Die biologische Stickstoff-Fixierung [Reprint 2021 ed.] 9783112585788, 9783112585771

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Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften der DDR Mathematik - Naturwissenschaften - Technik

Benno Parthier

Die biologische Stickstoff-Fixierung

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

14N 1Ü7C ia i u

Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften der D D R Mathematik — Naturwissenschaften — Technik

Benno Parthier

Die biologische Stickstoff-Fixierung Erkcnntnisstand und Problematik einer denkbaren praxisbezogenen Nutzung

AKADEMIE-VERLAG 1978

BERLIN

Jahrgang 1978 • Nr. 14/N

Vortrag auf der Sitzung der Klasse Biowissenschaften der Akademie der Wissenschaften der DDR am 2 7 . 1 0 . 1 9 7 7 von Prof v Dr. Benno Parthier, Institut für Biochemie der Pflanzen der AdW der DDR

Herausgegeben im Auftrage des Präsidenten der Akademie der Wissenschaften der DDR von Vizepräsident Prof. Dr. Heinrich Scheel

Erschienen im Akademie-Verlag, 108 Berlin, Leipziger Slraße 3—4 © Akademie-Verlag Berlin 1978 Lizenznummer: 202 • 100/231/78 C.csamtherslcllung: V E B Druckhaus Kölhen Bestellnummer: 762 693 2 (2010/78/14/N) • L S V 1315. Printed in G D R DDR 3 . - M

Die biologische Stickstoff-Fixierung — Erkenntnisstand und-Problematik einer denkbaren praxisbezogenen Nutzung Einleitung Die Bevölkerung unserer Erde steht auf dem Sektor Energie und Ernährung mit dem Ausgang dieses Jahrhunderts vor zwei riesigen Problemen, die sie bewältigen muß, wenn sie ihre Existenz sichern will — die Nutzung neuer Energiequellen und die Schaffung ausreichender Nahrungsmittel für eine noch immer exponentiell ansteigende Zahl menschlicher Individuen. Das zweite Problem ist eng mit dem Aspekt der biologischen Stickstoff-Assimilation als einer Grundlage der pflanzlichen Eiweißproduklion und damit der menschlichen Ernährung verbunden. E s stellt sich die berechtigte Frage, ob unsere heute genutzten Möglichkeiten der biologischen Stickstoff-Fixierung verbessert werden können, ob diese die Stickstoff-Düngung mit chemischen Produkten ergänzen, reduzieren oder gar ersetzen kann. Die Voraussetzungen für solche Vorstellungen behandelt dieser Aufsatz auf der Grundlage unserer heutigen biologischen, biochemischen und molekulargenetischen Kenntnisse über diesen Prozeß. Stickstoff-Verteilung

und -Assimilation

in globaler

Sicht

Im Gegensatz zur drohenden Erschöpfung der Energiequellen Kohle, Erdöl und Erdgas, die angestrengtes Suchen nach Mobilisierung rezenter C-Quellen ausgelöst hat, gibt es im Stickstoff-Haushalt unseres Planeten keinen Mangel an RohstoffReserven. Der Anteil von 8 0 % N2 in der Atmosphäre, dem 4 X 10 1 5 t entsprechen, ist unerschöpflich. Außerdem regeneriert er sich wenigstens teilweise wieder im Zuge eines Stickstoff-Kreislaufs auf der Erde. Gar nicht zu reden ist von den unermeßlichen, praktisch jedoch unzugänglichen Vorräten an Stickstoff höherer Oxydalionsstufen in den Gesteinen. B e i m Stickstoff liegt das Problem in einer suboptimalen Verfügbarkeit seiner biologisch wichtigen, reduzierten Form. Abbildung 1 zeigt eine stark vereinfachte Ubersicht über den Kreislauf des Stickstoffs und die daran beteiligten wichtigsten Prozesse. Die Pflanzen entnehmen Stickstoff aus dem Boden in der Regel als Nitrate, die mittels Nitrat- und Nitritreduktasen der Pflanzen oder auch der Bodenflora zu Ammoniak reduziert werden

(„gebundenes"

NH/, + ).

Uber Aminosäurebildung

und Biosynthese,

Stoff-

3

Pflanze

Atmosphäre

Boden Abb. 1

Schematische Übersicht über den Stickstoff-Kreislauf auf unserem Planeten

Wechsel u n d A b b a u der pflanzlichen P r o t e i n e erreicht der Stickstoff den

Boden

wieder, entweder nach A u l o l y s e oder ü b e r den U m w e g durch das T i e r . D a s „ f r e i e " A m m o n i a k i m B o d e n k a n n durch nitrifizierende B a k t e r i e n o x y d i e r t werden, wom i t dieser T e i l des Kreislaufs geschlossen ist. Schon in einer nicht kultivierten L a n d s c h a f t w ü r d e dieser K r e i s l a u f den Stickstollbcdarf nicht p e r m a n e n t decken k ö n n e n , weil ein nicht unerheblicher T e i l d a v o n durch die Aktivität einer denitrifizierenden

B o d e n f l o r a in die A t m o s p h ä r e entweicht (Abb. I). U n s e r e n nach Hoeh-

leislungskriterien gezüchteten K u l t u r p f l a n z e n genügt die so v e r f ü g b a r e Stickstoffm e n g e j e d o c h in k e i n e r W e i s e ; sie sind auf die Z u f u h r relativ großer M e n g e n künstlichen Stickstoffdüngers angewiesen. Quelle des mineralischen Düngers ist die chemische Industrie, die i m HABER-Boscu-Verfahren

NH3 aus Luftstiekstoff

und

II-j-Gas unter h o h e m D r u c k u n d h o h e r T e m p e r a t u r , also mit g r o ß e m Energieaufw a n d herstellt. — Nur ein relativ k l e i n e r Anteil der irdischen F l o r a v e r m a g den atmosphärischen Stickstoff zu b i n d e n u n d hat sich damit eine einzigartige Möglichkeit zur Stickstoff-SelbsLversorgung geschaffen. D i e heutige

Situation

in der landwirtschaftlichen

Erzeugung

von

Pflanzen-

eiweiß ist durch die D o m i n a n z des G e t r e i d e a n b a u e s gekennzeichnet. E r steuert 8 0 — 9 0 % zur G e s a m t p r o d u k t i o n bei, wenn die notwendigen M e n g e n a n D ü n g e r

4

under cereal cultivafion

!ha)

Abb. 2 Beziehung zwischen dem Kornertrag von Getreide und der Menge an StickstoffDüngung in hochentwickelten ( X ) und wenig entwickelten Ländern (O) in den Jahren 1950 bis 1971. Aus [1] zur V e r f ü g u n g gestellt werden. In A b b . 2 ist das V e r h ä l t n i s zwischen Getreideproduklion

(kg Körner/ha)

und Stickstoff-Düngung

globaler

dargestellt für den

Z e i t r a u m 1 9 5 6 — 1 9 7 1 , a b e r E x t r a p o l a t i o n d a r ü b e r h i n a u s erscheint zulässig. Außerd e m ist zwischen hochentwickelten L ä n d e r n (x) u n d sog. E n t w i c k l u n g s l ä n d e r n (o) unterschieden worden. Zwei T e n d e n z e n sind eindeutig a b z u l e s e n : E r s t e n s , d a ß in beiden L ä n d e r g r u p p e n H e k t a r e r t r ä g e und eingebrachte D ü n g e r m e n g e n kontinuierlich und proportional angestiegen sind — oder m i t a n d e r e n W o r t e n , E r h ö h u n g der K o r n e r t r ä g e n u r auf K o s t e n gesteigerter S t i c k s l o ü g a b e n erreicht wird. Zweitens, d a ß in den hochentwickelten L ä n d e r n die H e k t a r e r t r ä g e zwar u m den F a k t o r 1,5 bis 2 ü b e r denen der weniger entwickelten L ä n d e r liegen, es wird allerdings die vierfache

Menge

Stickstoff-Dünger in den B o d e n gebracht. B e i A n h a l t e n dieses T r e n d s werden im J a h r e 2 0 0 0 etwa 2 0 0 Mio. t Stickstoffdünger gebraucht, u m die W e l t e r n ä h r u n g zu sichern. 1 9 7 4 waren es 4 0 M i o . t, die

5

nicht ausreichten, u m die Nachfrage der Landwirtschaft zu befriedigen. Es darf auch nicht u n e r w ä h n t bleiben, daß n u r etwa 50% des chemischen StickstoffDüngers von den Pflanzen genutzt werden. Die übrigen 50% belasten das Grundwasser oder werden durch Denitrifikation der Atmosphäre zurückerstattet. Der hohe Energieverbrauch des HABER-BOSCH-Verfahrens, die wachsenden Transportkosten u n d steigenden Absatzpreise des mineralischen Stickstoff-Düngers h a b e n verständlicherweise zur Suche nach anderen, billigen Möglichkeiten der N2Reduktion angeregt. Neben den Agrarökonomen interessieren sich besonders die Naturwissenschaftler dafür, u n d seit etwa einem J a h r z e h n t wird in einigen hochentwickelten Ländern mit bemerkenswerter Intensität u n d nicht m i n d e r massiver finanzieller Unterstützung gezielt nach solchen ¡Möglichkeiten geforscht. Abgesehen von zumindest z. Zt. noch unbedeutenden, billigeren chemischen Verfahren ist es die biologische Stickstoff-Fixierung, die im B r e n n p u n k t des Interesses steht. W e n n m a n eine pauschale Bilanz der ^ - F i x i e r u n g auf der E r d e zieht, leuchtet dies u m so m e h r ein (Tab. 1). Tabelle 1 Aufschlüsselung der ^-Bindung auf der Erde auf verschiedenen Wegen und Vergleich zur Denitrifikation ( 10° t

kg

Fläche

Jahr

ha, Jahr

10" ha

^-Fixierung: 1. atmosphärisch (Blitz, Ozonisation, etc.): 2. industriell (HABER-Boscu-Verf.): 3. biologisch (gesamt): Landwirtschaft Leguminosen Nicht-Leguminosen Reisfelder Andere Vegetationen Meere Summe: Denitrifikation: Kontinente Meere Summe: Daten nach

H A R D Y & HAVELKA [ 1 ] ;

27 40* 175 90 75 8 7 57 28

50 — 350 5 30 25—30 0,6

0,25 1 0,14 12 36

242

43 40 83

3' 1

BURKS & HARDY [ 2 ] ;

13,4 36

QUISPEL [ 3 ]

* Jährliche Weltproduktion von ^-Düngemitteln mittels chemischer Verfahren: t (Statistisches Jahrbuch 1 9 7 7 . Staatsverlag der DDR, Berlin 1 9 7 7 ) .

42,3 X 106

6

Der Anteil biologischer ^ - F i x i e r u n g ist danach die wichtigste Quelle für den organisch gebundenen Stickstoff; die größere Hälfte davon stammt aus landwirtschaftlich genutzten Flächen, von diesen wiederum mehr als 3//, durch Leguminosen der Felder und Dauerwiesen. Die Meere spielen in der Intensität der Fixierung eine untergeordnete Rolle, obgleich sie auf Grund ihrer Größe insgesamt einen nennenswerten Beitrag liefern. Die Ziele der Wissenschaftler und der Wirtschaftsplaner sind daher klar abgesteckt: Optimierung der biologischen AVI'ixicrung bei Leguminosen auf der einen Seite; Suche nach neuen, ökonomisch vertretbaren Wegen einer No-Bindung durch Nicht-Leguminosen auf der anderen Seite. In beiden Fällen sind genaue Kenntnisse über den Fixierungsprozeß, über seine Prämissen, seine Mechanismen und deren Beeinflußbarkeit notwendige, erforschbare Voraussetzungen. Biologie und Physiologie

der

Stickstoff-Fixierung

Ernstzunehmende Forschungsarbeiten auf diesem Gebiete begannen in den 80er J a h r e n des vorigen Jahrhunderts, als die beiden Deutschen WILIARTH

HELLRIEGEL

und

mehrjährige Düngungsexperimente durchführten und ihre Ergebnisse

1 8 8 8 in den Mitteilungen des Vereins für Rübenzuckcrindustrie des Deutschen Reiches publizierten. In Abb. 3 ist das Hauptergebnis ihrer Bemühungen dargestellt.

gN o/s Ca tNOj)2 pro 6efoR Abb. 3

Vergleich von Wachstum bzw. Ertrag zwischen Hafer und Erbsen nach Düngung

m i t unterschiedlichen M e n g e n a n C a ( X 0 3 ) 2 . Nach HELLRIEGEL u n d WILFARTIIS E r g e b n i s s e n

zitiert in [2]

7

Sie verglichen Wachstum bzw. Ertrag von Hafer und Erbsen in separaten Kulturgefäßen nach Düngung mit unterschiedlichen Mengen an Ca-Nitrat und fanden einen erstaunlichen Unterschied: Während beim Getreide eine direkte Abhängigkeit zwischen Ertrag und zugefügter Düngermenge zu beobachten war, bestand diese Relation bei der Leguminose nicht — der Ertrag ohne Düngung war jenem bei mittlerer Düngergabe gleich. Daraus schlössen sie, daß Leguminosen ihren Stickstoff-Bedarf aus der Luft decken könnten und schrieben diese Fähigkeit den bereits bekannten Wurzelknöllchen zu. Noch im gleichen Jahr isolierte B E I J E R I N C K ein Bakterium aus den Knöllchen und nannte es Rhizobium radicicola. 1 8 9 2 fand W I I N O G H A D S K Y mit Clostridium pasteurianum ein freilebendes, Stickstoff bindendes Bakterium und führte damit den Beweis, daß Symbiose keine Voraussetzung für die N2-Fixierung ist. In den folgenden Jahrzehnten wurde nicht nur bekannt, daß fast alle Leguminosen-Arten Wurzelknöllchen besitzen, die von artspezilischen Rhizobien ausgelöst werden; man fand darüber hinaus in der Natur eine breite Palette von Organismen mit der Fähigkeit zur ^-Fixierung, der sog. Diazotrophie. Heute kennt man allein 15 Gattungen mit mehr als 200 Arten von Nicht-Leguminosen, die mit unterschiedlichen Mikroben in Symbiose leben, darunlcr Hölzer wie Erle oder Sanddorn, die in sehr feuchten, bzw. sehr trockenen Böden eine Pionierfunktion erfüllen. Neben freilebenden Anaerobiern gibt es auch aerobe NVFixierer wie Azotoiwcfer-Species oder Klebsiella pneumoniae. Sie leben teilweise in der Rhizosphäre der höheren Pflanzen oder gar in Assoziation mit den Wurzeloberflächen. Auf den Blättern von Urwaldpflanzen können ^-fixierende Bakterien Knötchen bilden. Schließlich gehören Blaualgen, frei oder intra- bzw. interzellulär in Hohlräumen von höheren Pflanzen oder in Gemeinschaft mit Pilzen als Flechten lebend, zu den wirkungsvoll Stickstoff fixierenden Organismen. Allen gemeinsam ist ihre prokaryotische Organisation. Abb. 4 enthält einige Beispiele ^-fixierender Formen oder Systeme. Free-living Nitrogen fixing organism

Associated organism

Azofobacter vinelandii

Hone

bacteria

. 0 Uosiridium posteurianum

None

Klebsiella pneumoniae

Various

Rhodospirillum rubrum

Cilrobacler freundii

None

Termite natural habitat Abb. 4

8

Aerobic

soils

Aerobic and anaerobic, Surface of soils; water; also in polluted ponds Anaerobic soils association with la photosynfhetic bacterium 1 plants, man

Termite

Beispiele freier und symbiontischer N 2 -Fixierung in der Natur. Aus [5]

gut

Welche NYFixierungsraten von den einzelnen Systemen erreicht werden, zeigt Tab. 2. Daraus geht hervor, daß Klee-, Lupinen- und besonders Luzerne-Arien die höchsten Fixierungsraten erreichen, daß auch bei Nicht-Leguminosen beträchtliche Raten beobachtet werden können, die jedoch auf Grund sehr unterschiedlicher Bedingungen stark schwanken. Von den Blaualgen-Assoziationen ragt der Wasserfarn Azolla hervor, in dessen Blatthöhlen Anabaena azollae Stickstoll assimiliert. Aus diesem Grunde werden Azolla oder auch freilebende Blaualgen in asiatischen Reisfeldern zur Gründüngung herangezogen. Interessant sind Assoziationen zwischen tropischcn Gräsern und freilebenden ^ - f i x i e r e n d e n Bakterien, die allein eine sehr geringe Rate aufweisen. Hierauf werden ökonomische Hoffnungen gesetzt, doch sind die bisherigen Ergebnisse noch sehr umstritten (vgl. S. 25). Wie sehr die ^ - F i x i e r u n g von der Anwesenheit der symbiontischen Bakterien abhängt, zeigen Vergleiche zwischen normal und steril angezogenen Leguminosen. Knöllchenfreie Pflanzen entwickeln sich nach Verbrauch der Reserven in den Samen praktisch nicht weiter. — Andererseits ist es in jüngerer Zeit unabhängig voneinander mehreren Arbeitsgruppen gelungen, Rhizobien auch extrazellulär zu kultivieren [7, 8]. Zunächst wurde Xo-Fixierung in Zellkulturen gefunden, die mit Rhizobium beimpft wurden. Die Bakterien drangen nicht in die Zellen ein, erhielten jedocli von dort offenbar Stoffe, die zur Ausbildung des ^ - f i x i e r e n d e n Enymkomplexes führten [9]. Schließlich fand man, daß Pentosen und Glutamat in der Kulturflüssigkeit genügten, um eine allerdings sehr schwache Aktivität nachzuweisen; sie liegt unter einem Prozent im Vergleich zu dem entsprechenden intakten symbiontischen System. Diese Experimente bewiesen jedoch, daß der Stickstoff-reduzierende Enzynikomplex von der bakteriellen DNA codiert und im Bakterium synthetisiert wird, nicht in der Zelle der höheren Pflanze.

Symbiotic

bacteria

Hon legumes

¡V *

Frankia

Atni

it Alder

Legumes

s _ , '' s ' / Nostoc muscorvm Anaboeno oiollae RhiiobiumjaponicM

1Tropical herb)

Alalia (Aquatic

feni)

Soybean

Root nodules of In stems; In leaf pores ; Root nodules of the alder tree a cyanobacterium a cyanobacterium the soybean

Rhiiobium

trifohi Rhiiobium

o^L.

w •

Clove r

Hoot nodules of clovcr

Ä

meliloti

Alfalfa

—i

Rout nodules of alfalfa

,

9

Tabelle 2 Vergleich der N2-Fixicrungskapazitäten verschiedener Systeme bzw. Organismen System

N2 fixiert (kg/ha/Jahr)

1. Symbiosen: Leguminosen (Rhizobium) Sojabohne Ackerbohne Klee Luzerne Lupine

60-90 80 — 90 100-160 130-600 150-170

Nicht-Leguminosen (Actinomyceten) Erle Sanddorn

40-300 2 — 180

2. Blaualgen-Assoziationen: Gunnera Azolla Flechten 3. Bakterien-Assoziationen: Azotobacter paspali/Paspalum Spirillum lipoferum/Digitaria (Mais, Reis, Zuckerrohr)

12-20 60-150 40-80 etwa 100 etwa 100 etwa 100

4. Freilebende Mikroorganismen: Blaualgen Azotobacter (aerob) Clostridium (anaerob) Daten nach

BUHNS & H A R D Y [2] ; EVANS & BARBER

25 0,3 0,3 [4]

Der Infektionsprozeß Aus Abb. 5 wird ersichtlich, daß sich die Bakterien im Innern der LeguminosenWurzelzellen befinden. W i e k o m m e n sie dort hin? Die zuvor freilebenden, nicht ^ - f i x i e r e n d e n F o r m e n infizieren Wurzelhärchen, das sind einzellige Absorptionsorgane der Wurzel, vielleicht angelockt durch Wurzelausscheidungen mit attrahierender Wirkung. Auf einen Stimulus der Bakterien hin (Indolylessigsäure?) krümmen sich die Spitzen der Wurzelhaare charakteristisch u m (Abb. 5), Polygalakluronase wird ausgeschieden. Beides f ü h r t zur Schwächung der Zelhvand der Wurzelhaare. Sie wird lokal invaginiert u n d wächst als ein aus Zellulose bestehender Infektionsschlauch in das Wurzelhaar hinein. I m Schlauch befinden sich die Bakterien. An den Wurzelrindenzellcn gibt es wieder eine Invagination. Im Cyloplasma der Rindenzelle platzt der Schlauch auf, die Bakterien ergießen sich ins 10

Zellplasma und vermehren sich, bis von der Rindenzelle nur ein randständiger Plasmaschlauch übrig bleibt. Aber auch die Rindenzellen proliferieren stark, wobei Cytokinin eine auslösende Rolle spielt. Die Bakterien verlieren ihre ursprüngliche Form, während sie durch eine Membran einzeln oder zu wenigen eingekapselt

a

Abb. 5 Schematisehe Darstellungen über Wurzelknöllclien an Leguminosen (a), Querschnitt durch Knöllchen (b), durch eine Wurzelrindenzelle mit eingekapselten Bakteroiden (c), Bakteroidenformen (d) sowie den InteklionsVorgang (e). Aus [10]

w e r d e n . D i e M e m b r a n w i r d v o n d e r Wirlszelle gebildet. E i n

Wurzelknöllchen

e n t h ä l t e t w a 3 5 0 0 0 Zellen m i t je 10 0 0 0 oder m e h r K a p s e l n , w o r i n m e i s t 4 — 6 B a k t e r o i d e e n t h a l t e n sind [2, 3]. Die m o r p h o l o g i s c h e W a n d l u n g d e r v e g e t a t i v e n B a k t e r i e n z e l l e z u m nicht-veget a t i v e n S t a t u s des B a k t e r o i d s v e r l ä u f t parallel m i t physiologischen V e r ä n d e r u n g e n , d e r e n wichtigste die B e f ä h i g u n g z u r X>-Eixierung ist. J e t z t w e r d e n m a s s i v G e n e a k t i v i e r t , die z u r N e u s y n t h e s e des v e r a n t w o r t l i c h e n E n z y m k o m p l e x e s , d e r Nitrogenase, f ü h r e n . E s e n t s t e h e n gleichfalls g r o ß e M e n g e n a n L e g h ä m o g l o b i n , d a s i m C y t o p l a s m a d e r W i r t s z e l l e dicht a n d e n K a p s e l m e m b r a n e n a n g e o r d n e t vorliegt. Auf d i e Artspezifität d e r B h i z o b i e n w u r d e o b e n b e r e i t s h i n g e w i e s e n . W i e e r k e n n t R. trijolii,

d a ß die K l e e w u r z e l d e r richtige W irt ist u n d a k z e p t i e r t L u z e r n e n i c h t ?

E r s t v o r w e n i g e n J a h r e n k o n n t e n spezifische P r o l e i n e a n d e r Z e l l w a n d d e r W u r z e l h a a r e e n t d e c k t w e r d e n , d i e d e n E r k e n n t n i s p r o z e ß e r m ö g l i c h e n [5], z. B. d a s T r i f o l i i n d e r K l e e w u r z e l n . E s w u r d e g e f u n d e n , d a ß f ü r Trifoliin i m m u n o l o g i s c h s e h r ä h n l i c h e B i n d u n g s o r l e in d e r S c h l e i m k a p s e l des B a k t e r i u m s u n d in d e r Zellw a n d des W u r z e l h a a r e s v o r l i e g e n (Abb. 6). Diese ü b e r r a s c h e n d e E n t d e c k u n g e i n e r gleichartigen a n t i g e n e n A f f i n i t ä t v o n W i r t s z e l l e u n d k ü n f t i g e m S y m b i o n t gleichen A n t i k ö r p e r m o l e k ü l w i r d m i t e i n e r A r t v o n M i m i k r y auf

zum

molekularer

E b e n e e r k l ä r t [5], d. h. d a s B a k t e r i u m v e r m a g b e s t i m m t e Teile d e r O b e r f l ä c h e d e r W i r t s z e l l w a n d z u i m i t i e r e n . D a d u r c h soll d a s i m m u n o l o g i s c h e A b w e h r s y s t e m d e r Zelle ü b e r l i s t e t w e r d e n ; so k a n n d a s B a k t e r i u m sich E i n g a n g v e r s c h a f f e n .

Trifoliin

Binding

site

Binding

site

Abb. 6 Schemalische Darstellung der „Erkennung" der Wurzelhaaroberfläche von Klee durch Rhizobium trijolii mittels Erkennungsprotein Trifoliin. Aus [5]

12

Biochemie

und

Enzymologie

Der Nitrogenase-Komplcx Die Stickstoff-Fixierung wird in komplizierter und im Detail noch nicht geklärter Weise

von

einem

Multienzymkomplex

katalysiert,

dem

Nitrogenase-

Systern. Dieses ist eine ungewöhnliche Erfindung der Natur, die in der Enzymologie ihresgleichen sucht. Nitrogenase ist der einzige bisher bekannte biologische Katalysator, der Dreifachbindungen aufzubrechen vermag, nicht nur jene des Distickstoff-Moleküls, sondern auch die von — C = N , — N = C — und — C = C — . Nitrogenase reduziert also auch Nitrile wie Cyanid, Isonitrile und Alkine, unter denen die Reduktion des Acctylens zu gaschromatographisch erfaßbarem Äthylen als Bestimmungsmethode der Nitrogenase-Aktivilät überragende Bedeutung erlangt hat. Diese Entdeckung [11] hat sich als außerordentlich fruchtbar für die NitrogenaseForschung erwiesen und leitete deren extensive Periode ein. 1960 war ein zweiter entscheidender methodischer Fortschritt gelungen, die NVFixierung in zellfreien Extrakten aus Clostridium.

Trotz großer Bemühungen mehrerer Arbeitsgruppen

war es bis dahin unmöglich gewesen, auch unter strikt anaeroben Bedingungen zellfreie Enzymaktivität nachzuweisen. In CARNAHANS Laboratorium [12] gelang es mit dem Trick einer extrem hohen Pyruvalzugabe. Pyruvat dient in der phosphoroklastischen Reaktion zugleich als Elektronendonator und Energiequelle, da zunächst Acetylphosphat entsteht, das mit Hilfe der Acetokinase A T P liefert. Zugleich wurde Ferredoxin als Elektronentransport-Protein erkannt. F ü r ein Mol fixierten Stickstoffs wurden 1 0 0 Mole Pyruvat verbraucht, woraus der hohe Energieaufwand der Nitrogenase-Reaktion (s. unten) angedeutet wurde. Zunächst seinen einige Eigenschaften des Nitrogenase-Komplexcs

vorgestellt.

E r besteht aus zwei Enzymkomponenten, diese aus mehreren monomeren Untereinheiten (Abb. 7). Alle enthalten sie für die Katalyse wichtige Metalle. Die eisenhaltige Komponente

II

(55—65 X 10 3 D Molekulargewicht)

besteht

aus

zwei

Untereinheiten, von denen jede zwei Eisenatome aufweist. Die Komponente I ( 2 0 0 — 2 7 0 X 10 3 D Molekulargewicht) gliedert sich in vier Untereinheiten, die gemeinsam 24 Eisenatome und zwei Molybdänatome gebunden haben. Alle Metalle scheinen über säurelabilen Schwefel an die Polypeptidketten gebunden zu sein [2, 13, 14], Da noch keine röntgenstrahlkristallographischen Untersuchungen an der Nitrogenase vorliegen, ist die genaue Lokalisation der Melallatome nicht bekannt. Aus indirekteren Methoden wie Eleklronenspinresonanz-Messungen

und

MössBAUER-Spektroskopie wurde jedoch geschlossen, daß sich die Molybdänatome in jenem katalytischen Zentrum der Nitrogenase befinden, in dem die Reduktion des Distickstoffs zum Ammoniak abläuft. Dort sind sie wahrscheinlich an einem separaten Protein, dem Mo-Kofaktor (der dazu 8 Eisenatome enthält), gebunden (Abb. 7). Die Rolle des Molybdäns in der Nitrogenase-Reaktion scheint in seiner einzigartigen Fähigkeit zu bestehen, in hoher und niedriger Oxydationsstufe zwei Elektronen transferieren zu können.

13

ATP

Abb. 7

ADP

Schematischc Darstellung clor Untereinheiten des Nilrogenase-Komplexes.

Aus

[5] verändert

¡Vitrogenase-Aktivität wird heute in der Regel mit dem Acetylenreduktions-Test bestimmt. Sie ist nur dann nachweisbar, wenn beide bzw. alle 3 Enzymkomponenlen vorhanden sind, in der Zelle in stöchiometrischem Verhältnis. Komponenten I und II aus verschiedenen diazotrophen Organismen isoliert und in vitro kombiniert ergeben mehr oder minder gut meßbare Enzymaktivitäten [2, 5, 14]. Eine hervorstechende Eigenschaft des Nitrogenase-Komplexes ist seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff. Nach Isolierung aus dem Zell-Kontakt verliert ein Enzymextrakt seine Aktivität an der Luft mit einer Iialbwerlzeit von einer Minute. Die aeroben ¡^-fixierenden Bakterien müssen demnach Schutzmechanismen für das Enzym entwickelt haben, und in den Zellen der Wurzelknöllchen muß der Sauerstoff von den eingekapselten Rhizobien ferngehalten werden. Azotobactcr hilft sich mit ungewöhnlich hohen Respirationsraten, den höchsten, die bekannt geworden sind. Der Sauerstoilgehalt der Zelle wird dadurch auf etwa 0,2% herabgesetzt. Das ist eine für die Nitrogcnase erträgliche Konzentration. In Blaualgen wird die Nilrogenase-Aktivität kompartimentiert in den meistens photosynthesefreien (genauer: PhoLosyslem Il-frcien) HeteroCysten gefunden, deren dicke Wand und Schleimhülle die 02-Diffusion stark vermindert. In den Wurzelknöllchen schließlich ist ein besonders spezialisierter und wirkungsvoller Schutzmechanismus gegenüber Sauerstoff ausgebildet: Das Cytoplasma der Wurzelrindenzellen enthält Leg-IIiunoglobin ( U l i ) . \% des Gesamtproleingehaltes der Knöllclien), ein in Struktur und Funktion dem tierischen IIb analoges Protein. Es bindet reversibel LuftsauerslofT, verhindert damit den 02-Zutrill zu den Bakterien, weil die oxydierte Form mit hoher 02-Bindungskapazität den Sauerstoff nur sehr langsam wieder abgibt. LHb ist ein besonders eindrucksvolles Beispiel für ein Symbiosesystem, in dem die Synthese des Globins vom genetischen System der Wirtszelle, die Häm-Svnthese jedoch von der Bak14

terien-DXA kontrolliert wird [15], Schließlich befindet sich an der Kapselobcrfläche der Bakteroide ein Endoxidase-System mit außerordentlich hoher Affinität zu Sauerstoff, wodurch auch Spuren desselben noch beseitigt werden. Der Reaktionsmechanismus Formal und in der Bilanz ist die biologische ^ - F i x i e r u n g dem chemischen IlABER-Boscii-Prozeß analog. Hier wie dort ist ein Katalysator notwendig und werden hypothetische Zwischenstufen angenommen, Diimid und Hydrazin, die in der Zelle jedoch bisher nicht gefunden wurden. Obwohl die Reaktion NT2 + 3 H2 ^ ^ 2 NH3 exergonisch ist und 10.9 kcal/Mol Energie entstehen, muß hohe Energie eingesetzt werden, um die 2 2 6 kcal Aklivierungsenergie des Disticksto IT-Moleküls zu erreichen. Durch Druck kann die NII3-Ausbeute erhöht werden. Bei der biologischen NVBindung setzt der Nilrogenase-Komplex die Aktivierungsenergie des N2 herab; die notwendige Energie entstammt dem Abbau von Photosyntheseproduklen während der oxydativen Phosphorylierung (bei Blaualgen auch Pholosynthesephosphorylierimg), wobei Energie zur biologisch vei'wertbaren Form A T P umgewandelt wird. Während im H.vBER-Boscii-Prozeß das Reduktionsmittel Wasserstoff gasförmig teilnimmt, werden die Reduktionsmittel der Zelle wiederum aus dem Ivohlenhydratabbau geliefert, allerdings in Form von Elektronen, die über eine Redox-Kelte mit Ferredoxin oder Flavocloxin als ElektronenIransportmittel ihren Weg zur Nilrogenase finden. In zellfreien Extrakten wird als Elektronendonator gewöhnlich Dithionit benutzt. Der Nitrogenase-Komplex katalysiert die beiden an zwei verschiedenen aktiven Zentren ablaufenden Reaktionen: — Die mit Eleklronentransport gekoppelte ATP-Hydrolyse, zu deren Ablauf Elektronendonator, -Überträger, A T P und M g + + benötigt wird; sie läuft im „elektronenaklivierendcn" Zentrum ab. — Die Substralreduktion, also die Bindung und nachfolgende Reduktion des N> zu NH : j bei gleichzeitiger Oxydation eines Elektronenakzcptors, in der Regel proloniertes Wasser, H3O"1". Dieser Reaktionsablauf findet im substratbindenden und reduzierenden Zentrum des Nilrogenase-Komplexes statt. Beide Funktionen können separat voneinander uniersucht werden; die erste ist von der zweiten unabhängig, aber die zweite ist von der ersten abhängig im Sinne der Energielieferung, nicht der Subslralbindungskinetik oder Subslralspczifilät. Die Aktivität der Nitrogenase wird allein durch das Angebot von A T P und Elektronendonator reguliert. Unsere Kenntnisse über die quantitativen Anforderungen an A T P im Reaklionsprozeß sind nach wie vor schwach. Dementsprechend schwanken Berechnungen darüber, wieviele Mole A T P pro Mol fixiertem N2 benötigt werden, weil äußere Faktoren erheblichen Einfluß ausüben. Allgemein ninunl man für die erste Reaktion ein Verhältnis von 1 A T P : 2c an. Da 4 bis 5 A T P pro Elektronenpaar im gesamten Nitrogenase-Prozeß liydrolvsiert werden, kommt man auf 12—15 A T P pro

fixiertem N9 [2, 14]. Angaben über 20—24 ATP schließen wohl einen Energieverbrauch für den Enzym-Turnover bzw. für die Erhaltung der Bakteroide in den Zellen mit ein. Eine genauere kinetische Vorstellung über den Mechanismus der ersten Reaktion (der „Elektronenaktivierung") im Nitrogenase-Komplex vermittelt das Modell in Abb. 8 : — Oxydiertes Fe-Protein (Komplex II) wird durch Ferredoxin, Flavodoxin oder Dithionit reduziert; — 4 Moleküle Mg—ATP pro dimeres Fe-Protein werden gebunden; der Komplex II wird zum Elektronendonator für das Mo—Fe-Protein (Komplex I ) ; — Mo—Fe-Protein tritt in halbreduzierter Form in die Reaktion ein; — der katalytisch aktive Zustand der Nitrogenase wird durch Elektronen-Transfer vom Fe-Protein auf das Mo—Fe-Protein unter ATP-Hydrolyse erreicht. (Minimum von 4 ATP-Molekülen pro Elektronenpaar.)

i-MgATP

(2Mg

*• 2

ATP • Fe-Protein

r

) 2 • Mo

Fe-Prote/n

(2 Mg ADP-Fe-Protein ° ) 2 - M o F e - P r o t e i n

c

r

2 H*

lMgAOP*lP,-•

Hi

(Fe - Protein " I 2 • Mo

Fe-Prote/n M

k Dissoziation Abb. 8

Hypothetische Reaktionsabfolge der Elektronenaktivicrungsreaktion im Nilro-

g r n a s c - K o m p l e x . Aus [14]

16

Beim Ablauf von Bindung und Reduktion des Distickstoffs oder anderer ¡Modellsubstrate (also im zweiten aktiven Zentrum des Nitrogenase-Komplexes) sind Vermutungen über die Existenz der Zwischenstufen Diimid und Hydrazin nur hypothetisch (Abb. 9, unten). Dagegen scheint gesichert, daß der Vorgang über Komplexbildungen mit dem Molybdän und Eisen des Nitrogenase-Komplexes I verläuft (Abb. 9, oben). Als klassischer Inhibitor der Nitrogenase fungiert Kohlenmonoxid, das den Elektronen-Transfer auf alle Substrate außer auf Il30 + verhindert. Gasförmiger Wasserstoff ist ein kompetitiver Hemmstoff der ^-Reduktion, nicht jedoch der Reduk-

Abb. 9 Schema der Substralkomplexieriing (oben) und hypothetischer Reaktionsablauf - Eukaryot unsicher; — notwendiger Transfer aller nif-Gene; — (^-Empfindlichkeit der Nitrogenase (Schutz?); — Energiehaushalt der Empfängerzelle

Ammoniak-Exkretion

Erhöhung der Lichtintensität oder des CCVGehaltes der Luft eine mehrfach gesteigerte N2-Fixierung erbrachte (Abb. 13). Da die beiden Faktoren unter Feldbedingungen kaum zu verändern sind, bleibt die Aufforderung an die Züchtcr, Leguminosen mit erhöhter apparenter Photosynthese, d. Ii. auch mit verminderter Photorespiration, zu seleklionieren oder zu züchten. 3. Die heute bekannten Leguminosen-ft/iisofrium-Systeme sind wahrscheinlich verbesserungsfähig hinsichtlieh der N2-Fixierungsraten.

23

Abb. 13

Einfluß der Assimilationskapazität durch Erhöhung der CCVKonzentration der

Luft auf die ^ - F i x i e r u n g von Sojabohnenpflanzen während einer Vegetationsperiode. Aus [2]. Linke Abb. = Rate (fixierte hVMenge pro Pflanze und Tag), rechte Abb. = Gesamtfixierung pro Pflanze

— Die Wege dazu führen sowohl über eine Suche oder gezielte Produktion von Rhizobittm-iTochleistungsstämmen als auch über ein Screening des weltweiten Leguminosen-Angebotes (von 10 000 Arten wurden erst 10% erfaßt; 0,5% werden kultiviert). Auch die Ersetzung wenig effektiver R.-Stämme durch solche mit höherer Leistung in Kulturleguminosen liegt in dieser Richtung. Vielleicht führt ein Weg dorthin über eine experimentelle Veränderung der artspezifischen Erkennungsproteine.

24

4. Optimierung der Assoziation freilebender ^ - f i x i e r e n d e r Bakterien mit Kulturgräsern. — Die assoziativen Symbiosen zwischen freilebenden ^ - f i x i e r e n d e n Formen und tropischen Gräsern haben in letzter Zeit viel Aufsehen erregt, da z. B . über Maiskulturen mit beträchtlicher Ni-Fixierung in Brasilien berichtet wurde [20]. Insgesamt sind die Ergebnisse solcher Experimente bisher zu schlecht reproduzierbar, um entscheiden zu können, ob hier ein ökonomisch vertretbarer Weg sich eröffnet. Wogen der großen Abhängigkeit der Systeme von Bodentemperaturen um 3 0 °C dürfte er für gemäßigte Zonen der Erde kaum in Frage kommen. 5. Übertragung der ^ - f i x i e r e n d e n Gene in die Zellen der wichtigsten Getreidepflanzen. — Dieser ebenso reizvolle wie (Erfolg vorausgesetzt) spektakuläre Weg könnte auch das ökonomische Problem mit einem Schlage lösen. Die folgenden methodischen Zwischenstufen sind dafür zu überwinden (Abb. 1 4 ) : a) nif-Gene tragende Plasmide werden durch Konjugation von )u/-haltigen Bakterien ( Klebsiella ) und »¿/-freien Empfängerzellen (E. coli) erhalten. Unter bestimmten Umständen ist dies möglich. In einigen Fällen wurden gene-

(a)

Konjugation

X nif

fmpfängerzelle

w

O

x

ra

O

X

Q

nif-P/osmid

Restriktionsenzyme, DNA-Ligase Transformation fiepUkotion, Kionierung

-

O Hybrid-Plasmid

^

Q

)

LOOP O

(di

Protoplast der Pflanzenzelle Abb. 14 Schema einzelner Stufen der ra/-Genübertragung aus Klebsiella Pflanzen mittels Plasmide. Einzelheiten im Text. Aus [6], verändert

in höhere

25

tisch instabile E. coft-Hybriden erhalten, die N2 fixierten. Die ni/-Gene lagen in Plasmiden vor, nicht i m Chromosom [21]; b) m'/-haltige Plasmide werden isoliert und durch Restriktionsnucleasen spezifisch gespalten, die Fragmente mit einem schnell-replizierenden Plasmid (Col. E 1) in vitro hybridisiert und mit Ligase zu einem extrachromosomalen D N A - R i n g kovalent v e r b u n d e n ; er enthält die

nif-Gene;

c) Transformation des Hybrid-Plasmids in E. coli u n d vielfache Replikation (Klonieren) mit d e m Ergebnis vieler Plasmid-Kopien mit

nif-Genen;

d) Einführung dieser Plasmide in einen Protoplasten höherer Pflanzen, der über Gewebekulturen vielleicht zu einer ^ - f i x i e r e n d e n Pflanze auswächst. Die Schwierigkeiten der m/-Gen-Manipulation sind offensichtlich (Tab. 3), obgleich nicht v o n prinzipieller Natur. So müßte der Gentransfer in die eukaryotische Zelle nicht ins G e n o m erfolgen, sondern E i n b a u der nif-Gene

in Chloroplasten-

Chromosomen genügten, die ebenfalls zirkulär und v o n erwünschter Gi'öße sind. D a auch A T P und Ferredoxin in Chloroplasten in ausreichender Menge vorhanden sind, wäre Energiezufuhr und Elektronentransport zur Nitrogenase gegeben. D a s zur Zeit unlösbare Problem scheint in der Notwendigkeit eines Schutzmechanismus des E n z y m k o m p l e x c s vor' Sauerstoff zu liegen, abgesehen v o n der Ungewißheit, wie lange eingepflanzte Gene in einer fremden U m g e b u n g informationsstabil bleiben.

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