A la búsqueda del secreto de la vida.: Una breve historia de la Biología Molecular [1 ed.] 8493619612, 9788493619619

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VIRUS patógenos (en coedición con la Fundación BBVA) Coordinadores: Luis Carrasco José Mª Almendral del Río VV. AA. CD con fichas interactivas

El libro “A la búsqueda del secreto de la vida” va avanzando desde los orígenes de la Biología Molecular, con la identificación de las macromoléculas esenciales y la comprensión de su estructura y función, hasta la incorporación de estos conceptos en la genética y sus leyes, culminando en uno de los hechos científicos de mayor trascendencia: la determinación de la estructura del DNA. Este hecho, que cambia sustancialmente nuestra forma de entender las bases de la vida, abre de par en par las puertas para la comprensión de los fenómenos subyacentes a la transmisión de la información genética, y permite un avance vertiginoso en la disciplina. Escrito en un tono riguroso, incorpora no obstante un material rico en anécdotas y características personales de los científicos protagonistas de cada paso descrito. De esta manera se nos ofrecen nuevas perspectivas que complementan y cualifican a las figuras señeras de la ciencia del siglo XX. El libro ofrece una posibilidad única de revisar los mecanismos mediante los cuales una disciplina nace y se afianza en el panorama científico-tecnológico, al compás de las transformaciones sociales, económicas y políticas que la enmarcan. Y todo ello en un tiempo relativamente corto, por lo que lector queda atrapado de forma natural en su lectura.

José María Valpuesta

BIOQUÍMICA. Técnicas y Métodos Autores: Pilar Roca Jordi Oliver Ana Mª Rodríguez CD con animaciones interactivas

Una Breve Historia de la Biología Molecular

A la Búsqueda del Secreto de la Vida

Otros títulos de la serie Base:

La Biología Molecular representa un caso especialmente interesante en la historia de la ciencia debido a su enorme trascendencia sobre nuestro conocimiento actual de la esencia y el funcionamiento de los seres vivos, así como en sus aplicaciones y potencial actual y futuro. Este libro pretende dar una visión de los antecedentes, nacimiento y desarrollo de esta fascinante disciplina, difícil de definir de una manera clara y desligarla de otras que la han dado sustento: la Bioquímica –que ha prestado multitud de técnicas–, la Genética –que ha proporcionado un buen número de ideas–, y la Física –quizás la que le ha dado el sello más propio–.

a la búsqueda del secreto de la vida

JOSÉ MARÍA VALPUESTA MORALEJO es Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad del País Vasco. Realizó una estancia postdoctoral en el Laboratory of Molecular Biology en Cambridge (Inglaterra) y en la actualidad es Profesor de Investigación del CSIC y Director del Centro Nacional de Biotecnología, donde desarrolla desde hace años una línea de investigación sobre chaperonas moleculares. Es autor de más de cien artículos en revistas internacionales. Desde 2005 es Presidente de la Sociedad de Microscopía de España, y también miembro de otras sociedades científicas españolas y extranjeras. En el ámbito de la divulgación científica, ha participado como ponente en conferencias, y escrito artículos de opinión en periódicos y revistas. Ha impartido numerosos cursos de doctorado en varias universidades españolas, entre ellos uno dedicado a la Historia de la Biología Molecular y sus antecedentes desde la historia antigua hasta nuestros días, germen del libro que ahora presentamos.

José María Valpuesta Prólogo de José Manuel Sánchez Ron

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A la búsqueda del secreto de la vida Una breve historia de la Biología Molecular

José María Valpuesta

Profesor de Investigación del CSIC Centro Nacional de Biotecnología

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A la búsqueda del secreto de la vida. Una breve historia de la Biología Molecular

© Editorial Hélice, 2008 © CSIC, 2008 © del autor, 2008 COEDITORES: EDITORIAL HÉLICE Elena Feduchi y Alicia Irurzun C/ Alberto Aguilera, 13, 4º 28015 Madrid Tel. y Fax: 91 548 11 90 www.editorialhelice.com

MAQUETACIÓN: Rebeca Irazábal DISEÑO DE PORTADA: Equipo 01 IMPRESIÓN: Closas Orcoyen, S.L.

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Reservados todos los derechos. Ninguna parte de este libro puede ser reproducida total ni parcialmente, ni almacenada en un sistema informático, ni trasmitida de cualquier forma o por cualquier medio, electrónico, mecánico, fotocopia, grabación u otros métodos, sin previo aviso y expreso permiso de Editorial Hélice® y CSIC. La infracción de los derechos mencionados puede ser constitutiva de delito contra la propiedad intelectual (artículos 270 y siguientes del Código Penal).

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A Marije, por su paciencia y por todo lo demás

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La realización del presente trabajo ha sido posible gracias a la financiación del Ministerio de Educación y Ciencia, dentro del Programa Nacional de Fomento de la Cultura Científica y Tecnológica. Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica 2004-2007.

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Prólogo Que la ciencia afecta profundamente a nuestras vidas es algo que a estas alturas de la historia debería constituir un lugar común. Cualquier persona se debería dar cuenta, por muy pequeños que sean sus conocimientos, de la gran distancia que separa su existencia, y la de sus progenitores, de la que llevaban quienes vivieron antes de, digamos (para extremar la evidencia de la argumentación), el siglo XIX. El rey más poderoso disponía de muchísimos menos recursos que los que en la actualidad son accesibles a una gran parte de la humanidad (hay otra que, ¡ay!, sigue sumida en los oscuros y terribles pozos de la miseria). Esos antepasados nuestros vivían, de media, menos, comían peor y no podían combatir como lo hacemos nosotros el calor, el frío o las enfermedades. Y ¿a qué se debe tales diferencias? ¿A, por ejemplo, la extensión de la democracia y de los derechos civiles? ¿A una mejor organización social? No, claro que no. Se debe al avance de la ciencia y a la, íntimamente ligada a tal progreso, institucionalización profesional de la actividad científica. Absolutamente básicos para entender no sólo lo que ahora sabemos acerca de los fenómenos que tienen lugar en la naturaleza, sino también para comprender cómo vivimos en la actualidad, son los siguientes desarrollos científicos que tuvieron lugar a lo largo del siglo XIX y primera mitad del XX (la lista se podría ampliar algo, pero contiene, espero, lo esencial): lo que en su tiempo se denominó “medicina científica” (fisiología, microbiología, histología, Helmholtz, Pasteur, Koch, Lister, Virchow, Ramón y Cajal...), las teorías del campo electromagnético (Faraday, Maxwell) y de la evolución de las especies (Darwin), los trabajos de Mendel en lo que más tarde se denominaría genética, el descubrimiento de la radiactividad y de nuevas radiaciones como los rayos X, y las revoluciones relativista (Einstein) y cuántica (puesta en marcha por Planck y culminada en una primera fase por Heisenberg y Schrödinger). Logros como estos conmovieron (algunos con relativa lentitud, como si fueran espoletas de efecto retardado; el caso de Mendel) el mundo, y a la postre resulta evidente que todos aquellos que no supieron de ellos, que no dispusieron de algún tipo de información acerca de sus contenidos e implicaciones, vivían en más de un sentido ajenos al mundo al que pertenecían, extrañados de él. Se les podía aplicar aquello que el siempre perspicaz e informado José Ortega y Gasset escribió en El tema de nuestro tiempo (1923): “Nuestra generación, si no quiere quedar a espaldas de su propio destino, tiene que orientarse en los caracteres generales de la ciencia que hoy se hace, en vez de fijarse en la política del presente, que es toda ella anacrónica y mera resonancia de una sensibilidad fenecida. De lo que hoy se empieza a pensar depende lo que mañana se vivirá en las plazuelas”. Pues bien, en la actualidad nos encontramos en una situación parecida, sólo que ahora no es la física, que dominó una gran parte del siglo que va de, aproximadamente, 1850 a 1950, y que tanta atención recibió de políticos, de industriales y de pensadores de todo tipo, por no decir de los medios informativos (significativo de esa dominancia y repercusión social es que el número del 31 de diciembre de 1999, la revista estadouni-

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 dense Time designara “Personaje del Siglo” ‑el XX, claro‑ al físico Albert Einstein). Ahora son las ciencias de la vida, las ciencias biomédicas en general, y las biológico-moleculares en particular, las que se encuentran en el epicentro del avance científico y de la incidencia de éste en la sociedad. Con justicia se puede decir que estamos asistiendo en estos dominios a una auténtica revolución científica. Como “ciencias de la vida” he caracterizado a las protagonistas de esta revolución en curso. Y el que su objeto sea eso, la vida, los procesos biológicos, explica, es cierto, no su pujanza científica (esta tiene sus propios orígenes, sus dinámicas interna y externa), pero sí el interés social que suscitan. Reconocemos en estas ciencias una cercanía de la que, en más de un sentido, carecía, por mucho que afectase a nuestras existencias, la física. De lo que las ciencias biomédicas tratan, resulta casi ocioso decirlo, es de aquello que nos es más próximo y querido: nuestros propios cuerpos y los medios de reproducción a los que podemos acceder (también tratan de otras cosas, por supuesto). Por todo esto, por las transcendentales y originales novedades a las que estas ciencias están dando lugar, y por su importancia para el conjunto de la vida, incluyendo nuestras vidas, es imprescindible que la sociedad, los legos en materias científicas (y también, por cierto, los científicos de otros campos), sepan algo –o mejor, lo más posible– de aquello que, como decía Ortega, “mañana se vivirá en las plazuelas”, aunque en realidad habría que actualizar esta frase diciendo: de aquello que se vivirá mañana mucho más, pero que ya se vive hoy. El presente libro, A la búsqueda del secreto de la vida. Una breve historia de la Biología Molecular, del profesor de investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y director del Centro Nacional de Biotecnología, José María Valpuesta, constituye un instrumento precioso en tal sentido. Mis razones para caracterizarlo de esta manera ‑instrumento precioso‑ son sencillas. Las resumiré brevemente. Es la obra de un profesional que conoce bien su disciplina, y no, como no es infrecuente que suceda, la de un historiador que se esfuerza por adquirir los conocimientos necesarios para poder entender y transmitir una historia tan compleja y exigente como es la de la biología molecular. Ahora bien, aun siendo el doctor Valpuesta un científico, en este libro muestra una gran sensibilidad y aptitudes para la reconstrucción histórica. Así, A la búsqueda del secreto de la vida es un excelente texto de historia, en el que no se olvida ninguno de los muy diversos protagonistas en la construcción y desarrollo de la biología molecular, como son ideas, teorías, programas de investigación, experimentos, instrumentos, técnicas, investigadores, instituciones y, por supuesto, los “entes” u “objetos” de los que se ocupa (células, proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, genes...). A través de las páginas que siguen, los lectores verán cómo se despliega ante sus ojos un espléndido y poliédrico espectáculo, en el que aparecen, transforman o combinan disciplinas emparentadas, sí, pero diferentes, como, por ejemplo, genética, bioquímica, biología molecular, ingeniería genética, genómica, proteómica o bioinformática. Y así, lo que es reconstrucción histórica se convierte también en una introducción (algunos dirán ‑es un término que a mí no me gusta demasiado‑ divulgación) a las ciencias biológico-moleculares, tarea ésta a la que ayudan de manera magnífica los gráficos que el autor ha preparado, que junto a las fotografías reproducidas hacen de la presente una de esas no excesivamente frecuentes obras en las que palabra e imagen se complementan añadiendo claridad y belleza estética. En el epílogo que cierra A la búsqueda del secreto de la vida, José María Valpuesta ha escrito: “Los últimos veinte años que han pasado desde el punto en que esta historia finaliza han dado lugar a muchos interesantes descubrimientos... pero todos ellos pertenecen a una historia que será contada en otro momento”. Pues bien, esperemos que ese “otro momento” no tarde en llegar. No sólo porque el profesor Valpuesta nos haya suscitado el apetito por completar la fascinante empresa intelectual que aquí ha tratado, sino porque necesitamos una historia lo más acabada y actualizada que sea posible para ser ciudadanos de pleno del mundo actual, un mundo profundamente penetrado por las ciencias biomédicas y biológico-moleculares, en las que tantas esperanzas tenemos depositadas todos. José Manuel Sánchez Ron Real Academia Española y Universidad Autónoma de Madrid

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Nota del autor El título de este libro no sólo intenta definir lo que en él se encierra sino que se adelanta a las críticas que pudieran producirse tras su lectura. Este libro es una breve historia de la Biología Molecular y, en consecuencia, no pretende describir en profundidad los acontecimientos que dieron lugar a esta disciplina, sino tan solo provocar el interés de los lectores hacia escrituras más especializadas. No hay por lo tanto citas que acompañen al texto, con el fin de hacerlo más ágil, pero el lector puede encontrar al final del libro una amplia bibliografía donde saciar su sed de conocimiento. Este libro es una breve historia de la Biología Molecular, es decir, la que este autor ha pergeñado, y es que esta historia pudiera haberse escrito de muy distintas maneras. Lo que aquí se cuenta finaliza aproximadamente a mediados de los años ochenta del siglo pasado. Muchos descubrimientos, algunos de ellos muy importantes, se han realizado con posterioridad a esa época, pero el autor no se ha sentido con fuerzas ni ha encontrado la suficiente perspectiva para narrarlos. Alguna de las figuras que describen ciertos experimentos clásicos no lo hacen de manera fidedigna, sino que los simplifican para mostrar de una forma más o menos sencilla el descubrimiento o la idea que subyace tras ellos. El experimento real en estos casos fue mucho más complejo o fueron en realidad una serie de experimentos, mucho más difíciles de describir por separado. Finalmente, quisiera agradecer ante todo el interés y la paciencia de las editoras de este libro, Elena Feduchi y Alicia Irurzun, y su empuje para que este esfuerzo llegara a buen puerto. Me gustaría dar también las gracias a Ricardo Arias, Antonio Bernad, José María Guantes, José López Carrascosa, Esteban Montejo y María Jesús Villa por las correcciones que han hecho del manuscrito. Quisiera expresar mi agradecimiento a las editoriales e instituciones que han consentido en ceder fotografías para ilustrar lo que aquí se describe. Quisiera también agradecer al CSIC y a su director de publicaciones, Miguel Ángel Puig-Samper, el interés que han mostrado por este proyecto. Berkeley 2006, Madrid 2007 9

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Índice Introducción ...................................................................................... 15 i. Los orígenes de la biología molecular . ............................... 23 La transmisión de la información (la Genética) .................................. Los estratos y los fósiles .................................................................... Charles Darwin ................................................................................ Gregor Mendel ................................................................................ La célula .......................................................................................... El núcleo .......................................................................................... Los cromosomas ..............................................................................

24 24 29 32 34 36 38

Las proteínas y los enzimas ................................................................. Las albúminas .................................................................................. Las proteínas .................................................................................... El enlace peptídico . ......................................................................... Los fermentos .................................................................................. El vitalismo . ..................................................................................... Los premios Nobel ........................................................................... Los enzimas y su naturaleza proteica . .............................................. La teoría coloidal de las proteínas .................................................... La cristalización del virus del mosaico del tabaco .............................

39 40 42 43 47 48 51 52 54 58

La Fundación y las técnicas ................................................................. La Fundación Rockefeller ................................................................. La cromatografía .............................................................................. La centrifugación . ............................................................................ La electroforesis ............................................................................... Los isótopos ..................................................................................... La microscopía electrónica ...............................................................

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La Física en la Biología Molecular ....................................................... La edad de oro de la Física .............................................................. La difracción de rayos X ................................................................... Linus Pauling . .................................................................................. Las fuerzas y los enlaces débiles .......................................................

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Índice

La estructura de las proteínas ............................................................. 78 Astbury y Bernal . ............................................................................. 78 Max Perutz y el Laboratorio de Biología Molecular ............................ 81 La determinación de la estructura en hélice α y lámina β . ................ 83 La determinación de las primeras estructuras proteicas .................... 88 La secuenciación de la insulina ........................................................ 95 Los ácidos nucleicos y la naturaleza del material hereditario ............ La nucleína ...................................................................................... Los ácidos nucleicos . ....................................................................... ¿Es el ácido nucleico el almacenador de la sustancia hereditaria? . ... La naturaleza del ácido nucleico ...................................................... Phoebus Levene . ............................................................................. La hipótesis tetranucleotídica ...........................................................

99 99 101 102 104 107 108

El nacimiento de la Genética: sexo y recombinación ......................... El redescubrimiento de Mendel ....................................................... Thomas Morgan y la mosca del vinagre . .......................................... Muller y los rayos X ..........................................................................

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La naturaleza de la sustancia hereditaria ............................................ La unión de la Bioquímica con la Genética ...................................... Un gen – un enzima ........................................................................ ¿Un gen = un enzima? .................................................................... El grupo de los fagos ........................................................................ Luria y la genética bacteriana ........................................................... El experimento de la batidora .......................................................... Chargaff y la complementariedad de las bases .................................

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La determinación de la estructura del DNA ........................................ Londres ............................................................................................ Cambridge ....................................................................................... Pasadena ......................................................................................... La carrera por la estructura del DNA . .............................................. La replicación del DNA . ..................................................................

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ii. La edad de oro de la biología molecular ............................ 159 El dogma central de la Biología ........................................................... George Gamow y el código genético ............................................... Linus Pauling y la anemia falciforme ................................................ Francis Crick y el club de la corbata de RNA ................................... Francis Crick y el Dogma Central de la Biología ............................... El RNA de transferencia ................................................................... El RNA mensajero ............................................................................ El RNA también almacena la información genética .......................... El mutón .......................................................................................... ¡Es un triplete sin comas! ................................................................. El desciframiento del código genético .............................................. Caracterización de los mecanismos de transcripción ........................ La maquinaria de traducción: el ribosoma .......................................

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Índice

El control genético ............................................................................... La hipótesis del operón .................................................................... El aislamiento del represor y el operador ......................................... La búsqueda del promotor ............................................................... Los transposones .............................................................................. El alosterismo ...................................................................................

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La revolución genética ......................................................................... Arthur Kornberg ............................................................................... La vida se crea en un tubo de ensayo .............................................. Problemas con la DNA polimerasa ................................................... Los fragmentos de Okazaki .............................................................. El nacimiento de la Ingeniería Genética ........................................... La recombinación del DNA . ............................................................ Los primeros contratiempos de la ingeniería genética: la reunión de Asilomar . .............................................................. Las nuevas técnicas de Biología Molecular ....................................... Los plásmidos . ................................................................................. La lectura y modificación del DNA .................................................. Los anticuerpos ................................................................................ La huella genética ............................................................................

198 198 199 201 203 205 206 208 209 212 212 217 219

iii. La consolidación de la biología molecular ...................... 221 Los atentados contra el dogma . .......................................................... El ayuste (splicing) de los genes ........................................................ La caracterización del ayuste . .......................................................... Los ribozimas ................................................................................... El mundo del RNA ........................................................................... El cáncer como motor del desarrollo de la Biología Molecular ......... El RNA hace DNA ............................................................................ Los oncogenes ................................................................................. El VIH .............................................................................................. El plegamiento de las proteínas ........................................................ Las proteínas de choque térmico y las chaperonas moleculares . ...... Los priones ......................................................................................

222 222 224 224 226 227 228 230 232 233 236 236

La consolidación de la Biología Molecular .......................................... El nacimiento de la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO) ...................................................................... El desarrollo de la Biología Estructural .............................................. La Bioinformática .............................................................................

238 238 239 243

Epílogo . ................................................................................................. 245 Bibliografía .......................................................................................... 247 Apéndices ............................................................................................... 249 Índice analítico .................................................................................. 261

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Introducción “Los organismos biológicos están compuestos de moléculas inanimadas. Cuando esas moléculas son aisladas y examinadas individualmente, su comportamiento se ajusta al de las leyes físicas y químicas que describen la materia inanimada” Albert Lehninger

“El crecimiento y división de las células se basa en las mismas leyes de la Química que controlan el comportamiento de las moléculas fuera de las células... no hay una Química especial para los seres vivos” James Watson

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Introducción

Aunque parezca que vivimos en un mundo enorme, en realidad la vida de la que formamos parte no es más que una pequeña mota en el espacio en la que se han dado las circunstancias adecuadas para que se genere un cierto grado de orden y para que éste se mantenga a lo largo del tiempo. De los mecanismos que generan ese orden, lo perpetúan y permiten de vez en cuando cambios sutiles que aseguren la búsqueda de nuevos caminos en la supervivencia de los sistemas biológicos, se ocupa la Biología Molecular. Este libro pretende dar una visión de los antecedentes, nacimiento y desarrollo de esta disciplina, cuyo nombre se debe al matemático americano Warren Weaver, quien en 1938 la definió como “una disciplina relativamente nueva en la que están siendo usadas modernas y delicadas técnicas para investigar detalles cada vez más minúsculos de ciertos procesos vitales”. Efectivamente, la Biología Molecular es una disciplina nueva, especialmente si se la compara con otras como las propias Matemáticas o la Física, pero en su corta vida ha sido testigo de grandes descubrimientos y ha penetrado rápidamente en un periodo de madurez que a algunos les parece ya decadencia. La Biología Molecular es una disciplina extraña, porque es difícil definirla de una manera clara y desligarla de otras que le han dado sustento. Y es que si las fronteras de la Biología Molecular no son claras, si ésta nace del aliento de distintos conocimientos y no tiene una clara delimitación, tampoco muchos biólogos moleculares se sienten a gusto con el nombre con que se les define, aunque lo utilizan como un recurso para evitar meterse en problemas. Quién mejor que el propio Francis Crick para explicar este sentimiento: “Me vi forzado a llamarme a mí mismo biólogo molecular cuando preguntado por legos qué era lo que hacía, me cansé de explicar que era una mezcla de cristalógrafo, biofísico, bioquímico y genetista, una explicación que, por otra parte, encontraban difícil de entender”.

¿Qué es, por tanto, la Biología Molecular? Como indica Crick, es difícil definirla con términos precisos. Una definición sencilla podría ser la siguiente: “La Biología Molecular es la rama de la biología que estudia los seres vivos y los fenómenos vitales con arreglo a las propiedades de sus estructuras moleculares”.

Es esta visión molecular lo que la hace diferente de la Bioquímica, la disciplina que más ha influido en la Biología Molecular, de la que ha tomado una gran parte de sus técnicas, y a la que, en cierta manera, ha acabado absorbiendo. Quien crea que esto último es exagerado, que se pare a pensar por qué los departamentos de Bioquímica de las facultades de todo el mundo llevan ahora el añadido de “... y Biología Molecular” o simplemente han hecho desaparecer el título de Bioquímica (quien esto escribe comenzó llamándose bioquímico hace veinte años para definirse ahora a sí mismo como biólogo molecular). Y es que la Bioquímica mantiene con la Biología Molecular una relación de amor y odio, pues muchos bioquímicos sostienen que ésta simplemente les ha 16

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Introducción

robado sus técnicas dándoles una capa de sofisticación. Erwin Chargaff, uno de los grandes bioquímicos del siglo pasado y una lengua muy afilada, dijo una vez que “la Biología Molecular no es más que la práctica sin licencia de la Bioquímica”. Este comentario, aunque guarde cierta parte de verdad, es claramente exagerado, pues a mi modo de ver sí que hay diferencias. Quien mejor las ha expuesto es Arthur Kornberg, sin duda uno de los padres de las modernas técnicas de la Biología Molecular, pero quien paradójicamente se ha definido como bioquímico contra viento y marea: “Mientras que la Biología Molecular se ha ocupado fundamentalmente de la tríada DNA, RNA y proteína, y de la transferencia de la información genética, la Bioquímica se ha preocupado de todas las moléculas de la célula como son los azúcares, los lípidos y las membranas: los procesos energéticos y del metabolismo, las funciones motoras y sensoriales”.

Esta definición es indudablemente mejor porque incluye otro de los puntos fuertes alrededor del cual se ha desarrollado la Biología Molecular: el almacenamiento, el uso y la transferencia de la información genética. Sin embargo, es incluso mejor la definición funcional que Kornberg depara para las dos disciplinas, o más bien para aquellos que trabajan encuadrados en cada una de ellas: “El bioquímico persigue la función (como la fermentación del azúcar al alcohol, la fotosíntesis, la visión, la replicación del DNA) para encontrar las estructuras responsables de ésta. Se siente impelido a romper la célula y diseñar experimentos para purificar las moléculas que realizan una determinada función. El bioquímico utiliza la Química para conectar con la Fisiología, y la Genética con los hechos físicos del sistema (...) Por otra parte, el biólogo molecular persigue la estructura (DNA o proteína) para encontrar su función. Modifica la estructura, la introduce en una célula intacta y, a partir de la respuesta que se produce en la célula, infiere la función de la estructura. El biólogo molecular, a menudo proveniente de la Física o la Genética, se siente a disgusto con la Bioquímica y generalmente trata de evitarla”.

En esta última frase, Kornberg apunta de manera cáustica pero precisa a las otras dos patas en las que se asienta la Biología Molecular, la Genética y la Física, que marcan de manera clara su diferencia con la Bioquímica. Y es que algunos de los conceptos novedosos que introduce la Biología Molecular tienen que ver con el análisis molecular de procesos básicos tales como la estabilidad, supervivencia y reproducción de los organismos, y tiene como gran mérito la visión de éstos como reservorios y transmisores de información. Es este último el aspecto que mejor define a la Biología Molecular, el estudio a nivel molecular del almacenamiento y transmisión de la información. Tales conceptos provienen de la Genética, la otra disciplina que más ha influido en términos cuantitativos en la Biología Molecular. Más concretamente, la influencia ha venido de aquellos genetistas interesados en

NIH, edificio 3, donde se ubicó el laboratorio de Arthur Kornberg desde 1945 a 1953, dentro del campus (United States Public Health Service. History of Medicine Division. Prints and Photographs Collection. Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

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Introducción

Linus Pauling recibiendo en 1974 la National Medal of Science del President Ford (Oregon State University. Library. Ava Helen and Linus Pauling Papers. Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

el soporte físico del material hereditario pero cansados de hablar de éste como de un ente abstracto, a la manera de la que se hablaba del flogisto hace trescientos años. El influjo de las dos disciplinas citadas ha sido tan poderoso que ha generado dos escuelas en la manera de entender lo que ahora consideramos como Biología Molecular. Una de ellas es la llamada escuela “informacionista”, de clara procedencia genética y alentada fundamentalmente desde los Estados Unidos y Francia, que ha dado preponderancia a la topología de la información y ha tenido una cierta raíz “vitalista” (los procesos no pueden ser reducidos debido a su complejidad). Por otra parte está la escuela “estructuralista”, de claro origen bioquímico y nacida en Gran Bretaña de la mano de científicos de la talla de los Bragg, padre e hijo, John Bernal y William Astbury y que ha tenido en el famoso Laboratory of Molecular Biology de Cambridge su mejor expresión. La escuela estructuralista ha dado preponderancia a la forma de las moléculas biológicas y por su naturaleza ha sido y es reduccionista. Durante muchos años las dos escuelas, como dijo John Kendrew, “... aunque se escuchan educadamente los unos en los seminarios de los otros, tienen poco que decirse entre ellos en términos de comunicación intelectual”. Y es que para un “estructuralista” como Astbury, “la Biología Molecular se preocupa fundamentalmente de las formas de las moléculas biológicas y de la evolución y ramificación de esas formas cuando se asciende hacia niveles más altos de organización. La Biología Molecular es predominantemente tridimensional y estructural, lo que no significa que sea meramente un refinamiento de la morfología, sino que debe hacerse preguntas sobre la génesis y la función”. Para un “estructuralista” todos los fenómenos biológicos, no importa cuan complejos sean, pueden ser explicados mediante leyes físicas simples, mientras que para un “informacionista” el sistema biológico es, sin embargo, bastante más complicado y no debe reducirse al mero estudio de las estructuras biológicas. En las dos escuelas ha influido de manera distinta pero igualmente poderosa la tercera “pata” sobre la que se asienta la Biología Molecular, la más delgada pero quizás la que ha marcado la diferencia con otras disciplinas biológicas. Esta no es otra que la Física, que ha exportado a la Biología Molecular una parte crucial de sus conceptos y técnicas. Sin el desarrollo de la mecánica cuántica y, con ella, de la teoría que explica la existencia de los enlaces débiles, sin el desarrollo de la teoría de la difracción de rayos X, la Biología Molecular simplemente no existiría. Mención especial en este aspecto merece la gigantesca figura de Linus Pauling que, aunque químico, supo como nadie aplicar los conocimientos desarrollados por la nueva Física a la caracterización de los enlaces que hacen únicas a las sustancias biológicas. En este aspecto, la contribución de Pauling es fundamental porque introdujo en el armamento de los biólogos conceptos e ideas imprescindibles para la comprensión de las sustancias biológicas como estructuras tridimensionales cuya forma está íntimamente relacionada con la función que realizan. Los conceptos de resonancia, puentes de hidrógeno, enlaces de van der Waals, eran conocidos por cier-

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tos físicos y químicos, pero Pauling los hizo accesibles a la comunidad científica en general y los usó para describir la estructura de las proteínas. Y esto es muy importante, porque no podemos olvidar que la vida se produce, entre otras cosas, por la existencia de los enlaces débiles. Pero no sólo es importante la contribución de la Física a la Biología Molecular como disciplina científica, sino también la de algunos físicos que, con su personalidad y guía, dieron luz y forma a la disciplina que hoy conocemos; bien por la influencia de sus escritos, como es el caso de Niels Böhr y Erwin Schrödinger; bien por su influencia directa sobre importantes científicos, como es el caso de Leo Szilard; o por el impacto de sus trabajos, como Lawrence Bragg, William Astbury, Max Delbrück, Francis Crick y Maurice Wilkins. La influencia de los físicos comenzó a hacerse notar en los años treinta del pasado siglo, cuando la época dorada de la Física parecía haber pasado y muchos físicos buscaban otros territorios donde desentrañar nuevas leyes. Es el danés Niels Böhr, uno de los padres de la Física cuántica, también uno de los primeros físicos en volver su mirada hacia la biología, la última terra incognita, y en pensar que los fenómenos biológicos quizás no puedan explicarse completamente mediante las leyes físicas conocidas. Sus escritos causaron un gran impacto en un joven discípulo suyo, el físico alemán Max Delbrück, quien dedicaría toda su vida a encontrar esas nuevas leyes. Los primeros trabajos de Delbrück influyeron a su vez en Erwin ­Schrödinger, el científico austriaco creador de la mecánica ondulatoria y quien, refugiado en Irlanda durante la II Guerra Mundial, escribió tras su finalización un libro de gran impacto en la comunidad científica, especialmente entre los físicos. En el libro ¿Qué es la vida?, lleno de ideas extrañas e incorrectas incluso para la época en que se escribe, Schrödinger anunció una nueva era para los físicos que se dedicasen al estudio de los procesos biológicos. Uno de los problemas que expuso como más excitante era la base física que sustenta el mantenimiento y transmisión de la información genética, y que está en el centro de lo que ahora conocemos como Biología Molecular:

Niels Henrik David BÖHR (1885‑1962). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

“¿Cómo los genes, tan pequeños comparados con el organismo en el que se encuentran, pueden ser responsables de mantener el orden en éstos? ¿Cómo los genes son capaces en general de resistir las fluctuaciones propias de cualquier sistema?”.

Y para ello ofrece un ejemplo muy revelador: “¿Cómo el gen que controla el labio de los Habsburgo ha podido mantener la información a lo largo de los siglos teniendo en cuenta que vivimos a 310 °K?”.

Portada del libro QUÉ ES LA VIDA. Editado en España por Tusquets.

Schrödinger propuso que el gen mantiene estable la información porque se encuentra en forma de “cristal aperiódico”. Esta afirmación, una clara contradicción en los términos, es por otra parte y sin que él lo supiera entonces, una clara analogía de la composición del material hereditario, 19

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el DNA. Schrödinger se apuntó a las ideas expresadas anteriormente por Delbrück sobre la estabilidad atómica de los genes y sugirió que “de las ideas de Delbrück sobre la sustancia hereditaria, se puede deducir que la materia biológica, sin eludir las leyes de la Física descubiertas hasta ahora, sigue otras leyes físicas que, una vez nos hayan sido reveladas, formarán parte de la Ciencia como las primeras”. Las ideas de Schrödinger influyeron en gran manera en una generación de físicos, químicos y biólogos entre los cuales podemos citar a Francis Crick, James Watson, François Jacob, Maurice Wilkins, etc., mientras que a otros grandes científicos como a Sydney Brenner, su lectura le dejó indiferente: “Casi todos mis colegas dijeron que el libro que más les ha influido ha sido ¿Qué es la Vida? Algunos parecen decir que ‘si no fuera por Schrödinger estaría tocando el violín en el metro’. Yo leí el libro al comienzo de mi carrera y tengo que decir que no recuerdo nada especial en relación a lo que toda esa gente dice”.

La influencia del libro, en cualquier caso, va por dos caminos opuestos. Mientras que Crick, sin duda alguna la figura más señera de la Biología Molecular y ateo militante, penetró en el nuevo campo dispuesto a eliminar los últimos destellos del vitalismo proclamado por los insignes físicos antes citados, Delbrück intentó por todos los medios encontrar esas “nuevas leyes”: “Mientras que la Física apunta a la búsqueda de leyes universales, los biólogos no pueden aspirar a tanto, ya que una sola célula, que almacena la información sobre miles de millones de años de evolución, representa más un evento histórico que uno físico (...) De la misma manera que encontramos detalles en los átomos ‑su estabilidad por ejemplo‑ que no son reducibles a la Física mecánica, podríamos encontrar detalles en la célula que no son reducibles a la Física atómica, pero cuya apariencia se mantiene en una relación de complementariedad con la Física atómica (...) Estas ideas pueden ser consideradas poco ortodoxas pero, al menos, han servido para atraer a la Biología a un físico, a mí”.

Delbrück ejemplifica como nadie esa vana búsqueda y su esfuerzo servirá paradójicamente para apuntalar los cimientos de la naciente disciplina. Ni que decir tiene que Crick, con su liderazgo intelectual en el Laboratory of Molecular Biology, y Delbrück a través de la dirección del llamado “grupo de los fagos”, son adalides de las dos escuelas, la estructuralista y la informacionista a las que me he referido anteriormente, dos escuelas que enfrentadas de manera sorda van a dar lugar al desarrollo de la nueva disciplina. ¡Qué mejor encuentro entre las dos escuelas que la determinación de la estructura del DNA, que da cuenta en la simple visualización de la estructura, de cómo se almacena y transmite la información! Este hecho marca, sin duda, el nacimiento de la Biología Molecular y es uno de los hitos científicos del siglo XX, con claras implicaciones sociales y económicas, como veremos en las últimas páginas de este libro. 20

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No perdamos más tiempo, y haciendo caso de las indicaciones del maestro Kornberg, sigamos los pasos de los ácidos nucleicos, de las proteínas y de la información hereditaria para entender cómo se forjó y desarrolló la Biología Molecular.

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Los orígenes de la Biología Molecular

I

“La célula (...) debe verse como el escenario de reacciones químicas diversas pero organizadas, en las cuales sustancias identificables por métodos químicos sufren cambios que se pueden observar por métodos químicos. Las moléculas de estas sustancias son activadas y sus reacciones son dirigidas en el espacio y el tiempo por los catalizadores comúnmente conocidos como enzimas. La influencia de los enzimas no difiere esencialmente de la de los catalizadores en los sistemas abióticos, salvo que en sus acciones son altamente específicos” Frederick Gowland Hopkins

La transmisión de la información (la genética) Las proteínas y los enzimas La fundación y las técnicas La física en la biología molecular La estructura de las proteínas Max Perutz y el Laboratorio de Biología Molecular La determinación de la estructura en hélice a y lámina b Los ácidos nucleicos y la naturaleza del material hereditario El nacimiento de la genética: sexo y recombinación La naturaleza de la sustancia hereditaria La determinación de la estructura del DNA

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

La transmisión de la información (la Genética) Los estratos y los fósiles

Robert BOYLE (1627-1691). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Isaac NEWTON (1642-1727). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

La Biología Molecular, como hemos comentado anteriormente, estudia los mecanismos moleculares por los que los fenómenos vitales se mantienen, se ejecutan y se transmiten. Para caracterizar esos procesos ha sido necesario desarrollar un enorme número de técnicas que nos han permitido conocer bastante bien los mecanismos por los que se desarrolla la Vida. Sin embargo, para llegar a este punto se ha requerido un cambio en la mentalidad con la que miramos los sistemas vivos para apreciar que la Vida se creó hace muchísimo tiempo y que desde entonces no ha cesado de evolucionar para adaptarse a todas las variaciones que se han ido produciendo en la Tierra. Ese cambio de mentalidad ha sido fruto del trabajo y la valentía de una serie de hombres que en su momento lucharon contra las ideas establecidas. El ser humano siempre ha sentido curiosidad por saber por qué los hijos se parecen a los padres, por qué poseen trazos comunes a los dos. En la mayor parte de las ocasiones, el hombre ha preferido dejar la respuesta en manos de sus respectivos dioses, pero en otras ocasiones, ha intentado buscarlas por sí mismo. La historia que quiero contar comienza el mediodía del 23 de octubre del año 4004 a.C. Esta es la fecha del nacimiento de la Tierra, de acuerdo a la conclusión a la que llegó a mediados del siglo XVII el obispo ­James Ussher, de la Iglesia de Irlanda, tras sesudos estudios de la Biblia. Al poco tiempo, Dios colocó en la Tierra a las plantas, a los animales y al hombre. Esta conclusión, origen de las teorías creacionistas, y que hoy nos llevaría a la risa (aunque no sería muy adecuado hacerlo en público en ciertas poblaciones de los estados sureños de Norteamérica), fue tomada muy en serio por sus coetáneos y por las siguientes generaciones. Afortunadamente, siempre ha habido mentes inquietas que se atrevieron a enfrentarse a las tesis oficiales. Una de las primeras personas en hacerse preguntas sobre la edad de la Tierra y, por lo tanto, de la vida que ésta encierra, fue Robert Hooke, discípulo y ayudante del gran científico ­Robert Boyle, patrono y fundador de la Royal Society. Hooke, primer secretario de esta Sociedad y un científico extraordinario al que tendremos oportunidad de encontrar en otras páginas de este libro, desarrolló una ingente labor en varios campos como el de la teoría de la luz, de la atracción de los cuerpos, de la elasticidad. Para su desgracia, Hooke se enfrentó con Isaac Newton, una de las mentes más poderosas de la humanidad, pero también un ser ruin y vengativo, quien a la muerte de Hooke y siendo presidente de la Royal Society, decidió borrar todo vestigio de éste, de tal manera que hoy no tenemos idea de cómo era (excepto, entre otras, por los escritos del propio Newton, quien no nos lo presenta en los mejores términos). En el asunto que nos ocupa, Hooke fue de los primeros en darse cuenta, o al menos de ponerlo por escrito hacia finales del siglo XVII, de que los fósiles que mucha gente había encontrado desde la antigüedad

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La transmisión de la información (la Genética)

eran estructuras biológicas petrificadas, y no rocas que por casualidad habían tomado esas curiosas formas, según la creencia oficial de la época. Así, según Hooke los fósiles de amonites “... son caparazones, que ya sea por algún diluvio, inundación, terremoto, o algún otro fenómeno, llegaron hasta ese lugar y fueron rellenados con algún tipo de barro o arcilla o agua ‘petrificante’ que, con el transcurso del tiempo, los ha endurecido”. Hooke llegó incluso a sugerir que parte de lo que ahora es tierra había sido en otras épocas mar, y viceversa. La Tierra, según Hooke, no era un sistema inamovible sino que había sufrido cambios colosales, que quizás no habían podido producirse en el tiempo de vida que ­Ussher le otorgó. A otro gran científico de la época, el astrónomo, inventor y corsario Edmund Halley, le fue encargado por aquellos años buscar las causas del Diluvio Universal. Para ello inventó un curioso método basado en el cálculo de la velocidad de salinización del mar, asumiendo que en el origen éste contenía agua dulce y que eran los ríos los que llevaron las sales que ahora poseían. El método, absolutamente descabellado, le llevó sin embargo a percibir que la edad de la Tierra pudiera ser mucho mayor que la sustentada por los seguidores del obispo Ussher. Otros hombres que también se hicieron preguntas parecidas fueron los naturalistas, científicos que en su afán de comprender la naturaleza sintieron la necesidad de clasificarla. Uno de ellos fue el inglés John Ray, autor de una monumental obra publicada en los albores del siglo XVIII, en la que describió una gran parte de las plantas y animales de Europa. Ray, furibundo puritano, encontró también difícil reconciliar sus ideas religiosas relacionadas con la edad de la Tierra, con el estudio de los fósiles, a los que atribuyó claramente un origen animal. Ray se sorprendió de que alguna de esas formas no existiera en aquellos tiempos, lo que sugería que habían desaparecido de la Tierra. Así, escribiendo sobre un bosque en el que había encontrado conchas fosilizadas:

Molde y contramolde de un trilobites. Era Primaria.

“Hace muchos años estos lugares estuvieron recubiertos de bosques, hasta que, ahogados por la violencia del mar, se mantuvieron por mucho tiempo bajo el agua hasta que los ríos llevaron hasta allí barro suficiente como para cubrir los árboles, rellenar las profundidades y crear tierra firme otra vez (...) Es cosa extraña teniendo en cuenta la juventud del mundo, pues de acuerdo a lo estimado, no tiene más de 6.000 años”.

Este comentario refleja la contradicción en la que se debatían Ray y otros muchos hombres en aquella época entre sus convicciones religiosas y los hechos que tercamente mostraban lo contrario. El mismo padre de la sistematización, el sueco Carl Linneo, también observó los fósiles y se hizo preguntas. En el tiempo de Linneo, a mediados del siglo XVIII no había ya dudas de que los fósiles eran restos de plantas y animales petrificados, pero la opinión general, alentada por la Iglesia, era que habían sido llevados a la Tierra por el Diluvio Universal, que acaeció no mucho después de la creación de aquélla. Linneo opinaba que el Diluvio sí se

Carl von LINNEO (1707-1778). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Georges Louis LECLERC, Conde de Buffon (1707-1788). © www.scientiadigital.com.

había producido, pero que uno de doscientos días no podía haber sido capaz de trasladar a seres marinos tan tierra adentro y haberlos cubierto de sedimento tan pronto. Linneo supuso que quizás al comienzo de la Tierra, toda ella habría estado recubierta de agua y que ésta se habría ido retirando paulatinamente, dejando restos de animales en lo que ahora es tierra firme. Era evidente que esto requería mucho más tiempo que los 6.000 años de historia que entonces se pensaba que tenía la Tierra, pero Linneo jamás se atrevió a afirmarlo. Los tiempos cambiaban y algunos hombres fueron más allá, y no se contentaron con poner en duda la edad de la Tierra, sino que intentaron calcularla. El primero de ellos fue Georges Louis Leclerc, más conocido como Conde de Buffon, intendente del Jardín Real, algo así como Científico Real. Buffon fue autor de una enorme obra de sistematización de la naturaleza, la Historia Natural, cuya publicación causó un gran impacto en Europa. La parte más original e interesante de ella tiene que ver con sus teorías sobre la transformación de las especies y sus estudios sobre la edad de la Tierra. En el primer caso, y entre otras cosas, Buffon terció en el debate que en los siglos venideros tendría tanta importancia: la transmisión hereditaria en la reproducción sexual. Frente a aquellos que opinaban que la información provenía o de los machos o de las hembras, Buffon sostuvo que la información procedía de las dos partes, lo que sugería un intercambio de los caracteres de los padres cuando éstos eran transmitidos a los hijos, algo que ya había sido postulado por los griegos y que, probablemente, podría haber compartido con el conde cualquier hombre de la calle al observar cómo algunos hijos poseen claros detalles físicos del padre o la madre. Sin embargo lo importante, dados los tiempos que corrían, era ponerlo por escrito y sugerir que cada uno de nosotros provenía en parte del intercambio de información que se da entre los padres, lo que indicaba un poderoso instrumento de variabilidad. Las ideas creacionistas, que establecían que los animales y las plantas que se encontraban en la Tierra habían sido colocados allí por el Todopoderoso y habían permanecido como tales desde la Creación, comenzaban a tambalearse. Respecto a la edad de la Tierra, Buffon opinaba que ésta en el momento de su nacimiento había estado al rojo vivo y, posteriormente, había sufrido un proceso de enfriamiento, al menos en su superficie. Se le ocurrió entonces que se podía determinar la edad de la Tierra llevando bolas de distintos tamaños al rojo vivo, midiendo el tiempo en el que su superficie alcanzaba temperaturas normales y trasladando esos cálculos al tamaño de la Tierra. De los resultados de esos experimentos, Buffon concluyó que la edad de la Tierra debía tener 42.964 años y 221 días (esto último, lógicamente, el día que lo escribió). Quien sí estuvo a punto de acertar en cuanto a la edad de la Tierra fue el francés Joseph Fourier, quien ostentó cargos tanto en la administración napoleónica durante la invasión de Egipto como luego en Francia, con Luis XVIII. Fourier fue el autor de una herramienta matemática poderosísima que lleva su nombre, y que es utilizada en la actualidad en cual-

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quier rama de la Ciencia y, por supuesto, en la Biología Molecular. Las series de Fourier, que sirven para tratar fenómenos que varían en función del tiempo, fueron desarrolladas por el científico francés para, entre otras cosas, determinar cómo se transmite el calor entre cuerpos. Este estudio le sirvió para hacer un cálculo de la edad de la Tierra en el que tuvo en cuenta el efecto aislante del calor que tiene la corteza terrestre, fría, que permite aislar mejor el calor que si fuese un cuerpo único. Aunque él no dejó escrita la edad de la Tierra, mediante el uso de su formulación se obtiene un valor de 100 millones de años, una cifra 1.000 veces mayor que la de Buffon, y sólo 50 veces menor de lo que ahora se supone. Otra figura importante del siglo XVIII fue Georges Cuvier, barón de Cuvier, autor también de una vasta obra en la que destaca para lo que aquí tratamos, Lecciones de Anatomía Comparada, obra en la que estableció nuevos cánones para el estudio de los seres vivos. De su obra surgieron dos principios fundamentales: el llamado principio de subordinación de los órganos, que indica una relación entre los órganos, y el llamado principio de correlación de las formas, que apunta a que ciertos caracteres se atraen mutuamente, mientras que otros se excluyen necesariamente. Utilizando estos principios, Cuvier pudo establecer una relación entre la estructura y la disposición de los órganos de acuerdo al tipo de animal (herbívoro, carnívoro). Cuvier estudió los fósiles de manera sistemática y razonada, y se le puede considerar el padre de la Paleontología. Fue el primero en reconstruir animales utilizando sus huesos, y del estudio de éstos dedujo también que la Tierra tenía que ser mucho más antigua que los escasos 6.000 años que el obispo Ussher le atribuyó. Desgraciadamente, Cuvier fue un firme partidario de la inmutabilidad de las especies y luchó con denuedo para impedir que las nacientes ideas sobre la evolución de aquéllas triunfasen. Las ideas evolucionistas provenían de las mentes de, entre otros, Erasmus Darwin, Jean Baptiste de ­Bonet, caballero de Lamarck, más conocido como Jean Baptiste de ­Lamarck, y Geoffroy Saint-Hilaire. Aunque menos conocido que ­Lamarck, Erasmus Darwin, abuelo de Charles Darwin y uno de los fundadores de la Sociedad Lunar, fue el primero en proponer, en un libro publicado en 1794, la adquisición de caracteres:

Georges CUVIER, barón de Cuvier (1769‑1832). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

“Todos los animales sufren transformaciones que en parte se producen por su propia actividad, en respuesta a placeres y dolores, y muchas de estas adquisiciones se transmiten a las posteriores generaciones”.

En estas pocas palabras están sintetizadas las leyes que Lamarck enunció quince años después, según las cuales las transformaciones del medio provocan modificaciones vitales en los seres vivos, de tal manera que contraen nuevos hábitos que duran tanto como las necesidades que los han hecho aparecer. Según Lamarck, un cambio en las circunstancias induce un cambio en los hábitos, que a su vez produce un cambio en la forma. Lamarck resumió sus ideas en dos famosas leyes: la Regla del uso y del no uso, según la cual la necesidad crea el órgano necesario, su uso

Jean Baptiste Pierre Antoine de Monet LAMARCK (1744-1829). © www.scientiadigital.com.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

lo refuerza y la falta de uso lo atrofia; y la Regla de la herencia de los caracteres adquiridos, por la que el carácter adquirido bajo la influencia de las condiciones ambientales se transmite a la generación siguiente. Geoffroy Saint-Hilaire se adhirió a las ideas de Lamarck y fue incluso más lejos, lanzando la hipótesis que podríamos asociar a las leyes de selección natural promulgadas por Charles Darwin años después: “Si las modificaciones adquiridas producen efectos nocivos, los animales que las manifiestan perecen y son sustituidos por otros que presentan una forma algo diferente, una forma que ha cambiado con el fin de adaptarse al nuevo entorno”.

Caricatura de James HUTTON (1726-1797) (izda.) y Joseph Black (drcha.). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Las teorías de Lamarck, en las que el ambiente es el motor del cambio y los organismos evolucionan para mejor adaptarse a él, suponen el primer cuerpo de ideas evolucionistas capaz de enfrentarse con éxito al creacionismo. Hoy sabemos que el lamarquismo es incorrecto, pero la lucha contra las ideas que Charles Darwin enunció posteriormente configuró la Biología del siglo XIX y se mantuvo hasta bien entrado el siglo XX, en algún caso con resultados nefastos, a los que nos referiremos en páginas posteriores. Es curioso apreciar que los escritos del abuelo Erasmus Darwin no fueron tenidos en cuenta como los de Lamarck. De haber ocurrido lo contrario, ¿cómo hubiéramos definido la polémica antes citada?, ¿darwinismo contra darwinismo? El azar nos hace a veces la vida más fácil. Pero volvamos a los fósiles y a las originales ideas de un desconocido agrimensor inglés, William Smith, un curioso personaje cuyas aventuras y desventuras son merecedoras de una película de Hollywood, y quien a finales del siglo XVIII y a lo largo de su vida profesional, recogió muestras y tomó notas sobre los lugares donde éstas aparecían. Smith se dio cuenta de que cada capa, lo que hoy llamaríamos estrato, poseía diferentes y, en algunos casos, únicos tipos de fósiles. Smith concluyó que la Tierra había sufrido cambios de enormes proporciones y con ella, los animales que entonces la poblaban. El grupo de anti-evolucionistas vio el cielo abierto con estos hallazgos y en poco tiempo se enunciaron teorías “catastrofistas” que apuntaban a que la Tierra podía ser en realidad mucho más antigua que lo que hasta entonces se había admitido, pero que a lo largo de su historia había sufrido una serie de cataclismos de origen desconocido que habrían dado lugar a los estratos que en realidad podían observarse en muchos lugares. Según los catastrofistas, lo que la Biblia describía, después de todo, era la vida que había surgido después de la última catástrofe, en la que Dios dejó en la Tierra su última creación. Todos contentos. No tanto. Así que volvamos a los estratos de la mano del escocés James Hutton. Este es uno de esos caballeros británicos de los siglos XVII y XVIII cuya inventiva, la producción de sal de amonio, le llevó a hacer dinero y a usarlo para satisfacer sus inquietudes intelectuales (en España sólo podemos aspirar, en el caso de la mayor parte de los caballeros de

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La transmisión de la información (la Genética)

aquella época, a la contribución de éstos al desarrollo de más ingeniosos juegos de cartas). Las inquietudes de Hutton tenían que ver con el estudio de las formaciones rocosas, y cristalizaron en el libro Historia de la Tierra en el que defendió que los procesos que se podían observar en la Tierra (erosión, vulcanismo, etc.) eran suficientes para explicar los cambios que ésta ha sufrido, siempre y cuando se asumiera que el tiempo durante el que los agentes habían actuado era enorme. Esta teoría, que podríamos denominar del uniformismo, chocó de frente con el creacionismo impuesto por la entonces inmensa figura de Cuvier, de tal manera que las ideas de Hutton apenas fueron tenidas en cuenta. Le tocó a un paisano de Hutton, Charles Lyell, padre de lo que hoy conocemos como Geología, acabar con las críticas al desarrollar y conseguir que se aceptasen las teorías de su predecesor. Lyell fue el vástago de una acaudalada familia que pagó sus estudios de Derecho en Oxford y sus viajes por varios países de Europa (el “Grand Tour” que los jóvenes y ricos ingleses hacían para acercarse al mundo clásico y probablemente también para comer mejor). En estos viajes, Lyell estudió las diferentes formaciones rocosas y terminó por convencerse del poder de las fuerzas naturales para transformar la superficie de la Tierra. En sus Principios de Geología discutió con convicción que todos los fenómenos geológicos eran debidos a procesos naturales que habían actuado sobre la Tierra durante un periodo enorme de tiempo y que, por lo tanto, la mano de Dios no era necesaria. El evolucionismo se mostraba imparable y sólo esperaba a quien lo formulara de la mejor manera posible. Fueron dos personas, Charles Darwin y Alfred Russell Wallace, a quienes les cupo el honor de tal cosa, aunque sólo la primera de ellas ha pasado a la historia con todos los parabienes, quizás porque su trabajo fue más amplio y profundo.

Charles Darwin Hay, sin duda, un antes y un después de Charles Darwin, entre otras cosas porque según el recientemente fallecido Ernst Mayr, una de las grandes figuras de la Biología del siglo XX, Darwin fue el primer intelectual “capaz de desarrollar una teoría en la que se separa de una manera clara Ciencia y Teología, sin lo cual la primera no puede ser completamente objetiva”. Y realmente éste fue uno de los méritos de Darwin, aterrador si se quiere, pues deja al Hombre solo en este Universo, al arbitrio de las fuerzas que le rodean. La reacción de las otras fuerzas, aquellas que controlan nuestra vida diaria, no se hizo esperar, una vez que las ideas de Darwin fueron comprendidas en toda su extensión. Probablemente todo esto ocurrió muy a pesar de los deseos de Darwin, reacio a enfrentarse a los problemas que, de seguro, sus ideas le depararían. Charles Darwin nació en 1809 en el seno de una familia rica y cultivada, entre cuyos miembros podemos citar a sus abuelos Erasmus y Josiah Wedgwood, este último fundador también de la Sociedad Lunar y dueño

Charles DARWIN (1809-1882). © www.scientiadigital.com.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Pinzones de Las Galápagos, uno de los ejemplos que usó Darwin para explicar la evolución.

de la famosa alfarería, y a su primo Francis Galton, creador de las primeras teorías eugenésicas. Darwin recibió enseñanzas de Medicina en la Universidad de Edimburgo para las que no estaba particularmente dotado, y desencantado pasó a Cambridge con el fin de realizar los estudios que le conducirían a ordenarse como Pastor. Sin embargo, durante ese tiempo se interesó por las Ciencias Naturales, algo que también había hecho en la capital escocesa, lo que le fue de utilidad cuando en 1831 y por azares del destino se cruzó en su camino una oferta para acompañar como naturalista al capitán de la corbeta Beagle, en un viaje alrededor del mundo. El viaje, que duró cinco años, fue crucial para lo que vino después. Darwin, un observador muy agudo de la Naturaleza (y de las personas, si uno lee su libro Diario de viaje), tomó nota de las formas de las especies y de cómo éstas podían variar ligeramente en función de los nichos en los que vivían. Observó, entre otros ejemplos, cómo los pinzones de las distintas islas Galápagos, que mantienen distintos microclimas en función de los vientos y corrientes marinas presentes en cada una de ellas, poseen un pico distinto que se ajusta exquisitamente a la distinta función que han desarrollado en cada uno de esos nichos. De vuelta en casa, después de varios años de análisis del material que trajo de su viaje, llegó a la conclusión de que los seres vivos habían sufrido una adaptación al medio que podía haber ocurrido a lo largo de muchísimos años. ¿Cómo era esta adaptación? Darwin incorporó las ideas de Lyell a sus teorías para proponer que, de la misma manera que la superficie de la Tierra había cambiado a lo largo de muchos años como consecuencia de las fuerzas naturales que operan de manera continua sobre aquélla, los animales que la pueblan habían sufrido esa adaptación también de manera continua durante ese mismo periodo de tiempo. Pero ¿cuál es el mecanismo que empujaba a la adaptación? Darwin lo encontró en los escritos de un hombre que poco tiene que ver con las Ciencias Naturales, el clérigo, matemático y profesor de Cambridge ­Thomas Malthus. Éste había publicado en 1798 su influyente obra Ensayo sobre el Principio de la Población y de la manera que ésta afecta la mejora futura de la Sociedad y en ella razonaba que la población de cualquier especie y también la humana, tendería a crecer de forma geométrica si no existiesen ciertas fuerzas que actuasen en contra de este crecimiento, manteniéndola en niveles parecidos. Esas fuerzas podían ser distintos depredadores, entre los que se pueden incluir los organismos que producen enfermedades, el medio ambiente y el alimento. Darwin comprendió enseguida que esos factores eran los que actuaban sobre las poblaciones como selección natural: “Cada año una especie cualquiera puede ver reducido su número por un número ilimitado de enemigos y circunstancias (...) La reducción del número de halcones afecta al número de sus presas y de sus depredadores (...) Hay multitud de fuerzas trabajando al unísono forzando a cada tipo de estructura (especie) a introducirse en los huecos de la economía de la naturaleza, empujando a otras especies peor adaptadas”.

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La transmisión de la información (la Genética)

En esta lucha por los recursos limitados, las especies peor adaptadas o los individuos más débiles dentro de cada especie sucumbirían, mientras que los mejor adaptados sobrevivirían y transmitirían sus caracteres a las siguientes generaciones. Este proceso de selección natural habría trabajado, según Darwin, desde el nacimiento de la Tierra produciendo continuos cambios en las plantas y en los animales, tal como los naturalistas habían observado en los estratos estudiados. Darwin creía haber determinado el proceso por el cual se produce la selección, pero ¿cuál es el que genera la variación, el que hace que se produzca un individuo con un pico más largo, con cuernos más fuertes o con más descendientes? Darwin nunca lo supo y sólo pudo hipotetizar incorrectamente que la variación se producía cuando el individuo adquiría por termino medio los caracteres de su padre y su madre, lo cual y contra lo que Darwin supuso, llevaría a una completa uniformización de los individuos en unas cuantas generaciones. Darwin tampoco supo dar una respuesta correcta a los mecanismos de la herencia y se adhirió con entusiasmo a la teoría de la Pangénesis, formulada por vez primera en tiempos de la Grecia clásica. Esta teoría apuntaba que la transmisión sexual llevaba consigo la transferencia de pequeñas partes de todos los órganos del cuerpo, que se iban separando y desarrollando hasta dar lugar al cuerpo maduro. Darwin había formulado ya sus principales ideas hacía 1842, pero se mostró reacio a publicarlas porque conocía la reacción que causarían en la sociedad victoriana. El antiguo estudiante de Teología había perdido sus convicciones religiosas hacía tiempo, pero no así su mujer, y Darwin tenía miedo de hacerle daño. Sus ideas habían circulado y eran conocidas por un reducido número de personas. Sin embargo, la llegada en 1858 de una carta remitida desde las costas malayas por un compatriota enfermo de malaria, hizo poner en marcha la maquinaria con las consecuencias que ahora conocemos. El remitente de la carta era un naturalista británico llamado Alfred Russel Wallace, catorce años más joven que Darwin, quien después de viajes por la cuenca amazónica y la península malaya, había llegado a la misma conclusión que éste. La carta de Wallace con la exposición de sus ideas forzó a Darwin a hacer públicas las suyas, de tal manera que los dos trabajos se comunicaron de manera conjunta ese mismo año en una reunión de la Sociedad Linneana, a la que Darwin pertenecía. La exposición de las ideas de los dos científicos no causó un efecto inmediato en la comunidad científica (en la reunión en la que Darwin comunicó sus tesis, la máxima preocupación fue la elección del vicepresidente de la sociedad), pero sí durante los siguientes años, especialmente después de que Darwin decidiera en 1859 publicar su obra capital, Sobre el origen de las especies por medio de la selección natural, o como es citada normalmente, El origen de las Especies. No tiene cabida en estas páginas describir la influencia que los escritos de Darwin han tenido en la visión de la Ciencia en general y la Biología en particular. Baste decir que esta última sufrió una conmoción que hizo temblar sus cimientos. A diferencia del lamarquismo, que propone que el ambiente es el motor de la variación de los organismos, que surge para 31

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adaptarse al medio y que perpetúa las soluciones exitosas mientras se adecúen al ambiente, el darwinismo asume que la variación es el motor del cambio, y el ambiente actúa seleccionando las formas de vida más exitosas que la variación ha producido. El darwinismo sostiene que la Vida no es más que un proceso evolutivo empujado por la variación, seguido de un proceso de selección que filtra las variantes menos aptas, y finalmente un proceso de herencia que mantiene las variaciones exitosas. Lógicamente, estas ideas chocaron con las que sostenían el creacionismo y con cualquier idea que colocara a Dios por encima de las cosas, y claramente sugerían la posibilidad de que, después de todo, los hombres no fuéramos hechos a semejanza del Todopoderoso, sino en primera instancia de un primate bípedo y en última instancia de una ameba. Los descubrimientos realizados a lo largo de todo el mundo durante el siglo XX de homínidos con distinto grado de desarrollo han confirmado claramente esa última hipótesis. Las ideas de Darwin le pusieron a los pies de los caballos de la Iglesia, pero curiosamente la respuesta a la pregunta del origen de la variación la supo dar un oscuro monje moravo, Gregor Mendel, quien en el jardín de la abadía agustina de Brno comenzaba sólo tres años antes de la publicación del Origen de las Especies a realizar sencillos experimentos con plantas.

Gregor Mendel

Gregor MENDEL (1822-1884). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Imagen, a principios del siglo XX, del jardín donde Mendel trabajó en la abadía de Brno, Moravia (República Checa).

Nuestro hombre no se llamaba realmente Gregor sino Johann (se cambió el nombre al ser ordenado sacerdote), y nació en 1822 en el seno de una de tantas familias alemanas que habitaron la región checa de Moravia hasta el final de la II Guerra Mundial, y que entonces pertenecía al imperio austro-húngaro. El padre de Mendel era un pobre agricultor que trabajaba para un gran terrateniente y la única manera de que Mendel pudiera realizar estudios superiores, como ocurría en otras muchas partes de Europa, era entrar en un seminario. Mendel lo hizo y fue ordenado sacerdote a los 27 años. Después pasó por la Universidad de Viena y estuvo varios años dando clases en diversas instituciones religiosas hasta que fue enviado al monasterio de Brno, no lejos de su pueblo natal. Allí comenzó a realizar los experimentos clásicos que le han hecho ser el padre de una disciplina, la Genética, que en realidad no nacería sino hasta casi cuarenta años después. Mendel poseía una mente muy observadora y grandes conocimientos de agricultura, gracias a los trabajos que de joven hizo en la granja arrendada por su padre; y dado que quería estudiar y entender cómo se producían y mantenían los cambios en ciertos caracteres que de siempre se observaban en las plantas, utilizó sus conocimientos y experiencias al efecto. Primero escogió una planta, el guisante, que era fácil de cultivar. También se aseguró, mediante la eliminación de los estambres, de que las plantas no se autofertilizaran, sino de que la fertilización fuera induci-

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da artificialmente. Además, buscó en la planta características sencillas que pudieran ser seguidas fácilmente (color de las flores, color y textura de las semillas, etc., en total siete distintos caracteres). Finalmente, algo muy novedoso para aquella época, utilizó técnicas estadísticas para tratar los datos y determinar si éstos resultaban significativos. En una primera instancia Mendel se aseguró de poseer cepas puras con los distintos caracteres cultivándolas durante varias generaciones, y después se dispuso a realizar experimentos de cruzamiento. Cuando, por ejemplo, cruzó plantas que poseían semillas verdes con otras con semillas amarillas, para su sorpresa y en vez de obtener plantas con un color intermedio, las semillas eran de color amarillo (Figura 1). Sin embargo, si permitía a estas plantas autofertilizarse, obtenía como promedio (de ahí el valor de la estadística, pues Mendel hizo experimentos con un gran número de plantas) un 75% de plantas con semillas de color amarillo y el restante 25% de color verde. Finalmente, el autocruzamiento de las plantas de color verde y las de color amarillo, daba lugar en el primer caso a un 100% de plantas con semillas verdes y en el segundo caso a un 85% de plantas con semillas amarillas y 15% con semillas verdes. Estos resultados se repitieron de manera casi exacta para cada uno de los caracteres estudiados. De hecho, las estadísticas eran tan buenas que algunos piensan que Mendel las retocó a posteriori para que fueran más contundentes. Sea como fuere, Mendel concluyó de sus estudios que los caracteres estudiados, lo que él llamó elementos, se encontraban en cada planta en pares (llamémosles A y a), cada uno proveniente de uno de sus padres, y que aquel que se imponía sobre el otro (semilla amarilla) era dominante (A), mientras que el otro era recesivo (a). De los dos caracteres, sólo uno era transmitido al retoño, pero cualquiera de los dos podía serlo con la



Detalle del original del manuscrito de Mendel “Experimentos con híbridos de plantas”.

Figura 1. Esquema de uno de los experimentos clásicos de Mendel. Para el experimento, Mendel se aseguró de tener plantas con un determinado fenotipo distinto y estable. A uno de estos fenotipos lo denominó dominante (A, azul en la figura), y otro recesivo (a, gris en la figura), de tal manera que la mezcla de los dos caracteres (Aa) producía el fenotipo dominante (azul en la figura). Sólo cuando se combinaban los dos caracteres recesivos (aa) se producía el color del fenotipo recesivo.

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Antony van LEEUWENHOEK (1632‑1723) con microscopio. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Réplica de uno de los microscopios de van Leeuwenhoek. © Science Museum / S&S Picture Library.

misma probabilidad. Estas ideas podían explicar por qué la fertilización de plantas de semillas amarillas (AA) con plantas de semillas verdes (aa) producía en una primera generación sólo plantas amarillas (Aa), por qué la autofertilización de éstas producía un 75% de plantas de semillas amarillas (25% de AA, 25% de Aa y 25% de aA) y sólo un 25% de plantas de semillas verdes (aa), y por qué el entrecruzamiento de estas dos poblaciones por separado (las de semillas amarillas y las de semillas verdes) daba lugar en el primer caso a un 85% de plantas con semillas amarillas (es decir, AA, Aa y aA) y a un 15% de plantas con semillas verdes (aa), y en el segundo caso un 100% de plantas con semillas verdes (aa). En retrospectiva, hay que decir que Mendel tuvo la habilidad (algunos dirían suerte, otros inteligencia) de trabajar con caracteres simples, es decir, que estaban gobernados por lo que hoy llamamos un solo gen, aunque no podemos descartar que Mendel utilizara caracteres más complejos, y que al no entender los resultados, los descartara. En cualquier caso, el monje presentó sus resultados en 1865 en la Sociedad Científica de Brno, pero éstos no fueron acogidos con mucho entusiasmo, probablemente porque nadie de la audiencia los entendió. Tampoco fueron entendidos por los científicos europeos, ni por el propio Darwin, en cuyo estudio se encontró una copia del trabajo. En cambio, la Iglesia sí que comprendió que sus ideas de alguna manera podían ser peligrosas, porque sabemos que fue amonestado, aunque no lo suficiente como para no ser nombrado abad del monasterio en 1868, lo que sin duda hizo que abandonara definitivamente sus estudios. Sin saberlo, Mendel había dado respuesta al origen de la variación en los sistemas biológicos. Desgraciadamente, esa respuesta llegó mucho antes de que la comunidad científica estuviera preparada para saber qué hacer con sus ideas. Y es que los hallazgos de Mendel son puramente conceptuales y en ningún momento se interrogó sobre dónde y en qué tipo de soporte se localizaban los factores de la herencia. Para hacerlo, es preciso penetrar y escudriñar con distintas técnicas el receptáculo donde se asienta la información genética, la célula.

La célula

“Micrographia”, libro de Robert HOOKE (1635-1703), donde se muestran las estructuras de corcho que dieron lugar al nombre de células. © Bibliothèque Nationale de France.

Para visualizar la célula no nos queda más remedio que utilizar un microscopio óptico, y aunque no está completamente claro quién construyó el primero, sí que podemos decir quién publicó los primeros trabajos prácticos. Éste no fue otro que Antony van Leeuwenhoek, un fabricante de paños holandés con inquietudes científicas, quien a finales el siglo XVII describió los primeros organismos microscópicos, muchos de los cuales eran sin duda unicelulares. Sin embargo, las primeras descripciones de estructuras celulares correspondieron a Robert Hooke y Marcello Malpighi, el primero de los cuales acuñó el término célula para describir las cavidades que al microscopio se observaban en el corcho, las cuales se asemejaban a celdas.

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Pasaron más de cien años, y se necesitó un mayor desarrollo de los microscopios para que en 1838 el botánico alemán Mathias Schleiden propusiera que todos los tejidos de las plantas están constituidos de células, y para que un año más tarde su compatriota Theodor Schwann sugiriera que las células son las unidades básicas de todos los organismos. Schwann apuntó que la célula representa la unidad básica de la vida, y que no importa cuan grandes y complejos sean los organismos, todos ellos están compuestos de células. La vida, según Schwann, “No puede ser considerada como un atributo místico concedido a un organismo completo, sino que es una propiedad compartida hasta por la más humilde célula”. Según Schleiden, “Cada célula lleva una doble vida, la independiente, y la coordinada con el resto de las células”. “El órgano es un estado celular, en el que cada célula es un ciudadano”, apuntó Schwann. Estas ideas colocaron a la célula como unidad vital, pero en aquel momento sirvieron también para atacar a las teorías de la Generación Espontánea, según las cuales la vida podía surgir de la materia inanimada. Estas teorías estaban muy en boga a mediados del siglo XIX, y se apoyaban, en un último extremo, en experimentos tales como el calentamiento de un trozo de material biológico en un recipiente y su posterior sellado, para comprobar como indefectiblemente la Vida volvía a aparecer. Esto se debía, se supo después, al desarrollo de las esporas que, de seguro, existían en el recipiente, y cuya existencia era desconocida por entonces. Correspondió a dos grandes científicos la refutación de tales teorías. El primero de ellos fue el químico y microbiólogo francés Louis Pasteur, realmente el padre de la Microbiología, quien utilizó una serie de bolas de vidrio calentadas y selladas para esterilizar el aire e impedir que las esporas que éste pudiera contener llegasen a la muestra, demostrando así que donde no hay vida no se puede crear tal. El segundo de los científicos y el que está más cerca de las ideas que ocupan estas líneas es el alemán Rudolf Virchow quien en 1858, el mismo año en que Wallace y Darwin presentaron sus trabajos sobre la evolución, demostró que la célula no podía aparecer de la nada. De la misma manera que los animales nacen de otros animales y las plantas de otras plantas, las células provienen de otras células. “Allí donde hay una célula, ha habido otra previamente”, apuntó Virchow. La célula era, pues, un prometedor objeto de estudio desde principios del siglo XIX. Sin embargo, los resultados no se produjeron a la velocidad que cabía esperar debido a la pobreza de las lentes de los microscopios que se habían desarrollado hasta entonces. Durante el siglo XIX estos problemas fueron solventados, fundamentalmente por científicos alemanes, y no es casual que la ciencia de ese país dominara los estudios citológicos durante el siglo XIX. Los defectos en las lentes, debidos fundamentalmente a problemas relacionados con su fabricación, se fueron resolviendo en parte mediante el desarrollo del microscopio compuesto, y culminaron en 1886 con el desarrollo por parte de los investigadores Ernst Abbe y Otto Schott, del famoso cristal de Jena, que se mostró prácticamente libre de defectos ópticos.

Louis PASTEUR (1822-1895). Estrasburgo, 6 julio 1850. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Ernst ABBE (1840-1905). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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Otro de los grandes avances en el estudio de la célula tuvo que ver con el desarrollo de la industria alemana de tinturas, consecuencia del alto nivel de la Química Orgánica de aquel país. Fue Paul Ehrlich, un gigante en varios campos de la Ciencia y merecedor del Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1908, quien primero utilizó esos tintes de manera sistemática para ver, entre otras cosas, si podían colorear de manera específica distintas partes de la célula. De hecho, él fue el primero en observar que algunos de los tintes básicos, coloreaban específicamente una pequeña estructura que se encontraba normalmente en el centro de la célula.

Paul EHRLICH (1855-1915) Fotografía de 1910. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Robert BROWN (1773-1858). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

El núcleo A decir verdad, esta estructura había sido ya descrita unos treinta años antes, a pesar de todos los inconvenientes técnicos citados anteriormente. El primero en hacerlo fue el botánico escocés Robert Brown, descubridor también del movimiento perpetuo de las partículas, y que mucho después se denominaría movimiento browniano. Brown observó en 1831 al microscopio una pequeña estructura en forma de nuez, que denominó núcleo (del diminutivo latino nucula, de nux nucis, “nuez”), a la que, a pesar de estar presente en todas las células estudiadas, no se le concedió en principio mucha importancia. No obstante, una serie de descubrimientos hicieron que los investigadores volvieran sus ojos hacia él. Uno de estos descubrimientos tuvo que ver con la observación en 1838 por parte del científico alemán Christian Ehrenberg de que el núcleo, al igual que la célula, se dividía mediante un proceso que él denominó como “fragmentación”. La aparición de tintes específicos contribuyó decisivamente al estudio del núcleo pero también a las falsas ideas sobre su función, apoyadas fundamentalmente en el hecho de que esos tintes dejaban de teñir al núcleo en ciertos momentos del ciclo celular, y por lo tanto la estructura nuclear desaparecía a ojos del observador. Hoy sabemos las causas de este, en apariencia, extraño comportamiento, que tienen que ver con la imposibilidad de que las tinturas puedan acceder al núcleo en esos momentos del ciclo, lo que impide su coloración. Este hecho causó la perplejidad de los científicos, quienes dedujeron que el núcleo no era una estructura importante para la célula. No obstante, había otros estudios que apuntaban a lo contrario, y es que ensayos de regeneración con ciertas células mostraban que si éstas se cortaban en dos, sólo la parte que contenía el núcleo era capaz de crecer y diferenciarse. Estos y otros experimentos llevaron a Ernst Haeckel, uno de los grandes patrones de la ciencia alemana, a proponer por primera vez que “... el núcleo es el reservorio del material hereditario, y el plasma que lo rodea le sirve de adaptación al mundo externo”. El desarrollo de los microscopios y de las técnicas de tinción fueron permitiendo un estudio en mayor profundidad del núcleo y de los cambios que se producían en él durante el ciclo celular, y lo que allí se vio

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resultó fascinante. Ya en 1841, el científico suizo Karl Nägeli había descubierto en el núcleo de plantas unas estructuras aproximadamente cilíndricas, y al poco tiempo, el embriologista alemán Karl Reichert observó el mismo tipo de estructuras en células animales, y en ambos casos parecían desaparecer en ciertos momentos del ciclo celular. Estas estructuras, que eran coloreadas muy fuertemente con ciertos tintes, fueron denominadas cromosomas (“cuerpos coloreados”) y su estudio requirió no sólo el uso de los citados tintes sino el desarrollo de sustancias que los fijaran y preservaran para un estudio más detallado. En 1873, el citólogo alemán Albert Schneider utilizó estas técnicas para determinar la relación que existía entre la disposición de los cromosomas y los distintos momentos del ciclo celular, y observó que durante la división celular los cromosomas pasaban al menos por dos estados, uno en el que se ordenaban y orientaban con respecto a sí mismos (lo que después se ha denominado metafase), y otro en el que la mitad de los cromosomas se mudaban a lugares opuestos de la célula (anafase). En los siguientes años, y gracias fundamentalmente a los trabajos del científico alemán Walther Flemming, se pudo caracterizar completamente el proceso de división del núcleo, que Flemming denominó mitosis. Para poder realizar este trabajo, y como ocurre en muchas facetas de la vida, no sólo hay que ser trabajador sino que además se requiere ser listo... y tener suerte. Flemming escogió para sus estudios células de salamandras, que poseen un núcleo muy grande, que tiñó con tintes básicos. La tinción, como ya se sabía de antemano, produjo una coloración muy fuerte y Flemming derivó la palabra griega chromos (color) para inventarse un nuevo término, cromatina, que definiese la estructura que estaba estudiando. Flemming observó, además, que en un momento dado de la división celular, la cromatina y las partículas cilíndricas contenidas en ésta se dividían en dos partes que se separaban longitudinalmente, lo que le llevó a proponer que los cromosomas se dividían en pares y que cada una de las unidades pasaba a una de las células hijas. Otros estudios que siguieron a éste reforzaron la localización en el núcleo del material hereditario. Las nuevas evidencias vinieron del campo de la fertilización, que en un principio se pensaba que tenía lugar por la unión de una célula macho con otra hembra. En 1874, el médico Leopold Auerbach observó que las células fertilizadas de gusano contenían dos núcleos en lugares opuestos de la célula. Seguidamente, los dos núcleos migraban hacia el centro de la célula y allí se fusionaban. Posteriormente el núcleo se separaba y desaparecía, para volver a aparecer en cada una de las dos células que se producían tras el proceso de división de la célula madre. El alemán Oscar Hertwig, discípulo de Haeckel, dio un paso más en los estudios de fertilización. Para ello, escogió huevos de erizo de mar, claramente visibles al microscopio y fáciles de mantener vivos en el laboratorio, de fijar y de teñir. Hertwig mezcló huevos y esperma y observó cómo, en muy pocos minutos, se producía la fertilización en forma de dos núcleos en partes opuestas del huevo. Aunque no lo pudo visualizar, Hertwig dedujo correctamente que uno de los dos

Dibujo de Walther FLEMMING (1843-1905), realizado en 1882 (Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung), que muestra distintas etapas de la mitosis y la división celular.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

núcleos pertenecía al esperma que había penetrado en el huevo. Además, confirmó el proceso descrito por Auerbach y afirmó que durante el proceso de división celular todos los núcleos provenían del primero producido por la fusión del que se encontraba en el huevo y en el espermatozoide. Parecía claro que la información para producir el organismo tenía como origen los núcleos parentales. Los resultados fueron confirmados en parte por el zoólogo suizo ­Hermann Fol, quien sí que observó cómo el espermatozoide penetraba en el huevo, pero no pudo visualizar el núcleo de aquél, por lo que dedujo que la fertilización se producía por la unión del núcleo del huevo con el citoplasma del espermatozoide. La idea que obtuvo de estos descubrimientos y de otros era que el núcleo almacenaba la sustancia hereditaria, y que estaba involucrado tanto en la creación de la primera célula del nuevo organismo, como en los posteriores procesos de división. Esto no es más que el corolario de la teoría celular de Virchow, traspasada al núcleo. Parafraseando a éste, podríamos decir que todo núcleo proviene de otro anterior, y que todos provenimos de un núcleo primigenio.

Los cromosomas

Dibujo de August WEISMANN (1834-1914) de 1892 que muestra la formación de las células germinales (el óvulo en A‑C) y el espermatozoide (en D‑F) del parásito Ascaris megalocephala en el que se observa el proceso de meiosis.

Durante la observación del núcleo, los científicos no pudieron dejar de percibir las pequeñas estructuras que encontraban en el interior de aquél, especialmente cuando eran teñidas con ciertos tintes. Los cromosomas cambiaban su forma y se movían con unos patrones claramente identificables en ciertos momentos del ciclo, y pronto quedó claro que estas estructuras jugaban un papel fundamental en el mantenimiento y transmisión de la herencia. Por de pronto, el científico austríaco Karl Rabl ‑otro de los muchos discípulos de Haeckel que dejaron secuelas por sus descubrimientos‑, apuntó en 1885 que los cromosomas, en contra de lo que se pensaba anteriormente y debido sobre todo a problemas con su tinción, permanecían como estructuras individuales al finalizar la división celular. Además, Rabl, a partir de sus propios estudios, sugirió que el número de cromosomas era constante en todas las células de un organismo determinado. ¿En todas? De llevar la contraria a Rabl se ocupó en 1883 el embriólogo belga Edouard van Beneden, quien trabajando con células de un gusano, descubrió que sus células germinales poseían la mitad de los cromosomas que las demás células. Sin embargo, van Beneden no fue capaz de interpretar correctamente los resultados, y correspondió a August Weismann sugerir que la disminución a la mitad del número de cromosomas en las células germinales conseguía que, tras la fusión de los cromosomas de las dos células parentales, la nueva célula poseyese el número de cromosomas típico de su organismo. Estos resultados y otros hicieron que el alemán Theodor Boveri y el americano Walter Sutton formularan a la vez y de manera independiente la teoría cromosómica de la herencia. Sutton fue un aventajado discípulo de Edmund Wilson, del que hablaremos más tarde, y con él uno de los primeros genetistas americanos. Es-

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Las proteínas y los enzimas

tados Unidos, en el cambio de siglo, se estaba convirtiendo en un país poderoso e industrializado, y ello comenzaba a reflejarse en su ciencia. Los norteamericanos venían entonces a Europa, a las universidades alemanas, británicas y francesas, a aprender ideas y técnicas. ¡Quién hubiese dicho entonces que cien años más tarde, el viaje a través del Atlántico se realizaría normalmente al revés! Sutton fue un gran científico pero, a pesar de sus descubrimientos, realizados cuando tenía veinticinco años, decidió dejar su tesis doctoral y después de publicar un único artículo en el que recogía sus resultados e ideas, se dedicó completamente a la Medicina. El mundo perdió un gran científico pero ganó un buen cirujano, al menos hasta que una apendicitis acabó con él durante la I Guerra Mundial. Los trabajos de Boveri, Sutton y otros sirvieron pues para dejar bien claro que en los cromosomas se encontraba la base de la herencia. En muchas ocasiones, su diferente tamaño permitía que pudieran ser seguidos y caracterizados individualmente, lo que hizo proclamar a van Beneden que cada uno de ellos probablemente realizara una función definida en la célula. Nos encontramos a finales del siglo XIX, y en un periodo de cincuenta años los investigadores habían penetrado en el núcleo, habían observado los cromosomas, los habían perseguido a lo largo del proceso de fusión celular durante la partenogénesis, y los habían rastreado durante la división celular. Parecía claro que en los cromosomas se encontraban los elementos hereditarios que un monje agustino llamado Mendel había propuesto, y era el momento adecuado para que estas ideas comenzaran a ser perseguidas desde un marco más físico. Sin embargo, quizás a estas alturas el lector más curioso y avezado no pueda resistirse a preguntar: “Y ese material hereditario, ¿de qué está hecho?, ¿cuál es su naturaleza química?”. Por supuesto que esa pregunta también se la hicieron todos estos grandes científicos que hemos ido citando. Porque, además, la respuesta estaba en un principio en sus manos. El núcleo, como toda la célula, contenía fundamentalmente proteína, pero también otra sustancia aparentemente única en este orgánulo, y que había sido descubierta y aislada en el último cuarto de siglo. La molécula pasó a llamarse primero nucleína y posteriormente ácido nucleico, y su historia es la de un encumbramiento, caída y resurgimiento final. Antes de contar esta historia, conviene que conozcamos un poco mejor a los dos protagonistas, las proteínas y los ácidos nucleicos, que sin saberlo y por culpa del ser humano, mantuvieron desde finales del siglo XIX hasta casi la mitad del siglo XX una lucha por el protagonismo sobre quién almacenaba el material hereditario.

Las proteínas y los enzimas El título de este capítulo se refiere al doble carácter de las proteínas como elementos estructurales de los organismos y como catalizadores de las 39

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transformaciones que transcurren en su seno. Que ciertas proteínas son causantes de la fermentación se descubrió a finales del siglo XIX, y como quiera que esta función general, la de servir de catalizador de las reacciones biológicas, está en el corazón de lo que se considera Biología Molecular, será tratada en las páginas de este libro.

Las albúminas

Iacopo Bartolomeo BECCARI (1682-1766). © U.S. National Library of Medicine.

Antoine-François de FOURCROY (1755-1809). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Claude Louis BERTHOLLET (1748‑1822), y Antoine Laurent LAVOISIER (1743-1794), reproducción de un fresco en la Sorbona, 1890. “Lavoisier convierte a Berthollet a la teoría de la neumática en 1785”. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Lo que hoy conocemos como proteínas no siempre han sido llamadas así, y de hecho el nombre es muy reciente si tenemos en cuenta que el hombre las ha conocido y utilizado desde tiempo inmemorial. Desde muy antiguo ha sabido de algunas de sus propiedades, entre otras su solidificación al ser calentadas (en el caso del huevo), al ser acidificadas (la leche) o al ser expuestas al aire (la sangre), y ha sabido utilizarlas en su provecho. Las primeras noticias de la utilización de material proteico provienen del Creciente Fértil, donde ya se conocían hace 7.000 años las propiedades de la leche y su transformación en queso y mantequilla. De los egipcios conservamos registros que nos dicen que al menos en la III Dinastía (2600 a.C.) se utilizaba la gelatina de los huesos y la piel de animales como adhesivos, en pinturas y en la construcción. Estos conocimientos y el aprovechamiento de las propiedades de estos materiales biológicos se fueron desarrollando a lo largo de la historia sin que en un principio el hombre se preguntara en demasía sobre su naturaleza. Sí que comenzaron muy pronto a denominarse como sustancias albuminoides o albúminas, y su nombre, según Plinio el Viejo, hace referencia a la clara de huevo (album ovi). Plinio era un hombre muy curioso y su último acto de curiosidad le llevó a la tumba, al querer contemplar desde demasiado cerca la erupción del Vesubio, que enterró en el año 79 a Pompeya y Herculano. Los primeros intentos de caracterización y sistematización de las albúminas se produjeron en el XVIII y tuvieron como protagonistas al florentino Iacopo Beccari y al francés Hilaire Martin Rouelle, quienes aislaron y purificaron material albuminoide de distintas fuentes animales y vegetales. Beccari fue el primero en describir la obtención de gluten (cola de pegar, en latín) a partir de la harina de trigo, mientras que Rouelle observó que las albúminas animales y vegetales tenían parecidas propiedades. Casi cien años después, su compatriota Antoine François de Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las sustancias albuminoides: “Una consistencia a menudo espesa, sabor insípido, solubilidad en agua fría, precipitación por calor, solubilidad en álcalis y sobre todo en amoniaco, capacidad de separarse a la temperatura del agua hirviendo de todos los líquidos en los que se disuelve, capacidad de pudrirse sin que se produzca acidez, éstas son las propiedades que caracterizan a las sustancias albuminoides”.

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Fue otro francés, el químico Claude Berthollet, quien comenzó a dar los primeros pasos serios hacia su caracterización química, utilizando para ello técnicas analíticas que ya comenzaban a ser de uso común en toda Europa, y desarrolladas entre otros por el gran químico Antoine-Laurent Lavoisier. Berthollet analizó distintas albúminas y determinó que éstas poseían una gran cantidad de nitrógeno, aunque las de origen animal en mayor grado que las de origen vegetal. El camino hacia un análisis más completo de las albúminas lo continuó el químico sueco Carl Wilhelm Scheele. Éste fue autor de una numerosa obra, aunque su carácter reservado y poco propenso al reconocimiento público hizo que sus trabajos fueran poco conocidos en su época. En su pequeño laboratorio, y sin apenas ayuda, Scheele aisló por primera vez el oxígeno y el hidrógeno, logros que en un principio fueron atribuidos respectivamente a los británicos Priestley y Cavendish (este último otro personaje peculiar donde los haya). Además preparó por primera vez cloro, estudió el fósforo, demostró que el grafito está formado por carbono, observó por primera vez que las sales de plata se ennegrecen con la luz ‑lo que sirvió para que años más tarde se pudiera desarrollar la fotografía‑, y descubrió, entre otros, los ácidos fluorhídrico, cianhídrico, tartárico, úrico, oxálico, láctico y, además, la glicerina. En el campo de la sustancias albuminoides, Scheele fue el primero en demostrar que las proteínas también poseen azufre en su composición. Entrado ya el siglo XIX, le tocó el turno al gran sueco Jons Jacob Berzelius, quien no sólo realizó grandes logros en el campo de la Química, descubriendo y aislando un gran número de elementos, sino que además llevó a cabo una importantísima labor de sistematización y anotación de los compuestos. Utilizando como elemento de referencia el oxígeno, determinó el peso atómico relativo de elementos conocidos hasta esa fecha. Berzelius es, quizás, el primer químico moderno, y a su alrededor se desarrolló un grupo como los que ahora se encuentran en cualquiera de los centros de investigación, con alumnos jóvenes que realizaban su tesis doctoral y con otros mayores que se aplicaban a labores de especialización. Su relación con las albúminas no vino de su propio trabajo, sino del apoyo científico y personal que prestó a un joven médico y profesor de Química de la Universidad de Rotterdam, Gerrit Mulder, quien comenzó a mediados de los años treinta del siglo XIX a realizar análisis de sustancias biológicas de interés médico para posteriormente pasar a estudiar las sustancias albuminoides. Mulder utilizó las técnicas desarrolladas por Berzelius para calcular las relaciones elementales de distintas albúminas de origen vegetal y animal, y observó variaciones en el contenido de fósforo y azufre entre las distintas sustancias estudiadas, pero también encontró una relación común a todas ellas en el contenido relativo de carbono, nitrógeno, oxígeno e hidrógeno. Como quiera que esa relación parecía mantenerse tanto en las albúminas del reino vegetal como en las animales, Mulder desarrolló la teoría de que las proteínas estaban constituidas por una albúmina que llamaremos “básica”, que era sintetizada por los vegetales y que

Carl Wilhelm SCHEELE (1742‑1786), pintado por J. Falander. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Jacob BERZELIUS (1779-1848). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Gerrit MULDER (1802-1880). © Science Museum / S&S Picture Library.

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Justus von LIEBIG (1803-1873) en su laboratorio de Munich. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

pasaba apenas modificada a los animales herbívoros cuando éstos ingerían las plantas, y de éstos a los animales carnívoros. Mulder escribió en 1838 a su maestro Berzelius, como lo había hecho muchas veces antes, acerca de estos experimentos, y éste, en su réplica, sugirió a Mulder que nombrara a estas sustancias como las primeras, las que se encuentran al frente, y utilizó para ello el nombre griego de proteios (“el primer lugar”). La palabra proteína había surgido y a su reconocimiento por parte de la comunidad contribuyó en gran medida la polémica suscitada entre Mulder y el más famoso químico de la época, el alemán Justus von ­Liebig, discípulo de Berzelius, sobre algunos aspectos de la composición de las proteínas.

Las proteínas Los análisis de Mulder eran muy buenos pero incorrectos, entre otras cosas porque hoy sabemos que las proteínas, salvo en contadas excepciones, no contienen fósforo. Sin embargo, supusieron un paso gigantesco en su caracterización. Una de las conclusiones que se deduce de la fórmula sugerida por Mulder era que las proteínas tienen un tamaño formidable, algo que años después iba a causar enormes problemas a quien se atreviera a citarlo en público. Nos encontramos en la primera mitad del siglo XIX, y como hemos comentado anteriormente, comenzaba a surgir en Alemania la considerada Edad de Oro de la Química Orgánica. Ante la imposibilidad de estudiar las proteínas a nivel molecular, los químicos siguieron dos líneas, la primera tenía que ver con la degradación controlada de las proteínas en busca de sus constituyentes, y una segunda posterior que tenía que ver con la síntesis de éstos. El aislamiento de los constituyentes comenzó a producirse cuando se descubrió que las proteínas calentadas en presencia de bases o ácidos se degradaban en pequeñas unidades que fueron denominadas aminoácidos (o amino ácidos, o más correctamente en general, α‑aminoácidos). Utilizando estos métodos, el primero de los aminoácidos en ser aislado fue el aminoácido leucina, extraído de la lana en 1819, y a éste le siguió la glicina, que se aisló de la gelatina en 1820. De ahí al aminoácido treonina, que se aisló en 1935, transcurrieron más de cien años, en los que se determinaron no sólo los 20 aminoácidos que podríamos llamar “canónicos”, sino muchos otros que se encuentran en ciertas proteínas de algunos organismos (Figura 2). Los aminoácidos tienen unas propiedades únicas y éstas aparecen sobre todo al formar las grandes cadenas. Estas propiedades tienen que ver con los grupos químicos que poseen, y que permiten una serie de enlaces débiles que son fundamentales para que las proteínas adquieran su estructura tridimensional. Pero no adelantemos acontecimientos y quedémonos por ahora con que los aminoácidos se llaman así en virtud de poseer, unido a un mismo átomo de carbono, un grupo carboxilo (‑ COOH) y un grupo amino (‑ NH2). Uno de los otros dos enlaces que 42

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Las proteínas y los enzimas

Aminoácido

Año de aislamiento

Material de origen

Asparagina

1818

espárrago

Glicina

1820

gelatina

Leucina

1820

músculo y lana

Tirosina

1849

caseína del queso

Serina

1865

seda

Ác. glutámico

1866

gluten de trigo

Ác. aspártico

1868

legumina

Fenilalanina

1881

semillas del lúpulo

Alanina

1888

fibra de la seda

Lisina

1889

caseína del queso

Arginina

1895

cuerno de vaca

Histidina

1896

esperma de esturión

Cisteína

1899

cuerno de vaca

Valina

1901

hidrolizados de proteína

Triptófano

1901

caseína del queso

Oxiprolina

1902

gelatina 

FIGURA 2. Tabla que muestra el año del aislamiento de ciertos aminoácidos, junto con su descubridor y el material de donde fueron extraídos.

el átomo de carbono puede tener lo comparte con un átomo de hidrógeno y el cuarto enlace es el que hace diferir a todos ellos, pues puede ser en el caso más simple otro átomo de hidrógeno (glicina) o grupos más complejos como hidroxilo (‑ OH), sulfhidrilo (‑ SH) u otros grupos (‑ COOH ó ‑ NH2) (Figura 3).

El enlace peptídico Que los aminoácidos tienen esa estructura común no se supo cuando los primeros fueron aislados, y hubo que esperar hasta 1858 para que el químico alemán August Kekulé, entonces catedrático de Química en la Universidad de Gante, sentara las bases estructurales de lo que ha llegado a ser la Química moderna. Kekulé propuso, entre otras cosas, que el carbono es tetravalente y que sus átomos pueden unirse entre sí formando largas cadenas, lo que permitió, a partir de entonces, una mejor comprensión de los compuestos orgánicos. También descubrió la estructura cíclica que poseen los compuestos aromáticos, descubrimiento que le vino según propia confesión a través de un sueño que tuvo cuando se quedó transpuesto en un autobús:

August KEKULÉ (1829-1896) sentado en el centro, con sus alumnos de la Universidad de Gante. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

“... los átomos saltaban delante de mis ojos. Ahora los grupos más pequeños permanecían modestamente al fondo. Mi ojo mental, más agudo, debido a las repetidas visiones de este tipo, podía distinguir estructuras mayores, con conformaciones diversas; largas filas, a veces más íntimamente unidas; todas retorciéndose y agitándose con un movimiento parecido al de una serpiente. De repente una de las serpientes había cogido con la boca su propia cola y su figura comenzó a dar vueltas delante de mis ojos. Como si hubiese sido el resplandor de un relámpago, me desperté”.

La serpiente mordiéndose la cola fue la pista que permitió a Kekulé sugerir una estructura cíclica para el benceno, cuyo análisis elemental no po-

              O                  || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |              CH3 Alanina Ala A

               O                   || CH ‑ C ‑ O‑

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |              CH ‑ CH3       |              CH3 Valina Val V

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |              CH2

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |              CH ‑ CH3       |              CH3 Leucina Leu L

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH ‑ CH3       |              CH2       |              CH3 Isoleucina Ile I

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |              CH2

              O ||                 + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |              CH2       |              S       |              CH3 Metionina Met M

Prolina Pro P            Fenilalanina Phe F

              O ||                 + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            H Glicina Gly G

Figura 3. Fórmula química de los 20 aminoácidos más frecuentes, con sus respectivos códigos de tres y una letra utilizados en los textos de biología. 

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |            CH2       |            CH2       |            NH       | +            C = NH    2       |            NH2 Arginina Arg   R

         Triptófano Trp W               O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |            CH2       |            CH2       |            CH2       |+            N    H3 Lisina Lys K

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2

             Histidina His H

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              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |              OH Serina Ser S

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH ‑ OH       |              CH3 Treonina Thr T

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2

              O ||                 + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |              C = O       |+              NH3 Asparagina Asn N

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |            CH2       |              C = O       |+              NH3 Glutamina Gln Q

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |            C = O       |            O‑ Ac. Aspártico Asp D

                     OH Tirosina Tyr Y

 

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |              SH Cisteína Cys C

              O                 || + H3N ‑ CH ‑ C ‑ O‑       |            CH2       |            CH2       |            C = O       |            O‑ Ac. Glutámico Glu E



día ser entendido con las teorías de aquella época. Los sueños sin duda pueden ayudar... a quien está preparado para entenderlos. Kekulé nunca pudo desarrollar completamente sus teorías, pero sus ideas influyeron grandemente en los químicos de aquella época y, en particular, en dos científicos a los que vamos a atender por unos momentos, porque son esenciales en la historia de las proteínas. Uno de ellos fue Emil Fischer, una inmensa figura como científico pero trágica como persona. Fischer realizó contribuciones muy importantes no sólo en el campo de las proteínas sino también en el campo de los azúcares, los ácidos nucleicos (por los que obtuvo el Premio Nobel de Química en 1902) y los enzimas, a los que nos referiremos más tarde. Fischer realizó su tesis doctoral en Estrasburgo, bajo la dirección de otro gigante de la química alemana, Adolf von Baeyer, Premio Nobel de Química en 1905. Von Baeyer era un fanático de la síntesis orgánica, y se pasaba horas en el laboratorio delante de la poyata, como cualquiera de sus alumnos, y Fischer siguió sus mismas costumbres, lo que a lo largo de su vida investigadora le causó varios envenenamientos accidentales, de alguno de los cuales nunca se recuperó. Fischer fue un magnífico experimentalista y exigió a su gente la perfección en sus trabajos sintéticos, de tal manera que cuando años después y por técnicas modernas se analizó una larga colección de los productos sintetizados en su laboratorio, sólo uno de los varios miles analizados resultó impuro. Fischer fue un decidido pangermanista en la época en que Prusia había conseguido unificar todos los

FIGURA 3 (cont.).

Adolf von BAEYER (1835-1917) y sus alumnos en su laboratorio de Munich. Sentados, de izda. a drcha.: Otto Fischer, Jakob Volhard, von Baeyer, Emil Fischer. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Franz HOFFMEISTER (1850-1922). © Science Museum / Science & Society Picture Library.

             R             O        R′     O       |      ||             |     || H2N ‑ CH ‑ C ‑ N ‑ CH ‑ C ‑ OH                    |                H Figura 4. Estructura química del enlace peptídico.

pueblos alemanes del norte y derrotar estrepitosamente a Francia en la guerra franco-prusiana de 1870. Tras la guerra, la naciente Alemania se había anexionado la Alsacia y con ella su capital, Estrasburgo, donde Fischer estudió. La Alemania nacida de esa guerra era una potencia in­ dustrial y científica, y Fischer apoyó las ideas expansionistas del emperador Guillermo que dieron lugar a la I Guerra Mundial. La guerra no salió como había sido planeada y Fischer, que había ayudado como otros científicos de la época al esfuerzo de la guerra, terminó por desencantarse de ésta. Además, en ella perdió a dos de sus hijos, lo que unido a su mala salud, probablemente fuera la causa de su suicidio en 1919. Fischer había comenzado a trabajar con las proteínas cuando ya era una persona conocida, y fruto de sus trabajos fue el aislamiento en 1901 de dos aminoácidos, la prolina y la valina. En aquella época, la mayor parte de los aminoácidos ya habían sido aislados, pero no se conocía nada sobre cómo éstos se unían para formar las cadenas peptídicas. Fischer formu­ló la nueva idea de lo que sería el enlace entre aminoácidos, y lo presentó en 1902 en el congreso de la Sociedad Alemana de Médicos y Científicos... a la vez que Franz Hofmeister. Este último era catedrático de Fisiología en la Universidad Alemana de Praga y un conocido fisiólogo, aunque no tuviera ni de lejos la fama de Fischer. Hofmeister se había involucrado en el estudio de las proteínas a través de la caracterización de sus productos de degradación en el tracto intestinal, y había comenzado a intentar purificarlas. A Hofmeister le debemos, todos aquellos que hemos sufrido o disfrutado con la purificación de proteínas, el método de precipitación mediante sulfato amónico. Hofmeister, en sus estudios sobre las proteínas, llegó a la conclusión de que el enlace que une los aminoácidos, el enlace peptídico, es en realidad un enlace covalente del tipo CO ‑ NH, es decir un enlace del tipo amida (Figura 4). Así, en su obra Sobre la estructura de la molécula de proteína (1902), Hofmeister esgrimió que “hay numerosos hechos que hablan de una distribución general en las proteínas de la unión ‑ CO ‑ NH ‑, entre otras cosas porque el nitrógeno en las proteínas está unido fuertemente como una amina / imina, porque además los aminoácidos puede ser unidos sintéticamente mediante un enlace amida y, finalmente, porque las proteínas pueden ser hidrolizadas como las amidas por ácidos y fermentos”. De una manera empírica Hofmeister observó que el enzima pepsina, descubierto por Theodor Schwann en 1836 y con la que el científico checo trabajaba en sus estudios sobre hidrólisis de proteínas, no actuaba sobre cadenas hidrocarbonadas que sólo poseían enlaces C ‑ C ó C ‑ H, lo que le sugirió que el enlace debía ser de otro tipo. Además, Hofmeister observó que la reacción de Biuret ‑una reacción colorimétrica que se produce cuando un átomo de cobre reacciona con una amida en una solución alcalina‑ generaba color en presencia de proteínas pero no con aminoácidos, por lo que dedujo correctamente que el enlace peptídico era un enlace amida que se produce entre los distintos aminoácidos. La reacción de Biuret no sólo ha tenido un papel importante en el establecimiento del enlace peptídico sino que durante años fue muy utilizada

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para medir la concentración de proteínas, hasta que otros métodos más sensibles la hicieron pasar al olvido. Como decíamos antes, en el mismo congreso en el que Hofmeister propuso la existencia del enlace peptídico, el gran Emil Fischer comunicó a los asistentes sus ideas sobre ese enlace, parecidas a las de Hofmeister, pero con criterios mucho más químicos. En los siguientes cinco años, Fischer estableció sin lugar a dudas la naturaleza del enlace peptídico y utilizando esos conocimientos, desarrolló técnicas para sintetizar péptidos. En una primera instancia, éstos fueron dipéptidos y tripéptidos, pero más tarde llegó a sintetizar un péptido de 18 aminoácidos. Esta síntesis fue considerada una hazaña por la comunidad internacional, pero Fischer se dio cuenta de que la síntesis de péptidos más grandes estaba fuera de las posibilidades de aquel momento, y al poco tiempo abandonó estos trabajos. Sin embargo, su influencia en el estudio de las proteínas persistió durante muchos años, con no muy buenas consecuencias en algunos casos, como veremos más tarde. Nos encontramos a principios del siglo XX, en una época en que la estructura general de las proteínas parecía establecida. Es, quizás, el momento en que debamos volver nuestra vista atrás para hacernos eco de varias polémicas científicas que configuraron en parte la biología del siglo XIX, y que tienen que ver con la naturaleza de los fermentos.

Los fermentos Al igual que las proteínas, la existencia de la fermentación era conocida por el hombre desde tiempo inmemorial, y había sido usada en la fabricación de pan y en la preparación de todo tipo de bebidas para alcanzar una mejor comunicación con los dioses, con el hombre... o todo lo contrario. Todas las culturas han sabido que el proceso de fermentación requiere, además de azúcar, la adición de un compuesto que induzca el proceso de transformación, y que en un principio se denominó fermento. Sin embargo, tanto el concepto de fermento como el de fermentación fueron utilizados en sus inicios de una forma muy relajada, de tal manera que su uso indicaba elixir o poción. Sólo en el siglo XVII las palabras fermento o fermentación se convirtieron en conceptos concretos relacionados con la Química. Es en el siglo XVIII, el siglo de la clasificación y la sistematización, cuando el holandés Hermann Boerhaave en su libro Elementos de Química restringió el uso del término fermentación para el proceso en el que una sustancia orgánica se descomponía en alcohol o ácido. Fue más tarde Lavoisier, que también realizó estudios sobre la fermentación, quien sugirió en su libro La fermentación del vino que el azúcar fermentado se podía separar en dos partes, una que se oxidaba a dióxido de carbono y otra que perdía oxígeno y daba lugar a alcohol. Lavoisier fue, sin duda, uno de los más importantes químicos de la historia y ha dejado contribuciones muy importantes en distintos campos de la Ciencia. El gran químico francés era un perfeccionista en todo lo que

Hermann BOERHAAVE (1668‑1738). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

hacía, desde los experimentos científicos, pasando por la organización de la Fábrica Nacional de Pólvora, hasta la recaudación de impuestos, franquicia real que su padre había comprado para él. Tan eficiente fue Lavoisier en la recaudación de impuestos, que cuando la Revolución se adueñó de las calles de París, algunas personas, entre ellas Marat, al que Lavoisier había afrentado tiempo atrás, recordaron su labor a favor del guillotinado rey y le dispensaron el mismo trato. Esta es una de las veces en que uno opina que “Mejor no sobresalir en nada... ni la cabeza”.

El vitalismo Sin embargo, la pregunta fundamental que se hacían los científicos de finales del siglo XVIII tenía que ver con la naturaleza del fermento y su modo de acción. Y es que entonces la idea que sustentaba una gran parte de la comunidad científica era la del vitalismo, una “vibración molecular” como se llamó entonces, que estaba incluida en el fermento, y que era lo que inducía el proceso. El vitalismo pretendía que las funciones de los sistemas biológicos eran inherentes a éstos y no podían ser reproducidas fuera de ellos sino mediante la transferencia de esa vibración, de esa fuerza vital. Por ejemplo, en el caso de la fermentación del azúcar, la molécula que era fermentada traspasaba esa capacidad a otras moléculas. La teoría del vitalismo, creada entre otros por el médico francés Teófilo de Bordeau, fue muy popular durante la primera mitad del siglo XIX, ganó muchos adeptos entre la comunidad científica alemana, y  tuvo por eminente defensor al filósofo alemán Friedrich Wilhelm ­Schelling, quien abogó por considerar a la Naturaleza poseedora de un alma. Sus escritos y los de su discípulo Dietrich Kieser merecieron el apoyo de parte de la clase médica, pues ambos filósofos consideraban a la Medicina, por su naturaleza inclinada a intentar entender el cuerpo humano, como la ciencia más cercana a Dios su creador. Kieser en su Sistema de la Medicina consideraba que el mundo, el universo, estaba regido por una polaridad positiva y negativa, el Sol que es positivo y la Tierra que es negativa. El carácter masculino estaba influido por el Sol mientras que la naturaleza femenina era más “terrestre”. La enfermedad era considerada como una alteración de la polaridad natural. Los problemas comenzaron cuando en 1837 y de manera independiente el francés Charles Caignard-Latour y los alemanes Theodor Schwann y Friedrich Kützing informaron de sus resultados del examen microscópico de la mezcla de fermentación. Los tres concluyeron que la levadura que se desarrollaba durante la fermentación estaba realmente compuesta por material vivo, “una masa de glóbulos que se reproducen por gemación y no se trata de una simple sustancia orgánica”. Aún más, pensaron que era probable que la descomposición del azúcar y su conversión en dióxido de carbono y alcohol era una consecuencia del desarrollo de la levadura. Estos descubrimientos fueron atacados por varios frentes. En uno de ellos estaba Berzelius, quien poco antes había desarro48

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llado una teoría química para la catálisis, que según él podía producirse con pequeñas sustancias biológicas. Sin embargo, Berzelius no alcanzó a aplicar esa teoría al fenómeno que, según Caignard-Latour, Schwann y Kützing ocurría en la fermentación, y criticó los resultados de los tres científicos. El otro frente fue mucho más peligroso. Y es que para entonces, como se ha discutido anteriormente, la Química había entrado en un proceso de desarrollo enorme, y algunos químicos como von Liebig y Friedrich Wöhler comenzaron a sugerir que todas las reacciones realizadas dentro de los seres vivos podían ser imitadas en el tubo de ensayo. Lo que siguió fue una aguda polémica entre estos dos gigantes de la química alemana y los defensores de las levaduras como causantes de la fermentación, y en la que los primeros, apoyándose en su mayor estatus científico y social, actuaron de mala fe y con tretas sucias. El resultado fue que Caignard-Latour dejó el estudio de las levaduras, en el que se había introducido de manera pasajera, mientras que Schwann perdió ciertas oportunidades académicas, siendo olvidado poco a poco. Y lo peor del asunto es que las dos partes tenían razón, pues la levadura produce la fermentación y ésta y cualquier otra reacción biológica puede en principio ser reproducida fuera de los organismos. Pero si las malas artes de von Liebig y Wöhler y su alta posición social les había valido con Caignard-Latour y con Schwann, lo que les venía ahora estaba probablemente por encima de sus fuerzas. Y es que Louis Pasteur, el gran científico francés que había demostrado que la Vida no se producía por generación espontánea, mantuvo sus convicciones para proclamar que la fermentación la producían los seres vivos y no agentes extraños, y se opuso con dureza a todos aquellos que apoyaron que las reacciones biológicas podían ser imitadas fuera de ese contexto: “Creo que no hay fermentación alcohólica sin que exista la organización, desarrollo y multiplicación de las células” vino a decir una vez. El estatus de Pasteur era único, con un conocimiento de distintos campos de la Ciencia como nadie en Europa, y con una oratoria y dialéctica temibles. Así, von Liebig, que le conocía bien, ignoró el desafío de Pasteur para realizar un experimento científico conjunto y frente a un comité de sus pares, una especie de duelo al amanecer con tubos de ensayo. El pulso científico entre el francés y los dos alemanes se vio además agravado por los desastrosos resultados para el país galo de la guerra franco-prusiana de 1870, que añadió al contencioso científico patrioterismo a raudales, y en eso los franceses son únicos. Sin embargo, las pruebas contra Pasteur se fueron acumulando poco a poco, y es que la Ciencia, a largo plazo, no entiende de países ni de culturas, sino que busca la Verdad por encima de todas las cosas. Así, von Liebig demostró que algunas reacciones se podían realizar con los extractos de organismos, tales como la rotura de la sacarosa para dar fructosa y glucosa. Sin embargo Pasteur se mostró imperturbable y consideró que ésta no era una reacción “biológica” y desarrolló el concepto de fermentación propiamente dicha para definir las reacciones según él verdaderamente biológicas. Y cuando Friedrich Wöhler, autor de una inmensa obra

Friedrich WÖHLER (1800-1882). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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Marcelin BERTHELOT (1827-1907). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Edward BÜCHNER (1860-1917). © Science Museum Pictorial / S&S Picture Library.

en el campo de la Química, sintetizó por primera vez un compuesto de origen biológico, la urea, Pasteur se defendió afirmando que ésta no podía considerarse un compuesto realmente biológico puesto que es un producto de degradación. Realmente con Pasteur no se podía. Sin embargo, los días del vitalismo estaban contados. El primer científico que intentó aunar lo que de verdad tenían las dos teorías fue Moritz Traube, un comerciante de vinos prusiano y antiguo alumno de Liebig, que disponía de suficiente dinero y tiempo libre para investigar en su propio laboratorio. Traube publicó en 1858 que la fermentación no dependía necesariamente de actividades biológicas sino que era producida por procesos químicos que podían reproducirse fuera de la célula. Esos fermentos, que existían en la célula, podían extraerse de ella. Desgraciadamente, Traube nunca intentó purificar alguno de esos fermentos, ni tampoco lo hizo Marcelin Berthelot, químico francés, quien tuvo en su haber la primera síntesis del etanol, ácido fórmico, metano, acetileno y benceno, y quien también realizó estudios en el campo de la fermentación. En unos experimentos llevados a cabo en 1860, Berthelot rompió levaduras y obtuvo una solución en la que se encontraba un fermento soluble, al que denominó “invertasa”, que se mostró capaz de degradar la sacarosa presente en el azúcar de caña, en sus dos componentes más simples, glucosa y fructosa. Los experimentos de Berthelot proporcionaron el primer ejemplo de un fermento que normalmente estaba dentro de la célula y que actuaba también después de la rotura celular. Parecía claro que la célula en sí no era el fermento, sino la que lo fabricaba. Berthelot no pudo sino rechazar que la fermentación fuera producida por una “fuerza vital”, y opinó que había que buscar, utilizando métodos químicos, las causas moleculares que estaban detrás de los procesos biológicos. Tampoco aisló ninguno de esos fermentos Eduard Büchner, pero sí que consiguió reproducir la fermentación en un extracto libre de células de levadura. Büchner fue un hombre con suerte, que es lo que al parecer se debe tener cuando se carece de talento, según dijo de él von Baeyer, con quien realizó su tesis doctoral. Büchner era un científico poco conocido, y después de trabajar con von Baeyer había obtenido puestos menores en distintas universidades alemanas. Durante las vacaciones de verano de 1897 se dispuso a ayudar en varios experimentos a su hermano mayor, Hans, un microbiólogo y catedrático de Higiene en la Universidad de Munich, quien pensaba que los extractos de levaduras podían tener propiedades curativas. Los hermanos Büchner se ayudaron de una presa hidráulica para romper las células y Edward pensó que quizás podía utilizar estos extractos para ver si era posible imitar la fermentación, cuestión que como se ha visto era candente en aquella época. Añadió azúcar a los extractos y al poco tiempo observó cómo se realizaba el proceso de la fermentación y cómo de la masa del extracto se desprendían burbujas de dióxido de carbono. Büchner repitió los experimentos y los perfeccionó, confirmando los resultados. Éstos fueron publicados en el mismo año bajo el título Fermentación alcohólica sin células de levaduras

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y en el artículo dejó claro que “la separación de la fermentación con respecto a la actividad de las células de levadura vivas no se ha producido hasta ahora. En el presente trabajo se describe un método que resuelve este problema”. Sin duda Büchner tuvo suerte, pero también supo aprovecharla, y el citado trabajo puso punto final a las ideas vitalistas a la vez que proporcionó a Büchner el Premio Nobel de Química en 1907. La suerte de Büchner sin embargo se le acabó en 1917, en plena I Guerra Mundial, cuando animado por el patriotismo que infectó a un gran número de científicos alemanes y a pesar de sus 57 años, se alistó en el ejército. Una bomba de cañón cayó cerca de él y acabó con su vida.

Los premios Nobel Desde finales del siglo XIX, la Ciencia fue ocupando un papel cada vez más importante en las sociedades más adelantadas. Mención especial en este sentido merece la acción de filántropos que decidieron apoyar los nuevos descubrimientos que supusieran una mejora de la condición humana. Uno de estos filántropos hizo algo que iba a cambiar la noción que la sociedad tiene de los científicos, y la que éstos tienen de sí mismos. Este hombre fue un millonario sueco con negocios en empresas armamentísticas y petroleras. Se llamaba Alfred Nobel y había sido el inventor de la dinamita, explosivo con el que amasó una enorme fortuna, pues sus fábricas suministraron explosivos a todas las contiendas que se produjeron (y se producen) a lo largo de este mundo. Cuenta la leyenda que un periódico francés confundió la muerte de un hermano de Nobel con la suya propia, y tituló su epitafio: “La muerte del señor muerte”. Impresionado porque pudiera ser recordado de esta manera, Nobel decidió dejar casi todo su dinero a una fundación que repartiese premios anualmente en el campo de la Literatura, la Paz y a varias disciplinas científicas. Para estas últimas, Nobel escogió los campos de la Física, la Química y el de Fisiología o Medicina (el Premio Nobel de Economía vino mucho más tarde y, aunque lleva tal nombre, no es en realidad financiado por la Fundación Nobel). Curiosamente, no se creó un premio para las Matemáticas, y circula la especie de que ello se debió a que Nobel temió que éste fuera dado algún día a un famoso matemático con el que se llevaba muy mal. Los premios debían entregarse a la mejor labor realizada en esos campos durante el año anterior, pero tras varias equivocaciones producidas por la poca perspectiva que proporcionaba esta condición (se concedieron premios Nobel a científicos por descubrimientos que luego no fueron tales), la Fundación Nobel decidió cambiar las reglas de los premios y concederlos a científicos cuyos descubrimientos pudieran haber sido realizados con anterioridad y sobre los que ya hubiera una cierta perspectiva. La concesión de los premios, que fueron haciéndose más famosos cada año, supuso una relevancia inusual para los premiados y contribuyó al conocimiento de los avances científicos por parte del público en gene-

Alfred Bernhard NOBEL (1833‑1896). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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ral. Como se podrá apreciar a lo largo de estas páginas, ninguna otra disciplina como la Biología Molecular se ha beneficiado tanto de la fama que han proporcionado los premios Nobel, pues a su formación y consolidación han contribuido los premios concedidos a científicos en las áreas de Física, Química y Fisiología o Medicina.

Los enzimas y su naturaleza proteica

Richard WILLSTÄTTER (1872-1942). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

A lo largo del siglo XIX y muy relacionados con la polémica sobre el vitalismo, se habían realizado estudios conducentes a aislar las sustancias que en la célula eran responsables de los procesos de fermentación y degradación. En 1833, los franceses Anselme Payen y Jean François Presos observaron que la solución acuosa presente durante la preparación de la cerveza contenía un material que, separado de la cebada, descomponía el almidón de las semillas sin germinar en azúcar. Los dos científicos procedieron a aislar ese material y obtuvieron un precipitado que, cuando se disolvía, volvía a producir la reacción antes citada pero mucho más eficientemente. El mismo Schwann obtuvo de la mucosa gástrica de los animales un “principio digestivo” capaz de degradar el músculo de los animales, la pepsina, a la que nos referimos anteriormente al hablar del trabajo de Hofmeister. También von Liebig y Wöhler se dedicaron a finales de los años cuarenta de ese siglo, a purificar una sustancia de las almendras amargas, la amigdalina, hasta llegar a cristalizarla. De la almendra consiguieron purificar también un fermento soluble, la emulsina, que hidroliza la amigdalina en glucosa, benzaldehído y ácido cianhídrico. Los dos científicos propusieron que la emulsina era un fermento de naturaleza albuminoide. A partir de entonces, un número cada vez mayor de fermentos fueron aislados y purificados, y caracterizadas las reacciones que catalizaban. La apreciación por parte de la comunidad científica de que los fermentos eran sustancias que se encontraban en el interior de las células, normalmente de levadura, llevó al fisiólogo animal Wilhelm Kuhne a proponer en 1878 para ese tipo de sustancias el nombre de enzima, una transformación de las palabras griegas que significan “en el fermento, dentro del fermento”. Posteriormente, la palabra enzima se generalizó para toda sustancia capaz de catalizar una reacción biológica. Los enzimas habían nacido y su naturaleza proteica fue confirmada por el mismo Emil Fischer, quien además sugirió en 1890 que los enzimas funcionan, con respecto al sustrato sobre el que actúan, como si de una cerradura y una llave se tratara (Figura 5). Esta genial intuición sería desarrollada años después por Linus Pauling y otros, como veremos más tarde. Sin embargo, como suele ser el caso, no todos estaban de acuerdo. La principal oposición a que los enzimas fueran considerados de naturaleza proteica partió de Richard Willstätter, otro discípulo de von Baeyer y el primer químico que realizó la síntesis de la cocaína. Willstätter se hizo famoso fundamentalmente por sus trabajos conducentes a la purificación

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Figura 5. Esquema “llavecerradura”, tal como lo propuso Fisher. E y S significan enzima y sustrato, respectivamente, mientras que P1 y P2 representan los productos de la acción enzimática.

de muchos pigmentos, entre otros la clorofila, y por los que obtuvo el Premio Nobel de Química en 1915. Para ello desarrolló métodos de purificación basados en la adsorción de las sustancias a geles inorgánicos, el embrión de las técnicas de cromatografía que tan fundamentales resultarían para el desarrollo de la Biología Molecular. Las purificaciones de pigmentos por parte del grupo de Willstätter eran tan buenas que cuando se analizaban con las técnicas de la época, sólo se encontraban los pigmentos que se pretendía purificar. Willstätter dedujo por lógica que eran los pigmentos, y no las proteínas, quienes poseían naturaleza enzimática, y atacó a aquellos que defendían a las proteínas como los agentes catalíticos, aduciendo para ello que las purificaciones de los supuestos enzimas no eran perfectas, lo cual era cierto, y que contenían los pigmentos necesarios para la actividad catalítica. El error de Willstätter, comprensible por otra parte, era que sus preparaciones de pigmento en realidad estaban contaminadas con minúsculas cantidades de enzimas. Este error pesó mucho en el desarrollo de un episodio crucial en la historia de la Biología Molecular, la determinación de la verdadera naturaleza de los genes, y a ello nos referiremos más tarde. Willstätter era un científico muy conocido y, por lo que parece, bastante terco, pues su resistencia a la naturaleza proteica de los enzimas duró mucho más de lo razonable, hasta su muerte en 1942 en Suiza, donde había huido de las persecuciones antisemitas. Y es que las evidencias sobre la naturaleza proteica de los enzimas eran cada vez más fuertes, y cristalizaron (nunca mejor dicho) en la purificación a homogeneidad de un enzima, la ureasa, y en su cristalización en 1926 de la mano de James Sumner, esto último también literal, pues Sumner era manco. Este químico americano estaba interesado en el desarrollo de métodos analíticos que decidió aplicar a la caracterización de algunos enzimas. Para ello tuvo que purificarlos, y a este objetivo se dedicó durante varios años. Los procesos de purificación y cristalización diseñados por Sumner seguían protocolos perfectamente razonados que fueron aplicados a otros enzimas, de tal manera que John Northrop, otro químico americano que trabajaba en el Instituto Rockefeller de Nueva York, pudo cristalizar en 1929 la pepsina, y a ésta siguieron los enzimas tripsina, quimotripsina,

James B. SUMNER (1887-1955) observa unos tubos que le muestra Hermann J. MULLER (1890-1967) en 1946, año en que ambos obtuvieron el Premio Nobel. © Radial Press.

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John NORTHROP (1891-1987) en 1946, año en que le concedieron el Premio Nobel de Química. © U.S. National Library of Medicine.

carboxipeptidasa y pepsinógeno. La importancia de este trabajo fue reconocida por el Comité Nobel, que concedió a Sumner y Northrop el Premio Nobel de Química en 1946, pues sus resultados mostraban a las claras que los enzimas, creados por seres vivos, podían ser extraídos de ellos y funcionar en el entorno mucho más simple de un tubo de ensayo. Y es que su función estaba impresa en su propia naturaleza y no requería en principio otros aditamentos presentes en la célula, lo que eliminaba completamente de la escena científica de la época cualquier residuo vitalista que pudiera estar enquistado en ella. Además, que las proteínas cristalizasen a la manera de los compuestos orgánicos más simples, sugería una homogeneidad en su naturaleza, lo que chocaba con alguna de las teorías que circulaban en aquella época, a las que ahora nos referiremos. A la búsqueda de la naturaleza de las proteínas se dedicaron durante los siguientes años una naciente raza de científicos, los que pronto serían llamados bioquímicos.

La teoría coloidal de las proteínas Sin embargo, la caracterización de las proteínas tuvo sus altibajos, y su estudio pareció estar afectado negativamente por la influencia de la llamada teoría coloidal de las proteínas, que dominó la vida científica del primer cuarto del siglo XX. Esta época ha sido considerada por algunos historiadores como una época oscura, aunque esto parece un poco excesivo ya que la lucha entre los que la apoyaron y sus detractores dio lugar al nacimiento de conceptos y técnicas que tuvieron mucha importancia en el desarrollo de la naciente Bioquímica y posteriormente, de la Biología Molecular. En pocas palabras, la teoría coloidal proponía en general, tanto para las moléculas orgánicas como para las biológicas, la existencia de un estado material llamado “coloidal” en el que las grandes macromoléculas no existían sino que lo que se producía eran agregados de pequeñas moléculas que se agrupaban de manera desordenada para formar “coloides”, con propiedades químicas y biológicas distintas y definidas según las moléculas presentes. Las estructuras coloidales existían claramente en el campo de las moléculas inorgánicas, y ciertas moléculas orgánicas como la celulosa, el caucho o algunas proteínas, parecían comportarse de la misma manera. Una de las razones que empujaron a pensar que las proteínas tenían que ser pequeñas moléculas era la “imposibilidad” para los químicos de principios del siglo de que las grandes macromoléculas pudieran ser solubles en agua, y la mayor parte de las proteínas lo eran. Y, sin embargo, la idea de que las proteínas pudieran ser grandes moléculas, mucho más grandes que las conocidas hasta entonces, ya había sido sugerida por Mulder en el mismo artículo en que introdujo el término “proteína”. La caracterización del enlace peptídico a principios del siglo XX sentaba las bases teóricas de la construcción de las estructuras poliméricas proteicas y no ponía ningún impedimento a la repetición ad 54

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nauseam de ese enlace para generar grandes moléculas. Sin embargo fue Fischer, el científico que más trabajó para desarrollar la teoría del enlace peptídico, uno de los más firmes oponentes a la idea de que las proteínas pudieran estar constituidas por largas cadenas de aminoácidos. La razón primordial para su oposición tuvo que ver quizás con sus fracasos para conseguir sintetizar largos polímeros de proteína, lo que pudiera haberle llevado a pensar que lo que él no podía hacer, la Naturaleza tampoco sería capaz de realizarlo. Sin embargo, las pruebas de que las proteínas eran grandes moléculas se acumulaban incluso a mediados del siglo XIX. Una de las primeras evidencias tuvo que ver con una proteína de la sangre, la hemoglobina. Esta es una proteína fundamental para la historia de la Bioquímica y la Biología Molecular, y a ella recurrieron para impulsar estas disciplinas y sus propias carreras científicos tan importantes como Hopkins, Adair, Pauling, Monod y Perutz, así que con la hemoglobina nos encontraremos varias veces a lo largo de estas páginas. Esta proteína, una de las primeras en ser purificada y cristalizada (lo fue alrededor de 1840), está constituida por una parte proteica y por un pigmento que contiene un átomo de hierro. El conjunto de pigmento y átomo de hierro se denominó en su momento hemina, mientras que a la proteína se la denominó globina. El científico alemán Hoppe-Seyler, uno de los primeros en realizar estudios sobre esta proteína, denominó al conjunto entero hemoglobina. Los análisis realizados a lo largo del siglo XIX sobre varios tipos de hemoglobinas, utilizando distintas técnicas, demostraron que todas poseían de manera constante un 0,4% de hierro, lo que habida cuenta de la masa atómica de este elemento, apuntaba para la hemoglobina una masa molecular de 16.000 daltons (un dalton es la doceava parte de la masa del átomo 12C; aprovecho la ocasión para apuntar que la unidad de masa lleva ese nombre en honor del científico inglés John Dalton, creador de una vasta obra en multitud de facetas, entre otras una teoría sobre el átomo y la combinación de los elementos). Otra prueba del gran tamaño de las proteínas vino los resultados de su hidrólisis secuencial. Esta técnica, muy primitiva entonces, sería de gran importancia en el futuro cuando, mucho más desarrollada, serviría para



John DALTON (1766-1844) recogiendo metano. Reproducción de original pintado a finales del XIX. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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determinar la secuencia de pequeñas proteínas. En el año 1871, los químicos checos Heinrich Hlasiwetz y Josef Habermann mostraron que la proteína caseína podía ser susceptible a varios procesos de hidrólisis secuencial, lo que indicaba claramente que su tamaño tenía que ser bastante grande. Otra técnica desarrollada en aquella época fue la determinación crioscópica de la masa molecular, y desde el principio formó parte del arsenal de la recién creada Química Física. Esta técnica, ideada por el químico francés François Marie Raoult, permitía determinar la masa molecular de un soluto basándose en la disminución del punto de congelación que una cantidad determinada de éste producía sobre la solución. La técnica no era muy precisa para grandes moléculas, pero aun así sirvió para calcular una masa molecular de 15.000 daltons para la ovoalbúmina, valor que aunque incorrecto, mostraba claramente el gran tamaño de algunas proteínas. Aproximadamente al mismo tiempo que se determinaban las masas moleculares de algunas de esas proteínas, nacía en Gran Bretaña la teoría coloidal. Ésta surgió en 1861 fruto de los estudios sobre la difusión de disoluciones a través de membranas del químico escocés Thomas Graham, un gran científico y el primer presidente de la Chemical Society. Graham observó que ciertas disoluciones de sustancias orgánicas, pero también de proteínas como la gelatina o la albúmina, mostraban una velocidad de difusión a través de las membranas mucho menor que las que se observaba para disoluciones de sustancias inorgánicas. Para estas moléculas que difundían rápidamente, Graham acuñó el término cristaloide, mientras que para las moléculas que poseían una velocidad de difusión más lenta inventó la palabra coloide, derivada de la palabra griega que designa a la cola, que se extraía de la gelatina. Graham definió a los coloides como agregados de los cristaloides, incapaces de cristalizar, y con tendencia a variar en sus propiedades físicas. Estas tres condiciones eran erróneas para el caso de las proteínas, especialmente la que tiene que ver con su incapacidad de cristalización, ya que lo contrario había sido demostrado mucho antes del trabajo de Graham. La teoría coloidal tuvo muchos seguidores cuyo trabajo en el campo de las proteínas ayudó enormemente a su caracterización inicial, pero dio lugar también a un “lado oscuro”, una especie de renacimiento de la alquimia. Y es que si bien muchos químicos coloidales que estudiaron las proteínas no tuvieron ningún problema en admitir que éstas eran grandes moléculas, otros científicos como el citado Graham o el americano Arthur Noyes, apostaron fuertemente por las proteínas como agregados de pequeñas moléculas y propusieron, sin ningún sustento, que este estado de agregación era fundamental para el desarrollo de los procesos vitales. Estas ideas degeneraron en una serie de pseudoteorías (teoría coloidal del envenenamiento, de la locura, de la salud, etc.), muy al gusto de ciertos charlatanes científicos dispuestos a hacerse un hueco en los libros o en el bolsillo de los tontos, especialmente si están repletos de dinero. Como curiosidad cabe destacar que el citado Noyes, por una parte representante de la teoría coloidal y, por lo tanto, de una visión anticua56

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da de la Biología, fue por otra parte uno de los “cerebros” de la creación del Instituto Tecnológico de California, más conocido como Caltech, y uno de los principales valedores del programa de Biología de esa universidad, que se convirtió en uno de los pilares de la Biología Molecular americana. La teoría coloidal de las proteínas comenzó a ser incorporada a los libros de texto de principios del siglo XX y tuvo sus fervientes seguidores entre muy serios y distinguidos científicos, entre los que se encuentra el ya mencionado Emil Fischer, a pesar de que las evidencias a favor del gran tamaño de las proteínas se acumulaban ya en esa época. Curiosamente, muchas de estas evidencias provinieron de los estudios y las técnicas desarrolladas al abrigo de la naciente Química Física, disciplina que en un principio trató de la caracterización física de las moléculas inorgánicas y orgánicas, pero cuyas técnicas analíticas sirvieron para medir de manera más o menos precisa las masas moleculares de muchas proteínas, la mayoría de las cuales dieron cifras cercanas a 16.000 daltons. La curiosa coincidencia en esta cifra para la mayor parte de las proteínas medidas, muchas veces de manera incorrecta, no pasó inadvertida. En el caso del químico sueco Theodor Svedberg, a quien nos referiremos posteriormente, la coincidencia en la cifra le indujo a elaborar una curiosa teoría según la cual todas las proteínas poseen una masa molecular de 16.000 daltons o múltiplo de este número. La teoría duró lo que tardaron en medirse otras proteínas con masas moleculares muy diferentes. El campo estaba abonado para las nuevas ideas que surgirían de la mano del químico alemán Herman Staudinger (Premio Nobel de Química en 1953), quien en 1922 propuso la teoría macromolecular y el término macromolécula para describir a grandes moléculas cuyos átomos se mantienen unidos por enlaces fuertes. Esta teoría fue desarrollada para el caso de polímeros orgánicos, pero pronto muchos científicos la hicieron suya para justificar con ella el gran tamaño que repetidamente encontraban en las proteínas con las que trabajaban. Uno de los más duros golpes que recibió la teoría coloidal de las proteínas vino de uno de sus más firmes defensores, Theodor Svedberg, quien había realizado durante las dos primeras décadas del siglo XX un trabajo destacado sobre los coloides, fruto del cual obtuvo el Premio Nobel de Química en 1926. En el transcurso de sus investigaciones sobre los compuestos coloidales, Svedberg desarrolló la técnica llamada de ultracentrifugación, que permite someter al material en estudio a grandes fuerzas gravitacionales, y que puede ser usada, entre otras cosas, para calcular de una manera muy exacta la masa molecular de moléculas en solución. Svedberg utilizó la ultracentrífuga a partir de 1924 para intentar demostrar que las proteínas eran, de acuerdo a las teorías coloidales que él apoyaba, una solución heterogénea de moléculas. Las primeras medidas las realizó con la caseína de la leche, en realidad una mezcla de varias proteínas, y los resultados obtenidos no hicieron sino confirmar sus expectativas. La sorpresa vino cuando realizó los mismos experimentos con otras proteínas y pudo observar que éstas

Theodor SVEDBERG (1884-1971). Ilustración del artículo “The Progress of Science: The Nobel Prizes”. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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se comportaban como una población única de moléculas, con una masa molecular definida. En el caso de la hemoglobina, la sorpresa fue aún mayor, puesto que los experimentos de ultracentrifugación mostraron una masa molecular de 67.000 daltons, cuatro veces la medida hasta entonces, lo que sugería la unión de cuatro moléculas de hemoglobina mediante algún tipo de enlace secundario. Los resultados vinieron en el mejor momento para confirmar algunas de las ideas que estaban desarrollándose en aquellos tiempos.

La cristalización del virus del mosaico del tabaco El golpe de gracia a la teoría coloidal y uno de los hitos del enfoque físico-químico que se estaba aplicando al estudio de las moléculas biológicas vino por la cristalización del virus del mosaico del tabaco (TMV), realizada por Wendell Meredith Stanley en 1935. La existencia de los virus (del latín veneno) se hipotetizó desde del siglo XIX, cuando en 1898 se determinó que la enfermedad denominada como del mosaico del tabaco, que debe su nombre a los dibujos que la infección produce en las hojas de esta planta, estaba causada por una entidad distinta a los microorganismos conocidos hasta la fecha. Aunque su pertenencia al mundo de la Biología no era clara, sí que era aceptado por la comunidad científica, tal como lo sugirió Hermann Muller en 1920, que los virus podían ser genes o formas primitivas de genes, vista su capacidad para reproducirse. Al año siguiente, el mismo Muller utilizó rayos X como fuente de energía y pudo demostrar que los virus mutaban, confirmando así la naturaleza genética de estas estructuras biológicas. Desde el primer momento los virus fueron estudiados por una parte de la comunidad científica, bien por su simplicidad, bien porque de algunos de ellos se sabía que eran causantes de enfermedades, en algunos casos con importantes consecuencias económicas. Es interesante apuntar que el presidente Franklin Delano Roosevelt, él mismo poliomielítico, fue una figura fundamental para que los Estados Unidos dedicaran importantes fondos para el estudio de la poliomielitis y el desarrollo de vacunas. Uno de los problemas fundamentales para el estudio de los virus es que su crecimiento no podía desarrollarse in vitro, y había que realizarlo con sistemas naturales. Esta fue una de las razones por la que durante los primeros años de su estudio, los virus vegetales fueron los más usados debido a la facilidad con la que infectan las plantas y se puede seguir su acción a través del daño que producen sobre las hojas. Uno de los más utilizados fue el TMV, que usó Stanley en uno de los episodios más importantes de la naciente Biología Molecular y por el que le fue concedido el Premio Nobel de Química en 1946. Stanley era un químico orgánico especializado en la síntesis de compuestos bioorgánicos cuando fue contratado por el Instituto Rockefeller de Princeton para caracterizar compuestos biológicos. La atmósfera del Instituto era de carácter reduccionista y la mayor parte 58

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de los científicos tendían a tratar de caracterizar los problemas biológicos utilizando técnicas de carácter físico y químico. Un año antes de que Stanley llegara al Instituto, uno de sus investigadores, John Northrop, había conseguido cristalizar la pepsina, y Stanley se fijó como objetivo uno más ambicioso: la cristalización de un sistema capaz de autorreplicarse. En la época en que estos experimentos se estaban realizando, la naturaleza química de los virus era materia de especulación, y no se tenía una idea clara de que estuvieran constituidos por proteínas. El virus TMV ya se había tratado de purificar y cristalizar sin éxito anteriormente, pero el triunfo de Stanley vino de utilizar sus conocimientos químicos, para caracterizar primero ciertos parámetros (pH, temperatura, etc.) bajo los que el virus era infectivo o podía ser inactivado (cambios de pH, tratamiento con proteasas, etc.). Tras una caracterización físico-química previa y en muy pocos meses, Stanley consiguió en 1935 la cristalización del TMV. Además, pudo determinar que el material era proteico y que las sucesivas recristalizaciones del virus no afectaban a su poder infectivo. La cristalización del virus fue considerada como uno de los grandes hitos de la Biología Molecular y Stanley fue tratado por la prensa americana como un ídolo. La cristalización del TMV fue también la confirmación de que grandes estructuras biológicas, en este caso incluso con capacidad para replicarse, podían ser tratadas como lo habían sido los compuestos orgánicos, y estudiadas con las mismas técnicas y enfoques. Un aspecto negativo de la cristalización del TMV provino del reforzamiento del dogma proteico de la herencia, pues los resultados de Stanley mostraban claramente que el virus, que según sus análisis parecía estar compuesto únicamente por proteína, podía replicarse y ampliar su cantidad, criterios propios del material hereditario. No pasó mucho tiempo sin que el trabajo fuera criticado, pues los británicos Bawden y Pirie observaron que el TMV contenía un 6% de RNA y que cualquier tratamiento con RNAsa destruía la capacidad infectiva del virus, por lo que concluyeron que el TMV no era una proteína pura sino una nucleoproteína. Stanley reconoció que él también había detectado el RNA, pero no le dio importancia pues si el DNA no era considerado entonces como el material genético, mucho menos lo era el RNA. Hubo que esperar hasta 1956, cuando ya no había ninguna duda de que la herencia descansaba en los ácidos nucleicos, para que el grupo de Heinz Fraenkel-Conrat en la Universidad de Berkeley demostrara que el RNA del TMV era portador del material genético del virus. Los descubrimientos de Stanley y otros científicos de la Fundación Rockefeller pusieron en cualquier caso en evidencia la importancia de las técnicas físicas en el estudio de las sustancias biológicas, técnicas que fueron determinantes en la caracterización de las proteínas y en la abolición de la teoría coloidal y su sustitución por la teoría macromolecular. En el desarrollo de varias de esas técnicas físicas como son la ultracentrifugación, la cromatografía, la electroforesis, el uso de isótopos y la microscopía electrónica, tuvo mucho que ver el dinero y el apoyo de la Fundación Rockefeller. 59

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La Fundación y las técnicas La Fundación Rockefeller

John ROCKEFELLER (1839-1937). © Radial Press.

Esta parte de la historia comienza en los Estados Unidos a finales del siglo XIX, cuando una nueva raza de capitalistas se desarrolló al abrigo de la rápida industrialización que se produjo en aquel país. Armados de una moral protestante de respeto a Dios, al trabajo y al dinero (el orden no tiene por qué ser necesariamente éste), nombres como los Rockefeller, Ford, Vanderbilt y Carnegie prosperaron y forjaron en parte el país que hoy conocemos. Su modo de actuación fue parecido: una gran falta de escrúpulos en el trabajo pero unas ciertas preocupaciones religiosas y sociales, que transformaron en filantropía. Un caso paradigmático es el de John Rockefeller, un magnate del petróleo que hizo una inmensa fortuna al frente de su compañía, la Standard Oil, primero en los campos petrolíferos de Pennsilvania, y luego en los que fueron apareciendo en los Estados Unidos y en el resto del mundo. Su modo de actuación fue tan duro y sus planes tan ambiciosos que se ganó la animadversión de parte de los poderes políticos, que vieron en el formidable hombre de negocios un peligro para la libertad de mercado. De la mano de Theodore Roosevelt, el gobierno americano creó una legislación antimonopolio con el objeto primordial de parar los pies a la Standard Oil, tan poderosa que de su partición se crearon varias de las más grandes compañías que hoy conocemos, tales como Mobil, Chevron, Amoco, Conoco y Atlantic. Rockefeller tenía ciertas inquietudes sociales, animadas fundamentalmente por su mentor espiritual, el reverendo baptista Frederick Gates, quien empujaba al magnate petrolero a que a Dios le fuera más fácil concederle un puesto en el Cielo. El reverendo Gates era un firme convencido de la necesidad de educar y cuidar a los más desfavorecidos, pero en este último caso, la medicina debía ir acompañada de la investigación que tuviera como fin la eliminación de las enfermedades. Gates convenció a Rockefeller para que creara en 1901 el Instituto Rockefeller de Investigación Médica, embrión de lo que sería medio siglo más tarde la Universidad Rockefeller de Nueva York (John Rockefeller y Frederick ­Gates están también ligados al nacimiento, en 1890, de la Universidad de Chicago). Años después, en 1913, Rockefeller creó la fundación que lleva su nombre, que no fue la primera americana, pero sí la más grande, a enorme distancia de las demás, gracias al gran número de acciones de sus propias compañías que el magnate americano donó a la fundación. Las principales preocupaciones de la fundación tenían y tienen que ver con la salud, educación y alimentación de las capas más desfavorecidas, aunque durante los primeros años ofreció algunos lados oscuros tales como una cierta ideología que fomentaba la superioridad de los anglosajones sobre el resto de los hombres, y el apoyo de proyectos eugenésicos. Un cambio fundamental en la Fundación Rockefeller en el tema que nos ocupa tuvo que ver con la llegada a la dirección de la división de

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Ciencias Naturales del matemático americano Warren Weaver, interesado en el campo de la Biología y en aplicar a esta disciplina enfoques y técnicas físicas. El cambio en la filosofía de la fundación no tuvo que ver sólo con la llegada de Weaver sino que estuvo también motivado por los efectos de la Gran Depresión, causados según los ideólogos de la fundación, por el poco conocimiento que tiene el hombre de sí mismo y de las fuerzas que le rodean. La fundación, que hasta ese momento había financiado en gran medida proyectos relacionados con la Física, diseñó un programa que abarcaba entre otras cosas el estudio de la fisiología, las hormonas y la nutrición. La ideología que encerraban algunas de las propuestas de ese nuevo programa es bastante criticable: “¿Puede el hombre controlar de manera inteligente su propio poder? ¿Podemos desarrollar una genética con la que poder generar en el futuro hombres superiores? ¿Podemos obtener un conocimiento suficiente de la fisiología y psicobiología del sexo para que el hombre pueda llevar un control racional de este peligroso aspecto de la vida? (...) ¿Podemos resolver los misterios de las diversas vitaminas? (...) ¿Puede el hombre adquirir suficiente conocimiento de sus propios procesos vitales de tal manera que podamos esperar racionalizar el comportamiento humano?”.

En 1934, y después de que varios aspectos de este programa, fundamentalmente los dedicados a la psicobiología, fueran muy criticados, el programa se reorientó hacia un mayor esfuerzo en la biología fundamental y en la aplicación a esta disciplina de técnicas físicas y químicas. Weaver fue en 1938 la primera persona que dejó escrita una definición del término Biología Molecular, que dio nombre al programa lanzado por la fundación, y que supuso un gran impulso a las técnicas biofísicas que tanto ayudaron al establecimiento de esta disciplina: “Entre los estudios que la Fundación Rockefeller está apoyando se encuentra una disciplina relativamente nueva que podría llamarse BIOLOGÍA MOLECULAR, en la que están siendo usadas modernas y delicadas técnicas para investigar detalles cada vez más minúsculos de ciertos procesos vitales”.

La fundación inyectó también dinero en la ciencia europea mediante el apoyo, entre otras, a instituciones científicas de Gran Bretaña, Alemania, Bélgica, Francia y España, en este último caso en la Junta de Ampliación de Estudios, predecesora del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Sin embargo, su principal actuación se centró en los Estados Unidos, de tal manera que se puede afirmar sin caer en la exageración que la Fundación Rockefeller, junto con las consecuencias de la II Guerra Mundial, fueran los principales responsables de que el liderazgo de la naciente Biología Molecular pasara del Viejo al Nuevo Continente. Esto se consiguió mediante una fuerte inversión de dinero con el que se apoyó no sólo su propio instituto de investigación sino a un cierto número de universidades tales como la Universidad de Chicago, la de Wisconsin o la Caltech en el sur de California. Esta última universidad, en parte gra-

Uno de los edificios del Instituto Rockefeller de Investigación Médica (Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

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cias a la ayuda de la Fundación Rockefeller, llegaría en muy pocos años a ser la referencia mundial en el campo de la naciente Biología Molecular, al contar entre sus científicos a figuras como Morgan, Sturtevant, ­Dhobanszki, Pauling, Corey, Beadle, Delbrück, etc. Además, financió los proyectos de científicos tan importantes como Morgan, Pauling, Beadle, Delbrück, Levene, Mirsky, etc. y organizó un sistema de becas para que jóvenes investigadores americanos y europeos pudieran visitar laboratorios de ambos lados del Atlántico. Finalmente, contribuyó con fondos al desarrollo de varias de las técnicas que ahora describiremos, pero también a la compra de los nuevos equipos desarrollados, tales como espectrofotómetros, ultracentrífugas, difractómetros de rayos X, contadores Geiger, etc.

La cromatografía Probablemente la técnica que más ha influido en la Biología Molecular hasta el advenimiento de las modernas técnicas de ingeniería genética, es la cromatografía. Esta técnica de separación de moléculas se basa en la disolución de una muestra compleja en una fase móvil (que puede ser un líquido o un gas). La fase móvil se hace pasar por una fase inmóvil, una matriz que es inmiscible con la anterior, y en la que los componentes a separar tienen distinta movilidad. Según la matriz escogida, la separación se producirá de acuerdo a su carga, su hidrofobia, su tamaño o su capacidad de unirse en mayor o menor grado a grupos químicos particulares. El primer científico que hizo uso de esta técnica fue el botánico ruso Mikhail Tswett, quien en 1903 fue el primero en describir su uso y quien acuñó el término cromatografía (del griego cromos, “color”, y graphos, “escritura”) para explicar la forma en que eran separados por la técnica los pigmentos vegetales que él estaba purificando. A Tswett se le ocurrió pasar el extracto de las plantas en una columna que contenía polvo de tiza y observó cómo se separaban los colores de los diferentes pigmentos. La técnica comenzó a popularizarse a los pocos años, fundamentalmente a través de la escuela orgánica alemana, y sirvió al grupo de Richard Willstätter para purificar y caracterizar la clorofila y otros pigmentos de las plantas. Otros muchos científicos utilizaron esta técnica, que llegó a ser tan popular entre los químicos orgánicos que uno de los líderes de la escuela alemana de Química, Heinrich Wieland, se quejó amargamente de que las técnicas clásicas se estaban abandonando por la recién llegada cromatografía: “Hasta ahora habíamos gastado mucho esfuerzo en destilar, cristalizar y recristalizar. Ahora vienen estos nuevos científicos y simplemente añaden la solución a un pequeño tubo”. Archer J. P. MARTIN (1910-2002) en 1952. © Radial Press.

Sin embargo, la cromatografía tuvo su desarrollo fundamental a partir de los trabajos de los británicos Archer J. P. Martin y Richard L. M. Synge,

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quienes en 1941 y trabajando en Leeds para la Asociación de Industrias de la Lana, desarrollaron la cromatografía líquida de reparto. En sus primeros experimentos en 1940, Martin y Synge utilizaron gel de sílice que se usaba entonces como agente de secado en las balanzas, y lo empaquetaron en una columna. Disolvieron una serie de aminoácidos en cloroformo y los hicieron pasar por aquélla. Después añadieron un agente de tinción, el naranja de metilo, y observaron cómo en la columna aparecían distintas bandas de color. Durante los siguientes años trabajaron en las mezclas de disolventes y en los tipos de silicatos, con el fin de obtener mejores separaciones. Martin continuó durante toda su vida trabajando en el desarrollo de otros métodos cromatográficos y, en colaboración con los científicos Ralph Consden y Andrew H. Gordon, desarrolló la técnica de cromatografía en papel, en la que éste actúa de fase inmóvil. Además, los tres tuvieron la idea de hacer correr la muestra en el papel en dos dimensiones, cambiando en cada una de ellas la fase líquida con el fin de conseguir una mejor separación de los componentes. Esta es la técnica que, como veremos posteriormente, utilizó Frederick Sanger en el desciframiento de la secuencia de la insulina, y la que modificó Erwin Chargaff para estudiar la composición nucleotídica del DNA. Además, en 1950, Martin y su colaborador Anthony James desarrollaron la técnica de cromatografía de gases, que tanta importancia iba a tener en la industria y en la Biología Molecular. Tal es la importancia del desarrollo de las técnicas cromatográficas que a Martin y Synge les fue concedido el Premio Nobel de Química en 1952, tan sólo once años después de las primeras descripciones de la técnica. A lo largo del siglo XX, la cromatografía se ha desarrollado enormemente, y se han producido importantes avances tales como la introducción de presión en las columnas para una mejor separación, o el desarrollo de técnicas de afinidad o intercambio iónico. En este desarrollo, así como en el de varias de las técnicas que vamos a describir, ha tenido capital importancia la influencia de la industria, especialmente la americana, que ha reaccionado rápidamente a la apertura de un nuevo mercado. Quizás en ninguna otra disciplina científica como la Biología Molecular han ido tan de la mano el sector académico y el industrial, y este maridaje es más claro a partir de la revolución genética que tuvo lugar durante los años setenta.

La centrifugación Otra de las técnicas que han influido en gran medida en el desarrollo de la Biología Molecular es la centrifugación, bien sea analítica o preparativa, y el principal valedor de esta técnica fue el sueco Theodore Svedberg. Como ya hemos comentado, Svedberg era un científico experto en coloides y durante sus primeros años trabajó fundamentalmente en la caracterización del movimiento browniano, estudios por los que le fue otorgado el Premio Nobel de Química de 1926. Las circunstancias de la concesión

Theodor SVEDBERG (1884-1971). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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Ultracentrífuga SPINCO. Fuente: CDC (Center for Disease Control and Prevention), Atlanta, EE.UU.

y el hecho de que fuera él mismo miembro de la comisión que los otorgaba fueron un poco embarazosas y, a partir de ese momento, Svedberg decidió que se haría merecedor del premio a toda costa. El interés de Svedberg por la centrifugación le había venido de su estancia en la Universidad de Wisconsin, donde conoció a Warren Weaver, profesor entonces de la citada universidad, quien había contribuido a desarrollar los primeros algoritmos para caracterizar la sedimentación de las moléculas cuando están sujetas a grandes fuerzas gravitacionales producidas por enormes velocidades de rotación. A la vuelta a su cátedra de Química de la Universidad de Uppsala, y con dinero de la Fundación Rockefeller, Svedberg desarrolló una primera centrífuga que podía aplicar fuerzas gravitatorias de 7.000 veces la fuerza de la gravedad, y poco después, otra que llegaba a las 100.000 veces. También ideó un dispositivo óptico para la observación de la sedimentación de las proteínas durante la centrifugación. Durante varios años, la ultracentrífuga de la Universidad de Uppsala fue la única en el mundo y el laboratorio de Svedberg se convirtió en un centro de peregrinación para los convertidos a la nueva técnica física. Financiado con dinero de la Fundación Rockefeller, durante los años 1926 a 1937 Svedberg midió las masas moleculares de más de 30 proteínas y otras muestras biológicas como ácidos nucleicos, y confirmó además que sus masas moleculares eran tan grandes como otras técnicas químico-físicas habían adelantado, lo que dejaba bien clara la naturaleza macromolecular de las proteínas. Uno de los grandes hitos de la utilización de la ultracentrífuga fue la colaboración entre el científico sueco y Wendell Stanley para el cálculo de la masa molecular del virus TMV, que resultó ser enorme, de unos 17 millones de daltons. Este valor, único y reproducible, mostraba claramente que el tamaño del TMV era homogéneo. De los valores de sedimentación se puede extraer la forma de la molécula bajo estudio, y Svedberg concluyó que la estructura del TMV era muy alargada, lo que fue confirmado posteriormente mediante su observación en el recién desarrollado microscopio electrónico, cuya invención describiremos posteriormente. La Fundación Rockefeller fue fundamental para que los diseños de Svedberg se trasladaran a los Estados Unidos, y pronto se instaló la primera ultracentrífuga en el Instituto Rockefeller, para el uso de sus científicos, entre ellos Northrop y Stanley. Las centrifugas también comenzaron a utilizarse en su vertiente preparativa, y dependiendo de las fuerzas aplicadas, se usaron en la separación de orgánulos y macromoléculas. Pronto los americanos comenzaron a desarrollar sus propias centrífugas, dotándolas de vacío para evitar el sobrecalentamiento, y de motores eléctricos, más fiables y silenciosos. Estos desarrollos, fruto de la colaboración entre los profesores Jesse Beans y Edward Pickels de la Universidad de Virginia, dieron lugar a la compañía SPINCO, que durante muchos años fue sinónimo de centrífuga. Durante los primeros años cuarenta, SPINCO vendió más de 300 aparatos a centros americanos, lo que da una idea del empuje que a la nueva Biología se estaba dando al otro lado del Atlántico, en una época en que los euro-

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peos se mataban entre ellos, o posteriormente intentaban recuperar su maltrecho sistema científico. Es interesante destacar que el desarrollo de la centrifugación tuvo una importancia muy grande en los procesos de separación de los elementos radioactivos que llevaron al desarrollo de las primeras bombas atómicas. En este proyecto estuvo involucrado uno de los personajes señeros de la Biología Molecular, el físico británico Maurice Wilkins, del que hablaremos largo y tendido más tarde.

La electroforesis En el nacimiento de esta técnica, capital para el desarrollo de la Biología Molecular, está también la mano de Svedberg y de la entonces poderosa escuela sueca de Químico-Física. Svedberg había iniciado el proyecto de construir un aparato con el que se pudiesen separar compuestos utilizando su diferencia de carga eléctrica. La idea era sencilla pero su desarrollo práctico estaba lleno de problemas técnicos, y tras sus primeros fracasos, Svedberg cedió su desarrollo a uno de sus discípulos, Arne Tiselius. La electroforesis (de elektro “electricidad”, y phoros, “movimiento”) es una técnica de separación que se basa en el aprovechamiento de la diferente velocidad de migración de partículas cargadas al ser aplicado sobre ellas un campo eléctrico. Tiselius había desarrollado parcialmente la técnica durante su tesis doctoral, pero desanimado por los mismos problemas que había tenido Svedberg ‑la difusión de las partículas durante el movimiento inducido por el campo eléctrico y el excesivo calentamiento del aparato‑, había abandonado su desarrollo. Sin embargo, durante una estancia en Princeton y tras sus conversaciones con científicos del Instituto Rockefeller sobre la necesidad de mejores técnicas de separación de proteínas, Tiselius retomó su interés en el desarrollo de la electroforesis. De regreso a Suecia y después de varios años pudo solventar, en parte, los problemas citados anteriormente que limitaban la resolución o separación de las proteínas en bandas, y desarrolló aditamentos para que la electroforesis fuera también preparativa. Los primeros aparatos de electroforesis, denominados Tiselius en honor a su creador, eran aparatos enormes, caros y difíciles de usar. El principal problema era que las bandas eran detectadas, no por medios químicos como en la actualidad, sino por medios ópticos muy complejos. En 1939 había 14 aparatos en Estados Unidos, 5 de ellos en el Instituto Rockefeller, la mayor parte comprados con dinero de la fundación. En pocos años sin embargo, había ya varias compañías que comercializaban el aparato de tal manera que en los años cincuenta había ya varios cientos de unidades, y fueron muchos más cuando los métodos de detección de las bandas se hicieron más simples y eficaces. A lo largo de los siguientes años se desarrollaron sistemas sólidos más perfeccionados, y así, el gel de sílice fue desplazado por el ágar y éste por la acrilamida. Los resultados que se obtuvieron inmediatamente fueron espectaculares, como por

Arne TISELIUS (1902-1971). © U.S. National Library of Medicine.

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ejemplo la separación de las distintas proteínas del suero, lo que demostraba su homogeneidad. El mismo Tiselius, en colaboración con Anthony Kabat y Michael Heidelberger, pudo determinar que los anticuerpos se encontraban en la fracción γ de las globulinas, y consiguió purificarlas en 1937. Además, la electroforesis permitió observar a L. G. Longworth, del Instituto Rockefeller, que había diferencias de movilidad entre las mismas proteínas de personas sanas y enfermas, lo que supuso abrir una vía para el estudio molecular de las enfermedades, como trataremos más adelante. El desarrollo de la electroforesis fue tan importante para la Ciencia en general, que el comité Nobel decidió conceder a Tiselius el Premio Nobel de Química en 1948.

Los isótopos

Harold Clayton UREY (1893-1981). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Otra de las técnicas que más ha contribuido al desarrollo de la Biología Molecular es el uso de isótopos. Fue en 1931 cuando Harold Urey, del departamento de Química de la Universidad de Columbia, descubrió el deuterio (2H), un isótopo pesado del hidrógeno, y cuatro años más tarde Rudolph Schoenheimer y David Rittenberg, de la misma universidad, ya realizaron los primeros ensayos con material biológico en el estudio de intermediarios del metabolismo. La Fundación Rockefeller vio la potencialidad de la técnica y concedió dinero para el desarrollo de isótopos con vistas al estudio de material biológico. Urey descubrió muy pronto el 15 N, un isótopo pesado del nitrógeno que era muy adecuado para marcar proteínas. Sin embargo, y a diferencia del tritio (3H), otro isótopo descubierto en aquella época que podía ser detectado por medidores de radioactividad como el contador Geiger, para la detección del 15N era necesario un espectrómetro de masas, lo que encarecía en demasía su uso. El hecho de que la mayor parte de los isótopos que se pudieron generar en aquella época correspondían precisamente a isótopos no radioactivos hizo que, aunque no se dudase del potencial del marcaje isotópico, sólo algunos laboratorios pudieran permitirse su uso. Además, los isótopos radioactivos que se produjeron al principio eran de una vida media muy corta y, por lo tanto, no eran fácilmente utilizables en aquella época en que los transportes eran muy lentos. La producción de isótopos radioactivos continuó desarrollándose, tal es el caso del 32P, sintetizado por primera vez por George Hevesy, y el de carbono 14C, sintetizado en 1940 por Martin Kamen y Samuel Ruben en el ciclotrón de Berkeley, construido en parte con dinero de la Fundación Rockefeller, lo que hizo mucho más fácil el uso de isótopos por parte de la comunidad científica. Sin embargo, el principal problema para la distribución de isótopos radioactivos era que su síntesis era monopolio del estado americano, el cual no permitió su comercialización hasta los años posteriores a la II Guerra Mundial, cediendo a las presiones de las autoridades científicas, conscientes de la potencialidad de su uso. Los primeros experimentos con isótopos, algunos de ellos cruciales para la Biología

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Molecular, no tardarían en llevarse a cabo, y los trataremos en páginas posteriores. También la Fundación Nobel apreció la importancia de los desarrollos sobre isótopos y concedió los premios Nobel de Química a Urey y Hevesy en 1934 y 1943, respectivamente.

La microscopía electrónica Esta técnica es una de las grandes aportaciones de la Física a la Ciencia en general y a la Biología en particular. Su desarrollo tuvo lugar, como quizás no podría haber sido de otro modo, en Alemania, cuna y valedora principal de la revolución que en el campo de la Física se produjo a principios del siglo XX. El microscopio electrónico se basa, de manera general, en los mismos principios que gobiernan un microscopio óptico excepto que en vez de fotones se usan electrones, y que las lentes no están hechas de vidrio pulido sino de solenoides que generan campos electromagnéticos, y que permiten en los microscopios modernos discernir detalles con una resolución de 0,1 nm. La capacidad de resolución del primer microscopio electrónico, diseñado en 1931 por los físicos alemanes Max Knoll y Ernst Ruska, era sin embargo mucho menor (cerca de 2 nm), aunque suficiente para visualizar un gran número de muestras biológicas. La potencialidad de la técnica se hizo evidente en seguida, de tal manera que a los pocos años la compañía Siemens en Alemania y la RCA en los Estados Unidos empezaron a comercializar los primero aparatos. Fue en Alemania donde el propio Ruska obtuvo las primeras imágenes de muestras biológicas, entre ellas la de virus, y pronto éstos fueron utilizados por microscopistas a ambos lados del Atlántico para estudiar su estructura y ciclo vital. El mismo Wendell Stanley utilizó el microscopio electrónico para confirmar la estructura del TMV. Un empuje formidable al uso del microscopio electrónico vino de la mano de los científicos de Cambridge Sydney Brenner, Richard Horne y Hugh Huxley, quienes desarrollaron a finales de los años cincuenta la técnica de tinción negativa, de fácil uso y que permitió aumentar la resolución de las estructuras biológicas. Con este y otros adelantos, la microscopía electrónica se convirtió en parte del armamento de la Biología Molecular, como veremos en otras páginas de este recuento, y mereció la concesión del Premio Nobel de Física a Ernst Ruska en 1986, más de 50 años después de la primera descripción de la técnica.

La Física en la Biología Molecular

Ernst RUSKA (1906-1988) trabajando con el primer microscopio electrónico en 1948. © Radial Press / HO.

Fotografía del virus del mosaico del tabaco (TMV) obtenida por microscopía electrónica. El TMV es uno de los sistemas biológicos que más importancia ha tenido en el desarrollo de la Biología Molecular. La barra representa 100 nm de longitud. Fotografía cedida por Rocío Arranz (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid).

La edad de oro de la Física Nuestra idea sobre la Vida es que está compuesta de moléculas que interaccionan entre sí y cuyo último fin es su perpetuación frente a un am67

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Wilhelm Conrad RÖNTGEN (1845‑1923). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Exterior del laboratorio de Röntgen en la Universidad de Wutzburg. © U.S. National Library of Medicine.

Radiografías de las manos del rey George y la reina Mary de Inglaterra en 1896. © Science Museum Library / S&S Picture Library.

biente completamente adverso. La función de estas moléculas biológicas, fundamentalmente proteínas, está íntimamente ligada a la forma que adquieren en el espacio. La adquisición de esa estructura está, a su vez, asociada a la existencia de una serie de fuerzas débiles, desconocidas hasta las postrimerías del siglo XIX. La existencia de esas fuerzas y otros conceptos que van a ser tan importantes en el nacimiento de la Biología Molecular, penetran en el campo biológico a través de los químicos interesados en la Biología, pero casi todos forman parte, total o parcialmente, de la revolución que tuvo lugar en la Física en las postrimerías del siglo XIX. En aquel tiempo, la Física era una disciplina bastante satisfecha de sí misma que había sido dividida por sus protagonistas en dos grandes cuerpos, los correspondientes a la materia y a la radiación. La materia se suponía que estaba formada por átomos, que eran pequeños objetos que se unían de alguna manera entre sí para formar moléculas. Por otra parte, la radiación electromagnética había sido descrita por el escocés James Clerk Maxwell, la figura central de la Física del siglo XIX, como una forma de vibración. La inmutabilidad de esas ideas iba a saltar por los aires cuando en 1895, y de manera completamente accidental, el físico alemán Wilhelm Röntgen, realizó un descubrimiento sorprendente en su laboratorio de la Universidad de Wurzburgo. Röntgen investigaba sobre los rayos catódicos que se producen cuando dos placas metálicas se someten a una corriente eléctrica en un recipiente con un cierto vacío. En estas condiciones, una de las placas actúa como cátodo y la otra como ánodo, y se produce una transferencia de partículas, que fueron identificadas en 1897 como electrones por el científico británico Joseph John Thompson. Röntgen estudiaba los rayos catódicos cuando, por casualidad, se apercibió de que cuando éstos incidían sobre cierto tipo de materiales, se producía un nuevo tipo de radiación que él denominó rayos X por su naturaleza desconocida. Esta nueva forma de radiación era capaz de atravesar casi todo tipo de sustancias, de tal manera que podía velar placas fotográficas que no estaban en principio a su alcance (de hecho, así fue como se dio cuenta de la existencia de esta nueva radiación). Se tardó muy poco tiempo, mucho menos que en comprender la naturaleza de esta radiación, en aprovechar las extrañas propiedades de los rayos X para la diagnosis médica, e incluso en espectáculos circenses, con desagradables consecuencias en algunos casos. Al descubrimiento de los rayos X, por el que Röntgen recibió el Premio Nobel en Física en 1901, siguió el de la radioactividad en 1896 por el físico francés Henri Becquerel, quien fue el primero en darse cuenta de que el elemento uranio emitía espontáneamente una forma de radiación. Durante los siguientes años, otros físicos como el matrimonio formado por Marie y Pierre Curie descubrieron y aislaron otros elementos radioactivos, entre ellos el radio, que dio nombre a este fenómeno, y por ello recibieron, junto con Becquerel, el Premio Nobel de Física en 1903 (Marie Curie, en realidad Marya Sklodowska, lo volvería a recibir, esta vez el de Química, en 1911). La radiación emitida por estos elementos fue clasifi-

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cada por el físico británico-neozelandés Ernest Rutherford como radiación α, β y γ, de acuerdo a su poder de penetración. Todas estas manifestaciones de la materia requerían una explicación, y la Física clásica se mostró incapaz de darla. Para ello se necesitaba una nueva formulación, y a ello se aplicaron un grupo de científicos de los dos lados del Atlántico, en lo que ha sido denominada por algunos como la edad dorada de la Física. Mientras que los rayos α fueron rápidamente identificados como partículas rápidas equivalentes a un átomo de helio que había perdido dos electrones, y los rayos β (o rayos catódicos) como electrones moviéndose rápidamente, los rayos γ y X resistían toda explicación, y mientras unos físicos pensaron que eran partículas como los electrones, otros los trataron de explicar como una forma de radiación pura. Fue Albert Einstein quien primero propuso, y Robert Millikan quien posteriormente verificó, la dualidad onda / partícula para explicar algunos fenómenos observados, tales como el efecto fotoeléctrico. En el primero de los dos artículos cruciales que publicó en 1905, y que le valdría el Premio Nobel de Física en 1921, Einstein examinó la teoría desarrollada por el físico alemán Max Planck por la que consiguió el Premio Nobel de Física en 1918, de acuerdo a la cual la energía electromagnética era emitida por objetos radiantes en cantidades discretas o cuantos de energía. Einstein utilizó la hipótesis cuántica de Planck para describir la radiación electromagnética visible o luz. De acuerdo con Einstein, la luz puede ser imaginada consistiendo en paquetes discretos de radiación. Einstein usó esta interpretación para explicar el efecto fotoeléctrico por el que ciertos metales emiten electrones cuando son iluminados por luz de una cierta frecuencia. La teoría de Einstein y su posterior elaboración formó parte de lo que ahora se conoce como mecánica cuántica, debida entre otros a físicos como el austriaco Erwin Schrödinger, de quien hemos ya hablado.

Marie CURIE (1867-1934) y Pierre Curie (1859-1906). Reproducción de un sello francés. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Albert EINSTEIN (1879-1940). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

La difracción de rayos X Sin embargo, mientras parecía cada día más claro que las propiedades de la luz podían ser explicadas si se asumía que ésta se comportaba como partícula y onda a la vez, los rayos X tendían a considerarse como ondas de energía, sin atender a que su naturaleza física, así como la de los rayos gamma, es la misma que la de la luz: ondas electromagnéticas cuya partícula asociada es el fotón, que a diferencia del electrón no posee masa. Hubo que esperar hasta el año 1920 para que el físico americano Arthur Holly Compton (Premio Nobel en Física en 1927) determinara sin lugar a dudas que los rayos X eran también partículas, mientras que fue el aristócrata y físico francés Louis de Broglie (Premio Nobel de Física en 1929), quien en su tesis doctoral presentada en 1923 demostró que la radiación poseía naturaleza de materia. La dualidad onda / partícula estaba completamente establecida.

Max PLANCK (1858-1947). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Max VON LAUE (1879-1960). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

William Henry BRAGG (1862-1942) con un espectrofotómetro en 1910. © Science Museum Pictorial / S&S Picture Library.

Sin embargo, la idea inicial de que los rayos X eran ondas fue la que dio lugar a uno de los episodios claves para la Biología Molecular. Fue al físico alemán Max von Laue (Premio Nobel de Física en 1914) a quien se le ocurrió que si los rayos X eran ondas de alta energía y de pequeña longitud de onda, podían ser difractadas si interaccionaban con átomos que se encontraban entre sí a distancias parecidas a la longitud de onda de la radiación. De acuerdo al físico alemán, cuando se hace incidir sobre un cristal un haz de rayos X que posee una longitud de onda parecida a la distancia entre los átomos que forman esa estructura cristalina, la mayor parte de los rayos X pasan por el cristal sin incidir en la materia. Sin embargo, aquellos que lo hacen, bien se anulan al chocar entre ellos, o bien se refuerzan entre sí, y cuando esa información es recogida en una placa fotográfica, aparece en forma de puntos llamados reflexiones, al conjunto de las cuales se denomina patrón de difracción o difractograma. Esta idea de von Laue fue demostrada experimentalmente en 1912 por Walter Friedrich y Paul Knipping, dos alumnos de Arnold Sommerfeld, de la Universidad de Munich. Friedrich y Knipping consiguieron hacer difractar rayos X a través de un cristal de sulfuro de zinc y registrar el patrón de difracción o difractograma en una película fotográfica. En él se podía observar que los haces de rayos X se reforzaban en ciertos puntos y en otros se anulaban, tal como von Laue había predicho. Sin embargo, mientras en un principio la escuela germana de Física se aplicó en utilizar el fenómeno de difracción de los rayos X para estudiar la propia naturaleza de éstos, en Inglaterra, más concretamente en la Universidad de Leeds, William Bragg y su hijo Lawrence Bragg, advirtieron lo interesante que podía ser utilizar el fenómeno inverso: que la difracción producida por los rayos X sobre moléculas orgánicas cristalizadas podía ser utilizada para calcular las distancias entre los átomos de esas moléculas y, por lo tanto, determinar su estructura en el espacio, es decir su estructura tridimensional. Fue Lawrence Bragg quien desarrolló la regla por la que se puede determinar en qué lugar del diagrama de difracción deben aparecer los puntos de difracción cuando una red cristalina de distancias interatómicas conocidas es “iluminada” con rayos X de longitud de onda también conocida, lo que se denominó posteriormente como ley de Bragg. La difracción de rayos X, gracias a la utilización de esta regla, permitió en poco tiempo la elucidación de las primeras estructuras inorgánicas como las estructuras cristalinas de NaCl, CaCl2 y CaBr2. Los dos Bragg recibieron el Premio Nobel de Física en 1915, cuando el hijo tenía veinticinco años y se encontraba luchando en el frente de Francia. Los físicos habían, pues, iniciado el desarrollo de una de las técnicas fundamentales en el devenir de la Biología Molecular, la difracción de rayos X, y los dos Bragg, especialmente el hijo, pueden considerarse los padres de la rama de la Biología Estructural, no sólo por esta contribución sino también por el padrinazgo que ejercieron sobre varias generaciones de científicos británicos, como veremos posteriormente.

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La Física en la Biología Molecular

Linus Pauling La comprensión de la naturaleza de los elementos gracias al desarrollo de la llamada Química Cuántica ayudó a entender su reactividad química y, por lo tanto, a profundizar en la naturaleza de las fuerzas que hacen que los átomos interaccionen para formar moléculas y compuestos cada vez más complejos, como los que se encuentran en los seres vivos. La unión de los conceptos de Física y Química, y su aplicación a las moléculas fue la obra fundamental de uno de los gigantes de la Ciencia del siglo XX, el químico americano Linus Pauling. Pauling estudió en la Universidad de Oregón y posteriormente se trasladó a Caltech, donde realizó su tesis doctoral. Durante los años 1925 y 1926 viajó por Europa, y allí estableció contactos con varias de las grandes figuras de la nueva Física que se encontraba en ebullición desde principios de siglo. Pauling visitó, entre otros, los laboratorios de Arnold Sommerfeld en Munich, de Niels Böhr en Copenhagen, de Schrödinger en Zurich y de William Bragg en Leeds. Armado con un bagaje único en Física y en Química, Pauling comenzó a utilizar un enfoque semiempírico para tratar de explicar la naturaleza de los enlaces químicos, y es que el científico americano era un maestro para describir en términos sencillos los conceptos más abstrusos. Mención especial merece en ese sentido la publicación en 1939 de su libro La naturaleza del enlace químico, obra que tuvo una enorme influencia en la percepción que a partir de entonces se tuvo de las fuerzas que gobiernan las moléculas. Pauling introdujo y popularizó a través de su obra conceptos como el de resonancia, hibridación y enlaces débiles mediante la incorporación al cuerpo químico de los enlaces por puente de hidrógeno y de van der Waals. El concepto de enlace covalente había sido desarrollado de una manera empírica por el químico americano Gilbert Lewis, y fundamentado matemáticamente por los físicos alemanes Walter Heitler y Fritz London, y con él se intentaba describir las fuerzas de atracción que se derivaban de la compartición de electrones por parte de dos átomos. Pauling popularizó también el concepto de enlace covalente en el contexto de las moléculas biológicas, más concretamente en las proteínas:

Linus PAULING (1901-1994). © Radial Press.

“El enlace covalente consiste en un par de electrones compartidos entre dos átomos, y que ocupan dos orbitales estables, uno por cada átomo”.

Puede que esta definición parezca trivial ahora, pero en su momento fue revolucionaria pues trataba de explicar fenómenos de naturaleza química con conceptos físicos modernos. Pauling también extendió la idea de resonancia para explicar la existencia en una molécula de dos posibles estados de igual energía pero diferente configuración, y fue utilizada por él para explicar entre otras cosas la naturaleza del enlace peptídico, descrito anteriormente por Hofmeister y Fischer a principios de siglo, y que según Pauling resuena entre dos conformaciones. Para demostrar esta hipótesis, Pauling decidió penetrar en el campo de la difracción de rayos X y, a lo

Gilbert Newton LEWIS (1875‑1946). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

largo de este proceso, terminó enfrentándose a la naciente y poderosa escuela estructuralista británica, a la que batió en su propio campo (y no cabe duda de que Pauling, como buen americano, amaba la competición y los desafíos). Así, Pauling hizo en 1922 la primera determinación de una molécula inorgánica compleja, la molibdenita, y desarrolló de manera paralela a Lawrence Bragg y publicó primero, para disgusto del inglés, las primeras reglas sobre la interpretación de los difractogramas de rayos X. No sería la última vez que Pauling se adelantaría a Bragg. Con el éxito de la determinación de moléculas simples, los dos laboratorios se lanzaron a una empresa más ambiciosa, la determinación de estructuras biológicas, y lo más evidente era intentarlo con proteínas que se sabía estaban formadas por estructuras repetitivas, como son los componentes de las fibras. Pero esto es otra historia que contaremos más tarde.

Las fuerzas y los enlaces débiles

Svante ARRHENIUS (1859-1927). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Hoy sabemos que cada proteína posee una secuencia de aminoácidos única, y que esa secuencia se dispone en el espacio tridimensional de una manera también única, de tal forma que la estructura espacial que adquiere y la función para la que ha sido creada están íntimamente relacionadas. Sin embargo esta idea, que todo estudiante de Biología en la actualidad acepta como un dogma, tardó en ser incorporada al conocimiento. Y es que a principios del siglo XX, aunque se sabía que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos y que la interacción entre éstos se produce mediante un enlace que se denominó peptídico y que sólo más tarde sería descrito en términos físicos como enlace covalente, se desconocía si cada tipo de proteínas tenía una secuencia única de aminoácidos. Tampoco se sabía si las proteínas tenían una forma específica, y los conocimientos sobre el enlace entre aminoácidos no invitaban en un principio a pensar que éstos pudieran disponerse y estabilizarse en el espacio tridimensional, en lo que Pauling denominaría estructura terciaria. Los esfuerzos de caracterización de las proteínas vinieron de la mano de descubrimientos que trascienden a la Biología y que tienen que ver con desarrollos de conceptos y técnicas en la Física y la Química, entre ellos las fuerzas y enlaces que hoy llamamos secundarios, que son fundamentales para comprender la estructura y función de las moléculas biológicas. Una de las ideas básicas que manejamos cuando hablamos de las proteínas es que son moléculas cargadas. Las primeras ideas sobre la posibilidad de que las proteínas fueran moléculas con carga aparecieron después de que en 1887 el químico sueco Svante Arrhenius (Premio Nobel de Química en 1903) publicara su teoría de la disociación electrolítica. La demostración de que las proteínas eran moléculas con carga vino de la mano del químico británico William Hardy, quien observó en 1899 que las proteínas podían moverse en campos eléctricos y que la dirección de

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este movimiento dependía del grado de acidez de la solución. Estos experimentos fueron los que posteriormente darían lugar al desarrollo de la electroforesis. Las proteínas fueron consideradas, por lo tanto, como moléculas cargadas, pero esa carga era considerada como una carga neta, que correspondía a toda la proteína. Esta idea comenzó a ser socavada cuando otros químicos como los alemanes George Bredig y Karl Winkelblech, trabajando con moléculas orgánicas, y entre ellas con aminoácidos, observaron que estas moléculas podían tener carga positiva y negativa a la vez en distintas partes de su estructura, y por lo tanto comportarse como dipolos, o como zwitteriones (“iones dobles”), tal como los denominó el químico alemán Franz Küster. Si los aminoácidos podían ser moléculas dipolares parecía razonable que las proteínas lo fueran también. Sin embargo, sólo en 1923 y gracias a la labor del químico danés Niels Bjerrum, pudo la comunidad científica convencerse de que las proteínas podían tener cargas de distinto signo a lo largo de su secuencia, y además comportarse como ácidos o bases dependiendo del grado de acidez de la disolución. La escala de pH, que es la medida de la concentración de ión hidronio (H3O+) en la disolución, fue ideada por el químico danés Soren Sörensen, él mismo uno de los primeros en medir la carga de las proteínas a distintos valores de pH y confirmar que las proteínas son, en realidad, anfotéricas, es decir, pueden actuar como ácidos y bases. Sörensen pronto se adhirió a la idea de que las proteínas poseían cargas de distinto signo a lo largo de su secuencia, idea que se contagió a la mayor parte de la comunidad científica. Otros resultados obtenidos aproximadamente en la misma época vinieron a mostrar que, aunque todos los aminoácidos poseen la naturaleza “zwitteriónica”, en las proteínas la mayor parte de las cargas negativas provienen de los grupos carboxilo de los aminoácidos aspártico y glutámico, mientras que la mayor parte de las cargas positivas provienen de los grupos amino de los aminoácidos arginina y lisina. Los estudios descritos mostraban, pues, que las proteínas poseen multitud de cargas. Sin embargo, si bien parecía evidente que algunas de estas cargas pudieran estar involucradas en los procesos químicos en los que las proteínas intervenían, poco se sabía sobre su papel en la forma de las proteínas. A decir verdad, y al contrario de lo que ocurre en la actualidad, a principios de siglo XX la forma de las proteínas no era un problema que preocupase a la comunidad científica, aunque la creencia general era que aquéllas poseían una estructura esférica. Esta creencia, carente de ninguna evidencia experimental, provenía del campo coloidal que asumía que todos los coloides tenían una forma esférica, y fue utilizada por el teórico australiano William Sutherland a finales del siglo XIX para, mediante el uso del coeficiente de difusión de la albúmina, calcular para ésta una masa molecular de 33.000 daltons, que era la que se aceptaba entonces. Este resultado no hizo sino reforzar la creencia de que las proteínas eran esféricas, y los primeros resultados experimentales directos también

George BREDIG (1868-1944). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Soren P. L. SÖRENSEN (1868‑1939). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

apuntaron en esa dirección. Así, en 1912, la química y nutricionista británica Harriette Chick utilizó técnicas de medidas de viscosidad en capilares, una técnica químico-física muy en boga, para medir no sólo la masa de ciertas proteínas sino su forma, que determinó como esférica. También las medidas obtenidas de la técnica de ultracentrifugación desarrollada por Svedberg apuntaron en la misma dirección. Todos estos resultados apuntalaron la noción de la globularidad de las proteínas, y comenzaron a denominarse proteínas globulares a partir de 1934. La idea de las proteínas como estructuras globulares repletas de cargas de distinto signo en su superficie comenzaba, por lo tanto, a introducirse entre los científicos, y con ella las consideraciones acerca de las fuerzas que empujan a las proteínas ‑en principio una sucesión lineal de aminoácidos‑, a compactarse y adquirir esa estructura globular. Bien es cierto que no todas las proteínas parecían comportarse de esa manera, y es que algunas como la queratina y el colágeno, aunque claramente compuestas de los mismos aminoácidos que formaban parte de las proteínas globulares, no poseían las mismas propiedades de solubilidad, y cuando eran analizadas al microscopio electrónico se observaban largas fibras. La caracterización estructural de estas proteínas, denominadas por esta razón proteínas fibrosas, iba a requerir el uso de la difracción de rayos X, como veremos posteriormente. Hablábamos de las fuerzas que producen la compactación de las proteínas, cuyo estudio ha dado lugar a uno de los campos más antiguos y dinámicos de la Biología Molecular y la Biofísica, el del plegamiento de proteínas. Que las proteínas podían desnaturalizarse se conocía desde tiempos inmemoriales, pues como ya hemos visto es precisamente esta propiedad la que las dio a conocer como tales y fue utilizada por el hombre para su propio beneficio. Desde que las proteínas fueron estudiadas de manera sistemática, se pensaba que el fenómeno de la desnaturalización, observado fundamentalmente por una pérdida de solubilidad, era irreversible. Esta apreciación cambió a mediados de los años veinte, cuando los investigadores americanos Mortimer Anson y Alfred Mirsky, trabajando entonces en la Universidad de Cambridge, consiguieron desnaturalizar la proteína hemoglobina y volver a renaturalizarla. A estos estudios siguieron otros parecidos con las proteínas tripsina y la albúmina de suero, que mostraron que este proceso de desnaturalización reversible podía ser universal. Este descubrimiento hizo cambiar la idea que se tenía de las proteínas y claramente sugirió que la función que perdían debido a la desnaturalización y volvían a ganar después de la renaturalización tenía que ver con la recuperación de las propiedades y de la estructura que las proteínas poseían. Los trabajos de Mirsky motivaron la curiosidad de Pauling, quien en un principio no estaba interesado en las moléculas biológicas, y llegó a ellas por una mezcla de curiosidad intelectual y de necesidad permanente (en esto no cambian los tiempos) de buscar financiación para sus investigaciones. En aquel tiempo la Fundación Rockefeller, como ya hemos comentado, invertía mucho dinero en la investigación biológica, y 74

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La Física en la Biología Molecular

Pauling, interesado por los estudios de desnaturalización de proteínas de Anson y Mirsky, y ya entonces uno de los químicos más famosos del mundo, se puso en contacto con este último para que realizase una estancia en su laboratorio de Caltech. Fruto de esta colaboración surgió un trabajo que influyó notablemente en la noción que a partir de entonces se tuvo de las proteínas. Pauling y Mirsky continuaron los estudios de desnaturalización de las proteínas y llegaron a la conclusión de que la desnaturalización no lleva consigo la rotura de los enlaces fuertes que mantienen unidos los aminoácidos, ni la separación de las moléculas en el estado coloidal (estamos todavía en 1935 y esta teoría todavía mantenía fuertes reductos en la comunidad científica), sino a la pérdida de los enlaces de naturaleza débil que estabilizan su estructura tridimensional. Eran pues los enlaces débiles, de acuerdo a este trabajo seminal de Pauling y Mirsky, quienes dan la forma y la estabilidad a las proteínas. “Hacia 1935 sentí que poseía un entendimiento bastante completo de la naturaleza del enlace químico”, confesó Pauling sin falsa modestia años después, y muy pronto dirigió su atención a moléculas biológicas complejas como la hemoglobina. Los estudios de Pauling sirvieron para caracterizar los dos estados de la proteína, es decir, en ausencia y en presencia del oxígeno que debe transportar. Estos trabajos atrajeron la atención de biólogos como el austriaco Karl Landsteiner (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1930), quien trabajaba entonces en la Fundación Rockefeller. Landsteiner, descubridor entre otras muchas cosas de los grupos sanguíneos y del factor Rh, se dio cuenta de que al inyectar en animales moléculas con pequeñas modificaciones respecto a otras anteriormente introducidas, aquéllos podían reconocer estas nuevas moléculas como distintas y reaccionar produciendo anticuerpos distintos. Landsteiner se apercibió de que esa especificidad tan sutil sólo podía explicarse como un reconocimiento específico entre antígeno y anticuerpo de carácter estereoespecífico, y en una interacción entre las moléculas de carácter más débil que la conocida hasta la fecha. El concepto de especificidad ya había sido introducido por Emil Fischer en sus estudios sobre enzimas y azúcares, pero Pauling, en colaboración con Landsteiner, dotó a ese concepto de un sentido más estructural y preciso. Animado por Landsteiner a aplicar los nuevos conceptos de enlace al fenómeno de especificidad, Pauling estudió la interacción entre anticuerpo y antígeno y demostró que la unión precisa entre las dos moléculas se producía no por medios químicos, sino por la forma de las moléculas. Asimismo descubrió que el anticuerpo se ajustaba al antígeno como un guante lo hace con una mano (y de hecho él utilizó exactamente esa figura), con estructuras complementarias que se unen mediante enlaces de hidrógeno y de van der Waals. Pauling sugirió que este tipo de ajuste se producía a nivel molecular entre otros tipos de moléculas tales como enzimas y sustratos (véase figura 5), las sustancias productoras de olores y receptores olfativos, e incluso que los genes estarían compuestos de moléculas complementarias.

Karl LANDSTEINER (1868-1943), ganador del Premio Nobel en 1930, conversando con el príncipe Carl de Suecia. © Radial Press.

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Figura 6. Esquema de un enlace por puente de hidrogeno entre dos moléculas de agua (arriba) y entre dos enlaces peptídicos (abajo).

John Desmond BERNAL (1901‑1971). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Es interesante hacer notar que a una conclusión parecida había llegado de manera independiente el científico chino Hsien Wu, con el mérito añadido de realizar su carrera científica en la China de entreguerras. Wu también hipotetizó que las proteínas nativas se pliegan en una conformación compacta de máxima estabilidad, que se alcanza mediante fuerzas de naturaleza no covalente como las polares y las iónicas. En realidad, el trabajo de Pauling y Mirsky era mucho más profundo que el del científico chino, pues los dos científicos tuvieron en cuenta la existencia de un tipo de enlaces recientemente descritos, los llamados de puente de hidrógeno. El concepto de puente de hidrógeno fue propuesto por primera vez en 1920 por los químicos norteamericanos Wendell Latimer y Worth Rodebush para definir la atracción de carácter débil que se establece entre el átomo de hidrógeno y ciertos átomos electronegativos como son el oxígeno, el nitrógeno y el flúor (aunque este último no se encuentre en condiciones normales en las moléculas biológicas). El enlace por puente de hidrógeno se puede producir no sólo entre moléculas distintas sino también entre átomos de una misma molécula, y esto es muy importante para la estructura de las moléculas biológicas, ya que produce la estabilización de una cierta conformación en el espacio tridimensional (Figura 6). La noción de enlace por puente de hidrógeno fue posteriormente utilizada por el químico británico John Desmond Bernal para explicar las extraordinarias propiedades del agua. Bernal, hijo de una familia de judíos irlandeses de origen sefardí, es uno de los científicos más influyentes en el campo biológico en la primera mitad del siglo XX. Hombre de una cultura enciclopédica, era conocido entre sus pares como “el sabio” (consciente de ello, un periodista que le mandó un cuestionario para una entrevista, entre otras cosas le preguntó qué era lo que no sabía. Bernal contestó que era ignorante acerca de las iglesias rumanas del siglo VI y VII. A los pocos días escribió al periodista pidiendo que corrigiera la respuesta y lo dejara en las iglesias del siglo VII). Bernal era conocido también por su curiosidad insaciable hacia todo ... y en especial hacia las mujeres. A pesar de no ser especialmente atractivo, era un mujeriego irresistible y tal era su fama que la mujer de un colaborador suyo, Isidoro Fanckuchen, y su propia secretaria constituyeron en broma un club que se llamó “el club de las mujeres que no se han acostado con Bernal”, en el que la primera ejercía de presidenta y la segunda de tesorera. A las pocas semanas, la mujer de Fanckuchen recibió una carta de la secretaria diciéndole que a partir de ese momento dejaba en manos de la primera los cargos de presidenta y tesorera. En relación con la Ciencia, Bernal trabajó sobre una cantidad enorme de temas a lo largo de su vida científica, y sobre alguno de ellos volveremos en páginas posteriores. En el caso que nos ocupa, la explicación que Bernal propuso para los enlaces interatómicos que se producían entre las moléculas de agua surgió al parecer de una conversación con el físico Ralph Fowler sobre la naturaleza del agua que forma la niebla, cuando ésta retrasó la salida de los dos científicos del aeropuerto de Moscú, ciu-

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dad a la que habían llegado para asistir a un congreso. Bernal y Fowler, de acuerdo con estudios teóricos y prácticos, sugirieron que cada átomo de hidrógeno es compartido por dos átomos de oxígeno (o lo contrario, que cada oxígeno es compartido por dos átomos de hidrógeno), en una forma de enlace polar en la que el átomo de hidrógeno posee una polaridad más positiva y el de oxígeno más negativa. Estas características inusuales son las que proporcionan a las moléculas de agua sus propiedades únicas, por otra parte imprescindibles para que exista la vida que conocemos. Pauling utilizó el concepto de enlaces por puente de hidrógeno para armar las primeras teorías sobre la formación de las estructuras proteicas, como así se recoge en el clásico artículo que publicó en 1936 con Alfred Mirsky: “La cadena polipeptídica se pliega en una configuración única y definida, que es mantenida así por enlaces de hidrógeno”.

Los enlaces de hidrógeno se pueden producir, pues, no sólo entre átomos de una misma cadena, lo que da lugar a la estabilización de la estructura terciaria de la proteína, sino entre distintas moléculas, lo que produce la estabilización de la estructura cuaternaria de los complejos macromoleculares. Pauling fue el primero, por tanto, en introducir las fuerzas débiles para intentar entender la cohesión de las moléculas biológicas, y su mayor éxito fue profundizar en esos conceptos para, utilizando resultados experimentales y sus enormes conocimientos sobre la naturaleza de los átomos, alumbrar sus dos “criaturas” científicas más importantes, la estructura de hélice α y de lámina β. Otras fuerzas débiles que tienen una importante contribución a la conformación de las proteínas, son las fuerzas de carácter hidrófobo, una manifestación indirecta de los enlaces de hidrógeno. Las proteínas disponen de regiones polares (o hidrófilas) y apolares (o hidrófobas), y mientras las primeras buscan su estabilización por enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua del disolvente y, por lo tanto, se disponen en el exterior de la proteína, las segundas son “empujadas” hacia el interior de ésta y “obligadas” a interaccionar entre sí por la atracción de las moléculas de agua que se encuentran en el exterior, mucho más favorable desde el punto de vista energético. Estas fuerzas que tienden a colapsar las regiones hidrófobas en el interior de la estructura terciaria de las proteínas son las más importantes desde el punto de vista energético en el proceso de plegamiento de las proteínas. Las primeras teorías sobre la hidrofobia de las moléculas orgánicas fueron propugnadas por el químico físico alemán Isidor Traube a principios del siglo XX, cuando mostró que ciertas moléculas orgánicas, cuando se colocaban en la interfase entre el aire y el agua, disponían sus regiones polares hacia el agua y las apolares hacia el aire. Sin embargo, correspondió a otro químico ilustre, el americano Irwin Langmuir (Premio Nobel de Química en 1932), el desarrollo y formulación de dicha teoría en 1917 y posteriormente su aplicación a las proteínas en 1938. Langmuir

Irving LANGMUIR (1881-1957) enseñando a Guglielmo MARCONI (1874-1937) el General Electric Research Laboratory en 1922. © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

se introdujo en el campo de las proteínas de la mano de la matemática británica de origen argentino Dorothy Wrinch, quien en 1936 propuso una teoría sobre la estructura de las proteínas que denominó teoría del ciclol. Según esta teoría y en pocas palabras, las proteínas se colapsan en una estructura globular gracias a que poseen una estructura no lineal sino cíclica. La teoría resultó ser incorrecta (o, al menos, en general, incorrecta, pues hace pocos años se descubrió un grupo de proteínas que se comportan de tal manera), pero lo más grave era que apenas se basaba en datos experimentales y cuando lo hacía era para interpretarlos incorrectamente. Esta teoría, y por qué no decirlo, el arrogante comportamiento de su principal valedora, generó una notable polémica en la que se vieron implicados Lawrence Bragg, Bernal y Pauling entre otros. Como ya hemos comentado, Langmuir apoyó inicialmente la teoría de Wrinch y en su auxilio utilizó el concepto de hidrofobia para reforzar la noción del colapso de las proteínas. Las ideas de Langmuir fueron afortunadamente separadas de las del ciclol y aceptadas por la comunidad internacional hasta su consolidación definitiva a partir de los trabajos realizados en la década de los años cincuenta por el biofísico americano Walter Kauzmann.

La estructura de las proteínas Astbury y Bernal La difracción de rayos X fue pronto utilizada en varios laboratorios de los dos lados del Atlántico para tratar de determinar la estructura de moléculas inorgánicas, aunque para ello fue necesario generar la tecnología específica. Así, el grupo de William Bragg desarrolló los primeros difractómetros de rayos X e introdujo las series de Fourier para convertir la información que genera la difracción de los rayos X al incidir sobre el cristal en información estructural del espécimen cristalino. Las primeras estructuras resueltas fueron las de pequeñas moléculas inorgánicas, pero pronto se hizo evidente el potencial de esta técnica para resolver estructuras complicadas como moléculas orgánicas o pequeñas moléculas biológicas. Los primeros pasos con especímenes biológicos fueron dados en Alemania, en el Instituto Kaiser Guillermo de Química de Fibras. Allí y en 1920 los químicos R. O. Herzog y W. Jahnke consiguieron por primera vez hacer difractar una muestra de celulosa. El patrón de difracción mostró enseguida una regularidad que sugirió que la estructura presentaba un orden. La interpretación de los resultados corrió a cargo de un físico húngaro, Michael Polanyi, quien sin ninguna experiencia en el campo consiguió en muy poco tiempo resolver la estructura general del cristal y en el proceso introdujo los primeros conceptos generales para la interpretación de los difractogramas. La determinación completa de la estructura de la celulosa tardó ocho años más, y fue llevada a cabo por dos científicos, el 78

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La estructura de las proteínas

austríaco Herman Mark y el alemán H. K. Meyer, quienes además contribuyeron a reforzar la naciente teoría macromolecular de Staudinger, que como se recordará proclamaba la existencia de grandes polímeros en el mundo orgánico y biológico. Los resultados de Mark y Meyer demostraron fehacientemente que la unidad repetitiva del cristal, lo que en términos más precisos se denomina celda unidad, podía corresponder a una pequeña parte de la molécula, en este caso la celulosa, que se repetía a lo largo del cristal y tenía, por lo tanto, un tamaño mucho mayor. Lo que podríamos llamar la escuela alemana de cristalografía y, en general, la ciencia alemana, sufrió un severo golpe con el ascenso al poder del movimiento nacionalsocialista. Las leyes racistas y la persecución política hicieron que, a partir de la mitad de la década de los treinta, muchos científicos alemanes salieran del país. El relevo en los estudios estructurales mediante difracción de rayos X fue tomado fundamentalmente por los científicos británicos, y en especial por dos discípulos de William Bragg, dos figuras que fueron fundamentales para el devenir de la Biología Molecular Estructural. La primera de tales figuras es William Astbury, un físico inglés que trabajó en el grupo de William Bragg en la Universidad de Manchester y luego en el University College de Londres. Bragg fue posteriormente nombrado Director de la Royal Institution, una organización que tiene como principal misión la promoción y divulgación de la ciencia en el Reino Unido, y el interés de Astbury por las moléculas biológicas nació de la petición de Bragg en 1926 para que obtuviera unos difractogramas de la lana y la seda, con el fin de mostrar en una charla de la citada institución la regularidad existente en moléculas de distinta naturaleza, entre ellas las biológicas. Dos años después, Astbury se trasladó como Profesor Titular a la Universidad de Leeds, uno de los centros de la entonces floreciente industria textil británica, y que además apoyaba la investigación sobre fibras, y allí realizó una labor capital durante los siguientes años (Figura 7).

Figura 7. Esquema de la difracción de electrones sobre una fibra, e imagen de un difractograma de la fibroína de la seda obtenido por Astbury.



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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Cámara de Difracción de Rayos X utilizada por John Bernal en 1927. © Science Museum / S&S Picture Library.

Dorothy HODKING (1910-1994) en 1940. © NMPFT Daily Herald Archive / S&S Picture Library.

La importancia de Astbury no se debe sólo a los resultados que obtuvo, sino fundamentalmente a las ideas que diseminó entre la comunidad internacional, algunas de ellas incorrectas, pero que en cualquier caso sirvieron para promover la caracterización estructural de las proteínas. El grupo de Astbury realizó un detallado estudio de muchas proteínas fibrosas y en el caso de la queratina, la fibra de la lana, encontró dos tipos de estructuras patrón que podían convertirse entre sí dependiendo del grado de estiramiento que se ejerciese sobre ellas. Para las dos conformaciones, que denominó α‑ y β‑queratina, Astbury y su grupo realizaron medidas muy cuidadosas de sus elementos repetitivos, y el científico inglés posteriormente propuso para las dos conformaciones estructuras que después se demostraron muy parecidas a las que luego resultaron correctas. A Astbury le cupo en cualquier caso el honor de ser el científico que realizó los primeros estudios de todo tipo de fibras biológicas, entre otras, una muy importante y para la que demostraría también su regularidad. Esa fibra es el DNA, y de ella hablaremos en posteriores capítulos. El segundo de los científicos que tuvo una importancia capital en el desarrollo de la Biología Estructural es el ya mencionado Bernal, químico de origen, y quien como Astbury perteneció al grupo de William Bragg hasta la llegada de éste a la Royal Institution. Bernal consiguió en 1927 una plaza de Profesor Titular en la Universidad de Cambridge (plaza que, por cierto, le fue denegada a Astbury), y allí comenzó a trabajar con cristales de proteínas (al parecer había un acuerdo entre Bernal y Astbury por el cual el primero se ocuparía de las proteínas que cristalizaban, mientras que el segundo trabajaría en las moléculas fibrosas, entre ellas el DNA). Bernal se dedicó en principio y fundamentalmente al estudio por rayos X de pequeñas moléculas biológicas tales como algunas vitaminas, que entonces comenzaban a ser descritas en la literatura científica. Para ello contó con la inestimable ayuda de la cristalógrafa Dorothy Crowfoot, posteriormente Dorothy Hodking, quien más tarde conseguiría el Premio Nobel de Química en 1964 por la determinación estructural de varias moléculas biológicas de importancia, entre otras la penicilina y la vitamina B12. Bernal comenzó a intentar difractar cristales de proteína en ­Cambridge, pero sus primeros intentos, al igual que los de algunos de sus coetáneos, fueron muy poco esperanzadores. El problema fundamental se debía a la deshidratación que sufrían los cristales cuando, para ser montados en el difractómetro, eran extraídos de la solución donde habían sido crecidos. Un golpe de suerte vendría en 1934 a dar un empuje al estudio de las proteínas. Un amigo de Bernal, el fisiólogo americano Glen Millikan, fue a visitar al bioquímico británico John ­Philpot que trabajaba en la Universidad de Uppsala, y que había preparado cristales de pepsina. Éstos eran muy grandes, y Millikan le comentó de pasada a Philpot que “sabía de una persona que daría los ojos por esos cristales”, por lo que éste le dio unos cuantos cristales a aquél. La suerte hizo que Millikan los transportase en el mismo líquido de cristali-

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Max Perutz y el Laboratorio de Biología Molecular

zación. Cuando Bernal los vio, se dio cuenta de la importancia de mantener los cristales hidratados en las mismas condiciones de cristalización. La calidad de los difractogramas obtenidos con cristales hidratados era muy superior, lo que vino a dar la razón a Bernal, quien en palabras de Dorothy Hodking, “paseó por las calles de Cambridge, muy excitado, pensando en el futuro y cómo sería posible conocer la estructura de las proteínas si esos difractogramas pudieran ser interpretados en todos sus detalles”. El futuro de la cristalografía de proteínas se desarrollaría en Cambridge, pero no de la mano de Bernal, quien en 1937 conseguiría finalmente una plaza de catedrático en el Birbeck College de Londres. La estancia de Bernal en Cambridge no fue lo exitosa que hubiera podido pensarse, y ello quizás fue debido a sus fuertes y públicas convicciones comunistas, que probablemente le cerraron puertas abiertas para otros, y quizás en parte a su incapacidad para concentrarse en un solo problema. Y es que Bernal sentía una curiosidad irrefrenable por cualquier aspecto de la Ciencia, lo que se reflejó en su faceta de divulgador científico, a la que dedicó los últimos años de su vida.

Max Perutz y el Laboratorio de Biología Molecular El futuro de la difracción de las proteínas iría asociado al de un químico austriaco, Maximilian Ferdinand Perutz. Éste pertenecía a una rica familia vienesa de origen judío (sefardí por más señas, pues el apellido ­Perutz no es más que la corrupción del español Pérez), aunque sus padres se habían convertido al catolicismo. Perutz había estudiado Química Orgánica en la Universidad de Viena, pero pronto mostró interés por el estudio de los sistemas biológicos. Cuando acabó sus estudios universitarios pidió a Herman Mark, el catedrático de Química Física de su universidad y uno de los precursores de la difracción con moléculas biológicas, que aprovechara un viaje suyo a Cambridge para que intercediese por él ante el por entonces más famoso de los bioquímicos británicos, ­Frederick Gowland Hopkins (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1929). Éste había adquirido prestigio internacional por sus contribuciones al descubrimiento y caracterización de vitaminas del crecimiento y parecía para Perutz el candidato ideal con quien continuar sus estudios. Sin embargo, cuando en el transcurso de su estancia en Cambridge, Mark visitó a Bernal y vio los difractogramas que estaba obteniendo con pepsina, pidió a éste que acomodara a Perutz en su grupo. A la llegada de Perutz a Cambridge en 1936, Bernal puso al joven austríaco a trabajar en la caracterización estructural de varias moléculas inorgánicas. ­Perutz, aunque aprendió durante este tiempo los rudimentos de la difracción de rayos X, se desesperaba por encontrar un buen espécimen biológico. La suerte vino en su ayuda meses después, cuando en unas vacaciones en su Austria natal fue a visitar a un lejano pariente suyo, el bioquí-

Max PERUTZ (1910-2002) con su modelo tridimensional de la hemoglobina. © MRC Laboratory of Molecular Biology.

Fredrick Gowland HOPKINS (1861‑1947). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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G. S. ADAIR (1896-1979). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Ernest RUTHERFORD (1871-1937). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

mico checo Felix Haurowitz, quien había realizado contribuciones importantes al estudio de los anticuerpos. Haurowitz además trabajaba con la proteína hemoglobina, de la que había obtenido cristales y en los que había observado cambios drásticos a consecuencia de la unión o eliminación de oxígeno a la proteína, que él opinaba eran un reflejo de los cambios que se producían en su estructura. Haurowitz hizo ver a Perutz la importancia de la hemoglobina y le sugirió que trabajara con ella. Además, le indicó que en Cambridge se encontraba uno de los mayores expertos en preparación de cristales de hemoglobina, el fisiólogo Gilbert Smithson Adair. Perutz se mostró entusiasmado con la idea y a su vuelta a Cambridge contactó con Adair, quien le enseñó a purificar hemoglobina y cristalizarla. Desde entonces, y durante más de 60 años, en una relación más estable y duradera que casi todos los matrimonios (pero no el de Perutz), el científico austriaco trabajó en la caracterización estructural y funcional de esta apasionante proteína. Al poco de su llegada a Cambridge ocurrieron una serie de acontecimientos que marcaron el futuro de Perutz y probablemente el de la Biología Molecular, y es que en 1937 falleció Lord Rutherford, el director el Laboratorio Cavendish de Física, y para reemplazarle fue nombrado Sir Lawrence Bragg, quien dejó libre su cátedra de Manchester. Ésta fue obtenida por Patrick Blackett quien, a su vez, dejó la cátedra en el Birbeck College de Londres. Fue Bernal quien sucedió a Blackett en Londres, y para allá marchó con su grupo, excepto Perutz, quien prefirió quedarse en Cambridge. Perutz fue acogido en un principio por David Keilin, famoso entonces por ser el descubridor de los citocromos, quien le prestó un poco de espacio en su laboratorio del Instituto Molteno, y allí siguió trabajando en la difracción de los cristales de hemoglobina. A las pocas semanas ­Perutz se armó de valor y pidió audiencia a Sir Lawrence para enseñarle los difractogramas de los cristales de hemoglobina. Bragg se mostró entusiasmado con los resultados de Perutz, pues mostraban claramente la potencialidad de la técnica que él había iniciado, en la resolución de complejas moléculas biológicas. Bragg consiguió dinero de la Fundación Rockefeller para pagar un salario a Perutz y dotarle de cierto equipamiento. Su ayuda fue definitiva, pues la II Guerra Mundial estaba a las puertas, y la persecución a los judíos se encontraba en su apogeo en los países dominados por Hitler. Los padres de Perutz habían perdido sus propiedades y estaban a punto de perder la vida cuando pudieron ser traídos a Inglaterra. Sin embargo, a Perutz su condición de emigrado no le salvó inicialmente de verse forzado a pasar varios meses de internamiento en un campo de concentración, primero en la isla de Man y luego en Canadá, hasta que la presión ejercida por las autoridades académicas consiguió que volviera a Inglaterra. Cuenta Perutz en sus memorias que, al poco tiempo, fue llamado por el Almirantazgo para que participara en un proyecto secreto dirigido por Bernal que tenía por objetivo la construcción, en medio del Atlántico, de enormes bases aéreas hechas de hielo y pulpa de madera. El plan era absurdo, pero Perutz trabajó en él con otros científicos durante varios meses, hasta que fue abandonado por razones políticas.

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Cuando la guerra acabó, Perutz volvió a su trabajo con la hemoglobina. Inglaterra estaba en un estado lamentable, y lo mismo podía decirse de su tejido científico. Por otra parte, la finalización de la guerra había dejado en la calle a numerosos jóvenes universitarios brillantes, algunos de ellos con ganas de comenzar o reemprender su carrera científica. La suerte hizo que alguno de ellos se acercaran a Max Perutz. El primero fue John Kendrew, un químico físico que había estado a las ordenes de ­Bernal durante la guerra, y gracias a su influencia había vuelto de ella con interés por los temas biológicos. Bragg, deseoso de mantener el desarrollo de la difracción de proteínas, logró de la institución británica que se encargaba de la investigación biomédica, el Consejo de Investigación Médica (Medical Research Council, MRC), que creara en 1947 una unidad “para el estudio de la estructura molecular de los sistemas biológicos”, luego llamado Laboratorio de Biología Molecular, el primero de los institutos dedicado a este fin, y desde luego el más famoso que ha existido. El LMB, como es conocido en los ambientes científicos, tuvo en una primera instancia a Perutz y Kendrew como los dos únicos investigadores, pero pronto se les unieron otros estudiantes de enorme talla, como ­Francis Crick y Hugh Huxley, este último uno de los descubridores del mecanismo de deslizamiento de la actina y miosina durante la contracción del músculo. Después llegaron Jim Watson, Sydney Brenner, Leslie Orgel, Michael Rosmann, etc., una reunión de talento como pocas veces se ha dado en la ciencia. Bragg consiguió para la recién creada unidad una cabaña en el patio del Instituto Cavendish donde pudieron acomodar parte de sus despachos y laboratorios. “La cabaña”, que así es llamada por todos y que todavía permanece en pie, se ha erigido en un icono de la Biología Molecular. Kendrew comenzó pues a desarrollar su tesis doctoral bajo la dirección de Max Perutz, pero para ello pidió hacerlo con una proteína diferente a la hemoglobina, y Perutz pensó en la mioglobina, parecida a aquélla, pues se encarga de transportar el oxígeno en las células del músculo, con la ventaja de ser más simple. Después de utilizar mioglobinas de distintas fuentes, se decantaron por la que obtuvieron del músculo de cachalote, que entonces se cazaba sin ningún tipo de restricciones y, de hecho, la mayor parte de los experimentos de cristalización que se realizaron durante los siguientes años se llevaron a cabo a partir de la mioglobina extraída de un único barril de músculo guardado en el refrigerador del instituto.

“Los seis grandes” del LMB (1967). De izquierda a derecha: Hugh Huxley, John Kendrew, Max Perutz, Francis Crick, Fred Sanger y Sydney Brenner. © MRC Laboratory of Molecular Biology.

“La cabaña” (1962), el embrión del LMB de Cambridge. © Hans Boye / MRC Laboratory of Molecular Biology.

La determinación de la estructura en hélice α y lámina β Los primeros trabajos de Perutz y Kendrew, bajo la supervisión de Bragg, tuvieron como objetivo caracterizar la estructura general de las proteínas y, en concreto, la llamada estructura α de Astbury, que por entonces ya se pensaba que estaba presente en casi todas las proteínas, entre ellas 83

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mioglobina y hemoglobina. Para la estructura de α‑queratina, Astbury había propuesto una estructura helicoidal, que parecía ser la solución más razonable de plegamiento cuando un polímero está compuesto de subunidades parecidas. Así, el mismo Crick explicaba en sus memorias: “Ya se conocía de antiguo que una cadena con uniones idénticas y repetitivas que se pliega de tal forma que cada unión se dispone de la misma manera y mantiene las mismas relaciones con sus vecinos más próximos, tiende a formar una hélice (llamada frecuentemente de manera incorrecta como espiral por los no matemáticos). Las soluciones extremas a este problema, la línea recta o el círculo, son matemáticamente tenidas como hélices degeneradas”.

Figura 8. Distancias interatómicas de los átomos que forman parte del enlace peptídico (arriba) y su naturaleza planar (abajo).

 Linus Pauling y Robert Corey observando un modelo de alfa hélice. © Science Museum / S&S Picture Library. Derecha: modelo de alfa hélice, tal como fue hipotetizada por ambos [“The discovery of the alfahelix and beta-sheet, the principal structural features of proteins” Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (2003) 100: 11207].

Astbury había propuesto que la estructura helicoidal por él sugerida poseía un paso de tuerca de 5,1 Å por vuelta de hélice, aunque otras fibras, algunas de ellas generadas por polipéptidos sintéticos, mostraban un paso de tuerca de 5,4 Å por vuelta de hélice. El grupo liderado por Bragg se dispuso a estudiar esa estructura y para ello utilizó un método estrictamente empírico basado en la medida cuidadosa de los patrones de difracción y en su posterior interpretación. Sin embargo el grupo británico tenía dos problemas, el menor de los cuales tenía que ver con sus propias carencias desde el punto de vista químico y con una concepción excesivamente cristalográfica del problema. El mayor problema era que el mismísimo Linus Pauling había comenzado también a estudiar la estructura helicoidal. En realidad, Pauling había abordado el problema antes que el grupo británico... y ya lo había resuelto. Pauling había contratado al cristalográfo americano Robert Corey para que confirmara sus ideas sobre la estructura de las proteínas, entre las que se incluía que el enlace peptídico debía ser plano, con las consiguientes restricciones en cuanto al movimiento de los seis átomos que forman parte de él (Figura 8). La determinación por parte de Corey de la estructura atómica de varios dipéptidos no sólo confirmó sus teorías sobre la planaridad del enlace peptídico, sino que le permitió conocer las distancias interatómicas de los átomos que rodean al enlace peptídico, lo que sería fundamental para lo que vino después. Armado con estos conocimientos teóricos, un día de 1948 en el que durante una estancia sabática en Oxford se encontraba en la cama aquejado de un resfriado y aburrido, Pauling decidió dedicarse a la papiroflexia. Para ello dibujó en un papel una cadena polipeptídica teniendo cuidado con mantener las distancias interatómicas relativas. Una vez hecho esto, Pauling hizo un cilindro con el papel intentando buscar la manera en que pudiera colocar el nitrógeno de un aminoácido con el oxígeno de otro dispuesto más lejos en la cadena, de tal manera que la distancia entre ellos permitiera la formación de un puente de hidrógeno. Modificando el cilindro de papel, Pauling consiguió varias estructuras helicoidales distintas que se ajustaban a las premisas antes descritas, pero las que le parecieron más razonables fueron la llamada hélice γ, que posee 5,1 aminoácidos por vuelta y que nunca se ha encontrado en la natu-

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raleza, y la hélice α en la que, en cada vuelta de hélice, se disponen 3,6 aminoácidos (en realidad, él midió 3,7 aminoácidos, pero esa es otra historia), que es la hélice “canónica” que se encuentra normalmente en las proteínas (Figura 9). El único problema es que las dimensiones de esta última estructura, aunque se ajustaban a las distancias que Pauling y ­Corey obtenían experimentalmente de las hélices que parecían producirse en pequeños péptidos sintéticos, no lo hacían con las de las estructuras naturales medidas por Astbury, que mostraban 5,1 Å por vuelta de hélice. Esta discrepancia hizo que Pauling se olvidara, al menos por un tiempo, de publicar su modelo estructural.



Figura 9. Modelo de alfa hélice para doblar. Para generar una doble hélice, copia este diagrama en una transparencia y enróllalo por el eje vertical hasta que el oxígeno marcado con una flecha en la parte inferior izquierda, solape con el oxígeno alfa, con la flecha apuntando al hidrógeno. Ajusta el solapamiento para que el NH vecino y el CO estén alineados, y entonces pégalos. El resultado es una alfa hélice.

Mientras tanto, el grupo británico seguía trabajando en la caracterización estructural de la estructura helicoidal, pero como hemos comentado, Bragg, Perutz y Kendrew intentaron producir un modelo basándose en dos asunciones incorrectas. La primera es que no tuvieron en cuenta la planaridad del enlace peptídico para generar el modelo, o más correctamente, que aunque conocían ese hecho, no lo tomaron como una condición imprescindible. En segundo lugar, como cristalógrafos que eran, no tuvieron jamás en cuenta otras posibilidades para el modelado de la estructura que un número íntegro de aminoácidos por número de vuelta, tres o cuatro, más acorde con la posibilidad de un eje de simetría en el centro de la estructura helicoidal. Los tres científicos generaron varios modelos helicoidales, que publicaron en 1950. Los modelos poseían distorsiones y tensiones en la geometría de los puentes de hidrógeno, de los que los autores eran conscientes, y así lo afirmaron en el artículo. La publicación de esos resultados y la posibilidad de que en un futuro inmediato el grupo de Bragg pudiera dar con un modelo más correcto, hizo que Pauling se lo pensase mejor y se atreviera a publicar su modelo. 85

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En realidad, lo que hizo el químico americano en 1951 en colaboración con Corey fue publicar en una serie de doce artículos en la revista ­Proceedings of the National Academy of Sciences USA los modelos de las estructuras de varias de las fibras estudiadas hasta la fecha, entre ellas las estructuras de hoja β antiparalela y paralela, unos modelos que mejoraron considerablemente el propuesto por Astbury en 1934 para este tipo de estructuras (Figura 10).

Figura 10. Estructuras de láminas β antiparalelas (arriba) y paralelas (abajo). 

Para la estructuras de hoja β, Pauling asumió lógicamente también la planaridad del enlace peptídico y modelizó las estructuras de tal manera que se ajustaban perfectamente a los patrones de difracción producidos por Astbury y el propio Corey. En la hoja antiparalela de Pauling y Corey, las láminas β de las cadenas polipeptídicas se disponían en forma de sierra y los puentes de hidrógeno entre las láminas se producían de manera paralela y unían los dientes de sierra para estabilizar la estructura final. La hoja paralela, una estructura hasta entonces no descrita, poseía una forma parecida, pero aquí los puentes de hidrógeno entre láminas no se producían de manera paralela. 86

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Los resultados de Pauling y Corey conmocionaron a la comunidad científica y prácticamente no generaron ninguna oposición, porque como declaró una vez Perutz “no sólo eran hermosos sino que cuando uno observaba las estructuras, sentía que no podían ser más que correctas”. Curiosamente, mientras Pauling enviaba los artículos para su publicación e iba a contribuir con ello a la gloría de la ciencia americana, era acusado por una comisión del congreso de su país de “actividades antiamericanas”. Su pecado había sido oponerse con todas sus fuerzas a la carrera armamentística en la que estaban involucradas en ese momento las dos grandes potencias mundiales. Las consecuencias de tal conducta iban a ser duras para Pauling: la disminución de fondos públicos y privados para su investigación, el aislamiento por parte de sus compañeros científicos e incluso la retirada del pasaporte, episodio que como veremos pudo tener cierta relevancia en la determinación de la estructura del DNA. Otro episodio ocurrido durante ese tiempo muestra la categoría intelectual de Pauling, quien había realizado comentarios públicos sobre la cantidad de plutonio que poseían las bombas atómicas que los americanos estaban entonces construyendo. Como quiera que la cifra era correcta y su cálculo muy complejo y sólo al alcance de muy pocos físicos, los cuales además trabajaban para el gobierno y estaban sometidos a la ley de Secretos Oficiales, el FBI interrogó al químico americano para conocer quién le había pasado esa información. “Nadie. Lo he calculado yo mismo”, fue su respuesta. Y era verdad. La presión sobre Pauling duró varios años, el tiempo que el ­“McCarthismo” dominó la vida política americana, pero se atenuó cuando el más famoso químico americano del siglo XX recibió el Premio Nobel de Química en 1954, y desapareció completamente cuando se le concedió el de la Paz en 1962, éste último precisamente por su lucha en favor del desarme. Curiosamente, la demostración de la existencia real de la estructura α‑helicoidal no corrió a cargo de Pauling sino de sus contrincantes del otro lado del Atlántico. La publicación del modelo atómico de la estructura en hélice α cayó como una bomba en el LMB, y Sir Lawrence Bragg sintió que el gran químico americano le había ganado otra vez la partida. A Max Perutz, sin embargo, se le ocurrió que si cada vuelta de hélice tenía un paso de tuerca de 5,4 Å y alojaba 3,6 aminoácidos, tenía que haber una repetición regular de 1,5 Å que correspondía al levantamiento de cada aminoácido, y que la existencia de esa distancia periódica debía reflejarse en un punto del difractograma que se dispusiera que correspondía precisamente a esos 1,5 Å. El problema es que esa reflexión no podía observarse en las condiciones normales en las que se habían realizado hasta entonces los experimentos de difracción sobre las fibras. Para encontrar la reflexión, Perutz tuvo que inclinar la muestra, en este caso un pelo de caballo. Cuando realizó el experimento y comprobó la existencia de la reflexión ‑y demostró, por lo tanto, la existencia de la hélice α propuesta por Pauling‑, Perutz corrió al despacho de Bragg a explicarle el experimento y su resultado final. Bragg le preguntó a Perutz

Linus Pauling trabajando en su laboratorio (1945), con el Dr. Dan H. Campbell. © Radial Press.

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sobre las causas que le habían llevado a pensar en el experimento, Perutz le contestó que la idea le había llegado como consecuencia de la rabia por no haber desarrollado el modelo de Pauling él mismo, a lo que Bragg le respondió: “Ojalá te hubiera hecho enojar antes”. Este es el título de un libro de memorias de Max Perutz, cuya lectura es más que recomendable. Bragg tenía razón, porque sin duda el descubrimiento de la periodicidad de 1,5 Å les hubiera llevado a la resolución del modelo mucho antes. Nadie es perfecto, sin embargo, y el propio Perutz cuenta que cuando escribió a Pauling para contarle el experimento que había llevado a cabo y su resultado final, Pauling se enrabietó por no habérsele ocurrido a él mismo, y es que los grandes hombres tampoco están libres de la soberbia (de hecho, son más propensos a ésta). La discrepancia entre las medidas de 5,1 y 5,4 Å obtenidas por diferentes investigadores fue resuelta en un golpe de genio en 1952 por Francis Crick (y de manera independiente también por Pauling). El científico británico postuló que la distancia de 5,1 Å correspondía a la propia de una hélice α mientras que la de 5,4 Å era la de un tipo de repetición que se produce en el enrollamiento de varias hélices α juntas, lo que ha venido a llamarse superhélice, estructura que fue encontrada años después en la proteína del músculo miosina. Crick haría otra gran contribución a la caracterización estructural de la hélice α y de paso a sus estudios sobre la estructura del DNA, cual fue la formulación en 1952 y en colaboración con Cochran y Vand, de la teoría de la difracción para estructuras helicoidales. La confirmación definitiva de la existencia de la hélice α provino, sin embargo, de la determinación estructural de las primeras proteínas, la mioglobina y la hemoglobina.

La determinación de las primeras estructuras proteicas En este caso no hubo batalla entre los dos lados del Atlántico por ver quién era el primero en resolver la estructura de una proteína, pues el mismo Pauling pensaba, tal como publicó en 1939, que “la gran complejidad de las proteínas hace bastante improbable que la determinación estructural de una proteína pueda ser realizada sólo por técnicas de difracción de rayos X”. Probablemente esta era la visión que compartía una gran parte de la comunidad científica, y no era para menos. El gran problema de los métodos de difracción de rayos X es que cuando éstos son dispersados por la nube electrónica de los átomos sobre los que se pretende obtener información estructural, una parte de ésta se pierde irremediablemente. El difractograma producto de la difracción de un cristal guarda en cada una de las reflexiones información que está relacionada con el nivel de detalle estructural (las reflexiones más cercanas al centro del difractograma guardan información más grosera, las más alejadas acumulan información de mayor detalle). Las reflexiones almacenan información sobre la amplitud de la onda, pues ésta es proporcional a la intensidad de 88

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aquéllas (Figura 11). Sin embargo, una parte fundamental de la información, el desplazamiento de la fase de la onda como resultado de la interacción con la nube electrónica, se pierde, y con ello la posibilidad de determinar directamente la estructura de la molécula que se está estudiando. Durante los primeros años en los que se comenzaron a resolver estructuras, éstas eran de moléculas inorgánicas que contenían un pequeño número de átomos y la solución a la estructura podía ser directa, gracias a las técnicas de Fourier introducidas por William Bragg, utilizando para ello dos métodos. El primero se basaba en adivinar la estructura, calcular para ella los parámetros teóricos que la representarían, incluidas las fases, y compararlos con los valores experimentales. El resultado obtenido, probablemente erróneo, estaría ya a medio camino entre la estructura inicial y la real, y la idea consistía en seguir realizando la misma operación hasta que los resultados teóricos y experimentales coincidieran. Este método era complejo, sobre todo si se tienen en cuenta los procedimientos de cálculo de aquella época, pero resultaba todavía utilizable para pequeñas moléculas inorgánicas como sales simples.



Figura 11. Esquema de un difractograma. Un haz de rayos X choca con un cristal. La mayor parte de los rayos atraviesan el cristal sin colisionar con sus moléculas (haz horizontal). En algunos casos, colisionan con las moléculas y el haz es difractado; lo que hace variar su amplitud (que es recogida en el difractograma, arriba derecha) y la fase (el máximo de la onda se desplaza respecto del original, esquema de abajo), que no es recogido en el difractograma y se pierde.

El segundo método, llamado de obtención de fases por átomo pesado, se basaba en unir a la molécula en estudio un átomo de alto peso atómico (o que la molécula ya lo tuviera), obtener los parámetros de difracción y localizar la posición de este átomo, que difracta los electrones mucho más que el resto de los átomos de la molécula. El siguiente paso consistía en calcular la fase del átomo pesado y utilizar este valor para calcular las fases del resto de los átomos. Sin embargo, ninguno de los dos métodos descritos podía ser utilizado para el cálculo de proteínas, pues incluso las más pequeñas contienen un enorme número de átomos comparado con la mayor parte de las moléculas orgánicas e inorgánicas. En este sentido, es preciso hacer notar la 89

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Max Perutz trabajando en el taller sobre modelos tridimensionales. © MRC Laboratory of Molecular Biology.

hazaña técnica que supuso la determinación por el grupo de Dorothy Hodking en el año 1956 y mediante el método de obtención de fases por átomo pesado, de la estructura de la vitamina B12, pues ésta es una estructura extremadamente compleja. En ayuda de los métodos de determinación estructurales vino en 1934 la publicación, por parte del cristalógrafo de origen neozelandés Arthur L. Patterson, de la escuela de William Bragg, de una formulación matemática basada en las series de Fourier que permitía el uso de las intensidades de las reflexiones para el cálculo de las fases. El método fue aceptado inmediatamente por la comunidad de cristalógrafos, especialmente para la resolución de pequeñas moléculas biológicas como aminoácidos y azúcares. Sin embargo, la síntesis de Patterson, como se conoce vulgarmente al método, es muy compleja y los cálculos eran excesivamente largos y tediosos, sobre todo por la ausencia en aquel entonces de ordenadores que pudieran llevarlos a cabo de una manera más sencilla. En cualquier caso, era una puerta abierta a la esperanza de poder realizar determinaciones estructurales de proteínas. A esta esperanza se agarraron diversos científicos, en especial uno, Max Perutz, con las características adecuadas para realizar esta tarea hercúlea y llena de obstáculos. Pocos científicos como Perutz reúnen en una sola persona las condiciones de inteligencia, perseverancia y humildad para poder resistir las tentaciones de abandonar un tarea que parecía no tener fin. Perutz y los científicos del LMB utilizaron durante varios años la síntesis de Patterson para calcular la forma general de las proteínas, a pesar de que ya en 1948 poseían difractogramas que almacenaban información de hasta 2,8 Å de resolución. Utilizando información bioquímica de la hemoglobina, en gran parte incorrecta, y en sus cálculos basados en la síntesis de Patterson, Perutz y su grupo publicaron en 1949 un artículo en el que hipotetizaban sobre la forma y el tamaño de la hemoglobina, que por entonces se pensaba que debía disponer en su interior de una estructura regular que promoviera su cristalización. La estructura era errónea pero contenía detalles de interés como la existencia de elementos “cilíndricos”, que inmediatamente Pauling asoció con la estructura helicoidal que para entonces él sabía que existía en las proteínas. Este trabajo fue el que empujó también al grupo británico al estudio de las estructuras helicoidales que hemos descrito anteriormente. Sin embargo, el camino emprendido por Perutz y supervisado por Bragg no conducía a ninguna parte, y esto les fue indicado claramente por un recién llegado al laboratorio, Francis Crick, quien en su primer seminario interno apuntó al asombrado conjunto de investigadores que le escuchaban, entre los que se encontraba un sorprendido y enrabietado Bragg, las razones por las que el enfoque utilizado hasta el momento conducía a un callejón sin salida. El seminario se titulaba “Qué loca búsqueda”, y era claramente una provocación en la boca de un recién llegado, pero muy adecuado a la personalidad de Crick, a quien y según reconoció su compañero Watson en sus memorias, “nunca le vi comportarse de una manera modesta”. El título de este seminario fue usa-

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do también por Crick para dar nombre a sus memorias, magníficamente escritas y muy esclarecedoras de los hechos que dieron lugar al nacimiento de la Biología Molecular. La solución al problema vino, según apunta Francis Crick en su autobiografía, de una sugerencia que él mismo hizo a Perutz para que utilizara el método de obtención de fases por átomo pesado o de reemplazamiento isomorfo, como se llama comúnmente, y que como hemos comentado anteriormente, estaba ya siendo aplicado por los cristalógrafos de compuestos orgánicos durante un tiempo. Gracias a este método, y ya en 1927, James M. Cork había resuelto estructuras de sustancias orgánicas, y el holandés Johannes Bijvoet había conseguido resolver la estructura de una compleja molécula orgánica, la estricnina, en dura pugna con cristalógrafos de Oxford que utilizaban métodos clásicos. Incluso Bernal en 1939, hablando para la Royal Institution, había sugerido la posibilidad de utilizar este método con moléculas biológicas. El método llevaba asociado la necesidad de introducir una o varias moléculas de un metal pesado en el interior del cristal sin cambiar las dimensiones de éste. Los cristalógrafos conocían pues el método, pero al principio y como reconocía el mismo Perutz, pensaban que sería imposible que funcionase con las enormes moléculas que eran las sustancias biológicas. El problema es que asumían que los átomos pesados no iban a afectar a la intensidad del gran número de reflexiones que se producen en un cristal de una molécula biológica como ocurre en el caso de pequeñas moléculas inorgánicas u orgánicas. Esto era cierto, pero el golpe de genialidad de Perutz fue darse cuenta de que bastaba con que la influencia fuera pequeña y medible. El problema fundamental consistía en introducir esos átomos pesados sin afectar a la red cristalina o a la propia proteína. En el caso de la hemoglobina, Perutz supo en 1953 de los trabajos de Austen Riggs en ­Harvard, quien había conseguido unir un átomo de mercurio a la hemoglobina utilizando un residuo de cisteína muy reactivo. Perutz, en unión del bioquímico Vernon Ingram, que se había incorporado al LMB recientemente, consiguió cristales con ese derivado de mercurio, denominado benzoato de para-mercurio, y difractó cristales de hemoglobina sin y con el derivado. Cuando observó los difractogramas de las dos muestras y comprobó que en verdad había diferencias de intensidad, Perutz anotó en uno de sus escritos: “Este fue quizás uno de los momentos más excitantes de mi carrera científica porque en ese momento supe que, en principio, el problema de la determinación estructural de las proteínas estaba resuelto”.

Sin embargo, y como Perutz comprobó al poco tiempo, la solución no era tan sencilla, y es que incluso la técnica de reemplazamiento isomorfo generaba indefiniciones. La solución final le llegó a Perutz tras una conversación con la cristalógrafa Dorothy Hodking, quien durante una visita a Cambridge le sugirió que si conseguía cristales de dos o más derivados, esas indefiniciones desaparecerían y entonces sí que podría determinar la 91

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Estructuras tridimensionales de la mioglobina (arriba y centro), en dos modelos distintos (© Science Museum / S&S Picture Library y (© MRC Laboratory of Molecular Biology) y (debajo) de la hemoglobina (© MRC Laboratory of Molecular Biology).

estructura tridimensional de la hemoglobina. Este método, ahora clásico, se denomina reemplazamiento isomorfo múltiple, y requiere, por lo tanto, preparar cristales con otros metales pesados. En ayuda de los proyectos de hemoglobina y mioglobina vino Howard Dintzis, un bioquímico que en su estancia postdoctoral en Cambridge desarrolló numerosos experimentos conducentes al marcaje de mioglobina y hemoglobina, y realizó cientos de experimentos con un número elevado de compuestos con átomos pesados, especialmente de mioglobina. En el caso de la hemoglobina, ocurrió una circunstancia curiosa y es que Perutz tuvo problemas para conseguir un segundo derivado que fuese isomorfo. Un día se acordó de que Dintzis, que había vuelto a Estados Unidos después de su experiencia postdoctoral en Cambridge, había dejado multitud de viales con distintos experimentos. Entre ellos encontraron varias muestras con cristales de hemoglobina con distintos derivados de metales pesados, que utilizaron inmediatamente. A partir de ese momento (1954) y aunque a ritmo lento, los experimentos avanzaron, no sólo desde el punto de vista de los métodos de cristalización, sino en la mejora en la toma de datos y en su manipulación, con la introducción de los primeros ordenadores que se construyeron e instalaron en Cambridge, en colaboración con el departamento de matemáticas, y con el desarrollo de los primeros programas para tratar los datos, en los que Kendrew tuvo un papel muy importante. El primer proyecto exitoso del grupo del LMB consistió en la determinación estructural a 6 Å de la mioglobina. Kendrew y Perutz eligieron alcanzar los 6 Å porque era una resolución baja y permitía trabajar con un número reducido de datos, suficientes para ser manejados por los ordenadores de aquella época. La resolución de 6 Å era, además y en principio, suficiente para visualizar los cilindros de hélice α que los estudios de Pauling preconizaban. La estructura tridimensional de la mioglobina de cachalote a 6 Å fue publicada en 1958, seguida un año más tarde por la de la hemoglobina de caballo a 5,5 Å de resolución, una hazaña si se tiene en cuenta que la hemoglobina es cuatro veces mayor que la mio­ glo­bi­na, ya que está compuesta de cuatro subunidades, dos copias de la subunidad α y dos de la β, las dos proteínas muy parecidas entre sí. Los resultados mostraron claramente la existencia de hélices a lo largo de las dos estructuras. Sin embargo, más interesante era todavía que las dos proteínas ‑que se sabía tenían una función parecida y les suponía también una secuencia de aminoácidos semejante (por lo menos la composición aminoacídica lo era)‑ tenían también una estructura parecida en la que las hélices α se disponían de manera semejante. Este parecido llevó a Perutz y a otros científicos a preguntarse sobre las relaciones evolutivas entre las dos proteínas asociadas a su semejanza de estructura y función, preguntas que están en el origen de los estudios sobre la evolución molecular. Al poco tiempo, los grupos liderados por Perutz y Kendrew se embarcaron en la extensión a mayor resolución del mapa de las dos proteínas, para lo que se apoyaron entre otras cosas en la mejora de la capacidad

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de cálculo de un nuevo ordenador instalado en Cambridge. En 1960 Kendrew y su grupo obtuvieron el mapa tridimensional de la mioglobina a 2 Å de resolución. El trabajo se realizó a caballo entre Cambridge y Londres, pues ­William Lawrence Bragg había sido nombrado, como su padre lo fue anteriormente, director de la Royal Institution, y por lo tanto había marchado a Londres con parte de su equipo, lo que dio lugar a una de las anécdotas más famosas en el mundo de la Biología Molecular. Bragg, a pesar de la fama obtenida por la consecución del Premio Nobel y su personalidad científica, era un hombre sencillo y de carácter familiar. Gustaba mucho de la jardinería, a la que había dedicado bastante tiempo a lo largo de su vida. Su puesto en la Royal Institution le proporcionaba tiempo libre para cuidar de un jardín, pero su casa de Londres no poseía uno, así que no se le ocurrió mejor idea que hacerse contratar de jardinero a tiempo parcial en la casa de una familia rica de Londres, que desconocía quién era realmente. El secreto fue descubierto cuando una visita, que se despedía de los dueños de la casa, reconoció al famoso científico trabajando en el jardín. “¿Qué hace Sir William en tu jardín?”, a lo que el dueño de la casa respondió. “¿Cómo Sir William? Si es Willy, nuestro jardinero”. No obstante, Bragg seguía trabajando y en Londres formó un grupo que, además de colaborar con la gente de Cambridge, mantenía sus propios proyectos. En el grupo de Bragg se encontraban, entre otros, David Phillips, más tarde Lord Phillips de Ellesmere, quien además de colaborar con Kendrew en la determinación estructural de la mioglobina se embarcó en su propio proyecto, la resolución de la estructura del enzima lisozima. Esta proteína había sido descubierta años antes por Alexander ­Fleming, y se sabía que era utilizada por ciertos organismos para romper las paredes de bacterias. En unos pocos años, en 1965, el grupo de Phillips y Bragg consiguió cristalizar la lisozima y determinar su estructura atómica. Fue el propio Bragg quien se encargó de delinear la estructura del enzima a partir de los datos de difracción, y es fácilmente imaginable la emoción que pudo embargar al creador de tan poderosa herramienta al ser, casi cincuenta años después, protagonista directo de su puesta de largo. La determinación estructural de la lisozima reveló dos hechos de extraordinaria importancia. El primero fue la observación por primera vez de la hoja β hipotetizada por Pauling y Corey. Esta estructura sólo puede ser observada con resoluciones por debajo de 4 Å, y la mioglobina, la otra estructura resuelta a resolución atómica hasta entonces, no poseía este tipo de estructura secundaria. La segunda observación tuvo que ver con el hecho de que la lisozima pudo ser cristalizada en ausencia y presencia de un análogo del sustrato, el inhibidor tri-N-acetilquitotriosa, lo que permitió por primera vez visualizar el mecanismo de ataque de un enzima sobre un sustrato, utilizando para ello la estructura de ambas moléculas. Otras proteínas fueron también resueltas durante los años finales de la década de los sesenta, tales como el enzima RNAsa, que fue determinada en Yale por el grupo de Frederick Richard, la carboxipeptidasa en

Construcción del EDSAC (Electronic Delay Storage Automatic Calculator) en el Cambridge University Mathematical Laboratory.

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John KENDREW (1917-1977) con su modelo de mioglobina © MRC Laboratory of Molecular Biology.

John Kendrew con otro modelo de mioglobina © MRC Laboratory of Molecular Biology.

Harvard por el grupo de William Lipscomb, la quimotripsina en el LMB por el grupo de David Blow, y la papaína por el grupo de Ian Drenth en Groninga. Estos resultados mostraron abiertamente la potencialidad de la técnica y empujaron a otros laboratorios a introducirse en este campo. La difracción de rayos X aplicada a la determinación estructural de proteínas se convirtió, a partir de ese momento, en un puntal de la Biología Molecular, y desde entonces ha producido resultados cruciales para el desarrollo de esta disciplina, algunos de los cuales los trataremos en páginas posteriores. Es curioso que para conocer la estructura de la hemoglobina a resolución verdaderamente atómica hubiera que esperar muchos años, hasta el año 1984 en el que el grupo de Perutz determinara la estructura atómica a 1,75 Å de resolución en ausencia y presencia de O2. Las diferencias observadas entre las dos estructuras sirvieron para explicar los cambios que se producen entre las dos conformaciones de la proteína y su comportamiento aparentemente anómalo, que fue también caracterizado funcionalmente en detalle por el mismo grupo de Perutz. Los resultados obtenidos por este extraordinario científico con la hemoglobina fueron utilizados por Monod, Changeux y Wyman para desarrollar la teoría que Monod denominó del alosterismo, que trata de explicar las interacciones que se producen entre las proteínas, fundamentalmente entre subunidades de un mismo complejo, para regular su propio comportamiento. En retrospectiva, es admirable la inteligencia y el tesón de Perutz para superar los enormes problemas asociados a la determinación estructural. En esta época en que todos los científicos trabajamos para obtener resultados inmediatos, acuciados por justificar con ellos los dineros que nos han sido concedidos y por adelantarnos a nuestros competidores, cabe la pena preguntarse si habría un sitio para un problema como el que Perutz resolvió, y para un científico como él, fuera de su querido LMB. Muy distinto camino fue el que recorrió su compañero de fatigas en la determinación estructural de proteínas, John Kendrew, quien marchó a Londres con Bragg y allí acabó de refinar la estructura de la mioglobina a 2 Å de resolución. Sin embargo Kendrew decidió que ahí había acabado su vida estrictamente científica y que otros caminos se abrían para él, algunos muy importantes para el establecimiento en Europa de la Biología Molecular. Kendrew aceptó puestos de responsabilidad político-científica y desde allí impulsó la creación en 1963 de la European Molecular Biology Organization (EMBO), una organización paneuropea financiada por los gobiernos de los países miembros, encargada de promocionar la Biología Molecular y a los científicos que se ocupan de ella. Kendrew fue su primer presidente y alma mater durante los primeros años, y su ejecutoria no fue ajena a la fuerte implantación de esta disciplina en toda Europa, para la que consiguió que se creara en las cercanías de Heidelberg un laboratorio de Biología Molecular, el European Molecular Biology Laboratory (EMBL), del que fue su primer director y al que logró convertir con el paso del tiempo en uno de los centros más prestigiosos del mundo. Kendrew fue tambien el fundador y director durante casi toda su vida activa de la

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primera revista dedicada específicamente a la Biología Molecular, el Journal of Molecular Biology, más conocida como JMB, en la que se han publicado trabajos fundamentales para el devenir de esta disciplina. Curiosamente, es el título de esta revista y su gran influencia en la comunidad científica, especialmente durante los años sesenta, setenta y ochenta, lo que hizo popularizar el término “Biología Molecular”.

La secuenciación de la insulina Es preciso hacer notar que la estructura de la mioglobina fue resuelta a nivel atómico antes de que se conociera su secuencia aminoacídica, algo que es imposible de imaginar en la actualidad. La determinación de una proteína a resolución realmente atómica implica que, en principio, se pueden discernir las cadenas laterales de los aminoácidos que la componen y, por lo tanto, determinar su exacta naturaleza. La información obtenida por Kendrew y colaboradores sirvió a investigadores del grupo del Instituto Rockefeller que estaban trabajando en ese momento en la secuencia de la mioglobina, para confirmar los resultados obtenidos. Sin embargo, lo normal es que la secuencia de una proteína sea conocida antes que su estructura, y es que al comienzo de la década de los sesenta y gracias al desarrollo de muchas de las técnicas descritas anteriormente, la secuenciación de las proteínas comenzaba a ser una técnica al alcance de ciertos laboratorios. Sin embargo, para ello tuvo que producirse uno de los hitos en la historia de la Biología Molecular, la secuenciación completa de la primera proteína. Esta fue la insulina (Figura 12), y el artífice de tal hazaña, pues como tal se la puede definir si se tiene en cuenta la época (1953) y los medios con que se realizó, fue el químico inglés ­Frederick Sanger, quien trabajaba por entonces en el departamento de Bioquímica de la Universidad de Cambridge.

Frederick SANGER (1918-). © U.S. National Library of Medicine.

Cadena A           S ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑ S                            |                       | Gly‑Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn                5               |              10                15                 |    21                              S                                                    S                                 |                                                 / Cadena B                 S                                         S                        |                                           | Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala                         5                       10                               15                          20             25                             30

Su logro tuvo un valor fundamental no sólo por el hecho de la propia secuenciación, sino porque demostró de una vez por todas que las proteínas, en este caso la insulina, están compuestas de una única y determinada secuencia, que proporciona a la proteína su correspondiente función. A mediados de los años cuarenta, aunque la mayor parte de la

Figura 12. Secuencia aminoacídica de la insulina, que posee dos cadenas (A y B) de distinta longitud, unidas por puentes disulfuro.

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DNFB 

              R         O       H        R′                  |              ||             |                | +  H2N ‑ C ‑ C ‑ N ‑ C ‑ COOH                   |               |               H                 H          péptido

                  R            O         H         R′        H               |                ||   |     |        N ‑ CH ‑ C ‑ N ‑ C ‑ COOH |                                 |                        H

N-(2,4-dinitrofenil)péptido (N-DNF péptido) H2O

                  R            O          H               |                ||        N ‑ CH ‑ C ‑ OH                      R′                           | + +  H3N ‑ COO‑                          | N-(2,4-dinitrofenil)                      H aminoácido aminoácido sin clasificar (identificado) Figura 13. Reacción de marcaje del extremo amino-terminal con el reactivo DNFB.

comunidad científica pensaba que cada proteína poseía una única secuencia, algunos científicos apoyaban otras teorías tales como que lo importante era la composición aminoacídica y no la disposición de los aminoácidos en la secuencia peptídica. Incluso los había que pensaban que una proteína estaba compuesta de la combinación al azar de un determinado número y porcentaje de péptidos. Una de las teorías más populares, propugnada por los químicos Bergmann y Niemann, apuntaba que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos dispuestos de manera periódica, lo que proporcionaba a aquéllas la posibilidad de guardar información genética de manera directa. Esta era una teoría que se acomodaba muy bien a las ideas que imperaban en aquella época, que dictaban que las proteínas almacenaban la información sobre la herencia y, por lo tanto, no sólo realizaban su propia actividad sino que guardaban la información con la que autorreplicarse. La insulina, una hormona involucrada en importantes procesos celulares, se conocía desde los primeros años del siglo XX, y ya en 1935 se había observado, gracias a que se encontraban dos tipos de extremos amino libres) en un carbono alfa, que estaba compuesta por dos cadenas, con un número total de 777 átomos. Para conseguir la secuenciación de la insulina, Sanger y su grupo durante los años 1951 a 1953 tuvieron la inteligencia de combinar varias técnicas a su alcance. En primer lugar, ­Sanger buscó reactivos con los que marcar los aminoácidos libres de tal manera que pudieran ser detectados y analizados. Después de muchas pruebas, se inclinó por un compuesto desarrollado en la Universidad de Cambridge, el dinitrofluorobenceno (DNFB), que proporciona color al grupo amino libre, que es el que se encuentra en la posición amino terminal (Figura 13). Su segunda buena idea fue buscar maneras de hidrolizar los péptidos y para ello recurrió no sólo a proteólisis química sino biológica, pues ya para entonces habían sido caracterizadas un cierto número de proteasas y se sabía cómo purificarlas. Finalmente, Sanger puso a punto, para resolver su propio problema, las técnicas cromatográficas recientemente desarrolladas en la cercana Leeds por Martin y Synge, de las que hablamos anteriormente. Lo primero que hizo Sanger y su pequeño grupo fue utilizar este armamento tecnológico para confirmar la existencia de dos cadenas unidas por puentes disulfuro, que podían ser separadas por reducción de los citados enlaces (Figura 14). Sanger y su grupo separaron por cromatografía las dos cadenas y observaron que una de ellas tenía por aminoácido terminal la glicina, y la otra, la fenilalanina. Sanger purificó las dos cadenas por separado y, posteriormente, mediante hidrólisis fuerte, separó todos los residuos de cada una de las cadenas, lo que permitió conocer todos los residuos, pero no su orden. Por otra parte, Sanger y su grupo llevaron a cabo la hidrólisis parcial de las dos cadenas mediante proteasas (tripsina y quimotripsina), generando así varios fragmentos. Para cada fragmento se realizó una hidrólisis fuerte y una hidrólisis suave, generando varios dipéptidos y tripéptidos. Los péptidos fueron separados y purificados. Posteriormente se marcaron con DNFB para saber cuál era el aminoácido

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Identificación de las dos cadenas y sus extremos

Tratamiento de la cadena b con proteasas                                      T1                                             ↓             T2                        ↓ T3 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala                                    Q1                           ↑                Q2                     ↑                Q3 Separación de los 6 fragmentos (3 de tripsina y otros 3 de quimotripsina) y secuenciación de cada uno de ellos Secuenciación del fragmento T2 Hidrólisis fuerte

Hidrólisis suave

Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys

        Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys

               DNFB              ↓

                     Hidrólisis suave                    ↓

DNFB-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys

Gly-Phe

               Hidrólisis fuerte              ↓

                     DNFB                    ↓

DNFB-Gly Phe Tyr Thr Pro Lys

Gly es el extremo N-terminal del péptido

Se realiza lo mismo con los 6 fragmentos. Se obtiene información sobre la composición de residuos pero no de su secuencia.

Phe-Tyr-Thr

Pro-Lys

DNFB-Gly-Phe DNFB-Phe-Tyr-Thr DNFB-Pro-Lys

                     Hidrólisis fuerte                    ↓ DNFB-Gly DNFB-Phe DNFB-Pro Phe Tyr Lys Thr

Secuencia determinada hasta ahora Gly – Phe – Phe – X – Y – Pro – Lys X: Tyr   o   Thr Y: Thr   o   Tyr

Síntesis química de los dos tripéptidos DNFB-Phe-Tyr-Thr o DNFB-Phe-Thr -Tyr y comparación mediante TLC con el tripéptido experimental Secuencia completa Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys Solapamiento de los 6 fragmentos Una vez secuenciados los 6 fragmentos se estudian sus secuencias y sus solapamientos para conocer la secuencia de toda la cadena T1:     Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg Q1: Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Tyr Q2:                                                           Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe T2:                                                                                      Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys Q3:                                                                                                 Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala T3:                                                                                                                  Ala

        Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

Secuencia completa Figura 14. Resumen de los experimentos de la secuenciación de la insulina.

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amino terminal, lo que en el caso de los dipéptidos permitió conocer de manera directa cuál era el otro residuo en el lado carboxilo. En el caso de los tripéptidos, el marcaje hacía posible determinar el aminoácido terminal pero no el orden de los otros dos. Para resolver este problema, ­Sanger y su grupo sintetizaron químicamente las dos posibles combinaciones de tripéptidos, que se corrieron cromatográficamente frente al tripéptido problema, aprovechando el hecho de que sólo la combinación aminoacídica correcta posee una movilidad idéntica al péptido control. La parte más compleja fue la caracterización de los tres puentes disulfuro formados por las seis cisteínas presentes entre las dos cadenas de la proteína (véase figura 12). Al final, Sanger pudo determinar que dos de los puentes eran intercatenarios, mientras que el tercero se producía entre dos residuos de la cadena pequeña, la de glicina. Al mismo tiempo que Sanger, y utilizando sus mismas técnicas, el bioquímico americano Vincent du Vigneaud consiguió no sólo secuenciar dos pequeñas hormonas, vasopresina y oxitocina, sino posteriormente sintetizarlas y comprobar que producían el mismo efecto biológico que las purificadas de los organismos. A Vigneaud le concedieron el Premio Nobel de Química en 1955, y sólo después de que la Academia Sueca se diera cuenta de que el trabajo de Sanger, que Vigneaud había imitado en parte para realizar su trabajo, era mucho más complejo y relevante, concedió a Sanger el Premio Nobel de Química en 1958. En cualquier caso, los resultados de Sanger y du Vigneaud mostraron sin lugar a dudas que las proteínas estaban formadas por una única y definida secuencia, que proporcionaba a aquéllas su funcionalidad. El trabajo de du Vigneaud abría además nuevos horizontes, pues mostraba que estaba en principio en las manos de los hombres imitar a la naturaleza y quizás mejorarla. Habría que esperar tan solo veinte años para que la revolución biotecnológica confirmara tales augurios. En puridad habría que comentar que los métodos de Sanger eran muy artesanales y difíciles de aplicar en procesos “industriales”. Fueron la base, sin embargo, con muchas modificaciones, para las siguientes secuenciaciones de proteínas, cada vez más complejas. Así en 1959 se secuenció la ribonucleasa (124 aminoácidos), en 1960 la proteína estructural del TMV (158 aminoácidos) y en 1964 la tripsina (223 aminoácidos). Los siguientes años fueron testigos de la automatización de las técnicas de secuenciación gracias al desarrollo por parte del científico sueco Per Victor Edman de la técnica de secuenciación a partir del residuo amino terminal. Esta técnica fue la utilizada para secuenciar proteínas durante más de tres décadas, pero en la actualidad está siendo reemplazada por otra mucho más poderosa como es la espectrometría de masas, una técnica también antigua pero que, gracias a los nuevos desarrollos, sus posibilidades se nos antojan ahora mismo ilimitadas. Hemos visto cómo la caracterización de las proteínas, tanto a nivel secuencial como estructural, tuvo un fuerte empuje durante la primera década de los años cincuenta. Hasta los años cuarenta, las proteínas parecían “reinar” sobre la célula, pues no sólo eran las responsables de la 98

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Los ácidos nucleicos y la naturaleza del material hereditario

forma de ésta a través de las proteínas del citoesqueleto, sino que catalizaban las reacciones biológicas que se producían en su interior. Además todo parecía indicar que su propia secuencia polipeptídica, compuesta por una gran variedad de aminoácidos, permitía almacenar la información genética que posibilitara su perpetuación. Los azúcares y los lípidos tenían un claro papel secundario, y sólo un grupo de científicos mantenía viva la posibilidad de que unos compuestos descubiertos menos de cien años antes pudieran “robar” el papel de material hereditario a las proteínas. Estos compuestos son los ácidos nucleicos, y sobre ellos nos concentraremos en las siguientes páginas.

Los ácidos nucleicos y la naturaleza del material hereditario La nucleína Esta historia comenzó en 1869, en una época en que el estudio de las proteínas comenzaba a entrar en una época dorada. A la vez que los científicos habían comenzado a caracterizar su composición, habían empezado a tomar conciencia de su enorme variedad y de las múltiples funciones que parecían jugar en los seres vivos. Además, las distintas polémicas que se habían desarrollado alrededor de las proteínas habían atraído a su estudio a numerosos científicos jóvenes. Uno de estos era Friedrich Miescher. Miescher pertenecía a una conocida familia de Basilea y, en su universidad, su padre y su tío habían ocupado de manera sucesiva las cátedras de Fisiología y Anatomía. Miescher había sido un buen estudiante de Medicina en la universidad local y enfrentado a la difícil decisión sobre qué hacer con su vida, siguió el consejo de su tío, Wilhelm His, y se decidió a realizar estudios de Fisiología en la Universidad de Tubinga. Allí trabajó bajo la dirección de quienes muchos consideran el primer bioquímico, Felix Hoppe-Seyler (Hoppe por parte de su padre, Seyler por parte de un cuñado que le adoptó cuando, siendo muy pequeño, sus padres murieron). Hoppe-Seyler había estudiado Medicina en Berlín y la había ejercido durante años hasta que se le presentó la oportunidad de trabajar en el Instituto de Patología que se creó en Berlín para Rudolf Virchow. De allí paso en 1860 a Tubinga, donde comenzó a hacerse famoso por sus estudios con la hemoglobina. Desde su descubrimiento, esta proteína había sido asociada con las extrañas propiedades de la sangre que posibilitaban mantener en su seno una cantidad de oxígeno mucho mayor que en una solución acuosa, y Hoppe-Seyler fue uno de los primeros en realizar estudios para caracterizar las propiedades de la hemoglobina como transportador de oxígeno. Cuando el joven Miescher llegó a Tubinga en 1869 para trabajar con Hoppe-Seyler, se encontraba muy influido por las ideas de Virchow

Johan Friedrich MIESCHER (1844‑1895).

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Fotografía del laboratorio de Miescher en el castillo de Tubinga (1879).

sobre la célula y deseaba enfocar sus estudios sobre una de las estructuras celulares, el núcleo. Hoppe-Seyler, por otra parte, deseaba continuar los estudios con los elementos celulares de la sangre, así que orientó a Miescher para que se concentrara en el núcleo de los leucocitos. Lógicamente, el primer problema que suele tener un estudiante de doctorado que se enfrenta con un espécimen por primera vez es dónde conseguir material para estudiarlo. Miescher lo encontró en un hospital cercano donde, como en cualquier hospital del siglo XIX y antes de la introducción de métodos antisépticos, las infecciones estaban a la orden del día. Allí pudo Miescher disponer de grandes cantidades de pus, constituido en su mayor parte por leucocitos. Por la mañana iba al hospital, recuperaba las vendas retiradas a los infectados y las lavaba para extraer todo el pus posible. Después filtraba la solución para eliminar restos de las vendas y dejaba que las células sedimentasen en el fondo del tubo. Miescher observó al microscopio las células y determinó que el método utilizado las mantenía intactas. Los primeros resultados de Miescher mostraron también que un tratamiento alcalino suave de las células, seguido de una neutralización con ácido producía un precipitado blanco. Después, Miescher procedió a buscar maneras de separar el núcleo del resto de la célula y al final encontró un método que consistía en tratar las células con alcohol para eliminar los lípidos, y posteriormente degradar la proteína presente mediante el tratamiento con pepsina procedente del estómago de cerdos. Finalmente decidió someter al núcleo al mismo tratamiento alcalino suave aplicado a la célula entera, y observó el mismo precipitado blanco. Después de asegurarse de que este precipitado no se producía cuando el resto de la célula se trataba de la misma manera, dedujo que ese material, que se comportaba como nada conocido hasta entonces, procedía del núcleo. Miescher procedió a realizar análisis de los elementos constituyentes de este precipitado utilizando las modernas técnicas que Hoppe-Seyler había ya introducido en su laboratorio. Miescher encontró que la sustancia poseía, además de carbono, nitrógeno, oxígeno e hidrógeno, un alto porcentaje de fósforo (3%) y azufre (2%). Como sabía que las proteínas descritas hasta la fecha no tenían fósforo y eran susceptibles al ataque por pepsina, Miescher dedujo que lo que tenía en el tubo de ensayo no era proteína sino otra sustancia de naturaleza distinta, a la que llamó nucleína. En cualquier caso, el precipitado que preparó Miescher sí contenía restos de proteínas, pues hoy sabemos que los ácidos nucleicos no poseen azufre y sí las proteínas. Miescher abandonó el laboratorio de Hoppe-Seyler a finales de 1869 para continuar estudios de fisiología en la Universidad de Leipzig con Karl Ludwig, pero antes dejó a Hoppe-Seyler un manuscrito donde describía sus hallazgos. Hoppe-Seyler había fundado una revista, que él dirigía y controlaba, la Hoppe-Seyler Medizinisch-Chemische Untersuchungen (Investigaciones Médico Químicas de Hoppe-Seyler), la primera revista de carácter bioquímico que se creó, y que todavía existe, aunque en

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franco declive. Los resultados de Miescher causaron perplejidad en ­Hoppe-Seyler, quien decidió repetirlos para asegurarse de que eran correctos. El artículo de Miescher tardó dos años en ser publicado en la revista de Hoppe-Seyler, y apareció junto a otros dos de su grupo en el que confirmaban y ampliaban los hallazgos de Miescher. El comportamiento de Hoppe-Seyler no parece muy ético, pero al parecer Miescher estaba al tanto de todo y no puso objeciones. La publicación de Miescher supuso una cierta conmoción en la comunidad científica y otros investigadores, además del grupo de Hoppe-Seyler, se dispusieron a caracterizar la nueva sustancia, lo que inició un nuevo campo en la naciente Bioquímica. Miescher, entre tanto, había vuelto a Basilea, donde se le ofreció un puesto en la universidad. En el año 1872, a su tío Wilhelm His se le concedió la cátedra de Anatomía en la Universidad de Leipzig, y His aconsejó a las autoridades universitarias que asignasen una de sus dos cátedras, la de Fisiología, a Miescher (la Ciencia se desarrollaba a tal velocidad que las autoridades académicas comprendieron que una persona ya no podía impartir a la vez Anatomía y Fisiología). Desde su llegada a Basilea, y en condiciones bastante precarias, Miescher continuó con los estudios sobre la nucleína, esta vez utilizando esperma de salmón, que en aquella época previa a la industrialización se pescaba por miles en la misma ciudad de Basilea. Durante el proceso de aislamiento de la nucleína, de la que Miescher pudo obtener cantidades mucho mayores que en el caso del pus, consiguió descubrir dos nuevas sustancias. Una era lo que él llamo protamina, de carácter proteico, y que se unía fuertemente a la nucleína, y la otra una sustancia que daba la reacción típica de las bases xantinas, y que Miescher dedujo erróneamente que procedía de la degradación de la protamina. También realizó estudios con la yema del huevo y encontró allí otra sustancia con una gran cantidad de fósforo, por lo que incorrectamente dedujo que era otro tipo de nucleína. Hoy sabemos que esta molécula es una proteína, fosvitina, pero aquella hipótesis avivó la posterior polémica sobre la verdadera naturaleza de la nucleína.

Los ácidos nucleicos La existencia de la nucleína fue enseguida puesta en duda por otros científicos de Francia, Gran Bretaña y Alemania, algunos de la talla de Karl Nägeli. El principal argumento de todos ellos era que la nucleína no era sino proteína contaminada con sales de fosfato. No obstante, Miescher, persona tímida pero de fuertes convicciones y con una capacidad de trabajo descomunal, perseveró en el empeño, y consiguió extraer la protamina de la nucleína mediante distintos tratamientos. La nucleína así purificada no mostró en su análisis elemental trazas de azufre, por lo que Miescher concluyó que esta vez no había proteína en la solución. El trabajo de purificación era arduo, como lo demuestra una carta que Miescher escribió a su tío: 101

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“Todo el proceso de purificación tiene que ser completado en un día. Voy al laboratorio a las cinco de la mañana y trabajo en una habitación sin calefacción. Las disoluciones con las que trabajo se preparan al instante y se utilizan sólo durante los siguientes minutos. Los precipitados deben guardarse sólo durante unas horas hasta que se llega al precipitado en alcohol. Mi trabajo acaba muy tarde por la noche...”.

Las condiciones de trabajo eran muy duras, y es probable que Miescher contrajese así la tuberculosis que le llevó posteriormente a la tumba. Miescher presentó su último trabajo sobre la nucleína en 1874 y, de manera sorprendente, dejó de trabajar sobre ese tema, abandonando su caracterización y dejando para otros científicos el estudio de su papel en la herencia biológica, en el que él paradójicamente jamás creyó. Durante los siguientes años, se dedicó a estudiar la fisiología de la respiración, a realizar informes sobre nutrición para distintos organismos estatales y a la docencia, que le ocupaba muchas horas del día. El esfuerzo realizado durante esos años y su naturaleza débil le pasaron factura, muriendo en el balneario de Davos a los 51 años. Miescher fue un hombre humilde y poco dado a vanagloriarse de sus éxitos, y por lo tanto su popularidad en vida nunca fue muy grande. Quizás en las palabras de su antiguo jefe en Leipzig, Karl Ludwig, encontradas en una carta que le envió poco antes de la muerte de Miescher, se pueda resumir la importancia de su trabajo: “En los siglos venideros, los hombres que trabajen con las células recordarán tu nombre con agradecimiento como pionero en este campo”.

La confirmación de los resultados de Miescher vino de los trabajos del patólogo alemán Richard Altmann, quien en 1889 logró también separar las proteínas del resto de la nucleína, utilizando para ello métodos más perfeccionados que los de Miescher. A la sustancia libre de proteína la llamó ácido nucleico. La razón de este cambio de nombre quizás tuviera que ver con el hecho de que la nucleína era asociada fundamentalmente con el material original de Miescher, que contenía proteínas.

¿Es el ácido nucleico el almacenador de la sustancia hereditaria? La aparición de la nueva sustancia, fuese nucleína o ácido nucleico, coincidió con el furor de los estudios sobre el núcleo y, especialmente, sobre los cromosomas. Habíamos dejado nuestra historia sobre éstos en un punto en el que eran considerados como los claros depositarios de la sustancia hereditaria, y nos preguntábamos sobre cuál podía ser la naturaleza química de esa sustancia. ¿Están los cromosomas formados por proteína o por ácido nucleico? Antes de que este último apareciese en escena, las proteínas eran las claras candidatas a ejercer el papel de almacén de 102

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la herencia. La razón fundamental para ello tenía que ver con que eran las únicas sustancias cuya variabilidad, ya para entonces demostrada, podía sugerir una capacidad para almacenar la información genética. Sin embargo, la aparición del ácido nucleico produjo un cambio en estas ideas. La nueva sustancia, de carácter ácido, era teñida con los mismos tintes básicos que teñían los cromosomas. Además, las proteínas extraídas del núcleo tienen carácter básico, por lo tanto, no podían ser teñidas con esos tintes. Así, a pesar de que las dos sustancias se encuentran en el núcleo, Walther Flemming sugirió en 1882, en su libro Substancia celular, Núcleo y División Celular que la cromatina que había identificado por su coloración con los tintes podía ser la nucleína de Miescher. Sólo tres años más tarde, en 1885, Oscar Hertwig fue más allá y apuntó que la “nucleína es la sustancia responsable no sólo de la fertilización sino de la transmisión de las características hereditarias”. Y más tarde, en 1896, el genetista americano Edmund Wilson, uno de los primeros en apostar por los cromosomas como depositarios de la carga hereditaria, escribió que “la cromatina debe ser considerada como la base física de la herencia. Ahora se sabe que la cromatina es similar si no idéntica a una sustancia conocida como nucleína (...) cuyo análisis muestra una composición química definida de ácido nucleico (un ácido orgánico complejo rico en fósforo) y en albúmina (...). De esto se llega a la conclusión que la herencia puede ser ejecutada por la transmisión física de un determinado compuesto de padres a hijos”. Es sorprendente observar que, a pesar de que ­Wilson hablara de una nucleína mezclada con proteína, no tuviera ninguna duda de que el recientemente descubierto ácido nucleico fuera la sustancia que guarda la información sobre la herencia. Curiosamente, estas ideas chocaron frontalmente con las del propio Miescher, quien desechó para la cromatina un papel en la transmisión de la herencia. Ello habla bien a las claras de la honestidad científica de Miescher, a quien ciertamente le hubiese ido muy bien, siendo su descubridor, subirse al carro de quienes proponían a los ácidos nucleicos como mantenedores de la herencia. Por el contrario, Miescher opinaba que ésta era almacenada en las proteínas y en la enorme variedad que de su combinación se podía generar. Hasta su muerte, Miescher creyó que “su” nucleína tenía un papel secundario en el núcleo, una especie de almacenador de fósforo, necesario en distintos momentos del ciclo celular, y un protector del verdadero material hereditario, que no era sino una proteína poseedora de hierro, que él mismo denominó cariogeno. La tinción de la cromatina vendría, según Miescher, de la reacción de la tintura con el hierro que dicha proteína guardaba en su seno. En cualquier caso, Miescher desconfiaba de las técnicas de tinción y pensaba que era peligroso apoyar las ideas en este tipo de experimentos. En una carta de 1890 a su tío Wilhelm His, escribió: “Una vez más debo defender mi piel frente al gremio de tintoreros que insiste en que no hay nada más que cromatina en la transmisión de la herencia”. 103

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Estas palabras las escribió Miescher a contracorriente, en el momento álgido en el que los ácidos nucleicos parecían imponerse sobre las proteínas en la pelea por la preeminencia como depositarios del material hereditario. Sin embargo, pronto las cosas empezaron a cambiar, de tal manera que el mismo Wilson, que en 1896 había defendido a machamartillo el papel de los ácidos nucleicos, escribió en 1925: “Estos hechos ofrecen una prueba concluyente de que los cromosomas y la continuidad genética de éstos no dependen de la persistencia de la cromatina”.

¿Qué ocurrió para que hubiese un cambio tan brusco? Una de las razones para que los ácidos nucleicos comenzaran a perder peso fue el hecho, observado por muchos científicos y para el que no se pudo hallar explicación en aquel entonces, de que la cromatina perdía su capacidad de ser teñida durante ciertos momentos del ciclo celular. Esto, que ahora sabemos es debido a que ciertas proteínas se unen al ácido nucleico e impiden acceder a él a las tinturas, fue tenido en ese momento como una indicación de que perdían ese ácido nucleico, lo cual era imposible para una sustancia que almacenase la herencia, estable por definición. El mayor golpe al papel de los ácidos nucleicos vino, sin embargo, de algunos de los científicos que más hicieron por entender su composición y propiedades, así que vamos a adentrarnos un poco más en estos aspectos.

La naturaleza del ácido nucleico

Albrecht KOSSEL (1853-1927). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

Dos figuras dominaron la caracterización química de los ácidos nucleicos, hecho que se produjo fundamentalmente durante los últimos veinte años del siglo XIX y los primeros diez del XX. La primera de tales figuras se llama Albrecht Kossel y fue el hijo de un banquero de la ciudad hanseática de Rostock. Kossel estudió Medicina en su propia ciudad y en Estrasburgo, en esta última en la época en que, tras la desastrosa (para los franceses) guerra franco-prusiana de 1870, la ciudad alsaciana había pasado a manos del Kaiser y de su primer ministro, el todopoderoso Bismarck. Kossel recibió clases de von Baeyer y de Hoppe-Seyler, y tuvo como compañero a Emil Fischer, así que es difícil encontrar una concentración de talento más grande (difícil sí, pero no imposible, pues como hemos visto anteriormente, en una cabaña de un patio de la Universidad de Cambridge ocurrió algo parecido a un milagro). Kossel pasó a realizar su tesis con Hoppe-Seyler, primero en Estrasburgo y posteriormente en ­Tubinga, en el mismo ala del castillo donde Miescher, unos años antes, había descubierto la nucleína. Kossel empezó a trabajar con ella de una manera casual, y es que, como comentamos anteriormente, en 1871 y en el mismo número de la revista en la que Miescher daba cuenta de su descubrimiento en leucocitos humanos, aparecía otro artículo en el que Hoppe-Seyler y sus colaboradores confirmaban la existencia de la nucleí-

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na en células de levadura. El trabajo de Hoppe-Seyler fue atacado en los siguientes años por varios científicos en la creencia de que lo que había descubierto en levadura no era sino proteína contaminada con fósforo inorgánico. A la llegada de Kossel a Tubinga, Hoppe-Seyler encargó en 1878 al joven doctorando que confirmara sus resultados. Éste repitió los experimentos, esta vez con técnicas más avanzadas que las usadas nueve años antes, y confirmó que las células de levadura poseían una sustancia rica en fósforo y con las mismas características químicas que la nucleína de Miescher. Este fue el comienzo de la relación de Kossel con los ácidos nucleicos que ya no abandonaría hasta su muerte. Kossel comenzó a tratar de hidrolizar distintos ácidos nucleicos en busca de sus componentes. Lo primero que encontró es que todos parecían contener unas bases nitrogenadas, las llamadas hipoxantina y xantina, esta última ya descubierta anteriormente por Miescher en la nucleína. Kossel observó que la supuesta nucleína descubierta por Miescher en la yema de huevo no producía esas bases después de su hidrólisis, por lo que correctamente concluyó que aquella sustancia era en realidad una proteína, cuya hidrólisis él mismo ya había demostrado que no producía hipoxantinas. Las hipoxantinas y xantinas son compuestos heterocíclicos cuyo estudio había atraído a los mejores químicos de la época. Es interesante resaltar que la caracterización por parte de los fisiólogos de muchos de estos compuestos mediante degradación de las sustancias biológicas de las que formaban parte, corría pareja con su síntesis química por parte de los químicos orgánicos. El ácido úrico, la primera de esas sustancias en ser descubierta, había sido aislado por Carl Scheele cien años antes, y sólo en 1875 el químico alemán Ludwig Medicus había propuesto una estructura para el ácido úrico y para un grupo de sustancias análogas. El primero en caracterizar estas sustancias mediante su síntesis (en aquella época, la única forma de estar seguro de la estructura de un compuesto) fue Emil Fischer, quien en el periodo entre 1883 y 1900 sintetizó más de 130 de estas sustancias, a las que denominó bases púricas o purinas (Figura 15). El grupo de Fischer también descubrió que la hipoxantina y la xantina eran en realidad productos de la desaminación, durante la hidrólisis a la que se sometía al ácido nucleico, de la adenina y la guanina, respectivamente. La guanina había sido aislada de excrementos de pájaro (guano, de ahí su nombre) ya en 1844, mientras que la adenina no fue aislada del páncreas de vaca hasta 1885. Más tarde, Kossel, que iba creciendo en fama y estatura científica, y que había dejado el grupo de Hoppe-Seyler para dirigir el suyo propio en Berlín, continuó los experimentos utilizando el método que había desarrollado Richard Altmann en 1889 para obtener lo que éste denominó ácido nucleico, una nucleína completamente libre de proteína. Usando este material obtenido de células de timo, Kossel y su estudiante Albert Neumann lo trataron con un ácido fuerte y obtuvieron en 1893 una nueva base que denominaron timina, en honor al tejido de donde había sido extraída. La timina se mostró como una base de un tipo diferente a la

Emil FISCHER (1852-1919). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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PURINAS Adenina (A) (DNA/RNA)

Citosina (C) (DNA/RNA)

Guanina (G) (DNA/RNA)

PIRIMIDINAS Timina (T) (DNA)

Uracilo (U) (RNA)

Figura 15. Fórmula química de las cinco bases que se encuentran más comúnmente en los ácidos nucleicos, con sus respectivos símbolos (en paréntesis). Mientras que A, G y C están en ambos tipos de ácidos nucleicos (DNA y RNA), T sólo se encuentra en el DNA, y U sólo en el RNA. 

adenina y guanina, y su estructura no fue elucidada sino en 1903 por un químico del grupo de Kossel, Hermann Steudel. Un año después del descubrimiento de la timina, Kossel y Neumann descubrieron en el mismo hidrolizado del ácido nucleico de timo otro compuesto parecido a ésta y lo denominaron citosina. Kossel reconoció que estas dos bases formaban parte de la familia de bases que el alemán Albert Pinner había denominado pirimidinas. Hasta entonces se pensaba que el ácido nucleico de levadura contenía, como el de timo, la base timina. Sin embargo, el mismo tratamiento que en el ácido nucleico de timo dio lugar a la timina produjo en el de levadura el aislamiento de otra base, el uracilo. El descubrimiento lo realizó en 1901 el médico italiano Alberto Ascoli, famoso entre otras cosas por haber diseñado el primer método para el reconocimiento del carbunco o ántrax. Curiosamente, el uracilo fue sintetizado por el grupo de Fischer en el mismo año en que Ascoli lo aislara de una sustancia biológica. El descubrimiento de cuatro bases en el ácido nucleico de la levadura llevó a Kossel a pensar durante un tiempo que había cuatro tipos de ácidos nucleicos, cada uno de ellos compuesto por un tipo de bases, pero trabajos posteriores suyos y de otros le hicieron finalmente rechazar esta teoría. El trabajo de Kossel no se limitó a la caracterización de los ácidos nucleicos, sino que estudió otros compuestos que encontró unidos a éstos. Así, descubrió unas proteínas parecidas a las protaminas, de carácter muy básico, y que estaban fuertemente unidas al ácido nucleico. A estas proteínas las llamo histonas y durante bastantes años se ocupó en caracterizar los aminoácidos presentes en estas proteínas, lo que le llevó a descubrir en 1896 el aminoácido histidina, cuyo nombre viene de la proteína en la que fue descubierta. También contribuyó a caracterizar la na106

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turaleza del enlace peptídico y determinó que los aminoácidos son levógiros. Es curioso observar que a lo largo de su vida científica, Kossel siempre pensó que las proteínas que se encontraban en el núcleo, protaminas e histonas, eran desde el punto de vista biológico mucho más importantes que los ácidos nucleicos. Kossel fue un tipo afable, dedicado fundamentalmente a la Ciencia, y un firme partidario de su internacionalización. En el periodo previo a la I Guerra Mundial y durante ella, a diferencia de muchos de sus colegas, se negó a seguir los dictados de los políticos. En un momento determinado, se le pidió que declarase a la opinión pública que la alimentación de la población alemana era correcta, a pesar de las evidentes limitaciones forzadas el bloqueo de los aliados, pero él se negó: “Prefiero verme forzado a empuñar un fusil que decir que una mentira es verdad”.

Su actitud le acarreó problemas en su país, pero también el reconocimiento internacional una vez que la guerra hubo finalizado.

Phoebus Levene En los últimos años del siglo XIX, el conocimiento sobre la composición de los ácidos nucleicos fue ampliándose y con ello la percepción de su compleja composición. Es en este momento cuando la segunda figura científica a la que nos hemos referido al principio de este apartado comienza a agrandarse. Phoebus Levene nació en Rusia en el seno de una familia judía acomodada y con negocios textiles en San Petersburgo. ­Levene, cuyo verdadero nombre era Feodor (cuando se hizo ciudadano norteamericano, cambió su nombre a Phoebus pensando que era la traducción correcta de su nombre ruso), estudió Medicina en la prestigiosa Academia Médica Imperial de San Petersburgo, donde tuvo como profesor de Química a un famoso catedrático, Alexander Borodin, más conocido por sus composiciones musicales. A causa de los pogromos de 1891, la familia de Levene decidió emigrar a los Estados Unidos, donde Levene ejerció la Medicina para la comunidad judía de Nueva York, a la vez que realizaba investigaciones en el Instituto de Patología de esa ciudad. Allí contrajo la tuberculosis, y fue enviado por su padre a diversos sanatorios europeos, entre ellos el de Davos, en Suiza, donde estuvo un tiempo recuperándose. Mientras se encontraba en Europa, Levene realizó varias estancias con distintos grupos de investigación, entre ellos el de Kossel, y posteriormente en el de Emil Fischer en Berlín. En estos dos laboratorios Levene aprendió técnicas bioquímicas y de síntesis orgánica que le fueron fundamentales en su carrera científica, que transcurrió a partir de 1905 en el Instituto Rockefeller de Nueva York, del que llegó a ser director del departamento de Química. Los estudios de Levene tuvieron como fin la caracterización de los ácidos nucleicos, tanto en lo que respecta a la determinación de sus

Phoebus Aaron LEVENE (1869‑1940). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

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Walter A. JACOBS (1883-1967). © Edgar Fahs Smith Collection. University of Pennsylvania Library.

componentes como a la posibilidad de que hubiera distintas clases de ácidos nucleicos. Dos líneas de trabajo apuntaban a lo anterior. La primera tuvo que ver con el estudio de las bases de los ácidos nucleicos, y es que mientras que el grupo de Kossel había determinado que tanto la citosina como la adenina y la guanina se encontraban en todos los tipos de DNA caracterizados hasta entonces, Levene estableció en 1905 que el uracilo se encontraba en el ácido nucleico de levadura pero no en el de timo. La segunda línea de trabajo tuvo que ver con la caracterización de otro de los compuestos presentes en el hidrolizado de los ácidos nucleicos, los azúcares. En 1847, von Liebig había aislado del músculo vacuno un ácido que él denominó ácido inosílico, y que en 1896 Franz Hasier determinó que estaba compuesto de hipoxantina, fosfato y un azúcar de cinco carbonos, una pentosa. En 1893 y de manera independiente, los grupos de Kossel y del fisiólogo sueco Olof Hammarsten ‑este último fundador de la muy importante escuela sueca de Bioquímica y Biofísica‑ identificaron entre los productos de la hidrólisis del ácido nucleico de levadura, una pentosa, que Levene y su estudiante Walter Jacobs caracterizaron en 1909 como una ribosa. Este tipo de molécula es un azúcar que el grupo de Fischer, cómo no, había sintetizado en el año 1891. Mucho más tiempo tardó en ser aislado el azúcar del ácido nucleico de timo, que en principio se pensó que podía ser uno de seis átomos de carbono, una hexosa. El problema fue que los tratamientos conducentes a su aislamiento, los mismos utilizados con la ribosa del ácido nucleico de levadura, producían en aquél su completa degradación. Tuvo que llegar el año 1929 para que Levene y Jacobs, utilizando una hidrólisis enzimática del ácido nucleico y una suave hidrólisis del material resultante, pudieran aislar un azúcar, que resultó ser la hasta entonces desconocida 2‑desoxirribosa. Parecía, pues, clara la existencia de al menos dos tipos de ácidos nucleicos: el “animal” o de timo, y el “vegetal” o de levadura (en aquella época se pensaba que las levaduras pertenecían al reino vegetal). El error de asimilar los dos tipos de ácidos nucleicos a la distinta naturaleza de su fuente fue producto de las limitadas técnicas de aislamiento de aquella época, y al hecho de que el ácido desoxirribonucleico fuera mucho más abundante que el ribonucleico en las células de timo, mientras que lo contrario ocurriese en las células de levadura. Fueron necesarios muchos años para que los dos tipos de ácidos nucleicos, el de timo y el de levadura, pasaran a denominarse ácido desoxirribonucleico (ADN, o más conocido por sus iniciales en inglés, DNA) y ácido ribonucleico (ARN o RNA), en función del tipo de azúcar que poseían.

La hipótesis tetranucleotídica De lo apuntado anteriormente se deduce que los ácidos nucleicos están compuestos por una base, un azúcar y una molécula de ácido fosfórico. 108

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Kossel y Steudel confirmaron esta composición cuando obtuvieron guanina, fosfato y pentosa del compuesto que Hammarsten había aislado años antes tras hidrólisis alcalina del páncreas y que él llamó ácido guanílico. Levene y Jacobs, tras cuidadosos análisis de esos componentes, concluyeron que la pentosa del ácido guanílico era también una ribosa y que la unión entre ésta, el fosfato y la base se producía de la misma manera que en el caso del ácido inosílico. Mediante suave hidrólisis ácida del ácido nucleico de timo, Levene y Jacobs obtuvieron por una parte la base y por otra el complejo entre el azúcar y el grupo fosfato, mientras que la hidrólisis básica produjo ácido fosfórico y un complejo formado por el azúcar y la base, al que denominaron nucleósido. De estos resultados, los dos científicos coligieron que la estructura entre los tres compuestos químicos, a cuyo conjunto denominaron nucleótido, se producía de la siguiente manera: fosfato-ribosabase. Los nucleótidos parecían ser, pues, las piezas básicas que formaban los ácidos nucleicos, y se unían entre sí mediante la interacción de un grupo fosfato de un nucleótido con el azúcar del siguiente (Figura 16). Adenosina

Adenosina-5′-fosfato



Figura 16. Fórmula química del nucleósido adenosina (izquierda) y su nucleótido monofosfato, adenosina-5’-fosfato (derecha). Se muestra debajo el enlace fosfodiéster entre dos desoxirribonucleótidos de timina y citosina.

La caracterización final de los ácidos nucleicos correspondió al escocés Alexander Todd, nombrado barón por la Reina Isabel II, un gigante (también en lo físico) de la química británica. Desde su cátedra de Química Orgánica, primero en Manchester y luego en Cambridge, Todd 109

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mostró interés por la caracterización y síntesis de compuestos biológicos, entre los que merece citarse la síntesis del nucleótido trifosfato de adenosina, más conocido como ATP, y cofactores y vitaminas, como la flavina, la vitamina B1 y la E. Los trabajos de Todd en el campo de los nucleótidos fueron muy importantes, y además de la estructura del ATP, Todd y su grupo, utilizando una mezcla de técnicas químicas y biológicas, entre las que se incluía el uso de un enzima encontrado en el páncreas por Walter Jones, la ribonucleasa, pudieron finalmente caracterizar la forma en que el azúcar y las bases están unidas y cómo el grupo fosfato se une a las dos ribosas contiguas mediante un enlace diéster en 3’ y 5’. Tres generaciones de científicos, encarnadas en Kossel, Levene y Todd, fueron necesarias para una elucidación completa de la composición química de los ácidos nucleicos. Kossel y Todd recibieron sendos premios Nobel de Química por su labor en este campo (Kossel el de 1910, Todd el de 1957), pero no así Levene, cuya influencia en el campo fue mayor si cabe. Quizás fuera esta influencia la que jugara en su contra, y es que Levene fue el defensor más reputado de una hipótesis, la tetranucleotídica, de enorme peso en la comunidad científica durante los primeros cuarenta años del siglo XX. Todo comenzó a finales del siglo XIX, en 1893, cuando Levene y Neumann realizaron los primeros análisis cuantitativos del ácido nucleico y encontraron una cantidad equimolecular de bases púricas y pirimidínicas. Otros científicos obtuvieron parecidos resultados, lo que llevó a Levene a hipotetizar que las cuatro bases se encontraban en las mismas cantidades. Levene sugirió en 1909 que también el RNA poseía una cantidad equimolecular de bases, lo que fue confirmado por otros investigadores. La razón para que todos los científicos de la época llegaran a estas erróneas conclusiones tenía que ver con las pobres técnicas analíticas de la época, que estaban sujetas a un porcentaje de error muy amplio, y fueron en parte propiciadas por la necesidad de encontrar un orden en los resultados que sirviera para construir una teoría coherente. La que se originó de estos resultados fue, al parecer, formulada por primera vez por Kessel y Neumann, quienes sugirieron que el DNA y RNA no eran sino una solución de tetranucleótidos, idea a la que Levene se adhirió y se mostró como su mayor propulsor. La hipótesis tetranucleotídica nació a principios del siglo XX, y los descubrimientos científicos que determinaron la topología de la interacción entre los compuestos que daban lugar a los ácidos nucleicos, formaron parte de los experimentos conducentes a confirmar la validez de esta hipótesis. A nadie se le escapa que la visión de los ácidos nucleicos como pequeñas moléculas idénticas excluía la posibilidad de que aquéllos pudieran ser los depositarios de la herencia, y la comunidad científica volvió sus ojos con más fuerza si cabe hacia las proteínas. Los ácidos nucleicos fueron tratados durante la época en que la hipótesis tetranucleotídica triunfó, como posibles almacenadores de fósforo, de energía, como protectores de las proteínas en el núcleo, etc. 110

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Los ácidos nucleicos y la naturaleza del material hereditario

Aunque algunos historiadores de la ciencia han hablado de aquella época (1910-1940) como “negra” para el desarrollo de la Biología Molecular, si se mira hacia atrás con una cierta perspectiva es muy difícil que hubiera podido albergar otra hipótesis diferente. La idea de los ácidos nucleicos como pequeñas moléculas era inherente a las conclusiones de la teoría coloidal que por entonces reinaba en la Química y en la Biología, y que como hemos comentado anteriormente, dictaba, entre otras cosas, que las moléculas biológicas no podían formar grandes polímeros sino pequeñas moléculas que interaccionaban entre sí mediante enlaces secundarios, que eran los causantes del gran tamaño que algunas moléculas parecían tener. Lo peor del asunto es que, en el caso de los ácidos nucleicos, los defensores de la teoría coloidal tenían todo el derecho a pensar así, pues el tratamiento que de ellos hacían los químicos que intentaban caracterizarlos (hidrólisis ácidas, básicas, ebullición, etc.), no podían producir sino pequeños trozos. Eso sin contar, además, con la presencia de ciertos enzimas, desconocidos al principio, que degradaban los ácidos nucleicos en pequeñas moléculas, y que hoy llamamos DNAsas y RNAsas. Sea lo que fuere, el análisis químico de los ácidos nucleicos con los que se trabajaba en aquella época mostraba pesos moleculares del orden de 1.500 dalton, curiosamente el que uno esperaría de un tetranucleótido, lo que daba más fuerza a la teoría tetranucleotídica. Tuvieron que ocurrir varios hechos que mostraran que los ácidos nucleicos pudieran no ser las moléculas aburridas que parecían ser, para que la comunidad científica volviera a mirarlos con interés. El primero de tales hechos tiene que ver con la naturaleza y localización de los ácidos nucleicos. Dos tipos de ácidos nucleicos se habían caracterizado hasta la fecha, el DNA y el RNA, pero se pensaba que éstos eran únicos en los organismos en los que se encontraban: el DNA en los animales y el RNA en las plantas. Fue en 1922 Einar Hammarsten, sobrino de Olof Hammarsten, el primero en aislar RNA en el páncreas de cerdo, y dos años después, fue Robert Feulgen, el inventor de una tinción específica para el DNA, quien mediante su uso descubrió esta sustancia en las plantas. El segundo de los hechos que sugirió que los ácidos nucleicos eran moléculas más interesantes de lo que cabía esperar, vino de la determinación de su verdadero tamaño. Curiosamente, esta historia nació porque en 1924 Einar Hammarsten decidió estudiar las propiedades coloidales del DNA. Hammarsten pertenecía a un grupo de científicos suecos entre los que se incluyen, entre otros, su tío Olof, su hermano Harald, además de Ivar Bang, Torbjörn Caspersson, Theodor Svedberg y Arne ­Tiselius, que durante la primera parte del siglo XX formaron parte de una poderosa escuela de Bioquímica y Biofísica en el seno de la cual se desarrollaron una serie de técnicas como la ultracentrifugación y electroforesis, mencionadas en parte en páginas anteriores. Hammarsten se dedicó a purificar el DNA de la mejor manera posible, siguiendo las líneas que habían marcado Miescher y Altmann en el pasado siglo cuando por pri111

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mera vez se intentó caracterizar este compuesto, pero dejando atrás los fuertes tratamientos químicos usados para su identificación. Hammarsten volvió a los tratamientos suaves y a la incubación del material biológico a bajas temperaturas, consiguiendo de esta manera que las recientemente descubiertas DNAsas no atacaran el material. Años después, en 1934, su alumno Torbjörn Caspersson utilizó el DNA así tratado como material para realizar experimentos con filtros de tamaño conocido, y se encontró con que los ácidos nucleicos poseían un tamaño muy grande, mucho mayor que el de las proteínas por entonces estudiadas. Cuatro años después, otros experimentos mostraron claramente que los ácidos nucleicos eran, en realidad, grandes polímeros. Uno de estos experimentos fue realizado por Rudolph Signer en la Universidad de Berna, con material donado por Hammarsten. Curiosamente, Signer prepararía poco después su propio DNA, de una calidad mayor, y que sería fundamental para la determinación de su estructura, como después veremos. Lo que hizo Signer fue adaptar una técnica utilizada en la medición de coloides llamada birrefringencia de flujo, que permite medir de manera más o menos grosera, las dimensiones y la masa molecular de los compuestos. Signer encontró para el DNA un peso molecular entre 500 y 1.000 kilodalton, un peso enorme para lo esperado para un coloide. El mismo Levene, firme defensor, como la mayor parte de los científicos de aquella época, de la naturaleza coloidal de los ácidos nucleicos, utilizó la centrifugación analítica de Svedberg para confirmar los resultados de Signer. Pero Levene hizo otro importante descubrimiento, y es que los resultados obtenidos por esta técnica mostraron claramente que el DNA utilizado no estaba formado por moléculas de masa heterogénea sino que ésta era única (para las mediciones de la época). Así pues, el tamaño del DNA era mucho mayor del determinado hasta entonces y, además, era una única molécula. Esto debiera haber dado qué pensar a los científicos de la época, pero la mayor parte de ellos, siendo firmes partidarios de las proteínas como almacenadores de la sustancia hereditaria, pasaron por alto este descubrimiento... y es que no hay peor ciego que el que no quiere ver. En la Ciencia se tiende a acomodar los descubrimientos científicos a los dogmas establecidos y se requiere una mente fuerte, capaz de resistir la presión que, sin duda van a establecer sobre ella los poderes fácticos, para mantener las nuevas ideas vivas hasta que los mismos poderes fácticos las acepten y las hagan suyas... muchas veces literalmente. En el caso que nos ocupa, Levene simplemente modificó su idea sobre los tetranucleótidos para acomodarla dentro de esos largos polímeros, de tal manera que éstos seguían siendo las mismas aburridas moléculas formadas por la repetición regular de tetranucleótidos (Figura 17). En retrospectiva, Levene no tenía por qué cambiar de idea. Después de todo, la equimolecularidad de las cuatro bases en los ácidos nucleicos era un dogma que no había sido rebatido en ningún momento, fundamentalmente porque no se había desarrollado ninguna técnica que pudiese calcular con más precisión la composición química de los ácidos nucleicos. En Biología Molecular, como en la mayor parte de las disciplinas 112

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Figura 17. Estructura de un tetranucleótido tal como lo propusieron Levene y Jacobs.

científicas, el desarrollo de las ideas va asociado al desarrollo de las técnicas que las confirman o rechazan, y que a su vez sirven para formular nuevas ideas. Esto es lo que ocurrió con la hipótesis tetranucleotídica, cuya defunción acaeció fundamentalmente gracias a los descubrimientos del científico austriaco Erwin Chargaff. Éste utilizó una de las técnicas cromatográficas desarrolladas en Gran Bretaña por Martin y Synge, la cromatografía en capa fina, para mostrar que el porcentaje de la composición de los diferentes nucleótidos varía entre las distintas especies pero es constante dentro de cada una de ellas. Chargaff realizó también otros descubrimientos cruciales para el desarrollo de la Biología Molecular, pero esto es otro asunto que trataremos más adelante. A esta altura de la historia (principio de los años cuarenta), parecía claro que los ácidos nucleicos constituían la mayor parte del material cromosómico, que guardaba en su interior y de alguna manera desconocida la información sobre la herencia. Pero antes de describir los sucesos que llevaron a la identificación definitiva del DNA como el depositario de esa información, convendría antes de nada que echáramos un vistazo a lo que se sabía hasta entonces sobre la herencia.

El nacimiento de la Genética: sexo y recombinación El redescubrimiento de Mendel Habíamos dejado el estudio de los cromosomas en el punto en que éstos eran considerados como depositarios de la herencia. Las técnicas habían avanzado lo suficiente como para estudiar los cromosomas en más detalle. Así, los investigadores habían observado que durante la mitosis los cromosomas se duplicaban y se disponían en pares dispuestos paralelamente, excepto en un punto en el que se unían, el llamado centrómero. Posteriormente, parecían volverse más cortos y gruesos y, finalmente, utilizando unas estructuras que se habían formado a la manera de un huso, se separaban unos de los otros hasta lugares lejanos de la célula, que terminaba dividiéndose para formar dos células hijas con la misma cantidad de material cromosómico que tenía la célula madre antes de la mitosis. 113

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Los científicos habían observado también que durante la meiosis se producía una mitosis y una posterior división extra de las células para acabar dando unas células que disponían de la mitad de los cromosomas, las células germinales. El momento, pues, era el adecuado para adentrarse aún más en estas estructuras e intentar entender los procesos que se producían en su interior. El movimiento fue iniciado por tres artículos publicados a lo largo del año 1900 y de manera independiente por el holandés Hugo de Vries, el alemán Carl Correns y el austriaco Erich Tschermak. Los tres científicos realizaron experimentos de hibridación con plantas, y los tres llegaron a conclusiones parecidas a las que Mendel había llegado bastantes años antes. En el caso de Correns, incluso trabajó también con guisantes y, según su propia confesión, supo de los trabajos del abad moravo durante el periodo de escritura del artículo. En el caso de de Vries, el más famoso científico de los tres, acuñador del concepto de mutante y mutación y creador de la primera teoría de las mutaciones, escribió en su artículo sobre hibridación de plantas lo siguiente acerca del trabajo de Mendel: “Esta importante monografía es citada tan raramente que yo mismo no conocí de su existencia hasta después de que hubiera concluido mis propios experimentos y hubiera observado que ambos coincidían”.

Según lo que parece, los tres científicos pudieron ser económicos con la verdad, ya que estaban relacionados con investigadores que de seguro conocían el trabajo de Mendel, y es que éste, aunque no muy popular, sí que era conocido en ciertos círculos científicos europeos. A decir verdad, ­Mendel se había carteado con el famoso Nägeli durante bastantes años, aunque el científico suizo había hecho caso omiso de las ideas del abad. Sea lo que fuere, los tres científicos dieron posteriormente crédito a ­Mendel, quien fue reconocido como padre no sólo de las ideas que vamos a tratar, sino de parte del vocabulario utilizado posteriormente por la comunidad científica. Ésta estaba ya preparada para entender estos resultados y para asumir la existencia física del material hereditario y de su transmisión. La Genética, palabra creada en 1905 por el científico británico ­William Bateson, proveniente del griego genno (“dar a luz”), había nacido, y a su lumbre acudieron científicos provenientes de varias disciplinas. Uno de ellos fue el biólogo danés Wilhelm Johannssen, quien acuñó en 1909 el nombre de gen para nombrar a las unidades de la herencia. Johanssen también inventó los conceptos de fenotipo para describir la manifestación externa de un cierto carácter, y genotipo para definir la base genética de ese fenotipo. Los primeros resultados sirvieron para confirmar las teorías de Mendel, pero pronto se observó que la realidad era normalmente mucho más compleja. Entre los primeros en hacer notar que un determinado fenotipo pudiera no ser controlado por un solo gen estuvieron el americano William Castle, el anteriormente citado Correns, así como el biólogo sueco Herman Nilsson-Ehle, quien trabajando con semillas de trigo, observó que al mezclar plantas de semillas rojas con otras de semillas blancas, obtenía varios tipos de semillas atendiendo a su color. Este 114

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patrón de colores era mucho más complicado que el descrito por ­Mendel y sus sucesores, pero más parecido a los cambios que vemos en nuestra vida normal (por ejemplo, cuando un hombre negro se casa con una mujer blanca, o viceversa). Sin embargo, después de realizar un estudio estadístico sobre un gran número de muestras, Nilsson-Ehle se apercibió de que el porcentaje de cada uno de los tipos de semillas obedecía a las leyes de Mendel, asumiendo que fueran dos pares de genes los que controlasen el citado fenotipo. El genetista americano Edward East, que trabajaba con plantas de tabaco, confirmó los resultados de Nilsson-Ehle, pero llegó incluso más lejos, pues habiendo conseguido líneas puras de plantas durante muchas generaciones, y manteniéndolas en un ambiente estable de temperatura y humedad, etc., observó que las plantas comenzaban a variar su tamaño. East dedujo que las pequeñas mutaciones espontáneas se ajustaban a las mutaciones que Darwin preconizaba en sus trabajos. Muchos científicos se preguntaron entonces si las mutaciones descritas por East eran el motor de la selección natural y la respuesta vino dada de manera independiente por los científicos John B. S. Haldane y Ronald S. Fisher en Gran Bretaña, Sewall Wright en Estados Unidos y Sergei S. Chetverikov en la Unión Soviética. Todos ellos llegaron a la conclusión de que los trabajos de Mendel respondían a un modelo muy simple mientras que, en la vida real, el fenotipo está definido por multitud de genes, cada uno de los cuales puede ser ligeramente distinto en cada individuo, lo que da lugar, en una población tan grande como lo es la humana, a una enorme variabilidad genética capaz de dar respuesta a las condiciones impuestas por el medio ambiente. Así, si una determinada mutación produce ventajas a los individuos que la poseen, la ventaja será propagada rápidamente por toda la población. De acuerdo a este concepto, y en su Teoría general de la selección natural (1930), Fisher calculó que si una nueva mutación produjese un 1% de ventaja a un individuo sobre el resto de la población, esa nueva mutación sería transmitida a la población entera en unas 100 generaciones. Otra de las presuntas desviaciones de las ideas de Mendel fue apuntada también por primera vez por Correns y Bateson, quienes observaron que una serie de caracteres aparecían siempre juntos y nunca se segregaban. Este fenómeno, denominado de encadenamiento o acoplamiento, fue descrito posteriormente por otros científicos, entre otros el que podemos considerar como padre de la Genética, el americano Thomas Morgan.

Thomas Morgan y la mosca del vinagre Morgan era hijo de una familia patricia americana sureña descendiente de los emigrantes puritanos del Mayflower, e incluso uno de sus ancestros había escrito el himno de su país. Aunque en sus inicios se había centrado en el campo de la Embriología, en el que llegó a hacerse famoso, con el tiempo se mostró desencantado de una disciplina demasiado compleja para las herramientas que se manejaban en aquella época, y decidió pa115

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Thomas MORGAN (1866-1945). © Radial Press.

Mosca del vinagre (Drosophila melanogaster).

sarse al entonces naciente campo de la Genética tras conocer los trabajos de de Vries sobre mutaciones. Morgan se planteó desde un primer momento caracterizar el marco físico donde reside la información hereditaria, los cromosomas, y pensaba que en este nuevo campo sí se disponía de las herramientas necesarias para intentar conseguirlo. Desde el año 1904 hasta 1928, y desde su cátedra de Zoología en la Universidad de Columbia en Nueva York, realizó un trabajo monumental que le valió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1933. Morgan fue uno de los científicos más influyentes de su época, no sólo por sus resultados sino por sus escritos, plasmados en dos libros que terminaron por ser clásicos de la Ciencia del siglo XX, El mecanismo de la herencia mendeliana (1915) y Teoría de los genes (1926). Parte de su éxito, además de por su natural talento, le vino por dos importantes decisiones. La primera tuvo que ver con la acertada elección de sus colaboradores, algo en lo que cualquiera que trabaje en el mundo de la investigación sabe, reside una gran parte del éxito de todo científico. Entre sus estudiantes se contaron investigadores de la talla de Hermann Muller, Alfred Sturtevant y Calvin B. ­Bridges, quienes con sus primeros resultados vencieron las iniciales reticencias de Morgan hacia las teorías mendelianas. Estos y otros estudiantes llegaron al laboratorio después de escuchar las, al parecer, magníficas clases del científico y divulgador Edmund Wilson, del que hemos hablado anteriormente, compañero de Morgan en la misma universidad, quien abrió los ojos de muchos jóvenes sobre el maravilloso mundo que se le ofrecía a quien penetrase en el nuevo campo. La segunda decisión tuvo que ver con la selección del espécimen con el que trabajaría el resto de su vida, que no fue otro que la mosca del vinagre, también llamada Drosophila melanogaster (Drosophila “amante del rocío”, y melanogaster “estómago negro”). La idea de trabajar con Drosophila le fue sugerida por el científico William Castle, y pronto sus ventajas se hicieron evidentes. Éstas tienen que ver con la facilidad y economía de su mantenimiento, ya que pueden criarse en unas botellas sella­das a las que se les añade un sencillo medio de cultivo. Además, Drosophila posee una gran rapidez de crecimiento, pues tiene un ciclo vital de dos semanas. Otra ventaja de la mosca del vinagre reside en el pequeño número de cromosomas y en su gran tamaño, lo que facilitó su análisis al microscopio óptico, en el que aparecían como una serie de bandas alternadas claras y oscuras que permitían seguir con relativa facilidad los cambios de patrón cuando se producían las recombinaciones. Los estudios de Morgan llevaron al descubrimiento de que los genes son entidades físicas separables unas de otras, y a confirmar que están localizados en los cromosomas. El grupo de Morgan se dedicó a buscar mutantes y en el proceso confirmó la existencia de grupos de factores asociados como, por ejemplo, el color del cuerpo, de los ojos, etc., que Morgan explicó por la presencia de genes encadenados, asociados en el mismo cromosoma de una manera lineal. Morgan también se apercibió de que algunos cromosomas son transmitidos de manera diferente dependiendo del sexo de la mosca, y los denominó “cromosomas del sexo”.

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Estos son un par de cromosomas que ya desde hacía tiempo se había observado que, a diferencia de los demás pares, son distintos en los machos y en las hembras. En este par de cromosomas, los dos miembros no tienen la misma forma. Uno de ellos es común en machos y hembras, y se llama X por su forma. El otro miembro del par puede tener disposición de X en las hembras, o una forma parecida a la Y en los machos. Morgan se dio cuenta de que cuando se cruzan dos moscas, si los cromosomas sexuales del zigoto son XX, éste se convierte en hembra, y si son XY, se convierte en macho. Continuando sus estudios sobre mutaciones, en 1909 Morgan dio por casualidad con una mutación en una mosca macho que contenía ojos blancos, a diferencia de los ojos rojos del individuo silvestre. Morgan cruzó el individuo mutante con una hembra silvestre, y sus retoños tuvieron todos los ojos rojos, lo que sugirió que el gen que producía la mutación de los ojos blancos era recesivo. Sin embargo, cuando estudió la siguiente generación, observó que la mitad de los machos que nacieron (éstos, a su vez, eran aproximadamente la mitad de la población) poseían ojos blancos, mientras que todas las hembras tenían ojos rojos. Morgan reconoció enseguida que el gen que producía la mutación se encontraba en el cromosoma X, y que siempre que se encontraba en las hembras, su fenotipo era invisible por el hecho de ser recesivo (Figura 18). También



Figura 18. Experimentos clásico de Morgan (experimento de los “ojos rojos”), por el que se descubrió la presencia de un gen asociado a un cromosoma específico, el X.

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observó que los individuos mutantes tenían una vida más corta, y sugirió que había otras características asociadas al gen (u otros genes) que no eran observables. A estas características genéticas asociadas en forma de genes Morgan las denominó grupos encadenados, cuya existencia explicaba en parte por qué algunas mutaciones no se describían correctamente por las leyes de Mendel. Y era en parte porque había veces en que el comportamiento observado se desviaba ligeramente del patrón previsto por las leyes mendelianas. Morgan, de acuerdo con la evidencia obtenida por microscopía óptica en la que se observaba cómo los cromosomas se enroscan durante algunos momentos del proceso de meiosis, sugirió que esto podía ser debido a que, a veces, los genes encadenados o segmentos de éstos pueden segregarse de su cromosoma y ser transferidos al otro par. De la observación del fenómeno de recombinación llegó a la conclusión, lógica por otra parte, de que la frecuencia de recombinación entre dos regiones es directamente proporcional a la distancia entre ellas (Figura 19). Basándose en este simple razonamiento y mediante el análisis de miles de mutantes, uno de sus más directos colaboradores, Alfred Sturtevant, construyó en 1913 el primer mapa genético de uno de los cromosomas de Drosophila, al que siguió el de los otros tres (Figura 20). Es preciso hacer notar, sin embargo, que estos mapas no eran mapas de genes como los que se muestran en la actualidad, sino que localizaban en la secuencia lineal del cromosoma el origen de ciertos fenotipos que los investigadores podían describir.

Figura 19. Esquema simple de los experimentos de recombinación que realizó Sturtevant para producir los primeros mapas físicos de los cromosomas. Dados tres genes (a, b y c) dispuestos linealmente, la probabilidad de recombinación (intercambio de material entre dos cromosomas, en este caso representados por las líneas azul y gris) es más alta entre dos elementos más alejados (a y c) que entre dos más cercanos (a y b, ó b y c).

Los resultados del grupo de Morgan fueron muy discutidos en varios frentes, bien por aquellos científicos que no estaban de acuerdo en que los cromosomas fueran los depositarios de la información hereditaria sino simples almacenes donde ésta se guardaba, o por aquellos que opinaban que la información contenida en los cromosomas no se almacenaba de manera lineal. Sin embargo, el hecho de que este tipo de experimentos funcionase era una prueba de la disposición lineal de la información genética en los cromosomas, así que a los pocos años las críticas cedieron. Abundando en el concepto de linealidad, Morgan tuvo la intuición en 118

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5 caracteres

Frecuencias de recombinación

y

color de cuerpo amarillo

y/w

0,010

w

ojos blancos

v/m

0,030

v

ojos rojos

v/r

0,269

m

ala miniatura

v/w

0,300

r

ala rudimentaria

v/y

0,322

w/m

0,327

y/m

0,355

w/r

0,450

Mapa genético



Figura 20. Descripción de uno de los primeros mapas genéticos realizados por Sturtevant (1913). Se puede apreciar la disposición relativa de genes que producen los caracteres descritos. Los genes se describían entonces fundamentalmente por el fenotipo por el que eran observados.

1916 de que la información sobre la herencia se acumulaba en estructuras químicas lineales, y de que las mutaciones que en esta estructura se produzcan tienen un efecto en el producto final que estas estructuras generan: “En principio no hay razones para pensar que se puedan producir varias mutaciones en una misma región del cromosoma. Si pensamos que éste está compuesto de una cadena de partículas químicas, puede haber un número de recombinaciones posibles y cada uno de estos cambios puede generar una diferencia en el producto final de la actividad de la célula y, por lo tanto, a un nuevo mutante”.

En cuanto a la naturaleza de esa partícula química, Morgan siempre apostó por las proteínas como las moléculas almacenadoras de la información genética. No hay que olvidar que durante los primeros tres decenios del siglo XX, la época dorada de los trabajos de Morgan, la teoría tetranucleotídica estaba en su pleno apogeo, y lo que es peor, sin noticias de los experimentos que acabarían por desmontarla.

Muller y los rayos X Una de las más importantes contribuciones a la caracterización de la naturaleza física del material hereditario provino de los experimentos con rayos X realizados por Herman Muller. Éste nació en Nueva York, en el seno de una familia católica de inmigrantes alemanes. Desde su juventud tuvo fuertes convicciones marxistas lo que desde luego no le ayudó cuando, después de dejar el laboratorio de Morgan, buscó acomodo en la Universidad de Tejas, que terminó por abandonar en 1932. Después de pasar un año en Berlín, aceptó entusiasmado una invitación para realizar investigaciones en la Unión Soviética con Nicolai Vavilov, una de las grandes figuras de la genética soviética. Sin embargo, la Unión Soviética no resultó ser el paraíso que esperaba encontrar. La llegada de Muller 119

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

coincidió con las luchas de poder en los medios científicos entre la vieja guardia de investigadores profesionales, seguidores de las ideas mendelianas, y una nueva ola de científico-políticos, educados en el marxismo, ejemplificados en la siniestra figura de Trofim Lysenko, un científico mediocre pero un político hábil entre los círculos de poder. Lysenko usó con inteligencia una mezcla de trasnochadas ideas lamarquistas, que todavía atraían a una pequeña parte de la comunidad científica, con la retórica marxista, y logró convencer al mismísimo Stalin de la bondad de sus ideas para poder dar de comer sin problemas a la población soviética. Para poder calibrar su categoría intelectual del científico ucraniano, baste algunas de sus ideas sobre la herencia: “Desde nuestra concepción, el organismo entero consiste sólo en el cuerpo ordinario que todo el mundo conoce. No hay en ese organismo sustancia especial además del cuerpo ordinario. Pero en una pequeña partícula, hablando de manera figurada, cualquier gránulo, cualquier gota de un cuerpo vivo, una vez que está vivo, posee necesariamente las propiedades de la herencia, esto es, la necesidad de las condiciones para su vida, crecimiento y desarrollo”.

Como puede observarse, una escritura que sería la envidia de cualquier político. A pesar de su ignorancia, Lysenko ascendió hasta el círculo personal de Stalin y desde su puesto no dudó en recurrir a la eliminación, incluso física, de aquellos que se oponían a sus ideas y a sus ambiciones, y en el proceso destruyó toda la escuela genética rusa, en la que figuraban nombres como los citados Vavilov y Chetverikov. Durante los veinticinco años en los que permaneció en el poder como Presidente de la Academia de Ciencias Agrícolas, sus ideas delirantes, entre las que se incluía la colocación cada vez más cercana, y de manera gradual, de las plantas en los cultivos para así poder cultivar un mayor número de ellas, o el intento de aclimatar árboles frutales en regiones cada vez más frías, llevaron a la hambruna y la muerte a varios millones de rusos y ucranianos, y por extensión a otros millones de chinos, pues Mao Tse Tung decidió poner en práctica en China las ideas de Lysenko, con las mismas desastrosas consecuencias. Este es un curioso y terrible caso en el que se mezclaron la Ciencia y la Política, y tuvo derivaciones en el mundo occidental. Las ideas de ­Lysenko fueron rápidamente tachadas de erróneas por la comunidad científica internacional, y el aparato de la Unión Soviética tuvo que llamar a la obediencia a aquellos científicos que estaban en sus filas, pero la respuesta fue muy diferente en distintos casos. Así, mientras el ya citado Haldane, probablemente el mejor escritor de Ciencia del siglo pasado y comunista acérrimo, decidió defender las ideas provenientes de Moscú, otro comunista, el científico francés Jacques Monod se opuso vehementemente a lo que él consideraba una estupidez, lo que unido a otros problemas con la jerarquía de su partido, le hizo tomar la decisión de abandonarlo. 120

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En el caso de Muller, éste pronto se enfrentó a las ideas de Lysenko, y antes de verse empujado a la cárcel o a un campo de “trabajo” en Siberia, prefirió escapar de la Unión Soviética y se trasladó primero a Edimburgo y posteriormente a la Universidad de Indiana, donde desarrolló la parte final de su actividad científica. Ésta tenía como punto principal el uso de alta energía sobre el material genético. Aunque los rayos X y la radiación ultravioleta (UV) ya se habían utilizado sobre el material biológico anteriormente, Muller tuvo la inteligencia de utilizar esas energías de una manera cuantitativa para profundizar en la naturaleza física del material hereditario. En 1927 describió una técnica por la que los rayos X inducen mutaciones en la mosca del vinagre en una proporción muchas veces mayor que la que se encuentra de forma natural. Muller la utilizó para aislar varios cientos de mutaciones, una gran parte de las cuales mantuvieron el nuevo fenotipo en las siguientes generaciones. Estos resultado mostraban, sin lugar a dudas, que la información había sido afectada de alguna manera, pero también que ese cambio había quedado registrado y estabilizado dentro del material genético, cualquiera que éste fuera, lo que reforzaba más si cabe la existencia de un soporte físico para el material hereditario. Además, el tratamiento con radiación de algunos de estos mutantes consiguió en alguno de los casos una reversión del fenotipo de la mutación, lo que sugería que estas mutaciones podían afectar a pequeñas áreas del material genético. Sobre la naturaleza de este material, Muller también apostó por las proteínas, aunque ciertos experimentos más sofisticados realizados con radiaciones UV debieran haberle hecho reflexionar. Estos experimentos fueron realizados en 1941 por los científicos americanos Alexander ­Hollaender, Charles Emmons y Howard Greenstein, los cuales utilizando radiación ultravioleta de distinta energía pudieron observar que el mayor número de mutaciones se producía cuando se irradiaba el material con radiaciones de longitudes de onda cercanas a los 260 nm, allí donde más absorben los ácidos nucleicos. Posteriormente, los mismos investigadores trataron con el mismo tipo de radiación muestras de ácido nucleico purificado y pudieron observar cambios drásticos en las propiedades del material. Sin embargo, estos científicos no pudieron o no quisieron ver el significado final de sus experimentos, influidos probablemente por las ideas dominantes en esa época, e hipotetizaron que aunque el ácido nucleico fuera el absorbente de la radiación, la energía era transmitida a la proteína que era la que sufría los cambios que afectaban al fenotipo de la muestra. Nos encontramos a principios de los años cuarenta y ya para entonces se había demostrado que los ácidos nucleicos no eran tetranucleótidos, pero las ideas sobre la falta de variabilidad en la secuencia de los ahora grandes polímeros de nucleótidos persistían. Otros resultados que reforzaban el supuesto papel de las proteínas como soporte de la información genética tenían que ver con la variabilidad con que se encontraban en los cromosomas. En un artículo publicado en la misma época, el científico americano Daniel Mazia mostró que la matriz de los cromosomas estaba constituida fundamentalmente por 121

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

proteínas y que si el ácido nucleico era digerido, la estructura de aquéllos parecía permanecer intacta, lo que apuntaba a que las proteínas formaban el núcleo de los cromosomas. Incluso resultados obtenidos con virus parecían reforzar el papel de las proteínas. En aquella época estaba en auge el estudio de los virus, especialmente los que infectan a las bacterias, los llamados bacteriófagos, de los que tendremos tiempo de ocuparnos en profundidad más tarde. El mismo Muller había sugerido que los bacteriófagos, o fagos como también se les llama, no eran sino un receptáculo con genes que tenían como misión su autoperpetuación, pero que estos genes eran proteínas. Ya para entonces se había cristalizado un virus, el del mosaico del tabaco (TMV), y los análisis realizados en este virus y en otros mostraron que, mientras las cantidades de alguno de los aminoácidos variaban de uno a otro, la cantidad de fósforo ‑marca con la que entonces se detectaban los ácidos nucleicos‑, era casi idéntica en todos ellos, lo que apuntaba a que éstos eran, sobre todo, un material de soporte. Todo ello sugería en aquella época que el material genético no podía ser otro que las proteínas, cuya variabilidad garantizaba la existente entre los seres vivos. Sin embargo, mientras que las pruebas del papel de las proteínas como soporte del material hereditario parecían acumularse, en varios laboratorios, de manera callada y a lo largo de los años treinta y cuarenta, se estaban realizando los experimentos que conducirían a la destrucción de estas ideas, no sin una fiera resistencia por parte de unos y la indiferencia por parte de otros.

La naturaleza de la sustancia hereditaria La unión de la Bioquímica con la Genética A lo largo de los años treinta tuvo lugar una de las épocas doradas de la Bioquímica, en la que se caracterizaron muchos de los ciclos enzimáticos que hoy estudiamos en los libros de texto. Por otra parte, la Genética estaba alcanzando su madurez, y las ideas acerca de un soporte físico y lineal para los genes estaban ya firmemente establecidas en la comunidad científica. Sin embargo, no era tan evidente entre la mayor parte de los científicos cómo la información guardada en los genes controlaba o se convertía en actividad enzimática. Aunque de manera clásica se ha establecido que la unión entre la Bioquímica y la Genética se produjo en 1941 cuando George W. Beadle y Edward L. Tatum demostraron que la síntesis de los enzimas es controlada por genes, se puede buscar un precedente en los trabajos realizados a principios de siglo por el médico inglés Archibald Garrod, quien ya entonces mostró una relación directa entre genes y metabolismo. Trabajando como médico en el hospital San Bartolomé de Londres (aunque él se declarara científico y poco interesado en la parte médica de su profesión), Garrod observó que varios miembros de una familia 122

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sufrían de alcaptonuria. Esta enfermedad, cuyo origen se conocía desde 1859, tiene como principal síntoma el oscurecimiento de la orina al contacto con el aire. Hoy sabemos que la alcaptonuria se debe a la falta de un enzima que actúa en la descomposición del anillo bencénico del aminoácido tirosina. Después del estudio de varios pacientes, Garrod observó que éstos tenían una relación concreta entre sí (los padres de los enfermos eran primos hermanos). Como conocía los trabajos de Bateson y otros que habían popularizado las ideas de Mendel, se dio cuenta de que los enfermos seguían unas pautas hereditarias de carácter mendeliano, y concluyó ya en 1902 que “se puede concebir que la degradación del anillo bencénico en un metabolismo normal sea debida a la acción de un enzima especial, y que éste no lo posean los enfermos congénitos de esta enfermedad”. En aquel tiempo, otras enfermedades de naturaleza parecida tales como el albinismo, la pentosuria y la cistinuria estaban siendo caracterizadas, y Garrod tuvo la inteligencia de definirlas como errores innatos del metabolismo en un libro publicado en 1909, The inborn errors of metabolism, que tuvo una limitada influencia por ser los conceptos allí expuestos muy adelantados para la época que a Garrod le tocó vivir. Sí que fueron, no obstante, reconocidos por reputados científicos como Haldane y ­Hopkins, pero desgraciadamente no pudieron ser continuados por Garrod y otros debido a la falta de una población de enfermos adecuada y, sobre todo, a la complejidad del problema, que sobrepasaba a las técnicas disponibles en aquella época. Otros trabajos que apuntaban a la relación entre genes y enzimas fueron estudios sobre mutaciones fácilmente observables y controlables. Entre ellos merece la pena destacar los del genetista francés de origen ruso Boris Ephrussi con el americano George Beadle en relación al color de los ojos de Drosophila melanogaster. El problema de estos trabajos es que, aunque el sistema bajo estudio parecía sencillo, en realidad era muy complejo porque estos sistemas están influidos por multitud de factores.

Un gen – un enzima El avance fundamental en este campo vino de los experimentos realizados por George Beadle. Éste había nacido en Nebraska en 1903 en el seno de una familia de granjeros, y después de estudiar en la universidad laboral de su estado, todo en la vida le condicionaba para ejercer como agricultor. Sin embargo, la influencia de un profesor que detectó en ­Beadle dotes inusuales, le empujó a ampliar estudios de Genética en la Universidad de Cornell. De allí se trasladó al otro lado del continente, a ­Caltech, al grupo de Morgan, quien había dejado Columbia para ejercer de jefe del Departamento de Genética en la universidad californiana. Allí conoció a Boris Ephrussi, quien estaba realizando una estancia en el grupo de Morgan, y con él comenzó una relación científica que luego continuaría durante un año en el Instituto Pasteur. Ambos científicos obtuvie-

George W. BEADLE (1903-1989) en 1958. © Radial Press.

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Edward L. TATUM (1909-1975). © U.S. National Library of Medicine.

ron importantes resultados trabajando en Drosophila y realizando en las larvas de este organismo complicados experimentos de transplante de tejidos de ojo con una mutación que producía en el ojo un color distinto al normal, y en los que se seguía la influencia que sobre el color del tejido foráneo tenía el tejido que ahora lo rodeaba. Beadle y Ephrussi concluyeron que existía tal influencia y que ésta se debía a la ausencia en el tejido del organismo mutado de una serie de sustancias que aquél no producía. Estas sustancias fueron caracterizadas bioquímicamente gracias al trabajo de otros científicos, entre ellos Edward Tatum, entonces ya un prometedor bioquímico. Fue en aquella época cuando Beadle y otros empezaran a acariciar la idea de que cada uno de los pasos del proceso por el que las distintas sustancias biológicas eran transformadas químicamente estaba controlado por enzimas específicos que, a su vez, eran controlados por genes específicos. Sin embargo, Beadle era consciente de la dificultad de probar tal cosa, y es que los organismos que se utilizaban para estudios genéticos no habían sido estudiados bioquímicamente de forma adecuada, y por el contrario, los organismos cuya bioquímica era conocida, no estaban caracterizados genéticamente. Sin embargo, tuvo una idea que a muchos se les antoja genial, aunque realmente ésta no le vino como a Arquímedes durante un baño o a Newton debajo de un manzano, sino que fue el fruto de una serie de acontecimientos fortuitos. Beadle pensó que el desenrollamiento de esta complicada madeja no vendría del enfoque habitual, descubrir mutaciones en un organismo y perseguir sus efectos, sino del enfoque contrario, utilizar un ciclo de reacciones bioquímicas bien conocidas y forzar la aparición de mutantes que afectasen a éstas. Beadle acompañó a esta brillante idea con dos acertadas decisiones. La primera decisión tuvo que ver con el organismo en el que realizar los experimentos, que no fue otro que la levadura Neurospora, un organismo con un solo juego de cromosomas, y en el que la modificación en un gen no se ve enmascarada por la otra copia. Esta levadura había sido estudiada en mucho detalle por la escuela de Morgan, a la que Beadle había pertenecido. El grupo de Morgan había realizado un gran trabajo en la localización de genes en cromosomas, pero había ignorado cuál era la naturaleza de los genes y su mecanismo de acción. Este problema era, de cualquier modo, común a la mayor parte de los genetistas, y quizás fuera un problema inherente a la Genética de aquella época que, de manera consciente, había separado lo que le era más propio, la herencia (es decir, la transmisión de los genes) del desarrollo (es decir, el mecanismo de acción de los genes). El mismo Morgan fue consciente de ese problema, pero pensaba que el estudio del mecanismo de acción de los genes era entonces demasiado complicado para ser estudiado con las técnicas de aquella época. La segunda decisión acertada de Beadle tuvo que ver con la selección de Edward Tatum como su socio en estos experimentos. Tatum era un magnífico experimentalista y tenía amplios conocimientos en Neurospora.

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Beadle y Tatum se pusieron a trabajar, pues, en Neurospora, con la idea de generar mutantes y buscar aquellos que requirieran la presencia externa de alguna sustancia que se sabía era necesaria para ciertas reacciones enzimáticas, tales como las vitaminas B1 o la B6. Beadle y Tatum irradiaron cultivos con rayos X en presencia y ausencia de ciertos cofactores y moléculas que se sabía eran esenciales para diversos pasos en un determinado ciclo enzimático, por ejemplo el de síntesis del aminoácido triptófano (Figura 21). Después de un análisis exhaustivo pudieron demostrar que cada uno de los pasos de este proceso está controlado por el producto de un gen distinto.



Figura 21. Resumen de los experimentos clásicos de Beadle y Tatum.

Los resultados de ambos científicos tuvieron una resonancia inusitada, lo que les llevó a obtener el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1958. Su investigación tuvo consecuencias prácticas inmediatas y Beadle comenzó a recibir financiación de las empresas alimenticias para intentar realizar mejoras en las variedades de plantas comerciales. Beadle trabajó en este aspecto durante muchos años de su vida, de tal manera que ha sido considerado por muchos como el padre de la biotecnología moderna. 125

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¿Un gen = un enzima?

Arriba: colonias de la variante R (R36A) de Pneumococcus Tipo n., pequeñas y rugosas, sembradas en agar sangre. Abajo: colonias mucoides, suaves (S) y brillantes como las del Tipo nI original. Fotografía de Mr. Joseph B. Haulenbeek (Aumento: 3.500x). Reproducida del Journal of Experimental Medicine (1944) 79: 137-158. © Rockefeller University Press.

A pesar de que los trabajos de Beadle y Tatum supusieron, como dice el título de esta parte, la unión de la Genética con la Bioquímica, es preciso verlos en el contexto en el que se desarrollaron. Así, mucha gente en aquella época pensó que la hipótesis de “un gen ‑ un enzima” confirmada por Beadle y Tatum no sólo era cierta, sino que el gen era también el enzima, habida cuenta de la idea asentada en la mayor parte de la comunidad científica de que el material hereditario estaba formado por proteínas. Uno de los primeros indicios de que esta hipótesis no era correcta se obtuvo en 1928 y de manera accidental por el médico inglés Frederick Griffith, quien trabajaba en Londres en el Ministerio de Salud y se dedicaba a estudiar dos tipos de neumococo que habían sido caracterizados en 1921 como R y S por Joseph Arthur Arkwright, del Instituto Lister de Londres. La cepa del tipo R tiene la superficie rugosa (R proviene de rough, rugoso) mientras que la cepa del tipo S tiene la superficie suave (S proviene de smooth, suave o liso). Arkwright, e independientemente Fred Neufeld en Alemania, habían descubierto que mientras que la cepa R era inofensiva, la cepa S era muy peligrosa para el hombre y completamente mortal para el ratón. Hoy sabemos que la letalidad de la cepa S es debida a la presencia en su membrana de una capa de polisacáridos que engaña al sistema defensivo de la célula, algo que no ocurre con la cepa R. Griffith, por razones no muy claras, decidió realizar el siguiente experimento (Figura 22). Destruyó mediante un calentamiento moderado un cultivo de una cepa S, lo inyectó en ratones y observó cómo éstos no morían. Sin embargo, si este extracto modificado era acompañado por una solución de un cultivo de cepa R, en principio inofensiva para el ratón, éste moría indefectiblemente. Además, al aislar los neumococos del cadáver de los ratones, encontró que éstos eran del tipo S. Estaba claro para Griffith que el extracto de la cepa S contenía una sustancia que transformaba la cepa R en S, y que él llamó principio transformante. Como ejemplo de que el darwinismo a principios del siglo XX no había vencido completamente, Griffith pensó que la transformación de la cepa R en S se debía a una adaptación lamarckiana de la cepa R gracias al estímulo producido por los restos de la cepa S. En realidad, el fenómeno de la transformación había sido descubierto un par de años antes por dos científicos rumanos, Cantacuzene y Bociu, pero sus resultados no fueron tenidos en cuenta. En cambio, los resultados de Griffith, muy a su pesar porque era una persona muy tímida y retraída (excepto al parecer cuando se ponía al volante de su pequeño deportivo), causaron una cierta conmoción en la comunidad que trabajaba en el campo de los neumococos. Uno de estos científicos fue Oswald Avery, un bacteriólogo ya bastante conocido y que dirigía un grupo en el Instituto Rockefeller de Nueva York. Avery era una persona de carácter tímido, dedicado por entero a la

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Figura 22. Esquema del experimento clásico de Griffith.

Ciencia. Procedía de Canadá, donde su padre había sido pastor baptista. Su madre había muerto a causa de una infección provocada por neumococos, y Avery había decidido estudiar estos microorganismos en busca de una cura. Durante sus estudios, Avery había caracterizado la reacción de inmunidad contra el polisacárido del neumococo antes mencionado, siendo ésta la primera evidencia de que los anticuerpos se pueden generar contra sustancias de naturaleza no proteica. Además, había contribuido a clasificar las cepas de neumococos conocidas en cuatro tipos a partir de su reacción inmunológica. Avery pensó inicialmente que el principio transformante de Griffith podía ser alguno de los polisacáridos por él caracterizados. Sin embargo, los resultados del científico inglés mostraban que un calentamiento de los extractos microbianos por encima de los 80 °C destruía el principio transformante, lo que descartaba a los polisacáridos, ya que éstos resistían tratamientos térmicos incluso mucho más fuertes. Avery pensó que los resultados de Griffith eran incorrectos, y no se los creyó hasta que de manera independiente el científico alemán Fred Neufeld y su propio grupo los reprodujeron (en este último caso, a escondidas de Avery). Una vez 127

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Oswald Theodore AVERY (1877‑1955), el tercero desde la izquierda sentado, con la Colgate University Band en 1900, cuando ya era investigador senior. (Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

convencido de la bondad de los resultados de Griffith, Avery se dispuso a aislar y caracterizar el principio transformante. Por lo pronto, Avery y su grupo (Martin Dawson, Lionel Allowey y Richard Sia; en las primeras publicaciones no apareció el nombre de Avery porque éste jamás firmaba un artículo en el que no hubiera realizado alguna parte del trabajo) mostraron que no era necesario inyectar en ratones los extractos de la cepa R, y lo que hicieron fue añadir un extracto de cultivo de la cepa S tratado con calor a un cultivo de la cepa R para que ésta se transformara en cepa S, capaz, por supuesto, de matar ratones. Los siguientes pasos fueron intentar purificar el principio transformante, un arduo proceso que duró varios años y que realizó Avery con la ayuda de Colin MacLeod y Maclyn McCarty, y en el que sucesivamente desecharon las proteínas, los lípidos y los azúcares. El principio transformante se aisló, entre otras cosas, después de un paso de centrifugación, una de las técnicas introducidas en el Instituto, lo que permitía compactar al final del tubo los materiales sólidos, mientras que en el sobrenadante permanecía el principio transformante, que por análisis químicos se determinó que era ácido nucleico, aunque con un porcentaje mínimo (1%) de impureza proteica. Otros experimentos mostraron que no podía ser proteína, pues las proteasas no lo degradaban; ni azúcares, pues los enzimas que destruían éstos tampoco eliminaban el principio transformante. Finalmente, demostraron que tampoco podía ser RNA pues las RNAsas recientemente purificadas por Moses Kunitz en su propio Instituto tampoco degradaban el principio. Posteriormente se vio que las DNAsas impedían la actividad transformante. La conclusión del famoso trabajo de Avery, MacLeod y McCarty, publicado en 1944, es que el principio transformante era el DNA, y además éste poseía carácter genético, pues era capaz de exportar información (Figura 23). Los resultados de Avery no causaron inicialmente un gran impacto, con dos importantes excepciones que iban a ser fundamentales para el devenir de la Biología Molecular: el científico de origen austríaco Erwin Chargaff que trabajaba en Nueva York, y quien decidió dejar sus anteriores estudios y dedicarse a la caracterización de los ácidos nucleicos, con las implicaciones que ello conllevó y que discutiremos posteriomente; y un joven licenciado de Columbia llamado Joshua Lederberg, que había decididido dedicarse a la Genética de organismos simples como las bacterias para caracterizar el almacenamiento y transmisión de la información. Una de las razones por las que el trabajo de Avery no fue en principio muy popular era que había sido publicado en una revista orientada fundamentalmente al campo médico, y que no era por tanto muy leída por la comunidad científica interesada en los mecanismos de la herencia. Pero el problema fundamental tuvo que ver con el carácter de Avery, muy cauto en la discusión de sus resultados, pues temía que ocurriese lo mismo que le había ocurrido a Willstätter en los años veinte, cuando se empeñó en proclamar, basándose en resultados erróneos, que había encontrado actividad enzimática en preparaciones libres de proteína. El

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Figura 23. Resumen esquemático de los experimentos del grupo de Avery. Los experimentos, que en la práctica se realizaron durante varios años, tienen que ver con el desarrollo de técnicas que permitieron confirmar que el factor transformante no está constituido por azúcares, lípidos, proteínas o RNA, sino que lo está por DNA.

problema de Willstätter era que sus preparaciones no estaban realmente libres de proteína y contenían impurezas de ésta que producían la actividad enzimática. La cristalización de la ureasa por parte de Sumner y de la pepsina por parte de Northrop en el propio instituto de Avery evidenciaron lo erróneo de las tesis de Willstätter y pusieron freno por un tiempo a ideas heterodoxas como las que Avery parecía estar ahora apoyando. Además, los resultados de Avery encontraron fuerte resistencia dentro del propio Instituto Rockefeller, que apoyaba hasta entonces la teoría tetranucleotídica y el llamado dogma proteico de la herencia. La mayor resistencia la encontró en la figura de Alfred Mirsky, abogado muy activo de las proteínas como almacenadores del material genético, quien pensaba que el principio transformante se encontraba en ese 1% de impureza proteica que contenía el material purificado por el grupo de Avery. Además, experimentos similares con otros organismos realizados posteriormente por distintos grupos no reprodujeron los resultados 129

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de Avery. Esto condujo a que la transformación y el principio transformante fueran considerados como un caso muy particular. Avery fue forzado a jubilarse por la dirección del Rockefeller a los 65 años y no le fue concedido el Premio Nobel, a pesar de la importancia de sus descubrimientos, debido fundamentalmente a la resistencia de uno de los miembros del comité Nobel, Einar Hammarsten, él mismo un gran especialista del DNA, pero quien no creía que fuera el depositario de la herencia. La influencia de la teoría tetranucleotídica de Levene era muy fuerte todavía y los ácidos nucleicos eran tenidos como actores secundarios en el proceso de transmisión de la herencia. El ATP hacía poco que había sido caracterizada como la molécula universal de la energía por Fritz ­Lipmann (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1953), y ello llevó a pensar que quizás los ácidos nucleicos eran unos reservorios de energía en los cromosomas, prestos a entregarla en los procesos de replicación. Otro de los problemas que llevaba consigo el que el DNA fuese el material genético era cómo éste podía controlar la formación de la cápsula polisacárida. Según Avery, se requería un paso intermedio entre el gen y el azúcar que debía estar mediado por un enzima o proteína. Para los que apoyaban la hipótesis de que las proteínas eran los transmisores de la información genética era muy sencillo pensar que el gen, es decir la proteína, pudiera ser también el enzima, pero era mucho más complejo para los que apoyaban el DNA entender cómo éste traspasaba su información a la proteína para que a su vez esta última ejerciera su acción sobre el azúcar. Hay que decir que otros científicos comenzaron a confirmar los resultados de Avery. Los más sólidos provinieron de André Boivin y Roger Vendrely, del Instituto Pasteur, quienes reprodujeron los resultados de Avery en la bacteria entérica Escherichia coli (E. coli). Otros de los experimentos que vinieron a reforzar el papel del DNA en la herencia los realizó Rollin Hotchkiss en el propio Instituto Rockefeller. Hotchkiss, utilizando la recientemente purificada DNAsa, consiguió destruir el principio transformante y demostró, además, que la impureza proteica que Avery y otros habían encontrado en el DNA provenía de la degradación de la adenina a glicina. Sin embargo, el problema de la naturaleza del gen estaba asociado a la elucidación de su mecanismo de acción, y para los que apoyaban la idea de que el DNA era el material genético era imprescindible abandonar el concepto de que los genes actúan controlando directamente las funciones celulares. Un enfoque adecuado para estudiar este proceso tan complejo fue buscar un sistema donde al menos una de las dos tareas fundamentales del material genético, la replicación, pudiera ser estudiada de la manera más simple posible. Este sistema parecía ser el de los virus que infectan a bacterias, los bacteriofagos o fagos, los cuales habían sido considerados por algunos como genes en estado puro. Los trabajos con este sistema, los resultados que se obtuvieron y algunas de las personas involucradas en estas investigaciones resultaron fundamentales para el devenir de la Biología Molecular 130

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El grupo de los fagos La influencia del llamado grupo de los fagos viene dada, no tanto por la importancia de los resultados que obtuvieron, que sí fue grande en algunos casos, sino por el enfoque que dieron a sus estudios y porque de este grupo nació no sólo la genética de los fagos sino también la genética bacteriana. El alma y creador de este grupo de científicos, que no fue en ningún caso una estructura organizada, fue Max Delbrück. Éste pertenecía a una familia de gran tradición intelectual: era bisnieto del gran químico Justus von Liebig, sobrino de uno de los fundadores del Instituto Kaiser Wilhelm de Investigación Médica e hijo del famoso historiador Hans Delbrück. Delbrück estudió Física en Gotinga y realizó estudios de doctorado en Copenhague con Niels Böhr, y allí fue influido por las ideas del gran físico sobre los procesos biológicos. Delbrück volvió a Berlin en 1932 a trabajar en problemas de fisión nuclear con Lise Meitner y Otto Hahn, pero allí también contactó con un grupo de genetistas liderados por el científico ruso Nikolaï Timofeeff-Ressovsky. Éste y el físico alemán Karl Zimmer se habían interesado por los trabajos de Herman Muller, quien realizaba por aquella época una estancia en el laboratorio del genetista ruso, sobre las mutaciones en el material hereditario inducidas por fuentes de alta energía, y habían llevado ellos mismos a cabo bombardeos sobre material biológico con partículas de distintas energías. A ­Delbrück se le ocurrió que podían intentarse cuantificar los cambios observados en el material biológico. Así, los tres científicos se dedicaron a aplicar rayos X sobre poblaciones de Drosophila y a cuantificar posteriormente las mutaciones que aparecían en ellas. Variando la energía de la radiación y la temperatura a la que se llevaba a cabo el experimento, ­Delbrück pudo realizar cálculos sobre el tamaño de los genes, que estimó en unas pocas micras. Los resultados fueron publicados en una revista de poca difusión pero tuvieron un cierto impacto, especialmente entre los físicos interesados por la Biología, y es que este trabajo fue el primer intento de utilizar la Física cuántica para estudiar los procesos biológicos. Los resultados de este trabajo llegaron a oídos de Schrödinger, que era conocido de Delbrück, quien los citó en su famoso libro ¿Qué es la vida? Esto proporcionó cierta fama a Delbrück quien, influido por Warren Weaver ‑el director de la sección de Biología de la Fundación Rockefeller, que quería por entonces atraer a las universidades americanas a físicos y químicos interesados por problemas biológicos‑, había decidido alejarse de la asfixiante atmósfera de la Alemania nazi y trasladarse a los Estados Unidos. Allí visitó varios laboratorios, instalándose primero en la Universidad Vanderbilt para hacerlo posteriormente y de manera permanente en Caltech. Fue en esta última universidad, en una visita que realizó al laboratorio de Morgan, donde pudo conocer en cierta profundidad, gracias a un científico del grupo de Morgan, Emory Ellis, un sistema biológico mucho más simple que el de la mosca, y que le pareció ideal para el estudio de los procesos biológicos, en especial el de la replicación: el bacteriófago.

Max DELBRÜCK (1906-1981). © Radial Press.

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Frederick TWORT (1877-1950) y Felix D’HERELLE (1873-1949), codescubridores de los bacteriófagos.

Salvador Luria, a la derecha, con Max Delbrück durante una de las reuniones en Cold Spring Harbor, en 1953. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Primera reunión del curso de los fagos en 1945 en el Jones Lab, CSHL. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Los bacteriófagos habían sido descubiertos en 1915 por el microbiologo británico Frederick Twort, y un año después por el francocanadiense Félix D’Herelle. Mientras que el primero se limitó a su descripción y abandonó enseguida su estudio, el segundo continuó estudiando los fagos desde su puesto de director del Instituto Pasteur de París, llegando a caracterizar su ciclo lítico y a desarrollar muchas de las técnicas de crecimiento y contaje que aún hoy se utilizan. D’Herelle fue el que dio nombre a estos virus; los denominó bacteriófagos, es decir, comedores de bacterias. Este sistema viral infecta a las bacterias y se replica en ellas utilizando parte de su maquinaria. En aquella época, la naturaleza de la interacción de los fagos con las bacterias no era clara y una parte de la comunidad científica liderada por John Northrop, famoso por haber cristalizado el enzima pepsina, pensaba que la transformación supuestamente producida por los virus dentro de la bacteria no era sino una transformación autocatalítica producida por una proteína bacteriana que, por causas desconocidas, pasaba a ser activa. Durante varios años, Delbrück y Emory Ellis se dedicaron a caracterizar el crecimiento de los virus utilizando enfoques novedosos, entre los que se incluía un gran número de estudios estadísticos, para los que Delbrück estaba particularmente dotado. La categoría intelectual de Delbrück fue pronto tenida en cuenta entre sus pares y sus alumnos, quienes vieron en él a un científico excepcional, capaz de cuestionarse todo lo que otros daban por sentado. Su actitud ante la Ciencia era la de una continua búsqueda de la Verdad, pero al mismo tiempo, de las nuevas leyes que permitieran comprender mejor la complejidad de los sistemas biológicos. En las reuniones que él organizaba y en su grupo impuso la discusión continua sobre los temas de trabajo, en un ambiente muy relajado, que Delbrück había imitado de su estancia en el grupo de Böhr, y que en un principio chocó con el rígido sistema americano que entonces imperaba. Su encuentro con Salvador Luria fue fundamental para la creación del grupo de los fagos. Salvador Luria era un médico italiano procedente de una adinerada familia judía de origen sefardí. Luria había ejercido como radiólogo en Roma, pero la ciencia le atrajo más que la práctica de la medicina y marchó a París al Instituto del Radio cuando las leyes antijudías del régimen fascista se hicieron más opresivas, y allí fue donde le sorprendió la invasión nazi. Escapó en bicicleta a Marsella, donde embarcó para los Estados Unidos. Allí, con la ayuda de su paisano, el famoso físico italiano Enrico Fermi, consiguió una beca Rockefeller que le permitió permanecer en los Estados Unidos. Fue siendo profesor de la Universidad de Columbia cuando conoció a Delbrück, iniciándose así una asociación de gran influencia para el desarrollo de la Biología Molecular. De la colaboración de los dos científicos con el entonces director del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL), el genetista de origen croata ­Milislav Demerec surgió la idea de unas reuniones veraniegas que, en un clima desenfadado y comunicativo, y bajo la poderosa influencia de ­Delbrück, pronto se tornaron en una cita obligada para un grupo de

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científicos interesados en los mismos problemas. Este grupo, o parte de él, se convirtió en el llamado “grupo de los fagos”, o la “iglesia de los fagos”, como con cierta maldad definió al grupo André Lwoff, debido a la admiración y obediencia a su líder. Una gran parte de estos científicos ya trabajaban con este sistema, pues consideraban que poseía la suficiente sencillez como para ser abordado por las técnicas existentes en la época. Sin embargo, Delbrück puso cierto orden y coordinación en su estudio, sugiriendo que se trabajase con un número reducido de fagos. Hasta entonces cada investigador trabajaba con uno propio y experimentos parecidos daban lugar a resultados difícilmente comparables. Delbrück “impuso” que se trabajase con ciertos fagos que habían sido aislados por Demerec y que parecían comportarse bien en cuanto a crecimiento sobre su huésped, facilidad de contaje de las colonias por ellos producidas, etc. Los fagos fueron denominados T1 (tipo 1) a T7, y sobre éstos se realizó (y, de hecho, se sigue realizando) una gran parte de los estudios con fagos que tanta importancia han tenido en el desarrollo de la Biología Molecular. Delbrück y Luria propiciaron que se utilizasen cuantas técnicas biofísicas y bioquímicas estuvieran disponibles para caracterizar estructural y funcionalmente estos sistemas biológicos. Así, el mismo Luria comenzó a realizar experimentos de difracción de rayos X sobre muestras biológicas, y convenció a un joven microscopista, Thomas F. Anderson, para introducirse en el mundo de los fagos y a caracterizar su estructura y modo de actuación mediante esta por entonces revolucionaria técnica.

Bacteriófagos T4. Tinción negativa. Cortesía del Dr. José Ruiz Castón (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid).

Luria y la genética bacteriana El uso de los fagos para comprender los procesos biológicos empujó también al nacimiento de la genética bacteriana, que tanta importancia ha tenido en el devenir de la Biología Molecular. Aunque se habían realizado estudios para intentar comprender el ciclo vital de las bacterias, el hecho de que se considerase que éstas no se reproducían sexualmente hizo pensar que no seguían los mismos procesos de herencia que otros sistemas biológicos, e incluso se llegó a pensar que las bacterias no contenían genes. Esto último era sorprendente si se tiene en cuenta que los virus, mucho más simples que las bacterias, eran considerados un almacén de información genética. Las primeras evidencias de que esto no era así provinieron de estudios que demostraron la adaptación de las bacterias a distintas fuentes de alimentación, aunque en aquellos momentos aún se desconocía si esa adaptabilidad tenía un componente genético o no. También se descubrió por aquella época, por parte de los científicos franceses André y Marguerite Lwoff, que las bacterias poseían los mismos coenzimas para las reacciones enzimáticas que los organismos superiores, lo cual, junto con el descubrimiento de Beadle y Tatum de que a cada enzima le corresponde un gen, contribuyó a establecer que las bacterias contenían genes como cualquier otro organismo. Esta idea fue reforzada por los experimentos 133

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Salvador LURIA (1912-1991). © Radial Press / Bill Chaplis.

de Hermann Muller con rayos X, que mostraban que el crecimiento de las bacterias se veía afectado al aplicarles este tipo de radiación. Finalmente, los experimentos realizados en 1934 por I. M. Lewis mostraron que las variaciones metabólicas de las bacterias eran debidas, no a un proceso adaptativo, sino a uno selectivo de carácter hereditario. Es a Salvador Luria a quien, sin embargo, le corresponde el título de padre de la genética bacteriana, que comenzó a desarrollar a través de sus estudios sobre los fagos. Luria estaba interesado en primera instancia en conseguir poblaciones puras de fagos y cepas bacterianas resistentes a éstos con el fin de caracterizar su naturaleza. Uno de estos estudios, realizado en 1943 y denominado posteriormente como experimento de la fluctuación (Figura 24), le proporcionó una fama considerable, a la vez que acabó de una vez por todas con los vestigios de ideas lamarckianas que se mantenían por aquella época.

Figura 24. Esquema general del experimento de fluctuación de Luria y Delbrück. Añadiendo fagos a cultivos bacterianos se observó que la frecuencia con que aparecían colonias que resistían la infección del fago no seguía las leyes estadísticas, lo que indujo a pensar que los fagos no inducían las mutaciones en las bacterias, sino que estas mutaciones estaban ya presentes por azar en su material genético. 

Luria se dio cuenta de que si la resistencia de una bacteria a un determinado fago estuviera inducida por éste, el porcentaje de bacterias resistentes que se observaría en un cierto numero de experimentos independientes sería variable pero estaría de acuerdo a las leyes estadísticas. Si, por el contrario, el fago sólo ayudara a seleccionar las bacterias que ya están adaptadas a la resistencia, el número de bacterias resistentes en un numero de experimentos independientes variaría considerablemente, dependiendo de que la mutación que ofrezca resistencia apareciera antes o después del ciclo replicativo. El resultado experimental fue que las mutaciones no se producían de acuerdo a las leyes de Poisson, lo que sugirió a Luria que los fagos no inducían la mutación en las bacterias sino que estas mutaciones se encontraban ya en su material hereditario. El análisis estadístico de los resultados de Luria por parte de Delbrück per134

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mitió, además, poder conocer con exactitud la velocidad de mutación en los experimentos, un parámetro muy importante y muy utilizado posteriormente en los análisis genéticos. Los resultados científicos de Delbrück y Luria así como su influencia sobre la comunidad científica les hicieron merecedores del Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1969. El siguiente paso importante en la caracterización de la genética bacteriana fue el estudio de la reproducción sexual en las bacterias, que hasta entonces se pensaba que no existía, pues éstas parecían reproducirse por división de sus estructuras. El estudio de la posible transmisión sexual de las bacterias era un asunto polémico, y el primer gran paso en su caracterización lo dieron Joshua Lederberg y Edward Tatum. Lederberg se doctoró en Microbiología en Yale y pronto reveló su gigantesca figura. Los experimentos que le elevaron al Olimpo de la Biología Molecular y por los que consiguió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1958, se produjeron entre 1946 y 1952, recién salido de la universidad, y tuvieron su origen en la influencia que ejercieron en él los trabajos seminales de Avery, MacLeod y McCarty. Lederberg quiso en principio realizar en bacterias experimentos parecidos a los que Beadle y Tatum habían ideado para levadura, y para ello requería cepas de E. coli con mutaciones que necesitasen metabolitos externos para crecer. Tatum disponía de esas cepas y juntos se dispusieron a hacer tales experimentos, que concluyeron en menos de dos meses. La idea de Lederberg era incubar bacterias que pudieran crecer sin la necesidad de ese metabolito con bacterias que sí lo requerían. Si estas últimas sobrevivían significaba que las bacterias con la propiedad de crecer en ausencia de ese metabolito habían traspasado esa propiedad a las bacterias deficitarias de la misma. En pocas palabras, había ocurrido una transmisión de material genético, pues la posibilidad de producir de novo ese metabolito en la bacteria dependía de un enzima y, por lo tanto, de un gen. Los resultados fueron positivos y en una primera instancia fueron criticados por parte de la comunidad científica, entre otros por Delbrück y Lwoff, pues se pensaba que la propiedad que podían haber traspasado no provenía del traspaso de gen sino del propio enzima. Sin embargo, experimentos de microscopía electrónica realizados por Lederberg y su colaborador Max Zelle mostraron que se producían el contacto directo y la transmisión sexual o conjugación, entre bacterias. Lederberg era de la opinión de que lo que ocurría entre las dos bacterias era un intercambio recíproco de material genético. Sin embargo, los trabajos en Londres del científico irlandés ­William Hayes mostraron que en este proceso de recombinación genética bacteriana la transmisión no es simétrica sino que hay un donador (macho) y un receptor (hembra) de esta información. En retrospectiva, hay que decir que Lederberg tuvo mucha suerte en utilizar cepas de E. coli como la K‑12 en las que sí se produce conjugación (sólo un porcentaje pequeño de las distintas cepas de E. coli es capaz de hacerlo), y en trabajar con marcadores (genes) que estaban cercanos entre sí y que, por lo tanto, podían ser intercambiados con cierta frecuencia. Sin embargo, no se debe restar ni un ápice a la genialidad de

Joshua LEDERBERG (1925-2008). © U.S. National Library of Medicine.

Micrografía de dos bacterias durante el proceso de conjugación, donde se observa el contacto directo entre ambas.

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Figura 25. Esquema general del experimento de Jacob y Wollman. La idea es que si la conjugación bacteriana se consigue detener a distintos tiempos, y además se logra detectar la actividad producida por la presencia de los nuevos genes (C, B y A) introducidos por la bacteria donadora (Hfr) en la aceptora (F ‑), se puede realizar un mapa genético del genoma introducido.

los experimentos de Lederberg y Tatum y la influencia que éstos tuvieron sobre la comunidad científica. Los siguientes años fueron testigos de un enorme crecimiento de la genética bacteriana, entre otras cosas por las ventajas que su manejo conlleva (facilidad y bajos costos de uso, rapidez en la observación de los resultados, etc.). Así, en pocos años, diferentes investigadores demostraron la existencia de transmisión de información genética entre distintos organismos, y el mismo Luria observó en 1945 que, de la misma manera que se producían bacterias mutantes resistentes a la infección de fagos, había fagos mutantes que podían crecer en esas bacterias resistentes. Hershey y Delbrück mostraron independientemente en 1946 que si dos tipos de fagos con distintas mutaciones infectan a la vez a una bacteria, los fagos que se producen pueden transmitirse sus mutaciones (o perderlas). Pronto, y de la mano de investigadores como Seymour Benzer, se comenzaron a realizar análisis genéticos de las bacterias que sirvieron para acercar el estudio del gen al nivel molecular. En este aspecto, tuvieron un gran papel los experimentos basados en los fenómenos de conjugación y transducción, este último descubierto por Lederberg y Zinder. En el primer caso se encuentran los trabajos clásicos de François Jacob y Elie Wollman, quienes a principios de los años cincuenta y en el proceso de caracterizar la recombinación se dieron cuenta de que interrumpiendo el proceso de conjugación de una cepa bacteriana llamada Hfr (High frequency recombination por su alta frecuencia de recombinación) a distintos tiempos, la transferencia de material no sólo era distinta, sino que analizando los cambios que producían en el aceptor, se podía conocer la disposición lineal de los genes en el cromosoma bacteriano y, por lo tanto, realizar un mapa genético (Figura 25). Los resultados obtenidos por los dos investigadores permitieron, además, determinar que el genoma bacteriano es circular. Estos experimentos abrieron el camino del análisis genético de las bacterias, y fueron seguidos por los experimentos de transducción de Lederberg y Zinder en 1950, quienes descubrieron este fenómeno cuando intentaban observar en Salmonella typhimurium el fenómeno de recombinación genética descrito para E. coli. Experimentos realizados anteriormente habían mostrado que existían cepas de Salmonella que poseían distintas propiedades antigénicas y que éstas podían combinarse mezclando esas cepas. Lederberg era de la opinión de que estas combinaciones eran producto de recombinación sexual entre distintas cepas. Los primeros experimentos sugirieron que, aunque se producía transferencia de material genético, éste no tenía lugar por contacto directo, como él mismo y Zelle habían mostrado con el fenómeno de conjugación de E. coli. La transferencia se producía mediante un agente desconocido que podía pasar por filtros y que resistía el ataque de la DNAsa. Las propiedades de ese agente eran parecidas a las de los bacteriófagos, y pronto este tipo de transferencia se encontró también en E. coli. Sólo más tarde, con la caracterización de los bacteriófagos lisogénicos, se pudo explicar el fenómeno de la transducción. Los fagos lisogénicos son aquellos que en vez de reproducirse y lisar inmediatamente la bacteria

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huésped, integran su genoma en el de ésta. Lederberg y colaboradores demostraron que en este proceso, y cuando por distintas circunstancias se desata el ciclo lítico, el fago arrastra con su genoma un trozo del cromosoma bacteriano y lo incluye en el de la bacteria que infecta posteriormente, introduciendo en ella las propiedades que confiere ese nuevo gen (Figura 26).



Figura 26. Esquema de la transducción inducida por lisogenia de un fago. La bacteria transducida recibe, a través del fago, material genético de otra bacteria.

Este descubrimiento abrió un campo enorme para el estudio de los genes y su organización, y sirvió, utilizando el mismo enfoque realizado anteriormente por Jacob y Wollman, para conocer que los genes que están relacionados con un determinado proceso metabólico se encuentran ordenados en el cromosoma en el mismo orden en que las proteínas reguladas por éstos actúan sobre el proceso. Esto llevó a la lógica conclusión, como veremos posteriormente, de que existe una corregulación de estos genes. El estudio y el uso de los procesos de recombinación sirvió para realizar el primer mapa genético de E. coli, con mucho más detalle que el realizado en Drosophila con técnicas genéticas más clásicas, y contribuyó en gran medida al nacimiento y desarrollo de la Genética Molecular.

El experimento de la batidora Los experimentos anteriormente descritos, realizados fundamentalmente a finales de la década de los cincuenta, fueron generalizando entre la comunidad científica la idea de que el material hereditario está compuesto por ácido nucleico y, en particular, por DNA. No obstante, toda137

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Laboratorio de Alfred HERSHEY (1908-1997) en el CSHL en 1952. Hershey es el tercero por la izquierda y Martha CHASE (1927‑2003) es la segunda. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

vía se mantenían fuertes reductos de opinión que mantenían a las proteínas como almacenadoras del material hereditario. El experimento que probablemente puso fin a estas ideas lo realizó un miembro del grupo de los fagos y es quizás el trabajo más influyente que se produjo entre sus filas. El experimento fue llevado a cabo en 1952 Alfred Hershey junto con su técnico Martha Chase, y por ello recibió junto a Delbrück y Luria el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1969. Los tres eran los líderes del “grupo de los fagos”, y aunque Hershey era el menos carismático de los tres, su autoridad científica estaba ya establecida cuando en 1951 se trasladó al CSHL desde la Universidad de Washington, y realizó allí el más famoso de sus experimentos (Figura 27). Hershsey había sido uno de los primeros científicos en explotar el poder de los isótopos radioactivos en el campo de la Biología Molecular, y de ellos se sirvió en este experimento de diseño simple pero genial. Hershey había seguido los experimentos de Thomas Anderson en los que este microscopista había observado fagos rotos bajo choque osmótico y había concluido que el material que se desparramaba por toda la superficie era el que, liberado de la presión del interior de la precabeza, penetraba en la bacteria y producía la siguiente generación de fagos. La idea que tuvo Hershey fue la de cultivar el fago T2 en un medio enriquecido en los isótopos radioactivos 35S y 32P, que marcan específicamente a las proteínas y al DNA, respectivamente. Hershey y Chase procedieron a aislar los fagos y a infectar con ellos una solución de bacterias. El siguiente paso fue aislar los fagos que se habían producido después del ciclo infectivo y determinar en ellos la presencia de radioactividad, que estaría asociada al material genético que se hubiese transmitido de los fagos “padres” a los “hijos”. Dependiendo de que la radioactividad que se encontrase en los fagos fuese la producida por 35S o 32P, se podría deducir de ello que eran las proteínas o el DNA los transmisores de la información genética. Para que el experimento funcionase, había que eliminar del cultivo bacteriano los fagos que no habían contribuido a la infección y las “carcasas” de los virus que sí lo habían hecho, una vez que éstos hubieran inyectado el material genético en el interior de las bacterias. Los primeros experimentos no funcionaron hasta que ­Hershey y Chase se apercibieron de que no habían conseguido desprender de la pared de las bacterias los fagos que habían inyectado ya su genoma. La idea que tuvieron para resolver ese problema, y que da nombre al experimento, fue la de utilizar una batidora casera prestada por un miembro del laboratorio, para agitar el cultivo bacteriano y conseguir así desprender de las bacterias todos los fagos vacíos. Después de esta operación, encontraron que la nueva generación de fagos producida por el ciclo infectivo sólo contenía 32P, por lo que dedujeron correctamente que el DNA almacenado en el fago era el transmisor de la información hereditaria. Los experimentos de Hershey, como ocurrió con los de Avery, no fueron completamente limpios y, sin embargo, a diferencia de los de éste

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Figura 27. Esquema simplificado del experimento de la “batidora”. El medio en el que las bacterias fueron crecidas contenía bien 32P o 35 S, de tal manera que el virus tenía marcado bien su DNA (el DNA tiene fósforo pero no azufre) o bien la cubierta proteica (los aminoácidos, salvo muy contadas excepciones, no contienen fósforo y sí azufre). Después de que los fagos infectasen las bacterias, los dos científicos consiguieron desprender las carcasas de aquellos mediante una fuerte agitación con una batidora. Una posterior centrifugación permitió separar las carcasas de bacteriófagos de las bacterias. La purificación de los fagos producidos presentes en el interior de las bacterias mostró que contenían 32P pero no 35S. Esto indicaba claramente que el material que se transmitía de una generación a la siguiente era el DNA y no la proteína.

último, fueron aceptados rápidamente por la comunidad internacional. ¿Por qué esa diferencia de trato? Porque en los ocho años que transcurrieron entre los dos publicaciones, la mayor parte de los científicos estaban ya completamente dispuestos a aceptar la idea de que el DNA era el almacenador de la sustancia genética. Otros resultados vinieron a inclinar la balanza más si cabe a favor del DNA. 139

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Chargaff y la complementariedad de las bases Como ya hemos comentado anteriormente, los trabajos del grupo de Avery ejercieron una profunda impresión en un científico austríaco que por entonces trabajaba en la Universidad de Columbia. Erwin Chargaff había realizado sus estudios universitarios en la Universidad de Viena, y después de varias estancias postdoctorales en Yale, París y Berlín, emigró definitivamente a los Estados Unidos cuando se hizo evidente que sus orígenes judíos le iban a deparar un negro futuro en Europa. Chargaff era un bioquímico muy meticuloso y durante la segunda mitad de los años cuarenta y en colaboración con su estudiante postdoctoral Ernst Vischer, desarrolló métodos de hidrólisis completa del DNA y perfeccionó la cromatografía en papel con el fin de separar y cuantificar de la mejor manera posible las bases que constituyen el DNA. Chargaff y su grupo realizaron cuidadosos análisis del DNA de varios organismos, comenzando con el bacilo de la tuberculosis pero utilizando también varios organismos eucariotas, y de sus estudios se obtuvieron dos conclusiones muy importantes, que fueron pronto denominadas reglas de Chargaff. La primera es que, para todas las especies estudiadas, la concentración de guanina (G) iguala a la de citosina (C), mientras que la de adenina (A) es similar a la de timina (T). En otras palabras, la suma de las bases púricas (A y G) es siempre igual a las de las bases pirimidínicas (C y T). La segunda de las conclusiones es que el porcentaje de las bases A y T (y, por ende, el de las bases C y G) es distinta para cada especie. 1) A + G = C + T en todos los DNAs 2) (A + T)  /  (C + G) varía en el DNA de cada especie

Erwin CHARGAFF (1905-2002). © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

De las citadas reglas, la primera implicación biológica que se extrae, y que el mismo Chargaff se encargó de proclamar, es que la teoría tetranucleotídica apoyada por Levene y otros y que postulaba que el DNA es un polímero de CGAT, era incorrecta. Hay quien ha sugerido que Chargaff tuvo suerte en utilizar como primer organismo de estudio el bacilo de la tuberculosis y no E. coli. De haber usado este último, que entonces comenzaba a popularizarse, hubiese llegado a la conclusión, porque es así en este organismo, de que la cantidad de las cuatro bases es la misma y que, por lo tanto, la teoría tetranucleotídica era correcta. En cualquier caso, todas las ideas remanentes acerca del papel secundario del DNA se derrumbaron definitivamente. La segunda implicación biológica parte de la igualdad en el número de las bases A y T, y de C y G, lo que sugiere una complementariedad y un posible apareamiento entre ellas. Desgraciadamente, Chargaff nunca llegó a apercibirse del significado biológico de este hecho, que sólo fue utilizado correctamente por Watson y Crick en la construcción de su modelo atómico del DNA. El científico austríaco, un hombre extraordinariamente culto y de rápido ingenio, siempre se mostró resentido por ello, a la vez que atacó sin descanso la forma de hacer Ciencia propugnada por Watson y Crick.

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Los resultados de Chargaff fueron acompañados en la misma época por los obtenidos por los citólogos franceses André Boivin, y el matrimonio Roger y Colette Vendrely que, a su vez, demostraron que el DNA siempre se encuentra en el núcleo en cantidades constantes para cada especie, excepto en las células germinales, que poseen la mitad de la cantidad de DNA que las otras células del organismo. Estos resultados y otros terminaron por desmontar la teoría tetranucleotídica de Levene y el papel de las proteínas como transmisores de la información. El campo estaba ya abonado para que los científicos inquirieran sobre la estructura del DNA con el fin de conocer en primera instancia el mecanismo que permite el almacenamiento de la información en ese largo polímero. La determinación de la estructura del DNA allanaría, sin duda, el camino que llevaría a desentrañar el mecanismo de transmisión de la herencia, y por otra parte, a penetrar en el que permite transformar la información almacenada en el DNA en sus ejecutores, las proteínas. Hoy sabemos que mientras que el primero de los caminos se recorrió casi inmediatamente, por lo menos en términos conceptuales, el segundo se mostró mucho más complejo y tardó al menos diez años en ser desentrañado en sus instancias básicas. Las herramientas para lanzarse a tamaño desafío estaban al alcance de los científicos. Nos encontramos en el inicio de la década de los cincuenta, y la difracción de rayos X, si bien todavía no había permitido la determinación estructural de estructuras biológicas, sí que había sido usada para modelizar las unidades básicas de las proteínas, la hélice α y la lámina β. ¿Por qué no ser usada de la misma manera para la determinación estructural de un polímero que había sido ya reconocido por Astbury como una estructura ordenada en el espacio? Por otra parte, la Química y la Bioquímica habían generado la suficiente información como para conocer en detalle las propiedades de sus moléculas constituyentes. Sólo faltaba, pues, quien usara todo este armamento de la manera más conveniente. Quien lo consiguiera obtendría, sin duda, uno de los mayores “botines” científicos del siglo XX y, sin saberlo, daría nacimiento oficial a una de las disciplinas de más empuje del siglo XX: la Biología Molecular.

La determinación de la estructura del DNA Este episodio es el momento culmen de la historia de la Biología Molecular, el momento en el que ésta adquiere su mayoría de edad y pasa a ser considerada como disciplina separada de todas las otras que han influido y guiado su camino. La determinación de la estructura del DNA es el triunfo del reduccionismo y de todos aquellos que siguieron esa senda para intentar entender los procesos biológicos, y es que no hay ejemplo más bello que muestre cómo de la estructura de una molécula se puede inferir alguna de sus funciones, como es, en este caso, la replicación del material hereditario. 141

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Mucho se ha escrito y hasta novelado, ya sea por los propios autores o por los estudiosos de la Biología Molecular, sobre los dos años en los que se desarrollaron los hechos que llevaron a la determinación de la estructura del DNA. En esta historia a veces parece haber buenos y malos, gente ambiciosa y episodios en que los escrúpulos intelectuales parecen haberse dejado a un lado. En cualquier caso, es una historia apasionante, no sólo por el premio en juego sino por la competición que se desarrolló entre tres laboratorios, el LMB de Cambridge, el de biofísica del King’s College en Londres y el de Caltech en California, aunque en el último caso la competición no se percibiera. Como ya se describió anteriormente, los primeros intentos documentados de caracterizar la estructura del DNA correspondieron al grupo de Astbury en Leeds, en 1938, quien, utilizando DNA proporcionado por el biofísico sueco Hammarsten, realizó los primeros difractogramas de fibras de DNA. Basándose en esos estudios, Astbury y su ayudante Florence Bell propusieron para el DNA una estructura helicoidal de una sola hebra con los nucleótidos dispuestos de manera perpendicular al eje longitudinal de la hebra, y con una separación entre aquéllos de 3,3 Å. La estructura propuesta por Astbury se ajustaba muy bien a las medidas obtenidas mediante diversas técnicas por los biofísicos suecos Hammersten y Caspersson, que apuntaban a largos oligómeros. Astbury, quien siempre había opinado que el DNA tenía un papel secundario respecto a las proteínas, apuntó que el DNA no tenía por qué estar compuesto por cuatro nucleótidos en relaciones equimoleculares. Sin embargo, y a pesar de lo prometedor de su trabajo, Astbury abandonó paulatinamente su trabajo con el DNA al no conseguir apoyo económico por parte de las autoridades científicas.

Londres Los trabajos sobre el DNA fueron continuados en Londres por Sven ­Furberg, quien en 1946 trabajaba en el grupo de Bernal en el Birbeck College de Londres. Furberg era un estudiante de doctorado noruego que, en el plazo de unos pocos meses de trabajo, había conseguido determinar la estructura del núcleosido citidina, una hazaña para la época. El trabajo con nucleósidos le llevo a interesarse por la estructura del DNA. Utilizando la estructura de la citidina ‑en la que se observaba que la base estaba en disposición perpendicular al azúcar‑ y los conocimientos de la época, Furberg hipotetizó para el DNA una estructura de hélice formada por una hebra. Su trabajo no se publicó inicialmente sino que quedó registrado en su tesis doctoral, que defendió para regresar posteriormente a su Noruega natal. Sólo años después, en 1952, cuando el interés por el DNA aumentó como consecuencia de los experimentos realizados por el grupo de los fagos, Furberg creyó interesante publicar sus hipótesis, en la que Bernal, agobiado por otros asuntos, nunca mostró especial interés, como luego reconocería él mismo con cierta amargura. 142

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Hubo que esperar hasta 1950 para que los estudios estructurales relacionados con el DNA iniciaran su empuje definitivo, de la mano esta vez de Maurice Wilkins, uno de los principales protagonistas de esta historia. Maurice Wilkins nació en Nueva Zelanda en 1916, desde donde a los seis años marchó para Birmingham. En Gran Bretaña se licenció en Ciencias físicas por la Universidad de Cambridge en 1938, y volvió a Birmingham a realizar el doctorado, y allí tuvo la suerte de trabajar con John Randall, uno de los grandes científicos británicos de la época, a cuyo esfuerzo intelectual se debe el desarrollo del radar, que tanta importancia tuvo en la derrota de los alemanes en la batalla de Inglaterra y en la guerra del Atlántico. Después de la guerra, Randall volvió su atención al estudio de problemas biológicos mediante la utilización de técnicas físicas, y a él se debió la creación del primer departamento de Biofísica en Gran Bretaña, primero en la Universidad de St. Andrews y luego en el King’s College de Londres, al que atrajo como ayudante a Maurice Wilkins. La creación de este departamento, al igual que el LMB de ­Cambridge, formó parte del apoyo que el MRC dio a la entonces revolucionaria idea de establecer lazos entre los físicos y biólogos, en un esfuerzo que tantos dividendos proporcionaría a la ciencia británica durante los siguientes años. Wilkins también contribuyó al esfuerzo bélico en el desarrollo de métodos de separación de isótopos de uranio, y su trabajo en este campo le llevó a California como integrante del proyecto Manhattan, nombre bajo el que se encubría el desarrollo de la primera bomba atómica. Tras la guerra, la lectura del libro de Schrödinger abrió los ojos a Wilkins, como a muchos otros físicos de su generación, sobre la posibilidad de aplicar conceptos y técnicas físicas al estudio de los sistemas biológicos. Wilkins actuó como asistente de Randall en el King’s College y allí, a partir de 1946, se aplicó en la utilización de diversas técnicas físicas al estudio de distintos materiales biológicos, entre ellos el DNA. Con esta sustancia biológica realizó experimentos tendentes a caracterizar su orientación dentro de las células, utilizando para ello técnicas espectroscópicas. Sólo cuando en 1950 Randall recibió una partida de DNA purificado por parte del grupo de Rudolph Signer, en la Universidad de Basilea, los acontecimientos se precipitaron. Wilkins decidió, entre otras cosas, someter al DNA a la difracción de rayos X en un aparato instalado en el propio King’s College, y en sus primeros estudios pudo observar que la utilización de fibras de DNA humedecidas, a la manera en que Bernal trataba los cristales de proteína, proporcionaba unos patrones de difracción mucho mejores que los obtenidos por Astbury de fibras deshidratadas. Los patrones de difracción cambiaban drásticamente dependiendo del grado de humedad, lo que hizo sugerir a Wilkins que se producía un gran cambio de conformación en el DNA que, a su parecer, estaba dispuesto en forma de hélice. En esto estaba Wilkins cuando ocurrió un hecho que vino a trastocar sus planes. Su jefe, Randall, había decidido contratar a un cristalógrafo para el grupo, ya que ni Wilkins ni Raymond Gosling, que era entonces el estudiante de doctorado que se ocupaba de tales menesteres, lo eran

Maurice WILKINS (1916-2004). © Radial Press.

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Comparación de la calidad de los difractogramas de DNA tomados respectivamente por Astbury en 1947 (en artículo “X‑Ray Studies of Nucleic Acids”), Franklin en 1951 y Arnott en 1981. 

Rosalind FRANKLIN (1920-1958). © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

realmente. La persona contratada resultó ser una mujer, Rosalind Franklin, que venía de hacer una estancia postdoctoral en París con las mejores referencias. Franklin había nacido en Londres en 1920, hija de un banquero judío que aunque le proporcionó una educación exquisita, quiso también que su hija se dedicara a tener su propia familia y cuidar de ella. Franklin se revolvió durante toda su vida contra esa idea, y además de estudiar Química Física en Cambridge, realizó allí su tesis doctoral sobre la estructura del carbón y otros compuestos derivados de él. Después marchó a París donde continuó sus estudios sobre la estructura del carbón, que están en el nacimiento de lo que hoy conocemos como la tecnología de la fibra de carbono, y gracias a los cuales se hizo una gran experta en la difracción de rayos X. Sus conocimientos fueron muy apreciados y cuando mostró su deseo de volver a Londres fue, como hemos dicho, contratada por Randall para trabajar en la estructura del DNA. Es en este momento cuando surgió un malentendido entre Franklin y Wilkins, propiciado por el propio Randall, quien no dejó las cosas claras en un principio. Así, mientras Franklin creyó que iba a trabajar con el DNA como investigadora independiente, Wilkins asumió que Franklin iba a ser su ayudante en esta investigación. Pronto surgieron los primeros roces, agravados en el caso de Franklin por el ambiente conservador del King’s College, muy distinto al que ella había conocido en París. La decisión de Randall para intentar acabar con el problema fue la de que Franklin se quedara con el DNA de Signer, y Wilkins trabajara con el que Erwin Chargaff iba a proporcionar al laboratorio, que resultó ser de peor calidad. En cualquier caso, Franklin era una excelente experimentalista, y con ayuda de Gosling, quien terminó realizando su tesis doctoral bajo su dirección, comenzó a realizar magníficos difractogramas de las fibras de DNA. Franklin y Gosling encontraron, siguiendo los estudios de Wilkins, que el DNA sufría un gran cambio conformacional dependiendo del grado de humedad a la que se sometiera a las fibras. Cuando la humedad era aproximadamente del 70%, el DNA mostraba un patrón de difracción con un gran número de puntos, muy parecido al de los cristales de proteína, mientras que el aumento de humedad generaba un patrón más simple, que Franklin catalogó como proveniente de una estructura helicoidal. La investigadora inglesa denominó a los dos tipos de DNA, formas A y B respectivamente.

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Franklin y Gosling fueron más allá y para ello usaron la información proporcionada por el bioquímico escocés de la Universidad de ­Nottingham John Masson Gulland, quien realizando experimentos de valoración del DNA había encontrado que los grupos fosfatos eran totalmente accesibles mientras que la mayor parte de las bases no lo eran. De esta información y de su propio trabajo, Franklin y Gosling dedujeron que los grupos fosfato se encontraban en el exterior de la estructura del DNA mientras que las bases se encontraban en su interior. También dedujeron, según el cálculo de la cantidad de agua en la muestra y la densidad de ésta, que las moléculas de DNA debían estar compuestas por 2 ó 3 hebras de DNA. Desgraciadamente, Franklin decidió en un principio trabajar con la estructura A, que es una estructura más informativa, pero también más compleja, lo que hizo que perdiera bastante tiempo. Mientras tanto, Wilkins había pedido a un físico amigo suyo, Alexander Stokes, que desarrollara la teoría matemática con la que poder entender la difracción de estructuras helicoidales. Stokes empezó a trabajar en ello, pero a la vez que él y en Cambridge, otro amigo de Wilkins se había puesto a la misma tarea.

Cambridge Francis Crick nació en Northampton (Inglaterra) en 1916, y realizó sus estudios universitarios en Física en el University College de Londres donde comenzó también su tesis doctoral, interrumpida por la II Guerra Mundial. Desde 1940 a 1947 trabajó para el Almirantazgo en el desarrollo del radar y de minas magnéticas, lo que le unió a otros protagonistas de esta historia, John Randall y Maurice Wilkins. Crick se interesó por la Biología a partir de 1946, mientras estaba todavía trabajando para el Almirantazgo, y tras escuchar una charla de Pauling y leer el famoso opúsculo de Schrödinger. Después de ser licenciado en 1947 y de trabajar en Cambridge en otro proyecto biológico, Crick consiguió entrar en el LMB en 1949, a la edad de 33 años, con el fin de realizar por fin su tesis doctoral. Esta versó sobre “Polipéptidos y proteínas: estudios con rayos X” y sería defendida en 1953, meses después de que Watson y Crick publicaran sus famosos artículos sobre la estructura del DNA. Crick era un hombre extraordinariamente inteligente y hasta cierto punto carente de ciertos convencionalismos que a veces ayudan a mantener las relaciones personales (lo que algunos llamarían “maneras”), y como hemos comentado anteriormente, su primera actuación a su llegada al LMB fue la de criticar, en presencia de Perutz, Kendrew y el mismísimo Bragg, el enfoque que éstos estaban utilizando para intentar resolver la estructura de las proteínas. Lo cierto es que Crick tenía razón, pero la forma de exponer su argumentación enfureció a Sir Lawrence, quien por un tiempo no vio con buenos ojos la presencia de Crick en el LMB y alguna vez pensó en darle acomodo en algún otro laboratorio. Crick era, en cualquier caso, un hombre con una curiosidad insaciable y nada mejor para hacerla cre-

Difractogramas de las formas A y B del DNA. Obsérvese que la forma A muestra una mayor complejidad en el diagrama de difracción. Rechazando el consejo de Wilkins y Crick, Franklin se empeñó en un principio en trabajar con esta forma. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Francis Harry Compton CRICK (1916-2004) en 1962, al día siguiente de recibir la noticia de la concesión del Nobel. © Radial Press.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

James Dewey WATSON (1928-). Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1962. © Radial Press.

cer que la llegada al LMB de un científico inteligente y ambicioso llamado James (Jim) Watson. Watson era un joven estudiante postdoctoral americano cuando llegó a Cambridge en 1951. Había nacido en 1928, y fue un alumno superdotado que acabó sus estudios universitarios en Chicago a los 19 años. Aunque tuvo sus dudas sobre si aplicarse al estudio de las aves, al final se decidió por la Biología experimental, y realizó su tesis doctoral con Salvador Luria en la Universidad de Indiana (fue, de hecho, su primer estudiante de doctorado). Su tesis, finalizada con 22 años, versó sobre “Las propiedades de los bacteriófagos inactivados mediante rayos X”. Mientras que Watson realizaba su tesis, se produjeron varios de los episodios científicos ya relatados que inclinaron la balanza hacia el DNA como portador del material genético. Watson era joven y no tenía los prejuicios de sus mayores, crecidos en la idea de que eran las proteínas los almacenadores de la sustancia hereditaria. Su nacimiento científico había, pues, coincidido con el desprestigio de esa idea. Además, la lectura del libro de Schrödinger también le había hecho inquirir sobre la naturaleza y estructura de la materia hereditaria. Influido por Luria y Delbrück decidió dedicarse a estudiar los ácidos nucleicos y por eso marchó a Copenhague a realizar estudios postdoctorales con Simon Kalkar sobre el metabolismo de los ácidos nucleicos, que pronto le aburrieron y decepcionaron. Sin embargo, durante un congreso en Nápoles asistió a una charla de Maurice Wilkins sobre la estructura del DNA, en la que éste mostró unos difractogramas de DNA recién obtenidos por él, que mostraban a las claras que el DNA podía cristalizarse y que, por lo tanto, poseía una estructura definida. Inmediatamente escribió a Luria para que le ayudara a convencer al director del LMB, Max Perutz, que era donde se estaba desarrollando a mayor nivel la difracción de rayos X aplicada a la determinación estructural de sustancias biológicas, para que le permitiera aprender esas técnicas. Luria consiguió que Perutz y Bragg, su inmediato superior y jefe del Laboratorio Cavendish ‑donde estaba entonces radicado el LMB‑, aceptaran su estancia en Cambridge donde, para poder tener una habitación en uno de sus Colleges, en el Clare College, tuvo finalmente que engañar a las autoridades universitarias aduciendo que iba a realizar una segunda tesis doctoral. Aunque oficialmente Watson comenzó a trabajar en la elucidación estructural del virus TMV, en realidad lo que le interesaba era intentar determinar la estructura del DNA. Para su suerte, en el LMB coincidió con Francis Crick, a quien enseguida contagió su pasión por el DNA. Watson y Crick eran muy parecidos en su forma de actuar, dos personas muy inteligentes y con muy pocas ganas de soportar la ignorancia y la estupidez de los demás (aunque, al parecer, toleraban muy bien la suya propia). Su carácter les haría tener problemas de relación con otra gente. De Watson se comenta que durante una reunión científica, y sintiendo que el orador de aquel momento daba una charla de poco interés, dejó patente su aburrimiento abriendo las páginas de un periódico y disponiéndose a leerlo. Aquella falta de educación no paso desapercibida, y al día siguiente los

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participantes del congreso se confabularon para, al comenzar la charla el propio Watson, abrir cada uno de ellos un periódico y leerlo durante un tiempo. En otra ocasión, preguntó con sorna (y por qué no decirlo, con mala educación) a un conferenciante cuándo iba a hacer de una vez algo interesante. Los modales de Crick no eran muy diferentes. Durante un congreso, y mientras escuchaba a un joven orador dar explicaciones bastante pobres sobre el modelo de una proteína, Crick saltó de su asiento y le chilló “Eres un aficionado. Deja el modelado para los profesionales”. El auditorio quedó pasmado. Al día siguiente, un famoso investigador que normalmente daba las charlas vestido de manera muy formal, apareció con una camiseta negra de manga corta. Cuando en un momento de la charla se dio la vuelta para dibujar algo en la pizarra, se pudo leer con grandes letras en su espalda “aficionado”. En cualquier caso, y en relación con el DNA, tanto Watson como Crick eran conscientes de la importancia de conocer su estructura y sabían que, por ser regular, podía en principio ser resuelta. Para ello se dispusieron a atacar el problema utilizando el mismo enfoque que usó Pauling para la elucidación de la estructura helicoidal de las proteínas, una mezcla de resultados experimentales y modelización de éstos, pero para ello tuvieron que resolver un problema personal, que era que ­Wilkins “permitiera” a su amigo Crick trabajar en ese problema. Después de la guerra, el dinero que el gobierno británico podía invertir en la Ciencia era escaso, y no estaba bien visto que dos unidades del MRC (el LMB y el laboratorio del King’s College donde Wilkins trabajaba, lo eran) se ocupasen exactamente del mismo problema. Wilkins no puso objeciones a Crick y en cuanto a las que podía poner el MRC, las investigaciones que se realizaron en Cambridge fueron, en principio, ocultadas a las auto­ri­da­des del organismo. Para entonces Crick, en colaboración con los matemáticos Cochran y Vand, había desarrollado la teoría matemática que explicaba la difracción por parte de estructuras helicoidales, con lo que disponían de un instrumento para poder entender la difracción producida por las fibras del DNA (Figura 28). Sin embargo, los dos científicos de Cambridge no disponían de difractogramas propios, así que tuvieron que recurrir a la información publicada por entonces, y la que pudieron obtener de los dos grupos del King’s College. Watson fue incluso a escuchar un seminario de Franklin en la que ésta comentó sus ideas acerca del DNA y de la disposición de los grupos fosfato hacia el exterior. Sin embargo, Watson no hizo caso de esas ideas y el primer modelo que se construyó en ­Cambridge lo fue con tres hebras de DNA, y con los grupos fosfatos hacia el interior y las bases hacia el exterior. El modelo era totalmente erróneo incluso para los conocimientos de la época y cuando durante una visita a Cambridge de Wilkins y Franklin, éstos se lo hicieron ver a Watson y a Crick, los dos científicos paralizaron durante un tiempo el desarrollo de sus modelos, pero no su interés por el DNA. Los comentarios de Franklin les habían hecho apercibirse de que las bases debían de localizarse en el corazón de la estructura y decidieron proseguir ese camino. Crick pidió a 147

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I. Los orígenes de la Biología Molecular Figura 28. Una estructura helicoidal viene definida fundamentalmente por dos parámetros (izquierda): el paso de vuelta o tuerca (pitch, P), que es la distancia a lo largo del eje longitudinal tras la que se repite un motivo, y el radio r de la hélice. Una hélice y, por lo tanto, cualquier polímero biológico que se disponga de esa manera, tiene una propiedad única y fundamental, y es que todas las posiciones del espacio tridimensional están representadas por alguno de los componentes de la hélice y, por lo tanto, su reconstrucción por técnicas de Fourier no requeriría en principio más que el registro de una fotografía, a diferencia de lo que ocurre con otros especimenes ordenados como son los cristales, de los que habría que tomar imágenes en multitud de ángulos distintos. Sin embargo, los patrones de difracción o difractogramas (derecha), que muestran siempre un perfil en forma de X, son más difíciles de interpretar que los obtenidos de cristales.

un amigo suyo, el matemático inglés John Griffith, sobrino del descubridor del “principio transformante”, que le hiciera el cálculo de cuál sería la mejor manera de que las bases, provenientes de dos o tres hebras de DNA, se apilaran entre sí. Griffith, sin embargo, le hizo ver a Crick que la mejor manera en la que las bases podían interaccionar entre sí no era mediante su apilamiento sino mediante su disposición lateral gracias a la interacción por puentes de hidrógeno entre purinas y pirimidinas. Sin saberlo, Griffith había llegado a esta conclusión independientemente de los estudios de Chargaff, muy famosos en aquella época pero desconocidos para los científicos ingleses, en los que se mostraba que la cantidad de A era igual a la de T, y la de G igual a la de C, en todos los organismos. Curiosamente, fue el mismo Chargaff quien en julio de 1952 les describió sus resultados, en una visita a Cambridge. Chargaff, un mordaz escritor y muy crítico posteriormente con el trabajo de Watson y Crick, describió así en su autobiografía el encuentro con los dos jóvenes científicos: “Por lo que pude ver, lo que los dos científicos querían, sin importarles mucho la química que había detrás de ello, era ajustar la secuencia del DNA en una hélice. La principal razón para esto era la recientemente publicada estructura helicoidal de Pauling para las proteínas (...) Les resumí mis resultados. Si conocían algo acerca de la igualdad en las cantidades de A y T, y de C y G, a mí me lo ocultaron, aunque en cualquier caso parecían ignorantes acerca de casi todo (...) Creo que el modelo de doble hebra de DNA surgió en sus mentes como consecuencia de nuestra conversación, pero esto sólo podrá ser quizás conocido en el futuro...”.

Chargaff, quizás amargado por su propia incapacidad para sacar consecuencias biológicas de sus propios resultados, fue injusto con Watson y Crick, porque lo cierto es que los dos científicos se olvidaron de la con148

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versación de Chargaff, lo que de seguro retrasó el descubrimiento de la estructura del DNA.

Pasadena En este punto entra el siguiente personaje de la historia, Linus Pauling, quien ya había conseguido dos logros importantes en relación a la determinación estructural mediante rayos X, adelantándose en ambos casos a los esfuerzos de Bragg y su grupo en el Cavendish. En la última ocasión en que ambos grupos habían competido por un mismo objetivo, Pauling había conseguido ser el primero en elucidar las estructuras básicas de las proteínas, la hélice α y la lámina β. Para ello, y a diferencia de los británicos que habían basado sus investigaciones en un enfoque meramente experimental, Pauling había determinado ambas estructuras mediante una ingeniosa combinación de datos experimentales, de sus grandes conocimientos sobre la naturaleza de los enlaces y del uso de modelos con los que se ponían a prueba las ideas generadas. Este tipo de acercamiento al problema biológico era el que Pauling comenzó a utilizar en la elucidación de la estructura del DNA. El interés de Pauling por el DNA había nacido de su asistencia a un seminario en el que un microscopista de ­Berkeley, Robley Williams, mostró imágenes de DNA saliendo de la ca­ beza de un bacteriófago. Para tener datos de calidad, Pauling pidió a ­Wilkins que le enviara sus difractogramas, pero éste se negó aduciendo que tenía que estudiarlos él mismo antes de poderlos compartir. A ­Pauling no le quedó otro remedio que utilizar los ya publicados por Astbury en 1938, de mucha peor calidad que los de Wilkins, y generar los suyos propios a través de Corey, pero éstos también resultaron ser de mala calidad. Aun así, Pauling comenzó a realizar las medidas con este material y para finales de 1952 había generado su primer modelo, una triple hélice compuesta por tres hebras de DNA y en el que los grupos fosfato se encontraban dispuestos en el interior de la estructura (Figura 29).

La carrera por la estructura del DNA A esta errónea conclusión había llegado Pauling, al igual que Watson y Crick anteriormente, debido a medidas incorrectas de la cantidad de agua presente en las fibras, mucho menor que la real, y que indujeron al gran científico a introducir en el modelo una hebra extra de DNA para ajustarse a los valores experimentales de densidad. El manuscrito fue enviado para su publicación a principio del año 1953, y Pauling mandó una copia a Bragg, pero éste la ocultó a Watson y Crick para intentar alejarles de este asunto. Sin embargo, Pauling había enviado otra copia a su hijo Peter, quien realizaba por entonces una estancia postdoctoral con John Kendrew. Peter pasó el manuscrito a su amigo Watson, quien no podía creer lo que estaba leyendo: 149

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Figura 29. (Izquierda) Modelo de la estructura del DNA de Pauling. En él se observa una triple hélice en el que los grupos fosfato se encuentran en el interior. © Science Museum Library / S&S Picture Library. (Derecha) Esquema de triple hélice adaptado del artículo de Pauling “A Proposed Structure for the Nucleic Acids”. Proc. Natl. Acad. Sci. 39 (1953): 84. 

“Nada más comenzar a leer el artículo, sentí que aquello no era correcto. Sin embargo, no pude localizar el error hasta que examiné las ilustraciones durante varios minutos. Entonces me di cuenta de que en el modelo de Pauling los fosfatos no se encontraban ionizados sino que poseían un hidrógeno y, por lo tanto, no tenían carga neta. De hecho, los ácidos nucleicos dibujados por Pauling no tenían carácter ácido. Además, los grupos fosfatos estaban dibujados así porque tenían un sentido, ya que las moléculas de hidrógeno formaban parte de los puentes de hidrógeno que mantenían unidas las tres hebras de DNA. Sin esos hidrógenos, las tres cadenas se liberarían. Todo lo que sabía de la química de los ácidos nucleicos me decía que los grupos fosfato jamás poseen átomos de hidrógeno unidos (...) Y, sin embargo, Linus, sin duda alguna el químico más astuto del mundo, había llegado a la conclusión opuesta”.

Tanto Watson como Crick comprendieron enseguida que el “gran hombre”, como era llamado Pauling por la comunidad científica, había cometido un error muy grande, y que pronto, una vez que le llegaran las críticas de la comunidad, se daría cuenta de los fallos de su modelo y actuaría en consecuencia. No había tiempo que perder. Watson marchó a Londres para hablar con Wilkins y Franklin, explicarles el modelo de Pauling y convencerles de que aunaran esfuerzos para intentar batir al científico americano, utilizando para ello los datos obtenidos en Londres y la modelización que llevaban a cabo en Cambridge. Sin embargo, Franklin se negó en redondo: “la estructura del DNA tendría que obtenerse a partir de los datos experimentales y no de meras especulaciones”. El viaje de Watson no fue en vano porque Wilkins mostró a aquél y sin permiso de Franklin un difractograma obtenido por ésta. El difractograma era magnífico, mucho mejor que nada de lo que Watson había visto hasta entonces. Para entonces el científico americano ya había aprendido a 150

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interpretar difractogramas, y comprendió enseguida que la estructura del DNA sólo podía ser la de una hélice. A la vuelta de Londres, Watson decidió que iba volver a modelizar la estructura del DNA utilizando sólo una doble hebra. Como acabamos de comentar, el uso de una triple hebra provenía de la asunción de unas medidas experimentales de la cantidad de agua en las fibras que todo el mundo reconocía que podían ser muy incorrectas, y según Watson la observación de los sistemas biológicos dejaba claro que éstos favorecían la existencia de pares de estructuras, y no de tripletes. En ayuda de los esfuerzos de los científicos del LMB vino un informe preparado por Franklin para el MRC, y que Perutz recibió y dejó leer a Watson y a Crick. Este episodio ha sido muy criticado por parte de la comunidad científica, pero Perutz siempre se defendió aduciendo que el informe no era confidencial y que podría leerlo cualquier miembro del MRC. Sea lo que fuere, el caso es que los difractogramas que Franklin había adjuntado en el informe fueron cuidadosamente estudiados por Watson y Crick, y de ellos dedujeron rápidamente que la doble hebra en la que habían comprometido sus esfuerzos tenía una repetición de 20 Å y una separación entre bases de 3,4 Å, un valor muy parecido al que ­Astbury había obtenido 15 años atrás. Sin embargo, en los primeros modelos que construyeron, y aunque parezca increíble visto el error de ­Pauling, volvieron a colocar los grupos fosfato en el interior de la doble hebra. Este enfoque duró un tiempo, hasta que vieron que todos los esfuerzos en ese sentido chocaban con consideraciones estéricas, y resolvieron colocar los grupos fosfatos hacia el exterior. Esto dejaba las bases hacia el interior y, por lo tanto, les llevó a considerar cómo éstas interaccionarían entre sí en el interior de la estructura. El trabajo de valoración de Gulland que había utilizado Franklin para colocar los grupos fosfato hacia el exterior indicaba también la presencia de puentes de hidrógeno entre las bases, y Watson y Crick intentaron buscar la mejor manera de que las bases interaccionaran a través de puentes de hidrógeno. Primero probaron a enfrentar entre sí a las purinas y a las pirimidinas, lo que daba lugar a que el esqueleto de las dos hebras no fuera regular, ya que el tamaño de las primeras era mayor que el de las segundas, y además no satisfacía el criterio de simetría que aparecía en los difractogramas del DNA. La pareja tuvo entonces un golpe de suerte porque en aquella época realizaba una estancia en el LMB Jerry Donohue, un químico del grupo de Pauling y una de las autoridades mundiales en puentes de hidrógeno. Cuando Watson y Crick enseñaron a Donohue su trabajo, éste les hizo ver que estaban utilizando para las bases las formas tautoméricas incorrectas. En aquella época era habitual el uso de las formas enol para describir las bases y estas formas eran las que Watson y Crick por ignorancia estaban utilizando, pero Donohue les indicó que las formas ceto eran las que se encontraban a pH fisiológico (Figura 30). Con ese tipo de estructuras, Watson comenzó a buscar la manera de emparejarlas mejor, hasta que encontró que el apareamiento que se 151

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Figura 30. Estructura de las formas enol y ceto de los cuatro nucleótidos de los que está compuestas las moléculas de DNA, y los posibles apareamientos para las dos formas químicas que se dan entre adenina y timina, y entre citosina y guanina. Obsérvese que la forma ceto, que se produce al pH fisiológico, da lugar a tres puentes de hidrógeno entre citosina y guanina, y dos entre adenina y timina, mientras que las correspondientes formas enol dan lugar a uno y ninguno, respectivamente. Estructura de las formas enol y ceto de los cuatro nucleótidos y su posible apareamiento.

producía entre A y T tenía una forma casi idéntica al producido entre C y G, lo que permitía que las dos hebras, enfrentadas en forma de hélice, pudieran discurrir de forma perfectamente paralela. Watson mostró el modelo a Donohue, quien dio su aprobación desde el punto de vista de la formación de puentes de hidrógeno, y a Crick, quien se mostró entusiasmado. El modelo, además, satisfacía ‑los dos científicos se dieron cuenta entonces de ello‑ los resultados obtenidos por Chargaff respecto a la igualdad en el contenido de A y T, y de C y G. Todo parecía concordar y entusiasmados, los científicos corrieron a comer al pub cercano al laboratorio, “The Eagle”, donde Crick contó a quien quiso escucharle (y a quien no quiso, también) que ellos dos habían descubierto el secreto de la Vida. El modelo final propuesto por Watson y Crick fue el de una doble hebra de DNA, en el que cada uno de los dos polímeros estaba dispuesto de manera antiparalela. Los grupos fosfato se colocaban en el exterior de la estructura helicoidal y los azúcares los unían con las bases, de esta manera que éstas quedaban orientadas de forma casi perpendicular al eje de la hélice. Para la interacción entre las bases de las dos cadenas, ­Watson y Crick propusieron la formación de dos puentes de hidrógeno entre A y T, y otros dos entre C y G. Pauling, el gran perdedor en esta contienda, pudo, sin embargo, paladear el sabor de una pequeña venganza pues hipotetizó la existencia de un tercer puente de hidrógeno en este último par, lo que se confirmó al cabo de unos años. Finalmente, la disposición de las bases y la interacción entre complementarias generaba en la estructura helicoidal dos surcos, uno grande y otro más pequeño, hecho que también tiene un significado fisiológico, pero que pasó desapercibido durante unos años (Figura 31). Durante los siguientes días, Watson y Crick se dispusieron a realizar un modelo a escala siguiendo las consideraciones apuntadas, contando además con el apoyo decidido de Bragg, convencido esta vez de que los británicos habían batido a Pauling en su propio juego. También dio su visto bueno al modelo el gran químico Alexander Todd, a quien los dos científicos se lo enseñaron a petición de Bragg (éste era muy consciente de que la falta de comunicación con Todd les había impedido ser los primeros en publicar un modelo atómico para la estructura de hélice α, pues Todd, a diferencia de Bragg y Perutz, era muy consciente de la planaridad del enlace peptídico, que ellos habían obviado en su modelo). También Wilkins y Franklin dieron su aprobación al modelo. Franklin, por entonces, había dejado de trabajar en el tipo A de DNA y tenía resultados con el tipo B que probablemente le hubieran conducido en poco tiempo a una estructura como la que Watson y Crick habían propuesto. Enseguida se pusieron de acuerdo, a través de sus jefes Bragg y ­Randall, para enviar a la revista Nature tres artículos que debían ser publicados en el mismo número. En el primero de ellos, Watson y Crick mostrarían su modelo; en los otros dos, los grupos de Wilkins y Franklin describirían separadamente los resultados experimentales que apoyaban el modelo de los primeros.

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Los tres artículos aparecieron en el mes de abril de 1953 y fueron reci­bi­dos con entusiasmo por parte de la comunidad científica. El de ­Watson y Crick es ciertamente un modelo de elegancia y concisión, y en él se exponía de manera sucinta la estructura de la doble hebra de DNA y se apuntaba de pasada que aquélla sugería un posible mecanismo de copia de la información almacenada en la hebra.



FIGURA 31. (a) Modelo de la estructura de doble hebra del DNA, vista frontal. (b) Dos vistas del modelo a lo largo del eje longitudinal. © MRC Laboratory of Molecular Biology. (c) Modelo de Watson y Crick realizado por el taller del LMB. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Comienzo del famoso artículo de Watson y Crick sobre la estructura de la doble hebra del DNA “A structure for deoxyribonucleic acid” (Nature 1953,171: 737) (1953) pág 1. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

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La replicación del DNA

Watson impartiendo un seminario en el CSHL en 1953 sobre la estructura del DNA. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Figura 32. Posibles tipos de replicación a partir de una doble hebra de DNA.

Matthews MESELSON (1930-). © U.S. National Library of Medicine.

Esta y otras ideas fueron desarrolladas con mayor detalle en otro artículo enviado a Nature un mes más tarde, en el que los dos científicos describieron más cuidadosamente la estructura de doble hebra del DNA y la posibilidad de que ésta se desenrollara, sola o con la ayuda de alguna proteína, para que las dos hebras pudieran transmitir la información mediante algún sistema de copia. La información se encontraba, según sugirieron Watson y Crick, en su “patrón de bases”, y los dos autores apuntaron que la replicación se produciría mediante la copia de cada una de las hebras, de tal manera que se formarían dos dobles hebras donde antes sólo había una. Watson y Crick propusieron también que la forma de replicación era semiconservadora, de tal manera que cada una de las dos dobles hebras que se generaba tras el proceso de replicación se podía hibridar con una de las hebras madre. Sin embargo, podía haber otras posibilidades, tal como apuntaron científicos como Delbrück. Una de ellas era la llamada replicación conservadora, en la que las dos hebras madres, una vez producido el proceso de replicación, volvían a unirse. El otro tipo de replicación era la dispersora, en la que no se conservaban las hebras de DNA y las hebras madre se podían romper en trozos pequeños, ser copiados y unidos al azar (hay que reconocer que esta última teoría es verdaderamente retorcida) (Figura 32). La prueba de que la replicación semiconservadora es la que realmente se produce tuvo que esperar cuatro años y se consiguió mediante uno de los experimentos más elegantes que se hayan producido hasta la fecha, que además abrió las puertas al Premio Nobel para Watson, Crick y Wilkins en 1962. La idea original provenía de Haldane, quien en 1941 había sugerido que la replicación genética podía ser estudiada mediante el uso de isótopos como el 15N. Sin embargo, los intentos que se realizaron posteriormente no fueron muy exitosos. En 1957 Mathew Meselson y Franklin Stahl, entonces en el Woods Hole Marine Biological ­Laboratory en Massachussets, decidieron intentarlo de nuevo y, para ello, desarrollaron una técnica que separa las moléculas en función de su diferente densidad, gracias a la aplicación de una gran fuerza centrífuga. Esta técnica, que se denomina de centrifugación en gradiente de densidad, se ha convertido en una de las más utilizadas en Biología Molecular. Primero tuvieron que buscar las mejores condiciones de separación y para ello buscaron una solución que fuese ligeramente más densa que el DNA. La respuesta a este problema vino de la mano de una solución de cloruro de cesio. Lo siguiente que hicieron fue cultivar bacterias de E. coli en un medio cuya única fuente de nitrógeno era el isótopo pesado 15N. Meselson y Stahl purificaron el DNA de bacterias cultivadas en medio con 15N y como control purificaron DNA de bacterias cultivadas en medio normal (con 14N como fuente de N). Como control, sometieron los dos tipos de DNA a una centrifugación en CsCl a más de 100.000 g y observaron que las dos bandas podían separarse en razón de su diferente densidad.

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El experimento real comenzó cuando los dos investigadores cultivaron bacterias en 15N durante varias generaciones, para después pasar el cultivo a un medio con 14N. Meselson y Stahl tomaron muestras a los tiempos medios en los que las células se dividen, para, de esta forma, aislar el DNA de distintas generaciones (Figura 33). Purificaron pues el DNA de cada una de ellas y lo sometieron a un proceso de centrifugación para separarlo de acuerdo a su densidad. Se encontraron con que el DNA correspondiente a la primera generación tenía una densidad intermedia a la correspondiente al DNA crecido en 14N y 15N, lo que se correspondía con un DNA en el que cada una de las hebras posee diferente densidad. Esta disposición concuerda con la generación de DNA de acuerdo a la replicación semiconservadora, pues de seguir el mecanismo de replicación conservadora hubiesen aparecido dos bandas de DNA (una pesada y otra ligera). El análisis de la segunda generación confirmó la hipótesis de la replicación semiconservadora, puesto que en este experimento aparecieron dos bandas, una de peso intermedio y otra correspondiente al DNA con 14N. En la tercera generación, las dos bandas persistían, pero la proporción de banda ligera respecto a la intermedia era de 3:1. El experimento era sencillo y hermoso a la vez, y además de dejar claro el mecanismo general de replicación del DNA, demostró su carácter universal ya que había sido realizado con DNA de bacteria, a pesar de que todos los experimentos que demostraban que el DNA era el material genético habían sido realizados hasta entonces con fagos. El experimento,



Figura 33. Esquema del experimento de Meselson y Stahl. Arriba, control que realizaron Meselson y Stahl para demostrar que el DNA generado en un medio con 15N era más pesado que uno generado en un medio con 14N, puesto que el primero penetraba más en un medio de cloruro de cesio sometido a un alta fuerza gravitatoria, debido a su mayor densidad. Debajo, modelo de la replicación semiconservativa cuando la doble hebra de DNA original está compuesta del isótopo 15N y en las siguientes generaciones se incorpora el isótopo ligero 14N. Derecha, esquema del experimento real, por ultracentrifugación en cloruro de cesio, que se ajustaba al modelo de replicación semiconservativa.

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I. Los orígenes de la Biología Molecular

Los premios Nobel de 1962: Wilkins (Fisiología y Medicina), Steinbeck (Literatura), Kendrew (Química), Perutz (Química), Crick (Fisiología y Medicina) y Watson (Fisiología y Medicina). © Radial Press.

además de confirmar las teorías de Watson y Crick sobre la forma en que se produce la replicación, apoyó de manera implícita la estructura del DNA por ellos propuesta, cuya confirmación final tuvo que esperar hasta mediados de los años setenta, cuando el grupo de Richard Dickerson pudo obtener por primera vez la estructura atómica de un pequeño fragmento de DNA, y hasta los años ochenta cuando se consiguió determinar la estructura atómica de un gran fragmento. El descubrimiento de la estructura del DNA supuso un hito para la Ciencia del siglo XX y como tal fue reconocido muy pronto por la comunidad científica al conceder a sus personajes principales el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962... A todos no. Rosalind Franklin moría a los 38 años de edad, en 1958, de un cáncer de ovario al que probablemente no era ajena la radiación recibida durante sus años de trabajo con los rayos X. Franklin había dejado en 1953 el King’s College para trabajar en otra universidad londinense, el Birbeck College, donde realizó un brillante trabajo en la caracterización estructural de otro viejo conocido de la Biología Molecular, el virus TMV. Respecto a los otros actores de esta historia, Crick vio incrementar su estatura científica y en los siguientes años se erigió, como veremos en las siguientes páginas, en el Primer Sacerdote de la naciente Biología Molecular (estoy seguro de que a Crick, que era un anticlerical convencido, no le hubiera gustado esta figura) y en sus últimos años decidió dar el paso a la última frontera de la biología, el estudio del cerebro y sus mecanismos, que no abandonó sino a su muerte en el año 2004. James ­Watson continuó durante unos años, fundamentalmente en la Universidad de Harvard, realizando una ciencia de primer nivel. Sin embargo, transformó de manera gradual su papel como científico en el de divulgador, político-científico y cazatalentos. Watson fue el autor del primer libro de texto de Biología Molecular, Molecular Biology of the Gene, que en sus distintas ediciones se convirtió en la “Biblia” de las sucesivas generaciones de jóvenes dispuestos a zambullirse en esta nueva y excitante disciplina. En Harvard tuvo que luchar a brazo partido para crear un departamento donde se realizase lo que él llamó la nueva Biología, en definitiva la Biología Molecular. Sus años en Harvard fueron duros (y él los hizo duros al resto de su facultad), pero al final consiguió lo que deseaba, como confesaría muchos años después cuando le fue concedido el Doctorado Honoris Causa por aquella universidad: “La razón real por la que vine aquí fue la de conseguir una mujer, ¡Y encontré una! Siempre quise casarme con una estudiante de aquí, y así lo he hecho. El argumento convencional era el de que yo buscaba buenos genes, pero la verdad es que ella era muy guapa”.

Durante varios años compaginó su cátedra en Harvard con el puesto de director del CSHL, que a su llegada mostraba signos evidentes de decadencia. Con una idea revolucionaria, casi mesiánica, Watson decidió que el CSHL dedicase casi todos sus esfuerzos a lo que él consideró una nueva frontera, la relación entre los virus y el cáncer. Con mucho trabajo 156

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pudo convencer a los filántropos y al propio CSHL de la bondad de su idea, y la historia ha mostrado lo acertado de su apuesta. Finalmente, en la década de los noventa se embarcó en la creación del Proyecto Genoma Humano del cual fue el primer líder, pero las vicisitudes que adornaron la lucha por mantener el esfuerzo público frente a las apuestas privadas y su caída final pertenecen a otra historia. En lo que respecta a Wilkins, durante varios años realizó una ciencia de primer nivel, especialmente en el campo de la estructura del RNA, pero su presencia científica se fue desvaneciendo poco a poco, hasta su muerte en el año 2004. El descubrimiento de la estructura del DNA había supuesto el nacimiento de la Biología Molecular, y los diez años siguientes servirían para apuntalar los conceptos generales que rigen esta disciplina, lo que Francis Crick definió como el Dogma Central de la Biología.

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II

La edad de oro de la Biología Molecular

“Es una buena norma no confiar demasiado en los resultados experimentales hasta que hayan sido confirmados por la Teoría” Arthur Eddington

El dogma central de la biología El control genético La revolución genética

“Cuando el Artemisón de Efeso ‑una de las siete maravillas de la antigüedad‑ ardió en llamas en el 356 a.C., se pudo apresar a un hombre que confesó haber incendiado el edificio para hacer su nombre inmortal. Los jueces, cuando lo condenaron, decretaron que su nombre debía permanecer anónimo para la posteridad. Poco después, sin embargo, el historiador Teopompos escribió que el nombre del loco era Herostratos... Cuando hace poco mencioné el nombre de Herostratos en un artículo, el editor me llamó para decirme que nadie en la editorial había oído jamás ese nombre, lo que de seguro habría satisfecho a los jueces de Efeso. Si Herostratos ha alcanzado la inmortalidad por haber incendiado el templo de Artemisa, quizás también el nombre de quién Herostratos consiguió las cerillas no debiera ser enteramente olvidado. Yo soy ese hombre” Erwin Chargaff (en clara alusión a Watson y Crick por su forma de hacer ciencia, pero también al papel de él mismo en el descubrimiento de la estructura del DNA)

“Tiene que ver con el desdoblamiento, pero no con la división de una sola cosa en sus opuestos, esto es, con la repetición, con el aumento, pero no con el desarrollo”. Trofim Lysenko (comentario acerca del descubrimiento de la estructura de la doble hélice del DNA)

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El dogma central de la Biología George Gamow y el código genético Es difícil describir la serie de acontecimientos que llevaron al desciframiento del código genético de una manera lineal, porque muchas de las ideas y resultados que dieron lugar a su elucidación se produjeron en distintos campos y de manera paralela. La idea de la existencia de un código genético era antigua entre la comunidad científica, pero se hizo más evidente desde que quedó claro que el material hereditario estaba almacenado en el DNA, mientras que las moléculas ejecutoras de la función celular eran fundamentalmente las proteínas. Era evidente que debía existir un código que pudiera ser copiado a las siguientes generaciones y que permitiera su traducción para que las proteínas fueran sintetizadas en el momento adecuado. Uno de los primeros en escribir sobre la posibilidad de que los seres vivos mantuvieran en su material hereditario un código que poseyera las propiedades apuntadas anteriormente fue Erwin Schrödinger, quien ya en 1941 y en su famoso libro ¿Qué es la vida? se refirió al código genético como una especie de código Morse en el que se codifica la información, y que en ese momento aventuró que pudiera estar formado por moléculas de proteínas. El siguiente impulso en el establecimiento del concepto de código genético se produjo tras la publicación del famoso artículo de Watson y Crick, y vino de la mano del físico George (Georgiy Antonovich) Gamow, investigador ruso emigrado a los Estados Unidos. Amigo de muchos de los grandes científicos de la época ‑no en vano había estudiado en Europa con varios de ellos, incluido Böhr‑, Gamow fue una figura muy interesante dentro de la ciencia del siglo XX, un hombre preocupado por asuntos relacionados con la Física y la Biología. Hasta que una cirrosis hepática, producto de su amor por el alcohol, le llevara a la tumba, Gamow se mostró como un científico extrovertido, autor de libros de divulgación científica muy populares en todo el mundo. Se cuentan de él innumerables anécdotas tales como la de su intento de huida de la Unión Soviética en una pequeña canoa desde un puerto del Mar Negro, que además de resultar infructuosa pudo llevar a la muerte a él y su mujer. Afortunadamente para ellos las corrientes les devolvieron a la costa y además nadie se apercibió de su loco plan. En otra ocasión, en 1948, y tras finalizar de escribir con su estudiante Ralph Alpher el que luego sería un famoso artículo que daría lugar a lo que hoy conocemos como teoría del Big Bang, convenció a su amigo Hans Bethe, un famoso físico ya entonces, para que firmara con ellos el artículo, que vino en llamarse “The alpha, beta, gamma paper”, por la semejanza fonética con los apellidos de los tres autores, Alpher, Bette y Gamow. También intentó que alguno de sus artículos fueran cofirmados por un personaje de sus libros de divulgación, el famoso Mr. Tompkins. Desgraciadamente, el editor se dio cuenta de la broma y lo impidió. Gamow hablaba seis idiomas, pero tenía un acento 160

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tan fuerte que a veces su conversación era difícilmente comprensible, lo que le llevó a decir a un colega suyo que “Gamow no hablaba seis idiomas distintos sino seis dialectos de un solo idioma, el gamowiano”. Gamow leyó, a instancias de Luis Álvarez ‑el famoso físico norteamericano‑, el artículo de Watson y Crick, y enseguida vio la relación entre la secuencia lineal de bases, allí donde se encontraba codificada la información, y la secuencia lineal de aminoácidos que da lugar a las diferentes proteínas. Gamow escribió una carta a Watson y Crick en la que les proponía un código para trasladar la información del DNA a las proteínas. El trabajo, que posteriormente se publicó en la revista Nature en 1954, fue denominado del código de diamante porque ésta es la forma que tiene el espacio que según Gamow se crea entre cuatro bases, dos de cada hebra, en el surco pequeño del DNA (Figura 34). Gamow sugirió que el DNA, concretamente uno de los surcos de la doble hebra, actúa como molde en el que se guarda la información sobre la secuencia de las proteínas. Según Gamow, existía una interacción física directa entre las bases en las que está contenida la información y entre los aminoácidos, de tal manera que la forma del hueco que tres bases de la doble hebra dejan en el espacio del surco del DNA dicta el aminoácido que puede encajarse entre ellas. Además, Gamow sugirió que el código es solapante, es decir, que parte de las bases que codifican un aminoácido también lo hacen con el anterior y con el siguiente. La razón por la que Gamow escogió el solapamiento de bases tiene que ver con el hecho de que la separación entre aminoácidos es menor que la que existe entre los nucleótidos y la única manera de casar aproximadamente las distancias era la de usar una base por aminoácido. Finalmente, Gamow propuso que la combinación de las cuatro bases debía servir para codificar 20 aminoácidos. El código de Gamow era incorrecto, entre otras cosas porque ya para entonces se sabía que el DNA se encontraba en el núcleo mientras que la síntesis de las proteínas se producía fuera de él, por lo que el DNA y las proteínas no podían interaccionar en el momento de la síntesis de estas últimas. Sin embargo, las ideas de Gamow iniciaron una reacción en cadena entre distintos científicos. La utilización de 20 aminoácidos por parte de Gamow era casual, pues en aquella época no se sabía con certeza si, de los 100 aminoácidos que se conocían, eran 20 exactamente los aminoácidos que se encuentran normalmente en la naturaleza. ­Watson y Crick, los dos todavía en el LMB pero el primero preparado para volver a los Estados Unidos, se dieron cuenta enseguida de la fuerza del concepto de código genético, y Crick especialmente lo hizo suyo. En colaboración con su primer estudiante postdoctoral, el sudafricano ­Sydney Brenner, se aprestó a caracterizarlo con la mayor profundidad posible y en poco tiempo demostró que el código solapante era incorrecto, al tiempo que en colaboración con Watson propuso otra lista de 20 aminoácidos, que resultó ser la correcta (curiosamente, hasta entonces nadie se había molestado en poner sobre el papel una lista de los aminoácidos relevantes).

Figura 34. Esquema del código genético de Gamow y de todas las posibilidades que se pueden producir en el hueco que se genera en el surco entre las dos hebras, dependiendo de las bases que formen parte de las dos hebras.

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En lo que sí acertó Gamow fue en el concepto de triplete, por otra parte algo bastante razonable, ya que tres bases es el número mínimo de éstas que pueden codificar 20 aminoácidos; y es que un código con una base sólo podría codificar 4 aminoácidos, mientras que uno de dos lo haría para 16 (4 × 4). El código de tres bases lo hace en realidad para 64 aminoácidos (4 × 4 × 4), pero la redundancia es un problema menor. La idea de Gamow de que la estructura de tres bases codifica un aminoácido mediante una interacción física tampoco era correcta, pues como se encargó de demostrar Crick, con las cuatro bases no existen las suficientes combinaciones de formas para que se puedan codificar 20 aminoácidos. La interacción no parecía, pues, ser directa, y sugería que tenía que haber un intermediario que sirviera de transmisión entre el DNA y la proteína que se producía. El RNA parecía ser el candidato adecuado para representar el papel de intermediario. Las evidencias eran indirectas pero se iban acumulando a lo largo de los años cuarenta y cincuenta. Una de las más fuertes tenía que ver con el hecho de que mientras que la cantidad de DNA en la célula era constante (excepto durante el proceso de división), la de RNA variaba a lo largo del ciclo celular y podía encontrarse en más cantidad en el momento en que producía un aumento de la síntesis de proteínas. Además, el DNA permanecía en general en el núcleo mientras que el RNA se encontraba fuera de él, en el citoplasma, que es el lugar donde se había observado que se sintetizaban las proteínas. La primera referencia escrita sobre la idea de que el DNA transmite la información al RNA y éste a su vez lo hace a la proteína apareció en 1947 en un artículo de los ya mencionados científicos franceses André Boivin y Roger Vendrely, y más concretamente, en el resumen en inglés que realizó el editor del artículo (en aquella época muchas revistas científicas admitían artículos en varios idiomas, pero se escribía un resumen en inglés, que en ocasiones era realizado por el propio editor del artículo), quien consignó a modo de sumario para resumir el trabajo de los dos franceses: “DNA makes RNA, and RNA makes protein”. La misma idea, más elaborada, fue propuesta por Alexander Dounce en 1952, un año antes de la publicación de los trabajos de Watson y Crick. Dounce sugirió que el RNA podía actuar de molde en la síntesis de proteínas. Además propuso que la información lineal dispuesta en la secuencia nucleotídica era trasladada a una secuencia lineal de aminoácidos. Sin embargo, el artículo de Dounce pasó inadvertido para la mayor parte de la comunidad científica, y sólo fue “descubierto” a partir de los resultados de Watson y Crick y como resultado de la búsqueda del código genético.

Linus Pauling y la anemia falciforme Aproximadamente al mismo tiempo que se producían estos acontecimientos se desarrollaron otros que vinieron a reforzar la idea del código genético, y es que en 1949 Linus Pauling publicó un artículo en el que 162

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demostró la naturaleza molecular de la enfermedad conocida como anemia falciforme. La causa de esta enfermedad, que es todavía común en áreas atacadas por la malaria, se había localizado anteriormente en un cambio en la hemoglobina, la proteína que transporta el oxígeno en los glóbulos rojos en la sangre. La hemoglobina de los enfermos de anemia falciforme se caracteriza por poseer una mayor capacidad para transportar oxígeno y muestra un cambio conformacional que se traduce en una propensión a polimerizar en largos filamentos que, a su vez, deforman los glóbulos rojos, produciendo la estructura en forma de hoz que da nombre a la enfermedad, que puede llegar a ser mortal. Hoy sabemos que la enfermedad está producida por una mutación de la hemoglobina que parece dar lugar a ventajas adaptativas en los lugares proclives a la malaria. La mutación proporciona una ventaja evolutiva a las personas que la poseen, puesto que parte del ciclo vital del parásito que porta la malaria ocurre en los glóbulos rojos, y la malaria es menos grave en las personas con esa mutación. Así, un individuo portador de un gen normal y otro mutante tiene más probabilidades de sobrevivir en esas zonas que un individuo con los dos genes normales. Por el contrario, el individuo con los dos genes mutados tendrá pocas posibilidades de sobrevivir. Como ya hemos comentado anteriormente, Pauling ya había trabajado en los años treinta con la hemoglobina en la caracterización de sus propiedades magnéticas, pero el interés por la enfermedad se produjo a través de un comité del que formaba parte, y que estudiaba las grandes líneas de actuación médica en los Estados Unidos después de la II Guerra Mundial, y en el que se hablaba de la anemia falciforme como problema que afectaba a un porcentaje de la población negra americana. Pauling pensó que la diferencia entre la hemoglobina normal y la que producía la anemia debía tener un origen químico. En colaboración con su alumno Harvey Itano, Pauling realizó experimentos de electroforesis que demostraron que los dos tipos de hemoglobina tienen una diferente movilidad electroforética. Este resultado mostraba claramente que la anemia falciforme era una enfermedad molecular, pues la diferencia debía residir en la sustitución de algún aminoácido. El mismo año en el que Pauling publicó su trabajo, otro científico americano, James Neel, de la Universidad de Michigan ‑uno de los primeros médicos que entró en la asolada Hiroshima después de la explosión de la bomba atómica‑, demostró que la anemia falciforme es una enfermedad que sigue un patrón mendeliano y que se transmite a través de un gen recesivo. La combinación de los resultados de Pauling y Neel mostraban la unión entre las teorías evolutivas de Darwin, la Genética de Mendel y la Biología Molecular. Estos experimentos estaban en la mente de Crick cuando, años después, en 1955, se dedicaba de lleno a la resolución del código genético. Sin embargo fue un comentario de Boris Ephrussi, durante un congreso, lo que le hizo volver sobre este asunto. Ephrussi le hizo ver a Crick que todavía no había evidencia directa de que un cambio en un gen produje-

Microscopía de hematíes normales (circulares, arriba, aumento 3.000x), y con hemoglobina mutada en un aminoácido (en forma de hoz, abajo, aumento 4.000x), causante de la anemia falciforme. Fuente: CDC, Janice Carr, 2005.

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ra un cambio en la proteína que aquél controlaba, y desde ese momento Crick se dispuso a demostrar que esto era así. Aunque sus primeros intentos de abordar el problema lo fueron con la proteína lisozima, pronto se apercibió de que la hemoglobina que daba lugar a la anemia falciforme era el espécimen adecuado. Su idea era demostrar que el cambio entre los dos tipos de hemoglobina se debía a un cambio de aminoácidos por culpa de una mutación en la secuencia nucleotídica. Para ello convenció a Vernon Ingram, un estudiante postdoctoral de Max Perutz con experiencia en química de proteínas y que entonces realizaba experimentos de marcaje con átomos pesados en la hemoglobina para los ensayos de cristalización descritos en páginas anteriores, para que trabajara en este problema. La ventaja de investigar en un gran centro científico como es Cambridge es que normalmente se encuentran las personas y técnicas adecuadas para ayudar a intentar resolver cualquier problema. En este caso, Max Perutz poseía una cierta cantidad de hemoglobina mutante y Fred Sanger, en el cercano departamento de Bioquímica, las técnicas y conocimientos adecuados para resolver el problema que Crick e Ingram pretendían atacar. La idea era cortar tanto la hemoglobina normal como la mutante utilizando proteasas, y observar la posible diferencia en la movilidad mediante electroforesis de algunos de los péptidos resultantes. El resultado fue positivo pues uno de los péptidos poseía una diferente movilidad respecto a su correspondiente en la hemoglobina normal. Ingram purificó cierta cantidad de los dos péptidos que mostraban diferente movilidad y se dispuso a secuenciarlos. Después de un arduo trabajo consiguió demostrar que la diferencia entre los dos péptidos y, por lo tanto, entre los dos tipos de hemoglobina, residía en un solo aminoácido, pues el residuo glutámico había sido reemplazado en la hemoglobina mutante por valina (Figura 35). Sus resultados, publicados en forma de dos artículos en la revista Nature, produjeron una gran conmoción, puesto que se demostró fehacientemente que una enfermedad que seguía unas pautas mendelianas,

Figura 35. Experimento de Ingram. Cromatograma de los péptidos de una hemoglobina normal (izquierda) y de otra con la mutación causante de la anemia falciforme (derecha). En azul oscuro se señala el péptido diferente, que muestra una distinta movilidad en ambos tipos de hemoglobina. Debajo, la secuencia de ambos péptidos, una vez realizada la secuenciación por Vernon Ingram. 

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con ciertas ventajas evolutivas, podía explicarse en términos moleculares por la simple sustitución de un aminoácido. Cuando las técnicas de secuenciación de nucleótidos se hicieron más accesibles, otra vez gracias a la labor de Fred Sanger, se encontró que la mutación se debía a la sustitución de una sola base, lo que hace que el codón GGA que codifica glutámico en la hemoglobina normal, en la hemoglobina mutante sea GUA, codón que codifica un aminoácido distinto, la valina. Estos resultados no hacían sino reforzar la existencia de un código genético. Gamow había sugerido que éste se podía identificar utilizando modelos teóricos o aproximaciones teórico-experimentales como las que realizó Pauling para resolver la estructura de la hélice α o Watson y Crick para determinar la estructura del DNA. La realidad se encargó de demostrar la necesidad de un enfoque totalmente experimental. Aún así, la formulación de ideas e hipótesis fue fundamental para desbrozar el camino. En el centro de este desarrollo se situó Francis Crick, cuya estatura científica se iba agrandando a pasos agigantados.

Francis Crick y el club de la corbata de RNA En el año 1957, Crick escribió dos artículos teóricos que iban a ser fundamentales para el devenir de la Biología Molecular, y en los que expresaba sus ideas sobre la transmisión de la información hereditaria y acerca del control que los genes realizan sobre la síntesis de proteínas. Uno de los artículos jamás se publicó como tal, pues pertenecía a una publicación interna del llamado “RNA tie club” (el club de la corbata de RNA), una humorada creada por George Gamow y James Watson, y que tenía por lema “Hazlo o muere, o no lo intentes”. El club estaba formado exclusivamente por 20 miembros, que se correspondían con los 20 aminoácidos, y entre ellos se encontraban Gamow (alanina), Watson (prolina), Crick (tirosina), Chargaff (lisina), y los famosos físicos Edward Teller (leucina) y Richard Feyman (glicina). El club nunca llegó a reunirse en su totalidad, pero sí que sirvió para que entre sus miembros circulasen ideas como las que Crick propuso en el citado artículo, que él mismo calificó como su “artículo más influyente jamás publicado”. En este artículo, Crick sugirió la llamada hipótesis del adaptador (Figura 36) y, a través de ella, propuso que, puesto que no veía manera por la que el DNA o el RNA transfirieran físicamente la información a los aminoácidos mediante una complementación de sus estructuras como en el



El club de la corbata de RNA (RNA Tie Club): Francis Crick (Tyr), Alex Rich (Arg), George Gamow (Ala), James Watson (Pro) y Melvin Calvin (His), en 1963, durante el simposio CSHL “Synthesis and Structure of Macromolecules”. © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

Figura 36. Esquema de aminoácido, adaptador y ácido nucleico.

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caso del apareamiento de bases en la estructura de doble hebra del DNA, debía existir un adaptador que sirviera de interfaz entre los dos tipos de moléculas biológicas, los nucleótidos del DNA y los aminoácidos de la proteína. Esta molécula, según Crick, podría ser un tipo de RNA, y necesitaría un enzima que uniera específicamente el aminoácido adecuado al adaptador específico de cada aminoácido: “La principal idea es que es muy difícil considerar cómo el DNA o el RNA pueden actuar de molde para las cadenas laterales de los 20 aminoácidos estándar. Tiene que haber algún tipo de estructura, con un patrón específico de grupos, que pueda formar enlaces de hidrógeno entre los dos tipos de moléculas. Por lo tanto propongo una teoría por la cual deben existir veinte adaptadores (uno por cada aminoácido) junto con veinte enzimas específicos. El adaptador con su aminoácido se ajustaría específicamente a la molécula de DNA o RNA donde pudiera formar puentes de hidrógeno específicos. De esta manera se colocarían los aminoácidos adecuados en el lugar donde fueran necesitados”.

Esta idea genial de Crick dio en el clavo, y los siguientes años fueron testigos de la frenética búsqueda de ese adaptador, lo que hoy llamamos el RNA de transferencia.

Francis Crick y el Dogma Central de la Biología El segundo artículo de Crick, “On protein synthesis” (“Sobre la síntesis de proteínas”), tuvo un impacto mucho mayor. Fue presentado primero como una comunicación oral a la Sociedad de Biología Experimental, y publicado en 1958 en una revista hoy desaparecida. En el artículo, Crick expuso las ideas fundamentales de lo que él mismo denominó y todo el mundo conoce hoy como “Dogma Central de la Biología”. Este concepto puede parecer pretencioso y es, desde luego, incorrecto, pues como ­Monod le hizo notar, la palabra dogma hace mención a un concepto innegable, en este caso en la Ciencia. En descargo de Crick hay que decir que, como él mismo confesó, desconocía el significado exacto de la palabra: “Yo pensaba que un dogma es una idea para la que no hay una razonable evidencia (...) Simplemente no sabía lo que significaba la palabra ‘dogma’. Podía haber llamado a mi idea ‘Hipótesis Central’ (...) Dogma era para mí simplemente una palabra pegadiza. Y desde luego que he pagado por mi error, porque a mucha gente le ha disgustado el uso de esa palabra, mientras que si hubiese usado la expresión ‘Hipótesis Central’, nadie se hubiera molestado”.

En el artículo, Crick creyó oportuno proponer ciertas teorías y utilizarlas para poder crear un marco en el que relacionar los descubrimientos que se estaban realizando en aquella época: “Mi propio pensamiento (y el de mis colegas) está basado en dos principios que llamaré la Hipótesis de la Secuencia y el Dogma Central. Apenas existe evidencia que apoye tales hipótesis, pero éstas me 166

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han ayudado a intentar comprender los complejos problemas a los que nos enfrentamos. Las presento aquí con la esperanza de que otros puedan hacer un uso parecido de ellas. Su naturaleza especulativa queda en evidencia por sus propios nombres, pero creo que es un ejercicio útil para intentar construir una teoría”.

A diferencia de lo que ocurrió con el primer artículo, no todas las ideas que Crick apuntó en este segundo artículo eran novedosas, e incluso algunas de las ideas representadas en el “Dogma Central” (Figura 37) ya circulaban en ciertos sectores de la comunidad científica. El mismo Watson apuntó que él mismo ya tenía un papel pegado en su escritorio a principios de los años cincuenta con las ideas del Dogma, y que posteriormente publicaría en un libro en 1965. El esquema de Crick, que contiene la mayor parte de las ideas expuestas en 1958, apareció en la revista Nature en 1970, y es el que se ha hecho famoso.



Figura 37. Esquema del dogma central de la biología.

Pero volvamos al famoso artículo de 1957 en el que Crick articuló sus ideas sobre la correlación entre la secuencia lineal de las bases y la de los aminoácidos. El científico inglés escribió: “La función más importante del material genético es el control (no necesariamente directo) de la síntesis de proteínas”.

Además, apuntó que “el hecho único de la síntesis de proteínas es que únicamente 20 aminoácidos son incorporados en una secuencia lineal, y para que una proteína sea tal, los aminoácidos que la componen deben unirse en un orden específico”. Así pues, el orden de los aminoácidos determina su estructura y, por ende, su función, y de esta manera, Crick puso las bases al problema del plegamiento de proteínas, tan en boga en la actualidad. Crick sugirió que debía de haber dos tipos de RNA. Además del RNA que sirve como adaptador entre el triplete de bases (en esta época todavía no se había demostrado que el triplete de bases fuera la unidad de información genética) y el aminoácido que codifica, debía existir otro RNA que, utilizando como molde el DNA, transfiriera la información genética al citoplasma para que las proteínas fueran sintetizadas. No era la primera vez que se apuntaba la idea de un RNA intermediario, o RNA mensajero como vino a llamarse finalmente, pues tal como comentamos anteriormente, Boivin, Vendrely y Dounce ya habían sugerido ideas parecidas, pero esta vez el mensaje de Crick llegó directo a los oídos de una comunidad científica mucho más receptiva. 167

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La información sobre la herencia, según Crick, está almacenada en la secuencia nucleotídica del DNA, que es única para cada gen y que está caracterizada por un orden determinado de las bases. Esta información puede ser copiada en otra hebra de DNA, en un proceso que se ha denominado replicación; puede ser transferida a una secuencia complementaria de RNA (transcripción), y de ésta pasar a la secuencia de aminoácidos de la proteína (traducción). Según el científico inglés, la transferencia de información de RNA a RNA y de RNA a DNA pudiera quizás ocurrir, pero no así el paso de información de la proteína al ácido nucleico, ni de la proteína a la proteína (Figura 37). Estas ideas necesitaban ser demostradas, y durante los siguientes años se produjo una febril actividad que vino a confirmar varias de las hipótesis de Crick y, de paso, a establecer de manera definitiva la Biología Molecular como una de las grandes disciplinas científicas del siglo XX.

El RNA de transferencia A decir verdad, la idea de un adaptador entre la secuencia de ácidos nucleicos y la de aminoácidos ya había sido sugerida, y en cierto modo demostrada, también en 1957 por el grupo de Paul Zamecnik, en la Universidad de Harvard. Zamecnik es uno de los grandes bioquímicos del siglo XX y sus resultados han sido determinantes para el devenir de la Biología Molecular. En el caso que nos ocupa, Zamecnik y su por entonces ayudante Mahlon Hoagland, realizando experimentos con ATP radioactivo marcado con 14C, descubrieron que la radioactividad aparecía en la adenina de un tipo de RNA que fueron capaces de aislar posteriormente. Su sorpresa fue mayúscula cuando en otro tipo de experimentos en los que utilizaban leucina marcada con 14C observaron con sorpresa que ésta se unía a RNA y que la unión era covalente. El RNA aislado era, pues, una mezcla de ácido nucleico y aminoácido y éste sólo podía separarse mediante la digestión completa con una RNAsa. El RNA adaptador se había descubierto, pero desgraciadamente para Crick, el término que prevaleció para este adaptador fue el de RNA de transferencia (tRNA). La confirmación de la existencia del tRNA vino unos años más tarde, en 1963, del trabajo de François Chapeville, alumno postdoctoral de Fritz Lipmann. Chapeville realizó uno de los experimentos más ingeniosos de la historia de la Biología Molecular, que le sirvió no sólo para demostrar la existencia de los tRNA como adaptadores entre la información que proviene del DNA y la secuencia de aminoácidos, sino además que la especificidad de esta información se encuentra en el RNA y no en el aminoácido que está unido a éste; en definitiva, que es la secuencia nucleotídica del RNA, que proviene del DNA, la que dirige la secuencia de la síntesis de proteínas. Es preciso hacer notar que para entonces ya se conocía el código genético, algo de lo que hablaremos posteriormente. Chapeville primero aisló y purificó el tRNA que codifica el aminoácido cisteína. Posterior168

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mente, mediante una transformación química, logró eliminar de este tRNA el grupo sulfhidrilo de la cisteína, con lo que convirtió este aminoácido en alanina (véase figura 3). A continuación, suministró a un extracto celular un polinucleótido sintético formado por U y G. De acuerdo al código genético, la mezcla de U y G en cualquier orden puede producir los aminoácidos fenilalanina, cisteína, leucina, triptófano, valina y glicina, pero no alanina. Chapeville observó que si suministraba el tRNA modificado, que codificaba cisteína pero que en realidad contenía alanina, ésta se unía a la cadena de aminoácidos producida. Sin embargo, cuando suministraba el tRNA purificado que codificaba alanina y que contenía realmente este aminoácido, no se unía a la cadena recién sintetizada (Figura 38).



Figura 38. Experimento de Chapeville. Se muestra el proceso normal de incorporación del aminoácido cisteína a la cadena naciente, y el experimento realizado por Chapeville modificando el aminoacil-tRNA.

Una vez aislados los primeros tRNA, el siguiente paso fue caracterizarlos en detalle. Fue el equipo de Robert Holley quien tuvo el honor de secuenciar el primer tRNA. Holley y su grupo, en un laboratorio del Ministerio de Agricultura en Ítaca, Nueva York, desarrollaron desde mediados de los años cincuenta técnicas de separación de los diferentes tRNAs, y cinco años después consiguieron secuenciar el primero de ellos, uno de los tRNA que codifica el aminoácido alanina. Para conseguirlo, el grupo de Holley utilizó técnicas parecidas a las usadas por Sanger para la secuenciación de proteínas, combinando la digestión del nucleótido mediante nucleasas y la cromatografía de los fragmentos. El tRNA de alanina posee 77 nucleótidos, algunos de los cuales están constituidos por unas bases que no son las canónicas sino especiales para este tipo de moléculas, lo que hizo, si cabe, más compleja esta hazaña 169

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Estructura molecular de una molécula de tRNA formando una estructura en horquilla debida a apareamientos internos entre las bases nitrogenadas.

científica que mereció el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1968. El grupo de Holley y el de Elizabeth Seller de la Universidad de Cornell hipotetizaron, a partir de ciertos resultados obtenidos por Holley y otros que apuntaban al apareamiento de bases en algunos sectores del tRNA, una estructura secundaria en forma de trébol que pronto atrajo la atención de la comunidad internacional. Sin embargo, hubo que esperar dos años y que tuviera lugar la secuenciación de otros tres tRNAs ‑uno de tirosina y dos de serina, que mostraban las mismas características generales y las mismas posibles zonas de apareamiento‑, para que el modelo fuese aceptado. La confirmación final vino de la cristalografía de rayos X. Gracias al desarrollo de técnicas cromatográficas cada vez más sofisticadas, se consiguieron más cantidades y más puras de tRNA con las que embarcarse en experimentos de cristalización. El premio por determinar la primera estructura de un tRNA dio lugar a uno de los episodios de competición más famosos de la historia de la Biología Molecular, el protagonizado otra vez entre los dos lados del Atlántico: en un lado por Alexander Rich del MIT y en el otro por el esfuerzo combinado de los grupos de Aaron Klug y Brian Clark, del LMB de Cambridge. Fue el grupo de Alex Rich quien primero obtuvo una estructura del tRNA, la del tRNA de fenilalanina, primero a 7 Å y posteriormente a 4 Å en 1973. Sin embargo, esta última tenía serios errores en su determinación, producto sin duda de las prisas por ser los primeros en publicarla, y les cupo el honor a los grupos de Klug y Clark de publicar en 1974 la primera estructura a 3 Å de resolución de ese mismo tRNA. En los siguientes años se fueron caracterizando los demás tRNAs, aproximadamente dos por aminoácido, y se demostró que cada tRNA posee un diferente anticodón (triplete de bases) que se complementa con el codón (triplete de bases que codifica un aminoácido) del RNA intermediario. Estas palabras fueron inventadas por Sydney Brenner, cuya estatura científica iba creciendo por momentos, y fueron incorporadas enseguida al vocabulario de la Biología Molecular. Durante los siguientes años, se realizarían experimentos muy importantes que contribuyeron a caracterizar mejor la maquinaria de traducción. Así, el grupo de Paul Berg en Stanford purificó varios de los enzimas involucrados en la unión de los aminoácidos a sus correspondientes ­tRNAs. La maquinaria de funcionamiento con respecto al tRNA estaba prácticamente caracterizada y una de las hipótesis de Crick, la del adaptador, se había demostrado.

El RNA mensajero La caracterización del tRNA fue una hazaña desde el punto de vista experimental, pero conceptualmente su existencia fue aceptada desde el primer momento. Más compleja fue la apreciación de la existencia del RNA mensajero (mRNA), y es que durante varios años se pensó que éste 170

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era lo que ahora conocemos como RNA ribosomal. Que el RNA tenía un papel en el citoplasma había sido descubierto en los años cuarenta por el científico sueco Torbjörn Caspersson, gracias al desarrollo de una serie de técnicas bioquímicas y espectroscópicas como la medida de la absorbancia a 260 nm, hoy todavía utilizada. Usando dichas técnicas Caspersson pudo determinar que el citoplasma contiene una gran cantidad de RNA, cantidad que es directamente proporcional a la síntesis de proteínas que se produce en la célula. A la misma conclusión por distinto camino había llegado el embriólogo belga Jean Brachet, quien observó a principios de los años cincuenta que, mientras que la cantidad de DNA aumentaba en los periodos de división celular, la cantidad de RNA era mayor cuantas más proteínas producía la célula. En 1955 Brachet consiguió eliminar el núcleo de las células y pudo observar cómo éstas mantenían la síntesis de proteínas durante varios días. El RNA se encontraba, pues, en el citoplasma y controlaba de alguna manera la síntesis de proteínas. Más o menos al mismo tiempo y en el Instituto Rockefeller de Nueva York, los grupos liderados por los científicos belgas Albert Claude y ­Christian de Duve, y por el rumano George Palade habían desarrollado una novedosa técnica de fraccionamiento celular por la que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1974. Para ello combinaron la ultracentrifugación ‑que les permitía separar los orgánulos celulares‑, la microscopía electrónica ‑con la que podían describir los orgánulos aislados‑, y las técnicas bioquímicas ‑que les facilitaron aislar e identificar enzimas que servían de marcadores específicos a esos orgánulos‑. Estos experimentos tenían como fin la búsqueda del agente tumoral que el americano Peyton Rous había descubierto en 1911. Rous había conseguido transferir cáncer de un pollo a otro a través de un extracto libre de células en el que él había considerado existía un agente infectivo, un virus. Durante este trabajo, Claude y sus colaboradores consiguieron aislar, además de los orgánulos clásicos como mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, etc., unas partículas que llamaron microsomas, y que Palade caracterizó a mediados de los años cincuenta y de manera independiente, a las que denominó ribosomas (los dos nombres fueron utilizadas durante un tiempo; de hecho también se denominaron corpúsculos de Palade). El científico rumano describió a los ribosomas como partículas que poseían RNA y relacionó su número con la actividad sintética de proteínas. Sin embargo, ya en 1950 Henry Borsook, trabajando en Caltech, había mostrado que la síntesis de proteínas tiene lugar en los ribosomas. El siguiente hito en la caracterización del RNA como intermediario en la síntesis de proteínas se produjo en el año 1953, cuando el grupo de ­Zamecnik, entonces en el Massachusetts General Hospital de Boston, consiguió desarrollar el primer sistema libre de células para el estudio de la síntesis de proteínas. Este sistema sería capital, como luego veremos, para la caracterización del código genético, pero en el caso que nos ocupa sirvió para demostrar fehacientemente que la síntesis de proteínas se produce en los ribosomas, pues utilizando aminoácidos marcados,

George E. PALADE (1912-). © U.S. National Library of Medicine.

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­ amecnik mostró sin lugar a dudas que la radioactividad se concentraba Z en una primera instancia en los ribosomas. De la combinación de los resultados obtenidos hasta entonces era lógico pensar que era el RNA que se encuentra en los ribosomas el agente involucrado en transmitir la información. Sin embargo, había datos que apuntaban lo contrario. Uno de ellos era el hecho de que, a pesar de que se conocía que las proteínas tenían una longitud muy variable, el RNA ribosómico aparecía como dos poblaciones de tamaño fijo (dos bandas de un tamaño aproximado de 0,6 y 1,2 megadalton). El segundo era que, a pesar de que el porcentaje de las bases que se encuentran en el DNA de cada especie era distinto, la composición de las bases del RNA ribosómico era parecida en todas ellas. Estos resultados sugerían que el RNA ribosómico tenía un papel estructural y no podía ser el RNA intermediario o mensajero que algunos, como Watson o Crick, creían que debía existir. Los primeros resultados que apuntaron la existencia de otro tipo de RNA los publicaron en 1956 Elliot Volkin y Lazarus Astrachan. Los dos científicos americanos, trabajando en los laboratorios de Oak Ridge en Tennessee, infectaron un cultivo de E. coli con bacteriófagos T2, e inmediatamente después de la infección aislaron el RNA producido, que estaba marcado porque el experimento se había realizado en presencia de nucleótidos radioactivos. Se encontraron con que la composición de bases del RNA era diferente a la de los ácidos nucleicos de la bacteria y del fago que ellos habían analizado anteriormente, por lo que hipotetizaron la existencia de otro tipo de RNA. Sin embargo, sus resultados no fueron comprendidos en ese momento. Tuvieron que pasar cuatro años, cuando las tesis y la influencia de Crick se extendieron por toda la comunidad científica, para que la existencia del RNA intermediario fuera aceptada. Ello vino de la mano de un experimento clásico en la historia de la Biología Molecular, que se realizó en 1960, el llamado experimento PaJaMo, llamado así por las iniciales de sus tres autores, el científico americano Arthur Pardee y los franceses François Jacob y Jacques Monod. Los experimentos eran en cierto modo la continuación de aquéllos que unos cuantos años antes había realizado Jacob con Wollman en relación con el fenómeno de la conjugación bacteriana. El experimento consistió en inducir la conjugación de dos cepas: una donadora que posee el gen del enzima β‑galactosidasa, pero que es sensible a la presencia del antibiótico estreptomicina; la otra cepa es aceptora, no posee el gen del enzima β‑galactosidasa y es resistente a la acción del antibiótico estreptomicina. Después de permitir la conjugación durante un cierto tiempo, se añadió al cultivo estreptomicina para matar todas las bacterias donadoras. Posteriormente midieron la síntesis de β‑galactosidasa y observaron que ésta se producía rápidamente, a una velocidad que no podía ser explicada por la síntesis del RNA ribosómico. Un tiempo después de realizar estos experimentos, en la Semana Santa de 1961, Jacob y Monod visitaron a Crick y Brenner en Cambridge con el fin de explicarles sus resultados. Los dos científicos del LMB duda172

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ron en principio de su validez, pero una vez convencidos, fue Brenner quien relacionó los resultados con los obtenidos por Volkin y Astrachan unos años antes. Era el RNA que estos dos científicos habían descubierto el que transmitía la información desde el DNA del núcleo hasta los ribosomas del citoplasma. Hoy sabemos que estas últimas partículas contienen un tipo de RNA estructural, que conocemos simplemente como ribosómico, y que sirve como cabeza lectora de la información que posee el RNA transportador, al que Brenner bautizó como RNA mensajero (mRNA). Durante esa misma tarde, Brenner y Jacob idearon una serie de experimentos para probar que el RNA mensajero existía y que el RNA ribosomal sólo estaba implicado en la síntesis de las proteínas. Los experimentos fueron llevados a cabo en Caltech por Jacob y Brenner durante ese mismo verano, en el laboratorio de Mathew Meselson, utilizando en parte la técnica de centrifugación en gradiente de densidad que éste había desarrollado y que había servido para demostrar la existencia de la replicación semiconservadora. El experimento consistió en cultivar bacterias de E. coli durante varias generaciones con dos isótopos pesados, 15N y 13C, hasta conseguir que las bacterias estuvieran marcadas por completo. Se trataba de que los ribosomas, que pueden ser fácilmente aislados mediante centrifugación diferencial, fueran más pesados que los ribosomas no marcados. Posteriormente, se transfirieron las bacterias a un medio normal al tiempo que se las infectaba con el bacteriófago T4, del que ya se conocía que una vez que infectaba las bacterias tomaba el control de la síntesis. A la vez se añadió U radioactivo para marcar el RNA que se produjera de novo. Al poco tiempo se lisaron las células y se realizó una centrifugación diferencial que sirvió para conocer que no había ribosomas ligeros, que debieran haberse formado si el RNA ribosómico se producía como consecuencia de la síntesis de proteínas (Figura 39). Sin embargo, sí que encontraron radioactividad asociada a los ribosomas, que se podía separar de éstos en forma de otro tipo de RNA que además hibridaba con el DNA viral. El diseño del experimento era extremadamente ingenioso, pero todos los intentos realizados durante un mes fueron infructuosos. Afortunadamente para los tres científicos, cuando iban a utilizar la última parte de muestra que les quedaba, se dieron cuenta de que se les había olvidado añadir durante los experimentos previos el ión magnesio, imprescindible para la estabilización de

1. Crecimiento bacteriano en medio con isótopos (15N y 13C) pesados. Obtención de bacterias marcadas radioactivamente, con ribosomas “pesados”.



Figura 39. Experimento clásico de Jacob, Brenner y Meselson, que demuestra de una manera definitiva la existencia de un RNA mensajero producido por la maquinaria celular que nada tiene que ver con el RNA ribosómico.

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2. Infección con fago T4 que destruye el DNA bacteriano. Las bacterias infectadas se transfieren a un me‑ dio ligero. Se añade U radioactivo como precursor de RNA. La síntesis de RNA viral incorporará este isótopo. Si los ribosomas tienen su propio DNA, se sintetizarán “ribo‑ somas virales” marcados con U*, diferentes de los ribosomas bacte‑ rianos “pesados”.

3. Se lisan las bacterias y se centrifugan en gradiente de CsCl.

4. Sólo aparece una banda correspon‑ 5. Se detecta el RNA de nueva síntesis, ya diente a ribosomas originales bacteria‑ que está marcado en ura­cilo. nos, marcados con isótopos pesados.

6. Se separa el RNA marcado en uracilo de los ribosomas bacterianos y se hibri‑ da con DNA del virus y de bacteria, encontrando que sólo es complemen‑ tario al DNA viral.

FIGURA 39 (Cont.).



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los ribosomas. Una vez solventado el error, el experimento fue un éxito y mostró sin lugar a dudas que existía un RNA que el organismo sintetizaba para, a su vez, generar proteínas. El RNA que se encontraba permanentemente en los ribosomas era un RNA que formaba parte de la maquinaria de estas partículas, y su cantidad en la célula no respondía a las variaciones en la síntesis de proteínas que se producía durante el ciclo celular. En honor a la verdad, hay que decir que el RNA mensajero fue descubierto a la vez, aunque de una manera menos elegante, por el grupo de James Watson, quien llevaba ya un tiempo trabajando en la Universidad de Harvard con los ribosomas y había descubierto en colaboración con Alfred Tissières, que estos orgánulos estaban compuestos por dos subunidades diferentes, las que llamamos pesada y ligera. Watson, en colaboración con los luego famosos François Gros y Walter Gilbert, utilizó en este caso una técnica ligeramente distinta que consistió en añadir fósforo radioactivo a células bacterianas y separar por gradiente diferencial el RNA que se formaba. Los autores del trabajo observaron que cuando el experimento se hacía en tiempos cortos, la radioactividad se incorporaba a un tipo de RNA que no era el ribosomal, y que posteriores caracterizaciones mostraron que poseía las propiedades que se le suponían al RNA mensajero de Sydney Brenner. La demostración de la existencia del RNA mensajero cayó como una bomba en la comunidad científica. Su publicación coincidió, además, con la celebración de uno de los famosos simposia en el CSHL y allí también fueron presentados estos resultados. La voz cantante la llevó Sydney ­Brenner, quien para entonces ya se había convertido en un científico muy famoso. Durante su charla y en la defensa de la universalidad de este tipo de RNA, Brenner se dejó llevar por la pasión y comparó el RNA mensajero con Mercurio, el mensajero de los dioses. Al hacer esto, Erwin ­Chargaff, presente en la sala y siempre dispuesto a la polémica, se levantó y gritó: “Sí, pero no olvides que Mercurio era también el dios de los ladrones”. Otros experimentos vinieron a confirmar la existencia del RNA mensajero. Uno de los más importantes tiene que ver con el desarrollo de la técnica de hibridación, debida a los científicos americanos Benjamín Hall y Sol Spiegelman, quienes en 1961 consiguieron hibridar DNA del fago T2 con el RNA producido por éste, lo que dejaba patente que el RNA era producido gracias a un molde de DNA. Finalmente, y también ese mismo año, el grupo de Alexander Rich consiguió caracterizar por técnicas de microscopía electrónica la presencia de factorías de ribosomas, los llamados polisomas, descritos por primera vez por Gilbert, unidos secuencialmente a una cadena de mRNA y sintetizando proteína a partir de ella.

Imagen de unos polirribosomas o polisomas. Figura 2 en “The excitement of discovery” Alexander Rich. Ann. Rev. Biochem (2004) 73:1.

El RNA también almacena la información genética Crick ya había asumido en su famoso dogma que el RNA podía autorreplicarse, y es que unos meses antes de su publicación se había podido 175

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demostrar que el RNA podía también actuar como material almacenador de la herencia. Este descubrimiento se realizó gracias al virus TMV, que ya había contribuido al desarrollo de la Biología Molecular y que todavía depararía alguna sorpresa más. Tras su cristalización por Stanley y la anterior observación de su capacidad de replicación, el virus TMV había sido una referencia para aquellos que apoyaban a las proteínas como almacenadoras de la sustancia hereditaria... hasta que se descubrió que contenía RNA. El advenimiento del DNA como material hereditario hizo volver los ojos sobre el TMV y sobre el hecho de que sólo contiene RNA. Fue el grupo de Heinz Fraenkel-Conrat, de la Universidad de Berkeley, quien gracias a unos elegantes experimentos consiguió demostrar que era el RNA del virus TMV el agente infeccioso. Fraenkel-Conrat y su grupo consiguieron separar la proteína y el RNA de varias cepas del virus que producían diferentes síntomas en las plantas. Posteriormente, uniendo RNAs y proteínas de distintas cepas consiguieron no sólo generar virus maduros capaces de infectar plantas sino que pudieron observar que los efectos que se producían en cada planta eran los típicos de la cepa representada por el RNA y no por la proteína, lo que vino a demostrar que el agente infeccioso era el RNA almacenado en la estructura vírica (Figura 40).

Figura 40. Esquema simplificado del experimento de FraenkelConrat. 

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El mutón Otra serie de descubrimientos ayudarían a apuntalar y a desarrollar el modelo teórico surgido de la estructura e ideas de Watson y Crick. Uno de los trabajos más importantes de esa época vino a demostrar que el gen no es la unidad discreta de información sino que ésta es el nucleótido, lo que además abrió paso al concepto molecular del gen. Estos experimentos fueron realizados en el periodo que va de los años 1953 a 1961 por Seymour Benzer, un físico teórico que se introdujo posteriormente en la Biología Molecular. Benzer aisló en el gen rII del bacteriófago T4 un enorme número de mutaciones (más de 3.000). Este gen está involucrado en la lisis de la bacteria hospedadora y tiene dos peculiaridades respecto a su fenotipo que hicieron que Benzer se fijase en él. La primera es que los fagos mutantes (rII‑) producen un tipo de manchas en las placas de los cultivos de la cepa K11 distintas de la silvestre (rII+), lo que hizo que el grupo de Benzer pudiera detectar las mutaciones fácilmente. La segunda peculiaridad es que los mutantes de rII infectan pero no lisan otra cepa, la llamada B, mientras que el fago con el gen silvestre lo hace en las dos cepas. El grupo de Benzer realizó un mapa genético extremadamente fino del gen basándose en la frecuencia de recombinación entre dos mutaciones distintas. Como ya conocemos de los trabajos de Morgan y Sturtevant, cuanto más alejadas están entre sí dos mutaciones mayor es la probabilidad de que se produzca un intercambio entre ellas si se produce recombinación. El experimento que diseñó Benzer era a la vez sencillo e ingenioso. Se trataba de infectar la cepa K11 de E. coli con pares de mutantes y obtener de ésta fagos en los que no se habían producido entrecruzamientos, y fagos recombinantes (tanto dobles mutantes como fagos normales en los que el entrecruzamiento había eliminado las dos mutaciones). De los fagos producidos se tomaban dos alícuotas iguales y con una se infectaba la cepa K11 (que mostraba el número de fagos totales) y con la otra la cepa B (que mostraba los fagos silvestres que se habían producido por entrecruzamiento). El cociente entre los dos valores, a la manera de los experimentos genéticos de Sturtevant realizados más de dos décadas atrás, indicaba la proximidad de las dos mutaciones. Los experimentos realizados por el grupo de Benzer fueron de dos tipos: las combinaciones de mutantes de eliminación, que proporcionan información sobre distancia relativa entre ellos, y las combinaciones entre mutantes de eliminación y puntuales. La combinación entre los dos tipos de experimentos y los resultados sobre frecuencia de recombinación llevó al grupo de Benzer a obtener una mapa del gen muy fino en el que observaron que la distancia mínima de mutación correspondía a un nucleótido, un mutón según la palabra ideada por Benzer. Los resultados del científico americano también confirmaron la idea de que la recombinación se producía no sólo entre distintos genes sino también dentro de ellos. 177

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¡Es un triplete sin comas!

A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C             ·               ·               · A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C  A  B  C

Figura 41. Esquema del código solapante (arriba), puntuado (centro) y no solapante (debajo). Las líneas horizontales muestran en cada caso el triplete de bases que son leídas para codificar un aminoácido.

El concepto molecular del gen se fue ampliando con otros descubrimientos, muchos de ellos realizados en el LMB por Crick y Brenner. Éste último había ya demostrado en 1957 que el código genetico no podía ser solapante. Como ya vimos anteriormente, la idea del código solapante había sido introducida por Gamow y asumía que, dada una secuencia lineal de nucleótidos que codifica una secuencia lineal de aminoácidos, cada triplete de nucleótidos (y por entonces todavía no se había demostrado que el triplete fuera la unidad de codificación) estaba involucrado en la codificación de un aminoácido, del anterior (a través de los dos primeros del triplete más el ultimo del anterior triplete) y del posterior (a través de los dos últimos nucleótidos y el primero del siguiente triplete). Este tipo de código introducía una limitación, y es que dado que el número de bases era muy pequeño (cuatro) forzaba a que la secuencia que codificaba un aminoácido influyera en la siguiente. En otras palabras, que para un aminoácido cualquiera, y dentro de una secuencia lineal, no podía seguirle otro aminoácido cualquiera, sino sólo unos determinados. Afortunadamente, en 1957 ya se había secuenciado un gran número de pequeños péptidos y proteínas, y Brenner tuvo la inteligencia de observar esas secuencias y deducir de éstas que las limitaciones impuestas por el código solapante no se cumplían, por lo que este tipo de código no se daba para la codificación de proteínas. Aunque se había demostrado que el código no es solapante, había otras dudas sobre la naturaleza de la disposición de la información que había que despejar. Una de las más importantes tenía que ver con la posibilidad de que el código tuviera pausas o comas, o bien que fuera continuo, es decir que todas las bases dispuestas en la secuencia nucleotídica poseyeran información sobre la proteína que iba a ser sintetizada (Figura 41). A resolver esta duda se pusieron en 1961 Brenner, Crick y la técnica de éste, Leslie Barnett, y para ello utilizaron el mismo sistema puesto a punto por Benzer mientras estaba realizando una estancia sabática en el LMB, el del gen rII del fago T4 descrito anteriormente. Crick y Barnett, utilizando agentes mutagénicos como la acridina y la proflavina, generaron mutantes de eliminación y de adición dentro del gen rII que identificaron mediante la utilización de las cepas antes descritas. Observaron que, si bien ninguno de los dos tipos de mutantes eran capaces de generar lisis, la recombinación de un mutante de eliminación con otro de eliminación producía fagos silvestres, por lo que concluyeron que la información que contenía la secuencia de un ácido nucleico no tenía pausas. El mismo tipo de experimentos pero más laboriosos terminaron por confirmar las ideas de Crick y otros de que la unidad de información genética era el triplete de bases. Uno de los experimentos consistió en gene­ rar secuencialmente mutaciones de inserción. Así, mientras mutaciones de una y dos inserciones generaban mutantes rII‑, un triple mutante generaba fagos silvestres, por lo que concluyeron que el triplete era la unidad de codificación. Los experimentos que demostraron tal cosa acabaron una

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noche en la que estaban solos Crick y su técnico Barnett. Cuando ambos fueron conscientes del resultado final, Crick le dijo a Barnett: “Leslie, ¿te das cuenta de que en este momento somos las dos únicas personas en el mundo que sabemos que un triplete es la unidad de codificación?”.

¿A quién no le gustaría decir una frase parecida alguna vez en su vida? Los experimentos en realidad fueron mucho más complejos de lo que aquí se describe, pues consiguieron, además, mutantes de 4, 5 y 6 adiciones que vinieron a confirmar lo dicho anteriormente, pues los mutantes de 4 y 5 adiciones generaron mutantes rII‑, y los de 6 generaron mutantes silvestres. Estos resultados fueron publicados en 1961, y como Crick y Brenner pensaban que nadie leería con atención el artículo, decidieron añadir una referencia falsa para probar a sus lectores. Ésta era la de un tal Leonardo da Vinci, y se sorprendieron al recibir la llamada del editor preguntando quién era ese científico italiano, así que tuvieron que eliminarla del artículo. Finalmente, los resultados de Crick y Brenner fueron confirmados en 1965 por George Streisinger y colaboradores, utilizando otro sistema diferente, el gen de la lisozima de T4. Otro concepto predicho en el trabajo de Watson y Crick, el de la colinealidad entre la información almacenada en la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica, fue confirmada en 1963 por el grupo de Charles Yanofsky en la Universidad de Stanford, utilizando también la misma tecnología desarrollada por Benzer. Yanofsky había generado una serie de mutaciones en la subunidad α de la triptófano sintetasa, que producían un enzima inactivo a pesar de que mantenían su estructura nativa. Utilizando la técnica de recombinación antes descrita, Yanofsky pudo determinar la distancia que existía entre las dos mutaciones. A la vez, mediante experimentos de secuenciación análogos a los realizados por Sanger con la insulina, pudo determinar los aminoácidos mutados en los dos mutantes y su distancia en la secuencia aminoacídica, que se correlacionaba directamente con los resultados obtenidos con los experimentos genéticos.

El desciframiento del código genético Los descubrimientos que siguieron a la formulación del modelo de la estructura atómica del DNA (y no debemos olvidar que la estructura de Watson y Crick seguía siendo un modelo cuya demostración se produciría mucho más tarde) establecieron el marco conceptual que debía gobernar el código genético. Los experimentos realizados durante estos años dorados para la Biología Molecular habían logrado determinar que la información genética se almacena en el ácido nucleico (DNA o RNA) y que se convierte en proteínas mediante una compleja maquinaria en la que están involucrados varios tipos de RNA. Se había conseguido determinar también que la información almacenada en el DNA lo es en forma 179

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Paul C. ZAMECNIK (1913-) en el centro de la foto. © U.S. National Library of Medicine.

Marshall NIRENBERG (1927-), a la derecha, y su primer estudiante postdoctoral, Heinrich MATTHAEI (1929-), a la izquierda. (Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

de una secuencia lineal de nucleótidos en la que la combinación de tres nucleótidos codifica los 20 aminoácidos. Finalmente, había quedado claro que el código es, además, no solapante y carece de comas o espacios en blanco. Faltaba sólo descifrar el código, determinar qué tripletes codifican qué aminoácidos y cómo la maquinaria del ribosoma sabe cuándo comienza y termina la lectura sobre el mRNA. Tanto Gamow como posteriormente Crick, Watson y Brenner pensaron que el desciframiento del código genético podía lograrse con un enfoque parecido al que se había utilizado con la determinación de la estructura helicoidal de las proteínas o la estructura de doble hebra del DNA: la combinación de datos experimentales y su modelado. Sin embargo, el código genético sólo pudo ser descifrado gracias a un enfoque completamente experimental en el que dos factores resultaron fundamentales, el desarrollo de sistemas de expresión de proteínas libres de DNA y el descubrimiento de un enzima, la polinucleótido fosforilasa. Del primero de esos dos puntos ya hemos hablado, y tuvo como principal protagonista a Paul Zamecnik, quien desde finales de los años cuarenta estaba interesado en comparar la síntesis de proteínas que se realizaba en células normales y cancerosas. Sus primeros resultados, muy frustrantes, le llevaron a intentar caracterizar y simplificar el sistema de síntesis proteica. Gracias a estos esfuerzos, hacia el año 1954 el grupo de Zamecnik ya había conseguido desarrollar una serie de técnicas que incluían el marcaje de aminoácidos, la medida de la radioactividad incorporada a las proteínas y, sobre todo, las técnicas de fraccionamiento celular que le habían permitido poseer un sistema de síntesis proteica simple y bastante bien caracterizado que constaba de muy pocos elementos: ATP, aminoácidos, ribosomas y un extracto celular muy específico cuya composición se desconocía en aquella época, pero que carecía de DNA. La necesidad de la presencia de ATP sugería a Zamecnik que tenía que haber un intermediario energético aminoacídico que tuviese unido ATP. Fue esta intuición la que llevó ‑como describimos anteriormente‑ al descubrimiento del tRNA. Los extractos celulares fueron perfeccionados posteriormente por el grupo de Alfred Tissières en Harvard, quien utilizó para ello extractos de E. coli. El segundo de los hitos tuvo que ver con el hallazgo de manera ac­ ciden­tal por parte de la científica francesa de origen ruso Marianne ­Grunberg-Manago, de un enzima que se tornó extraordinariamente útil. En 1955, Grunnberg-Manago, y mientras estudiaba en el laboratorio de Severo Ochoa el papel del ATP como transportador de energía, descubrió un enzima que, en vez de hidrolizar ATP, sintetizaba con él una sustancia que el grupo de Ochoa tardó meses en caracterizar y que resultó ser un polinucleótido de adenina. El enzima, llamado polinucleótido fosforilasa, era capaz de hacer lo mismo si se le suministraban otros nucleótidos trifosfato (GTP, UTP o CTP). El enzima, cuya función real era y es todavía desconocida, fue utilizado en 1960 por Marshall Nirenberg, un investigador muy joven de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (NIH) y por su estudian-

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te postdoctoral Heinrich Matthaei, para realizar el primer paso en el desciframiento del código genético. Los dos investigadores, que trabajaban en la caracterización de la síntesis de proteínas, habían observado que cuando se añadía RNA del virus de TMV al extracto bacteriano modificado del sistema de Tissières se producía un espectacular aumento de la síntesis proteica. Matthaei quiso utilizar como control negativo de un experimento un RNA artificial, una larga cadena de poli‑U generada utilizando el sistema de Ochoa y Grunnberg-Manago que se estaba utilizando en un laboratorio aledaño, porque pensaba que no produciría síntesis proteica. Matthaei puso a trabajar durante un tiempo el sistema libre de células que contenía, además, los 20 aminoácidos (16 de ellos radioactivos) y el polímero de U, y luego lo paró mediante precipitación con ácido. Posteriormente observó que se había producido una gran cantidad de proteína. Durante varios días trabajó en identificar el polipéptido creado por el sistema artificial, que resultó ser un polímero de fenilalanina. Esto indicaba que el triplete UUU codificaba este aminoácido. Otros experimentos mostraron que los polinucleótido poli‑A y poli‑C sintetizaban respectivamente cadenas de poli-lisina y poli-prolina (Figura 42).



Notas manuscritas de Marshall Nirenberg en 1962 sobre posibles codones. (Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

Figura 42. Esquema del experimento clásico de Nirenberg y Matthaei, con el que los dos científicos consiguieron conocer los primeros códigos de tripletes. Para ello utilizaron polímeros de bases prestados por un laboratorio vecino, y la polinucleótido fosforilasa de Ochoa.

Los resultados revolucionaron a la comunidad científica internacional, especialmente cuando fueron comunicados en el Congreso Internacional de Bioquímica celebrado aquel año en Moscú. Comenta Crick en sus memorias que: “El congreso en Moscú fue especialmente interesante gracias a los resultados presentados por Marshall Nirenberg, por entonces un desconocido. Había oído rumores de sus experimentos, pero no conocía los detalles. Matt Meselson, con quien me encontré en uno de los corredores del congreso, me alertó de la charla de Nirenberg, en una pequeña sala alejada, y allí fui a escucharle. Me impresionó tanto su charla que le pedí que la repitiera en un simposio más importante del que yo era moderador. Lo que Nirenberg mostró era que se podía añadir un RNA artificial, un mensajero artificial a un sistema libre de ácidos nucleicos, y sintetizar con ello proteínas. En detalle, había añadido poli‑U, es decir 181

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un polímero de RNA compuesto únicamente de nucleótidos de uracilo, y había sintetizado gracias a él un polímero de fenilalanina. Esto sugería que el triplete UUU (asumiendo que el código está compuesto de tripletes) codificaba la fenilalanina. Escribí en su momento que la audiencia estaba electrizada. Sin embargo Seymour Benzer tiene una fotografía en la que se observa que todo el mundo estaba muy aburrido. En cualquier caso, el descubrimiento de Nirenberg hizo época”. De izda. a dcha. Robert W. HOLLEY (1922-1993), Marshall W. NIRENBERG (1927-) y Gobind KHORANA (1928-), ganadores del Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1968. © Radial Press.

Severo OCHOA (1905-1993). Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1959. Cortesía del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, Madrid.

Los resultados de Nirenberg dieron lugar a una competición, a veces no muy caballerosa, entre varios laboratorios por el desciframiento completo del código genético. El trabajo fundamental fue llevado a cabo por los laboratorios de Nirenberg, Severo Ochoa y del científico de origen paquistaní Gobind Khorana. En el caso de Ochoa, sus primeros experimentos no sólo sirvieron para confirmar los resultados de Nirenberg sino que se embarcó como aquél en la generación de polímeros compuestos de dos nucleótidos (p. ej. U y A, U o G, etc.) que sirvieron para ir descifrando parte del código genético y para mostrar que éste era, como no podía ser de otra manera, degenerado, es decir que varios tripletes codificaban un mismo aminoácido. Otro de los diferentes experimentos consistió en generar polímeros con cantidades distintas pero conocidas de las distintas bases, que dieron lugar a péptidos de diferentes aminoácidos. El cálculo de la frecuencia de los distintos codones posibles con la determinación de los porcentajes de aminoácidos producidos dio lugar a la asignación de varios codones para ciertos aminoácidos. Finalmente, el trabajo del grupo de Khorana, un químico orgánico introducido en el mundo de la Biología Molecular, contribuyó al desciframiento del código al ser capaz, utilizando técnicas de Bioquímica y de Química Orgánica, de generar secuencias específicas de nucleótidos (por ejemplo, UAGUAGUAG, o CGUCGUCGU). Para ello sintetizó polímeros de DNA de secuencia conocida que utilizaba de molde para, con el enzima RNA polimerasa, descubierto en aquella época, generar fragmentos de RNA conocidos que utilizó con el sistema antes descrito. Este tipo de experimentos permitió determinar fehacientemente el código correspondiente a un gran número de tripletes, pues por entonces ya se había demostrado por parte de Crick que la unidad de codificación era el triplete. La confirmación de que esto era así vino por parte de Nirenberg y de su alumno Philip Leder, quienes en un experimento muy elegante fueron capaces de demostrar que era necesaria al menos la presencia de trinucleótidos para que una secuencia de RNA se uniera a los ribosomas. Para ello utilizaron ribosomas purificados, una mezcla de tRNAs radioactivos y RNAs artificiales de uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos. El experimento consistió en hacer pasar la mezcla de ribosomas, tRNAs y, de manera separada, cada uno de los RNAs artificiales, a través de un filtro que no permitía el paso de los ribosomas pero sí de los tRNAs y de los RNAs artificiales. Nirenberg demostró que la radioactividad permanecía unida al filtro (es decir, a los ribosomas), cuando el RNA utilizado poseía al menos tres nucleótidos (Figura 43).

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Figura 43. Esquema del experimento de Nirenberg de filtración de ribosomas. Nirenberg utilizó un filtro que permitía el paso de los distintos tRNAs y tripletes (izquierda) pero no de los ribosomas purificados (centro). Utilizó tRNAs específicos marcados radioactivamente (derecha; en la figura el tRNA de Phe) y distintos tripletes. Sólo el triplete específico para Phe (en este caso, UUU) formará el complejo con el ribosoma y el tRNA de Phe, lo que impedirá su paso por el filtro (a diferencia del resto de tRNAs) y quedará unido a él para ser posteriormente detectado.

Este tipo de experimentos ayudó a determinar que el orden de las bases era importante para la codificación del aminoácido. Así, se sabía que la mezcla de U y G daba lugar a la incorporación de valina a los ribosomas. El grupo de Nirenberg preparó trinucleótidos con G y U (GUU, UGU, UUG, UGG, GUG, GGU) y observó que, de estos seis, sólo el trinucleótido GUU era capaz de incorporar valina al ribosoma, lo que dejó claro que no sólo la composición de bases sino su orden era importante para la codificación de los aminoácidos. Sin embargo, este tipo de experimentos con filtros deparó una recompensa mayor, el empuje final para la determinación del código genético. Y es que, una vez sabido que un trinucleótido podía ser utilizado para unir específicamente su tRNA con el aminoácido que le correspondía, Nirenberg y Leder consiguieron sintetizar trinucleótidos específicos con los que unir a los ribosomas su aminoácido correspondiente a través de tRNAs marcados radioactivamente. Una vez determinado el código de los aminoácidos y sabiendo que éste era lineal y no solapante, se vio clara la necesidad de encontrar las señales que dan lugar a la iniciación y finalización de la lectura de la secuencia del RNA mensajero por parte del ribosoma. En el primer caso, ya en 1958 los científicos americanos H. J. Morowitz y M. Spaulding se habían dado cuenta, mediante la observación de las secuencias de las proteínas determinadas por entonces, que el aminoácido metionina se encontraba en un porcentaje muy alto como primer residuo. Sin embargo, fue el grupo de Fred Sanger en Cambridge quien en 1964 descubrió la existencia en las bacterias de dos tipos de tRNA, uno que codifica metionina y otro un derivado de éste, la formil-metionina. Posteriores trabajos realizados por varios grupos demostraron que el codón que codifica este aminoácido, AUG, es el codón que marca el inicio de la traducción. El descubrimiento de los tres codones de finalización de la traducción tuvo lugar como consecuencia de la caracterización de una serie de fagos 183

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II. La edad de oro de la Biología Molecular

mutantes que sólo crecen cuando las bacterias a las que infectan poseen también cierto tipo de mutaciones, que resultaron serlo en los citados tres tripletes. El primero de los tripletes se denominó ámbar, en honor de su descubridor Harry Bernstein (ámbar en alemán), del grupo de Seymour Benzer en Caltech. Los otros dos tripletes fueron descubiertos en Cambridge por el grupo de Sydney Brenner, y se denominaron ópalo y ocre respectivamente, con el fin de mantener el código de colores. Fue este último grupo, gracias a una serie de finos experimentos genéticos, quien logró determinar que los tres tripletes de terminación son respectivamente UAG, UGA y UAA (Figura 44).

SEGUNDA BASE U

Figura 44. Esquema ideado por Crick del código genético, otra de sus contribuciones a la biología molecular. 

C

A

G

A

G

UUU

Phe

UCU

Ser

UAU

Tyr

UGU

Cys

U

UUC

Phe

UCC

Ser

UAC

Tyr

UGC

Cys

C

UUA

Leu

UCA

Ser

UAA

Stop

UGA

Stop

A

UUG

Leu

UCG

Ser

UAG

Stop

UGG

Trp

G

CUU

Leu

CCU

Pro

CAU

His

CGU

Arg

U

CUC

Leu

CCC

Pro

CAC

His

CGC

Arg

C

CUA

Leu

CCA

Pro

CAA

Gln

CGA

Arg

A

CUG

Leu

CCG

Pro

CAG

Gln

CGG

Arg

G

AUU

Ile

ACU

Thr

AAU

Asn

AGU

Ser

U

AUC

Ile

ACC

Thr

AAC

Asn

AGC

Ser

C

AUA

Ile

ACA

Thr

AAA

Lys

AGA

Arg

A

AUG

Met, Start

ACG

Thr

AAG

Lys

AGG

Arg

G

GUU

Val

GCU

Ala

GAU

Asp

GGU

Gly

U

GUC

Val

GCC

Ala

GAC

Asp

GGC

Gly

C

GUA

Val

GCA

Ala

GAA

Glu

GGA

Gly

A

GUG

Val

GCG

Ala

GAG

Glu

GGG

Gly

G

TERCERA BASE

PRIMERA BASE

U

C

Los trabajos conducentes al desciframiento del código genético y la importancia de este descubrimiento supusieron la concesión del Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1968 a Nirenberg y Khorana (Ochoa ya lo había conseguido nueve años antes por otros trabajos). La caracterización del código y de la maquinaria de síntesis mostró en definitiva, que el código es degenerado, ya que los 20 aminoácidos eran codificados por 61 codones. Hay algunos aminoácidos como la leucina que resultan codificados por seis distintos codones, mientras que otros como el triptófano o la metionina lo son por uno solo, que en el último caso también sirve como codón de iniciación. Al comienzo de la caracterización de los tRNAs se pensó que al menos habría uno por codón, pero el hecho de que después de varios 184

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años de fecundo trabajo se hubieran encontrado sólo 40 tRNAs mientras que había 61 codones que codificaban aminoácidos llevó a un cierto desasosiego a los científicos que trabajaban en este campo. Los primeros resultados que vinieron a desentrañar en parte este enigma procedieron del grupo de Khorana, quien encontró que en E. coli había tRNAs que codificaban varios codones. En todos los casos, los codones reconocidos por el mismo tRNA variaban sólo en la tercera base. La explicación a este hecho vino del trabajo de Francis Crick, quien en 1966 ofreció otra de sus grandes aportaciones al armazón conceptual de la Biología Molecular, la llamada hipótesis de los pares oscilantes ­(wobble-base pairing hypothesis). Crick sugirió la posibilidad de que la tercera base de lectura del codón no tuviera los mismos requerimientos estéricos para la interacción con su par y así se podría producir, por lo tanto, apareamientos que no fueran del tipo Watson-Crick. Según Crick, esto podría hacer que en algunos casos la tercera base del triplete fuera redundante y conseguir que un determinado tRNA pudiese reconocer más de un codón, lo que fue confirmado posteriormente de manera experimental.

Caracterización de los mecanismos de transcripción Durante la década de los años sesenta también fueron realizándose una serie de descubrimientos que ayudaron a caracterizar los mecanismos de transcripción del DNA y de la síntesis de proteínas. En 1963, aunque ya se había demostrado la colinealidad entre la información que reside entre la cadena nucleotídica y la aminoacídica, todavía no se sabía con certeza cómo se producía ésta última. Una hipótesis apuntaba a que en el ribosoma, y teniendo como molde el mRNA, las moléculas de tRNA se unían al azar para formar la secuencia proteica en el orden adecuado. La otra hipótesis sostenía que las moléculas de tRNA se unían al mRNA en un orden establecido, que lógicamente tenía que ver con la secuencia del mRNA. En 1963, Howard Dintzis se encargó de demostrar que la síntesis de las proteínas comienza en el extremo amino terminal y procede hacia el carboxilo terminal. Para ello utilizó reticulocitos de conejo, que sintetizan fundamentalmente las dos cadenas de hemoglobina, que además son fácilmente separables. Dintzis utilizó para sus estudios la cadena α y las técnicas desarrolladas por Vernon Ingram para caracterizar la hemoglobina que da lugar a la anemia falciforme. Empleó aminoácidos marcados radioactivamente en el 14C y observó, utilizando técnicas de pulso y caza, cómo los aminoácidos marcados se encontraban al final de la cadena y cómo la radioactividad de los péptidos aumentaba de manera directa con el tiempo en que los aminoácidos marcados radioactivamente hubieran sido incorporados a los aminoácidos. En 1967, el grupo de Waclaw Szybalski, de la Universidad de Wisconsin, demostró fehacientemente que sólo una de las hebras de DNA es trans185

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crita a mRNA en un momento determinado. Para ello utilizó el DNA del fago T7, que sabía que poseía una gran cantidad de citosinas una de las hebras. Szybalski y su grupo separaron las dos hebras de DNA mediante calentamiento, y añadieron un RNA sintético que contenía mucha G y que, por lo tanto, se unía con gran afinidad a la región rica en C de esa hebra. El material se centrifugó en un gradiente de CsCl que separó la hebra libre de DNA de la doble hebra DNA-RNA. Szybalski y sus colaboradores volvieron a separar la doble hebra de DNA y RNA y destruyeron el RNA; aislando así las dos hebras de DNA de manera independiente. Posteriormente añadieron mRNA de T7 a estas dos hebras de DNA, y observaron que el mRNA sólo se unía a una de ellas. Szybalski y su grupo concluyeron que únicamente una de las dos hebras de DNA es la que se transcribe. Esto, sin embargo, no significaba que sólo una de las hebras de DNA trasmitiera información genética. Así, en 1969 y en la Universidad de Tufts, los científicos Ramamirtha Jayaraman y Edward Goldberg aislaron dos tipos de mRNA del fago T4, uno que se había transcrito al principio de la infección y otro hacia al final de ésta; por otra parte separaron las dos hebras de DNA y, mediante experimentos de hibridación con los tipos de mRNA y las dos hebras de DNA, demostraron que cada uno de los mRNA se unía a una hebra diferente de DNA, lo que dejaba claro que las dos hebras contienen información genética.

La maquinaria de traducción: el ribosoma Aunque se conocía desde principio de los años cincuenta que en los ribosomas se encontraba la maquinaria de síntesis de las proteínas, la caracterización de estas complejas estructuras no despegó sino hasta casi veinte años después, y lo hizo gracias a un enfoque fundamentalmente bioquímico y a los esfuerzos teóricos de James Watson, quien propuso varias de las ideas sobre el funcionamiento de los ribosomas que supusieron un revulsivo en el campo. Sin embargo, el motor inicial que empujó a la caracterización del ribosoma fue el intento de comprender cómo el mRNA y el tRNA se reconocían entre sí en el interior del ribosoma. Ya en los primeros estudios quedó claro que el ribosoma no trabajaba solo, sino que lo hacía en compañía de una compleja red de proteínas, y es que los primeros intentos de sintetizar proteínas a partir de extractos muy puros de ribosomas, mRNA y tRNA, obtenidos mediante experimentos de centrifugación diferencial, resultaron un fracaso. Para que la síntesis se produjera era necesaria la presencia de algunas “impurezas”, de ciertos factores, los primeros de los cuales fueron purificados por primera vez en el laboratorio de Fritz Lipmann en la Universidad Rockefeller de Nueva York. Estos factores, denominados de elongación (EF‑Tu, EF‑G, EF‑Ts, etc.), se revelaron necesarios para que la síntesis de proteínas se produjera, y fueron el detonante para la frenética búsqueda de muchas otras proteínas que regularan la maquinaria de síntesis proteica. Pronto se observó que la síntesis no podía iniciarse sin 186

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la presencia de unas proteínas que fueron denominadas factores de iniciación (IF), que fueron descubiertos gracias a los esfuerzos de los laboratorios de Severo Ochoa en Nueva York, François Gros en París, y ­Robert Thach en Harvard. Finalmente, el mismo tipo de enfoque (centrifugación diferencial, ensayos bioquímicos, purificación de proteínas en ciertos extractos y reconstitución controlada del sistema junto con más ensayos bioquímicos) sirvió para que los grupos de Watson y ­Nirenberg constataran en un primer momento la existencia y realizaran posteriormente la purificación de los llamados factores de liberación (RF), necesarios para la liberación de la cadena peptídica una vez que ésta es sintetizada. Otros experimentos bioquímicos en los que la centrifugación diferencial se reveló imprescindible sirvieron para mostrar que los ribosomas en realidad están formados por dos unidades llamadas 50S (subunidad grande) y 30S (subunidad pequeña), en razón de su movilidad gravitatoria en unidades Svedberg, y que eran, a su vez, una compleja mezcla de moléculas de RNA y proteínas. El desarrollo de técnicas electroforéticas más sofisticadas, de las que hablaremos posteriormente, permitió a partir de los primeros años sesenta y gracias al trabajo de varios grupos, la caracterización de los componentes de las dos subunidades, que resultaron poseer, en el caso de la subunidad grande, dos moléculas distintas de RNA (rRNA 23S y 5S) y 32 proteínas diferentes, y en el caso de la pequeña, una molécula de RNA (rRNA 16S) y 21 proteínas diferentes. Una de las grandes hazañas de aquella época la realizó el grupo de Masayasu ­Nomura de la Universidad de Wisconsin, quien consiguió reconstituir la subunidad pequeña añadiendo el rRNA 16S y las 21 proteínas que lo constituyen. Estos experimentos sirvieron, entre otras cosas, para confirmar que las dos subunidades ribosómicas se unían en presencia de iones magnesio no sin que antes la pequeña formara primero un complejo con el mRNA y el factor de iniciación. La unión de las dos subunidades forma el ribosoma y la maquinaria de traducción comienza entonces a funcionar. Los tRNAs penetran en el interior del ribosoma, allí donde se produce la unión entre las dos subunidades, y lo hacen a través de la subunidad grande, guiados por un factor de elongación, que posteriormente se libera gracias a un cambio conformacional inducido por la hidrólisis de GTP. La generación del enlace covalente entre los dos aminoácidos presentes en el ribosoma se lleva a cabo gracias a la acción enzimática de la subunidad grande, tal como fue descubierto en 1969 por Robin Monro en el grupo de David Vázquez, del Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid (Figura 45). La demostración de que el mRNA se movía según las proteínas iban siendo sintetizadas por el ribosoma provino de ingeniosos experimentos de protección frente a la digestión por nucleasas realizados en el laboratorio de Ochoa por Peter Lengyel, quien en un experimento in vitro puso la maquinaria de síntesis a funcionar y después de suaves tratamientos digestivos mediante nucleasas observó que el patrón de protección que presentaban los ribosomas variaba con el tiempo. 187

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Figura 45. Esquema general de la síntesis de proteínas en el ribosoma. 

Otro de los grandes descubrimientos de aquella época en relación con el proceso de traducción tuvo que ver con el mecanismo de reconocimiento del mRNA por parte del ribosoma. El mérito de este descubrimiento correspondió a la científica americana Joan Steitz y a los investigadores australianos Lynn Dalgarno y su estudiante John Shine. Steitz ya se había hecho un nombre en el campo de los ribosomas cuando, trabajando como estudiante postdoctoral en el LMB de Cambridge y utilizan188

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do las mismas técnicas de protección del mRNA por parte del ribosoma frente al ataque de nucleasas desarrolladas por Lengyel, había podido determinar que el ribosoma protegía tres regiones específicas del mRNA del fago con el que trabajaba. Steitz, mediante técnicas de secuenciación desarrolladas por Fred Sanger en el mismo LMB, pudo secuenciar esas tres regiones que pertenecían a los tres genes del fago, y demostrar que las tres poseían no sólo el codón de iniciación AUG sino que los codones siguientes codificaban los aminoácidos propios de esos tres genes. Steitz había confirmado de esta manera que el codón de iniciación que reconocía el ribosoma codificaba también el aminoácido metionina, que podía encontrarse en cualquier otro lugar de la secuencia. ¿Cómo podía saber el ribosoma cúal es el AUG que indica la iniciación de la síntesis de proteínas y cuál es el que simplemente codifica una metionina de la secuencia polipeptídica? La respuesta a esta pregunta vino del interés de Steitz, unos años después y ya como profesora en la Universidad de Yale, por el trabajo de dos desconocidos australianos. Shine y Dalgarno habían secuenciado en 1974 la parte final del rRNA 16S de la subunidad pequeña y habían hipotetizado un posible apareamiento entre una pequeña secuencia de este fragmento de rRNA y una región del mRNA que se encontraba justo antes del codón de iniciación. Esta hipótesis era muy atrevida porque Dalgarno sólo había secuenciado una parte muy pequeña del rRNA y la casualidad de que fuera justo esa la región de interacción con el mRNA era demasiado grande. Además, la interacción entre las dos moléculas de RNA se basaba en la existencia de apareamientos no canónicos entre algunas de las bases. Steitz quedó impresionada con el trabajo y decidió comprobar si era cierto. Para ello tuvo la suerte de poder utilizar una RNAsa recién purificada, la colicina, con la que se podía cortar el fragmento terminal del rRNA 16S. Posteriormente, sometió ese fragmento a un ensayo de hibridación con un mRNA y el resultado fue positivo. El mecanismo de reconocimiento por parte del ribosoma de la región de iniciación de la síntesis había sido descubierto y a la secuencia corta del mRNA que precede a los codones de iniciación y que es complementaria de secuencias del extremo 3’ del rRNA 16S de la subunidad pequeña (30S) se la conoce desde entonces como secuencia Shine-Dalgarno. Los quince años que siguieron a la propuesta de estructura del DNA fueron testigo de un asombroso flujo de ideas y resultados que dieron lugar al establecimiento de la Biología Molecular como una disciplina madura y permitieron definir sus conceptos fundamentales, que tienen que ver con el flujo de información desde el DNA (o RNA) hasta la proteína. Este flujo de información se produce a través de los procesos de replicación, transcripción y traducción, que están mediados fundamentalmente por moléculas de ácido nucleico. Faltaba por determinar cómo se controlan esos procesos, cómo se decide cuándo un DNA debe replicarse o trasladar su información a las moléculas de RNA para que su traducción dé lugar a las proteínas, que son en definitiva las que ejecutan las órdenes que están almacenadas en el DNA. ¿Quién controla ese 189

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DNA? La respuesta está en las propias proteínas y este descubrimiento fue obra fundamental de la escuela francesa de Biología Molecular, de los científicos André Lwoff, Albert Jacob y Jacques Monod.

El control genético Jacques Monod, André Lwoff, Francois Jacob (3º, 4º y 5º de pie, por la izda.) y otros ganadores del Premio Nobel de 1965, con Sir Lawrence Bragg. © Radial Press / Str.

La hipótesis del operón ¿Cómo se produce el control genético? ¿Por qué unas moléculas son sintetizadas en ciertos momentos en grandes cantidades y en otros casi desaparecen? A mediados de los años cincuenta la mayor parte de la comunidad científica creía que los genes codificaban sólo proteínas que tenían un papel metabólico o estructural, es decir, eran o enzimas o componentes del esqueleto celular. El pensamiento general era que el aumento o disminución de la actividad de los enzimas se debía a un cambio entre una conformación inactiva a otra activa. Sin embargo, fueron apareciendo otras ideas que comenzaron a cambiar la mentalidad de los científicos y que desembocaron en el desarrollo de los conceptos de genes reguladores y del operón. En honor a la verdad hay que decir que el fenómeno de la adaptación de la síntesis enzimática había sido ya descrito por Frédéric Dienert en 1900, quien observó que los enzimas que en levaduras hacen uso de la galactosa como fuente de carbono sólo estaban presentes cuando había galactosa. Este fenómeno fue denominado en 1930 “de adaptación enzimática” por el finlandés Henning Karström. Ocho años después, el microbiólogo americano John Yudkin publicó la llamada teoría de acción de masas, según la cual los enzimas se encuentran en la célula en equilibrio con sus precursores inactivos: un equilibrio que favorece la formación de enzimas activos para aquellos que son constitutivos (producidos en las células independientemente de la presencia de sustrato), pero que favorece la existencia de los precursores inactivos en el caso de los enzimas adaptativos (no presentes en la células y únicamente producidos cuando hay sustrato en el medio). Según esta teoría, la unión del sustrato al enzima adaptativo puede estabilizar y favorecer la presencia del enzima activo frente a su precursor inactivo. Esta ingeniosa hipótesis fue rechazada por Jacques Monod, quien junto con André Lwoff había observado en el Instituto Pasteur de París el llamado fenómeno de la diauxia, por el que las bacterias, cuando disponen de dos tipos de nutrientes, usan primero uno hasta que lo agotan y luego utilizan el otro. André Lwoff era un científico francés de origen ruso cuya reputación internacional estaba firmemente establecida cuando Jacques Monod entró a formar parte de su grupo. Monod procedía de una familia francesa de origen hugonote y era un hombre extraordinariamente culto e inteligente que tuvo un papel muy importante en la resistencia francesa durante la II Guerra Mundial. Monod había estudiado biología y música, y sólo durante su estancia postdoctoral en California

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El control genético

decidió dedicarse definitivamente a la primera. A su vuelta a París, ya de forma independiente, se dedicó a estudiar por qué ciertos enzimas parecían ser producidos por las bacterias cuando eran necesitados. Monod comenzó a trabajar con un enzima, β‑galactosidasa, que hidroliza el disacárido lactosa en sus dos componentes, galactosa y glucosa. Este enzima resultó ser ideal por dos razones. La primera es que se disponía no sólo de una buena caracterización bioquímica de este enzima, sino además de una gran cantidad de mutantes, generados fundamentalmente por el gupo de Joshua Lederberg. La segunda razón tiene que ver con el hecho de que este enzima resistía las altas temperaturas existentes en la terraza del Instituto Pasteur, donde Monod tenía su laboratorio, y que carecía del aparataje, hoy básico en cualquier laboratorio que se precie de tal, para trabajar a 4 °C. Los estudios de Monod en Francia y de Lederberg en América permitieron demostrar que, dependiendo de las condiciones, se producía un aumento o descenso del enzima β‑galactosidasa, que Monod en primera instancia interpretó como un equilibrio del enzima entre una conformación activa y otra inactiva. Lwoff, sin embargo, pensó de otra manera e interpretó los resultados de Monod en la línea de la adaptación enzimática que había descrito Karström veinte años antes. Lwoff trabajaba en otro problema biológico muy interesante, el de la lisogenia, descubierta años antes en Bruselas por el médico belga Jules Bordet (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1919). La lisogenia se produce cuando ciertos fagos, en vez de desarrollar el clásico ciclo lítico ‑en el que toman el control de la maquinaria celular de síntesis proteica, se reproducen en grandes cantidades y terminan lisando la célula‑, sufren en este caso una transformación por la que insertan su genoma en el de la bacteria y se reproducen a la par que ella. La lisogenia había sido estudiada en el Instituto Pasteur durante años por el matrimonio formado por Eugène y Elisabeth Wollman, pero su existencia había sido negada por muchos científicos, entre ellos por Max Delbrück, quien entre sus grandes habilidades estaba la de equivocarse frecuentemente. Lwoff comenzó a trabajar a principios de los años cincuenta con Elie Leo Wollman, el hijo del matrimonio antes citado, en la lisogenia producida por el fago λ, un fago descubierto por Esther Lederberg ‑la mujer de Joshua‑ y que infecta a E. coli. Lwoff y Wollman, e independientemente Jean Weigle en Caltech (este último había sido puesto a trabajar por Max Delbrück en la demostración de la inexistencia de la lisogenia), confirmaron que la lisogenia se producía y los primeros descubrieron, además, que podía inducirse el ciclo lítico de esos fagos “dormidos” (profagos) mediante radiación ultravioleta sobre las bacterias que los poseían. Al proyecto de estudio de la lisogenia se unió a principios de los años cincuenta Albert Jacob, un médico francés imposibilitado para ejercer su profesión debido a las heridas producidas en el desembarco de Normandía cuando formaba parte del ejército del general De Gaulle. Lwoff puso a Jacob a buscar los mecanismos por los que el ciclo lisogénico se trans191

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II. La edad de oro de la Biología Molecular

forma en ciclo lítico. Los experimentos de Jacob, en colaboración con Elie Wollman condujeron, como ya hemos comentado en páginas anteriores, a la caracterización de la recombinación genética en bacterias y al primer mapa genético bacteriano. Fue Jacob quien reconoció que el proceso de inducción de la β‑galactosidasa estudiado por Monod y el proceso lítico en el profago por él estudiado podían tener las mismas bases moleculares, y los dos científicos franceses juntaron fuerzas (ambos trabajaban en el Instituto Pasteur) para caracterizar el fenómeno general de la inducción. La colaboración entre los dos científicos fue magnífica porque la formación bioquímica de Monod se complementaba perfectamente con la genética de Jacob. Los experimentos más importantes de los dos científicos tuvieron que ver con un exhaustivo uso de mutantes de tres enzimas que parecían actuar de manera concertada, la β‑galactosidasa (LacZ), la lactosa permeasa (LacY) y la galactosidasa transacetilasa (LacA). La existencia de los tres enzimas había sido determinada previamente por Joshua Lederberg, quien había aislado mutantes de ellos, pero Jacob y Monod ‑mediante experimentos de conjugación genética descritos anteriormente‑, determinaron que los genes que codificaban los tres enzimas se disponían juntos en el genoma (véase figura 25). Sin embargo, los experimentos que aquí nos ocupan tuvieron lugar tras la llegada al Instituto Pasteur de Arthur Pardee, un bioquímico americano que había demostrado de manera paralela a Monod y a su colaborador Jean Pierre Changeux la existencia entre los enzimas de un mecanismo de inhibición por retroalimentación (feedback inhibition) por el que el enzima es inhibido por el producto de su actividad. Pardee era un magnífico experimentalista que puso a punto numerosas técnicas en el laboratorio de Monod, y fue él quien realizó el famoso experimento PaJaMo. El experimento decisivo surgió de los trabajos realizados con un mutante bacteriano que había convertido en constitutiva la producción de los tres enzimas, es decir, que producía los tres enzimas de manera continua, incluso en ausencia de lactosa. Los experimentos de localización genética mostraron que el gen que parecía controlar la síntesis de los tres enzimas (que los dos investigadores denominaron LacI) y que parecía fallar en este mutante, se encontraba cerca de los tres genes pero no unido a ellos. Mediante arduos y complicados experimentos de conjugación y utilizando distintos mutantes para los tres genes y para LacI, Jacob y Monod pudieron establecer que el conjunto de genes, que denominaron operón, estaba constituido por: los genes estructurales (en este caso LacZ, LacY y LacA); un gen regulador (LacI) que codifica una proteína reguladora (represora o activadora); un promotor, que es una región del DNA que se encuentra antes de los genes estructurales, y que posteriormente se descubrió que es el lugar donde se une la RNA polimerasa al comienzo del proceso de transcripción; y finalmente, un operador, una región del DNA entre el promotor y los genes estructurales que es reconocida por el producto del gen regulador. 192

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El control genético

La hipótesis del operón propuesta por Jacob y Monod establecía la existencia de genes reguladores que controlan a los estructurales mediante un doble mecanismo de control de carácter negativo, de tal manera que los genes estructurales dejan de expresarse cuando están reprimidos por la acción de un gen regulador, y se expresan cuando el gen represor es, a su vez, reprimido. En honor a la verdad, hay que decir que esta ingeniosa teoría les fue propuesta a los dos científicos franceses por Leo Szilard, un físico húngaro de origen judío que escapó de su país cuando la extrema derecha llegó al poder, y esa experiencia influyó tanto en su conducta que Szilard desde entonces nunca poseyó una casa sino que vivió en hoteles, con las maletas listas para partir en el caso de cualquier contingencia. Szilard fue un científico de gran perspicacia, uno de los primeros en advertir de la posibilidad de que Hitler consiguiera la bomba atómica y en presionar a las autoridades americanas para que la construyeran primero. Szilard formó parte importante del proyecto Manhattan, del que fue expulsado por sus enfrentamientos con la dirección. Posteriormente se convirtió en un luchador ardiente contra el uso de la bomba atómica, lo que le acarreó problemas con la administración americana. En sus últimos años, Szilard trasladó su insaciable curiosidad a la Biología Molecular y fue un impulsor de la organización EMBO. Participó en varias reuniones del “Grupo de los Fagos” y visitó muchos de los grandes laboratorios del mundo para conocer sus resultados y proponerles ideas. Una de sus primeras contribuciones al campo de la Biología tuvo que ver con el diseño del primer “quimostato”, un aparato que mantenía constante la entrada de nutrientes al fermentador a la vez que extraía de él una cantidad de cultivo, logrando así que las bacterias del medio estuvieran siempre en fase exponencial de crecimiento. En el asunto del operón, Szilard sugirió a Jacob y Monod la posibilidad de que sus resultados pudieran explicarse por la existencia de un doble control negativo sobre los genes estructurales, mucho más sutil en su acción que la existencia de un solo sistema de control. La idea de Szilard fue rechazada por Monod durante un tiempo (de hecho, parece ser que casi llegaron a las manos durante una discusión sobre este asunto), pero convencido de su bondad, fue publicada por los dos científicos franceses en 1961. Según la hipótesis de Jacob y Monod, el gen regulador produce una proteína, en este caso un represor, que se une al gen operador e impide la unión de la RNA polimerasa al promotor de la transcripción. Cuando hay un nivel de sustrato (lactosa) suficiente en la célula, éste se une al represor, por el que tiene una gran afinidad, y lo libera de su lugar de unión, momento en que la RNA polimerasa puede unirse al promotor y comenzar la transcripción. Si el sustrato es consumido, el represor vuelve a unirse al operador e impide la transcripción de los genes estructurales (Figura 46). La hipótesis de Jacob y Monod se mostró en principio correcta, pero al mismo tiempo comenzaron a publicarse resultados que mostraban que otros genes estructurales estaban bajo el control de regulado-

Jacques MONOD (1910-1976) y Leo SZILARD (1898-1964). Cortesía de Esther Bubley.

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Figura 46. Esquema de la hipótesis del operón de la lactosa. Un grupo de moléculas represoras se unen al operador, impidiendo la transcripción del DNA. En presencia de altos niveles de lactosa (el sustrato), ésta se une al represor e induce un cambio conformacional que libera a éste del operador, lo que permite la transcripción de los genes bajo el control de su promotor. La síntesis de las tres proteínas producirá la hidrólisis de lactosa, que reducirá su nivel en la célula y permitirá que las moléculas del represor se unan otra vez al operador e inhiban la transcripción del DNA. 

res positivos. El dogmatismo y la influencia de Monod sobre la comunidad científica impidieron que durante varios años otras teorías fueran aceptadas, pero al final la realidad se impuso y hoy sabemos que los genes reguladores influyen de muy diversas formas sobre los genes estructurales.

El aislamiento del represor y el operador

Walter GILBERT (1932-) junto a un modelo de doble hélice de DNA en 1980. © Radial Press / HO Harvard.

La hipótesis del operón era eso, una hipótesis, y necesitaba ser confirmada o rechazada por resultados experimentales. Su confirmación tardó seis años en llegar y se produjo tras una lucha entre dos grupos... de la Universidad de Harvard: el de Walter (Wally) Gilbert y el de Mark Ptashne, ambos bajo el paraguas de James Watson. Gilbert es una figura importante de la Biología Molecular y receptor del Premio Nobel de Química en 1980 por una de sus varias contribuciones, y para muchos una menor: la concerniente al desarrollo de una técnica de secuenciación de DNA. Físico de formación, siendo profesor de la Universidad de Harvard en el departamento de Física Teórica, Gilbert sintió la llamada de la Biología y decidió dar el salto a mediados de los años cincuenta y unirse al grupo de Jim Watson, quien entonces había conseguido una cátedra en Harvard. Watson llegó una vez a decir que “atraer a Gilbert a la Biología había sido su mayor logro para la Ciencia”, lo que viniendo de uno de los descubridores de la estructura del DNA

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debe significar algo. A mediados de los años sesenta, ya como cabeza de un grupo importante, Gilbert decidió intentar la purificación del represor del gen de la β‑galactosidasa, cuya posible existencia había revolucionado la Biología Molecular. Ptashne, más joven que Gilbert, y convertido hacía poco en jefe de grupo, pretendió la purificación de otro tipo de represor, el que determinaba el ciclo lítico o lisogénico del fago λ. Los dos científicos se enfrentaban a un problema que habría hecho abandonar a la mayor parte de sus pares: la minúscula cantidad de represor que se estimaba existía en la célula. Para intentar contrarrestar este problema, Gilbert y Ptashne recurrieron a distintas estrategias. En el caso del primero, ideó un procedimiento para localizar durante el proceso de purificación las fracciones que contenían el represor, y es que éste se une con alta afinidad a un análogo de la lactosa, IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido), uno de los inductores que ya utilizaron antes Lederberg y Monod. Gilbert sintetizó IPTG radioactivo y siguió al enzima a través de la radioactividad unida a las diferentes fracciones del proceso de purificación. Después de un arduo proceso, el grupo de Gilbert consiguió purificar en 1967 una pequeña cantidad de represor puro. En el caso de ­Ptashne, a éste se le ocurrió irradiar las bacterias con luz ultravioleta justo antes de infectarlas con el fago λ, destruyendo así el mRNA bacteriano y consiguiendo de esta manera que la maquinaria de transcripción sólo produjera proteínas víricas, entre ellas el represor. Posteriormente, utilizó un ensayo de unión al DNA del fago para localizar el represor, lo que le sirvió no sólo para purificar la proteína sino, además, para confirmar su unión específica al DNA vírico. El aislamiento de la región del operador fue realizada por el grupo de Gilbert en 1972 y está en el nacimiento de las técnicas de secuenciación que le proporcionarían el Premio Nobel de Química años después. A Gilbert se le ocurrió que, puesto que el represor se unía al operador, era razonable pensar que la proteína podía proteger al DNA del ataque de una DNAsa. El grupo de Gilbert encontró que el represor lac protegía un trozo de DNA de 24 pares de bases, que posteriormente secuenció mediante técnicas todavía artesanales. La secuencia del operador mostró una simetría que apuntaba la posibilidad de que fueran dos moléculas de represor las que se unieran al operador, lo que se confirmó posteriormente. En los años siguientes, los grupos de Gilbert y Ptashne consiguieron caracterizar en mayor detalle la interacción entre los represores y los operadores, pero la confirmación de que existía un mecanismo común de interacción vino de la mano de la ya pujante cristalografía de rayos X, y en 1981 se determinó por primera vez la estructura de dos represores de los genes cro y crp, por los grupos de Brian Mathews (Universidad de Oregón) y Tom Steitz (Universidad de Yale), respectivamente. Las dos estructuras mostraron que el represor formaba un dímero con dos motivos del tipo hélice α‑vuelta-hélice α, que encajaban perfectamente con dos regiones cercanas del surco grande del DNA, uniéndose así muy fuertemente al operador. 195

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La búsqueda del promotor A la vez que se buscaba la secuencia del operador, varios grupos y entre ellos el de Gilbert, intentaban dar con la del promotor. En el fago λ, los experimentos de protección del DNA en presencia de la RNA polimerasa mostraron que este enzima impedía la degradación de una región de unos 60 pares de bases, 40 de los cuales se encontraban en la secuencia antes del comienzo de la transcripción. El análisis nucleotídico de esta región no mostró ninguna característica especial en varios de los sistemas estudiados, pero un estudiante de Gilbert, David Pribnow, observó en la secuencia de varios sistemas conocidos entonces, una cierta similitud en una región situada 10 nucleótidos antes del inicio de la transcripción. Esta región, que ahora se llama normalmente la “región ‑10”, se denominó durante un tiempo la caja Pribnow, porque al mostrarla en el artículo, el estudiante rodeó la secuencia con un rectángulo. Sin embargo, parecía que la región ‑10 era demasiado pequeña y distinta en los sistemas estudiados hasta entonces para conferir la gran especificidad que mostraba la unión de la RNA polimerasa al DNA. Esta paradoja se resolvió tiempo después cuando se encontró otra región, unos 35 pares de bases antes del inicio de la transcripción, que poseía los suficientes elementos comunes en varios sistemas como para hipotetizar que la RNA polimerasa se uniera también a ella. En el año 1979 se caracterizó finalmente la interacción entre la RNA polimerasa y el promotor y se determinó sin ninguna duda que la RNA polimerasa se une a las regiones ‑35 y ‑10 para iniciar el proceso de transcripción.

Los transposones

Barbara McCLINTOCK (1902-1992) Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1983, junto a Jacques Monod en el simposio de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa “Nucleic Acids and Nucleoproteins.” © Courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.

La hipótesis del operón supuso una revolución en la Biología Molecular pues mostró el camino a la caracterización del control de la acción de los genes y, por lo tanto, al control de las funciones celulares. La idea de que unos genes regulasen a otros pareció revolucionaria a todo el mundo... excepto a dos mujeres. Una de ellas era la esposa de Jacob, quien al llegar éste a casa entusiasmado con la revolucionaria idea del operón que él y Monod acababan de pergeñar, a ella, lega en la materia, le pareció obvia, con la consiguiente irritación de su marido. La otra mujer era una científica americana que diez años antes ya había propuesto una teoría parecida, incluso más revolucionaria si cabe. Barbara McClintock era una genetista que trabajaba con los granos del maíz. Después de 20 años de arduas investigaciones observó comportamientos inusuales en la coloración de los granos que no obedecían a las leyes de Mendel, y llegó al convencimiento de que los cambios de color que observaba se debían a que había genes que saltaban de un lado a otro del cromosoma y, al hacerlo, activaban o desactivaban genes según tomaran su control o lo abandonaran. Los genes, por lo tanto, podían moverse dentro del cromosoma, algo que estaba en contra de las ideas imperantes en aquella época. La teoría

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de los genes intercambiables (jumping genes) o transposones se mostró como una teoría revolucionaria en el año de su publicación (1951). Sin embargo pasó casi desapercibida durante un tiempo; en parte, por lo adelantado de las ideas contenidas en su hipótesis, que ofrecía un medio muy poderoso para explicar la evolución de las especies; en parte también por el carácter de McClintock, tímida y contraria a cualquier tipo de polémica. Sus resultados siguieron publicándose en la revista de su instituto (CSHL) sin que apenas fueran mencionados por la comunidad internacional, y sólo los resultados de Jacob y Monod hicieron que los suyos propios salieran a la luz pública y fueran tenidos en cuenta. Para muchos, sus resultados e ideas supusieron el siguiente gran paso, después de los trabajos de Mendel, en la comprensión de los fenómenos evolutivos, y aunque ocurrió 30 años más tarde de la publicación de su teoría, ­McClintock recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en solitario como reconocimiento a su transcendental labor.

Fotografía de cinco mazorcas de maíz y el microscopio de Barbara McClintock en la Smithsonian Institution (National Museum of American History. Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

El alosterismo Después de sus trabajos sobre el operón y el RNA mensajero, Jacob y Monod siguieron cada uno su camino. Jacob siguió investigando en los procesos de división celular durante un tiempo, para pasar posteriormente al estudio del desarrollo del ratón. Monod fue dejando paulatinamente la ciencia activa y se convirtió en escritor de éxito y en el director del Instituto Pasteur, al que sacó de la incuria económica a costa de una actuación muy criticada por su estilo poco dado al compromiso. Participó en política haciendo de mediador en los incidentes que se produjeron durante las manifestaciones de Mayo del 68, y mucho antes había abandonado dando un portazo el Partido Comunista francés. Todas estas actividades no le impidieron realizar, antes de morir de cáncer en 1976, una contribución final a la teoría del control molecular, en colaboración con su estudiante Jean-Pierre Changeux y con Jeffries Wyman, un científico americano inclasificable que se encontraba en aquella época de investigador visitante en la Universidad de Roma y que llevaba años trabajando en el estudio de la regulación de las proteínas. Los tres científicos utilizaron, entre otros resultados, los obtenidos hasta entonces con la proteína tetramérica hemoglobina, para desarrollar en 1963 una hipótesis con la que intentar comprender la interacción entre las distintas subunidades de un complejo proteico o entre proteínas y sus reguladores. La hipótesis que los tres científicos pergeñaron fue denominada por Monod alosterismo (del griego allos, “otro”, y stereos, “forma”) y ha servido, junto con otras teorías que aparecieron posteriormente, para ofrecer un marco conceptual con el que estudiar los complejos cambios que se producen en ciertas moléculas biológicas como consecuencia de la interacción con sus sustratos y reguladores (Figura 47). El concepto de cambio conformacional de las proteínas, tan imbuido en la cultura científica en la actualidad como explicación para casi cualquier 197

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Figura 47. Esquema de la modulación de un enzima alostérico.



proceso, es hijo del alosterismo, como también lo es la idea del proceso de oligomerización como un mecanismo más sutil de control de las funciones ejercidas por una determinada proteína.

La revolución genética Arthur Kornberg

Arthur KORNBERG (1918-2007). © U.S. National Library of Medicine.

Como comentamos anteriormente, del modelo de Watson y Crick de la doble hebra del DNA y de la lectura de sus famosos artículos de 1953 se sugirió de manera directa e inmediata la idea de la replicación del DNA. Resulta curioso observar, con la perspectiva que dan los años pasados, que no fuera éste el proceso estudiado de manera mayoritaria por la comunidad científica, sino los menos obvios de la transcripción y traducción a los que ya nos hemos referido en páginas anteriores. Sin embargo, la replicación del DNA pasó a ser al poco tiempo uno de los grandes campos de trabajo de la Biología Molecular y su caracterización fue el fruto del ataque combinado de las técnicas bioquímicas y genéticas. Hay una figura que sobresale por encima de todas las demás, Arthur ­Kornberg, no sólo por la ingente labor que él mismo realizó durante sus más de cuarenta años de activa investigación, sino por la escuela que creó a su alrededor en la Universidad de Stanford, y que con el paso de los años daría lugar a lo que ahora denominamos Ingeniería Genética. Y es que Kornberg ilustra como nadie la importancia de la enseñanza y del ejemplo sobre los investigadores que dan sus primeros pasos, pues como dijo una vez André Lwoff: “La habilidad de un científico es, ante todo, la de buscarse un buen maestro”.

Kornberg, hijo de una pobre familia judía proveniente de Europa, se graduó como médico en 1937 y ejerció como tal en la armada america198

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La revolución genética

na durante varios años. Su interés por la investigación le llevó a trabajar en los NIH de Bethesda, todavía como médico militar. Realizó una estancia como estudante postdoctoral, primero en el laboratorio de Severo Ochoa en Nueva York y luego con Carl Cori en San Luis. A su vuelta a los NIH, ya como investigador independiente, su talla como científico comenzó a crecer, y pronto fue llamado a dirigir el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Washington en San Luis. De allí se mudó en 1959 a Stanford para organizar el Departamento de Bioquímica de su universidad, donde hasta el día de su muerte en 2007 se mantuvo como Catedrático Honorario. Durante varios años, Kornberg se había labrado una gran fama gracias a sus trabajos de caracterización de la síntesis de nucleótidos. Este trabajo le llevó, una vez en Stanford, a estudiar la síntesis del RNA. Fue en aquel tiempo cuando en el laboratorio de Severo Ochoa se identificó y luego se aisló la famosa polinucleótido fosforilasa que tanta importancia tuvo en el desciframiento del código, y que luego se descubrió que, en realidad, no era la verdadera RNA polimerasa. Sin embargo, y para evitar la competición directa con su maestro, Kornberg decidió estudiar la síntesis de DNA. Su decisión iba a transformar la Biología Molecular. A lo largo de su vida, Kornberg utilizó para ello un enfoque eminentemente reduccionista que se basaba en la purificación a homogeneidad de los enzimas en los que trabajaba para ir gradualmente haciendo el sistema más complejo. Su actuación científica se basaba en el aforismo de su amigo y también bioquímico Efraim Racker, “No malgastes pensamientos limpios en enzimas sucios” y en ello concentró su esfuerzo y el de su equipo, que fue creciendo con los años y añadiendo nombres como el de Paul Berg, Dale Kaiser, Robert Lehman, Robert Baldwin y otros muchos.

La vida se crea en un tubo de ensayo El trabajo de la caracterización de la DNA polimerasa comenzó a mediados de la década de los cincuenta, y para ello Kornberg decidió utilizar la bacteria E. coli como sistema de trabajo debido a su relativa sencillez. Kornberg comenzó estudiando la incorporación de nucleótidos al DNA y observó que, para que esto ocurriese, se requería la presencia de un segmento de DNA que actuase como molde y de un extracto donde debía encontrarse un enzima, que tras años de duro trabajo pudo purificar en 1958. Al enzima lo denominó DNA polimerasa y lo utilizó entre otras cosas para verificar dos de los puntos esenciales del modelo de Watson y Crick: que las dos hebras de DNA son antiparalelas y que el DNA siempre es polimerizado desde el extremo 5’ al 3’. La caracterización de la DNA polimerasa le llevó a demostrar que no sólo tenía actividad polimerasa en el sentido 5’ → 3’, sino que poseía actividad exonucleasa en el sentido contrario (3’ → 5’), lo que le servía para corregir errores. La combinación de las dos funciones tiene una importancia capital, como posteriormente se descubrió, para conseguir que 199

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la DNA polimerasa genere muy pocos errores durante su funcionamiento, lo que desde luego es imprescindible para la transmisión fidedigna de la información genética. Posteriores estudios del grupo de Kornberg les llevaron a aislar un fragmento del enzima que poseía la actividad polimerasa y exonucleasa 3’ → 5’. El fragmento se denominó Klenow, en honor del estudiante danés Hans Klenow, quien logró aislarlo mediante proteolisis controlada. Sin embargo, el comportamiento de la DNA polimerasa purificada por Kornberg era difícil de entender. Su actividad era muy baja y sólo producía pequeñas cantidades de DNA. Cuando el DNA sintetizado se observaba al microscopio electrónico, tenía gran cantidad de ramificaciones, algo que no se veía en el DNA nativo purificado. Además, el DNA producido no parecía tener capacidad genética ni infectiva, lo que en un caso determinado impidió la publicación de un trabajo de Kornberg, y es que uno de los revisores del trabajo criticó que el DNA sintético podía no ser un DNA “real” si no poseía las propiedades infectivas del DNA natural. Kornberg no se tomaba ese tipo de comentarios a la ligera, y los siguientes doce años los dedicó a dar adecuada respuesta a la inquietud del citado revisor. El primer paso lo realizó de la mano de Robert Sinsheimer, de ­Caltech, quien previamente había aislado y caracterizado un bacteriófago, φX174, que posee una sola hebra de DNA circular. En colaboración con ­Sinsheimer y utilizando el DNA de φX174 y la DNA polimerasa, Kornberg pudo generar un DNA de doble hebra, pero que resultó no ser infectivo. Después de un tiempo, Kornberg se apercibió de que el DNA sintetizado no era circular y que necesitaba serlo para tener capacidad infectiva. La solución a este problema vino gracias al descubrimiento, por parte de una serie de laboratorios y entre ellos el del propio Kornberg, de un enzima que une DNA, la DNA ligasa. Kornberg utilizó este enzima para unir el DNA y conseguir, mediante su replicación, un DNA de doble hebra circular. El siguiente problema al que se tuvo que enfrentar fue el aislamiento del DNA sintético para utilizarlo posteriormente como molde y comprobar con éste último que era infectivo. Si resultaba serlo, Kornberg habría generado, utilizando para ello varias herramientas biológicas, un DNA capaz de replicarse y de conservar sus propiedades biológicas. Para ello, el grupo de Kornberg utilizó en una primera instancia nucleótidos radioactivos y con un derivado funcional de timina, que poseía un átomo de bromo que lo hacía más pesado que la timina natural. Así, utilizando para una hebra DNA molde, DNA polimerasa y DNA ligasa, generó una doble hebra circular, que luego separó por calentamiento. La hebra sintetizada, más pesada que la natural, se separó por centrifugación, y una vez separada se utilizó a su vez en un nuevo proceso de replicación usando nucleótidos normales y ligeros. Volvió a separar las hebras y aisló esta vez la ligera, idéntica a la natural del fago utilizada en una primera instancia, y ensayó su infectividad, que resultó ser positiva (Figura 48). El experimento, publicado en 1967, demostró por primera vez la capacidad del hombre para crear vida, o por lo menos para manipularla, y fue motivo de enorme exaltación en los medios americanos y mundiales. 200

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1. A partir de una hebra de DNA se sintetiza otra más pesada gracias a la presencia en solución de un derivado de T más pesado.

2. Las dos hebras se separan mediante calentamiento. 

3. Las dos hebras, la original del fago y la sintética (más pesada) se aislan mediante centrifugación.

4. Se recoge la hebra sintética.

5. Con la hebra sintética y utilizando nucleótidos, DNA polimerasa y DNA ligasa, se genera otro dúplex de DNA. 6. Las dos hebras se separan por calentamiento y se aísla la recién sintetizada mediante centrifugación.

7. Se utiliza para ensayos de infección en bacterias. ¡¡¡ ES INFECTIVA !!!



Figura 48. Esquema del experimento de Kornberg que permitió por primera vez generar de manera sintética un DNA capaz, a su vez, de infectar bacterias y producir en ellas las proteínas codificadas en sus genes.

Problemas con la DNA polimerasa La caracterización del proceso de replicación continuó también con la ayuda de la Genética, gracias, entre otras, a las contribuciones del científico inglés John Cairns, quien en el CSHL puso a punto ingeniosos experimentos de pulso y caza con timidina radioactiva que demostraron, incluso visualmente, que la replicación del DNA se produce de forma continua y simétrica en las dos hebras. Cairns y otros genetistas desarrollaron una gran cantidad de mutantes sensibles a la temperatura que permitieron describir un buen número de enzimas involucrados en la replicación, ya fuera en el proceso de iniciación (DnaA y DnaC, una helicasa que abre la doble hebra de DNA) o en el de elongación (DnaB, DnaE, DnaG, DnaN, DnaX y DnaZ, entre otros). Durante todo ese proceso, Cairns se dio cuenta de que ninguno de esos 201

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II. La edad de oro de la Biología Molecular

mutantes afectaba a la función de la polimerasa descubierta por ­Kornberg, lo cual era sorprendente teniendo en cuenta la importancia capital de este enzima en la replicación. El grupo de Cairns buscó mutantes para el enzima y, tras arduos trabajos, encontró uno, pero el mutante no era letal en condiciones normales y sólo generaba problemas si a las células se les aplicaba luz UV, que se sabía dañaba las moléculas de DNA. Parecía que la DNA polimerasa descubierta por Kornberg no era esencial y que, además, estaba involucrada en la reparación del DNA. Estos resultados iban en contra de los publicados por Kornberg durante los últimos años en relación con este enzima, y pronto el científico americano recibió furibundos ataques de la prensa, en especial de una revista inglesa llamada Nature New Biology, del grupo Nature (Kornberg tenía por costumbre publicar sus artículos en revistas americanas y quizás eso pudiera haber influido en el comportamiento de la revista británica). En ayuda de Kornberg, y como si de una película de Hollywood se tratara, vino uno de sus hijos. De los tres vástagos de Kornberg, dos de ellos, Roger y Tom, se han dedicado también a la Biología Molecular, y el primero de los dos recibió en el año 2006 el Premio Nobel de Química. El segundo de ellos, sin embargo, pretendió en un principio ser chelista profesional, pero una enfermedad en las manos se lo impidió, así que prosiguió con sus estudios en Biología en la Universidad de Columbia. Un día durante una de las clases el genetista Malcolm Gefter puso la DNA polimerasa de Kornberg como ejemplo de cómo la ausencia de un adecuado análisis genético puede llevar a la incorrecta caracterización de un enzima. Tom Kornberg salió en defensa de su padre y Gefter le ofreció a aquél la posibilidad de buscar la respuesta en su laboratorio. En apenas tres semanas, Gefter y Tom Kornberg consiguieron aislar dos enzimas que se comportaban como la DNA polimerasa de Kornberg, apodada Pol I por Cairns. De las dos nuevas polimerasas, Pol II y Pol III, la última resultó ser la verdadera polimerasa involucrada en la replicación del DNA, mientras que Pol I tiene como principal misión la reparación de roturas en la doble hebra de DNA. Todas ellas requieren, sin embargo, además de los cuatro trinucleótidos, el DNA molde sobre el que efectuar la replicación y otro factor, que también el grupo de Kornberg consiguió determinar. Y es que otro de los resultados desconcertantes que había obtenido previamente el bioquímico americano era la imposibilidad por parte de la DNA polimerasa de iniciar la replicación sin que hubiera un factor que Kornberg encontró y que denominó iniciador de la reacción. Durante los primeros años de trabajo con este enzima ese problema no se había mostrado porque las preparaciones contenían en sus impurezas este factor, y sólo la mejora en la purificación lo había dejado al descubierto. Esta impureza era un fragmento de RNA unido a la hebra simple de DNA que actuaba como molde en el proceso de replicación y que actuaba de cebador de la DNA polimerasa para que ésta iniciara la polimerización del DNA. Kornberg y su grupo se apercibieron de que para iniciar la replicación era necesaria un enzima llamado RNA primasa, en realidad una RNA po202

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limerasa que había sido identificada años antes. Utilizando los enzimas a su disposición y mediante ingeniosos experimentos, Kornberg pudo demostrar que la RNA primasa produce la síntesis de un fragmento de RNA en un segmento de la hebra molde, a partir del cual la pol III comienza a replicar el DNA. Posteriormente, la acción exonucleasa de la DNA polimerasa elimina el RNA y rellena ese fragmento de hebra simple con la secuencia de DNA complementaria. Finalmente, la acción de una DNA ligasa circulariza la doble hebra del bacteriófago. Kornberg demostró que este complejo mecanismo era parecido en otros organismos como el bacteriófago G4, en el que la RNA polimerasa generaba un pequeño iniciador sobre el que continuaba la DNA polimerasa. Para confirmar que la RNA primasa es necesaria, Kornberg utilizó dos tipos de experimentos. En el primero usó rifampicina, que bloquea la RNA polimerasa, y observó que no se producía replicación del virus. En un segundo experimento utilizó mutantes que eran insensibles a la rifampicina para observar que aun en presencia de ésta la replicación se llevaba a cabo (Figura 49).



Figura 49. Esquema de los experimentos de Kornberg que sirvieron para demostrar que la replicación de DNA requiere una molécula cebadora, que es un pequeña hebra de RNA, sintetizada por una RNA polimerasa (RNA primasa).

Los fragmentos de Okazaki Los experimentos llevados a cabo por los grupos de Kornberg y Cairns, tal como comentamos anteriormente, habían dejado claro que la replicación se produce a la vez en las dos hebras de DNA. Sin embargo, también era evidente que la DNA polimerasa actuaba siempre en la dirección 5’ → 3’. Eso hacía que la lectura y replicación de una de las hebras, la que se abre en la dirección 3’ → 5’, fuera inmediata. Pero, ¿cómo se producía la replicación en la otra hebra? La respuesta a este problema fue dada por un antiguo estudiante postdoctoral de Kornberg, Reiji Okazaki, quien en la Universidad de Nagoya y en 1968 logró demostrar que la replicación del DNA en la otra hebra se produce por la acción de la DNA polimerasa en su dirección normal, pero de manera discontinua, mediante la generación de pequeños fragmentos que fueron llamados de Okazaki, y que posteriormente eran ligados por una DNA ligasa. Para demostrarlo, ­Okazaki puso el sistema a replicar in vitro y como fuente de nucleótidos 203

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añadió, en experimentos de pulso y caza, nucleótidos tritiados. Posteriormente separó las hebras mediante tratamiento alcalino y sometió el conjunto a una centrifugación en gradiente. Al final, midió la radioactividad de las distintas fracciones y observó que ésta se concentraba en un DNA de gran tamaño (resultado de la replicación “normal” de la hebra 3’ → 5’) y en unos fragmentos de 1.000-2.000 nucleótidos que se incorporaban gradualmente al fragmento de gran tamaño como resultado, según se supo posteriormente, de la acción de una ligasa que unía los citados fragmentos (Figura 50). La replicación de las dos hebras de DNA se produce, por lo tanto, de manera continua en una hebra, mientras que

1. DNA replicando activamente.

2. Adición de nucleótidos 3H radiactivos durante 5 minutos (pulso).

3. Adición de nucleótidos sin marcar (caza). Repetición de pasos 2 y 3 varias veces (pulso → caza, pulso → caza...).

4. Separación de las hebras en solución alcalina y ultracentrifugación. Figura 50. Experimento de Okazaki. Los experimentos de “pulso y caza” de Okazaki mostraron la existencia de una hebra de gran tamaño, (resultado de la replicación “normal” de la hebra 3’ → 5’) y fragmentos pequeños de un tamaño parecido, producto de la síntesis discontinua proveniente de lectura de la hebra 5’ → 3’. 

6. Análisis de los resultados: – Fragmentos de 1.000-2.000 nucleótidos. – DNA de gran tamaño.

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en la otra se hace de manera discontinua, y posteriormente se rellenan los fragmentos con una DNAsa especial y con una ligasa.

El nacimiento de la Ingeniería Genética Las décadas de los años setenta y ochenta dieron lugar a una serie de descubrimientos y avances técnicos que revolucionaron la Biología Molecular. Las técnicas de clonación y secuenciación de genes fueron desarrolladas en aquella época gracias al descubrimiento, purificación y caracterización de una serie de enzimas (de restricción, replicación y transcripción del DNA, entre otras), pero también gracias a su comercialización por compañías nacidas de varios de aquellos laboratorios, que hicieron a su vez posible su uso masivo por parte de otros grupos que, de otro modo, no habrían podido tener acceso a esas herramientas. Las técnicas de ingeniería genética fueron, con algunas técnicas bioquímicas, las primeras herramientas universales de las que dispuso la comunidad científica, que dieron lugar al crecimiento de industrias biotecnológicas cuyo desarrollo final es difícil de vislumbrar. Los comienzos de la ingeniería genética tienen sus raíces en California, fundamentalmente en la Universidad de Stanford, donde alrededor de la figura de Arthur Kornberg se identificaron y aislaron varios de los enzimas que han hecho posible esta revolución científica, tales como DNA polimerasas, DNA ligasas, varias exonucleasas y la DNA transferasa terminal. Sin embargo, algunas de las contribuciones esenciales para el nacimiento de la Ingeniería Genética se hicieron en otros lugares, como las que realizaron Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton O. Smith, los primeros científicos a los que el Comité Nobel reconoció su labor en este campo, concediéndoles el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978. El grupo de Arber fue el primero en caracterizar, en 1968 y en la Universidad de Ginebra el fenómeno de restricción, y en descubrir además alguno de los enzimas que lo llevan a cabo. Arber estudiaba en aquel tiempo un fenómeno no muy bien comprendido entonces, denominado modificación controlada por el huésped, por el que las bacterias protegen su DNA de la degradación que afecta al virus que las ha infectado. Arber demostró que las bacterias metilan su DNA para protegerse, y además postuló que esa protección ocurría frente a una serie de enzimas propias que reconocen y cortan lugares específicos dentro de la secuencia de DNA y que de esa manera intentan eliminar el DNA vírico que ha penetrado en la célula. Hamilton Smith, trabajando en el hospital Johns ­Hopkins de Baltimore, confirmó dos años después la hipótesis de Arber y caracterizó la estructura química de las regiones de DNA que son atacadas por esos enzimas, que contribuyó a aislar en algunos casos Estos enzimas se denominaron de restricción y fue Daniel Nathans, también en el Johns Hopkins, quien utilizó por primera vez alguno de esos enzimas para realizar cortes específicos en genomas, como el del virus del simio (simian virus 40, SV40), y realizar así mapas genéticos de muchos sistemas.

Uno de los primeros mapas de restricción, realizado por Daniel Nathans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1974) 71: 942.

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La recombinación del DNA Sin embargo, el hito clave en el nacimiento de las técnicas de recombinación del DNA se produjo en Stanford en 1971 y lo llevaron a cabo en paralelo dos grupos, el de Dale Kaiser y el de Paul Berg, quienes se habían formado científicamente con Arthur Kornberg. La idea de ambos grupos era introducir en un organismo un gen foráneo de interés, utilizando para ello un plásmido, que es un fragmento de DNA que se encuentra en los organismos procariotas fuera del genoma y que se replica independientemente. En el caso de Kaiser, el motivo para realizar un experimento de clonación provino de su alumno de doctorado, Peter ­Lobban, quien como idea general para su tesis sugirió la introducción del gen de la insulina en el genoma del fago λ. Para ello, Lobban propuso aislar el fragmento de insulina por un lado, utilizando para ello enzimas de restricción, y por otro, el genoma del fago, linealizado también mediante enzimas de restricción. La idea de Lobban para unir los dos framentos de DNA era simple y a la vez genial: añadir a los extremos 3’ del fragmento de insulina y de λ los nucleótidos A y T respectivamente. Posteriormente, se realizaría la unión de los dos fragmentos y se separarían las moléculas de DNA circular del DNA no circularizado mediante centrifugación en gradiente. Los huecos en el DNA circularizado se rellenarían con DNA polimerasa (Figura 51). Finalmente se utilizaría el microscopio electrónico para observar la circularización del DNA. La introducción del plásmido

Figura 51. Esquema ideado por Kaiser y Lobban para la generación de un plásmido artificial en el que al genoma del fago λ se le introduce el gen de la insulina. A uno de los fragmentos se le añaden As y al otro Ts por los dos lados de la doble hebra. Se incuban los dos fragmentos para conseguir su hibridación y los huecos se rellenan con una DNA polimerasa a la vez que se circulariza con una DNA ligasa. 

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artificial dentro del organismo huésped, la bacteria E. coli era en principio un problema, que fue solventado gracias al descubrimiento por parte de un científico del grupo de Lederberg, Mort Mandel, de que la exposición de las bacterias a una alta concentración de calcio aumenta enormemente la permeabilidad de sus membranas y, con ello, la introducción de DNA exógeno, lo que se denominó posteriormente como transformación. Paralelamente, el grupo de Paul Berg, que trabajaba con el virus oncogénico SV40, se interesó por la posibilidad de introducir un gen en su genoma. Para ello cortaron el DNA del virus, que es circular, con un enzima de restricción cedida por Herbert Boyer, de quien luego hablaremos largo y tendido. Posteriormente introdujeron en el genoma de SV40, mediante un enfoque parecido al de Lobban, un grupo de genes del fago λ y el operon lac de E. coli. Los dos grupos finalizaron con éxito sus planes, pero mientras que Kaiser eligió limar unos flecos de la tesis de ­Lobban antes de publicar los resultados, Berg los publicó inmediatamente. El resultado fue que mientras que el artículo de Berg, aparecido en 1972, causó una gran conmoción en la comunidad científica, el posterior trabajo de Kaiser no resultó tan interesante, y es que en esta vida no sólo hay que ser inteligente sino también listo. En cualquier caso, el campo de la manipulación genética había nacido y la comunidad científica pronto fue consciente de la potencialidad de estas técnicas para poder sintetizar proteínas de interés médico o económico en organismos inferiores como las bacterias, o modificar plantas para hacerlas resistentes a enfermedades, o corregir enfermedades producidas por mutaciones en el material genético. Acompañando a los potenciales beneficios aparecieron también los potenciales peligros de la manipulación genética, en forma de nuevas armas biológicas, así como consideraciones de orden ético. A partir de los trabajos de Berg, Kaiser y otros, en la Universidad de Stanford se fueron colocando los cimientos de la Ingeniería Genética. El grupo de Boyer purificó un enzima de restricción en un plásmido de E. coli llamado RI y de ahí el nombre dado a este enzima, EcoRI, uno de los más utilizados hasta la fecha. Fue este enzima el que utilizó el grupo de Berg en el experimento de clonación descrito anteriormente, ya que observó que cortaba el genoma de SV40 en un solo punto de la doble cadena. En el proceso de caracterización de este enzima, Janet Mertz y Ronald Davis, del grupo de Berg, descubrieron que el corte que produce EcoRI no generaba extremos romos sino cohesivos, lo que sugería la posibilidad, gracias el uso de la DNA ligasa, de producir uniones específicas con otras moléculas de DNA cortadas de la misma manera, una de las herramientas más utilizadas a partir de entonces en los experimentos de recombinación genética. El siguiente paso obvio en el desarrollo de las técnicas de recombinación del DNA vino de la búsqueda de vectores sencillos de manipular, y la contribución primera y principal procedió de la colaboración de los grupos de Herbert Boyer y Stanley Cohen, este último Premio Nobel de 207

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Fisiología o Medicina en 1986. Boyer estaba muy interesado en el desarrollo de técnicas de manipulación genética y Cohen había trabajado durante bastante tiempo en el estudio de la resistencia bacteriana, que residía fundamentalmente en los plásmidos que las bacterias poseen en su citoplasma. Ambos científicos tuvieron la idea de crear un plásmido que contuviera los genes de resistencia a antibióticos. En su primer trabajo importante que publicaron en 1973, consiguieron fusionar dos segmentos de DNA, un fragmento de E. coli que poseía el gen de la resistencia a tetracicilina y otro de S. aureus que poseía el de resistencia a penicilina. Al año siguiente, introdujeron en un plásmido un segmento del genoma de sapo (Xenopus laevis), de tal manera que el plásmido introducido en la bacteria transcribía RNA y se replicaba de manera estable en el citoplasma bacteriano. La ingeniería genética con DNA de organismos superiores había nacido y con ella una serie de posibilidades médicas e industriales enormes. Boyer fue consciente de esas posibilidades y en colaboración con un socio capitalista, Robert Swanson, creó en 1976 la primera empresa de biotecnología, Genentech. El éxito de esta compañía fue y es enorme (lo que no ha ocurrido, todo hay que decirlo, con otras muchas creadas durante los últimos treinta años), y sus laboratorios han producido un gran número de proteínas recombinantes de interés farmacológico, como por ejemplo la primera insulina humana producida en un microorganismo (1977). En esa época, el grupo de Boyer y otros grupos sobreexpresaron, utilizando técnicas parecidas, muchas otras proteínas como la somatostatina (en este caso unida en la expresión al gen de la β‑galactosidasa), otras hormonas como el interferón, etc. En el caso de estas pequeñas hormonas, el gen insertado en el vector de expresión se sintetizó químicamente, uniendo de esta manera técnicas de Química Orgánica a las nacientes de Biología Molecular.

Los primeros contratiempos de la ingeniería genética: la reunión de Asilomar Ahora que están de actualidad los problemas éticos derivados del uso de células troncales o células madre, resulta interesante apuntar que éste no ha sido el primer enfrentamiento que se ha producido entre distintas fuerzas sociales, políticas y científicas a resultas de los desarrollos favorecidos por la pujante Biología Molecular. El primero de tales problemas surgió en los primeros años de la década de los setenta, propiciado en este caso por un sector de la propia comunidad científica que veía con preocupación el uso y modificación de organismos potencialmente peligrosos. La polémica comenzó cuando Janet Mertz, que como hemos dicho trabajaba con Paul Berg, expuso en público y durante un congreso que tuvo lugar en 1971, su intención de realizar experimentos de clonación con genes de SV40, un virus del que se conocían sus propiedades cancerígenas. El biólogo Robert Pollack, que era consciente de tales propieda208

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des, avisó a Berg de los problemas que esto podría acarrear. Fue el mismo Paul Berg quien inició la polémica, pues pidió una moratoria en el uso de las técnicas de recombinación hasta que hubiese una discusión sobre los potenciales peligros de su uso y se desarrollasen protocolos de actuación y medidas de seguridad adecuadas en las instalaciones científicas. Auspiciados por los NIH, en febrero de 1975 se reunieron en Asilomar (California) un grupo de científicos (Paul Berg, David Baltimore, Sydney Brenner entre otros muchos), para discutir sobre los experimentos genéticos y sus posibles peligros para la salud humana. El documento final hizo una serie de recomendaciones para la investigación en este campo, pero sugirió que ésta, con las precauciones pertinentes, debía continuar por los enormes beneficios que podía ofrecer. Las medidas propuestas, que nacieron de esta reunión y de otras que tuvieron lugar en Europa, fueron físicas y biológicas. En el primero de los casos se desarrollaron laboratorios específicos para el uso de organismos biológicos con distintos grados de peligrosidad. En el segundo de los casos, se fomentó el desarrollo y uso de cepas más seguras, que no pudieran sobrevivir fuera de las condiciones impuestas en el laboratorio. La primera de tales cepas la creó en 1976 Roy Curtis III, de la Universidad de Alabama, y se llamó chi 1776. Esta cepa requería un compuesto para sobrevivir, el ácido diaminopimélico, que no se encuentra en el intestino humano y, por lo tanto, no podía infectar al hombre. Desgraciadamente, esta bacteria funcionaba mal pues crecía muy lentamente y su uso se hizo inviable. Otro de los esfuerzos en este sentido, éste más exitoso, provino de Sydney Brenner quien observó que una de las cepas de E. coli que más se usaban en aquella época, la K‑12, crecía bastante mal fuera de las condiciones usadas en el laboratorio, así que se utilizó esta cepa y derivadas suyas para los subsiguientes experimentos. Sin embargo, pronto se crearon otras cepas más exitosas, tales como las cepas derivadas de K‑12 y denominadas EK2. Se crearon también plásmidos que no poseyesen sistemas de conjugación, lo que evitaba el paso de información a otras cepas. El paso de los años y la inexistencia de las catástrofes anunciadas mostró que el sentido común prevalece normalmente sobre las lógicas inquietudes que puedan surgir a causa del rápido desarrollo científico y tecnológico.

James Watson y Sydney BRENNER (1927-), durante la reunión de Asilomar (California) en febrero de 1975. © U.S. National Library of Medicine.

Las nuevas técnicas de Biología Molecular Otro de los grandes hitos en el desarrollo de la Biología Molecular y de la recombinación genética fue el desarrollo de técnicas para el aislamiento de los genes, que fue llevado a cabo por varios laboratorios, pero especialmente el de David Hogness, discípulo de Kornberg, quien, con Michael Grunstein desarrolló en 1975 la técnica de generación de bibliotecas genómicas. Hogness y Grunstein trabajaban entonces con la mosca Drosophila y pretendían aislar ciertos genes de interés. Para ello, los dos investigadores 209

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cortaron el genoma de la mosca con enzimas de restricción e insertaron los fragmentos en plásmidos que incorporaron a bacterias. Posteriormente diluyeron las bacterias y las pasaron a placas petri para conseguir colonias individuales. Las colonias se traspasaron a papel de celulosa, se desnaturalizaron para separar las dos hebras de DNA y se incubaron con un segmento de DNA del gen que se pretendía aislar y que había sido marcado previamente con radioactividad (Figura 52). La idea era conseguir hibridar el gen de interés con el DNA de la colonia que lo poseyera, lo que se comprobó mediante autorradiografía del papel donde se había producido la hibridación. Posteriormente, aislaron las colonias que producían hibridación, las crecieron y purificaron sus plásmidos para extraer de ellos, mediante enzimas de restricción, el gen deseado. Se había puesto la base para conseguir una colección de clones bacterianos (o libros) que contendrían plásmidos cada uno de ellos con un fragmento distinto

Figura 52. Esquema del método de generación de bibliotecas genómicas.



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del DNA genómico de Drosophila, obteniéndose en conjunto lo que se conoce como una biblioteca genómica de este organismo: un conjunto de secuencias representativas de todo su genoma. Enseguida muchos científicos se apercibieron de la potencialidad de este tipo de técnicas para el diagnóstico clínico de enfermedades causadas por alteraciones genéticas. La primera contribución a este campo partió del grupo de Yuet Wai Kan de la Universidad de San Francisco, quien, utilizando un DNA de globina y mediante técnicas de hibridación, fue capaz de distinguir sujetos sanos de otros con el gen modificado de la globina que da lugar a la anemia falciforme. Otras de las técnicas que se desarrolló enormemente en aquellos años fue la de la electroforesis, para la que se idearon nuevos soportes tales como la agarosa y la acrilamida. El investigador americano Jake Maizel introdujo el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) en las técnicas de electroforesis para lograr una mejor separación de las proteínas. Este detergente, además de romper los enlaces débiles que se producen entre proteínas, permite conseguir una relación aproximadamente constante entre la masa de la proteína y la carga, de tal manera que la separación por efecto de la carga se convierte realmente en una separación por masa. Esta propiedad del SDS fue usada por Eladio Viñuela y colaboradores en la Universidad de Nueva York, quienes observaron que la movilidad de las proteínas en un gel es inversamente proporcional al logaritmo de sus masas moleculares, lo que permitió el cálculo directo y aproximado de la masa molecular de la proteína en estudio (Figura 53). El científico suizo Uli Laemmli, trabajando entonces en el LMB de Cambridge, desarrolló métodos de tampones discontinuos (la publicación en la que Laemmli describió esta técnica es una de las más citadas en la historia de la Biología Molecular), y William Studier ideó los geles en tiras, que hicieron posible la electroforesis y la comparación directa de muchas muestras distintas en un mismo ensayo. A la par que se producía el desarrollo de los soportes hubo una clara mejora de los métodos de detección de las muestras, tales como el bromuro de etidio para los ácidos nucleicos y el azul de coomassie para las proteínas, este último un tinte utilizado en la industria textil australiana. También se aislaron y purificaron numerosos enzimas de restricción, que fueron fundamentales en el desarrollo de las técnicas de clonación y en la creación de mapas genéticos de los plásmidos que se estaban desarrollando. En este aspecto fue muy importante, como ya hemos comentado, la imbricación de la investigación básica con las nuevas empresas de biotecnología, que tomaron el relevo en el descubrimiento de nuevos enzimas de restricción y se dedicaron a su comercialización a precios relativamente bajos, lo que hizo que las técnicas de Biología Molecular pudieran ser accesibles a laboratorios de todo el mundo. El desarrollo de las técnicas de bibliotecas genómicas (o genotecas) y la necesidad del aislamiento de secuencias o genes específicos motivó la invención de una de las técnicas más poderosas desarrolladas hasta la fecha, la de la transferencia de los fragmentos separados por electroforesis

Figura 53. Representación logarítmica de las masas moleculares de proteínas frente a sus movilidades electroforéticas relativas (M) sobre un gel de SDS‑poliacrilamida. Se muestra, como ejemplo, la interpolación del peso molecular de una proteína problema.

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Primer esquema de la transferencia Southern. Cortesía de Edwin Southern, en Genomics, Society and Policy (2006) 2: 50.

a un material en el cual se pudieran analizar mucho más fácilmente. La idea se le ocurrió en 1975 al científico británico Edwin Southern, trabajando entonces en la Universidad de Edimburgo, y rápidamente se popularizó entre la comunidad científica (mucho antes de que Southern pudiera publicarla). Poco tiempo después, cuando los científicos John Alwine y George Stark de la Universidad de Stanford diseñaron una técnica parecida para transferir y aislar RNA, se les ocurrió la humorada de llamarla técnica Northern. Así que cuando la técnica se adaptó para las proteínas no podía sino llamarse Western... Edwin Southern no desapareció del mundo de la Biotecnología sino que puede considerarse uno de los padres de la Genómica, ya que de su mente y su mano nacieron años después los primeros “chips” con nucleótidos que han revolucionado la reciente Biología Molecular.

Los plásmidos

Mapa genético del plásmido de E. coli, vector de clonación denominado PBR322. Se indican las dianas de restricción únicas, el origen de replicación y los genes que confieren resistencia a antibióticos.

Las técnicas de recombinación del DNA dieron un salto cualitativo cuando a mediados de los años setenta comenzaron a desarrollarse los primeros plásmidos en los que se introdujeron las secuencias de muchos enzimas de restricción. El modelo sobre el que la mayor parte de los vectores posteriores se derivaron, el pBR322, lo construyó en 1977 el científico mejicano Francisco Bolívar, que trabajaba entonces en el grupo de ­Boyer. El desarrollo de plásmidos se mostró imparable y cuando los creados hasta entonces no pudieron incorporar DNA de un cierto tamaño, como el de los organismos eucariotas, se desarrollaron los llamados “cósmidos”, vectores que pueden empaquetarse en bacteriófagos para que éstos infecten el organismo hospedador. Otro de los campos en los que se introdujeron las técnicas de DNA recombinante es el de la modificación de organismos superiores. En 1980 los grupos de Jeff Schell y Marc van Montagu, de la Universidad de Gante, produjeron la primera planta transgénica mediante la utilización de un plásmido procedente de una bacteria que infecta a plantas, Agrobacterium tumefaciens. En el mismo año, el grupo de Frank Ruddle en Yale logró crear los primeros animales transgénicos al insertar genes de origen vírico en oocitos de ratones. Después de varias divisiones celulares in vitro, los embriones fueron implantados a una “madre de alquiler”, que dio lugar a 78 ratones, de los cuales dos tenían insertados de manera estable los genes foráneos, según se pudo demostrar. Al año siguiente y utilizando la misma técnica, el mismo grupo logró introducir genes humanos en ratones.

La lectura y modificación del DNA A principios de los años ochenta, las técnicas de recombinación del DNA se habían desarrollado de manera imparable, pero habrían limitado mu212

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cho su potencialidad sin el avance de otras técnicas que harían de la Ingeniería Genética una de las herramientas más poderosas creadas por el hombre. El primero de estos progresos tiene que ver con la capacidad de producir mutaciones en los genes en el lugar y con las características deseadas por el experimentador. Hasta entonces, los científicos buscaban mutaciones naturales en las bacterias y en los virus que fueran de su interés, o forzaban al organismo a mutar esperando que algunas de las mutaciones producidas fueran adecuadas para los estudios subsiguientes. Sin embargo, en 1978, el grupo de Michael Smith, de la Universidad de ­British Columbia, anunció un método de mutagénesis puntual que iba a revolucionar la Biología Molecular y que le valió el Premio Nobel de Química en 1993. La idea era simple pero muy ingeniosa. Se trataba de insertar el gen a mutar en un fago con DNA de hebra simple como el φX174 o el M13 y producir su replicación utilizando para ello moldes de la replicación que poseyeran los cambios puntuales que se pretendían introducir (Figura 54). La maquinaria de replicación del fago permitía estos fallos en el apareamiento de las bases, que eran transmitidos a la hebra hija y, posteriormente, a toda la descendencia del virus. Su replicación en grandes números permitía, además, disponer de una gran cantidad de DNA mutado con el que realizar muchos experimentos.



Figura 54. Esquema del sistema de mutagénesis puntual de Smith.

Gracias a la generación de mutantes puntuales se podía estudiar, por primera vez y de manera directa, el papel funcional o estructural de aminoácidos puntuales con lo que confirmar o sugerir nuevas hipótesis de trabajo. La técnica era tan útil que pronto se instaló en todos los laboratorios de Biología Molecular que se considerasen como tales. Sin embargo, no tardó en ser sustituida por una modificación de esta técnica todavía más poderosa, la de la reacción en cadena mediada por polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR), cuyo desarrollo supuso un 213

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hito fundamental en el desarrollo de todas las técnicas asociadas con el DNA recombinante. El concepto fundamental de esta técnica procede de los bucles que se utilizan en los programas informáticos, a los que no era ajeno su inventor, Kary Mullis. Éste trabajaba para la compañía de biotecnología Cetus cuando en 1983 se le ocurrió la idea de amplificar una secuencia de DNA mediante la utilización de dos iniciadores, uno por cada hebra del DNA a amplificar, dispuestos en los dos extremos contrarios en cada una de las hebras. Mediante la repetición de manera cíclica de la separación de las hebras, la unión de éstas a sus respectivos iniciadores y la síntesis de cada una de las cadenas, Mullis pensó que se podía generar una cantidad exponencial de DNA (Figura 55). Además, la técnica de PCR podía utilizarse para mutar la secuencia introduciendo las mutaciones, como en la técnica de Smith, en los iniciadores de la síntesis.

Figura 55. Método de PCR. Representación del principio de ampliación del número de copias de una región de DNA de interés por el método de PCR. Mediante la realización de sucesivos ciclos de replicación de la región, se consigue incrementar el número de copias de esa región de forma exponencial.

El método de PCR es ahora universalmente utilizado y permite la multiplicación de cantidades minúsculas de DNA (fósiles, víctimas de crímenes, identificaciones de todo tipo, etc.). Sin embargo, la técnica tardó cierto tiempo en desarrollarse, entre otras cosas porque no se había encontrado por entonces una DNA polimerasa que soportase durante largo tiempo los grandes cambios de temperatura que exige la separación de las dos hebras. La solución a este problema vino del aislamiento de la DNA polimerasa de un organismo muy especial, la bacteria termófila Thermus aquaticus, descubierta en 1967 por Thomas Brock. Éste trabaja-

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ba en la Universidad de Indiana cuando, durante un viaje al Parque ­Nacional de Yellowstone, observó la presencia en las fuentes termales de organismos que crecían a muy altas temperatures. En aquel tiempo se creía que el límite superior para las reacciones biológicas era de 73 °C y Brock aisló un organismo que crecía a 85 °C. El descubrimiento de este tipo de organismos llevó a la posterior designación de un nuevo dominio de bacterias, las arquebacterias o Arqueas, a las que nos referiremos posteriormente. A partir de los años ochenta, el estudio y uso de las proteínas termófilas se extendió enormemente y ha tenido una importancia fundamental en el desarrollo de la Biotecnología y de la Biología Estructural, en este último caso por la facilidad con que estas proteínas pueden ser expresadas y, en muchas ocasiones, cristalizadas. La homología de secuencias entre estas proteínas termófilas cristalizadas y las de los eucariotas ha permitido, en muchas ocasiones, trasladar a las segundas la información estructural obtenida en las primeras y poder confirmar, mediante mutagénesis puntual, el papel funcional y estructural de distintos aminoácidos dentro de una determinada proteína. En cualquier caso, el desarrollo de las técnicas de mutagénesis dirigida no habría servido de nada si éstas no hubieran venido acompañadas del diseño de métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. Estos métodos existían desde principios de los años setenta, y habían servido para que en 1976 Robert Holley ya hubiera conseguido secuenciar un tRNA, el del aminoácido alanina, y Walter Fiers en Gante hubiera hecho lo propio con el genoma completo de un pequeño fago, el MS2. Sin embargo, estas técnicas eran muy laboriosas y artesanales, y estaban al alcance de muy pocos laboratorios. La situación iba a cambiar a partir del año 1976 gracias a los desarrollos que se produjeron en dos laboratorios a ambos lados del Atlántico. El primer esfuerzo provino del grupo de Walter Gilbert, quien durante sus trabajos en la caracterización de la interacción específica entre el represor lac y su secuencia de DNA desarrolló dos técnicas de gran interés. Utilizando geles de poliacrilamida de gran resolución fue capaz de separar el DNA por tamaños de secuencia y usar esa técnica para, en presencia de la proteína, que protegía ciertas secuencias, determinar cuáles eran éstas. Como consecuencia natural de estos experimentos de protección y, en colaboración con su colega Allan Maxam, Gilbert comenzó a desarrollar un método de lectura del DNA, que estaba basado en la degradación química del DNA, aunque era complejo de llevar a cabo. Además, la información que se obtenía no era directamente interpretable, lo que hacía difícil su escalado. Sin embargo, habría sido utilizado por toda la comunidad científica si no se hubiera desarrollado otro método, el de Frederick Sanger (Figura 56). Como hemos dicho anteriormente, Frederick Sanger, desde su puesto en el departamento de Bioquímica de la Universidad de Cambridge, ya había desarrollado métodos de secuenciación de proteínas que le habían llevado a obtener el Premio Nobel de Química en 1958. Desde mediados de los años sesenta, y trabajando ya en el LMB, había sido convencido 215

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Figura 56. Esquema de la secuenciacion enzimática del DNA. El método de secuenciación de Sanger se basa fundamentalmente en el uso del fragmento Klenow de la polimerasa, y de una mezcla de nucleótidos y didesoxinucleótidos, que van a detener la reacción (en una cierta proporción) en cada uno de los pasos de síntesis. Cada uno de los cuatro carriles contiene un solo didesoxinucleótido (ddA, ddT, ddG o ddC), que indicará que ese nucleótido es el último que se ha unido en ese paso de síntesis concreto. La mezcla de nucleótidos posee también nucleótidos radioactivos, que son los que van a ser detectados en el gel. Éste, que contiene el detergente SDS y el agente caotrópico urea, es capaz de separar los fragmentos con diferencias de un nucleótido, por lo que el investigador sólo tiene que ir leyendo de abajo hacia arriba cada una de los cuatro carriles. En el caso de la figura, la banda que se encuentra más abajo corresponde a un fragmento que ha finalizado en G (porque ese carril contiene sólo ddGs), por lo que el primer nucleótido leído en esa secuencia será G. Después GA, GAT, GATT, etc. Esta forma de lectura era capaz de leer, a los pocos años del desarrollo de este método, varios cientos de bases en un solo gel.

por Crick y Brenner para desarrollar un método de secuenciación de nucleótidos. La inteligencia de Sanger, que ejemplifica como nadie al científico trabajador y alejado de las genialidades de otras eminentes figuras (“Sólo soy un tipo que da vueltas por el laboratorio” es su propia definición como científico), es la de haber sabido integrar en una sola técnica una serie de descubrimientos hechos en aquella época, como las técnicas de clonación en plásmidos sencillos como el M13, la generación de nucleótidos de terminación, además de mejorar las técnicas de electroforesis. 216

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Aunque tanto Gilbert como Sanger recibieron el Premio Nobel de Química de 1980 por el desarrollo de sus respectivas técnicas de secuenciación, sólo el de Sanger se ha seguido utilizando y en sus últimos desarrollos técnicos ha servido para acometer la secuenciación de genomas enteros como el humano.

Los anticuerpos Esta parte de la Biología Molecular pertenece a la llamada Inmunología, cuyo estudio ‑como hemos podido reconocer a lo largo de estas páginas‑, es tan antiguo y extenso que podría establecerse como disciplina separada (y, desde luego, muchos científicos la tratan así). En lo que a este trabajo respecta, se pretende mostrar el desarrollo de los estudios sobre los anticuerpos como herramienta de la Biología Molecular. Los anticuerpos fueron descubiertos a finales del siglo XIX por Emil von Behring (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1901) y ­Shibasaburo Kitasato cuando descubrieron una sustancia en la sangre de animales inmunizados contra la difteria que era capaz de precipitar la toxina que producía esta enfermedad. El descubrimiento de los anticuerpos llevó a Paul Ehrlich a desarrollar teorías de la interacción entre éstos y el antígeno, su inductor. Según Ehrlich, el antígeno y el anticuerpo debían ajustarse como lo hacen una llave y su cerradura, según la famosa metáfora que Emil Fischer ideó para los enzimas y sus sustratos. Fue ­Ehrlich el primero que postuló que los anticuerpos tienen dos dominios, el que interacciona con el antígeno, y el que lo hace con otros anticuerpos para formar el precipitado. Esta hipótesis fue parcialmente confirmada en 1936 por I. A. Parventjev, quien mostró que el tratamiento de una solución de anticuerpos con tripsina dejaba intacto un fragmento de anticuerpo que mantenía la capacidad de interaccionar con el antígeno. Este tipo de estudios fue continuado en 1946 en la Universidad de ­Cambridge por Rodney Porter, entonces en el grupo de Fred Sanger, quien tras doce años de arduo trabajo fue capaz de aislar dos dominios, los que hoy denominamos Fab (dominio de interacción con el antígeno) y Fc (dominio de complementación). Sólo tres años más tarde, en 1959, Gerald ­Edelman pudo demostrar que los anticuerpos constan de dos tipos de proteínas, una más pequeña (denominada cadena ligera o L de light), y otra más grande (llamada cadena pesada o H de heavy), lo que permitió a Porter hipotetizar primero y demostrar después que cada molécula de anticuerpo consta de dos moléculas ligeras y dos pesadas (Figura 57). Esta estructura general fue confirmada en 1967 mediante microscopía electrónica, y a mayor resolución en la década de los setenta, por difracción de rayos X, primero de un fragmento Fab y posteriormente del anticuerpo entero. ¿Cómo se produce la enorme diversidad de anticuerpos? La historia de las múltiples teorías que se fueron formulando a lo largo de los siglos XIX y XX para intentar dar contestación a este hecho experimental so-

Figura 57. Diagrama esquemático de un anticuerpo (IgG). Se pueden observar las regiones de las que se compone la molécula.

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César MILSTEIN (1927-2002) y Fred Sanger en el LMB. © MRC Laboratory of Molecular Biology.

brepasa el marco de este libro, aunque algunas de ellas han sido descritas en cierta forma en páginas anteriores, como la teoría del “molde” formulada por Pauling tras sus estudios de los anticuerpos en colaboración con Karl Landsteiner. Los experimentos realizados a lo largo de la segunda mitad del siglo XX mostraron algo distinto. En 1955 Niels Jerne propuso que la variabilidad de los anticuerpos se producía antes de encontrarse con el antígeno, y era éste quien seleccionaba e inducía la multiplicación del anticuerpo cuya conformación se ajustaba a la suya. Los descubrimientos que se produjeron posteriormente vinieron a confirmar esta hipótesis. En 1965 William Dreyer y Claude Bennet propusieron que las regiones variables (V) y constantes (C) de la molécula de anticuerpo, que habían sido recientemente caracterizadas, estaban codificadas por distintos genes. En el caso de las regiones C, sólo hay una copia, pero los autores sugirieron que hay miles de las V, que se recombinaban para dar el anticuerpo VLCL y VHCH adecuado. Fue Susumu ­Tonegawa quien en 1976 observó que las secuencias V y C que se encuentran juntas en las células de mieloma no se encuentran juntas en células embrionarias. A partir de esos estudios, Tonewaga desarrolló la teoría de la diversidad en los anticuerpos por la que recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1987, en la que hipotetiza que la diversidad de los anticuerpos se produce por un proceso de recombinación y mutación somática. La caracterización estructural y funcional de los anticuerpos no solo sirvió para comprender mejor los fenómenos inmunológicos sino que los propios anticuerpos se aprovecharon, a partir de entonces, como una herramienta científica y biotecnológica de primer orden, entre otras cosas para la detección, purificación y caracterización estructural de proteínas. Sin embargo, el hito más importante que tiene que ver con los anticuerpos en su vertiente biotecnológica y médica fue el desarrollo de los anticuerpos monoclonales por parte del argentino César Milstein y del alemán Georges Köhler, que les hizo merecedores junto con el anteriormente mencionado Jerne, del Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1984. Los anticuerpos son producidos por las células B en respuesta a la presencia de un antígeno o cuerpo extraño, y a pesar de que cada célula produce un tipo único de anticuerpo, los anticuerpos son distintos en cada célula. A este conjunto de anticuerpos ligeramente distintos que reaccionan contra un mismo antígeno se les denomina anticuerpos policlonales, y son los que se utilizaban (y se siguen utilizando en la actualidad) hasta que en 1975 a Milstein y Köhler, que trabajaban en el LMB de Cambridge, se les ocurrió una brillante idea. Ésta era la de fusionar una célula B, productora de un solo tipo de anticuerpos (clon), con una célula tumoral de mieloma múltiple, en principio “inmortal”, para generar una célula híbrida (hibridoma) capaz de dividirse indefinidamente y producir así enormes cantidades de un único tipo de anticuerpo, al que se denominó anticuerpo monoclonal (Figura 58). La idea resultó un éxito y revolucionó la Biología Molecular y la Biotecnología, en sus vertientes médica e industrial.

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La revolución genética



Figura 58. Experimento de Milstein y Köhler de anticuerpos monoclonales. La obtención de anticuerpos monoclonales implica una serie de etapas: inmunización del animal, obtención de los linfocitos B y su fusión con células de mieloma inmortal, selección de los hibridomas resultantes usando un medio selectivo, y producción de los anticuerpos monoclonales, que reconocen un único epítopo del inmunógeno.

La huella genética Una de las aplicaciones más poderosas de las técnicas moleculares descritas en las páginas anteriores, y que ha tenido una importante incidencia social, fue la descubierta en 1984 por Alec Jeffreys, un científico de la universidad británica de Leicester. Jeffreys estudiaba desde hacía años las diferencias genéticas que existen entre distintas especies, y en el transcurso de sus trabajos encontró unos pequeños trozos de DNA que se repetían multitud de veces a lo largo del genoma. Estos trozos de DNA parecían formar parte del llamado “DNA basura”, que no codificaba ninguna proteína. Jeffreys preparó un oligonucleótido radioactivo con esa secuencia y lo usó, utilizando para ello la técnica de hibridación descrita en páginas anteriores, para determinar sus sitios de unión en el DNA genómico humano. Posteriormente corrió en un gel el producto de la hibridación y 219

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II. La edad de oro de la Biología Molecular

observó el patrón de bandas radioactivas que se producían, que daban cuenta del número y la extensión de la repetición de esos pequeños fragmentos. En el experimento había utilizado muestras de varias personas, algunas de ellas con lazos de sangre, y también las de varios animales. Para su sorpresa, Jeffreys observó que, aunque todas las muestras eran distintas entre sí, las de los familiares contenían enormes semejanzas que podían servir para relacionarlos entre sí. El científico británico pronto se apercibió de varias de las potenciales aplicaciones de su descubrimiento: “... utilizando la técnica se podría deducir cómo distintos animales están relacionados entre sí y así estudiar la evolución de las especies”.

Con ser estas aplicaciones interesantes, las que más incidencia tendrían para la sociedad llegarían muy pronto, pues Jeffreys y otros entendieron enseguida que la técnica, que se denominó “huella genética” (DNA fingerprint), podía ser utilizada para exámenes forenses. Los primeros desarrollos del método no estuvieron exentos de problemas y fueron causa de litigios en los tribunales sobre lo procedente de su uso como prueba legal. Sin embargo, una vez resueltas esas deficiencias, la huella genética se ha mostrado como una técnica imprescindible en la demostración de la inocencia o culpabilidad de acusados de crímenes o violaciones como en pruebas de paternidad.

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III

La consolidación de la Biología Molecular “El fin último del movimiento que se está produciendo en la biología reside en la explicación de todos los fenómenos biológicos en términos de Física y Química”

Francis Crick

Los atentados contra el dogma La consolidación de la biología molecular

“La Vida no es sino una sucesión de puentes de hidrógeno que se crean, se mantienen y se rompen en el momento adecuado” Anónimo

“Los únicos enlaces importantes en Biología son los puentes de hidrógeno” Jacques Monod (durante un congreso)

“No digas eso, Jacques, si no existieran los enlaces covalentes seríamos gas” Contestación de uno de los asistentes

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III. La consolidación de la Biología Molecular

Los atentados contra el dogma A partir de los años setenta, la Biología Molecular se convirtió en una disciplina madura, reconocida como tal por la comunidad científica, a la vez que robaba cada vez más protagonismo a la Bioquímica y la Genética. Una gran parte de la investigación en Biología Molecular iba a estar dominada por los desarrollos que tienen que ver fundamentalmente con la Ingeniería Genética, que serían utilizados para conseguir un conocimiento cada vez más profundo de los distintos procesos biológicos. Parte de este éxito tiene que ver con el esfuerzo promovido por las autoridades político-científicas para alcanzar esa tierra de promisión (nuevos fármacos, nuevas terapias...) a la que los descubrimientos realizados parecían llevar. Sin embargo, para muchos estudiosos de la Biología Molecular, ésta pareció entrar en un periodo “aburrido” en que los muchos resultados que se obtuvieron, algunos espectaculares, tan solo sirvieron para confirmar y desarrollar los conceptos generales formulados durante las brillantes décadas anteriores. Hay algunos descubrimientos, sin embargo, que fueron a perturbar en distinto grado los cimientos sobre los que se asienta el llamado Dogma Central de la Biología.

El ayuste (splicing) de los genes La colinealidad entre el mensaje genético almacenado en el DNA, el mensaje transmitido a través del mRNA y el expresado en la secuencia aminoacídica había sido demostrada en los organismos procariotas, y se pensaba que, a pesar de la mayor complejidad de los organismos eucariotas, éstos seguían las mismas pautas. Sin embargo, las primeras evidencias de que no siempre ocurría así aparecieron a principio de los años sesenta, cuando el grupo de Jim Darnell de la Universidad Rockefeller detectó, en el núcleo de células animales, un RNA mayor que el que posteriormente se detectaban en el citoplasma. Este tipo de RNA fue denominado RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) y, aunque ya desde un principio se supuso que debía ser algún tipo de precursor nuclear del mRNA, su caracterización se vio impedida durante años por la falta de técnicas con las que manejarlo. A principio de los años setenta, el interés por el hnRNA se reactivó como consecuencia del hallazgo, por parte de Aaron Shatkin del Instituto Roche, de una “protección” en el extremo 5’ del mRNA que consistía en una guanina modificada unida por un enlace covalente, a la vez que el grupo de Darnell mostró la existencia de una cola de adeninas (As) en el extremo 3’. Ambas estructuras, el llamado cap y la cola de poliadeninas, estabilizan el mensajero y lo protegen de la degradación. Lo sorprendente era que las dos modificaciones se encontraban tanto en los mRNA como en los hnRNA que se suponían eran los precursores. ¿Cómo y dónde se producía el acortamiento del hnRNA para dar lugar al mRNA? 222

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La respuesta a esta pregunta supuso uno de los grandes hitos de la Biología Molecular desde el punto de vista conceptual, y vino de la mano de los descubrimientos realizados fundamentalmente por dos grupos, uno radicado en el MIT y liderado por Philip Sharp, y otro localizado en el CSHL, bajo la batuta de Richard Roberts. Ambos provenían del esfuerzo de James Watson por formar, a principio de la década de los sesenta en el CSHL y bajo su dirección, una escuela de científicos preocupados por caracterizar una serie de virus animales que se presumía podían tener un papel relevante en procesos cancerígenos. La decisión de Watson de cambiar la línea principal de investigación del CSHL fue muy polémica entonces, pues la idea que sustentaba el cambio era muy heterodoxa, y los resultados en relación con el cáncer sólo dieron su fruto bastantes años después, pero durante ese largo camino los investigadores del CSHL generaron una gran cantidad de resultados de enorme relevancia biológica. En el caso que nos ocupa, Sharp estaba estudiando en el MIT un adenovirus e intentando caracterizar el fenómeno por el que unos genes de este virus se transcriben durante el comienzo de su ciclo infectivo y otros lo hacen más tarde. El grupo de Sharp observó, mediante técnicas de hibridación entre el DNA del virus y los mRNA que éste producía, que los segundos hibridaban con el primero en su totalidad excepto en la región 5’ y en la cola de adeninas en el extremo 3’, por lo que dedujeron que estas dos regiones, especialmente la primera, debía provenir de otra región de la secuencia del DNA. El grupo de Richard Roberts también trabajaba con adenovirus y observó que todas las regiones 5’ de los mensajeros virales poseían la misma secuencia. Además, los experimentos de hibridación que realizaron mostraron que esa región provenía de la transcripción de tres segmentos físicamente separados. La confirmación de que el mRNA se formaba por la unión de distintos segmentos de DNA, como si la región codificante estuviera partida, provino de experimentos de microscopía electrónica realizados por el grupo de Roberts. Este procesamiento interno del RNA, que tiene lugar en el núcleo celular, elimina las secuencias no codificantes, empalmándose las secuencias que sí darán lugar a una secuencia proteica. En castellano este proceso se ha venido a denominar de ayuste, por la forma de nudo marinero que al microscopio electrónico muestra este fenómeno biológico. Los resultados de ambos grupos fueron publicados en 1977 y conmocionaron a la comunidad científica, de tal manera que en 1993 los dos científicos recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina. Faltaba por ver si ese mecanismo era universal, y la confirmación de que así era vino de varios laboratorios que trabajaban con distintos organismos y proteínas. Como casi siempre que se produce un gran descubrimiento, se desarrolló a la vez la terminología que lo intenta explicar de la mejor forma posible. En este caso, fue Walter Gilbert quien inventó los términos intrón y exón para denominar a las regiones no codificantes y codificantes, respectivamente. Hoy sabemos que el fenómeno de ayuste está muy 223

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extendido entre organismos eucariotas superiores, de tal manera que hay genes en las que hasta el 95% del DNA transcrito puede corresponder a intrones y debe ser eliminado. Aunque al principio los científicos quedaron estupefactos por la acumulación sin sentido en la célula de enormes regiones no codificantes, hoy se sabe que esas secuencias extra de DNA en combinación con fallos aleatorios en el proceso de ayuste pueden ser un instrumento muy potente de variabilidad genética, que ha permitido evolucionar a los eucariotas, aunque también interviene en la generación de mutaciones dañinas.

La caracterización del ayuste ¿Cómo se produce el ayuste? ¿Cuál es la maquinaria que lo controla? Para que estas preguntas pudieran ser contestadas fue necesario en primer lugar el desarrollo de un sistema libre de células que produjera el ayuste, lo que fue conseguido por primera vez en 1983 por el grupo de Sharp. El desarrollo de sistemas in vitro más completos por parte de los grupos de Sharp y de Tom Maniatis permitió caracterizar en detalle los mecanismos generales de la edición del RNA tales como la presencia de manera casi general de la secuencia GU y AG al comienzo y al final del intrón, respectivamente, que actúa en el reconocimiento de la región del ayuste de la misma manera que la secuencia Shine-Dalgarno es reconocida para dar inicio a la traducción. Otro de los fenómenos que fueron descubiertos fue el de la existencia de un “lazo” ‑porque así se veía mediante microscopía electrónica‑, producto de la circularización del mRNA gracias a un enlace entre la G del comienzo del intrón y una A dispuesta casi al final de éste. Una vez producido el “lazo”, éste es eliminado y los dos exones se unen (Figura 59). La eliminación del intrón se produce mediante la actuación de un complejo ribonucleoproteico muy grande formado por más de 50 proteínas y varios RNAs, cuya descubrimiento e inicial caracterización fue llevada a cabo por el grupo de Joan Steitz.

Los ribozimas Si el descubrimiento del ayuste del RNA había hecho temblar los cimientos conceptuales establecidos por Francis Crick a mediados de los años cincuenta, su caracterización iba a deparar un golpe directo al Dogma Central de la Biología, que asignaba a los ácidos nucleicos un papel almacenador o transmisor de la información hereditaria, mientras que dejaba para las proteínas la ejecución de las actividades celulares básicas, entre ellas las catalíticas. Los causantes de este revuelo fueron el científico americano Thomas Cech y el canadiense Sidney Altman, y su revolucionario trabajo iba a recompensarles con el Premio Nobel de Química de 1989. Cech era catedrático de la Universidad de Colorado 224

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Figura 59. Esquema de un ayuste, representando la formación del lazo (intrón) que posteriormente se eliminará.

en 1978 cuando, trabajando en la caracterización del rRNA del protozoo Tetrahymena, observó por microscopía electrónica el fenómeno del ayuste. Cech se decidió a intentar aislar las proteínas que lo producían y para ello comenzó a trabajar, de acuerdo con el método clásico de purificación, con distintos extractos para observar en ellos la actividad editora de RNA. El problema con que se encontró al poco tiempo era que la citada actividad se producía sin que se requiriesen extractos. Después de cuidadosos experimentos en los que pudo descartar cualquier impureza proteica, Cech llegó a la inevitable conclusión de que el ayuste del rRNA lo producía la propia molécula. El rRNA se comportaba como un enzima (aunque esto no es exactamente correcto, porque a diferencia de los enzimas “canónicos”, el rRNA no se regenera al cabo de la reacción) y fue denominado ribozima. Cech publicó sus resultados en 1981, asustado de las consecuencias que se derivarían de aquéllos. Y tenía razón para estarlo, pues muy pocos investigadores creyeron sus conclusiones en primera instancia, incluso cuando Cech reprodujo dos años más tarde el ayuste del rRNA de Tetrahymena en un sistema libre de proteínas. 225

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III. La consolidación de la Biología Molecular

Anteriormente a los resultados de Cech, se había observado que el tRNA también sufría un proceso de ayuste, y se pensaba que esta actividad estaba regulada por una RNAsa denominada P, que Sydney Altman había ayudado a caracterizar durante su estancia como alumno postdoctoral en el LMB de Cambridge. Desde 1971, y como jefe de grupo en la Universidad de Yale, Altman se dispuso a purificar el enzima, pero el empeño resultó imposible, pues aunque consiguió purificar un complejo formado por proteínas y RNA, la eliminación de este último acababa con la actividad editora. Altman y su grupo se dedicaron a caracterizar este RNA que resultó ser, no una mezcla de RNAs, sino uno solo de un tamaño determinado. Altman pensó que este RNA, al que llamó M1, podría actuar como cofactor de la actividad catalítica del enzima, ya que por sí solo era incapaz de cortar el tRNA. La publicación del trabajo de Cech hizo que Altman volviese a mirar al RNA M1 como un posible ribozima. Una caracterización más profunda provocó que, al final, éste consiguiera condiciones en las que M1 cortaba y ayustaba el tRNA. Altman determinó, pues, que este RNA era también un ribozima y que las proteínas que lo acompañaban, al revés de lo que cualquiera habría pensado, actuaban modulando la actividad de aquél.

El mundo del RNA A lo largo de la década de los años ochenta se encontraron otras actividades enzimáticas asociadas al RNA, incluida la actividad peptidil transferasa que realiza la subunidad grande del ribosoma, lo que condujo a un cambio de actitud por parte de los científicos en relación con la actividad catalítica del RNA. A decir verdad, este cambio había comenzado en los años setenta gracias a los estudios sobre la evolución del RNA ribosomal realizados por Carl Woese, de la Universidad de Illinois, que le permitieron, entre otras cosas, dar un papel primordial al RNA ribosomal en el desarrollo de la vida y redibujar el arbol taxonómico con la creación de un tercer dominio, el de las arquebacterias, más cercano al dominio de los eucariotas que al de las bacterias. La idea de que el RNA pudo ser la materia primigenia de la Vida fue calando entre parte de la comunidad científica, y se sustanció en dos famosos artículos: el primero, publicado por Crick a mediados de los sesenta; y un segundo que tuvo más repercusión, de la mano de Walter Gilbert en 1986. Los dos artículos venían a decir que el RNA pudo, en el principio de los tiempos, haber ejercido a la vez el papel de almacenador de la información y de agente catalítico. Sólo más tarde otras moléculas biológicas mejor adaptadas para guardar la información de manera más estable (el DNA) o para ejercer funciones catalíticas (las proteínas) sustituyeron en general al RNA en esas funciones. La actividad autocatalítica del RNA, y el hecho de poder crear exones e intrones “a voluntad” pudo en su momento ser un poderoso mecanismo evolutivo. En apoyo de estas teorías vinieron los resultados obtenidos a finales de los años noventa por Harry Noller de la 226

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Universidad de Santa Cruz en California, quien pudo observar que la formación del enlace peptídico dentro del ribosoma está catalizada por el RNA y no por las proteínas que forman parte de éste. Este campo de la Biología Molecular, con amplias raíces en la Biología Evolutiva, sólo acaba de despegar.

El cáncer como motor del desarrollo de la Biología Molecular El cáncer se conoce desde la antigüedad y ya en la Grecia clásica los médicos y curiosos observaron los efectos de esta enfermedad en pacientes y en cadáveres. La palabra cáncer deriva de la raiz griega karkynos (cangrejo), y se asoció con esta enfermedad por la forma en que ésta iba distribuyéndose en distintas direcciones por el cuerpo del enfermo. Desde aquella época hasta finales del siglo XIX las teorías sobre el origen del cáncer fueron múltiples y algunas se nos antojan ahora peregrinas, tales como el comportamiento inmoral, la depresión, etc. Posteriormente, la Medicina se tornó más científica y el origen del cáncer dio lugar a dos teorías: una que sugería que el cáncer no poseía naturaleza infecciosa y otra que apuntaba a que sí existía un agente infeccioso, que obligó a buscarlo entre los microorganismos que en aquella época se comenzaban a aislar en gran cantidad. Sin embargo, se puede decir que los estudios modernos del cáncer comenzaron un día del año 1909 cuando un granjero de Long Island se presentó en el Instituto Rockefeller con un hermoso pollo de exhibición con un tumor en el pecho. Para quitarse al granjero de encima, buscaron al único científico del Instituto con interés en el cáncer. Éste era un médico llamado Peyton Rous, que terminó comprando al granjero su preciado pollo. Rous iniciaría así el estudio de un virus que por su benignidad e importancia para el desarrollo de la Biología Molecular llevó a decir a Peter Duesberg, el famoso y heterodoxo virólogo de Berkeley: “Los estudios sobre el virus del sarcoma de Rous han producido cinco premios Nobel, decenas de miembros de la Academia, miles de artículos científicos... y la muerte de diez pollos”.

Uno de estos premios Nobel fue el propio Rous, quien recibió el de Fisiología o Medicina en 1966, más de cincuenta años después de la visita del granjero, cuando ya tenía 85 años de edad. Rous decidió extraer el tejido cancerígeno al pollo, homogeneizarlo e inyectarlo a otros pollos, y observó que éstos desarrollaron los mismos síntomas (Figura 60). Rous sugirió que el causante de los tumores podía ser “... un pequeño parásito, quizás un virus”. Hay que decir en honor a la verdad que en aquella época los virus se definían por aquello que no eran (protozoos, bacterias...) ya que, después del uso de filtros que impedían el paso de microorganismos, la acción nociva del filtrado persistía (de hecho, el otro nombre usado para los virus era el de “agentes no filtrables”).

Figura 60. Esquema del experimento original de P. Rous que demostró que los virus podían transmitir tumores (sarcomas) en pollos.

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El descubrimiento de Rous causó una cierta conmoción en su época y muchos científicos se lanzaron a repetir los resultados en distintos sistemas. Sin embargo, la mayoría de ellos no pudieron reproducirlos. Peor que esto fueron las conclusiones a las que llegó a principio de los años veinte el médico danés Johannes Fibiger, quien anunció que el cáncer podía ser inducido en ratas cuando las cucarachas que éstas comían estaban infectadas con un pequeño parasito intestinal. En una de las meteduras de pata más graves de la Fundación Nobel, Fibiger recibió el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1926. Sin embargo, nadie pudo nunca reproducir sus resultados. La teoría de la infección por microorganismos, incluidos entre éstos los virus, fue anatematizada durante varias décadas y aquéllos que la apoyaron se arriesgaron a ver destruida su carrera científica. Esto es precisamente lo que le ocurrió a un médico americano, Ludwik Gross, quien a principios de los años cincuenta osó publicar unos resultados muy parecidos a los que Rous había mostrado cuarenta años antes, la existencia de un virus que era capaz de inducir leucemia en ratones. Gross estuvo a punto de ser expulsado de su trabajo, y sólo cuando otros científicos de más prestigio que él confirmaron sus resultados, pudo la comunidad científica aceptar la idea de que los virus, cuya existencia estaba para entonces más que demostrada, pudieran ser agentes causantes de ciertos cánceres. ¿Cómo se produce este fenómeno? Las primeras respuestas vinieron de los experimentos del médico italiano Renato Dulbecco (Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1975), quien había marchado a los Estados Unidos justo después de la II Guerra Mundial, y quien primero en C ­ altech y después en La Jolla fue capaz de desarrollar técnicas de crecimiento de virus, entre otros el que Rous había descubierto a principios de siglo, llamado en su honor virus del sarcoma de Rous (Rous Sarcoma Virus, RSV). Usando estas técnicas Dulbecco pudo observar que el RSV dejaba de reproducirse una vez que era capaz de infectar el cultivo de las celulas animales que Dulbecco había desarrollado. Dulbecco sugirió que esta parada se debía a que el genoma del virus se insertaba en el genoma del hospedador, algo parecido a lo que ya se había demostrado que ocurría con los bacteriófagos lisogénicos y las bacterias a las que éstos infectan.

El RNA hace DNA Los siguientes desarrollos en este campo los llevó a cabo un antiguo estudiante postdoctoral de Dulbecco, Harry Rubin, quien años después en la Universidad de Berkeley y junto con su por entonces becario Howard Temin, consiguieron mejorar las técnicas de Dulbecco, lo que les permitió observar que el RSV era capaz de infectar células de pollo, reproducise en ellas y liberarse al exterior sin afectar al ciclo propio de sus hospedadores. Este tipo de ciclo vital era diferente del ciclo lítico estudiado para la mayor parte de los fagos, pero también diferente al ciclo lisogénico de fa228

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gos como el lambda (λ), pues estos últimos “dormían” insertados en el genoma del hospedador hasta que se volvían líticos. En cualquier caso, ­Rubin y otros apostaron por un modelo en el que el genoma vírico se insertaba en el del hospedador. Este modelo pareció hacerse pedazos cuando en 1960 el grupo de Lionel Crawford, del Instituto de Virología de la Universidad de Glasgow descubrió que el genoma del RSV estaba compuesto de RNA. ¡Cómo iba a insertarse el RNA viral en un genoma compuesto de DNA! Para ello el RNA tendría que ser transformado en DNA, lo que iba contra los preceptos asumidos por la comunidad científica. La mayor parte de los investigadores involucrados en el estudio del virus RSV abandonaron las ideas anteriores... excepto Howard Temin, quien ya como jefe de grupo en la Universidad de Wisconsin se mantuvo obcecado en la idea de que el proceso de transferencia de información en el virus RSV, y probablemente en otros virus del mismo tipo, se producía a través de un trasvase de información del RNA al DNA, y de éste al RNA. Para ello, el RNA viral debiera convertirse en DNA por la acción de un enzima que Temin denominó transcriptasa inversa. En apoyo de esta teoría, ­Temin descubrió que la producción del virus RSV se bloqueaba cuando se añadían al sistema inhibidores de la transcripción, lo que sugería que el DNA estaba involucrado en el proceso de reproducción del virus. Postular la existencia del enzima se mostró más fácil que encontrarlo. Durante casi diez años Temin luchó por intentar hallar la hipotética transcriptasa inversa, recibiendo de vez en cuando alentadoras noticias como el aislamiento, en virus como vaccinia, de RNA polimerasas propias que eran introducidas por el propio virus en la célula del hospedador. Temin pensó que éste podía ser el caso para el virus RSV y, para ello, decidió purificar éste, rompió su cubierta mediante un tratamiento suave con detergentes, añadió nucleótidos y, después de un tiempo, observó que aparecía DNA (Figura 61). ¡La transcriptasa inversa existía y era transportada por el propio virus!



Figura 61. Experimento de Temin.

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Ahora sólo faltaba purificarla, pero ese honor no le cupo a Temin sino a otro investigador, David Baltimore, quien trabajaba en el MIT con otros virus animales causantes de cáncer y que parecían comportarse como el RSV. Baltimore también encontró que la transcriptasa del virus de la leucemia del ratón se encontraba dentro de la cubierta viral y posteriormente aisló el enzima. Este conjunto de resultados publicados en 1970 reportaron a Temin y a Baltimore el Premio Nobel de Fisiología o Medicina sólo cinco años después.

Los oncogenes

Harold VARMUS (1939-) en los NIH. (National Institutes of Health. Office of NIH History. Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

Los descubrimientos de Temin y Baltimore causaron conmoción no sólo por la aparente contradicción que suponían a los postulados de Crick, sino porque los virus que poseen RNA y que insertan su información genética en el genoma del hospedador a través de una transcriptasa inversa, parecían estar involucrados en procesos cancerígenos. A partir de la mitad del siglo pasado, el cáncer había atraído la atención y preocupación de la sociedad en los países desarrollados. Una gran parte de la investigación biológica se dedicó al estudio del cáncer, no sólo con el fin de buscar remedios para esta enfermedad, sino porque parecían ser modelos adecuados para profundizar en muchos procesos biológicos. La asociación de ciertos procesos cancerígenos con estos virus, denominados retrovirus, fue el origen de una de las primeras teorías modernas sobre el origen del cáncer, la de los provirus. Ya en 1959 Howard Temin había hipotetizado la existencia en ciertos virus de genes causantes de cancer, lo que luego se denominarían oncogenes, pero fue en 1969 cuando ­Robert Huebner y George Todaro formularon la teoría según la cual los retrovirus se habrían introducido en los genomas de los animales hacía mucho tiempo, se habrían mantenido en ellos de manera “dormida” y como tal serían transmitidos de generación en generación, y sólo en ciertas condiciones podrían activarse y convertirse en oncogénicos. Posteriormente surgirían otras variaciones a esta primera teoría, pero en todas ellas el oncogén viral poseía un papel fundamental en el proceso cancerígeno. Un fuerte apoyo a la teoría proviral del cáncer provino de los estudios del grupo de Rubin a principio de los años setenta, los cuales mostraron que se podía separar, por una parte la capacidad del virus para reproducirse como cualquier virus, y por otra la de generar tumores, ya que encontraron mutantes de RSV que se reproducían sin producir tumores. Esto significaba que existía un gen que producía el cáncer, al que se denominó src (de sarcoma), y que el grupo de Duesberg localizó en uno de los extremos del genoma viral. El siguiente paso en el aislamiento de los oncogenes provino de la caracterización de la inserción del genoma viral en el de la célula hospedadora, trabajo que realizaron en gran parte los investigadores de la Universidad de San Francisco Michael Bishop y Harold Varmus, y que les valió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1989. A lo largo de la deca-

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da de los años setenta, los dos científicos caracterizaron el complejo proceso de integración mediado por la transcriptasa, y en ese proceso aislaron el primer oncogén. Para ello, Bishop y Varmus no sólo utilizaron y mejoraron la técnica de hibridación entre DNA y RNA inventada por Sol Spiegelman, sino que además dispusieron del creciente arsenal de enzimas que la industria y la comunidad científica comenzaba a poner a disposición de los investigadores. En 1975 y en un experimento ya clásico, Bishop y Varmus generaron DNA a partir del RNA viral mediante el uso de la transcriptasa inversa, y posteriormente cortaron el DNA con enzimas de restricción, esperando que uno de los fragmentos contuviera el gen src. Posteriormente separaron las hebras y las hibridaron con los fragmentos producidos por los mismos enzimas de restricción a partir de un virus mutante que no contenía src. La idea era que el único segmento del DNA viral que no pudiera hibridarse sería el correspondiente al que contuviera el gen src (Figura 62).



Figura 62. Esquema de los experimentos de Bishop y Varmus.

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El experimento funcionó y pudieron aislar el citado gen. Ese mismo tipo de experimentos sirvió para demostrar la existencia de un gen parecido al src en el propio genoma del pollo. Los dos científicos, además de encontrar genes parecidos en otras aves, concluyeron que el gen debía de tener un papel importante en la regulación del crecimiento celular y en el desarrollo embrionario. En 1978 los dos científicos encontraron un gen parecido en mamíferos, con lo que se extendía la existencia de este oncogén a organismos superiores. En los años siguientes se encontraron otros genes que realizaban parecidas funciones y que, además de ser oncogénicos, llevaban a cabo funciones normales en la célula. En 1979 el grupo de Robert Weinberg desarrolló el método de transfección y consiguió aislar el DNA del virus insertado mediante enzimas de restricción, reintroducirlo en células normales y generar en éstas un proceso cancerígeno, lo que confirmó que el provirus poseía propiedades transformantes, que se producen en algunos casos sin la presencia del oncogén, simplemente por la integración del genoma viral en las cercanías de un oncogén propio del organismo, al que causa una desregulación de su expresión. El aislamiento de las secuencias transformantes y su homología con una serie de genes muy conservados llevaron al descubrimiento del primer oncogén humano ras por los grupos de Weinberg, Mariano Barbacid y Michael Wigler. Las dos siguientes décadas fueron testigos de un enorme desarrollo en el estudio de los retrovirus, cuyo mecanismo de inserción en el genoma ha sido caracterizado como análogo al de los transposones y, por lo tanto, como un posible mecanismo de evolución. Es preciso hacer notar que los importantes descubrimientos que tuvieron lugar en aquella época estuvieron acompañados de una gran concienciación social acerca del impacto que el cáncer comenzaba a producir en las sociedades avanzadas, que habían eliminado de su cuerpo social ciertas enfermedades de naturaleza infecciosa para encontrarse con otras asociadas a las nuevas formas de vida. En 1971 el presidente americano Richard Nixon declaró oficialmente la “guerra al cáncer” y comparó la importancia que para la sociedad tenía esa nueva cruzada al proyecto Manhattan de la II Guerra Mundial o al proyecto Apolo, entonces en pleno apogeo y escaparate de la superpotencia en la lucha soterrada con su enemigo soviético. Los siguientes cinco años vieron triplicar el presupuesto que los Estados Unidos dedicaban al estudio del cáncer, con los consiguientes beneficios no sólo para la lucha contra esta enfermedad sino para el desarrollo de la propia Biología Molecular

El VIH El comienzo de los años ochenta fue testigo de un impulso al estudio de los retrovirus, debido a un suceso que sobrepasó los medios científicos para convertirse en un fenómeno médico, social y mediático. En 1981 y en Los Ángeles se describió un tipo de cáncer desconocido hasta entonces 232

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y que, al cabo del tiempo, producía un cuadro de enfermedades característico causado por la pérdida de las defensas inmunitarias. La enfermedad vino a llamarse Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y, si bien al comienzo, aquélla se concentró entre jóvenes homosexuales en América y Europa, en la actualidad se ha convertido en una pandemia que está literalmente destrozando las sociedades de varios países africanos. Pasaron dos años antes de que el grupo de Luc Montagnier en el Instituto Pasteur pudiese aislar un retrovirus en enfermos que luego desarrollaban el SIDA, y al que se denominó Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). En 1984, el científico americano Robert Gallo en los NIH fue capaz de relacionar el virus VIH con el SIDA, a la vez que se iniciaba una controversia entre él y Luc Montagnier sobre la prioridad en el descubrimiento del virus, hoy claramente resuelta en beneficio del segundo. El virus VIH resultó ser un retrovirus mucho más complejo que los conocidos hasta entonces, debido a dos cualidades (si pudieran llamarse así) que le hacen más temible que otros virus. Una de ellas es que ataca a las células del sistema inmunitario, las mismas que están especializadas en la defensa de nuestro organismo. La otra es que su transcriptasa inversa produce muchos errores y, por lo tanto, mutaciones, lo que le permite buscar nuevas vías para evadir el sistema inmunitario. Desde el punto de vista científico, los más de veinte años en que la comunidad científica ha estudiado el VIH han dado lugar a un conocimiento muy profundo del virus, lo que ha sido muy beneficioso para el desarrollo de varios aspectos de la Biología Molecular. Desde el punto de vista médico, las investigaciones han dado lugar a una serie de medicamentos que, si bien no acaban con el virus, mantienen a éste en una situación tal que los enfermos pueden llevar una vida prácticamente normal. Estos medicamentos son, sin embargo, caros y sólo accesibles a los ciudadanos de las sociedades occidentales, para vergüenza de todas ellas. La vacuna contra el VIH está lejos de ser una realidad.

El plegamiento de las proteínas Uno de los problemas más interesantes de la Biología Molecular es el del plegamiento de las proteínas, cuyo estudio se puede rastrear hasta los años veinte en los que Anson y Mirsky, trabajando en Cambridge con distintas proteínas, mostraron que se podía desnaturalizarlas y renaturalizarlas reversiblemente. Como ya hemos comentado anteriormente, estos estudios interesaron a científicos como Pauling, y sirvieron para desarrollar en su caso todo el armazón conceptual de los enlaces fuertes y débiles que hoy conocemos y en los que se basa la estructura de las moléculas biológicas. El estudio del plegamiento de proteínas sufrió un fuerte empujón desde el momento en que se tuvo plena consciencia de que cada proteína posee una secuencia única, es decir, que la función de una proteína determinada viene dada por la secuencia de sus aminoácidos. Las primeras ideas de cómo se produce el plegamiento de proteínas sugerían la acción 233

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de moldes (otras proteínas) que inducían el correcto plegamiento de otras. Sin embargo, pronto se impuso la más simple de las hipótesis, aquella que apuntaba que la estructura final de las proteínas viene dada por la secuencia de los aminoácidos, que adquieren esa conformación espacial por ser la más estable desde el punto de vista termodinámico. Crick era de esa misma opinión, y en su famoso artículo en el que exponía el llamado Dogma Central, sugirió que “el plegamiento es, simplemente, función del orden de los aminoácidos”. A esta conclusión también llegó, entre otros, Perutz, quien analizando las estructuras de las distintas secuencias de mioglobina y hemoglobina determinadas durante los años sesenta, no pudo evitar preguntarse: “¿Cómo se produce este plegamiento?, es difícilmente concebible que un molde fuerce a la cadena a adquirir su forma. Es más razonable pensar que la cadena, una vez sintetizada y provista de su grupo hemo alrededor del cual pueda plegarse, adquiera su configuración espontáneamente, como la única que satisfaga los requerimientos estereoquímicos de la secuencia aminoacídica”.

Christian Boehmer ANFINSEN (1916-1995) en 1969 (Cortesía de los National Institutes of Health. National Library of Medicine).

Aunque esta hipótesis estaba en la mente de la mayor parte de la comunidad científica, había que demostrar que realmente era así, y de ello se encargó Christian Anfinsen, un científico americano que trabajaba en los NIH en el estudio de la relación entre la estructura y la función de las proteínas. Anfinsen se propuso determinar cuál era la hipótesis correcta y para ello tuvo dos ideas fundamentales. La primera fue buscar una proteína sencilla y cuya actividad fuera fácilmente medible, y para ello escogió un enzima, la ribonucleasa. La segunda tuvo que ver con la forma en que midió el plegamiento de la proteína, ya que, en vez de intentar estudiar la síntesis de novo, lo que hizo fue desnaturalizar el enzima y luego ensayar su replegamiento. La ribonucleasa posee cuatro puentes disulfuro y para romperlos utilizó un agente reductor como el β‑mercaptoetanol. A lo largo de los años cincuenta y sesenta, y en una serie de experimentos ahora clásicos y por los que obtuvo el Premio Nobel de Química en 1972, el grupo de Anfinsen desnaturalizó el enzima mediante urea, rompió los puentes disulfuro con β‑mercaptoetanol y luego procedió a eliminar los dos agentes de manera secuencial y gradual. Hay 105 posibilidades de formación de los cuatro puentes disulfuro con los ocho residuos de cisteína, y si la estructura final viniera dada por información externa, la eliminación de urea y β‑mercaptoetanol generaría un porcentaje alto de proteína no activa (104 / 105 posibilidades). Sin embargo, los experimentos demostraron que, si las condiciones eran las adecuadas, la pro­ teína recuperaba su forma nativa, lo que indicaba claramente que en la secuencia de la proteína se encuentra la información para que ésta adquiera su conformación nativa, que es la más estable desde el punto de vista termodinámico (Figura 63). Según la hipótesis termodinámica existen dos estados: el desnaturalizado, que es análogo a la proteína recién sintetizada y que, en condiciones in vitro, se consigue mediante la desnaturalización con agentes cao-

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Figura 63. Experimento clásico de Anfinsen.

trópicos que rompen los enlaces débiles pero no los covalentes; y el nativo, que la proteína alcanza por ser el más estable termodinámicamente. En 1968, esta hipótesis fue refutada por Cyrus Levinthal, de la Universidad de Columbia, uno de los pioneros en el uso de los ordenadores como instrumento de apoyo para la Biología Molecular y el creador de los primeros programas para la representación tridimensional de las estructuras biológicas. Levinthal sugirió que si una proteína se pliega mediante reacción de dos estados (es decir, con un solo camino para conseguirlo), y dado el enorme número de posibles conformaciones a rastrear para conseguir la conformación nativa, la única posibilidad para que una proteína se pliegue en un periodo razonable de tiempo (y esto ocurre normalmente en el rango de milisegundos a segundos), es que haya intermediarios de plegamiento y distintos caminos para cada uno de ellos, es decir, que haya también un control cinético sobre el plegamiento. Hoy se 235

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considera que el control sobre el plegamiento de proteínas es fundamentalmente termodinámico, pero existe también un componente cinético.

Las proteínas de choque térmico y las chaperonas moleculares

Reconstrucción tridimensional, obtenida mediante microscopía electrónica y técnicas de procesamiento de imagen, del complejo formado por dos chaperonas moleculares, las denominadas CCT (la estructura grande de la izquierda, en forma de barril) y Hsc70 (la región transparente situada arriba a la derecha). Dentro del volumen de esta segunda chaperona se ha introducido su estructura atómica, obtenida por técnicas de difracción de rayos X. La combinación de estas dos técnicas estructurales, microscopía electrónica y difracción de rayos X, es un novedoso enfoque que permite una mejor caracterización estructural de grandes complejos macromoleculares. Cortesía de los Drs. Jorge Cuéllar y Jaime MartínBenito. Centro Nacional de Biotecnología, Madrid.

Después de los trabajos de Anfinsen nadie dudaba de que las proteínas adquiriesen por sí solas su conformación nativa. Sin embargo, a principios de la década de los sesenta, una serie de descubrimientos vinieron a poner en duda que el proceso de plegamiento fuera tan simple. Fue primero el biólogo italiano Ferruccio Ritossa quien observó los cambios que se producían en las células de Drosophila cuando se las trataba con calor o ciertos compuestos químicos. Diez años después, Alfred Tissières, de la Universidad de Ginebra ‑pero entonces de periodo sabático en C ­ altech‑, y Hershell Mitchell descubrieron que cuando las mismas células de Drosophila eran sometidas a un choque térmico, la mayor parte de las proteínas se expresaban en menor cantidad, excepto un número reducido de éstas, que veían aumentada su expresión en una gran proporción. Experimentos posteriores de Tissières y de otros científicos mostraron que este tipo de proteínas se encontraban en todos los organismos estudiados. La función específica de estas proteínas vino del trabajo del científico griego Costa Georgopoulos, de la Universidad de Ginebra, quien en 1978 observó que ciertas mutaciones de E. coli impedían el crecimiento del fago λ. Georgopoulos demostró que los productos de una serie de genes (GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE, etc.), que se sobreexpresaban en condiciones de choque térmico, eran los responsables del crecimiento del fago. Durante los siguientes años se encontraron otras moléculas que se mostraron también necesarias para el plegamiento de muchas proteínas, pero es en el mismo 1978 cuando el científico británico Ronald Laskey, trabajando entonces en el LMB, definió a este tipo de proteínas como chaperonas, lo que en castellano denominaríamos acompañantes o “carabinas”. La función de las chaperonas fue sistematizada a mediados de los años ochenta por otro científico británico, John Ellis, quien sugirió que estas proteínas “carabina” actúan de manera general asistiendo a las proteínas en su plegamiento. Esta propuesta pareció inicialmente un atentado contra los postulados generales del Dogma y una vuelta a las primeras teorías que sugerían la necesidad de proteínas específicas para el plegamiento de proteínas. La realidad es que todos tenían, en principio, razón, pues la mayor parte de las proteínas pueden autoplegarse utilizando la información codificada en su propia secuencia aminoacídica; pero en la práctica les resulta difícil hacerlo en el adverso entorno celular, y requieren la ayuda de las chaperonas.

Los priones La existencia de las chaperonas no es, pues, un atentado contra el Dogma Central de la Biología, pero sí lo fue la existencia de los llamados 236

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priones, o proteínas infectivas. El Dogma postula que la información sólo se transfiere a través de los ácidos nucleicos, bien sea DNA o RNA, y llega hasta la proteína, que ejecuta la acción que le viene dada en su estructura y, por lo tanto, en su secuencia. El descubrimiento de que las proteínas pueden, en ciertos casos, transmitir información sobre la conformación que deben adoptar se debe a Stanley Prusiner, un neurobiólogo de la Universidad de San Francisco. Prusiner había estado varios años trabajando en la caracterización de ciertas enfermedades neurodegenerativas como son, entre otras, la enfermedad de Alzheimer, de Creutzfeldt-Jacob o el Kuru de Nueva Guinea. Estas enfermedades, que comenzaron a ser descritas a principios del siglo XX, se caracterizan por una pérdida lenta pero irreversible de las capacidades mentales y físicas del individuo, hombre o animal, que las sufre. Hasta entonces se pensaba que este tipo de enfermedades estaba causada por algún tipo de virus, que por la lentitud del proceso de la enfermedad, pasó a ser llamado lento. Prusiner y su grupo se dedicaron durante varios años a la búsqueda y aislamiento del virus, que no encontraron por ninguna parte. Sí que pudieron aislar una proteína, que Prusiner apuntó en 1982 como causante de la enfermedad neurodegenerativa. A la proteína la llamó prión (una mezcla de las palabras proteinaceous ­infectious particle y el sufijo de partícula on), y la publicación de su hipótesis en 1982 causó una gran sensación y polémica, pues apuntaba a una proteína como agente transportador de información. Prusiner sufrió ataques de una gran parte de la comunidad científica, pero distintos resultados fueron lentamente confirmando lo que en principio parecía una “herejía”. Las siguientes dos décadas fueron testigos de una gran cantidad de hallazgos sobre el prión, una gran parte de ellos por parte del grupo de Prusiner, quien acabó por ser galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1997. Ahora se sabe que el prión posee dos conformaciones, una no infectiva, de la que se desconoce su función real en la célula, y otra infectiva que resulta de un cambio conformacional (Figura 64) y que es capaz de transmitir información sobre esa nueva conformación a otras moléculas del prión para generar estructuras fibrilares, que son las realmente nocivas para la célula. También se han acumu-

                                PrPc

 

                                                    PrPSc

Figura 64. Estructura tridimensional del dominio globular de la proteína del prion en su conformación PrPc y en la conformación PrPSc, determinados mediante resonancia magnética nuclear. Figura adaptada de la web: Cohen, F. E. (2008). Actualizada al 19 de febrero de 2004. Universidad de California. The Cohen Group. Disponible desde Internet en http: /  / www.cmpharm. ucsf.edu / cohen [con acceso el 23 de abril de 2008].

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lado un gran número de evidencias sobre la posibilidad de atravesar barreras inter-especie para transmitir sus propiedades a la proteína homóloga de esa nueva especie. Parece, por lo tanto, claro que en ciertas ocasiones, las proteínas pueden guardar información que puede ser transmitida a otras proteínas.

La consolidación de la Biología Molecular Como hemos comentado anteriormente, a partir de los años setenta la Biología Molecular entró en una fase que algunos como el historiador de la Ciencia y biólogo molecular Gunther Stent, han denominado “académica”. Durante esta fase, los descubrimientos sobre los mecanismos moleculares que guían la replicación, transcripción y traducción se produjeron cada día, pero todos ellos, salvo algunos de los citados en el capítulo anterior, se han enmarcado bajo el paraguas del Dogma Central. La Biología Molecular, sin embargo, pareció impregnar a toda la Biología y fue robando protagonismo y recursos a otras disciplinas afines, siguiendo la estela de la Física, la otra disciplina que junto con la Biología Molecular se ha convertido, por mor de la potencialidad de algunos de sus descubrimientos y aplicaciones, en las niñas mimadas de los políticos que de vez en cuando fijan sus ojos en la Ciencia.

El nacimiento de la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO) Cualquier lector atento ha podido darse cuenta, tras la lectura de estas páginas, del lento declinar de la ciencia europea. Habrá podido también percibir que la preponderancia que mantuvo en el concierto mundial hasta bien entrados los años treinta se transformó en un papel secundario a partir de la II Guerra Mundial, con las notables excepciones del LMB en Cambridge y del Instituto Pasteur en París. Las consecuencias de la guerra, junto con un sistema científico muy atrasado en comparación con el americano, hicieron que la emigración de científicos europeos hacia los Estados Unidos, que se produjo antes de la guerra principalmente por motivos políticos, fuera después de ella por razones científicas y económicas. Para intentar parar esa sangría y empujar el desarrollo de la Biología Molecular europea, una serie de científicos se reunieron en Ravello (Italia) en 1963. Entre estos estaban, como ya describimos en páginas anteriores, John Kendrew ‑entonces recientemente alejado de la ciencia activa‑, y Leo Szilard, un emigrado europeo que había realizado su última huida, esta vez de vuelta a Europa a consecuencia de los fragores de la guerra fría. Como otros físicos anteriormente, Szilard se había introducido en la Biología Molecular en búsqueda de la última frontera y en el camino había realizado importantes aportaciones teóricas al esquema general del control genético. De vuelta en Europa, se le ocurrió que el 238

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esquema de organización paneuropea para la física nuclear como era el CERN podía ser exportado a la Biología Molecular. La idea era implicar a los gobiernos europeos democráticos en la creación de una red paraestatal de ayudas a jóvenes investigadores, y en la creación de centros de investigación que diesen un empujón a la pujante Biología Molecular. La Organización Europea de Biología Molecular (European Molecular ­Biology Organization, EMBO) se fundó en 1963 con John Kendrew, que acababa de ser galardonado con el Premio Nobel de Química, como eminente figura a la cabeza de la organización. Los primeros años fueron difíciles, pues la EMBO no tuvo un apoyo inmediato por parte de los gobiernos de la Euro­pea occidental, y sobrevivió de la mano de la Fundación ­Volkswagen, deseosa de apoyar a la Biología Molecular y a los físicos y químicos que querían introducirse en ella. Sólo después de cinco años de travesía del desierto se produjo un apoyo por parte de los gobiernos euro­peos, que permitió no sólo una exitosa política de becas para que jóvenes europeos visitasen otros laboratorios de Europa y América, sino que una vez resueltas ciertas discrepancias entre algunos países, se pudo establecer en 1975 el primer laboratorio europeo de Biología Molecular, el European ­Molecular Biology Laboratory (EMBL), en Heidelberg (Alemania). Después de este centro de investigación se crearon tres más, dos de ellos curiosamente al abrigo de instalaciones europeas de Física de altas energías como son los sincrotones, de los que hablaremos posteriormente, y que entre otras actuaciones han permitido que la biología estructural europea se mantenga al mismo o mejor nivel que la americana. A partir de los años ochenta, la EMBO inició una exitosa política editorial con la creación de varias revistas científicas, entre otras EMBO Journal y EMBO ­Reports, que se encuentran entre las revistas más importantes en el campo de la Biología Molecular.

El desarrollo de la Biología Estructural Los años setenta fueron testigos, en todo el mundo pero especialmente en Europa, de un periodo de madurez de lo que hoy se ha denominado Biología Estructural. El primer empuje vino dado por la cristalografía de rayos X, que como describimos en páginas anteriores, había permitido la primera determinación estructural de una proteína a resolución atómica, la mioglobina. El desarrollo de esta técnica había venido de la mano paciente de Max Perutz, quien a mediados de los años ochenta vio recompensado su sueño iniciado casi cincuenta años antes con la determinación a resolución atómica de la estructura de la hemoglobina. Para entonces, el liderazgo de la difracción de rayos X en el LMB había pasado a manos de otro científico genial, Aaron Klug, quien tras su colaboración con el grupo de Rosalind Franklin en el Birbeck College de Londres, se mudó a Cambridge para revolucionar el campo de la Biología Estructural, gracias a varios logros muy importantes, alguno de los cuales le proporcionaron el Premio Nobel de Química en 1982. El primero de ellos, ya 239

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comentado, fue el de la primera determinación en 1974 de la estructura atómica de un tRNA. El segundo se produjo cuatro años después, y fue la determinación estructural del virus TMV, un hito en la Biología Estructural si se tiene en cuenta el enorme tamaño del virus en comparación con el resto de las proteínas resueltas hasta entonces. Además, el grupo de Klug caracterizó en profundidad la formación del virus maduro a partir del RNA y de las proteínas que forman la estructura viral. Nada hacía, sin embargo, presagiar el desarrollo que tuvo la cristalografía de rayos X en los siguientes años. A ello contribuyó no sólo el lógico desarrollo de cualquier técnica sino que vino complementado con la mejora de las técnicas de expresión recombinante y de purificación de proteínas. Además, se desarrollaron nuevas fuentes de radiación de rayos X, varios órdenes de magnitud más poderosas que las que poseían los generadores construidos hasta ese momento para los laboratorios. Estas nuevas fuentes eran los llamados sincrotrones, que comenzaron a construirse en Estados Unidos, Japón y Europa después de la II Guerra Mundial. El sincrotrón es una gran instalación, un acelerador de electrones derivado de las grandes instalaciones que se crearon fundamentalmente para el estudio de altas energías. Su diseño y desarrollo es muy complejo, y en Europa había dado lugar a la creación de organismos paneuropeos como el ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), que han tenido una gran importancia para la ciencia del continente. La idea de la utilización de radiación sincrotrón en Biología provino de dos científicos británicos que pensaron que podía usarse para obtener información estructural de alta resolución para el estudio de los mecanismos de funcionamiento del músculo. El primero de ellos fue Hugh Huxley, quien ya había hecho importantes contribuciones a la caracterización de los mecanismos moleculares del movimiento muscular. El otro fue Kenneth Holmes, estudiante predoctoral de Rosalind Franklin y colaborador durante varios años de Aaron Klug, quien realizó con ambos importantes contribuciones para determinar la estructura del TMV y de ciertas ribonucleoproteínas. A finales de los años sesenta, los difractómetros de laboratorio habían alcanzado un gran poder pero mostraban ciertas limitaciones para obtener difractogramas de muestras biológicas cada vez más complejas. En el caso del músculo, los experimentos de difracción pretendían caracterizar los cambios que durante el ciclo de contracción y relajación del músculo se producen en las interacciones regulares de los filamentos de actina y miosina. Los experimentos se realizaban con músculos de rana que eran susceptibles a estímulos por nucleótidos durante un cierto tiempo después de su extracción, y como la señal que se obtenía con los difractómetros era muy débil y los músculos necesitaban irradiarse durante mucho tiempo, los experimentos no podían realizarse adecuadamente. La solución, pensaron Huxley y Holmes, era utilizar una radiación más poderosa que podía extraerse de las fuentes sincrotrón. Aunque los estudios teóricos eran pesimistas acerca de las ventajas de la utilización de radiación sincrotrón, pronto los hechos mostraron potencialidad de esta fuente de energía y los desarrollos científicos realizados 240

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desde finales de los años sesenta, fundamentalmente en el sincrotrón DESY de Hamburgo (Alemania, Deutsches Elektronen SYnchrotron), permitieron numerosas aplicaciones en el campo biológico. A instancias de Kendrew y auspiciada por la EMBO se creó en 1975 en el sincrotrón de Hamburgo una sucursal del EMBL, y se hizo lo propio al cabo del tiempo en el sincrotrón del ESRF en Grenoble (Francia). El uso de la radiación sincrotrón ha sido fundamental para la resolución de estructuras más complejas, como es el caso de la determinación estructural de la primera proteína de membrana, el centro de reacción fotosintética (photosynthetic reaction center), llevada a cabo en 1984 por tres científicos alemanes, Johann Deisenhofer, Robert Huber y Hartmut Michel, quienes compartieron el Premio Nobel de Química en 1988. Las proteínas de membrana habían sido terra incognita para la cristalografía debido a su naturaleza anfipática, y es que para su cristalización se requiere que la proteína mantenga las condiciones adecuadas tanto en su región hidrófila como en la hidrófoba, para lo que es necesario el uso de detergentes adecuados. Su desarrollo fue la labor de Hartmut Michel, quien consiguió cristalizar el centro de reacción fotosintética gracias al uso de un detergente sintetizado muy poco tiempo antes, el octil glucósido. Existen, sin embargo, otras dos técnicas estructurales que se fueron desarrollando a pasos agigantados, fundamentalmente en Europa, y que pueden complementar y en algunos caso superar a la difracción de rayos X. La más desarrollada de las dos es la llamada Resonancia Magnética Nuclear (RMN, o NMR en inglés). La RMN se basa en la propiedad que tienen los núcleos de ciertos elementos de poseer un espín (movimiento rotatorio) que se desdobla en distintos niveles de energía en presencia de un cierto campo magnético. Si en ese momento se les aplica una cierta cantidad de energía electromagnética, todos los núcleos saltan al nivel de más energía. La diferencia entre los dos niveles es propia de cada elemento pero está influida por los elementos cercanos, por lo que se puede obtener información de distancias interatómicas. El desarrollo de la RMN y la caracterización de los principios físicos que la guían fue uno de los campos más fructíferos de la Física en el periodo anterior y posterior de la II Guerra Mundial, y dio como fruto la consecución de tres premios Nobel en Física, los de Isaac Rabi (Premio Nobel de Física en 1944), Felix Bloch y Edward Purcell (ambos Premios Nobel de Física en 1952). Pronto se vio el potencial de la RMN para el estudio de moléculas biológicas, y ya en 1957 se publicó el primer espectro de una proteína, la ribonucleasa, así como las primeras asignaciones de sus picos de resonancia, aunque fueran a un nivel muy grosero. Se requirió un gran desarrollo teórico e instrumental para que en 1982 el grupo del científico suizo Kurt Wüthrich en Zurich pudiera resolver por primera vez la estructura atómica de una proteína, el inhibidor de la proteasa de semen de toro (BUSI, BUll Seminal Inhibitor) lo que le valió el premio Nobel de Química en 2002. Los primeros resultados fueron acogidos con escepticismo por parte de la comunidad científica, así que el cristalógrafo Robert Huber sugirió que se determinase de manera independiente, tanto por cristalografía

Arriba, sincrotrón DESY de Hamburgo (Alemania), en funcionamiento desde los años sesenta; y abajo, sincrotrón ESRF en Grenoble (Francia), construido en 1988 por la unión de 12 países europeos.

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Microscopio electrónico en el CDC /  Carter Center. El ex presidente Jimmy Carter en 1985.

Fotografía de una científica trabajando en un microscopio electrónico, en los CDC. Fuente: James Gathany / CDC.

de rayos X en su propio laboratorio como por RMN en el de Wüthrich, la estructura atómica de una pequeña proteína, el tendamistat. Los resultados obtenidos por las dos técnicas, publicados a principios de 1986, fueron virtualmente idénticos, lo que acabó con todas las dudas hacia la RMN, que desde entonces se ha desarrollado enormemente y ha permitido el ataque con éxito de proteínas con tamaños superiores a los 20 kilodalton. La tercera de las técnicas estructurales, la Microscopía Electrónica (ME), es una vieja conocida de la Biología Molecular, aunque utilizada hasta los años setenta únicamente como instrumento de análisis cualitativo. La microscopía electrónica había tenido hasta entonces un desarrollo importante gracias a la invención por parte de científicos del LMB (Huxley y Brenner, entre otros) de técnicas de contraste artificial. La utilización de metales pesados para contrastar artificialmente las muestras biológicas permitió su fácil observación y hacer que la ME fuera accesible a un mayor número de laboratorios. Sin embargo, las observaciones eran de carácter cualitativo y no estaban exentas de artefactos. El desarrollo de la microscopía electrónica como herramienta de análisis estructural se produjo en una primera instancia a través del estudio de los virus esféricos, realizado en Inglaterra por Aaron Klug, Donald Caspar y John Finch, a partir de los años setenta. Este tipo de virus ya había sido estudiado por Bernal antes de la II Guerra Mundial, y Watson y Crick habían predicho anteriormente que debían poseer algún tipo de simetría cúbica, pero fueron Klug y Finch quienes determinaron mediante estudios de rayos X y ME que la simetría de estos virus era icosaédrica, con un número mínimo de 60 subunidades. Los estudios de los citados científicos mostraban que los virus debían poseer una proteína que se autoensamblaba en distintos número de subunidades, dependiendo del tipo de virus, pero siguiendo unos principios básicos generales. Para hacerlo y conseguir una estructura simétrica, debían interaccionar de una manera idéntica... o casi. Inspirados por los trabajos del arquitecto americano Buckminster Fuller, Caspar y Klug desarrollaron la teoría de la cuasiequivalencia para los virus icosaédricos que se ha demostrado correcta para los virus caracterizados hasta la fecha, y según la cual las proteínas del virus se autoensamblan de manera espontánea para buscar las condiciones de mínima energía, utilizando para ello interacciones cuasiequivalentes. Los estudios realizados mediante ME con virus icosaédricos y helicoidales sirvieron a Klug y a varios de sus colaboradores en el LMB para desarrollar la teoría de la formación de la imagen, que utilizaron para comprender qué es lo que realmente se observa en un microscopio electrónico, y para posteriormente desarrollar procedimientos, muchos de ellos basados en las herramientas de difracción de rayos X, de reconstrucción tridimensional de grandes complejos macromoleculares. Los trabajos de Klug mostraron la potencialidad de la ME para determinar estructuras teóricamente a cualquier resolución, aunque en la práctica el nivel de resolución estuviera limitado por la preparación de la muestra. El desarrollo de mejores técnicas de preservación de las muestras que se

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produjo a lo largo de los años setenta y principios de los ochenta, fundamentalmente en laboratorios europeos, y el uso de especímenes ordenados en forma de cristales bidimensionales sirvieron a los científicos del LMB Richard Henderson y Nigel Unwin para mostrar en 1975 por primera vez que la ME era capaz de proporcionar información estructural de proteínas a alta resolución (7 Å), pues pudieron determinar la existencia de varias hélices α en la proteína de membrana bacteriorrodopsina. Para obtener este tipo de resolución era necesario en principio disponer de cristales bidimensionales, pero a partir de los años ochenta varios grupos, entre ellos los de Joachim Frank y Marin van Heel, iniciaron el desarrollo de procedimientos para la reconstrucción tridimensional de muestras no ordenadas, que veinte años después han mostrado su enorme potencial para la determinación, incluso a nivel atómico, de proteínas y grandes complejos macromoleculares.

A la izquierda, Richard HENDERSON (1945‑) mostrando la estructura de la proteína bacteriorrodopsina. © MCR Laboratory of Molecular Biology.

La Bioinformática Finalmente, es importante describir aunque sea a muy grandes rasgos, los desarrollos que tuvieron lugar alrededor de una máquina que se ha mostrado imprescindible para la existencia de la Biología Molecular: el ordenador. Queda claro para el lector avezado que ninguna de las tres técnicas que se acaban de comentar habría podido ser desarrollada y utilizada de la manera más eficiente sin el apoyo de las distintas técnicas computacionales que se fueron desarrollando en paralelo a las citadas técnicas estructurales. Otra de las disciplinas que comenzaron a recibir un fuerte impulso a partir de la década de los sesenta es la que, de manera general, ha venido a denominarse Bioinformática, y que tiene que ver con el estudio mediante técnicas computacionales de las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas y de la estructura en general de las moléculas biológicas. En varios aspectos, su desarrollo real tuvo que esperar hasta finales de los años setenta y principios de los ochenta, cuando las técnicas de secuenciación de proteínas y, sobre todo, de ácidos nucleicos permitieron la determinación de un razonable número de secuencias con las que poder realizar estudios de comparación y evolución. Aproximadamente a esa época pertenecen los primeros algoritmos de predicción del plegamiento de proteínas, que son los primeros intentos en un campo que se ha mostrado enormemente difícil hasta la fecha. Desde un punto de vista menos ambicioso, pero más efectivo, cabe señalar los primeros algoritmos de predicción de la estructura secundaria o los primeros estudios de evolución molecular utilizando para ello las secuencias de aquellas proteínas de las que se conocía un cierto número de secuencias de diferentes especies, como es el caso de la hemoglobina y el citocromo c. También en esa época aparecieron las primeras bases de datos de nucleotidos y proteínas tales como GenBank, EMBL (ésta producto de la decisión política de EMBO de hacer una base de datos europea) y SWISSPROT, y con ellos aumentó la necesidad de crear programas de todo tipo (compa-

Modelo de una de las primeras computadoras portátiles en el inicio de los años 80 (Global Health Odyssey’s Historical Object of the Month for August, 2004) utilizado en los CDC. Fuente: James Gathany/CDC (2004).

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III. La consolidación de la Biología Molecular

ración, alineamiento, predicción de estructura, evolución, etc.) para tratar el continuo aumento de la información almacenada en las bases de datos. Esta información se hizo más accesible con la aparición de las redes de ordenadores como EMBNET y BIONET, y finalmente con la explosión de INTERNET, que ha permitido una rápida comunicación entre la comunidad científica. La bioinformática ha nacido para permanecer entre nosotros, más si cabe con la creciente disponibilidad de ordenadores personales cada vez más poderosos, pequeños y baratos.

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Epílogo Los últimos veinte años que han pasado desde el punto en que esta historia finaliza han dado lugar a muchos interesantes descubrimientos; entre otros, el del RNA de interferencia o el de la degradación controlada de las proteínas, pero todos ellos pertenecen a una historia que será contada en otro momento. Mientras tanto, la Biología Molecular se ha consolidado como una de las disciplinas científicas de más proyección y que más recursos y jóvenes investigadores atrae. Los departamentos universitarios de Biología Molecular y los institutos científicos dedicados exclusivamente a esta disciplina han crecido enormemente, y generan resultados en cantidades tan grandes que han hecho prácticamente imposible seguir el conjunto de ellos. Así, la Biología Molecular se ha ido dividiendo en varias ramas y, al amparo de éstas han ido creándose numerosas publicaciones donde registrar los resultados producidos. Esta disciplina, como la Química muchos años antes, se ha convertido no sólo en generadora de conocimiento sino en motor de una actividad industrial que crece vertiginosamente. La Biología Molecular ha aumentado su escala y ha adoptado estructuras tan solo conocidas antes en el mundo de la Física. Así se han creado grandes consorcios internacionales para la secuenciación de los genomas de distintas especies, entre ellas la humana, cuya publicación parcial en el año 2000 mereció la aparición conjunta y por videoconferencia entre los dos lados del Atlántico de los presidentes de los dos países que más han contribuido al desarrollo de la Biología Molecular: los Estados Unidos y la Gran Bretaña. Estos proyectos gigantes han dado lugar a la aparición de nuevas ramas bautizadas con el poco imaginativo nombre de “ómicas” (genómica, proteómica, metabolómica, transcriptómica...) que están proporcionando una enorme cantidad de datos, pero por el momento menos información de la esperada (Sydney Brenner, muy contrario a este tipo de enfoque y una lengua muy afilada, ha definido esta forma de hacer ciencia como “low input, high throughput, no output”). Apenas han pasado cincuenta años desde que Crick anunciara a los sorprendidos clientes del pub “The Eagle” el descubrimiento del secreto 245

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Epíloto

de la Vida. Estos años han sido testigos no sólo del desentrañamiento de los mecanismos generales por los que aquélla se mantiene y se transmite, sino del desarrollo de herramientas que nos ha permitido modificarla a voluntad, jugando, como alguien ha dicho, a “ser Dios”. Ninguna disciplina científica se ha desarrollado a tal velocidad como la Biología Molecular, ninguna otra ha suscitado con igual magnitud la curiosidad y la esperanza de la gente. La posibilidad de erradicar de nuestra sociedad un gran número de enfermedades de carácter hereditario, de producir nuevos y más efectivos medicamentos, de mejorar en definitiva el bienestar general del hombre está ahí, a la vuelta de la esquina, cada vez más cerca. Sin embargo, el motor que mueve a muchos científicos dentro de este campo sigue siendo el afán por desentrañar con mayor profundidad los numerosos y complejos mecanismos que controlan los procesos biológicos. Como quizás pudiera haber dicho Francis Crick, no hay nuevas leyes por descubrir pero queda mucha diversión por delante.

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Bibliografía Angier, Natalie. Natural obsessions. Virago Book (2000). Asimov, Isaac. Introducción a la Ciencia. Plaza & Janés (1985). Bishop, Michael. How to win the Nobel Prize. Harvard University Press (2003). Brenner, Sydney. My life in Science. BMC Books (2001). Cairns, J., Stent, G. y Watson, J. (Eds.). Phage and the origins of molecular ­biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992). Crick, Francis. What mad pursuit. Weidenfeld and Nicholson (1988). Dickerson, Richard E. Present at the flood. How structural molecular biology came about. Sinauer Associates, Inc. (2005). Echols, Harrison. Operators and promoters. The story of molecular biology and its creators. University of California Press (2001). Finch, John. A Nobel fellow on every floor. Medical Research Council. Laboratory of Molecular Biology (2008). García Barreno, Pedro (Ed.). 50 años de ADN. La doble hélice. Espasa (2003). Gratzer, Walter. Eurekas y euforias. Editorial Crítica (2002). Gribbin, John. In search of the double helix. Corgi Books (1985). Gribbin, John. Science. A history. Penguin books Ltd. (2002). Hausmann, Rudolf. To grasp the essence of life. Kluwer Academic Publishers (2002). Jacob, François. The statue within. An autobiography. Cold Spring Harbor ­Laboratory Press (1995). Judson, Horace F. The eighth day of creation. Simon & Schuster (1979). Kay, Lily E. The molecular vision of life. Oxford University Press (1993). Kornberg, Arthur. For the love of enzymes. Harvard University Press (1989). Lagerkvist, Ulf. DNA pioneers and their legacy. Yale University Press (1998). Maddox, Brenda. Rosalind Franklin. The dark lady of DNA. Haper Collins ­Publishers (2002). McElheny, Victor K. Watson & DNA. Making a scientific revolution. Basic Books (2004). Morange, Michel. A history of Molecular Biology. Harvard University Press (2000). Ochoa, Severo. Escritos. C.S.I.C. (1999). Olby, Robert. The path to the double helix. Dover publications (1994). Perutz, Max. Is science necessary? Barrie & Jenkins (1989). Perutz, Max. Ojalá te hubiese hecho enojar antes. Ediciones Granica (2002). 247

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Bibliografía

Portugal, Franklin H. y Cohen, Jack. A century of DNA. The Massachusetts ­Institute of Technology Press (1977). Sánchez Ron, José Manuel. El siglo de la ciencia. Taurus (2000). Schrödinger, Erwin. ¿Qué es la vida? Tusquets Editores (1984). Silvers, Robert B. (Ed.). Hidden histories of Science. Granta Books (1995). Stent, Gunther S. The coming of the golden age: a view of the end of progress. Natural History Press (1969). Tanford, Charles y Reynolds, Jacqueline. Nature’s robots. A history of proteins. Oxford University Press (2001). Ullmann, Agnes (Ed.). Origins of Molecular Biology. A tribute to Jacques Monod. American Society of Microbiology Press (2003). Watson, James D. DNA. The secret of life. Arrow Books Ltd. (2004). Watson, James D. The double helix. Penguin (1970). Watson, James D. Genes, girls and Gamow. Oxford University Press (2001). Witskowski, Jan (Ed.). The inside history. DNA to RNA to protein. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2005).

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Apéndices CIENTÍFICOS CITADOS EN EL LIBRO, ORDENADOS ALFABÉTICAMENTE POR APELLIDO Nombres de científicos citados en el libro ALTMAN Sidney ALTMANN Richard ANFINSEN Christian Boehmer ANSON Mortimer ARBER Werner ARRHENIUS Svante ASCOLI Alberto ASTBURY William AUERBACH Leopold AVERY Oswald BAEYER Adolf Von BALTIMORE David BATESON William BEADLE George BECCARI Iacopo BECQUEREL Henri BEHRING Emil von BENEDEN Edouard Van BENZER Seymour BERG Paul BERNAL John Desmond BERTHELOT Marcelin BERTHOLLET Claude BERZELIUS Jons Jacob BISHOP Michael BJERRUM Niels BLOCH Felix BOERHAAVE Hermann BORDEAU Teófilo de BORDET Jules BORSOOK Henry BOVERI Theodor BOYER Herbert

Periodo (1939-) (1852-1900) (1916-1995) (1901-1968) (1929-) (1859-1927) (1877-1957) (1898-1961) (1828-1897) (1877-1955) (1835-1917) (1938-) (1861-1926) (1903-1989) (1682-1776) (1852-1908) (1854-1917) (1845-1910) (1921-) (1926-) (1901-1971) (1827-1907) (1748-1822) (1779-1848) (1936-) (1879-1958) (1905-1983) (1668-1738) (1722-1776) (1870-1961) (1897-1984) (1862-1915) (1936-)

Nobel* 1989 1972 1978 1903

1905 1975 1958 1903 1901

1980

1989 1952

1919

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Apéndices Nombres de científicos citados en el libro BRACHET Jean BRAGG Lawrence BRAGG William BREDIG Georg BRENNER Sydney BRIDGES Calvin B. BROGLIE Louis de BROWN Robert BÜCHNER Eduard CAIGNARD-LATOUR Charles CAIRNS John CASPERSSON Ivar Bang Torbjörn CASTLE William CECH Thomas R. CHANGEUX Jean-Pierre CHAPEVILLE François CHARGAFF Erwin CHETVERIKOV Sergei S. CHICK Harriette CLARK Brian CLAUDE Albert COHEN Stanley COMPTON Arthur Holly CORRENS Carl CRICK Francis CURIE Marie CURIE Pierre CUVIER Georges DALTON John DARWIN Charles DARWIN Erasmus DEISENHOFER Johann DELBRÜCK Max DEMEREC Milislav DONAHUE Jerry DULBECCO Renato DUVE Christian de EAST Edward EDMAN Per Victor EHRLICH Paul EINSTEIN Albert FEULGEN Robert FIBIGER Johannes FISCHER Emil FISHER Ronald S. FLEMING Alexander FLEMMING Walther FOL Hermann FOURCROY Antoine François de FOURIER Joseph

Periodo (1909-1998) (1890-1971) (1862-1941) (1868-1924) (1927-) (1889-1938) (1892-1987) (1773-1853) (1860-1917) (1777-1859) (1922-) (1910-1997) (1867-1962) (1947-) (1936-) (1928-) (1905-2002) (1880-1959) (1875-1977) (1945-) (1899-1983) (1922-) (1892-1962) (1864-1933) (1916-2004) (1867-1934) (1859-1906) (1769-1832) (1766-1844) (1809-1882) (1731-1802) (1943-) (1906-1981) (1895-1966) (1920-1985) (1915-) (1917-) (1879-1938) (1916-1977) (1854-1915) (1879-1955) (1884-1955) (1867-1928) (1852-1919) (1890-1962) (1881-1955) (1843-1905) (1845-1892) (1755-1809) (1768-1830)

Nobel* 1914 1914 2002 1929 1907

1989

1974 1986 1927 1962 1903/10 1903

1988 1969

1975 1974

1908 1921 1926 1902 1945

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Apéndices Nombres de científicos citados en el libro FRAENKEL-CONRAT Heinz FURBERG Sven GALLO Robert GAMOW George (Georgiy Antonovich) GARROD Archibald GILBERT Walter GRAHAM Thomas GRUNBERG-MANAGO Marianne GULLAND John Masson HABERMANN Josef HALDANE John B. S. HALLEY Edmund HAMMARSTEN Einar HAMMARSTEN Olof HAYES William HERELLE Félix d’ HERSHEY Alfred HERTWIG Oscar HEVESY George HLASIWETZ Heinrich HOAGLAND Mahlon HODKING Dorothy HOFMEISTER Franz HOLMES Kenneth HOLLEY Robert HOMPTON Arthur Holly HOOKE Robert HOPKINS Frederick Gowland HOPPE-SEYLER Felix HOTCHKISS Rollin HUBER Robert HUTTON James HUXLEY Hugh INGRAM Vernon JACOB François JACOBS Walter JEFFREYS Alec JERNE Niels K. JOHANNSSEN Wilheim KEILIN David KEKULÉ August KENDREW John KHORANA Gobind KIESER Dietrich KITASATO Shibasaburo KLUG Aaron KNOLL Max KÖHLER Georges J. F. KORNBERG Arthur KORNBERG Roger D.

Periodo (1910-1999) (1920-1983) (1937-) (1904-1968) (1857-1936) (1932-) (1805-1869) (1921-) (1898-1947) (1841-1914) (1892-1964) (1656-1742) (1889-1968) (1841-1932) (1918-1994) (1873-1949) (1908-1997) (1849-1922) (1885-1966) (1825-1875) (1921-) (1910-1994) (1850-1922) (1934-) (1922-1993) (1892-1962) (1635-1703) (1871-1947) (1825-1895) (1911-2004) (1937-) (1726-1797) (1924-) (1924-) (1920-) (1883–1967) (1950-) (1911-1994) (1857-1927) (1887-1963) (1829-1896) (1917-1997) (1922-) (1779-1862) (1852-1931) (1926-) (1897-1969) (1946-1995) (1918-2007) (1947-)

Nobel*

1980

1969 1943

1964

1929

1988

1965

1984

1962 1968

1982 1984 1959 2006

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Apéndices Nombres de científicos citados en el libro KOSSEL Albrecht KUHNE Wilhelm KÜTZING Friedrich LAMARCK Jean Baptiste de LANDSTEINER Karl LANGMUIR Irving LAUE Max von LAVOISIER Antoine-Laurent LECLERC Georges Louis LEDERBERG Joshua LEEUWENHOEK Anthony van LEVENE Feodor “Phoebus” LEVINTHAL Cyrus LEWIS Gilbert LIEBIG Justus von LINNEO Carl LIPMANN Fritz LURIA Salvador LWOFF André LWOFF Marguerite (Bourdaleix) LYELL Charles LYSENKO Trofim MALPIGHI Marcello MALTHUS Thomas MARTIN Archer John Porter MATTHAEI Heinrich McCLINTOCK Barbara MEDICUS Ludwig MENDEL Gregor MESELSON Mathew MICHEL Hartmut MIESCHER Friedrich MILSTEIN César MILLIKAN Robert MIRSKY Alfred MONOD Jacques MONTAGNIER Luc MORGAN Thomas MULDER Gerrit MULLER Hermann Joseph MULLIS Kary NATHANS Daniel NEEL James NILSSON-EHLE Herman NIRENBERG Marshall NORTHROP John NOYES Arthur OCHOA Severo OKAZAKI Reiji PALADE George

Periodo (1853-1927) (1837-1900) (1807–1893) (1744-1829) (1868-1943) (1881-1957) (1879-1959) (1743-1794) (1707-1788) (1925-2008) (1632-1723) (1869-1940) (1922-1990) (1875-1946) (1803-1873) (1707-1778) (1899-1986) (1912-1991) (1902-1994) (1905-1979) (1797-1875) (1889-1976) (1653-1694) (1766-1834) (1910-2002) (1929-) (1902-1992) (1847-1915) (1822-1884) (1930-) (1848-) (1844-1895). (1927-2002) (1868-1923) (1900-1974) (1910-1976) (1932-) (1866-1945) (1802-1880) (1890-1967) (1944-) (1928-1999) (1915-1999) (1873-1949) (1927-) (1891-1987) (1866-1936) (1905-1993) (1930-1975) (1912-)

Nobel* 1910

1930 1932 1914

1953 1969 1965

1952 1983

1988 1984 1923 1965 1933 1946 1993 1978

1968 1946 1959 1974

252

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Apéndices Nombres de científicos citados en el libro PASTEUR Louis PATTERSON Arthur L. PAULING Linus PERUTZ Maximiliam Ferdinand PHILLIPS David PLANCK Max PRUSINER Stanley PTASHNE Mark PURCELL Edward RABI Isaac RABL Karl RANDALL John RAOULT François Marie RAY John RICH Alexander RITOSSA Ferruccio ROBERTS Richard J. RÖNTGEN Wilheim ROUELLE Hilaire Martín ROUS Peyton RUSKA Ernest RUTHERFORD Ernest SAINT-HILAIRE Geoffroy SANGER Frederick SCHEELE Carl Wilheim SCHELLING Friedrich Wilheim SCHRÖDINGER Erwin SCHWANN Theodor SHARP Phillip A. SIGNER Rudolf SMITH Hamilton SMITH Michael SORENSEN Soren STAHL Franklin STANLEY Wendell Meredith STAUDINGER Herman STEUDEL Hermann STREISINGER George STURTEVANT Alfred SUMNER James SUTHERLAND William SUTTON Walter SVEDBERG Theodor SYNGE Richard L. M. SZILARD Leo SZYBALSKI Waclaw TATUM Edward TEMIN Howard THOMPSON Joseph John TISELIUS Arne

Periodo (1822-1895) (1902-1966) (1901-1994) (1914-2004) (1924-1999) (1858-1947) (1942-) (1941-) (1912-1997) (1898-1988) (1853-1917) (1905-1984) (1830-1901) (1628-1705) (1924-) (1936-) (1943-) (1845-1923) (1716-1778) (1879-1970) (1906-1988) (1871-1937) (1772-1844) (1918-) (1742-1786) (1775-1854) (1887-1961) (1810-1882) (1944-) (1903-1990) (1931-) (1932-2000) (1868-1939) (1929-) (1904-1971) (1881-1965) (1871–1967) (1927-1984) (1891-1970) (1887-1955) (1859-1911) (1877-1916) (1884-1971) (1914-1994) (1938-1964) (1921-) (1909-1975) (1914-1994) (1856-1940) (1902-1971)

Nobel*

1954/62 1962 1918 1997 1952 1944

1993 1901 1966 1986 1908 1958/80

1933 1993 1978 1993

1946 1953

1946

1952

1958 1975 1948

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Apéndices Nombres de científicos citados en el libro TISSIÈRES Alfred TODD Alexander TONEGAWA Susumu TRAUBE Moritz TSCHERMAK Erich TSWETT Mikhail TWORT Frederick UREY Harold VARMUS Harold VAVILOV Nicolai VIGNEAUD Vincent du VIRCHOW Rudolf VRIES Hugo de WALLACE Alfred Russell WATSON James WEAVER Warren WEISMANN August WILKINS Maurice WILSON Edmund WILLSTÄTER Richard WINKELBLECH Karl WOESE Carl WÖHLER Friedrich WOLLMAN Elie Leo WRIGHT Sewall WU Hsien WÜTHRICH Kurt WYMAN Jeffries YANOFSKY Charles YUDKIN John ZAMECNIK Paul

Periodo (1917-2003) (1907-1997) (1939) (1826–1894) (1871-1962) (1872-1919) (1877-1950) (1893-1981) (1939-) (1887-1943) (1901-1978) (1821-1902) (1848-1935) (1823-1913) (1928-) (1894-1978) (1834-1914) (1916-2004) (1856-1939) (1872-1942) (1810-1865) (1928-) (1880-1882) (1917-) (1889-1988) (1893-1959) (1938-) (1901-1995) (1925-) (1910-1995) (1914-)

Nobel* 1957 1987

1934 1989 1955

1962

1962 1915

2002

* Para conocer la categoría y el motivo de la concesión del premio Nobel, consúltese la tabla ­siguiente, ordenada cronológicamente.

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Apéndices

PREMIOS NOBEL CITADOS EN EL LIBRO, ORDENADOS CRONOLÓGICAMENTE Año 1901

Física

Campo

1901

Fisiología o Medicina

1902

Química

1903

Física

1903

Física

1903

Química

1905

Química

1907

Química

1908

Fisiología o Medicina

1908

Química

1910

Fisiología o Medicina

Motivo “En reconocimiento de los extraordinarios servicios prestados por el descubrimiento de los sorprendentes rayos posteriormente denominados con su nombre” “Por su trabajo en terapia con sueros, especialmente su aplicación contra la difteria, con el que ha abierto una nueva vía en el campo de la ciencia médica y con el que ha colocado en las manos de los médicos un arma victoriosa contra las enfermedades y la muerte” “En reconocimiento de los extraordinarios servicios prestados con sus trabajos relativos a la síntesis de azúcares y purinas” “En reconocimiento de los extraordinarios servicios prestados por su descubrimiento de la radioactividad espontánea” “En reconocimiento de los extraordinarios servicios prestados por sus investigaciones conjuntas sobre el fenómeno de radiación descubierta por el Profesor Henri Becquerel” “En reconocimiento de los extraordinarios servicios prestados al avance de la Química por su teoría electrolítica de la disociación” “En reconocimiento de los servicios en el avance de la química orgánica y la química industrial a través de su trabajo en los colorantes orgánicos y compuestos hidroaromáticos” “Por sus investigaciones bioquímicas y su descubrimiento de la fermentación libre de células” “En reconocimiento de su trabajo sobre la inmunidad” “Por sus investigaciones sobre la desintegración de los elementos y la química de las sustancias radioactivas” “En reconocimiento por sus contribuciones a nuestro conocimiento de la química celular realizada a través de su trabajo con proteínas, incluidas las sustancias nucleicas”

Laureado Wilhelm Conrad Röntgen

Emil von Behring

Emil Fischer

Henri Becquerel

Marie Curie Pierre Curie

Svante Arrhenius

Adolf von Baeyer

Eduard Buchner Paul Ehrlich Junto con Ilya Ilyich Mechnikov Ernest Rutherford

Albrecht Kossel

255

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Apéndices Año 1911

Campo Química

1914

Física

1914

Física

1915

Química

1918

Física

1919

Fisiología o Medicina

1921

Física

1923

Física

1926

Fisiología o Medicina

1926

Química

1927

Física

1929

Física

1929 1930

Fisiología o Medicina (Junto con Christiaan Eijkman) Fisiología o Medicina

1932

Química

1933

Física

1933

Fisiología o Medicina

1934

Química

1943

Química

Motivo “En reconocimiento a sus servicios para el avance de la química, por el descubrimiento de los elementos Radio y Polonio, por el aislamiento del Radio y el estudio de la naturaleza de este notable elemento” “Por su descubrimiento de la difracción de los rayos X por cristales” “Por sus servicios en el análisis de la estructura cristalina mediante rayos X” “Por sus investigaciones sobre pigmentos vegetales, especialmente la clorofila” “En reconocimiento a los servicios prestados al avance de la Física por su descubrimiento de los cuantos de energía” “Por sus descubrimientos sobre la inmunidad” “En reconocimiento de sus servicios a la Física Teórica, y especialmente por su descubrimiento de la ley del efecto fotoeléctrico” “Por su trabajo sobre la carga elemental de la electricidad y sobre el efecto fotoeléctrico” “Por su descubrimiento del carcinoma Spiroptera” “Por su trabajo sobre sistemas dispersos” “Por su descubrimiento del efecto al que dio su nombre” “Por su descubrimiento de la naturaleza ondulatoria” “Por su descubrimiento de las vitaminas que estimulan el crecimiento” “Por su descubrimiento de los grupos sanguíneos humanos” “Por sus descubrimientos e investigaciones en química de superficies” “Por su descubrimiento de nuevas y productivas formas de teoría atómica” “Por sus descubrimientos relacionados con el papel jugado por el cromosoma en la herencia” “Por su descubrimiento del hidrógeno pesado” “Por su trabajo sobre el uso de isótopos como moléculas trazadoras en el estudio de procesos químicos”

Laureado Marie Curie, née Sklodowska

Max von Laue William Bragg Lawrence Bragg Richard Willstätter Max Planck

Jules Bordet Albert Einstein

Robert A. Millikan Johannes Fibiger Theodor Svedberg Arthur Holly Compton Junto con C.T.R. Wilson Louis de Broglie Sir Frederick Hopkins Karl Landsteiner Irving Langmuir Erwin Schrödinger Junto con Paul Adrien Maurice Dirac Thomas H. Morgan Harold C. Urey George de Hevesy

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Apéndices Año 1944

Física

Campo

1945

Fisiología o Medicina

1946

Fisiología o Medicina

1946

Química

1946

Química

1948

Química

1952

Física

1952

Química

1953 1953

Fisiología o Medicina (Junto con Hans Adolf Krebs) Química

1954

Química

1955

Química

1957

Química

1958

Fisiología o Medicina

1958

Fisiología o Medicina

1958

Química

Motivo “Por su método de resonancia para el registro de las propiedades magnéticas de los núcleos atómicos” “Por el descubrimiento de la penicilina y efecto curativo en varias enfermedades infecciosas” “Por el descubrimiento de la producción de mutaciones mediante irradiación con rayos X” “Por su descubrimiento de que los enzimas pueden ser cristalizados” “Por la preparación de enzimas y proteínas virales en forma pura” “Por sus trabajos sobre electroforesis y análisis de adsorción, especialmente por sus descubrimientos relacionados con la naturaleza compleja de las proteínas del suero” “Por el desarrollo de nuevos métodos para la medida magnética nuclear de precisión y los descubrimientos relacionados con ellos” “Por su invención de la cromatografía de reparto” “Por su descubrimiento de la coenzima A y su importancia en el metabolismo intermediario” “Por sus descubrimientos en el campo de la química macromolecular” “Por sus investigaciones sobre la naturaleza del enlace químico y su aplicación a la elucidación de la estructura de las sustancias complejas” “Por su trabajo sobre compuestos sulfurosos de importancia bioquímica, especialmente por la síntesis por primera vez de una hormona polipeptídica” “Por su trabajo con nucleótidos y coenzimas de naturaleza nucleotídica” “Por su descubrimiento de que los genes actúan regulando eventos químicos definidos” “Por sus descubrimientos relacionados con la recombinación genética y la organización genética de las bacterias” “Por su trabajo sobre la estructura de las proteínas, especialmente la de la insulina”

Laureado Isidor Isaac Rabi

Sir Alexander Fleming Junto con Ernst Boris Chain y Sir Howard Walter Florey Hermann Joseph Muller James B. Sumner John H. Northrop Wendell M. Stanley Arne Tiselius

Felix Bloch E. M. Purcell

Archer J. P. Martin Richard L. M. Synge Fritz Lipmann Herman Staudinger Linus Pauling

Vincent du Vigneaud

Lord Alexander Todd George Beadle Edward Tatum Joshua Lederberg

Frederick Sanger

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Apéndices Año 1959

Campo Fisiología o Medicina

1962

Fisiología o Medicina

1962 1962

Paz Química

1964

Química

1965

Fisiología o Medicina

1966

Fisiología o Medicina

1968

Fisiología o Medicina

1969

Fisiología o Medicina

1972

Química (Junto con Stanford Moore y William H. Stein)

1974

Fisiología o Medicina

1975

Fisiología o Medicina

1978

Fisiología o Medicina

1980

Química

1980

Química

1982

Química

Motivo “Por su descubrimiento de los mecanismos de la síntesis biológica de los ácidos ribonucleico y desoxirribonucleico” “Por sus descubrimientos relacionados con la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su importancia en la transferencia de información en los seres vivos” “Por sus estudios sobre la estructura de las proteínas globulares” “Por la determinación mediante la técnica de rayos X de las estructuras de sustancias bioquímicas de gran importancia” “Por sus descubrimientos relacionados con el control genético de la síntesis de enzimas y virus” “Por el descubrimiento de los virus inductores de tumores” “Por su interpretación del código genético y su función en la síntesis de proteínas” “Por sus descubrimientos relacionados con el mecanismo de replicación y la estructura genética de los virus” “Por su trabajo en la ribonucleasa, especialmente en relación con la conexión entre la secuencia aminoacídica y la conformación biológicamente activa” “Por sus descubrimientos en relación a la organización estructural y funcional de la célula” “Por sus descubrimientos en relación con la interacción entre tumores víricos y el material genético de la célula” “Por el descubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación a problemas de genética molecular” “Por sus contribuciones a la determinación de la secuencia de las bases de los ácidos nucleicos” “Por sus estudios sobre la bioquímica de los ácidos nucleicos, con particular énfasis en el DNA recombinante” “Por su desarrollo de la microscopía electrónica aplicada a la cristalografía y la elucidación estructural con esta técnica de complejos proteína-ácido nucleico de importancia biológica”

Laureado Severo Ochoa Arthur Kornberg Francis Crick James Watson Maurice Wilkins Linus Pauling John Cowdery Kendrew Max Ferdinand Perutz Dorothy Crowfoot Hodgkin François Jacob André Lwoff Jacques Monod Peyton Rous Junto con Charles B. Huggins Robert W. Holley Har Gobind Khorana Marshall W. Nirenberg Max Delbrück Alfred D. Hershey Salvador E. Luria Christian B. Anfinsen

Albert Claude Christian de Duve George E. Palade Renato Dulbecco Howard Martin Temin David Baltimore Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith Frederick Sanger Walter Gilbert Paul Berg

Aaron Klug

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Apéndices Año 1983

Campo Fisiología o Medicina

1984

Fisiología o Medicina

1986

1986

Física (Junto con Gerd Binnig y Heinrich Rohrer) Fisiología o Medicina

1987

Fisiología o Medicina

1988

Química

1989

Fisiología o Medicina

1989

Química

1993

Fisiología o Medicina

1993

Química

1993

Química

1997

Fisiología o Medicina

2002

Fisiología o Medicina

2002

Química (Junto con John B. Fenn y Koichi Tanaka)

2006

Química

Motivo “Por su descubrimiento de los elementos genéticos móviles” “Por sus teorías en relación con la especificidad, desarrollo y control del sistema inmune, y por el descubrimiento del principio de producción de anticuerpos monoclonales” “Por su trabajo fundamental en óptica electrónica, y por el diseño del primer microscopio electrónico” “Por sus descubrimientos en los factores de crecimiento” “Por su descubrimiento del principio genético de la generación de la diversidad de los anticuerpos” “Por la determinación de la estructura tridimensional del centro de reacción fotosintético” “Por su descubrimiento del origen celular de los oncogenes retrovirales” “Por sus descubrimientos de las propiedades catalíticas del RNA” “Por su descubrimiento del ayuste de los genes” “Por sus contribuciones fundamentales al establecimiento de técnicas de mutagénesis puntual y dirigida, y su desarrollo para los estudios de proteínas” “Por la invención del método de la reacción en cadena de la polimerasa” “Por el descubrimiento de los priones - un nuevo principio biológico de infección” “Por sus descubrimientos en relación con la regulación genética del desarrollo de los órganos y de la muerte celular programada” “Por el desarrollo de la espectroscopía de resonancia magnética nuclear para la determinación de la estructura tridimensional de macromoléculas biológicas en solución” “Por sus estudios sobre las bases moleculares de la transcripción en eucariotas”

Laureado Barbara McClintock Niels K. Jerne Georges J. F. Köhler César Milstein

Ernst Ruska

Stanley Cohen Junto con Rita Levi‑Montalcini Susumu Tonegawa

Johann Deisenhofer Robert Huber Hartmut Michel J. Michael Bishop Harold E. Varmus Sidney Altman Thomas R. Cech Richard J. Roberts Phillip A. Sharp Michael Smith

Kary B. Mullis Stanley B. Prusiner Sydney Brenner Junto con H. Robert Horvitz y John E. Sulston Kurt Wüthrich

Roger D. Kornberg

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Índice analítico A Abbe, Ernst, 35 ácido desoxirribonucleico. Véase DNA guanílico, 109 inosílico, 108 nucleico, 39, 101, 102, 105 ribonucleico. Véase RNA úrico, 105 acridina, 178 Adair, Gilbert, 55, 82 adenina, 105 adenosín trifosfato. Véase ATP Agrobacterium tumefaciens, 212 albinismo, 123 albúmina, 40, 74 alcaptonuria, 123 α (alfa)-queratina, 84 Allowey, Lionel, 128 alosterismo, 94, 197 Alpher, Ralph, 160 Altman, Sidney, 224 Altmann, Richard, 102, 105, 111 Álvarez, Luis, 161 Alwine, John, 212 aminoácido, 42 Anderson, Thomas F., 67, 133, 138 anemia falciforme, 163, 211 Anfinsen, Christian, 234 animal transgénico, 212 Anson, Mortimer (Tim) Louis, 74, 75, 233 anticodón, 170 anticuerpo, 217 monoclonal, 218 policlonal, 218 antígeno, 217 ántrax, 106 Arber, Werner, 205 Ardnt, Uli, 93 Arkwright, J. A., 126 arqueobacterias, 226

Ascoli, Alberto, 106 Asilomar, 208 Astbury, William, 16, 18, 19, 79, 142, 143, 149, 151 Astrachan, Lazarus, 172, 173 ATP, 110, 180 Auerbach, Leopold, 37 Avery, Oswald, 126, 135, 140 ayuste, 222, 224 B bacilo de la tuberculosis, 140 bacteriófago. Véase fago bacteriorrodopsina, 243 Baeyer, Adolf von, 45, 50, 52, 104 Baldwin, Robert, 199 Baltimore, David, 209, 230 Bang, Ivan, 111 Barbacid, Mariano, 232 Barnett, Leslie, 178 base nitrogenada, 140 pirimidínica, 106, 140 púrica, 105, 140 bases de datos, 243 Bateson, William, 114, 115, 123 Beadle, George W., 122, 123, 124, 133 Beagle, 30 Beans, Jesse, 64 Beccari, Iacopo, 40 Becquerel, Henri, 68 Behring, Emil von, 217 Bell, Florence, 142 benceno, 44 Beneden, Edouard van, 38 Bennet, Claude, 218 Benzer, Seymour, 136, 177, 182, 184 Berg, Paul, 170, 199, 206, 207, 209 Bergmann, Max, 96 Bernal, John, 18, 76, 80, 81, 82, 91, 142, 143, 242

Bernstein, Harry, 184 Berthelot, Marcelin, 50 Berthollet, Claude, 41 Berzelius, Jons Jacob, 41, 48 β (beta)-galactosidasa, 172, 191, 192, 195 β (beta)-mercaptoetanol, 234 Bethe, Hans, 160 biblioteca genómica, 209, 211 Bijvoet, Johannes, 91 bioinformática, 243 Biología Molecular, 95, 222 BIONET, 244 Bishop, Michael, 230 Bjerrum, Niels, 73 Blackett, P.M.S., 82 Bloch, Felix, 241 Blow, David, 94 Bociu, Olga, 126 Boerhaave, Hermann, 47 Böhr, Niels, 19, 71, 131, 132, 160 Boivin, André, 130, 141, 162, 167 Bolívar, Francisco, 212 Bonet, Jean Baptiste de. Véase Lamarck Bordeau, Teofilo de, 48 Bordet, Jules, 191 Borodin, Alexander, 107 Borsook, Henry, 171 Boveri, Theodor, 38 Boyer, Herbert, 207 Boyle, Robert, 24 Brachet, Jean, 171 Bragg, Lawrence, 18, 19, 70, 72, 82, 87, 93, 145, 149, 152 Bragg, William, 18, 70, 71, 78, 79, 83, 89, 90 Bredig, Georg, 73 Brenner, Sydney, 20, 67, 83, 161, 170, 172, 178, 180, 184, 209, 216, 242 Bridges, Calvin B., 116

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Índice analítico Brock, Thomas, 214 Broglie, Louis de, 69 Brown, Robert, 36 Büchner, Eduard, 50 Büchner, Hans, 50 Buffon, Conde de, 26 BUSI, 241 C Caignard-Latour, Charles, 48 Cairns, John, 201 caja Pribnow, 196 Caltech, 57, 71, 75, 142, 171, 200, 228, 236 cáncer, 230 Cantacuzene, Ion, 126 cap, 222 carbono, 43 carboxipeptidasa, 54, 93 carbunco, 106 cariogeno, 103 caseína, 56, 57 Caspar, Donald, 242 Caspersson, Torbjörn, 111, 112, 142, 171 Castle, William, 114, 116 Cech, Thomas Robert, 224 celda unidad, 79 célula, 34 centrifugación, 63 en gradiente de densidad, 154 centrómero, 113 CERN, 239, 241 Changeux, Jean Pierre, 94, 192, 197 chaperona, 236 Chapeville, François, 168 Chargaff, Erwin, 17, 63, 113, 128, 140, 144, 148, 159, 165 Chase, Martha, 138 Chemical Society, 56 Chetverikov, Sergei S., 115, 120 chi 1776, 209 Chick, Harriette, 74 chips de nucleótidos, 212 choque térmico, 236 ciclo celular, 37 cistinuria, 123 citidina, 142 citocromo, 82 citosina, 106 Clark, Brian, 170 Claude, Albert, 171 clonación, 205, 206, 211, 216 clorofila, 53 cloruro de cesio, 154, 186 club de la corbata de RNA, 165 cocaína, 52 Cochran, William, 88, 147 código de diamante, 161 genético, 160, 179

codón, 170 ámbar, 184 de inicio, 183 de terminación, 184 ocre, 184 ópalo, 184 Cohen, Stanley, 207 cola de adeninas, 222 Cold Spring Harbor Laboratory. Véase CSHL colicina, 189 coloide, 54, 56 Compton, Arthur Holly, 69 conjugación, 135 Consden, Ralph, 63 contador Geiger, 66 Corey, Robert, 84, 149 Cori, Carl, 199 Cork, James M., 91 Correns, Carl, 114, 115 cósmido, 212 Crawford, Lionel, 229 Crick, Francis, 16, 19, 20, 83, 84, 88, 90, 140, 145, 149, 150, 152, 161, 163, 165, 166, 168, 170, 172, 175, 177, 178, 179, 185, 198, 216, 221, 224, 230, 234, 242, 246 cristalografía de rayos X, 170, 195, 239 cristaloide, 56 cromatina, 37 cromatografía, 53, 62 de gases, 63 en capa fina, 113 en papel, 63, 140 líquida de reparto, 63 cromosoma, 37, 38, 113 del sexo, 116 Crowfoot, Dorothy. Véase Hodking, Dorothy CSHL, 132, 156, 197, 223 cuanto de energía, 69 Curie, Marie, 68 Curie, Pierre, 68 Curtis III, Roy, 209 Cuvier, George, 27 D Dalgarno, Lynn, 188 dalton, 55 Dalton, John, 55 Darnell, Jim, 222 Darwin, Charles, 27, 28, 29, 114, 163 Darwin, Erasmus, 27 Davis, Ronald, 207 Dawson, Martin, 128 Deisenhofer, Johann, 241 Delbrück, Hans, 131

Delbrück, Max, 19, 20, 131, 136, 146, 154, 191 Demerec, Milislav, 132 DESY, 241 diauxia, 190 Dienert, Frédéric, 190 difracción de rayos X, 18, 69, 141, 144, 217 difractograma, 70, 88 dinitrofluorobenceno. Véase DNFB Dintzis, Howard, 92, 185 DNA, 108, 128, 155, 226 A, 144 B, 144 basura, 219 estructura, 141 exonucleasa, 205 fingerprint, 220 ligasa, 200, 203, 205, 206, 207 polimerasa, 199, 200, 202, 203, 205, 206 recombinación, 206 replicación, 154, 155, 198 transferasa terminal, 205 DNAsa, 111, 130, 136, 195 DNFB, 96 dodecil sulfato de sodio. Véase SDS Dogma Central de la Biología, 157, 166, 222, 224 dominio Fab, 217 Fc, 217 Donohue, Jerry, 151 Dounce, Alexander, 162, 167 Drenth, Ian, 94 Dreyer, William, 218 Drosophila melanogaster, 116, 131, 209, 236 Duesberg, Peter, 227, 230 Dulbecco, Renato, 228 Duve, Christian de, 171 E E. coli, 135, 154, 177, 199, 208 East, Edward, 115 EcoRI, 207 Eddington, Arthur, 159 Edelman, Gerald, 217 Edman, Per Victor, 98 efecto fotoeléctrico, 69 Ehrenberg, Christian, 36 Ehrlich, Paul, 36, 217 Einstein, Albert, 69 electroforesis, 65 Ellis, Emory, 131 Ellis, John, 236 EMBL, 94, 239, 241, 243 EMBNET, 244 EMBO, 94, 193, 241, 243 Emmons, Charles, 121 emulsina, 52

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Índice analítico encadenamiento de genes, 115 enlace amida, 46 covalente, 46, 71, 187, 222 débil, 18, 42, 71, 75, 76, 211 peptídico, 43, 46, 54, 84, 86, 107, 152 enzima, 52 de restricción, 205, 207, 211 Ephrussi, Boris, 123, 163 errores innatos del metabolismo, 123 Escherichia coli. Véase E. coli escuela estructuralista, 20 informacionista, 20 espectrometría de masas, 98 estreptomicina, 172 estricnina, 91 estructura terciaria, 72 European Molecular Biology Laboratory. Véase EMBL European Molecular Biology Organization. Véase EMBO exón, 223 exonucleasa, 199 experimento de Cairns, 201 de cruzamiento, 33 de difracción, 87 de fluctuación, 134 de inducción, 136 de la batidora, 138 de protección del DNA, 196 de Temin, 230 PaJaMo, 172, 192 F factor de elongación, 186 de iniciación, 187 de liberación, 187 fago, 122, 130 Ø(phi)X174, 200, 213 G4, 203 λ (lambda), 191, 195, 206, 229 lisogénico, 136 m13, 213 T, 133 T2, 138, 172, 173, 175 T4, 177, 178, 179, 186 T7, 186 fenotipo, 114 fermento, 47 Feulgen, Robert, 111 Feyman, Richard, 165 Fibiger, Johannes, 228 Fiers, Walter, 215 Finch, John, 242 Fischer, Emil, 45, 52, 55, 57, 71, 75, 104, 105, 107, 108, 217 Fisher, Ronald S., 115

Física, 68 Ø(phi)X174, 200, 213 flavina, 110 Fleming, Alexander, 93 Flemming, Walther, 37, 103 Fol, Hermann, 38 formil-metionina, 183 fosvitina, 101 fotón, 69 Fourcroy, Antoine François de, 40 Fourier, Joseph, 26, 78, 89, 90 Fowler, Ralph, 76 fraccionamiento celular, 180 Fraenkel-Conrat, Heinz, 176 fragmento de Klenow, 200 de Okazaki, 203 Frank, Joachim, 243 Franklin, Rosalind, 144, 147, 150, 152, 156, 239, 240 Friedrich, Walter, 48, 70 fuerza de van der Waals, 71 Fuller, Buckminster, 242 Fundación Nobel, 51, 228 Rockefeller, 59, 60, 64, 66, 75, 82, 131 Volkswagen, 239 Furberg, Sven, 142 G galactosidasa transacetilasa, 192 Gallo, Robert, 233 Galton, Francis, 30 Gamow, George, 160, 165, 178, 180 Garrod, Archibald, 122 Gates, Frederick, 60 Gefter, Malcolm, 202 geles de poliacrilamida, 215 gen, 114, 177, 178 estructural, 192 grupo encadenado, 118 operador, 192 recesivo, 117 regulador, 192 GenBank, 243 genética, 114 bacteriana, 131, 133 genotipo, 114 Georgopoulos, Costa, 236 Gilbert, Walter, 175, 194, 215, 223, 226 globina, 55 Goldberg, Edward, 186 Gordon, Andrew H., 63 Graham, Thomas, 56 Greenstein, Jesse P., 121 Griffith, Frederick, 126 Griffith, John, 148 Gros, François, 175 Gross, Ludwik, 228

Grunberg-Manago, Marianne, 180 Grunstein, Michael, 209 grupo de los fagos, 20, 131, 133, 138, 142 guanina, 105 Gulland, John Masson, 145, 151 H Habermann, Josef, 56 Haeckel, Ernst, 36, 37, 38 Haldane, John B.S., 115, 120, 123, 154 Hall, Benjamin, 175 Halley, Edmund, 25 Hammarsten, Einar, 111 Hammarsten, Harald, 111 Hammarsten, Olof, 108, 109, 111, 142 Hardy, William, 72 Hasier, Franz, 108 Haurowitz, Felix, 82 Hayes, William, 135 Heel, Marin van, 243 Heidelberger, Michael, 66 Heitler, Walter, 71 hélice α, 83 hemina, 55 hemoglobina, 55, 74, 75, 82, 90, 99, 163, 197 Henderson, Richard, 243 Herelle, Felix d’, 132 Hershey, Alfred, 136, 138, 140 Hertwig, Oscar, 37 Hevesy, George, 66 hibridación, 71, 175, 219, 223 hibridoma, 218 hipótesis central, 166 de los pares oscilantes, 185 del adaptador, 165 del alosterismo, 197 tetranucleotídica, 108, 110 hipoxantina, 105 His, Wilhelm, 99, 101, 103 histidina, 106 histona, 106 Hlasiwetz, Heinrich, 56 hnRNA, 222 Hoagland, Mahlon, 168 Hodking, Dorothy, 80, 81, 90, 91 Hofmeister, Franz, 46, 71 Hogness, David, 209 hoja β, 86, 93 Hollaender, Alexander, 121 Holley, Robert, 169, 215 Holmes, Kenneth, 240 Hooke, Robert, 24, 34 Hopkins, Frederick Gowland, 23, 55, 81, 123 Hoppe-Seyler, Ernst Felix, 55, 99, 100, 104

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Índice analítico Horne, Richard, 67 Hotchkiss, Rollin, 130 Huber, Robert, 241 Huebner, Robert, 230 huella genética, 220 Hutton, James, 28 Huxley, Hugh, 83, 240, 242 I ingeniería genética, 205, 213, 222 Ingram, Vernon, 91, 164, 185 iniciador de replicación DNA, 202 Inmunología, 217 Instituto Cavendish, 83 de Tecnología de Massachussets. Véase MIT del Radio, 132 Kaiser Guillermo de Investigación Médica, 131 de Química de Fibras, 78 Lister, 126 Molteno, 82 Pasteur, 130, 233, 238 Roche, 222 Rockefeller, 58, 60, 95, 107, 126, 130, 171 Tecnológico de California. Véase Caltech Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Véase NIH insulina, 95, 206, 208 interferón, 208 Internet, 244 intrón, 223 invertasa, 50 IPTG, 195 isótopo radioactivo, 66, 138 Itano, Harvey, 163 J Jacob, Albert, 191 Jacob, François, 20, 136, 137, 172, 197 Jacobs, Walter, 108, 109 James, Anthony, 20, 24, 28, 63, 186 Janssen, Zacharias, 34 Jayaraman, Ramamirtha, 186 Jeffreys, Alec, 219 Jerne, Niels, 218 JMB, 95 Johannssen, Wilheim, 114 Jones, Walter, 110 Journal of Molecular Biology. Véase JMB K Kabat, Anthony, 66 Kaiser, Dale, 104, 199, 206 Kan, Yuet Wai, 211

Karström, Henning, 190, 191 Kauzmann, Walter, 78 Keilin, David, 82 Kekulé, August, 43 Kellenberger, Edward, 67 Kendrew, John, 18, 83, 92, 93, 94, 145, 149, 239, 241 Khorana, Gobind, 182, 184 Kieser, Dietrich, 48 Kitasato, Shibasaburo, 217 Klenow fragmento de, 200 Hans, 200 Klug, Aaron, 170, 239, 240, 242 Knipping, Paul, 70 Knoll, Max, 67 Kohler, Georges, 218 Kornberg, Arthur, 17, 21, 198, 199, 202, 205, 206, 209 Kornberg, Roger, 202 Kornberg, Tom, 202 Kossel, Albrecht, 104, 107, 109, 110 Kuhne, Wilhelm, 52 Kunitz, Moses, 128 Küster, Franz, 73 Kützing, Friedrich, 48 L Laboratorio de Biología Molecular en Cambridge. Véase LMB Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg. Véase EMBL Laboratory of Molecular Biology. Véase LMB lac, 195 lactosa permeasa, 192 Laemmli, Uli, 211 Lamarck, Jean Baptiste de, 27 lámina β, 86, 93 Landsteiner, Karl, 75, 218 Langmuir, Irwin, 77 Laskey, Ronald, 236 Latimer, Wendell, 76 Laue, Max von, 70 Lavoisier, Antoine-Laurent, 41, 47 Leclerc, Georges Louis. Véase Buffon, Conde de Leder, Philip, 182 Lederberg, Esther, 191 Lederberg, Joshua, 128, 135, 191, 192 Leeuwenhoek, Antony van, 34 Lehman, Robert, 199 Lehninger, Albert, 15 Lengyel, Peter, 187, 189 Levene, Aaron Feodor, 107, 109, 110, 112, 130 Levinthal, Cyrus, 235 Lewis, Gilbert, 71 Lewis, I.M., 134

ley

de Bragg, 70 de Lamarck, 27 de Mendel, 32 de Poisson, 134 de selección natural, 28 Liebig, Justus von, 42, 49, 52, 131 Linneo, Carl, 25 Lipmann, Fritz, 130, 168, 186 Lipscomb, William, 94 lisogenia, 191 lisozima, 93 LMB, 18, 20, 83, 91, 94, 145, 151, 161, 170, 178, 211, 218, 236, 238, 242, 243 Lobban, Peter, 206 London, Fritz, 71 Longworth, L.G., 66 Lord Phillips de Ellesmere. Véase Phillips, David Lubavin, Nicholas, 101 Ludwig, Karl, 100, 102 Luria, Salvador, 132, 133, 136, 146 Lwoff, André, 133, 190 Lwoff, Marguerite, 133 Lyell, Charles, 29, 30 Lysenko, Trofim, 120, 159 M m13, 213 MacLeod, Colin, 128, 135 macromolécula, 57 Maizel, Jake, 211 Malpighi, Marcello, 34 Malthus, Thomas, 30 Maniatis, Tom, 224 mapa de restricción, 205 genético, 118, 136 marcaje de aminoácidos, 180 Martin, Archer John Porter, 62, 96, 113 Mason, Max, 64 Mathews, Brian, 195 Matthaei, Heinrich, 181 Maxam, Allan, 215 Maxwell, James Clerk, 68 Mayr, Ernst, 29 Mazia, Daniel, 121 McCarty, Maclyn, 128, 135 McClintock, Barbara, 196 ME, 67, 217, 242 Medicus, Ludwig, 105 meiosis, 38, 114 Mendel, Gregor, 32, 39, 113, 123, 163 Mertz, Janet, 207, 208 Meselson, Mathew, 154, 173, 181 método de secuenciación de Maxam y Gilbert, 215 de Sanger, 215

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Índice analítico Michel, Hartmut, 241 Microscopía Electrónica. Véase ME microscopio, 34 microsoma, 171 Miescher, Friedrich, 99, 104, 111 Millikan, Glen, 80 Millikan, Robert, 69 Milstein, César, 218 mioglobina, 83, 92, 93, 94, 95 Mirsky, Alfred Ezra, 74, 77, 129, 233 MIT, 156, 170, 223 Mitchell, Hershell, 236 mitosis, 37, 113 modificación controlada por el huésped, 205 molibdenita, 72 Monod, Jacques, 55, 94, 120, 166, 172, 190, 197, 221 Monro, Robin, 187 Montagnier, Luc, 233 Montagu, Mark van, 212 Morgan, Thomas Hunt, 115, 119, 124, 131, 177 Morowitz, Harold J., 183 mosca del vinagre. Véase Drosophila melanogaster movilidad electroforética, 163 MRC, 147 mRNA, 170, 173, 175, 185, 222 MS2, 215 Mulder, Gerrit, 41, 42, 54 Muller, Hermann, 58, 116, 119, 122, 131, 134 Mullis, Kary, 214 mutación, 114, 134 mutagénesis puntual, 213 mutante, 114 puntual, 213 mutón, 177 N Nägeli, Karl, 37, 101, 114 Nathans, Daniel, 205 Neel, James, 163 Neufeld, Fred, 126, 127 Neumann, Albert, 105, 110 Neurospora, 124 Newton, Isaac, 24 Niemann, Carl, 96 NIH, 180, 199, 233 Nilsson-Ehle, Herman, 114 Nirenberg, Marshall, 180, 181, 184, 187 Nixon, Richard, 232 Nobel Alfred, 51 premios, 51 Noller, Harry, 226 Nomura, Masayasu, 187 Northern blot, 212 Northrop, John, 53, 59, 132

Noyes, Arthur, 56 nucleína, 39, 100 núcleo celular, 36, 39 nucleósido, 109 nucleótido, 109 O Ochoa, Severo, 180, 182, 184, 187, 199 Okazaki fragmentos de, 203 Reiji, 203 operador, 195 operón, 192 ordenador, 235, 243 Organización Europea de Biología Molecular. Véase EMBO Orgel, Leslie, 83 oxitocina, 98 P Palade corpúsculos de, 171 George Emil, 171 Pardee, Arthur, 172, 192 Parventjev, I.A., 217 Pasteur, Louis, 35, 49 Patterson, Arthur L., 90 Pauling, Linus, 18, 52, 55, 71, 74, 77, 84, 88, 90, 145, 148, 149, 150, 162, 218, 233 Payen, Anselme, 52 pBR322, 212 PCR, 213 pentosa, 108 pentosuria, 123 pepsina, 46, 52, 53, 80 pepsinógeno, 54 peptidil transferasa, 226 Perutz, Maximiliam Ferdinand, 55, 81, 83, 87, 90, 92, 94, 145, 146, 151, 164, 234, 239 pH, 73 Phillips, David, 93 Philpot, John, 80 Pickels, Edward, 64 pirimidina, 151 Planck, Max, 69 planta transgénica, 212 plásmido, 206, 208, 209, 210 artificial, 212 pBR322, 212 plegamiento de proteínas, 74, 92, 167, 233, 243 Plinio el Viejo, 40 Polanyi, Michael, 78 poliA. Véase cola de adeninas polinucleótido fosforilasa, 180, 199 sintético, 169 Pollack, Robert, 208

Porter, Rodney, 217 Presos, Jean Francois, 52 Pribnow caja de, 196 David, 196 principio de correlación de las formas, 27 de subordinación de los órganos, 27 transformante, 126 prión, 237 profago, 191 proflavina, 178 promotor, 196 protamina, 101 proteína, 40, 42, 226 de choque térmico, 236 desnaturalización, 75 estructura, 42, 46, 71, 75, 76, 78 fibrosa, 74 globular, 74 plegamiento, 74, 92, 167, 233, 243 represora, 194 provirus, 230 proyecto Apolo, 232 Genoma Humano, 157 Manhattan, 143, 193, 232 Prusiner, Stanley, 237 Ptashne, Mark, 194 puente de hidrógeno, 71, 76, 152 disulfuro, 234 Purcell, Edward Mills, 241 purina, 105, 151 pus, 100 Q queratina α, 84 quimostato, 193 quimotripsina, 53, 94, 96 R Rabi, Isaac, 241 Rabl, Karl, 38 Racker, Efraim, 199 radiación, 69 Randall, John, 143, 145, 152 Raoult, François Marie, 20, 40, 56, 187 ras, 232 Ray, John, 25 rayos X, 68, 119, 125 reacción de Biuret, 46 de inmunidad, 127 en cadena de la polimerasa. Véase PCR recombinación genética bacteriana, 135

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Índice analítico reemplazamiento isomorfo, 91 múltiple, 92 regla de Chargaff, 140 de la herencia de los caracteres adquiridos, 28 del uso y del no uso, 27 Reichert, Karl, 37 relacion carga-masa, 211 replicación conservadora, 154 dispersora, 154 semiconservadora, 154 represor, 193, 194 lac, 215 resonancia, 71 retrovirus, 230 ribonucleasa, 98, 110, 234 ribosa, 108, 109 ribosoma, 171, 186 ribozima, 224 Rich, Alexander, 156, 170, 175 Richard, Frederick, 93 rifampicina, 203 Riggs, Austen, 91 Ritossa, Ferruccio, 236 Rittenberg, David, 66 RMN, 241 RNA, 108, 162, 175, 226 adaptador. Véase tRNA de transferencia. Véase tRNA heterogéneo nuclear. Véase hnRNA M1, 226 mensajero. Véase mRNA primasa, 202 tie club. Véase “club de la corbata de RNA” RNAsa, 93, 111 P, 226 Roberts, Richard, 223 Rockefeller, John, 60 Rodebush, Worth, 76 Röntgen, Wilheim, 68 Roosevelt, Franklin Delano, 58 Roosevelt, Theodore, 60 Rosmann, Michael, 83 Rouelle, Hilaire Martín, 40 Rous, Peyton, 171, 227 Royal Institution, 93 Royal Society, 24 RSV, 228 Ruben, Samuel, 66 Rubin, Harry, 228, 230 Ruddle, Frank, 212 Ruska, Ernst, 67 Rutherford, Ernest, 69 S Saint-Hilaire, Geoffroy, 27, 28 Salmonella, 136

Sanger, Frederick, 63, 95, 164, 165, 179, 183, 215 Scheele, Carl Wilheim, 41, 105 Schell, Jeff St., 212 Schelling, Friedrich Wilheim, 48 Schleiden, Mathias, 35 Schneider, Albert, 37 Schoenheimer, Rudolph, 66 Schott, Otto, 35 Schrödinger, Erwin, 19, 69, 71, 131, 143, 146, 160 Schwann, Theodor, 35, 46, 48, 49, 52 SDS, 211 secuencia Shine-Dalgarno, 224 secuenciación, 243 de DNA, 165, 205 método enzimático, 217 método químico, 215 de la insulina, 95 de proteínas, 98, 169 de tRNA, 170, 215 selección natural, 31 Seller, Elizabeth, 170 Sharp, Philip, 223 Shatkin, Aaron, 222 Shine, John, 188 Sia, Richard, 128 SIDA, 233 Signer, Rudolph, 112, 143 simetría, 85, 151, 195 simetría viral cúbica, 242 icosaédrica, 242 sincrotrón, 240 Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. Véase SIDA Sinsheimer, Robert, 200 síntesis de Patterson, 90 de péptidos, 47 de proteínas, 162, 166, 186 sistema libre de células, 171 Smith, Hamilton O, 205 Smith, Michael, 213 Smith, William, 28 Sociedad Lineana, 31 Lunar, 27 somatostatina, 208 Sommerfeld, Arnold, 70, 71 Sörensen, Soren, 73 Southern blot, 212 Southern, Edwin, 212 Spaulding, M., 183 Spiegelman, Sol, 175, 231 SPINCO, 64 splicing. Véase ayuste src, 230 Stahl, Franklin, 138, 154 Standard Oil, 60

Stanley, Wendell Meredith, 58, 67, 122 Staphylococcus. aureus, 208 Stark, George, 212 Staudinger, Herman, 57, 79 Steitz, Joan, 188, 224 Steitz, Tom, 195 Stent, Gunther, 154, 238 Steudel, Hermann, 106, 109, 110 Stokes, Alexander, 145 Streisinger, George, 179 Studier, William, 211 Sturtevant, Alfred, 116, 118, 177 sulfato amónico, 46 Sumner, James, 53 superhélice, 88 Sutherland, William, 73 Sutton, Walter, 38 SV40, 205, 207, 208 Svedberg, Theodor, 57, 63, 74, 111, 112 Swanson, Robert, 208 SWISSPROT, 243 Synge, Richard Laurence Millington, 62, 96, 113 Szilard, Leo, 19, 193, 238 Szybalski, Waclaw, 185 T T, fago, 133 T2, 138, 172, 173, 175 T4, 177, 178, 179, 186 T7, 186 Tatum, Edward L., 122, 124, 133, 135 técnicas de recombinación del DNA, 206 de secuenciación del DNA, 195 Teller, Edward, 165 Temin, Howard, 228, 230 tendamistat, 242 teoría celular, 38 coloidal de las proteínas, 54, 111 de acción de masas, 190 de la cuasiequivalencia, 242 de la disociación electrolítica, 72 de la generación espontánea, 35 de la Pangénesis, 31 de las mutaciones, 114 de los genes intercambiables, 197 del “Big Bang”, 160 del ciclol, 78 del enlace peptídico, 55 del molde, 218 del uniformismo, 29 general de la selección natural, 115 macromolecular, 57 tetranucleotídica, 111, 140, 141 Tetrahymena, 225

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Índice analítico Thach, Robert, 187 Thermus aquaticus, 214 Thompson, Joseph John, 68 timina, 105 Timofeeff-Ressovsky, Nikolaï, 131 Tiselius, Arne, 65, 111 Tissières, Alfred, 180, 236 TMV, 58, 67, 98, 122, 176, 240 Todaro, George, 230 Todd, Alexander, 109, 110, 152 Tompkins, Mr., 160 Tonegawa, Susumu, 218 transcripción, 224 transcriptasa inversa, 229 transducción, 136 transformación, 207 transgénico, 212 transposón, 197 Traube, Isidor, 77 Traube, Maurice, 50 triplete, 178 tripsina, 53, 74, 96, 98, 217 triptófano sintetasa, 179 tritio, 66 tRNA, 166, 168, 182, 185 Tschermak, Erich, 114 Tse-Tung, Mao, 120 Tswett, Mikhail, 62 Twort, Frederick, 132 U ultracentrifugación, 57 universidad Alemana de Praga, 46 de Alabama, 209 de Basilea, 99, 143 de Berkeley, 176, 228 de Berna, 112 de British Columbia, 213 de California, 123 de Cambridge, 74, 80, 95, 143, 215 de Chicago, 61 de Colorado, 224 de Columbia, 66, 116, 132, 140, 202, 235 de Cornell, 123, 170 de Edimburgo, 30 de Gante, 43, 212 de Ginebra, 205, 236 de Glasgow, 229 de Harvard, 168, 194 de Illinois, 226 de Indiana, 121, 146, 215 de Leeds, 70

de de de de de de de de de de de de de de de de de de de de de de

Leicester, 219 Leipzig, 100 Manchester, 79 Marburgo, 107 Michigan, 163 Munich, 50, 70 Nagoya, 203 Nottingham, 145 Oregón, 71, 195 Rotterdam, 41 San Francisco, 211, 230, 237 Santa Cruz, 227 St. Andrews, 143 Stanford, 179, 198, 205, 208 Tejas, 119 Tubinga, 99 Tufts, 186 Uppsala, 64, 80 Vanderbilt, 131 Viena, 32, 81, 140 Virginia, 64 Washington, 138 en San Luis, 199 de Wisconsin, 61, 124, 185, 187, 229 de Wurzburgo, 68 de Yale, 189, 195, 226 Rockefeller de Nueva York, 60, 186 Unwin, Nigel, 243 uracilo, 106 urea, 50, 75, 234 Urey, Harold, 66 Ussher, James, 24, 25, 27 V Vand, Vladimir, 88, 147 Varmus, Harold, 230 vasopresina, 98 Vavilov, Nicolai, 119 Vázquez, David, 187 Vendrely, Colette, 141 Vendrely, Roger, 130, 141, 162, 167 Vigneaud, Vicent du, 98 VIH, 233 Vinci, Leonardo da, 179 Viñuela, Eladio, 211 Virchow, Rudolf, 35, 99 virus de la Inmunodeficiencia Humana. Véase VIH del Mosaico del Tabaco. Véase TMV del sarcoma de Rous. Véase RSV SV40, 205, 207, 208

Vischer, Ernst, 140 vitalismo, 48 vitamina B, 125 B1, 110 E, 110 Volkin, Elliot, 172, 173 Vries, Hugo de, 114 W Wallace, Alfred Russell, 29, 31 Watson, James, 15, 20, 83, 90, 140, 145, 146, 149, 150, 152, 154, 161, 165, 167, 172, 175, 177, 179, 180, 187, 198, 223, 242 Weaver, Warren, 16, 61, 64, 131 Wedgwood, Josiah, 29 Weigle, Jean, 191 Weinberg, Robert A., 232 Weismann, August, 38 Western blot, 212 Wieland, Heinrich, 62 Wigler, Michael, 232 Wilkins, Maurice, 19, 20, 65, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 152, 157 Williams, Robley, 149 Willstätter, Richard, 52, 62, 128 Wilson, Edmund, 38, 103, 116 Winkelblech, Karl, 73 Woese, Carl, 226 Wöhler, Friedrich, 49, 52 Wollman, Elie Leo, 191 Wollman, Elisabeth, 191 Wollman, Ellie, 136, 137, 172 Wollman, Eugène, 191 Wright, Sewall, 115 Wrinch, Dorothy, 78 Wu, Hsien, 76 Wüthrich, Kurt, 241 Wyman, Jeffries, 94, 197 X xantina, 101, 105 Xenopus laevis, 208 Y Yanofsky, Charles, 179 Yudkin, John, 190 Z Zamecnik, Paul, 168, 171, 180 Zimmer, Karl, 131 Zinder, Norton, 136 zwitterion, 73

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VIRUS patógenos (en coedición con la Fundación BBVA) Coordinadores: Luis Carrasco José Mª Almendral del Río VV. AA. CD con fichas interactivas

El libro “A la búsqueda del secreto de la vida” va avanzando desde los orígenes de la Biología Molecular, con la identificación de las macromoléculas esenciales y la comprensión de su estructura y función, hasta la incorporación de estos conceptos en la genética y sus leyes, culminando en uno de los hechos científicos de mayor trascendencia: la determinación de la estructura del DNA. Este hecho, que cambia sustancialmente nuestra forma de entender las bases de la vida, abre de par en par las puertas para la comprensión de los fenómenos subyacentes a la transmisión de la información genética, y permite un avance vertiginoso en la disciplina. Escrito en un tono riguroso, incorpora no obstante un material rico en anécdotas y características personales de los científicos protagonistas de cada paso descrito. De esta manera se nos ofrecen nuevas perspectivas que complementan y cualifican a las figuras señeras de la ciencia del siglo XX. El libro ofrece una posibilidad única de revisar los mecanismos mediante los cuales una disciplina nace y se afianza en el panorama científico-tecnológico, al compás de las transformaciones sociales, económicas y políticas que la enmarcan. Y todo ello en un tiempo relativamente corto, por lo que lector queda atrapado de forma natural en su lectura.

José María Valpuesta

BIOQUÍMICA. Técnicas y Métodos Autores: Pilar Roca Jordi Oliver Ana Mª Rodríguez CD con animaciones interactivas

Una Breve Historia de la Biología Molecular

A la Búsqueda del Secreto de la Vida

Otros títulos de la serie Base:

La Biología Molecular representa un caso especialmente interesante en la historia de la ciencia debido a su enorme trascendencia sobre nuestro conocimiento actual de la esencia y el funcionamiento de los seres vivos, así como en sus aplicaciones y potencial actual y futuro. Este libro pretende dar una visión de los antecedentes, nacimiento y desarrollo de esta fascinante disciplina, difícil de definir de una manera clara y desligarla de otras que la han dado sustento: la Bioquímica –que ha prestado multitud de técnicas–, la Genética –que ha proporcionado un buen número de ideas–, y la Física –quizás la que le ha dado el sello más propio–.

a la búsqueda del secreto de la vida

JOSÉ MARÍA VALPUESTA MORALEJO es Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad del País Vasco. Realizó una estancia postdoctoral en el Laboratory of Molecular Biology en Cambridge (Inglaterra) y en la actualidad es Profesor de Investigación del CSIC y Director del Centro Nacional de Biotecnología, donde desarrolla desde hace años una línea de investigación sobre chaperonas moleculares. Es autor de más de cien artículos en revistas internacionales. Desde 2005 es Presidente de la Sociedad de Microscopía de España, y también miembro de otras sociedades científicas españolas y extranjeras. En el ámbito de la divulgación científica, ha participado como ponente en conferencias, y escrito artículos de opinión en periódicos y revistas. Ha impartido numerosos cursos de doctorado en varias universidades españolas, entre ellos uno dedicado a la Historia de la Biología Molecular y sus antecedentes desde la historia antigua hasta nuestros días, germen del libro que ahora presentamos.

José María Valpuesta Prólogo de José Manuel Sánchez Ron

Serie base

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