Biología y cultivo del mejillón (Mytilus galloprovincialis) en Galicia 8400099648, 9788400099640

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26 TÍTULOS PUBLICADOS: 10 El Fago Lambda 29 y los orígenes de la Biología Molecular en España. Jesús Ávila (cord.). 11  Láminas delgadas y recubrimientos. Preparación, propiedades y aplicaciones. José María Abella Martín.

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12 Maduración y post-recolección de frutos y hortalizas. Carmen Merodio y María Isabel Escribano (editores).

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13 Applied study of cultural heritage and clays. José Luis Pérez Rodríguez (editor). 14 Limnogeología en España: Un homenaje a Kerry Kelts. Blas Valero Garcés (cord.). 15 Aplicaciones clínicas del biomagnetismo. Antonio Madroñero de la Cal. 16 Diseños de plantación y formación de árboles frutales. Mariano Cambra Ruiz de Velasco y Rafael Cambra Ruiz de Velasco. 17 Reología de suspensiones cerámicas. Rodrigo Moreno Botella. 18 Atlas histológico del lenguado senegalés, Solea senegalensis (Kaup, 1858). Juana M.ª Arellano y Carmen Sarasquete. 19 Clones de albariño (Vitis vinifera L.) seleccionados en el Consejo Superior de Investigaciones Científicas. María del Carmen Martínez Rodríguez, Susana Boso Alonso, José Luis Santiago Blanco. 20 Estudios sobre la biodiversidad de la región de Bahía Honda (Veraguas, Panamá). Santiago  Cas­ troviejo (edic.), Alicia Ibáñez (edic.). 21 International Studbook Gazella Dama Mhorr. Andrés Barbosa, Gerardo Espeso. 22 Landscapes as Cultural Heritage in the European Research (Proceedings of the Open Workshop. Madrid). Almudena Orejas Saco del Valle, María Ruiz del Árbol Moro.

Antonio Figueras

23 Lecciones de la catástrofe del «Prestige». Antonio Figueras Huerta. 24 Depuración de aguas residuales: modelización de procesos de lodos activos. Manuel Gil Rodríguez. 25 New acoustics. Selected topics II. F. Montero de Espinosa Freijo-C. Ran-Guerra-J. Pfretzschner (editores). 26 Biología y cultivo del mejillón (Mytilus Galloprovincialis) en Galicia. Antonio Figueras Huerta.

CSIC

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CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

BIOLOGÍA Y CULTIVO DEL MEJILLÓN (Mytilus galloprovincialis) EN GALICIA

ANTONIO FIGUERAS

BIOLOGÍA Y CULTIVO DEL MEJILLÓN (Mytilus galloprovincialis) EN GALICIA

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS MADRID 2015

Reservados todos los derechos por la legislación en materia de Propiedad Intelectual. Ni la totalidad ni parte de este libro, incluido el diseño de la cubierta, puede reproducirse, almacenarse o transmitirse en manera alguna por medio ya sea electrónico, químico, óptico, informático, de grabación o de fotocopia, sin permiso previo por escrito de la editorial. Las noticias, los asertos y las opiniones contenidos en esta obra son de la exclusiva responsabilidad del autor o autores. La editorial, por su parte, solo se hace responsable del interés científico de sus publicaciones. Versión electrónica de la 1.ª edición, Madrid, CSIC, 2007 Primera edición: 2002 Segunda edición rev. y aum.: 2011

Catálogo general de publicaciones oficiales: http://publicacionesoficiales.boe.es Editorial CSIC: http://editorial.csic.es (correo: [email protected])

© CSIC © Antonio Figueras e-ISBN: 978-84-00-09964-0 e-NIPO: 723-15-115-0 Maquetación: Sociedad Anónima de Fotocomposición

AGRADECIMIENTOS En este libro hemos intentado recoger resultados de investigación sobre el mejillón gallego fruto del trabajo desarrollado a lo largo de más de 20 años de trabajo. Sería interminable nombrar a todos los que nos han ayudado a lo largo de estos años. Agradezco a los «bateeiros», conocidos o no, su trabajo continuado y pocas veces valorado que ha permitido alcanzar esta realidad «milagrosa» y de referencia internacional que es el mejillón gallego. A todos los investigadores que han trabajado en este tema y que han apoyado con su investigación el desarrollo de este sector. Especialmente a los que desarrollaron su tarea investigadora de forma directa o indirecta (Buenaventura Andreu, Fernando Fraga, Fernando Saíz, Ramón Margalef, Manuel López Benito, Antonio Figueras, Juan Seoane, Manuel Gómez Larrañeta) en los primeros años con muy pocos medios, escaso sueldo y bajo reconocimiento social. También a todo el personal del Intituto de Investigaciones Marinas que nos han ayudado en el desarrollo de estos trabajos. Una mención especial a Laura Poisa por su ayuda. En particular quiero agradecer a mi padre, Antonio Figueras Montfort, su tarea pionera en el estudio del mejillón gallego y el haberme inculcado el afán por trabajar ordenada y constantemente. También agradezco a mi familia su paciencia y cariño continuos. ANTONIO FIGUERAS

In Memoriam Antonio Figueras Montfort (1918-2007), estudió Magisterio y Ciencias Naturales en Madrid y Barcelona. Como maestro de escuela desarrollo su tarea profesional en el Pirineo catalán y en la escuela de una colonia textil. En 1950 se incorporó como becario al recién creado Instituto de Biología Aplicada (sección investigación marina) que luego se convirtió en Instituto de Investigaciones Pes-

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Biología y cultivo del mejillón (Mytilus galloprovincialis) en Galicia

queras incorporado al Patronato «Juan de la Cierva» del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. A partir de 1953 desarrolló su trabajo en el Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo, con una estancia en Cádiz para ayudar en el inicio del nuevo Instituto. Su trabajo investigador se centró en la biología y cultivo de moluscos bivalvos (especialmente el mejillón) aunque al principio realizó estudios de pesquerías de especies de interés comercial. A mi padre

ÍNDICE GENERAL PRÓLOGO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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A. Figueras

I. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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A. Figueras

II. Cultivo del mejillón en Galicia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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A. Figueras, J. Cáceres-Martínez

ASPECTOS DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN Y VIDA LARVARIA III. Estudios sobre el ciclo gonadal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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J. Cáceres-Martínez, A. Figueras

III.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV. Vida larvaria del mejillón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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J. Cáceres-Martínez, A. Figueras

IV.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V. Fijación de los juveniles del mejillón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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J. Cáceres-Martínez, A. Figueras

V.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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SISTEMA CIRCULATORIO E INMUNE VI. Bioquímica del suero. Efecto de patógenos y variaciones estacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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A. Figueras, María Santarém, B. Novoa

VI.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Biología y cultivo del mejillón (Mytilus galloprovincialis) en Galicia

VII. Inmunología del mejillón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.1. Hemocitos de mejillón. Producción de radicales de oxígeno y nitrógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Beatriz Novoa, Carolina Tafalla, Camino Ordás, Antonio Figueras

VII.1.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.1.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.1.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.2. Sistema inmune del mejillón. Influencia de factores externos en los mecanismos de defensa . . . . . . . . . . . . . . . .

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Beatriz Novoa, María Santarém, Antonio Figueras

VII.2.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.2.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII.2.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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ENFERMEDADES DEL MEJILLÓN VIII. Estudios epizootiológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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José Antonio F. Robledo, Antonio Figueras

VIII.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VIII.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VIII.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

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Beatriz Novoa, José Antonio F. Robledo, María Pernas, Pablo Balseiro, Antonio Figueras

IX.1. Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX.2. Material y métodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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ECOFISIOLOGÍA DEL MEJILLÓN X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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M.J. Fernández Reiríz, P. Duarte, U. Labarta

X.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X.2. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X.3. Resultados y Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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GENÉTICA DEL MEJILLÓN XI. Genética poblacional del mejillón gallego . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Montse Pérez, Ángel P. Diz, Fernando Cruz y Pablo Presa

XI.1. Marcadores genéticos para el estudio del mejillón . . . . . . XI.1.1. Uso histórico de marcadores genéticos en mejillón . XI.1.2. Ventajas e inconvenientes de los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Índice general

XI.2. Estatus taxonómico del los mejillones europeos . . . . . . . . XI.2.1. Relaciones filogenéticas de las poblaciones europeas . XI.2.2. Estatus genético del mejillón peninsular. . . . . . . . XI.3. Características genéticas del mejillón gallego . . . . . . . . . . XI.3.1. Primeros estudios sobre su identidad genética . . . XI.3.2. Dinámica genética en las rías gallegas . . . . . . . . . XI.3.3. Patrón filogeográfico del mejillón gallego . . . . . . XI.4. Perspectivas de la gestión genética del mejillón . . . . . . . . XI.4.1. Necesidades de investigación y carencias del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XI.4.2. La conservación del mejillón en un plan integral de gestión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PRÓLOGO ANTONIO FIGUERAS

El éxito del cultivo del mejillón gallego puede ser más frágil de lo que parece. Muchos agoreros han avisado con insistencia, como el pastor de la fábula sobre la visita del lobo, de las posibilidades de un hundimiento de uno de los ejemplos paradigmáticos de la Acuicultura mundial. Un cultivo que en cincuenta años pasó del cero al infinito, de no existir a ser una referencia: el milagro del mejillón gallego. Aunque, afortunadamente, se han introducido cambios tanto en la producción como en la regulación administrativa, el cultivo del mejillón tiene asignaturas pendientes. Hemos intentado describir algunas de ellas, pero es imposible agotar la imponente realidad de esta actividad. Un aspecto esencial, que hasta ahora ha permitido sostener el enorme éxito del cultivo del mejillón y que no se ha estudiado en profundidad, es la, relativamente constante y abundante, disponibilidad de semilla. En nuestro trabajo recomendamos algunas medidas para administrar y proteger, con una base más sólida, el uso de la semilla del mejillón para el cultivo: 1. Las mejores áreas para disponer colectores en las bateas se situan en el exterior de las Rías. El período de colocación de colectores puede extenderse hasta el verano. 2. Los colectores se pueden colocar en cualquier parte de la batea y no solamente en los bordes. 3. Se podrían delimitar zonas de colecta de semilla en las zonas externas de las Rías, en donde se colocasen colectores en boyas o sistemas de long-line. La aplicación de las medidas anteriores deben estar apoyadas por un programa de monitoreo permanente de la fijación en diferentes zonas de las Rías (bateas y litorales), en el que participen los productores de mejillón y las autoridades locales.

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Antonio Figueras

Aunque no se hayan detectado mortalidades importantes del mejillón durante el período de estudio, esto no significa que el mejillón esté exento de sufrirlas. A medida que el cultivo del mejillón se desarrolla entran en juego una serie de factores que se encontraban ausentes y que pueden hacer que una enfermedad cobre una importancia inusitada. Entre estos factores tenemos la transferencia de animales vivos entre zonas de cultivo, las altas densidades del cultivo, el ser un monocultivo, la degradación del medio en el que se realiza esta actividad que en parte se puede achacar al propio cultivo. Los escasos conocimientos sobre el sistema inmune de estos animales y el hecho de que carezca de memoria y de especificidad nos impide utilizar métodos tradicionales, como la vacunación, de lucha contra las enfermedades en la producción animal. Por ello considero muy importante el conocimiento detallado de todas las enfermedades y parásitos que afectan a ésta y que se mantenga un control minucioso de su evolución, distribución y repercusión en el rendimiento del cultivo. Es necesario mantener un control constante en todas las áreas en las que se desarrolla el cultivo sin perder de vista los bancos naturales que, de momento, son el origen de parte de los juveniles que se emplean en el cultivo. Hemos puesto a punto distintas técnicas de diagnóstico para Marteilia, el parásito más peligroso del mejillón, que permitirán determinar con mayor rapidez y certeza la presencia del mismo en las distintas zonas del cultivo. También la Genómica ha llegado a los estudios sobre el mejillón. En base a su estructura bioquímica y a su actividad biológica, se han descrito diversos péptidos antimicrobianos en el mejillón (Mytilus edulis y M. galloprovincialis). Técnicas como el mRNA differential display (mRNA-DD) o la Suppression Subtractive Hybridisation (SSH) nos permitirán identificar genes involucrados en la respuesta immune y en otros funciones. Esto nos ayudará a identificar «genes de interés» inducidos por infección o con elevado protagonismo en aspectos de interés que puedan ser utilizados como marcadores moleculares para seleccionar estirpes de interés en acuicultura. Aún quedan otras asignaturas pendientes, como por ejemplo la predicción de las «mareas rojas» de dinoflagelados para permitir que los cultivadores puedan cosechar, procesar o vender el mejillón antes de esperar a la toxina se elimine naturalmente, la puesta a punto de un método que permita destruir la toxina de los tejidos de los moluscos bivalvos que han ingerido dinoflagelados tóxicos durante las mareas rojas, la selección genética de líneas de mejillón resistentes a las enfermedades y con altas tasas de crecimiento y de rendimiento en carne. La lista se podría alargar y alguien me podría tachar de soñador, pero no hay que olvidar que si alguien hubiera oído a los pioneros del cultivo del mejillón hace cincuenta años, probablemente les hubiera aplicado el mismo calificativo y sin embargo hoy el mejillón gallego, con sus problemas, es una magnífica realidad. Nos encontramos ante unas perspectivas de futuro muy interesantes. Ahora, es más necesario que nunca, desarrollar investigación multidisciplinar, que involucre a un gran número de equipos trabajando en mejillón.

I.

ANTECEDENTES ANTONIO FIGUERAS

La riqueza en recursos marinos renovables de las costas de Galicia y en particular de sus rías es proverbial y superior a la de otras regiones del mundo de gran producción. Esto es más evidente cuando se comparan las cifras de producción primaria de algunas zonas dadas en gramos de carbono por metro cuadrado y año: Perú, 600; Ría de Vigo, 300; Atlántico Norte de 100 a 150 y Mediterráneo Occidental 25. Lo es todavía más cuando se comparan las cifras de producción, secundaria o terciaria, es decir, de especies útiles para el consumo que se alimenten de fitoplancton directa o indirectamente. En Perú se producen 200 Kg por hectárea y año de anchoveta; en Islandia 80 de pesca de arrastre; en las islas Feroe 60; en Marruecos 55; en Galicia 40 (pesca de arrastre); en el Mar del Norte 17; en Terranova 22; en el Mediterráneo 10 mientras que en la Ría de Vigo se producen 186 kilogramos de mejillón cultivado por hectárea y año. Ahora bien, por un lado la industrialización y el crecimiento de la población ribereña, con el empleo cada vez mayor de sustancias contaminantes, y por otro la incidencia del sector extractivo estimulado por el creciente aumento de la demanda y el alza de los precios de los frutos del mar, considerados como artículos de lujo, hacen peligrar esta riqueza. Según Fraga (en Figueras, 1979) basándose en las cifras actuales de productividad primaria, el producto que se puede extraer de las rías es muy superior al actual. Dicha productividad depende de la luz y de la profundidad hasta donde pueda llegar lo que es función de la limpidez de las aguas, de ahí la importancia de evitar en lo posible los aportes terrígenos y los vertidos de desagües tanto de origen industrial como doméstico. En los años desde el 1974 al 1977 el incremento de la turbidez en la ría de Vigo redujo el espesor de la capa fotosintética en un 20%, con el correspondiente descenso en la productividad primaria. De estas partículas sólidas la más perjudicial es sin duda la arcilla ya que no sólo hace dismi-

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Antonio Figueras

nuir la productividad primaria, sino que interfiere directamente en la alimentación de los moluscos filtradores. Desde 1977 hasta la fecha se han seguido realizando rellenos, que han hecho esta situación más grave llegando a cubrir bancos muy productivos de almeja, como el que había en Bouzas-Alcabre en la ría de Vigo. Otro factor, del que depende la producción primaria, es la concentración de sales nutrientes minerales (fósforo, nitrógeno y potasio). En las Rías Bajas tanto la forma como las dimensiones, el aporte de agua dulce, la dirección de la costa etc., todo tiende a favorecer el sistema de transporte de nutrientes del fondo a la superficie. El agua rica en nutrientes al elevarse en el interior de las rías hasta la zona iluminada da lugar a una gran producción de fitoplancton. Parte de los detritus y demás restos orgánicos particulados que se encuentran en el agua superficial, sedimentan antes de que el agua de la ría salga al exterior, siendo descompuestos en la capa inferior y transportadas las sales de nuevo hacia el interior de la ría. En cierto modo, la ría actúa como una trampa que retiene los nutrientes. Los vientos del nordeste y la configuración orográfica de las rías junto con el fenómeno del afloramiento costero, descrito en otro capítulo, influyen en favor de la riqueza de las rías. Considerando todos los factores descritos anteriormente podemos afirmar que las Rías Bajas podrían producir cerca del millón de toneladas de moluscos al año: es decir multiplicar holgadamente por cinco la producción actual. Pero no basta sólo con producir especies que puedan ser utilizadas para la alimentación del ser humano, no se puede olvidar la producción primaria; los factores que favorezcan a ésta influyen directamente en el aumento de la producción de especies comerciales. Por ejemplo, algunos compuestos organoclorados a concentraciones altas pueden inhibir la fotosíntesis en un 90%, con lo que la producción comercial, aún sin contar con los efectos tóxicos de la sustancia, quedaría reducida al 10% por el efecto del déficit en el suministro alimentario. También influye en la producción primaria la estructura de las rías en cuanto que determinan el sistema de circulación del agua. Las modificaciones de la estructura natural de la costa pueden alterar el flujo del aporte de sales nutrientes a las rías, bajando así la producción primaria. Esto se hace en favor de la ubicación de zonas comerciales, plantas de elaboración de pescados, frigoríficos y otras instalaciones en terrenos ganados al mar que perfectamente podrían localizarse en otros lugares. La especie que se ha cultivado con más éxito en Galicia ha sido el mejillón. La explicación radica en que el suministro de juveniles-semilla es constante y a un precio muy razonable: el trabajo del que lo recoge. No es así con las demás especies en las que habitualmente se explota el banco, aunque últimamente se emplee semilla de almeja que proviene de criaderos en tierra para repoblar bancos dado que la producción propia del banco no es suficiente para mantener el nivel de extracción que la demanda comercial exige. El problema de la alimentación no existe en el mejillón ya que su dieta se compone de plancton, que está filtrando continuamente: respirando y alimentándose. Un mejillón de unos 4 centímetros filtra 5 litros de agua a la hora.

I. Antecedentes

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Este cultivo comenzó en la modalidad de batea en España en el año 1901 en la provincia de Tarragona, pasando enseguida a Barcelona. El arranque en Galicia se plantea con la primera concesión oficial del juez Moratinos para instalar –hacia los años 30– una batea en Bouzas (Vigo), empujada por el catedrático de Biología Don Luís Iglesias cuando convence al pionero Ozores de dedicarse a ello. Esta iniciativa se realiza con éxito –según el Prof. Lopez Capont– por un exiliado francés que llegó a Carril en el belicoso 1940. Y es aquí, en Galicia, donde alcanza su máximo desarrollo. En la actualidad hay alrededor de 3.000 bateas, de 500 metros cuadrados de superficie media de las que cuelgan en cada una aproximadamente 500 cuerdas de diez metros de longitud, de 100 kilos de peso y con una producción media por batea de 50 toneladas al año. Como dato interesante podemos apuntar que una batea produce unas 160 toneladas de materia seca al año. Materia orgánica que necesita de oxígeno para degradarse con lo que esto tiene de negativo para el ecosistema que los sustenta. No hay que olvidar que no es sólo el mejillón el que vive en la ría. Además, no sólo es el mejillón el que defeca en la ría, están los vertidos humanos y los industriales. No puede quedar todo en crítica. La industria del mejillón gallego es motivo de admiración en todo el mundo. No en vano estamos a la cabeza, siendo con 250.000 toneladas, el segundo productor del mundo de mejillón después de China. Esta producción constituye el 94% de la producción de la acuicultura española. El grado de conocimiento de la biología de la especie que tienen nuestros cultivadores es asombroso. Saben en que momento tienen que colocar las cuerdas para la captación de semilla. Saben que la semilla de esta procedencia crece mejor en determinada zona de la ría. Saben cuando va a haber marea roja. Se dan cuenta inmediatamente de cuando hay que disminuir el número de cuerdas por metro cuadrado porque el mejillón no está creciendo como debe. Realizan la operación de desdoble (separación del mejillón de la cuerda original para hacer una nueva en la que el mejillón tiene menor densidad y puede crecer con mayor facilidad) de las cuerdas en el momento preciso para que el mejillón sufra lo menos posible. Además se han desarrollado maquinarias que facilitan las operaciones de cultivo como las desgranadoras que permiten separar el mejillón con más eficacia y menos esfuerzo o las encordadoras que facilitan la colocación del mejillón en la cuerda. Todo esto no sería posible si no se dieran las condiciones ambientales que permiten este buen crecimiento del mejillón: nueve centímetros en año y medio, aunque esto depende de las zonas. Las últimas caídas en rendimiento de producción en este cultivo se deben precisamente a una combinación de infracciones en lo apuntado al principio: no se trata tan sólo de proteger al mejillón sino también de su comida. Esperemos que el mejillón no siga los pasos de su hermana rica la ostra, y que, cuando menos, mantenga los niveles de producción a que nos tiene acostumbrados. Tal vez, como ya están haciendo algunos productores (por ejemplo cultivando dorada en la misma batea y alimentándolas con mejillones), haya que conseguir la diversificación del cultivo. La sustitución del monocultivo dis-

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Antonio Figueras

minuiría los riesgos de una mortalidad masiva permitiendo a los cultivadores tener las espaldas cubiertas. En el presente trabajo hemos intentado reunir lo que actualmente sabemos sobre dos aspectos, a mi juicio, fundamentales para el desarrollo del cultivo del mejillón en Galicia y sobre los que hemos trabajado durante los últimos 15 años. Por una parte, el mantenimiento y mejora de lo que, en mi opinión, constituye la clave del éxito para el cultivo: la abundancia de juveniles (semilla) que permite iniciar el cultivo sin coste del material vivo. Por otra, el estudio de las enfermedades, verdadero caballo de batalla de la producción animal. La importancia en este caso es incluso superior dado que los moluscos bivalvos carecen de un sistema inmune propiamente dicho. Aunque poseen mecanismos de defensa contra los posibles organismos patógenos, estos no son específicos y además este sistema no tiene memoria, por lo que la diagnosis rápida, eficaz y certera es necesaria para evitar los daños asociados a la presencia de estos agentes patógenos. No hemos olvidado otros dos aspectos cruciales: la capacidad de carga de nuestras Rías y la base genética que nos permitirá mejorar la calidad y eficacia de la producción.

II.

CULTIVO DEL MEJILLÓN EN GALICIA ANTONIO FIGUERAS y JORGE CÁCERES

II.1.

HISTORIA DEL CULTIVO DEL MEJILLÓN EN GALICIA

La especie de mejillón que se cultiva en España es Mytilus galloprovincialis (Sanjuán et al., 1990), fundamentalmente en las Rías Gallegas (NO de la Península). Su aprovechamiento se remonta a los antiguos asentamientos humanos de Galicia en el siglo IV a. de C. En las cercanías de las villas nativas se han encontrado grandes depósitos de conchas de almejas, ostras y mejillones, denominadas «concheiros» que evidencian el consumo de estos recursos (Vázquez, 1975a, 1975b; De La Peña, com. per.*). En los alrededores de los poblados romanos del siglo 1 d. de C se han encontrado depósitos similares (Demarsa, 1965). Referencias posteriores indican que los moluscos bivalvos, en especial la ostra, fueron parte importante de la alimentación de familias nobles y del clero. Durante el siglo XVI, algunas villas de la zona suministraban ostras, almejas y mejillones a los Reinos de Asturias y de Castilla (Ferreira, 1988). Si bien la ostra era el molusco favorito de la Iglesia y la nobleza, el mejillón era un alimento popular a nivel local y además se usaba como abono para la agricultura y cebo para la pesca (Navaz y Sans, 1942; Ferreira, 1988). Se extraía, sin ningún tipo de control, directamente de los abundantes bancos naturales en las zonas rocosas de las Rías. No fue hasta principios del siglo XX cuando el mejillón comenzó a ser un recurso importante en España. El inicio del cultivo del mejillón se sitúa en Tarragona y Barcelona en 1901 y 1909 respectivamente, usando postes de madera, similares a los empleados en Francia, en la zona de entre mareas sobre los cuales se adhiere el mejillón, ya sea natural o manualmente cuando se obtiene en cuerdas colectoras y se traslada a los postes. Después de los prime* De La Peña, A. 1992. Arqueólogo. Museo de Pontevedra, Pasantería # 10, Pontevedra.

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Antonio Figueras y Jorge Cáceres

ros intentos se desechó este sistema en favor de las estructuras flotantes (bateas). Más tarde, las iniciativas de Manuel Trigo (Andreu, 1958) y de Alfonso Ozores (Durán et al., 1990) permitieron iniciar el cultivo del mejillón en las Rías Gallegas. En principio se usó el sistema francés (Figueras, 1989), sin embargo este sistema fue abandonado y en 1946 comenzaron a usarse de manera generalizada balsas flotantes para su cultivo (Andreu, 1958, 1962, 1963, 1968; Bardach et al., 1972). Es en los años 30 cuando se fondea una batea en Bouzas (Ría de Vigo). El Marques del Rial, Sr. D. Alfonso Ozores, asesorado técnicamente por el catedrático de Biología de la Universidad de Santiago de Compostela, D. Luís Iglesias, fueron los que iniciaron este proceso que ha llegado a convertirse en el milagro del mar gallego. Las primeras bateas estaban hechas en base a un flotador central en la que se montaba un entramado rectangular de madera de 100 a 500 m2. También se empleaban los cascos de barcos viejos en los que se colocaba el mismo armazón de madera del que se suspendían las cuerdas de esparto (Spartium junceum) (Fig. II.1, 2). Los cultivadores ponían los juveniles de mejillón en las cuerdas y cuando alcanzaban la talla comercial, los recogían (Andreu, 1958; Canel, 1968; Núñez y Castro, 1990). Posteriormente los cascos de barco fueron reemplazados por otras estructuras en las que, a veces, había pequeños galpones que servían para guardar la herramienta o para guarecerse de las inclemencias del tiempo (Fig. II.3) Los flotadores eran normalmente de madera envueltos en tela metálica y recubiertos de cemento. Hoy en día quedan algunas bateas antiguas pero la mayoría están hechas a base de un armazón de troncos de eucalipto (Fig. II.4, 5). Su tamaño varía considerablemente y oscila entre los 100 y los 500 m2 (Pérez Camacho et al., 1991). Estas estructuras se apoyan en flotadores (de 1 a 6 unidades) hechas de madera o acero cubiertos con fibra de vidrio, o poliéster y a veces están llena de poliéster expandido (Fig. II.6, 7). Dependiendo del número de flotadores la superficie utilizable puede ir desde el 80% cuando se emplea un flotador central, hasta el 90% cuando se emplean de cuatro a seis flotadores (Pérez Camacho et al., 1991). Los cultivadores aseguran sus bateas con dos cadenas de hierro y un ancla de 20 toneladas de cemento. Las bateas se sitúan en grupos llamados parques, separadas entre 80 y 100 metros de cada una (Figs. II.9a, b). Estos varían en el número de bateas y su situación está regulada por las autoridades marítimas. Desde el principio del cultivo del mejillón en 1946, el número de bateas se incrementó moderadamente hasta llegar a 400 en 1956, pero después de ese momento, se incrementó rápidamente (Tabla II.1). El tamaño medio de las bateas también creció desde 297 m2 en 1977 hasta llegar a 369 m2 en 1984 (Pérez Camacho et al., 1991). Actualmente los cultivadores trabajan empleando barcos anchos y de poco fondo (9 toneladas), propulsados por máquinas de diesel de unos 24 caballos de potencia, dotados de una grúa con un gran cesto de hierro para elevar las cuerdas cargadas de mejillón (Núñez y Castro, 1990).

II. Cultivo del mejillón en Galicia

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TABLA II.1 Número de bateas y producción de mejillón desde 1946 a 2003

II.2.

Año

Bateas

1946 1956 1958 1959 1960 1962 1963 1965 1966 1967 1968 1972 1975 1976 1987 1989 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

10 410 707 909 1.099 1.327 1.424 1.684 2.050 2.615 2.786 2.996 3.134 3.095 3.242 3.347 3.386 3.337

Producción (t) 22.460 39.700 50.900 61.550 74.300 79.750 94.300 114.800 146.450 156.000 167.800 175.000 200.000 230.000 188.480 188.969 261.146 261.996 247.730 246.018 260.043 248.839

IMPORTANCIA DEL CULTIVO DEL MEJILLÓN

En 2003 la producción mundial de mejillón fue de 1.775.808 tm sólo siendo superada por la producción de ostra en lo que respecta al resto de los bivalvos. Actualmente el cultivo de Mytilus edulis, Mytilus galloprovincialis y otras 8 especies de mitílidos se realiza en 47 países. Entre ellos los principales productores son China (38%), España (14%), Italia (8%), Dinamarca (5%), Tailandia (5%), Nueva Zelanda (5%), Francia (4%), Chile (4%) y Holanda (3%). En 2003 la producción del mejillón en Europa alcanzó un valor de 448 millones de dólares y sólo fue superada por el valor alcanzado por la producción de salmónidos (725 millones $) y superando incluso al valor de la ostra (331 millones $). Estas cifras colocan al cultivo del mejillón como uno de los más importantes dentro de la acuicultura mundial y el más importante en la acuicultura española, tanto desde el punto de vista productivo como económico (Figueras, 1993; Guerrero et al., 1993). En las obras de Labarta et al. (2002, 2004) se analiza en profundidad la evolución de estos aspectos.

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II.3.

Antonio Figueras y Jorge Cáceres

DESCRIPCIÓN DE LA ZONA DE CULTIVO

La costa de Galicia (Fig. II.9), con una longitud aproximada de 1.309 Km, está caracterizada por la presencia de valles fluviales sumergidos llamados Rías que reciben un aporte fluvial en su origen. Tienen una longitud de 18 a 33 km y una anchura, en la boca de 7 a 15 km de largo. Casi todas están parcialmente cerradas por una o varias islas. Su profundidad varía de 40 a 60 m y sus fondos son lodosos (Andreu, 1958; Prego, 1990). La productividad anual de las rías está en torno a los 10,5 mg carbono/litro/hora. La temperatura oscila entre lo 10° y los 20°C, la salinidad está alrededor de las 34‰ y la amplitud de las mareas es de 4 metros. Las corrientes de marea son relativamente fuertes. De acuerdo con Fairbridge (1980) y Prego (1990) las rías gallegas suelen presentar una circulación semejante a la de un estuario parcialmente estratificado, en donde hay un nivel inferior más salino y uno superior menos salino con una mezcla vertical entre ambos. Su elevada productividad se debe, en gran parte, al aporte de nutrientes debido al afloramiento del «Agua Central Nor-Atlántica» (ACNA) frente a las costas gallegas que ocurre entre abril y octubre (Blanton et al., 1984). Además, los nutrientes arrastrados hacia las Rías por las lluvias (la precipitación media anual es de 1.250 mm3) de las laderas de las colinas que rodean las rías favorecen la gran abundancia de fitoplancton (Andreu, 1976; Iglesias et al., 1984; Figueras, 1989). El abrigo de las rías ofrece un ambiente ideal para el cultivo del mejillón en cuerdas que se suspenden de las bateas o balsas flotantes (Lutz et al., 1991). La zona de mayor cultivo es la ría de Arousa en la que se cultiva el 60% de los mejillones que se producen en España, seguida por las rías de Vigo y Pontevedra. En las zonas externas de las rías se encuentran poblaciones naturales de mejillón distribuidas en la zona intermareal a lo largo de grandes extensiones de la costa y en las islas, alcanzando una densidad de hasta 24 mejillones/m2. También se detectan a lo largo de toda la ría especialmente en las zonas rocosas. Los cultivadores recogen los juveniles de mejillón de estas zonas para iniciar el cultivo. La fijación de estos juveniles tiene lugar durante todo el año, siendo el tiempo que va de mayo a septiembre el momento en el que se produce con mayor intensidad

II.4.

ESPECIES ASOCIADAS Y PREDADORES

Las especies asociadas a las poblaciones naturales de mejillón son aquellas que aparecen en las zonas rocosas intermareales tales como los cirrípedos, Balanus sp., y algas, Enteromorpha sp. Los depredadores del mejillón incluyen los cangrejos, Carcinus maenas, la estrella de mar, Asteria rubens, y las aves marinas. Las especies acompañantes del mejillón cultivado en las cuerdas suspendidas de las bateas, llegan a ellas como fases planctónicas o reptando cuando las cuerdas tocan el fondo. Entre estas especies se encuentran los crustáceos como el decápodo Pisidia longicornis; anfípodos como Phtisica marina y Eurystheus maculatus; ascidias, Ascidiella aspersa y Ciona intestinalis; y especies incrustantes

II. Cultivo del mejillón en Galicia

23

como los balanos y los poliquetos, Elminius modestus y Pomatoceros sp. La competencia se establece fundamentalmente por el espacio y por el alimento, invadiendo, a veces, la concha de los mejillones. Aunque el daño causado por los predadores es normalmente muy limitado, ocasionalmente, algunas cuerdas pueden ser invadidas por la estrella de mar A. rubens y por un gasterópodo Nucella lapillus que pueden llegar a causar la pérdida de toda la cuerda. Además algunos peces como el sargo, Diplodus sargus, y la dorada, Sparus aurata, pueden destruir la semilla y dañar la concha de los ejemplares adultos. El copépodo parásito Mytilicola intestinalis, que se ha asociado con pérdidas en los cultivos de mejillones de otros países, no ha provocado pérdidas en el mejillón de Galicia. Tampoco el parásito Marteilia sp. presente en los mejillones cultivados en Galicia, que ocasionó el inicio del declive del cultivo de ostra plana en Francia, causa aparentemente daños serios al cultivo del mejillón. Los cultivadores eliminan las especies acompañantes y los predadores a mano cuando realizan la tarea del desdoble (Andreu, 1976; Pérez y Román, 1979; González, 1982; Figueras, 1982; Figueras et al., 1991).

II.5.

MÉTODO DE CULTIVO

La técnica y artes de cultivo empleadas en la zona las han descrito Andreu (1958,1962, 1963,1968); Canel (1968); Bardach et al. (1972); SOMEGA (1975); Figueras (1976); Román y Pérez (1979); Aguirre (1979); Mariño et al. (1982); Figueras (1987, 1989); Núñez y Castro (1990); Durán et al. (1990); Pérez Camacho et al. (1991). El cultivo de mejillón puede dividirse en cinco etapas. Estas incluyen: 1) Obtención de la semilla, 2) Colocación de los juveniles en las cuerdas, 3) Desdoble, 4) Engorde y 5) Cosecha. 1)

Obtención de la semilla

El cultivo comienza cuando los cultivadores obtienen la semilla, fundamentalmente de las poblaciones naturales (60-70%) y el resto de las cuerdas que sitúan como colectores en las propias bateas. Los cultivadores pueden recoger hasta 1.500 kg de semilla (juveniles) en las mareas bajas, en las aproximadamente cuatro horas que dura cada una, en las zonas de roca situadas en la parte de las rías más próxima al Océano Atlántico (Fig. II.10, 11) (Figueras, 1989). Con este fin emplean una herramienta denominada «rasqueta», que tiene una hoja metálica de unos 10 cm2 unida a un mango de madera. Los cultivadores colocan los mejillones en las cuerdas de sus bateas o las venden a otros. El precio oscila en torno a 1 €/kg. Los cultivadores recogen unas 4.500 toneladas de semilla de mejillón (juveniles, talla media = 2 cm) en cada ciclo de cultivo. La semilla es transportada a las bateas manteniéndola húmeda, y se coloca en las cuerdas durante las 24 horas siguientes a la recolección. Como colectores de semilla en las bateas, los cultiva-

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Antonio Figueras y Jorge Cáceres

dores emplean redes viejas que suspenden de las bateas durante marzo y abril (Fig. II.12) (Andreu, 1958; Nuñez y Castro, 1990). 2)

Colocación de la semilla (juveniles) en las cuerdas

Los cultivadores colocan la semilla en las cuerdas a mano o empleando una maquina que los envuelve con una red de algodón o rayón; esta red se desintegra en pocos días (Fig. II.13, 14). Por entonces los mejillones han producido un nuevo biso y se han unido a la cuerda. Los cultivadores suelen colocar de 1,5 a 1,75 kg de semilla por metro de cuerda, siendo el peso medio de una cuerda de semilla de 14 kg (Figueras, 1989). Las cuerdas, son nomalmente de 3 cm de grosor, están hechas de nylon, polietileno o esparto (S. junceum), su longitud oscila de 6 a 10 metros. Su superficie rugosa facilita la fijación de los mejillones. Cada cuerda con mejillones adheridos tiene un lazo al final, que está unido a una cuerda de poliéster más fina llamada «rabiza» (12-14 mm de grosor), que a su vez está unida a la batea. La rabiza tiene una vida media de unos 3-4 años ya que está expuesta al aire y al sol (Figueras, 1989), mientras que la cuerda grande dura una media de 5,8 años (Pérez Camacho et al., 1991). Cada batea tiene de 200 a 700 cuerdas. Cada 30-40 cm se sitúan palos de madera o de plástico entre las hebras de la cuerda para evitar que se desprendan grupos de mejillones (Fig. II.15, 16) (Figueras, 1989; Núñez y Castro, 1990; Pérez Camacho et al., 1991). Los cultivadores colocan de 1 a 3 cuerdas por m2 de superficie de batea. Esta distribución permite un adecuado flujo de agua rica en nutrientes para los mejillones impidiendo que las cuerdas se toquen unas a otras (Figueras, 1989). Los cultivadores colocan las cuerdas principalmente de noviembre a marzo (Pérez Camacho et al., 1991). 3)

Desdoble

El tercer paso es el desdoble. Esta operación tiene como objetivo evitar que los mejillones se caigan de la cuerda en momentos de mal tiempo, además permite que crezcan rápida y uniformemente (Figueras, 1989; Núñez y Castro, 1990). Los cultivadores realizan esta operación cuando los mejillones están a medio crecer (longitud de la concha 4-5 cm) cuando han alcanzado 5-6 meses de talla, normalmente de junio a octubre (Figueras, 1989; Núñez y Castro, 1990). El peso promedio de las cuerdas ha aumentado alrededor de 50 kg. Se trasladan las cuerdas a los botes usando una grúa (Fig. II.17) y frotan los grupos de mejillones sobre una mesa con un tamiz hecho con barras de acero que permite separarlos en distintas tallas (Fig. II.18). También se puede usar un cedazo cilíndrico (Fig. II.19). Con esta operación se consiguen preparar 3 o 4 cuerdas a partir de cada cuerda original empleando la red de algodón o rayón ya descrita anteriormente (Figueras, 1989). El peso medio de las cuerdas es de 46 kg (Pérez Camacho et al., 1991). Aquellos cultivadores que han automatizado esta operación emplean de 5 a 15 segundos por metro de cuerda, o menos de 14 horas para preparar 500 cuerdas de 10 metros de longitud (Fig. II.20) (Figueras, 1989). Si los mejillones crecen muy rá-

II. Cultivo del mejillón en Galicia

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pidamente y su peso puede causar que se deslicen soltándose de la cuerda, esta operación vuelve a repetirse. También suele hacerse cuando los cultivadores quieren que todos los mejillones tengan un tamaño similar en el momento de la cosecha (Bardach et al., 1972; Figueras, 1989). 4)

Engorde

En Galicia el crecimiento es rápido, especialmente en las áreas de las rías cercanas al océano, pudiendo alcanzar el tamaño comercial (8-10 cm) en 8 o 9 meses, aunque normalmente, el tiempo necesario para alcanzar la talla comercial es de 13 meses. Sin embargo, si la densidad de bateas es elevada este crecimiento puede hacerse más lento (Figueras, 1989). En verano el crecimiento es mínimo, mientras que en invierno es el momento de mayor crecimiento. Este bajo crecimiento detectado en verano está relacionado con la escasez de plancton en el agua estratificada, siendo más importante que el efecto de la temperatura que consigue que la semilla de primavera y de otoño tengan el mismo tamaño al final del primer invierno (Bardach et al., 1972; Figueras, 1989). 5)

Cosecha

En Galicia existe mejillón de tamaño comercial a lo largo de todo el año y se puede cosechar en cualquier momento. El momento de máxima cosecha va de octubre a marzo cuando la demanda del mercado es mayor y la condición de la vianda es la mejor. El peso de la carne del mejillón puede llegar a ser el 50% del peso total en el momento de mejor condición. Cuando un porcentaje elevado de mejillones ha desovado o está próximo al desove, la cosecha debe esperar hasta que se encuentren en mejores condiciones (Figueras, 1989). La producción media por m2 de batea alcanza los 130 kg y para una batea entera la producción oscila entre las 20 y las 100 t, con un valor medio de 47 t, siendo estos valores altamente variables (Pérez Camacho et al., 1991). Otro dato de producción es que cada metro de cuerda puede producir en torno a los 10 kg de mejillón (Figueras, 1989). Las pérdidas anuales (mortalidad natural y manejo) se han estimado en un 15% (SOMEGA, 1975). Recientemente los resultados de cultivos experimentales de mejillón muestran que la mortalidad está en torno al 5%. Para cosechar el mejillón, los granjeros utilizan una grúa para elevar las cuerdas a sus barcos, allí los mejillones son separados y clasificados sobre una mesa cedazo. Se eliminan los mejillones pequeños, el fango, las conchas vacías, las ascidias y otros organismos acompañantes. Los mejillones pequeños vuelven a ser empleados en el cultivo. Los de talla comercial se empacan en bolsas de nylon y se envían a las plantas de depuración (Fig. II.21). Las mujeres son normalmente las encargadas de estos trabajos. Cada una maneja unos 200 kg de mejillón cada 8 horas. La producción de mejillón ha aumentado drásticamente desde 1956 (Tabla II.1).

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II.6.

Antonio Figueras y Jorge Cáceres

MANEJO DE LAS BATEAS

Cada batea tiene normalmente tres tipos de cuerdas: aquellas empleadas para recoger la semilla, aquellas con mejillones en crecimiento, y por último las que tiene mejillones de talla comercial. Así los cultivadores mantienen la producción de su batea en continuo (Figueras, 1989). Dado que los mejillones crecen más rápido cerca de la superficie del agua, algunos cultivadores invierten sus cuerdas periódicamente para producir mejillones del mismo tamaño (Lutz et al., 1991). En las bateas con un único flotador central, el equilibrio de las bateas se altera cuando los cultivadores levantan cuerdas para el desdoble o para la cosecha, y por lo tanto hay que poner tanques con agua en la zona apropiada para evitar que se hunda. Otro problema radica en la gran cantidad de fauna acompañante que crece en las bateas que produce un considerable incremento de peso de las mismas. Ocasionalmente, los cultivadores tienen que limpiar los flotadores. Esta operación es más sencilla cuando la batea está casi vacía, así los flotadores están elevados y los organismos son expuestos al aire y mueren facilitando su eliminación. Para las reparaciones importantes las bateas son trasladadas a astilleros. Una batea tradicional de tamaño medio tiene una vida media de 10 a 15 años, mientras que una moderna con flotadores de fibra de vidrio dura bastante más (Lutz et al., 1991). Las bateas en uso tienen una edad de hasta 30 años, con una media de 8 años (Pérez Camacho et al., 1991).

II.7.

ESTRUCTURA DE LA INDUSTRIA MEJILLONERA

En Galicia la industria mejillonera es esencialmente familiar. En 1975, SOMEGA estimó que cada propietario poseía una media de 3,4 bateas; pocos tenían más de 10 unidades. Actualmente, el número medio de bateas es de 1,5 y siguen siendo negocios eminentemente familiares (MAR; 1991). Algunas, pocas, compañías, tienen más de 12 bateas con trabajadores permanentes o temporales. Pueden llegar a poseer su propia planta depuradora o trabajan en estrecha colaboración con plantas de depuración o conserveras (Núñez y Castro, 1990). Otro grupo de mediano tamaño es aquel que tiene de 5 a 12 bateas, y que a veces contrata ayuda externa. Finalmente, el grupo más numeroso es el de las familias que tienen de 1 a 5 bateas. Realizan todo el trabajo y alternan las tareas de la batea con la agricultura y la pesca de bajura (Núñez y Castro, 1990). Todos los miembros de la familia trabajan en el cultivo. Andreu (1976) afirmó que con la excepción del trabajo pesado las mujeres realizaban todo el trabajo en las bateas. El manejo de una batea típica lo realizan un hombre y tres mujeres. El tamaño de la fuerza de trabajo del cultivo de mejillón es difícil de estimar debido a la gran interconexión de actividades ya que un número elevado de compañías trabajan simultáneamente con otras especies de moluscos y con otros productos del mar. En 1958, se estimaba en 450 el número de personas que trabajaban directamente en el cultivo del mejillón. En 1985, se estimó en 7.000 personas las que

II. Cultivo del mejillón en Galicia

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trabajaban directamente en el cultivo del mejillón y en 3.000 las que trabajaban en las industrias asociadas (depuradoras, conserveras, congeladores, transporte, astilleros y talleres mecánicos). Debido al gran crecimiento de la industria se han creado asociaciones de mejilloneros. La mayor denominada OPMAR, agrupa al 80% de los propietarios. En la actualidad existen en Galicia unos 2.000 propietarios con sus familias trabajando en el cultivo del mejillón (MAR, 1991).

II.8.

REGULACIÓN ADMINISTRATIVA DEL CULTIVO DEL MEJILLÓN

La primera norma reguladora relacionada con el cultivo del mejillón se aprobó en 1961. En 1974, se desarrolló el primer plan para la instalación de las bateas en las rías. En 1969 se promulgó una norma regulando la extracción de mejillones de las poblaciones naturales, para evitar su destrucción. Se prohibía la recolección de mejillones desde enero a julio, estableciendo un tamaño mínimo de captura de 50 mm. En la actualidad existen una serie de normas elaboradas por la Comunidad Autónoma entre las que se encuentran la ley de Pesca (Ley 6/1993) y el Decreto 406/1996 modificado por el Decreto 174/2002 de la Xunta de Galicia que establece un Reglamento de viveros de cultivos marinos en las aguas de Galicia. En estas normas se especifica exhaustivamente todo lo referente a las concesiones, cambios de ubicación, transmisión de la titularidad, permutas, el anclaje, las reparaciones, los tipos de cuerda y al abastecimiento de semilla tanto de colectores de batea como de los bancos naturales. Legalmente no existe un límite al número de bateas que puede tener un único propietario, pero recientemente éste se ha limitado mediante nuevas normas que consideran la calidad del agua y la capacidad de carga de la zona. En 1993 se estableció una regulación sobre la calidad del agua para el cultivo de moluscos armonizada con la normativa europea (Real Decreto 345/1993). En la orden de la Xunta de Galicia del 29 de julio de 1993 publicada en el DOGA n.º 217 se declaran y clasifican las zonas de producción de mejillón. Esta normativa ha sido presentada recientemente en la Ley de la Comunidad Autónoma de Galicia 8/2001, de 2 de agosto, de protección de la calidad de las aguas de las rías de Galicia y de ordenación del servicio público de depuración de aguas residuales urbanas.

II.9.

REGULACIÓN ADMINISTRATIVA DE LA COMERCIALIZACIÓN DEL MEJILLÓN

En 1964 se aprobó la primera ley que regulaba la calidad sanitaria de los moluscos para el consumo humano. Se realizó una clasificación de la calidad de las aguas y se distribuyó el litoral en base a esta calidad. La ley establece que todos

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Antonio Figueras y Jorge Cáceres

los pescadores y acuicultores necesitan una licencia para comercializar moluscos y que todos los moluscos bivalvos, vengan de un parque o de cultivo o de una batea, han de ser depurados antes de su comercialización. La ley que regulaba la depuración de los moluscos fue modificada en 1970, añadiendo especificaciones sobre el tipo, tamaño y color del embalaje, incluyendo el empleo de un procedimiento de control sanitario oficial para mejorar el control del mercado nacional y de las exportaciones (SOMEGA, 1975). La última modificación fue realizada en 1985. El Real Decreto 345/1993 sobre calidad del agua definía por primera vez tres tipos de zonas destinadas al cultivo de moluscos bivalvos dependiendo de la carga bacteriana detectada y establece el tratamiento posterior de los productos procedentes de las mismas. Además determina una serie de condiciones aplicables a los productos del mar referentes a la carga bacteriana, la presencia de productos tóxicos, radionucleidos y biotoxinas. El Decreto de la Xunta de Galicia 399/1996 regula los programas de control sanitario de los moluscos bivalvos. Todas estas normas vienen recogidas en la APA/1029/2003 de 23 de abril, por la que se hacen públicas las nuevas relaciones de zonas de producción de moluscos y otros invertebrados marinos vivos en el litoral español, aprobadas previamente por las Comunidades Autónomas. Esta Orden se fundamenta en el R.D. 571/1999 de 9 de abril, que traspone la Directiva del Consejo 91/492 de 15 de julio. En un primer momento esta Directiva fue traspuesta por el R.D. 345/1993, parcialmente derogado en la actualidad por el Real Decreto arriba mencionado. El Real Decreto 345/1993 prevé la necesidad de dar difusión a la relación de las zonas de producción con indicación de su ubicación y sus límites, en las que se podrán recolectar moluscos bivalvos, moluscos gasterópodos, tunicados y equinodermos marinos vivos de producción natural para el marisqueo o de acuicultura, estableciendo su clasificación de acuerdo con las normas reguladas en el mismo.

II.10.

DEPURACIÓN

En 1964, se estableció en Galicia la primera estación de depuración con una capacidad diaria de 15 t de mejillón (DEMARSA, 1965). En 1975 se habían registrado en la región 20 y en la actualidad existen 54. Las depuradoras obtienen agua a través de tuberías submarinas a una profundidad de unos 3 metros por debajo de la superficie en marea baja. El agua es tratada habitualmente con hipoclorito sódico (1-3‰) o se le inyecta gas cloro. El agua clorada se deja caer en cascada, a través de varios tanques de cemento, antes de llegar a los tanques de depuración en los que se encuentran los moluscos bivalvos. El uso del ozono es muy limitado y no existe esterilización por rayos ultravioleta. Los mejillones se mantienen en bandejas o cestos encima de plataformas de cemento a una densidad de 30 kg/m2. Cada cesto contiene 17 kg de mejillones. Para conseguir eliminar las bacterias patógenas normalmente es suficiente con una depuración de 24 horas, con el fin de ampliar el margen de seguridad se man-

II. Cultivo del mejillón en Galicia

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tienen durante 48 horas. Después de este proceso los mejillones se empacan manual o automáticamente en bolsas de 1, 2, 5, 10 y 15 kg; las bolsas se cierran con alambre metálico. Los mejillones depurados se empacan en bolsas amarillas con la certificación sanitaria correspondiente. Los mejillones no depurados se empacan en bolsas rojas. Los colores y su uso son obligatorios. Actualmente, según los criterios de la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1991 (91/142/CEE), la calidad sanitaria de los moluscos se fija según una clasificación de las zonas de producción en función del número de coliformes fecales y Escherichia coli, de la siguiente forma: Zonas A: para consumo humano directo. Moluscos con menos de 300 coliformes fecales o menos de 230 E. coli por 100 g de carne y líquido intervalvar. Zonas B: Moderadamente contaminados, moluscos con menos de 6000 coliformes fecales o menos de 4600 E. coli por 100 g de carne en el 90% de las muestras tomadas. Sólo se pueden destinar a consumo después de tratamiento en un centro de depuración o tras su reinstalación en una zona A. Zonas C: Fuertemente contaminados, moluscos con menos de 60000 coliformes fecales por 100 g de carne de molusco. Se podrían destinar a consumo tras un largo período de reinstalación en una zona limpia. El Real Decreto 345/1993 sobre calidad del agua establece en su Anexo II que los productos de la acuicultura o de marisqueo tendrán menos de 300 coliformes fecales o menos de 230 E. coli por cada 100 gramos de carne de molusco bivalvo o líquido intervalvar en una prueba NMP (NPP) en la que se utilicen 5 tubos y 3 diluciones o en cualquier otro método de análisis bacteriológico de precisión equivalente demostrada. Además no habrá Salmonella en 25 gramos de molusco y no contendrán compuestos tóxicos incluidos en el Anexo IV, ni podrán rebasar los límites máximos de radionucleidos reseñadas en el Anexo IV del mismo Real Decreto. II.11.

MAREAS ROJAS

Considerando la alta fertilidad de las rías, es normal que ocasional, aunque raramente, los moluscos producidos en las rías gallegas no sean aptos para el consumo humano. Existe una red de vigilancia continua para detectar la presencia de crecimientos exagerados de dinoflagelados tóxicos. La Consellería de Sanidad sigue continuamente la presencia de las toxinas paralizante (PSP; Paralityc shellfish poison) o diarreica (DSP, Diarrhetic shellfish poison). Tan pronto como su presencia es detectada, se prohibe la extracción y comercialización de los moluscos procedentes de la ría o sección de la misma. El Real Decreto 345/1993 sobre calidad del agua establece en su anexo II que el contenido en PSP no debe sobrepasar 80 mg por 100 gramos de parte consumible de moluscos bivalvos y que los métodos habituales de análisis biológico no deben dar reacción positiva a la presencia de DSP.

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II.12.

MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD DEL MEJILLÓN GALLEGO

El Instituto Tecnológico para el Control del Medio Marino (INTECMAR, http://www.intecmar.org/) realiza la mayoría de las tareas encaminadas a velar por la calidad del mejillón gallego. La Ley 3/2004, del 7 de junio, de creación del «Instituto Tecnolóxico para o Control do Medio Mariño de Galicia», en el ámbito de la Comunidad Autónoma de Galicia y al amparo de su Estatuto de autonomía, crea un ente de derecho público con personalidad jurídica y patrimonio propio y con plena capacidad y autonomía para el cumplimiento de sus fines. El INTECMAR, dependiente de la Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos, asume las competencias atribuidas al Centro de Control do Medio Mariño, integrado como dirección general en la Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos constituyéndose como el instrumento de la Administración de la Comunidad Autónoma de Galicia para el ejercicio de las funciones del control de las calidad del medio marino, de aplicación de las disposiciones legales en materia de control técnico-sanitario de los productos del mar y de asesoría técnico-científica sobre pesca, marisqueo y acuicultura en el ámbito de las zonas de producción en aguas competencia de la Comunidad Autónoma. El INTECMAR tiene como objetivo general desarrollar un estricto e intensivo sistema de control sobre las características del medio marino para darle cumplimiento formal a la legislación vigente en cuanto a la producción de moluscos y otros organismos marinos, contribuyendo a desarrollar nuevas estrategias de explotación y comercialización basada en la oferta de productos de óptima calidad con absoluta garantía sanitaria, desarrollo de estudios de carácter científico-técnico destinados a facilitar los conocimientos necesarios para la correcta gestión de los recursos marinos protegiendo y mejorando las calidades de sus aguas Además le corresponde al «Instituto Tecnolóxico para o Control do Medio Mariño de Galicia», entre otras, las siguientes potestades administrativas: a)

b) c)

Aplicación de la normativa sobre calidad de las aguas y producción de moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura. En concreto, el control de las condiciones oceanográficas, biogeoquímica marina y poblaciones fitoplantónicas, de las biotoxinas marinas, de la contaminación química y de contaminación microbiológica, tanto en lo referente a los organismos coma a las zonas de producción. La investigación para el conocimiento y control de las patologías de los organismos marinos sometidos a la explotación comercial mediante la pesca, el marisqueo y la acuicultura. Decretar la apertura y el cierre del ejercicio de las actividades pesqueras, de marisqueo y acuicultura en función del resultado de los controles que se realicen sobre la calidad de las aguas y los productos con la aplicación de la normativa vigente.

II. Cultivo del mejillón en Galicia

d) e)

f)

II.13.

31

Aquellas funciones que regularmente se le atribuyan a la lucha contra la contaminación marina. El cumplimiento de los programas de control del medio marino en el ámbito de las funciones que establece esta ley y que determine la Xunta de Galicia en función de la legislación vigente y sus propias necesidades para la gestión del medio marino. Aquellas funciones que en el ámbito de competencia de la Comunidad Autónoma puedan serle atribuidas por la Xunta de Galicia en materia de control de las características del medio marino y de sus recursos sometidos a explotación comercial DISTRIBUCIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DEL MEJILLÓN CULTIVADO EN GALICIA

Los cultivadores trasladan directamente los mejillones a las plantas de depuración o a las plantas conserveras. Hay dos mercados para el mejillón: el fresco y el procesado. Grandes cantidades de mejillón son comercializadas en fresco pero el mercado de la conserva ha crecido desde 1984 (Tablas II.2 y II.3). La mecanización del manejo es mínima para reducir el daño a las conchas del mejillón y aumentar así la vida media de los mejillones durante el transporte. En la época de más calor se emplean camiones refrigerados y en los viajes largos se colocan barras de hielo para mantener una humedad elevada. Algunas veces se ha empleado el transporte por ferrocarril. Normalmente, los cultivadores venden el mejillón a las estaciones de depuración que a su vez lo venden a los mercados centrales (Núñez y Castro, 1990). Este procedimiento está cambiando y ya algunas asociaciones de productores de mejillón abastecen a los mercados centrales incrementando el margen de beneficio.

TABLA II.2 Comercialización de mejillón en fresco desde 1984 a 1989 Cantidad comercializada Año 1984 1985 1986 1987 1988 1989

Nacional

Exportación

Total

70.000 75.000 76.500 85.000 70.000 68.000

22.000 21.000 19.000 24.000 28.000 27.000

92.000 96.000 95.500 109.000 98.000 95.000

El mercado de producto procesado trabaja sólo con las carnes de mejillón que pueden ser procesados para su uso en la conserva, la semiconserva o el congela-

32

Antonio Figueras y Jorge Cáceres

do. Los mejillones que van directamente a las fábricas de conserva son los de peor calidad y tamaño (Núñez y Castro, 1990). Allí son preparados friéndolos o hirviéndolos y después son cubiertos con diversas salsas. Pueden ser presentados de muy diversas maneras. Las latas (de tamaño variable pero normalmente en el caso de los mejillones de 115 g) son selladas, esterilizadas y empacadas para su distribución mundial. La producción conservera se ha duplicado desde 1984 a 1989 (Tabla II.3). TABLA II.3 Comercialización de mejillón en fresco desde 1984 a 1989 Cantidad comercializada Año 1984 1985 1986 1987 1988 1989

Nacional

Exportación

Total

28.000 36.200 47.000 56.300 63.000 69.000

3.800 4.600 4.200 4.300 5.100 6.000

31.800 40.800 51.200 60.800 68.100 75.000

El mercado del mejillón ha cambiado bastante desde el inicio del cultivo. Al principio, el consumo de mejillón era muy limitado, pero hoy en día el consumo es superior a las 100.000 t, principalmente en fresco (MAR, 1991). En 1984 la distribución de la producción era 40% para el mercado fresco (76% para el consumo nacional y el 24% para la exportación), 50% para la conserva (89% para el consumo nacional y el 11% para la exportación), y el 10% restante para congelados. Recientemente la proporción ha cambiado a 60% comercializado en fresco y el resto (40%) para conserva. La cantidad de mejillón destinado al congelado se ha incrementado hasta llegar a las 15.000 t por año (MAR, 1991). Las exportaciones se realizan principalmente a Italia, Francia y Alemania.

II.14.

COSTES Y PRECIOS DEL CULTIVO DE MEJILLÓN EN GALICIA

De acuerdo con Andreu (1976), el coste de una batea está condicionado por los materiales empleados y por su tamaño. En 1948 una batea de 800 cuerdas con todo su equipo costaba 83.000 pesetas. En 1958, su coste alcanzó las 250.000 pesetas; éstas se repartían de la siguiente forma 150.000 pesetas para carpintería; 21.000 para cadena y anclaje; 65.000 para las cuerdas de esparto y 14.000 para el barco y gastos varios. En 1976, el coste subió al 1.500.000 o 2.000.000 de pesetas (Figueras, 1976); actualmente su coste, incluyendo el equipo, alcanza los 90.000 € (15.000.000 de pesetas).

II. Cultivo del mejillón en Galicia

33

En 1951, el precio del mejillón era de 2,0 a 2,5 pesetas el kg, y en 1958, de 3,5 a 5,75 pesetas el kg (Veiga, 1958). En 1976, el precio del mejillón en la batea era de 7,5 a 9,1 pesetas por kg, el mayorista lo pagaba de 7,5 a 9,1 pesetas por kg. El precio para el consumidor era de 30 pesetas por kg (Andreu, 1976). Actualmente el precio está sobre los 1,5-2 € por kg. Estos precios son realmente bajos cuando se los compara con los pagados por otros productos del mar o por la carne de ovino o vacuno. Los beneficios obtenidos por una familia se han calculado en torno al 25% de la producción total de sus bateas (MAR, 1991). II.15.

PERSPECTIVAS DE FUTURO

En los últimos 50 años Galicia se ha convertido en uno de los principales productores de mejillón del mundo. Aunque las predicciones de producción son bastante halagüeñas, existen diversos factores biológicos, tecnológicos y socieconómicos que deben ser considerados y estudiados para mantener e incrementar la producción. El rápido crecimiento de la producción del mejillón durante los primeros años se ha interrumpido y se ha mantenido a partir de 1975 alrededor de las 200.000 tm. (Tabla II.1). Sin embargo, el tamaño de las bateas y longitud de las cuerdas de cultivo han aumentado, con lo que se ha puesto de manifiesto que los rendimientos por unidad de superficie han disminuido (Núñez y Castro, 1990; Durán et al., 1990; OPMAR, 1990; Pérez Camacho et al., 1991; Guerrero et al., 1993). Por lo tanto estimamos que la producción total está alcanzando su límite y probablemente el número de bateas deba ser estrictamente regulado (Porta, 1978). Para incrementar la producción probablemente sea necesario encontrar nuevas áreas que permitan el desarrollo del cultivo de esta especie. De momento, las pérdidas ocasionadas por los depredadores y los parásitos Mytilicola intestinalis (copepodo) y Marteilia sp. (protozoo) no son importantes. Aún así, es muy importante el mantener un programa de control de mortalidades de mejillón y sobre las prevalencias e incidencias de los parásitos y del estado de condición del mejillón. No se deben permitir traslados de mejillón sin saber si éstos están sanos. También es necesario un programa específico para mantener y mejorar la calidad del agua, porque un deterioro de esta calidad debilitaría al mejillón permitiendo que aumentara la prevalencia de los parásitos y los niveles de contaminantes como los metales pesados. En este sentido el programa de control de mareas rojas debe continuar al alto nivel que está siendo desarrollado por los diversos laboratorios situados en Galicia. También es importante evaluar el impacto del cultivo de mejillón sobre otras especies presentes en el mismo ecosistema, algunas de las cuales tienen un alto valor económico. Otro aspecto importante es el relacionado con la distribución y recolección de juveniles de mejillón. Aspectos como disponibilidad, efecto de la recogida de juveniles de las poblaciones naturales y su capacidad de recuperación, son esenciales para regular y controlar el uso de los juveniles para el cultivo. El cultivo del mejillón puede beneficiarse del uso de nuevos materiales para la construcción de bateas, incluyendo flotadores y cuerdas; el diseño de bateas su-

34

Antonio Figueras y Jorge Cáceres

mergibles que permitiría el cultivo en zonas expuestas al oleaje incrementaría la superficie de las zonas dedicadas al cultivo (Figueras y Figueras, 1990); habría que introducir mejoras en el sistema que evita el desprendimiento de los mejillones y en la maquinaria para la cosecha, el transporte y el procesado. Sin embargo, cualquier mejora debe tener en cuenta a los pescadores y cultivadores de Galicia, no en vano, uno de los puntos clave en el gran desarrollo de este cultivo es el bajo coste laboral debido al carácter familiar de las empresas. Con una elevada mecanización una gran cantidad de empleo podrá perderse. Solamente una mejor organización de los productores, tal como está sucediendo, permitirá cambiar estas estructuras facilitando que los productores controlen el precio final del mercado. Las organizaciones de productores de mejillón como OPMAR y las investigaciones realizadas han identificado una serie de problemas de organización, comercialización, modernización y de carácter biológico, que se requiere resolver para la mejora del cultivo. Ya se han tomado algunas medidas, entre ellas la regulación en el número (500) y longitud (10 m) de las cuerdas de cultivo por batea; regulación del tamaño de las bateas (550 m2); control de los desechos de las labores de cultivo (DOGA 5.177, 28/07/90); y la denominación del mejillón como producto de «calidade galega» para exportación con lo que se pretende mejorar su comercialización.

II.16.

CULTIVO DEL MEJILLÓN E INVESTIGACIÓN EN GALICIA

El desarrollo de las técnicas descritas ha sido relativamente empírico a través de la iniciativa y experiencia de los propios productores. La investigación comenzó un poco después de iniciado el cultivo en la zona con trabajos referentes a la biología y cultivo del mejillón (Andreu, 1954, 1958, 1960a, 1960b, 1963, 1968, 1976a, 1976b, 1976c, 1977; Figueras, 1956, 1973, 1973a, 1976); parasitología (Andreu, 1960b, 1963, 1965); composición química del mejillón (Fraga, 1956a, 1956b, 1958, 1959; Fraga y López-Capont, 1958; López y Rodríguez, 1957; Rodríguez, 1957; Rodríguez y Besada, 1957a, 1957b). Además se iniciaron estudios sobre las mareas rojas (Margalef, 1956). Posteriormente, el interés y las necesidades del sector favorecieron que los trabajos de investigación se diversificaran hacia aspectos de Patología (Figueras y Figueras, 1981; Figueras, 1987,1991; Figueras y Montes, 1987; Figueras y Villalba, 1988; Figueras et al., 1991, Figueras y Robledo, 1993, Figueras y Robledo, 1994; Fernández et al., 1990; Robledo et al., 1993a, 1993b, 1994a, 1994b, 1994c, 1994c; Carballal et al., 1993); taxonomía y genética (Figueras y Figueras, 1983; Sanjuán et al., 1986, 1990; Crespo, 1989; Crespo et al., 1990; Quezada et al., 1989, Presa et al. 2002, Presa y Pérez, 2003, 2005); ecología (Cabanas et al., 1979; Pérez y Román, 1979a, 1979b; Román y Pérez, 1979a, 1979b, 1982; González, 1982); ocurrencia y efectos de las mareas rojas (Fraga et al., 1988; Anderson et al., 1989; Pérez Camacho, 1989). Se continuaron estudios de biología general del mejillón cultivado y descripciones sobre las técnicas de cultivo (Canel,

II. Cultivo del mejillón en Galicia

35

1968; Bardach et al., 1972; SOMEGA, 1975; Román y Pérez, 1979a, 1979b; Aguirre, 1979; Mariño et al., 1982; Figueras, 1982; Figueras, 1987, 1989; Nuñez y Castro 1990; Durán et al., 1990; Pérez Camacho et al., 1991); ciclo reproductivo (Ferrán et al., 1990; Villalba, 1993); inmunología (Santarém et al., 1990, 1992, 1994); impacto ambiental del cultivo de mejillón (Collazo et al., 1993; Landri et al., 1993); diversos aspectos de la fisiología del mejillón (Louzao et al., 1990; Sanjuán et al., 1990, 1993; Treviño et al., 1990; Herrero, 1993, Pérez Camacho et al., 1984, 2000, Navarro et al. 1994 Babarro et al. 2000 a, b); importancia de la procedencia de semilla para cultivo (Reyeiro et al., 1990). No debemos olvidar los trabajos de Labarta et al. (2002, 2004) en los que se sintetizan diversos aspectos socioeconómicos del cultivo del mejillón. Seguro que algunos trabajos han quedado en el tintero pero una somera lectura de la bibliografía de este volumen servirá para adquirir conciencia de la importancia de la investigación gallega sobre el mejillón. Este aumento en las investigaciones sobre el mejillón gallego, ha permitido enriquecer el conocimiento de la especie y mejorar algunos aspectos del cultivo. También ha dejado una sensación de cobertura respecto al estudio científico del mejillón con relación al cultivo, aunque como se verá más adelante hay aspectos que requieren más atención.

II. Cultivo del mejillón en Galicia

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Figura II.1. Batea para cultivo de mejillón construida empleando un casco de barco viejo.

Figura II.2.

Vista de una batea desde el fondo. José Luis González. Marevisión © copyright

Figura II.3. Batea para cultivo de mejillón con un solo flotador central de cemento y madera.

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Figura II.4.

Antonio Figueras y Jorge Cáceres

Batea de diseño reciente para cultivo de mejillón.

Figura II.5. Construcción de bateas aprovechando la bajamar.

Figura II.6.

Construcción de bateas con flotadores metálicos.

II. Cultivo del mejillón en Galicia

39

Figura II.7. Reparación en bajamar de bateas para el cultivo del mejillón.

Figura II.8.

Mapa de la costa de Galicia.

Figura II.9b.

Figura II.9a. Vista de polígono de bateas.

Disposición actual de las bateas.

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Antonio Figueras y Jorge Cáceres

Figura II.10. Post-larvas de mejillón de 400 mm de longitud máxima.

Figura II.11. Semilla de mejillón. Longitud máxima media 1-2 cm.

Figura II.12. Cuerda con semilla de mejillón fijada naturalmente.

II. Cultivo del mejillón en Galicia

Figura II.13.

41

Encordado de semilla de mejillón a mano.

Figura II.14. Encordado de semilla de mejillón a mano.

Figura II.15.

Salida de la cuerda de la maquina automática de encordar mejillón.

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Antonio Figueras y Jorge Cáceres

Figura II.16. Entrada de la cuerda en la máquina automática de encordar mejillón.

Figura II.17. Grúa empleada para levantar las cuerdas con mejillón crecido.

Figura II.18.

Operación de clasificación de mejillón previa al desdoble.

II. Cultivo del mejillón en Galicia

43

Figura II.19. Clasificación del mejillón.

Figura II.20.

Cuerdas de mejillón en tierra.

Figura II.21. Mejillón preparado para su comercialización.

ASPECTOS DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN Y VIDA LARVARIA

III.

ESTUDIOS SOBRE EL CICLO GONADAL JORGE CÁCERES-MARTÍNEZ y ANTONIO FIGUERAS

III.1.

INTRODUCCIÓN

Un aspecto esencial, que hasta ahora ha permitido sostener el cultivo del mejillón y que no se ha estudiado en profundidad, es la disponibilidad de semilla. Andreu (1954, 1958) apuntó la posibilidad de comercializar semilla para otras regiones del país o el extranjero y esta observación se ha mantenido hasta nuestros días, sin embargo no se ha realizado ningún estudio que permita evaluar esta posibilidad. Las escasas observaciones y estudios en este tema (Andreu, 1954, 1958; Aguirre, 1979; Mariño et al., 1982) muestran resultados confusos. Figueras (1982) destacó la necesidad de aclarar dichas observaciones y datos pero, hasta ahora, no se ha realizado ningún estudio en ese sentido. Es de especial interés subrayar que el enorme éxito del cultivo del mejillón en el mundo se debe a que éste se ha desarrollado en zonas en donde la disponibilidad de semilla del medio natural es relativamente constante y abundante (Andreu, 1958; Hickman, 1992; Mason 1976). En consecuencia, se han realizado diversos estudios sobre tres aspectos fundamentales de la biología del mejillón que en conjunto contribuyen a conocer la disponibilidad de semilla para cultivo: ciclo reproductivo, vida larvaria y fijación. Entre ellos destacan los de Zhang et al. (1980, 1984) en China; Dare (1973, 1976, 1981), Dare y Davies (1975), Dare et al. (1983) en el Reino Unido; Hrs-Brenko (1973, 1974) en el Adriático; Margus y Teskeredzic (1986) en la ex Yugoslavia; Hosomi (1980,1984) en Japón; Tursi et al. (1990) en Italia; Salas y García (1987) en México; Incze y Lutz (1980) en Canadá y Estados Unidos; Podniesinski (1986) en Estados Unidos. Recientemente se ha llamado nuevamente la atención sobre la importancia de los estudios sobre disponibilidad de semilla del mejillón para cultivo. Entre 1990 y 1992 se detectó una alarmante disminución en la fijación y en consecuencia en la disponibilidad de semilla que afectó la producción del mejillón en varios países

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Jorge Cáceres-Martínez y Antonio Figueras

del norte de Europa. Para analizar las causas de esta disminución, la Comisión de la Unión Europea a través de su programa FAR, financió dos reuniones de especialistas de diversos países de Europa en 1992 y 1993. Esta disminución de la abundancia de semilla se ha querido relacionar con diversos factores ambientales sin éxito. Aspectos de la biología y anatomía del mejillón El mejillón pertenece al phylum Mollusca, clase Bivalvia, familia Mytilidae, siendo las especies más estudiadas y cultivadas, Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis. Este género se distribuye en aguas boreales y templadas en todos los océanos y grandes mares del mundo, tanto en la zona submareal como intermareal, ocupando una amplia diversidad de sustratos (Koehn, 1991). La anatomía y fisiología del mejillón ha sido descrita con detalle por Field (1922). Posteriormente en las revisiones de Bayne (1967, 1991) y Gosling (1992) sobre biología, fisiología y cultivo del género Mytilus, se recogen los avances sobre los estudios anatómicos y fisiológicos. Para una mejor comprensión de los aspectos tratados en este trabajo a continuación incluimos un breve resumen de su anatomía. El cuerpo del mejillón se encuentra contenido dentro de la concha formada por dos valvas simétricas articuladas entre sí por una serie de dientes (3-4) que permiten su apertura y cierre. La forma de la concha es triangular, más ancha en la región anterior, zona de la charnela, que en la región posterior en donde es delgada y plana. El lado posterior de la concha es semicircular; en la región dorsal se forma casi una línea recta hasta la charnela en donde se curva hacia abajo en un ángulo de 45° hacia el umbo, localizado en la punta de la concha (Field, 1922). La microestructura de la concha está compuesta por dos o tres capas de aragonita y calcita, la cara interna está recubierta por una capa nacarada y la cara externa tiene una cutícula quitinosa. La coloración de la concha generalmente es de color negro-azulado y en ella se marcan las estrías de crecimiento (Field, 1922; Morton, 1992). En la cara interna se insertan el ligamento de la charnela, el músculo aductor anterior y los músculos retractores del pie y del biso (Fig. III.1A). El cuerpo está cubierto por los dos lóbulos unidos en su borde anterior que forman el manto. También están soldados en su parte dorsal mientras que en la parte ventral están separados permitiendo la salida del pie y del biso. Los bordes libres están recorridos por una banda muscular de forma festoneada, soldada a la concha y de color oscuro. El grosor del manto es variable pues depende de su estado de madurez sexual. La cavidad que queda delimitada por los bordes del manto se conoce como cavidad paleal de cuya cara ventral sale el pie y el biso. Desplegando los lóbulos del manto se aprecian las branquias formando cuatro láminas delgadas estriadas transversalmente; en el centro se observa el hepatopáncreas de color café-amarillento sobre el que pasan los músculos retractores del pie (color blanco); el pie, un músculo alargado de color rojo o naranja oscuro, junto a él se

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

49

encuentra la glándula del biso; la bolsa de polichinela que contiene las gónadas que invaden el manto en el momento de la reproducción (Fig. III.1B) Sistema reproductor del mejillón Los mejillones son organismos con sexos separados (dioicos) y externamente no presentan dimorfismo sexual. Sin embargo, en un 75-80% de los casos la distinta tonalidad del manto y de la bolsa de polichinela permite diferenciar los sexos cuando la concha del mejillón se ha abierto; mientras que en los ejemplares hembras suele ser de color ladrillo o anaranjado intenso, los individuos machos presentan una tonalidad blanquecina (Campbell, 1969; Durfort, 1973). La mayoría de las poblaciones de mejillón contienen aproximadamente igual número de hembras y machos (Seed, 1981; Kautsky, 1982; Sprung, 1983). Ocasionalmente se pueden dar casos de individuos hermafroditas y la madurez sexual se puede alcanzar al año de vida, pero la talla a la cual ésta ocurre depende de las tasas de desarrollo en cada localidad (Field, 1922; Seed, 1969,1976; Sprung, 1983). El sistema reproductivo consiste en numerosos conductos que se ramifican a través de los lóbulos del manto sin seguir una tendencia en particular. Los conductos se hacen cada vez más finos hasta terminar en un folículo, en cuyo epitelio germinal se forman las oogonias y espermatogonias que después del proceso de gametogénesis, darán origen a oocitos y espermatocitos, que formarán a los óvulos y a los espermatozoides respectivamente (Field, 1922). Los folículos de los machos son numerosos y uniformes, por el contrario los de las hembras son anchos, menos numerosos y de tamaño variable. En el período que precede a la puesta, los lóbulos del manto están casi exclusivamente llenos de tejido reproductivo. Los demás órganos, con excepción de las branquias, músculos y pie, también están ocupados o cubiertos por los órganos genitales. Los productos sexuales pasan a través de los gonoductos de cada lóbulo y salen al exterior a través del poro genital situado anteriormente al músculo abductor posterior, en el ángulo formado entre el mesosoma y la branquia más interna. Después de la puesta los folículos desaparecen. Además de los gametos y la red circulatoria (vasos, conductos, senos y los hemocitos), el tejido del manto posee dos tipos principales de células: células vesiculares del tejido conectivo (VCT) que almacenan grandes cantidades de glucógeno y células adipogranulares (AG) que contienen gránulos, gotas de lípidos y algunas cantidades de glucógeno (Lubet, 1959; Lubet et al., 1976; Bayne et al., 1982; Pipe, 1987; Peek y Gabbott, 1989). En los machos también existen las células de Sertoli y en las hembras las células foliculares (Peek y Gabbott, 1989). Estas células son las encargadas de poner en contacto las células de reserva con las células germinales en desarrollo mediante uniones a través de las cuales tiene lugar el intercambio y circulación de pequeñas moléculas e iones. Las AG actúan como una fuente inmediata de nutrientes y las VCT se encargan del suministro de energía según las demandas estacionales (Pipe, 1987).

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Jorge Cáceres-Martínez y Antonio Figueras

Ciclo gonadal y del tejido de reserva del mejillón El ciclo reproductivo incluye una serie de procesos que van desde la activación de la gónada mediante la gametogénesis hasta la puesta (liberación de los gametos) y la subsiguiente recesión de la gónada. Por lo tanto se puede dividir en un período reproductivo, que comienza con el inicio de la gametogénesis y culmina con la emisión de los gametos, y un período vegetativo o post-puesta (Seed, 1976), en el que se eliminan los restos de gametos no evacuados y se comienzan a almacenar reservas en las células AG y VCT, para la próxima gametogénesis. En consecuencia el tejido de reserva sufrirá cambios en su volumen (Lowe et al., 1982; Worral y Widdows, 1984; Pipe, 1985, 1987; Peek y Gabbott, 1989). Este ciclo se da de manera continua a través del tiempo en la cual una etapa da origen a la siguiente. En distintos puntos de la costa inglesa, el desarrollo gonadal de Mytilus edulis comienza durante octubre o noviembre (Seed, 1976; Seed y Suchanek, 1992). La gametogénesis tiene lugar durante el invierno hasta que a principios de primavera la gónada está completamente madura. Durante los meses de primavera hay emisiones parciales de gametos, después se produce una rápida gametogénesis hasta que a principios de verano hay, nuevamente, gametos maduros. Este segundo período de gametogénesis es más evidente en mejillones de la zona baja intermareal en donde las condiciones de alimentación son más favorables. Pueden ocurrir emisiones de gametos menos intensas durante el verano hasta que a finales de agosto o septiembre la gónada comienza a entrar en el estadío de reposo. De finales de agosto a octubre el tejido del manto se engrosa con cantidades variables de reservas nutritivas, las cuales se usarán durante el invierno cuando la disponibilidad de alimento puede ser limitante. Si bien las mayores emisiones de gametos ocurren en primavera-verano, pueden ocurrir emisiones menores durante todo el año (Seed y Suchanek, 1991). De acuerdo con Seed y Suchanek (1991), se han encontrado también largos períodos reproductivos en Mytilus edulis resultantes de desoves continuos, especialmente, durante la primavera y verano, en poblaciones naturales de otras partes de Europa y del mundo. También parecen ser característicos de muchas poblaciones de mejillón en cultivo, que se desarrollan bajo condiciones particularmente favorables en nutrientes. Sin embargo, otras poblaciones de mejillón pueden presentar un único y reducido período de desove con una duración de sólo algunas semanas, como ocurre en Noruega (Bøhle, 1963; Lande, 1973) lo que parece estar relacionado con la disponibilidad de alimento en otras épocas del año. El ciclo reproductivo en Mytilus galloprovincialis y Mytilus edulis de la bahía de Arcachon en Francia es prácticamente el mismo que el descrito para las costas inglesas, aunque en M. galloprovincialis el inicio y el desarrollo de la gametogénesis se observaron en agosto pudiendo existir puestas en septiembre. Sin embargo, éstas se detienen por el descenso de temperaturas a finales del otoño y se reinician a finales de marzo, continuando hasta julio (Lubet, 1956). Seed (1976) analiza registros del ciclo reproductivo de Mytilus de varias partes del mundo señalando que, mientras que las especies situadas hacia el sur del

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

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hemisferio norte se reproducen más tarde durante el año y la duración de la puesta tiende a reducirse hacia el norte, en las especies del norte sucede lo contrario (se reproducen antes y la extensión del período reproductivo se extiende hacia el sur). Esta situación se ha asociado, entre otros factores, a la temperatura. Estacionalidad del ciclo reproductivo del mejillón en Galicia Andreu (1954) indica que la época de freza del mejillón en Galicia alcanza su máxima actividad a partir de la segunda quincena de marzo y que existen puestas secundarias de menor importancia casi todo el año. Posteriormente, Andreu (1958, 1962, 1963) refiriéndose a su observación de 1954, añade que las puestas secundarias, son especialmente acusadas, con tiempo favorable en otoño. Este mismo autor en 1968 y 1976, con base en sus anteriores trabajos indica que el ciclo de reproducción del mejillón gallego es muy amplio, abarcando las tres cuartas partes del año y que presenta dos puestas: – La más abundante en primavera que normalmente se inicia en febrero y termina a inicios del verano, traduciéndose en una fijación de semilla abundante en los litorales y bateas. – La segunda ocurre en otoño-invierno, entre noviembre y enero. En este caso la fijación ocurre únicamente sobre las rocas del litoral. Más tarde, Aguirre (1979) estudia el estado de madurez de las gónadas, época de puesta y edad de la primera puesta en el mejillón de la ría de Vigo. Utiliza como indicador de la madurez sexual la talla de los oocitos y encuentra, al igual que Andreu (1954, 1958), que hay individuos maduros durante todo el año y que hay dos puestas, una en primavera (marzo-abril) y otra en otoño (septiembre a octubre). Aunque detectó una fijación del mejillón sobre colectores de bateas después de la puesta de primavera, no la detectó después de la puesta de otoño. Aguirre (1979) explica estos resultados por la posible mortalidad de las larvas en otoño-invierno debida a las bajas temperaturas. Mariño et al. (1982) determinan el ciclo reproductivo del mejillón en la ría de Arosa, a través de la fijación ocurrida sobre colectores de batea, encontrando que el período reproductivo comprende desde marzo-abril hasta julio-agosto. Sin embargo, apuntan que durante el resto del año (otoño-invierno) el mejillón tiene las gónadas muy desarrolladas pudiendo haber puestas durante este tiempo. El hecho de que estas puestas no resulten en una fijación de las larvas producidas puede deberse a que la puesta es muy escasa o a que las larvas mueren por condiciones ambientales desfavorables en esa época del año (temperatura, salinidad, alimento). No se vuelve a aportar datos sobre el ciclo reproductivo del mejillón en Galicia hasta las experiencias de Ferrán (1991) en las Rías de Arosa y Muros. Este autor, estudiando el ciclo estacional del tejido de reserva, del desarrollo gonadal, de las reservas bioenergéticas del manto así como las variaciones temporal y geográfica de los ciclos gonádicos, concluye que las puestas del mejillón gallego cultivado, están muy extendidas a lo largo del año y que las emisiones de mayor im-

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portancia ocurren durante la primavera y pueden extenderse hasta bien avanzado el verano. Concluye además que hay dos puestas en primavera, separadas por un intervalo de restauración gonadal que puede durar entre 13 y 30 días. Villalba (1993) estudia el ciclo gonadal y de células adipogranulares del mejillón de cultivo en las Rías de Vigo, Arosa, Muros y Ares-Betanzos. Encontró que, con algunas diferencias entre las Rías, la gametogénesis se desarrolla a lo largo del otoño e inicio del invierno, utilizando las reservas acumuladas en el tejido de reserva en los meses previos. En el invierno los mejillones permanecieron maduros y la primera puesta masiva no se produjo hasta primavera. Tras la puesta hubo una rápida restauración gonadal y una nueva puesta en primavera. En verano una parte de los mejillones restauró de nuevo la gónada y realizó nuevas puestas, aunque la mayor parte reabsorbió la gónada. Solamente en la ría de Ares-Betanzos se detectó una única puesta masiva a principios del verano.

III.2.

MATERIAL Y MÉTODOS

Durante un período de cinco años hemos estudiado el ciclo de desarrollo gonadal de M. galloprovincialis cultivado experimentalmente en cestas situadas en distintas bateas y en poblaciones naturales del litoral y en la Ría de Vigo. El estudio se desarrolló en dos experiencias solapadas de dos años de duración cada una para las poblaciones en cultivo y un estudio de casi dos años para las poblaciones naturales. La Ría de Vigo tiene 33 Km de largo con un área superficial de 176 Km2 y un volumen de agua de 3.273 Km3. Está dividida en tres partes bien definidas: la parte interior corresponde a la ensenada de San Simón y presenta características de estuario debido a los aportes de agua dulce del río Oitavén, la zona media se extiende desde el estrecho de Rande hasta Cape del Mar y la parte externa, bajo condiciones oceánicas, va desde Cape del Mar hasta las Islas Cíes. Estas islas dividen la boca de la Ría en dos: la boca sur que tiene 5 Km de ancho y 67 m de profundidad, y la boca norte, más pequeña con 2,5 Km de ancho y 23 m de profundidad. Las zonas de Cabo Home y Liméns están encuadradas dentro de la zona externa de la Ría con características hidrográficas totalmente oceánicas, la temperatura del agua varía entre 13,2 y 19,5°C y la salinidad entre 32 y 35 ppm. En Meira, ya en la zona media de la Ría, la temperatura fluctúa entre 12,3 y 20,3°C y la salinidad entre 29 y 35 ppm. Las zonas de Domayo y San Adrián están situadas en el límite de la zona interna de la Ría y presentan condiciones totalmente estuáricas (Prego y Fraga, 1992). La temperatura del agua oscila entre 12,2 y 19,2°C y la salinidad entre 26 y 35 ppm. (Fig. III.2). Entre diciembre de 1987 y marzo de 1990 determinamos la influencia de la localidad y la profundidad muestreando en los polígonos H, distrito I de Liméns y C, distrito II de Meira. En cada localidad se sumergieron, a profundidades de 2 y 5 m, 900 mejillones de una talla media inicial de 41,4 mm (DE=6,3) repartidos a iguales densidades en 11 cestos del tipo usado para el engorde de ostras. Durante el primer año el muestreo se realizó con una frecuencia mensual y posteriormente

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

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con una frecuencia bimensual. En todos los casos el tamaño de la muestra fue de 30 ejemplares. Entre enero de 1989 y diciembre de 1990 realizamos las experiencias para determinar la influencia de la localidad sobre el desarrollo gonadal. Esto se llevó a cabo en los mismos polígonos de la experiencia anterior en Liméns y Meira, pero incluimos Domayo (batea del polígono A, distrito III) con objeto de ampliar la cobertura del estudio. En cada una de las localidades se repartieron en 13 cestas, a densidades iguales, 500 mejillones con una talla media de 45,3 mm (DE = 7,9). Las cestas se sumergieron a 5 m y, la frecuencia de muestreo fue bimensual. Para determinar el ciclo gonadal de mejillones de poblaciones del litoral muestreamos mensualmente, entre octubre de 1991 y mayo de 1993, 30 mejillones adultos (longitud total media 50,57 mm, DE = 0,59) de los bancos naturales de mejillón de Cabo Home y San Adrián en la zona intermareal. Durante todas las experiencias se tomaron registros de salinidad con un refractómetro portátil con compensación de temperatura (Aquafauna, 0-100 ppm), y de temperatura con un termómetro 0-50°C. Para determinar el ciclo de desarrollo gonadal empleamos el método de estereología cuantitativa, es decir el recuento de los componentes del manto en cortes histológicos que se prepararon de acuerdo con protocolos establecidos en nuestro laboratorio. El estudio del ciclo gonadal se realizó tomando como referencia la variación, durante el período de estudio, de los principales componentes del manto, a saber: – Gametos maduros (GM). – Gametos en desarrollo (D). – Células vesiculares del tejido conectivo (VCT). – Células adipogranulares (AG). – Espacios foliculares libres (E). La diferenciación entre gametos maduros e inmaduros en machos es muy clara ya que las espermátidas y los espermatozoides se diferencian de espermatogonias y espermatocitos por su forma y ubicación dentro del folículo. En el caso de las hembras se consideraron como gametos inmaduros a las oogonias y oocitos adheridos a la pared del folículo, con un eje longitudinal inferior al doble del eje transversal. Las células vesiculares del tejido conectivo y las adipogranulares se distinguen con toda precisión y los espacios foliculares libres se consideraron como espacios evacuados (E). La estereología cuantitativa se basa en el principio de Delesse (1847) que establece que en una sección bidimensional o fracción de volumen (que representaremos por las letras Vv) de una roca (o cualquier otro sólido compuesto, por ejemplo un tejido), la naturaleza y distribución de los componentes seccionados está relacionada cuantitativamente con su naturaleza tridimensional y su distribución en la estructura de un todo (Briarty, 1975). Este principio parte de que la fracción

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de volumen (Vv) de los diversos componentes «i» de un sólido compuesto se puede estimar midiendo, sobre secciones tomadas aleatoriamente, las áreas relativas de sus perfiles y su expresión matemática es: AAi = VVi. La fracción de volumen del componente i (VVi) se define como el volumen del componente i en la unidad de volumen del espacio de referencia, y se estima mediante una retícula con una serie de puntos alineados, de tal forma que se obtiene contando el número de puntos que se encuentran sobre los perfiles del componente i. Es necesario para esta estimación delimitar el espacio de referencia y sus componentes, en este caso el manto. Con este fin se empleo la retícula de Weibel et al. (1966) situada en el ocular del microscopio. Utilizando el objetivo de 20X se contaron los componentes del manto que quedaron debajo de los extremos de cada segmento de los 21 (42 puntos de recuento) de que consta dicha retícula. Este procedimiento se repitió cinco veces (210 puntos de recuento) al azar sobre el corte histológico de la gónada de cada mejillón para obtener una representatividad del estado de madurez en todo el corte. Finalmente se suman las apariciones de cada componente del manto y se expresan como fracción de volumen (Vv) del total posible (%): å de apariciones de cada componente del manto/210´100. Una representación muy clara del ciclo gonádico y del tejido de reserva, se obtiene mediante los índices gonádico (IG) y somático (IS) (Ferrán, 1991), que no son más que la suma de las fracciones de volumen ocupadas por gametos maduros e inmaduros en el primer caso y por células vesiculares y adipogranulares en el segundo, en ambos casos el total se expresa en %. Independientemente de que la representación gráfica de la fluctuación de las fracciones de volumen de los componentes del manto permite inferir la ocurrencia de la gametogénesis, la emisión de gametos y los procesos de acumulación de reservas, un aumento en el índice gonádico denota la ocurrencia de la gametogénesis y un aumento en el índice somático denota la acumulación de reservas. Los resultados obtenidos se interpretaron bajo estas consideraciones. Con el fin de establecer si había diferencias significativas desde el punto de vista estadístico entre los ciclos gonadales obtenidos en cada localidad y situación, se tomó como referencia el índice gonádico (IG) (igualmente se puede tomar como indicador el índice somático (IS), ya que la relación entre ambos es interdependiente) y se aplicaron test de Kruskal-Wallis y de Mann-Witney (Zar, 1984).

III.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como se observa en la Figura III.3, las mayores proporciones de gametos maduros y en desarrollo se detectaron entre el invierno y primavera de 1989, aunque hay un desplazamiento en la presencia de gametos durante 1990, de invierno a mediados del verano. La liberación de gametos también ocurrió durante todo el año. Las células adipogranulares y vesiculares del tejido conectivo, fueron abundantes durante la mayor parte del seguimiento, aunque sus niveles más bajos se detectaron entre invierno y primavera.

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

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El análisis de la Figura III.4, muestra ciertas diferencias entre el ciclo gonadal e índices gonádico y somático detectados en cada una de las localidades estudiadas, sobre todo en las magnitudes de los índices gonádico y somático ocurridas entre febrero y junio de 1990, sugiriendo una disminución entre las diferencias del valor de cada índice de Liméns hacia Domayo. Sin embargo, el análisis estadístico, tomando como referencia el índice gonádico obtenido en cada una de las tres localidades, reveló que dichas diferencias no fueron significativas (H = 1,55, p > 0,05, test de Kruskal-Wallis). Tampoco la profundidad afectó significativamente estos parámetros. El patrón general indica que el índice gonádico aumenta en el invierno alcanzando sus valores más altos en primavera, para luego disminuir a partir del verano y alcanzar sus valores más bajos en el otoño, posteriormente el ciclo se reinicia. Con respecto al estudio de la influencia de la localidad en mejillones de batea y litoral, las variaciones de los componentes del manto y las fluctuaciones del índice gonádico y somático son similares (diferencias no significativas) en los cuatro puntos estudiados y aunque cada uno de ellos presenta variaciones respecto a los demás, el patrón general se mantiene. En las Figuras III.5 y III.6 se muestran los valores promedio de las variaciones de los componentes del manto y de las fluctuaciones del índice gonádico y somático obtenidos de las cuatro localidades estudiadas. El patrón general indica que los gametos maduros comienzan a aumentar en el invierno para alcanzar sus valores más altos en la primavera y, posteriormente, comenzar a disminuir. La presencia de folículos evacuados es más o menos proporcional a la cantidad de gametos maduros, aunque aumenta un poco en la primavera. Por el contrario, las células adipogranulares y las vesiculares del tejido conectivo son abundantes en verano y otoño. La fluctuación inversa entre los gametos y el tejido de reserva se aprecia claramente mediante la representación gráfica del índice gonádico y somático. En la Figura III.7 se muestran los valores promedio del índice gonádico y somático de los tres estudios desde diciembre de 1987 hasta junio de 1993. Si bien las localidades y situación (profundidad) no fueron las mismas, dada la similitud entre los patrones de fluctuación de los índices gonádico y somático obtenida de los tres estudios, la representación gráfica permite una valoración general de las fluctuaciones del ciclo gonadal del mejillón en la Ría de Vigo durante más de 5 años. En general se aprecia un patrón común que se repite cíclicamente, sin embargo, la magnitud y amplitud de las fluctuaciones presentan características propias cada año. La proporción general de machos y hembras se mantuvo alrededor del 50% y sólo se observaron tres casos de hermafroditismo en el total de muestras examinadas. En la ría de Vigo, la gametogénesis ocurre durante el otoño e inicios de invierno, cuando el tejido de reserva es abundante (células adipogranulares y vesiculares del tejido conectivo) y aporta la energía para este proceso. Durante el invierno los gametos están morfológicamente maduros, y pueden ocurrir emisiones de gametos, sin embargo las puestas más importantes se inician hasta la primavera, probablemente estimuladas por el aumento de la temperatura. Después de las primeras emisiones de gametos, pueden ocurrir procesos rápidos de gametogénesis

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permitiendo nuevas emisiones durante la misma estación y, en ocasiones, extenderse hasta el verano. Durante el resto del año siguen ocurriendo emisiones de gametos, pero su magnitud, aunque variable, se mantiene en baja proporción especialmente durante finales del verano y el otoño. Por otro lado, nuestros resultados reflejan variaciones a nivel local, sobre el ciclo gonadal general descrito antes. Una de nuestras hipótesis de trabajo fue que pudieran ocurrir diferencias entre el ciclo gonadal de mejillones sometidos a condiciones de cultivo con el ciclo gonadal de aquellos establecidos en poblaciones naturales, así como variaciones de unos y otros con respecto a la localidad dentro de la Ría. En este sentido, las variaciones del ciclo gonadal descritas por Seed (1976) en poblaciones naturales de mejillón establecidas a diferente altura de la zona intermareal de litorales protegidos y expuestos reflejaron ciertas diferencias: mientras que en los mejillones establecidos en el litoral inferior, en donde la disponibilidad de alimento es mayor, la restauración de la gónada en el verano ocurrió en la mayoría de los mejillones, en aquellos situados en la zona del litoral superior, la restauración sólo la alcanzaron algunos ejemplares. En nuestro caso, en el ciclo gonadal de los mejillones muestreados de las zonas litorales y en los flotadores y cadenas de las bateas no apreciamos diferencias notables. Una razón es que, al realizar el muestreo en los litorales sobre los mejillones de la zona baja intermareal, la disponibilidad de alimento en principio no fue un factor diferencial. Otra de las preguntas a responder es la posible existencia de diferencias en algún parámetro de la reproducción entre localidades de la misma Ría. Detectamos una tendencia a una menor magnitud del índice gonádico respecto al somático, del exterior al interior de la Ría, lo que sugiere una menor respuesta reproductiva hacia el interior (Cáceres y Figueras, 1997). En este sentido, es importante señalar que aunque los valores de salinidad, temperatura y clorofilas a, b, c no son muy diferentes entre una localidad y otra (Centro Galego para o Control da Calidade do Medio Marino, 1992), hay otras condiciones que pueden afectar el ciclo reproductivo como puede ser la presencia de parásitos. Figueras et al. (1991); Villalba et al. (1993); Robledo et al. (1994) encontraron una mayor prevalencia del protozoo parásito Marteilia refringens en las zonas internas que en las externas de las Rías de Arosa y Vigo. Robledo et al. (1994) asociaron esta situación a la densidad de mejillones cultivados, ya que el mayor número de bateas se encuentra hacia el interior y en consecuencia, si la infección depende de la oportunidad de encuentro entre el parásito y el hospedador, las posibilidades de infección y prevalencia de la enfermedad se acentúan en esas áreas. Sin embargo, estas diferencias no se detectaron en el estudio de influencia de la localidad y la profundidad en Liméns y Meira, ni en el de influencia de la localidad en poblaciones naturales de litoral y de batea. En la ría de Vigo el factor profundidad (1 a 5 m) no parece tener influencia sobre el ciclo reproductivo de mejillones en condiciones de cultivo (Cáceres y Figueras, 1997). La baja incidencia de hermafroditas sugiere que M. galloprovincialis posee un gonocorismo estable, una condición caracterizada por la presencia de algunos hermafroditas en una especie gonoida normal (Brouseau, 1983).

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

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Figura III.1. Mytilus galloprovincialis. A. Cara dorsal e internas de las valvas donde se aprecian las impresiones musculares. B. Cuerpo con las paredes del manto y branquias vueltas hacia los lados en donde se señalan sus principales estructuras (Modificado de Gras, 1976 y Landín, 1981)

Figura III.2 Mapa de la Ría de Vigo. A. Las flechas delgadas indican la circulación de agua y las gruesas la llegada de agua oceánica. B. Puntos de muestreo y polígonos de bateas en donde se obtuvieron muestras.

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Figura III.3. Variaciones en la fracción de volumen ocupada por los distintos componentes del manto en mejillones de las tres localidades estudiadas. VCT. Células vesiculares. AC. Células adipogranulares. EF. Folículos evacuados. DG. Gametos en desarrollo. RG. Gametos maduros.

III. Estudios sobre el ciclo gonadal

Figura III.4.

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Variaciones de los índices somático y gonádico en mejillones mantenidos en las tres localidades estudiadas en la Ría de Vigo.

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Figura III.5. Variaciones promedio en las tres localidades estudiadas en la fracción de volumen ocupada por los distintos componentes del manto. VCT. Células vesiculares. AC. Células adipogranulares. E. Folículos evacuados. D. Gametos en desarrollo. M. Gametos maduros.

Figura III.6.

Variaciones promedio en las cuatro localidades estudiadas de los índices somático (IS) y gonádico (IG) de mejillones de la Ría de Vigo.

Figura III.7. Fluctuaciones promedio de los de los índices somático (IS) y gonádico (IG) de mejillones de la Ría de Vigo desde diciembre de 1987 hasta junio de 1993.

IV. VIDA LARVARIA DEL MEJILLÓN. EL DESARROLLO LARVARIO DEL MEJILLÓN JORGE CÁCERES-MARTÍNEZ y ANTONIO FIGUERAS

IV.1.

INTRODUCCIÓN

Los mejillones expulsan sus gametos directamente de los conductos genitales al mar en donde se realiza la fertilización. Las hembras liberan los huevos intermitentemente en cordones de color naranja que rápidamente se tornan esféricos y se disocian en el medio. Su tamaño varía entre 60 y 80 mm y su número depende del estado de madurez de la hembra y no de su talla (Field, 1922; Strathmann, 1987). Una hembra de Mytilus edulis de unos 7 cm de longitud total de la concha, puede producir alrededor de 7,5 ´ 106 huevos durante un período completo de desove, mientras que otros ejemplares de tallas similares pueden producir hasta 40 ´ 106 huevos (Thompson, 1979). Los machos expulsan el esperma en corrientes, su color es blanco dando un aspecto lechoso al agua. La ultraestructura del espermatozoide y del huevo las han descrito Bernard (1986) y Humphries (1969). La reacción del acrosoma facilita la penetración del espermatozoide dentro del huevo (Nijima y Dan, 1965). La vida larvaria se inicia después de que el huevo ha sido fertilizado adquiriendo un diámetro de hasta 90 mm y que se caracteriza por tener un saco vitelino de un grosor entre 0,5 y 1,0 mm. De acuerdo con Widdows (1991) después de 4 a 5 horas (a 18°C), en que han ocurrido una serie de divisiones, aparece un cilio y el embrión es capaz de nadar. El estadío de larva trocófora se alcanza aproximadamente después de 24 a 48 horas de la fertilización; en este estadío se comienza a formar la concha a partir del delgado ectodermo dorsal, la glándula de la concha secreta la primera concha de la larva llamada prodisoconcha I. En este estadío la larva posee una charnela o gozne recto mostrando una forma «D» con un tamaño de 100 a 120 mm. La segunda concha o prodisoconcha II se comienza a secretar dentro de las valvas de la prodisoconcha I; es secretada cíclicamente por el manto

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exhibiendo líneas de desarrollo concéntricas y ornamentaciones que la distinguen de la prodisoconcha I. A este estadío también se le conoce como veliconcha o estadío de larva velíger; entre los 15 y 20 días después de la fertilización, cuando la larva velíger ha alcanzado una talla entre las 150 a 160 mm, se forman dos protuberancias o umbos que se curvan hacia la parte posterior de la concha dando origen a la larva velíger umbonada. En total el estadío de larva velíger dura varias semanas, dependiendo de las condiciones ambientales, durante las cuales se da un rápido desarrollo de 120 a 250 mm. La larva velíger tiene una morfología relativamente simple: el velo u órgano ciliado natatorio y que también se usa en la alimentación, intestino funcional y concha. Al alcanzar una talla alrededor de 300 mm de longitud total de la concha, después de 30 a 40 días desde la fertilización, se desarrolla la mancha ocular y el pie. Este estadío es denominado pedivelíger por la coexistencia del velo y pie, y se dice que la larva es competente para iniciar la fijación (Widdows, 1991). Crecimiento y duración de la vida larvaria del mejillón En Mytilus edulis el desarrollo medido en longitud total de la concha desde la primera prodisoconcha hasta el estadío de pedivelíger generalmente es lineal (Sprung, 1984; Pechenik et al., 1990), con una tasa de desarrollo máxima de 12 mm día–1 a 18°C y bien alimentadas. Sin embargo, las curvas de desarrollo tienden a hacerse asintóticas a bajas temperaturas (6°C) y en condiciones de mala alimentación (Sprung, 1984) o cuando las larvas en estadío pedivelíger retarden la metamorfosis por la ausencia de sustratos disponibles para la fijación (Bayne, 1965). En consecuencia la duración de la vida larvaria puede ser de 3 semanas, pero puede extenderse hasta 3 meses. Si bien un período muy extendido de vida planctónica favorece una amplia dispersión gracias a las corrientes marinas, también tendrá como consecuencia una reducción en las posibilidades de supervivencia (Widdows, 1991) ya que las probabilidades de ser depredado aumentan (Kautsky, 1982). El éxito para completar este período de vida depende de: a) una adecuada disponibilidad de alimento; b) condiciones ambientales favorables, en especial la temperatura, salinidad, oxígeno y contaminantes; c) predación; y d) contacto con áreas y condiciones favorables para la fijación (Hrs-Brenko 1973, Widdows 1991). Variación estacional de la abundancia de las larvas del mejillón El estudio de las fluctuaciones en la abundancia de larvas de mejillón permite, de manera indirecta, conocer los períodos de reproducción de la especie y su duración (Chiperfield, 1953; Seed y Suchanek, 1992). Si bien este conocimiento no es muy preciso, debido a la dispersión de larvas por las corrientes marinas a zonas alejadas de la población que les dio origen, en conjunto con estudios sobre la gametogénesis y la fijación, permite obtener una visión muy completa de la biología

IV. Vida larvaria del mejillón. El desarrollo larvario del mejillón

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reproductiva y de las primeras etapas de la vida del organismo. Esta información es esencial para la obtención de semilla para cultivos comerciales. En la mayoría de las regiones, las larvas de Mytilus pueden encontrarse durante la mayor parte del año y alcanzan su máximo número durante la primavera y verano (Seed, 1969; Hrs-Brenko, 1973, 1974; Buyanovskii y Kulikova, 1985). Su presencia se corresponde, en consecuencia, con la amplitud del período reproductivo característico de Mytilus (Hrs-Brenko, 1973, 1974). Estudios del zooplancton y presencia de larvas del mejillón en las Rías Gallegas En las Rías Gallegas, los estudios sobre zooplancton y en especial sobre larvas de moluscos son particularmente escasos. Carus Falcón (1903) realizó un inventario sobre algunos componentes del zooplancton de la ría de Arosa. Hasta que Vives (1960) retoma esta investigación sobre el zooplancton superficial de la ría de Pontevedra no se realizaron trabajos sobre este tema. A continuación Corral (1972); Corral y Spohor (1976) y Álvarez-Osorio (1977) realizan diversos trabajos sobre copépodos y Alcaraz (1977) sobre técnicas de colecta de zooplancton. Corral y Álvarez-Osorio (1978) estudiaron la composición y distribución espacial y temporal del zooplancton en la ría de Arosa, encontrando que la presencia de larvas de lamelibranquios en general es abundante en primavera y finales del verano, especialmente en la zona interna de la Ría. Posteriormente Domínguez y Alcaraz (1983) identifican las larvas de moluscos lamelibranquios de la ría de Pontevedra; apuntando que si bien la morfología de la charnela es muy característica para la familia Mytilidae, la identificación a nivel de especie es difícil, así que la forma encontrada se asignó a Mytilus galloprovincialis por la extraordinaria abundancia de esta especie en la Ría. Alcaraz y Domínguez (1985) estudiaron el ciclo anual de abundancia de larvas de lamelibranquios en la ría de Pontevedra. Encontraron que Mytilus galloprovincialis fue, junto Cerastoderma edule la especie más abundante. La mayor densidad de larvas se observó durante la primavera y el verano, con un pico de abundancia en el mes de julio. En agosto sufrió un brusco descenso, aunque no desapareció del todo hasta diciembre. En cuanto a estudios de laboratorio sobre la vida larvaria de Mytilus galloprovincialis en la zona, se tiene como antecedente el trabajo de Aguirre (1979) que logró con éxito el mantenimiento de larvas desde la fertilización hasta la fijación. El crecimiento, las fases larvarias y su duración, fueron prácticamente las mismas que se han descrito para Mytilus edulis (Field, 1922; Bayne, 1965; Widdows, 1991). IV.2.

MATERIAL Y MÉTODOS

Con el fin de minimizar los problemas de muestreo de zooplancton determinamos la abundancia de larvas de mejillón en la ria de Vigo mediante la filtración de

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Jorge Cáceres-Martínez y Antonio Figueras

volúmenes de agua obtenidos mediante una bomba de succión sumergible y bidones de plástico de 25 l. El muestreo se realizó cada mes entre octubre de 1991 y mayo de 1993 en las localidades: litoral de Cabo Home y San Adrián; polígono de bateas de Liméns y de San Adrián. En las zonas litorales (Cabo Home y litoral de San Adrián) se filtraron por gravedad entre 25 y 50 l de agua de mar tomada de la superficie de las inmediaciones de los bancos de mejillón durante la bajamar. En las cuatro localidades se tomaron registros de salinidad, con un refractómetro portátil con compensación de temperatura (Aquafauna, 0-100 ppm), y de temperatura con un termómetro manual 0-50°C. Las muestras obtenidas en cada una de las localidades se fijaron en una solución de metanol al 70% inmediatamente después de filtrarla, para su posterior análisis. Las larvas se separaron de la muestra mediante una micropipeta, se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 10% para eliminar la materia orgánica (ligamento y partes blandas de la larva), limpiar y separar las valvas. Posteriormente se sumergieron varias veces en agua destilada para eliminar el hipoclorito de sodio. Si las valvas no se separaban espontáneamente, el proceso se aceleraba empleando una aguja enmangada. Las valvas se colocaron con la ayuda de una micropipeta sobre un portaobjetos. Se usó gelatina glicerinada como medio de montaje. La identificación de larvas veliger o «larvas D» a nivel de genero y especie es muy difícil o practicamente imposible (Rees, 1950; Loosanof et al., 1966; Domínguez y Alcaraz, 1983) por lo que, para la interpretación de resultados, éstas se agruparon en términos generales como larvas «D» de moluscos bivalvos. La identificación fue posible a partir de los estadios de larva umbonada y pedivelíger a nivel de genero (Mytilus) utilizando las claves y observaciones de Rees, 1950; Lutz y Hidu, 1979; Le Pennec, 1978, 1980. Las medidas utilizadas para la identificación fueron la longitud total, ancho, altura de la concha la ornamentación de la prodisoconcha I, especialmente característica en Mytilus (Werner, 1939; Lehnberg y Theede, 1979) y medidas y dentición de la charnela. La identificación de larvas competentes y especialmente de post-larvas es más sencilla tomando en cuenta las mismas características ya señaladas. Para la interpretación de resultados se diferenciaron larvas «D», larvas velíger umbonadas y pedivelíger (> 200 mm de longitud total de la concha) y, post-larvas (> 470 mm de longitud total de la concha). El límite de la talla inferior de este último grupo se determinó en función de los valores de talla (longitud total de la concha) máximos registrados para larvas pedivelíger competentes de Mytilus edulis (Rees, 1954; Bayne, 1965; Widdows, 1991). Para comparar la abundancia de larvas en las diferentes localidades, se utilizó un test de Kruskal-Wallis (ver Podniesinski, 1986), seguido de un test de comparación tipo Tukey cuando las diferencias fueron significativas (Zar, 1984). Se hicieron además test de «T» para comparar la composición de tallas entre localidades y ANOVAS de una vía para comparar los registros de salinidad y temperatura en las distintas localidades (Sokal y Rohlf, 1979).

IV. Vida larvaria del mejillón. El desarrollo larvario del mejillón

IV.3.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados promedio del número de larvas y post-larvas obtenidas en los polígonos de bateas (zonas pelágicas de la Ría) se muestran en la Figura IV.1A. La presencia de larvas «D» se detectó la mayor parte del año y fue la más abundante, la presencia de larvas pedivelíger y de las post-larvas fue muy escasa. El valor máximo en abundancia de larvas «D» ocurrió entre finales del invierno y principios de primavera (febrero-marzo), hasta inicios del verano (julio). Los registros de larvas pedivelíger ocurrieron unos 30 días después del valor máximo en abundancia de larvas «D». El número de post-larvas en el plancton de estas localidades es muy escaso y esporádico, cuando ocurrieron, se registraron, entre unos 30 y 60 días después del registro de las mayores abundancias de larvas pedivelíger. Los resultados promedio del número de mejillones obtenidos en las zonas litorales de la Ría se muestran en la Figura IV.1B. En este caso las larvas «D» son escasas, sus incrementos coinciden con los detectados en las zonas de bateas. Por el contrario la presencia de larvas pedivelíger y post-larvas fue más abundante y ocurrió entre 60 y 90 días después de que se detectaron los picos en abundancia de larvas «D» en las cuatro localidades (bateas y litorales). El análisis estadístico de la abundancia de las larvas «D» en las cuatro localidades estudiadas confirmó que éstas fueron mucho más abundantes entre los polígonos de bateas que en las zonas litorales (Test de Kruskal-Wallis, H = 9.931. p < 0,02, seguido por una comparación tipo Tukey), y que la abundancia de larvas pedivelíger y post-larvas es mayor en los litorales, en especial en el litoral de Cabo Home, que en las bateas (Test de Kruskal-Wallis, H = 11.423. p < 0,01, seguido por una comparación tipo Tukey). Estas diferencias también muestran que en las localidades del interior de la Ría: litoral y polígono de bateas de San Adrián, el número total de larvas y post-larvas fue menor que en las correspondientes localidades del exterior de la Ría: litoral de Cabo Home y Polígono de San Adrián. Las tallas de larvas pedivelíger obtenidas en los polígonos de bateas en Liméns y San Adrián fluctuaron entre 0,200 mm y 0,400 mm y de forma esporádica y ocasional se detectaron post-larvas con tallas entre 0,500 mm y 1.000 mm. En los litorales de Cabo Home y San Adrián las tallas variaron entre 0,225 mm y 2.100 mm. Estas diferencias entre las localidades litorales y las de cultivo fueron estadísticamente significativas (T = 7.338, p < 0,01). En la Figura IV.2, se muestra la distribución de frecuencias de tallas de larvas pedivelíger y post-larvas durante el período de mayor incidencia de las mismas en Cabo Home y Litoral de San Adrián durante el período de mayor incidencia. En Cabo Home, el mayor número de las larvas pedivelíger se detectó en julio y agosto, y entre septiembre y octubre se apreció una mayor dispersión de tallas hacia la derecha (post-larvas). En el litoral de San Adrián se aprecia una situación similar en julio aunque en agosto las larvas pedivelíger disminuyen. En septiembre y octubre las larvas pedivelíger desaparecen y se llegan a encontrar algunas post-larvas.

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Considerando los máximos de abundancia de larvas «D», larvas pedivelíger y post-larvas obtenidas en nuestros estudios, estimamos que la duración de la vida larvaria de Mytilus galloprovincialis de la ría de Vigo en condiciones naturales es de 30 a 60 días (Cáceres y Figueras, 1997). Esta duración queda dentro de los límites de duración de vida larvaria que se han descrito para Mytilus edulis en diferentes regiones del mundo (Widdows, 1991) y un poco superior a la duración de la vida larvaria (50 días) de Mytilus galloprovincialis estimada en laboratorio (Aguirre, 1979). Nosotros encontramos un pico en abundancia de larvas «D» que se extiende entre el inicio de la primavera y el verano, correspondiéndose con los resultados de Corral y Álvarez-Osorio (1978) y Alcaraz y Domínguez (1986) para las rías de Arosa y Pontevedra. Sin embargo, en los estudios citados no se presenta un análisis en la composición de tallas de las larvas que nos pudiese indicar si, como en nuestro caso, los estadíos de larva pedivelíger y post-larva son escasos y aparecen al final de la ocurrencia de los máximos de abundancia de larvas del mejillón en el plancton. En la ría de Vigo la presencia de larvas «D» durante casi todo el año, con su mayor abundancia entre marzo y julio, indica una continua emisión y fertilización de gametos lo cual coincide con un período reproductivo muy extendido durante el año y con una emisión de gametos máxima entre primavera y principios del verano como en el caso de Mytilus edulis en diferentes localidades de Europa y el mundo (Hrs-Brenko, 1973, 1974). Evidentemente la correspondencia no es exacta poniéndose de manifiesto diferencias interanuales, pero que se corresponden respecto a estaciones o épocas. Un hecho fundamental que parece influir sobre la observación de un segundo período reproductivo en el otoño, basándose en la observación de fijaciones durante esa época en zonas rocosas, como lo menciona Andreu (1954, 1958), está relacionado con la dispersión de post-larvas después de que se han establecido sobre el sustrato y han sufrido la metamorfosis (Maas Geesteranus, 1942; Verwey, 1952; De Blok y Geelen, 1958; Bayne, 1964). Hemos detectado, la presencia esporádica y en reducido número de post-larvas en las muestras obtenidas en las zonas de cultivo (zonas abiertas con profundidades entre 15 y 20 m), mientras que éstas fueron mucho más abundantes en las zonas litorales, y a finales del verano y principios del otoño. Esta situación muestra dos aspectos fundamentales sobre las características y adaptaciones del mejillón durante su vida larvaria y post-larvaria: el primero, que las larvas «D» están completamente adaptadas a la vida planctónica, sus estructuras y características: velo, peso, forma, capacidad natatoria, las confiere justamente a una vida flotante cerca de la superficie (Bayne, 1976), por lo cual se encuentran en la zona pelágica; el segundo, que a partir del estadío de larva pedivelíger se da una disminución o pérdida de la capacidad natatoria, se presenta un fototactismo negativo y un geotropismo positivo que las dirige hacia el fondo (Bayne, 1965, 1976). Como post-larva, todas sus estructuras se han adaptado a la vida bentónica y en consecuencia se encontrará cerca del fondo o los litorales donde es su hábitat natural. En él, las post-larvas están expuestas al choque del oleaje y a la acción de las co-

IV. Vida larvaria del mejillón. El desarrollo larvario del mejillón

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rrientes, sobre todo en zonas de fuerte exposición al oleaje. Como consecuencia pueden estar sujetas a una continua dispersión. El alcance de dicha dispersión parece estar limitado por la fuerza de las corrientes y las características de la post-larva: peso, talla, forma y, adaptaciones para la vida planctónica. Estas últimas han desaparecido, pero en contraparte la secreción de un filamento mucoso y largo aumenta sus posibilidades de flotación (Sigurdson et al., 1976; Lane et al., 1985). Según los resultados de este estudio, así como los de Bøhle (1971), Hrs-Brenko (1973) y Kautsky (1982) que coinciden en la escasa o nula presencia de post-larvas de mejillón en muestras de plancton en zonas abiertas (pelágicas), la distribución parece estar restringida a una escala más o menos local, y cerca del litoral, a menos que las corrientes sean los suficientemente fuertes para arrastrar a las post-larvas grandes distancias y en grandes cantidades, tal y como puede ocurrir con cualquier otra partícula, viva o no, con o sin filamentos, a la deriva en el mar. Como resultado de dichas dispersiones, pueden aparecer post-larvas en ciertas localidades y especialmente en zonas rocosas donde las dispersiones son frecuentes, durante todo el año, sobre todo en el otoño cuando hay un empeoramiento en las condiciones marítimas. Es muy común en las Rías gallegas observar a finales del verano y principio del otoño, grandes cantidades de algas y otros organismos sésiles arrojados a los litorales durante esta época del año. Este hecho podría explicar las observaciones de Andreu (1954, 1958) sugiriendo erróneamente la ocurrencia de una segunda puesta en otoño con fijación exclusiva sobre las rocas del litoral. El hecho de que se muestra una mayor abundancia en el número total de larvas y post-larvas en las zonas externas que en las internas de la Ría, puede deberse a una mortalidad diferencial o a la influencia de las corrientes. En el primer caso los registros de salinidad y temperatura en ambas zonas no muestran una diferencia estadisticamente significativa. Por lo tanto es difícil asumir que alguno de estos factores favoreciera una mortalidad diferencial. Hay otros factores que podrían favorecer estas diferencias, tales como la contaminación o la depredación. Sin embargo un factor que parece contribuir a una distribución diferencial de larvas entre la zona interna y externa de la ría son las corrientes, ya que mantienen un flujo constante que entra por la boca sur de la ría y que luego es impulsado hacia afuera por el aporte de agua dulce del rio Oitabén en el interior (Prego et al., 1990). Esta circulación arrastraría a las larvas hacia las zonas externas de la Ría. Reuniendo los datos sobre desarrollo gonadal y presencia de larvas en el zooplancton podemos afirmar que: el período reproductivo (liberación de gametos y fertilización) del mejillón en las Ría de Vigo es el característico para Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis en otras regiones de Europa (Reino Unido, Francia). Es decir, puede haber emisiones de gametos y fertilización durante todo el año, pero su mayor abundancia ocurre entre principios de primavera y verano. La presencia de larvas «D» ocurre de manera simultánea en el período reproductivo descrito, mientras que las larvas pedivelíger y post-larvas ocurre entre finales del verano y principios del otoño, principalmente en las zonas litorales. Esto está de acuerdo con las características propias de la forma de vida de las larvas compe-

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tentes y las post-larvas que las confieren a ese tipo de hábitat. Se pueden encontrar post-larvas en el plancton de zonas abiertas, aunque, en muy escasa abundancia. Sin embargo son frecuentes en muestras de plancton de las zonas litorales y especialmente en litorales expuestos. Estos hechos parecen ser el resultado de la dispersión de las post-larvas por el oleaje y las corrientes. La aparición de post-larvas en litorales rocosos durante el otoño y aún en invierno, no se debe a una nueva puesta sino a la dispersión de post-larvas durante esas épocas.

Figura IV.1. Promedio mensual del número de larvas «D» (LD), larvas pediveliger (PV) y postlarvas (PL) de mejillón obtenidos en las zonas de bateas Limens y San Adrián (A) y en los litorales de Cabo Home y San Adrián (B).

IV. Vida larvaria del mejillón. El desarrollo larvario del mejillón

Figura IV.2.

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Distribución de frecuencias de tallas en los litorales de Cabo Home y San Adrián en la época de mayor incidencia de larvas pediveliger y postlarvas.

V.

FIJACIÓN DE LOS JUVENILES DEL MEJILLÓN: FIJACIÓN DEL MEJILLÓN JORGE CÁCERES-MARTÍNEZ y ANTONIO FIGUERAS

V.I.

INTRODUCCIÓN

Después de un período de vida planctónica, las larvas del mejillón y otros moluscos bivalvos alcanzan un estadío de desarrollo que las prepara para la vida bentónica y que se conoce como «pedivelíger» (Carriker, 1961). Este estadío se caracteriza por el desarrollo de una mancha ocular conocida como ojo, del órgano pedal o pie y por conservar el velo, lo cual les permite nadar y reptar sobre el sustrato; en el mejillón esto ocurre cuando la larva ha alcanzado una talla alrededor de 300 mm y se dice que es competente para la fijación (Eyster y Pechenik, 1987; Widdows, 1991). Según Verwey (1959, 1966) y Bayne (1964, 1965, 1976) en esta etapa el mejillón posee fototropismo negativo y geotropismo positivo por lo que se encuentra cerca del fondo. Los movimientos reptantes y natantes están asociados a un comportamiento de búsqueda, durante el cual la larva puede o no recibir estímulos que desencadenan la fijación y metamorfosis (Bayne, 1965). Después de la fijación mediante la secreción del biso, la larva pierde o reabsorbe el velo y se lleva a cabo la metamorfosis que consiste en la reorientación de estructuras, incremento de la complejidad de los sistemas orgánicos y la secreción de la disoconcha o concha de adulto (Bayne, 1971). Si bien la secuencia exacta de estímulos y respuestas que ocurren durante la fijación no se ha descrito para ninguna especie de mejillón (Bayne, 1976), se ha encontrado que las algas filiformes y los hidroides pueden favorecerla (DeBlok y Geelen, 1958; Bayne,1965, 1971; Seed, 1969; Bøhle, 1971). Esta asociación sugirió que pudiese intervenir alguna atracción de tipo químico entre dichos sustratos y las larvas. Cooper (1981) sugirió que los componentes fenólicos de algunas algas favorecen la fijación del mejillón, pero su observación no se ha comprobado. Además se ha encontrado que la fijación puede ocurrir sobre sustratos fila-

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mentosos artificiales como cuerdas de nylon, filamentos de algodón, cuerdas de esparto (Spartium junceum), cabello animal plastificado, filamentos de fibra de vidrio, etc. (DeBlok y Geelen, 1958; Davies, 1974; Mason, 1976; Lutz, 1980; Dare, 1984; Figueras 1989). Otro aspecto característico de la fijación de Mytilus, es que ésta puede no ser definitiva. Desde los primeros trabajos sobre fijación de Mytilus edulis se determinó que la post-larva puede cambiar repetidamente de sustratos, lo que se asoció a un cambio en los requerimientos tigmotácticos de la especie durante el estadío de post-larva (Maas Geesteranus, 1942; Verwey, 1952; De Blok y Geelen, 1958). Modelo propuesto por Bayne (1964) para la fijación de semilla del mejillón primaria y secundaria Bayne (1964) estudió la fijación de Mytilus edulis en Menai Straits, al norte de Gales; su estudio incluyó el análisis de muestras de zooplancton, algas filamentosas y un banco de mejillones adultos. Sus resultados mostraron gran cantidad de pequeñas post-larvas (250 a 375 mm) sobre el alga filamentosa Ceramium rubrum y no así sobre el banco de adultos estudiado, en donde la talla media de las post-larvas fue de 1,2 mm. En las muestras de zooplancton encontró tanto larvas competentes como post-larvas de diferente talla. Así que, basándose además en la «movilidad» de las post-larvas (Maas Geesteranus, 1942; Verwey, 1952; De Blok y Geelen, 1958), postuló el modelo de fijación primaria y secundaria para Mytilus edulis haciéndolo extensivo al género Mytilus: «La larva competente del mejillón con una talla menor de 375 mm se fija sobre sustratos filamentosos lejos de los bancos de adultos. Siguiendo esta fijación primaria, la post-larva pasa por una fase migratoria durante la cual es transportada por las corrientes. Durante esta fase puede fijarse y soltarse por sí misma de los sustratos filamentosos y cuando alcanza una talla entre 900 mm y 1.500 mm la post-larva se fija sobre el banco de adultos». Bayne (1964) apuntó que esta estrategia es utilizada por el mejillón para evitar una competencia intraespecífica negativa de las pequeñas post-larvas y los adultos. Este modelo fue apoyado indirectamente por los estudios de Seed (1969) y Dare (1976) ya que las post-larvas más pequeñas que encontraron fijadas en los bancos de adultos fueron de una talla de entre 1000 a 2000 mm y de 550 a 700 mm respectivamente. Dare (1976) y Dare et al. (1983) caracterizaron a las post-larvas de 230 a 400 mm como «fijantes» primarios (primary settlers) y aquellas mayores de 500 mm como «fijantes» secundarios (secondary settlers). Estos nuevos límites redujeron aquellos propuestos por Bayne (1964) dejando una diferencia de tallas muy estrecha entre una primera fijación lejos de los adultos de su especie y una segunda fijación entre ellos, a pesar de esto, el modelo ha sido ampliamente aceptado hasta nuestros días (Seed, 1969; Dare, 1976; Sigurdsson et al., 1976; Suchanek, 1978; Sunila, 1981; Dare et al., 1983; Lane et al., 1985).

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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Fijación directa de la semilla del mejillón Después del estudio de Bayne (1964), se han llevado a cabo experiencias que han cuestionado la aplicación del modelo propuesto por él en otras localidades y especies del género. También se ha encontrado que la fijación de larvas competentes puede ocurrir sobre una amplia diversidad de sustratos no necesariamente filiformes. Suchanek (1978) encontró que Mytilus edulis es capaz de fijarse directamente sobre los sustratos rocosos disponibles y no sólo sobre algas filamentosas; Petersen (1984) también señala la fijación directa de Mytilus californianus, aunque en bajas densidades, sobre sustratos rocosos. MacGrath et al. (1988) y King et al. (1990) encontraron que Mytilus edulis se fija directamente sobre los bancos de mejillones adultos sin pasar por una etapa previa de desarrollo sobre algas filamentosas. Andreu (1976) apunta que el patrón de fijación de Mytilus galloprovincialis podría ser mucho más simple que el descrito por Bayne (1964). En estudios de laboratorio se ha encontrado que Mytilus edulis es capaz de fijarse sobre el biso de adultos de su propia especie (Eyster y Pechenik, 1987). Sin embargo, hasta ahora no se ha realizado ningún trabajo para intentar dilucidar las diferencias y las implicaciones ecológicas de una fijación directamente del plancton a los bancos de adultos, y una fijación primaria y secundaria (Bayne, 1964). Una característica fundamental durante la vida de la post-larva del mejillón, es su capacidad para secretar un filamento mucoso. Las primeras observaciones sobre su importancia se deben a Verwey (1966), quién sugirió que las larvas pedivelíger de Mytilus edulis pueden secretar un filamento mucoso, mientras nadan, que favorece el contacto con el substrato y que posiblemente facilita, posteriormente, el comportamiento reptante. Sigurdsson et al. (1976) demuestran la capacidad de secreción de este mucus a partir del estadío pedivelíger, hasta más de 2,5 mm, por parte de Mytilus edulis y otros bivalvos estimulados por pequeñas corrientes. Encuentran que puede ser muy largo sobrepasando varias veces la longitud del animal y que su composición podría ser de mucopolisacáridos. Sus experiencias mostraron que el mucus puede aumentar la flotabilidad de la post-larva y concluyen que este mecanismo permite la migración de las post-larvas refiriéndose al modelo de Bayne (1964). Más tarde Blok y Tan-Maas (1977) sugieren que la función del mucus es principalmente la de fijarse al sustrato. Encuentran que las post-larvas se pueden «colgar» del sustrato con el filamento mucoso y que después puede usarse como una guía sobre la cual el mejillón repta y alcanza el sustrato, tal y como lo hacen las arañas. Lane et al. (1985) encuentran que el mucus es un monofilamento distinto en forma y función de los filamentos del biso y que su papel es aumentar la capacidad dispersiva de las post-larvas de Mytilus edulis en alusión al modelo de Bayne (1964). También sugieren, basándose en un estudio previo (Lane et al., 1982), que el mucus es producido por unas glándulas especiales que posteriormente desaparecen para contribuir a la formación del biso.

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De acuerdo con los trabajos anteriores el mucus podría tener una función doble, la de tomar contacto con el substrato y la de propiciar la llamada migración bisal o migración bisopelágica, tal y como ha sido denominada por Bayne (1964), Lane et al. (1985) y otros. Referente a este último aspecto, diversos trabajos sobre la dispersión de otras especies de bivalvos y gasterópodos parecen confirmar la existencia de una fase de dispersión pelágica en estadíos post-larvales y juveniles pero no mencionan una migración dirigida como en el modelo de Bayne (1964) (Sigurdsson et al. 1976, Beukema y Blas 1989, Martel y Chia 1991a, 1991b). Sin embargo, nuevamente para el caso de Mytilus edulis, hay estudios que contradicen la existencia de una fase de migración de las post-larvas, Bøhle (1971), Hrs-Brenko (1973) y Kautsky (1982) no encuentran post-larvas ni juveniles en sus muestreos de plancton sugiriendo que dicha fase no existe. Estudios sobre fijación de semilla del mejillón en las Rías Gallegas Desde el punto de vista ecológico no existe ningún trabajo que aborde el patrón de fijación del mejillón (Mytilus galloprovincialis) en Galicia, el comportamiento de la larva y la post-larva ni su relación con condiciones ambientales. En este sentido la única referencia es la observación de Andreu (1976) que basándose en el hecho de que el mejillón se fija abundantemente sobre colectores filamentosos artificiales (cuerdas de nylon y esparto) y ahí mismo se desarrolla, sugirió que el modelo de fijación tendría que ser más simple que el descrito por Bayne (1964) para Mytilus edulis. Con relación al cultivo del mejillón y la fijación, Andreu (1958, 1965, 1968, 1977) describe dos períodos de fijación; el primero y más abundante ocurre durante la primavera sobre cuerdas colectoras, cuerdas de cultivo (dificultando su manejo) y en zonas rocosas; el segundo ocurre durante el otoño pero sólo sobre zonas rocosas. Estas diferencias fueron asociadas a un problema de fototropismo y supervivencia de larvas durante el otoño-invierno, hecho que no había sido estudiado. Lamentablemente en ninguno de los trabajos de Andreu (1958, 1965, 1968, 1977) se aportan datos cuantitativos sobre sus observaciones. De acuerdo con Andreu (1958) su información fue utilizada por los mejilloneros de la zona para iniciar colectas de semilla sobre colectores artificiales dispuestos en las bateas durante abril, mayo y en ocasiones hasta junio; ya que anteriormente toda la semilla se obtenía de los bancos naturales en las zonas rocosas expuestas e islas cercanas a las Rías. Actualmente el 70% se sigue obteniendo de las poblaciones naturales y el restante 30% de los colectores en las propias bateas (Figueras, 1989; Pérez-Camacho et al., 1990). Contrario a lo que Andreu afirmó (1958, 1965, 1968, 1977), Mariño et al. (1982) indicaron que la fijación sobre colectores en bateas, ocurre de mayo hasta septiembre con un pico en agosto y no detectaron una fijación durante el otoño. Aguirre (1979) apuntó que la estación de fijación sobre colectores de cuerda en batea tiene lugar de abril a junio y excepcionalmente hasta julio, tampoco detectó

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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fijación durante el otoño. En ninguno de estos trabajos se hizo un análisis de la fijación con respecto al modelo de fijación primaria y secundaria de Bayne (1964). Con relación a la ausencia de fijación durante el otoño, tanto Mariño et al. (1982) como Aguirre (1979) argumentan que puede deberse a una menor supervivencia de las larvas en dicha época del año debida a las bajas temperaturas. Mariño et al. (1982) añaden que puede deberse a que durante esta época del año no ocurre un desove masivo. Recientemente Dijkema (1992), hace referencia a resultados preliminares sobre fijación en la Ría de Arosa que indican una fijación más abundante en las áreas externas de la Ría. Aparte de estos trabajos no existe ningún otro antecedente sobre los períodos de fijación, abundancia, colecta de bancos naturales, y estrategias de manejo de semilla en la zona. En consecuencia, consideramos necesario el estudio detallado del proceso de fijación de Mytilus galloprovincialis en la zona, con objeto de describir el modelo de fijación de la especie, para aclarar la ocurrencia de la fijación durante el otoño y en que condiciones, y para sentar las bases de un plan de manejo de semilla para el cultivo. V.2. A.

MATERIAL Y MÉTODOS Estudios de campo

El estudio de campo se llevó a cabo en la Ría de Vigo en las localidades litorales de Cabo Home y San Adrián, así como en las zonas de cultivo de Liméns y San Adrián. Las diferentes condiciones ambientales en cada una de ellas, y los objetivos específicos de los estudios realizados motivaron el diseño y utilización de diferentes estrategias de muestreo y tipo de colectores. Durante los muestreos de semilla en todas las localidades se tomaron medidas de salinidad con un refractómetro portátil con compensación de temperatura (Aquafauna, 0-100 ppm) y de temperatura con un termómetro convencional 0-50°C. 1. Fijación mensual de semilla del mejillón en las zonas litorales y en colectores de batea La fuerte acción del oleaje en los litorales expuestos planteó la necesidad de una estructura de dos barras cilíndricas paralelas que se unen con tornillos a cuatro bases independientes. Como colectores se utilizaron trozos de cuerdas de nylon de 35 cm de longitud por 2 cm de diámetro (225 cm2) del tipo usado por los mejilloneros de la zona. En la zona rocosa expuesta (Cabo Home) la estructura se colocó justo por encima del nivel de baja mar de primavera entre el banco de mejillón. En la costa rocosa protegida (San Adrián) la estructura se colocó sobre un muelle de cemento abandonado, donde existe un banco de mejillón, a la misma altura que en la costa rocosa. A intervalos de aproximadamente un mes y coincidiendo con la marea más baja durante ese período, se retiró un colector de la estructura y se sustituyó por

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uno nuevo. Simultáneamente se rasparon, con la ayuda de una pala de mano, áreas estándar de 225 cm2, equivalentes a la superficie del colector, directamente del banco de adultos en ambas localidades. Para determinar la fijación en los colectores de la bateas de cultivo (Liméns y San Adrián) se utilizó una serie de 12 colectores en una barra de acero inoxidable de 80 cm por 1 cm de diámetro, que se colgó a 1 m de profundidad en la cara occidental de las bateas. Aproximadamente cada mes se retiró un colector de la serie y se sustituyó por uno nuevo, estos colectores registraron la fijación mensual. Otro colector de la serie se retiró durante el muestreo, éste no fue reemplazado y mediante él se registró la fijación acumulada y la ocurrencia de fijación de larvas competentes y post-larvas sobre juveniles y adultos. Las muestras se almacenaron en una solución de etanol al 70%. Cada colector o muestra se sumergió durante 5 min en una solución al 10% de hipoclorito de sodio. Inmediatamente después, los colectores o muestras se lavaron sobre una serie de tamices de 0,9 mm a 4,0 mm de luz de malla bajo agua corriente para separar los organismos por tamaños. Las fracciones obtenidas se secaron durante 24 h a 80°C y se separaron de los tamices con un cepillo para, posteriormente, identificar y separar al mejillón de otros moluscos bivalvos. La identificación se realizó siguiendo las descripciones de Werner (1939); Rees (1950); Lutz y Hidu (1979); Lehnberg y Theede (1979); Le Pennec (1978, 1980). Los recuentos se realizaron con un microscopio estereoscópico (Nikon, SMZ-10). Se contaron todos los mejillones en cada fracción a excepción de las muestras obtenidas durante los máximos de fijación, en estas ocasiones se tomaron submuestras del 30% al azar. Los mejillones obtenidos en los tamices de luz de malla inferior a 3 mm se midieron con un micrómetro, mientras que aquellos obtenidos en los tamices mayores se midieron con un calibre. Para corroborar la posible ocurrencia de una fijación primaria y secundaria en esta especie, se realizó una diferenciación entre los fijantes primarios (0,250 a 0,470 mm), y los secundarios (> 470 mm) de acuerdo con las tallas mínimas y máximas registradas para larvas pedivelíger competentes de Mytilus edulis (Rees, 1954; Bayne, 1965; Widdows, 1991). 2. Fijación de semilla del mejillón sobre diferentes especies de algas Durante la primavera y verano de 1992, se recogieron diversas especies de algas existentes en las cuatro localidades (litorales de Cabo Home y San Adrián y zonas de cultivo de Liméns y San Adrián) para determinar la presencia de mejillones sobre ellas. Las algas se fijaron en una solución de metanol al 70% y se trasladaron al laboratorio. Mediante un primer análisis con el microscopio estereoscópico (equipado con una cámara Nikon FX-35DX) y con la ayuda de fotografías se determinó la distribución de los mejillones sobre las diversas estructuras de las algas: rizoma, placa basal, talo. Las algas se identificaron, se secaron a 70°C durante 24 h y se sacudieron sobre la serie de tamices, indicado en los pun-

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tos anteriores, para separar y contar a los mejillones. El número de mejillones por alga se expresó como número por gramo de peso seco del alga. 3. Influencia de la profundidad y ubicación de los colectores en la fijación de semilla del mejillón Durante la primavera-verano de 1991 y 1992 se estudió la fijación sobre colectores suspendidos en bateas de la zona externa e interna de la Ría a profundidades de 1, 5, y 10 m y en diferentes zonas de la batea, anterior (cara oeste), media y posterior a 1 m de profundidad. Como colectores se utilizaron piezas de 15´15´2,5 cm de cabello animal recubierto con plástico del tipo recomendado por Davies (1974). Los colectores se colocaron en bolsas de malla plástica (2 cm de diámetro de luz de malla) y se suspendieron de una cuerda de nylon. Los colectores se reemplazaron en períodos de 7 a 25 días y las experiencias se realizaron en diversas bateas. Los colectores se manejaron de manera similar a los colectores de cuerda mensuales. 4. Influencia de la marea y altura del litoral en la fijación de semilla del mejillón En el verano de 1993 se registró la fijación de mejillones en el litoral rocoso expuesto de Cabo Home durante un ciclo de 24 h en todo el perfil litoral. Por la disponibilidad y características filamentosas, como colectores se usaron piezas de 19 ´ 16 ´ 0,8 cm de fibra sintética. En el litoral se colocaron dos sistemas de poleas paralelos (separados entre sí unos 20 m) desde el nivel de baja mar (0,33 m) del día del muestreo, hasta la marca de nivel de la marea más alta de primavera (4,0 m) usando cuerdas de polietileno (0,5 cm de diámetro). De éstas se colgaron una serie de 6 colectores cada 5 m. Estos se reemplazaron durante tres períodos; después de 6 h. desde la primera bajamar, después de 6 h. de la pleamar, y después de 6 h. de la siguiente baja mar. Simultáneamente una serie de tres colectores se sumergieron a 2, 5 y 9 m de profundidad desde una embarcación anclada a 500 m enfrente de la costa, y se reemplazaron cada 2 h. Las alturas de mareas en metros se estimaron a partir del nivel de bajamar registrado para el 21/06/93 en la tabla de mareas (Junta del Puerto y Ría de Vigo 1993). El nivel más bajo de marea de primavera es definido como cero en los datos de marea. La extracción y separación de semilla se realizó siguiendo la metodología descrita anteriormente. 5. Fijación de semilla del mejillón sobre diferentes tipos de sustratos artificiales En el verano de 1993 se probaron cinco tipos de sustratos filamentosos en la zona de Cabo Home: fibra sintética, cabello animal recubierto con plástico, plástico, alambre y alambre galvanizado. Los colectores se probaron por triplicado y

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se colgaron de un pequeño long-line a 1 m de profundidad a 200 m de la costa. Los colectores se recuperaron después de 24 h de permanencia en el mar y se trasladaron al laboratorio. La extracción y manejo de los colectores y mejillones se realizó mediante la metodología ya descrita. En este caso los colectores se secaron durante 24 h a 80°C para expresar los resultados en número de ejemplares fijados por peso del sustrato. 6. Análisis estadísticos Se utilizó el test de Kruskal-Wallis para comparar el número de mejillones adheridos en colectores y sobre los adultos en las diferentes localidades. Cuando las diferencias fueron significativas, se utilizó el test de comparación de promedios tipo-Tukey (Zar, 1984). El test de Wilcoxon de rangos asignados se usó para comparar el número de mejillones adheridos en los colectores colocados en las bateas en la zona externa e interna de la Ría. Para la comparación de tallas de las post-larvas encontradas a diferentes alturas de la zona intermareal, en los colectores colocados a diferente profundidad y posición en las bateas, y en los colectores de diferente tipo, se utilizaron pruebas de «T» y ANOVAS de una vía. B.

Estudios de Laboratorio

Uno de los aspectos que ha sido muy poco estudiado en laboratorio es el comportamiento de larvas competentes durante la fijación, su capacidad de selección del sustrato adecuado, y la capacidad migratoria de las post-larvas para establecerse finalmente en los bancos de adultos en que se basa el modelo de Bayne (1964). En este sentido se plantearon las siguientes experiencias. Durante el verano de 1993 se recogieron mejillones adultos y post-larvas del litoral rocoso expuesto (Cabo Home) mediante el raspado del banco natural. Para obtener las post-larvas, la muestra se llevó al laboratorio y se lavó en agua de mar corriente sobre la serie de tamices (0,09 a 4 mm) de la forma antes descrita. De las fracciones obtenidas en los tamices de luz de malla: 0,09, 0,2 y 0,3 mm, se separaron las post-larvas con la ayuda del microscopio estereoscópico y se conformaron tres grupos con base en la longitud total de la concha (Tabla V.1), las mediciones se realizaron con un micrómetro. Cada grupo se mantuvo por separado en vasos de precipitados de 2 l con aireación ligera en un cuarto de temperatura controlada (16°C± 1°C). El ciclo de luz se mantuvo a 12 h luz:12 h oscuridad. El agua se cambió cada 2 días usando agua de mar filtrada y la salinidad se mantuvo a 35 ppm. Los grupos se alimentaron cada 48 h. con una mezcla de 50 ml de Isochryssis galvana y Pavlova lutheri (6´105 células ml–1), las cuales se cultivaron mediante las técnicas convencionales para cultivo de microalgas. Los adultos se mantuvieron en acuarios de 60 l con agua de mar corriente y se alimentaron siguiendo el mismo régimen.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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TABLA V.1 Longitud total de la concha de los tres grupos de post-larvas usadas en los experimentos del laboratorio. Se muestran los valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de cada uno de ellos Grupos (mm)

n................. Mínimo . . . . . . . . . . . . Máximo . . . . . . . . . . . . Media . . . . . . . . . . . . . DT. . . . . . . . . . . . . . . .

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

356 0,250 0,375 0,333 0,022

356 0,550 0,975 0,805 0,092

359 0,900 1,975 1,348 0,217

1. Filamento mucoso Durante la manipulación de las post-larvas se observó la producción de un largo filamento mucoso con el que se adherían a la aguja de disección, paredes y fondo de cajas Petri, así como a diferentes partículas y a otras post-larvas. Para detectar con claridad el mucus hialino sin matar a las post-larvas usando colorantes químicos, se agregó polvo de carbón activado a una caja Petri con un grupo de post-larvas. El carbón activado se adhirió al mucus haciéndolo visible y fue fotografiado usando el microscopio estereoscópico equipado con la cámara. 2. Sustratos y determinación de su superficie Para determinar las preferencias de las post-larvas por diferentes sustratos, se utilizaron trozos limpios de la rodófita filamentosa Ceramium rubrum, considerada como idónea para la fijación de larvas competentes de mejillón (Bayne, 1964). También se emplearon filamentos bisales limpios de mejillones adultos, ya que según Bayne (1964) este tipo de sustratos tendería a ser evitado por las larvas competentes y porque, en oposición a Bayne (1964), ha sido descrito como favorable a la fijación por otros autores (Petersen, 1984; Eyster y Pechenik, 1987); red de nylon y material fibroso, por ser sustratos filamentosos artificiales. Al final de los experimentos todos los sustratos se secaron a 70°C durante 24h, entonces se calculó su superficie mediante un submuestreo de trozos de diferente tamaño usando un analizador de imágenes semiautomático (software «VIDS V» para IBM PS/2). Las submuestras se secaron (70°C durante 24h) y se pesaron en una balanza de precisión. Con estos datos se calculó una ecuación por el procedimiento de mínimos cuadrados entre el área total y el peso seco de cada sustrato. Se obtuvieron las siguientes ecuaciones (área en mm2 y peso en mg): área de Ceramium rubrum = –0,727 + 0,201 (peso), r = 0,96, n = 29; área de los filamentos bisales = –0,865 + 0,208 (peso), r = 0,90, n = 18; área del material fibroso = 0,443 + 0,227 (peso), r = 0,94, n = 15; área de la red de nylon = –1.667 + 0,208 (peso), r = 93, n = 17. A partir de estas ecuaciones se calculó la superficie empleada de cada sustrato y los resultados se expresaron como % de mejillones por cada cm2 de sustrato probado.

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3. Estudio sobre la atracción de sustratos para la fijación de post-larvas del mejillón Se colocaron veinticinco post-larvas de cada grupo en placas Petri de plástico de 87 mm de diámetro, llenas con 55 ml de agua de mar filtrada. En cada placa Petri se colocó solamente uno de los sustratos para determinar su atracción. Las pruebas se realizaron por triplicado en condiciones de agua estática y en agitación. Para agitar el agua, las placas Petri se colocaron sobre un agitador orbital a 50 rpm. Después de un período de 24 h se contó el número de post-larvas fijadas sobre el sustrato. 4. Estudio sobre la capacidad de post-larvas del mejillón para seleccionar sustratos Se colocaron veinticinco post-larvas de cada grupo con los cuatro sustratos descritos en el punto anterior para determinar si las post-larvas de los diferentes grupos son capaces de seleccionar un sustrato específico de entre varias opciones y si cambian de uno a otro en función de sus necesidades. En las condiciones de agua estática los sustratos se colocaron equidistantes de las post-larvas ubicadas en el centro de las cajas de Petri, mientras que en las condiciones de agua en agitación los sustratos se movieron libremente. A las 12, 18 y 24 h se contó el número de post-larvas fijadas en cada sustrato. Como en el caso anterior las pruebas se realizaron por triplicado. 5. Fijación de post-larvas entre mejillones adultos Para determinar si post-larvas de los diferentes grupos de talla mostraban preferencia por fijarse lejos o cerca de adultos de su propia especie, se utilizaron dos grupos de 4 mejillones adultos vivos, los cuales se revisaron y lavaron en agua de mar corriente para eliminar posibles post-larvas adheridas a ellos. Cada uno de los grupos se colocó en uno de los extremos de 2 acuarios de vidrio de 15´30´10 cm. A las 24 h los adultos ya se habían fijado al acuario y entonces se colocaron 125 post-larvas de cada uno de los grupos en el lado opuesto de los acuarios. El experimento se realizó en condiciones de agua estática y en agitación, en este caso el acuario se colocó sobre un incubador orbital (25 ciclos por min) durante 24 h. Al final se examinaron cuidadosamente los mejillones y el fondo de los acuarios para determinar el lugar donde se fijaron las post-larvas. Las conchas de mejillones y los balanos adheridos a ellas se cubrieron con papel aluminio para formar moldes que se cortaron cuidadosamente, se secaron (70°C por 24 h) y pesaron. Simultáneamente trozos de papel aluminio de 1 a 10 cm2 se pesaron para obtener, como en el caso de los otros sustratos, una ecuación por mínimos cuadrados y estimar la superficie disponible para la fijación, área del aluminio (cm2) = – 52.248 + 29.747 (peso, mg), r = 0,97, n = 5.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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6. Análisis estadísticos Para comparar la fijación de post-larvas sobre los diferentes sustratos se utilizó el test de Kruskal-Wallis seguido de un test de comparación múltiple tipo-Tukey cuando fue necesario (Zar, 1984). Para determinar las diferencias respecto a las pruebas en condiciones de agua con y sin agitación se usó el test de rangos asignados de Wilcoxon (Eyster y Pechenik 1987). V.3. V.3.1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios de campo

El registro mensual de fijación indicó que ésta ocurrió durante todo el período de estudio, mostrando un pico entre primavera e inicios del otoño que fue más abundante en 1991 que en 1992 (Fig. V.1). La presencia de post-larvas menores de 0,470 mm indicó que hubo fijación directa del plancton a los colectores artificiales en todas las localidades. Su número fue mayor entre primavera y mediados del verano que durante inicios del otoño. La fijación en general fue más abundante en las localidades externas que en las internas así como más abundante en los litorales que en las bateas de cultivo. El test de Kruskal-Wallis mostró que no hubo diferencias significativas respecto a la comparación del porcentaje de post-larvas menores de 0,470 mm entre localidades (H = 57.079, p > 0,05). Las mayores tallas encontradas en los muestreos fueron menores de 5,0 mm de longitud total de la concha. Estudiando la fijación acumulada también se observó que la fijación fue más abundante en las localidades externas que en las internas así como en los litorales que en las bateas (Fig. V.2). En contra de lo esperado respecto al modelo de Bayne (1964) se encontraron post-larvas menores de 0,470 mm en todas las localidades, indicando que hubo fijación directa del plancton al banco de adultos y a las cuerdas con juveniles y adultos. El porcentaje de post-larvas menores de 0,470 mm en el muestreo mensual fue mayor que en el muestreo acumulado y esta diferencia fue estadisticamente significativa (test de Kruskal-Wallis, H = 118,8, p < 001). Las post-larvas menores de 0,470 mm se encontraron distribuidas sobre todas las estructuras de las algas sin una tendencia en especial. Sin embargo los mejillones mayores de esa talla se encontraron en las estructuras basales o rizoma de las algas formando piñas. En la Tabla V.2, se muestra el número total de mejillones y el porcentaje de post-larvas menores de 0,470 mm encontradas en las diferentes especies de algas estudiadas. Las post-larvas se encontraron sobre algas filamentosas (Ceramium rubrum y Ceramium ciliatum); algas cartilaginosas (Chondrus crispus y Laurencia pinnatifida); y algas membranosas (Lomentaria articulata y Plocamium cartilagineum). No hubo diferencias estadisticamente significativas entre la fijación ocurrida en los colectores colocados en las diferentes partes de la batea (Fig. V.3). El análi-

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TABLA V.2 Número total de mejillones y contribución porcentual de post-larvas menores de 0,470 mm encontradas adheridas por g de talo seco de las diferentes especies de algas recogidas en las 4 localidades estudiadas. Los valores indican la media obtenida en cada especie durante el verano de 1992. n = número de ejemplares examinados Sustrato

Especie

n

Total de mejillones

< 0,470 mm (%)

Alga

Laurencia pinnatifida Chondrus crispus Plocamium coccineum Ceramium rubrum Ceramium ciliatum Lomentaria articulata Enteromorpha intestinalis Caulacanthus ustulatus Sargassum muticum

8 5 4 8 5 5 4 3 4

215 106 765 198 45 1.911 34 411 4

30,5 45,0 12,9 38,3 10,0 11,6 43,7 4,9 20,4

Hydroide

Plumaria setacea

3

207

42,1

sis de los colectores colocados en la parte anterior (cara oeste), media, y posterior de la batea en Liméns, evidenció la ocurrencia de dos picos de fijación, uno el 1.º de julio y otro el 10 de agosto de 1992. En la batea de San Adrián se detectó un pico de fijación el 18 de mayo y un segundo pico, más suave, el 1.º de julio. Al igual que en el caso anterior, las diferencias entre la fijación ocurrida en las diferentes zonas de la batea, no fueron estadisticamente significativas. Sin embargo, la diferencia entre el número total de post-larvas encontradas en una y otra localidad resultaron estadisticamente significativas (p < 0,01, test de rangos asignados de Wilcoxon). Los picos detectados tanto en Liméns como en San Adrián a las diferentes profundidades, coincidieron con aquellos detectados en las diferentes zonas de la batea. La fijación fue menor a 1 m de profundidad que a 5 y 10 m de profundidad (Fig. V.4), sin embargo estas diferencias no fueron estadisticamente significativas. Las diferencias entre el número de post-larvas adheridas en los colectores de la localidad externa (Liméns) con respecto a la interna (San Adrián) fueron estadisticamente significativas (p < 0,01, test de Wilcoxon de rangos asignados). El número de post-larvas menores de 0,470 mm disminuyó al final de la experiencia tanto en los colectores sumergidos a diferentes profundidades como en aquellos colocados en diferentes zonas de las bateas en ambas localidades. Sin embargo el número total de post-larvas se mantuvo alto. Esta tendencia resultó ser estadísticamente significativa (p = 0,01). El análisis estadístico mostró que no hubo diferencias estadisticamente significativas entre la población obtenida de los colectores colocados por todo el perfil intermareal (F = 2,7, p > 0,05, ANOVA de una vía). Sin embargo, la abundancia fue significativamente mayor en la zona baja del perfil intertidal que en la alta (p < 0,05).

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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La fijación fue irregular durante el ciclo de marea, sin embargo se detectó un incremento relativo después de la marea alta, especialmente en los colectores sumergidos a 2 m de profundidad (Fig. V.5). El análisis estadístico mostró que la fijación fue más abundante a 2 m que a 8 m de profundidad (H = 8.502, p = 01, test de Kruskal-Wallis seguido por una comparación múltiple tipo Tukey). Sorprendentemente, la talla mínima y máxima registradas fueron 0,225 y 0,375 mm respectivamente y las diferencias entre la composición de tallas obtenida en los colectores sumergidos a diferente profundidad no fueron estadisticamente significativas (F = 0,064, p > 0,05, ANOVA de una vía). Sin embargo las diferencias entre la población obtenida en los colectores colocados sobre el perfil intermareal y frente a él, fueron estadísticamente significativas (p < 0,001, test de T). Con respecto al porcentaje de post-larvas adheridas a los diferentes sustratos probados, la fijación fue mayor sobre la fibra sintética, el cabello animal plastificado y los plásticos que sobre los alambres aunque se encontraron algunas post-larvas sobre ellos. El análisis estadístico mostró que las diferencias fueron significativas (Test de Kruskal-Wallis, H = x, p < 0,0). Se encontró una correspondencia entre las mayores temperaturas y la ocurrencia de los picos de fijación. La salinidad fluctuó entre 31 y 36 ppm y no se detectó ninguna relación con la fijación. V.3.2.

Estudios de laboratorio

El agua en movimiento favoreció la fijación de las post-larvas de los tres grupos en todos los sustratos (p < 0,01, test de Wilcoxon’s de rangos asignados, cuatro pruebas pareadas, para un total de 600 post-larvas). El test estadístico de Kruskal-Wallis no mostró diferencias significativas entre la atracción de los diferentes sustratos. Las diferencias tampoco fueron significativas respecto a los tres grupos para igual sustratos, sin embargo, parece que existe cierta atracción de los tres grupos de post-larvas por los filamentos del biso y los talos de la rodófita Ceramium rubrum. En la Figura V.6, se muestran los resultados de preferencia por uno u otro tipo de sustrato en condiciones de agua con agitación y sin ella. En este caso, como en el anterior, la agitación del agua favoreció la fijación de los tres grupos de post-larvas en los diferentes sustratos. Los filamentos del biso y los talos de Ceramium rubrum fueron los sustratos más favorables para la fijación de post-larvas. En el experimento realizado sin agitar el agua, las post-larvas de los tres grupos prefirieron dispersarse reptando sobre el fondo de las placas Petri. No mostraron preferencias por ninguno de los sustratos a su alcance. En la Tabla V.3, se muestra el número de post-larvas de cada grupo que se encontraron fijadas sobre las diferentes partes de los adultos e incrustaciones de la concha tanto en condiciones de agitación del agua como sin ella. Al igual que en los anteriores experimentos la fijación fue mayor en condiciones de agitación del agua. En estas condiciones, los tres grupos de post-larvas se encontraron adheridos en porcentajes similares sobre los diferentes sustratos. Sin embargo, los tres

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grupos de post-larvas mostraron preferencia por los filamentos del biso (H = 9,7, p < 0,001, test de Kruskal-Wallis seguido por una comparación múltiple tipo-Tukey). En condiciones de agua estática los tres grupos se encontraron adheridos a los diferentes sustratos en porcentajes similares (H = 2,4, p > 0,05, test de Kruskal-Wallis), y todas las post-larvas mostraron preferencia por permanecer y reptar sobre el fondo y paredes del acuario (H = 8,9, p < 0,001, test de Kruskal-Wallis seguido de una comparación múltiple tipo-Tukey). TABLA V.3 Número de post-larvas de cada grupo adheridas sobre los diferentes sustratos durante el experimento de fijación de post-larvas sobre adultos Con agitación del agua Sustrato

Biso. . . . . . . . . . . . . Concha del mejillón . Balano . . . . . . . . . . . Acuario . . . . . . . . . .

Grupo Grupo Grupo 1 2 3 12,25 1,64 1,20 0,80

10,75 1,50 1,20 0,90

12,00 2,40 1,99 0,66

Total 35,0*** 5,54 4,39 2,36

Sin agitación del agua Grupo Grupo Grupo 1 2 3 0,25 0,14 0,00 2,64

0,38 0,00 0,26 2,67

0,20 0,00 0,26 2,64

Total 0,83 0,14 0,52 7,9***

*** p < 0,001.

Se detectó que las post-larvas de los tres grupos podían secretar un filamento de consistencia mucosa y transparente por el que podían agruparse con sus respectivos mucus y permanecer juntas. Mediante este mecanismo se llegaron a formar grupos de hasta 100 individuos. En los experimentos con agua en agitación el mucus se usó para tomar contacto y adherirse al sustrato. Se observaron post-larvas colgando del sustrato por medio del filamento mucoso, individualmente o formado piñas de más de 20 ejemplares. En la ría de Vigo, N O de España, las larvas competentes de Mytilus galloprovincialis se fijan durante todo el año sobre todo tipo de sustratos disponibles en el área incluyendo aquellos existentes en los bancos de adultos. Su número fue mayor entre primavera y mediados del verano que durante inicios del otoño. La fijación en general fue más abundante en las localidades externas que en las internas así como más abundante en los litorales que en las bateas de cultivo. La mayor presencia de pequeñas post-larvas sobre sustratos filamentosos, es el resultado del mecanismo utilizado para la fijación, mediante el «filamento mucoso de contacto» que se secreta desde el estadío tardío de pedivelíger hasta los estadíos post-larvales y que se adhiere fácilmente a superficies filamentosas. Como pudimos comprobar en experiencias de laboratorio su presencia sobre este tipo de sustratos no es el resultado de un comportamiento selectivo para evitar los bancos de adultos. Si el sustrato ofrece la protección necesaria contra las corrientes, acción del oleaje, competencia y predación, la post-larva de mejillón se puede establecer ahí, colonizando nuevas áreas o reclutándose en las poblaciones ya establecidas.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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Si el sustrato es subóptimo, la post-larva de mejillón es eliminada o las corrientes y olas la dispersan, entrando en una fase recurrente de fijación hasta que muere o aleatoriamente alcanza un sustrato óptimo. El incremento en corrientes y oleaje fuera de la época de desove de la especie, cuando la presencia de larvas competentes es mínima, favorece la dispersión y colonización por parte de las post-larvas de áreas que pueden no ser óptimas para las larvas competentes y pequeñas post-larvas. Las post-larvas pueden reptar sobre el sustrato y alcanzar una mejor posición sobre él, así como formar piñas mostrando un comportamiento gregario. La aplicación de la secuencia de eventos aquí referida permite aclarar los resultados, aparentemente, contradictorios de diversos estudios sobre fijación en diferentes partes del mundo y especies del genero Mytilus, bajo la interpretación del modelo de fijación primaria y secundaria de Bayne (1964). Sin embargo, su aplicación a un comportamiento general en Mytilus debe ser confirmada con más estudios. El hecho de restar protagonismo a un comportamiento «inteligente» del mejillón durante la fijación y posterior dispersión, no disminuye en nada el éxito de dispersión, colonización y permanencia, característico de las poblaciones de mitílidos. Una estrategia de fijación y dispersión pasivas con la ayuda del filamento mucoso de contacto, aunque menos espectacular que la hipótesis de una larva con una capacidad de elección muy poderosa, no es menos importante. En este mismo sentido el alcance y destino de la fase de dispersión de post-larvas parece depender fundamentalmente de la acción y dirección de las corrientes. En el caso de muestras de zooplancton obtenidas en las zonas pelágicas de la Ría de Vigo, la presencia de post-larvas es inexistente o muy escasa y cuando se encuentran es hacia finales del verano y principios del otoño. Por el contrario, la presencia de post-larvas en las muestras de plancton de los litorales es abundante durante dicha época. En el muestreo realizado durante el ciclo de 24 h en el litoral de Cabo Home se encontraron larvas competentes (0,250 a 0,375 mm) sobre los colectores del litoral y sobre aquellos colocados frente a él (500 m). Sin embargo, las post-larvas y juveniles, solamente se encontraron sobre los colectores del litoral siendo especialmente abundantes hacia la zona infralitoral. Estas observaciones sugieren una dispersión a una escala local. La presencia de post-larvas mayores de 0,470 mm sugiere la llegada a los sustratos muestreados de mejillones que previamente se habían fijado en otros sustratos (Maas Geesteranus 1942, Verwey 1952, Blok y Geelen 1958, Bayne 1964, 1965, Seed 1969, Tan 1975, Widdows 1991), pero también sugiere el crecimiento de post-larvas sobre los colectores y sustratos muestreados durante el período de muestreo. Ambas posibilidades se aprecian claramente tomando como ejemplo la fijación ocurrida sobre los colectores en Cabo Home durante junio y julio de 1991: en junio el número de post-larvas menores y mayores de 0,470 mm fue de 20.000 y 25.000 respectivamente. Un mes más tarde el número de las post-larvas menores de 0,470 mm fue de 4.000 mientras que el número de las mayores fue de 50.000. Esto sólo se puede explicar por la llegada de post-larvas previamente fija-

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das en otros sustratos y por el crecimiento de aquellas establecidas desde el inicio sobre el colector. Los resultados de este estudio mostraron que dentro de los máximos de fijación, el porcentaje de post-larvas menores de 0,470 mm disminuyó a finales del verano y principios del otoño, pero no así el número total de mejillones, sugiriendo que un sustrato disponible comienza a ser colonizado desde el inicio de la temporada de fijación con la llegada de larvas competentes. Conforme avanza la temporada las post-larvas crecen y llegan más larvas y post-larvas al sustrato con lo que al final de la temporada el sustrato puede estar saturado. De este modo el aumento en las corrientes consecuencia de las tormentas del otoño fácilmente dispersará a las post-larvas excedentes que serán arrastradas hasta que mueran o alcancen aleatoriamente un nuevo sustrato. Adicionalmente puede haber dispersión de post-larvas y juveniles cuando los sustratos donde se encuentran adheridas son arrastrados por las corrientes (rafting) tal y como ocurre con pequeños bivalvos, gasterópodos (Martel y Chia, 1991). La fijación que hemos detectado en diferentes alturas de la zona intermareal sugiere que la marea y la acción del oleaje favorecen una fijación diferencial de larvas y post-larvas. La marea y las corrientes transportan a las larvas a los litorales. En ellos la exposición al oleaje es continua y especialmente fuerte, favoreciendo una distribución uniforme de larvas y post-larvas. Esta población es lanzada continuamente hacia el litoral por la marea y las olas, si la velocidad de la corriente es favorable, las larvas y post-larvas se podrán fijar sobre los sustratos disponibles por todo el perfil del litoral. Sin embargo, las diferencias en el tiempo de exposición al aire entre unos minutos en la parte baja del perfil litoral a casi 6 h en la zona superior, dan como resultado una fijación más abundante en la zona inferior. Además el efecto de desecación, por exposición al aire, favorecerá una mayor mortalidad en los mejillones fijados en zonas altas del litoral. Tan (1975) encontró una correlación estadisticamente significativa entre la supervivencia de post-larvas de Mytilus viridis y el período de exposición a la atmósfera. Chipperfield (1953) indicó que Mytilus edulis requiere estar sumergido entre 4 y 5 h para fijarse al sustrato. En este sentido el hecho de encontrar mejillones adheridos a los colectores de la zona más alta del perfil litoral muestran que la fijación fue inmediata, ya que estos colectores sólo estuvieron bajo el agua unos minutos debido al ciclo natural de la marea. Nuestras observaciones de laboratorio confirman una fijación inmediata ya que en ocasiones al sólo contacto de la aguja de disección con las post-larvas éstas se adherían a ella. Cuando se agitaron las cajas Petri con las post-larvas y los diferentes sustratos, la fijación también fue inmediata. Siempre encontramos una mayor tasa de fijación cuando el agua se encontraba en movimiento. Hemos observado que el filamento mucoso de las postlarvas les permite sujetarse inmediatamente al sustrato, en consecuencia es probable que inmediatamente después se inicie la secreción del biso. Esta observación podría ayudar a explicar de forma más clara el proceso de fijación de Mytilus en el cual el papel de contacto y sujeción del filamento mucoso es fundamental. La capacidad de secreción

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del filamento mucoso se inicia al final del estadío de larva pedivelíger (Sigurdsson et al., 1976) en consecuencia el filamento se secreta para sujetarse al sustrato, una vez en él, se lleva a cabo la metamorfosis, secretándose el biso para una fijación más fuerte. Esta hipótesis deberá ser estudiada con más detalle. Por otro lado hemos encontrado fijación de larvas y post-larvas de mejillón sobre todo el perfil litoral, desde la zona superior dominada por balanos, a la inferior dominada por mejillones adultos. Esto confirma que la fijación ocurre aleatoriamente sobre cualquier sustrato disponible. La existencia de sustratos adecuados y la mortalidad y dispersión de las post-larvas parecen ser los principales factores que determinan una distribución particular de las mismas, su distribución no se debe a una búsqueda «inteligente» del sustrato adecuado. Por otro lado la fijación sobre los colectores colocados en diferentes partes de las bateas y a diferentes profundidades, mostraron una distribución de la fijación de mejillón bastante uniforme. Esto sugiere también una distribución relativamente homogénea de larvas en el plancton con una tendencia a aumentar entre 5 y 10 m de profundidad, lo cual estaría de acuerdo con el comportamiento fototáctico y geotáctico de las larvas competentes. La presencia de grandes post-larvas indica la dispersión de las mismas, esto refleja cierta contradicción respecto a una fase de dispersión local, sin embargo es posible que dichas post-larvas proviniesen de las cuerdas de las propias bateas de cultivo donde se colocaron los colectores, ya que continuamente se agitan, especialmente a finales del verano, cuando las cuerdas y otros sustratos pueden estar saturados y cualquier sacudida desprenderá algunas post-larvas. Ecología y comportamiento de larvas y post-larvas del mejillón y su aplicación en el manejo de semilla para su cultivo A manera de resumen y en función de su aplicación para el manejo de semilla del mejillón en la zona, los resultados obtenidos indican que: la fijación ocurre a una talla aproximada de 300 mm y el período en que ésta ocurre en mayor abundancia es entre primavera y mediados del verano. Posteriormente hay una dispersión de una parte de las post-larvas en función de la saturación de sustratos disponibles y las corrientes que se puede extender hasta principios del otoño. Estas post-larvas en consecuencia, no son indicadoras de una nueva puesta masiva. Esta fase dispersiva es limitada a las zonas litorales donde la exposición al oleaje y fluctuaciones de marea la favorecen, aunque si se dan condiciones de corrientes fuertes su alcance puede ampliarse. Por otro lado, desde el punto de vista del productor, la semilla del mejillón está compuesta por ejemplares de entre 0,5 y 2 cm, estas tallas, desde el punto de vista biológico corresponden a post-larvas y juveniles de una edad de entre 1 y 3 meses después de la fijación. Sin embargo, entre el biso de ellas se encuentran grandes cantidades de pequeñas post-larvas 0,300 a 5000 mm de edades entre 0 y 1 meses. En consecuencia las estimaciones de crecimiento se verán alteradas por la mezcla de tallas y por la supervivencia de unas u otras.

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Hasta ahora, la colocación de colectores en bateas y colecta de semilla en los bancos naturales, se ha hecho en función de 2 períodos reproductivos y dos épocas de fijación con características distintas, la primaveral con fijación en colectores de batea y en los litorales y la otoñal con fijación sólo en los litorales (Andreu, 1954, 1958; Aguirre, 1979). En consecuencia, los colectores en las bateas se colocan durante marzo, abril y mayo, y en los bordes de las bateas. Esta última costumbre se debe a que se cree que los colectores en los bordes actúan como filtros para que la semilla no se fije en los colectores del interior de la batea donde se engorda el mejillón, ya que la semilla que se fija sobre las cuerdas de cultivo dificulta la limpieza del producto, además de competir por espacio y alimento. También se ha argumentado que colocar colectores en el interior de las bateas dificultaría el manejo de las cuerdas de cultivo. La extracción de semilla de los bancos naturales se realiza de acuerdo con las dos épocas señaladas. La presión de extracción sobre ellos se ha incrementado, tanto por el aumento en la demanda de semilla debido al crecimiento en el número de bateas dedicadas al cultivo del mejillón, como por factores de diverso tipo, entre ellos, el que algunas zonas como las islas Cíes han sido declaradas parques naturales y en consecuencia se ha prohibido la extracción de semilla de sus litorales, esto ha orillado a los mejilloneros a recurrir a bancos más alejados y a una mayor explotación en las zonas permitidas. La limitación en el número de cuerdas por batea, sin diferenciar entre cuerdas colectoras y cuerdas para engorde, favorece la tendencia a recurrir a la semilla de los bancos naturales, ya que así, las cuerdas de las bateas se usan sólo para el engorde. Se han creado situaciones conflictivas debido a la coexistencia del mejillón con otros recursos de alto valor comercial como el percebe (Pollicipes cornucopia) ya que por proteger a esta especie se limitan también las zonas de extracción de semilla del mejillón. Ha aumentado el desarrollo urbano y portuario invadiendo zonas de bancos naturales del mejillón, además el aumento en el vertido de aguas residuales de dichos núcleos industriales y urbanos pueden afectar los bancos naturales de semilla del mejillón. A título orientativo, y para tener una idea de la cantidad de semilla necesaria para el cultivo, podemos hacer una estimación tomando en cuenta los censos más recientes del número de bateas que existen en las Rías Gallegas (3.386 bateas). El número promedio de cuerdas de semilla por batea es de 137 (10-12 m de largo), en cada una de las cuales se colocan unos 14,1 Kg de semilla de una longitud media de 2 cm (Figueras, 1989; Pérez-Camacho, 1991). Considerando dichos valores, la cantidad de semilla utilizada que resulta es de unas 6.540,7 Tm por año. Aproximadamente 2.289,3 Tm se obtienen de las cuerdas colectoras colocadas en las bateas (35% de las bateas) y 4.251,4 Tm de los bancos naturales (65% de las bateas). De las muestras obtenidas del raspado de los bancos naturales durante el presente estudio, se obtiene que el peso medio de semilla del mejillón (0,250 a 2000 mm) obtenida de la zona intermareal en 1 m2 es de 19,64 Kg. Por lo tanto, una estimación orientativa sobre el total de superficie empleada para extraer semilla de las zonas rocosas de las Rías, es alrededor de 21,6 Ha.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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Por otro lado, considerando que el precio actual de venta de semilla por parte de algunas personas que la extraen de los bancos naturales para venderla a los mejilloneros, es de 1 €/Kg, entonces el valor de las 4.251,4 Tm es de 4 millones de euros. Recomendamos algunas medidas para administrar y proteger, con una base más sólida, el uso de la semilla del mejillón para el cultivo. Los resultados descritos en este trabajo permiten hacer una serie de sugerencias para contribuir a mejorar su manejo: 1. Las mejores áreas para disponer colectores en las bateas se sitúan en el exterior de las Rías, así que el mayor esfuerzo de colecta se puede centrar en dichas zonas. El período de colocación de colectores puede extenderse hasta el verano. 2. Los colectores se pueden colocar en cualquier parte de la batea y no solamente en los bordes. Un diferente color de la rabiza permitiría con facilidad manejar estas cuerdas colectoras. La disposición de estos colectores en el interior de la batea permitiría aumentar la superficie de captación tanto para larvas competentes como aquellas dispersadas de las propias cuerdas de cultivo. En consecuencia el período de disposición de colectores puede extenderse hasta julio-agosto. Un período largo de colecta requeriría la sustitución periódica de los colectores para mantener su eficiencia. Los colectores saturados podrían trasladarse a zonas de mala fijación en el interior de las Rías. 3. Se podrían delimitar zonas de colecta de semilla en las zonas externas de las Rías, en donde se colocasen colectores en boyas o sistemas de long-line. Esto permitiría, por un lado aprovechar en su totalidad las bateas para engordar del mejillón y por otro disminuir la presión de extracción sobre los bancos naturales. La mejor temporada de colecta en estas zonas sería de abril a mediados de julio, debido a que ésta es la época de fijación de larvas competentes, después las fijaciones que ocurren están dominadas por post-larvas que han sido dispersadas de otros sustratos. Sin embargo el carácter más o menos local de dicha dispersión reduce las posibilidades de colecta fuera de las bateas o los bancos naturales del litoral. 4. En las zonas de extracción de semilla no se debe hacer una «limpieza» total del banco, sino que se deben dejar núcleos o «parches» de semilla a partir de los cuales se permita la recuperación del mismo. Dichas zonas no deben ser explotadas hasta su recuperación. La colecta de semilla en estas zonas puede ser preferencialmente entre mediados del verano y otoño, con objeto de permitir el establecimiento de la puesta anual para, posteriormente, colectar post-larvas y juveniles que ya han pasado una etapa selectiva. La aplicación de las medidas anteriores deben estar apoyadas por un programa de monitoreo permanente de la fijación en diferentes zonas de las Rías (bateas y litorales), en el que participen los productores de mejillón y las autoridades locales. En este sentido se propone la utilización de un colector de cuerda de nylon estanda-

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Jorge Cáceres-Martínez y Antonio Figueras

rizado (material, tamaño y superficie) así como el tipo de soportes diseñados para las zonas batidas por el oleaje. Las densidades de semilla de mejillón obtenidas en los colectores de nylon durante el presente estudio, variaron entre 0 a 0,4 mejillones/cm2 en el otoño-invierno y de 0,5 a 262 mejillones/cm2 en la primavera-verano. A partir de dichos valores se estimó un «índice de abundancia de fijación (IAF)». Este índice podría ser utilizado para conocer y valorar las fluctuaciones y abundancia de fijación por zonas y así decidir la colocación, sustitución y traslado de colectores. El límite de los valores de las distintas categorías del IAF podrían optimizarse con los registros de fijación durante períodos más prolongados. En la Figura V.7, se muestran de manera esquemática las posibilidades, calidad (larvas competentes o post-larvas) y calendario de la colecta de semilla en las Rías Gallegas. Las posibilidades de comercialización de semilla del mejillón, que fue sugerida desde las primeras observaciones de Andreu (1954, 1958), podrá valorarse en función de complementar el presente estudio con un trabajo sobre recuperación de bancos naturales, de carga parasitaria y posible transmisión de enfermedades de post-larvas y juveniles.

Figura V.1. Fijación mensual de mejillones sobre colectores situados en distintos puntos de la Ría de Vigo. Las barras oscuras indican el número total de mejillones y las claras el número de postlarvas menores de 0,470 mm.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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Figura V.2. Fijación acumulada de mejillones sobre colectores situados en distintos puntos de la Ría de Vigo. Las barras oscuras indican el número total de mejillones y las claras el número de postlarvas menores de 0,470 mm.

Figura V.3. Fijación de mejillones sobre colectores situados en la cara anterior (A), media (M) o posterior (P) de las bateas de Limens y San Adrián de la Ría de Vigo. Las barras oscuras indican el número total de mejillones y las claras el número de postlarvas menores de 0,470 mm.

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Jorge Cáceres-Martínez y Antonio Figueras

Figura V.4. Fijación de mejillones sobre colectores situados a 1, 5 y 10 metros de profundidad en las bateas de Limens y San Adrián de la Ría de Vigo. Las barras oscuras indican el número total de mejillones y las claras el número de postlarvas menores de 0,470 mm.

Figura V.5. Número de postlarvas adheridas a los colectores situados a 2 (barras negras), 5 (barras rayadas) y 8 metros (barras blancas) de profundidad durante un ciclo de 24 horas en Cabo Home.

V. Fijación de los juveniles del mejillón: fijación del mejillón

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Figura V.6. Porcentaje de postlarvas de los grupos 1, 2, y 3 adheridas a los sustratos en el experimento de selección realizado con agitación (CA) y sin ella (SA).

Figura V.7. Representación esquemática de la duración y magnitud de los sucesos que ocurren durante las primeras etapas de vida del mejillón en la Ría de Vigo. La altura de cada curva representa el porcentaje máximo de abundancia de cada suceso en una escala de 0 a 100%.

SISTEMA CIRCULATORIO E INMUNE

VI. BIOQUÍMICA DEL SUERO. EFECTO DE PATÓGENOS Y VARIACIONES ESTACIONALES ANTONIO FIGUERAS, MARÍA SANTAREM y BEATRIZ NOVOA

VI.1.

INTRODUCCIÓN

Las principales funciones del sistema circulatorio de los moluscos bivalvos son el transporte de nutrientes, oxígeno, anhídrido carbónico y otros metabolitos de deshecho y la defensa inmune del animal. La energía incorporada y no utilizada en el metabolismo de mantenimiento es rápidamente almacenada en forma de lípidos, carbohidratos y proteínas para ser utilizada en el crecimiento somático y germinal (Barber et al., 1988). El almacenaje de energía y su utilización están vinculados generalmente a la actividad reproductora (Gabbot, 1975; Thompson, 1977; Mulvey y Feng, 1981; Fisher & Newell, 1986). Además, los constituyentes bioquímicos de la hemolinfa se han utilizado para describir los efectos de ciertos parásitos sobre el molusco hospedador (Fisher y Newell, 1986). En el caso particular de los mejillones, estos estudios se han llevado a cabo centrándose en los efectos de los parásitos sobre el conjunto del mejillón (Williams, 1969; Dennis et al., 1974; Ferrán, 1991) así como en la estacionalidad y/o la influencia de los factores ambientales (Bayne, 1973). Hasta el momento pocas investigaciones han tenido por objetivo el estudio de la relación existente entre la presencia del parásito y la composición en carbohidratos y proteínas del suero (Mulvey y Feng, 1981; Santarém et al., 1992). La mayor parte de los estudios de los componentes de la hemolinfa se han llevado a cabo en la ostra americana (Crassostrea virginica) describiendo los efectos de factores ambientales y de parásitos (fundamentalmente el protozoo Haplosporidium nelsoni) en la hemolinfa del hospedador (Feng y Canzonier, 1970; Ford, 1986; Fisher y Newell, 1986; Chu y La Peyre, 1989).

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VI.2.

Antonio Figueras, María Santarem y Beatriz Novoa

MATERIALES Y MÉTODOS

Zona de estudio El estudio de la bioquímica del suero se llevó a cabo en mejillones de Meira, en la Ría de Vigo. Se escogió este lugar porque las prevalencias de los parásitos detectados eran intermedias entre las detectadas en la zona externa e interna de la misma Ría (Fernández et al., 1990). Los mejillones (Mytilus galloprovincialis), con una longitud media de 45 mm y 7,3 g de peso medio, se obtuvieron de colectores situados en la mencionada Ría y se colocaron en bateas a dos profundidades (1-2 y 4-5 m) empleando cestas de las habitualmente utilizadas en el cultivo de la ostra. Cada mes (con la excepción de noviembre) entre abril de 1988 y diciembre de 1988, se retiraron 30 mejillones para la extracción de la hemolinfa y para la realización de estudios histológicos. Extracción de hemolinfa Las muestras de hemolinfa se extrajeron del músculo aductor posterior utilizando una jeringuilla de insulina. Con la ayuda de una lima se practicó una muesca en la concha del mejillón, a la altura del mencionado músculo, facilitando así la extracción. De cada mejillón se extrajo 1 ml de hemolinfa aproximadamente. Determinación de la concentración de carbohidratos totales Los carbohidratos totales fueron cuantificados colorimétricamente utilizando el método del fenol sulfúrico (Dubois et al., 1956) según Strickland y Parsons (1968), y utilizando como patrón sacarosa disuelta en agua destilada (500 mg/ml). Determinación de la concentración de carbohidratos reductores El método utilizando fue el de Bernfeld (1951) modificado por Forohui y Gunn (1983). También en este caso el patrón utilizado fue sacarosa disuelta en agua destilada (2 mg/ml). Determinación de la concentración de proteínas totales Las proteínas fueron cuantificadas siguiendo el método de Lowry (Lowry et al., 1951) y utilizando como patrón albúmina de suero bovina disuelta en agua destilada (500 mg/ml). Los resultados se expresan en términos de equivalentes de albúmina de suero bovina por ml de hemolinfa. Histología, estereología e índice de condición Las muestras fueron procesadas para histología siguiendo los protocolos rutinarios descritos anteriormente. El cálculo del índice de condición y el estudio estereológico se hizo según el proceso descrito en el capítulo anterior.

VI. Bioquímica del suero. Efecto de patógenos y variaciones estacionales

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Análisis estadísticos Se compararon los niveles de los componentes de la hemolinfa con respecto a la localidad, mes y el estado de parasitación mediante un análisis de varianza de una vía. Los valores de las concentraciones de carbohidratos totales y reducidos, y proteínas fueron transformados logarítmicamente antes del análisis para cumplir con las condiciones de homoce-dasticidad (Sokal y Rohlf, 1981). Después de un análisis previo, no se encontraron diferencias entre machos y hembras para los parámetros medidos por lo que los análisis posteriores se llevaron a cabo utilizando todos los individuos sin distinción de sexo. Para cada parásito o grupo de parásitos se evaluó su influencia en los niveles bioquímicos de los componentes de la hemolinfa utilizando también un análisis de varianza de una vía. En los casos en los que la prevalencia de los parásitos fue muy baja (menor del 5%), los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando las muestras de 2 y 5 metros conjuntamente. VI.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los valores de los carbohidratos totales (Fig. VI.1A) variaron entre 0,053 y 0,668 mg/ml en los mejillones situados a 2 m de profundidad y entre 0,075 y 0,700 mg/ml en los situados a 5 m de profundidad. En estos últimos, se observó un solo máximo en julio y los valores mínimos se alcanzaron en diciembre (0,075 mg/ml). En el caso de los mejillones situados a 2 m de profundidad, la evolución de los niveles fue más irregular detectándose dos máximos, el primero en junio (0,528 mg/ml) y el segundo en agosto (0,668 mg/ml) y como en el caso anterior al final de la experiencia los valores fueron mínimos (0,053 mg/ml). El análisis de varianza demostró que la concentración de los carbohidratos totales estuvo influenciada por el mes de muestreo (n = 454, p < 0,05). La concentración de los carbohidratos reductores del suero de los mejillones de la zona de Meira se indica en la figura VI.1B. Ésta presentó un patrón similar en ambas muestras. Se observaron tres máximos, el primero en julio (0,887 y 0,669 mg/ml respectivamente), el segundo en septiembre (1.021 y 0,835 mg/ml respectivamente) y el tercero en diciembre (0,516 y 0,633 mg/ml respectivamente). La concentración de los carbohidratos reductores vino determinada por la profundidad a la que se recogió la muestra (n = 440, p < 0,05) y por el mes (n = 448, p < 0,05) encontrándose que fue mayor en los mejillones de 2 m de profundidad que en los de 5 m de profundidad. La concentración de proteínas totales también presentó un patrón similar en los mejillones de ambas profundidades (Fig. VI.1C). Durante toda la experiencia, el nivel de proteínas varió entre 0,620 y 1.962 mg/ml para los mejillones situados a 2 m de profundidad y de 0,770 y 2.830 mg/ml para los mejillones de 5 m de profundidad. Estos últimos presentaron valores ligeramente mayores que los cultivados a 2 m de profundidad, diferencias que fueron significativas (n = 452, p = 0,034). Los valores máximos y mínimos se alcanzaron al mismo tiempo en ambas muestras. El primer máximo fue en junio (1.962 y 2.232 mg/ml respectivamente),

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Antonio Figueras, María Santarem y Beatriz Novoa

el segundo en agosto (1.610 y 1.886 mg/ml respectivamente) y el tercero en octubre (1.232 y 2.830 mg/ml respectivamente). Se detectó una alternancia de valores máximos y mínimos de la concentración de las proteínas en meses consecutivos. TABLA VI.1 Comparación de los parámetros de la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis de la Ría de Vigo mediante un análisis de varianza de una vía respecto a la presencia del parásito (valores de p < 0,05, fueron considerados significativos, n: número de mejillones) Parásito o enfermedad

Organismos tipo clamidial. Organismos tipo ciliado . . Steinhausia mytilovum. . . . Marteilia refringens . . . . . Mytilicola intestinalis . . . . Infiltración . . . . . . . . . . . . Granulocitoma . . . . . . . . .

Carbohidratos totales

Carbohidratos reducidos

Proteínas

n

p

N

p

n

p

93 89 38 85 139 105 80

0,275 0,982 0,748 0,775 0,647 0,147 0,030*

91 87 36 83 137 103 78

0,299 0,037* 0,221 0,368 0,006* 0,465 0,771

93 89 38 85 139 105 80

0,732 0,913 0,580 0,974 0,961 0,757 0,039*

Los estudios histológicos mostraron la presencia de organismos de tipo clamidial, del protozoo Marteilia refringens y de organismos de tipo ciliado en los túbulos digestivos, también se encontraron ciliados en las branquias, el copépodo parásito Mytilicola intestinalis se localizó en el intestino y el microsporidio Steinhausia mytilovum en los ovocitos, además aparecieron infiltraciones de hemocitos y granulocitomas en la glándula digestiva. La frecuencia de aparición de los parásitos no fue afectada por la profundidad (n = 464, p > 0,050). Las concentraciones de los carbohidratos totales y de las proteínas del suero estuvieron influenciados por la presencia de granulocitomas y la de los carbohidratos reductores por la presencia de organismos de tipo clamidial y de Mytilicola intestinalis, sin que, en ambos casos, los valores de los carbohidratos reductores de los individuos no parasitados estuvieran por encima de los de los parasitados (Tabla VI.1). Por otro lado, los análisis estadísticos llevados a cabo utilizando grupos de dos parásitos mostraron que los carbohidratos reductores de la hemolinfa se vieron afectados por cualquier par de parásitos en los que estuviese presente Marteilia refringens o Mytilicola intestinalis; sin embargo, tampoco los valores de los individuos no parasitados estuvieron por encima de los valores de los parasitados. La concentración de las proteínas de la hemolinfa no se vio influida en ningún caso por la combinación de los parásitos (Tabla VI.2). En el caso de Marteilia refringens-infiltración y Marteilia refringens-granulocitoma la concentración de los carbohidratos totales fue mayor en los mejillones no infectados que en los infectados, principalmente en los meses de verano. Estos mejillones además presentaron un índice de condición mayor.

VI. Bioquímica del suero. Efecto de patógenos y variaciones estacionales

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TABLA VI.2 Comparación de los parámetros de la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis mediante un análisis de varianza respecto a la presencia de grupos de parásitos (valores de p < 0,05, fueron considerados significativos, GD. glándula digestiva, n: número de mejillones, M refringens = Marteilia refringens, M. intestinalis = Mytilicola intestinalis) Parásito y/o enfermedad

Carbohidratos totales

Carbohidratos reducidos

Proteínas

n

p

n

p

n

p

M. refringens-M. intestinalis . . . M. refringens-Clamidia . . . . . . . M. refringens-Ciliados en GD . . M. refringens-Infiltración . . . . . M. refringens-Granulocitoma . . .

148 102 97 124 87

0,714 0,502 0,899 0,033* 0,05*

146 100 95 122 85

0,004* 0,152 0,015* 0,180 0,844

148 102 97 124 87

0,817 0,937 0,787 0,455 0,295

M. intestinalis-Clamidia . . . . . . M. intestinalis-Ciliados en GD. . M. intestinalis-Infiltración . . . . . M. intestinalis-Granulocitoma . .

170 169 192 146

0,194 0,985 0,168 0,822

168 167 190 143

0,008* 0,000* 0,004* 0,011*

170 169 192 146

0,971 0,390 0,989 0,927

Ciliados en GD-Granulocitoma . Clamidia-Infiltración . . . . . . . . . Clamidia-Granulocitoma . . . . . . Ciliados en GD-Infiltración . . . . Ciliados en GD-Granulocitoma . Infiltración-Granulocitoma . . . .

103 131 94 124 90 114

0,413 0,024* 0,620 0,703 0,039* 0,290

101 129 92 122 90 112

0,049* 0,629 0,284 0,137 0,546 0,282

103 131 94 124 90 114

0,853 0,864 0,867 0,683 0,490 0,814

En ambas profundidades, Mytilus galloprovincialis el desarrollo del ciclo reproductivo no fue diferente del ya descrito por Ferrán (1992). La producción de gametos y el desarrollo de la gónada ocurren principalmente en primavera, momento en que el número de gametos comienza a disminuir hasta alcanzar el mínimo en otoño para de nuevo comenzar a incrementarse en invierno. El volumen de células de reserva: células adipogranulares y tejido conectivo vesicular fue mayor en el período verano-otoño y menor en primavera. Los mejillones de ambas profundidades presentaron dos máximos en el índice de condición a lo largo del año, el primero en marzo y el segundo en septiembre con valores mínimos en julio y sin que se apreciasen diferencias significativas entre ambas profundidades (n = 460, p > 0,05). Los carbohidratos tienen dos funciones biológicas fundamentales: una como reserva de energía y otra como elementos estructurales. Los mejillones cultivados a 5 m de profundidad presentaron un claro patrón estacional en los carbohidratos totales. Los valores fueron bajos en abril, alcanzando el máximo en julio. Este máximo coincidió con el índice de condición más bajo, quizás debido a que la puesta del mejillón acababa de finalizar y los mejillones necesitarían almacenar energía en forma de carbohidratos para la próxima gametogénesis. En la muestra de mejillones cultivados a 2 m de profundidad el máximo está desplazado hacia

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agosto y además se detecta otro máximo en abril. Bayne (1973) encontró que la concentración más baja de carbohidratos en el suero de Mytilus edulis se detectaba entre mediados del verano y mediados del invierno. Sin embargo nuestros valores fueron mayores en el verano, lo que parece indicar un distinto comportamiento de las dos especies de mejillones o tal vez condiciones ambientales diferentes. Aunque nuestro trabajo se ha circunscrito al suero, también hemos observado que la variación anual de los carbohidratos totales estuvo también relacionada con las células VCT. En primavera, cuando los factores ambientales tales como nutrientes, temperatura del agua y salinidad son favorables, se produce el primer «bloom» de fitopláncton (Campos-Loriz y González, 1975; Iglesias y Nunes, 1982; Figueiras y Niell, 1987). El número de VCT comienza a incrementarse y la movilización de los carbohidratos totales obtenidos del alimento podría hacerse a través de la hemolinfa para reponer las VCT. La concentración de los carbohidratos reductores es un reflejo del metabolismo de los carbohidratos, presentando un perfil irregular con tres máximos en ambas muestras. Además, los niveles encontrados en la hemolinfa fueron bajos durante la mayor parte del año. Estos resultados sugieren que, hasta junio, la actividad metabólica de los mejillones es baja, produciéndose un gran incremento de estos componentes en junio, septiembre y diciembre. Ya que no se encontró relación con el desarrollo gonadal, esta variación podría ser el resultado de cambios en las condiciones ambientales o de una movilización de las reservas de carbohidratos. Las proteínas tienen varias funciones biológicas: se asocian a reacciones enzimáticas, al transporte de sustancias, regulación del metabolismo, defensa, soportes estructurales y almacén de energía. La concentración de proteínas fue mayor en mejillones cultivados a 5 m de profundidad en octubre y no se observó patrón de variación anual alguno, resultados que concuerdan con los obtenidos por Bayne (1973) en Mytilus edulis. En nuestro estudio encontramos otro máximo en junio en ambos puntos de muestreo. Santarém et al. (1992) obtuvieron diferentes valores de la concentración de proteínas dependiendo de la localización de la muestra (interior o exterior de la Ría). En nuestro caso, los resultados en Meira siguen el patrón de la muestra del interior de la Ría (valores de abril mayores que los de julio) siendo estos valores mayores que los encontrados por Santarém et al. (1992) para esta misma zona. La alternancia mensual de valores altos y bajos en la concentración de proteínas entre mayo y octubre en ambas muestras podría hacernos pensar en una movilización rítmica de tales componentes. Fisher y Newell (1986) sugieren que el desarrollo de gametos podría ser el responsable de las variaciones en la concentración de proteínas del suero. En nuestro caso las variaciones en la concentración tuvieron lugar durante todo el muestreo, no dándose coincidencia alguna ni con el máximo ni con el mínimo en la producción de gametos por lo que el desarrollo gametogénico no sería un factor determinante de la variación de las proteínas del suero. Es importante señalar el patrón en «dientes de sierra» encontrado tanto en los carbohidratos reductores como en las proteínas. Los valores altos de carbohidratos reductores coincidieron con valores bajos de la concentración de

VI. Bioquímica del suero. Efecto de patógenos y variaciones estacionales

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proteínas y los valores altos de proteínas coincidieron con valores bajos de la concentración de carbohidratos reductores. Estos resultados sugieren una movilización rítmica de las reservas: cuando los carbohidratos se emplean totalmente, el mejillón podría utilizar proteínas como combustible y cuando las proteínas se emplean totalmente, el mejillón podría utilizar carbohidratos garantizando así la disponibilidad de energía durante todo el año. Sin embargo esta hipótesis necesita ser comprobada. Todos los componentes de la hemolinfa variaron dependiendo del mes en que se efectuó el muestreo. Santarém et al. (1992) indican que las proteínas y otros parámetros de la hemolinfa relacionados con la respuesta humoral y celular varían de acuerdo con la época del año y la localidad. Nuestros resultados sugieren una estrecha relación de la concentración de los componentes de la hemolinfa de la temperatura, la salinidad y la disponibilidad de alimento que son, a su vez, dependientes del mes del año. En la mayor parte de los meses, la concentración de los carbohidratos reductores fue mayores en los mejillones de 2 m de profundidad y la concentración de proteínas lo fue en los mejillones de 5 m de profundidad (en ambos casos éstas fueron estadísticamente significativas). La razón de tal variación continúa siendo una incógnita, pero podríamos pensar que son las condiciones ambientales las que favorecen en un caso la movilización de los carbohidratos y, en el otro caso, la de las proteínas. Los estudios histopatológicos no mostraron parásitos nuevos con respecto a los ya descritos para los mejillones de la misma zona (Fernández et al., 1990; López et al., 1990; Figueras et al., 1991b; Mourelle, 1993). Los componentes del suero no se vieron afectados por la presencia de un único parásito, sin embargo, al estudiar el efecto de varios parásitos juntos, los análisis estadísticos sí mostraron diferencias significativas entre los mejillones parasitados y no parasitados en la concentración de los carbohidratos totales y reductores. Los carbohidratos reductores fueron los componentes de la hemolinfa que más se vieron afectados por los parásitos y Mytilus intestinalis o Marteilia refringens estuvieron presentes en la mayoría de los casos en los que las diferencias entre parasitados y no parasitados fueron significativas. Los mejillones afectados por estos parásitos podrían presentar un balance energético más reducido ya que Marteilia refringens parasita las células de los túbulos digestivos, responsables de la digestión intracelular del alimento y que sirven además como lugar de almacén para las reservas metabólicas (Thompson et al., 1974). Por otro lado, los adultos de Mytilicola intestinalis están presentes en el intestino de los mejillones, con lo que además de dañar el epitelio digestivo del intestino (Davey y Gee, 1988) podrían actuar en la expoliación de alimento. En nuestro estudio las reservas energéticas en forma de carbohidratos totales fueron más bajos en los mejillones infestados que en los no infectados con Marteilia refringens-infiltración y Marteilia refringens-granulocitoma. La variación en los carbohidratos reductores es más difícil de explicar pues las concentraciones de los carbohidratos reductores de los mejillones no infectados no fueron superiores a la de los infectados. A pesar de ello, el índice de condición también fue mayor en los animales no infectados.

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Antonio Figueras, María Santarem y Beatriz Novoa

Feng y Canzonier (1970) señalan cambios en los niveles de proteínas de la hemolinfa de Crassostrea virginica infectada con Haplosporidium nelsoni y Bucephalus sp. Por su parte, Ford (1986) apunta que la concentración de proteínas en el suero cae fuertemente y de acuerdo con la intensidad de infección por H. nelsoni. Cuando lo que se estudia son los parásitos agrupados de dos en dos no se detectan diferencias entre los niveles de proteínas entre los infectados y no infectados, por lo que quizás sería necesario trabajar con mejillones muy parasitados, de forma semejante al trabajo realizado por Ford (1986) en ostras infectadas por H. nelsoni para detectar los posibles efectos de los parásitos en la concentración. En la mayoría de los casos, no se encontraron diferencias entre el volumen celular de los distintos tipos celulares de la gónada de los mejillones parasitados y no parasitados. Podría haber ocurrido que en una misma muestra, al encontrarse mejillones en varios estados de desarrollo gonadal, los efectos de los parásitos durante el ciclo reproductivo hubieran quedado enmascarados. La forma en que los parásitos afectan a las rutas metabólicas permanece todavía sin aclarar. Los resultados sugieren la existencia de un sinergismo entre los diferentes patógenos que tiene más efectos sobre el hospedador que la acción de cada uno de ellos por separado. Estos estudios deberían ser corroborados en términos de fisiología celular en condiciones de laboratorio para poder afirmar o negar con mayor rotundidad estas hipótesis.

VI. Bioquímica del suero. Efecto de patógenos y variaciones estacionales

Figura VI.1.

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Concentración media mensual de carbohidratos totales. (A). Carbohidratos reductores (B) y proteínas totales (C) de la hemolinfa del mejillón.

VII.

INMUNOLOGÍA DEL MEJILLÓN

INTRODUCCIÓN GENERAL A pesar de la importancia de las enfermedades para el cultivo de moluscos bivalvos, hasta ahora, no se han descrito enfermedades que produzcan mortalidades graves en el mejillón. Estos organismos cuentan con un eficiente sistema inmune inespecífico compuesto tanto de elementos humorales como celulares, que les protege de los potenciales agentes patógenos. Al igual que otros invertebrados, los moluscos carecen de inmunoglobulinas y de respuestas adaptativas o específicas que caracterizan la respuesta inmune de vertebrados; no tienen por tanto memoria inmunológica por lo que no es posible la prevención de enfermedades mediante la vacunación. El sistema humoral consta de una serie de péptidos antimicrobianos eficaces frente a infecciones de bacterias y hongos (Mitta et al., 1999, 2000) mientras que el sistema de defensa celular implica mecanismos de fagocitosis, aglutinación y producción de radicales intermediarios de oxígeno (ROI) y de nitrógeno (RNI) con potente acción microbiocida (Ordás et al., 2000, Arumugam et al., 2000; Gourton et al., 2001, Torreilles et al., 1999; Tafalla et al., 2002a, 2003a). El hemocito La unidad de defensa celular en los moluscos bivalvos es el hemocito. Los hemocitos se mueven libremente en el sistema circulatorio abierto y pueden migrar fácilmente al tejido conectivo laxo y viceversa (Adema et al. 1991). No se conoce cual es el órgano hematopoyético de los moluscos bivalvos, aunque se ha postulado que podría ser el tejido conectivo dado que en esa zona se detectan altas concentraciones de hemocitos y un elevado número de mitosis (Smolowitz et al. 1989).

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Beatriz Novoa et al.

Los hemocitos se han dividido tradicionalmente según sus características morfológicas en granulares o granulocitos, y no granulares o hialinocitos (Feng 1988, Fisher 1986), aunque la primera de las poblaciones puede incluir a su vez distintos tipos celulares (Auffret 1988). Los granulocitos deben su nombre al aspecto que le confieren los numerosos lisosomas o gránulos que poseen en el citoplasma. Este tipo hemocitario tiene la capacidad de extender rápidamente pseudopodios, y es generalmente más grande y de mayor capacidad fagocítica que los hialinocitos (Feng 1988, Fisher 1986). Los hialinocitos son células redondas de elevada proporción núcleo: citoplasma que contienen menos lisosomas que los hemocitos granulares (Feng 1988). Algunos autores afirman que los hialinocitos y los granulocitos son distintos tipos celulares; otros opinan que los dos tipos son el primero y último estadío del desarrollo de un único tipo celular (Adema et al. 1991). El mayor problema para la clasificación de las células de la hemolinfa es la existencia de tipos celulares intermedios y la falta de herramientas inmunológicas que permitan caracterizar las poblaciones hemocitarias. Mecanismos de defensa asociados a los hemocitos La fagocitosis supone, junto con los factores de defensa humorales, la primera línea de defensa una vez evitadas las barreras físico-químicas (Ratcliffe et al. 1985). La fagocitosis consta de cinco pasos: reconocimiento de la partícula extraña, adherencia, ingestión, destrucción y eliminación (Feng 1988). Las dos primeras etapas pueden suceder tanto pasivamente por colisión al azar, como activamente por quimiotaxis. A pesar de que el proceso no se encuentra bien estudiado en los moluscos bivalvos, el reconocimiento de la partícula extraña parece estar mediado por receptores de la membrana de los hemocitos (Fawcett y Tripp 1994, Feng 1988) y la adherencia de los hemocitos al agente extraño está mediada por factores humorales, lectinas y aglutininas. Tras la adherencia se produce la ingestión, normalmente mediante la extensión de pseudópodos por parte del hemocito e inclusión del agente extraño en una vacuola fagocítica (Ratcliffe et al. 1985). Esta vacuola, llamada fagosoma primario, se fusiona con los gránulos del citoplasma hemocitario para formar el fagosoma secundario (Fisher 1986). Dichos gránulos, verdaderos lisosomas, contienen enzimas entre los que se incluyen la fosfatasa ácida, esterasas no específicas, peroxidasas y lisozima (Carballal et al. 1997b, Fisher 1986, Ratcliffe et al. 1985). Estas proteínas enzimáticas se descargan sobre el microorganismo ingerido, destruyéndolo (López et al. 1997b, Ratcliffe et al. 1985). Además de participar en la destrucción del microorganismo fagocitado, los enzimas también pueden secretarse a la hemolinfa en el proceso llamado desgranulación. La desgranulación representa la base morfológica de la liberación al suero, asociada con la fagocitosis, de los enzimas lisosomales contenidos en los granulocitos (Foley y Cheng 1977).

VII. Inmunología del mejillón

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La actividad fagocítica de los hemocitos puede verse afectada por algunos agentes contaminantes, como fungicidas y metales pesados (Baier-Anderson y Anderson 2000, Brousseau et al. 2000, McIntosh y Robinson 1999, Roesijadi et al. 1997). Por tanto, la calidad del agua de cultivo de los moluscos de interés comercial podría condicionar en parte el estado inmunológico de dichos animales. Este hecho ha provocado que en los últimos años se haya despertado un creciente interés hacia el mejillón como indicador biológico de la contaminación. La modulación de su respuesta inmune es uno de los aspectos que se está estudiando para determinar si puede estar relacionada con la intensidad y tipo de contaminación en la que viven estos animales. La estimulación de los fagocitos por perturbaciones de los receptores de la membrana o por ingestión de partículas extrañas produce un aumento del consumo de oxígeno debido a la activación de los enzimas NAD(P)H- oxidasa y mieloperoxidasa (MPO) (Adema et al. 1991, Anderson 1996a). La NAD(P)H- oxidasa es una flavoproteína oxidasa adherida a la membrana, y la MPO es un enzima intracelular localizado principalmente en el interior de los lisosomas primarios (Austin y Paynter 1995). La actividad de estos dos enzimas, conocida como el sistema MPO- peróxido- halido, transforma el oxígeno molecular en los radicales tóxicos de oxígeno (ROIs) superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), oxígeno libre (1O2), radical hidroxilo (·OH) y ácido hipocloroso (HOCl). Estas moléculas son potentes efectores destructivos que pueden funcionar independientemente o en asociación con los enzimas lisosómicos (Adema et al. 1991, Feng 1988). Para la activación tanto de los enzimas generadores de ROIs como hidrolíticos parece necesaria la acidificación de los fagocitos, hecho que se ha demostrado en los hemocitos de ostra tras la ingestión de material particulado (Beaven y Paynter 1999). Al proceso de producción de ROIs se le denomina estallido respiratorio y es un importante mecanismo de defensa. Otro de los mecanismos celulares que los bivalvos emplean para defenderse de agresiones externas es la encapsulación. La encapsulación se produce cuando las partículas demasiado grandes para ser fagocitadas son rodeadas por grupos de hemocitos (Feng 1988, Fisher 1986, Ratcliffe et al. 1985). Las células sanguíneas se diferencian, como para la reparación de la herida, en fibroblastos, y se agrupan concéntricamente alrededor del agente extraño (Feng 1988, Fisher 1986). Los hemocitos no están prediferenciados para fagocitar o encapsular, puesto que los primeros que alcanzan la partícula siempre intentan fagocitarla (Fisher 1986). Mecanismos de defensa humorales · Lisozima Las lisozimas son 1,4-b-N- acetilmuramidasas que rompen el enlace glicosídico entre el C-1 del ácido N-acetilmurámico y el C-4 de la N- acetilglucosamina en el péptidoglucano bacteriano, principal polímero estructural de la pared celular bacteriana (Jollès y Jollès 1984). Se ha descrito actividad de la lisozima en gran cantidad de moluscos bivalvos (véase Chu 1988). La lisozima se almacena

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Beatriz Novoa et al.

en los lisosomas que contienen los gránulos de los hemocitos granulares (Mohandas et al. 1985, Zachary y Hoffmann 1984), y se libera al suero sin ruptura de la membrana plasmática en el proceso de desgranulación (Cheng et al. 1975, Foley y Cheng 1977, Mohandas et al. 1985). Este fenómeno, habitual en los hemocitos de los moluscos, es estimulado con la fagocitosis de bacterias (Mohandas et al. 1985). El nivel de lisozima en el suero de los bivalvos se encuentra fuertemente condicionado por la estación (Feng y Canzonier 1970), el estrés (Steinert y Pickwell 1985) y el ciclo mareal (McHenery et al. 1983). El papel primordial de la lisozima de los moluscos bivalvos es la digestión, puesto que estos animales son capaces de alimentarse de bacterias y necesitan romperlas para digerirlas. Esto explica que en numerosos moluscos bivalvos, entre los que se encuentra el mejillón, se haya descrito una mayor concentración del enzima en los tejidos asociados a los procesos digestivos (McHenery et al. 1979). Sin embargo, la lisozima también desempeña un papel relevante en la defensa del hospedador, como demuestra la relación existente entre la actividad de la lisozima del suero de ostra y el grado de infección por Bucephalus sp. y Minchinia nelsoni (Feng y Canzonier 1970). Los granulocitos poseen otros enzimas líticos lisosómicos además de la lisozima, como por ejemplo la fosfatasa ácida o la b-glucuronidasa en el caso de almeja fina, mejillón y ostra (Carballal et al. 1997b, López et al. 1997c, Yoshino y Cheng 1976). Estas sustancias líticas también están presentes en el suero, lo que parece ser debido a la hipersíntesis y liberación de estos enzimas desde los hemocitos fagocíticos en respuesta a la infección bacteriana (Chu 1988). De hecho, se ha demostrado que las defensinas (determinados péptidos antimicrobianos) del mejillón (Mytilus galloprovincialis) se liberan de los hemocitos al plasma tras la infección por bacterias (Mitta et al. 1999a). Recientemente, se han descrito y caracterizado nuevos péptidos con actividad bactericida en los hemocitos de esta especie de mejillón, la miticina y las mitilinas (Mitta et al. 1999b, 2000). Estas últimas parecen desempeñar un papel relevante en la destrucción intracelular de las bacterias fagocitadas (Mitta et al. 2000). · Lectinas Las lectinas o aglutininas son sustancias presentes en el suero de los moluscos bivalvos que reconocen y opsonizan cuerpos extraños para favorecer su fagocitosis (Olafsen 1988). Además, las lectinas poseen otras propiedades inmunológicas como la precipitación y la mediación de la quimiotaxis (Ratcliffe et al. 1985). Hace tiempo que se demostró la importancia de los carbohidratos presentes en la superficie tanto de los hemocitos como del agente extraño en la fagocitosis mediada por las lectinas (Mullainadhan y Renwrantz 1986). Chu (1988) resume dos de las teorías que explican el fenómeno de discriminación de lo no propio en los invertebrados. Una de ellas sugiere que las lectinas facilitan la adhesión entre la célula y el material extraño mediante la unión de determinados azúcares de superficie durante los procesos de fagocitosis y encapsulación (Fig. VII.1). La otra teoría se basa en el reconocimiento específico de lo propio, de modo que toda partí-

VII. Inmunología del mejillón

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cula adherida al hemocito, atraída mediante la opsonización por lectinas o simplemente por azar, será ingerida a no ser que se reconozca como propia. En cualquier caso, se han formulado otras teorías sobre los mecanismos bioquímicos por los que las aglutininas reconocen agentes no propios y participan en la defensa de los invertebrados; estas teorías se encuentran revisadas por Olafsen (1988) y continúan siendo objeto de estudio (Suzuki y Mori 1990).

Lectina del suero

Lectina de la membrana

Partícula no propia

Hemocito Partícula no propia

Hemocito Azúcar

Azúcares Figura VII.1.

Diagramas mostrando las posiciones de las lectinas y azúcares que facilitarían la unión entre las partículas no propias y los hemocitos (Chu 1988).

Las lectinas de los moluscos han sido extensamente estudiadas (Olafsen 1986). Se ha demostrado la aglutinación de bacterias y de eritrocitos de vertebrados por el suero de mejillón, ostra, almeja, pulpo y otras especies de moluscos (Fisher y DiNuzzo 1991, Leippe y Renwrantz 1988, Tamplin y Fisher 1989, Tripp 1992b). También existen aglutininas en otros fluidos corporales de los bivalvos, como el mucus de la cavidad paleal (Fisher 1992). El aumento en la actividad de las lectinas en la hemolinfa de ostra tras la exposición a bacterias confirma su implicación en la defensa del molusco contra este tipo de agente patógeno (Olafsen et al. 1992). La similitud en los receptores de membrana para las lectinas entre los hemocitos y determinados parásitos podría explicar la evasión de la fagocitosis por parte de dichos patógenos (Fisher 1988b, Kanaley y Ford 1990). Se han aislado y descrito molecularmente determinadas aglutininas del suero de muchos moluscos bivalvos, como mejillón, almeja de agua dulce (Corbicula fluminea) y ostra (Acton et al. 1969, Renwrantz y Stahmer 1983, Vasta et al. 1982, Yang y Yoshino 1990). También se han caracterizado las moléculas de reconocimiento para las lectinas presentes en la superficie de los hemocitos (Renwrantz y Stahmer 1983, Yoshino 1983). En cuanto a los factores físico-químicos que regulan la opsonización, diversos estudios han demostrado que éste es un proceso dependiente del tiempo y la temperatura (Cheng et al. 1995, Fryer y Bayne 1989, Schoenberg y Cheng 1982), por lo que se supone varía estacionalmente.

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Beatriz Novoa et al.

· Otros factores de defensa humoral El sistema profenoloxidasa, compuesto por una serie de reacciones en cascada semejante al complemento de mamíferos (Ratcliffe et al. 1985, Söderhäll y Smith 1986), había sido descrito sólo en algunos invertebrados, como ascidias y crustáceos (Arizza et al. 1995, Jackson et al. 1993, Sritunyalucksana et al. 1999, Sung et al. 1998). Recientemente, se ha demostrado que la actividad fenoloxidasa, enzima final del sistema profenoloxidasa, también existe en la hemolinfa de una especie de mejillón (Asokan et al. 1997). Por otra parte, los hemocitos de moluscos tienen actividad óxido nítrico sintasa (Conte y Ottaviani 1995, Franchini et al. 1995, Nieto-Fernández et al. 1999), enzima implicada en la producción del radical activo NO. Esta molécula parece funcionar como agente bactericida en algunas especies de moluscos, entre las que se encuentra el mejillón (Ottaviani et al. 1993). La interacción entre el anión superóxido (O2-) y el NO liberados por los hemocitos estimulados por un agente particulado produce el oxidante peroxinitrito, que entre sus funciones incluye la eliminación de determinados protozoos parásitos (Torreilles y Guèrin 1999).

VII.1. HEMOCITOS DE MEJILLÓN. PRODUCCIÓN DE RADICALES DE OXÍGENO Y NITRÓGENO BEATRIZ NOVOA, CAROLINA TAFALLA, CAMINO ORDÁS y ANTONIO FIGUERAS

VII.1.1.

INTRODUCCIÓN

La fagocitosis es uno de los mecanismos de defensa más importantes de los moluscos bivalvos. La ingestión de partículas extrañas está normalmente asociado con la liberación de moléculas citotóxicas como la lisozima o los radicales intermediarios de oxígeno (ROIs), que matan y destruyen microorganismos potencialmente patógenos. La generación intracelular de ROIs se detecta por la producción de un precipitado azul debida a la reducción de NBT («nitroblue tetrazolium»), mientras que el estallido respiratorio extracelular se suele cuantificar, espectrofotométricamente, por la reducción de citocromo C. La quimioluminiscencia (CL) permite la medición de ambas actividades, tanto la extra como la intracelular, con mayor sensibilidad que los métodos anteriormente citados (Adema et al. 1991). Las moléculas excitadas (ROIs) producidas por estas células liberan fotones simples durante su vuelta al estado basal, generando luz a partir de reacciones químicas en un proceso de quimioluminiscencia. Además de generar fotones, los intermediarios de oxígeno pueden oxidar moléculas no tóxicas como el luminol hidrazido cíclico (5- amino- 2,3- dihidro- 1,4- ftalazinediona) (Allen y Loose 1976. La respuesta de CL intensificada por luminol (CLlum) se emplea universalmente para medir la producción de ROIs en moluscos bivalvos. La respuesta de quimioluminiscencia se ha caracterizado en Mytilus edulis (Noël et al., 1993; Kumazawa et al., 1993), pero hasta ahora se han hecho pocos estudios sobre la modulación de la CL en hemocitos de M. galloprovincialis (Torreilles et al., 1997). Otro de los mecanismos de defensa es la producción de óxido nítrico (NO), que ha sido descrito en los hemocitos de moluscos (Ottaviani et al. 1993). En ma-

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míferos, el NO es producido mediante la NO sintasa inducible por los macrófagos a partir de arginina en respuesta a citoquinas proinflamatorias tales como interferón g (INFg) o factor de necrosis tumoral a (TNFa), lipopolisacárido bacteriano o parásitos (Fang, 1997). Esta molécula es producida normalmente por los macrófagos aunque en algunas especies se ha detectado la producción por los neutrófilos. En Mytilus galloprovincialis, se han usado distintos métodos para medir la producción de NO. Arumugam et al. (2000) demostraron producción de NO en homogenados de hemocitos en respuesta a laminarina, phorbol miristato acetato (PMA) o durante la fagocitosis. En otro estudio, la producción de NO fue indirectamente demostrada por la conversión de L-arginina a L-citrulina marcadas (Gourdon et al., 2001). La producción de otro radical libre asociado a la presencia de NO, el peroxinitrito fue detectada en Mytilus galloprovincialis en respuesta al zimosán (Torreilles et al., 1999). Sin embargo, el papel del NO en el sistema inmune de estas especies de moluscos no se ha determinado todavía. En este capítulo analizamos la producción de radicales de oxígeno y nitrógeno por parte de los hemocitos de mejillón, su modulación por parte de moléculas externas y las posibles relaciones entre ambos tipos de radicales. VII.1.2.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y extracción de la hemolinfa Los mejillones (Mytilus galloprovincialis) se recogieron en bateas de las Rías bajas gallegas (Pontevedra y Vigo). En el laboratorio se mantuvieron en acuarios con aireación alimentados diariamente con Tetraselmis svecica. La extracción de la hemolinfa del músculo aductor se llevó a cabo mediante un orificio practicado en la concha mediante una jeringuilla de insulina. La hemolinfa de tres a cinco animales fue mezclada y mantenida en hielo hasta su uso para evitar la agregación de hemocitos. Producción de radicales de oxígeno: quimioluminiscencia (CL) La producción de radicales de oxígeno fue determinada mediante el análisis de la quimioluminiscencia. La producción de CL se midió en un contador de centelleo (Tri-Carb 2500 TR Liquid Scintillation Analyzer, Packard) o bien en un luminómetro Fluoroskan de Labsystems (2000 ms tiempo de lectura) cada 5 min durante 30 min. Las lecturas máximas obtenidas en cada pocillo se utilizaron para medir la actividad. La solución stock de luminol 10–1 M (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazinedione, Sigma) se preparó en dimetil sulfóxido (DMSO) justo antes de su utilización. Los ensayos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Alícuotas de hemolinfa se incubaron con 500 ml de stock de luminol diluido en ASW y se midió la quimioluminiscencia basal. Finalmente se añadieron los distintos estímulos alcanzando la concentración final de luminol 10–4 M (Bachère et al., 1991). En el contador de centelleo, la respuesta de quimioluminiscencia al estí-

VII. Inmunología del mejillón

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mulo se midió de 10 a 15 ciclos y los resultados se expresan como conteos por minuto (Cpm) o en forma de índice de estimulación (SI), SI = valor máximo de cpm de hemocitos estimulados/valor máximo de cpm de hemocitos control. Cada experimento se repitió al menos dos veces. Efecto de distintos estímulos en la quimioluminiscencia Se determinó el efecto de distintos estímulos sobre la quimioluminiscencia de los hemocitos de mejillón. Se empleó una suspensión de zimosán A (Sigma) en agua de mar artificial al 35‰. La respuesta CL se midió después de la adición de zimosán a concentraciones de 5, 2, y 1 mg ml–1. Con el fin de determinar la especificidad de la reacción se añadió superóxido dismutasa (SOD) (a una concentración final de 300 U ml–1) a la suspensión de zimosán (2 mg ml–1) en algunas muestras. Se determinó el efecto de cinco concentraciones de 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma) (50, 20, 10, 1 y 0,1 mg ml–1) y de tres de lipopolisacarido de Escherichia coli (LPS, Sigma) (100, 10 y 1 mg ml–1, concentraciones finales). Los controles de cada experimento fueron tratados con agua de mar artificial en vez de los estímulos. El efecto de Vibrio tapetis en la CL se estudió con bacterias cultivadas en triptona soja agar (TSA) suplementado con Na Cl (concentración final del 2%). El efecto de un parásito de moluscos Perkinsus atlanticus (Ordás & Figueras, 1998), en la CL se estudió mediante distintos experimentos en los que se analizó la respuesta de CL a la incubación de hemocitos con suspensiones celulares del parásito o a los productos extracelulares. Producción de radicales de nitrógeno La producción de NO se determinó mediante la reacción de Griess que cuantifica el contenido en nitrito de los sobrenadantes, ya que el NO es una molécula poco estable y se degrada a nitrito y nitrato (Green et al., 1982). Después de la incubación de los hemocitos a 20°C, se tomaron 50 ml de cada pocillo y se pusieron en otra placa de 96 pocillos. Se añadieron 100 ml de sulfanilamida al 1% (Sigma) en ácido fosfórico al 2,5% a cada pocillo, seguidos por 100 ml de 0,1% N-naftil-etilenediamina (Sigma) en ácido fosfórico al 2,5%. Se midió la densidad óptica utilizando un espectofotómetro multiscan (Labsystems) a 540 nm. La concentración molar de nitrito en la muestra se determinó empleando curvas estándar generadas a partir de concentraciones conocidas de nitrito sódico. Efecto del PMA en la producción de NO por hemocitos de mejillón Se determinó el efecto del acetato de forbol miristato (PMA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) en la producción de NO por los hemocitos de mejillón. Para ello, se añadieron diferentes concentraciones de PMA (100 mg ml–1 y 50 mg ml–1 de concentración final) a muestras de sangre. Una vez añadido el PMA la hemolinfa se repartió en placas de 96 pocillos (100 ml por pocillo) y se incubó a

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20°C2 o 24 h. Después de ese tiempo, se midió la concentración de NO en la hemolinfa. Para confirmar la especificidad de la reacción se empleo, en algunos experimentos, el inhibidor de la sintasa de NO, NG-metil-L-arginina (L-NMMA) (Sigma) a una concentración de 1 mM, en combinación don diferentes dosis de PMA. Se incluyeron controles con L-NMMA solamente. Todos los experimentos se realizaron con tres mezclas distintas de hemocitos de mejillón y se empelaron triplicados para cada muestra. Dadores de NO Se emplearon dos dadores de NO trinitrato de glicerina (GTN) y S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP) (Merck y Sigma). Previamente determinamos la producción de NO y la posible citotoxicidad de ambos compuestos, incubando los hemocitos con diferentes concentraciones de GTN o SNAP durante 30 min o 2 h. En el caso de GTN, determinamos el efecto de 0,5; 0,25; 0,1 y 0,05 mg ml–1, mientras que en el caso de SNAP las concentraciones empleadas fueron 1.000; 500; 250 y 100 mM. Estas concentraciones habían sido determinadas previamente como óptimas para producción de NO en vertebrados. En todos los casos, se emplearon dos grupos de sangre con los dos tratamientos y las distintas concentraciones de cada donante de NO y después de 30 min o 2 h de incubación a 20°C se midió el NO en los sobrenadantes siguiendo el método descrito anteriormente. Se determinó la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripan, contando el número de células viables en una cámara Neubauer. Efecto del NO exógeno en la respuesta de quimioluminiscencia al zimosán Para determinar si la preincubación de células con NO tenía efecto en la respuesta de quimioluminiscencia frente a zimosán, se emplearon en estos experimentos las dosis de GTN tolerada sin efecto en la viabilidad de los hemocitos (0,1 and 0,05 mg ml–1). En el caso del SNAP se emplearon las concentraciones 1000, 500 and 250 mM. En todos los casos, las suspensiones de hemocitos en su propia hemolinfa se trataron con las diferentes concentraciones de los donantes de NO y se dispensaron en las placas de 96 pocillos usando triplicados para cada tratamiento (100 ml por pocillo). Se disolvió Luminol (Sigma) en DMSO para conseguir una concentración de 10 mM. Después de 2 h de incubación de los hemocitos de mejillón a 20°C, se añadieron a cada pocillo 100 ml de agua de mar filtrada conteniendo luminol (0,3 mM concentración final) y zimosán (2 mg ml–1 concentración final) diluido en agua de mar filtrada. Se incluyeron algunos pocillos sin zimosán como controles de la estimulación de la quimioluminiscencia. Efecto del NO exógeno sobre la fagocitosis de los hemocitos La fagocitosis de los mejillones se determinó empleando el Kit VibrantTM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) que contiene Escherichia coli marcada con fluores-

VII. Inmunología del mejillón

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ceína. En todos los casos, se trataron suspensiones de hemocitos en su propia hemolinfa con las diferentes concentraciones de los donantes de NO y se dispensaron en placas de 96 pocillos usando triplicados para cada tratamiento (100 ml por pocillo). Inmediatamente después, se añadieron a cada pocillo 50 ml de una suspensión que contenía las bacterias marcadas con fluoresceína y se incubaron las placas durante 2 h a 20°C. Después de la incubación la solución se eliminó de los pocillos mediante aspiración por vacío y se añadieron 50 ml de azul tripan a cada pocillo. El exceso de azul tripán se eliminó mediante aspiración por vacío y la placa se leyó empleando un luminómetro Fluoroskan (Labsystems) con excitación a 480 nm y emisión de 520 nm. En todos los casos se incluyeron controles sin bacterias y sin células. Análisis estadístico Los datos se compararon empleando el test de la t de Student y se expresan como la media ± desviación estandar. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p < 0,05. Todos los tratamientos se estudiaron por triplicado para cada mezcla de hemolinfa. La significación de los índices de estimulación (SIs) se testó mediante el test no paramétrico de Kolmogorov-Smirnov. VII.1.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Respuesta de quimioluminiscencia de hemocitos de mejillón frente a diversos estímulos La Figura VII.2 muestra la típica curva de la respuesta de quimioluminiscencia de los hemocitos de mejillón ante cualquier estímulo. La CL se incrementa rápidamente después de la adición de zimosán en contraste con los controles que muestran una respuesta CL constante (Fig. VII.2.A). La estimulación fue dosis dependiente, el máximo valor de CL se incrementó de acuerdo con la concentración de zimosán añadido como estímulo. Los hemocitos del mejillón Mytilus galloprovincialis muestran en presencia de zimosán un patrón de respuesta de CL muy similar a los de los hemocitos de M. edulis (Noël et al., 1993). La adición de SOD a la suspensión de zimosán utilizada como estimulante causó la caída de la CL comparada con la del control (tratado sólo con zimosán) (Fig. VII.2.B). Esta inhibición de la respuesta de CL mediante la SOD confirma el papel de los aniones superóxido en esta respuesta de los hemocitos de M. galloprovincialis. De hecho, Carballal et al. (1997b), han mostrado que los hemocitos de M. galloprovincialis poseen NADH oxidasa. La estimulación de la CL se incrementó también con el tratamiento de PMA. El índice de estimulación (SI) fue ligeramente superior a 0,1 (1,625 ± 0,125), 20 (2,000 ± 0,500), y 50 mg ml–1 (2,250 ± 0,500) que a 1 mg ml–1 (1,125 ± 0,125). Por otra parte, la respuesta de CL después de la adición de zimosán fue significativamente más elevada en los hemocitos que habían sido preincubados con 50 mg ml–1 de PMA (SI = 8,85 ± 0,65) comparados con los incubados en agua de mar artificial SI = 6,59 ± 0,21) (probabilidad de dos caras < 0,001).

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El hecho de que la estimulación de la CL sea más elevada con zimosán que con PMA se ha mostrado con hemocitos de mejillón del norte (M. edulis) y ostra (Austin et al., 1995; Torreilles et al., 1997). Sin embargo, los valores máximos de CL que encontramos en los hemocitos tratados con PMA fueron más bajos en nuestros experimentos. Estas variaciones intra e interespecíficas pueden ser causadas no sólo por variaciones en el metabolismo sino también por la condición en la que los animales fueron muestreados y al período del año (Noël et al., 1993). El LPS no causó un incremento de la emisión de CL por los hemocitos de mejillón. En todas las concentraciones ensayadas, la CL de los controles y los tratados fue la misma. El LPS activa los hemocitos de Mytilus edulis que incrementan su perímetro, adhesión y movilidad (Hughes et al., 1991). Sin embargo, el LPS no activó la emisión de CL en los hemocitos de M. galloprovincialis tal vez por la ausencia de los receptores de membrana apropiados en esta especie. La bacteria Vibrio tapetis no afectó la respuesta quimioluminiscencia de los hemocitos del mejillón. Tal como sucedió con el LPS, la emisión de CL fue la misma en los controles y en los hemocitos de mejillón tratados. Se ha descrito que los hemocitos de M. galloprovincialis son capaces de fagocitar Vibrio tapetis (Carballal et al., 1997a; Ordás et al., 1999). El que V. tapetis no estimule la CL de los hemocitos de mejillón puede ser explicado en base a una liberación de fosfatasa ácida por la bacteria (Borrego et al., 1996). Esta enzima puede alterar la respuesta celular del hospedador inhibiendo la producción de aniones superóxido (Anderson, 1996b). Así la bacteria podría ser fagocitada sin desatar el estallido respiratorio y sin producción subsiguiente de CL por los hemocitos. De hecho, se ha demostrado que la capacidad bactericida de los hemocitos de ostra no depende de la producción de ROIs (Bramble & Anderson, 1999). La ausencia de estimulación de CL se ha descrito también e hemocitos de ostra y vieira tratados con V. anguillarum y Listonella anguillarum, aunque otras especies bacterianas estimulaban la CL (Lambert & Nicolas, 1998; Bramble & Anderson, 1997). Esto podría estar relacionado con la patogenicidad de cada bacteria y su capacidad para eliminar ROIs. Las células de Perkinsus atlanticus no estimularon la producción de CL. La CL producida por la estimulación con zimosán después de 2,5 h de incubación de hemocitos con suspensiones de P. atlanticus cayeron en relación inversa al incremento de la concentración de células parasitarias (Fig. VII.3). Los ECPs de P. atlanticus también inhibieron la CL estimulada por zimosán (Fig. VII.4). Los estudios sobre la interacción entre parásitos y el estallido respiratorio han mostrado que los parásitos muertos estimulan la CL de hemocitos mientras que los vivos no lo hacían (Anderson, 1999; Le Gall et al., 1991; Volety & Chu, 1995). Esto apoya la explicación dada anteriormente sobre la capacidad de eliminación de ROIs por ciertos patógenos, bacterias o parásitos. Por tanto la inhibición de la respuesta de CL por concentraciones altas de células de P. atlanticus podrían ser debidas a la secreción de fosfatasa ácida por el parásito (Ordás et al., 1999). Las células de Perkinsus fueron lavadas antes de ser añadidas a los hemocitos para eliminar los productos secretados al medio. Sin embargo, podrían haber liberado fosfatasa ácida durante el tiempo de medición de CL o de preincuba-

VII. Inmunología del mejillón

119

ción con los hemocitos. De hecho, este enzima es secretada tan rápidamente que alcanza elevadas concentraciones solamente tres días después de cambiar el medio de cultivo (Ordás et al., 1999). Para obtener ECP, el medio de cultivo se concentró 10 veces, por lo tanto se puede asumir que la concentración de la fosfatasa ácida era 10 veces más elevada que en el medio normal. Esta elevada concentración de fosfatasa ácida puede explicar la inhibición de la respuesta de CL de los hemocitos de mejillón tratados con ECPs de Perkinsus. Esto resultados concuerdan con los obtenidos con hemocitos de ostra fagocitando células de P. marinus (Anderson, 1999; La Peyre et al., 1995a; Volety & Chu, 1995). Efecto del PMA sobre la producción de NO por hemocitos de mejillón El PMA induce significativamente la producción de NO por hemocitos de mejillón (Fig. VII.5). Después de 30 min de incubación de las células con el estimulante solo la concentración más alta de PMA fue capaz de inducir una respuesta significativa, mientras que a las 2 h de incubación, las dosis de 100 mg ml–1 and 50 mg ml–1 fueron capaces de estimular las células significativamente. Después de 24 h de incubación no se detectó respuesta a PMA. Con el fin de verificar la especificidad de la reacción, el experimento se repitió en la presencia de L-NMMA, un inhibidor de NO sintasa. Después de 30 min de incubación el inhibidor causó la bajada en la producción de NO en respuesta a PMA pero no de forma significativa. Sin embargo, después de 2 h de incubación (Fig. VII.5), el L-NMMA redujo significativamente la producción de NO por los hemocitos en respuesta a la concentración más elevada de PMA. Viabilidad de hemocitos en presencia de donadores de NO Antes de determinar el efecto del NO exógeno en las funciones inmunes del NO, se determinó el efecto de los diferentes donadores en la producción de NO y en la citotoxicidad para los hemocitos utilizando diferentes concentraciones de GTN y SNAP después de 30 min y 2 h de incubación. En las Fig. VII.6 y VII.7, se muestra la producción de NO cuando los hemocitos se incubaron con las distintas concentraciones de GTN y SNAP. El SNAP no tuvo efecto en la viabilidad celular tal como se comprobó con la prueba del azul tripán después de 30 min o 2 h de incubación a ninguna de las dosis empleadas. Sin embargo, el GTN produjo un descenso significativo de la viabilidad de los hemocitos a las concentraciones más elevadas que se utilizaron (0,5 mg ml–1 and 0,25 mg ml–1) (Fig. VII.8). Efecto de NO exógeno sobre la respuesta de quimioluminiscencia y fagocitosis de los hemocitos de mejillón En el caso del GTN, el efecto sobre la respuesta de quimioluminiscencia frente a zimosán se determinó utilizando las dos concentraciones más bajas que no habían tenido efecto significativo sobre la viabilidad celular. El NO producido en

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Beatriz Novoa et al.

estas condiciones fue 8,07 mM (SD = 0,132) y 8,6 mM (SD = 0,044), para 0,05 y 0,1 mg ml–1 respectivamente, mientras que la concentración de NO en los controles fue 6,88 mM (SD = 0,617). Estas diferencias en la producción de NO, no fueron significativamente distintas. En estas condiciones, el efecto de estas dos concentraciones de GTN en la respuesta de los hemocitos se muestra en la Fig. VII.9.A. GTN causó un descenso en la respuesta del hemocito aunque no fue significativa en todos los casos. En tres de cuatro grupos de hemocitos, la respuesta al zimosán decreció significativamente con 0,1 mg ml–1 de GTN. Cuando se utilizó SNAP, la concentración de NO obtenida después de 2 h de incubación fue de 65,87 mM (SD = 32,4), 21,22 mM (SD = 5,07) y 17,23 mM (SD = 0,259) nitrito, de 1000 mM, 500 mM y 250 mM, respectivamente, mientras que el NO medido en los controles fue 4,95 mM (SD = 0,518). En todos los grupos de hemocitos estudiados (N = 5), la preincubación de 2 h con NO aportado exógenamente por el SNAP, disminuyó significativamente la respuesta de quimioluminiscencia de los hemocitos de mejillón frente al zimosán (Fig. VII.9.B). Ni el GTN ni el SNAP tuvieron un efecto significativo sobre la capacidad de los hemocitos para fagocitar E. coli. En el caso del SNAP, la respuesta disminuyó en dos de los cuatro grupos estudiados pero no hubo respuesta en los otros dos. Aunque nuestros resultados y otros estudios recientes en distintas especies de bivalvos han mostrado la existencia en hemocitos de un producción inducida de NO se sabe muy poco sobre el papel que esta molécula juega en el sistema inmune de estos animales. En mamíferos se ha mostrado que el NO inhibe con frecuencia las funciones de los neutrófilos (Forslund y Sundqvist, 1997). Hemos demostrado que la preincubación con NO exógeno disminuye significativamente la producción de radicales de oxígeno medida como la respuesta de quimioluminiscencia de hemocitos frente a zimosán pero sin embargo no tiene ningún efecto sobre la capacidad de fagocitar bacterias. Esta disminución se observó en todos los grupos de hemocitos cuando el NO alcanzó valores significativamente más altos que en los cultivos control e incluso en algunos casos cuando la concentración de NO no fue significativamente más elevada que en los controles. Estos valores significativos de NO se obtuvieron con el donante de NO SNAP, que genera una elevada cantidad de NO sin causar efectos negativos en la viabilidad de los hemocitos. En humanos se postuló que el NO inhibe la fagocitosis de neutrófilos y la producción de radicales de oxígeno sugiere que un patógeno que genera NO puede tener más posibilidades de burlar un ataque por neutrófilos. En nuestro caso la fagocitosis de bacterias no fue alterada significativamente por el NO, esto sólo ocurrió en el caso de la respuesta de quimioluminiscencia que esta relacionada directamente con la producción de radicales de oxígeno que está asociada e incrementa la eficacia de la fagocitosis. Estudios previos realizados en Mytilus edulis, demostraron indirectamente que la agrupación de bacterias estaba mediada por el NO, ya que la inhibición de la síntesis de NO resultaba en un descenso de la función. Torreilles y Guérin (1999) muestran la formación de peroxinitrito en los hemocitos de M. galloprovincialis expuestos a zimosán. Un estudio reciente en M. galloprovincialis también mostró que tanto el NO como los radicales de oxígeno se producen asociados a la fagocitosis de partículas de látex, ya que los inhibido-

VII. Inmunología del mejillón

121

res de la sintasa del NO disminuyen la respuesta de quimioluminiscencia (Gourdon et al. 2001). Por lo tanto, parece probable que después de la estimulación, los hemocitos produzcan NO y radicales de oxígeno ya que se forma peroxinitrito a partir de la combinación de superóxido y NO. Puede ser posible que cuando se producen al mismo tiempo después de la estimulación cada uno de estos dos compuestos regule la formación del otro, ya que el peroxinitrito es muy tóxico para las células (Beckman et al. 1990). Se sabe que el NO inhibe la síntesis de proteínas en muchas líneas celulares. En mamíferos se piensa que el efecto antagonista entre la producción de radicales de NO y oxígeno sólo se da en determinadas circunstancias, para proteger a las células de daños oxidativos y radicales tóxicos (Wong y Billiard, 1995; Fang, 1997). En definitiva, los hemocitos de mejillón pueden producir NO en respuesta a un estimulante específico como el PMA, este NO puede inhibir significativamente la producción de radicales de oxígeno, medidos como quimioluminiscencia, producidos en respuesta al zimosán cuando la concentración de NO en los cultivos de hemocitos alcanza valores significativamente más elevados que en los controles. Sin embargo, la capacidad de estas células para fagocitar bacterias no es alterada significativamente por el NO. Tal vez, como sucede en vertebrados superiores, el NO actúa como una señal de parada para la respuesta inflamatoria, probablemente impidiendo la formación excesiva de peroxinitrito.

VII.2. SISTEMA INMUNE DEL MEJILLÓN. INFLUENCIA DE FACTORES EXTERNOS EN LOS MECANISMOS DE DEFENSA BEATRIZ NOVOA, MARÍA SANTARÉM, ANTONIO FIGUERAS

VII.2.1.

INTRODUCCIÓN

La hemolinfa es la responsable de la defensa del organismo ya que es donde se encuentran los hemocitos y componentes del suero que median la respuesta inmune de los bivalvos. Al igual que en los vertebrados, los mecanismos de defensa de los invertebrados contra lo no propio se pueden agrupar en celulares y humorales. Los hemocitos constituyen el principal modo de defensa contra agentes extraños en moluscos bivalvos marinos (Cheng, 1981; Bayne, 1983; Rasmussen et al., 1985). Sin embargo, el papel exacto de los factores humorales en la defensa interna de los moluscos no está claro (Chu, 1988). Se han descrito variaciones en el número y tipo de hemocitos en moluscos bivalvos como respuesta a la presencia de materiales extraños (Farley, 1968; Moore y Lowe, 1977; Suresh y Mohandas, 1990) y sabemos que los cambios en las condiciones ambientales afectan al número, tipo y capacidad defensiva de los hemocitos (Feng, 1965; Thompson et al., 1978; Fisher et al., 1989). Se han relacionado las variaciones en los niveles de lisozima, aglutininas y proteínas en la hemolinfa, con la actividad de los mecanismos de defensa internos (Trip, 1966; McDade y Trip, 1967; Feng y Canzonier, 1970; Hardy et al., 1976). Además, las variaciones estacionales y ambientales de los constituyentes de la hemolinfa se han asociado también al ciclo reproductivo (Mulvey y Feng, 1981; Fisher y Newell, 1986; Chu y La Peyre, 1989; Ford et al., 1993).

124

VII.2.2.

Beatriz Novoa et al.

MATERIALES Y MÉTODOS

Zona de estudio Los mejillones (Mytilus galloprovincialis) de 47,3 mm de longitud total media (DT = 4,14) y 12,3 g de peso medio (DT = 3,63), se obtuvieron de colectores situados en bateas de Meira, en la zona media de la Ría de Vigo. Los mejillones se colocaron en Liméns y Domayo a 5 m de profundidad (Fig. III.2) y entre abril de 1990 y enero de 1991 se muestrearon 20 mejillones en cada localidad cubriendo todas las estaciones el año (abril, julio, octubre de 1989 y enero de 1990). Estas zonas representan dos áreas en donde actualmente se está llevando a cabo el cultivo del mejillón, siendo la carga parasitaria mayor en la zona interna que en la externa. Número y tipos celulares de la hemolinfa Las muestras de hemolinfa se extrajeron como se ha detallado anteriormente. Se tomó una alícuota de 100 ml de hemolinfa y se fijó en 1% de formol en tampón fosfato salino (0,05 M, pH 8,4). El recuento del número de hemocitos se realizó utilizando una cámara de Neubauer. Para el estudio de la morfología de los hemocitos en la hemolinfa, se tomó otra alícuota de 100 ml de la muestra original y se depositó sobre un portaobjetos. Éstos se mantuvieron durante 5 minutos a 20°C para permitir la sedimentación de los hemocitos y posteriormente se fijaron durante 5 minutos con una solución de glutaraldehído al 2,5% en agua destilada. A continuación se lavaron los portaobjetos en agua destilada durante 2 minutos, se deshidrataron en etanol (96%) durante un minuto y se dejaron secar al aire. Estas preparaciones se tiñeron con el Kit Hemacolor (Merck), se lavaron con agua destilada y se dejaron secar al aire. El resto de la hemolinfa se centrifugó a 400 ´ g durante 10 min a 4°C para eliminar las células y* el sobrenadante (hemolinfa sin células o suero) se almacenó a –20°C para posteriores análisis. Determinación de la actividad de la lisozima La actividad de la lisozima se determinó espectrofotométricamente según el método de Shugar (1952). En primer lugar se preparó una suspensión patrón de Micrococcus lysodeitkicus (15 mg/100 ml) con una absorbancia de 0,6-0,7 en tampón fosfato 0,066 M (pH 6,24). A continuación se añadió hemolinfa libre de células (50 ml) a 1 ml de la suspensión de bacterias, midiéndose la disminución de absorbancia a 450 nm a intervalos de 1 minuto entre los 5 y los 10 minutos a temperatura ambiente (20-22°C) en un espectrofotómetro Hewlett Packard 8452A. Se prepararon soluciones patrón con lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma) de 15, 10, 5, 1 y 2,5 mg de lisozima por ml en tampón fosfato (0,066 M, pH 6,24).

VII. Inmunología del mejillón

125

Para cada concentración de enzima se determinó la variación de absorbancia por minuto (DA/min) y con estos datos se obtuvo una curva patrón de la concentración de la enzima frente la DA/min. Una unidad se define como la cantidad de enzima en el extracto que produce una actividad equivalente a 1 mg de lisozima, bajo las condiciones arriba descritas. Los resultados se expresarán como las unidades de lisozima por mg de proteína del suero. Determinación del título de aglutinación Para determinar el título de aglutinación se diluyeron seriadamente 100 ml de suero en una placa de 96 pocillos. En cada pocillo se depositaron 2 ml de PLP (Polystyrene Latex Particles, 0,605 mm de diámetro, Sigma) al 2,5% en agua de mar estéril. Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como control se utilizó agua de mar estéril. La actividad se expresó como el recíproco de la dilución más alta que causa aglutinación de las partículas de PLP. Determinación de la clorofila a y la temperatura Para conocer la influencia de los niveles de la clorofila a (un indicador de la disponibilidad de alimento) en la concentración de los constituyentes de la hemolinfa se determinó la clorofila a siguiendo el método de Yentsch y Menzel (1963). Además se tomaron datos de la temperatura del agua. Análisis estadísticos Los niveles de los componentes de la hemolinfa se compararon con respecto a la localidad y mes mediante un análisis de varianza. Se utilizó el mismo análisis para estudiar la influencia del estado de parasitación en los componentes de la hemolinfa. Se utilizó el test de independencia de G para estudiar la relación entre la frecuencia de Mytilicola intestinalis con la localidad en la que se llevó a cabo el cultivo. Como columnas se utilizaron el número de mejillones infestados y no infestados con M. intestinalis. Los tipos celulares de la gónada se compararon con respecto a la localidad utilizando un test de Kruskall-Wallis. VII.2.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las medias de los diferentes parámetros de la hemolinfa (actividad de la lisozima, concentración de proteínas, título de aglutinación, número de hemocitos circulantes, porcentaje de hemocitos granulares y agranulares) de las dos localidades de estudio se presentan en la Tabla VII.1. Los valores más bajos de hemocitos circulantes se encontraron en el mes de julio y los máximos valores correspondieron a Liméns, siendo además las dife-

126

Beatriz Novoa et al.

TABLA VII.1 Parámetros de la hemolinfa del mejillón (Mytilus galloprovincialis) procedente de las zonas de Domayo y Liméns. Entre paréntesis se expresa la desviación típica

Domayo

Abril Julio Octubre Enero

Liméns

Abril Julio Octubre Enero

Proteínas (mg/ml)

Lisozima (U/mg protein)

Título de aglutinación

0,65 (0,37) 1,10 (0,22) 0,48 (0,26) 0,50 (0,23) 0,49 (0,22) 1,26 (0,58) 0,67 (0,37) 0,77 (0,28)

7,69 (43,18) 8,00 (80,28) 2,29 (9,62) 1,60 (4,71) 15,00 (80,74) 18,00 (135,31) 0,30 (3,46) 1,56 (8,39)

371,70 (617,85) 2,112,00 (192,06) 59,25 (63,31) 26,40 (45,27) 136,80 (126,57) 4,416,00 (178,31) 73,00 (155,67) 26,36 (34,75)

Hemocitos Hemocitos Hemocitos circulantes agranulares granulares (x106/ml) (%) (%) 3,44 (2,29) 1,46 (1,60) 2,17 (1,58) 3,51 (1,61) 3,48 (2,72) 2,50 (1,54) 3,38 (2,10) 3,53 (2,73)

23,89 (11,73) 14,91 (11,91) 7,72 (10,52) 12,65 (5,87) 35,93 (14,43) 10,70 (6,53) 15,64 (16,94) 11,32 (5,85)

76,11 (8,30) 85,09 (20,20) 92,28 (24,02) 87,35 (6,10) 64,07 (20,28) 89,30 (6,92) 84,36 (16,95) 88,68 (9,64)

rencias significativas entre ambas localidades (n = 158, p = 0,004). En las dos localidades el número de hemocitos circulantes estuvo determinado por el momento del año en que se recogió la muestra (n = 158, p = 0,01). Por otro lado, el porcentaje de hemocitos granulares varió entre 64,1% y 92,3% y en el caso de los hemocitos agranulares osciló entre 7,7% y 35,9% (Tabla VII.1). El mayor número de hemocitos agranulares se encontró en las dos localidades en abril. Se comprobó que ni el momento ni la localidad de muestro tuvieron influencia en el número de hemocitos granulares y agranulares (n = 158, p > 0,05). Sin embargo, sí se encontraron diferencias significativas en el número de hemocitos circulantes en Domayo y en el número de hemocitos granulares y agranulares en Liméns entre mejillones infestados y no infestados con Mytilicola intestinalis (n = 156, p = 0,03; n = 158. p = 0,04 y n = 158, p = 0,045, respectivamente). Los valores de la concentración de proteínas variaron entre 0,48 y 1,26 mg/ml encontrándose los máximos valores en ambas localidades en julio. Sólo en Liméns los valores de la concentración de proteínas estuvieron influenciados por el momento del año en que se recogió la muestra (n = 156, p < 0,05). Por su parte, los máximos valores de la actividad de la lisozima y el título de aglutinación fueron detectados en julio, tanto en Domayo como en Liméns (8,0 y 18,0 U/mg de proteína para la actividad de la lisozima y 2,112 y 4,416 para el título de aglutinación, respectivamente). Los valores de estos parámetros fueron mayores en Liméns que en Domayo y las diferencias fueron significativas (n = 158, p = 0,011 y n = 158, p < 0,05, respectivamente). Estos parámetros de la hemolinfa también fueron influenciados por el momento del año en que se tomó la muestra

VII. Inmunología del mejillón

127

(n = 158, p < 0,05 en ambos casos). Se encontró además una correlación positiva entre el título de aglutinación y los niveles de lisozima en Liméns y Domayo (0,587 y 0,496, respectivamente). Finalmente, el análisis de varianza entre la presencia de Mytilicola intestinalis y los niveles de proteínas, lisozima y título de aglutinación no presentó diferencias significativas entre infestados y no infestados (n = 158, p > 0,05). El parásito que presentó una mayor prevalencia fue el copépodo Mytilicola intestinalis que se encuentra en el tracto digestivo. Su prevalencia fue mayor en Domayo que en Liméns (Tabla VII.2) y dependiente de la época del año (n = 156, p < 0,05). El parásito Marteilia refringens sólo se encontró en Domayo y con una pravalencia baja, por lo que no fue posible aplicar los análisis estadísticos para estudiar su influencia en los parámetros estudiados. TABLA VII.2 Prevalencias (%), de los principales parásitos detectados en los mejillones (Mytilus galloprovincialis) en Domayo y Liméns

Domayo

liméis

Abril Julio Octubre Enero Abril Julio Octubre Enero

Mytilicola intestinalis

Marteilia refringens

65,00 63,16 36,84 50,00 75,00 42,11 5,00 40,00

15,00 5,26 26,32 15,00 0,00 0,00 0,00 0,00

En ambas localidades, Mytilus galloprovincialis presentó un ciclo reproductivo típico. El crecimiento de la gónada y la producción de gametos tiene lugar principalmente en abril y el volumen de células de reserva del manto (adipogranulares y vesiculares) fue alto en octubre y bajo en abril. En el presente estudio se encontró que el tipo y número de hemocitos estuvo influenciado por la temperatura y la clorofila a. Feng (1965) señala que el número de hemocitos circulantes en Crassostrea virginica estaba determinado por la cantidad de alimento disponible y por la temperatura del agua. Así, si la temperatura y disponibilidad de alimento estuviesen directamente correlacionados con el número de hemocitos, cabría esperar los mayores valores en octubre, cuando la clorofila a y la temperatura son mayores en la Ría de Vigo. En este estudio no hemos encontrado un elevado número de hemocitos en este período ya que en ambas localidades estudiadas los valores más bajos fueron en julio, un período de baja disponibilidad de alimento y cuando los mejillones acaban de completar la gametogénesis. Durante el período de post-puesta se produce una movilización de los hemocitos hacia el manto para eliminar los restos celulares después del proceso de puesta (Suresh y Monadas, 1990). Nuestros resultados sugieren que la combi-

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Beatriz Novoa et al.

nación de la baja concentración de clorofila a y el período de post-puesta podría explicar la pérdida de hemocitos circulantes observada en julio. Figueras et al. (1991b) señalan que los mejillones infestados con Mytilicola intestinalis presentan daños en los tejidos próximos al parásito, además de una infiltración hemocitaria. Aunque no hubo diferencias significativas en el número de hemocitos granulares y agranulares entre mejillones infestados y no infestados por M. intestinalis, se detectó un mayor número de hemocitos agranulares en abril en ambas localidades, un período en el que la prevalencia de M. intestinalis fue mayor. De la misma manera, Ford et al. (1993) detectan un incremento en el número de células circulantes en la ostra americana (Crassostrea virginica) asociada con daños en los tejidos e inflamación producida por Haplosporidium nelsoni. Una reacción común de los hemocitos de los invertebrados a la presencia de parásitos es la desgranulación como consecuencia de la fusión o exocitosis de hemocitos granulares; por lo tanto, es posible que la disminución de hemocitos granulares pudiera ser debida a una desgranulación de estas células asociado con el daño en los tejidos e infiltración producida por M. intestinalis. Los mejillones de Liméns presentaron unos niveles de lisozima, título de aglutinación y proteínas significativamente mayores que los de Domayo. Fisher y Newell (1986) encontraron diferencias en la composición de la hemolinfa entre ostras de diferentes localidades y atribuyeron estas diferencias a condiciones ambientales diferentes. En nuestro estudio, los factores ambientales (disponibilidad de alimento y temperatura) fueron similares en ambas localidades por lo que tal variación no es explicable en términos de condiciones ambientales diferentes. Los cambios en los constituyentes de la hemolinfa a lo largo del tiempo han sido ya estudiados y se ha propuesto una relación con el almacén de sustancias energéticas y el ciclo gametogénico (Thompson, 1977; Mulvey y Feng, 1981; Fisher y Newell, 1986). Chu y La Peyre, 1989) encuentran en las ostras un incremento en las concentraciones de la proteínas y lisozima de la hemolinfa durante un período de altos niveles de clorofila a y baja temperatura. Contrariamente a esto, nosotros hemos encontrado que las concentraciones de proteínas, lisozima y título de aglutinación fueron mayores en julio en ambas localidades, un período de baja concentración de clorofila a y baja temperatura del agua. Los niveles de estos componentes se incrementaron en octubre, cuando los niveles de clorofila a y temperatura fueron mayores. Por lo tanto los factores exógenos (temperatura y clorofila a) aparentemente juegan un papel en la variación de la concentración de estos componentes de la hemolinfa, pero opuestos a los descritos por Chu y La Peyre (1989) para la ostra americana. El aumento de los niveles de lisozima y título de aglutinación en julio, un período post-puesta estuvo posiblemente ligado al ciclo de reproducción de los mejillones. Fernández Castro y Vido de Mattio (1987) observaron que en un período de condiciones alimenticias favorables y altas temperaturas del agua, los animales almacenan sustancias y desarrollan las gónadas al mismo tiempo. Estas observaciones también fueron apuntadas por Fisher y Newell (1986) que sugieren que la disminución en la concentración de las proteínas de la hemolinfa puede ser el resultado de su consumo por el organismo debido al rápido desarrollo de los gametos. De la misma manera, encontramos bajos niveles de proteínas en un período de alto desarrollo de células adipogranulares y vesiculares.

VII. Inmunología del mejillón

129

El papel de la lisozima y las aglutininas en el sistema de defensa de las ostras y otros invertebrados no está claro. Feng y Canzonier (1970) encontraron incrementos significativos de la actividad de la lisozima en ostras moderadamente infectadas con Haplosporidium nelsoni. A pesar de las altas prevalencias de Mytilicola intestinalis en mejillones de Domayo, nuestros resultados no muestran ninguna relación de los niveles de lisozima y título de aglutinación con la prevalencia de M. intestinalis en los mejillones. De la misma manera, Chu y La Peyre (1989) no observaron ninguna relación entre la infección por Perkinsus marinus en ostras Americanas (Crassostrea virginica) y la concentración de la lisozima en la hemolinfa. Estos autores argumentaron que los cambios en las concentraciones de la lisozima podrían ser debidos al ciclo de reproducción de la ostra. En nuestro estudio, varios componentes de la hemolinfa fueron afectados por la localidad y/o el momento del año en el que se tomó la muestra, lo que sugiere que algunos de ellos presentan cambios estacionales. Se encontraron diferencias significativas entre mejillones infestados y no infestados por Mytilicola intestinalis en la proporción de los distintos tipos de hemocitos de la hemolinfa; sin embargo, la forma en que el parásito causa tales variaciones continúa siendo desconocida. Posteriores investigaciones deberían centrarse en esta dirección para entender mejor el papel de los componentes de la hemolinfa en la reacción ante la infección y cómo el parásito puede afectar a las rutas metabólicas del hospedador. Estos estudios deberían ayudar a encontrar maneras eficaces de combatir los organismos patógenos.

130

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1.500 A

cpm

1.000

500

0 0 5 mg ml

-1

50 2 mg ml

-1

100 1 mg ml

-1

150 Agua de mar artificial (control)

1.500

B

cpm

1.000

500

0 0

50

100

150

tiempo (min)

zimosán+SOD

zimosán (control positivo)

Agua mar artificial (control negativo)

Figura VII.2. Respuesta de quimioluminiscencia frente al zimosán. A. Efecto de diferentes cocnentracions de zimosán. B. Inhibición de la quimioluminiscencia por SOD. En ambos casos los resultados se expresan como media de CL de dos muestras de hemolinfa (5 mejillones por muestra) con desviaciones estándar.

VII. Inmunología del mejillón

131

Índice de estimulación (IE)

1,25

1

0,75

0,5

0,25

0 1E + 03

1E + 04

1E + 05

1E + 06

1E + 07

Concentración de Perkinsus atlanticus (cell ml-1) Figura VII.3. Respuesta de quimioluminiscencia frente a diferentes concentraciones de Perkinsus atlanticus. Los resultados se expresan como media de CL de dos muestras de hemolinfa (5 mejillones por muestra) con desviaciones estándar.

1.500

cpm

750

500

250

0 25

75 50 tiempo (min)

Agua mar artificial (control negativo)

zimosán+SOD

0

100

125

zimosán (control positivo)

Figura VII.4. Efecto inhibitorio de los productos extracelulares (ECP) de Perkinsus atlanticus en la respuesta de quimioluminiscencia de hemocitos de mejillón. Los resultados se expresan como media de CL de dos muestras de hemolinfa (3 mejillones por muestra) con desviaciones estándar.

132

Beatriz Novoa et al.

15 Control -1 PMA (100 µg ml ) -1 PMA (50 µg ml )

Nitrito (µM)

10

5

0 30 min

2h Tiempo de incubación

Figura VII.5. Producción de NO y efecto de L-NMMA (1mM) por hemocitos de mejillón a dos concentraciones de PMA después de 2 h de incubación a 20°C. Los datos se presentan como concentración media de nitrito (mM) de tres grupos de hemocitos distintos. * Concentración de NO significativamente más elevada que los controles no estimulados P < 0,05.

14

14

30 min *

Nitrito (µM)

12

2h

*

12

*

*

10

10

8

8

6

6

4

4

2

2 0

0 Control 0,05

0,1

0,25

0,5 -1 Concentración GTN (mg ml )

Control 0,05

0,1

0,25

0,5 -1 Concentración GTN (mg ml )

Figura VII.6. Acumulación de NO en hemocitos tratados con distintas dosis de GTN después de 30 min o 2 h. Los resultados se muestran como concentración media de NO (mM) (N=2) * Concentración de NO significativamente más elevada que los controles no tratados con GTN P < 0,05.

VII. Inmunología del mejillón

133

100

100

*

* Nitrito (µM)

* 75

*

75

* 50

50

25

25

0

*

0 Control 1.000 500

250

Control 1.000 500

100

Dosis SNAP (µM)

250

100

Dosis SNAP (µM)

Figura VII.7. Acumulación de NO en hemocitos tratados con distintas dosis de SNAP después de 30 min o 2 h. Los resultados se muestran como medias de concentraciones de NO (mM) (N=2). * Concentración de NO significativamente más elevada que los controles no tratados con SNAP P < 0,05.

Log10 hemocitos viables

6

Pool 1 Pool 2

6

5,5

5,5

5

5

4,5

Pool 1 Pool 2

4,5 0,1 0,25 0,5 Control 0,05 Concentración GTN (mg ml-1)

0,25 0,5 Control 0,05 0,1 Concentración GTN (mg ml-1)

Figura VII.8. Viabilidad de hemocitos de mejillón tratados con distintas dosis de GTN determinada mediante el método de exclusión de azul de tripán después de 30 min (A) y 2 h (B). Los resultados se muestran como el número en Log10 de hemocitos viables en dos grupos distintos.

134

Beatriz Novoa et al.

Figura VII.9. Respuesta de quimioluminiscencia de hemocitos de mejillón frente a zimosán después de 2 h de incubación a 20°C con diferentes dosis de GTN (A) o SNAP (B). Los datos se muestran como la media de unidades luminiscencia relativas (RLU) para tres réplicas de distintos grupos de hemocitos. Se incluyen controles no estimulados en todos los casos, como controles de la estimulación de hemocitos con zimosán * Quimioluminiscencia significativamente más baja que los controles no tratados con los dadores de NO, p < 0,05.

ENFERMEDADES DEL MEJILLÓN

VIII.

ESTUDIOS EPIZOOTIOLÓGICOS JOSÉ ANTONIO F. ROBLEDO y ANTONIO FIGUERAS

VIII.1.

INTRODUCCIÓN

Los moluscos bivalvos marinos actúan como hospedadores de un amplio espectro de organismos patógenos. Durante las últimas tres décadas, paralelamente al crecimiento de la acuicultura de moluscos, la patología ha experimentado un gran desarrollo. Sin embargo, los primeros estudios de los patólogos se centraron en aquellos agentes que se asocian a mortalidades. Entre estos agentes patógenos se incluyen virus, bacterias, protozoos y metazoos, en ostras, almejas, mejillones, pectínidos y otros moluscos (Lauckner, 1983). Le Gall et al. (1988) señalan mortalidades de la vieira (Pecten maximus) en Francia y asocian estas mortalidades a infecciones en las branquias por organismos semejantes a riquetsias. Desde los años 80, el protozoo Bonamia ostreae se asocia con mortalidades de la ostra plana (Ostrea edulis) en Europa y Norteamérica (Elston et al., 1986, Grizel et al., 1988). Este protozoo que parasita las células sanguíneas es uno de los responsables de la práctica desaparición de la ostra plana en España (Figueras, 1991; Figueras y Montes 1988; Montes, 1993). Ruano y Cachola (1986) atribuyen a la presencia de Perkinsus atlanticus las mortalidades cercanas al 80% detectadas en la almeja fina (Ruditapes decussatus) de la Ría de Faro en Portugal. Otra especie, Perkinsus marinus, desde su descripción en los años 50 es un importante agente patógeno para la ostra americana (Crassostrea virginica) en los Estados Unidos asociándose a mortalidades principalmente en verano, cuando la salinidad es más alta de lo normal (Andrews, 1988). En los años 50 también apareció Haplosporidium nelsoni, comúnmente conocido como «MSX», en la ostra americana, se extendió rápidamente destruyendo más del 90% de los bancos de ostras (Haskin y Andrews 1988; Ford, 1992). Recientemente, y también asociada a mortalidades en masa (más del 50%), la bacteria denominada Vibrio P1 fue identificada como el agente etiológico de la enfermedad del anillo marrón «anneau brun» de la al-

138

José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

meja japonesa (Tapes philippinarum) cultivada en Francia (Paillard y Maes, 1990). Este agente ya se ha identificado en almejas finas y japonesas cultivadas en España (Figueras et al., 1996; Novoa et al., 1998). Principales parásitos del mejillón La bibliografía registra muy pocas citas referidas a mortalidades del mejillón, la mayoría atribuidas al copépodo Mytilicola intestinalis. Las más importantes fueron las acaecidas en Holanda durante los años 40-50 (Korringa, 1951), la detectada en la Isla de Príncipe Eduardo en Canadá (Li y Clyburne, 1979) y la más reciente, la ocurrida en el mejillón cultivado de la Laguna de Venecia (Mundford, 1981) donde en algunos parques se llegaron a alcanzar tasas de mortalidad del 80%. McGladdery (1990) señala mortalidades estacionales en el mejillón cultivado en Canadá, pero hasta ahora, la causa de dichas mortalidades es desconocida y se cree que posiblemente sea algún tipo de desorden fisiológico, más que un agente patógeno. A pesar de su importancia económica, hay una falta de información sobre el estado de salud del mejillón comparado con otras especies de bivalvos cultivados, quizás como consecuencia de esta ausencia de mortalidades. Otro punto a considerar es que si la información disponible sobre el mejillón cultivado es baja, los datos sobre bancos naturales de mejillón aún son más escasos, a pesar de que constituyen la principal fuente de semilla para el cultivo (60%) y de que este cultivo se lleva a cabo en zonas próximas a estos bancos naturales (Cáceres-Martínez y Figueras, 1997). Marteilia refringens El phylum Paramyxea engloba un grupo importante de parásitos protozoos de invertebrados marinos. Actualmente, el Phylum Paramyxea está dividido en dos clases: Marteiliidea con tres géneros Marteilia (Grizel et al., 1974; Perkins, 1976) Paramarteilia (Ginsburger-Vogel y Desportes, 1979) y Marteilioides (Comps et al., 1986) y Paramixidea con un sólo género, Paramyxa (Chatton, 1991). Estos organismos, particularmente los de los géneros Marteilia y Marteilioides, han sido ampliamente estudiados debido a las mortalidades detectadas asociadas a su presencia en varias especies de bivalvos de explotación comercial. Entre ellos, cabe destacar Marteilia refringens (Grizel et al., 1974; Perkins, 1976) la cual, desde su descubrimiento en 1968, ha causado y sigue causando importantes mortalidades en Ostrea edulis en Europa, y Marteilia sydneyi (Perkins y Wolf, 1976) responsable de la enfermedad conocida como QX y causante de altas mortalidades de la ostra Saccostrea commercialis en Australia. En 1982, Comps et al. describen una nueva especie del género Marteilia (M. maurini) considerándola como la única especie de Marteilia capaz de parasitar mejillones. La diagnosis de las dos especies encontradas en Europa se realizó mediante estudios estructurales y especificidad de hospedador (Grizel, 1974; Comps et al., 1982; Figueras y

VIII. Estudios epizootiológicos

139

Montes, 1988). Desde que se observó Marteilia refringens, inicialmente considerada como parásito exclusivo de Ostrea edulis en Mytilus galloprovincialis (Figueras y Robledo, 1993) se rechazó la especificidad de hospedador como carácter taxonómico. La falta de rasgos claros que permitan distinguir ambas especies sugieren que Marteilia maurini, no es realmente una especie diferente de Marteilia refringens. Un estudio reciente ha cambiado el criterio utilizado por Perkins y Wolf (1976); Comps et al. (1982) y Auffret y Poder (1985) para la identificación de las especies de Marteilia. Longshaw et al. (1997) concluyen que Marteilia maurini, presente en Mytilus edulis y M. galloprovincialis, no puede ser separada de Marteilia refringens detectada en Ostrea edulis usando los criterios ultrastructurales tradicionalmente empleados hasta ahora. Los efectos producidos por los organismos del phylum Paramyxea son diversos. Probablemente, la existencia de una resistencia innata al parásito o factores medioambientales juegan un papel importante en la patogenicidad de estos protozoos. La mayor parte de los parásitos del género Marteilia infectan la glándula digestiva. Dado el gran número de especies y hospedadores de los miembros del género Marteilia sus efectos son diversos, encontrándose en la mayoría de los casos en el hepatopáncreas del hospedador. Marteilia sp. produce distintos efectos dependiendo de su hospedador. En la almeja gigante Tridacna maxima, produce quistes dentro del riñón (Norton et al., 1993). La infección de Marteilia sp. en la viera, Agaropecten gibbus provoca mortalidades de casi un 100% a partir de 4 semanas desde la aparición de la primera infección (Moyer et al., 1993). La especie Marteilia sydneyi provoca también mortalidades masivas en su hospedador, Saccostrea commercialis. Este parásito, responsable de la enfermedad conocida como QX, ha sido la causante de pérdidas de hasta el 80% de la ostra S. commercialis en Queensland, Australia (Wolf, 1979). La muerte es atribuible a una invasión total de la glándula digestiva por el patógeno, lo cual causa la muerte por extenuación. Los efectos originados por Marteilia refringens en la ostra plana (Ostrea edulis), así como en las especies de mejillón, Mytilus edulis y M. galloprovincialis, han sido objeto de estudio por muchos autores. La severidad de la infección viene determinada por lo avanzado del estado de desarrollo del parásito. La presencia de las formas plasmodiales jóvenes en la pared del estómago de M. galloprovincialis fue asociada con la destrucción del tejido, así como una masiva secreción de mucus e infiltración hemocitaria en la glándula digestiva (Figueras et al., 1991a). Nosotros hemos detectado la presencia de formas plasmodiales de un organismo similar a Marteilia en las branquias de mejillón asociado a una fuerte infiltración hemocitaria en la zona. Si realmente las formas plasmodiales no provocan reacción en el hospedador, esto explicaría la ausencia de reacción provocada por Marteilia refringens en Crassostrea gigas, observándose sólo ocasionalmente una ligera infiltración (Cahour, 1978; Montes, 1994).

140

José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

Con el desarrollo de la infección, pueden observarse cantidades variables de infiltraciones hemocíticas (Alderman, 1979). Se ha observado la aparición de una reacción hemocitaria en los túbulos digestivos primarios y secundarios (Robledo y Figueras, 1995a), en el tejido conectivo de la glándula digestiva, así como en el epitelio estomacal y divertículos digestivos (Villalba et al., 1993a). Este mismo autor destaca la formación en Mytilus galloprovincialis de granulocitomas (concentraciones masivas de hemocitos) que producen la destrucción tanto de los parásitos como de los tejidos incluidos en estas zonas. No existe, sin embargo, evidencia de que estén asociados necesariamente con la presencia de Marteilia, ya que también han sido descritos en mejillones sanos (Figueras et al., 1991). Auffret y Poder (1985) no encontraron respuesta hemocítica por la infección de Marteilia maurini en M. edulis, aunque observan tejidos necrosados asociados con la presencia de formas maduras del parásito. La presencia de Marteilia en las células de la glándula digestiva, interfiere directamente con la alimentación del hospedador (Robledo et al., 1995a). La infección por el parásito provoca una mayor demanda energética lo que conduce a una reorganización de reservas y a la pérdida de células adipogranulares (Villalba et al., 1993a). Por otra parte, la gametogénesis y el desarrollo gonadal están retrasados en los mejillones (M. galloprovincialis) infectados (Figueras et al., 1991a, Villalba et al., 1993a) y ostras (O. edulis) infectadas (Robert et al., 1991), siendo incapaces de iniciar nuevos ciclos gametogénicos en el año siguiente (Villalba et al., 1993a). En O. edulis infectadas por M. refringens se ha observado que mantienen sus conchas cerradas durante períodos anormales de tiempo, conduciendo en los estados terminales a la incapacidad de cerrar las conchas (His et al., 1976). En Mytilus galloprovincialis y Ostrea edulis la liberación de esporas al lumen de los túbulos digestivos produce la destrucción del tejido adyacente (Alderman, 1979; Robledo y Figueras, 1995). La combinación de todos estos efectos puede ocasionar la muerte del hospedador (Villalba et al., 1993). VIII.2.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreos Los estudios epidemiológicos abarcan diferentes muestreos de una duración aproximada de dos años cada uno. En total se cubre un período de seis años (finales de 1987-principios de 1993), cuatro localidades en polígonos de bateas (Cabo Home, Liméns, Meira, Domayo y San Adrián), dos localidades en bancos naturales (Cabo Home y San Adrián), dos profundidades (1-2 m y 4-5 m) y dos orígenes de mejillón (Liméns y Meira) (Fig. III.2). El estudio epidemiológico se complementa con un seguimiento de mortalidad para las zonas de Liméns, Meira y Domayo, desarrollado durante los años 1992, 1993 y parte de 1994. Para las experiencias se utilizaron cestas de las denominadas «ostrícolas», que permitían saber en todo momento el origen de los mejillones desde el inicio de la

VIII. Estudios epizootiológicos

141

experiencia y salvaguardarlos de posibles predadores (cangrejos, estrellas de mar, etc.). Las ristras de cestas se situaban en la zona central de la batea. Periódicamente, a la vez que se realizaban los muestreos, se limpiaban las cestas de erizos de mar, pequeños cangrejos, estrellas de mar, esponjas, mejillones de nueva fijación, balanos y cualquier otro organismo que limitase el paso de agua a través de la cesta o constituyese una amenaza para los mejillones. Muestreos a)

b)

c)

En noviembre de 1987, el mejillón (Mytilus galloprovincialis) de la puesta de primavera se situó en dos localidades: Liméns y Meira y a dos profundidades en cada localidad: 1-2 y 4-5 m. Este muestreo tenía por objeto comprobar si había diferencias en la carga parasitaria del mejillón en función de la zona de la Ría donde se cultivase y en función de la profundidad a la que se colocasen los mejillones. Para cada muestreo se utilizaron 880 mejillones repartidos en dos grupos de 11 cestas y a razón de 40 mejillones por cesta. Las ristras de cestas se colocaron en la zona central de las bateas. El muestreo comenzó el mes de diciembre de 1987 y se desarrolló el primer año (1988) con una frecuencia mensual y el segundo año (1989) y principios del tercero (1990) con una frecuencia bimensual. Cada vez que se levantaban las cestas de las bateas se retiraban 30 individuos. Con este muestreo se pretendía verificar si los mejillones cultivados en una tercera zona (Domayo) situada en la parte más interna de la Ría, albergaban una mayor cantidad de parásitos. La semilla de mejillón, con dos meses de edad (longitud total media 7,5 mm, SD = 4,0) fue recogida de roca de Cabo Home y procedía de la puesta de otoño. En enero de 1988 se colocaron en bolsas de malla en Liméns, Meira y Domayo. En Liméns y Meira los mejillones se situaron en los mismos polígonos que en la experiencia anterior, y en Domayo se situaron en bateas del polígono A dentro del distrito III. Meses antes de iniciarse el muestreo, se repartieron 520 mejillones en 13 cestas a razón de 40 mejillones por cesta y se colocaron en la zona central de la batea a 4 m de profundidad (45,3 mm longitud total media, SD = 7,9). El muestreo de 30 ejemplares por mes fue bimensual entre enero de 1989 y diciembre de 1990. Se diseñó una tercera experiencia para verificar si el origen del mejillón podía ser un factor determinante en la carga parasitaria de los mejillones. Con tal fin se colocaron mejillones de Liméns (45,0 mm longitud total media, SD = 5,0) en Liméns y Meira; y mejillones nativos de Meira (42,9 mm longitud total media, SD = 5,0) también en Meira y Liméns. En ambos casos se utilizó semilla de la puesta de primavera recogida de colectores en batea. El mejillón se colocó en las cestas de experimentación en el mes de febrero de 1990 a 4 m de profundidad. En cada punto de muestreo se partió de 540 mejillones repartidos en 12 cestas a razón de 45 individuos por cesta. Bimensualmente se recogieron muestras de 30 ejemplares desde abril de 1990 hasta octubre de 1991.

142

d)

e)

f)

José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

Entre noviembre de 1991 y febrero de 1993, se muestrearon 30 mejillones adultos por mes de los bancos naturales de Cabo Home y San Adrián (longitud total media 51,34 mm, SD = 0,73). Simultáneamente se recogieron muestras de mejillones adultos de flotadores de bateas de Liméns (longitud total media 62,37 mm, SD = 1,04) y San Adrián. Las muestras se situaron en bateas del polígono G Liméns (longitud total media 59,80 mm, SD = 0,94). En ambos casos las bateas estaban situadas en las proximidades de los bancos naturales. Se realizó un control de la semilla utilizada para encordar para comprobar la carga parasitaria en el momento de ser recogida para encordar. En octubre de 1992 se recogió la semilla fijada a cuerdas y cestas de Meira (longitud total media 22,27 mm, SD = 3,21) y Liméns (longitud total media 19,78 mm, SD = 1,90). En el caso de Domayo no fue posible realizar este muestreo debido a la casi ausencia de fijación. El número de individuos muestreados fue de 30. Además de los muestreos en los que se estudiaba la influencia de la localidad y profundidad, influencia de la localidad, influencia del origen de mejillón y control de semilla, se realizó un muestreo para controlar la extensión de la parasitosis en Galicia. En marzo de 1993 se recogieron muestras de mejillones tanto de zona de bateas como de bancos naturales de las Rías de Arousa, Pontevedra y Vigo. Los mejillones procedentes de las bateas estaban permanentemente sumergidos en el agua mientras que los procedentes de bancos naturales estaban sujetos a los ciclos de marea.

Histología Las muestras de mejillones se limpiaban, se pesaban y medían y, una vez abiertos, se pesaba la carne y la concha por separado. El índice de condición se calculó mediante la fórmula de Aguirre (1979): (Peso de la carne/Peso total – Peso de la concha) ´ 100. La carne de los mejillones se fijó con líquido de Davidson (Shaw y Battle, 1957) durante 24 h. De cada especimen se tomaron porciones transversales oblicuas de aproximadamente 5 mm de ancho de tal forma que quedasen incluidos manto, gónada, glándula digestiva, branquias, riñón y pie (Fig. VIII.1). Estas muestras de tejido se incluyeron en parafina, y posteriormente se realizaron cortes de 5 mm de espesor (Reichert-Jung 2040) que se tiñeron con haematoxilina de hierro, fucsina ácida y azul de anilina (Gray, 1954). Para la tinción específica de riquetsias se utilizó el método de Macchiavello (Culling, 1974). La observación de las preparaciones se realizó en un microscopio Nikon Optiphot a 400 X-1000 X aumentos. Análisis estadísticos Para la comparación entre medias se utilizó un test de Kruskal-Wallis seguido por un ANOVA con una comparación de medias de Tukey (Zar, 1984). Se utilizó un test de independencia de G con tablas de contingencia para estudiar la relación

VIII. Estudios epizootiológicos

143

entre la presencia de parásitos con la localidad, profundidad y el origen geográfico de los mejillones. El coeficiente de similaritud S3 para datos binarios tomados como 0 (ausencia) o 1 (presencia). Estos coeficientes permiten estudiar la asociación entre datos binarios y muestra la proporción de pares en los cuales al menos uno de los dos ocurre (Coger, 1985). Posteriormente se estudió la relación entre la presencia de parásitos mediante una correlación dicotómica. Para los análisis estadísticos se utilizó la hoja de cálculo Microsoft Excel 3.0 y Systat 5.1a ambos para Macintosh (Apple).

VIII.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En Galicia, después de décadas de cultivo, no se han detectado mortalidades de importancia (Figueras et al. 1991; Robledo et al. 1992), sobre todo si lo comparamos con las ocurridas con la ostra plana (Ostrea edulis) y debidas al protozoo Bonamia ostreae (Figueras, 1991a; Montes, 1991, Montes et al., 1991). A pesar de la ausencia de mortalidades en masa en el mejillón cultivado en Galicia (Figueras et al., 1991), en los últimos años se ha detectado una tendencia hacia la disminución de la producción y del rendimiento en carne (Figueras, 1989) siendo asociada con la presencia de parásitos (Figueras et al., 1991). VIII.3.1.

Organismos de tipo clamidial

Los moluscos bivalvos son organismos filtradores que concentran microorganismos del medio en que habitan (Minet et al., 1987) motivo por el que han sido objeto de estudios para determinar si concentraban microorganismos patógenos humanos (Harshbarger et al., 1977). Las riquetsias y las clamidias son parásitos intracelulares obligados que causan importantes enfermedades en el hombre. Las clamidias presentan varios estados de desarrollo que sólo se pueden distinguir claramente utilizando el microscopio electrónico. Riquetsias y clamidias han sido descritas en un amplio número de moluscos y en algunos casos asociadas con mortalidades (Lauckner, 1983). La prevalencia de estos organismos en los túbulos digestivos del mejillón fue variable dependiendo de la zona y época de muestreo (Fig. VIII.2). Los mejillones de Meira presentaron mayores prevalencias medias anuales que los de Liméns (21,17 y 9,22% respectivamente). Los resultados del test de independencia de G mostraron que su presencia fue dependiente de la localidad e independiente de la profundidad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 1.072, G = 0,499 NS; Liméns de 2 and 5 m, n = 961, G = 3.987 NS; Meira y Liméns de 2 m, n = 975, G = 19.982***; Meira y Liméns de 5 m, n = 953, G = 2.874 NS). Sin embargo, el test de Kruskal-Wallis mostró que no había diferencias entre localidades (p = 0,297, n = 71). Los meses con mayores prevalencias fueron septiembre de 1988 para los mejillones de Liméns y entre septiembre de 1988 y julio de 1989 para los mejillones de Meira. En el segundo año de estudio, las prevalencias me-

144

José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

dias anuales fueron mayores en las muestras de Meira de 2 m y Meira de 5 m e inferiores en las muestras Liméns de 2 m y Liméns de 5 m (Tabla VIII.1). TABLA VIII.1 Prevalencias medias anuales de los parásitos en Mytilus galloprovincialis de la Ría de Vigo en cada uno de los puntos muestreados Muestras Parásito Organismos tipo clamidia S. mytilovum Ciliados glándula digestiva Ciliados branquias M. intestinalis

Año 1988 1989 1988 1989 1988 1989 1988 1989 1988 1989

Meira 2 m

Meira 5 m

Liméns 2 m

Liméns 5 m

15,81 27,16 19,47 16,18 9,20 13,82 68,14 90,41 51,75 39,94

16,38 25,33 17,11 9,52 7,78 16,00 54,23 75,33 47,36 47,33

11,15 3,02 17,87 7,99 9,21 14,50 72,07 74,96 30,50 25,11

15,89 6,82 5,98 3,33 10,75 18,17 53,92 66,79 26,82 30,58

Se encontraron pequeños cuerpos de inclusión de forma esférica o alargada dentro de las células del epitelio branquial del mejillón con un diámetro medio de 14,4 mm (SD = 3,7, n = 30). No se detectó ninguna respuesta evidente en asociación con las infecciones. Los resultados con el método de Macchiavello para la identificación de riquetsias fueron negativos. Se ha asociado la presencia de cuerpos de inclusión en las células epiteliales de la glándula digestiva de mejillones de Galicia con riquetsias (Fernández et al., 1990; Villalba et al., 1990; Figueras et al., 1991). Sin embargo, ninguno de los autores llevó a cabo estudios de microscopía electrónica que permitiesen su verdadera identificación. Cajaraville y Angulo (1991) identifican los cuerpos de inclusión en las células del epitelio digestivo de M. galloprovincialis de las costas vascas como perteneciente al grupo de las clamidias y los denominan «Chlamydias-like organisms». Estos autores señalan una prevalencia de 5,31% en marzo de 1988; esta prevalencia fue más baja que la señalada en este estudio para la misma época del año. El diámetro de los cuerpos de inclusión (9 mm) fue ligeramente menor que el obtenido para mejillones de la costa gallega (10,16 mm). Mourelle (1993) describe cuerpos de inclusión en el epitelio de los túbulos digestivos y lo asocia a organismos de tipo riquetsia. Aunque ligeramente mayores a las encontradas en nuestro estudio, la descripción, localización y dimensiones parecen indicar que se trata del mismo tipo de organismo. Aunque aparentemente estos microorganismos no desencadenan respuesta por parte del hospedador, las infecciones masivas pueden llegar a tener efectos mortales sobre el hospedador, principalmente en las fases larvarias (Morrison y Shum, 1982, 1983; Leibovitz, 1989). Estos autores señalan que las altas prevalen-

VIII. Estudios epizootiológicos

145

cias de la enfermedad en adultos sugieren que éstos actuarían como portadores y cuando se utilizan como progenitores en las puestas pueden llegar a producir pérdidas en las «hatcheries» y sospechan que la transmisión se produciría vía aparato digestivo. En larvas, quizás debido a la falta de un sistema inmune completo, se produce la extensión en masa del agente infeccioso, resultando en una total destrucción del epitelio del tracto digestivo. Las prevalencias obtenidas en nuestro estudio cabe considerarlas entre medias y altas y son superiores al organismo de tipo riquetsia descrito por Mourelle (1993). A pesar de ello no se detectaron daños de importancia, lo que parece corroborar la hipótesis de Leibovitz (1989) de que no llegan a producir mortalidades en adultos e incluso podría ser una infección endémica al encontrarse en todos los meses del año. Con una prevalencia muy baja también encontramos inclusiones en el epitelio de las branquias. Como en el caso anterior, la falta de estudios al microscopio electrónico no nos permite conocer con exactitud el grupo al que pertenece este organismos, aunque al ser la tinción negativa con el método de Macchiavello (Culling, 1974), lo denominaremos organismo de tipo clamidial. Mourelle (1993) también describe cuerpos de inclusión en el epitelio de las branquias y también lo asocia a organismos de tipo riquetsia. Especial atención se debería prestar a este microorganismo ya que organismos de este tipo en las branquias han sido asociados con mortalidades en masa de adultos de vieira (Pecten maximus) en Francia (Le Gall et al., 1988). III.3.2.

Protozoos

VIII.3.2.1. Marteilia refringens La prevalencia de Marteilia refringens varió dependiendo del año, del lugar y profundidad a la que el mejillón fue cultivado. Los mejillones de Meira presentaron mayor prevalencia de M. refringens que aquellos de Liméns (17,43 y 4,21%, respectivamente) y los mejillones de la muestra de 2 m de profundidad que aquellos de la muestra de 5 m (13,35 y 8,29%, respectivamente). Tanto en Liméns como en Meira, las prevalencias medias anuales de M. refringens fueron mayores en el segundo año en los mejillones de la muestra de 2 m de profundidad y menor en los mejillones de la muestra de 5 m de profundidad (Tabla VIII.2). Los resultados del test de independencia de G mostraron que la presencia de M. refringens fue influenciada por la localidad y la profundidad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 1.101, G = 11,05***; Liméns de 2 y 5 m, n = 966, G = 6,68**; Meira y Liméns de 2 m, n = 980, G = 44,80***; Meira y Liméns de 5 m, n = 952, G = 45,59***). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias en la prevalencia de M. refringens (n = 71, df = 3, G < 0,05) y las comparaciones post-hoc entre medias por el procedimiento de Tukey mostró que las diferencias fueron entre localidades y no entre profundidades (Meira de 2 y 5 m, G = 0,158 NS; Liméns de 2 y 5 m, G = 0,572 NS; Meira y Liméns de 2 m, G < 0,05*; Meira y Liméns de 5 m, G = < 0,05*).

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

TABLA VIII.2 Prevalencias medias anuales de Marteilia refringens en Mytilus galloprovincialis en los experimentos de: influencia de la localidad y profundidad, localidad, y origen de los mejillones (M2: Meira-2 m de profundidad, M5: Meira 5-m de profundidad, LS: Liméns-2 m de profundidad, L5: Liméns-5 m de profundidad; L: Liméns, M: Meira, D: Domayo; origen del mejillón*, lugar donde fueron cultivados**) Localidad y profundidad

Localidad

Origen de los mejillones

Año M2

M5

L2

L5

L

M

D

L*L**

M*L** M*M** L*M**

1988 1989 1990 1991

13,35 15,04 4,59 27,71 13,62 7,75 – – – – – –

2,79 1,74 – –

– – – 4,61 31,57 42,50 6,39 26,42 34,53 – – –

– – 3,40 4,34

– – 3,99 6,78

– – 5,48 12,50

– – 6,00 10,29

TOTAL

20,53 14,33 6,17

2,26

5,50 28,99 38,51

3,87

5,38

8,99

8,14

Los mejillones de Meira a 2 m de profundidad presentaron en marzo de 1990 las mayores prevalencias de Marteilia refringens (53,85%); la prevalencia en estos mejillones presentó una estacionalidad con máximos en el período primavera-verano. Los mejillones cultivados en Meira a 5 m de profundidad presentaron dos picos en la prevalencia de M. refringens, en julio 1988 (27%) y en julio 1989 (23%). En estas muestras las mayores prevalencias fueron en otoño. Durante todo el experimento la prevalencia de Marteilia refringens en Liméns fue más baja que en Meira. Los máximos valores fueron detectados en agosto de 1988 (17%) a 2 m de profundidad. Durante toda la experiencia, la prevalencia a 5 m de profundidad fue muy baja (máximos de 10%). En algunos meses M. refringens no se detectó en absoluto. En Meira la prevalencia de Marteilia refringens estuvo entre los valores de Liméns y Domayo aunque más próximos a los de Domayo. Las prevalencias medias de M. refringens en Liméns, Meira y Domayo durante los dos años de estudio fueron 5,50, 28,99 y 38,51% respectivamente. Estas prevalencias medias anuales fueron inferiores en el segundo año de estudio en Meira y Domayo (Tabla VIII.2). Los resultados del test de independencia de G mostraron que la presencia de M. refringens fue influenciada por la localidad (df = 1 en cada caso, Liméns y Meira, n = 664, G = 68,18***; Liméns y Domayo, n = 618, G = 112,06***; Meira y Domayo, n = 580, G = 13.231,10***). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias en la prevalencia del parásito y la comparación entre medias por el procedimiento de Tukey mostró que las diferencias fueron entre Liméns y Domayo, entre Liméns y Meira pero no entre Meira y Domayo (n = 35, df = 2, P < 0,05). Los mejillones de Domayo presentaron durante el muestreo tres picos en la prevalencia de Marteilia: mayo de 1989 (73%), febrero de 1990 (44%) y agosto de 1990 (39%). Estas muestras presentaron un patrón estacional, principalmente durante el primer año: desde el invierno hasta finales de primavera hubo un incremento en la prevalencia para a continuación descender hasta alcanzar los valores

VIII. Estudios epizootiológicos

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mínimos en noviembre. En Meira, la prevalencia de M. refringens presentó dos picos: enero de 1989 (43%) y abril de 1990 (41%). Independientemente del origen geográfico, los mejillones cultivados en Meira presentaron siempre mayores prevalencias de Marteilia refringens que los mejillones cultivados en Liméns (Tabla VIII.2). En este experimento las mayores prevalencias de Marteilia fueron en abril de 1991 y octubre de 1991. En Liméns la prevalencia del parásito no excedió valores del 11%. Los resultados del test de independencia de G mostraron que la prevalencia de M. refringens fue independiente del origen de los mejillones y dependiente de la localidad (df = 1 en cada caso, Meira en Meira y Liméns en Meira, n = 533, G = 0,02 NS; Liméns en Liméns y Meira en Liméns, n = 476, G = 0,002 NS; Meira en Meira y Meira en Liméns, n = 475, G = 4,09*; Liméns en Liméns y Liméns en Meira, n = 534, G = 5,60*). Sin embargo, con el test de Kruskal-Wallis no encontramos diferencias entre las muestras (n = 34, df = 3, P = 0,114 NS). En los mejillones procedentes de bancos naturales las fases del parásito identificadas correspondieron a las formas plasmodiales en el epitelio del estómago y de los túbulos digestivos primarios y secundarios y a los preesporangios y esporangios en el epitelio de los túbulos digestivos secundarios. La prevalencia de Marteilia refringens varió dependiendo de lugar de muestreo (Tabla VIII.3). El protozoo estuvo prácticamente presente en todas las muestras de San Adrián, tanto las procedentes de bateas como las procedentes del banco natural. El resultado del tets G de independencia señaló que en el interior de la Ría la presencia de M. refringens no fue influida por el lugar de muestreo (banco natural o batea) (df = 1, n = 313, G = 0,00 NS). En los mejillones procedentes de Liméns y Cabo Home no se detectó el parásito. El parásito estuvo presente en las células epiteliales del estómago (plasmodio) así como en las células epiteliales de los túbulos digestivos primarios y secundarios (plasmodio y esporangio). Cuando estaba en las células epiteliales del estóTABLA VIII.3 Prevalencia de Marteilia en mejillones de la Ría de Vigo Date Nov. 1991 Dic. 1991 Ene. 1992 Feb. 1992 Mar. 1992 Abr. 1992 Oct. 1992 Nov. 1992 Dic. 1992 Ene. 1993

San Adrián (B)

S. Adrián (BN)

Liméns (B)

Cabo Home (BN)

– 6,67 13,33 11,54 – – – 14,81 4,17 –

26,67 0,00 13,33 17,86 16,67 20,00 13,79 17,24 3,33 10,34

– 0,00 0,00 0,00 – – 0,00 – 0,00 –

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 –

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

mago se localizaba en la zona apical. El eje mayor del plasmodio medía 9,9 mm y la célula primaria dentro del plasmodio 4,1 mm en el eje mayor. Las formas plasmodiales también se localizaron en túbulos digestivos primarios y secundarios; donde el parásito fue ligeramente menor (8,4 mm). A medida que la esporulación progresa, el esporangiosoro se agranda hasta alcanzar 19,6 mm en el eje mayor este esporangiosoro contiene primordios de esporangios. Finalmente, el esporangiosoro contiene esporangios maduros (7,3 mm de longitud) con cuatro esporas cada, la longitud de la espora fue de 2,6 mm. Esta forma del parásito es eliminada al exterior vía estómago e intestino. La infección con Marteilia no siempre estuvo acompañada por la infiltración de hemocitos en la glándula digestiva (Fig. VIII.3). La presencia de plasmodios en las células epiteliales del estómago y de los túbulos digestivos primarios y secundarios no produce la destrucción de las células que los lleva. Los túbulos digestivos de mejillones fuertemente infectados con Marteilia refringens presentaron la casi total destrucción de la arquitectura. Cuando los esporangiosoros y los esporangia se liberan las células digestivas y piramidales también pueden ser descargadas en el lumen de los túbulos digestivos. En la Figura VIII.4 está recogido el desarrollo de Marteilia refringens en el mejillón. Un caso simple de una fase plasmodial de protozoo tipo Marteilia en las branquias estuvo asociado con una fuerte infiltración hemocitaria en el área de las branquias próxima a estas formas plasmodiales. Las cuatro formas plasmodiales variaron entre 11 y 15 mm en el eje mayor contiendo una formas que recordaban a un primordio esporangial. El parásito parece estar localizado en el interior de las células branquiales. La Figura VIII.5 muestra los resultados del estudio del desarrollo de la infección con Marteilia refringens en Mytilus galloprovincialis. Los plasmodios en el estómago fueron la fase más frecuente a lo largo del estudio, siendo en algunos meses la única forma presente en el mejillón. En el experimento de la influencia de la localidad y la profundidad, en ambas muestras de Meira, la liberación de esporagios ocurrió principalmente en el período primavera-verano. Durante el segundo año los esporangios fueron menos frecuentes. No se detecto un patrón en la presencia de formas intermediarias entre los plasmodios y los esporangios maduros. En Meira, la localidad en la cual la prevalencia de Marteilia fue mayor, la liberación de esporangios ocurrió desde mediados de primavera a mediados de verano. De nuevo, en el experimento de la influencia de la localidad, el plasmodio en el estómago fue el estado más representado. En Domayo y Meira, las localidades con mayor prevalencia de Marteilia refringens, la liberación de esporangios ocurrió desde enero a septiembre (Fig. VIII.6). Las muestras de Liméns en el experimento de influencia de la localidad y todas las muestras en el experimento de la influencia del origen de los mejillones debido a las bajas prevalencias detectadas, no pudieron ser utilizadas para el estudio del desarrollo de la infección. El protozoo Marteilia refringens fue detectado en todas las localidades estudiadas durante los cuatro años en que se desarrollaron las experiencias. Por lo

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tanto el parásito está presente en Mytilus galloprovincialis cultivado en la Ría de Vigo al menos desde 1987. La prevalencia de este parásito cambió con el año y la localidad. Es importante señalar las diferencias en la prevalencia media de Marteilia de Meira durante un año de exposición al parásito (14,19, 31,57 y 5,74); esto se podría explicar en base a un cambio en la susceptibilidad del mejillón o debido a un cambio en la cantidad de estados infectivos presentes en el ambiente o quizás debido a la presencia de un hospedador intermediario que pudiera experimentar cambios que pudieran influir en al prevalencia de Marteilia. No se encontraron evidencias que permitan eliminar ninguna de las hipótesis arriba mencionadas. Figueras et al. (1991) sugieren la existencia de un gradiente en la prevalencia de Marteilia desde el interior al exterior de la Ría. En la Ría de Arosa los mejillones de la zona interna presentaron mayor prevalencia que aquellos localizados en la zona externa (Villalba et al., 1993). Nosotros también hemos encontrado que los mejillones cultivados en la zona interna de la Ría de Vigo (Domayo) estuvieron más parasitados que aquellos localizados en la zona media (Meira) y externa (Liméns). Estos resultados confirman un gradiente estuario-oceánico en la prevalencia de la marteiliasis. Si la infección depende de la probabilidad de encuentro entre el parásito y el hospedador, una de las posibles razones podría ser la mayor densidad de bateas en el interior de la Ría que decrece hacia el exterior de la Ría. Los resultados en bancos naturales de mejillón también confirman este gradiente en la Ría de Vigo. Nosotros también describimos un gradiente en profundidad con referencia a Marteilia mayor a 2 m de profundidad que a 5 m de profundidad en ambas localidades muestreadas. Un fototactismo positivo de los estados infectivos primarios podría explicar estas diferencias. No encontramos diferencias entre los mejillones muestreados en los campos naturales sometidos al régimen de mareas y los obtenidos de los flotadores de las bateas que están permanentemente sumergidos en el mar. Estos resultados sugieren que este factor no tiene influencia en la prevalencia del parásito. El origen geográfico de los mejillones no tuvo ninguna influencia en la prevalencia de la infección de Marteilia mientras que la localidad donde los mejillones fueron cultivados si tuvo influencia en la prevalencia. Villalba et al. (1993) no encontraron un patrón temporal claro en la infección de mejillones cultivados en la Ría de Vigo durante 1988 y 1989. Grizel y Tige (1973, 1979) a partir de experimentos de transplante señalan que las infecciones son adquiridas entre mayo y agosto y es durante este período cuando se producen las mortalidades máximas de las ostras. Nuestros resultados muestran una tendencia estacional con un máximo de prevalencia en el período de primavera-verano. Nosotros también encontramos este patrón en mejillones cultivadas en otras áreas de la Ría de Vigo. La circulación de agua es mayor en invierno (Prego y Fraga, 1992) cuando la prevalencia de Marteilia es más baja. Además, el incremento de la prevalencia en el período de primavera-verano es coincidente con la disminución de la circulación de agua en la Ría (Prego y Fraga, 1992).

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VIII.3.2.2. Steinhausia mytilovum Es un protozoo perteneciente al phylum Microspora que fue descrito por Field (1921) en los oocitos del mejillón Mytilus edulis denominándolo Haplosporidium mytilovum. Sprage (1965) lo transfiere al grupo de los Chytridiopsis y finalmente Sprage et al. (1972) crean la familia Chytridiopsidae con el género Steinhausia y adquiere su actual nombre de S. mytilovum. Este protozoo ya ha sido descrito en mejillones de Galicia (Fernández et al., 1990; Villalba et al., 1990; Figueras et al., 1991b; Mourelle, 1993) y recientemente Steinhausia sp. en las almejas de Galicia (Villalba et al., 1993; Robledo datos no publicados). En mejillones de la Ría de Vigo, los quistes se encontraron principalmente en el citoplasma de los oocitos, pero también en el núcleo. En ocasiones pueden encontrarse dos quistes por oocito (Fig. VIII.7) De forma esférica, presentaron un diámetro de 9-18 mm (diámetro medio 13,12 mm, SD = 1,87, n = 49), contienen esporas esféricas de entre 1-2 mm de diámetro (media 1,79 mm, SD = 0,45, n = 49). El número de esporas por quiste fue bastante variable, entre 10 y 41 (media 19, SD = 6,29, n = 49). De forma general, no se detectó ninguna respuesta evidente en asociación con las infecciones. Sin embargo, en hembras en post-puesta junto con los oocitos infectados que restaban en los folículos se detectó un gran número de células sanguíneas. La prevalencia de Steinhausia mytilovum fue variable dependiendo de la zona y mes de muestreo. Las mayores prevalencias se alcanzaron en 1988 en mejillones procedentes de Liméns y entre septiembre de 1988 y julio de 1989 para los mejillones de Meira. Los valores de Meira fueron mayores que los de Liméns (15,57 y 8,79% respectivamente) y en ambos lugares los mejillones de la muestra de 2 m de profundidad estuvieron más parasitados que los situados a 5 m de profundidad. La prevalencia media anual se incrementó de 1988 a 1989 (Tabla VIII.1). Sin embargo, los resultados del test de independencia de G mostraron que la presencia de S. mytilovum no estuvo influida ni por la localidad ni por la profundidad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 485, G = 2.732 NS; Liméns de 2 y 5 m, n = 394, G = 0,923 NS; Meira y Liméns de 2 m, n = 416, G = 1.168 NS; Meira y Liméns de 5 m, n = 409, G = 3.588 NS). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias en la prevalencia de parásitos (p = 0,041, n = 71) y la comparación entre medias por el procedimiento de Tukey mostró que las diferencias entre las muestras de Meira de 5 m y Liméns de 5 m fueron significativas. Coincidimos con Sprage (1965) en que el número de huevos infectados es bastante pequeño debido a que para encontrar el parásito se necesita un largo período de búsqueda a través de la gónada. Mourelle (1993) describe prevalencias de S. mytilovum del 30 en Moaña en el verano de 1989, las prevalencias detectadas por nosotros para la misma zona y el mismo año fueron equivalentes e inferiores a las detectadas el año (45%), esto parece indicar variaciones anuales. Hemos observado que en hembras en post-puesta pueden quedar huevos parasitados indicando que su viabilidad puede haber sido alterada y en este caso sí encontramos infiltración, que sería consecuencia de la post-puesta más que una respuesta a la presen-

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cia del parásito. Aúnque la prevalencia de este parásito es alta en algunos meses del año, tenemos dudas sobre la importancia de este parásito en el proceso reproductivo debido a la gran cantidad de huevos que produce este invertebrado bentónico marino. VIII.3.2.3. Coccidios Los Coccidios incluyen varias especies parásitas de moluscos bivalvos. Se trata de parásitos celulares obligados. La anisogamia y esporogonia ocurren en el molusco hospedador, principalmente en las células epiteliales del riñón. Es posible que existan hospedadores intermediarios que soporten la esquizogonia pero todavía no han sido identificados. Pseudoklossia glomerata parasita el epitelio del riñón y en ocasiones el ganglio visceral de Tapes virgineus y Tapes florideus en el mar Mediterráneo (Leger y Dubosq, 1915). Las células parasitadas llegan a hipertrofiarse al ocupar todo el citoplasma el parásito. Las células afectadas pueden desprenderse y en el caso de infestaciones fuertes causar serios daños al riñón. Pseudoklossia pectinis se encuentra en Pecten maximus de Roscoff (Francia) (Leger y Dubosq, 1917), Pseudoklossia (Hyaloklossia) pelseneeri en Tellina sp. y Donax sp. (Léger, 1897). Un coccidio similar a P. pectinis parasita el epitelio del riñón de Ostrea edulis de Auray (Francia) (Tigé et al., 1977). Pseudoklossia sp. se encontró en las células del riñón y las células infectadas estaban hipertrofiadas, dado que el espacio normalmente ocupado por el citoplasma estaba totalmente invadido por el parásito (Fig. VIII.8). Las células infectadas pueden permanecer en contacto con el epitelio renal mediante un delgado pedúnculo o bien desprenderse. Al microscopio óptico no se detecto ningún tipo de reacción por parte del hospedador. El diámetro del gamonte estuvo alrededor de 9-14 mm. La prevalencia fue muy baja, menos del 0,5% mensual. VIII.3.2.4. Ciliados Estos organismos se encontraron en las células digestivas de los túbulos digestivos y en las branquias. Se encontraron en las células digestivas de los túbulos digestivos (usualmente uno por célula) y no en las células piramidales basófilas (Fig. VIII.9). Estos parásitos tienen forma de pera y están cubiertos de cilios. El eje mayor varió entre 5 y 16 mm (media 11,1 mm, SD = 2,5, n = 28), el eje menor entre 4 y 9 mm (media 5,78 mm, SD = 0,96, n = 28) y presentaron entre 1 y 13 núcleos (media 6,12 mm, SD = 2,73, n = 28). Los organismos tipo ciliado producen un alargamiento de la célula que ocupan, sin embargo, los mejillones no reaccionaron ante este parásito. Los mejillones durante 1988 presentaron valores más bajos que los muestreados en 1989. Los resultados del test de independencia de G mostraron que su presencia no estuvo influida ni por la localidad ni por la profundiad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 1.072, G = 1.366 NS; Liméns de 2 y 5 m, n = 960, G = 0,923 NS; Meira y Liméns de 2 m, n = 985, G = 0,144 NS; Meira y Liméns de 5 m, n = 952, G = 1.177 NS). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias

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en la prevalencia de los parásitos entre las zonas muestreadas (p > 0,050, n = 71). Los mejillones de Liméns presentaron tres picos en la prevalencia de este parásito: en primavera de 1988 (20-40%), otoño de 1988 (15-35%) y en verano de 1989 (30-35%). Los mejillones de Meira también presentaron tres picos. El primero en primavera de 1988 (16-30%), el segundo en otoño de 1988 (10,00%). El tercer pico fue a finales de primavera de 1989 (26%) en Meira de 5 m y en verano de 1989 (23,33%) en Meira de 2m. Se encontró un cuarto pico al comienzo del muestro en Meira de 2 m (39,00%). Los ciliados se encontraron también en las branquias y su presencia varió entre cero y más de 145 en una sección. Los ciliados se localizaron en el epitelio de las branquias o entre ellas y no se detectó ni daño ni reacción por parte del mejillón. Los ciliados fueron los organismos que alcanzaron las mayores prevalencias, llegando a valores del 100%. Los mejillones de Meira presentaron mayores prevalencias medias anuales que los de Liméns (72,03 y 66,93% respectivamente) y en ambos lugares los mejillones de las muestra de 2 m de profundidad presentaron mayores valores que los situados a 5 m. El porcentaje medio anual se incrementó de 1988 a 1989 (Tabla VIII.1). Sin embargo, los resultados del test de independencia de G mostraron que la presencia de ciliados fue sólo dependiente de la profundidad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 1,076, G = 32,244***; Liméns de 2 y 5 m, n = 962, G = 29.475***; Meira y Liméns de 2 m, n = 975, G = 0,008 NS; Meira y Liméns de 5 m, n = 958, G = 0,657 NS). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias en la prevalencia (p = 0,024, n = 71). Los mejillones de Meira y Liméns presentaron tres picos en la prevalencia: a finales de primavera-principios del verano de 1988 (71-90%), a finales del otoño-principios del invierno de 1988 (80-90%) y entre principios de primavera-finales del otoño de 1989 (100%) en el caso de Meira. Los mejillones de Liméns: en el invierno de 1988 (67,75-48,57%), a finales del otoño (90,0-86,67%) y a principios del invierno de 1989 (100-95,65%). La mayor parte de los ciliados son considerados como comensales sin efecto patológico sobre el organismo en el que se asientan, sin embargo organismos que aparentemente actúan como comensales pueden actuar como parásitos cuando su número llega a ser extremadamente elevado o bajo condiciones de estrés del hospedador (Lauckner, 1983). Especies del género Ancistrum han sido descritas en gran número en las branquias de Mytilus edulis y M. galloprovincialis. Aunque, aparentemente comensales, cuando se encuentran en grandes cantidades pueden llegar a interferir en el movimiento del agua a través de las branquias dificultando el transporte de las partículas alimenticias (Jørgensen, 1966; Blake, 1971). En este trabajo no hemos identificado los ciliados presentes en las branquias y tampoco detectamos ninguna reacción visible al microscopio óptico contra los ciliados por parte del hospedador aún cuando el número de organismos por sección fuese muy elevado. Estos resultados sugieren que los ciliados presentes en las branquias son consecuencia o reflejo de su abundancia en el ambiente marino más que una invasión de un parásito.

VIII. Estudios epizootiológicos

VIII.3.3.

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Metazoos

VIII.3.3.1. Trematodos Los moluscos bivalvos pueden actuar como hospedadores intermediarios o excepcionalmente como hospedadores definitivos de los trematodos digénidos. Las formas larvales han sido señaladas prácticamente en cada especie de bivalvo por lo que puede considerarse a los tremados digénidos como los más importantes metazoos parásitos de bivalvos. A pesar de ello, la mayor parte de las publicaciones se refieren a descripciones taxonómicas, listas de parásitos-hospedadores y zona de recogida. Poco se conoce a cerca de los ciclos biológicos y las interacciones fisiológicas y bioquímicas. Proctoeces maculatus tiene como hospedador definitivo un pez, sin embargo, es capaz de completar su ciclo de vida en el mejillón. Según Prénot (1965a) estas discrepancias en el ciclo de vida serían debidas a la diferente temperatura de las aguas. En lugares fríos, el ciclo de vida se desarrollaría completamente en el mejillón y en aguas menos frías el pez sería el hospedador definitivo (obligado). Sin embargo, Dolgkh’s (1967) encuentra la fase adulta en peces de aguas frías. Martínez (1973) indica que podría tratarse de dos especies de Proctoeces morfológicamente todavía indistinguibles. Los esporocistos parasitan al mejillón procedente de la costa atlántica (Stunkard y Uzmann, 1959; Sypeck, 1979), de la costa mediterránea (Dias-Serrano, 1972; Canzonier, 1972; Ferrer, 1981) de la costa atlántica europea (Fernández et al., 1990; López et al., 1990; Figueras et al., 1991b). Después de haber tenido lugar en el interior del mejillón dos o tres generaciones de esporocistos, éstos empiezan a producir cercarias sin pasar por la fase de redia (Martínez, 1973). El ciclo biológico en las costas mediterráneas francesas incluye otros dos hospedadores: un nereidomorfo, Leptoneris, donde se aloja la metacercaria y un pez lábrido, Crenilabrus, en el que se desarrolla el adulto. Sin embargo, Sypek (Stunkard y Suman, 1959) describe todas las fases biológicas en el mejillón. Ferrer (1983) lleva a cabo un estudio ultraestructural de las diferentes fases de diferenciación en el tegumento de la cercaria. Los esporocistos con cercarias de Proctoeces maculatus se encontraron en muy baja prevalencia tanto en el mejillón cultivado experimentalmente como en el procedente de los bancos naturales (menos del 1 por 1.000). La presencia del parásito produjo supresión de la gametogénesis ya que los órganos reproductores estaban atrofiados o simplemente no estaban. En algunos casos se pudo detectar una fuerte respuesta por parte del hospedador capaz de destruir el parásito. La prevalencia detectada fue mayor que la detectada por Ferrer (1981) en mejillones cultivados en la misma área (1-3%). Proctoeces maculatus ya había sido identificado en Mytilus galloprovincialis del mar Mediterráneo y del Océano Atlántico (Martínez, 1973; Ferrer, 1981). Aunque este parásito causa serias lesiones en los tejidos donde se localiza, la baja prevalencia hace que no sea una verdadera amenaza para el cultivo del mejillón.

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VIII.3.3.2. Copépodos (Mytilicola intestinalis) Este copépodo, identificado como Mytilicola intestinalis, se encontró principalmente en el intestino del mejillón pero también en el estómago (Fig. VIII.10). Mytilicola intestinalis induce cambios en el epitelio del intestino de Mytilus edulis, estos cambios son el reemplazamiento de las células epiteliales columnares ciliadas por un epitelio cúbico no ciliado (Couteaux-Bargeton, 1953; Moore et al., 1978). Nosotros no encontramos estos cambios en M. galloprovincialis infestado con el mismo parásito. Coincidimos con Moore et al. (1978) en que los ganchos de las antenas causan erosión o irritación del epitelio digestivo. Este daño estaría limitado al área donde se localiza el parásito, sin embargo como el parásito se puede desplazar dentro del intestino, este daño se podría extender a otras áreas del intestino. No se detectó fibrosis en el tejido conectivo situado debajo del epitelial como se encontró en Crasssostrea gigas inducido por Mytilicola orientalis (Sparks, 1962). Coincidimos con Moore et al. (1978) que el daño sería rápidamente reparado y no se desencadenaría una fuerte reacción contra el parásito por parte del hospedador. Otra forma negativa de actuación sobre el hospedador sería mediante la obstrucción del intestino cuando el número de parásitos es muy elevado. La circulación de los productos alimenticios vería dificultado su paso a través de la zona en la que los parásitos se encuentran concentrados. En Liméns durante el segundo año de muestreo se detectó una cierta estacionalidad del parásito. La prevalencia aumentó de diciembre para entonces ir disminuyendo hasta septiembre (Tabla VIII.4). Los resultados del test de independencia de G mostraron que la presencia de M. intestinalis fue dependiente de la localidad e independiente de la profundidad (df = 1 en cada caso, Meira de 2 y 5 m, n = 1.073, G = 0,684 NS; Liméns de 2 y 5 m, n = 970, G = 0,096 NS; Meira y Liméns de 2 m, n = 955, G = 46.626***; Meira y Liméns de 5 m, n = 914, G = 45.636***) (df = 1 en cada caso, Liméns y Meira, n = 636, G = 20.871***; Liméns y Domayo, n = 588, G = 7.131* y Meira y Domayo, n = 574, G = 2.862 NS) y el origen geográfico de los mejillones (df = 1 en cada caso, Liméns en Liméns y Meira in Liméns, n = 405, G = 0,015 NS; Meira en Meira y Liméns en Meira, n = 386, p = 0,300 NS; Liméns en Liméns y Liméns en Meira, n = 406, G = 23.291***; Meira en Meira y Meira en Liméns, n = 389, G = 18.721***). El test de Kruskal-Wallis mostró que hubo diferencias en la prevalencia del parásito (n = 71, p > 0,05). En los bancos naturales de mejillón el copépodo se encontró en todas las zonas muestreadas alcanzándose prevalencias cercanas al 100% en San Adrián (Tabla VIII.4). Los resultados del test de independencia de G- (NS p > 0,05, *0,05> p > 0,01, **0,05> p > 0,005, ***p < 0,005, Sokal y Rohlf, 1981) mostraron que la prevalencia de Mytilicola intestinalis dependía de la localidad (gl = 1 en cada caso, San Adrián (batea) y Liméns, n = 292, G = 19.061***; San Adrián (banco natural) y Cabo Home, n = 643, G = 4.848*) y localización (banco natural o batea) en la zona externa de la Ría (Liméns y Cabo Home, gl = 1, n = 258, G = 13.898***) pero no en la zona interna de la Ría (San Adrián batea y banco natural, gl = 1, n = 569, G = 0,748 NS).

VIII. Estudios epizootiológicos

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TABLA VIII.4 Prevalencia media mensual de Mytilicola intestinalis en Bateas y Bancos naturales San Adrián

Liméns

Cabo Home

Fecha Nov. 1991 Dic. 1991 Ene. 1992 Feb. 1992 Mar. 1992 Abr. 1992 Oct. 1992 Nov. 1992 Dic. 1992 Ene. 1993 Feb. 1993

Batea

Banco natural

Batea

Banco natural

– 64,29 69,23 44,44 – – – 65,22 35,71 70,83 68,75

62,07 51,72 61,54 92,31 33,33 43,33 68,00 69,23 60,71 84,62 83,33

– 10,34 16,67 3,85 – – 0,00 – 36,84 42,86 –

53,33 20,83 50,00 72,73 20,00 13,04 33,33 71,43 52,38 – –

La prevalencia en nuestro estudio fue menor que la señalada por Mourelle (1993) para mejillones de la misma zona (Meira). Nuestros resultados sugieren una variación espacial de la prevalencia debido a que la utilización de diferentes bateas en los estudios puede resultar en una variación de la prevalencia. Figueras y Figueras (1981) encuentran que el grado de infestación en la Ría de Vigo ha ido incrementándose de acuerdo con el número de bateas debido a que la infestación se produce al azar. Aunque, la presencia del copépodo fluctúa durante todo el año, es en la época de invierno-primavera cuando se alcanzan las mayores prevalencias. Figueras y Figueras (1981) encuentran que los mayores valores de prevalencia se dan en otoño y Davey (1989) señala valores altos excepto de mayo a julio. En el presente trabajo las mayores prevalencias se encontraron en la zona interna de la Ría (Domayo y Meira) que en la zona externa de la Ría (Liméns). Hay varias hipótesis que podrían explicar este gradiente de la parte interna hacia la parte externa de la Ría: (i) la concentración de bateas es mayor en la zona interna y media que en la zona externa con lo que la probabilidad de encuentro entre el hospedador y el parásito será mayor. (ii) las corrientes marinas en la Ría de Vigo entran principalmente por la boca sur y sale por la boca norte (Prego y Fraga, 1992), esta circulación podría concentrar las fases infestivas en las áreas donde están situadas la mayor parte de las zonas de cultivo. Con la mayor densidad de bateas en la zona interna de la Ría cabría esperar una disminución de la prevalencia Mytilicola intestinalis hacia la zona externa de la Ría, sin embargo, nuestros resultados sobre bancos naturales de mejillón, no confirman este gradiente ya que las mayores prevalencias fueron encontradas en mejillones procedente de bancos naturales en San Adrián. En la zona externa de la Ría encontramos diferencias en la prevalencia de M. intestinalis entre los mejillones procedentes de los bancos naturales donde están sometidos a los ciclos mareales y los procedentes de la batea que están sumergidos permanentemente; sin embargo encontramos resultados opuestos en la zona interna de la Ría.

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

En el presente estudio no se encontraron diferencias de prevalencia con la profundidad, sin embargo, Paul (1983) señala un aumento del porcentaje de parasitación y número medio de parásitos con la profundidad. La presencia de Mytilicola intestinalis no parece muy importante para el mejillón como ya indicó Davey (1989) en Mytilus después de un seguimiento de 10 años de mejillones de las costas en Inglaterra. Este autor señala que la intensidad de infestación alcanza valores superiores a cualquiera de los señalados hasta el momento para esa especie, sin embargo, la población hospedadora es capaz de sostener la infestación indefinidamente. Después de cuatro años de seguimiento del mejillón en Galicia, se puede concluir que éstos en la Ría de Vigo pueden sostener niveles de infestación elevados. Lauckner (1983) señala que aunque se atribuyeron a este parásito mortalidades masivas ocurridas en el mejillón, en esos mismos estudios no se prestó atención a otros posibles agentes patógenos que pudieran haber sido los responsables o actuar sinérgicamente con M. intestinalis en el desencandenamiento de las mortalidades. Se encontró una correlación entre la presencia de Mytilicola intestinalis y los ciliados presentes en las branquias. La correlación dicotómica no fue significativa entre los demás organismos. Esta correlación podría ser el resultado de la alta prevalencia de ambos agentes más que un verdadero sinergismo entre ellos. La correlación dicotómica entre los otros organismos presentes en el mejillón podrían señalar que la presencia de un parásito fue independiente de otro. Estos resultados podrían indicar que los factores que gobiernan la entrada de los parásitos serían independientes o específicos para cada parásito. VIII.3.3.3. Turbelarios (Urastoma cyprinae) Los turbelarios son platihelmintos de vida libre predominantemente predadores y carroñeros. Miembros de los órdenes Rhabdocoela y Alloeocoela han sido descritos más íntimamente relacionados con los moluscos marinos, habitando respectivamente en el tracto digestivo y la cavidad del manto (Lauckner, 1983). Se han descrito turbelarios en numerosos moluscos bivalvos, tanto de las costas europeas como americanas (Lauckner, 1983). Los más citados pertenecen al género Paravortex. Atkins (1934) señala prevalencias entre 50 y 80% de P. cardii en el berberecho Cardium edule, a pesar de lo cual indica que los hospedadores «parecen estar sanos». Wardle (1980) encuentra que los hospedadores afectados por Paravortex gemellipara no presentaban ninguna lesión. Sin embargo turbelarios de los géneros Stylochus y Pseudostylochus, entre otros, son conocidos como auténticos predadores de moluscos bivalvos, llegando a producir grandes pérdidas principalmente cuando afectan a individuos jóvenes (Bytinski-Salz, 1935; Loosanoff, 1956; Provenzano, 1961; Bebster y Medford, 1961). En ocasiones los turbelarios actúan como oportunistas que atacan a bivalvos debilitados que por alguna razón son incapaces de cerrar sus valvas (Pearse y Wharton, 1938). Varios autores habían señalado la presencia de turbelarios no identificados en el lumen del intestino y entre los filamentos de las branquias de Mytilus galloprovincialis del noroeste de España, aunque con una prevalencia muy baja y una pa-

VIII. Estudios epizootiológicos

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tología no clara (López et al., 1990; Figueras et al., 1991b). Sin embargo, hasta ahora, Urastoma cyprinae no había sido identificado en mejillones de Galicia. Los resultados de nuestro estudio muestran que Urastoma cyprinae causa reacciones patológicas en el mejillón. El turbelario es vermiforme cuando se encuentra nadando en la cavidad del manto y entre vermiforme y esférico cuando está entre los filamentos branquiales (Fig. VIII.11). La longitud de los gusanos vivos se situó entre 0,4 y 0,8 mm. En la parte anterior se pueden observar un par de ojos pigmentados. Los especímenes de U. cyprinae se localizaron tanto en la hemibranquia interna como en la externa, entre los filamentos branquiales y orientados a lo largo de la branquia. Aunque los turbelarios se pueden encontrar en cualquier punto de la branquia, fue a nivel de la zona media donde aparecieron con más frecuencia. En ocasiones, se encontraron nadando libremente en la cavidad paleal. El número de turbelarios por muestra varió entre 1 y 50. En las áreas de las branquias donde se localizaba el turbelario pero no se apreciaba el punto blanco, el único daño que se detectó fue la compresión de los filamentos branquiales por parte del parásito (Fig. VIII.11). A medida que la infestación progresa se puede observar una reacción por parte del mejillón en forma de infiltración de células sanguíneas que comienzan a ser visibles en la zona de máxima compresión de las branquias (Fig. VIII.12). En zonas muy afectadas la lesión más evidente fue la desorganización de los filamentos branquiales. El espacio entre dos filamentos adyacentes (ostium) se vio considerablemente reducido en el área que rodaba al turbelario. Los senos sanguíneos de las zonas afectadas estaban ensanchados si se comparaba con los de zonas sanas debido a la infiltración hemocitaria. Las células epiteliales de los filamentos estaban hipertrofiadas. Durante el desarrollo de los muestreos realizados antes de 1990, el parásito no se detectó ni en el examen macroscópico ni en el microscópico. En 1990, el turbelario se detectó en las localidades de Liméns, Meira y Domayo y la mayor prevalencia se registró en Domayo (80%). En los muestros realizados para determinar la influencia del origen de la semilla, las mayores prevalencias ocurrieron entre octubre y diciembre, alcanzándose un máximo de 90% en diciembre de 1991. Los exámenes histológicos señalaron que sólo los mejillones muestreados en julio y agosto de 1991 estuvieron libres del parásito. Con la excepción de Aldán y Bueu en la Ría de Pontevedra, las muestras de bancos naturales presentaron unas prevalencias bajas o ausencia del parásito. En el muestreo de control de semilla realizado en octubre, el turbelario apareció con una prevalencia del 2,5% en la semilla de Liméns y con una prevalencia del 3,33% en la semilla de Meira. Nuestras observaciones sobre la aparición de los turbelarios coinciden con los estudios de Noury-Sraïri et al. (1990). Estos autores señalan que mientras los gusanos están cubiertos de un capullo mucoso y cuando se encuentran entre las branquias presentan una forma redondeada, mientras que cuando se han liberado de este capullo presentan una forma alargada del cuerpo. En la experiencia de la influencia de la localidad y profundidad no se encontraron turbelarios. La primera detección de Urastoma cyprinae fue en marzo de

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

1989 en el transcurso de la experiencia de la influencia de la localidad, tanto en mejillones de Liméns como Meira. Por lo tanto, el principio de la epizootia se puede establecer a principios de 1989. La prevalencia aumentó durante 1990, con un pico del 90% en diciembre de 1991. Todos los mejillones de batea examinados en marzo de 1993 estaban infestados por el parásito y la prevalencia varió entre 34,48 y 93,33%. La ausencia de U. cyprinae en Meira-Liméns durante el incremento detectado en octubre-diciembre de 1991 continúa sin explicación. Tanto los mejillones cultivados en batea como los procedentes de bancos naturales presentaron este nuevo parásito. Los mejillones extraídos de los bancos naturales de Cabo Home, Ribeiriña, Rianxo, Carril y O Grove no presentaron el parásito o éste se encontraba con una baja prevalencia, tal vez por la naturaleza expuesta a la acción del oleaje y los ciclos de mareas de estas localidades. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Murina y Solonchenko (1991), que encontraron un mayor número de parásitos en Mytilus galloprovincialis de sedimentos de arena (con un máximo de 170 turbelarios en un único mejillón) si se compara con mejillones extraídos del fondo rocoso (con un máximo de 7 turbelarios en un único mejillón). Destacar que los mejillones procedentes de bancos naturales de Aldán y Bueu presentaron una prevalencia elevada (26,67 y 66,67%, respectivamente). En las experiencias de influencia de la localidad e influencia del origen del mejillón, las mayores prevalencias se detectaron desde finales del otoño hasta principios del invierno, cuando las aguas de la Ría de Vigo presentan las temperaturas más bajas (Cáceres-Martínez et al., 1993). La variación en la prevalencia mensual sugiere un ciclo anual con un pico en diciembre. Los resultados obtenidos en la experiencia de influencia del origen del mejillón indican que la presencia del turbelario es independiente del origen de los mejillones ya que el parásito se detectó en todas las localidades. Murina y Solonchenko (1991) también encuentran que en Mytilus galloprovincialis del Mar Negro, las mayores cantidades de turbelarios se encuentran desde mediados del invierno hasta principios de la primavera. Estos resultados sugieren que el grado de infestación presenta un patrón estacional que está directamente relacionado con la temperatura del agua, y que las bajas temperaturas llevan consigo unas prevalencias e intensidades mayores. Esto contrasta fuertemente con la presencia de U. cyprinae en la ostra americana Crassostrea virginica. Este hospedador contiene una gran cantidad de Urastoma durante los meses templados, y un pequeño número durante los meses fríos; probablemente muchos especímenes del turbelario dejan la ostra durante los meses fríos (Fleming, 1986). Este ciclo anual de U. cyprinae en C. virginica se debe al ciclo de vida del hospedador ya que la ostra es incapaz de alimentarse a temperaturas por debajo de los 5°C y cierra sus valvas desde noviembre hasta abril (Fleming, 1986). Los mejillones fuertemente infestados se pueden reconocer por la presencia de puntos blancos en las branquias. Sin embargo, cuando el parásito es muy joven, su presencia sólo se puede detectar mediante preparaciones histológicas. Las diferencias encontradas entre los seguimientos macroscópicos y microscópicos sugiere que el análisis histológico es una técnica adecuada para describir y valo-

VIII. Estudios epizootiológicos

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rar los efectos de Urastoma cyprinae en las branquias del mejillón. Sin embargo, para una correcta estimación del número de parásitos por hospedador, los estudios histológicos deberían incluir todas las branquias. Se deben de llevar a cabo más estudios para entender el ciclo biológico y estacional de este platihelminto en la región gallega así como para conocer los efectos en la fisiología del mejillón. Un mayor conocimiento de Urastoma cyprinae en el mejillón nos podría indicar por qué el parásito no afectaba al mejillón de esta zona y quizás tomar medidas que permitan evitar la presencia del turbelario en mejillones de zonas no afectadas. A modo de conclusión, aunque no se hayan detectado mortalidades del mejillón (Mytilus galloprovincialis) durante el período de estudio esto no significa que los mejillones estén libres de parásitos. Es cierto que los mejillones no han sido afectados por enfermedades tan severas como las que afectan a las ostra plana (Ostrea edulis) y esto quizás haya desencadenado en una menor importancia y conocimiento de las enfermedades del mejillón. Otra posible causa es que debido a su amplia distribución, los mejillones no han estado sometidos a las transferencias que si han ocurrido con otras especies comercialmente importantes como las ostras (McGladdery, 1990). A medida que la industria se desarrolla entran en juego una serie de factores que se encontraban ausentes y que pueden hacer que una enfermedad cobre una importancia inusitada. Entre estos factores tenemos la transferencia de animales vivos entre zonas de cultivo, las altas densidades de trabajo en relación a las densidades de las poblaciones salvajes, alteraciones de las puestas. Con este estudio se ha demostrado la presencia de agentes en los distintos tejidos del mejillón. Queda establecida la línea base de parásitos para el mejillón de esta zona de España. Si en el futuro alguna mortalidad ocurre, será importante saber si los parásitos que entonces se detecten ya se encontraban con anterioridad o si se trata de un agente patógeno de nueva aparición.

VIII. Estudios epizootiológicos

161 Figura VIII.1. Corte histológico de mejillón. M: manto. P-Gb: Pie-glándula del biso. Mr: músculo retractor. R: Riñón. Gd: Glándula digestiva. E: Estómago. Ir: Intestino recurrente. It: Intestino terminal. B: Branquia. F: Folículos gonadales.

Figura VIII.2. Organismos tipo clamidia en los túbulos digestivos de mejillón. B: Organismos tipo clamidia a mayores aumentos (diámetro de la clamidia: 12 mm).

Figura VIII.3. Marteilia (probablemente) refringens. Esporangios en túbulos digestivos. Diámetro de los esporangios: 20 mm.

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

Figura VIII.4.

Ciclo de vida de Marteilia según Grizel et al., 1974.

VIII. Estudios epizootiológicos

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Figura VIII.5. Desarrollo de la infección de Marteilia en Mytilus galloprovincialis. A. Influencia de la profundidad en la localidad de Meira. B. Comparación entre localidades. 1. Plamodio en el epitelio del estómago. 2 Plasmodia en el epitelio de los túbulos digestivos. 3. Esporangiosoros con primordios de esporontes. 4. Esporangiosoros con esporontes no maduros. 5. Esporangiosoros con esporontes maduros.

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José Antonio F. Robledo y Antonio Figueras

Figura VIII.6. Prevalencia de Marteilia en Mytilus galloprovincialis en los experimentos de influencia de la localidad y profundidad, influencia de la localidad y la influencia del origen del mejillón.

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Figura VIII.7. Steinhausia mytiliovum, parásito de los oocitos de mejillón. El parásito, indicado, por una flecha mide 10 mm de diámetro.

Figura VIII.8. Pseudoklossia glomerata, parásito del riñón del mejillón. A: Aspecto general (barra: 100 mm). B: Detalle (barra: 20 mm).

Figura VIII.9. Ciliado parasitando células de los túbulos digestivos del mejillón. A: Aspecto general (barra: 40 mm). B: Detalle (barra: 10 mm).

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Figura VIII.10. Copépodos de la especie Mytilicola intestinalis (asteriscos) en el intestino del mejillón (barra: 400 mm).

Figura VIII.11. Urastoma cyprinae (turbelario) presente en las branquias del mejillón.

Figura VIII.12. Infiltración hemocitaria y lesión causadas por una infestación aguda con este parásito (barra: 200 mm).

IX. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE MEJILLÓN: MARTEILIA REFRINGENS BEATRIZ NOVOA, JOSÉ ANTONIO F. ROBLEDO, MARÍA PERNAS, PABLO BALSEIRO y ANTONIO FIGUERAS

IX.1. A.

INTRODUCCIÓN

Marteilia y el mejillón

La mayor parte de las enfermedades de moluscos bivalvos se diagnostican utilizando aposiciones de tejidos y preparaciones histológicas. La visualización al microscopio óptico de las preparaciones histológicas no es fácilmente estandarizable. Por otra parte, debido a que el procesado de las muestras y su observación al microscopio óptico consume mucho tiempo y dinero, y requiere personal especializado, su uso supone ciertas limitaciones en los estudios epidemiológicos, donde el tamaño y el número de las muestras es muy elevado, haciendo casi inviable llevar a cabo campañas de profilaxis. El parásito protozoo Marteilia refringens (Fig. IX.1) ha causado importantes mortalidades en la ostra plana (Ostrea edulis) en Europa. A pesar de la gran cantidad de trabajos realizados (Van Banning, 1979; Balouet et al., 1979; Grizel, 1985; Lester, 1986; Perkins, 1988; Figueras y Robledo, 1993) para intentar esclarecer el ciclo de vida del parásito Marteilia refringens, éste permanece todavía incierto. Debido a que no ha sido posible transmitir la enfermedad, se ha sugerido que es necesaria la presencia de un hospedador intermedio (Lester, 1986; Roubal et al., 1989; Berthe et al., 1997). Hasta el momento, no existen características morfológicas claras que permitan diferenciar entre las dos especies de Marteilia (M. refringens y M. maurini), presentes en Europa, desconociéndose cuál es la especie de Marteilia que parasita el mejillón Mytilus galloprovincialis cultivado en Galicia. El desconocimiento del ciclo de vida de Marteilia conduce a un difícil control de esta enfermedad.

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Beatriz Novoa et al.

En la directiva 91/67 de la CEE Marteilia refringens y Bonamia ostreae están incluidas en la lista II anexo A. Esta lista incluye patógenos que causan importantes pérdidas para la industria de la acuicultura europea, los cuales deben ser obligatoriamente declarados. La normativa europea incluye una serie de enfermedades de moluscos y peces y ha concedido una calificación de las zonas de producción, dependiendo de la existencia o no de dichas enfermedades. Zonas libres de parásito pueden exportar a todas las zonas, mientras que las zonas infectadas tienen restringido el movimiento de especies, pudiendo exportar sólo a otras zonas infectadas. Dado que los animales infectados por el parásito Marteilia tienen restringido su movimiento a zonas libres del mismo, es importante una detección precisa de este parásito. Algunos moluscos han sido reconocidos como no portadores de Marteilia refringens, permitiéndose su movimiento a todas las áreas. Estos individuos, aún estando libres de la enfermedad podrían actuar como portadores asintomáticos, dispersando la enfermedad a zonas libres del parásito. Es por tanto importante, desarrollar sistemas de diagnóstico estandarizables y sencillos, pudiendo valorarse la presencia de Marteilia de forma similar en todos los países miembros de la Unión Europea. Mediante las observaciones histológicas el protozoo Marteilia puede pasar inadvertido, puede ser mal interpretada una preparación o podemos estar ante un estadío del parásito que nos resulta desconocido. Todo esto, puede conducir a la transferencia de animales, que han sido erróneamente considerados libres del parásito, a zonas no contaminadas, diseminándose de esta forma la enfermedad. Por otra parte, como se puso de manifiesto anteriormente, la transmisión y el ciclo de vida de Marteilia refringens es hasta el momento desconocido. Puesto que los estudios realizados parecen indicar que existe un hospedador alternativo es necesaria la búsqueda de Marteilia en el mayor número posible de organismos que cohabitan con el mejillón en el medio natural, hasta encontrar los posibles hospedadores alternativos del parásito. Indudablemente, el descubrimiento de Marteilia en otros posibles organismos que ayudarían a la propagación de la enfermedad, afectaría, probablemente, al libre movimiento de estas especies, con las repercusiones económicas que ello conlleva. Las relaciones y diferencias entre Marteilia maurini (supuestamente especie de Marteilia que afecta al mejillón) y Marteilia refringens (parásito de declaración obligatoria) que afecta a la ostra no están claras. Los datos obtenidos mediante microscopía electrónica (Fig. IX.3) sugieren que la especie de Marteilia presente en Mytilus galloprovincialis es Marteilia refringens. (Villalba et al., 1993; Robledo y Figueras, 1995). Sin embargo, si realmente se trata de esta especie no se explica porqué este parásito no parasita la ostra plana (Ostrea edulis) tras cohabitación durante casi dos años con mejillones Mytilus galloprovincialis en el medio natural (Figueras y Robledo, 1993). A pesar de los grandes esfuerzos realizados mediante microscopía electrónica de transmisión, no se ha conseguido encontrar aspectos que permitan separar Marteilia maurini (descrita originalmente en mejillón y no asociada a mortalidades) y M. refringens (descrita en ostra plana y asociada a mortalidades) (Longshaw et al., 2001). Por otra parte, mientras

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

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las mortalidades de Ostrea edulis por Marteilia refringens han alcanzado niveles de hasta el 100%, no se han registrado mortalidades masivas en el mejillón. Es por tanto, fundamental, determinar cuál es la especie que está parasitando el mejillón, Mytilus galloprovincialis y si se trata o no de la misma especie que parasita la ostra. Por esto, y dado que las transferencias de moluscos infectados con Marteilia están restringidas por la directiva comunitaria 91/67, es importante determinar si el mejillón, Mytilus galloprovincialis puede actuar como vector del parásito y transmitir la enfermedad a la especie susceptible, Ostrea edulis. Dada la alta producción de Mytilus galloprovincialis en Galicia es interesante conocer qué papel juega esta especie de mejillón en la transmisión de la Marteiliasis. Por esta razón, hemos intentado realizar la transmisión experimental de Marteilia entre individuos del mismo género, Mytilus galloprovincialis y Mytilus edulis, o entre especies distintas, Mytilus galloprovincialis y Ostrea edulis. Los resultados obtenidos en los experimentos de transmisión de Marteilia, bien entre distintos géneros de mejillón o entre distintas especies de moluscos (mejillón y ostra) han resultado negativos, coincidiendo con los publicados anteriormente. Por esto, nos decidimos a profundizar en la caracterización de este parásito mediante el uso de la biología molecular para intentar diferenciar los patógenos de ostra y mejillón. Puesto que hasta el momento, ni los estudios estructurales, ni las experiencias de transmisión del parásito realizadas, han resuelto cual es la especie de Marteilia que afecta a Mytilus galloprovincialis en Galicia, es necesario el empleo de técnicas alternativas para intentar establecer la identidad de este parásito. Como alternativa a los métodos tradicionales, se ha empleado la comparación de secuencias nucleotídicas, que comparten un antecesor común, para realizar los estudios de las relaciones taxonómicas y filogenéticas en varios organismos (Medlin, 1988; Goggin y Baker, 1993). Entre los genes empleados, se han elegido los ARNs ribosomales, más concretamente el ARNr 18s, ya que presenta una alta cantidad de información, está universalmente distribuido y es particularmente útil para esclarecer relaciones entre individuos filogenéticamente distintos. Sin embargo, la secuencia de la unidad pequeña ribosómica (ARNr 18s) es también idéntica en todos los aislados de Marteilia estudiados (Berthe et al., 2000). Al igual que sucede con el género Marteilia, la posición de otros muchos parásitos protozoos ha sido muy controvertida. El género Perkinsus, importante parásito de moluscos, ha sufrido una gran cantidad de cambios en su situación taxonómica. Mediante la secuenciación del gen de ARNr 18s, se ha demostrado que este parásito es filogenéticamente más cercano a los dinoflagelados y coccidios que a los hongos, como se había sugerido inicialmente tras observaciones del complejo apical de este organismo (Goggin y Baker, 1993). Las estrategias de secuenciación del gen ARNr 18s están basadas en la existencia de zonas conservadas intercaladas entre zonas variables (Medlin et al., 1988). Para iniciar la amplificación de ADN mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplean oligonucleótidos o «primers» sintéticos complementarios a las zonas conservadas.

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Beatriz Novoa et al.

Por todas las razones anteriormente expuestas, como objetivo de nuestras investigaciones nos hemos planteado la puesta a punto de sistemas alternativos para la detección del parásito Marteilia. Dado que las técnicas de inmunología y de biología molecular son actualmente utilizadas en gran cantidad de campos de la medicina y veterinaria obteniéndose muy buenos resultados, los nuevos sistemas de diagnóstico se basaron en estas técnicas. B.

Nuevas técnicas de diagnóstico para enfermedades de moluscos bivalvos

Inmunodiagnóstico Las técnicas de inmunodiagnóstico aplicadas a la detección de organismos patógenos de los invertebrados marinos constituyen una herramienta muy útil dada su especificidad y sensibilidad. Debido a que dichos organismos carecen de respuesta inmune mediada por inmunoglobulinas, la inmunodiagnosis se basa en la disponibilidad de anticuerpos que reaccionen específicamente contra los organismos patógenos. La obtención de anticuerpos poli o monoclonales constituye el paso crítico para el desarrollo de estas técnicas. La mayor parte de los patógenos de los moluscos son protozoos intracelulares, riquetsias o virus que no pueden ser cultivados in vitro, debido a que no se han desarrollado líneas celulares de invertebrados marinos. En un principio, la obtención de anticuerpos específicos se vio dificultada por la falta de suspensiones de antígeno de alta pureza. Sin embargo, el desarrollo de protocolos de purificación (Miahle et al., 1985, 1988c; Robledo et al., 1995b) ha permitido la obtención de anticuerpos altamente específicos (Rogier et al., 1991; Noel et al., 1991a; Cochennec et al., 1992). Los anticuerpos monoclonales son poblaciones homogéneas, generadas por la fusión de una célula secretora de un anticuerpo, obtenida de un animal inmunizado, con una célula tumoral de crecimiento indefinido. Las células híbridas, denominadas hibridomas retienen las propiedades de ambos tipos celulares; por un lado la secreción de anticuerpos de los linfocitos y por otro la capacidad de las células del mieloma de crecer indefinidamente (Köhler y Milsten, 1975). Cada anticuerpo derivado de un clon del hibridoma se denomina anticuerpo monoclonal (Mab) y reacciona contra un único antígeno. Debido a su alta especificidad, homogeneidad y producción ilimitada, el uso de anticuerpos monoclonales es preferido al de los policlonales para inmunoensayos sofisticados como el ELISA y el inmunodot. Los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados para la diagnosis en medicina y veterinaria. En acuicultura, los anticuerpos monoclonales se han obtenido y utilizado para el diagnóstico de diversas enfermedades en moluscos; para la detección de Bonamia ostreae, parásito intracelular de Ostrea edulis (Rogier et al., 1991), para la comparación serológica de aislados de este protozoo (Mialhe et al., 1988), así como para su detección mediante ELISA (Cochennec et al., 1992). En almejas, se han empleado para el diagnóstico del agente causal de

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la enfermedad del anillo marrón en la especie Tapes philippinarum, (Noel et al., 1991a) así como para la detección de Perkinsus atlanticus en Tapes decussatus (Goggin et al., 1991). En Mytilus edulis se obtuvieron anticuerpos monoclonales para el diagnóstico de hemocitos neoplásicos (Noel et al., 1991b), así como para la detección del parásito del mejillón Marteilia sp. (Robledo et al., 1994). Los anticuerpos policlonales, resultantes de una respuesta inmune generalizada, contienen una población de anticuerpos que reaccionan contra un gran número de determinantes antigénicos incluyendo antígenos del hospedador. Son, por esta razón, menos específicos y por ello utilizados en ensayos menos sofisticados, como la inmunofluorescencia indirecta. Dicha técnica, ha sido utilizada en el campo de la patología de moluscos en varias ocasiones. Se empleó en la comparación de aislados de Perkinsus marinus, parásito protozoo que afecta a la ostra Crassostrea virginica. (Dungan y Roberson, 1993; Mialhe et al., 1988c) utilizan anticuerpos poli y monoclonales para el análisis serológico de dos especies diferentes dentro del género Bonamia. También se utilizaron anticuerpos policlonales dirigidos contra Marteilia sydneyi, parásito de la ostra Saccostrea commercialis, en ensayos de inmunofluorescencia y de marcaje con oro para su utilización en microscopía electrónica (Roubal et al., 1989). El uso de los anticuerpos mono y policlonales constituye una muy buena herramienta no sólo en el campo del diagnóstico sino también en el estudio de los ciclos de vida de estos parásitos. El desarrollo de técnicas inmunológicas permitiría analizar la variación antigénica entre aislados procedentes de diferentes áreas geográficas, así como las alteraciones antigénicas experimentadas durante los diferentes estadíos de estos organismos (Miahle, 1988). Finalmente, el uso de dichos anticuerpos podría ayudar a aclarar el papel de los receptores implicados en el proceso de reconocimiento entre el hospedador y el parásito. Diagnóstico mediante técnicas de Biología Molecular. Una sonda y/o la disponibilidad de unos «primers» específicos son el paso crítico hacia el desarrollo de un sistema de diagnóstico basado en las técnicas de biología molecular. Las técnicas de biología molecular permiten la detección del genoma (ADN o ARN) de un determinado organismo, tanto en tejidos o células aisladas, como en fluidos biológicos. Debido a su gran especificidad y sensibilidad, su desarrollo es fundamental para el diagnóstico de las enfermedades de moluscos bivalvos. Actualmente, ya se han caracterizado y secuenciado distintos genes de moluscos así como de diversos grupos de patógenos, siendo posible seleccionar secuencias consenso para todos los representantes de un grupo de interés (Fong et al., 1993; Gajadhar, 1991; Goggin et al., 1993; Ko et al., 1995; Littlewood et al., 1991; Mc Cuthan et al., 1988; Medlin et al., 1988). El diseño de «primers» específicos ha permitido el diagnóstico de gran número de parásitos protozoos. Ko et al. (1995) diseñaron «primers» para la detección de Haplosporidium costale, resultando específicos para el parásito y no para su huésped, Crassostrea virginica, ni para un organismo de su mismo género, Haplosporidium nelsoni. Este parásito

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fue por su parte, específicamente amplificado mediante PCR con los «primers» descritos por Stokes et al. (1995). La ausencia de reacción de una sonda de ADN y de «primers» específicos para Minchinia teredinis frente a otros parásitos haplosporidios, Haplosporidium nelsoni, costale y lousiana confirmó los resultados previamente obtenidos mediante inmunoensayos (Mc Govern y Burreson, 1989) que indicaban diferencias antigénicas entre las esporas de Minchinia teredinis y Haplosporidium nelsoni. El parásito de la ostra Saccostrea commercialis, Marteilia sydneyi, fue detectado mediante el empleo de primers específicos derivados de la región del espaciador interna, ITS 1 del ARNr (Anderson et al., 1995). La aplicación de la técnica de PCR con «primers» específicos a la detección del parásito RLO (ricketsia- like organism) mostró resultados satisfactorios (Kellner-Cousin et al., 1993). Estas secuencias de oligonucleótidos se pueden aplicar a varios tipos de ensayos: – Hibridación mediante «dot-blot», consistente en la fijación de los ácidos nucleicos a un filtro y la posterior hibridación con una sonda. Estos ensayos ya han sido utilizados en el diagnóstico de algunos patógenos de moluscos entre ellos: Perkinsus atlanticus (Goggin et al., 1991), Bonamia ostreae (Hervio, 1992) y Haplosporidium nelsoni (Stokes et al., 1995). – Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction o PCR), permiten la amplificación de una determinada región del genoma de un organismo de manera sencilla. De esta manera se puede, por ejemplo usar la técnica de PCR para detectar la presencia de ADN de Marteilia en el molusco. Para ello se emplean unos cebadores específicos que son pequeñas secuencias (de unos 20 nucleótidos de longitud) complementarias a los extremos de la región que queremos amplificar. Reproduciendo in vitro el sistema que emplean las células eucariotas para replicar su ADN y empleando una DNA polimerasa termoestable podemos aumentar exponencialmente el número de copias de la región de interés. Posteriormente el resultado de la PCR se puede visualizar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, que se intercala entre las bases de ADN y permite su visualización al iluminarse con luz ultravioleta a 488 nm. Un gran número de patógenos de importancia en acuicultura han sido diagnosticados mediante esta técnica. Entre ellos Marteilia sydneyi (Anderson et al., 1995), rickettsias (Kellner-Cousin et al., 1993), Haplosporidium costale (Ko et al., 1995) y Haplosporidium nelsoni (Stokes et al., 1995). – La técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) es una técnica complementaria a la PCR la cuál nos permite vislumbrar la variabilidad de un determinado producto de PCR mediante el corte por medio de enzimas de restricción, que reconocen unas pequeñas regiones de ADN altamente específicas (unos 4 pares de bases) que son conocidas como «dianas de restricción» y producen cortes siguiendo un patrón conocido. Por tanto, puesto que las dianas de restricción son dependientes de la secuencia, se pueden diferenciar en un gel de agarosa secuencias diferentes pero del mismo tamaño tras el tratamiento con enzimas de restricción que produzcan

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fragmentos de distinto tamaño. El resultado es un bandeado característico de cada secuencia conocido como patrón de restricción. – Hibridación in situ, que permite la detección del parásito directamente en las células o en cortes histológicos mediante una sonda. Su aplicación a aposiciones de tejido es de gran interés en el campo de la acuicultura ya que permite la detección del parásito sin la necesidad de realizar el complejo proceso de la histología. Esta técnica presenta otra ventaja, ya que los protozoos pueden presentan diversas morfologías a lo largo de su ciclo de vida y esto puede confundir el diagnóstico por histología (Fig. IX.1). Sin embargo, el ADN permanece inalterado a lo largo del ciclo. De esta forma mediante hibridación in situ se podría revelar la presencia de estadios del ciclo de vida de un parásito con morfología desconocida. – La técnica de Single Strand Conformation Polymorphism (poliformismo de conformación de cadena única de ADN) permite el análisis comparativo en un gel de fragmentos de ADN de igual tamaño pero que difieren en su secuencia. Esto es posible gracias a que los fragmentos de ADN monocatenario, al renaturalizarse, adoptan una determinada estructura tridimensional, que es dependiente de la secuencia de nucleótidos, de tal forma que dos secuencias diferentes adoptarían dos conformaciones diferentes y migrarían de distinta manera en un gel de acrilamida. En Australia, esta técnica fue empleada para trazar la evolución de la enfermedad QX, causada por Marteilia sidneyi (Kleeman et al., 2004). IX.2.

MATERIAL Y MÉTODOS

Inmunodiagnosis Los anticuerpos monoclonales 1/1-3, 3/1-1, 4/1-1, 6/2-3, 9/1-1, 12/1-1, que reaccionan contra Marteilia sp. aislada de Mytilus edulis procedente de Francia (Robledo et al., 1994) fueron obtenidos siguiendo la tecnología del hibridoma desarrollada por Kohler y Milstein (1975). Brevemente, se realizó una primera inmunización de 4 ratones Balb-c con glándulas digestivas de Mytilus edulis fuertemente parasitados por Marteilia sp. Aquellos ratones que presentaron mejor respuesta fueron seleccionados, dándoles una última dosis de recuerdo con parásito purificado. Se extrajo el timo, cuyos linfocitos se utilizaron para la fusión con una línea celular de mieloma. Aquellos hibridomas que resultaron específicos se clonaron utilizando la técnica de dilución límite (Robledo et al., 1994). El título de los anticuerpos se obtuvo empleando las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y de Enzima-inmunoensayo (ELISA) siguiendo los protocolos descritos en los siguientes apartados. Ambas técnicas se aplicaron sobre purificado de Marteilia utilizando diluciones seriadas de los anticuerpos (directa, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/500, 1/1000). El título de los diferentes anticuerpos se definió como el recíproco de la mayor dilución que presentó reacción positiva (emisión de fluorescencia o un valor de densidad óptica superior a la muestra sin

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tratar con el anticuerpo) en el ensayo empleado, inmunofluorescencia (IF) o ELISA. Inmunofluorescencia indirecta Para los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IF) se aplicaron las células de Marteilia purificada, aposiciones de tejidos o cortes histológicos sobre un portaobjetos tratado con 50 mg/ml de poli-l-lisina (Sigma) para aumentar la adherencia. Una vez seca la muestra, se fijó con acetona durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 30 ml del anticuerpo monoclonal sin diluir y se incubó 30 minutos a 37°C en cámara húmeda. Tras lavar dos veces con PBS para eliminar el anticuerpo no unido, se incubó con anti-IgG de ratón conjugado con fluoresceína (Sigma) diluido 1/50 en PBS 1x y 0,1% de azul de Evans, durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda y en la oscuridad. A continuación, se lavó de nuevo tres veces con PBS 1x o agua destilada y se montó con glicerina de baja fluorescencia (Fluoroprep, Biomeriux). Las preparaciones se observaron en un microscopio de epifluorescencia Nikon con filtro B2. Técnica de la inmunoperoxidasa Cortes histológicos de mejillones infectados y sin infectar por Marteilia se sometieron a un proceso de desparafinado y rehidratación. Una vez equilibradas en PBS 1x, las muestras se trataron durante 10 minutos con una solución 10% H2O2 en metanol para eliminar las enzimas endógenas. Tras lavar con tampón PBS, se incubó durante aproximadamente 1 hora con una solución de tripsina al 0,1% en CaCl2 al 1% (pH 7). La acción de la tripsina se detuvo con agua destilada seguida de un baño en tampón PBS. Después de incubar en solución bloqueante (TBS +2% BSA+ 0,05% Tween 20) a 37°C en cámara húmeda durante 30 minutos, se añadió el anticuerpo monoclonal sin diluir, dejándolo 60 min a 37°C. A continuación, se hicieron tres lavados con tampón PBS y se incubó durante 30 min a 37°C en cámara húmeda con el anti-IgG de ratón, conjugado con peroxidasa y diluido 1:50 en solución bloqueante. Tras lavar con tampón PBS, se añadió el substrato enzimático DAB (3-3¢diaminobenzidina) dejándolo actuar entre 5 y 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con agua del grifo. Las preparaciones se tiñeron con hematoxilina de Mayer’s, se montaron con medio de montaje Depex y se observaron al microscopio óptico. Inmunodot Esta técnica se realizó en un aparato, Biodot (Biorad) que contiene una serie de pocillos en los que se aplica la muestra y sobre los cuales se puede aplicar vacío. Para ello, tras hidratar una membrana de nitrocelulosa de 0,45 mm de poro en tampón TBS durante 15-30 minutos se hizo el montaje del biodot. A continuación, se añadieron de nuevo 100 ml de tampón TBS para hidratar la membrana y se aplicó vacío hasta que se vació el primer pocillo. Se añadieron 100 ml del antígeno, suspensión celular de Marteilia purificada y se incubó una hora a tempera-

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tura ambiente. Posteriormente se añadió a cada uno de los pocillos 200 ml de solución de bloqueo (TBS, 1% BSA) y se dejó hasta que son adsorbidos por gravedad. Tras lavar dos veces con 200 ml de TBS, se añadieron 100 ml del anticuerpo monoclonal sin diluir, incubándose una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido se eliminó lavando tres veces con TBS. Un segundo anticuerpo, anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma) se añadió diluido 1:1250 y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se lavó de nuevo como anteriormente y se añadió el sustrato de la enzima, cloronaftol o DAB hasta la aparición del color. La membrana se lavó con agua destilada para parar el desarrollo de color y una vez seca, se leyeron los resultados. Enzima-inmunoensayo (ELISA) Se aplicaron 50 ml de una suspensión celular de Marteilia en una placa de poliestireno dejándolos toda la noche a 4°C para conseguir la adsorción del antígeno. Después de lavar 5 veces con 100 ml de tampón TBS, se bloqueó con 50 ml de TBS-T1 (TBS con 0,2% de Tween 20) al que se le añadió un 5% de leche en polvo y se incubó durante 2 horas a 37°C. A continuación, se lavó 5 veces con 100 ml TBS-T2 (TBS con Tween 20 al 0,05%) y se añadieron 50 ml de anticuerpo monoclonal sin diluir, incubando durante 2 horas a 37°C. Para eliminar el anticuerpo no unido se lavó 5 veces con 100 ml de TBS-T2. Después se añadieron 50 ml de anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma), diluido 1/2000 en tampón TBS-T1 y se incubó durante 1 hora a 37°C. Tras 5 lavados con 100 ml de TBS-T1, seguidos de 5 lavados con 100 ml de tampón TBS, se añadieron 50 ml por pocillo de sustrato enzimático ortofenilendiamina. A los 20 minutos, se añadieron 25 ml de ácido sulfúrico 3M para parar la reacción y se hizo la lectura de la densidad óptica a 492 nm en un lector de placas. Diagnosis mediante biología molecular Extracción del ADN El ADN de las muestras se extrajo empleando el kit DNAZOL (Gibco Life Technologies). Los pooles de tejido de semilla y las larvas se colocaron en un eppendorf de 1 ml previamente autoclavado. Posteriormente, se adicionaron 250 ml de reactivo DNAZOL (Life Technologies). El tejido se homogenizó con un potter para eppendorf y a continuación se añadieron 750 ml de DNAZOL mezclándolo de nuevo. Luego, la muestra se centrifugó a 10.000 g (rotor F2402, Beckman GS-15R) durante 10 minutos a 4°C, recogiendo el sobrenadante y pasándolo a otro eppendorf. Con el fin de precipitar el ADN se adicionaron 500 ml de alcohol absoluto frío y se dejó a temperatura ambiente por un tiempo de 3 minutos. Posteriormente, el eppendorf se centrifugó dos veces a 4.000 g (rotor F2402, Beckman GS-15R) durante 3 minutos a 4°C, eliminando el sobrenadante. El precipitado formado se

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secó a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Luego, se disolvió en 50 ml de NaOH 8 mM. El ADN obtenido se cuantificó espectrofotométricamente y se congeló a –80°C hasta su posterior uso. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR diagnóstico recomendada por la Oficina Internacional de las Epizootias (O.I.E.) amplifica un fragmento de unos 334 pb de la región ITS (internal transcribed spacer) de Marteilia. Los «primers» empleados son: – 2S («primer sense»): 5¢ CCGCACACGTTCTTCACTCC 3¢ – 3As («primer antisense») 5¢ TCGCGAGTTTCGACAGACG 3¢ Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes finales de 25 ml, con 2,5 ml de Tampón de PCR 10X [10 mM de Tris, 50 mM de KCl (pH 8,3)], 2,5 mM de MgCl2, 0,4 mM de dNTPs, 0,4 mM de cada uno de los cebadores y 0,05 U de enzima Taq polimerasa. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Applied Biosystems Gene Amp® PCR system 9700. El perfil de temperaturas general fue: 5 minutos a 94°C de desnaturalización inicial; 30 ciclos de desnaturalización a 1 minuto a 94°C, anillamiento a 1 minuto a 55°C, y extensión a 1 minuto a 72°C; y una extensión final de 5 minutos a 72°C. Estas condiciones de reacción, particularmente en lo que respecta al MgCl2 y al número de ciclos y temperatura de hibridación, son flexibles y dependen de las características de la PCR a realizar, pudiendo ser modificadas para otras reacciones. Todas las amplificaciones incluyeron controles positivos (ADN de moluscos parasitados) y controles negativos (mezcla de reacción sin ADN). Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón TAE (0,04 M Tris-acético; 0,001 M EDTA) teñido con bromuro de etidio. Secuenciación y clonación de los fragmentos amplificados Los productos de PCR se purificaron mediante la digestión durante 1 h a 37°C con los enzimas exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (Amersham Pharmacia Biotech). A continuación se desnaturalizaron los enzimas a 80°C durante 15 min. Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación de los productos de PCR purificados se empleó el kit ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. El diseño de los cebadores específicos para los distintos parásitos se realizó una vez amplificado parte del gen del ARNr 18s mediante cebadores universales, posterior comparación con las secuencias de otros organismos relacionados y selección de las regiones más variables que cumplen los requisitos exigidos para esta función. Cada producto de PCR se sometió a la reacción de secuenciación al menos cuatro veces con el mismo cebador. Los productos resultantes de las reacciones de secuenciación se purificaron por precipitación con etanol/MgCl2 y se resuspendieron en 3-5 ml de formamida: tampón de carga (incluido en el kit) 5: 1 (v: v). La secuenciación se realizó, previa

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desnaturalización de las muestras a 94°C durante 3 min, en el secuenciador automático ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron con los programas Gene Jockey y Clustal X. En algunos casos, cada fragmento de PCR se insertó en un vector de clonaje TA (Invitrogen Corp.) vía los residuos de deoxiadenosina (A) añadidos durante la PCR a los extremos 3¢, y la deoxitimidina (T) del vector. Los vectores TA con el inserto se transformaron en Escherichia coli competentes One Shot TOP 10 F¢ (Invitrogen Corp.). El ADN plasmídico de los clones positivos obtenidos, se recuperó con el kit Quantum Prep Plasmid Miniprep (Biorad) en un proceso conocido como «miniprep». El ADN de los «minipreps» se amplificó de nuevo con la pareja de cebadores previamente empleada y el producto de la reacción (2,5 ml) se cortó con un enzima de restricción llamada HhaI (0,25 ml del stock de 10 U/ml, hasta un volumen final de 10 ml incluyendo 1 ml de tampón 10 ×) durante 1 h a 37°C. Los perfiles de restricción se visualizaron en un gel de agarosa al 2% en TBE teñido con bromuro de etidio, en el que se incluyó el patrón de peso molecular 100 Base- Pair Ladder (Amershan Pharmacia Biotech). Dot blot Los ácidos nucleicos extraídos y los productos de PCR se desnaturalizaron primeramente mediante calor manteniéndolos a 94°C durante 10 minutos, seguido de un tratamiento alcalino con NaOH 1M durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se trataron con una solución neutralizante (1,5M NaCl, citrato sódico 0,15M, Tris-HCl 0,25M (pH 8), HCl 0,25M), manteniéndose en hielo hasta su aplicación. Sobre una membrana de nylon (Amershan) previamente hidratada con SSC 6x, se aplicaron las muestras en un Bio-dot. Los ácidos nucleicos se fijaron a la membrana mediante calor (80°C, dos horas) y se utilizó como sonda el producto de amplificación del ADN de Marteilia aislada de Mytilus galloprovincialis procedente de Galicia. Hibridación in situ A.

Células

En un portaobjetos de vidrio se aplicaron 100 ml de células de purificado de Marteilia, se incubaron a 60°C durante 1 hora para obtener una buena adherencia, y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos. A continuación, se hicieron 2 baños de PBS 1x de 5 min y se deshidrató la muestra en soluciones crecientes de etanol. La muestra se prehibridó con una solución de formamida 50%, SSC 2x, dextran sulfato 5%, leche en polvo desnatada 0,2% a 42°C durante al menos 30 minutos. La hibridación se realizó en un aparato de PCR in situ (Perkin Elmer) dado que mantiene la temperatura más estable durante todo el proceso. Para la hibridación se añadieron 10 ml de sonda marcada con fluoresceína. Se incubó durante 10 minutos a 95°C para la desnaturalización del ácido nucleico del parásito y de la sonda y a continuación se hibridó a 42°C toda la noche. La elimi-

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nación de la sonda no unida se hizo mediante lavados en soluciones decrecientes de SSC. Las muestras se tiñeron con solución de azul de Evans al 10% en PBS y se visualizaron en un microscopio con epifluorescencia (Nikon). Como controles negativos, se incluyeron una muestra a la cual no se aplicó sonda, así como células de mejillón no infectadas por Marteilia. Mejillones adultos (Mytilus galloprovincialis) infectados con Marteilia se tomaron de la zona interna de la Ría de Arousa (A Pobla) y se mantuvieron en acuario hasta su uso. El ADN de Marteilia refringens fue cedido por el Dr F. Berthe del Laboratorio Europeo de Referencia para las enfermedades de Moluscos Bivalvos. Como controles negativos se utilizaron mejillones, M. edulis procedentes de Inglaterra, de una zona libre de Marteilia. Antes de ser utilizados se corroboró la ausencia de parásito mediante aposiciones de la glándula digestiva. Para purificar el parásito se partió de al menos 20 glándulas digestivas de mejillón fuertemente infectadas (Robledo et al., 1995). La extracción de ácidos nucleicos se realizó a partir de suspensiones de Marteilia purificada así como de glándula digestiva de Mytilus edulis no infectado procedente de Inglaterra. La reacción de amplicación en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó con «PCR beads» (Pharmacia) añadiendo los «primers», el ADN y H2O hasta un volumen final de 25 ml. Una vez resuspendido en el volumen final de 25 ml las concentraciones de los reactivos son las siguientes: 1,5 unidades de Taq polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 mM de cada nucleótido. Las muestras se sometieron a un primer ciclo de desnaturalización a 95°C durante 5 minutos seguidas de 35 ciclos de amplificación (94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto) y finalizando con un ciclo de 7 minutos a 72°C para terminar de elongar todas las cadenas. Las reacciones se hicieron en un termociclador Gene amp PCR 2400 de Perkin Elmer. Para construir la sonda se emplearon las siguientes parejas de «primers» Estos «primers» también se emplearon para medir la sensibilidad de la PCR y del «Dot blot»: – B1 («primer sense»): 5¢ CTAACGTCGCTTCACCCATGC 3¢ – B2 («primer antisense»): 5¢ CCACCGAACATCTTTCCTGGTTCG 3¢ – B3 («primer sense»): 5¢ CCCATGCAATAGAAAACACCCTGCTC 3¢ – B4 («primer antisense»): 5 ¢CGTCTGTCGAGGCCACTCCATGAC 3 ¢ B.

Tejidos

Se cortaron bloques de parafina de los moluscos parasitados en secciones de 7 mm y se depositaron en portaobjetos tratados con silano «Silane-prep slides» (Sigma). Se incubaron un mínimo de 24 h a 37°C. Las secciones fueron desparafinadas mediante dos inmersiones de 5 minutos en xileno, seguidas de dos inmersiones de 5 minutos en etanol absoluto y secadas al aire. Luego, las soluciones fueron tratadas con 75 mg/ml de proteinasa K a

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37°C durante 30 minutos, a continuación incubadas en un tampón de inactivación de la proteinasa K (0,1M Tris; 0,1 M NaCl) durante tres minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras fueron deshidratadas en dos pasos de un minuto en etanol 95° primero y en etanol absoluto después y se dejaron secar al aire. Las secciones fueron prehibridadas durante 30 min a 42°C con 500 ml de buffer de hibridación (50% de formamida; SSC 4x; 20% dextran-sulfato; 2,5 mg ARNt de levadura; 1x solución de Denhardt). Para hibridar la sonda cada corte histológico fue cubierto con un Gene Frame® (AB Gene), en donde se depositó la sonda correspondiente. Luego las muestras fueron sometidas a desnaturalización a 95°C durante cinco minutos, enfriadas en hielo durante tres minutos e incubadas toda la noche a 42°C para que se produjera la hibridación. Por último las secciones fueron lavadas dos veces durante cinco minutos en SSC 2x a temperatura ambiente y una vez a 42°C en SSC 0,4x durante diez minutos. La detección de la sonda marcada fue realizada mediante el DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Estudios de validación de PCR en la diagnosis de Marteilia Se realizaron estudios de comparación de técnicas tradicionales de diagnóstico de los tres principales patógenos de moluscos bivalvos (histología, citología) con técnicas de biología molecular (PCR) con los «primers» 2S y 3As. En paralelo, se tomaron tejidos de cada molusco tanto para biología molecular, como para histología (fijación en Davidson) y para la realización de improntas. Los análisis se realizaron además de forma paralela y sobre los mismos individuos en el Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo (CSIC) así como en el Centro de Control de Medio Marino (Xunta de Galicia) para comprobar la repetibilidad de los ensayos. En el caso de Marteilia sp., se realizó un muestreo en 4 zonas distintas de mejillón (30 individuos por zona). Se comparó la similitud entre técnicas, así como su sensibilidad.

IX.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inmunodiagnosis Se seleccionaron 6 anticuerpos monoclonales específicos tanto de los esporoblastos como de las esporas. Cuatro de estos anticuerpos se unieron a la pared del esporoblasto, sin embargo la intensidad de fluorescencia no fue la misma en todos los esporoblastos y a algunos esporoblastos no se unieron los anticuerpos (Fig. IX.2). La especificidad de dichos anticuerpos se demostró puesto que no existió reacción cruzada con el mejillón con ninguno de los anticuerpos utilizados. Perkins (1976) señala que la pared se forma alrededor de cada esporoblasto en desarrollo y que está formada por una serie de campos granulares. Nuestros resultados indican que la pared de los esporoblastos no estaban en el mismo estado de desarrollo, por lo tanto no todos los antígenos estarían expresados totalmente.

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También es posible que los epitopos de Marteilia sp. hayan sido modificados en el procesos de purificación. Las pequeñas partículas fluorescentes observadas podrían proceder de restos de paredes de esporoblastos. También se obtuvieron anticuerpos contra las esporas de Marteilia sp. Dos de los anticuerpos monoclonales reaccionan aparentemente sólo con la espora. A algunas esporas dentro del esporangio no se les unió el anticuerpo, sin embargo las esporas libres si presentaban fluorescencia. Es posible que los anticuerpos no puedan atravesar la pared del esporoblasto y alcanzar los epitopos de la espora. La zona roja observada en el interior de la espora podría corresponder al núcleo. Estos anticuerpos monoclonales podrían ser específicos de algún componente del citoplasma. Todos los anticuerpos monoclonales ensayados con Marteilia refringens de Mytilus galloprovincialis de España indican la presencia de epitopos comunes. Villalba et al. (1993) identificaron la especie presente en M. galloprovincialis como M. refringens. Tal como se discutió anteriormente en un experimento de campo, Figueras y Robledo (1993) encuentran que Marteilia, entonces sp., de mejillones no infecta ostras planas (Ostrea edulis). Los anticuerpos producidos pueden ser utilizados para ayudar a entender la problemática de las especies del género Marteilia así como el ciclo biológico de este parásito. Todavía queda por conocer la localización subcelular de los epitopos mediante la técnica del immunogold. Además, los isotipos de cada anticuerpo monoclonal deben ser conocidos en el futuro. Estos anticuerpos fueron ensayados por Anderson et al. (1994) contra Marteilia sydneyi sin observarse reacción. Las técnicas de inmunodiagnóstico desarrolladas podrían, por tanto, utilizarse para diferenciar aislados de Marteilia de diferentes orígenes geográficos y hospedadores, lo cual nos permitiría, en último término, clarificar la taxonomía y las relaciones filogenéticas de este género realizando comparaciones entre miembros del grupo Paramyxea aislados de diferentes hospedadores en todo el mundo. La heterogeneidad de los anticuerpos policlonales proporciona una mayor capacidad para la detección de antígenos específicos de cada estadío del parásito (Burreson, 1988). La utilización de la mezcla de todos los Mabs va a permitir detectar más estadíos del parásito, lo cual puede ser útil para la búsqueda de Marteilia en huéspedes alternativos, permitiendo esclarecer su ciclo de vida, hasta hoy todavía desconocido. La aplicación de estos anticuerpos monoclonales a la detección de Marteilia en cortes histológicos mediante inmunofluorescencia dio resultados negativos (Tabla IX.1). Una posible justificación de los resultados obtenidos mediante esta técnica, podría ser que los epítopos hayan sido modificados por los procesos de fijación o calor para su absorción al portaobjetos. Por otra parte, quizá algunos anticuerpos no atraviesen la pared esporangial. Sin embargo, tras el tratamiento con tripsina-Cl2Ca para aumentar la permeabilidad de la célula, los resultados continuaron siendo negativos. Mediante el empleo de los anticuerpos monoclonales conjugados con peroxidasa en la detección del parásito en preparaciones histológicas se obtuvieron re-

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

181

TABLA IX.1 Comparación de las técnicas de inmunodiagnóstico

IF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inmunofluorescencia en tejido . Inmunoperoxidasa en tejido . . . Inmunodot . . . . . . . . . . . . . . . ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1/1-1

3/1-1

4/1-1

6/2-3

9/1-1

– – – – –

+ – + – +

+ – – + +

+ – + + +

+ – + + +

12/1-1 Mezcla + – – – +

+ – + + +

sultados positivos. Estos resultados contrastan con los obtenidos mediante inmunofluorescencia, pudiendo estar ocasionados por una diferencia en la sensibilidad de las técnicas. Mediante los sistemas enzimáticos, por la formación de un complejo antígeno-anticuerpo se produce la transformación de muchas moléculas de sustrato, mientras que en los sistemas de fluorescencia la relación es 1:1. Por esta razón los sistemas enzimáticos son, generalmente, más sensibles. La técnica del ELISA es ampliamente utilizada en el campo de la medicina y veterinaria dada su sensibilidad, rapidez, automatización y capacidad de cuantificación (Yolken, 1982). En la Figura IX.4 se muestra la sensibilidad de este ensayo utilizando el anticuerpo monoclonal 9/1-1, ya que fue el que presentó mayores valores de densidad óptica en los análisis anteriores. Como se puede observar, se obtuvo un límite de detección de 400 células. Los controles negativos no presentaron reacción. Los anticuerpos monoclonales ensayados mediante ELISA, reaccionaron únicamente con las células de Marteilia y no con las de mejillón, siendo por tanto una técnica específica. Por otra parte, el inmunodot también resultó ser específico pero no cuantitativo. Con las dos técnicas se obtienen mejores resultados después de la sonicación. En la Tabla IX.2 se muestran los datos de absorbancia obtenidos mediante ELISA sonicando y sin sonicar. Quizá este resultado es producto de una debilitación o incluso de la ruptura de la membrana de la pared esporangial, facilitando un mejor acceso de los Mabs dirigidos contra los epítopos de las esporas. TABLA IX.2 Datos de absorbancia obtenidos mediante ELISA sonicando y sin sonicar la muestra Anticuerpos monoclonales

Marteilia sonicada. . . . Marteilia sin sonicar . .

3/1-1

4/1-1

6/2-3

9/1-1

12/1-1

Mezcla

0,648 ± 0,005 0,437 ± 0,006

0,358 ± 0,025 0,268 ± 0,006

0,114 ± 0,016 0,088 ± 0

0,960 ± 0,007 0,600 ± 0,089

0,314 ± 0,013 0,148 ± 0,001

1,048 ± 0 0,530 ± 0

* Los datos representan unidades de densidad óptica ± desviación estándar.

182

Beatriz Novoa et al.

Diagnóstico mediante técnicas de biología molecular Análisis de secuencias Se secuenció el gen que codifica el ARNr 18s de Marteilia sp que había sido aislada y purificada de Ostrea edulis, Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis procedente de Francia, España y Croacia. Las secuencias del parásito fueron idénticas independientemente del hospedador y del origen geográfico de los bivalvos Debido a la baja prevalencia de Marteilia en España hubo que analizar más de 1000 mejillones y ostras para conseguir suficiente Marteilia purificada. Muy pocos animales estaban lo suficientemente parasitados para que su utilización en la purificación mereciera la pena. Basándonos en los alineamientos de secuencias con otros parásitos, la secuencia de Marteilia refringens contenía regiones variables que son específicas para Marteilia refringens. Los análisis filogenéticos de las relaciones entre las secuencias del gen del ARNr 18s de Marteilia refringens y las de 26 eucariotas muestran que M. refringens no está relacionada con ningún organismo eucariota cuya secuencia sea conocida. La región variable de la secuencia, que es específica para M. refringens, se empleó para preparar una sonda que utilizamos en los experimentos de hibridación in situ. Estos experimentos demostraron una fuerte reacción positiva de las células de M. refringens y confirmaron la identidad de la secuencia obtenida confirmando que pertenecía a M. refringens. Los «primers» diseñados para Marteilia refringens amplificaron específicamente Marteilia aislada de Mytilus galloprovincialis procedente de las rías gallegas, sin reaccionar con el hospedador. Regiones ITS de Marteilia. Tipado por PCR de cepas de Marteilia Debido a la elevada homología que encontramos entre todas las secuencias del ARNr 18s de todas las Marteilia purificadas de una gran variedad de hospedadores y de localidades geográficas, nos planteamos buscar la existencia de polimorfismo en la región espaciadora ITS. El objetivo era determinar la existencia de distintas especies de Marteilia en Europa. Ya que las regiones no codificantes de los genes ribosómicos evolucionan más rápidamente que el gen del ARNr 18s, comparamos la secuencia de esta región ITS de parásitos procedentes de distintos hospedadores y localidades. El análisis de las secuencias de esa región ITS indica la existencia de dos grupos genéticos dentro de M. refringens. La diferencia entre estos dos grupos esta basada en un valor de bootstrap (equivale a muestreos con reemplazamiento) de 98%. Las secuencias que definen un grupo se obtuvieron mayoritariamente de Marteilia purificada de mejillones mientras que aquellas del otro grupo se obtuvieron de Marteilia aislada de ostras. Esto nos condujo a definir dos grupos de M. refringens el tipo «M «(mejillón) y el tipo «O» (ostra). El análisis de los productos de PCR mediante la técnica RFLP de la región ITS, confirmaron el polimorfismo de secuencias ya que en los geles de agarosa en

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

183

los que visualizábamos los productos de PCR tratados con los enzimas de restricción, detectábamos dos perfiles que correspondían a la Marteilia del mejillón (tipo «M») y la de la ostra (tipo «O») (Fig. IX.5). En Francia, el tipo «M» de Marteilia siempre se detectaba en mejillones y el tipo «O» en ostras. Sin embargo, en la zona de La Trinité en la que ambas especies, ostra y mejillón, estaban infectadas con Marteilia, de quince mejillones infectados con Marteilia y de 20 ostras, un ejemplar de cada especie estaba infectados simultáneamente por Marteilia tipo «O» y «M». En el caso de Marteilia aislada de Mytilus galloprovincialis en Croacia, el análisis de su ITS por RFLP en todos los clones mostraron un perfil similar a la Marteilia aislada de Mytilus edulis de Francia. Los resultados obtenidos en Francia parecían indicar la existencia de dos especies de Marteilia: una de declaración obligatoria, que parasita a ostra (Marteilia refringens) y otra que parásita a mejillón (Marteilia maurini) y que no parece provocar mortalidades. Sin embargo, en España, los resultados de los análisis realizados empleando la técnica de RFLP de los distintos aislados de Marteilia procedentes de varias localidades de la Península Ibérica mostraron una mayor complejidad que los de Francia: – De los 38 clones analizados de Marteilia procedente de Mytilus galloprovincialis cultivados en Galicia, la mayoría (79%) pertenecía al tipo M. – Se analizaron 16 clones de Marteilia obtenidos de 5 ostras planas infectadas con Marteilia procedentes del Delta del Ebro (Mar Mediterráneo): 2 clones fueron clasificados como tipo «M» y 14 como tipo «O». Tres de estas cinco ostras tenían Marteilia sólo del tipo «O». Las otras dos tenían ambos tipos «O» y «M». – También analizamos 26 clones de Marteilia aislada de 7 ostras planas infectadas procedentes de Huelva (Atlántico Sur europeo). 16 de estos 26 clones pertenecían al tipo «M» y 9 al tipo «O». Un clon presentaba un perfil de RFLP totalmente distinto a estos dos «O» y «M». En las siete ostras infectadas no se detectó coinfección de los dos tipos de genéticos de Marteilia, excepto el nuevo perfil que se detectó en una ostra con Marteilia tipo «M». El empleo de la RFLP de la región ITS como marcador poblacional en el caso de las Marteilia procedentes de Ostrea edulis de Grecia y de Mytilus galloprovincialis de Italia reveló en primer lugar un gran número de moluscos coinfectados con ambos tipo de parásito, tanto el Tipo O (Marteilia refringens) cómo el Tipo M (Marteilia maurini). La Tabla IX.3 recoge los resultados tanto de los perfiles encontrados en la Península Ibérica como de los presentes en Italia y Grecia. Esto es consecuente con los resultados obtenidos por López-Flores et al. (2004) en diversas localidades del Mediterráneo y en Galicia. Además ya se observó la presencia de Marteilia en ostra de Huelva cuya forma mayoritaria era tipo M (Novoa et al., 2005). Una objeción a la técnica de RFLP como técnica de diagnóstico específico, radica en que la diferenciación mediante dianas de restricción reduce la información obtenida de una secuencia a los puntos de interés y obvia el resto de la variabilidad acumulada. La presencia de estos dos tipos moleculares podría es-

184

Beatriz Novoa et al.

tar relacionado con un cierto grado de separación, o incluso tratarse de cepas distintas, pero no parece suficiente evidencia para considerar M. maurini como una especie diferente de M. refringens. Todo esto, añadido a la información relativa a la debilidad de los argumentos ultrastructurales empleados para diferenciar dichas especies (en la Figura IX.3 podemos apreciar la similitud existente en características ultrastructurales de Marteilia procedente de ostra plana y mejillón) y a las secuencias recogidas en la bibliografía, nos sugiere que se debe considerar a M. refringens como el agente causante de la marteiliosis en mejillón (M. edulis y M. galloprovincialis) y en ostra plana (O. edulis) en Europa. Nuestros estudios, demuestran que aunque hay dos líneas evolutivas diferenciadas que corresponden más o menos estrictamente con los tipo «M» y «O», basándonos en la filogenia esperada, es evidente que algunos tipos «O» habían pasado a tipos «M» y viceversa. Además, encontramos Marteilia tipo «O» en mejillón y tipo «M» en ostra lo cual sugiere que ha habido varias transmisiones de especies de Marteilia entre mejillones y ostra.

TABLA IX.3 Porcentaje de cada tipo de Marteilia encontradas en M. galloprovincialis y O. edulis procedentes de diferentes localidades de España y del Mediterráneo según RFLP de los productos de PCR clonados Hospedador Mejillones . . Mejillones . . Ostras . . . . . Ostras . . . . . Ostras . . . . .

Número de Tipo M Tipo O animales Clones (%) (%) infectados 13 14 9 5 7

38 60 40 16 26

79 47 25 12 61

21 53 75 88 29

Otro perfil (%)

Coinfección (n.º animales)

0 0 0 6 0 4 0 2 10 (Tipo X) 1 (De tipos M y X)

Localidad Ría de Arousa La Spezia (Italia) Kavála (Grecia) Delta del Ebro Huelva

Sensibilidad de las técnicas de biología molecular para el diagnóstico de Marteilia Los «primers» B1-B2 y B3-B4 son sensibles para el ADN de Marteilia aislada de Mytilus galloprovincialis procedente del litoral gallego. El producto de PCR de aproximadamente 650 pares de bases es detectable con 150 ng de ADN de Marteilia purificada y con el ADN extraído de 2´106 células, sin observar la formación de ningún producto con 1,5 mg de ADN de mejillón Mytilus edulis no infectado. La sensibilidad resultante es algo inferior a la obtenida para otros parásitos protozoos (Anderson et al., 1995; Kellner-Cousin et al., 1993; Stokes et al., 1995). Sin embargo, la posibilidad de realizar una nested PCR con los «primers» internos B3-B4 aumenta considerablemente la sensibilidad hasta 15 fg y 2´105 células. Esta reamplificación incrementa no sólo la sensibilidad, ya que se aumenta el número de ciclos, sino también la especificidad, puesto que utiliza «primers» contenidos dentro de los productos obtenidos en la primera amplificación.

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

185

Los resultados negativos obtenidos con el ADN de M. edulis al utilizar los primers específicos, B1-B2 y B3-B4, indican que dichos «primers» no hibridan con el genoma del mejillón. La sonda no radioactiva derivada del fragmento B3-B4 resulta igualmente específica para este parásito en los ensayos de hibridación mediante «Dot blot», detectando aproximadamente 75 mg del ADN del parásito. Su utilización en combinación con la PCR aumenta hasta en dos órdenes de magnitud la sensibilidad de esta técnica. Una de las ventajas de la técnica del «Dot blot» es el gran número de muestras que pueden ser analizadas simultáneamente, siendo esto de gran interés puesto que permite el análisis de muchos productos de PCR, a la vez que aumenta su sensibilidad. Los resultados positivos obtenidos mediante hibridación in situ confirman la especificidad de la sonda. La prueba no radioactiva hibridó específicamente con las células de Marteilia purificada, sin observarse señal con células no infectadas ni con el control negativo. Aunque estos resultados no se produjeron ni en frotis ni en cortes histológicos a pesar de utilizar tratamientos que facilitan la penetración de la sonda, se ha descrito la hibridación en diferentes especies de Marteilia a lo largo del mundo (Kleeman et al., 2002; Thèbault et al., 2005). En las Tablas IX.4 y IX.5 se muestra la sensibilidad de Dot blot» y «PCR» en cuanto a cantidad de ADN y número de células de Marteilia detectadas. TABLA IX.4 Comparación en la sensibilidad del «Dot blot» frente a la «PCR» simple y a la nested «PCR» 1,5 mg

150 ng

15 ng

3 ng

1,5 ng

150 fg

15 fg

– + + + +

– + + + +

– – + + +

– – + + +

– – – + +

– – – + +

– – – – +

«Dot blot» . . . . . . . . . PCR . . . . . . . . . . . . . PCR/Dot . . . . . . . . . . «Nested» PCR . . . . . . «Nested» PCR/dot . . .

TABLA IX.5 Comparación de los métodos «Dot blot», PCR simple y «nested» PCR en el número de células detectadas 7

6

5

2´10 2´10 2´10 2´10 «Dot blot» . . . . . . . . . . . . PCR . . . . . . . . . . . . . . . . PCR/Dot . . . . . . . . . . . . . Nested «PCR» . . . . . . . . . Nested «PCR»/«Dot blot».

– + + + +

– + + + +

– – + + +

– – – – +

4

10

4

– – – – –

3

3

4´10 2´10 4´10 – – – – –

– – – – –

– – – – –

2

200

100

– – – – –

– – – – –

186

Beatriz Novoa et al.

Comparación de las técnicas citológicas, histológicas, inmunológicas y de biología molecular para el diagnóstico de Marteilia Hemos realizado la diagnosis de Marteilia directamente en muestras de mejillón Mytilus galloprovincialis utilizando diversas técnicas. Los resultados indican que la amplificación por PCR con «primers» específicos para dicho parásito fue la más sensible detectándose el parásito en 13 de 20 muestras (65%). Estos porcentajes disminuyeron al aplicar las técnicas convencionales de aposiciones de tejidos (25%) e histología (20%), así como los inmunoensayos aplicados, que detectaron el parásito en tres ocasiones. Boulo et al. (1989) realizaron comparaciones entre los sistemas de diagnóstico clásico y la detección mediante anticuerpos monoclonales del parásito Bonamia ostreae. En aquellas ostras que presentaban niveles ligeros de infección se observó discrepancia. Los autores sugirieron que más que un problema en la sensibilidad de las técnicas de diagnóstico convencionales empleadas, se debe a la presencia o ausencia de Bonamia en la parte de la muestra examinada. La observación de cortes histológicos resultó menos eficaz que la técnica de PCR. Aunque esta técnica resultó ser menos sensible, no se debe olvidar que la histología nos proporciona una información valiosa en cuanto a la localización del parásito dentro del huésped, así como los daños producidos por el mismo. Las técnicas inmunológicas aplicadas a la detección de células de Marteilia purificada resultaron ser sensibles y específicas. Cuando la técnica de inmunodot se aplicó a las muestras, sólo se detectaron 3 de los 20 casos analizados, aunque todos ellos habían resultados positivos por otras técnicas, mostrando que la especificidad era buena. Sin embargo, con la técnica del ELISA, una muestra que había resultado negativa al aplicar las otras técnicas resultó positiva, sugiriendo que se trata de un falso positivo. Esto no implica que dicha técnica tenga que ser rechazada, puesto que resultó ser específica y sensible al aplicarla a la detección de células de Marteilia purificada. Ahora bien, puesto que estos resultados son preliminares, para la utilización del ELISA en la detección del parásito en muestras de tejido, se ha de profundizar más en estudios futuros para evitar los falsos positivos. La hibridación mediante «Dot blot» es una técnica de biología molecular ampliamente utilizada en la diagnosis de parásitos (Mc Cutchan et al., 1988; Kellner-Cousin et al., 1993; Stokes y Burreson, 1995) presentando la ventaja, al igual que el ELISA, de poder analizar varias muestras simultáneamente. En este trabajo se ha observado que aunque específica no ha resultado muy sensible, ya que no se han detectado dos casos positivos mediante frotis. La falta de sensibilidad podría deberse a la pequeña cantidad de ADN del parásito frente al huésped, resultando en una pérdida de sensibilidad porque disminuye la posibilidad de contacto y unión de la sonda y el ADN. Marcajes radioactivos de la sonda aumentarían la sensibilidad, pero su empleo no es muy recomendable, debido a los problemas que conlleva el uso de isótopos radioactivos. La técnica de hibridación in situ ha sido empleada por varios autores para comprobar la especificidad de las sondas y para la detección de varios parásitos

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

187

protozoos. Así, Stokes et al. (1995) utilizaron una sonda de ADN para la observación de plasmodios de Haplosporidium nelsoni en cortes histológicos. De la misma manera, el parásito Minchinia teredinis es detectado en su huésped, Teredo spp (Stokes et al., 1995). Células de hemolinfa infectadas por el parásito protozoo Haplosporidium nelsoni fueron detectadas por Fong et al. (1993) mediante la técnica de hibridación in situ. La posibilidad de realizar esta técnica sobre aposiciones de tejido, es de una gran aplicación al campo de la acuicultura, puesto que proporcionaría una manera rápida y sencilla de detectar el parásito, sin tener que realizar las técnicas histológicas, que requieren tiempo y especialización. Los resultados obtenidos con purificado de Marteilia han sido positivos, lo que incita a una profundización en la aplicación de esta técnica. La amplificación mediante PCR del ADN del parásito proporciona un indicador de la presencia o ausencia del parásito que puede ser de utilidad en un gran número de situaciones prácticas. En comparación con los otros métodos empleados resultó ser la más sensible, detectándose en 8 casos más que la técnica de aposiciones de tejido. Stokes et al. (1995) realizaron la comparación entre los métodos, análisis de hemolinfa, histología y PCR con «primers» específicos, para diagnosticar la infección por el parásito Haplosporidium nelsoni. Sus resultados muestran que de los 20 individuos analizados, 19 son detectados por PCR, frente a los 11 diagnosticados por el análisis de hemolinfa y a los 10 mediante histología, mostrando que la técnica de amplificación por PCR es la más sensible. La principal desventaja de la PCR frente a otros métodos es que no es fácilmente cuantificable. La eficiencia de la PCR depende de un gran número de factores. Debido a que consiste en una multiplicación exponencial del ADN a amplificar, la variación en la cantidad de ADN inicial, la presencia de inhibidores y la gran cantidad de componentes implicados en la reacción de amplificación, origina grandes diferencias en el producto formado. Sin embargo, se han desarrollado métodos de cuantificación mediante PCR-competitiva (Piatak et al., 1993), y métodos semicuantitativos en el diagnóstico de Perkinsus marinus (Marsh et al., 1995). Recientemente se está popularizando la PCR en tiempo real que permite una cuantificación de forma simple. El movimiento de especies ha sido el causante de la dispersión de múltiples enfermedades de los moluscos bivalvos. El control de estas enfermedades, antes de su importación, previene la transferencia de especies infectadas a zonas libres del parásito. La PCR proporciona una oportunidad para detectar infecciones de baja intensidad con mayor sensibilidad que las técnicas tradicionales. El uso de la PCR podría, por otra parte, ser útil en la certificación de la semilla. Los posibles falsos negativos obtenidos mediante la observación de los cortes histológicos pueden ser evitados mediante el uso de dicha técnica. Esto permitiría a los «criadores» la compra de semilla libre de parásitos. El ciclo de vida del protozoo Marteilia es hasta ahora desconocido. La disponibilidad de una técnica específica y sensible como la PCR va a permitir un rápido screening de múltiples posibles huéspedes intermediarios. De hecho, en Francia se ha demostrado la presencia de Marteilia refringens en el copépodo Paracartia grani, pre-

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Beatriz Novoa et al.

sente en los estanques dónde se mantienen las ostras antes de su consumo para engorde y mejora de sus propiedades organolépticas. Sin embargo, no se pudo completar el ciclo de vida, puesto que aunque se pudo transmitir desde ostras infectadas a copépodos sanos, no fue posible transmitirlo desde copépodos infectados a ostras sanas, lo que sugiere la presencia al menos de otro hospedador intermediario en el ciclo de vida del parásito que originase las formas infectivas para el molusco (Audemard et al., 2002). En el curso de los mismos experimentos también se observó la presencia del ADN del parásito en el cnidario Cereus pedunculatus, aunque no se pudo demostrar la presencia de M. refringens en los tejidos por hibridación in situ. La técnica de PCR in situ permite la amplificación de ADN en combinación con la hibridación, sumando a las ventajas anteriormente citadas de la hibridación, la sensibilidad y especificidad de la técnica de PCR. Sin embargo, a causa de la necesidad de instrumentación y laboratorios muy especializados, así como de personal muy cualificado, su uso no está muy extendido. Estudios de validación de PCR en la diagnosis de Marteilia Hemos realizado la diagnosis de Marteilia directamente en muestras de mejillón Mytilus galloprovincialis utilizando diversas técnicas y comparando los resultados entre dos laboratorios. Los resultados indican que la amplificación por PCR con «primers» específicos (Fig. IX.6) para dicho parásito fue la más sensible (Tabla IX.6). La observación de cortes histológicos resultó menos eficaz que la técnica de PCR. Aunque esta técnica resultó ser menos sensible, no se debe olvidar que la histología nos proporciona una información valiosa en cuanto a la localización del parásito dentro del huésped, así como los daños producidos por el mismo. Sin embargo, en uno de los laboratorios participantes en el experimento de comparación de técnicas, se pudo comprobar que la histología puede ser tanto o más sensible que la biología molecular. Esta disparidad podría deberse a la inexperiencia con las técnicas de biología molecular, unida a la destreza en la detección microsTABLA IX.6 Resultados de diferentes técnicas de diagnóstico realizadas en dos laboratorios diferentes, el Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo y el Instituto Tecnológico para o Medio Mariño de Vilaxoán N.º Positivos

Muestras analizadas

% Positivos

PCR

A B

26 5

120 120

21,7 4,2

Histología

A B

7 6

120 120

5,8 5,0

Citología

A B

5 5

120 120

4,2 4,2

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

189

cópica de Marteilia. Esta disparidad también se manifiesta en las medidas de similitud entre técnicas y laboratorios (Tabla IX.7). TABLA IX.7 Similitud obtenida entre técnicas y laboratorios mediante el coeficiente de coincidencia simple

PCR A PCR B Histología A Histología B Citología A Citología B

PCR A

PCR B

1,000 0,825 0,975 0,983 0,983 0,983

1,000 0,800 0,808 0,808 0,808

Histología A Histología B Citología A Citología B

1,000 0,992 0,992 0,992

1,000 0,983 0,983

1,000 1,000

1,000

Son muchos los factores que han de tomarse en cuenta a la hora de la elección de una técnica para el diagnóstico de un parásito. En la Tabla IX.8 se muestra la valoración de las técnicas empleadas en el diagnóstico de Marteilia, atendiendo a los criterios de estandarización, objetividad, rapidez, sensibilidad y especificidad. Debido a la carencia de mejillones resistentes a la enfermedad y de métodos de tratamiento efectivos, es importante el desarrollo de nuevos sistemas diagnóstico, que apoyen estrategias para el control de la enfermedad. Las técnicas desarrolladas en este trabajo van a permitir un diagnóstico más rápido y eficaz de Marteilia pudiendo ser aplicadas en estudios futuros para el desarrollo de métodos que permitan la prevención y control de la Marteiliasis, así como su aplicación en la búsqueda de un huésped alternativo. TABLA IX.8 Comparación entre diferentes tipos de técnicas empleadas en el diagnóstico de enfermedades de moluscos Técnica

Duración

Siembra e identificación de bacterias Inoculación en líneas celulares-seroneutralización (virus)

Media (horas) Alta (7 días) Media (2-3 días) Alta (semanas) Media (horas) Baja (horas)

Citología Histología

ELISA (inmunodiagnóstico) PCR

Coste

Especificidad

Cualificación técnica

Bajo

Elevada

Media

Medio

Se cubre todo

Alta

Medio

Elevada

Media-Alta

Alto

Media

Alta

Medio

Media

Media

Alto

Alta

Media

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

191

Figura IX.1. (A) Corte histológico de mejillón, Mytilus galloprovincialis. Células primarias de Marteilia refringens en el epitelio digestivo. (B) Aspecto de una infección avanzada, con los túbulos digestivos del mejillón repletos de esporangiosoros refringentes. (C) Frotis de glándula digestiva. Escala: 50 mm.

Figura IX.2. Detección de Marteilia mediante un anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína que reacciona con las paredes de los esporoplasmos.

192

Beatriz Novoa et al.

Figura IX.3. (A) Célula primaria de Marteilia sp. con una célula secundaria (B) Esporangiosoro con 8 preesporangios y esporas inmaduras (C) Espora madura de M. refringens mostrando 3 esporoplasmas, pared engrosada característica de madurez y haplosporosomas esferoides (D) Haplosporosomas esferoides de M. refringens de ostra plana mostrando médula y córtex (E) Haplosporosomas oblongos y esferoides de Marteilia sp. de mejillones. Nótese el cortex y la médula y el engrosamiento de la pared. (F) Inclusiones de placa estríada en el citoplasma de los esporangiosoros en desarrollo. Escalas de las figuras indicadas mediante barras: (A) = 1 mm; (B) = 2 mm; (C) = 500 nm; (D) = 100 nm; (E) y (F) = 200 nm

IX. Diagnóstico de enfermedades de mejillón: Marteilia refringens

Figura IX.4.

193

Límite de detección de Marteilia aplicando la técnica de ELISA.

Figura IX.5. Detección de polimorfismos en la región ITS-1 de Marteilia.

Figura IX.6. Gel de agarosa de los productos de PCR amplificados con los «primers» 2S-3As. La calle 1 y 9 incluyen un marcador de peso molecular de 100 pb. La calle 2 incluye un control positivo de una muestra fuertemente parasitada y la calle 8 un control negativo sin ADN.

ECOFISIOLOGÍA DEL MEJILLÓN

X.

MODELOS DE COMPORTAMIENTO ALIMENTARIO EN EL MEJILLÓN DE LAS RÍAS DE GALICIA M.ª JOSÉ FERNÁNDEZ-REIRIZ, PEDRO DUARTE y UXIO LABARTA

X.1.

INTRODUCCIÓN

La mayor parte de los modelos desarrollados para describir el comportamiento alimentario de los moluscos bivalvos se han basado en las relaciones empíricas entre procesos fisiológicos y variables ambientales (Hawkins et al., 1999; Pouvreau et al., 2000). Algunas de estas relaciones parecen ser ampliamente aplicables, pero su poder predictivo con nuevos datos es desconocido. El uso de relaciones mecanicistas puede ser más adecuado, dado que estas implican mecanismos de relación causa-efecto descritos por parámetros significativos biológicamente. Uno de los escasos modelos mecanicistas de fisiología de los bivalvos es el de Willows (1992). Este modelo es un intento de describir el comportamiento alimentario de los bivalvos siguiendo una enfoque de optimización. El inconveniente de este tipo de modelos es que por lo general incluyen muchas interacciones entre las diferentes variables, parámetros y procesos que son difíciles de medir y por tanto escasamente disponibles para muchas especies. El desarrollo de los modelos mecanicistas depende de un conocimiento cuantitativo en profundidad de los sistemas modelados, incluyendo en este conocimiento las interacciones o compromisos entre los diferentes procesos. Algunos autores tienen discutido la idea de un principio termodinámico para describir el «objetivo» que los sistemas buscan para sobrevivir. Uno de estos objetivos fue definido como el principio de «maximun power» (Lotka, 1922a y b). Este principio establece que si existen dos sistemas competitivos (Individuos, poblaciones, comunidades, ecosistemas) el superviviente sería el más eficiente en la transformación de energía, acumulando una mayor cantidad de energía libre para el trabajo

198

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

(crecimiento, reproducción) por unidad de tiempo. Es aceptado generalmente que aquellos comedores óptimos presentan ventajas en una población. También se acepta que el «objetivo» debe ser la ganancia máxima de energía neta, de acuerdo con el principio de «maximun power». Si se asume que las pérdidas metabólicas son linealmente proporcionales a la ganancia neta de energía, entonces la maximización de la absorción orgánica es equivalente a la maximización de la ganancia neta de energía. Esto parece ser cierto en los bivalvos, donde se ha podido establecer una relación lineal entre pérdidas metabólicos e incorporación de energía (Hawkins et al., 1989; Widdows and Hawkins, 1989) o crecimiento (Jørgensen, 1990), en mejillones y otras especies. El primer proceso en la alimentación de bivalvos filtradores es el bombeo de agua, medido como tasa de aclaramiento (CR). Una regulación fisiológica de la tasa de ingestión en función de los requerimientos nutricionales, a partir de la CR, fue propuesta por Winter (1978). Nuevos y más recientes resultados han permitido demostrar que la CR varía como una función de la concentración y calidad del seston (Bayne, 1993, 1998; Bayne et al., 1993; Hawkins et al., 1999). Según Jorgensen (1990, 1996), estos cambios dependen del ambiente físico y no de una regulación fisiológica. Sin embargo Bayne (1992) sugiere que cada uno de los cambios puede se controlado fisiológicamente. Riisgård (2001) y Riisgård et al. (2003) consideran que el cierre valvar es una respuesta mecanicista de la regulación fisiológica. La tasa de aclaramiento (CR) no es el único proceso implicado en la maximización de la absorción orgánica y ganancia neta de energía, así, los procesos selectivos del alimento también son importantes (Bayne, 1992). Sin embargo, en ecosistemas de baja carga de seston como son las rías gallegas (Materia orgánica particulada total (TPM) < 3 mg l–1), donde la mayor parte del seston disponible es fitoplancton (Figueiras et al., 2002), los procesos selectivos pueden tener una importancia menor que en aguas de elevada turbidez, con altos contenidos en TPM. Esto se ha demostrado por la ausencia de seudoheces en los experimentos de alimentación desarrollados en condiciones de concentraciones naturales de seston en la Ría de Arousa (Figura 1). Algunos autores consideran que la CR es constante y máxima hasta un cierto límite de concentración de TPM, por encima del cual presenta un fuerte descenso (Winter, 1973, 1978; Raillard et al., 1993; Raillard and Ménesguen, 1994 and Smaal, 1997). Los modelos de crecimiento potencial (SFG) de los bivalvos filtradores incluyen su alimentación, digestión, excreción y metabolismo (Hawkins et al., 2002). Para construir cada modelo es necesario disponer de una cantidad significativa de datos para la especie objetivo, así como datos de las condiciones ambientales bajo las cuales los procesos fisiológicos son estudiados. Las investigaciones pueden desarrollarse en el laboratorio, bajo condiciones controladas de temperatura y alimento (Hawkins et al., 2002), o en el medio natural (Babarro et al., 2000 a y b, y este trabajo). En los trabajos en laboratorio es posible establecer las respuestas fisiológicas a rangos predefinidos de variables ambientales e identificar curvas o superficies de respuesta que puedan ser utilizadas en los modelos matemáticos. La capacidad de aclimatación y sus adaptaciones compensatorias a cambios en la

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

Figura 1.

199

Ría de Arousa. Los asteriscos muestran el lugar donde se llevó a cabo el trabajo experimental.

disponibilidad de alimento (Bayne, 1993) incrementa la complejidad de predicción de su comportamiento alimentario. A pesar de las dificultades mencionadas anteriormente, los modelos de SFG pueden tener una importante aplicación práctica en las zonas de producción de mejillones como es el caso de las Rías de Galicia. Si el SFG puede predecirse a partir de variables ambientales como la temperatura del mar o la concentración de clorofila, las cuales pueden ser monitorizadas automáticamente, los modelos operativos pueden ser utilizados para prever las condiciones fisiológicas de los mejillones cultivados en batea y optimizar las prácticas de gestión de su cultivo. Practicas que pueden incluir variaciones en la densidad de cultivo y localización en función de la capacidad de carga medioambiental (Duarte et al., 2003). En este trabajo se pretende construir un sencillo modelo matemático del crecimiento potencial (SFG) del mejillón, utilizando las características de calidad del agua y datos fisiológicos obtenidos en la Ría de Arousa (Galicia), una importante área de cultivo de mejillón, dirigido a dar respuesta a los siguientes interrogantes: 1. ¿Cuales son los principales condicionantes que afectan a las tasas de aclaramiento e ingestión (CR e IR, respectivamente) en la Ría de Arousa?

200

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

2. ¿Es posible predecir el SFG del mejillón utilizando relaciones simples entre parámetros de la calidad del agua y alguno de los procesos fisiológicos mencionados? 3. ¿Cómo maximizan su absorción orgánica los mejillones en ecosistemas de baja carga de seston? X.2.

MATERIAL Y MÉTODOS

Trabajo experimental Cosecha y mantenimiento de los mejillones Se cultivaron semillas de Mytilus galloprovincialis de aproximadamente 20 mm de longitud sobre bateas en una zona media exterior de la Ría de Arousa (Galicia, NW de España) (Fig. 1). El cultivo experimental comenzó en invierno bajo condiciones de producción en batea (500 m2). Se realizaron dos series de experimentos una en 1995-96 y otra en 1998, y ambas cubrieron la primera fase del cultivo de mejillón desde semilla a desdoble (50-60 mm). Se utilizaron un total de 16 cuerdas de cultivo (12m), con una densidad de semilla de 19 Kg por cuerda (1,6 Kg m–1 de cuerda o 2.600 mejillones m–1 de cuerda). Medidas Los datos de temperatura del agua (T°C), salinidad (S‰) y clorofila-a (Chl-a) fueron suministrados por el Centro de Control de Calidade del Medio Marino de la Consellería de Pesca, Marisqueo y Acuicultura (Xunta de Galicia). El seston natural fue caracterizado como materia particulada (POM, mg l–1), materia inorgánica particulada (PIM, mgl–1) y volumen particulado (mm3 l–1). Se recogieron muestras de seston natural (n = 6 por día de muestreo) y heces (n = 32 por día de muestreo) producidas por los mejillones durante un período de 2 h, en dos ocasiones consecutivas para cada mejillón y día de muestreo. Muestras de alícuotas de volúmenes conocidos de agua de mar y muestras de heces fueron filtradas sobre filtros GFC precalcinados (450°C/4 h) y lavados con solución isotónica de formiato amónico (0,5 M). Se estableció la materia seca total, como peso, después de llevar los filtros a peso constante (110°C/12 h). La materia orgánica corresponde a la pérdida de peso después de la calcinación en un horno mufla a 450°C/4 h. Se determinó el volumen particulado (mm3 de TPM) en un rango de partícula entre 2-50mm, usando un Coulter-Counter Multisizer II ajustado con un tubo de 100 mm de apertura. La tasa de aclaramiento (CR) fue determinada usando el método Box Raft Experimental Chamber. Las cajas rectangulares (45 ´ 40 ´ 14 cm, longitud ´ ancho ´ alto) tienen una capacidad de 19 l, con una tubería de PVC que bordea la parte superior, y distribuye el flujo de entrada uniformemente (3 l min–1). Unas estructuras con 16 espacios individuales se sitúan en la parte interior de las cajas en donde se colocan los mejillones individualmente. En cada experimento se usaron 3 cajas con

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

201

una de ellas como blanco. Las tres cajas toman la dieta desde un tanque común situado en un nivel más alto y así se distribuye el alimento por gravedad. Los flujos usados fueron lo suficientemente bajos para poder registrar diferencias significativas entre la concentración de partículas a la salida (outflows) desde las cámaras control y las cámaras experimentales. Estas velocidades de flujo fueron también suficientes para eliminar la posibilidad de recirculación del agua a través de la cavidad del manto. El caudal del flujo a través de cada canal fueron determinados simultáneamente en volúmenes de agua recogido del agua a la salida (outflow) en un tiempo dado. Un Coulter-Counter Multisizer con apertura de tubo de 100 mm se usó para determinar la diferencia entre la concentración de partículas en el outflow desde la cámara control (C1) y el outflow de cada cámara experimental (C2). La tasa de aclaramiento fue calculada como: caudal de flujo multiplicada por (C1–C2)/C1. Los experimentos se realizaron durante 7 h y la tasa de aclaramiento media fue calculada sobre la base de varias medidas (n = 6–8). La tasa de ingestión orgánica (OIR mg h–1) fue calculada como el producto de CR y concentración orgánica del alimento (mg POM l–1). La eficiencia de absorción (AE) fue cuantificada según Conover (1966). AE = (F–E) / (1–E)F

(1)

donde F y E son el contenido orgánico (en peso) del alimento y de las heces, respectivamente. La tasa de absorción (AR en mg POM h–1) fue calculada como producto de OIR y la eficiencia de absorción (AE). La tasa metabólica fue obtenida midiendo el consumo de oxígeno (VO2 en ml de O2 min–1). Los mejillones fueron colocados en cámaras cilíndricas de 780 ml (alto 85 mm y diámetro 115 mm) cerradas con sondas de oxígeno (YSIR 5730). La concentración de oxígeno fue registrada a intervalos regulares con un contador de oxígeno (YSIR 58) conectado a la sonda. Las medidas de oxígeno se realizan hasta que la concentración cae por debajo del 70% del valor inicial. Una cámara control sin individuos se usó de forma rutinaria para corregir el error sistemático inherente incluido en la respiración bacteriana y la deriva del electrodo. La tasa metabólica fue entonces calculada como: VO2 = 60 (Ct0–Ct1)(V/t1–t0)

(2)

donde t0 y t1 son la concentración de oxígeno del agua (ml O2 l–1) al comienzo y al final del experimento, respectivamente; V es el volumen de la cámara y t1–t0 representan el período de medida en minutos. Talla de estandarización En orden a evitar variabilidad en la tasa fisiológica causada por diferencias en la talla, las tasas fueron estandarizadas a un individuo de 1 g de peso de carne de acuerdo a la ecuación. Ys = Ye(Ws/We)b

(3)

202

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

donde Ys es el parámetro a estandarizar; Ws es el peso estandar (1 g); We es el peso del mejillón experimental; Ye es el parámetro fisiológico no corregido y b es el exponente peso específico (b = 0,53 para CR [Pérez-Camacho y González, 1984) y b = 0,75 para metabolismo (Bayne & Newel, 1983)]. Conceptos para el modelado Inicialmente, nosotros dirigimos la cuestión acerca de la maximización de la CR sobre simples fundamentos teóricos. Para ello consideramos las siguientes ecuaciones: FR = CR ´ TPM

(4)

FR, CR y TPM en mgh–1, lh–1 y mgl–1, respectivamente. Si asumimos que el contenido de TPM orgánico (OCS) iguala la materia orgánica ingerida (OCI) y que la tasa de ingestión (IR) iguala a la tasa de filtración (FR) debido a que no hay producción de seudoheces (Babarro et al., 2000a): OCS = OCI

(5)

OIR = FR ´ OCI (mg h–1)

(6)

AR = AE ´ IR ´ OCI

(7)

Finalmente,

Asumimos una relación hiperbólica entre AE y OCI y una relación tipo saturación entre AR y OIR (ver Resultados y Discusión, Fig. 4a y b y Fig. 5a y b). AE = a – (b/OCI)

(8)

donde a y b son parámetros de ajuste. Esto es similar a lo que ha sido descrito por otros autores (Hawkins et al., 1999). A partir de la asunción anterior, en relación a la relación entre AR y OIR, es posible escribir la siguiente ecuación tipo Michaelis-Menten. AR = ARmax

OIR OIR + K AR

(9)

donde ARmax, es la tasa de absorción máxima. KAR es el valor de OIR que permite alcanzar ½ de la ARmax. Combinando las ecuaciones 4, 6 y 9, la ecuación 10 puede ser reescrita en términos de CR: AR = ARmax

CR ´ TPM ´ OCS CR ´ TPM ´ OCS + K AR

(10)

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

203

Esta ecuación implica que en ausencia de seudoheces, cuando la OCI no es controlada por un proceso de alimentación selectivo (ecuación 5), la AR es maximizada cuando CR ® ¥. Por lo tanto, desde esta asunción se puede predecir que los mejillones en la Ría de Arousa maximizan la AR manteniendo la CR en el valor más alto posible. Esto no debería ser el caso en ecosistemas de aguas turbias debido a que la presencia de seudoheces invalida la asunción de que IR = FR y por lo tanto AR no puede ser expresada como una función de CR según la ecuación 10. En orden a validar esta asunción, se desarrolló un modelo sencillo para simular la CR en función de la capacidad del volumen del digestivo, utilizando para ello la capacidad del digestivo y la concentración de alimento. Para ello se usó la ecuación (11) dada por Willows (1992): CR =

Vg

(11)

t =T

C ò V ( S , t )dt t=0

donde, Vg es la capacidad de volumen del digestivo (mm3); C es la concentración t =T

de alimento (cel l–1), S es la tasa de inversión digestiva y

ò V ( S , t )dt es la canti-

t=0

dad de capacidad digestiva (mm3 h cel–1) utilizada por una partícula de alimento como una función del tiempo de residencia y el volumen de la partícula. Para simplificar, asumimos que t =T

ò V ( S , t )dt = V T 0

(12)

t=0

donde V0 es el volumen de la partícula previo a la digestión y T es el tiempo de residencia (Willows 1992). La asunción anterior implica que el volumen del intestino ocupado por las partículas de alimento es constante e independiente de su tiempo de residencia. Otra implicación es que las partículas pueden perder su contenido orgánico por absorción pero su tamaño permanece inalterable. Este podría ser el caso de los frústulos de las diatomeas (Willows, 1992). Las unidades del denominador de la ecuación 11, son mm3 h l–1. En el presente trabajo se usa volumen empaquetado en vez de concentración de células y la ecuación 11 se escribe como: CR =

Vg CV T

(13)

donde Cv es el volumen empaquetado (mm3h l–1). La ecuación 13 tiene las mismas unidades que la ecuación 11. El denominador de ambas ecuaciones se refiere a la capacidad digestiva utilizada por los bivalvos

204

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

que será proporcional al tiempo de residencia y al tamaño y a la cantidad de partículas ingeridas. Se implementó el modelo usando el software Stella (Stella versión 5.1.1 para Windows) (Fig. 2). En este modelo, la CR es calculada como un mínimo entre 2,9 lh–1 (la CR media calculada con los datos obtenidos en 1995-96 y 1998) y estandarizados para un mejillón de 1 g DW y con el valor calculado con la ecuación 13. Esto evita valores elevados y no realistas de la CR cuando el denominador de la ecuación 13 se aproxima a cero. La tasa de egestión es calculada desde la relación del contenido del digestivo con el tiempo de paso. Se realizó un análisis de sensibilidad con el objetivo de testar cual es el efecto que diferentes concentraciones de alimento y el tiempo de residencia en el digestivo tienen sobre la CR. Las simulaciones se realizaron en el rango de tiempos de tránsito y volúmenes de digestivo mostradas por Smaal (1992) (Fig. 2). Contenido del tubo digestivo

OIR

Volumen del tubo digestivo

CR

FR

heces

Tiempo de transito en el tubo digestivo

Concentración de alimento

Figura 2. Diagrama del modelo creado en Stella para simular la CR como en función de la concentración de alimento, utilizando la capacidad digestiva y el volumen del tubo digestivo (ver texto). Los parámetros del modelo y las ecuaciones son las siguientes: Tiempo de transito en el tubo digestivo = 1,45 – 10,9 (h) (Smaal, 1997); Contenido del tubo digestivo = OIR – heces (mm3 de partículas); Volumen del tubo digestivo = 12,0 – 20,0 (mm3) (Smaal, 1997); CR = Min (2,9, ecuación 13) (1 h–1); FR (mm3h–1) (Ecuación 4); OIR (mm3h–1) (ecuación 6) (ver texto).

Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para sintetizar la calidad del agua y los datos de los parámetros fisiológicos (Statistica software).

X.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Descriptiva y estadística multivariante Los valores medios de las variables ambientales medidas en el período 1995-1996 y 1998 son recogidos en la Tabla 1. En los datos del 95-96 el rango de

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

205

TPM está entre 0,49-2,56 con un valor medio de 0,97 mgl–1, mientras en el grupo de datos del 98 el rango de TPM está entre 0,65-2,21 con un valor medio de 1,16 mg l–1. En relación al POM en el primer grupo el rango está entre 0,28-1,00, con un valor medio de 0,45 mgl–1. El rango en los datos del 98 fue 0,38-0,70 con un valor medio de 0,53 mgl–1. La calidad OCS (POM/TPM ratio) presentó una estrecha fluctuación alrededor de 0,5 en ambos grupos. El volumen particulado varió desde 0,29 a 1,66 mm3 l–1 con un valor medio de 0,78 mm3 l–1en los datos del 1995-96 y desde 0,28 a 1,87 mm3 l–1, con un valor medio de 0,80 mm3 l–1 en 1998. La temperatura está en el rango 12,9-15,6°C y 14,2-17,7°C para el 95-96 y 98 respectivamente. Los valores de salinidad que dependen de la lluvia están en un valor medio de aproximadamente 34‰. La Chl a mostró una alta variabilidad y las mayores diferencias entre las dos series estudiadas, los valores medios fueron de 0,98 y 1,73 mg l–1, para 95-96 y 98 respectivamente. Se observan fluctuaciones en una serie de picos a lo largo de los experimentos. Desde febrero a julio de 1996 el rango de Chl a es 0,6-1,96 mg l–1 y desde 0,23-3,6 mg l–1 en 1998. Sin embargo desde noviembre 1995 a febrero 1996 el rango fue 0,29-0,75 mg l–1. El índice Chl a/POM mostró una gran variación con valores entre 2-3,8 para 1995-96 y 0,5-6,3 para 1998. El rango de CR fue 1,86-4,73 lh–1, en los datos del 95-96 y entre 1,66-6,3 lh–1 en los datos de 1998 para mejillones de 1 g de DW (Tablas 1 y 2). Aunque estos datos son comparables con los rangos obtenidos por otros autores para otras especies de bivalvos pero con unos intervalos mayores de concentraciones de TPM, POM y Chl a (Hawkins et al., 1999, 2000) el estrecho límite de confianza obtenido –9 y 14% de la CR media, en los períodos 95-96 y 1998, respectivamente– sugiere una relativa baja variabilidad en la CR. De hecho el análisis de la Fig. 3a y b muestra que, con la excepción de unos pocos valores de invierno, el rango de la CR es 2,0-3,5 lh–1. La Tabla 2 presenta una síntesis de los resultados experimentales mostrados por diferentes autores, en relación a la CR de bivalvos, con diferentes volúmenes empaquetados, TPM, materia orgánica particulada (POM) y concentraciones de clorofila a (Chl a). Hay algunas diferencias importantes entre los datos obtenidos en las Rías gallegas por Navarro et al., (1991), Babarro et al., (2002a), los resultados presentados en este trabajo y los datos obtenidos por otros autores. Los resultados obtenidos en las Rías gallegas muestran una mayor variabilidad en relación a TPM, POM, Chl a y CR (Tabla 2). Los datos de Hawkins (1999,2001) y Gardner (2002) fueron obtenidos bajo condiciones controladas y cubren unos rangos mayores de TPM, POM, Chl a que aquellos observados en la Rías gallegas. Esta es probablemente la razón para la mayor variabilidad observada en la CR. El límite de confianza del 95% (aproximadamente 2 veces la desviación estándar) para la media de la CR, obtenida por Babarro et al., (2002a) y para los resultados en este trabajo son c.a. 9% y 14% de la media, respectivamente. En el caso de Gardner (2002), una desviación estándar corresponde al 55% de la media de la CR para la misma especie Mytilus galloprovincialis.

POM mgl–1

0,37 ± 0,11 0,29 ± 0,04 0,31 ± 0,03 0,37 ± 0,08 1,00 ± 0,27 0,46 ± 0,03 0,28 ± 0,03 0,39 ± 0,06 0,57 ± 0,08 0,46 ± 0,10 0,52 ± 0,09 0,64 ± 0,04 0,39 ± 0,03 0,29 ± 0,04 0,43 ± 0,08

0,74 ± 0,27 0,86 ± 0,23 0,35 ± 0,10 0,59 ± 0,15 1,53 ± 0,08 0,52 ± 0,08 0,62 ± 0,08 0,61 ± 0,06 0,47 ± 0,08 0,54 ± 0,09 0,49 ± 0,08 0,39 ± 0,07 0,27 ± 0,12 0,29 ± 0,19

TPM mgl–1

0,68 ± 0,18 0,49 ± 0,15 0,83 ± 0,11 0,74 ± 0,21 2,56 ± 0,68 0,79 ± 0,06 0,55 ± 0,07 1,34 ± 0,20 1,31 ± 0,11 0,88 ± 0,22 0,96 ± 0,18 1,38 ± 0,12 0,74 ± 0,09 0,62 ± 0,09 0,72 ± 0,13

1,18 ± 0,15 1,45 ± 0,37 0,78 ± 0,13 1,11 ± 0,18 2,21 ± 0,08 1,04 ± 0,12 1,13 ± 0,12 1,31 ± 0,12 1,05 ± 0,15 1,16 ± 0,15 0,98 ± 0,12 0,86 ± 0,10 0,65 ± 0,17 0,74 ± 0,31

Date

27-11-1995 05-12-1995 13-12-1995 20-12-1995 03-01-1996 17-01-1996 31-01-1996 15-02-1996 28-02-1996 13-03-1996 27-03-1996 10-04-1996 24-04-1996 05-06-1996 03-07-1996

28-01-1998 05-02-1998 11-02-1998 25-02-1998 04-03-1998 18-03-1998 01-04-1998 15-04-1998 29-04-1998 13-05-1998 27-05-1998 10-06-1998 24-06-1998 08-07-1998

0,44 ± 0,14 0,59 ± 0,17 0,43 ± 0,06 0,52 ± 0,03 0,68 ± 0,03 0,52 ± 0,06 0,50 ± 0,04 0,70 ± 0,07 0,58 ± 0,07 0,62 ± 0,07 0,50 ± 0,04 0,46 ± 0,04 0,38 ± 0,05 0,45 ± 0,12

0,30 ± 0,12 0,20 ± 0,06 0,52 ± 0,06 0,36 ± 0,05 1,56 ± 0,21 0,33 ± 0,13 0,27 ± 0,11 0,96 ± 0,21 0,74 ± 0,05 0,42 ± 0,06 0,44 ± 0,07 0,74 ± 0,08 0,35 ± 0,04 0,33 ± 0,07 0,29 ± 0,02

PIM mgl–1 15,65 ± 0,70 15,40 ± 1,08 15,56 ± 0,45 13,68 ± 0,41 14,26 ± 0,26 13,93 ± 0,65 13,23 ± 0,29 13,86 ± 0,65 12,91 ± 0,42 13,15 ± 0,08 13,83 ± 0,24 14,41 ± 0,48 15,02 ± 0,57 15,04 ± 1,21 14,34 ± 0,69

T °C 32,84 ± 1,96 31,31 ± 4,73 35,16 ± 0,50 34,76 ± 0,37 30,07 ± 2,95 28,01 ± 4,77 30,13 ± 1,40 31,06 ± 2,17 34,14 ± 1,36 34,91 ± 0,35 33,06 ± 0,42 32,53 ± 2,69 33,69 ± 1,72 34,97 ± 0,96 35,59 ± 0,16

Salinity ‰

0,23 ± 0,18 14,24 ± 0,70 34,38 ± 1,49 ± 0,28 14,31 ± 0,56 33,89 ± 2,75 ± 0,49 14,38 ± 0065 33,39 ± 1,54 ± 0,28 14,35 ± 0,57 32,96 ± 1,84 ± 0,51 14,33 ± 0,46 34,39 ± 1,19 ± 0,59 14,33 ± 0,61 34,39 ± 2,73 ± 0,65 14,93 ± 0,41 33,44 ± 2,73 ± 0,54 14,93 ± 0,07 33,44 ± 0,92 ± 0,25 15,48 ± 0,98 26,46 ± 3,59 ± 0,21 15,69 ± 1,01 32,23 ± 14,66 ± 0,99 34,98 ± 1,88 ± 0,33 16,80 ± 1,21 34,43 ± 0,69 ± 0,15 17,01 ± 1,08 34,92 ± 2,23 ± 0,35 17,67 ± 1,06 34,99 ±

0,75 ± 0,18 0,36 ± 0,27 0,48 ± 0,15 0,61 ± 0,15 0,37 ± 0,36 0,29 ± 0,28 0,64 ± 0,27 1,43 ± 0,36 1,16 ± 0,18 1,19 ± 0,37 1,71 ± 0,28 1,96 ± 1,60 1,06 ± 0,35 1,12 ± 0,59 1,03 ± 0,30

Chl-a mgl–1

0,278 ± 0,107 0,417 ± 0,095 0,557 ± 0,102 0,586 ± 0,161 1,871 ± 0,098 1,086 ± 0,098 0,730 ± 0,188 1,544 ± 0,101 1,197 ± 0,560 0,648 ± 0,045 0,738 ± 0,095 0,686 ± 0,151 0,412 ± 0,079 0,586 ± 0,087

0,570 ± 0,287 0,389 ± 0,207 0,524 ± 0,087 0,455 ± 0,084 1,290 ± 0,086 0,515 ± 0,078 0,292 ± 0,048 0,712 ± 0,063 1,066 ± 0,143 0,899 ± 0,288 1,262 ± 0,264 1,663 ± 0,147 0,655 ± 0,150 0,765 ± 0,098 0,644 ± 0,161

Part. Volume mm3l–1

0,37 0,41 0,56 0,47 0,31 0,50 0,45 0,54 0,55 0,53 0,51 0,54 0,59 0,61

0,55 0,59 0,38 0,51 0,39 0,59 0,51 0,29 0,43 0,52 0,54 0,47 0,53 0,46 0,60

OCS POM/TPM

0,20 1,03 3,51 1,39 0,83 1,15 2,43 2,09 0,88 3,09 0,00 2,19 1,05 3,04

1,11 0,74 0,57 0,83 0,14 0,36 1,17 1,07 0,89 1,35 1,78 1,42 2,15 1,79 1,43

CHLTPM–1 mg mg–1

Variables ambientales medidas en la Ría de Arousa en dos períodos (1995-96 y 1998)

TABLA 1

0,53 2,51 6,32 2,95 2,70 2,28 5,44 3,91 1,59 5,79 0,00 4,04 1,79 5,00

2,02 1,25 1,52 1,63 0,36 0,62 2,32 3,71 2,05 2,59 3,27 3,04 4,05 3,86 2,38

CHLPOM–1 mg mg–1

206 M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

207

7,0 6,0

CR (Lh-1)

5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 28-10-1995 17-12-1995 05-02-1996 26-03-1996 15-05-1996 04-07-1996 23-08-1996 Fecha 7,0 6,0

CR (Lh-1)

5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 18-12-1997 27-01-1998 08-03-1998 17-04-1998 27-05-1998 06-07-1998 15-08-1998 Fecha Figura 3. Tasas de aclaramiento. Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b). Los valores medios de tasa de aclaramiento están representados por líneas discontinuas. Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

Nuestros resultados en la Ría de Arousa mostraron que la CR no estaba estadísticamente relacionada con la TPM (análisis de correlación con p > 0,05). Esto puede ser explicado por la baja concentración media de seston, valor típico de este ecosistema (aproximadamente 0,9 mgl–1). En el presente estudio, y en el rango de valores de TPM observados, una relación lineal fue observada entre la tasa de ingestión orgánica (OIR) y el TPM (ecuación 14). Dado que no existe producción de seudoheces, la OIR está directamente relacionada con la IR confirmando la relación lineal sugerida previamente (Ecuación 4 y 6). OIR = 0,189 + 0,555TPM (n = 18, r2 = 0,72, p < 0,001)

(14)

Mytilus galloprovincialis Perna canaliculus Chlamys farreri

Navarro et al. (1991)

Hawkins et al. (1999)

Hawkins et al. (2001)

3,71 ± 1,72

0,19 – 7,86

0,6 – 299,9

0,35 – 1,08

0,38 – 0,70 0,53 ± 0,03

0,28 – 1,00 0,45 ± 0,07

–

0,8 – 151,5

0,21 – 459,37

0,29 – 4,70 2,44 ± 0,59

0,29 – 1,96 0,98 ± 0,19

CHL –1 (mg L )

2,78 ± 1,88

0 – 10

0 – 20

1,32 – 3,201

1,66 – 6,30 2,89 ± 0,41

1,86 – 4,73 2,91 ± 0,27

CR –1 (L h )

* Estimado desde valores medios medidos en varias ocasiones y presentados en los correspondientes trabajos.

3,31 ± 1,44

11,56 ± 3,38

3,2 – 104,9

2 – 3786

0,70 – 2,71

0,65 – 2,21 1,12 ± 0,14

0,49 – 2,56 0,97 ± 0,18

POM –1 (mg L )

Perna canaliculus

–

0,9 – 26,0

–

0,78 – 1,57

0,29 – 1,66 0,78 ± 0,14

TPM –1 (mg L )

3,95 ± 2,17

Mean ± SD

Ranges *

Ranges *

Ranges *

Ranges Mean ± CL

Ranges Mean ± CL

Particle volume (mm3 L–1)

Mytilus galloprovincialis

Aulacomya maoriana

Mytilus galloprovincialis

Unpublished data (this work)

Gardner (2002)

Mytilus galloprovincialis

Species

Babarro et al. (2002a)

Authors

Datos bibliográficos de Rangos y tasas de aclaramiento medias, bajo diferentes niveles de concentracion y calidad de alimento

TABLA 2

208 M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

209

De acuerdo con lo observado en estudios previos en las Rías gallegas (Navarro et al., 1991 y Pérez-Camacho et al., 2000), la AE se eleva asintóticamente hasta un valor máximo de 0,77 o 0,89 con un valor de OCI de 1,0, para los datos del 95-96 y 98, respectivamente. Eficiencias de absorción negativas aparecen con valores de OCI por debajo de 0,2. La ecuación hiperbólica incluida en la Figura 4a y b, explicó el 45 y 59% de la varianza, respectivamente. En este estudio una relación de saturación tipo Michaelis-Menten se asume entre la AR y OIR (Conceptos para el Modelado y Fig. 5a y b). La Figura 5a muestra datos obtenidos desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 que evidencian la cinética de saturación asumida. La Figura 5b, obtenida con los datos de 1998 no confirma la asunción, probablemente debido a que los valores de la OIR no fueron suficientemente altos para que la AR alcance la meseta. De hecho los valores más altos de OIR fueron obtenidos en el primer período. Un análisis de componentes principales (PCA) ha sido utilizado para sintetizar las características de calidad del agua y los datos fisiológicos recogidos en la Tabla 1. Se realizó un análisis separado para las series de resultados de 1995-96 y 1998, luego de estandarizar los datos por medio de una transformación logarítmica [Ln(x+1)]. En la Figura 6 los dos ejes mayores para cada serie de datos se presentan junto con las variables. Una aparente diferencia entre los datos de las series de 1995-96 y 1998 es la distancia entre CR y OIR, en el primer caso, y su proximidad en el segundo caso. Por otra parte, en los resultados de 1995-96, la OIR se localiza en las proximidades de la TPM, POM y Volumen particulado, lo que no sucede en la serie de datos de 1998. Mientras que los datos de 1995-96 sugieren que la OIR depende principalmente del alimento disponible, en el caso de los datos de 1998 esto no es cierto, sugiriendo una estrecha dependencia entre la OIR y CR, antes que del alimento disponible, y por lo tanto, la existencia de una regulación activa de la tasa de aclaramiento (CR), dado que en ausencia de seudoheces la tasa de ingestión no es regulada, dependiendo exclusivamente de la CR y el alimento disponible (ecuación 6). Por otra parte los coeficientes de variación para los datos de 1995-96 son 25,6 y 48,8% para la CR y la OIR respectivamente, mientras que en los datos de 1998 los mismos valores son 38 y 30,8%. Estos resultados establecen que para el primer período estudiado hubo menos variabilidad en la CR que en la OIR, sugiriendo que este proceso es más dependiente de la concentración de alimento, mientras que en el último período la variabilidad de la CR juega un papel más importante en la regulación de la OIR. En concordancia con ello, la media de la concentración de alimento en el primer período fue más baja que en el último (Tabla 1). Por lo tanto puede especularse que en ocasiones del muestreo de 1998 ha ocurrido un proceso negativo de retroalimentación entre llenado del sistema digestivo y CR, de acuerdo al modelo de Willows (ver anteriormente).

210

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

1,0 a

0,9 0,8 0,7

AE

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

AE = 0,95-

0,1

0,18 OCI

0,0 0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

OCI 1,0 b

0,9 0,8 0,7

AE

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

AE = 1,12-

0,1

0,23 OCI

0,0 0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

OCI Figura 4. Eficiencia de absorción (AE) en función del contenido orgánico de la materia ingerida (OCI). Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b) (ver texto).

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

211

2,0 1,8

a a

1,6

AR (mg h-1)

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,5

1,0

1,5

2,0 IR (mg

2,5

3,0

3,5

2,5

3,0

3,5

h-1)

2,0 1,8 1,6

b b

AR (mg h-1)

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,5

1,0

1,5

2,0 OIR (mg

h-1)

Figura 5. Tasa de absorción (AR) en función de la tasa de ingestión (OIR). Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero hasta julio de 1998 (b). Todos los valores estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

212

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

1,4 CHL

1

Particle volume

Factor 2

0,6 0,2

MPO POM/TPM

Temperature

-0,2

MPT

OIR

-0,6

Q2 CR

-1 -0,8

-0,4

0

1995-96

0,4

0,8

1,2

Factor 1

0,6 Temperature

MPO

0,4 MPT

0,2

MPI

POM/TPM

Factor 2

0

CHL

-0,2 -0,4 -0,6 -0,8

OIR

CR

-1 -1,2 -1,2 1998 Figura 6.

-0,8

-0,4

0

0,4

0,8

1,2

Factor 1

Análisis de componentes principales para los conjuntos de datos de 1995-96 y 1998. Sólo se muestran los dos primeros ejes principales (ver texto).

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

213

Resultados empíricos y de los modelos Diferentes autores describen la dependencia de la CR y OIR de los parámetros ambientales usando diferentes aproximaciones. Raillard et al. (1993) y Raillard y Ménesguen (1994) asumen constante la CR para Crassostrea gigas hasta una concentración umbral de TPM de acuerdo a la ecuación: CR = CR max× exp( kf × min(0 , T S - TPM ))

(17)

donde: CRmax: Tasa de aclaramiento estándar (2 l h–1 g–1 (carne DW)); Ts – TPM umbral (200 mg l–1) Esta ecuación predice una CR constante cuando la concentración de TPM es menor o igual a la concentración umbral de seston, seguido por una caída exponencial por encima de dicha concentración umbral. Una aproximación similar fue utilizada por Barillé et al., (1997), si bien en este caso el descenso lineal de la CR con la concentración de TPM fue previsto por encima de concentraciones de seston superiores a 60 mg l–1. Otro umbral de 192 mg l–1 ha sido considerado para el descenso exponencial de la CR. Ren & Ross (2001) utilizan una aproximación similar, utilizando una función continua después de la función discontinua de Barillé et al. (1997). La asunción de una CR constante hasta un umbral de TPM cuando las branquias se tupen se ha basado en los datos experimentales de Deslous-Paoli et al. (1992) y en el trabajo de Bougrier et al. (1995). La fuerte caída de la CR por encima de la concentración umbral de seston Ts, fue observada, entre otros, por Barille & Prou (1993). Estas observaciones sostienen la idea de una CR estable en ecosistemas con bajo TPM. El modelo ecofisiológico formulado por Smaal (1997), también se ha basado en una CR constante hasta que la concentración de seston total (TPM) alcanza un umbral de 46,6 mg l–1, de acuerdo a Prins et al. (1991). Por otra parte Hawkins et al. (1998), establecen un conjunto de ecuaciones empíricas de relación entra la tasa de filtración, el seston total y su contenido orgánico (OC) para Cerastoderma edule, Crassostrea gigas y Mytilus edulis (ecuación 18). FR = aTPM b OC

(18)

donde a, b and c son parámetros empíricos. A pesar del hecho de que en ese trabajo las ecuaciones para el cálculo directo de la CR no se establecen, este parámetro puede ser estimado a partir de la relación de la tasa de filtración (FR) y la concentración de seston. Las formulaciones matemáticas presentadas por los autores citados sugieren una dependencia no lineal de la FR respecto a la concentración de seston y su contenido orgánico. Sin embargo, los resultados gráficos de Hawkins et al. (1998) sugieren un comportamiento casi-lineal de la tasa de filtración (FR) como función de la concentración de seston (TPM) en un rango entre 10 a 40 mg l–1 para todas las especies estudia-

214

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

das. La contribución del contenido orgánico oscila desde un efecto negativo en C. edule a positivo in M. edulis, siendo su contribución menor que aquella del TPM. En algunos casos, una ecuación para la CR no ha sido presentada (Hawkins et al., 2002). En cambio, la CR es obtenida a partir de la Tasa de Filtración (FR) dividida por la concentración de alimento. La FR se calcula con diferentes ecuaciones para las fracciones de detritus y clorofila, reflejando una regulación activa de la alimentación y de la selección como función de la concentración y calidad del alimento. En síntesis, todos ellos son modelos en los cuales se ha asumido que ocurre una regulación activa de la CR y/o FR, únicamente por encima de una concentración critica de alimento, y modelos en los cuales se ha asumido que la regulación ocurre en todos los rangos de calidad y concentración de alimento. En los ejemplos expuestos anteriormente, la regulación está determinada por las condiciones del alimento en el medio ambiente, y no por alguna condición fisiológica. En este trabajo ambas aproximaciones son evaluadas, asumiendo una CR constante (el descenso exponencial por encima de un umbral de TPM no ha sido considerado dados los bajos niveles de materia suspendida en la Ría de Arousa), y describiendo la alimentación como una función de las condiciones ambientales. Resultados obtenidos con una CR constante Considerando la CR media de 2,91 ± 0,27 o 2,89 ± 0,41 l h–1 para un mejillón de 1 g de peso seco (DW) para los años 1995-96 o 1998, respectivamente (ver anteriormente), y calculando la OIR a partir de las ecuaciones 4, 5 y 6, resulta un ajuste adecuado entre los datos obtenidos y estimados para la experimentación del año 1995-1996, pero no para aquella del año 1998 (Figuras 7a y b). Esto sugiere que la variabilidad de la OIR es principalmente controlada por la concentración de alimento y no por la variabilidad de la CR o FR, para el conjunto de datos de 1995-96. A partir de los valores de OIR de la Figura 7 y de las ecuaciones 8 y 9, se ha calculado la AR (siendo los parámetros de la ecuación 8 aquellos establecidos en las Figuras 4a y b). Nuevamente se puede observar una estrecha similitud entre los valores medidos y calculados para los resultados de 1995-96 (Figura 8). Un polinomio de segundo orden ha sido utilizado para establecer la relación entre la tasa de Respiración (RR, mg O2 h–1) con la Chl a y la TPM (ecuación 15, Figura 9): RR = 0 ,071 - 0 ,066TPM + 0 ,001TPM 2 + 0 ,081TPMChla - 0 ,119Chla 2 (15) (n = 29, r2 = 0,88, p < 0,001) A partir de las tasas de Absorción (AR) y respiración (RR) calculadas y transformadas a J h–1 presentadas en la Figura 10, se ha calculado el crecimiento potencial (SFG) y comparado con aquellos valores obtenidos a partir de las tasas fisiológicas experimentales (Figura 11). Observándose una cerrada correspondencia entre los valores del modelo y los experimentales descritos por Babarro et al. (2000b) para el conjunto de datos de los años 1995-96. La correspondencia en-

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

215

90,0 a

80,0 70,0

OIR Jh-1)

60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1

9

17

24

38

52

66

81 94 107 121 135 149 191 219 Días

90,0 b

80,0 70,0

OIR (Jh-1)

60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1

16

31

46

61

76

91

106

121

136

151

Días Figura 7. Tasas de ingestión medidas (cuadrados) y predichas (líneas). Predicciones hechas asumiendo una CR constante. Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b) Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

216

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

50,0

a

45,0 40,0

AR (Jh-1)

35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1

9

17

24

38

52

66

81 94 107 121 135 149 191 219 Días

50,0

b

45,0 40,0

AR (Jh-1)

35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1

16

31

46

61

76 91 Días

106

121

136

151

Figura 8. Tasas de absorción medidas (cuadrados) y predichas (líneas). Predicciones hechas asumiendo una CR constante. Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b) Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

217

Figura 9. Superficie ajustada (ecuación 15) a los datos experimentales de respiración obtenidos en 1995-96. Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

tre los valores observados y predichos ha sido analizada con un análisis de regresión lineal Modelo II, de acuerdo a Laws y Archie (1981), con el método de regresión al eje mayor como recomiendan Mesplé et al. (1996) y describen Sokal y Rohlf (1995). La pendiente de la regresión Modelo II entre lo predicho y lo observado, ha sido ligeramente inferior a 1 (0,71) y el intercepto del eje de ordenadas no fue significativamente diferente de cero (p < 0,05). Esto implica que los valores obtenidos en el modelo subestiman los valores observados, y que esta subestimación se incrementa con el SFG (Mesplé et al., 1996). La varianza explicada por el modelo fue significativamente superior que aquella varianza no explicada (p < 0,001) al ser testada con un ANOVA. Cuando se hizo una comparación similar para el conjunto de datos experimentales del año 1998 (Fig. 11b), los resultados del ANOVA sugieren que la varianza explicada por el modelo es muy baja (p > 0,05). Sin embargo si, en este conjunto de datos, se ignoran los dos valores más altos (correspondientes a las más altas CR (Figura 3b), la pendiente de la regresión Modelo II no difiere significativamente de la otra (p < 0,05), pero el intercepto del eje y de ordenadas es significativamente mayor que cero (P < 0,05). La varianza explicada por el modelo es significativa (p < 0,05). Los resultados obtenidos no son completamente concluyentes, pero ellos sugieren que la CR promedio puede ser un razonable punto de partida para predecir la OIR en la Ría de Arousa en aquellos períodos de relativamente baja disponibilidad de alimento (ver el apartado de Estadística descriptiva y multivariante).

218

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

18,0

a

16,0 14,0

PR (Jh-1)

12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 1

9

17

24

38

52

66

81 Días

94 107 121 135 149 191 219

18,0

b

16,0 14,0

PR (Jh-1)

12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 1

16

31

46

61

76 91 Días

106

121

136

151

Figura 10. Tasas respiratorias medidas (cuadrados) y predichas (líneas). Predicciones hechas asumiendo una CR constante. Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b) Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

219

40,0

a

35,0 30,0 25,0 SFG (Jh-1)

20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 -5,0 -10,0 -15,0 1

16

31

46

61

76

91 106 121 136 151 166 181 196 211 Días

40,0

b

35,0 30,0

SFG (Jh-1)

25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 -5,0 -10,0 1

16

31

46

61

76 91 Días

106

121

136

151

Figura 11. SFG medido (cuadrados) y predicho (líneas). Predicciones hechas asumiendo una CR constante. Medidas tomadas en la Ría de Arousa, en condiciones de campo, desde noviembre de 1995 hasta julio de 1996 (a) y desde enero a julio de 1998 (b) Todos los valores están estandarizados para 1 g de tejido seco de mejillón (ver texto).

220

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

Resultados obtenidos para la relación funcional entre alimentación y parámetros ambientales No fue posible encontrar ninguna relación funcional entre la CR y los parámetros ambientales que podían ser aplicados correctamente a ambas series de datos. Otros intentos para mejorar la calidad del modelo de ajuste fueron probados, esto es, ajustando el OIR a una función gamma (Hawkins et al., 2002) o a una función del tipo: OIR = (a + b · POM) exp(c, CHL)

(16)

donde, a, b y c son los parámetros ajustados. Con ambas series de datos se obtuvieron buenos ajustes. Sin embargo, se encontraron relaciones diferentes entre la OIR y las variables POM y Chl a. El parámetro b fue positivo y el c negativo para los datos de 1995-96, mientras que para los datos del 1998 se observó lo contrario. Por lo tanto, no fue posible encontrar una relación funcional entre la alimentación y los parámetros ambientales que podían aplicarse a ambas series de datos. De acuerdo a los resultados de este trabajo, parece razonable concluir que ni la asunción de una CR constante en los rangos de concentración de alimento observados, ni el uso de relaciones funcionales entre alimentación y parámetros ambientales, pueden proporcionar una solución general para modelar la alimentación del mejillón en la Ría de Arousa. Otras aproximaciones Con el fin de obtener un conocimiento más detallado de los factores que pueden explicar la variabilidad de la CR en el mejillón en la Ría de Arousa se aplicó el modelo teórico de Willows (1992) (ver Conceptos de Modelado). Bajo la asunción de que el sistema digestivo está siempre lleno, este modelo no predice una CR estable frente un bajo rango de concentración de alimento. Sus resultados teóricos están basados en el concepto según el cual la CR está condicionada continuamente por la capacidad digestiva utilizada por los bivalvos, de acuerdo con la ecuación 12. La asunción de «llenado del sistema digestivo» conlleva la predicción de un fuerte descenso de la CR con la concentración de alimento. Si se asume que la capacidad digestiva actúa en retroalimentación negativa sobre la CR a partir de un cierto umbral, entonces cabría esperar –en un estrecho rango de concentración de alimento– una meseta en la CR. Esto podría ocurrir si el tiempo de residencia del alimento en el sistema digestivo es comparable al tiempo empleado para filtrar las partículas ingeridas, especialmente si el tubo digestivo está trabajando por debajo de su capacidad. En este caso, la acumulación de alimento en el estómago podría mantenerse baja y estable sin pérdidas en la capacidad digestiva. Por lo tanto, la CR podría permanecer estable. Esta situación

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

221

solamente podría esperarse con bajas cargas de seston. Esta hipótesis fue probada en el presente trabajo mediante un modelo realizado en Stella (Fig. 2). La Figura 11a muestra la CR obtenida para un amplio rango de tiempo de residencia del alimento en el sistema digestivo y para valores extremos de volumen del digestivo descritos por Smaal (1997). Es evidente que la CR se muestra estable hasta un valor umbral, por encima del cual comienza a descender exponencialmente con el tiempo de tránsito digestivo. La situación descrita en la Fig. 12a, cuando la CR muestra un patrón estable para el rango inferior de tiempo de tránsito digestivo, se corresponde con la máxima concentración de alimento observada durante el estudio (1,9 mm3 l–1) y aceptando que el volumen particulado del alimento no cambia con la absorción. Considerando la media de la concentración de alimento (0,8 mm3 l–1), la pérdida de volumen particulado durante la absorción y los tiempos de tránsito digestivo estimados durante el estudio entre l 2 y 3 horas, el argumento a favor de la CR estable parece más probable. La independencia relativa de la CR con el tiempo de tránsito digestivo hasta un valor umbral es debida a un llenado del estómago por debajo de su máxima capacidad (Fig. 11b). Cuando el contenido estomacal alcanza el volumen del estómago, la CR decrece rápidamente. Estos resultados sugieren que con la baja concentración de seston observada en la Ría de Arousa es muy probable que el volumen estomacal del mejillón se encuentre por debajo de su máxima capacidad la mayor parte del tiempo, estimulando una CR alta y estable. Sin embargo, si este ha sido el caso durante los dos períodos experimentales analizados en este trabajo, se podrían esperar predicciones del SFG de similar calidad. Pero la similitud entre ambas predicciones ocurrió únicamente cuando se ignoraron los valores extremos de SFG, correspondientes a valores extremos de CR, en el período de 1998. Por tanto es posible especular bien que, el cálculo de la CR en el modelo creado en Stella infraestima la retroalimentación negativa debida al llenado del sistema digestivo, y/o que los mejillones estudiados en el período de 1998, de media, tengan un contenido estomacal mayor que durante el período 1995-96, debido a la generalmente mayor carga de seston (Tabla 1). En cualquier caso, parece claro que los datos obtenidos en el período de 1998, reflejan algún mecanismo de regulación del OIR dependiente de la CR. Observaciones generales Cuando el proceso de selección del alimento juega un papel significativo es importante clarificar el procesamiento de la materia orgánica viva, procedente de organismos fitoplantónicos ricos en clorofila, de la materia orgánica no fitoplanctónica, y de la restante materia inorgánica, durante la retención diferencial en las branquias y la expulsión selectiva pre-ingestiva en pseudo-heces (Hawkins et al., 2002). En estos casos, las asunciones sintetizadas en las ecuaciones 4 a 8 no son validas. Es más, la temperatura puede jugar un papel limitante en algunos casos (Barillé et al., 1997; Ren & Ross, 2001). La posible asunción de una CR constan-

222

M.ª José Fernández-Reiriz, Pedro Duarte y Uxio Labarta

3,50 3,00

20 mm3 1,9 mm3 l-1 12 mm3 1,9 mm 3 l-1 12 mm3 0,8 mm3 l-1 20 mm3 0,8 mm3 l-1

CR (Ih-1g-1)

2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,00

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Tiempo de transito en el tubo digestivo (h)

12,00

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Tiempo de transito en el tubo digestivo (h)

12,00

Contenido del tubo digestivo (mm3)

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00 0,00

Figura 12. Valor de CR (a) y contenido del tubo digestivo (b) predichos para 1 g de tejido seco de mejillón, en función del tiempo de transito del tubo digestivo, utilizando dos volúmenes del tubo digestivo diferentes –12 y 20 mm3– tomados de Smaal (1997) y dos concentraciones de alimento diferentes –1,9 y 0,8 mm3l–1– los cuales fueron respectivamente el valor máximo y el valor medio.

X. Modelos de comportamiento alimentario en el mejillón de las Rías de Galicia

223

te bajo condiciones de baja carga de materia en suspensión simplifica el modelo de SFG. El modelo calculado en Stella, está basado en el modelo teórico de Willows (1992), sugiriendo que a bajas concentraciones de seston observadas en las rías gallegas, los mejillones no utilizan su capacidad digestiva total la mayor parte del tiempo. En esta situación, la retroalimentación negativa debida al llenado estomacal sobre la CR no es efectiva. Conclusiones Considerando los objetivos del presente trabajo y los resultados presentados, parece plausible concluir que en la Ría de Arousa la habitual aproximación a un modelo de comportamiento alimentario de bivalvos filtradores es difícilmente aplicable al mejillón. La CR no está impulsada generalmente por la disponibilidad de alimento si no por las retroalimentaciones fisiológicas. Por lo tanto, la CR podría cambiar incluso bajo concentraciones de seston bajas contradiciendo la asunción de una CR constante. Es más, la relación entre CR y/o OIR y alimento parecen estar mediatizados por otros procesos/variables, con diferentes respuestas a las concentraciones de POM y Clorofila, según lo observado en experimentos llevados a cabo en diferentes años. Por tanto, no parece sencillo predecir la SFG a partir de relaciones simples entre procesos fisiológicos y los parámetros de calidad del agua. Pueden obtenerse aproximaciones someras, usando una media de los datos de CR y disponibilidad de alimento (POM y Chl a). Es probablemente necesario construir un modelo que incorpore las retroalimentaciones fisiológicas a la CR y a la OIR, en la línea del modelo de Willows (Willows, 1992). Atendiendo a las consideraciones teóricas y los datos obtenidos, parece plausible la hipótesis de que los mejillones en la Ría de Arousa podrían maximizar la absorción orgánica manteniendo la tasa de aclaramiento (CR) a su máximo nivel, excepto cuando el sistema digestivo estuviese lleno, u otras condiciones fisiológicas impusiesen alguna regulación sobre la tasa de aclaramiento. Agradecimientos Agradecemos a: Dr. J. Babarro, Dr. L. Freites, L. Nieto, B. Gonzalez, S. Villar y E. Maroño su colaboración en los trabajos de campo en los que se sustenta este estudio. Este trabajo se ha desarrollado con el soporte financiero del proyecto «UE MABENE EVK3-2001-00144».

GENÉTICA DEL MEJILLÓN

XI.

LA GENÉTICA POBLACIONAL DEL MEJILLÓN GALLEGO

MONTSE PÉREZ, ÁNGEL P. DIZ, FERNANDO CRUZ y PABLO PRESA

INTRODUCCIÓN Este capítulo está dedicado a revisar el escaso conocimiento disponible sobre la genética del mejillón de las rías gallegas, Mytilus galloprovincialis1. En la sección primera se describen someramente las herramientas utilizadas en el estudio genético del mejillón, que han servido para establecer diversos fenómenos poblacionales y evolutivos en las últimas tres décadas. En la sección segunda se enfoca el complejo escenario taxonómico de las poblaciones europeas, caracterizado por frecuentes áreas de solapamiento e hibridación interespecíficos. En la sección tercera se revisa el conocimiento actual sobre las características genéticas de las poblaciones gallegas, y en la sección cuarta se discuten algunas actuaciones posibles y necesarias en Galicia, para una gestión genética del mejillón, que permitan la explotación y conservación del acervo génico de las poblaciones gallegas, sometidas a cultivo intensivo durante décadas. Las especies del género Mytilus han sido los organismos con más estudios genéticos poblacionales, en comparación con cualquier grupo de organismos marinos (Seed, 1992; Gosling, 2003). En primer lugar, su amplia distribución natural y la gran diversidad de hábitat que ocupan, les convierte en organismos modelo de muchas especies costeras de moluscos, para el estudio de múltiples parámetros de dinámica genética poblacional, y de respuesta a factores selectivos manipula1

A pesar de que hayan pasado veinte años tras la adscripción genética de las poblaciones gallegas a Mytilus galloprovincialis (Sanjuan y col., 1986), con no poca frecuencia se encuentran comentarios periodísticos, textos divulgativos, y hasta artículos científicos actuales, en los que estas poblaciones se asignan arbitrariamente a las especies congenéricas M. edulis y M. trossulus.

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Montse Pérez, Ángel P. Diz, Fernando Cruz y Pablo Presa

bles en cultivo. En segundo lugar, la alta fecundidad del mejillón, combinada con la facilidad de su muestreo y cultivo, le hacen apto para estudios genéticos in vivo e in vitro; concretamente las dos fases del ciclo biológico, una de dispersión larvaria y otra adulta sedentaria, ofrecen un modelo natural para el estudio de la dinámica génica y del mantenimiento de patrones de variación genética en poblaciones naturales. En tercer lugar, la hibridación interespecífica dentro de este género, ha propiciado la realización de numerosos estudios en las últimas tres décadas sobre la fertilidad de los híbridos, los niveles de introgresión interespecífica de los genomas, la extensión y mantenimiento de las zonas híbridas, y el flujo génico interespecífico. Desde una perspectiva poblacional básica se persigue descifrar cuáles son los mecanismos de aislamiento reproductivo entre estas especies, prezigóticos o postzigóticos, que aporten claves sobre los mecanismos de especiación. Desde una perspectiva aplicada, comienza a calar en la opinión de los sectores productor y científico la necesidad de promover la genética del mejillón, para impulsar su producción, mejora y conservación. XI.1. XI.1.1.

MARCADORES GENÉTICOS PARA EL ESTUDIO DEL MEJILLÓN Uso histórico de marcadores genéticos en mejillón

Los estudios sobre las propiedades de los marcadores genéticos son de gran ayuda para evaluar su aplicabilidad en planes de gestión de especies (e.g., Avise y Hamrick, 1996). Las preferencias históricas en cuanto a la elección de un marcador o al desarrollo de otros nuevos, dependen del estado de avance de la tecnología y del balance entre las necesidades de investigación y las aplicaciones potenciales de dicho marcador (Figura XI.1). Los estudios genéticos poblacionales en mejillón anteriores a 1980, se efectuaron principalmente con alozimas para describir el estatus genético de las poblaciones, y también con marcadores cariológicos, para establecer el cariotipo de las especies próximas y sus relaciones evolutivas (revisado en Thiriot-Quievreux, 2002). Mientras que las técnicas citogenéticas han sido aplicadas y mejoradas de manera constante durante décadas, debido a su importancia central en manipulación génica y mapeo, el comienzo del análisis del ADN mitocondrial a partir de 1980, y del análisis del ADN nuclear en los años 90, está desplazando a los alozimas en estudios poblacionales. La pérdida de popularidad de los alozimas no sólo responde a limitaciones técnicas, como la falta de estandarización de la lectura de electromorfos o la inferencia genética indirecta que su interpretación impone, sino también a la mayor versatilidad de las técnicas basadas en ADN. A pesar de la superior informatividad de los marcadores de ADN, algunas limitaciones específicas de estos marcadores, como sus diferentes tasas de evolución o el tipo de herencia que exhiben, han promovido el uso de aproximaciones experimentales que combinan varias categorías de marcadores. Este enfoque combinado supuso una estrategia frecuente a finales de los años 90, debido a la estima menos insesgada de la diversidad gené-

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

229

Número de estudios

tica, proporcionada por el estudio simultáneo de varias dianas genómicas, tanto dentro de especie como entre especies (e.g., Avise, 1994). 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1980

1985

1990 1995 Quinquenio

2000

2005

Figura XI.1. Uso histórico de marcadores genéticos en Mytilus desde 1970. Alozimas (círculo), marcadores cariotípicos (cuadrado), marcadores de ADN mitocondrial (triángulo superior), marcadores de ADN nuclear (triángulo inferior), proteómica (estrella), combinación de marcadores (diamante).

XI.1.2.

Ventajas e inconvenientes de los marcadores moleculares

Uno de los objetivos fundamentales de la genética de la conservación es la identificación de unidades evolutivamente significativas (Waples, 1991), i.e., de subconjuntos de poblaciones reproductivamente aisladas o semiaisladas. Dicha identificación se efectúa mediante marcadores genéticos polimórficos, que constituyen una herramienta insustituible en la gestión de la diversidad de las especies salvajes y explotadas (Haig, 1998). Un marcador ideal para el manejo y la conservación debe ser polimórfico, neutral, codominante, de coste moderado, y mostrar baja homoplasia y error de genotipado. El polimorfismo de los marcadores moleculares ha sido una herramienta muy útil en muchos aspectos poblacionales de mejillones, tales como su estructuración, migración, introgresión e hibridación (e.g., Hilbish y col., 2002). Sin embargo, tal como se discute a continuación, ninguno de los marcadores al uso reúne las propiedades necesarias para resolver el amplio espectro de problemáticas poblacionales inherentes a cada rango taxonómico. Por una parte, los marcadores genéticos altamente conservados dentro de especie (e.g., ITS1-ADNr), son útiles para identificar barreras interespecíficas, pero resultan poco informativos dentro de especie (e.g., Heath y col., 1995). Por

230

Montse Pérez, Ángel P. Diz, Fernando Cruz y Pablo Presa

otra parte, los marcadores polimórficos a escala intraespecífica (e.g., alozimas), son razonablemente informativos dentro de especie, pero carecen con frecuencia de potencia suficiente para diferenciar especies evolutivamente próximas. En mejillones, esta exclusión taxonómica dependiente del marcador, impone la combinación de varios marcadores para acceder a una estima más realista del estatus genético de sus poblaciones, especialmente en áreas de solapamiento entre especies. Aunque en algunas situaciones ha sido posible establecer la dirección y el grado de introgresión génica diferencial (e.g., Quesada y col. 1995a), la existencia y prevalencia de flujo génico en áreas de hibridación e introgresión son difícilmente estimables. Esta dificultad es debida a la compleja estructura de las poblaciones naturales de mejillón, resultante de un patrón discontinuo de flujo génico entre especies, pero también depende de las propiedades del marcador molecular analizado, y de las limitaciones interpretativas impuestas por los algoritmos matemáticos disponibles. Marcadores citogenéticos Los estudios citogenéticos permiten obtener información sobre la estructura y la organización molecular de los cromosomas. El avance de las técnicas citogenéticas ha contribuido al desarrollo de diversos marcadores cromosómicos, aplicables tanto en estudios de diferenciación entre especies como de relaciones evolutivas entre taxones (e.g., Martínez-Lage y col., 1995). Con estas técnicas se ha podido determinar el número de cromosomas de varias especies de mejillón, la diversidad cariotípica entre individuos, y la localización de algunos grupos génicos como los ribosómicos (ZON, Zona del Organizador Nucleolar). Los 43 estudios citogenéticos revisados aquí a partir de 1969, incluyen el análisis de los cromosomas de mejillón por bandeo G (e.g., Pasantes y col., 1990), tinción argéntea específica de ZON (e.g., Martínez-Expósito y col., 1994), tratamientos con restricción enzimática y bandeo C (e.g., Martínez-Lage y col., 1994; Pasantes y col., 1996), tinción con fluorocromos y bandeo N (e.g., Martínez-Expósito y col., 1997), e hibridación in situ con diversas sondas sintéticas (e.g., González-Tizón y col., 2000; Insua y col., 2001). Aunque los marcadores cromosómicos presentan un elevado poder de resolución para diferenciar niveles taxonómicos (e.g., Insua y col., 2001), hay aun falta de consenso sobre la morfología de los cariotipos y sobre la interpretación de los polimorfismos intraespecíficos (Gosling, 1992). Por ejemplo, son controvertidas las diferencias en el par cromosómico 2, metacéntrico en M. edulis y subtelocéntrico en M. galloprovincialis (Thiriot-Quievreux, 1984), que no han sido corroboradas en otros estudios (e.g., Dixon y Flavell, 1986). Es sabido que las inversiones y translocaciones pueden tener gran relevancia evolutiva en especiación animal, sin embargo, las inversiones pericéntricas ocurren tanto dentro como entre poblaciones de M. edulis y M. galloprovincialis (e.g., Pasantes y col. 1990; Martínez-Lage y col., 1996), y parecen carecer de valor taxonómico en este caso. Aunque los marcadores cariotípicos son indispensables en estudios evolutivos, no son

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

231

fácilmente reproducibles ni técnicamente estandarizables para su aplicación ecuménica en genética de poblaciones. Marcadores alozímicos Las alozimas son variantes proteicas de genes multialélicos de función conocida, que exhiben un grado moderado de polimorfismo. Las diferencias aminoacídicas entre las unidades polipeptídicas de la enzima, se traducen en algunos casos en una migración diferencial de electromorfos, que es función de su carga neta y de su peso molecular (e.g., Murphy y col., 1996). La principal ventaja de su uso consiste en el rápido análisis de muchos loci e individuos a coste reducido. La aplicación de alozimas en mejillón comenzó en los años 70, alcanzó su máxima popularidad a mediados de los 90, y actualmente están siendo desplazados por marcadores de ADN más resolutivos. Aunque a lo largo de las tres últimas décadas las alozimas han proporcionando claves muy importantes sobre la variación genética inter e intraespecífica en mejillones, (e.g., McDonald y Koehn, 1988), sólo seis loci polimórficos han sido útiles para establecer grados de diferenciación génica, algunos entre las tres especies europeas de Mytilus (Mpi, Gpi, y Aap), y otros entre pares de estas especies (Odh, Pgm, y Est-D). Las alozimas han sido aplicadas con más éxito en estudios de estructuración genética. Por ejemplo, han permitido detectar discontinuidades genéticas, como las descritas entre poblaciones atlánticas y mediterráneas de M. galloprovincialis de la Península Ibérica (Sanjuan y col., 1994; Quesada y col., 1995b), entre poblaciones de M. edulis del norte y del sur de Japón (Yamanaka y Fujio, 1984)2, o entre poblaciones de Mytilus sp. de la costa chilena (Tarifeño y col., 2005; Cárcamo y col., 2005; Toro y col., 2005). Sin embargo, la mayoría de los análisis alozímicos en mejillón se ha orientado al estudio del mantenimiento y la dinámica de las zonas híbridas en Europa o en Canadá (e.g., Bierne y col., 2003), más que al conocimiento de la variación intraespecífica con orientación filogeográfica o de gestión de la diversidad genética. Las principales circunstancias que determinan la actual aplicación discontinua de alozimas son, i) la cantidad y calidad de muestras de tejido necesarias para su análisis, ii) el bajo polimorfismo3 disponible para detectar microdiferenciación o para asignar genotipos a especie (Diz, 2005), iii) su limitada utilidad taxonómica debida a la variación clinal de algunas frecuencias génicas, forjada por efectos selectivos, e.g., locus Gpi en la costa atlántica de los EEUU (Hall, 1985), iv) las sustituciones silenciosas y sinónimas, que conducen a subestimar la variación genética subyacente, y v) su limitada sensibilidad en estadíos larvarios. Estos inconve2

En la época en la que se desarrolló este trabajo, se desconocía la presencia de M. galloprovincialis y M. trossulus en Japón (McDonald y col., 1990), y se denominaba genéricamente al mejillón, M. edulis. 3 El número medio de alelos por locus y población es de 4,01±1,23 sobre 15 loci alozímicos analizados en 75 poblaciones de M. galloprovincialis. Como referencia de este polimorfismo puede considerarse que en 7 microsatélites analizados en una población se han observado 9,57±3,40 alelos por locus (Diz, 2005).

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Montse Pérez, Ángel P. Diz, Fernando Cruz y Pablo Presa

nientes de las alozimas, hacen inapropiada su aplicación como marcadores exclusivos en estudios poblacionales. Marcadores nucleares Los polimorfismos de ADN nuclear debidos a sustitución en zonas codificantes, ofrecen una estima directa del acervo genético de las especies. Su aplicación en mejillón ha proporcionado marcadores diagnósticos o parcialmente diagnósticos entre especies, pero muy pocos polimorfismos intraespecíficos. Se han caracterizado alrededor de 22 marcadores nucleares por secuenciación y PCR-RFLPs, como los genes ribosómicos 5S (Insua y col., 2001) y 18S (Kenchington y col., 1994; Winnepenninckx y col., 1994, 1996; Distel, 2000), una región codificante de una proteína similar a la protamina, específica del empaquetamiento de esperma (PLIIa) (Olivares y col., 1993), los extremos 5' y 3' de las regiones repetitiva y no repetitiva del gen que codifica la proteína adhesiva del biso (FP1) en M. galloprovincialis (Filpula y col., 1990; Inoue y Odo, 1994), una porción de 300 pb del gen de la proteína específica del esperma (PHI-1) (Ruíz-Lara y col., 1992; Heath y col., 1996), y dos fragmentos amplificados en los extremos 5' y 3' del exón de 2,5 kb del gen de la proteína adhesiva del pie (Filpula y col., 1990; Rawson y col., 1996; Hilbish y col., 2002). Entre los marcadores de ADN no codificante analizados en mejillón, destacan el intrón-3 del gen de la calmodulina de Mytilus sp., CaM-1 (Corte-Real y col., 1994), el intrón-1 del gen de la actina de M. galloprovincialis, mac-1 (Ohresser y col., 1997; Daguin y Borsa, 1999) y los espaciadores intergénicos ribosómicos ITS1 e ITS2 (Heath y col., 1995, 1996). El uso de primers EPIC diseñados a partir de exones para amplificar secuencias intermedias, ha revelado algunas diferencias entre las frecuencias génicas de muestras procedentes de zonas híbridas (Côrte-Real y col., 1994; Heath y col., 1996). Sin embargo, aún estas regiones no pueden considerarse una fuente rica en marcadores para Mytilus sp., debido a la escasez de secuencias disponibles, y a la gran longitud de los amplicones, que enmascara la presencia de variación si no se combinan con información de su secuencia nucleotídica, de la estructura alélica (SSCP), o de los patrones de restricción (RFLP). La amplificación de secuencias de ADN anónimas es otra alternativa como fuente de marcadores, que requiere una considerable inversión de trabajo sin la seguridad de obtener grados suficientes de polimorfismo intraespecífico. En esta categoría se han estudiado en mejillón tres segmentos de ADN anónimo (Beynon y Skibinski, 1996; Rawson y col., 1999), y el locus anónimo-I de Mytilus sp., MAL-I (Rawson y col., 1999). Finalmente, los polimorfismos detectados en clones de ADNc, no pueden en general ser registrados por PCR, lo que supone una gran limitación para su empleo a escala poblacional (Venier y col., 2003). Marcadores mitocondriales El ADN mitocondrial es un genoma haploide con tasas de mutación de 5 a 10 veces más aceleradas que el ADN nuclear (e.g., Brown y col., 1993). Esa tasa de mutación hace que sea más probable encontrar diferencias entre poblaciones o es-

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

233

pecies en este genoma que en marcadores nucleares codificantes. En general, los segmentos no codificantes como la región D-loop exhiben elevadísimos niveles de variación con respecto a regiones codificantes, como el gen del citocromo b, probablemente a causa de menores restricciones funcionales. Aunque la mitocondria animal presenta generalmente una herencia estrictamente materna (Birky, 1995), se han encontrado casos de herencia paterna secundaria e.g., Drosophila (Kondo y col., 1990). En mejillón se ha observado un sistema más complejo de transmisión paterna de las mitocondrias, DUI (Double Uniparental Inheritance) (Skibinski y col., 1994; Zouros y col., 1994) cuya heteroplasmia se caracteriza porque las hembras portan básicamente ADNmit materno (mitotipos F) y los machos portan ADNmit materno en tejidos somáticos y ADNmit paterno (mitotipos M) en sus gónadas (e.g., Cao y col., 2004). El análisis de la variación de ADN mitocondrial ha proporcionado mucha información sobre la taxonomía de vertebrados a escala específica (e.g., Moritz y col., 1987) y también ha sido estudiada en mejillones desde finales de los años 80. Esta variación genética se ha registrado a partir de RFLPs sobre el genoma total, y sobre segmentos mitocondriales amplificados por PCR. Por ejemplo, se ha observado que las frecuencias haplotípicas difieren entre poblaciones alopátridas de M. edulis y M. galloprovincialis en el Reino Unido (e.g., Edwards y Skibinski, 1987), y su divergencia nucleotídica es del 3-4%, lo que concuerda con datos paleontológicos (Barsotti y Meluzzi, 1968). También se ha estudiado la secuencia de regiones mitocondriales concretas como el gen de la citocromo-c oxidasa (e.g., Hoeh y col., 1996), de la subunidad ribosómica 16S (e.g., Geller y col., 1993), de la citocromo-oxidasa III (e.g., Zouros y col., 1994), o el de la ND2 (Quesada y col., 1998). Sin embargo ninguna de las diferencias en el ADNmit permite el diagnóstico interespecífico completo (al igual que los alozimas), y la distancia genética calculada sobre haplotipos mitocondriales es frecuentemente de escala intraespecífica. Los 37 genes del genoma mitocondrial constituyen un complejo grupo de ligamiento de unos 18 kb, que presentan tasas de evolución diferenciales (e.g., Stewart y col., 1995). Por otra parte, la mayoría del genoma mitocondrial no evoluciona de forma neutral, debido por ejemplo a una relajación diferencial de la selección en los mitotipos F y M (Quesada y col., 1998), lo cual dificulta las inferencias sobre el origen evolutivo de las poblaciones o la asignación de progenies. En ocasiones los polimorfismos de regiones del ADN mitocondrial como la citocromo-oxidasa III en Mytilus sp., muestran una variación regional intraespecifica de muy difícil interpretación en términos de dinámica poblacional (i.e., Kim y col., 2000)4. Aunque el uso de marcadores mitocondriales resulta útil para establecer relaciones filogenéticas entre especies próximas (e.g., Meyer, 1993), el genoma mitocondrial no representa más que una fracción minúscula del registro genético y evolutivo de un organismo con reproducción sexual. Es por ello improbable que su limitada representatividad 4

En especies de elevados tamaños efectivos poblacionales, resulta a veces complicada la interpretación de grados elevados de variación genética observados en regiones mitocondriales y en algunos microsatélites (Balloux y col., 2000).

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evolutiva permita establecer reconstrucciones filogenéticas definitivas entre las especies de mejillón (Presa y col., 2002a). Marcadores poblacionales emergentes A pesar de la actual aplicación de la bioinformática y de la genética molecular al conocimiento de muchos genomas, el del mejillón muestra un retraso considerable. Herramientas hoy usuales en otras especies, como la proteómica o los marcadores microsatélites, están aún calibrándose en el mejillón, y se prevé su generalización a lo largo de esta década. En los últimos años se ha empezado a desarrollar la proteómica de los mejillones europeos, Mytilus sp. (e.g., López y col., 2001, 2002a,b; Mosquera y col., 2003; Diz y Skibinski, 2005), i.e., el estudio de las proteínas expresadas por sus genomas. Los proteomas son variables entre especies, entre individuos, y entre distintos estadíos del desarrollo individual. Por ello su análisis permite la evaluación causal de los cambios y de las diferencias fenotípicas. Su estudio a través de la electroforesis bidimensional (2-DE) es capaz de resolver miles de proteínas del complejo biológico celular, mediante su separación basada en el punto isoeléctrico y el peso molecular. El estudio de la expresión proteica diferencial de mejillones sometidos a diferentes condiciones ambientales o de diferentes hábitat, es una potente técnica que podría permitir conocer aspectos relacionados con la ecología, la fisiología, la genética, y en definitiva, procesos evolutivos y adaptativos en diferentes especies y poblaciones. Sin embargo, esto sólo será posible cuando se solventen los problemas de reproducibilidad asociados a la técnica 2-DE, y a los métodos de visualización de proteínas. En este sentido se han hecho avances recientes en estandarización y en disminución de la intervención del usuario en la 2-DE (Görg y col., 2004), así como en técnicas de identificación de proteínas basadas en la espectrometría de masas. Por otra parte los microsatélites, son tramos repetitivos simples de ADN en tándem, que se distribuyen en función de las restricciones selectivas de cada ventana genómica (Cruz y col., 2005; Pérez y col., 2005a). Estos marcadores presentan tasas mutacionales elevadas y son por ello muy informativos a escala intraespecífica (e.g., Presa y col., 1994), constituyendo los marcadores de elección en la gestión genética de muchas especies explotadas y naturales (e.g., Bouza y col., 2002). Tienen además numerosas ventajas en acuicultura respecto a otros marcadores5, y han permitido detectar subestructuras genéticas intraespecíficas antes inapreciables (e.g., Tessier y col., 1995; Estoup y col., 2000). La validación de baterías múltiplex de microsatélites para los mejillones europeos (Presa y col., 2002b), permitirá abordar a medio plazo, el estudio de fenómenos de microdiferenciación y persistencia/volatilidad de estructuras genéticas, y a largo plazo, el desarrollo de mapas de ligamiento para la identificación de caracteres de interés productivo (QTL) y estudios de genómica comparada (e.g., rodaballo, Martínez y 5

Los microsatélites suelen presentar herencia mendeliana codominante y permiten efectuar un genotipado rápido y económico por métodos no invasivos (e.g., Estoup y col., 1993).

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

235

col., 2005). Concretamente para el estudio de la introgresión interespecífica, es necesario el marcado genético individual, el cual no resulta sencillo en mejillón, en ninguna etapa del desarrollo. Esta falta de resolución individual es particularmente frustrante para asignar individuos o muestras a especies con fines ecológicos, reproductivos, de conservación o comerciales (Presa y Pérez, 2003). Por ejemplo, la comprensión de la estructura de las zonas híbridas requiere la determinación precisa de la contribución genética de cada especie, basándose en un conocimiento preciso de los acervos génicos parentales involucrados. Es aquí donde los microsatélites pueden ser de gran utilidad, y especialmente cuando las propiedades de los sistemas biológicos estudiados se ajusten a los requerimientos teóricos de los algoritmos de asignación (e.g., Paetkau y col., 2004). A pesar de las prometedoras propiedades de los microsatélites en mejillones, existen varios factores que disminuyen su potencia analítica. En primer lugar, los alelos nulos producidos por la mutación en las regiones de anillamiento de los cebadores de PCR, y en segundo lugar la elevada homoplasia, que introduce sesgos en el patrón de mutación asumido en cada locus, y limita especialmente la inferencia filogenética (Estoup y col., 2002). Los alelos nulos pueden y deben evitarse antes de la elección de la batería de microsatélites que se utilizará en estudios aplicados, mediante la validación segregacional de cada locus en familias de hermanos completos (e.g., Castro y col., 2004). Corolario Para diseñar un plan de conservación dirigido sobre el genoma entero de las especies, la selección de los marcadores apropiados del elenco posible no resulta sencilla. Al objeto de minimizar las limitaciones inherentes a cada marcador y promediar nuestra visión del estatus genético de las especies, es necesario evaluar las congruencias filogeográficas de genes nucleares y mitocondriales (e.g., Presa y col., 2002a). Desde hace aproximadamente una década, ya se han empezado a utilizar en mejillones estrategias que combinan varios de los marcadores descritos anteriormente (e.g., ITS - PLIIa, Heath y col., 1995; alozimas - ADN mitocondrial, Sanjuan y col., 1996; alozimas - ITS - Glu-5' - COIII, Comesaña y col., 1999; ITS - MAL-I - Glu-5' - ADNr 16S, Rawson y col., 1999; Glu-5' - mac-1, Daguin y Borsa, 2000; ADNr 5S - ZON, Insua y col., 2001), lo que conduce a un mejor conocimiento del estatus genético de poblaciones y especies de mejillón. Estudios de covariación entre diferentes dianas moleculares, han proporcionado perspectivas muy interesantes sobre las fuerzas que influyen en la variabilidad genética intrapoblacional de organismos acuáticos (e.g., Pogson y Zouros, 1994). Las estrategias que combinan diversos marcadores genéticos con el uso de herramientas predictivas, deberán pues contribuir a la comprensión de las interacciones entre variables que afectan al poder resolutivo de los marcadores genéticos (Bernatchez y Duchesne, 2000). Los microsatélites, con claras limitaciones de uso e interpretación a grandes escalas taxonómicas, son particularmente ideales para caracterizar muestras larvarias y poblaciones experimentales (Manuel y col., 1996), y para conocer la reorganización genómica intraespecífica tras invasiones locales por mejillones exóticos (e.g., Grant y Cherry, 1985).

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XI.2.

ESTATUS TAXONÓMICO DE LOS MEJILLONES EUROPEOS

La controversia existente respecto al estatus taxonómico de las especies M. edulis y M. galloprovincialis ha estado presente durante los dos últimos siglos, y el reconocimiento de M. trossulus ha complicado aun más los escenarios evolutivos propuestos para este género (Riginos y Cunningham, 2005). Las incongruencias filogenéticas registradas en el género Mytilus, son probablemente debidas a una visión evolutiva sesgada, derivada de una inferencia basada en pocos genes de distinta tasa evolutiva (efectos de deriva de linajes, duplicación y extinción génica, y transferencia génica horizontal a escalas evolutivas) (Maddison, 1996). Estas controversias no serán definitivamente resueltas hasta la utilización simultanea de muchos genes sobre las mismas poblaciones, de muestreos interanuales y amplios capaces de capturar más diversidad genética dentro del género, de la definición de los acervos génicos específicos, y de la cuantificación de las diferencias reales entre los genomas de las tres especies, a través de su proteoma y de su transcriptoma. XI.2.1.

Relaciones filogenéticas entre las poblaciones europeas

La mayoría de los estudios genéticos en mejillones se han encaminado a dilucidar las relaciones taxonómicas dentro del género Mytilus (e.g., Riginos y Cunningham, 2005). Estos estudios responden a la necesidad de utilizar información genética precisa como herramienta de clasificación biológica, frente a la confusa plasticidad fenotípica propiciada por la fuerte variación ambiental que actúa sobre estas especies. Todos los datos disponibles de estudios genéticos, inmunológicos y morfológicos, indican que las tres especies europeas de Mytilus son muy próximas evolutivamente, como lo demuestra además su capacidad para hibridar en múltiples zonas de contacto. Por ejemplo, las diferencias de frecuencias alozímicas entre el Mar Báltico y el Mar del Norte, son probablemente debidas a selección diferencial por un gradiente de salinidad (e.g., Tedengren y col., 1990), y sugieren que M. trossulus del Báltico sería un ecotipo especializado del norteño M. edulis, ambos taxones originados a partir del mismo linaje evolutivo (Riginos y Cunningham, 2005). Como se apuntaba arriba, existen incongruencias entre marcadores tal como la mayor divergencia de M. galloprovincialis dentro del complejo Mytilus europeo, obtenida con ADNmit-RFLPs (Wenne y Skibinski, 1995) o con microsatélites (Diz, 2005) (Figura XI.2), que contradice la mayor proximidad de M. galloprovincialis y M. edulis observada con el resto de marcadores genéticos6. Téngase en cuenta también la ausencia de congruencia entre estimas de divergencia entre M. galloprovincialis y M. edulis, tal como la distancia genética calculada a partir de 6

Por ejemplo, estudios de ADNmit (e.g., Rawson y Hilbish 1995), ADN nuclear (e.g., Riginos y McDonald, 2003), cariotípicos (revisados por Thiriot-Quievreux, 2002), y estimas de incompatibilidad gamética (e.g., Rawson y col. 2003), sitúan a M. edulis y M. galloprovincialis como las especies genéticamente más próximas de este género.

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

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PCR-RFLPs de ADN anónimo y ARNr 18S, que fluctúa entre valores típicos de especies gemelas (Ds < 0,05) (Beynon y Skibinski, 1996; Distel, 2000), y valores elevados (Ds = 0,350) calculados con alozimas (Hummel y col., 2001), correspondientes a un claro nivel interespecífico. Esto indica que aunque la distancia genética es un dato apreciado para evaluar los grados de diferenciación entre taxones, y clarificar incertidumbres taxonómicas provocadas por fenocopias, no debe ser utilizada como parámetro único para establecer límites taxonómicos en mejillón, dada la elevada varianza entre loci y la frecuente hibridación y flujo génico entre estas especies. En segundo lugar es imprescindible invocar el efecto que el muestreo poblacional ejerce sobre las estimas de divergencia entre especies. Por ejemplo, no resulta comparable el escenario evolutivo derivado del estatus genético de muestras representativas de las tres especies a escala mundial, con el escenario de las poblaciones europeas, que no refleja en absoluto las distancias interespecíficas reales del enfoque mundial, i.e., la divergencia entre especies va a ser dependiente del peso que en el cuerpo muestral tengan las poblaciones puras, e.g., M. trossulus del Pacífico Norte, y las híbridas, e.g., zona híbrida M. edulis y M. trossulus en Europa y en Canadá. (A) Mg

0,38

Me

(B) 0,43

M t

Me

0,21

Mg

0,10 Me

0,63

Mg

Me

(E) Mg 0,0Me

Mt

(D)

(C) Mt

0,21

Mt

Mg

(F) 0,09

Mt

Mg

0,41

Me

0,12 Mt

Figura XI.2. Relaciones taxonómicas entre las tres especies europeas de mejillón (Mg, M. galloprovincialis; Me, M. edulis; Mt, M. trossulus), estimadas a partir de alozimas (Hummel y col., 2001) Fig. 3(A), (Väinölä y Hvilsom, 1991), Fig 3(B); ADNmit-RFLPs (Wenne y Skibinski, 1995), Fig 3(C); ADNmit-COIII (Quesada y col., 1998) y ADNmit-16S (Geller y col., 1993), Fig. 3(D); ADNr-18S (Distel, 2000) y tres marcadores nucleares anónimos de ADNc (Beynon y Skibinski, 1996), Fig. 3(E); 5 microsatélites de M. galloprovincialis (Diz, 2005) Fig. 3(F).

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A pesar de las diferencias de morfología espermática entre las especies de Mytilus sp. (e.g., Crespo y col., 1990), existen numerosas evidencias morfológicas y genéticas de que la hibridación y la introgresión son muy acusadas en poblaciones naturales (Gosling, 1984), i.e., se han documentado zonas híbridas entre M. galloprovincialis y M. edulis desde el norte de España hasta Escocia (Skibinski y Beardmore, 1979; Gosling y Wilkins, 1981), y entre M. edulis y M. trossulus en las inmediaciones del Mar Báltico (Väinölä y Hvilsom, 1991). En estas áreas de hibridación es posible observar una estructura genética compleja compuesta por individuos puros, híbridos e introgresados, e.g., en el Atlántico canadiense (Toro y col., 2004), que nos permite dudar de la existencia de una barrera reproductiva sólida entre estas especies. De hecho, las evidencias poblacionales de hibridación e introgresión efectuadas a partir de loci alozímicos parcialmente diagnósticos, y consistentes en una disminución de los coeficientes de diferenciación bajo hibridación (Wright, 1951), y en un exceso de heterocigotos respecto al déficit común en moluscos (e.g., Volkaert y Zouros, 1989), han sido corroboradas por la viabilidad de los híbridos en cruzamientos artificiales (e.g., Beaumont y col., 2004) o por la ausencia de incompatibilidad gamética entre especies, e.g., entre M. galloprovincialis y M. edulis (Rawson y col., 2003). La existencia de zonas híbridas estables entre especies diferenciadas es un hecho bien descrito en plantas y animales (Barton y Hewitt, 1985), si bien su dinámica poblacional y su causalidad molecular siguen siendo un tema central en genética de la especiación. En la mayoría de los casos se trata de zonas muy restringidas debido a la baja viabilidad de los híbridos. Se asume en estos casos que el número de genes que constituye tales barreras reproductivas debe ser tan elevado, que el resto de genes estarían ligados a ellos, impidiendo la progresión evolutiva de los híbridos (Johannesson y col., 1990). Siguiendo estos argumentos, algunos autores (e.g., Koehn, 1991) consideran que a pesar de la hibridación y de la alta capacidad dispersiva de los tres taxones europeos de mejillón, estos constituyen especies diferentes pues existe una divergencia suficiente de genes nucleares para distinguirlas sin ambigüedad. La definición biológica de especie basada en barreras reproductivas (Mayr, 1970), alcanza en Mytilus su paradigma limitante. Cabe pues plantearse ¿Cuánta hibridación debemos asumir entre taxones para considerarlos con-específicos? o ¿Cuán inviables o infértiles deberían ser los híbridos para considerar especies a sus progenitores? Conseguidas estas respuestas podríamos definir operacionalmente el estatus taxonómico de las poblaciones europeas de mejillón. Desde una perspectiva fundamental, dada la hibridación extensiva dentro de este género, es prudente asumir la falta de datos significativos para la categorización del mejillón europeo en tres especies distintas, en términos genéticos y reproductivos. Sin embargo, desde una perspectiva conservacionista, es aconsejable seguir considerándolas tres especies evolutivamente diferenciadas.

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

XI.2.2.

239

Estatus genético del mejillón peninsular

Una vez comprobado que el mejillón de la costa Atlántica Ibérica correspondía a Mytilus galloprovincialis (Sanjuan y col., 1986), al igual que las poblaciones mediterráneas, se efectuaron estudios más amplios con alozimas (Sanjuan y col., 1994; Quesada y col., 1995b) y con ADN mitocondrial (Quesada y col., 1995c; Sanjuan y col., 1996). Estos estudios constataron la existencia de cierto grado de diferenciación genética entre poblaciones atlánticas y mediterráneas, relacionado con la barrera oceanográfica del frente Almería-Orán (Tintore y col., 1988). Dicha barrera parece limitar el intercambio larvario en la fase planctónica de algunos organismos como la ostra Ostrea edulis (Saavedra y col., 1993), aunque este fenómeno no es generalizable ni entre especies ni entre marcadores dentro de especie (e.g., Lemaire y col., 2005). La comprensión de las implicaciones poblacionales de este fenómeno oceanográfico, requeriría conjugar también la componente histórica, que contempla las oscilaciones ocurridas en el nivel del Mar Mediterráneo durante los últimos seis millones de años (e.g., Blanc, 1968). Estudios efectuados con marcadores microsatélites del mejillón (Diz, 2005), en congruencia con los trabajos anteriores, han detectado también dicha diferenciación atlántico-mediterránea (2,93% de varianza genética entre vertientes respecto al 1,84% dentro de vertientes) y la naturaleza atlántica de las poblaciones del Mar de Alborán (Figura XI.3). Por otra parte se recobran valores de diferenciación interpoblacional (FST) más elevados en el Atlántico (0,021±0,013) que en el Mediterráneo (0,009±0,011), probablemente generados por la mayor heterogeneidad ambiental atlántica. La variación clinal abrupta de algunas frecuencias génicas de microsatélites entre ambos lados del frente Almería-Orán, también observada con alozimas y ADNmit (Sanjuan y col., 1994; Quesada y col., 1995a,b), sugiere la existencia de un flujo génico restringido entre vertientes (Diz, 2005). Sin embargo, su génesis, mantenimiento e interpretación, son controvertidas, dado que solamente se observan clinas en pocos loci del total analizado. Los análisis en curso con microsatélites y el proteoma del mejillón, son las herramientas moleculares disponibles más potentes para el estudio del fenómeno clinal descrito. Estos estudios permitirán a corto plazo comprender mejor la magnitud, dirección y dinámica del flujo génico en una interfase poblacional de especial interés, ya que se trata de un modelo natural caracterizado por una heterogeneidad ambiental polarizada, un intercambio zonal reducido, y un hipotético escenario de especiación incipiente.

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Figura XI.3. Barrera al flujo génico (línea gruesa) generada en mejillón a partir de la información satelital GPS y los valores de FST (Manni y col., 2004) de microsatélites (Diz, 2005). Los números corresponden a poblaciones de mejillón distribuidas a lo largo de la costa ibérica, desde el Mar Cantábrico (#1) hasta el Mar Mediterráneo (#17). La barrera coincide con el frente Almería-Orán, y también separa las poblaciones mediterráneas de las cantábricas.

XI.3. XI.3.1.

CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DEL MEJILLÓN GALLEGO Primeros estudios sobre su identidad genética

Hasta finales de los años ochenta del siglo XX se pensaba que el mejillón del Atlántico Peninsular pertenecía a la especie M. edulis, ocupando M. galloprovincialis la región mediterránea e.g., mediterranean blue mussel. Los primeros estudios genéticos se orientaron a identificar taxonómicamente al mejillón de las costas gallegas (Sanjuan y col., 1986, 1990). Estos autores estudiaron caracteres parcialmente diagnósticos entre ambas especies, tanto morfológicos como alozímicos (Est-D, Lap-1, Odh y Mpi), en varias poblaciones de mejillón gallego (Sada, Laxe, Carril, Pontevedra y Aldán), con controles de M. galloprovincialis del Mediterráneo (Marbella y Tarragona) y de M. edulis (Dinamarca y Holanda). Sus resultados mostraron que el mejillón gallego pertenece inequívocamente a la especie M. galloprovincialis, que se extiende desde el Mediterráneo hasta la costa Cantábrica de la Península Ibérica (Sanjuan y col., 1994). Su distribución meridional se extiende por el Mediterráneo hasta el Norte de África (Comesaña y col., 1998), mientras que la septentrional alcanza las Islas Británicas, hasta donde hibrida con M. edulis a partir de la frontera Hispano-Francesa (Gosling, 1984). En la década de los años 90 el mejillón gallego fue también catalogado como M. galloprovincialis por su ultraestructura espermática (Crespo y col., 1990), y

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

241

por sus características citogenéticas (e.g., Martínez-Lage y col., 1992), i.e., se observó un cariotipo diploide estándar (n=28), tanto en poblaciones del Mediterráneo (Valencia) como de la localidad gallega de Sta. Cristina. También se estudiaron algunas de sus propiedades cariotípicas (tamaño del genoma, ploidía, regiones ZON), utilizadas para establecer relaciones interespecíficas dentro del género (revisadas por Thiriot-Quievreux, 2002), y para inferir relaciones entre aneuploidías y tasas de crecimiento o contaminación ambiental (e.g., Martínez Expósito y col., 1992). XI.3.2.

Dinámica genética en las rías gallegas

La fase larvaria del mejillón es el momento de su ciclo vital en el que puede ocurrir migración pasiva que homogenice el acervo génico de las poblaciones. Por ejemplo, ha sido documentada una dispersión de 300 km a partir del punto de desove, en poblaciones de las Islas Británicas (Gilg y Hilbish, 2003). Es por tanto esperable que no exista restricción al flujo génico entre las rías gallegas, i.e., que el mejillón constituya una sola población con enormes efectivos poblacionales en cada ría, cuyas puestas anuales se mezclen en proporciones variables dependiendo de las condiciones oceanográficas y climatológicas. Hay sin embargo dudas razonables para plantear el estudio de la dinámica genética local en términos de estructuración, debido a tres factores. En primer lugar porque asumiendo la ausencia de estructuración con la lógica de la hipótesis anterior, no se han efectuado trabajos exhaustivos para refutarla, ni estos han sido implementados hasta el momento para optimizar la explotación del recurso. En segundo lugar, porque se piensa que la dispersión post-larvaria es mayoritariamente local (Cáceres-Martínez y Figueras, 1998a), lo cual apoyaría la existencia de flujo génico restringido entre rías (Scheltema, 1971). En mejillón se han observado desde dispersiones de amplio rango hasta inesperadas restricciones migratorias locales. Por ejemplo las frecuencias alozímicas de poblaciones europeas de M. galloprovincialis, son muy homogéneas en rangos geográficos muy amplios (e.g., McDonald y col., 1990), al igual que ocurre entre poblaciones mediterráneas y sudafricanas, con distancias genéticas (Ds de Nei) del orden de 0,010±0,004 (SE) (Grant y Cherry, 1985). Estas distancias solapan con las observadas entre poblaciones mediterráneas (Skibinski y col., 1980) y corresponden con el rango esperado entre poblaciones conespecíficas (0,00-0,050; Ferguson, 1980). Por el contrario, se han observado diferencias significativas en las frecuencias alozímicas de Est-D, Mpi y Odh, entre muestras de M. galloprovincialis de localidades del sudoeste inglés que distan menos de 5 km (Beaumont y col., 1989). Ni la capacidad dispersiva efectiva, ni la distancia geográfica, son por tanto factores predictivos del grado de heterogeneidad entre poblaciones de esta especie. En tercer lugar, algunos estudios previos sugieren la existencia de adaptaciones locales con base genética. Por ejemplo, algunos experimentos efectuados en Galicia con semilla de distinta procedencia, señalaron pequeñas diferencias entre lotes en tasa de crecimiento, mortalidad y biomasa (Fuentes y col., 1994).

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Los datos alozímicos ponen de manifiesto una ausencia de estructuración genética de las poblaciones gallegas (Sanjuan y col., 1990), y estudios genéticos recientes con marcadores microsatélites (Diz y Presa, 2003a; Diz, 2005), confirman la ausencia de estructuración genética entre rías (Figura XI.4), i.e., la varianza genética debida a diferencias entre las poblaciones gallegas (1,76%) es muy similar a escala peninsular (1,84%), y lo mismo ocurre con las FST asociadas (FST = 0,018 entre poblaciones gallegas, y FST = 0,019 entre poblaciones atlánticas ibéricas). Sin embargo, la definición de estructuración depende del criterio establecido para evaluar la divergencia, i.e., la consideración de stock requiere la definición de un rasgo genético característico determinable por quien clasifica, mientras que la consideración de subespecie (definición biológica) requiere mayor divergencia entre poblaciones para un mayor número de genes que la de stock o la de Unidad Evolutivamente Significativa (ESU, Waples 1991). Tanto los valores de diferenciación génica de microsatélites entre rías como el árbol filogenético, indican que las frecuencias génicas de algunas poblaciones de las rías Altas divergen significativamente de las de las rías Bajas (Diz, 2005), i.e., el valor FST medio dentro y entre rías (FST = 0,002 ± 0,0012), es de un orden inferior respecto al observado con la Ría de Betanzos (FST = 0,010 ± 0,0012). ¿Es esta divergencia estable, o artefactual?, y en el primer caso, ¿Tiene relevancia para la gestión del mejillón?

s uro eM ad Rí

Muros (Mumu) Esteiro (Mues) Noia (Muno) Porto do Son (Mupo) Corrubedo (Muco)

Ribadeo (Riar) Ferrol (Befe) Ares (Bear) R Bergondo (Bebe) ía de Be Dexo (Bede) tan zo Barrañán (Beba) s oia yN

Isla de Noro (Arno) Ribeira (Arri) Boiro (Arbo) Ría de A Rianxo (Arrx) rosa Villagarcía (Arvi) Grove (Argr)

Galicia ra

Nerga (Vine) Tirán (Viti) Rande (Vira) Samil (Vito) Monteferro (Vimo)

Rí ad

eV ig

o

ed Sanxenxo (Posa) tev Pon Combarro (Poco) de a í Marín (Poma) R Bueu (Pobu) Menduiña (Pome)

PORTUGAL

Figura XI.4. Árbol Neighbor-joining de poblaciones de mejillón de las Rías Gallegas (Diz, 2005), elaborado con los microsatélites Mgm1, Mgm2, y Mgm3 (Presa y col., 2002a). Los valores nodales de soporte topológico se expresan en porcentaje sobre 1.000 réplicas de bootstrap.

XI.3.3.

Patrón filogeográfico del mejillón gallego

Las leves diferencias de frecuencias génicas entre rías Altas y rías Bajas pueden deberse a muchos factores, entre los cuales cuatro son los más intuitivos, i.e., i) una fluctuación interanual azarosa de las frecuencias génicas, ii) una diferen-

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

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ciación regional provocada por la unidireccionalidad estacional de las corrientes marinas, iii) una reducción del flujo génico efectivo entre ambas regiones, y iv) un efecto antropogénico de introducción aleatoria de semilla en los cultivos. En primer lugar, la fluctuación anual de frecuencias puede ser comprobada mediante el análisis interanual de las mismas poblaciones (Presa y col., datos no publicados). En segundo lugar, las corrientes marinas estacionales podrían determinar el sentido del flujo génico antes del asentamiento, ya que es improbable que se produzcan movimientos relevantes tras este (e.g., Kautsky, 1982; Cáceres-Martínez y Figueras, 1998a). La llamada Corriente de Navidad (Pole-ward current), es una vena de agua caliente poco profunda de componente norte, que procede del Atlántico central, transcurre paralela a la costa Gallega, y gira hacia el Golfo de Vizcaya por la aceleración de Coriolis (Sánchez y Gil, 2000). Esta corriente dominante desde noviembre a marzo, ejercería una función difusora de larvas planctónicas de la primavera temprana (Fuentes y Molares, 1994; Cáceres-Martínez y Figueras, 1998b), desde las rías Bajas hacia las rías Altas. Por otra parte, la corriente del Golfo de Vizcaya predomina desde abril a octubre y recorre la costa Gallega hacia el sur, arrastrando larvas de puestas sucesivas. Un efecto esperado bajo unidireccionalidad del flujo larvario, determinado por resonancia de una corriente dominante con el tiempo reproductivo, sería un incremento de la riqueza alélica en destino. Sin embargo este enriquecimiento no se observa en estudios recientes con microsatélites (Diz y Presa, 2003a,b), y por ello la hipótesis más verosímil para explicar la leve divergencia génica de las poblaciones de Betanzos-Ares, es el confinamiento de estas poblaciones (o de las muestras tomadas de dichas poblaciones) en el interior de dicha ría, estando menos expuestas a las corrientes exteriores que determinan la dispersión larvaria en plataforma. En tercer lugar es argumentable un patrón de flujo génico reducido entre las rías Altas y las rías Bajas. Esta reducción estaría condicionada, bien al comportamiento larvario, bien a barreras efectivas al flujo génico. La limitación de la dispersión por comportamiento larvario parece improbable en esta especie, tal como indican diversos estudios ya mencionados. Por otra parte se ha descrito una cuestionada barrera oceanográfica en el Noroeste de la Península Ibérica, provocada por la confluencia de masas de agua sub-superficiales (100-400 m de profundidad) del Golfo de Vizcaya y del Atlántico Norte. Esta barrera separaría las aguas sub-superficiales del Noroeste Ibérico en dos áreas con características ecológicas diferenciales, septentrional y occidental, que confluyen en la franja Fisterra-Malpica (Fraga y col., 1982; Estrada, 1984; González-Gurriarán y Olaso, 1987). Aunque no se descarta la influencia de esta hipotética barrera sobre la dispersión larvaria del mejillón, hay dos hechos que permiten reducir su influencia en fenómenos de diferenciación poblacional. El primero consiste en que la diferenciación sería más acusada sobre aquellas especies cuya deriva pasiva se situase en torno a la barrera oceánica, i.e., en los 100-400 m de profundidad, entre las que no se encuentra el mejillón. El segundo factor en contra de la barrera consiste en la ausencia de diferencias génicas entre poblaciones del norte y del oeste de Galicia, en especies de cefalópodos con capacidad dispersiva muy limitada (Sepia sp.), y de otras con mayor capacidad dispersiva (Ilex sp,

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Loligo sp., Todaropsis sp.; Scophthalmus sp.; Platichthys flesus) (Pérez-Losada, 1998; Bouza y col., 2002). En cuarto lugar, la leve diferenciación de algunas poblaciones de Betanzos (así como de otras que muestran FST significativos respecto al resto de poblaciones analizadas con microsatélites, i.e., Combarro, Boiro e Isla de Noro (abreviadas en Figura XI.3 como Poco, Arbo y Arno), podría deberse a un efecto antropogénico de trasvase de semilla entre rías. Estas introducciones son relativamente frecuentes en cada sesión de encordado, y proceden del rascado de roca intermareal de cualquier punto de la costa gallega. Un efecto genético inmediato de esta práctica es la homogeneización de las poblaciones de mejillón, que podría ser sinérgica con la que se produce naturalmente por corrientes. En este caso la acción antropogénica no afectaría al estatus genético natural de las poblaciones. Sin embargo, en caso de que la homogeneización por corrientes no tuviera lugar, los trasplantes indiscriminados de semilla entre rías estarían produciendo una homogeneización de los acervos génicos de cada ría, que no conlleva necesariamente efectos negativos a corto plazo para el mejillón, pero sí impediría la diversificación génica azarosa, localidad-dependiente, que permite asegurar la adaptabilidad del recurso a largo plazo. Una segunda consecuencia genética de los transplantes, que sí explicaría la divergencia genética de algunas poblaciones, es la derivada de la introducción de semilla exótica de especies congenéricas. Si bien no disponemos de datos precisos sobre la frecuencia ni la intensidad de estos transplantes, debemos valorar que sus consecuencias a corto plazo pueden ser dramáticas para las poblaciones locales, i.e., exogamia, competencia inter-específica, e introducción de parásitos y enfermedades víricas (e.g., Smith y Wayne, 1996). XI.4. XI.4.1.

PERSPECTIVAS DE LA GESTION GENÉTICA DEL MEJILLÓN Necesidades de investigación y carencias del sistema

A pesar del esfuerzo investigador realizado en diversos aspectos de la biología del mejillón durante las últimas décadas, i.e., en mitilicultura (e.g., Cáceres-Martínez y Figueras, 1998c; Villalba,. 1995), biomonitorización (e.g., Hummel y Patarnello, 1994), taxonomía (e.g., Gardner, 1992), hibridación e introgresión (e.g., Skibinski y col., 1978), biogeografía (e.g., Sanjuan y col., 1997), mecanismos de transmisión uniparental doble del ADNmt (e.g., Skibinski y col., 1994; Zouros y col., 1994), proteómica (e.g., López y col., 2001), y bioinformática (e.g., Pérez y col., 2005a), apenas se ha avanzado en conocimientos genéticos esenciales para la gestión y la toma de decisiones sobre su explotación y conservación. Esta carencia de estudios genéticos finos es extrapolable a muchas otras especies explotadas en Galicia, y se debe por una parte al propio recurso, dada su buena viabilidad en cultivo, y por otra parte a la falta de impulso en I+D+i, privado y público. No se ha sabido enfocar a largo plazo la inversión científica en esta especie, ni en la formación y el asociacionismo de genetistas moleculares, bioinformáticos y

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

245

matemáticos. Pensamos que estos factores han propiciado que no se haya hecho demasiado hincapié en el seguimiento genético del mejillón, ni en el desarrollo de estrategias de mejora genética o de producción y transplante controlado de semilla. Para ilustrar algunos ejemplos, veamos brevemente algunas carencias adscritas a dominios concretos de investigación (Figura XI.5).

UL AT I

IP AN M IO

Dinámica Poblacional

DOMINIO COMERCIAL

O IV

UT

L VO

IN

Historia Evolutiva

E O-

M

Gestión Genética

EC

DO

IO

PRODUCCIÓN Y CALIDAD

Plan Integral de Gestión

IN

Selección de líneas Plan de control génico

M DO

Mapa genético Genómica Funcional

VO

CONSERVACION DE LA ESPECIE

MARKETING Y SEGURIDAD

Identificación genética - Trazabilidad molecular – Genética Forense

Figura XI.5.

Dominios de investigación en acciones transversales para el manejo genético del mejillón.

A escala genético-poblacional se desconoce la dinámica larvaria local, la erosión génica producida durante cinco décadas de cultivo intensivo, la existencia de episodios selectivos naturales en puntos concretos del ciclo vital, o el grado de introgresión génica de otras especies en los cultivos locales. Este desconocimiento hace que sean impredecibles las consecuencias de su repoblación, sobreexplotación o la alteración del hábitat, sobre los niveles de diversidad genética que mantienen al recurso en sus niveles óptimos de explotación. A escala genético-estructural, aparte de los estudios citogenéticos de los años 90 anteriormente mencionados, no se dispone de ninguna referencia física para acceder a la organización génica del mejillón, ni por ende para abordar la genómica estructural comparada que permitiría la localización de genes de interés previamente caracterizados en otras especies. A escala genético-funcional, se puede afirmar que aun no se han abordado definitivamente tareas necesarias como la manipulación de la respuesta genético-inmunológica y fisiológica ante infecciones víricas, o la selección de líneas resistentes o de mayor crecimiento. A escala comercial, aunque ya en los dos últimos eventos científicos de la WEFTA (Western European Fish Technologists Association) se puso de manifiesto la conveniencia de desarrollar sistemas moleculares para la identificación de los mejillones comerciales, con fines de control de calidad y seguridad alimentarias, no existen aún sistemas de identificación validados para ninguna especie de mejillón. Al igual que se ha desarrollado para otras especies (e.g., género Merluccius, Pérez y col., 2005b), la trazabilidad molecular de subproductos de mejillón tendría aplicaciones inmediatas en el control de las importaciones para

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defensa de los sectores importador, transformador y consumidor (fraude comercial, asesoramiento en el etiquetado y control público de calidad), en el control del comercio de especies en riesgo de extinción, las procedentes de zonas contaminadas o en alarmas alimentarias (sanidad y seguridad alimentarias). Es sin embargo reseñable que la trazabilidad molecular a escala intraespecífica resulta más improbable que a escala inter-específica, debido a la proximidad genética de las especies europeas, y a la frecuente y ubicua introgresión génica entre ellas. Aunque recientemente se han hecho avances significativos en el establecimiento de las divergencias genéticas de poblaciones conespecíficas cultivadas en otras partes del mundo (Tarifeño y col., 2005; Cárcamo y col., 2005; Toro y col., 2005), la diagnosis regional de M. galloprovincialis aun deberá esperar al desarrollo amplio de la genómica, que podría permitir la selección de baterías multilocus para el diagnóstico de origen. A escala productiva no se han validado herramientas moleculares para el manejo de las poblaciones explotadas, ni para asistencia en la manipulación génica de cultivos experimentales. Por otra parte, el abastecimiento cada vez más precario de semilla natural habría requerido la inversión en investigación sobre sistemas de producción artificial, para compensar caídas naturales de biomasa o por catástrofes, para la venta a terceros, y para generación de cruzamientos controlados con fines científicos, que permitieran impulsar las ventajas del mejillón como organismo modelo en muchas disciplinas científicas. ¿Por qué no se han desarrollado en Galicia estas necesidades aparentemente apremiantes? Creemos que la imposibilidad de abordar todos estos aspectos en una sola acción de investigación, combinada con la particular estructura minifundista de la ciencia en España, generan un marco inapropiado para la envergadura metodológica y temporal que requieren dichas necesidades. En segundo lugar, vivimos un atraso en el desarrollo de sistemas de manipulación in vitro, en el control molecular de procesos metabólicos del mejillón, y en disponibilidad de instalaciones destinadas exclusivamente a estos objetivos en esta especie. En tercer lugar, la falta de coordinación de los grupos españoles que trabajan en mejillón, y la deficiente formación en técnicas de análisis y manipulación de los genomas, imposibilita el desarrollo de nuevos objetivos. Finalmente, pero menos justificable que el resto de carencias, la falta de un impulso económico empresarial y público a una acción potente de I+D+i en esta especie estratégica para nuestra economía, determina que los problemas biológicos espontáneos o periódicos se aborden con retraso y sin medios específicos. Para ser competitivos en un mercado global, dados los cambios inminentes que está experimentando el sector mitilicultor a escala mundial (incremento de producción en países competidores), será necesario incorporar a la cadena de producción local las tecnologías de genotipado de las poblaciones (gestión de poblaciones), las herramientas de identificación molecular y protección del producto propio (calidad-trazabilidad), las herramientas de genómica estructural para la búsqueda de QTL (mapeo génico), y las herramientas de genómica funcional y proteómica que permitan comprender la expresión génica en la respuesta fisiológica.

XI. La genética poblacional del mejillón gallego

XI.4.2.

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La conservación del mejillón en un plan integral de gestión

El mejillón constituye una pieza clave del equilibrio ecosistémico y es per se un patrimonio de valor intrínseco, susceptible de ser objetivo prioritario de la Genética de la Conservación en Galicia. Además representa unos de sus más emblemáticos patrimonios culturales, cuyo desarrollo productivo ha ido paralelo al de las poblaciones humanas. La caracterización de su diversidad genética es el punto de referencia para emprender acciones de explotación y conservación. Por ejemplo, la estabilidad de las poblaciones requiere la diversidad genética necesaria para mantener su viabilidad y permitir la adaptación a diferentes ambientes y la selección artificial. Por otra parte, el conocimiento genético fino de las poblaciones permite caracterizar combinaciones génicas adaptativamente relevantes, que constituyen un excelente material de investigación. El control de la diversidad genética interanual de las poblaciones gallegas, es una acción preventiva para combatir caídas en su producción, y una herramienta prospectiva para realizar mejoras en el cultivo y recomendaciones para la conservación. Los trabajos que se desarrollan actualmente de forma exhaustiva con marcadores microsatélites (laboratorio de los autores), van enfocados al conocimiento de la dinámica local interanual de la diversidad del mejillón. Estos datos genéticos son imprescindibles para elaborar un plan integral de gestión de esta especie, en el cual todo su potencial genético pueda ser gestionado para su explotación sostenible (socioeconómica), segura (ecosistémica), y perdurable (conservacionista) (e.g., Grumbine, 1994). Es pertinente definir los criterios de conservación a partir de datos genéticos. La conservación del mejillón gallego, sometido a explotación intensiva y a importaciones y exportaciones masivas, debe responder a unidades de manejo (MU) mejor que a unidades evolutivamente significativas (ESU, Waples 1991), difícilmente definibles en mejillón. El reconocimiento de ESU en mejillones es controvertido por la misma razón apuntada arriba respecto a su identificación genética, i.e. debido a los elevados flujos génicos entre especies y poblaciones, y a la plasticidad fenotípica que, bien acarrea sobreestimas del número de ESU, bien lleva a subestimas por fenocopiado. En el mejillón gallego, las MU podrían ser metapoblaciones intraespecíficas o poblaciones confinadas en cada ría. En este caso la definición de MU tiene más que ver con el manejo práctico a pequeña escala que con ESU. Aunque esta estrategia tiene la principal desventaja de la implementación de planes de gestión independientes para cada ría, cuenta con gran valor conservacionista, pues previene la erosión de diversidad de poblaciones confinadas (caso visto de rías Altas y poblaciones con alelos específicos), que son en general unidades económica y biológicamente independientes (Gosling, 1992). Hay aún muchas tareas que permanecen sin abordar en la conservación del mejillón, tales como el establecimiento de su patrón de dinámica génica, por otra parte de dudoso mantenimiento en el tiempo y en el espacio, debido a la temporalidad de las corrientes estacionales, al calentamiento global que modifica la distribución latitudinal de las poblaciones, a las acciones antropogénicas de trasplante de semilla, y de introducciones accidentales en agua de lastre (Sarver y Foltz,

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1993; Geller y col., 1994). El seguimiento de la cantidad de cambios genéticos intraespecíficos que se producen por invasiones biológicas (Lee y Morton, 1985; McDonald y Koehn, 1988; Carlton y Geller, 1993) o en competencia con mejillones introducidos (Wilkins y col., 1983; Heath y col., 1995), es extremadamente relevante para comprender la dinámica poblacional de especies potencialmente competidoras del mejillón local.

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ÍNDICE DE AUTORES

Antonio Figueras Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Moluscos Bivalvos Eduardo Cabello 6 36208 Vigo, España [email protected] Beatriz Novoa Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Moluscos Bivalvos Eduardo Cabello 6 36208 Vigo, España [email protected] Pablo Balseiro Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Moluscos Bivalvos Eduardo Cabello 6 36208 Vigo, España [email protected] Jorge Cáceres-Martínez Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada. Apdo. Postal 2732, C.P. 22860, Ensenada, Baja California, México. [email protected]

Jose Antonio Fernández Robledo Center of Marine Biotechnology University of Maryland Biotechnology Institute Suite 236, Columbus Center 701 East Pratt Street Baltimore, MD 21202, USA [email protected] María Santarem Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Moluscos Bivalvos Eduardo Cabello 6 36208 Vigo España Camino Ordás Facultad de Biología Universidad de La Coruña. La Coruña España [email protected] Carolina Tafalla CISA-INIA. Valdeolmos Madrid [email protected]

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Índice de autores

María Pernas Escario Servicio de Virología Molecular, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España [email protected]

Montse Pérez, Campus Universitario de Vigo, Facultad de Ciencias del Mar, Área de Genética, 36310 Vigo, España [email protected]

Uxío Labarta Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Eduardo Cabello 6 36208 Vigo, España [email protected]

Ángel Pérez Diz, Campus Universitario de Vigo, Facultad de Ciencias del Mar, Área de Genética, 36310 Vigo, España A.E.Pé[email protected]

María José Fernández Reiriz Instituto Investigaciones Marinas. CSIC. Eduardo Cabello 6 36208 Vigo, España [email protected]

Fernando Cruz Campus Universitario de Vigo, Facultad de Ciencias del Mar, Área de Genética, 36310 Vigo, España [email protected]

P. Duarte Universidade Fernando Pessoa. CEMAS, 349 Praça 9 de Abril, 4249-004 Porto, Portugal

Pablo Presa Campus Universitario de Vigo, Facultad de Ciencias del Mar, Área de Genética, 36310 Vigo, España. [email protected]

Este libro se terminó de imprimir en Madrid, en los talleres de Sociedad Anónima de Fotocomposición el día 30 de mayo de 2007.

e-ISBN: 978-84-00-09964-0 e-NIPO: 723-15-115-0