Elektrophorese auf Papier und anderen Trägern [Reprint 2021 ed.] 9783112546048, 9783112546031

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ELEKTROPHORESE AUF PAPIER UND A N D E R E N TRÄGERN

ELEKTROPHORESE AUF PAPIER UND ANDEREN TRÄGERN

VON

DR. LILLY VÄMOS Zentralforschungsinstitut für Lebensmittelindustrie, Budapest

M I T 65 A B B I L D U N G E N U N D 53 T A B E L L E N

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN 1972 AKADÉMIAI KIADÓ • BUDAPEST 1972

Ungarischer Originaltitel: PAPlRELEKTROFORÄZIS Müszaki Könyvkiadö, Budapest

Durchsicht und Ergänzung der vom Verlag Akademiai Kiadö besorgten Übersetzung DR. HARTMUT NIEDRICH Institut für Pharmakologie •der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin

Akadimiai Kiadö, Budapest 1972 Gemeinschaftsausgabe des Akademie-Verlages GmbH, 108 Berlin, Leipziger Straße 3—4 und des Akademiai Kiadö, Budapest V., Alkotmäny utca 21 Alle Rechte vorbehalten 'Gesamtherstellung: Akademiai Nyomda, Budapest Bestellnummer: 5759 EDV-Nr.: 761 410 6 Printed in Hungary

INHALTSVERZEICHNIS

Vorwort

11

1. Einleitung 1.1. Geschichtliche Übersicht 1.2. Terminologie 1.3. Symbole Literatur

13 14 16 17

2. Theoretische Grundlagen der Papierelektrophorese 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4. 2.1.5. 2.1.6. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.5.

Faktoren, welche die Wanderung von Ionen im elektrischen Feld beeinflussen Der Einfluß der Ladung des Ions auf seine Wanderung Der Einfluß des Dissoziationsgrades der wandernden Substanz und des pH-Wertes des Elektrolytmediums auf die Wanderung Beziehungen zwischen der Diffusionskonstante und der Beweglichkeit des wandernden Partikels Die Wirkung der Ionenstärke des Elektrolytmediums auf die Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens Der Einfluß von Feldstärke, Stromstärke und Zeit auf die Wanderung Die Auswirkung der Temperatur und der Verdunstung auf die Elektrophorese Einige für die Trägerelektrophorese charakteristische Erscheinungen Der Einfluß des Trägermaterials auf die Wanderung Die Auswirkung der Elektroosmose auf die Wanderung des Partikels Der Einfluß der Kapillarströmung auf die Wanderung des Partikels Die Adsorption des wandernden Teilchens an dem Papier Molekularsieb- und Ionenaustauscheffekte bei der Trägerelektrophorese Literatur

19 20 21 24 25 26 28 30 30 35 37 38 38 39

6

INHALTSVERZEICHNIS

3. Die Technik der Papierelektrophorese 3.1. 3.1.1. 3.1.1.1. 3.1.1.2. 3.1.1.3. 3.1.2. 3.1.2.1. 3.1.2.2. 3.1.2.3. 3.1.2.4. 3.1.2.5. 3.1.3. 3.2. 3.2.1. 3.2.1.1. 3.2.1.2. 3.2.1.3. 3.2.1.4. 3.2.1.5. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.3.1. 3.2.3.2. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.3.5.1. 3.3.5.2.

Der feste Träger Das Papier und ähnliche Träger Zellulosepapier Glasfaserpapier Zelluloseacetat-Folien Sonstige organische Träger Agar-Agar Stärke Synthetische Polymere Zellulosepulver Seide Anorganische Träger Literatur Apparaturen und Arbeitsmethoden Diskontinuierliche Verfahren mit niedrigen und mittleren Spannungen • Geräte mit frei hängendem Papierstreifen Geräte mit waagerechtem, frei aufliegendem Papierstreifen Geräte mit waagerechten, zwischen zwei Platten gelagerten Papierstreifen Radialelektrophorese Zweidimensionale Papierelektrophorese Kombination der Papierelektrophorese mit der Papierchromatographie Kontinuierliche Papierelektrophorese Prinzip der kontinuierlichen Elektrophorese Geräte zur kontinuierlichen Papierelektrophorese Sonstige präparative Verfahren Hochspannungs-Papierelektrophorese Die »Crossing«-Papierelektrophorese Literatur Die Ausführung der Arbeitsphasen der Papierelektrophorese . . . Die Vorbereitung der zu trennenden Substanzen Die Vorbereitung des Trägers Hilfsmittel Die Sichtbarmachung der getrennten Substanzen Die quantitative Analyse Bestimmung nach Elution Bestimmung unmittelbar auf dem Papier Literatur

41 41 41 42 42 43 43 44 44 44 45 45 45 48 49 49 53 56 59 59 60 61 61 63 70 71 77 77 80 80 82 82 83 84 84 85 89

INHALTSVERZEICHNIS

7

4. Die Anwendung der Papierelektrophorese 4.1.

Die Papierelektrophorese anorganischer Substanzen

91

4.1.1. 4.1.2. 4.1.2.1. 4.1.2.2. 4.1.2.3. 4.1.2.4.

Allgemeine Grundlagen Trennung von Kationen Trennung der Kationen der I . Gruppe Trennung der Kationen der I I . Gruppe Trennung der Kationen der I I I . Gruppe Papierelektrophoretische Trennung der seltenen Erden und Aktiniden Trennung der Kationen der I V . Gruppe Trennung der Kationen der V. Gruppe Trennung von V-, W-, Nb- und Ta-Ionen Trennung komplexer Kationen Papierelektrophorese von Kationen-Gemischen verschiedener Gruppen Trennung von Anionen Nachweis anorganischer Ionen nach der papierelektrophoretischen Trennung Nachweis von Kationen. Reagenzien und ihre Anwendung Reagenzien zum Nachweis von Anionen Quantitative Bestimmung Literatur Die Papierelektrophorese organischer Substanzen Trennung von Oxy.verbindungen (Alkohole und Phenole) Nachweis der getrennten Substanzen auf dem Papier Literatur Papierelektrophorese von Oxoverbindungen Literatur Trennung von Kohlehydraten und mehrwertigen A l k o h o l e n . . . . Trennung einfacher Zucker Trennung von Oligosacchariden . Trennung von Zuckerderivaten Trennung von Polysacchariden Trennung von mehrwertigen Alkoholen : Nachweis von Kohlehydraten und mehrwertigen Alkoholen Literatur Papierelektrophorese organischer Säuren Nachweis organischer Säuren Literatur Trennung von Triterpenoiden und Steroiden . Nachweis von Steroiden Literatur

91 94 94 95 99

4.1.2.5. 4.1.2.6. 4.1.2.7. 4.1.2.8. 4.1.2.9. 4.1.3.* 4.1.4. 4.1.4.1. 4.1.4.2. 4.1.5. 4.2. 4.2.1. 4.2.1.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.3.1. 4.2.3.2. 4.2.3.3. 4.2.3.4. 4.2.3.5. 4.2.3.6. 4.2.4. 4.2.4.1. 4.2.5. 4.2.5.1.

101 103 105 105 106 110 112 115 116 118 118 118 122 122 126 127 128 128 128 129 130 135 137 138 139 140 141 147 148 148 152 152

8 4.2.6. 4.2.7. 4.2.7.1. 4.2.7.2. 4.2.7.3. 4.2.8. 4.2.8.1. 4.2.8.2.

4.2.8.3. 4.2.8.4. 4.2.8.5. 4.2.8.6. 4.2.8.7. 4.2.8.8. 4.2.8.9. 4.2.8.10. 4.2.9. 4.2.9.1. 4.2.9.2. 4.2.9.3. 4.2.9.4. 4.2.9.5. 4.2.9.6. 4.2.9.7. 4.2.9.8. 4.2.9.9. 4.2.9.10. 4.2.9.11. 4.2.9.12. 4.2.10. 4.2.10.1. 4.2.10.2. 4.2.10.3.

INHALTSVERZEICHNIS Trennung von Schwefelverbindungen Literatur Trennung von Nitroverbindungen und Aminen Trennung von Nitroverbindungen Trennung von Aminen Nachweis der Amine Literatur Trennung von Aminosäuren und Peptiden Trennung von Aminosäuren mittels einfacher Elektrophorese. . Trennung von Aminosäuren durch wiederholte Elektrophorese; zweidimensionale Methoden; Kombination von Papierelektrophorese und Papierchromatographie Trennung von Aminosäuren mittels Hochspannungs-Papierelektrophorese Trennung von Aminosäuren mittels kontinuierlicher Papierelektrophorese Sonstige Trennverfahren für Aminosäuren Trennung von Aminosäurederivaten Nachweis von Aminosäuren Beispiele der Anwendung Trennung von Peptiden; die Fingerprint-Methodo Die papierelektrophoretische Kontrolle der Peptidsynthese . . . Literatur ! Papier elektrophorese von Proteinen Die Ausführung der Trennung Trennung von Serumproteinen Die Anfärbung von Proteinen und ihre quantitative Auswertung Spezielle Probleme der papierelektrophoretischen Untersuchung von Serumproteinen Trennung von Proteinen anderer biologischer Flüssigkeiten Trennung von Zellproteinen Trennung von Hämoglobinen . Trennung von Lipoproteinen Trennung von Glyko- und Mucoproteinen Trennung von Enzymen Trennung von Hormonen Trennung sonstiger tierischer und pflanzlicher Proteine . . . Literatur Trennung von Purinen, Pyrimidinen, Nukleinsäuren und ihren Derivaten Trennung von Purinkörpern und Pyrimidinen Trennung von Nukleosiden und Nukleotiden Trennung von Nukleinsäuren

153 155 155 155 155 158 158 158 159

161 162 168 168 168 170 171 171 175 176 178 179 180 181 185 190 191 192 193 197 199 205 206 206 212 212 213 218

INHALTSVERZEICHNIS 4.2.10.4. Nachweis von Purinen, Pyrimidinen, Nukleinsäuren und ihren Derivaten . Literatur 4.2.11. Trennung der Vitamin-B-Gruppe und verwandter Verbindungen Literatur .' 4.2.12. Trennung sonstiger stickstoffhaltiger, heterocyclischer Verbindungen Literatur . 4.2.13. Papierelektrophorese von Alkaloiden Literatur 4.2.14. Elektrophorese von Antibiotica Literatur 4.2.15. Papierelektrophorese von Farbstoffen Literatur

9

219 219 221 226 227 228 228 232 233 234 234 237

5. Praktikum zur Papierelektrophorese 5.1. 5.1.1.

5.1.2.

5.2.

Beispiele für die praktische Durchführung der Papierelektrophorese Trennung von Aminosäuren in biologischen Flüssigkeiten mittels Kombination der Papierelektrophorese und der Papierchromatographie Trennung und quantitative Bestimmung proteolytischer Enzyme mit milchkoagulierender Wirkung Literatur Hinweise für den Eigenbau von Geräten

239

239 243 246 246

6. Sonstige Methoden der Trägerelektrophorese G.l. 6.2. 6.3. 6.4. 6.4.1. 6.4.2. 6.5. 6.6. 6.6.1.

Mikro- und Ultramikroverfahren Literatur ; Membran-Elektrophorese Literatur Dünnschicht-Elektrophorese Literatur Agargel-Elektrophorese Spezielle Protein-Trennungen Spezielle Nukleinsäure-Trennungen Literatur Immun-Elektrophorese Literatur Stärkegel-Elektrophorese Die praktische Durchführung

249 250 250 257 258 267 268 272 273 275 276 277 277 278

10

INHALTSVERZEICHNIS

6.6.2. 6.6.3. 6.6.4.

Mikromethoden und zweidimensionale Verfahren Anfärbung und quantitative Auswertung Spezielle Beispiele für Protein-Trennungen Literatur 6.7. Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese 6.7.1. Vertikale Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach RAYMOND 6.7.1.1. Der Molekularsiebeffekt 6.7.1.2. Geräte zur Polyacrylamidgel-Elektrophorese 6.7.1.3. Präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese 6.7.2.

Disk-Elektrophorese nach

ORNSTEIN u n d DAVIS

282 284 285 290 291 292 294 294 . . 295 297

6.7.2.1. Die Grundlagen der Disk-Elektrophorese 298 6.7.2.2. Die praktische Durchführung der Disk-Elektrophorese 300 6.7.2.3. Geräte zur analytischen Disk-Elektrophorese und spezielle Techniken 304 306 6.7.2.4. Präparative Disk-Elektrophorese 6.7.3. Nachweis und quantitative Auswertung 309 6.7.4. Anwendung der Polyacrylamidgel-Elektrophorese 312 Literatur 318

7. Bibliographische Hinweise 7.1. Englische und russische Übersetzung einiger wichtiger Fachausdrücke auf dem Gebiete der Papierelektrophorese 321 7.2. Einige Fachbücher über Papierelektrophorese und verwandte Gebiete 322

8. Nachtrag zum Literaturverzeichnis

325

9. Autorenverzeichnis

329

10. Sachverzeichnis

345

VORWORT

Das vorliegende Buch ist eine erweiterte Fassung des 1967 im Müszaki Kiadö (Verlag Technik), Budapest, in ungarischer Sprache erschienenen Werkes »Papirelektroforezis« (Papierelektrophorese). Die deutschsprachige Ausgabe wurde mit neueren Angaben aus der Liter a t u r der Papierelektrophorese ergänzt. Außerdem enthält sie ein zusätzliches Kapitel über einige, in den letzten J a h r e n weitläufig angewandte Elektrophoreseverfahren, wie die Dünnsehicht-, die Stärkegelund die Polyacrylamidgel-Elektrophorese. An dieser Stelle möchte ich folgenden Autoren und Verlagen, die mir freundlicherweise bereits erschienene Abbildungen und Tabellen zur Veröffentlichung überließen, meinen Dank aussprechen: G. Atfield, K . Blau, E . J . Bourne, M. Chemla, R . Consden, J . D. R . Thomas, M. J . Crumpton, A. Dittmer, K . Dose, J . T. Edward, J . E . Ford, J . L. Frahn, J . Franc, G. Franglen, W. Grassmann, D. Gross, J . Halmekoski, C. Hanot, N. Henning, V. Jokl, H . Kutzim, M. Lederer, A. Lözsa, G. B. Marini-Bettölo, R. Markham, H . J . McDonald, W. P . McKinley, H . Michl, Ç. A. Pasternak, H . Peeters, O. Perilä, J . B. Pridham, 2 . Pucar, F . Scheiffarth, P . G. Scheurlen, N. Siliprandi, H . Svensson, H . H . Strain, M. Szwaj, A. Tiselius, C. de Vries, H . E . Wade, Th. Wieland, J . Wilde, F . Wuhrmann, Ch. Wunderly; Acta Chemica Scandinavica, Bulletin des Sociétés Chimiques Belges, Butterworth Legal Medical and Scientific Publishers, Elsevier Publishing Company, Nature Editorial a n d Publishing Offices, Macmillan & Co. Ltd., Royal Swedish Academy of Science (Arkiv förKemi), Sauerländer AG., Science American Association for t h e Advancement of Science, Springer Verlag (Heidelberg), Springer Verlag (Wien), The American Chemical Society, The Biochemical Journal, The Chemical Society, The Rockefeller University Press, The Society for Analytical Chemistry, U r b a n & Schwarzenberg, V E B Gustav Fischer Verlag, Verlag Chemie G m b H , Year Book Medical Publishers, Inc. Endlich möchte ich Herrn Dr. H . Niedrich f ü r die sorgfältige Durchsicht des deutschsprachigen Manuskriptes danken. Budapest, im Sommer 1970

Dr. Lilly

Vâmos

1. EINLEITUNG

1.1. Geschichtliche Übersicht Die Entdeckung des Elektrophorese-Phänomens wird R E U S S [ 1 ] zugeschrieben. Seine 1809 veröffentlichte Arbeit enthält einen Versuch, bei dem die Schenkel eines mit nassem Sand gefüllten U-Rohres an ein galvanisches Element angeschlossen werden. An der positiven Seite entsteht infolge der Wanderung der feinen Sandteilchen oberhalb der Sandschicht eine Trübung der ursprünglich klaren Wasserschicht. Die der Elektrophorese gewidmeten frühen Arbeiten folgten — wenn auch unbewußt — zwei verschiedenen Richtungen. Die sog. »trägerfreie Elektrophorese« (Methode der »beweglichen Grenzflächen« = moving boundaries), bei der sich die Wanderung der elektrisch geladenen Partikel frei in einer Lösung vollzieht, entwickelte sich unabhängig von der »Träger«- oder »Zonen«-Elektrophorese; bei dieser Methode wird das Wanderungsmedium der Teilchen in einen Träger aufgesaugt, d. h. an den Träger gebunden. Interessanterweise befaßt sich der größte Teil der frühen Arbeiten mit der Trägerelektrophorese. Das Verfahren der »freien Elektrophoresen wurde erstmals 1892 von P I C T O N und L I N D N E R zur Trennung von Proteinen angewandt [2]. Im Jahre 1909 baute M I C H A E L I S [3] ein neuartiges Gerät zu diesem Zweck. Das Verfahren wurde jedoch erst durch die Arbeiten und durch das Gerät des Nobelpreisträgers T I S E L I U S in den Jahren 1925 bzw. 1937 [4, 5] zu einer allgemein verbreiteten analytischen Methode. Den ersten Schritt zur Entwicklung der Trägerelektrophorese soll L O D G E gemacht haben, der 1886 die Wanderungsgeschwindigkeiten von Ionen in indikatorhaltiger Gelatine gemessen hatte [6]. M A S S O N und S T E E L E [7, 8] bedienten sich ebenfalls der Gelatine, während W H E T H A M [9] 1895 zur Stabilisierung der elektrophoretischen Wanderungszone Agar verwendete. In der Eiweißanalyse gebrauchten als erste F I E L D und T E A G U E einen mit Agar stabilisierten Elektrolyten [10, 11, 12],

Das Papier erschien als Träger ziemlich spät in der Literatur. Erstmalig wurde es von K Ö N I G 1937 zu Elektrophoresezwecken herangezogen [13], 1939 trennten K Ö N I G und K L O B U S I T Z K Y [14] das gelbe Pigment aus Schlangengift mittels Papierelektrophorese ab und schafften somit die Grundlagen der eiweißanalytischen Anwendung der Methode. Bis zur Veröffentlichung der grundlegenden Arbeit über Papier-

14

1. E I N L E I T U N G

Chromatographie von C O N S D E N , G O K D O N u n d M A R T I N [ 1 5 ] waren n u r vereinzelt Arbeiten zur Elektrophorese erschienen. Der große Erfolg und die schnelle Verbreitung der Papierchromatographie förderten zugleich die Entwicklung der Papierelektrophorese. 1948 wurden die beiden Verfahren von H A U G A A R D und W I E L A N D zur zweidimensionalen Trennung von Aminosäure- u n d Peptidgemischen kombiniert [16, 17, 18]. Die Anwendung der Papierelektrophorese zur Trennung makromolekularer Substanzen verbreitete sich seit 1950 durch die Arbeiten v o n C R E M E R u n d TISELITJS, D U R R U M , M C D O N A L D , GRASSMANN,

HAN-

NIG und anderen Autoren [19, 20, 21, 22], Im weiteren entwickelte sich die Trägerelektrophorese besonders hinsichtlich ihrer technischen Vervollkommnung. Auf diesem Gebiete sind die kontinuierlichen elektrophoretischen Verfahren von HAUG A A R D , G R A S S M A N N und S V E N S S O N [ 2 3 , 2 4 , 2 5 ] sowie die von M I C H L [26] eingeführte Hochspannungselektrophorese von hervorragender Bedeutung. Parallel zu diesen Verfahren wurden ständig neuere Trägermaterialien entwickelt, welche sich mehr oder minder bewährten, so z. B. Agargel [27], Stärkegel [28], Kieselgel [29, 30], Asbestfaser [31], Baumwolle [32], feingemahlene Glaswolle u n d Glasfaserpapier [33, 34] sowie das in der Literatur der letzten J a h r e zweifellos am meisten verbreitete Polyacrylamidgel [35]. Obwohl die Zahl der heutzutage angewandten festen Träger beträchtlich ist u n d an manchen bessere Trennungen zu erzielen sind als am Papier, ist die Bedeutung der Papierelektrophorese auch heute noch nicht zu unterschätzen. Da bei Anwendung von Papier die Vorbereitung des Trägers keiner besonderen Arbeit bedarf und Fehler bei der Trägervorbereitung ausgeschlossen sind, erfreut sich dieses Verfahren gleichbleibender Popularität.

1.2.

Terminologie

Für die Bezeichnung der einzelnen elektrophoretischen u n d darunter auch der papierelektrophoretischen Verfahren bedient man sich in der Literatur verschiedener Länder und Sprachen unterschiedlicher Ausdrücke. Die Uneinheitlichkeit der Terminologie ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß sich die einzelnen Verfahren in den einzelnen Ländern voneinander unabhängig entwickelt haben. Die verschiedenen Bezeichnungen können zu Begriffsverwirrungen führen und erschweren zugleich auch das Studium der Literatur, wie dies auch von S T R I C K L A N D [44] betont wird, deshalb werden im folgenden die häufiger gebräuchlichen Ausdrücke erläutert.

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1. E I N L E I T U N G

Chromatographie von C O N S D E N , G O K D O N u n d M A R T I N [ 1 5 ] waren n u r vereinzelt Arbeiten zur Elektrophorese erschienen. Der große Erfolg und die schnelle Verbreitung der Papierchromatographie förderten zugleich die Entwicklung der Papierelektrophorese. 1948 wurden die beiden Verfahren von H A U G A A R D und W I E L A N D zur zweidimensionalen Trennung von Aminosäure- u n d Peptidgemischen kombiniert [16, 17, 18]. Die Anwendung der Papierelektrophorese zur Trennung makromolekularer Substanzen verbreitete sich seit 1950 durch die Arbeiten v o n C R E M E R u n d TISELITJS, D U R R U M , M C D O N A L D , GRASSMANN,

HAN-

NIG und anderen Autoren [19, 20, 21, 22], Im weiteren entwickelte sich die Trägerelektrophorese besonders hinsichtlich ihrer technischen Vervollkommnung. Auf diesem Gebiete sind die kontinuierlichen elektrophoretischen Verfahren von HAUG A A R D , G R A S S M A N N und S V E N S S O N [ 2 3 , 2 4 , 2 5 ] sowie die von M I C H L [26] eingeführte Hochspannungselektrophorese von hervorragender Bedeutung. Parallel zu diesen Verfahren wurden ständig neuere Trägermaterialien entwickelt, welche sich mehr oder minder bewährten, so z. B. Agargel [27], Stärkegel [28], Kieselgel [29, 30], Asbestfaser [31], Baumwolle [32], feingemahlene Glaswolle u n d Glasfaserpapier [33, 34] sowie das in der Literatur der letzten J a h r e zweifellos am meisten verbreitete Polyacrylamidgel [35]. Obwohl die Zahl der heutzutage angewandten festen Träger beträchtlich ist u n d an manchen bessere Trennungen zu erzielen sind als am Papier, ist die Bedeutung der Papierelektrophorese auch heute noch nicht zu unterschätzen. Da bei Anwendung von Papier die Vorbereitung des Trägers keiner besonderen Arbeit bedarf und Fehler bei der Trägervorbereitung ausgeschlossen sind, erfreut sich dieses Verfahren gleichbleibender Popularität.

1.2.

Terminologie

Für die Bezeichnung der einzelnen elektrophoretischen u n d darunter auch der papierelektrophoretischen Verfahren bedient man sich in der Literatur verschiedener Länder und Sprachen unterschiedlicher Ausdrücke. Die Uneinheitlichkeit der Terminologie ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß sich die einzelnen Verfahren in den einzelnen Ländern voneinander unabhängig entwickelt haben. Die verschiedenen Bezeichnungen können zu Begriffsverwirrungen führen und erschweren zugleich auch das Studium der Literatur, wie dies auch von S T R I C K L A N D [44] betont wird, deshalb werden im folgenden die häufiger gebräuchlichen Ausdrücke erläutert.

1.2. TERMINOLOGIE

15

Der Ausdruck »Elektrophorese« stammt von MICHAELIS [ 3 ] , MARTIN und SYNGE [ 3 6 ] beschränkten den Gebrauch dieser Bezeichnung auf Kolloide und benutzten f ü r Ionen im engeren Sinne den Ausdruck »Ionophorese«. Diese Unterscheidung ist jedoch ganz willkürlich. In demselben Sinne werden auch die Bezeichnungen »Papierelektrophorese« [37] und »Papierionophorese« [38] gebraucht, während »Ionographie« [ 2 1 ] und »Papierographie« seltener vorkommen. STRAIN [ 4 0 ] und seine Mitarbeiter fanden die Bezeichnung »Elektrochromatographie« am treffendsten. Die Trägerelektrophorese, d. h. die Elektrophorese in einem »stabilisierten Elektrolyten« wird in der englischsprachigen Literatur mit Vorliebe »zone electrophoresis« [41] genannt, zum Unterschied zur trägerfreien Elektrophorese. Diese Bezeichnung bringt treffend zum Ausdruck, daß bei der Trägerelektrophorese die Komponenten eines Gemisches als scharf getrennte und abgegrenzte Zonen erscheinen, wohingegen bei der freien Elektrophorese nur die am schnellsten und die am langsamsten wandernde Komponente rein erhalten werden kann. Im weiteren werden die Bezeichungen »Elektrophorese« oder »Papierelektrophorese« gebraucht. Spezielle Begriffe, wie z . B . »Agarophorese« [42], »Immunelektrophorese« [43] oder »Disk-Elektrophorese« [45] werden in den entsprechenden Kapiteln erklärt. Jener Papierstreifen, der die durch Elektrophorese bereits getrennten Substanzen trägt, wird als »Elektropherogramm« oder »Pherogramm« bezeichnet. Die bei der quantitativen Auswertung desselben erhaltene Verteilungskurve wird zum Unterschied )>elektrophoretisches Diagramm« genannt. In der Literatur wird dieses Diagramm auch o f t als »Elektropherogramm« bezeichnet. STRICKLAND [ 4 4 ] hält »Elektrophoregramm« f ü r den aus dem Griechischen richtig abgeleiteten Ausdruck, der in den englischsprachigen Veröffentlichüngen der letzten beiden J a h r e auch immer häufiger vorkommt. Da aber im deutschen Sprachgebrauch »Elektropherogramm«, »Pherogramm« usw. weit verbreitet sind, wollen wir diese Ausdrücke beibehalten. Die Wanderung der Substanzen auf dem Papier im Laufe der Elektrophorese wird mit einem der folgenden Meßwerte charakterisiert : a) Wanderung oder Wanderungs-Strecke [cm oder m m ] b) Wanderungsgeschwindigkeit, d. h. der in der Zeiteinheit zurückgelegte Weg [cmJh, mm/h, mm/min] c) elektrophoretische Beweglichkeit, d. h. der Quotient der Wanderungsgesehwindigkeit und der Feldstärke f c m ! F _ 1 A _ 1 ] .

Die Wanderung wird in Richtung der Anode mit ( + ), in Richtung der Kathode mit ( —) bezeichnet. Die zur Elektrophorese benutzte Elektrolytlösung wird als Elektrolytmedium, Pufferlösung oder Pufferelektrolyt bezeichnet. Bei der Elek-

16

1. EINLEITUNG

trophorese von pH-empfindlichen Substanzen ist es vorteilhaft, als Elektrolyt medium einen Puffer einzusetzen, da die sich an den Elektroden vollziehenden Elektrolysevorgänge dann den pH-Wert des Mediums weniger beeinflussen. F ü r die Ergebnisse der Elektrophorese sind außer dem pH-Wert auch die qualitative Zusammensetzung und Molarität oder Ionenstärke des Elektrolytmediums von Bedeutung und deshalb anzugeben. Zur Charakterisierung der Elektrophoresebedingungen wird die Feldstärke bzw. das Spannungsgefälle entlang der Papierstreifen angegeben [ Vjcm], In der älteren Literatur ist oft nur die Klemmspannung angeführt. Weitere charakteristische Daten sind die auf den Querschnitt bzw. die Breite des Papierstreifens bezogene Stromstärke [mA/cm], die Dauer der Elektrophorese (Stunde = [/¿] oder Minute = [min]) und bei Hochspannungsverfahren auch die Temperatur des Kühlmediums [°C]. Die Qualität des Filterpapiers wird in der Literatur nicht immer angegeben. Sie spielt — im Gegensatz zur Papierchromatographie — auch keine entscheidende Rolle.

1.3. Symbole Die Maßeinheiten sind — falls nicht anders vermerkt — im metrischen System zu verstehen. In dem Kapitel »Theoretische Grundlagen der Papierelektrophorese« werden folgende Symbole angewandt: c = Proportionalitätsfaktor zwischen dem elektrokinetischen Potential und der Beweglichkeit C = Ionenkonzentration des Elektrolytmediums d = Wanderung des elektrisch geladenen Teilchens d' = die im Laufe der Elektrophorese in porösem Träger zurückgelegte Strecke d* = Stärke der als Kondensator betrachteten elektrischen Doppelschicht da = die auf dem Papier unmittelbar meßbare Wanderung de = die der elektrophoretischen Wanderung zuzuordnende Strecke d0 — die infolge der Elektroosmose zurückgelegte Strecke D = Dielektrizitätskonstante des Mediums D0 = Diffusionskonstante des wandernden Ions e = Ladung an der Oberflächeneinheit des Teilchens F = FABADAYsche Konstante Fe = Kraft, welche die elektrophoretische Wanderung verursacht H = die sich im Laufe der Elektrophorese entwickelnde Wärme (JouLEscho Wärme) I = Stromstärke K = Dissoziationskonstante des wandernden Elektrolyten

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1. EINLEITUNG

trophorese von pH-empfindlichen Substanzen ist es vorteilhaft, als Elektrolyt medium einen Puffer einzusetzen, da die sich an den Elektroden vollziehenden Elektrolysevorgänge dann den pH-Wert des Mediums weniger beeinflussen. F ü r die Ergebnisse der Elektrophorese sind außer dem pH-Wert auch die qualitative Zusammensetzung und Molarität oder Ionenstärke des Elektrolytmediums von Bedeutung und deshalb anzugeben. Zur Charakterisierung der Elektrophoresebedingungen wird die Feldstärke bzw. das Spannungsgefälle entlang der Papierstreifen angegeben [ Vjcm], In der älteren Literatur ist oft nur die Klemmspannung angeführt. Weitere charakteristische Daten sind die auf den Querschnitt bzw. die Breite des Papierstreifens bezogene Stromstärke [mA/cm], die Dauer der Elektrophorese (Stunde = [/¿] oder Minute = [min]) und bei Hochspannungsverfahren auch die Temperatur des Kühlmediums [°C]. Die Qualität des Filterpapiers wird in der Literatur nicht immer angegeben. Sie spielt — im Gegensatz zur Papierchromatographie — auch keine entscheidende Rolle.

1.3. Symbole Die Maßeinheiten sind — falls nicht anders vermerkt — im metrischen System zu verstehen. In dem Kapitel »Theoretische Grundlagen der Papierelektrophorese« werden folgende Symbole angewandt: c = Proportionalitätsfaktor zwischen dem elektrokinetischen Potential und der Beweglichkeit C = Ionenkonzentration des Elektrolytmediums d = Wanderung des elektrisch geladenen Teilchens d' = die im Laufe der Elektrophorese in porösem Träger zurückgelegte Strecke d* = Stärke der als Kondensator betrachteten elektrischen Doppelschicht da = die auf dem Papier unmittelbar meßbare Wanderung de = die der elektrophoretischen Wanderung zuzuordnende Strecke d0 — die infolge der Elektroosmose zurückgelegte Strecke D = Dielektrizitätskonstante des Mediums D0 = Diffusionskonstante des wandernden Ions e = Ladung an der Oberflächeneinheit des Teilchens F = FABADAYsche Konstante Fe = Kraft, welche die elektrophoretische Wanderung verursacht H = die sich im Laufe der Elektrophorese entwickelnde Wärme (JouLEscho Wärme) I = Stromstärke K = Dissoziationskonstante des wandernden Elektrolyten

1.3. SYMBOLE. LITERATUR K* K

l L' 1 Q r R Re RP S

Sp S'b 1 T u u0 U

= =

= =

= = = =

= = --

=

= = = — =

v = V = Y„ = X — z — Z = a = f = rj = Ä= fi = o =

17

Leitfähigkeit des Elektrolytmediums spezifische Leitfähigkeit des Systems Papier—Elektrolytmedium gesamte Streckenlänge im Gerät Streckenlänge im Gerät bei Anwendung eines porösen Trägers mechanisches Wärmeäquivalent Gesamtladung eines kolloiden Partikels Radius des elektrisch geladenen Teilchens universelle Gaskonstante Widerstand des Elektrolyts Widerstand des mit dem Elektrolyten d u r c h t r ä n k t e n Papierstreifens Querschnitt des mit dem Elektrolyten gefüllten Geräts (Glasrohres) bei freier Elektrophorese Querschnitt des Papiers Querschnitt des Weges der Ionen im Papier Dauer der Elektrophorese Temperatur elektrophoretische Beweglichkeit elektroosmotische Beweglichkeit unmittelbar a m Papierstreifen gemessene elektrophoretische Beweglichkeit elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit Spannung Volumen der Poren a u f dem Papier Feldstärke mittlere L a d u n g des Ions Valenz der Ionen des Elektrolytmediums scheinbarer elektrolytischer Dissoziationsgrad elektrokinetisches Potential Viskosität des Mediums Verdünnung Ionenstärke »Obstruktionsfaktor« des Papiers

Die Symbole der in den anderen Kapiteln vorkommenden wenigen empirischen Formeln wurden nicht vereinheitlicht, sondern aus der Originalliteratur übernommen.

Literatur [1] RETJSS, F . F . : Mem. Soc. Imper. Natural., [Moskau] 2 (1809), 327 [ 2 ] P I C T O N , H . , L I N D N E B , S . E . : J . e h e m . S o c . 61 ( 1 8 9 2 ) , [ 3 ] MICHAELIS, L . : B i o c h e m . Z . 16 ( 1 9 0 9 ) , 8 1

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2

Vämos

18

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2. THEORETISCHE GRÜNDLAGEN DER PAPIERELEKTROPHORESE

2.1. Faktoren, welche die Wanderung von Ionen im elektrischen Feld beeinflussen Das Hauptproblem der Arbeiten, die sich mit der Theorie der Elektrophorese befassen, besteht in der Bestimmung der Faktoren, die die Wanderung der elektrisch geladenen Partikel im elektrischen Feld beeinflussen. Bei der Papier- oder im allgemeinen bei der Trägerelektrophorese ist die Antwort auf diese Frage sehr schwierig, da die unmittelbar am Papierstreifen gemessene Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens von sehr vielen Faktoren abhängt. Hinsichtlich der Deutung einiger Erscheinungen hat die Fachliteratur bis heute noch nicht endgültig Stellung genommen. Die eingehende Erörterung der verschiedenen Theorien würde den Zielsetzungen dieses Buches nicht entsprechen. Deshalb werden wir uns hauptsächlich mit der Auswirkung jener Faktoren befassen, die bei der praktischen Durchführung zur richtigen Wahl der Versuchs- bzw. Meßbedingungen und zum Verständnis des eventuellen anomalen Verhaltens gewisser Substanzen dienen können. Die Wanderung eines Ions im elektrischen Feld wird nach B L O C K , D U R R U M und Z W E I G [ 1 ] durch die in folgende drei Gruppen geteilten Faktoren beeinflußt: 1. D i e für das Ion c h a r a k t e r i s t i s c h e n F a k t o r e n : Vorzeichen und Größe der Ladung, Gestalt, Teilchengröße, Dissoziationsgrad, eventueller amphoterer Charakter und D i f f u s i o n s k o n s t a n t e des g e l a d e n e n Partikels. , 2. D i e E i g e n s c h a f t e n d e r U m g e b u n g d e s I o n s : K o n zentration, Ionenstärke, chemische und dielektrische E i g e n s c h a f t e n , p H - W e r t , T e m p e r a t u r und V i s k o s i t ä t des E l e k t r o l y t m e d i u m s sowie das Vorhandensein unpolarer Moleküle. 3. D i e a n g e l e g t e Feldstärke, die Stromstärke, die Stromverteilung e n t l a n g der W a n d e r u n g s s t r e c k e des Partikels usw.

Außer diesen Faktoren muß bei der Papierelektrophorese in Betracht gezogen werden, daß das geladene Teilchen in einem porösen Medium wandert. Mit der Beeinflussung durch das poröse Medium befaßt sich Kapitel 2.2.

2*

20

2. GRUNDLAGEN DER PAPIERELEKTROPHORESE

2.1.1. Der Einfluß der Ladung des Ions auf seine

Wanderung

U m in einem elektrischen Feld zu wandern, braucht ein Stoffpartikel eine elektrostatische Ladung. Ungeladene Teilchen sowie amphotere Moleküle bei dem p H - W e r t ihres isoelektrischen Punktes können infolge der Elektroosmose (s. a. 2.2.2 ) ebenfalls wandern. Zur elektrophoretischen Trennung nicht dissoziierender Substanzen, wie z . B . Steroide oder Kohlehydrate, wird eine dissoziierende oder eine mit einem Elektrolyten gebildete Komplexverbindung derselben hergestellt [2], Die einzelnen Ionen sind Träger der Einheit der elektrischen Ladung (4,80 • 1 0 - 1 0 elektrostatische Einheiten) oder eines Vielfachen derselben. Die direkt gemessene Ladung kann jedoch auch ein Bruchteil davon sein, da der Ladungszustand eines Teilchens nicht konstant bleibt. Deshalb wird mit statistischen Durchschnittswerten gerechnet (1). In einem unendlich verdünnten, praktisch salzfreien Medium wirkt auf ein Kolloid-Partikel mit der Gesamtladung Q eine die elektrophoretische Wanderung verursachende K r a f t Fe = XQ,

(1)

X = Feldstärke, F/cm.

Die Endgeschwindigkeit eines sich bei konstanter Feldstärke bewegenden Teilchens bleibt wegen der Viskosität des Mediums konstant. F ü r kugelförmige Partikel kann das STOKESsche Gesetz angewendet "werden. Daraus folgt: X Q = 6 nt] rv , (2) rj = Viskosität des Mediums; r = Radius des Partikels; v = elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit.

F ü h r t man die elektrophoretische Beweglichkeit, u, d. h. die Wanderungsgeschwindigkeit des Partikels bei dem Einheitswert der Feldstärke [ F / c m ] ein, dann ist « =

X

6 7tt]r

(3)

Die Beweglichkeit ist also eine Funktion der Größe u n d der unmittelbar meßbaren Beweglichkeit des Teilchens. Die mit der F o r m des Partikels verbundenen Faktoren treten im Nenner der Gleichung (3) auf [3]. Mit entsprechenden Änderungen gilt die Beziehung auch f ü r Teilchen anderer Form. Die obigen Gleichungen sind f ü r ein unendlich verdünntes Medium gültig. Solche Bedingungen bestehen jedoch bei der praktischen Durchf ü h r u n g der Elektrophorese nie, weshalb man die Wechselwirkung

2.1. F A K T O R E N

DER

21

IONENWANDERUNG

der Ionen des Elektrolytmediums mit den wandernden Ionen nicht außer acht lassen kann. Offenbar können zwei Ionen umso leichter und schneller voneinander getrennt werden, je größer der Unterschied zwischen ihren Beweglichkeiten ist. Wenn also die Beweglichkeiten der Ionen A und B, welche die Strecken dA und dB zurücklegen, gleich uA bzw. uB sind, dann ist dA ~ dB = (uA — uB) Xt, (4). X — Feldstärke; t = Wanderungszeit

2.1.2. Der Einfluß des Dissoziationsgrades der wandernden Substanz und des pH-Wertes des Elektrolytmediums auf die Wanderung Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt besonders bei schwachen Elektrolyten und amphoteren Verbindungen vom Dissoziationsgrad ab [4]. Auch bei vollständig dissoziierenden starken Elektrolyten muß der scheinbare Dissoziationsgrad (a) berücksichtigt werden, welcher eine Funktion der Verdünnung ist: (5> /loo Av = Leitfähigkeit der L ö s u n g v o m endlichen Verdünnungsgrad v, A „ = L e i t f ä h i g k e i t der unendlich v e r d ü n n t e n L ö s u n g [ 5 ]

Tabelle 1 stellt nach L E D E R E R [5] die Leitfähigkeitswerte von Kaliumchloridlösungen bei 18 °C dar. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß sich z.B.in einer 0,1 N Lösung das vollständig dissoziierte KaliumTabelle 1 Leitfähigkeit Konzentration gÄq/i 0 0,0001 0,001 0,01 0,1 1

von Kaliumchloridlösungen 1 gÄq enthaltendes Volumen, [Liter]

10 000 000 1 000 000 100 000 10 000 1 000

bei 18 °C nach LEDERER [ 5 ]

Spezifische Leitfähigkeit

0,00001291 0,0001273 0,001224 0,0112 0,0983

Äquivalente Leitfähigkeit

Scheinbarer Dissoziationsgrad

129,9 129,1 127,5 122,4 122,0 98,3

(1,00) 0,994 0,980 0,943 0,862 0,757

22

2. G R U N D L A G E N D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

chlorid hinsichtlich der Leitfähigkeit so verhält, als wenn es nur zu 86% dissoziiert wäre. Der Grund dafür liegt in dem D E B Y E — H Ü C K E L Effekt. Danach behindert in konzentrierten Lösungen die »ionische Atmosphäre«, d. h. die die einzelnen Ionen umgebenden entgegengesetzt geladenen Ionen, ihre Bewegung im elektrischen Feld. Ähnlich wirkt auch die reversible Bildung von Ionenkomplexen in konzentrierten Lösungen, indem sie die effektive Ladung der Ionen vermindert. Schwache Säuren und Basen dissoziieren in Abhängigkeit vom pHWert des Elektrolytmediums mehr oder weniger. Der dissoziierte und nicht dissoziierte Teil stehen miteinander in reversiblem Gleichgewicht und wandern daher mit gleicher Geschwindigkeit. Diese Geschwindigkeit ist niedriger als es diejenige des dissoziierten Anteiles sein würde. Der Zusammenhang zwischen der Dissoziationskonstante K und dem pH-Wert kann durch folgende Gleichung beschrieben werden pH =

VK

+ log

[dissoziierter Anteil] [nicht dissoziierter Anteil]

(6)

Ampholyte, wie z. B. Aminosäuren können sich in Abhängigkeit vom p H des Puffermediums als Kationen oder als Anionen verhalten. Bei dem pH, der ihrem isoelektrischen Punkt entspricht, besitzen sie keine Ladung. Ähnlich verhalten sich auch Metall-Ampholyte in komplexbildenden Elektrolyten [6]. Auf dieser Erscheinung beruht die elektrophoretische Trennung der Ampholyte. Wenn nämlich der pHWert des Puffers höher ist als der isoelektrische Punkt des Partikels, dann erhält dieses eine negative Ladung und wandert zur Anode. Bei einem niedrigeren p H hingegen wandert es mit positiver Ladung zur Kathode. Bei der Trennung dreier Substanzen mit verschiedenem isoelektrischen Punkt wählt man zweckmäßig einen Puffer, dessen pHWert dem mittleren isoelektrischen Punkt entspricht. In diesem Falle wandert die Verbindung mit dem mittleren isoelektrischen Punkt nicht (bzw. nur entsprechend der Elektroosmose), während die Substanz mit dem im mehr basischen Bereich liegenden isoelektrischen Punkt zur Kathode, die mehr saure Substanz hingegen zur Anode wandert. Zur Trennung schwacher Säuren und Basen oder amphoterer Verbindungen kann der optimale pH-Wert des Elektrolytmediums nach C O N S D E N , G O R D O N und M A R T I N [7] auf folgende Weise bestimmt werden. Es seien HA und H_B zwei Säuren mit den Dissoziationskonstanten Ka und Kb und den Ionenbeweglichkeiten ua und ub. In diesem Falle ist die im Elektrophorese-Gerät unmittelbar gemessene Beweglichkeit JJ _ 0

uWgL^ 0[A ]j [HA] + [A~]

uaIC, [H+] + Ä"a

(7)

2.1. F A K T O R E N D E R

IONENWANDERUNG

23

Das Maß der Trennung ergibt sich aus der Differenz der unmittelbar gemessenen Beweglichkeiten der beiden Säuren Uh

=

u„K„ [H+] + Ka

ubKb [H+] + Kb

(8)

Die Differenz der unmittelbar gemessenen Beweglichkeiten ist am größten, wenn ha _ ' [Ka R k„ ' ub [H+] = V i { K a + Kb)-\ [Ua K n ubKb

(9)

oder pH =

vKa

+

vKb

- lg

IF/ Ub -

f*k\ Kb 'uaKa ubK„

(10)

Wenn Ka >• Kh, d. h. pK a •< pK b — mit Ausnahme des Falles, wenn KJK b zwischen den Werten uju b und ub\ua liegt — ergibt sich bei der Anwendung des optimalen pH die maximale Differenz der unmittelbar gemessenen Beweglichkeiten als

(Ua-Ub)=ub

'uaKa 1 Ub Kb Ka\Kb-1

(11)

Auf Grund dieser Beziehung wurde von CONSDEN, GORDON und für die Kieselgelelektrophorese von zwei Aminosäuren ein Diagramm aufgestellt, welches die Werte von (TJa — TJb)jub als Funktion von pÜL6 —• pK a bei verschiedenen ua\ub Werten sowie den optimalen Trennungs-pH darstellt. SOCZEWINSKI und WAKSMUNDZKI [42] erarbeiteten eine graphische Methode für organische Säuren und Basen zur Bestimmung der Wirksamkeit der Trennung als Funktion des pH-Wertes. FRANC und KovÄft [46] benutzten die pH-Abhängigkeit der Wanderungsgeschwindigkeit zur Charakterisierung aromatischer Substanzen mittels sog. »papierelektrophoretischer Spektren«, auf ähnliche Weise, wie es in der Papierchromatographie üblich ist. MARTIN

24

2. GRUNDLAGEN DER PAPIERELEKTROPHORESE

2.1.3. Beziehungen zwischen der Diffusionskonstante Beweglichkeit des wandernden Partikels

und der

Bei der Wanderung des einwertigen Ammonium-Ions in verdünntem Essigsäure-Elektrolyten fanden E D W A R D und C R A W F O R D [ 3 1 ] , daß die Beweglichkeit des Ions durch folgende Beziehung zu charakterisieren ist: Uz = UoQVoha,

(12)

uz — Beweglichkeit im Elektrolyten gegebener Konzentration; u 0 = Beweglichkeit in unendlich verdünnter wäßriger Lösung; rj0 und rja = Viskositätswerte des Wassers bzw. der verdünnten Essigsäurelösung; p = »Obstruktionsfaktor« des Papiers (vgl. 2.2.1.).

Der Wert up kann bei unendlicher Verdünnung aus den Diffusions konstanten errechnet werden: u0=zD0FIBT,

(13)

z = mittlere Ladung des Ions; D,| = Diffusionskonstante des Ions bei unendlicher Verdünnung; F = FARADAYsche Konstante; R = universale Gaskonstante; T = Temperatur

Im Falle von Ampholyten (z.B. Aminosäuren oder Peptiden) kann der Wert von z bei verschiedenen pH-Werten aus den Dissoziationskonstanten der dissoziierenden Gruppen der Verbindung errechnet werden. Tabelle 2 enthält die errechneten, sowie die durch Versuche ermittelten z-, u0 - und uz-Werte von Peptiden. Wie ersichtlich, besteht zwischen den errechneten und gemessenen uz-Werten bei z >fokussierende Elektrophorese« gewährleistet [29, 30]. Das zu trennende Kationengemisch wird in der Mitte des Papierstreifens aufgetragen. Kathode und Anode sind mit verschiedenen Grundelektrolyten umgeben. Auf der Kathodenseite befindet sich ein Komplexbildner, z . B . ÄDTA, während der Anodenelektrolyt aus einer dekomplexierenden HN0 3 - oder HCl-Lösung besteht. I m Laufe der Elektrophorese wandern die Wasserstoffionen zur Kathode und treffen sich mit den entgegengesetzt wandernden Anionen des Kathodenelektrolyts. So entsteht längs des Papiers ein pH-Gradient sowie ein Konzentrationsgradient des Komplexbildners. Da nun, wie bereits gesagt, das kationische oder anionische Verhalten eines Metallions von der Konzentration des Komplexbildner-Elektrolvten abhängt, wird es in der Nähe der Kathode (wo die Konzentration des Komplexbildners hoch ist) als komplexes Ariion und in der Nähe der Anode (bei niedriger Konzentration des Komplexbildners) als Kation vorliegen. Diese beiden Formen des Metallions wandern einander bis zu dem Punkt entgegen, wo ein kritischer pH-Wert bzw. Konzentrationswert des Komplexbildners herrscht. Hier hört die Wanderung auf. In diesem »Focus«, dessen Lage auf dem Papierstreifen lediglich von den Stabilitätskonstanten des komplexen Metallanions abhängt (welche für verschiedene Metallionen verschieden ist), wird das Kation eine scharfe Zone bilden. Als Elektrolytlösungen werden zumeist Lösungen anorganischer Säuren bzw. Basen verwendet. Zur Gruppentrennung von Kationen werden u . a . 1 n und 0,5 n Salzsäure [31, 32], zur Trennung von Anionen 1 N KCl [32] oder 0,1 N NaOH [17] angewandt. Auch organische Säuren wie Milchsäure [5], Weinsäure [33] oder Zitronensäure [34] sowie ÄDTA-Lösungen verschiedener Konzentrationen [35, 36] werden eingesetzt. CHAKRABORTTY [37] machte die Beobachtung, daß in einem mit Schwefelsäure auf p H 1 eingestellten Sulfat-Elektrolvten die Reihenfolge der Beweglichkeiten der Ionen umgekehrt ist als im unendlich verdünnten Elektrolyten: am schnellsten wandern die ein-, und am langsamsten die drei- und vierwertigen Ionen.

94

4. A N W E N D U N G D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

Zur Bestimmung der wahren Beweglichkeit anorganischer Ionen aus der meßbaren scheinbaren Beweglichkeit wurde von PUÖAR bzw. P u c a r u n d J a k o v a c [38, 39] eine Formel entwickelt, in welcher die Adsorptions- u n d Elektroosmose-Erscheinungen berücksichtigt werden: ? / ' — n' u = 1,2 — mm F - 1 h _ 1 cm, (41) —

u' = die scheinbare Beweglichkeit des Ions; u e = die scheinbare B e w e g l i c h k e i t des Elektroosmose-Indikators; iiy = der für das I o n charakteristische adsorptionschromatographische Faktor; Rf e = der für den Elektroosmose-Indikator charakteristische adsorptionschromatographische F a k t o r ; 1,2 = der der Porosität und Struktur des a n g e w a n d t e n Papiers (Munktell 20/100) entsprechende Korrekturfaktor.

4.1.2. Trennung von

Kationen

Bei der Behandlung des Materials wird möglichst die in der qualitativen Analyse übliche Gruppeneinteilung zugrunde gelegt. Dieses Prinzip k a n n jedoch nicht immer voll eingehalten werden, da bei der E n t wicklung der Trennverfahren o f t andere Gesichtspunkte maßgebend waren, wie z. B. die Trennung der Kationen eines gegebenen Gemisches. 4.1.2.1. Trennung der Kationen der I. Gruppe Die elektrophoretischen Trennungen der Kationen der Gruppen I / a u n d I/b werden hier zusammen behandelt. In Tab. 6 werden einige diskontinuierliche Trennungsbeispiele angeführt. Die zweidimensionale Trennung der Nitrate von H g | + , P b 2 + u n d Ag+, sowie von Hg 2 +, Bi+ + +, Cu 2 + , Pb 2 + u n d Cd 2+ mittels Elektrochromatographie kann im 0,1 M Milchsäure-Elektrolyten bei 250 V u n d 100 mA in 20 Minuten, in dem 4 m N H 4 O H - 0,008 m ZitronensäureElektrolyten bei 160. . .170 V u n d 100 mA ebenfalls in 20 Minuten durchgeführt werden [6]. Cu 2 + , Ag+, Ni 2 + und F e 3 + wurden mittels kontinuierlicher Papierelektrophorese im basischen Tartrat-Oxalat-Elektrolyten getrennt [6]. Zur kontinuierlichen Trennung von Cu 2+ von A g + sowie Cd 2 + , A g + , Bi 3 + u n d A l 3 + , ferner T l + von Al 3 + sowie T1+ von As 3 + wurde in 1 M N H 4 O H gelöstes 0,01 M ÄDTA bzw. 0,05 M Zitronensäure verwendet [46].

4.1. PAPIERELEKTROPHORESE ANORGANISCHER SUBSTANZEN

95

An Hand der papierelektrophoretischen Wanderung zweiwertiger Ionen (Cu 2+ , Pb 2 + , Zn 2 + , Cd2+ und Hg 2 + ) in 1 bis 10 m LiCl-Lösungen ermittelten S m i b o u s und G e l e d a die Stabilitätskonstanten der Chlorkomplexe [47]. 4.1.2.2. Trennung der Kationen der II. Gruppe Einige Beispiele für die Trennung von Sb-, Sn-, As-Ionen untereinander und von den Ionen der I. Gruppe sind in Tab. 7 angeführt. 3+ S t r a i n und S u l l i v a n [6] trennten die Chloride von As und Sb 3+ mittels zweidimensionaler Elektrochromatographie im 0,4 m DLalaninhaltigen 0,1 i Milchsäurepuffer bei 300 V und 100 mA in 20 Minuten. Zur Trennung der Chloride von Sn 2 + , As 3+ und Sb 3+ mittels kontinuierlicher Durchfluß-Papierelektrophorese gebrauchten sie einen aus 0,02 M Milchsäure, 0,02 m Weinsäure und 0,04 M DL-Alanin bestehenden Puffer bei 300 V und 95 mA [6], Das Schema der Trennung bzw. der Weg der Ionen auf dem Trennbogen ist in Abb. 34 veranschaulicht. Die Papierelektrophorese eignet sich ausgezeichnet zur Trennung der Edelmetallionen. Tabelle 8 enthält einige Beispiele. Die binären und ternären Gemische von Pt 4 + , Pb 2 + , Ir 4 + und Rh 3 + konnten in verschiedenen ÄDTA-Lösungen auch kontinuierlich getrennt werden [52]. Das Verhalten von Rh 3+ -Komplexen wurde mittels Papierelektrophorese und Ionenaustauscher-Chromatographie studiert [56, 5 7 ] , Die Beweglichkeiten von Edelmetall-Ionen bestimmte M u k e r j e e [58, 59, 60] in einer großen Anzahl von Elektrolyten. Die Trennung

Abb. 34: Die Trennung der Chloride von Sn 2 + , A s 3 + und S b 3 + mittels kontinuierlicher Papierelektrophorese nach S t b a i n und S u l l i v a n [6] a — kontinuierliche Auftragung des zu trennenden Gemisches; b — Richtung der Elektrolytströmung; c, d, e — Sammeln der getrennten Fraktionen von Sn , + , As 3 + und Sb 3 +

4. A N W E N D U N G

96

D E R

P A P I E R E L E K T R O P H O R E S E

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\ W(-1 10-": 1,0; t = 20 °C, H = 0,1 (Elektrolyt: KNO,)

äquivalenten Beweglichkeit und dem Reziproken der Quadratwurzel des Molekulargewichts auf: u 1 - = 14,7 — - 0 , 2 9 , z ]/M

(42)

u = die elektrophoretische Beweglichkeit, z = die Ladung des Ions, M = das Molekulargewicht.

Eine allgemeine Beweglichkeitsgleichung wurde auch für die Aminosäurekomplexe der zweiwertigen Ionen abgeleitet. Eine graphische Methode zur annähernden Bestimmung der Komplexbildungskonstanten aus den elektrophoretischen Beweglichkeiten stellte J O K L ebenfalls auf [106], V A N O O Y und H O U T M A N [ 1 0 7 ] studierten mittels HochspannungsElektrophorese die Reaktionen der Hexahalogenkomplexe von dreiwertigem Iridium in wäßrigen Lösungen bei p H 3 und bei Temperaturen von 25 —110 °C. Die Elektrophorese der markierten Lösungen wurde bei 0 °C und 80 V/cm durchgeführt. Da die entsprechenden Komplexe des vierwertigen Iridiums auf dem Papier reduziert wurden, mußte die Elektrophorese .auf Kieselgel-Dünnschichten in 0,1 N Salzsäure durchgeführt werden [ 1 0 8 ] . Bei derTrennung von Kobalt-ammin-Komplexionen fand M A K I [ 1 0 9 ] ,

108

4. A N W E N D U N G

DER

PAPIERELEKTROPHORESE

daß die Beweglichkeit der Ionen ihrer Ladung proportional und unabhängig vom pH-Wert des Elektrolyten ist. Er trennte die Ionen [Co(NH3)6]C1.„ [CO(NH3)5N02]C12, cis-[Co(NH 3 ) 4 (NO i )JCl, trans-[Co(NH 3 ) 1 (N0 2 )JCl ) [Co(NH,) s (NO,) s ], [Co(NH 3 ) 2 (N0 2 ) 4 ]K und [Co(N0 2 ) 6 ]Na 3 .

Die Ionen [Cr(H 2 0) 6 ] 3+ , [Cr(H20)5Cl]2+ und [Cr(H20)4ClJ+ wurden in einem HCl KCl-haltigen Elektrolyten bei 200 V in 2,5 Stunden getrennt [110]. Die Komplexe des Eisen(III)-rhodanids sind ebenfalls mittels Papierelektrophorese studiert worden [111]. K A W A M U R A U. Mitarb. [112] trennten folgende Chromkomplexe: [Cr(H 2 0) c ] 2 (S0 4 ) 3 , [Cr(H 2 0) 6 ](C104)3 , [Cr(H 2 0) 4 (C 2 0 4 )] 2 S0 4 , [Cr(H 2 0) 4 (C 2 0 4 )]C10 4 , [Cr(H 0) 3 (C 0 4 )(CH 3 C00)], K[Cr(H 2 0)„(C 2 0 4 ) 2 ] und K 3 [Cr(C 2 0 4 ) 3 ].

Als Elektrolyt verwendeten sie 0,33 N HC104. Die Elektrophorese dauerte bei 500 V 1 Stunde. Die Wanderungsstrecken der untersuchten Kationen sowie der Anionen waren ihren Ladungen annähernd proportional. Die getrennten Ionen wurden auch quantitativ bestimmt [113]. Auch mit den Liganden SOJ-, SCN" und NHj" gebildete Chromkomplexe waren Gegenstand von Untersuchungen [114]. B I G H I und T R A B A N E L L I [ 1 1 5 ] trenntenKobalt-ammin- und Chromammin-Komplexe mittels kontinuierlicher Papierelektrophorese. Die Trennung von [Co(NH3)6]C13, [Co(NH3)5C1]C12, [Co(NH3)4(N02)2] N 0 2 und

[Co(NH3)3(N02)3]

wurde auf Whatman Nr. 3 MM-Papier in 0,25%iger NH4C1-Lösung bei 100 V bzw. 200 V und 30 mA in 12 Stunden durchgeführt. Zur Trennung von [Cr(NH3)5Cl]Cl2, [Cr(NH3)3Cl3] und [Cr( NH 3 ) 6 ](N0 3 ) 3

wurde eine l%ige NH4C1-Lösung bei 200 V verwendet. Richtung und Geschwindigkeit der Wanderung entsprachen in allen Fällen den Ladungen der Ionen. M A Z Z E I und L E D E R E R [ 1 1 6 ] studierten mittels HochspannungsElektrophorese die Bildung von Ionenpaaren bei Kobaltkomplexen und ihre Rolle bei elektrophoretischen Trennungen. Die Trennungen liefen bei 1500 V und 15 °C 30 Minuten in verschiedenen Salzen einund mehrwertiger anorganischer und organischer Säuren als Elektrolyt. In Acetatpuffer wanderten Tris(äthylendiamin)kobalt(III)chlorid und Tris(dipyridyl)kobalt(III)chlorid mit nahezu gleicher Geschwindigkeit, obwohl dem Ionenvolumen des letzteren eine geringere Wanderungs-

4.1. P A P I E R E L E K T R O P H O R E S E A N O R G A N I S C H E R S U B S T A N Z E N 109

geschwindigkeit entsprechen würde. In Natriumperchlorat wanderten die beiden Komplexe mit den ihren Ionenvolumina entsprechenden Geschwindigkeiten. In zweiwertigen Elektrolyten bewegen sich die kleineren Komplexionen schneller als die größeren. Die Wechselwirkung zwischen den Komplexen und den zweiwertigen Ionen hängt von der Größe, Form und Ladung der Komplexe ab. Die eis- und transPaare der Komplexe konnten in zweiwertigen Elektrolyten ebenfalls gut getrennt werden. L E D E R E R und MAZZEI [ 1 1 7 ] studierten mit derselben Technik auch die Bildung von Ionenpaaren zwischen Komplexen des dreiwertigen Kobalts und organischen Anionen sowie zwischen anionischen komplexen Cyaniden und mehrwertigen Metallionen. Es wurde festgestellt, daß z. B. in Trichloracetat als Elektrolyt komplexe Kationen des Typs [CoA 6 ] 3+ als Anionen wandern. Andererseits verhalten sich Komplexe der Formel [ilf(CN) 6 ] 2_ in Aluminium- oder Zirkoniumchlorid-Lösung als Kationen. M A C E K und P R I B I L [ 1 1 8 ] studierten das Verhalten der mit Komplexon gebildeten Komplexe von U O | + , Cu 2+ und Fe 3 + in verschiedenen Elektrolyten. Die Wanderung von Komplexen des Indiums und Galliums in 11 organischen Säuren wurde bei verschiedenen pH-Werten studiert [119]. Das elektrophoretische Verhalten des Indiums in Gegenwart von Chloridionen auf Glasfaserpapier in Salzsäurelösungen verschiedener Konzentrationen (10~ 3 M bis 3 M) sowie in kaliumchloridhaltiger Salzsäure war Gegenstand der Untersuchung. Bei der Elektrophorese bei 15 V/cm in konzentrierten HCl-Lösungen > l M w a n d e r t e Indium als Anion, bei 60 V/cm und 0,025 M HCl als Kation [120], Bei der Elektrophorese von 233 Pa in 0,05 M Schwefelsäure bleiben 90% der Aktivität unbeweglich am Startpunkt zurück. Diese auch in Salzsäure zu beobachtende Erscheinung ist auf die Aggregation des Protactiniums zurückzuführen. In Gegenwart von 1 0 - 3 M Fluorid bleiben nur 18% der Aktivität am Startpunkt zurück, und bei 10" 2 M Fluoridkonzentration wandert die ganze Aktivität als anionische Bande. Oxalationen verhindern ebenfalls die Aggregation [121]. 152 MARCTT [122] trennte Eu, 147 Pm, 241Am und 246Cm durch elektrophoretische Fokussierung, als Komplexbildner wurde Natriumpolyphosphat verwendet. Zur Trennung von U O | + , 90 Sr und 90 Y, sowie von U O | + und 152Eu mittels elektrophoretischer Fokussierung wurde Wein- oder Zitronensäure als Komplexbildner eingesetzt [123]. Das elektrophoretische Verhalten der Organometall-Kationen (C 2 H 5 ) 3 Pb + und (C 2 H 5 ) 2 Pb 2+ wurde in wäßrigen Lithiumchloridlösungen verschiedener Konzentrationen studiert [124].

4. ANWENDUNG D E R

110

4.1.2.9.

Papierelektrophorese Gruppen

PAPIERELEKTROPHORESE

von Kationen-Gemischen

verschiedener

In der Praxis sind diese Trenn verfahren von großer Bedeutung, gestatten sie doch den Nachweis von Kationen verschiedener Gruppen nebeneinander ohne Trennungsgang. C E T I N I [ 1 2 5 ] gebrauchte zur Elektrophorese eines aus 19 Kationen und 2 Metallanionen bestehenden Gemisches dreierlei Elektrolytlösungen: 1. 25 ml 4 N Milchsäure + 25 ml 2 N Na 2 C0 3 /i; 2. 40,02 ml 0,2 N HCl und 250 ml 0,2 M Kaliumhydrogenphthalat/Z; 3. 468 ml 0,1 M Natriumzitrat und 532 ml 0,1 N Salzsäure. Tabelle Trennung

13 von Kationen

GROSS [ 1 2 6 ]

Kation

Einwertig Ag Hg Cu T1 Cs Li Na NH, K Rb Zweiwertig Ba Be Ca Cd Co Cu Fe Mg Mn Ni Pb Sn Sr

uo 2 Zn

mittels Hochspannungs-Papierelektrophorese Wanderung zur Kathode, cm

6,0 0,0 17,6 35,8 39,65 20,2 27,2 39,1 38,2 39,7 26,5 16,5 27,9 19,9 21,9 16,9 21,2 23,6 21,9 21,3 21,75 0,0 24,9 8,95 21,8

100 V/cm, 0,75 m Ameisensäure, 20 Min.

Kation

nach

Wanderung zur Kathode, cm

Dreiwertig AI Bi Ce Fe La Sb Ti

17,9 3,9 21,02 8,45 22,5 0,0 10,4

Vier werlig Ce Th Ti Zr

6,77 10,2 8,4 0,5

4.1. P A P I E R E L E K T R O P H O R E S E

ANORGANISCHER

SUBSTANZEN

111

G R O S S [126] trennte eine große Anzahl von Kationen mit der Hochspannungs-Elektrophorese. Als Elektrolyt verwendete er eine 0,75 M Ameisensäure-Lösung, in der, wie aus Tab. 13 hervorgeht, sämtliche geprüften Kationen zur K a t h o d e wandern. Die Trennzeit betrug 20 Minuten, die Feldstärke 100 V/cm und die Stromstärke 6 mA/cm. Das zwischen Platten gelagerte Papier wurde mit 1 a t ü belastet, die Temperatur des Kühlwassers war 11 °C u n d der Feuchtigkeitsgehalt des Filterpapiers 140%. In 0,1 M Ammoniumcarbonat, p H 8,9 k o n n t e bei 80 V/cm nur im Falle ein- und zweiwertiger Kationen eine meßbare Wanderung beobachtet werden. D E V R I E S U. Mitarb. [127] trennten ebenfalls in einem Gerät mit zwischen zwei Platten gelagerten Papierstreifen im 1 N Zitronensäure-Elektrolyt bei 30 V/cm in einer Stunde eine große Anzahl von Metallionen, darunter auch Metallanionen. Die auf Co 2+ bezogenen relativen Beweglichkeitswerte sind in Tab. 14 angeführt.

Tabelle

1 4

Auf Co- + bezogene Beweglichkeitswerte von Metallionen im 1 N Zitronensäure• Elektrolyten bei 30 V/cm in 1 Std., nach DE VRIES U. Mitarb. [127] Ion

T1+ 2+

Ba Sr 2 + Ca2+ Mg 2 + Mn 2 + Fe2+ Cr 3+ Co 2 + Cd2+ Zn2+ Be2+ Ni2+ Pb2+ Cu 2 + La3+ Ce 3 + y

3

+

Relative Beweglichkeit

Ion

1 2 0 ± 3

Al 3 + In3+

1 1 9 ± 2

uo§+-

1 1 9 ± 2

Ag+ Ga 3 + Hg 2 + AsO|"

1 7 9 ± 1

1 1 8 ± 1 1 1 3 ± 3 1 0 7 ± 1 100 100

96±2 91±2 9 0 ± 2 8 5 ± 2

57±2 45±3 45±3 39±1 35±2

T h

4 + 3+

Bi Fe3+ AsO|" Sb 3 + CrOr Au3+ Sn4 + T i

4 +

Zr*+ MoOf-

Relative Beweglichkeit 29-1-2 2 6 ± 1 1 7 ± 2 6 ± 1 2 ± 1 0 0

-9±2 - 9 ± 3 - 1 8 ± 3

-18±4 -26±2 - 2 8 ± 1

-42±2 -44±5 -45±3 -52±2 -57±2

— W a n d e r u n g zur A n o d e

JOKL u. Mitarb. [128] trennten 64 Ionen in 0,05 M N-(2-Hydroxyäthyl)iminodiessigsäure-Lösungen bei verschiedenen pH-Werten. Die

112

4. A N W E N D U N G D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

Elektrophorese wurde auf Papierstreifen von 120% Feuchtigkeitsgehalt bei 15 V/cm u n d 20 °C durchgeführt. Die zu trennenden Ionen konnten als einfache Salze aufgetragen werden, da sich die Komplexbildung auf dem elektrolythaltigen Papier sofort nach dem Auftragen vollzog. F ü r die meisten Metallionen ergaben p H - W e r t e zwischen 2 u n d 3 die besten Trennungen. Kationen verschiedener Gruppen wurden auch in Alkalinitrat- [130] bzw.-hydrogensulfat- u n d -pyrosulfatschmelzen [131] getrennt. 4.1.3. Trennung von Anionen Das Schrifttum der Papierelektrophorese von Anionen ist wesentlich geringer als das der Kationen. Ein Grund hierfür liegt wohl darin, daß bei Anionen die durch Komplexbildung a u f t r e t e n d e Änderung der Ladung u n d der Wanderungsrichtung nicht ausgenutzt werden kann. Die Trennung der Anionen wird nicht nach der analytischen Gruppeneinteilung behandelt, da die Mehrzahl der in der Literatur beschriebenen Verfahren die Trennung von Gemischen verschiedener Gruppen betrifft. Einige Beispiele zur Trennung von Anionen sind in Tab. 15 angeführt. B I G H I u n d T R A B A N E L L I [ 7 3 ] trennten Thionate (S 3 0^~, S 4 0 | ~ , S s O§-) mittels kontinuierlicher Papierelektrophorese in l % i g e r Natrium-kaliumtartrat-lösung bei 20 °C und 12 mA in 12 Stunden. SANSONI u n d K L E M E N T [ 1 4 3 ] führten die kontinuierliche Papierelektrophorese von Polyphosphaten im Natriumborat-NatriumhydroxidPuffer, p H 10, durch. Tabelle Trennung

15 von Anionen

Ionen

mittels

diskontinuierlicher

Versuchsbedingungen, Bemerkungen

so§-, s2o§-

In photographischer Gelatine auch von anderen reduzierenden Substanzen getrennt

Thiosulfat, Tri-, Tetra-, Pentathionate, Selenound Telluro-Diund Tetrathionate

Beweglichkeit nimmt mit zunehmender S-Atomzahl ab; Beweglichkeit von Se- und Te-Verbindungen kleiner als von entsprechenden S-Verbindungen

Papierelektrophorese Elektrolyt

Literatur

0,2 M N a 2 H P 0 4 + 0,1 M Zitronensäure, pH 7

[132]

0,05 M Kaliumhydrogenphthalat, p H 4,2 und 6,2

[133]

4.1. PAPIERELEKTROPHORESE ANORGANISCHER SUBSTANZEN 113 (Fortsetzung von Tab. 15) Ionen

Versuchsbedingungen, Bemerkungen

Elektrolyt

Literatur

SeO§-, SeOf" Te©§-, TeO|-

7,5 V/cm, 3 Std.

0,4 N Na 2 S0 4

[134]

SeOl", TeO|-

2 Std., Se wandert nicht, Te wandert zur Kathode

0,5 N HCl

[135]

NH+, N2Hjj+, NH3OH+, NO3-, N 0 7 , N20§-,

Trennung in drei Schritten 0,001 N H 2 S0 4 ; Na 2 S0 4 — NaOH; Na 2 S0 4 —NaOH — - Fe(OH)3; Na 2 S0 4 — Ag 2 S0 4

H2POJ" , HPOF", POJ-

Nachweis der Wanderung mit radioaktivem Phosphat

Phosphorsäure

[137]

S O R , POJ-

150 V, 30 mA; Phosphat wandert kaum, Sulfat schnell zur Anode

0,5 n HCl

[135]

Kondensierte Phosphate

Hochspannungsverfahren

NaOH - Borat

[138]

N 2 0|-

Phosphat-Silikat

Natriumborat — NaOH

[136]

[102]

Cl-, B r " , J "

300 V, 10 Min.; Reihen- 0,25 M Milchsäure folge von Br und J Funktion der Elektrolytkonzentration; auch zweidimensional mit Chromatographie

[139]

J - , JO3-, JOj"

Studixmi der Umwandlung von 132Te zu 1 3 2 J

0 , 0 1 - 1 , 0 n NaOH

[140]

J O J , TeOf" JO3, - J -

Wie oben, Hochspannung

NaCl, < 0,5 n

[140]

J O r , JO3

3 - 4 0 0 V, 1 , 5 - 2 Std. Gips-Dünnschicht, auch quantitative Bestimmung

0,05 M (NH 4 ) 2 C0 3

[141]

Fe(CN)|", Fe(CN)|- CNS-, CR 2 or, POR

20 Min.; Cr20?~ wird während der Elektrophorese zersetzt

0,5 M Milchsäure

[142]

Fe(CN)t", Fe(CN)|-

5 V/cm, 30 bzw. 50 Min. Fe(CN)|- wandert 11 bzw. 23 mm; Fe(CN)|~ 22 bzw. 34 mm

0,5 n HCl, 0,1 3sr KCl

8 Yämoa

[135, 32]

114

4. A N W E N D U N G D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

J A K O V A C und L E D E R E R [19] trennten eine größere Anzahl von Anionen, darunter auch Metall-Anionen in 2%igem (NH 4 ) 2 C0 3 Elektrolyten bei 150 V in einer Stunde. G R A S S I N I und L E D E R E R [144] verwendeten zur Trennung bei 240 V 0,1 N NaOH. Die Wanderungswerte bei beiden Verfahren sind in Tab. 16 dargestellt. G R O S S [145] trennte Anionen mittels Hochspannungselektrophorese auf Whatman 3 MM in 0,1 M (NH 4 ) 2 C0 3 bei 100 V/cm. Die Temperatur des Kühlwassers war 12 °C, die Trennzeit 20 Minuten. Die Trennung von B r _ und Cl~ nahm auf längeren Papierstreifen 35 Minuten in Anspruch. Die auf Cl~ bezogenen Wanderungswerte sind in Tab. 17 angeführt. MOGHISSI [17] setzte die Dünnschicht-Hochspannungselektrophorese auf Kieselgel-Träger zur Trennung von Anionen ein. In 0,1 N. NaOH nahm die Trennung bei 45 V/cm nur einige Minuten in Anspruch. T A K I T A N I U. Mitarb. [146] trennten 19 anorganische Ionen und Oxalat auf stärkehaltigen Kieselgelschichten (Macherey und Nagel Silicagel S-HR) in 0,05 N Na 2 C0 3 -Lösung. Bei 1000 V/30 cm dauerte die Trennung 20 Minuten. B L A S I U S U. Mitarb. [147, 148, 149] studierten mittels Hochspannungspapierelektrophorese die bei der W A C K E N R O D E R schen Reaktion entstehenden Schwefelverbindungen.

Tabelle

16

Elektrophoretische und

Anion

BO§AsO|~ AsO|PO|" P2OfNOi N07 CICLO. C107 Br B1O3 JJOi" JO7

J 7,

Wanderungswerte

LEDERER [20,

von Anionen

nach

LEDERER

sowie

GRASSINI

144]

Wanderung, m m a

33 36,5 61 59 57 83 83 80 76 —

83 67 82 50 (2 Flecke, | 0 und 11, [Tailing

b

30-32 23-27 51-54 46-48 —

92 81-84 90-91 72-76 73-80 92-96 60-65 96-101 40-42 ( 5-15, 1 Tailing [bis 40

; 150 V, 1 Std., 2%iges (NH 4 )„CO, 240 V .1 Std., 0,1 N NaOH "

Anion F~ SCNSOfS2OR SOJs2or SeOjTeO|" TeO|" [Fe(CN) 6 ] 4 [Fe(CN) 6 ]3VO3 MOOR

Wanderung, mm a 67 64 70 86 78 80 60 49 38, Tailing 85 72 60 61

b 60-61 72-77 62-69 86-89 73-81 85 58-60 49-52 0 73-77 79-80 —

—

4.1. P A P I E R E L E K T R O P H O R E S E ANORGANISCHER SUBSTANZEN 115 Tabelle

17

Elektrophoretische Beweglichkeitswerte von Anionen Papierelektrophorese nach G R O S S [ 1 4 5 ]

Anion

ciBrJF" ClOj CIO, NO7 NOj S2" sor SOJ-

s2or s 2 o §s2or

POJBrO^ JO,' SCN" Fe(CN)|Fe(CN)J~"

Relative Wanderungsstrecke (Cl- = 1,00)** 1,00 1,03 0,96 0,71 0,85 0,84 0,95 0,91 0,92 0,71 0,84 0,92 0,71 0,92 0,56 0,73 0,49 0,81 0,96 0,87

bei der

Hochspannungs-

Beweglichkeit cm2 V" 1s" 1 • 10« kung 18 °C* 65,4 67,5 66,0 46,6 58,3 55,0 —

61,8

25 °C* 76,3

71,84 71,2

— —

68,3 —

72,0 79,8 85,0

Tailing

— — —

48,2 34,0 56,5

86,0

Tailing

—

0,1 M (NH4)2COa, 100 V/OM, 20 min, 13 mA/CM; Kühlwassertemperatur 12 °C. — * Aus Literaturangaben, freie Elektrophorese Absolute Beweglichkeit von Cl~ in der freien Elektrophorese 3 1 , 2 x l 0 - s (12—14°C); 3 4 , 6 x l 0 ~ 5 ( 1 8 - 2 0 ° C )

4.1.4. Nachweis anorganischer Ionen nach der Trennung

papierelektrophoretischen

Am einfachsten und bequemsten werden die getrennten Ionen direkt auf dem Papier nachgewiesen, deshalb soll hier auf die Nachweisverfahren nach Elution nicht eingegangen werden, obwohl solche o f t zum Einsatz gelangen.Z.B.werden, Nachweis und quantitative Bestimmung von Alkalimetall-Ionen nach Elution mittels Flammenphotometrie durchgeführt. In den meisten Fällen, auch bei Anwendung von Elutionsverfahren, ist es nötig, die Lage der nachzuweisenden Substanzen auf dem Papier zu bestimmen. Es werden einige Nachweisreagenzien beschrieben, welche die Sichtbarmachung der den einzelnen Ionen entsprechenden Zonen am Papier ermöglichen. Das Papier wird 8*

116

4. A N W E N D U N G D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

entweder mit den Reagenzlösungen besprüht oder eingetaucht. Reagenzien in Gas- oder Dampfform werden, da ihre Anwendung umständlicher ist, seltener eingesetzt. Am zweckmäßigsten werden Gruppen reagenzien angewandt, mit welchen gleichzeitig mehrere getrennte Ionen nachgewiesen werden können. Spezifische Reagenzien für einzelne Ionen werden nicht behandelt. Sie können in der Broschüre der F a . Merck [ 1 5 0 ] , und f ü r Kationen in der Arbeit von D E V R I E S u. Mitarb. [127] gefunden werden. 4.1.4.1. Nachweis von Kationen -Reagenzien und ihre Anwendung A l i z a r i n [127]: Die gesättigte Lösung in 96%igem Alkohol wird zum Besprühen des Papiers verwendet. In Ammoniakatmosphäre entwickelt sich die Färbung. Danach wird mit gesättigter wäßriger Lösung von Borsäure besprüht. Dabei ändert sich die Farbe einiger Ionenflecken. Alkali- und Erdalkali-Ionen reagieren — mit Ausnahme von Li, Mg und Ca — nicht, auch Cr 3 + , Cd, Ag, AsOf~, AsO|~~ und MoO| + geben keine Reaktion. O x i n [90,127]: Das Papier wird mit der l%igen Lösung des 8-Oxychinolin in 80%igem Äthanol besprüht, danach mit Ammoniak behandelt und im UV-Licht beobachtet. Die Färb flecken zahlreicher Kationen sind auch bei Tageslicht sichtbar. Cr 3 + , AsOj, - und AsO]~ reagieren nicht. Das Reagenz eignet sich auch zum Nachweis einer Anzahl seltener Erden. D i t h i z o n [127]: Zum Nachweis von Schwermetallionen wird eine 0,025%ige Lösung des Reagenzes in 80%igem Aceton verwendet, nach dem Besprühen wird das Papier in eine Ammoniakatmosphäre gebracht. K o j i s ä u r e [150]: 0,1 g in 100 ml 60%igem Äthanol werden als Sprühmittel benutzt. Die Metallionenflecken fluoreszieren im UVLicht. M o r i n [127, 150]: Nach Besprühen mit einer l%igen Reagenzlösung in Eisessig zeigen Al 3 + -Ionen im UV-Licht eine grüne Fluoreszenz. Nach dem Besprühen mit dem Gemisch von 1 Teil l % i g e r Morinlösung in 96%igem Äthanol und 4 Teilen konzentrierter Salzsäure kann im UV-Licht die gelbe Fluoreszenz von I n 3 + , Ga 3 + , T h 4 + , Sb 3 +, Ti 4+ und Zr 4 + beobachtet werden. Q u e r c e t i n [150]: Nach Besprühen mit der 0,2%igen Lösung des Reagenzes in 96%igem Äthanol können in Ammoniakatmosphäre im filtrierten UV-Licht Sb, Cu, Ni, Fe, Cr, Mn, K, Li und Be nachgewiesen werden.

4.1. PAPIERELEKTROPHORESE ANORGANISCHER

SUBSTANZEN 117

C h l o r a n i l s ä u r e [127]: Das Elektropherogramm wird in die 0,l%ige Reagenzlösung in Äther getaucht und danach mit reinem Äther gewaschen. Im UV-Licht gibt eine große Anzahl von Kationen verschiedene Farbeffekte. R u b e a n s ä u r e [150]: Das Papier wird mit einer 0,5%igen Rubeansäurelösung in 96%igem Äthanol besprüht. Das angetrocknete Elektropherogramm wird in eine Ammoniakatmosphäre gebracht, wo die Flecken von Cu, Co, M und Mn sichtbar werden. D i t h i o - o x a m i d [127]: Mit gesättigter Lösung des Reagenzes in 96%igem Äthanol wird besprüht. Dann werden die Papierstreifen in eine Ammoniak-Atmosphäre gehängt. Tl, Co, Ni, Pb, Cu, Ag, Bi, Sb und Au geben — in den meisten Fällen braune — Farbflecken. S c h w e f e l w a s s e r s t o f f [127]: Zum Nachweis der Kationen der I. und II. Gruppe werden die Papierstreifen zuerst mit Zitronensäurelösung angesäuert und dann in eine Schwefelwasserstoff-Atmosphäre gehängt. Falls nachher das Papier noch in eine AmmoniakAtmosphäre gebracht wird, können auch die mit (NH 4 ) 2 S reagierenden Kationen der I I I . Gruppe nachgewiesen werden. Zum Nachweis der Kationen der I. und I I . Gruppe eignet sich auch eine frisch bereitete 0,5%ige wäßrige Na 2 S-Lösung. D i p h e n y l c a r b a z i d [150]: Zum Nachweis von Ag, Pb, Cu, Sn, Mn, Zn und Ca wird das Papier mit einer l%igen Lösung in 96%igem Alkohol besprüht und dann getrocknet. Danach besprüht man mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung. D i p h e n y l c a r b a z o n [150]: Man benützt eine gesättigte Lösung in 96%igem Äthanol. Nach dem Besprühen muß mit 25%iger Ammoniumhydroxid- oder 1 n Natriumhydroxid-Lösung nachgesprüht werden. Mit dem Reagenz sind Ag, Zn und Cd nachzuweisen. V i o l u r s ä u r e [150]: Die l,5%ige wäßrige Lösung eignet sich zum Nachweis von Alkali- und Erdalkali-Ionen. Die besprühten Elektropherogramme müssen 30 Minuten bei 100 °C entwickelt werden. Die Violursäure ist eine sehr schwache Säure; falls die zu prüfende^ Lösung eine stärkere Säure als Essigsäure enthält, reagiert sie nicht. J 2 - D ä m p f e [151]: J 2 eignet sich zum Nachweis von K, Na, L i und Mg. N i n h y d r i n [152]: Die 0,l%ige Lösung in Äthanol wird alsSprühreagenz verwendet. Die Papierstreifen werden danach 10 Minuten lang bei 80 °C gehalten: K, Na, Li, Ca und Mg ergeben eine ähnliche Farbreaktion wie die Aminosäuren.

118

4. A N W E N D U N G D E R

PAPIERELEKTROPHORESE

4.1.4.2. Reagenzien zum Nachweis von

Anionen

Als Universal-Reagenzien können Säure-Basen-Indikatoren, z. B. eine 0,05%ige Bromkresolpurpur-Lösung in 90%igem Äthanol eingesetzt werden [145], Sonstige Reagenzien: 2 , 6 - D i c h l o r p h e n o l - I n d o p h e n o l - N a t r i u m [150]: 0,2 g werden in 100 mZ 96%igem Äthanol gelöst, dann mit 3 g AgN0 3 geschüttelt und filtriert. Ammoniummolybdat-Perchlorsäure-Reagenz [150] zum Nachweis von Phosphorsäuren. Lösung I: 3 g (NH 4 ) 2 Mo0 4 in 225 ml Wasser + 30 ml NH4C1 und 15 m/ 60%ige Perchlorsäure. Lösung II: 0,2 g SnCl2 in 5 ml 36%iger Salzsäure werden mit Wasser auf 250 ml verdünnt. Die Lösung ist frisch zu bereiten. Nach Besprühen mit Lösung I muß das Elektropherogramm 3 bis 5 Minuten bei 105 °C getrocknet und dann mit Lösung I I besprüht werden. A m m o n i a k - S i l b e r n i t r a t [73, 142] eignet sich zum Nachweis von Ferrocyanid, Ferricyanid, Rhodanid, Thionaten usw. 0,01 n J 2 - L ö s u n g [132] kann zum Nachweis von Sulfit und Thiosulfat verwendet werden.

4.1.5. Quantitative

Bestimmung

F ü r die quantitative Bestimmung stellte M A K I [153] im Falle von Ba 2 + und Al 3 + -Ionen eine lineare Beziehung zwischen der Zonenlänge der getrennten Substanzen und ihren Konzentrationen fest. Ein ähnlicher Zusammenhang wurde auch bei der Elektrophorese von [Co(NH 3 ) 6 ] 3 ~ u n d [Fe(CN) 6 ] 4_ -Ionen gefunden. In letzterem Falle war die Länge der getrennten Zonen auch dem reziproken Wert der Ionenstärke des Puffers proportional [154].

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chem. Commun 24 (1959), 1385 [137] ENGELCKE, J. L., STRAIN, H . H . : Analyt. Chem. 26 (1954), 1872 [138] SANSONI, B., BAUMGARTNER, L.: Z. analyt. Chem. 158 (1957), 241 [139] NAGAI, H.: K u m a m o t o J. Sei., Ser. A 2 (1954), 103; Ref.: Chem. Abstr. 50 (1956), 13655 g [ 1 4 0 ] SHUKLA, S . K . , BACHER, M . , ADLOFF, J . P . : J . C h r o m a t o g r . 10 ( 1 9 6 3 ) , 9 3 [ 1 4 1 ] DOBICI, F . , GRASSINI, G . : J . C h r o m a t o g r . 10 ( 1 9 6 3 ) , 9 8

[142] NAGAI, H . , KURATA, SH.: J. chem. Soc. Japan, pure Chem. Sect. 77 (1956),

451

[143] SANSONI, B., KLEMENT, R.: Angew. Chem. 66 (1954), 598 [ 1 4 4 ] GEASSINI, G . , L E D E R E B , M . : J . C h r o m a t o g r . 2 ( 1 9 5 9 ) ,

[145] GBOSS, D.: Chem. and Ind. (1957), 1597

326

[ 1 4 6 ] TAKITANI, S . , SUZUKI, M . , F U J I T A , N . , HOZUMI, K . : J a p a n A n a l y s t

(1966), 595 [147] BLASIUS, E „ KRÄMER, R.: J. Chromatogr. 20 (1965), 367 [148] BLASIUS, E „ WAGNER, H.: J. Chromatogr. 26 (1967), 549 [ 1 4 9 ] BLASIUS, E . , SCHÖNHABD, G . : J . C h r o m a t o g r . 28 ( 1 9 6 7 ) , [ 1 5 0 ] MEECK, E . A . G . : » A n f ä r b e r e a g e n z i e n für Dünnschicht-

385 und

15

Papier-

Chromatographien, Darmstadt [151 ] TAKA.CS, M.: J. Chromatogr. 14 (1964), 564 [152] GBOSS, D.: J. Chromatogr. 10 (1963), 233 [153] MAKI, M.: Japan Analyst 4 (1955), 413; Ref.: Chem. Abstr. 50 (1956), 16529 i

[154] MAKI, M.: Japan Analyst 4 (1955), 377; Ref.: Chem. Abstr. 50 16529 i

(1956).

4.2. Die Papierelektrophorese organischer Substanzen Das Anwendungsgebiet der Papierelektrophorese umfaßt sozusagen sämtliche Gruppen der organischen Substanzen. Vorwiegend wird sie jedoch auch heute zur Analyse von Proteinen, Aminosäuren und Peptiden eingesetzt. Demgemäß ist die Literatur über die papier elektrophoretische Trennung dieser Substanzgruppen sehr groß, während der Trennung anderer Substanzen oft nur eine geringe Anzahl von Veröffentlichungen gewidmet wurde.

4.2.1. Trennung von Oxyverbindungen (Alkohole und Phenole) Mittels Papierelektrophorese hat man Phenole, Phenolderivate und mehrwertige Alkohole getrennt. Letztere werden auch bei den Kohlehydraten (Kap. 4.2.3.) behandelt. Die Phenole können in Form ihrer Boratkomplexe elektrophoretisch getrennt werden. F O S T E R trennte zyklische Alkohole in einer 0,012 M Boraxlösung bei einer Feldstärke von 20 V/cm [1, 2, 3]. M I C H L [4]

122

4. A N W E N D U N G

DER

PAPIERELEKTROPHORESE

[135] LEDERKE, M.: Chem. and Ind. 1954, 1481 [ 1 3 6 ] VEPBEK-SISKA, J . , SMEBOTTS, F . , PLISKA, V . , VESELY, F . :

Coll.

Czech,

chem. Commun 24 (1959), 1385 [137] ENGELCKE, J. L., STRAIN, H . H . : Analyt. Chem. 26 (1954), 1872 [138] SANSONI, B., BAUMGARTNER, L.: Z. analyt. Chem. 158 (1957), 241 [139] NAGAI, H.: K u m a m o t o J. Sei., Ser. A 2 (1954), 103; Ref.: Chem. Abstr. 50 (1956), 13655 g [ 1 4 0 ] SHUKLA, S . K . , BACHER, M . , ADLOFF, J . P . : J . C h r o m a t o g r . 10 ( 1 9 6 3 ) , 9 3 [ 1 4 1 ] DOBICI, F . , GRASSINI, G . : J . C h r o m a t o g r . 10 ( 1 9 6 3 ) , 9 8

[142] NAGAI, H . , KURATA, SH.: J. chem. Soc. Japan, pure Chem. Sect. 77 (1956),

451

[143] SANSONI, B., KLEMENT, R.: Angew. Chem. 66 (1954), 598 [ 1 4 4 ] GEASSINI, G . , L E D E R E B , M . : J . C h r o m a t o g r . 2 ( 1 9 5 9 ) ,

[145] GBOSS, D.: Chem. and Ind. (1957), 1597

326

[ 1 4 6 ] TAKITANI, S . , SUZUKI, M . , F U J I T A , N . , HOZUMI, K . : J a p a n A n a l y s t

(1966), 595 [147] BLASIUS, E „ KRÄMER, R.: J. Chromatogr. 20 (1965), 367 [148] BLASIUS, E „ WAGNER, H.: J. Chromatogr. 26 (1967), 549 [ 1 4 9 ] BLASIUS, E . , SCHÖNHABD, G . : J . C h r o m a t o g r . 28 ( 1 9 6 7 ) , [ 1 5 0 ] MEECK, E . A . G . : » A n f ä r b e r e a g e n z i e n für Dünnschicht-

385 und

15

Papier-

Chromatographien, Darmstadt [151 ] TAKA.CS, M.: J. Chromatogr. 14 (1964), 564 [152] GBOSS, D.: J. Chromatogr. 10 (1963), 233 [153] MAKI, M.: Japan Analyst 4 (1955), 413; Ref.: Chem. Abstr. 50 (1956), 16529 i

[154] MAKI, M.: Japan Analyst 4 (1955), 377; Ref.: Chem. Abstr. 50 16529 i

(1956).

4.2. Die Papierelektrophorese organischer Substanzen Das Anwendungsgebiet der Papierelektrophorese umfaßt sozusagen sämtliche Gruppen der organischen Substanzen. Vorwiegend wird sie jedoch auch heute zur Analyse von Proteinen, Aminosäuren und Peptiden eingesetzt. Demgemäß ist die Literatur über die papier elektrophoretische Trennung dieser Substanzgruppen sehr groß, während der Trennung anderer Substanzen oft nur eine geringe Anzahl von Veröffentlichungen gewidmet wurde.

4.2.1. Trennung von Oxyverbindungen (Alkohole und Phenole) Mittels Papierelektrophorese hat man Phenole, Phenolderivate und mehrwertige Alkohole getrennt. Letztere werden auch bei den Kohlehydraten (Kap. 4.2.3.) behandelt. Die Phenole können in Form ihrer Boratkomplexe elektrophoretisch getrennt werden. F O S T E R trennte zyklische Alkohole in einer 0,012 M Boraxlösung bei einer Feldstärke von 20 V/cm [1, 2, 3]. M I C H L [4]

4.2. P A P I E R E L E K T R O P H O R E S E ORGANISCHER SUBSTANZEN

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