkeit des in den SDS-Proben enthaltenen Bromphenolblau sollte 3-4 cm pro Stunde betragen. Dafür werden relativ niedrige elektrische Spannungen (100-500 V) bei höheren Stromstärken (20-100 mA) gebraucht. Die Kühltemperatur während der Elektrophorese sollte 10-15 °C betragen. Falls das Gel während der Elektrophorese "dampft" und damit einen Niederschlag von Wasserdampf auf dem Deckel der Trennkammer verursacht, muß die elektrische Spannung reduziert werden, bevor das Gel zu brennen beginnt. SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Formiai-Taurinat-Puffer system. Zur Beseitigung der Nachteile der Gradientengele wurde eine neue Methode der SDS-DiskElektrophorese in homogenen Flachgelen entwickelt [30]. Sie wird in einem TRISFormiat-Taurinat-Puffersystem durchgeführt, das eine höhere Pufferkapazität als die bekannten Puffersysteme hat, und zur Trennung von Proteinen mit relativen Molekülmassen von 6 000 bis 450 000 geeignet ist. Diese Methode benötigt keine Gelelektrodenstreifen, sondern Papierelektrodenstreifen. Die Handhabung der Papierelektrodenstreifen ist einfacher als die der Gelelektrodenstreifen. Außerdem sind sie nicht toxisch, während die Gelelektrodenstreifen Spuren des neurotoxischen Monomers Acrylamid enthalten. Die Methode kann ebenso

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

159

für eine vertikale Trennung verwendet werden - dann braucht man keine Elektrodenstreifen, weil das Gel mit den beiden Elektrodenpuffern unmittelbar in Kontakt tritt. Das Sammelgel, das Trenngel und der Anodenstreifen enthalten TRIS-Formiat-Puffer, der Kathodenstreifen TRIS-Taurinat-Puffer. Ameisensäure (HA) bildet das Leition - das Formiat-Ion (A~), Taurin (HB) das Folgeion - das Taurinat-Ion (B'), das TRIS das Gegenion - das TRIS-Ion (HC+). Bei 25 °C und einer lonenstärke / = 0, l mol/1 sind die Mobilitäten des Formiat-, Taurinat- und TRIS-Ions wie folgt: A -=-44,22. l O'9, - = -23,53.10-9 und + = 17,27.1 '9 m2/(s V) [31]. Um eine hohe Auflösung zu erzielen, müssen die effektiven Mobilitäten der SDSProtein-Komplexe im Sammelgel höher als die effektive Mobilität des Folgeions sein, im Trenngel umgekehrt. Infolgedessen wird die wandernde lonengrenze zwischen dem Leitund Folgeion den Protein-SDS-Komplexen im Sammelgel folgen, im Trenngel aber wird sie die Komplexe allmählich überholen, wobei sich die Proteine konzentrieren und danach voneinander trennen. Um das TPJS-Formiat-Taurinat-Puffersystem zusammensetzen, müssen wir die beharrliche Funktion von Kohlrausch, den Dissoziationsgrad des Taurins, den pH-Wert des Folgepuffers (pHb), d.h. des Kathodenpuffers, und den pH-Wert des Leitpuffers (pHa) im Sammel- und Trenngel sowie im Anodenpuffer berechnen. Aus den Gleichungen in Kap. 2.4 folgt, daß die beharrliche Funktion von Kohlrausch [32] F^ = CHTa^HFo = 0,802, wobei Cj^g und CHA die Molarkonzentrationen der Ameisensäure und des Taurins sind. Falls wir annehmen, daß cj^ = 0,10 mol/1, ergibt sich, daß CHB = 0,0802 mol/1 ist. Die SDS-Protein-Komplexe bewegen sich in einem H3-Trenngel mit effektiven Mobilitäten, die niedriger als -6 IQ·9 m2/(s V) sind. Deswegen muß die effektive Mobilität des Taurinat-Ions - im Sammel- sowie im Trenngel -6. l O'9 m2/(s V) betragen. Daraus ergibt sich, daß der Dissoziationsgrad des Taurins im Folgepuffer (Kathodenpuffer) 0,17 ist und die lonenstärke des Folgepuffers 7b = 0,170,0802 = 0,0136 mol/1 betragen sollte. Entsprechend der Theorie von Debye-Hückel [33] ist bei 7b = 0,0136 mol/1 pKtfiC+b gleich 8,17 und pA^rß gleich 8,96. Dadurch kann aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung berechnet werden, daß pHb = 8,5 und pHa = 7,8 ist. Die Zusammensetzung der unterschiedlichen Puffer-Gel-Lösungen ist in Tab. 2.7-5, 2.7-6 und 2.7-7 angegeben. Tab. 2.7-5 Rezepturen zur Herstellung der Lösungen, die für die SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystem benötigt werden. Anodenpuffer pH = 7,8 TRIS 99 % Ameisensäure Taurin Acrylamid

BIS SDS 87 % Glycerin Dest. Wasser ad

18,72 g 4,57 ml 0,18g 21,52ml 100,00 ml

Kathodenpuffer pH = 8,5 4,20g

6,02g

0,18g 21,52ml 100,00 ml

Monomerlösung T = 50 g/dl, C = 0,03 . 48,50 g

1,50g 100,00 ml

160

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.7-6 Zusammensetzung von unterschiedlichen Gelen mit einem TRIS-Formiat-Puffer. Sammelgel T=5g/dl pH = 7,8 Anodenpuffer, ml Monomerlösung, ml 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, ml 10 g/dl APS, ml Dest. Wasser, ml, ad

25,00 10,00 16,14 0,46 0,46 100,00

Trenngel T=9g/dl pH = 7,8 25,00 18,00 16,14 0,46 0,46 100,00

Trenngel T=llg/dl pH = 7,8

Trenngel T=J3g/dl pH = 7,8

Trenngel T^ 1 5 g/dl pH = 7,8

Trenngel T= 1 7 g/dl pH = 7,8

25,00 22,00 16,14 0,46 0,46 100,00

25,00 26,00 16,14 0,46 0,46 100,00

25,00 30,00 16,14 0,46 0,46 100,00

25,00 34,00 16,14 0,46 0,46 100,00

Tab. 2.7-7 Probenpuffer. Nichtreduzierender Puffer pH = 7,8

Reduzierender Puffer, 2x pH = 7,8

Alkylierende Lösung, 2x

25,00 ml 1,13g 9,34 ml 1,38ml 100,00 ml

50,00 ml 2,27g 0,31g 18,69 ml 2,77 ml 100,00 ml

. 3,70 g 100,00 ml

Anodenpuffer SDS 1,4-Dithiothreitol lodacetamid 87 % Glycerin 1 g/l Bromphenolblau Dest. Wasser ad

Auf der Basis der vorgeschlagenen Methode können Fertiggele für die SDS-DiskElektrophorese hergestellt werden (Kap. 2.16.3). Sie bestehen aus einem Sammelgel und einem Trenngel. Das Sammelgel umfaßt ca., 1/3, das Trenngel ca. 2/3 des Gelvolumens (Abb. 2.7-5).

Kathodenstreifen \

Sammelgel \ Applikatorschablone Grenze Haftfolie oder Haftnetz

Trenngel Anodenstreifen

Abb. 2.7-5 Schema eines Gels für die SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Formiat-TaurinatPuffersystem.

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

161

Vor der Elektrophorese wird auf die Kühlplatte einer elektrophoretischen Kammer 0,5-1,0 ml Kerosen oder Silikonöl DC-200 aufgetragen und das Fertiggel, mit der Haftfolie nach unten und der Deckfolie nach oben, auf die Kühlplatte aufgelegt. Danach wird die Deckfolie sorgfältig mit einem Roller gewalzt, damit die Luft zwischen der Haftfolie und der Kühlplatte hinausgedrückt wird und sich eine dünne Flüssigkeitsschicht bildet, die die Kühlung gleichmäßig vermittelt. Danach werden die beiden Gelenden mit den entsprechenden Papierelektrodenstreifen bedeckt, die den notwendigen Anoden- bzw. Kathodenpuffer enthalten. Auf das Sammelgel, vor dem Kathodenstreifen, wird eine Applikationsschablone, am besten aus Silikon, aufgelegt, die leicht angedrückt werden sollte, damit ein guter Kontakt mit dem Gel errecht wird. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte der Abstand zwischen den Schlitzen der Applikationsschablone und dem Kathodenstreifen ca. 10 mm betragen (Abb. 2.7-5). In die Schlitze werden je 5-10 der SDS-Proben aufgetragen. Die Proben sollten 20 g/dl Glycerin enthalten und mit je 2-3 dest. Wasser überschichtet werden. Danach werden die Elektroden auf die Papierelektrodenstreifen aufgelegt und die Elektrophorese gestartet. Der Eintrag der Proben in die Schlitze ist von großer Bedeutung für die Qualität der Elektrophoreseergebnisse. In Zusammenhang damit schlagen wir vor, daß die Proben in den Schlitzen der Applikationsschablone mit dest. Wasser überschichtet werden. Es besteht keine Gefahr, daß die Proben sich mit dem Wasser mischen, da sie höhere Konzentrationen an Glycerin enthalten (Tab. 2.7-7). Auf diese Weise nimmt die Oberfläche der Proben eine horizontale Position ein, während sie ohne Wasser konkav wird (Abb. 2.7-6).

Abb. 2.7-6 Die Oberfläche einer Probe ohne (a) und mit (b) überschichtetem Wasser.

Die Kassette zum Gießen eines Fertiggels, das das TRIS-Formiat-TaurinatPuffersystem enthält, wird folgenderweise aufgebaut: ein Paar Tropfen Wasser werden auf eine Glasplatte aufgetragen, danach wird eine Haftfolie mit den Maßen der Glasplatte mit ihrer hydrophoben Seite auf die Platte aufgelegt. Die Folie wird mit einer Rolle aufgewalzt, um die Luft zwischen der Haftfolie und der Glasplatte hinauszudrücken. Ein 0,5 mm dicker U-fbrmiger Silikonstreifen wird auf die Ränder der oberen (hydrophilen) Seite der Haftfolie aufgelegt und dann mit einer anderen Glasplatte bedeckt. Wenn die Präzisionskassette von DESAGA, Heidelberg zur Verfugung steht, wird diese Prozedur einfacher. Die auf diese Weise aufgebaute Kassette wird mit Klammern befestigt und in Vertikalposition gestellt. Ca. 1/3 des Kassettenvolumens wird mit der Sammelgel-Monomer-

162

2 Elektrophorese der Proteine

der Trenngel-Monomerlösung aufgefüllt. Nach einer Polymerisationsdauer von 30 min bei Zimmertemperatur wird das Gel für die SOS-Elektrophorese verwendbar. Viel komplizierter verläuft das Gießen eines Netzgels. Dafür schlagen wir folgende Prozedur vor: Einige Wassertropfen werden auf eine Glasplatte aufgebracht (s.o.) und sie wird mit einer hydrophoben Polyesterfolie mit den Maßen der Glasplatte bedeckt. Darauf wird ein Polyesternetz gelegt und mit dem Leitpuffer getränkt, der 30 g/dl Glycerin enthält. Der Überschuß des Puffers wird mit einem Filterpapier bedeckt und mittels Walzens abgetrocknet. Auf die Polyesterfolie wird ein U-förmiger Silikonstreifen aufgelegt, so daß er 1-2 mm weit vom Netz entfernt ist. Der Streifen wird mit einer anderen Glasplatte bedeckt, die vorher mit Repel-Silan hydrophobisiert wurde. Die Kassette wird mit Klammern befestigt und von oben nach unten mit Lösungen aufgefüllt, wie oben beschrieben. Nachdem die Lösungen geliert haben, wird die Kassette zerlegt und die Polyesterfolie zusammen mit dem Netzgel auf die Kühlplatte einer Trennkammer gelegt, wie bei einem Foliengel. Nach der Elektrophorese wird das Netzgel ohne die untere Polyesterfolie mit Hilfe von zwei Pinzetten in die Fixierlösung übertragen. Die Fixierung und Färbung der Proteinbanden sowie die Entfärbung des Gelhintergrunds verlaufen schneller und gleichmäßiger in homogenen Gelen, während dieselben Prozesse langsamer und ungleichmäßiger in den Gradientengelen stattfinden. Außerdem behalten die homogenen SDS-Gele ihre ursprüngliche Form nach dem Trockenvorgang, während die Gradienten-SDS-Gele sich verbiegen. Die SDS-Elektrophorese im TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystem wird bei konstantem Strom (konstanter Stromdichte von 0,65 mA/mm2 und elektrischer Spannung von 100-500 V) und Temperatur von 10°C nach folgendem Elektrophoreseprogramm durchgeführt, bis die Farbstoffront den gegenüberliegenden Elektrodenstreifen erreicht hat (Tab. 2.7-8): Tab. 2.7-8 Trennbedingungen bei unterschiedlichen SDS-Gelen. Gelmaße (mm) 77, 85, 80 120 120 120 200 120 250

100

Strom (mA)

Limitierungsspannung (V)

Limitierungsleistung (W)

25 40 65 80

400 500 500 500

10 20 33 40

Einige mit dieser Methode enthaltene Ergebnisse können Abb. 2.7-7 entnommen werden.

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

163

•

«gg. ^^^^

tttftruna·.

·

fl^Wi^

zzt' 3MI^F

-llfiil—5~ II

·

——

^

Abb. 2.7-7 Elektrophoretische Ergebnisse in einem 13 g/dl homogenen SDS-Flachgel. Alternative Proteinkonzentrationen von 0,250 und 0,125 mg/ml. Von links nach rechts: Leberproteine vom Schwein (Stellen l und 2); Muskelproteine vom Rind (Stellen 3 und 4); Proteine der Erdnuß (Stellen 5 und 6); -Globuline vom Rind (Stellen 7 und 8); Proteine von Escherichia coli (Stellen 9 und 10). Auf der 11. Stelle sind Markerproteine (SIGMA, Deisenhofen, MW-SDS-200 Kit) aufgetragen - von oben nach unten: Carboanhydrase von Rindererythrozyten, / = 29 000; Ovalbumin, A/r = 45 000; Rinderserumalbumin, A/r = 66 000; Phosphorylase b aus Kaninchenmuskel, A/r = 97 000; ß-Galactosidase von Escherichia coli, A/r = 116000; Myosin aus Kaninchenmuskel, MT = 205000. Auftragsvolumen von 5 . Elektrophorese bei konstantem Strom von 80 mA (100-500 V) und Temperatur von 10 °C. Laufzeit von 90 min. Färbung mit Coomassie Brillantblau R 250.

Ein anderes Puffersystem, das Taurin enthält, ist das TRIS-Sulfat-TaurinatPuffersystem [34]. Hier ist das Sulfat-Ion das Leition. Der effektive pH-Wert bei diesem System ist 8,9, der nahe dem Taurin-p£c-Wert Hegt, aber weit vom pATc-Wert des TRISlons entfernt ist. Infolgedessen und wegen der niedrigen Elektrolyten-Konzentration, ist die Pufferkapazität des Systems relativ niedrig.

SDS-Disk-Elektrophorese in Gradientengelen In einem Gradientengel wandern die Proteine gegen zunehmende Viskosität. Infolgedessen bewegt sich die Front einer Bande langsamer als ihr Schwanz und die Bande wird schärfer. SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Acetat-TRICINal-Puffersystem. Die SDSDisk-Elektrophorese in Gradientengelen, die in einem TRIS-Acetat-TRICINat-Puffersystem durchgeführt wird, wurde empirisch von Schägger und Jagow [35] entwickelt. Sie ist für die Auflösung der niedermolekularen Proteine (MT < 14 000) besser geeignet als das klassische TRIS-Chlorid-Glycinat-Puffersystem. Außerdem zeigen die hergestellten Gele eine höhere Lagerstabilität, weil sie einen TRIS-Acetat-Puffer mit pH = 6,4 enthalten - einem pH-Wert, bei dem die Hydrolyse des Polyacrylamidgels sehr langsam verläuft. Das TRJS-Acetat-TRICINat-Puffersystem benutzt das TRICINat-Ion als Folgeion anstelle des Glycinat-Ions beim System von Laemmli (Abb. 2.7-8).

164

2 Elektrophorese der Proteine

b Elektrodenpuffer pH = 6,4 Probe im Sammelgel pH = 6,4 Treraigel pH = 7,1

Elektrodenpuffer pH = 7,1

Ac

Tr

Abb. 2.7-8 Schema der SDS-Disk-Elektrophorese in einem TRIS-Acetat-TRICINat-Puffersystem.

Kommerziell wurde das TRIS-Acetat-TRICINat-Puffersystem beim ExcelGel-System (Pharmacia Biotech, Upsalla) verwendet (Kap. 2.16.3). Das ExcelGel-System besteht aus einer Horizontalgelschicht (einem Sammelgel und einem Trenngel) und zwei Polyacrylamidgel-Elektrodengelen. Das Sammelgel hat eine -Konzentration von 5 g/dl bei C = 0,03, während die -Konzentration des Trenngels von 8 auf 18 g/dl bei demselben C-Wert linear steigt. Beide Gele enthalten einen TRIS-Acetat-Puffer mit pH = 6,4 (0,12 mol/1 TRIS, 0,12 mol/1 Essigsäure und l g/dl SDS). Das Anodengel (T = 12 g/dl, C = 0,03) enthält einen TRIS-Acetat-Puffer (0,45 mol/1 TRIS, 0,45 mol/1 Essigsäure, 0,4 g/dl SDS und 0,05 g/dl Orange G, pH = 6,6), das Kathodengel (T = 12 g/dl, C = 0,03) einen TRIS-TRJCINatPuffer (0,08 mol/1 TRIS, 0,8 mol/1 TRICIN und 0,6 g/dl SDS, pH = 7,1). Die elektrophoretische Trennung der Proteine findet bei pH = 7, l statt, also weit von den powerten des TRIS-Ions und des TRICIN: 8,3 bzw. 8,0. Außerdem enthalten die Elektrodengele immer noch das giftige Acrylamid und ihre Handhabung ist, wegen ihrer Konsistenz, kompliziert. Der größte Nachteil der Gradientengele ist aber ihre mühsame und teuere Herstellung. Außerdem verbiegen sie sich beim Trocknen, weil sie sich ungleichmäßig zusammenziehen. Die SDS-Gradientengele für die Disk-Elektrophorese im TRIS-Acetat-TRICINatPuffersystem können nach folgenden Rezepturen hergestellt werden (Tab. 2.7-9):

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

165

Tab. 2.7-9 Rezepturen zur Herstellung von Gradientengelen (120 20 g/dl zur Durchführung von SDS-Disk-Elektrophorese. Puffer-Gel-System

TRIS-Acetat-Puffer, ml (0,64 mol/1, pH = 7,4) Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 20 g/dl SDS, ml 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, ml 10 g/dl APS, ml Dest. Wasser, ml Elektrodenpuffer TRIS-Acetat-Puffer, ml (0,64 mol/1, pH = 7,4) Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 20 g/dl SDS, ml Dest. Wasser, ml

Konzentrationen

250

Hintere Kammer (berechnet för 7 ml Mischung)

0,5 mm) mit T = 4 bis

Vordere Kammer (berechnetför 10ml Mischung)

0,1 6 mol/1

1,75

2,50

Hintere Kammer (7= 20 g/dl) Vordere Kammer (T= 4 g/dl) 0,10 g/dl Hintere Kammer: 0 g/dl Vordere Kammer: 20 g/dl 0,05 g/dl 0,05 g/dl

2,80

0,80

0,04 -

0,05 2,30

0,035 0,035 2,34

0,05 0,05 4,25

Konzentrationen

0,04 mol/1 12,0 g/dl 0,10 g/dl

Elektrodenbrücken

125,0 -

10,0 1875,0

Elektrodengele

30,0 7,20 0,15 -

Um eine Gradientengel-Elektrophorese durchzuführen, wird ein SDS-Polyacrylamidgel auf der Kühlplatte einer elektrophoretischen Kammer plaziert und seine Enden mit Elektrodengelen belegt, wobei das Kathodengel auf das Sammelgel gelegt wird. Im Abstand von 0,5-1,0 cm vor dem Kathodengel wird ein Applikationsband auf das Sammelgel gelegt, leicht angedrückt und je 10 der vorbehandelten Proben pro Schlitz aufgetragen.

2.7.3 Färbung der Proteinbanden Nachdem der Frontmarker Bromphenolblau das anodische Gelende erreicht hat, muß die Elektrophorese gestoppt und die Proteinbanden gefärbt werden. Die Farbstoffe und die SDS-Ionen konkurrieren um dieselben Bindungsstellen auf den Proteinen. Deshalb müssen die SDS-Ionen vor der Färbung entfernt werden. Wenn sie unvollständig aus dem Gel entfernt sind, färben sich die Proteinbanden langsam und schwach. Gewöhnlich fixiert man die Proteinbanden in einer starken Säure, z.B. in 10-20 g/dl Trichloressigsäure, und versucht in derselben Lösung SDS zu entfernen. Dies benötigt aber längere Zeit, da SDS ein saures Salz ist, das sich bei niedrigen pH-Werten schlecht löst. Die Entfernung der SDS-Mizellen kann beschleunigt werden, wenn die Proteinbanden in Methanol-Essigsäure fixiert werden. Das Methanol erhöht den CMC-Wert (s.o.), wo-

166

2 Elektrophorese der Proteine

bei SDS leichter ausgewaschen wird. Die Mischung Alkohol-Essigsäure wirkt aber auf die Fixierung der Proteine unzureichend, so daß niedermolekulare und hydrophobe Proteine im Gel nicht präzipitiert bleiben. Außerdem verringert der relativ niedrige pH-Wert auch hier die Löslichkeit des SDS, so daß die SDS-Entfernung ebenso mühsam verläuft. Wir bieten eine einfache Prozedur zur gleichzeitigen Proteinfixierung und SDS-Entfernung an - in methanolischen oder ethanolischen Lösungen von Glutardialdehyd: SDS, als ein anionisches Detergens, löst sich gut in diesen Lösungen (sie werden neutral oder schwach alkalisch nach der Vermischung mit dem Gel), während das Glutardialdehyd die Proteine in einem räumlichen Netz fixiert. Danach können die Proteinbanden einer Coomassie-, Silber- oder India-Ink-Färbung unterworfen werden (Tab. 2.7-10). Tab. 2.7-10 Gleichzeitige Fixierung der Proteinbanden und SDS-Entfernung aus dem Gel. Färbung mit Coomassie-Brillantblau R 250. Fixierung und SDSEntfernung Färbung Entfärbung Trocknen

20 min in 5 g/l Glutardialdehyd in 300 ml/l Methanol. Gleiche Volumina von 4,0 g/l Coomassie-Brillantblau R 250 in EthanolWasser (6:4, V:V) und 200 ml/1 Essigsäure mischen, und 10 min färben. Einigemal je 30 min in Methanol-Essigsäure-Glycerin-Wasser (3:1:1:5, V: V). Die Polyacrylamidgele unter einer Cellophanmembran (die Agarosegele ohne Cellophanmembran) bei Zimmertemperatur unter einem Fön oder in einem Trockner.

Bei Verwendung von Netz-Polyacrylamidgelen wird die in Tab. 2.7-10 angegebene Zeit halbiert. Andere Färbemethoden, die nach der SOS-Elektrophorese verwendet werden, sind die schnelle Coomassie-Färbung, die kolloidale Färbung und die Silberfärbung. Die kolloidale Färbung hat eine höhere Nachweisempfindlichkeit (ca. 30 ng Protein pro Bande), dauert aber über Nacht. Bei ihr entfällt die Hintergrundentfärbung [36] (Kap. 2.14.1). Die Silberfärbung bietet die höchste Empfindlichkeit, hat leider eine mangelnde Reproduzierbarkeit (Kap. 2.14.2).

2.7.4 Blotting nach der SOS-Elektrophorese Nach einer SDS-Elektrophorese werden oft die Proteine aus dem Gel auf eine immobilisierende Membran (Blotmembran) geblottet (Kap. 2.13) und danach spezifisch oder unspezifisch nachgewiesen. Die einzige Hürde für das Blotting ist die Haftfolie, die undurchlässig für elektrischen Strom ist. Die dünnen foliengestützten Gele können für das Diffusionsblotting verwendet werden. Das Elektroblotten kann mit SDS-Netzgelen durchgeführt werden, da das Netz die freie Bewegung aller Ionen, inklusive die der Protein-SDS-Komplexe, gestattet. Dabei werden sehr gute Ergebnisse in einem TRISTaurinat-PufFer mit pH = 8,5 (kontinuierliches Blotten) oder in einem TRIS-FormiatTaurinat-Puffersystem mit pH = 7,8-8,5 (diskontinuierliches Blotten) erhalten [37] (Abb. 2.7-9).

167

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

Abb. 2.7-9 Semidry-Blotting der Proteine aus einem ri3-SDS-Netzgel nach einer SDS-DiskElektrophorese. Blotten in einem TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystem bei konstantem Strom von l mA/cm2 im Laufe von 30 min. Färbung mit Amidoschwarz 10B.

2.7.5 Bestimmung der Molekülmassen von SDS-denaturierten Proteinen Die Bestimmung der Molekülmassen von SDS-denaturierten Proteinen wird durch Vergleich der Mobilitäten der zu untersuchenden Proteine mit den Mobilitäten der Proteine mit bekannten Massen - der Markerproteine (Tab. 2.7-11) durchgeführt [40, 41]. Grundlage dafür ist die Abhängigkeit der Proteinmobilität von der PolyacrylamidgelKonzentration (7), die mit den Ferguson-Plots angegeben wird (Kap. 1.7.6). Tab. 2.7-11 Relative Molekülmassen (A/r) von Markerproteinen, die zur elektrophoretischen Bestimmung von Molekülmassen verschiedener SDS-denaturierten Proteine verwendet werden. Proteine Immunglobulin M a2-Makroglobulin Thyreoglobulin Ferritin -Makroglobulin (reduziert) Immunglobulin A Immunglobulin G ß-Galactosidase (E. coli) Ceruloplasmin Phosphorylase a (Muskel) Lactoperoxidase Plasminogen Transferrin Rinderserumalbumin Katalase (Leber) Glutamat-Dehydrogenase (Leber) -Kette des IgG

Mr 950 000 380 000 355 000 220 000 190 000 160 000 150000 130000 124000 100 000 93000 81000 76000 66290 57500 53000 50000

Proteine Ovalbumin Alkohol-Dehydrogenase (Leber) Lactat-Dehydrogenase (Muskel) Pepsin Kohlensäure- Anhydrase Carboanhydrase B Chymotrypsinogen Trypsin Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor Myoglobin Hämoglobin Ribonuklease b Lysozym a-Lactalbumin Cytochrom c (Muskel) Insulin (reduziert) Glucagon

Mr

43000 39805 36 180 34700 30000 28739 25666 23300 20095 17200 15500 14700 14314 14 176 11700 6600 3500

168

2 Elektrophorese der Proteine

Die Bestimmung der Masse SDS-denaturierten Proteine erfolgt so, daß man zunächst die RfWerte der Eich- und Probenproteine ermittelt, sodann werden die Rf-Werte gegen den Zehnerlogarithmus der Molekülmassen der Eichproteine aufgetragen. Es resultiert eine Eichgerade. Aus der Wanderungsstrecke des Proteins mit der unbekannten Molekülmasse und der Eichgerade kann die gesuchte Molekülmasse ermittelt werden (Abb. 2.7-10). a h

log M r

logs Abb. 2.7-10 Bestimmung der Molekülmassen mit Hilfe der SDS-Elektrophorese. a) Banden der Probenproteine x, y und z; b) Banden der Markerproteine; c) Eichgerade. A/r - relative Molekülmasse; 5 - Wanderungsstrecke.

Das Verfahren verläuft folgendermaßen: Man mißt die Wanderungsstrecken der Eichproteine und trägt sie auf der Abszissenachse und die Zehnerlogarithmen ihrer relativen Molekülmassen auf der Ordinatenachse eines Koordinatensystems auf. Aus der Verbindung der einzelnen Punkte resultiert eine Eichgerade. Mit ihrer Hilfe kann man von den Wanderungsstrecken der Probenproteine ihre Molekülmassen ermitteln. Bei Verwendung der Beziehung log Mr = log T + b (Mr = relative Molekülmasse, T = Gesamt-Monomerkonzentration in g/dl, a und b = Konstanten) können Molekülmassenbestimmungen von SDS-denaturierten Proteinen mit einer durchschnittlichen Genauigkeit von 6 % durchgeführt werden. Das gilt auch für Papain und Pepsin, die nur Spuren von SDS binden, sowie Ribonuklease und Lysozym, die, obwohl SDS in der üblichen Massenkonzentration binden, in homogenen SDS-Polyacrylamid gelen ein abweichendes Trennverhalten zeigen [40], Die Eichbeziehung zwischen und gilt für lange Trennzeiten (16 h bei 2 V/cm) [41], bei kurzen Trennzeiten gibt es aber erhebliche Abweichungen bei Proteinen mit Molekülmassen, die kleiner als 10 000 bzw. größer als 300 000 sind. Die Wanderungsstrecken der Proteine bei der SDS-Elektrophorese in linearen SDSGradienten-Polyacrylamidgelen und ihre entsprechenden Molekülmassen korrelieren über

169

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

die Beziehung log Mr = a Vs + b [42]. Hierbei ist Mt die relative Molekülmasse, s die zurückgelegte Wanderungsstrecke und a und b Konstanten. Trägt man log MT gegen Vs auf, resultiert, unabhängig von der Elektrophoresedauer, eine Gerade. Diese Beziehung kann auf reduzierte und nicht reduzierte SDS-Protein-Komplexe sowie auf Glykoproteine und auf kohlenhydratfreie Proteine angewandt werden.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Konzentrationen von TMEDA oder APS in der Monomerlösung waren zu niedrig. Die APS-Lösung war zu alt oder unsachgemäß gelagert.

Die Rezeptur für die Gelzusammensetzung überprüfen. Pro I ml Monomerlösung 50 10 ml/dl TMEDA und 50 10 g/dl APS verwenden. Eine neue APS-Lösung verwenden. Bei 4-8 °C hält eine APS-Lösung ca. 2 Wochen. Die Monomerlösung bei Raumtemperatur (25 °C) oder bei 37 °C in einem Trockner oder Brutschrank polymerisieren. Nach dem Gießen die Monomerlösung mit dest. Wasser überschichten.

Vor der Elektrophorese Das Polyacrylamidgel polymerisiert nicht oder wird klebrig.

Die Polymerisationstemperatur war zu niedrig.

Die Geloberkante ist klebrig und löst sich von der Haftfolie. Die Hälfte des Gels ist nicht oder ist unvollständig polymerisiert. Die Monomerlösung polymerisiert zu schnell. Es gibt Luftblasen im Gel.

Der Luftsauerstoff inhibierte die Polymerisation der Geloberkante. Die APS-Lösung hat sich nicht überall mit der Monomerlösung vermischt - am häufigsten beim Gießen eines Gradientengels. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu hoch. Die Luftblasen stammten aus dem Auslaßschlauch des Gradientenmischers. Die Haftfolie oder die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kam, war unsauber.

Das Gel löst sich von der Haftfolie.

Eine falsche Haftfolie wurde verwendet. Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen.

Die APS-Lösung überall mit der Monomerlösung vermischen.

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung reduzieren. Den Auslaßschlauch säubern und trocknen. Die Luftblasen durch heftiges Anklopfen auf die Gießkassette herausdrücken. Die hydrophile Seite der Haftfolie und die gegenseitige Glasplatte nicht mit Fingern berühren. Vor der Benutzung die Glasplatte mit Geschirrspülmittel waschen. Die Haftfolien für die Polyacrylamidund Agarosegele nicht verwechseln. Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen. Vor dem Gießen die richtige Seite mit Wassertropfen prüfen.

170

2 Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Das Gel haftet nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte.

Die Monomerkonzentration war zu niedrig.

Die Acrylamid- oder BIS-Konzentration erhöhen.

Die Glasplatte war zu hydrophil. Das Gel ist zu lange in der Gießkassette geblieben.

Die Glasplatte mit Repel-Silan beschichten. l h nach der Polymerisation das Polyacrylamidgel aus der Gießkassette entnehmen.

Das Polyacrylamidgel hydrolysierte, da der pH-Wert des Puffers über 8,8 betrug.

Die Polyacrylamidgele mit alkalischen

Es gibt Flüssigkeit auf der Oberfläche des Polyacrylamidgels.

Puffern in 2 Wochen verwenden.

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig elektrischer Strom. Die Elektrophorese dauert zu lange (die Front wandert zu langsam). Die Front wandert bogenförmig in einem Gradientengel. Das Gel dampft (der Deckel der Trennkammer wird mit kondensiertem Wasserdampf bedeckt).

Das Gel funkt und brennt.

Es zeigt sich ein Proteinpräzipitat an der Schlitzkante.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Der elektrische Strom fließt teilweise unter der Haftfolie.

Alle Steckverbindungen überprüfen.

Das Gradientengel polymerisierte vor dem horizontalen Ausgleich des Dichtegradienten. Die Kühlung ist ungenügend.

Die APS-Konzentration in beiden Monomerlösungen reduzieren.

Die elektrische Spannung ist zu hoch. Es gibt dünne Stellen im Gel die Haftfolie wurde beim Gelgießen nicht fest auf die Glasplatte der Gießkassette gewalzt. Die Proteine aggregieren beim Eintritt ins Gel. Die freien SH-Gruppen der Polypeptidketten verbinden sich durch Schwefelbrücken und bilden Proteinaggregate, die nicht in die Gelporen eindringen können.

Kerosen oder Silikonöl DC-200 als Kontaktflüssigkeit verwenden.

Die Kühltemperatur senken. Die Kühlblöcke sollen aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein. Die elektrische Spannung reduzieren. Die Haftfolie auf der Glasplatte der Gießkassette festwalzen.

Die Probe verdünnen.

Alkylierung der SH-Gruppen mit lodacetamid.

Nach der Elektrophorese Keine Banden im Gel.

Schwache Proteinbanden im Gel.

Die Kathode und Anode waren vertauscht. Die Proteine haben das Gel verlassen. Die Proteinkonzentration war zu niedrig.

Den Anschluß der Elektroden am Stromversorger überprüfen. Den Lauf der Farbstoffront beachten. Die Proben konzentrieren.

171

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe Die Probe mit Ultraschall behandeln, die Konzentration an SDS erhöhen. Silberfärbung verwenden.

Die Proteinbanden sind unscharf.

Die Probe war nicht vollständig gelöst. Die Nachweisempfindlichkeit der Färbemethode war zu niedrig. Die Protein-SDS-Komplexe wurden nicht ausgebildet. Alte Proben.

Frische Proben ansetzen oder die alten Proben nochmals mit SDS aufkochen, Reduktionsmittel neu zugeben und neu alkylieren. Nach dem Stromabschalten die Proteine sofort fixieren. Vor dem Auftragen die Proben zentrifugieren. In die schwere Monomerlösung weniger APS geben. Die Proben konzentrieren und geringeres Volumen auftragen.

Diffusion nach der Trennung. Die Proteinbanden ziehen Streifen nach. Bogenförmige Banden in einem Gradientengel. Die Proben aus den benachbarten Spuren sind ineinander gelaufen.

Es gab Festbestandteile in der Probe. Es gab Wärmekonvektion bei der Gelpolymerisation.

Das Probenvolumen war zu groß. Die Auftragsschablone lag auf dem Gel nicht dicht auf.

Das Coomassie-Brillantblau hat ungenügende Färbeintensität.

SDS wurde ungenügend aus den Proteinen entfernt. Die Alkoholkonzentration der Entfärbelösung ist zu hoch.

Das Gel löst sich beim Färben von der Haßfolie.

Die Haftfolie rollt sich ein.

Die starken Säuren, die in manchen Lösungen enthalten sind (TCA), hydrolysieren die Bindung zwischen der Haftfolie und einem hochkonzentrierten Gel. Das Gel zieht sich zusammen.

Die SDS-Konzentration sollte in der Probe l g/dl und im Gel 0,1 g/dl nicht unterschreiten.

Nach dem Auflegen die Auftragsschablone leicht andrücken, um keine Luftblasen zwischen der Schablone und dem Gel zuzulassen. SDS vor der Färbung vollständig auswaschen. Länger färben als bei der Nativ-Elektrophorese. Die Ethanol- oder Methanolkonzentration in der Entfärbelösung reduzieren. Die hochkonzentrierten Gele (T > 10 g/dl) mit einem Vernetzungsgrad von C = 0,02 herstellen, anstelle von üblich verwendetem C = 0,03.

In die letzte Lösung 5-10 g/dl Glycerin geben, um das Gel elastischer zu machen.

172

2 Elektrophorese der Proteine

Literatur [1] Hjelmeland LM, Chrambach A, Electrophoresis, 2, l (1981) [2] Shapiro AL, Vinuela E, Maizel JV, Biochem BiophysRes Commun, 28, 815 (1967) [3] Poduslo JF, Anal Biochem, 114, 131 (1981) [4] Eley MH, Burns PC, Kanapell CC, Camphell PS, Anal Biochem, 92, 411 (1979) [5] Aün DT, Shapiro R, Kinka JM, Anal Biochem, 145, 170 (1985) [6] Panyim S, Chalkley R, J Biol Chem, 246, 7557 (1971) [7] Pitt-Rivers R, Impiobato FS A, Biochem J, 109, 825 (1968) [8] Reynolds JA, Tanford C, Proc NatAcadSci USA, 66, 1002 (1970) [9] Weber K, Osbom M,JBiol Chem, 244, 4406 (1969) [10] Laemmli UK, Favre M, J Mol Biol, 80, 575 (1973) [11] Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW, Laemmli UK, J Biol Chem, 252, 1102 (1977) [12] Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 3, 273 (1980) [13] Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG, in Electrophoresis, Allen RC, Arnaud P (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin - New York, S. 257 (1981) [14] Ansorge W, De Maeyer L, J Chromat, 202, 45 (1980) [15] Olsson I, Axiö-Fredriksson ÜB, Degherman M, Olsson B, Electrophoresis, 9, 16 (1988) [16] Pharmacia LKB ExcelGel: Precast gel and buffer Tryckkontakt, Uppsala (1989)

strips for horizontal SDS electrophoresis,

[17] Heukeshoven J, Dernick R, in Electrophoresis Forum '91, Radola BJ (Hrsg.), TU München, München, S. 415(1991) [18] King J, Laemmli UK, Mol Biol, 62, 465 (1971) [19] Maizel Jr JV, Nature, 227, 680 (1970) [20] Swank RT, Munkres KD, Anal Biochem, 35, 462 (1971) [21] Dunker AK, Rueckert RR, J Biol Chem, 244, 5074 (1969) [22] Peisker KZ, Med Lab Diag, 25, 372 (1964) [23] Peisker K, Nahrung, 30, 89 (1986) [24] Maizel JV, in Fundamental Techniques in Virology, Habel K (Hrsg.), Acad Press, New York, S. 334 (1969) [25] Lane LC, Anal Biochem, 86, 655 (1978) [26] Laemmli UK, Nature, 227, 680 (1970) [27] Ornstein L, Ann N Acad Sei, 121, 321 (1964) [28] Davis BJ, Ann N

Acad Sei, 121, 404 (1964)

2.7 SDS-Elektrophorese der Proteine

173

[29] Heukeshoven J, Dernick R, in Electrophoresis Forum '89, Radola BJ (Hrsg.), TU München, München, S. 283 (1989) [30] Michov BM, Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystems und dafür geeignete homogene Elektrophoreseplatten, Deutsches Patent, 4127546, 20.08.1991 [31] Michov BM, Electrophoresis, 6, 471 (1985) [32] Kohlrausch F, Ann Phys, 62, 209 (1897) [33] Debye P, Hückel E, Phys Z, 24, 185 (1923) [34] Schafer-Nielsen C, Electrophoresis, 8, 20 (1987) [35] SchäggerH, Jagow G, Anal Biochem, 166, 368 (1987) [36] Neuhoff V, Stamm R, Eibl H, Electrophoresis, 6, 427 (1985) [37] Michov BM, GIT Fachz Lab, 36, 746 (1992) [38] Shapiro AL, Vinuela E, Maizel JV, Biochem BiophysRes Comm, 28, 815 (1967) [39] Weber K, Osborn MJ, Biol Chem, 244, 4406 (1969) [40] Lambin P, Anal Biochem, 85, 114 (1978) [41] Poduslo JF, Rodbard D, Anal Biochem, 101, 394 (1980) [42] Rothe GM, Electrophoresis, 3, 255 (1982)

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine eine besondere Art von Elektrophorese Die isoelektrische Fokussierung (EEF, Elektrofokussierung) stellt eine Elektrophorese in einem pH-Gradienten dar. Sie wird zur Trennung von amphoteren Substanzen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten, z.B. Proteinen bzw. Enzymen, Poly- und Oligopeptiden verwendet. Im Laufe der isoelektrischen Fokussierung verlieren die amphoteren Substanzen allmählich ihre effektiven Gesamtladungen (Kap. 1.3.3) im pH-Gradienten, verlangsamen dadurch ihre Geschwindigkeit und fokussieren (konzentrieren) an ihren isoelektrischen Punkten. Die Richtung und die Geschwindigkeit der elektrophoretischen Wanderung eines amphoteren Polyions in einem pH-Gradienten hängt von seiner effektiven Gesamtladung ab, die es am jeweiligen pH-Wert aufweist. Ein Protein mit einer positiven effektiven Ladung, z.B. wandert in Richtung Kathode, wobei es bei steigendem pH-Wert des pHGradienten durch Deprotonierung allmählich seine Ladung verliert. Das dauert so lange bis die Zahl seiner negativen und positiven Ladungen sich ausgleicht und somit seine effektive Gesamtladung gleich Null wird, d.h. bis es seinen isoelektrischen Punkt (pl) erreicht. Entfernt sich das Polyion, z.B. durch Diffusion, von seinem pl-Punkt, erhält es wieder eine positive oder negative Ladung, die es zur Rückwanderung zwingt. Es gibt zwei Möglichkeiten zur Ausbildung eines pH-Gradienten (Kap. 1.5.3): durch freie Ampholyte (Trägerampholyte), die in einem elektrischen Feld einen freien pH-Gradienten aufbauen, oder durch immobilisierte Ampholyte (Immobiline), die an einem Polyacrylamidgel kovalent gebunden werden und einen immobilisierten pH-Gradienten (IPG) ausbilden. pH-Gradienten wurden zum erstenmal von Ikeda und Suzuki beobachtetet [1]. Sie stellten fest, daß bei der Elektrolyse eines Proteinhydrolysats in einer Trennkammer die sauren Aminosäuren sich an der Anode, die neutralen in der Mitte und die basischen an der Kathode sammelten, wobei sich ein pH-Gradient bildete. Später entwickelte Kolin [2] instabile pH-Gradienten in den Difrusionszonen zwischen Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten und erhielt während der Elektrophorese scharfe Proteinbanden. Die Herstellung von stabilen und gleichmäßigen pH-Gradienten beruht auf der Theorie von Svensson (Rilbe) [3, 4] über die Erzeugung von pH-Gradienten mit beweglichen (freien) Ampholyten (Kap. 1.5.3): wenn ein Gemisch aus Hunderten von Ampholyten mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten sich in einem elektrischen Feld befindet, bildet sich von selbst ein pH-Gradient aus. Aufgrund dieser Vorstellungen synthetisierte Vesterberg [5, 6] die ersten Trägerampholyte mit puffernden Carboxyl- und Aminogruppen. Später wurden andere Trägerampholyte synthetisiert, die zusätzlich zu den Carboxyl- und Aminogruppen Reste der Phosphor- und Schwefelsäure enthalten [7]. Die isoelektrischen Punkte der meisten Proteine und Peptide befinden sich im pHBereich 3 bis 11 (Kap. 1.3.3), der durch einen pH-Gradienten von 3 bis 10 überdeckt wird. Der 3-10-pH-Gradient kann seinerseits in gewünschte pH-Unterbereiche gespreizt werden: sollte z.B. ein Proteingemisch im pH-Bereich 5-6 fokussiert werden, müssen entsprechende Trägerampholyte verwendet werden; sollten die Proteine ihre pl-Punkte im Bereich 5,4-5,7 haben, muß der pH-Gradient noch enger ausgebildet werden.

2.8 Isoelektrische Fokussiening der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

175

Die isoelektrische Fokussiening mit Trägerampholyten wird in unterschiedlichen Trennmedien wie Polyacrylamidgel [8, 9], Agarosegel [10, 11], Acetylcellulose-Folien [12, 13] und granulierten Gelen [14, 15] durchgeführt. Diese Träger stabilisieren die pH-Gradienten, dürfen aber keinen Molekülsiebeffekt aufweisen. Die isoelektrische Fokussierung hat eine weitreichende Verwendung. Mit ihrer Hilfe wurden z.B. mehr als 300 Hämoglobin-Varianten beschrieben [16, 17] und Lipoproteine [18, 19], Phänotypen der oq-Antithrypsine [20, 21], Urinproteine [22, 23], Globuline [24, 25], Speichelproteine [26, 27], die Katalase [28] und viele andere Proteine analysiert. Außerdem wurden Fleischproteine [29, 30], Kartoffelsorten [31, 32] und Weizensorten [33, 34] untersucht sowie genetische Analysen in der forensischen Medizin [35, 36] durchgeführt.

2.8.1 Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten Die Trägerampholyte stellen ein heterogenes Gemisch unterschiedlicher niedermolekularer aliphatischer Oligoamino-Oligocarbonsäuren mit eng benachbarten pl-Punkten von 2,5 bis 11 dar. In einem elektrischen Feld wandern sie bis sie ihre pl-Punkte erreichen und bilden somit einen pH-Gradienten. Ein pH-Gradient mit Trägerampholyten sollte folgende Eigenschaften haben: • Der pH-Gradient muß in allen seinen Punkten genügend Pufferkapazität verfügen; • Die Pufferkapazität und Leitfähigkeit des pH-Gradienten müssen gleichmäßig verteilt werden; • Der pH-Gradient muß möglichst linear sein. Das ist mit der Zahl der Trägerampholyte verbunden - je mehr Komponenten die Trägerampholytmischung bilden, um so "glatter" wird der pH-Gradient. Der Kontakt der Elektroden zum Trennmedium erfolgt über Elektrodenlösungen, deren pH-Werte niedriger bzw. höher als die minimalen bzw. maximalen pl-Punkte der Trägerampholyte sind.

Eigenschaften der Trägerampholyte Die Trägerampholyte sind Zwitterionen. Ihre chemische Formel - CH, - N - (CH,)r - N - CH, l l CH,2 l NH2

CH, l 2 C02H

zeigt, daß sie saure Carboxylgruppen sowie basische Aminogruppen enthalten. Um einen stabilen und gleichmäßigen pH-Gradienten zu gewährleisten (Kap. 1.5.3), sollten die idealen Trägerampholyte: • Aus sehr vielen Komponenten gebildet werden, um einen gleichmäßigen pH-Gradienten zu erzeugen; • Niedrige Molekülmassen (MT < 1000) haben, um schnell ihre pl-Punkte zu erreichen;

176

2 Elektrophorese der Proteine

• Genügend Pufferkapazität und Leitfähigkeit an ihren pl-Punkten zeigen. Die Pufferkapazität muß so hoch sein, daß die Trägerampholyte auch in Gegenwart anderer geladener Ionen, z.B. Protein-Polyionen, den pH-Wert entlang des pH-Gradienten bestimmen. Die pH-Gradientenbereiche, die eine niedrigere Leitfähigkeit haben, werden einer erhöhten Spannung ausgesetzt und somit lokal überhitzt, was seinerseits zur Reduzierung der Feldstärke in den anderen Teilen des pH-Gradienten führt. Da die pK-Werte der Trägerampholyte und der zu analysierenden Proteine temperaturabhängig sind, sollte die isoelektrische Fokussierung bei einer konstanten Temperatur durchgeführt werden, am besten bei 10 °C. Zur Analyse der Proteine kann auch KryoIEF verwendet werden, die bei -10 bis -20 °C vollzogen wird [37]. Entstehung eines pH-Gradienten. Die Trägerampholyte befinden sich in einer homogenen Verteilung bis ein elektrisches Feld angelegt wird. Die Ausbildung eines pHGradienten erfolgt in drei Etappen (Abb. 2.8-1): 1. Die Trägerampholyte beginnen, entsprechend ihren effektiven Ladungen, zur entgegengesetzten Elektrode zu wandern. Trägerampholyte mit pl-Punkten, die niedriger als der pH-Wert des Trennmediums sind, tragen negative Ladungen und wandern deswegen zum anodischen Gelende. Trägerampholyte mit pl-Punkten, die höher als der pH-Wert des Trennmedium sind, tragen positive Ladungen und wandern zum kathodischen Gelende. Infolgedessen entstehen zwei steile pH-Gradienten in der Elektrodennähe mit einem pH-Plateau dazwischen. 2. Die engen pH-Gradienten verbreitern sich, während das pH-Plateau schmaler wird. 3. Das pH-Plateau verschwindet und beide pH-Gradienten bilden einen linearen pH-Gradienten aus. pH

10 9 8 7 6 5 4 3

Zeit Abb. 2.8-1 Entwicklung eines pH-Gradienten mit Trägerampholyten. a, b und c - Stadien der Gradientenentstehung.

Die Trägerampholytionen in einem ausgebildeten pH-Gradienten besitzen keine elektrophoretische Mobilität mehr. Sie sind jedoch nirgendwo fixiert und können sich im Trennmedium frei bewegen. Damit sind sie zwei schädlichen Einflüssen ausgesetzt: der Elektroosmose und den fremden Puffern. Die Elektroosmose fuhrt zum Kathodendrift des Wassers, was unerwünschte Deformationen des pH-Gradienten zur Folge haben

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

177

kann. Die fremden Puffer, z.B. die in den Proteinproben, können, besonders bei einer hohen Konzentration der Proteine oder Elektrolyte (Salze), lokalen Deformationen des pH-Gradienten verursachen, die "krumme" Proteinbanden zur Folge haben (Abb. 2.8-2).

a

b

Abb. 2.8-2 Einfluß der lonenstärke der Probe auf das Bandenaussehen, a) Proben mit geringer lonenstärke; b) Proben mit hoher lonenstärke.

Da die Pufferkapazität eines pH-Gradienten niedrig ist, wird der pH-Gradient vom Kohlendioxid in der Luft beeinflußt. Das Kohlendioxid verbindet sich mit Wasser im Gel und bildet Kohlensäure, die die pH-Werte des pH-Gradienten bei pH > 8,2 um 0,2-0,3 pH-Einheiten senkt [38] Außerdem verursachen die im Gel gebildeten Hydrogencarbonat-Ionen HCÜ3" eine Anodendrift des pH-Gradienten. Der Einfluß des Kohlendioxids kann folgenderweise minimiert werden: • Die Geloberfläche kann mit einer dünnen Polyesterfolie bedeckt werden; • Die Elektrofokussierung kann in einer geschlossenen Trennkammer unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt werden; oder • In die Trennkammer können mit konzentriertem NaOH getränkte Filterkartons eingelegt werden, wobei NaOH das Kohlendioxid bindet. Hohe Konzentrationen von Glycerin, Sorbit oder Saccharose verändern auch den pH-Gradienten, wenn ihre Konzentration höher als 10-15 ml(g)/dl ist. Tiiralionskurvenanalyse. Die Fokussierungsgele mit Trägerampholyten können auch zur Ermittlung von Protein-Titrationskurven verwendet werden. Damit erhält man Information über den isoelektrischen Punkt eines Proteins sowie über seine Mobilität bei unterschiedlichen pH-Werten. Die Titrationskurvenanalyse [39] verläuft folgendermaßen: In einem quadratischen Flachgel mit Trägerampholyten und einer schmalen Gelrinne in der Mitte wird eine isoelektrische Fokussierung in Richtung der Gelrinne durchgeführt, bis sich ein von links nach rechts steigender pH-Gradient ausbildet. Dann wird das Gel um 90° gedreht und die Elektrodenstreifen entfernt. Eine Proteinlösung wird in die Gelrinne einpipettiert und eine Elektrophorese bei elektrischer Spannung von 600 V im Laufe von 10 bis 45 min senkrecht zum pH-Gradienten durchgeführt. Während der Elektrophorese bleiben die

178

2 Elektrophorese der Proteine

Trägerampholyte an ihrem Ort, da sie an ihrem pl keine effektiven Ladungen haben, die Protein-Polyionen wandern aber mit unterschiedlichen Mobilitäten, in Abhängigkeit vom pH-Wert des pH-Gradienten, und bilden Titrationskurven aus [40, 41], die den klassischen Säuren- und Basen-Titrationskurven ähneln. Der pl eines Proteins befindet sich an der Stelle, wo die Gelrinne seine Titrationskurve schneidet (Abb. 2.8-3). Gelrinne Protein-Titrationskurve

10

Elektrophorese

pH

Isoelektrische Fokussierung

Abb. 2.8-3 Titrationskurvenanalyse.

Separator-Elektrofokussierung. Die Auflösung des pH-Gradienten kann durch Zugabe von entsprechenden Separatoren, ebenso als pH-Gradienten-Modifizierer bekannt, erhöht werden [42, 43]. Die Separatoren stellen Aminosäuren oder amphotere Puffersubstanzen dar, die den pH-Gradienten in der Nähe ihrer isoelektrischen Punkte abflachen und somit die Auflösung in diesem pH-Bereich steigern. Bekannte Separatoren sind z.B. Tetraglycin (pl = 5,2), Prolin (pl = 6,3), Threonin (pl = 6,5), ß-Alanin (pl = 6,9), 5-Aminovaleriansäure (pl = 7,5), 7-Aminocaprylsäure, Histidin (pl = 7,6) und 6-Aminocapronsäure (pl = 8,0). Mit 0,33 mol/1 ß-Alanin wurde z.B. das glykosylierte HbAj c vom eng benachbarten HbA, der Hämoglobin-Hauptbande, in einem pH-Gradienten von 6-8 getrennt [44].

IEF mit Trägerampholyten in Polyacrylamidgelen Das am häufigsten verwendete Trennmedium für die isoelektrische Fokussierung ist das Polyacrylamidgel - in einer Konzentration von T= 4-5 g/dl und C = 0,03 für die Elektrofokussierung von Proteinen und in einer Konzentration von T = 10 g/dl und C = 0,025 für die Elektrofokussierung von Oligopeptiden. Da das Polyacrylamidgel keine polaren Gruppen besitzt, können bei der IEF sehr hohe Feldstärken eingesetzt werden, ohne störende elektroosmotische Effekte zu verursachen. Polyacrylamidgele haben keine adsorptiven Eigenschaften, sind chemisch äußerst widerstandsfähig und werden von Enzymen nicht angegriffen. Ihre Porengröße kann durch Variieren der Polyacrylamidkonzentration und des Vernetzungsgrades bestimmt werden. Polyacrylamidgel ist aber zur Auftrennung von Makromolekülen, deren relative Molekülmassen MT = 500 000 übersteigen, nicht geeignet. Solche Polyionen können nur in Agarosegelen fokussiert werden.

179

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Die isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen kann in Rundgelen [45, 46] sowie in Flachgelen [47, 48] durchgeführt werden. Gegenwärtig läßt die Bedeutung der Rundgele und der vertikalen Flachgele nach und sie werden von horizontalen Flachgelen verdrängt. Die horizontalen Flachgele weisen gegenüber den Rund- und Vertikalgelen wichtige Vorteile auf: l. Sie ermöglichen den direkten Vergleich vieler Proben in einem Gel unter identischen Trennbedingungen (bei den vertikalen Flachgelen ist dies auch möglich); 3. Die Probenauftragsstelle kann zwischen der Kathode und Anode beliebig variiert werden; 4. Der pH-Gradient kann mit einer Oberflächenelektrode direkt gemessen werden. Dünne und ultradünne Polyacrylamidgele für die IEF mit Trägerampholyten. Im Laufe der Zeit haben sich die dünnen [49, 50] und ultradünnen [51, 52] Flachgele aus Polyacrylamid zur Durchführung der isoelektrischen Fokussierung durchgesetzt. Ein nächster Fortschritt war die Einführung dünner, auf Haftfolie polymerisierter Polyacrylamidgele. Mit der Verringerung der Geldicke auf 0,5 mm und weniger verbesserte sich die Kühlung des Gels. Dies ermöglichte eine Elektrofokussierung bei höheren elektrischen Spannungen, was zu einer schnelleren und schärferen Trennung führte. Außerdem wurden das Probenvolumen sowie die Reagenzkonzentration (z.B. die der Trägerampholyte) reduziert und die Zeit beim Färben, Entfärben und Trocknen des Gels verkürzt. Heute werden vorbehandelte Polyester-Haftfolien (z.B. GelBond, FMC, Rockland, Me.) geliefert, die zur Haftung von dünnen und ultradünnen Polyacrylamidoder Agarosegelen vorgesehen sind [53]. Bei der isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten werden in der Regel Polyacrylamidgele mit T= 5 g/dl und C = 0,03 verwendet. Die übliche Konzentration der Trägerampholyte im Gel ist 2-2,5 g/dl (Tab. 2.8-1). Tab. 2.8-1 Rezepturen zum Gießen von Polyacrylamidgelen für die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten. Innenmaße der Gießkassette 120 250 0,5 mm, Innenmaße der Klappkassette 120 240 mm. Komponenten

Konzentration

Kassettentechnik 16 ml Mischung Geldicke 0,5 mm

Klapptechnik 6 ml Mischung Geldicke 0,15 mm

Für wasserlösliche Proben Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 40 g/dl Trägerampholyte, ml 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, 10 g/dl APS, Bidest. Wasser, ml

7= 5 g/dl

1,6

0,6

2 g/dl 20 g/dl 0,05 ml/dl 0,05 g/dl

0,8 3,7 80,0 80,0 9,7

0,3 1,4 30,0 30,0 3,6

180

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.8-1 Fortsetzung. Komponenten

Konzentration

Kassettentechnik 16 ml Mischung Geldicke 0,5 mm

Klapptechnik 6 ml Mischung Geldicke 0,15 mm

=5 g/dl

1,6

0,6

2 g/dl 6-9 mol/1 20 g/dl 0,05 ml/dl 0,05 g/dl

0,8 5,8-8,6 3,7 80,0 80,0 9,7

0,3 2,2-3,2 1,4 30,0 30,0 3,6

Für wasserunlösliche Proben Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 40 g/dl Trägerampholyte, ml Harnstoff, g 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, 10 g/dl APS, Bidest. Wasser, ml

Da die Trägerampholyte selbst tertiäre Aminogruppen besitzen, kann eine Trägerampholyten-haltige Monomerlösung auch ohne TMEDA polymerisieren. Rehydratisierbare Polyacrylamidgele für IEF mit Trägerampholyten. Die Polymerisation einer Monomerlösung in Gegenwart von Trägerampholyten benötigt eine höhere Konzentration von Ammoniumperoxodisulfat, was den pH-Gradienten beeinflußt. Außerdem, wie auch bei anderen Polyacrylamidgelen, wird die Polymerisation durch den Luftsauerstoff gehemmt, deshalb muß die Monomerlösung mit einer Wasserstrahlpumpe entlüftet werden. Um das Ammoniumperoxodisulfat und die Monomerreste zu beseitigen, werden rehydratisierbare Gele verwendet [54, 55], Sie polymerisieren ohne Zugabe von Trägerampholyten, werden danach mit Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Vor der EEF werden die rehydratisierbaren Gele in 2 g/dl Trägerampholyten mit 20-30 ml/dl Glycerin gequollen (rehydratisiert), bis sie ihre ursprüngliche Dicke erreichen. Die rehydratisierbaren Gele besitzen gegenüber den nassen Gelen folgende Vorteile: • Die Katalysatoren (TMEDA und hauptsächlich APS) und die Acrylamid- und BISReste werden aus dem Gel ausgewaschen. Das wirkt sich positiv aus, weil die Ionen von Ammoniumperoxodisulfat und TMEDA und die gewöhnlich in sehr geringen Konzentrationen vorhandene Acrylsäure Elektroosmose sowie Iso-pH-Linien bei der isoelektrischen Fokussierung verursachen; • Die Trägerampholyte stören die Haftung der Gele an der Haftfolie, sofern sie in der Monomerlösung anwesend sind. Wenn ein Gel zusammen mit Trägerampholyten polymerisiert ist, löst es sich in einer sauren Lösung, z.B. von TCA, teilweise oder völlig von der Haftfolie ab. Führt man die Trägerampholyte erst mit der Rehydratisierungslösung zu, bleibt die Haftung gut; • Die nichtionischen Detergenzien, die der Monomerlösung beigemischt werden, um die Löslichkeit der hydrophoben Proteine zu erhöhen, inhibieren ebenfalls die Haftung des Gels an der Haftfolie. Diese Probleme gibt es bei den rehydratisierbaren Gelen nicht sie können mit Triton X-100, Nonidet NP-40 oder zwitterionischen Detergenzien, wie CHAPS, in beliebiger Konzentration rekonstituiert werden.

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

181

• Rehydratisierbare Gele können bei -20 °C unbegrenzt lange gelagert werden. Die rehydratisierbaren Gele haben aber auch Nachteile: • Das Waschen, Trocknen und Rehydratisieren kostet Zeit; • Die rehydratisierbaren Gele neigen zur Wasserabscheidung auf der Geloberfläche. Die Rehydratisierzeit (Quellzeit) für 0,5 mm dicke Gele beträgt in der Regel 2 Stunden. In Anwesenheit von Harnstoff und nichtionischen oder zwitterionischen Detergenzien muß sie aber bis über Nacht verlängert werden (Tab. 2.8-2). Tab. 2.8-2 Unterschiedliche Rehydratisierungslösungen und ihre Anwendung. Rehydratisierungslösungen

Dauer

Anwendung

4 g/dl Ampholine, 2 ml/dl Nonidet NP-40

über Nacht

Membranproteine [56], alkalische Phosphatase [57] Serum VLDL, Apolipoprotein E [58]

8 mol/1 Harnstoff, 0,5 g/dl Ampholine, über Nacht 30 ml/dl Glycerin 8 mol/I Harnstoff, 0,5 g/dl Ampholine, über Nacht 50 mmol/1 DTT 9 mol/1 Harnstoff, 0,5 ml/dl Nonidet NP-40 über Nacht

Globine, Plasma, getrocknetes Vollblut, Erythrozytenlysat [59] hydrophobe Proteine, komplexe Proteine, 2D-Elektrophorese [60]

Ein Maß für die erfolgreiche Durchführung der Rehydratisierung ist das Aussehen der Geloberfläche - das rehydratisierbare Gel sollte die ganze Rehydratisierungslösung aufsaugen und keine Lösung sollte auf der Geloberfläche verblieben sein. Wenn die Rehydratisierungslösung eine höhere Konzentration eines nichtionischen Detergens enthält, z.B. Nonidet NP-40 oder Triton X-100 in einer Konzentration über l ml/dl, kann es vorkommen, daß nach dem Quellen die Oberfläche schmierig ist. In diesem Fall muß die Oberfläche mit einem fusselfreien Filterpapier abgetrocknet werden.

IEF mit Trägerampholyten in Agarosegelen Das Agarosegel stellt eine Alternative zum Polyacrylamidgel zur Durchführung der isoelektrischen Fokussierung von Polyionen mit hohen Molekülmassen dar [61, 62], da es weite Poren hat und, auch bei geringen Konzentrationen, eine hohe Stabilität zeigt. Die Stabilität des Agarosegels beruht auf seiner dreidimensionalen Struktur, die durch Wasserstoffbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten wird. Heute sind die Agarosegele ein unverzichtbares Trennmedium für die IEF von Proteinen mit hohen Molekülmassen (MT > 100 000). Das Agarosegel hat aber auch einen wesentlichen Nachteil - seine elektrisch geladenen Gruppen verursachen elektroosmotische Effekte. Das Agarosegel wurde für die isoelektrische Fokussierung eingesetzt, nachdem es gelang, durch Abtrennung von Agaropektin-Resten aus dem Agar die elektrischen Ladungen der Agarose fast völlig zu entfernen [63, 64]. Es ist aber immer noch mit starker Elektroosmose bei den Agarosegelen zu rechnen, die die Auflösung der isoelektrischen Fokussierung vermindern.

182

2 Elektrophorese der Proteine

Die IEF findet meistens in 0,8-1,0 g/dl Agarosegelen statt. Sie haben gegenüber den Polyacrylamidgelen wichtige Vorteile: • Die Agarose ist ungiftig; • Die Herstellung der Agarosegele durch Abkühlen von Agaroselösungen stellt ein einfaches Verfahren dar, das keine Katalysatoren braucht. Nach der Produktion enthalten die Agarosegele keine verbliebenen Monomere und Nebenprodukte, die auf die Proteine schädlich einwirken können, • Das Agarosegel hat geringe Viskosität, da es großporig ist. Das erlaubt die isoelektrische Fokussierung aller möglichen Makromoleküle - bis zu einer relativen Masse von einigen Millionen; • Die Agaroseporosität begünstigt die Durchführung unterschiedlicher immunologischer Methoden , z.B. der Immunfixation; • Durch Zusatz von linearem Polyacrylamidgel ist es möglich, rehydratisierbare Agarosegele herzustellen [65]. Trotz dieser Vorteile zeigt das Agarosegel wichtige Nachteile, die ihre Verwendung als ein Trennmedium für die isoelektrische Fokussierung von sehr großen Proteinen beschränken: • Die Agarosegele sind immer noch nicht elektroosmosefrei, da sie immer noch geladene Carboxyl- und Sulfatgruppen enthalten; • Harnstoff-Agarosegele können schwer hergestellt werden, da der Harnstoff die Ausbildung der Agarosegel-Helixstruktur stört. Dünne und ultradünne Agarosegele für IEF. Wie beim Polyacrylamidgel gewinnen mehr und mehr die dünnen [66, 67] und ultradünnen [68] Agarosegele an Popularität, da sie eine nützliche Verwendung bei der Elektrofokussierung der hochmolekularen Proteine (Mr > 100 000) finden. Die Herstellung dieser Gele ist in Kap. 1.7.5 beschrieben worden. Wenn die Agarosegele Harnstoff enthalten sollten, muß die Agarosekonzentration 2 g/dl betragen und das Gießen bei einer Temperatur durchgeführt werden, die nicht höher als 65 °C ist. Danach muß das Gel über Nacht bei Raumtemperatur gelieren. Die Agaroselösungen, die zum Gießen von Agarosegelen verwendet werden, enthalten in der Regel außer l g/dl Agarose noch 2,0 g/dl Trägerampholyte und 10 g/dl Sorbit oder 30 g/dl Glycerin.

Durchführung der IEF in Gelen mit Trägerampholyten Probenvorbereitung. Die Proteine in der Probe müssen vollständig aufgelöst werden und eine Konzentration haben, bei der die Proteinbanden im Pherogramm sichtbar werden. Für die Coomassie-Brillantblau-Färbung reicht es, wenn die Gesamtproteinkonzentration in der Probe etwa l g/dl, für die Silberfärbung etwa 0,1 g/dl beträgt. Das Auftragsvolumen sollte am besten zwischen 5 und 10 liegen. Die stark verdünnten Proteinlösungen können durch Ultrafiltration konzentriert werden (Kap. 2.7.1). Die isoelektrische Fokussierung von löslichen Proteinen wird in der Regel von keinen Schwierigkeiten begleitet, da sie a priori gelöst sind. Die hydrophoben Proteine, z.B. Lipoproteine, dürfen nicht mit Hilfe eines ionischen Detergenses, z.B. SDS, gelöst werden, sondern mit Hilfe von 8-9 mol/1 Harnstoff. Falls die Proteine, z.B. Membranproteine, immer noch ungelöst sind, kommen zusätzliche nichtionische Detergenzien

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

183

(Nonidet NP-40, Triton X-100) in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2 ml/dl oder zwitterionische Detergenzien (CHAPS) in Betracht [69, 70]. Der Harnstoff und die Detergenzien lösen die Quartärstruktur der Proteine auf und entfalten die Polypeptidketten. Die Disulfidbrücken zwischen den Polypeptidketten werden durch Zugabe von 1,4-Dithiothreitol aufgespalten. Die lonenstärke (eine Funktion der Salzkonzentration, Kap. 1.2.1) der Probe muß auf ein Minimum reduziert werden, da eine lonenstärke, die höher als die im Gel ist, bei der isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten lokale Gradientendriften verursacht. Als eine kritische obere Grenze der Salzkonzentration in einer Proteinprobe wurde 20 mmol/1 angegeben [71], sie sollte aber am besten 5 mmol/1 betragen. Wenn nötig, können die Proben durch Dialyse, Gelfiltration und Ultrafiltration entsalzt werden (Kap. l .7.1). Probenauftrag. Die Probe kann auf unterschiedliche Weise aufgetragen werden: direkt auf die Geloberfläche in Form von kleinen Tröpfen; in die Löcher einer Schablone aus Silikongummi, Polyesterfolie u.a., die parallel zu den Elektrodenstreifen auf das Gel gelegt wird; auf Plättchen aus Filterpapier, Glasfaserpapier, Acetylcellulose-Membran oder anderen Materialien, die vorher auf das Gel gelegt worden sind; oder mit Applikatorplättchen, die mit der Probe getränkt sind (Abb. 2.8-4).

Abb. 2.8-4 Probenauftrag bei der IEF. a) direkt auf die Geloberfläche; b) in die Löcher einer Schablone; c) auf Plättchen auf dem Gel; d) mit Applikatorplättchen, die mit der Probe getränkt sind.

Von all diesen Verfahren ist der Auftrag der Proben in die Löcher einer Schablone die bequemste Technik. Die Schablone muß mindestens 10 mm vom Elektrodenstreifen entfernt sein. Beim Probenauftrag durch aufgelegte oder mit der Probe getränkten Papier- oder Glasfaserplättchen wird ein Restvolumen der Probe vom Plättchen zurückgehalten, deswegen sollten sie nach einer gewissen Zeit entfernt werden. Bei der Vertikalelektrophorese können die Proben nur am oberen Gelende aufgetragen werden. Danach gehen, je nach dem Trennsystem, die anodisch oder die kathodisch wandernden Proteine im oberen PufFertank verloren.

184

2 Elektrophorese der Proteine

Elektrodenlösungen. Während der isoelektrischen Fokussierung finden an den Elektroden elektrolytische Prozesse statt. An der Kathode, wo ein Elektronenüberschuß besteht, bilden sich Hydroxid-Ionen: 2e" 2 OH l

2HO-H

+

H,

an der Anode, wo Elektronenmangel herrscht, werden Protonen abgegeben:

2e2H

H2jO

1/20,

Infolgedessen sinkt der pH-Wert am anodischen Ende des Gels, während der pH-Wert an seinem kathodischen Ende sich erhöht. Um den pH-Gradienten stabil zu halten, werden entsprechende Elektrodenlösungen verwendet - eine Säure am Anodenende des Gels bzw. eine Base an seinem Kathodenende (Tab. 2.8-3). Wenn ein saurer Trägerampholyt mit der Anodenlösung in Kontakt tritt, lädt sich seine basische Gruppe positiv und er wird von der Kathode angezogen, und umgekehrt. Es darf keinen großen Unterschied zwischen den Leitfähigkeiten des Gels und des Elektrodenstreifens geben, sonst treten lokale Überhitzungen auf, die zum Austrocknen des Gels fuhren. Die Elektrodenlösungen können zusätzlich 30-40 ml/dl Glycerin enthalten, was das Austrocknen der Elektrodenstreifen verhindert. Tab. 2.8-3 Elektrodenlösungen für Polyacrylamid- und Agarosegelen.

Polyacrylamidgel

Agarosegel

die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten in

pH-Gradient

Anodenlösung

Kathoden lösung

3 -10

0,5 mol/1 H3P04

0,5 mol/1 NaOH

0,25 mol/1 Essigsäure

0,25 mol/1 NaOH

0,025 mol/1 Asparaginsäure und 0,025 mol/1 Glutaminsäure

0,025 mol/1 Lysin und 0,025 mol/1 Arginin

5 -8

0,04 mol/1 Glutaminsäure

0,25 mol/1 NaOH

3 -7

0,04 mol/1 Glutaminsäure

0,2 mol/1 Hisüdin

6 -8

0,25 mol/1 HEPES

0,2 mol/1 Histidin

3 -10

0,5 mol/1 Essigsäure

0,5 mol/1 NaOH

Der Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden wird über 5-7 mm breite Filterpapierstreifen vermittelt. Der Anodenelektrodenstreifen enthält die saure Lösung, der Kathodenelektrodenstreifen die basische Lösung.

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

185

Durchführung der isoelektrischen Fokussierung. Die Papierelektrodenstreifen werden auf eine Glasplatte gelegt und gleichmäßig mit den entsprechenden Elektrodenlösungen getränkt. Danach werden die überschüssigen Elektrodenlösungen abgetupft und die Papierelektrodenstreifen auf das Gel gelegt. Die isoelektrische Fokussierung in foliengestützten Gelen mit Trägerampholyten wird nach folgendem Schema durchgeführt: Auf die Kühlplatte einer elektrophoretischen Kammer werden 0,5-1,0 ml Kerosen, Silikonöl DC 200 oder andere minderflüchtige Alkane als Kühlvermittler gegeben und ein Gel wird mit der Haftfolie nach unten so aufgelegt, daß keine Luftbläschen zwischen der Folie und der Kühlplatte eingeschlossen bleiben. • Die Elektrodenstreifen, mit der Anoden- bzw. Kathodenlösung getränkt, werden auf beide Gelenden gelegt; • Die Gele werden vorfokussiert, damit sich die pH-Gradienten ausbilden können und einige unerwünschte Ionen, z.B. APS- und TMEDA-Ionen im Gel in Richtung beider Elektrodenstreifen wandern. Bei einer Trennstrecke von 10 cm dauert die Vorfokussierung 30-60 min bei 400-500-1000 V. Gele mit erhöhter GlycerinKonzentration und rehydratisierte Gele erfordern keine Vorfokussierung; • Die Proben werden mit Hilfe von Applikationsstreifen aufgetragen, etwa 5-10 je Schlitz; • Nach der Vorfokussierung wird auf das Gel eine Auftragsschablone aufgelegt. In deren Schlitze werden jeweils 5-10 entsalzte Proben mit einer Proteinkonzentration von 0,1-0,5 mg/ml aufgetragen. Danach werden die Gelenden mit den entsprechenden Papierelektrodenstreifen bedeckt (Abb. 2.8-5); • Die Feldstärke wird stufenweise von 50-100 V/cm bis auf 300-500 V/cm erhöht, abhängig vom pH-Bereich und der Konzentration der Trägerampholyte, der Geldicke, Glycerin-Konzentration, Kühltemperatur und Stabilisierung des Gels durch Folie oder Gewebe. Wegen der besseren Wärmeableitung vertragen die gewebegestützten Gele höhere Feldstärken als die foliengestützten Gele. Bei den Standard-Trennstrecken von 10 cm wird für die meisten Proteine ein Gleichgewicht nach 5000-20000 Vh erreicht. Als Kriterium für das Gleichgewicht kann der Ausgleich von anodisch und kathodisch aufgetragenen Proben gelten; • Nachdem die Hälfte der Elektrofokussierungszeit vorbei ist, muß die isoelektrische Fokussierung unterbrochen und die Auftragsschablone entfernt werden sowie die überschüssige Lösung an den Elektrodenstreifen mit Filterpapier abgesaugt werden. Die IEF in gewebegestützten Gelen wird in folgenden Schritten durchgerührt: • Das gewebegestützte Gel, zusammen mit seiner Deckfolie, wird direkt (ohne Zwischenfolie und ohne Kühl Vermittler) auf die auf 15 °C gekühlte Kühlplatte der elektrophoretischen Kammer gelegt. Danach werden die eventuellen Luftblasen vorsichtig mit einem Fotoroller entfernt und die Deckfolie abgezogen; • Die Elektrodenstreifen, auf die Gelgröße zugeschnitten und mit den entsprechenden Elektrodenlösungen getränkt, werden auf die Gelenden gelegt; • Auf das Gel wird ein Applikationsband aufgelegt und leicht angedrückt, um guten Kontakt zu ermöglichen. In seine Löcher werden je 5-10 der Proben auftragen; • Die Elektroden werden auf die Elektrodenstreifen auflegt und die isoelektrische Fokussierung (bei Gelen mit einer Trennstrecke von 10 cm) mit 200V Anfangsspannung gestartet;

186

2 Elektrophorese der Proteine

• Die elektrische Spannung wird alle 30 min um 400 V, danach, ab 1000 V, alle 30 min um 500 V erhöht, bis eine maximale Spannung von 3000 V erreicht wird. Bei Gelen mit hoher Glycerin-Konzentration werden Spannungen bis zu 6000 V angelegt; • Die Elektrofokussierung wird bei der maximalen Spannung bis zum gewünschten Vh-Produkt fortgesetzt. Kathodenstreit'en

Auftragsschablone

Anodenstreifen

Abb. 2.8-5 Gel mit Trägerampholyten, das mit Papierelektrodenstreifen und einer Auftragsschablone bedeckt ist.

Die isoelektrische Fokussierung in einem Standard-Gel (120 250 0,5 mm) wird im Laufe von ca. 3 h bei 10 °C, konstanter Leistung von 8-12 W und einer Limitierungsspannung von 2000-3000 V durchgeführt. Sie muß bei definierten Temperaturen durchgeführt werden, da die pH-Werte im Gel sowie die Trennbarkeit der Proteine temperaturabhängig sind. Für die meisten IEF-Methoden eignet sich eine Temperatur von 10 °C. In Gegenwart von 9 mol/1 Harnstoff darf man aber die Temperatur 15 °C nicht unterschreiten, um das Auskristallisieren von Harnstoff zu vermeiden. Eine konstante Leistung hat sich bei der isoelektrischen Fokussierung als die bequemste Einstellung erwiesen. Zu Beginn der Elektrofokussierung tragen die Trägerampholyte hohe effektive Ladungen, deswegen hat das Gel eine hohe Leitfähigkeit. Mit der Annäherung an ihren isoelektrischen Punkten und der Bildung des pH-Gradienten verlieren sie aber ihre Ladungen und damit ihre Mobilität. Deswegen sinkt ihre Leitfähigkeit, was die Steigerung der elektrischen Spannung verursacht. Somit ergibt sich während der isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten ein typisches StromSpannung-Verhältnis - der elektrische Strom fallt, die elektrische Spannung steigt, die elektrische Leistung bleibt konstant. Wenn man über keinen Stromversorger mit konstanter Leistungsregelung verfügt, kann die elektrische Spannung während der IEF stufenweise erhöht werden. Es gibt fast keinen Unterschied zwischen der Durchführung einer isoelektrischen Fokussierung in einem Polyacrylamidgel und einem Agarosegel. Wichtig ist, daß vor der isoelektrischen Fokussierung die Oberfläche des Agarosegels mit einem Filterpapier abgetrocknet wird, um den beim Aufbewahren gebildeten oberflächlichen Flüssigkeitsfilm zu entfernen. Eine Vorfokussierung bei Agarosegelen ist zu vermeiden, weil die Kathodendrift in

187

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Eine Vorfokussierung bei Agarosegelen ist zu vermeiden, weil die Kathodendrift in einem Agarosegel st rker als in einem Polyacrylamidgel ausgepr gt ist. Au erdem mu man zwischendurch die isoelektrische Fokussierung unterbrechen und das bersch ssige Wasser an den Elektrodenstreifen mit Filterpapier absaugen. Die isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamid- und Agarosegelen verl uft im Prinzip unter denselben Bedingungen (Tab. 2.8-4). Tab. 2.8-4 Elektrophoretische Bedingungen f r die isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamid- bzw. Agarosegelen mit 2 g/dl Tr gerampholyten bei 10 °C und einer Trennstrecke von 10 cm. pH-Intervall

Zeit

Leistung

Spannung

Strom

60min 90 min

Die Spannung auf 300 V einstellen. Die Spannung auf 300 V einstellen.

maximal maximal

maximal maximal

10min 120 min 15min 180 min

Wie bei der Vorfokussierung. Die Leistung um Faktor 2,5 erh hen. Wie bei der Vorfokussierung. Die Leistung um Faktor 2,5 erh hen.

200V maximal 200V maximal

maximal maximal maximal maximal

30 min 60 min

Die Spannung auf 500 V einstellen.

maximal

maximal

Die Spannung auf 500 V einstellen.

maximal

maximal

Polyacrylamidgele Vorfokussierung pH = 3,5-10 Enge pH-Gradienten (2 pH-Einheiten) Fokussierung pH = 3,5-10 Enge pH-Gradienten (2 pH-Einheiten) Agarosegele pH = 3,5-10 Enge pH-Gradienten (2 pH-Einheiten)

Der Leistungs-, Spannungs- und Stromverlauf w hrend der Elektrofokussierung sind in Abb. 2.8-6 dargestellt. ,W

ί/,ν

/,mA

6

/

5 4 3

1500

,·"'

Χ

15 10

1000 _,--*"

2

500

r>

5

^--"·~'~'

Ι

Ι

ι

ι

ι

ι

ι

ι

10

20

30

40

50

60

70

80

η min

Abb. 2.8-6 Ein typischer Verlauf der Leistung (P), der Spannung (U) und des Stroms (7) bei isoelektrischer Fokussierung mit Tr gerampholyten in einem Polyacrylamidgel mit den Ma en 120 χ 250 χ 0,250 mm in einem pH-Gradienten von 3-10 bei 10 °C im Laufe von 90 min. Leistungsbegrenzung auf 5 W, Spannungsbegrenzung auf 2000 V und Strombegrenzung auf 20 mA. Λ - - - [ / , · · 7.

188

2 Elektrophorese der Proteine

pH-Messung. Die pH-Werte im Gel werden meistens mit Oberflächenelektroden mit einem Meßmembrandurchmesser von 3-4 mm gemessen. Eine anderes viel langsameres Verfahren zur Messung der pl-Werte in einem pH-Gradienten ist die pH-Messung der eluierten Gelstückchen: Das Gel wird in gleiche Stückchen geschnitten, jedes Stückchen in einem kleinen Volumen von 10 mol/1 KC1 eluiert und der pH-Wert der Elutionslösung gemessen. Ein drittes Verfahren zur Messung der pH-Gradienten wird nach der Erstellung einer Eichkurve durchgeführt, die sich mittels fokussierter Markerproteine mit bekannten plWerten ergibt. Auf diese können die pl-Werte der zu untersuchenden Proteine extrapoliert werden. Am häufigsten werden folgende Markerproteine verwendet (Tab. 2.8-5): Tab. 2.8-5 Häufig verwendete Markerproteine. Markerproteine

pl-Werte

Amyloglucosidase von Aspergillus niger Ferritin aus Pferdemilz Albumin aus Rinderserum ß-Lactoglobulin aus Rindenmilch Conalbumin

3,6 4,2, 4,3, 4,5 4,8 5, l 5,9

Myoglobin vom Pferd

6,8, 7,2

Myoglobin vom Wal LDH aus Kaninchenmuskel Ribonuklease Cytochrom c

7,7, 8,2 8,6 9,5 10,7

Färbung der Proteinbanden. Nach der isoelektrischen Fokussierung werden die Gele gewöhnlich mit Coomassie-Brillantblau oder Silber gefärbt. Wir schlagen folgende Färbung mit Coomassie-Brillantblau R 250 vor: Fixieren Färben

Entfärben Trocknen

20 min in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V) oder 10 g/dl CC13CO2H. Gleiche Volumina von 4,0 g/l Coomassie-Brillantblau R 250 in Methanol-Wasser (6:2, V:V) und 200 ml/l Essigsäure mischen und 20 min färben. Einigemal in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V: V). An der Luft unter einer auf dem Gel gespannten Cellophanmembran bei Raumtemperatur oder mit einem Fön.

Andere Färbemöglichkeiten sind die schnelle Färbung mit Serva Violett 17 und die Silberfärbung (Kap. 2.14.1 und 2.14.2). Bei den Agarosegelen ist die Silberfärbung nicht so erfolgreich wie bei den Polyacrylamidgelen, weil im basischen Bereich des Agarosegels immer eine starke Elektroosmose vorhanden ist.

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

189

2.8.2 Isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten Die immobilisierten pH-Gradienten (IPG) wurden von Gasparic, Bjellqvist und Rosengren [72] eingeführt. Sie bestehen aus pH-bestimmenden Substanzen (Immobilinen), die an das Polyacrylamidgel gebunden sind [73, 74]. Die Verteilung der Immobiline erfolgt beim Gießen des Gels und nicht von selbst, wie bei den Trägerampholyten. Somit wird die Kathodendrift, die bei der IEF mit Trägerampholyten vorhanden ist, bei den immobilisierten pH-Gradienten ausgeschlossen. Dies ist besonders wichtig für die IEF in engen pH-Gradienten, wo die Kathodendrift sich klar bemerkbar macht. Außerdem wird der kovalent am Gel gebundene pH-Gradient bei längeren Elektrofokussierungszeiten nicht geändert. Die isoelektrische Fokussierung in IPG-Gelen hat gegenüber der IEF mit Trägerampholyten folgende Vorteile: • Die IPG sind stabile pH-Gradienten, die durch keine äußeren Einflüsse (Elektroosmose, höhere lonenstärken der Proben oder Proteinüberladungen) deformiert werden - es bilden sich keine verzogenen Iso-pH-Linien. • Die immobilisierten pH-Gradienten weisen eine gleichmäßige Pufferkapazität und Leitfähigkeit entlang des Gels auf. Dies kann bei den Trägerampholyten nicht garantiert werden, weil nicht alle ihre Komponenten in gleicher Konzentration vorliegen. • Die IPG-Gele besitzen eine geringe Leitfähigkeit, da die Immobiline sich nicht frei bewegen können. Dadurch entwickelt sich während der isoelektrischen Fokussierung äußerst wenig Wärme, selbst bei sehr hohen elektrischen Spannungen. • Die immobilisierten pH-Gradienten sind ein Bestandteil des Polyacrylamidgels. Dadurch gibt es keine Randeffekte - die Trennungen können auch in schmalen Gelstreifen durchführt werden. • Die Auflösung der IEF in immobilisierten pH-Gradienten ist extrem hoch. Sie übertrifft die Auflösung der IEF mit Trägerampholyten um das 10-20fache und erlaubt, daß Proteine, deren pl-Werte sich nur um 0,001-0,002 pH-Einheiten unterscheiden, sich in einem ultraengen pH-Intervall, d.h. in einem pH-Intervall, der enger als eine pH-Einheit ist, voneinander trennen [75]. Während die Auflösung der isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten maximal 0,02 pH-Einheiten/cm ist, kann die Auflösung der isoelektrischen Fokussierung in IPG-Gelen 0,001 pHEinheiten/cm erreichen. Die isoelektrische Fokussierung in IPG-Gelen hat aber auch Nachteile: • Die Herstellung der immobilisierten pH-Gradienten ist kompliziert und auf die Polyacrylamidgele angewiesen. • Die IPG-Gele sind nicht vollkommen inert wie die Polyacrylamidgele. Dies kann Proteinabsorption verursachen. • Während der IEF wird eine sehr hohe elektrische Spannung benötigt. • Die elektrophoretischen Trennungen dauern zu lange.

Eigenschaften der Immobiline Die Immobiline sind niedermolekulare Acrylamid-Derivate, die puffernde Gruppen tragen. Ihre allgemeine Strukturformel ist

190

2 Elektrophorese der Proteine

CH, = CH — C — N — R

II

O

l

H

wobei der Rest R entweder eine saure Gruppe (Carboxylgruppe) oder eine basische Gruppe (tertiäre Aminogruppe) enthält. Mittels seiner Methylengruppe nimmt das Immobilin an der Copolymerisation des Acrylamids und BIS teil. Es sind sieben Immobiline bekannt (Pharmacia Biotech, Uppsala), die folgende Dissoziationskonstanten pKc haben: 3,6, 4,4, 4,6, 6,2, 7,0, 8,5 und 9,3. Die Immobiline werden in einer Stammkonzentration von 0,2 mol/1 geliefert. Sie polymerisieren und hydrolysieren spontan [76, 77], deswegen wird empfohlen [78], 0,005 mg/ml Hydrochinonmonomethylether den Stammlösungen der sauren Immobiline (mit pK = 3,6, 4,4, und 4,6) zuzugeben und die vorwiegend basischen Immobiline (mit pK = 6,2, 7,0, 8,5 und 9,3) in w-Propanol zu lösen. Somit können die Stammlösungen der Immobiline über Monate und Jahre bei 4 °C aufbewahrt werden. Sie dürfen nicht eingefroren werden. Dünne und ultradünne IPG-Gele. Die dünnen und ultradünnen IPG-Gele (Kap. 1.7.6) werden bei der IEF am meisten verwendet. In der Praxis der isoelektrischen Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten werden 0,5 mm starke sowie ultradünne Gele bevorzugt [79]. Die dünnen und ultradünnen IPG-Gele haben mehrere Vorteile gegenüber den dicken (über 1,0 mm) IPG-Gelen: • Die isoelektrische Fokussierung in dünnen und ultradünnen Gelen zeichnet sich durch effektivere Wärmeableitung bei höheren Feldstärken aus, wodurch sich die Trennzeit reduziert; • Die verkürzte Trennzeit vermindert die Diffusion, was schärfere Proteinbanden zur Folge hat; • Die dünnen und ultradünnen Gele werden schneller fixiert, gefärbt und getrocknet. Die Herstellung der immobilisierten pH-Gradienten stellt eine Säure-Base-Titration zwischen zwei Immobilin-Lösungen dar, die gleiche Konzentration an Acrylamid und BIS haben. Der entstehende pH- Wert an jedem Punkt des pH-Gradienten kann durch die Henderson-Hasselbalchsche-Gleichung berechnet werden. Falls das Immobilin eine Säure ist, ergibt sich die Gleichung -- , C

(2.8-1)

C

HA - B

falls es eine Base ist - die Gleichung C

B - CHA pH =pKc + log - , C HA

(2.8-2)

wobei pKc die Dissoziationskonstante der puffernden Immobilingruppe ist und CHA bzw. e die molaren Konzentrationen des sauren bzw. basischen Immobilins sind.

191

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Die LPG-Gele werden mit Hilfe eines Gradientenmischers (Kap. 1.6.5) hergestellt [80], wie die Gradientengele (Kap. 1.7.6), wobei die schwere und die leichte Lösung unterschiedliche Immobiline in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. Die Mischkammer wird mit der sauren Lösung gefüllt, das Reservoir mit der basischen Lösung. Die saure Lösung enthält 25 ml/dl Glycerin (schwere Lösung), die basische Lösung 5 ml/dl Glycerin (leichte Lösung). Man hat sich darauf geeinigt, daß die schwere Lösung sauer ist und den unteren Teil des immobilisierten pH-Gradienten bildet und daß die leichte Lösung basisch ist und den oberen Teil des pH-Gradienten aufbaut. Für die EEF von Proteinen werden Gele mit T = 4 g/dl und C = 0,04, für die EEF von Oligopeptiden Gele mit T= 10 g/dl und C = 0,025 empfohlen. Die Gießkassette ist identisch mit der in Kap. 1.6.5 beschriebenen Gießkassette. Das Volumen einer Standard-Gießkassette (mit inneren Maßen von 120 250 0,5 mm) beträgt ca. 15 ml. Deswegen werden, mit einer Reserve von l ml, in die Mischkammer eines angeschlossenen Gradientenmischers 8 ml schwere Lösung und in sein Reservoir 8 ml leichte Lösung eingefüllt. Die benötigten Immobilinvolumina können entweder aus den mit dem Computer ausgerechneten Tabellen entnommen (Tab. 2.8-6, 2.8-7 und 2.8-8) werden. Tab. 2.8-6 Volumina der sauren (schweren) Ksj und basischen (leichten) 0,2 mol/1 Immobilin-Lösung Vbi, die zum Gießen eines 15-ml-Gels (120 250 0,5 nun) mit einem breiten immobilisierten pH-Gradienten von 2 bis 6 pH-Einheiten benötigt werden [81, 76]. Beide Lösungen enthalten Monomere in gleicher Konzentration, die schwere Lösung enthält mehr Glycerin (s.o.). Saure (schwere) Lösung Vsj ( ) von 0,2 mol/l Immobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8,5 9,3 159 303 221 37 232 411 719 356 213 308 374 415 289 314 442 502 442 300 588

119 53 128 228 240

59 135 135 310 125 247 -

84 234 266 221 189 172 147

240 222 214 125 116 146 124 159 243

60 111 99 145 237 194 71 50 202 62 74 130 12 146 47

23 287 198 121 189 185 194 187 91 424 139 133 121 178

451 186 50 43 65 150 118 68 -

pH-Intervall

3,5- 5,0 4,0- 6,0 4,5- 6,5 5,0- 7,0 5,5- 7,5 6,0- 8,0 6,5- 8,5 7,0- 9,0 7,5- 9,5 8,0-10,0 4,0- 7,0 5,0- 8,0 6,0- 9,0 7,0-10,0 4,0- 8,0 5,0- 9,0 6,0-10,0 4,0- 9,0 5,0-10,0 4,0-10,0

Basische (leichte) Lösung Vfri ( ) von 0,2 mol/l Immobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8,5 9,3 113 208

185 153 102 258 110 49 161 93 129 48 53 78 11 -

165 278 304 253

394 66 295 133 226 31 61

248 147 130 144 126 93 82

81 70 86 192 140 178 192 18 27

125 117 153 173 148 124 493 175 143 184 239 173 76 113 193 158 224 260

385 158 171 151 175 193 101 74 195 185 126 187 178 156 127 38 165 84

291 185 154 467 120 149 154 122 174 354 146 190

192

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.8-7 Volumina der sauren (schweren) Va und basischen (leichten) 0,2 mol/1 Immobilin-Lösung Vbi, die zum Gießen eines 15-ml-Gels (120 250 0,5 mm) mit einem engen immobilisierten pHGradienten von l pH-Einheit im pH-Interval 3,8-10,5 benötigt werden [76, 82]. Beide Lösungen enthalten Monomere in gleicher Konzentration, die schwere Lösung enthält mehr Glycerin (s.o.). Saure (schwere) Lösung Vsj ( ) von 0,2 mol/l Immobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8,5 9,3 _

300 244 188 116 84 60 667 563 479 413 361 319 286 259 238 222 518 444 385 339 301 271 248 229 215 203 548 524 500 656 553 472 407 356 315

482 436 403 380 367 364 369 382 320 360 400 460 460 460 . -

_

_

_

460 460 460 460 460 460 723 621 542 482 436 404 380 367 364 369 -

579 510 457 418 390 373 364 365 374 393 400 400 400 -

400 400 400 711 613 535 476 432 400

pH-Intervall

Basische (leichte) Lösung il) Vbi von 0,2 mol/l Immobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8,5 9,3 _

69 75 84 94 108 125 147 173 -

3,8-4,8 3,9-4,9 4,0-5,0 4,1-5,1 4,2-5,2 4,3-5,3 4,4-5,4 4,5-5,5 4,6-5,6 4,7-5,7 4,8-5,8 4,9-5,9 5,0-6,0 5,1-6,1 5,2-6,2 5,3-6,3 5,4-6,4 5,5-6,5 5,6-6,6 5,7-6,7 5,8-6,8 5,9-6,9 6,0-7,0 6,1-7,1 6,2-7,2 6,3-7,3 6,4-7,4 6,5-7,5 6,6-7,6 6,7-7,7 6,8-7,8 6,9-7,9 7,0-8,0 7,1-8,1 7,2-8,2 7,3-8,3 7,4-8,4 7,5-8,5 7,6-8,6 7,7-8,7 7,8-8,8 7,9-8,9 8,0-9,0

. 180 151 129 111 97 86 77 70 64 60 140 119 104 91 81 73 67 62 58 55 292 268 244 177 149 127 110 96 85

_

195 201 397 428 471 529 604 701 460 460 460 460 460 460 -

460 460 460 460 428 380 386 370 364 366 377 397 428 471 529 604 -

m

366 364 370 386 411 448 498 564 649 758 400 400 400

_

. 400 400 400 384 369 364 366 379 400

135 149 311 351 402 465 545 644 56 80 108 132 180 236 -

193

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese Tab. 2.8-7 Fortsetzung. Saure (schwere) Lösung Vsi ( }) von 0,2 mol/l Jmmobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8,5 9,3 _ - 379 283 - 366 257 . 236 - 364 - 369 220 . 207 - 384 . 701 644 . . . 604 545 . 465 529 . 471 402 . 351 428 . 397 311 . 377 280 . 366 255 . 235 364 370 219 -

pH-Intervall 8,1-9,1 8,2-9,2 8,3-9,3 8,4-9,4 8,5-9,5 8,6-9,6 8,7-9,7 8,8-9,8 8,9-9,9 9,0-10,0 9,1-10,1 9,2-10,2 9,3-10,3 9,4-10,4 9,5-10,5

Basische (leichte) Lösung Vfoi ( ) von 0,2 mol/l Jmmobilin mit pK 3,6 4,6 6,2 7,0 8.5 9,3 76 69 63 59 56 173 147 125 108 94 84 75 69 63 59

. . . . . . . . . -

.

-

432 476 535 613 711

.

.

_ 382 369 364 367 380 403 436 482 542 621

Tab. 2.8-8 Volumina der sauren (schweren) Va und basischen (leichten) 0,2 mol/l Immobilin-Lösung Pjji, die zum Gießen eines 15-ml-Gels (120 250 0,5 mm) mit einem extrem sauren immobilisierten pH-Gradienten benötigt werden (81, 76). Beide Lösungen enthalten Monomere in gleicher Konzentration, die schwere Lösung enthält mehr Glycerin (s.o.). Extrem saurer pH-Bereich y^j ( ) von 0,2 mol/l Immobilin mit pK VSj ( ) von 0,2 mol/l Immobilin mit pK 3,6 4,4 4,6 6,2 9,3 pH-Intervall 3,6 4,4 4,6 6,2 9,3 _ _ _ _ _ _ 3,8-4,8 400 400 85 315 3,9-4,9 432 356 379 96 3,5-5,0 165 248 159 84 113 119

Die in Tab. 2.8-6, 2.8-7 und 2.8-8 gegebenen Rezepturen können auch durch einfache graphische Interpolationen zur Herstellung von beliebigen maßgeschneiderten immobilisierten pH-Gradienten im pH-Bereich 3,5-10,5 verwendet werden. Ermitteln wir z.B. die Immobilin-Volumina, die zur Herstellung des pH-Gradienten 4,7-5,2 benötigt werden, müssen wir folgenden Weg gehen (Abb. 2.8-7): • Aus Tab. 2.8-6 oder 2.8-7 wählen wir die Rezeptur jenes pH-Gradienten aus, der den gewünschten pH-Bereich einschließt - in unserem Falle den pH-Gradienten 4,5-5,5; • Die Volumina der sauren und der basischen Immobilin-Lösung dieses pH-Gradienten tragen wir auf Millimeterpapier auf und verbinden sie durch Geraden; • Der saure und der basische Endpunkt des gewünschten Gradienten markieren wir auf der pH-Gradienten-Achse und ziehen durch sie vertikale Linien; • An den Schnittpunkten zwischen den Vertikallinien und den Verbindungsgeraden lesen wie die Volumina der Immobilin-Lösungen des gewünschten pH-Gradienten ab.

194

2 Elektrophorese der Proteine Volumen der sauren Immobiline, l

Volumen der basischen Immobiline,

800

800

600

600

400

400

200

200

4,1

4,2

4,3

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

5,0 5,1 pH-Gradient

Abb. 2.8-7 Graphische Interpolation eines maßgeschneiderten immobilisierten pH-Gradienten mit pH = 4,3-4,8. Auf der Ordinatenachse sind die Volumina der Immobilin-Lösungen aufgetragen. Aus der Grafik ergibt sich, daß zur Erstellung von 8,0 ml saurer (schwerer) Lösung mit pH = 4,3 365 der Immobilin-Stammlösung mit pK = 4,6 und 137 der Immobilin-Stammlösung mit pK - 9,3 nötig sind, und von 8,0 ml basischer (leichter) Lösung mit pH = 4,8 399 der Immobilin-Stammlösung mit pK = 4,6 und 258 der Immobilin- Stammlösung mit pK = 9,3 benötigt wird.

Nachdem die saure und die basische Lösung zusammengemischt sind, müssen sie ad pH = 7,0 titriert werden. Der pH-Wert von 7,0 stellt eine gleichmäßige Copolymerisation der Monomere und Immobiline sicher. Die Titration wird in der Regel mit HC1 und TMEDA durchgeführt. Nebenbei kann der benötigte pH-Wert von 7,0 durch einen 0,125 mol/l TRIS-Hydrogenphosphat-PufFer mit pH = 7,0 erreicht werden. Nach der Polymerisation werden HC1, TMEDA und der TRIS-Hydrogenphosphat-Puffer aus dem Gel ausgewaschen und das Gel getrocknet. Ein Beispiel zur Vorbereitung einer Monomer-Immobilin-Lösung wird in Tab. 2.8-9 gezeigt. Nachdem die beiden Immobilin-Lösungen vorbereitet sind, wird die saure Lösung mit TMEDA und die basische Lösung mit HC1 ad pH = 7,0 titriert. Dafür werden ca. 80 10 ml/dl TMEDA und 100 0,4 mol/l HC1 verbraucht.

195

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Tab. 2.8-9 Herstellung von L sungen f r ein 120 χ 250 χ 0,5 mm dickes IPG-Gel (7" = 4 g/dl, C = 0,03) mit einem pH-Gradient von 4 bis 10.

Monomerl sung (T = 50 g/dl, C = 0,03), ml Immobiline pK = 3,6, μΐ pK = 4,6, μΐ pK = 6,2, μΐ pK = 7,0, μΐ p/: =8,5, μΐ pK = 9,3, μΐ 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, μΐ 10 g/dl APS, μΐ Bidest. Wasser, ml, ad

Saure L sung pH = 4,0

Basische L sung pH = 10,0

0,64 588,0 243,0 48,0 178,0 2,2 80,0 70,0 8,0

0,64 61,0 27,0 260,0 84,0 190,0 0,4 80,0 70,0 8,0

Mit dem Gradientenmischer wird ein linearer pH-Gradient hergestellt, der nach der Polymerisation fest mit dem Polyacrylamidgel verbunden bleibt (Abb. 2.8-8). Durch Auswahl der Immobiline und Variation ihrer Konzentrationen lassen sich auch ultraenge pH-Gradienten (bis zu 0,01 pH/cm) herstellen. Dabei ist eine maximale Aufl sung von 0,002 pH-Einheiten zu erreichen [83, 84]. Basisches Gelende

Saures Gelende

Abb. 2.8-8 Schema eines Polyacrylamidgels mit copolymerisierten Immobilinen.

Rehydralisierbare IPG-Gele. Nach dem Gie en kann ein IPG-Gel sofort verwendet oder getrocknet werden. Vor dem Trocknen mu das Gel 3 mal je 20 min mit bidest. Wasser und 20 min in 2-5 ml/dl Glycerin unter Sch tteln gewaschen und danach mittels eines Ventilators in einer staubfreien Kammer getrocknet werden. Das getrocknete Gel wird in eine Folie eingeschwei t und im K hlschrank bei 4-8 °C f r einige Tage oder im Gefrierschrank bei -20 °C f r unbegrenzte Zeit aufbewahrt. Das getrocknete Gel, das als

196

2 Elektrophorese der Proteine

rehydratisierbares Gel bezeichnet wird (Kap. 1.7.6), kann zu einer späteren Zeit mit entsprechenden Lösungen rehydratisiert (gequollen, rekonstituiert) werden. Bei der Verwendung einer Rehydratisierungslösung muß man folgendes beachten: Wenn die Harnstoff-Konzentrationen höher als 9 mol/1 im Gel sind, kristallisiert Harnstoff aus. Dasselbe passiert bei niedrigeren Konzentrationen von Harnstoff, aber einer isoelektrischen Fokussierung bei unter 15 °C. Außerdem zerfällt der Harnstoff im Gel zu Ammoniumcyanat, deswegen muß das Harnstoff-hakige rehydratisierte Gel innerhalb eines Tages verwendet werden. Bei der Herstellung von Harnstoff-Lösungen ist auch zu berücksichtigen, daß 1,2 g Harnstoffsich in 1,0 ml Wasser löst. Detergenzien helfen dem Harnstoff bei der Denaturierung der Proteine. Reduktionsmittel zerlegen die Disulfid-Brücken und damit die Proteine zu ihren Polypertidketten. Glycerin bzw. Sorbitol oder Saccharose wirken einem möglichen elektroosmotischen Fluß im Gel entgegenwirken und dadurch erhöhen sie die Auflösung, der isoelektrischen Fokussierung. Gleichzeitig aber beeinflussen diese Additive den pH-Gradienten. Es ist auch eine isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten in Anwesenheit von Trägerampholyten (carrier ampholytes, CA) bekannt, die als HybridIEF [85, 86] oder als IPG-CA bezeichnet wird. Bei dieser Methode verringern die Trägerampholyte die Tendenz, Protein-Polyionen vom immobilisierten pH-Gradienten absorbiert zu werden [87, 88]. Sie werden so ausgewählt, daß der durch sie entstehende pH-Gradient den immobilisierten pH-Gradienten einschließt.

Durchführung der IEF in IPG-Gelen Die Probenvorbereitung für die isoelektrische Fokussierung in IPG-Gelen unterscheidet sich nicht von der für die IEF mit Trägerampholyten. Die Entsalzung der Probe ist hier jedoch keine notwendige Forderung, da die immobilisierten pH-Gradienten durch hohe lonenstärken nicht gestört werden. Bjellquist u.a. [89] empfehlen, daß die Salzkonzentration bei der IEF in IPG-Gelen 100 mmol/1 nicht überschreitet, was 5 mal höher als die kritische Salzkonzentration bei der IEF mit Trägerampholyten ist. Bei der Herstellung von Zell-Lysaten empfiehlt sich die Zugabe von 8 mmol/1 PMSF als Protease-Inhibitor [90]. Der Probenauftrag auf IPG-Gele unterscheidet sich ebenfalls nicht vom Probenauftrag auf Gele mit Trägerampholyten (s.o.). Dafür haben sich die perforierten Silikonauftragsbänder als sehr bequem erwiesen. Die Präzipitation der Probe am Auftragsort tritt aber bei der IEF in immobilisierten pH-Gradienten stärker auf als bei der IEF mit Trägerampholyten. Dies kann bei der Hybrid-isoelektrischen Fokussierung vermieden werden. In diesem Fall muß die Probe auch Trägerampholyte (in einer Konzentration von 10 g/dl) enthalten [91]. Als Elektrodenlösungen für die IEF in IPG-Gelen sowie für die Hybrid-IEF werden 0,1 g/dl NaOH oder 0,01 mol/1 Lysin (als Kathodenlösung), und 0,1 g/dl H3PO4 oder 0,01 mol/1 Glutaminsäure (als Anodenlösung) verwendet. Es genügt auch, wenn die beiden Elektrodenstreifen nur mit dest. Wasser getränkt sind. Die isoelektrische Fokussierung in IPG-Gelen wird folgenderweise durchgeführt: • Das IPG-Gel wird aus dem Gefrierfach entnommen und bei Raumtemperatur belassen. Erst wenn es die Raumtemperatur angenommen hat, wird seine Verpackung geöffnet

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

197

und das Gel in einer Rehydratisierungskassette rehydratisiert, bis es seine ursprüngliche Dicke erreicht; • Auf die Kühlplatte einer Trennkammer werden einige Tropfen von Kerosen (Siedepunkt 70 °C) oder einem anderen wenig flüchtigen Alkan gegeben und das Gel wird mit der Haftfolie nach unten aufgelegt, so daß sich zwischen der Trennkammer und der Haftfolie ein luftblasenfreier Film bildet, der einen gleichmäßigen Wärmeaustausch sicher stellt; • Die meistens mit Wasser getränkten Elektrodenstreifen werden über das kathodische bzw. anodische Ende aufgelegt; • Die Proben werden aufgetragen; • Der Kammerdeckel wird aufgelegt und der Stromversorger eingeschaltet; Die IEF in IPG-Gelen wird in der Regel bei 10 °C durchgeführt. Es ist darauf zu achten, daß die Gelseite mit dem niedrigen pH-Wert an der Anode und die Gelseite mit dem höheren pH-Wert an der Kathode in Kontakt tritt. Wenn die Gele Harnstoff enthalten, muß die Trenntemperatur 15 °C betragen, da bei niedrigen Temperaturen der Harnstoff auskristallisiert. Da der pH-Gradient fest am Gel gebunden und vollständig ausgebildet ist, benötigt die isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten keine Vorfokussierung. Die IEF in IPG-Gelen verläuft in zwei Phasen: Während der ersten Phase wandern die Proteine bei konstanter elektrischer Spannung ins Gel ein. Dafür wird die elektrische Leistung und der elektrische Strom auf Maximalwerte eingestellt und die elektrische Spannung auf 120-300 V, damit die Feldstärke möglichst niedrig wird (bis 40 V/cm). Wenn die Anfangs-Feldstärke zu hoch ist, präzipitieren die Proteine teilweise. Da die puffernden Gruppen des immobilisierten pH-Gradienten im Gel verankert sind und sich nicht frei bewegen, haben die IPG-Gele niedrige Leitfähigkeit und infolgedessen hat der Strom nur eine Stärke von 1-2 mA (Abb. 2.8-9). Diese Phase dauert 60 min. P, W 9 g 7

u, v

/ , mA

2500

6

2000

5

6 5

4

1500

4 3 2

3

1000 2 500

l

l 0

0 0

10

20

30

40

50

60

min

Abb. 2.8-9 Verlauf der Leistung (P), der Spannung (U) und des Stroms (7) während der ersten 60 min der IEF in einem engen immobilisierten pH-Gradienten (pH = 4,5-4,8). P,---U, /.

198

2 Elektrophorese der Proteine

In der zweiten Phase der IEF wird der Spannungsregler auf Maximalwert gestellt und der Leistungsregler so eingestellt, daß die die Leistung 10 W (bei der IEF in EPG-Gelen), die Spannung maximal 4500-5000 V bzw. 2000 V (bei der Hybrid-IEF) und der Strom 15 mA und erreicht. Der elektrische Widerstand bei den IPG-Gelen ist 50-100 mal höher als der bei den Gelen für die IEF mit Trägerampholyten. Deswegen sollte die Spannung bei der isoelektrischen Fokussierung in IPG-Gelen höher sein und die IEF länger dauern. Die Elektrofokussierungszeit ist in der Regel umgekehrt proportional zu den pH-Einheiten, die ein pH-Gradient enthält: für weite pH-Gradienten (4-7 pH-Einheiten) 3-4 h, für enge pH-Gradienten (2 pH-Einheiten) 8 h, für enge und ultraenge pH-Gradienten (eine pH-Einheit und enger) 16 h (über Nacht). Die Applikationsstreifen sollen nach ein Drittel der Elektrofokussierungszeit abgenommen werden, wobei die Flüssigkeit auf der Auftragsstelle mit Filterpapier entfernt werden muß. Bei den IPG-Gelen kann der pH-Gradient nicht mit Kontaktelektroden gemessen werden, weil die Leitfähigkeit der Gele extrem niedrig ist. Der pH-Gradient wird üblicherweise mit pI-Markern ermittelt. IPG-Gele können einer konventionellen oder kolloidalen Coomassie-Färbung mit Phosphor- oder Schwefelsäure unterzogen werden (Kap. 2.13.1). Bei den kolloidalen Färbungsverfahren sind die verwendeten Lösungen fast geruchlos und das Gel enthält keine Hintergrundfärbung. Falls eine höhere Färbeempfindlichkeit erwünscht ist, werden die IPG-Gele mit Silber gefärbt (Kap. 2.13.2). Nach der isoelektrischen Fokussierung können die Gele auch geblottet werden (Kap. 2.15.2). Qualitatives Blotting kann aber nur dann durchgeführt werden, wenn die IPGGele gewebegestützt sind, d.h. wenn sie auf ein Netz gegossen sind. Foliengestützte Gele können nicht geblottet werden - die auf den Markt gebräuchlichen Geräte zum Entfernen des Gels von der Haftfolie können diese Aufgabe nicht befriedigend lösen.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Vor der isoelektrischen Fokussierung Das Polyacrylamidgel polymerisiert nicht oder wird klebrig.

Die Konzentration der Monomere war zu niedrig.

Die Konzentration erhöhen.

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu niedrig. Die APS-Lösung war zu alt oder ist unsachgemäß gelagert.

Pro l ml Monomerlösung 5 10 g/dl APS-Lösung und 5 10 ml/dl TMEDA verwenden. Eine neue APS-Lösung verwenden, Bei Aufbewahren im Kühlschrank bei 4-8 °C ist die APS-Lösung für 2 Wochen verwendbar.

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Probleme

Die Geloberkante ist klebrig und löst sich von der Haftfolie. Die Konsistenz desAgarosegels ist ungenügend.

Die Monomerlösung polymerisiert zu schnell.

Es gibt Luftblasen im Gel.

Das Gel löst sich von der Haßfolie.

199

Ursachen

Abhilfe

Die Konzentration des Luftsauerstoffes in der Monomerlösung war zu hoch. Die höheren Konzentrationen von Trägerampholyten (über 3 g/dl) wirkten polymerisationshemmend.

Die Monomerlösung an einer Wasserstrahlpumpe entlüften.

Der Luftsauerstoff hat die Polymerisation der Oberkante inhibiert. Die Agarose-Konzentration war zu niedrig. Die Gelierzeit war zu kurz.

Niedrigere Trägerampholyt-Konzentrationen verwenden oder das Gel in Abwesenheit von Trägerampholyten polymerisieren und später es mit trägerampholythaltigen Lösungen rehydratisieren. Nach dem Gießen die Monomerlösung mit dest. Wasser überschichten. Die Rezeptur überprüfen.

Das Gelieren muß mindestens 60 min bei Zimmertemperatur oder besser über Nacht bei 4 °C dauern. Höhere Agarose-Konzentration (2 Harnstoff veränderte die Agarosegel-Struktur. g/dl) oder rehydratisierbares Agarosegel verwenden Die Konzentration von TMEDA Die Rezeptur für das Gelgießen überoder APS in der Moprüfen. nomerlösung war zu hoch. Das Gel bei 20-25 °C gießen. Die Temperatur in der Umgebung war sehr hoch. Es gab in der Monomerlösung Die Monomerlösung entlüften. gelöste Luft, die bei der Gelpolymerisation entweichte. Luftblasen vom Auslaßschlauch Den Auslaßschlauch säubern und der Gießvorrichtung oder des trocknen. Die Luftblasen durch heftiGradientenmischers gelangten ges Klopfen auf die Gießkassette in die Gießkassette. entfernen. Die Glasplatte, die mit der Vor der Benutzung die Glasplatte Monomerlösung in Berührung waschen. kommt, war unsauber. Die Haftfolie war unsauber. Die hydrophile Seite der Haftfolie mit Fingern nicht berühren. Es wurde eine falsche Haftfolie Die Haftfolien für Polyacrylamid- und verwendet. Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel wurde auf die falsche Das Gel nur auf die hydrophile Seite Seite der Haftfolie gegossen. der Haftfolie gießen, mit Wassertropfen die richtige Seite feststellen. Die Monomerlösung enthielt Niedrigere Detergenskonzentration eine hohe Konzentration des verwenden oder das Gel in Abwesennichtionischen Detergenzes heit von Detergenzien polymerisieren. Triton X-100 oder Nonidet Sie werden beim Rehydratisieren ins NP-40. Gel gebracht.

200

Probleme

Das Gel haftete nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte.

2 Elektrophorese der Proteine

Ursachen

Abhilfe

Der Monomerlösung enthielt höhere Konzentrationen von Trägerampholyten (über 3 g/dl) oder nichtionische Detergenzien. Die Glasplatte war zu hydrophil.

Rehydratisierbare Gele verwenden.

Das Gel war zu lange in der Gießkassette.

Spätestens l h nach der Polymerisation das Polyacrylamidgel aus der Gießkassette entnehmen.

Die Glasplatte reinigen und mit RepelSilan behandeln.

Während der isoelektrischen Fokussierung Es fließt kein oder zu wenig Strom.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt.

Es gibt einen schlechten Kontakt an den Elektrodenstreifen. Die Stromstärke steigt während der IEF an.

Die Elektrodenlösungen sind vertauscht.

Es tritt Wasserkondensation auf dem Deckel der Trennkammer auf.

Die elektrische Leistung ist zu hoch. Die Kühlung ist ungenügend.

Das Gel "schwitzt" (wird mit Wassertropfen bedeckt).

Es gibt keine wasserbindenden Additive im Gel. Es gab kein oder zu wenig Glycerin in der Rehydratisierungslösung. Die Geloberfläche des Agarosegels war nicht abgetrocknet.

Es gibt Wasserkondensation über bestimmten Stellen des Gels. Es gibt Wasserkondensation über der Kathode.

Es gibt Luftblasen in der Kontaktflüssigkeit, die zur lokalen Überhitzung fuhren. Es gibt starke Elektroosmose bei den Agarosegelen oder bei Polyacrylamidgelen, die viel Acrylsäure enthalten.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die Standardeinstellung bei IEF in einem IPG-Gel ist 5000 V, 1,0 mA und 5,0 W. Die gleichmäßige Auflage der Elektroden überprüfen, eventuell mit Glasplatten beschweren. Die basische Elektrodenlösung an das kathodische, die saure an das anodische Gelende verwenden. Die elektrische Leistung soll maximal 2,5 W/ml Gel betragen. Die Kühltemperatur überprüfen. Die Kühlblöcke sollten aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein. Kerosen oder Silikonöl DC 200 zwischen den Kühlblock und die Haftfolie geben. In die Monomerlösung 20 g/dl Glycerin oder 10 g/dl Saccharose oder 10 g/dl Sorbit geben. In die Rehydratisierungslösung 20 g/dl Glycerin zufügen. Vor der IEF die Geloberfläche des Agarosegels mit Filterpapier abtrocknen. Die Luftblasen entfernen.

Agarose für die IEF verwenden. Das Acrylamid Umkristallisieren oder zur Monomerlösung l g/dl Amberlite MB1 geben. Den Kathodenstreifen abtrocknen.

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Das Gel funkt und brennt.

Die Haftfolie lag beim Gelgießen nicht fest auf der Glasplatte und deswegen haben sich dünne Stellen im Gel gebildet. Schlechte Kühlung des Gels.

Vor dem Gelgießen die Haftfolie fest an die Glasplatte der Gießkassette walzen.

Der Harnstoff in den IPGGelen kristallisiert aus.

Iso-pH-Linien im Gel.

Die lEF-Temperatur ist zu niedrig. Die Oberfläche trocknet aus. Die Salzkonzentration in der Probe ist zu hoch. Die Konzentration von APS ist zu hoch.

201

Kerosen oder Silikonöl DC 200 zwischen die Haftfolie und die Kühlplatte geben. Bei 10-15 °C fokussieren. Zur Rehydratisierungslösung 0,5 ml/dl Nonidet NP-40 geben. Die Probe entsalzen. Die Konzentration von APS reduzieren oder rehydratisierbare Gele verwenden.

Nach der isoelektrischen Fokussierung Es gibt keine Proteinbanden im Gel. Die Proteinbanden sind sehr schwach.

Die Proteinbanden sind unscharf.

Die Banden ziehen Schweife nach.

Es gibt krumme Banden.

Die Proben aus den benachbarten Spuren laufen ineinander.

Die Proteinmasse ist so groß, daß das Protein nicht ins Gel einwandern konnte. Die Proteinkonzentration war zu niedrig. Die Probe ist nicht vollständig gelöst. Die Konzentration der Trägerampholyte war zu niedrig. Die Elektrofokussierungszeit war zu kurz. Es gab Präzipitate oder Partikel in der Probe. Das Auftragsmaterial hält die Proteine zurück und gibt sie später an das Gel ab. Es gab lokale Gradientendriften bei der IEF mit Trägerampholyten. Das Probenvolumen war zu groß. Die Auftragsschablone lag nicht dicht auf dem Gel.

Die Konzentration T reduzieren oder Agarosegel verwenden. Die Proben konzentrieren oder mehr auftragen. Die Probe mit Ultraschall behandeln und Additive verwenden, um sie zu lösen. Die Konzentration der Trägerampholyte im Gel muß mindestens 2 g/dl betragen. Die Elektrofokussierungszeit verlängern. Die Probe zentrifugieren. Nach 30 min IEF das Auftragsmaterial vom Gel abnehmen oder ein Lochband verwenden. Die Proben entsalzen.

Die Proben konzentrieren und geringeres Volumen auftragen. Nach dem Auflegen die Auftragsschablone leicht an das Gel andrücken, um keine Luftblasen zwischen der Schablone und dem Gel entstehen zu lassen.

202

2 Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Es gibt wellige Iso-pHLinien.

Die APS-Konzentration war zu hoch.

Die Banden am Gelrand sind stark verzogen. Es gibt einen blauen Hintergrund nach einer Coomassie-Färb ung. Die Haßfolie rollt sich ein.

Das Harnstoff-Gel war überlagert - der Harnstoff ist zu Isocyanat zerfallen. Die Proben sind zu nahe am Rand aufgetragen worden. Die basischen Immobilingruppen binden die CoomassieFarbstoffe. Das Gel zieht sich in allen Richtungen zusammen.

Rehydratisierbare Gele verwenden. Die Viskosität im Gel durch Zugabe von 10 g/dl Sorbit erhöhen. Die Harnstoff-Gele sofort nach ihrer Herstellung verwenden. Die Gelenden mindestens l cm frei von Proben lassen. Eine kolloidale oder Silber-Färbemethode verwenden. In das letzte Waschwasser 2-5 ml/dl Glycerin geben.

Literatur [1] Ikeda K, Suzuki S, US Patent I, 015891 (1912) [2] Kolin A, Meth BiochemAnal, 6, 259 (1958) [3] Svensson H, Acta Chem Scand, 15, 325 (1961) [4] Svensson H, Acta Chem Scand, 16, 465 (1962) [5] Vesterberg O, British Patent U0818 (1968) [6] Vesterberg O, Acta Chem Scand, 23, 2653 (1969) [7] Righetti PG, Isoelectric Focusing. Theory, Methodology and Applications, Work TS, Burdon RH (Hrsg.), Eisevier Biomedical Press, Amsterdam (1989) [8] Leaback DH, Rutter AC, Biochem Biophys Res Commun, 32, 447 (1968) [9] Wrigley CW, J Chromat, 36, 362 (1968) [10] Rosen A, Ek K, Aman P, J Immunot Methods, 28, 1 (1979) [11] Stromski

, Anal Biochem, 119, 387 (1982)

[12] Ambler J, Walker B, Clin Chem, 25, 1320 (1979) [13] Janik B, Dane RB, in Electrophoresis '81, Allen RC, Arnaud P (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, 8.77(1981) [14] Radola BJ, Ann N YAcadSci, 209, 127 (1973) [15] Frey MD, Radola BJ, Electrophoresis, 3, 216 (1982) {16] Jeppsson JO, Application Note 307, LKB-Produkter AB, Stockholm (1977)

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

203

[17] Dassett P, Braconnier F, Rosa J, J Chromat, 227, 267 (1982) [18] Zannis VI, Breslow JL, in Electrophoresis 79, Radola BJ (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, 5.437(1980) (19) Meinik BC, Melnik S¥,Anal Biochem, 171, 320 (1988) [20] Allen RC, Oulla PM, Arnaud P, Baumstark JS, in Electrofocusing and Isotachophoresis, Radola BJ, Graesslin D (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, S. 255 (1977) [21] Jeppsson JO, in Electrofocusing and Isotachophoresis, Radola BJ, Graesslin D (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, S. 273 (1977) [22] Robtol L, Clin ChimActa, 29, 101 (1970) [23] Peisker K, ZMedLab Diagn, 26, 28 (1985) [24] Chu JL, Oharavi A, Elkon KB, Electrophoresis, 9, 121 (1988) [25] Mehta PD, Patrick BA, Black J, Electrophoresis, 9, 126 (1988) [26] Chisholm DM, Beeley JA, Mason DK, Oral Surg, 35, 620 (1973) [27] Bustos SE, Fung L, in Electrophoresis '81, Allen RC, Arnaud P (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, 5.317(1981) [28] Ogata M, Satoh Y, Electrophoresis, 9, 128 (1988) [29] King ML, Meat Science, 11, 59 (1984) [30] Kaiser KP, Krause J, Z Lebensm Unters Forsch, 180, 181 (1985) [31] Stegemann H, Francksen H, Macka V, Z Naturforsch, 28, 722 (1973) [32] Kaiser KP, Bruhun LC, Belitz HD, Z Lebensm Unters Forsch, 154, 339 (1974) [33] Hussein KRF, Stegemann H, Z Acker Pflanzenbau, 146, 68 (1978) [34] Coake RJ, Draper SR, J Nat Inst Agric Bot, 16, 173 (1983) [35] Patzelt O, Geserick G, Schröder H, Electrophoresis, 9, 393 (1988) [36] Weidinger D, Cleve H, Electrophoresis, 9, 662 (1988) [37] Righetti PG,JChromat, 138, 213 (1977) [38] Delincee H, Radola BJ, Anal Biochem, 90, 603 (1978) [39] Rosengren A, Bjellqvist B, Gasparic V, in Electrofocusing and Isotachophoresis, Radola BJ, Graesslin D (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, S. 165 (1977) [40] Righetti PG, Gianazza E, Prot Biol Fluids, 27, 711 (1977) [41] Righetti PG, Krishnamoorthy R, Gianazza E, Labie D, J Chromat, 166, 455 (1978) [42] Caspers ML, Posey Y, Brown RK, Anal Biochem, 79, 166 (1977) [43] Beccaria L, Chiumello G, Gianazza E, Luppis B, Righetti PG, Am J Hemat, 4, 367 (1978) [44] Jeppson JO, Franzen B, Nilsson VO, Sei Tools, 25, 69 (1978) [45] Wrigley CJ, Chromat, 36, 362 (1968) [46] Dale G, Latner AL, Lancet, 20, 847 (1968) [47] Fawcett JS, FEES Lett, 1,81 (1968)

204

2 Elektrophorese der Proteine

[48] Catsimpoolas N, Clin ChimActa, 22, 237 (1968) [49] Vesterberg O, in Isoelectric Focusing, Arbuthnatt JP, Beeley JA (Hrsg.), Butterworths, London, S. 78 (1975) [50] Davies H, in Isoelectric Focusing, Arbuthnatt JP, Beeley JA (Hrsg.), Butterworths, London, S. 97 (1975) [51] Görg A, Postel W, Westermeier R, Anal Biochem, 89, 60 (1978) [52] Radola BJ, Electrophoresis, \, 43 (1980) [53] Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 3, 273 (1980) [54] Rabinson HK, Anal Biochem, 49, 353 (1972) [55] Sippel TO, Anal Biochem, 159, 349 (1986) [56] Rimpilainen M, Righetti PG, Electrophoresis, 6, 419 (1985) [57] Sinha PK, Bianchi-Bosisio A, Meyer-Sahellek W, Righetti PG, Clin Chem, 32, 1264 (1986) [58] Baumstark M, Berg A, Halle M, Keul J, Electrophoresis, 9, 576 (1988) [59] Rossmann U, Altland K, Electrophoresis, 8, 584 (1987) [60] Görg A, Postel W, Weser J, Günter S, Strahler JR, Hanash SM, Somerlot L, Electrophoresis, 8, 45 (1987) [61] Saravis CA, O'Brien M, Zamcheck N, JImmunol Methods, 29, 91 (1979) [62] Stromska DP, Anal Biochem, 119, 375 (1982) [63] Laas TI, J Chromat, 66, 347 (1972) [64] Johansson GB, Hjerten S, Anal Biochem, 59, 200 (1974) [65] Hoffman WL, Jump AA, Kelly PJ, Elanogovan N, Electrophoresis, 10, 741 (1989) [66] Saravis CA, Cunningham CG, Marasco PV, Cook RB, Zamchek N, in Electrophoresis 79, Radola BJ (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, S. 117 (1980) [67] Saravis CA, Cantaroa W, Marasco P V, Burke B, Zamchek N, Electrophoresis, l, 191 (1980) [68] Triet AJ, Electrophoresis, 5, 374 (1984) [69] Gianazza E, Astarri C, Righetti PG, J Chromat, 171, 161 (1979) [70] Olsson I, Laas T, J Chromat, 215, 373 (1981) [71] Kleiner! T, Elektrophoretische Methoden in der Proteinanalytik, Georg Thieme, Stuttgart - New York (1990) [72] Gasparic V, Bjeüquist B, Rosengren A, Swedish patent No. 14049-1 (1975), US Patent (1978), Deutsches Patent (1981) [73] Dossi G, Celentano F, Gianazza E, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 7, 123 (1983) [74] Gianazza E, Chillemi F, Duranti M, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 8, 339 (1983) [75] Görg A, Postel W, Weser J, Patutschnick W, Cleve H, Am J Human Genet, 37, 922 (1984) [76] Gianazza E, Astrua-Testari S, Righetti PG, Electrophoresis, 6, 113 (1985) [77] Pietta P, Potaterra E, Fiorino A, Gianazza E, Righetti PG, Electrophoresis, 6, 162 (1985)

2.8 Isoelektrische Fokussierung der Proteine - eine besondere Art von Elektrophorese

205

[78] Saveby GM, Petterson P, Andrasko J, Ineva-Flygare L, Jahannesson U, Görg A, Postel W, Domscheit A, Mauri PL, Pietta P, Gianazza E, Righetti PG, J Biochem Biophys Methods, 16, 141 (1988) [79] Pascali VL, Dobosz M, d'Alaia E, Electrophoresis, 9, 514 (1988) [80) Görg A, Postel W, Westermeier R, Righetti PG, Ek K, LKB Application Note, 320 (1982) [81] Gianazza E, Celentano F, Dossi G, Bjellqvist B, Righetti PG, Electrophoresis, S, 88 (1984) [82] Application Note 324, LKB Bromma, Schweden [83] Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG, Gianazza E, Görg A, Westermeier R, Postel W, J Biochem Biophys Methods, 6, 317 (1982) [84] Weidinger S, Cleve H, Schwarzfischer F, Postel W, Weser J, Görg A, Hum Genet, 66, 356 (1984) [85] Fawcett JS, Chrambach A, Prot Biol Fluids, 33, 439 (1985) [86] Altland C, Rossmann U, Electrophoresis, 6, 314 (1985) [87] Rabilloud T, Gelfi C, Bassi ML, Righetti PG, Electrophoresis, 8, 305 (1987) [88] Fawcett JS, Vicchio D, Chrambach A, Electrophoresis, 9, 469 (1988) [89] Bjellquist B, Linderholm M, östergren K, Strahler J, Electrophoresis, 9, 453 (1988) [90] Strahler JR, Hanash SM, Somerlot L, Weser J, Postel W, Görg A, Electrophoresis, 8, 165 (1987) [91] Righetti PG, Chiari M, Gelfi C, Electrophoresis, 9, 65 (1988)

2.9 Free-Flow-Elektrophorese der Proteine Die Free-Flow-Elektrophorese wurde von Grassmann und Hannig [1,2] entwickelt. Sie wird zur Trennung von Peptiden und Proteinen inkl. Enzymen, von Nukleosiden, Nukleotiden, Nukleaten, von Lysosomen, Mitochondrien, Ribosomen, Chloroplasten, von Viren, Bakterien und Parasiten, von unterschiedlichen Zellen wie Thrombozyten, Nierenzellen, Erythrozyten, Leukozyten, Thymuszellen, Tumorzellen etc. eingesetzt [3, 4]. Sie benötigt keinen Träger und keine Bandenelution, was ein Vorteil gegenüber den anderen elektrophoretischen Methoden ist. Heute kann die Free-Flow-Elektrophorese als ein Trennverfahren definiert werden, bei dem der Puffer mit den Proben durch einen üblicherweise 0,5 mm schmalen Spalt zwischen zwei gekühlten Glasplatten ein elektrisches Feld senkrecht durchfließt [5]. Oben wird die Probe zugeführt, unten werden die Fraktionen durch Schläuche gesammelt. Entsprechend dem eingesetzten elektrophoretischen Prinzip wird Free-FlowZonenelektrophorese, Free-Flow-Isotachophorese und Free-Flow-IsoelektrischeFokussierung unterschieden.

Theorie der Free-Flow-Elektrophorese Die Theorie der Free-Flow-Elektrophorese wird aus der Voraussetzung abgeleitet, daß auf die Probe zwei zueinander senkrechte Kräfte wirken: das elektrische Feld in Richtung der Abszissenachse und die Pufferströmung in Richtung der Ordinatenachse [6]. Infolgedessen legt die Probe nach einer gewissen Zeit t die Strecken und y zurück. Das Verhältnis zwischen diesen Strecken kann als tg bezeichnet werden, wobei der Winkel zwischen der Resultierenden und der y-Achse ist (der Ablenkungswinkel). Der Ablenkungswinkel vergrößert sich mit der Erhöhung der Stärke des elektrischen Feldes und verkleinert sich mit der Erhöhung der Geschwindigkeit der Pufferströmung (Abb. 2.9-1). Puffer

Probe

Abb. 2.9-1 Schema der Free-Flow-Elektrophorese.

2.9 Free-Flow-Elektrophorese

207

Das Verhältnis der Strecke zur Strecke y, also zwischen der elektrophoretischen Geschwindigkeit der Probe Vj und der Geschwindigkeit des Puffers vp, ist gleich X

Vj

tg6= — = — .

y

V

(2.9-1)

P

Die elektrophoretische Geschwindigkeit in einem elektrischen Feld wird durch die Gleichung

J I vi = \iiE=vi—=\ii— /

(2.9-2)

beschrieben, wobei ^ die Mobilität der Probe ist, E die Stärke des elektrischen Feldes, J die Dichte des elektrischen Stroms, die spezifische Leitfähigkeit des Puffers, 7 die Stärke des elektrischen Stroms und q der Querschnitt der elektrischen Kammer. Aus Gl. 2.9-1 und der letzten Gleichung ergibt sich

tg

= -.

(2.9-3)

Da die Stärke des elektrischen Stroms, der Querschnitt der elektrophoretischen Kammer, die spezifische Leitfähigkeit des Puffers und die Geschwindigkeit des Puffers während der Trennung konstant sind, hängt die Auflösung der Free-Flow-Elektrophorese nur von der Mobilität der Probe ab. Bei der waagerechten Ausführung der Free-Flow-Elektrophorese [7], die zwischen zwei mit Luft gekühlten Glasplatten (60 60 cm) durchgeführt wird, kommt es gewöhnlich zur Sedimentation von Zellen und Zellbestandteile im Puffer. Deswegen werden in der Regel Geräte mit senkrechter Trennrichtung verwendet [8, 9]. Der Puffer wird mittels einer Schlauchpumpe der Trennkammer zugeführt und die Probelösung an einer engen Stelle im oberen Teil der Trennkammer mit Hilfe einer Dosierpumpe aufgetragen. Der Stromtransport wird durch Filterpapierstreifen aufrechterhalten, die in seitliche Elektrodentanks eintauchen. Die Trennkammer wird mit Wasser gekühlt. Die Entnahme der Fraktionen erfolgt mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit parallelen Silikonschläuchen. Die Verweilzeit der Probe in der Trennkammer wird von unterschiedlichen Faktoren bestimmt (s.o.). Eine zu kurze Verweilzeit hat eine zu kurze Wanderungsstrecke und damit eine begrenzte Auflösung zur Folge. Bei zu langer Verweilzeit sind die Ergebnisse auch nicht optimal. Der Grund dafür ist die Thermokonvektion, die die Auflösung vermindert. Eine angemessene Verweilzeit beträgt 5-10 oder mehr Minuten bei 10-20 °C und elektrischer Feldstärke von 200-250 V/cm. Die gleichmäßige Bewegung der geladenen Teilchen wird durch die Thermokonvektion und Elektroosmose (Kap. 1.5.1) gestört. Die Thermokonvektion hat eine große Bedeutung vor allem bei senkrechter Lage der Trennkammer. Nur ein effektives Abführen der Jouleschen Wärme kann die Ergebnisse verbessern. Um die

208

2 Elektrophorese der Proteine

Elektroosmose zu unterdrücken, kann man die innere Oberfläche der Glasplatten der Trennkammer mit bestimmten Substanzen beschichten, z.B. mit Albumin.

2.9. l Free-Flow-Zonenelektrophorese Die Free-Flow-Zonenelektrophorese wird in einem (kontinuierlichen) Puffer durchgeführt (Abb. 2.9-2). Der Puffer sollte über genügend Pufferkapazität verfügen und einen entsprechenden pH- Wert haben, am besten im neutralen (pH = 7,0-7,4) oder im leicht alkalischen Bereich (pH = 8-9). Außerdem sollten die Pufferkomponenten nicht mit den zusätzlich zugegebenen Substanzen, z.B. viskosen Additive, wie Saccharose oder Glycerin, reagieren können. In diesem Zusammenhang sollte man den Borat-Puffer erwähnen, dessen Borsäure mit Polyolen saure Komplexverbindungen bildet [10]. Puffer

Probe

Abb. 2.9-2 Schematische Darstellung der Free-Flow-Zonenelektrophorese

Bei der Free-Flow-Zonenelektrophorese werden zwei geladene Teilchen durch ihre unterschiedlichen Geschwindigkeiten in einem elektrischen Feld um unterschiedliche Winkel aus der Fließrichtung abgelenkt. Die Konzentration des Puffers sollte im Vergleich zur Probelösung hoch sein, damit über den gesamten Trennbereich den gleichen pH-Wert und die gleiche Feldstärke herschen. Das Hauptanwendungsgebiet der Free-Flow-Zonenelektrophorese ist die Trennung und Isolierung von Zellen und Zellorganellen. Demgegenüber spielt diese Methode bei der Protein- und Enzymisolierung eine untergeordnete Rolle, was vor allem auf die im Vergleich zu anderen Free-Flow-Elektrophoresetechniken schlechtere Auflösung und die starke Verdünnung der Probe zurückzuführen ist. Es sind aber zahlreiche Beispiele von zonenelektrophoretischer Trennung und Reinigung von Zellen (Lymphozyten, Nierenzellen, Tumorzellen) und von Zellorganellen (Lysosomen, Mitochondrien) beschrieben worden [11]. Ein Beispiel für Free-Flow-Zonenelektrophorese von Zellen ist die elektrophoretische Trennung von menschlichen T- und B-Lymphozyten (Abb. 2.9-3). Obwohl sich die

209

2.9 Free-Flow-Elektrophorese

Lymphozyten kaum in ihrer Größe unterscheiden, gelingt es, sie aufgrund ihrer unterschiedlichen Oberflächenladung voneinander zu trennen [12]. Gesamtzellenzahl, %

30

20

10

40

42

44

46

48 Fraktion-Nr.

Abb. 2.9-3 Free-Flow-Zonenelektrophorese von T- und B-Lymphozyten. Trennpuffer TRIS-Hydrogenphosphat-Puffer (0,01 mol/1 NaHjPC^ mit TRIS auf pH = 7,4 einstellen und 0,15 mol/1 NaCl und 0,003 mol/1 KC1 zufügen); Kathodenpuffer. TRIS-Hydrogenphosphat-Puffer (0,03 mol/1 NaHjPC^ mit TRIS auf pH = 7,4 einstellen und 0,45 mol/1 NaCl und 0,008 mol/1 KCI zugeben); Anodenpuffer. TRIS-Hydrodenphosphat-Puffer (0,2 mol/1 NaHjPC^ mit TRIS auf pH = 7,0 einstellen; Probe: 2-107 Zellen/ml, suspendiert im Trennpuffer; Verweilzeit: 6 min; Feldstärke: 240 V/cm.

2.9.2 Free-Flow-Isotachophorese Bei der Free-Flow-Isotachophorese werden diskontinuierliche Puffersysteme verwendet, die, wie bereits angedeutet, aus einem Leit- und einem Folgepuffern bestehen (Kap. 2.4.2 und 2.6.1). Wie bekannt, muß die Mobilität des Leitions größer und die des Folgeions kleiner als die Mobilitäten der zu trennenden Teilchen sein. Als Gegenelektrolyt (Elektrolyt, der das Gegenion bildet) wird eine schwache Base oder Säure ausgewählt, die im effektiven pH-Bereich eine hohe Pufferkapazität hat. Die Probelösung wird zwischen dem Leit- und Folgepuffern aufgetragen. Nur unter diesen Bedingungen herrscht nach dem Anlegen des elektrischen Feldes eine niedrige Feldstärke im Bereich des Leitpuffers, eine hohe Feldstärke im Bereich des Folgepuffers und eine mittlere Feldstärke im Probenbereich. Dadurch trennen sich die Probenteilchen der Probe in Zonen mit abnehmender Mobilität auf (Abb. 2.9-4).

210

2 Elektrophorese der Proteine Puffer

Probe

o

Abb. 2.9-4 Schematische Darstellung einer Free-Flow-Isotachophorese von zweier negativ geladener Teilchen.

Um die getrennten Substanzen fern voneinander zu halten, werden Spacersubstanzen zur Probe hinzugefugt. Bei der Trennung von Proteinen werden z.B. Aminosäuren eingesetzt, deren Mobilitäten sich zwischen denen der zu trennenden Proteine befinden. Die Free-Flow-Isotachophorese wird zur Analyse von organischen Säuren, Antibiotika, Aminosäuren, Oligopeptiden und Proteinen eingesetzt. Mit ihrer Hilfe werden z.B. die Immunglobuline G, A und M gereinigt.

2.9.3 Free-Flow-Isoelektrische-Fokussierung Bei der Free-Flow-Isoelektrischen-Fokussierung in einem linearen pH-Gradienten [13] wird die Trägerampholytlösung über den gesamten Trennspalt zugegeben. Die zu trennenden Proteine können entweder als eine schmale Zone am oberen Ende des Trennspaltes zugegeben oder in der Trägerampholytlösung gelöst werden. Nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes bildet sich zunächst ein pH-Gradient, dann fokussieren die Proteine an ihren isoelektrischen Punkten (Abb. 2.9-5).

2.9 Free-Flow-Elektrophorese

211

Trägerampholyte mit Probe

Abb. 2.9-5 Schematische Darstellung der Free-Flow-Isoelektrischen-Fokussierung in einem pH-Gradienten.

Neben Trägerampholyten können auch andere Elektrolyte, z.B. die Good-Puffer [14], verwendet werden. Wichtig ist es, daß die Differenz zwischen dem pl- und pÄT-Wert eines Elektrolyten möglichst klein und die Zahl der puffernden Elektrolyte möglichst groß ist (Kap. 1.5.3). Die Probelösungen sollten entsalzt werden und keine hohe ProteinKonzentration enthalten. Wenn das nicht der Fall ist, können Präzipitate entstehen. Die Free-Flow-Isoelektrische Fokussierung wird zur Trennung von allen amphoteren Substanzen verwendet, z.B. von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Peptid-Hormonen, Enzymen, Nukleoproteinen, Viren.

2.9.4 Detektion Es ist möglich, daß die elektrophoretische Trennung der Probensubstanzen mit Hilfe eines Detektionssystems schon im Trennspalt analysiert werden kann. Ein Detektionssystem (Elphor-Scan-System von Bender & Hobein, München) besteht aus einem Scanner und einem Computer mit Drucker und Software. Der Scanner ähnelt einem Zweistrahlphotometer. Durch unterschiedliche Filter kann die optische Dichte des fließenden Puffers mit der Probe bei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen werden, wobei ein motorgetriebener Meßschlitten die Messung über den gesamten Trennspalt erlaubt. Es ist möglich, Absorptionsmessungen auch in UV-Licht zu führen, wofür ein zusätzliches 0,5 mm dickes Quarzfenster auf die rückwärtige Glasplatte der Trennkammer aufgesetzt werden muß. Vor jeder elektrophoretischen Trennung muß die Absorption des reinen Puffers im Trennspalt gemessen werden, um die Basislinie zu ermitteln und speichern, die nachher von den Meßwerten der Probe abzuziehen ist. Die Signale vom Meßschlitten werden zum Computer geleitet, wo sie mit Hilfe entsprechender Software verarbeitet, gedruckt und gespeichert werden können.

2 Elektrophorese der Proteine

212

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu •wenig Strom. Die Stromstärke steigt während der IEF an.

Es gibt keinen oder schlechten Kontakt mit dem Stromversorger. Die Elektrodenlösungen sind vertauscht. Die Kühlung ist ungenügend.

Alle Steckverbindungen überprüfen.

Die saure Lösung zur Anode, die basische Lösung zur Kathode gießen. Die Kühlwasserfluß überprüfen. Wenn nötig, die Leistung reduzieren.

Nach der Elektrophorese Die Konzentration der Proteine ist niedriger geworden.

Die Proteine wurden proteolytisch verdaut.

Die Probenvorbereitung überprüfen. Inhibitor, z.B. EDTA, hinzufugen.

Literatur [1] Grassmann W, Ange\v Chem, 62, 170 (1950) [2] Grassmann W, Hannig K, Naturwissenschaften, 37, 397 (1950) [3] Grassmann W, Naturwissenschaften, 38, 200 (1951) [4] Hannig K, Electrophoresis, 3, 235 (1982) [5] Wagner H, Kühn R, Hofstetter S, in Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden, Wagner H, Blasius, E (Hrsg.), Springer, Heidelberg, S. 223 (1989) [6] Roman MC, Brown PR, Anal Chem, 66, 86 (1994) [7] Barrolier J, Watzke E, Gibian H, Naturforschung, 13B, 754 (1958) [8] Hannig K, Hoppe Seyler's 2 Physiol Chem, 338, 211 (1964) [9] Hannig K, Z Anal Chem, 181, 244 (1961) [10] Michov BM, JAppI Biochem, 4, 436 (1982) [11] Hannig K, Heidrich HG, Free-Flow Electrophoresis, GIT, Darmstadt (1990) [12] Baier TG, Weber G, Heinrich U, Hartmann K, Schönberg HD, Anal Biochem, 171, 91 (1988) [13] Wagner H, Speer W, J Chromat, 157, 259 (1978) [14] Good NE, Winget GD, Biochem, 5, 467 (1966)

2.10 Die Proteine können in zwei Richtungen getrennt werden - die zweidimensionale Elektrophorese Die zweidimensionale Elektrophorese (2D-Elektrophorese, high resolution twodimensional electrophoresis, protein mapping) wird auf vielen Forschungsgebieten, z.B. zur Untersuchung von Proteinen in Mikroorganismen [l, 2], Pflanzen [3, 4] oder in der Milch [5, 6] verwendet. Die klinische Diagnostik ist auch ein Gebiet, wo eine präzise Auftrennung der Proteine von großer Bedeutung ist [7, 8]. Bei genetischen Erkrankungen z.B. liegt mindestens ein abnormales Protein zugrunde, bei vielen anderen Erkrankungen treten charakteristische Proteinveränderungen auf. Der hohe technische Aufwand aber, die lange Analysenzeit, die mangelnde Reproduzierbarkeit sowie die unzureichende Software für die Computerauswertung der 2D-Pherogramme fuhren dazu, daß die 2D-Elektrophorese immer noch keine Routinemethode für die Forschung oder Diagnostik geworden ist. Das Prinzip der zweidimensionalen Elektrophorese wurde 1969/1970 entdeckt [9, 10]: bei der eindimensionalen Elektrophorese werden die Proteine nach ihren Ladungen oder Massen getrennt, bei der zweidimensionalen Elektrophorese nach beiden Kriterien. Infolgedessen verfugt die zweidimensionale Elektrophorese über eine enorm hohe Auflösung - sie erlaubt die Auftrennung von zwei Protein-Polyionen, die sich nur durch einen geladenen Aminosäurerest unterscheiden. Bei der 2D-Elektrophorese werden die Proteine in einer ersten Richtung (Dimension) durch die isoelektrische Fokussierung nach ihren isoelektrischen Punkten getrennt, die eine Funktion ihrer Ladungen sind. Danach werden die fokussierten Proteinbanden in einer zweiten Richtung (Dimension), die senkrecht zur ersten Dimension ist, durch die SDS-Elektrophorese nach ihren Massen nochmals getrennt. Dadurch bilden die ProteinPolyionen ein zweidimensionales Pherogramm von Proteinflecken (Spots), das wie eine geographische Karte aussieht. Wie auf einer Landkarte läßt sich auch hier die Lage jedes Proteinflecks in einem rechtwinkligen (kartesianischen) Koordinatensystem bestimmen, wobei auf der Abszissenachse die steigenden pl-Werte und auf der Ordinatenachse die steigenden Molekülmassen aufgetragen sind (Abb. 2.10-1). Die 2D-Elektrophorese wurde in den 70er Jahren als eine Kombination zwischen einer isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten in vertikalen Rundgelen (1. Dimension) und einer SDS-Elektrophorese in vertikalen Flachgelen (2. Dimension) entwickelt [11, 12]. Heute wird sie vorzugsweise in horizontalen dünnen Gelen durchgeführt [13, 14]: Bei diesem Verfahren verläuft die isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension in einem horizontalen auf Folie polymerisierten Flachgel. Danach wird die Laufstrecke streifenförmig vom Gel aongeschnitten und im Puffer der zweiten Dimension äquilibriert, um die Proteine elektrisch zu laden und mit SDS zu umhüllen. Da das horizontale Fokussierungsgel auf Folie polymerisiert ist, findet bei der Übertragung keine Längenveränderung statt. Auch die SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension wird in einem horizontalen dünnen foliengestützten SDS-Gel, gewöhnlich einem Porengradientengel, durchgeführt.

214

2 Elektrophorese der Proteine

pi

pi l. Dimension Isoelektrische Fokussierung

2. Dimension SDS-Elektrophorese

Abb. 2.10-1 Prinzip der zweidimensionalen Elektrophorese: Die Proteine werden in einer ersten Dimension durch die isoelektrische Fokussierung und danach in einer zweiten Dimension durch die SDS-Elektrophorese getrennt. 1. Fokussierungsgel; 2. Kontaktgel; 3. SDS-Polyacrylamidgel.

Falls die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten durchgeführt wird, wird die 2D-Elektrophorese als IsoDalt-System bezeichnet [15]: Iso für die pI-Trennung mittels der isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten, Dali für die Massentrennung mittels der SDS-Elektrophorese (von Dalton - der alten Einheit für die Masse, die keinen Platz im ,57-System gefunden hat, aber immer noch in der amerikanischen Literatur verwendet wird). Falls die isoelektrische Fokussierung in einem immobilisierten pHGradienten (IPG-Get) durchgeführt wird, wird die 2D-Elektrophorese IPGDalt- System genannt. Bei der zweidimensionalen Elektrophorese nach O'Farrell [11] und Klose [12] wird die Proteinprobe zuerst mit einer isoelektrischen Fokussierung in einem Gel mit 8-9 mol/1 Harnstoff, einem nichtionischen Detergens, z.B. Triton X-100 oder Nonidet NP-40, und Dithiothreitol getrennt und danach mit einer SDS-Elektrophorese in einem Gradientengel separiert. Der Harnstoff und das nichtionische Detergens lösen die Quartärstruktur der Proteine auf, während das Dithiothreitol ihre Disulfidbrücken reduziert, wobei sie sich in ihre Untereinheiten (Polypeptidketten) zerlegen. Damit gelang es O'Farrell die E.-ColiProteine in mehr als 1000 Komponenten zu trennen. Es ist möglich, daß die 2D-Elektrophorese auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen durchgeführt wird [11, 16]. Die Auflösung dieser Methode ist jedoch geringer als die unter denaturierenden Bedingungen. Die native 2D-Elektrophorese ist von Bedeutung, falls die biochemische Aktivität der Proteine (Enzyme) erhalten werden soll. Eine Verbesserung der 2D-Elektrophorese ist die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung in einem Gel mit einem immobilisierten pH-Gradienten (IPG-Gel) [17]. Bei

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

215

der ersten Dimension der 2D-Elektrophorese kann auch die Hybridfokussierung in einem IPG-Gel mit Trägerampholyten (Kap. 2.8.2) verwendet werden [18]. Die 2D-Elektrophorese mit Trägerampholyten zeichnet sich durch eine kürzere Fokussierungsdauer aus, als bei der 2D-Elektrophorese in IPG-Gelen, deswegen wird sie immer noch bevorzugt. Die 2D-Elektrophorese in IPG-Gelen aber verfugt über eine erheblich höhere Reproduzierbarkeit. Man kann außerdem von den getrockneten IPGGelen so viel Gelstreifen abschneiden, wie man für seine unmittelbare Arbeit braucht, während bei der IEF mit Trägerampholyten das ganze Gel benutzt werden muß. Die 2D-Elektrophorese umfaßt folgende Schritte: 1. Isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension Herstellung von Polyacrylamidgelen mit Trägerampholyten oder IPG-Gelen für die isoelektrische Fokussierung; Probenvorbereitung für die erste Dimension; Isoelektrische Fokussierung. 2. SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension Herstellung von Gelen für die SDS-Elektrophorese; SDS-Äquilibrierung der IEF-Gelstreifen für die zweite Dimension; SDS-Elektrophorese. 3. Nachweis der Proteine und Auswertung der 2D-Pherogramme Silberfärbung; Autoradio- und Fluorographie; Auswertung der 2D-Pherogramme.

2.10.1 Isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension Herstellung von Polyacrylamidgelen mit Trägerampholyten oder IPG-Gelen für die isoelektrische Fokussierung Die Gele für die IEF mit Trägerampholyten haben eine -Konzentration von 4-5 g/dl und einen Vernetzungsgrad C von 0,03, und enthalten 9 mol/1 Harnstoff und 1-2 g/dl Trägerampholyte. Ihre Herstellung unterscheidet sich nicht von der der anderen Gele (Kap. 1.7.6). Die Lösungen, die benötigt werden, sollten im Kühlschrank aufbewahrt werden, wobei die APS-Lösung nicht länger als zwei Wochen verwendet werden kann. Für das IPGDalt-System werden am häufigsten immobilisierte pH-Gradienten mit pH von 4-10, 4-7 und 7-10 verwendet. Sie können folgendermaßen hergestellt werden (Tab. 2.10-1):

216

2 Elektrophorese der Proteine

Tab. 2.10-1 Herstellung von Lösungen für 120 mit pH-Gradienten von 4-10, 4-7 und 7-10.

250

0,5 mm dicke IPG-Gele (T = 4 g/dl, C = 0,03)

IPG-Gradienten pH = 4-10

Leichte Lösung Immobiline

pK = 3,6, >4,6, pK = 6,2, pÄ: = 7,0, p£ = 8,5, p/: =9,3, Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, 10 g/dl APS, Bidest. Wasser, ml, ad

61,0 27,0 260,0 84,0 190,0 0,64 0,3 37,0 37,0 8,0

pH = 7-10

pH = 4-7

Schwere Lösung

Leichte Lösung

Schwere Lösung

Leichte Lösung

Schwere Lösung

588,0

161,0 394,0 81,0 144,0 467,0 0,64

308,0 59,0 240,0

48,0 173,0 187,0 149,0 0,64

289,0

0,3 37,0 37,0 8,0

2,0 37,0 37,0 8,0

243,0 48,0 178,0

0,64 2,0 37,0 37,0 8,0

0,64

0,3 37,0 37,0 8,0

202,0 187,0

0,64 2,0 37,0 37,0 8,0

Die Lösungen werden in einem Gradientenmischer gemischt und bei Raumtemperatur oder 37 °C polymerisiert. Danach wird das IPG-Gel aus der Gießkassette entnommen, 3 mal je 20 min in bidest. Wasser und l mal in 2 ml/dl Glycerin gewaschen, und schließlich bei Zimmertemperatur unter einem Ventilator getrocknet. Das Gel wird in einer Folie verpackt und bei -20 °C aufbewahrt.

Probenvorbereitung für die erste Dimension Die Probe für die 2D-Elektrophorese sollte eine Proteinkonzentration von ca. 10 mg/ml haben und 8,0-9,0 mol/1 Harnstoff, 1,0-2,0 ml/dl Nonidet NP-40, 0,5 g/dl DTT und 0,8-1,0 g/dl Trägerampholyte (falls die erste Dimension in Gelen mit Trägerampholyten stattfindet) enthalten.

Isoelektrische Fokussierung Das Gel mit den Trägerampholyten wird auf einen mit Kerosen oder Silikonöl DC-200 beschichteten Kühlblock gelegt. Seine Enden werden mit Papierelektrodenstreifen bedeckt, wobei der Anodenstreifen 10 mmol/1 Glutaminsäure oder 0,8 mol/1 Phosphorsäure (54,3 ml 85 % Phosphorsäure ad 1000,0 ml bidest. Wasser) und der Kathodenstreifen 10 mmol/1 Lysin oder 0,8 mol/1 Ethylendiamin (53,7 ml Ethylendiamin ad 1000,0 ml bidest. Wasser) und 10 g/dl Glycerin enthält. Zwischen die Elektrodenstreifen wird ein Silikonapplikationsband aufgelegt und in seine Schlitze je 10 Probe pipettiert. Das getrocknete IPG-Gel wird aus dem Gefrierschrank entnommen und ca. 10 min bei Raumtemperatur belassen. Danach werden von ihm 4-5 mm breite Gelstreifen mit einer Papierschneidemaschine abgeschnitten und in eine mit einer Rehydratisierungslösung

217

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

gefüllte Quellkassette eingelegt. Die Rehydratisierungslösung enthält gewöhnlich 8,0-9,0 mol/l Harnstoff (480,5-540,5 g Harnstoff ad 1000,0 ml dest. Wasser), 0,5 ml/dl Nonidet NP-40 und 10 mmol/1 DTT (1,54 g DTT ad 1000,0 ml dest. Wasser). Nach dem Rehydratisieren (Anquellen) der IPG-Gelstreifen, das bei Raumtemperatur im Laufe von 3 bis 24 Stunden stattfindet, werden die gequollenen IPG-Gelstreifen der Quellkassette entnommen und ihre überschüssige Quellösung zwischen zwei Filterpapieren entfernt, damit der Harnstoff auf der Oberfläche nicht auskristallisiert. Sie werden mit den sauren Enden zur Anode auf den mit Kerosen beschichteten Kühlblock einer Horizontalkammer gelegt. Danach werden die IPG-Gelstreifen mit Papierelektrodenstreifen senkrecht bedeckt (Abb. 2.10-2). Bei der isoelektrischen Fokussierung in IPG-Gelstreifen genügt, wenn die Elektrodenstreifen nur mit bidest. Wasser getränkt sind. Die Probe wird mit Hilfe eines Silikonauftragsbandes aufgetragen.

4

2 l

Abb. 2.10-2 IEF in IPG-Gelstreifen. 1. Trennkammer; 2. Elektrodenstreifen; 3. Probe; 4. IPG-Gelstreifen.

Die isoelektrische Fokussierung in der l. Dimension der 2D-Elektrophorese wird bei 10-15 °C durchgeführt, wobei nur bei der IEF mit Trägerampholyten eine Vorfokussierung benötigt wird (Tab. 2.10-2). Bei der isoelektrischen Fokussierung in IPG-Gelen ist die Vorfokussierung überflüssig, da der pH-Gradient bereits ausgebildet ist. Tab. 2.10-2 Trennbedingungen bei der isoelektrischen Fokussierung. Trennstrecke Vorfokussierung Spannung Zeit Fokussierung Spannung Zeit

Wem

400V lh 5000V Bei pH = 4-10 5 h

20cm

650V 1h

Bei pH = 4-7 und 7-10 7 h

5000V Bei pH = 4-10 8 h

Bei pH = 4-7 und 7-10 über Nacht

218

2 Elektrophorese der Proteine

Nach der isoelektrischen Fokussierung wird das Gel mit den Trägerampholyten bzw. die IPG-Gelstreifen im Gefrierschrank bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff aufbewahrt oder direkt für die 2. Dimension der 2D-Elektrophorese verwendet.

2.10.2 SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension Herstellung von Gelen für die SDS-Elektrophorese Für die zweite Dimension der 2D-Elektrophorese kann ein flaches SDS-Gradientengel oder ein flaches SD S-Homogengel [19, 20] verwendet werden. In beiden Fällen besteht das Gel aus einem Sammel- und einem Trenngel, wobei der äquilibrierte Gelstreifen auf das Sammelgel gelegt wird. Das Sammelgel hat gewöhnlich eine Konzentration von T - 5 g/dl und C = 0,02-0,04 und kann 0,125 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit pH = 6,8 enthalten (Kap. 2.7.2). Das SDS-Gradiententrenngel kann unterschiedliche Konzentrationen haben, z.B. T - 10-15 g/dl und C = 0,02-0,04, und 0,375 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit pH = 8,8 (Kap. 2.7.2) enthalten. Der wichtigste Unterschied zwischen einem Polyacrylamidgel für die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten und einem IPG-Gel ist der Vernetzungsgrad C: im ersten Fall ist er gewöhnlich gleich 0,02, im zweiten 0,03. Das Gradientengel wird mit Hilfe eines Gradientenmischers (Kap. 1.6.5) auf das Sammelgel gegossen (Kap. 1.7.6). Dafür wird eine Gießkassette (Kap. 1.6.5) bis zu einer Höhe von 1/3 des Kassettenvolumens mit Sammelgellösung gefüllt und danach mit Sammelgelpuffer überschichtet. Nach der Polymerisation wird der Sammelgelpuffer abgesaugt und das Restvolumen mit Gradientengellösung gefüllt (Tab. 2.10-3). Tab. 2.10-3 Herstellung von Monomerlösungen zum Gießen eines SDS-Sammelgels und eines ri2-15-SDS-Gradientengels in einer Gießkassette mit Innenmaßen von 120 250 0,5 mm. Sammelgel

T = 5 g/dl, C = 0,03 Gelpuffer, ml Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C = 0,03) Monomerlösung, ml (T = 50 g/dl, C= 0,02) SDS,g 87 % Glycerin, ml 10 ml/dl TMEDA, 10 g/dl APS,

Dest. Wasser, ml, ad

Trenngel Leicht Schwer T = 12 g/dl, C = 0,02 7= 15 g/dl, C = 0,02

1,25 0,50

1,50 -

1,50 -

-

1,44

1,80

0,01 30,0 30,0 6,0

0,01 1,20 30,0 30,0 6,0

0,01 1,50 25,0 25,0 5,0

Die Gießkassette wird zum Dichteausgleich 10 min bei Raumtemperatur, dann zum Polymerisieren 30 min bei 37 °C belassen.

219

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

Als Elektrodenpuffer wird oft ein TRIS-Glycinat-Puffer mit pH - 8,3 (Kap. 2.6.1) verwendet.

SDS-Äquilibrierung der IEF-Gelstreifen für die zweite Dimension Nach der isoelektrischen Fokussierung wird das Trägerampholyten-haltige IEF-Gel oder die IPG-Gelstreifen vom Kühlblock der elektrophoretischen Kammer genommen und das Trägerampholyten haltige IEF-Gel mit einer Schere in Gelstreifen geschnitten. Danach werden alle Gelstreifen unter ständigem Schütteln mit einer SDS-Äquilibrierungslösung behandelt. Die Äquilibrierungslösung (Tab. 2.10-4) bildet einerseits Protein-SDSKomplexe in den Streifen, wäscht andererseits die Trägerampholyte im Gel aus, weil sie die nachfolgende SDS-Elektrophorese stören (falls die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten durchgeführt wurde). Tab. 2.10-4 Zusammensetzung einer Äquilibrierungslösung. Konzentration

Vorbereitung

50 mmol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit pH = 6,8

6,06 g TRIS in 80 ml bidest. Wasser lösen, mit 4 mol/1 HC1 auf pH = 6,8 titrieren und mit bidest. Wasser auf 100 ml auffüllen

1-2 g/dl SDS 6,0 mol/l (36,0 g/dl) Harnstoff l g/dl 1,4-Dithiothreitol 0,26 mol/1 (4,81 mg/dl) 2-Iodacetamid 0,1 mmol/1 (3,0 mg/dl) EDTA 30 g/dl Glycerin 0,01 g/dl Bromphenolblau

Zugeben, wenn bei IEF Harnstoff anwesend war. Kurz vor Gebrauch zugeben.

Die Äquilibrierung der Gelstreifen findet in Reagenzgläsern statt. Die Trägerampholyten-haltigen lEF-Gelstreifen werden 2 min und die IPG-Gelstreifen zweimal je 15 min äquilibriert. Bei der zweiten Äquilibrierung der IPG-Gelstreifen wird 0,26 mol/1 2-Iodacetamid zugefügt. 2-Iodacetamid alkyliert die SH-Gruppen der Proteine und außerdem vermeidet bei der Silberfärbung eine Streifenbildung im Gel. Danach werden die äquilibrierten IEF- oder IPG-Gelstreifen für l min zwischen zwei trockene Filterpapierbogen gelegt, um die überschüssige Äquilibrierungslösung abzusaugen. Die überflüssigen Trägerampholyten-haltigen IEF-Gelstreifen oder die IPGGelstreifen können bei -80 °C gelagert und später äquilibriert werden. Nach der Äquilibrierung der Gelstreifen wird auf die kerosenbeschichtete Kühlplatte einer elektrophoretischen Kammer ein homogenes oder ein SDS-Gradientengel aufgelegt und sein Sammelgel mit einem äquilibrierten Gelstreifen, mit der Gelseite nach unten, bedeckt. Der Gelstreifen kann entweder in einen langen Probenschlitz im SDS-Gel eingelegt werden (lay-in-Technik) oder auf seine Oberfläche aufgelegt werden (lay-onTechnik). Die lay-in-Technik wird nach einer isoelektrischen Fokussierung mit Trägerampholyten bevorzugt. Dabei sollte man darauf achten, daß die Ränder des IEF-Gelstreifens

220

2 Elektrophorese der Proteine

möglichst exakt im Probeschlitz des SDS-Gels liegen. Außerdem muß die Dicke des IEFGelstreifens mit der Tiefe des Probenschlitzes übereinstimmen. Die lay-on-Technik wird nach einer isoelektrischen Fokussierung in IPG-Gelstreifen verwendet: der Gelstreifen wird nicht in einen Probenschlitz, sondern mit der Gelseite nach unten auf das SDS-Sammelgel aufgelegt.

SDS-Elektrophorese Die fokussierten Proteine werden im Sammelgel konzentriert und danach in einem homogenen oder Gradientengel getrennt. Für die Gradientengel-Elektrophorese wird gewöhnlich das klassische diskontinuierliche Puffersystem von Ornstein [21] und Davis [22] mit Zusatz von SDS [23] verwendet. Außer in Gradientengelen kann die SDS-Elektrophorese ebenfalls in homogenen Gelen mit einem hochauflösenden Puffersystem durchgeführt werden [22, 23] (Kap. 2.7.3). Nach dem Auflegen der äquilibrierten Gelstreifen werden auf die Gelenden entsprechende Gel- oder Papierelektrodenstreifen aufgelegt. Die SDS-Vorelektrophorese sowie die SDS-Elektrophorese werden bei 10-15 °C durchgeführt. Nach der SDS-Vorelektrophorese, die für ein Standard-Gel (120 250 0,5 mm) ca. 60 min bei 30-80 mA, 200 V und 6-16 W dauert, werden die Gelstreifen entfernt. Die SDS-Elektrophorese findet bei 30-80 mA, 800 V und 15-40 W, abhängig vom Puffer, für weitere 1,5-5 Stunden statt, bis die Front des Bromphenolblau den anodischen Elektrodenstreifen erreicht hat (Abb. 2.10-3).

Abb. 2.10-3 SDS-Elektrophorese nach Auflegen eines äquilibrierten Gelstreifens auf das SDSSammelgel. 1. Trennkammer; 2. Anodenstreifen; 3. Trenngel; 4. Sammelgel; 5. Gelstreifen mit getrennten durch IEF Proteinbanden; 6. Kathodenstreifen.

221

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

2.10.3 Nachweis der Proteine und Auswertung der 2D-Pherogramme Das Aussehen eines 2D-Pherogramms ist tüpisch (Abb. 2.10-4). Der Nachweis seiner Proteinflecken wird hauptsächlich über eine Silberfarbung oder eine Autoradio- bzw. Fluorographie durchgeführt.

t

SDS IPG Abb. 2.10-4 Schema der horizontalen 2D-Elektrophorese bei Verwendung von immobilisierten pH-Gradienten in der ersten Dimension.

Silberfarbung. Die Silberfärbung ist heutzutage die höchstempfindliche Nachweismethode für Proteine, deren Verwendung ständig zunimmt (Kap. 2.14.2). Ihre Empfindlichkeit liegt bei 0,05 bis 0,1 ng/mm2. Sie wird aber von einem unterschiedlich stark gefärbten und unklaren Gelhintergrund begleitet. Außerdem zeigen die Proteinflecke verschiedene Farbtöne, was die Proteinquantifizierung erschwert. Autoradio- und Fluorographie. Die Autoradiographie und Fluorographie (Kap. 2.14.7) sind die empfindlichsten Nachweismethoden für ein 2D-Pherogramm. Als Autoradiographie wird die Übertragung der Emission von radioaktiv markierten Proteinen auf einen Röntgenfilm bezeichnet, während bei der Fluorographie durch Wechselwirkung zwischen einer radioaktiven Strahlung und einer szintillierenden Substanz sichtbares Licht entsteht, das den Film schwärzt. Mit Hilfe der Autoradiographie können zwei Proteine verglichen werden. Dafür sollten sie mit unterschiedlichen Isotopen markiert werden - das eine Protein mit 3 H-Aminosäuren, das andere mit 14C-Aminosäuren oder 35S-Methionin. Die Proteinmarkierung erfolgt in der Regel in lebenden Zellen, sie kann aber auch durch zusätzliche Bindung durchgeführt werden. Die beiden Proteine werden gemischt und im gleichen Gel getrennt. Nach der 2D-Elektrophorese können durch unterschiedliche Expositionen des Filmes zwei unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden - ein - - und ein 14 C- Autoradiogramm, die durch Übereinanderlegen verglichen werden können.

222

2 Elektrophorese der Proteine

Für die Fluorographie wird 15 g/dl 2,5-Diphenyloxazol (PPO) in Dimethylsulfoxyd (DMSO) verwendet. Dafür wird das Flachgel nach der 2D-Elektrophorese für l h in eine Fixierlösung, für 10 min in eine Entfärbelösung, über Nacht in DMSO, 3,5 h in 15 g/dl PPO in DMSO und l h in 5 g/dl Glycin aufbewahrt. Danach wird das Gel getrocknet, indem auf das Lochblech einer Trockenplatte 10 Blatt nasses Filterpapier, eine nasse Cellophanmembran, das Gel, eine zweite nasse Cellophanmembran und eine poröse Polyethylenplatte aufeinander gelegt und mit einem Gummilappen bedeckt werden. Nun werden alle Schichten unter Vakuum zusammengepreßt, das mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe erzeugt wird. Das Trocknen erfolgt über Nacht bei 50 °C. Auf das getrocknete Gel wird ein Röntgenfilm gelegt. Die Exposition des Filmes findet bei -70 °C im Laufe von 2-3 Tagen statt. Schließlich wird der Film wie üblich entwickelt: 6 min entwickeln, 10 min fixieren und 10-20 min wässern. Auswertung der 2D-Pherogramme. Die visuelle Auswertung eines 2D-Pherogramms mit seinen mehreren hundert Proteinflecken erfordert einen Leuchtkasten. Auf diese Weise können nur Positionsunterschiede, das Fehlen von Proteinflecken oder starke Intensitätsunterschiede erkannt werden. Eine präzise Auswertung der Proteinflecke kann nur mit Hilfe eines Densitometers und eines Computers durchgeführt werden (Kap. 2.15.5). Auf diese Weise können Proteinflecke von zwei unterschiedlichen bakteriellen Stämmen sowie von ihren Hybriden verglichen werden.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Vor der isoelektrischen Fokussierung bzw. SDS-Elektrophorese Das Polyacrylamidgel polymerisiert nicht oder wird klebrig.

Die Konzentration von Acrylamid, BIS, TMEDA oder APS in der Monomerlösung ist zu niedrig. Die APS-Lösung war zu alt oder unsachgemäß gelagert.

Die Konzentration von LuftsauerstofT in der Monomerlösung war zu hoch.

Die Konzentrationen erhöhen. Pro l ml Monomerlösung 5 10 g/dl APS-Lösung und 5 10 ml/dl TMEDA verwenden. Eine neue APS-Lösung verwenden, Die APS-Lösung im Kühlschrank bei 4-8 °C aufbewahren. Unter diesen Bedingungen ist sie für 2 Wochen verwendbar. Die Monomerlösung an einer WasserStrahlpumpe entlüften,

223

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

Probleme

Die obere Kante des Gels ist klebrig und löst sich von der Haßfolie. Die Monomerlösung polymerisierte zu schnell.

Es gibt Lußblasen im Gel.

Ursachen

Abhilfe

Die höheren Konzentrationen von Trägerampholyten (über 3 g/dl) bremsen die Polymerisation.

Niedrigere Konzentrationen von Trägerampholyten verwenden oder das Gel in Abwesenheit von Trägerampholyten polymerisieren und später mit Trägerampholythaltigen Lösungen rehydratisieren. Nach dem Gießen die Monomerlösung mit dest. Wasser überschichten.

Der Luftsauerstoff hat die Polymerisation der Oberkante inhibiert. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu hoch. Die Temperatur in der Umgebung war sehr hoch. Die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kommt, war unsauber. Die Haftfolie ist unsauber. In die Monomerlösung gelangen Luftblasen aus dem Gradientenmischer.

Das Gel löst sich von der Haßfolie.

Das Gel haftet nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte.

Eine falsche Haftfolie wurde verwendet. Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen. Die Monomerlösung enthielt eine hohe Konzentration des nichtionischen Detergenzes Triton X-100 oder Nonidet NP-40. Die Glasplatte war zu hydrophil. Das Gel ist zu lange in der Gießkassette geblieben.

Es zeigt sich Flüssigkeit auf der Oberfläche des Polyacrylamidgels.

Im Laufe der Zeit hydrolysiert das Polyacrylamidgel, falls der pH-Wert seines Puffers über 8,8 ist.

Die Rezeptur für das Gelgießen überprüfen. Das Gel bei 20-25 °C gießen. Vor der Benutzung die Glasplatte waschen. Die hydrophile Seite der Haftfolie nicht mit Fingern berühren. Vor dem Gießen des Gels die Auslaßschläuche des Gradientenmischers säubern und trocknen. Die Luftblasen in der Gießkassette durch heftiges Klopfen entfernen. Die Haftfolien für Polyacrylamid- und Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen; mit Wassertropfen die richtige Seite feststellen. Niedrigere Detergenskonzentration verwenden oder das Gel in Abwesenheit von Detergenzien polymerisieren, die später beim Rehydratisieren ins Gel eindringen. Die Glasplatte reinigen und mit RepelSilan behandeln. Spätestens l h nach der Polymerisation das Polyacrylamidgel aus der Kassette entnehmen. Die Polyacrylamidgele mit alkalischen Puffern innerhalb von 2 Wochen verwenden. Wenn möglich, die Monomerlösung in neutralen oder fast neutralen Puffern polymerisieren lassen.

2 Elektrophorese der Proteine

224

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Während der isoelektrischen Fokussierung bzw. SDS-Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig Strom.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt.

Es besteht schlechten Kontakt an den Elektrodenstreifen bzw. Elektrodengelen. Die Stromstärke steigt während der IEF an. Die Front wandert bogenförmig im SDSGradientengei Es entwickelt sich Wasserkondensation auf dem Deckel der Trennkammer.

Es zeigt sich Wasserkondensation über bestimmten Stellen im Gel. Das Gel "schwitzt" (wird mit Wassertropfen bedeckt). Das Gel funkt und brennt.

Der Harnstoff in den 1PGGelen kristallisiert aus. Iso-pH-Linien im Gel.

Die Elektrodenlösungen sind vertauscht. Das Gradientengel ist vor dem horizontalen Ausgleich des Dichtegradienten polymerisiert. Die Kühlung ist nicht genügend.

Die elektrische Leistung ist zu hoch. Lokale Überhitzung wegen Luftblasen in der Kontaktflüssigkeit. Es gibt keine wasserbindenden Additive (Glycerin oder Saccharose) im Gel. Die Haftfolie lag beim Gelgießen nicht fest auf der Glasplatte und deswegen haben sich dünne Stellen im Gel gebildet. Die lEF-Temperatur ist zu niedrig. Die Konzentration von APS war zu hoch. Zerfall des Harnstoffs im Gel zu Isocyanat.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die Standardeinstellung bei einem IPG-Gel ist 5000 V, 1,0 mA und 5,0 W. Die gleichmäßige Auflage der Elektroden auf den Elektrodenstreifen bzw. Elektrodengelen überprüfen. Die saure Lösung zur Anode, die basische Lösung zur Kathode geben. Die APS-Konzentration in den beiden Monomerlösungen reduzieren. Die Kühltemperatur überprüfen; die Kühlblöcke sollten aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein. Kerosen oder Silikonöl DC200 zwischen den Kühlblock und die Haftfolie geben. Die elektrische Leistung sollte maximal 2,5 W/ml Gel betragen. Die Luftblasen entfernen.

In die Monomerlösung 20 g/dl Glycerin oder 10 g/dl Saccharose geben. In die Rehydratisierungslösung 20 g/dl Glycerin zufügen. Vor dem Gelgießen die Haftfolie an der Glasplatte der Gießkassette fest walzen. Bei 15 °C fokussieren. Die Konzentration von APS reduzieren oder rehydratisierbare Gele verwenden. Die Harnstoff-Gele sofort nach ihrer Herstellung verwenden.

Nach der SDS-Elektrophorese Es gibt keine Banden im Gel. Die Proteinbanden im Gel sehen schwach aus. Die Proteinbanden sind unscharf.

Die Kathode und Anode waren vertauscht. Die Proteinkonzentration in der Probe war zu niedrig. Die Protein-SDS-Komplexe wurden nicht ausgebildet. Es gab proteolytischen Abbau der Proteine.

Den Anschluß der Elektroden am Stromversorger überprüfen. Die Proben konzentrieren, größere Probenvolumina auftragen. Die SDS-Konzentration soll in der Probe l g/dl und im Gel 0, l g/dl nicht unterschreiten. Die Probe mit Proteaseinhibitoren (PMSF, EDTA u.a.) mischen.

225

2.10 Die zweidimensionale Elektrophorese

Probleme

Das Gel löst sich beim Färben von der Haßfolie.

Die Haßfolie rollt sich ein.

Ursachen

Abhilfe

Es gab Diffusion nach der Trennung. Die starken Säuren (TCA), die in manchen Lösungen enthalten sich, hydrolysieren die Bindung zwischen der Haftfolie und dem Gel. Das Gel zieht sich zusammen.

Nach dem Stromabschalten die Proteine sofort fixieren. Die hochkonzentrierten Gele (T> 10 g/dl) mit einem Vernetzungsgrad von C = 0,02 herstellen, anstelle von üblich verwendetem C = 0,03. In die letzte Waschlösung 5-10 g/dl Glycerin geben, um das Gel elastischer zu machen.

Literatur [1J Pollard JW, in Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Proteins, Celis J, Brava R (Hrsg.), Academic Press, San Diego, S. 363 (1983) [2) Lossius I, Siastad K, Haarr L, Kleppe K, J Gen Microbiol, 130, 3153 (1964) [3J Remy R, Ambard-Bretteville F, de Francs CC, Electrophoresis, 8, 528 (1987) [4] Holloway PJ, Arundel PH, Anal Biochem, 172, 8 (1988) [5] Marshall T, Williaos KM, Electrophoresis, 9, 143 (1988) [6] Anderson NG, Powers MT, Tollaksen SL, Clin Chem, 28, 1045 (1982) [7] Marshall T, Anal Biochem, 139, 506 (1984) [8] Wirth PJ, Yaspa SH, Thorgeirsson S, Hennings H, Cancer Res, 47, 2831 (1987) [9] Macko V, Stegemann H, Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem, 350, 917 (1969) (10] Dale G, Latner AL, Clin Chim Acta, 24, 61 (1969) [11] O'Farrell PH,JBiol Chem, 250, 4007 (1975) [12] Klose J, Humangenetik, 26, 231 (1975) [13] Scheele GA,JBiol Chem, 250, 5375 (1975) [ 14] Goldsmith MR, Rattner EC, Koehler MD, Balikov SR, Bock SC, Anal Biochem, 99, 33 (1979) [15] Anderson NG, Anderson NL, Anal Biochem, 85, 331 (1978) [ 16] Manabe T, Tachi K, Kojima K, Okuyama T, J Biochem, 85, 649 (1979) [17] Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG, Gianazza E, Görg A, Westermeier R, Postel W, J Biochem Biophys Methods, 6, 317 (1982) [18] Altland K, Rossmann U, Electrophoresis, 6, 314 (1985)

226

2 Elektrophorese der Proteine

[19] Michov BM, Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines TRIS-Formiat-Taurinat-Puffersystems und dafür geeignete homogene Elektrophoreseplatten, Deutsches Patent, 4127546, 20.08.1991 [20] Michov BM, GITFachz Lab, 36, 746 (1992) [21] Ornstein L, Ann N YAcadSci, 121, 321 (1964) [22] Davis BJ, Ann N YAcadSci, 121, 404 (1964) [23] Laemmli UK, Nature, 227, 680 (1970)

2.11 Präparative Elektrophorese der Proteine Bei der präparativen Elektrophorese der Proteine werden die elektrophoretisch aufgetrennten Fraktionen aus dem Träger, gewöhnlich dem Gel, eluiert. Das kann entweder während oder nach der Elektrophorese durchgeführt werden.

2.11.1 Elution der Proteine während der Elektrophorese Die Elution der Proteine aus dem Gel während der Elektrophorese wird nach folgendem Prinzip durchgeführt: die Proteine, die das Trenngel verlassen, werden durch einen PufFerstrom zu einem Sammler abtransportiert. Das kann z.B. mit Hilfe eines Kanals in der Mitte des Trenngels [1] oder eines Kanals zwischen dem unteren Teil eines 4 g/dl Polyacrylamidgels und dem oberen Teil eines dünnen 25 g/dl Polyacrylamidgels stattfinden, das im unteren Teil der Kassette einpolymerisiert ist [2]. Beide Methoden zeigen eine begrenzte Effektivität. Die erste erfordert ein spezielles Gerät, die zweite einen Gelhalter und das Gießen von einigen Gelschichten. Außerdem fließt der Puffer in beiden Systemen durch einen Horizontalkanal, der innerhalb des Trenngels liegt, und das kurze Trenngel reduziert die Auflösung. Deswegen ist die Ausbeute zu niedrig - z.B. für Albumin und Cytochrom-Oxidase 20-40 % von ihren Mengen. Eine einfache Vorrichtung [3] zur Elution der getrennten Proteine aus dem Gel stellt eine Kassette mit Gel dar, die im unteren Teil einen schmalen Kanal hat. Der Kanal kommuniziert mit einem Schlauch, der mit einer Peristaltikpumpe verbunden ist. Die Pumpe wälzt durch den Kanal langsam einen Puffer um, der die Proteinfraktionen zu einem Sammler abtransportiert (Abb. 2.11-1).

Gel

Peristaltische Pumpe

Kollektor Abb. 2.11-1 Einfache Vorrichtung zur Durchführung von Proteinelution während der Elektrophorese.

228

2 Elektrophorese der Proteine

Ein ähnliches Gerät für die präparative Elektrophorese wurde auf der Basis der vertikalen Mini-Protean-II-Kammer ( -RAD, Hercules, Ca.) entwickelt [4]: In diesem Gerät wird die Kassette von drei ein mm dicken Spacern, zwei äußeren und einem inneren, in zwei Abteilungen aufgeteilt: eine große für das präparative Gel und eine kleine für das Detektorgel (Abb. 2. 1 1-2). Kollektor

Puffer

Präparat! ves Gel

Detektorgel

Abb. 2.11-2 Schema eines Geräts für die Elution der Proteine während der Elektrophorese. Die Kassette hat 2 Abteilungen: eine große für das präparative Gel und eine kleine für das Detektorgel. Die Anschlüsse für den zirkulierenden Elutionspuffer stehen in Kontakt mit den inneren Oberflächen der Spacer auf beiden Seiten des präparativen Gels und sind mit einer 2-Kanal-Peristaltikpumpe verbunden. Das untere Ende des präparativen Gels ist in eine Dialysemembran eingeschlagen.

Zwischen dem großen Polyacrylamidgel und seine Spacern sind Polyethylenschläuche befestigt, die bis zum Boden des präparativen Gels reichen. Das Detektorgel dient zur Bestimmung der Positionen der gefärbten Proteine. Beide Gele bestehen aus einem Sammelgel (T = 3 g/dl und C= 0,03) und einem Trenngel (7= 10 g/dl und C = 0,03) und enthalten das Puffersystem von Laemmli [5] oder Schägger-Jagow [6]. Mit Hilfe von zwei Kämmen werden am oberen Ende der Gele Vertiefungen zum Probenauftrag gebildet. Nach der Gelpolymerisation werden die Glasplatten der Kassette vorsichtig vom präparativen Gel entfernt und eine Dialysemembran um sein Ende und die beiden Polyethylenschläuche befestigt. Danach werden die Glasplatten wieder auf das Gel gelegt und jeder Schlauch wird mit einem Separatkanälchen der Peristaltikpumpe verbunden (Abb. 2.11-2). Der Elutionspuffer wird durch die Schläuche gepumpt, wobei der Druck auf beiden Seiten der Membran gleich bleiben muß. Wenn nicht, kann die Membran zerreißen. Der Einlaßschlauch ist mit einem Pufferreservoir verbunden, der Auslaßschlauch mit einem Fraktionskollektor. Bei Verwendung dieses Geräts beträgt die Ausbeute zwischen 89 und 99 % der Proteinmenge.

2.11 Präparative Elektrophorese der Proteine

229

2 1.2 Elution der Proteine nach der Elektrophorese Die elektrophoretisch getrennten Proteine werden vom Gel nach Ausschneiden (Exzision) der Banden eluiert (extrahiert). Dies kann nach einem der folgenden Verfahren durchgeführt werden: l. nach Homogenisieren des Gels; 2. nach chemischer Depolymerisation des Gels und 3. durch eine Elektroelution. Die Elution nach Homogenisieren des Gels verläuft gewöhnlich folgendermaßen: 1. Ein Teil des Gels wird für Proteine gefärbt, um festzustellen, wo sich die zu untersuchenden Proteine befinden; 2. Die Gelstücke, in denen sich die Proteinbanden befinden, werden mit einer Schere ausgeschnitten und zerkleinert; 3. Danach werden sie in Reagenzgläser überführt, wo die Proteine nach einem Homogenisieren mit Puffer eluiert werden. Die Ausbeute bei der Elution nach dem Homogenisieren hängt vom Zerkleinerungsgrad des Gels ab. Je feiner die Gelstückchen sind, desto größer ist die Ausbeute. Dieses Elutionsverfahren ist jedoch zeitaufwendig und unvollständig, da immer noch Proteine im Gel verbleiben. Die Elution nach chemischer Depolymerisation des Gels ist eine komplizierte Arbeit, bei der das Protein oft chemisch verändert wird. Die Elektroelution der getrennten Proteine kann in einem Puffer [7] oder in einem Puffersystem [8] durchgeführt werden. Sie verläuft in folgenden Schritten: an einem Röhrchen mit einem Sieb wird ein Beutel aus einer Dialysemembran befestigt, das Röhrchen wird mit Puffer gefüllt und in einen Tank mit demselben Puffer eingesetzt. Das Polyacrylamidgel wird in kleine 1-2 mm dicke Stückchen geschnitten und in das Röhrchen übertragen. Die Elektroelution wird oft in einem 0,05 mol/1 Ammonium-Hydrogencarbonat-Puffer mit pH = 7,4 bei Raumtemperatur durchgeführt [9]. Bessere Ergebnisse werden in einem 0,05 mol/1 TRIS-Chlorid-Puffer mit pH = 7,4 erzielt [10]. Danach wird elektrischer Strom angelegt, wobei die Proteine durch das Sieb in den Dialysebeutel eindringen (Abb. 2.11-3). Schließlich kann das Proteineluat konzentriert und lyophilisiert werden.

Abb. 2.11-3 Schema einer Vorrichtung für Elution nach der Elektrophorese. 1. Röhrchen mit Puffer; 2. Gel; 3. Sieb; 4. Tank mit Puffer; 5. Dialysebeutel.

230

2 Elektrophorese der Proteine

Die Elektroelution zeichnet sich durch relativ hohe Ausbeuten aus. Durch sie wird z.B. bis zu 95 % des Insulins, Myoglobins und Rinderserumalbumins aus einem Gel eluiert.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu niedrig. Die APS-Lösung war zu alt oder unsachgemäß gelagert. Die Raumtemperatur war zu niedrig. Die Konzentration von Acrylamid oder BIS war zu niedrig. Die Monomer- oder APS-Lösung war überlagert.

Die Zusammensetzung der Monomerlösung überprüfen. Die Konzentration von TMEDA oder APS erhöhen. Neue APS-Lösung verwenden. Die APS-Lösung im Kühlschrank lagern. Das Gel bei 20-25 °C gießen.

Die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kommt, war unsauber. Der Luftsauerstoff in der Monomerlösung inhibierte die Gelpolymerisation. Eine falsche Haftfolie wurde verwendet.

Vor der Benutzung die Glasplatte mit Geschirrspülmittel oder Ethanol waschen. Vor dem Gelgießen die Monomerlösung entgasen.

Vor der Elektrophorese Die Monomerlösung polymerisiert nicht oder zu langsam.

Die Polyacrylamidgele sind zu weich und klebrig.

Die Monomerlösung polymerisiert zu schnell.

Es entstehen Luftblasen beim Gießen der Polyacrylamidgele.

Es entstehen Luftblasen während der Polymerisation der Monomerlösung. Das Gel löst sich von der Haßfolie.

Die Konzentration von Acrylamid oder BIS erhöhen.

Die maximale Lagerdauer im Kühlschrank für eine Monomerlösung liegt bei 4 Wochen, für eine APS-Lösung bei 2 Wochen. Die Konzentraüon von TMEDA 5 10 g/dl APS-Lösung und 5 oder APS in der Monomerlö10 ml/dl TMEDA pro l ml sung war zu niedrig. Monomerlösung verwenden. Es gab zu viel Luftsauerstoff in Die Monomerlösung an der Wasserder Monomerlösung. strahlpumpe entlüften. Die Konzentration von TMEDA Die Rezeptur für das Gelgießen überoder APS in der prüfen - die Konzentrationen von Monomerlösung war zu hoch. TMEDA oder APS reduzieren. Die Raumtemperatur ist extrem Das Gel bei 20-25 °C gießen. hoch. Die hydrophile Seite der Haftfolie Die Haftfolie war unsauber. nicht mit Fingern berühren.

Die Haftfolien für Polyacrylamid- und Agarosegele nicht vertauschen.

231

2.11 Präparative Elektrophorese der Proteine

Ursachen

Abhilfe

Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen.

Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen, vorher die Seite mit Wassertropfen überprüfen. Die Haftfolien bei Raumtemperatur, trocken und im Dunkeln aufbewahren.

Probleme

Die Haftfolie ist falsch oder zu lange gelagert.

Während der Elektrophorese Es fließt kein oder zu wenig elektrischer Strom.

Das Gel "dampft" - der Deckel der Trennkammer wird mit kondensiertem Wasserdampf bedeckt.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Schlechter Kontakt an den Elektrodenstreifen oder -gelen. Die elektrische Spannung ist zu hoch.

Die Kühlung ist ungenügend.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die gleichmäßige Auflage der Elektroden überprüfen, eventuell mit Glasplatten beschweren. Die elektrische Spannung reduzieren.

Die Kühltemperatur überprüfen. Die Kühlblöcke sollen aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein.

Nach der Elektrophorese Es gibt keine Proteinbanden im Gel.

Die Proteinbanden bildeten Schweife.

Die Kathode und Anode sind vertauscht. Die Proteine haben das Gel verlassen. Die Probe enthielt zu viel Proteine.

Den Anschluß am Stromversorger überprüfen. Den Lauf der Farbstoffront beachten. Geringeres Probenvolumen auftragen oder die Probe verdünnen.

Literatur [1] Groschup MH, Boschwitz J, Timoney JF, Electrophoresis, 12, 90 (1991) [2] Carpenter HC, Skeritt JH, Wrigley CW, Margolis J, Electrophoresis, 7, 221 (1986) [3] Kyriakopoulos A, Kalcklösch M, Weiß-Nowak C, Behne D, Electrophoresis, 14, 108 (1993) [4] Lim YP, Callanan H, Lin SH, Thompson NL, Hixson DC, Anal Biochem, 214, 156 (1993) [5] Laemmli UK, Nature, 227, 680 (1970) [6] Schägger H, Jagow G, Anal Biochem, 166, 368 (1987) [7] Hunkapiller MW, Lujan E, Ostrander F, Hood LE, Methods Enzymol, 91, 227 (1983)

232

2 Elektrophorese der Proteine

[8] Chrambach A, The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis, VCH, Weinheim - Deerfield Beach, F1. (1985) [9] Hunkapiller MW, Lujan E, Ostrander F, Hood LE, Methods Enzymol, 91, 227 (1983) [10] Horuk R, in Advances in Electrophoresis, Chrambach A, Dünn MJ, Radola BJ (Hrsg.), VCH, Weinheim - Basel - Cambrige - New York, Bd. l, S. 361 (1987)

2.12 Präparat!ve isoelektrische Fokussierung Die präparative isoelektrische Fokussierung kann mit Trägerampholyten oder in immobilisierten pH-Gradienten durchgeführt werden.

2.12.1 Präparative IEF mit Trägerampholyten in granulierten Gelen Die präparative isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten wird hauptsächlich in granulierten horizontalen Gelen durchgeführt [1,2]. Dafür wird ein gereinigtes Dextrangel (Sephadex) oder ein granuliertes Polyacrylamidgel mit Trägerampholyten vermischt und in eine Gießform (eine Glasplatte mit einem Silikongummirahmen) gegossen. Nach einer Vorfokussierung zur Ausbildung des pH-Gradienten wird ein Teil des Gels herausgenommen, mit der Probe vermischt und wieder an seinen Platz zurückgegeben. Nach der präparativen IEF können die Proteinfraktionen durch einen Papierabdruck lokalisiert und in einer Menge bis zu 100 mg eluiert werden. Die präparative isoelektrische Fokussierung in horizontalen granulierten Gelen umfaßt folgende Schritte: • Herstellung eines granulierten Gels; • Einbringen einer Probe ins granulierte Gel; • Isoelektrische Fokussierung; • Isolieren und Elution der Proteine.

Herstellung eines granulierten Gels Für die präparative IEF können Sephadex G-75, G-200 oder am besten Ultrodex (Pharmacia Biotech, Uppsala) verwendet werden [3], die am wenigsten freies Dextran enthalten. Das granulierte Polyacrylamidgel Bio-Gel P-60 wird bei Untersuchungen von Enzymen verwendet, da es enzymatisch resistent ist. SephadexG-75 und G-200 müssen vor der Herstellung des Gels mit destilliertem Wasser gewaschen werden Beim Ultrodex, einem gereinigten Dextrangel, entfällt das Waschen. Das Gel wird gewöhnlich in einer Fritte gewaschen, die auf eine Vakuumflasche aufgesetzt ist. Zuerst nimmt das Gel Wasser auf und quillt, danach durchströmt das Wasser das gequollene Gel und wird mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Nachden die Differenz zwischen den Leitfähigkeiten des Wassers vor und nach dem Waschen ein Minimum erreicht hat, kann der Waschprozeß beendet werden. Nach dem Waschen kann das Gel getrocknet oder im gequollenen Zustand aufbewahrt werden. Vor dem Trocknen muß das gewaschene Gel in einer Fritte mit steigenden Konzentrationen von Ethanol durchströmt werden - zuerst mit 50 ml/dl, dann mit 70 ml/dl, am Ende mit reinem Ethanol. Um ein horizontales granuliertes Gel für die präparative isoelektrische Fokussierung herzustellen, wird das gequollene Gel mit Trägerampholyten gemischt, in eine horizon-

234

2 Elektrophorese der Proteine

tale Schicht gegossen und bis zu der Konsistenz getrocknet, die kein Abfließen des Gels beim Neigen der Gießform auf 45° erlaubt. Die Herstellung einer horizontalen Schicht aus granuliertem Gradientengel umfaßt 3 Schritte: Mischen des gewaschenen Gels mit Trägerampholyten, Einlegen der Elektrodenstreifen in die Gießform und Gießen der Gel-Trägerampholyten-Mischung, und partielles Trocknen der Gel-Trägerampholyten-Mischung (Abb. 2.12-1).

Abb. 2.12-1 Herstellung einer horizontalen Schicht aus granuliertem Gel für die präparative IEF mit Trägerampholyten. Nach dem Mischen des Gels mit Trägerampholyten und Einlegen der Elektrodenstreifen (1) wird die Mischung (2) in eine Gießform (3) gegossen und danach partiell mittels einer Lampe (4) getrocknet.

Mischen des gewaschenen Gels mit Trägerampholyten. Das gequollene Gel wird mit Trägerampholyte vermischt. Es wurde festgestellt, daß für die präparative isoelektrische Fokussierung von 10 mg Protein l ml Gel mit 2 g/dl Trägerampholyten gebraucht wird, nach der Gleichung

mr V * =

(2.12-1)

10

wobei Va, in ml, das Volumen der partiell getrockneten Gelschicht, V0 das Standardvolumen von l ml, und mp, in mg, das zu fraktionierende Protein ist. Es darf nicht vergessen werden, daß sich beim Trocknen die Masse des gequollenen Gels auf 65 % reduziert. Deswegen soll das Volumen des gequollenen Gels um 100/65 = 1,5 mal größer sein (s.u.). Das Volumen der Trägerampholyten-Stammlösung FCA, die dem Gel beigemischt werden muß, ergibt sich aus der Gleichung: C

CA

(2.12-2)

2.12 Präparative isoelektrische Fokussierung

235

wobei CCA die gewünschte Trägerampholyten-Endkonzentration (meistens 2 g/dl) nach dem partiellen Trocknen der Gel-Trägerampholyten-Mischung, und c§L die Konzentration der Trägerampholyten-Stammlösung ist. Das Mischen des gequollenen Gels mit Trägerampholyten wird folgenderweise durchgeführt: Das benötigte Volumen des gequollenen Gels, gleich 1,5 Fg (Gl. 2.12-1), wird auf einem Becherglas markiert und soviel gequollenes Gel in das Glas gegossen, daß die Grenze zwischen der Geloberfläche und überschüssigem Wasser, die sich nach 10-15 min einstellt, mit der Markierung übereinstimmt. Dann wird das überschüssige Wasser dekantiert, das erforderliche Volumen der Trägerampholyten-Stammlösung (Gl. 2.12-2) ins Becherglas gegossen und das Gemisch 20 min geschüttelt. Einlegen der Elektrodenstreifen in die Gießform und Gießen der Gel-Trägerampholyten-Mischung. Vor dem Gießen der Gel-Trägerampholyten-Mischung werden zwei 5-7 mm breite Eisktrodenstreifen aus Filterkarton ausgeschnitten, so daß sie um 2 mm kürzer als die Innenbreite der Gießform sind. Danach werden auf den kathodischen und anodischen Innenrand der Gießform so viele Elektrodenstreifen übereinander einlegt, bis die gesamte Dicke der Rahmensdicke entspricht. Die Elektrodenstreifen werden mit l g/dl Trägerampholyten getränkt, die Gießform nivelliert und die Gel-Trägerampholyten-Mischung gegossen (Abb. 2.12-1). Um die Verteilung der Mischung zu beschleunigen, kann die Gießform leicht geschüttelt werden. Partielles Trocknen der Gel-Trägerampholyten-Mischung. Die Gel-TrägerampholytenMischung wird danach aus ca. 70 cm Höhe mit kaltem Luftstrom auf 65 % seiner ursprünglichen Masse getrocknet (Abb. 2.12-1). Dieser Prozeß dauert etwa 2 h. Man verfolgt die Massenabnahme, indem man die Gießform von Zeit zu Zeit wiegt, bis ihre Gesamtmasse m gleich

m = /Mg + 0,65 m0 wird. Dabei ist mg die Masse der leeren Gießform mit den eingelegten feuchten Elektrodenstreifen und m0 die Masse der Gel-Trägerampholyten-Mischung vor dem partiellen Trocknen.

Einbringen einer Probe ins granulierte Gel Die Salzkonzentration in der Probe muß, wie bei der analytischen isoelektrischen Fokussierung, möglichst niedrig sein - bis zu 0,001 mmol/ml Gel, wenn die Konzentration der Trägerampholyte im Gel 2 g/dl beträgt. Die Probe kann in der Gelschicht gleichmäßig verteilt oder als eine Zone in die Gelschicht eingebracht werden. Im ersten Fall wird die Probe beim Mischen des Gels mit Trägerampholyten zugefügt. Somit lassen sich größere Probenvolumina ins Gel einfüllen. Im zweiten Fall wird ein rechteckiger Rahmen benutzt, der in die Gelschicht mindestens 2 cm weit vom Elektrodenstreifen entfernt eingesetzt wird. Das Gel im Rahmen wird mit einem Spatel aufgenommen und in ein Becherglas überfuhrt. Dort wird es mit der Probe vermischt und in den Rahmen zurückgegossen. Danach wird der Rahmen aus dem Gel heraus-

236

2 Elektrophorese der Proteine

genommen und wieder der Kontakt zwischen der Auftragszone mit der Probe und der übrigen Gelschicht hergestellt (Abb. 2.12-2).

Abb. 2.12-2 Auftrag der Probe als eine Zone in die granulierte Gelschicht. 1. Glasplatte mit einem Silikongummirahmen; 2. Elektrodenstreifen; 3. Vertierung in der Gelschicht; 4. granuliertes Gel.

Isoelektrische Fokussierung Vor dem Start der präparativen isoelektrischen Fokussierung werden auf die Elektrodenstreifen feuchte Filterpapierstreifen aufgelegt. Der anodische Filterpapierstreifen wird mit 0,5 mol/1 H3PO4, der kathodische mit 0,5 mol/1 NaOH getränkt. Danach wird die Gießform mit der granulierten Gelschicht auf die Kühlplatte einer Trennkammer gelegt. Zwischen der Glasplatte der Gießform und der Kühlplatte der Trennkammer werden 1-2 ml Wasser aufgetragen, um den Wärmeaustausch zu verbessern. Danach wird der Sicherheitsdeckel aufgelegt und der Stromversorger angeschlossen. Die Bedingungen für die präparative isoelektrische Fokussierung sind in Tab. 2.12-1 angegeben: Tab. 2.12-1 Bedingungen für die präparative IEF in horizontalen granulierten Gelschichten mit 2 g/dl Trägerampholyten bei einer Laufstrecke von 20 cm.

Vorfokussierung Fokussierung

P, W

/, mA

U, V

Zeit, h

Die Leistung erhöhen bis die Spannung 300 V beträgt. Die Leistung erhöhen bis die Spannung 600 V beträgt.

maximal

maximal

2

maximal

maximal

16-20

Isolieren und Elution der Proteine Nach der Beendigung der präparativen Elektrofokussierung werden die Proteinfraktionen mit Hilfe eines Fraktionierungsgitters oder nach Visualisierung ihrer Positionen voneinander isoliert.

2.12 Präparative isoelektrische Fokussierung

237

Am schnellsten ist die Isolierung mittels eines Fraktionierungsgitters [4]. Das Fraktionierungsgitter wird in die Gelschicht gepreßt und die entstandenen Gelsegmente mit einem Spatel aufgenommen (Abb. 2.12-3). Dies kann jedoch zum Zerteilen der Proteinfraktionen fuhren.

Abb. 2.12-3 Isolierung der Proteinfraktionen mit einem Fraktionierungsgitter.

Das Visualisieren der Proteinpositionen wird folgendermaßen durchgeführt: • Nach Beendigung der präparativen IEF wird ein Filterpapierblatt (Filterpapierreplica) auf die Gelschicht so aufgelegt, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden (Abb. 2.12-4). • Nach 60 s wird es abgenommen, auf eine Glasplatte gelegt und mit heißer Luft getrocknet. • Die übertragenen Proteine werden 5 min in 10 g/dl Trichloressigsäure fixiert, 5 min in 0,1 g/dl Coomassie-Brillantblau R 250 in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V) gefärbt und schließlich der Hintergrund in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V. V) entfärbt.

Abb. 2.12-4 Auflegen eines Filterpapierblaües auf das Gel, um die Proteinpositionen zu visualisieren. 1. Glasplatte mit einem Silikongummirahmen; 2. granuliertes Gel; 3. Filterpapierblatt.

238

2 Elektrophorese der Proteine

Das noch feuchte Filterpapierreplica wird unter die Gießform gelegt, um die Lage der Proteinfraktionen in der Gelschicht festzustellen. Die Gelsegmente mit den gewünschten Proteinfraktionen werden mit einem Spatel voneinander isoliert und aufgenommen. Bei diesem Verfahren läßt aber die Trennschärfe der getrennten Proteine deutlich nach, weil immer eine gewisse Zeit bis zum Isolieren verloren geht. Nach der Isolierung werden die Proteinfraktionen aus dem granulierten Gel eluiert (extrahiert). Die Elution findet in Elutionssäulen statt - in Röhrchen aus Polyethylen oder Glas mit einer Länge von 10 cm und einem Durchmesser von l cm, die von unten mit einem Sieb oder Glaswolle verschlossen sind. Das granulierte Gel wird in diesen Säulen mit Elutionspuffer gespült, wobei das Gel zurückgehalten wird, während der Puffer zusammen mit den Proteinen in Reagenzgläsern gesammelt wird. Die gewonnenen Proteine müssen nach der Elution von den begleitenden Trägerampholyten befreit werden. Dafür werden unterschiedliche Methoden verwendet, die im Prinzip auf der Differenz zwischen den Massen der Trägerampholyte (A/r « 800) und denen der Proteine zurückzuführen sind: Dialyse, Gelfiltration und Ultrafiltration. Schließlich werden die Proteine lyophilisiert oder eingefroren.

Rezyklisierende isoelektrische Fokussierung Die rezyklisierende isoelektrische Fokussierung (RIEF) von Bier et al. [5] basiert auf dem Prinzip der kontinuierlichen Rückführung des Trennmediums in die Elektrophoresekammer bis zur vollständigen Trennung. Dafür sind verhältnismäßig kleine Trennkammern mit einer externen Wärmeabführung notwendig. Die Apparatur besteht aus einer Trennkammer, einer Multikanal-Peristaltikpumpe und einem Thermostat. Die Trennkammer hat eine Breite von 3 cm und ein Gesamtvolumen von 25 ml. Sie setzt sich aus 12 nebeneinander angeordneten Säulen aus Plexiglas zusammen, die oben und unten jeweils eine Mündung für Zu- und Ablauf des rezyklisierenden Puffers besitzen. Jede Säule ist durch eine Nylonmembran mit einer Porengröße von 10 von der Nachbarsäule getrennt. An die erste und zwölfte Säule sind die Elektrodenlösungen angeschlossen, die durch lonenaustausch-Membranen von den anderen Säulen getrennt sind. Die Multikanal-Peristaltikpumpe transportiert die Mischung aus Probe und Trägerampholyten, geteilt in 10 Fraktionen, und die Elektrodenlösungen. Der Thermostat hat ebenso 12 Kanäle. 10 für die Proben-Trägerampholyten-Mischung und 2 für die Elektrodenlösungen (Abb. 2.12-5).

239

2.12 Präparative isoelektrische Fokussierung

-Monitor

Thermostat

Trennkammer

Computer Pumpe

Abb. 2.12-5 Schema der RIEF-Apparatur.

Die Trennkammer wird mit der Probe und den Trägerampholyten gefüllt, die danach durch die Pumpe und den Thermostat rezyklisieren. Solange die Trägerampholyte und die Proteine sich in der Trennkammer befinden, wandern sie durch die Membranen, immer näher zu ihren pl-Punkten. Dadurch verteilt sich ein pH-Gradient zwischen den Säulen. Bei jedem Durchlauf durch die Trennkammer wandern die Proteine immer näher zu ihrem isoelektrischen Punkt. Die bei der rezyklisierenden isoelektrischen Fokussierung entstehende Joulesche Wärme wird vom Thermostat abgeführt. Für jede Säule werden der pH-Wert, die Leitfähigkeit, die Temperatur und die optische Dichte der Probe gemessen und mit Hilfe eines Computers gesteuert. Die präparative IEF wird solange durchgeführt, bis der Gleichgewichtszustand erreicht ist. Die rezyklisierende isoelektrische Fokussierung wurde erfolgreich bei der Reinigung von mono- und polyklonalen Immunglobulinen [6] sowie bei der Isolierung von rekombinanten DNA-Produkten verwendet.

2.12.2 Präparative IEF in immobilisierten pH-Gradienten Die präparative isoelektrische Fokussierung kann auch in immobilisierten pH-Gradienten durchgeführt werden [7, 8] - als präparative IEF in dicken IPG-Gelen oder als Kanalfokussierung.

Präparative IEF in dicken IPG-Gelen Bei dieser Methode werden die Proteine in einem 5 mm dicken IPG-Gel fraktioniert und danach auf elektrophoretischem Weg eluiert [9]. Die dicken IPG-Gele werden auf dieselbe Weise wie die dünnen IPG-Gele (Kap. 2.8.2) hergestellt, die benötigte Geldicke verlangt aber Kassettendichtungen mit entsprechender Dicke. Für den Probenauftrag

240

2 Elektrophorese der Proteine

wird beim Gelgießen ein 2-3 mm tiefer Probeschlitz gezogen. Er soll vom anodischen bzw. kathodischen Gelrand mindestens 1,5 cm und vom linken bzw. rechten Gelrand mindestens 5 mm entfernt sein. Nach der präparativen IEF werden an beiden seitlichen Gelrändern jeweils ein Gelstreifen abgeschnitten und mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Auf diese Weise lassen sich die Positionen der getrennten Proteinfraktionen bestimmen. Die Proteinfraktionen binden stärker an den IPG-Gelen als an anderen Trägern, deswegen müssen sie elektrophoretisch aus dem IPG-Gel eluiert werden. Dafür werden Streifen mit den getrennten Proteinfraktionen aus dem IPG-Gel ausgeschnitten und in ein granuliertes Gel elektrophoretisch übertragen. Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt: 0,8 g/dl Agarose mit geringer Elektroosmose wird in einem Elutionspuffer, z.B. 0,1 mol/1 TRIS-Glycinat-Puffer (pH = 9,1), suspendiert und nach Auflösen durch Erhitzen in eine Form mit 5 mm dickem Silikongummirahmen gegossen. Aus dem Agarosegel werden zwei Streifen in Querrichtung ausgeschnitten, so daß zwei Vertiefungen entstehen. In eine Vertiefung wird der IPG-Gelstreifen mit den zu eluierenden Proteinen eingelegt, der zweite wird mit granuliertem Gel gefüllt, das in demselben ElutionspufFer gequollen wurde. Danach wird die Proteinfraktion elektrophoretisch aus dem IPG-Gelstreifen durch das Agarosegel in das granulierte Gel überführt. Das granulierte Gel wird in eine Elutionssäule übertragen und die Proteine werden mit dem Elutionspuffer eluiert (Abb. 2.12-6).

Abb. 2.12-6 Elektrophoretische Elution der Proteinfraktionen nach präparativer IEF in einem dicken IPG-Gel. 1. Glasplatte mit einem Silikongummirahmen; 2. Granuliertes Gel, das die Proteine auffängt; 3. Agarosegel; 4. Streifen eines IPG-Gels mit fokussierten Proteinen.

Kanalfokussierung Bei der Kanalfokussierung [10, 11] findet die präparative Elektrofokussierung der Proteine in einem IPG-Gel und ihr Transfer in einem einzigen granulierten Gel statt. Sie umfaßt folgende Schritte:

241

2.12 Preparative isoelektrische Fokussiemng

Gießen eines präparativen IPG-Gels; analytische IEF auf den Randstreifen des IPG-Gels; Ausheben der Kanäle; präparative isoelektrische Fokussierung; Elution der Proteine (Abb. 2.12-7).

Schlitz

Granuliertes Gel Probe

Abb. 2.12-7 Kanalfokussierung. a) Herstellung eines IPG-Gels; b) Ausschneiden der Randstreifen und Durchfuhren einer analytischen IEF mit den Proteinproben, um festzustellen, wo sich die uns interessierenden Proteine befinden; c) Herausschneiden einer Vertiefung und Ausfüllen mit granuliertem Gel; d) Herausspateln des granulierten Gels nach der präparativen IEF und Eluieren des getrennten Proteins.

Gießen eines präparativen IPG-Gels. Ein IPG-Gel für die Kanalfokussierung wird in derselben Dicke und genauso hergestellt wie ein IPG-Gel für die analytische EEF (Kap. 2.8.2). Der einzige Unterschied besteht in den Schlitzen, die zum Probenauftrag verwendet werden: an den Rändern des Gels werden zwei kurze Probenschlitze zur analytischen Lokalisierung der zu trennenden Proteine gezogen, in der Gelmitte ein langer Schlitz zum Auftrag der Probe vor der präparativen IEF. Analytische IEF auf den Randstreifen des IPG-Gels. Aus einem gewaschenen und getrockneten IPG-Gel werden seine beiden Randstreifen, die jeweils einen Probenschlitz enthalten, abgeschnitten und rehydratisiert. Nach einer analytischen Elektrofokussierung eines geringen Teils der Probe in diesen Gelstreifen werden sie gefärbt, um die Lage der präparativ zu trennenden Proteine festzustellen. Ausheben der Kanäle. Der Gelrest wird unter den gleichen Bedingungen rehydratisiert wie die Randstreifen. Danach wird er auf eine Glasplatte aufgelegt und nebenan die Randstreifen mit den gefärbten Proteinbanden. Dort, wo sich die gewünschte Proteinbande befindet, wird mittels eines Spatels eine Vertiefung (Kanal) ins Gel geschnitten. Der Kanal, der mit gequollenem granuliertem Gel (Sephadex G-75, G-200 oder Ultrodex) gefüllt wird, sammelt das gewünschte Protein. Das gequollene granulierte Gel wird folgendermaßen vorbereitet: granuliertes Gel wird in ein Reagenzglas mit

242

2 Elektrophorese der Proteine

Überschuß an Wasser suspendiert und 15 min quellen lassen, danach wird das überstehende Wasser dekantiert und das gequollene Gel mittels einer Spritze mit einer dicken Kanüle in die Vertiefung eingefüllt. Falls notwendig, kann man auf dieselbe Weise mehrere Vertiefungen bilden, um unterschiedliche Proteine zu präparieren. Präparative isoelektrische Fokussierung. Die präparative isoelektrische Fokussierung in einem IPG-Gel wird unter denselben Bedingungen durchgeführt wie die analytische IEF in IPG-Gelen. Elution der Proteine. Nach Beendigung der präparativen Elektrofokussierung in einem IPG-Gel wird der Inhalt der Vertiefung mit einem Spatel aufgenommen und auf eine Elutionssäule übertragen. Die Proteine werden genauso eluiert, eingefroren oder lyophilisiert, wie nach einer präparativen IEF mit Trägerampholyten. Das dicke oder mit Kanälen versehene IPG-Gel kann mehrmals für präparative IEF verwendet werden. Vorher muß es mit einem Puffer von den Restproteinen gereinigt, gewaschen und getrocknet werden.

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Vor der isoelektrischen Fokussierung Die Monomerlösung polymerisiert nicht oder polymerisiert zu langsam.

Die Monomer- oder APSLösung sind überlagert.

Niedrige Konzentration von APS oder TMEDA. Die Polymerisationstemperatur ist zu niedrig.

Die Monomerlösung polymerisiert zu schnell.

Es gibt Luftblasen im Gel.

Die Konzentration von Luftsauerstoff in der Monomerlösung ist zu hoch. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung ist zu hoch. Die Temperatur in der Umgebung ist sehr hoch. In der Monomerlösung gibt es gelöste Luft, die bei der Gelpolymerisation entweicht.

Diese Lösungen sollen immer im Kühlschrank aufbewahrt werden. Die Monomerlösung ist im Laufe von 4 Wochen verwendbar, die 10 g/dl APS innerhalb von 2 Wochen. Immer 5 10 g/dl APS und 5 10 ml/dl TMEDA pro l ml Monomerlösung verwenden. Das Gel bei 20-25 °C gießen, oder im Trocken- oder Brutschrank bei 37 °C polymerisieren lassen. Die Monomerlösung an einer Wasserstrahlpumpe entlüften. Die Rezeptur für das Gelgießen überprüfen. Das Gel bei 20-25 °C gießen. Die Monomerlösung entlüften.

243

2.12 Präparative isoelektrische Fokussierung

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kommt, ist unsauber.

Vor der Benutzung die Glasplatte waschen.

Während der isoelektrischen Fokussierung Es fließt kein oder zu wenig Strom.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Schlechter Kontakt an den Elektrodenstreifen oder -gelen.

Die Stromstürke steigt während der IEF an.

Die Elektrodenlösungen sind vertauscht.

Wasserkondensation auf dem Deckel der Trennkammer.

Die elektrische Leistung ist zu hoch. Die Kühlung ist ungenügend.

Das Gel funkt und brennt.

Schlechte Kühlung des Gels.

Funkenbildung entlang der Folienkante. Der Harnstoff in den IPG-Gelen kristallisiert aus.

Die Elektrodenstreifen reichen über die Gelkanten hinaus. Die lEF-Temperatur ist zu niedrig. Die Oberfläche trocknet aus.

Es bilden sich Präzipitate aufder Geloberfläche oder an der Probenauftragsstelle.

Die Proteine sind nicht ausreichend gelöst.

Protein- oder Salzkonzentration in der Probe sind zu hoch.

Alle Steckverbindungen überprüfen. Die Standardeinstellung bei einem IPG-Gel ist 5000 V, 1,0 mA, 5,0 W. Die gleichmäßige Auflage der Elektroden überprüfen, eventuell mit Glasplatten beschweren. Die basische Elektrodenlösung auf das kathodische, die saure auf das anodische Gelende auftragen. Die elektrische Leistung maximal auf 2,5 W/ml Gel einstellen. Die Kühltemperatur überprüfen. Die Kühlblöcke sollten aus Glas, emailliertem Metall oder am besten aus Keramik sein; Kerosin oder Silikonöl DC 200 zwischen den Kühlblock und die Haftfolie geben. Kerosen oder Silikonöl DC-200 zwischen die Haftfolie und die Kühlplatte geben. Die Elektrodenstreifen etwas kürzer als die Gelbreite zuschneiden. Bei 10-15 °C fokussieren.

Zur Rehydratisierungslösung 0,5 ml/dl Nonidet NP-40 geben. Höhere Harnstoff-Konzentration (9 mol/1) verwenden. Nichtionisches Detergens (Nonidet NP-40) zur Probe und in das Gel geben. Die Probe verdünnen und entsalzen.

Nach der isoelektrischen Fokussierung Keine Proteinbanden im Gel.

Es gab im Gel einpolymerisierte Acrylsäure.

Die maximale Lagerdauer des Polyacrylamidgels ist l Woche im Kühlschrank. Die Monomerlösung mit dem Ionenaustauscher Amberlite MBl behandeln.

244

2 Elektrophorese der Proteine

Literatur [1] RadolaBJ, BiochimBiophysActa, 386, 181 (1975) [2] Frey MD, Radola BJ, Electrophoresis, 3, 216 (1982) [3] Radola BJ, Methods Enzymol, 104,256(1984) [4] Radola BJ, Biochim BiophysActa, 295, 412 (1973) [5] Bier M, Egen NB, Allgyer TT, Twitty GE, Mosher RA, in Peptides. Structure and Biological Function, Gross E, Meienhofer J (Hrsg.), Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, S. 79 (1979) [6] Binion SB, Rodkey LS, Egen NB, Bier M, Electrophoresis, 3, 284 (1982) [7] Ek K, Bjellquist B, Righetti PJ, Biochim Biophys Methods, 8, 135 (1983) [8J Gelfi C, Righetti PG, J Biochim Biophys Methods, 8, 157 (1983) [9] Skoog B, Sahlin B, Blanche C, LKB Application Note 325 (1984) [10] Bartels R, Bock L, in Electrophoresis '88, Schafer-Nielsen C (Hrsg.), VCH, Weinheim, S. 289 (1988) [11] Bartels R, Bock L, in Electrophoresis Forum '89, TU München, München, S. 498 (1989)

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme Die meisten Proteine sind von Natur aus farblos. Deswegen müssen sie nach der Elektrophorese sichtbar gemacht (gefärbt) werden. Die unspezifische Färbung umfaßt drei Schritte. Fixieren, Färben und Entfärben, und endet gewöhnlich mit dem Trocknen des Trennmediums.

Fixieren Das Fixieren verursacht Proteinfällung durch Denaturierung oder chemische Verbindungen zwischen den einzelnen Proteinmolekülen. Dafür wird eine Mischung von Alkohol, Essigsäure und Wasser, Trichloressigsäure, 5-Sulfosalicylsäure oder Glutardialdehyd verwendet. Fällung durch die Mischung Alkohol-Essigsäure-Wasser. Das Volumenverhältnis zwischen den Bestandteilen der Mischung beträgt am häufigsten 3:1:6. Der Alkohol Methanol oder Ethanol dehydratiert die Proteine, während die Essigsäure den pH-Wert der Lösung senkt. Dadurch wird einerseits die Hydratationshülle der Proteine beschädigt, andererseits befinden sich die meisten von ihnen an oder nahe ihren pl-Punkten. Als Folge wird ihre Löslichkeit stark reduziert und sie präzipitieren. Fällung durch Trichloressigsäure oder (und) 5-Sulfosalicylsäure. Bei Verwendung von 10-20 g/dl Trichloressigsäure (TCA) fallen alle Proteine mit relativen Molekülmassen über 5000 aus. Die 5-Sulfosalicylsäure in einer Konzentration von 2-5 g/dl präzipitiert ebenfalls die meisten Proteine, nicht aber apGlykoprotein im Serum. Noch stärker wirkt eine Mischung aus 10 g/dl Trichloressigsäure und 5 g/dl Sulphosalicylsäure in Wasser oder noch besser in 30 ml/dl Methanol. Die Trichloressigsäure kann bei höheren Polyacrylamid-Konzentrationen (T> 15 g/dl) Trübungen im Gel verursachen. Fällung durch Glutardialdehyd. Glutardialdehyd, in einer Konzentration von 0,5-1,0 g/dl, wird gewöhnlich zum Vernetzen von Oligopeptiden oder kleineren Proteinmolekülen (MT = 1000 - 10 000) verwendet. Seine Aldehydgruppen reagieren mit den Aminogruppen der Nachbarproteine und bilden damit ein unlösliches Netz (Abb. 2.13-1). Diese Reaktion findet bei pH = 6-7, nicht in sauren Lösungen statt. Deswegen muß sie in einem angemessenen Puffer durchgeführt werden, z.B. in HydrogenphosphatPuffer(Kap. 1.2.3).

Färben Beim Färben binden bestimmte Farbstoffe an den Proteinen. Die meist verbreiteten Farbstoffe sind die Farbstoffe der Coomassie-Gruppe und Silber. Die ultradünnen Polyacrylamidgele können nach dem Fixieren getrocknet und in trockenem Zustand in die Färbelösung gelegt werden [1]. Dadurch werden die Proteine

246

2 Elektrophorese der Proteine

schneller gefärbt, was eine leichtere Färbung des Hintergrunds des Trennmediums (des Gels) zur Folge hat. Ein Zwischentrocknen ist obligat für Agarosegele.

Abb. 2.13-1 Glutardialdchyd als Vernetzer der Proteine.

Entfärben Durch das Entfärben wird der Hintergrund des Trennmediums durchsichtig, so daß nur die gefärbten Banden zu sehen sind. Dies kann im Prinzip in der Lösung vorgenommen werden, in der Farbstoff gelöst wurde, z.B. in der Mischung Methanol-EssigsäureWasser (3:1:6, V:V). Zu langes Entfärben fuhrt zum Verschwinden der schwachen Proteinbanden.

Trocknen Das Trocknen ist ein Verfahren, durch das die Pherogramme als Dokumentationsmaterial aufbewahrt werden können (s.u.). Es wird an der Luft, unter einem Fön oder in einem Trockner durchgeführt. Falls die Polyacrylamidkonzentration hoch ist (über 10 g/dl), müssen die nassen Gele mit einer Cellophanmembran überdeckt und dann getrocknet werden. Die ultradünnen Polyacrylamidgele sowie die Agarosegele benötigen gewöhnlich keine Abdeckung mit einer Cellophanmembran.

2.13.1 Coomassie-Färbung Zur Coomassie-Gruppe, der Gruppe von Triphenylmethanfarbstoffen, gehören vor allem Coomassie-Brillantblau R 250 und G 250, und Coomassie- Violett R 200 (Tab. 2. 13-1). Die Coomassie-Farbstoffe wurden ursprünglich zur Färbung von Seide und Wolle (auch Proteinen) verwendet. Erst in den 60er Jahren wurden sie zum Färben von elektrophoretisch getrennten Proteinbanden eingeführt - zuerst das Coomassie-Brillantblau R 250 [2, 3], danach Coomassie-Brillantblau G 250 [4],

247

2.13 Qualitative Auswertung der Protcin-Pherogramme

Tab. 2.13-1 Die wichtigsten Farbstoffe, die bei der Elektrophorese und Blotting verwendet werden. Farbstoffe

Eigenschaften

Chemische Formeln

c=< > = N:

Coomassie®-Brillantblau R 250 (Acid Blue 83)

SO,

NH

Coomassie®-Brillantblau G 250 (Acid Blue 90) SO,

NH

Coomassie®-Violett R 200 (Acid Violett 17)

SO,

NaO3S

Naphtholblauschwarz B (Amidoschwarz 10 B)

Mr = 825,99 = 560 nm Lösbar in Methanol und Ethanol Empfindlichkeit 10-50 ng/mm2 / = 845,99 = 580 nm Lösbar in warmem Wasser, Methanol und Ethanol Empfindlichkeit 15-50 ng/mm2 Lösbar in Wasser, Methanol und Ethanol Empfindlichkeit 50-100 ng/mm2 A/r = 616,50

NO,

Ponceau S

Mr = 760,58

Es gibt zwei Färbeverfahren mit Coomassie-Farbstoffen: bei Verwendung von organischen Lösungsmitteln und organischen Säuren (konventionelle Variante) oder bei Verwendung von Ammoniumsulfat und Phosphorsäure oder Schwefelsäure (kolloidale Variante). Gegenüber den anderen Färbemethoden ist die konventionelle Variante relativ schnell und wenig arbeitsaufwendig. Sie kann sowohl bei Polyacrylamidgelen als auch bei Agarosegelen verwendet werden. Konventionelle Coomassie-Färbung. Diese Färbung wird bei Nativ-, SDS- und IEF-Polyacrylamidgelen mit 0,5-2 g/dl nichtionischen Detergenzien eingesetzt [5, 6], Vorteile. ein relativ einfaches Verfahren. Nachteile, unangenehmer Essiggeruch der Färbe- und

248

2 Elektrophorese der Proteine

Entfärbelösung. Wenn das Detergens nicht vollständig ausgewaschen ist, erhält das Gel einen blauen Hintergrund. Empfindlichkeit. 100 ng Protein / Bande. Fixieren 30 min in 10-20 g/dl TCA. Danach wird das Gel mit Leitungswasser gewaschen. Bei Gelen, die nichtionische Detergenzien (Nonidet NP-40, Triton X-100) enthalten, wird die Fixierung mit 30 ml/dl Isopropanol durchgeführt. Färben 10 bis 60 min mit einer Mischung von Lösung A (0,2 g/dl CoomassieBrillantblau R 250 gelöst in 60 ml/dl Methanol oder Ethanol) und Lösung B (20 ml/dl Essigsäure), im Volumenverhältnis 1:1. Entfärben Einigemal in Methanol (Ethanol)-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V). Die letzte Entfärbelösung sollte 5 ml/dl Glycerin enthalten. Die Fixierung, Färbung und Entfärbung können durch Erhöhung der Temperatur bis 60 °C beschleunigt werden. Trocknen Das Polyacrylamidgel wird mit seiner Haftfolie nach unten auf eine Glasplatte gelegt und mit einer in Wasser gequollenen Cellophanmembran bedeckt. Die Luftblasen zwischen dem Gel und der Cellophanmembran werden mittels eines Rollers herausgestrichen und die Ränder der Cellophanmembran um die Glasplattenränder herumgelegt. Das Trocknen wird gewöhnlich bei Raumtemperatur durchgeführt. Coomassie-Färbung nach Fixieren mit Glutardialdehyd. Diese Methode, die wir vorschlagen, kann bei allen Polyacrylamid- oder Agarosegelen verwendet werden. Vorteile: restlose Entfernung von SDS aus SDS-Gelen und vollständiger Nachweis auch von Oligopeptiden (bis zu 20 Aminosäureresten). Empfindlichkeit: 50-100 ng Protein / Bande. Fixieren 10-30 min in 5 g/l Glutardialdehyd in 30 ml/dl Methanol oder 50 ml/dl Ethanol. Färben Gleiche Volumina von 4,0 g/l Coomassie-Brillantblau R 250 in Methanol-Wasser (6:4, V:V) und 200 ml/l Essigsäure mischen und 10 min färben. Entfärben Einigemal je 30 min in Methanol-Essigsäure-Glycerin-Wasser (3:1:1:5, V:V). Trocknen Unter einer Cellophanmembran bei Raumtemperatur, unter einem Fön oder in einem Trockner. Kolloidale Coomassie-Färbung in Phosphorsäure nach Neuhoff et al. [7, 8]. Diese Methode nutzt den Umstand, daß Coomassie-Brillantblau G 250 sich bei Anwesenheit von Ammoniumsulfat und Phosphorsäure im kolloidalen Zustand befindet. Die Methode wird bei allen Polyacrylamidgelen verwendet. Vorteile: keine Hintergrundfärbung, hohe Empfindlichkeit. Empfindlichkeit: mehr als 30 ng Protein / Bande; 0,7 ng Protein / mm2. Fixieren l h in 12 g/dl TCA. Färben Über Nacht in 0, l g/dl gereinigtem Coomassie Brillantblau G 250 in 2 g/dl H3PO4 mit 10 g/dl Ammoniumsulfat und 20 ml/dl Methanol. (Reinigung von Coomassie-Farbstoffen: 3-4 g Coomassie Brillantblau G 250 in 250 ml 7,5 ml/dl Essigsäure lösen und auf 60-70 °C anwärmen. Ammoniumsulfat einrühren bis zu einer Konzentration von

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogrammc

Stabilisierung

249

30 g/dl. Nach Abkühlung die Lösung filtrieren oder zentrifugieren und das Sediment verwenden. Herstellung der Färbelösung. 100,0 g Ammoniumsulfat langsam zu 980 ml 2 g/dl H3P04 zugeben, bis es sich vollständig löst, dann 20 ml 5 g/dl Coomassie-Brillantblau G 250 Lösung zugeben. Die Färbelösung nicht filtrieren.). Danach 1-3 min in 0,1 mol/1 TRIS-Hydrogenphosphat-Puffer mit pH = 6,5 waschen und l min in 25 ml/dl Methanol spülen. Den Protein-Farbstoff-Komplex in 20 g/dl Ammoniumsulfat lassen.

Kolloidale Coomassie-Färbung in Schwefelsäure nach Blakesley und Boezi [9]. Diese Methode wird bei nativen, IEF- und SDS-Polyacrylamidgelen verwendet. Vorteile. Ein relativ schnelles Verfahren, keine Hintergrundfärbung, die Lösungen sind fast geruchlos. Nachteile, relativ langsame Methode mit geringerer Empfindlichkeit als die bei der konventionellen Färbung. Empfindlichkeit, über 200 ng Protein / Bande. Fixieren und Färben Im Laufe von mindestens 3 Stunden unter Schütteln bei 50 °C oder über Nacht bei Raumtemperatur in einer kolloidalen Lösung (l g Coomassie-Brillantblau G 250 unter Rühren in l mol/1 Schwefelsäure [55,5 ml konz. 2$ 4 ad 11] lösen, nach drei h Rühren abfiltrieren, das braune Filtrat mit 220 ml 10 mol/1 Kalilauge [123,0 g KOH ad 220,0 ml] versetzen, 310 ml 100 g/dl TCA hinzufügen und gut vermischen die Lösung wird grün). Waschen 1-2 h in Wasser, wobei die grünen Banden blau werden. Trocknen An der Luft bei Raumtemperatur. Coomassie-Violett-Färbung nach Patestos et al. [10]. Vorteile: eine schnelle Färbemethode. Fixieren 10 min in 20 g/dl TCA. Danach für 5 min das Gel in 3 g/dl H3PO4 (21 ml 85 % H3PO4 ad l 1) einlegen. Färben 10 min in 0,1 g/dl Coomassie-Brillantblau Violett R 200 in 10 g/dl H3PO4. Diese Lösung wird ex tempore vorbereitet, indem l Volumen l g/dl Coomassie Violett R 200 mit 9 Volumina 11 g/dl H3PO4 gemischt werden. Sie enthält Coomassie-Violett R 200 in kolloidaler Form im Laufe von 10-15 min. Die Stammlösung von l g/dl Coomassie-Violett R 200 wird auf einem Magnetrührer bei 50-60 °C vorbereitet. Sie ist für mehrere Wochen bei Raumtemperatur haltbar. Entfärben 30-60 min in 3 g/dl H3PO4 (s.o.), danach für 3-5 min die Gele in 5 g/dl Glycerin konservieren. Trocknen Bei Raumtemperatur. Coomassie-Färbung von Agarosegelen, Dieses Verfahren wird bei allen Agarosegelen auf Folien oder Glasplatten verwendet. Empfindlichkeit, mehr als 200 ng Protein / Bande. Fixieren 5-10 min in 20 g/dl Trichloressigsäure. Waschen 2 mal je 2-5 min in Ethanol-Essigsäure-Wasser (25:10:65, V:V) schütteln, danach 5-10 min in 95 ml/dl Ethanol.

250

Trocknen Färben Entfärben Trocknen

2 Elektrophorese der Proteine

An der Luft oder mit Heißluft (Haarfön oder Trockenschrank). 5 min in 1,5 g/dl Coomassie-Brillantblau R 250 in Ethanol (Methanol)Essigsäure-Wasser (3 5:10:5 5, V: V). Einigemal in Ethanol (Methanol)-Essigsäure-Wasser (35:10:55, V: V). An der Luft oder mit Heißluft (Fön oder Trockenschrank).

Färbung mit Ponceau S. Diese Färbemethode wird bei Acetylcellulose-Folien verwendet. Fixieren und Färben 5 min in 0,3 g/dl Ponceau S in 3 g/dl TCA. Entfärben 3-4 mal in 0,5 g/dl TCA. Trocknen Bei Raumtemperatur. Färbung mit Amidoschwarz 10B, Dieses Verfahren wird bei Nitrocellulose-Blotmembranen verwendet. Fixieren und Färben 3 min in 0,1 g/dl (l g/l) Amidoschwarz 10 B in Methanol-EssigsäureWasser (3:1.6, V:V). Entfärben In Methanol-Essigsäure-Wasser (3: l :6, V: V). Trocknen Bei Raumtemperatur.

2.13.2 Silberfärbung der Proteine Die Silberfärbung der Proteine [11, 12] ist 10- bis 100-fach empfindlicher als die Coomassie-Färbung - ihre Nachweisgrenze liegt bei l bis 0,1 ng Protein pro mm2 Bandenfläche. Nicht alle Proteine aber lassen sich in gleichem Maße mit Silber färben [13] - es gibt solche, die kaum oder gar nicht mit den Silber-Ionen reagieren [14]. Bei Durchführung der Silberfärbungs-Prozeduren sollte man alle Lösungen mit bidest. Wasser ansetzen und mit Gummihandschuhen arbeiten, weil die Methode auf Unreinheiten extrem empfindlich reagiert. Die Mechanismen der Silberfärbung von Proteinen ähneln denen des fotografischen Prozesses [15] und verlaufen nach folgendem Schema: • Fixieren; • Sensibilisieren; • Entwickeln (sichtbar machen); • Stoppen; • Trocknen. Das Fixieren unterscheidet sich nicht von dem der Coomassie-Färbung. Beim Sensibilisieren werden Silber-Ionen von den präzipitierten Proteinen gebunden und dort durch Reduktion in Silberkeime umgewandelt. Die Reduktion wird von den funktionellen Gruppen der Aminosäurereste und den Peptidbindungen verursacht. Beim Entwickeln werden alle Silber-Ionen im Gel mit Hilfe der Silberkeime, als Katalysator, von einem starken Reduktionsmittel (z.B. Formaldehyd) zu metallischem Silber reduziert (Abb. 2.13-2). Die Reduktion verläuft in unmittelbarer Nähe der Silberkeime, d.h. dort, wo sich die Proteinbanden befinden, wesentlich schneller als im

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

251

Gel und fuhrt zur Umwandlung der Proteinbanden in dunkelbraune bis schwarze Färbungen. Aldehyd-Hydrat

JH

2 Ag+

^~"-:::^·* «^Reduktion

Lösliche Silber-Ionen

=»-

Ag 2

+

2H 2 O

Unlösliches Silber

Abb. 2.13-2 Mechanismus der Silberfärbung.

Es sind zwei Verfahren des Sensibilisierens und des Entwickeins beschrieben. Beim ersten Verfahren wird das Sensibilisieren in einer basischen Silberdiaminlösung durchgeführt [16], während das Entwickeln bei einem niedrigen pH-Wert verläuft, z.B. in einer Zitronensäure-Lösung. Beim zweiten Verfahren wird das Sensibilisieren in einer neutralen Silbernitratlösung durchgeführt, während das Entwickeln bei einem höheren pH-Wert verläuft, z.B. in einer Natriumcarbonatlösung [17, 18]. Nun muß man den Reduktionsprozess schnell stoppen, ansonsten werden alle SilberIonen im Gel zu metallischem Silber reduziert, was zu einem schwarzen Hintergrund führt. Dies wird im Prinzip durch eine starke Änderung des pH-Wertes bewirkt. Das Trocknen der gefärbten Pherogramme ähnelt dem nach einer Coomassie-Färbung. Die Silberfärbung ist, im Vergleich zur Coomassie-Färbung, eine komplizierte und weniger reproduzierbare Färbemethode. Sie verlangt extrem reine Chemikalien, besonders Reduktionsmittel. Ihre sehr hohe Empfindlichkeit aber stellt einen deutlichen Vorteil dar Deshalb versucht man ständig, diese Methode zu optimieren. Klassische Silberfärbung nach Merril et al. [19]. Diese Methode wird zum Färben von SDS-, 2D- und IEF-Gelen (vor allem IPG-Gelen) verwendet. Alle Schritte sollten auf einem Schüttler durchfuhrt werden. Vorteile 10 bis 50 mal empfindlicher als die Coomassie-Färbung, für die 2D-Elektrophorese die bisher empfindlichste Färbung. Nachteile, die Quantifizierung ist schwierig und der Hintergrund des Gels wird oft zu dunkel. Empfindlichkeit. 0,05 bis 0,1 ng Protein / mm 2 . Fixieren l Stunde in Fixierlösung l (20 g/dl TCA), l Stunde in Fixierlösung 2 (Methanol-Essigsäure-bidest. Wasser, 5:1:4, V.V) und l Stunde bis über Nacht in Fixierlösung 3 (Ethanol-Essigsäure-bidest. Wasser, 10:7:83, V\V). Danach das Gel für 5 min in Oxidationslösung (0,6 g Kaliumdichromat in 600 ml bidest Wasser mit 172 65 % Salpetersäure rühren bis K2Cr2O7 vollständig gelöst wird) einlegen Schließlich das Gel 4 mal je 30 s in bidest. Wasser waschen. Sensibilisieren Das Gel für 30 min in Silbernitratlösung (1,2 g Silbernitrat in 600 ml bidest. Wasser) legen.

252

Entwickeln

Stoppen Trocknen

2 Elektrophorese der Proteine

Das Gel 2 mal in Entwicklerlösung (53,4 g Natriumcarbonat und 0,9 ml 37 % Formaldehydlösung in 1600 ml bidest. Wasser; wenn Na2CO3 vollständig gelöst ist, mit bidest. Wasser auf 1800 ml auffüllen) spülen, danach das Gel bis zu 15 min in der Lösung lassen, bis die gewünschte Färbeintensität erreicht ist. 10 min in Stoplösung (10 ml/dl Essigsäure), danach zweimal je 10 min mit bidest. Wasser waschen. An der Luft oder mit Heißluft.

5-Minuten-Silberfärbung nach Krause und Elbertzhagen [20]. Diese Methode wird gewöhnlich zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Coomassie-Brillantblau-Färbung verwendet. Wenn die Gele nicht mit Coomassie-Brillantblau gefärbt sind, müssen sie 30 min in 20 g/dl TCA fixiert, 2 mal je 5 min in Methanol-Essigsäure-Wasser (45:10:45, V: V), 4 mal je 2 min in dest. Wasser gewaschen, 2 min in 2 ml/dl Glycerin imprägniert und an der Luft getrocknet werden. Vorteile', sehr schnelle Methode. Nachteile, weniger empfindlich als die anderen Silberfärbemethoden. Sensibilisieren und Entwickeln 35 ml von Lösung A (5 g/dl Na2CO3) und 65 ml von Lösung B (0,2 g/dl NH4NO3, 0,2 g/dl AgNO3, 1,0 g/dl Wolframatokieselsäure und 1,4 ml/dl 37 % Formaldehyd) mischen und das Gel in die entstandene weißliche Suspension eintauchen. Inkubieren bis eine gewünschte Farbeintensität erreicht wird. Stoppen Mit 0,05 mol/1 EDTA oder l ml/dl Essigsäure. Danach wird das Gel und die Rückseite der Haftfolie mit einem Wattebausch vom metallischen Silber gereinigt. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft. Polychromatische Silberfärbung nach Hempelmann und Kaminsky [21]. Dieses Verfahren wird bei nativen, SDS-, und IEF-Polyacrylamidgelen verwendet. Empfindlichkeit: wie bei der Merril-Methode. Fixieren In 10 g/dl TCA 30 min. Danach 30 min in 0,002 g/dl DTT in EthanolEssigsäure-bidest. Wasser (20:5:75, V/V) reduzieren und 5 min in 0,5 g/dl Kaliumdichromat oder 0,1 % H2O2 oxydieren. Schließlich mit bidest. Wasser waschen. Sensibilisieren 10 min in 0, l g/dl AgNO3. Danach mit bidest. Wasser waschen. Entwickeln l min in frischer Lösung aus 3 g/dl Na2CO3 und 0,02 g/dl Paraformaldehyd. Danach l h in Methanol-Glycerin-bidest. Wasser (5:1:4, V:V). Trocknen An der Luft oder mit Heißluft. Schnelle Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick [22]. Dieses Verfahren wird bei ultradünnen (mit einer Dicke bis zu 0,5 mm) nativen SDS- und IEF-Polyacrylamidgelen verwendet. Vorteile, schnelles Verfahren. Das Stoppen mit Glycin verhindert die Farbveränderungen der Banden, wie dies häufig bei Essigsäure vorkommt. Empfindlichkeit 5 ng Protein / Bande.

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

Fixieren

Sensibilisieren Entwickeln Stoppen Trocknen

253

10 min in Ethanol-Essigsäure-bidest. Wasser (3:1:6, V:V). Danach 15 min in 0,4 mol/l Natriumacetat mit 0,25 g/dl Na-thiosulfat und 0,5 g/dl Glutardialdehyd in 30 ml/dl Ethanol. Schließlich 3 mal je 4 min in bidest. Wasser waschen. 3-5 min in 0,2 g/dl AgNO3 in 0,05 /dl 37 % Formaldehyd. l min in 2,5 g/dl Na2CO3 in 0,02 /dl 37 % Formaldehyd mit pH =11,7. l min in 1,0 g/dl Glycin. Danach 2 mal je 3 min mit bidest. Wasser waschen. An der Luft oder mit Heißluft.

30-Minulen-Silberfärbung der Proteine nach Nesterenko et al. [23]. Empfindlichkeit. wie bei der Methode von Merril. Fixieren 5 min in einer Mischung aus 60 ml 50 ml/dl Aceton, 1,5 ml 50 g/dl TCA und 25 37 % HCHO. Einigemal in bidest. Wasser, 5 min in 60 ml 50 ml/dl Aceton, l min in einer Mischung aus 0,1 ml 10 g/dl Na2S2O3 5H2O und 60 ml bidest. Wasser und 3 mal je 5 s in bidest. Wasser spülen. Sensibilisieren 8 min in einer Mischung aus 0,8 ml 20 mg/dl AgNO3, 0,6 ml 37 % HCHO und 60 ml bidest. Wasser. Zweimal je 5 s in bidest. Wasser spülen. Entwickeln 10-20 s in einer Mischung aus 1,2 g Na2CO3, 25 37 % HCHO und 25 10 g/dl Na2S2O3 5H2O. Stoppen 30 s in l ml/dl Essigsäure und 10 s in bidest. Wasser spülen. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft. Silberfärbung von Proteinen und Nukleinsäuren nach Ansorge [24]. Diese Methode wird bei 0,2-1,0 mm nativen, SDS- und IEF-Polyacrylamidgelen sowie NukleinsäureGelen verwendet. Alle Prozeduren sollten auf einem Schüttler durchgeführt werden. Vorteile, ein schnelles Verfahren. Nachteile: bei Gelen mit Harnstoff bekommt man einen starken Hintergrund. Empfindlichkeit, mehr als 0,2 ng Protein / Bande oder 0,5 ng RNA / Bande. Fixieren 2,5-20 min in 12 g/dl TCA und 2 g/dl CuCl2 in 50 ml/dl Methanol, 2,5-10 min in Ethanol-Essigsäure-bidest. Wasser (10:5:85, V:V), 2,510 min in 0,01 % KMnO^ 2,5-10 min in Ethanol-Essigsäure-bidest. Wasser (10:5:85, V:V), 0,5-10 min in 10 ml/dl Ethanol und 2,5-10 min in bidest. Wasser waschen. Sensibilisieren 2,5-10 min in 0,1 g/dl AgNO3. Entwickeln 20 s bis 4 min in 2-10 g/dl K2CO3 in 0,01 % Formaldehyd. Stoppen 20 s bis 2 min in Ethanol-Essigsäure-bidest. Wasser (10:5:85, V.V). Danach 15 min in bidest. Wasser waschen. Eine Überentwicklung kann mit 0,5 g/dl Na2S2O3 reduziert werden. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft.

254

2 Elektrophorese der Proteine

Silberfärbung von Agarosegelen nach Willoughby und Lambert [25]. Bei dieser Methode wird das Gel wie bei einer Coomassie-Färbung fixiert, gewaschen und getrocknet. Fixieren 5-10 min in 20 g/dl Trichloressigsäure. Danach 2 mal je 2-5 min in Ethanol-Essigsäure-Wasser (25:10:65, V:V) und schließlich 5-10 min in 95 ml/dl Ethanol. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft (Haarfbn oder Trockenschrank). Färben 35,0 ml Lösung A (25 g Na2CO3 in 500 ml bidest. H2O) mit 65,0 ml Lösung B (1,0 g NH4NO3, 1,0 g AgNO3 und 5,0 g Wolframatokieselsäure in 7,0 ml 37 % Formaldehyd lösen und mit bidest. H2O auf 500 ml auffüllen) mischen, das Gel in die entstandene weißliche Suspension legen und schütteln bis die gewünschte Färbungsintensität erreicht ist. Danach mit bidest. Wasser spülen. Stoppen In 0,05 mol/1 EDTA oder Glycin, oder l ml/dl Essigsäure. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft. Die Proteine können durch spezifisches Färben ihrer Kohlenhydrat- bzw. Lipidanteile sichtbar gemacht werden.

2.13.3 Glykoproteinfärbung PAS-Methode mit Periodsäure und Schiffschem Reagens nach Kapitany und Zebrowski [26]. Diese Methode wird bei Polyacrylamidgelen mit oder ohne Haftfolien verwendet. Nachteile, einige Proteine, z.B. a-Lactoglobulin, werden gefärbt, obwohl sie keine Glykoproteine sind. Empfindlichkeit, geringer als die Coomassie-Methoden. Fixieren 10-15 min in 12,5 g/dl TCA. Färben 2 Stunden in l g/dl Periodsäure. Danach 4 mal je 15 min in 15 ml/dl Essigsäure waschen und 2 Stunden mit Schiffschem Reagens im Kühlschrank bei 4 °C inkubieren. Entfärben Über Nacht in mehreren Lösungen von 7 g/dl Essigsäure bis die Entfärbelösung farblos bleibt. Die Glykoproteinbanden werden rotviolett (Magenta). Trocknen An der Luft oder mit Heißluft.

2.13.4 Lipoproteinfärbung Färbung mit Sudanschwarz B. Diese Methode wird gewöhnlich bei Agarosegelen verwendet, wo die Lipoprotein-Elektrophorese am häufigsten durchgeführt wird. Trocknen Das Agarosegel wird bei 60 °C im Trockenschrank getrocknet. Färben 15 min in frisch hergestellter Färbelösung (90 ml Ethanol, 10 ml Sudanschwarz-Lösung und 75 ml 2 g/dl Natriumchlorid-Lösung vor der Färbung mischen. Falls sich ein Präzipitat bildet, Ethanol zugeben bis sich das Präzipitat auflöst. Die Sudanschwarz-Lösung besteht aus

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

Entfärben Trocknen

255

2 g/dl Sudanschwarz B in Ethanolund wird bei Raumtemperatur oder, wenn nötig, bei 40 °C vorbereitet). 15 min in einer Mischung aus Ethanol und 2 g/dl Natriumchlorid (55:45, V:V). Danach einige s in dest. Wasser waschen. Bei 60 °C.

Außer den bis hier beschriebenen unspezifischen Nachweismethoden gibt es viele spezifische Nachweismethoden für aktive Proteine, die mit Hilfe der Elektrophorese getrennt worden sind.

2.13.5 Enzymfärbung Enzyme oder ihre Inhibitoren können direkt im Gel oder indirekt in einem zusätzlichen Träger durch Farbreaktionen nachgewiesen werden. Beim direkten Nachweis wird das Gel mit den elektrophoretisch getrennten Enzymen in eine Lösung mit dem spezifischen Substrat gelegt, an das ein Diazo-Farbstoff gekoppelt ist. Beim indirekten Nachweis wird das Gel mit einem zusätzlichen Träger, z.B. Chromatographiepapier, AcetylcelluloseFolie oder Agarosegel bedeckt, der mit einer Lösung des spezifischen Substrats getränkt ist. Zur Zeit sind mehrere Reaktionen zum spezifischen Nachweis von Enzymen entwickelt worden: für die alkalische Phosphatase [27, 28], Alkohol-Dehydrogenase [29, 30], Amylase [31, 32], Cellulase [33, 34], Desoxyribonuklease [35], Glucosidase [36], Glycosyl-Transferase [37, 38], Katalase [39, 40], Kreatin-Kinase [41], Lactat-Dehydrogenase [42], Malat-Dehydrogenase [43], Peroxidase [44, 45], Phosphogluko-Mutase [46], Peptid-Hydrolasen [47, 48], saure Phosphatase [49, 50], Trypsin [51] u.a. Nachweis von Esterase-Isoenzymen, Alle Prozeduren erfolgen bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Die Methode ist fur native und IEF-Polyacrylamidgele verwendbar. Empfindlichkeit: höher als die der Coomassie-Färbung. Enzymatische Reaktion In ot-Naphthylacetat-Lösung (60 mg -Naphthylacetat in 5 ml Aceton lösen), wobei sich eine weiße Emulsion bildet. Färben Echtblausalz-Lösung (100 mg Echtblausalz [Fast Blue B] in 2-3 ml bidest. Wasser lösen) zu einem 0,1 mol/1 Hydrogenphosphat-Puffer mit pH = 7,0 (20,6 g Na2HPO4 und 4,4 g NaH2PO4 ad l l mit bidest. Wasser) geben. Die vollständige Entwicklung der violettroten Esterasebanden dauert etwa 10 min. Stoppen und Entfärben In Methanol-Essigsäure-dest. Wasser (2:1:7, V:V) bis sich der rötlichgelbe Hintergrund auswäscht. Trocknen An der Luft oder mit Heißluft.

256

2.13.6 Immunologische

2 Elektrophorese der Proteine

Nachweismethoden

Wenn ein Protein im Pherogramm über keine enzymatische Aktivität verfugt, kann es immunologisch, d.h. durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen werden. Generell kann dies durch Immunfixation oder Immunprint erreicht werden. Bei der Immunfixation wird das Gel mit den elektrophoretisch getrennten Proteinen mit einer Immunglobulin-Lösung übergössen [52], beim Immunprint wird das Gel mit einem zweiten Träger aus Gel (gewöhnlich aus Agarose und selten aus Polyacrylamid) oder aus Folie (meistens aus Acetylcellulose) bedeckt, die mit Immunglobulincn getränkt ist [53] (Kap. 2.2.1). Beim entstehenden Kontakt zwischen dem Trenngel und der Inkubationslösung bzw. dem zweiten Träger findet Diffusion in beiden Richtungen statt: das Protein diffundiert aus dem Trenngel aus, die Immunglobuline diffundieren in das Trenngel hinein, wobei sich unlösliche Immunpräzipitate im Trenngel oder im zusätzlichen Träger bilden. Durch längeres Waschen des Trenngels bzw. des zusätzlichen Trägers mit geeignetem Puffer entfernt man alle nicht fixierten Proteine. Danach werden die Immunpräzipitate nach einer unspezifischen Methode gefärbt. Nachweis nach Immunfixation in Agarosegelen. Bei der Immunfixation [54, 55] entstehen Immunpräzipitate im Agarosegel, die nachher gefärbt werden. Empfindlichkeit, wie bei der Coomassie-Färbung. Immunreaktion Eine Antikörperlösung (ihre Konzentration richtet sich nach dem Antigen-Antikörper-Titer) auf die Oberfläche des Agarosegels mit den elektrophoretisch getrennten Proteinen (Antigenen) gießen, mit einem Glasstab gleichmäßig ausstreichen, so daß sich ca. 5 /cm2 Geloberfläche verteilen und 10-20-30 min abwarten. Danach über Nacht in physiologischer Kochsalzlösung (0,15 mol/1 [9 g/l] NaCl) das Gel waschen und trocknen. Färben 15 min mit Coomassie-Brillantblau R 250 (s.o.). Entfärben Wie bei der Coomassie-Färbung (s.o.). Trocknen An der Luft oder mit Heißluft. Nachweis nach Immunprint mit Acetylcellulose-Folien. Bei dieser Methode wird eine Acetylcellulose-Folie in einer monospezifischen Antikörperlösung getränkt, an der Luft getrocknet und auf das Gel mit den getrennten Proteinen gelegt. Vorteile, einfaches Tränken der Acetylcellulose-Folie mit einer Antikörperlösung, einfache Färbung und Entfärbung. Nachteile, die Acetylcellulose-Folien lassen sich schwer von der Geloberfläche entfernen. Empfindlichkeit, wie die Coomassie-Färbung. Immunreaktion 3-5 min die Acetylcellulose-Folie auf der Geloberfläche lassen. Danach die Folie über Nacht in physiologischer Lösung (s.o.) waschen. Auf diese Weise werden alle Proteine ausgewaschen, außer den unlöslichen Immunpräzipitaten. Färben 5 min mit Coomassie-Brillantblau R 250 (s.o.). Entfärben Wie bei der Coomassie-Färbung (s.o.). Trocknen An der Luft oder mit Heißluft.

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

257

Nachweis nach Immunprint mit Agarosegelen. Ein Agarosegel wird zusammen mit monospezifischen Antikörpern auf eine Haftfolie gegossen, an der Luft getrocknet und auf das Gel mit den elektrophoretisch getrennten Proteinen gelegt. Vorteile, die Agarosegele für Immunprint lassen sich leichter von der Geloberfläche entfernen. Nachteile, die Färbung ist komplizierter als bei den Acetylcellulose-Folien. Empfindlichkeit, wie bei der Coomassie-Färbung. Immunreaktion

Färben Entfärben Trocknen

Das Agarosegel mit den Antikörpern3-5 min auf dem Pherogramm lassen. Danach es über Nacht in physiologischer Lösung waschen. Auf diese Weise werden alle Proteine ausgewaschen, außer den unlöslichen Immunpräzipitaten. Schließlich wird das Agarosegel getrocknet. 15 min mit Coomassie-Brillantblau R 250 (s.o.). Wie bei der Coomassie-Färbung (s.o.). An der Luft oder mit Heißluft.

2.13.7 Autoradiographie und Fluorographie der Proteine Bei der Autoradio- und Fluorographie werden die Proteine mit radioaktiven Isotopen markiert. Nach der Elektrophorese wird die radioaktive Emission, die von den Proteinbanden ausgeht, durch Schwärzung auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht. Die Autoradiographie ist die empfindlichste Nachweismethode für Proteine. Mit ihr können Proteinspuren von l O'5-10"6 % vom Gesamtprotein nachgewiesen und quantifiziert werden. O'Farrell [56] hat mit Hilfe der Autoradiographie nach einer zweidimensionalen Elektrophorese 1100 Proteine in einem Escherichia-Coli-Lysat gefunden. Die Autoradiographie kann direkt oder indirekt durchgeführt werden. Für die direkte Autoradiographie werden die Proteine mit den Isotopen 14C, 35S, 32P oder 125I markiert [57, 58] und das Trenngel wird nach der Elektrophorese für 24 h in Kontakt mit einem Röntgenfilm gebracht. Die Schwärzungen auf dem Film erfolgen durch die direkte Bestrahlung der radioaktiv markierten Proteine im Gel. Bei der indirekten Autoradiagraphie wird die radioaktive Strahlung mit Hilfe eines Calciumwolframat-Schirms verstärkt. Deswegen ist sie mehrmals empfindlicher als die direkte Autoradiographie. Nach der Elektrophorese baut man ein "Sandwich" auf, der aus dem Trenngel, einem Röntgenfilm und dem verstärkenden Schirm besteht, und inkubiert es bei -70 °C. Die radioaktive Strahlung, die aus dem Gel emittiert wird, trifft zunächst den Film und erzeugt dort Schwärzung, die man normalerweise bei der direkten Autoradiographie erhält. Der Teil der Strahlung, der den Film durchdringt, trifft den Schirm und regt dort von Lichtquanten an. Diese gelangen zurück auf den Film und verstärken die Schwärzungen. Bei der Autoradiographie können die entstandenen Schwärzungen ausgeschnitten und gewogen werden Somit kann man die Konzentrationen der elektrophoretisch getrennten Proteine ermitteln. Mit radioaktiv markierten Antigenen können auch, nach einer Immunreaktion, Antikörper autoradiographisch visualisiert werden [59]. Bei der Fluorographie wird das Gel mit den elektrophoretisch getrennten Proteinen, die vorher mit 3H, 14C oder 35S markiert wurden, mit scintillierenden Substanzen wie

258

2 Elektrophorese der Proteine

2,5-Diphenyloxazol [60] oder Natriumsalicylat [61] imprägniert. Nach dem Trocknen des Gels läßt man es bei -70 °C auf einen Röntgenfilm einwirken. Bei der Wechselwirkung zwischen der radioaktiven Strahlung und der scintillierenden Substanz entsteht sichtbares Licht, das den Film schwärzt. Es ist auch möglich, die Probe vor der Elektrophorese mit einem Fluoreszenzmarker [62, 63] zu behandeln, der nach der Elektrophorese die Banden unter UV-Licht sichtbar macht. Doppelisotopendetektion. Die Doppelisotopendetektion stellt eine Kombination aus Fluorographie und Autoradiographie dar. Sie ist von Interesse, wenn die Flecke von zwei Proben nach einer zweidimensionalen Elektrophorese miteinander verglichen werden sollen. Eine der beiden Proben wird mit einem schwachen ß-Strahler markiert, z.B. mit 3H, die andere mit einem Isotop, das energiereiche ß-Strahlen emittiert, z.B. mit 14C oder 35 S. Danach werden die beiden Proben gemischt und einer zweidimensionalen Elektrophorese untergezogen. Zuerst wird das 2D-Pherogramm fluorographisch sichtbar gemacht, wobei die Proteine der beiden Proben Schwärzungen auf dem Röntgenfilms verursachen. Danach legt man eine lichtundurchlässige Schicht zwischen das Gel und einen Röntgenfilm. Damit nur den energiereichen ß-Strahlen ist es immer noch möglich, die Schicht zu durchdringen und den Film zu schwärzen. Auf diese Weise erhält man autoradiographisch das 2D-Pherogramm der zweiten Probe, ohne daß die Proteine der ersten Probe auf dem Film Flecke erscheinen. Der Vergleich des Fluorogramms mit dem Autoradiogramm hilft bei der Erklärung der Proteinzusammensetzung beider Proben.

2.13.8 Dokumentation der Protein-Pherogramme Die Dokumentation der Protein-Pherogramme erfolgt Trocknen der Gele.

durch Photographic oder

Photographic. Zur Dokumentation der Pherogramme kann eine Kleinbildformat-Kamera mit einem Makroobjektiv verwendet werden. Ein schwarz-weißes Foto kann mit Hilfe eines panchromatischen Negativfilmes aufgenommen werden, während für ein farbiges Foto ein Kunstlichtfilm notwendig ist. Falls die Proteinbanden blau gefärbt sind (bei Coomassie-Färbung), kann man durch einen gelben Filter photographieren, um die Empfindlichkeit des Filmes zu erhöhen. Trocknen der Gele. Die dünnen und ultradünnen Gele trocknen schnell an der Luft. Die Gradienten-Polyacrylamidgele werden mit ihrer Haftfolie nach unten auf eine Platte aus Glas gelegt und luftblasen- und faltenfrei mit einer in Wasser gequollenen Cellophanmembran bedeckt, wobei die überstehende Ränder der Membran auf die Unterseite der Glasplatte umgefaltet werden. Beim Trocknen zieht sich das dampfdurchlässige Cellophan zusammen und haftet fest auf der Geloberfläche.

259

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Proteinbanden sind schwach gefärbt.

Die Empfindlichkeit der Färbemethode ist zu gering. Nachweisempfindlichkeit der Pcroxidase-Reaktion zu gering.

Länger färben.

Der Gelhintergrund wird bei einer Coontassie-Färbung blau.

Die basischen Immobilingruppen in IPG-Gelen binden Coomassie.

Die Coomassie-Farbe hat ungenügende Effektivität.

SDS wurde von den Proteinen nicht vollständig entfernt. Die Alkoholkonzentration in der Entfärbelösung ist zu hoch.

Anderes Peroxidase-Substrat verwenden, z.B. Tetrazolium-Methode oder Immunogold-Methode verwenden. Färbelösung mit einer CoomassieKonzentration weniger als 0,5 g/dl verwenden. Eine kolloidale oder Silber-Färbemethode anwenden. Die Gele längere Zeit reinigen, um SDS zu entfernen, und länger färben. Die Konzentration von Ethanol oder Methanol in der Entiarbelösung reduzieren oder eine Kolloidalfärbemethode verwenden.

Literatur [ l ] Frey MD, Radola BJ, Electrophoresis, 3, 27 (1982) [2] Fazekas de St. Groth S, Webster RG, Datyncr A, Biochim BiophysActa, 71, 377 (1963) [3] Meyer TS, Lambert BL, Biochim BiophysActa, 107, 144 (1965) [4| Diezel W, Kopperschläger G, Hoffmann E, Anal Biochem, 48, 617 (1972) [5] Fairbanks B, Steck TL, Wallach DFH, Biochemistry, 10, 2606 (1971) [6| Reisner AH, Methods Enzymol, 104, 439 (1984) [7] Neuhoff V, Stamm R, Eibl H, Electrophoresis, 6, 427 (1985) [8| Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W, Electrophoresis, 9, 255 (1988) [9| Blakesley RW, Boezi JA, Anal Biochem, 82, 580 (1977) [10] Patestos NP, Fauth M, Radola BJ. Electrophoresis, 9, 488 (1988) 111] S witzer RC, Merril CR, Shifrin S, Anal Biochem, 98, 231 (1979) [12] Merril CR, Switzer RC, van Kcuren ML, Proc NatAcadSci USA, 76, 4335 (1979) [13] Gersten DM. Wolf PH, Ledley RS, Radriguez L V, Zapolski EJ, Electrophoresis, 7, 327 (1986)

260

2 Elektrophorese der Proteine

[14] Morrissey JH, Anal Biochem, 117, 307 (1981) [15] Merril CR,Adv Electrophoresis, l, 111 (1987) [16] Merril CR, Acta Histochem Cytochem, 19, 655 (1986) [17] Merril CR, Goldman D, van Keuren ML, Electrophoresis, 3, 17 (1982) [18] Nielsen BL, Brown LR, Anal Biochem, 144, 311 (1984) [19] Merril CR, Goldman D, Sedman SA, Ebert MH, Science, 211, 1437 (1981) [20] Krause I, Elbertzhagen H, in Elektrophorese-Forum '87, Radola BJ (Hrsg.), S. 382 (1987) [21] Hempelmann, Kaminsky R, Electrophoresis, 7, 481 (1986) [22] Heukeshoven J, Dernick R, in Electrophoresis Forum '89, Radola BJ (Hrsg.), TU München, München, S. 283 (1989) [23] Nesterenko MV, Tilley M, Upton Si, J Biochem Biophys Methods, 28, 239 (1994) [24] Ansorge W, J Biochem Biophys Methods, 11, 13 (1985) [25] Willoughby EW, Lambert A, Anal Biochem, 130, 353 (1983) [26] Kapitany RA, Zebrowski El, Anal Biochem, 56, 361 (1973) [27] Pickering CE, Pickering RS, Arch Toxicol, 39, 249 (1978) [28] Hodson AW, Skillen A W, Anal Biochem, 169, 253 (1988) [29] Vulkanen KH, Goldmann D, Electrophoresis, 9, 132 (1988) [30] Peisker K, Nahrung, 30, 1051 (1986) [31] Kadofuku T, Sato T, Manabe T, Okuyama T, Electrophoresis, 4, 427 (1983) [32] Peisker K, Nahrung, 30, 463 (1986) [33] Curioni A, Dal Belin Perufio A, Nuti MP, Electrophoresis, 9, 327 (1988) [34] Biely P, Markovic D, Mislovicuva D, Anal Biochem, 144, 147 (1985) [35] Karpetsky TP, Brown CE, McFarland E, Brady ST, Roth W, Rahman A, Jewett P, Biochem J, 219, 553(1984) [36] Kinzkofer A, Radola BJ, Electrophoresis, 4, 408 (1983) [37] Mukasa H, in Molecular Microbiology and Immunobiology of Streptococcus Mutants, Hamada S (Hrsg.), Eisevier, Amsterdam, S. 121 (1986) [38| Mukasa H, Tsufnari H, Shimamura A, Electrophoresis, 8, 29 (1987) [39] Ogata M, Satoh Y, Electrophoresis, 9, 128 (1988) [40| Schiefer S, Teifel W, Kindl H, Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem, 357, 163 (1976) [41] Williams J, Marshall T, Electrophoresis, 8, 536 (1987) [42] Pretsch W, Charles DJ, Narayanan KR, Electrophoresis, 3, 142 (1982) [43] Soltis DE, Haufler CA, Darrow DC, Tastony GJ, Am Fern J, 73, 9 (1983) [44] Schrauwen JAM, J Chromat, 23, 177(1966) [45] Butler MJ, Lachante M, Anal Biochem, 162, 443 (1987)

2.13 Qualitative Auswertung der Protein-Pherogramme

[46] Kilias H, Gelfi C, Righetti PG, Electrophoresis, 9, 187 (1988) [47] Plow EF, Biochim BiophysActa, 630, 47 (1980) [48] Kelleher PJ, Juliano RL, Anal Biochem, 136, 470 (1984) [49] Günther S, Postel W, Wiering H, Görg A, Electrophoresis, 9, 618 (1988) [50] Allen RC, Budowle B, Saravis CA, Lack P M, Acta Histochem Cytochem, 19, 637 (1986) [51] Ohlsson BG, Weström BR, Karlsson BW, Electrophoresis, 8, 415 (1987) [52] Marshall MO, Clin ChimActa, 104, l (1980) [53] Cotton RGH, Milstein C, J Chromal, 86, 219 (1973) [54] Suzuki K, Harumoto T, Ito S, Matsumoto H, Electrophoresis, 8, 481 (1987) [55] Pätsch-Schneider L, Klein H, Electrophoresis, 9, 602 (1988) [56] O'Farrell PH, J Biol Chem, 250, 4007 (1975) [57] Laskey RA, Mills AD, Eur J Biochem, 56, 335 (1975) [58] Laskey RA, Mills AD, FEBS Lett, 82, 314 (1977) [59] Keck K, Grossberg AL, Pressmann D, EurJImmunol, 3, 99 (1973). [60] Bonner WM, Laskey RA1, Eur J Biochem, 46, 83 (1974) [61] Chamberlain P, Anal Biochem, 98, 132(1978) [62] Falk BW. Elliot C, Anal Biochem, 144, 537 (1985) [63] Harawitz PM, Bowman S, Anal Biochem, 165, 430 (1987)

261

2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie Mit bloßem Auge kann man nur die Anwesenheit oder das Fehlen einer Bande erkennen. Es ist aber schwierig oder unmöglich die Unterschiede zwischen den Färbungsintensitäten (Konzentrationen) der Polyionen festzustellen. Dies kann durch Densitometrie des Pherogramms durchgeführt werden [1].

2.14.1 Grundlagen der Densitometrie Zur Densitometrie benötigt man ein spezielles Gerät zur quantitativen Messung der elektrophoretischen Ergebnisse, ein Densitometer (Kap. 1.6.4). Mit seiner Hilfe kann die Lichtabsorption der Banden sowie ihre Rf-Werte (ihre relativen Laufstrecken) gemessen und eine Kurve - das Densitogramm - erhalten werden. Die Flächen unter dem Densitogramm entsprechen den Polyionenkonzentrationen. Mit Hilfe der Densitometrie und eines Computers kann man auch die Molekülmassen und die isoelektrischen Punkte der Proteine bestimmen. Die Densitogramme sind die übliche Auswertungssform der Ergebnisse, die in der klinischen Chemie mit der Acetylcellulose- und Agarosegel-Zonenelektrophorese erhalten werden. Hier werden hochauflösende Densitometer verwendet, die mit Hilfe von Computern mit geeigneter Software die nebeneinander liegenden Banden scannen und analysieren können. Die Densitogramme werden den getrockneten Gelen und Gel-Fotos vorgezogen. Die Banden der Densitogramme können oftmals exakter verglichen werden als die Banden der Pherogramme (Abb. 2.14-1). Mit der Einführung der hochauflösenden Gel-Elektrophorese und Blotting-Methoden werden höhere Anforderungen an die Densitometrie gestellt [2].

Abstand

Startpunkt

Abb. 2.14-1 Schema der Densitometrie. a) Pherogramm; b) Densitogramm.

263

2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie

Wenn ein Lichtstrahl mit einer bestimmten Wellenlänge und einer bestimmten Intensität 70, in cd, auf einer Substanz eingestrahlt, wird ein Teil davon absorbiert und dadurch seine Intensität auf / gesenkt. Der natürliche Logarithmus des Verhältnisses von eingestrahltem zu durchgelassenem Licht wird als Extinktion E bezeichnet:

E = In — .

(2.14-1)

Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz steigt die Extinktion einer verdünnten Lösung linear zur Konzentration der Lösung nach folgender Beziehung: (2.14-2) wobei , in m2/mol, ein Koeffizient, c, in mol/1, die Konzentration der Substanz, und d, in m, die Schichtdicke ist. In der analytischen Chemie wird auch die Größe optische Dichte (ÖD, dimensionslos) verwendet. Sie bezeichnet die Menge einer Substanz, die, gelöst in l ml Lösungsmittel in einer Küvette mit l cm Schichtdicke, eine Extinktion von l ergibt. Die konventionelle Photometric gehorcht dem Gesetz von Lambert-Beer, da hier die Extinktion von stark verdünnten Lösungen gemessen wird. Bei der PherogrammDensitometrie ist aber die absorbierende Substanz ein hochkonzentriertes Proteinpräzipitat, das an einem Farbstoff gebunden ist, oder ein autoradiographischer Fleck. Es ist festgestellt worden, daß das Verhältnis der Polyionen-Konzentration zur Absorption nicht linear sondern hyperbolisch oder sigmoidal ist. Bei der Densitometrie wird weißes oder Laserlicht verwendet. Das weiße Licht muß mit Hilfe geeigneter Filter auf den optimalen Wellenlängenbereich eingestellt werden, weil die Farbstoffe, die zur Proteinfärbung verwendet werden, unterschiedliche Absorptionsmaxima haben (Abb. 2.14-2). Der Laserstrahl hat eine fixierte Wellenlänge und eine extrem schmale Breite, nur eine Spektrallinie. Die Wellenlänge des HeliumNeon-Lasers z.B. ist 632,5 nm. Mit dem weißen Licht ist es möglich, lineare Absorptionsmeßwerte bis maximal 2,5 ÖD zu erhalten, mit einem Laser bis zu 4,0 OD. OD

1,0 . 0,8 0,6 0,4 0,2 0 520

540

560

580

600

620

640

, nm

Abb. 2.14-2 Absorptionsspektren verschiedener Farbstoffe. — Coomassie-Brillantblau R 250; Coomassie-Brillantblau G 250; - - Naphtolblauschwarz B (Amidoschwarz l OB)

264

2 Elektrophorese der Proteine

2.14.2 Auflösung eines Densitometers Die Auflösung eines Densitometers hängt von der Breite des Lichtstrahls, der Tiefe der Messung und der Schrittweite der Lichtquelle bzw. des Objekts ab. Abhängig davon, ob die Messung an der Oberfläche oder im Inneren des Trennmediums erfolgt, wird reflektierende oder transmittierende Densitometrie unterschieden. Die Densitometer arbeiten in der Regel im Transmissionsmodus, da meistens durchsichtige Gele, Blotmembranen oder Autoradiogramme untersucht werden. Breite des Lichtstrahls. Die Breite des Lichtstrahls hat eine entscheidende Bedeutung für die Auflösung des Densitometers, wenn die getrennten Banden dicht nebeneinander liegen. Je breiter der Lichtstrahl, desto mehr kann die darin gemessene Absorption von der Absorption an Bandenmaxima und Bandenminima abweichen (Abb. 2.14-3). Der Lichtstrahl darf aber eine bestimmte Mindestbreite nicht unterschreiten, da dies zur Verringerung seiner Intensität und somit zu einer Verschlechterung der Meßergebnisse fuhrt. Deswegen muß bei der Wahl der Lichtstrahlsbreite ein Kompromiß getroffen werden. Ein weißer Lichtstrahl sollte nicht dünner als 100 , ein Laserstrahl nicht dünner als 50 sein Breiter Lichtstrahl

Absorption ÖD

Schmaler Lichtstrahl

Absorption ÖD Abstand

Abstand

Abb. 2.14-3 Vermessung von dicht nebeneinander liegenden Banden mit einem breiten und einem schmalen Lichtstrahl.

Tiefe der Messung. Die Strahlen aus einer konventionellen weißen Lichtquelle werden mit Hilfe optischer Linsen auf einen Brennpunkt innerhalb des Gels fokussiert. Vor und hinter dem Brennpunkt sind sie nicht fokussiert, was bei dickeren Gelen zu einem Verlust an Auflösung führt. Die Laserstrahlen besitzen von Natur aus eine hohe Parallelität. Deswegen verfügen die Laserdensitometer über eine größere Auflösung als die Densitometer mit konventionellen Lichtquellen. Gele, die bis zu 3 mm dick sind, können mit einem Laserstrahl ohne Verlust an Auflösung vermessen werden. Bei dünnen und ultradünnen Gelen hat die Tiefe der Messung keine große Bedeutung.

265

2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie

Schrittweite des Densilomelers. Die Schrittweite des Densitometers bestimmt den Abstand zwischen zwei Meßpunkten im Densitogramm. Sie sollte kleiner als die Breite des Lichtstrahls sein. Wenn sie größer ist, gibt es Auflösungsverluste.

2.14.3 Basislinie und Bandenintegration Die Basislinie legt den Hintergrund des Densitogramms fest. Es gibt zwei Grundverfahren zum Definieren der Basislinie (Abb. 2.14-4): Beim ersten Verfahren wird die Basislinie als eine horizontale Gerade durch den tiefsten Punkt des Densitogramms gezogen (horizontale Basislinie). Dieses Verfahren wird bei Pherogrammen mit homogenem Hintergrund verwendet. Beim zweiten Verfahren verbindet die Basislinie die Bandenminima miteinander (manuelle Basislinie). Dieses Verfahren wird bei ungleichmäßig gefärbtem Hintergrund eingesetzt. Selbstverständlich hat das erste Verfahren mehrere Vorteile, eine manuelle Basislinie bringt aber präzisere Ergebnisse, da sie sicherer den Einfluß des Hintergrundes ausschließt. Absorption ÖD 4

Absorption ÖD

3 2 l

a

Abstand

Abstand

Abb. 2.14-4 Unterschiedliche Basislinien. a) Horizontale Basislinie; b) Manuelle Basislinie. Basislinie

Die Bandenintegration (Bandenauswertung) kann nach zwei Verfahren bestimmt werden (Abb. 2.14-5) Bei der senkrechten Integration werden die Minima einer Bande durch senkrechte Linien mit der Basislinie verbunden und die eingegrenzte Fläche gemessen. Bei der Gaußschen Integration werden die Bandenflächen als Gaußsche Flächen darstellt. Dieses Verfahren ist viel präziser, benötigt aber einen Computer mit entsprechender Software.

266

2 Elektrophorese der Proteine

ÖD

Abstand

Abstand

Abb. 2.14-5 Integration der Bandenflächen bei unvollständiger Auflösung. ä) Senkrechte Integration; b) Gaußsche Integration.

2.14.4 Auswertung eines Densitogramms Bei der Auswertung eines Densitogramms können absolute oder relative Konzentrationen ermittelt werden. Im ersten Fall werden Eichkurven benötigt, im zweiten Fall eine Abhängigkeit zwischen der Konzentration und der Bandenfläche. Die absolute Konzentration eines Proteins läßt sich von der Eichkurve desselben Proteins ablesen. Die relative Konzentration eines Proteins ist oft von größerer Bedeutung als ihre absolute Konzentration. In diesem Fall densitometriert man das Pherogramm und berechnet das Verhältnis zwischen der Bandenfläche des zu untersuchenden Proteins gegenüber der totalen Bandenfläche des Densitogramms. Im Bereich geringer Proteinkonzentrationen besteht eine lineare Beziehung zwischen der Konzentration und der entsprechenden Bandenfläche - die Fläche unter der Bande wächst mit der Konzentration.

2.14.5 Zweidimensionale Densitometrie Es gibt Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Densitometrieen von ein- und zweidimensionalen Pherogrammen. Bei der eindimensionalen Densitometrie werden die Banden eines Pherogramms nur in einer Richtung gescannt, wobei der scannende Lichtstrahl das Gesamtpherogramm abtastet. Bei der zweidimensionalen Densitometrie werden die Flecken (Spots) eines Pherogramms in zwei Richtungen gemessen, wobei die Information in digitale Signale übersetzt und in einem Computer [3, 4] verarbeitet wird. Bei der eindimensionalen Densitometrie bekommt man eine bergfbrmige Kurve auf einer Basislinie, d.h. das eindimensionale Densitogramm hat zwei Dimensionen. Bei der zweidimensionalen Densitometrie bekommt man eine bergfbrmige Kurve auf einer Basisfläche, d.h. das zweidimensionale Densitogramm hat drei Dimensionen. Somit ähnelt das zweidimensionale Densitogramm einer Landkarte (Abb. 2.14-6).

267

2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie

Abb. 2.14-6 Eindimensionale (a) und zweidimensionale Vermessung (Proteinflecke).

(b) der

Proteinbanden

Die Auswertung der Proteinkonzentrationen in eindimensionalen Pherogrammen erfolgt nach der Proportionalität zwischen der Proteinkonzentration und der Bandenfläche, in zweidimensionalen Pherogrammen nach der Proportionalität zwischen der Proteinkonzentration und dem Bandenvolumen. Deswegen wird bei der zweidimensionalen Densitometrie eine angemessene Computersoftware benötigt, welche die Basisfläche und die Fleckenintegration berücksichtigt [5, 6]. Die Entscheidung, ob die Flecke (protein maps) von zwei Proteinen übereinstimmen oder nicht, wird ebenfalls vom Computer getroffen

2.14.6 Densitometriefehler Die Auswertung eines Pherogramms hängt von der Qualität der Trennung ab. Wenn die Banden krumm oder schlecht gefärbt sind, oder das Pherogramm einen starken Hintergrund hat, wird die Auswertung unglaubwürdig. Die Gradientengele z.B. weisen nach der Färbung einen sich verändernden Hintergrund auf, der im Verhältnis zur Polyacrylamidgel-Konzentration steht. Diese Faktoren führen zu Densitometriefehlern, die in zwei Gruppen eingeordnet werden können: Fehler beim Densitometrieren und Fehler beim Vermessen der Bandenflächen. Fehler beim Densitometrieren. Fehler beim Densitometrieren kommen am häufigsten bei einer Über- oder Unterbewertung der Banden vor. Bei der densitometrischen Überbewertung des Pherogramms werden Flecke erfaßt, die keine Proteinbanden darstellen. Das können Schmutzteilchen, Fingerabdrücke u.a. sein. Bei der densitometrischen Unterbewertung des Pherogramms werden die Proteinbanden unvollständig erfaßt. In diesem Fall werden mehrere parallele Scans empfohlen, bis alle Banden erfaßt werden (Abb. 2.14-7).

268

2 Elektrophorese der Proteine

ÖD

ÖD

Abstand

Abstand

Abb. 2.14-7 Densitometriefehler durch unvollständiges Erfassen der Proteinbanden. a) Der Lichtstrahl ist zu schmal, um die breiten und seitlich verschobenen Banden zu erfassen; b) Mehrere parallele Scans führen zur Erfassung aller Banden.

Fehler beim Vermessen der Bandenflächen. Früher wurde das Vermessen der Bandenflächen planimetrisch durchgeführt oder wurden Bandenkopien aus Papier ausgeschnitten und gewogen. Heute wird das Vermessen der Bandenflächen sehr präzise vom Computer ausgeführt.

Problem lösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Überbewertung eines Densitogramms

Es werden Flecken erfaßt, die keine Banden darstellen, sondern Schmutzteilchen, Fingerabdrücke u.a. sind. Der Meßstrahl war zu schmal. Deswegen sind die breiten Proteinbanden nicht vollständig erfaßt.

Mit Handschuhen arbeiten. Reine Lösungen verwenden.

Unterbewertung eines Densitogramms

Mehrere parallele Scans machen, um alle Proteinbanden zu erfassen.

2.14 Quantitative Auswertung der Protein-Pherogramme - Densitometrie

Literatur [1] Cantu GR, Nelson JW, BioTechniques, 16, 322 (1994) [2] Westermeier R, Schickle HP, Theßeling G, Walter WW, GH Lab Med, 4, 194 (1988) [3] Manabe T, Okuyama T, J Chromat, 264, 435 (1983) |4] Prehm J, Jungblut P, Klose J, Electrophoresis, 8, 562 (1987) [5] Anderson NB, Anderson L, Clin Chem, 28, 739 (1982) |6] Kuick RD, Hanash SM, Strahler JR, Electrophoresis, 9, 192 (1988)

269

2.15 Blotting der Proteine Western-Blotting Wie in Kap. 1.1.2 erwähnt, ist das Blotting keine elektrophoretische Methode, sondern eine Nachweismethode, die auch elektrophoretisch durchgeführt werden kann. Sie wird nach der Elektrophorese zum Nachweis von einzelnen Polyionen verwendet. Das Blotting wird benötigt, weil die elektrophoretisch getrennten Proteine, die sich üblicherweise in Gelen befinden, für hochmolekulare Nachweis-Liganden, z.B. Antikörper, Antigene, Lectine, DNA, RNA, nicht zugänglich sind. Deswegen werden sie vom Gel auf die Oberfläche einer Membran übertragen. Vor der spezifischen Nachweisreaktion müssen die unbesetzten Bindungsstellen der Membran mit bestimmten Substanzen blockiert werden, die nicht an der Nachweisreaktion teilnehmen (Abb. 2.15-1). Die Blotmembran mit den gebundenen Proteinen wird als Proteinblot bezeichnet, das ganze Verfahren als Western-Blotting [1,2]. Proteinbanden

Transfer

s r r r r j oei • ^ | ··' x^ J

^r

Blockierung

^r

^r ^r

Blotmembran

4.

SS Detektion

Blockierreagenz l

^^..^;;.,'· - ;,. . -

-;

'&','&--'·· jP·.'"_ & /

T

Liganden (Sonden)

Abb. 2.15-1 Etappen beim Blotting.

2.15.1 B lotmembranen Die Blotmembranen enthalten Cellulose-Derivate oder Kunststoff. Die wichtigsten Blotmembranen bestehen aus Nitrocellulose, Polyvinilydendifluorid, Nylon, Diazobenzyloxymethylcellulose, Diazophenylthioethercellulose und aktiviertem Glasfaserpapier. • Die Nitrocellulosemembran (NC) ist die am häufigsten verwendete Blotmembran [3, 4]. Üblicherweise sind Nitrocellulosemembranen mit Porengrößen von 0,2 oder 0,45 erhältlich. Je kleiner die Poren sind, desto größer ist die Bindungskapazität der Blotmembran. Durch Liganden-Beschichtung der Nitrocellulosemembranen kann die Adsorption der Glykoproteine und Lipide verbessert werden [5]. Die Nitrocellulose-Blotmembran kann außerdem für präparative Zwecke eingesetzt

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

•

•

•

•

271

werden, da die Proteine wieder eluiert werden können [6]. Die mechanische Stabilität der NC-Membranen ist begrenzt, deswegen hat man in letzter Zeit versucht, vliesverstärkte NC-Membranen herzustellen. Polyvinylidendifluorid-Membranen (PVDF) verfugen über hohe Bindungskapazität und sind mechanisch stabil [7, 8], Sie werden ebenfalls für direkte Proteinsequenzierung verwendet [9]. Nylonmembranen haben auch gute mechanische Stabilität [10]. Sie binden die ProteinPolyionen elektrostatisch und durch hydrophobe Wechselwirkungen. Dadurch bekommt man bei der Färbung einen starken Hintergrund, da auch Farbstoffmoleküle gebunden werden. Diazobenzyloxymethyl-Papiere [11] und Diazophenylthioether-Papiere [12] (DBM bzw. DPT) binden die Protein-Polyionen elektrostatisch und kovalent. Sie werden durch Nylonmembranen ersetzt. Aktivierte Glasfaserpapiere [13] werden verwendet, wenn die geblotteten Proteine sequenziert werden müssen.

Das Blotting umfaßt drei Schritte: Transfer der Proteinbanden auf eine Blotmembran, Blockierung der freien Bindungsstellen der Blotmembran durch ein Blockier-Reagenz und Detektion der geblotteten Proteine durch spezifischen Liganden (Sonden) oder unspezifische Proteinfärbung.

2.15.2

Transfer

Heute sind vier Transferverfahren bekannt: Diffusionsblotting, Kapillarblotting, Vakuumblotting und Elektroblotting. Während bei den Nukleinsäuren das Kapillar- oder Vakuumblotting am häufigsten verwendet werden (Kap. 3.6), wird bei den Proteinen das Elektroblotting bevorzugt.

Elektroblotting der Proteine Das Elektroblotting wurde vor allem in Zusammenhang mit der schnellen Verbreitung der SDS-Elektrophorese entwickelt. Es stellt die schnellste Art von Blotting dar - dauert von einer halben bis zu 24 Stunden. Bei den foliengestützten Gelen ist seine Durchführung problematisch, da die Haftfolie nach der Elektrophorese entfernt werden muß [14]. Inzwischen gibt es netzgestützte Gele [15, 16], die zum Elektroblotten geeignet sind. Das Elektroblotting hat zwei Ausführungen: Tankblotting und Semidry-Blotting. Tankblotting. Beim Tankblotting [ 17] werden das Gel mit den elektrophoretisch getrennten Proteinen und die Blotmembran zwischen Filterpapieren in eine Kassette eingelegt und in einen mit bis zu 4 l Puffer gefüllten Tank eingehängt. Danach wird das Gel zwischen zwei beidseitig aufgespannten Elektroden geblottet. Der Puffer muß gekühlt werden, damit sich der Blotsandwich nicht erwärmt. Der Transfer wird meist über Nacht durchgeführt.

272

2 Elektrophorese der Proteine

Das Tankblotting der SDS-Gele wird in einem kontinuierlichen Puffer durchgeführt, z.B. im TRIS-Glycinat-Puffer mit pH = 8,3 (Kap. 1.2.3), der SDS und Methanol enthält (s.u.). Ein Borat-Puffer (Kap. 1.2.3) mit pH = 9,2 [18] ist beim Blotten von Glykoproteinen zu empfehlen, da die Borsäure komplexe Verbindungen mit den Alkoholgruppen der Zuckerreste bildet, wodurch sich die Zahl ihrer negativen Ladungen erhöht. Saure Gele mit basischen Proteinen können in 0,7 ml/dl Essigsäure geblottet werden. Semidry-Blotting. Das Semidry- (halbtrockene) Blotting hat sich bei den Proteinen durchgesetzt [19, 20], Bei ihm werden das Gel und die Blotmembran zwischen Filterpapierbogen gelegt, die mit Transferpuffer getränkt sind. Der entstandene Blotsandwich wird zwischen die horizontalen Graphitplatten eines Blotters eingelegt (Abb. 2.15-2). Es sind auf dem Markt auch Blotter mit Glaskohlenstoffplatten erhältlich (C77, Frankfurt), die fester als die Graphitblotter sind. Graphit und Glaskohlenstoff sind die bevorzugten Elektrodenmaterialien für das Semidry-Blotting, da sie eine hohe elektrische Leitfähigkeit haben. Außerdem ist das elektrische Feld zwischen den Platten homogen und hat eine hohe Feldstärke, da der Abstand zwischen den Platten gering ist. Dadurch wird schneller und gleichmäßiger geblottet und man kann auf Kühlung verzichten. Wenn das Gel an eine Haftfolie gebunden ist, muß es vor dem Semidry-Blotting von der Folie befreit werden, was kaum ohne eine Beschädigung des Gels erfolgen kann. Viel bequemer für diesen Zweck sind die Netzgele (ELPHO, Nürnberg). Sie sind Gele, die auf ein Netz gegossen sind. Das Semidry-Blotting kann, ähnlich der Elektrophorese, in einem kontinuierlichen Puffer oder in einem diskontinuierlichen Puffersystem durchgeführt werden. Beim Semidry-Blotting in kontinuierlichen Puffern wird auf den beiden Seiten der Blotmembran derselbe Puffer verwendet. Unter diesen Bedingungen bilden sich auf der Blotmembran Banden, die in der Regel nicht scharf genug sind. Das Verhalten ist aber sehr einfach. Der Transferpuffer sollte 0,05-0,06 g/dl SDS und 20 ml/dl Methanol enthalten. SDS gewährleistet einen besseren Transfer der hydrophoben Proteine, besonders der fokussierten Proteine, die an ihren pl-Werten keine Ladungen haben. Das Methanol verhindert das Quellen des Gels während des Transfers. Wenn die Proteine ihre Nativität oder die Enzyme ihre Aktivität beibehalten sollen, darf der Transferpuffer kein Methanol enthalten. Bei den Agarosegelen sollte der Transfer ebenfalls ohne Methanol durchgeführt werden, da es die Agarosenstruktur verändert. Für das Semidry-Blotting in kontinuierlichen Puffern können viele Puffer verwendet werden (Kap. 1.2.3), am besten der gleiche Puffer, in dem die Elektrophorese durchgeführt wurde. Ein oft brauchbarer Puffer ist z.B. der TRIS-Glycinat-Puffer, bekannt von der Disk- sowie der SDS-Elektrophorese (Tab. 2.15-1).

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

273

Tab. 2.15-1 Kontinuierliches Semidry-Blotting in einem TRIS-Glycinat-Puffer mit pH = 8,3. Komponenten

Konzentration

TR1S Glycin SDS Methanol Natriumazid Dest. Wasser ad

48,0 mmol/1 39,0 mmol/l 2,0 mmol/1 5,0 mol/1 1,5 mmol/1

Herstellung 5,81 g 2,93 g 0,58 g 200,0 ml 0,1 g 1000,0 ml

Beim Semidry-Blotting in diskontinuierlichen Puffersystemen werden die elektrophoretisch getrennten Protein-Polyionen von einer wandernden Zonengrenze überholt. Dadurch gelangen die einzelnen Proteine konzentriert und gleichzeitig auf der Blotmembran, was sich in schärferen Banden widerspiegelt. Dieses Verfahren wird auch beim Nativblotting (ohne SDS) empfohlen: wenn die SDS-Konzentration im diskontinuierlichen Puffersystem niedrig ist, z.B. 0,10 g/l, werden die nativen Proteine nicht denaturiert. In Tab. 2.15-2 ist ein diskontinuierliches Puffersystem für das Semidry-Blotting angegeben, das wir empfehlen [21]. Es kann bei denaturierten (nach SDSElektrophorese) oder nativen Proteinen (nach Disk-Elektrophorese oder isoelektrischer Fokussierung) eingesetzt werden Tab. 2.15-2 TRIS-Formiat-Taurinat-Puflersystem für Disk-Semidry-Blotting. Anodenpuffer:

TRIS-Formiat-Puffer,

TR1S 99 % Ameisensäure (SDS Methanol NaN 3 Dest. Wasser ad Kathodenpuffer: TRIS Taurin (SDS Methanol NaN3 Dest. Wasser ad

TRJS-Taurinat-Puffer,

pH =7,8,1 = 0,06 mol/l 0,077 mol/1 0,018 mol/1 2,0 mmol/1 5,0 mol/1 l,5 mmol/1

9,36 g 2,29 ml 0,58 g) 200,0 ml 0,10g 1000,0 ml

pH = 8,5, I = 0,01 mol/l 0.035 mol/1 0,048 mol/1 2,0 mmol/1 5.0 mol/1 0,0015 mol/1 1000,0 ml

4,20 g 6,02 g 0,58 g/l) 200,0 ml 0,10g 1000,0 ml

Das Disk-Semidry-Blotting verläuft folgendermaßen (Abb. 2-15-2):

274

2 Elektrophorese der Proteine

'· '·'

ljiu

Kathodenplatte Kathodenpapier Anodenpapier Cellophan Netzgel Blotmembran Anodenpapier Anodenplatte

Abb. 2.15-2 Schema eines Disk-Semidry-Blottings.

• Die Anodenplatte wird mit dest. Wasser getränkt, um gleichmäßigen Stromfluß zu erreichen. • Filterpapiere, zugeschnitten auf die Gelgröße, werden mit Anoden- und Kathodenpuffer getränkt. • Eine Blotmembran, eine Cellophanmembran und das Netzgel mit den elektrophoretisch getrennten Banden werden für 3-4 min unter Schütteln im Anodenpuffer äquilibriert. • Auf die untere, Anodenplatte des Blotters werden ein dickes Filterpapier mit Anodenpuffer und darauf nacheinander die Blotmembran, das Netzgel (mit dem Gel nach unten), die Cellophanmembran, ein anderes Filterpapier mit Anodenpuffer und ein dickes Filterpapier mit Kathodenpuffer aufgelegt. • Der entstandene Blotsandwich wird mit einem Roller gewalzt, so daß die Luftblasen zwischen seinen Schichten entfernt werden. • Auf den Blotsandwich wird die obere, Kathodenplatte des Blotters aufgelegt und mit einem Gewicht von l bis 3 kg beschwert. Damit wird erreicht, daß die Gasbläschen, die sich während des Transfers bilden, seitlich den Blotsandwich verlassen und das Blotten nicht stören. • Der Stromversorger des Blotters wird eingeschaltet. Während der Blotting-Manipulationen sollte man Gummihandschuhe tragen, um keine Verunreinigungen in den Puffern oder auf den Blotmembranen und Filterpapieren zu hinterlassen. Transferbedingungen. Der Transfer beim Semidry-Blotting findet in der Regel bei einer Stromdichte von 0,8-1,0 mA/cm2 Blotfläche statt. Die Dichte des elektrischen Stroms kann auf 1,5 mA/cm2 erhöht werden, es sollte aber nicht vergessen werden, daß eine Stromsteigerung die Joulesche Wärme erhöht. Die Dauer des Transfers hängt von der Geldicke ab. Wir schlagen vor, daß eine 0,5 mm dicke Gelschicht ca. 60 min geblottet wird. Das bedeutet, daß ein 0,25 mm dickes Gel ca. 30 min und ein 1,0 mm dickes Gel 120 min geblottet werden sollte. Die Transferzeit hängt auch von der lonenstärke des Puffers ab, wobei in einem verdünnten Puffer schneller geblottet wird, und umgekehrt. Außerdem spielt die Gel-Konzentration auch eine gewisse Rolle - Gele mit niedrigeren Konzentrationen werden schneller als Gele mit höheren Konzentrationen geblottet.

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

275

Das Blotten aus Nativ- und Fokussierungsgelen verläuft schneller (in ca. 30 min), da die getrennten nativen Proteine globuläre Form haben und die Gele (bei der isoelektrischen Fokussierung) weitporiger sind. Nachdem der Transfer vollendet ist, kann die Blotmembran blockiert oder unmittelbar gefärbt werden.

2.15.3 Blockierung Zum Abdecken der freien Bindungsstellen auf der Blotmembran werden geeignete makromolekulare Substanzen (Blockier-Reagenzien) verwendet. Sie dürfen nicht mit den transferierten Proteinen oder mit den spezifischen Nachweisreagenzien reagieren. Die Blockierung verhindert auch, daß sich die spezifischen Nachweissubstraten an die Blotmembran binden und eine starke Hintergrundfärbung verursachen. Als ein Blockier-Reagenz für das Proteinblotting wird meist 2-10 g/dl Rinderserumalbumin verwendet. Andere Blockier-Reagenzien sind: 5 g/dl Magermilchpulver, 3 g/dl Fischgelatine, 0,05 g/dl Tween 20, 1,0 g/dl Casein, 10 g/dl fetales Kälberserum. Die Blockierung erfolgt am schnellsten bei 37 °C. Beim Blockieren von PVDFMembranen wird die flüssige Fischgelatine gegenüber Rinderserumalbumin oder Casein bevorzugt [22]. Nach dem Transfer und der Blockierung können die geblotteten Proteine spezifisch durch Sonden delektiert oder unspezifisch gefärbt werden.

2.15.4 Detektion durch Sonden und Farbstoffe Abhängig von den Sonden werden folgende Blotting-Verfahren unterschieden: Enzym-, Immun- und Lectinblotting. Enzymblotting. Beim Enzymblotting werden native Enzyme geblottet, die mit Hilfe spezifischer Substrate und gekoppelter Farbreaktionen nachgewiesen werden [23, 24], Immunblotting. Beim Immunblotting [25, 26] werden die Antigene (Proteine) auf die Blotmembran transferiert, die nach ihrer Blockierung Präzipitationsbanden mit spezifischen Immunglobulinen bilden. Die Präzipitationsbanden können durch Bindung eines markierten Proteins, z.B. des mit 125I markierten Protein A, sichtbar gemacht werden [27], Protein A darf aber wegen seiner Radioaktivität nicht in allen Labors verwendet werden und bindet außerdem nur bestimmte IgG-Subklassen. Um die Präzipitationsbanden nachzuweisen, können auch Antiantikörper verwendet werden, die mit einem Enzym verbunden sind - Enzym-gekoppelte Sekundärantikörper. Häufig verwendete Enzyme sind die Peroxidase und die alkalische Phosphatase. Das Immunblotting mit Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörpern hat sich zu einer Standardmethode für die immunologische Identifizierung von Proteinen entwickelt [28, 29]: Nach der Elektrophorese, dem Transfer und der Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Blotmembranen wird der Proteinblot mit einer Lösung getränkt,

276

2 Elektrophorese der Proteine

die monospezifische Kaninchenantikörper gegen das Protein enthält. Durch Waschen in einem Puffer werden die ungebundenen Antikörper entfernt, während die Immunpräzipitate bleiben. Der Proteinblot wird in einen anderen Puffer mit Peroxidasegekoppelten Sekundärantikörpern gegen die Kaninchenantikörper getaucht. Dabei entstehen zusätzliche Immunpräzipitate, die die Enzym-gekoppelten Antikörpern enthalten. Schließlich können die Immunpräzipitate mit einer geeigneten Farbreaktion, insbesondere mit der Tetrazolium-Blau-Methode nach Taketa [30], sichtbar gemacht werden. Alle anderen Proteinbanden bleiben unsichtbar. Der Vergleich zwischen dem unspezifisch gefärbtem Gel und dem Immunblot macht die präzise Identifizierung der Proteine möglich (Abb. 2.15-3).

- _ Ergebnisse

Detektion mit Sekunda rantikörpern

Detektion mit Primärantikörpern

Abb. 2.15-3 Immunblotting mit Enzym-gekoppelten Sekundärantikörpern.

Ähnlich zur beschriebenen Methode ist das Verfahren mit Sekundärantikörpern, die mit alkalischer Phosphatase gekoppelt sind [31, 32]. Sehr empfindlich ist ebenfalls der Nachweis mit Sekundärantikörpern, die mit kolloidalem Gold gekoppelt sind [33] (Goldgekoppelten Sekundärantikörpern). Dabei kann die Nachweisempfindlichkeit zusätzlich mit Silber erhöht werden und eine untere Nachweisgrenze von ca. 100 pg erreicht werden [34], Das Immunblotting kann auch mit Hilfe des Biotin-Avidin-Systems durchgeführt werden. Das Biotin (Vitamin H) wurde als Wuchsstoff für die Hefe entdeckt. Das Avidin ist ein aus dem Eiklar isoliertes Glykoprotein, das mit Biotin fest verbunden ist Der Komplex wird von Peptidhydrolasen (Proteasen) nicht hydrolysiert. Das Biotin-Avidin-System wird mit einem Enzym gekoppelt, z.B. mit der Peroxidase [35], und mit entsprechenden Antikörpern. Nach dem Transfer treten bestimmte Proteine auf der Blotmembran in Wechselwirkungen mit den gekoppelten Antikörpern. Das gebundene Enzym (Peroxidase oder alkalische Phosphatase) katalysiert die Umwandlung des entsprechenden Substrats in ein Produkt, das mit einer Farbreaktion nachgewiesen werden kann (Abb. 2.15-4).

277

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

Substrat Produkt

Blotmembran Abb. 2.15-4 Nachweis von geblotteten Proteinen mit Hilfe des Biotin-Avidin-Systems.

Lectinblotting. Für den Nachweis von Glykoproteinen werden als Sonden Lectine verwendet [36, 37]. Die Visualisierung erfolgt über die Aldehydgruppen der Glykoproteine oder die Avidin-Biotin-Methode [38]. Eine unspezifische Färbung der Blotmembranen kann mit Amidoschwarz l OB oder anderen Farbstoffen durchgeführt werden. Amidoschwarz-Färbung. Die Amidoschwarz-Färbung der geblotteten Proteine ist am meisten verbreitet. Die Blotmembranen werden für 3-4 min in 0,1 g/dl Amidoschwarz 10B (Naphtolblauschwarz B) in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V:V) gefärbt, danach wird der Membranhintergrund in Methanol-Essigsäure-Wasser (3:1:6, V.V) entfärbt. Die Färbung mit Coomassie-Brillantblau hat bei den Blotmembranen eine begrenzte Verwendung, da es sich stark an die meisten Membranen bindet und sich von ihnen nicht vollständig lösen kann. Andere Färbemethoden. Die geblotteten Proteine können auch mit Ponceau S [39], India-Ink, Fast Green FCF oder Chelaten gefärbt werden. Es kann auch eine Färbung mit kolloidalem Gold [40] verwendet werden. Die Empfindlichkeit der India-Ink-Färbung ist beinahe so hoch wie die der Silberfärbung. Die Methode kann nach folgendem Schema durchgeführt werden [41, 42]: • Die Blotmembran wird 5 min in 0,2 mol/1 NaOH und 4 mal je 10 min in einer PBSTween-Lösung gewaschen. Die PBS-Tween-Lösung wird aus 48,8 g NaCl, 14,5 g Na2HPO4, 1 , 1 7 g NaH2PO4, 0,5 g NaN 3 und 2,5 ml Tween 20 in 5 l dest. Wasser vorbereitet. • Die Blotmembran wird 2 h bis über Nacht in filtrierter 0,1 g/dl Pelikan-Füllfederhalter-Tinte (Fount India) in 1 ml/dl Essigsäure in PBS-Tween-Lösung gefärbt. • Die Blotmembran wird 2 mal je 2 min mit Wasser gewaschen und schließlich an der Luft getrocknet. Bei der reversiblen Färbung mit Fast Green FCF (Echtgrün FCF) wird die Blotmembran für 5 min in 0,1 g/dl Fast Green FCF in l ml/dl Essigsäure gefärbt und danach der Hintergrund der Blotmembran 5 min in dest. Wasser entfärbt. Falls eine volle Entfärbung der Banden benötigt wird, sollte die Membran noch 5 min in 0,2 mol/1 NaOH verbleiben.

278

2 Elektrophorese der Proteine

Danach kann die Blotmembran blockiert und ein immunologischer oder ein LectinNachweis durchgeführt werden. Chelate können ebenfalls als reversible Farbstoffe für geblottete Proteine dienen. Solche Fähigkeit besitzt z.B. der purpurrot gefärbte Chelatkomplex Ferrozin/Ferro-Ion [43], der sich mit den Proteinen verbindet (Abb. 2.15-5). Die Reversibilität der Chelatfärbung erfolgt durch Inkubieren der gefärbten Blotmembran in einer neutralen oder basischen Lösung in Anwesenheit von 20 mmol/1 EDTA, wobei sich die EDTAlonen mit den Ferro-Ionen verbinden und damit den Chelatkomplex zerstören.

\

Ferrozin

Ferro-Ion

Abb. 2.15-5 Schema der Bildung eines Chelatkomplexes zwischen Ferrozin und einem Ferro-Ion.

Transparentmachen der Blotmembranen. Eine Nitrocellulose-Blotmembran kann nach der Färbung transparent werden, ohne daß die gefärbten Banden ihre Farbintensität ändern [44]. Dafür muß die Blotmembran mit einer Monomerlösung getränkt werden, die den gleichen Brechungsindex wie die Nitrocellulose hat. Danach wird das Monomer mit Hilfe eines Photoinitiators und einer UV-Bestrahlung polymerisiert. Die Monomerlösung besteht gewöhnlich aus 2 g/dl Benzoinmethylether in TMPTMA. In einer dunklen Flasche ist sie bei Raumtemperatur für 2 Wochen verwendbar, bei 4-8 °C - längere Zeit. Die Transparenz wird durch folgendes Vorgehen erreicht: • Auf eine PVC-Folie wird 0,3 ml Monomerlösung mit einem Photoinitiator pipettiert und eine getrocknete Nitrocellulose-Blotmembran aufgelegt, um sich mit der Monomerlösung vollzusaugen; • Auf die Blotmembran werden noch einige Tropfen der Monomerlösung pipettiert und eine zweite PVC-Folie daraufgelegt; • Mit einem Fotoroller werden die Luftblasen zwischen der Blotmembran und den PVC-Folien vorsichtig entfernt; • Beide Seiten des entstandenen Sandwiches werden je 15 s mit UV-Licht bestrahlt.

279

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

Problemlösungen Ursachen

Abhilfe

Der Blotsandwich wurde nicht unter Puffer zusammengebaut.

Nach dem Aufbau des Blotsandwiches die Luftblasen mit einem Fotoroller herauswalzen.

Es fließt kein oder zu wenig Strom. Die elektrische Leistung ist zu hoch.

Eine der Steckverbindungen hat keinen oder schlechten Kontakt. Der elektrische Strom fließt um den Blotsandwich herum.

Alle Steckverbindungen überprüfen.

Die elektrische Spannung steigt während des Blottens an. Der Blotter wird während des Blotting heiß.

Zwischen den Elektrodenplatten und den Filterpapieren gibt es Gasbläschen. Die Stromstärke ist zu hoch.

Probleme Vor dem Blotten Es gibt Luftblasen zwischen den Filterpapieren.

Während des Blottens

Die Filterpapiere und die Blotmembran auf die Gelgröße zuschneiden. Die Kathodenplatte mit einem Gewicht von 1-2 kg beschweren, damit die Gasbläschen seitlich entweichen. In der Regel bei 0,8-1,0 m A/cm2 blotten.

Nach dem Blotten Es ist kein Transfer auf der Blotmembran festzustellen.

Die Elektroden waren falsch gepolt.

Der Transfer ist unvollständig.

Die Transferzeit war zu kurz.

Der Transfer ist unregelmäßig.

Das Blotmuster sieht schlecht aus.

Die Proteine haben das Gel verlassen, sind aber nicht auf der Blotmembran zu finden. Starker Hintergrund der Blotmembran.

Der elektrische Strom floß am Blotsandwich vorbei. Der Stromfluß war unregelmäßig, weil die Elektrodenplatten trocken waren. Es gab Luftblasen im Blotsandwich. Das Polyacrylamidgel ist während des Blottens gequollen. Die niedermolekularen Peptide sind beim Nachweis ausgewaschen worden. Das Blockieren war ineffektiv. Es sind Kreuzreaktionen mit dem Blockierreagenz aufgetreten.

In einem basischen Puffersystem in Anodenrichtung blotten, in einem sauren Puffersystem in Kathodenrichtung. Bei dickeren oder konzentrierten Gelen die Blotzeit verlängern. Die Blotmembran und Filterpapiere auf die Gelgröße zuschneiden. Vor dem Blotten die Elektrodenplatten mit dest. Wasser gleichmäßig befeuchten. Vor dem Blotten die Luftblasen mit einem Fotoroller aus dem Blotsandwich herauswalzen. 20 ml/dl Methanol zum Transferpuffer zugeben. Den Farbstoff in einer Fixierlösung lösen. Beim Verwenden einer Nylonmembran kann die Fixierlösung Glutardialdehyd enthalten. Länger blockieren oder höhere Temperatur verwenden (37 °C). Ein anderes Blockierreagenz einsetzen, z.B. Fischgelatine oder Magermilch.

280

2 Elektrophorese der Proteine

Literatur [1] Towbin H, Staehelin T, Gordon J, Proc NatAcadSci USA, 76, 4350 (1979) [2] Gershoni JM, Palade GE, Anal Biochem, 131, l (1983) [3J Hansen JS, Heegaard PMH, Jensen SP, Norgaard-Pedersen B, Bog-Hansen TC, Electrophoresis, 9, 273 (1988) [4] Erlich HA, Levinson JR, Cohen SN, McDevitt HO,JBiol Chem, 254, 254 (1979) [5] Handmann E, Jarvis HM, JImmunol Methods, 83, 113 (1985) [6] Montelaro RC, Electrophoresis, 8, 432 (1987) [7] Pluskai MB, Przekop MB, Kavonian MR, Vecoli C, Hicks DA, BioTechniques, 4, 272 (1986) [8] Reigh JA, Klein OC,Appl Theor Electrophoresis, l, 59 (1968) [9] Matsudaira P,JBiol Chem, 262, 10035 (1987) [ 10) Gershoni JM, Palade GE, Anal Biochem, 124, 396 (1982) [11J Burnette WN, Anal Biochem, 112, 195 (1981) [12] Reiser J, Wardale J, Eur J Biochem, 114, 569(1981) [13] Aebersold RH, Teplow D, Hood LE, Kent SBH, J Biol Chem, 261, 4229 (1986) [14] Jägersten C, Edström A, Olsson B, Jacobson G, Electrophoresis, 9, 662 (1988) [15] Nishizawa H, Murakami A, Hayashi N, lida M, Abe YI, Electrophoresis, 6, 349 (1985) [16] Kinzkofer-Peresch A, Patestos NP, Fauth M, Kegel F, Zok R, Radola BJ, Electrophoresis, 9, 497 (1988) [17] Bittner M, Kupferer P, Morris CF, Anal Biochem, 102, 459 (1980) [18] Reiser J, Stark GR, Methods Enzymol, 96, 205 (1983) [19] Kyhse-Andersen),J Biochem Biophys Methods, 10,203 (1984) [20] Tovey ER , Baldo BA, Electrophoresis, 8, 384 (1987) [21] Michov BM, Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines TRJS-Formiat-Taurinat-Puffersystems und daßir geeignete homogene Elektrophoreseplatten, Deutsches Patent, 4127546, 20.08.1991 [22] Lee SL, Stevens J, Wang WW, Lanzillo JJ, BioTechniques, 17, 60 (1994) [23] McLellan T, Ramshaw JA, Biochem Genetics, 19, 647 (1981) [24] Sack J, Rohringer R, Anal Biochem, 171, 310 (1988) [25] Karcher D, Lowenthal A, Thormar H, Noppe M, J Immunol Methods, 43, 175 (1981) [26] Holmquist L, Electrophoresis, 9, 511 (1988) [27] Renart J, Reiser J, Stark GR, Proc NatAcadSci USA, 76. 3116 (1979) [28] Kuisley KA, Rodkey LS, Electrophoresis, 9, 183 (1988) [29] Huang CM, Kraft HG, Gregg RE, Clin Chem, 37, 576 (1991) [30] Taketa K, Electrophoresis, 8, 409 (1987)

2.15 Blotting der Proteine - Western Blotting

281

[31] Blake MS, Johnston KH, Russell-Jones GJ, Anal Biochem, 136, 175 (1984) [32] Pätsch-Schneider L, Klein H, Electrophoresis, 9, 602 (1988) [33] Brada D, Roth J, Anal Biochem, 142, 79 (1984) [34] Moeremans M, Daneels G, Van Dijck A, Langanger G, De Mey J, J Immunol Methods, 74, 353 (1984) [35] Hsu S-M, Raine L, Fanger H, J Histochem Cytochem, 29, 577 (1981) [36] Rohringer R, Halden DC, Anal Biochem, 144, 118 (1985) [37] Eisenberg RJ, J Virol, 60, 157(1986) [38] Bayer EA, Ben-HurH, Wilchek M, Anal Biochem, 161, 123 (1987) [39] Salinovich O, Montelaro RC, Anal Biochem, 156, 341 (1986) [40] Moeremans M, Daneels G, De Mey J, Anal Biochem, 145, 315 (1985) [41] Hanckock K, Tsang VCW, Anal Biochem, 133, 157 (1983) [42] Westermeier R, Elektrophorese-Praktikum, VCH, Weinheim - New York - Basel - Cambridge, S. 195(1990) [43] Patton WF, Lam L, Su Q, Lui M, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Anal Biochem, 220, 324 (1994) [44] Pharmacia LKB Development Technique File No. 230. PhastSystem (1989)

2.16 Fertiggele und -kits fur Protein-Elektrophorese Die Herstellung von Fertiggelen und Fertigkits ist ein Trend in der Entwicklung der Elektrophorese (Kap. 4.2). Am meistens sind die Agarose- und Polyacrylamid-Fertiggele verbreitet. Außerdem sind Acetylcellulose-Fertigkits erhältlich.

2.16.1 Fertigkits für Acetylcellulose-Zonenelektrophorese Die Acetylcellulose-Fertigkits (ELPHO, Nürnberg; SEBIA, Issy-les-Moulineaux; Helena, Beaumont, Tx.; u.a.) werden für die Acetylcellulose-Zonenelektrophorese (Kap. 2.1.1) zur Trennung von Serum-, Liquor- und Urinproteinen verwendet. Ein Acetylcellulose-Fertigkit (ELPHO, Nürnberg) ist zur Untersuchung von 500 Proben geeignet. Es enthält 50 Acetylcellulose-Folien und einen nichttoxischen Puffer ohne Barbitursäure. Außerdem beinhaltet das Kit Lösungen zum Färben und Transparentmachen der Acetylcellulose-Folien sowie Glasplatten und Filterpapiere.

2.16.2 Agarose-Fertiggele und -kits Die Agarose-Fertiggele haben unterschiedliche Maße, aber fast immer die gleiche Dicke von 0,5 mm. Sie und die Agarosegel-Fertigkits werden am häufigsten für die klinische Diagnostik verwendet. Mit den Agarosegelen wird eine fast doppelt so hohe elektrophoretische Auflösung als bei der Acetylcellulose-Zonenelektrophorese erreicht. Außerdem werden sie für unterschiedliche spezielle Probleme benutzt, z.B. zur Trennung von Hämoglobinen und von den Isoenzymen der Kreatin-Kinase, der LactatDehydrogenase und der alkalischen Phosphatase.

Fertiggele und -kits für Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine Die Fertiggele und Fertigkits für die Agarosegel-Zonenelektrophorese der Proteine werden am häufigsten zur Trennung von Serum-, Liquor- und Urinproteinen verwendet. Die Agarosegel-Zonenelektrophorese wird in der Regel mit gebogenen Agarosegelen in Beckman- oder Sebia-Kammern durchgeführt, womit direkter Kontakt zwischen dem Gel und den Elektrodenpuffern geschaffen wird. Seltener werden sie in flachen Kammern eingesetzt. Ein Agarosegel-Kit (Beckman, Fullerton, Ca; SEBIA, Issy-les-Moulineaux; Helena, Beaumont, Tx.; ELPHO, Nürnberg) ist zur Untersuchung von 100 Proben vorgesehen. Die Proben werden mit Applikationsschablonen aufgetragen. Außer mit Elektrodenpuffern kann die Agarosegel-Zonenelektrophorese mit Papierelektrodenstreifen durchgeführt werden (ELPHO, Nürnberg).

2.16 Fertiggele und Fertigkits für Protein-Elektrophorese

283

Ein Agarosegel-Kit enthält 10 Agarosegele auf Haftfolie, Elektrodenpuffer (der Elektrodenpuffer von ELPHO, Nürnberg ist barbitursäurefrei), Fixierlösung, Färbelösung, Entfärbelösung, Applikationsschablonen und Filterpapiere. Die Maße der Agarosegele sind 77 100 mm, 80 100 mm oder 85 100 mm, die Konzentration der Agarose 0,5-1,0 g/dl.

Fertiggele und -kits fur Immunfixation und Affinitätselektrophorese Fertiggele und Fertigkits für Immunfixations-Elektrophorese der Proteine sind bei Beckman, Fullerton, Ca.; Immuno, Wien; und SEBIA, Issy-les-Moulineaux erhältlich. Sie sind für 10 Patienten bestimmt, bei denen alle Serumproteine und die Immunglobuline G, A und M sowie ihre leichte Ketten ( und ) analysiert werden können. Eine Art der Affinitätselektrophorese ist die Lectin-Elektrophorese der Proteine. Sie ist zur Trennung von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase vorgesehen. Fertiggele und Fertigkits für Lectin-Elektrophorese werden von SEBIA, Issy-les-Moulineaux und ELPHO, Nürnberg angeboten. Ein Fertigkit ist zur Untersuchung von 100 Proben bestimmt. Das Kit von ELPHO, Nürnberg besteht aus 10 Agarosegelen auf Haftfolien, Elektrodenpuffer, Substratlösungen zum enzymatischen Nachweis der Isoenzyme, Probenpuffer, Applikationsschablonen und Filterpapieren. Der Puffer in den Agarosegelen und der Elektrodenpuffer ist nichttoxisch und enthält keine Barbitursäure. Die Agarosegele lassen sich in der Regel nicht rehydratisieren, obwohl dies nicht ausgeschlossen ist [1]. Im nassen Zustand sollten sie bei 4 °C gelagert werden und sind unter diesen Bedingungen monatelang verwendbar. Die Agarose-Fertiggele dürfen nicht eingefroren werden, da sie schrumpfen.

2.16.3 Polyacrylamid-Fertiggele und -kits Die Polyacrylamidgele, die auf Haftfolie (Pharmacia Biotech, Uppsala; ELPHO, Nürnberg; SERVA, Heidelberg u.a.) oder Haftnetz (ELPHO, Nürnberg) gegossen sind, können im feuchten oder trockenen Zustand gelagert werden. Die feuchten Gele sind in der Regel 0,5 mm dick. Die feuchten Polyacrylamidgele von ELPHO, Nürnberg befinden sich zwischen zwei Polyesterfolien (Haft- und Deckfolie) und sind in Polyethylenumschlägen verpackt. Bei 4 °C können sie monatelang gelagert werden, unabhängig davon, ob sie für die Zonenelektrophorese, Disk-Elektrophorese, SDS-Elektrophorese oder isoelektrische Fokussierung bestimmt sind. Ein Fertiggel besteht aus einem Sammel- und einem Trenngel oder enthält kein Sammelgel (Abb. 2.16-1). Das Trenngel kann unterschiedliche Polyacrylamidkonzentration (7) haben - von 8 bis 18 g/dl.

284

2 Elektrophorese der Proteine

Kathodenstreifen

Applikationsschablone Gel

Haftfolie oder Haftnetz

•^.•^^^^^^^^"j^

Anodenstreifen Abb. 2.16-1 Schema eines homogenen Fertiggels ohne Sammelgel.

Fertiggele und -kits für Disk-Elektrophorese der Proteine Die Fertiggele für die Disk-Elektrophorese der Proteine werden mit Puffern getränkten Papierelektrodenstreifen geliefert (ELPHO, Nürnberg). Sie sind auf Folie oder Netz gegossen, in Maßen von 77 100, 80 100, 85 100, 124 124, 124 200 und 124 255 mm und haben eine Konzentration von T = 9, 11, 13, 15 und 17 g/dl. PolyacrylamidFertiggele gibt es ebenso in Fertigkits, die zusätzlich Fertiglösungen zum Nachweis der Proteine enthalten (ELPHO, Nürnberg; SEBIA, Issy-les-Moulineaux). Das Verhältnis der -Konzentration der Fertiggele zu den relativen Molekülmassen Mr von nativen und SDS-behandelten Proteinen ist in Abb. 2.16-2 und Tab. 2.16-1 dargestellt. M · 10S ' 10

Native Elektrophorese

5

7

9

11

13

15

17

19 21

23 25 T, g/dl

Abb. 2.16-2 Verhältnis der Polyacrylamidkonzentration von Fertiggelen zu den relativen Molekülmassen MT der Proteine.

2.16 Fertiggele und Fertigkits für Protein-Elektrophorese

285

Tab. 2.16-1 Polyacrylamidkonzentrationen, die zur Trennung von Proteinen mit unterschiedlichen Molekülmassen verwendet werden. Polyacrylamidkonzentration T, g/dl 9 11 13 15 17

Mr bei Nativ-Elektrophorese 350-600· 103 300-450· 103 200-400 103 150-300-1 03 100-250-1 03

Mr bei SDS-Elektrophorese 150-300- 103 1 20-250· 103 100-200-1 03 50-150- 103 5-100 103

Neben feuchten Fertiggelen sind auch CleanGele erhältlich (Pharmacia Biotech, Uppsala). Die CleanGele stellen rehydratisierbare Homogengele dar, mit einem Sammelgel mit T= 5 g/dl und einem Trenngel mit T= 10 g/dl. Die CleanGele können in einem nativen oder SDS-Puffer rehydratisiert werden. Bei -20 °C können sie praktisch unbegrenzt lange aufbewahrt werden.

Fertiggele und -kits fiir SDS-Disk-Elektrophorese der Proteine Die Fertiggele und Fertigkits für die SDS-Disk-Elektrophorese der Proteine von ELPHO, Nürnberg sind 0,5 mm dick und auf Folie oder Netz gegossen [2]. Sie liegen zwischen zwei Polyesterfolien, wobei die obere (Deckfolie) locker mit dem Gel verbunden ist. Die Deckfolie muß entfernt werden, damit vor der Elektrophorese eine Applikationsschablone auf das Fertiggel gelegt werden kann. Die netzgestützten SDSFlachgele sind für das Elektroblotten geeignet. Diese Gele sind in unterschiedlichen Maßen erhältlich: 77 100, 80 100, 85 100, 124 124, 124 200 und 124 255 mm. ELPHO, Nürnberg liefert außerdem Fertigkits für SDS-Elektrophorese für die klinische Diagnostik. Ein Kit enthält 10 Gele, Elektrodenpuffer und Färbelösungen. Die Gele sind für 100 Proben vorgesehen und werden in folgenden Maßen hergestellt: 77 100, 80 100 und 85 100 mm. -RAD, Hercules, Ca. stellt SDS-Fertiggele für die Vertikalelektrophorese in ihrer elektrophoretischen Kammer Mini-Protean II her. Sie haben die Maße 80 100 l mm, enthalten einen TRIS-Glycinat- oder einen TRIS-TRICINat-Puffer und sind homogene (T= 7,5, 10, 12 und 15 g/dl) oder Gradientengele (T= 4-20 oder 10-20 g/dl). Pharmacia Biotech, Uppsala bietet homogene und Gradientengele für die SDSElektrophorese an. Die homogenen Gele haben Trenngele mit T= 7,5, 12,5 oder 15 g/dl, die Gradientengele - Trenngele mit T = 8-18 oder 12-14 g/dl. Die Gradientengele mit T = 8-18 g/dl werden unter den Namen ExcelGele angeboten. Sie sind 0,5 mm dick, enthalten ein TRIS-Acetat-TRJCINat-Puffersystem [3] und bestehen aus einem Sammelund einem Trenngel (Kap. 2.7.2). Der Kontakt zum Gel wird durch puffergetränkte Gelelektrodenstreifen übertragen.

286

2 Elektrophorese der Proteine

Fertiggele und -kits für isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten Polyacrylamid-Fertiggele für die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten werden von SERVA, Heidelberg, Pharmacia Biotech, Uppsala; ELPHO, Nürnberg u.a. hergestellt. Sie sind 0,15-0,30-0,50 mm dick. Ihre Gesamtpolyacrylamidkonzentration T beträgt 5 g/dl bei einem Vernetzungsgrad C von 0,03. Die Fertiggele für die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten werden auf Haftfolie oder Haftnetz gegossen. Die Netzgele (ELPHO, Nürnberg) sind zum Blotten geeignet. Die Polyacrylamid-Fertiggele und -kits für die isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten von ELPHO, Nürnberg werden zur Bildung linearer pH-Gradienten in den pH-Bereichen 3-10, 4-6, 5-8, 7-9 (Abb. 2.16-3) u.a. verwendet. Sie liegen zwischen zwei Polyesterfolien. Die obere Folie ist locker mit dem Gel verbunden. Sie muß entfernt werden, damit vor der isoelektrischen Fokussierung eine Applikationsschablone auf das Fertiggel gelegt werden kann. Die Maße ihrer Haftfolien sind : 77 100, 80 100, 85 100, 124 124, 124 200 und 124 255 mm. Die Gele werden mit Papierelektrodenstreifen geliefert, die die entsprechenden Anodenund Kathodenlösungen enthalten.

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

Abb. 2.16-3 pH-Gradienten, die mit Fertiggelen abgedeckt werden können.

Die IEF-Fertiggele für das PhastSystem (Kap. 1.6.8) sind für die pH-Bereiche 3-9, 4-6,6 und 5-8 geeignet.

Fertiggele und -kits fiir isoelektrische Fokussierung mit Immobilinen Die Immobilin-Fertiggele und -kits von ELPHO, Nürnberg sind für die isoelektrische Fokussierung mit Immobilinen geeignet. Sie sind 0,5 mm dicke auf Folie oder Netz gegossene Gele und werden mit Papierelektrodenstreifen geliefert. Die ImmobilinFertiggele sind für die pH-Bereiche 4-10, 4-7, 7-10 und 5-6 bestimmt und sind in folgenden Maßen erhältlich: 77 100, 80 100, 85 100, 124 124, 124 200 und 124x255 mm. Pharmacia Biotech, Uppsala liefert Immobiline-DryPlates: getrocknete Gele, die immobilisierte pH-Gradienten enthalten und mit Wasser wieder feucht gemacht werden müssen. Es gibt Immobiline-DryPlates zur Herstellung von den pH-Gradienten: 4,0-7,0, 4,2-4,9, 4,5-5,4, 5,0-6,0 und 5,6-6,6. Es sind auch Immobiline-DryStrips erhältlich, die für die pH-Gradienten 3,0-10,0, 3,0-10,5 und 4,0-7,0 geeignet sind.

287

2.16 Fertiggele und Fertigkits fiir Protein-Elektrophorese

Fertigkits fur Blotting der Proteine ELPHO, Nürnberg stellt Fertigkits von Blotpapieren mit Puffern und Blotmembranen für Elektroblotting her. Die Blotkits sind für Gele mit den Maßen 124 124, 124 200 und 124 255 mm lieferbar. Kammern für Fertiggele. Die Kammern, die für Fertiggele geeignet sind, sind in Tab. 2.16-2 angegeben. Tab. 2.16-2 Kammern für Fertiggele. Kammern

Maße der Folien (des Netzes) 77 (80, 85)

100 mm

124

124 mm

124

200 mm

124x255 mm

Beckman; Sebia K-20; Idea Sei. Mini-Slab; Biometra Mini-Focus; -RAD Mini-Protean II Desaphor HE & HF; Multiphor & Ultrophor; Resolute HMP; Servaphor; -RAD Bio-Phoresis Desaphor HE & HF; Multiphor & Ultrophor; Pharmacia FBE Immuno, Servaphor Desaphor HE & HF; Multiphor & Ultrophor; Resolute HMP; Servaphor; -RAD Bio-Phoresis; Pharmacia FBE Immuno

Problemlösungen Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Monomerlösung polymerisiert nicht oder das Polyacrylamidgel wird weich und klebrig.

Die Konzentration von Acrylamid oder BIS in der Monomerlösung ist zu niedrig.

Die Rezeptur für das Gelgießen überprüfen.

Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu gering. Die APS-Lösung ist zu alt oder unsachgemäß gelagert.

Pro l ml Monomerlösung 5 10 ml/dl TMEDA und 5 10 g/dl APS verwenden. Eine neue APS-Lösung verwenden. Ihre maximale Lagerdauer im Kühlschrank beträgt 2 Wochen. Das Gel im Trocken- oder Brutschrank bei 37 °C polymerisieren. Rehydratisierbare Gele verwenden. Das Rehydratisieren mit trägerampholytenhahiger Lösung durchführen.

Die Temperatur ist zu niedrig. Eine hohe Konzentration von Trägerampholyten (über 3 g/dl) hemmt den Polymerisationsprozeß. Die Konzentration des Luftsauerstoffs war in der Monomerlösung zu hoch.

Die Monomerlösung mit einer Wasserstrahlpumpe entlüften.

288

2 Elektrophorese der Proteine

Probleme

Ursachen

Abhilfe

Die Geloberkante ist klebrig und löst sich von der Haftfolie. Das Gel polymerisiert zu schnell.

Der Luftsauerstoff hat die Polymerisation der Geloberkante inhibiert. Die Konzentration von TMEDA oder APS in der Monomerlösung war zu hoch. Die Raumtemperatur war zu hoch. Es gab gelöste Luft in der Monomerlösung, die bei der Gelpolymerisierung entweichte. Die Glasplatte, die mit der Monomerlösung in Berührung kam, war unsauber. Die Haftfolie war unsauber.

Nach dem Gießen die Geloberkante des Gels mit dest. Wasser überschichten. Die Rezeptur für das Gelgießen überprüfen.

Es gibt Luftblasen im Polyacrylamid- oder Agarosegel.

Die Konsistenz des Agarosegels ist ungenügend.

Die Glasplatten waren zu kalt das Agarosegel erstarrte beim Gießen. Die Agarose-Konzentration ist zu niedrig. Die Gelierzeit war zu kurz.

Der Harnstoff verändert die Agarosestruktur. Das Gel löst sich von der Haßfolie.

Das Gel haftet nicht an der Haftfolie, sondern an der Glasplatte.

Eine falsche Haftfolie wurde verwendet. Das Gel wurde auf die falsche Seite der Haftfolie gegossen. Der Monomerlösung enthielt hohe Konzentration von Trägerampholyten (über 3 g/dl) oder nichtionische Detergenzien (Nonidet NP-40, Triton X-100). Die Haftfolie wurde falsch oder zu lange gelagert. Die Glasplatte war zu hydrophil. Das Gel war zu lange in der Gießkassette.

Das Gel bei 20-25 °C gießen. Die Monomerlösung entgasen.

Vor der Benutzung die Glasplatte waschen. Die hydrophile Seite der Folie nicht mit Fingern berühren. Die Temperatur der Glasplatten soll beim Gießen 60-70 °C betragen. Die Rezeptur überprüfen.

Das Gelieren muß mindestens 60 min bei Raumtemperatur oder besser über Nacht dauern. Höhere Agarosekonzentration verwenden (z.B. 2 g/dl) und längere Zeit gelieren lassen. Die Haftfolien für Polyacrylamidgele und für Agarosegele nicht vertauschen. Das Gel nur auf die hydrophile Seite der Haftfolie gießen, vorher mit Wassertropfen die Seite überprüfen. Rehydratisierbare Gele verwenden. Das Rehydratisierung mit Trägerampholyten- oder Detergens-haltigen Lösungen durchführen. Die Haftfolien bei Raumtemperatur und im Dunkeln aufbewahren. Die Glasplatte reinigen und mit RepelSilan beschichten. Spätestens l h nach der Polymerisation das Gel aus der Gießkassette entnehmen.

2.16 Fertiggele und Fertigkits für Protein-Elektrophorese

Literatur (1] Gombocz E, Chrambach A, Appl Theoret Electrophoresis, l, 109 (1989) [2] Michov BM, GJTFachzLab, 7, 746 (1992) [3] Schägger H, Jagow G, Anal Biochem, 166, 368 (1987)

289

2.17 Klinische Anwendungen der ProteinElektrophorese Unmittelbar nach ihrer Entdeckung wurde die Elektrophorese ein wichtiger Bestandteil der klinischen Diagnostik. Heute gibt es zahlreiche elektrophoretische Methoden zur routinemäßigen Untersuchung aller menschlichen Flüssigkeiten, z.B. des Serums, Liquors und Urins.

2.17.1 Serumprotein-Elektrophorese Die klinische Bedeutung der Serumprotein-Elektrophorese besteht darin, Konzentrationsänderungen der Proteine festzustellen, welche im Verlauf unterschiedlicher Erkrankungen auftreten. Die Abweichungen vom "normalen" Serum-Pherogramm entweder in Form zusätzlicher bzw. fehlender Proteine oder als Erhöhung bzw. Senkung der Konzentration normal vorkommender Proteine weisen auf die Notwendigkeit spezieller Proteinuntersuchungen hin. Es ist auch möglich, durch die Serumprotein-Elektrophorese bestimmte Erkrankungen direkt zu diagnostizieren, z.B. manche genetische Defekte wie Bisalbuminämie und Hypogammaglobulinämie. Bei parallelen elektrophoretischen Untersuchungen vom Serum, Liquor und Urin können auch polyklonale Gammopathien bei Hepatitis und anderen Infektionskrankheiten oder monoklonale Gammopathien festgestellt werden, z.B. das multiple Myelom und die Waldenströmsche Makroglobulinämie. Außerdem sind viele der Serumproteine Akutphase-Proteine, d.h. Proteine, deren Konzentration sich während einer akuten Entzündung erhöht. Heute werden die Serumproteine routinemäßig durch die Acetylcellulose-Zonenelektrophorese (Kap. 2.1.1) und durch die Agarosegel-Zonenelektrophorese (Kap. 2.2) in fünf Hauptfraktionen (Hauptbanden) getrennt: Albumin, Alphaj-, Alpha2~, Beta- und Gamma-Globuline. Die Hauptfraktionen enthalten unterschiedliche Proteine (Abb. 2.17-1), wobei die meisten von ihnen Glykoproteine sind, nur wenige sind Lipoproteine. Das Verhältnis zwischen den Massenkonzentrationen des Albumins und den Globulinen beträgt normal 1,5-3 : 1.

Albumin Das Albumin ist nicht nur die schnellste Hauptfraktion der Serumproteine, sondern mit 60-70 % der gesamten Proteinkonzentration die größte. Es wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert. Seine relative Molekülmasse ist ca. 69 000, sein isoelektrischer Punkt liegt bei pH = 4,9. Das Albumin hat zwei Hauptfunktionen: 1. Es bestimmt den kolloidosmotischen Druck im Blut und reguliert dadurch den Wasseraustausch zwischen dem Blut und der interzellulären Flüssigkeit; 2. Es transportiert unterschiedliche Stoffe wie freie Fettsäuren, Hormone, Pigmente sowie Medikamente.

291

2.17 Klinische Anwendungen der Protein-Elektrophorese

· 109 m 2 /(sV)

Sedimentations konstante S

Abb. 2.17-1 Normale Serumproteine ohne die Lipoproteine [1]. Modif. I. Transthyretin (Präalbumin); 2. Albumin; 3. a1M-Glykoprotein; 4. Prothrombin; 5. ,-Antitrypsin; 6. ,-saures Glykoprotein; 7. a,T-Glykoprotein (Tryptophan-armesa,-Glykoprotein); 8. a1B-Glykoprotein (leicht präzipitierendes ,-Glykoprotcin); 9. Tyroxin-bindendes Globulin; 10. a,-a2-Antitrypsin; I I . -23,69 · ΙΟ·9

-13 · ΙΟ"9 «Tauri„= = -24,17· ΚΓ9 und -13 · ΙΟ"9 a

Glyc,„=

- = 0.46. -28,51 · ΙΟ"9

Entsprechend der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung sollte das Glycin bei pH = 9,49, das Taurin bei pH = 8,91 und die Bors ure bei pH = 9,11 gel st sein, um ihre Ionen den Proteinen folgen zu k nnen. 2.8 Die Pufferkapazit t eines Puffers h ngt von seiner Konzentration und dem pK- Wert der zu puffernden Substanz ab (Kap. 1.2.2): je h her ihre Konzentration ist und je n her sich ihr pAT-Wert am pH-Wert des Puffers befindet, desto h her ist die Pufferkapazit t. In dieser Aufgabe ist die Konzentration aller Puffer gleich, also die Pufferkapazit t h ngt nur vom ρΑΓ-Wert ab. Von den gegebenen Elektrolyten haben die Base TRIS und die S ure ACES p T-Werte, die am n chsten zu pH = 7,0 liegen. Also, ein TRIS-ACESat-Puffer h tte die h chste Pufferkapazit t. 2.9 Wenn der Dissoziationsgrad von TRIS Oj und Glycin aHG gleich α sind, ergibt sich aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung, da

l-α α pH = ρλ:ΗΤ+ + log - = pKHG + log - . α l-α Also, ρΚΗΎ+ - ρλ'ΗΟ

( l - α) ( l - α)

10

α2 d.h. α = 0,8188 und pH = 8,93. 2. 10 Es folgt aus der Debye-H ckelschen Gleichung (1.2-5), da

0,0 11/2 = 8 07 + ' -- = 8'16 und

0,01 1/2 9 78

= >

1+0,0 1l/2

d.h. aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung (1.2-2) ergibt sich, da

Lösung der Aufgaben

393

= (l + 10 PH-P*"')'1 = (l + 10 8.30-8,16)-! = Q42Q.

und ttHG = (l + 10 P^-PH)-1 = (l + 10 9,69-8,30)-! = 0 039 Also,

0,01 TRIS -

0,420

und

0,01 CHG = - = 0,256 mol/1. 0,039

Lösung der Aufgaben 3 3.1 Die relative Molekülmasse Mr eines Mononukleotidrestes beträgt ca. 314, näherungsweise kann man aber mit 330 rechnen. Dies bedeutet, daß zwei Mononukleotidreste (ein Paar) eine relative Molekülmasse von ca. 660 haben. Deswegen enthält eine Doppelhelix-DNA mitA/ r von 2-106

2 · 106 - * 3 000 2 330 und eine Doppelhelix-DNA mit A/r von 2 107

2 · 107

30 000 2 · 330 Basenpaare. 3.2 Ein Mononukleotidrest trägt eine negative Ladung. Die relative Molekülmasse eines Mononukleotidrestes ist ca. 330. Daraus ergibt sich, daß eine einsträngige RNA mit Mr von 4· 104

4 10" - * 120 330 Ladungen hat und eine einsträngige RNA mit MT von 4· 105

4 105 - * l 200 330 Ladungen. 3.3 Wenn eine DNA vorwiegend AT-Paare enthält, schmilzt sie bei einer niedrigeren Temperatur (70 °C), weil sich zwischen A und T zwei Wasserstoffbrücken bilden; wenn eine DNA aus

394

Anhang vorwiegend GC-Paaren besteht, schmilzt sie bei einer höheren Temperatur (90 °C), weil zwischen G und C drei Wasserstoffbindungen vorliegen.

3.4 Die Gleichung, die das Verhältnis zwischen der Mobilität einer DNA und der Agarose-Konzentration ausdrückt, ist folgende:

bzw. log

= log

0

- KRc.

3.5 Die Geschwindigkeit der DNA-Fragmente verlangsamt sich bei der Anwesenheit von Ethidiumbromid im Gel um ca. 15 %, weil es sich zwischen die Basen einlagert und damit die Masse der DNA vergrößert. 3.6 Bis vor kurzem gab es zwei Methoden für eine DNA-Sequenzierung: durch chemische Spaltung endmarkierter DNA und durch die Kettenabbruchmethode über Einbau von Didesoxynukleotiden. Diese Sequenzierungsmethoden erfordern aber relativ große DNA-Mengen. Die PolymeraseKettenreaktion (PCR) ist eine hocheffiziente Methode zur gezielten Vermehrung von Nukleinsäuren (PCR-Produkten), die später für eine anschließende Sequenzierung, z.B. durch Elektrophorese, geeignet sind (Kap. 3.3.1). Die PCR-Methode benötigt nur kleinste Mengen eines biologischen Materials. Die Sequenz des Templates für das Design der PCR-Primer muß aber zumindest teilweise bekannt sein. Dies stellt eine gewisse Einschränkung gegenüber der klassischen Klonierung von unbekannten DNA-Fragmenten dar. 3.7 Es ist bekannt (Kap. 1.4), daß die Mobilität der DNA

E

d/t

dl

U/l

tU

wobei V DNA (in m/s) die Geschwindigkeit der nativen DNA, E (in V/m) die Stärke des elektrischen Feldes, d (in m) der Abstand zwischen den Elektroden, / (in s) die Zeit, U (in V) die elektrische Spannung und / (in m) die Laufstrecke ist. Bei unserem Beispiel ist d = 0,127 m, / = 0,1 m, t = 3600 s und U = 250 V. Deswegen ergibt sich aus der obigen Gleichung, daß 0,127-0,1 = 14,1 ·

"9 m2/(s V).

3600 · 250 3.8 Es ist bekannt (Kap. 1.4.7), daß

wobei o-,· der Dissoziationsgrad des TRIS-Ions ist, und ' bzw. seine Mobilität sind. Also,

+ unc

* ^HT+ seine effektive Mobilität

Lösung der Aufgaben

5-

395

9

= 0,2078. 24,06 · l O'9 Aus der Gleichung von Henderson-Hasselbalch (Kap. 1.2.2) folgt, daß l - OT l - 0,2078 pH = p£c + log - = 8, 16 + log - =8,74. OT 0,2078 3.9 Es folgt aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung (Kap. 1.2.2), daß «TRJS = 0 + 10 P"^0)'1 = (l + 10 8.0-8,24)-! = o 635 Also,

C

TRIS

=

0,04 - = 0,063 moiyi. 0,635

Der pH- Wert von 8,0 liegt weit über dem p£c-Wert der Essigsäure, deswegen sind alle ihre Moleküle dissoziiert. Das bedeutet, daß die Konzentration der Essigsäure gleich der lonenstärke ist, also 0,04 mol/1. Damit ergibt sich die Zusammensetzung des Puffers, wie folgt: TRIS 99 % Essigsäure Na2EDTA-2H2O

7,63 g 2,3 1 ml 0,37 g

3. 10 Es folgt aus der Debye-Hückelschen Gleichung (Kap. 1.2. 1), daß

pKMT

0,11/2 = 8,07 + - = 8,3 1 1+0,1 1/2

und

- = 7,20

2.0,1 1 / 2 --

=6,72.

Nach der Gleichung von Henderson-Hasselbalch (Kap. 1.2.2) ist der Dissoziationsgrad des TRIS a

TRis = O + 10 PH-P^)·1 = (l +

7 0 8 31

· ' - )-1 = 0,953

und der Dissoziationsgrad des Dihydrogenphosphat-Ions 2