Bactériologie et virologie pratique 9782804104917

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ET VIROLOGIE PRA DR IQUE — ÉPUISÉ

.11.1,LI &LAZÈTEE

Bactériologie Virologie pratiq J. Grosjean D. Clavé M. Archambaud C. Pasquier

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https://archive.org/details/bacteriologieetv0000unse

Bactériologie et virologie pratique

Chez Le même éditeur

DeFranco, Robertson, Locksley, Immunité. La réponse immunitaire dans les maladies infectieuses et inflammatoires Guillaume, Mycologie Guillaume, Parasitologie

Guillaume, Parasitologie sanguine Murphy, Travers, Walport, /mmunobiologie de Janeway, 3° édition Petsko, Ringe, Structure et fonction des protéines

Roitt, Delves, Martin, Burton, Fondements de l'immunologie

Thomas, Guégan, Renaud, Écologie et évolution des systèmes parasités

Bactériologie et virologie pratique Jérôme Grosjean, Christophe Pasquier, Maryse Archambaud et Danielle Clave

Pour toute information sur notre fonds et les nouveautés dans votre domaine de

spécialisation, consultez notre site web : www.deboeck.com

© Groupe De Boeck s.a., 2009

11€ édition

Editions De Boeck Université Rue des Minimes 39, B-1000 Bruxelles Tous droits réservés pour tous pays. Il est interdit, sauf accord préalable et écrit de l'éditeur, de reproduire (notamment

par photocopie] partiellement ou totalement le présent ouvrage, de le stocker dans une banque de données ou de le communiquer au public, sous quelque forme et de quelque manière que ce soit. Imprimé en Belgique Dépôt légal : Bibliothèque Nationale, Paris : juin 2009 Bibliothèque royale de Belgique : 2009/0074/402

ISBN 978-2-8041-0491-7

SOMMAIRE Abréviations générales Abréviations antibiotiques

Sérum

9

Sang : bactériémies et virémies

12

Liquide céphalo-rachidien Liquides de ponction

18

2e

Urines Sphère ORL Sphère respiratoire Selles Sphère génitale Prélèvements périnataux

25 30 34 A0 45 52

Lésions cutanées et suppurations

co)

Cathéters

09

Techniques d'identification usuelles Diagnostic direct en‘bactériologie Diagnostic direct en Virologie Diagnostic indirecten bactériologie et virologie

61 66 72

Bactéries à Gram positif Coques StaphylocOCCus aureus

el(ee)

Bactériologie et virologie pratique

Staphylocoques à coagulase négative (SCN) Streptococcus pyogenes (groupe À) Streptococcus agalactiae Streptocoques Groupe «milleri» Streptocoques Groupe «viridans» Streptococcus pneumoniae Enterococcus Corynebacterium diphtherae Corynébactéries et Corynéformes commensaux Nocardia Listerna monocytogenes Bacillus cereus — Bacillus anthracis

78 81 84 87 89 91 95 101 103 107 111 114

Bactéries à Gram négatif

Coques Neisseria meningitidis Meisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Bacilles Entérobactéries , -Haemophilus influenzae Pasteurella multocida Campylobacter spp. Helicobacter pylori Brucella melitensis Bordetella pertussis Vibrio spp. Aeromonas Sp. Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter baumanni Legionella pneumophia

Anaërobies généralité

1T2

| di 121 123

120 139 142 145 148 151

155 190 163 66 170 ile)

0

Sommaire

Clostridium tetani

179

Clostridium perfringens

181

Clostridium difficile

183

Clostridium botulinum

86

Bacilles à Gram —

88

Bartonella henselae

193

ycobactéries

196

Mycobacterium spp.

196

Mycoplasmes

202

Mycoplasma spp.

202

Bactéries cytoparasites obligatoires

204

Coxiella burneti Bactéries cytoparasites obligatoires

Chlamydia 500. Spirochaetales Trevonema pallidum

Spirochaetales

Borrelia burgdofer

|

204 207

207 210 210

214

213

Adénovirus

ts

Virus herpès simplex (HSV)

217

Virus de la varicelle et du zona (VZV)

221

Virus Epstein-Barr (EBV)

220

Cytomégalovirus (CMV)

229

HHV-6/7 HHV-8

234 236

Virus B19

238

Papillomavirus (HPV)

240

Virus de l'hépatite B (HBV)

243

Bactériologie et virologie pratique

Virus à ARN

247

Virus de l'hépatite À (HAV) Enterovirus Virus de l'hépatite E (HEV) Virus de l'hépatite C (HCV) Virus de l'hépatite D (HDV) VIrus grippaux V irus respiratoire syncytial (RSV) V us des oreilons V irus de la rougeole V irus de la rubéole R Ofavirus V irus de l'immunodéficience humaine (HV)

247 20Ù 293 206 209 261 264 267 269 2 274 216

ABRÉVIATIONS GÉNÉRALES negai majoritairement négatif majoritairement positif

CF CI50 CLED

positif

milieu saccharose-phosphate

CLHP

aérobie anaëérobie facultatif alanine amino peptidase

anticorps arginine dihydrolase acide désoxyribonucléique antigène alanine aminotransiérase anaërobie anaërobie préférentiel acide rbonucléique aérobie strict aspartate aminotransférase agent transmissible non conventionnel B19 virus gélose lactosée au Pourpre de Bromocrésol Buffered Charcoal Yeast Extract ADN branché bile esculine Brain Heart Infusion bacille de Koch / M. {uberculosis BK Virus test de Christie-Atkins-MunchPetersen) catalase concentration cytotoxique 50

un des corécepteurs du HIV-1 Centers for Diseases Control and prevention

CMI CMV CNR COAG CPG CXCR4 DNAse EBV ECBC

ECP ELISA

EN ESB ESC FTA-abs

GC GEL GGT GISA HACEK

Clamping Factor concentration inhibitice 50 cystine-lactose-électrolyte déficient chromatographie Liquide Haute Performance concentration minimale inhibitrice (d'un antibiotique) cytomégalovirus (HHV-5 centre national de référence coagulase chromatographie phase gazeuse un des corécepteurs du HV-1 désoxyribonucléase Epstein Barr virus (HHV-4) examen cytobactériologique des crachats effet cytopathique Enzyme Linked Immunosorbent ASsay éléments nuclées encéphalopathie spongiforme bovine esculine (hydrolyse) Auorescent Treponemal Antibody Test rapport Guanine-Cytosine (en %) gélatinase gamma glutamyl transférase Staphylococcus aureus de sensibilité diminuée aux glycopeptides Haemophilus aphrophilus/ paraphrophilus/parainfluenzae, Actinobacilus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis,

Bactériologie et virologie pratique

HAdV HAV/VHA HBV/VHB HCV/VHC HDV/VHD HEV/VHE HHV-6 HHV-7 HHV-8 HIP HIV/VIH HPV HSV HTLV | IF IFD IF IgA 19G

Eikenella corrodens, Kingella Kingae adénovirus humain hépatite À (virus) hépatite hépatile hépatite hépatite Human Human Human

B (Virus) C (Virus) D (Virus) E (Virus) Herpesvirus 6 Herpesvirus 7 Herpesvirus 8 hydrolyse de l'hippurate Virus de l'immunodéficience humaine Papilomavirus humains Human Herpes Virus 1 (HHV-1 et HHV-2) Human T Lymphotropic Virus itermédiaire mmunofluorescence nmunofluorescence directe mmunofluorescence indirecte immunoglobulines de type À

IgM

mmunoglobulines de type G mmunoglobulines de type M

IND INNTI

ndole nhibiteurs non nucléosidiques de

INTI IP IST JCPyV LAP LBA LCR LDC MA MAN MGG

anscriptase inverse D ibiteurs nucléosidiques de la transcriptase S inverse ibiteurs de Protéase infections sexuellement transmisSibles JC virus eucine aminopeptidase

iquide de lavage broncho-alvéoaire iquide céphalo-rachidien

ysine décarboxylase microaérophile mannose ay Grunwald Giemsa

RCIU RSV/VRS RT-PCR

macrolides-lincosamines-streptogramines mononucléose infectieuse mobilité Man Rogosa et Sharpe (Milieu de) Nucleic Acid Sequence Based ASSay non déterminé réduction des Nitrites réduction des nitrates en nitrites niveau de sécurité microbiologiue omposé vibriostatique nithine cécarboxylase fho-nitro-phényl-galactopyranode CMHeMSMeINS) Open Reading Frame (cadre ouvert de lecture) oto-rhino-laryngologie oxydase protéine À phosphatase alcaline Penicilin - Binding Proteins Polymerase Chain Reaction phénylalanine désaminase polyéthylène glycol polynucléaires neutrophiles poste de sécurité microbiologique pyrrolidony| arylamidase pyrazinamidase résistant retard Croissance /1 utero virus respiratoire syncytial Reverse Transcriplase puis Polymerase Chain Reaction sensible staphylocoque à coagulase négative small Colony Variant (de SiavhyloCOCCUS) syndrome d'immunodéficience acquise

Abréviations générales

sodium polyanéthol sulfonate thiosulfate citrate bile saccharose (milieu) franscrioiase inverse Transcrioted Mediated Assay Treponema Pallidum Haemoggluünaton Assay test d'immobilisation des tréponemes où test de Nelson et Mayer trypcase soja unité formant une colonie urée (hydrolyse de l') variable vancomycine, colistine, amphotéricine B, timéthoprime (gélose) Veneral Disease Research Laboratory viande foie (gélose) VF réaction de Voges-Proskauer VP VPN/VPP valeur prédictive négative/positive stomatite vésiculeuse (virus) VSV Varicello Zoster Virus (HHV-3) VZV Western Blot WB xylose XYL £

B MGP

B méthyl glucopyranoside

ABRÉVIATIONS ANTIBIOTIQUES Macrolides — Lincosamides — Streptogramines

B-lactamines penic iline G

érythromycine

ampicilline

lincomycine

amox cilline

clndamycine

amox Cilline + acide clavulanique

pristinamycine

OXaCI

Glycopeptides

céfalotine céfoxiti

vancomycine

Moxa actam

teicoplanine ticarc

Üicarc ine + acide clavulanique

Fluoroquinolones

pipéracilline

acide nalidixique

pipére cilline + tazobactam

norfloxacine ofloxacine

lévofloxacine norfloxacine azireonam

moxifloxacine

eneme

Autres antibiotiques

apeneme

fampicine Aminosides

acide fusidique gentamicine

riméthoprime-sulfaméthoxazole

netilmicine

osfomycine

mycine kanamycine tobra

étracycline

L

amikacine

inézolide Furanes

|

Lecture des tableaux de Sensibilité aux antibiotiques Les noms des antibiotiques sont écrits avec leur sigle :voir liste

Les antibiotiques S sont surlignés en Ré et les antibiotiques R sont en fete Tous les phénotypes de résistance acquise ne sont pas décrits:les phénotypes rares ne figurent pas.

1 ‘alRÉLÈVEMENTS

La sérologie consiste en la mise en évidence et/ou le dosage d'anticorps spécifiques d'un agent infectieux donné. Le but est d' évaluer l'état de l'immunité vis-à-vis de ce pathogène. Les anticorps recherchés peuvent ê re suivant les techniques des lgG ou des IgM et plus rare-

ment des IgA. Certaines techniques permettent la détec ion de toutes les classes d'anticorps (dépistages) ; les résultats seront alo s qualitatifs. Les anticorps sont détectables au minimum 8 à 10 jou s après l'infection. Pendant ces 8 à 10 jours de délai, l'infection est séro ogiquement inapparente. D'une manière générale, les IgG perdurent toute la vie o u décroissent lentement. Les IgM ne sont présents qu'a proximité de la primo-I nfection où dans certains cas lors d'une réactivation. Toutefois certaines personnes gardent des IgM persistantes. Les sérologies s'interprètent sur l'ascension ou la décroissance du taux des anticorps à quel-

ques semaines d'intervalle. Ainsi une montée du taux des anticorps, notamment des lgG objectivent une infection récente. Celle-ci doit être franche (x 2 à x 4 en T5 jours). Nous nous limiterons dans cette fiche présenter les sérologies classiques.

Bactériologie : Tableau 1-1 : Sérologies bactériennes effectuées en pratique courante de laboratoire Bactérie recherchée

frevonema pallidum

Appellations actuelles (et anciennes)

Technique(s) courante(s)

Sérologie syphilitique, TPHA- | TPHA: Hémagglutination VDRL, (BW: Bordet-Wasindirecte Sermann) VDRL : Agglutnation direct

FTA, TPI, ELISA

Bactériologie et virologie pratique

Bactérie recherchée

Appellations actuelles

TO EME

EC)

CEE)

LE

Brucella Spp.

Rose Bengale Test ou sérologie de Wright

Agglutnation (Wright, Antigène tamponné ou Rose bengale, Fixation du complément, Coombs, IF, ELISA

Borella burgaorteri

Sérologie de la maladie de lyme

1° intention : ELISA 20 intention : Western Blot, F

Legionella Spp.

Sérologie légionellose

Fl où ELISA

Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae

Sérologie Chlamydia

F, Eixation du complément, ELISA

Coxiella Sop.

Sérologie Fièvre Q

F

Mycoplasma pneumoniae

Sérologie mycoplasme

Fixation du complément,

ÆLISA, IA Bartonella spo

Sérologie de la maladie des griffes du chat

A

Streptocoque À

ASLO (antistreptolysine O), ASDOR (antistreptodornase)

Leptospira Sp.

Sérologie leptospirose (séro- | Agglutination logie Martin-Pettit)

Agglutination directe où ELISA

Salmonella Typhi et Paratyphi® | TAB, Sérologie Widal et Felix | Agglutination des anticorps Anti-0 et Anti-H LE

* ne doit plus être réalisée

Tableau 1-2: Sérologies virales effectuées en pratique courante de laboratoire Virus recherché

Technique(s) courante(s)

Cytomégalovirus

1gG et/ou IgM par ELISA Avidité des lgG

Epstein Barr Virus

ELISA, hémagglutination, MNI Test (PBD — Paul Bunnel Davidson)

erpes simplex virus

gG ou IgM type 1+2 par ELISA

HV-6, HHV-8

gG par ELISA, IF

Hépatite À

gG et/ou IgM par ELISA

10

|

Prélèvements

Virus recherché

Technique(s) courante(s)

Hépatite B

gM ou Ac HBc, Ac HBs, Ac HBe, Ag HBS, Ag HBe par ELISA

Hépatite C

ELISA

Hépatite D (agent delta)

gG ou anticorps totaux par ELISA

Hépatite E

gG et/ou IgM pa

HTLV let ||

ELISA

Virus ourlien (des oreillons)

gG et/ou IgM par ELISA

Virus morbileux (de la rougeole)

ue

Virus de la rubéole

lgG evou IgM par ELISA

VZV (Varicelle zona)

lgG et/ou IgM par ELISA

où ELISA IgG + IgM avec élévation

1° intention:ELISA (dépistage 2 tests différents, l'un des deux tests peut être un combo anticorps + antigene p24) 21% Intention : Western Blot

HV

Erythrovirus B19 (Parvovirus)

ELISA IgM et 1gG

11

1

Bactériologie et virologie pratique

Sang: bactériémies et virémies

Bactériologie Les hémocultures sont des examens permettant de rechercher les bactériémies. Elles sont fréquemment prescrites en milieu hospitalier notamment en cas de fièvre, mais aussi en cas de suspicion d'endocardites. Devant la gravité potentielle du pronostic tout résultat même partiel doit être transmis au clinicien. Ils permettront d'adapter le traitement antibiotique déjà institué de manière probabiliste,

> Bactéries à rechercher Le sang est un liquide biologique stérile même s’il peut exister des bactériémies physiologiques transitoires en période post-prandiale, Les bactériémies sont le plus souvent mono-microbiennes. L'interprétation est simple si la bactérie retrouvée n'est jamais commensale de la peau. Si elle ‘est, le microbiologiste doit essayer en collaboration avec le clinicien de distinguer les contaminants des bactériémies vraies.

Tableau 1-3 :Conduite à tenir devant la positivité d'hémoculture(s) Bactérie

Conduite à tenir

Quelle qu'elle soit

Bactériémie vraie.

Plusieurs hémocultures

positives avec

une même bactérie

|

Bactérie

Prélèvements

Conduite à tenir

Bactéries n'appartenant pas à la | Bactériémie vraie, flore cutanée

Une seule hémoculture positive sur la série

Bactérie rarement retrouvée dans la flore cutanée.

À considérer comme une bactériémie vraie après discussion avec le clinicien.

Bactéries

Discussion avec le clinicien Si le même germe est retrouvé au niveau d'un foyer infectieux ou de la porte d'entrée | pourra être considéré comme

de la flore cutanée

responsable EX: S epidermidïs sur un cathéter ou sur autre matériel (valve) Sinon évoquer une contamination

Plusieurs hémocultures positives avec

plusieurs espèces bactériennes. Terrain st ou foyer digestif

Quelles qu'elles soient | Bactériémie vraie,

+

Absence de bactériémie (bactéries classiques) si les conditions de Toutes les hémocul- | prélèvement et de transport ont été optimales. tures sont négatives | Bactérie de pousse impossible sur les géloses (Coxiella, Bartonella, …) Si le patient était sous antibiotiques, la culture a pu être décapitée. 2

Tableau 1-4: Micro-organismes fréquemment retrouvés dans les bactériémies. Micro-organisme

Remarque /

Fréquence

attention particulière

Rôle dans une éventuelle contamination

Escherichia coli

Pare

Staphylocoques coagulase L és | Patients porteurs de cathéters négative”

intravasculaires ou autres

Staphylococcus aureus

44

|Auresentérobactéries

—

|Anaérobles stricts

Je a

dispositifs implantables

Possible

Possible Rare

—

13

Bactériologie et virologie pratique

Micro-organisme

Remarque /

Fréquence

tendant particulière

Streptococcus pneumoniae

ETES une éventuelle contamination Jamais

Streptococcus du groupe

Endocardite

viridans

Rare

Enterococcus 50.

Rare

Corynebacterium spp.

Fréquent

Bacillus Spp.

Fréquent

Propionibacterium

Fréquent

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

-

Patients immunodéprimés

Listeria monocytogenes

Neisseria meningitiais

Femme enceinte

Jamais

|

Meningococcémie gravissime

Brucella Spp.

Endocardite

Campylobacter Spo. Salmonella S0p. * Les staphylocoques à coagulase négative sont parfois à tort considérés comme des contaminants, Cette interprétation doit tenir compte du contexte :patient porteur de matériel étranger

> Prélèvement L'hémoculture est un examen à renouveler pour augmenter sa sensibilité. Toutefois ‘on considère maintenant que deux ou trois séries d'hémocultures effectuées avant l'introduction de l'antibiothérapie et espacées de 30 à 60 minutes par 24 heures suffisent, Chez l'adulte un volume minimum de 10 mL par flacon est à prélever. Chez le nourrisson un flacon et un

volume de 1 à 2 mL sont suffisants (flacon pédiatrique). Les hémocultures doivent êtres prélevées avec certaines précautions. |!faut ainsi effectuer une détersion de la peau au savon suivie d'une antisepsie rigoureuse (alcool 70 %, puis polyvidone iodée — Bétadine ©). Lexiste plusieurs types de flacons à hémocultures de différents fabricants. Ils contiennent tous une résine adsorbeuse de cations ou du charbon activé neutralisant l'action des antibiotiques. On utilise un jeu de deux flacons aérobie et anaérobie dont la composition est la suivante:

—

aérobie :atmosphère ambiante avec différentes quantités de CO, ajouté

—

anaérobie: CO, +N,

14

1.

Prélèvements

L'ensemencement est effectué directement dans les flacons lors du prélèvement. I est déconseillé de conserver les hémocultures dans une étuve avant leur transfert dans un automate d'hémoculture.

> Prise en charge du prélèvement au laboratoire + Méthode manuelle Cette méthode est aujourd'hui de plus en plus supplantée par les méthodes automatisées.

+

Méthodes automatisées

Les flacons sont placés dans un automate à 35°C au minimum 5 jours. lls possèdent à leur base un détecteur colorimétique incorporé. Ce détecteur est sensible à l'abaissement du pH et donc à la production de CO, lors de la pousse bactérienne. Le virage de couleur est détecté par réflectométrie ou fluorescence sur l'automate. Celui-ci effectue plusieurs lectures par heure. En cas de positivité détectée par l'automate on effectuera les étapes suivantes.

État frais :peut permettre de donner une première indication au clinicien et d'orienter le choix des milieux de culture et de l'atmosphère d'incubation. Gram: réalisé en systématique. Attention une bactérie peut avoir un aspect déroutant (exposition aux antibiotiques).

Examen direct État frais : peut permettre de donner une première indication au clinicien et d'orienter le choix des milieux de culture et de l'atmosphère d'incubation. Gram : réalisé en systématique. Attention une bactérie peut avoir un aspect déroutant (exposition aux antibiotiques).

Technique d’ensemencement Homogénéiser par retournement successif le flacon puis prélever une goutte de bouillon sous poste de sécurité microbiologique. Effectuer ensuite une subculture sur — _gélose au sang cuit de type polyvitex® sous CO, à 37°C

— _gélose au sang en anaérobiose à 37°C L'incubation des boîtes doit être poursuivie pendant 5 jours.

15

Bactériologie et virologie pratique

La présence de virus ou d'antigènes viraux dans le sang n'a pas du tout la même signification qu'une bactériémie. En effet, beaucoup de virus peuvent se trouver transitoirement ou non dans la circulation générale.

> Conditions de prélèvement et techniques de recherche ° Isolement viral Le prélèvement est effectué sur tube hépariné, citraté ou plus rarement EDTA. Le transport jusqu'au laboratoire doit être à température ambiante rapide et ne pas excéder 2 heures. La culture cellulaire dépend du virus recherché. Pour les virus présents dans les cellules mononucléées, ilest possible d'augmenter la sensibilité de la recherche en effectuant une séparation des cellules. Elle s'effectue par centrifugation sur un gradient de densité (type Ficoll®) qui permet de collecter l'anneau leucocytaire. + Antigénémies Les principaux antigènes viraux recherchés dans le sang le sont pour le VHB (HBe ou HBs) et le VIH (Ag p24). Par ailleurs pour le CMV, l'antigénémie pp65 n'est utilisé en pratique courante que dans quelques laboratoires. Elle permet de détecter et de quantifier en |F les polynucléaires porteurs de la phosphoprotéine pp65 signant une virémie. Cette technique manuelle tend à être remplacer par la PCR quantitative sur sang total. + Recherche du génome par PCR sur sang total ou plasma Le prélèvement est réalisé sur tubes EDTA, acheminé à température ambiante dans les 6 h au laboratoire. Les recherches s'effectuent selon les cas sur plasma, cellules ou sang total. Les techniques de PCR ou RT-PCR utilisées sont qualitatives ou quantitatives (charges virales). Elles permettent ainsi de suivre l'évolution la charge virale en particulier sous traitement.

16

> Virus recherchés Tableau 1-5: Principaux virus recherchés et techniques utilisées Virus Adénovirt

Technique de recherche

Antigénémie

tomég E térovirus Epstein Barr Virus V Us de h épatite B Virus de l'hépatite C

Culture cellulaire

non

(pp 65) à

iCile

non

| (HBe, HBs) ==

V irus de h épaïte E

V irus Rerpes simplex HIV Erythrovirus B19 (Parvovirus) BK/JC Virus

il

Bactériologie et virologie pratique

Liquide céphalo-rachidien

En raison de l'engagement du pronostic vital, l'examen cytobactériologique et/ou virologique du LCR s'impose devant toute suspicion de méningite.

> Bactéries etvirus àrechercher Le LCR est un liquide stérile. Ainsi une présence d'un micro-organisme est anormale quelque soit la bactérie. Tableau 1-6: Différents micro-organismes responsables de méningites

Adulte > 60 ans

Neisseria meningitiais Streptococcus pneumonlae

Streptococcus agalactae Escherichia coli

Listeria MONOCy0gENnEs Haemophilus influenzae D

Borrelia spp Slaphylococcus

aureus Pseudomonas AETUgINOSA

HSV-2 HSV-1 Enterovirus

Adulte

; avec terrain

Jeune Adulte et enfant = Btane

Enfant < 5 ans

NE

TTENTS

1,

Adulte >60 ans

Adulte avec terrain

Enfant < 5 ans

Nouveau-né

Neurochirurgie”

Autres bactéries:

Autres Virus :

Jeune Adulte et enfant > 5ans

Prélèvements

VZV, CM, HHV-6, HW polioV, rougeole, ….

Oreillons*

* en baisse car bonne efficacité de la vaccination “liquides de dérivation :toutes les bactéries peuvent être retrouvées, y compris celles de la flore cutanées.

> Prélèvement Le LCR doit parvenir au laboratoire le plus rapidement possible en raison de la fragilité de certains germes et de la gravité potentielle du diagnostic.

> Prise en charge du prélèvement au laboratoire L'examen doit être réalisé en urgence.

+

Cytologie et examen direct

Aspect macroscopique Eau de roche, clair, eau de riz, trouble, purulent, hématique ou hémolysé.

Numération cellulaire La numération est effectuée immédiatement, Le nombre d'éléments nucléés est inférieur à 5 par mm°. Chez le nouveau-né, il peut s'élever jusqu'à 30 éléments nucléés par mm°. En cas d'anomalie, il faut effectuer une formule après cytocentrifugation et coloration au MGG. Les résultats et les orientations diagnostiques sont explicités dans le tableau 1-7.

Examen biochimique du LCR La glycorachie et la protéinorachie sont utiles en urgence. La chlorurorachie est comprise entre 120 et 130 mmol/L, la protéinorachie entre 0,15 et 0,30 g/L et la glycorachie entre 2,5 et 3,5 mmol/L. Cette valeur est à comparer avec la glycémie sanguine. On estime que la glycorachie est comprise entre la moitié et les deux tiers de la glycémie. L'hypoglycorachie est un signe très spécifique de méningite bactérienne (dont tuberculeuse) ou mycosique :un taux de glucose inférieur à 50 % de la glycémie ou inférieur à 0,4 g/L doit être considéré comme pathologique.

119

Bactériologie et virologie pratique

Les hyperprotéinorachies entre 1 et 5 g/L voire plus, sont habituelles en cas de méningites bactériennes (y compris la méningite tuberculeuse), en revanche, au cours des méningites viraes ou de diverses affections neurologiques, l'augmentation de la protéinorachie reste souvent modérée ( Bactéries àrechercher Toutes les bactéries isolées de ces échantillons sont potentiellement pathogènes. Toutefois certaines sont plus fréquemment retrouvées.

Liquide pleural Noter l'aspect macroscopique (purulent, chyleux, séro-hématique, trouble, citrin), et le taux de protéines (< 30 g/L: transsudat, > 30 g/L: exsudat, en faveur d'une infection ou d'une pathologie tumorale). Tableau 1-8 :Bactéries responsables de pleurésies. TESTER EU Firres us

AETESTESEUNNURES

Pleurésies tuberculeuses

Streptococcus pneumoniae Haemophilus Influenzae Staphylococcus aureus

Legionella Chlamydia et Chlamydophila Rickettsia

Mycobacterium tuberculosis

Éventuellement anaérobies

22

1.

Prélèvements

Liquide d’ascite L'infection du liquide d'ascite est l'une des complications infectieuses des plus fréquentes chez le cirrhotique surtout lorsque le taux de protéines est < 10 g/L d'ascite. Une infection du liquide d'ascite est possible pendant la tuberculose.

Tableau 1-9: Bactéries responsables d'infection du liquide d'ascite. Bactéries fréquemment isolées Bacilles à gram négatif (+++) Escherichia coli

Coques à gram positif (+) SIrEpIOCCOCUS Spp

Klebsiella 50p Enterobacter s0p

Enterococcus spp Staphylococcus spp

Liquide péricardique Les étiologies sont fréquemment virales (entérovirus en particulier). Tableau 1-10: Bactéries responsables d'infections du liquide péricardique. Bactéries fréquemment isolées Staphylococcus S0p. SIreptOCOCCUS Spp. Haemopñilus Spp. Streptococcus pneumoniae Neissera meningitidis

Liquide péritonéal ll faut différencier les péritonites primitives des péritonites secondaires à une perforation d'organe, à un kyste ou un abcès et surtout une intervention chirurgicale. Tableau 1-11 : Bactéries responsables de péritonites

Bactéries fréquemment isolées Péritonite primitive

Péritonite secondaire

Escherichia coli

Enterobacteriaceae Anaërobies Enterococcus

Streptococcus pneumoniee (chez l'enfant)

Liquide articulaire ll faut différencier les arthrites septiques primitives de celles secondaires à une infection sur

prothèse.

23

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 1-12: Bactéries responsables d'infection du liquide articulaire. Arthrites septiques primitives

Arthrites septiques secondaires

Staphylococcus aureus Srep{oCOCCUs spp Nerssera gonorhoeae Kingella kingae” Brucella Sp. Entérobactéries Mycobacterium s0p. Joutes bactéries possibles

Slaphyloccocus spp. (souvent mulli-résistants) Toutes bactéries possibles

* chez l'enfant

> Prélèvement Il faut privilégier le prélèvement et le transport dans un flacon hermétique sans bulle d'air ou un flacon d'hémocultures sous vide (pour les bactéries anaérobies). Certaines bactéries qui peuvent êtres retrouvés dans ces prélèvements sont particulièrement fragiles. Le transport au laboratoire doit être le plus rapide possible.

> Prise en charge du prélèvement au laboratoire + Cytologie et examen direct Pour ces liquides un examen cytobactériologique est obligatoire : numération éléments nucléés, fomnule leucocytaire, hématies et recherche de cristaux (liquide articulaire). Un examen direct par coloration de Gram doit être réalisé après cytocentifugation. + Ensemencement Les milieux suivants sont ensemencés. —

_gélose au sang sous CO, et en anaërobiose

—

_gélose au sang cuit de type polyvitex® (dite «chocolat») sous CO,

—

mettre l'échantillon, si ce n'est déjà fait, en culture dans des flacons à hémocultures aérobie et anaérobie.

—

bouillon d'enrichissement

Incubation : 5 jours, pour les liquides articulaires minimum 15 jours. Les milieux pour mycobactéries sont ensemencés à la demande du clinicien.

24

|

Prélèvements

TRS

Bactériologie L'examen cytobactériologique des urines (ECBU) est un examen explorant les infections urinaies basses (asymptomatiques, cysütes) ou leurs complications les infections urinaires hautes pyélonéphrites, prostatites)

L'urine est un liquide biologique normalement stérile, Toute présence confirmée de bactéries dans l'urine intravésicale est pathologique. L'urètre peut contenir des germes commensaux qui peuvent être emmené par le flux urinaire, La détection de la présence de leucocytes et de nitrites (présence d'une nitrate réductase chez es entérobactéries) par l'utilisation de bandelettes chimiques a une bonne valeur prédictive négative (VPN) chez les patients immunocompétents.

Le plus souvent une seule espèce est isolée. L'isolement de plusieurs espèces est en faveur d'une contamination lors du prélèvement, néanmoins de rares infections plurimicrobiennes existent. Les espèces pathogènes diffèrent suivant les terrains

Tableau 1-13: Nourrissons et enfants (filles le plus souvent)

Groupes " Entérobactéries

Proportions

Espèces Escherichia coli

Rue

hit Proteus mirabilis

Jè2E

Remarques

Klebsiella pneumoniae

Citrobacter

Fe

Pseudomonas aeruginosa

-

Less à

Entérocoques

”

ei positif

Staphylocoques

Ge

AU Gram négatif

25

Sur sonde

Saone

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 1-14: Adultes. Femmes le plus souvent Homme

Enfant

+/-

Escherichia coli Klebsiella

Entérobactéries

Proteus mirabilis

Citrobacter

AUTRE Baciles à Gram -

Autres entérobactéries

:

+

Pseudomonas aeruginosa

+

+

ne.

.

Siaphylococcus

|

+/-

ve

Saprophyticus

RUES à Gram +

Staphylococcus aureus

+/-

Staphylococcus à coagulase -

el

Entérocoque

ni

Streptocoque B

+

Autres germes***

+/-

() Femmes jeunes, (‘) d'origine vaginale ?, (**) Attention particulière à porter à Candida spp, Escherichia coli (colonies naines), Lactobacillus spp (femmes agées) et Corynebacterium urealyticum (thiase et pH alcalin)

> Prélèvement Possibilité de retrouver une flore bactérienne commensale de l'urètre si le prélèvement est mal fait. L'interprétation se basera sur le dénombrement semi-quantitatif des bactéries de l'échantillon. Adulte :Lavage des mains puis désinfection locale et enfin, recueil du milieu du jet des urines du matin de préférence, ou ayant séjourné au moins 3 heures dans la vessie.

Nourrisson :poche collectrice, à vérifier ou changer après 30 min. Le délai de prise en charge comprend le délai d'arrivée au laboratoire. —

< 3h à température ambiante et sans conservateur.

—

< 12h

—

Gi présence d'un conservateur, voir délai fabricant

si conservation à 4 + 2°C sans conservateur

26

1.

Prélèvements

> Prise en charge du prélèvement au laboratoire +

Cytologie et examen direct.

Aspect macroscopique :Noter l'aspect: limpide, trouble, hématique, présence éventuel de sédiment. Cytologie : L'examen cytologique doit permettre d'identifier et éventuellement de dénombrer les cellules (PNN, hématies,.….) présentes dans l'urine, Il s'accompagne d'une recherche de Cristaux. Leucocytes : |Is sont comptés en cellules (Malassez®, Kova®) ou de plus en plus fréquemment sur automates. Le seuil de significativité diffère suivant les situations (tableau 1-15)

Cylindres : Les cylindres peuvent être hyalins, hématiques {inclus d'hématies), leucocytaires inclus de leucocytes), ou granuleux (inclus de leucocytes lysés), Autres cellules : || est important d'identifier la présence de cellules épithéliales ou de cellules rénales Cristaux : Les cristaux fréquemment retrouvés sont des cristaux d'urate (fréquent pour Proteus spp), de phosphate ammoniaco-magnésien (Corynebacterium urealyticum), ou d'oxalate de calcium. D'autres cristaux peuvent être identifiés.

+

Examen bactériologique

Il faut procéderà un examen direct afin de pouvoir orienter le clinicien sans qu'il ait à attendre

le résultat de la culture.

Examen direct: État Frais : Noter la présence de bactéries et leur éventuelle mobilité.

Après coloration de Gram : Notamment en cas de suspicion de pyélonéphrite chez l'enfant: diagnostic d'urgence

Culture Technique d'ensemencement :Homogénéiser l'urine puis ensemencer avec une anse calbrée (10 LL) afin d'obtenir une culture quantitative.

Géloses à ensemencer :Soit Gélose ordinaire avec lactose (BCP, CLED, Mac Conkey), soit utilisation de plus en plis courante de géloses chromogènes qui permettent l'identification des bactéries les plus courantes (Uriselect®, CHROMagar”, CPS 1D®, UTI®) : incubation 24h. Utilisation dans quelques cas de géloses riches types Polyvitex® afin de rechercher des germes exigeants rencontrés dans des situations particulières (Haemophilus, Aerococcus, Cor/nebacterium uealyticum) : incubation 48h, La recherche de mycobactéries peut être faite à la demande du clinicien.

27

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 1-15: Seuils de significativité. Le seuil de leucocyturie est de 10° par mL Bactériurie UFC/mL

Signes cliniques

Bactéries Eschenchia coli et Staphylococcus saprophyticus

0:

+

Entérobactéries Pseudomonas aeruginosa, Slaphylococcus aureus.….

> 105

je

Staphylocoque coagulase négative

10:

-

Autres bactéries

> 104

++

Autres bactéries

Streptococcus agalactiae,

Virologie En pratique quotidienne la recherche de virus dans les urines ne se fait pour le CMV et dans une moindre mesure pour le BK virus et certains adénovirus (AdV11 et 21). Toutefois d'autres virus peuvent être excrêtés dans les urines. Le. CMV est recherché dans le$ urines du nouveau-né, Sa présence permet d'affirmer une transmission materno-fœtale lorsque la virurie est positive avant le 10°" jour de vie. La recherche de BK Virus est prescrite en cas de cystite hémorragique chez l'immunodéprimé. Les Adénovirus (AdV11) sont responsables de cystite hémorragique isolée chez l'enfant.

> Technique de recherche e

Isolement viral

CMV: la culture se fait le plus souvent sur cellules de fibroblastes embryonnaires humains (MRCS5). La virurie est en général massive. On observe un effet cytopathique caractéristique en quelques jours (bancs de poisson) du fait du fort inoculum., Une culture CMV ne peut être rendue négative qu'après un délai de 3 semaines. ADV: la culture est effectuée en général sur cellule de type HeLa. L'effet cytopathique est visible en 3 à 21 jours. || est constitué de cellules arrondies réfringentes avec rétraction «en dentelle ». 28

|

«+

Prélèvements

Détection du génome viral

La détection de ces trois virus est possible en PCR classique ou quantitative (temps réel). La quantification du BK virus permet de suivre l'évolution de la virurie chez l'immunodéprimé.

> Prélèvement ° Isolement viral (culture cellulaire de CMV ou d’adénovirus) Le prélèvement doit être effectué dans un récipient stérile. Une quantité au moins égale à 10 mL est recommandée. ll est préférable que le transport ait lieu à +4 + 2°C. Si le délai de traitement de l'échantillon est supérieur à 2 heures, celui-ci doit être stocké en milieu de transport adapté au maximum 24h,

+

Recherche du génome (de CMV ou BK virus)

Le prélèvement doit être effectué dans un récipient stérile. Une quantité au moins égale à 2 mL est recommandée. Si le délai de transport est inférieur à 6 h il peut avoir lieu à température ambiante. S'il est supérieur à ce délai, il doit être stocké à +4 + 2°C.

29

Bactériologie et virologie pratique

Sphère ORL

Bactériologie Les prélèvements sont effectués en cas d'angines, de sinusites ou d'otites.

> Flore commensale +

Voies respiratoires supérieures

La flore buccale varie en fonction de l'état bucco-dentaire et de l'alimentation,

Tableau 1-16: Flore bactérienne des voies respiratoires supérieures

Espèces commensales

Espèces potentiellement pathogènes présentes dans la flore commensale

Streptococcus alpha hémolytique

Haemophilus influenzae

Streptococcus non hémolytique

Streptococcus pneumoniae

Corynébactéries commensales Neissera commensales Bactéries anaëgrobies strictes Stavhylococcus coagulase négative à

Slaphylococcus aureus Streptococcus pyogenes

Espèces en transit Entérobactéries Pseudomonas Spp.

e Voies auditives externes On retrouve ici la flore cutanée (staphylocoques, corynébactéries, Propionibacterium, StreptoCOqUEesS)

30

1,

Prélèvements

> Bactéries à rechercher +

Sinusites

Tableau 1-17 : Bactéries responsables d'une sinusite aiguë ou chronique Sinusite aiguë

°

Sinusite chronique

Enfants

Adultes

Quelque soit l'âge

Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae

Idem enfants plus: Branhamella catarrhalis Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Anaërobies

Autres bacilles à gram négatif Prevotella Sp. Fusobacterium Spp.

Otites

Tableau 1-18: Bactéries responsables d'otites Otite moyenne aiguë

Otite chronique

Enfants de plus de | Nourrissons de 3 mois et adultes moins de 3 mois

Quelque soit l’âge

Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Branhamella catarrhalis Staphylococcus aureus

Pseudomonas aBrUgINOSa Entérobactéries Staphylococcus aureus Streptococcus Dyogenes Anaërobies

Idem plus: Pseudomonas AErUgINOSA Entérobactéries

31

Otite externe

| Quelque soit l’âge Pseudomonas aBlUgINOSa, Staphylococcus aureus Strepiococcus pyogenes, Entérobactéries ACromonas SO. ViDrio Spp: Candida S0p. ASpergilus Spp.

|

Bactériologie et virologie pratique

*

Angines

Tableau 1-19: Bactéries responsables d'angines Andine

aiaüet’e

DAS In Streptococcus Dyogenes (groupe À) Streptocoques

B-hémolytiques des groupes C et & Arcanobactenum haemolyticum {hémolyse franche en 48h) Neisseria gonorrhoeae (très rare)

Angine

Angine à fausse

Phlégmon

ulcéronécrotique

membrane

de l'amygdale

Mise en évidence de l'association fusospirochétienne EBV Syphilis

Corynebacterium djphteriae EBV

SIreplococcus Dyogenes Haemophilus influenzae Slaphylococcus aureus Anaërobies

(1) Si récidive de l'angine recherche éventuellement les germes rencontrés dans les shusites aiguës, (2) Bactéries toujours beta-hémolytiques (sauf Neisseria gonorhogae dans un contexte d'IST).

+

Cas de la coqueluche

Recherche de Bordetella pertussis sur prélèvement pharyngé lors d'un tableau de toux (PCR + culture).

> Prélèvements + Différents types de prélèvement Les prélèvements sont généralement faits à l'écouvillon et souvent placés dans un milieu de transport adapté. Ils doivent être amenés le plus rapidement possible au laboratoire. Deux écouvillons peuvent être prélevés, un pour la culture, l'autre pour l'examen direct,

La recherche d'antigènes de Streptococcus pyogenes peut être réalisé directement par le clinicien lors d'un test immunoenzymatique rapide. D'autres prélèvements (pus de paracentèse ou aspiration de pus de sinus) sont prélevés à la seringue.

> Priseen charge

des prélèvements au laboratoire

La recherche d'antigènes de Streptococcus pyogenes peut être réalisé directement par le clinicien lors d'un test immunoenzymatique rapide. D'autres prélèvements (pus de paracentèse ou aspiration de pus de sinus) sont prélevés à la seringue. 32

1.

Prélèvements

Examen direct: Les milieux suivants sont ensemencés,

—

Gélose au sang ——(+ inhibiteurs des bactéries à gram négatif, type acide nalidixique et colistine) incubée sous CO,

—

(Gélose au sang cuit permettant la recherche de bactéries exigeantes de type Haemophilus (inutile pour les angines aiguës)

—

—

VCAT pour recherche de Neisseria gonorrhoeae

dans les prélèvements d'oites et sinusites il est rajouté une gélose pour bacilles à Gram négatif (BCP, CLED) et une gélose anaërobie.

Écouvilonnage des lésions pour recherche de virus herpès simplex et du virus de la varicelle et du zona. Recherche d'entérovirus en cas de méningites aiguës (porte d'entrée).

33

Bactériologie et virologie pratique

Sphère respiratoire

L'examen cytobactériologique des crachats (ECBC) se pratique couramment en cas de suspicion de preumopathies ou de bronchites (origine infectieuse ou surinfection). En bactériologie, ces examens peuvent ne pas être contributifs si les crachats sont contaminés par la flore des voies aérodigestives supérieures. Les aspirations protégées, les liquides de lavage broncho-alvéolaire, sont réalisés dans le cadre des pneumopathies nosocomiales.

Bactériologie

> Flore commensale Les alvéoles pulmonaires, ainsi quede bronches sont ee stériles. Les Late présentent une ciliature permettant une épuration des bactéries vers les voies respiratoires Supérieures. Par ailleurs, des mécanismes immunologiques (IgA, macrophages,.….) permettent de maintenir cette stérilité.

> Bactéries à rechercher Les bactéries à rechercher différent suivant ëcontextene

Tableau 1-20: Bactéries recherchées dans les Pneumopathies communautaires Recherche systématique

Suivant le contexte

Strepiococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Branhamella catarrhalis

Mycobacterium spp. Nocardia spp. Legionella pneumophila Pasteurella Sp. Rhodococcus spp.

Bactéries non cultivables Chlamydophila pneumoniae Chlamydophila psittaci Mycoplasma spp.

|

34

|,

Prélèevements

Recherche systématique

Suivant le contexte

Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Branhamella catarrhalis

Mucoviscidose Burkholderia cepacia Pseudomonas aeruginosa mucoldes Stenotrophomonas maltophila

Abcès pulmonaires Nocardia Sp. Actinomyces S0p. Tableau 1-21 : Bactéries recherchées dans les pneumopathies nosocomiales

Recherche systématique

Suivant le contexte

Germe des pneumopathies nosocomiales Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa

Anaërobies Stenotrophomonas maltophilia Legionella pneumoniae

Entérobactéries Acinetobacter baumannii

> Prélèvements e

Différents types de prélèvement

Examen cytobactériologique des crachats (ECBC) : L'ECBC doit être prélevé le plus soigneusement possible (afin d'éviter la contamination par la salive). Avant de procéder, il faut effectuer un rinçage soigneux de la bouche à l'eau stérile. Le recueil peut être facilité par une kinésithérapie.

Prélèvements distaux : Guidés par fibroscopie —

Fibroaspiration : Aspiration des sécrétions simples au niveau des bronches

—

Lavage bronchoalvéolaire :Le prélèvement consiste à injecter dans une bronche du sérum physiologique (à 37°C) qui est ensuite réaspiré et placé dans un flacon stérile.

—

Brossage distal protégé:le prélèvement est réalisé à l'aide d'une petite brosse fine avec des poils en nylon. L'extrémité de la brosse est ensuite placée stérilement dans 1 mL de sérum physiologique.

Non guidés par fibroscopie —

Aspiration endotrachéale chez le patient intubé

—

Aspiration distale protégé par cathéter

95

Bactériologie et virologie pratique

° Transport Les prélèvements pulmonaires doivent être transmis au laboratoire le plus rapidement possible afin d'éviter une prolifération des germes de la flore aux dépens du (ou des) germets) pathogene(s).

> Prise en charge des prélèvements au laboratoire +

Examen cytobactériologique des crachats (ECBC):

Examen direct et conformité du prélèvement : Les critères de Murray et Washington, permettent d'apprécier le degré de contamination par la salive. Au Gram, l'échantillon est examiné au grossissement x 100 (x 10 oculaire et x 10 objectif. | faut ensuite dénombrer le nombre de cellules épithéliales et de leucocytes par champ (moyenne sur 10 champs). Il est bien sur important de donner l'aspect et la quantité de bactéries visibles au Gram.

Tableau 1-22: Classes d'ECBC suivant Murray et Washington Cellules par champ

UE TIETES

Leucocytes

LL

Les crachats de classes 1 et 2 sont trop fortement contaminés par la salive et ne doivent donc pas être mis en culture (sauf aplasie et mucoviscidose). Ilfaut demander un autre prélèvement et donner les recommandations pour effectuer ce prélèvement. Les crachats de classes 3 et 4 ont un nombre de leucocytes qui témoigne d'une réaction inflammatoire mais sont contaminés par la salive. Ils peuvent éventuellement être mis en culture avec toutelois des résultats à rendre sous réserve, Les crachaïis de classe 5 sont de qualité optimale. Culture et dénombrement: || est recommandé dans les cas généraux (hors mucoviscidose

et patients immunodéprimés) de ne donner une signification clinique qu'à l'espèce majoritaire à condition que celle-ci dépasse le seuil de 10ou 107 unités formant colonies (UFC) par mL.

36

1.

Prélèvements

Parfois une deuxième espèce peut être prise en considération si elle est présente dans les mêmes quantités. Pour cela après fluidification de l'échantillon (N-acétyl-cystéine + billes de verre), il est important de diluer celui-ci d'un facteur 10° à 10* avant ensemencement calibré (oese de 10 LL). La culture doit se faire obligatoirement sur : — _gélose au sang cuit permettant la culture des Haemophilus sous CO,

—

gélose au sang sous CO,

—

_gélose au sang + acide nalidixique colistine sous CO,

—

Legionela, Nocardia, Actinomyces: ensemencer les géloses avec une grosse goutte du produit pathologique sans dilution préalable,

Cas particulier :Mucoviscidose | L'ECBC devra être ensemencé pur (recherche de portage) et dilué. Des géloses spécifiques, permettant la recherche de Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia ou Stenotrophomonas maltophile, devront être ajoutées à celles couramment utilisées. Rechercher les colonies naines de Siaphylococcus aureus.

« _ Brossage distal protégé l'échantillon est ensemencé directement que l'ECBC. Le reste du liquide disponible peut alors analyse cytologique par MGG et un Gram ci un seuil de 10° UFC/mL est considéré

à l'aide d'une oese calibrée sur les mêmes géloses être cytocentrifugé afin d'effectuer sur ce culot une par exemple. comme significatif.

+ Liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) La quantité plus importante de volume ramenée (par rapport à la brosse) permet de cytocentrifuger le prélèvement et d'effectuer plusieurs recherches :Gram pour les bactéries, Ziehl eelsen pour les mycobactéries, MGG, … Un seuil de 10* UFC /mL est significatif.

37

Bactériologie et virologie pratique

Suivant l'étiologie suspectée la technique de prélèvement et la façon de traiter l'échantillon varient. Le lavage broncho-alvéolaire est le prélèvement de choix pour l'exploration des pneumopathies virales. Toutefois des prélèvements moins invasifs comme l'aspiration ou l'écouvillonnage nasopharyngés sont utilisés en pratique courante. Les prélèvements réalisés en vue d'une culture virale doivent être mis dans un milieu de transport approprié aux virus recherchés. Ils doivent être amenés dans les 2 h au laboratoire ou conservés quelques heures à + 4+2°C,. Des écouvilons munis de milieux de transport (Virocult®) peuvent être utilisés pour les écouvilonnages pharyngés ou nasaux. Les prélèvements peuvent être congelés avec les techniques de biologie moléculaire.

> Technique de recherche Tableau 1-23: principales techniques de recherche utilisables Techniques de recherche

Biologie

moléculaire Adénovirus

ECR qualitative

Isolement viral

QTITTE)

QUICE

Oui (HeLa) puis

IF Agglutination

typage

(Late»

Cytomégalovirus

PCR qualitative ou quantitative

Oui (MRCS5)

Entérovirus

RT-PCR qualitative

Oui puis typage

Gite Acte

RT-PCR qualitative, | Oui puis (F ou EA | et EI direct sur typage pour typage. prélèvement

HSV-1 et 2

Rhinovirus

Varicelle Zona

— PCR qualitative ou quantitative, typage

Oui (MRC5) IF pour typage HSV 1 où HSV 2

7. IF spécifique de type 1 ou type 2

RT-PCR qualitative

Oui

PCR qualitative

Oui (MRC5) mais culture délicate car Virus fragile

Autres virus :

Virus Respiratoire syncytial (RSV), Coronavirus, Para-

PCR ou RT-PCR, culture, IF possibles selon les cas. Non effectué en pratique courante.

Infuenzavirus, Hantavirus, … 38

1.

Prélèvements

> Prélèvement Tableau 1-24 :échantillons pouvant être utilisés pour rechercher les principaux virus responsables de pneumopathies. Echantillons

Aspiration / écouvillonnage 9 nasal

Écouvillonnage pharyngé

Adénovirus

;

+ (Adv latents) x

Cytomégalovirus

(excrétion asymptomatique)

+++ (Immunodéprimé PCR quantitative) ue

HSV-1 et2

--

(excrétion symptomatique ou non)

+++

{mmunodéprimé, PCR quantitative)

Rhinovirus

{mmunodéprimé PCR quantitative)

Varicelle-Zona

Autres virus : Virus Respiratoire syncitial (RSV),Coronavirus, ParaInfuenzavirus, Hantavirus, … ‘Non effectué en pratique courante. Uniquement à visé épidémiologique ou de recherche.

39

Bactériologie et virologie pratique

STATS

Bactériologie > Flore bactérienne commensale Les selles contiennent essentiellement des bactéries dont 99 % sont anaérobies. je les aérobies les entérobactéries et entérocoques prédominent. Un déséquilibre de cette flore, suite à des modifications alimentaires, la prise d'un antibiotique où à l'introduction d'un pathogène, peut provoquer des troubles à type de diarrhée.

> Bactéries à rechercher Les étiologies différent selon le contexte clinique :notion de voyage, d'épidémie, prise d'antibiotiques, …

+ Cas général Ilfaut distinguer les mécanismes entéro-invasifs des mécanismes entéro-toxiques. Une bactérie entéro-invasive pénètre la muqueuse intestinale provoquant une inflammation et des douleurs abdominales. La diarrhée est sanglante et leucocytaire. Une bactérie entéro-toxique produit une toxine provoquant une perte hydrique dans les fèces. La toxine peut soit être sécrétée /7 situ par une bactérie ou peut être absorbée telle quelle avec l'aliment. Dans ce cas on ne retrouve pas systématiquement la bactérie en cause dans les selles. Tableau 1-25: Bactéries retrouvées en fonction du type de diarrhée. Type de bactéries responsables de la diarrhée

Bactéries retrouvées Salmonella enterica Shigella po Escherichia coli (EIEC) Yersinia enterocolitica Campylobacter spp

Entéro-invasives

40

1.

Type de bactéries responsables de la diarrhée

Prélèvements

Bactéries retrouvées Escherichia coli (ETEC, EPEC, EHEC) Clostridium pertringens Clostridium difficile Bacillus cereus Campylobacter spp

Entéro-toxinogènes in situ

Aeromonas Spp

Vibrio cholerae 0 :1, et 0 :139 Vibrio halophiles

Clostridium perfingens À Bacillus cereus Staphylococcus aureus

Entéro-toxinogènes (toxines exogènes)

+ Malades immunodéprimés Les bactéries à Gram négatif sont largement dominantes, Pseudomonas spp, Staphylococcus aureus, Levures, …

> Prélèvement La plupart des diarrhées d'origine toxinigues sont spontanément résolutives chez l'immunocompétent. Toutefois un prélèvement de selles se justifie devant une diarrhée sanglante et/ou une diarrhée fébrile ou non résolutive rapidement. L'échantillon de selles (1 cm”) est déposé dans un pot hermétique propre à usage unique. Seule une petite quantité de selles est nécessaire en privilégiant le sang ou les glaires. Un écouvillonnage rectal peut suffire dans certains cas (nourrisson). Les selles doivent être acheminées au laboratoire le plus rapidement possible (+4+ 2°C idéalement). Le délai entre le prélèvement et l'ensemencement ne devra pas dépasser 12 heures, et pendant ce délai les selles devront être conservées à +4+2°C.

> Prise en charge du prélèvement au laboratoire + Examen macroscopique L'examen macroscopique est primordial: aspect des selles (liquides, molles, pâteuses, mouées) et présence éventuelle de glaires ou de sang,

° Examen direct: L'examen direct est important: présence d'hématies, de leucocytes et l'éventuel caractère monomorphe de la flore.

41

Bactériologie et virologie pratique

En cas de choléra, on retrouve une flore monomorphe composée de bacilles incurvés mobiles (selles eau de riz). °

Coproculture:

Standard: Les milieux ensemencés sont incubés au minimum 48 h, Un déséquilibre de flore est recherché sur un milieu peu sélectif (BCP, CLED). Salmonella et Shigella : existe des milieux sélectifs pour Salmonelles-Shigelles (SS, Drigalski, Hektoen, DCL, Rambach®), et des milieux chromogènes (SM ID°) rendant l'identification plus aisée. est possible d'utiliser des milieux d'enrichissement liquides en Salmonelles (Mueller-Kauffmann, Sélénite, Rappaport). Yersinia : Ces bactéries peuvent se rechercher sur les mêmes géloses sélectives que Salmonella-Shigella. Elles peuvent aussi se rechercher sur une gélose spécifique contenant des = antibiotiques (Cefsulodine-lrgasan® et Novobiocine) incubés à 37°C (idéalement 29°C). Campylobacter :On utilise des milieux contenant du charbon et du désoxycholate (Karmali, Skirrow, Buztler) incubés en atmosphère micro-aérophile à 37°C ou 41°C. Recherches spécifiques

Clostridium difficile : On peut utiliser des milieux sélectifs contenant de la céfoxitine (George). Les deux toxines À et B doivent être recherchées. Ilexiste des techniques Elisa conventionnelles sur automate. Ces techniques donñent un résultat rapide et ainsi peuvent permettre de prendre es mesures (isolement et traitement du patient) qui s'imposent, Escherichia coli: Les EPEC responsables de diarrhées de l'enfant de moins de deux ans se recherchent sur milieu type EMB ou Drigalski. En cas de suspicions de Syndrome hémolytique et urémique (SHU). |! faut isoler les Æ. coli et faire la recherche de toxines (agglutination et/ou PCR). De nombreuses souches d’E col ‘esponsables de SHU sont 0 :157 et sorbitol (-). Chez le voyageur: |! faut alors aussi penser à —

Aeromonas S0p. qui se recherche sur une gélose au sang contenant de l'ampicilline.

— _Vibrio halophiles :recherchés sur gélose au sang, car ils ne poussent pas sur BCP —

Wbrio cholerae: l'examen direct est souvent positif pour le cholera. Ils se recherchent classiquement après enrichissement (eau peptonée alcaline repiquée sur gélose TCBS) pour un porteur.

42

]

Prélèvements

La majorité des diarrhées sont virales. L'identification du virus responsable de la diarrhée ne présente aucun intérêt autre qu'épidémiologique.

Des virus responsables de manifestations cliniques autres que les diarrhées peuvent êtres excrétés dans les selles (virus de l'hépatite À, entérovirus, ….). Les virus présents dans les selles sont non enveloppés, à transmission féco-orale et résistants dans le milieu extérieur.

> Virus responsables de diarrhée Les virus responsables de diarrhées sont classiquement :

Tableau 1-26: Virus responsables de diarrhée. Contexte clinique

Rotavirus

. Fréquence

Transmission fécale-orale Epidémies hivernales surtout chez enfants avant 3 ans

Épidémies de collectivités Caliciviru cn

Première cause de gastroentérites épidémiques non bactériennes

Astrovirus

Divers

Adénovirus (notamment 40/41)

Divers

Fes

> Virus non responsable de diarrhée retrouvés dans les selles Tableau 1-27: Virus non responsables de diarrhée mais dont la recherche dans les selles a un intérêt pour l'exploration d'une autre symptomatologie. Symptomatologie principale Enterovirus

Méningites, herpangine, péricardites, …

Virus de la poliomyélite

Méningites, poliomyélite antérieure aiguë

Hépatite À

Cytolyse hépatique avec ictère

Hépatite E

43

Bactériologie et virologie pratique

> Techniques de recherche Tableau 1-28: Techniques de recherche des virus retrouvés dans les selles.

Techniques de recherche Biologie moléculaire* (le

Isolement viral (culture)

Rotavirus

ICT, ElA, Agglutination

Adénovirus

|

Non, pour AdV40/41

(notamment 40/41) | RTPCR dual. RAS Re

AibES

tative

Astrovirus

Non

* non réalisé en pratique courante

44

re

SÉHROUNEIOR

[

Prélèvements

Sphère génitale

Bactériologie

> Flore vaginale Les espèces présentes sont dites mutuellement exclusives. La présence de chacune limite la multiplication des autres. L'examen direct revêt ainsi une très grande importance afin d'apprécier cet équilibre. Environ 20 espèces bactériennes sont présentes physiologiquement et dans cet écosystème, les lactobacilles ont un rôle fondamental.

La flore peut être caractérisée de la façon suivante : —

|lexiste des variations à la fois qualitatives et quantitatives au cours du cycle

—

Elle est constituée essentiellement de bactéries à Gram +

—

Les anaérobies stricts sont 2 à 5 fois plus fréquents que les aérobies.

—

Des bactéries présentes physiologiquement peuvent être des pathogènes opportunistes en cas de déséquilibre de la flore.

Tableau 1-29A:

Bactéries de la flore vaginale Flore dominante — Goupe | Lactobacilus spp. : plusieurs espèces

Flore de voisinage digestive et cutanée Groupe || Anaëérobies :plusieurs espèces Streptocoques du groupeB (Streptococcus agalactiaë) Entérocoques Corynebactenum $00. Staphylocoques à coagulase négative Gardnerella vaginalis Mobiluncus Spp. Mycoplasma hominis, genitalum Ureaplasma urealyticum Entérobactéries : Esherichia col, … Candida

45

Bactériologie et virologie pratique

Bactéries de la flore vaginale Flore oropharyngée Groupe Streptocoques Haemophilus Flore de l'environnement Pseudomonas Acinetobacter

Tableau 1-29B

Type d'infections

Germes considérés toujours comme pathogènes

Endocervicite et ses complications: (Endométrite, Salpingite, Pelipéritonite)

Neisseria gonarrhoeae Chlamydia trachomatis

Infection vaginale

Inchomonas vaginalis

Tableau 1-29C Type d'infections Vaginose Vaginite

Endométrite : Circonstances cliniques à risque

Port d'un stérilet, Investigation endoutérine postpartum, postabortum Salpingite

Germes à potentialité pathogène © |Flore de voisinage digestive et cutanée Groupe || Anaërobies :plusieurs espèces Streptocoques du groupe B (Sagalactiae Entérocoques Corynebacterium Sp. Staphylocoques à coagulase négative Gardnerella vaginalis Mobiluncus spp. Mycoplasma hominis, genitalium Üreaplasma urealyticum Entérobactéries : Esherichia col, … Candida spp.

Flore oropharyngée Groupe lil Streptocoques | Faemophius

46

1

Prélèvements

Tableau 1-29D Type d'infections

Germes de portage

Infections maternofoetales et néonatales Situation à risque:rupture prématurée de la poche des eaux, menace d'accouchement prématuré

BHVRI (bactéries vaginales à haut risque d'infection maternofoetale ou néonatale) Streptococcus agalactiae ++++ Escherichia coli Slaphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae

Strepiococcus pyogenes Haemophilus Sp.

> Flore génitale masculine L'urêtre masculin est normalement stérile, mais l’on peut aussi retrouver des germes de la flore cutanée en quantité relativement faible.

> Conduite à tenir devant une ulcération ano-génitale ° Prélèvement Prélever la sérosité à la base ou au bord de l'ulcère avec un dispositif adapté (oese, vaccinostyle). e

Examen direct

Microscope à fond noir ou IF: Examen au microscope à fond noir ou en immunofluorescence pour mettre en évidence 7reponema pallidum responsable de la syphilis.

Après coloration : Coloration de Gram. La coloration au MGG est utlle pour mettre en évidence Haemaphilus ducreyi (maladie du chancre mou) et Corynebacterium granulomatis (Donovanose) qui prennent peu la coloration de Gram.

°

Culture et biologie moléculaire

Culture bactérienne pour rechercher des bactéries pyogènes. On peut éventuellement pratiquer une culture cellulaire ou de la biologie moléculaire (PCR) pour mettre en évidence d'une infection à Chlamydia trachomatis (Maladie de Nicolas Favre), à Haemoohilus ducreyi (Chancre mou), à Herpès ou Papillomavirus

> Conduite à tenir devant des lésions vésiculeuses ano-génitales Recherche d'HSV. VZV et éventuellement de papilomavirus. 47

Bactériologie et virologie pratique

> Conduite à tenir devant une urétrite +

Chez l’homme

Prélèvements —

Sérosités purulentes au méat,

—

Prélèvement endo-urétral à l'écouvilon et/ou avec un dispositif de grattage de cellules épithéliales (1 à 2 cm à l'intérieur du méat. Ceci est d'autant plus important en l'absence d'écoulement où en cas d'écoulement minime.

—

1% jet urinaire au minimum 2 heures après la dernière miction (recherche de Chlamydiae trachomatis, Neisseria gonorrhoeae et Mycoplasma genitalium par biologie moléculaire).

Agents pathogènes recherchés

,

Neisseria gonorrhoeae, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalum, frichomonas vaginalis, Garanerella vaginalis (rarement), Candida albicans, Streptococcus agalactae et Corynebacterium seminale.

Examen direct Faire une coloration de Gram. La présence de diplocoques à Gram négatif dans des polynucléaires est pathognomonique de Veisseria gonorrhoeae

Culture et biologie moléculaire Les géloses suivantes sont à ensemencer :

— —

(Gélose au sang cuit enrichie de type polyvitex avec ou sans inhibiteur pour recherche Neisseria gonorrhoeae sous CO, Gelose au sang +/ — acide nalidixique pour les coques à Gram +

On peut éventuellement faire éventuellement une culture cellulaire pour recherche de Chlamydiae trachomatis, ou des milieux spécifiques pour recherche des Ureaplasma. Les techniques de biologie moléculaire se développent sur 1° jet urinaire une recherche de Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genialium et Neisseria gonorrhoeae £

°

Chez la femme

Ce syndrome est généralement composé de brûlures mictionnelles et de pollakiuries Outre les germes des cystites ou pyélonéphrites, ces syndromes peuvent être causés par Chlamydia trachomats, Mycoplasma genitalum, Ureaplasma urealyticum et Neisseria gonor "0e.

48

1]

Prélèvements

> Conduite à tenir devant des leucorrhées +

Prélèvements

Proposition pour la conduite d'un prélèvement vaginal:

1. Prélever la paroi vaginale à l'aide d'un écouvillon en coton en amassant le maximum de matière.

2. Etaler sur lame pour le diagnostic après coloration de Gram d'une vaginose bactérienne. 3. Prélever l'endoco! à l'aide d'un écouvilon n'inhibant pas la pousse de Meisseria gonorrhoeae

4.

Prélever l'endocol en frottant légèrement afin de détacher quelques cellules

épithéliales pour la culture ou la PCR de Chlamydia trachomatis L'entrée du vagin (éventuellement auto-prélèvement) et l'urine 1% jet peuvent aussi permettre

uniquement par PCR la recherche de Chlamydia trachomatis, de Neisseria gonorrhoeae et de Mycoplasma genitalium. °

Micro-organismes recherchés

Mycose vaginale: Candida S0p. Vaginose bactérienne : réalisation primordiale de l'examen direct C'est un déséquilibre de la flore aboutissantà la disparition des lactobacilles et à la multiplication anormale de Gardenerella vaginalis et d'espèces anaérobies diverses et de mycoplasmes, Le pH vaginal et le test à la potasse sont des éléments essentiels au diagnostic. || faut aussi rechercher les cellules épithéliales criblées de bactéries «clue-cells ». Conférence de consensus :3 de ces critères permettent de poser le diagnostic de vaginose bactérienne.

—

pH vaginal > 4,5

—

Test à la potasse positif

—

Leucorrhées malodorantes et adhérentes

—

Présence de clue-cells à l'examen direct.

49

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 1-30: Evaluation de la flore génitale après coloration de gram d'après Nugent. Score

Morphotype

Lactobacillus

a

Mobiluncus

0

Het

0

0

Î

+++

+

|

+1 ++

?

sun

++

|

++ / ++

$

-

+++

4

0

De Duon

Le score du frottis est calculé en pratiquant la somme des scores obtenus pour les différents morphotypes bactériens observés. ù On catégorise la flore vaginale en trois groupes différents: Groupe 1 (score compris entre 0 et 3 : flore normale,

Groupe 2 (score compris entre 4 et 6): —lore intermédiaire. Les lactobacilles sont peu abondants associés à d'autres mo rphotypes peu diversifiés présents en quanté relativement limitée. 11 s'agit d'une flore vaginale altérée mais dont l'aspect bact@:riologique n'est pas en faveur d'une vaginose bactérienne, Groupe 3 (score compris entre 7 et 10): flore évocatrice d'une vaginose bacté. enne. Disparition des lactobacilles au profit d'une flore de type anaérobie abondante et polymorphe, avec présence éventuelle de vibrions et/ou de clue-cells.

Vaginite :

Présence d'un écoulement contenant de nombreux PNN, L'odeur est en général nauséabonde. Multiplication anormale de bactéries pyogènes (Entérobactéries, Streptocoques du groupe B, Actinomyces, Mycoplasmes et Staphylocoques) ou de Frichomonas vaginalis. °

Culture

Les géloses suivantes sont gé néralement ensemencées : Gélose au sang cuit enrichie de type polyvitex avec (VCAT) ou sans inhibiteur pour recherche de Neisseria gonorrhoëae sous CO, Gélose au sang +/ — acide nalidixique pour les coques à Gram+ milieux spécifiques pour recherche d'Ureaplasma urealyticum Éventuellement culture cellulaire pour recherche de Chlamydia trachomatis

50

1

Prelèvements

Deux virus sont couramment recherchés: les virus Herpes Simplex et les papilomavirus humains oncogènes.

> Technique de recherche + Examen direct Un examen direct en lF sur lame permet de rendre un résultat en quelques heures. En cas de lésions franches, c'est un examen relativement sensible et permettant de typer HSV-1 et/ou HSV-2, Toutetois, il doit être effectué par un opérateur expérimenté et la préparation des lames doit être optimale. En effet, une lame mal dégraissée provoquera un voile rendant l'examen ininterprétable. «Isolement viral La culture cellulaire est simple à faire dans le cas de l'HSV l'effet cytopathique est rapide, massif, en 1 à 2 jours et facilement reconnaissable. Les cellules se détachent et forment une grappe de raisin. L'effet cytopathique pour une excrétion asymptomatique d'HSV peut prendre un peu plus de temps (4 à 5 jours) pour être détecté. Les papillomavirus ne sont pas cultivables en pratique courante.

+ Détection du génome viral Dans le cas d'une ulcération génitale, la détection du génome viral HSV est possible par PCR quantitative et permet le typage. La recherche des Papilomavirus humains à haut risque oncogène est réalisée par PCR ou par hybridation ARN/ADN,

> Prélèvements ° Isolement viral L'échantillon doit être placé dans un milieu de transport. Les cytobrosses utilisées pour les prélèvements du col utérin peuvent être placées dans le milieu proposé dans le kit ou en sérum physiologique. ll doit être transmis dans les 6 h à température ambiante ou stocker à + 4+2 °C à défaut pendant au maximum 24 heures.

+ Recherche génome Les conditions sont identiques à celles décrites pour isolement viral. || peut être congelé à —20°C ou mieux à —80°C.

91

Bactériologie et virologie pratique

TA

TT

LOT

LETEL

Les infections survenant avant les 72 h premières heures de la vie du nouveau-né sont presque exclusivement d'origine materno-fætale, Il faut distinguer ici 3 mécanismes physiopathologiques : —

Infections in utero de type transplacentaire (passage de l'agent à travers le placenta) |nfections in utero avec chorio-amniotite (infection du placenta)

| ections per partum (infection par passage dans la filière génitale maternelle).

Bactériologie > Flore normale Le nouveau-né naît en principe stérile et est rapidement colonisé (peau, tube digestif).

Tableau 1-31 : Bactéries retrouvées dans les prélèvements périnataux Commensale du vagin de manière transitoire ou permanente | Responsable d'infections Haut risque infectieux :

Autres

sexuellement transmissibles =

Streptococcus agalactiae (groupe B) Listeria monocytogenes Escherichia colinotamment de type capsulaire K1 Haemophilus influenzae

*

Streptococcus pyogenes (groupe À) Slaphylococcus aureus, | autres entérobactéries, Gardnerella vaginalis, …

Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum Chlamydia trachomatis, …

Suspicion d'infection materno-fœtale

Le prélèvement de choix pour diagnostiquer une infection du nouveau-né est le liquide gastique. On lui adjoint classiquement au moins 2 prélèvements dit périphériques (oreilles + au

92

1.

Prélèvements

moins 1 autre orifice). L'hémoculture sur sang du cordon est systématique pour confirmer l'infection néonatale. La ponction de LCR est indiquée en cas d'altération de l'état général, de signes cliniques neurologiques ou de sepsis. Les prélèvements de l'enfant peuvent être complétés par des prélèvements maternels :placenta (origine hématogène), prélèvement génital (vaginal, pour les suspicions d'infections par voie basse).

> Prise en charge des prélèvements au laboratoire + Liquide gastrique Un examen direct est obligatoire par coloration de Gram. On notera la présence ou l'absence de polynucléaires et de bactéries. Au niveau de l'ensemencement, une gélose au sang et une gélose au sang cuit de type polyvitex® sont placées sous CO, à 37°C.

+

Prélèvements périphériques

Ces échantillons peuvent être contaminés par la flore génitale ou par des germes de l'environnement, ce qui implique une interprétation commune des résultats des différents échantillons avec le pédiatre. Ils devront êtres ensemencés sur les mêmes géloses dans les mêmes conditions afin de pouvoir rechercher les mêmes germes. L'hémoculture et le LCR seront traités d'une manière habituelle.

Techniques de recherche Le diagnostic chez le nouveau-né fait intervenir uniquement le diagnostic direct (biologie moléculaire surtout) ou éventuellement les anticorps de classe 1gM du fait de la présence d'anticorps d'origine maternelle de classe 1gG pendant les premiers mois de vie de l'enfant.

Prélèvement Le cytomégalovirus se recherche dans le sang ou dans les urines du nouveau-né en cas de séroconversion maternelle pendant la grossesse ou lors des réactivations. 1 convient de faire

une recherche de CMV à la naissance devant tout retard de croissance /n utero d'étiologie incertaine. Les techniques de détection dans le sang et dans les urines sont données aux chapitres correspondants.

La recherche dans les urines doit être fait dans les 10 jours suivant la naissance afin de

distinguer l'infection in utero de l'infection en période péri-natale. La virurie massive rend la recherche aisée.

53

Bactériologie et virologie pratique

L'infection à HV est diagnostiquée chez le nourrisson par la recherche du génome viral ARN dans le plasma sanguin (ou ADN dans les leucocytes) à la naissance, 1 mois, 3 mois et 6 mois. En absence d'infection, le dépistage sérologique HIV ne devient négatif qu'à partir de 18-24 mois de vie. L'infection à VHC est diagnostiquée par la mise en évidence de l'ARN VHC dans le plasma sanguin, Comme chez l'adulte de rares guérisons spontanées peuvent survenir. L'infection VHB est normalement prévenue par sérovaccination du nouveau-né. Un diagnostic positif se fera par recherche de l'Ag HBs et de l'ADN viral sanguin. L'évolution vers la chronicité est très fréquente.

54

1,

Prélèevements

Lésions cutanées et suppurations

Bactériologie Étant donné les différentes localisations et situations cliniques il est indispensable d'obtenir les renseignements pour guider l'analyse et l'interprétation des résultats. La qualité de la réalisation des prélèvements (après nettoyage de la lésion) est essentielle pour mettre en évidence les bactéries potentiellement pathogènes et pour diminuer au maximum l'isolement des bactéries cutanées commensales,

>» Flore normale + Flore résidente La flore est stable et importante en quantité (10° à 107 bactéries / cm’ de peau selon les zones sèches ou humides). Elle agit comme barrière contre la colonisation par d'autres espèces. Trois genres sont prédominants : Siaphylococcus (à coagulase -), Corynebacterium (ipophiles et non lipophiles) et Propionibacterium. ° Flore en transit Ce sont notamment Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus (portage nasal et périnéal), autres streptocoques, … existe une implantation transitoire à partir du milieu extérieur (Pseudomonas, Acinetobacter, …) ou à partir du tube digestif: (Entérobactéries, Entérocoques,….). IL està noter l'importance dans le portage et la transmission des bactéries responsables d'infections nosocomiales :SAMR des fosses nasales et cutané (périnée).

” ed à ee

. diférent suivant jecontexte die

Dans les dermatoses bactériennes (furoncle, anthrax, impétigo, panaris, erysipèle) les prélevements ne sont pas nécessaires : les bactéries le plus souvent responsables sont Saphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptocoques B-hémolytiques (groupe C et G). Dans les infections avec nécrose importante (fascite nécrosante), les prélèvements sont réalisés: S aureus et S. pyogenes sont également isolées, mais les souches sont souvent productrices de toxines (toxine leucocidine de Panton-Valentine pour Slaphylococcus aureus et toxine erythogène pour Streptococcus pyogenes). 55

Bactériologie et virologie pratique

+

Dansles infections après effraction accidentelle

Piqûre aiguille Streptococcus pyogenes où autres Streptocoques fB-hémolytiques, Staphylococus aureus, … Piqûre insecte : Elle peut se surinfecter avec bactéries présentes sur la peau. Dans le cas particulier de la piqûre de tique, il est à noter la transmission de Borrelia, agent de la maladie de Lyme. Cette bactérie provoque une atteinte cutanée avec érythème migrant. Le diagnostic direct peut se faire par PCR sur biopsie tissulaire mais se fait généralement grâce à une sérologie. Piqûre couteaux, arêtes poisson... : IL faut penser à Ersypelothix rhusopathiae qui provoque un erysipéloide cutané et diffus. Le prélèvement doit être profond de type biopsie.

Surinfection brûlure : Dans un premier temps la lésion est stérile, Puis la zone brûlée va se coloniser. Des biopsies ou empreintes au niveau de la … sont réalisées avec évaluation semi-quantitative des bactéries par gramme de tissu où cm‘ de peau.

Les bactéries retrouvées : Saohylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Entérobactéries, Bacillus cereus, … peuvent être cause de sepsis et de mortalité importante. Traumatisme avec plaie ouverte : Accident de la voie publique, agricole, domestique ….

est important de connaître le lieu de la contamination pour la recherche des bactéries de l'environnement. || ne faut pas prélèver avant le nettoyage initiale de la plaie. || ne faut d’ailleurs prélever qu'en cas de surinfection. Terre: Bacilus (cereus), Entérobactéries, Pseudomonas, Clostridium, Actinomyces.…, Eau: Aeromonas Spp., Vibrio (halophiles eaux de mer), Entérobactéries, Pseudomonas, … Attention aux formes fulminantes pour Aeromonas et Bacilus cereus: pouvoir nécrotique important.

Ne pas oublier Clostridium tetani pour la prévention (par contre bactérie rarement retrouvée en cas de tétanos).

Morsure, Griffades, Léchage plaie, par animal: Infections très fréquentes souvent polymicrobiennes. Les bactéries proviennent de la flore pharyngée de l'animal: grande diversité des espèces {habitat des petits bacilles à gram — de culture difficile) Abces hyperalgique très précoce pour Pasteurellose.

56

l.

Prélévements

Morsure de chien Pasteurella multocida Stavhylococcus aureus Staphylococcus intermeaius Streptocoques B et B hémolytiques Capnocytovhaga canimorsus Bergeyella, … Neissera animales

Morsure, griffade de chat Pasteurella multocida

Bartonella henselae ou quintana (maladie des griffes du chat: diagnostic par sérologie) Morsure d'homme : On y pense souvent lors de complication à distance :abcès cerveau, arthrite, On retrouve les bactéries de la flore pharyngée de l'homme: | —

Anaërobies :Bacilles à Gram —: Prevotella pigmentés et non pigmentés, Porphyromonas, Fusobacterium nucleatum, necrophorum. Coques à Gram +: Peptosfreptococcus

—

Streptocoques oraux

—

Siaphylococcus aureus

— —

…

Ejkenela corrodens Haemoohilus influenzae

Ulcère pied diabétique : C'est un problème fréquent chez le diabétique mal équilibré. 1 n'existe aucun moyen formel permettant de différencier une colonisation d'une infection. || ne faut pas prélever sans nettoyage sérieux avec du sérum physiologique de la lésion. Il faut privilégier les prélèvements profonds :aspiration à l'aiguille, biopsies osseuses L'interprétation doit tenir compte :

—

des conditions de recueil du prélèvement

—

des conditions et du délai de transport du prélèvement au laboratoire

—

du nombre de prélèvements où l8 même germe est isolé (germes commensaux)

Les bactéries retrouvées (souvent plusieurs): —

Plaie récente: Siaohylococcus aureus, Streptocoques, Corynébactéries (attention à Corynebacterium ulcerans toxinogène), Stavhylococcus lugdunensis

—

Plaie > 1 mois: + Entérobactéries, Entérocoques, Pseudomonas aeruginosa,

57

Bactériologie et virologie pratique

—

Antibiothérapie antérieure :Bactéries multirésistantes SARM, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.…

—

Si biopsies osseuses : identifier toutes les souches y compris Staphylocoques à coagulase —

Escarre (uülité des prélèvements ?) : I ne faut prélever que les malades en choc septique ou en cas de recherche de BMR

> Prélèvements Les prélèvements doivent être mis en flacon stérile (liquides d'aspiration, biopsie).

Les prélèvements cutanés sont réalisés avec un écouvillon. Certains modèles d'écouvillons intègrent un milieu de transport permettant d'améliorer la résistance du prélèvement au transport. En effet, sans milieu de transport, le délai d'arrivée au laboratoire doit être strictement inférieur à 2 heures,

> Prise en charge des prélèvements au laboratoire * Examen direct et cytologie Un examen direct après coloration de Gram est possible °

Ensemencement

Préparation des échantillons : Les biopsies sont découpées ou broyées stérilement (hotte à flux laminaire) Mise en culture : Les milieux à ensemencer peuvent être:

— — —

Gélose au sang Gélose chocolat Polyvitex sous CO, Gélose au sang en anaérobiose

—

Milieu liquide d'enrichissement: Bouillon Schaedler, Thioglycolate

—

Gélose au sang acide nalidixique et colistine si flore importante

Temps d'incubation : ILest d'environ 5 jours mais doit être plus long pour la biopsie osseuse : 15 jours.

58

|,

Prélévements

Cathéters

Bactériologie Les cathéters peuvent être colonisées par des bactéries le plus souvent d'origine cutanée : cette colonisation pourra aboutir à un état septicémique. La mise en culture des cathéters a pour but de prouver l'origine d'une septicémie.

> Bactéries à rechercher Toutes les bactéries peuvent être retrouvées Les plus fréquentes :

—

Staphylocoques à coagulase —:

—

Siaphylococcus aureus

— Entérobactéries Plus rarement : —

Pseudomonas aeruginosa

— Acinetobacter Spp Les Staphylocoques à coagulase —, par leur capacité à fabriquer du biofilm peuvent adhérer

sur du matériel.

> Prélèvement L'embout du cathéter sera mis dans un flacon stérile et le délai d'arrivée au laboratoire devra être inférieur à 2 heures.

> Prise en charge des prélèvements au laboratoire + Ensemencement Préparation des échantillons : le cathéter est mis dans 1 mL de sérum physiologique Mise en culture avec une anse de 10 LL pour ensemencer une Gélose au sang Temps d'incubation: 48 heures

e Interprétation Une colonie correspond à 102 UFC /mL., La colonisation est significative si 10° UFC /mL. Cette interprétation doit également tenir compte des résultats des hémocultures. 59

«

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|

TECHNIQUES D’IDENTIFICATION USUELLES tériologie Diagnostic direct en bac

D

Le diagnostic direct est à privilégier pour le diagnostic des infections actives. Le diagnostic indirect (sérologie) permet essentiellement un diagnostic rétrospectif et de déterminer un statut immunitaire vis-à-vis d'un agent infectieux. En bactériologie, il repose sur la technique de culture,

+

e

e

Examen direct sur le prélèvement —

Etat frais Cellules :polynucléaires Bactéries : forme, mobilité

—

Coloration de Gram Bactéries :forme, groupement, coloration (Gram + ou —).

Mise en culture: —

Choix des milieux de culture en fonction de la nature des prélèvements

—

Choix de l'atmosphere

—

Temps d'incubatio

Le lendemain et les jours suivants:

Bien observer les différentes colonies et les caractères culturaux (milieux, atmosphère, hémolyse).

—

Coloration de GRAM (violet de gentiane, lugol, décoloration alcool, fuschine de Ziehl ou safranine)

61

Bactériologie et virologie pratique

—

Alternatives à la coloration de Gram * Sensibilité à la vancomycine et la colistine: Bactérie à GRAM —: vanco R, col S Bactérie à GRAM +: vanco S, coli R * Test à la potasse: solution aqueuse à 3% de KOK sur une lame, prélever une colonie et homogénéiser en soulevant l'anse. Gram — file, Gram + non

—

Catalase Enzyme détruisant les peroxydases issues des réactions cytoplasmiques d'oxydation et toxiques pour les bactéries. Mode opératoire :eau oxygénée 20 volume ou réactifs commerciaux — Sur lame — Sur milieu gélosé — En milieu liquide

Lecture :

+: formation de bulles : absence de bulles Faux positifs :pseudocatalase (ex, Lactobacillus, Pediococcus)

—

Oxydase

4

Enzyme qui participe au transfert des électrons de leurs substrats sur une molécule d'oxygène. Mode opératoire: — Réactif liquide:imprégner un morceau de papier filtre

— Pastiles commerciales Lecture: +: coloration violette —: absence de coloration Ne pas attendre pour lire la couleur Ainsi le choix de la galerie d'identification (manuelle ou sur automate) est guidé par ces caractères primordiaux. Travailler sur des colonies bien isolées et toujours faire un isolement en parallèle de la galerie d'identification pour vérifier la pureté. Attention aux souches anaërobies qui peuvent être aérotolérantes (Propionibacterium, Clostridium tertum). Croissance aérobie signifie ici pousse sur des géloses incubées en atmosphère normale où sous CO, 62

2

Techniques d'identification usuelles

Tableau 2-1 : Les bactéries Gram + selon les caractères de la primoculture {liste non limitative) Forme

sance

Catalase Morphologie

Genres

CAS Coques

aérobie

Streptococcus et apparentés

Staphylococcus et apparentés,

CAT +

Micrococcus.….

anaérobie

Bacilles

Peptostreptococcus

Bacillus

aérobie

SpOrUIANtS | anaérobie

Clostridium (CAtes

Listeria

CAT -

Lactobacillus Erysipelothrix

Morphologie

régulière

GRAM + aërobie

Corynebacterium et apparentés Nocardia (AS)

Bacilles

non

Morphologie

sporulants

irrégulière Arcanobactenium Bifidobactenium, Mobiluncus, Eubacterium.….

anaëérobie

Propionibacterium (aérotolérant)

63

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 2-2: Les bactéries à Gram-— selon les caractères de la pimoculture (liste non limitative) Catalase

Croissance

Morphologie

Neisseria, Branhamella.. ji Moraxella

OX +

Coques

CAT +

aëérobie

Genres

Oligella

Kingella

OX CAF anaërobie

Eikenella Veilonella

Entérobactéries Acinetobacter (AS)

OX -

Stenotrophomonas (AS) Pseudomonas et apparentés (AS), Alcaligenes, Havobacterium spp..…. (AS) Aeromonas Vibrio Pasteurella Bordetella bronchiseptica Brucella (AS)

OX +

GRAM aérobie

4

Bacilles OU COCCObacilles

Kingella, Eikenella

Pas de Culture su

gélose au sang

Haemophilus, Legionela. Bordetella pertussis Francisella

Es

anaërobie

LES

Bacteroides, Fusobacterium.

microaërophile

a ol

| Felicobacter

64

2,

Techniques d'identification usuelles

> Identification des colonies +

Détermination de l’espèce bactérienne biochimique :galeries miniaturisées ou automates antigénique : par agglutnation

moléculaire : PCR ciblée avec amorces spécifiques ou séquençage ARN16S Spectrométrie de masse: le diagnostic est basé sur l'empreinte protéomique par un Spectromètre de masse MaldiTOF Cette technique est rapide (10 min) et peu OnÉTEUSE.

e Détermination du sérogroupe par agglutination ou par PCR.

> Autres diagnostic direct Détection de toxines Par PCR ciblée avec amorces spécifiques Par technique immunochromatographique (toxine C. difficile)

Détection d’Ag spécifiques Par agglutination (Neisseria meningitidis dans LCR) Par immunoenzymologie (Legionella pneumophila 1 dans les urines) Détection d'ADN bactérien PCR ciblée PCR ARN

16 S et séquençage.

65

Bactériologie

et virologie pratique

Diagnostic direct en Virologie

Le diagnostic direct est à privilégier pour le diagnostic des infections actives. Le diagnostic indirect (sérologie) permet essentiellement un diagnostic rétrospectif et de déterminer un statut immunitaire vis-a-vis d'un agent infectieux.

Techniques couramment utilisées en virologie médicale L'essor de la virologie médicale fait suite à l'apparition des techniques de recherche de virus:

—

isolement viral en culture dans les années 1950

—

Immunologie avec recherche d’'antigènes ou anticorps dans les années 1970

—

biologie moléculaire dans les années 1990

De plus la mise en évidence d'infections sévères et chroniques, et le développement de traitements efficaces imposent maintenant un diagnostic et un suivi biologique.

> Techniques d'isolement viral en culture cellulaire Tous les virus ne sont pas isolables en routine au laboratoire. Historiquement les isolements étaient effectuées à partir d'inoculations intra-cérébrales de souriceaux nouveau-nés puis sur des œufs de poules embryonnés. Actuellement la plupart des isolements sont obtenus après inoculation de cellules cultivées en monocouche ou en suspension.

°

Type de cellules:

Les cellules cultivées sont généralement de 3 types: —

Cellules hétéroploides en lignée continue à partir de cellules cancéreuses.

—

Cellules diploides à partir de cellules embryonnaires.

—

Cellules obtenues directement d'un tissu (primo-explantation).

66

.

2.

Techniques

d'identification usuelles

Tableau 2-3: Lignées cellulaires utilisées en virologie médicale

Type

Nom

. | Tissu primaire

Origine

Tissu d'origine

Singe

Rein

Sang Diploïde

MRCS

|

Fibroblastes de poumons embryonnaires

KB

Homme

|

He

°

fe its du nasopharynx Cancer du col de l'utérus

Tumeur

Hep-2

(lIgnée continue)

MDCK

Chien

MDBK

Bœuf

Vero

Singe

RK13

Lapin

|

Rein

Méthodologie:

Prétraitement: Mécanique : les échantillons solides sont broyés ou filtrés. Contaminations :les échantillons peuvent être traités avec des antibiotiques et éventuellement des antifongiques pour éviter les contaminations. Des flltrations stérilisantes peuvent également êtres effectués.

Inoculation : Le virus est inoculé par mise en contact direct avec les cellules permissives (après centrifugation ou non). En fonction des virus recherchés un panel de cellules permissives adaptées sera Utilisé.

67

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 2-4: Virus couramment cultivés Nom

Cellules permissives

Virus Herpes Simplex

RC5

Cytomégalovirus

RC5

Virus varicelle

| MRCS, DCK

Adénovirus

| HeLa, MRC5

Echovirus

RC5,

MDCK

Coxsackievirus

RC5,

MDCK,Vero

Poliovirus

RC5,

MDCK,Vero

D'autres virus sont cultivables mais d'une manière plus difficile ou peu courante : EBV, VIH, Virus Parainfluenza, Virus de la gnppe À et B, VRS, Virus des oreillons; Virus de la rougeole, Virus de a rubéole. e Lecture: Après une incubation à 37°C (33°C pour les virus respiratoires) sous CO, pendant 1 et 15 jours suivant le virus, la mise en évidence de la multiplication virale est possible. Elle s'effectue par un examen en contraste de phase de la nappe cellulaire à la recherche d'un effet cytopathique (ECP). La spécificité de l'ECP peut être confirmée par les tests de diagnostics directs. Tableau 2-5: Mise en évidence des virus en culture

Techniques

Principe

Sur les cellules |Immunofluorescence (IP

Détection d'antigènes viraux par un anticorps spécifique marqué Jar Un fluorophore

Immunopéroxydase (IP)

Détection d'antigènes viraux par un anticorps spécifique marqué par une péroxydase

Test de séroneutralisation

nhibition de la multiplication du virus suspecté par incubation préalable à l'inoculation avec un antisérum

68

2.

Techniques

Techniques d'ide ntification usuelles

Principe

Sur le surnageant de culture

Immuno-enzymologie

Détect on d'antigènes viraux par un anticorps spécifique marqué

par une enzyme

es

————

Biologie moléculaire {PCR ou hybridation)

Détec on du génome du virus produit

Activité enzymatique virale

Détection d'une activité transcriptase inverse par biologie

(PCR ou ElA)

moléculaire

> Techniques de biologie moléculaire Elle permet d'augmenter de manière importante la sensibilité de la détection des virus isolables en culture et de détecter les virus non isolables. Classiquement la biologie moléculaire en virologie a deux finalités. La première est la détection ou la quantification d'un génome viral dans un échantillon. La seconde est la caractérisation du génome viral nécessaire pour obtenir un typage viral ou la détermination de la résistance des VITUS aux antviraux.

°

Détection et/ou quantification d’un génome viral:

Après extraction et purification des acides nucléiques de l'échantillon, un f agment génomique viral est amplifié de manière spécifique par PCR. La PCR (Polymerase Chain Reaction ou Amplification par polymérisation en chaîne) permet la multiplication exponentielle d'un segment d'ADN situé entre deux amo [ces judicieusement choisies. L'amplification est cyclique et réalisée automatiquement dans un hermocycleur. Pour détecter la p =ésence de l'ADN amplifié plus leurs techniques sont disponibles :

—

migration en ge d'agarose (ou autre) avec coloration au bro nure d'éthidium ou SYBR green etvisualisation d'une bande spécifique sous ultraviolets.

Hybridation en p hnase solide et révélation en ElA — Hybridation en p hase liquide (sondes à hydrolyse, sondes à émission) et détection en temps réel grâce à des thermocycleurs spécifiques. Pour les virus à ARN une étape de transc iption inverse doit être realisée avant PCR ou lors de la PCR. —

69

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 2-6: Les différentes sortes de PCR couramment utilisées en virologie Technique

Principe

PCR

PCR «classique » en point final

RT-PCR

Transcription inverse de l'ARN en ADNC puis PCR

PCR etRT- | Deux PCR successives avec PCR nichée | deux couples d'amorces dont (nested)

Coût, Simplicité

Pas de quantification, sensibilité variable Idem PCR

Idem PCR

5e nsibilité Faux positifs :grande sensibilité

l'un encadre l'autre

aux contaminations

PCR suivi d'une hybridation

Spécificité et sensibilité détection d'inhibiteur

PCR/RT-PCR | avec une sonde marquée puis ELISA réaction ELISA pour détection ( du Signal

PCR/RT.PCR RES

Inconvénients

Avantages

Matériel spécifique

à Plusieurs PCR enr ême temps Sur des séquences enchâssées

Amplification sas simultanée de plusieurs

ou non

Développement de la technique

genomes viraux,

|

Spécificité :détection d'un type de virus

PcRrr-ecr | Amplification d'une séquence

(ex Entérovirus). Très utile en depistage.

CONSENSUS

consensus à une même famille de virus

TE

Spécificité :Nécessite une technique plus spécifique pour identification d'espèce.

PCR/RT-PCR Amplification et lecture en temps | simultanée de la quantité d'ADN réel amplifiée

Quantitication, sensibilité, spécificité, rapidité. Détection d'inhibiteur Investisseme nt initial

Pour terminer deux écueils classiques de la PCR devront toujours resterà l' [qe][22]«æ) it du virologue ors de la validation des résultats.

+ Faux positifs: C'est le corollaire de la grande sensibilité de la technique. Un résultat faussement positif peut avoir des conséquences graves. Ceci impose de prendre de grandes précautions lors de la réalisation et le choix des techniques (système chimique préventif = L'extraction, l'amplification et la détection doivent être réalisées dans des pièces séparées et adaptées. Les témoins négatifs et les blancs sont systématiquement utilisés pour chaque manipulation.

70

2.

Techniques

d'identification usuelles

e Faux négatifs:Les conséquences d'un résultat rendu d'une manière faussement négative peut être tout aussi grave.

Ils ont pour causes : amorces inadaptées à la séquence virale (variabilité virale), mauvais prélèvement, problème d'extraction ou inhibition de l'amplification. Le choix des techniques, l'automaïüsation et l'utilisation de contrôle interne et/ou externe permettent de limiter le risque de faux négatits.

71

Bactériologie et virologie pratique

Diagnostic indirect: bactériologie et virologie

> Techniques immunologiques La recherche d'antigène est en général plus rapide et sensible que la culture virale. Elles permettent aussi la mise en évidence de virus non isolables en culture. La recherche d'anticorps généralement dans le sérum (sérologie) utilise entre autres les mêmes techniques

Tableau 2-7 : Techniques immunologiques Techniques

Principe

Immuno-enzymologie

Fixation des anticorps du patient sur des antigènes viraux et

je Western Blot où Immunoblot

évélation par une antiglobuline anti-1gG ou IgM marquée par une enzyme. = = a À Fixation des anticorps du patient sur différents antigènes viraux immobilisés sur une bandelette et révélation par une antiglobuline anti-IgG marquée par une enzyme, LEE

,

/

n

“

,

Inhibition de l'hémagglutination

Le sérum du patient réagit avec les virus en suspension bloquant l'interaction virus-globules rouges (uniquement pour les virus hémagglutinants).

Agglutnation

Agglutination du virus ou de particules couvertes d'antigènes viraux par le sérum du patient.

Immunofluorescence directe ou indirecte

Réaction de fixation ou déviation du complément Séroneutralisation

L'immunofluorescence directe (IF) consiste à détecter un antigène Viral grâce à un anticorps spécifique puis de révéler cette reconnaissance par une antiglobuline marqué par un fluorophore, En immunofluorescence indirecte la même technique est utilisée pour a — détecter un anticorps fixé sur un antigène spécifique grâce à un anticorps secondaire.

Le sérum du patient réagit avec l'antigène et fixe le complément | inhibant sa fixation sur un système hémolvtique. Inhibition de la multiplication d'un virus par incubation préalable à

(référence mais technique | l'inoculation avec le sérum du patient

lourde)

72

3.1 À GRAM POSITIF

BACTÉRIES

Noi .il

> Habitat Bactérie ubiquitaire Flore résidente de la peau de l'homme et des animaux. Transitoire dans les autres flores.

> Pouvoir pathogène e

Infections suppuratives : peau, tissu mou, muscle, 05, tractus respiratoire, valve cardiaque, tractus urinaire après manœuvre instrumentale. …, Infection sur matériel étranger.

°

Toxi-infection: dues à la synthèse de différentes toxines par certaines souches, —

[SST-1 (toxine du choc toxique staphylococcique)

—

_exfoliatine responsable du syndrome

—

_entérotoxines responsables de toxi-infections alimentaires ou d'entérocolites après sélection d'une souche productrice d'entérotoxines par l'antibiothérapie

de la peau ébouillantée

718

Bactériologie et virologie pratique

—

leucocidine de Panton-Valentine (LPV), responsable d'infections nécrosantes : lésions dermonécrotiques, pneumopathies nécrosantes communautaires chez les sujets jeunes immunocompétents d'évolution sévère (75% de létalité). Ces souches productrices de LPV sont plus fréquemment isolées en Afrique qu'en Europe : attention aujourd'hui de repérer ces cas cliniques, de faire confirmer la présence de cette toxine, pour limiter la diffusion de ces souches.

Les infections à S aureus résistants à la méticilline (SARM) occupent une place prépondérante dans les infections nosocomiales et font l'objet aujourd'hui de mesures standardisées de détection des porteurs et de prévention

> Echantillons biologiques Très nombreux. Tous les échantillons sont possibles.

> Diagnostic direct: e

Caractères morphologiques: Aspect Gram

Capsule ou spore

Mobilité

Coques en amas

e

Caractères culturaux:

ie

Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aëro-Anaërobie

Géloses nutritive, au sang, à l'acide nalidixique Gélose de Chapman

Colonies hémolytiques souvent Pigment jaune orangé Mannitol +

Certaines souches isolées plus particulièrement dans des infections chroniques (pulmonaires au cours de la mucoviscidose, osseuses, ..), ont des colonies plus petites «small colony variant » :

la croissance de ces bactéries est altérée, en raison d'une déficience d'une voie de biosynthèse (chaîne respiratoire ou chaîne métabolique). La difficulté est de reconnaître ces colonies «naines», qui poussent plus lentement, qui ne sont pas hémolytiques, qui peuvent être exigeantes en CO, et mannitol négatives sur Chapman.

+

Caractères enzymatiques et biochimiques: furanes

Coag libre

Coag

DNASE

liée

74

Polymyxine B

MAN

PYRA

12

3.1

Bactéries à Gram positif

> Diagnostic différentiel Caractères différentiels S aureus Autres Staphylocoques coagulase et/ou Dnase +

QEUt S. aUreus S. intermedius*

+

se +

S. Ayicus”

-

+

+

S. schlelfen coagulans’

+

Le

S. schleifen schlelfen

=

+

S. delphini” S. lutrae”

+ +

+

S. lugdunensis

-

S. Caprae*

-

SC CUS S o S. aUEUS anaerobius”

: Su à

ir

È

s

7

7.

-

-

+

+

-

+/-

+/-

-

=

à

Je

+

-

=

+/-

+

+

+ + + +

= = € É

=

+ + +

+/de

+ = =

+

Tnase = Dnase the CF = Clumping fac * = espèces d'origine animale,

-l+

partie des tests d'agglutination à

aureus

ane

us

est catalase

—, pousse en anaërobiose

> Sensibilité aux antibiotiques e

B-lactamines (3 phénotypes)

Molécule à tester: P, FOX 1 — Phénotype sauvage : LADA) 2 — Phénotype Pénicillinase 90 % des souches P < 29mm

ENT

Colonies « squatter » grosses colonies en bordure zone d'inhibition | —

AMC OX CF

Si P > 29 mm faire Nitroeéfin (test chromogénique)

nes

3 — Phénotype SARM 25 % des souches hospitalières Production PLP2a FOX < 25 mm ou MOX < 23 mm

P. AMX, AMC, OX, CF

si FOX compris entre 27 et 25 mm si résistances associées : Fluoroquinolones, Aminosides,

confirmer R à OX par : agglutination PLP2a ou gène mec par PCR

75

ci

Profil SRAM

Bactériologie

e

et

virologie

pratique

Aminosides (4 phénotypes)

Molécule à tester: GM, TM, K GM = NET et K =AN

1 — Phénotype sauvage

né

2—SiGM:R

Dé

Profil de SARM 3-SiGM:SetTM:R,K:RousS Profil de SARM 4—SiGM,TM:Set K:R e

GM, NET, TM, AN

A 4

Macrolides — Lincosamides — Streptogramines

Molécules à tester : E, L, PT et L = CLI 1 — Phénotype sauvage

6

2=SIiE:Retl, PT:S MLSB inductible antagonisme E/L R à Let SB induite par E LCR lMRETEIRS

=

+

MLSB constitutif AS RES EMA PIER

+

°

Glycopeptides

Molécules à tester : VA, TEC 1 — Phénotype sauvage

Fe

2 — GISA si VA, TEC < 1/7mm, si TEC < VA de 3mm si en milieu liquide VA ou TEC = | faire CMI VA, TEC CMI critiques 4-8mg/

ma

76

VA, TEC ICE

A renvoyer au CNR

3.1

e

Bactéries à Gram

Fluoroquinolones

Molécule à tester : OFX ou LEV 1 — Phénotype sauvage

T4

OFX, LEV

2—si OFXouLEV:IouR Profil de SARM

ae

OFX, LEV

°

Autres antibiotiques à tester

RA, FOS, FA, SXT, TET, LI

CNR des Staphylocoques (Groupement hospitalier Est, centre de microbiologie et pathologie, institut de microbiologie, université Claude Bernard Lyon 1, 69437 Lyon Cedex3

toi

positif

Bactériologie et virologie pratique

Coques à Gram + : Staphylocoques à coagulase négative (SCN)

> Habitat

S

Bactérie ubiquitaire, Flore résidente de la peau de l'homme et des animaux. Transitoire dans les autres flores.

> Pouvoir pathogène °

Infection urinaire chez la femme jeune: S saprophyticus

° Infections nosocomiales : survenant sur du matériel étranger. La mise en place de plus en plus fréquente de matériel va favoriser la survenue de ce type d'infection: infection de cathéter ou sondes, de matériel prothétique en traumatologie, en cardiologie (valves cardiaques, Pace-maker), en diabétologie (pompe à insuline), …

S. epidermidis reste l'espèce majoritaire (forme des biofilms) suivi par S. haemolyticus.

> Echantillons biologiques Très nombreux. À identifier dans les échantillons normalement stériles :hémocultures, cultures d'embouts de cathéter, de prélèvements per-opératoires en traumatologie, en chirurgie cardiovasculaire, …

78

3.1

Bactéries à Gram positif

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect Gram

Capsule ou spore

Mobilité

Coques en amas

e

+

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aëro-anaérobie

Géloses nutritive, BCP, au sang, à l'acide nalidixique Gélose de Chapman

Colonies blanches Hémolyse ou non selon l'espèce Mannitol v

Caractères enzymatiques et biochimiques:

OX

car

fur nes

Coag libre

bjyse

Coag liée

myxineB

©

-

V

V

S/

+

Poÿ-

AN V

PyrA

wp

V

V

> Diagnostic différentiel Caracteres différentiels des SCN isolés chez l'homme

URE S. epidermidis

S. haemolyÜCUus

PAL

Li

-

%

PyrA

ADH

à Tréhaice

VP

ODC

Pi

-

se

:

je

=

-

+

+

+

+

-

-

VOTRE

(ME

-

-

-

"

Fe

S. pulveri

-

=

=

2

Fe

:

|_S. capitis

-

ae

”

3

F2

S schleiferi 7 schleiferi E

© cohni urealyücum

. RES

=

“ ë sx

V


Pouvoir pathogène Le plus souvent transmission alimentaire. Infection si le système immunitaire est perturbé :soit naturellement soit après une maladie ou un traitement.

e _Listériose materno-fætale: Chez la femme enceinte, selon l'âge de la grossesse | y a avortement ou naissance d'un enfant infecté. La symptomatologie chez la mère est très peu parlante:simple état pseudo-grippal avec fièvre. Chez le nouveau-né :forme septique précoce et forme méningée aiguë plus tardive (4-10 jours).

111

Bactériologie et virologie pratique

+

_Listériose de l'adulte:

Formes septicemiques pures

Formes neuro-méningées :méningo-encéphalites ou encéphalites pures de diagnostic difficile Formes localisées très rares: hépatites, pleurésies, ostéomyélites, arthrites, péritonites, endocar dites Y

Echantillons biologiques

e

Femme enceinte: hémocultures essentiellement

°__

Après l'accouchement d'un enfant infecté ou après avortement: prélèvement vaginal ou lochies

e

Nouveau-né: placenta, liquide gastrique, oreille, hémoculture, LCR, méconium.

°

Adultes: hémocultures, LCR (aspect panaché du liquide avec polynucléaires et lymphoCVIES), PUS.

Porteurs sains transitoires :selles (non recherché).

> Diagnostic direct: e

Caractères morphologiques : Aspect gram

Capsule ou spore

Petits bacilles

Non capsulés, non

. réguliers isolés

spôrulés

e

Mobilité

| Immobiles à 37°C, Mobiles à 22°C

ü

Caractères culturaux:

+

Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aëro-Anaerobie

Géloses nutritives, au sang, à l'acide nalixidique et aussi milieux Dillés ou hypersalés

Aspect colonie Colonies hémolytiques. Zone étroite d'hémolyse complète, majorée par Slaphylococcus aureus = camp test

Caractères enzymatiques et biochimiques:

OX

CAT

GLU

ESC

VP

IND

URE

H2S

GEL

MAN

RHA

XYL

NI

— Caractères antigéniques: sérovar selon antigènes somatiques (15) et flagellaires (5). 1/2a, 1/2b, et 4b surtout, 142

3.1

Bactéries à Gram positif

L.monocytogenes a des antigènes communs avec les Streptocoques et Enterococcus faecalis.

— Pouvoir pathogène expérimental : virulence pour la souris (septicémie mortelle), le cobaye et le lapin (conjonctivite purulente après instillation conjonctivale = test d'Anton).

> Diagnostic différentiel Avec les autres bacilles Gram + :

Bacillus sont sporulés, oxydase + Corynebacterium sont des bacilles irréguliers, groupés en paquet, immobiles. Lactobacillus ont une pousse plus lente et catalase —,

Erysivelothrix sont catalase —, H2S +. Avec des colonies très comparables : Streptococcus agalactiae B (Ag commun), Enterococcus: cocci catalase —,

Avec les autres espèces de Lister.

> Diagnostic indirect Sans intérêt si le germe est isolé. Recherche des anticorps anti-listériolysine O (anti LLO).

> Sensibilité aux antibiotiques Phénotype sauvage:

e

B-lactamines

L. monocytogenes est naturellement R aux céphalosporines Par contre est toujours sensible à l'amoxicilline et l'imipénème : l'activité est bactériostatique,

e autres antibiotiques Sensibilité aux aminosides, glycopeptides, timéthoprime-sulfaméthoxazole, rifampicine. Résistance naturelle : clindamycine, fosfomycine. CNR - Centre

National de Référence des Listera Groupe micro-organisme et barrière de l'hôte Institut Pasteur Laboratoire des Listeria 25-28 Rue du Dr Roux — 75 724 Paris Cédex 15

113

Bactériologie et virologie pratique

Bacilles Gram +

> Habitat zactérie de l'environnement: terre, végétaux, eaux. Importance de la résistance des spores :champs contaminés par cadavres d'animaux.

> Pouvoir pathogène e

B.cereus —

Toxi-infections alimentaires collectives apres ingestion d'aliments contaminés, Deux types de toxines entraînant un syndrome diarrhéique ou émétique

—

Infections des tissus mous: plaies traumatiques.

—

Infections oculaires: port de lentilles

—

Infections systémiques :septicémies sur terrain immunodéprimé. B. cereus peut contaminer poches de sang. Facteurs de virulence :nombreuses toxines (phospholipases, hémolysines, protéases, entérotoxines), pouvoir nécrotique. e

B.anthracis

—

Forme cutanée: papule rouge évoluant vers une vésicule noirâtre

114

3.1

Bactéries à Gram positif

—

Forme pulmonaire: par inhalation de spore, peut évoluer vers une forme septicémique mortelle

—

Forme digestive: par ingestion de spore (viande contaminée mal cuite), diarrhée Sanglante, septicémie.

Maladie professionnelle :par contacts avec animaux (éleveurs, vétérinaires) et par contacts avec produits contaminés poudre d'os, laine….

Bactérie de la liste des bactéries de guerre biologique :depuis 2001 plusieurs laboratoires en France sont labellisés centres de compétence pour la réalisation d'un diagnostic rapide par PCR, Classe de Risque NSB3,.

> Echantillons biologiques Prèlèvements de plaie, oculaires, sécrétions bronchiques Hémoculture Prélèvements d'environnement

> Diagnostic direct: °

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Bacilles trapus En chaînes dans les Spore ovalaire prélèvements pour | B anthracis: capsulé B. anthracis

e

Mobilité B. cereus: + Banthracis: —

ce Peut se décolorer

Caractères culturaux: Type respiratoire

Aéro-Anaerobie

Géloses permettant la pousse

Géloses ordinaires

"ep

ect coloni

a

Colonies de grande taille Contour irrégulier, mate large zone d'hémolyse pour B. cereus

Bactériologie et virologie pratique

e Caractères enzymatiques et biochimiques: Très proches pour ces 2 espèces de Bacilus (0)4

CAT

Gélatine

VP

Citrate

4

h

#

4

+

hémolyse

Pénicilline G

mobilité

B. cereus B. anthracis

| -/+ faible 48h

|

S

il

-

=

> Diagnostic différentiel Caractères différentiels avec autres Bacillus

Par une galerie complète avec étude de la fermentation des hydrates de carbone API5OCH, ou par PCR ;

> Sensibilité aux antibiotiques e f-lactamines B. anthracis est S aux f-lactamines B. cereus est R à la pénicilline G, amoxicilline et peu sensible aux céphalosporines, ° - Fluoroquinolones La ciprofloxacine est active et recommandée dans le traitement

°

Aminosides, Glycopeptides, Lincosamides : actifs

CNR de Référence du Charbon Unité des toxines et pathogénie bactérienne Institut Pasteur 25-28 Rue du Dr Roux 75 724 Paris Cédex 15

116

|

3.2 BACTÉRIES À GRAM NÉGATIF >

a

CocciàGram-

|

Neisseria meningitid

NSB:/[ID0], ee,

©

O2, Cult

>Habitat Bactérie strictement humaine :rhinopharynx. 5 à 10 % porteur sain. Transmission par voie aérienne lors de contacts directs.

> Pouvoir pathogène ° e__ e e e e ° Le

Méningite cérébrospinale Septicémie: avec purpura fulminans Infections respiratoires Infections génitales Infection articulaire Péricardite Conjonctivite pronostic dépend de la précocité de la prise en charge du patient pour les formes sévères 14

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques Liquide céphalorachidien

Hémoculture Lésion cutanée purpurique Sécrétions bronchiques

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore Capsule polysaccharidique :

Cocci en diplocoques, faces aplaties

e

Mobilité

12 sérogroupes non sporulé

Caractères culturaux:

Type respiratoire Aérobie strict

Géloses permettant la pousse Géeée Ér

EE

Pousse favorisée par le CO, +

Aspect colonie grisètre, à bords irréguliers,

de 0,5 à 1 mm de diamètre.

Caractères enzymatiques et biochimiques:

(0)

Cat

glucose

maltose

YGT

ONPG

évulose, saccharose : -

+

Détermination du sérogroupe:

Doit être réalisé rapidement pour la mise en route d'une vaccination chez les sujets contacts pour les sérogoupes C et À: technique d'agglutination (kits commerciaux) à partir de colonies soit sur gélose chocolat, soit sur gélose Muller Hinton. Sérogroupe B le plus fréquent en France, suivi des sérogoupes C et W135. Les autres sérogroupes À, Y, X, Z, 29E H, |, K, L sont plus rares. 118

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Diagnostic différentiel Avec Neisseria subflava: autre espèce glucose+, maltose+ mais non agglutinable

> Autres méthodes de diagnostic Recherche d'antigènes solubles dans le LCR, sérum. Amplification génique (PCR) directe à partir du LCR, Ces méthodes déterminent le sérogroupe

> Sensibilité aux antibiotiques Sur Gélose Muller Hinton au sang, inoculum Mac Farland 0,5

B-lactamines Détermination des CMI des B-lactamines (péniciline G, amoxiciline, céfotaxime, ceftriaxone) : concentrations critiques de la pénicilline G 0,06-1 mg/L, de l'amoxicilline 0,25-2 mg/L et de céfotaxime et ceftriaxone :0,12 mg/L. ©: Les antibiotiques utilisés en prophylaxie seront testés: rfampicine, ciprofloxacine (CMI critique 0,03-0,06mg/L).

> Déclaration obligatoire Toute souche doit être déclarée à la DDASS et doit être envoyée au CNR. Ce Centre étudie toutes les souches sur le plan épidémiologique avec étude des sérotypes, sous-types, analyse des iso-enzymes, et détermination du complexe clonal. Cette surveillance en liaison avec l'INVS permet de lancer des vaccinations de masse :sérogroupe C, A et excep-

tionnellement sérogroupe B

Centre national de référence des Méningocoques, Unité des infections bactériennes invasives, Institut Pasteur, 25 —28 Rue du Docteur Roux.

1nIE)

Bactériologie et virologie pratique

Cocci à Gram-

NSB:, ee,

ue

0, Cuit+

Photo CDC Atlanta/Dr. Norman Jacobs

> Habitat” Bactérie strictement humaine, pathogène strict obligatoire.

> Pouvoir pathogène °

Infections génitales: —

chez l'homme urétrite (blennorragie) le plus souvent symptomatique, complications épididymite, prostatite rare.

—

chez la femme: symptomatologie à bas bruit, infection de l'endocol avec urétrite, pouvant évoluer vers une salpingite, pelvipéritonite avec risque de stérilité.

+

Infections disséminées: polyarthalgies, septicémie, endocardite

+

Infections anorectale et pharyngée (IST)

+

Infection néonatale :au moment de l'accouchement risque de transmission, conjonctivite du nouveau-né.

120

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Echantillons biologiques Génitaux : —

chez l'homme: urétral, marge anale

—

Chez la femme: endoco!, urétral, glandes Skène et Bartholin, endomètre, trompes, marge anale.

Prélèvement pharyngé, Hémoculture, liquide articulaire,

Prélèvements périphériques du nouveau-né

> Diagnostic direct: +

+

+

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou Spore

Cocci en diplocoques, faces aplaties

Non capsulés, non sporulés

Mobilité

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect coloniel

Aërobie strict Exigeant en CO,

Gélose chocolat isovitalex Gélose chocolat sélective Culture lente (3-4 jours)

grisâtre, brillante ou mate, à bords irréguliers, de 0,5 à 1 mm de diamètre.

Caractères enzymatiques et biochimiques: Glucose

| Prolinearylamidase

maltose, lévulose, saccharose :—, yat: -

> Diagnostic différentiel Avec les autres Neisseria: seule espèce à être glucose+, maltose — et prolinearylamidase + Pour des souches atypiques (glucose -), le diagnostic différentiel se pose avec Neissera cinerea: N. gonorrhoeae est résistant à la colistine contrairementà M cinerea. Avec Kingella denitrificans qui présente les mêmes caractères biochimiques :cette espèce est catalase — et coccobacillaire.

Bactériologie et virologie pratique

> Sensibilité aux antibiotiques Sur Gélose chocolat polyvitex, inoculum Mac Farland 1

+

f-lactamines

Déterminer les CM: concentrations critiques de la Péniciline G 0,06-1 mg/L, de l'amoxiciline 0,25-2 mg/L et de la ceftriaxone ($ si 4mg/L. e Aminosides La spectinomycine, aminoside strictement réservé à cette espèce doit être testée (S si CMI < 64mg/L) ° Fluoroquinolones La résistance aux fluoroquinolones est évaluée dans un premier temps avec un disque d'acide nalidixique:si le diamètre est inférieur à 25mm faire les CMI (concentrations critiques ofloxacine 0,12-0,25 mg/L, ciprofloxacine 0,03-0,06 mg/L).

CNR Gonocoques Institut Alfred-Fournier

\

25 Boulevard Saint-Jacques 75 014 Paris

122

3.2

Cocci à Gram-

NSB;, e,

| Branhamella catarrhalis

pi Cult:

» Pouvoir pathogène e e

Bactéries à Gram négati

Infection bronchopulmonaire Otite, Sinusite, Infection oculaire

> Echantillons biologiques Sécrétions bronchiques Ecoulement oreille Pus de sinus

1123

Bactériologie

et virologie pratique

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Coccobacille

e

Caractères culturaux:

Géloses permettant

L'RCS UE

Gélose au sang, Gélose chocolat Culture lente (3 jours)

Aérobie strict Non exigeant en CO,

+

Aspect colonie E

la pousse

Colonies blanchâtres,

non hémolytiques

Caractères enzymatiques et biochimiques: (0)

Cat

DNAse

Tributyrine

3

+

+

Hydrolyse

> Diagnostic différentiel Avec les Nerssera par le caractère asacharolytique

> Sensibilité aux antibiotiques + f-lactamines: de très nombreuses souches (80%) possèdent une B-lactamase hydrolysant l'amoxicilline, inhibée par l'acide clavulanique. Le test nitrocéfin doit être réalisé. Les céphalosporines de 3°génération restent actives,

+

Autres antibiotiques actifs :macrolides, tétracyclines, fluoroquinolones, cotrimoxazole.

124

3.2

Bactéries à Gram négatif

NSB:;, [bol ED,

0>, Cult:

Klebsiella

Shigella

125

Bactériologie et virologie pratique

Salmonella

> Habitat Bactéries commensales du tube digestif de l'homme et des animaux, retrouvées également dans l'environnement.

> Pouvoir pathogène +

Infections sévères spécifiques sont à déclaration obligatoire.

Fièvres typhoïdes :Sa/monella Typhi (NSB3) et Paratyphi Salmonelloses majeures: réservoir malades et porteurs chroniques (lithiase vésiculaire). Contamination directe et indirecte (eaux souillées) Dysenterie bacillaire :Shigella dysenteriae type 1 Bactérie invasive :Shiga-toxine Peste: Yersinia pestis (NSB3) Pouvoir pathogène :Peste bubonique et Peste pulmonaire

Foyers de peste en Afrique, Amérique USA (13 états, écureuils), Asie, Russie Possibilité de cas importé

aladie réémergente :augmentation du nombre de cas rapportés à l'OMS depuis 1990, Existence de souches multrésistantes aux antibiotiques (streptomycine, chloramphénicol, étracycline) à Madagascar, En Inde épidémie en 1994 : peste pulmonaire. Chaine de transmission indirecte rongeur-puce-rongeur et directe peste pulmonaire Peste endémique pour les professions exposées 126

3.2

Bactéries à Gram négatif

Adénite mésentérique : Yersinia pseudotuberculosis Ozène, Rhinosclérome : Xlebsiella ozenae, K. rhinoscleromatis °

Gastroentérites

Salmonella mineures : Responsable de TIAC Réservoir animal : bovins, ovins, volailles et réservoir humain Contamination directe et indirecte par des aliments contaminés (viandes, œufs...) Bactéries entéropathogènes invasives, septicémies possibles Antbiothérapie : pas toujours nécessaire Shigella flexneri, S. sonneï: bactéries entéroinvasives Yersinia enterocolitica : 6 biotypes et plusieurs sérogroupes, le biotype TA n'est pas pathogène; les autres sont impliqués en pathologie humaine, entérotoxine et bactérie invasive. Contamination par alimentation (viande de porc...)

Escherichia coli différents pathovars Entérotoxinogènes = ETEC Turista, entérotoxines Entéropathogeènes = EPEC gastroentérites infantiles Entéroinvasifs = EIEC diarrhées invasives Entérohémoragiques = EHEC colites hémoragiques avec complication de SHU (syndrome hémolytique et urémique), épidémies possibles (aliments contaminés). ®

Infections urinaires Primitives : Escherichia coli, Proteus mirabilis

Secondaires chirurgie, sondage : Serrata, Enterobacter … e

Autres infections nfections d’origine digestive : péritonite, hépatobiliaires nfections respiratoires postinhalation, nosocomiales jons postopératoires chirurgie digestive, gynécologique nfections cutanées: ulcères

ons osseuses jons néonatales :Escherichia coli antigène capsulaire K1 e

Dissémination de ces infections :septicémie, choc endotoxinique

> Echantillons biologiques Coproculture, Hémoculture, Urine .….Tous les échantillons Prélèvements d'environnement

127

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Non sporulé,

la plupart mobile à

,

Gram

Mobilité à 22°C: Hafniae alvei, Yenterocolitica, Ÿ pseudotuberculosis immobile :Kebsiella, Shigella °

Caractères culturaux: Type respiratoire | Géloses permettant la pousse

Aëéro-Anaërobie

Géloses ordinaires

Aspect colonie Colonies bombées, lisses, rondes, Bords réguliers 1,5 à 3 mm Avec particularité selon les espèces Partois hémolytiques

Milieux utilisés : BCP (gélose lactosé au bromocrésol pourpre), CLED, Drigalski lactose et bleu de bromothymol Sélectifs :DCL, Hektoen, Rambach, CIN (Voir coproculture) £ Colonies fines : Yersinia, pousse mieux à 28°C Calonies muqueuses Xebsiella, certaines souches de E.col, Salmonella Colonies naines £.coli déficients exigence en thymidine Pigmentation surtout sur milieu exempt de sucre fermentescible es Jaune : Enterobacter Sakazaki, Pantoea agglomerans, Rose-Rouge : Serratia rubidea, quelques Serratia marcescens +

Caractères enzymatiques et biochimiques des entérobactéries Glucose avec

Nitratase

Comprimé vibriostatique 0129

Les exceptions Catalase —: Shigella dysenteriae Fermentation glucose sans gaz: Sa/monella Typhi, Shigella (sauf S flexneri 6, S boydif 4), Klebsiella rhinoscleromatis, Yersinia pestis, Yenterocolitica, Ÿ pseudotuberculosis.… .

128

3.2

*

Bactéries à Gram négatif

Caractères principaux d'identification des espèces

Lactose, ONPG, H,S, VP APP Citrate, Urée, Indol, LDC, ODC sont les principaux tests. Ils se réalisent en galeries miniaturisées ou avec les automates, Pour interpréter une galerie:s'assurer de la pureté de l'isolement, des caractères d'une entérobactérie. Lactose + ou lactose — ONPG +

H,S

Indol

VP

Citrate

urée

Citrobacter freunat

Escherichia coli

Cltrobacter kosern pe Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter autres Serratia marcescens

Hafniae alvel

+

Lactose — et ONPG — ou + ODC Proteus mirabilis Providencia stuarüi

Morganella morgani' Salmonella entenñca

Salmonella Tyohi Shigella dysenterae

Shigella sonne! Shigella autre |Yersinia enterocolitica

129

urée | citrate

ONPG

Bactériologie et virologie pratique

*

Caractères antigéniques

—

Tests complémentaires d'agglutination pour sérogrouper une Sa/monella et donner un nom : étape d'identification antigénique indispensable, Le sérovar est donné par la formule antigénique. 2 types d'antigènes à la base de ce sérogroupage : Antigène somatique O, Antigène flagellaire H

Plus antigène Vi pour S. Typhi. La nomenclature complète : Sa/monella enterica enterica Typhi

La nomenclature simplifiée ne tient compte que du sérovar: Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis — Tests complémentaires d'agglutination pour confirmer une identification biochimique de Shigella

> Diagnostic différentiel Métabolisme fermentatif oxydase +: Vbrionaceae (Aeromonas, Vibnio) exigence nutritive, immobile :Pagteurella, Haemophilus

Métabolisme non fermentatif, aérobie strict oxydase+ : Pseudomonas, Favobacterium, … oxydase —: Stenotrophomonas, diplobacille immobile :Acinetobacter

130

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Sensibilité aux antibiotiques Tableau 3-1: Entérobactéries du Groupe 1 Phénotype Sensible (E .col, P mirabilis, Salmonella Sop., Shigella spo) Pase Bas/Haut niveau

Phénotype

sauvage

Case (ee)|) Bas/Haut

BLSE

niveau

Ampi, Amoxicilline Amoxi+A.clavulanique Ticarciline Piperilline

Piper-- Tazobactam

XD

(ep)=m5)

=ù)

Mess) UM =

CHAICAICOAINCDECN:

Céphalosporines : 1° Céfalotine 2° Céfamand

26h27

AE

Céfoxitine, Céfotétan _

3° Céfotaxime Ceftriaxone Ceftazidime 4° Céfépime Céfixime

Imipénème, Ertapénème

US) EN M DE NEC CONCELCPLIC

NCA CON INICERCONCPHECHECPUNCENN CRETE

Tester obligatoirement le céfixime dans les infections urinaires :ne pas répondre sur le résultat du cefotaxime

Salmonella Typhimurium: Phénotype de type résistant aux inhibiteurs correspond le plus souvent à une carbeniciliräse (Carb-2) : souche épidémique Lysotype DT104 Attention aux BLSE pour Proteus mirabils Evolution : BLSE : Apparition de nouvelles enzymes hydrolysant les Céphalo Ill: (E. col CTX-M, MEN-1, Salmonella PER-1)

Acquisition de Céphalosporinase plasmidique chez E.col, S enteritidis, K. pneumoniae, P mirabilis Oxacillinases :résistantes aux inhibiteurs :E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae, …

131

Bactériologie et virologie pratique

Tableau 3-2: Entérobactéries Groupe 2 Phénotype Pénicillinase bas niveau (K.pneumoniae, K. oxytoca, C. kooseri(diversus), C. amalonaticus, Escherichia hermani) Phénotype SETIET TE Pase Bas niveau

Pase Haut niveau

BLSE

Hyperproduction Pase K.oxytoca

Ampi, Amoxicilline Amoxi+A.clavulanique

R

Ticarcilline Piperilline Piper+ Tazobactam Céphalosporines : 1° Céfalotine 2° Céfamand Céfoxitine Cétotétan

3° Céfotaxime Ceftriaxone Ceftazidime 4° Céfépime Céfixime Atreonam

Imipénème, Ertapénème

Mise en évidence de la pénicillinase hyperproduite de X oxytoca: Diamètre de Céfotaxime > Ceftriaxone et Ceftazidime > Aztreonam

Synergie Augmentin avec Céfotaxime, mais pas avec Ceftazidime Diamètre de Céfoxitine > ou =Céfotaxime

Evolution: Xebsiella preumoniae apparition de nouvelles enzymes IRT

Oxacillinases :résistantes aux inhibiteurs :K pneumoniae: activité modérée des CAG Nouvelles enzymes :céphalosporinases acquises CMY, MIR, BI, FOX, Carbapénémases sensibles aux inhibiteurs X. pneumoniae, K . oxytoca: KPC

132

3.2

Bactéries à Gram négatif

Tableau 3-3: Entérobactéries Groupe 3 Céphalosporinase inductible (Enterobacter Serrata,, Morganela, Providencia(stuartirettger), Hafniae alvei, Citrobacter freunali, Pantoea agglomerans) Phénotype sauvage Case inductible

Case déréprimée

Pase Haut

BLSE

niveau Ampi, Amoxicilline

R R//S

Amoxi+A.clavulanique

Ticarcilline

R

R

R R

R S ou R

R

Piperilline Piper+ Tazobactam Céphalosporines : 1° Céfalotine 2° Céfoxitine Céfotétan

S S ou R

3° Céfotaxime Ceftriaxone Cefazidime 4° Céfépime

R/|

R/|

A7treonam

Imipénème, Ertapénème

CHNINCPMINCONEAIUINE?

COANCONICONCONENDTC®

Résistance naturelle Cefoxitine :£. cloacae, E. aerogenes, C freundii, M. morgani, Serrata marscecens Mise en évidence de BLSE ou Céphalosporinase déréprimée: attention avec les automates quand CMI C3G >1mg/ Couler une boîte à la Cloxaciline 500mg, Ensemencer un MH ordinaire et la boite à la cloxacilline (inhibiteur de céphalosporinase)

Mettre les disques” CTX, CAZ, ATM, FEP et au centre AMC Si céphalosporinase déréprimée :Diamètres CTX, CAZ, ATM > sur la boîte cloxacilline par rapport au MH ordinaire

Si BLSE les diamètres de CAZ et CTX sont souvent différents les images de synergie AMC — CTX, CAZ, FEP, ATM sont plus nettes sur la boîte à la cloxacilline:attention BLSE fréquente chez E. aerogenes Nouvelles BLSE: type CTX-M E. cloacae

Evolution :2 types carbapénémases

133

Bactériologie et virologie pratique

S aux inhibiteurs test de synergie AMC/IMP Difficile à mettre en évidence faible expression (NMC-A, SME, IMI, KPC..) Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, R aux inhibiteurs mais sensible à EDTA, résistance souvent associée aux aminosides, aztréonam reste actif (IMP VIM ...) Serratia La résistance à l'imipénème pour ce groupe est souvent due à l'accumulation de plusieurs mécanismes : imperméabilité + hyperproduction céphalosporinases

+

f-lactamines

1 — Phénotype sauvage: 5 groupes Toutes les espèces sont: ANA

a — Phénotype sensible Groupe 1 Salmonella, Proteus mirabilis, Shigella, Escherichia coli

Re

AMX, AMC TIC, TCC, PIP, PTZ CF CTX, CAZ

ES

Kebsiela | Citrobacter Koseri

RE DUR CUS

c — Phénotype céphalosporinase bas niveau Groupe 3 Enterobacter, Serratia: Citrobacter freundii Morganella, Hañiae

AMX, AMC, CF TIC, TCC, PIP PTZ CTX, CAZ

Providencia.…

d — Phénotype pénicillinase et céphalosporinase bas niveau Groupe 4 Yersinia,

RD .

Serratia fonticola e — Phénotype céfuroximase Groupe 5 Proteus vulgaris Proteus penneri

134

AMX, CF AMC, TIC, TCC, PIP, PTZ (CD 071V4

Bactéries à Gram négati |

2 — Phénotypes de résistance acquise :

production de B-lactamases a — Phénotype pénicillinase :bas et haut niveau Fréquent pour E.coli, P mirabilis Haut niveau pour le groupe 2

Selon niveau d'expression, la récupération par les inhibiteurs (a. clavulanique, tazobactam), est variable

b — Phénotype pénicillinase R aux inhibiteurs Les uréidopénicillines peu touchées, la céfalotine reste active, aucune action des inhibiteurs

CTX, CAZ

c — Phénotype fB-lactamase à spectre étendu : BLSE Diamètre CTX, CAZ diminué

CMI CTX, CAZ >1mg/l

Mise en évidence : - Synergie AMC/CIIG :bouchon de champagne Rapprochement ou éloignement des disques CIIIG / AMC - Pour bactéries avec céphalosporinase, faire test synergie sur Boîte à la cloxacilline (250mg/l) pour inhiber céphalosporinase - Etests, disques de CIIIG combinés avec a.clavulanique Toutes les entérobactéries : en augmentation pour LE. Coli (type CTX-M d'origine communautaire)

—

ADSRLORALA OS CTX, CAZ, FEP : R/ AMC, PTZ : S///R

Bactériologie et virologie pratique

d — Phénotype céphalosporinase déréprimée pour groupe 3 et acquisition céphalosporinase pour groupe 1 et 2

Augmentation des CMI des CG Récupération par la cloxacilline

AMX, AMC, TIC, PIP, PTZ CTX, CAZ, ATM : R/| FEP: S/. R

FEP peut rester active

Pour E. coli attention au cefixime (à tester si profil de céphalosporinase)

e — Phénotype pénicillinase hyperproduite pour X. oxyloca Augmentation des CMI des CIIIG synergie AMC/CTX, ATM pas de synergie avec CAZ CTX>CRO et CAZ>ATM

AMX, AMC, TIC, PIP.PTZ CTX, ATM, CRO : R/

E

f— Phénotype d'imperméabilité à Ertapénème Toujours tester ertapénème pour une entérobactérie

f = Phénotypes de résistance aux carbapénèmes Le mécanisme le plus fréquent est une accumulation de mécanismes de résistance :

Toutes les bétalactamines

E. cloacae, $. marcescens

Très rare carbapénémase :

AMX, AMC, PIP, PTZ CTX, CAZ, FEP ATM

de type S aux inhibiteurs : Synergie possible AMC : IMP

IMP:/R NAS pour carbapénémase S à DTA

de type S à EDTA

Les souches d'Entérobactéries résistantes à l'imipénèm e sont exceptionnelles et sont à déclarer au CLIN

136

Bactéries à Gram

*

Aminosides

Molécule à tester :GM, NET, TM, AN 1 — Phénotype sauvage KEY oaut Providencia EYE ANA 2 — Phénotypes de résistance acquise

NET, TM, AN AAC6 : attention BLSE

NET,—AN GM, NET, TM, AN *

Fluoroquinolones

Molécule à tester: NAL, NOR, OFX, CIP 1 — Phénotype sauvage A2

612

2 — Phénotypes de résistance acquise

NAL NOR, OFX, NAL, NOR, OFX, CIP NAL, NOR, OFX, CIP °

Autres antibiotiques à tester

FOS, SXT, FU

Proteus — Providencia — Morganella :

Tigécycline :antibiotique récent peut être actif

137

négatif

Bactériologie et virologie pratique

CNR Escherichia coli et Shigella Laboratoire des Bactéries Pathogènes Entériques 25-28 rue du Dr Roux 75 724 Paris Cedex 15

CNR Salmonella Institut Pasteur Laboratoire des Bactéries Entériques 25-28 rue du Dr Roux 75 724 Paris Cedex 15

Laboratoire associé Hôpital Robert Debré Service de Microbiologie 48 Bd Serrurier — 7/5 019 Paris

CNR Peste et autres yersinioses Institut Pasteur — Unité des Yersinia 25-28 rue du Dr Roux 75 724 Paris Cedex 15

138

Pathogènes

3.2

Bactéries à Gram négatif

Bacilles Gram -

Ancien nom = bacille de Pfeiffer car Pieiffer en faisait l'agent de la grippe or c'est un agent de Surinfection. Espèce type du genre Haemophilus (16 espèces dans ce genre).

> Habitat Bactérie strictement humaine. Bactérie commensale des voies aériennes supérieures, plus rarement au niveau du tractus génital et de la conjonctive.

> Pouvoir pathogène 2 types d'infections: —

infection aiguë, provoquée par les souches capsulées de sérotype b, invasives: méningite (purulente chez l'enfant de moins de 3 ans laissant souvent malgré un traitement bien conduit des séquelles neuro-sensorielles), épiglottite (associée à une septicémie), pneumopathie, péricardite, cellulite, infection ostéoarticulaire chez les jeunes enfants. Ces infections sont en très nette diminution depuis la mise en place de la vaccination (1992).

139

Bactériologie et virologie pratique

—

les infections dues aux souches non capsulées :pneumopathie chez des patients avec maladies sous-jacentes (bronchite chronique, grippe, mucoviscidose), otite, sinusite, conjonctivite, infection néonatale, infection génitale.

>» Vaccination

;

|

L'immunité naturelle contre H. influenzae capsulée est de type humoral : Ac anti-capsule. Vaccin avec la fraction polysaccharidique de Haemophilus influenzae de type b: le polyribosyl‘ibitol-phosphate (PRP) conjugué à l'anatoxine tétanique pour améliorer la réponse vaccinale.

> Echantillons biologiques — sécrétions bronchiques et prélèvements de la sphère ORL — hémocultures, LCR, suppuration profonde — prélèvements génitaux, prélèvements de nouveau-né.

> Diagnostic direct +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore Capsulés pour les soughes invasives,

Bacilles très fins, petits

°

+

Mobilité

non sporulés

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aéro-Anaërobie (culture favorisée par CO),)

Géloses sang cuit (chocolat + polyvitex). Culture discrète sur gélose au sang. Exigence en facteur X (hémine) et V (NAD).

Colonies fines parfois muqueuses, non hémolytiques

Caractères enzymatiques et biochimiques:

CAT)

| ONPG | GLU

XYL

Les biotypes sont différenciés avec l'indol, l'urée et l'ODC

140

PORPHYRINE

3.2

Bactéries à Gram négatif

Sérotypage par agglutination : 6 sérotypes de a à f pour les souches capsulées, le b est le plus virulent. Ce sont des Ag polysaccharidiques.

> Diagnostic différentiel Avec les autres petits bacilles gram —: par l'exigence en facteurs X, V.

Avec les autres Haemophilus :par les facteurs X et V. l'indol, l'urée, l'ODC.

> Autre méthodes de diagnostic Recherche des Antigènes solubles dans LCR, sérum.

> Sensibilité aux antibiotiques Sur gélose chocolat

+

B-lactamines

1 — Phénotype sauvage IAA

RE pe

1 — Phénotype de résistance acquise a — B-lactamase plasmidique non inductible (test nitrocefin +) :

P, AMX, AMC, CF, CTX, b — Modifications de PLP: rarement. Bas niveau de résistance à toutes les B-lactamines (disque ampiciline à 2 ug: diametre < 20mm ou disque de céfalotine à 30 ug': diamètre < 1/mm). S'assurer qu'il n'y a pas de sphéroplastes (formes globuleuses) dans le diamètre d'inhibition.

°

Fluoroquinolones

Phénotype sauvage : Tester avec disque à. nalidixique 30 ug, si diamètre < 21mm, faire CM: ofloxacine, ciprofloxacine, moxifloxacine :R sr > 0,5mgl lévofloxacine :R si >1mg/

Bactériologie et virologie pratique

ÉTAIT ELLE

NSB>, æ,

fe

Pasteurella multocida

-

|

©

0; , Cult*

Pasteurella multocida est l'espèce type du genre Pasteurella qui comporte trois sous — espèces : P multocida multocida, P multocida septica, P multocida galiciaa.

> Habitat

|

|

,

Bactérie commensale des muqueuses des animaux (mammifères, oiseaux) domestiques et Sauvages, principalement au niveau des voies aériennes supérieures, plus rarement au niveau des muqueuses digestives ou génitales. Persiste peu de temps dans le milieu extérieur (sensible à la dessiccation et au froid).

> Pouvoir pathogène ° Infection suppurative: après morsures ou griffades de chiens ou de chats. Secondairement peuvent se compliquer par des atteintes ostéoarticulaires et par des formes septicémiques en particulier après évidemment ganglionnaire en amont du point d'inoculation. L'infection peut également se développer sur des lésions préexistantes (ulcères...) par contact avec la salive d'un animal. Ces infections peuvent être polymicrobiennes. Les infections locales sont caractérisées par la rapidité de l'apparition des signes inflammatoires et par une douleur intense,

142

3.2

Bactéries à Gram négatif

+R multocida peut coloniser transitoirement les muqueuses de l'homme et être à l'origine d'infections respiratoires chez des patients atteints de bronchopneumopathies obstructives.

> Echantillons biologiques |

plaie infectée après morsures ou léchage par des animaux sécrétions bronchiques hémoculture Suppuration profonde plus rarement

— — Y

Diagnostic direct: Caractères morphologiques: Aspect gram

°

Mobilité

Gram

Caractères culturaux: Type respiratoire

Aéro-Anaérobie (microaérophile)

+

Capsule ou Spore

Géloses permettant la pousse

Géloses au sang, au sang cuit. Pas de pousse sur Mac Conkey

A

t coloni dard ï

Colonies rondes lisses, grises, non hémolytiques, 1 à 2mm de diametre Souches respiratoires sont muqueuses

Caractères enzymatiques et biochimiques :

MAN

P multocida

P sepiica

P gallcioa

143

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic différentiel — — —

autres Pasteurela Entérobactéries : oxydase —, pousse sur Mac Conkey, O 129: R Vibrionaceae (Vibrio, Aeromonas) : mobile, pousse sur Mac Conkey

—

Pseudomonas: mobile, aérobie strict

—

Baciles et coccobacilles à gram — isolés dans les morsures : Capnocytovhaga canimorsus, Capnocytophaga cynodegmi (CAT — O 129 R) Bergeyella zoohelcum (urée +) Neisseria weaveri et EF4 (0 129 R) Nelssera animalornis (indol-)

> Sensibilité aux antibiotiques Pasteurella multocida est S aux B-lactamines (rares souches avec pénicillinase), tétracyclines, fluoroquinolones, timethoprime-sulfamethoxazole. Les aminosides, les macrollides, lIncosamides sont peu actifs.

144

3,2

Bacilles Gram-

lobacter

> Habitat.

Bactéries à Gram négatli

NSB;, æ,

sp.

D

"mr

DO; Cut:

—

|

Tube digestif des animaux: volailles pour C jejuni, porc et volailles pour G coli bovins, ovins, pour C. fetus. La transmission à l'homme se réalise par la chaîne alimentaire.

- Pouvoir pathogène °

Infection intestinale: diarrhées aqueuses avec possibilité de sang dans les selles et douleurs abdominales. Fréquence aussi importante que les diarrhées à Saimonela.

e

Septicémie: C felus est l'espèce la plus fréquemment retrouvée dans les hémocultures avec la survenue de Jocalisations secondaires (tissu vasculaire, méninges, tissu ostéoarticulaire.) É Complications non infectieuses :syndrome de Guillain Barré suite à une infection à G jejuni, arthrite réactionnelle, érythème noueux.

145

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques Selles, Sang, Liquide articulaire

> Diagnostic direct: °

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacille incurvé

+

Gram

+ en VO de moucheron

Caractères culturaux: Géloses permettant

Type respiratoire

Aspect colonie

la pousse

Gélose sélective:au charbon

Micro-aérophile :10% CO,

de Karmali

Colonies translucides, petites

Gélose au sang

Importance de l'état frais pour les hémocultures pour mettre une atmosphère microaérophile. Transformation des bacilles en formes coccoides non viables pour Cjejuni et C. coli

* Caractères enzymatiques et biochimiques: Les Campylobacter sont uréase — et inactifs sur les sucres ox

Cat

C coli

Hippurate

RU

Céfalotine

ET

RE

C fetus

> Diagnostic indirect e _ Sérologie: par ELISA

> Diagnostic différentiel Avec Arcobacter: aérotolérant 146

3,2

Bactéries à Gram négatif

> Sensibilité aux antibiotiques Sur Muller Hinton enrichi au sang de cheval (10%), inoculum 3 Mc Farland, incubation 3 |OUrS.

+

B-lactamines

de nombreuses souches entéropathogènes produisent une pénicilinase sensible à l'acide clavulanique, Les céphalosporines de 3 génération sont actives.

° aminosides, tétracyclines, macrolides généralement actifs:résistance aux environs de 10 %

+ fluoroquinolones La résistance augmente et est plus importante pour C. coli que pour C jejuni

CNR CNR Campylobacter et Helicobacter Université Victor Segalen Bordeaux 2 EA 516 Bactériologie et épidémiologie des infections digestives 146 rue Léo-Saignat BP 76 33 076 Bordeaux cedex

147

Bactériologie et virologie pratique

Bacilles Gram-

NSB>, &»,

UO;, Cult”

> Habitat Tube digestif (estomac, duodénum) de l'homme:fréquemment retrouvée, dès l'enfance.

- Pouvoir pathogène °

Gastrite chronique: infection chronique répandue dans le monde, fréquente dans les pays en voie de développement

+

Ulcère gastroduodénal

e

Genèse des cancers gastriques: première bactérie impliquée dans la genèse d'un cancer

°

Lymphome de MALT

> Echantillons biologiques Biopsies gastriques: antre, fundus (plusieurs biopsies par endoscopie). Transport en milieu spécial, le plus rapidement au laboratoire à 4°C.

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacille incurvé

=

x

5

Lecture prolongée de l'examen direct (Gram frottis de biopsie) : bactéries incurvées regroupées en banc de poisson.

148

3.2

°

Bactéries à Gram négatif

Caractères culturaux: Géloses permettant

Type respiratoire

Micro-aérophile :10% CO,

la pousse

Aspect colonie

Gélose chocolat Gélose sélective spécifique

Colonies translucides, petites

Ensemencement après broyage de la biopsie. Culture lente à 37°C: jusqu'à 10 jours. Surveiller les cultures et repiquage au bout de 48H: Transformation des bacilles en formes coccoides non viables. +

Caractères enzymatiques et biochimiques:

OX

CAT

URE

pi

PAL

Urée par test rapide

> Diagnostic indirect — Sérologie:par ELISA et Immunoblot détection des 19G. Techniques de dépistage. Positive 3 Semaines après le début de la maladie, persistance des anticorps plusieurs semaines après éradication — Recherche d’antigènes dans les selles:par technique immunoenzymatique

— Test respiratoire à l’urée marquée au C13: utile au dépistage et contrôle du traitement Hippurate

(0)

C. jejuni

.

C coli

+

> Diagnostic différentiel Avec autres Helicobacter

149

Céfalotine

Bactéri ologie et virologie pratique

> Se nsibilité

aux antibiotiques

|

Sur Mu ller Hinton enrichi au sang de cheval (10 %), inoculum 3 Mc Farland, incubation 3 jours : antibiogramme difficile à réaliser (difficulté d'obtenir des subcultures). Possibilité de faire CMI par ETest pour macrolides et ciprofloxacine 8

B- lactamines

IMposs ibilté de tester en diffusion la sensibilité à l'amoxicilline : il existe de rares souches de sensibi ié diminuée.

°

macrolides

Molécu e à tester en diffusion: érythromycine, interprétation valable pour la clarythromycine. Possibi té de réaliser PCR pour la détection de la résistance.

e

flu oroquinolones

Molécu e à tester: ciprofloxacine, interprétation valable pour lévofloxacine et moxifloxacine

°

métronidazole

Pas de technique valable pour détecter la résistance au métronidazole

CNR CNR Campylobacter et Helicobacter Université Victor Segalen Bordeaux 2 FA 516 Bactériologie et épidémiologie des infections digestives 146 rue Léo-Saignat BP 76 33 076 Bordeaux cedex

e

Pri x Nobel de médecine: BJ. Marshall, JR. Warren

150

3.2

CÉTHIESRA ELLE _ Brucella melitensis

Bactéries à Gram négatif

NSB:, æ, (DOI, F .

|

(: Cult

Seule espèce avec 8 sous espèces (melitensis, suis, abortus, suis, canis, neotermae, cetecea, pinnipediaë). Partcularité du génome bactérien des Brucëlla: 2 chromosomes. Bactérie à manipuler avec précautions (NSB3). Fréquence des contaminations au cours de manipulation au laboratoire. Envoyer tous les isolats au laboratoire de référence. Maladie à déclaration obligatoire.

> Habitat

Er

Eds

ee

Bactérie des animaux (mammifères) d'élevages et sauvages surtout autour du bassin méditerranéen. B. melitensis frappe surtout les caprins et ovins; & abortus les bovins; B. suis (plus rare) les porcs et les lièvres. Mais {n'y a pas de spécificité d'hôte rigoureuse.

> Pouvoir pathogène e Chez l'animal: infection de l'appareil génital (orchite, avortement), fréquence des formes inapparentes, e Chez l'homme: Pénétration cutanéo-muqueuse (maladie professionnelle : vétérinaires, éleveurs) ou rarement digestive (par l'ingestion d'aliments contaminés :produits laitiers de fabrication artisanale) à l'origine de la maladie chez des vacanciers ou des citadins. 151

Bactériologie et virologie pratique

Pas de contamination inter-humaine. Incubation de 2 à 4 semaines (passage dans le système lymphatique). Phase aiguë septicémique :fièvre ondulante, sudoro-algique de 2 à 4 mois, souvent inapparente. Phase subaiguë localisée:foyers ostéo-articulaires, génitaux, rarement neuro-méningées. Phase chronique invalidante où «patraquerie » avec lésions articulaires, hépatiques, nerveuses {neuro-brucellose).

> Echantillons biologiques Hémoculture essentiellement, mais aussi ganglion lymphatique, moelle osseuse, LCR, liquide de ponction articulaire, biopsie (osseuse...)

La recherche de Brucella doit être bien précisée au laboratoire par le prescripteur : augmenter le temps d’incubation des milieux de cutures.

> Diagnostic direct: *

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacilles petits (coccobacilles)

*_ Caractères culturaux: LA Type respiratoire

Afobie Sci

Géloses permettant la pousse

: Aspect colonie

Géloses au sang, au Sang cuit BCYE Milieux contenant des vitamines

Colonies petites, rondes,

Quelques souches sont exigeantes en CO, (B. aborus, ovis).

+

Caractères enzymatiques et biochimiques:

+rapide (-rarement) * à faire sous PSM car risque d'aérosols.

152

lisses, non hémolytiques Pousse lente (parfois 15 jours)

3.2

Bactéries à Gram négatif

L'agglutination avec des sérums monospécifiques permet de reconnaître B melitensis B abor{Us et B suis,

> Diagnostic différentiel Coccobacilles à gram — oxydase + — —

Uréase + mais qui sont PDA +: Moraxella phenyloyruvica, Oligella urealytica. Uréase — mais pousse plus lente:Francisella tularensis.

> Diagnostic indirect — Epreuve à l'Ag tamponné (EAT) coloré au Rose-Bengale :agglutination sur lame, Ac de type I9G. Sert au dépistage dans les enquêtes épidémiologiques. — Sérodiagnostic de Wright: agglutination lente, précocement positif, Ac de type IgM, titre de plus de 1/80, il existe des réactions croisées. Dans 1 % des cas des Ac bloquants sont présentis de type IgA:on les recherche par un blocking test. Des faux positifs peuvent apparaître chez des patients infectés par Yenterocolitica sérotype 09, Francisella tularensis et chez des individus vaccinés contre le choléra. — Réaction de fixation du complément (RFO) : 1gG. Reste positive tardivement. — Immunofluorescence indirecte (Al) : positive plus tardivement, sert au dépistage des brucelloses anciennes et chroniques. — ELISA distingue les formes aiguês et chroniques ;sert dans enquêtes épidémiologiques. Si Brucellose à B canis: sérologie —, envoyer à l'école vétérinaire pour sérologie spéciale. £

— Hypersensibilité retardée : IDR à la mélitine. À faire après avoir prélevé pour la sérologie. Stade brucellose

Hémocultures | Wright

> Sensibilité aux antibiotiques L'antibiogramme n'est pas réalisé au laboratoire en raison du risque de contamination. Les aminosides, les tétracyclines, la rifampicine, les fluoroquinolones, le triméthoprime-sulfaméthoxazole, l'érythromycine sont généralement actifs.

153

Bactériologie et virologie pratique

CNR CNR Brucella AFSSA Unité Zoonoses bactériennes 23 Avenue du Général de Gaulle, BP 67 94 706 Maisons-Alfort Cedex Laboratoire associé CHU Grenoble Laboratoire de Bactériologie, BP 217 38 043 Grenoble Cedex 09

154

Gram

negali

NSB;, æ,

0>, Cut:

Ancie

EI

Espèce typ

la

EI

Gena

Il existe aussi Bordetella parapertussis et Bordetella bronchiseptica

Habitat Bactérie très

Îr

agile

Pathogene strict de l'homme, retrouvé dans les voies respiratoires supérieures des malades Contamination par contact direct avec

Les malades Au

un malade où un sujet atteint d'une forme fruste méconnue.

teurs pendant 1 mois environ

> Pouvoir pathogène e Coqueluche: infection aiguë A r les bactériesse fixent aux cellules cillées de la trachée et des bronches (pas de pénétration de la muqueuse). Incubation de 7 à 10 jours 3 phases :catarrhale (8 à 15 j) tres His paroxystique avec des quintes de toux sui vies d'une inspiration profondeet bruyante «chant du coq» (3 à 6 semaines), convalescence avec persistance des quintes. a épidémies sont rares depuis la généralisation de la vaccination mais elles existent. L'im-

nunité due au vaccin n'est pas parfaite et des coqueluches peuvent être observées chez 1155

Bactériologie et virologie pratique

des sujets vaccinés. Chez ces sujets le diagnostic est difficile, souvent ce sont des adultes, Ils contaminent alors les très jeunes enfants. Les malades atteints de SIDA semblent plus sensibles à l'infection.

L'immunité est solide et durable après la maladie. Les anticorps maternels ne traversent pas le placenta:nourrisson non protégé à la naissance. C'est une maladie très grave chez l'enfant de moins de 6 mois. Diagnostic clinique essentiellement.

> Echantillons biologiques Sécrétions bronchiques : écouvilonnage naso-pharyngé ou aspiration des mucosités (par aspiration naso-pharyngée douce sur tube sec et stérile). À faire en début de maladie. Doivent être apportés immédiatement au laboratoire.

> Diagnostic direct +

+

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Bacille court

Capsulé, non sporulé

Mobilité

Caractères culturaux:

Type respiratoire Aérobie

Géloses permettant

la pousse

Aspect colonie

Milieu de Bordet et Gengou Pas de pousse sur gélose au Sang, chocolat

Colonies hémolytiques en goutte de rosée après 3 à 7 jours à 35°C

Culture délicate. Dans les meilleures conditions (au tout début de la maladie), la sensibilité de la culture ne dépasse pas 50 à 60 %.

+

Caractères enzymatiques et biochimiques:

OX

+

URE

D

NO

MUR

Mise en évidence de l’ADN bactérien par PCR sur produit pathologique: plus sensible que culture

156

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Diagnostic différentiel Entre les espèces du genre Bordetella. : Pousse sur Bordet Gengou

Pousse sur GS

B paraperussis B. bronchiseptica

> Diagnostic indirect Sérologie à faire sur 2 sérums à 1 mois d'intervalle. Cinétique des AC ant toxines. Elisa ou Immuno-empreinte (sensibles et spécifiques mais d'interprétation délicate) : IgG antitoxine. Ne plus faire de réaction d'agglutination.

> Sensibilité aux antibiotiques Antbiogramme rarement pratiqué. S: cyclines, timéthoprime-sulfamétoxazole, macrolides. L'érythromycine est l'antibiotique de choix.

.

Inefficacité des B-lactamines. Les antibiotiques ne semblent pas modifier l’évolution de la coqueluche mais ils préviennent les complications pleuro-pulmonaires et ORL. Ils raccourcissent la durée de la période de contagion.

> Vaccination Suspension de B pertussis phase | inactivée par chauffage :associé aux anatoxines diphtériques et tétaniques. Vaccination en France depuis 1966. Actuellement mise au point de fractions acellulaires vaccinantes plus immunogènes et mieux tolérées qui permettent de revacciner les adolescents.

CNR Coqueluche et autres bordetelloses Institut Pasteur Unité de la prévention et des thérapies moléculaires, des maladies humaines 25-28 rue du Dr Roux — 75 724 Paris Cedex 15

Bactériologie et virologie pratique

Bacilles Gram-

D

NSB;, [DO], æ, O,Cuit:

20 espèces de Vibrio divisés en espèces halophiles et non halophiles (V/ cholerae).

> Habitat

de

Ce sont des bactéries de l’eau: mer et rivière.

Vibrio cholerae Bactérie strictement humaine, éliminée dans l'environnement par les selles de malades ou porteurs. Bactérie fragile (UV, acidité, dessiccation, température basse ou haute). La dose infectieuse est élevée 105 à 10!! bact/mL), Espèces halophiles Besoin de sel surtout de Na +. Largement répandues (eaux de toutes les mers du monde et faune marine).

>» Pouvoir pathogène °_ Choléra: Vibrio cholerae toxinogène (DO) maladie à déclaration obligatoire. Diarrhée importante, déshydratation majeure, mortalité élevée. Production d'une exotoxine protéique thermolabile entraînant une inhibition de la réabsorption du sodium dans le grêle avec une perte hydroélectrolytique.

158

3,2

Bactéries à Gram négatif

Ilexiste des formes bénignes, voir asymptomatiques. Vibrio cholerae: 155 sérogroupes basés sur antigène O 2 sérogroupes responsables du choléra :01 (2 biovars :cholerae et elton et 0139.

Situation actuelle : Maladie infectieuse évoluant sous la forme de pandémie —

7° pandémie due à V! cholerae eltor:a débuté en 1961 en Indonésie et s'est répandue dans le monde entier, essentiellement fixée dans les pays chauds et pauvres (hygiène fécale défaillante) :Asie du sud est, Inde, Bengladesh, Moyen orient, Afrique, Europe de l'est.

En 1991 cette pandémie a atteint l'Amérique du Sud par le Pérou (le choléra avait disparu depuis 1895). —

En Inde l'autre biotype V cholerae cholerae existe à l'état endémique (Bengladesh)

En Europe on note flambées de choléra:

— — — — V cholerae °

1965:URSS 1971-1975-1979: Portugal, Espagne 1974: fale 1997, 1994: Roumanie, Albanie, Ukraine 0139: en 1992 démarre au Bengale et n'a pas diffusé,

Vibrio cholerae non toxinogène

Gastro-entérites invasives ®

Vibrio mimicus:

Gastro-entérites voisines de celles de Vibrio cholerae non 01.

° _ Vibrio parahaemolyticus: Intoxications alimentaires :consommation de produits de la mer.

° Vibrio alginolyticus, vulnificus, hollisae.…… : Gastro-entérites invasives- ffections de plaies, otites, conjonctivites, septicémies…

> Echantillons biologiques Selles essentiellement. Penser aux espèces halophiles dans tous les échantillons surtout si contact avec eau de mer et si consommation de poissons crus.

159

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic direct +

Caractères morphologiques:

°

Aspect gram

Capsule ou spore

Bacilles, incurvés

Parfois capsules, non sporules

Mobilité

Caractères culturaux:

Géloses permettant

Type respiratoire

Gélose au sang TCBS (thiosulfate, citrate, bile, Saccharose) Gélose alcaline TTGA (taurocholate, tellurite, gélatine agar) eau peptonée alcaline :permet enrichissement

Aéro-Anaérobie

Aspect colonie A

la pousse

Colonies saccharose +

Colonies grises à centre noir avec zone d'opacité gélatine + Pas de pousse si souche halophile

V cholerae 0139: saccharose —, Vibrio halophiles ne poussent pas sur BCP car besoin de Na* x= +

Caractères enzymatiques et biochimiques: CAT

Métabolisme

0 129

ADH

fermentatif

Les différents Vbrio:

Halophile

ADH | LDC

cholerae mMiImiCus

parahaemolyücus

ue

fluvialis

160

(ODC

PolymyxineB | VP

Polymyxine B

3,2

Bactéries à Gram négatif

Les biotypes de Vibrio cholerae

Hémolyse GR mouton

cholerae

S

eltor

R

È

L

de

:

os

d

Envoyer tous les l/ cholerae isolés au centre de référence. Recherche de la production de toxine : PCR (région du génome CTX avec gènes de virulence

Latex sensibilisé, agglutination. existe des souches non toxinogènes.

> Diagnostic différentiel Avec les bacilles à Gram — à métabolisme fermentatif. Vibrio

Aeromonas

-

e

Pleisio- | Entéro- |:PseudoChromosh à | bactéries monas | bacterium*

monas

Fermentant

Mobilité

ODC ADH

Halophile GEL

+/er

* Chromobacterium violaceum: pigment violet ri

** Wibrio metschnikovii est oxydase -

“** Certaines souches de Vbrio cholerae sont résistantes au comprimé vibriostatique 0129 en raison de la présence d'un plasmide codant également pour la résistance au Bactrim.

> Sensibilité aux antibiotiques Les Vibrio sont sensibles aux céphalosporines de 3° génération, quinolones, aminosides, Des résistances sont fréquentes à l'amoxicilline, aux tétracyclines et triméthoprime-sulfaméthoxazole.

161

Bactériologie et virologie pratique

CNR CNR Vibrions et Choléra Laboratoire des bactéries pathogènes entériques Institut Pasteur Unité du Choléra et des vibrions 25-28 rue du Dr Roux 75 724 Paris Cedex 15

162

3.2

Bactéries à Gram négatif

Plusieurs espèces: les plus fréquentes À. hydrophila, A, caviae, À. veroni biovar sobria où veronil.

> Habitat Bactéries de l'eau douce, notamment des eaux souillées. Peuvent se multiplier à +4°C. Portage intestinal transitoire chez l'homme.

> Pouvoir pathogène ° Gastro-entérite pouvant être très sévère. Fréquente en été. Contamination hydrique et alimentaire. Toxi-infection alimentaire possible. En milieu hospitalier: risque potentiel d'infections nosocomiales (surveillance de l'eau). e Infection extra-digestive : infection de plaies, de brûlures, de fractures ouvertes (contact avec l'eau), Dermohypodermite pouvant se compliquer de myonécrose,

e Bactériémie chez malade immunodéprimé: association fréquente avec cancer hépatique.

163

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques — Plaie: diagnostic d'urgence. — Selles: diagnostic difficile. Certains milieux sélectifs sont inhibiteurs (milieu SS); il a été proposé une gélose au sang rendue sélective par de l'ampiciline (30 mg/) :les souches d'Aeromonas hyarophila et veronii apparaissent B-hémolytiques et l'oxydase peut être mise en évidence. Les souches poussent sur le milieu sélectif Yersin. — Hémoculture

> Diagnostic direct: +

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacille

À. salmonicida est immobile.

+

*

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aëéro-Anaërobie

Gélose au sang Gélose au sang + ampicilline Fe (30mg/) Mac conkey, Drigalski Pousse mal sur Hektoen Milieu CIN des Yersinia

Colonies en 24h semblables aux coliformes,

Caractères enzymatiques et biochimiques:

CAT

Métabolisme

0 129

ADH

fermentatif

Différentiation difficile des espèces basée sur LDC, VP esculine, arabinose.

> Diagnostic différentiel Avec les bacilles à Gram — à métabolisme fermentatif :voir tableau sur fiche Wbrio. Bien tenir compte des caractères d'orientation de base car les galeries commercialisées peuvent conduire au diagnostic de brio et non d'Aeromonas,

164

NN

Bactéries à Gram négatif

> Sensibilité aux antibiotiques °

f-lactamines

La plupart des Aeromonas sont R à amoxicilline et ticarciline

Ces bactéries peuvent acquérir différentes B-lactamases, variables selon les espèces (pénicillinases, céphalosporinases, carbapénémases).

° Autres antibiotiques Les Aeromonas sont très sensibles aux fluoroquinolones, aminosides et triméthoprime-sulfaméthoxazole.

165

Bactériologie et virologie pratique

>

Bacilles Grameudomonas aeruginosa

jo

53

LES

P aeruginosa est l'espèce du genre Pseudomonas la plus rencontrée en pathologie infectieuse,

Habitat Bactérie ubiquitaire.

|

Capable de survivre dans l'environnement (eaux, surface, air, aliments), particulièrement en milieu humide. En milieu hospitalier P aeruginosa peut être rencontré dans l'environnement proche du malade, Peut faire partie de la flore transitoire de l'homme: flore digestive, cutanée, pharyngée : il est montré que le portage augmente avec la durée d'hospitalisation,

>Pouvoir pathogène P aeruginosa est un pathogène opportuniste. Les infections pourront avoir une origine endogène ou exogène. Infection communautaire: principalement broncho-pneumopathie évoluant sur un mode chronique dans la mucoviscidose et les dilatations de bronches; otite externe, endophtalmie après traumatisme, infection cutanée dans les ulcères. Infection nosocomiale :preumopathie chez les malades sous respirateur, infection ostéoartculaire sur matériel, infection urinaire chez les malades sondés, infection cutanée secondaire à des brûlures, septicémie.

166

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Echantillons biologiques Très nombreux. Tous les échantillons chez l'homme et de l'environnement.

> Diagnostic direct: °

Caractères morphologiques: Aspect gram _»

+

Capsule où spore

Mobilité

Parfois capsulés, non Sporulés

+ (plutôt en ligne droite)

Caractères culturaux:

Type respiratoire

Aërobie

| Géloses permettant la pousse

Géloses nutritives, BCP, au Sang. Gélose cétrimide. Pas d'exigence particulière.

Aspect colonie Colonies plates, bord irrégulier, aspect irisé métallique Pigment vert brillant diffusible : pyoverdine (commun au groupe) et pyocyanine spécifique de cette espèce

Odeur de type seringa

Certaines souches peuvent présenter des caractères différents:

°

—

colonies non pigmentées ou colorées en brun où en rouge (par production de pyomélanine ou pyorubrine),.

—

colonies d'aspect mucoide (souches isolées dans certaines pathologies chroniques :mucoviscidose, dilatation des bronches).

—

colonies naines, plus difficiles à cultiver.

Caractères enzymatiques et biochimiques: Pousse à 41°C

kanamycine

_

Sauf colonies mucoides

Plusieurs sérotypes en fonction des Ag O du lipopolysaccharide. 167

Bactériologie

et virologie pratique

> Diagnostic différentiel Avec les espèces de Pseudomonas du groupe fluorescens qui peuvent être pigmentées (pyoverdine) essentiellement P fluorescens et P putida: ces espèces ne poussent pas à 41°C et sont sensibles à la Kanamycine

> Sensibilité aux antibiotiques °

f-lactamines

| — Phénotype sauvage

TIC, PIP. PTZ, CAZ, FEP ATM, IMP AMX, AMC, CTX, CRO, ERT 2 — Phénotype de résistance non enzymatique :fréquent Diamètre

TIC < PIP, CAZ < 21mm CAZ > ATM ou CAZ = ATM Absence synergie TCC/CAZ

TIC, ATM _

AA Se LEP: SJ R|

VAS

3 — Phénotype céphalosporinase : fréquent

Diamètre

TIC > PIP. TIC < 20mm

m

ATM < PIP, CAZ < ATM Absence synergie TCC/CAZ

FEP: S/. R

4 — Phénotype pénicillinase Diamètre

TIC < PIP, CTX > 14mm

PTZ > PIP ou PTZ = PIP

si

Absence synergie TCC/CAZ

TIC, PIP -

. _ _ :

5 — Phénotype BLSE: rare Diamètre CAZ diminué synergie TCC/CAZ

ne

168

TIC, PIP, PTZ, CAZ, ATM, FEP

Bactéries à Gram négatil

6 — Phénotypes résistance à IMP

Imperméabilité spécifique : fréquent

IMP TIC, PIP, PTZ, CAZ, ATM, FEP

Carbapénémase : rare

IMP TIC, PIP. PTZ, CAZ, FEP

+/- inhibée par EDTA Ces mécanismes de résistance aux B-lactamines sont souvent associés, ce qui rend difficile la lecture de l'antibiogramme Nouvelles molécules actives :Méropénème et Doripénème CMI plus basses sur P aeruginosa °

Aminosides

Molécule à tester: GM, TM, AN 1 — Phénotype sauvage

GM, TM, AN

2 — Phénotypes de résistance acquise

GM, TM, AN AN: TM, GM

°

Fluorcquinolones

Molécule à tester :OFX, CIP 1 — Phénotype sauvage

OFX, CIP

2 — Phénotype de résistance acquise

(012.010)2

*

Autres antibiotiques à tester

FOS

169

Bactériologie et virologie pratique

Bacilles Gram -

NSB:, æ,

Ce genre est très hétérogène (32 groupes d'hybridation ADN-ADN). L'espèce la plus souvent isolée chez l'homme est Acinetobacter baumannii

>. Habitat Bactérie ubiquitaire. Présente dans l'environnement surtout hospitalier:résiste particulièrement à la dessiccation et persiste longtemps sur les surfaces sèches. Peut être retrouvée en situation de portage chez l'homme: au niveau de la peau, du tube digestif.…

> Pouvoir pathogène * Bactérie pathogène opportuniste, Acinetobacter baumannii est reconnu responsable d’une grande variété d'infections, le plus souvent nosocomiales : pneumopathie chez des patients ventilés, septicémie, infection du site opératoire, infection urinalre, …

Ces infections peuvent évoluer sur un mode épidémique principalement dans les services de réanimation. Le manuportage est la voie de transmission la plus fréquente. C'est une des bactéries les plus difficiles à maïtriser dans un contexte épidémique. 170

3.2

Bactéries à Gram négatif

> Echantillons biologiques Très nombreux. Principalement :sécrétion bronchique, cathéter, sang, pus, urine.

> Diagnostic direct: °

Caractères morphologiques:

Aspect gram

Capsule où Spore

Bacilles ou coccobacilles

Parfois capsules, non sporulés

°

Mobilité

Caractères culturaux: Type respiratoire

| Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aérobie strict

Géloses nutritives, BCP. au sang Gélose Mac Conkey:

Colonies arrondies, lisses, bords réguliers, 2-3mm diametre

Pousse à 37° C mais la croissance à 44° C et 41° C caractérise l'espèce À. baumannil. +

Caractères enzymatiques et biochimiques:

OX

CAT |GEU)

LAC

ARA

SOR

CT

|UDD

ODC

GEL’

URE

en

> Diagnostic différentiel Avec entérobactéries : parCaractère aérobie strict Avec Pseudomonas: par oxydase Avec autres espèces d'Acinetobacter: par croissance à 44° C

> Sensibilité aux antibiotiques °

B-lactamines

Imipénème est souvent la seule B-lactamine possible pour traiter les infections à À. baumannii A. baumannii est résistant naturellement à amoxiciline, CIG et CIIG.

171

Bactériologie et virologie pratique

Les phénotypes de résistance acquise résultent d'une surexpression ou d'une acquisition de B-lactamases rendant les céphalosporines de 3° génération résistantes.

2 mécanismes de résistance sont à surveiller et à déclarer au CLIN: —

fB-lactamase à spectre étendu: BLSE: clone épidémique est retrouvé dans difféents hôpitaux en France. Cette souche n'est sensible /7 vitro qu'à l'imipénème et a colistine, La mise en évidence se fait par la synergie entre l'acide clavulanique et es céphalosporines de 3°génération en présence de cloxaciline (incorporée dans une boîte de Muller Hinton à une concentration de 250 mg/L)

— _carbapénèmase : avec un niveau de résistance élevé aux carbapénèmes. °

Autres antibiotiques

Aminosides Le phénotype sauvage est S aux aminosides ;

Plus de 80 % des souches sont au moins R à un des aminosides. Fluoroquinolones : ofloxacine, ciprofloxacine S L'acquisition de R est importante. Rifampicine :possède une activité intéressante, mais les risques de mutation sont élevés.

Colistine: 5 Tigécycline: antibiotique récent peut être actif \

172

Bactéries

Espèce type du genre Legionella

négalit

\SB, F3)æ

Bacilles Gram-

Mais || existe 48 e

à Gram

(15 types antigéniques)

ans le aenre Legionella

Crédit photo : Dr C. M

> Habitat Bactérie hydro-tellurique qui aime l'eau tiède Détruites à 60° C

Se rencontre dans les lacs, étangs, les sols humides et surtout dans les tours aéro-réfrigérantes, l'eau chaude des stations thermales et l'eau chaude sanitaire. Survie longtemps dans les biofilms, les amibes libres, les cyanobactéries

> Pouvoir pathogène ° Maladie des légionnaires: décrite en 1976. C'est une pneumopathie fébrile apres incubation de 2 à 10 jours

Syndrome grippal: fièvre élevée, douleurs musculaires, anorexie, asthénie, diarrhées, nausées, vomissements, troubles psychiques ou complications cardiaques, désordres rénaux...

Evolution rapide vers une pneumopathie interstitielle radiologique et un épanchement pleural.

Inefficacité d’un traitement par fB-lactamines. 1179

|

|

Bactériologie et virologie pratique

Grave chez les immunodéprimés.

Facteurs favorisants :tabagisme, éthylisme, diabète, insuffisance rénale chronique, affections cardio-respiratoires chroniques, âge de plus de 50 ans, sexe masculin Touche plutôt les adultes que les enfants. Due dans plus de 80% des cas à L. pneumophila de sérogroupe 1. Mais les autres types ou d’autres espèces de Legionella peuvent donner les mêmes signes cliniques. °

Fièvre de Pontiac: forme bénigne, passe souvent inaperçue

° Manifestations extra-pulmonaires rares mais pouvant se voir chez des immunodéprimés (cellulites, péricardites, péritonites..……). Bactérie pathogène stricte obligatoire.

> Echantillons biologiques Se multiplient dans les macrophages alvéolaires de l'homme. Expectorations, LBA, aspirations trachéales ou bronchiques :peu de bactéries dans ces échantillons. Liquide pleural +++

Biopsie pulmonaire, Sang mais il faut des techniques spéciales. Attention le sérum physiologique risque d’inhiber les cultures il vaut mieux utiliser

de l’eau distillée stérile.

- Diagnostic direct +

+

Caractères morphologiques Aspect gram

Capsule ou spore

Bacille où coccobacille

Non capsulé, non sporulé

| Mobilité — (prennent al la coloration)

Caractères culturaux: aspect plus flamenteux des bacilles après culture. Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Aërobie strict

Géloses nutritives au charbon avec L-cystêine et fer: BCYE et GVPC (+ vancomycine, glycine, colistine)

Pousse lente (jusqu'à 10 jours) Lecture des boîtes à J3, J5 et J10. Colonies en verre «fritté», reflets roses

3,2

Bactéries à Gram négatif

Pousse de 25° C à 37° C, croissance favorisée par 2,5 % de CO, Pas de pousse sur Gélose BCYE sans cystéine et gélose au sang +

Caractères enzymatiques et biochimiques

HIP

flactamase

agglutination avec particules de latex Groupe 1 ou groupe 2-14

—

souvent faible * peut se faire en galerie API 20 E

La culture de la bactérie, à privilégier, permet d'envoyer la souche au centre de référence. Elle sera étudiée, comparée avec les souches de l'environnement. Ceci favorise la recherche de l'origine de la contamination et permet d'éviter les épidémies.

> Diagnostic différentiel Avec autres espèces de Legionella: basé sur É caractèresa

de et d'agglutination.

> Autres méthodes de diagnostic ° Recherche des antigènes solubles dans les urines: Pour sérogroupe 1 seulement :bonne spécificité ELISA (résultat en quelques heures) où immunochromatographie sur membrane (lecture en 15 mn). Apparition dès les symptômes et persistance jusqu'à 2 mois après la guérison. Un test négatif ne doit pas faire exclure le diagnostic de légionellose. + Recherche par PCR: directement sur l'échantillon. Méthode rapide permettant de détecter toutes les espèces de Legionella.

> Diagnostic indirect IF avec AC anti LPS : titre > ou = 1/256 (cas probable) ELISA permet un screening. Faux positifs :réactions croisées avec Mycobactéries, Chlamydia, Mycoplasma, Coxiela burnetti, Campylobacter Importance de la cinétique des AC :augmentation du titre X4.

175

Bactériologie et virofogie pratique

Aucun intérêt de rechercher les lg M. Séroconversion lente (peut être de 6 semaines)

> Sensibilité aux antibiotiques Ne pas faire d'étude systématique de la sensibilité aux antibiotiques du fait de résultats ininterprétables en clinique. C'est une bactérie intracellulaire.

B-lactamines: À Macrolides : éryihromycine 5, mais surtout azithromycine et clarithromycine.

Fluoroquinolones : ofloxacine, ciprofloxacine S

Rifampicine : possède une activité intéressante mais doit être utilisé en association. Colistine: À

> Déclaration obligatoire À la DDASS pour enquête épidémiologique.

Au CLIN si suspicion de cas nosocomial,

CNR Légionelles Groupe Hospitalier Est, Centre de biologie Est Institut de microbiologie 59 Boulevard Pinel 69 677 BRON cédex

176

BACTÉRIES

3 ANAÉROBIES

Anaérobies généralité

Bactéries qui ne peuvent pas se multiplier en présence d'oxygène. Certaines d'entre elles sont même tuées quand elles sont exposées à l'oxygène.

> Procédures spécifiques pour e — — — —

Le prélèvement Par ponction à la seringue le plus souvent possible Milieu de transport obligatoire Analyse rapide _|mportance de l'examen microscopique

e

Culture

Les milieux de culture Milieux d'entretien : milieux liquides et solides particuliers contenant des peptones très riches et supplémentés (sang — hémine — Vit, K3)

Les conditions de culture — Milieux « désaérés » = « régénérés » — Culture sous atmosphère sans 0, avec CO, et N,. e L’antibiogramme Milieu recommandé = Gélose Wilkins-Chalgren, non supplémenté pour Bacteroides groupe fragilis, et enrichi de 5 % de sang pour les autres.

1

Bactériologie et virotogie pratique

> Classification °

Evolution de la taxonomie actuellement avec les techniques moléculaires.

| — Anaérobies telluriques :Anaérobies sporulés se trouvant dans le sol, l'air et les poussières.

Bacilles gram +: Genre Costidium. Spores sont des formes de résistance = au laboratoire :chaleur (80° pendant 10 minutes) où à alcoo! 95° pendant 45 minutes à 1h.

Il — Anaérobies médicaux: flore endogène de Veilon commensale Très nombreuses espèces. Cocci à gram +

Cocci à gram -

Peptococcus Veillonella Peptostreptococcus | Acidaminococcus Megasphaera

Bacilles à gram +

CÉIESENIEUS

Propionibacterium Actinomyces Eggerthella Atopobium

Bacteroides Prevotella Porphyromonas Fusobacterium Leptotrichia Selenomonas Bilophila

Collinsela.., = ex Eubacterium Bifidobacterium Alloscardovia Parascardovia

Scardovia Mobiluncus.

CNR Bactéries anaérobies et botulisme Institut Pasteur Unité Bactéries anaëérobies et toxines 25-28 Rue du Dr Roux 75 724 Paris cedex 15

3.3

GÉRÉE

Bactéries anaérobies

NSB;/[B0], —,

_ Clostridium.

0; , Cuit*

> Habitat Intestin de l'homme et des animaux. Environnement.

> Pouvoir Pathogène Le diagnostic de tétanos est un diagnostic clinique. La multiplication de la bactérie est très discrète et très limitée dans le temps, ce qui rend l'isolement au niveau de la porte d'entrée très aléatoire et difficile. La toxine, très neurotrope, n'est pas retrouvée dans le sang. Le gène responsable de sa biosynthèse serait porté par un plasmide.

> Echantillons biologiques Pus divers, biopsie, sang, selles (faire numération). Aliments si intoxication,

> Diagnostic direct +

e

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacilles très fins

Capsulés, Sporulés (spores terminale : en . tête d'épingle)

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Anaërobie strict

Géloses riches au sang, gélose au 2 phényl-éthanol

Culture en nappe sur la gélose Odeur de corne brûlée Non hémolytiques

179

Bactériologie et virologie pratique

+

Caractères enzymatiques et biochimiques :

OX

CAF

: SAC

GEU

GAZ

NIT

H2S

IND

Bien identifié par les galeries miniaturisées,

— Recherche de la toxine : Inoculation IM au cobaye, Réaliser l'épreuve du cobaye protégé. Recherche du gene par PCR.

> Diagnostic différentiel Avec les autres Clostridium protéolytiques non glucidolytiques. Bactérie très rarement isolée au laboratoire.

> Sensibilité aux antibiotiques Bonne activité de toutes les B lactamines, chloramphénico!, clindamycine, vancomycine, nitroimidazolés,

> Déclaration obligatoire À la DDASS Envoyer la souche au CNR,

180

3,3

Bacilles Gram+

î

|

Bactéries anaérobies

NSB;, æ,

me

0, Cult:

Bactérie toxinogène

> Habitat Intestin de l'homme et des animaux. Environnement.

> Pouvoir Pathogène Responsable de tableaux cliniques très graves, mais rarissimes :

—_ myonécrose —

—

Septicémie post-abortum

| Toxine de type À

pneumonie nécrosante

— _entérocolite nécrosante }Toxine de type C Plus fréquemment isolé comme agent de surinfections (pus d'origines diverses), bactériémies transitoires. Intoxications alimentaires bénignes (entérotoxine type A) dont la fréquence est certainement

sous-évaluée. 181

Bactériologie et virotogie pratique

> Echantillons biologiques Pus divers, biopsie, sang, selles (faire numération). Aliments si intoxication.

> Diagnostic direct +

°

+

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Bacilles trapus droits

Capsulés, Sporulés (spores non visibles dans les produits pathogènes)

ME

+ (culture jeune)

Caractères culturaux:

Type respiratoire

Géloses permettant la

Anaërobie strict

gélose au 2 phényl-éthanol

pousse Géloses riches au sang,

Aspect colonie

Colonies assez grosses apparaissant en 24h, Double zone d'hémolyse

Caractères enzymatiques et dites

CAT

= GÈU

GEL

NIT

IND

SAC

Bien identifié par les galeries miniaturisées.

° Diagnostic différentiel Avec C. baraïii qui est très proche mais GEL -.

> Sensibilité aux antibiotiques Bonne activité de toutes les B lactamines, chloramphénicol, clindamycine, vancomycine, nitroimidazolés. De rares souches résistantes à la Pénicilline G par modification des PLP ont été signalées.

182

3.3

Bactéries anaérobies

BETTER ELLES

Bactérie toxinogène : cytotoxine = toxine B, entérotoxine = toxine À, toxine binaire (ADP ribosyl transférase spécifique de l'actine)

> Habitat Intestin de l'homme et des animaux. Environnement : sol (20 %) — eau (50-80 %) (forme sporulée) Portage sain fréquent chez enfants de moins de 1 an rendant la recherche de ce germe inutile dans cette population — adultes (3 à 7 %).

> Pouvoir Pathogène Colite pseudo-membraneuse sévère post-antibiothérapie Origine endogène ou exogène (épidémies nosocomiales) Rarement :bactériémie, péritonite, abcès intra abdominal, infection de plaie chirurgicale, abcès divers. Les souches isolées peuvent être non toxinogènes et il n'y a pas toujours eu d'antibiotique avant l'infection.

183

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques Selles

> Diagnostic direct °

Caractères morphologiques: Aspect gram Bacilles assez fins

dos

e

Capsule ou spore

Mobilité

Capsulés, Sporulés

Caractères culturaux:

Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Anaérobie strict

Géloses riches au sang, gélose au 2 phényl-éthanol. Milieu sélectif C.C.FA. de George (cycloserine — céfoxitine — fructose — agar) : 48h,

Colonies non hémolytiques. Colonies plates, tramées, à bords irréguliers. À repiquer très rapidement car très sensible à oxygène. Odeur de purin +++,

*

+

Caractères enzymatiques et biochimiques:

NIT

H,S 2

IND

LAC

ES een Pacs Bien identifié par les galeries miniaturisées :leucine et proline amino — peptidase +. Agglutination sur lame des colonies (test au latex) : Ag pariétaux. Recherche des toxines A et B: À partir des selles ou des colonies.

Délai de conservation à +4°C est de 24h, toxine dénaturée à +22°C Test ELISA avec AC monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la toxine À ou contre les toxines À et B: test rapide, sensible mais coûteux. Performances comparables à la technique de référence :effet cytopathogène sur culture cellulaire (toxine B). Souche hyperproductrice de toxine :clone 027

184

3,3

Bactéries anaëérobies

> Diagnostic différentiel Pose peu de problème.

> Sensibilité aux antibiotiques R. naturelle aux céfamycines et au céfotaxime.

Beaucoup de souches sont sensibles aux autres 8 lactamines Résistance fréquente : macrolides et lincosamides, tétracyclines, chloramphénicol Sensibilité constante : vancomycine } per os nitroimidazolés } pour le traitement ac. fucidique bacitracine

> Déclaration Aux CLIN des établissements de santé. Isolement du malade. || faut nettoyer les chambres à l'eau de Javel. Attention au clone 027 qui est très épidémique.

185

Bactériologie et virologie pratique

ÉTAT ROLE

TER

TR

ELLES

RIRE

Se

NSB;, [DO], æ, HAN

_ Clostridium botulinum

ER

ae

©)

0;, Cult:

> Habitat Intestin de l'homme et des animaux. Environnement.

> Pouvoir Pathogène Bactérie responsable du botulisme, dû généralement à une intoxination (ingestion de toxine préformée dans l'aliment), mais beaucoup plus rarement à une toxi-infection : —

botulisme par blessure;

—

botulisme du nouveau-né (intestin) 90 à 95 % avant 6 mois paralysie flasque;

—

_botulisme type nouveau-né chez l'adulte immunodéprimé.

> Echantillons biologiques Bactérie retrouvée dans aliments si intoxication, rarement selles ou plaies, Recherche de toxine dans sérum ou aliment suspect.

> Diagnostic direct Il n'existe pas un C botulinum mais plusieurs espèces très différentes biochimiquement et antigéniquement. e

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou spore

Bacilles trapus droits | Capsulés, Sporulés

e

Mobilité

rs

Gram

Co

Caractères culturaux: Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Géloses riches au sang, pisse

gélose au 2 phényl-éthanol

186

Aspect colonie

Colonies assez grosses apparaissant en 24h, hémolytiques

3,3

+

Bactéries anaëérobies

Caractères enzymatiques et biochimiques:

B ien identifié par les galeries miniaturisées. Recherche de la toxine 0 n distingue 7 types toxiniques : À à F; type G = C argentinense Beaucoup de souches sont bitoxinogènes. Mise en évidence de la toxine dans sérum du malade (éventuellement vomissements — seles).

La recherche se fait par inoculation à la souris, par voie intrapéritonéale, de sérum de malade.

En cas de toxine, les souris inoculées avec le sérum seul présentent en 18h une paraVsie flasque qui entraîne rapidement la mort.

Recherche aussi de la toxine dans les aliments: laboratoires spécialisés.

> Diagnostic différentiel Pose peu de problèmes.

> Sensibilité aux antibiotiques Bonne activité de toutes les B lactamines

> Déclaration obligatoire

À la DDASS

187

Bactériologie et virologie pratique

Bacilles Gram-

NSB>, æ,

Res

07,Cut

Groupe très important (24 genres), comprenant de très nombreuses espèces de bacilles et coccobacilles, mobiles ou immobiles dont la classification est toujours en cours de remaniement.

> Habitat Intestin de l'homme et des animaux.

Cavité buccale Vagin

Pouvoir Pathogène Suppurations abdominales

Bacteroides fragilis et esp. voisines Bilophila wadsworthia

Vaginoses — Suppurations gynécologiques

Prevotella bivia Prevotella disiens

4

Porphyromonas asaccharolytica

Suppurations ORL

Prevotella oralis et esp. voisines Fusobacterium nucleatum Fusobacterium necrophorum

Infections respiratoires basses

Prevotella melaninogenica Prevotella oralis Prevotella intermedia Fusobacterium nucleatum

He

|

Infections des tissus mous

Prevotella oralis Fusobacterium nucleatum

Abcès du cerveau

Fusobacternium nucleatum

Bacteroides fragilis

188

3.3

Bactéries anaëérobies

Infections bucco-dentaires

Prevotella groupe oralis Prevotela intermedia Prevotella melaninogenica Porphyromonas endodontalis Porphyromonas gingivalis Fusobacterium nucleatum Leptotrichia buccalis Centiveda periodontii Selenomonas sp.

Septicémies

Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron

> Echantillons biologiques Pus divers, biopsie, sang

> Diagnostic direct e

e

Caractères morphologiques: Aspect gram

Capsule ou Spore

Mobilité

Bacilles

Capsulés ou non, : non Sporulés

— OÙ parfois +

Caractères culturaux: Type respiratoire Anaëérobie strict

e

Géloses permettant

la pousse

Aspect colonie

Géloses riches au sang

Culture parfois lente

Caractères enzymatiques et biochimiques: Pigmentation des colonies

La différenciation des principaux genres se fait sur:

—

culture en présence de vert brillant:disque chargé à 100mg

—

culture en présence de bile:milieu à 20 % de bile ou disque chargé à 5mg

189

Bactériologie et virologie pratique

—

sensibilité à certains antibiotiques: Kanamycine à 1000 11g Colistine à 10ug Vancomycine à 51g [at]

Schématiquement : Kanamycine (1000ug) R Bile R

Bacteroides groupe fragilis, B. splanchnicus.

Bile S

Prevotella et Porohyromonas (Vanco $) pigmentés et non pigmentés.

Kanamycine (1000ug) S

Colistine R Capnocytovhaga Colistine S Nitrate — Fusobacterium et Leptotnchia Nitrate + autres Bacteroides, Bilophila, Campylobacter Sutterela. Vert brillant (100 mg)

R

Fusobacterium

S

Bacteroides, Prevotelle, Porohyromonas

> Diagnostic différentiel Bacteroides tragilis est plus fréquemment isolé et bien identifié par les galeries commercialisés.

> Sensibilité aux antibiotiques e

Bacteroides fragilis —

Présence d'une B lactamase particulière, chromosomique, non inductible, non détectable par le nitrocefin, chez 80 % des souches en France. — résistanceà Ampicilines Céphalosporines de 1 génération Céfuroxime

Cette f lactamase est inhibée par l'acide clavulanique, le sulbactam et le tazobactam. —

Antbiotiques habituellement actifs : Pipéracilline Céfoxitine Céfotetan Amoxiciline + Ac, clavulanique Ticarcilline + Ac. clavulanique Pipéraciline + Tazobactam 190

3.3

Bactéries anaëérobies

oxalactam mipénème

Chloramphénicol Métronidazole (ilexiste quelques souches Résistantes) —

e

Les céphalosporines de 3° génération sont peu actives (céphalosporinase endogène) ainsi que les fluoroquinolones.

—

Résistance acquise fréquente aux tétracyclines et à l'érythromycine.

—

Parfois, il existe une Carbapénémase R à toutes les B lactamines (1 % des souches)

Prevotella et Porphyromonas

Résistance acquise fréquente aux aminopénicillines (B lactamase) pour les espèces pigmentées en noir.

° Fusobacterium Espèces résistantes aux macrolides, mais sensibles à la clindamycine. Chez Æ nucleatum, apparition de plus en plus fréquente de résistance à la pénicilline par production de pénicillinase (27 % en Europe).

191

3.4 BACTÉRIES

AUTRES Bacilles à Gram-

|

NSB,, æ, 0

Culte

Détection en IF

> Habitat Le réservoir est le chat (surtout — 1 an). Le vecteur est une puce, Chats porteurs sains.

> Pouvoir pathogène ° Maladie des griffes du chat: Après morsure où griffure de cha , Une Semaine après, apparition d'une pustule où une papule sur le site de la plaie. Puis apparition rapide où non d'u ne adénopathie sur le territoire drainant +/ — splénomégalie. Peut être accompagnée d'autres manifestations systémiques (fatigue, fièvre). Endocardites à hémocultures nég atives, bactériémies persistantes, Angiomatose bacillaire et péliose hépatique (immunodéprimé). HS

Bactériologie et virotogie pratique

> Echantillons biologiques Biopsie ganglionnaire ou hémoculture avec système de centrifugation lyse (Isolator®)

> Diagnostic direct e

Culture:

—

Caractères morphologiques:

Aspect Gram

Capsule ou spore

Mobilité

Bacille de 1X0,51M

légèrement incurvé.

— Caractères culturaux: = Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aérobie strict

Gélose au sang cuit cœur

Petites (< 1mm),

cervelle, BCYE

blanches et sèches.

Aspect colonie

Culture lente, 10 à 30 jours en primo-culture, 3 jours en sous culture.

— Caractères enzymatiques et biochimiques: Urée

+

Glucose

Biologie moléculaire:

Possible soit en ARN T6$, soit sur le gène htrA ou gltA codant pour la citrate synthétase.

Pratiguée sur tous les types de prélèvement. Sensibilité de l'ordre de 75 % chez les patients présentant les signes cliniques et épidémiologiques adéquates.

> Diagnostic différentiel Bartonella quintana (agent de la fièvre des tranchées) responsable aussi d'endocaraite, de bactériémies et d'angiomatose bacillaire chez l'immunodéprimé.

Afpia felis 194

3,4

Autres bactéries

> Diagnostic indirect Sérologie se positive une semaine après l'apparition des symptômes. Technique Al est la plus utilisée. Un titre en IgG > à 512 est très significatif (VPP 91 %). IgM en faveur d'une infection récente. Réactions croisées possible avec Cbumetii et Chlamydia sp.

> Sensibilité aux antibiotiques Très sensible à la plupart des antibiotiques (B-lactamines, aminosides, rfampicine, cyclines).

195

Bactériologie et virologie pratique

NSB./[B9] , BAAR, Dauer

Ce sont des bacilles ayant une propriété tinctoriale essentielle (ils sont alcoolo-acido-résistants : BAAR) et contenant des acides mycoliques. ls y a plusieurs espèces (près de 90) qui déterminent des maladies différentes : 1 tuberculosis, M. bovis et M. africanurñ la tuberculose, M. /eprae la lèpre et les autres responsables (Mycobactéries commensales dites atypiques) des mycobactérioses.

Les techniques utilisées pour les mettre en évidence sont spécifiques et sont isolées du reste du laboratoire de bactériologie (utilisation d'un PSM, étuves dédiées, milieux particuliers). Les mycobactéries tuberculeuses sont des microorganismes NSB.,

1 — Mycobacterium tuberculosis complex M. tuberculosis (bacille de Koch), M. bovis (dont le BCG), M. aficanum, M. microt, M. pinnipedlii, M. canet.

> Habitat SON toujours pathogènes. Animal : bovins et animaux domestiques pour M. bovis,.… Rongeurs pour M. microti, mammiferes marins pour M. pinnivedii.

Homme : M. tuberculosis

M. tuberculosis n'a jamais êté isolé dans l'environnement. 196

3.4

Autres bactéries

> Pouvoir pathogène Responsables de la tuberculose maladie à déclaration obligatoire.

—

—

Primo-infection: asymptomatique, après contamination aérienne se forme un granulome qui se nécrose :caséum, mais les défenses immunitaires le limitent et les bacilles sont quiescents. Les réactions tuberculiniques sont positives. Tuberculose maladie (chez moins de 10% des primo-infections) si extension du yer infectieux au poumon le plus souvent mais aussi aux reins, aux organes géniestUX, AUX ganglions, aux os, au péritoine ou au péricarde.…

enfes)

—

Siimmunodéprimés ou enfants ou vieillards des formes généralisés ou des méningites peuvent se voir.

> Echantillons biologiques Prélèvements respiratoires (expectorations, tubages, aspirations bronchiques), urines, sang, liquides d'épanchements, biopsie, LCR... : L'émission bacillaire étant intermittente renouveler les prélèvements 3 jours de suite.

> Diagnostic direct Toujours chercher à mettre en évidence la mycobactérie responsable pour orienter le clinicien pour l'isolement du patent et son traitement.

e

Culture: —

Traitement préalable des échantillons contenant une flore polymicrobienne :surtout les prélèvements respiratoires. Faire une décontamination — fluidification — homogénéisation (soude, action mucolytique de la N-acétyl-L-cystéine en présence de citrate de sodium).

—

Concentration de l'échantillon par centrifugation.

— Caractères morphologiques: Faire un examen direct au Ziehl-Neelsen ou à l'auramine (fluorescence pour dépistage) sur l'échantillon concentré :BAAR absent ou présent (malade contagieux «bacillifère »). Aspect

Capsule ou spore

Mobilité

Bacille parois ,

invisible

filamenteux

HO

Bactériologie et virologie pratique

—

Caractères culturaux:

Type respiratoire

Géloses permettant la pousse

Aspect colonie

Loewenstein-Jensen

Lisse et crème au début puis

Coletsos

grossit, devient rugueuse en chou

Aérobie strict

iddlebrook

fleur beige (tuberculosis).

Utilisation de milieux liquides (7H9) |.POuSSe plus rapide ou uilisation FR

d'automates

Soit culture rapide :espèces commensales, pathogènes opportunistes Soit culture lente, 15 à 50 jours en primo-culture :espèces pathogènes obligatoires ({uberculosis et leprae) et potentiellement pathogènes.

—

Caractères enzymatiques et biochimiques: Niacine

Thermosensible (détruite 68°C) K

TCH (ac. thiophène, ee

me

* résistant à D-cyclosérine

+

Biologie moléculaire:

Permet de différencier mycobactéries tuberculeuses — mycobactéries atypiques soit à partir du prélèvement qui a montré un examen direct + (détection directe par amplification génomique) soit à partir de la culture (sonde spécifique, séquençage).

> Diagnostic indirect e__

Sérologie: ELISA possible mais non spécifique,

e

Exploration de l’immunité à médiation cellulaire: des régions du génome codant

pour des protéines spécifiques (ESAT6, CFP10) de M tuberculosis et non du BCG ont été déterminées. Ces protéines font fabriquer par les cellules mononuclées de l'interféron y (INFY) chez les sujets atteints de tuberculose infection. Deux techniques sont commercialisées pour quantifier la réponse INFy après stimulation par ESATG et CFP10: ELISPOT © et QUANTIFERON ©, 198

3.4

Autres bactéries

Ces méthodes sont plus sensibles et plus spécifiques que l'intradermoréaction (IDR) à la tuberculine pour identifier au sein d'une population les sujets ayant une tuberculose latente à risque de développer une forme active.

> sensibilité aux antibiotiques

+

—

Anïübiogramme par méthode des proportions:la croissance de l'inoculum bactérien en présence d'un antibiotique est comparée à celle de la dilution au 1/100 de cette population en milieu sans antibiotique. La présence de plus de 1% de mutants résistants signe la résistance de la souche. Se fait en milieu solide ou maintenant en milieu liquide.

—

Détection génotypique des résistances :bandelettes ou puces.

Antüibiotiques actifs:

Aminosides :streptomycine, amikacine Rifampicine

Fluoroquinolones ISoniazide, pyrazinamide, éthambutol, thioamides :spécifiques aux Mycobactéries, M. bovis est naturellement R à pyrazimamide.

+ Résistance acquise: toujours par mutation pour M. tuberculosis, Ilexiste des souches multrésistantes qui poseront des difficultés thérapeutiques et même des souches ultrarésistantes.

e__ Traitement: associer les antibiotiques ++++. Classiquement 4 antituberculeux majeurs : isoniazide, rifampicine, éthambutol, pyrazinamide.

2 — Mycobacterium spp. Non tuberculeuses Encore appelées mycobactéries atypiques.

> Habitat

|

4

Environnement :eau surtout y compris eau potable. Ne sont pas des pathogènes obligatoires.

> Pouvoir pathogène —

Sujet immunocompétent: infection localisé d'évolution chronique. Infection pulmonaire simulant la tuberculose (sujet âgé ayant une infection sous-jacente), infection cutanée (nodule chez personne entretenant un aquarium..….), infection post-trau1199

Bactériologie et virologie pratique

matique, infection post-opératoire (ostéo-articulaire), adénite cervicale le plus souvent chez l'enfant. ….

— _Sujetimmunodéprimé : chez les sidéens (< 100 CD,/mm) infections fréquentes et sévères pulmonaires, cutanées où osseuses.

> Echantillons biologiques Prélèvements respiratoires (expectorations, tubages, aspirations bronchiques), prélèvements cutanés, sang, liquides d'épanchements, biopsie, LCR...

> Diagnostic direct Toujours chercher à mettre en évidence la mycobactérie responsable. Même démarche que pour les mycobactéries tuberculeuses. En général croissance plus rapide que pour M. tuberculosis complex.

Certaines nécessitent des conditions de culture particulières (milieux, température différente) en particulier M. marinum.

Elles ont une catalase thermorésistante à 68° C. Identification des colonies se fait par des tests génotypiques.

> Sensibilité aux antibiotiques Pas de techniques standardisées

Méthodes et antibiotiques choisis en fonction de l'identification, Envoi de la souche à un CNE,

3 — Mycobacterium leprae Bacille de Hansen. Intracellulaire obligé. Maladie strictement humaine, qui déclenche des réactions immunoallergiques destructrices au niveau des nerfs périphériques. La lèpre est avant tout un diagnostic clinique:forme tuberculoide (peu de bacilles) ou forme lépromateuse (très nombreux bacilles), S'observe dans les régions subtropicales et équatoriales du globe. Cette bactérie n'est pas cultivable. Recherche —

par examen direct (coloration de Ziehl-Neelsen) :BAAR regroupés en amas ou globi.

—

où par amplification génique. 200

3.4

Autres bactéries

Echantillons:frottis après raclage doux de la cloison nasale,

d'une sérosité, d'un léprome ulcéré, de sang capillaire au niveau du lobe de l'oreille.

CNR Mycobactéries et résistance des mycobactéries aux antituberculeux Faculté de Médecine Pitié-Salpétrière Service de Bactériologie-Hygiène 91 Bd de l'Hôpital 75 634 Paris Cedex 13

Laboratoire associé CHU Henri-Mondor Laboratoire de Bactériologie 51 Av du Maréchal de Tassigny 94 010 Créteil Cedex

201

Bactériologie et virotogie pratique

LU NIENUTE

NSB>, 0>, Cult +

> Habitat Mycoplames colonisant l'homme : muqueuses respiratoires : 1/ycovlasma pneumoniae

muqueuses génitales : Ureaplama S0p. (U parvum et U urealyticum), Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium.

> Pouvoir pathogène e

M. pneumoniae

Infections respiratoires :pneumonie atypique primitive chez l'enfant et l'adulte jeune. °

M. Hominis, Ureaplasma spp., M. genitalium

La présence à l'état commensal des deux premières espèces rend difficile l'interprétation de leur pouvoir pathogène, Chez l'homme: Ureaplasma S$pp. et M. genitalium peuvent être responsables d'urétrite non gonococcique, d'épididymite et de prostatite.

Chez la femme M. hominis est retrouvée dans les vaginoses, A genitalium dans les cervicites, M. hominis, M. genitalium et Ureaplasma spp. dans les endométrites

Dans les troubles de la reproduction et les infections néonatales 47. hominis et Ureaplasma pp. pourraient jouer un rôle. Des infections extra génitales peuvent survenir chez des patients immunodéprimés :arthrites, septicémies.

> Echantillons biologiques Aspiration nasopharyngée pour M. pneumoniae

Prélèvements urétraux, premier jet des urines, spermes, sécrétions prostatiques, prélèvements cervico-vaginaux, biopsies endomètre pour les mycoplasmes génitaux. Autres prélèvements :liquide articulaire, biopsie synoviale, sang.…

Les conditions de transport sont strictes pour la culture :à +4°C, dans un milieu de transport spécifique pour assurer la viabilité (milieu 2SP à base de saccharose, phosphate). 202

3.4

Autres bactéries

> Diagnostic direct Bactéries sans paroi : leur culture demande des milieux particuliers et ne trouble pas les milieux liquides.

Les milieux de culture sont complexes :sérum, extrait de levure et des antibiotiques. La détection de pousse des milieux liquides se réalise par le virage d'indicateurs colorés: —

Le milieu de Haflick à l'arginine convientà M. hominis

— Le milieu de Shepard à l'urée pour Ureaplasma 50p. Our milieux gélosés, les colonies de M. hominis prennent l'aspect en œuf sur le plat, celles de Ureaplasma S0p. sont petites et colorées en brun en présence d'urée et de sulfate de manganèse

Pour le diagnostic direct de M. pneumoniae et M. genitalium, ilse réalise par biologie moléculaire. De même la PCR peut être utile pour le diagnostic des mycoplasmes dans les localisations extra génitales (liquides articulaires).

> Diagnostic indirect Pour M. pneumoniae Différentes techniques Réaction de fixation du complément :avec règles stricts d'interprétation titre d'au moins 1/64 Réaction immunoenzymatique : nombreuses trousses

Agglutination de particules de latex

Pour mycoplasmes génitaux Aucune sérologie possible.

> Sensibilité aux antibiotiques Les méthodes de dilution en milieu liquide ont êté adaptées, étant donné les exigences de culture différentes des bactéries classiques. Plusieurs kits avec 1 ou 2 concentrations d'antibiotiques sont disponibles : Il faut tester la résistance aux tétracyclines (plus fréquentes chez M. hominis), aux macrolides et aux fluoroquinolones des Mycoplasmes génitaux et particulièrement lorsqu'ils sont isolés de

sites extra génitaux chez des immunodéprimés.

203

Bactériologie

et

virologie

MECS

pratique

da

trac, 0 Cult +/-

Coxiela burnetii est une bactérie intracelulaire obligatoire ayant longtemps appartenu à la famille des Rickettsiaceae mais qui est maintenant classée à part, C'est l'agent de la fièvre Q (Q fever)

> Habitat Les mammifères (ovins et caprins) sont les hôtes de © burnetil Elle peut aussi infecter l'homme ou d'autres mammifères comme le chien. La fièvre Q est donc ne anthropozoonose

C burnetii peut causer une prématurité, un faible poids à la naissance ou des avortements. La transmission se fait a l'homme par aérosols à partir des animaux infectés. Ceux-ci ont généralement une forme asymptomatique mais ils éliminent la bactérie par les matières fécales, ‘urine, le lait et surtout les produits de parturition (accouchement).

C burneti est très résistant aux agents extérieurs. Bien que ne se répliquant que dans les cellules, elle Survie longtemps dans l'environnement.

204

3,4

Autres bactéries

> Pouvoir pathogène —

La forme aiguê est caractérisée par une flèvre isolée, une hépatite et / ou une pneumonie atypique. Chez la femme enceinte elle peut provoquer une placentite conduisant à une prématurité, un avortement ou une infection in utero.

—

Les formes chroniques regroupent surtout des endocardites à hémoculture négative. Ces endocardites surviennent sur un terrain favorable comme une valvulopa+ thie préexistante, une infection sur prothèse ou sur anévrisme, Chez la femme cette forme chronique peut donner des fausses couches à répétitions.

> Echantillons biologiques Les échantillons sont hautement contaminants et doivent être traités en laboratoire de sécurité de niveau 3: laboratoires spécialisés.

Sang, biopsie hépatique ou pulmonaire, ou placenta ou lait.

> Diagnostic direct e Examen direct: Les bactéries sont difficilement visibles par coloration de Gram. La coloration la plus adaptée est la coloration de Gimenez (fuschine basique).

e Isolement des bactéries en culture cellulaire: La culture est possible sur flbroblastes mais dans un laboratoire spécialisé. La bactérie est très dangereuse à manipuler au laboratoire car tres contagieuse. e Biologie moléculaire: Des techniques spécifiques recherchant l'ADN bactérien par PCR sont possibles.

> Diagnostic indirect Devant la complexité et“la dangerosité du diagnostic direct, la sérologie est la principale méthode de diagnostic de C.burnetil Cburneti cultivée sur des fibroblastes (souche Nine Mile) présente des antigènes de phase Il, alors que ceux prélevés sur des rates de souris présentent des antigènes de phase |. Les phases permettent de diagnostiquer les infections tardives des infections aiguës. e Forme aiguë: Les IgM apparaissent généralement deux semaines après l'infection et disparaissent en quelques mois. Ils ne sont pas spécifiques de phase. Les lgG apparaissent quelques jours plus tard et persistent pendant des années. 205

Bacté riologie et virologie pratique

Au cours de l'infect on aiguë il existe un titre élevé d'IgG anti phase Il avec un titre plus faible

d'IgG anti phase | et éventuellement la présence d'IgM Un titre d'IgG anti phase || > à 200 est considéré par le centre national de référence de Cburneti comme significatif d'une infection aiguê.

6 orme chronique: Le diagnostic est suspecté devant u 1 taux d'IgG anti phase | > 800 et est porté si ce taux est - à 1600 et ceci quelle que soit le taux d'IgG anti phase Il,

> Sensibilité aux antibiotiques LES a tibiotiques

régulièrement sensibles sont les cyclines, la rifampicine, et les fluoroquinolo1es. Aucun n'est bactéricide. £

Toute ois la bactérie étant intracellulaire la diffusion de l’antibiotique dans ce compartiment est

très importante, Ainsi les cyclines sont le traitement de choix. La du ée du traitement est de 3 semaines au moins dans la forme aiguë et de 3 ans dans les endocardites.

Dans es formes chroniques il semble que l'ac ivité de la doxycycline soit diminuée par l'acidité du pH lysosomial. On rajoute des agents alcalinisants le lysosome (hydroxychloroquine ou Plaquenil®) pour rétablir l'activité de l’antibiotiq UE,

206

3.4

Bactéries cytoparasites

obligatoires

|

Autres

bactéries

@

HE UANEE Cult +/-

> Habitat Bactéries à développement intracellulaire obligatoire. 3 espèces pathogènes pour l'homme : Chlamydia trachomatis (origine humaine) différents sérovars À à C, D à K, L1, L2, 3

Chlamydophila pneumoniae (origine humaine) Chlamydophila psitaci (origine aviaire)

> Pouvoir pathogène e

C. trachomatis —

Infections génitales: sérovars D à K, principale cause d'IST. La transmission est directe par relations sexuelles. — Chez l'homme : urétrite non gonococcique ou post gonococcique, épididymite — Chez la femme: cervicite urétrite qui peut être asymptomatique mais les complications salpingite, pelvipéritonite peuvent entrainer un état de stérilité, de grossesse extra utérine. 207

Bactériologie et virologie pratique

—

maladie de Nicolas Favre: sérovar L1, L2, L3 répandue dans les régions tropicales mais en recrudescence en Europe chez les homosexuels (adénite inguinale, rectte aigue).

—

Infections oculaires: —_ Trachome :kératoconjonctivite chronique exceptionnelle en France, mais princi-

pale cause de cécité dans le monde. Sérovar À à C — _Conjonctivite chez l'adulte à la suite d'une infection génitale — Conjonctivite du nouveau-né suite à une contamination au moment de l'accourchement qui peut Se compliquer d'une pneumopathie interstitielle.

—

Syndrome de Fiessinger-Leroy — Reiter:arthrite, uvéite, urétrite.

°C. pneumoniae

e

—

Infections respiratoires :pharyngite qui peut évoluer vers une bronchite où une pneumopathie qui reste le plus souvent pauci symptomatique.

—

Maladie coronarienne : nombreux arguments er faveur du rôle de C pneumoniae dans la maladie athéromateuse coronarienne.

C.psittaci —

Infection respiratoire :ornithosepsittacose caractérise par un syndrome pseudogrippal jusqu'à une pneumopathie sévère.

> Echantillons biologiques Selon les infections pour GC trachomatis : nécessité d'obtenir des cellules par grattage des muqueuses infectées —

génitales: — chez la femme: écouvilonnage endocol, biopsie endomètre, liquide cul de sac fme Douglas, urêtre — chez l'homme :écouvilonnage urètre (1 à 2 cm dans le canal urétral) ou premier jet d'urine — dans le cas de LGV: écouvilonnage anorectal ou ponction ganglion

—

oculaires :grattage de la conjonctive

—

pneumopathies :aspiration endotrachéale

Les conditions de transport sont strictes pour la culture :à +4°C, dans un milieu de transport spécifique pour assurer la viabilité comme milieu 2SP (saccharose, phosphate) ou M4RT.

208

A

3.4

Autres

bactéries

> Diagnostic direct: pour C. trachomatis e Par culture cellulaire: méthode de référence sur cellules McCoy ou HeLa avec mise en évidence des inclusions intracytoplasmiques à l'aide d'anticorps monoclonaux. e Par tests antigéniques : Immunofluorescence sur frottis ou technique ELISA mais manque de sensibilité

e Par biologie moléculaire: différentes trousses d'amplification génique sont commerciaisées et permettent la détection dans les urines, sur les écouvillonnages d'endocol ou urétral, mais également dans un écouvilonnage vulvo-vaginal chez la femme. Bonne sensibilité de cette méthode.

> Diagnostic indirect Différentes techniques : il est souvent difficile de distinguer une cicatrice sérologique d'une infection évolutive, en raison de la persistance des anticorps. Réaction de fixation du complément : limitée au diagnostic de l'ornithose

Réaction immunoenzymatique Immunofluorescence indirecte :il existe une communauté antigénique importante entre les 3 espèces qui rend difficile l'interprétation,

:

Pour C trachomatis, le sérodiagnostic est limité aux infections hautes, aux ulcérations évoquant une LGV, dans le cadre d'un bilan d'infertilité, et aux pneumopathies du nouveau-né. Le diagnostic d'infection aigue est porté sur une séroconversion ou la présence d'IgM pour C. pneumonie.

> Sensibilité aux antibiotiques Pas d'antibiogramme possible en routine Les antibiotiques actifs sont: —

Macrolïdes :azithromycine en traitement minute

—

Tétracyclines ‘doxycycline

—

Huoroquinolones :ofloxacine

Réseau de surveillance RENACHLA en France

209

Bactériologie

et virologie

pratique

Spirochaetales

NSB;, Spirille,

0$, Cuit > Habitat Les tréponèmes colonisent les muqueuses génitales, orales et digestives humaines et animales. La plupart sont non pathogènes. Seuls quatre tréponèmes sont pathogènes pour l'homme. lreponema pallidum subsp. pallidum est responsable de la syphilis vénérienne.

> Pouvoir pathogène °__T. pallidum subsp. pallidum Responsable de la syphills vénérienne. La transmission est sexuelle et l'infection évolue en 3 phases: ù

—

Phase primaire :chancre apparaissant 3 semaines après un contact sexuel. Ulcération, unique, rosée, supericiel sur base indurée, propre et indolore. Adénopathie mobile indolore et unilatérale, Guérison spontanée en 4 semaines environ.

—

Phase secondaire: liée à la dissémination septicémique survenant quelques semaines après le chancre. Signes cutanés polymorphes prédominent: roséole (macules roses), syphilides (papules rouges) localisées aux extrémités et conta-

gieuses, plaques muqueuses. —

Phase tertiaire: survient plusieurs années après la contamination en absence de traitement. Signes cutanés (gommes), cardiovasculaires (aortites, anévrysmes de la crosse aortique) et neurologiques (heurosyphilis avec tabès, paralysie, gammes cérébrales)

La syphilis congénitale survient en cas de syphilis secondaire chez une femme enceinte.

+

_T. pallidum subsp. partenue ou endemicum, T. carateum

Responsables respectivement du pian, du béjel et de la pinta (ou caraté

> Echantillons biologiques Sérum, prélèvement par écouvillonnage du chancre, des plaques muqueuses ou des syphilides ou ponction ganglionnaire pour le diagnostic direct,

210

3.4

Autres

bactéries

> Diagnostic direct Mise en évidence de bactéries spiralées mobiles au microscope à fond noir. Recherche par immunofluorescence où PCR. Treponema pallidum n'est pas cultivable sur milieux artificiels (nécessite d'inoculations au lapin)

> Diagnostic indirect Recherche d'Ac contre les Ag tréponémiques :TPHA (Treponema pallidum Haemaglutination Assay — hémagglutnation passive d'hématies de mouton couvertes d'Ag), FTA-abs (Fluorescent Treponema Assay — IF indirecte après adsorption), EIA (immunoenzymatique) et test de Nelson {immobilisation des tréponèmes). Ces tests sont plus spécifiques que le suivant,

Recherche d'Ac contre le cardiolipide : VDRL (Venereal Disease Research Laboratory — aggluünation de particules de latex ou de charbon sensibilisées). Des faux positifs sont possibles en particulier en cas de troubles dysimmunitaires Titre d'Ac

FTA

Nelson

À

20

30

60

80

jours

Contamination

Les dépistages associent VDRL+TPHA (obligatoire en prénuptial et lors d'une déclaration de grossesse). En cas de testS négatifs et de suspicion clinique faire un FTA-abs à la recherche d'IgM. En cas de traitement précoce les résultats des tests se négativent.

> Sensibilité aux antibiotiques La bactérie est sensible aux pénicilines, aux cyclines et aux macrolides (allergie aux pénicillines). La référence sont les pénicilines retard en injection unique (benzathine-benzyl pénicilline ou Extenciline® IM). Pour les phases tardives, le traitement par péniciline doit être efficace pendant 2 à 3 semaines et peut conduire à une réaction d'Herxheimer (allergie aux composants bactériens libérés) nécessitant d'associer une corticothérapie.

211

Bactériologie et virologie pratique

L'efficacité est validée sur le suivi des taux d'Ac par le VDRL quantitatif qui décroissent et se négativent. Le TPHA se négative rarement en dehors des syphilis primaires traitées. La prévention repose sur le dépistage, le traitement des sujets infectés et l'utilisation de préservatif.

3.4

Spirochaetales | | orrelia burgdoferi

. :

Autres bactéries

NSB:, Spirille, 0” Cult +/-

La borréliose de Lyme a été découverte en 1975 dans dans la ville éponyme du Connecticut (USA). Ily avait alors de nombreux cas d'arthrites chez des enfants. Toutefois cette maladie est connue depuis 1909, À cette date un médecin suédois, Afzelius, décrivit la manifestation principale de cette affection, Erythema chronicum migrans (ECM).

> Habitat Le réservoir est essentiellement constitué des rongeurs et des cervidés. L'homme est un hôte accidentel. || se contamine par morsure de tique en forêt, principalement entre le printemps et l'automne. Le risque de développer une maladie de Lyme après une morsure de tique est inférieur à 1 %. Ce germe existe dans toutes les régions tempérées :Amérique du ti Europe, Asie, Australie, Afrique du Sud.

> Pouvoir pathogène Les facteurs de virulence sont mal connus. Toutefois différentes protéines de surface (OSP = outer surface protein) ont été décrites. Elles sont le siège de variations antigéniques. La maladie se décompose en 3 phases: —

Phase primaire: Elle apparaît quelques jours après la morsure de tique (qui peut passer inaperçue). C'est une lésion cutanée de type érythème cutané migrant (ECM). D'un point de vue clinique c'est une macule puis une papule rouge, chaude, inflammatoire, non prurigineuse, s'étendant de façon centrifuge en cocarde pour prendre un aspect annulaire qui peut dépasser 50 cm de diamètre. Cette lésion disparaît ensuite spontanément en quelques semaines sans laisser de cicatrice.

—

Phase secondaire: Quelques semaines plus tard, des signes cardiaques, neurologiques (méningite à liquide clair, radiculite algique, paralysie faciale à figore), articulaires ou cutanées apparaissent. Ils sont dus à la dissémination de la bactérie par septicémie. Ces symptômes peuvent guérir spontanément.

—

Phase tertiaire: Plusieurs mois après la contamination, peuvent apparaître des complications articulaires (arthrites chroniques), cutanées (acrodermite chronique atrophiante de Pick-Herxheimer) ou neurologiques.

213

Bactériologie et virologie pratique

>

Echantillons biologiques

Les prélèvements où ces bactéries pourront être isolées sont :les lésions cutanées, les hémocultures, le LCR et le liquide articulaire,

> Diagnostic direct ° Culture: Elle est longue et difficile. Elle est réservée à des laboratoires spécialisés. Peu sensible. ° Par PCR: Elle est effectuée dans les urines, les biopsies cutanées et surtout synoviales (+++). Elle est très spécifique et très sensible mais n'est pas standardisée.

> Diagnostic indirect e _ Sérologie: c'est le diagnostic principal de la maladie de Lyme. Elle peut être effectué dans le sérum, le LCR et le liquide articulaire. Les techniques sont les suivantes :

—

ELISA (ici le choix de l'Ag est primordial) ou parfois Immunofluorescence indirecte Ag = bactérie entière). Elle est positive dans 50 % des cas à la phase primaire et dans 100 % des cas aux deux phases suivantes. Les réactions peuvent manquer de spécificité et notamment croiser avec 7eponema, LeptoSpira, étles autres borrélioses. Il est préférable ainsi devant toute séroogie positive de toujours faire en parallèle une sérologie syphilitique.

—

°

Western blot: Cette méthode est utilisée pour confirmer l'IFI ou l'ELISA positifs. Elle est utile dans les zones à forte endémicité.

Par l'épreuve thérapeutique: Le diagnostic biologique étant parfois décevant.

> Sensibilité aux antibiotiques La bactérie est sensible aux B-lactamines qui constitue le traitement de choix. Toutefois elle est aussi Sensible aux cyclines et aux macrolides.

214

4,1 Virus À ADN Adénovirus |

Elecdes ee dae, genre bone espècesques nn. à Ê Virus de taille moyenne (100 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin linéaire de 35 Kb environ. Présence de spicules hémagglutinantes. Réplication intranucléaire dans de nombreuses types cellulaires. Spicule

Génome

(

Capside

Protéines internes

> Epidémiologie-” Virus résistant dans l'environnement et à la 7 De directe où fes e par voie fécoorale, aérienne ou l'environnement. Cas sporadiques ou épidémies. Virus strictement humain.

> Pouvoir pathogène

:

P—

Incubation de durée variable, courte en général. Les formes nd.

e

sont A

Infections respiratoires (B, C et E): Pharyngites (AdV 1, 2, 5 et6), angines de l'enfant, rarement pneumopainies, … 215

Bactériologie et virologie pratique

°

Infections digestives (A et F): gastro-entérites de l'enfant (AdV 40 et 41), adenite mésentériques, …….

°

Infections urinaire (B): cysüte hémorragique (AdV 11, 21, 34 et 35), néphrite,

°

Infections oculaires (B et D): conjoncüvite hémorragique aiguë, kérato-conjonctivite épidémique (AdV 8, 19 et 37),

+ Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas de formes sévères. Selles, sécrétions naso-pharyngées, cutanéo-muqueux et autres sites atteints: recherche de l'ADN ou des antigènes viraux.

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR qualitative (rarement faite)

—

Recherche du virus par culture :possible sur cellules Hela ou Hep2 avec un ECP en 3 à 15 jours, sauf pour les AdV 40 et 41. -_ Recherche d’antigènes viraux: par agglutination ou ELISA dans les selles

> Diagnostic indirect —

Recherche d'anticorps spécifiques : en réaction de déviation du complément ou en ELISA, La présence d'IgM signe une primo-infection, La présence d'IgG signe une infection ancienne.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables de diarrhées aiguës de l'enfant (rotavirus), ou d'infections respiratoires

> Traitement prophylactique ou curatif Ho —

Prophylaxie:

Pas de vaccin disponible.

—

Traitement:

Pas de traitement antiviral spécifique. Traitement symptomatique

4,1

Virus à AD

ECP sur MRC5

> Taxonomie etStructure Famille des Herpesviridae, sous-famille des Alohaherpesvirinae, genre Simplexvirus, espèces Human herpes virus 1 (HHV-1 ou HSV-7) et Human herpes virus 2 (HHV-2 ou HSV-2)

Virus de grande taille (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 152 kb. Réplication intranucléaire.

Capside Protéines internes

Protéines enveloppe

217

Bactériologie

et virologie

pratique

>» Epidémiologie

;

De

otre

Virus fragile, contamination par contact direct étroit ou indirect (objets souillés). Cas sporadiques. Virus strictement humain, La prévalence des anticorps HSV-1 chez l'adulte varie de 40 à 95 % selon le niveau d'hygiène des populations (60 % environ en France), celle de HSV-2 est d'environ 15 % en France. Habituellement HSV-1 est responsable d'infections oro-pharyngées etHSV-2 d'infections génitales,

> Physiopathologie Après contamination et réplication locale, le virus migre par voie axonale vers le corps cellulaire du neurone sensitif Innervant le territoire correspondant. Dans le noyau de ce dernier, le génome se circularise sous forme épisomique et persiste sans réplication virale. Cette latence peut être interrompue et provoquer des réactivations. Le virus migre alors vers l8 même territoire cutanéo-muqueux par voie axonale. Ces réactivations sont associées à une réplication et une excrétion locale du virus. Epithélium

GangJlion nerveux

Système nerveux

cutanée ou muqueux

sensitif

central

© © virion Latence

Migration axonale

Réactivation L——

> Pouvoir pathogène

>

-

es.

Incubation courte, La symptomatologie est due au tropisme cutanéo-muqueux et neurologique du virus (latence neurologique). La primoinfection et les réactivations sont le plus souvent asymptomatiques,

+ Gingivostomatite: primo-infection clinique survenant chez l'enfant et associant une éruption vésiculeuse douloureuse buccale associée à une fièvre et des adénopathies. Guérison spontanée avec latence dans le ganglion de Gasser.

218

4,1

Virus à AT

Herpès génital: primo-infection symptomat ique au niveau génital avec une érupti vésiculeuse douloureuse, inflammatoire associée à une fièvre, des adénopathies inguinal u 1e dyspareunie et éventuellement des signes mé ningés. Ulcé ration rapide des vésicules p

( uérison spontanée, Récurrences labiales où génitales boss bles sous |effet d'un stress, des UV des .. Eruption vésiculeuse en b ouquet survenant toujours au même site (bouton de fièvre), précédée de brûl U fes avec € n général une symptomatologie m oins intense qu e celle de la primo-in ection et u ne guérison spontanée. Les réact \Vations peuvent être asy mpitomatiques et s'acco mpagner d'une excrét ion virale. nenstruations (herpès cataménial),

Autres localisations : herpès oculaire (kéraïite à HSV-1), encéphalite herpétique (encéph alite fébri e aiguë à HSV-1 surve nant chez l'adulte jeun e), méningite à HSV-2, herpès néonatal (contan nination lors de l'accouc hement : formes cutanées, neurologiques ou disséminées d'évolution gravissime avec encéph alite, hépatite, éruption généralisée), herpès disséminé ou profond de l'immunodéprimé, syndron ne de Kaposi-Juliusberg (herpès sur un eczéma).

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique. Sang (sérum ou sang total):recherche d'anticorps, virémie (ADNémie) Ecouvillonnage des lésions cutanéo-muqueuses (oro-pharynx, génitales, .…): recherche de l'ADN viral ou du virus

LCR, Orifices chez le nouveau-né (Œil, nez, gorge, oreilles, vulve),.

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR qualitative ou quantitative en temps réel, permettant la discrimination HSV-1 et 2.

—

Recherche d’antigènes viraux :par ELISA (moins sensible que la PCR) ou par IF (discrimination HSV-1 et 2),

—

Recherche du virus par culture: culture facile en 24 à 48h avec ECP caractéristique (grappe de raisin). Confirmation et typage par IF ou PCR.

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques :IgG (HSV-1+2) pour contrôle d'immunité post-infectieuse. Des tests ELISA spécifiques de l'HSV-2 sont utilisés en épidémiologie. Les IgM ont peu d'intérêt du fait de la facilité du diagnostic direct.

2119

Bactériologie et virotogie pratique

—

En cas d'encéphalite virale, la recherche d'interféron dans le LCR est positive (forte sécrétion)

—

Une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) est souvent notée lors d'une infection sévère à HSV.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'éruptions vésiculeuses (VZV, entérovirus) ou l'herpes circiné (dermatophyte). Avec les virus responsables d'encéphalites (CMV, JCV, fièvres hémorragiques, .….) où de méningites (entérovirus).

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible. Hygiène personnelle et prévention des IST (préservatif) Prélèvement génital pour recherche de l'HSV chez les femmes enceintes à terme ayant des antécédents d'herpès génital. En cas de récurrence, de primo-infection clinique ou de détection virale, ors de l'accouchement une prévention adaptée doit être faite:décontamination des voies génitaes et de l'enfant, aciclovir, éventuellement césarienne. Un dépistage chez l'enfant est possible. Traitement: L'aciclovir (ACV, per os, IV, crème, Zovirax®) est l'antiviral de choix. C'est un analogue acyclique de la guanosine (analogue nucléosidique) qui après une première phosphorylation par une hymidine kinase virale (TK) va‘inhiber sous forme tiphosphoryiée l'ADN-polymérase virale. | agit comme un +terminateur de chaîne et a une haute spécificité. Le valaciclovir (Zélitrex®) est une prodrogue (ester de L-valine) de l'aciclovir qui permet une meilleure biodisponibilité par voie orale, Le famciclovir (FCV, per os, Oravir®), prodrogue du penciclovir (PCV), est un analogue acyclique de la guanosine phosphorylé par les TK cellulaires et ayant une activité de perturbation de l'élongation. Certains virus deviennent résistants par mutation de la TK virale (perte de spécificité ou d'activité) ou de l'ADN polymérase virale. Des explorations génotypique et phénotypique de ces ésistances sont possibles dans des laboratoires spécialisés (CNR). Le traitement est local ou oral dans les formes bénignes, oral dans la prévention des herpès écidivant et IV en urgence dans les formes sévères, Le foscarnet (acide phosphonoformique, PFA, IV, Foscavir®) est un analogue du pyrophosphate et inhibe directement l'ADN polymérase virale. Le cidofovir (CDV, IV, Vistide®) est un analogue monophosphorylé de la cytosine qui agit sous forme triphosphorylée (indépendamment de la TK). Ces molécules néphrotoxiques ne sont utilisées qu'en seconde intention dans les formes sévères. D'autres molécules antivirales (toxiques) sont utilisables en traitement local de l’herpès ophtalmique (IdU, Ara-A, TFT, ...).

220

4.1

Virus de la varicelle

:

LUE EN (74)

U

Virus à ADN

An, ©

Détection en IE

ECP en culture

> Taxonomie et Structure Le espèce Famille des Herpesviridae, sous-famille des Alphaherpesvirnae, genreD Human herpes virus 3 (HHV-3 ou VZV) Virus de grande taille (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 125 kb. Réplication intranucléaire, Capside Protéines

internes

Génome

Protéines

enveloppe

Tégument

Ai

Bactériologie et virologie pratique

>» Epidémiologie Virus fragile, contamination par contact direct ou indirect (objets souilés, voie Re POSsible, Virus hautement contagieux provoquant de ie épidémies. Virus strictement humain. La prévalence des anticorps VZV chez l'adulte est > 95 %.

> Physiopathologie Après contamination, le virus se multiplie dans le nœud ne ns puis après une première virémie, il gagne le système réticulo-endothélial.

le site ed en

Noeud lymphatique

Epithélium æ)_ ©

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Virémie © Re

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vésiculeuse

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Système

réticulo-endothélial

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secondaire SRE

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épisome Latence

Migration axonale

L]

Réactivation

Pouvoir pathogène Incubation de 14 jours en moyenne. La symptomatologie est due au tropisme cutanéo-muqueux et neurologique du virus (latence neurologique dans les ganglions nerveux sensitifs), La primoinfection (varicelle) et les réactivations (zona) sont le plus souvent symptomatiques.

* Varicelle: éruption vésiculeuse généralisée et prurigineuse, débutant au niveau du tronc et évoluant en plusieurs poussées dans un contexte fébrile ( ASAT) est souvent notée lors d'une infection sévère à VZV,

Bactériologie et virotogie pratique

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'éruptions vésiculeuses (HSV, entérovirus).

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin à virus vivant atténué avec des recommandations limitées aux sujets non immunisés au contact des immunodéprimés ou aux sujets avant immunodépression ou immunodéprimés {hors HV). Contre-indication en cas de grossesse. Immunoglobulines spécifiques (Z1G ou Varitec®) en cas d'exposition chez un sujet à risque. Hygiène personnelle et éviction scolaire conseillée jusqu'à disparition complète des croûtes, Traitement: oymptomatique le plus souvent pour une varicelle de l'enfant (ongles courts, désinfection à la

chlorhexidine)

|

Les +formes graves ou sévères sont traitées par l'aciclovir (ACV, Zovirax®, per os, IV) ou le valaciclovir (Zelitrex®). Le penciclovir (PCV, per os), le foscarnet (acide phosphonoformique, PA, IV, Foscavir®) et le cidofovir (CDV, V Vistide®) sont également actif sur ce virus.

224

4,1

Virus à AD

Virus Epstein-Barr (A1)

.

ADN,

> Taxonomie etStructure Famille des Herpesviridae, sous-famille des Gammaherpesvirinae, genre Lymphocryptovirus, espèce Human herpes virus 4 (HHV-4 ou EBV). Virus de grande taille (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 186 kb. Réplication intranucléaire dans les lymphocytes B.

Capside Protéines internes”

Génome

nt|

Protéines

oi Be

re

Tégument

> Epidémiologie

Ee

_

_——

Virus fragile, contamination par contact direct (salive, sang, sexuel). Cas sporadiques. Virus strictement humain. La prévalence des anticorps EBV chez l'adulte est > 95%.

> Pouvoir pathogène Incubation longue. La symptomatologie est due au tropisme pour les cellules épithéliales et les lymphocytes B (latence lymphocytaire de plusieurs types en fonctions de l'expression du génome). Virus transformant les lymphocytes B. La primoinfection et les réactivations sont le plus souvent asymptomatiques. Virus oncogène,

Fréquent: ° Mononucléose infectieuse (MNI): primo-infection symptomatique à EBV survenant chez l'adolescent ou le jeune adulte. Fièvre prolongée avec angine souvent pseudomembra225

Bactériologie et virologie pratique

1euse, asthénie, polyadénopathie, splénomégalie, rash (surtout après administration d'ampiciline). Évolution favorable en 2-3 semaines. Syndrome mononucléosique sanguin fréquent (profération des lymphocytes T en réponse à l'infection des lymphocytes B), cytolyse hépatique 1odérée, Complications possibles :thrombopénie, rupture de rate, atteintes neurologiques, … ° Excrétion virale salivaire longue (> à 6 mois) expliquant son surnom de maladie du Daiser. Rare:

e Syndrome de Purtilo: infection à EBV gravissime survenant sur un terrain génétique particulier (déficit immunitaire lié à l'X). e Lymphome de Burkitt (prolifération lymphocytaire B) touchant surtout les enfants en Afrique et Nouvelle Guinée) et carcinome du nasopharynx (adultes en Chine, Afrique du Nord), maladie de Hodgkin

> Echantillons biologiques

LE

Diagnostic biologique systématique en cas de formes sévères. Sang (sérum ou sang total): recherche d'anticorps (MNI Test,.….), virémie (ADNémie) Y

Diagnostic direct:

|

Recherche du génome viral: PCR quantitative en temps réel sur sang total.

|

Recherche du virus par culture: non fait en routine. Mise en évidence du caractere transformant des lymphocytes B.

> Diagnostic indirect —

Recherche d'anticorps hétérophiles :MNI test (enfant > 6 ans uniquement), réaction de Paul Bunnell Davidsohn (Ac anti-Forssmann).

Recherche d'anticorps spécifiques :en ELISA ou en IF. IgG VCA, IgM VCA (Viral Capsid Ag), IgG EBNA (EB Nuclear Ag), 1gG EA (Early Ag). La présence d'IgM VCA isolée signe une MN. La présence d'IgG VCA et EBNA signe une infection ancienne. La présence des 3 marqueurs est en faveur d'une réactivation, Les Ac anti EBNÀ peuvent être absents chez l'immunodéprimé.

226

4,1

1gG VCA nfection ancienne

_

Primo-infection

3e

nfection active

a

Lymphome de burkitt lié à EBV

++

Carcinome du nasopharynx ié à EBV

De

IgM VCA

IgG EA

Virus à ADN

_ lgG EBNA

-

IgG VCA

des niveau marqueurs

4 à 8 semaines ET contamination

1 à3 mois

temps

Une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) est souvent notée lors d'une infection sévère à EBV.

> Diagnostic différentiel | cm HV Lu Avec les autres agents responsables de syndromes de avec fausses (angine diphtérie la particulier en d'angines responsables agents Les …). mose, membranes). De trop nombreuses angines à EBV sont encore diagnostiqué comme angine bactérienne et traité par de l'amoxiciline, provoquant alors parfois des éruptions cutanées.

PPT

Bactériologie et virologie pratique

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible.

Dépistage lors des dons d'organes et de tissus. Suivi des lymphoproliférations des immunodéprimés, risque de lymphomes. Traitement: Traitement symptomatique. Pas de traitement antiviral spécifique.

A

ture

Détection

TATISR A MAD)

par IF (antigènémie

> Taxonomie etStructure Famille des Hervesviridae, sous-famille des Betaherpesvirinae, genre Cytomegalovirus, espèce Human hervesvirus 5 (HHV-5 ou HCMV)

Capside Protéines Génome

internes

Protéines BERSERES

Tégument

229

Bactériologie et virologie pratique

Virus de grande taile (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 240 kb. Réplication intranucléaire dans les fibroblastes, les leucocytes, cellules endothéliales et épithéliales.

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traductions séquentielles

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transcriptions

Q séquentielles @e

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Epidémiologie Virus fragile. Virus strictement humain, La prévalence des anticorps CMV chez l'adulte est de 50 % en France, 90-100 % dans les PED.

Contamination par les sécrétions oropharyngés essentiellement. Contamination possible, par voie sanguine où sexuelle essentiellement. Contamination enfant mère essentiellement par les sécrétions oro-pharyngé et les urines (lors du change de bébé). Dans le sens mère enfant contamination ja utero, par le lait maternel et par les sécrétions oro-pharyngés. 230

4,1

Virus à ADN

> Pouvoir pathogène Incubation longue (30 jours). La primoinfection et les réactivations sont le plus souvent asympEE Latence systématique dans les monocytes et cellules endothéliales. tomatiques.

*__ Primo-infection: Chez l'enfant le plus souvent asymptomatique malgré quelques adénopathies. Chez l'adulte asymptomatique sinon fièvre prolongée avec polyadénopathie, parfois céphalées, Splénomégalie. Syndrome mononucléosique sanguin, thrombopénie et cytolyse hépatique fréquentes. Rares complications :hépatite, méningo-encéphalite, polyradiculonévrite de Guillain Barré + Infection congénitale: en cas de contamination précoce avec anomalies auditives, oculaires, où neurologiques. Rare maladie des inclusions cytomégaliques (fœætopathie active SÉVÈTE) Infections viscérales, pneumopathies interstitielles (allogreffe de moelle), rénales (greffe de rein), rétinopathies (SIDA, < 50 lymphocytes T CD4* /mm)

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique : —

Suspicion d'infection materno-fϾtale

—

En cas de formes sévères ou chez l'immunodéprimé.

—

Peut être proposé devant tout RCIU non étiquetté

Sang (sérum ou sang total):recherche d'anticorps, virémie (ADNémie) Liquide amniotique, LCR, Lait, sperme,.…. Toujours confirmer un diagnostic prénatal sur le nouveau-né,

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR quantitative en temps réel sur sang total, liquide amniotique, …

—

Recherche du virus par culture: culture classique avec ECP lent (10-20 jours) mais caractéristique sur cellules MRCS (fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains). Culture rapide en 24h avec centrifugation après inoculation, puis révélation par un Ac anti-Ag très précoce du CMV marqué à la péroxydase (IP) (marquage des noyaux en marron).

—

Recherche de l'Ag pp65 (antigènémie) : Mise en évidence par IF de la protéine pp65 du CMV dans le noyau après cytocentrifugation de 200 000 polynucléaires. Test quantitatif.

231

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : en ELISA. La présence d'IgM signe une infection active (primo-infection ou réactivation). La présence d'IgG signe une infection ancienne. Une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) est souvent notée lors d'une infection sévère à CMV, La datation de l'infection, très utile lors d'une suspicion d'infection materno-fætale utilise l'index d'avidité des 1gG permettant de dater l'infection > à 3 mois ou < à 3 mois.

> Diagnostic différentiel Avec les autres agents responsables de syndromes mononucléosiques (EBV, HIV, toxoplasmose, …). Dans le cadre d'une grossesse : rubéole, B19V ou tout autre maladie provoquant des anomalies fætales comparable à l'infection in utéro à CMV.

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible (recherche active sur le sujet). Hygiène, éviter les enfants malades et les contacts salivaires (femmes enceintes séronégatives pour le CMV vis-à-vis notamment de jeunes enfants). Dépistage lors des dons d'organes mais pas de dépistage recommandé en France pour les femmes enceintes devant l'absence de traitement validé dans cette population. Suivi des sujets greffés (avec traitement préemptif, traitement lors de la positivité de la virémie et avant les signes cliniques) Traitement: Chez l’immunodéprimé, et si on dispose de cette possibilité, levée éventuelle de l’immunodépression.

Le ganciclovir (GCV, Cymévan”, per os, IV) est l'antiviral de choix. C'est un analogue acyclique de la guanosine (analogue nucléosidique) qui après une première phosphorylation par une thymidine kinase virale (UL97) va inhiber sous forme triphosphorylé l'ADN-polymérase virale (UL54). Il agit comme un terminateur de chaîne et a une haute spécificité. Le valganciclovir (Rovalcyte®) est une prodrogue (ester de L-valine) du ganciclovir qui permet une meilleure biodisponibilité par voie orale,

Certains virus deviennent résistants par mutation de la TK (perte de spécificité ou d'activité) ou de l'ADN polymérase virales.

Le traitement est oral dans les formes bénignes ou en préventif (greffes) et IV en urgence dans les formes sévères.

232

4,1

Virus à ADN

Le foscarnet (acide phosphonoformique, PFA, IV, Foscavir®) est un analogue du pyrophosphate et inhibe directement l'ADN polymérase virale. Le cidofovir (CDV, IV Vistide® Forvade®) est un analogue monophosphoryié de la cytosine qui agit sous forme triphosphorylée (indépendamment de la TK). Ces molécules néphrotoxiques ne sont utilisées qu'en seconde intention dans les formes sévères. Le formivirsen (Vitravene®) est un oligonucléotide antisens actif en intravitréen sur les rétinites à CMV,

Immunothérapie a êté parfois utilisé. En cours d'évaluation : maribavir (inhibiteur de la TK) et tomeglovir (inhibiteur la terminase)

CNR Cytomégalovirus CHU Limoges Laboratoire de Bactériologie Virologie Hygiène 2 avenue Martin-Luther-King 87042 Limoges Cedex

233

Bactériologie et virologie pratique

HHV-6 / 7

ADN.

>» Taxonomie et Structure

|

Famille des Herpesviridae, sous-famille des Betaherpesvirinae, genre Roseolovirus, espèces Human herpesvirus 6 et 7 (HHV-6 et 7). Virus de grande taille (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 150 kb environ, Réplication intranucléaire dans les fibroblastes, les leucocytes, cellules endothéliales et épithéliales. Capside

Protéines Génome

internes

ià

Protéines Be

Tégument

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par les sécrétions oro-pharyngées, par voie sanguine ou sexuelle. Transmission possible mêre-enfant, Virus strictement humain. La prévalence des anticorps HHV-6 chez l'adulte est de plus de 90 % en France.

> Pouvoir pathogène Incubation longue, La primo-infection et les réactivations sont le plus souvent asymptomatiques. Latence systématique dans les monocytes et cellules endothéliales,

+ Exanthème subit (6° maladie infantile): primo-infection associant, fièvre élevée de 2-8 jours suivie d'un exanthème rubéoliforme. Possibles thrombopénies, syndromes mononucléosiques, atteintes neurologiques.

+ Réactivations chez l’immunodéprimé: fièvre, leucopénie, hépatites, atteintes neurologiques. 234

4,1

Virus à ADN

Diagnostic biologique non systématique. Sang (sérum ou sang total):recherche d'anticorps, virémie (ADNémie) LCR, Lait, sperme, liquide amniotique,…

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR qualitative ou quantitative en temps réel sur sang total

>Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques: en ELISA. La présence d'IgM signe une infection active (primo-infection ou réactivation) survenant en général dans la petite enfance. La présence d'IgG signe une infection ancienne.

> Traitement prophylactique ou curatif Pas de vaccin disponible. Pas de traitement spécifique en dehors de la levée éventuelle de lIMMUNOSUPPressIoN

235

Bactériologie et virologie pratique

ADN.

> Taxonomie et Structure Farilé des Herpesviridae, sous-famille des PE" ae, genre Rhadinovirus, espèce Human herpesvirus8 (HHV-8),. Virus de grande taile (150 à 200 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin de 160 kb. Réplication intranucléaire dans les leucocytes, celules endothéliales et épithéliales. Capside Protéines internes

Génome

ar Protéines t Be

Tégument

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par les sécrétions oro-pharyngées, par voie sanguine ou sexuelle. Transmission possible mère-enfant. Cas sporadiques. Virus strictement humain. La prévalence des anticorps HHV-8 chez l'adulte est de 2 % en France, jusqu'à 50 % dans certains PED, Virus oncogène.

> Pouvoir pathogène Incubation longue. La primoinfection et les réactivations sont le plus souvent asymptomatiques. Latence systématique dans les monocytes et cellules endothéliales. Responsable de pathologies essentiellement chez les sujets immunodéprimés.

+ Maladie de Kaposi: pathologie initialement cutanée faite de tumeurs cutanées violacées {néo-angiogénèse) pouvant disséminer dans l'organisme.

236

4,1

°

LymphomeB

Virus à ADN

primitif des séreuses, maladie de Castleman multicentrique.

>» Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique. Sang (sérum ou sang total): recherche d'anticorps, virémie (ADNémie)

>» Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR qualitative ou quantitative en temps réel sur sang total.

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps

ee

en ELISA.

> Traitement prophylactique ou curatif Pas de vaccin disponible. Pas de traitement spécifique en des de la levée éventuelle de lImMmuNnosUuppression

237

Bactériologie et virologie pratique

ADN, > Taxonomie et Structure Famille des Parvoviridae, genre Erythrovirus, espèce 819 virus. || est également dénommé parvovirus B19 ou érythrovirus B19. Virus de très petite taille (20 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN simple brin inéaire de 5 kb environ. Réplication intranucléaire dans les cellules précurseurs érythroides (lignée rouge).

Génome

:

Capside

>» Epidémiologie

|

Virus très résistant dans l'environnement et à la chaleur. Contamination aérienne, par produits sanguins (hémophiles) ou mère-enfant. Cas sporadiques ou épidémies vernales. Prévalence des Ac anti-B19V chez l'adulte jeune de 40% et chez l'adulte âgé de plus de 70%. Virus strictement humain.

> Pouvoir pathogène ncubation de 18 jours. La symptomatologie est essentiellement due à la réponse immune et à ‘atteinte de la lignée érythroide. Les formes asymptomatiques sont fréquentes.

+ Mégalérythème épidémique (5° maladie infantile): primo-infection à BT9V, éruption maculo-papuleuse fébrile débutant sur les joues, puis s'étendant au tronc. Arthralgies fréquentes chez l'adulte, Guérison spontanée sans séquelle, + Anémies: crises d'érythroblastopénies chez l'adulte, anémies chroniques. Favorisées par es anomalies des hématies ou de l’hémoglobine ou l'immunodépression. + Anasarque fœto-placentaire: œdème généralisé du fœtus (ascite) et du placenta (+ hydramnios) lié à l'anémie fœtale età une myocardite. Survient surtout au second trimestre de grossesse. 238

4,1

Virus à ADN

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas de formes sévères. Sérum, liquide amniotique :recherche de l'ADN viral ou des Ac

>Diagnostic direct : —

Recherche du génome viral: PCR qualitative ou quantitative

—

Pas de culture facile

>» Diagnostic indirect Recherche d’anticorps spécifiques :en ELISA. La présence d'IgM signe une primo-infection. La présence d'IgG signe une infection ancienne, Recherche d'une anémie fœtale (cordocentese) ou d'anomalies de la lignée érythrocytaire.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'éruptions cutanées (Rougeole, rubéole, …) et l'alloimmunisation fæto-maternelle

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible. Préparation des produits sanguins (résistance au chauffage). Traitement: Pas de traitement antiviral spécifique. Traitement symptomatique : traitement de l'anémie (transfusion, .….).

239

Bactériologie et virologie pratique

Papillomavirus (HPV)

ADN, &

> Taxonomie et Structure Famille des Papilomaviridae, genres Alphaà Pipapillomavirus, espèces Human papilomavirus IAA EN AIRE) Virus de petite taille (50 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ADN double brin circulaire de 8 kb. Plus de 120 types ont été identifiés chez l'Homme. Réplication intranucléaire dans les cellules des épithéliums stratifiés humains (infection des cellules basales, pas de système de culture facile)

Gé

SE

Capside

> Epidémiologie Virus très résistant dans l'environnement, contamination directe par contact (sexuel, accouchement, .….)ou indirecte (objet, sol des piscines, .….). Cas sporadiques. Virus strictement humain. Virus oncogène

> Pouvoir pathogène Incubation longue. La symptomatologie est essentiellement due à la prolifération cellulaire induite par le virus au niveau des épithéliums et parfois au caractère oncogène de certains types viraux (HPV-16 et HPV-18 en particulier). ls ont un tropisme cutané ou muqueux (génital). Les formes asymptomatiques sont fréquentes.

°

Verrues: pamaïes, plantaires, cutanées (HPV-1, 3, 7, ...

+ Condylomes et papillomes: condylomes acuminés vénériens ou crêtes de coq, papillomes laryngés (HPV-6, 11, ….). Lésions sexuellement transmissibles et récidivantes. - _Dysplasies et cancers cutanés ou génitaux: cancers du col utérin (HPV-16, 18,...), cancers de la marge anale, .…

Lésions peu contaminantes (production virale faible ou absente),

4,1

Virus à ADN

L'oncogenèse nécessite une infection persistante avec un HPV oncogène, l'intégration du génome viral, là surexpression des protéines oncogènes E6 et E7 conduisant à la transformation et a l'immortalisation des cellules infectées puis à l'accumulation d'anomalies génétiques rendant ces cellules cancéreuses.

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique. Diagnostic anatomopathologique sur les biopsies.

Frottis cervico-vaginal ou anal, biopsie :recherche de l'ADN viral

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR, hybridation, hybridation in situ. Typage haut risque oncogene (ou bas risque) par hybridation ou séquençage.

—

En développement: quantification du génome viral, des ARNm codant les protéines oncogènes E6 et E7, des ADN HPV intégrés, :

—

Cytologique: recherche de Koillocytes (cellules caractéristiques) au frottis cervico-vaginal ou anal,

> Diagnostic indirect Non fait en pratique (recherche uniquement).

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables de tumeurs cutanées (Moluscum contagiosum, Nodule des trayeurs, Ori, HHV-8, .…..).

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin à agent inactivé (Gardasyl®, HPV-6, 11, 16 et 18, 3 ISC) ou Cervarix®, HPV-16 et 18, 3 SC), contenant des protéines virales L1 recombinantes auto-assemblées en pseudocapsides, recommandé pour les jeunes filles avant leur activité sexuel (14 ans, rattrapage possible jusquà 23 ans). Dépistage des infections cervicales à HPV et du cancer du col par frottis cervico-vaginaux (tous les 3 ans à partir de 35 ans) et examen cytologique. En cas de cytologie d'interprétation difficile (ASCUS) recherche de l'ADN HPV ou colposcopie (+ biopsie et examen histologique).

Bactériologie et virologie pratique

Traitement : Pas de traitement antiviral spécifique. Traitement physique des lésions:chirurgie (conisation), Laser, cryothérapie, … Traitement par des topiques :podophylline, acide salicylique, acide trichloacétique, 5 fluorouracile, imiqumod,

CNR Papillomavirus Institut Pasteur

25-28 rue du Docteur Roux

75015 PARIS

242

AVIS

Virus de l’hépatite B (HBV)

A AD

ADN,

> Taxonomie et Structure Famille des Hepaahaviridae (\irus à ADN des hépatites), genre Orthohepadnavirus, espece

Hepatts B virus (HBV) Virus de taille moyenne (42 nm), enveloppé et polymorphe, capside de symétrie icosaédrique, génome ADN circulaire double brin partiel de 3,2 kb. Réplication intranucléaire principalement dans les hépatocytes humains, persistante possible (épisome ou intégration).

Ag HBs (S)

S TERRES pré-S1

D.

Polymérase (P)

MERS PURE pré-S2

.— Dents

Nucléocapside (C, AgHBc)

E

X

enveloppe

Structure du virion et expression du génome HBV

> Epidémiologie

:

Virus relativement résistant dans l'environnement, contamination par le sang, par voie sexuel et de la mère a l'enfant. Il est présent dans tous les fluides corporels (sécrétions génitales, salive, …) ce qui explique la possibilité de contamination par voie salivaire. Cas sporadiques. Virus strictement humain. La prévalence est de moins de 1 % en France, > 10% dans certaines régions d'Afrique et d'Asie. 350 millions de sujets infectés dans le monde. Virus oncogène.

> Pouvoir pathogène

_

.

-

Incubation de 1 à 3 mois. La symptomatologie est en partie due à la réponse immunitaire antivirale qui va éliminer les hépatocytes infectés. Les formes asymptomatiques sont fréquentes (70 %).

243

Bactériologie

°

et virologie pratique

Hépatite virale aiguë: Associant classiquement un ictère cutanéo-muqueux (hyperbi-

lrubunémie), une décoloration des selles, une coloration foncée des urines, parfois un prurit généralisé (cholestase) et une asthénie avec anorexie. Dans 95 % des cas, l'évolution est la quérison spontanée sans séquelle avec une asthénie résiduelle et une immunité protectrice post-infectieuse,

-_

Hépatite fulminantes: rares 1-2%, insuff sance hépato-cellulaire rapide avec taux de

prothrombine < 45 %, (ou facteur V) et signes neurologiques.

° Hépatite chronique: dans 5 % des cas chez l'adulte mais 90 % des cas chez le nouveau-né, Elle est définie par la persistance de l'AgHBs plus de 6 mois . Le risque est l'évolution vers la cirrhose en 15-20 ans (20%) et l'hépatocarcinome (3 à 5% par /an sur cirrhose). Possibles manifestations extra-hépatiques (cutanées).

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas d’hépatite virale et en sécurité virale. Sang (sérum ou plasma): recherche d'anticorps et d'antigènes, de l'ADN viral

|W

Diagnostic direct:

—

Recherche du génome viral: PCR quantitative où hybridation moléculaire Sur sérum/ plasma (détection en temps réel) pern nettant de détecter et de qua nüfier la réplication virale. Les ADNeémies élevées sont souvent > 10 Log copies /mL.

—

Séquençage du génome viral: rec herche de mutant pré-C (régi on précédant le gene C), génotypage ou recherche de mutatio S associées a la résistance tests spécialisés).

—

Recherche d’antigènes spécifiques: AgHBs (surface) signa nt un portage du Virus, AgHBe (pré-C) signant normalemen une réplication importante, L'AgHBc (capside) n'est présent qu'au niveau hépatique.

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : Ac anti-HBs signa nt une immunité protectrice postinfectieuse (guérison) ou post-vaccinale (absence d'Ac anti-HBc associés) si > 10 mUl/mL. Ac anti-HBc signant une immunité post-infectieuse non prote ctrice. Les IgM anti-HBc signent normalement une infection récente (hépatite aiguë), mais peuvent être présentes lors d'une hépatite chronique. Ac anti-HBe signant la présence d'une réplication faible (absence AgHBe) ou, si l'ADNnémie est élevée, celle d'un virus mutant pré-C n'excrétant pas l'AgHBe. Recherche d'une cytolyse hépatique avec élévation des tran saminases (ALAT > ASAT) parfois très importante. Hyperbilirubinémie, hyperlymphocytose modérée.

4,1

Virus à ADN

‘Hépatite aiguë ALAT élevée | Iictère

IgG anti-HBc AC anti-HBe Ac anti-HBs

gM anti-HBc des niveau marqueurs

contamination

Traitement prophylactiqueou curatif Prophylaxie :

—

Vaccin fractionné coftenant de l'AgHBs recombinant (protéine S ou pré-S/S, produite dans la levure ou les cellules CHO de hamster). Recommandée pour la population générale dans le calendrier vaccinal (vaccin hexavalent à 2 mois, 4 mois, 12 mois), obligatoire pour le personnel du corps de santé (contrôler les Ac anti-HBs). .

—

Dépistage obligatoire de l'AgHBs à 6 mois de grossesse pour, en cas de portage, sérovaccination du nouveau-né à la naissance. Le risque de transmission varie de 30 à 90 % en présence de l'Ag HBe à 10-20 % en cas d'AgHBs isolé.

—_

|mmunoglobulines spécifiques en cas d'exposition (nouveau-né, ….)

245

Bactériologie

et virologie pratique

—

Déclaration obligatoire à la DDASS des Hépatites B aiguës.

—

Préservatif et dépistage des dons de sang, tissus et organes.

Traitement: Traitement antiviral spécifique pour les hépatites chroniques après évaluation de l'activité hépatique (ALAT, ponction biopsie hépatique avec score METAVIR, élastométrie hépatique ou combinaison de marqueurs biochimiques). Interféron alpha:action antivirale, immunomodulatrice et anti-proliférative. — _interféron-alpha pégylé 2a ou 2b (Pégasys”, Viraféron-peg*)

—_interféron 2a où 2b (Roféron®, Introna®) inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse INTI:

— 3TC ou lamivudine (Zéffix®) —_ FTC ou emtricitabine (Emtriva®) — —

_entécavir (Baraclude*)

_telbivudine (Sebivo®)

inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse du HBV _adefovir dipivoxyl (Hepséra®)

— —

_ténofovir dipivoxyl fumarate (Viread®)

Les traitements sont poursuivis au long cours et les associations de molécules sont en cours d'évaluation. Le FTC et le TNF ne sont pour l'instant indiqué que chez les patients co-infectés HIV+HBV, D'autres molécules sont en cours d'évaluation, en particulier la clevudine. L'objectif thérapeutique est l'obtention d'un ADN viral sérique indétectable, la normalisation des ALAT, une séroconversion HBe. La guérison sous traitement (séroconversion HBs) est très rare. Transplantation hépatique en cas d'hépatite fulminante Éviter les médicaments et les produits hépatotoxiques (alcool), règles hygièno-diététiques.

CNR Virus des Hépatites B, C et Delta CHU Henri Mondor Inserm U635 — Bactériologie /virologie/hygiène 51 av du Maréchal de Tassigny — 94010 Creteil Cedex

246

4,2 Virus À ARN

> Taxonomie et Structure Famille des Picomaviridae (petits virus à ARN), genre Hepatovirus, espèce Human hepattis Virus À (HHAV)

Virus de petite taille (30 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ARN simple brin de polarité positive de 8 kb.

VPg

VP4 Réplication intracytoplasmique dans les hépatocytes humains.

> Epidémiologie Virus résistant dans l'envifonnement, contamination féco-orale directe (défaut d'hygiène) ou indirecte (aliments, eaux, coquillages souillés). Cas sporadiques ou petites épidémies. Strictement humain. La prévalence des anticorps varie chez l'adulte de 15 à 100% en fonction de l'endémicité de l'infection et du niveau socio-économique du pays.

> Pouvoir pathogène Incubation d'environ 30 jours. La symptomatologie est essentiellement due à la réponse immunitaire antivirale qui va éliminer les hépatocytes infectés. Les formes asymptomatiques sont fréquentes en particulier chez les enfants. 247

Bactériologie

°

et virologie pratique

Hépatite virale aiguë: Associant classiquement un ictère cutanéo-muqueux (hyperbi-

lrubunémie), une décoloration des selles, une coloration foncée des urines, parfois un prurit généralisé (cholestase) et une asthénie avec anorexie, L'évolution est la guérison spontanée sans séquelle avec une asthénie résiduelle et une immunité protectrice post-infectieuse.

° Hépatite fulminantes: rares (< 0,5%, insuffisance hépato-cellulaire rapide avec taux de prothrombine < 45 %, (ou facteur V) et signes neurologiques). +

Jamais d’hépatite chronique.

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas d’hépatite virale. Sang (sérum): recherche d'anticorps (habituellement), de l'ARN viral

Selles: recherche de l'ARN viral

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR sur sérum et selles (non fait en pratique).

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : IgM en cas de suspicion d'hépatite À aiguë, IgG pour contrôle d'immunité post-vaccinale ou post-infectieuse. Recherche d'une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) parfois très importante, Hyperbilirubinémie, hyperlymphocytose modérée,

> Diagnostic différentiel Avec les autres hépatites virales aiguës à transmission féco-orale (HEV) en particulier. Rechercher systématiquement une infection par HBV, HCV, En cas de retour des tropiques, penserà une fièvre hémorragique (fièvre jaune, dengue, ….) ou à une leptospirose. Chez l'immunodéprimé rechercher une hépatite à CMV ou à un autre Herpesviridae.

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin à agent inactivé, recommandé pour les voyages en zone d'endémie, pour les sujets exposés au péril fécal (travail en collectivité, avec l'enfance handicapé, homosexualité masculine) ou sujet atteint d'une pathologie hépatique. Immunité protectrice contrôlable par la recherche des IgG spécifiques. 248

4,

Hygiène personnelle et collective (salubrité et contrôle des eaux)

Traitement : Pas de traitement antiviral spécifique. Transplantation hépatique en cas d'hépatite fulminante Eviter les médicaments et les produits hépatotoxiques (alcool). Suivre la décroissance des ALAT.

CNR Virus des hépatites à transmission entérique (hépatites À et E) Hopital Paul Brousse Laboratoire de virologie 12, Avenue Paul Vaillant Couturier — 94804 Villejuif

249

®) É

Virus à ARN

Bactériologie et virologie pratique

>

Enterovirus

ECP en culture

> Taxonomie et Structure Famille des Picomnaviridae (petits virus à ARN), genre Enterovirus, espèces Human enterovirus virus À, B, C, D et Polovirus 1 à 3. Chaque espèce comporte plusieurs sérotypes. Les anciennes dénominations ECHOvirus, Coxsackie virus A et B sont réparties dans les 4 espèces d'entérovirus.

Virus de petite taille (30 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ARN simple brin de polarité positive de 8 kb.

VPg

VP4

Réplication intracytoplasmique dans de nombreuses cellules humaines.

250

4,2

Virus à ARN

> Epidémiologie Virus résistant dans l'environnement, contamination féco-orale directe (défaut d'hygiène) ou indirecte (objet, aliments, eaux souillés, .…..). Cas sporadiques ou épidémies préférentiellement en période estivale, Virus infectant les humains et certains animaux.

> Pouvoir pathogène Incubation de durée variable. Les formes asymptomatiques sont très fréquentes. e Poliovirus: Poliomyélite antérieure aiguë (angines, méningites avec paralyses flasques ascendantes) e

_Coxsackie virus A: Herpangine, syndrome main-pied-bouche, conjonctivite hémorragique

e

__Coxsackie virus B: péricardites, myocardites, pleurodynies et hépatites.

° Tous les entérovirus :méningites lymphocytaires de l'enfant, paralysies flasques, syndromes fébriles ORL ou respiratoires, … e

Rares infections chroniques : neurologiques, cardiaques où musculaires.

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas de formes sévères.

Méningites :LCR, gorge et selles En fonction de l'atteinte: écouvilonnage cutanéo-muqueux, urines, liquide amniotique, sérum, gorge et selles.

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR sur LCR, sérum et selles (méningite) ou autres échantillons. Amorces de PCR consensus à l'ensemble des entérovirus ou parfois PCR spécifique. |

—

Recherche du virus sur culture cellulaire : révélation par effet cytopathique, immunofluorescence, typage par séroneutralisation, RT-PCR,.

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques :IgG pour contrôle d'immunité post-vaccinale contre les poliovirus 1, 2 et 3. Pas d'intérêt en diagnostic.

251

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic différentiel Dans les méningites lymphocytaires avec le virus des oreillons et HSV-2,

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin contre les poliovirus à agent inactivé (vaccin Salk) recommandé pour toute la population (voir calendrier vaccinal). Vaccin à agents vivant atténué (vaccin Sabin), non utilisé en France actuellement mais utilisé notamment dans beaucoup de pays en voie de développement. Hygiène personnelle et collective (salubrité et contrôle des eaux). Traitement:

Pas de traitement antiviral spécifique. Traitement symptomatique.

CNR Entérovirus Groupement Hospitalier Est Centre de Biologie et Pathologie Institut de Microbiologie 59 bd Pinel — 69677 Bron Cedex

4,2

Virus de l'hépatite E (HEV)

Virus à AR

ARN, &

> Taxonomie et Structure Famille à définir, genre Hepevirus, espèce Hepatitis virus E (HEV) Virus de pelite taille (30 nm), capside de symétrie icosaédrique, génome ARN simple brin de polarité positive de 7,5 kb. Réplication intracytoplasmique dans les hépatocytes.

VPg

> Epidémiologie Virus résistant dans l'environnement, contamination féco-orale directe (défaut d'hygiène) ou indirecte (aliments, eaux, coquillages souillés). Cas sporadiques de retour de voyage ou autochtones ou petites épidémies. Virus infectant l'Homme et les animaux (porc, cer, rat, volailles). La prévalence des anticorps est importante en Asie, Afrique et Amérique centrale.

> Pouvoir pathogène Incubation d'environ 40 jours. La symptomatologie est en partie due à la réponse immunitaire antvirale qui va éliminer les hépatocytes infectés. Les formes asymptomatiques sont fréquentes.

° Hépatite virale aiguë :Associant classiquement un ictère cutanéo-muqueux (hyperbilirubunémie), une décoloration des selles, une coloration foncée des urines, parfois un prurit généralisé et une asthénie avec anorexie. L'évolution est la guérison spontanée sans séquelle avec une asthénie résiduelle et une immunité protectrice post-infectieuse. °

Hépatite fulminantes ou sévères: plus fréquente que pour les hépatïites A (insuf-

fisance hépato-cellulaire rapide avec taux de prothrombine < 45 %, (facteur V chutant plus rapidement que les autres facteurs) et signes neurologiques). Infection en fin de grossesse :

jusqu'a 20 % de létalité. °

Pas d’hépatite chronique (sauf immunodéprimé).

253

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas d’hépatite virale. Sang (sérum): recherche d'anticorps et de l'ARN viral Selles:recherche de l'ARN viral

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR sur sérum et selles (diagnostic de référence)

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : IgM en cas de suspicion d'hépatite E aiguë, IgG pour contrôle d'immunité post-infectieuse. Recherche d'une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) parfois très importante. Hyperbilirubinémie, hyperlymphocytose modérée.

> Diagnostic différentiel Avec les autres hépatites virales aiguës à transmission féco-orale (HAV) en particulier car la plus fréquente. Rechercher systématiquement une infection par HBV, HCV. En cas de retour des tropiques penser à une fièvre hémorragique (fièvre jaune, dengue, .….) où à une leptospirose. Chez l'immunodéprimé rechercher une hépatite à CMV ou à un autre Herpesviridae. \

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible pour l'instant, Hygiène personnelle et collective (salubrité et contrôle des eaux) Traitement:

Pas de traitement antiviral spécifique. Transplantation hépatique en cas d'hépatite fulminante Éviter les médicaments et les produits hépatotoxiques (alcool). Suivre la décroissance des ALAT.

254

4,2

CNR Virus des hépatites à transmission entérique (hépatites À et E) Hopital Paul Brousse Laboratoire de Virologie 12, Avenue Paul Vaillant Couturier

94804 Villejuif Laboratoire associé HEV Hôpital d'instruction des Armées du Val de Grace Laboratoire de biologie clinique

74 Bd du Port Royal 15230 Paris Cedex 05

255

Virus à ARN

Bactériologie et virologie pratique

Virus de l'hépatite C (HCV)

ARN,

> Taxonomie et Structure Famille des Haviviridae, genre Hepacivirus, espèce Hepatitis C virus (HCV) Virus de taille moyenne (60 nm), polymorphe, capside de symétrie icosaédrique, génome ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9,6 Kb. Réplication cytoplasmique principalement dans les hépatocytes humains, persistance possible (réplication continue, pas de latence). Protéines d'enveloppe Génome Capside

enveloppe

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par le sang (toxicomanie, transfusion avant 1991) et de la mère à l'enfant (< 5%). Transmission sexuelle exceptionnelle (via le sang). Cas sporadiques, Strictement humain. La prévalence est de T % en France, > 10 % dans certaines régions d'Afrique et d'Asie, 170 millions de sujets infectés dans le monde. Virus oncogène.

> Pouvoir pathogène Incubation d'environ 30 jours. La symptomatologie est essentiellement due à la réponse immunitaire antivirale qui va éliminer les hépatocytes infectés. Les formes asymptomatiques sont très fréquentes (> 70 %). e Hépatite virale aiguë: Associant classiquement un ictère cutanéo-muaqueux modéré, parfois un prurit généralisé et une asthénie avec anorexie. Dans 20 % des cas, l'évolution est la guérison spontanée sans séquelle avec une asthénie résiduelle. Pas d'immunité protectrice post-infectieuse.

°

Hépatite fulminantes: tres rares,

+ Hépatite chronique: dans 80 % des cas chez l'adulte. Elle est définie par la persistance de l'ARN viral plus de 6 mois. Le risque est l'évolution vers la cirrhose en 15-20 ans (20 %) et l'hépatocarcinome (3 à 5 % par /an sur cirrhose). Possibles manifestations extra-hépatiques (cryoglobulinémies, glomérulonéphrites). 256

4,2

Virus à ARN

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas d’hépatite virale et en cas d’accident d'exposition au sang. Sang (sérum ou plasma) : recherche d'anticorps, de l'ARN viral.

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: PCR quantitative, TMA ou hybridation moléculaire (bDNA) sur sérum/plasma (détection en temps réel) permettant de détecter et quantifier la réplication virale, Une variation supérieure à 0,5 Log copies /mL est significative. Les ARNémies élevées sont souvent > 1 000 000 copies /mL.

—

Recherche d’antigènes spécifiques :possible recherche d'antigène HCV par ELISA.

—

Génotypage : par séquençage du génome viral ou hybridation. Génotypes de 1 à 6 nécessaires pour déterminer la durée et le pronostic du traitement (tests spécialisés).

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : Dépistage des anticorps anti-HCV par ELISA. Un test non négaïf doit être confirmé sur un second échantillon avec une technique ELISA différente ou un immunoblot (RIBA :Recombinant Immuno Binding Assay).

Hépatite aiguë

|

Hépatite chronique (80%)

|

Cirrhose (15%)

Anticorps VHC

ARN VHC

niveau des marqueurs

contamination

3 mois

15-20 ans

temps

Recherche d'une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) parfois très importante, Hyperbilirubinémie, hyperlymphocytose modérée.

AGIT

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic différentiel Avec les autres hépatites virales aiguês mais surtout chroniques (HBV + HDV).

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de Vaccin disponible. Dépistage des dons de sang (Ac + ARN), tissus et organes. Hygiène. Échange de seringues ou de pailles pour les toxicomanes.

Traitement: Traitement possible des hépatites aiguës avec >90 % de guérison. Traitement antiviral spécifique pour les hépatites chroniques après évaluation de l'activité hépaique (ALAT, ponction biopsie hépatique avec score METAVIR, élastométrie hépatique ou combinaison de marqueurs biochimiques). D On utilise l'interféron-alpha pégylé (Pégasys®, Viraféron-peg®, 1 ISC/ semaine) associé à la bavirine (Rébétol® ou Copéqus®, per os). Les interférons provoquent un syndrome pseudogrippal, des décompensations de pathologies sévères, des dépressions, des troubles dysimmurnitaires). La ribavirine induit des anémies hémolytiques et est tératogène. Les traitements sont poursuivis 6 mois (génotypes HCV 2 et 3) ou 12 mois (génotypes HCV 1, 4,5 et6 ou sujet co-infecté par HV). Contrôle de la virémie à 3 mois (poursuite du traitement si baisse de la charge virale >.2 Log copies/mL), contrôle de l'indétectabilité de la charge virale à la fin du traitement et 6 mois après (réponse virologique prolongée ou guérison). Suivi des ALAT. Possible traitement par IFN à faible dose à visée anti-fibrosante en cas d'échec. Des anti-protéases HCV (NS3) et anti-ARN polymérases (NS5B) HCV seront bientôt disponibles. Transplantation hépatique en cas d'hépatite fulminante ou cirrhose au stade terminal. Éviter les médicaments et les produits hépatotoxiques (alcool).

CNR Virus des Hépatites B, C et Delta CHU Henri Mondor Inserm U635 — Bactériologie/Virologie/Hygiène 51 av du Maréchal de Tassigny 94010 CRETEIL Cedex

258

4,2

Virus de l’hépatite D (HDV)

Virus à AR

ARN

> Taxonomie et Structure HDV ou agent delta est un virus satellite du HBV appartenant au genre Deltavirus. Virus de taille moyenne (42 nm), polymorphe, génome ARN circulaire simple brin de 1,7 kb. Génome ARNSsb circulaire avec auto-appariement

AgHBs

petite protéine delta

grande protéine delta enveloppe

Réplication intranucléaire dans les hépatocytes humains infectés par HBV.

> Epidémiologie Virus fragile dans l'environnement, contamination par le sang et le sexe. Cas sporadiques de coinfections (HBV+HDV) ou de surinfections (HBV puis HDV). Strictement humain. Environ 5 % des sujets porteurs d'Ag HBs sont infectés par HDV

> Pouvoir pathogène Incubation d'environ 30 jours. Les formes asymptomatiques sont fréquentes (70 %).

+

Hépatite virale aiguë:

e

Hépatite fulminantes: 5 % des co-infections et 10 % des surinfections.

°

Hépatite chronique: 5 % en cas de co-infection, 70 % en cas de surinfection.

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas d’hépatite virale B.

Sang (sérum ou plasma) :recherche d'anticorps et d'antigènes, de l'ADN viral

259

Bactériologie et virologie pratique

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR quantitative (détection en temps réel) permettant de détecter et quantifier la réplication virale,

> Diagnostic indirect Recherche d'anticorps spécifiques : Ac anti-HDV (totaux, 1gG ou 1gM) signant une immunité post-infectieuse. L'infection sera confirmée par la recherche de l'ARN viral. La présence d'IigM anti-HBc est en faveur d'une co-infection. Recherche d'une cytolyse hépatique avec élévation des transaminases (ALAT > ASAT) parfois très importante.

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin anti-HBV et mesures de prévention contre l'hépatite B.

Traitement: On utilise soit l'interféron-alpha pégylé (Pégasys®, Viraféron-peg®) ou non (Roféron®, Introna®). Le taux de rémission est faible, Transplantation hépatique en cas d'hépatite fulminante

Eviter les médicaments et les produits hépatotoxiques (alcool), règles hygiéno-diététiques.

CNR Virus des Hépatites B, C et Delta CHU Henri Mondor Inserm U635 — Bactériologie/Virologie/Hygiène 51 av du Maréchal de Tassigny 94010 CRETEIL Cedex

4,2

Virus à AR

Virus grippaux

> Taxonomie et Structure Famille des Orhomyxoviridee, genres Influenzavirus A, B et C, espèces Influenza À, B et C Virus. Virus de grande taille polymorphe (100 nm), capside de symétrie hélicoïdale, génome ARN de polarité négative de 8 segments (À et B, 6 pour C) d'environ 14 kb au total. Enveloppe porteuse d'hémagglutinines (H1 à H16 pour les virus À) et de neuraminidases (N1 à N9 pour les Virus À)

Nomenclature :A/Sydney/5/97(H3N2) = influenza À, souche N° &, isolée à Sydney en 1997 possédant une H de type 3 et une N de type 2. Réplication intranucléaire dans les cellules de l'arbre respiratoire humain.

> Epidémiologie

L

Virus fragile, contamination par voie aérienne (toux, éternuements) ou plus rarement indirecte par contact (mains). Transmissions interhumaines le plus souvent. Transmissions zoonotiques possibles. Epidémies hivernales annuelles ou pandémies. Virus adaptés à l'Homme ou à l'animal (chevaux, chiens, porcs, oiseaux, .….). Réservoir naturel : oiseaux aquatiques.

261

|

Bactériologie et virologie pratique

Mammifères et oiseaux

Hommes

Oiseaux aquatiques

N

H1 à H3

Q A}

N1 à N2

RE),

0

H1Neà H16 N9

Porc

Virus très variables avec 2 types d'évènements génétiques générateurs :glissement antigénique (dérive génétique sur les gènes de la N et H par mutations ponctuelles, responsable des épidémies hivernales) et cassure antigénique (réassortiment par échanges de segments génomiques dont H et N, responsable de pandémie)

> Pouvoir pathogène Incubation courte 1 à 3 jours. Les formes asymptomatiques sont fréquentes.

e Grippe: syndrome grippal avec rhino-pharyngite associant une fièvre élevée (> 39°C) d'apparition brutale, avec des frissons, céphalées, myalgies, courbatures, arthralgies et asthénie. Guérison spontanée en 5 jours énviron. e Complications: surinfections bronchopulmonaires, pneumopathie sévère (grippe maligne), décompensation d'une tare pré-existante, encéphalite, myocardite, péricardite, …

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique en cas d’épidémie. Aspiration nasopharyngée ou écouvillonnage nasal, éventuellement LBA. Sérum, CCR

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR sur aspiration naso-pharyngée

—

Recherche d’antigènes viraux: par ELISA rapide ou lF sur aspiration naso-pharyngée

—

Recherche du virus par culture :culture sur cellules MDCK (rein de chien) avec un ECP confirmé par IF où hémadsorption. Anciennement inoculation à l'œuf de poule embryonné (encore utlisé pour production vaccinale) ou au furet.

262

4,2

Virus à ARN

> Diagnostic indirect Recherche Ac spécifiques par réaction de déviation du complément ou IHA pour un diagnostic rétrospectif.

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie :

Vaccin antigrippal. Vaccin fractionné en France, recommandé pour les sujets âgés (-65 ans), sujets atteints de pathologies chroniques (ALD), personnel médical et femmes enceintes. || contient les protéines H, N et M2 de 3 souches (2 Influenza ÀHBN2 et H1N1 et 1 B). Composition définie annuellement par l'OMS. Réseaux de surveillance nationaux (Groupes régionaux d'observation de la grippe, GROG). Hygiène, éviction scolaire souhaitable en phase aiguë. Plan gouvernemental de lutte contre la pandémie grippale, contrôles vétérinaires.

Traitement : Traitement symptomatique. inhibiteur du canal ionique M2: amantadine (Mantadix®, Symmetrel®, per os) et rimant [at] dine. Ils bloquent la décapsidation virale pH dépendante. Traitement prophylactique pour les Virus influenza À. Peu efficace. inhibiteur de la neuraminidase virale : zanamivir (Relenza®, inhalation) et oseltamivir (Tamniflu®, per os). Ils inhibent la libération des virions par blocage du site catalytique la neuraminidase. Elle clive les liens entre les acides sialiques (récepteurs cellulaires) et les hémagglutinines des virus influenza À et B. Efficace en traitement prophylactique et curatif,

CNR Virus Influenzae — Région Sud Groupement Hospitalier Est Centre de Biologie et Pathologie Institut de Microbiologie 59 BD Pinel — 69677 Bron Cedex

CNR Virus Influenzae — Région Nord Institut Pasteur Unite de Genetique Moleculaire des Virus Respiratoires 25/28, Rue du Docteur Roux — 75724 Paris Cedex 15

263

Bactériologie et virologie pratique

Virus respiratoire syncytial

(RSV)

ECP en culture

Détection en IF,

> Taxonomie et Structure Famille des Paramyxoviridae, sûus-famille des Pneumovirinae, genre Pneumovirus, espèce Human respiratory syncytial virus (HRSV)

Virus de grande taille polymorphe (80-350 nm), capside de symétrie hélicoidale, génome ARN simple brin de polarité négative de 15 kb. gpF gpG

ARN, N, L,P (ribonucléoprotéine)

Réplication intracytoplasmique dans les cellules de l'arbre respiratoire humain.

264

4,2

Virus à ARN

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par voie aérienne ou indirecte par contact. Deux types viraux RSV A et B. Cas sporadiques où épidémies hivernales chez les enfants. Virus strictement humain.

> Pouvoir pathogène Incubation courte de 2 à 4 jours. e Bronchiolite: touche les enfants de moins de 2 ans en général, suite à une rhinopharyngite, apparition d'une toux avec une dyspnée obstructive expiratoire avec une polypnée et un tirage. L'évolution est en général favorable en 8-10 jours. Possible détresse respiratoire en particulier en cas d'âge < 3 mois où d'hyper-réactivité bronchique. °

Rhinite, bronchite, pneumonie: chez l'enfant ou l'immunodéprimé.

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique systématique en cas de formes sévères. Aspiration nasopharyngée ou écouvillonnage nasal, éventuellement LBA.

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral: RT-PCR sur aspiration naso-pharyngée

—

Recherche d’antigènes viraux :par test ELISA rapide, immunochromatographie.

—

Recherche du virus par culture: culture avec un ECP (syncytia formant des cellules géantes plurinucléées) en 5 à 10 jours sur cellules MRCE,

> Diagnostic indirect Sans intérêt en pratique.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'infections respiratoires: /nfluenzavirus, parainfluenzavirus, Adenovirus, Rhinovirus, Coronavirus, Metapneumovinus, …

Bactériologie et virolo gie pratique

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pour les enfants immunodéprimés, possible immunisation passive avec un Ac monoclonal antiRSV (palivizumab, Synagys®). Eviction scolaire conseil ée en phase aiguë. Traitement :

La ribavirine en aéroso (Virazole®) a été utilisée dans les formes graves et est d'efficacité discutée.

Traitement symptomatiq ue (oxygénothérapie si nécessaire, désobstruction nasale, antibiothérapie en cas de surinfection) et surtout kinésithérapie respiratoire (flapping).

266

4,2

Virus des oreillons

DU

Virus à AR

arN

> Taxonomie et Structure Famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Paramyxovirinae, genre Rubulavirus, espèce Mumps virus Virus de grande taille polymorphe (300 nm), capside de symétrie hélicoïdale, génome ARN simple brin de polarité négative de 15 Kb. gpF gpG

ARN,N,L,P (ribonucléoprotéine)

Réplication intracytoplasmique dans les cellules de l'arbre respiratoire humain.

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par voie aérienne ou indirecte par contact. Cas sporadiques ou épidémies hivernales et vernales chez les enfants. Virus strictement humain. Prévalence en forte diminution en corrélation avec la couverture vaccinale.

> Pouvoir pathogène Incubation 18 jours. LeS formes asymptomatiques sont fréquentes. ° °

Oreillons: parotidite bilatérale fébrile avec parfois otalgies, céphalées. Complications :méningites ourliennes, orchites, ovarites, pancréatites, …

267

Bactériologie et virologie pratique

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique. Sérum. Aspiration nasopharyngée ou écouvilonnage nasal, éventuellement LBA. Urines, ane Y

Diagnostic direct:

—

Recherche du génome viral: RT-PCR sur aspiration naso-pharyngée (rarement fait)

—

Recherche d’antigènes viraux: par IF Recherche du virus par culture :culture avec un ECP en 5 à 10 jours sur cellules Véro, IF

> Diagnostic indirect Recherche d'IgG et d'IgM. Hyperamylasémie,

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin anti-ourlien à agent atténué (ROR®), recommandé pour tous les enfants à partir de 9 mois (2 doses SC) puis con injectionentre 13 et 24 mois. Vaccin contre-indiqué lors de la grossesse. Hygiène, éviction scolaire (6 jours à partir du début éruption).

Traitement : Pas de traitement spécifique, traitement symptomatique.

268

4,2

Virus de la rougeole

DST

Virus à AR

o

> Taxonomie et Structure Famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Paramyxoviinae, genre Morbilivirus, espèce Measles virus Virus de grande taille polymorphe (250 nm), capside de symétrie hélicoïdale, génome ARN simple brin de polarité négative de 16 kb. gpF gpG

ARN, N, L, P (ribonucléoprotéine)

Réplication intracytoplasmique dans les cellules de l'arbre respiratoire humain.

> Epidémiologie Virus fragile, contamination par voie aérienne ou indirecte par contact. Cas sporadiques ou

épidémies hivernales vernales chez les enfants, Virus strictement humain. Prévalence en forte diminution en corrélation avec la couverture vaccinale.

> Pouvoir pathogène ncubation 10 jours. Les formes asymptomatiques sont possibles.

° _ Rougeole: touche les enfants de moins de 10 ans en général, suite à un catarrhe occulonasal fébrile, apparition d'une éruption cutanée morbilliforme débutant à la face et se généralisant (éléments maculo-papuleux rouges vifs). Signe de Koplik caractéristique mais fugace sur a face interne des joues. ° Complications: encéphalites aiguës, post-infectieuses (leuco-encéphalite péri-veineuse), tardives (panencéphalite sclérosante subaigué, PESS). Surinfections ORL, pneumopathies.

269

Bactériologie

et virologie pratique

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique.

Sérum. Aspiration nasopharyngée ou écouvillonnage nasal, éventuellement LBA. Urines, LCR, …

> Diagnostic direct: —

Recherche du génome viral:RT-PCR sur aspiration naso-pharyngée (rarement fait)

—

Recherche d’antigènes viraux: par 1F

—

Recherche du virus par culture :culture avec un ECP en 5 à 10 jours sur cellules Véro, IF

> Diagnostic indirect Recherche d'IgG et d'IgM spécifiques.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'infections respiratoires (/nfluenzavirus, parainfluenzavirus, Adenovirus, Rhinovirus, Coronavirus, Metapneumovirus, …) où d'éruptions maculo-papuleuses (rubéole, EBV, B19V, HHV-6, ...).

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin antirougeoleux, vaccin à agent atténué (inclus dans le ROR®), recommandé pour tous les enfants à partir de 9 mois (2 doses SC) puis seconde injection entre 18 et 24 mois. Vaccin contre-indiqué lors de la grossesse. Hygiène, éviction scolaire (6 jours à partir du début éruption). Déclaration obligatoire. Traitement: Pas de traitement spécifique, traitement symptomatique.

CNR CNR Virus de la rougeole INSERM U 404 — Cervi 21 Avenue Tony Garnier — 69365 Lyon Cedex 7

4,2

Virus de la rubéole

Virus à AR

ARN,

> Taxonomie et Structure Famille des ogaviridae, genre Rubivirus, espèce Rubella virus (RUBV) Virus de taille moyenne (70 nm), capside de symétrie icosaédrique, enveloppé, génome ARN simple brin de polarité positive de 10 kb. Réplication intracytoplasmique dans de nombreuses cellules humaines Protéines d'enveloppe Génome

Capside

enveloppe

> Epidémiologie Virus très fragile, contamination par voie aérienne. Cas sporadiques ou épidémies vernales chez les enfants ou les jeunes adultes (problème chez les femmes enceintes séronégatives). Virus strictement humain.

> Pouvoir pathogène Incubation de 16 jours. Le patient est contagieux 7 jours avant et après le début de l’éruption. Les formes asymptomatigues sont très fréquentes (50 %) et l'éruption pas toujours caractéristique. 4 ° Rubéole: au cours d'un syndrome infectieux discret (< 38,5°C) avec polyadénopathie, éruption rubéoliforme (discrète, faite de macules roses pâles de petite taille, commençant à la face puis se généralisant et disparaissant en 3-4 jours. Chez l'adulte des arthralgies sont possibles. Thrombopénies transitoires fréquentes (possible purpura) et rares encéphalites.

° _Rubéole congénitale: les malformations surviennent uniquement en cas de contamination de l'embryon avant la 20° semaine d'aménorrhée (SA). Elle est très fréquente et sévère en cas de contamination maternelle avant la 11° SA, associant malformations oculaires (cataractes,

Bactériologie et virologie pratique

rétinopathie, microphtalmie), neurologiques (retard psycho-moteur, …), auditives (surdités) et cardiaques (hypoplasie artère pulmonaire, persistance canal artériel). Foetopathie (retard de croissance intra-utérin, hépatomégalie, purpura, ...)

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique sauf en cas de grossesse. Sérum : recherche d'anticorps (très rarement virémie ou urines) Liquide amniotique ou sang fætal: diagnostic prénatal (DPN) Y

—

Diagnostic direct Recherche du génome viral: RT-PCR sur liquide amniotique ou sur sang fœtal (diagnostic prénatal, DPN) ou sang du nouveau-né (très rarement maternel).

—

Recherche du virus par culture : possible mais difficile (mise en évidence du phénomène d'interférence avec un entérovirus ou par hémadsorption), Rarement réalisée actuellement.

> Diagnostic indirect —

Recherche des Anticorps: ELISA (plus rarement: inhibition de l'hémagglutination ou gglutination de particules sensibilisées),

[ab]

Les IgM anti-rubéole sont présentes lors de l'éruption et persistent 4 à 8 semaines, elles pernettent le diagnostic d'infection récente. Les IgM peuvent être réalisées sur sang fœtal. Les 1gG anti-rubéole persistent à vie.

Dans certains cas, l'avidité des IgG (faible en cas de rubéole récente) ou la recherche d'IgÀ peuvent être recherchées pour dater une infection maternelle, Toujours confirmer un DPN sur e NOUVEAU-NÉ.

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables d'exanthèmes (en particulier lors d'une grossesse) : Adenovirus, Enterovirus, EBV, CMV, B19V, HHV-6/7, HV...

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin à agent atténué (inclus dans le ROR®), recommandé pour tous les enfants à partir de 9 mois (2 doses SC) puis entre 13 et 24 mois. Rattrapage possible (Rudivax®) en prépuberté ou sous contraception (contre-indiqué lors de la grossesse).

272

4,2

Virus à ARN

Dépistage de la rubéole systématique (IgG + IgM) lors des déclarations de grossesse. Si la femme n'est pas immunisée suivi sérologique mensuel jusqu'à la 20° semaine d'aménorrhée, Hygiène, éviter les enfants malades et les contacts salivaires (femmes enceintes séronégatives pour la rubéole). Pas d'éviction scolaire systématique. Traitement: Pas de traitement antiviral spécifique. Possible interruption médicale de grossesse (IMG) en cas de malformations fœtales à l'échographie ou de rubéole congénitale précoce avérée.

273

Bactériologie et virologie pratique

ARN, © > Taxonomie et Structure Famille des Reoviridae (petits virus à ARN), genre Rotavirus, espèces Rodavirus À, B et C Virus de taille moyenne (80 nm), triple capside de symétrie icosaédrique, génome ARN double brin comportant 11 segments d'au total 18 Kb,

Plus de 20 types P (protéine VP7) et 14 G (VP4) ont été identifiés chez l'Homme, Réplication intracytoplasmique dans les entérocytes humains.

> Epidémiologie Virus très résistant dans l'environnement, contamination féco-orale directe (défaut d'hygiène) ou indirecte (aliments, eaux, coquillages souillés). Cas sporadiques ou épidémies hivernales chez les enfants de moins de 3 ans. Infection des humains et des animaux jeunes (porcelet, veau). Cause majeure de mortalité infantile dans les pays en voie de développement.

> Pouvoir pathogène Incubation courte, 2 jours. La symptomatologie est essentiellement due à la destruction partielle des villosités et a des anomalies d'absorption des sucres. Les formes asymptomatiques sont fréquentes. e Gastroentérite aiguë: Diarrhée aqueuse fébrile avec vomissements, parfois douleurs abdominales et anorexie chez les jeunes enfants. Risque de déshydratation. L'évolution est la guérison spontanée sans séquelle en 5 à 7 jours avec une immunité protectrice post-infectieuse pour le type antigénique concerné.

274

4,2

Virus à ARN

> Echantillons biologiques Diagnostic biologique non systématique.

Selles:recherche de d'antigènes viraux (ou rarement de l'ARN viral)

> Diagnostic direct: —

Recherche d’antigènes viraux: par agglutination ou ELISA sur les selles

—

Recherche du génome viral: RT-PCR sur selles (non fait en pratique).

> Diagnostic indirect Sans intérêt

> Diagnostic différentiel Avec les autres virus responsables de gastroentérites ou de diarrhées:Adenovirus, et d'autres VIrUS non diagnostiqués sur le plan biologique comme les Norovirus, Sapovirus, Astrovirus.

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Vaccin à agent atténué (Rotarix® ou Rotateq®), recommandé uniquement pour les enfants à risque à partir de 2 mois (2 à 3 doses par voie orale) et avant 2 ans. Hygiène personnelle et collective, isolement si nécessaire.

Traitement : Pas de traitement antiviral spécifique. Réhydratation par voie orale où parentérale si nécessaire. Hospitalisation en cas de signe de gravité uniquement (> 3mois).

CNR Virus entériques (entérovirus exclus) CHU de Dijon Laboratoire de virologie 1, Boulevard Jeanne D'Arc BP 1542 — 21079 Dijon cedex

275

Bactériologie et virologie pratique

Virus de l'immunodéficience humaine (HIV)

[5], ARN,

> Taxonomie et Structure Famille des Retrovinioae (virus à ARN possédant une transcriptase inverse), Sous-famille des Orthoretrovininae, genre Lentivirus, espèce Human Immunodeficiency virus 1 et 2 (HIV-1 et

HIV-2) Virus de taille moyenne (100 nm), capside de symétrie cubique (conique), génome ARN simple brin de polarité positive de 10 kb, diploide, glycoprotéines d'enveloppe

(trimère de op41+aqp120)

nucléocapside conique (p24)

enveloppe

…

génome ARN (2 copies) matrice

transcriptase inverse (p66+p51)

(p17)

intégrase (p32)

Réplication avec intégration obligatoire (provirus) dans les lymphocytes T CD4+ et les monocytes, Le virus pénètre dans ces cellules grâce à la molécule CDA (récepteur principal) et à un corécepteur (CCRS ou CXCR4, récepteurs de chimiokines).

276

2

Virus à ARN

maturation

attachement

RARIRRRES

traduction

PP

ee Pol transcription

+ LS

assemblage

mue

inverse

8

an

3

D

À

a

Cd

re

|

transcription

|

> Epidémiologie

|

|

ARR

:

D

RE

va

Virusfragile, contamination par voie sanguine (transfusion avant 1985, toxicomanie, exposition proà sexuelle et mere-enfant. Strictement humain, virus homologue chez le chimpanzé (SV)et les macaques. Prévalence en France 80 à 100 000 sujets, incidence: 6000 nouveaux cas par an. Prévalence dans le monde > 43 millions. HIV-1 est responsable de la pandémie mondiale (principalement HIV-1 groupe M, très rarement O où N), HIV-2 est surtout présent en Afrique de l'Ouest. Virus très variable

2TAL

Bactériologie et virologie pratique

> Pouvoir pathogène Incubation d'environ 3 semaines. L'infection évolue en 3 phases. Stade À

Stade B

Asymptomatique Primo-infection

Lymphadénopathie

Stade C

Symptomatique

Symptomatique

non SIDA

SIDA

Classification cl nique de l'infection à VIH d'après le Center for diseases control (CDC 1993) ° Primo-infection: Souvent asymptomatique ou d'aspect anodin, Elle correspond à une réplication inten se du HIV avant la mise en place d'une réponse immune, Les signes cliniques sont non spécif iques, variables et régressent spontanément :pharyngite, angine, fièvre, polyadénopathie, mê ningites, …

+ _ Phase asymptomatique: Le sujet ne présente aucun signe clinique d'immunodépression. La réponse immune contrôle partiellement la réplication du HIV,

°

SIDA (syn drome d’immunodéficience acquise): le sujet présente une immunodéression (immu nité à médiation cellulaire, souvent un taux de lymphocytes T CD4+ < 200/

=)

mm° ou < 15 %) et cliniquement des pathologies opportunistes infectieuses (pneumocystose, tuberculose, toxoplasmose cérébrale, candidose profonde, ...) ou tumorales (cancer du col, ymphome, ..) définissant le stade sida selon l'OMS (ou le CDC d'Atlanta).

> Echantill ons biologiques Diagnostic biologique systématique après une exposition ou en sécurité virale. Sang (sérum) : recherche d'anticorps (dépistage, immunoblot, recherche d'Ag p24 Sang (plasma): mesure de la charge virale HIV-T (ou HIV-2), plus rarement autres liquides biologiques (LC R, plasma séminal, .….), génotypage de résistance.

Sang (cellules mononuclées): recherche du virus par culture ou du génome par PCR ou

RT-PCR.

278

4,2

Virus à ARN

> Diagnostic direct: Détection/quantification de l'ARN viral: quantification de l'ARN viral plasmatique par RT-PCR quantitative ou une autre technique de biologie moléculaire (NASBA, bDNA). Une variation > 0,5 Log est significative, seuil de détection environ 50 copies d'ARN HIV-1/ mL de plasma. Des techniques non commercialisées existent pour HIV-2 et certains virus variants. Test utilisé en routine pour le suivi d'efficacité thérapeutique, une évaluation pronostique et le diagnostic chez les nouveaux-nés ou en cas de suspicion de primo-infection. L'ARN HIV-7 est détectable environ 10 jours après la contamination.

Détection/quantification de l’Ag p24: test ELISA utilisé pour le diagnostic des primo-infections si l'ARN n'est pas disponible (détection environ 15 jours après la contamination). Génotypage de résistance :recherche, par séquençage des gènes codant les protéines cibles des antirétroviraux (RT, PR, gp41,.….) des mutations associées à la résistance aux =] antrétroviraux. Interprétation complexe et évolutive. Détection/quantification de l'ADN viral: test spécialisé Culture virale : test spécialisé

Phénotypage de résistance: test spécialisé utilisant des virus recombinants cultivés en présence d'antirétroviraux.

Détermination du tropisme viral:test spécialisé permettant la détermination des corécepteurs utilisés par le virus par séquençage de la gp120 (V 3) ou test phénotypique avec Virus recombinants.

Diagnostic indirect Dépistage des Ac anti-HIV: Tesis très sensibles. En 2008, un dépistage doit être effectué par 2 techniques ELISA différentes (un test rapide peut être utilisé) dont au moins une détectant HIV-2 et les HIV-1 groupe ©. Certains tests dits combinés, détectent les Ac anti-HIV et l'Ag p24 en 1 temps (réduction de la fenêtre virologique). Les Ac apparaissent entre 3 semaines et 3 mois après la contamination. Résultats :positif (+/+), négatif (-/-), discordant (+/-). En ca$ de non négativité, confirmer systématiquement la spécificité des Ac sur le même échantillon par la réalisation d'un immunoblot où d'un western blot (élimination des faux positifs). Cet algorithme doit évoluer rapidement vers le passage à l’utilisation d'un seul test combiné. Immunoblot ou western blot: Résultats, positif pour HIV-1 où HIV-2, négatif ou indéterminé. Un sujet sera déclaré HIV positif, uniquement après confirmation d'un premier dépistage positif sur un second échantillon. On note souvent un syndrome mononucléosique sanguin lors de la primo-infection. Lymphopénie progressive au cours de l'infection. 279

Bactériologie

et virologie pratique

primo-infection

ARNHIV4

|

phase asymptomatique (latence clinique)

Î

|

|

a

SIDA

|

| Anticorps HIV-1

|

æ)

© 2

3 Lu

E

Fa

Taux

de

T

lymphocytes

=

200 /mm3——

a £

CD4+

contamination

5-10 ans

L'utilisation des corécepteurs CCRS (virus R5) et CXCRA (virus X4) évolue lors de l'infection avec présence dans 50 % des cas de virus utilisant CXCRA4 au stade SIDA.

> Diagnostic différentiel Lors d'un Syndrome mononucléosique sanguin rechercher les autres étiologies :MNI (EBV), CM, toxoplasmose. Rechercher systématiquement les infections transmises par voie sanguine (HBV, HCV, HDV) ou sexuelles pouvant être associées. Faire le diagnostic des pathologies et infections opportunistes

> Traitement prophylactique ou curatif Prophylaxie : Pas de vaccin disponible. Utilisation des préservatifs. Dépistage systématique (Ac et ARN) lors des dons de sang, tissus et organes. Proposition systématique en prénuptial et lors de la déclaration de grossesse, Déclaration à la DDASS de la séropositivité HV obligatoire et anonyme. Prévention de la transmission mère-enfant (antirétroviraux, suivi obstétrical, césarienne éventuelle, traitement post-exposition de l'enfant). Consultation de Dépistage Anonyme et Gratuite (C.D.A.G.) disponibles dans tous les départements. Traitement:

De nombreux antirétroviraux sont disponibles. lls permettent un contrôle de la réplication virale (ARN HIV-T plasmatique indétectable) et une restauration immunitaire (Taux de lymphocytes 280

4,2

Virus à ARN

T CD4*). Les patients symptomatiques ou ayant des lymphocytes T CD4* < 350 sont traités (traitement systématique si < 200). La guérison n'est actuellement pas possible, Le traitement comprend au minimum 3 antirétroviraux (trthérapie) comportant 2 INTI + 1 IP (associée au ritonavir) ou 2 INTI + 1 INNTI ou éventuellement 3 INT Le ritonavir est systématiquement associé à une autre antiprotéase pour en améliorer la pharmacocinétique (compétition pour la métabolisation par le CYP3A4). Attention ceci peut induire des interactions médicamenteuses.

La charge virale HIV et le taux de lymphocytes T CD4+ sont mesurés tous les 3 mois. La olérance clinique et biologique est également contrôlée. Le traitement doit être pris régulièrenent et à vie. L'éducation thérapeutique à un rôle majeur dans l'adhérence du patient et dans a prévention de la sélection de virus résistants._ Les effets indésirables sont nombreux et la olérance variable : intolérance cutanée (ABC), hématotoxicité (AZT), neuropathie périphérique d4T, ddC, ddl) ou centrale (EFV), hépatotoxicité (NVP EFV, IP), pancréatite (ddl, d4T), diarrhée (œe (IP), tubulopathie (TDF), lithiase rénale (IDV), troubles lipidiques et glycémiques (IP), lipodystrophies (INT! + IP). Ne pas oublié le traitement des pathologies opportunistes éventuelles. qui est prioritaire sur le

traitement antirétroviral, Celui-ci est alors souvent arrêté (interactions médicamenteuses) et sa reprise se fait après contrôle de l'infection opportuniste. Pour les sujets ayant moins de 200 lymphocytes T CD4+, une prévention systématique de la pneumocystose et de la toxoplasmose est réalisée par du cotrimoxazo! (Bactrim®). INTI (nucléosidiques) AZT (Rétrovir') 3TC (Epivir') INNTI (non nucléosidiques)

da (Zérit) ABC (Ziagen') ddl (Videx”) FTC (Emtriva”) ddC (Hivid”) INTI (nucléotidiques)

Névirapine (Viramune”) Efavirenz (Sustiva) Delavirdine (Rescriptor)

TDF (Viread')

Inhibiteur de l’Intégrase Raltégravir, Elvitégravir,… FUSION

Inhibiteur Fusion Enfuvirtide (Fuzéon') IP (inhibiteur de protéase)

Saquinavir (Invirase”, Fortovase) Ritonavir (Norvir”) Indinavir (Crixivan”) Nelfinavir (Viracept")

inhibiteur Corécepteurs

ARE

Maraviroc, Vircriviroc, …

2

Amprénavir (Agenerase) Fosamprénavir (Telzir’)

Lopinavir (Kalétra‘) Atazanavir (Reyataz') Tripranavir (Aptivus”) Darunavir (Prezista”)

281

Bactériologie et virologie pratique

inhibiteurs nu cléosidiques de la transcriptase inverse (INTI): agissent sous formes triphosporylées (phosphoryiation intracellulaire) en s'intégrant à la chaine d'ADN viral en cours d'élongation par la 1

—

ATT où zidovudine (Rétrovir®)

—

DAT ou stavudine (Zérit®)

—

DdC ou zalcitabine (Hivid®) (non utilisé actuellement)

—

Ddl ou dida 10sine (Videx®)

—

ABC ou abacavir (Ziagen)

—

S3]C ou lam ivudine (Epivir®)

—

FICouem ricitabine (Emtriva®)

—

TDF ou ténofovir disoproxil fumarate (Viread®)

—

RCV ou rac vir et ATC ou apricitabine (indisponible actuellement)

—

En association: AZT+3TC (Combivir®), AZT+3TC+ABC (Trizivir®), ABC+8TC (Kivexa®), TDF+FTC (Truvada®)

inhibiteurs no n nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI):agissent en rendant la Tl inactive par modification de la conformation de son site catalytique. Molécules activent uniquement sur es HIV-1 groupe M.

—

_NVP ou névirapine (Viramune®)

—

EFV ou éfavirenz (Sustiva®) ”

—"

DEV ou delaviridine (Rescriptor®) (non utilisé)

—

Etravirine (T C125, Intelence®)

—

Rilpivirine (TMC278 indisponible actuellement)

—

En association: TDF+FTC+EFV (Atripla®)

inhibiteurs de la protéase virale (IP, suffixe :navir) : agissent en bloquant le site catalytique de la protéase virale et donc la maturation par clivage des protéines virales internes (Gag et Gag-Pol), rendant les particules virales non infectieuses,

—

SQV ou saquinavir (Invirase® ou Fortovase®)

—

DV ou indinavir (Crixivan®)

—

_RTV ou ritonavir (Norvir®) (utilisé en association avec les autres IP sauf le NFV)

—

NFV ou nelinavir (Viracept®)

—

APV ou amprénavir (Agénérase®) (non utilisé)

—

FosAPV ou fosamprénavir (Telzir®)

—

[PV ou lopi navir+ RTV (Kalétra®)

—

ATV ou atazanavir (Reyataz® 282

4,2

—

TPV ou tipranavir (Aptivus®)

—

DRV ou darunavir (MC114, Prézista®)

Virus à ARN

inhibiteurs de la fusion : agissent en bloquant la fusion des enveloppes virales et cellulaires par interaction avec la gp41 virale. Molécule active uniquement sur les HIV-1 groupe M.

—

enuvirtide (Fuzéon®) (2 ISC /)

inhibiteurs des corécepteurs (suffixe:viroc) :agissent comme des inhibiteurs compétitifs du HIV en se fixant au corécepteur viral CCR5. —

MVC où maraviroc (Celsentri®)

—

VCV ou vicriviroc (indisponible actuellement)

—

TNX-355 (indisponible actuellement)

inhibiteurs de l’intégrase (suffixe:gravir) : agissent en bloquant l'intégration de l'ADN viral au génome cellulaire en bloquant le site catalytique l'intégrase virale.

— —

raltégravir (Isentress®) elvitégravir (indisponible en 2009)

CNR Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) CHU Bretonneau Departement de Microbiologie et Virologie Faculté de Médecine de Tours 2 bis bvd Tonnelle — 37032 Tours cedex

283

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]J. Grosjean

D. Clavé

Bactériologie

M. Archambaud

C. Pasquier

Virologie

pratique

C: manuel pratique a sa place dans la poche de tous les étudiants et professionnels en microbiologie médicale. IL détaille l'ensemble des étapes du diagnostic microbiologique, du prélèvement

à l'édition des résultats : choix des techniques,

identification, sensibilité aux traitements, interprétation. Les bactéries et virus d'identification courante sont présentés en détails grâce à des fiches illustrées. Ce livre couvre l'ensemble du programme de microbiologie de l'internat en pharmacie et de nombreux items des ECN.

Cet ouvrage s'adresse à un large public : étudiants en pharmacie, en médecine, en BTS d'analyses médicales, biologistes médicaux, internes et techniciens en biologie médicale. Remerciements : les auteurs remercient le Pr François Denis pour son aide.

Jérôme Grosjean est interne en biologie médicale au laboratoire de bactériologievirologie-hygiène du CHU de Limoges.

Maryse Archambaud Christophe Pasquier et Danielle Clavé sont est professeur toutes deux maîtres des universités et de conférences des praticien hospitalier au universités et praticiens | laboratoire de virologie hospitaliers au . du CHU de Toulouse.

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